Contenido iii
USP 39-NF 34
Contenido VOLUMEN 1
Artículos Nuevos que Aparecen en USP 39 Ausentes en USP 38 y sus Suplementos .......... xxxviii
Declaración de la Misión y Prefacio . .
vii
Artículos Incluidos en USP 38 Ausentes en USP 39 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xxxix Lista Detallada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xi
Integrantes del Ciclo de Revisión 2010-2015 .......................
xiii
Funcionarios . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xiii
Advertencias Advertencias y Requisitos Generales . . . . . . . . . . 1
junta Directiva . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xiii Consejo de Expertos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xiii Comités de Expertos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xiv Grupos Asesores ........................ xxii In Memóriam .......................... xxii
Miembros y Delegados de la Convención de la Farmacopea de los Estados Unidos de América, a partir del 31 de mayo de 2015 . . . . . . . . . . xxiii Reconocimiento para los Donantes de Materiales de Referencia y de Monografías en 2014 ............. xxx
Capítulos Generales Ver página 63 para detalles del contenido
Pruebas y Valoraciones Generales . . . . . . . . . . . 67 Requisitos Generales para Pruebas y Valoraciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67 Aparatos para Pruebas y Valoraciones . . . . . . . 114 Pruebas Microbiológicas . . . . . . . . . . . . . . . . . 119 Pruebas y Valoraciones Biológicas . . . . . . . . . . 154 Pruebas y Valoraciones Químicas . . . . . . . . . . . 243 Pruebas y Determinaciones Físicas . . . . . . . . . . 454 Información General . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 820
Acta Constitutiva .................. xxxii Gobierno de la USP ................ xxxiii Estatutos ............................. xxxiii Normas y Procedimientos ................ xxxiii Políticas de la USP ...................... xxxiii
Suplementos Dietéticos ................. 2213
Reactivos, Indicadores y Soluciones. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2279
Especificaciones de Reactivos . . . . . . . . . . . . . 2284 Indicadores y Papeles Indicadores de Prueba . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2366
Incorporaciones . . . . . . . . . . . . . . . . . .
xxxvii
Soluciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2369
Artículos Incorporados a USP 39 mediante Suplementos ......................... xxxvii
Soluciones Amortiguadoras . . . . . . . . . . . . 2369
iv Contenido
Soluciones Colorimétricas
USP 39-NF 34
2370
Soluciones Reactivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2371 Soluciones Volumétricas. . . . . . . . . . . . . . . 2381
Índice Índice Combinado de USP 39 y NF 34 . . . . . . . 1-1
Columnas Cromatográficas . . . . . . . . . . . . . . 2391
VOLUMEN 3
Tablas de Referencia Envases para Dispensar Cápsulas y Tabletas . . 2397 Descripción y Solubilidad Relativa de Artículos de la USP y del NF. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2408
Guía para los Capítulos Generales . . . .
Solubilidades Aproximadas de Artículos de la USP y del NF . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2472
Advertencias
, · Pesos At om1cos ...................... . 2481
vii
Advertencias y Requisitos Generales . . . . . . . . . . xi
Masas Atómicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2484 Tabla Alcoholimétrica . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2486 Tabla de Viscosidad Intrínseca . . . . . . . . . . . . 2488
USP 39
Equivalencias de Temperatura . . . . . . . . . . . . 2490
Monografías Índice
Monografías Oficiales de USP 39, 1-Z ...... 4705
Índice Combinado de USP 39 y NF 34 . . . . . . . 1-1
Índice Índice Combinado de USP 39 y NF 34 ....... 1-1
VOLUMEN 2 Guía para los Capítulos Generales . . . .
VOLUMEN 4 vii
Guía para los Capítulos Generales. . . .
vii
Advertencias Advertencias y Requisitos Generales . . . . . . . . . . xi
Advertencias Advertencias y Requisitos Generales .......... xi
USP 39 Suplementos Dietéticos Monografías Monografías Oficiales de USP 39, A-H ...... 2493
Monografías Oficiales . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6919
USP 39-NF 34
NF 34
Contenido v
Excipientes Excipientes USP y NF, Agrupados por Categoría . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7645
Incorporaciones Artículos Nuevos que Aparecen en NF 34 Ausentes en NF 33 y sus Suplementos . . . . 7643
Monografías Monografías Oficiales de NF 34. . . . . . . . . . . 7655
Artículos Nuevos que Aparecen en NF 34 . . . 7643 Lista Detallada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7644
Índice Índice Combinado de USP 39 y NF 34 ....... 1-1
USP 39
Misión
y Prefacio vii
Misión y Prefacio USP 39-NF 34 y sus Suplementos Este apartado brinda información sobre la Convención de la Farmacopea de los Estados Unidos de América (USP), así como también información general sobre la 39.ª revisión de la Farmacopea de los Estados Unidos de América (USP 39) y la 34.ª edición del Formulario Nacional (NF 34) y sus Suplementos. Los textos de USP 39-NF 34 serán oficiafes a partir del 1 º de mayo de 2016, los textos del Primer Suplemento de USP 39-NF 34 serán oficiales a partir del 1º de agosto de 2016 y los textos del Segundo Suplemento de USP 39-NF 34 serán oficiales a partir del 1 º de diciembre de 2016, a menos que se indique algo diferente. DECLARACIÓN DE LA MISIÓN Los compendios USP-NF se publican en cumplimiento con la misión de la USP: Mejorar la salud en todo el mundo a través de normas públicas y programas relacionados que ayuden a garantizar la calidad, seguridad y beneficio de Jos medicamentos y alimentos. HISTORIA La USP tiene una historia rica, que remonta a 1820 cuando once médicos se reunieron en la Cámara de Senadores del Capitolio de los EE.UU. para establecer una farmacopea para los EE.UU. Puede aprender más sobre la historia de la USP y los acontecimientos más importantes, dirigiéndose al sitio Web de la USP (http://www.usp.org/about-usp/ our-history). CONTENIDO DE LOS COMPENDIOS USP-NF Los compendios USP-NF contienen monografías de sustancias (ingredientes) y productos para artículos oficiales reconocidos en los compendios USP-NF (ver Advertencias y Requisitos Generales 2.20 Artículos Oficiales). Salvo escasas excepciones, todos los artículos sobre los que existen monografías en los compendios USP-NF se comercializan legalmente en los EE.UU. o están contenidos en artículos que se comercializan legalmente. Los compendios USP-NF también incluyen monografías para preparaciones magistrales. Una monografía de los compendios USP-NF de una sustancia, producto o preparación oficial puede constar de varios componentes, incluido el nombre del artículo, la definición, las condiciones de envasado, almacenamiento y otros requisitos, y una especificación. Los capítulos generales proporcionan los procedimientos gue se citan con frecuencia, a veces con criterios de aceptacion, con el fin de compilar en un solo lu9ar información repetitiva que se aplica a muchas monograf1as. Para mayor información sobre normas en las monografías y capítulos generales de los compendios USP-NF ver Advertencias y Requisitos Generales, 3. 7O Aplicabilidad de las Normas. Las monografías y capítulos generales, nuevos, eliminados y revisados de esta edición se indican en el apartado Incorporaciones.
Organización de los Compendios USP-NF-Los compendios USP-NF se publican en cuatro volúmenes. El Volumen 7 incluye secciones de preliminares (Misión y Prefacio, Integrantes, sitios Web y páginas del Gobierno de la USP e Incorporaciones/Lista Detallada). Asimismo, incluye Advertencias y Requisitos Generales, Capítulos Generales, capítulos generales de Suplementos Dietéticos, Reactivos y Tablas de Referencia. El Volumen 2 incluye monografías de la USP correspondientes a las letras A-H y el Volumen 3 incluye monografías de la USP correspondientes a las letras 1-Z. El Volumen 4 incluye monografías de Suplementos Dietéticos, Incorporaciones del NF/Lista Detallada, Excipientes y monografías del NF. Para facilitar el uso y referencias convenientes, todos los cuatro volúmenes incluyen el índice combinado, así como las Advertencias y Requisitos Generales y la Guía para los Capítulos Generales. Los capítulos generales específicos para los suplementos dietéticos se incluyen por orden numérico con los demás capítulos generales en la USP. Las monografías de excipientes se presentan por lo general en el NF, pero pueden también aparecer en la USP, con la referencia cruzada correspondiente cuando también son fármacos. El apartado Excipientes (Volumen 4) presenta una tabla de los excipientes organizados por categoría funcional. Suplementos-Los Suplementos de USP-NF se rigen por un programa de publicación estándar anual: el Primer Suplemento se publica en febrero y se oficializa el 1 º de agosto. El Segundo Suplemento se publica en junio y se oficializa el 1 º de diciembre. Los usuarios de los productos impresos de la USP deben conservar los Suplementos y verificar la sección de "Official Text" (Texto Oficial) del sitio Web de la USP para contar con el texto oficial actualizado. La versión en línea de los compendios USP-NF se actualiza con cada Suplemento o con la revisión anual. Cada vez que se publica una nueva edición o Suplemento durante la suscripción vigente, se publica una nueva versión electrónica. El Indice de cada Suplemento es acumulativo e incluye citas de la revisión anual y, en el caso del Segundo Suplemento, citas del Primer Suplemento. Los dos Suplementos se incluyen en la siguiente edición anual, junto con las nuevas revisiones oficiales que hayan sido adoptadas con posterioridad al Segundo Suplemento de la edición previa de los compendios. Revisiones de USP-NF-Los compendios USP-NF se revisan en forma continua mediante un proceso excepcional de participación pública e interacción sustancial entre la USP y sus partes interesadas, tanto a nivel nacional como internacional. Las revisiones se presentan anualmente, como Revisiones de Normas en USP-NF y en los Suplementos semestrales, y como Revisiones Aceleradas en el sitio Web de la USP [Fe de Erratas, Anuncios de Revisión Intermedia (lnterim Revision Announcement (IRA) y Boletines de Revisión (Revision Bulletins)]. Revisiones de Normas-El proceso de revisión de normas de la USP requiere la publicación de las propuestas de la revisión en el Pharmacopeial Forum (PF) durante un período de notificación y comentarios de 90 días y, después de la aprobación del Comité de Expertos pertinente de la USP, se publica la revisión en los próximos compendios USP-NF o Suplemento, según corresponda. Aprenda más sobre el pro-
viii Misión y Prefacio ceso de desarrollo y revisión en el sitio Web de la USP (http://www.usp.org/usp-nf/development-process). Revisiones Aceleradas-Se usa el proceso de Revisión Acelerada para oficializar revisiones de USP-NF en forma más rápida que a través del proceso de Revisión de Normas de la USP. Apr~nda más S?bre los Boletines de Revisión, .Anl!ncios de Rev1sion Intermedia (IRA) y Fe de Erratas, y el cnteno para cada uno y la implementación de cada uno en el sitio Web de la USP (http://www.usp.org/usp-nf/official-text). Modificación de Referencias Farmacopeicas-En ocasiones, la USP y sus Comités de Expertos consideran necesario modificar los títulos de los capítulos generales o de textos similares que pudieran estar referidos en otras normas en los compendios USP-NF. Cuando esto sucede, el personal de la USP lleva a cabo un riguroso proceso para identificar y actualizar tales referencias. Dichas actualizaciones pueden realizarse mediante una revisión de rutina, o para casos en los que una actualización no representa un cambio significativo en el estándar en cuestión, mediante una actualización directa de la referencia en dicha norma sin necesidad de aviso ni periodo de comentarios. En todos los casos, la USP publicará en su sitio Web un aviso en el que se indique el cambio de la fuente, cualquier referencia resultante y si dichas referencias se actualizarán a través de una revisión de rutina o una actualización directa. Actualización de la Información Química-Las actualizaciones de la sección de Información Química al principio de las monografías se realizan continuamente y no se identifican con símbolos de revisión. Los nombres químicos y los pesos molecu_lares se actualizan cuando la monografía s~ .somete a revision para que correspondan con la fuente oficial, Nombres Adoptados en los Estados Unidos (USAN, por sus siglas en ing!és). Las estructuras químicas se actualizan de forma continua. Los nombres químicos por lo general reflejan las convenciones al momento del desarrollo o revisión de la monografía. Si las reglas de nomenclatura de CAS o IUPAC han sufrido cambios importantes, los nombres químicos pueden revisarse o agregarse para reflejar dichas reglas. Los pesos moleculares se derivan de la fórmula química y se basan en la tabla de pesos atómicos. Los pesos atómicos son los recomendados por IUPAC y reflejan la composición isotóp.ica de material terrestre normal. Cuando se presenten cambios en los valores recomendados por IUPAC, se entiende que los cambios en los pesos moleculares se realizarán dentro del tiempo esperado. La representación gráfica de las estructuras de compuestos químicos tiene como propósito ayudar visualmente a establecer la identidad química y se entiende que representa una de muchas formas posibles de representar la molécula. La introducción de una representación gráfica así como cambios que resulten en la misma información química, p. ej., una molécula quiral invertida o agregando una estruc-. tura molecular, se puede agregar fuera del proces.o de revisión. Asimismo, se entiende que para el tautomensmo, la molécula representada puede ser uno de los tautómeros, pero se entiende que la intención es representar todos los isómeros en equilibrio. Los centros estereogénicos representados con enlaces sin realce implican mezclas de estereómeros-enantiómeros, diastereómeros, epímeros (anómeros), entre otros. Dependien<:!o del mon:iento <:Je estas actualizaciones, lº~ usuarios podnan notar d1ferenc1as en una estruc~ura qu1m1ca entre las publicaciones del PF y de los compendios USP-NF, así como entre la versión impresa y en línea de los compendios USP-NF. Texto Sombreado y Símbolos-El texto sombreado se usa para identificar el texto que ha sido modificado, agregado o eliminado desde su última publicación. Los símbolos identifican el inicio y el final de cada revisión o de texto no armonizado. La siguiente tabla resume los tipos de sí~bc;ilos y los subíndices relacionados que se usan en las publicaciones de la USP:
USP 39 Tipo de Revisión
Subíndice
Símbolo
Anuncio de Revisión Intermedia Boletín de Revisión
•texto nuevoec1RA01-;"1-
(IRA 01-jul-2016) *
2016)
•texto nuevoe CBR01-eoe-
(BR 01-ene-2016)*
2016)
Texto eliminado
(IRA 01-jul-2016) *
• e(IRAOl-jul-2016) Ü
1 S (USP39/ usp39**
• •1 S (USP39) 0 .A..lo.(USP39)
Texto adoptado en los
•texto nuevo., srusPJ9!
1 S o 25 (edición anual de la USP)*
•texto nuevo,.1usPJ9J
Edición anual de la usp**
Suplementos Texto adoptado en USP-NF Armonización
+texto nacional remanente o texto no armonizado+
Erratas
•texto nuevoe crnR01-;"1-
(ERR 01-jul-2016)
2016)
Referencias a capítulos
•texto nuevoe (AFOl-m•y-
(AF Ol-may-2016)
2016)
•texto nuevo e
(Oficial 01-dic-
(Oficial 01-dic-2016)
201
* Un número o fecha en subíndice indica el IRA, el Boletín de Revisión o el Suplemento donde la revisión apareció por primera vez. **Un ejemplo de una revisión que se oficializó en los compendios USP-NF sería •usp39.
La siguiente tabla presenta los símbolos y fechas oficiales para los IRA y los Suplementos de los compendios USP 39-NF 34. Fechas Oficiales y Símbolos Para los Anuncios de Revisión Intermedia y los Suplementos de los Compendios USP 39-NF 34
Suplemento
Anuncio de Revisión Intermedia Propuesto 42(1) 42(2) 42(3)
2
USP 40-NF
42(4) 42(5) 42(6)
Fecha Oficial 1º de julio de 2016 1º de agosto de 2016 1 º de septiembre de 2016 1º de noviembre de 2016 1 º de diciembre de 2016 1º de enero de 201 7 1º de marzo de 2017 1º de mayo de 201 7
Símbolos
•ye(IRA 01-jul-2016) •y.1 S (USP39)
• •
Y•CIRA 01-sep-2016) Y•CIRA Ol-nov-2016)
•y.25 (USP39) •ye(IRA 01-ene-2017) •ye(IRA 01-mar-2017)
•
Y•
35
Asimismo, en la versión en línea de los compendios USP-NF las monografías y capítulos generales que han sido
revisad~s, pero que aún no se han publ!cado en los .c?m-
pendios USP-NF nj s~s Supler:ientos (p.ej., COl)l
sión y comentarios adicionales. Si se reciben comentarios adicionales, estos son considerados e incorporados por el Comité de Expertos según corresponda. Para los casos en los que las propuestas se oficialicen sin necesidad de repu~ blicación en el PF, se publica un resull!en de los comei:t~rnos recibidos junto con las respuestas pertinentes del Com1te de
Misión y Prefacio ix
USP 39
Expertos en el apartado Comentarios del sitio Web de la USP al momento de la publicación de la revisión. Los Comentarios no forman parte del texto oficial y no están destinados para su aplicación por parte de autoridades reglamentarias, sino gue explican los fundamentos de las respuestas del Comite de Expertos a los comentarios públicos. En caso de discrepancia entre el contenido de los Comentarios y el texto oficial, el texto oficial prevalecerá. En caso de controversia o cuestionamiento sobre la interpretación, prevalecerá el lenguaje del texto oficial, de manera única e independiente de los Comentarios. Presentaciones Impresas y Electrónicas-Para más información sobre los formatos disponibles de los compendios USP-NF ver Advertencias y Requisitos Generales, 2.1 O Texto Oficial. Traducciones de USP-NF-Los compendios USP-NF se encuentran disponibles en ediciones en español, ruso y chino. El mantenimiento de la edición en español sigue el mismo enfoque de revisión que la edición en inglés; las demás traducciones están basadas en revisiones anteriores de los compendios USP-NF. Estándares de Referencia USP-EI uso de los Estándares de Referencia USP promueve la calidad uniforme de los medicamentos y sustenta la fiabilidad y uniformidad para aquéllos que llevan a cabo los análisis para el cumplimiento de las normas y demás usuarios de los compendios USP-NF, incluidos fabricantes, compradores y autoridades reglamentarias. Los Estándares de Referencia USP se citan en procedimientos específicos tanto en monografías como en capítulos generales. La USP oficializa este material a través de estudios meticulosos de caracterización y de análisis colaborativos, seguidos por la revisión y aprobación del uso farmacopeico del material de referencia por parte de los Comités de Expertos del Consejo de Expertos. El Catálogo USP, que lista la colección de Estandares de Referencia USP, y más información sobre uso y almacenamiento, se encuentra disponible en el sitio Web de la USP (http://www.usp.org/referencestandards). Este programa se beneficia de una amplia contribución voluntaria de materiales adecuados y de datos de prueba ye_rtinentes por parte de fabricantes de productos farmaceut1cos. ÓRGANOS DE GOBIERNO, DE ESTABLECIMIENTO DE NORMAS Y DE ASESORAMIENTO DE LA USP Los órganos de gobierno, de establecimiento de normas y de asesoramiento de la USP incluyen la Convención de la USP, la Junta Directiva, el Consejo de Expertos y sus Comités de Expertos, Paneles de Expertos y personal. Otros cuerpos de voluntarios incluyen Foros de Partes Interesadas y Equipos de Proyecto, que ofrecen a partes interesadas la oportunidad de contribuir, mediante consejos y recomendaciones, hacia el avance de las normas y procesos de la USP. Aprenda más sobre la composición y trabajo de la Convención de la USP, la Junta Directiva, los Comités de Expertos y los Paneles de Expertos en el sitio Web de la USP (http:// www.usp.org/about-usp/leadership/governance). Aprenda más sobre los Foros de Partes Interesadas y Equipos de Proyecto en el sitio Web de la USP (http://www.usp.org/meetings-courses/stakeholder-forums). La sección Integrantes incluye un listado actualizado de los Delegados de la Convención de la USP con derecho a voto y de los miembros y enlaces gubernamentales ante el Consejo de Expertos y sus Comités de Expertos y Paneles de Expertos. Trabajo Conjunto con la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (Food and Drug Administration o FDA)-Conforme a lo especificado por la ley de los EE.UU., la USP trabaja con el secretario del Department of Health and Human Services (Secretaría de Salud y Asuntos Sociales), principalmente a través de la FDA. La USP trabaja de distintas formas con dicha agencia, pero la interacción principal se da mediante el Programa de Enlaces Gubernamentales. El Programa de Enlaces Gubernamentales
permite que representantes de la FDA y otras agencias ~u bernamentales participen en las reuniones de los Comites de Expertos y de los Paneles de Expertos, con lo que se facilita la interacción entre el personal gubernamental y los Comités de Expertos. El personal de los Centros de la FDA responsable de revisar las actividades farmacopeicas proporciona oportunidades y vínculos específicos para el intercambio de comentarios. La Office of Policy for Pharmaceutical Quality (Oficina de Política para la Calidad Farmacéutica) en el Center for Drug Evaluation and Research (Centro de Evaluación e Investigación de Medicamentos) es el contacto principal para los temas farmacopeicos entre la FDA y la USP. NORMAS Y PROCEDIMIENTOS Documentos Rectores-Las normas de los compendios USP-NF gozan de un gran reconocimiento porque son normas autorizadas, tienen fundamento científico y se establecen a través de un proceso transparente y fiable. Ver la sección Acta Constitutiva en este libro; los Estatutos (http:// www.usp.org/about-usp/leadership/bylaws) y las Normas y Procedimientos del Consejo de Expertos (http://www.usp.org/ about-usp/leadership/policies-rules). Colectivamente, estos documentos sirven como principios rectores de las actividades referentes al establecimiento de normas para el personal y los colaboradores voluntarios de la USP. RECONOCIMIENTO LEGAL Reconocimiento de los Compendios USP-NF-Los compendios USP-NF están reconocidos por la legislación y costumbre en muchos países del mundo. En los EE.UU., la Ley FD&C (Ley sobre Alimentos, Medicamentos y Cosméticos) define el término "compendio oficial" para referirse a la USP oficial, al NF oficial, a la Farmacopea Homeopática de los Estados Unidos de América oficial o a cualquiera de sus suplementos. Las normas de USP-NF desempeñan un papel en las disposiciones sobre adulteración y rotulación incorrecta (m1sbranding) de la Ley FD&C, las cuales se aplican también a productos biológicos, que constituyen un subconjunto de medicamentos b¡yo la Public Health Service Act (Ley de Servicios de Salud Publica) (ver Advertencias y Requisitos Generales, 2.30 Reconocimiento Legal). La FDA requiere que los nombres de los artículos que no son oficiales se distingan y diferencien claramente de cualquier otro nombre reconocido en un compendio oficial. Los medicamentos con un nombre reconocido en USP-NF también se considerarán rotulados incorrectamente a menos que cumplan con las normas farmacopeicas de envasado y etiquetado (para mayor información ver Advertencias y Requisitos Generales, 3.10.1 O Aplicabilidad de las Normas a Productos Farmacéuticos, Fármacos y Excipientes. Medicamentos-El objetivo de la USP es contar con monografías de fármacos y medicamentos en los compendios USP-NF para todos los medicamentos legalmente comercializados en los EE.UU., incluyendo medicamentos químicos y biológicos, y sus ingredientes. La USP también desarrolla monografías para productos terapéuticos legalmente comercializados no aprobados por la FDA; p.ej., medicamentos anteriores a 1938, medicamentos de venta libre comercializados bajo el sistema de Monografías de Medicamentos de Venta Libre de la FDA (FDA OTC Monograph System), suplementos dietéticos y preparaciones magistrales. Cuando corresponda, el cumplimiento de lo estipulado en una monografía de USP-NF, será obligatorio en todo momento durante la vida de un artículo, desde su producción hasta su caducidad. Productos Biológicos-En los EE.UU., los productos biológicos se consideran un subconjunto de medicamentos, independientemente de que estén aprobados por la FDA de conformidad con la Ley FD&C [y se les conceda una solicitud de medicamento nuevo (NDA, por sus siglas en inglés)]
x Misión y Prefacio o de conformidad con la Public Health Service Act [la Ley PHS, por la que reciben una licencia de productos biológicos (BLA, por sus siglas en in~lés)]. Como resultado, todos los productos biológicos considerados por la Ley PHS están sujetos a los requisitos reglamentarios para medicamentos de la Ley FD&C, lo que significa que tienen que cumplir con las disposiciones sobre adulteración y rotulación incorrecta (misbranding) de la Ley FD&C, incluyendo los requisitos farmacopeicos de USP-NF. Lo anterior se aplica de la misma manera a los productos biológicos aprobados por la vía "351 (a)" de larga data de la Ley PHS, así como por la nueva vía "351 (k)" para productos biosimilares agregada por la reforma de la legislación de salud de 201 O [Biologics Price Competition and lnnovation Act, Title VII, Subtitle A of the Patient Protection and Affordable Care Act, Public Law 111-148 (Ley sobre Innovación y Precios Competitivos para Productos Biológicos, Título VII, Subtítulo A de la Ley de Protección y Cuidados de la Salud Accesibles para el Paciente, Ley Pública 111-148)]. Suplementos Dietéticos-Las enmiendas a la Ley FD&C de la Ley de Salud y Educación sobre Suplementos Dietéticos de 1994 establecen que se puede considerar a un suplemento dietético un alimento rotulado incorrectamente (misbranded) si dicho suplemento está cubierto por las especificaciones de un compendio oficial (es decir, los compendios USP-Nf), declara cumplir con dichas especificaciones y no cumple con las mismas. En esto difiere de un producto farmaceutico, para el cual la conformidad con la norma farmacopeica aplicable es obligatoria sin necesidad de aseverarlo. Preparaciones Magistrales-La preparación magistral implica la preparación, mezclado, ensamblaje, alteración, envasado y etiquetado de un medicamento, dispositivo u otro artículo, derivado de una orden de un profesional de la salud o como iniciativa a dicha orden, basándose en los patrones rutinarios de administración regularmente observados. La USP proporciona capítulos generales y monografías para preparaciones magistrales. Aprenda más sobre preparaciones magistrales en el sitio Web de la USP (http://www. usp.org/usp-healthcare-professionals/compounding). Dispositivos Médicos-La Sección 201 (h) de la Ley FD&C define como dispositivo a un instrumento, aparato, artículo similar, o componente de los mismos, reconocido en USP-NF. La Sección 502(e) de la Ley FD&C, en ausencia de una designación de la FDA, define el nombre establecido de un dispositivo como el título oficial en un compendio oficial. A pesar de estas disposiciones reglamentarias, no se cuenta con un reconocimiento del papel de la USP para establecer normas farmacopeicas para dispositivos médicos c<;>mparable al que existe para medicamentos y productos b1ologicos. De acuerdo con la Food and Drug Administration Modernization Act of 1997 (Ley de Modernización de la Administración de Alimentos y Medicamentos de 1997), el Center for Devices and Radiological Health (Centro para Dispositivos y Salud Radiológica) reconoce normas nacionales e internacionales, entre las que se incluyen als¡unas pruebas y valoraciones de la USP para dispositivos medicos. Nomenclatura-Para información sobre el proceso de desarrollo de nomenclaturas, el Comité de Expertos sobre Nomenclatura, Seguridad y Etiquetado, y el trabajo de la USP con el Consejo de Nombres Adoptados en los Estados Unidos (USAN, por sus siglas en inglés), ver el sitio Web de la USP (http://www.usp.org/usp-nf/development-process/ compendial-nomenclature). Nombres Químicos y Números de Registro CAS-Los subtítulos químicos que aparecen en las monografías son los nombres empleados en los índices del Chemical Abstracts Service (Servicio de Resúmenes Químicos; CAS, por sus siglas en inglés) de la American Chemical Society (Sociedad Química de los Estados Unidos). Sólo se incluyen en las mono~rafías cuyos títulos especifican sustancias que constituyen entidades químicas definibles. El primer subtítulo es la forma invertida del nombre químic9 sistemático desarrollado por el CAS para los propósitos del Indice Colectivo (Collective In-
USP 39 dex o CI). El segundo subtítulo, que se presenta en forma no invertida, es un nombre IUPAC preferido (PIN) sancionado y empleado por la lnternational Union of Pure and Applied Chemist~ (Unión Internacional de Química Pura y Aplicada o IUPAC). Los nombres IUPAC preferidos también son usados por la Organización Mundial de la Salud (OMS). En ocasiones, se proporciona un tercer subtítulo por razones históricas o cuando el sinónimo emplea una convención nominal alternativa pero equivalente. Las monografías con subtítulos químicos generalmente incluyen también los números de registro CAS. Estos números entre corchetes funcionan de manera independiente de la nomenclatura como indicadores numéricos invariables de sustancias químicas singulares, no ambiguas, en el registro CAS y, por consiguiente, son convenientes y gozan de un uso difundido. ACTIVIDADES DE ARMONIZACIÓN Grupo de Debate Farmacopeico-La USP armoniza las monografías de excipientes y los capítulos generales farmacopeicos en el Grupo de Debate Farmacopeico (PDG, por sus siglas en inglés). Este grupo incluye representantes de la Farmacopea Europea, de la Farmacopea Japonesa y de la Farmacopea de los Estados Unidos de America, as1 como de la OMS (como observador). De acuerdo con la definición del PDG, "un capítulo general farmacopeico u otro documento farmacopeico está armonizado cuando una sustancia o un producto farmacéutico, que se analiza según el procedimiento armonizado del documento, produce los mismos resultados y se lle:¡ia a la misma decisión respecto de aceptarlo o rechazarlo . El sitio Web de la USP contiene información sobre el PDG, incluyendo la historia, el procedimiento de trabajo del PDG, un glosario y una lista de las monografías y capítulos generales que han completado las etapas de 1-6 del proceso de armonización farmacopeica que resulta en texto aprobado de Armonización en Etapa 6 de USP (http://www.usp.org/usp-nf/harmonization). Otras Actividades de Armonización-La USP participa en diversas actividades de armonización que incluyen a todas las farmacopeas. Estas actividades, actualmente en desarrollo, se enfocan en Buenas Prácticas Farmacopeicas y normas públicas óptimas para todos los medicamentos. OTROS COMPENDIOS DE LA USP USP Compounding Compendiu~EI USP Compounding Compendium es un compendio electrónico que incluye todos los capítulos generales que se encuentran en los compendios USP-NF relacionados con la preparación magistral, además de capítulos generales de sustento a los que se hace referencia en los capítulos de preparación magistral y en las Advertencias y Requisitos Generales USP-NF. El propósito del USP Compounding Compendium es proporcionar acceso conveniente a los capítulos generales para los profesionales encargados de la preparación magistral. USP Herbal Medicines Compendiu~EI USP Herbal Medicines Compendium (HMC) es un compendio en línea que ayudará a garantizar la calidad de los ingredientes botánicos usados en los medicamentos botánicos. Las monografías del HMC proporcionan especificaciones de calidad-pruebas, procedimientos y criterios de aceptación-con procedimientos analíticos vafidados y materiales de referencia relacionados que facilitan la evaluación del cumplimiento. El HMC puede ayudar a fabricantes de ingredientes, fabricantes de productos botánicos, agencias reglamentarias y otras partes interesadas en la evaluación del cumplimiento de los ingredientes botánicos medicinales con normas públicas independientes y para controlar la calidad de artículos que se comercializan internacionalmente. El HMC está disponible en https://hmc.usp.org. USP Dietary Supplements Compendiu~EI Dietary Supplements Compendium combina, en dos volúmenes, las normas
USP 39 USP-NF para suplementos dietéticos, normas e información del Food Chemicals Codex, documentos reglamentarios y de la industria, así como otras herramientas y recursos. Se publica cada dos años en una edición impresa de tapa dura. Food Chemicals Codex-EI Food Chemica/s Codex (FCC) es un compendio reconocido internacionalmente de normas de monografías y pruebas de pureza y calidad para ingredientes alimenticios, p.ej. conservantes, saborizantes, colorantes y nutrientes. El FCC se publica cada dos años, con suplementos cada seis meses, y está disponible en formato impreso y electrónico. Las revisiones propuestas al FCC están disponibles para su revisión y comentario público a través del FCC Forum, al cual se puede acceder de manera gratuita en forum.foodchemicalscodex.org.
OTROS RECURSOS DE LA USP Chromatographic Columns-Esta exhaustiva publicación de referencia, previamente titulada "Chromatographic Reagents (Reactivos Cromatográficos)", ofrece información detaflada necesaria para llevar a cabo los procedimientos cromatográficos incluidos en los compendios USP-NF. La publicación Chromatographic Columns lista los nombres comerciales de los reactivos para columna citados en todas las
Misión y Prefacio xi propuestas de procedimientos analíticos nuevos o revisados para cromatografía de gases o de líquidos publicados en el PF desde 1980. La publicación Chromatographic Columns también ayuda a mantener un registro de los reactivos que se usaron para validar los procedimientos analíticos que se han oficializado. El listado de reactivos para columna con sus marcas se actualiza bimestralmente y se publica en el sitio Web de la USP. USP Dictionary-EI USP Dictionary of USAN and lnternational Drug Names ofrece, en un solo volumen, los Nombres
Adoptados en los Estados Unidos (USAN, por sus siglas en ingles) más actualizados para los fármacos; los nombres USP-NF oficiales; las denominaciones comunes, los nombres comerciales y químicos; las fórmulas gráficas; las fórmulas y los pesos moleculares; los números de registro CAS y las designaciones por código; los fabricantes de fármacos; y las categorías farmacológicas y terapéuticas. El USP Dictionary ayuda a asegurar la exactitud de los siguientes puntos: etiquetado del producto; informes, artículos y correspondencia; solicitudes reglamentarias de la FDA y prospectos de productos farmacéuticos. Se publica anualmente. Para mayor información sobre el USP Dictionary ver el sitio Web de la USP (http://www.usp.org/usp-nf/development-process/ compendial-nomenclature).
USP 39
Integrantes / Comités xiii
Integrantes
2010-2015 Ciclo de Revisión Funcionarios de la Convención de la USP, junta Directiva, Consejo de Expertos, Comités de Expertos, Paneles de Expertos y Grupos Asesores Upper Gwynedd, PA
Funcionarios (2010-2015) Timothy R. Franson, B.S. Pharm., M.D.
Presidente Washington, DC
René H. Bravo, M.D., F.A.A.P.
Presidente Saliente
San Luis Obispo, CA
John E. Courtney, Ph.D.
Tesorero
Jeffrey L. Sturchlo, Ph.D.
Representante At Large
New York, NY
Gail R. Wllensky, Ph.D.
Representante At Large Bethesda, MD
Ron T. Plervincenzi, Ph.D. Director Ejecutivo, Febrero 20 74-presente
(ex-officio)
Rockville, MD
Bethesda, MD
Susan S. de Mars, J.D.
Secretaria Rockville, MD
Consejo de Expertos (2010-2015) Ron T. Piervincenzi, Ph.D.
Presidente, Consejo de Expertos
Junta Directiva (2010-2015) Thomas R. Temple, B.S. Pharm., M.S., F.A.Ph.A.
Presidente Representante At-Large
Des Moines, IA
Carolyn H. Asbury, Ph.D., Sc.M.P.H.
Representante del Interés Público New York, NY
Robert L. Buchanan, Ph.D.
Representante At Large
Rockville, MD
James E. Akers, Ph.D.
Presidente, Capítulos Generales-Microbiología
Leawood, KS
Gregory E. Amldon, Ph.D.
Presidente, Capítulos Generales-Análisis Físico Ann Arbor, MI
Lawrence H. Block, Ph.D.
Presidente, Monografías-Excipientes
Pittsburgh, PA
Matthew W. Borer, Ph.D.
College Park, MD
Presidente, Estándares de Referencia
Thomas E. Menighan, B.S. Pharm., M.B.A., Sc.D., F.A.Ph.A.
Glgi S. Davldson, B.S.Pharm., DICVP
Representante At Large Washington, DC
Robert M. Russell, M.D.
Representante del Sector Medicina Arlington, MA
Kiran Mazumdar-Shaw
Representante At Large Bangalore, India
Marilyn K. Speedle, Ph.D.
Representante del Sector Farmacia Minneapolis, MN
Stephen P. Spielberg, M.D., Ph.D.
Representante del Sector Medicina
lndianapolis, IN
Presidente, Preparación Magistral Raleigh, NC
James E. DeMuth, Ph.D.
Presidente, Capítulos Generales-Formas Farmacéuticas Madison, WI
Andrew G. Ebert, Ph.D.
Presidente, Monografías-Ingredientes Alimenticios
Sandy Springs, GA
Mary G. Foster, Pharm.D., BFA
Presidente, Capítulos Generales-Envasado, Almacenamiento y Distribución Philadelphia, PA
Antony Raj Gomas, Ph.D.
USP 39
xiv Comités / Integrantes Presidente, USP Medicines Compendium-Sur Asia
Hyderabad, India Dennls K.J. Goreckl, B.S.P., Ph.D. Presidente, Monografías-Suplementos Dietéticos
Saskatoon, SK, Canada Jean F. Huxsoll, Ph.D. Presidente, Monografías-Productos Biológicos Biotecnología 2
y
Emeryville, CA Eugene J. McGonigle, Ph.D. Presidente, Monografías-Moléculas Pequeñas 4
Langhorne, PA Michael G. Mulkerrln, Ph.D. Presidente, Monografías-Productos Biológicos Biotecnología 1
y
Redwood City, CA Bernard A. Olsen, Ph.D. Presidente, Monografías-Moléculas Pequeñas 3
West Lafayette, IN Robert E. Osterberg, Ph.D. Presidente, Toxicología
Vienna, VA Ernest Parente, Ph.D. Presidente, Monografías-Moléculas Pequeñas 2
Overland Park, KS Dhananjay Patankar, Ph.D. Presidente, USP Medicines Compendium-Productos Biológicos
Bangalore, India Thomas P. Reinders, Pharm.D. Presidente, Nomenclatura, Seguridad
Richmond, VA Maria lnes R.M. Santoro, Ph.D.
y Etiquetado
Peggy Casanova, M.Sc.; Ofelia Espejo, Ph.D.; Lidiette Fonseca González, M.Sc.; José Juarez Eyzaguirre, Ph.D.; Monica l. Hirschhorn, M.Sc.; José Maria Parisi, M.Sc.; Luisa Fernanda Ponce D'León Quiroga, Ph.D.; Osear Quattrocchi, M.Sc.; Mauricio A. Seigelchifer, Ph.D.; Caroline R. Weinstein-Oppenheimer, Ph.D.
Comités de Expertos de la Farmacopea de los Estados Unidos de América Nomenclatura, Seguridad y Etiquetado THOMAS P. REINDERS, PHARM.D., Presidente
Mary B. Baker, M.B.A., Pharm.D.; Lawrence H. Block, Ph.D.; Dawn M. Boothe, D.V.M., Ph.D.; Mrunal S. Chapekar, Ph.D.; Stephanie Y. Crawford, Ph.D., M.P.H.; Steven J. Dentali, Ph.D.; Dennis E. Doherty, M.D.; Abraham G. Hartzema, Pharm.D., Ph.D., MSPH; William M. Heath, B.S. Pharm., MBA; William M. Heller, Ph.D.; Kent T. Johnson, M.S.; Donald S. MacLean, Ph.D.; Joan C. May, Ph.D.; Ginette A. Pepper, R.N., Ph.D., FAAN; Joanne G. Schwartzberg, M.D.; Debora J. Simmons, R.N., M.S.N.; R. William Soller, Ph.D.; Kailas Thakker, Ph.D.; Thomas Tice, Ph.D.; Theodore G. Tong, Pharm.D.; Jeanne Tuttle, B.S.Pharm.; Ping Wang, M.S.; Anthony Wong, M.D., Ph.D. Panel de Expertos en Directrices Modelos para Medicare-CONCLUIDO DAVID H. CAMPEN, M.D., Presidente
Nancy Jo Braden, M.D.; Chester B. Good, M.D., MPH; Roy Guharoy, Pharm.D., MBA; Raymond Hohl, M.D., Ph.D.; Arthur l. Jacknowitz, Pharm.D.; Ronald P. Jordan, R.Ph., APhA; Rice C. Leach, M.D., MSHSA; David B. Lorber, M.D., FCCP; Raymond C. Love, Pharm.D., FASHP; Philip Marcus, M.D., MPH; Gary Matzke; Joel S. Mindel, M.D.; Mark Noga, Pharm.D.; Charles D. Ponte, Pharm.D.; N. Lee Rucker, MSPH; Melody Ryan, Pharm.D., MPH; Joanne G. Schwartzberg, M.D.; Brian K. Solow, M.D.; Robert L. Talbert, Pharm.D.; Dennis P. West, Ph.D.
Presidente, USP Medicines Compendium-América Latina
Sao Paulo, Brazil Robert R. Singer, M.Sc. Presidente, Estadística
Union City, CA Jlasheng Tu, Ph.D. Presidente, USP Medicines Compendium-Asia Oriental
Nanjing, Jiangsu, China Glenn A. Van Buskirk, Ph.D. Presidente, Monografías-Moléculas Pequeñas 1
Basking Ridge, NJ Wesley E. Workman, Ph.D. Presidente, Capítulos Generales-Análisis Biológico
Chesterfield, MO Tlmothy J. Wozniak, Ph.D. Presidente, Capítulos Generales-Análisis Químico
lndianapolis, IN
Comités de Expertos (2010-2015) [Nota-El siguiente listado de Comités de Expertos incluye los Paneles de Expertos que asesoran a Comités de Expertos específicos. El listado de Paneles de Expertos y sus miembros representa a aquellos Paneles formados y aprobados en su totalidad a partir de mayo de 2015. Los Paneles de Expertos se forman y desintegran continuamente durante todo el ciclo de revisión de la USP, por lo que en un futuro se publicarán otras listas de miembros.]
Paneles de Expertos para el Comité Ejecutivo del Consejo de Expertos Panel de Expertos para la Traducción al Español ENRIQUE FEFER, PH.D., Presidente
Panel de Expertos en Etiquetado de Envases de Medicamentos de Venta Bajo Receta JOANNE G. SCHWARTZBERG, M.D., Y GERALD MCEVOY, PHARM.
D., Ca-Presidentes Cindy Brach, MPP; Joan E. Kapusnik-Uner, Pharm.D.; Sandra Leal, Pharm.D.; Linda L. Lloyd, M.Ed.; Melissa A. Madigan, Pharm.D.; Ruth M. Parker, M.D.; Thomas P. Reinders, Pharm.D.; William H. Shrank, M.D.; Patricia E. Sokol, R.N., J.D.; Darren K. Townzen, MBA; Jeanne Tuttle, Pharm.D.; Michelle D. Wiest, Pharm.D.; Michael S. Wolf, Ph.D., MPH
Panel de Expertos en Pronunciación WILLIAM M. HELLER, PH.D., Presidente
Mary B. Baker, Pharm.D.; Stephanie Y. Crawford, Ph.D.; David F. Long, Ph.D.; Joan C. May, Ph.D.; Anthony Palmieri, Ph.D.; Thomas P. Reinders, Pharm.
D.
Monografías-Moléculas Pequeñas 1 GLENN
A. VAN BUSKIRK, PH.D., Presidente
Jay C. Brumfield, Ph.D.; Elizabeth B. Cariello; David A. Fay, Ph.D.; Rupa lyer, M.S.; Amy J. Karren, N.R.C.M.; Assad J. Kazeminy, Ph.D.; Huiyi Li, Ph.D.; Raphael M. Ornaf, Ph.D.; Jeffrey S. Rohrer, Ph.D.; David F. Schuck, Ph.D.; Nhan L. Tran, Ph.D.; Danny L. Tuck, Ph.D. Monografías-Moléculas Pequeñas 2 ERNEST PARENTE, PH.D., Presidente
Mahmoud M. H. Al Omari, Ph.D.; Allan D. Bokser, Ph.D.; Shrikant N. Dhumal, Ph.D.; Tina M. Engel, Ph.D.; Maria
USP 39
lnes R.M. Santoro, Ph.D.; Dennis A. Stephens, Ph.D.; Luciano Virgili, Ph.D.; Yuwen Wang, Ph.D.; Bo Wen, Ph.D.; Joseph E. Yakupkovic, Ph.D.; Patrick N. Yat, Ph.D.; Louis W. Yu, Ph.D.
Panel de Expertos en Acetaminofeno de Venta Libre KYLEN WHITAKER, PH.D., Presidente Tina M. Engel, Ph.D.; David A. Fay, Ph.D.; Saulius A. Gylys; Michael T. Rankin, M.S.; David H. Rogers, Ph.D.; Gregory K. Webster, Ph.D. Panel de Expertos en AcetaminofenoCONCLUIDO DAVID A. FAY, PH.D., Presidente G~eg J. Davies; Tina M. Engel, Ph.D.; Saulius A. Gylys; C11fford J. Herman, Ph.D.; Poonam Pall, M.S.; Greg A. Roberts, M.A.; David H. Rogers, Ph.D.; Gregory K. Webster, Ph.D.; Kylen W. Whitaker, Ph.D. Monografías-Moléculas Pequeñas 3 BERNARD A ÜLSEN, PH.D., Presidente Richard A. Blessing, M.S.; Thomas A. Broadbent, Ph.D.; Nicholas Cappuccino, Ph.D., M.B.A.; lan C.hung, Ph.D.; John E. Darnels, M.S., M.B.A.; Jeffrey S. Fle1tman, Ph.D.; Yuri Goldberg, Ph.D., O.Se.; Pauline M. Lacroix, M.Sc.; Julie K. Lorenz, Ph.D.; Mark G. Papich, D.V.M., M.S.; Donald M. Parsons, Ph.D.; David G. Reed, M.B.A.; Thomas W. Rosanske, Ph.D.; Joseph G. Stowell, Ph.D.; Cathy L. Wood Monografías-Moléculas Pequeñas 4 EUGENE J. McGONIGLE, PH.D., Presidente Lakshmi Prasad Alaparthi, Ph.D.; Mark S. Bailey; Josep M. de Ciurana; Alain Duguet, Ph.D.; Quanyin Gao, Ph.D.; Jerome M. Lewis, M.B.A., Ph.D.; Osear Liu, Ph.D.; Marian L. Meyer, M.B.A., ~.h.D.; Colín Minchom, Ph.D.; Patrick A. Noland, M.S.; V11aya Ramesh, B.Pharm.; Hemant Kumar Sharma, Ph.D.; Michael J. Skibic, M.S.; William J. Taraszewski, Ph.D.; Michiel M. Van Oort, Ph.D.; Martín J. Williamson, Ph.D.; Steve S. Zigler, Ph.D. Monografías-Productos Biológicos y Biotecnología 1 MICHAEL G. MULKERRIN, PH.D., Presidente Jan Amstrup, Ph.D.; Parastoo Azadi, Ph.D.; Christopher J. Burns, Ph.D.; Frederic Carriere, Ph.D.; Charles S. Craik, Ph.D.; Michael R. DeFelippis, Ph.D.; Helene GazzanoSantoro, Ph.D.; Anne M. Jespersen, Ph.D.; Kristian Johansen, Ph.D.; Ned Mozier, Ph.D.; Barbara Mulloy, Ph.D.; Harold N. Rode, Ph.D.; Martín Schiestl, Ph.D.; Yeowon Sohn, Ph.D. Panel de Expertos en Heparina Bovina no Fraccionada WESLEY E. WORKMAN, PH.D., Presidente Tania Andrade, B.S. Pharm.; Irene Bartoli, B.Sc.; Leticia Maria Bertot, Pharm.D.; Elaine Gray, Ph.D.; Marco Guerrini, Ph.D.; Kristian Johansen, Ph.D.; Robert Linhardt, Ph.D.; Barbara Mulloy, Ph.D.; Marilene Nuss Rangel; Zachary Shriver, Ph.D.; Pearle Torralba, Ph.D.; Christian Viskov, Ph.D. Panel de Expertos en Valoraciones Biológicas de Eritropoyetina-CONCLUIDO CHRISTOPHER J. BURNS, PH.D., Y MICHAEL G. MULKERRIN, PH.D., Ca-Presidentes Jan Amstrup, Ph.D.; Evangelos Bakopanos, Ph.D.; Jill A. Crouse-Zeineddini, Ph.D.; Helene Gazzano-Santoro, Ph.D.; Martín Schiestl, Ph.D. Panel de Expertos en Glucagón HAROLD RODE, PH.D., Presidente
Integrantes / Comités xv
Jan Amstrup, Ph.D.; Matthew W. Borer, Ph.D.; Adrian F. Bristow, Ph.D.; Anne M. Jespersen, Ph.D.; Elizabeth Clark Kramer, Ph.D.
Panel de Expertos en Insulina HAROLD RODE, PH.D., Presidente Jan Amstrup, Ph.D.; Wilfried P. Arz, Ph.D.; Matthew W. Borer, Ph.D.; Chris J. Burns, Ph.D.; Helene Gazzano-Santoro, Ph.D.; Morten Hach, M.S.; Anne M. Jespersen, Ph.D.; Elizabeth Clark Kramer, Ph.D.; Martin Schiestl, Ph.D. Panel de Expertos en Heparinas de Bajo Peso Molecular ELAINE GRAY, PH.D., Y EDWARD K. CHESS, PH.D., CoPresidentes Christopher P. Bryant, Ph.D.; lshan Capila, Ph.D.; Venkatesan S. Chidambaram, Ph.D.; Soby M. Fennell; Gyongyi S. Gratzl, Ph.D.; Kristian Johansen, Ph.D.; Barbara Mulloy, Ph.D.; Anna K.Y. Nordin; Bruna Parma, M.Sc.; Patrick A. Rousseau, Ph.D.; Zachary Shriver, Ph.D.; Christian Viskov, Ph.D. Panel de Expertos en Preparaciones Farmacéuticas Enzimáticas FREDERIC CARRIERE, PH.D., Presidente Anisha Akula, Ph.D.; Gregory M. Beck, Ph.D.; Charles S. Craik, Ph.D.; Luigi Ghidorsi; Andreas Koerner; Thomas Langdon; Claus Middelberg, Ph.D.; Tibor Sipos, Ph.D. Panel de Expertos en Péptidos Terapéuticos MICHAEL R. DEFELIPPIS, PH.D., Presidente lvo F. Eggen, Ph.D.; Brian P. Gregg, M.B.A.; Marion King, Pll.D.; Paul Matejtschuk, Ph.D.; Narendra R. Patel, M.Sc.; Marie-Aimee Plancquaert, Ph.D.; Harold Rode, Ph.D.; Raimon Rubires, Ph.D.; Firuz Shakoori, Ph.D.; Ved P. Srivastava, Ph.D.; Aleksander Swietlow, Ph.D.; Michael S. Verlander, D.Phil. Panel de Expertos en Heparinas no FraccionadasCONCLUIDO WESLEY E. WORKMAN, PH.D., Presidente Edward K. Chess, Ph.D.; Huihong Fan, Ph.D.; Gyongyi S. Gratzl, Ph.D.; Elaine Gray, Ph.D.; Kristian Johansen, Ph.D.; Jian Liu, Ph.D.; Barbara Mulloy, Ph.D.; Zachary Shriver, Ph.D.; Pearle Torralba, Ph.D.; Christian Viskov, Ph.D. Monografías-Productos Biológicos y Biotecnología 2 JEAN F. HUXSOLL, PH.D., Presidente Mehrshid Alai, Ph.D.; Merry L. Bain, M.S.; Barbara E. Blum, Ph.D., M.P.H.; Pamela Clark, M.O., J.D.; Elaine Gray, Ph.D.; Deepak Jain, Ph.D.; Christopher Mason, Ph.D., FRCS; Brian K. Nunnally, Ph.D.; Nicole M. Provost, Ph.D.; William E. Tente, M.S.; Peter J. Vandeberg, Ph.D.; Darin J. Weber, Ph.D.; Earl K. Zablackis, Ph.D. Panel de Expertos en Células CD-34 Positivas NICOLE M. PROVOST, PH.D., Presidente Ruud Hulspas, Ph.D.; Elizabeth l. Read, M.O.; Michael D. Rosu-Myles, Ph.D.; Luisa Saraiva, Ph.D.; Richard J. Stebbings, Ph.D.; D. Robert Sutherland, M.Sc.; Lili Wang, Ph.D.; Albertus W. Wognum, Ph.D. Panel de Expertos en Análisis de Proteínas Plasmáticas TIMOTHY K. HAYES, PH.D., Presidente Mehrshid Alai, Ph.D.; Joseph Bertolini, Ph.D.; Elaine Gray, Ph.D.; Steven Herring, Ph.D.; Dorothea Sesardic, Ph.D.; Derek G. Toth, M.S.; Peter J. Vandeberg, Ph.D.
USP 39
xvi Comités / Integrantes
Panel de Expertos en Factores de Coagulación Derivados de Plasma y RecombinantesCONCLUIDO jEAN F. HUXSOLL, PH.D., Presidente Mehrshid Alai, Ph.D.; Gretchen A. Elliott, M.S.; Elaine Gray, Ph.D.; Steven Herring, Ph.D.; Michael jankowski
Panel de Expertos en Tejidos y Productos Derivados de Tejidos DEEPAK ]AIN, PH.D., y WILLIAM E. TENTE, M.S., Ca-Presidentes Merry L. Bain, M.S.; Barbara E. Blum, Ph.D., M.P.H.; Robert Buehler, Ph.D.; Frederick Cahn, Ph.D.; Shannon L.M. Dahl, Ph.D.; Steven Goldstein, Ph.D.; John E. Kemnitzer, Ph.D.; Alyce Linthurst Jones, Ph.D.; Timothy Neja, M.B.A; Darin J. Weber, Ph.D.; Wesley E. Workman, Ph.D.
Capítulos Generales-Análisis Químico TIMOTHY J. WOZNIAK, PH.D., Presidente Anthony C. Bevilacqua, Ph.D.; Christopher Burgess, Ph.D.; Geoffrey P.R. Carr, Ph.D., FRSC; Pei Chen, Ph.D.; Thomas J. DiFeo, Ph.D.; John W. Dolan, Ph.D.; Edward J. Fletcher; john P. Hammond, FRSC; john V. Hinshaw, Ph.D.; Paul R. Keller, Ph.D.; Nancy Lewen; Todd D. Maloney, Ph.D.; Nuno Matos; Ganapathy Mohan, Ph.D.; Greg A. Pennyroyal; Melissa M. Phillips, Ph.D.; Osear A. Quattrocchi, M.Sc.; Timothy L. Shelbourn, M.S., M.B.A.; Teri C. Soli, Ph.D.; Daniel D. Traficante, Ph.D.; Bruno A.R. Vrebos, Ph.D.
(761) Panel de Expertos en Resonancia Magnética Nuclear (NMR)-CONCLUIDO DANIEL D. TRAFICANTE, PH.D., Presidente Andreas Kaerner, Ph.D.; Andrew C. Kolbert, Ph.D., M. T.M.; Yue Luo, Ph.D.; Joseph Ray, Ph.D.; Susan Reutzel-Edens, Ph.D.; Timothy L. Shelbourn, M.B.A., M.S.; Christina Szabo, Ph.D.; Fred Xi, Ph.D.
Panel de Expertos en Quimiometría PEI CHEN, PH.D., y NUNO MATOS, Ca-Presidentes Chunsheng Cai, Ph.D.; Robert Tom Cambron, Ph.D.; Peter de B. Harrington, Ph.D.; Mark J. Henson, Ph.D.; Yang (Angela) Liu, Ph.D.; Zhenqi (Pete) Shi, Ph.D.; Yvan C.D. Vander Heyden, Ph.D.; Stanislav O. Zakharkin, Ph.D.; Lin Zhang, Ph.D.
Panel de Expertos en Impurezas Elementales NANCY LEWEN, Presidente Charles Barton, Ph.D., DABT; Courtney M. Callis, MPH, DABT; Steven J. Dentali, Ph.D.; Anna M. Fan, Ph.D., DABT; Edward james Fletcher; Bruce A. Fowler, Ph.D., A.T.S.; Roland Frotschl; Assad J. Kazeminy, Ph.D.; Richard Ko, Pharm.D., Ph.D.; Melissa M. Phillips, Ph.D.; Timothy L. Shelbourn, M.B.A., M.S.
Panel de Expertos en Adulteración de Suplementos Dietéticos con Fármacos y Análogos de Fármacos DENNIS K.J. GORECKI, PH.D., Presidente joseph Betz, Ph.D.; Pei Chen, Ph.D.; Hans Geyer, Ph.D.; Jana B. Hildreth, B.S.; lkhlas A. Khan, Ph.D.; Hwee-Ling Koh, Ph.D.; Cynthia L. Morris-Kukoski, Pharm.D.; james Neal-Kababick, B.S.; Olivier P. Rabin, Ph.D.; John W. Spink, Ph.D.; Darryl M. Sullivan; Nicole T. Vu, Ph.D.; Kate Yu, Ph.D.
Panel de Expertos en Espectrometría de MasasCONCLUIDO PAUL R. KELLER, PH.D., Presidente Parastoo Azadi, Ph.D.; Timothy R. Baker, Ph.D.; Geoffrey P.R. C~rr, Ph.D., FRSC; Roy ~obson, Ph.D.; Kenneth D. Gre1s, Ph.D.; Douglas E. K1ehl, M.Sc.; Mike S. Lee, Ph.D.; ]un Wheeler, Ph.D.; Li Zang, Ph.D.
Panel de Expertos en Modernización de Pruebas de Identificación NANCY LEWEN, Presidente Michelle R. Adamson; Anthony C. Bevilacqua, Ph.D.; Geoffrey P.R. Carr, Ph.D.; Pei Chen, Ph.D.; jonathan W. DeVries, Ph.D.; Maryna Dmitriieva, Ph.D.; Michael Hornig, Ph.D.; Bernard A. Olsen, Ph.D.; jeffrey S. Rohrer, Ph.D.; Anne M. Warner, Ph.D.
Panel de Expertos en Disolventes Residuales OSCAR A. QUATIROCCHI, M.Sc., Presidente Coleman C. Chasteen, M.S.; john Connelly, Ph.D.; john V. Hinshaw, Ph.D.; Elizabeth C. Hoogendoorn, M.S.; Bruce P. Johnson, Ph.D.; Eric C. Kesslen, Ph.D.; Elizabeth Kovacs; Paul W. Lockwood, M.S.; Gregory P. Martin, M.S.; Ganapathy Mohan, Ph.D.; Yuwen Wang, Ph.D.
Panel de Expertos en Atributos del Agua Estéril Envasada-CONCLUIDO
ANTHONY c. BEVILACQUA, PH.D., Presidente Dennis R. Jenke, Ph.D., M.B.A.; Max S. Lazar; Timothy J. McGovern, Ph.D.; Rostyslaw O. Slabicky; Teri C. Soli, Ph.D.
Panel de Expertos en Agua para Uso Analítico TERI C. Sou, PH.D., Presidente Anthony C. Bevilacqua, Ph.D.; Lucia Clontz, D.H.Sc., M.Sc.; Max S. Lazar; Nancy Lewen; Bruno Rossi, M.S.
Panel de Expertos en Agua para Uso Farmacéutico TERI C. Sou, PH.D., Presidente Anthony C. Bevilacqua, Ph.D.; Lucia Clontz, D.H.Sc., M.Sc.; Max S. Lazar; Rostyslaw O. Slabicky
Panel de Expertos en Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X-CONCLUIDO TIMOTHY L. SHELBOURN, M.B.A., M.S., Presidente Lora L. Brehm; W. Tim Elam; George J. Havrilla; Andrew J. jensen; Riitta Kaijansaari, M.Sc.; John 1.H. Patterson, Ph.D.; Rene E. Van Grieken, Ph.D.; Bruno A.R. Vrebos, Ph.D.
Capítulos Generales-Análisis Físico GREGORY E. AMIDON, PH.D., Presidente Fahad Al-Jenoobi, Ph.D.; Abdullah M. Al-Mohizea, Ph.D.; Shaukat Ali, Ph.D.; Graham Buckton, Ph.D., D.Sc., FRSC; David J. Goldfarb, Ph.D.; Bruno C. Hancock, Ph.D.; Ravi Harapanhalli, Ph.D.; Xiaorong He, Ph.D., M.B.A.; Stephen W. Hoag, Ph.D.; Ronald G. lacocca, Ph.D.; Gregory P. Martin, M.S.; Richard Meury; Prabu Nambiar, M.B.A., Ph.D.; james A. Ponto, M.S.; Sally W. Schwarz, M.S.; Changquan C. Sun, Ph.D.; Kevin A. Swiss, Ph.D.; Allen C. Templeton, Ph.D.; Dale Eric Wurster, Ph.D.; Geoff G.Z. Zhang, Ph.D.
(1059) Panel de Expertos en Desempeño de Excipientes GREGORY E. AMIDON, PH.D., Y ERIC A. SCHMITI, PH.D., CoPresidentes Abdullah M. Al-Mohizea, Ph.D.; Shaukat Ali, Ph.D.; Lawrence H. Block, Ph.D.; Patrick Deluca, Ph.D.; Carl Frey, M.S.; Xiao.rong He, Ph.D., M.B.A.; .stephen W. Hoag, Ph.D.; M1chelle A. Long, Ph.D.; Richard C. Moreton, Ph.D.; Prabu Nambiar, Ph.D., M.B.A.; james A. Ponto, M.S.; Kent Sternitzke, Ph.D.; Kevin A. Swiss, Ph.D.; Sean V. Taylor, Ph.D.
Panel de Expertos en (821) Identificación y Valoración de Radionucleldos, y (1821) Teoría y Práctica de la Radioactividad y (1823) Medicamentos para Tomografía de Emisión de Positrones SALLY W. SCHWARZ, M.S., Presidente
USP 39 Cathy Sue Cutler, Ph.D.; Jonathan M. Fitzsimmons, Ph.D.; Paula M. jacobs, Ph.D.; Thijs Kroon, Pharm.D.; Jerome M. Lewis, Ph.D.; Roger Moroney, M.S.; James A. Ponto, M.S.; Duann V. Thistlethwaite, B.S.; Steven S. Zigler, Ph.D.
Panel de Expertos en Buenas Prácticas de Documentación
c.
KIM HUYNH-BA, M.S., Presidente Kathleen V. Brady, B.S.; Frank J. Diana, Ph.D.; Lisa An~ Fink, ~BA; Craig Hamilton,, Ph.D.; .Judy Lin, M.S.; Anian K. M1ttal, M.Pnarm.; Kevm A. Sw1ss, Ph.D.
Panel de Expertos en Medicamentos para Tomografía de Emisión de PositronesPreparación Magistral-CONCLUIDO STEVEN S. ZIGLER, PH.D., Presidente Samuel C. Augustine, Pharm.D., FAPhA; Marc Berridge, Ph.D.; Joseph C. Hung, Ph.D., BCNP; Donald R. Kinney; Maxim Kiselev, Ph.D.; Neale Scott Mason, Ph.D.; Steve Mattmuller, M.S., R.Ph.; Sally W. Schwarz, M.S.; Jean-Luc Vanderheyden, Ph.D.
Panel de Expertos en Impurezas en Productos Farmacéuticos PRABU NAMBIAR, PH.D., M.B.A., Presidente Abdullah M. Al-Mohizea, Ph.D.; Shaukat Ali, Ph.D.; Steven W. Baertschi, Ph.D.; Judy P. Boehlert, Ph.D.; Robert G. Bui~e,. Ph.D.; Greg J. Davies~ Xi~orong He, Ph.D., M.B.A., K1m C. Huynh-Ba, M.S., M1chael Koberda, Ph.D.; Robert E. Osterberg, Ph.D.; Ernest Parente, Ph.D.; David H. Rogers, Ph.D.; Mary W. Seibel; Kevin A. Swiss, Ph.D.
Panel de Expertos en Microscopía Electrónica de Barrido-CONCLUIDO RONALD G. IACOCCA, PH.D., Presidente Dale S. Aldrich; Marc Mamak, Ph.D.; Richard Meury; James P. Vitarelli, Ph.D.
Integrantes / Comités xvii
Raymond Nims, Ph.D.; Mark Plavsic, Ph.D.; Michael Rubino, Ph.D.
(1102-1105) Panel de Expertos en Métodos de Pruebas Inmunológicas-CONCLUIDO KENNETH R. MILLER, PH.D., Presidente Jan Amstrup, Ph.D.; Yadira Hernandez Rodriguez, Ph.D.; Rakesh Kakkar, Ph.D.; Kelledy Manson; Hersh Mehta, Ph.D.; Patrick Niven; Steven J. Swanson, Ph.D.
(1240) Panel de Expertos en Pruebas Virales para Plasma Humano Destinado como Intermediario de Fabricación-CONCLUIDO JOHN A SALDANHA, PH.D., Presidente Albrecht Groener, Ph.D.; Mary Gustafson, Ph.D.; Douglas C. Lee, Ph.D.; Hannelore M. Willkommen, Ph.D.
Panel de Expertos en Capítulos Generales sobre Valoraciones Biológicas-CONCLUIDO ROBERT R. Janice Ph.D.; Ph.D.; A.
SiNGER, M.Sc., Presidente D. Callahan, Ph.D.; Jill A. Crouse-Zeineddini, David M. Lansky, Ph.D.; David J. LeBlond, Karen J. Roberts, R.Ph.; Timothy Schofield, M.
Panel de Expertos en CrioconservaclónCONCLUIDO )AMES MOLDENHAUER, M.S., Presidente Allison Hubel, Ph.D.; Elizabeth l. Read, M.D.; Yvonne A. Reid, Ph.D.; Glyn Stacey, Ph.D.
Panel de Expertos en Vacunas GllcoconjugadasCONCLUIDO CHRISTOPHER )ONES, PH.D., Presidente Paolo Costantino; Didier A. Giffroy, Ph.D.; Suresh Karupothula, Ph.D.; Jeremy P. Kunkel, Ph.D.; SureshBabu Rajan, M.Pharm; Nei! Ravenscroft, Ph.D.; Mary L. Retzlaff, Ph.D.; Marsha R1chmond, Ph.D.; Philippe Talaga, Ph.D.
Panel de Expertos en Validación y Verificación
GREGORY P. MARTIN, M.S., Presidente Kimber L. Barnett, Ph.D.; Christopher Burgess, Ph.D.; Todd Cecil, Ph.D.; Pal!I D. Curry, Ph.D.; Joachim Ermer, Ph.D.; Gyongy1 S. Gratzl, Ph.D.; John P. Hammond, FRSC; Elizabeth Kovacs; David J. LeBlond, Ph.D.; Rosario LoBrutto, Ph.D.; Anne K. McCaslandKeller, Ph.D.; Pauline L. McGregor, Ph.D.; Phil Nethercote, Ph.D.; Allen C. Templeton, Ph.D.; David P. Thomas, Ph.D.; M.L. Jane Weitzel
Panel de Expertos en Pesas y Balanzas
GREGORY P. MARTIN, M.S., Presidente Dirk Ahlbrecht; Cesar D. Bautista, Jr., Ph.D.; Klaus Fritsch, Ph.D.; Robert Mielke; David Sebastian Pattavina, M.S.; Allen C. Templeton, Ph.D.
Panel de Expertos en Análisis de Gllcoproteínas y Glicanos CHRISTOPHER )ONES, PH.D., Presidente Parastoo Azadi, Ph.D.; Michael R. DeFelippis, Ph.D.; Gary Rogers, Ph._D.; jeffrey S. Rohrer, Ph.D.; Martin Sch1estl, Ph.D.; ]1hong Wang, Ph.D.; Zhuchun Wu, Ph.D.; Rebecca A. Zangmeister, Ph.D.
Panel de Expertos en Medición de Proteína de Células Huésped-CONCLUIDO ANTHONY R. MIRE-SLUIS, PH.D., Presidente Jan Amstrup, Ph.D.; Oliver Anderka, Ph.D.; Svetlana Bergelson, Ph.D.; Heather A. Boux, Ph.D.; John S. lvancic, Ph.D.; Ned Mozier, Ph.D.; Kesh Prakash, Ph.D.; Martin Vanderlaan, Ph.D.; David C. Wylie, Ph.D.
Capítulos Generales-Análisis Biológico WESLEY E. WORKMAN, PH.D., Presidente Robert G. Bell, Ph.D.; Jill A. Crouse-Zeineddini, Ph.D.; Gary C. du Moulin, Ph.D.; Barry D. Garfinkle, Ph.D.; Timothy K. Hayes, Ph.D.; Christopher Jones, Ph.D.; Kenneth R. Miller, Ph.D.; Anthony R. Mire-Sluis, Ph.D.; Elizabeth l. Read, M.D.; Anthony A.G. Ridgway, Ph.D.; John A. Saldanha, Ph.D.; Junzhi Wang, Ph.D.; Teruhide Yamaguchi, Ph.D.; Lynn C. Yeoman, Ph.D.
(1050) Panel de Expertos en Evaluación de la Seguridad Viral en Productos Biotecnológicos Obtenidos de Líneas Celulares de Origen Humano o Animal ROBERT G. BELL, PH.D., Presidente Johannes Bluemel, Ph.D.; Jeri Ann Boose, Ph.D.; Houman Dehghani, Ph.D.; Yuling L. Li, Ph.D.;
Panel de Expertos en lnmunogenicidadCONCLUIDO ANTHONY R. MIRE-SLUIS, PH.D., Presidente Viswanath Devanarayan, Ph.D.; Boris Gorovits, Ph.D.; Shalini Gupta, Ph.D.; Eugene Koren, M.D., Ph.D.; Valerie Quarmby, Ph.D.; Susan Richards, Ph.D.; Gopi Shankar, Ph.D.; An Song, Ph.D.; Meena Subramanyam, Ph.D.; Steven J. Swanson, Ph.D.; Bonnie Wu, Ph.D.
Panel de Expertos en Anticuerpos Monoclonales Recombinantes de Uso Terapéutico-CONCLUIDO ANTHONY R. MIRE-SLUIS, PH.D., Presidente Michel P. Byrne, Ph.D.; Mary E.M. Cromwell, Ph.D.; Jill A. Crouse-Zeineddini, Ph.D.; Michael R. DeFelippis, Ph.D.; Siegfried Giess, Ph.D.; Steffen Gross; Alka
xviii Comités / Integrantes Kamra, Ph.D.; ]oseph Kutza, Ph.D.; Kenneth R. Miller, Ph.D.; Michael G. Mulkerrin, Ph.D.; Martin Schiestl, Ph.D.; Dieter Schmalzing, Ph.D.; Yeowon Sohn, Ph.D.; Robin Christopher Thorpe, Ph.D.; David C. Wylie, Ph.D.
Panel de Expertos en ADN Residual en Productos Obtenidos por Biotecnología WESLEY E. WORKMAN, PH.D., Presidente Pascal R. Anger; Jon R. Borman; Audrey Chang, Ph.D.; Thomas E. Haemmerle, Ph.D.; Scott Kuhns, Ph.D.; Junzhi Wang, Ph.D.; Weihong Wang, Ph.D.; ]udith Zhu-Shimoni, Ph.D. Panel de Expertos en Medición de Proteína Total WESLEY E. WORKMAN, PH.D., Presidente Methal Albarghouthi, Ph.D.; Matthew W. Borer, Ph.D.'. Olivier C. Germay, .Ph.D.; Anne M. ]espersen, Ph.D., Lars Nygaard, M.S., Wendy R. Safell-Clemmer, M.S.; Martin Schiestl, Ph.D.; William M. Skea, Ph.D.; Lynn C. Yeoman, Ph.D. Panel de Expertos en Pruebas para la ldentlficacion por Resonancia Magnética Nuclear (NMR) de Vacunas Polisacáridos CHRISTOPHER ]ONES, PH.D., Presidente Chitrananda Abeygunawardana, Ph.D.; Yves Aubin, Ph.D.; Francesco Berti, Ph.D.; Cristiana Campa, Ph.D.; Thomas P. ]acques, Ph.D.; Michael T. ]ones, Ph.D.; ]eremy P. Kunkel, Ph.D.; Neil Ravenscroft, Ph.D.; Philippe Talaga, Ph.D.; Earl K. Zablackis, Ph.D. Panel de Expertos en Vacunas Para Uso HumanoVacunas Virales BARRY D. GARFINKLE, PH.D., Presidente John G. Aunins, Ph.D.; Francesco Berti, Ph.D.; Mark Galinski; Lucy Gisonni-Lex; ]ohn D. Grabenstein, Ph.D.; ]oan C. May, Ph.D.; Brian K. Nunnally, Ph.D.; Cecile Maria Ponsar, Ph.D.; Silke M. Schepelmann, Ph.D.; Earl K. Zablackis, Ph.D. Capítulos Generales-Formas Farmacéuticas ]AMES E. DEMUTH, PH.D., Presidente Dale S. Aldrich; Paul D. Curry, ]r., Ph.D.; Mario A. Gonzalez, Ph.D.; Vivian A. Gray; Ralph A. Heasley, Ph.D.; Anthony J. Hickey, Ph.D., O.Se.; Michael E. Houghton; Munir A. Hussain, Ph.D.; Johannes Kraemer, Ph.D.; David F. Long, Ph.D.; John W. Mauger, Ph.D.; ]olyon P. Mitchell, Ph.D., FRSC; Beverly Nickerson, Ph.D.; Alan F. Parr, Pharm.D., Ph.D.; Guirag Poochikian, Ph.D.; Galen W. Radebaugh, Ph.D., R.Ph.; ]ohn G. Shabushnig, Ph.D.; Raymond D. Skwierczynski, Ph.D.; ]ason A. Suggett, Ph.D., M.B.A.; Kailas Thakker, Ph.D.; Thomas R. Tice, Ph.D.; Sailesh Varia, Ph.D.; Mehran Yazdanian, Ph.D. (1) Panel de Expertos en Inyectables-CONCLUIDO ]OHN G. SHABUSHNIG, PH.D., Presidente Dale S. Aldrich; Lori Alquier, M.S.; Diane ]. Burgess, Ph.D.; David F. Driscoll, Ph.D.; David F. Long, Ph.D.; Thomas R. Tice, Ph.D.; Martín Woodle, Ph.D. (771) Panel de Expertos en Preparaciones Oftálmicas ASHIM K. MITRA, PH.D., Presidente Dale S. Aldrich; Cynthia M. Bach, M.S.; ]effrey S. Fleitman, Ph.D.; Seshadri Neervannan, Ph.D.; Stacey M. Platzer; Satish K.. Singh, Ph.D.; Thomas R. Tice, Ph.D.; George W. Tin, Ph.D. (787) Panel de Expertos en Partículas en Inyectables Biofarmaceuticos DALE S. ALDRICH, Presidente Mary E.M. Cromwell, Ph.D.; Paul D. Curry, Ph.D.; Jolyon P. Mitchell, Ph.D., FRSC; Linda O. Narhi, Ph.D.;
USP 39 Alla Polozova; Dean C. Ripple, Ph.D.; ]ohn G. Shabushnig, Ph.D.; Satish K. Singh, Ph.D.; Lisa A. Wenzler Savin, Ph.D. (788) Panel de Expertos en Partículas en
Inyectables DALE S. ALDRICH, Presidente Dan Berdovich; Lew Brown, B.S.; Kevin Dahl, Ph.D.; Robert Gavin, M.S.; Dean Ripple, Ph.D. Panel de Expertos en Cápsulas Rellenas con Líquido VIVIAN A GRAY, Presidente Ewart Cole, Ph.D.; ]ean-Luc Colín, Ph.D.; joe Fotso, Ph.D.; Munir A. Hussain, Ph.D.; Vi N. Schmidt, M.S.; Stephen C. Tindal; Madhusudan Vudathala, M.Pharm., M.B.A. Panel de Expertos en Pruebas de Desempeño de Formas Farmacéuticas Semisólidas KAILAS THAKKER, PH.D., Presidente Eric Beyssac, Ph.D.; Robert G. Buice, Ph.D.; Bryan Crist; james E. De Muth, Ph.D.; Geoffrey N. Grove, Ph.D.; L. Thomas Hall, Ph.D.; ]ohn S. Heaney; Matthew Kersey, .Ph.D.; Hans-Jue.rc:¡en Knitter; Patricia L. Lee, M.S.; Patnck C. Mahn; W11íiam M. Rosenthal; Steve W. Shaw Panel de Expertos en los Criterios de Solubilidad para Fármacos de Uso Veterinario MARIO A GONZALEZ, PH.D., Presidente Mike Apley, DVM, Ph.D.; Bryan Crist; Robert P. Hunter, M.S., Ph.D.; Mark G. Papich, M.S., D.V.M.; Alan F. Parr, Pharm.D., Ph.D.; ]im E. Riviere, DVM, Ph.D., O.Se. Panel de Expertos en el Uso de Enzimas en la Prueba de Disolución de Cápsulas de Gelatina VIVIAN A GRAY, Presidente Ewart Cole, Ph.D.; ]oan M. Dalla Riva Toma, Ph.D.; Luigi Ghidorsi; ]ian-Hwa Guo, Ph.D.; Feixue Han, Ph.D.; Jian-Hwa Han, Ph.D.; Christopher T. Hosty; ]ianmei D. Kochling, Ph.D.; ]ohannes Kraemer, Ph.D.; Thomas Langdon; Steven R. Leinbach; Gregory P. Martin, M.S.; Steven M. Meyerhoffer, Ph.D.; Richard C. Moreton, Ph.D.; Krishnaswamy S. Raghavan, Ph.D.; Edward Shneyvas, Ph.D.; ]ason A. Suggett, Ph.D.; Stephen C. Tindal; Madhusudan Vudathala, M.Pharm., M.B.A.; Hu Wang, M.S. Panel de Expertos en Inspección Visual de Parenterales RUSSELL E. MADSEN, M.S., Presidente Dale S. Aldrich; ]ohn D. Ayres, M.O., J.D.; Roy Cherris; John G. Shabushnig, Ph.D.; Deborah Shnek, Ph.D. Capítulos Generales-Microbiología ]AMES E. AKERS, PH.D., Presidente james P. Agalloco, M.S., M.B.A.; Dilip Ashtekar, Ph.D.; Anthony M. Cundell, Ph.D.; Russell E. Madsen, M.S.; Karen Z. McCullough, M.S.; Jianghong Meng, Ph.D.; Leonard W. Mestrandrea, Ph.D.; Rainer F. Newman, M.S.; Donald C. Singer, M.S.; Scott V.W. Sutton, Ph.D.; Edward C. Tidswell, Ph.D. (81) Panel de Expertos en Valoración Microbiana-Antibióticos-CONCLUIDO THOMAS B. MAY, PH.D., Presidente David L. Gibbs, Ph.D.; Amy J. Karren, RM/SM; Nilesh Prabhakar Shinde, M.S.; Brenda Sullivan Panel de Expertos en Modernización de Valoraciones Microbiológicas ]AMES E. AKERS, PH.D., Presidente
Integrantes /Comités xix
USP 39 Mark R. Coleman, Ph.D.; Gerald M. jensen, Ph.D.; Ronald G. Lauback; jeremy Lebel; Fred J. Marsik, Ph.D.; Edgar L. Mendaros; Elizabeth A. MonnotChase, Ph.D.; jorn Thyme, D.V.M.; Glenn A. Van Buskirk, Ph.D.
Capítulos Generales-Envasado, Almacenamiento y Distribución MARY G. FOSTER, PHARM.D., BFA, Presidente Chris Chandler, Pharm.D.; Michael N. Eakins, Ph.D.; Shirley A. Feld, M.Sc.; Dana M. Guazzo, Ph.D.; Dennis R. jenke, M.B.A., Ph.D.; Daniel J. Malinowski; Daniel L. Norwood, M.S.P.H., Ph.D.; Kevin E. O'Donnell; Devinder Pal, M.Pharm.; Diane M. Paskiet; Michael A. Ruberto, Ph.D.; Marv D. Shepherd, Ph.D.; Sarah Skuce; Li Xiong, Ph.D.
(381) Panel de Expertos en Tapones Elastomérlcos para Inyectables DIANE M. PASKIET, Presidente Douglas J. Ball, M.S., DABT; Michael N. Eakins, Ph.D.; Ronald G. lacocca, Ph.D.; Renaud J.G. Janssen, Ph.D.; Dennis R. Jenke, Ph.D.; Heinz Kirchmeyer, Ph.D.; Philippe LeGall, M.S.; Daniel L. Norwood, Ph.D.; Michael A. Ruberto, Ph.D.; Wai (John) Wong, Ph.D.; Lisa M. Yoest, M.S.
(659) Panel de Expertos en Requisitos de Envasado y Almacenamiento CHRIS CHANDLER, PHARM.D., Y SHIRLEY ANN FELD, M.SC., Co-
Presidentes Eleanor Freeman, B.S.; Kevin E. O'Donnell; Devinder Pal, M.Pharm.; Robert H. Seevers, Ph.D.; Li Xiong, Ph.D.
(671) Panel de Expertos en Envases-Pruebas de Desempeño-CONCLUIDO DAN J. MALINOWSKI, Presidente Yisheng Chen, Ph.D.; Michael N. Eakins, Ph.D.; Mary G. Foster, Pharm.D., BFA; Hugh E. Lockhart, Ph.D.; Dennis P. O'Reilly; Frank D. Witulski, M.S.; Li Xiong, Ph.D.
(1118) Panel de Expertos en Dispositivos de Monltoreo-Tlempo, Temperatura y HumedadCONCLUIDO CHRIS CHANDLER, PHARM.D., Presidente Thaddeus Prusik, Ph.D.; Robert H. Seevers, Ph.D.; David A. Ulrich, M.S.; lsmail Uysal, Ph.D.
(1207) Panel de Expertos en Envasado de Productos Estériles-CONCLUIDO DANA M. GUAZZO, PH.D., Presidente James P. Agalloco, M.S., M.B.A.; James E. Akers, Ph.D.; Peter Buus; Shu-chen Chen; Ronald Forster, Ph.D.; Lee E. Kirsch, Ph.D.; Ronald Mueller; Donald C. Singer, M.S.; David Walker
(1664) Panel de Ex11ertos en Límites y Buenas Prácticas de Lixlvlables-CONCLUIDO DANIEL L. NORWOOD, PH.D., Presidente Michael N. Eakins, Ph.D.; Dennis R. Jenke, Ph.D., M.B.A.; Timothy J. McGovern, Ph.D.; james O. Mullis, M.S.; Lee M. Nagao, Ph.D.; Diane M. Paskiet; Michael A. Ruberto, Ph.D.; Cheryl Stults, Ph.D.
Panel de Expertos en Blocompatlbllidad de los Materiales Usados en Sistemas de Envasado, Dispositivos Médicos e Implantes DANIEL L. NORWOOD, PH.D., Presidente Douglas J. Ball, M.S.; Stephen A. Barat, Ph.D.; William P. Beierschmitt, Ph.D.; Denise Bohrer, Ph.D.; Tage C. G. Carlson, Ph.D.; Michael N. Eakins, Ph.D.; Jill A.
Glosson, B.A.; Douglas E. Kiehl, M.Sc.; Anita Y. Sawyer, M.S.
Panel de Expertos en Materiales para Ensayos Clínicos (Buenas Prácticas de Distribución) MARY G. FOSTER, PHARM.D., BFA, Presidente Rafik H. Bishara, Ph.D.; Glaucia K. Braga, Ph.D.; Steven A. jacobs, M.B.A.; Martin Jeiven, M.S.; Claude Jolicoeur, B.S.; Desiree Valentine, M.B.A.
Panel de Expertos en Buenas Prácticas de Distribución-CONCLUIDO MARY G. FOSTER, PHARM.D., BFA, Presidente
Gl~ucia K. Brag_a, Ph.D.; Chr~s Chandler, Pharm.D.;
M1chael N. Eal
Panel de Expertos en Sistemas Plásticos Usados en la Fabricaclon de Medicamentos DENNIS R. JENKE, PH.D., Presidente Denise G. Bestwick, B.S.; Weibing Ding, Ph.D.; Michael N. Eakins, Ph.D.; Jerold (Jerry) M. Martin, M.Sc.; Daniel L. Norwood, Ph.D.; Diane M. Paskiet; Cheryl L.M. Stults, Ph.D.; Ken M. Wong, M.Sc.
Estándares de Referencia MATIHEW w. BORER, PH.D., Presidente Bianca Avramovitch, Ph.D.; Adrian F. Bristow, Ph.D.; A_ntony Raj Gomas, Ph.D.; Shaohong )in; Catherine A. R1mmer, Ph.D.; lffaaz M. Salahudeen, Ph.D.; Ma Shuangcheng, Ph.D.; Ralph E. Sturgeon, Ph.D.; Robert L. Watters, Ph.D.; M.L. Jane Weitzel; Xinyue Xiao, M.S.
Estadística
ROBERT R. SINGER, M.Sc., Presidente Bruno Boulanger, Ph.D.; Richard K. Burdick, Ph.D.; David J. Christopher, M.S.; David ). LeBlond, Ph.D.; Anthony G. Okinczyc, M.P.H., M.B.A.; Dennis Sandell, Ph.D.; Timothy Schofield, M.A.; Charles Y. Tan, Ph.D.; Harry Yang, Ph.D.
Panel de Expertos en Uniformidad de Contenido con Muestras de Gran Tamaño DENNIS SANDELL, PH.D., Presidente james S. Bergum, Ph.D.; Myron B. Diener, M.S.; Walter Hauck, Ph.D., Jeffrey Hofer, M.S.; Gregory L. Lamer, M.S.
Toxicología ROBERT E. ÜSTERBERG, PH.D., Presidente Charles Barton, Ph.D.; Joseph F. Borzelleca, Ph.D.; john Doull, Ph.D., M.D.; Marion Ehrich, Ph.D.; Gregory L. Erexson, Ph.D., DABT; Bruce A. Fowler, Ph.D., ATS; Bo Li, Ph.D.; Timothy J. McGovern, Ph.D.; Michel Mikhail, Ph.D.; Jeffrey P. Smith, Ph.D.
Comité de Expertos del Formulario Nacional Monografías-Excipientes LAWRENCE H. BLOCK, PH.D., Presidente Kenneth S. Alexander, Ph.D., Ed.Sp.; Fernando A. Alvarez-Nunez, Php.; Shireesh. P. Apte, P~.D.; Tim D. Cabelka, Ph.D.; Bnan A.C. Carhn, Ph.D.; Richard N. Cawthorne, Ph.D.; Jian-Hwa Guo, Ph.D.; Felicitas Guth, Ph.D.; Mary C. Houck, Ph.D.; William J. Lambert, Ph.D.; Philip H. Merrell, Ph.D.; Richard C. Moreton, Ph.D.; Eric J. Munson, Ph.D.; Paul B. Myrdal, Ph.D.; Yihong Qiu, Ph.D.; Venkatramana Rao, Ph.D.; jiasheng Tu, Ph.D.; Richard H. Wendt, Ph.D.
USP 39
xx Comités / Integrantes
(1197) Panel de Expertos en Buenas Prácticas de Distribución para Excipientes Farmacéuticos a Granel GREGORY E. AMIDON, PH.D., Y RICHARD C. MORETON, PH.D., Ca-Presidentes
Lawrence H. Block, Ph.D.; William Dale Carter, M.S.; Zak T. Chowhan, Ph.D.; Marc Fages; Elizabeth Ferguson-Brown; Mary G. Foster, Pharm.D., BFA; Linda A. Herzog, M.B.A.; Ashok V. Katdare, Ph.D.; Zakiya Kurdi, Ph.D.; Edward G. Malawer, Ph.D., CQA; Frank Milek, Ph.D.; Becca Mitchell; Dwight Mutchler; Carnet E. Peck, Ph.D.; Mike Schultz, R.Ph.; Alexa Smith, M.S.; Glenn Sokoloski; Kelly Taylor; jiasheng Tu, Ph.D.
Panel de Expertos en Glicerina TIM D. CABELKA, PH.D., Presidente Lawrence H. Block, Ph.D.; Carlos E. Bortolotto, B.S.; Frances K. Byrne, M.S.; lan A. Duncan, Ph.D.; Balaji V. Kadri, M.Pharm., M.Sc., MBA; Tanja Natterer; Marian J. Rinken, Ph.D.; Gwen E. Rucker, B.S.; David A. Sharknas, B.S.; Hong Zhou, Ph.D. Panel de Expertos en Povidonas BERNHARD D. FUSSNEGGER, PH.D. Y CARL PERINI, M.S., Co-
Panel de Expertos para la Revisión de Arginina ]AMES R. BROOKS, PH.D., Presidente Marilyn Barrett, Ph.D.; Louis Cantilena, M.D.; Rebecca B. Costello, Ph.D.; johanna T. Dwyer, O.Se., RD; Mary L. Hardy, M.D.; Scott A. jordan, Ph.D.; Robin Marles, Ph.D.; Ronald J. Maughan, Ph.D.; Robert Osterberg, Ph.D.; Bruce E. Rodda, Ph.D.; Robert R. Wolfe, Ph.D.; jorge Zuniga, Ph.D. Panel de Expertos para la Revisión de BetaAlanina RICHARD Ko, PHARM.D., PH.D., Presidente Louis Cantilena, M.D., Ph.D.; Rebecca B. Costello, Ph.D.; William j. Evans, Ph.D.; Mary L. Hardy, M.D.; Scott A. jorda~, Ph.D.; Rona.ld J. Ma~ghan, Ph.D.; janet W. Rankin, Ph.D.; Abb1e E. Sm1th, Ph.D. Panel de Expertos en el Modelado de Seguridad de Suplementos Dietéticos MARY L. HARDY, M.D., Presidente VA Shiva Ayyadurai, Ph.D., SMVS, SMME; Louis Cantilena, M.D.; Mary Avis Fox, Ph.D., MPH; Scott A. jordan, Ph.D.; Diane R. Mould, Ph.D.; Mkaya Mwamburi, M.D., Ph.D, M.A.; Robert E. Osterberg, Ph.D.; Charles Yoe, Ph.D.
Presidentes
Lawrence H. Block, Ph.D.; Feng Chen, Ph.D.; David J. Filiar, MBA; Edward G. Malawer, Ph.D.; Syed A.A. Rizvi, Ph.D.; john W. Spink, Ph.D.; Fan Wu, Ph.D.
Panel de Expertos en Talco LAWRENCE H. BLOCK, PH.D., Presidente Detlef Beckers, Ph.D.; jocel_yne Ferret, Ph.D.; Gregory P. Meeker, M.S.; Aubrey M1ller, M.D., M.P.H.; Robert E. Osterberg, Ph.D.; Dilip M. Patil, M.S.; julie W. Pier, M.S.; Steve Riseman, Ph.D.; Martin S. Rutstein, Ph.D.; Gary P. Tomaino; Drew Van Orden, M.S., M.A.; james S. Webber, Ph.D. Comité de Expertos en Información Terapéutica y Sustento al Formulario NANCY jo BRADEN, M.D., Presidente Marialice S. Bennett, B.S.Pharma, RPh, FAPhA; Andrea Brassard, Ph.D., FNP-C, FAANP; Judith P. Clark, B.S.; Babette S. Edgar, Pharm.D., M.B.A.; Chester B. Good, M.D., MPH, FACP; William M. Heath, B.S. Pharm., MBA; Raymond j. Hohl, M.D., Ph.D.; Raymond C. Love, Pharm.D., BCPP; Robert J. Meyer, M.D.; Seth M. Powsner, M.D.; Marcus M. Reidenberg, M.D.; N. Lee Rucker, M.S.P.H.; Melody Ryan, Pharm.D., MPH; Joanne G. Schwartzberg, M.D.; Robert L. Talbert, B.S., Pharm.D.; J. Russell Teagarden, D.M.H., M.A.
Comité de Expertos de la USP y del Dietary Supplements Compendium Monografías-Suplementos Dietéticos y Medicinas Herbarias DENNIS K.J. GüRECKI, B.S.P., PH.D., Presidente Marilyn L. Barrett, Ph.D.; ]oseph M. Betz, Ph.D.; Michael S. Bradley, M.S.; ]osef A. Brinckmann; James R. Brooks, Ph.D.; Robert L. Chapman, Ph.D.; De-an Guo, Ph.D.; Bill J. Gurley, Ph.D.; Sukhdev Swami Handa, Ph.D.; David C. Hopp, Ph.D.; Scott A. Jordan, Ph.D.; Joy A. joseph, M.S.; A. Douglas Kinghorn, Ph.D., O.Se.; Richard Ko, Pharm.D., Ph.D.; Raimar Léibenberg, Ph.D.; Tieraona Low Dog, M.D.; Gail B. Mahady, Ph.D.; Robin j. Marles, Ph.D.; Guido F. Pauli, M.D., Ph.D.; Zhongzhi Qian, M.S.; Eike Reich, Ph.D.; Paul L. Schiff, jr., Ph.D.; Fabio M.B. Soldati, Ph.D.; Edward H. Waysek, Ph.D.; Wayne R. Wolf, Ph.D.
Panel de Expertos en Revisiones Basadas en Evidencia TIERAONA Low DOG, M.D., Presidente Louis Cantilena, M.D., Ph.D.; Stephanie Chang, M.D., M.P.H.; Mei Chung, Ph.D.; Rebecca B. Costello, Ph.D.; Dennis K.j. Gorecki, Ph.D.; Scott A. jordan, Ph.D. Panel de Expertos en Suplementos Dietéticos de Liberación Prolongada jOY A ]OSEPH, M.S., Presidente Charles Barton, Ph.D.; joseph F. Borzelleca, Ph.D.; Michael S. Bradley, M.S.; james R. Brooks, Ph.D.; Marion Ehrich, Ph.D.; Vivian A. Gray; Carol S. johnston, Ph.D.; Raimar Loebenberg, Ph.D.; Alexander G. Schauss, Ph.D.; Elizabeth A. Yetley, Ph.D. Panel de Expertos en Herbal Medicines Compendium-Asia Oriental ZHONGZHI QIAN, M.S., Presidente Kai shun Bi, Ph.D.; Shilin Chen, Ph.D.; De-an Guo, Ph.D.; Shen Ji, Ph.D.; Brad WC Lau, M.S., Ph.D.; Clara Bik San Lau, Ph.D.; Ping Li, Ph.D.; Rui Chao Lin, Ph.D.; Shangmei Shi, B.S.; Pengfei Tu, Ph.D.; ZhengTao Wang, Ph.D.; Yang-Chang Wu, Ph.D.; Shishan Yu, Ph.D.; Zhao Zhonzhen, Ph.D. Panel de Expertos en Herbal Medicines Compendium-Sur Asia SUKHDEV SWAMI HANDA, PH.D., Presidente Amit Agarwal; C.K. Katiyar, Ph.D.; Rasadah Mat Ali, Ph.D.; D.G. Naik, Ph.D.; Sankaran Natarajan, Ph.D.; M.K. Raina, Ph.D.; Neeraj Tandon, Ph.D.
Comité de Expertos del Food Chemicals Codex Monografías-Ingredientes Alimenticios ANDREW G. EBERT, PH.D., Presidente Michael H. Auerbach, Ph.D.; janet L. Balson, M.S.; Hans K. Biesalski, M.D., Ph.D.; Simon Brooke-Taylor, Ph.D.; Richard C. Cantrill, Ph.D.; junshi Chen, M.D.; Grady W. Chism, Ph.D.; Roger A. Clemens, Dr.P.H.; jonathan W. ~eVries, Ph.D.; john w.. Finley, Ph.D.; Carl .Frey, M.S.; E1nat Haleva, Ph.D.; Lon L. Klopf, Ph.D.; D1ane B. McColl, j.D.; Richard A. Myers, Ph.D.; joseph A. Scimeca,
USP 39 Ph.D.; Fereidoon Shahidi, Ph.D.; Karina R. Vega-Villa, Ph.D.; Liangli Yu, Ph.D.
Integrantes /Comités xxi
Panel de Expertos en Proteínas Terapéuticas RUSTOM S. MODY, PH.D., Presidente Sriram V. Akundi, Ph.D.; Sanjay Bandyopadhyay, Ph.D.; jaby )acob, Ph.D.; Dhananjay Patankar, Ph.D.; Venkata Ramanna, Ph.D.; Alok Sarma, Ph.D.; Gul Raj Soni, Ph.D.; Meenu Wadhwa, Ph.D.
Panel de Expertos en Ingredientes AlimenticiosAdulterantes Intencionales )ONATHAN w. DEVRIES, PH.D., Presidente Paul Brent, Ph.D.; Susan M. Brown, M.E.A.; Christophe A. Cavin, Ph.D.; Henry Chin, Ph.D.; Robin Churchill, Ph.D.; Karen Everstine, Ph.D., M.P.H.; Hazen Frederick Cale, Ph.D.; Shaun Kennedy; Petra Lutter, Ph.D.; Richard A. Myers, Ph.D.; John Spink, Ph.D.; Saskia van Ruth, Ph.D.; Carl Winter, Ph.D.; Yongning Wu, M.D.; Liangli Yu, Ph.D.
Panel de Expertos en Vacunas MAHESH K. BHALGAT, PH.D., Presidente Sunil Gairola, Ph.D.; Gaurav Gupta, Ph.D.; Sunil Gupta, M.D.; Mei Mei Ho, Ph.D.; Suresh Karupothula, Ph.D.; K. Anand Kumar, Ph.D.; Y.U.B. Rao, Ph.D.; Anil Sood, M.Sc.; Ajay Kumar Tahlan, M.D.
Panel de Expertos en Calidad y Autenticidad de Aceite de Oliva RICHARD c. CANTRILL, PH.D., Presidente Diego Garcia-Gonzalez, Ph.D.; Claudia Guillaume, M.Sc.; Zohar Kerem, Ph.D.; Paul H. Miller, B.A.; Agusti J. Romero, Ph.D.; Selina Wang, Ph.D.
USP Medicines Compendium-Asia Oriental )IASHENG Tu, PH.D., Presidente Ying Chen, B.S.; Zhonggui He, Ph.D.; Fangwen Shuai; Qiaofeng Tao, Ph.D.; Hao Wang, Ph.D.; Weibing Wang; Yue-Sheng Wang, Ph.D.; Hongyan Xie; Luo Zhuoya, Ph.D.
Comité de Expertos de la USP y del USP on Compounding Preparación Magistral GIGI S. DAVIDSON, B.S.PHARM., DICVP, Presidente Lisa D. Ashworth, R.Ph.; Gus S. Bassani, Pharm.D.; Edmund ). Elder, )r., Ph.D.; Maria do Carmo M. Garcez, B.S.Pharm.; Deborah R. Houston, Pharm.D.; Patricia C. Kienle, M.P.A.; Keisha D. Lovoi, B.S.Pharm.; Linda F. McElhiney, Pharm.D.; William A. Mixon, M.S.; David W. Newton, Ph.D.; Alan F. Parr, Pharm.D., Ph.D.; R~gina F. Peacock, Ph.D.; Robert P. Shrewsbury, Ph.D.; Ke1th St. John, M.S. Panel de Expertos en Preparación Magistral con Fármacos Peligrosos PATRICIA c. KIENLE, M.P.A., Presidente Thomas H. Connor, Ph.D.; Eric Kastango, M.B.A., B.S. Pharm.; Melissa A. McDiarmid, M.D., MPH; Kenneth R. Mead, Ph.D.; Martha Polovich, Ph.D.; Lucille A. Power; james T. Wagner Panel de Expertos en Preparación MagistralPreparaciones Estériles )AMES E. AKERS, PH.D., Y GiGI S. DAVIDSON, B.S. PHARM., DICVP, Ca-Presidentes Michael W. Anneken, B.S. Pharm., R.Ph.; Byron Ashworth; )effrey A. Clanton, M.S.; Cynthia T. Culmo, B.S.; Gordon M. Ely; Brenda S. )ensen, CPhT, M.B.A.; Patrick A. Lester, B.S. Pharm., DVM, M.S.; Paul N. Limberis, B.S.; Lisa A. McCartney, BMS; Elizabeth A. Monsees, RN, MSN, MBA; Barbara M. Soule, RN, MPA, B.S.; Matthew Stanton, Pharm.D.; Marc H. Stranz, Pharm.D.; William A. Stuart, B.S.; Vaiyapuri Subramaniam, Pharm.D.; Angela W. Yaniv, Pharm.D.
Comités de Expertos del USP Medicines Compendium USP Medicines Compendium-Productos
Biológicos DHANANJAY PATANKAR, PH.D., Presidente Sriram V. Akundi, Ph.D.; Mahesh K. Bhalgat, Ph.D.; )ason B. Bock, Ph.D.; Daniel Silva Guedes, Ph.D.; Gye Mee )ang, M.S.; Sridevi Khambhampaty, Ph.D.; Jaeok Kim, M.S.; Young-Phil Lee, Ph.D.; Rustom S. Mody, Ph.D.; Venkat R. Mukku, Ph.D.; Venkata Ramana, Ph.D.; Mauricio A. Seigelchifer, Ph.D.; Li Shi, Ph.D.; Dongmei Su, Ph.D.; Utpal Tatu, Ph.D.; Meenu Wadhwa, Ph.D.
USP Medicines Compendium-América Latina
MARIA INES R.M. SANTORO, PH.D., Presidente Maria Alice Bockelmann, Ph.D.; Mauro Cesar de Faria, B. Se., MBA; Elizabeth lgne Ferreira, Ph.D.; )osé Aparício Brittes Funck, Ph.D.; Ana María Camero Collado, B.Sc.; Silvia Susana Giarcovich, Ph.D.; Patricia Soledad Carreña González, M.Sc.; María Catalina Díaz Gutiérrez, B.Sc.; Osear Quattrocchi, M.Sc.; Jaime-Humberto Rojas, M.Sc.; Graciela Aguilar Gil Samaniego, B.Sc.; Silvia Storpirtis, Ph.D. USP Medicines Compendium-Estados Recientemente Independizados (ERl)-Rusia-CONCLUIDO ALLA A. MIKHAYLOVA, M.S., Presidente Farid Aliyev, Ph.D.; Svetlana O. Chikalova, M.S.; Konstantin V. Dubinin, Ph.D.; Victoriya Georgiyants, Ph.D.; Lilit Ghazaryan; Tea Jikia, Ph.D.; Oiga Maklakova, MBA; Siarhei l. Marchanka, Pharm.D.; Oiga G. Potanina, D.Sc.; Andrey Prokhorov, M.D.; Mirzohidjon M. Qodirov, M.S.; Sergii Sur, M.D., Ph.D.; Anna V. Titova, Ph.D.; Valiantsina V. Tsimoshyna; Ardak U. Tulegenova, D.Sc.; Ramenskaya Calina Vladislvovna, Ph.D. USP Medicines Compendium-Sur Asia
ANTONY RAJ GOMAS, PH.D., Presidente Rajiv Desai, Ph.D.; Manish Gangrade, Ph.D.; Sushil Gangwal, Ph.D.; Farnaz Malik, Ph.D.; Mangesh Arvind Mantri, Ph.D., MBA; Petla Naidu, Ph.D.; Sheikh M. Rahman, Ph.D.; Zahid Saeed, B.Pharm.; Mohammad Tahir Siddique, M.Sc., MBA; Sukhdev Singh, M.Sc.; Sukumar Sinha, Ph.D.; Saji Thomas, Ph.D.
Enlaces Gubernamentales ante los Comités de Expertos y los Paneles de Expertos Enlaces de la Administración de Alimentos y Medicamentos de los EE.UU. (FDA) Rajiv Agarwal, Ph.D.; Ali Al-Hakim, Ph.D.; Om Anand, Ph.D.; Juan Arciniega, D.Sc.; Jane A. Axelrad, ).D.; Anamitro Banerjee, Ph.D.; Steven R. Bauer, Ph.D.; )onathan Bray, B.S.; Michael R. Brent, Ph.D.; Lucinda F. Buhse, Ph.D.; Teresa T. Cain, Ph.D.; )ohn H. Callahan, Ph.D.; Tura C. Camilli, Ph.D.; Steven Casper, Ph.D.; Wiley A. Chambers, M.D.; Jane Chang, Ph.D.; Donna F. Christner, Ph.D.; )ohn F. Cipollo, Ph.D.; Carolyn Cohran, Ph.D.; Thomas Colatsky, Ph.D.; )erry Cott, Ph.D.; Mike Darj, Ph.D.; Mamata De, Ph.D.; lan F. DeVeau, Ph.D.; Shulin Ding, Ph.D.; Cory D. Evans, Ph.D.; Raafat M. Fahmy, Ph.D.; Patrick Faustino, Ph.D.; Daniel Folmer, Ph.D.; Rick L. Friedman, M.S.; Michael Scott Furness, Ph.D.; Zongming Gao, Ph.D.; Tapash Ghosh, Ph.D.;
xxii Comités / Integrantes Devinder S. Gill, Ph.D.; Lillie D. Golson, Pharm.D.; Yin Guo, Ph.D.; Michael Hadwiger, Ph.D.; Bruce D. Harris, Ph.D.; William Hess; Laura S. Huffman, M.S.; Gregory W. Hunter, Ph.D.; Mai Huynh, M.S.; Robert lser, M.S.; joseph E. Jablonski, Ph.D.; Lauren Jackson, Ph.D.; David S. Kaplan, Ph.D.; John F. Kauffman, Ph.D., M.B.A.; David A. Keire, Ph.D.; Michael C. Kennedy, Ph.D.; Andrea K. Kerrigan, M.S.; Mansoor A. Khan, R.Ph., Ph.D.; Loice C. Kikwai, Ph.D.; Robert H. King, Ph.D.; Donald N. Klein, Ph.D.; Bogdan Kurtyka, Ph.D.; Stephen E. Langille, Ph.D.; Sau L. Lee, Ph.D.; Robm Levis, Ph.D.; Tsai-lien Lin, Ph.D.; Richard Lostritto, Ph.D.; Ragine Maheswaran, Ph.D.; lngrid Markovic, Ph.D.; Ewa Marszal, Ph.D.; Gerald E. Marti, M.D., Ph.D.; Marilyn N. Martinez Pelsor, Ph.D.; Dorota Matecka, Ph.D.; Jeffrey B. Medwid, Ph.D.; Randa Melhem, Ph.D.; Janis R. Messenheimer, D.V.M.; John Metcalfe, Ph.D.; Yana Mille, R. Ph.; Tahseen Mirza, Ph.D.; Amit K. Mitra, Ph.D.; Sanja Modric, D.V.M., Ph.D.; Magdi M. Mossoba, Ph.D.; Laxma Nagavelli, Ph.D.; Linda L. Ng, Ph.D.; Mickey Parish, Ph.D.; Suhas Patankar, Ph.D.; Frank Perrella, Ph.D.; Kristina E. Peters, Pharm.D.; Erika A. Pfeiler, Ph.D.; Laura C. Pogue, Ph.D.; Vaikunth Prabhu, Ph.D.; CAPT Kimberly Rains, Pharm. D.; Rahdika Rajagopalan, Ph.D.; Sam e;;. Raney, Ph.D.; Andre S. Raw, Ph.D.; Snanaz Read, Ph.D.; Bnan D. Rogers, Ph.D.; Allen Rudman, Ph.D.; R. Duane Satzger, Ph.D.; Peter Scholl, Ph.D.; Paul Schwartz, Ph.D.; Suzanne J. Sechen, Ph.D.; Paul Seo, Ph.D.; Rakhi Shah, Ph.D.; jannavi Srinivasan, Ph.D.; Ann Stohlman, D.V.M.; Yichun Sun, Ph.D.; Neeru Takiar, M.S.; Jennifer Thomas, J.D.; Ram C. Tiwari, Ph.D.; Paula R. Trumbo, Ph.D.; Yiying Tsai, Pharm.D., M.P.H.; Saleh A. Turujman, Ph.D.; Willie F. Vann, Ph.D.; Perry Wang, Ph.D.; Russell Wesdyk, M.B.A.; Steven Wolfgang, Ph.D.; Jo H. Wyeth, Pharm.D.; Li Xia, Ph.D.; Betsy jean Yakes, Ph.D.; Susan Zuk, Ph.D.
USP 39
U.S. National lnstitute of Standards and Technology (NIST) Val R. Miller, Ph.D.
Grupos Asesores [Nota-El Director Ejecutivo puede nombrar organismos asesores para apoyar la labor del Consejo de Expertos y de la Convención, y para asesorar al personal interno en asuntos relacionados con políticas. El siguiente listado de Grupos Asesores y sus miembros representa a aquellos Grupos formados y aprobados en su totalidad a partir de mayo de 2015. Los Grupos Asesores se forman y desintegran continuamente durante todo el ciclo de revisión de la USP, por lo que en un futuro se publicarán otras listas de miembros.] Grupo Asesor para Titular Monografías-CONCLUIDO Robert S. Beardsley, R.Ph., Ph.D.; Micnael Cohen, R.Ph.; Marjorie Coppinger; Mary Jo Goolsby, Ed.D., M.S.N., C.A.E.; Chandraprakash Kasireddy, Ph.D.; Barbara Kochanowski, Ph.D.; Murray Kopelow, M.D., F.R.C.P.C.; Gary Matzke, Pharm.D.; Linda F. McElhiney, Pharm.D., R.Ph.; David Newton, Ph.D.; Annette Perschke, R.N., M.S.N.; Marjorie Phillips, M.S.; Peter H. Rheinstein, J.D., M.S.; Elliott M. Sogol, P~p., R.~h.; Vaiyapuri ~ubramaniam, Pharm.D., M.S.; Ph1hp Trav1s; Mark Wiggms, M.S.
Federal Commission for the Protection against Sanitary Risk (COFEPRIS), Mexico Gregorio Tecuapetia
Grupo Asesor de Leche Descremada en Polvo ROBERT MAGALETTA, PH.D., Presidente Grant Abernethy, Ph.D.; Marti Bergana, Ph.D.; Sneh Bhandari, Ph.D.; jack Cappozzo, M.S.; Kuanglin Chao, Ph.D.; Jonathan DeVries, Ph.D.; Gerard Downey, Ph.D.; Stephen Ellison, Ph.D.; George Greene; Einat Haleva, Ph.D.; James M. Harnly, Ph.D.; Peter de B. Harrington, Ph.D.; Steven Holroyd, Ph.D.; William J. Hurst; Gregory A. lsraelson; Moon S. Kim, Ph.D.; Petra Lutter, Ph.D.; Bill MacLuckie, Ph.D.; Andrew Mackey, Ph.D.; Carmen Martin-Hernandez; Anitra Payne; Benjamín B. Perston, Ph.D.; Jianwei Qin; Joseph P. Romano; Roman Romero, Ph.D.; Catherine Shaw; Suqin Sun, B.S.; John Szpylka, Ph.D.; Paul Wehling; Jinchuan Yang, Ph.D.; Steven Zbylut, Ph.D.; Caro! Zyrbko, Ph.D.
Health Canada Victoria Kyeyune
In Memóriam
Otros Enlaces Gubernamentales Brazllian Pharmacopeial Commission Gerson Pianetti, Ph.D.; Monica Soares, Ph.D. Chinese Pharmacopeial Commlssion Zhongping Guo; Peng Han
National lnstitute for Quality Control In Health (INCQS), Brazll Filipe Silva, Ph.D. The Saudi Food and Drug Authority (Saudi FDA), Saudi Arabia Ali M. Al Homaidan, Ph.D. U.S. Centers for Diease Control and Prevention Melissa Schaefer, M.D.; Nadine Shehab, Pharm.D., MPH U.S. Centers for Medicare and Medicaid Servlces Marie E. Manteuffel, Pharm.D., M.P.H.
La USP extiende su reconocimiento a los siguientes Voluntarios Expertos quienes fallecieron durante el ciclo 2010-2015: Robert G. Bursey, Ph.D. (Monografías-Comité de Expertos de Ingredientes Alimenticios) Mark C. Roman, Ph.D. (Comité de Expertos de Capítulos Generales-Análisis Químico) Ashwani Kumar Sahu, M.Sc. (Panel de Expertos en Vacunas) James A. Shea, Ph.D. (Panel de Expertos en Buenas Prácticas de Documentación) Ranga Velagaleti, Ph.D. (Monografías-Comité de Expertos de Ingredientes Alimenticios) Karen Wheless, M.S. (Comité de Expertos de Capítulos Generales-Análisis Químico)
Integrantes/ Miembros xxiii
USP 39
Miembros y Delegados de la Convención de la
Farmacopea de los Estados Unidos de América a partir del 31 de mayo de 2015 Instituciones Académicas y Asociaciones VinculadasAsociaciones Académicas
Indiana University School of Medicine, David R. Jones, Ph.D. joan C. Edwards School of Medicine Marshall University, Gary
O. Rankin, Ph.D. johns Hopkins University School of Medicine, Daniel M. Ashby,
M.S., FASHP Keck School of Medicine of University of Southem California,
American Association of Colleges of Nursing, Ginette A.
Pepper, Ph.D. American Association of Colleges of Osteopathic Medicine, An-
thony J. Silvagni, O.O., Pharm.D., M.Sc., FACOFP, FAFPE American Association of Colleges of Pharmacy, Lucinda L. Maine, Ph.D., R.Ph. Association of American Medica/ Colleges, David W. Nierenberg, M.O. Association of American Veterinary Medica/ Colleges, Dawn M. Boothe, D.V.M., Ph.D., M.S. Association of Faculties of Pharmacy of Canada, Raimar Loebenberg, Ph.D.
Paul D. Holtom, M.O. Loma Linda University School of Medicine, John N. Buchholz,
Ph.D. Louisiana State University Schoo/ of Medicine, Kurt J. Varner,
Ph.D. Louisiana State University Schoo/ of Medicine at Shreveport,
Henry R. McKnight, B.S., M.S., Pharm.D. Loyola University Chicago Stritch School of Medicine, Jawed
Fareed, Ph.D. Mayo Medica/ School, Peter J. Post, Pharm.D., R.Ph. Medica/ University of South Carolina College of Medicine,
Kenneth D. Tew, Ph.D. Meharry Medica/ College School of Medicine, Clivel G.
Instituciones Académicas y Asociaciones VinculadasUniversidades y Facultades de Medicina Baylor College of Medicine, Lynn C. Yeoman, Ph.D. Bastan University School of Medicine, Carol T. Walsh, Ph.D. Brody School of Medicine at East Carolina University, Abdel A.
Abdel-Rahman, Ph.D., FAHA Case Western Reserve University School of Medicine, Walter B.
Geho, M.O., Ph.D. Chicago Medica/ School at Rosalind Franklin University of Medicine and Science, Ann K. Snyder, Ph.D. Columbia University College of Physicians and Surgeons, Ru-
dina Odeh-Ramadan, Pharm.D. Creighton University Schoo/ of Medicine, Peter W. Abel, Ph.D. Duke University School of Medicine, Sharon L. Ellison, Pharm.
D. East Tennessee State University james H. Quillen College of Medicine, Kenneth E. Ferslew, Ph.D. Eastern Virginia Medica/ School, Senthil Kumar Rajasekaran,
M.O. Florida State University College of Medicine, Graham A.
Patrick, Ph.D. Geisel School of Medicine at Dartmouth, Lionel D. Lewis, M.O. Georgetown University School of Medicine, Thomas G.
Sherman, Ph.D. Howard University College of Medicine, Robert E. Taylor, M.O.,
Ph.D., FACP
Charlton, Ph.D. Mercer University School of Medicine, Wayne Glasgow, Ph.D. Michigan State University College of Human Medicine, Rami B.
lbrahim, M.Sc., Pharm.D., BCPS, BCOP Morehouse School of Medicine, Ward Kirlin, Ph.D. Mount Sinai School of Medicine, ]oel S. Mindel, M.O., Ph.D. New York Medica/ College, Mario A. lnchiosa, Ph.D. New York University School of Medicine, Lewis S. Nelson,
M.O. Northeast Ohio Medica/ University College of Medicine, Werner
Geldenhuys, Ph.D. Northwestern University Feinberg School of Medicine, Steven
M. Belknap, M.O. Ohio State University College of Medicine, Robert J. Weber,
Pharm.D., M.S. Pennsylvania State University College of Medicine, Kelly D.
Karpa, Ph.D., R.Ph. Ponce School of Medicine, Leon Ferder, M.O. Rutgers, the State University of New jersey, New jersey Medica/ School, Deborah Lazzarino, Ph.D. Rutgers, the State University of New jersey, Robert Wood johnson Medica/ School, Susan Goodin, Pharm.D., FCCP,
BCOP Saint Louis University School of Medicine, Heather Macarthur,
Ph.D., B.Sc. San juan Bautista School of Medicine, Marielis E. Rivera Ruiz,
Ph.D. Sidney Kimmel Medica/ College at Thomas jefferson University,
Walter Kraft, M.O., M.S., FACP Southern Jllinois University School of Medicine, Carl Faingold,
Ph.D.
xxiv Miembros/ Integrantes
USP 39
SUNY at Buffalo School of Medicine and Biomedical Sciences,
Paul J. Kostyniak, Ph.D., DABT
Marrero, M.D.
SUNY Downstate Medica/ Center College of Medicine, ]acob V.
Aranda, M.D., Ph.D., FRCPC
University of South Alabama College of Medicine, ]ack A. Di-
Palma, B.S., M.D.
SUNY Upstate Medica/ University, David F. Lehmann, M.D.,
Pharm.D.
University of South Carolina School of Medicine, Kenneth B.
Walsh, Ph.D.
Temple University School of Medicine, Alan Cowan, Ph.D. Texas A&M Hea/th Science Center College of Medicine, D.
Samba Reddy, Ph.D., R.Ph.
University of Puerto Rico School of Medicine, Miguel A.
.
Texas Tech University Health Sciences Center School of Medicine, Peter Syapin, Ph.D. The Warren Alpert Medica/ Schoo/ of Brown University, Wayne
D. Bowen, Ph.D. Tufts University School of Medicine, Ross W. Thompson, M.S.,
R.Ph. Tulane University School of Medicine, David W. Busija, Ph.D.,
M.D. (Hon.) Uniformed Services University of the Hea/th Sciences, Louis R.
Cantilena, M.D., Ph.D. Universidad Central del Caribe Schoo/ of Medicine, Harry
Mercado, M.D. University of Alabama at Birmingham School of Medicine,
Richard J. Whitley, M.D. University of Arizona College of Medicine, Hillary A. Franke,
M.D., M.S. University of Arkansas for Medica/ Sciences College of Medicine,
Paul L. Prather, Ph.D., B.S. University of California Davis School of Medicine, Timothy E.
Albertson, M.D., M.P.H., Ph.D. University of California San Francisco School of Medicine, Linda
L. Liu, M.D. University of Chicago Pritzker School of Medicine, Michael L.
Maitland, M.D., Ph.D. University of Cincinnati College of Medicine, Marianne F. lvey,
Pharm.D., M.P.H., FASHP University of Connecticut Hea/th Center School of Medicine,
Kimberly J. Metcalf, Pharm.D. University of Hawaii john A. Burns Schoo/ of Medicine, Robert A. Nichols, Ph.D. University of 11/inois College of Medicine at Chicago, Randal A.
University of South Florida Morsani College of Medicine, Shu-
feng Zhou, M.D., Ph.D. University of Tennessee, Memphis College of Medicine, Trevor
W. Sweatman, Ph.D. University of Texas Medica/ School at Houston, Gary C.
Rosenfeld, Ph.D. University of Utah Schoo/ of Medicine, Richard J. Sperry, M.D.,
Ph.D. University of Virginia School of Medicine, Robert J. Meyer,
M.D. University of Washington School of Medicine, Suzanne M. Al-
len, M.D., M.P.H. University of Wisconsin School of Medicine and Public Health,
F. Michael Hoffmann, Ph.D. Vanderbilt University School of Medicine, C. Michael Stein,
M.D. Virginia Commonwealth University School of Medicine, Dominic A. Sica, M.D. Wake Forest University School of Medicine, Kathy P. Bricker,
Pharm.D., BCPS Washington University School of Medicine in St. Louis, Evan D.
Kharasch, M.D., Ph.D. Wayne State University School of Medicine, Stephen A. Lerner,
M.D. Wright State University Boonshoft School of Medicine, Khalid
M. Elased, Ph.D., R.Ph. Ya/e University School of Medicine, Seth Powsner, M.D.
Instituciones Académicas y Asociaciones VinculadasUniversidades y Facultades de Farmacia
Skidgel, Ph.D. University of lowa Carver College of Medicine, Donald E. Le-
tendre, Pharm.D. University of Kansas School of Medicine, Sam J. Enna, Ph.D. University of Kentucky College of Medicine, Lisa A. Cassis,
Ph.D. University of Louisvil/e School of Medicine, Peter P. Rowell,
Ph.D. University of Maryland School of Medicine, Margaret M.
McCarthy, Ph.D. University of Massachusetts Medica/ Schoo/, Roy Guharoy,
Pharm.D., M.B.A., FCP, FCC, FASHP University of Miami Miller School of Medicine, ]oshua D. Len-
chus, D.0., R.Ph., FACP University of Michigan Medica/ School, Paul F. Hollenberg,
Ph.D. University of Mississippi School of Medicine, Deborah S. Minor,
Pharm.D., FAHA University of Missouri-Kansas City School of Medicine, james
M. Wooten, Pharm.D. University of Nebraska College of Medicine, L. Charles Murrin,
Ph.D. University of Nevada School of Medicine, lain L. Buxton,
Pharm.D. University of New Mexico Health Sciences Center School of Medicine, Arti Prasad, M.D. University of North Dakota School of Medicine and Hea/th Sciences, James E. Porter, Ph.D. University of Oklahoma College of Medicine, Pramod K.
Chetty, M.D. University of Pennsylvania School of Medicine, Patrick J.
Brennan, M.D. University of Pittsburgh School of Medicine, Dennis P.
Swanson, M.S.
Auburn University Harrison School of Pharmacy, William R. Ra-
vis, Ph.D. Butler University College of Pharmacy and Health Sciences, Su-
dip K. Das, Ph.D. Campbell University Schoo/ of Pharmacy, Antoine Al-Achi,
M.S.Pharm., Ph.D., M.S. Chicago State University College of Pharmacy, Duc P. Do,
Ph.D. Creighton University School of Pharmacy and Health Professions, J. Christopher Bradberry, Pharm.D. Drake University College of Pharmacy and Health Sciences,
Abebe E. Mengesha, Ph.D. Duquesne University Mylan School of Pharmacy, Ira S. Buck-
ner, Ph.D. Ernest Mario School of Pharmacy at Rutgers University, Long-
qin Hu, Ph.D. Ferris State University College of Pharmacy, Kim E. Hancock,
Ph.D. Florida A & M University College of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Mandip Sachdeva, Ph.D. Hampton University School of Pharmacy, Chengan Du, Ph.D.,
M.P.H. Howard University College of Pharmacy, Nursing and Allied Hea/th Sciences, Emmanuel O. Akala, Ph.D. ldaho State University College of Pharmacy, Kevin W.
Cleveland, Pharm.D. Lake Erie Col/ege of Osteopathic Medicine School of Pharmacy,
Sachin S. Devi, B.Pharm., Ph.D. Loma Linda University School of Pharmacy, W. William
Hughes, Ph.D. Long /s/and University Arnold and Marie Schwartz Col/ege of Pharmacy and Health Sciences, David R. Taft, B.S.Pharm.,
Ph.D.
USP 39
Integrantes / Miembros xxv
Massachusetts College of Pharmacy and Health SciencesBoston, David A. Williams, Ph.D. Massachusetts College of Pharmacy and Health Sciences School of Pharmacy-Worcester, Robert Campbell, Ph.D., M.S. Mercer University College of Pharmacy and Health Sciences, J.
University of California San Francisco School of Pharmacy,
Midwestern University Chicago College of Pharmacy, Anna Ka-
University of Connecticut School of Pharmacy, Peter J. Tycz-
Grady Strom, Ph.D. bakov, Pharm.D.
kowski, R.Ph., M.B.A.
Bowman, Ph.D., R.Ph.
Omidian, Ph.D., M.Sc., B.Sc.
University of Georgia College of Pharmacy, Gurvinder Singh
Rekhi, Ph.D., M.S. University of Houston College of Pharmacy, F. Lamar Pritchard,
Ph.D. University of 11/inois at Chicago Col/ege of Pharmacy, Stepha-
nie Y. Crawford, Ph.D., M.P.H.
Ohio Northern University Raabe College of Pharmacy, Jenelle
L. Sobotka, Pharm.D.
University of Kansas School of Pharmacy, Christian Schoneich,
Ph.D.
Oregon State University College of Pharmacy, J. Mark
Christensen, Ph.D.
University of Kentucky College of Pharmacy, Eric J. Munson,
Ph.D.
Pacific University College of Health Professions School of Pharmacy, Susan M. Stein, R.Ph., M.S. Palm Beach Atlantic University Gregory School of Pharmacy,
Adwoa O. Nornoo, B.Pharm., M.S., Ph.D. Purdue University School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Stephen R. Byrn, Ph.D. Roseman University of Health Sciences College of Pharmacy, Mark C. Decerbo, Pharm.D., BCPS, BCNSP Samford University McWhorter School of Pharmacy, John J.
f.
University of Maryland School of Pharmacy, Natalie D.
Eddington, Ph.D. University of Michigan College of Pharmacy, Gregory E. Ami-
don, B.S., Ph.D. University of Minnesota College of Pharmacy, Marilyn K. Spee-
die, Ph.D. University of Mississippi School of Pharmacy, Michael A.
Repka, D.D.S., Ph.D. University of Missouri-Kansas City School of Pharmacy, Cydney
E. McQueen, Pharm.D. Dunn School of Pharmacy,
Nina Hengen, M.D., Ph.D. South Carolina College of Pharmacy, James J. Sterrett, Pharm.
D., BCPS South Dakota State University College of Pharmacy, David L.
Helgeland, B.S.Pharm., M.B.A., Ed.D. South University School of Pharmacy, S. Craig Dyar, Ph.D. Southern //Jinois University Edwardsville School of Pharmacy,
William M. Kolling, Ph.D. Southwestem Oklahoma State University School of Pharmacy,
Shelly Stockton, Ph.D. St. john's University College of Pharmacy and Allied Health Professions, Abu Serajuddin, Ph.D. St. Louis College of Pharmacy, John Pieper, Pharm.D. SUNY at Buffalo Schoo/ of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Alfred T. Reiman, R.Ph. Temple University School of Pharmacy, Michael Borenstein,
Ph.D. Texas Southern University College of Pharmacy and Health Sciences, Dong Liang, Ph.D. Texas Tech University Health Sciences Center Schoo/ of Pharmacy, Arthur A. Nelson, Ph.D., R.Ph. The Ohio State University Col/ege of Pharmacy, Robert W.
Brueggemeier, Ph.D. The University of Arizona College of Pharmacy, Michael Ma-
yersohn, Ph.D. The University of lowa College of Pharmacy, Mickey L. Wells,
Ph.D. The University of Louisiana at Monroe College of Pharmacy,
Sami M. Nazzal, Ph.D. The University of North Carolina at Chapel Hill Eshelman School of Pharmacy, Dennis M. Williams, Pharm.D. The University of Texas at Austin College of Pharmacy, Janet C.
Walkow, Ph.D. The University of Toledo College of Pharmacy, Kenneth S.
Alexander, R.Ph., Ph.D. Tauro University California College of Pharmacy, Alison
McCormick, Ph.D. University of Arkansas far Medica/ Sciences College of Pharmacy, Mark Estes, Pharm.D. University of California San Diego Skaggs School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Grace M. Kuo, Pharm.D.,
Ph.D., M.P.H.
University of Florida College of Pharmacy, Rhonda Cooper-De-
Hoff, Pharm.D., M.S., FAHA
North Dakota State University College of Pharmacy, Nursing and Allied Sciences, Jagdish Singh, Ph.D. Northeastern University Bouve College of Health Sciences School of Pharmacy, Mansoor M. Amiji, Ph.D. NOVA Southeastern University College of Pharmacy, Hamid H.
Arnold, Ph.D., B.S.
Pankaj B. Desai, Ph.D. University of Colorado Skaggs School of Pharmacy, Peter J.
Rice, Pharm.D., Ph.D.
Midwestern University College of Pharmacy-Glendale, Bill J.
Shenandoah University Bemard
Leslie Z. Benet, Ph.D. University of Cincinnati james L. Winkle College of Pharmacy,
University of Nebraska Medica/ Center College of Pharmacy,
Michael F. Powell, B.S. Pharm, M.S. University of New Mexico College of Pharmacy, Lynda S. We-
lage, B.S., Pharm.D. University of Oklahoma College of Pharmacy, Vibhudutta
Awasthi, Ph.D., M.Pharm. University of Pittsburgh School of Pharmacy, Michael A. Ze-
maitis, Ph.D. University of Rhode lsland College of Pharmacy, David R.
Worthen, Ph.D., J.D. University of Sao Paulo College of Pharmacy, Prof. Terezinha
de Jesus Andreoli Pinto University of Southern California School of Pharmacy, Stan G.
Louie, Pharm.D. University of Tennessee Health Science Center College of Pharmacy, Laura A. Thoma, Pharm.D., B.S. University of the Pacific Thomas j. Long School of Pharmacy and Health Sciences, Xiaoling Li, Ph.D. University of the Sciences in PhiTadelphia, Philadelphia College of Pharmacy, Daniel A. Hussar, Ph.D. University of Utah College of Pharmacy, John W. Mauger,
Ph.D. University of Washington School of Pharmacy, Thomas K. Haz-
let, Pharm.D., Dr.P.H. University of Wisconsin-Madison School of Pharmacy, James E.
DeMuth, Ph.D., R.Ph. University of Wyoming School of Pharmacy, Kurt Dolence,
Ph.D. Virginia Commonwealth University/Medical College of Virginia School of Pharmacy, Phillip M. Gerk, Pharm.D., Ph.D. Washington State University College of Pharmacy, Danial E.
Baker, Pharm.D., FASHP, FASCP Wayne State University Eugene Applebaum College of Pharmacy and Health Sciences, Sheila M. Wilhelm,
Pharm.D. West Virginia University School of Pharmacy, Arthur l. Jackno-
witz, Pharm.D. Western University of Health Sciences College of Pharmacy, Su-
nil Prabhu, Pharm.D., R.Ph. Wilkes University Nesbitt School of Pharmacy, Harvey A.
Jacobs, Ph.D. Xavier University of Louisiana College of Pharmacy, Tarun K.
Manda!, Ph.D.
xxvi Miembros / Integrantes
Instituciones Académicas y Asociaciones VinculadasUniversidades y Facultades de Medicina Osteopática NOVA Southeastem University College of Osteopathic Medicine Nicole Cook, Ph.D., M.P.H. '
Organizaciones de Consumidores y Otras Organizaciones que Representan el Interés Público AARP, Leigh Purvis Alzheimer's Association, William Thies, Ph.D. American Autoimmune Related Diseases Association, Virginia T. Ladd, R.T. Amer(can Cancer Society, Mark Clanton, M.D., M.P.H. Amer~can Diabetes Association, jane L. Chiang, M.D. American Hea/th Quality Association, Kenneth Mishler, R.Ph., Pharm.D. American Heart Association, Robert Lee Page 11, Pharm.D., M.S.P.H., FCCP, FAHA, FASHP FASCP BCPS CGP Arthritis Foundation, john H. Klippel, M.Ó. ' Center for Science in the Public lnterest David G. Schardt M.S. I ' Consumers Union, Lisa L. Gill, B.A. ECRI lnstitute, jeffrey C. Lerner, Ph.D. Jnstitute for Safe Medication Practices, Michael R. Cohen, R. Ph., M.S., Sc.D., FASHP Nat(onal Consur:iwrs Lea9ue, Rebecca Burkholder, ).D. Nat1onal Counol on Pat1ent lnformation and Education William R. Bullman, M.A.M. ' National Organization for Rore Disorders, Diane E. Dorman Nqt!onal Os~eoporosis Foundation, Amy Porter W1//1am }. Clinton Foundation, Rodger W. Stringham, Ph.D.
Organismos, Divisiones y Asociaciones Gubernamentales Vinculados Agency for Healthcare Research and Qualitv Scott R. Smith Ph.D. ,, I Argen.tin.e Pharmacopoeia, Héctor A. Giuliani, Pharm.D. Cynthia T. Culmo Braz1/1an Pharmacopoeia Commission, Mónica da Luz Carvalho Soares Brazil's National lnstitute of Quality Control in Health Filipe Soares Quirino Silva, Ph.D. ' British Pharmr;icopoeia Commission, james Pound Centers for D1sease Control and Prevention, Cindy P. Dougherty, Pharm.D. Centers for Medicare & Medicaid Services Jeffrey A. Kelman I I M.D. China National Center for Food Safety Risk Assessment, junshi Chen, M.D. Chinese Pharmacopoeia Commission, Zhang Wei Department of Veterans Affairs Veterans Health Administration Timothy ). Stroup, R.Ph. ' European Directorate for the Quality of Medicines and HealthCare, Susanne Keitel FDA Center for Biologics Evaluation and Research, john G. Bishop 111 FDA Center for Devices and Radiological Health, Marilyn M. Lightfoote, M.D., Ph.D. FDA Center for Drug Evaluation and Research, Pallavi Nithyanandan, Ph.D. FDA Center for Food Safety and Applied Nutrition, Daniel E. Folmer, Ph.D. Asso~1.at1on of Food and Drug Officials,
USP 39 FDA Center for Veterinary Medicine, janis R. Messenheimer, D.V.M. Federal Commission for Protection Against Sanitary Risks, Rocio del Carmen Alatorre Eden-Wynter, M.C. Federal Service on Surveillance in Healthcare of Russian Federation, Valentina F. Kosenko, Ph.D., Pharm. Food and f!~ugs Authority, Ghana, Eri.c .Karikari-Boateng, M.S. Food, Medicine and Hea/th Care Admin1stration and Control Authority of Ethiopia, Yehulu Denekew Alamneh, B.Sc., M.A. Genera! Directorate of Medicines, Suppfies and Drugs, Laura Ceron, Q.F. Health Canada, Karen Reynolds Health Canada, Food Directorate, Barbara Lee Health Canada, Natural and Non-prescription Health Products Directorate, Bruce Randall lndian Pharmacopoeia Commission, G.N. Singh, Ph.D., M.Pharm. lndonesi~n Pharmacopo~ia_ Commission, Augustine Zaini, M.S. lntemat1onal Trade Admin1stration-U.S. Department of Commerce, james D. Rice, B.A., M.A. }apan's Ministry of Health Labour and Welfare, Pharmaceuticals and Medica/ Devices Agency, Nobuo Uemura jo~dr;in Food and Drug Administration, Dr. Lubna R. Qusous M~m.stry of Food and Drug Safety, Dr. jin-Ho Wang Min1stry of Health of the Republic of Belarus, Liudmila Reutskaya, Pharm.D. Ministry of Health of the Republic of Uzbekistan, Mirzohidjon Kodirov, Ph.D. Morocco's Directorate of Medicines and Pharmacy, Laila Hakkou National Agency for Food and Drug Administration and Cont1yt, Dr. Mo.ni~a H. Eimunjeze Nat1onal Assoc1at1on of Boards of Pharmacy, Elizabeth Scott Russell, B.S.Pharm. National Center for Quality Control, Ofelia del Rosario Villalva Rojas, Q.F. National Centre for Expertise of Drugs, Medica/ Products and Medica/ Equipment, Ardak U. Tufegenova, Ph.D. National Drug Authority of Uganda, Gordon Katende Sematiko National Health Surveillance Agency, Lais Santana Dantas B.S. National lnstitute for Biologica/ Standards and Control Adrian F. Bristow, Ph.D. ' National lnstitute of Drug and Food Surveillance, Eduardo Vergel Bayona National lnstitute of Metrology, Quality and Technology, Valnei Smarc;aro da Cunha, Ph.D. National lnstitute of Standards and Technology, Michael J. Tarlov, Ph.D. Nat(onal lnst(tutes for Food and Drug Control, Bo Li, Ph.D. Nat1onal lnst1tutes of Health, Robert DeChristoforo, R.Ph., M.S., FASHP Perman~nt Commission _of the Pharmacopoeia of the United Mex1can States, Mana del Carmen Becerril-Martinez Pharmacopoeia of Chinese Taipei, jaw-jou Kang, Ph.D. Pharmacy Council of India, Bhojraj Suresh, M.Pharm., Ph.D., D.Sc. Philippine Pharmacopeia, Maria Lourdes C. Santiago, B.S.Pharm., M.S.Pharm. Saudí Food and Drug Authority, Abdullah S. Alhomoud, M.S. State Administration of Ukraine on Medicinal Products Andrii V. Shovkovyi ' Tan¡;ania Food and Drugs Authority, Yonah H. Mwalwisi Thm Pharmacopoeia Committee, Kornvika Charupant, Ph.D. The Pharmacy Board of Sierra Leone, Wiltshire C.N. johnson, B.Pharm. (Hons) USL., M.Sc (Brad UK), MPSSL, FPCPharm Therapeutic Goods Administration of Australia, Vivienne Christ, B.App.Sc., MASM Ukrainian Scientific Pharmacopoeial Center for Quality of Medicines, Oleksandr l. Gryzodub, Ph.D. United Stqtes Agency for lntemational Development, Anthony F. Boni
USP 39 United States Air Force-Office of the Surgeon General, Deborah
Myers, R.Ph., M.B.A. United States Department of Health and Human Services,
Donald Wright, M.D., M.P.H. United States Food and Drug Administration-Offíce of the Commissioner, Jingyee Kou, Ph.D. United States Navy Bureau of Medicine and Surgery-Office of the Surgeon General, Thinh V. Ha, Pharm.D., M.B.A., M.S. United States Pub/ic Health Service-Office of the Surgeon General, Christina H. Lee, Pharm.D. Vietnamese Pharmacopoeia Commission, Luc Thi Thu Hang,
Ph.D.
Integrantes / Miembros xxvii American Veterinary Medica/ Association, Donald C. Sawyer,
D.V.M., Ph.D. Argentine Association of Industrial Pharmacy and Biochemistry,
Federico Montes de Oca, M.B.A. Brazilian National Association of Compounding Pharmacists,
Maria do Carmo Garcez Calibration and Validation Group, Herman Lam, Ph.D. Canadian Pharmacists Association, Perry Eisenschmid, M.B.A. Canadian Society for Pharmaceutical Sciences, Neal M. Davies,
B.Sc. Pharm., Ph.D., R.Ph. Drug lnformation Association, Susan A. Cantrell, B.S.Pharm.,
R.Ph., CAE European Federation for Pharmaceutical Sciences, Hendrik J. de
Otras Asociaciones Profesionales y Científicas de Profesionales de la Salud AACC lnternational, Amy Hope Academy of Managed Care Pharmacy, Edith A. Rosato, R.Ph.,
IOM Academy of Nutrition and Dietetics, Kathryn M. Camp, M.S.,
RD, CSP, LN American Academy of Allergy, Asthma and lmmunology,
Michael R. Nelson, M.D., Ph.D. American Academy of Neurology, jack J. Chen, Pharm.D., FASCP, FCCP American Academy of Nurse Practitioners, jan Towers, Ph.D., NP-C American Academy of Ophthalmology, Wiley A. Chambers, M.D. American Academy of Pediatrics, Hank Farrar, M.D. American Academy of Physician Assistants, Marie-Michele Leger, M.P.H., PA-C American Academy of Veterinary Pharmacology and Therapeutics, Carol A. Davis, Ph.D. American Association of Pharmaceutical Scientists, Christopher
McCurdy, Ph.D., R.Ph. American Botanical Council, Mark Blumenthal American Chemica/ Society, Denise L. Creech American College of Clinical Pharmacology, Stephen N. Keith,
M.D., M.S.P.H. American College of Clinical Pharmacy, C. Edwin Webb,
Pharm.D., M.P.H. American College of Physicians, Brian L. Strom, M.D. American Dental Association, Eugenio D. Beltrán-Aguilar, D.
M.D., M.P.H., M.S., Dr.P.H. American Dental Education Association, Vahn A. Lewis,
Pharm.D., Ph.D. American Geriatrics Society, Todd P. Semla, M.S., Pharm.D.,
BCPS, FCCP, AGSF American Medica/ Association, Barry D. Dickinson, Ph.D. American Nurses Association, Rita Munley Gallagher, Ph.D.,
R.N. American Optometric Association, Jimmy D. Bartlett, O.D. American Pharmacists Association, Thomas E. Menighan,
R.Ph., M.B.A., FAPhA American Public Health Association, Deborah K. Walker, Ed.D. American Society for Clinical Pharmacology and Therapeutics,
Patricia W. Slattum, Pharm.D., Ph.D. American Society for Microbiology, Amy L. Leber, Ph.D. American Society for Nutrition, Robert M. Russell, M.D. American Society for Parenteral and Entera/ Nutrition, Gordon
S. Sacks, Pharm.D., BCNSP, FCCP American Society for Pharmacology and Experimenta/ Therapeutics, Jan M. Kitzen, Ph.D. American Society for Quality, Donald C. Singer, M.S. American Society of Anesthesiologists, H.A. Tillmann Hein,
M.D., Ph.D. American Society of Consultant Pharmacists, Arnold E. Clay-
man, Ph.D., FASHP American Society of Health-System Pharmacists, Paul W. Abra-
mowitz, Pharm.D., FASHP
Jong, Ph.D. lnfusion Nurses Society, Mary C. Alexander, C.R.N.I., M.A.,
R.N., CAE, FAAN lnstitute of Food Technologists, William Fisher, M.S. lnternational Academy of Compounding Pharmacists, Matthew
Kopacki, B.S.Pharm. lnternational Council of Nurses, David C. Benton, RGN, RMN,
BSC, MPhil, FFNF, FRCN lnternational Society for Cellular Therapy, Joseph C. Laning,
Ph.D. lnternational Society for Pharmaceutical Engineering, Stephen
M. Tyler, M.S. National Alliance of State Pharmacy Associations, Rebecca P.
Snead, R.Ph., B.S.Pharm. National Community Pharmacists Association, Carolyn C. Ha,
Pharm.D. National Pharmaceutical Association, Barry A. Bleidt, Ph.D.,
Pharm.D. National Pharmacy Technician Association, Michael J.
johnston, CPhT New jersey Pharmaceutical Quality Control Association,
Barbara J. Ferguson, B.A. Pan American Pharmaceutical Federation, Maria Elena
Girard-Cuesy Parenteral Drug Association, /ne., Richard M. Johnson, M.Sc. Regulatory Affairs Professionals Society, Sherry L. Keramidas,
Ph.D., CAE Society of Critica/ Care Medicine, Timothy S. Yeh, M.D.,
FCCM Society of Nuclear Medicine and Molecular lmaging, )effrey P.
Norenberg, Pharm.D. Western Compendia/ Discussion Group, Assad J. Kazeminy,
Ph.D.
Asociaciones Profesionales y Científicas de Profesionales de la Salud-Sociedades Médicas Estatales de los Estados Unidos de América California Medica/ Association, Charles W. Maas, M.D.,
M.P.H. Connecticut State Medica/ Society, Eric B. Einstein, M.D. Hawaii Medica/ Association, Jone Geimer-Flanders, D.0. Indiana State Medica/ Association, Daria Schooler, M.D., R.Ph. towa Medica/ Society, Harold W. Miller, M.D. Kansas Medica/ Society, Tracie Collins, M.D., M.P.H. Maine Medica/ Association, Stevan Gressitt, M.D. Massachusetts Medica/ Society, Bruce G. Karlin, M.D. MedChi-Maryland State Medica/ Society, Peter H. Rheinstein,
M.D., ).D., M.S. Medica/ Association of the State of Alabama, Allan R.
Goldstein, M.D. Medica/ Society of New jersey, joseph N. Micale, M.D. Medica/ Society of the District of Columbia, Kim A. Bullock,
M.D. Medica/ Society of the State of New York, Richard S. Blum,
M.D.
xxviii Miembros / Integrantes Minnesota Medica/ Association, Robert K. Meiches, M.O.,
M.B.A. Missouri State Medica/ Association, Thomas L. Holloway Montana Medica/ Association, Jean Branscum New Mexico Medica/ Society, ]erry D. Mclaughlin, M.O. North Dakota Medica/ Association, Robert (Rob) W. Beattie,
M.O. Pennsylvania Medica/ Society, Ralph Schmeltz, M.O., FACP,
FACE Puerto Rico Medica/ Association, Rolance G. Chavier-Roper,
M.O. Rhode lsland Medica/ Society, Peter A. Hollmann, M.O. South Dakota State Medica/ Association, E. Paul
Amundson, M.O. Tennessee Medica/ Association, John J. lngram 111, M.O. Texas Medica/ Association, Kevin H. McKinney, M.O., FACE,
FACP Utah Medica/ Association, Michelle S. McOmber, B.S., M.B.A. West Virginia State Medica/ Association, Kevin W. Yingling,
M.O., R.Ph., FACP Wisconsin Medica/ Society, Thomas M. Derrig, M.O.
USP 39 New Mexico Pharmacists Association, William G. Troutman,
Pharm.D. North Carolina Association of Pharmacists, Stephen F. Eckel,
Pharm.D., M.H.A. North Dakota Pharmacists Association, Michael D. Schwab Ohio Pharmacists Association, Amelía S. Bennett, R.Ph. Oklahoma Pharmacists Association, Wiley L. Williams, J.D. Oregon State Pharmacy Association, joshua Free, Pharm.D.,
M.B.A. Pennsylvania Pharmacists Association, George R. Haynes,
Pharm.D., Ph.D. Pharmacists Society of the State of New York, Tracy R. Russell,
CAE Pharmacy Society of Wisconsin, Susan M. Kleppin, R.Ph.,
FASHP Rhode /stand Pharmacists Association, John Grossomanides,
Pharm.D. South Carolina Pharmacy Association, Craig Burridge, M.S.,
CAE South Dakota Pharmacists Association, Leonard J. Petrik,
Pharm.D. Tennessee Pharmacists Association, Micah Cost, Pharm.D.,
Asociaciones Profesionales y Científicas de Profesionales de la Salud-Asociaciones Farmacéuticas Estatales de los Estados Unidos de América Alabama Pharmacy Association, Valerie A. Oakley, Pharm.D. Alaska Pharmacists Association, Amber L. Briggs, Pharm.D. Arizona Pharmacy Association, Kelly Ridgeway Arkansas Pharmacists Association, Kristen G. Riddle, Pharm.D. California Pharmacists Association, ]on R. Roth, CAE Colegio de Farmaceuticos de Puerto Rico, Milagros Morales,
R.Ph. Colorado Pharmacists Society, Val Kalnins, R.Ph. Connecticut Pharmacists Association, Peter J. Sposato, R.Ph.,
B.C.N.P. Delaware Pharmacists Society, Kenneth (Kevin) Musto, R.Ph. Florida Pharmacy Association, Michael A. Moné, J.D., R.Ph.,
FAPhA Georgia Pharmacy Association, Larry L. Braden, B.S., R.Ph., D.
Se. Hawaii Pharmacists Association, Ronald T. Taniguchi,
Pharm.D. ldaho State Pharmacy Association, Pam Eaton Jllinois Pharmacists Association, Norman A. Hoback,
B.S.Pharm. Indiana Pharmacists Alliance, Daniel D. Degnan 111, Pharm.D.,
M.S. lowa Pharmacy Association, Thomas R. Temple, R.Ph., M.S. Kansas Pharmacists Association, Michael Larkin Kentucky Pharmacists Association, Patricia R. Freeman, Ph.D. Louisiana Pharmacists Association, Randall Brooks, B.S. Maine Pharmacy Association, Laurier A. Lamie, R.Ph. Maryland Pharmacists Association, Matthew G. Shimoda,
Pharm.D. Massachusetts Pharmacists Association, Steven D. Geoffroy,
R.Ph. Michigan Pharmacists Association, Eric D. Roath, Pharm.D. Minnesota Pharmacists Association, Lowell ]. Anderson, O.Se.,
FAPhA, FFIP Mississippi Pharmacists Association, Kimsey O'Neal, Pharm.D. Missouri Pharmacy Association, Ron L. Fitzwater, CAE, M.B.A. Montana Pharmacy Association, Lori Morin, M.B.A., Pharm.D. Nebraska Pharmacists Association, Samuel C. Augustine,
Pharm.D., FAPhA New Hampshire Pharmacists Association, Elizabeth A.
Robertson, R.Ph. New jersey Pharmacists Association, Steve H. Zlotnick,
Pharm.D.
M.S. Texas Pharmacy Association, Eric H. Frankel, MSE, Pharm.D. Utah Pharmacists Association, Adam W. ]ones Virginia Pharmacists Association, Marianne R. Rollings, R.Ph. Washington D.C. Pharmacy Association, Michael J. Kim,
Pharm.D. Washington State Pharmacy Association, ]eff Rochon,
Pharm.D. West Virginia Pharmacists Association, Patty ]ohnston, B.S. Wyoming Pharmacy Association, William H. Rathburn, R.Ph.
Asociaciones de Fabricantes, Comerciales y Afiliadas American Chemistry Council, Michael P. Walls, Esq. American Herbal Products Association, Maged H. Sharaf, Ph.D. American Hospital Association, John R. Combes, M.O. Animal Hea/th Jnstitute, Richard A. Carnevale, V.M.D. Association of the European Self-Medication lndustry, Christelle
Anquez-Traxler Biotechnology lndustry Organization, Earl S. Dye, Ph.D. Bulk Drug Manufacturers Association, Airra Krishna Reddy,
B.Sc. Compressed Gas Association, Michael B. Tiller, B.S., B.A. Consumer Health Products Canada, Adam C. Kingsley, B.Sc.,
NP, CAE Consumer Healthcare Products Association, john Punzi, Ph.D. Council for Responsible Nutrition, James C. Griffiths, Ph.D. Egyptian Chamber of Pharmaceutical lndustry, Abdulla Molok-
hia, Ph.D. European Generic Medicines Association, Julie Marechal-Jamal,
M.S. Flavor and Extract Manufacturers Association, John H. Cox,
J.D. Food Marketing Jnstitute, Catherine M. Polley, R.Ph. Generic Animal Drug Alliance, Stephanie Batliner Generic Pharmaceutical Association, David R. Gaugh, R.Ph. Grocery Manufacturers Association, Shannon M. Cooksey,
M.S., PMP Healthcare Distribution Management Association, Karen J.
Ribler lndian Drug Manufacturers' Association, Daara B. Patel,
B.Com., D.l.M.M. lnternational Dairy Foods Association, ]ohn T. Allan 111, B.S.,
M.S. lnternational Federation of Pharmaceutical Manufacturers and Associations, Caroline Mendy lnternational Food Additives Council, Robert Rankin lnternational Generic Pharmaceutical Alliance, Nicholas
Cappuccino, Ph.D.
USP 39
Integrantes / Miembros xxix
fnternational Pharmaceutical Excipients Council of the Americas, Priscilla Zawislak . Mexico's National Chamber of the Pharmaceut1cal lndustry,
J. Rivelino Flores, M.Sc. National Association of Chain Drug Stores, Alex J. Adams,
Pharm.D. Personal Care Products Council, Beth Anne Lange, Ph.D., B.S. Pharmaceuticaf Care Management Association, Greg S.
Johnson, B.A.
.
Pharmaceuticaf Research and Manufacturers of Amenca,
Mark Wiggins, B.S., M.S.
J.
. .
Sao Paulo State Pharmaceutical Manufacturers Assooat1on,
Nelson dos Santos, jr. The joint Commission, jeannell M. Mansur, B.S. Pharm.,
Pharm.D.
· / The jordanian Association of Manufacturers of Pharmaceut1ca s & Medica/ Appliances, Hanan J. Sboul, M.B.A., CAE
Organismos No Gubernamentales para el Establecimiento de Normas y Determinación de Conformidad Accreditation Council far Pharmacy Education, Dimitra V. Trav-
los, Pharm.D., BCPS
.
.
.
American Type Culture Collect1on, El1zabeth J. Kerngan, B.A. AOAC Jnternational, E. james Bradford, ph.D. . Association far the Advancement of Medica/ lnstrumentat1on,
joseph Carl Lewe.lling, B.A.,. M.A.
.
Chilean Pharmacope1a Foundat1on1 Carohne R.
Weinstein-Oppenheimer, Ph.D.
.
Clinical and Laboratory Standards lnst1tute, Luann Ochs, M.S. URAC, Kylanne Green, R.N., N.P.
xxx Donantes / Integrantes
USP 39
Reconocimiento para los
Donantes de Materiales de Referencia y de Monografías en 2014 La USP reconoce y agradece el apoyo de las empresas que han participado en el establecimiento de las normas USP mediante el aporte de información para el desarrollo de nuevas monografías o la donación de candidatos a materiales de referencia. La siguiente lista incluye a las empresas que aportaron monografías propuestas en 2014 o que donaron candidatos a materiales de referencia establecidos como Estándares de Referencia USP durante 2014. Abbvie lnc. ACell, lnc. ACS Dobfar Actavis ple. Ajinomoto North America, lnc. Almirall S.A. Amano Enzyme USA Co., Ltd. Apicore LLC Apotex, lnc. Arcadia Biosciences, lnc. Archer Daniels Midland Company - ADM Arevipharma GmbH Arista Industries lnc. Astellas Pharma lncorporated AstraZeneca lnc. Aurobindo Pharma Ltd. BASF Corporation Baxter Healthcare Corporation Bayer Pharma AG BCN Peptides SA Beneo Group Bioriginal Food & Science Corp Boehringer lngelheim Pharma GMBH & Co. KG Bristol-Myers Squibb C.E. Roeper GmbH Cadila Healthcare Limited Camag Cambrex Corporation Canadian Phytopharmaceuticals Corp. China Medical Association of Minorities Cipla Ltd. Claris Lifesciences Ltd. Cognis Deutschland GmbH & Co. Colorcon, lnc. Cosma S.P.A. Covidien Croda lnc. CU Chemie Uetikon GMBH Cyanotech Danisco A/S Dishman Group Divis Laboratories Ltd. Dow Chemical Co. Dr. Reddy's Laboratories Limited DSM Nutritional Products, lnc. DSM Sinochem Pharmaceuticals Eisai Food and Chemical Co., Ltd.
Eli Lilly and Company Emcure Pharmaceuticals Ltd. Erfa Canada 2012 lnc. Erregierre S.P.A Euromed Evonik Rexim (Nanning) Pharmaceutical Co. Ltd Excella GMBH Exova, lnc Fermion Ferrer Health Tech Fresenius Kabi Oncology Limited Garuda lnternational, lnc. Gattefosse SA GE Healthcare lnc. Gedeon Richter USA GlaxoSmithKline Glenmark Pharma Ltd. Gnosis S.p.A. Golden-Shell Biochemical Co., Ltd. Helsinn Chemicals SA Henan Dongtai Pharm. Co., Ltd. Hoffman-Laroche lnc. Hope Pharmaceuticals Hospira, lnc. - North America Hovione Farmaciencia SA Hunan Normal University Huntsman Advanced Materials lmpax Laboratories lnc. lndena SPA lnterchem Corp. lpca Laboratories Ltd. janssen Pharmaceutical jinan jinda Pharmaceutical Chemistry Co., Ltd. JMC Corporation johnson & johnson - USA jost Chemical Company jubilant Generics Ltd. Kemin Human Nutrition and Health Kobayashi Perfumery Co., Ltd. Lake Chemical Pvt. Ltd. Lite Technologies, Ltd. Lonza AG Lundbeck Pharmaceutical Lupin Pharma Lusochimica SPA Mallinckrodt Pharmaceuticals Mangalam Drugs & Organics Ltd. Mantrose-Haeuser Co. lnc. McDermott, Will & Emery McNeil Consumer Healthcare - A Division of johnson & johnson lnc. Medichem Merck and Co., lnc. Merial MSN Laboratories, Ltd.
USP 39 Mylan Laboratories Limited Natural Remedies NIBSC Novartis Pharma AG Nutrasweet Palsgaard, lnc. Par Pharmaceutical Companies, lnc. PennConsult Pfizer Pharmavite LLC Plantex USA lnc. Polymed Therapeutics, lnc. Procos SpA PuraPharm lnternational (H.K.) Ltd. Reckitt Benckiser Group Recordati SPA Sandoz lnc. Sangrose Laboratories Pvt. Ltd. Sanofi Aventis Deutchland GmbH Sasol North America lnc. Schwabe North America Scino Pharm Taiwan, Ltd. Sequent Scientific Limited Shaanxi Jia He Phytochem Co., Ltd Shanghai lnstitute of Materia Medica (SIMM) Sicor Sifavitor SPA
Integrantes / Donantes xxxi
Sigma-Aldrich Solvay Pharmaceuticals SST Corporation Sterling S.N.1.F.F. Italia SpA Strides Arcolab Limited Sun Pharmaceutical Industries Ltd. Suven Lite Sciences Ltd. Symrise, lnc Synkem Teva Pharmaceuticals Industries Ltd. - Israel The Chao Center ThermoFisher Scientific Thomas Swan & Co., Ltd. Torrent Pharmaceuticals Ltd. Trifarma SPA UCB, lnc. North America Unichem Laboratories Ltd. University of Macau Upsher-Smith Laboratories, lnc. Uquifa Italia S.P.A. Verdure Sciences Wockhardt Ltd. Wuhan Wuyao Pharmaceutical Co., Ltd. Zhejiang Apeloa Jiayuan Pharmaceutical Co., Ltd. Zhe1iang Hangzhou Xinfu Pharmaceutical Co., Ltd. Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co., Ltd. Zhe1iang Huahai Pharmaceutical Co., Ltd.
xxxii Acta Constitutiva
USP 39
Acta Constitutiva En mayo de 1900 la Convención le ordenó a la junta Directiva que constituyera la asociación de la USP conforme a la legislación del Distrito de Columbia (Estados Unidos de América). La creación de la asociación se vio retrasada debido a que la legislación del Distrito de Columbia exigía que la mayoría de los funcionarios firmantes del Certificado de Constitución fueran residentes del Distrito, por lo que fue
necesario designar representantes que cumplieran con tal requisito. No obstante, se procedió a elaborar el Acta Constitutiva, que se firmó e inscribió definitivamente el 11 de julio de ese mismo año. A continuación figura el texto del certificado original:
Certificado de Constitución
Por el presente, los suscriptos, ciudadanos de los Estados Unidos, mayores de edad y en su mayoría ciudadanos del Distrito de Columbia, constituyen una asociación que se denominará Convención de la Farmacopea de los Estados Unidos de América (The United States Pharmacopeial Convention), según lo dispuesto en los artículos 545 a 552 inclusive, de las Leyes Revisadas de los Estados Unidos para el Distrito de Columbia y su enmienda aprobada por Ley del Congreso, aprobada el día 23 de abril de 1884. Esta Asociación se constituye por un plazo de novecientos noventa y nueve años. Su objeto es promover y fomentar la ciencia y el arte de la medicina y la farmacia mediante la realización de investigaciones, experimentos y otros procedimientos adecuados destinados a seleccionar y denominar materiales que puedan utilizarse apropiadamente como medicamentos y fármacos, incluyendo fórmulas para su preparación; establecer normas y directivas uniformes para quienes practican la medicina y la farmacia en los Estados Unidos, que les permitan determinar con exactitud la identidad, el contenido y la pureza de tales medicamentos y fármacos, y otros propósitos afines y similares; e imprimir y distribuir en general, a intervalos adecuados, las mencionadas fórmulas y los resultados de dichas selecciones, denominaciones y determinaciones de índole similar, entre los miembros de esta Asociación, farmacéuticos y médicos generalmente de los Estados Unidos, así como entre quienes tengan interés en la farmacia y en la medicina. La administración y control de los asuntos, fondos y bienes de la Asociación durante su primer año de existencia estarán a cargo de una junta Directiva, integrada por los siete miembros siguientes: ALBERT E. EBERT SAMUEL
GEORGE W. SLOAN
A.D. SHEPPARD
HORATIO
C.
WOOD
CHARLES RICE
WILLIAM S. THOMPSON CHARLES E. ÜOHME
En fe de lo cual firmamos y sellamos el presente documento este séptimo día del mes de julio del año 1900. WILLIAM S. THOMPSON
(SELLO]
WILLIAM M. MEW
(SELLO]
G. LLOYD MAGRUDER
(SELLO]
FRANK M. CRISWELL
[SELLO]
]OHN T. WINTER
(SELLO]
MURRAY G. MOTIER
[SELLO]
THOMAS
C.
SMITH
(SELLO]
USP 39
Gobierno de la USP xxxiii
Gobierno de la USP Estatutos Los Estatutos de USP para el período 2015-2020 están disponibles en el sitio electrónico http://www.usp.org/about-usp/
leadershíp/bylaws.
Normas y Procedimientos Las Normas y Procedimientos del Consejo de Expertos para el período 2015-2020 están disponibles en el sitio electrónico http://www. usp. org/about-usp/leadership/polícies-rules/rules-procedures-council-experts.
Políticas de la USP Las políticas de la USP están disponibles en el sitio electrónico http://www.usp.org/about-usp/leadershíp/polícies-rules.
USP 39
FARMACOPEA DE LOS UNIDOS DE ESTADOS , AME RICA Oficial desde el 7º de mayo de 20 76
TRIGÉSIMA NOVENA REVISIÓN
© 2016 The United States Pharmacopeial Convention
12601 Twinbrook Parkway, Rockville, MD 20852 Todos Jos derechos reservados.
USP 39
Incorporaciones xxxvii
Incorporaciones Artículos Incorporados a USP 39 mediante Suplementos Primer Suplemento (1 º de agosto de 2015)
CAPÍTULOS GENERALES (202) Identificación de Aceites Fijos por Cromatografía en Capa Delgada (203) Procedimiento de Cromatografía en Capa Delgada de Alta Resolución para Identificación de Artículos de Origen Botánico (1 064) Identificación de Artículos de Origen Botánico por Cromatografía en Capa Delgada de Alta Resolución
(1106.1) Ensayos de lnmunogenicidad-Diseño y Validación de Ensayos para Detectar Anticuerpos Neutralizantes Antifármacos (1229 .11) Esterilización en Fase de Vapor (1663) Evaluación de Sustancias Extraíbles Relacionadas con Envases Farmacéuticos y Sistemas de Administración (1664) Evaluación de Sustancias Lixiviables en Medicamentos Relacionadas con Envases Farmacéuticos y Sistemas de Administración (1664.1) Medicamentos Nasales y para Inhalación Oral
SUPLEMENTOS DIETÉTICOS Aceite de Semilla de Borraja, Cápsulas Aceite de Semilla de Lino, Cápsulas Menaquinona-7 Menaquinona-7, Cápsulas Menaquinona-7, Preparación Menaquinona-7, Tabletas
Extracto de Menaquinona-7 de Bacillus subtilis ssp. subtilis Metilcobalamina Raíz y Rizoma de Notoginseng Raíz y Rizoma de Notoginseng en Polvo Extracto Seco de Raíz y Rizoma de Notoginseng
MONOGRAFÍAS DE USP Malato de Almotriptán Almotriptán, Tabletas Amlodipino, Valsartán e Hidroclorotiazida, Tabletas Anastrozol, Tabletas Buprenorfina, Solución Bucal, Preparación Magistral Veterinaria Diclofenaco Sódico y Misoprostol, Tabletas de Liberación Retardada Clorhidrato de Epirubicina, Inyección Galantamina, Cápsulas de Liberación Prolongada Galantamina, Solución Oral Fumarato de lbutilida lmiquimod, Crema
Levetiracetam, Inyección Diclorhidrato de Levocetirizina Metaxalona Metaxalona, Tabletas Clorhidrato de Minociclina, Tabletas de Liberación Prolongada Norelgestromina Clorhidrato de Selegilina, Gel Tópico, Preparación Magistral Tadalafilo, Suspensión Oral, Preparación Magistral Clorhidrato de Tramado!, Suspensión Oral, Preparación Magistral Veterinaria Voriconazol, Solución Oftálmica, Preparación Magistral Veterinaria
USP 39
xxxviii Incorporaciones
MONOGRAFÍAS DE USP Zonisamida, Suspensión Oral, Preparación Magistral
Segundo Suplemento (1º de diciembre de 2015)
CAPÍTULOS GENERALES (212) Análisis de Oligosacáridos (1025) Pancreatina
(11 32) Medición de Proteína Residual de Células Huésped en Productos Biofarmacéuticos (1223.1) Validación de Métodos Alternativos para Valoraciones Microbiológicas de Antibióticos
SUPLEMENTOS DIETÉTICOS Semilla de Alholva Semilla de Alholva en Polvo Extracto en Polvo de Semilla de Alholva Espirulina
Espirulina, Tabletas Fruto de Esquisandra del Norte de China Fruto de Esquisandra del Norte de China en Polvo Aceite de Onagra, Cápsulas
MONOGRAFÍAS DE USP Amlodipino y Valsartán, Tabletas Andamiaje de Fibroína de Seda Andamiaje de Vejiga Porcina Dipropionato de Beclometasona, Solución Oral, Preparación Magistral Cisaprida, Inyección, Preparación Magistral Veterinaria Cisaprida, Suspensión Oral, Preparación Magistral Veterinaria Ciclosporina, Solución Oftálmica, Preparación Magistral Veterinaria Enrofloxacino, Suspensión Oral, Preparación Magistral Veterinaria Ezetimiba Ezetimiba, Tabletas
Famciclovir, Suspensión Oral, Preparación Magistral Lamivudina, Tabletas Lamotrigina, Tabletas de Liberación Prolongada Diclorhidrato de Levocetirizina, Tabletas Lopinavir y Ritonavir, Solución Oral Marbofloxacino, Suspensión Oral, Preparación Magistral Veterinaria Clorhidrato de Propafenona, Cápsulas de Liberación Prolongada Benzoato de Rizatriptán, Tabletas Benzoato de Rizatriptán, Tabletas de Desintegración Oral Tartrato de Tolterodina
Artículos Nuevos que Aparecen en USP 39 Ausentes en USP 38 y sus Suplementos [NOTA-Los artículos que se incluyen en esta lista se marcan en el libro con los siguientes símbolos • .a.usr39. Esto se aplica tanto a los artículos nuevos como a secciones de artículos existentes que han tenido revisiones.]
CAPÍTULOS GENERALES (129) Procedimientos Analíticos para Anticuerpos Monoclonales Recombinantes de Uso Terapéutico (162) Prueba de Potencia Antitoxina Diftérica en lnmunoglobulinas Humanas (503.1) Ácido Trifluoroacético en Péptidos (580) Valoración de Vitamina C (661.1) Materiales Plásticos de Construcción (661.2) Sistemas de Envases Plásticos para Uso Farmacéutico
(855) Nefelometría, Turbidimetría y Comparación Visual (914) Viscosidad-Métodos por Medida de Presión (1661) Evaluación de Sistemas de Envases Plásticos y sus Materiales de Construcción con Respecto a su Impacto sobre la Seguridad del Usuario (1730) Espectroquímica de Plasma-Teoría y Práctica (1735) Espectrometría de Fluorescencia de Rayos XTeoría y Práctica (1 771) Productos Oftálmicos-Pruebas de Desempeño
USP 39
Incorporaciones xxxix
SUPLEMENTOS DIETÉTICOS Raíz de Astrágalo Raíz de Astrágalo en Polvo Extracto Seco de Raíz de Astrágalo
Condroitina Sulfato de Sodio de Tiburón 5-Hidroxi-L-triptófano
MONOGRAFÍAS DE USP Acetato de Abiraterona Acetato de Abiraterona, Tabletas Clorhidrato de Ácido Aminolevulínico Aprepitant Aprepitant, Cápsulas Aripiprazol, Tabletas Aripiprazol, Tabletas de Desintegración Oral Calcipotrieno Calcipotrieno, Ungüento Candesartán Cilexetilo e Hidroclorotiazida, Tabletas Clorhidrato de Ciclobenzaprina, Cápsulas de Liberación Prolongada Dalteparina Sódica Clorhidrato de Difenhidramina y Clorhidrato de Fenilefrina, Tabletas Entecavir Entecavir, Tabletas
Eszopiclona Eszopiclona, Tabletas Clorhidrato de Fenilefrina, Tabletas Fluconazol en Cloruro de Sodio, Inyección Propionato de Fluticasona y Salmeterol, Aerosol para Inhalación Propionato de Fluticasona y Salmeterol, Polvo para Inhalación Micofenolato de Sodio Ácido Micofenólico, Tabletas de Liberación Retardada Montelukast Sódico, Gránulos Orales Montelukast Sódico, Tabletas Montelukast Sódico, Tabletas Masticables Paliperidona Sitagliptina, Tabletas Fosfato de Sitagliptina Teriparatida
Artículos Incluidos en USP 38 Ausentes en USP 39 CAPÍTULOS GENERALES (361) Valoración de Barbitúricos MONOGRAFÍAS DE USP Cápsulas que Contienen por lo Menos Tres de los Siguientes Fármacos-Acetaminofeno y Sales de Clorfeniramina, Dextrometorfano y Fenilpropanolamina Solución Oral que Contiene por lo Menos Tres de los Siguientes Fármacos-Acetaminofeno y Sales de Clorfeniramina, Dextrometorfano y Fenilpropanolamina Tabletas que contienen por lo Menos Tres de los Siguientes Fármacos-Acetaminofeno y Sales de Clorfeniramina, Dextrometorfano y Fenilpropanolamina Maleato de Clorfeniramina y Clorhidrato de Fenilpropanolamina, Cápsulas de Liberación Prolongada Maleato de Clorfeniramina y Clorhidrato de Fenilpropanolamina, Tabletas de Liberación Prolongada
Bitartrato de Fenilpropanolamina Clorhidrato de Fenilpropanolamina, Cápsulas Clorhidrato de Fenilpropanolamina, Cápsulas de Liberación Prolongada Clorhidrato de Fenilpropanolamina, Solución Oral Clorhidrato de Fenilpropanolamina, Tabletas Clorhidrato de Fenilpropanolamina, Tabletas de Liberación Prolongada Sulfato de Guanadrel Sulfato de Guanadrel, Tabletas Insulina Humana Cinc, Suspensión Insulina Humana Cinc de Acción Prolongada, Suspensión Lipresina, Solución Nasal Sulfato de Protamina para Inyección
xi Lista Detallada
USP 39
LISTA DETALLADA
Advertencias Generales, Monografías, Capítulos Generales, Reactivos y Tablas Afectadas por Cambios que Aparecen en USP 39 Los números de página se refieren a USP 3 9. Nota-Las siguientes listas indican, entre paréntesis, seguido del título de la sección o subsección, si la sección es nueva o si la subsección se agregó o eliminó de una sección ya existente. Las entradas que aparecen sin ninguna designación de la forma "nueva," "agregada," o "eliminada," tienen cambios en la redacción que se incluyeron en el texto oficial existente.
Advertencias y Requisitos Generales Advertencias Generales, 3 Introducción; 1. Título y Revisión; 2. Estado Oficial y Reconocimiento Legal; 3. Cumplimiento de las Normas; 4. Monografías y Capítulos Generales; 5. Componentes de las Monografías; 6. Prácticas y Procedimientos de Prueba; 8. Términos y Definiciones; 9. Prescripción y Dispensación; y 1O. Conservación, Envasado, Almacenamiento y Etiquetado
Capítulos Generales
Pruebas y Valoraciones Generales Equipos para Pruebas y Valoraciones (21) Termómetros (eliminado), 117 Pruebas y Valoraciones Biológicas (129) Procedimientos Analíticos para Anticuerpos Monoclonales Recombinantes de Uso Terapéutico (nuevo), 219 (162) Prueba de Potencia Antitoxina Diftérica en lnmunoglobulinas Humanas (nuevo), 239 Pruebas y Valoraciones, Químicas (411) Valoración de Acido Fólico, 339 (503) Acido Acétic,o en Péptidos, 383 INTRODUCCION Método 2 (agregada) REQUISITOS ADICIONALES Estándares de Referencia USP
(503.1) Acido Trifluoroacético en Péptidos (nuevo), 384 (580) Valoración de Vitamina C (nuevo), 440 Pruebas y Determinaciones Físicas (661) Sistemas de Envases Plásticos y sus Materiales de Construcción, 527 Title, Introducción y Alcance (661.1) Materiales Plásticos de Construcción (nuevo), 528 (661.2) Sistemas de Envases Plásticos para Uso Farmacéutico (nuevo), 541 (670) Envases-Componentes Auxiliares, 545 Introducción y Desecantes (agregada) (711) Disolución, 578 Introducción
(730) Espectroquímica de Plasma, 601 (751) Partículas Metálicas en Ungüentos Oftálmicos (eliminado), 620 (771) Productos Oftálmicos-Pruebas de Calidad, 632 (790) Partículas Visibles en Inyectables, 658 Introducción
(851) Espectrofotometría y Dispersión de Luz (eliminado), 754 (855) Nefelometría, Turbidimetría y Comparación Visual (nuevo), 777 (914) Viscosidad-Métodos por Medida de Presión (nuevo), 806
Información General (1045) Artículos Obtenidos por Biotecnología (eliminado), 990 (1059) Desempeño de Excipientes, 1150 lntroduccion, Tabletas y Cápsulas, y Líquidos Orales
(1251) Pesada en una Balanza Analítica, 1969 Introducción y Calificación (1661) Evaluación de Sistemas de Envases Plásticos y sus Materiales de Construcción con Respecto a su Impacto sobre la Seguridad del Usuario (nuevo), 2002 (1730) Espectroquímica de Plasma-Teoría y Práctica (nuevo), 2064 (1735) Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X-Teoría y Práctica (nuevo), 2071 (1771) Productos Oftálmicos-Pruebas de Desempeño (nuevo), 2136
Suplementos Dietéticos (2040) Desintegración y Disolución de Suplementos Dietéticos, 2240 Prueba de Ruptura para Cápsulas Blandas y Disolución
Reactivos, Indicadores y Soluciones
Reactivos Especificaciones de Reactivos Reactivos, Introducción, 2280
,
6. Pruebas Generales para Reactivos
~cido ~cido
Fórmico al 98 por ciento (nuevo), 2289 Litocólico, 2290 Acido Quenodesoxicólico, 2292 Bromelina, 2303 Citrato de Calcio, 2308 3-Cloropropano-1,2-diol (nuevo), 2311 Qesmosterol (nuevo), 2314 ~ter Bencílico (nuevo), 2323 Eter Laurílico de Polioxietileno 1O, 2323 Fosfato de Sodio y Amonio Tetrahidrato, 2326 Fumarato de Estearilo Sódico (nuevo), 2328 lsobutirato de Pregnenolona (nuevo), 2333
USP 39 Latosterol (nuevo), 2334 1-Monodecanoil-rac-glicerol (nuevo), 2337 1-Monooctanoil-rac-glicerol (nuevo), 2337 Nitrato Cúprico Hidrato, 2338 Nitrato de Torio, 2338 2-Pirrolidona (nuevo), 2345 Politetrafluoroetileno (nuevo), 2346 Sulfato de Calcio, Dihidrato, 2355 Soluciones Volumétricas Arsenito de Potasio, Décimo Normal (O, 1 N), 2383 Edetato Disódico, Décimo Molar (O, 1 M) (nueva), 2384 Edetato Disódico, Veinteavo Molar (0,05 M), 2384 Nitrato de Plata, Décimo Normal (O, 1N), 2387 Permanganato de Potasio, Décimo Normal (O, 1 N), 2388 Tiosulfato de Sodio, Décimo Normal (O, 1 N), 2390 Columnas Cromatográficas L8, 2391 L1O, 2391 L11, 2391 L20, 2391 L65, 2393 L78, 2394 L88 (nueva), 2394 L92 (nueva), 2394 L93 (nueva), 2394 L94 (nueva), 2394
Tablas de Referencia Especificaciones del Envase para Cápsulas y Tabletas Acetato de Abiraterona, Tabletas (nueva), 2397 Ácido Micofenólico, Tabletas de Liberación Retardada (nueva), 2397 Aprepitant, Cápsulas (nueva), 2398 Aripiprazol, Tabletas (nueva), 2398 Aripiprazol, Tabletas de Desintegración Oral (nueva), 2398 Bromuro de Piridostigmina, Tabletas, 2398 Candesartán Cilexetilo e Hidroclorotiazida, Tabletas (nueva), 2398 . . ., Citrato de Orfenadnna, Tabletas de L1berac1on Prolongada, 2399 Clorhidrato de Ciclobenzaprina, Cápsulas de Liberación Prolongada (nueva), 2399 Clorhidrato de Difenhidramina y Clorhidrato de Fenilefrina, Tabletas (nueva), 2400 Clorhidrato de Fenilefrina, Tabletas (nueva), 2400 Clorhidrato de Propoxifeno, Cápsulas (eliminada), 2400 Clorhidrato de Propoxifeno y Acetaminofeno, Tabletas (eliminada), 2400 Clorhidrato de Propoxifeno, Aspirina y Cafeína, Cápsulas (eliminada), 2400 Entecavir, Tabletas (nueva), 2402 Eszopiclona, Tabletas (nueva), 2402 Montelukast Sódico, Tabletas (nueva), 2404 Montelukast Sódico, Tabletas Masticables (nueva), 2404 Napsilato de Propoxifeno, Tabletas (eliminada), 2404 Napsilato de Propoxifeno y Acetaminofeno, Tabletas (eliminada), 2404 .. . Napsilato de Propoxifeno y Aspirina, Tabletas (eliminada), 2404 Sitagliptina, Tabletas (nueva), 2405
Lista Detallada xli Descripción y Solubilidad Relativa de Artículos de la USP y del NF Acetato de Abiraterona (nueva), 2409 Aluminometasilicato de Magnesio, 2416 Aluminosilicato de Magnesio, 2416 Aprepitant (nueya), 241 7 Clorhidrato de Acido Aminolevulínico (nueva), 2425 Entecavir (nueva), 2437 Eszopiclona (nueva), 2438 Etilparabeno Sódico (nueva), 2439 Fosfato de Sitagliptina (nueva), 2442 Micofenolato Sódico (nueva), 2452 Monocaprilato de Glicerilo (nueva), 2452 Monocaprilocaprato de Glicerilo (nueva), 2452 Paliperidona (nueva), 2457
Monografías (USP 39) Acetato de Abiraterona (nueva), 2497 Acetato de Abiraterona, Tabletas (nueva), 2498 Alopurinol, 2606 IMPUREZAS Impurezas Orgánicas
REQUISITOS ADICIONALES Estándares de Referencia USP
Sulfato de Aluminio y Acetato de Calcio para Solución Tópica, ?673 VALORACION Sulfato de Aluminio Tetradecahidrato tato de Calcio Monohidrato
y Ace-
Clorhidrato de Ácido Aminolevulínico (nueva), 2715 Fosfato de An~azolina, 281 O DEFINICION , IDENTIFICACION Prueba B,
VALORACION Procedimiento
IMPUREZAS Impurezas Orgánicas
PRUEBAS ESPECIFICAS Intervalo o Temperatura de Fusión, Clase la
(eliminada) REQUISITOS ADICIONALES Estándares de Referencia USP
Aprepitant (nueva), 2831 Aprepitant, Cápsulas (nueva), 2833 Aripiprazol, Tabletas (nueva~, 2843 . , Aripiprazol, Tabletas de Desmtegrac1on Oral (nueva), 2845 Acido Ascórbi~o, Tabletas, 2853 DEFINICIOt-J VALORACION Procedimiento 7 y Procedimiento 2
(agregada) _ PRUEBAS DE DESEMPENO Disolución y Desintegración (agregada) REQUISITOS ADICIONALES Etiquetado (agregada) y Estándares de Referencia USP (agregada) Sulfato de Atropin¡;t, Ungüento Oftálmico, 2899 IDENTIFICACION ldentification-Bases Orgánicas Nitrogenadas, Prueba A,
PRUEBAS ESPECIFICAS Partículas Metálicas en Ungüentos Oftálmicos
(eliminada) y Otros Requisitos (agregada) Bacitracina, 2931 , IDENTIFICACION Prueba A y Pryeba B (agregada) PRUEBAS ESPECIFICAS Composición de Bacitracina
REQUISITOS ADICIONALES
xlii Lista Detallada Envasado y Almacenamiento
Bacitracina, Ungüen~o Oftálmico, 2934 PRUEBAS ESPECIFICAS
Determinación de Agua, Método I (eliminada), Partículas Metálicas en Ungüentos Oftálmicos (eliminada) y Otros Requisitos (agregada) REQUISITOS ADICIONALES
Envasado y Almacenamiento Bacitracina Cinc,,2936 , INFORMACIOl)J QUIMICA IDENTIFICACION Prueba A y Pn¡eba B (agregada) PRUEBAS ESPECIFICAS
Composición de Bacitracina, Contenido de Cinc y Pruebas de Esterilidad REQUISITOS ADICIONALES
Envasado y Almacenamiento
Bacitracina Cinc y Sulfato de Polimixina B, Ungüento Oftálmico, 2939 VALORACION
Bacitracina PRUEBAS DE DESEMPEÑO Llenado Mínirr¡o (eliminada) PRUEBAS ESPECIFICAS
Determinación de Agua, Método I (eliminada); Partículas Metálicas en Ungüentos Oftálmicos (eliminada); Pruebas de Esterilidad; Otros Requisitos (agregada) REQUISITOS ADICIONALES Envasado y Alma~enamiento Benzocaína, Solucif>n Otica, 2976 IDENTIFICACION Prueba A,y Prueba B (agregada) VALORACION
Procedimiento IMPUREZAS
Impurezas Orgánicas (agregada) REQUISITOS ADICIONALES Estándares de Referencia USP (agregada) Benzocaína, Tablet9s de Disolución Bucal, 2978 IDENTIFICACION Prueba A, VALORACION
Procedimiento IMPUREZAS
Impurezas Orgánicas (agregada) REQUISITOS ADICIONALES
Envasado y Almacenamiento y Estándares de Referencia USP Benzocaína y Men~ol, Aerosol Tópico, 2981 IDENTIFICACION
Prueba A, VALORACION
Benzocaína y Mentol
USP 39 Gluconato de Calcjo, 3138 IDENTIFICACION
Absorción en el Infrarrojo, Prueba B IMPUREZAS
Límite de Hierro Calcipotrieno (nueva), 3152 Calcipotrieno, Ungüento (nueva), 3154 Candesartán Cilexetilo e Hidroclorotiazida, Tabletas (nueva), 3164 Clorhidrato de Ciclobenzaprina, Cápsulas de Liberación Prolongada (nueva), 3366 Ciprofloxacino,, Ungüento Oftálmico, 3418 VALORACION
Procedimiento PRUEBAS DE DESEMPEÑO Llenado Mínirr¡o (eliminada) PRUEBAS ESPECIFICAS
Partículas Metálicas en Ungüentos Oftálmicos (eliminada) y Otros Requisitos (agregada) Cloranfenicol, l)ngüento Oftalmico, 3523 VALORACION
Procedimiento, PRUEBAS ESPECIFICAS Llenado Mínimo (eliminada), Partículas Metálicas en Ungüentos Oftálmicos (eliminada) y Otros Requisitos (agregada) Cloranfenicol y Sulfato de Polimixina B, Ungüento Oftálmico, 352,5 VALORACION
Cloranfenicol , PRUEBAS ESPECIFICAS
Partículas Metálicas en Ungüentos Oftálmicos (eliminada) y Otros Requisitos (agregada) Clorhidrato de Clortetraciclina, Ungüento Oftálmico, 3578 PRUEBAS DE DESEMPEÑO Llenado Mínirr¡o (eliminada) PRUEBAS ESPECIFICAS Determinación de Agua, Método/ (eliminada);
Partículas Metálicas en Un9üentos Oftálmicos (eliminada); y Otros Requisitos (agregada) Clotrimazol, lnsert9s Vaginales, 3582 1DENTI FICACION Prueba 8,(agregada) VALORACION
Procedimiento IMPUREZAS
Impurezas Orgánicas (agregada) REQUISITOS ADICIONALES Estándares de Referencia USP Clotrimazol, SolucLón Tópica, 3584 IDENTIFICACION Prueba A,y Prueba B (agregada) VALORACION
Procedimiento
IMPUREZAS
IMPUREZAS
Impurezas Orgánicas (agregada) PRUEBAS ESPECIFICAS Otros Requisitos (eliminada), Prueba de Presión (agregada) y Prueba de Fuga (agregada) REQUISITOS ADICIONALES
Impurezas Orgánicas (agregada) REQUISITOS ADICIONALES
Estándares de Referencia USP Budesónida, 306} , INFORMAQON QUIMICA VALORACION
Procedimiento IMPUREZAS
Procedimiento 7: Límite de 2 7-Acetato de Budesónida (eliminada), Procedimiento 2: Límite de 7 1-Cetobudesónida (eliminada), Procedimiento 3 (eliminada) e Impurezas Orgánicas (agregada) REQUISITOS ADICIONALES
Estándares de Referencia USP
Estándares de Referencia USP Clotrimazol, Tabletas de Disolución Bucal, 3585 IDENTIFICACION Prueba A,y Prueba B (agregada) VALORACION
Procedimiento IMPUREZAS
Impurezas Orgánicas (agregada) REQUISITOS ADICIONALES Estándares de Referencia USP Cloxacilina Sódica,, 3590 IDENTIFICACION Prueba B (agregada) e Identificación-Prue-
bas Gene¡afes, Sodio, Prueba C VALORACION
Procedimiento IMPUREZAS
USP 39
Lista Detallada xliii Impurezas Orgánicas (agregada)
PRUEBAS ESPECIFICAS
Pruebas de Esterilidad REQUISITOS ADICIONALES
Estándares de Referencia USP Dalteparina Sódica (nueva), 3667 Fosfato Sódico de ,Dexametasona, Crema, 3716 IDENTIFICACION Prueba 8,(agregada) VALORACION
Procedimiento REQUISITOS ADICIONALES
Estándares de Referencia USP Fosfato Sódico de Dexametasona, Inyección, 3717 , IDENTIFICACION Prueba 8,(agregada) VALORACION
Procedimiento REQUISITOS ADICIONALES
Envasado y Almacenamiento, y Estándares de Referencia USP Fosfato Sódico de Dexametasona, Solución Oftálmica, 3718 , IDENTIFICACION Prueba 8,(agregada) VALORACION
Procedimiento REQUISITOS ADICIONALES
Envasado y Almacenamiento, y Estándares de Referencia USP Fosfato Sódico de Dexametasona, Ungüento Oftálmico, 3719 , IDENTIFICACION Prueba 8,(agregada) VALORACION
Procedimiento PRUEBAS DE DESEMPEÑO Llenado Mínir110 (eliminada) PRUEBAS ESPECIFICAS
Partículas Metálicas en Ungüentos Oftálmicos (eliminada) y Otros Requisitos (agregada) REQUISITOS ADICIONALES
Envasado y Almacenamiento, y Estándares de Referencia USP Diclofenaco Potásic;:o, Tabletas, 3769 IDENTIFICACION
Prueba 8, VALORACION
Procedimiento IMPUREZAS
Impurezas Orgánicas Diclofenaco Sódico, Tabletas de Liberación Pro, longada, 3772 IDENTIFICACION
Prueba 8, VALORACION
Procedimiento IMPUREZAS
Impurezas Orgánicas REQUISITOS ADICIONALES
Envasado y Almacenamiento Diclofenaco Sódico, Tabletas de Liberación Retardada, 3774 , IDENTIFICACION
Prueba 8, VALORACION
Procedimiento IMPUREZAS
Impurezas Orgánicas REQUISITOS ADICIONALES
Envasado y Almacenamiento Dicloxacilina Sódic,a, 3783 IDENTIFICACION
Prueba 8 (agregada) e Identificación-Pruebas Gene¡afes, Sodio, Prueba C VALORACION
Procedimiento IMPUREZAS
Impurezas Orgánicas (agregada) REQUISITOS ADICIONALES Estándares de Referencia USP Clorhidrato de ,Difenhidramina, Cápsulas, 3806 VALORACION
Procedimiento IMPUREZAS
Impurezas Orgánicas (agregada) REQUISITOS ADICIONALES Envasado y Almacenamiento, y Estándares de Referencia USP Clorhidrato de ,Difenhidramina, Inyección, 3808 VALORACION
Procedimiento IMPUREZAS
Impurezas Orgánicas (agregada) REQUISITOS ADICIONALES Envasado y Almacenamiento, y Estándares de Referencia USP Clorhidrato de Difenhidramina, Solución Oral, 3809 , IDENTIFICACION
Prueba A, VALORACION
Procedimiento IMPUREZAS
Impurezas Orgánicas {agregada) PRUEBAS DE DESEMPENO Volumen de El]trega (agregada) PRUEBAS ESPECIFICAS pH (agregada), Pruebas de Recuento Microbiano y Pruebas de Microorganismos Específicos (agregada) REQUISITOS ADICIONALES
Envasado y Almacenamiento, y Estándares de Referencia USP Clorhidrato de Difenhidramina y Clorhidrato de Fenilefrina, Tabletas (nueva), 3811 Divalproex Sódico, Cápsulas de Liberación Retardada, 3875 PRUEBAS DE DESEMPEÑO
Disolución Sulfato de Efedrinq, Inyección, 3989 IDENTIFICACION
Prueba 8, VALORACION
Procedimiento IMPUREZAS
Impurezas Orgánicas (agregada) REQUISITOS ADICIONALES Envasado y Almacenamiento, y Estándares de Referencia USP Maleato de Enalapril, Tabletas, 4012 PRUEBAS DE DESEMPENO
Disolución Entecavir (nueva), 4033 Entecavir, Tabletas (nueva), 4035 Clorhidrato de Epitetraciclina, 4047 IDENTIFICACION
Absorción en el Infrarrojo, Prueba A (agregada) y t;rueba 8 (agregada) VALORACION
Procedimiento IMPUREZAS
Límite de 4-Epjanhidrotetraciclina (agregada) PRUEBAS ESPECIFICAS
4-Epianhidrotetraciclina (eliminada) REQUISITOS ADICIONALES Estándares de Referencia USP Eritromicina, Ungüento Oftálmico, 4079
USP 39
xliv Lista Detallada VALORACIÓN
Procedimiento PRUEBAS DE DESEMPEÑO Llenado Mínirr¡,o (eliminada) PRUEBAS ESPECIFICAS
Partículas Metálicas en Ungüentos Oftálmicos (eliminada), Determinación de Agua, Método I (eliminada) y Otros Requisitos (agregada) REQUISITOS ADICIONALES
Envasado y Almacenamiento, y Estándares de Referencia USP Eszopiclona (nueva), 4156 Eszopiclona, Tabletas (nueva), 4157 Clorhidrato de Fenilefrina, Tabletas (nueva), 4236 Fluconazol, Inyección, 4340 Fluconazol en, Dextrosa, Inyección, 4344 DEFINICION , IDENTIFICACION Prueba d? Dextrosa, Prueba B (agregada) VALORACION
Procedimiento IMPUREZAS
Impurezas Orgánicas Procedimiento 1: Para Impurezas No Polares; Impurezas Orgánicas Procedimiento 2: Para Impurezas Potares; Impurezas Orgánicas: Procedimiento 3 (eliminada); Impurezas Orgánicas: Procedimiento 4 (eliminada) REQUISITOS ADICIONALES Etiquetado (eliminada) Fluconazol en Cloruro de Sodio, Inyección (nueva), 4347 Fluoresceína Sódiq1, 4383 IDENTIFICACION
Prueba C, VALORACION
Procedimiento IMPUREZAS
Acriflavina e Impurezas Orgánicas (agregada) REQUISITOS ADICIONALES
Estándares de Referencia USP Propionato de Fluticasona y Salmeterol, Aerosol para Inhalación (nueva), 4433 Propionato de Fluticasona y Salmeterol, Polvo para Inhalación (nueva), 4439 Gentamicina y Acetato de Prednisolona, Ungüento Oftálmico,,4531 IDENTIFICACION
Cromatografía en Capa Delgada, Prueba A VALORACION
Acetato de Prednisolona PRUEBAS DE DESEMPEÑO Llenado Mínirr¡,o (eliminada) PRUEBAS ESPECIFICAS
Partículas Metálicas en Ungüentos Oftálmicos (eliminada), Determinación de Agua, Método I (eliminada) y Otros Requisitos (agregada) REQUISITOS ADICIONALES
Envasado y Almacenamiento, Sulfato de Gentamicina, Ungüento Oftálmico, 4535 IDENTIFICACIÓN
Cromatografía en Cap_a Delgada, Prueba A PRUEBAS DE DESEMPENO Llenado Mínirr¡,o (eliminada) PRUEBAS ESPECIFICAS
Partículas Metálicas en Ungüentos Oftálmicos (eliminada), Determinación de Agua, Método I (eliminada) y Otros Requisitos (agregada) REQUISITOS ADICIONALES
Envasado y Almacenamiento Halcinónida, 4603, IDENTIFICACION Prueba B,(agregada) VALORACION
Procedimiento IMPUREZAS
Impurezas Orgánicas Halcinónida, Cremp, 4604 IDENTIFICACION Prueba A y Prueba B (agregada) IMPUREZAS Impurezas Orgánicas (agregada) REQUISITOS ADICIONALES
Envasado y Almacenamiento Halcinónida, Ungü,ento, 4606 IDENTIFICACION Prueba A y Prueba B (agregada) IMPUREZAS Impurezas Orgánicas (agregada) REQUISITOS ADICIONALES
Envasado y Almacenamiento Acetato de Hidrocortisona, Ungüento Oftálmico, 4652 , PRUEBAS ESPECIFICAS Partículas (eliminada), Otros Requisitos (a9regada) y Llenado Mínimo (eliminada) ldoxuridma, Ungüel)to Oftálmico, 4716 PRUEBAS ESPECIFICAS
Partículas Metálicas en Ungüentos Oftálmicos (eliminada) y Otros Requisitos (agregada) lodixanol, 4788 , IDENTIFICACION
Prueba B y Procedimiento, Prueba C (eliminac:ja) VALORACION
Procedimiento IMPUREZAS
Límite de Yoduro Libre; Límite de Calcio (eliminada); Yodo Libre (eliminada), Límite de Amina Aromática Libre; Límite de Metano/, Alcohol lsopropífico y Metoxietanol (eliminada); Límite de 2-Metoxietanol (agregada); Impurezas Orgánicas; Impurezas Orgánicas, Procedimiento 2 (eliminada); Límite de Compuesto Relacionado E de lodixanol e Impureza H de lodi~anol (agregada) PRUEBAS ESPECIFICAS
Pruebas de Recuento Microbiano y Pruebas de Micro01;ganismos Específicos (eliminada) y Rotación Optica, Rotación Específica (eliminada) REQUISITOS ADICIONALES
Envasado y Almacenamiento lohexol, 4799 , IDENTIFICACION
Prueba B; Prueba de Identificación por Cromatografía en Capa Delgada, Prueba C (eliminada); y Procedimiento, Prueba D (eliminac:ja) VALORACION
Procedimiento IMPUREZAS
Límite de Compuestos fónicos; Yodo Libre (eliminada); Límite de Yoduro Libre; Impurezas Orgánicas; Límite de Metano/, Alcohol /sopropílico y Metoxietanol (eliminada); Límite de 2-Metoxietanol (agregada); Límite de 3-Cloro-1,2-Propanodiol (eliminada); Límite de 3-Cloropropano-1,2-diol (agregada); y Límit? de Amina Aromática Libre PRUEBAS ESPECIFICAS
Rotación Optica, Rotación Específica (eliminada) REQUISITOS ADICIONALES
Envasado y Almacenamiento, y Estándares de Referencia USP Ketorolaco Tromet9mina, Inyección, 4909 IDENTIFICACION Prueba A y Prueba B (agregada)
USP 39 VALORACIÓN Procedimiento IMPUREZAS Impurezas Orgánicas (agregada) REQUISITOS ADICIONALES Estándares de Referencia USP Ketorolaco Tromet9mina, Tabletas, 4911 IDENTIFICACION Prueba A,y Prueba B (agregada) VALORACION Procedimiento PRUEBAS DE DESEMPEÑO Uniformidad de Unidades de Dosificación IMPUREZAS Impurezas Orgánicas Letrozol, Tabletas, 4950 _ PRUEBAS DE DESEMPENO Disolución Clorhidrato de Lid9caína, 5008 IDENTIFICACION Absorción, en el Infrarrojo, Prueba A VALORACION Procedimiento IMPUREZAS Impurezas Orgánicas (agregada) PRUEBAS ESPECIFICAS Intervalo o Temperatura de Fusión (eliminada) REQUISITOS ADICIONALES Envasado y Almacenamiento, y Estándares de Referencia USP Loratadina, Tabletas, 5062 PRUEBAS DE DESEMPEÑO Disolución IMPUREZAS Impurezas Orgánicas Meloxicam, 5) 66 DEFINICION IDENTIFICACIÓN Prueba B, VALORACION Procedimiento IMPUREZAS Impurezas Orgánicas, Procedimiento 7 e Impurezas Orgánicas, Procedimiento 2 REQUISITOS ADICIONALES Estándares de Referencia USP Clorhidrato de ,Memantina, 5172 VALORACION Procedimiento IMPUREZAS Impurezas Orgánicas Mentol, 5181 IMPUREZAS Compuestos Relacionados Mesalamina, 5200, IDENTIFICACION Prueba B,y Prueba C (eliminada) VALORACION Procedimiento IMPUREZAS (loruros y Sulfatos, Sulfatos; Contenido de Acido 3-Aminosalicílico y Otras Impurezas Relacionadas; y Contenido de Anilina, 2-Aminofenol y 4-Aminofenol REQUISITOS ADICIONALES Estándares de Referencia USP Metocarbamol, 5294 IMPUREZAS Impurezas Orgánicas Metocarbamol, Inyección, 5295 IMPUREZAS Límite de Aldehídos Metocarbamol, Tabletas, 5296 IMPUREZAS
Lista Detallada xlv
Impurezas Orgánicas rylicofenolato de Sodio (nueva), 5340 Acido Micofenólico, Tabletas de Liberación Retardada (nueva), 5341 Montelukast Sódico, Gránulos Orales (nueva), 5413 Montelukast Sódico, Tabletas (nueva), 5415 Montelukast Sódico, Tabletas Masticables (nueva), 5417 Sulfato de Neomicina, UngQento Oftálmico, 5483 PRUEBAS DE DESEMPENO Llenado Mínim,o (eliminada) PRUEBAS ESPECIFICAS Determinación de Agua, Método I (eliminada), Partículas Metálicas en Ungüentos Oftálmicos (eliminada) y Otros Requisitos (agregada) Sulfato de Neomicina y Fosfato Sódico de Dexametasona, Cr~ma, 5485 IDENTIFICACION Prueba B, VALORACION Fosfato de Dexametasona REQUISITOS ADICIONALES Estándares de Referencia USP Sulfato de Neomicina y Fosfato Sódico de Dexametasona, SoJución Oftálmica, 5487 IDENTIFICACION Prueba B, VALORACION Fosfato de Dexametasona REQUISITOS ADICIONALES Estándares de Referencia USP Sulfato de Neomicina y Fosfato Sódico de Dexametasona, Uf)güento Oftálmico, 5488 IDENTIFICACION Prueba B, VALORACION Fosfato de Dexametasona PRUEBAS DE DESEMPEÑO Llenado Mínim,o (eliminada) PRUEBAS ESPECIFICAS Determinación de Agua, Método I (eliminada), Partículas Metálicas en Ungüentos Oftálmicos (eliminada) y Otros Requisitos (agregada) REQUISITOS ADICIONALES Estándares de Referencia USP Sulfato de Neomicina y Sulfato de Polimixina B, Ungüento Oftálmico, 5495_ PRUEBAS DE DESEMPENO Llenado Mínim,o (eliminada) PRUEBAS ESPECIFICAS Determinación de Agua, Método I (eliminada); Pruebas de Esterilidad; Partículas Metálicas en Ungüentos Oftálmicos (eliminada); y Otros Requisitos (agregada) Sulfato de Neomicina y Sulfato de Polimixina B con Dexameta~ona, Ungüento Oftálmico, 5497 VALORACION Dexametasona PRUEBAS DE DESEMPEÑO Llenado Mínim,o (eliminada) PRUEBAS ESPECIFICAS Determinación de Agua, Método lb (eliminada); Pruebas de Esterilidad; Partículas Metálicas en Ungüentos Oftálmicos (eliminada); y Otros Requisitos (agregada) Sulfato de Neomicina, Sulfato de Polimixina B y Bacitracina, Ungüento Oftálmico, 5500 PRUEBAS DE DESEMPENO Llenado Mínim,o (eliminada) PRUEBAS ESPECIFICAS Determinación de Agua, Método I (eliminada); Pruebas de Esterilidad; Partículas Me-
USP 39
xlvi Lista Detallada tálicas en Ungüentos Oftálmicos (eliminada); y Otros Requisitos (agregada) Sulfato de Neomicina, Sulfato de Polimixina B y Bacitracina Cinc, Ungüento_ Oftálmico, 5501 PRUEBAS DE DESEMPENO Llenado Mínif11o (eliminada) PRUEBAS ESPECIFICAS Determinación de Agua, Método I (eliminada); Partículas Metálicas en Ungüentos Oftálmicos (eliminada); y Otros Requisitos (agregada) REQUISITOS ADICIONALES Envasado y Almacenamiento Sulfato de Neomicina, Sulfato de Polimixina B, Bacitracina Y. Acetato de Hidrocortisona, Ungüento Oftalmico, 5508 VALORACION
Acetato de Hidrocortisona
Procedimiento IMPUREZAS
Impurezas Orgánicas (agregada) PRUEBAS ESPECIFICAS
Pruebas de Esterilidad REQUISITOS ADICIONALES
Estándares de Referencia USP Clorhidrato de Oxitetraciclina y Sulfato de Polimixina B, Ungüento Oftálmicg, 5728 PRUEBAS DE DESEMPENO Llenado Mínimo (eliminada); Partículas Metálicas en Ungüentos Oftálmicos (eliminada); Determinación de Agua, Método 1 (eliminada); y Otro~ Requisitos (agregada) PRUEBAS ESPECIFICAS
Partículas Metálicas en Ungüentos Oftálmicos (eliminada) REQUISITOS ADICIONALES
PRUEBAS DE DESEMPEÑO Llenado Mínif110 (eliminada) PRUEBAS ESPECIFICAS
Envasado y Almacenamiento
Determinación de Agua, Método I (eliminada); Pruebas de Esterilidad; Partículas Metálicas en Un9üentos Oftálmicos (eliminada); y Otros Requisitos (agregada) Sulfato de Neomicina, Sulfato de Polimixina B, Bacitracina Cinc e Hidrocortisona, Ungüento Oftálmico, 551 O , VALORACION Hidrocortisona
Paliperidona (nueva), 5743 Bromuro de Pancuronio, Inyección, 5755 IMPUREZAS
Impurezas Orgánicas REQUISITOS ADICIONALES
Envasado y Almacenamiento Paroxetina, Tabletas de Liberación Prolongada, 5777 , VALORACION
Procedimiento
PRUEBAS DE DESEMPEÑO Llenado Mínif11o (eliminada) PRUEBAS ESPECIFICAS
PRUEBAS DE DESEMPEÑO
Disolución IMPUREZAS
Determinación de Agua, Método I (eliminada); Partículas Metálicas en Ungüentos Oftálmicos (eliminada); y Otros Requisitos (agregada) Sulfato de Neomicina, Sulfato de Polimixina B, Bacitracina Cinc y Acetato de Hidrocortisona, Ungüento Oftálmico, 5511 VALORACION
Impurezas Orgánicas REQUISITOS ADICIONALES Etiquetado (agregada) y Estándares de Refe-
rencia USP Bromuro de Piridostigmina, Tabletas, 5892 IMPUREZAS Impurezas Orgánicas (agregada) REQUISITOS ADICIONALES
Envasado y Almacenamiento, y Estándares de Referencia USP
Acetato de Hidrocortisona PRUEBAS DE DESEMPEÑO Llenado Mínif110 (eliminada) PRUEBAS ESPECIFICAS
Determinación de Agua, Método I
VALORACIÓN
Propofol, Emulsión Inyectable, 6058 IMPUREZAS, ~elimi
nada); Pruebas de Esterilidad; Part1culas Metálicas en Ungüentos Oftálmicos (eliminada); y Otros Requisitos (agregada) REQUISITOS ADICIONALES
Envasado y Almacenamiento Citrato de Orfe,nadrina, Inyección, 5647 VALORACION
Procedimiento IMPUREZAS
Impurezas Orgánicas REQUISITOS ADICIONALES
Envasado y Almacenamiento, y Estándares de Referencia USP Citrato de Orfenadrina, Tabletas de Liberación Prolongada, 5~49 VALORACION
Procedimiento PRUEBAS DE DESEMPEÑO
Disolución IMPUREZAS
Impurezas Orgánicas REQUISITOS ADICIONALES
Envasado y Almacenamiento, y Estándares de Referencia USP Oxacilina Sódica, ~664 IDENTIFICACION
Absorción en el Infrarrojo, Prueba A (agregada); Prueba B; e Identificación-Pruebas Generales, Sodio, Prueba C
Límite de Acidos Grasos Libres Clorhidrato de Propoxifeno (eliminada), 6062 Clorhidrato de Propoxifeno, Cápsulas (eliminada), 6064 Clorhidrato de Propoxifeno y Acetaminofeno, Tabletas (eliminada), 6065 Clorhidrato de Propoxifeno, Aspirina y Cafeína, Cápsulas (eliminada), 6066 Napsilato de Propoxifeno (eliminada), 6068 Napsilato de Propoxifeno, Suspensión Oral (eliminada), 6069 Napsilato de Propoxifeno, Tabletas (eliminada), 6069 Napsilato de Propoxifeno y Acetaminofeno, Tabletas (eliminada), 6070 Napsilato de Propoxifeno y Aspirina, Tabletas (eliminada), 6071 Sulfato de Protaminsi, Inyección, 6081 PRUEBAS ESPECIFICAS pH (eliminada) Clorhidrato de Ral9xifeno, Tabletas, 6129 IDENTIFICACION
Absorción en el lnfrarrpjo, Prueba A PRUEBAS DE DESEMPENO
Disolución REQUISITOS ADICIONALES Etiquetado (agregada) Ritonavir, 6206 , PRUEBAS ESPECIFICAS Difracción de Rayos X (eliminada)
Lista Detallada xlvii
USP 39 Sacarina Sódica, 6~47 INTRODU,CCION DEFINICION , IDENTIFICACION Prueba C IMPUREZAS Impurezas Orgánicas, Procedimiento 7: Límite de Toluenosuff9namidas
PRUEBAS ESPECIFICAS Prueba para Sustancias Fácilmente Carbonizables; Acidez o Alcalinidad; Transparencia de la Solución, y Color de la Solución
REQUISITOS ADICIONALES Envasado
y Almacenamiento, y Etiquetado
Salicilamida, 6251 , IDENTIFICACION Prueba B,y Prueba C (eliminada)
VALORACION Procedimiento
IMPUREZAS
Prueba A,y Prueba B (agregada)
VALORACION Sulfacetamida Sódica Prednisolona
Partículas Metálicas en Ungüentos Oftálmicos
(eliminada) y Otros Requisitos (agregada) Telmisartán e Hidroclorotiazida, Tabletas, 6491 PRUEBAS DE DESEMPEÑO Disolución
REQUISITOS ADICIONALES Etiquetado (agregada) Teriparatida (nueva), 6528 Tetraciclina, 6546 , IDENTIFICACION Prueba C (eliminada) e ldentificación-Tetraciclinas, fy1étodo //, Prueba D (eliminada) VALORACION Procedimiento
IMPUREZAS
Intervalo o Temperatura de Fusión
(eliminada) REQUISITOS ADICIONALES Estándares de Referencia USP
Simvastatina, Tabl~tas, 6307 IDENTIFICACION Prueba A,y Prueba B (agregada) VALORACION
Impurezas Orgánicas
REQUISITOS ADICIONALES Estándares de Referencia USP
Clorhidrato de Tetraciclina, 6549 IDENTIFICACION Prueba B; Identificación-Pruebas Generales, Cloruros, Prueba C; Procedimiento, Prueba D (eliminada); e ldentificación-Tetraciclinas, Método IJ, Prueba E (eliminada)
Procedimiento
VALORACION
IMPUREZAS Impurezas Orgánicas (agregada)
REQUISITOS ADICIONALES
Procedimiento
IMPUREZAS Impurezas Orgánicas
Estándares de Referencia USP
Sitagliptina, Tabletas (nueva), 6312 Fosfato de Sitagliptina (nueva), 6313 Cloruro de Sod)o, Ungüento Oftálmico, 6330 VALORACION Procedimiento
PRUEBAS DE DESEMPEÑO Llenado Mínirr¡o (eliminada) PRUEBAS ESPECIFICAS
PRUEBAS ESPECIFICAS Pruebas de Esterilidad
REQUISITOS ADICIONALES Etiquetado
y Almacenamiento
Salicilato de S,adio, 6349 DEFINICION , IDENTIFICACION Identificación-Pruebas Generales, Sodio, Prueba B,y Prueba C (agregada)
VALORACION Procedimiento
IMPUREZAS Impurezas Orgánicas (agregada) REQUISITOS ADICIONALES Estándares de Referencia USP
Salicilato de Sodio, Tabletas, 6350 IDENTIFICACION Identificación-Pruebas Generales, Sodio, Prueba A,y Prueba B
VALORACION Procedimiento
IMPUREZAS Impurezas Orgánicas (agregada) REQUISITOS ADICIONALES Estándares de Referencia USP
Sulfacetamida Sódiqi, Ungüento Oftálmico, 6382 PRUEBAS ESPECIFICAS Partículas Metálicas en Ungüentos Oftálmicos
(eliminada) y Otros Requisitos (agregada) Sulfacetamida Sódica y Acetato de Prednisolona, Ungüento Oftálmis:o, 6384 IDENTIFICACION
y
Estándares de Referencia USP
Clorhidrato de ,Tetraciclina, Cápsulas, 6551 VALORACION Procedimiento
IMPUREZAS Impurezas Orgánicas
Partículas Metálicas en Ungüentos Oftálmicos
(eliminada) y Otros Requisitos (agregada) REQUISITOS ADICIONALES Envasado
de
PRUEBAS DE DESEMPEÑO Llenado Mínirr¡o (eliminada) PRUEBAS ESPECIFICAS
Impurezas Orgánicas
PRUEBAS ESPECIFICAS
y Acetato
PRUEBAS ESPECIFICAS Pérdida por Secado (eliminada) REQUISITOS ADICIONALES Estándares de Referencia USP
Clorhidrato de Tetraciclina, Ungüento Oftálmico,
6557
,
IDENTIFICACION Prueba A (agregada)_ PRUEBAS DE DESEMPENO Llenado Mínirr¡o (eliminada) PRUEBAS ESPECIFICAS Determinación de Agua, Método I (eliminada); Partículas Metálicas en Ungüentos Oftálmicos (eliminada); Otros Requisitos (agregada) REQUISITOS ADICIONALES Estándares de Referencia USP
Tiroides, 6624 IMPUREZAS Límite de Yoduros Inorgánicos
Tiroides, Tabletas, p625 IDENTIFICACION Prueba A (agregada) REQUISITOS ADICIONALES Etiquetado (agregada) Tobramicina, Ungyento Oftálmico, 6640 IDENTIFICACION Cromatografía en Cap__a Delgada, Prueba A
PRUEBAS DE DESEMPENO Llenado Mínirr¡o (eliminada) PRUEBAS ESPECIFICAS
xlviii Lista Detallada Pruebas de Esterilidad; Determinación de Agua, Método I (eliminada); Partículas Metálicas en Un9üentos Oftálmicos (eliminada); y Otros Requisitos (agregada) Tobramicina y Dexametasona, Ungüento Oftálmico, 6643 , IDENTIFICACION Cromatografía en Cap_a Delgada, Prueba A PRUEBAS DE DESEMPENO Llenado MíninJo (eliminada) PRUEBAS ESPECIFICAS Partículas Metálicas en Ungüentos Oftálmicos (eliminada); Pruebas de Esterilidad; Determinación de Agua, Método I (eliminada); y Otros Requisitos (agregada) Tolcapona, 66~5 VALORACION Procedimiento IMPUREZAS Impurezas Orgánicas PRUEBAS ESPECIFICAS Absortividad (eliminada) REQUISITOS ADICIONALES Envasado y Almacenamiento Tolcapona, Tableta>, 6656 IDENTIFICACION Absorció11 en el Infrarrojo, Prueba A VALORACION Procedimiento PRUEBAS DE DESEMPEÑO Disolución IMPUREZAS Impurezas Orgánicas REQUISITOS ADICIONALES Envasado y Almacenamiento Clorhidrato de ,Trihexifenidilo, 6736 VALORACION Procedimiento IMPUREZAS Impurezas Orgánicas PRUEBAS ESPECIFICAS Contenido de Cloruros (eliminada) y pH (agregada) REQUISITOS ADICIONALES Estándares de Referencia USP Ungüento Oftálmicq Lubricante Suave, 6769 PRUEBAS ESPECIFICAS Homogeneidad (eliminada), Partículas Metálicas en Ungüentos Oftálmicos (eliminada) y Otros Requisitos (agregada) Valina, 6785 IMPUREZAS Compuestos Relacionados REQUISITOS ADICIONALES Estándares de Referencia USP Zaleplón, 6890 IMPUREZAS Impurezas Orgánicas REQUISITOS ADICIONALES Estándares de Referencia USP
Mono9rafías (Suplementos Dietéticos) Raíz de Astrágalo (nueva), 6961 Raíz de Astrágalo en Polvo (nueva), 6964 Extracto Seco de Raíz de Astrágalo (nueva), 6966 Aceite de Semilla ge Borraja, 6985 IDENTIFICACION Identificación de Aceites Fijos por Cromatografía en Capa Delgada, Prueba B REQUISITOS ADICIONALES
USP 39 Etiquetado (agregada) y Estándares de Referencia USP (agregada) Condroitina Sulfato ,de Sodio, 7057 PRUEBAS ESPECIFICAS Límite de Disacáridos /nespecíficos Condroitina Sulfato de Sodio de Tiburón (nueva), 7062 Aceite de Semilla ge Lino, 7215 IDENTIFICACION Identificación de Aceites Fijos por Cromatografía en Capa Delgada, Prueba B (agregada) IMPUREZAS Grasas y Aceites Fijos, Trazas de Metales (eliminada) REQUISITOS ADICIONALES Etiquetado (agregada) y Estándares de Referencia USP (agregada) Aceite de Onagra,,7275 IDENTIFICACION Identificación de Aceites Fijos por Cromatografía en Capa Delgada, Prueba B REQUISITOS ADICIONALES Etiquetado (agregada) y Estándares de Referencia USP (agregada) 5-Hidroxi-L-triptófano (nueva), 7366 Vitaminas Hidrosolubles, Cápsulas, 7391 CO,NTENIDO Acido Ascórbico (eliminada); Ascorbato de Calcio (elin;iinada); Ascorbato de Sodio (eliminada); Acido Ascórbico, Ascorbato de Calcio y Ascorbato de Sodio (agregada); Biotina, Método 7; Biotina,, Método 2; Cianocobalarpina, Método 2; Acido Fálico, Método 7; Acido Fálico, Método 2; Pantotenato de Calcio, Método 7; Pantotenato de Calcio, Método 2; Pantotenato de Calcio, Método 3; Niacina o Niacinamida, Clorhidrato de Piridoxina, Riboflavina y Tia mina, Método 7; Tiamina, Método 2; Niacina o Niacinamida, Clorhidrato de Piridoxina, Riboflavina y Tiamina, Método 3 CONTAMINANTES Ausencia de Microorganismos Específicos Vitaminas Hidrosolubles, Tabletas, 7405 CO,NTENIDO Acido Ascórbico (eliminada); Ascorbato de Calcio (elin;iinada); Ascorbato de Sodio (eliminada); Acido Ascórbico, Ascorbato de Calcio y Ascorbato de Sodio (agregada) CONTAMINANTES Ausencia de Microorganismos Específicos Vitaminas Hidrosolubles con Minerales, Cápsulas, 7417 CO,NTENIDO Acido Ascórbico (eliminada); Ascorbato de Calcio (elin;iinada); Ascorbato de Sodio (eliminada); Acido Ascórbico, Ascorbato de Calcio y Ascorbato de Sodio (agregada); Biotina, Método 7; Biotina, Método 2; Cianocobalaminp, Método 7; Cianocobajamina, Método 2; Acido Fálico, Método 7; Acido Fálico, Método 2; Pantotenato de Calcio, Método 7; Pantotenato de Calcio, Método 2; Pantotenato de Calcio, Método 3; Niacina o Niacinamida, Clorhidrato de Piridoxina, Riboflavina y Tiamina, Método 7; Tiamina, Método 2; Niacina o Niacinamida, Clorhidrato de Piridoxina, Riboflavif)a y Tiamina, Método 3 PRUEBAS ESPECIFICAS Ausencia de Microorganismos Específicos Vitaminas Hidrosolubles con Minerales, Tabletas, 7448 CONTENIDO
Lista Detallada xlix
USP 39 Ácido Ascárbico (eliminada); Ascorbato de Calcio (elin:iinada); Ascorbato de Sodio (eliminada); Acido Ascárbico, Ascorbato de Calcio y Ascorbat9 de Sodio (agregada)
PRUEBAS ESPECIFICAS Ausencia de Microorganismos Específicos Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles, Cápsulas, 7515 CONTENIDO Ácido Ascórbico (eliminada); Ascorbato de Calcio (elin:iinada); Ascorbato de Sodio (eliminada); Acido Ascárbico, Ascorbato de Calcio y Ascorbato de Sodio (agregada); Biotina, Método 7; Biotina,, Método 2; Cianocobalatpina, Método 2; Acido Fálico, Método 7; Acido Fálico, Método 2; Pantotenato de Calcio, Método 7; Pantotenato de Calcio, Método 2; Pantotenato de Calcio, Método 3; Niacina o Niacinamida, Clorhidrato de Piridoxina, Riboflavina y Tia mina, Método 7; Tiamina, Método 2; Niacina o Niacinamida, Clorhidrato de Piridoxina, Ribof/avina y Tiamina, Método 3 CONTAMINANTES Ausencia de Microorganismos Específicos Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles, Solución Oral, 7535 CONTENIDO Ácido Ascárbico (eliminada); Ascorbato de Calcio (elin:iinada); Ascorbato de Sodio (eliminada); Acido Ascárbico, Ascorbato de Calcio y Ascorbato de Sodio (agregada) CONTAMINANTES Ausencia de Microorganismos Específicos Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles, Tabletas, 7545 CONTENIDO Ácido Ascárbico (eliminada); Ascorbato de Calcio (elin:iinada); Ascorbato de Sodio (eliminada); Acido Ascárbico, Ascorbato de Calcio y Ascorbato de Sodio (agregada)
CONTAMINANTES Ausencia de Microorganismos Específicos Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales, Cápsulas, 7564 CO,NTENIDO Acido Ascárbico (eliminada); Ascorbato de Calcio (elin:iinada); Ascorbato de Sodio (eliminada); Acido Ascárbico, Ascorbato de Calcio y Ascorbato de Sodio (agregada); Biotina, Método 7; Biotina, Método 2; Cianocobalaminp, Método 7; Cianocobajamina, Método 2; Acido Fálico, Método 7; Acido Fálico, Método 2; Pantotenato de Calcio, Método 7; Pantotenato de Calcio, Método 2; Pantotenato de Calcio, Método 3; Niacina o Niacinamida, Clorhidrato de Piridoxina, Riboflavina y Tiamina, Método 7; Tiamina, Método 2; Niacina o Niacinamida, Clorhidrato de Piridoxina, Riboflavina y Tiamina, Método 3 CONTAMINANTES Ausencia de Microorganismos Específicos Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales, Solución Oral, 7593 CONTENIDO Ácido Ascárbico (eliminada); Ascorbato de Calcio (elin:iinada); Ascorbato de Sodio (eliminada); Acido Ascárbico, Ascorbato de Calcio y Ascorbato de Sodio (agregada) CONTAMINANTES Ausencia de Microorganismos Específicos Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales, Tabletas, 7608 CONTENIDO Ácido Ascárbico (eliminada); Ascorbato de Calcio (elin:iinada); Ascorbato de Sodio (eliminada); Acido Ascárbico, Ascorbato de Calcio y Ascorbato de Sodio (agregada) CONTAMINANTES Ausencia de Microorganismos Específicos
USP 39
Advertencias Generales 1
Advertencias y Requisitos Generales Aplicables a las Normas, Pruebas, Valoraciones y Otras Especificaciones de la Farmacopea de los Estados Unidos
1. Título y Revisión ....................... 3
6.70. Reactivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 6.80. Equipo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
2. Estado Oficial y Reconocimiento Legal ................................... 3
7. Resultados de Pruebas ................. 9
2. H:i. Texto Oficial ........................... 3 2.20. Artículos Oficiales ....................... 3 2.30. Reconocimiento Legal .................... 3
3. Cumplimiento de las Normas ........... 4 3.1 O. Aplicabilidad de las Normas ................ 4 3.20. Indicación de Cumplimiento ................ 5
4. Monografías y Capítulos Generales ..... 5 4.1 O. Monografías ........................... 5 4.20. Capítulos Generales ...................... 5
S. Componentes de las Monografías ...... 6 5.1 O. 5.20. 5.30. 5.40. 5.50. 5.60. 5.70. 5.80.
Fórmulas Moleculares ..................... 6 Sustancias Agregadas ..................... 6 Descripción y Solubilidad .................. 6 Identidad ............................. 7 Valoración . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 Impurezas y Sustancias Extrañas ............. 7 Pruebas de Desempeño ................... 7 Estándares de Referencia USP ............... 8
6. Prácticas y Procedimientos de Prueba ................................. 8 6.1 O. Prácticas Seguras de Laboratorio ............. 8 6.20. Procedimientos Automatizados .............. 8 6.30. Métodos y Procedimientos Alternativos y Armonizados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 6.40. Con Respecto a la Sustancia Seca, Anhidra, Incinerada o Exenta de Disolventes .............. 8 6.50. Preparación de Soluciones ................. 9 6.60. Unidades Necesarias para Completar una Prueba . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
7.1 O. Interpretación de los Requisitos .............. 9 7.20. Reglas para Redondeo ................... 1O
8. Términos y Definiciones ............... 1 o 8.1 O. Abreviaturas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1O 8.20. Aproximadamente ..................... 1O 8.30. Contenido de Alcohol ................... 1O 8.40. Pesos Atómicos ....................... 1 O 8.50. Determinaciones con Blancos ............. 1 O 8.60. Concomitantemente .................... 1O 8.70. Desecador . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1O 8.80. Logaritmos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1O 8.90. Cepas Microbianas ..................... 1O 8.1 OO. Inapreciable . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1O 8.11 O. No menos de (NLT) y No más de (NMT) ..... 1 O 8.120. Olor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 8.130. Por ciento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 8.140. Concentraciones Porcentuales ............. 11 8.150. Presión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 8.160. Tiempo de Reacción .................... 11 8.170. Peso Específico ....................... 11 8.180. Temperaturas ........................ 11 8.190. Tiempo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 8.200. Transferir . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 8.21 O. Vacío . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 8.220. Desecador al Vacío ..................... 11 8.230. Agua . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 8.240. Pesos y Medidas ...................... 11
9. Prescripción y Dispensación ...........
12 9.10. Uso de Unidades Métricas ................ 12 9.20. Cambios en Volumen .................... 13
USP 39
2 Advertencias Generales
1 O. Conservación, Envasado, Almacenamiento y Etiquetado ...................
13
10.1 O. Envasado y Almacenamiento .............. 1 3 10.20. Etiquetado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3
Advertencias Generales 3
USP 39
ADVERTENCIAS Y REQUISITOS GENERALES La sección de Advertencias y Requisitos Generales (en lo sucesivo, Advertencias Generales) presenta las suposiciones básicas, definiciones y condiciones que se usan por defecto para la interpretación y aplicación de la Farmacopea de los Estados Unidos de America (USP, por sus siglas en inglés) y del Formulario Nacional (NF, por sus siglas en inglés). Los requisitos establecidos en estas Advertencias Generales se aplican a todos los artículos reconocidos en la USP y en el NF (en lo sucesivo, los "compendios") y a todos los capítu~'~ii~~,nerales, a menos que se especifique algo diferente.
2. ESTADO OFICIAL Y RECONOCIMIENTO LEGAL 2.10. Texto Oficial
!-~ 1. TÍTULO Y REVISIÓN El título completo de esta publicación (que consiste en cuatro volúmenes e incluye sus Suplementos) es: Farmacopea de los Estados Unidos de América, Trigésima Novena Revisión y Formulario Nacional, Trigésima Cuarta Edición. Estos títulos pueden abreviarse a USP 39, a NF 34, y a USP 39-NF 34. La Farmacopea de los Estados Unidos, Trigesima Novena Revisión, y el Formulario Nacional, Trigésima Cuarta Edición, reemplazan a todas las revisiones anteriores. Cuando se emplean las siglas "USP", "NP' o "USP-NP' sin ningún otro calificativo, las mismas se refieren únicamente a USP 39, NF 34, y a sus Suplementos, durante el tiempo que estos compendios estén vigentes. Los mismos títulos, sin ninguna distinción, se aplican tanto a la presentación impresa como a la electrónica de este contenido. Aunque la USP y el NF se publican en forma conjunta y comparten estas Advertencias Generales, cada uno de ellos constituye por sí mismo un compendio separado. Esta revisión es oficial a partir del 1º de mayo de 2016, a menos que se indique algo diferente mediante un texto específico. Los Suplementos de la USP y el NF se publican periódicamente.
2.20. Artículos Oficiales Un artículo oficial es un artículo reconocido en la USP o el NF. Se considera que un artículo está reconocido e incluido en un compendio cuando se publica su monografía en el compendio y se le asigna una fecha oficial a la misma en forma específica o general. El título especificado en una monografía es el título oficial para ese artículo. Los nombres que se consideren sinónimos de títulos oficiales no pueden ser utilizados para sustituir a los nombres oficiales. Los artículos oficiales incluyen tanto sustancias oficiales como productos oficiales. Una sustancia oficial es un fármaco, excipiente, ingrediente dietético u otro ingrediente, o un componente de un dispositivo terminado para el cual el título de la monografía no incluye indicación alguna sobre la naturaleza de la forma terminada. Un producto oficial es un producto farmacéutico, suplemento dietético, preparación magistral, o dispositivo terminado para el cual se provee una monografía. 2.30. Reconocimiento Legal Los compendios USP y NF están reconocidos por las legislaciones y reglamentaciones de muchos países del mundo. Las autoridades reglamentarias pueden hacer cumplir las normas presentadas en la USP y el NF; no obstante, debido a que el reconocimiento de los compendios USP y NF puede variar de país a país, se recomienda que los usuarios conozcan las legislaciones y reglamentaciones aplicables. En los Estados Unidos, de acuerdo con la Federal Food, Drug, and Cosmetic Act (Ley Federal de Alimentos, Medicamentos y Cosméticos o FDCA), tanto la USP como el NF están reconocidos como compendios oficiales. Un medicamento con un nombre reconocido en USP-NF debe cumplir con las normas farmacopeicas de identidad o se le considerará adulterado,
4 Advertencias Generales
USP 39
rotulado incorrectamente (misbranded) o ambos. Ver, p.ej., la FDCA § 501 (b) y 502(e)(3)(b); ver también las reglamentaciones de la FDA, el Título 21 del CFR § 299.5(a&b). Para evitar que se les considere adulterados, los medicamentos deben cumplir además con las normas farmacopeicas de contenido, calidad y pureza, a menos que se declaren en el etiquetado todos los aspectos en los que el medicamento difiere. Ver, p.ej., FDCA § 501 (b) y Título 21 del CFR § 299.5(c). Asimismo, para evitar que se les considere rotulados incorrectamente, los medicamentos reconocidos en los compendios USP-NF deben también envasarse y etiquetarse de conformidad con las normas farmacopeicas. Ver la FDCA § 502(g). Un suplemento dietético que declara cumplir con las especificaciones de USP se considerará como un alimento incorrectamente rotulado (misbranded food) si incumpliera con las mismas. Ver la FDCA § 403(s)(2)(D). La ejecución de las normas USP es responsabilidad de la FDA y demás autoridades gubernamentales en los EE.UU. y ciernas países. La USP no desempeña ningún papel en la ejecucion de las normas.
3. CUMPLIMIENTO DE LAS NORMAS 3.10.
a recuencia e ana isis y e muestreo se eja 1 re a as preferencias o instrucciones de aquéllos que llevan a cabo los análisis para determinar el cumplimiento con las normas y a los demás usuarios de USP-NF, incluidos fabricantes, compradores o autoridades reglamentarias. Los productos oficiales se preparan de acuerdo con los principios reconocidos de buenas prácticas de fabricación y a partir de ingredientes que cumplan con las normas de USP o NF, siempre que existan normas para dichos ingredientes (para suplementos dietéticos, ver la sección 3.10.20). Las sustancias oficiales se elaboran según principios reconocidos de buenas prácticas de fabricación con ingredientes que cumplen con las especificaciones establecidas para asegurar que las sustancias resultantes cumplan con los requisitos de las monografías oficiales. 3.10.1 O. Aplicabilidad de las Normas a Productos Farmacéuticos, Fármacos y Excipientes Las normas correspondientes de los compendios USP o NF se aplican a cualquier artículo comercializado en los Estados Unidos que (1) se reconozca en el compendio y (2) que se destine o etiquete para su uso como medicamento o como ingrediente de un medicamento. Dichos artículos (productos farmacéuticos, fármacos y excipientes) incluyen medicamentos para humanos (ya sea dispensados con receta, "de venta libre" o de otro tipo), así como medicamentos para animales. Las normas correspondientes se aplican a dichos artículos, independientemente de que se agregue o no la denominación "USP" o "NF". Las normas se aplican por igual a los artículos con títulos oficiales o nombres derivados por transposiciones de las palabras que componen los títulos oficiales, o por transposición en el orden de los nombres de dos o mas ingredientes activos en los títulos oficiales, o cuando se usen sinónimos con la intención o efecto de sugerir un grado significativo de identidad con el título o nombre oficial. 3.10.20. Aplicabilidad de las Normas a Dispositivos Médicos, Suplementos Dietéticos y a sus Componentes e Ingredientes Un artículo reconocido en la USP o el NF debe cumplir con las normas farmacopeicas si el artículo es un dispositivo médico, componente destinado para un dispositivo médico,
USP 39 suplemento dietético, ingrediente dietético, u otro ingrediente destinado para su incorporación en un suplemento dietético, y si declara en su etiquetado el cumplimiento con los compendios USP o NF. En general, los suplementos dietéticos se elaboran con ingredientes que cumplen con las normas de los compendios USP, NF, o Food Chemicals Codex. Cuando no existen tales normas, las sustancias pueden usarse en suplementos dietéticos siempre que hayan mostrado ser de grado alimenticio de calidad aceptable utilizando otros procedimientos adecuados. 3.20. Indicación de Cumplimiento Un producto farmacéutico, fármaco o excipiente puede usar la denominación "USP" o "NF" junto a su título oficial o en otra parte de la etiqueta únicamente cuando: (1) existe una monografía en el compendio especificado y (2) el artículo cumple con la identidad estipulada en el compendio correspondiente. Cuando se determina que un producto farmacéutico, fármaco, •preparación magistrat.. usn? o excipiente difiere de las normas USP o NF pertinentes de contenido, calidad, o pureza al aplicar las pruebas, procedimientos y criterios de aceptación establecidos en el compendio correspondiente, estas diferencias deben indicarse de forma clara en la etiqueta. Cuando un producto farmacéutico, fármaco, 4prEiParación magistral ... usP39 o excipiente no cumple con la identidad estipulada en los compendios USP o NF o se le ha agregado una sustancia que interfiere con las pruebas y procedimientos establecidos, se le debe asignar un nombre diferente y totalmente distinto de cualquier otro nombre reconocido en los compendios USP o NF. Un dispositivo médico, suplemento dietético o ingrediente o componente de un dispositivo médico o suplemento dietético puede usar la denominación "USP" o "NF" junto a su título oficial o en otra parte de la etiqueta, únicamente cuando: (1) existe una monografía en el compendio especificado y (2) el artículo cumple con las normas de la monografía y demás normas aplicables en el compendio correspondiente. La denominación "USP" o "NF" en la etiqueta de un artículo no debe ni puede interpretarse como un aval por parte de la USP ni tampoco debe interpretarse como una confirmación por parte de la USP de que tal artículo cumple con las normas pertinentes de la USP. La USP puede iniciar una acción legal si se declara o presenta un artículo como un artículo oficial en uno de los compendios de la USP y ésta determina que tal aseveración no fue hecha de buena fe. La denominación "USP-NF" puede usarse en la etiqueta de un artículo, siempre que dicha etiqueta también lleve una frase tal como "Cumple con las normas NF publicadas por la USP", indicando el compendio particular que corresponde aplicar. Cuando se usan las siglas "USP " "NF " o "USP-NF" en la etiqueta de un artículo para indic1ar que' el artículo cumple con las normas farmacopeicas, las siglas deben aparecer junto al título oficial del artículo. Las siglas no deberán aparecer dentro de símbolos, como por ejemplo círculos, cuadrados etc., y deberán estar en letras mayúsculas. Si un suplemento dietético no cumple con todos los requisitos farmacopeicos aplicables, pero contiene uno o más ingredientes dietéticos u otros ingredientes reconocidos en los compendios USP o NF, se puede indicar que tales ingredientes individuales cumplen con las normas USP o NF o que son de calidad USP o NF siempre y cuando la denominación se limite a los ingredientes individuales y no se insinúe que el suplemento dietético cumple con las normas en USP.
Cambio en la redacdón:
4. MONOGRAFÍAS Y CAPÍTULOS GENERALES
Advertencias Generales 5 4.1 O. Monografías Las monografías establecen el nombre, definición, especificaciones y demás requisitos relacionados con el envasado, almacenamiento y etiquetado del artículo. Las especificaciones consisten en pruebas, procedimientos y criterios de aceptación que ayudan a asegurar la identidad, contenido, calidad y pureza del artículo. Para los requisitos generales relacionados con secciones específicas de la monografía, ver la sección 5, Componentes de las Monografías. Debido a que, en ocasiones, las monografías no proporcionan normas para todas las características relevantes, algunas sustancias oficiales pueden ajustarse a las normas USP o NF, pero diferir en lo que respecta a propiedades no normalizadas que son relevantes para su uso en preparaciones específicas. Para asegurar la 4 reemplazabilidad 4 uSP39 en esos casos, se recomienda a los usuarios comprobar la equivalencia funcional o determinar tales caractensticas antes de su uso. 4.10.1 O. Aplicabilidad de los Procedimientos de Prueba •Una sola monografía puede .inclu.ir n:iás de una pr1Jel;>a, procedimiento y/o criterio de oceptádón. para· el mismo~ atti~ buto. A menos que se especifique de. otro modo en la mq~ nografía1 todas las pruebas son requisitos~ En algunos casos, las instrucciones. de la monografía permiten la seleccic;ín. de pruebas que reflejen.atributos de artículos producidos~!' diferentes fabrkantes; tales·como·distintas formas polímórfi-: cas, impurezas, hidratos y disolución. Las instrucciones. de las monografías indican las pruebas, proce.dimientqs ,y/o cri· terios de aceptación qt.Je se deben usar, y el requisJto de etiquetado correspondiente ..a.vse19 El orden en el que se presentan estas pruebas en la monografía se basa en el orden en el que fueran aprobadas por el Comité de Expertos pertinente para su inclusión en la monografía. La Prueba 1 no es necesariamente la prueba para el producto innovado.r o. para el productode r.efE~ren cia. •Dependiendo de las instrucciones de la monografía, por lo regular no se. requiere una.declaración en el etíque~ tado sí se usa la Prueba 1 ;.a.usPY 4.10.20. Criterios de Aceptación Los criterios de aceptación consideran errores analíticos y variaciones inevitables durante la fabricación y preparación magistral, así como el deterioro hasta un grado considerado aceptable en condiciones prácticas. La existencia de criterios de aceptación farmacopeicos no constituye razón para aseverar que una sustancia oficial cuya pureza se aproxima al 100 por ciento "excede" la calidad farmacopeica. De igual manera, el hecho de que un artículo se haya preparado usando criterios más estrictos que los especificados en la monografía no constituye una razón válida para aseverar que el artículo "excede" los requisitos farmacopeicos. Un producto oficial debe formularse con la intención de suministrar el 100 por ciento de la cantidad de cada ingrediente declarado en la etiqueta. Cuando debido a requisitos legales aplicables, se requiera que la cantidad mínima de una sustancia presente en un suplemento dietético sea mayor que el criterio de aceptación inferior permitido por la monografía, el criterio de aceptación superior de la monografía puede incrementarse en una cantidad correspondiente. Los criterios de aceptación especificados en las monografías individuales y en los capítulos generales para preparaciones magistrales se basan en los atributos de calidad que se espera podrían caracterizar un artículo preparado magistralmente a partir de fármacos e ingredientes a granel de acuerdo con los procedimientos establecidos o con los principios reconocidos de buenas prácticas de preparación magistral descritos en estos compendios. 4.20. Capítulos Generales A cada capítulo general se le asigna un número que aparece entre paréntesis angulares junto al título (p.ej.: Cromatografía (621 )). Los capítulos generales pueden contener lo siguiente: • Descripciones de pruebas y procedimientos para su aplicación en monografías individuales,
6 Advertencias Generales
USP 39
• Descripciones y especificaciones de condiciones y prácticas de preparacion magistral, • Información general para la interpretación de requisitos farmacopeicos, • Descripciones de prácticas generales de almacenamiento farmacéutico, dispensación y envasado, o • Guías generales para fabricantes de sustancias oficiales o productos oficiales. Cuando una monografía hace referencia a un capítulo general, los criterios de aceptación pueden presentarse después de dos puntos. Algunos capítulos pueden servir como descripciones generales introductorias de una prueba o técnicas analíticas. Además, pueden hacer referencia a otros capítulos generales que contengan técnicas, detalles de los procedimientos y, en ocasiones, criterios de aceptación.
Cambio en la redacción; 5. COMPONENTES DE LAS MONOGRAFÍAS 5.10. Fórmulas Moleculares Las fórmulas moleculares de los ingredientes activos que se usan en la definición del contenido requerido de un artículo farmacopeico tienen por objeto designar las entidades químicas, tal como aparecen en el nombre químico completo del artículo, con una pureza absoluta (100 por ciento). 5.20. Sustancias Agregadas
Las sustancias agregadas se presumen inadecuadas para su inclusión en un artículo oficial y por lo tanto quedan prohibidas, si ""•usP39 su presencia afecta negativamente la biodisponibilidad, la eficacia terapéutica o la seguridad del artículo oficial; o "'•us?19 interfieren con las pruebas o valoraciones prescritas para determinar el cumplimiento de las normas farmacopeicas •(ver 3.2() Indicación de Cumplí, miento),1>.usm. El aire contenido en el envase de un artículo oficial puede extraerse o reemplazarse por dióxido de carbono, helio, argón o nitrógeno, o una mezcla de estos gases, siempre que sea apropiado. No es necesario declarar en el etiquetado el uso de alguno de dichos gases. 5.20.1 O. Sustancias Agregadas •1.usP:~, en Sustancias Oficiales
Las sustancias oficiales pueden contener únicamente las agregadas específjcas pe~mitidas por la n;onograf1a 1nd1v1duaL •Tales sustancias agreg¡:¡das .no debetan exceder la cantidad requerida para lograr el. e(ec;:to. deseado ....:usi>39 Si se permite tal adición, la etiqueta debe indicar los nombres y las cantidades de las sustancias agregadas. s,us~an~i~s
5.20.20. Sustancias Agregadas ,.t.:(Ex~lpiii!ntes lngr:edientes)1.usPJJ1 en Productos Oficiales
e
A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, pueden agregarse sustancias y excipientes adecuados tales como agentes antimicrobianos, bases farmacéuticas, transportadores, recubrimientos, saborizantes, conservantes, estabilizantes y vehículos a un producto oficial para mejorar su estabilidad, utilidad o apariencia, o para facilitar su preparación. Se pueden emplear excipientes y sustancias agregadas exclusivamente para impartir color a los productos oficiales, excepto para aquéllos destinados a la administración parenteral u oftálmica, siempre que cumplan con las reglamentaciones de la FDA para el uso de coíorantes y que sean adecuadas en todos los otros aspectos. (Ver también Sustancias Agregadas en Medicamentos Inyectables y en Implantes (1 )). En la preparación de ungüentos y supositorios, se pueden variar las proporciones de las sustancias que constituyen la base para mantener la consistencia adecuada en diferentes condiciones climáticas, siempre que no se varíe la concentración de los ingredientes activos y que no se afecte la biodisponibilidad, la eficacia terapeutica o la seguridad de la preparación.
5.20.20.1. En Preparaciones Magistrales
Las preparaciones magistrales para las que se proporciona una composición completa deben contener únicamente los ingredientes indicados en las fórmulas, a menos que se exceptúe específicamente en este documento o en la monografía individual. Se pueden presentar desviaciones en los procesos especificados o en los métodos de preparación magistral, pero no en sus ingredientes o proporciones, siempre que la preparación final cumpla con las normas pertinentes y se prepare siguiendo el proceso especificado. Cuando la monografía de una preparación magistral exige una cantidad de un ingrediente expresada con respecto a la sustancia seca, no es necesario secar el ingrediente antes de utilizarlo, siempre que se tome debida cuenta del agua u otras sustancias volátiles presentes en la cantidad utilizada. Existen formulaciones de alcohol especialmente desnaturalizado que se usan de acuerdo con los estatutos y reglamentaciones federales de la Interna! Revenue Service, (IRS, por sus siglas en inglés, Oficina de Recaudación de Impuestos del Gobierno de los Estados Unidos). Una formulación apropiada de alcohol especialmente desnaturalizado puede sustituir al Alcohol en la fabricación de preparaciones farmacopeicas destinadas para uso interno o para uso tópico, siempre que el desnaturalizante sea volátil y no quede en el producto terminado. Un producto terminado destinado a aplicación tópica sobre la piel puede contener alcohol especialmente desnaturalizado, siempre que el desnaturalizante sea un ingrediente normal en la preparación o una sustancia agregada permitida; en ambos casos, el desnaturalizante se debe identificar en la etiqueta de la preparación tópica. Cuando se indique un proceso en la monografía individual, toda preparación elaborada magistralmente con alcohol desnaturalizado debe ser idéntica a la que se obtiene mediante el proceso indicado. 5.20.20.2. En Suplementos Dietéticos
Pueden agregarse ingredientes adicionales a los productos de suplementos dietéticos siempre que tales ingredientes: (1) cumplan con los requisitos reglamentarios aplicables y (2) no interfieran con las valoraciones y las pruebas prescritas para determinar el cumplimiento de las normas farmacopeicas. 5.30. Descripción y Solubilidad Una prueba cuantitativa de solubilidad se considerará como una prueba de pureza, únicamente cuando se describe y designa como tal en una monografía. Una monografía puede incluir información relacionada con la descripción del artículo. La información de "descripción y solubilidad" correspondiente a un artículo también aparece en la tabla de referencia Descripción y Solubilidad Relativa de Artículos de la USP y del NF. La tabla de referencia indica sólo las propiedades de los artículos que cumplen con las normas de la monografía. La tabla de referencia está destinada principalmente para aquéllos que usan, elaboran y dispensan fármacos y/o artículos relacionados. Aunque la información proporcionada en las monografías y la información en la tabla de referencia puede ayudar indirectamente a la evaluación preliminar de un artículo, dicha información no constituye en sí misma una norma o prueba de pureza. La solubilidad aproximada de una sustancia farmacopeica se indica mediante uno de los siguientes términos descriptivos:
Término Descrintivo Muv soluble Fácilmente soluble Soluble Moderadamente soluble Poco soluble
Partes de Disolvente Requeridas para 1 Parte de Soluto Menos de 1 De 1a10 De 10 a 30 De 30 a 100 De 100 a 1000
Advertencias Generales 7
USP 39
Término Descrintivo Muv noca soluble Prácticamente insoluble o Insoluble
Partes de Disolvente Requeridas para 1 Parte de Soluto De 1000 a 1 O 000 Mayor que o igual a 10000
5.40. Identidad
La prueba farmacopeica bajo el título Identidad o Identificación se proporciona como una ayuda para verificar la identidad de los artículos según se indica, p.ej., en la etiqueta de sus envases, y para establecer si se trata del artículo nombrado en USP-NF. La prueba de Identidad o Identificación para un artículo en particular puede comprender uno o más procedimientos. Cuando se lleva a cabo una prueba farmacopeica de Identidad o Identificación, se deben cumplir todos los requisitos de todos los procedimientos especificados para satisfacer los requisitos de la prueba. El incumplimiento de un artículo con los requisitos de una prueba de Identidad o Identificación prescrita (es decir, que no cumpla con los requisitos de todos los procedimientos especificados que componen dicha prueba) indica que el artículo está rotulado incorrectamente y/o adulterado. 5.50. Valoración
Las pr~ebas de va_loración para preparaciones ma_gistrales no han sido concebidas para evaluar una preparacion magistral antes de su dispensación, sino como pruebas oficiales para casos en los que exista duda o controversia acerca de la conformidad de la preparación con las normas oficiales. 5.50.10. Unidades de Potencia (Biológica)
Para las sustancias que no pueden ser caracterizadas completamente por medios químicos •o físicos, o que requieren la confirmación de la funcionalidad o de una estructura terciaria, puede ser necesario expresar las cantidades de ádividad biológica en unidades de potencia biológica, definidas por un estándar de referencia designado como patrón ofi· cial. Para casos en los que los materiales de referencia se han discontinuado, las unidades internacionales de potencia pueden definirse en términos de masa molecular, como el caso de las vitaminas A, D y E. Cuando se encuentran disponibles, los Estándares Biológicos Internacionales de la Organización Mundial de la Salud (OMS) definen las Unidades Internacionales (UI). Las monografías de la USP hacen referencia a las unidades asígnada,s por tos Estándares de Referencia USP directamente c<;>mo Unidades Internacionales (UI) o como "Unidades USP". Para ah:)UnOS productos biológicos, las unidades de potencia. asignan en comparación con el correspondiente Estáriqar de los Estados Unidos de América (U.S. Standard) establecido po~ la FDA (ver Pr?ductos Bíoló9ícos {1041)), ~x~stan o no Unidades Internacionales o Unrdades USP def1n1das. Se ·.debe tener en cuenta que para el etiquetado relacionado con el producto, P..ej., en envases, no se requiere utilizar la frase completa / Unidades USP [nombre del producto]" que aparece en muchas monografías de la USP en la . seccion de etiquetado. El término "Unidades USP" se puede utilizafen el etiquetado del producto de conformidad con los requisitos farmacopeicos de la USP, siempre y cuando sea cl(!rp {! partir del contexto que el volumen se declara en términos de Unidades USP [nombre del producto]. En dichos casos; debe ser claro que "Unidades USP" y "Unidades USP [nombre del producto]" comparten el mismo significado ....uspj9
en
se
5.60. Impurezas y Sustancias Extrañas
Las pruebas para determinar la presencia de sustancias extrañas e impurezas se establecen para limitarlas a cantidades que no sean objetables en las condiciones normales de empleo del artículo (ver también Impurezas en Fármacos y Productos Farmacéuticos (1 086)). Además de las pruebas prescritas en la monografía individual, se deben aplicar otras pruebas y criterios de aceptación adecuados para detectar y controlar impurezas que pudieran resultar de cambios en los métodos de procesamiento o que provengan de fuentes externas, cuando su presencia no concuerde con las buenas prácticas
de fabricación o las buenas prácticas farmacéuticas aplicables. 5.60.10. Otras Impurezas en los Artículos de la USP y el NF Cuando una monografía de los compendios USP o NF incluye una valoración o prueba de impurezas orgánicas cromatográfica, diferente de una prueba de disolventes residuales, y el procedimiento de la monografía no detecta una impureza presente en la sustancia, se deben expresar la cantidad e identidad de la impureza, si fueran ambas conocidas, bajo el encabezado Otra(s) lmpureza(s) en el etiquetado (certificado de análisis) de la sustancia oficial. La presencia en una sustancia oficial de cualquier impureza no declarada en el etiquetado constituye una desviación de la norma si el contenido es de O, 1 % o mayor. La suma de las Otras Impurezas combinada con las impurezas detectadas por los métodos de la monografía no puede exceder del 2,0% (ver Impurezas Comunes (466)), a menos que en la monografía se indique algo diferente. Las siguientes categorías de fármacos quedan excluidos de los requisitos de Otras Impurezas: • productos de fermentación y derivados semisintéticos obtenidos a partir de ellos, • radiofármacos, • productos biológicos, • productos obtenidos por biotecnología, • péptidos, • productos botánicos y • productos crudos de origen animal o vegetal. No debe incluirse ninguna sustancia conocida como tóxica en Otras Impurezas. 5.60.20. Disolventes Residuales en los Artículos de la USP y el NF Todos los artículos de los compendios USP y NF están sujetos al control pertinente de disolventes residuales, incluso cuando la prueba no esté indicada en la monografía individual. Los disolventes que se empleen durante los procesos de fabricación deben ser de calidad adecuada. Asimismo, se debe tomar en consideración la toxicidad y el nivel residual de cada disolvente y limitar los disolventes conforme a los principios definidos y los requisitos especificados en Disolventes Residuales (467), según los métodos generales indicados en dicho capítulo u otros métodos adecuados. 5.60.30 Impurezas Elementales en Medicamentos y Su¡>lemer:itos '?ietéticC!s USP
Con vigencia a partir qel 1 de enero de 2018, se controlarán las impurezas elementales en los medicamentos ofidac les de_ ~cuerdo con·los principios definidos y los requisitos espec1t1Cados en Impurezas Elemental~s-límites {232). Con vigencia a partir del 1 de enero .de 2018, se controlarán los contaminantes elementales en los suplementos dietéticos oficiales de acuerdo con los prindpios definidos y los requi· sitos especificados en Contaminantes Elementa~s .en Suplementos Dietéticos (2232). También, coh vigencia a partir del 1 de enero de 2018, el capítulo Metales Pesados {231) será eliminado, así como todas las. referencias a dicho capítulo gue se encuentren en 1os capítulos. generales y las monograf1as. La USP permitirá la adopción temprana de los requisitos de los capítulos {232) y {2232). Además, si el capítulo (232) o el (2232/, según corresponda, se implementan por comp!et9 ~n lo ql;Je respecta a un medicamento o suplemento d1etet1co particular antes del 1 de enero de 2018, dicho producto y sus ingredientes ya no necesitarán cumplir con los requisitos aplicables del capítulo {231) para ser considerados por la USP en cumplimiento con los requisitos de USP-NF.•
(BR Ol-abt-2015)
5.70. Pruebas de Desempeño
Cuando las determinaciones de uniformidad de contenido se hayan efectuado usando la misma metodología analítica e~pecifi~ada en la Valorac(~n, tomando debida cuenta de las d1ferenc1as en la preparac1on de la muestra, el promedio de todas las determinaciones individuales de uniformidad de contenido puede usarse como el resultado de la Valoración.
8 Advertencias Generales 5.80. Estándares de Referencia USP Los Estándares de Referencia USP son materiales auténticos que han sido aprobados como adecuados para su uso como estándares de comparación en las pruebas y valoraciones de la USP o el NF. (Ver Estándares de Referencia USP (11 )). Cuando una rrueba o valoración de los compendios USP o NF indique e uso de un Estándar de Referencia USP, sólo se considerarán concluyentes los resultados obtenidos usando el Estándar de Referencia USP especificado. Cuando un procedimiento exija el uso de un artículo oficial y no de un Estándar de Referencia USP como material de referencia, se debe utilizar una sustancia que satisfaga todos los requerimientos indicados para dicho artículo en la monografía oficial. Si alguna norma nueva de la USP o del NF requiere el uso de un Estándar de Referencia USP nuevo que aún no esté disponible, dicha parte de la norma que contiene el requisito no será oficial hasta que el material de referencia USP especificado esté disponible. Salvo que la etiqueta del estándar de referencia indique una potencia o contenido específicos, se asume que el estándar de referencia tiene una pureza del 100,0% para la ªflicación oficial. A menos que se indique algo diferente en e procedimiento de la monografía individual o en un capítulo general, los Estándares de Referencia USP deben usarse de acuerdo con las instrucciones de sus etiquetas. Cqmbio en la redacción:
6. PRÁCTICAS Y PROCEDIMIENTOS DE PRUEBA 6.1 O. Prácticas Seguras de Laboratorio Al realizar procedimientos farmacopeicos, se deben seguir prácticas seguras de laboratorio, las cuales incluyen medidas precautorias, equipo de protección y prácticas de trabajo acordes a las sustancias químicas y procedimientos usados. Antes de realizar cualquier procedimiento descrito en los compendios, el analista debería conocer los peligros asociados con las sustancias químicas y las técnicas y medios de protección contra dichos riesgos. Estos compendios no tienen como objetivo describir tales peligros o medidas de protección. 6.20. Procedimientos Automatizados Los procedimientos automatizados y manuales que emplean los mismos fundamentos químicos se consideran equivalentes. 6.30. Métodos y Procedimientos Alternativos y Armonizados Se pueden usar métodos y/o procedimientos alternativos que proporcionen alguna ventaja en cuanto a exactitud, sensibilidad, precisión, selectividad o adaptabilidad a la automatización o a la reducción de datos computarizados o en otras circunstancias especiales. Dichos métodos y procedimientos alternativos se deben validar según se describe en el capítulo general Validación de Procedimientos Farmacopeicos (1225) y se debe demostrar que proporcionan resultados equivalentes o mejores. Solamente aquellos resultados obtenidos por los métodos y procedimientos suministrados en los compendios serán concluyentes. Se recomienda remitir a la USP los procedimientos alternativos para su evaluación como reemplazos potenciales o para agre$Jarlos a las normas (ver la sección 4. 7O, Monograf1as). En ciertos capítulos generales se indica que el texto en cuestión está armonizado con el texto correspondiente de la Farmacopea Europea y/o la Farmacopea japonesa y que estos textos son intercambiables. Por ello, si el cumplimiento de un requisito de una sustancia o preparación fuera determinado usando un método intercambiable de una de estas farmacopeas, también debería cumplir los requisitos de la USP. Sin embargo, si apareciera una diferencia, o en el caso de controversia, sólo el resultado obtenido mediante el procedimiento y/o método dado en la USP será concluyente. 6.40. Con Respecto a la Sustancia Seca, Anhidra, Incinerada o Exenta de Disolventes
USP 39 A menos que se especifique algo diferente, todos los cálculos se efectúan con respecto a la sustancia "tal como se encuentra". Se pueden realizar los procedimientos de las pruebas sobre la sustancia sin secar o sin incinerar y calcular los resultados con respecto a la sustancia seca, anhidra o incinerada siempre que la monografía indique una prueba para Pérdida por Secado, Determinación de Agua o Pérdida por Incineración, respectivamente. Cuando la presencia de humedad u otro material volátil puede interferir con el procedimiento, la monografía individual especifica que es necesario secar la sustancia con anterioridad, paso que es obligatorio. La expresión "exenta de disolventes" significa que se deben corregir los cálculos por la presencia de disolventes conocidos, según se determinan usando los métodos descritos en Disolventes Residuales (467), a menos que la monografía proporcione una prueba de límite de disolventes residuales. La expresión "previamente secada(o)" sin otro calificativo si9nifica que la sustancia se debe secar según se indica en Perdida por Secado (731) o Determinación de Agua (921) (determinación gravimétrica). Cuando se indique secar al vacío sobre un desecante, se debe utilizar un desecador al vacío, una pistola para secado al vacío u otro instrumento apropiado para secado al vacío. 6.40.1 O. Incinerar hasta Peso Constante "Incinerar hasta peso constante" significa que deberá continuarse la incineración a 800 ± 25º, a menos que se indique algo diferente, hasta que dos pesadas consecutivas, la segunda de las cuales se realiza después de un periodo adicional acorde con la naturaleza y cantidad del residuo, no difieran en más de 0,50 mg por g de sustancia tomada. 6.40.20. Secado hasta Peso Constante "Secado hasta peso constante" significa que deberá continuarse el secado hasta que dos pesadas consecutivas, la segunda de las cuales se realiza después de un periodo adicional de secado acorde con la naturaleza y cantidad del residuo, no difieran en más de 0,50 mg por g de sustancia tomada. 6.50. Preparación de Soluciones 6.50.10. Filtración Cuando en un procedimiento se indica "filtrar" sin otro calificativo, el líquido se debe pasar a través de un papel de filtro adecuado o dispositivo equivalente hasta que el filtrado sea transparente. Dados fos posibles efectos del filtro, se pueden desechar los volúmenes iniciales del filtrado. 6.50.20. Soluciones A menos que se especifique de otro modo, todas las soluciones deben prepararse con Agua Purificada. Las soluciones para mediciones cuantitativas deben prepararse usando analitos medidos o pesados con exactitud (ver la sección 8.20, Aproximadamente). Una expresión tal como "(l en 1 O)" significa que 1 parte en volumen de un líquido debe diluirse con, o que 1 parte en peso de un sólido debe disolverse en, una cantidad suficiente de diluyente o disolvente para que el volumen de la solución final sea de 1 O partes medidas en volumen. Expresiones similares a "(20:5:2)" significan que los números respectivos de partes, medidas en volumen, de los líquidos señalados deben mezclarse, a menos que se indique algo diferente. 6.50.20.1. Ajuste de Soluciones Cuando un procedimiento exige una concentración específica, se puede usar una solución con otra normalidad o molaridad, siempre que se tenga en cuenta la diferencia en la concentración y no se aumente el error de la medición. En las pruebas y valoraciones se pueden tomar cantidades proporcionalmente mayores o menores que los especificados de las sustancias a analizar y los correspondientes Estándares de Referencia, siempre y cuando las mediciones resulten con una exactitud equivalente o mejor. A menos que se indique algo diferente, las concentraciones de analitos deben prepararse de modo que queden dentro del diez por ciento (10%) del valor indicado. En el caso
USP 39 "'.a.usm de que un procedimiento se adapte al intervalo de trabajo de un instrumento, las concentraciones de las soluciones pueden diferir del valor indicado en más de diez por ciento (10%), realizando los cambios apropiados en los cálculos asociados. Todo cambio realizado debe quedar dentro del intervalo validado del instrumento. Cuando se indica el ajuste del pH mediante un ácido o base y no se indica la concentración, se pueden usar concentraciones apropiadas de dicho ácido o base. 6.50.20.2. Soluciones Reactivo La información acerca de las Soluciones Reactivo (SR) se encuentra en el apartado Soluciones Reactivo en la sección Reactivos, Indicadores y Soluciones de los compendios USP-NF. El uso de una Solución Reactivo alternativa o cambios en la Solución Reactivo utilizada puede requerir de validación. 6.50.20.3. Soluciones Indicadoras Cuando se especifica el uso de una SR indicadora en un procedimiento, se deben agregar aproximadamente 0,2 mL ó 3 gotas de dicha solución, a menos que se indique algo diferente. 6.60. Unidades Necesarias para Completar una Prueba A menos que se especifique algo diferente, se debe tomar un número suficiente de unidades para asegurar un resultado analítico adecuado. 6.60.1 O. Tabletas Cuando en el procedimiento de una monografía de Tabletas se indica pesar y reducir a polvo fino no menos de un cierto número de Tabletas, se entiende que se debe pesar y reducir a polvo un número contado de Tabletas. La porción tomada de Tabletas reducidas a polvo debe ser representativa del total de Tabletas y pesada con exactitud. 6.60.20. Cápsulas Cuando en el procedimiento de una monografía de Cápsulas se indique vaciar, tan completamente como sea posible, el contenido de no menos de cierto número de Cápsulas, se entiende que se debe abrir cuidadosamente un número contado de Cápsulas y se debe retirar cuantitativamente, combinar, mezclar y pesar con exactitud el contenido de las mismas. La porción tomada del contenido de las Cápsulas debe ser representativo del contenido total de las Cápsulas y pesado con exactitud. 6.70. Reactivos La ejecución adecuada de las pruebas y valoraciones farmacopeicas y la confiabilidad de los resultados dependen, en parte, de la calidad de los reactivos utilizados en estos procedimientos. A menos que se especifique algo diferente, se deben usar reactivos que cumplan con lo establecido en las especificaciones de la edición vigente de Reagent Chemicals publicada por la American Chemical Society (ACS). Cuando tales especificaciones no existan o cuando por distintas razones la pureza requerida de un reactivo fuera diferente, se suministran especificaciones farmacopeicas de reactivos de calidad aceptable (ver la sección Reactivos, Indicadores y Soluciones en USP-NF). Los reactivos no tratados por ninguna de estas especificaciones deben ser de grado adecuado para la realización del método de valoración o prueba en cuestión. La inclusión en los compendios de estos reactivos, indicadores y soluciones empleadas como reactivos, no implica que tales sustancias tengan utilidad terapéutica. Cualquier referencia a la USP o el NF en sus etiquetados debe incluir también el término "reactivo" o "grado reactivo". La USP puede proveer reactivos en caso de que no se encuentren comercialmente disponibles. 6.80. Equipo A menos que se indique algo diferente, la especificación de un tamaño o tipo definido de recipiente o de aparato es sólo una recomendación. Es posible usar otras dimensiones o tipos siempre que sean adecuados para el uso pretendido. 6.80.10. Aparatos de Medición Cuando se indique el uso de matraces volumétricos u otros dispositivos para medir, pesar o clasificar en forma
Advertencias Generales 9
exacta, se deben emplear estos equipos u otros que posean, al menos, una exactitud equivalente. 6.80.10.1. Pipeta Cuando se especifica el uso de una pipeta, ésta se puede sustituir por una bureta adecuada. Cuando se indica el uso de una pipeta calibrada "para contener", ésta se puede sustituir por un matraz volumétrico adecuado. 6.80.10.2. Protección contra la Luz Cuando se indique el uso de recipientes con protección actínica o resistentes a la luz, se pueden utilizar recipientes especialmente tratados para proteger el contenido contra la luz, o recipientes transparentes que se hayan recubierto o envuelto adecuadamente para volverlos opacos. 6.80.20. Instrumentos Es posible sustituir el instrumento especificado por otro instrumento siempre que el instrumento sustituto se base en los mismos principios fundamentales de operación y tenga una sensibilidad y exactitud equivalente o mayor; tales características se deben calificar como apropiadas. Si se mencionara una marca o un proveedor de un material, un instrumento o una pieza de equipo, o el nombre y la dirección de un fabricante o distribuidor (por lo general pueden aparecer como notas al pie de página), esta información se brinda sólo por conveniencia y no implica aprobación, aval o certificacion. 6.80.20.1. Columnas y Tubos Cromatográficos El término "diámetro" se refiere al diámetro interno (DI). 6.80.20.2. Otros Tipos de Tubos y Tuberías El término "diámetro" se refiere al diámetro externo (DE). 6.80.20.3. Baño de Vapor Cuando se indique e uso de un baño de vapor, se usa vapor vivo fluente u otra fuente de calor regulado a una temperatura equivalente. 6.80.20.4. Baño de Agua A menos que se especifique algo diferente, un baño de agua requiere agua en ebullición vigorosa. 6.80.30. Dispositivos de Medición de Temperatura Los dispositivos de medición de temperatura adecuados para las pruebas Farmacopeicas cumplen con especificaciones que son rastreables a un estándar del National lnstitue of Standards and Technology (Instituto Nacional de Normas y Tecnología de los EE.UU. o NIST) o equivalente. Los dispositivos de medición de temperatura pueden ser del tipo liquido en vidrio o un tipo de indicador de temperatura análogo o digital, tal como un dispositivo de temperatura con resistencia, termistor o termopar. La estandarización de termómetros se lleva a cabo en una frecuencia de análisis establecida con una temperatura estándar rastreable al NIST. Por ejemplo, se puede consultar la edición vigente de las normas El de la American Society of Testing of Materials (Sociedad Estadounidense para el Análisis de Materiales o ASTM) para termómetros de líquido en vidrio. 7. RESULTADOS DE PRUEBAS 7.10. Interpretación de los Requisitos Los resultados analíticos observados en el laboratorio (o los calculados a través de determinaciones experimentales) se comparan con los criterios de aceptación especificados para determinar si el artículo cumple con los requisitos farmacopeicos. El valor de informe, que por lo general se obtiene combinando valores de varias determinaciones individuales, se compara con los criterios de aceptación. El valor de informe es el resultado final de un procedimiento completo de medición, según se ha documentado. Cuando los criterios de aceptación se expresan de forma numérica en estas Advertencias Generales mediante la especificación de un límite superior y/o inferior, los valores permitidos incluyen a los valores especificados, pero no los valores fuera del límite o límites. Los criterios de aceptación se consideran significativos hasta el último dígito señalado.
1 O Advertencias Generales
USP 39
7.10.5. Concentraciones Nominales en Ecuaciones
caciones de los capítulos generales Aparatos Volumétricos
Cuando se especifica una "concentración nominal", calcular la concentración basándose en la cantidad declarada en la etiqueta. En los procedimientos de valoración, la corrección por contenido de agua típicamente se indica en la Definición y en la etiqueta del Estándar de Referencia USP. Para otros procedimientos, la corrección por contenido y/o potencia valorados se realiza antes de usar la concentracion en la ecuación provista en la monografía. 7.10.10. Equivalencia en Procedimientos Volumétricos Las instrucciones de los procedimientos volumétricos concluyen con una declaración de equivalencia entre el peso del analito y cada mL de solución volumétrica normalizada. En tales equivalencias, se entenderá que el número de cifras significativas en la concentración de la solución volumétrica corresponde al del número de cifras significativas en el peso del analito. Siempre que corresponda, se deben hacer correcciones en todas las valoraciones volumétricas basándose en la determinación con un blanco (ver Volumetría (541 )). 7.20. Reglas para Redondeo Los valores observados o calculados deben redondearse al mismo número de decimales que el expresado para el límite. No deberá efectuarse el redondeo antes de concluir los cálculos correspondientes para obtener el valor de informe. Los cálculos intermedios (p.ej., la pendiente de la curva de linealidad) pueden redondearse para propósitos de informe, pero si se requiere realizar cálculos adicionales se deben utilizar los valores originales sin redondear. Los criterios de aceptación son números fijos y no se redondean. Cuando se requiere redondear una cifra, se considera solamente el dígito que se encuentra a la derecha del último lugar decimal en la expresión del límite. Si este dígito es menor de 5, se elimina sin cambiar el dígito que lo precede. Si este dígito es igual o mayor a 5, se elimina y el d1gito que lo precede se aumenta en 1 .
(31) y Balanzas (41 ), respectivamente. 8.30. Contenido de Alcohol
Cambio en la redacción: 8. TÉRMINOS Y DEFINICIONES
8.1 O. Abreviaturas • ER corresponde a un Estándar de Referencia USP. • SC corresponde a una Solución Colorimétrica. • SR corresponde a una Solución Reactivo. • SV corresponde a una Solución Volumétrica estandarizada de conformidad con las instrucciones provistas en la monografía individual o en la sección Reactivos, Indicadores y Soluciones de USP-NF. 8.20. Aproximadamente El término "aproximadamente" indica una cantidad que puede variar dentro del 1 0%. Si se especifica una medición como "medida con exactitud" o "pesada con exactitud" se deben seguir las especifi-
Reouisito Farmacooeico Límite de valoración 298,0%
Límite de valoración Sl 01,5%
Prueba de límite S0,02%
Prueba de límite S3 ppm
Los porcentajes de alcohol, como los indicados en Contenido de Alcohol, son porcentajes en volumen de C2HsOH a 15,56º. Cuando se exige el uso de alcohol, alcohol etílico o etanol en una fórmula, prueba o valoración, se debe usar el artículo de la monograf1a Alcohol de la USP. Cuando se hace referencia a "C2HsOH", significa etanol absoluto (100 por ciento). Cuando un procedimiento exige alcohol deshidratado, alcohol absoluto o alcohol anhidro, se debe usar el artículo de la monografía Alcohol Deshidratado de la USP. 8.40. Pesos Atómicos Los pesos atómicos usados para calcular pesos moleculares y los factores en las valoraciones y en otras partes donde éstos aparezcan, son los establecidos por la Commission on Atomic Weights and lsotopic Abundances de la IUPAC (Comisión de Pesos Atómicos y Abundancias Isotópicas de la Unión Internacional de Química Pura y Aplicada). 8.50. Determinaciones con Blancos Cuando se indique realizar "cualquier corrección necesaria" por medio de una determinacion con un blanco, tal determinación debe efectuarse usando las mismas cantidades de los mismos reactivos tratados de la misma manera que la solución o mezcla que contiene la porción de sustancia en análisis, pero omitiendo dicha sustancia. 8.60. Concomitantemente El término "concomitantemente" indica que las determinaciones o mediciones deben efectuarse en sucesión inmediata. 8.70. Desecador La instrucción "en un desecador" indica el uso de un recipiente cerrado herméticamente, de tamaño y diseño adecuados, que mantiene una atmósfera de bajo contenido de humedad mediante un desecante adecuado, por ejemplo, cloruro de calcio anhidro, perclorato de magnesio, pentóxido de fósforo o gel de sílice. Ver también la seccion 8.220, Desecador al Vacío. 8.80. Logaritmos Los logaritmos empleados son logaritmos en base 1 O. 8.90. Cepas Microbianas Cuando se cita e identifica una cepa microbiana por el número de catálogo de la American Type Culture Collection (Colección Estadounidense de Cultivos de Referencia o ATCC), la cepa específica debe emplearse directamente o, si se hacen cultivos sucesivos, no deben usarse más de cinco pasajes a partir de la cepa original. 8.100. Inapreciable El término "inapreciable" indica una cantidad que no excede de 0,50 mg. 8.110. No menos de (NLT) y No más de (NMT) Las siglas en inglés "NLT" (not less than) significan y se traducen como "no menos de". Las siglas en inglés "NMT"
Ejemplos de Redondeo de Valores Numéricos oara Comnaración con los Reouisitos Valor Sin Redondear Resultado Redondeado 97,96% 98,0% 97,92% 97,9% 97 95% 98 0% 101,55% 101,6% 101,46% 101,5% 10145% 101 5% 0,025% 0,03% 0,015% 0,02% o 027% 003% 3,5 ppm 4 ppm 3,4 ppm 3 ppm 2,5 ppm 3 ppm
Cumnle Sí No Sí No Sí Sí No Sí No No Sí Sí
Advertencias Generales 11
USP 39 (not more than) significan y se traducen como "no más de". 8.120. Olor Los términos "inodoro," "prácticamente inodoro," "con un débil olor característico" y expresiones semejantes, indican la evaluación de una cantidad adecuada de material recientemente abierto después de la exposición al aire durante 15 minutos. La asignacion de un olor es sólo descriptiva y no deberá considerarse como una norma de pureza para un lote particular de un artículo. 8.130. Por ciento La expresión "por ciento" usada sin otros calificativos significa: • Porc.e~t.aje peso en peso, para mezclas de sólidos y sem1sohdos; • Porcentaje peso en volumen, para soluciones o suspensiones de sólidos en líquidos; • Porcentaje volumen en volumen, para soluciones de líquidos en líquidos; y • Porcentaje peso en volumen, para soluciones de gases en líquidos. Por ejemplo, una solución al 1 por ciento se prepara disolviendo 1 g de un sólido o semisólido, o 1 mL de un líquido, en disolvente suficiente para obtener 100 mL de solución. 8.140. Concentraciones Porcentuales Las concentraciones porcentuales se expresan según se indica a continuación: • Porcentaje Peso en Peso (p/p) se define como el número de g de un soluto en 100 g de solución. • Porcentaje Peso en Volumen (p/v) se define como el número de g de un soluto en 100 mL de solución. • Porcentaje Volumen en Volumen (v/v) se define como el número de mL de un soluto en 100 mL de solución. 8.150. Presión La presión se determina usando un manómetro o barón:etro adecuado, calibrado en términos de la presión ejercida por una columna de mercurio de la altura indicada. 8.160. Tiempo de Reacción El tiempo de reacción es de 5 minutos a menos que se especifique algo diferente. 8.170. Peso Específico El P.e~o. específico es el peso de una sustancia en aire a 2~º d1v1d1do por el peso de un volumen igual de agua a la misma temperatura. 8.180. Temperaturas A menos que se indique algo diferente, las temperaturas se expresan en grados centígrados (Celsius) y todas las mediciones se hacen a 25º. Cuando se especifica calor moderado, se indica toda temperatura no mayor de 45º (113º F). 8.190. Tiempo A menos que se especifique algo diferente, las reglas para redondeo, según se describen en la sección 7.20, Reglas para Redondeo, se aplican a todos los tiempos especificados. 8.200. Transferir El t~r~ino "transferir" indica una manipulación cuant1tat1va. 8.210. Vacío El término "al vacío" especifica la exposición a una presión menor de 20 mm de mercurio (2,67 kPas), a menos que se indique algo diferente. 8.220. Desecador al Vacío Un "desecador al vacío" es un desecador gue mantiene una atmósfera de baja humedad a una presion reducida de no más de 20 mm de mercurio (2,67 kPas) o a la presión indicada en la monografía individual. 8.230. Agua 8.230.10. Agua como Ingrediente de un Producto Oficial Cuando aparece como un ingrediente en un producto oficial, el agua cumple con los requisitos de la monografía de agua adecuada en la USP o el NF.
. esos y e 1 as En general, se emplea el Sistema Internacional de Unidades (SI) para pesos y medidas, de acuerdo con lo establecido y revisado por la Conférence générale des poids et mesures (Conferencia General de Pesos y Medidas). A los fines de los compendios, el término "peso' se considera como sinónimo de "masa". La molalidad se representa por medio del símbolo m precedido por un número que es el número de moles de soluto contenidos en 1 kilogramo de disolvente. La molaridad se representa por medio del símbolo M precedido por un número que es el número de moles de soluto contenidos en una cantidad de disolvente suficiente para preparar 1 litro de solución. La normalidad se representa por medio del símbolo N precedido por un número que es el número de equivalentes de soluto contenidos en una cantidad de disolvente suficiente a a re arar 1 litro d solución
Unidades
Símbolo
metro centímetro milímetro
m cm mm
micrómetro
11m
nanómetro Ánastréim
nm Á
kiloaramo aramo miliaramo
ka a ma
Comentarios
Lonnitud
Anteriormente referido como micrón Anteriormente se usaba el símbolo mµ (para milimicrón) lnual a O 1 nm
Masa
microgramo
ua
El símbolo µg se usa en la USP y el NF para representar microgramos, pero los microgramos se pueden representar como "mcg" para propósitos de etiquetado y prescripción. El término "gamma", simbolizado por la letra griega y, se usa con frecuencia para designar al microgramo en la literatura de bioquímica.
12 Advertencias Generales Unidades nanoaramo oicoaramo
USP 39
Símbolo na
ºª
dalton kilodalton
Da kDa
seaundo minuto hora
s min h
Unidades voltio milivoltio hercio kilohercio meaahercio electronvoltio kiloelectronvoltio megaelectronvoltio
Comentarlos
También referido como la unidad de masa atómica unificada y es igual a 1 /12 veces la masa de un átomo no enlazado de carbono12.
Tiemoo
L dL
mililitro microlitro
ml uL
Celsius
ºC
Comentarlos
Unidad de frecuencia
eV keV MeV
Radiación
Volumen
litro decilitro
Símbolo V mV Hz kHz MHz
becnuerelio kilobecquerelio megabecauerelio gigabecauerelio
1 L es igual a 1000 cm 3 (centímetros cúbicos). 1 ml es igual a 1 cm 3, en ocasiones se denomina ce.
Temperatura
curio milicurio microcurio nanocurio
Cantidad de Sustanda
Ba
Unidad del SI para la actividad de radionucleidos
kBn MBa GBa
Ci mCi uCi nCi
Unidad para la actividad de radionucleidos que no forma parte del SI.
Otros
mol milimol micromol femtomol
eauivalente miliequivalente
mol mmol u mol fmol
Ea
Históricamente referido como peso molecular en gramos o peso atómico en aramos
También referido como peso equivalente en gramos. Se usa en el cálculo de concentración de sustancia en unidades de normalidad. Esta unidad actualmente ya no representa la de uso preferido en química analítica o metroloaía.
mEa
os mol miliosmol
Osmol mOsmol
oascal kilooascal libras por pulgada cuadrada milímetro de mercurio
Pa kPa
Presión osmótica de una solución, relacionada con la concentración de una sustancia
Presión
aceleración debida a la gravedad revoluciones por minuto
al.!'"111
rom
Usada para expresar la velocidad de centrifuaación. Usada para expresar la velocidad de centrifuaación.
Prefl)os Seleccionados del SI Nombre nina mena kilo deci centi mili micro nano oico femto
Símbolo G M k d e m u n D
f
Factor 109 106 10 3 10-1 10-2 10-3 10_,;
1 o-• 10-12 10-15
9. PRESCRIPCIÓN Y DISPENSACIÓN
osi
mmHn
Unidades eléctricas amoerio
A
lnual a 133 322 Pa
9.1 O Uso de Unidades Métricas Las prescripciones de artículos farmacopeicos se escribirán usando unidades métricas para indicar la cantidad y/o contenido deseados, a menos que se indique algo diferente en la monografía individual (ver también la sección 5.50. 7O, Unidades de Potencia [Biológica]). Si la prescripción de una cantidad se hace en otro sistema de medidas, se debe dispensar sólo una can · · crita usando el · ema mé ·
Advertencias Generales 13
USP 39 9.20 Cambios en Volumen
10.10. Envasado y Almacenamiento
En la dispensación de medicaciones prescritas, pueden obviarse los pequeños cambios de volumen que se producen debido a variaciones en la temperatura ambiente.
Todos los artículos en los compendios USP o NF están sujetos a los requisitos de envasado y almacenamiento especificados en el capítulo general Requisitos de Envasado y Almacenamiento (659), a menos que se provean requisitos distintos en una monografía "'individual..,usp39.
Cambio en la redacción:
"'10.20. Etiquetado
10. CONSERVACIÓN, ENVASADO, ALMACENAMIENTO Y ETIQUETADO
Todos los artfcul()s en la .USP o el NF están sujetos a los requisitos de etiquetado especificados en el capituló a menos que se provean requisitos diferentes en una monografía· inaividual...,usP39
•.11.vSP39
<7),
Guía de los Capítulos Generales / Diagrama de Capítulos 15
USP 39
Diagrama de Capítulos Guía de Diagramas-Capítulos Generales USP 1 Artículos Oficiales • Fármacos Activos No Complejos-Pruebas Universales: Ver Diagrama 7a • Fármacos Activos No Complejos-Pruebas Específicas: Ver Diagrama 7b • Fármacos Biológicos de Origen Natural y Recombinante: Ver Diagrama 2 • Excipientes-Pruebas Universales: Ver Diagrama 3a • Excipientes-Pruebas Específicas: Ver Diagrama 3b • Medicamentos Activos No Complejos-Pruebas Universales: Ver Diagrama 4a • Medicamentos Activos No Complejos-Pruebas Específicas: Ver Diagrama 4b • Medicamentos Biológicos de Origen Natural y Recombinante: Ver Diagrama 5 • Vacunas: Ver Diagrama 6 • Sangre y Hemoderivados: Ver Diagrama 7 •Productos Derivados de Células, Genes y Tejidos: Ver Diagrama 8 • Ingredientes de Suplementos Dietéticos: Ver Diagrama 7 7 • Productos de Suplementos Dietéticos: Ver Diagrama 72 • Preparación Magistral-Sustancia/Preparación/Dispensación: Ver Diagrama 73 • Dispositivos Médicos • (691) Algodón • (861) Suturas-Diámetro • (871) Suturas-Sujeción de Agujas Generalmente Aplicables • Elementos Básicos • (1058) Calificación de Instrumentos Analíticos • (1097) Procedimientos para el Muestreo de Polvos a Granel • (1151) Formas Farmacéuticas • (1196) Armonización Farmacopeica • (1224) Transferencia de Procedimientos Analíticos • (1225) Validación de Procedimientos Farmacopeicos • (1226) Verificación de Procedimientos Farmacopeicos • Distribución de Medicamentos: Ver Diagrama 9 • Microbiología-Productos No Estériles: Ver Diagrama 7Oa • Microbiología-Productos Estériles: Ver Diagrama 7Ob
1 Esta tabla y los Diagramas 1-13 que se presentan a continuación tienen la finalidad de ser una guía de los capítulos en esta publicación. Es probable que no incluyan la información completa y no pretenden cumplir con las expectativas de los artículos o limitar la aplicación de las pruebas a cualquier artículo en los compendios USP-NF.
Diagrama la. Fármacos Activos No Complejos-Pruebas Universales Impurezas Capítulo (7) Etiquetado (11) Estándares de Referencia USP
Descripción
Identificaclón
•
• •
(81) Antibióticos-Valoraciones Microbiolóqicas
(181) Identificación-Bases Orgánicas Nitrogenadas
(191) Identificación-Pruebas Generales (193) ldentificación-Tetraciclinas (19 7) Pruebas de Identificación Espectrofotométrica
(201) Prueba de Identificación por Cromatografía en Capa Delgada
(202) Identificación de Aceites Fijos por Cromatografía en Capa Delgada
Valoración
• •
• • • •
Orgánicas
Inorgánicas
Disolventes Residuales
1 6 Diagrama de Capítulos J Guía de los Capítulos Generales
USP 39
Diaqrama la. Fármacos Activos No Compleios-Pruebas Universales (Continuación) Impurezas Capítulo
Descripción
(203) Procedimiento de Cromatografía en Capa Delgada de Alta Resolución para Identificación de Artículos de Origen Botánico
Identificación
Valoración
Orgánicas
• •
(211) Arsénico (221) Cloruros y Sulfatos
•
(223) Dimetilanilina (2 31 ) Metales Pesados
(241) Hierro (251) Plomo (261) Mercurio (281) Residuo de Incineración (291) Selenio (351) Valoración de Esteroides (391) Valoración de Epinefrina
•
(401) Grasas y Aceites Fijos (425) Antibióticos-Va/oración Yodométrica
• •
• •
(451) Volumetría con Nitrito (461) Determinación de Nitrógeno (466) Impurezas Comunes (467) Disolventes Residuales
• • •
(471) Combustión en Matraz con Oxígeno (511) Valoración de un Esteroide Aislado
• •
(541) Volumetría (621) Cromatografía
•
• •
• •
•
(735) Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X
•
•
(736) Espectrometría de Masas
• •
•
(761) Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear (781) Rotación Óptica (801) Po/orografía (852) Espectroscopía de Absorción Atómica (853) Espectroscopía de Fluorescencia (854) Espectroscopía en el Infrarrojo Medio (855) Nefelometría, Turbidimetría y Comparación Visual (85 7) Espectroscopía Ultravioleta-Visible (941 ) Caracterización de Sólidos Cristalinos y Parcialmente Cristalinos por Difracción de Rayos X sobre Polvo (DRXP)
• •
•
(730) Espectroquímica de Plasma
(733) Pérdida por Incineración
• •
• • • • • • •
(232) Impurezas Elementales-Límites (233) Impurezas Elementales-Procedimientos
(731) Pérdida por Secado
Disolventes Residuales
•
(206) Aluminio
(659) Requisitos de Envasado y Almacenamiento
Inorgánicas
• • • • • • •
• • •
• •
• • • •
•
•
•
• •
•
Guía de los Capítulos Generales / Diagrama de Capítulos 1 7
USP 39
Diagrama la. Fármacos Activos No Complejos-Pruebas Universales (Continuación) Impurezas Descripción
Capítulo
Identificación
(1064) Identificación de Artículos de Orígen Botánico por Cromatografía en Capa Delgada de Alta Resolución
Valoración
Orgánicas
•
(1119) Espectroscopía en el Infrarrojo Cercano
• •
(1120) Espectroscopía Raman (1223.1) Validación de Métodos Alternativos para Valoraciones Microbiológicas de Antibióticos
•
(1735) Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X-Teoría y Práctica
• • • • • • •
(1852) Espectroscopía de Absorción Atómica-Teoría y Práctica (1853) Espectroscopía de FluorescenciaTeoría y Práctica (1854) Espectroscopía en el Infrarrojo Medio-Teoría y Práctica (1857) Espectroscopía Ultravioleta-Visible-Teoría y Práctica
• •
(1730) Espectroquímica de Plasma-Tearía y Práctica
(1 761 ) Aplicaciones de la Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear
Disolventes Residuales
•
(1086) Impurezas en Fármacos y Productos Farmacéuticos
(1736) Aplicaciones de la Espectrometría de Masas
Inorgánicas
• •
•
•
• •
•
•
•
•
•
Diagrama 1 b. Fármacos Activos No Complejos-Pruebas Específicas Capítulo
Caracterización Fisicoquímica
•
(41) Balanzas
(301) Capacidad Neutralizan te de Ácido (429) Medición del Tamaño de Partícula por Difracción de Luz
• • •
•
(541) Volumetría (616) Densidad Aparente y Densidad por Asentamiento de los Polvos (631) Color y Acromatismo ( 641 ) Totalidad de la Disolución ( 651 ) Temperatura de Solidificación (695) Cristalinidad (699) Densidad de Sólidos (721) Intervalo de Destilación (731) Pérdida por Secado (735) Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X (741) Intervalo o Temperatura de Fusión (761) Espectroscopia de Resonancia Magnética Nuclear (776) Microscopía Óptica (781) Rotación Óptica (785) Osmolalidad y Osmolaridad
Contenido de Agua
•
(31) Aparatos Volumétricos
(268) Porosidad Mediante Adsorción-Desorción de Nitrógeno
Equipamiento
• • • • • • • • • • • • • •
•
USP 39
18 Diagrama de Capítulos / Guía de los Capítulos Generales
Diagrama 1 b. Fármacos Activos No Complejos-Pruebas Específicas (Continuación) Caracterización Fisicoquímica
Capítulo (786) Estimación de la Distribución del Tamaño de Partícula por Tamizado Analítico
Contenido de Agua
Equipamiento
•
•
(791) pH
• • • • • • • • •
(811) Finura de Polvos (821) Radioactividad (831) Índice de Refracción (841) Peso Específico (846) Área Superficial Específica (881 ) Resistencia a la Tensión (891) Análisis Térmico (911) Viscosidad-Métodos Capilares (912) Viscosidad-Métodos Rotatorios (913) Viscosidad-Método de Bola Rodante
•
•
(9 21 ) Determinación de Agua (941) Caracterización de Sólidos Cristalinos y Parcía/mente Cristalinos por Difracción de Rayos X sobre Polvo (DRXP)
• •
(1051) Limpieza de Material de Vidrio
• • •
(1119) Espectroscopía en el Infrarrojo Cercano (1120) Espectroscopia Raman (11 71) Análisis por Solubilidad de Fases
•
(1251) Pesada en una Balanza Analítica (1730) Espectroquímica de Plasma-Teoría y Práctica
• •
(1735) Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X-Teoría y Práctica (1761) Aplicaciones de fa Espectroscopia de Resonancia Magnética Nuclear
• •
(1911) Reometría
Diagrama 2. Fármacos Biológicos de Origen Natural y Recombinante
Capítulo ( 7) Etiquetado (11) Estándares de Referencia USP
Descrlpción
Id en tificación
Seguridad
•
•
(63) Pruebas para Micoplasmas (71) Pruebas de Esterilidad
•
•
• • • •
(81) Antibióticos-Va/oraciones Microbiológicas (85) Prueba de Endotoxinas Bacterianas
•
• •
(41 ) Balanzas
(62) Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Microorganismos Específicos
Flslcoquímica
Impurezas Relacionadas con el Proceso
Relacionadas con el Producto
•
(31) Aparatos Volumétricos
(61) Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano
Valoración
Equipamlento
•
•
(8 7) Pruebas de Reactividad Biológica, In Vitro
• •
(88) Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo
•
•
Caracterizaclón
Guía de los Capítulos Generales/ Diagrama de Capítulos 19
USP 39
Dia!Jrama 2. Fármacos Biológicos de Origen Natural y Recombinante (Continuación)
Capítulo
Descrlpción
ldentificación
(111) Diseño y Análisis de Va/oraciones Biológicas
Seguridad
Valoración
Físicoquímica
• •
(121) Valoración de Insulina (121.1) Procedimientos Analíticos Fisicoquímicos para lnsu/inas
•
(126) Pruebas de Identidad Biolóqica de Somatropina
•
(208) Valoración de Anti-Factor Xa y Anti-Factor /la para Heparinas No Fraccionadas y Heparinas de Bajo Peso Molecular
•
•
(231) Metales Pesados (232) Impurezas ElementalesLímites (233) Impurezas ElementalesProcedimientos (467) Disolventes Residuales (503) Ácido Acético en Péptidos (503.1) Ácido Trifluoroacético en Péptidos
(621) Cromatografía
• •
•
• •
•
•
•
•
•
•
• • • • •
•
•
•
• •
• • • •
• •
• •
(731) Pérdida por Secado
• •
(781) Rotación Óptica (786) Estimación de la Distribución del Tamaño de Partícula por Tamizado Analítico
• • •
•
•
(730) Espectroquímica de Plasma
•
(831) Índice de Refracción
(854) Espectroscopía en el lnfrarrojo Medio
•
•
(541) Volumetría
(853) Espectroscopía de Fluorescencia
•
•
(212) Análisis de Oligosacáridos
(852) Espectroscopía de Absorción Atómica
•
•
(209) Determinaciones de Peso Molecular de Heparinas de Bajo Peso Molecular
(761) Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear
Caracterización
• •
(197) Pruebas de Identificación Espectrofotométricas
(736) Espectrometría de Masas
Relacionadas con el Producto
•
•
(191) Identificación-Pruebas Generales
(695) Cristalinidad
Impurezas Relacionadas con el Proceso
•
(129) Procedimientos Analíticos para Anticuerpos Monoclonales Recombinantes de Uso Teropéutico
(631) Color y Acromatismo
Equipamiento
• • •
• • •
• •
• •
• • •
• • •
20 Diagrama de Capítulos / Guía de los Capítulos Generales
o·1a!lrama 2
Capítulo
Descrlpclón
. de f'armacos Bº10 I' og1cos
ldentlficación
Segurldad
(855) Nefelometría, Turbidimetría y Comparación Visual
o.rigen Natura Valoraclón
•
(857) Espectroscopía Ultravioleta-Visible
•
USP 39
•
., ) y Recom bl nante (Continuacion
Flslcoquímica
(1030) Capítulos de Va/oraciones Biológicas-Información General y Glosario
•
• •
(1032) Diseño y Desarrollo de Va/oraciones Biológicas
•
(1033) Validación de Valoradones Biológicas
• •
(1034) Análisis de Valoraciones Biológicas (1041) Productos Biológicos (1044) Crioconservación de Células
•
•
Impurezas Relacionadas con el Proceso
• •
•
•
• •
(921) Determinación de Agua (1025) Pancreatina
Equlpamiento
Relacionadas con el Producto
• •
• •
• •
• •
•
• • •
•
•
•
•
(1048) Calidad de Productos Biotecnológicos: Análisis de la Construcción Expresable en Células Usadas para la Producción de Productos Proteínicos Obtenidos con ADN Recombinante (1052) Artículos Obtenidos por Biotecnología-Análisis de Aminoácidos
Caracterización
• • •
•
•
• • •
• • •
• •
(1054) Artículos Obtenidos por Biotecnología-lsoelectroenfoque
•
• •
(1055) Artículos Obtenidos por Biotecnología-Mapeo de Pépti dos
•
•
•
•
•
(1056) Artículos Obtenidos por Biotecnología-Electroforesis en Gel de Poliacrilamida
•
•
•
•
•
(1057) Artículos Obtenidos por Biotecnología-Valoración de Proteínas Totales
•
•
• •
•
•
•
•
(1053) Electroforesis Capilar
(1065) Cromatografía Jónica (1084) Análisis de Glicoproteínas y Glicanos-Consideraciones Generales (1102) Métodos de Pruebas Inmunológicas-Consideraciones Generales
•
•
•
•
•
(1103) Métodos de Pruebas Inmunológicas-Ensayo por Inmunoadsorción Ligado a Enzimas (ELISA)
•
•
•
•
•
(1104) Métodos de Pruebas Inmunológicas-Análisis por Inmunotransferencia
•
•
•
•
(1105) Métodos de Pruebas Inmunológicas-Resonancia de Plasmón Superficial
•
•
Guía de los Capítulos Generales / Diagrama de Capítulos 21
USP 39
Diagrama 2. Fármacos Biológicos de Origen Natural y Recombinante (Continuación)
Capítulo
Descripción
ldentificaclón
(1113) Caracterización, ldentificación y Tipificación de Cepas Microbianas (1121) Nomenclatura (1125) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Generalidades
Seguridad
Valoraclón
Fisicoquímica
Equipamlento
Impurezas Relacionadas con el Proceso
Relacionadas con el Producto
Caracterizaclón
• •
•
•
(1126) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Extracción, Detección y Secuenciación
•
•
(1127) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Amplificación
•
• • •
(1128) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Micromatrices (1129) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Genotipificación (1130) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Enfoques para Detectar Trazas de Ácidos Nucleicos (Análisis de ADN Residual) (11 32) Medición de Proteína Residual de Células Huésped en Productos Biofarmacéuticos (1180) Plasma Humano (1181) Microscopía Electrónica de Barrido
•
•
• •
•
•
•
(1211) Esterilización y Garantía de Esterilidad de Artículos Farmacopeicos
•
(1229) Esterilización de Artículos Farmacapeicos
•
(1229.4) Esterilización de Líquidos por Filtración
•
(1251) Pesada en una Balanza Analítica
•
(1736) Aplicaciones de la Espectrometría de Masas
•
(1761) Aplicaciones de la Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear
•
•
•
•
• •
•
(1853) Espectroscopía de Fluorescencia-Teoría y Práctica
• •
•
• •
• •
(1854) Espectroscopía en el Infrarrojo Medio-Teoría y Práctica
•
•
•
•
•
(1857) Espectroscopía Ultravioleta-Visible-Teoría y Práctica
•
•
•
•
•
(1852) Espectroscopía de Absorción Atómica-Teoría y Práctica
• •
•
Diagrama 3a. Excipientes-Pruebas Universales Impurezas Capítulo (7) Etiquetado (181) Identificación-Bases Orgánicas Nitrogenadas
Descripción
Identificación
• •
Valoración
Orgánicas
Inorgánicas
Disolventes Residuales
USP 39
22 Diagrama de Capítulos / Guía de los Capítulos Generales
D"1agrama 3a. Exc1p1 1 1entes-p rue bas
., ) u. mversa es (Contmuac1on
Impurezas Capítulo (191) Identificación-Pruebas Generafes
Descripción
Identificación
(197) Pruebas de Identificación Espectrofotométricas
• •
(201) Prueba de Identificación por Cromatografía en Capa Delgada
•
(202) Identificación de Aceites Fijos por Cromatografía en Capa Delgada
•
(203) Procedimiento de Cromatografía en Capa Delgada de Alta Resolución para Identificación de Artículos de Origen Botánico
•
Valoración
Orgánicas
(206) Aluminio (211 ) Arsénico (221 ) Cloruros y Sulfatos
•
(226) 4-Epianhidrotetraciclina (228) Óxido de Etileno y Dioxano
(232) Impurezas Elementales-Límites (233) Impurezas Elementales-Procedimientos (241) Hierro (251) Plomo (261) Mercurio (281) Residuo de Incineración (291) Selenio
• •
(345) Valoración de Ácido Cítrico/ Citrato y Fosfato (401) Grasas y Aceites Fijos (425) Antibióticos-Va/oración Yodométrica
• • • •
(461) Determinación de Nitrógeno (466) Impurezas Comunes
•
(467) Disolventes Residuales (469) Etilenglicol, Dietilenglicol y Trietilenglico/ en Sustancias Etoxiladas
•
(471) Combustión en Matraz con Oxígeno
•
(541) Volumetría
•
• •
•
•
• •
(730) Espectroquímica de Plasma (731) Pérdida por Secado (733) Pérdida por Incineración (735) Espectrometría de Fluorescencía de Rayos X (736) Espectrometría de Masas (781) Rotación Óptica (801 ) Po/orografía
•
•
(431) Determinación de Grupos Metaxi/o
(621) Cromatografía
Disolventes Residuales
• • • • • • • • • • •
(231) Metales Pesados
(311) Valoración de Alginatos
Inorgánicas
• • • •
• • •
• •
Guía de los Capítulos Generales / Diagrama de Capítulos 23
USP 39
Diagrama 3a. Excipientes-Pruebas Universales (Continuación) Impurezas Capítulo
Descripción
(852) Espectroscopía de Absorción Atómica
Identificación
(853) Espectroscopía de Fluorescencia
• •
(854) Espectroscopía en el Infrarrojo Medio
•
Valoración
•
(941 ) Caracterización de Sólidos Cristalinos y Parcialmente Cristalinos por Difracción de Rayos X sobre Polvo (DRXP)
•
(1064) Identificación de Artículos de Origen Botánico por Cromatografía en Capa Delgada de Alta Resolución
•
Inorgánicas
Disolventes Residuales
• •
• • • • •
(855) Nefelometría, Turbidimetría y Comparación Visual (85 7) Espectroscopía Ultravioleta-Visible
Orgánicas
• • •
(l 086) Impurezas en Fármacos y Productos Farmacéuticos
•
(l 091) Etiquetado de Ingredientes Inactivos
•
(1119) Espectroscopía en el lnfrarrojo Cercano
(l 735) Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X-Teoría y Práctica
• • •
(1736) Aplicaciones de la Espectrometría de Masas
•
(1852) Espectroscopía de Absorción Atómica-Teoría y Práctica (1853) Espectroscopía de Fluorescencia-Teoría y Práctica
• •
(1854) Espectroscopía en el lnfrarrojo Medio-Teoría y Práctica
•
(1857) Espectroscopía UltravioletaVisible-Teoría y Práctica
•
(1730) Espectroquímica de Plasma-Teoría y Práctica
• •
• • • •
• •
• •
D agrama 3 b . Exc1p1 1 ientes-Pruebas Espec1'fi cas Capítulo
Caracterización Flslcoquímlca
Agua para Uso Farmacéutico1
(41) Balanzas
•
(301) Capacidad Neutralizante de Ácido (429) Medición del Tamaño de Partícula por Difracción de Luz
• •
•
(541) Volumetría (616) Densidad Aparente y Densidad por Asentamiento de los Polvos 1 Ver
Microbiología (Diagrama 7O).
Funcionalidad/ Seguridad/BPF
• •
(31) Aparatos Volumétricos
(268) Porosidad Mediante Adsorción-Desorción de Nitrógeno
Equipamiento
•
USP 39
24 Diagrama de Capítulos / Guía de los Capítulos Generales
Diagrama 3b. Excipientes-Pruebas Especificas (Continuacion) Capítulo (631) Color y Acromatismo ( 641) Totalidad de la Disolución
Caracterización Flslcoquímlca
Equipamiento
• •
(645) Conductividad del Agua
(695) Cristalinidad (699) Densidad de Sólidos (721) Intervalo de Destilación (731) Pérdida por Secado (735) Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X
• • • •
• •
(741) Intervalo o Temperaturo de Fusión
•
(761) Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear
• • •
(776) Microscopía Óptica (781) Rotación Óptica (785) Osmolalidad y Osmolaridad
•
(786) Estimación de la Distribución del Tamaño de Partícu/a por Tamizado Analítico
•
(79l)pH
•
(811) Finura de Polvos (821) Radioactividad (831) Índice de Refracción (841 ) Peso Específico (846) Área Superficial Específica (881) Resistencia a la Tensión (891) Análisis Térmico (911) Viscosidad-Métodos Capilar (912) Viscosidad-Métodos Rotatorios (913) Viscosidad-Método de Bola Rodante
•
• •
• • • •
•
• • • •
(921) Determinación de Agua (941) Caracterización de Sólidos Cristalinos y Parcialmente Cristalinos por Difracción de Rayos X sobre Polvo (DRXP) (1051) Limpieza de Material de Vidrio (1059) Desempeño de Excipientes (1074) Guías para la Evaluación de la Seguridad Biológica de los Excipientes 1
Ver Microbiología (Diagrama 1O).
Funcionalidad/ Seguridad/BPF
• •
(643) Carbono Orgánico Total
( 651 ) Temperatura de Solidi· ficación
Agua para Uso Farmacéutico 1
• • • •
Guía de los Capítulos Generales/ Diagrama de Capítulos 25
USP 39
Diagrama 3b. Excipientes-Pruebas Específicas (Continuación) Capítulo
Caracterización Fisicoquímlca
Equipamiento
Agua para Uso Farmacéutico 1
Funcionalidad/ Seguridad/BPF
(l 078) Buenas Prácticas de Fabricación para Excipientes Farmacéuticos a Granel
•
(1 080) Excipientes Farmacéuticos a Granel-Certificado de Análisis
•
(1097) Procedimientos para el Muestreo de Polvos a Grone!
•
(1119) Espectroscopía en el Infrarrojo Cercano
• •
(1174) Fluidez de Polvos (1195) Guía sobre Cambios Significativos en Excipientes Farmacéuticos a Granel
• •
(1197) Procedimientos para el Muestreo de Polvos a Grone/
•
(1230) Agua para Uso en Hemodiálisis
• •
(1231) Agua para Uso Farmacéutico (1251) Pesada en una Balanza Analítica
•
(1644) Teoría y Práctica de Mediciones de Conductividad Eléctrica de Soluciones
•
(1730) Espectroquímica de Plasma-Teoría y Práctica
•
(1735) Espectrometría de Fluorescencia de Rayos XTeoría y Práctica
•
(1761) Aplicaciones de la Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear
• •
(1911) Reometría 1
Ver Microbiología (Diagrama 1O).
Diagrama 4a. Medicamentos Activos No Complejos-Pruebas Universales Impurezas Capítulo (7) Etiquetado (81) Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas (191) Identificación-Pruebas Generales
Descripción
Identificación
Valoración
• •
(19 7) Pruebas de Identificación Espectrofotométricas
• •
(201) Prueba de Identificación por Cromatografía en Capa Delgada
•
(202) Identificación de Aceites Fijos por Cromatografía en Capa Delgada
•
(203) Procedimiento de Cromatografía en Capa Delgada de Alta Resolución para Identificación de Artículos de Origen Botónico
•
Orgánicas
Inorgánicas
Disolventes Residuales
26 Diagrama de Capítulos / Guía de los Capítulos Generales
D"1agrama 4 a. M e d'1camentos
USP 39
., ) Act1vos . . No Comp1. e1os-p rue b as umversa es (C ontinuaoon
Impurezas Capítulo
Descripción
Identificación
Valoración
(227) 4-Aminofenol en Medicamentos que Contienen Acetaminofeno
Orgánicas
• • •
(233) Impurezas ElementalesProcedimientos (281) Residuo de Incineración (341) Agentes Antimicrobianos-Contenido
• • •
(351) Valoración de Esteroides (391) Valoración de Epinefrina (413) Análisis de Impurezas en Gases Medicina/es
•
(415) Valoración de Gases Medícinales
•
(451) Volumetría con Nitrito
•
(461) Determinación de Nitrógeno
• •
(466) Impurezas Comunes (467) Disolventes Residuales (501) Sales de Bases Orgánicas Nitrogenadas
•
•
•
• •
•
•
(541) Volumetría ( 611 ) Determinación de Alcohol (621) Cromatografía (730) Espectroquímica de Plasma
•
• • •
(733) Pérdida por Incineración (735) Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X
•
(736) Espectrometría de Masas
•
(781) Rotación Óptica
• •
•
(852) Espectroscopía de Absorción Atómica
•
• •
(853) Espectroscopía de Fluorescencia
•
•
•
(854) Espectroscopía en el lnfrarrojo Medio
•
• •
(857) Espectroscopía Ultravioleta-Visible
•
•
• • •
(1064) Identificación de Artículos de Origen Botánico por Cromatografía en Capa Delgada de Alta Resolución
•
(801) Po/orografía
(855) Nefelometría, Turbidimetría y Comparación Visual
•
•
(1065) Cromatografía Jónica (1086) Impurezas en Fármacos y Productos Farmacéuticos
(1223.1) Validación de Métodos Alternativos para Va/oraciones Microbiológicas de Antibióticos
Disolventes Residuales
•
(232) Impurezas ElementalesLímites
(1121) Nomenclatura
Inorgánicas
•
• •
Guía de los Capítulos Generales/ Diagrama de Capítulos 27
USP 39
Diagrama 4a. Medicamentos Activos No Complejos-Pruebas Universales (Continuación) Impurezas Capítulo
Descripción
Valoración
Identificación
Orgánicas
(1730) Espectroquímica de Plasma-Teoría y Práctica
•
•
(1735) Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X-Teoría y Práctica
•
•
• • •
• •
•
(1854) Espectroscopía en el Infrarrojo Medio-Teoría y Práctica
•
•
•
(1857) Espectroscopía Ultravioleta-Visible-Teoría y Práctica
•
•
•
(1736) Aplicaciones de la Espectrometría de Masas (1852) Espectroscopía de Absorción Atómica-Teoría y Práctica (1853) Espectroscopía de Fluorescencia-Teoría y Práctica
Inorgánicas
Disolventes Residuales
•
Diagrama 4b. Medicamentos Activos No Complejos-Pruebas Específicas Pruebas de Desempeño Mucosa Capítulo
Equipamiento
Contenido de Agua
Oftálmica 1
Nasal
Parenteral
Oral
(2) Medicamentos Ora/es-Pruebas de Calidad del Producto
•
(3) Medicamentos Tópicos y TransdérmicosPruebas de Calidad del Producto
•
(4) Medicamentos para Mucosas-Pruebas de Calidad del Producto
•
(5) Medicamentos Nasales y para InhalaciónInformación General y Pruebas de Calidad del Producto CDS
(41) Balanzas (71) Pruebas de Esterilidad
•
•
•
•
• • • •
(85) Prueba de Endotoxinas Bacterianas (87) Pruebas de Reactividad Biológica, In Vitro (88) Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo
• •
(151) Prueba de Pirógenos
•
(301) Capacidad Neutralizante de Ácido
•
(381) Tapones Elastoméricos para Inyectables (541) Volumetría 1 Ver Microbiología (Diagrama 10).
lnhalatoria
•
(1) Inyectables
(31) Aparatos Volumétri-
Tópica
Mucosa (7 superficies de membrana)
• •
28 Diagrama de Capítulos /
Guía de los Capítulos Generales
USP 39
, ) e¡os-Prue bas Espec1T 1cas Continuacion D1aqrama 4 b . Med"1camentos Activos No eomp 1.
Pruebas de Desempeño Mucosa Capítulo
Equipamiento
Contenldo de Aqua
Oftálmlca 1
(601) Medicamentos Nasales y para Inhalación: Pruebas de Calidad de Desempeño de Aerosoles, Atomizadores y Poivos
Nasal
Parenteral
Oral
Tópica
•
•
(602) Propelentes
• •
( 60 3) Aerosoles Tópicos
•
(604) Velocidad de Fuga (697) Contenido en Envases para Inyectables
• • •
( 711 ) Disolución (724) Liberación de Fármacos (729) Distribución del Tamaño de Glóbulos en Emulsiones Inyectables de Lípidos
•
(751) Partículas Metálicas en Ungüentos Oftálmi-
•
CDS
(771) Productos Oftálmicos-Pruebas de Calidad
• •
(785) Osmolalidad y Osmolaridad (787) Partículas Subvisibles en Inyectables de Proteínas Terapéuticas
•
(788) Partículas en lnyectables
•
(789) Partículas en So/uciones Oftálmicas
•
( 790) Partículas Visibles en Inyectables (791) pH
•
(891) Análisis Térmico (905) Uniformidad de Unidades de Dosificación (921) Determinación de Agua
•
•
• •
•
•
•
• •
• •
(1005) Emisión Acústica
Microbiología (Diagrama 7O).
•
•
(731) Pérdida por Secado
1 Ver
•
•
(705) Atributos de Calidad para Tabletas Cuyo Etiquetado Indica Ranurada Funcional
(1087) Disolución lntrínseca Aparente-Procedimientas de Pruebas de Disolución para Disco Rotatorio y Disco Estacionario
•
•
( 701 ) Desintegración
(1051) Limpieza de Materia/ de Vidrio
lnhalatoria
Mucosa (7 superficies demembrana)
• •
•
• •
Guía de los Capítulos Generales/ Diagrama de Capítulos 29
USP 39
Diagrama 4b. Medicamentos Activos No Complejos-Pruebas Específicas (Continuación) Pruebas de Desempeño Mucosa Capítulo
Equipamiento
Contenido de Agua
Oftálmical
Nasal
Parenteral
Oral
(1 088) Evaluación In Vivo e In Vitro de Formas Farmacéuticas
•
(1090) Evaluación de Desempeño del Producto Farmacéutico-Biodisponibilidad, Bioequivalencia y Disolución
•
(1092) Procedimiento de Disolución: Desarrollo y Validación
•
(1094) Cápsu/as-Pruebas de Disolución y Atributos de Calidad Re/acionados
•
(1113) Caracterización, Identificación y Tipificación de Cepas Microbionas
• •
(1217) Fuerza de Ruptura de las Tabletas (1229) Esterilización de Artículos Farmacopeicos
•
(1229 .2) Esterilización con Calor Húmedo de Líquidos Acuosos
•
(1229.3) Monitoreo de la Biocarga
• •
(1229.4) Esterilización de Líquidos por Filtración
•
( 1601 ) Productos para Nebulización-Pruebas de Caracterización
•
(1724) Medicamentos Semisó/idos-Pruebas de Desempeño (1 771) Productos Ohálmicos-Pruebas de Desempeño
• •
(1 787) Medición de Partícu/as Subvisibles en Inyectables de Proteínas Terapéuticas
•
(1 788) Métodos para la Determinación de Partícu/as en Inyectables y Soluciones Oftálmicas
•
1 Ver Microbiología (Diagrama 10).
lnhalatoria
•
(1216) Friabilidad de las Tabletas
(1251) Pesada en una Balanza Analítica
Tópica
Mucosa (7 superficies de membrana)
30 Diagrama de Capítulos / Guía de los Capítulos Generales
USP 39
Diagrama 5. Medicamentos Biológicos de Origen Natural y Recombinante Impurezas
Capítulo
ldentiflcación
Caracterización
Equipamiento
Descripción
Segurldad
Valoración
Flsicoquímica
•
( 7) Etiquetado
•
•
(31) Aparatos Volumétricos
•
•
•
(61) Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiono
•
•
•
• •
(85) Prueba de Endotoxinas Bacterianas
• • •
(87) Pruebas de Reactividad Biológica, In Vitro
•
(62) Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Microorganismos Específicos (63) Pruebas para Micoplasmas (71) Pruebas de Esterilidad
(88) Pruebas de Reactividad Biológica, In Vi-
•
vo
•
•
•
•
•
•
(90) Suero Fetal Bovino-Atributos de Calidad y Pruebas de Funcionalidad
•
(111) Diseño y Análisis de Valoraciones Biológicas
•
(121) Valoración de Insulina
•
(121.1) Procedimientos Analíticos Fisicoquímicos para Insulinas
•
(123) Pruebas de /dentidad Biológica de Glucagón
•
(124) Valoraciones Biológicas de Eritropoyetina (126) Pruebas de /dentidad Biológica de Somatropina
•
• •
(41) Balanzas
(89) Enzimas Usadas como Materiales Auxiliares en Ja Fabricación de Productos Farmacéuticos
Relacionadas con el Producto
•
(1) Inyectables
(11) Estándares de Referencia USP
Pruebas Mise.
Relacionadas con el Proceso
•
•
•
•
• •
• •
• •
•
USP 39
Guía de los Capítulos Generales / Diagrama de Capítulos 31
o·1agrama 5
, ) Me dicamentos Bi o I'oqi cos d e Ori1gen Natura y Recom b"mante ( Continuacion
Impurezas
Capítulo
ldentifieación
(129) Procedimientos Analíticos para Anticuerpos Monoclonales Recombinantes de Uso Terapéutico
Caracterización
Equipamiento
Pruebas Mise.
Descrlpción
Seguridad
Valoración
Fislcoquímica
•
•
(1 30) Atributos de Calidad de la Proteína A
(197) Pruebas de /dentificación Espectrofotométricas
•
• • •
(208) Valoración de Anti-Factor Xa y AntiFactor /la para Heparinas No Fraccionadas y Heparinas de Bajo Peso Molecular
•
(209) Determinaciones de Peso Molecular de Heparinas de Bajo Peso Molecular
•
(212) Análisis de Oligosacáridos
•
•
•
• • • •
(231) Metales Pesados (232) Impurezas Elementales-Límites (233) Impurezas Elementales-Procedimientas (341) Agentes Antimicrobianos-Contenido
•
(467) Disolventes Residuales
•
(503) Ácido Acético en Péptidos
• • •
• •
(541) Volumetría (621) Cromatografía (631) ColoryAcromatismo (660) Envases-Vidrio
•
• • •
( 661 ) Sistemas de Envases Plásticos y sus Materiales de Construcción
•
( 661.1) Materiales Plásticos de Construcción
•
(661.2) Sistemas de Envases Plásticos para Uso Farmacéutico
•
(671) Envases-Pruebas de Desempeño
•
(695) Cristalinidad
Relacionadas con el Producto
•
(151) Prueba de Pirógenos (191) IdentificaciónPruebas Generales
Heladonadas con el Proceso
•
•
•
32 Diagrama de Capítulos / Guía de los Capítulos Generales
D1aqrama 5. Medi camentos B1o I'oq1i cos d e
USP 39
o.rigen Natura
y
., ) Recom b"mante Contmuaoon
Impurezas
Capítulo
ldentiflcaclón
Caracterizaclón
(697) Contenido en Envases para Inyectables
Equipamiento
Pruebas Mise.
Descrlpclón
Segurldad
Valoración
Fislcoquímica
Relaclonadas con el Proceso
Relacionadas con el Producto
•
(730) Espectroquímica de Plasma
•
(731) Pérdida por Secado
•
(736) Espectrometría de Masas
•
•
•
•
•
•
(761) Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear
•
•
•
•
•
•
•
(781) Rotación Óptica (785) Osmolalidad y Osmolaridad
•
(786) Estimación de la Distribución del Tamaño de Partícula por Tamizado Analítico
•
(787) Partículas Subvisibles en Inyectables de Proteínas Terapéuticas
•
(788) Partículas en Inyectables
• •
(791) pH (831) Índice de Retraeción (852) Espectroscopía de Absorción Atómica
•
•
(853) Espectroscopía de Fluorescencia
• •
•
(854) Espectroscopía en el Infrarrojo Medio (855) Nefelometría, Turbidimetría y Comparación Visual (857) Espectroscopía Ultravioleta-Visible
•
• • •
•
•
•
• •
•
•
•
•
•
•
•
•
•
• • •
(921) Determinación de Agua (1024) Suero Bovino
•
•
•
•
•
(1032) Diseño y Desarrollo de Valoraciones Biológicas
•
•
•
(1033) Validación de Valoraciones Biológicas
•
•
•
(1034) Análisis de Va/oraciones Biológicas
•
•
•
(1025) Pancreatina (1030) Capítulos de Valoraciones Biológicas-lnformación General y Glosario
(1041) Productos Biológicos
•
• • •
•
•
•
•
•
Guía de los Capítulos Generales/ Diagrama de Capítulos 33
USP 39
. Diaqrama 5. Medicamentos B1o I'oq1cos de Oriqen Natura y Recom b.mante (Continuacion)
Impurezas
Capítulo
ldentificaclón
(1044) Crioconservación de Células
Caracterizaclón
Equipamiento
Pruebas Mise.
Descripción
Seguridad
Fislcoquímica
Relacionadas con el Producto
•
•
(1050) Evaluación de la Seguridad Viral en Productos Biotecnológicos Obtenidos de Líneas Celulares de Origen Humano o Animal
Valoración
Relacionadas con el Proceso
•
(l 052) Artículos Obtenidos por Biotecnología-Análisis de Aminoácidos
•
•
•
•
•
(1053) Electroforesis Capilar
•
•
•
•
•
(1054) Artículos Obtenidos por Biotecnología-lsoelectroenfoque
•
•
•
•
•
(1055) Artículos Obtenidos por Biotecnología-Mapeo de Péptidos
•
•
•
•
•
(1056) Artículos Obtenidos por Biotecno/ogía-Electroforesis en Gel de Poliacrilamida
•
•
•
•
•
(1057) Artículos Obtenidos por Biotecnología-Va/oración de Proteínas Totales
•
•
•
•
•
(1065) Cromatografía fónica
•
(1084) Análisis de Glicoproteínas y G/icanos-Consideraciones Generales
•
•
•
(1102) Métodos de Pruebas lnmunológicas-Consideraciones Generales
•
•
•
•
•
(1103) Métodos de Pruebas lnmunológicas-Ensayo por Inmunoadsorción Ligado a Enzimas (ELISA)
•
•
•
•
•
(1104) Métodos de Pruebas lnmunológicas-Análisis por Inmunotransferencia
•
•
•
•
(1105) Métodos de Pruebas lnmunológicas-Resonancia de Plasmón Superficial (11 06) Ensayos de Inmunogenicidad-Diseña y Validación de lnmunoensayos para Detectar Anticuerpos Antifármacos
•
• •
USP 39
34 Diagrama de Capítulos / Guía de los Capítulos Generales
Dlaarama 5. Medicamentos Blolóalcos de Orlaen Natural y Recomblnante (Continuacion) Impurezas
Capítulo
ldentlfleación
Caracterlzación
Equipamiento
Pruebas Mise.
Descrlpción
Segurldad
(1106.1) Ensayos de lnmunogenicidadDiseño y Validación de Ensayos para Detectar Anticuerpos Neutralizantes Antifármacos
•
(1111) Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Criterios de Aceptación para Preparaciones Formacéuticos y Sustancias de Uso Farmacéutico
•
(1113) Caracterización, Identificación y Tipificación de Cepas Microbianas
•
Valoración
Flslcoauímlca
Relacionadas con el Proceso
•
•
(1121 ) Nomenclatura (1125) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Generalidades
•
•
(1126) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Extracción, Detección y Secuenciación
•
•
(1127) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Amplificación
•
•
(1128) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Micromatrices
•
(1129) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Genotipificación
•
•
(1130) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Enfoques para Detectar Trazas de Ácidos Nucleicos (Análisis de ADN Residual)
•
•
(1132) Medición de Proteína Residual de Células Huésped en Productos Biofarmacéuticos
•
•
(1181) Microscopía Electrónica de Barrido
•
(1211) Esterilización y Garantía de Esterilidad de Artículos Farmacopeicos
•
(1229) Esterilización de Artículos Farmacopeicos
•
(1229 .4) Esterilización de Líquidos por Filtración
•
Relacionadas con el Producto
Guía de los Capítulos Generales/ Diagrama de Capítulos 35
USP 39
Diagrama 5. Medicamentos Biológicos de Origen Natural y Recombinante (Continuación) Impurezas
Capítulo
ldentiflcación
Caracterización
(1251) Pesada en una
Equipamiento
Pruebas Mise.
Descripción
Seguridad
Valoración
Fisicoquímica
Relacionadas con el Proceso
Relacionadas con el Producto
•
Balanza Analítica (1660) Envases de Vi-
drio-Eva/uación de fa Durabilidad de la Superficie Interna
•
(1661) Evaluación de
Sistemas de Envases Plásticos y sus Materia/es de Construcción con Respecto a su lmpacto sobre la Seguridad del Usuario
•
(1663) Evaluación de
Sustancias Extraíbles Relacionadas con Envases Farmacéuticos y Sistemas de Administración
•
(1664) Evaluación de
Sustancias Lixiviables en Medicamentos Relacionadas con Envases Farmacéuticos y Sistemas de Administración (1736) Aplicaciones de
la Espectrometría de Masas
• •
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
(1761) Aplicaciones de
la Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear (1787) Medición de
Partículas Subvisibles en Inyectables de Proteínas Terapéuticas
•
(1 788) Métodos para
la Determinación de Partículas en Inyectables y Soluciones Oftálmicas (1852) Espectroscopía
de Absorción Atómica-Teoría y Práctica ( 185 3) Espectroscopía
de FluorescenciaTeoría y Práctica (1854) Espectroscopía
en el Infrarrojo Medio-Teoría y Práctica ( 185 7) Espectroscopía
Ultravioleta-VisibleTeoría y Práctica
• •
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
36 Diagrama de Capítulos / Guía de los Capítulos Generales
USP 39
Diagrama 6. Vacunas Impurezas
Capítulo
ldentifieación
Caracterizaclón
Equipamiento
Pruebas Mise.
Descrlpclón
Seguridad
Valoración
Fisicoquímica
(11) Estándares de Referencia USP
•
(31) Aparatos Volumétricos
• •
(41) Balanzas (63) Pruebas para Micap/asmas
• •
(71) Pruebas de Esterilidad (81) Antibióticos-Va/oraciones Microbiológicas
•
(85) Prueba de Endotoxinas Bacterianas
•
(88) Pruebas de Reactividad Biológica, In Vi-
•
VD
(90) Suero Fetal Bovino-Atributos de Ca/idad y Pruebas de Funcionalidad
•
(111) Diseño y Análisis de Valoraciones Biológicas
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
(151) Prueba de Pirógenos
• •
(341) Agentes Antimicrobianos-Contenido ( 621 ) Cromatografía
Relacionadas con el Producto
•
(1) Inyectables
(660) Envases-Vidrio
Re lacionadas con el Proceso
•
•
(661 ) Sistemas de Envases Plásticos y sus Materiales de Construcción ( 661 .1) Materiales Plásticos de Construcción
• •
•
•
(661.2) Sistemas de Envases Plásticos para Uso Farmacéutico
• •
(671) Envases-Pruebas de Desempeño ( 69 5) Cristalinidad (697) Contenido en Envases para Inyectables
•
(731) Pérdida por Secado (736) Espectrometría de Masas
•
•
•
•
• •
( 761 ) Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear
•
•
•
•
•
(786) Estimación de la Distribución del Tamaño de Partícula por Tamizado Analítico
•
Guía de los Capítulos Generales/ Diagrama de Capítulos 37
USP 39
" ) D"1ag rama 6Vacunas (Contmuaoon
Impurezas
Capítulo
ldentificación
Caracterización
Equipamiento
Pruebas Mise.
(787) Partículas Subvisibles en Inyectables de Proteínas Terapéuticas
•
(788) Partículas en Inyectables
•
(790) Partículas Visibles en Inyectables
•
Descripción
Seguridad
Valoración
•
Fisicoquímica
(85 3) Espectroscopía de Fluorescencia
• •
(854) Espectroscopía en el Infrarrojo Medio
•
• • • •
(855) Nefelometría, Turbidimetría y Comparación Visual
•
•
(857) Espectroscopía Ultravioleta-Visible
•
•
(791) pH (852) Espectroscopía de Absorción Atómico
(921) Determinación de Agua
• •
•
(1024) Suero Bovino (1030) Capítulos de Valoraciones Biológicas-/nformación General y Glosario
•
•
•
(1032) Diseño y Desarrollo de Va/oraciones Biológicas
•
•
•
(1033) Validación de Valoraciones Biológicas
•
•
•
(1034) Análisis de Va/oraciones Biológicas
•
•
•
(1041) Productos Biológicos
Relacionadas con el Proceso
•
(1044) Crioconservación de Células
•
•
•
•
•
•
•
(1053) Electroforesis Capilar
•
•
•
•
•
(1054) Artículos Obtenidos por Biotecnología-lsoelectroenfoque
•
•
•
•
•
(1055) Artículos Obtenidos por Biotecnología-Mapeo de Péptidos
•
•
•
•
•
(1056) Artículos Obtenidos por Biotecnología-Electroforesis en Gel de Poliacrilamida
•
•
•
•
•
(1052) Artículos Obtenidos por Biotecnología-Análisis de Aminoácidos
Relacionadas con el Producto
38 Diagrama de Capítulos /
USP 39
Guía de los Capítulos Generales , ) D1aqrama 6. Vacunas (Continuacion
Impurezas
Capítulo (1057) Artículos Obtenidos por Biotecnología-Valoración de Proteínas Totales
ldentificaclón
•
Caracterlzaclón
Equipamiento
Pruebas Mise.
Descrlpclón
Seguridad
Valoración
•
•
(1065) Cromatografía fónica
Flslcoquímica
•
Relaclonadas con el Proceso
Relacionadas con el Producto
•
•
(1084) Análisis de G/icoproteínas y Glicanos-Consideraciones Generales
•
•
•
(11 02) Métodos de Pruebas lnmunológicas-Consideraciones Generales
•
•
•
•
(1103) Métodos de Pruebas lnmunológicas-Ensayo por Inmunoadsorción Ligado a Enzimas (ELISA)
•
•
•
•
(1104) Métodos de Pruebas lnmunológicas-Análisis por Inmunotransferencia
•
•
•
•
(1105) Métodos de Pruebas lnmunológicas-Resonancia de Plasmón Superficial
•
•
(1113) Caracterización, Identificación y Tipificación de Cepas Microbianas
•
(1121) Nomenclatura
•
(1126) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Extracción, Detección y Secuenciación
•
•
•
(1127) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Amplificación
•
•
•
(1128) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Micromatrices
•
(1129) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Genotipificación
•
(1130) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Enfoques para Detectar Trazas de Ácidos Nucleicos (Análisis de ADN Residual)
•
(1211) Esterilización y Garantía de Esterilidad de Artículos Farmacopeicos
•
(1229) Esterilización de Artículos Farmacopeicos
•
Guía de los Capítulos Generales/ Diagrama de Capítulos 39
USP 39
,, ) DI aarama 6 V acunas (Contmuaoon
Impurezas
Capítulo
ldentificaclón
Caracterización
Equipamiento
Pruebas Mise.
(1229 .4) Esterilización
de Líquidos por Filtración (1234) Vacunas para Uso Humano-Vacunas de Polisacáridos y G/icoconjugados (1235) Vacunas para
Uso Humano-Cansíderaciones Generales
•
•
•
•
•
Valoración
Flslcoquímica
•
•
•
(1251) Pesada en una
•
•
•
Relacionadas con el Producto
• •
•
Pruebas Virológicas Uso Humano-Vacunas Bacterianas
Seguridad
•
(1237) Métodos de (1238) Vacunas para
Descripción
Relacionadas con el Proceso
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Balanza Analítica (1660) Envases de Vi-
drio--Evaluación de la Durabilidad de la Superficie Interna
•
(1661) Evaluación de
Sistemas de Envases Plásticos y sus Materia/es de Construcción con Respecto a su lmpacto sobre la Seguridad del Usuario
•
(1663) Evaluación de
Sustancias Extraíbles Relacionadas con Envases Farmacéuticos y Sistemas de Administración
•
(1664) Evaluación de
Sustancias Lixiviab/es en Medicamentos Re/acionadas con Envases Farmacéuticos y Sistemas de Administración (1 736) Aplicaciones de
la Espectrometría de Masas (1761) Aplicaciones de la Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear
• •
•
•
•
•
•
(1 787) Medición de
Partículas Subvisibles en Inyectables de Proteínas Terapéuticas
•
(1 788) Métodos para
Ja Determinación de Partículas en Inyectables y Soluciones Oftálmicas (1852) Espectroscopía
de Absorción Atómica-Teoría y Práctica
•
•
•
40 Diagrama de Capítulos / Guía de los Capítulos Generales
USP 39
Diagrama 6. Vacunas (Continuación) Impurezas
Capítulo
ldentlfie ación
Caracterlzaclón
Equipamiento
Pruebas Mise.
Descrlpclón
Seguridad
Valoración
Flslcoquímica
(1853) Espectroscopía de FluorescenciaTeoría y Práctica
•
•
(1854) Espectroscopía en el Infrarrojo Medio-Teoría y Práctica
•
•
(185 7) Espectroscopía Ultravioleta-VisibleTeoría y Práctica
•
•
DI agrama 7
Relaclonadas con el Proceso
Relacionadas con el Producto
sangre y Hemoderva 1 d os Impurezas
Capítulo
ldentlflcaclón
Caracterlzaclón
Equipamiento
Descripclón
Segurldad
•
•
(31) Aparatos Volumétricos
•
(41) Balanzas
•
(51 ) Pruebas de Eficacia Antimicrobiana
•
(62) Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Microorganismos Específicos
•
(71) Pruebas de Esterilidad
•
(85) Prueba de Endotoxinas Bacterianas
• •
(87) Pruebas de Reactividad Biológica, In Vitro (88) Pruebas de Reactividad Biológica, In Vi-
Relacionadas con el Producto
•
•
•
•
•
•
•
VO
(111) Diseño y Análisis de Valoraciones Biológicas
•
(151) Prueba de Pirógenos
(197) Pruebas de /dentificación Espectrofotométricas
Flslcoquímica
•
(61) Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiono
(191) IdentificaciónPruebas Generales
Valoración
•
(1) Inyectables (11) Estándares de Referencia USP
Pruebas Mise.
Relaclonadas con el Proceso
• •
• •
Guía de los Capítulos Generales/ Diagrama de Capítulos 41
USP 39
DI agrama 7
sangrey Hemod e rlva dos (Con t'muaoon Impurezas
Capítulo
ldentlflcaclón
Caracterlzaclón
Equipamiento
Pruebas Mise.
Descripclón
Segurldad
(208) Valoración de Anti-Factor Xa y AntiFactor /la para Heparinas No Fraccionadas y Heparinas de Bajo Peso Molecular (209) Determinaciones de Peso Molecular de Heparinas de Bajo Peso Molecular
(631) ColoryAcromatismo
Flslcoquímica
•
• •
•
•
•
•
•
• • •
• •
•
(660) Envases-Vidrio
•
(661) Sistemas de Envases Plásticos y sus Materiales de Construcción
•
(661.1 ) Materiales Plásticos de Construcción
•
(661.2) Sistemas de Envases Plásticos para Uso Farmacéutico
•
(671) Envases-Pruebas de Desempeño
•
•
(695) Cristalinidad (697) Contenido en Envases para Inyectables
•
(731) Pérdida por Secado (736) Espectrometría de Masas
•
•
(761) Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear
•
•
• •
(785) Osmolalidad y Osmolaridad (787) Partículas Subvisibles en Inyectables de Proteínas Terapéuticas
• • •
•
(788) Partículas en Inyectables
• •
(790) Partículas Visibles en Inyectables
•
(791) pH (852) Espectroscopía de Absorción Atómica
•
(853) Espectroscopía de Fluorescencia
• •
(854) Espectroscopía en el Infrarrojo Medio
Relacionadas con el Producto
•
(341) Agentes Antimicrobianos-Contenido (621) Cromatografía
Valoración
Relacionadas con el Proceso
• • •
• • •
• • • •
• • •
42 Diagrama de Capítulos / Guía de los Capítulos Generales
DI agrama 7
USP 39
., ) sangrey Hemode rivados (Contmuacion
Impurezas
ldentlflcaclón
Capítulo (855) Nefelometría, Turbidimetría y paración Visual
Ultravioleta-Visible
Equipamiento
Pruebas Mise.
Descrlpción
Seguridad
Valoración
•
•
• •
•
•
•
•
•
•
•
• •
• •
Com-
(85 7) Espectroscopía
Caracterlzaclón
•
Flslcoquímica
Relacionadas con el Proceso
• •
• • •
(921) Determinación de Agua
Relacionadas con el Producto
(1030) Capítulos de Valoraciones Biológicas-lnformación General y Glosario
(1032) Diseño y Desarrol/o de Valoraciones Biológicas
(1033) Validación de Valoraciones Biológicas
(1034) Análisis de Va/oraciones Biológicas
•
(1035) Indicadores Bio-
•
lógicos para Esterilización
(1041 ) Productos Bioló-
•
gicos
(1044) Crioconserva-
•
ción de Células
(1052) Artículos Obtenidos por Biotecnología-Análisis de Aminoácidos
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
nidos por Biotecnología-Valoración de Proteínas Totales
•
•
•
•
•
(1065) Cromatografía
•
(1053) Electroforesis Capilar
(1 054) Artículos Obtenidos por Biotecnología-lsoe/ectroenfoque
(1055) Artículos Obtenidos por Biotecnología-Mapeo de Péptidos
(1056) Artículos Obtenidos por Biotecno/ogía-Electroforesis en Gel de Poliacrilamida
(1057) Artículos Obte-
fónica
(1102) Métodos de Pruebas lnmunológicas-Consideraciones Generales
•
•
•
•
•
•
•
•
(1103) Métodos de Pruebas lnmunológicas-Ensayo por Inmunoadsorción Ligado a Enzimas (ELISA)
Guía de los Capítulos Generales/ Diagrama de Capítulos 43
USP 39
D aqrama 7. Sanqre y Hemoder1vad os (Contmuacion) Impurezas
Capítulo (1104) Métodos de Pruebas lnmunológicas-Análisis por Inmunotransferencia (1105) Métodos de Pruebas lnmunológicas-Resonancia de Plasmón Superficial
ldentlflcación
•
Caracterlzaclón
Equipamiento
Pruebas Mise.
Descrlpclón
Segurldad
Valoración
•
• •
•
(1106) Ensayos de Inmunogenicidad-Diseño y Validación de lnmunoensayos para Detectar Anticuerpos Antifármacos
•
(1106.1) Ensayos de lnmunogenicidadDiseño y Validación de Ensayos para Detectar Anticuerpos Neutralizantes Antifármacos
•
(1111) Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Criterios de Aceptación para Preparaciones Formacéuticas y Sustancias de Uso Farmacéutico
•
(111 3) Caracterización, Identificación y Tipificación de Cepas Microbianas
•
(1116) Control Microbiológico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento Aséptico
• •
(1121) Nomenclatura (1125) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Generalidades
•
(11 30) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Enfoques para Detectar Trazas de Ácidos Nucleicos (Análisis de ADN Residual)
•
Flslcoauímlca
Relaclonadas con el Proceso
(1180) Plasma Humano
•
(1211) Esterilización y Garantía de Esterilidad de Artículos Farmacopeicos
•
(1229) Esterilización de Artículos Farmacopeicos
•
(1229 .4) Esterilización de Líquidos por Filtración
•
(1237) Métodos de Pruebas Virológicas
•
Relaclonadas con el Producto
•
44 Diagrama de Capítulos / Guía de los Capítulos Generales
USP 39
Diagrama 7. Sangre y Hemoderlvados (Continuación) Impurezas
Capítulo
ldentlflcaclón
Caracterlzaclón
Equipamiento
Pruebas Mise.
(1240) Análisis de Virus en Plasma Humano para Fabricación Posterior
Descrlpclón
Segurldad
Valoración
Flsicoquímica
Relacionadas con el Proceso
Relacionadas con el Producto
•
(1251) Pesada en una Balanza Analítica
•
(1660) Envases de Vidría-Evaluación de la Durabilidad de Ja Superficie Interna
•
(1661) Evaluación de Sistemas de Envases Plásticos y sus Materia/es de Construcción con Respecto a su fmpacto sobre fa Seguridad del Usuario
•
(1663) Evaluación de Sustancias Extraíbfes Relacionadas con Envases Farmacéuticos y Sistemas de Administración
•
(1664) Evaluación de Sustancias Lixiviables en Medicamentos Refacionadas con Envases Farmacéuticos y Sistemas de Administración
•
(1736) Aplicaciones de la Espectrometría de Masas
•
•
•
•
•
•
(1761) Aplicaciones de Ja Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear
•
•
•
•
•
•
(1787) Medición de Partículas Subvisibles en Inyectables de Proteínas Terapéuticas
•
(1788) Métodos para la Determinación de Partículas en Inyectables y Soluciones Oftálmicas
•
(1852) Espectroscopía de Absorción Atómica-Teoría y Práctica
•
•
•
•
•
(1853) Espectroscopía de FluorescenciaTeoría y Práctica
•
•
•
•
•
(1854) Espectroscopía en el Infrarrojo Medio-Teoría y Práctica
•
•
•
•
•
(1857) Espectroscopía Ultravioleta-VisibleTeoría y Práctica
•
•
•
•
•
Guía de los Capítulos Generales/ Diagrama de Capítulos 45
USP 39
Diagrama 8. Productos Derivados de Células, Genes y Tejidos Pruebas Específlcas1,2
Pruebas Universales
Capítulo
ldentlflcaclón
Valoración
Biocompatibilldad
Cuestlones Microblológlcas y de Esterllldad
Cuestlones del Producto
Caracterlzaclón
•
(31) Aparatos Volumétricos
• •
(41) Balanzas (61) Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano
•
(62) Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Microorganismos Específicos
•
(63) Pruebas para Micoplasmas
•
(71) Pruebas de Esterilídad
• •
(85) Prueba de Endotoxinas Bacterianas (87) Pruebas de Reactividad Biológica, In Vitro
• •
(88) Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo (90) Suero Fetal BovinoAtributos de Calidad y Pruebas de Funcionalidad
•
(92) Factores de Crecímiento y Citokinas Usados en la Fabricación de Productos de Terapia Cefular
•
(111) Diseño y Análisis de Valoraciones Biológicas
•
(151) Prueba de Pirógenos
•
(161) Dispositivos Médicos-Pruebas de Endotoxinas Bacterianas y Pirógenos
•
(381) Tapones Elastoméricos para Inyectables ( 621) Cromatografía
Equipamiento
•
(1) Inyectables (11) Estándares de Reterenda USP
Cuestiones de Producción
• •
•
(785) Osmolalidad y Osmolaridad
•
(787) Partículas Subvisibles en Inyectables de Proteínas Terapéuticas
•
(788) Partículas en lnyectables
•
(79l)pH
•
1
2
Para la prueba de Funcionalidad, ver (881) Resistencia a la Tensión. Para la prueba de Agua, ver (1231) Agua para Uso Farmacéutico.
USP 39
46 Diagrama de Capítulos / Guía de los Capítulos Generales
Diagrama 8. Productos Derivados de Células, Genes y Tejidos (Continuación) Pruebas Específicasl,2
Pruebas Universales
Capítulo
ldentlflcaclón
Valoración
Blocompatlbilidad
(797) Preparación Magistrol-Preparaciones Estériles
Cuestiones Microbiológicas y de Esterilldad
Cuestiones de Producción
Cuestiones del Producto
Caracterización
•
(905) Uniformidad de Unidades de Dosificación
• • • •
(911) Viscosidad-Métodos Capilares (912) Viscosidad-Métodos Rotatorios (913) Viscosidad-Método de Bola Rodante
•
(1024) Suero Bovino (1027) Citometría de Flujo (1030) Capítulos de Va/oraciones Biológicas-Información General y Glosario
Equipamiento
• •
•
(1031) Biocompatibilidad de los Materiales Usados en Envases de Medicamentas, Dispositivos Médicos e Implantes
• •
(1032) Diseño y Desarro/lo de Valoraciones Biológicas
•
•
•
(1033) Validación de Va/oraciones Biológicas
•
(1034) Análisis de Valoraciones Biológicas
•
• •
• •
(1041) Productos Biológi-
•
CDS
(1043) Materiales Auxiliares para Productos Ce/ulares, Génicos y de lngeniería Tisular (1044) Crioconservación de Células
• •
•
(1 046) Productos Derivados de Células y Tejidos (1047) Productos de Teropía Génica
•
• •
•
• •
(1 048) Calidad de Produetos Biotecnológicos: Análisis de la Construcción Expresab/e en Células Usadas para la Producción de Productos Proteínicos Obtenidos con ADN Recombinante
•
(1049) Calidad de Produetos Biotecnológicos: Pruebas de Estabilidad de Productos Biotecnológicos o Biológicos
•
1 2
Para la prueba de Funcionalidad, ver (881) Resistencia a Ja Tensión. Para la prueba de Agua, ver (1231) Agua para Uso Farmacéutico.
Guía de fas Capítulos Generales/ Diagráriia dE' Capfürl~ 47
USP 39
' ) Diagrama 8. Productos Derivados de Celulas, Genes y Te¡ºId os (Continuacion Pruebas Específicas 1, 2
Pruebas Universales
Capítulo
ldentlficación
Valoración
Biocompatibilidad
(1 050) Evaluación de la Seguridad Viral en Produetos Biotecnológicos Obtenidos de Líneas Ce/u/ares de Origen Humano o Animal
CuestionesMicrobiológicas y de Esterilidad
Cuestiones de Producción
Cuestiones del Producto
Equipamiento
Caracterización
•
(1051) Limpieza de Materia/ de Vidrio
•
(1052) Artículos Obtenidos por BiotecnologíaAnálisis de Aminoácidos
•
(105 3) Electroforesis Capilar
•
(1054) Artículos Obtenidos por Biotecnologíalsoe/ectroenfoque
•
(1055) Artículos Obtenidos por BiotecnologíaMapeo de Péptidos
•
(1056) Artículos Obtenidos por BiotecnologíaElectroforesis en Gel de Poliacrilamida
•
(105 7) Artículos Obtenidos por BiotecnologíaValoración de Proteínas Totales
•
(1074) Guías para Ja Evaluación de la Seguridad Biológica de Jos Excipientes
•
(1084) Análisis de G/icoproteínas y GlicanosConsideraciones Generales
•
(1086) Impurezas en Fármacos y Productos Farmacéuticos
•
(11 02) Métodos de Pruebas InmunológicasConsideraciones Generales
•
•
•
(1103) Métodos de Pruebas Inmunológicas-Ensayo por lnmunoadsorción Ligado a Enzimas (ELISA)
•
•
•
(1104) Métodos de Pruebas InmunológicasAnálisis por lnmunotransferencia
•
•
(1113) Caracterización, Identificación y Tipificación de Cepas Microbionas 1
•
Para la prueba de Funcionalidad, ver (881) Resistencia a la Tensión.
2 Para la prueba de Agua, ver (1231)
Agua para Uso Farmacéutico.
48 Diagrama de Capítulos / Guía de los Capítulos Generales
USP 39
Diagrama 8. Productos Derivados de Células, Genes y Telldos (Continuación) Pruebas Específicas 1,2 Pruebas Universales
Capítulo
ldentlflcaclón
Valoración
Blocompatlbllldad
(1116) Control Microbiológico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento Aséptico
Cuestlones MIcroblológlcas y de Esterllldad
Cuestiones de Producción
Cuestlones del Producto
Equipamiento
Caracterlzaclón
• •
(1121) Nomenclatura (1126) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Extracción, Detección y Secuenciación
•
•
(1127) Técnicas Basadas en Ácidos NucleicosAmplificación
•
•
(1128) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Microma trices
•
(1129) Técnicas Basadas en Ácidos NucleicosGenotipificación
•
(1130) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Enfoques para Detectar Trazas de Ácidos Nucleicos (Análisis de ADN Residual)
•
(1151) Formas Farmacéuticas
•
(1184) Pruebas de Sensibilización
•
(1208) Pruebas de Esterilidad-Validación de Sistemas Aisladores
•
(1 211 ) Esterilización y Garantía de Esterilidad de Artículos Farmacopeicos
•
(1227) Validación de Recuperación Microbiana en Artículos Farmacopeicos
•
(1229) Esterilización de Artículos Farmacopeicos
• • •
(1229.3) Monitoreo de la Biocarga (1229.4) Esterilización de Líquidos por Filtración (1237) Métodos de Pruebas Virológicas
(1285) Preparación de Muestras Biológicas para Análisis Histológico e Inmunohistoquímico 1 2
•
•
(1251) Pesada en una Balanza Analítica
•
•
Para la prueba de Funcionalidad, ver (881) Resistencia a la Tensión. Para la prueba de Agua, ver (1231) Agua para Uso Farmacéutico.
•
•
Guía de los Capítulos Generales / Diagrama de Capítulos 49
USP 39
Diagrama 8. Productos Derivados de Células, Genes y Telldos (Continuación) Pruebas Especiflcas1,2 Pruebas Universales
Capitulo
ldentlflcaclón
(1285 .1 ) Tinción con Hemotoxilina y Eosina de Cortes de Tejidos para Examen Microscópico
Valoración
Blocompatlbllldad
CuestlonesMIcroblológlcas y de Esterllldad
Cuestiones de Producción
Cuestlones del Producto
Equipamiento
•
•
Caracterlzaclón
•
(1787) Medición de Partícu/as Subvisibles en Inyectables de Proteínas Terapéuticas
•
(1788) Métodos para la Determinación de Partícu/as en Inyectables y Soluciones Oftálmicas
•
1
Para la prueba de Funcionalidad, ver (881) Resistencia a la Tensión.
2 Para la prueba de Agua, ver (1231)
Capitulo (7) Etiquetado (17) Etiquetado de Envases de Medicamentos de Venta Bajo Receta Médica (87) Pruebas de Reactividad Biológica, In Vitro (88) Pruebas de Reactividad Bio/óqica, In Vivo (381) Tapones Elastoméricos para Inyectables (659) Requisitos de Envasado y Almacenamiento (660) Envases-Vidrio (661) Sistemas de Envases Plásticos y sus Materiales de Construcción (661 .1 ) Materiales Plásticos de Construcción (661.2) Sistemas de Envases Plásticos para Uso Farmacéutico (670) Envases-Componentes Auxiliares (671) Envases-Pruebas de Desempeño (698) Volumen de Entreqa (735) Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X (755) Llenado Mínimo (1066) Ambientes Físicos que Favorecen el Uso Seguro de los Medicamentos
Agua para Uso Farmacéutico.
Fabricante
Diagrama 9. Distribución de Medicamentos Distribución Mayorista Transportista de Muestras
Reenvasador
Farmacia
Médico
• •
• • • • • • • • • • • • •
• • • • • •
•
• • • • •
•
•
•
•
•
• • •
•
•
(1079) Buenas Prácticas de Almacenamiento y Distribución para Medicamentos
•
•
•
•
•
•
(1118) Dispositivos de Manitoreo-Tiempo, Temperatura y Humedad
•
•
•
•
•
•
•
50 Diagrama de Capítulos / Guía de los Capítu/051 Generales
USP 39
" ) DI agrama 9 DI strfbucon I' de Me di cament os (Continuac1on
Capítulo
Fabricante
(1136) Envasado y Reenvasado-Envases Unitarios (1151) Formas Farmacéuticas (1152) Medicamentos Veterinarios Usados en Alimentos para Animales (11 77) Buenas Prácticas de Envasado
Transportista
Mayorista
Distribución de Muestras
Farmacia
•
• • • •
Médico
• •
•
•
•
(11 78) Buenas Prácticas de Reenvasado (1191) Consideraciones sobre Estabilidad en la Práctica de Dispensación
Reenvasador
• •
• •
•
(1265) Información Escrita de los Medicamentos RecetadosGuías
•
(1660) Envases de Vidrio-Evaluación de la Durabilidad de la Superficie Interna
•
•
•
(1661) Evaluación de Sistemas de Envases Plásticos y sus Materiales de Construcción con Respecto a su Impacto sobre la Sequridad del Usuario
•
•
•
(1663) Evaluación de Sustancias Extra/bles Relacionadas con Envases Farmacéuticos y Sistemas de Administración
•
(1664) Evaluación de Sustancias Lixiviables en Medicamentos Relacionadas con Envases Farmacéuticos y Sistemas de Administración
• Diagrama 10a. Mlcroblolog1a-Productos No Esteriles
Capítulo (61) Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano
Recuento Microbiano
•
(62) Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Microorganismos Específicos (63) Pruebas para Micoplasmas (61 O) Métodos de Muestreo Microbiológico Alternativos para Productos Nasales e Inhaladores No Estériles (1111) Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Criterios de Aceptación para Preparaciones Farmacéuticas y Sustancias de Uso Farmacéutico
• •
(111 3) Caracterización, Identificación y Tipificación de Cepas Microbianas
•
•
(2022) Procedimientos Microbiológicos para Comprobar la Ausencia de Microorganismos Específicos-Suplementos Nutricionales y Dietéticos (2023) Atributos Microbiológicos de los Suplementos Nutricionales y Dietéticos No Estériles
• • • • •
(1115) Control de Biocarga de Fármacos y Medicamentos No Estériles (2021) Pruebas de Recuento Microbiano-Suplementos Nutricionales y Dietéticos
Ausencia de Microorganismos Objeta bles
• •
•
USP 39
Guía de los Capítulos Generales/ Diagrama de Capítulos 51
o·1agrama 10b
Capítulo
Pruebas de Esterilidad
Indicadores Biológicos-Pruebas de Resistencia (63) Pruebas para Micoplasmas
Micoplasma
Procesami ento Aséptico
' 11 es p ro d uctos Ester MI ero bl oog1a1 Montaje 2
Filtraclón
Montaje
Otro
Esterilización Final Esterilizaclón Final
(55)
(71)
Pruebas de Esterili-
dad (151)
Calor Húmedo
Calor Seco
Radlaclón
Óxido de Etileno
•
•
•
•
•
•
•
•
• •
Prueba de Piróge-
•
nos Indicadores Biológicos para Esterilización
(1035)
Desinfectantes y Antisépticos
•
Determinación de Actividad de Agua en Productos Formacéuticos No Estériles
•
(1072) (1112)
Caracterización, Identificación y Tipificación de Cepas Microbianas
(1113)
•
Control Microbiológico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento Aséptico
•
•
(1116)
•
•
Óptimas Prácticas de Laboratorio Microbiológico
(111 7)
•
Envasado de Produetos Estériles-Evaluación de Integridad
(1207)
Pruebas de Esterilidad-Validación de Sistemas Aisladores
(1208)
•
• •
•
EsterilizaciónIndicadores e Integradores Químicos y Físicoquímicos
(1209)
Esterilización y Garantía de Esterilidad de Artículos Farmacopeicos
•
•
(1211)
•
•
Productos Farmacéuticos con Esterilización Terminal-Liberación Paramétrica
•
•
•
•
•
•
•
•
(1222)
•
Validación de Métodos Microbiológicos Alternativos
(1223)
Esterilización de Artículos Farmacopeicos
(1229)
• •
•
•
Esterilización con Vapor de Agua por Contacto Directo
(1229 .1)
1 2
Para los límites de endotoxinas, ver (85) Prueba de Endotoxinas Bacterianas. Para BFS, FFS y SFS, ver (1116) Control Microbiológico y Monitoreo de Ambientes
•
• de Procesamiento Aséptico.
Fase Líquida
Fase de Vapor
52 Diagrama de Capítulos / Guía de los Capítulas Generales
Capítulo
Pruebas de Esterllldad
USP 39
" ) ' 11es 1 (Contmuaoon D agrama 10b.Mero blo 1og1a-Productos Ester Esterlllzaclón Flnal ProMonta)e2 cesaEsteÓxlmlenrlllza- Calor Rado de Micoto FiiplasAséptraMonclón HúCalor dlaEt lleOtro Final medo Seco clón no ma tlco clón taje
(1229 .2) Esterilización
• •
con Calor Húmedo de Líquidos Acuosos
(1229.3) Monitoreo de
• •
la Biocarga
(1229.4) Esterilización de Líquidos por Filtración
•
•
•
(1229.6) Esterilización
•
•
en Fase Líquida
(1229.7) Esterilización
•
por Gases
(1229.8) Esterilización
•
por Calor Seco
(1229.1 O) Esterilización
•
por Radiación
(1229 .11 ) Esterilización
•
en Fase de Vapor 1 2
Fase de Vapor
Fase Líqulda
•
Para los límites de endotoxinas, ver (85) Prueba de Endotoxinos Bacterianas. Para BFS, FFS y SFS, ver (1116) Control Microbiológico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento Aséptico.
Diagrama 11. Ingredientes de Suplementos D1etetlcos
No Botánicosl,2
Botánicos
Capítulo (7) Etiquetado (91) Valoración de Pantotenato de
Descripción
Identificaclón
Contenido
Segurldad/ Pureza
Caracterizaclón Flslcoquímlca
• • •
(115) Valoración de Dexapantenol (171) Valoración de Actividad de Vitamina B,, trofotométricas
(201) Prueba de Identificación por Cromatografía en Capa Delgada
(202) Identificación de Aceites Fijos por Cromatografía en Capa Delgada
Valoración de Vitamlnas3
•
Calcio
(197) Pruebas de Identificación Espec-
Otro
•
• •
(203) Procedimiento de Cromatografía en Capa Delgada de Alta Resolución para Identificación de Artículos de Oriqen Botánico
(211) Arsénico (231) Metales Pesados (233) Impurezas Elementales-Procedimientos
(251) Plomo (261) Mercurio (281) Residuo de Incineración (401) Grasas y Aceites Fijos
•
• • • • • •
(411 ) Valoración de Ácido Fálico
Para complejos, ver Sustancias Obtenidas por Biotecnología (Diagrama 2). 2 Para Minerales, Aminoácidos y Metabolitos no complejos, ver Fármacos Activos No Complejos (Diagrama 1). 3 Ver también Fármacos Activos No Complejos (Diagrama 7). 1
•
•
Guía de los Capítulos Generales/ Diagrama de Capítulos 53
USP 39
., ) DI agrama 11 . 1ngredl entes de sup1ementos DI eteticos (Continuac1on
No Botánicos 1,2
Botánicos
Capítulo
Descripción
Identificaclón
Contenido
Segurldad/ Pureza
Caracterizaclón Fislcoquímlca
Otro
(441) Valoración de Niacina o Niacinamida
• • •
(451) Volumetría con Nitrito (461) Determinación de Nitrógeno
•
(467) Disolventes Residuales
•
(481) Valoración de Riboflavina
• •
(5 31) Valoración de Tia mina (541) Volumetría (551 ) Valoración de Vitamina E (561) Artículos de Origen Botánico (563) Identificación de Artículos de Origen Botánico (565) Extractos Botánicos (571) Valoración de Vitamina A
• •
• •
• •
•
•
•
•
• •
(581) Valoración de Vitamina D
•
(591) Determinación de Cinc ( 611) Determinación de Alcohol
•
( 621) Cromatografía (730) Espectroquímica de Plasma
•
(731) Pérdida por Secado (733) Pérdida por Incineración (735) Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X
•
• • • • •
(736) Espectrometría de Masas (761) Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear (776) Microscopía Óptica
•
•
•
• • •
(852) Espectroscopía de Absorción Atómica
•
(853) Espectroscopía de Fluorescencia
• •
• • • •
•
• •
(79l)pH
(854) Espectroscopía en el Infrarrojo Medio (855) Nefelometría, Turbidimetría y Comparación Visual (85 7) Espectroscopía Ultravioleta-Visible (1064) Identificación de Artículos de Origen Botánico por Cromatografía en Capa Delgada de Alta Resolución
•
(111 3) Caracterización, Identificación y Tipificación de Cepas Microbianas
•
•
•
(1225) Validación de Procedimientos Farmacopeicos
• •
(1226) Verificación de Procedimientos Farmacopeicos 1
•
•
(1065) Cromatoqrafía fónica
(1181) Microscopía Electrónica de Barrido
Valoración de Vitaminas3
Para complejos, ver Sustancias Obtenidas por Biotecnología (Diagrama 2).
2 Para Minerales, Aminoácidos y Metabolitos no complejos, ver 3 Ver también Fármacos Activos No Complejos (Diagrama 1).
Fármacos Activos No Complejos (Diagrama 1).
USP 39
54 Diagrama de Capítulos /Guía de los Capítufos;Generales
" ) '1cos (Contmuac1on Diagrama 11. lngredi entes d e Sup ementos D etet
No Botánicos 1•2
Botánicos
Capítulo
Descripción
Identificaclón
Contenido
Caracterizaclón Flslcoquímlca
Segurldad/ Pureza
(1736) Aplicaciones de la Espectrometría de Masas
•
(1761) Aplicaciones de la Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear
•
(1852) Espectroscopía de Absorción Atómica-Teoría y Práctica
(1854) Espectroscopía en el Infrarrojo Medio-Teoría y Práctica (1857) Espectroscopía Ultravioleta-Visible-Teoría y Práctica
• • •
(2021) Pruebas de Recuento Microbiano---Suplementos Nutricionales y Dietéticos
•
(2022) Procedimientos Microbiológicos para Comprobar la Ausencia de Microorganismos Específicos-Suplementas Nutricionales y Dietéticos
•
(2023) Atributos Microbiológicos de Jos Suplementos Nutricionales y Dietéticos No Estériles
•
(2030) Información Complementaria para Artículos de Origen Botánico
•
(2232) Contaminantes Elementales en Suplementos Dietéticos
• •
(2250) Detección de Suplementos Dietéticos Irradiados 1 Para complejos, ver
Valoración de Vltamlnas3
•
• • • •
(1853) Espectroscopía de Fluorescencia-Teoría y Práctica
Otro
Sustancias Obtenidas por Biotecnología (Diagrama 2). Fármacos Activos No Complejos (Diagrama 1).
2 Para Minerales, Aminoácidos y Metabolitos no complejos, ver 3 Ver también Fármacos Activos No Complejos (Diagrama 1).
'1 cos DI agrama 12 p ro d uctos d e sup1ementos DI etet
Pruebas Específicas
Pruebas Universales Impurezas
Capítulo (7) Etiquetado (31 ) Aparatos Volumétricos
Descripclón
Identificaclón
Valoraclón/ Contenido
•
(91) Valoración de Pantotenato de Calcio
•
(171) Valoración de Actividad de Vitamina B,,
•
(201) Prueba de Identificación por Cromatografía en Capa Delgada
• • •
(202) Identificación de Aceites Fijos por Cromatografía en Capa Delgada
•
(197) Pruebas de Identificación Espectrofotométricas
lnorgánicas
Equipamiento
• •
(41 ) Balanzas
(191) Identificación-Pruebas Generales
Orgánlcas
Dlsolventes Reslduales
Pruebas de Desempeño
Seg urldad/ Pu reza
Guía de/Qt(apítulos Generales/ Diagrama de Capítulos 55
USP 39
Dlaqrama 12. Productos de Suplementos Dleté. t1cos (Continuacion) Pruebas Universales
Pruebas Específicas
Impurezas
Capítulo (203) Procedimiento de Cromatografía en Capa Delgada de Alta Resolución para Identificación de Artículos de Origen Botánico
Descripclón
Identificaclón
Valoraclón/ Contenido
Orgánlcas
lnorgánlcas
Dlsolventes Residuales
• •
(231) Metales Pesados
• •
(251) Plomo (261) Mercurio
•
(281 ) Residuo de Incineración (411 ) Valoración de Ácido Fólico
• •
(441) Valoración de Niacina o Niacinamida
•
(451) Volumetría con Nitrito
•
(466) Impurezas Comunes (467) Disolventes Residuales
•
•
(5 31 ) Valoración de Tia mina
•
(541 ) Volumetría (551) Valoración de Vitamina E
• •
(561) Artículos de Origen Botánico
•
•
•
(565) Extractos Botánicos (571) Valoración de Vitamina A
• •
(581) Valoración de Vitamina D (621) Cromatografía (730) Espectroquímica de Plasma
•
• •
•
(736) Espectrometría de Masas (776) Microscopía Óptica
• •
•
•
(801) Polarografía
(85 3) Espectroscopía de Fluorescencia (854) Espectroscopía en el Infrarrojo Medio
• • •
(855) Nefelometría, Turbidimetría y Comparación Visual (85 7) Espectroscopía Ultravioleta-Visible
•
•
(781) Rotación Óptica
(852) Espectroscopía de Absordón Atómica
• •
(733) Pérdida por Incineración (735) Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X
Segurldad/ Pu reza
•
(211 ) Arsénico
(563) Identificación de ArtícuJos de Origen Botánico
Equipamiento
Pruebas de Desempeño
•
•
• • • •
• • • • • •
• •
•
Guía de los Capítulos.,Generales
56 Diagrama de Capítulos /
USP 39
, ) D1aqrama 12. Prod uctos d e Sup' ementos D1etet1cos Continuacion Pruebas Universales
Pruebas Específicas
Impurezas
Capítulo
Descripción
Identificación
Valoración/ Contenido
Orgánicas
(1051) Limpieza de Material de Vidrio
lnorgánlcas
Dlsolventes Residuales
Equipamiento
Pruebas de Desempeño
•
(1064) Identificación de Artículos de Origen Botánico por Cromatografía en Capa Delgada de Alta Resolución
•
(l 065) Cromatografía Jónica
•
(1086) Impurezas en Fármacos y Productos Farmacéuti-
•
CDS
(1094) Cápsulas-Pruebas de Disolución y Atributos de Calidad Relacionados
•
(1113) Caracterización, /dentificación y Tipificación de Cepas Microbianas (1151) Formas Farmacéuticas (1216) Friabilidad de las Tabletas
Seg uridad/ Pu reza
• • •
(1251) Pesada en una Balanza Analítica
•
(1736) Aplicaciones de la Espectrometría de Masas
•
(1852) Espectroscopía de Absorción Atómica-Teoría y Práctica
•
•
•
(1853) Espectroscopía de Fluorescencia-Teoría y Práctica
•
•
•
(1854) Espectroscopía en el Infrarrojo Medio-Teoría y Práctica
•
•
•
(185 7) Espectroscopía Ultravioleta-Visible-Teoría y Práctica
•
•
•
(2021) Pruebas de Recuento Microbiano-Suplementos Nutricionales y Dietéticos
•
(2022) Procedimientos Microbiológicos para Comprobar la Ausencia de Microorganismos Específicos-Suplementas Nutricionales y Dietéticos
•
(2023) Atributos Microbiológicos de los Suplementos Nutriciona/es y Dietéticos No Estériles
•
(2030) Información Complementaría para Artículos de Origen Botánico
•
(2040) Desintegración y Disolución de Suplementos Dietéticos
•
(2091) Variación de Peso de Suplementos Dietéticos
•
Guía de los Capítulos Generales/ Diagrama de Capítulos 57
USP 39
Diagrama 12. Productos de Suplementos Dietéticos (Continuación) Pruebas Universales
Pruebas Específicas Impurezas
Descripción
Capítulo
Valoración/ Contenido
Identificación
Orgánicas
lnorgánlcas
(2232) Contaminantes Elementales en Suplementos Dietéticos
•
(2250) Detección de Suplementas Dietéticos Irradiados
•
Disolventes Reslduales
Equipamiento
Pruebas de Desempeño
Seg uridad/ Pu reza
•
(2750) Prácticas de Fabricación para Suplementos Dietéticos
•
•
•
Diagrama 13. Preparación Magistral-Sustancia/Preparación/Dispensación Impurezas
Capítulo (7) Etiquetado (11) Estándares de Reterenda USP
Global
Descripclón
ldentiflcaclón
Valoraclón
Envasado
Caracterlzaclón Flslcoquímlca
Segurldad
Equlpamlento
Relaclonadas con el Proceso
Relaclonadas con el Producto
• •
•
•
•
(31) Aparatos Volumétri-
•
•
• •
CDS
(41) Balanzas (61) Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano
•
(62) Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Microorganismos Específi-
•
CDS
(71) Pruebas de Esterilidad
•
(81) Antibióticos-Va/oraciones Microbiológicas
•
(85) Prueba de Endotoxinas Bacterianas (87) Pruebas de Reactividad Biológica, In Vitro
• •
(88) Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo
•
(111) Diseño y Análisis de Valoraciones Biológicas
•
(191) IdentificaciónPruebas Generales
•
(197) Pruebas de ldentificación Espectrofotométricas
•
(201) Prueba de ldentificación por Cromatografía en Capa Delgada
•
(202) Identificación de Aceites Fijos por Cromatografía en Capa Delgada
•
•
•
USP 39
58 Diagrama de Capítulos / Guía de los Capítulos Generales
-
Diagrama 13. Preparacion Maalstral-Sustancla/Preparac¡-on/Dlspensaclon (Continuacion) Impurezas
Capítulo
Global
(203) Procedimiento de Cromatografía en Capa Delgada de Alta Resolución para Identificación de Artículos de Origen Botánico
Descripclón
ldentlflcaclón
Valoraclón
En vasado
Caracterlzaclón Flslcoquímlca
Segurldad
Equlpamlento
(541) Volumetría
•
(621) Cromatografía (659) Requisitos de Envasado y Almacenamiento
• •
•
•
( 661) Sistemas de Envases Plásticos y sus Materia/es de Construcción
•
•
(661.1) Materiales Plásticos de Construcción
•
(661.2) Sistemas de Envases Plásticos para Uso Farmacéutico
•
(671) Envases-Pruebas de Desempeño
•
(730) Espectroquímica de Plasma
• •
•
• • •
•
•
•
• • •
•
(731) Pérdida por Secado (736) Espectrometría de Masas
•
(761) Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear
•
(781) Rotación Óptica (786) Estimación de la Distribución del Tamaño de Partícula por Tamizado Analítico
• • •
•
(795) Preparación Magistraf-Preparaciones No Estériles
•
(797) Preparación Magistral-Preparaciones Esté riles
•
(823) Fármacos para Tomografía de Emisión de Positrones para Uso en Preparaciones Magistrales, Investigación Clínica y Estudios Científicos
•
(831) Índice de Retraeción
(854) Espectroscopía en el Infrarrojo Medio
• • •
• •
(660) Envases-Vidrio
(853) Espectroscopía de Fluorescencia
Relacionadas con el Producto
•
(231) Metales Pesados
(852) Espectroscopía de Absorción Atómica
Relaclonadas con el Proceso
• • •
• • •
• •
• •
• •
• •
Guía de los Capítulos Generales/ Diagrama de Capítulos 59
USP 39
., M ag1stra 1DI agrama 13 p reparac1on
., ) ,, /D"1spensacI'on (Contmuaoon . /P reparac1on sustanc1a
Impurezas
Capítulo
Global
Descripción
ldentlficaclón
(855) Nefelometría, Turbidimetría y Comparación Visual (85 7) Espectroscopía Uftravioleta-Visible
•
Valoraclón
Envasado
Caracterizaclón Fisicoquímica
Seguridad
Equipamiento
Reladonadas con el Proceso
•
•
•
•
•
•
•
• •
(9 21 ) Determinación de Agua (1015) Aparatos Automatizados de Síntesis Radioquímica
•
(1031) Biocompatibilidad de los Materiales Usados en Envases de Medícomentos, Dispositivos Médicos e Implantes
•
(l 052) Artículos Obtenidos por BiotecnologíaAnálisis de Aminoácidos
•
•
(1053) Electroforesis Capilar
•
•
(l 054) Artículos Obtenidos por Biotecnologíalsoelectroenfoque
•
•
(1055) Artículos Obtenidos por BiotecnologíaMapeo de Péptidos
•
•
(1056) Artículos Obtenidos por BiotecnologíaElectroforesis en Gel de Poliacrilamida
•
•
(1057) Artículos Obtenidos por BiotecnologíaValoración de Proteínas Totales
•
•
(1064) Identificación de Artículos de Origen Botónico por Cromatografía en Capa Delgada de Alta Resolución
•
(1065) Cromatografía lónica
•
(1066) Ambientes Físicos que Favorecen el Uso Seguro de los Medicamentas
•
(1113) Caracterización, Identificación y Tipificación de Cepas Microbionas
• •
(1121) Nomenclatura (1136) Envasado y Reenvasado-Envases Unitaríos (1151) Formas Formacéuticas
•
•
Relacionadas con el Producto
USP 39
60 Diagrama de Capítulos / Guía de los Capítulos Generales
Dlaarama 13. Preparación Maalstral-Sustancla/Preparaclón/DlsPensaclón (Continuación) Impurezas
Capítulo (11 52) Medicamentos Veterinarios Usados en Alimentos para Animales (1160) Cálculos en la Práctica Farmacéutica (1163) Garantía de Calidad en la Preparación Magistral
Global
Descripclón
ldentlflcaclón
Valoración
En vasado
Caracterlzaclón Flslcoauímlca
Segurldad
• • •
(1176) Balanzas y Aparatos Volumétricos para Prescripciones
•
(1191) Consideraciones sobre Estabilidad en la Práctica de Dispensación
•
(1229) Esterilización de Artículos Farmacopeicos (1229.2) Esterilización con Calor Húmedo de Líquidos Acuosos
• •
(1229.3) Monitoreo de la Biocarqa
•
(1229.4) Esterilización de Líquidos por Filtración
•
(1229.6) Esterilización en Fase Líquida (1229.7) Esterilización por Gases
• •
(1229.8) Esterilización por Calor Seco
•
(1229 .1 O) Esterilización por Radiación
•
(1229 .11) Esterilización en Fase de Vapor
•
(1231) Agua para Uso Farmacéutico
•
(1251 ) Pesada en una Balanza Analítica (1265) Información Escrita de los Medicamentos Recetados-Guías
Equipamiento
• •
(1660) Envases de Vidrio-Eva/uación de la Durabilidad de la Superficie Interna
•
(1661) Evaluación de Sistemas de Envases Plásticos y sus Materiales de Construcción con Respecto a su Impacto sobre la Seguridad del Usuario
•
Relaclonadas con el Proce-
so
Relaclonadas con el Producto
Guía de los Capítulos Generales/ Diagrama de Capítulos 61
USP 39
Diagrama 13. Preparación Magistral-Sustancia/Preparación/Dispensación (Continuación) Impurezas
Capítulo
Global
Descripción
ldentlflcaclón
Valoraclón
Envasado
(1663) Evaluación de Sustancias Extraíbles Relacionadas con Envases Farmacéuticos y Sistemas de Administración
•
(1664) Evaluación de Sustancias Lixiviables en Medicamentos Relacionadas con Envases Farmacéuticos y Sistemas de Administración
•
Caracterlzación Fisicoquímlca
Seguridad
Equipamiento
Relaclonadas con el Proceso
Re lacionadas con el Producto
(1736) Aplicaciones de la Espectrometría de Masas
•
•
•
•
•
•
(1 761) Aplicaciones de la Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear
•
•
•
•
•
•
(1852) Espectroscopía de Absorción AtómicaTeoría y Práctica
•
•
•
•
•
(1853) Espectroscopía de Fluorescencia-Teoría y Práctica
•
•
•
•
•
(1854) Espectroscopía en el Infrarrojo MedioTeoría y Práctica
•
•
•
•
•
(185 7) Espectroscopía UItravioleta-Visible-Teoría y Práctica
•
•
•
•
•
Guía para los Capítulos Generales 63
USP 39
Guía para los Capítulos Generales (Para obtener la lista alfabética completa de los capítulos generales de esta Farmacopea, consulte "Capítulos Generales" en el índice.)
PRUEBAS V VALORACIONES GENERALES Requisitos Generales para Pruebas y Valoraciones (1) Inyectables ............................. 57 (2) Medicamentos Orales-Pruebas de Calidad del Producto ............................. 71 (3) Medicamentos Tópicos y Transdérmicos-Pruebas de Calidad del Producto .................. 76 (4) Medicamentos para Mucosas-Pruebas de Calidad del Producto ..................... 82 (5) Medicamentos Nasales y para InhalaciónInformación General y Pruebas de Calidad del Producto .......................... 86 (7) Etiquetado ............................. 95 (11) Estándares de Referencia USP .............. 101
Aparatos para Pruebas y Valoraciones (1 7) Etiquetado de Envases de Medicamentos de Venta Bajo Receta ................... (21) Termómetros ......................... (31) Aparatos Volumétricos ................... (41) Balanzas .............................
Pruebas y Valoraciones Químicas Pruebas de Identificación
104 107 107 108
Pruebas Microbiológicas (51) Pruebas de Eficacia Antimicrobiana .......... 109 (55) Indicadores Biológicos-Pruebas de Resistencia ... . ...................................... 112 (61) Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano .......... 115 (62) Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Microorganismos Específicos ..... 122 (63) Pruebas para Micoplasmas ................ 130 (71) Pruebas de Esterilidad ................... 136
Pruebas y Valoraciones Biológicas (81) (85) (87) (88) (89)
(111) Diseño y Análisis de Valoraciones Biológicas ... 190 (115) Valoración de Dexpantenol ............... 207 (121) Valoración de Insulina .................. 208 (121.1) Procedimientos Analíticos Fisicoquímicos para Insulinas ....................... 211 (123) Pruebas de Identidad Biológica de Glucagón .. 213 (124) Valoraciones Biológicas de Eritropoyetina ..... 216 (126) Pruebas de Identidad Biológica de Somatropina ........................ 218 (129) Procedimientos Analíticos para Anticuerpos Monoclonales Recombinantes de Uso Terapeutico .. 218 (1 30) Atributos de Calidad de la Proteína A ....... 220 (151) Prueba de Piró9enos ................... 228 (161) Dispositivos Medicos-Pruebas de Endotoxinas Bacterianas y Pirógenos ................ 229 (162) Prueba de Potencia Antitoxina Diftérica en lnmunoglobulinas Humanas ............. 218 (1 71) Valoración de Actividad de Vitamina B11 ..... 230
Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas .... 144 Prueba de Endotoxinas Bacterianas .......... 163 Pruebas de Reactividad Biológica, In Vitro ..... 169 Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo ..... 171 Enzimas Usadas como Materiales Auxiliares en la Fabricación de Productos Farmacéuticos .... 1 77 (90) Suero Fetal Bovino-Atributos de Calidad y Pruebas de Funcionalidad ................ 180 (91) Valoración de Pantotenato de Calcio ......... 184 (92) Factores de Crecimiento y Citokinas Usados en la Fabricación de Productos de Terapia Celular ... 186
(181) Identificación-Bases Orgánicas Nitrogenadas ............................. (191) Identificación-Pruebas Generales .......... (193) ldentificación-Tetraciclinas .............. (197) Pruebas de Identificación Espectrofotométrica ............................ (201) Prueba de Identificación por Cromatografía en Capa Delgada ....................... (202) Identificación de Aceites Fijos por Cromatografía en Capa Delgada ................ (203) Procedimiento de Cromatowafía en Capa Delgada de Alta Resolucion para Identificación de Artículos de Origen Botánico ....
233 233 237 237 239 239 239
Pruebas de Límite (206) Aluminio ............................ 240 (207) Prueba para el Derivado 1,6-Anhidro de Enoxaparina Sódica ................... 241 (208) Valoración de Actividad Anti-Factor Xa y Anti-Factor lla para Heparinas No Fraccionadas y de Bajo Peso Molecular ................ 246 (209) Determinaciones de Peso Molecular de Heparinas de Bajo Peso Molecular ......... 250 (211) Arsénico ............................ 252 (212) Análisis de Oligosacáridos ............... 252 (221) Cloruros y Sulfatos .................... 254 (223) Dimetilanilina ........................ 255 (226) 4-Epianhidrotetraciclina ................. 255
USP 39
64 Guía para los Capítulos Generales (227) 4-Aminofenol en Medicamentos que Contienen Acetaminofeno ...................... 256 (228) Óxido de Etileno y Dioxano .............. 257 (231) Metales Pesados ...................... 260 (232) Impurezas Elementales-Límites ........... 262 (233) Impurezas Elementales-Procedimientos ..... 265 (241) Hierro .............................. 269 (251) Plomo ............................. 270 (261) Mercurio ............................ 271 (267) Porosimetría por Intrusión de Mercurio ...... 274 (268) Porosidad Mediante Adsorción-Desorción de Nitrógeno ....................... 277 (271) Prueba para Sustancias Fácilmente Carbonizables ........................... 281 (281) Residuo de Incineración ................. 281 (291) Selenio ............................. 282
Otras Pruebas y Valoraciones (301) (311) (341) (345) (351) (371)
Capacidad Neutralizante de Ácido ......... 282 Valoración de Alginatos ................. 284 Agentes Antim[crobianos-Contenido ....... 285 Valoración de Acido Cítrico/Citrato y Fosfato .. 288 Valoración de Esteroides ................. 289 Valoración de Cobalamina con Marcador Radioactivo ......................... 290 (381) Tapones Elastoméricos para Inyectables ...... 291 (391) Valoración de Epinefrina ................. 297 (401) Grasas y Aceite,s Fijos ................... 298 (411) Valoración de Acido Fólico ............... 313 (413) Análisis de Impurezas en Gases Medicinales ... 313 (415) Valoración de Gases Medicinales ........... 314 (425) Antibióticos-Valoración Yodométrica ....... 317 (429) Medición del Tamaño de Partícula por Difracción de Luz ..................... 318 (431) Determinación de Grupos Metoxilo ........ 323 (441) Valoración de Niacina o Niacinamida ....... 325 (451) Volumetría con Nitrito .................. 330 (461) Determinación de Nitrógeno ............. 330 (466) Impurezas Comunes ................... 331 (467) Disolventes Residuales .................. 333 (469) Etilenglicol, Dietilenglicol y Trietilenglicol en Sustancias Etoxiladas ................ 348 (471) Combustión en Matraz con Oxígeno ....... 350 (481) Valoración de Riboflavina ................ 350 (501) ~ales de Bases Orgánicas Nitrogenadas ...... 351 (503) Acjdo Acético en Péptidos ............... 352 (503.1) Acido Trifluoroacético en Péptidos ........ 352 (511) Valoración de un Esteroide Aislado ......... 352 (525) Dióxido de Azufre ..................... 353 (531) Valoración de Tiamina .................. 358 (541) Volumetría .......................... 359 (551) Valoración de Vitamina E ................ 362 (561) Artículos de Origen Botánico ............. 370 (563) Identificación de Artículos de Origen Botánico ........................... 384 (565) Extractos Botánicos .................... 397 (571) Valoración de Vitamina A ................ 400 (580) Valoración de Vitamina C ................ 405 (581) Valoración de Vitamina D ................ 405 (591) Determinación de Cinc ................. 415
Pruebas y Determinaciones Físicas (601) Medicamentos Nasales y para Inhalación: Pruebas de Calidad de Desempeño de Aerosoles, Atomizadores y Polvos ....... (602) Propelentes .......................... (603) Aerosoles Tópicos ..................... (604) Velocidad de Fuga ..................... (61 O) Métodos de Muestreo Microbiológico Alternativos para Productos Nasales e Inhaladores No Estériles ............... (611) Determinación de Alcohol ...............
416 442 444 445 445 447
(616) Densidad Aparente y Densidad por Asentamiento de los Polvos .................. 449 (621) Cromatografía ........................ 453 (631) Color y Acromatismo ................... 464 (641) Totalidad de la Disolución ............... 465 (643) Carbono Orgánico Total ................. 466 (645) Conductividad del Agua ................. 467 (651) Temperatura de Solidificación ............. 471 (659) Requisitos de Envasado y Almacenamiento ... 472 (660) Envases-Vidrio ....................... 481 (661) Sistemas de Envases Plásticos y sus Materiales de Construcción ....................... 487 (661.1) Materiales Plásticos de Construcción ...... 487 (661.2) Sistemas de Envases Plásticos para Uso Farmacéutico ....................... 487 (670) Envases-Componentes Auxiliares .......... 494 (671) Envases-Pruebas de Desempeño .......... 497 (691) Algodón ............................ 505 (695) Cristalinidad ......................... 507 (696) Caracterización de Sólidos Cristalinos por Microcalorimetría y Calorimetría de Disolución .... 507 (697) Contenido en Envases para Inyectables ...... 51 O (698) Volumen de Entrega ................... 511 (699) Densidad de Sólidos ................... 514 (701) Desintegración ....................... 516 (705) Atributos de Calidad para Tabletas Cuyo Etiquetado Indica Ranurado Funcional ...... 519 (711) Disolución .......................... 520 (721) Intervalo de Destilación ................. 531 (724) Liberación de Fármacos ................. 532 (729) Distribución del Tamaño de Glóbulos en Emulsiones Inyectables de Lípidos ........ 538 (730) Espectroquímica de Plasma .............. 541 (731) Perdida por Secado .................... 549 (733) Pérdida por Incineración ................ 549 (735) Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X .. 550 (736) Espectrometría de Masas ................ 555 (741) Intervalo o Temperatura de Fusión ......... 561 (751) Partículas Metálicas en Ungüentos Oftálmicos ......................... 564 (755) Llenado Mínimo ...................... 564 (761) Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear ............................ 565 (771) Productos Oftálmicos-Pruebas de Calidad ... 575 (776) Microscopja Optica .................... 575 (781) Rotación Optica ...................... 578 (785) Osmolalidad y Osmolaridad .............. 579 (786) Estimación de la Distribución del Tamaño de Partícula por Tamizado Analítico .......... 582 (787) Partículas Subvisibles en Inyectables de Proteínas Terapéuticas ................. 586 (788) Partículas en Inyectables ................ 589 (789) Partículas en Soluciones Oftálmicas ......... 593 (790) Partículas Visibles en Inyectables ........... 594 (791) pH ................................ 595 (795) Preparación Magistral-Preparaciones No Estériles ............................ 599 (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles ............................ 608 (801) Polarografía ......................... 657 (811) Finura de Polvos ...................... 661 (821) Radioactividad ........................ 662 (823) Fármacos para Tomografía de Emisión de Positrones para Uso en Preparaciones Magistrales, , Investigación Cl~~ica y Estudios Científicos ... 674 (8 31) Indice de Refracc1on ................... 684 (841 ) ~eso Específico ....................... 685 (846) Area Superficial Específica ................ 686 (851 ) Espectrofotometría y Dispersión de Luz ...... 690 (852) Espectroscopía de Absorción Atómica ....... 698 (853) Espectroscopía de Fluorescencia ........... 702 (854) Espectroscopía en el Infrarrojo Medio ....... 709 (855) Nefelometna, Turbidimetría y Comparación Visual ............................. 709 (857) Espectroscopía Ultravioleta-Visible .......... 713
Guía para los Capítulos Generales 65
USP 39 (861) (871) (881) (891) (905) (911) (912) (91 3) (914) (921) (941)
Suturas-Diámetro .................... Suturas-Sujeción de Agujas .............. Resistencia a la Tensión ................. Análisis Térmico .............. ·... : ; ..... Uniformidad de Unidades de Dos1f1cac1on .... Viscosidad-Métodos Capilares ............ Viscosidad-Métodos Rotatorios ........... Viscosidad-M~todo de Bola R?dante .... ; ... Viscosidad-Metodos por Medida de Pres1on .. Determinación de Agua ................. Caracterización de _Sóli~os Cristali_nos . , y Parcialmente Cristalinos por D1fracc1on de Rayos X sobre Polvo (DRXP) ...........
720 721 722 723 727 731 733 738 738 740 744
INFORMACIÓN GENERAL (1005) Emisión Acústica ..................... 752 (101 O) Datos Analíticos-Interpretación y Tratamiento ........................... 756 (1015) Aparatos Automatizados de Síntesis Radioquímica ....................... 772 (1024) Suero Bovino ........................ 774 (1025) Pancreatina ......................... 774 (1027) Citometría de Flujo : .... : . ; . : ......... 788 (1030) Capítulos de Valoraciones B1olog1cas-lnformación General¡ Glosario ............. 806 (1031) Biocompatibilida de los Mate.ria le~ ~sacios en Envases de Medicamentos, D1spos1t1vos Médicos e Implantes ................. 818 (1032) Diseño y Desarrollo de Valoraciones Biológicas ......................... 829 (1033) Validación de Valoraciones Biológicas ...... 849 (1034) Análisis de Valor~c~ones Biológica_s..... ; ..... 866 (1035) Indicadores Biolog1cos para Estenl1zac1on .... 880 (1041) Productos Biológicos .................. 885 (1043) Ma,teriales Auxiliares _pa_ra ~roductos Celulares, Genicos y de lngen1ena Tisular .......... 886 (1044) Crioconservación de Células ............. 895 (1 045) Artículos Obtenidos por Bi?tecnologf~ ...... 909 (1046) Productos Derivados de Celulas y Tejidos .... 925 (1047) Productos de Terapia Génica . ; . : ..... ; .... 958 (1048) Calidad de Productos Biotecnolog1cos: Anal1s1s de la Construcción Expresable en Células Usadas para la Producción de Produ~tos Proteínicos Obtenidos con ADN Recombinante ....... 990 (1049) Calidad de Productos Biotecno~ógicos: ?r~ebas de Estabilidad de Productos B1otecnolog1cos o Bioló9icos ........................ 993 (1050) Evaluacion, d~ la Seguri~ad Viral ~n Productos Biotecnolog1cos Obtenidos de Lineas Celulares de Origen Humano o Animal .... 998 (1051) Limpieza de Material de Vidrio ... ·,· ..... 1012 (1052) Artículos Obtenidos por Biotecnolog1aAnálisis de Aminoácidos .............. 101 2 (1053) Electroforesis Capilar ................. 1026 (1054) Artículos Obtenidos por Biotecnologíalsoelectroenfoque ................... 1034 (1055) Artículos Obtenidos por BiotecnologíaMapeo de Péptidos .......... ·, ...... 1037 (1056) Artículos Obtenidos por Biot.ecn_olo~1a Electroforesis en Gel de Pohacnlam1da .... 1043 (1057) Artículos Obtenidos por BiotecnologíaValoración de Proteínas Totales ......... 1050 (1058) Calificación de Instrumentos Analíticos .... 1055 (1059) Desempeño de Excipientes ............. 1061 (1061) Color-Medición Instrumental . _. ..... ; ·.. 1083 (1064) Identificación de Artículos de Origen Botan1co por Cromato~rafía en Capa Delgada de Alta Resolucion .................... 1086 (1065) Cromatografía lónica ................. 1086 (1066) Ambientes Físicos que Favorecen el Uso Seguro de los Medicamentos .......... 1089 (1072) Desinfectantes y Antisépticos ........... 1097
(1074) Guías para la Evaluación de la Seguridad Biológica de los Excipientes ............ 1103 (1078) Buenas Prácticas de Fabricación para Excipientes Farmacéuticos a Granel ............... 1107 (1079) Buenas Prácticas de Almacenamiento y Distribución para Medicamentos ....... 1125 (1080) Excipientes Farmacéuticos a GranelCertificado de Análisis ................ 11 36 (1084) Análisis de Glicoproteínas y GlicanosConsideraciones Generales ............ 1144 (1086) Impurezas en Fármacos y Productos Farmacéuticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1155 (1087) Disolución Intrínseca Apar~nte~~rocedimientos de Pruebas de D1soluc1on para Disco Rotatorio y Disco Estacionario ..... 1158 (1088) Evaluación In Vivo e In Vitro de Formas Farmacéuticas ..................... 1163 (1090) Evaluación de Desempeño del Producto Fa_rmacéutico-Biodisponibilidad, Bioequivalencia y Disolución .............. : ........ 1175 (1 091) Etiquetado de Ingredientes Inactivos ...... 1184 (1092) Procedimiento de Disolución: Desarrollo y Validación ....................... 1184 (1094) Cápsulas-Prueb~s de Disol_ución y Atributos de Calidad Relacionados ....... 1193 (1097) Procedimientos para el Muestreo de Polvos a Granel ......................... 1202 (11 02) Métodos de Pruebas InmunológicasConsideraciones Generales ............ 1216 (1103) Métodos de Pruebas InmunológicasEnsayo por lnmunoadsorción Ligado a Enzimas (ELISA) .................... 1225 (1104) Métodos de Pruebas lnmunológ_icasAnálisis por lnmunotransferenc1a ........ 1236 (11 05) Métodos de Pruebas l~munológi~asResonancia de Plasmon Superficial ....... 1249 (11 06) Ensayos de lnmunogenicidad-Diseño y Validación de lnmunoensayos para Detectar Anticuerpos Antifármacos ............. 1266 (11 06.1) Ensayos de lnmunogenicidad-Diseño y Validación de Ensayos para Detectar Anticuerpos Neutralizantes Antifármacos .. 1266 (1111) Examen Microbiológico de Pr~ductos No Estériles: Criterios de Aceptación para Preparaciones Farmacéuticas y Sustancias de Uso Farmacéutico ................ 1284 (1112) Determinación de Actividad de A9ua en Productos Farmacéuticos No Esteriles ..... 1285 (1113) Caracterización, Identificación y Tipificación de Cepas Mi_crob1anas ........ 1288 (1115) Control de Biocarga de Farmacos y Medicamentos No Estériles ................ 1293 (1116) Control Microbiológico Y. Monito~eo. de Ambientes de Procesamiento Asept1co .... 1300 (111 7) Óptimas Prácticas de Laboratorio Microbiológico ..................... 1 314 (1118) Dispositivos de Monitoreo-Tiempo, Temperatura y Humedad ............. 1321 (1119) Espectroscopía en el Infrarrojo Cercano .... 1 328 (1120) Espectroscopía Raman ................ 1335 (1121) Nomenclatura ..... , ................. 1343 (1125) Técnicas Basadas en Acidos NucleicosGeneralidades .... ,· ................ 1 346 (1126) Técnica~ Basadas ~~ Acidos Nuc~ei~C?s Extraccion, Detecc1on,y Secuenc1ac1on ..... 1352 (1127) Técnicas Basadas en Acidos NucleicosAmplificación ..... ,· ................. 1 362 (1128) Técnicas Basadas en Acidos Nucle1cosMicromatrices .... ,. ........ : ....... 1373 (1129) Técnicas Basadas en Acidos Nucle1cosGenotipificación ... ,· ........ : ....... 1380 (1130) Técnicas Basadas en Acidos Nucle1c9sEnfoques para Detectar Trazas de Acidos Nucleicos (Análisis de ADN Residual) ..... 1 385
66 Guía para los Capítulos Generales (11 32) Medición de Proteína Residual de Células Huésped en Productos Biofarmacéuticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1385 (11 36) Envasado y Reenvasado-Envases Unitarios ......................... 1388 (1151) Formas Farmacéuticas ................ 1398 (1152) Medicamentos Veterinarios Usados en Alimentos para Animales .............. 1424 (1160) Cálculos en la Práctica Farmacéutica ...... 1426 (1163) Garantía de Calidad en la Preparación Magistral ......................... 1441 (1171) Análisis por Solubilidad de Fases ......... 1447 (1174) Fluidez de Polvos .................... 1450 (1176) Balanzas y Aparatos Volumétricos para Prescripciones ..................... 1454 (11 77) Buenas Prácticas de Envasado ........... 1456 (1178) Buenas Prácticas de Reenvasado ......... 1459 (1180) Plasma Humano .................... 1462 (1181) Microscopía Electrónica de Barrido ....... 1487 (1184) Pruebas de Sensibilización ............. 1497 (1191) Consideraciones sobre Estabilidad en la Práctica de Dispensación ............. 1509 (1195) Guía sobre Cambios Significativos en Excipientes Farmacéuticos a Granel ...... 1514 (1197) Buenas Prácticas de Distribución para Excipientes Farmacéuticos a Granel ...... 1526 (1207) Envasado de Productos Estériles-Evaluación de Integridad ...................... 1551 (1208) Pruebas de Esterilidad-Validación de Sistemas Aisladores ........................ 1553 (1209) Esterilización-Indicadores e Integradores Químicos y Fisicoquímicos ............ 1558 (1211) Esterilización y Garantía de Esterilidad de Artículos Farmacopeicos .............. 1561 (1216) Friabilidad de las Tabletas .............. 1566 (1217) Fuerza de Ruptura de las Tabletas ........ 1567 (1222) Productos Farmacéuticos con Esterilización Terminal-Liberación Paramétrica ....... 1571 (1223) Validación de Métodos Microbiológicos Alternativos ....................... 1575 (1223.1) Validación de Métodos Alternativos para Valoraciones Microbiológicas de Antibióticos ...................... 1575 (1224) Transferencia de Procedimientos Analíticos .. 1579 (1225) Validación de Procedimientos Farmacopeicos ......................... 1581 (1226) Verificación de Procedimientos Farmacopeicos ......................... 1587 (1227) Validación de Recuperación Microbiana en Artículos Farmacopeicos .............. 1588 (1229) Esterilización de Artículos Farmacopeicos ... 1593 (1229 .1) Esterilización con Vapor de Agua por Contacto Directo ................. 1598 (1229.2) Esterilización con Calor Húmedo de Líquidos Acuosos ................. 1602 (1229.3) Monitoreo de la Biocarga ............ 1607 (1229.4) Esterilización de Líquidos por Filtración ... 161 O (1229.6) Esterilización en Fase Líqurda .......... 1618 (1229.7) Esterilización por Gases .............. 1621 (1229.8) Esterilización por Calor Seco .......... 1624 (1229 .10) Esterilización por Radiación .......... 1626 (1229 .11) Esterilización en Fase de Vapor ........ 1626 (1230) Agua para Uso en Hemodiálisis .......... 1631 (1231) Agua para Uso Farmacéutico ........... 1632 (1234) Vacunas para Uso Humano-Vacunas de Polisacáridos y Glicoconjugados ...... 1662 (1235) Vacunas para Uso Humano-Consideraciones Generales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1680 (1237) Métodos de Pruebas Virológicas ......... 1698 (1238) Vacunas para Uso Humano-Vacunas Bacterianas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 720 (1240) Análisis de Virus en Plasma Humano para Fabricación Posterior ................ 1 734 (1241) Interacciones Agua-Sólido en Sistemas Farmacéuticos ..................... 1745
USP 39 (1251) Pesada en una Balanza Analítica ......... 1750 (1265) Información Escrita de los Medicamentos Recetados-Guías ................... 1755 (1285) Preparación de Muestras Biológicas para Análisis Histológico e lnmunohistoquímico ......................... 1757 (1285.1) Tinción con Hematoxilina y Eosina de Cortes de Tejidos para Examen Microscópico .. 1762 (1601) Productos para Nebulización-Pruebas de Caracterización .................... 1765 (1644) Teoría y Práctica de Mediciones de Conductividad Eléctrica de Soluciones .... 1768 (1660) Envases de Vidrio-Evaluación de la Durabilidad de la Superficie Interna ...... 1776 (1661) Evaluación de Sistemas de Envases Plásticos y sus Materiales de Construcción con Respecto a su Impacto sobre la Seguridad del Usuario ............... 1776 (1663) Evaluación de Sustancias Extraíbles Relacionadas con Envases Farmacéuticos y Sistemas de Administración .................... 1776 (1664) Evaluación de Sustancias Lixiviables en Medicamentos Relacionadas con Envases Farmacéuticos y Sistemas de Administración .................... 1776 (1664.1) Medicamentos Nasales y para Inhalación Oral ............................ 1776 (1724) Medicamentos Semisólidos-Pruebas de Desempeño ....................... 1 781 (1730) Espectroquímica de Plasma-Teoría y Práctica .......................... 1567 (1 735) Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X-Teoría y Práctica ............ 1567 (1 736) Aplrcaciones de la Espectrometría de Masas ........................... 1795 (1761) Aplicaciones de la Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear ......... 1818 (1771) Productos Oftálmicos-Pruebas de Desempeño ....................... 1567 (1787) Medición de Partículas Subvisibles en Inyectables de Proteínas Terapéuticas ..... 1840 (1788) Metodos para la Determinacion de Partículas en Inyectables y Soluciones Oftálmicas .... 1855 (1852) Espectroscopía de Absorción Atómica-Teoría y Práctica ........................ 1870 (1853) Espectroscopía de Fluorescencia-Teoría y Práctica ........................ 1880 (1854) Espectroscopía en el Infrarrojo Medio-Teoría y Práctica ........................ 1890 (1857) Espectroscopía Ultravioleta-Visible-Teoría y Práctica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1900 (1911) Reometría ......................... 191 O
SUPLEMENTOS DIETÉTICOS (2021) Pruebas de Recuento Microbiano-Suplementos Nutricionales y Dietéticos ............. 191 7 (2022) Procedimientos Microbiológicos para Comprobar la Ausencia de Microorganismos EspecíficosSuplementos Nutricionales y Dietéticos ... 1922 (2023) Atributos Microbiológicos de los Suplementos Nutricionales y Dietéticos No Estérrles .... 1929 (2030) Información Complementaria para Artículos de Origen Botánico .................... 1932 (2040) Desintegración y Disolución de Suplementos Dietéticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1942 (2091) Variación de Peso de Suplementos Dietéticos ........................ 1950 (2232) Contaminantes Elementales en Suplementos Dietéticos ........................ 1951 (2250) Detección de Suplementos Dietéticos Irradiados ........................ 1955 (2750) Prácticas de Fabricación para Suplementos Dietéticos ........................ 1958
Requisitos Generales/ (1) Inyectables 67
USP 39
Capítulos Generales Pruebas y Valoraciones Generales
Requisitos Generales para Pruebas y Valoraciones (1) INYECTABLES (Este capítulo será oficial hasta el 30 de abril de 2016) Ver (1) Medicamentos Inyectables y en Implantes (Parenterales}--Pruebas de Calidad del Producto
INTRODUCCIÓN Los artículos parenterales son preparaciones destinadas a la inyección a través de la piel u otro tejido externo, en lugar de la vía alimentaria, administrando las sustancias activas que contienen directamente en un vaso sanguíneo, órgano, tejido o lesión, usando la fuerza de la gravedad u otra fuerza. Los artículos parenterales se preparan meticulosamente mediante métodos diseñados para garantizar el cumplimiento de los requisitos establecidos por la Farmacopea en lo referente a esterilidad, pirógenos, partículas y otros contaminantes. Cuando corresponde, contienen inhibidores del crecimiento de microorganismos. Una inyección es una preparación destinada para la administración parenteral, y/o para reconstituir o diluir un artículo antes de su administración parenteral.
NOMENCLATURA Y DEFINICIONES Nomenclatura1 La siguiente nomenclatura corresponde a cinco tipos generales de preparaciones apropiadas y destinadas para la administración parenteral. Pueden contener amortiguadores del pH, conservantes y otras sustancias agregadas. 1. Inyección de [FÁRMACO]-Preparaciones líquidas que son fármacos o sus soluciones. [NOTA-En los títulos de las monografías y para facilitar el ordenamiento del libro y su indexación, este nombre aparece en forma invertida, como [FÁRMACO], Inyección.]
2. [FÁRMACO} para Inyección-Sólidos secos que al agregarles vehículos adecuados constituyen soluciones que cumplen con todos los requisitos para Inyecciones. 3. Emulsión Inyectable de [FÁRMACO]-Preparaciones líquidas de fármacos disueltos o dispersos en un medio emulsionante adecuado. [NOTA-En los títulos de las monografías y para facilitar el ordenamiento del libro y su indexación, este nombre aparece en forma invertida, como [FÁRMACO], Emulsión Inyectable.] 4. Suspensión Inyectable de [FÁRMACO]-Preparaciones líquidas de sólidos suspendidos en un medio líquido adecuado. [NOTA-En los títulos de las monografías y para facilitar el ordenamiento del libro y su indexación, este nombre aparece en forma invertida como [FÁRMACO], Suspensión Inyectable.]
El Comité de Nomenclatura de Fármacos de la USP ha adoptado esta nomenclatura para implementarla mediante revisiones suplementarias de USP 34-NF 29. Para los títulos de las monografías oficiales vigentes de la forma [FÁRMACO] Estéril que no hayan sido revisados todavía, la siguiente nomenclatura continúa en uso en esta Farmacopea: (1) los fármacos, o sus soluciones o emulsiones, aptas para inyección, llevan títulos de la forma [FÁRMACO], Inyección; (2) los sólidos secos o líquidos concentrados que no contengan amortiguadores del pH, diluyentes ni otras sustancias agregadas y que, al añadir los disolventes adecuados, constituyen soluciones que cumplen con los requisitos para Inyecciones en todos los aspectos, y que se distinguen mediante títulos de la forma [FÁRMACO] Estéril; (3) las mismas preparaciones descritas en (2) excepto que éstas contienen uno o más amortiguadores del pH, diluyentes, u otras sustancias agregadas, y que se identifican por títulos de la forma [FÁRMACO] para Inyección; (4) sólidos suspendidos en un medio líquido adecuado y que no son para inyección por vía intravenosa o intratecal, se identifican por títulos de la forma [FÁRMACO], Suspensión Estéril; y (5) sólidos secos que, al agregarles vehículos adecuados, forman preparaciones que cumplen con todos los requisitos para las Suspensiones Estériles y se distinguen por títulos de la forma [FÁRMACO] Estéril para Suspensión. 1
68 (1) Inyectables/
Requisitos Generales
USP 39
5. [FÁRMACO] para Suspensión Inyectable-Sólidos secos que al añadirles vehículos adecuados constituyen preparaciones que cumplen con todos los requisitos para Suspensiones Inyectables.
Definiciones PRODUCTOS BIOLÓGICOS Las definiciones Farmacopeicas de preparaciones estériles para uso parenteral no se aplican generalmente en el caso de productos biológicos debido a su naturaleza especial y a requisitos de patente o licencia (ver Productos Biológicos (1041 )).
INGREDIENTES
Vehículos y Sustancias Agregadas Vehículos Acuosos-Los vehículos para Inyecciones acuosas cumplen con los requisitos de la Prueba de Pirógenos (151) o de la Prueba de Endotoxinas Bacterianas (85), según corresponda. El Agua para Inyección se emplea generalmente como vehículo, a menos que se especifique algo diferente en la monografía individual. El cloruro de sodio se puede agregar en cantidades suficientes para convertir la solución resultante en isotónica; y la Inyección de Cloruro de Sodio, o la Solución de Ringer Inyectable, pueden reemplazar parcial o totalmente al Agua para Inyección, a menos que se especifique algo diferente en la monografía individual. Para condiciones aplicables a otros adyuvantes, ver Sustancias Agregadas en este capítulo. Otros Vehículos-Los aceites fijos empleados como vehículos para Inyecciones no acuosas son de origen vegetal, son inodoros o prácticamente inodoros, y no tienen ningún olor que sugiera rancidez. Cumplen con los requisitos de la prueba para Parafina Sólida en Aceite Mineral, manteniéndose el baño frío a 1Oº, tienen un Índice de Saponificación entre 185 y 200 (ver Grasas y Aceites Fijos (401 )), tienen un Índice de Yodo entre 79 y 141 (ver Grasas y Aceites Fijos (401 )), y cumplen con los requisitos de las pruebas siguientes. Materia lnsaponificable (ver Grasas y Aceites Fijos (401 )): No más de 1,5% Índice de Acidez (ver Grasas y Aceites Fijos (401 )): No más de 0,2 Índice de Peróxido (ver Grasas y Aceites Fijos (401 )): No más de 5,0 Determinación de Agua, Método le (921 ): No más de O, 1 % Límite de Cobre, Hierro, Plomo y Níquel-[NoTA-La prueba para níquel se requiere únicamente si el aceite ha sido sometido a hidrogenación o si se ha usado un catalizador de níquel durante el procesamiento.] Proceder según se indica en la sección Trazas de Metales en Grasas y Aceites Fijos (401 ). No se encuentra más de 1 ppm de cobre; no se encuentra más de 1 ppm de hierro; no se encuentra más de 1 ppm de plomo; y no se encuentra más de 1 ppm de níquel. Los monoglicéridos o diglicéridos sintéticos de ácidos grasos se pueden emplear como vehículos, siempre que sean líquidos, se mantengan transparentes cuando se enfrían a 1 Oº y presenten un Índice de Yodo no mayor de 140 (ver Grasas y Aceites Fijos (401 )). Se pueden emplear estos y otros vehículos no acuosos, siempre que sean seguros, en el volumen de la Inyección administrada y siempre que no interfieran con la eficacia terapéutica de la preparación o con su respuesta a las valoraciones y pruebas especificadas. Sustancias Agregadas-Se pueden agregar sustancias adecuadas para aumentar la estabilidad o la utilidad de las inyecciones, a menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, siempre que sean inocuas en las cantidades administradas y no interfieran con la eficacia terapéutica o con las respuestas a las valoraciones o pruebas especificadas. No se pueden agregar colorantes a una solución destinada a la administración parenteral con el único propósito de conferir color a la preparación terminada (ver además Sustancias Agregadas en Advertencias Generales y Pruebas de Eficacia Antimicrobiana (51 )). Debe tenerse especial cuidado en la elección y empleo de sustancias agregadas en las preparaciones para inyección que se administran en un volumen superior a 5 ml. A menos que se especifique algo diferente, prevalecen los siguientes límites máximos: 0,01 % para agentes que contengan mercurio y para compuestos tensoactivos catiónicos; 0,5% para clorobutanol, cresol, fenal y sustancias de tipo similar; y 0,2% para dióxido de azufre, o una cantidad equivalente de sulfito, bisulfito, o metabisulfito de potasio o de sodio. A las preparaciones destinadas para inyección que se presenten en envases multidosis, independientemente del método de esterilización empleado, se les debe agregar una sustancia o una mezcla de sustancias adecuada para prevenir el crecimiento de microorganismos, a menos que prevalezca una de las siguientes condiciones: (1) hay instrucciones diferentes en la monografía individual; (2) la sustancia contiene un radionucleido con una vida media física de menos de 24 horas; o (3) los ingredientes activos son antimicrobianos. Tales sustancias se emplean en concentraciones que impidan el crecimiento o la existencia de los microorganismos en las preparaciones para inyección. Tales sustancias cumplen además con los requisitos de Pruebas de Eficacia Antimicrobiana (51) y Agentes Antimicrobianos-Contenido (341 ). Los procesos de esterilización han de ser usados aunque se empleen dichas sustancias (ver además Esterilización y Garantía de Esterilidad de Artículos Farmacopeicos (1211 )). Se puede extraer el aire del envase, o desplazarlo con un gas químicamente inerte. Cuando así se especifique en una monografía, el etiquetado debe incluir información sobre la sensibilidad al oxígeno del artículo.
Requisitos Generales/ (1)
USP 39
Inyectables 69
ETIQUETAS Y ETIQUETADO Etiquetado NOTA-Ver las definiciones de "etiqueta" y "etiquetado" en la sección 10.40, Etiquetado del apartado 1 O. Conservación, Enva-
sado, Almacenamiento y Etiquetado en las Advertencias y Requisitos Generales. La etiqueta indica el nombre de la preparación; en el caso de una preparación líquida, el contenido porcentual de fármaco o la cantidad de un fármaco en un volumen especificado; en el caso de una preparación seca, la cantidad de ingrediente activo; la vía de administración; una declaración de las condiciones de almacenamiento y la fecha de caducidad; el nombre y el domicilio comercial del fabricante, envasador o distribuidor; y un número de lote identificativo. El número de lote puede proporcionar todo el historial de fabricación del envase específico, incluyendo todas las operaciones de fabricación, llenado, esterilización y etiquetado. Cuando una monografía individual permita variar las concentraciones de los ingredientes activos en la preparación parenteral de gran volumen, se indica la concentración de cada ingrediente nombrado en el título oficial como si fuera parte del título oficial, es decir, Dextrosa 5%, Inyección; o Dextrosa (5%) y Cloruro de Sodio (0,2%), Inyección. El etiquetado incluye la siguiente información si no se especifica la fórmula completa en la monografía individual: (1) En el caso de una preparación líquida, el contenido porcentual de cada ingrediente o la cantidad de cada ingrediente en un volumen especificado, salvo que los ingredientes agregados para ajustar a un pH dado o para hacer isotónica la solución se puedan declarar por el nombre y una indicación acerca de su efecto; y (2) en el caso de una preparación seca u otra preparación a la que se va a agregar un diluyente antes de utilizarla, la cantidad de cada ingrediente, la composición del diluyente o diluyentes recomendados [sólo el nombre o nombres, si la fórmula se especifica en la monografía individual], la cantidad que se va a emplear para alcanzar una concentración específica de ingrediente activo y el volumen final de la solución así obtenida, una breve descripción del aspecto físico de la solución reconstituida, instrucciones para el almacenamiento adecuado de la solución reconstituida y una fecha de caducidad que limite el período durante el cual se espera que la solución reconstituida tenga la potencia requerida o declarada si se ha almacenado según se indica. Los envases de Inyecciones destinadas a diálisis, hemofiltración o soluciones de irrigación y que contienen un volumen de más de 1 L declaran que el contenido no está destinado para infusión intravenosa. Las Inyecciones destinadas para uso veterinario declaran ese fin. El envase se etiqueta de modo que una superficie suficiente del envase quede sin cubrir en toda su longitud o circunferencia para permitir la inspección del contenido. CONTENIDO DE SUSTANCIA ACTIVA Y VOLUMEN TOTAL DE PRODUCTOS FARMACÉUTICOS INYECTABLES MONODOSIS Y MULTIDOSIS Para productos farmacéuticos inyectables monodosis y multidosis, el contenido de sustancia activa por el volumen total debe ser la expresión principal y prominente en el panel principal de la etiqueta, seguida inmediatamente por el contenido de sustancia activa por mL entre paréntesis. Para envases que contienen un volumen de menos de 1 mL, el contenido de sustancia activa por fracción de mL debe ser la única expresión de contenido. El contenido por mL debe expresarse como mg/mL, y no como mg/1 ml. Los siguientes formatos son aceptables para contenidos de más de 1 mL: Contenido total de sustancia activa/volumen total: 500 mg/1 O mL Contenido de sustancia activa/mL: 50 mg/mL
o Contenido total de sustancia activa/volumen total: 25 000 Unidades/5 mL Contenido de sustancia activa/mL: 5000 Unidades/mL El siguiente formato es aceptable para contenidos de menos de 1 mL: 12,5 mg/0,625 mL Existen, no obstante, algunas excepciones para la expresión del contenido de sustancia activa por volumen total. En algunos casos, la expresión principal y prominente del contenido total de un fármaco por envase puede no ser efectiva en la prevención de errores en la administración y toma de medicamentos (p.ej., insulina). Un ejemplo de ello es el uso de la lidocaína u otros medicamentos similares empleados como anestésicos locales, casos en que el producto se ordena y administra por porcentaje (p.ej., 1%, 2%), o un anestésico local en combinación con epinefrina que se expresa como una relación (p.ej., 1:100 000). En tales casos, se debe expresar el contenido total de sustancia activa: por ejemplo, 1% (100 mg/1 O mL). Los sólidos secos, los cuales deben ser reconstituidos, deben también seguir este formato, con la excepción de que sólo se debe indicar el contenido total del fármaco y no el contenido de sustancia activa/volumen total o el contenido de sustancia activa/ml.
Aluminio en Preparaciones Parenterales de Gran Volumen (PPGV), Preparaciones Parenterales de Pequeño Volumen (PPPV) y Envases a Granel para Farmacias (EGF) Usados en Terapia de Nutrición Parenteral Total (NPT) (a) El contenido de aluminio de las PPGV usadas en terapia de NPT no debe exceder de 25 µg por L (µg/L).
70 (1) Inyectables /
Requisitos Generales
USP 39
(b) El prospecto del envase de las PPGV usadas en terapia de NPT debe declarar que el producto farmacéutico no contiene más de 25 µg de aluminio por L. Esta información debe incluirse en la sección "Precauciones" del etiquetado de todas las PPGV usadas en terapia de NPT. (c) Si la cantidad máxima de aluminio en las PPPV y en los EGF es 25 µg por L (µg/L) o menos, en lugar de declarar la cantidad exacta de aluminio que contiene cada uno, tal como en el párrafo (d), la etiqueta del envase primario de las PPPV y los EGF usados en la preparación de preparaciones parenterales de NPT (con las excepciones que se indican más adelante) pueden declarar: "No contiene más de 25 µg/L de aluminio". Si la PPPV o el EGF es un polvo liofilizado, la etiqueta del envase primario puede declarar lo siguiente: "Cuando se reconstituye de acuerdo con las instrucciones del prospecto adjunto, la concentración de aluminio no será más de 25 µg/L". (d) El nivel máximo de aluminio a la fecha de caducidad debe declararse en la etiqueta del envase primario de todas las PPPV y los EGF usados en la preparación de artículos parenterales para NPT y emulsiones inyectables. El contenido de aluminio debe declararse de la siguiente manera: "No contiene más de _ µg/L de aluminio". La etiqueta del envase primario de todas las PPPV y los EGF que son polvos liofilizados usados en la preparación de soluciones de NPT deben declarar lo siguiente: "Cuando se reconstituye de acuerdo con las instrucciones del prospecto adjunto, la concentración de aluminio no será más de_ µg/L." Este contenido máximo de aluminio debe declararse como el más alto entre los tres niveles siguientes: (1) El nivel más alto de las partidas producidas durante los últimos tres años. (2) El nivel más alto de las últimas cinco partidas. (3) El nivel máximo con respecto a los niveles históricos, pero sólo hasta completar la producción de las primeras cinco partidas después del 26 de julio de 2004. El prospecto adjunto en los envases de todas las PPGV, PPPV y los EGF usados en la preparación de productos para NPT debe contener una declaración de advertencia. Esta advertencia debe estar incluida en la sección "Advertencias" del etiquetado y debe declarar lo siguiente: "ADVERTENCIA: Este producto contiene aluminio que puede ser tóxico. El aluminio puede alcanzar niveles tóxicos con la administración parenteral prolongada, si existe insuficiencia renal. Los neonatos prematuros en particular tienen mayor riesgo debido a la inmadurez de sus riñones y a que requieren grandes cantidades de soluciones de calcio y fosfato que contienen aluminio. Los estudios indican que los pacientes con insuficiencia renal, incluidos los neonatos prematuros, que reciben niveles de aluminio por vía parenteral mayores de 4 µg a 5 µg por kg por día, acumulan aluminio a niveles asociados con la toxicidad ósea y del sistema nervioso central. La acumulación en los tejidos puede ocurrir incluso con niveles más bajos de administración de productos para NPT".
ENVASADO Envases para Inyecciones Los envases, incluyendo los cierres, para preparaciones para inyecciones no deben ejercer sobre el contenido ninguna acción física o química que pueda alterar de alguna manera la concentración, calidad o pureza más allá de los requisitos oficiales en condiciones normales o habituales de manejo, transporte, almacenamiento, venta y uso. Los envases deben estar hechos de un material que permita la inspección del contenido. Por lo general, el tipo de vidrio preferible para cada preparación se indica en la monografía individual. A menos que se diferente en la individual, se envasar las (ver Para definiciones de envases monodosis y multidosis, ver las secciones 10.20.70 y 10.20.11 O, "''n"'r"'''"rn<> 1nr<> Generales. Los envases con los establecidos en Envases-Vidrio
tencias
Los envases deben estar o de tal modo que impidan la contaminación o la pérdida del contenido. La validación de la integridad del envase debe demostrar que no existe contaminación por penetración de microorganismos o de impurezas químicas o físicas. Además, el envase debe ser capaz de mantener las cantidades totales y relativas o concentraciones especificadas de solutos y del vehículo cuando se expone a condiciones extremas previstas en la fabricación y procesamiento, almacenamiento, transporte y distribución. Los cierres para envases multidosis deben permitir la extracción del contenido sin quitar o destruir el cierre. El cierre debe permitir la penetración de una aguja y el cerramiento de inmediato luego de retirarla, protegiendo el envase de la contaminación. La validación de la integridad del envase multidosis debe incluir una verificación de que un envase de ese tipo impide la contaminación microbiana o la pérdida del contenido del producto en las condiciones previstas de múltiples entradas y usos. Los envases para venoclisis en tándem (piggyback containers) son por lo general envases de infusión intravenosa empleados para administrar una segunda infusión a través de un conector de algún tipo o a través de un inyector en el equipo de administración del primer líquido, evitándose así la necesidad de inyectar en otro sitio al paciente. Los envases para venoclisis en tándem son también conocidos como envases de infusión secundaria.
Requisitos Generales/ (1)
USP 39
Inyectables 71
Concentrado de Cloruro de Potasio para Inyección El uso de un sistema de cierre negro en un vial [p.ej., una tapa negra de fácil desprendimiento adherida al casquillo (tapa "flip-off") y un casquillo negro para sostener el cierre elastomérico] o el uso de una banda o una serie de bandas negras sobre el estrechamiento del cuello de una ampolla se reserva sólo para el Concentrado de Cloruro de Potasio para Inyección y está prohibido su uso en cualquier otra inyección.
Agentes de Bloqueo Neuromuscular y Paralizantes Todas las preparaciones inyectables de agentes de bloqueo neuromuscular y agentes paralizantes se deben envasar en viales con una declaración de advertencia impresa en los casquillos o en las tapas de sobresello. Tanto el casquillo del envase como la tapa de sobresello deben llevar impresas en blanco o negro (lo que proporcione el mayor contraste con el color del casquillo o la tapa) la declaración: "Advertencia: Agente Paralizante" o "Agente Paralizante" (dependiendo del tamaño del sistema de cierre). Alternativamente, la tapa de sobresello puede ser transparente y sin inscripción, de manera que permita la visualización de la declaración de advertencia sobre el casquillo de cierre.
Envases para Sólidos Estériles Los envases, incluyendo los cierres, para sólidos secos destinados para uso parenteral no deben ejercer sobre el contenido ninguna acción física o química que altere de alguna manera el contenido, la calidad o la pureza más allá de los requisitos oficiales, en condiciones normales o habituales de manejo, transporte, almacenamiento, venta y uso. Un envase para un sólido estéril debe permitir la adición de un disolvente adecuado y la extracción de porciones de la solución o suspensión resultante de tal modo que se mantenga la esterilidad del producto. Cuando la Valoración en una monografía indica un procedimiento para la Solución muestra, donde se deba tomar el contenido total extraíble de un envase monodosis con una jeringa y aguja hipodérmica, se extraerá ese contenido en la forma más completa posible con una jeringa hipodérmica seca, de una capacidad nominal que no exceda de tres veces el volumen a extraer, y provista con una aguja número 21 de una longitud no menor de 2,5 cm (1 pulgada), tomando la precaución de expeler cualquier burbuja de aire, y se descargará en un recipiente para dilución y valoración.
Contenido del Envase Cada envase de inyección debe contener un exceso suficiente que permita extraer del mismo la cantidad declarada de fármaco. Dicha extracción se debe realizar de acuerdo a las instrucciones del etiquetado, si fueran provistas. DETERMINACIÓN DEL VOLUMEN DE INYECCIÓN EN LOS ENVASES Esta sección está armonizada con los textos correspondientes de la Farmacopea Europea y/o la Farmacopea japonesa. Estas farmacopeas se han comprometido a no realizar ningún cambio unilateral a esta sección armonizada. Una porción del presente texto (ver más adelante) es texto USP nacional, y, por lo tanto, no forma parte del texto armonizado; está marcada con símbolos (+.) para especificar este hecho. Las suspensiones y emulsiones deben agitarse antes de extraer el contenido y antes de determinar la densidad. Las preparaciones viscosas y aceitosas pueden entibiarse siguiendo las instrucciones de la etiqueta, si fuera necesario, y agitar minuciosamente justo antes de extraer el contenido. El contenido seguidamente se enfría a una temperatura de 20-25ºC antes de medir el volumen. •Las formulaciones de sólidos estériles se deben reconstituir de acuerdo a las instrucciones del etiquetado antes de retirar su contenido. Luego se debe medir el contenido siguiendo los procedimientos para suspensiones, emulsiones o soluciones, según sea apropiado .• Envases Monodosis-Seleccionar 1 envase si el volumen del envase es de 1O mL o más, 3 envases si el volumen nominal es más de 3 mL y menos de 1 O mL, o 5 envases si el volumen nominal es 3 mL o menos. Tomar individualmente el contenido total de cada envase seleccionado con una jeringa seca de una capacidad que no exceda de tres veces el volumen a medir y provista con una aguja número 21 de longitud no menor de 2,5 cm (1 pulgada). Expulsar cualquier burbuja de aire de la jeringa y la aguja, y luego descargar el contenido de la jeringa, sin vaciar la aguja, en una probeta calibrada y seca (calibrada "para contener" más que "para verter" los volúmenes marcados) de un tamaño tal que el volumen que se va a medir ocupe al menos el 40% de su volumen graduado. Alternativamente, el volumen del contenido, en mL, puede calcularse como la masa, en g, dividida por la densidad. Para envases con un volumen nominal de 2 mL o menos, el contenido de una cantidad suficiente de envases puede combinarse para obtener el volumen requerido para la medición, siempre que, para cada envase, se emplee un conjunto diferente y seco de jeringa y aguja. El contenido de los envases de 1O mL o más se puede determinar abriéndolos y vaciando el contenido directamente en una probeta graduada o un vaso de precipitados tarado. El volumen no es menor que el volumen nominal en el caso de envases examinados individualmente o, en el caso de envases con un volumen nominal de 2 mL o menos, no es menor que la suma de los volúmenes nominales de los envases que se toman colectivamente.
72 (1) Inyectables/ Requisitos Generales
USP 39
Envases Multidosis-Para Inyecciones en envases multidosis que declaran rendir un número específico de dosis de un volumen determinado, seleccionar 1 envase y proceder según se indica para los envases monodosis, empleando el mismo número de conjuntos diferentes de jeringa y aguja que el de dosis especificadas. El volumen es tal que cada jeringa no descarga menos de la dosis indicada. Inyecciones en Cartuchos o Jeringas Prellenadas-Seleccionar 1 envase si el volumen es 1O mL o más, 3 envases si el volumen nominal es más de 3 mL y menos de 1O mL, o 5 envases si el volumen nominal es 3 mL o menos. Si fuera necesario, equipar los envases con los accesorios requeridos para su uso (aguja, émbolo, jeringa) y transferir a un vaso de precipitados tarado y seco todo el contenido de cada envase sin vaciar la aguja, empujando el émbolo en forma lenta y continua. Determinar el volumen, en mL, calculado como la masa, en g, divida por la densidad. El volumen medido de cada envase no es menor que el volumen nominal. Soluciones Intravenosas de Gran Volumen-Para soluciones intravenosas, seleccionar 1 envase. Transferir el contenido a una probeta graduada seca, de una capacidad tal que el volumen que se va a medir ocupe al menos el 40% del volumen nominal de la probeta. Medir el volumen transferido. El volumen no es menor que el volumen nominal.
Etiquetado en los Casquillos y las Tapas de Sobresello Los profesionales de la salud que utilizan productos inyectables deben ser capaces de ver fácilmente las indicaciones del etiquetado que comunican mensajes de seguridad importantes críticos para evitar situaciones de amenaza de muerte inminente y actuar de acuerdo con tales indicaciones. Estas indicaciones precautorias del etiquetado deben ser sencillas, concisas y desprovistas de toda información no esencial. Los productos que no requieren indicaciones precautorias no deben incluir ninguna información para que aquéllos que si las requieran se puedan reconocer inmediatamente. Para lograr este propósito se requiere un enfoque sistemático para el etiquetado de los productos inyectables, tal que asegure que los casquillos y tapas de sobresello-un área de estos productos debe ser de alta visibilidad para los profesionales de la salud durante el uso de estos medicamentos-sean reservados para comunicar mensajes críticos de seguridad. En consecuencia: 1. Sólo pueden aparecer indicaciones precautorias sobre la superficie superior (círculo) del casquillo y/o la tapa de sobresello de un vial que contenga un producto inyectable. La indicación precautoria debe aparecer tanto en el casquillo como en la tapa pero puede aparecer solamente en la tapa, si el casquillo de sobresello es transparente y la indicación precautoria debajo de la tapa es fácilmente legible. Una indicación precautoria es aquélla destinada a prevenir una situación de amenaza de muerte inminente y puede incluir instrucciones relacionadas con la seguridad y la potencia, si fuera necesario. Algunos ejemplos de tales indicaciones precautorias son los siguientes, entre otros: "Advertencia-Agente Paralizante" y "Diluir Antes de Usar". El texto de la indicación precautoria se debe imprimir en un color que contraste y sea fácilmente visible en condiciones normales de uso. 2. Si no es necesaria una indicación precautoria, la superficie superior del vial, incluyendo el casquillo o la tapa de sobresello, debe quedar en blanco. 3. Otras declaraciones o características que incluyen, entre otros, números o letras de identificación, como por ejemplo números de códigos, números de lote, nombres de empresas, logotipos o nombres de productos, etc., pueden aparecer en la superficie lateral (falda) del casquillo pero no en la superficie superior (círculo) de los casquillos o las tapas de sobresello de los viales que contengan productos inyectables. La presencia de tales declaraciones o características en la falda del casquillo no deben distraer o interferir con la indicación precautoria de la superficie superior.
Envasado y Almacenamiento El volumen de inyección en envases monodosis proporciona la cantidad especificada para administración parenteral de una vez y en ningún caso es más que el volumen suficiente para permitir la extracción y administración de 1 L. Las preparaciones destinadas para administración intrarraquídea, intracisternal o peridural se envasan sólo en envases monodosis. A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, un envase multidosis contiene un volumen de Inyección suficiente para permitir la extracción de no más de 30 ml. Las siguientes inyecciones están exentas de la restricción de 1 L de los requisitos anteriores relacionados con el envasado: 1. Inyecciones envasadas para uso extravascular como soluciones de irrigación o diálisis peritoneal. 2. Inyecciones envasadas para uso intravascular como nutrición parenteral o como líquido de reemplazo o sustitución para ser administrado en forma continua durante una hemofiltración. Las inyecciones envasadas para uso intravascular que pudieran usarse como líquido durante una hemodiálisis u otros procesos de reemplazo mediante administración intermitente, continua o en bolo, deben cumplir con la restricción de 1 L a menos que se trate de una excepción mencionada anteriormente. Cuando se declara que las inyecciones están destinadas para uso veterinario, éstas están exentas de los requisitos de envasado y almacenamiento en lo referente a las limitaciones para envases monodosis y de las limitaciones de volumen para los envases multidosis.
Requisitos Generales / (1) Medicamentos Inyectables 73
USP 39
MATERIA EXTRAÑA Y PARTÍCULAS Los artículos destinados a la administración parenteral deben prepararse de una manera diseñada para excluir partículas, según se define en Partículas en Inyectables (788), y otras materias extrañas, según corresponda para la forma farmacéutica. Cada envase final de todas las preparaciones parenterales debe inspeccionarse en la medida de lo posible para detectar la presencia de materia extraña y partículas observables (de ahora en adelante denominadas "partículas visibles") en su contenido. El proceso de inspección debe estar diseñado y calificado para asegurar que todos los lotes de todas las preparaciones parenterales estén prácticamente exentos de partículas visibles. La calificación del proceso de inspección debe realizarse en referencia a las partículas en el rango visible de un tipo que puede surgir del proceso de fabricación o llenado. Debe desecharse todo envase cuyo contenido presente indicios de partículas visibles. La inspección para detectar partículas visibles puede realizarse cuando se lleva a cabo la inspección para detectar otros defectos críticos, tales como envases o sellos rotos o defectuosos, o bien cuando se caracteriza el aspecto de un producto liofilizado. Cuando la naturaleza del contenido o el sistema de cierre del envase permite solamente una inspección limitada del contenido total, la inspección del 100% de un lote debe completarse con la inspección de contenidos reconstituidos (p.ej., secos) o contenidos extraídos (p.ej., de un envase ámbar oscuro) de una muestra de envases del lote. Todas las Inyecciones de gran volumen para infusiones monodosis y las Inyecciones de pequeño volumen están sujetas a los procedimientos microscópicos o de oscurecimiento de luz y a los límites de partículas subvisibles especificados en Partículas en Inyectables (788), a menos que se especifique algo diferente en la monografía individual. Un artículo envasado como Inyección, ya sea de gran volumen o de pequeño volumen, cumple con los requisitos expuestos para Inyecciones de pequeño volumen cuando la etiqueta del envase indica que contiene 100 mL o menos, si la monografía individual incluye una prueba para Partículas en Inyectables (788); cumple con los requisitos expuestos en Inyecciones de gran volumen para infusiones monodosis cuando la etiqueta del envase indica que contiene más de 100 ml.
ESTERILIDAD Pruebas de Esterilidad-Las preparaciones para inyección cumplen con los requisitos en Pruebas de Esterilidad (71 ).
SOLUCIONES RECONSTITUIDAS Los sólidos secos cuyas soluciones reconstituidas se preparan para inyección llevan títulos de la forma [FÁRMACO] para Inyec-
ción. Ya que estas formas farmacéuticas se reconstituyen en el momento en el que las usará el profesional de salud interviniente, no se incluyen las pruebas y normas para la solución reconstituida para su administración en las monografías individuales para sólidos secos o líquidos concentrados estériles. Sin embargo, a los efectos de garantizar la calidad de las preparaciones inyectables en el momento de ser administradas, se proporcionan las siguientes pruebas no destructivas para demostrar la aptitud de las soluciones reconstituidas cuando se preparan inmediatamente antes de usar. Totalidad y Transparencia de la Solución-Reconstituir la solución según se indica en el etiquetado suministrado por el fabricante para la forma farmacéutica seca estéril. A: El sólido se disuelve completamente, sin dejar ningún residuo visible como materia no disuelta. B: La solución reconstituida no es significativamente menos transparente que un volumen igual de diluyente o de Agua Purificada contenida en un recipiente similar y examinada de modo similar. Partículas-Reconstituir la solución según se indica en el etiquetado suministrado por el fabricante para la forma farmacéutica seca estéril: la solución está esencialmente libre de partículas extrañas que se puedan observar en una inspección visual.
(1) MEDICAMENTOS INYECTABLES Y EN IMPLANTES
(PARENTERALES)-PRUEBAS DE CALIDAD DEL PRODUCTO (El capítulo se oficializará el 7º de mayo de 20 76) (El nombre actual del capítulo es (1) Inyectables)
INTRODUCCIÓN Los medicamentos parenterales incluyen inyectables e implantes que se inyectan a través de la piel u otro tejido de barrera externo, o que se implantan dentro del cuerpo para permitir la administración directa del fármaco activo en los vasos sanguíneos, órganos, tejidos o lesiones. Los inyectables se pueden presentar como formas farmacéuticas de liberación inmediata o prolongada. Los medicamentos parenterales en implantes son formas farmacéuticas de acción prolongada que proveen una liberación continua de los fármacos activos durante periodos que van de meses a años. Para la liberación sistémica, se pueden
74 (1) Medicamentos Inyectables/ Requisitos Generales
USP 39
implantar por vía subcutánea, mientras que para la administración local, se pueden implantar en una parte específica del cuerpo. Los medicamentos parenterales se pueden administrar por vía intravenosa, intraventricular, intraarterial, intraarticular, subcutánea, intramuscular, intratecal, intracisternal e intraocular. Las formas farmacéuticas parenterales se pueden presentar como soluciones, suspensiones, emulsiones, polvos estériles para soluciones y suspensiones (incluyendo liposomas), implantes (incluyendo micropartículas) y productos que consten de un fármaco y un dispositivo, tales como los estents para elución de fármacos. Para descripciones adicionales de formas farmacéuticas que caen dentro de la categoría general de medicamentos parenterales dirigirse a las secciones posteriores de este capítulo y al capítulo Formas Farmacéuticas (1151) 1 • El capítulo Nomenclatura (1121) 1 provee información para establecer los nombres y títulos de monografías USP de medicamentos parenterales. El capítulo (1) provee las directrices generales para la revisión y el desarrollo de monografías individuales y no pretende reemplazar a éstas últimas. El capítulo (1) provee listas de pruebas de calidad del producto comúnmente requeridas de una manera concisa y coherente. El capítulo se divide en cuatro secciones principales: (1) pruebas universales de calidad del producto que son aplicables a formas farmacéuticas parenterales; (2) pruebas específicas de calidad del producto que deben tenerse en cuenta además de las pruebas universales; (3) pruebas de calidad del producto para formas farmacéuticas específicas donde se citan todas las pruebas aplicables (universales y específicas) para la forma farmacéutica específica; y (4) pruebas de desempeño del producto. Siempre que existan, las monografías harán referencia al capítulo (1) o a partes específicas del mismo. Si no se cuenta con una monografía específica para un medicamento (monografía inexistente), los capítulos generales proveen las pruebas de calidad que pueden ser usadas por los fabricantes hasta que la USP desarrolle la monografía de la forma farmacéutica. Las definiciones Farmacopeicas de preparaciones estériles para uso parenteral pueden no ser aplicables a algunos productos biológicos debido a su naturaleza especial y a requisitos de patente o licencia (ver Productos Biológicos (1041 )1 ). No obstante, algunos medicamentos biológicos terminados cuyas monografías contienen el término"lnyección" en el título deben cumplir con los requisitos del capítulo (1) o las secciones del mismo que se especifiquen en la monografía.
Pruebas de Calidad y de Desempeño del Medicamento Los procedimientos y criterios de aceptación para las pruebas de medicamentos parenterales se dividen en dos categorías: (1) aquéllos que evalúan los atributos de calidad del producto, p.ej., identificación, esterilidad y partículas, y están incluidas en este capítulo y (2) aquéllos que evalúan el desempeño del producto, p.ej., liberación in vitro del fármaco desde el medicamento. Mientras que las pruebas de calidad evalúan la integridad de la forma farmacéutica, las pruebas de desempeño evalúan el desempeño (biodisponibilidad) que tendría el producto luego de administrarlo al paciente. Una prueba de desempeño del producto, es decir, una prueba de liberación de fármacos para suspensiones, emulsiones, polvo para suspensión (incluyendo micropartículas y liposomas) y estents para elución de fármacos, debe llevarse a cabo usando procedimientos apropiados.
Cambio en la redacción:
PRUEBAS COMUNES DE CALIDAD DEL PRODUCTO PARA FORMAS FARMACÉUTICAS PARENTERALES
PRUEBAS UNIVERSALES A continuación se citan las pruebas universales que son aplicables a las formas farmacéuticas parenterales. Descripción: Se debe proveer una descripción cualitativa de la forma farmacéutica. Los criterios de aceptación deben incluir la apariencia final aceptable. Si el color cambia durante el almacenamiento, puede resultar apropiado realizar un procedimiento cuantitativo o semicuantitativo para evaluar el color. Esta sección especifica el contenido o la cantidad declarada del artículo (ver Etiquetado (7)). El capítulo (1121 )1 ofrece información adicional sobre términos y definiciones de uso común. Identificación: Las pruebas de identificación se tratan en Advertencias y Requisitos Generales 5.40. Las pruebas de identificación deben establecer la identidad de los fármacos presentes en el artículo y deben distinguirlo de compuestos con estructura estrechamente relacionada que podrían estar presentes. La prueba de identidad más concluyente es el espectro de absorción IR (ver • Espectroscopía de Absorción Atómica (852), Espectroscopía de Fluorescencia (853), Espectroscopía en el Infrarrojo Medio (854), Espectroscopía en el Infrarrojo Cercano {856), Espectroscopía Ultravioleta-Visible (857>t• (Aroi-moy- 2016¡ y Pruebas de Identificación Espectrofotométrica (197)). Cuando no es posible obtener un espectro IR adecuado, se pueden usar otros métodos analíticos. Los métodos espectrofotométricos Raman o de infrarrojo cercano también podrían ser aceptables como única prueba para la identificación de los constituyentes en el medicamento formulado (para mayor información ver Espectroscopía en el Infrarrojo Cercano (1119) 1 y Espectroscopía Raman (1120) 1 ). La identificación realizada únicamente mediante un solo tiempo de retención cromatográfico no se considera específica. Sin embargo, puede ser aceptable el uso de dos procedimientos cromatográficos en los que la separación se basa en principios diferentes o en una combinación de pruebas en un solo procedimiento (ver Croma-
1 Todos los capítulos con números superiores a <1000> son únicamente para fines informativos. Dichos capítulos pueden resultar útiles, aunque no son obligatorios.
USP 39
Requisitos Generales/ (1) Medicamentos Inyectables 75
tografía (621) y Prueba de Identificación por Cromatografía en Capa Delgada (201 )). Los capítulos Identificación-Pruebas Generales (191) y Espectrometría de Masas (736) ofrecen información adicional con respecto a las pruebas de identificación.
Valoración: Se debe usar una prueba específica e indicadora de estabilidad para determinar la concentración (contenido) del medicamento. Para los casos en los que se justifique el uso de una valoración no específica, se deben usar otros procedimientos analíticos complementarios para lograr la especificidad. Se debe usar un procedimiento específico cuando exista evidencia de la interferencia de los excipientes con la valoración no específica. Impurezas: Las pruebas para Impurezas se tratan en Advertencias y Requisitos Generales 5.60. Todos los artículos deben ser analizados para asegurar que cumplen con los requisitos. Materia extraña y partículas: Los artículos destinados para administración parenteral deben prepararse de una manera diseñada para excluir partículas conforme a lo definido en Partículas Subvisibles en Inyectables de Proteínas Terapéuticas (787), Partículas en Inyectables (788) y Partículas en Soluciones Oftálmicas (789), así como para excluir otras partículas según resulte apropiado para la forma farmacéutica. Se debe inspeccionar cada uno de los envases finales de todas las preparaciones parenterales en la medida de lo posible para detectar la presencia de materia extraña y partículas observables (en lo sucesivo denominadas partículas visibles) en su contenido. El proceso de inspección debe estar diseñado y calificado para asegurar que todos los lotes de todas las preparaciones parenterales estén esencialmente exentos de partículas visibles, conforme a lo definido en Partículas Visibles en Inyectables (790). La calificación del proceso de inspección debe realizarse en referencia a las partículas en el rango visible y a aquellas partículas que puedan surgir del proceso de fabricación o llenado. Debe desecharse todo envase cuyo contenido presente indicios de partículas visibles. La inspección para detectar partículas visibles puede realizarse al momento de examinar otros defectos críticos, tales como envases o sellos rotos o defectuosos, o bien cuando se caracteriza el aspecto de un producto liofilizado. Cuando la naturaleza del contenido o el sistema envase-cierre del envase permita solamente una inspección limitada del contenido total, la inspección del 100% de un lote debe complementarse con la inspección de contenidos reconstituidos (p.ej., liofilizados) o contenidos extraídos (p.ej., de un envase ámbar oscuro) de una muestra de envases del lote. Las inyecciones de gran volumen para infusiones monodosis, las inyecciones de pequeño volumen y los empaques a granel para farmacias (PBP, por sus siglas en inglés) están sujetos a los procedimientos microscópicos o de obstrucción de luz y a los límites de partículas subvisibles especificados en el capítulo (788), a menos que se especifique algo diferente en la monografía individual. Un artículo envasado como inyección, ya sea de gran volumen o de pequeño volumen, cumple con los requisitos establecidos para inyecciones de pequeño volumen cuando la etiqueta del envase indica que contiene 100 mL o menos. Cumple con los requisitos establecidos para inyecciones de gran volumen para infusiones monodosis cuando la etiqueta del envase indica que contiene más de 100 ml. Esterilidad: La esterilidad de todos los medicamentos destinados para administración parenteral debe confirmarse usando los métodos descritos en Pruebas de Esterilidad (71) o por un método alternativo aprobado. Endotoxinas bacterianas: Todos los artículos destinados para administración parenteral deben prepararse de forma tal que se limiten las endotoxinas bacterianas conforme a lo definido en Prueba de Endotoxinas Bacterianas (85) o Prueba de Pirógenos (151 ). Contenido del envase: Se debe determinar el contenido del envase cuando resulte apropiado (ver el capítulo propuesto de pruebas generales Contenido en Envases para Inyectables (697)). Sustancias lixiviables y extraíbles: El sistema de envase no debe interactuar física o químicamente con la preparación de forma que se altere su contenido, calidad o pureza más allá de los requisitos oficiales o establecidos. El sistema de envase debe cumplir con los requisitos de Elastoméricos ), de Envasado Almacenamiento (659), Envases-Vidrio (660), Materiales Plásticos de Construcción (661.1) y Sistemas de Envases Plásticos para Uso Farmacéutico (661.2). Se encontrar información adicional con respecto al análisis de sistemas de envases en Evaluación de Sustancias Extraíbles Relacionadas con Envases Farmacéuticos y Sistemas de Administración (1663) y Evaluación de Sustancias Lixiviables en Medicamentos Relacionadas con Envases Farmacéuticos y Sistemas de Administración (1664). Integridad del cierre del envase: El sistema de envase debe cerrarse o sellarse de modo tal que prevenga la contaminación o la pérdida de contenido. La validación de la integridad del envase debe demostrar que no existe contaminación por penetración de microorganismos o la adquisición o pérdida de cualquier parámetro físico o químico que se considere necesario para proteger el producto (ver Envasado de Productos Estériles-Evaluación de Integridad (1207)). Etiquetado: Todos los artículos destinados para administración parenteral deben cumplir con los requisitos de etiquetado definidos en el capítulo (7).
Pruebas Específicas Además de las pruebas universales citadas anteriormente, se pueden considerar las siguientes pruebas específicas para cada caso y, cuando resulte apropiado, se hace referencia a las mismas en la monografía USP-NF. Propiedades fisicoquímicas: Éstas incluyen propiedades como Osmolalidad y Osmolaridad (785), pH (791 ), Peso Específico (841) y Viscosidad-Métodos Capilares (911 ). Uniformidad de unidades de dosificación: Esta prueba es aplicable a medicamentos parenterales y formas farmacéuticas envasadas en envases unitarios. Incluye tanto la masa de la forma farmacéutica como el contenido de la sustancia activa en la misma (ver Uniformidad de Unidades de Dosificación (905)).
76 (1) Medicamentos Inyectables/ Requisitos Generales
USP 39
Vehículos y sustancias agregadas: Existen otros vehículos, acuosos y no acuosos, aparte de los tratados a continuación. Todos los vehículos deben ser adecuados para el uso que se les pretende dar y no deben impactar la calidad del medicamento. Vehículos acuosos-Los vehículos acuosos deben cumplir con los requisitos del capítulo (151) o del (85), según se especifique en la monografía. El vehículo de uso más general es el Agua para Inyección. Se puede agregar cloruro de sodio o dextrosa para isotonizar la solución resultante; y la Inyección de Cloruro de Sodio, o la Solución de Ringer Inyectable pueden reemplazar parcial o totalmente al Agua para Inyección. Vehículos no acuosos-Los aceites fijos son una clase de Vehículos no acuosos. Los aceites fijos empleados como vehículos son de origen vegetal e inodoros. Cumplen con los requisitos de la prueba de Parafina Sólida en la monografía de Aceite Mineral con el baño de enfriamiento mantenido a 1Oº. Asimismo, cumplen con los requisitos de las siguientes pruebas: • Índice de Saponificación (ver el capítulo Grasas y Aceites Fijos (401 )): Entre 185 y 200 • Índice de Yodo (ver el capítulo (401 )): Entre 79 y 141 • Materia lnsaponificable (ver el capítulo (401 )): No más de 1,5% • Índice de Acidez (ver el capítulo (401 )): No más de 0,2 • Índice de Peróxido (ver el capítulo (401 )): No más de 5,0 •Agua, Método le (del capítulo Determinación de Agua (921 )): No más de 0, 1% • Límite de Cobre, Hierro, Plomo y Níquel: [NOTA-La prueba para níquel no se requiere si el aceite no ha sido sometido a hidrogenación, o si no se ha usado un catalizador de níquel durante el procesamiento.] Proceder según se indica en el capítulo (401 ), Trazas de Metales o Impurezas Elementales-Procedimientos (233). Cumplen con los requisitos en Impurezas Elementales-Límites (232). Los monoglicéridos o diglicéridos sintéticos de ácidos grasos se pueden emplear como vehículos, siempre que sean líquidos, se mantengan transparentes cuando se enfrían a 1Oº y presenten un Índice de Yodo no mayor de 140. Sustancias Agregadas-Se pueden agregar sustancias adecuadas a preparaciones para incrementar la estabilidad o la utilidad, a menos que se prohíban en la monografía. No se pueden agregar colorantes a una preparación con el único propósito de conferir color a la preparación terminada (ver Advertencias y Requisitos Generales 5.20 y Pruebas de Eficacia Antimicrobiana (51)). Debe tenerse especial cuidado en la elección y uso de sustancias agregadas en preparaciones con volúmenes superiores a 5 ml. Los siguientes límites prevalecen a menos que se indique de otro modo: • Mercurio y agentes catiónicos tensoactivos: No más de 0,01 % • Clorobutanol, cresol, fenol y sustancias similares: No más de 0,5% • Dióxido de azufre o una cantidad equivalente de sulfito, bisulfito o metabisulfito de potasio o sodio: No más de 0,2% Conservante antirnicrobiano: Se deben agregar agentes antimicrobianos a las preparaciones destinadas para inyección en envases multidosis, a menos que prevalezca una de las siguientes condiciones: (1) existen instrucciones diferentes en la monografía individual; (2) la sustancia contiene un radio isótopo con una vida media física menor que 24 horas; o (3) los ingredientes activos son antimicrobianos. Tales sustancias deben cumplir con los requisitos del capítulo Pruebas de Eficacia Antimicrobiana (51) y Agentes Antimicrobianos-Contenido (341 ). Contenido de agua: El contenido de agua en productos liofilizados debe determinarse siempre que sea apropiado (ver el capítulo Determinación de Agua (921 )). Reactividad biológica: Los medicamentos en implante y las combinaciones fármaco/dispositivo que contienen un material polimérico deben cumplir con los requisitos de Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo (88). Distribución de tamaño de glóbulos: La emulsiones deben cumplir con los requisitos de Distribución del Tamaño de Glóbulos en Emulsiones Inyectables de Lípidos (729). Contenido de Aluminio: 25 µg/L para parenterales de gran volumen usados en terapia de nutrición parenteral total (TPN, por sus siglas en inglés). Los parenterales de pequeño volumen y los empaques a granel para farmacias usados para preparar la terapia de nutrición parenteral total deben declarar en la etiqueta del envase inmediato el nivel máximo de aluminio en la fecha de caducidad si el nivel máximo excede de 25 µg/L. Totalidad y transparencia de soluciones: Las siguientes pruebas se llevan a cabo para demostrar la aptitud de las soluciones reconstituidas que se preparan antes de su administración. Reconstituir la solución según se indica en el etiquetado suministrado por el fabricante: • El sólido se disuelve completamente, sin dejar ninguna materia sin disolver. • La solución reconstituida no es significativamente menos transparente que un volumen igual de diluyente o de Agua Purificada contenida en un recipiente similar y examinada de modo similar. Las soluciones de proteína pueden presentar una opalescencia inherente. La solución reconstituida está exenta de partículas que se puedan observar durante la inspección visual (ver el capítulo Partículas Visibles en Inyectables (790)).
PRUEBAS DE CALIDAD DEL PRODUCTO PARA FORMAS FARMACÉUTICAS PARENTERALES ESPECÍFICAS A continuación se citan las pruebas de calidad del producto para las formas farmacéuticas específicas. Los capítulos específicos referidos para la prueba pueden encontrarse en las secciones Pruebas Universales y Pruebas Específicas. Cuando no esté disponible una prueba farmacopeica, se debe usar un procedimiento validado con criterios de aceptación.
USP 39
Requisitos Generales/ (1) Medicamentos Inyectables 77 Soluciones
Una solución es una forma farmacéutica líquida transparente y homogénea que contiene una o más sustancias químicas (p.ej., fármacos o excipientes) disueltas en un disolvente (acuoso o no acuoso) o una mezcla de disolventes miscibles entre sí. Las soluciones destinadas para administración parenteral (p.ej., mediante inyección o para irrigación) deben ser estériles y biocompatibles con el sitio de administración al que están destinadas. Esto incluye considerar factores tales como tonicidad, pH, pirogenicidad, partículas extrañas y compatibilidad fisicoquímica, entre otros. A menos que se justifique de otro modo, se requieren las siguientes pruebas para soluciones para inyección: • Pruebas Universales • Pruebas Específicas - Propiedades Fisicoquímicas: Peso Específico, Viscosidad, pH, Osmolaridad y Osmolalidad - Conservantes Antimicrobianos
Polvos Estériles para Solución Los polvos estériles para solución (también referidos como polvos estériles para inyección) están formados por fármacos y otros componentes tales como ingredientes para formulaciones secas para asegurar la estabilidad química y física de la presentación dentro de un envase para uso final. Se puede proveer un diluyente estéril acompañante o compartimentos de diluyente para facilitar la reconstitución al volumen final deseado. El artículo estéril para inyección se presenta en diversas formas: polvo liofilizado destinado para solución final, sólidos pulverizados destinados para solución final, o sólidos secos que al reconstituirlos forman líquidos viscosos. La descripción debe incluir una sección que describa la facilidad de dispersión y la reconstitución. La forma farmacéutica es un sólido homogéneo que se reconstituye fácilmente en la forma final con el diluyente especificado, y la dispersión se completa agitando suavemente. A menos que se justifique de otro modo, las siguientes pruebas se aplican a polvos estériles para inyección: • Pruebas Universales • Pruebas Específicas - Propiedades Fisicoquímicas: Peso Específico, Viscosidad, pH, Osmolaridad y Osmolalidad Lo siguiente se aplica a soluciones reconstituidas: • Uniformidad de Unidades de Dosificación (905): Para asegurar la uniformidad de las unidades de dosificación, cada unidad en una partida debe contener una cantidad de fármaco cercana a la cantidad declarada dentro de un intervalo estrecho. Las unidades de dosificación se definen como formas farmacéuticas que contienen una sola dosis o una parte de una dosis de fármaco en cada unidad. Para formas farmacéuticas líquidas, los analistas deben realizar la valoración usando una cantidad de material reconstituido bien mezclado, retirado de un envase individual en condiciones normales de uso, expresar los resultados como dosis entregada y calcular el valor de aceptación. • Pérdida por Secado (731 ): El procedimiento establecido en este capítulo determina la cantidad de materia volátil de cualquier tipo expelida en las condiciones especificadas. • Determinación de Agua (921 ): El contenido de agua o de disolvente puede tener efectos importantes sobre la reconstitución y la estabilidad. Para los artículos que requieren un control del contenido de agua o de disolvente, los analistas deben llevar a cabo uno de los métodos siguientes o reemplazarlo por uno que resulte adecuado. • Aspecto: Los analistas deben evaluar el nivel y la variación de la unidad para los siguientes parámetros: - Color del Aglomerado: Varía dentro de los parámetros esperados. - Textura y Homogeneidad del Aglomerado: Varía dentro de los parámetros esperados. - Presencia de Material Extraño: Se deben rechazar todas las unidades con material extraño. - Tamaño y Distribución de Partícula (Polvo Seco): La evaluación de la forma apropiada y cristalinidad de los sólidos en polvo es una medida del control y uniformidad del proceso. •Estimación de la Distribución del Tamaño de Partícula por Tamizado Analítico (786): Este capítulo se puede usar para polvos sueltos. Cristalinidad: Se puede caracterizar la cristalinidad de un material para determinar si cumple con el requisito de cristalinidad cuando éste se indique en la monografía individual de un fármaco. • Microscopía Óptica (776): La cristalinidad se puede caracterizar mediante microscopía de luz polarizada para evaluación cualitativa del tamaño, la forma y la cristalinidad de sólidos. A menos que se especifique de otro modo en la monografía individual, los analistas deben montar una muestra sólida en aceite mineral sobre un portamuestras de vidrio limpio o cubreobjetos y deben examinar la mezcla usando un microscopio polarizante: Las partículas presentan birrefringencia (colores derivados de la interferencia) y posiciones de extinción cuando se gira la platina del microscopio. Vehículos y diluyentes: Las pautas para reconstitución y suspensión de polvos secos se encuentran en las monografías específicas. Cuando existe un diluyente específico envasado para su uso con un producto en particular el cual no esté incluido en una monografía, entonces el artículo final se prepara con dicho diluyente.
78 (1) Medicamentos Inyectables / Requisitos Generales
USP 39
Suspensiones Las suspensiones parenterales son formas farmacéuticas líquidas que contienen partículas sólidas en un estado de dispersión uniforme. Las suspensiones para administración parenteral deben ser estériles y compatibles con el sitio de administración. Se debe tomar en cuenta el pH y la pirogenicidad, además de que se deben identificar límites apropiados. Las evaluaciones de estabilidad física de las suspensiones parenterales deben incluir evaluaciones para confirmar que el intervalo del tamaño de partícula de la materia suspendida no cambie con el tiempo y para confirmar que los sólidos en la preparación se pueden resuspender con facilidad para obtener una preparación uniforme. Para las suspensiones inyectables se requiere el cumplimiento con las pruebas para soluciones inyectables además de las siguientes pruebas, a menos que se justifique algo diferente: • Pruebas Universales • Pruebas Específicas - Propiedades Fisicoquímicas: pH - Uniformidad de Unidades de Dosificación - Conservantes Antimicrobianos
Liposomas Los liposomas son medicamentos singulares con propiedades únicas que pueden estar en forma de solución o suspensión. Los liposomas son dispersiones acuosas de lípidos anfifílicos y tienen baja solubilidad en agua. Se organizan como una lámina de dos capas que encierra un compartimiento acuoso interno y se conocen como vesículas de bicapa lipídica. Los liposomas pueden tener una sola bicapa lipídica (vesícula unilaminar) o pueden tener una estructura multicapa parecida a una cebolla (vesícula multilaminar). Los lípidos anfifílicos comprenden una cabeza compuesta por un grupo hidratado en la interfase de agua de la bicapa unido a un grupo hidrófobo que forma el interior de la bicapa mediante la asociación con el grupo hidrófobo de lípidos de la lámina opuesta de la bicapa. Las propiedades físicas del liposoma y su bicapa pueden variar ampliamente dependiendo de la composición lipídica, la composición acuosa y la temperatura con respecto a los puntos de transición de fase de los componentes acilo. Debido al compartimiento acuoso central, una prueba simple para determinar la presencia de liposomas en una dispersión de lípidos sirve para determinar la presencia de una fase acuosa atrapada. Un medicamento liposómico consta del fármaco, los componentes del liposoma y otros ingredientes inactivos pero críticos tales como una dispersión acuosa, a menos que el contenido sea un producto liofilizado. A menos que se justifique de otro modo, se requieren las siguientes pruebas para liposomas: • Pruebas Universales • Pruebas Específicas - Propiedades Fisicoquímicas: pH - Composición de Lípidos y Ácidos Grasos, incluyendo el grado de insaturación y la especificidad de la posición en las cadenas laterales acilo y productos de degradación críticos tales como lisolípidos2 - Tamaño de Partícula 2 - Distribución del Tamaño de Partícula de Vesículas Liposomales 2 - Laminalidad 2 - Composición de Fosfolípidos2 - Porcentaje de Lípidos Libres vs. Porcentaje de Lípidos Encapsulados 2 - Fármaco Libre vs. Fármaco Encapsulado - Fuerza lónica y Fuerza Osmótica2
Polvos Estériles para Suspensión Los polvos estériles para suspensiones están formados por fármacos y otros componentes tales como ingredientes para formulaciones secas para asegurar la estabilidad química y física de la presentación dentro de un envase para uso final. Se puede proveer un diluyente estéril acompañante o compartimentos de diluyente para facilitar la reconstitución al volumen final deseado. El artículo estéril inyectable se puede presentar de diversas formas: polvo liofilizado destinado a suspensión final, sólidos pulverizados destinados a suspensión final o micropartículas que mantienen su integridad y que se administran en forma de suspensión estéril. La descripción debe incluir una sección que describa la facilidad de dispersión y la reconstitución. La forma farmacéutica es un sólido homogéneo que se reconstituye fácilmente en la forma final con el diluyente especificado, y la dispersión se completa agitando suavemente. A menos que se justifique de otro modo, las siguientes pruebas se aplican a polvos estériles para inyección: • Pruebas Universales • Pruebas Específicas • Endotoxinas Bacterianas 2
Cuando no esté disponible una prueba farmacopeica, se debe usar un procedimiento validado con criterios de aceptación.
USP 39
Requisitos Generales/ (1 > Medicamentos Inyectables 79
- Propiedades Fisicoquímicas: pH, Osmolaridad y Osmolalidad Lo siguiente se aplica a suspensiones reconstituidas: • Uniformidad de Unidades de Dosificación (905): Para asegurar la uniformidad de las unidades de dosificación, cada unidad en una partida debe contener una cantidad de fármaco cercana a la cantidad declarada dentro de un intervalo estrecho. Las unidades de dosificación se definen como formas farmacéuticas que contienen una sola dosis o una parte de una dosis de fármaco en cada unidad. Para formas farmacéuticas líquidas, los analistas deben realizar la valoración usando una cantidad de material reconstituido bien mezclado, retirado de un envase individual en condiciones normales de uso, expresar los resultados como dosis entregada y calcular el valor de aceptación. • Pérdida por Secado (731 ): El procedimiento establecido en este capítulo determina la cantidad de materia volátil de cualquier tipo expelida en las condiciones especificadas. • Determinación de Agua (921 ): El contenido de agua o de disolvente puede tener efectos importantes sobre la reconstitución y la estabilidad. Para los artículos que requieren un control del contenido de agua o de disolvente, los analistas deben llevar a cabo uno de los métodos siguientes o reemplazarlo por uno que resulte adecuado. • Aspecto: Los analistas deben evaluar el nivel y la variación de la unidad para los siguientes parámetros: - Color del Aglomerado: Varía dentro de los parámetros esperados. - Textura y Homogeneidad del Aglomerado: Varía dentro de los parámetros esperados. - Presencia de Material Extraño: Se deben rechazar todas las unidades con material extraño: - Tamaño y Distribución de Partícula (Polvo Seco): La evaluación de la forma apropiada y cristalinidad apropiada de los sólidos en polvo es una medida de control y uniformidad del proceso. •Estimación de la Distribución del Tamaño de Partícula por Tamizado Analítico (786): Este capítulo se puede usar para polvos sueltos. Cristalinidad: Se puede caracterizar la cristalinidad de un material para determinar si cumple con el requisito de cristalinidad cuando éste se indique en la monografía individual de un fármaco. • Microscopía Óptica (776): La cristalinidad se puede caracterizar mediante microscopía de luz polarizada para evaluación cualitativa del tamaño, la forma y la cristalinidad de sólidos. A menos que se especifique de otro modo en la monografía individual, los analistas deben montar una muestra sólida en aceite mineral sobre un portamuestras de vidrio limpio o cubreobjetos y deben examinar la mezcla usando un microscopio polarizante: Las partículas presentan birrefringencia (colores derivados de la interferencia) y posiciones de extinción cuando se gira la platina del microscopio. Vehículos y diluyentes: Las pautas para reconstitución y suspensión de polvos secos se encuentran en las monografías específicas. Cuando existe un diluyente específico envasado para su uso con un producto en particular el cual no esté incluido en una monografía, entonces el artículo final se prepara con dicho diluyente. Micropartículas: Algunas micropartículas se proveen como polvos estériles que deben reconstituirse en forma de suspensión antes de la inyección. Las principales preparaciones de micropartículas deben reconstituirse en forma de suspensión inyectable. Para los requisitos de las pruebas de calidad, consultar la sección Implantes.
Emulsiones Las emulsiones para formas farmacéuticas parenterales son preparaciones líquidas de fármacos disueltos o dispersados en un medio de emulsión adecuado. Las emulsiones de aceite en agua o de agua en aceite por lo regular atrapan al fármaco. Las emulsiones por lo general son formas farmacéuticas líquidas homogéneas, turbias y de color blanco que contienen una o más sustancias químicas (p.ej., fármacos y excipientes) disueltas en un disolvente (acuoso o no acuoso) o una mezcla de disolventes miscibles entre sí. Las emulsiones destinadas para administración intravenosa deben ser estériles y compatibles con el sitio de administración al que está destinado. A menos que se justifique de otro modo, se requieren las siguientes pruebas para emulsiones inyectables: • Pruebas Universales • Pruebas Específicas - Propiedades Fisicoquímicas: pH, Osmolaridad y Osmolalidad - Distribución del Tamaño de Glóbulos - Cantidad de Glóbulos de Grasa (lípidos) 2 - Porcentaje de Lípidos Libres vs. Porcentaje de Lípidos Encapsulados 2 - Fármaco Libre vs. Fármaco Encapsulado
Implantes Los implantes para liberación prolongada están compuestos por una matriz de fármaco y excipiente polimérico que puede o no tener una membrana externa de control de velocidad. El excipiente polimérico debe ser biocompatible pero puede o no ser biorreabsorbible. Algunos implantes se fabrican con metal de grado médico con una bomba osmótica en su interior que produce la liberación prolongada del fármaco. Los implantes deben ser estériles y, por lo general, en forma de cilindro, aunque también se usan otras formas. Los disolventes usados para disolver la formulación pueden conducir a la esterilización, por lo que el método de prueba de esterilidad interno debe demostrar que la preparación de la muestra no provoca la esterilización de la muestra de prueba.
80 (1) Medicamentos Inyectables / Requisitos Generales
USP 39
Los implantes en forma de cilindro para administración sistémica por lo general se proveen en un dispositivo de inserción para administración subcutánea o local, tal como administración ocular local. Asimismo, los implantes se pueden implantar quirúrgicamente para administración local, p.ej., administración ocular. A menos que se justifique de otro modo, se requieren las siguientes pruebas para implantes: • Pruebas Universales • Pruebas Específicas - Uniformidad de Unidades de Dosificación Dependiendo del medicamento, pueden ser necesarias las siguientes pruebas: • Contenido de Agua Geles in situ: Los geles estériles in situ son preparaciones líquidas que están destinadas para inyectarse en sitios terapéuticos específicos. Por lo regular, están compuestos por polímeros en disolventes orgánicos y, al momento de su inyección, los disolventes emigran del sitio, dejando una masa gelificada. Las preparaciones se pueden inyectar tal como se encuentran, al momento de su reconstitución, a partir de la formación in situ, o a partir de catálisis iniciada químicamente que resulta en la forma final. A menos que se justifique de otro modo, se requieren las siguientes pruebas para geles in situ: • Pruebas Universales • Pruebas Específicas - Propiedades Fisicoquímicas: Viscosidad - Conservantes Antimicrobianos - Contenido y Actividad del Iniciador Catalizador2 - Monómero Residua12 - Tiempo de Formación del Ge12 Micropartículas: Micropartículas reabsorbibles inyectables para liberación prolongada con un diámetro generalmente de 20 a 100 µm. Están compuestas por fármacos incluidos dentro de un excipiente polimérico biocompatible y biorreabsorbible, p.ej., excipientes de poliéster. Las micropartículas se proveen como polvos estériles en un vial o jeringa. justo antes de su administración intramuscular o subcutánea, el polvo de micropartículas debe suspenderse en un vehículo acuoso para inyección (diluyente). El vehículo para inyección por lo regular está formado por Agua para Inyección, agente tensoactivo y mejorador de viscosidad, y puede contener un compuesto que ajuste la osmolalidad, p.ej., un azúcar con o sin un compuesto que controle el pH, p.ej., un ácido. El vehículo para inyección debe ser estéril y debe analizarse de acuerdo a los requisitos para soluciones destinadas para administración parenteral. A menos que se justifique de otro modo, se requieren las siguientes pruebas para micropartículas para inyección: • Pruebas Universales • Pruebas Específicas - Uniformidad de Unidades de Dosificación - Contenido de Agua - Disolventes Residuales Dependiendo del medicamento, pueden ser necesarias las siguientes pruebas: • Distribución del Tamaño de Partícula • Propiedades Fisicoquímicas: pH, Osmolalidad y Osmolaridad
Estents para Elución de Fármacos Los estents para elución de fármacos son estents, metales diminutos o estructuras de polímeros que se usan para mantener las arterias abiertas después de una intervención médica, en los cuales se incorpora un fármaco en el interior o sobre la plataforma del estent. Los estents para elución de fármacos por lo regular tienen dos componentes de análisis: (1) pruebas funcionales que por lo general son métodos de la American Society for Testing and Materials (Sociedad Estadounidense para Ensayos y Materiales o ASTM) que están fuera del alcance de este capítulo y (2) pruebas analíticas. A menos que se justifique de otro modo, se requieren las siguientes pruebas para estents para elución de fármacos: • Pruebas Universales • Pruebas Específicas - Uniformidad de Unidades de Dosificación. El contenido de la sustancia activa en la forma farmacéutica es aplicable para estents para elución de fármacos envasados en envases unitarios. La prueba se puede realizar mediante uniformidad de contenido o variación de peso (ver el capítulo Uniformidad de Unidades de Dosificación (905)). Siempre que se justifique adecuadamente, el número de estents requerido para esta prueba puede ser menor que el recomendado en el capítulo (905). - Reactividad Biológica - Partículas - Espesor(es) del Recubrimiento 2 - Robustez del Recubrimiento y Susceptibilidad a la Ruptura o Expansión 2 - Fármaco Libre vs. Fármaco Encapsulado2 - Morfología (superficie y sección cruzada) 2
Requisitos Generales / (2) Medicamentos Orales 81
USP 39
-
Polidispersión2 Cociente de Copolímero 2 Punto de Transición Vítrea 2 Adhesión del Recubrimiento a la Superficie del estent2 Prueba de Reacción del Tejido 2 Peso Molecular del Polímero 2
PRUEBAS DE DESEMPEÑO DEL PRODUCTO Una prueba de desempeño para inyectables y productos implantados debe tener la capacidad de medir la liberación de fármacos a partir de las formas farmacéuticas fabricadas. Asimismo, debe ser reproducible y confiable, y, aunque no se trata de una medición de biodisponibilidad, la prueba de desempeño debe ser capaz de detectar cambios en las características de liberación del fármaco del producto terminado. Estos cambios tienen el potencial de alterar el desempeño biológico del fármaco en la forma farmacéutica, y pueden estar relacionados con ingredientes activos o inactivos/inertes en la formulación, con atributos físicos o químicos de la formulación terminada, con variables de fabricación, con los efectos de transporte y almacenamiento, con efectos de envejecimiento y con otros factores de formulación críticos para las características de calidad del medicamento terminado. Favor de consultar el capítulo Procedimiento de Disolución: Desarrollo y Validación (1092) al desarrollar la prueba de liberación de fármacos, al seleccionar el medio de liberación de fármacos, el aparato o el procedimiento y el método analítico. Las pruebas de desempeño del producto pueden servir para una gran variedad de propósitos en el desarrollo del producto y en el monitoreo del medicamento posterior a la aprobación. Asimismo, proveen garantía sobre el desempeño equivalente para productos que han sufrido cambios en las materias primas, reubicación o cambios en el sitio de fabricación y demás cambios posteriores a la aprobación conforme a lo detallado en las Pautas para la Industria SUPAC de la FDA (SUPAC-IR, SUPAC-MR y SUPAC-SS; disponibles en www.fda.gov/cder/guidance). En este capítulo, se debe considerar una prueba de desempeño de la USP para productos inyectables e implantados a fin de sustentar la liberación de partidas.
(2) MEDICAMENTOS ORALES-PRUEBAS DE CALIDAD DEL PRODUCTO INTRODUCCIÓN La administración oral es la vía de administración más común para medicamentos. Todos los medicamentos orales conllevan a la acción local y/o sistémica en la cavidad oral y/o en el tracto gastrointestinal. Los medicamentos orales se dividen en dos categorías principales: sólidos y líquidos. Los medicamentos orales sólidos incluyen, entre otros, cápsulas, tabletas, gránulos y polvos. De manera similar, los medicamentos orales líquidos incluyen, entre otros, soluciones, suspensiones y emulsiones. Las definiciones y descripciones de estas formas farmacéuticas, así como información abreviada sobre su composición y procesos de fabricación se encuentran en el capítulo Formas Famacéuticas (1151 ). 1 El presente capítulo general (2) se centra en las pruebas de calidad de productos que generalmente son necesarias para medicamentos orales para una sola molécula o una combinación de moléculas pequeñas de ingredientes activos. Este capítulo no contempla los productos biológicos en formas farmacéuticas sólidas. En este capítulo, los términos "fármaco" e "ingrediente activo" se usan de manera intercambiable. El contenido de este capítulo no necesariamente se aplica a medicamentos destinados para un uso distinto a la administración oral. Por ejemplo, el capítulo no trata las formas farmacéuticas oromucosas. Algunas de las pruebas indicadas en este capítulo se pueden llevar a cabo durante el proceso u omitirse como pruebas de rutina basándose en la validación del proceso. Sin embargo, una vez que el producto esté en el mercado, éste debe cumplir con los requisitos farmacopeicos de la USP al momento del muestreo y análisis. El capítulo (2) provee un marco de sustento para nuevas monografías individuales; éstas se consideran documentos de "avance" y no pretenden apartarse de las monografías individuales (no reemplazan a las monografías individuales). Además, el capítulo (2) provee listas de los requisitos de pruebas de calidad de productos comunes y consolidadas de manera coherente y concisa. Cuando exista una monografía, ésta contendrá todas las pruebas requeridas para la forma farmacéutica. Cuando no exista la monografía de un medicamento específico, el capítulo general proveerá las pruebas de calidad específicas disponibles como recurso para los fabricantes hasta que la USP desarrolle las monografías particulares requeridas para la forma farmacéutica. Cuando esté disponible un procedimiento de prueba validado para el medicamento específico, éste se identifica en un capítulo general con un número inferior a (1000). Para aquéllos casos en los que no sea posible recomendar un procedimiento
1 [NOTA-Todas las referencias a los capítulos a partir del (1000) son únicamente para propósitos informativos y para su uso como recurso útil. Estos capítulos no son obligatorios a menos que su aplicación se indique explícitamente.]
82 (2) Medicamentos Orales / Requisitos Generales
USP 39
validado pero se cuente con información para la prueba de calidad y/o de desempeño del producto, dicha información estará descrita en un capítulo informativo con un número superior a (1000).
Pruebas de Calidad y de Desempeño de Medicamentos Las pruebas, los procedimientos analíticos y los criterios de aceptación de una monografía para medicamentos orales se dividen en dos categorías: (1) aquéllas que evalúan los atributos generales de calidad del producto y (2) aquéllas que evalúan el desempeño del producto, el cual es un atributo específico de calidad generalmente vinculado a los estudios de biodisponibilidad y de bioequivalencia (ver el capítulo Evaluación de Desempeño del Producto Farmacéutico-Biodisponibilidad, Bioequivalencia y Disolución (1090)). 1 Las pruebas de calidad del medicamento pretenden evaluar atributos tales como identificación, contenido (valoración), impurezas (pruebas universales), uniformidad del contenido de la dosis, pH, llenado mínimo, contenido de alcohol, contenido volátil y contenido microbiano (pruebas específicas). Las pruebas de desempeño de medicamentos están diseñadas para evaluar la liberación de fármacos in vitro a partir de las formas farmacéuticas, p.ej., Disolución (711) y Liberación de Fármacos (724). Para medicamentos orales líquidos en solución, el desempeño se considera óptimo, por lo que no se incluye una prueba de desempeño en la monografía. Cada uno de estos atributos es importante para adquirir un entendimiento primario de la calidad y desempeño de un medicamento. Por ende, constituyen los cimientos para la monografía. Un producto oficial debe cumplir con todas las pruebas de calidad de medicamentos y las pruebas de desempeño de medicamentos incluidas en su monografía correspondiente. [NOTA-Las pruebas de disolución, específicamente la similitud del perfil de disolución entre contenidos mayores y contenidos menores de un producto de un fabricante dado y el perfil de similitud entre el producto genérico y el producto de réferencia, se emplean para el otorgamiento de bioexenciones. Ver el capítulo (1090). 1]
PRUEBAS DE CALIDAD DE PRODUCTOS PARA MEDICAMENTOS ORALES Las pruebas de calidad para medicamentos orales se dividen en dos categorías: (1) pruebas universales que se aplican a todos los medicamentos orales y que se deben incluir en la monografía, y (2) pruebas específicas cuya inclusión debe considerarse para tipos específicos de productos orales.
PRUEBAS UNIVERSALES Los atributos de calidad del producto para formas farmacéuticas orales son importantes para asegurar que los productos comercializados cumplan con los requisitos mínimos de calidad. Las pruebas universales deben aplicarse a todas las formas farmacéuticas orales y deben incluir Descripción, Identificación, Contenido (prueba de valoración) e Impurezas (orgánicas, inorgánicas y disolventes residuales). DESCRIPCIÓN
La descripción tiene un carácter general y no constituye una norma por sí misma. Ésta comunica la aparición de un artículo que cumple con los estándares de la monografía. IDENTIFICACIÓN
La prueba de identificación se define en las Advertencias y Requisitos Generales, 5.40 y se incluye en una monografía para ayudar a confirmar que el artículo contiene el fármaco declarado en la etiqueta mediante una identificación positiva del fármaco o de las sustancias en un medicamento. Un método para confirmar la identidad consiste en comparar el tiempo de retención de la muestra con el obtenido en inyecciones estándar en un procedimiento cromatográfico de valoración. Otros métodos que a menudo se usan para confirmar ortogonalmente la identidad del ingrediente activo son: Prueba de Identificación (201 ), Pruebas de Identificación Espectrofotométrica (197), Espectroscopía en el Infrarrojo Cercano (1119)1 y Espectroscopía Raman (1120), 1 entre otros. El procedimiento ser capaz de distinguir entre el ingrediente activo y todos los excipientes que están presentes o de los productos de degradación potenciales que pudieran estar presentes. Se debe tener cuidado de asegurar que el sistema cromatográfico separa el artículo de otros fármacos, impurezas y aditivos estrechamente relacionados. La absorción en el infrarrojo y en el ultravioleta también se pueden usar para la identificación (ver el capítulo (197)), cuando se haya demostrado que el procedimiento es selectivo para el fármaco mediante un estudio de validación o verificación apropiado. Los resultados de la prueba de identificación deben compararse con los resultados obtenidos de un estándar de referencia adecuado preparado de manera similar.
Requisitos Generales/ (2) Medicamentos Orales 83
USP 39
VALORACIÓN La valoración es una prueba específica e indicadora de la estabilidad para determinar la potencia (contenido) del medicamento. Cuando se justifica una valoración no específica (p.ej., volumetría), se debe asegurar mediante otros procedimientos analíticos de sustento la capacidad de detectar cualquier especie interferente. En general, la aceptación a priori de una variación de ±10% en los límites de un atributo de calidad (p.ej., valoración) a partir de la cantidad declarada esperada (100%) en la mayoría de los casos pretende tomar en cuenta la variabilidad de la fabricación y la estabilidad durante la vida útil, y se basa principalmente en la noción de que tal variación en un atributo de calidad tiene una menor probabilidad de ocasionar un impacto adverso perceptible en el resultado clínico deseado. Los criterios de aceptación de 95,0%-105,0% se usan con justificación (p.ej., para medicamentos con un índice terapéutico estrecho). También se aceptan las valoraciones de actividad y las valoraciones de contenido absoluto siempre que se justifique. IMPUREZAS El fármaco y los excipientes usados en la fabricación del medicamento pueden presentar impurezas del proceso, subproductos sintéticos y otras impurezas inorgánicas y orgánicas. Los límites de dichas impurezas están indicados en las monografías del fármaco y de los excipientes. Existe la posibilidad de que ocurra degradación durante la fabricación del producto y durante su vida útil, la cual, entre otros factores, puede resultar de la degradación del fármaco o de interacciones entre el fármaco y los excipientes. Los procedimientos y criterios de aceptación deben limitar específicamente los materiales tóxicos. Ver los requisitos específicos en las Advertencias Generales de la USP, 5.60 Impurezas y Sustancias Extrañas. [NOTA-Para información adicional, consultar el capítulo Impurezas en Fármacos y Productos Farmacéuticos (1086). 1)
PRUEBAS ESPECÍFICAS PARA TABLETAS Además de las pruebas universales descritas anteriormente, se deben considerar las siguientes pruebas específicas para tabletas, dependiendo de la naturaleza del fármaco y de la formulación. CONTENIDO VOLÁTIL La prueba y el método específico dependen de la naturaleza del artículo. Se debe tener consideración especial a las formas farmacéuticas cuyo contenido de agua pudiera ser un potencial atributo de calidad y a los productos en los que se emplean disolventes para la fabricación del medicamento. Cuando la presencia de humedad u otro material volátil pueda tornarse crítica, los analistas deben determinar la cantidad de disolventes volátiles no unidos o de materia volátil de cualquier tipo separado mediante Pérdida por Secado (731) u otra técnica adecuada (p.ej., actividad del agua). Para sustancias que parecen contener agua como el único componente volátil, el procedimiento provisto en el capítulo Determinación de Agua (921) puede ser apropiado. Para los medicamentos, los analistas también deben consultar el capítulo Disolventes Residuales (467). DESINTEGRACIÓN La desintegración es un atributo esencial de los sólidos orales, excepto para aquéllos destinados a ser masticados antes de tragarlos y para los productos de liberación retardada o prolongada. Esta prueba mide el tiempo que tarda en desintegrarse la unidad de dosificación en un medio acuoso y se describe en detalle en el capítulo (701 ). Para algunas formas farmacéuticas, p.ej., tabletas efervescentes, tabletas de desintegración, tabletas solubles, entre otros, la Farmacopea Europea describe en gran detalle la prueba de desintegración. La prueba de desintegración para algunas de las formas farmacéuticas de este capítulo se incluye para proveer información de integridad. Para información sobre procedimientos detallados, consultar el capítulo (701) o la Farmacopea Europea. Siempre que se incluye, la prueba de desintegración se usa únicamente como una prueba de control de calidad y no como una prueba de desempeño del producto, y debe cumplir con las especificaciones de la monografía. Una prueba de desintegración podrá usarse como una prueba de desempeño del producto únicamente cuando la desintegración se haya correlacionado con la disolución de una forma farmacéutica (Pauta Q6A de la ICH, disponible en www.ich.org). Para todos los demás casos, se deberá considerar una prueba de disolución como una prueba de desempeño del producto. fRIABILIDAD DE LAS TABLETAS El procedimiento de prueba se aplica a la mayoría de las tabletas comprimidas sin cubierta. La friabilidad determina la capacidad de las tabletas para soportar las tensiones mecánicas y su resistencia a la formación de astillas y a la abrasión en la superficie. [NOTA-Para información adicional, consultar el capítulo Friabilidad de las Tabletas (1216). 1·]
84 (2) Medicamentos Orales / Requisitos Generales
USP 39
FUERZA DE RUPTURA DE LAS TABLETAS La fuerza de ruptura de las tabletas mide la integridad mecánica de las tabletas, que es la fuerza requerida para provocar que fallen (es decir, que se rompan) en un plano específico. [NOTA-Para información adicional, ver el capítulo Fuerza de Ruptura de las Tabletas (121 7).1]
UNIFORMIDAD DE UNIDADES DE DOSIFICACIÓN La uniformidad de unidades de dosificación debe demostrarse mediante uniformidad de contenido o variación de peso. La uniformidad de contenido se basa en la valoración del contenido individual de fármacos en un número de unidades de dosificación para determinar si los contenidos individuales son lo suficientemente cercanos a la cantidad declarada. La variación de peso se puede usar como alternativa para estimar la uniformidad del contenido ante ciertas condiciones (ver el capítulo Uniformidad de Unidades de Dosificación (905)).
TABLETAS SIN CUBIERTA Las tabletas sin cubierta incluyen tabletas de una sola capa que resultan de una sola compresión de partículas y tabletas de capas múltiples que constan de capas concéntricas o paralelas obtenidas mediante compresión sucesiva de partículas de composición diferente. Los excipientes usados generalmente no tienen el propósito específico de modificar la liberación del fármaco en los fluidos digestivos. Las tabletas sin cubierta incluyen, entre otras, las siguientes: tabletas efervescentes, tabletas bucales, tabletas sublinguales, tabletas masticables, tabletas de desintegración, tabletas de desintegración oral, bolos, tabletas solubles, tabletas para solución oral y tabletas para suspensión oral. Los bolos, que son tabletas grandes y alargadas destinadas para administrarse en animales, deben considerarse tabletas sin cubierta y deben cumplir con los requisitos de calidad del producto. Para las tabletas sin cubierta, la desintegración debe analizarse según lo indicado en el capítulo (701 ). TABLETAS BUCALES, SUBLINGUALES Y DE DESINTEGRACIÓN ORAL (DE DISPERSIÓN ORAL) Estas formas farmacéuticas se estudiarán en el nuevo capítulo Medicamentos para Mucosas-Pruebas de Calidad del Producto (4), el cual se publicará en un futuro. Se citan en este capítulo sólo para propósitos informativos y para proveer información completa. TABLETAS MASTICABLES Las tabletas masticables no requieren cumplir con la prueba de desintegración. Las tabletas masticables (intactas) deben someterse a la prueba de disolución, como una prueba de desempeño del producto (cuando se cite en la monografía), debido a que podrían ser tragadas por un paciente sin haberlas masticado apropiadamente. En general, las condiciones de la prueba de disolución para tabletas masticables deben ser las mismas que para las tabletas no masticables de la misma fracción o ingrediente activo. TABLETAS DE DESINTEGRACIÓN O DE DISPERSIÓN Se trata de tabletas destinadas para ser dispersadas en agua antes de su administración para proporcionar una dispersión homogénea. Finura de la dispersión: Colocar 2 tabletas en 100 mL de agua y mezclar hasta que se dispersen por completo. Se obtiene una dispersión sin grumos que pasa a través de un tamiz Nº 25 (71 O µm). TABLETAS PARA SOLUCIÓN ORAL Y TABLETAS PARA SUSPENSIÓN ORAL Finura de la dispersión: Colocar 2 tabletas en 100 mL de agua y mezclar hasta que se dispersen por completo. Se obtiene una dispersión sin grumos que pasa a través de un tamiz Nº 25 (71 O µm).
TABLETAS RECUBIERTAS Las tabletas recubiertas son tabletas cubiertas con una o más capas de mezclas de varias sustancias tales como resinas sintéticas o naturales, gomas, gelatinas, diluyentes inactivos e insolubles, azúcares, plastificantes, polioles, ceras, materia colorante autorizada por la autoridad competente y, en ocasiones, sustancias saborizantes y sustancias activas. Las tabletas recubiertas con azúcar o película incluyen, entre otras: tabletas con cubierta simple, tabletas de liberación prolongada y tabletas de liberación retardada. Cuando sea aplicable, se debe realizar una prueba de desintegración según lo descrito en el capítulo (701 ). No existen pruebas de calidad adicionales específicas para tabletas de liberación prolongada ni para tabletas de liberación retardada. Se deben aplicar las pruebas universales de calidad a estos productos.
PRUEBAS ESPECÍFICAS PARA CÁPSULAS Además de las pruebas universales descritas anteriormente, se deben considerar las siguientes pruebas específicas para cápsulas, dependiendo de la naturaleza del fármaco y de la formulación. Las pruebas de calidad del producto que se consideran específicas al tipo de cápsula incluyen aquéllas para contenido volátil (capítulos (731) y (921)). Las cápsulas de una pieza a menudo se usan para administrar un fármaco como solución o suspensión. Las cápsulas de dos piezas constan de dos piezas telescópicas de tapa y cuerpo de diversos tamaños estándar y se usan
Requisitos Generales / (2) Medicamentos Orales 85
USP 39
para administrar material sólido como polvo, gránulos o tabletas pequeñas. Las cápsulas de liberación modificada incluyen, entre otras: cápsulas de liberación retardada y cápsulas de liberación prolongada. Desintegración: Proceder según se indica en el capítulo (701 ), Cápsulas de Gelatina Blanda para cápsulas de una pieza y Cápsulas de Gelatina Dura para cápsulas de dos piezas. La desintegración para cápsulas de liberación modificada se describe en sumo detalle en la Farmacopea Europea. No existen pruebas de calidad adicionales específicas para cápsulas de liberación prolongada ni para cápsulas de liberación retardada. Se deben aplicar las pruebas universales de calidad a estos productos.
PRUEBAS ESPECÍFICAS PARA GRÁNULOS Además de las pruebas universales descritas anteriormente, se deben considerar las siguientes pruebas específicas para gránulos, dependiendo de la naturaleza del fármaco y de la formulación. Los gránulos son formas farmacéuticas sólidas que están compuestas de aglomeraciones de partículas más pequeñas. Los gránulos incluyen, entre otros: gránulos efervescentes, gránulos recubiertos, gránulos de liberación prolongada y gránulos de liberación retardada. Las pruebas que se consideran específicas para el tipo de gránulos incluyen contenido volátil (capítulos (731) y (921 )). La desintegración para gránulos efervescentes se describe en sumo detalle en la Farmacopea Europea. Basándose en la naturaleza del artículo y en criterios científicos, podrían ser aplicables pruebas adicionales, incluida la finura de polvos, entre otras.
PRUEBAS ESPECÍFICAS PARA POLVOS Los polvos orales deben indicar lo siguiente: "Sólo para Uso Oral". Las pruebas que se consideran específicas para el tipo de polvo incluyen: Llenado Mínimo (755) y contenido volátil (capítulos (731) y (921 )). El capítulo Llenado Mínimo (755) presenta especificaciones aplicables a los polvos orales. Basándose en la naturaleza del artículo y en criterios científicos, podrían ser aplicables pruebas adicionales, incluidos el pH en soluciones acuosas, la finura de polvos, los límites microbanos, entre otros.
PRUEBAS ESPECÍFICAS PARA LÍQUIDOS Las pruebas de calidad del producto recomendadas para un medicamento líquido incluyen las pruebas universales descritas anteriormente y las pruebas específicas incluidas más adelante. La mayoría de las pruebas de calidad para líquidos requieren la evaluación de productos monodosis para estimar el atributo de calidad. Las instrucciones específicas para realizar las pruebas de calidad para productos monodosis o multidosis se proveen en la monografía o en el capítulo general. Por ejemplo, la variación de peso se puede usar cuando se controla adecuadamente la aptitud de mezclado para las sustancias activas y los excipientes en la mezcla para asegurar su distribución uniforme, como en el caso de las soluciones.
VOLUMEN DE ENTREGA Cuando la formulación líquida se envasa en un envase multidosis, se debe cumplir con el capítulo Volumen de Entrega (698).
DETERMINACIÓN DE ALCOHOL Si la formulación líquida contiene una cantidad de alcohol, se debe incluir el capítulo Determinación de Alcohol (611 ). Los límites pueden ser una concentración absoluta, en porcentaje, o relativos a un contenido declarado.
PH Los productos orales líquidos generalmente son formulaciones acuosas que son susceptibles a cambios en el pH derivados de la exposición al C0 2 atmosférico. El ingreso de C0 2 atmosférico y el cambio en el pH de los productos orales líquidos únicamente es relevante para los productos acuosos. Aunque es menos crítico que para las preparaciones oftálmicas, el pH de una formulación líquida puede afectar el sabor y la estabilidad. El intervalo de pH conforme a lo descrito en el capítulo pH (791) se indica en la monografía.
CONTENIDO MICROBIANO La presencia de ciertos microorganismos en preparaciones no estériles tiene el potencial de reducir o incluso inactivar la actividad terapéutica del producto, y tiene el potencial de afectar adversamente la salud del paciente. Algunos productos orales líquidos pueden estar sujetos a un control microbiológico extremo, mientras que otros no requieren control alguno. La necesidad de especificaciones microbianas para un producto oral líquido dado depende de su formulación y uso y se indica en la monografía.
86 (2) Medicamentos Orales / Requisitos Generales
USP 39
[NOTA-Para información adicional, ver el capítulo Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Criterios de Aceptación para Preparaciones Farmacéuticas y Sustancias de Uso Farmacéutico (1111 ). 1]
ANTIOXIDANTE Se debe realizar una prueba de liberación. La prueba para vida útil podría no ser necesaria cuando los datos de desarrollo y estabilidad así lo justifiquen (Pauta Q6A de la ICH).
SUSTANCIAS EXTRAÍBLES Cuando los datos de estabilidad y desarrollo no presentan evidencia significativa de productos extraíbles, se puede proponer la eliminación de esta prueba. Cuando los datos demuestren la necesidad de criterios de aceptación para soluciones oralestapón de goma, recubrimiento interno de la tapa, frasco de plástico-se deben recopilar datos tan pronto como sea posible durante el proceso de desarrollo (Pauta Q6A de la ICH).
TIPOS DE FORMAS FARMACÉUTICAS LÍQUIDAS Las pruebas de calidad específicas para estas formas farmacéuticas se proveen en sus respectivas monografías. SOLUCIONES ORALES Y POLVOS Y GRÁNULOS PARA SOLUCIÓN
Las pruebas para formulaciones "para Solución" se llevan a cabo en una solución bien mezclada del medicamento reconstituido según se indica en el etiquetado. EMULSIONES, SUSPENSIONES Y POLVOS Y GRÁNULOS PARA SUSPENSIÓN
Las pruebas para formulaciones "para Suspensión" se llevan a cabo en una suspensión bien mezclada del medicamento reconstituido según se indica en el etiquetado. Las pruebas de calidad del producto para suspensiones debe incluir al menos una prueba de capacidad de suspensión. POLVOS Y GRÁNULOS PARA JARABES Y POLVOS PARA GOTAS ORALES
Después de su disolución o suspensión, cumplen con los requisitos de la monografía para la forma farmacéutica final. El contenido volátil (capítulos (731) y (921 )) puede ser una prueba de calidad adicional para polvos y gránulos para reconstitución.
PRUEBAS ESPECÍFICAS PARA FORMAS FARMACÉUTICAS ORALES MISCELÁNEAS PRODUCTOS ORALES LIOFILIZADOS
Determinación de Agua (921 ), Método la: Los productos orales liofilizados cumplen con la prueba. Los límites se aprueban según lo indicado en la monografía específica.
(3) MEDICAMENTOS TÓPICOS Y TRANSDÉRMICOS-PRUEBAS DE CALIDAD DEL PRODUCTO INTRODUCCIÓN Los medicamentos de aplicación tópica se dividen en dos categorías generales: medicamentos que se aplican para generar una acción localizada y los que se aplican para conseguir efectos sistémicos después de su absorción a través de la piel en el torrente sanguíneo. La acción localizada puede presentarse en la superficie del sitio de aplicación (p.ej., estrato córneo, epitelio ocular), en los tejidos subyacentes (p.ej., epidermis y/o dermis) y en tejidos subcutáneos (p.ej., músculo o articulación). Los medicamentos de aplicación tópica incluyen, entre otros, cremas, geles, ungüentos, pastas, suspensiones, lociones, espumas, atomizadores, aerosoles, soluciones y sistemas transdérmicos de liberación de fármacos (STD, también conocidos como parches). Las definiciones y descripciones de estas formas farmacéuticas, así como una breve información sobre su composición y/o proceso de fabricación, se encuentran disponibles en el capítulo Formas Farmacéuticas (1151 ). Los procedimientos y criterios de aceptación aceptables para analizar los medicamentos de aplicación tópica se pueden dividir en dos clases: aquéllos que evalúan los atributos generales de calidad del producto y aquéllos que evalúan el desempeño del producto. Los atributos de calidad del producto incluyen: descripción, identificación, valoración (contenido), impurezas, propiedades fisicoquímicas, uniformidad de unidades de dosificación, contenido de agua, pH, viscosidad aparente, límites microbianos, contenido de conservantes antimicrobianos, contenido de antioxidantes, esterilidad (cuando corresponda), así como otras pruebas específicas para cada producto. Las pruebas de desempeño del producto evalúan la liberación de fármacos y demás atributos que afectan la liberación de los fármacos de la forma farmacéutica terminada.
USP 39
Requisitos Generales/ (3) Medicamentos Tópicos y Transdérmicos 87
Aunque la mayoría de los productos de aplicación tópica son semisólidos, líquidos o suspensiones, los STD son dispositivos que se aplican sobre la piel y varían en su composición y método de fabricación. Los STD liberan sus ingredientes activos mediante diversos mecanismos, los cuales pueden ser pasivos o activos. Este capítulo abarca únicamente las pruebas relacionadas con STD pasivos.
PRUEBAS DE CALIDAD DEL PRODUCTO PARA MEDICAMENTOS DE APLICACIÓN TÓPICA
Pruebas Universales Las pruebas universales (ver Guía Q6A de la ICH-Specifications: Test Procedures and Acceptance Criterio for New Drug Substances and New Drug Products: Chemical Substances [Especificaciones: Procedimientos de Prueba y Criterios de Aceptación para Nuevos Fármacos y Nuevos Medicamentos: Sustancias Químicas], disponible en www.ich.org) se listan a continuación y se aplican a todos los medicamentos de aplicación tópica. Descripción: Se debe proporcionar una descripción cualitativa del medicamento. Los criterios de aceptación deben incluir el aspecto final aceptable de la forma farmacéutica terminada y del envase. El examen visual debe identificar los cambios de color, migración adhesiva (es decir, flujo frío) para STD, separaciones, cristalización, entre otros, que sean específicos del medicamento. La descripción debe especificar el contenido o la cantidad declarada en la etiqueta del artículo. Ésta última no es una prueba farmacopeica, pero forma parte de la especificación del fabricante para el medicamento. Identificación: Las pruebas de identificación se discuten en las Advertencias y Requisitos Generales, 5.40. Las pruebas de identificación deben establecer la identidad del o de los fármacos presentes en el artículo y deben distinguir entre compuestos con estructuras estrechamente relacionadas que pudieran estar presentes. Las pruebas de identidad deben ser específicas para el o los fármacos (p.ej., espectroscopía en el infrarrojo). Los métodos de espectrofotometría en el Infrarrojo Cercano (NIR, por sus siglas en inglés) o Raman también podrían ser aceptables para la identificación del producto farmacéutico (ver Espectroscopía en el Infrarrojo Cercano (1119) y Espectroscopía Raman (1120)). La identificación mediante un tiempo de retención cromatográfico único no es específica. Valoración: Se debe usar una prueba específica e indicadora de la estabilidad para determinar el contenido del medicamento. Para los casos en los que se justifica el uso de una valoración no específica, (p.ej., Volumetría (541 )), se deben usar otros procedimientos analíticos de respaldo para conseguir la especificidad general. Impurezas: El fármaco y los excipientes usados en la fabricación del medicamento pueden presentar impurezas del proceso, subproductos sintéticos, impurezas asociadas con el adhesivo (p.ej., monómeros residuales), disolventes residuales (ver Disolventes Residuales (467)), metales pesados (ver Metales Pesados (231 )), entre otras impurezas inorgánicas y orgánicas, las cuales deben ser evaluadas y controladas. Asimismo, se deben evaluar y controlar las impurezas producidas por la degradación del fármaco, así como aquéllas producidas durante el proceso de fabricación del medicamento.
Pruebas Específicas Además de las pruebas universales citadas anteriormente, se deben considerar las siguientes pruebas específicas para cada caso en particular. Uniformidad de unidades de dosificación: Esta prueba se aplica a los STD y a las formas farmacéuticas en envases unitarios (ver Uniformidad de Unidades de Dosificación (905)). Contenido de agua: Cuando resulte apropiado, se debe incluir una prueba de contenido de agua (ver Determinación de Agua (921 )). Esta prueba por lo general depende de la formulación. Por lo tanto, no se incluye en la monografía oficial del medicamento, pero forma parte de la especificación del fabricante para el mismo. Límites microbiológicos: El examen microbiológico para medicamentos no estériles se realiza en conformidad con los métodos provistos en los capítulos generales Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano (61) y Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Microorganismos Específicos (62), a menos que se haya demostrado que la formulación posee por sí misma propiedades antimicrobianas. Los criterios de aceptación para medicamentos no estériles basados en el recuento total de microorganismos aerobios (TAMC, por sus siglas en inglés) y en el recuento total combinado de hongos filamentosos y levaduras (TYMC, por sus siglas en inglés) se proporcionan en el capítulo Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Criterios de Aceptación para Preparaciones Farmacéuticas y Sustancias de Uso Farmacéutico (1111 ). Contenido de conservantes antimicrobianos: Se deben establecer criterios de aceptación para el contenido de conservantes antimicrobianos en productos multidosis. Dichos criterios deben basarse en los niveles de conservante antimicrobiano necesarios para mantener la calidad microbiológica del producto durante todas las etapas de su uso y vida útil propuestos (ver Pruebas de Eficacia Antimicrobiana (51 )). Contenido de antioxidantes: Si el medicamento contiene antioxidantes, se deben establecer pruebas para determinar su contenido, a menos que se pueda detectar su degradación por oxidación empleando otro método de prueba, como por ejemplo, una prueba de impurezas. Se deben establecer criterios de aceptación para el contenido de antioxidantes. Dichos criterios deben basarse en los niveles de antioxidante necesarios para mantener la estabilidad del producto durante todas las etapas de su uso y vida útil propuestos.
88 (3) Medicamentos Tópicos y Transdérmicos / Requisitos Generales
USP 39
Esterilidad: Dependiendo del uso de la forma farmacéutica (p.ej., preparaciones oftálmicas, productos que se aplicarán a heridas abiertas o áreas con quemaduras), se deberá demostrar la esterilidad del producto según corresponda (ver Pruebas de Esterilidad (71) ). pH: Cuando corresponda, el pH de los medicamentos de aplicación tópica deberá analizarse al momento de la liberación de la partida y en los tiempos de muestreo de estabilidad designados para el monitoreo entre partidas. Algunos medicamentos de aplicación tópica contienen cantidades muy limitadas de agua o fase acuosa, por lo que no siempre se requiere la medición de su pH. Esta prueba por lo general depende de la formulación. Por lo tanto, no se incluye en la monografía oficial del medicamento, pero forma parte de la especificación del fabricante para el mismo. Tamaño de partícula: Por lo general, la determinación y el control del tamaño de partícula de los fármacos activos en medicamentos de aplicación tópica se llevan a cabo en la etapa de desarrollo de la formulación. No obstante, los medicamentos de aplicación tópica deben ser examinados para detectar cualquier alteración del tamaño de partícula (es decir, apariencia de las partículas, cambios de forma, tamaño, hábito o agregación de las partículas) del fármaco que pudiera ocurrir durante el procesamiento y almacenamiento del producto. Dichos exámenes se deben realizar al momento de la liberación de la partida y en los tiempos de muestreo de estabilidad designados para el monitoreo entre partidas, debido a que los cambios visiblemente observables (macro y microscópicamente) podrían comprometer la integridad y/o el desempeño del medicamento. Estos tipos de pruebas por lo general dependen de la formulación, por lo que no se incluyen en las monografías oficiales pero forman parte de la especificación del fabricante para el mismo.
PRUEBAS ESPECÍFICAS PARA MEDICAMENTOS OFTÁLMICOS Las formas farmacéuticas oftálmicas deben cumplir con los requisitos del capítulo Pruebas de Esterilidad (71 ). Si los ingredientes específicos usados en la formulación no son susceptibles a las técnicas de esterilización de rutina, se pueden usar ingredientes que cumplan con los requisitos de esterilidad descritos en (71 ), junto con una fabricación aséptica. Cada preparación oftálmica para usos múltiples debe contener una sustancia o mezcla de sustancias adecuada para destruir o impedir la proliferación de los microorganismos accidentalmente introducidos al usar el producto (ver Sustancias Agregadas en Ungüentos Oftálmicos (771 )), a menos que se indique algo distinto en la monografía individual o a menos que la fórmula misma sea bacteriostática y/o el sistema de administración promueva la bacteriostasis. La preparación oftálmica terminada debe estar exenta de partículas grandes y debe cumplir con los requisitos de Pérdida y Partículas Metálicas (771 ). Los envases primarios para preparaciones oftálmicas deben ser estériles al momento de llenarlos y cerrarlos. Es obligatorio sellar los envases primarios para preparaciones oftálmicas con un cierre que evidencie la alteración intencional para asegurar la esterilidad al momento del primer uso.
PRUEBAS ESPECÍFICAS PARA MEDICAMENTOS SEMISÓLIDOS DE APLICACIÓN TÓPICA Viscosidad Aparente La viscosidad es una medida de la resistencia de la formulación al flujo, además de una evaluación de las propiedades reológicas de la forma farmacéutica (p.ej., formas farmacéuticas semisólidas). Debido a que únicamente los fluidos newtonianos poseen una viscosidad medible que no depende de la velocidad de cizallamiento, las formas farmacéuticas semisólidas que no son newtonianas presentan una vicosidad aparente. La viscosidad aparente de los medicamentos semisólidos se debe analizar al momento de la liberación de la partida e, inicialmente, en los tiempos de muestreo de estabilidad designados para establecer las especificaciones para el monitoreo entre partidas y de vida útil. Se deben desarrollar procedimientos de medición de acuerdo a lo indicado en Viscosidad-Métodos Capilares (911 ). Para semisólidos tixotrópicos y/o que presentan cambios irreversibles en la viscosidad después del cizallamiento, se debe prestar especial atención a los procedimientos de preparación de la muestra para minimizar la variabilidad en las mediciones de viscocidad aparente ocasionadas por el historial variable de cizallamiento (p.ej., velocidad y temperatura de mezclado, operación de llenado, manipulación de las muestras). Además, en el caso de algunos productos, puede ser necesario contar con especificaciones de viscosidad aparente para más de un conjunto de condiciones (p.ej., etapa de proceso a granel, producto final envasado, velocidades altas y bajas de cizallamiento, diferentes temperaturas). Se deben establecer especificaciones de viscosidad aparente basadas en datos obtenidos durante el desarrollo del producto y el análisis de la vida útil, para la liberación de la partida y durante toda la vida útil propuesta. La prueba de viscosidad aparente depende de la formulación y/o del proceso. Por lo tanto, no se incluye en la monografía oficial del medicamento, pero forma parte de la especificación del fabricante para el medicamento. Asimismo, las especificaciones de viscosidad aparente para formas farmacéuticas semisólidas pueden variar al momento de la liberación de la partida y durante la prueba de estabilidad. Aunque la viscosidad aparente del medicamento terminado al momento de la liberación de la partida debe cumplir con las especificaciones de desarrollo del mismo, para la prueba de estabilidad, las especificaciones de viscosidad aparente para el medicamento deben basarse en la evaluación estadística del producto durante su vida útil.
USP 39
Requisitos Generales/ (3) Medicamentos Tópicos y Transdérmicos 89
Uniformidad en los Envases Los medicamentos semisólidos de aplicación tópica pueden presentar una separación física durante los procesos de fabricación y durante la vida útil. Para asegurar la integridad del medicamento, es fundamental evaluar la uniformidad del producto terminado al momento de la liberación de la partida y durante la vida útil. PRODUCTOS ENVASADOS EN TUBOS La uniformidad de contenido dentro de los tubos puede evaluarse de la siguiente manera. Retirar o cortar con cuidado el sello de la parte inferior del tubo y realizar un corte vertical desde la parte inferior hasta la parte superior del tubo. Cortar con cuidado alrededor del borde superior del tubo, abrir las dos solapas y sujetarlas de modo que el producto quede expuesto. Inspeccionar el producto visualmente para determinar si hay separación de fases, cambios en la apariencia física y la textura, así como otras propiedades descritas en la prueba de Descripción. Si no se observa separación de fases o cambios en la apariencia física y la textura, y si el producto cumple con los criterios de aceptación de Descripción, proceder según se indica en las siguientes secciones. Si el producto presenta una separación de fases y/o cambios en la apariencia física o la textura, el producto no cumple con la prueba de uniformidad de contenido del tubo. Los procedimientos descritos a continuación se pueden modificar dependiendo de la sensibilidad del procedimiento cuantitativo usado para determinar la cantidad de fármacos presentes en la formulación. Para productos multidosis que contienen 5 g o más
Procedimiento 7 1. Usando un solo tubo, después de inspeccionar visualmente el producto, retirar una cantidad apropiada de producto de las partes superior, media e inferior del tubo. El tamaño de las muestras debe ser tal que permita realizar al menos una determinación cuantitativa de los ingredientes activos. Determinar la cantidad de los ingredientes activos en cada porción del producto usando cualquier procedimiento cuantitativo apropiado validado y evaluar los resultados de prueba usando los Criterios de aceptación A. 2. Si el producto no cumple con los Criterios de aceptación A, analizar tres tubos adicionales de la misma partida siguiendo el paso 1 descrito anteriormente y evaluar los 12 resultados de prueba obtenidos usando los Criterios de aceptación B.
Procedimiento 2 1 . Usando dos tubos, después de inspeccionar visualmente el producto, retirar una cantidad apropiada de producto de las partes superior, media e inferior de cada tubo. El tamaño de las muestras debe ser tal que permita realizar al menos una determinación cuantitativa de los ingredientes activos. Determinar la cantidad de los ingredientes activos en cada porción del tubo usando cualquier procedimiento cuantitativo apropiado validado y evaluar los resultados de prueba usando los
Criterios de aceptación A. 2. Si el producto no cumple con los Criterios de aceptación A, analizar dos tubos adicionales de la misma partida siguiendo el paso 1 descrito anteriormente y evaluar los 12 resultados de prueba obtenidos usando los Criterios de aceptación B. Para productos multidosis que contienen menos de 5 g de producto 1. Analizar porciones de las partes superior e inferior de dos tubos usando el Procedimiento 7 o el Procedimiento 2 descritos anteriormente. Evaluar los resultados de prueba usando los Criterios de aceptación A. 2. Si el producto no cumple con los Criterios de aceptación A, analizar dos tubos adicionales de la misma partida siguiendo el paso 1 descrito anteriormente y evaluar los ocho resultados de prueba obtenidos usando los Criterios de aceptación B. Criterios de aceptación para la prueba de uniformidad de contenido del tubo (envase): Al determinar la desviación estándar relativa (RSD, por sus siglas en inglés) de múltiples tubos, determinar primero la varianza a partir de las tres mediciones de cada tubo y promediar todos los tubos. La RSD se calcula usando esta varianza promedio. Criterios de aceptación A-Todos los resultados están dentro del intervalo de valoración del producto y la RSD es no más de 6% o la indicada en las especificaciones del producto o en la monografía oficial. Si la RSD es mayor de 6%, usar los Criterios de
aceptación B. Criterios de aceptación 8-Todos los resultados están dentro del intervalo de valoración del producto y la RSD de los 12 resultados es no más de 6% o la indicada en las especificaciones del producto o en la monografía oficial. PRODUCTOS ENVASADOS EN ENVASES DIFERENTES A LOS TUBOS Para los productos semisólidos que se envasan en envases diferentes a los tubos, para los que no se pueda usar el método de muestreo anteriormente presentado, se pueden aceptar otros métodos como el descrito a continuación para un tarro. 1. Seleccionar una jeringa adecuada cuya longitud sea suficiente para alcanzar el fondo del recipiente. 2. Retirar y colocar aparte el émbolo de la jeringa, y cortar la parte inferior del cuerpo de la jeringa. El muestreo se debe llevar a cabo desde un punto a la izquierda/derecha de una línea media en la superficie del tarro a fin de conservar una región intacta en el otro lado para cualquier investigación adicional (Ver la Figura 1).
90 (3) Medicamentos Tópicos y Transdérmicos /Requisitos Generales
USP 39
PARTE SUPERIOR PARTE MEDIA PARTE INFERIOR
Figura 1. Muestreo de un tarro. 3. Presionar lentamente el cuerpo de la jeringa hacia el interior del envase hasta alcanzar el fondo. Luego, hacer girar el cuerpo de la jeringa que contiene el núcleo de la muestra y retirar la jeringa del envase. 4. Insertar el émbolo de la jeringa en el cuerpo y extrudir cuidadosamente el núcleo de la muestra sobre una superficie limpia en tres porciones iguales que representen a las partes superior, media e inferior del envase. 5. Retirar una muestra apropiada, que sea representativa de la porción media de las partes superior, media e inferior de las muestras del envase, y analizar de acuerdo con las instrucciones citadas en Productos Envasados en Tubos.
PRUEBAS ESPECÍFICAS PARA SISTEMAS TRANSDÉRMICOS DE LIBERACIÓN DE FÁRMACOS Los STD o parches se formulan con una capa de adhesivo para asegurar el contacto íntimo con la piel y para permitir la administración de la dosis deseada de fármaco. El adhesivo de los STD debe permitir el fácil desprendimiento de la capa protectora antes de su uso, se debe adherir adecuadamente a la piel humana durante la aplicación, debe mantener su adhesión a la piel durante el periodo de uso prescrito y debe permitir el fácil retiro del STD al final de su uso sin dejar residuo u ocasionar daños a la piel u otros efectos indeseados. Asimismo, los adhesivos deben ser capaces de mantener el desempeño del STD durante toda la vida útil del medicamento. Por lo general, se emplean tres tipos de pruebas de desprendimiento para STD: prueba de desprendimiento (a partir de un sustrato estándar), prueba de desprendimiento de la capa protectora y prueba de adherencia. Los criterios de aceptación son específicos para cada producto y se definen para asegurar que las propiedades de adhesión de cada partida de STD estén dentro del intervalo definido por el diseño del producto y que sean uniformes entre partidas, basándose en las especificaciones de desarrollo del producto o en la evaluación estadística de múltiples partidas de producto durante la vida útil del mismo.
Prueba de Desprendimiento Esta prueba mide la fuerza requerida para retirar (desprender) un STD adherido a una superficie de un sustrato estándar (p.ej., acero inoxidable pulido). El STD se aplica al sustrato usando las técnicas especificadas para aplicación y se acondiciona a una temperatura y tiempo específicos. Luego, el STD se desprende del sustrato con un instrumento que permite controlar el ángulo de desprendimiento (p.ej., 90 ó 180 grados) y la velocidad de desprendimiento (p.ej., 300 mm/minuto), mientras se registra la fuerza de desprendimiento. Este procedimiento se repite usando un mínimo de cinco muestras independientes. El producto no cumple con la prueba si la fuerza promedio de desprendimiento está fuera del intervalo aceptable, determinado durante el desarrollo del producto y/o basado en la evaluación estadística de múltiples partidas de producto durante la vida útil del mismo.
Prueba de Desprendimiento de la Capa Protectora Esta prueba mide la fuerza requerida para separar la capa protectora de la capa de adhesivo del STD. La prueba se lleva a cabo con una muestra de producto terminado. La muestra de prueba se acondiciona usando procedimientos específicos (temperatura y tiempo). Luego, la capa protectora se desprende del STD con un instrumento que permite controlar el ángulo de desprendimiento (p.ej., 90 ó 180 grados) y la velocidad de desprendimiento, mientras se registra la fuerza de desprendimiento. Este procedimiento se repite usando un mínimo de cinco muestras independientes. El producto no cumple con la prueba si la fuerza promedio de desprendimiento está fuera del intervalo aceptable, determinado durante el desarrollo del producto y/o basado en la evaluación estadística de múltiples partidas de producto durante la vida útil del mismo.
USP 39
Requisitos Generales/ (3) Medicamentos Tópicos y Transdérmicos 91 Prueba de Adherencia
Se han desarrollado diversos métodos para analizar la adherencia, los cuales incluyen, por ejemplo el Método de Adherencia a Sonda y el Método de Bola Rodante. Queda a criterio del fabricante de STD decidir qué método es el más adecuado para cada medicamento. MÉTODO DE ADHERENCIA A SONDA Esta prueba mide la fuerza requerida para separar la punta de la sonda de prueba de la capa de adhesivo del STD. Esta prueba emplea un instrumento diseñado para crear una unión entre la punta de una sonda de prueba de acero inoxidable (con una geometría definida) y el STD, usando una fuerza controlada (ligera presión) y condiciones de prueba específicas (es decir, velocidad, tiempo de contacto, presión de contacto, temperatura). Luego, mientras se controla la velocidad de desprendimiento de la sonda, la prueba mide el perfil de la fuerza requerida para separar la punta de la sonda del STD y la fuerza máxima requerida para romper la unión (adherencia). Este procedimiento se repite usando un mínimo de cinco muestras independientes. El producto no cumple con la prueba si el resultado de prueba promedio (perfiles de fuerza y/o adherencia) está fuera del intervalo aceptable, determinado durante el desarrollo del producto y/o basado en la evaluación estadística de múltiples partidas de producto durante la vida útil del mismo. MÉTODO DE BOLA RODANTE Esta prueba mide la distancia recorrida por una bola definida sobre la capa de adhesivo del STD usando condiciones definidas, como parámetro que depende de las propiedades adherentes de la capa de adhesivo. Esta prueba emplea una configuración diseñada para rodar una bola (de material, peso, tamaño y superficie definidos) desde una rampa (con un ángulo y longitud definidos) sobre la capa de adhesivo (con orientación definida) en condiciones de prueba específicas (temperatura) (ver la ASTM 03 72 7 para más detalles). La distancia recorrida por la bola sobre la capa de adhesivo se mide usando un dispositivo de medición adecuado. Este procedimiento se repite usando un mínimo de cinco muestras independientes. El producto no cumple con la prueba si la distancia promedio recorrida está fuera del intervalo aceptable, determinado durante el desarrollo del producto y/o basado en la evaluación estadística de múltiples partidas de producto durante la vida útil del mismo.
Prueba de Fugas Esta prueba se aplica únicamente a STD de tipo moldeado-llenado-sellado (en reservorios o bolsas). El STD de tipo moldeado-llenado-sellado se debe fabricar manteniendo un enfoque de cero tolerancia para fugas, debido al potencial de pérdida de dosis ante la presencia de las mismas. Es necesario implementar métodos de control durante el proceso para examinar los STD en búsqueda de elementos que pudieran ocasionar fugas, los cuales requieren un desarrollo importante por parte de los fabricantes de STD. ANÁLISIS DURANTE EL PROCESO Durante el proceso de fabricación, se debe examinar el STD para detectar la presencia de fugas (o el potencial de fugas) por perforación, cortadura o sello defectuoso generado por fallas tales como burbujas de aire, salpicaduras del gel o mala alineación de la capa posterior y de la capa protectora. A menos que se implemente una tecnología analítica automatizada de proceso, se debe llevar a cabo un análisis durante el proceso para identificar estos defectos usando los siguientes procedimientos de prueba: Inspección visual 1. Examinar aleatoriamente un número específico de STD, el cual se define basándose en el tamaño de la partida. 2. Inspeccionar cada STD muestreado visualmente y de manera minuciosa para detectar fugas. 3. El producto no cumple con la prueba si alguno de los STD examinados presenta una fuga. Integridad del sello: Los sellos de los sistemas transdérmicos deben someterse a pruebas de estrés para asegurar que la presión aplicada no fuerce la apertura del sello, lo cual generaría una fuga. 1. Examinar aleatoriamente un número específico de STD, el cual se define basándose en el tamaño de la partida. 2. Inspeccionar cada STD muestreado, visualmente y de manera minuciosa, para detectar fugas. 3. Colocar cada STD muestreado sobre una superficie rígida y plana, y colocar encima un peso de 13,6 kg. Dejar que el peso descanse encima del STD durante 2 minutos. Una vez retirado el peso, inspeccionar visualmente el STD para detectar fugas. 4. El producto no cumple con la prueba si el número de STD que presentan fugas es mayor que el límite aceptable establecido por el fabricante. Prueba del producto envasado: Los STD pueden presentar fugas después de haber sido envasados en sus envases primarios debido a la operación misma de envasado o debido a la apertura del envase por parte del usuario. En consecuencia, los STD deben ser analizados para detectar fugas después de su fabricación y de su envasado en el material de envasado primario.
92 (3) Medicamentos Tópicos y Transdérmicos / Requisitos Generales
USP 39
1. Analizar aleatoriamente un número específico de STD, el cual se define basándose en el tamaño de partida, después de colocarlos en su material de envasado primario. 2. Retirar los STD muestreados de su envase e inspeccionarlos visualmente y de manera minuciosa para detectar fugas. 3. Luego, limpiar cada STD muestreado uniformemente con un hisopo humedecido con un disolvente. Es necesario limpiar tanto el lado posterior como el lado de la capa protectora del STD. Asimismo, se debe limpiar la superficie interna de la bolsa. Luego, retirar el hisopo y valorar el contenido de fármaco. 4. El producto no cumple con la prueba si la cantidad total de fármaco del STD, y su bolsa correspondiente, excede el límite aceptable establecido por el fabricante.
(4) MEDICAMENTOS PARA MUCOSAS-PRUEBAS DE CALIDAD DEL PRODUCTO INTRODUCCIÓN Para los propósitos de distinción taxonómica de formas farmacéuticas por vía de administración, la vía mucosa de administración de medicamentos se subdivide en siete superficies de membrana, las cuales se caracterizan como óticas, oftálmicas, nasales, orofaríngeas, uretrales, vaginales y rectales. Dicha clasificación no incluye la vía mucosa pulmonar, tratada en el capítulo Medicamentos Nasales y para Inhalación-Información General y Pruebas de Calidad del Producto (5). Un medicamento se administra en cualquiera de estas siete superficies mucosas para producir una acción local o una absorción sistémica. La acción local ocurre en el área próxima a la de aplicación. Cuando se pretende generar una acción local, por lo regular no se desea la absorción sistémica la cual además es innecesaria para el efecto terapéutico. No obstante, en algunos casos se usa la administración de un medicamento por vía mucosa para absorción sistémica debido a que evita el metabolismo de primer paso, provee una administración sistémica más rápida, o representa una alternativa cuando la administración oral no es posible (en el tracto gastrointestinal) debido a una enfermedad. Muchas de las formas farmacéuticas citadas en el capítulo Formas Farmacéuticas (1151 )1 pueden administrarse a través de las diversas superficies de las membranas en la categoría de mucosas. Los procedimientos analíticos y criterios de aceptación para las pruebas de medicamentos se dividen en dos categorías: aquéllas que evalúan los atributos generales de calidad del producto y aquéllas que evalúan el desempeño del producto. Las pruebas de calidad de los productos evalúan atributos tales como identificación, valoración (contenido), impurezas y uniformidad de contenido de la dosis, y, por lo general, forman parte de la monografía oficial. Las pruebas de desempeño del producto incluyen la prueba de disolución para una forma farmacéutica oral sólida (ver Disolución (711 )) y la prueba de liberación de fármacos (ver Liberación de Fármacos (724)). En conjunto, las pruebas de calidad y de desempeño aseguran la identidad, contenido, calidad y pureza de un medicamento para mucosas. Asimismo, este capítulo provee listas de pruebas comunes y consolidadas de calidad del producto y algunas pruebas específicas basadas en los requisitos de la vía de administración del medicamento. Las monografías existentes contienen todas las pruebas requeridas para el artículo. En el caso de monografías nuevas para medicamentos específicos o en los casos en los que no se cuente con una monografía, el capítulo provee pruebas de calidad específicas como un recurso para los fabricantes hasta que la USP desarrolle las monografías particulares del producto específico.
Cambio en la redacción:
PRUEBAS DE CALIDAD DE MEDICAMENTOS PARA MUCOSAS Este capítulo provee pruebas de calidad generalmente necesarias, pruebas aplicables a productos específicos y pruebas aplicables a una o más de las vías mucosas específicas. Se espera que cualquier forma farmacéutica que se administre por una vía mucosa específica se analice mediante las pruebas de calidad que en este capítulo se citan bajo el encabezado correspondiente a dicha vía específica.
Pruebas Generalmente Necesarias Los atributos de calidad de las formas farmacéuticas para mucosas deben reflejar requisitos aceptables para los productos que se hallan en el mercado. Las siguientes pruebas deben aplicarse de manera general a todas las formas farmacéuticas destinadas para administración por mucosas. Las pruebas que son generalmente necesarias para todos los artículos incluyen: Definición, Identificación, Valoración e Impurezas (orgánicas, inorgánicas y disolventes residuales). Por lo regular, la monografía de un producto USP incluye la referencia a la prueba del capítulo Uniformidad de Unidades de Dosificación (905). 1 Todas las referencias a capítulos con número superiores a 1000 tienen únicamente propósitos informativos como recursos útiles. Dichos capítulos no son obligatorios a menos que se indique explícitamente su aplicación.
USP 39
Requisitos Generales/ (4) Medicamentos para Mucosas 93 DEFINICIÓN
La sección Definición (ver Advertencias y Requisitos Generales 4. 7O) de una monografía USP describe el medicamento y especifica el intervalo aceptable para el contenido de los fármacos presentes en la forma farmacéutica según se obtiene en la valoración. Para ciertos productos, la Definición incluye toda la información adicional pertinente, como por ejemplo, la presencia o ausencia de otros componentes, excipientes o coadyuvantes y declaraciones precautorias sobre toxicidad y estabilidad. La información sobre la apariencia se usa en registros reglamentarios para ayudar a la identificación del producto. Debido a que los atributos descriptivos tales como tamaño, forma, color, entre otros, son específicos de cada producto individual en el mercado, por lo general no se requiere una descripción cualitativa como parte de una monografía USP (ver el capítulo (1151 )). IDENTIFICACIÓN La Identificación se incluye en una monografía como una ayuda para verificar la identidad del artículo y para proveer una identificación positiva del fármaco o fármacos en un medicamento (ver Advertencias y Requisitos Generales 5.40). VALORACIÓN La valoración se usa para determinar la concentración del fármaco (o su contenido) en el medicamento. Por lo regular, la valoración es específica e indicadora de estabilidad. Cuando se justifique una valoración inespecífica, otros procedimientos analíticos complementarios deberían asegurar la detección y limitación de cualquier especie interferente. Los resultados de la valoración a menudo se informan como porcentaje de la cantidad declarada, con criterios de aceptación que por lo general están en el intervalo de 90,0% a 110,0%. Para algunos productos antibióticos, el intervalo puede ser más amplio. La amplitud de estos límites tiene como propósito dejar margen a la variabilidad de la fabricación, incluyendo cambios en la estabilidad, así como variación analítica. El intervalo de aceptación más estrecho de 95,0%-105,0% se usa con menos frecuencia y requiere justificación. IMPUREZAS Las impurezas de proceso incluyen aquéllas que surgen de los materiales de partida, subproductos de síntesis, así como otras impurezas orgánicas e inorgánicas que pueden estar presentes en el fármaco y en los excipientes usados en la fabricación del medicamento. Estas impurezas se controlan usando la prueba apropiada, según se especifica en las monografías del fármaco y de los excipientes. Las impurezas en el medicamento también pueden resultar de la degradación del fármaco o de los excipientes, de las interacciones entre el fármaco y un excipiente o de las interacciones entre el fármaco y los componentes del envase. Los procedimientos y criterios de aceptación deben limitar específicamente los productos de degradación tóxicos así como los productos de degradación que pongan en peligro la calidad del artículo si estos exceden ciertos niveles. Se deben proveer límites para las impurezas del proceso cuya presencia se determine durante la prueba de productos de degradación. El capítulo Impurezas en Fármacos y Medicamentos (1086) 1 y el documento ICH Q3B lmpurities in New Drug Products (Impurezas en Nuevos Medicamentos) 2 proveen una discusión más completa sobre este tema. UNIFORMIDAD DE UNIDADES DE DOSIFICACIÓN El capítulo (905) se usa para asegurar que la uniformidad del contenido del fármaco en las unidades de dosificación se encuentre dentro de un intervalo estrecho cercano a la cantidad declarada. La prueba se aplica sólo a formas farmacéuticas que contienen una sola dosis o una parte de una dosis del fármaco en cada unidad. La uniformidad de unidades de dosificación se puede demostrar mediante uno de dos métodos: uniformidad de contenido o variación de peso. La uniformidad de contenido se basa en las valoraciones de un número de unidades de dosificación individuales. La variación de peso se puede usar para estimar la uniformidad de contenido en ciertas condiciones.
Formas Farmacéuticas por Vías Mucosas Específicas y Pruebas Específicas Además de las pruebas de calidad generalmente necesarias previamente discutidas, la forma farmacéutica puede requerir pruebas de calidad específicas que son comunes a diversas vías de administración. El capítulo •Medicamentos Inyectables y en Implantes (1 ;. (AF oi-may-2016¡ provee requisitos comunes para productos inyectables e implantes. El capítulo Medicamentos Orales-Pruebas de Calidad del Producto (2) provee requisitos de análisis para tabletas y tabletas de disolución bucal. El capítulo Medicamentos Tópicos y Transdérmicos-Pruebas de Calidad del Producto (3) provee requisitos de análisis comunes para semisólidos (cremas, ungüentos y geles). El capítulo (5) presenta requisitos de análisis para atomizadores y aerosoles. Para los casos en
2 ICH Q3B (R2) lmpurities in New Drug Products, 2006, •http://www.ich.org/products/guidelines/quality/article/quality-guidelines.htmle sultado el 6 de mayo de 2014.
ERR(Ol-oct-2015 ¡,
Con-
94 (4) Medicamentos para Mucosas/ Requisitos Generales
USP 39
los que este capítulo no presenta una prueba específica para una forma farmacéutica, no se requieren pruebas adicionales a menos que se incluyan en la especificación de la monografía individual. VÍA ÓTICA La vía ótica se caracteriza por la administración de una preparación en o a través del oído. No siempre se requiere demostrar la esterilidad (ver Pruebas de Esterilidad (71 )) para productos administrados en el oído. Por lo regular, la esterilidad se requiere cuando el producto se administra en el oído interno o cuando el tímpano se encuentra dañado. Para casos en los que no se requiere la esterilidad, puede ser necesario el recuento cuantitativo de bacterias mesófilas y hongos que crecen en condiciones anaeróbicas, ver el capítulo Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano (61 ), o la determinación de la ausencia o presencia limitada de organismos específicos, ver el capítulo Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Microorganismos Específicos (62). Si se usa un conservante antimicrobiano, puede ser necesario cumplir con los requisitos de los capítulos Pruebas de Eficacia Antimicrobiana (51) y Agentes Antimicrobianos-Contenido (341 ). Las formas farmacéuticas administradas por la vía ótica incluyen líquidos, soluciones y suspensiones. VÍA OFTÁLMICA La vía oftálmica se refiere a la administración en el ojo. Además de las pruebas generalmente necesarias, se deben considerar las siguientes pruebas específicas para medicamentos oftálmicos (ver la Tabla 7). Para productos que se inyectan o implantan en el ojo, ver el capítulo 1lilfl:illl~llllilil· A continuación se citan algunas de las pruebas importantes de calidad del producto para productos administrados por la vía oftálmica. Ver Ungüentos Oftálmicos (771) para detalles y demás información sobre calidad de productos. • Materia Extraña y Partículas • Esterilidad •Tamaño de Partícula y Distribución del Tamaño de Partícula • Conservantes Antimicrobianos Tabla 1. Medicamentos Administrados por la Vía Oftálmica, Pruebas Específicas Vía Oftálmica Forma Farmacéutica
Pruebas Específicas Llenado Mínimo (755)
Geles
Medicamentos Tópicos y Transdérmicos-Pruebas de Calidad del Producto (3) Osmolalidad y Osmolaridad (785) pH (791) Tensión superficial
Viscosidad-Métodos del Viscosímetro Capilar (911) Viscosidad-Métodos del Reómetro Rotatorio (912) Emulsiones Insertos
Potencial zeta
Prueba de Endotoxinas Bacterianas (85) Llenado Mínimo (755)
Ungüentos
Medicamentos Tópicos y Transdérmicos-Pruebas de Calidad del Producto (3) Partículas en Soluciones Oftálmicas (789) pH(791)
Viscosidad-Métodos del Viscosímetro Capilar (911) Viscosidad-Métodos del Reómetro Rotatorio (912) Viscosidad-Métodos del Viscosímetro de Bola Rodante (913) Soluciones
Osmolalidad y Osmolaridad (785)
Tiras
En la actualidad no existen pruebas específicas (pueden aplicarse requisitos adicionales específicos de las monografías)
pH (791) Osmolalidad y Osmolaridad (785) Tamaño de partícula y distribución del tamaño de partícula
Viscosidad-Métodos del Viscosímetro Capilar (911) Viscosidad-Métodos del Reómetro Rotatorio (912) Suspensiones
Viscosidad-Métodos del Viscosímetro de Bola Rodante (91 3)
Requisitos Generales/ (4) Medicamentos para Mucosas 95
USP 39
VÍA NASAL La vía nasal se refiere a la administración en o a través de la nariz para efecto local o sistémico (ver la Tabla 2). Tabla 2. Medicamentos Administrados por la Vía Nasal, Pruebas Específicas Vía Nasal Forma Farmacéutica Aerosoles
Pruebas Específicas del Producto Medicamentos Nasales
y para Inhalación-Información General y Pruebas de Calidad del Producto (5)
Llenado Mínimo (755)
Geles (Jalea)
Medicamentos Tópicos
y Transdérmicos-Pruebas de Calidad del Producto (3)
Llenado Mínimo (755)
Ungüentos
Medicamentos Tópicos
y Transdérmicos-Pruebas de Calidad del Producto (3)
Atomizado res
Medicamentos Nasales
y para Inhalación-Información General y Pruebas de Calidad del Producto (5)
Soluciones
Medicamentos Nasales
y para Inhalación-Información General y Pruebas de Calidad del Producto (5)
VÍA OROFARÍNGEA La vía orofaríngea se refiere a la administración en la cavidad oral y/o la región faríngea. La vía orofaríngea se subclasifica por superficies intra-orales específicas, tales como bucal o sublingual. La administración bucal y sublingual por lo general están destinadas a promover la absorción sistémica mediante la permeación a través de la mucosa respectiva. Sin embargo, en este contexto, la administración oral puede referirse a la aplicación tópica para acción local (ver la Tabla 3). Las pruebas de calidad para productos administrados en superficies orofaríngeas a menudo se ajustan a aquéllas para administración oral en el tracto gastrointestinal (ver el capítulo (2)). Tabla 3. Medicamentos Administrados por la Vía Orofaríngea, Pruebas Específicas Vía Orofaríngea Forma Farmacéutica
Pruebas Específicas
Parches Bucales
Ver el capítulo Medicamentos Tópicos y Transdérmicos-Pruebas de Calidad del Producto (3) para requisitos de prueba comunes para parches.
Películas
En la actualidad no existen pruebas específicas (pueden aplicarse requisitos adicionales específicos de las monografías)
Geles
Medicamentos Tópicos
Gomas
En la actualidad no existen pruebas específicas (pueden aplicarse requisitos adicionales específicos de las monografías)
Tabletas de Disolución Bucal
En la actualidad no existen pruebas específicas (pueden aplicarse requisitos adicionales específicos de las monografías)
Llenado Mínimo (755)
Medicamentos Tópicos
y Transdérmicos-Pruebas de Calidad del Producto (3)
y Transdérmicos-Pruebas de Calidad del Producto (3)
Ungüentos
Llenado Mínimo (755)
Soluciones (Enjuagues)
En la actualidad no existen pruebas específicas (pueden aplicarse requisitos adicionales específicos de las monografías)
Atomizadores
Medicamentos Nasales
Tabletas
Medicamentos Ora/es-Pruebas de Calidad del Producto (2)
y para Inhalación-Información General y Pruebas de Calidad del Producto (5)
VÍA URETRAL La vía uretral se refiere a la administración dentro de la uretra, por lo regular para acción local, aunque también es posible la distribución sistémica. El capítulo (61) y el capítulo (62) pueden ser aplicables. Los medicamentos en esta categoría incluyen insertos uretrales.
VÍA VAGINAL La vía vaginal se refiere a la administración dentro de la vagina, por lo regular para acción local, aunque también es posible la distribución sistémica. El capítulo (61) y el capítulo (62) pueden ser aplicables (ver la Tabla 4). Densidad relativa de espumas: Determinar la densidad relativa de espumas pesando una masa de espuma (m) y una masa del mismo volumen de agua (e) en un recipiente de fondo plano. Densidad relativa de espumas= m/e. Volumen de expansión de espumas: Estimar el volumen de expansión de espumas a 25º usando una bureta graduada y un envase generador de espuma equipado con un disparador de dosis integrado a la bureta.
96 (4) Medicamentos para Mucosas/ Requisitos Generales
USP 39
Tabla 4. Medicamentos Administrados por la Vía Vaginal, Pruebas Específicas del Producto Vía Vaginal Forma Farmacéutica
Pruebas Específicas Llenado Mínimo (755) Medicamentos Tópicos y Transdérmicos-Pruebas de Calidad del Producto (3)
Cremas
Llenado Mínimo (755)
Aspecto físico (de la espuma y de la espuma colapsada) Densidad relativa de espumas Volumen de expansión de espumas
Espumas
Llenado Mínimo (755)
Geles
Medicamentos Tópicos y Transdérmicos-Pruebas de Calidad del Producto (3)
Insertos
En la actualidad no existen pruebas específicas (pueden aplicarse requisitos adicionales específicos de las monografías)
VÍA RECTAL La vía rectal se refiere a la administración en el recto. Los productos que se administran en el recto pueden producir efectos locales o liberación en la circulación sistémica. Determinación de tiempo de ablandamiento de supositorios lipofílicos: La prueba pretende determinar, en las condiciones definidas, el tiempo que transcurre hasta que un supositorio mantenido en agua a 37 ± 0,5º se ablanda hasta el grado en que ya no ofrece resistencia al aplicarle un peso definido (ver la Tabla 5). Densidad relativa de espumas: Determinar la densidad relativa de espumas pesando una masa de espuma (m) y una masa del mismo volumen de agua (e) en un recipiente de fondo plano. Densidad relativa de espumas= m/e. Volumen de expansión de espumas: Estimar el volumen de expansión de espumas a 25º usando una bureta graduada y un envase generador de espuma equipado con un disparador de dosis integrado a la bureta. Tabla 5. Medicamentos Administrados por la Vía Rectal, Pruebas Específicas Vía Rectal Forma Farmacéutica
Pruebas Específicas Llenado Mínimo (755)
Apariencia física (de la espuma y de la espuma colapsada) Densidad relativa de espumas
Espumas
Volumen de expansión de espumas Llenado Mínimo (755)
Ungüentos
Medicamentos Tópicos y Transdérmicos-Pruebas de Calidad del Producto (3)
Supositorios
Tiempo de ablandamiento de supositorios lipofílicos
Soluciones
En la actualidad no existen pruebas específicas (pueden aplicarse requisitos adicionales específicos de las monografías)
Suspensiones
En la actualidad no existen pruebas específicas (pueden aplicarse requisitos adicionales específicos de las monografías)
(5) MEDICAMENTOS NASALES Y PARA INHALACIÓN-INFORMACIÓN GENERAL Y PRUEBAS DE CALIDAD DEL PRODUCTO l. INTRODUCCIÓN Los medicamentos para inhalación entregan un fármaco a los pulmones mediante inhalación oral e incluyen las siguientes formas farmacéuticas: aerosoles para inhalación, polvos para inhalación, atomizadores para inhalación, soluciones para inhalación, suspensiones para inhalación, concentrados para preparar soluciones inhalables y fármacos para preparar solución inhalable. Los medicamentos nasales entregan fármacos en la cavidad nasal e incluyen las siguientes formas farmacéuticas: aerosoles nasales, atomizadores nasales, soluciones nasales y polvos nasales. En este capítulo no se discuten los medicamentos nasales en forma de geles ni ungüentos. La Tabla 7 provee una lista de nombres establecidos y definiciones para estas formas farmacéuticas. Asimismo, en el capítulo general Formas Farmacéuticas (1151) se proveen definiciones, breve información acerca de los métodos de fabricación y un glosario de nombres de estas formas farmacéuticas.
Requisitos Generales/ (5) Medicamentos Nasales y para Inhalación 97
USP 39
Tabla 1. Nombres Establecidos y Definiciones Nombre Establecido
Definición
Aerosol para Inhalación
Medicamento para inhalación oral que se envasa a presión y entrega una cantidad específica de ingredientes terapéuticamente activos al activar un sistema de válvula que entrega una dosis exactamente medida. Los aerosoles para inhalación se conocen comúnmente como inhaladores de dosis fija.
Polvo para Inhalación
Medicamento en polvo para inhalación oral que se usa con un dispositivo que lo transforma en aerosol y libera una cantidad exactamente medida de los ingredientes terapéuticamente activos. Los Polvos para lnhalación se conocen comúnmente como inhaladores de polvo seco.
Atomizador para Inhalación
Forma farmacéutica líquida de un medicamento para inhalación oral, en un envase no presurizado, que libera una cantidad exactamente medida de la formulación en forma de niebla o rocío.
Solución para Inhalación
Medicamento en solución para inhalación oral que se emplea con un sistema de nebulización.
Suspensión para Inhalación
Medicamento en suspensión para inhalación oral que se emplea con un sistema de nebulización.
Concentrado para Solución lnhalable
Solución de un fármaco para inhalación oral que se debe diluir antes de su administración con un sistema de nebulización.
[Fármaco] para Solución lnhalable
Medicamento en polvo que, al agregarle un vehículo adecuado, genera una solución que cumple con todos los aspectos de una Solución para Inhalación.
Aerosol Nasal
Medicamento para aplicación local en las fosas nasales que se envasa a presión y entrega una cantidad específica de ingredientes terapéuticamente activos al activar un sistema de válvula de dosis exactamente medida.
Atomizador Nasal
Forma farmacéutica líquida de un medicamento para aplicación local en las fosas nasales en un envase no presurizado que, al activarlo, libera una cantidad exactamente medida de la formulación en forma de niebla o rocío.
Solución Nasal
Forma farmacéutica líquida de un medicamento no presurizado para aplicación local en las fosas nasales.
Polvo Nasal
Medicamento en polvo para aplicación local en las fosas nasales que emplea un dispositivo que libera y transforma en aerosol una cantidad exactamente medida de los ingredientes terapéuticamente activos.
Este capítulo general (5) provee los lineamientos generales para sustentar nuevas monografías individuales. Éste es un documento de "avance" y no pretende reemplazar el desarrollo necesario de monografías individuales. Este capítulo provee listas de pruebas de calidad del producto que se requieren típicamente, consolidadas de manera concisa y coherente. Cuando exista una monografía, ésta deberá contener todas las pruebas requeridas para la forma farmacéutica en particular. Cuando no se dispone de una monografía para un medicamento específico (inexistente), el capítulo general provee pruebas de calidad que se pueden usar hasta que la monografía específica para la forma farmacéutica aparezca en el compendio USP-NF. Cuando se dispone de un procedimiento de prueba de desempeño validado para el medicamento específico, éste se identifica en un capítulo general con un número menor a (1000). Toda la información adicional o la información sobre tecnologías venideras que aún no han sido validadas en su totalidad, puede estar disponible en los capítulos informativos con números superiores a (1000).1
Pruebas Generales de Calidad y Pruebas de Calidad de Desempeño para Medicamentos Una monografía de medicamento de la USP contiene pruebas, procedimientos analíticos y criterios de aceptación. Las pruebas de medicamentos se dividen en dos categorías: (1) pruebas que evalúan los atributos generales de calidad y (2) pruebas de calidad que evalúan el desempeño del producto, p.ej., uniformidad de dosis liberada y sus características físicas tales como distribución del tamaño aerodinámico de partícula. Las pruebas generales de calidad evalúan la integridad de la forma farmacéutica, mientras que las pruebas de calidad del desempeño evalúan la liberación del fármaco y otros atributos que pueden relacionarse con el desempeño in vivo del medicamento. En conjunto, las pruebas de calidad y de desempeño garantizan la identidad, contenido, calidad y pureza de los medicamentos para inhalación y nasales. Las dos secciones siguientes de este capítulo listan atributos de calidad del producto para medicamentos para inhalación y para medicamentos nasales, respectivamente. La sección final describe en mayor detalle las pruebas de calidad para medicamentos para inhalación y nasales. El capítulo general Medicamentos Nasales y para Inhalación: Pruebas de Calidad de Desempeño de Aerosoles, Atomizadores y Polvos (601) contiene pruebas de desempeño del producto para medicamentos nasales y para inhalación, y se debe usar junto con este capítulo (5).
Todas las referencias a los capítulos superiores a 1000 son sólo para fines informativos y para su uso como un recurso útil. Estos capítulos no son obligatorios a menos que se instruya explícitamente su aplicación.
1
98 (5) Medicamentos Nasales y para Inhalación / Requisitos Generales
USP 39
11. PRUEBAS GENERALES DE CALIDAD EN MEDICAMENTOS PARA INHALACIÓN Aerosol para Inhalación DESCRIPCIÓN El término aerosol en este contexto es una forma farmacéutica que consiste en una preparación sólida o líquida envasada a presión y destinada para su administración en forma de niebla fina. El término descriptivo aerosol también se refiere a la niebla fina de diminutas gotitas o partículas sólidas que se emiten desde el dispositivo que contiene al medicamento. Los aerosoles para inhalación, también conocidos como inhaladores de dosis fija, son preparaciones que se caracterizan por dispersar el ingrediente farmacéutico activo en las vías respiratorias durante la aspiración oral para lograr un efecto local o sistémico, mientras que los aerosoles nasales, que también se conocen como inhaladores de dosis fija nasales, se caracterizan por depositar los ingredientes farmacéuticos activos en la cavidad nasal para lograr un efecto local o sistémico Una formulación en aerosol por lo regular contiene fármacos disueltos o suspendidos en propelentes o una mezcla de propelentes y codisolventes y posiblemente otros excipientes adecuados. Un medicamento en aerosol para inhalación, comúnmente conocido como inhalador de dosis fija, libera una cantidad específica de ingredientes terapéuticamente activos con un calidad definida al activar un sistema de válvula que entrega una dosis exactamente medida. Las pruebas generales de calidad para medicamentos en aerosoles para inhalación deben incluir lo siguiente (ver la sección IV más adelante en este capítulo para un análisis más detallado de cada prueba): • Identificación • Valoración • Impurezas y Productos de Degradación • Contenido de Agua • Partículas Extrañas • Sustancias Lixiviables • Patrón de Rocío • Límite Microbiano • Contenido de Alcohol (si estuviera presente) • Peso de Llenado Neto • Velocidad de Fuga • Para pruebas de calidad de desempeño, referirse al capítulo (601 ).
Solución para Inhalación DESCRIPCIÓN Los medicamentos en solución para inhalación por lo general tienen una base acuosa y son preparaciones estériles. Están diseñados para ser transportados a los pulmones mediante nebulización con un nebulizador externo específico. Dichas preparaciones medicinales por lo general se envasan en envases monodosis semipermeables e incluyen además un empaque protector para minimizar el ingreso de contaminantes extraños volátiles, la pérdida de disolvente y la exposición al oxígeno y la luz. La nebulización implica la generación mediante energía ultrasónica, efecto de Venturi u otros medios mecánicos/eléctricos apropiados de una niebla fina de gotitas acuosas que contienen el fármaco en solución, y su contínua administración al paciente. Las pruebas generales de calidad para soluciones para inhalación deben incluir lo siguiente (ver la sección IV más adelante en este capítulo para un análisis más detallado de cada prueba): • Identificación • Valoración • Impurezas y Productos de Degradación • Uniformidad de Contenido (dosis previamente medidas) • Valoración de Conservante Antimicrobiano y Excipientes Estabilizadores (si estuvieran presentes) • Esterilidad • Partículas Extrañas • pH • Osmolalidad • Sustancias Lixiviables • Peso de Llenado Neto • Pérdida de Peso • Para pruebas de calidad de desempeño, referirse al capítulo (1601 ).
USP 39
Requisitos Generales/ (5) Medicamentos Nasales y para Inhalación 99 Suspensión para Inhalación DESCRIPCIÓN
Los medicamentos en suspensión para inhalación por lo general tienen una base acuosa y son preparaciones estériles. Están diseñados para ser transportados a los pulmones mediante nebulización con un nebulizador externo específico. Dichas preparaciones de medicamentos por lo general se envasan en envases monodosis semipermeables e incluyen además un empaque protector para minimizar el ingreso de contaminantes extraños volátiles, la pérdida de disolvente y la exposición al oxígeno y la luz. La nebulización implica la generación mediante energía ultrasónica, efecto de Venturi u otros medios mecánicos apropiados de una niebla fina de gotitas acuosas que contienen los componentes de la formulación y su continua administración al paciente. Las pruebas generales de calidad para suspensiones para inhalación deben incluir lo siguiente (ver la sección IV más adelante en este capítulo para un análisis más detallado de cada prueba): • Distribución del tamaño de partícula de la formulación en el envase inmediato. • Para todos los demás atributos generales de calidad, referirse a los atributos de la Solución para Inhalación anteriormente indicados.
Concentrado para Solución lnhalable DESCRIPCIÓN Los medicamentos concentrados para solución inhalable por lo general tienen una base acuosa y son preparaciones estériles. Al diluirlos, de acuerdo con las instrucciones del etiquetado, incluyendo la identidad y la cantidad de vehículo para dilución, están diseñados para ser transportados a los pulmones mediante nebulización usando un nebulizador externo. Dichas preparaciones medicinales por lo general se envasan en envases monodosis semipermeables e incluyen además un empaque protector para minimizar el ingreso de contaminantes extraños volátiles, la pérdida de disolvente y la exposición al oxígeno y la luz. La nebulización implica la generación mediante energía ultrasónica, efecto de Venturi u otros medios mecánicos/eléctricos apropiados de una niebla fina de gotitas acuosas que contienen los componentes de la formulación y su continua administración al paciente. Las pruebas generales de calidad para concentrados para solución inhalable deben incluir lo siguiente (ver la sección IV más adelante en este capítulo para un análisis más detallado de cada prueba): •Transparencia y color de la solución luego de la dilución de acuerdo con las instrucciones del etiquetado. • Para todos los demás atributos generales de calidad, referirse a los atributos anteriormente indicados en Solución para Inhalación.
Fármacos para Solución lnhalable DESCRIPCIÓN (POLVO) Un fármaco para solución inhalable es un medicamento en polvo (con un colorante específico) que al agregarle un vehículo adecuado, de acuerdo con las instrucciones del etiquetado, incluyendo la identidad y la cantidad de vehículo para dilución, forma una solución que cumple con todos los aspectos de los requisitos para la Solución para Inhalación. Las pruebas generales de calidad de fármacos para soluciones inhalables deben incluir lo siguiente (ver la sección IV más adelante en este capítulo para un análisis más detallado de cada prueba): • Contenido de agua •Transparencia, color y totalidad de la solución dentro del tiempo especificado, luego de la reconstitución • Para todos los demás atributos generales de calidad, referirse a los atributos de la Solución para Inhalación anteriormente indicados luego de reconstituir el medicamento.
Atomizador para Inhalación DESCRIPCIÓN Los medicamentos en atomizadores para inhalación por lo general son formulaciones líquidas con base acuosa envasadas en un sistema de envase y cierre compacto que contiene una unidad de bomba atomizadora integrada que al activarla descarga una cantidad exactamente medida de una niebla fina de gotitas de la formulación. La niebla puede generarse por diversos medios tales como acción mecánica, electricidad, o energía derivada de la aspiración por parte del paciente. Los mecanismos a través de los cuales se generan las gotitas difieren entre los varios tipos de atomizadores para inhalación. Estos medicamentos pueden proveerse en presentaciones de dosis única o multidosis. Los medicamentos en atomizadores para inhalación pueden presentar un diseño para dosis previamente medida o con dispositivos de dosis fija. Una unidad para dosis previamente medidas contiene una cantidad de formulación líquida previamente medida en un envase individual (p.ej., un blíster) que el paciente inserta en el dispositivo antes de usar. Un producto con dispositivo de dosis fija contiene una cantidad de la formulación
100 (5) Medicamentos Nasales y para Inhalación / Requisitos Generales
USP 39
líquida en un depósito que resulta suficiente para un número preestablecido de dosis, y el dispositivo descarga cada dosis como un rocío fijo exacto durante la vida útil de la unidad. Las pruebas generales de calidad para atomizadores para inhalación deben incluir lo siguiente (ver la sección IV más adelante en este capítulo para un análisis más detallado de cada prueba): • Geometría de la Nube • Para todos los demás atributos generales de calidad, referirse a los atributos de la Solución para Inhalación anteriormente indicados. • Para pruebas de calidad de desempeño, referirse al capítulo (601 ).
Polvo para Inhalación DESCRIPCIÓN Los medicamentos en polvo para inhalación, comúnmente conocidos como inhaladores de polvo seco, dispensan polvos para inhalación mediante un dispositivo que los transforma en aerosol liberando una dosis exacta del ingrediente activo solo o con los excipientes adecuados con características físicas uniformes. Los diseños actuales incluyen inhaladores de polvo seco con dosis previamente medidas y con dispositivos de dosis fija, los cuales dependen de diversas fuentes de energía para crear y dispersar el aerosol durante la aspiración por parte del paciente. Los inhaladores de polvo seco con dosis previamente medidas contienen cantidades discretas de formulación en envases individuales (p.ej., cápsulas o blísters) que se insertan en el dispositivo antes de usar. Los inhaladores de polvo seco con dosis previamente medidas también pueden contener las unidades de dosificación ordenadas en forma de cargadores multidosis en el sistema de liberación. Los inhaladores de polvo seco con dispositivos de dosis fija tienen un depósito interno que contiene una cantidad de formulación suficiente para entregar múltiples dosis mediante el accionamiento del dispositivo por parte del paciente. Las pruebas generales de calidad para polvos para inhalación deben incluir lo siguiente (ver la sección IV más adelante en este capítulo para un análisis más detallado de cada prueba): • Identificación • Valoración • Impurezas y Productos de Degradación •Uniformidad de Contenido (dosis previamente medidas) • Contenido de Agua • Partículas Extrañas • Límite Microbiano •Contenido Neto (dispositivos de dosis fija) • Disolventes Residuales • Sustancias Lixiviables Volátiles y Semivolátiles • Para pruebas de calidad de desempeño, referirse al capítulo (601 ).
111. PRUEBAS GENERALES DE CALIDAD EN MEDICAMENTOS NASALES Aerosol Nasal Referirse a los atributos del Aerosol para Inhalación anteriormente indicados.
Atomizador Nasal DESCRIPCIÓN Los medicamentos en atomizador nasal por lo general son formulaciones líquidas con base acuosa que se aplican a la cavidad nasal para lograr efectos locales y/o sistémicos. Contienen ingredientes terapéuticamente activos disueltos o suspendidos en una solución o en mezclas de excipientes en un sistema de envase y cierre compacto no presurizado. El sistema de envase y cierre incluye una unidad de bomba atomizadora integrada que al activarla libera un rocío que contiene una cantidad exactamente medida de niebla fina de gotitas de la formulación. La dispersión de la formulación en forma de rocío por lo general se logra forzando el paso de la formulación a través del accionador del dispositivo nasal y su orificio. A menudo, dichos productos vienen en presentaciones multidosis con dispositivos de dosis fija (ver Atomizador para Inhalación) en las que la bomba atomizadora determina la dosis. Los medicamentos en atomizadores nasales también se pueden presentar en un diseño de dosis previamente medidas. Las pruebas generales de calidad para atomizadores nasales deben incluir lo siguiente (ver la sección IV más adelante en este capítulo para un análisis más detallado de cada prueba): • Identificación • Valoración • Impurezas y Productos de Degradación •Valoración de Excipientes Conservantes y Estabilizadores (si estuvieran presentes)
USP 39
Requisitos Generales/ (5) Medicamentos Nasales y para Inhalación 101
• Uniformidad de Contenido (dosis previamente medidas) • Distribución del Tamaño de Partícula (para suspensiones) • Partículas Extrañas • Patrón de Rocío • Límite Microbiano • Sustancias Lixiviables • Peso de Llenado Neto • pH • Osmolalidad • Viscosidad •Esterilidad (dosis previamente medidas) • Para pruebas de calidad de desempeño, referirse al capítulo (601 ).
Polvo Nasal Referirse a los atributos de calidad del Polvo para Inhalación anteriormente indicados.
Solución Nasal DESCRIPCIÓN Por lo general, las soluciones nasales medicinales son formulaciones líquidas en base acuosa que se aplican a la cavidad nasal para lograr un efecto local. Pueden contener soluciones de fármacos solos o mezclados con excipientes en un sistema de envase y cierre compacto no presurizado. El sistema de envase y cierre incluye un sistema de descarga que administra cantidades no medidas de la formulación en forma de gotitas en una niebla fina. Por lo regular, dichos productos vienen en presentaciones multidosis. Las pruebas generales de calidad para medicamentos en solución nasal deben incluir lo siguiente (ver la sección IV más adelante en este capítulo para un análisis más detallado de cada prueba): • Identificación • Valoración • Impurezas y Productos de Degradación • Valoración de Conservantes y Excipientes Estabilizadores (si estuvieran presentes) • Partículas Extrañas • Límite Microbiano • Sustancias Lixiviables • Peso de Llenado Neto • pH • Osmolalidad • Viscosidad
IV. DESCRIPCIÓN DE LAS PRUEBAS DE CALIDAD DEL PRODUCTO A continuación se listan pruebas de calidad del producto que deben aplicarse a los medicamentos nasales y para inhalación y a los productos para nebulización. Las pruebas de calidad específicas del producto se tratan en las monografías de los productos.
Descripción Ver las formas farmacéuticas previas correspondientes y las etiquetas pertinentes para la monografía de un medicamento.
Contenido de Alcohol (si estuviera presente) Si se usa alcohol en la formulación de un medicamento, se debe incluir una valoración específica con criterios de aceptación apropiados.
Valoración (contenido y uniformidad de contenido) Las valoraciones de fármacos en medicamentos de la USP se realizan mediante procedimientos indicadores de estabilidad validados siguiendo el capítulo general Validación de Procedimientos Farmacopeicos (1225). La prueba de Valoración debe medir el fármaco disponible y su estabilidad, incluyendo la adherencia del fármaco a los componentes del envase y del cierre. Contar
102 (5) Medicamentos Nasales y para Inhalación / Requisitos Generales
USP 39
con criterios de aceptación apropiados puede proveer una mayor garantía sobre la reproducibilidad de la fabricación y puede asegurar un mejor cumplimiento con otros atributos de desempeño (p.ej., uniformidad de dosis liberada). Si un medicamento declara contener un solo enantiómero de un fármaco quiral, los analistas pueden usar una valoración quiral o una combinación de valoración no quiral y un procedimiento validado para controlar la presencia del enantiómero no deseado como una impureza.
Valoración de Conservantes y Excipientes Estabilizadores (si estuvieran presentes) Por lo general, se debe valorar cualquier conservante (p.ej., un antimicrobiano) o excipiente estabilizador (p.ej., un antioxidante, un agente que se agrega específicamente para minimizar o prevenir la degradación) en envases multidosis siguiendo un procedimiento indicador de la estabilidad validado de acuerdo con los lineamientos de la guía ICH Q2 vigente. Los criterios de aceptación correspondientes normalmente se basan en la efectividad apropiada del conservante, la cual se demuestra mediante una prueba de desafío microbiano.
Uniformidad de Contenido para Formas Farmacéuticas Previamente Medidas Ver el capítulo (905).
Transparencia y Color de la Solución Luego de la Dilución Las formas farmacéuticas de concentrados para solución inhalable y fármacos para solución inhalable deben diluirse y reconstituirse de acuerdo con las instrucciones del etiquetado antes de su administración por nebulización. El tipo y la cantidad de vehículo usado para la dilución y la reconstitución deben especificarse en el etiquetado. Se deben llevar a cabo estudios apropiados para evaluar la transparencia, el color de la solución luego de la dilución o reconstitución. Los estudios también deben incluir análisis de estabilidad física y química apropiados y sobre las características de desempeño.
Partículas Extrañas Las partículas extrañas en estos medicamentos se deben controlar de manera adecuada. Las partículas en medicamentos nasales y para inhalación pueden originarse durante la fabricación y a partir de los componentes de la formulación y del envase y cierre. Para la evaluación toxicológica, se debe determinar el tipo, el origen, la cantidad y el tamaño de las partículas extrañas, incluyendo partículas finas (p.ej., menos de 1O µm) a lo largo del periodo de almacenamiento durante el estudio de estabilidad.
Identificación Se utiliza una o varias pruebas de identificación específicas para verificar la identidad del fármaco en el medicamento. Si se emplea un método no específico para la identificación, se lo debe combinar con un segundo método independiente y complementario. Asimismo, se debe llevar a cabo una prueba de identificación específica para formas polimórficas. Además, si el fármaco es una sal, se debe incluir una prueba de identificación apropiada para el contraión.
Impurezas y Productos de Degradación Se deben usar procedimientos analíticos indicadores de estabilidad validados de acuerdo con el capítulo general vigente (1225) de la USP para determinar los niveles de impurezas y productos de degradación en un medicamento. Por lo regular, se establecen criterios de aceptación para impurezas y productos de degradación individuales, totales no especificados, y totales, siguiendo la guía vigente ICH Q3B. Para umbrales de informe, identificación y calificación y demás información relevante, se deben seguir las pautas vigentes de la ICH Q3B.
Sustancias Lixiviables Los medicamentos nasales y para inhalación se deben evaluar para determinar la presencia de compuestos que podrían lixiviarse a partir de los componentes elastoméricos, plásticos o del recubrimiento del sistema de envase y cierre que están en contacto directo con la formulación. Además, el medicamento puede inadvertidamente contener otros contaminantes residuales derivados de la fabricación y el procesamiento. Las sustancias lixiviables pueden incluir sustancias aromáticas polinucleares, nitrosaminas, monómeros, plastificantes, aceleradores, antioxidantes y vulcanizadores. Los contaminantes del procesamiento pueden incluir agentes de tratamiento de las superficies, o sustancias de procesamiento que se pueden disolver, asociar químicamente o suspender en la formulación. Por ende, durante todo el periodo de vida útil hasta la fecha de caducidad, el medicamento debe someterse a una evaluación de los compuestos que puedan migrar a la formulación desde diversas fuentes. El análisis a realizar depende del tipo de
USP 39
Requisitos Generales/ (5) Medicamentos Nasales y para Inhalación 103
formulación, por ejemplo si es un polvo o un líquido y de la composición del sistema de envase y cierre; p.ej., un medicamento envasado en un envase semipermeable se debe evaluar para determinar el ingreso de sustancias lixiviables volátiles. Se deben aplicar especificaciones apropiadas para identificar, monitorear y cuantificar los lixiviables en el medicamento usando procedimientos analíticos validados con niveles de cuantificación mínimos apropiados. Se deben establecer y justificar los criterios de aceptación correspondientes desde la perspectiva toxicológica y de seguridad.
Velocidad de Fuga Los estudios de velocidad de fuga en aerosoles medicinales nasales y para inhalación se pueden realizar durante la caracterización y desarrollo del medicamento para justificar la selección de componentes apropiados del sistema de envase y cierre (p.ej., válvula y envase) y de parámetros apropiados de fabricación del medicamento, incluyendo el proceso de precintado de la válvula. Las especificaciones para los estudios de la prueba de Velocidad de Fuga de la USP se pueden basar en la determinación de la diferencia en peso con el paso del tiempo a una temperatura especificada sobre múltiples unidades de cada partida. Ver Velocidad de Fuga (604) para información adicional.
Límites Microbianos La calidad microbiana de las formas farmacéuticas cuando se indica en Pruebas Generales de Calidad en Medicamentos para Inhalación y Pruebas Generales de Calidad en Medicamentos Nasales por lo regular se controla mediante pruebas y criterios de aceptación validados y apropiados para el recuento total de microorganismos aerobios, el recuento total de hongos filamentosos y levaduras, y la demostración de la ausencia de patógenos indicadores especificados. Los criterios de aceptación se pueden expresar en microorganismos por envase. Para mayor información, consultar los capítulos Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano (61) y Métodos de Muestreo Microbiológico Alternativos para Productos Nasales e Inhaladores No Estériles (61 O).
Peso de Llenado Neto Se deben establecer pruebas y criterios de aceptación para evaluar y controlar el peso neto total de la formulación dentro del envase.
Osmolalidad Para controlar la tonicidad de la formulación de formas farmacéuticas cuando se indica en Pruebas Generales de Calidad en Medicamentos para Inhalación, se debe analizar la osmolalidad del producto con especificaciones apropiadas conforme a lo descrito en Osmolalidad y Osmolaridad (785).
pH Se debe establecer una especificación apropiada para el pH de la formulación de las formas farmacéuticas cuando se indique en Pruebas Generales de Calidad en Medicamentos para Inhalación y Pruebas Generales de Calidad en Medicamentos Nasales conforme a los descrito en el capítulo pH (791 ).
Distribución del Tamaño de Partícula Para medicamentos en suspensión para inhalación y en suspensión para atomizador nasal, se pueden usar métodos apropiados y criterios de aceptación correspondientes para la determinación de la distribución del tamaño de partícula del fármaco en la formulación dentro del envase.
Geometría de la Nube Debido a que diversos factores pueden afectar las características de la nube de rocío en aerosoles para inhalación, atomizadores para inhalación, aerosoles nasales, o en atomizadores nasales, su caracterización completa es importante para evaluar el desempeño del sistema de liberación. La geometría de la nube se puede determinar mediante una variedad de procedimientos usando métodos validados apropiadamente. La geometría de la nube también se puede controlar mediante criterios de aceptación apropiados que midan las características del patrón de rocío, incluyendo la forma y el tamaño de la nube de rocío en condiciones experimentales e instrumentales definidas para la prueba.
104 (5) Medicamentos Nasales y para Inhalación / Requisitos Generales
USP 39
Reconstitución y Tiempo de Reconstitución (polvos) Las formas farmacéuticas de fármacos para solución inhalable deben reconstituirse antes de su administración. Por consiguiente, se deben realizar estudios de compatibilidad apropiados para evaluar el tipo y la cantidad de los disolventes, así como el tiempo de reconstitución necesario para la preparación de la solución final antes de su administración al paciente. Los estudios de compatibilidad también deben incluir análisis de estabilidad física y química apropiados de la solución reconstituida, además de incluir la caracterización del desempeño.
Disolventes Residuales Se deben usar pruebas adecuadas y validadas para determinar los niveles de cualquier disolvente en el medicamento. Ver Disolventes Residuales (467) para información adicional.
Patrón de Rocío Debido a que diversos factores pueden afectar el patrón de rocío de medicamentos en aerosol para inhalación, en aerosol nasal o en atomizador nasal, la caracterización completa del patrón de rocío es importante para evaluar el desempeño de la válvula específica y del accionador o la bomba. El patrón de rocío se puede determinar usando métodos validados apropiadamente y criterios de aceptación correspondientes que midan la forma, la densidad y el tamaño del mismo. El procedimiento de prueba para patrones de rocío normalmente es específico para el medicamento y puede incluir, entre otros aspectos, la distancia entre la boquilla y el plano de medición o la superficie de recolección, el número mínimo de accionamientos por patrón de rocío para permitir la discriminación, la orientación de la superficie de recolección con respecto a la boquilla y los procedimientos de visualización.
Esterilidad Todas las formas farmacéuticas para inhalación con base acuosa son preparaciones estériles y deben cumplir con los requisitos en Pruebas de Esterilidad (71 ).
Viscosidad Se debe incluir una prueba de viscosidad con criterios de aceptación apropiados para formas farmacéuticas cuando así se indique en Pruebas Generales de Calidad en Medicamentos para Inhalación y en Pruebas Generales de Calidad en Medicamentos Nasales según corresponda (ver Viscosidad-Métodos Capilares (911) ).
Contenido de Agua Se debe establecer una especificación apropiada para el contenido de agua de las formas farmacéuticas cuando así se indique en Pruebas Generales de Calidad en Medicamentos para Inhalación y en Pruebas Generales de Calidad en Medicamentos Nasales para asegurar la estabilidad continua del medicamento y el desempeño aceptable del mismo. Se deben usar procedimientos analíticos validados conforme a lo descrito en Determinación de Agua (921 ). Proceder según se indica en el capítulo (921 ), con las siguientes modificaciones: equipar el vaso de un sistema cerrado para volumetría con una abertura a través de la cual pasa un tubo de dispersión de gases de porosidad gruesa conectado a un cilindro para muestras.
Pérdida de Peso Los medicamentos deben evaluarse para determinar la pérdida de peso, p.ej., los medicamentos envasados en envases semipermeables se deben evaluar para determinar las propiedades de todo el sistema de envase y cierre que protegen contra la pérdida de humedad.
(7) ETIQUETADO DEFINICIÓN El término etiquetado se refiere a todas las etiquetas y demás materiales escritos, impresos o gráficos que aparezcan directamente sobre el envase primario de un artículo, o sobre o dentro de cualquier empaque o envoltorio secundario, con excepción
Requisitos Generales / (7) Etiquetado 105
USP 39
de los embalajes externos destinados para el transporte. El término etiqueta designa la parte del etiquetado que se encuentra sobre el envase primario. Los embalajes para el transporte que contengan un solo artículo se etiquetan por lo menos con la identificación del producto (excepto los artículos controlados), el número de lote, la fecha de caducidad y las condiciones de almacenamiento y distribución, salvo que dicho envase sea también el envase primario o la parte exterior del empaque destinado al consumidor.
ETIQUETAS Y ETIQUETADO PARA MEDICAMENTOS EXPRESADOS COMO LA PARTE ACTIVA EN EL NOMBRE Y EL CONTENIDO Los nombres y contenidos de medicamentos y preparaciones magistrales deberán expresarse en términos de la parte activa y su contenido correspondiente en la etiqueta (ver Nomenclatura (1121 ), Política para la Denominación de Monografías de Medicamentos y Preparaciones Magistrales que Contienen Sales de Fármacos). Excepciones: Se puede considerar una excepción a esta Política, en aquellos casos raros en los que el uso de la forma salina específica de la parte activa en el nombre suministra información vital desde una perspectiva clínica. En tales casos, cuando el título de la monografía contiene la forma salina específica de la parte activa, el contenido del producto o preparación también se expresa en términos de la forma salina específica. Etiquetado: Las etiquetas y el etiquetado deben indicar claramente la forma salina específica de la parte activa que está presente en el producto o preparación, debido a que esta información puede ser útil para profesionales de la salud y pacientes. Se proveen en el etiquetado los nombres y los contenidos tanto de la parte activa como de la forma salina específica (cuando corresponde).
ETIQUETAS Y ETIQUETADO PARA MEDICAMENTOS INYECTABLES Las etiquetas 1 y el etiquetado indican la siguiente información: • Nombre de la preparación • En el caso de una preparación líquida, la cantidad o proporción de cada parte activa y/o fármaco en un volumen especificado • En el caso de una preparación magistral estéril, los nombres y las cantidades o concentraciones de parte activa y/o fármaco en el envase inmediato (ver Preparación Magistral-Preparaciones Estériles (797), Responsabilidad del Personal de Preparación Magistral) • En el caso de una preparación seca u otra preparación a la que se le deba agregar un diluyente antes de su uso, la cantidad o proporción de cada parte activa y/o fármaco, el volumen final de solución o suspensión, las instrucciones para el almacenamiento adecuado de la solución reconstituida y una fecha de caducidad o fecha límite de uso (ver la sección Fecha de Caducidad y Fecha Límite de Uso) • Vías de administración • Nombre y proporción de todos los ingredientes inactivos, excepto que los ingredientes agregados para ajustar el pH o para hacer isotónico el medicamento, se pueden declarar por sus nombres con una indicación acerca de su efecto • Indicación de las condiciones de almacenamiento • Nombre y domicilio comercial del fabricante, envasador o distribuidor • Número de lote identificativo y fecha de caducidad • "Venta sólo con prescripción médica" • La dosis recomendada o común. El envase deberá etiquetarse de modo que una superficie suficiente de éste quede descubierta en toda su longitud o circunferencia para permitir la inspección del contenido. El número de lote debe proporcionar todo el historial de fabricación del envase específico, incluyendo todas las operaciones de fabricación, llenado, esterilización y etiquetado. Cuando la monografía individual permita variar las concentraciones de la parte activa y/o el fármaco en una inyección de gran volumen, se indica la concentración de cada parte activa y/o fármaco nombrado en el título oficial como si fuera parte del título oficial (p.ej., Dextrosa 5%, Inyección o Dextrosa 5% y Cloruro de Sodio 0,2%, Inyección). Las Inyecciones destinadas para uso veterinario sólo deben etiquetarse para ese fin. El etiquetado de vacunas no se incluye en este capítulo general.
Contenido y Volumen Total para Medicamentos Inyectables Monodosis y Multidosis Para medicamentos inyectables monodosis y multidosis, el contenido por volumen total debe ser la expresión principal y prominente en el panel principal de la etiqueta, seguida en proximidad cercana por el contenido/mL entre paréntesis. Para envases que contienen un volumen de menos de 1 mL, el contenido por fracción de mL debe ser la única expresión de concentración. El contenido en un mL debe expresarse como mg/mL, y no como mg/l ml. Los siguientes formatos son aceptables para contenidos de más de 1 mL: 1
Para limitaciones de espacio, ver el CFR § 201.1 O(i) y el Título 21 del CFR § 610.60.
106 (7) Etiquetado / Requisitos Generales
USP 39
Contenido total/volumen total: 500 mg/l O mL Contenido/mL: 50 mg/mL
o Contenido total/volumen total: 25 000 Unidades/5 mL Contenido/mL: 5000 Unidades/ml. El siguiente formato es aceptable para medicamentos que contienen menos de 1 mL: 12,5 mg/0,625 mL Existen algunas excepciones para la expresión del contenido por volumen total. En algunos casos, la expresión principal y prominente del contenido total de un fármaco por envase puede no ser efectiva en la prevención de errores en la administración y toma de medicamentos (p.ej., insulina). Otro ejemplo de ello es el uso de la lidocaína (u otros fármacos similares empleados como anestésicos locales, casos en que el producto se ordena y administra por porcentaje, (p.ej., 1% o 2%). En tales casos, se debería expresar el contenido total de la siguiente manera: por ejemplo, 1% se puede expresar como (100 mg/l O mL) o (10 mg/mL). Los sólidos secos que deben ser reconstituidos, deben también seguir este formato, con la excepción de que sólo se debe indicar el contenido total del fármaco y no la concentración en forma de contenido/volumen total o el contenido/ml.
Expresión de la Relación de Contenido Los medicamentos que contienen un solo fármaco que también se expresan como una relación, tal como la epinefrina, deberán etiquetarse únicamente en términos de concentración, es decir contenido/ml. Un formato de expresión de una relación tal como 1:1000 es inaceptable para medicamentos con un solo fármaco. Ejemplos: Epinefrina, Inyección, USP, 1:1000 deberá expresarse como 1 mg/mL Epinefrina, Inyección, USP, 1 :1 O 000 deberá expresarse como O, 1 mg/mL Clorhidrato de lsoproterenol, Inyección, USP, 1 :5000 deberá expresarse como 0,2 mg/mL Metilsulfato de Neostigmina, Inyección, 1:1000 deberá expresarse como 1 mg/mL Cuando se combina con un anestésico local, la concentración de epinefrina se expresará en forma de relación. Ejemplos: Clorhidrato de Lidocaína 1% y Epinefrina 1:100 000, Inyección, USP Clorhidrato de Bupivacaína 0,25% y Epinefrina 1 :200 000, Inyección, USP
Envases a Granel para Farmacias Cuando un envase se ofrece como un Envase a Granel para Farmacias, la etiqueta deberá: (a) indicar de manera prominente "Envase a Granel para Farmacias-No para infusión directa"; (b) contener o referir a información sobre técnicas adecuadas para garantizar el uso seguro del producto; y (c) portar una declaración que limite el intervalo de tiempo en el que el envase puede usarse una vez que ha sido perforado, siempre que se mantenga en las condiciones de almacenamiento declaradas (ver Requisitos de Envasado y Almacenamiento (659)).
Casquillos
y Tapas de Sobresello
Los profesionales de la salud que utilizan productos inyectables deben ser capaces de ver fácilmente las indicaciones del etiquetado que comunican mensajes de seguridad importantes críticos para evitar situaciones en donde se ponga en riesgo la vida de forma inminente y actuar de acuerdo con tales indicaciones. Estas indicaciones precautorias del etiquetado deben ser simples, concisas y desprovistas de toda información no esencial. Los productos que no requieren indicaciones precautorias no deben incluir ninguna información para que aquéllos que si las requieran se puedan reconocer inmediatamente. Para lograr este propósito se requiere un enfoque sistemático para el etiquetado de los productos inyectables que asegure que los casquillos y tapas de sobresello-un área de estos productos de alta visibilidad para los profesionales de la salud durante el uso de estos medicamentos-sean reservados para comunicar mensajes críticos de seguridad. En consecuencia: 1. Sólo pueden aparecer indicaciones precautorias sobre la superficie superior (círculo) del casquillo y la tapa de sobresello de un vial que contenga un producto inyectable. La indicación precautoria debe aparecer tanto en el casquillo como en la tapa pero puede aparecer solamente en el casquillo, si la tapa de sobresello es transparente y la indicación precautoria debajo de la misma es fácilmente legible. Una indicación precautoria es aquélla destinada a prevenir una situación que ponga en riesgo la vida de forma inminente y puede incluir instrucciones relacionadas con la seguridad y la potencia, si fuera necesario. Algunos ejemplos de tales indicaciones precautorias incluyen, entre otros: "Advertencia-Agente Paralizante" y "Diluir Antes de Usar." El texto de la indicación precautoria se debe imprimir en un color que contraste y sea fácilmente visible en condiciones normales de uso. 2. Si no es necesaria una indicación precautoria, la superficie superior del vial, incluyendo el casquillo o la tapa de sobresello, debe quedar en blanco.
USP 39
Requisitos Generales/ (7) Etiquetado 107
3. Otras declaraciones o características que incluyen, entre otros, números o letras de identificación, como por ejemplo números de códigos, números de lote, nombres de empresas, logotipos o nombres de productos, etc., pueden aparecer en la superficie lateral (falda) del casquillo pero no en la superficie superior (círculo) de los casquillos o las tapas de sobresello de los viales que contengan productos inyectables. La presencia de tales declaraciones o características en la falda del casquillo no deben distraer o interferir con la indicación precautoria de la superficie superior.
Concentrado de Cloruro de Potasio para Inyección El uso de un sistema de cierre negro en un vial (p.ej., una tapa de sobresello negra y un casquillo negro para sostener el cierre elastomérico) o el uso de una banda o una serie de bandas negras sobre el estrechamiento del cuello de una ampolla se reserva sólo para el Concentrado de Cloruro de Potasio para Inyección (ver el capítulo (659)).
Agentes de Bloqueo Neuromuscular y Paralizantes Todas las preparaciones inyectables de agentes de bloqueo neuromuscular y agentes paralizantes se deben envasar en viales con una declaración de advertencia impresa en los casquillos y en las tapas de sobresello. Tanto el casquillo del envase como la tapa de sobresello deben llevar impresas en blanco o negro (lo que proporcione el mayor contraste con el color del casquillo o la tapa) la declaración: "Advertencia: Agente Paralizante" o "Agente Paralizante" (dependiendo del tamaño del sistema de cierre). Como alternativa, la tapa de sobresello puede ser transparente y sin inscripción, de manera que permita la visualización de la indicación precautoria sobre el casquillo de cierre.
Aluminio en Inyectables de Gran Volumen (IGV), Inyectables de Pequeño Volumen (IPV) y Envases a Granel para Farmacias (EGF) Usados en Terapia de Nutrición Parenteral Total (NPT) 1. El contenido de aluminio de los IGV usados en terapia de nutrición parenteral total (NPT) no debe exceder de 25 mcg/L. 2. El prospecto del envase de los IGV usados en terapia de NPT debe declarar que el medicamento no contiene más de 25 mcg de aluminio por L. Esta información debe incluirse en la sección Precauciones del etiquetado de todos los IGV usados en terapia de NPT. 3. Si la cantidad máxima de aluminio en los IPV y en los EGF es 25 mcg/L o menos, en lugar de declarar la cantidad exacta de aluminio que contiene cada uno, tal como en el párrafo (4), la etiqueta del envase primario de los IPV y los EGF usados en la preparación de mezclas o formulaciones para NPT (con las excepciones que se indican a continuación) pueden declarar: "No contiene más de 25 mcg/L de aluminio." Si el IPV o el EGF es un polvo liofilizado, la etiqueta del envase primario puede declarar lo siguiente: "Cuando se reconstituye de acuerdo con las instrucciones del prospecto adjunto, la concentración de aluminio no será más de 25 mcg/L." 4. El nivel máximo de aluminio a la fecha de caducidad debe declararse en la etiqueta del envase primario de todos los IPV y los EGF usados en la preparación de formulaciones y mezclas para NPT. El contenido de aluminio debe declararse de la siguiente manera: "No contiene más de_ mcg/L de aluminio." La etiqueta del envase primario de todos los IPV y los EGF que son polvos liofilizados usados en la preparación de soluciones para NPT deben declarar lo siguiente: "Cuando se reconstituye de acuerdo con las instrucciones del prospecto adjunto, la concentración de aluminio no será más de _ mcg/L." Este contenido máximo de aluminio debe declararse como el más alto entre los tres niveles siguientes: • El nivel más alto de las partidas producidas durante los últimos tres años • El nivel más alto de las últimas cinco partidas • El nivel máximo con respecto a los niveles históricos, pero sólo hasta completar la producción de las primeras cinco partidas. El prospecto adjunto en los envases de todos los IGV, los IPV y los EGF usados en la preparación de mezclas y formulaciones para NPT debe contener la siguiente declaración en la sección de Advertencias del etiquetado: ADVERTENCIA: Este producto contiene aluminio que puede ser tóxico. El aluminio puede alcanzar niveles tóxicos con la administración parenteral prolongada, si existe insuficiencia renal. Los neonatos prematuros en particular tienen mayor riesgo debido a la inmadurez de sus riñones y a que requieren grandes cantidades de soluciones de calcio y fosfato que contienen aluminio. Los estudios indican que los pacientes con insuficiencia renal, incluidos los neonatos prematuros, que reciben niveles de aluminio por vía parenteral mayores de 4-5 mcg/kg/día, acumulan aluminio a niveles asociados con la toxicidad ósea y del sistema nervioso central. La acumulación en los tejidos puede ocurrir incluso con niveles más bajos de administración.
ETIQUETAS V ETIQUETADO PARA MEDICAMENTOS V OTRAS CATEGORÍAS Las etiquetas y etiquetados deben incluir la siguiente información: 1. En el caso de una preparación líquida, el contenido porcentual de cada parte activa y/o fármaco o la cantidad de cada parte activa y/o fármaco en un volumen especificado, excepto que los ingredientes agregados para ajustar a un pH dado o para hacer isotónica la solución se puedan declarar por el nombre y una indicación acerca de su efecto.
108 (7) Etiquetado / Requisitos Generales
USP 39
2. En el caso de una preparación magistral, el etiquetado debe indicar: "Este medicamento es una preparación magistral" (ver Preparación Magistral-Preparaciones No Estériles (795), Proceso de Preparación Magistral, Criterios para la Elaboración de Una Preparación Magistral para Cada Fármaco).
3. En el caso de una preparación seca u otra preparación a la que se le deba agregar un diluyente antes de su uso, la cantidad de cada parte activa y/o fármaco, la composición de los diluyentes recomendados [sólo el o los nombres si la fórmula se especifica en la monografía individual], la cantidad que se usará para lograr una concentración específica de la parte activa o el fármaco, el volumen final de solución, las instrucciones para el almacenamiento adecuado de la solución reconstituida y una fecha de caducidad o fecha límite de uso (ver la sección Fecha de Caducidad y Fecha Límite de Uso).
Cantidad de Parte Activa y/o Fármaco por Unidad de Dosificación La concentración de un medicamento se expresa en la etiqueta del envase en términos de la parte terapéuticamente activa o del fármaco en microgramos, miligramos, gramos o porcentaje, independientemente de la forma que se use en el título, a menos que se indique de otro modo en una monografía individual. Los nombres de la parte activa y del fármaco, así como sus cantidades equivalentes se proveen en la etiqueta del envase y en el etiquetado (ver el capítulo (1121 ), Política para la Denominación de Monografías de Medicamentos
y Preparaciones
Magistrales que Contienen Sales de Fármacos).
Los artículos oficiales en cápsulas, tabletas u otras formas farmacéuticas deberán etiquetarse indicando la cantidad de cada parte activa y/o fármaco o el nutriente reconocido que está contenido en cada unidad. Las soluciones o suspensiones orales de dosis única (independientemente de si se proveen como preparaciones líquidas o preparaciones líquidas que se reconstitutyen a partir de sólidos con la adición de un volumen designado de un diluyente específico) deberán etiquetarse expresando la cantidad de cada parte activa y/o fármaco o nutriente reconocido administrado en las condiciones descritas en el capítulo Volumen de Entrega (698). Los medicamentos oficiales que no se envasan como dosis únicas deberán etiquetarse indicando la cantidad de cada parte activa y/o fármaco en cada mililitro o gramo, o expresando el porcentaje de cada uno de estos ingredientes (ver Advertencias y Requisitos Generales 8. 740, Concentraciones Porcentuales). Una excepción son los líquidos o sólidos orales destinados para su reconstitución para producir líquidos orales que, alternativamente, pueden etiquetarse en términos de cada porción de 5 mL de líquido o del líquido resultante. A menos que se especifique de otro modo en una monografía o un capítulo, las concentraciones o cantidades deberán declararse solamente en unidades métricas [ver también Advertencias y Requisitos Generales 5.50. 7O, Unidades de Potencia (Biológica)].
Fecha de Caducidad y Fecha Límite de Uso La etiqueta de un medicamento o suplemento nutricional o dietético oficial debe llevar una fecha de caducidad. Todos los productos deben exhibir la fecha de caducidad de manera tal que pueda ser leída por una persona común en las condiciones normales de compra y uso. La fecha de caducidad debe aparecer en forma prominente, contrastando claramente con el fondo, o grabada en relieve con nitidez, y debe ser fácilmente comprendida (p.ej., "CAD, VENC o EXP 6/13," "Cad, Venc o Exp 13 de junio " o "Caducidad, Vencimiento o Expiración 6/2013"). [NOTA-Para obtener información adicional, consultar los Voluntary Codes and Guidelines of the Consumer Healthcare Products lndustry de la Consumer Healthcare Products Association.] Las monografías para ciertas preparaciones especifican cómo se debe determinar la fecha de caducidad que aparece en la etiqueta. En ausencia de un requisito específico en la monografía individual de un medicamento o un suplemento nutricional, la etiqueta debe llevar una fecha de caducidad asignada para dicha formulación y empaque del artículo, con la siguiente excepción: no es necesario exhibir la fecha de caducidad en el caso de medicamentos o suplementos nutricionales envasados en envases destinados a la venta sin receta médica, en cuyo etiquetado no se establezcan limitaciones de dosificación y que se mantengan estables durante un período de no menos de 3 años, siempre que se almacenen en las condiciones prescritas. En el caso de artículos oficiales que deban exhibir una fecha de caducidad, tales artículos deberán dispensarse únicamente en un envase, o a partir de un envase, etiquetado con fecha de caducidad, y la fecha de dispensación del producto deberá ser anterior a la fecha de caducidad declarada. La fecha de caducidad identifica el período durante el cual se estima que el artículo cumple con los requisitos de la monografía oficial, siempre que se conserve en las condiciones de almacenamiento prescritas. La fecha de caducidad limita el tiempo durante el cual un artículo puede ser dispensado o usado. En los casos en que se indica sólo el mes y el año de caducidad, se entiende que la fecha se refiere al último día del mes indicado. La fecha límite de uso es la fecha después de la cual no se debe utilizar un producto. Basándose en la información provista por el fabricante o en esta subsección, el dispensador deberá colocar una fecha límite de uso adecuada en la etiqueta del envase del artículo recetado para limitar el uso del mismo por parte del paciente. La fecha límite de uso colocada en la etiqueta no debe ser posterior a la fecha de caducidad del envase del fabricante. Ver también la sección Preparaciones Magistrales más adelante. Para los artículos que requieran ser reconstituidos antes de su uso, se debe colocar en el etiquetado una fecha límite de uso apropiada para el producto reconstituido. Para todas las otras formas farmacéuticas, al determinar la fecha límite de uso, el dispensador debe tomar en cuenta, además de cualquier otro factor relevante lo siguiente: • La naturaleza del medicamento • El envase en el que fue envasado por el fabricante y su fecha de caducidad • Las características del envase para el paciente, si el artículo se reenvasa para su dispensación
Requisitos Generales/ (7) Etiquetado 109
USP 39
• Las condiciones de almacenamiento esperadas a las que el artículo puede ser expuesto • Las condiciones de almacenamiento inusuales a las que el artículo puede ser expuesto • El período estimado para la duración del tratamiento. Después de tomar en cuenta dichos factores, el dispensador deberá colocar una fecha límite de uso adecuada en la etiqueta del envase del artículo para limitar el uso del mismo por parte del paciente. A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, o en ausencia de datos de estabilidad, esa fecha límite de uso no podrá ser posterior a: (a) la fecha de caducidad indicada en el envase del fabricante, o (b) 1 año a partir de la fecha en que se dispense el medicamento, lo que represente un período menor. Para formas farmacéuticas líquidas y sólidas no estériles que están envasadas en envases unitarios y de dosis única, la fecha límite de uso debe ser de 1 año a partir de la fecha de envasado del medicamento en envases unitarios o de dosis única, o la fecha de caducidad indicada en el envase del fabricante, lo que represente un período menor, a menos que los datos de estabilidad o el etiquetado del fabricante indiquen algo diferente.
Preparaciones Magistrales La etiqueta del envase o empaque que contiene una preparación magistral oficial debe llevar una fecha límite de uso. La fecha límite de uso es la fecha después de la cual no debe usarse la preparación magistral. La fecha límite de uso se determina basándose en criterios distintos a los utilizados para determinar las fechas de caducidad de los medicamentos fabricados en forma industrial. La etiqueta en el empaque del envase de una preparación magistral oficial debe incluir las palabras "preparación magistral" después del nombre del medicamento (p.ej., Baclofeno, Solución Oral, Preparación Magistral). Además, las preparaciones magistrales oficiales USP para pacientes animales incluirán la palabra "veterinario(a)" después de la denominación oficial (p.ej., Atenolol, Suspensión, Preparación Magistral Veterinaria).
Irrigación, Hemofiltración y Diálisis Los envases flexibles para inyecciones destinadas a diálisis, hemofiltración o soluciones de irrigación y que contienen un volumen de más de 1 L, deberán etiquetarse indicando que el contenido no está destinado para infusión intravenosa.
Uso de Ceros al Comienzo y al Final de una Cantidad Con el fin de minimizar la posibilidad de errores en la dispensación y administración de medicamentos, cuando la cantidad de parte activa y/o fármaco se exprese en números enteros, se debe indicar sin coma decimal seguida de ceros (p. ej., indicar 4 mg, no 4,0 mg). Cuando la cantidad de parte activa y/o fármaco se exprese en un número decimal menor a 1, se debe indicar con un cero antes de la coma decimal (p.ej., indicar 0,2 mg; no ,2 mg).
Alcohol El contenido de alcohol en una preparación líquida debe especificarse en la etiqueta como un porcentaje (v/v) de C2 H5 0H.
Productos Botánicos La etiqueta de una planta u otro producto botánico destinado para uso como suplemento dietético deberá incluir la leyenda "Si está embarazada o en período de lactancia, consulte a un profesional de la salud antes de usar este producto."
Electrólitos La concentración de electrólitos para terapias de reemplazo (p.ej., sodio, potasio, cloruro), deberá especificarse en la etiqueta en miliequivalentes (mEq)/volumen. [NOTA-El contenido de fósforo en inyectables deberá expresarse en miliMoles (p.ej., mMol/volumen). Asimismo, la etiqueta del producto deberá indicar la cantidad del ingrediente o ingredientes, expresada en términos de peso o concentración porcentual.]
Productos No Orales Un producto destinado para inyección o uso tópico deberá indicar los nombres de todas las sustancias agregadas (ver Advertencias y Requisitos Generales 5.20, Sustancias Agregadas).
Sales de Fármacos Es un principio establecido que los artículos oficiales deben tener un único título oficial (ver Advertencias y Requisitos Generales 2.20 y los requisitos farmacopeicos de nomenclatura en el capítulo (1121 )). Con el objeto de ahorrar espacio en las etique-
USP 39
11 O (7) Etiquetado / Requisitos Generales
tas, y dado que los símbolos químicos de las sales inorgánicas más comunes son bien conocidos por los profesionales de la salud, se permiten las siguientes alternativas para el etiquetado de artículos oficiales que son sales: HCI para clorhidrato; HBr para bromhidrato; Na para sodio; y K para potasio. Los símbolos Na y K se usan para abreviar el nombre de las sales de ácidos orgánicos; sin embargo, estos símbolos no deben usarse cuando se emplea la preposición de en el título oficial, es decir cuando se denominan oficialmente de sodio o de potasio (con el metal al comienzo de la denominación oficial en inglés), (p.ej., Fenobarbital Sódico, que se denomina Phenobarbital Sodium en inglés, se puede abreviar a Fenobarbital Na, pero no se deberá escribir Salicilato de Na para abreviar Salicilato de Sodio, el cual se denomina Sodium Salicylate en inglés).
Cápsulas y Tabletas Especiales La etiqueta de cualquier Cápsula o Tableta destinada para una administración que no sea la ingestión oral de la unidad entera, deberá llevar una indicación bien visible sobre el modo de uso (ver Nomenclatura Farmacopeica, Pautas de Nomenclatura en el sitio Web de la USP en www.usp.org).
Productos con Vitaminas La etiqueta de los medicamentos oficiales debe indicar su contenido de vitaminas expresado en unidades métricas por unidad de dosificación. Las cantidades de vitamina A, O y E también se pueden expresar en Unidades USP. Las cantidades de vitamina A expresadas en unidades métricas hacen referencia a las cantidades equivalentes de retinol (alcohol de vitamina A). La etiqueta de los suplementos nutricionales debe incluir un número identificatorio de lote, de control o de partida.
Temperatura Ambiente Controlada Los artículos pueden etiquetarse indicando su almacenamiento a "temperatura ambiente controlada" o a una temperatura de "hasta 25º", u otra indicación basada en la misma temperatura cinética media (ver el capítulo (659)).
Envase Resistente a la Luz Cuando se use una cubierta opaca para proveer protección de la luz para un producto sensible a la luz envasado en un envase transparente o incoloro o translúcido, la etiqueta del envase deberá indicar que la cubierta opaca es necesaria hasta el momento de uso o administración del contenido (ver Envases-Pruebas de Desempeño (671 ), Prueba de Transmisión de Luz y el capítulo (659)).
Envase Unitario Todos los envases unitarios deberán etiquetarse indicando la identidad, cantidad y/o concentración, el nombre del fabricante, el número de lote y la fecha de caducidad del artículo (ver el capítulo (659)).
Envase Monodosis Un envase monodosis deberá etiquetarse como tal y, cuando el espacio lo permita, la etiqueta deberá incluir instrucciones apropiadas para su desecho (ver el capítulo (659)).
Envase de Unidad de Uso Un envase de unidad de uso deberá etiquetarse como tal, sin ninguna modificación adicional excepto la adición del etiquetado apropiado (ver el capítulo (659)).
Protección de la Congelación El envase deberá incluir una indicación apropiada para proteger el artículo de la congelación si estuviera sujeto a la pérdida de contenido o potencia, o a la alteración destructiva de sus características (ver el capítulo (659)).
Etiquetado de Envases de Venta bajo Receta Médica Como mínimo, un envase de venta bajo receta médica deberá etiquetarse tomando en cuenta al paciente. La etiqueta deberá contener información esencial que sea importante para el uso seguro y efectivo del medicamento por parte del paciente. Las etiquetas deben tener un diseño y formato que optimice la legibilidad y el entendimiento (ver Etiquetado de Envases de Medicamentos de Venta Bajo Receta (1 7)).
USP 39
Requisitos Generales / (11) Estándares de Referencia USP 111 ETIQUETADO GENERAL
Se recuerda a los usuarios referirse siempre a las Advertencias y Requisitos Generales para la evaluación o aplicación de cualquier norma farmacopeica. Las Advertencias y Requisitos Generales tratan diversos aspectos relacionados con el etiquetado, entre los que se incluyen 3.20, Indicación de Cumplimiento (cuando un artículo puede etiquetarse con la denominación USP, NF o USP-NF, y requisitos relacionados con las diferencias en identidad, denominación, contenido, calidad o pureza); 5.20. 7O, Sustancias Agregadas, Excipientes e Ingredientes en Sustancias Oficiales; 6.70, Reactivos; y 8.240, Pesos y Medidas (p.ej., el microgramo puede expresarse como µg o mcg. Para propósitos de etiquetado o prescripción, se prefiere "mcg").
(11) ESTÁNDARES DE REFERENCIA USP Los Estándares de Referencia provistos por la Convención de la Farmacopea de los Estados Unidos de América (Estándares de Referencia USP o ER) son muestras bien caracterizadas de fármacos y alimentos específicos (fármacos, productos biológicos, excipientes, suplementos dietéticos, ingredientes alimenticios, impurezas, productos de degradación, reactivos y estándares de verificación de desempeño). Cuando los ER USP se aprueban como aptos para su uso como estándares de comparación en las pruebas o valoraciones documentales (es decir, como componentes de las monografías) en la Farmacopea de los Estados Unidos (USP) o en el Formulario Nacional (NF), también adquieren estatus oficial y reconocimiento legal en los Estados Unidos de América. Es responsibilidad del usuario evaluar la aptitud de los ER para su uso en otras aplicaciones. Los ER USP oficiales son los estándares primarios en jurisdicciones que los reconocen como tales y, cuando corresponda, se calibran con respecto a materiales de referencia internacionales tales como los provistos por la Organización Mundial de la Salud. Los ER USP no están destinados para uso terapéutico. Los ER USP se ofrecen para propósitos de metrología legal y pueden ayudar a asegurar la comparabilidad de los resultados y la trazabilidad a las unidades del Sistema Internacional de Unidades (SI) independientemente del estado de certificación. Los ER USP son Materiales de Referencia conforme a lo definido en el Vocabulario Internacional de Metrología-Conceptos Básicos y Generales y Términos Asociados (VIM): 3ra edición, 2007.
TIPOS DE ESTÁNDARES DE REFERENCIA Estándares de Referencia para Artículos USP o NF Los Estándares de Referencia para los artículos oficiales en USP o NF se ofrecen como materiales puros o como mezclas de sustancias químicas que constituyen un reflejo de los fármacos o excipientes correspondientes. El uso de estos materiales se especifica en la monografía del artículo. Por lo general, estos materiales son necesarios para la Valoración y/o las pruebas de Identificación. La evaluación de la aptitud de un ER USP para usos distintos a los especificados en una monografía es responsabilidad del usuario. El valor de propiedad o el valor de cálculo del Estándar de Referencia se declara en la etiqueta y se debe incluir en los cálculos usados en la monografía y en los capítulos generales aplicables. Para los Estándares de Referencia que no cuentan con un valor de propiedad o un valor de cálculo declarado en la etiqueta o en la documentación adjunta, se debe asumir que el Estándar de Referencia es 100,0% puro para las aplicaciones cuantitativas farmacopeicas.
Estándares de Referencia de Impurezas Los Estándares de Referencia de impurezas pueden incluir lo siguiente: • Impurezas orgánicas que pueden surgir durante los procesos de fabricación o durante la vida útil de un artículo y pueden incluir materiales iniciales, productos intermedios, subproductos, reactivos, catalizadores y/o productos de degradación. • Impurezas inorgánicas que normalmente resultan de un proceso de síntesis y que pueden incluir reactivos, catalizadores, metales pesados o sales inorgánicas • Disolventes residuales que pueden ser líquidos orgánicos o inorgánicos que se usan para preparar soluciones o suspensiones durante la síntesis de un artículo Los Estándares de Referencia de Impurezas pueden presentarse como materiales purificados de un solo componente o como mezclas de más de una impureza. Otras opciones para controlar impurezas pueden incluir la presentación del artículo oficial con un contenido de impurezas declarado, el uso de tiempos de retención y factores de respuesta cromatográfica relativos, o la provisión de valores teóricos tales como las absortividades UV a longitudes de onda seleccionadas. En ediciones anteriores de la farmacopea, las impurezas se designaban por sus nombres químicos. Para facilitar la búsqueda y el orden en el índice, los nombres químicos de las impurezas se han reemplazado gradualmente por la denominación "ER Compuesto Relacionado Y de X," donde X es el nombre del artículo oficial e Y es una letra secuencial del alfabeto. La designación de esta letra no concuerda necesariamente con los esquemas de denominación usados por otras farmacopeas. Asimismo, los Estándares de Referencia de mezclas de impurezas se pueden designar según el uso al que están destinados, como por
112 (11) Estándares de Referencia USP /
Requisitos Generales
USP 39
ejemplo "ER Aptitud del Sistema de X". Los nombres convencionales y los nombres químicos se reproducen en el catálogo y en la etiqueta del ER.
Materiales de Referencia Certificados Los Materiales de Referencia Certificados de USP (MRC) son Estándares de Referencia que proporcionan valores de propiedades certificados con incertidumbres asociadas y trazabilidad metrológica, de conformidad con las Guías 30-35 de la lnternational Organization for Standardization (ISO). El uso correcto de estos MRC respalda la trazabilidad de los resultados a las unidades del SI y la capacidad de comparabilidad de los procedimientos.
Estándares de Referencia USP para Productos Biológicos La USP ofrece ER para productos biológicos y materiales auxiliares. Por diversas razones, que incluyen razones históricas, y conforme se indica en la Sección 5.50.1 O Unidades de Potencia (Biológica) en las Advertencias y Requisitos Generales, los ER USP para productos biológicos pueden diferir en la cantidad de unidades de potencia, por definición, o en otros aspectos de los demás estándares reconocidos internacionalmente. A menos que así se indique en la monografía, los estándares de referencia internacionales generalmente no son intercambiables y se requieren ER USP para las pruebas y valoraciones de USP-NF.
Estándares de Referencia NF Se pretende designar y etiquetar como "Estándares de Referencia USP" a los Estándares de Referencia actualmente etiquetados como "Estándares de Referencia NF", conforme a la consolidación de la USP y el NF dentro de la USP a partir del 2 de Enero de 1975. Cuando sea necesario un Estándar de Referencia USP, se puede usar la sustancia correspondiente etiquetada como un "Estándar de Referencia NF".
Transición de Sustancias Auténticas a Estándares de Referencia USP En el pasado, la USP desarrollaba a manera de servicio materiales de referencia altamente caracterizados no requeridos para su uso en monografías o capítulos generales de USP-NF, los cuales se distribuían como Sustancias Auténticas (SA). Las SA son sustancias químicas altamente caracterizadas que se analizan mediante estudios en colaboración y se ponen a disposición como un servicio primariamente para los laboratorios analíticos, clínicos, farmacéuticos y de investigación. Estos materiales pueden usarse en la identificación, el desarrollo de métodos, la evaluación del desempeño de métodos, u otras aplicaciones que sean adecuadas y estén validadas por el usuario. La USP dejará de lanzar materiales etiquetados como "Sustancias Auténticas". Todos los materiales de referencia liberados al mercado, independientemente que se requiera o no su uso en una monografía o capítulo general de USP-NF, serán "Estándares de Referencia USP".
Referencias Visuales Auténticas Las Referencias Visuales Auténticas son Estándares de Referencia USP, pero a diferencia de los materiales de referencia químicos, las Referencias Visuales Auténticas (RVA) no se usan en análisis químicos. Las RVA son imágenes visuales usadas por los analistas para comparar ciertos artículos de prueba y asegurar que cumplen con los requisitos farmacopeicos. Las RVA se incorporan por referencia en la monografía.
Estándares de las Pruebas de Verificación de Desempeño USP Estos materiales se proporcionan para analizar y, cuando fuese adecuado, facilitar el ajuste de la operación de un instrumento para asegurar que los resultados obtenidos son exactos y/o precisos o que proporcionan resultados aceptables. El uso de estos Estándares de Referencia se describe generalmente en los capítulos de pruebas generales asociados y en la información relacionada.
APLICACIONES DE LOS ESTÁNDARES DE REFERENCIA USP Las aplicaciones oficiales de los ER USP se especifican en las monografías y capítulos generales de USP-NF. Incluyen lo siguiente: • usos cuantitativos en valoraciones de fármacos y formulaciones, pruebas de límite, o blancos y controles • usos cualitativos, (p.ej., pruebas de identificación, pruebas de aptitud del sistema, o marcadores de picos cromatográficos) • usos específicos del método, (p.ej., estándares de verificación de desempeño, RVA, estándares de punto de fusión y el set de conteo de partículas)
Requisitos Generales/ (11) Estándares de Referencia USP 11 3
USP 39
Según se describió con anterioridad, la USP también ofrece Sustancias Auténticas que no se especifican para su uso en una monografía o capítulo general de USP, las cuales se usan a criterio del usuario.
ENVASADO La cantidad de material por envase individual de ER USP depende de la aplicación farmacopeica del estándar y es, por lo general, suficiente para varias determinaciones. Algunos estándares (principalmente materiales con requisitos importantes de manipulación o materiales que estén disponibles únicamente en pequeñas cantidades) se proporcionan en envases de un solo uso. Dichos productos de un solo uso por lo general son liofilizados y su contenido se declara en unidades de masa o actividad por envase. Cuando así se declara, el contenido del envase debe reconstituirse en su totalidad sin la necesidad de pesarlo nuevamente. Las instrucciones de reconstitución se proveen en la etiqueta o en las monografías en que se usa el estándar.
ETIQUETADO El texto de la etiqueta proporciona toda la información requerida para el almacenamiento y uso correctos de los ER USP en las aplicaciones de las monografías. La etiqueta incluye instrucciones de uso, advertencias de seguridad, información requerida para las sustancias controladas y un valor de propiedad o un valor de cálculo para los estándares con aplicaciones cuantitativas. Para los estándares de verificación de desempeño, se proveen intervalos de aceptación. Cuando resulta necesario, los ER USP están acompañados de documentación adicional, como por ejemplo Hojas de Datos Técnicos o Cromatogramas Típicos. A menos que se indique algo distinto en el procedimiento de la monografía individual o en un capítulo general, los ER USP se deben usar de acuerdo con las instrucciones en la etiqueta del Estándar de Referencia. Las Hojas de Datos de Seguridad de los Materiales para todos los materiales de referencia USP están disponibles en el sitio Web de la USP. Aunque los ER USP se vuelven a analizar de acuerdo con un programa predefinido para determinar la aptitud continua de uso, los ER USP no presentan una fecha de caducidad en la etiqueta. Un lote de ER USP puede usarse en sus aplicaciones oficiales siempre que se publique como "Current Lot" (Lote Vigente) en la versión vigente del USP Reference Standards Catalog (Catálogo de Estándares de Referencia USP) o que no haya alcanzado su Fecha de Uso Válida. Al agotarse, se designa a este lote en el catálogo como "Previous Lot" (Lote Anterior) y se le asigna una "Valid Use Date" (Fecha de Uso Válida). La USP publica bimestralmente el Catálogo de Estándares de Referencia. Se puede encontrar la versión vigente del catálogo en el sitio Web de la USP: www.usp.org. Es responsabilidad del usuario constatar antes de su uso que el lote del Estándar de Referencia USP en cuestión tiene un estatus oficial como "Current Lot" (Lote Vigente) o como "Previous Lot" (Lote Anterior) dentro de la Fecha de Uso Válida.
Cambio en la redacción:
USO ADECUADO Muchas pruebas y valoraciones farmacopeicas están basadas en la comparación de una muestra de prueba con un ER USP. En estos casos, las mediciones se realizan en preparaciones de la muestra de prueba y del Estándar de Referencia. Cuando se indica que se debe preparar en diluciones sucesivas, o de otro modo, una Solución estándar o una Preparación estándar para realizar una determinación cuantitativa, está previsto que la sustancia del Estándar de Referencia se pese con exactitud (ver • Balanzas (41 CAf ol-may-zo 16) y Aparatos Volumétricos (31) ). También se deben tomar en cuenta los errores potenciales asociados con el pesaje de masas pequeñas (ver también la Sección 6.50.20.1 Ajuste de Soluciones en las Advertencias y Requisitos Generales). Según se indicó anteriormente, los Estándares de Referencia que se definen basándose en el contenido por envase son una excepción. Las instrucciones de uso de los ER USP incluyen lo siguiente: •Tal Como se Encuentra (As Is): Usar sin tratamiento previo ni corrección por sustancias volátiles. Ésta es la opción de preferencia y se escoge siempre que los datos validados indiquen que el contenido de sustancias volátiles es constante con el transcurrir del tiempo. • Secar Antes de Usar (Dry Befare Use): Usar inmediatamente después de secar en las condiciones indicadas. El secado no debe realizarse en el envase original. Se debe transferir una porción del material a un recipiente de secado distinto. • Determinar Volumétricamente el Contenido de Agua al Momento de su Uso (Determine Water Content Titrimetrically At Time of Use): Usar con una corrección por el contenido de agua o la pérdida por secado determinada en una porción separada del material. Cuando se requiere de una determinación volumétrica de agua al momento de usar el Estándar de Referencia, proceder según se indica en el Método/ en Determinación de Agua (921 ). Para ello se aceptan métodos instrumentales o microanalíticos. Cuando se usen cantidades habituales (aproximadamente 50 mg del Estándar de Referencia), valorar volumétricamente con una solución del reactivo diluida de 2 a 5 veces. Cuando requiera la determinación de la pérdida por secado de una porción separada del ER USP, proceder según se indica en la etiqueta. Se pueden usar tamaños de muestra más pequeños que los requeridos en el capítulo de pruebas generales Pérdida por Secado (731) para un ER USP, siempre que el usuario pueda obtener un resultado suficientemente exacto.
>•
114 (11) Estándares de Referencia USP /
Requisitos Generales
USP 39
Siempre que las instrucciones de uso declaradas requieran de secado o de una corrección por sustancias volátiles, se lo debe realizar al momento del uso. Se deben controlar los detalles experimentales adicionales mediante los Procedimientos Operativos Estándares del usuario y las buenas prácticas de laboratorio.
ALMACENAMIENTO Los ER USP deben almacenarse en la configuración de envasado provista por la USP (p.ej., viales que se envasan en bolsas selladas herméticamente). Cuando se especifiquen condiciones de almacenamiento especiales, se deben seguir las instrucciones de la etiqueta. Los viales sin abrir se deben almacenar según se indica en la etiqueta. Es responsabilidad del usuario asegurar que el contenido de los viales abiertos continúe siendo adecuado para el uso provisto y que se mantenga tanto la asignación de valores como la información de incertidumbre.
Aparatos para Pruebas y Valoraciones (17) ETIQUETADO DE ENVASES DE MEDICAMENTOS DE VENTA BAJO RECETA INTRODUCCIÓN El uso erróneo de medicamentos ocasiona más de un millón de eventos adversos por año en los Estados Unidos. En lo que respecta a medicamentos recetados, la mejor (y generalmente la única) fuente de información para los pacientes es la etiqueta del envase del medicamento de venta bajo receta y, aunque en ocasiones el paciente dispone de otra información escrita y asesoramiento verbal, la etiqueta del envase del medicamento de venta bajo receta debe satisfacer las obligaciones profesionales del médico que receta y del farmacéutico. Estas obligaciones incluyen proveer al paciente aquella información que resulte esencial y necesaria para entender la forma segura y apropiada de uso del medicamento y el apego al esquema prescrito de medicación. El entendimiento inadecuado de las instrucciones de uso del medicamento recetado y de la información auxiliar en los envases dispensados se ha generalizado. Diversos estudios han descubierto que el 46% de los pacientes no entienden una o más instrucciones de posología, mientras que el 56% malinterpreta una o más de las advertencias auxiliares. El problema se acentúa en pacientes con un bajo nivel de alfabetismo o semi analfabetos, así como en pacientes que reciben varios medicamentos con esquemas de administración innecesariamente complejos o no estandarizados. Un estudio demostró que los pacientes con bajo nivel de alfabetismo son 34 veces más propensos a malinterpretar las advertencias en las etiquetas de los medicamentos recetados. Sin embargo, incluso los pacientes con un nivel adecuado de alfabetismo a menudo malinterpretan las instrucciones y advertencias comunes de los medicamentos recetados. Asimismo, existen grandes discrepancias entre las advertencias auxiliares y las instrucciones adicionales indicadas por cada médico para el mismo medicamento recetado. A menudo, la evidencia específica para sustentar una declaración auxiliar es poco clara y los pacientes en muchas ocasiones ignoran dicha información. Sin embargo, aún se requieren mayores estudios con respecto a la necesidad esencial y al beneficio que proporciona la información auxiliar en la etiqueta (tanto texto como íconos) para mejorar el entendimiento del paciente sobre el uso seguro y apropiado de sus medicamentos en comparación con el uso de un lenguaje simplificado y explícito únicamente. La falta de normas universales para el etiquetado de envases de medicamentos de venta bajo receta que se dispensan es una causa importante por la que el paciente malinterpreta las instrucciones, no las sigue de manera adecuada y comete errores de medicación. El 18 de mayo de 2007, el Comité de Expertos en Uso Seguro de Medicamentos de la USP estableció un Panel Asesor con los siguientes objetivos: 1) determinar el contenido y formato óptimos de las etiquetas de los medicamentos de venta bajo receta para promover el uso seguro de medicamentos mediante la revisión crítica de factores que promueven u ocasionan que el paciente no entienda las instrucciones de los medicamentos de venta bajo receta y 2) crear normas universales para etiquetas de medicamentos de venta bajo receta con respecto al formato/apariencia y el contenido/lenguaje. En noviembre de 2009, el Panel Asesor en Alfabetización en Salud y Etiquetado de Envases de Medicamentos Recetados presentó sus recomendaciones al Comité de Expertos en Uso Seguro de Medicamentos, el cual a su vez solicitó a la USP desarrollar normas para etiquetas centradas en el paciente en lo referente a formato, apariencia, contenido y lenguaje de las instrucciones en los medicamentos de venta bajo receta a fin de promover el entendimiento por parte de los pacientes. Dichas recomendaciones conforman el fundamento de este capítulo general.
USP 39
Aparatos / (1 7) Etiquetado de Envases de Medicamentos 115
[NOTA-Estas normas no se aplican cuando personal autorizado, que actúa dentro del marco de su profesión, administra un medicamento de venta bajo receta a un paciente.]
NORMAS PARA ETIQUETAR ENVASES DE MEDICAMENTOS RECETADOS QUE PROMUEVAN EL ENTENDIMIENTO EN LOS PACIENTES Organizar la Etiqueta del Medicamento de Venta Bajo Receta de una Manera Centrada en el Paciente La información debe organizarse de la manera que mejor refleje la forma en que la mayoría de los pacientes buscan y entienden las instrucciones de uso de los medicamentos. El etiquetado del envase de los medicamentos de venta bajo receta debe presentar al paciente únicamente la información más importante requerida para entender el uso seguro y efectivo.
Se Deben Enfatizar las Instrucciones y Demás Información Importante para los Pacientes Presentar de manera prominente la información crítica para los pacientes sobre el uso seguro y efectivo del medicamento. En la parte superior de la etiqueta, se debe especificar el nombre del paciente, el nombre del medicamento (especificar el nombre genérico y comercial completos) y la dosis, además de instrucciones de uso explícitas y claras en lenguaje sencillo. Las instrucciones de los medicamentos de venta bajo receta deben seguir un formato estándar de modo que el paciente pueda estar seguro de que cada elemento se encontrará en un orden reglamentado cada vez que reciba un medicamento recetado. Otra información menos crítica aunque importante (p.ej., nombre y número telefónico de la farmacia, nombre del médico que receta, fecha de llenado, fecha de rellenado, fecha de caducidad, número de receta médica, cantidad de medicamento, descripción física e información auxiliar basada en evidencia) no debe predominar sobre la información crítica para el paciente. Esta información menos crítica se debe colocar lejos de las instrucciones de dosificación (p.ej., en la parte inferior de la etiqueta o en otra ubicación menos prominente) puesto que distrae a los pacientes e interfiere con su reconocimiento y entendimiento.
Lenguaje Simplificado El lenguaje de la etiqueta debe ser claro, conciso y familiar, y se debe usar de forma estandarizada. Se deben usar únicamente términos y cláusulas comunes. No se deben usar palabras poco familiares (incluyendo términos en latín) ni jerga médica. No se recomienda el uso de fórmulas o software de legibilidad para simplificar extractos de texto como los presentados en las etiquetas de los medicamentos de venta bajo receta. En su lugar, se deben usar cláusulas simplificadas y estandarizadas, redactadas de tal forma que aseguren el fácil y correcto entendimiento de las instrucciones (mediante retroalimentación obtenida de muestras de diversos consumidores).
Proveer Instrucciones Explícitas Las instrucciones de uso (es decir, la SIG o signatura) deben separar claramente la dosis misma del esquema de administración de cada dosis a fin de transmitir explícitamente el número de unidades de dosificación y el momento en que deben administrarse (p.ej., periodos (partes) específicos del día, tales como la mañana, el medio día, la tarde y antes de acostarse). Las instrucciones deben incluir detalles específicos sobre los periodos de administración. No se deben usar caracteres alfabéticos en lugar de números. Por ejemplo, se debe escribir "Tomar 2 tabletas por la mañana y 2 tabletas por la tarde" en lugar de "Tomar dos tabletas dos veces al día"). Siempre que sea posible, se deben usar instrucciones estandarizadas (p.ej., se debe escribir "Tomar 1 tableta por la mañana y 1 tableta por la tarde" si la prescripción indica b.i.d.). Por lo general, se deben evitar instrucciones ambiguas basadas en intervalos de dosificación tales como dos veces al día o 3 veces al día, o en intervalos por horas tales como cada 12 horas, puesto que dichas instrucciones se consideran implícitas más que explícitas, pueden requerir destreza con los números y la interpretación del paciente puede ser distinta de la intención del médico que expidió la receta. Aunque puede parecer que las instrucciones expresadas en horas específicas (p.ej., 8 a.m. y 1O p.m.) se entienden con más facilidad que las instrucciones ambiguas e implícitas, en realidad son menos fáciles de entender y pueden presentar mayores problemas de seguimiento debido a los patrones de vida de cada individuo, tales como el horario de trabajo, que los intervalos de tiempo más generales como por la mañana, por la tarde, después del desayuno, con el almuerzo, o antes de dormir. El uso uniforme de la misma terminología ayudará a evitar confusiones en los pacientes. Se deben evitar instrucciones ambiguas tales como "tomar según lo indicado" a menos que se proporcionen instrucciones complementarias claras y asesoramiento (p.ej., instrucciones de uso que no quepan en la etiqueta del envase del medicamento de venta bajo receta). La etiqueta del envase debe incluir una indicación clara que refiera al paciente a dichos materiales complementarios.
116 (1 7) Etiquetado de Envases de Medicamentos / Aparatos
USP 39
Incluir el Propósito de Uso Si el propósito del medicamento se incluye en la receta médica, también debe incluirse en la etiqueta del envase del medicamento de venta bajo receta, a menos que el paciente prefiera la omisión del mismo. Se debe preguntar a los pacientes cuáles son sus preferencias al momento de remitir las recetas médicas para dispensar. Los factores de confidencialidad y el uso aprobado por la FDA (p.ej. uso declarado en la etiqueta frente a uso alternativo) pueden restringir la inclusión del propósito en las etiquetas. La evidencia actual respalda la inclusión del propósito de uso en un lenguaje claro y simple (p.ej., "para la presión sanguínea alta" en lugar de "para la hipertensión").
Limitar la Información Auxiliar La información auxiliar que aparezca en la etiqueta del envase del medicamento de venta bajo receta debe basarse en evidencia científica y redactars.e en lenguaje explícito minimizado para evitar distraer a los pacientes con información innecesaria. La mayoría de los pacientes, en particular aquellos con un nivel bajo de alfabetismo, prestan poca atención a la información auxiliar. La información debe presentarse de manera estandarizada y debe ser crítica para que el paciente entienda y use el medicamento de forma segura (p.ej., advertencias y alertas críticas para la administración). Con frecuencia, los pacientes malinterpretan los íconos. Asimismo, los íconos que ofrecen imágenes abstractas para transmitir mensajes que sean difíciles de descifrar pueden ser poco efectivos para promover el entendimiento en comparación con el uso exclusivo de texto simplificado. Deben usarse únicamente aquellos íconos que, basándose en estudios con consumidores, mejoren el entendimiento del paciente sobre su uso correcto. La información auxiliar basada en evidencia, tanto texto como íconos, debe estandarizarse de modo que pueda aplicarse de manera uniforme y que no dependa de la preferencia individual del médico que receta.
Tener en Cuenta el Dominio Limitado del Inglés Cuando sea posible, las instrucciones de uso en la etiqueta del envase del medicamento de venta bajo receta deben proveerse en el idioma preferido del paciente; de otro modo, existiría el riesgo de que los pacientes con un dominio limitado del inglés malinterpretaran las instrucciones, lo cual podría llevar a errores de medicación y resultados adversos para la salud. Además, siempre que sea posible, las instrucciones de uso deben proporcionarse también en inglés a fin de facilitar el asesoramiento; el nombre del medicamento debe estar en inglés para que el personal de emergencia y demás intermediarios tengan rápido acceso a la información. Las etiquetas de los medicamentos de venta bajo receta deben traducirse usando procesos de traducción de alta calidad. A continuación se proporciona un ejemplo de proceso de traducción de alta calidad: • La traducción es realizada por un traductor capacitado cuya lengua materna es el idioma de destino • La revisión de la traducción es realizada por un segundo traductor capacitado quien resuelve cualquier diferencia con el primer traductor • La revisión de la traducción es revisada por un farmacéutico cuya lengua materna es el idioma de destino quien resuelve las diferencias con los traductores previos • Se prueba la comprensión con la audiencia a la que está destinada Cuando no es posible contar con un proceso de traducción de alta calidad, las etiquetas deben imprimirse en inglés y se deben usar los servicios de un intérprete capacitado siempre que sea posible para asegurar la comprensión del paciente. El uso de traducciones generadas por computadora debe limitarse a programas de calidad demostrada debido a que las instrucciones de dosificación pueden carecer de uniformidad y representar riesgos potenciales. La estandarización de las instrucciones traducidas y los avances tecnológicos son necesarios para asegurar la exactitud y seguridad del etiquetado de los envases de medicamentos de venta bajo receta para pacientes con un dominio limitado del inglés.
Mejorar la Legibilidad Las etiquetas deben contar con un diseño y formato que permita su fácil lectura. En la actualidad, no existe evidencia firme que sustente la superioridad en cuanto a legibilidad de los tipos de letra serif frente a los tipos de letra sans serif, por lo que se pueden usar tipos de letra no estrecha de cualquier tipo. Se debe optimizar la tipografía usando las siguientes técnicas: • Impresión en alto contraste (p.ej., impresión en negro sobre fondo blanco). •Tipos de letra familiares, simples y no estrechas con suficiente espacio dentro y entre caracteres (p.ej., Times Roman o Aria!). •Uso de mayúsculas (es decir, siguiendo las reglas del inglés: primera letra en mayúscula seguida de palabras en minúsculas, con excepción de nombres propios). •Tipo de letra grande (p.ej, Times Roman de mínimo 12 puntos o Arial de 11 puntos) para información crítica. Tomar en cuenta que el tamaño de punto no representa el tamaño de letra real, por lo que 2 tipos de letra con el mismo tamaño nominal de punto pueden tener en realidad tamaños de letra distintos. La altura x, que es la altura de la x minúscula del tipo de letra, se ha utilizado como un indicador más exacto del tamaño aparente en lugar del tamaño de punto. Por
USP 39
Aparatos/ (31) Aparatos Volumétricos 11 7
ejemplo, para un tamaño de punto dado, la altura x y el tamaño aparente de Arial son en realidad mayores que las de Times Roman. No usar tipografía menor que Times Roman de 1 O puntos o el tamaño de letra equivalente de otra fuente. Los adultos de mayor edad, particularmente, tienen dificultades para leer impresiones pequeñas. • Usar un espacio en blanco adecuado entre líneas de texto (25%-30% del tamaño de punto). • Usar espacios en blanco para distinguir entre secciones de la etiqueta, tales como instrucciones de uso frente a información de la farmacia. • Usar sólo texto orientado horizontalmente. Existen otras medidas que también pueden mejorar la legibilidad: • De ser posible, minimizar la necesidad de girar el envase para leer líneas de texto. • Nunca truncar o abreviar la información crítica. • El uso de resaltado, negrillas y otras marcas tipográficas deben mantener la legibilidad (p.ej., impresión en alto contraste y color claro para el resaltado) y deben enfatizar la información central para el paciente o aquella información que facilite el seguimiento (p.ej., número de dispensaciones adicionales). • Limitar el número de colores usados para el resaltado (p.ej., no más de uno o dos). • Usar renglones separados para distinguir los tiempos de dosificación. Tener en cuenta los impedimentos visuales: • Ofrecer un acceso alternativo para pacientes con impedimentos visuales (p.ej., sistemas táctiles, auditivos o visuales mejorados que puedan emplear tecnologías de asistencia avanzadas).
Eliminar lo .siguiente:
. . (21). TERMÓMETROS Los dispositivos para medir la temperatura adecuados para las pruebas de la Farmacopea deben ser rastreables y cumplir con las especificaciones de las normas del NIST. Pueden ser de dos tipos: dispositivos de vidrio de columna líquida o dispositivos con indicador de temperatura digital o analógico, como por ejemplo un dispositivo de resistencia, un termistor.o un termopar. Los indicadores de temperatura analógicos o digitales constan de una sonda de temperatUra que contiene un sensor.La sonda está conectada a un medidor que convierte la señal en ohmios o milivoltios en un lectura de temperatura. En este tipo de indicadores, la parte de la sonda de temperatura que se sumerge en el medio para medír su temperatura está fabrh:;adj'il de· un material inerte. La calibración de los indicadores de temperatura analógicos y digitales se realiza con un estándar de temperatura rastreable a las normas NIST, con una frecuencia de ensayo predeterminada. Es sumamente importante seleccionar el dispositivo de medición de temperatura según las condiciones en las que se va a utilizar. Los termómetros de vidrio de columna líquida pueden calibrarse por inmersión total, parcial o completa y, en la medida de lo posible, cada termómetro se debería emplear según las condiciones de inmersión en las que se calibró. Lá calibración de los termómetros se realiza según una frecuencia predeterminada con un estándar de temperatura rastreable a las norrnas NIST. Ver la versión vigente de la norma El de la ASTM (Asociación Estadounidense de Ensayos y Materiales). La calibración de los termómetros de vidrio de columna líquida por inmersión total implica la inmersión del termómetro hasta el extremo superior de la columna líquida dejando el resto de la columna y la cámara de expansión superior expuestas a la temperatura ambi.ente. La calibración de los termómetros por inmersión parcial implica la inmersión hasta la línea de inmersión indicada en el frente del termómetro dejando el resto de la columna expuesta a la temperatura ambiente. La calibración por inmersión completa implica la inmersión de todo el termómetro sin que quede ninguna parte de la columna expuesta a la temperatura ambiente. Si se utilizan otras condiciones de inmersión, es necesario realizar una corrección por columna emergente a fin de obtener lecturas de temperatura correctas .... u5p39
(31) APARATOS VOLUMÉTRICOS La mayoría de los aparatos volumétricos disponibles en los Estados Unidos están calibrados a 20º, a pesar de que la temperatura que predomina en general en los laboratorios se aproxima más a los 25º. Para minimizar el error volumétrico, la temperatura debería ser la misma para los aparatos volumétricos, el material que se está preparando, los disolventes que se utilizan para preparar las soluciones volumétricas, el área en la cual se preparan y el ajuste de volumen final.
118 (31) Aparatos Volumétricos/ Aparatos
USP 39
uso Para lograr el grado de precisión requerido en muchas valoraciones farmacopeicas que incluyen mediciones volumétricas e indican que una cantidad sea "medida con exactitud", los aparatos deben elegirse y usarse con cuidado. El tamaño de una bureta debe ser tal que el volumen de la solución volumétrica no represente menos del 30% del volumen nominal. Cuando se deben medir menos de 1 O mL de solución volumétrica, en general se requiere una bureta de 1O mL o una microbureta.
ESTÁNDARES DE EXACTITUD Las tolerancias de capacidad para los matraces volumétricos, las pipetas de transferencia y las buretas son las mismas aceptadas por el Instituto Nacional de Normas y Tecnología (National lnstitute of Standards and Technology) (Clase A), 1 según se indica en la Tabla 1, la Tabla 2 y la Tabla 3, respectivamente. [NOTA-Las tablas de este capítulo listan las tolerancias para los tamaños de uso más común. Para una lista completa de tolerancias y otros criterios aplicables, consultar las normas referidas de la ASTM.] Usar aparatos volumétricos de Clase A a menos que se especifique algo diferente en la monografía individual. Cuando se especifica un aparato volumétrico de plástico, las tolerancias de capacidad aceptadas son iguales a las del vidrio Clase B. 2 Las tolerancias de capacidad para las pipetas de medición (es decir, graduadas) de hasta 1O mL inclusive, son algo mayores que las tolerancias para las pipetas de transferencia de los mismos tamaños, es decir, 1O µL, 20 µL y 30 µL para las pipetas de 2 mL, 5 mL y 1O mL, respectivamente. Las pipetas calibradas "para verter", graduadas y de transferencia, se deben escurrir en posición vertical y luego apoyar las puntas contra la pared del recipiente receptor para escurrirlas por completo. Las lecturas de volumen en las buretas deberían estimarse con una exactitud de 0,01 mL para buretas de 25 mL y 50 mL, y con una exactitud de 0,005 mL para buretas de 5 mL y 1O ml. Las pipetas calibradas "para contener" se utilizan en casos especiales, generalmente para medir líquidos viscosos, como jarabes; sin embargo, se puede usar un matraz volumétrico en lugar de una pipeta "para contener". En tales casos, la pipeta o el matraz debería lavarse después del vaciado y los lavados agregarse a la porción medida. Tabla 1. Matraces Volumétricos Volumen nominal, mL
10
25
50
100
250
500
1000
Límite de error, mL
0,02
0,03
0,05
0,08
0,12
0,20
0,30
Límite de error, %
0,20
0,12
0,10
0,08
0,05
0,04
0,03
Tabla 2. Pipetas de Transferencia Volumen nominal, mL
1
2
5
10
25
50
100
Límite de error, mL
0,006
0,006
0,01
0,02
0,03
0,05
0,08
Límite de error, %
0,60
0,30
0,20
0,20
0,12
0,10
0,08
Tabla 3. Buretas Volumen nominal, mL
1 O (tipo "micro")
25
50
Subdivisiones, mL
0,02
0,1
0,1
Límite de error, mL
0,02
0,03
0,05
(41 ) BALANZAS Este capítulo establece los requisitos para balanzas que se usan para materiales que deben ser pesados con exactitud (ver y Requisitos Generales, 8.20). A menos que se especifique algo diferente, cuando las sustancias deban ser "pesadas con exactitud", la pesada se debe realizar usando una balanza que esté calibrada dentro de su intervalo operativo y que cumpla con los requisitos de repetibilidad y exactitud definidos. Para balanzas que se usan en otras aplicaciones, su repetibilidad y exactitud deben valorarse junto con los requisitos para su uso. Con respecto a los principios teóricos de estos requisitos, ver Pesada en una Balanza Analítica (1251 ), ya que puede ser una fuente útil, aunque no obligatoria. Advertencias
REPETIBILIDAD La repetibilidad se evalúa pesando una pesa de prueba no menos de 1O veces. [NOTA-La pesa de prueba debe estar dentro del intervalo operativo de la balanza, pero no es necesario que la pesa esté calibrada. Debido a que, dentro de la capacidad de 1
Ver
2 Ver
ASTM 288-06, ASTM E287-02, ASTM El 189-00 y ASTM E969-02. ASTM E 288 y Estándar ISO 384.
USP 39
Pruebas Microbiológicas/ (51) Pruebas de Eficacia Antimicrobiana 119
la balanza la desviación estándar es prácticamente independiente de la masa de muestra, no se requiere usar un peso de prueba pequeño, ya que éste podría resultar difícil de manejar.] La repetibilidad es satisfactoria si el doble de la desviación estándar del valor pesado dividido por el peso neto más pequeño deseado (es decir, el peso neto más pequeño que Jos usuarios planean usar en esa balanza) no excede de 0, 10%. Si la desviación estándar obtenida es menos de 0,41 d, donde des el menor intervalo de la escala, reemplazar la desviación estándar con 0,41 d. En este caso, la repetibilidad es satisfactoria si 2 x 0,41 d, dividido por el peso neto más pequeño deseado, no excede de 0,10%.
EXACTITUD La exactitud de una balanza es satisfactoria si su valor de pesada, cuando se prueba con pesas adecuadas, está dentro del 0, 10% del valor del peso de prueba. Una pesa de prueba es adecuada cuando tiene una masa entre 5% y 100% de la capacidad de la balanza. El error máximo permisible de la pesa de prueba (emp), o alternativamente, la incertidumbre en la calibración de la pesa no debe ser más de un tercio del límite de exactitud para Ja prueba. [NOTA-Las siguientes normas son aplicables: ASTM E617 (disponible en http://www.astm.org) y OIML R 111 (disponible en http://www.oiml.org).]
Pruebas Microbiológicas (51) PRUEBAS DE EFICACIAANTIMICROBIANA INTRODUCCIÓN Los conservantes antimicrobianos son sustancias agregadas a productos farmacéuticos acuosos. Las formas farmacéuticas no estériles pueden tener conservantes agregados para protegerlas del desarrollo de microorganismos introducidos inadvertidamente durante o después del proceso de fabricación. En el caso de artículos estériles envasados en envases multidosis, los conservantes antimicrobianos se agregan para inhibir el desarrollo de microorganismos que puedan introducirse por la extracción reiterada de dosis individuales. En todas las unidades multidosis estériles se espera encontrar uno o más conservantes antimicrobianos. Los conservantes antimicrobianos no deben emplearse en lugar de las buenas prácticas de fabricación, solamente para reducir la población microbiana viable de un producto no estéril, o para controlar la biocarga antes de la esterilización de formulaciones multidosis durante la fabricación. Los conservantes antimicrobianos de las formas farmacéuticas farmacopeicas cumplen con los requisitos en 5.20 Sustancias Agregadas de las Advertencias y Requisitos Generales. Todos los agentes antimicrobianos útiles son sustancias tóxicas. Para la máxima protección de los pacientes, la concentración del conservante que se indique como eficaz en el producto envasado final debe ser inferior al nivel que pueda resultar tóxico para los seres humanos, basándose en la dosis recomendada del producto medicinal. La concentración de un conservante antimicrobiano agregado puede mantenerse al mínimo si los ingredientes activos de la formulación poseen actividad antimicrobiana intrínseca. La eficacia antimicrobiana, ya sea inherente al producto o producida por la adición de un conservante antimicrobiano, debe ser demostrada para todas las inyecciones envasadas en envases multidosis o para otros productos que contengan conservantes antimicrobianos. La eficacia antimicrobiana debe ser demostrada para formas farmacéuticas de base acuosa, multidosis tópicas y orales, y para otras formas farmacéuticas, como por ejemplo oftálmicas, óticas, nasales, de irrigación y líquidos de diálisis (ver Formas Farmacéuticas (1151 )). Para los propósitos de la prueba, "acuoso" se define como una actividad de agua de más de 0,6 (ver Determinación de Actividad de Agua en Productos Farmacéuticos No Estériles (1112)). Los organismos de desafío se basan generalmente en los posibles contaminantes del producto farmacéutico, teniendo en cuenta los atributos físicos, Ja formulación y el uso previsto del mismo. La serie de organismos de desafío estándar descrita en esta prueba no necesita prevenir la inclusión de otras especies, si se considera útil para medir la actividad biológica de los conservantes de un producto específico. Estos organismos de desafío suplementarios no se discuten en este capítulo, pero se pueden añadir a los organismos de prueba descritos.
120 (51) Pruebas de Eficacia Antimicrobiana /Pruebas Microbiológicas
USP 39
PROCEDIMIENTOS GENERALES Este capítulo proporciona procedimientos para demostrar la eficacia de conservantes antimicrobianos agregados. Estos conservantes antimicrobianos deben estar declarados en la etiqueta. Los procedimientos y los criterios de aceptación para la eficacia se aplican a un producto en el envase original sellado en el que fue distribuido por el fabricante (ver la Tabla 7 para categorías de productos). Esta prueba no tiene que realizarse en estos envases, pero se debe evitar el uso de materiales que puedan interaccionar con el conservante en los envases que se usan para la prueba de eficacia microbiana.
Procedimiento de Promoción del Crecimiento y Aptitud del Método de Recuperación CONSIDERACIONES GENERALES Debe establecerse la capacidad del procedimiento para detectar microorganismos de desafío en presencia de un producto a examinar adecuadamente neutralizado. La aptitud del procedimiento debe volver a confirmarse si se produce algún cambio en los materiales o métodos, el producto o los materiales que están en contacto directo con el producto y que pueda alterar los resultados de la prueba. Debe establecerse la capacidad promotora del crecimiento de los medios usados en este procedimiento. PREPARACIÓN DE CEPAS DE PRUEBA Usar suspensiones estandarizadas de cepas de prueba o preparar según se indica a continuación. Las técnicas de mantenimiento de cultivos de lote de siembra (sistemas de lote de siembra) se usan para que los microorganismos viables empleados para inoculación correspondan a no más de cinco pasajes desde el lote de siembra maestro original. Cultivar por separado cada cepa bacteriana y fúngica de prueba (ver la Tabla 2). Usar los cultivos de los siguientes microorganismos: 1 Candida albicans (ATCC Nº 10231 ), Aspergillus brasiliensis (ATCC Nº 16404), Escherichia coli (ATCC Nº 8739), Pseudomonas aeruginosa (ATCC Nº 9027) y Staphylococcus aureus (ATCC Nº 6538). Los microorganismos viables empleados en el procedimiento deben formar parte de un cultivo de crecimiento reciente (p.ej., en fase logarítmica de crecimiento) a excepción de las esporas A. brasiliensis. Se describen las condiciones de cultivo para el inóculo (ver la Tabla 2) donde los medios adecuados son el Agar Digerido de Caseína y Soja o Medio de Agar Sabouraud Dextrosa. Para cosechar los cultivos bacterianos y de C. albicans, emplear solución salina SR estéril, lavar la superficie de crecimiento y recogerlo en un recipiente adecuado. Para cosechar las esporas de A. brasiliensis, usar solución salina SR estéril que contenga 0,05% de polisorbato 80. La suspensión de esporas debe tratarse asépticamente (p.ej., filtración a través de lana de vidrio estéril) para eliminar hitas. Todas las suspensiones microbianas deben prepararse para garantizar que no se produce un traslado de medio de crecimiento residual del inóculo (p.ej., centrifugación seguida de resuspensión en un líquido de suspensión estéril apropiado). Como alternativa, los organismos del cultivo madre pueden crecer en un medio líquido adecuado (es decir, Caldo Digerido de Caseína y Soja o Caldo Sabouraud Dextrosa) y las células se pueden cosechar mediante centrifugación, luego lavar y resuspender en líquido de suspensión estéril apropiado. Las suspensiones microbianas que se usan para inoculaciones deben ajustarse para obtener un recuento microbiano de aproximadamente 1 x 108 ufc/mL. Usar las suspensiones bacterianas y de levaduras dentro de las 2 horas o dentro de las 24 horas, si se almacenan entre 2º y 8º. Se puede preparar una suspensión de esporas estable y mantenerla a 2º-8º hasta 7 días. [NOTE-El cálculo estimado de la concentración del inóculo se puede obtener mediante procedimientos turbidimétricos para los microorganismos de desafío y luego confirmarse mediante un recuento en placa.] PROMOCIÓN DEL CRECIMIENTO DE LOS MEDIOS Los medios usados en este procedimiento deben ser capaces de permitir el crecimiento microbiano. Analizar cada partida de medio listo para usar y cada partida de medio preparado a partir de medio deshidratado o de los ingredientes descritos. Para medios sólidos, los recuentos obtenidos deben ser al menos 50% del valor calculado para un inóculo estandarizado. Para un inóculo recientemente preparado, se produce un crecimiento de microorganismos comparable al obtenido anteriormente con una partida de medio analizada y aprobada previamente.
Aptitud del Método de Recuento en Presencia del Producto Preparar una dilución 10-1 (en volumen) agregando 1 mL del producto a 9 mL de solución salina u otro diluyente neutralizante. Continuar este patrón de dilución hasta niveles de dilución 10-2 y 1 Q-3. Agregar un número apropiado de organismos de desafío a cada tubo de producto diluido, mezclar y sembrar en placa un volumen adecuado de cada dilución para obtener
1
Disponible en American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209 (http://www.atcc.org).
USP 39
Pruebas Microbiológicas/ (51) Pruebas de Eficacia Antimicrobiana 121
menos de 250 ufc/placa para bacterias y levaduras (idealmente entre 25 y 250 ufc) o menos de 80 ufc/placa para A. brasiliensis (idealmente entre 8 y 80 ufc). Esta siembra en placa debe realizarse como mínimo por duplicado (aunque un número mayor de repeticiones puede ser útil para minimizar la variabilidad en la estimación del recuento en placa). Se realiza un control positivo de este procedimiento al introducir los mismos inóculos en solución salina y transferir volúmenes similares de solución salina a placas de agar. Un patrón de recuperación adecuado es aquél que proporciona al menos 50% del recuento de esta solución salina de control (promediado). Si el producto diluido presenta propiedades antimicrobianas, quizás deban incorporarse neutralizadores específicos a los diluyentes o a los medios de recuperación. Para más información, ver Validación de Recuperación Microbiana en Artículos Farmacopeicos (1227). La capacidad del procedimiento para medir la eficacia de los conservantes puede verse comprometida si la aptitud del método requiere una dilución significativa (10- 2 ó 1Q-3), ya que esto afectará la recuperación medida (p.ej., puede ser difícil medir una reducción logarítmica de 3 unidades para un inóculo de 1Q5-106 ). Si no se encuentra un agente neutralizador o método adecuado y la aptitud del método requiere una dilución significativa, se puede usar un nivel más alto de inóculo (p.ej., 107108 ) de manera que se pueda medir una reducción logarítmica de 3 unidades. El promedio de la recuperación informada no puede ser menos de 1 ufc/placa (o 100 ufc/mL si se realiza el recuento en placa de 1 mL por duplicado a una dilución de 1 Q-2). La filtración por membrana se puede usar para filtrar volúmenes más grandes de diluciones para contrarrestar esta dificultad o para asistir en la neutralización de las propiedades antimicrobianas.
Análisis del Producto CATEGORÍAS DE PRODUCTOS Para los fines de análisis, los artículos farmacopeicos se dividen en cuatro categorías (ver la Tabla 7). Los criterios de eficacia antimicrobiana para estos productos se establecen en función de la ruta de administración. Es de esperar que las formulaciones que contienen conservantes cumplan con los estándares mínimos de eficacia, si están envasados en envases multidosis o en envases unitarios. Tabla 1. Categorías de Productos Farmacopeicos Categoría
Descripción del Producto
1
Inyectables, otros parenterales incluyendo emulsiones, productos áticos, productos nasales estériles y productos oftálmicos preparados con bases o vehículos acuosos
2
Productos empleados de manera tópica preparados con bases o vehículos acuosos, productos nasales no estériles y emulsiones, incluyendo aquéllos que se aplican a membranas mucosas
3
Productos orales a excepción de antiácidos, preparados con bases o vehículos acuosos
4
Antiácidos preparados con una base acuosa
PROCEDIMIENTO El procedimiento puede realizarse ya sea en cinco envases originales, si hay suficiente volumen de producto disponible en cada envase y si el envase del producto puede ser penetrado asépticamente (es decir, aguja y jeringa a través de un tapón de goma elastomérico), o en cinco recipientes bacteriológicos estériles con tapa [inerte con respecto a los agentes antimicrobianos] de tamaño adecuado a los que se ha transferido un volumen suficiente de producto. Inocular cada envase o recipiente, según corresponda, con uno de los inóculos preparados y normalizados, y mezclar. El volumen de suspensión del inóculo empleado está entre 0,5% y 1,0% del volumen del producto para minimizar los efectos potenciales en el producto. La concentración de microorganismos de prueba agregados al producto (Categoría 7; 2 ó 3) es tal que la concentración final de la preparación de prueba después de la inoculación está comprendida entre 1 x 105 y 1 x 106 ufc/mL del producto. En los productos de la Categoría 4 (antiácidos), la concentración final de la preparación de prueba después de la inoculación está comprendida entre 1 x 1Q3y1 x 104 ufc/mL del producto. La concentración inicial de microorganismos viables en cada preparación de prueba se calcula a partir de la concentración de microorganismos en cada inóculo normalizado determinada mediante el método de recuento en placa. Incubar los envases o recipientes inoculados a 22,5 ± 2,5º. Tomar muestras de cada uno de ellos en los intervalos apropiados (especificados en la Tabla 3). Registrar todos los cambios de apariencia observados en estos intervalos. Determinar mediante el procedimiento de recuento en placa el número de ufc presentes en cada preparación de prueba en los intervalos correspondientes (ver Procedimientos Generales en Pruebas de Recuento Microbiano (61 )). El recuento en placa se realizará usando un mínimo de placas por duplicado, con el número de ufc promediado antes de la determinación de ufc/mL deducido. Si se usa filtración por membrana, usar filtros de membrana por duplicado para cada estimación. Usando las concentraciones calculadas de ufc/mL presentes al inicio de la prueba, calcular el cambio en valores log 10 de la concentración de ufc/mL para cada microorganismo en los intervalos de prueba aplicables, y expresar los cambios en la concentración en términos de reducciones logarítmicas. La reducción logarítmica se define como la diferencia entre el valor de la concentración inicial de ufc/mL en la suspensión, en unidades logw y el valor de ufc/mL, en unidades log 10, de los sobrevivientes al tiempo correspondiente.
122 (51) Pruebas de Eficacia Antimicrobiana / Pruebas Microbiológicas
USP 39
Tabla 2. Condiciones de Cultivo para la Preparación de lnóculos
Organismo
Escherichia coli (ATCC Nº 8739)
Pseudomonas aeruginosa (ATCC Nº 9027)
Staphylococcus aureus (ATCC Nº 6538)
Candida albicans (ATCC Nº 10231)
Aspergillus brasiliens (ATCC Nº 16404)
Temperatura de Incubación
Tiempo de Incubación del lnóculo
Tiempo de Incubación de Recuperación Microbiana
Caldo Digerido de Caseína y Soja; Agar Digerido de Caseína y Soja
32,5 ± 2,5º
18-24 horas
3-5 días
Caldo Digerido de Caseína y Soja; Agar Digerido de Caseína y Soja
32,5 ± 2,5°
18-24 horas
3-5 días
Caldo Digerido de Caseína y Soja; Agar Digerido de Caseína y Soja
32,5 ± 2,5°
18-24 horas
3-5 días
Medio de Agar Sabouraud Dextrosa; Caldo Sabouraud Dextrosa
22,5 ± 2,5°
44-52 horas
3-5 días
Agar Sabouraud Dextrosa; Caldo Sabouraud Dextrosa
22,5 ± 2,5°
6-10 días
3-7 días
Medio Apropiado
Criterios de Eficacia Antimicrobiana Los requisitos de eficacia antimicrobiana se alcanzan si se cumplen los criterios especificados en la Tabla 3 (ver Resultados de Pruebas en Advertencias Generales). La expresión "ningún incremento" en los recuentos se define como no más de 0,5 unidades log 10 por encima del valor con el que se compara. Tabla 3. Criterios para los Microorganismos Evaluados En productos de la Categoría 1 A los 7 días, una reducción logarítmica de no menos de 1,0 desde el recuento inicial calculada; a los 14 días, una reducción logarítmica de no menos de 3,0 del recuento inicial; y a los 28 días ningún incremento con respecto al recuento de los 14 días.
Bacterias Levaduras y Hongos Filamentosos
Ningún incremento a los 7, 14 y 28 días con respecto al recuento inicial En productos de la Categoría 2 A los 14 días, una reducción logarítmica de no menos de 2,0 desde el recuento inicial; a los 28 días ningún incremento con respecto al recuento de los 14 días
Bacterias Levaduras y Hongos Filamentosos
y
Ningún incremento a los 14 y 28 días con respecto al recuento inicial En productos de la Categoría 3 A los 14 días, una reducción logarítmica de no menos de 1,0 desde el recuento inicial; a los 28 días ningún incremento con respecto al recuento de los 14 días
Bacterias Levaduras y Hongos Filamentosos
y
Ningún incremento a los 14 y 28 días con respecto al recuento inicial En productos de la Categoría 4
Bacterias, Levaduras y Hongos Filamentosos
Ninqún incremento a los 14 y 28 días con respecto al recuento inicial
(55) INDICADORES BIOLÓGICOS-PRUEBAS DE RESISTENCIA RECUENTO TOTAL DE ESPORAS VIABLES Para indicadores biológicos en portador de papel, retirar tres muestras del indicador biológico pertinente de sus envases individuales originales. Desmenuzar el papel hasta reducirlo a las fibras que lo componen colocando las muestras de prueba en un vaso estéril de 250 mL de un mezclador adecuado que contenga 100 mL de Agua Purificada esterilizada y enfriada, y mezclando durante el tiempo que se considere adecuado para obtener una suspensión homogénea. No es inusual que se requieran tiempos de mezclado de 15 minutos o más para obtener una recuperación óptima. Transferir a un tubo estéril de 16 mm x 125 mm con tapa de rosca una alícuota de 1O mL de la suspensión. Si se trata de un Indicador Biológico para Esterilización por Vapor, Portador de Papel, calentar el tubo que contiene la suspensión en un baño de agua de 95º a 100º durante 15 minutos
USP 39
PruebGs Microbiológicas/ (55) Indicadores Biológicos 123
(choque térmico), comenzando a medir el tiempo cuando la temperatura alcanza los 95º. Si se trata de un Indicador Biológico para Esterilización por Calor Seco, Portador de Papel y de un Indicador Biológico para Esterilización con Óxido de Etileno, Portador de Papel, calentar el tubo que contiene la suspensión en un baño de agua de 80º a 85º durante 1 O minutos, comenzando a medir el tiempo cuando la temperatura de la suspensión de esporas alcance los 80º. Enfriar rápidamente en un baño de hielo-agua de Oº a 4º. Transferir a tubos adecuados dos alícuotas de 1 mL y hacer diluciones seriadas apropiadas en Agua Purificada estéril; las diluciones se seleccionan por medio de cálculos de manera que se obtengan preferentemente entre 30 y 300 colonias, pero no menos de 6, en cada una de las placas del par cuando se tratan según se describe a continuación. Cuando el indicador biológico tiene una concentración baja de esporas, puede ser necesario modificar la serie de diluciones y usar más placas en cada dilución. Preparar una serie independiente de placas para cada alícuota. Colocar 1,0 mL de cada dilución seleccionada en cada placa de un par de placas de Petri de 15 mm x 100 mm. En un plazo de 20 minutos, agregar a cada placa 20 mL de Medio Agar con Digerido de Caseína y Soja que se haya fundido y enfriado a una temperatura entre 45º y 50º. Agitar por rotación suave para obtener una suspensión homogénea y dejar solidificar. Incubar las placas en posición invertida a una temperatura entre 55º y 60º para el Indicador Biológico para Esterilización por Vapor, Portador de Papel, y a una temperatura entre 30º y 35º para el Indicador Biológico para Esterilización con Óxido de Etileno, Portador de Papel y para el Indicador Biológico para Esterilización por Calor Seco, Portador de Papel, o a la temperatura de recuperación óptima especificada por el fabricante. Examinar las placas después de transcurridas 24 y 48 horas, registrando el número de colonias para cada placa, y usar el número de colonias observado después de 48 horas para calcular los resultados. Calcular el número promedio de esporas por muestra a partir de los resultados, usando el factor de dilución apropiado. La prueba es válida si el logaritmo del número de esporas por portador a las 48 horas es igual o mayor que el logaritmo del número después de 24 horas en cada caso. Para Indicador Biológico para Esterilización por Vapor, Autocontenido, extraer asépticamente los tres portadores del envase y proceder según se indica en Indicador Biológico para Esterilización por Vapor, Portador de Papel. Para Indicadores Biológicos para Esterilización por Calor Húmedo, Calor Seco y Gases, Portadores Diferentes al Papel, retirar asép-
ticamente los tres portadores de su empaque o envase original. Colocar cada portador en un recipiente estéril apropiado que contenga 100 mL de Agua Purificada enfriada y someter a ultrasonido o agitar en un agitador de vaivén durante un tiempo apropiado. Para una recuperación óptima se pueden requerir 15 minutos o más. Se debe llevar a cabo un estudio previo que garantice que el método de recuperación produzca como resultado una recuperación de por lo menos 50% a 300% del recuento viable de esporas declarado. Transferir a un tubo estéril de 16 mm x 125 mm con tapa de rosca una alícuota de 1O mL de la suspensión. Calentar los tubos que contienen suspensiones de Bacillus atrophaeus, Bacillus subtilis y Bacillus coagulans entre 80º y 85º durante 1 O minutos. Calentar los tubos que contienen una suspensión de Geobacillus stearothermophilus entre 95º y 100º durante 15 minutos. Comenzar a medir el tiempo cuando se alcance la temperatura más baja de los intervalos indicados. Enfriar rápidamente en un baño de hielo-agua de Oº a 4º. Transferir dos alícuotas de 1 mL a tubos adecuados y hacer diluciones seriadas apropiadas en Agua Purificada. Las diluciones seleccionadas deben ser aquellas que preferiblemente rindan entre 30 y 300 colonias, pero no menos de 6, en cada par de placas cuando se traten según se describe a continuación. Cuando el indicador biológico tiene una concentración baja de esporas, puede ser necesario modificar la serie de diluciones y usar más placas en cada dilución. Preparar una serie independiente de placas para cada alícuota. Colocar 1,0 mL de cada dilución seleccionada en cada placa de un par de placas de Petri de 15 mm x 100 mm. En un plazo de 20 minutos, agregar la alícuota a cada placa conteniendo 20 mL de agar que se haya fundido y enfriado a una temperatura entre 45º y 50º. Agitar por rotación suave para obtener una suspensión homogénea. Para G. stearothermophilus, B. atrophaeus, B. subtilis y B. coagulans, usar Medio de Agar Digerido de Caseína y Soja, e incubar las placas aeróbicamente en posición invertida a las siguientes temperaturas respectivas para cada microorganismo: de 55º a 60º, de 30º a 35º y de 48º a 52º, o a la temperatura óptima especificada por el fabricante del indicador biológico. Examinar las placas después de transcurridas 24 y 48 horas. Registrar el número de colonias observado en cada placa. Calcular el número promedio de esporas por portador a partir de los resultados, usando el factor de dilución apropiado. La prueba es válida si el logaritmo del número de esporas por portador a las 48 horas es igual o mayor que el logaritmo del número después de 24 horas en cada caso. Para Indicadores Biológicos para Esterilización por Calor Húmedo, Calor Seco y Gases, Suspensiones Líquidas de Esporas, usando G. stearothermophilus, B. atrophaeus, B. subtilis y B. coagulans como indicadores biológicos, preparar una dilución seriada apropiada de la suspensión original de esporas en Agua Purificada enfriada contenida en un tubo estéril de 16 mm x 125 mm con tapa de rosca y efectuar los procedimientos de recuentos de esporas viables especificados en Indicadores Biológicos para Esterilización por Calor Húmedo, Calor Seco y Gases, Portadores Diferentes al Papel.
DETERMINACIÓN DEL VALOR D Efectuar todas las pruebas descritas en esta sección bajo condiciones asépticas, usando equipo estéril para microorganismos no termofílicos. La determinación del Valor D para G. stearothermophilus y B. coagulans se puede realizar en un ambiente controlado pero no clasificado.
Aparatos El equipo de prueba para la determinación de la resistencia microbiana se describe en detalle en la norma ISO 18472, Sterilization of Hea/th Care Products-Biologica/ and Chemical lndicators-Test Equipment (Esterilización de Productos para el Cuidado de
124 (55) Indicadores Biológicos / Pruebas Microbiológicas
USP 39
la Salud-Indicadores Biológicos y Químicos-Equipo de Prueba). 1 Los detalles de los Resistómetros para Evaluación de Indicadores Biológicos (BIER, por sus siglas en inglés) individuales varían según su diseño y el proceso de esterilización particular con el que se usan conjuntamente. Siempre y cuando el desempeño del BIER cumpla con los requisitos de la norma ISO para exposición del indicador biológico, se aceptan diferencias en el diseño.
Procedimiento Realizar las pruebas del valor D para cada set de condiciones de esterilización aplicable según indique la etiqueta del indicador biológico envasado en análisis. Tomar un número suficiente de grupos de muestras de indicadores biológicos en sus envases individuales originales, constando cada grupo de no menos de 5 muestras. El número de grupos proporciona un intervalo de observaciones desde no menos de un valor D declarado por debajo del tiempo de supervivencia declarado, hasta no menos de un valor D declarado por encima del tiempo de muerte declarado. Colocar cada grupo en portamuestras separados adecuados que permitan exponer cada muestra a la condición de esterilización indicada en una ubicación específica en la cámara de esterilización del BIER. Controlar los parámetros de funcionamiento del aparato BIER, usando portamuestras sin muestras. Seleccionar una serie de tiempos de esterilización en incrementos a partir del menor tiempo para las muestras a analizar. Las diferencias en los tiempos de esterilización a lo largo de las series son tan constantes como sea posible y la diferencia entre los tiempos adyacentes no es mayor de 75% del valor D declarado. Los procedimientos de prueba para el uso de resistómetros BIER en la evaluación de la resistencia microbiana se definen en una serie de normas ISO bajo la serie 11138.2, 3, 4, s Se debe seguir la norma apropiada para el indicador biológico. Los métodos de prueba y los portadores usados con el BIER se pueden adaptar a las características específicas del indicador biológico. El método y aparatos usados para portadores de papel pueden diferir de los de otros portadores y serán sustancialmente diferentes de los usados para suspensiones de indicadores biológicos. Las condiciones de exposición para el valor D de portadores de materiales alternativos son iguales a las condiciones usadas para determinar el valor D de portadores de papel. Si la etiqueta del fabricante permite el uso del portador de indicador biológico con múltiples métodos de esterilización, entonces los datos sobre el valor D, tiempo de supervivencia y tiempo de muerte tendrán que ser proporcionados por el fabricante para cada método de esterilización. Es posible que los indicadores biológicos inoculados en portadores distintos de los de papel se usen para métodos de esterilización y descontaminación por gas o vapor tales como dióxido de cloro y peróxido de hidrógeno en fase de vapor. Las condiciones físicas estándar para la evaluación de indicadores biológicos para uso con dióxido de cloro o peróxido de hidrógeno en fase de vapor no han sido definidos. En el caso de dióxido de cloro, la concentración del gas, la humedad relativa y la temperatura son condiciones críticas del control del proceso que se pueden medir con exactitud. El fabricante de los indicadores biológicos comercializados para uso con dióxido de cloro debería declarar las condiciones bajo las cuales se llevó a cabo la determinación del valor D en forma tal que el usuario pueda, cuando menos, discernir la resistencia de un lote de indicadores biológicos en comparación con sus propias condiciones de uso anticipadas. La situación con el peróxido de hidrógeno en fase de vapor es más compleja. Diversos fabricantes de equipos han propuesto diferentes condiciones de descontaminación o esterilización. Por esa razón, no existe un proceso estándar para efectuar la descontaminación o esterilización de superficie con peróxido de hidrógeno en fase de vapor. Como consecuencia, no existen métodos industriales estándar de evaluación de indicadores biológicos para peróxido de hidrógeno en fase de vapor y se ha informado que podría no haber una correlación directa entre la concentración de vapor y la velocidad o incluso la eficacia de inactivación del indicador biológico. Adicionalmente, resulta difícil evaluar con exactitud la humedad relativa, que a menudo se define como un parámetro crítico para el proceso, en presencia de peróxido de hidrógeno en forma de vapor. Por estas razones es preferible considerar la resistencia de los indicadores biológicos como una medida relativa o comparativa del fabricante, más que como un verdadero valor D. Por lo tanto, dependiendo del equipo y de los procesos empleados, podría ser imposible para un usuario final duplicar las pruebas de resistencia del indicador biológico efectuadas por el fabricante. Para Indicadores Biológicos para Esterilización por Calor Húmedo, Calor Seco y Gases, Suspensiones Líquidas de Esporas efectuar las determinaciones del valor D para cada uno de los microorganismos que se proporcionan como una suspensión líquida de
1 ANSl/AAMl/ISO 18472:2006, Sterilization of Health Care Products-Biological and Chemical lndicators-Test Equipment (Esterilización de Productos para el Cuidado de la Salud-Indicadores Biológicos y Químicos-Equipo de Prueba). Association far the Advancement of Medica( lnstrumentation (AAMI), 111 O N. Glebe Road, Suite 220, Arlington, VA 22201-4795 2 ANSl/AAMl/ISO 11138-1 :2006, Sterilization of Health Care Products-Biological lndicators-Part 1: General requirements, 2nd ed. (Esterilización de Productos de Salud-Indicadores Biológicos-Parte 7: Requisitos generales, 2º ED.). Association far the Advancement of Medica! lnstrumentation (AAMI), 111 ON. Glebe Road, Suite 220, Arlington, VA. 3 ANSl/AAMl/ISO 11138-2:2006, Sterilization of Health Care Products-Biological lndicators-Part 2: Biological lndicators far Ethylene Oxide Sterilization Processes, 3rd ed. (Esterilización de Productos para el Cuidado de la Salud-Indicadores Biológicos-Parte 2: Indicadores Biológicos para Procesos de Esterilización con Óxido de Etileno, 3º Ed.) Association far the Advancement of Medica! lnstrumentation (AAMI), 111 ON. Glebe Road, Suite 220, Arlington, VA. 4 ANSl/AAMl/ISO 11138-3:2006, Sterilization of Health Care Products-Biological lndicators-Part 3: Biological lndicators far Moist Heat Sterilization Processes. (Esterilización de Productos para el Cuidado de la Salud-Indicadores Biológicos-Parte 3: Indicadores Biológicos para Procesos de Esterilización por Calor Húmedo.) Association far the Advancement of Medical lnstrumentation (AAMI), 111 ON. Glebe Road, Suite 220, Arlington, VA. 5 ANSl/AAMl/ISO 11138-4:2006, Sterilization of Health Care Products-Biological lndicators-Part 4: Biological lndicators far Dry Heat Sterilization Processes. (Esterilización de Productos para el Cuidado de la Salud-Indicadores Biológicos-Parte 4: Indicadores Biológicos para Procesos de Esterilización por Calor Seco.) Association far the Advancement of Medica! lnstrumentation (AAMI), 111 ON. Glebe Road, Suite 220, Arlington, VA.
USP 39
Pruebas Microbiológicas/ (55) Indicadores Biológicos 125
esporas. La prueba se efectúa usando diluciones seriadas apropiadas basadas en el título declarado de esporas de la suspensión en Agua Purificada en un tubo estéril. Cuando la suspensión se coloca sobre o en un sustrato como un tapón elastomérico o un producto formulado, su resistencia puede diferir de la determinada en Agua Purificada. La diferencia puede ser significativa para el uso de indicadores biológicos y las medidas apropiadas hechas antes del uso en actividades de validación de la esterilización.
Recuperación Después de completar el procedimiento de esterilización para el Indicador Biológico para Esterilización por Calor Seco, Portador de Papel, el Indicador Biológico para Esterilización con Óxido de Etileno, Portador de Papel o el Indicador Biológico para Esterilización por Vapor, Portador de Papel, según corresponda y dentro de un tiempo determinado no mayor de 4 horas, retirar asépticamente cada tira y agregarla a un medio apropiado (ver Medios en Pruebas de Esterilidad (71 >) para sumergir el indicador biológico por completo en un tubo adecuado. Para cada muestra del Indicador Biológico para Esterilización por Vapor, Autocontenido, se sumerge la tira de papel en el medio autocontenido según las instrucciones del fabricante, dentro de un tiempo determinado no mayor de 4 horas. Incubar cada tubo a la temperatura óptima de recuperación especificada por el fabricante. Observar cada tubo con medio inoculado a intervalos apropiados durante un total de 7 días después de la inoculación. (Cuando se observa crecimiento en cualquier momento de la observación en particular, se puede suspender la incubación de dicha muestra.) Tomar nota del número de muestras que no presentan evidencia de crecimiento en ningún momento. Para Indicadores Biológicos para Esterilización por Calor Húmedo, Calor Seco y Gases, Portadores Diferentes al Papel, la recuperación de esporas de los portadores de indicador biológico seguirá los procedimientos de recuperación descritos en Recuento Total de Esporas Viables. Los métodos de determinación del valor D para indicadores biológicos en portador de papel se pueden usar para calcular el valor D de portadores diferentes al papel. Las condiciones de incubación para los microorganismos que se pueden usar para indicadores biológicos en portadores diferentes al papel se describen en la sección Recuento Total de Esporas Viables. Para Indicadores Biológicos para Esterilización por Calor Húmedo, Calor Seco y Gases, Suspensiones Líquidas de Esporas, los métodos de recuperación después de la exposición a las condiciones de esterilización son aquellos descritos en la sección Recuento Total de Esporas Viables para suspensiones líquidas y cuando se hace una determinación del valor D por calor seco a partir de suspensiones de B. atrophaeus, se siguen los mismos procedimientos de recuperación descritos en Indicador Biológico para Esterilización por Vapor, Portador de Papel. Cuando se usa C. sporogenes como indicador biológico, los métodos para la preparación e inoculación, así como los métodos y medios de recuperación, deben adaptarse al uso de este formador de esporas anaeróbico.
Cálculos La determinación de los valores D de los indicadores biológicos se puede efectuar usando el Método de Spearman-Karber Limitado, el Método de la Curva de Supervivencia o los procedimientos de Stumbo-Murphy-Cochran. 6, 7, 8 Para determinar los valores D, es preferible usar el mismo método definido por el fabricante del indicador biológico. El uso de un método distinto puede producir diferencias que son más un artefacto del método que una variación en el desempeño del indicador biológico.
Tiempo de Supervivencia y Tiempo de Muerte Tomar dos grupos, cada uno integrado por 1O muestras del indicador biológico pertinente, en sus envases individuales originales. Colocar las muestras de un grupo en un portamuestras adecuado que permita exponer cada muestra a las condiciones de esterilización en una ubicación específica en la cámara BIER. Exponer las muestras durante el tiempo de supervivencia requerido, ingresar a la cámara y retirar los portamuestras con las 1O muestras. Repetir el procedimiento anterior inmediatamente, o precalentar si transcurrió un tiempo sustancial, para someter el segundo portamuestras con 1O muestras a condiciones similares a las primeras pero durante el tiempo de muerte requerido. El Tiempo de supervivencia y el tiempo de muerte para todos los indicadores biológicos con monografias se describe en la correspondiente monografía oficial bajo el encabezamiento de cada uno.
6
Pflug, 1.J. Syllabus far an lntroductory Course in the Microbiology and Engineering of Sterilization Processes, 4th ed. St. Paul, MN: Environmental Sterilization Services,
1980. 7 Pflug, 1.J., and G.M. Smith. The Use of Biological lndicators for Monitoring Wet-Heat Sterilization Processes, in Sterilization of Medica/ Products, ed. E.R.L. Gaughran and K. Kereluk. New Brunswick, NJ: Johnson and Johnson, 1977, 193-230. 8 Holcomb, R.G., and 1.J. Pflug. The Spearman-Karber Method of Analyzing Quantal Assay Microbial Destruction Data, in Microbiology and Engineering Sterilization Processes, ed. 1.J. Pflug. St. Paul, MN: Environmental Sterilization Services, 1979.
126 (61) Examen Microbiológico / Pruebas Microbiológicas
USP 39
(61) EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE PRODUCTOS NO ESTÉRILES: PRUEBAS DE RECUENTO MICROBIANO INTRODUCCIÓN Las pruebas que se describen en este capítulo permitirán el recuento cuantitativo de bacterias mesófilas y hongos que pueden desarrollarse en condiciones aeróbicas. Las pruebas han sido diseñadas principalmente para determinar si una sustancia o preparación cumple con una especificación establecida de calidad microbiológica. Si se emplean con tales propósitos, seguir las instrucciones que se indican a continuación, incluyendo el número de muestras a tomar, e interpretar los resultados según se indica más abajo. Los métodos no son aplicables a productos que contengan microorganismos viables como ingredientes activos. Pueden utilizarse procedimientos microbiológicos alternativos, incluidos los métodos automatizados, siempre que se haya demostrado su equivalencia con el método Farmacopeico.
PROCEDIMIENTOS GENERALES Realizar la determinación en condiciones diseñadas para evitar la contaminación microbiana extrínseca del producto a examinar. Las precauciones a tomar para evitar la contaminación deben ser tales que no afecten a ningún microorganismo que deba detectarse en la prueba. Si el producto a examinar posee actividad antimicrobiana, ésta debe eliminarse o neutralizarse en la medida de lo posible. Si se usan inactivadores para este fin, se debe demostrar su eficacia y la ausencia de toxicidad para los microorganismos. Si se emplean sustancias tensoactivas en la preparación de la muestra, se debe demostrar la ausencia de toxicidad para los microorganismos y su compatibilidad con cualquier inactivador usado.
MÉTODOS DE RECUENTO Usar, según se indica, el método de Filtración por Membrana o uno de los Métodos de Recuento en Placa. El Método del Número Más Probable (NMP) es generalmente el método de recuento microbiano menos exacto; sin embargo, para algunos grupos de productos con biocarga muy baja, puede resultar el método más apropiado. La elección de un método se basa en factores tales como la naturaleza del producto y el límite de microorganismos requerido. El método seleccionado debe permitir el análisis de un tamaño de muestra suficiente para juzgar el cumplimiento con la especificación. Se debe establecer la aptitud del método seleccionado.
PRUEBA DE PROMOCIÓN DEL CRECIMIENTO, APTITUD DEL MÉTODO DE RECUENTO Y CONTROLES NEGATIVOS Consideraciones Generales Se debe establecer la aptitud de la prueba para detectar microorganismos en presencia del producto a examinar. Se debe confirmar la aptitud si se introduce un cambio en la realización de la prueba o en el producto que pudiera afectar los resultados del análisis.
Preparación de Cepas de Prueba Usar suspensiones estables estandarizadas de cepas de prueba o preparar según se indica más abajo. Las técnicas de mantenimiento de cultivos de lote de siembra (sistemas de lote de siembra) se usan para que los microorganismos viables empleados para inoculación correspondan a no más de cinco pasajes desde el lote de siembra maestro original. Cultivar, por separado, cada cepa bacteriana y fúngica de prueba según se indica en la Tabla 1.
Pruebas Microbiológicas/ (61) Examen Microbiológico 127
USP 39
Tabla 1. Preparación y Uso de Microorganismos de Prueba Aptitud del Método de Recuento en Presencia del Producto
Promoción del Crecimiento Recuento Total de Hongos Fiiamentosos y Levaduras
Recuento Total de Microorganismos Aerobios
Recuento Total de Hongos Fiiamentosos y Levaduras
Preparación de Cepas de Prueba
Recuento Total de Microorganismos Aeroblos
Agar Digerido de Caseína y Soja o Caldo Digerido de Caseína y Soja 30º-35º 18-24 horas
Agar Digerido de Caseína y Soja y Caldo Digerido de Caseína y Soja $ 100 ufc 30º-35º s 3 días
Agar Digerido de Caseína y Soja/NMP Caldo Digerido de Caseína y Soja s 100 ufc 30º-35º s 3 días
Pseudomonas aeruginosa Agar Digerido de Caseína y Soja o Caldo Dipor ejemplo ATCC 9027, NCIMB 8626, CIP 82.118 gerido de Caseína y Soja 30º-35º o NBRC 13275 18-24 horas
Agar Digerido de Caseína y Soja y Caldo Digerido de Caseína y Soja s 100 ufc 30º-35º s 3 días
Agar Digerido de Caseína y Soja/NMP Caldo Digerido de Caseína y Soja s 100 ufc 30º-35º s 3 días
Bacillus subtilis por ejemplo ATCC 6633, NCIMB 8054, CIP 52.62 o NBRC 3134
Agar Digerido de Caseína y Soja o Caldo Digerido de Caseína y Soja 30º-35º 18-24 horas
Agar Digerido de Caseína y Soja y Caldo Digerido de Caseína y Soja s 100 ufc 30º-35º s 3 días
Agar Digerido de Caseína y Soja/NMP Caldo Digerido de Caseína y Soja s 100 ufc 30º-35º s 3 días
Candida a/bicans por ejem- Agar Sabouraud DextroploATCC 10231, NCPF sa o Caldo Sabouraud Dextrosa 20º-25º 2-3 3179, IP 48.72 o NBRC 1594 días
Agar Digerido de Caseína y Soja S 100 ufc 30º-35º s 5 días
Agar Sabouraud Dextrosa s 100 ufc 20º-25º s 5 días
Agar Digerido de Caseína y Soja $ 1 00 ufc 30º-35º s 5 días NMP: no aplica
Agar Sabouraud Dextrosa s 100 ufc 20º-25º s 5 días
Agar Sabouraud Dextro- Agar Digerido de Caseína y Sojas 100 ufc sa o Agar Papa Dextro30º-35º s 5 días sa 20º-25º 5-7 días o hasta aleanzar una buena esporulación
Agar Sabouraud Dextrosa $ 100 ufc 20º-25º s 5 días
Agar Digerido de Caseína y Soja s 100 ufc 30º-35º $ 5 días NMP: no aplica
Agar Sabouraud Dextrosa s 1 00 ufc 20º-25ºs 5 días
Microorganismo Staphylococcus aureus por ejemplo ATCC 6538, NCIMB 9518, CIP 4.83 o NBRC 13276
Aspergillus brasi/iensis por ejemplo ATCC 16404, IMI 149007, IP 1431.83 o NBRC 9455
Usar Solución Amortiguada de Cloruro de Sodio-Peptona de pH 1,0 o Solución Amortiguadora de Fosfato de pH 7,2 para realizar las suspensiones de prueba; para suspender esporas de A. brasiliensis, se puede añadir 0,05% de polisorbato 80 a la solución amortiguadora. Utilizar las suspensiones dentro de las 2 horas o dentro de las 24 horas si se almacenan a una temperatura entre 2º y 8º. Como alternativa para la preparación y posterior dilución de una suspensión fresca de las células vegetativas de A. brasiliensis o B. subtilis, preparar una suspensión estable de esporas y luego usar un volumen apropiado de la suspensión de esporas para la inoculación de prueba. La suspensión estable de esporas puede mantenerse a una temperatura de 2º a 8º durante un período validado.
Control Negativo Para verificar las condiciones de prueba, realizar un control negativo usando el diluyente seleccionado en lugar de la preparación de prueba. No debe observarse crecimiento de microorganismos. Asimismo, realizar un control negativo al analizar los productos según se indica en Pruebas de Productos. Es necesario investigar cualquier falla en el control negativo.
Promoción del Crecimiento de los Medios Analizar cada partida de medio listo para usar y cada partida de medio preparado a partir de medio deshidratado o de los ingredientes indicados. Inocular porciones/placas de Caldo Digerido de Caseína y Soja y Agar Digerido de Caseína y Soja con un número pequeño (no más de 100 ufc) de los microorganismos indicados en la Tabla 7, empleando una porción/placa individual de medio para cada uno. Inocular placas de Agar Sabouraud Dextrosa con un número pequeño (no más de 100 ufc) de los microorganismos indicados en la Tabla 7, empleando una placa individual de medio para cada uno. Incubar de acuerdo con las condiciones descritas en la Tabla 7. Para medios sólidos, el crecimiento obtenido no debe diferir en un factor mayor de 2 a partir del valor calculado para un inóculo estandarizado. Para un inóculo recién preparado, se produce un crecimiento de microorganismos comparable al obtenido anteriormente con una partida de medio analizada y aprobada previamente. Los medios líquidos son adecuados si se produce un crecimiento claramente visible de microorganismos comparable al obtenido anteriormente con una partida de medio analizada y aprobada previamente.
128 (61) Examen Microbiológico / Pruebas Microbiológicas
USP 39
Aptitud del Método de Recuento en Presencia del Producto PREPARACIÓN DE LA MUESTRA El método para preparar la muestra depende de las características físicas del producto a examinar. Si ninguno de los procedimientos que se describen a continuación resultara satisfactorio, se debe desarrollar un procedimiento alternativo adecuado. Productos Solubles en Agua-Disolver o diluir (por lo general se prepara una dilución 1 en 1 O) del producto a examinar en Solución Amortiguada de Cloruro de Sodio-Peptona de pH 1,0, en Solución Amortiguadora de Fosfato de pH 7,2 o en Caldo Digerido de Caseína y Soja. Si fuera necesario, ajustar a un pH de 6 a 8. Preparar diluciones adicionales, con el mismo diluyente, si fuera necesario. Productos No Grasos Insolubles en Agua-Suspender el producto a analizar (por lo general se prepara una dilución 1 en 1O) en Solución Amortiguada de Cloruro de Sodio-Peptona de pH 7, O, en Solución Amortiguadora de Fosfato de pH 1,2 o en Caldo Digerido de Caseína y Soja. Se puede añadir un agente tensoactivo, tal como 1 g por L de polisorbato 80, para favorecer la suspensión de sustancias poco humectables. Si fuera necesario, ajustar a un pH de 6 a 8. Preparar diluciones adicionales, con el mismo diluyente, si fuera necesario. Productos Grasos-Disolver el producto a examinar en miristato de isopropilo esterilizado por filtración o mezclarlo con la cantidad mínima necesaria de polisorbato 80 estéril u otro reactivo tensoactivo estéril no inhibitorio que se calienta, si fuera necesario, a no más de 40º o, en casos excepcionales, a no más de 45º. Mezclar cuidadosamente y, si fuera necesario, mantener la temperatura en un baño de agua. Agregar una cantidad suficiente del diluyente seleccionado precalentado para obtener una dilución 1 en 1O del producto original. Mezclar cuidadosamente, manteniendo la temperatura durante el menor tiempo necesario para la formación de una emulsión. Se puede preparar una serie de diluciones decimales adicionales empleando el diluyente seleccionado que contenga una concentración adecuada de polisorbato 80 estéril u otro reactivo tensoactivo estéril no inhibitorio. Líquidos o Sólidos en Forma de Aerosol-Transferir el producto asépticamente a un aparato con filtro de membrana o un recipiente estéril para un muestreo posterior. Usar el contenido completo o una cantidad definida de dosis fijas de cada envase analizado. Parches Transdérmicos-Retirar las láminas protectoras ("cubiertas de protección") de los parches transdérmicos y colocarlas, con el adhesivo hacia arriba, sobre bandejas de vidrio o plástico estériles. Cubrir la superficie adhesiva con un material poroso estéril adecuado (p.ej., gasa estéril) para prevenir que los parches se peguen unos a otros y transferirlos a un volumen adecuado del diluyente seleccionado que contenga inactivadores tales como polisorbato 80 y/o lecitina. Agitar la preparación vigorosamente por lo menos durante 30 minutos. INOCULACIÓN Y DILUCIÓN Agregar a la muestra, preparada según las instrucciones previas, y a un control (sin incluir material de la prueba) un volumen suficiente de suspensión microbiana para obtener un inóculo de no más de 100 ufc. El volumen de la suspensión del inóculo no debe exceder del 1% del volumen del producto diluido. Para demostrar una recuperación microbiana aceptable del producto, se debe usar el factor de dilución más bajo posible de la muestra preparada para la prueba. Si esto no fuera posible debido a la actividad antimicrobiana o la baja solubilidad, deben desarrollarse otros protocolos adecuados. Si la inhibición del crecimiento por la muestra no puede evitarse de cualquier otra manera, la alícuota de suspensión microbiana puede agregarse después de la neutralización, la dilución o la filtración. NEUTRALIZACIÓN/ELIMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA Comparar el número de microorganismos recuperados a partir de la muestra preparada, diluida según se indica en Inoculación y Dilución e incubada siguiendo el procedimiento descrito en Recuperación de Microorganismos en Presencia del Producto, con el número de microorganismos recuperados a partir de la preparación de control. Si se inhibe el crecimiento (reducción en un factor mayor de 2), modificar el procedimiento para la prueba de recuento particular con el objeto de garantizar la validez de los resultados. La modificación del procedimiento puede incluir, por ejemplo, (1) Un aumento en el volumen del diluyente o medio de cultivo; (2) Incorporación de agentes neutralizantes generales o específicos en el diluyente; (3) Filtración por membrana; o (4) Una combinación de todas las medidas anteriores. Agentes Neutralizantes-Los agentes neutralizantes pueden usarse para neutralizar la actividad de los agentes antimicrobianos (ver la Tabla 2). Pueden añadirse al diluyente seleccionado o al medio, preferentemente antes de la esterilización. Si se usan, se debe demostrar su eficacia y la ausencia de toxicidad para los microorganismos mediante un blanco con neutralizador y sin el producto.
Pruebas .Microbiológicas/ (61) Examen Microbiológico 129
USP 39
Tabla 2. Agentes Neutralizantes Comunes/Métodos para Sustancias de Interferencia Agentes Neutralizantes Potenciales/Método
Sustancia de Interferencia Glutaraldehído, mercuriales
Sulfito ácido de sodio (Bisulfito de sodio)
Fenólicos, alcohol, aldehídos, sorbato
Dilución
Aldehídos
Glicina
Compuestos de amonio cuaternario (CAC), parahidroxibenzoatos (parabenos), bis-biguanidas
Lecitina
CAC, yodo, parabenos
Polisorbato
Mercuriales
Tioglicolato
Mercuriales, halógenos, aldehídos
Tiosulfato
EDTA (edetato)
Iones de Mg o Ca
Si no se encuentra un método de neutralización adecuado, puede suponerse que la imposibilidad de aislar el microorganismo inoculado es atribuible a la actividad microbicida del producto. Esta información permite deducir que no es probable que el artículo se contamine con esa determinada especie de microorganismo. No obstante, es posible que el producto inhiba solamente algunos microorganismos especificados en este capítulo pero que no inhiba otros no incluidos entre las cepas de prueba o aquellos para los cuáles éstas no son representativas. En consecuencia, realizar la prueba con el factor de dilución más alto compatible con el crecimiento microbiano y el criterio de aceptación específico. RECUPERACIÓN DE MICROORGANISMOS EN PRESENCIA DEL PRODUCTO Para cada uno de los microorganismos en la lista, realizar pruebas individuales. Contar sólo los microorganismos de la cepa de prueba agregada. Filtración por Membrana-Usar filtros de membrana con un tamaño nominal de poro no mayor de 0,45 µm. Escoger el tipo de material del filtro de manera que la eficiencia en la retención de bacterias no se vea afectada por los componentes de la muestra a investigar. Usar un filtro de membrana para cada uno de los microorganismos mencionados. Transferir una cantidad adecuada de la muestra preparada según se indica en Preparación de la Muestra, Inoculación y Dilución y Neutralización/Eliminación de la Actividad Antimicrobiana (que preferiblemente represente 1 g del producto, o menos si se espera un gran número de ufc) al filtro de membrana, filtrar inmediatamente y enjuagar el filtro de membrana con un volumen adecuado de diluyente. Para determinar el recuento total de microorganismos aerobios (RTMA), transferir el filtro de membrana a la superficie del Agar Digerido de Caseína y Soja. Para determinar el recuento total combinado de hongos filamentosos y levaduras (RTCHL), transferir la membrana a la superficie del Agar Sabouraud Dextrosa. Incubar las placas según se indica en la Tabla 7. Realizar el recuento. Métodos de Recuento en Placa-Aplicar los métodos de recuento en placa al menos por duplicado para cada medio y usar el recuento medio del resultado. Método de Vertido en Placa-Para placas de Petri de 9 cm de diámetro, agregar a la placa 1 mL de la muestra preparada según se indica en Preparación de la Muestra, Inoculación y Dilución y Neutralización/Eliminación de la Actividad Antimicrobiana y de 15 a 20 mL de Agar Digerido de Caseína y Soja o Agar Sabouraud Dextrosa, manteniendo la temperatura de ambos medios a no más de 45º. Si se emplean placas de Petri más grandes, aumentar la cantidad del medio de agar proporcionalmente. Emplear al menos dos placas de Petri para cada microorganismo mencionado en la Tabla 7. Incubar las placas según se indica en la Tabla 7. Tomar la media aritmética de los recuentos obtenidos en cada medio y calcular el número de ufc en el inóculo original. Método de Extensión en Superficie-Agregar de 15 a 20 mL de Agar Digerido de Caseína y Soja o Agar Sabouraud Dextrosa a cada placa de Petri de 9 cm de diámetro, aproximadamente a 45º, y dejar solidificar. Si se emplean placas de Petri más grandes, aumentar el volumen del agar proporcionalmente. Secar las placas, por ejemplo, en un gabinete con flujo de aire laminar o en una incubadora. Emplear al menos dos placas de Petri para cada microorganismo mencionado en la Tabla 7. Esparcir un volumen medido de no menos de O, 1 mL de la muestra, preparada según se indica en Preparación de Ja Muestra, Inoculación y Dilución y Neutralización/Eliminación de la Actividad Antimicrobiana sobre la superficie del medio. Incubar y realizar el recuento según se indica en Método de Vertido en Placa. Método del Número Más Probable (NMP)-La precisión y exactitud del Método del NMP son menores que las del método de Filtración por Membrana o el Método de Recuento en Placa. Los resultados no confiables se obtienen particularmente para el recuento de hongos filamentosos. Por estas razones, el Método del NMP se reserva para el RTMA en situaciones en las que no haya otro método disponible. Si se justifica el empleo del método, proceder de la siguiente manera: Preparar una serie de al menos tres diluciones decimales en serie del producto según se indica en Preparación de la Muestra, Inoculación y Dilución y Neutralización/Eliminación de Actividad Antimicrobiana. A partir de cada nivel de dilución, usar tres alícuotas de 1 g o 1 mL para inocular tres tubos con 9 a 1 O mL de Caldo Digerido de Caseína y Soja. Si fuera necesario, se puede agregar al medio un agente tensoactivo, tal como polisorbato 80, o un inactivador de agentes antimicrobianos. Por lo tanto, si se preparan tres niveles de dilución, inocular nueve tubos.
130 (61) Examen Microbiológico / Pruebas Microbiológicas
USP 39
Incubar todos los tubos a una temperatura de 30º a 35º durante no más de 3 días. Si la lectura de los resultados resulta difícil o dudosa dada la naturaleza del producto a examinar, subcultivar en el mismo caldo o en Agar Digerido de Caseína y Soja durante un período de 1 a 2 días a la misma temperatura y usar estos resultados. A partir de la Tabla 3, determinar el número más probable de microorganismos por g o por ml del producto a examinar. Tabla 3. Valores del Número Más Probable de Microorganismos Combinaciones Observadas de Números de Tubos que Muestran Crecimiento en Cada Juego
NMP porgo por mL de Producto
Límites de Confianza de95%
Número de g o mL de Producto por Tubo
0,1
0,01
o o o o o o
o o
o
<3
0-9,4
1
3
0,1-9,5
1
o
3
0,1-10
1
1
6,1
1,2-17
2
6,2
1,2-17
1 1
o o o
o o o
1
1
1
3
0,001
9,4
3,5-35
3,6
0,2-17 1,2-17
1
7,2
2
11
4-35
o
7,4
1,3-20
1
1
1
11
4-35
1
2
o
11
4-35
1
2
1
15
5-38
1
3
16
5-38
2
9,2
1,5-35
1
14
4-35
2
o o o
o o 2
20
5-38
2
1
o
15
4-38
2
1
1
20
5-38
2
1
2
27
9-94
2
2
o
21
5-40
2
2
1
28
9-94
2
2
2
35
9-94
2
3
o
29
9-94
2
3
1
36
9-94
3
o
23
5-94
1
38
9-104
3
o o o
2
64
16-181
3
1
o
43
9-181
3
1
1
75
17-199
3
1
2
120
30-360
3
1
3
160
30-380
2
3
3
2
o
93
18-360
3
2
1
150
30-380
3
2
2
210
30-400
3
2
3
290
90-990
3
3
o
240
40-990
3
3
1
460
90-1980
3
3
2
1100
200-4000
3
3
3
>1100
RESULTADOS E INTERPRETACIÓN
Al verificar la aptitud del método de Filtración por Membrana o del Método de Recuento en Placa, se debe obtener un recuento medio de cualquier microorganismo de prueba que no difiera en un factor mayor de 2 del valor del control definido en
USP 39
Pruebas Microbiológicas/ (61) Examen Microbiológico 131
Inoculación y Dilución en la ausencia del producto. Al verificar la aptitud del Método del NMP, el valor calculado a partir del inóculo debe estar dentro de los límites de confianza de 95% de los resultados obtenidos con el control. Si los criterios mencionados anteriormente no pueden cumplirse para uno o más de los microorganismos analizados con cualquiera de los métodos descritos, se debe utilizar para examinar el producto, el método y las condiciones de prueba más cercanas a esos criterios.
PRUEBA DE PRODUCTOS Cantidad Usada para la Prueba A menos que se indique algo diferente, usar 1Og o 1O mL del producto a examinar, tomados con las precauciones mencionadas anteriormente. Para líquidos o sólidos en forma de aerosol, muestrear 1O envases. Para parches transdérmicos, muestrear 1O parches. Se puede reducir la cantidad a analizar de las sustancias activas que se formulan en las siguientes condiciones: la cantidad por unidad de dosificación (por ej., tableta, cápsula, inyección) es menor o igual a 1 mg o la cantidad por g o mL (para preparaciones que no se presentan en unidades de dosificación) es menor de 1 mg. En estos casos, la cantidad de la muestra a analizar no es menor que la cantidad presente en 1O unidades de dosificación o 1Og o 1O mL del producto. Para materiales que se usan como sustancias activas en los que la cantidad de la muestra es limitada o el tamaño de la partida es extremadamente pequeño (es decir, menos de 1000 mL o 1000 g), la cantidad analizada debe ser 1% de la partida a menos que se indique, o justifique y autorice una cantidad menor. Para productos cuyo número total de entidades en una partida es menor de 200 (por ej. muestras que se usan en ensayos clínicos), el tamaño de la muestra puede reducirse a dos unidades o a una unidad si el tamaño es menor de 1 OO. Escoger la(s) muestra(s) aleatoriamente a partir del material a granel o de los envases disponibles de la preparación. Para obtener la cantidad requerida, mezclar los contenidos de un número suficiente de envases para proporcionar la muestra.
Examen del Producto FILTRACIÓN POR MEMBRANA Usar un aparato de filtración diseñado para permitir la transferencia del filtro al medio. Preparar la muestra empleando un método cuya aptitud se haya demostrado según se indica en Prueba de Promoción del Crecimiento y Aptitud del Método de Recuento, transferir la cantidad adecuada a dos filtros de membrana y filtrar inmediatamente. Lavar cada filtro siguiendo el procedimiento que haya demostrado su aptitud. Para determinar el RTMA, transferir uno de los dos filtros de membrana a la superficie del Agar Digerido de Caseína y Soja. Para determinar el RTCHL, transferir la otra membrana a la superficie del Agar Sabouraud Dextrosa. Incubar la placa de Agar Digerido de Caseína y Soja a una temperatura de 30º a 35º durante un período de 3 a 5 días y la placa de Agar Sabouraud Dextrosa a una temperatura de 20º a 25º durante un período de 5 a 7 días. Calcular el número de ufc por g o por mL del producto. Al examinar los parches transdérmicos, filtrar por separado 10% del volumen de la preparación descrita en Preparación de la Muestra a través de cada una de las dos membranas de filtración estériles. Transferir una membrana al Agar Digerido de Caseína y Soja para el RTMA y la otra membrana al Agar Sabouraud Dextrosa para el RTCHL. MÉTODOS DE RECUENTO EN PLACA Método de Vertido en Placa-Preparar la muestra empleando un método cuya aptitud se haya demostrado según se describe en Prueba de Promoción del Crecimiento y Aptitud del Método de Recuento. Preparar al menos dos placas de Petri para cada medio por cada nivel de dilución. Incubar las placas de Agar Digerido de Caseína y Soja a una temperatura entre 30º y 35º durante un período de 3 a 5 días y las placas de Agar Sabouraud Dextrosa a una temperatura entre 20º y 25º durante un período de 5 a 7 días. Escoger las placas correspondientes a una dilución determinada y que muestren el mayor número de colonias, menor de 250 para el RTMA y 50 para el RTCHL. Tomar la media aritmética de los recuentos por medio de cultivo y calcular el número de ufc por g o por mL del producto. Método de Extensión en Superficie-Preparar la muestra empleando un método cuya aptitud se haya demostrado según se describe en Prueba de Promoción del Crecimiento y Aptitud del Método de Recuento. Preparar al menos dos placas de Petri para cada medio y cada nivel de dilución. Para la incubación y cálculo del número de ufc, proceder según se indica en el Método de Vertido en Placa. MÉTODO DEL NÚMERO MÁS PROBABLE Preparar y diluir la muestra empleando un método cuya aptitud se haya demostrado según se describe en Prueba de Promoción del Crecimiento y Aptitud del Método de Recuento. Incubar todos los tubos durante un período de 3 a 5 días a una tempera-
132 (61) Examen Microbiológico / Pruebas Microbiológicas
USP 39
tura de 30º a 35º. Subcultivar, si fuera necesario, empleando el procedimiento cuya aptitud se haya demostrado. Registrar para cada nivel de dilución el número de tubos que muestran crecimiento microbiano. A partir de la Tabla 3, determinar el número más probable de microorganismos por g o por mL del producto a examinar.
Interpretación de los Resultados El recuento total de microorganismos aerobios (RTMA) se considera equivalente al número de ufc encontrado usando Agar Digerido de Caseína-Soja; si se detectan colonias de hongos en este medio, contarlas como parte del RTMA. El recuento total combinado de hongos filamentosos y levaduras (RTCHL) se considera equivalente al número de ufc encontrado empleando Agar Sabouraud Dextrosa; si se detectan colonias de bacterias en este medio, contarlas como parte del RTCHL. Cuando se espera que el RTCHL exceda el criterio de aceptación debido al crecimiento bacteriano, se puede usar Agar Sabouraud Dextrosa que contenga antibióticos. Si se realiza el recuento mediante el Método del MNP, el valor calculado es RTMA. Cuando se indica un criterio de aceptación para la calidad microbiológica, éste se interpreta de la siguiente manera: - 101 ufc: recuento máximo aceptable = 20; - 10 2 ufc: recuento máximo aceptable = 200; - 10 3 ufc: recuento máximo aceptable = 2000; y así sucesivamente. Las soluciones y medios recomendados se indican en Pruebas de Microorganismos Específicos (62).
(62) EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE PRODUCTOS NO ESTÉRILES: PRUEBAS DE MICROORGANISMOS ESPECÍFICOS INTRODUCCIÓN Las pruebas que se describen en este capítulo permitirán determinar la ausencia, o presencia limitada, de microorganismos específicos que puedan ser detectados en las condiciones descritas. Las pruebas han sido diseñadas principalmente para determinar si una sustancia o preparación cumple con alguna especificación establecida de calidad microbiológica. Si se emplean con tales propósitos, seguir las instrucciones que se indican a continuáción, incluyendo el número de muestras a tomar, e interpretar los resultados según se indica más abajo. Pueden utilizarse procedimientos microbiológicos alternativos, incluyendo métodos automatizados, siempre que se haya demostrado su equivalencia con el método farmacopeico.
PROCEDIMIENTOS GENERALES La preparación de muestras se realiza según se indica en Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano (61 ). Si el producto a examinar posee actividad antimicrobiana, ésta debe eliminarse o neutralizarse en la medida de lo posible según se describe en Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano (61 ). Si se emplean sustancias tensoactivas en la preparación de la muestra, se debe demostrar su ausencia de toxicidad para los microorganismos y su compatibilidad con cualquier inactivador usado, según se describe en Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano (61 ).
PROPIEDADES DE PROMOCIÓN DEL CRECIMIENTO E INHIBITORIAS DE LOS MEDIOS, APTITUD DE LA PRUEBA Y CONTROLES NEGATIVOS Se debe establecer la capacidad de la prueba para detectar microorganismos en presencia del producto a examinar. Se debe confirmar la aptitud de la prueba si se introduce un cambio en la ejecución de la prueba o en el producto que pudiera afectar los resultados.
Preparación de Cepas de Prueba Usar suspensiones estables estandarizadas de cepas de prueba según se indica más abajo. Las técnicas de mantenimiento de cultivos de lote de siembra (sistemas de lote de siembra) se usan para que los microorganismos viables empleados para inoculación correspondan a no más de cinco pasajes desde el lote de siembra maestro original.
PruebasiMicrobiológicas / (62) Examen Microbiológico 133
USP 39
MICROORGANISMOS AEROBIOS Cultivar por separado cada cepa bacteriana de prueba en recipientes que contengan Caldo Digerido de Caseína y Soja o Agar Digerido de Caseína y Soja a una temperatura de 30º a 35º durante un período de 18 a 24 horas. Cultivar por separado la cepa de prueba de Candida albicans en Agar Sabouraud Dextrosa o Caldo Sabouraud Dextrosa a una temperatura de 20º a 25º durante un período de 2 a 3 días. Staphylococcus aureus
Por ejemplo ATCC 6538, NCIMB 9518, CIP 4.83 o NBRC 13276
Pseudomonas aeruginosa
Por ejemplo ATCC 9027, NCIMB 8626, CIP 82.118 o NBRC 13275
Escherichia coli
Por ejemplo ATCC 8739, NCIMB 8545, CIP 53.126 o NBRC 3972
Sa/monella enterica subesp. enterica serovar Typhimurium o, como alternativa,
Por ejemplo ATCC 14028
Sa/monella enterica subesp. enterica serovar Abony
Por ejemplo NBRC 100797, NCTC 6017 o CIP 80.39
Candida albicans
Por ejemplo ATCC 10231, NCPF 3179, IP 48.72 o NBRC 1594
Usar Solución Amortiguada de Cloruro de Sodio-Peptona de pH 7,0 o Solución Amortiguadora de Fosfato de pH 1,2 para preparar las suspensiones de prueba. Usar las suspensiones dentro de las 2 horas o dentro de las 24 horas si se almacenan a una temperatura de 2º a 8º. CLOSTRIDIOS Usar Clostridium sporogenes, como por ejemplo ATCC 11437 (NBRC 14293, NCIMB 12343, CIP 100651) o ATCC 19404 (NCTC 532 o CIP 79.3). Cultivar la cepa clostridial de prueba en condiciones anaeróbicas en Medio Reforzado para Clostridios a una temperatura de 30º a 35º durante un período de 24 a 48 horas. Como alternativa para Ja preparación y posterior dilución de una suspensión fresca de las células vegetativas de C/. sporogenes, se emplea una suspensión estable de esporas para la inoculación de prueba. La suspensión estable de esporas puede mantenerse a una temperatura de 2º a 8º durante un período validado.
Control Negativo Para verificar las condiciones de prueba, realizar un control negativo usando el diluyente seleccionado en Jugar de Ja preparación de prueba. No debe observarse crecimiento de microorganismos. Asimismo, realizar un control negativo al analizar Jos productos según se indica en Pruebas de Productos. Es necesario investigar cualquier falla en el control negativo.
Propiedades de Promoción del Crecimiento e Inhibitorias de los Medios Analizar cada partida de medio listo para usar y cada partida de medio preparado a partir de medio deshidratado o de Jos ingredientes. Verificar las propiedades adecuadas de Jos medios pertinentes según se indica en Ja Tabla 7. Prueba/Medio
Tabla 1. Propiedades Indicadoras de Promoción del Crecimiento e Inhibitorias de los Medios Propiedad Cepas de Prueba
Prueba eara bacterias Gram-negativas tolerantes a Ja bilis Caldo Mossel para Enriquecimiento de Enterobacterias
Promoción del crecimiento
E. co/i
Inhibitoria
S. aureus
Promoción del crecimiento + Indicadora
E. coli
P. aeruginosa
Agar Violeta Rojo Bilis Glucosa
P. aeruqinosa Prueba de Escherichia coli Caldo MacConkey
Agar MacConkey
Promoción del crecimiento
E. coli
Inhibitoria
S. aureus
Promoción del crecimiento + Indicadora
E. coli
Promoción del crecimiento
Salmonella enterica subesp. enterica serovar Typhimuriumo
Prueba de Salmonella Caldo Rappaport-Vassiliadis para Enriquecimiento de Salmonella
Salmonella enterica subesp. enterica serovar Abony Inhibitoria
S. aureus
134 (62) Examen Microbiológico/ Pruebas Microbiológicas
USP 39
, ) ., d e 1 Cree1m 1ento e In hlbl toras d e 1os Medi os Continuacion • d a d es In di ca d oras de Promoc1on Ta bl a 1. Prop1e
Prueba/Medio
Propiedad
Cepas de Prueba
Agar Xilosa Lisina Desoxicolato
Promoción del crecimiento + Indicadora
Salmonella enterica subesp. enterica serovar Typhimuriumo Salmonella enterica subesp. enterica serovar Abony
Prueba de Pseudomonas aeruginosa Agar Cetrimida
Promoción del crecimiento
P. aeruginosa
Inhibitoria
E. coli
Prueba de Sta!J_h)'.'_/ococcus aureus Promoción del crecimiento + Indicadora
S. aureus
Inhibitoria
E. coli
Medio Reforzado para Clostridios
Promoción del crecimiento
CI. sporogenes
Agar Columbia
Promoción del crecimiento
C/. sporogenes
Caldo Sabouraud Dextrosa
Promoción del crecimiento
C. albicans
Agar Sabouraud Dextrosa
Promoción del crecimiento + Indicadora
C. albicans
Agar Manitol Salado
Prueba de Clostridios
Prueba de Candida albicans
Prueba de las Propiedades de Promoción del Crecimiento, Medios Líquidos-Inocular una porción del medio apropiado con un número pequeño (no más de 100 ufc) del microorganismo adecuado. Incubar a la temperatura especificada durante un tiempo no mayor que el período menor indicado en la prueba. Se produce un crecimiento claramente visible de microorganismos comparable al obtenido anteriormente con una partida de medio analizada y aprobada previamente. Prueba de las Propiedades de Promoción del Crecimiento, Medios Sólidos-Usar el Método de Extensión en Superficie (ver Métodos de Recuento en Placa en Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano (61 )), inoculando cada una de las placas con un número pequeño (no más de 100 ufc) del microorganismo adecuado. Incubar a la temperatura especificada durante un tiempo no mayor que el período menor indicado en la prueba. Se produce un crecimiento de microorganismos comparable al obtenido anteriormente con una partida de medio analizada y aprobada previamente. Prueba de las Propiedades Inhibitorias, Medios Sólidos o Líquidos-Inocular el medio apropiado con al menos 100 ufc del microorganismo adecuado. Incubar a la temperatura especificada durante un tiempo no menor del período mayor indicado en la prueba. No se produce crecimiento del microorganismo de prueba. Prueba de las Propiedades Indicadoras-Usar el Método de Extensión en Superficie (ver Métodos de Recuento en Placa en Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano (61 )), inoculando cada una de las placas con un número pequeño (no más de 100 ufc) del microorganismo adecuado. Incubar a la temperatura especificada durante un período que se encuentre en el intervalo indicado en la prueba. Las colonias son comparables, en apariencia y reacciones indicadoras, a aquellas anteriormente obtenidas con una partida de medio analizada y aprobada previamente.
Aptitud del Método de Prueba Para cada producto nuevo a analizar, realizar una preparación de la muestra según se indica en el párrafo pertinente en Pruebas de Productos. Al momento de la mezcla, agregar cada cepa de prueba en el medio de crecimiento indicado. Inocular individualmente las cepas de prueba. Usar un número de microorganismos equivalente a no más de 100 ufc en la preparación de prueba inoculada. Realizar la prueba según se indica en el párrafo pertinente en Pruebas de Productos empleando el período más corto de incubación indicado. Se deben detectar los microorganismos específicos con las reacciones indicadoras según se describe en Pruebas de Productos. Cualquier actividad antimicrobiana del producto requiere de una modificación del procedimiento de la prueba (ver Neutralización/Eliminación de la Actividad Antimicrobiana en Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano (61 )). Para un producto determinado, si la actividad antimicrobiana con respecto al microorganismo para el cual se indica la prueba no puede neutralizarse, se asume que el microorganismo inhibido no estará presente en el producto.
PRUEBAS DE PRODUCTOS
Bacterias Gram-Negativas Tolerantes a la Bilis Preparación de la Muestra e Incubación Previa-Preparar una muestra empleando una dilución 1 en 1O de no menos de 1 g del producto a analizar según se indica en Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano (61 ), excepto que se debe usar Caldo Digerido de Caseína y Soja como diluyente de elección, mezclar e incubar a una tempera-
Pruebas.Microbiológicas/ (62) Examen Microbiológico 135
USP 39
tura de 20º a 25º durante un período suficiente para resucitar las bacterias pero que no estimule la multiplicación de los organismos (por lo general 2 horas pero no más de 5 horas). Prueba de Ausencia-A menos que se indique algo diferente, usar un volumen correspondiente a 1 g del producto, según se indica en Preparación de la Muestra e Incubación Previa, para inocular Caldo Mossel para Enriquecimiento de Enterobacterias. Incubar a una temperatura de 30º a 35º durante un período de 24 a 48 horas. Subcultivar en placas de Agar Violeta Rojo Bilis Glucosa. Incubar a una temperatura de 30º a 35º durante un período de 18 a 24 horas. El producto cumple con la prueba si no se desarrollan colonias. Prueba CuantitativaSe/ección y Subcultivo-lnocular cantidades adecuadas de Caldo Mossel para Enriquecimiento de Enterobacterias con la preparación según se indica en Preparación de la Muestra e Incubación Previa y/o diluciones de la misma que contengan respectivamente O, 1 g; 0,01 g y 0,001 g (ó O, 1 ml; 0,01 ml y 0,001 ml) del producto a examinar. Incubar a una temperatura de 30º a 35º durante un período de 24 a 48 horas. Subcultivar cada uno de los cultivos en una placa de Agar Violeta Rojo Bilis Glucosa. Incubar a una temperatura de 30º a 35º durante un período de 18 a 24 horas. Interpretación-El crecimiento de colonias constituye un resultado positivo. Indicar la menor cantidad del producto que produce un resultado positivo y la mayor cantidad que produce un resultado negativo. Determinar la cantidad probable de bacterias a partir de la Tabla 2. Tabla 2. Interpretación de Resultados Resultados para Cada Cantidad del Producto
Cantidad Probable de Bacterias por g o mL del Producto
0,01 g o 0,01 mL
0,001 g o 0,001 mL
+
+
+
más de 103
+
+
-
menos de 10 3 y más de 1 0 2
+
-
-
menos de 10 2 y más de 1 O
-
-
-
menos de 1 O
0,1go0,1 mL
Escherichia coli Preparación de la Muestra e Incubación Previa-Preparar una muestra usando una dilución 1 en 1O de no menos de 1 g del producto a analizar según se indica en Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano (61) y usar 1 O ml o la cantidad correspondiente a 1 g o 1 ml, para inocular una cantidad adecuada (determinada según se describe en Aptitud del Método de Prueba) de Caldo Digerido de Caseína y Soja, mezclar e incubar a una temperatura de 30º a 35º durante un período de 18 a 24 horas. Selección y Subcultivo-Agitar el recipiente, transferir 1 ml de Caldo Digerido de Caseína y Soja a 100 ml de Caldo MacConkey e incubar a una temperatura de 42º a 44º durante un período de 24 a 48 horas. Subcultivar en una placa de Agar MacConkey a una temperatura de 30º a 35º durante un período de 18 a 72 horas. Interpretación-El crecimiento de colonias indica la posible presencia de E. coli. Esto se confirma mediante pruebas de identificación. El producto cumple con la prueba si no se desarrollan colonias o si los resultados de las pruebas de identificación son negativos.
Salmonella Preparación de la Muestra e Incubación Previa-Preparar el producto a analizar según se indica en Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano (61) y usar una cantidad correspondiente a no menos de 1 Og ó 1O ml, para inocular una cantidad adecuada (determinada según se describe en Aptitud del Método de Prueba) de Caldo Digerido de Caseína y Soja, mezclar e incubar a una temperatura de 30º a 35º durante un período de 18 a 24 horas. Selección y Subcultivo-Transferir O, 1 ml de Caldo Digerido de Caseína y Soja a 1O ml de Caldo Rappaport-Vassiliadis para Enriquecimiento de Salmonella e incubar a una temperatura de 30º a 35º durante un período de 18 a 24 horas. Subcultivar en placas de Agar Xi/osa Lisina Desoxicolato. Incubar a una temperatura de 30º a 35º durante un período de 18 a 48 horas. Interpretación-El crecimiento de colonias bien desarrolladas de color rojo, con o sin centros negros indica la posible presencia de Salmonella. Esto se confirma mediante pruebas de identificación. El producto cumple con la prueba si no se desarrollan colonias de los tipos descritos o si los resultados de las pruebas de identificación confirmatorias son negativos.
Pseudomonas aeruginosa Preparación de la Muestra e Incubación Previa-Preparar una muestra usando una dilución 1 en 1 O de no menos de 1 g del producto a analizar según se indica en Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano (61) y usar 1O ml o la cantidad correspondiente a 1 g ó 1 ml, para inocular una cantidad adecuada (determinada según se descri-
136 (62) Examen Microbiológico/ Pruebas Microbiológicas
USP 39
be en Aptitud del Método de Prueba) de Caldo Digerido de Caseína y Soja y mezclar. Al analizar parches transdérmicos, filtrar el volumen de muestra correspondiente a un parche de la preparación (ver Parches Transdérmicos en Preparación de la Muestra en Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano (61 )) a través de un filtro de membrana estéril y colocar en 100 ml de Caldo Digerido de Caseína y Soja. Incubar a una temperatura de 30º a 35º durante un período de 18 a 24 horas. Selección y Subcultivo-Subcultivar en una placa de Agar Cetrimida e incubar a una temperatura de 30º a 35º durante un período de 18 a 72 horas. Interpretación-El crecimiento de colonias indica la posible presencia de P. aeruginosa. Esto se confirma mediante pruebas de identificación. El producto cumple con la prueba si no se desarrollan colonias o si los resultados de las pruebas de identificación confirmatorias son negativos.
Staphylococcus aureus Preparación de la Muestra e Incubación Previa-Preparar una muestra usando una dilución 1 en 1 O de no menos de 1 g del producto a analizar según se indica en Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano (61) y usar 1 O ml o la cantidad correspondiente a 1 g ó 1 ml, para inocular una cantidad adecuada (determinada según se describe en Aptitud del Método de Prueba) de Caldo Digerido de Caseína y Soja y homogenizar. Al analizar parches transdérmicos, filtrar el volumen de muestra correspondiente a un parche de la preparación (ver Parches Transdérmicos en Preparación de la Muestra en Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano (61 )) a través de un filtro de membrana estéril y colocar en 100 ml de Caldo Digerido de Caseína y Soja. Incubar a una temperatura de 30º a 35º durante un período de 18 a 24 horas. Selección y Subcultivo-Subcultivar en una placa de Agar Manito/ Salado e incubar a una temperatura de 30º a 35º durante un período de 18 a 72 horas. Interpretación-El crecimiento de colonias amarillas o blancas rodeadas de una zona amarilla indica la posible presencia de S. aureus. Esto se confirma mediante pruebas de identificación. El producto cumple con la prueba si no se desarrollan colonias de los tipos descritos o si los resultados de las pruebas de identificación confirmatorias son negativos.
Clostridios Preparación de la Muestra y Tratamiento Térmico-Preparar una muestra usando una dilución 1 en 1O (con un volumen total mínimo de 20 ml) de no menos de 2 g o 2 ml del producto a analizar según se indica en Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano (61 ). Dividir la muestra en dos porciones de al menos 1O ml. Calentar una porción a 80º durante 1 O minutos y enfriar rápidamente. No calentar la otra porción. Selección y Subcultivo-Usar 1O ml o la cantidad correspondiente a 1 g o 1 ml del producto a analizar de ambas porciones para inocular cantidades adecuadas (determinadas según se indica en Aptitud del Método de Prueba) de Medio Reforzado para Clostridios. Incubar bajo condiciones anaeróbicas a una temperatura de 30º a 35º durante 48 horas. Después de la incubación, realizar subcultivos a partir de cada recipiente en Agar Columbia e incubar bajo condiciones anaeróbicas a una temperatura de 30º a 35º durante 48 a 72 horas. Interpretación-El crecimiento anaeróbico de bacilos (con o sin endosporas) que dan una reacción de catalasa negativa indica la presencia de Clostridios. Esto se confirma mediante pruebas de identificación. Si no se detectan colonias de los tipos descritos o si las pruebas de identificación confirmatorias resultan negativas, el producto cumple con la prueba.
Candida albicans Preparación de la Muestra e Incubación Previa-Preparar el producto a analizar según se indica en Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano (61) y usar 1O ml o la cantidad correspondiente a no menos de 1 g ó 1 ml, para inocular 100 ml de Caldo Sabouraud Dextrosa y mezclar. Incubar a una temperatura de 30º a 35º durante un período de 3 a 5 días. Selección y Subcultivo-Subcultivar en una placa de Agar Sabouraud Dextrosa e incubar a una temperatura de 30º a 35º durante un período de 24 a 48 horas. Interpretación-El crecimiento de colonias blancas puede indicar la presencia de C. albicans. Esto se confirma mediante pruebas de identificación. El producto cumple con la prueba si no se desarrollan tales colonias o si las pruebas de identificación confirmatorias resultan negativas.
Pruebas Microbiológicas/ (62) Examen Microbiológico 137
USP 39
SOLUCIONES RECOMENDADAS V MEDIOS DE CULTIVO NOTA-Esta sección se proporciona como información. Las siguientes soluciones y medios de cultivo han resultado satisfactorios en el cumplimiento de los objetivos para los cuales se indican en la prueba de contaminación microbiana en la Farmacopea. Se pueden usar otros medios siempre que se pueda demostrar su aptitud. Solución Amortiguadora Madre-Transferir 34 g de fosfato monobásico de potasio a un matraz volumétrico de 1000 ml, disolver en 500 ml de Agua Purificada, ajustar con hidróxido de sodio a un pH de 7,2 ± 0,2, agregar Agua Purificada a volumen y mezclar. Dispensar en recipientes y esterilizar. Almacenar a una temperatura de 2º a 8º. Solución Amortiguadora de Fosfato de pH 7,2-Preparar una mezcla de Agua Purificada y Solución Amortiguadora Madre (800:1 v/v) y esterilizar. Solución Amortiguada de Cloruro de Sodio-Peptona de pH 7,0 3,6 g
Fosfato Monobásico de Potasio
7,2 g (equivalente a fosfato 0,067 M)
Fosfato Dibásico de Sodio Dihidrato
4,3 g
Cloruro de Sodio
1,0 g
Peptona (de carne o caseína)
1000 ml
Agua Purificada
Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo validado. Caldo Digerido de Caseína y Soja 17,0 g
Digerido Pancreático de Caseína Digerido Papaínico de Soja
3,0 g
Cloruro de Sodio
5,0 g
Fosfato Dibásico de Potasio
2,5 g
Glucosa Monohidrato
2,5 g 1000 ml
Agua Purificada
Ajustar el pH para que después de la esterilización sea de 7,3 ± 0,2 a 25º. Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo validado. Agar Digerido de Caseína y Soja 15,0 g
Digerido Pancreático de Caseína
5,0 g
Digerido Papaínico de Soja
5,0g
Cloruro de Sodio Agar
15,0 g
Agua Purificada
1000 ml
Ajustar el pH para que después de la esterilización sea de 7,3 ± 0,2 a 25º. Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo validado. Agar Sabouraud Dextrosa Dextrosa
40,0 g
Mezcla de Digerido Péptico de Tejido Animal y Digerido Pancreático de Caseína (1 :1)
10,0 g 15,0 g
Agar
1000 ml
Agua Purificada
Ajustar el pH para que después de la esterilización sea de 5,6 ± 0,2 a 25º. Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo validado. Agar Papa Dextrosa Infusión de papas
200g
Dextrosa
20,0 g
Agar
15,0g
Agua Purificada
1000 ml
Ajustar el pH para que después de la esterilización sea de 5,6 ± 0,2 a 25º. Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo validado.
138 (62) Examen Microbiológico/ Pruebas Microbiológicas
USP 39
Caldo Sabouraud Dextrosa Dextrosa
20,0 g
Mezcla de Digerido Péptico de Tejido Animal y Digerido Pancreático de Caseína (1 :1) Agua Purificada
10,0 g 1000 mL
Ajustar el pH para que después de la esterilización sea de 5,6 ± 0,2 a 25º. Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo validado. Caldo Mossel para Enriquecimiento de Enterobacterias Digerido Pancreático de Gelatina
10,0 g
Glucosa Monohidrato
5,0 g
Bilis de Buey Deshidratada
20,0 g
Fosfato Monobásico de Potasio
2,0 g
Fosfato Dibásico de Sodio Dihidrato
8,0 g
Verde Brillante
15 mg
Agua Purificada
1000 mL
Ajustar el pH para que después del calentamiento sea de 7,2 ± 0,2 a 25º. Calentar a 100º durante 30 minutos y enfriar inmediatamente. Agar Violeta Rojo Bilis Glucosa Extracto de Levadura
3,0 g
Digerido Pancreático de Gelatina
7,0 g
Sales Biliares
1,5 g
Cloruro de Sodio
5,0 g
Glucosa Monohidrato
10,0 g
Agar
15,0 g
Rojo Neutro
30 mg
Cristal Violeta
2 mg 1000 mL
Agua Purificada
Ajustar el pH para que después del calentamiento sea de 7,4 ± 0,2 a 25º. Calentar hasta el punto de ebullición; no calentar en autoclave. Caldo MacConkey Digerido Pancreático de Gelatina
20,0 g
Lactosa Monohidrato
10,0 g
Bilis de Buey Deshidratada
5,0 g
Púrpura de Bromocresol
10 mg
Agua Purificada
1000 mL
Ajustar el pH para que después de la esterilización sea de 7,3 ± 0,2 a 25º. Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo validado. Agar MacConkey Digerido Pancreático de Gelatina Peptonas (de carne y caseína) Lactosa Monohidrato Cloruro de Sodio Sales Biliares
17,0 g 3,0 g 10,0 g 5,0 g 1,5 g
Agar
13,5 g
Rojo Neutro
30,0 mg
Cristal Violeta Agua Purificada
1 mg 1000 mL
Ajustar el pH para que después de la esterilización sea de 7, 1 ± 0,2 a 25º. Calentar a ebullición durante 1 minuto, agitando constantemente, y luego esterilizar en un autoclave usando un ciclo validado.
USP 39
Pruebas.Microbiológicas/ (62) Examen Microbiológico 139
Caldo Rappaport-Vassiliadis para Enriquecimiento de Salmonella Peptona de Soja
4,5 g
Cloruro de Magnesio Hexahidrato
29,0 g
Cloruro de Sodio
8,0 g
Fosfato Dibásico de Potasio
0,4 g
Fosfato Monobásico de Potasio
0,6 g
Verde de Malaquita
0,036 g 1000 mL
Agua Purificada
Disolver, calentando ligeramente. Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo validado a una temperatura que no exceda de 115º. El pH debe ser de 5,2 ± 0,2 a 25º luego del calentamiento y esterilización en autoclave. Agar Xilosa Lisina Desoxicolato Xi losa
3,5 g
L-Lisina
5,0 g
Lactosa Monohidrato
7,5 g
Sacarosa
7,5 g
Cloruro de Sodio
5,0 g
Extracto de Levadura
3,0 g
Rojo de Fenal
80 mg
Agar
13,5 g
Desoxicolato de Sodio
2,5 g
Tiosulfato de Sodio
6,8 g
Citrato Férrico Amónico
0,8 g
Agua Purificada
1000 mL
Ajustar el pH para que después del calentamiento sea de 7,4 ± 0,2 a 25º. Calentar a ebullición, enfriar a 50º y verter en placas de Petri. No calentar en un autoclave. Agar Cetrlmida Digerido Pancreático de Gelatina
20,0 g
Cloruro de Magnesio
1,4 g
Sulfato de Potasio
10,0 g
Cetrimida
0,3 g
Agar
13,6 g
Agua Purificada
1000 mL
Glicerol
10,0 mL
Calentar a ebullición durante 1 minuto con agitación. Ajustar el pH para que después de la esterilización sea de 7,2 25º. Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo validado.
± 0,2 a
Agar Manitol Salado Digerido Pancreático de Caseína
5,0g
Digerido Péptico de Tejido Animal
5,0 g
Extracto de Carne
1,0 g
D-Manitol
10,0 g
Cloruro de Sodio
75,0 g
Agar
15,0 g
Rojo de Fenal
0,025 g
Agua Purificada
1000 mL
Calentar a ebullición durante 1 minuto con agitación. Ajustar el pH para que después de la esterilización sea de 7,4 25º. Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo validado. Medio Reforzado para Clostridios Extracto de Carne
10,0 g
Peptona
10,0 g
Extracto de Levadura
3,0 g
± 0,2 a
140 (62) Examen Microbiológico/ Pruebas Microbiológicas
USP 39
Medio Reforzado para Clostridios Almidón Soluble
1,0 g
Glucosa Monohidrato
5,0 g
Clorhidrato de Cisteína
0,5 g
Cloruro de Sodio
5,0 g
Acetato de Sodio
3,0 g
Agar
0,5 g
Agua Purificada
1000 ml
Hidratar el agar y disolver calentando hasta ebullición y revolviendo constantemente. Si fuera necesario, ajustar el pH para que después de la esterilización sea de 6,8 ± 0,2 a 25º. Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo validado. Agar Columbia Digerido Pancreático de Caseína
10,0 g
Digerido Péptico de Carne
5,0 g
Digerido Pancreático de Corazón
3,0 g
Extracto de Levadura
5,0 g
Almidón de Maíz
1,0 g
Cloruro de Sodio
5,0 g
Agar, de acuerdo con la capacidad de gelificación
10,0-15,0 g
Agua Purificada
1000 ml
Hidratar el agar y disolver calentando hasta ebullición y revolviendo constantemente. Si fuera necesario, ajustar el pH para que después de la esterilización sea de 7,3 ± 0,2 a 25º. Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo validado. Dejar enfriar a una temperatura de 45º a 50º, agregar, cuando sea necesario, sulfato de gentamicina correspondiente a 20 mg de gentamicina base y verter en placas de Petri.
(63) PRUEBAS PARA MICOPLASMAS INTRODUCCIÓN El género micoplasma representa un grupo de bacterias diminutas que no tienen pared celular. Este género comprende más de 120 especies. Son los organismos procariotas autorreplicantes más pequeños. Las células varían en tamaño y morfología y no se pueden colorear con Gram, pero las impresiones de las colonias sobre agar sólido se pueden colorear con azul de metileno o una tinción equivalente. Los micoplasmas son parásitos y comensales, y algunos pueden ser patógenos para una gran variedad de huéspedes animales y vegetales. En humanos, los micoplasmas son por lo general parásitos de superficie que colonizan el epitelio de los tractos respiratorio y urogenital. Los micoplasmas son comunes y pueden ser causa de contaminación seria en los cultivos de células y/o tejidos usados para producir artículos farmacopeicos. También pueden causar contaminación en el caldo de digestión de caseína de soja filtrado y esterilizado. Una infección en un cultivo celular puede persistir por un periodo prolongado sin causar un daño celular aparente. La infección de las células en un cultivo puede afectar prácticamente todas las vías del metabolismo celular, alterando incluso las características fenotípicas de las células y su crecimiento normal. La presencia de especies de micoplasma no siempre trae como resultado turbidez debido a crecimiento en los cultivos o una alteración visible de las células. La prueba para detección de micoplasmas es un requisito necesario de control de calidad para garantizar de manera confiable la pureza de los productos biotecnológicos y de los materiales afines usados para producir dichos productos. Este capítulo de pruebas generales describe dos métodos requeridos para detectar la contaminación por micoplasma en los artículos de prueba y en los cultivos tisulares y/o celulares usados para producir dichos artículos, caldos de digestión o cualquier otro material en el que se sospeche contaminación por micoplasma. Estos son: (A) el procedimiento en medios de agar y caldos y (B) el procedimiento en cultivo de células indicadoras. Estas pruebas requieren una cuidadosa técnica aséptica y condiciones de laboratorio apropiadas. Con el fin de garantizar que las pruebas y la interpretación de los resultados sean apropiadas, el personal debe estar adecuadamente capacitado y calificado. Para detectar micoplasmas se puede utilizar una técnica validada de amplificación de ácidos nucleicos (NAT, por sus siglas en inglés) o un método basado en la actividad enzimática, siempre que el método usado demuestre ser comparable con ambos métodos (A) y (B). Los métodos alternativos se deben validar apropiadamente. Los requisitos de validación para los métodos alternativos no se tratarán en este capítulo.
Pruebas Microbiológicas/ (63) Pruebas para Micoplasmas 141
USP 39
MÉTODO DE CULTIVO Elección de los Medios de Cultivo La prueba se efectúa usando un número suficiente de medios de cultivo tanto sólidos como líquidos para garantizar el crecimiento en las condiciones de incubación elegidas de pequeñas cantidades de micoplasmas (aproximadamente 100 unidades formadoras de colonias o ufc; o 100 unidades cambiadoras de color, o ucc) que puedan estar presentes en el artículo o material de prueba. Los medios de cultivo líquidos deben contener rojo de fenol. La gama de medios de cultivo escogidos ha demostrado tener propiedades nutritivas satisfactorias al menos para los microorganismos que aparecen en Cepas de Microorganismos de Prueba para Control de Calidad (a continuación). Las propiedades nutritivas de cada nuevo lote de medio de cultivo se verifican para los microorganismos apropiados en la lista. Cuando se hagan las pruebas para micoplasmas se deben incluir en cada una al menos dos especies o cepas conocidas de micoplasmas (listadas en Cepas de Microorganismos de Prueba para Control de Calidad) como controles positivos, una de las cuales debe ser fermentadora de dextrosa (es decir, M. pneumoniae o una especie y cepa equivalente) y la otra debe ser hidrolizadora de arginina (es decir, M. ora/e o una especie y cepa equivalente). Solo al examinar líneas celulares de insectos se debe incluir una cepa de control de espiroplasma (p.ej., S. citri ATCC 29747, S. melliferum ATCC 29416 o una especie y cepa equivalente). Adicionalmente, estas cepas pueden ser un poco más exigentes en sus requerimientos nutricionales. Necesitan temperaturas de incubación más bajas (al igual que las líneas celulares de insectos).
Cepas de Microorganismos de Prueba para Control de Calidad Los cultivos de controles positivos no deben tener más de 15 pases desde el aislamiento. Las especies o cepas de micoplasmas aptas para el uso se enumeran a continuación: - Acholeplasma laidlawii (vacunas y/o materiales derivados de células o cultivos para uso humano y veterinario cuando se ha usado un antibiótico durante la producción) - M. gallisepticum (cuando se ha usado material aviar durante la producción o cuando la vacuna o el cultivo celular están destinados al uso en aves de corral) - M. hyorhinis (vacunas o cultivos celulares veterinarios no aviares) - M. ora/e (vacunas para uso humano y veterinario) - M. pneumoniae (vacunas o bancos de células para uso humano) u otras especies apropiadas de fermentadores de o-glucosa como M. fermentans - M. synoviae (cuando se ha usado material aviar durante la producción o cuando la vacuna o el banco de células está destinado al uso en aves de corral) Las cepas de prueba pueden ser aislados de campo que han sufrido un número limitado de subcultivos (no más de 15), se almacenan congeladas (-20º o menos) o liofilizadas y se identifican como pertenecientes a las especies requeridas, por comparación con cultivos tipo, por ejemplo, los que aparecen en la Tabla 7. Tabla 1. Cultivos Tipo para Identificar Aislados de Campo Usados como Cepas de Prueba Número NCTC
Número CIP
Número ATCC
A. laidlawii
NCTC10116
CIP 75,27
ATCC 23206
M. gallisepticum
NCTC 10115
CIP 104967
ATCC 19610
M. fermentans
NCTC 10117
CIP 105680
ATCC 19989
M. hyorhinis
NCTC 10130
CIP 104968
ATCC 17981
M. ora/e
NCTC 10112
CIP 104969
ATCC 23714
M. pneumoniae
NCTC 10119
CIP 103766
ATCC 15531
M. synoviae
NCTC 10124
CIP 104970
ATCC 25204
Organismo de Prueba
Condiciones de Incubación Incubar los medios de cultivo líquidos en recipientes herméticamente tapados a 36±1 º. Incubar los medios de cultivo sólidos en condiciones microaerofílicas (atmósfera de hidrógeno que contenga< 0,5% de oxígeno y/o nitrógeno que contenga 5% a 10% de dióxido de carbono en nitrógeno). Debe aportarse la humedad suficiente para evitar la desecación de la superficie del agar a 36 ± 1º.
Propiedades Nutritivas Efectuar la prueba de propiedades nutritivas para cada nueva partida de medio de cultivo. Inocular el medio de cultivo elegido con los microorganismos de prueba apropiados; no usar más de 100 ufc por placa que contenga al menos 9 mL de medio de cultivo sólido y por recipiente de 100 mL de medio de cultivo líquido; usar una placa y un recipiente aparte para cada especie de microorganismo. Incubar el medio de cultivo y hacer subcultivos a partir de 0,2 mL de medio líquido en medio sólido a
142 (63) Pruebas para Micoplasmas / Pruebas Microbiológicas
USP 39
los intervalos especificados (ver a continuación en Prueba de Micoplasmas en el Material o Artículo de Prueba). El medio sólido cumple con la prueba si se encuentra un recuento dentro del intervalo de 0,5 unidades logarítmicas de la cantidad inoculada para cada microorganismo de prueba. El medio líquido cumple con la prueba si se encuentra crecimiento en las placas de agar subcultivadas a partir del caldo, por lo menos en 1 subcultivo para cada microorganismo de prueba. El uso de un microscopio con un aumento de 1OOx o mayor puede ser útil.
Sustancias lnhibidoras La prueba de sustancias inhibidoras se efectúa una vez para un producto determinado y se repite siempre que haya un cambio en el método de producción que pueda afectar la detección de micoplasmas. Para demostrar la ausencia de sustancias inhibidoras, llevar a cabo la prueba de propiedades nutritivas en presencia y ausencia del artículo o material de prueba. Si el crecimiento de un microorganismo de prueba en más de 1 subcultivo ocurre en ausencia del artículo o material de prueba antes que en su presencia, se encuentran presentes sustancias inhibidoras. Lo mismo es cierto si las placas directamente inoculadas con el artículo o material de prueba no están dentro del intervalo de 0,5 unidades logarítmicas del número de colonias de aquellas inoculadas sin el artículo o material de prueba. En ambos casos, las sustancias inhibidoras se deben neutralizar o contrarrestar su efecto por un método apropiado; por ejemplo, por pase en sustratos que no contengan inhibidores o por dilución en un volumen mayor de medio antes de la prueba. Si se usa la dilución, se pueden usar volúmenes mayores de medio o se puede dividir el volumen del inóculo en varios matraces de 100 ml. La eficacia de la neutralización o de otros procesos se controla repitiendo la prueba de sustancias inhibidoras después de la neutralización.
Prueba para Micoplasmas en el Artículo o Material de Prueba Inocular no menos de 1 O mL del artículo o material de prueba por 100 mL de cada medio líquido. Si ocurre un cambio de pH significativo después de la adición del artículo o material de prueba, se restablece el valor original de pH del medio de cultivo por medio de la adición de una solución estéril de hidróxido de sodio o de ácido clorhídrico. Inocular 0,2 mL del artículo o material de prueba en cada placa de medio sólido. Incubar el medio líquido durante 20 a 21 días. Incubar el medio sólido durante no menos de 14 días, excepto para aquellas placas correspondientes al subcultivo de 20 a 21 días, las cuales se incuban durante 7 días. Simultáneamente, incubar una porción de 100 mL, sin inóculo, de cada medio líquido y placa de agar, como control negativo. En los días 2 a 4 después de la inoculación, subcultivar cada medio líquido por inoculación de 0,2 mL al menos en 1 placa de cada medio sólido. Repetir el procedimiento entre los días 6 y 8, de nuevo entre los días 1 3 y 15 y una vez más entre los días 19 y 21 de la prueba. Observar el medio líquido cada 2 ó 3 días y si se presenta un cambio de color, subcultivar. Si un medio líquido muestra contaminación bacteriana o fúngica, la prueba es inválida. La prueba es válida si se puede leer al menos 1 placa por medio y por día de inoculación. Incluir en la prueba controles positivos preparados por inoculación de no más de 100 ufc de al menos 1 microorganismo de prueba en medio de agar o caldo. Cuando se lleve a cabo la prueba de detección de micoplasmas periódicamente, se recomienda utilizar los microorganismos de prueba en rotación periódica. Los microorganismos de prueba usados son los listados en Elección de los Medios de Cultivo. Incubar los caldos nutritivos y las placas en una atmósfera humidificada con condiciones microaerofílicas (5% a 10% de C0 2 ).
Interpretación de los Resultados Al finalizar el periodo de incubación prescrito, examinar todos los medios sólidos inoculados en busca de la presencia de colonias de micoplasmas. El producto cumple con la prueba si no ha ocurrido crecimiento de las colonias típicas de micoplasmas. El producto no cumple con la prueba si ha ocurrido crecimiento de las colonias típicas de micoplasmas en cualquiera de los medios sólidos. La prueba es inválida si 1 o más de los controles positivos no muestra crecimiento de micoplasmas al menos en 1 placa de subcultivo. La prueba es inválida si 1 o más de los controles negativos muestra crecimiento de micoplasmas. Si se observan colonias sospechosas, usar un método validado apropiado para determinar si se deben a micoplasmas.
Soluciones y Medios Recomendados para el Método de Cultivo NOTA-Esta sección se proporciona como información. SOLUCIONES Caldo de infusión de Corazón Vacuno Corazón vacuno (para preparar la infusión)
500 g
Peptona
10 g
Cloruro de sodio Agua destilada
Sg hasta 1000 ml
USP 39
Pruebas Microbiológicas/ (63) Pruebas para Micoplasmas 143
Vitaminas Esenciales Biotina
100 mg
Pantotenato de calcio
100 mg
Cloruro de colina
100 mg
Ácido fálico
100 mg
i-lnositol
200 mg
Nicotinamida
100 mg
Clorhidrato de piridoxal
100 mg
Riboflavina
10 mg
Clorhidrato de tiamina
100 mg
Agua destilada
hasta 1000 m L
Agar, Purificado Un agar altamente refinado para usar en microbiología e inmunología, preparado por un procedimiento de intercambio iónico que da como resultado un producto con superior pureza, claridad y poder gelificante. Contiene los siguientes ingredientes: Agua
12,2%
Cenizas
1,5%
Cenizas insolubles en ácido
0,2%
o
Cloro Fosfato (calculado como P2 0 5 )
0,3%
Nitrógeno total
0,3%
Cobre
8 ppm
Hierro
170 ppm
Calcio
0,28%
Magnesio
0,32%
Solución Salina Balanceada de Hanks (modificada) Cloruro de sodio
6,4 g
Cloruro de potasio
0,32 g
Sulfato de magnesio heptahidrato
0,08 g
Cloruro de magnesio hexahidrato
0,08 g
o, 112 g
Cloruro de calcio anhidro Fosfato ácido disódico dihidrato
0,0596 g
Fosfato diácido de potasio anhidro
0,048 g
Agua destilada
hasta 800 ml
Infusión de Cerebro-Corazón Infusión de cerebro de ternero
200 g
Infusión de corazón vacuno
250 g 1o g
Proteosa peptona Glucosa monohidrato
2g
Cloruro de sodio
5g
Fosfato ácido disódico anhidro
2,5 g
Agua destilada
hasta 1000 ml
Caldo PPLO Infusión de corazón vacuno
50 g
Peptona
1o g
Cloruro de sodio
5g
Agua destilada
hasta 1000 m L
MEDIOS
Se recomiendan los siguientes medios. Se pueden usar otros medios, siempre que cumplan los criterios dados en las secciones Elección de los Medios de Cultivo, Condiciones de Incubación, Propiedades Nutritivas y Sustancias lnhibidoras.
144 (63) Pruebas para Micoplasmas J Pruebas Microbiológicas
USP 39
Medios de Hayfllck recomen d ad o para 1a detecc I'on genera Id e m1cop asmas Medio Líquido Caldo de infusión de corazón vacuno
90,0 ml
Suero de caballo (sin calentar)
20,0 ml
Extracto de levadura (250 c¡/L) (se recomienda extracto de levadura fresca)
10,0 ml
Rojo de fenol (solución de 0,6 g/L)
5,0 mL
Penicilina (20 000 Ul/ml)
0,25 ml
Ácido desoxirribonucleico (solución de 2 g/L)
1,2 ml
Ajustar a un pH de 7,8 Medio Sólido Preparar como se describió anteriormente, reemplazando el caldo de infusión de corazón vacuno por agar de infusión de corazón vacuno que cantenqa 15 g/L de agar.
Medios de Frey (recomenda do para la deteccI'on de M. synoviae) Medio Líquido Caldo de infusión de corazón vacuno
90,0 ml
Vitaminas esenciales
0,025 ml
Glucosa monohidrato (solución de 500 g/L)
2,0 ml
Suero de cerdo (inactivado a 56º durante 30 min)
12,0ml
P -Nicotinamida adenina dinucleótido (solución de 1O g/L)
1,0 ml
Clorhidrato de cisteína (solución de 1O c¡/L)
1,0 ml
Rojo de fenal (solución de 0,6 g/L)
5,0 ml
Penicilina (20 000 Ul/ml)
0,25 ml
Mezclar las soluciones de p -nicotinamida adenina dinucleótido y clorhidrato de cisteína y después de 1O minutos agregar a los demás ingredientes. Ajustar a un pH de 7,8 Medio Sólido Caldo de infusión de corazón vacuno
90,0 ml
Agar, purificado
1,4 q
Ajustar a un pH de 7,8; esterilizar en autoclave y lueqo agregar: Vitaminas esenciales
0,025 ml
Glucosa monohidrato (solución de 500 g/L)
2,0 ml
Suero de cerdo (sin calentar)
12,0 ml
p -Nicotinamida adenina dinucleótido (solución de 1O g/L)
1,0 ml
Clorhidrato de cisteína (solución de 1O g/L)
1,0 ml
Rojo de fenal (solución de 0,6 g/L)
5,0 ml
Penicilina (20 000 Ul/ml)
0,25 ml
Medios de Frlls (recomendado para la detección de mlcoplasmas no aviares) Medio Líquido Solución salina balanceada de Hanks (modificada)
800 ml
Agua destilada
67 mL
Infusión de cerebro-corazón
135 ml
Caldo PPLO
248 ml
Extracto de levadura (170 g/L)
60 ml
Bacitracina
250 mg
Meticilina
250 mg
Rojo de fenal (5 g/L)
4,5 ml
Suero de caballo
165 mL
Suero de cerdo
165 ml
Ajustar a un pH de 7,40 a 7,45
Pruebas Microbiológicas/ (63) Pruebas para Micoplasmas 145
USP 39
Medios de Frlls (recomendado para la detección de micoplasmas no aviares) (Continuación) Medio Sólido Solución salina balanceada de Hanks (modificada)
200 ml
DEAE-dextrano
200 mg
Agar, purificado
15,65 g
Mezclar bien y esterilizar en autoclave. Enfriar a 100º. Agregar a 1740 ml de Medio Líquido como se describió anteriormente.
MÉTODO DE CULTIVO DE CÉLULAS INDICADORAS Los cultivos celulares se tiñen con un colorante fluorescente que se une al ADN. Los micoplasmas se detectan por su patrón de fluorescencia filamentoso o particulado característico sobre la superficie celular y, si la contaminación es abundante, en las áreas vecinas. Las mitocondrias en el citoplasma se pueden teñir pero se distinguen fácilmente de los micoplasmas. Para suspensiones virales, si la interpretación de los resultados se ve afectada por efectos citopáticos marcados, neutralizar el virus usando un antisuero específico que no tenga efectos inhibidores sobre los micoplasmas o usar un sustrato de cultivo celular que no permita el crecimiento del virus. Para demostrar la ausencia de efectos inhibidores del suero, efectuar las pruebas con controles positivos en presencia y ausencia del antisuero.
Verificación del Sustrato Usar células Vero o un cultivo celular equivalente (por ejemplo, la línea de células de producción) que tenga una eficacia equivalente para detectar micoplasmas. Probar la eficacia de las células que se van a usar aplicando el procedimiento descripto a continuación e inoculando no más de 100 ufc o ucc de microorganismos de cepas de referencia adecuadas de M. hyorhinis y M. ora/e. Las células son adecuadas si se detectan ambas cepas de referencia. Las células indicadoras se deben subcultivar sin antibióticos antes de usarlas en la prueba.
Método de Prueba NOTA-Lo siguiente se proporciona como información. SOLUCIONES Solución Salina Amortiguada con Fosfato Fosfato Monobásico de Potasio 2,0 M-Disolver 13,61 g de fosfato monobásico de potasio anhidro en 50 mL de agua. Fosfato Dibásico de Potasio 2,0 M-Disolver 17,42 g de fosfato dibásico de potasio anhidro en 50 mL de agua. Solución Salina Amortiguada con Fosfato (pH 7,4)-Combinar 3,6 mL de Fosfato Monobásico de Potasio 2,0 M, 16,4 mL de Fosfato Dibásico de Potasio 2,0 M, 8 g de cloruro de sodio, y 1 L de agua. Mezclar bien. Ajustar el pH si fuera necesario. Solución Madre de Bisbenzimida-Disolver 5 mg de bisbenzimida en agua y diluir con el mismo disolvente hasta 100 ml. Almacenar en la oscuridad. Solución de Trabajo de Bisbenzimida-lnmediatamente antes de usar, diluir 100 µL de Solución Madre de Bisbenzimida con Solución Salina Amortiguada con Fosfato (pH 1,4) hasta 100 ml. Solución Amortiguadora de Fosfato-Citrato de pH 5,5-Mezclar 56,85 mL de una solución de 28,4 g/L de fosfato ácido disódico anhidro y 43, 15 mL de una solución de 21 g/L de ácido cítrico. MÉTODO 1. Sembrar el cultivo de células indicadoras con una densidad apropiada (por ejemplo, 2 x 104 a 2 x 1os células/mL, 4 x 1 Q3 a 2,5 x 104 células/cm 2 ) que lleven a la confluencia después de 3 días de crecimiento. Inocular 1 mL del producto a examinar en el recipiente con cultivo celular e incubar a 36 ± 1º. 2. Después de 3 días de incubación como mínimo, cuando las células hayan alcanzado la confluencia, hacer un subcultivo sobre cubreobjetos en recipientes adecuados o sobre alguna otra superficie (por ejemplo, portaobjetos con cámara para cultivo) adecuada para el procedimiento de prueba. Sembrar las células con baja densidad, de forma que puedan alcanzar una confluencia del 50% después de 3 a 5 días de incubación. La confluencia completa impide la visualización de micoplasmas después de la tinción y debe evitarse. 3. Retirar el medio y enjuagar las células indicadoras con solución salina amortiguada con fosfato, pH 7,4; luego agregar una solución fijadora adecuada (una mezcla recién preparada de 1 volumen de ácido acético glacial SR y 3 volúmenes de metano! se considera adecuada cuando se usa bisbenzimida para la tinción). 4. Retirar la solución fijadora y lavar las células con Agua Purificada estéril. Secar los portaobjetos completamente si se van a colorear más de 1 hora después (es preciso tener especial cuidado cuando se colorean las láminas después del secado debido a los artefactos que se podrían producir).
USP 39
146 (63) Pruebas para Micoplasmas / Pruebas Microbiológicas
5. Agregar un colorante apto para ADN y dejar en reposo durante el tiempo adecuado (la solución de trabajo de bisbenzimida y un tiempo de reposo de 1O minutos se consideran adecuados). 6. Retirar el colorante y enjuagar la monocapa con Agua Purificada. 7. Montar cada cubreobjetos, cuando corresponda (una mezcla de volúmenes iguales de glicerol y Solución Amortiguadora de Fosfato-Citrato de pH 5,5 es apropiada para el montaje). Examinar por fluorescencia (para la coloración con bisbenzimida resulta apropiado usar un filtro de excitación de 330 nm a 380 nm y un filtro de barrera LP de 440 nm) con un aumento de 400x o mayor. 8. Comparar la apariencia microscópica de los cultivos de prueba con la de los controles negativos y positivos, buscando fluorescencia extranuclear. Los micoplasmas producen puntitos o filamentos en el citoplasma de la célula indicadora. También pueden producir puntitos y filamentos en los espacios intercelulares. Siguiendo el protocolo establecido durante la validación, se examinan múltiples campos microscópicos.
Interpretación de los Resultados El producto a examinar cumple con la prueba si no está presente la fluorescencia típica de los micoplasmas. La prueba es inválida si los controles positivos no presentan la fluorescencia típica de los micoplasmas. La prueba es inválida si los controles negativos presentan la fluorescencia típica de los micoplasmas.
(71) PRUEBAS DE ESTERILIDAD •Algunas partes de este capítulo general han sido armonizadas con los textos correspondientes de la Farmacopea Europea y/o la Farmacopea Japonesa. Las partes no armonizadas están marcadas con los símbolos (+.) para indicar esta situación .• Estos procedimientos farmacopeicos no se han diseñado para garantizar que una partida de un producto es estéril o ha sido esterilizada. Esta garantía se consigue principalmente mediante la validación del proceso de esterilización o de los procedimientos del procesamiento aséptico. La prueba se aplica a sustancias, preparaciones o artículos cuya esterilidad es requerida por Ja Farmacopea. Sin embargo, un resultado satisfactorio únicamente indica que no se han encontrado microorganismos contaminantes en la muestra examinada bajo las condiciones de la prueba.
PRECAUCIONES CONTRA LA CONTAMINACIÓN MICROBIANA La prueba de esterilidad se lleva a cabo bajo condiciones asépticas, por lo que, para lograr tales condiciones, el entorno de la prueba debe adaptarse a la manera en que ésta se realice. Las precauciones para evitar la contaminación se deben tomar de modo tal que no se afecte a ningún microorganismo que deba detectarse en esta prueba. Las condiciones de trabajo en las que se efectúan las pruebas se monitorean regularmente mediante el muestreo adecuado del área de trabajo y la realización de controles apropiados.
MEDIOS DE CULTIVO Y TEMPERATURAS DE INCUBACIÓN Los medios para la prueba se pueden preparar según se indica a continuación o se pueden usar medios equivalentes disponibles comercialmente siempre y cuando cumplan con los requisitos de la Prueba de Promoción del Crecimiento de Organismos Aerobios, Anaerobios y Hongos.
Se ha hallado que los medios de cultivo siguientes son adecuados para la prueba de esterilidad. El Medio Líquido de Tioglicolato sirve principalmente para el cultivo de bacterias anaerobias. Sin embargo, también detecta bacterias aerobias. El Medio de Digerido de Caseína y Soja es adecuado para el cultivo tanto de hongos como de bacterias aerobias. Medio Líquido de Tioglicolato L-Cistina Cloruro de Sodio Dextrosa Monohidrato/ Anhidra Agar Extracto de Levadura (soluble en agua) Digerido Pancreático de Caseína
0,5 g 2,5 g 5,5/5,0 g 0,75 g 5,0 g 15,0 g
USP 39
Pruebas Microbiológicas/ (71) Pruebas de Esterilidad 147
Medio Líquido de Tioglicolato (Continuación)
Tioglicolato de Sodio o Ácido Tioglicólico Solución de Resazurina Sódica (1 en 1000), recién preparada Agua Purificada
0,5 g 0,3 mL 1,0 mL 1000 mL
El pH después de la esterilización es de 7, 1 ± 0,2. Mezclar la L-cistina, el agar, el cloruro de sodio, la dextrosa, el extracto de levadura y el digerido pancreático de caseína con el agua purificada y calentar hasta su disolución. Disolver el tioglicolato de sodio o el ácido tioglicólico en la solución y, de ser necesario, agregar hidróxido de sodio 1 N de modo que, después de la esterilización, la solución tenga un pH de 7, 1 ± 0,2. Si se requiere filtración, calentar nuevamente la solución sin llegar a ebullición y filtrar mientras está caliente a través de un papel de filtro humedecido. Agregar la solución de resazurina sódica, mezclar y colocar el medio en recipientes adecuados, de forma que la relación entre superficie y profundidad sea tal que no más de la mitad superior del medio haya experimentado un cambio de color indicativo de la captación de oxígeno al final del período de incubación. Esterilizar usando un proceso validado. Si el medio se almacena, mantenerlo a una temperatura entre 2º y 25º en un envase estéril y hermético. Si una porción mayor que el tercio superior del medio ha adquirido un color rosado, el medio puede recuperarse una vez calentando los recipientes en un baño de agua o en vapor fluente hasta que desaparezca el color rosado, y enfriar rápidamente tratando de evitar la entrada de aire no estéril en el recipiente. No usar el medio por un periodo de almacenamiento más largo que el que ha sido validado. El Medio Líquido de Tioglicolato debe incubarse a 30º-35º. Para productos que contienen un conservante mercurial que no se pueden analizar mediante el método de filtración por membrana, se puede utilizar Medio Líquido de Tioglicolato incubado a 20º-25º en lugar de Medio de Digerido de Caseína y Soja, siempre y cuando haya sido validado según se indica en Prueba de Promoción del Crecimiento de Organismos Aerobios, Anaerobios y Hongos. Es posible utilizar el siguiente medio de tioglicolato alternativo para los casos en que se prescriba o justifique y autorice. Preparar una mezcla que tenga la misma composición que la del Medio Líquido de Tioglicolato, pero omitiendo el agar y la solución de resazurina sódica. Esterilizar según se indica anteriormente. El pH después de la esterilización es 7,1 ± 0,2. Calentar en un baño de agua antes de usar e incubar a 30º-35º bajo condiciones anaeróbicas. Medio de Digerido de Caseína y Soja
Digerido Pancreático de Caseína
17,0 g
Digerido Papaínico de Harina de Soja Cloruro de Sodio Fosfato Dibásico de Potasio Dextrosa Monohidrato/Anhidra Agua Purificada
3,0 g 5,0 g 2,5 g 2,5/2,3 g 1000 ml
El pH después de la esterilización es de 7,3 ± 0,2. Disolver los sólidos en el Agua Purificada, calentando ligeramente hasta lograr la disolución. Enfriar la solución a temperatura ambiente y ajustar el pH con hidróxido de sodio 1 N de modo que, después de la esterilización, se obtenga un pH de 7,3 ± 0,2. Filtrar el medio si fuera necesario para lograr una solución transparente, y verter en recipientes adecuados y esterilizar usando un procedimiento validado. Almacenar a temperatura entre 2º y 25º en un recipiente estéril y bien cerrado, a menos que se use inmediatamente. No usar el medio por un periodo de almacenamiento más largo que el que ha sido validado. El Medio de Digerido de Caseína y Soja debe incubarse a 22,5 ± 2,5º.
•Medios para Penicilinas o Cefalosporinas Cuando deban usarse medios de prueba de esterilidad en el método de Inoculación Directa del Medio de Cultivo que se indica en Prueba de Esterilidad del Producto a Examinar, modificar la preparación del Medio Líquido de Tioglico/ato y del Medio de Digerido de Caseína y Soja según se indica a continuación. Transferir asépticamente a los recipientes de cada medio una cantidad de f3 -lactamasa suficiente para inactivar la cantidad de antibiótico presente en la muestra de prueba. Determinar la cantidad de /3 -lactamasa requerida para inactivar el antibiótico empleando una preparación de f3 -lactamasa cuyo poder inactivante de penicilinas o cefalosporinas haya sido valorado previamente. [NOTA-Los medios complementados con /J-lactamasa también pueden usarse en la prueba de filtración por membrana.] Alternativamente (en un lugar completamente separado del usado para las pruebas de esterilidad), confirmar que se incorpora una cantidad adecuada de /3 -lactamasa en el medio, siguiendo cualquiera de los dos métodos indicados en Prueba de Aptitud del Método, usando como desafío menos de 100 unidades formadoras de colonias (ufc) de Staphylococcus aureus (ver Tabla 7). Debe observarse un crecimiento microbiano típico del cultivo inoculado como confirmación de que la concentración de f3 -lactamasa es adecuada .•
148 (71) Pruebas de Esterilidad / Pruebas Microbiológicas
USP 39
Tabla 1. Cepas de Microorganismos de Prueba Adecuados para Usar en la Prueba de Promoción del Crecimiento y en la Prueba de Aptitud del Método Bacterias Aerobias Staphylocaccus aureus
ATCC 6538, CIP 4.83, NCTC 10788, NCIMB 9518, NBRC 13276
Bacillus subtilis
ATCC 6633, CIP 52.62, NCIMB 8054, NBRC 3134
Pseudomonas aeruginosa• \
ATCC 9027, NCIMB 8626, CIP 82.118, NBRC 13275
Bacteria anaerobia Clostridium sporogenes• 2 •
ATCC 19404, CIP 79.3, NCTC 532 or ATCC 11437, NBRC 14293
Hongos Candida a/bicans
ATCC 10231, IP48.72, NCPF 3179, NBRC 1594
Aspergillus brasiliensis (Aspergillus Níger)
ATCC 16404, IP 1431.83, IMI 149007, NBRC 9455
•1 •2
Un microorganismo alternativo es Kocuria rhizophifo (Micrococcus futeus) ATCC 9341 .• Una alternativa para Clostridium sporogenes, cuando se desea usar un microorganismo no formador de esporas, es Bacteroides vufgatus (ATCC 8482) .•
Los medios usados cumplen con las pruebas siguientes, realizadas antes o en forma paralela, con la prueba sobre el producto a examinar.
Esterilidad Incubar porciones del medio durante 14 días. No se produce crecimiento de ningún organismo.
Prueba de Promoción del Crecimiento de Organismos Aerobios, Anaerobios y Hongos Evaluar cada lote de medio listo para usar, y cada partida de medio preparado ya sea a partir de medio deshidratado o mezclando los ingredientes. Las cepas adecuadas de microorganismos se indican en la Tabla 1. Inocular porciones de Medio Líquido de Tioglicolato con un número pequeño (no más de 100 ufc) de los microorganismos siguientes, usando una porción de medio distinta para cada una de las especies: Clostridium sporogenes, Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus. •Inocular porciones de medio de tioglicolato alternativo con un número pequeño (no más de 100 ufc) de Clostridium sporogenes .• Inocular porciones de Medio de Digerido de Caseína y Soja con un número pequeño (no más de 100 ufc) de los microorganismos siguientes, usando una porción de medio distinta para cada una de las especies: Aspergillus brasiliensis, Bacillus subtilis y Candida albicans. Incubar durante no más de 3 días en el caso de bacterias y durante no más de 5 días en el caso de hongos. Las técnicas de mantenimiento de cultivos de lote de siembra (sistemas de lote de siembra) se usan para que los microorganismos viables empleados para la inoculación correspondan a no más de cinco pasajes desde el lote de siembra maestro original. Los medios son adecuados si se produce un crecimiento claramente visible de los microorganismos.
•LÍQUIDOS DE DILUCIÓN V LAVADO PARA FILTRACIÓN POR MEMBRANA Líquido A PREPARACIÓN Disolver 1 g de digerido péptico de tejido animal en agua para obtener 1 litro, filtrar o centrifugar para clarificar, si fuera necesario, y ajustar a un pH de 7, 1 ± 0,2. Transferir a envases y esterilizar empleando un proceso validado. PREPARACIÓN PARA PENICILINAS O CEFALOSPORINAS Agregar asépticamente a la Preparación anterior, si fuera necesario, una cantidad de fJ-lactamasa estéril suficiente para inactivar cualquier actividad residual de antibióticos en las membranas después de haber filtrado la solución de la muestra de prueba (ver Medios para Penicilinas o Cefalosporinas).
Líquido D Agregar 1 mL de polisorbato 80 por cada litro de Líquido A, y ajustar a un pH de 7, 1 ± 0,2. Transferir a envases y esterilizar empleando un proceso validado. Usar este líquido para artículos que contengan lecitina o aceite, o para dispositivos etiquetados "para administración estéril".
USP 39
Pruebas Microbiológicas / (71) Pruebas de Esterilidad 149
Líquido K Disolver 5,0 g de digerido péptico de tejido animal, 3,0 g de extracto de carne bovina y 10,0 g de polisorbato 80 en agua para obtener 1 litro. Ajustar el pH para obtener, después de la esterilización, un pH de 6,9 ± 0,2. Transferir a envases y esterilizar empleando un proceso validado .•
PRUEBA DE APTITUD DEL MÉTODO Llevar a cabo una prueba según se describe más adelante en Prueba de Esterilidad del Producto a Examinar usando exactamente los mismos métodos, a excepción de las modificaciones siguientes.
Filtración por Membrana Después de transferir a la membrana el contenido del envase o envases a analizar, agregar un inóculo de un número pequeño de microorganismos viables (no más de 100 ufc) en la porción final del diluyente estéril usado para enjuagar el filtro.
Inoculación Directa Después de transferir al medio de cultivo el contenido del envase o envases a analizar (para catgut y otros materiales de sutura quirúrgica para uso veterinario: hebras), agregar al medio un inóculo de un número pequeño de microorganismos viables (no más de 100 ufc). En ambos casos, usar los mismos microorganismos que los mencionados anteriormente en Prueba de Promoción del Crecimiento de Organismos Aerobios, Anaerobios y Hongos. Realizar una prueba de promoción del crecimiento como control positivo. Incubar todos los recipientes que contienen medio durante no más de 5 días. Si después de la incubación se obtiene un crecimiento claramente visible de microorganismos, comparable visualmente con el del recipiente de control sin producto, el producto no posee actividad antimicrobiana en las condiciones de la prueba o tal actividad se ha eliminado satisfactoriamente. La prueba de esterilidad puede entonces llevarse a cabo sin otras modificaciones. Si no se obtiene un crecimiento claramente visible en presencia del producto a evaluar, comparable visualmente con el de los recipientes de control sin producto, el producto posee actividad antimicrobiana que no se ha eliminado satisfactoriamente en las condiciones de la prueba. Modificar las condiciones con el fin de eliminar la actividad antimicrobiana y repetir la Prueba de Aptitud del Método.
Esta prueba de aptitud del método se lleva a cabo (a) cuando la prueba de esterilidad tiene que realizarse en un producto nuevo; y (b) siempre que haya un cambio en las condiciones experimentales de la prueba. La prueba de aptitud del método podrá llevarse a cabo simultáneamente con la Prueba de Esterilidad del Producto a Examinar.
PRUEBA DE ESTERILIDAD DEL PRODUCTO A EXAMINAR
•Número de Artículos a Evaluar A menos que se especifique algo diferente en otra parte de este capítulo o en la monografía individual, evaluar el número de artículos especificado en la Tabla 3. Si el contenido de cada artículo está en cantidad suficiente, (ver la Tabla 2) se puede dividir para agregarlo a cada uno de los medios especificados en porciones iguales y apropiadas. [NOTA-Realizar las pruebas de esterilidad empleando dos o más de los medios especificados.] Si cada artículo no contiene las cantidades suficientes para cada medio, usar el doble del número de artículos indicado en la Tabla 3.• Tabla 2. Cantidad Mínima a Usar para cada Medio Cantidad Mínima a Usar (a menos que se justifique y autorice algo diferente)
Cantidad por Envase
Líquidos Menos de 1 ml
El contenido total de cada envase
1-40 ml
La mitad del contenido de cada envase, pero no menos de 1 ml
Más de 40 ml y no más de 100 ml
20 ml
Más de 100 ml
10% del contenido del envase, pero no menos de 20 ml
Líquidos antibióticos 1 ml Preparaciones insolubles, cremas y ungüentos que deben suspenderse o emul- Usar el contenido de cada envase para suministrar no menos de 200 mg sionarse
USP 39
150 (71) Pruebas de Esterilidad / Pruebas Mícrobíológícas
Tabla 2. Cantidad Mínima a Usar para cada Medio (Continuación) Cantidad Mínima a Usar (a menos que se justifique y autorice algo diferente)
Cantidad por Envase
Sólidos Menos de 50 mg
El contenido total de cada envase
50 mg o más, pero menos de 300 mg
La mitad del contenido de cada envase, pero no menos de 50 mg
300 mg-5 g
150 mg
Más de 5 g
500 mg
Catgut y otros materiales de sutura quirúrgica para uso veterinario
3 secciones de una hebra (cada una de 30 cm de longitud)
•Apósito quirúrgico/algodón/gasa (en envases)
100 mg por envase
Material de sutura y otro material de un solo uso envasado individualmen- El dispositivo completo te Otros dispositivos médicos
El dispositivo completo, cortado en piezas o desmontado.
Tabla 3. Número Mínimo de Artículos a Evaluar en Relación con el Número de Artículos en la Partida Número Mínimo de Artículos a Analizar para cada Medio (a menos que se justifique y autorice algo diferente)**
Número de Artículos en la Partida*
Preparaciones parenterales No más de 100 envases
10% o 4 envases, lo que resulte mayor
Más de 100 pero no más de 500 envases
1 O envases
Más de 500 envases
2% o 20 envases, lo que resulte menor
•Para preparaciones parenterales de gran volumen
2% o 1O envases, lo que resulte menor
Antibióticos sólidos Envases a granel para farmacias (<5 g)
20 envases
Envases a granel para farmacias (2:5 g)
6 envases
Graneles y mezclas
Ver Productos sólidos a granel.
Preparaciones oftálmicas y otras preparaciones no inyectables No más de 200 envases
5% o 2 envases, lo que resulte mayor
Más de 200 envases
1O envases
Si el producto se presenta en la forma de envases monodosis, aplicar el esquema mostrado anteriormente para preparaciones para uso parenteral. Catgut y otros materiales de sutura quirúrgica para uso veterinario
2% o 5 envases, lo que resulte mayor, hasta un total máximo de 20 envases
•No más de 1 00 artículos
10% o 4 artículos, lo que resulte mayor
Más de 1 00, pero no más de 500 artículos
1O artículos
Más de 500 artículos
2% o 20 artículos, lo que resulte menor.
Productos sólidos a granel Hasta 4 envases
Cada envase
Más de 4 envases, pero no más de 50 envases
20% o 4 envases, lo que resulte mayor
Más de 50 envases
2% o 1O envases, lo que resulte mayor
* Si no se conoce el tamaño de la partida, usar el número máximo de artículos prescritos. ** Si el contenido de un envase es suficiente para inocular dos medios, esta columna da el número de envases necesarios para los dos medios juntos.
La prueba puede llevarse a cabo mediante la técnica de Filtración por Membrana o por Inoculación Directa del Medio de Cultivo con el producto a examinar. Se incluyen controles negativos adecuados. La técnica de filtración por membrana se usa cuando la naturaleza del producto lo permite, es decir, para preparaciones acuosas filtrables, para preparaciones alcohólicas o aceitosas y para preparaciones miscibles con, o solubles en, disolventes acuosos o aceitosos, siempre que dichos disolventes no posean un efecto antimicrobiano en las condiciones de la prueba.
Filtración por Membrana Usar filtros de membrana con un tamaño nominal de poro no mayor de 0,45 µm, cuya eficacia para retener microorganismos haya sido establecida. Por ejemplo, se usan filtros de nitrato de celulosa para soluciones acuosas, oleosas y con bajo contenido alcohólico; y se usan filtros de acetato de celulosa, por ejemplo, para soluciones con alto contenido alcohólico. Es posible que para ciertos productos (p.ej., antibióticos) se necesiten filtros especialmente adaptados. La técnica descrita más adelante supone que se usarán membranas de aproximadamente 50 mm de diámetro. Si se usan filtros de un diámetro diferente, los volúmenes de las diluciones y los lavados deben ajustarse según corresponda. El aparato de filtración y la membrana se esterilizan usando técnicas adecuadas. El aparato se diseña de tal modo que la solución a examinar
USP 39
Pruebas Microbiológicas / (71) Pruebas de Esterilidad 151
se pueda introducir y filtrar en condiciones asépticas: permite retirar asépticamente la membrana para transferirla al medio de cultivo, o es adecuado para llevar a cabo la incubación dentro del aparato mismo después de agregarle el medio. SOLUCIONES ACUOSAS Si corresponde, transferir una pequeña cantidad de un diluyente estéril adecuado, como por ejemplo el •Líquido A (ver Líquidos de Dilución y Lavado para Filtración por Membrana),. a la membrana en el aparato y filtrar. El diluyente puede contener sustancias neutralizantes adecuadas y/o sustancias inactivantes apropiadas, por ejemplo, en el caso de los antibióticos. Transferir a la membrana o membranas el contenido del envase o envases a analizar, si fuera necesario, después de diluirlo hasta el volumen usado en la Prueba de Aptitud del Método con el diluyente estéril elegido, pero usando no menos de las cantidades del producto a examinar indicadas en las Tablas 2 y 3. Filtrar inmediatamente. Si el producto posee propiedades antimicrobianas, lavar la membrana no menos de tres veces, filtrando en cada lavado el volumen del diluyente estéril elegido usado en la Prueba de Aptitud del Método. El ciclo de lavado no debe exceder de cinco lavados con 100 mL por filtro, cada uno, incluso si durante la prueba de aptitud del método se ha demostrado que tal ciclo no elimina por completo la actividad antimicrobiana. Transferir la membrana completa al medio de cultivo o cortarla asépticamente en dos partes iguales y transferir cada mitad a sendos medios adecuados. Usar el mismo volumen de cada medio que el empleado en la Prueba de Aptitud del Método. Alternativamente, transferir el medio a la membrana en el aparato. Incubar los medios durante no menos de 14 días. SÓLIDOS SOLUBLES Usar para cada medio no menos de la cantidad de producto indicada en las Tablas 2 y 3 disuelto en un disolvente adecuado, como por ejemplo el disolvente suministrado con la preparación, Agua Estéril para Inyección, solución salina estéril o una solución estéril adecuada como por ejemplo •Líquido A (Líquidos de Dilución y Lavado para Filtración por Membrana),. y proceder con la prueba según lo indicado anteriormente para Soluciones Acuosas usando una membrana adecuada para el disolvente elegido. ACEITES Y SOLUCIONES OLEOSAS Usar para cada medio no menos de la cantidad de producto indicada en las Tablas 2 y 3. Los aceites y las soluciones oleosas de viscosidad lo suficientemente baja se pueden filtrar sin dilución a través de una membrana seca. Los aceites viscosos se pueden diluir según sea necesario con un diluyente estéril adecuado, como por ejemplo el miristato de isopropilo, que ha demostrado no tener actividad antimicrobiana en las condiciones de la prueba. Dejar que el aceite penetre la membrana por su propio peso y, a continuación, filtrar, aplicando presión o succión gradualmente. Lavar la membrana al menos tres veces filtrando cada vez aproximadamente 100 mL de una solución estéril adecuada, como por ejemplo el •Líquido A (ver Líquidos de Dilución y Lavado para Filtración por Membrana),. que contenga un agente emulsionante adecuado a una concentración que haya demostrado ser apropiada en la Prueba de Aptitud del Método, como por ejemplo polisorbato 80 a una concentración de 1Og por L •(Líquido K) •. Transferir la membrana o membranas al medio o medios de cultivo, o viceversa, según lo descrito anteriormente para Soluciones Acuosas e incubar a las mismas temperaturas y durante los mismos tiempos. UNGÜENTOS Y CREMAS Usar para cada medio no menos de las cantidades de producto indicadas en las Tablas 2 y 3. Los ungüentos en base grasa y las emulsiones del tipo agua en aceite pueden diluirse al 1% en miristato de isopropilo según lo descrito anteriormente, calentando si fuera necesario a no más de 40º. Es probable que en casos excepcionales se requiera calentar hasta no más de 44º. Filtrar tan rápidamente como sea posible y proceder según lo descrito anteriormente para Aceites y Soluciones Oleosas. •JERINGAS PRELLENADAS Para jeringas prellenadas sin agujas estériles acopladas, expulsar el contenido de cada jeringa en uno o dos embudos para filtración por membrana individuales o en recipientes individuales antes de la transferencia. Si se adjunta una aguja estéril, expulsar directamente el contenido de la jeringa tal como se ha indicado anteriormente y proceder según lo descrito para Soluciones Acuosas. Evaluar la esterilidad de la aguja mediante el procedimiento de Inoculación Directa que se indica en Prueba de Aptitud del Método. SÓLIDOS PARA INYECCIÓN DISTINTOS DE ANTIBIÓTICOS Reconstituir los artículos de prueba según las instrucciones de la etiqueta y proceder según lo indicado para Soluciones Acuosas o Aceites y Soluciones Oleosas, lo que corresponda aplicar. [NOTA-Si fuera necesario, se puede agregar diluyente en exceso para facilitar la reconstitución y filtración del artículo de prueba reconstituido.]
152 (71) Pruebas de Esterilidad / Pruebas Microbiológicas
USP 39
ANTIBIÓTICOS SÓLIDOS PARA INYECCIÓN Envases a Granel para Farmacias, <5 g-Tomar una cantidad aproximada a 300 mg de sólido de cada uno de 20 envases, transferir asépticamente a un matraz Erlenmeyer estéril de 500 mL, disolver en aproximadamente 200 mL de Líquido A (ver Líquidos de Dilución y Lavado para Filtración por Membrana) y mezclar; o bien, reconstituir según lo indicado en la etiqueta, cada uno de 20 envases y transferir una cantidad de líquido o suspensión que equivalga aproximadamente a 300 mg de sólido a un matraz Erlenmeyer estéril de 500 mL, disolver en aproximadamente 200 mL de Líquido A y mezclar. Proceder según lo indicado para Soluciones Acuosas o para Aceites y Soluciones Oleosas, lo que corresponda aplicar. Envases a Granel para Farmacias, ~5 g-Tomar aproximadamente 1 g de sólido de cada uno de 6 envases, transferir asépticamente a un matraz Erlenmeyer estéril de 500 mL, disolver en aproximadamente 200 mL de Líquido A y mezclar; o bien, reconstituir según lo indicado en la etiqueta, cada uno de 6 envases y transferir una cantidad de líquido que equivalga aproximadamente a 1 g de sólido a un matraz Erlenmeyer estéril de 500 mL, disolver en aproximadamente 200 mL de Líquido A y mezclar. Proceder según lo indicado para Soluciones Acuosas. ANTIBIÓTICOS SÓLIDOS, GRANELES Y MEZCLAS Retirar asépticamente una cantidad suficiente de sólido de la cantidad adecuada de envases (ver Tabla 2), mezclar hasta obtener una mezcla que equivalga aproximadamente a 6 g de sólido y transferir a un matraz Erlenmeyer estéril de 500 mL. Disolver en aproximadamente 200 mL de Líquido A y mezclar. Proceder según lo indicado para Soluciones Acuosas. PRODUCTOS ESTÉRILES EN AEROSOL Para productos líquidos en forma de aerosol presurizado, congelar los envases en una mezcla de hielo seco y alcohol por lo menos a -20º durante aproximadamente 1 hora. Si es posible, dejar que el propelente escape antes de abrir asépticamente el envase y transferir el contenido a un recipiente de combinación estéril. Agregar 100 mL de Líquido D al recipiente de combinación y mezclar suavemente. Proceder según lo indicado para Soluciones Acuosas o para Aceites y Soluciones Oleosas, según corresponda. DISPOSITIVOS CON GUÍAS QUE DECLARAN SER ESTÉRILES Pasar asépticamente un volumen de Líquido D no inferior a 1 O veces el volumen de las guías a través de cada dispositivo analizado. Recoger los líquidos en un recipiente estéril adecuado y proceder según lo indicado para Soluciones Acuosas o Aceites y Soluciones Oleosas, según corresponda. En el caso de jeringas vacías estériles, extraer diluyente estéril hacia el émbolo a través de la aguja estéril, si está acoplada, o a través de una aguja estéril acoplada para el propósito de la prueba y expulsar el contenido en un recipiente de combinación estéril. Proceder según lo indicado anteriormente .•
Inoculación Directa del Medio de Cultivo Transferir directamente en el medio de cultivo la cantidad de la preparación a examinar que se indica en las Tablas 2 y 3, de modo que el volumen del producto no sea mayor que el 10% del volumen del medio, a menos que se indique algo diferente. Si el producto a examinar posee actividad antimicrobiana, realizar la prueba después de neutralizar esta actividad con una sustancia neutralizante adecuada o mediante su dilución en una cantidad suficiente de medio de cultivo. Cuando sea necesario usar un volumen grande del producto, probablemente sea preferible usar un medio de cultivo concentrado preparado de tal modo que se tenga en cuenta la dilución subsiguiente. Cuando corresponda, el medio concentrado podrá agregarse directamente al producto en su envase. LÍQUIDOS OLEOSOS Usar medios a los que se les haya agregado un agente emulsionante apropiado a una concentración que haya demostrado ser adecuada en la Prueba de Aptitud del Método, por ejemplo polisorbato 80 a una concentración de 1Og por L. UNGÜENTOS Y CREMAS Realizar una dilución de aproximadamente 1 en 1 O, emulsionando con el agente elegido en un diluyente estéril adecuado, como por ejemplo el •Líquido A (ver Líquidos de Dilución y Lavado para Filtración por Membrana) .• Transferir el producto diluido a un medio que no contenga agente emulsionante. Incubar los medios inoculados durante no menos de 14 días. Observar los cultivos varias veces durante el período de incubación. Agitar suavemente los cultivos que contengan productos oleosos todos los días. Sin embargo, cuando se use Medio Líqui-
USP 39
Pruebas Microbiológicas/ (71) Pruebas de Esterilidad 153
do de Tioglicolato para detectar microorganismos anaerobios, agitar o mezclar mínimamente con el fin de mantener las condiciones anaerobias. CATGUT Y OTROS MATERIALES DE SUTURA QUIRÚRGICA PARA USO VETERINARIO Usar para cada medio no menos de las cantidades del producto indicadas en las Tablas 2 y 3. Abrir el envase sellado teniendo en cuenta las precauciones de asepsia y retirar tres secciones de la hebra para cada medio de cultivo. Llevar a cabo la prueba sobre las tres secciones, cada una de 30 cm de longitud, que se han cortado al comienzo, medio y final de la hebra. Usar hebras completas de envases recién abiertos. Transferir cada una de las secciones de la hebra a los medios elegidos. Usar suficiente medio para cubrir adecuadamente el material a analizar (de 20 mL a 150 mL). •SÓLIDOS Transferir una cantidad de producto en forma de sólido seco (o preparar una suspensión del producto agregando diluyente estéril al envase primario) correspondiente a no menos de la cantidad indicada en las Tablas 2 y 3. Transferir el material así obtenido a 200 mL de Medio Líquido de Tioglicolato y mezclar. Del mismo modo, transferir la misma cantidad a 200 mL de Medio de Digerido de Caseína y Soja y mezclar. Proceder según lo indicado anteriormente. ALGODÓN PURIFICADO, GASA, APÓSITOS QUIRÚRGICOS Y ARTÍCULOS RELACIONADOS De cada envase de algodón, vendas de gasa enrollada o apósitos quirúrgicos grandes que se deba evaluar, extraer asépticamente dos o más porciones de 100 a 500 mg cada una de la parte más interna de la muestra. Para materiales de un solo uso envasados individualmente, extraer asépticamente todo el artículo. Sumergir las porciones o el artículo en cada medio y proceder según lo indicado anteriormente. DISPOSITIVOS ESTÉRILES Los artículos pueden sumergirse ensamblados o desmontados. Para asegurar que los conductos del dispositivo también estén en contacto con los medios, sumergir la cantidad adecuada de unidades en un volumen de medio suficiente para sumergir completamente el dispositivo y proceder según lo indicado anteriormente. Para dispositivos extremadamente grandes, sumergir aquellas porciones del dispositivo que han de entrar en contacto con el paciente en un volumen de medio suficiente para lograr la inmersión completa de esas porciones. Para catéteres en los que se requiere la esterilidad del lumen interno y de la parte externa, cortarlos en piezas de modo que el medio entre en contacto con todo el lumen, o llenar el lumen con medio y sumergir la unidad intacta .•
OBSERVACIÓN E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS A intervalos durante el período de incubación, y al momento de su finalización, examinar los medios en busca de evidencias macroscópicas de crecimiento microbiano. Si el material que se está evaluando enturbia el medio de modo que no puede determinarse fácilmente la presencia o ausencia de crecimiento microbiano mediante examen visual, transferir porciones de medio (no menores de 1 mL cada una) 14 días después de comenzada la incubación, a recipientes nuevos con el mismo medio y, a continuación, incubar el recipiente original y el de transferencia durante no menos de 4 días. Si no se hallan evidencias de crecimiento microbiano, el producto examinado cumple con la prueba de esterilidad. Si se hallan pruebas de crecimiento microbiano, el producto examinado no cumple con la prueba de esterilidad, a menos que pueda demostrarse claramente que la prueba resultó inválida por causas no relacionadas con el producto examinado. La prueba puede considerarse inválida sólo si se cumplen una o más de las siguientes condiciones: a. Los datos de monitoreo microbiológico de las instalaciones para pruebas de esterilidad demuestran una falla. b. Una revisión del procedimiento analítico usado durante la prueba en cuestión revela un error. c. Se halla crecimiento microbiano en los controles negativos. d. Después de determinar la identidad de los microorganismos aislados de la prueba, el crecimiento de esta especie (o especies) puede atribuirse de manera inequívoca a errores con respecto al material o a la técnica usados al realizar el procedimiento de la prueba de esterilidad. Si la prueba se declara inválida, se repetirá con el mismo número de unidades de la prueba original. Si no se hallan pruebas de crecimiento microbiano en la prueba repetida, el producto examinado cumple con la prueba de esterilidad. Si se hallan pruebas de crecimiento microbiano en la prueba repetida, el producto examinado no cumple con la prueba de esterilidad.
154 (71) Pruebas de Esterilidad / Pruebas Microbiológicas
USP 39
APLICACIÓN DE LA PRUEBA A PREPARACIONES PARENTERALES, OFTÁLMICAS Y OTRAS PREPARACIONES NO INYECTABLES QUE DEBEN CUMPLIR CON LA PRUEBA DE ESTERILIDAD Al usar la técnica de filtración por membrana, utilizar, siempre que sea posible, el contenido total del envase, pero no menos de las cantidades indicadas en las Tablas 2, diluyendo cuando sea necesario hasta aproximadamente 100 mL con una solución estéril adecuada, como por ejemplo el •Líquido A (ver Líquidos de Dilución y Lavado para Filtración por Membrana) .• Al usar la técnica de inoculación directa de medios, usar las cantidades que se muestran en la Tabla 2, a menos que se justifique y autorice algo diferente. Las pruebas de esterilidad bacteriana y fúngica se llevan a cabo sobre la misma muestra del producto a examinar. Cuando el volumen o la cantidad de un único envase sea insuficiente para llevar a cabo las pruebas, se usará el contenido de dos o más envases para inocular los distintos medios.
NÚMERO MÍNIMO DE ARTÍCULOS A ANALIZAR En la Tabla 3 se indica el número mínimo de artículos a analizar en relación con el tamaño de la partida.
Pruebas y Valoraciones Biológicas (81) ANTIBIÓTICOS-VALORACIONES MICROBIOLÓGICAS INTRODUCCIÓN E INFORMACIÓN GENERAL En las condiciones adecuadas, la actividad (potencia) de los antibióticos puede demostrarse por su efecto inhibidor sobre los microorganismos. La reducción en la actividad microbiana puede ser difícil de demostrar por métodos químicos. Este capítulo resume los procedimientos para antibióticos reconocidos en la Farmacopea de los Estados Unidos (USP) para los que la valoración microbiológica es el método analítico estándar. Se utilizan dos técnicas generales: la valoración en cilindro-placa (o en placa) y la valoración turbidimétrica (o en tubo). La Tabla 7 lista todos los antibióticos que incluyen valoraciones microbiológicas y especifica el tipo de valoración (cilindro-placa o turbidimétrica). Tabla 1 Tipo de Valoración
Antibiótico Amfotericina B
Cilindro-placa
Bacitracina
Cilindro-placa
Bleomicina
Cilindro-placa
Capreomicina
Turbidimétrica
Carbenicilina
Cilindro-placa
Cloranfenicol
Turbidimétrica
Clortetraciclina
Turbidimétrica
Cloxacilina
Cilindro-placa
Colistimetato
Cilindro-placa
Colistina
Cilindro-placa
Dihidroestreptomicina
Turbidimétrica
Eritromicina
Cilindro-placa
Cilindro-placa
Gentamicina
Cilindro-placa
Gramicidina
Turbidimétrica
Nafcilina
Cilindro-placa
Natamicina
Cilindro-placa Cilindro-placa
Neomicina
Turbidimétrica
Pruebas Biológicas/ (81) Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas 155
USP 39
Tabla 1 (Continuación) Antibiótico Novobiocina
Tipo de Valoración Cilindro-placa
Nistatina
Cilindro-placa
Oxitetraciclina
Turbidimétrica
Paromomicina
Cilindro-placa
Penicilina G
Cilindro-placa
Polimixina B
Cilindro-placa
Sisomicina
Cilindro-placa
Tetraciclina
Turbidimétrica
Tioestreptona
Turbidimétrica
Troleandomicina
Turbidimétrica
Tilosina
Turbidimétrica
Vancomicina
Cilindro-placa
[NOTA-Realizar todos los procedimientos descritos en las monografías asépticamente. Tomar las precauciones de seguridad adecuadas al realizar estas valoraciones debido a las posibles alergias a los fármacos y a que se usan cultivos vivos de organismos en los procedimientos] Valoración en cilindro-placa: La valoración en cilindro-placa se basa en la difusión del antibiótico desde un cilindro vertical a través de una capa de agar solidificado en un plato o placa de Petri. El crecimiento del microorganismo específico inoculado en el agar resulta inhibido en un área circular o zona en torno al cilindro que contiene la solución del antibiótico. Valoración turbidimétrica: La valoración turbidimétrica se basa en la inhibición del crecimiento de un microorganismo en una solución uniforme del antibiótico en un medio fluido que favorezca el crecimiento del microorganismo en ausencia del antibiótico. Unidades y Estándares de Referencia: La potencia de los antibióticos se designa en unidades (U) o en µg de actividad. En ambos casos, la unidad o µg de actividad del antibiótico se establece originalmente contra un Estándar Maestro Federal de los Estados Unidos para el antibiótico en cuestión. El Estándar de Referencia USP correspondiente se calibra en términos del estándar maestro. En un principio, se consideraba que un antibiótico seleccionado como estándar de referencia constaba en su totalidad de una sola entidad química y, por lo tanto, se le asignaba una potencia de 1000 µg/mg. En muchos de estos casos, a medida que los métodos de fabricación y purificación para ciertos antibióticos avanzaron en su desarrollo, fue posible obtener antibióticos con más de 1000 µg de actividad/mg. Tales antibióticos tenían una actividad equivalente a un número determinado de µg del estándar de referencia original. No obstante, la mayoría de las veces, los µg de actividad son, numéricamente, exactamente equivalentes a los µg (peso) de la sustancia pura. En ciertas ocasiones, como las citadas a continuación, los µg de actividad definidos en términos del estándar maestro original equivalen a una unidad: 1. Cuando el antibiótico se presenta como la base libre y en forma de sal, y los µg de actividad han sido definidos en términos de una de estas formas. 2. Cuando la sustancia antibiótica consta de un número de componentes que son químicamente similares pero que difieren en actividad antibiótica. 3. Cuando las potencias de una familia de antibióticos se expresan en términos de un estándar de referencia que consta de un solo miembro de la familia el cual, no obstante, puede ser por sí mismo heterogéneo. No se debe asumir que los µg de actividad corresponden a los µg (peso) de la sustancia antibiótica. Aparato: El material de laboratorio usado para almacenar y transferir microorganismos y diluciones de prueba debe ser estéril y estar exento de residuos que pudieran interferir en la valoración (ver Limpieza de Material de Vidrio (1051 )). Usar un método de esterilización validado tal como calor seco, vapor o irradiación; o usar material de laboratorio estéril y desechable. Control de temperatura: Se requiere control termostático en varias etapas de una valoración microbiológica: durante el cultivo de un microorganismo y la preparación de su inóculo, así como durante la incubación en las valoraciones en placa y tubo. Referirse a los requisitos específicos de temperatura provistos más adelante para cada tipo de valoración. Organismos de prueba: El organismo de prueba para cada antibiótico se lista en la Tabla 3 para la valoración en cilindroplaca y en la Tabla 8 para la valoración turbidimétrica. Los organismos de prueba se especifican mediante su número de identificación en la American Type Culture Collection (Colección de Cultivos Tipo de los EE.UU. o ATCC). Para asegurar el desempeño aceptable de los organismos de prueba, estos deben ser almacenados y conservados de manera apropiada. Se deben establecer las condiciones de almacenamiento específicas durante la validación o verificación del método. Desechar los cultivos si se observa un cambio en las características del organismo. Almacenamiento prolongado: Para el almacenamiento prolongado, mantener los organismos de prueba en una solución de almacenamiento adecuada, tal como suero fetal de ternero al 50% en caldo, glicerol al 10%-15% en caldo tripticasa de soja (caldo digerido de caseína y soja), sangre de oveja desfribinada o leche descremada. Los cultivos que se van a almacenar durante periodos prolongados se almacenan mejor en estado liofilizado; se prefieren temperaturas de -60º o inferiores; son aceptables temperaturas inferiores a -20º.
156 (81) Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas/ Pruebas Biológicas
USP 39
Cultivos primarios: Preparar los cultivos primarios transfiriendo organismos de prueba desde los viales de almacenamiento prolongado a medios apropiados e incubando en condiciones de crecimiento adecuadas. Almacenar los cultivos primarios a la temperatura apropiada, por lo general a 2º- 8º, y desechar después de tres semanas. Se puede usar el mismo cultivo primario para preparar los cultivos de trabajo por un máximo de siete días únicamente. Cultivos de trabajo: Preparar los cultivos de trabajo transfiriendo el cultivo primario a medios sólidos apropiados para obtener colonias aisladas. Incubar los cultivos de trabajo en condiciones apropiadas para obtener un crecimiento satisfactorio para la preparación de los inóculos de prueba. Preparar cultivos de trabajo nuevos para cada día de análisis. Crecimiento o desempeño no característicos de un organismo de prueba: Usar cultivos madre, cultivos primarios o cultivos de trabajo nuevos cuando un organismo de prueba presente crecimiento o desempeño no característicos. Diseños de valoración: Los diseños experimentales adecuados son clave para incrementar la precisión y minimizar el sesgo. Controlar los parámetros de incubación, la distribución de temperaturas y el tiempo es crítico para minimizar el sesgo; esto se puede lograr acomodando las placas y gradillas, según se indica en cada valoración. Valoración en cilindro-placa: Las comparaciones se limitan a las relaciones entre las mediciones del diámetro de la zona dentro de las placas, sin tener en cuenta la variación entre placas. Las respuestas individuales de las placas se normalizan basándose en el tamaño relativo de la zona del estándar comparado con el tamaño medio de la zona del estándar en todas las placas. Valoración turbidimétrica: Para evitar un sesgo sistemático, colocar aleatoriamente tubos duplicados en gradillas separadas de manera que cada gradilla contenga un conjunto completo de tratamientos. El propósito de esta configuración es minimizar la influencia de la distribución de la temperatura sobre las muestras duplicadas. La valoración turbidimétrica, debido a la configuración de las muestras en las gradillas para tubos de ensayo, es sensible a ligeras variaciones de temperatura. Asimismo, la influencia de la variación de la temperatura se puede disminuir al asegurar un flujo de aire o la convección de calor adecuados durante la incubación. Se deben colocar por lo menos tres tubos para cada concentración muestra y estándar (un conjunto completo de muestras) en una sola gradilla. Las comparaciones se limitan a las relaciones entre los valores de turbidez observados dentro de las gradillas. Consideraciones sobre potencia: Dentro de las restricciones citadas anteriormente, el diseño de valoración recomendado emplea una curva estándar de cinco concentraciones y una sola concentración de cada preparación muestra. Para la valoración en cilindro-placa, cada placa incluye únicamente dos tratamientos, el tratamiento de referencia (mediana de los niveles del estándar, es decir, 53) y una de las otras cuatro concentraciones del estándar (5 7, 52 , 54 y 55) o la muestra (U 3 ). La concentración de la muestra es una estimación basada en la concentración deseada. La muestra se debe diluir para proporcionar una concentración nominal que se estima es equivalente a la mediana de la concentración de referencia del estándar (5 3). El propósito de diluir a la mediana de la concentración de referencia es asegurar que el resultado de la muestra caerá dentro de la porción lineal de la curva estándar. La prueba determina la potencia relativa de U3 en función de la curva estándar. La muestra ( U3 ) debe tener una potencia relativa de aproximadamente 100%. La potencia final de la muestra se obtiene multiplicando el resultado de U3 por el factor de dilución. Una valoración debe considerarse preliminar si el valor de potencia de la muestra calculado es inferior al 80% o superior al 125%. En dicho caso, los resultados sugieren que la concentración de la muestra supuesta durante la preparación de la solución madre de la muestra era incorrecta. Si esa fuera la situación, se puede ajustar la potencia supuesta de la muestra basándose en el valor de potencia preliminar y repetir la valoración. De otro modo, la potencia se derivará de una porción de la curva donde las respuestas del estándar y la muestra probablemente no serán paralelas. Las determinaciones microbiológicas de potencia están sujetas a variables intervaloración e intravaloración, de modo tal que se requieren dos o más valoraciones independientes para obtener una estimación confiable de la potencia de una muestra determinada. Partiendo de soluciones madre y diluciones de prueba tanto del estándar como de la muestra, preparadas por separdo, llevar a cabo otro día valoraciones adicionales de una muestra determinada. La potencia media debe incluir los resultados de todas las valoraciones independientes válidas. El número de valoraciones requerido para lograr una estimación de potencia confiable depende de la variabilidad de la valoración y de la incertidumbre máxima requerida para la estimación de potencia. Ésta última se evalúa mediante la amplitud del intervalo de confianza (ver Cálculos, Límites de confianza y combinaciones de cálculos de valoración). El resultado combinado de una serie de valoraciones independientes más pequeñas a lo largo de varios días es una estimación de potencia más confiable que la obtenida de una sola valoración grande con el mismo número total de placas o tubos. Se debe tomar en cuenta que las valoraciones adicionales o una menor variabilidad permite que el producto cumpla con intervalos de especificación más estrechos. Al reducir la variabilidad de las valoraciones se logra el límite de confianza requerido con menos valoraciones.
MÉTODO DE CILINDRO-PLACA Control de temperatura: Usar equipo calificado y calibrado de manera apropiada para obtener los rangos de temperatura especificados en la Tabla 3. Aparato Placas: Placas de Petri de plástico desechables o de vidrio (de aproximadamente 20 x 100 mm) con tapas Cilindros: Cilindros de acero inoxidable o porcelana; de 8±O,1 mm de diámetro externo; de 6±O,1 mm de diámetro interno; de 1O±O,1 mm de altura. [NOTA-Limpiar los cilindros cuidadosamente para eliminar cualquier residuo; es necesario
Pruebas Biológicas/ (81) Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas 157
USP 39
limpiar ocasionalmente en un baño ácido, por ejemplo, con ácido nítrico aproximadamente 2 N o con ácido crómico (ver Limpieza de Aparatos de Vidrio (1051)).] Soluciones estándar: Para preparar una solución madre, disolver una cantidad adecuada del Estándar de Referencia USP de un determinado antibiótico o todo el contenido de un vial de Estándar de Referencia USP, cuando corresponda, en el disolvente especificado en la Tabla 2 y diluir a la concentración especificada. Almacenar a 2º-8º y usar dentro del periodo indicado. En el día de la valoración, preparar a partir de la solución madre cinco o más diluciones de prueba, con un aumento de concentración entre diluciones sucesivas, por lo general, en una proporción de 1 :1,25. Usar el diluyente final especificado de tal manera que la mediana tenga la concentración sugerida en la Tabla 2. Soluciones muestra: Asignar a la muestra una potencia supuesta por unidad de peso o volumen. En el día de la valoración, preparar una solución madre de la misma manera que se especifica para el Estándar de Referencia USP (Tabla 2). Diluir la solución madre de la muestra en el diluyente final especificado hasta obtener una concentración nominal igual a la mediana de la concentración del estándar (5 3). Tabla 2 Dilución de Prueba
Solución Madre
Antibiótico
Disolvente Inicial
Concentración Inicial
Diluyente Adicional
Anfotericina sc,ci
Dimetil sulfóxido
-
-
Bacitracinat
Ácido clorhídrico 0,01 N
-
-
Bleomicina
B.l 6e
-
Carbenicilina
B. le
-
-
Cloxacilina
B.1 e
-
-
Concentración Final
Mediana dela Concentración
Usar dentro de
Diluyente Final
1 mg/mL
El mismo día
B. loe
100 U/mL
El mismo día
B.le
1 U/mL
2 U/mL
14 días
B.l 6e
0,04 U/mL
1 mg/mL
14 días
B.le
20 µg/mL
5 µg/mL
(S,)•,b 1 µg/mL
1 mg/mL
7 días
B.F
Colistemetatoc
Agua
10 mg/mL
B.6e
1 mg/mL
El mismo día
B.6e
1 µg/mL
Colistina
Agua
10 mg/mL
B.6e
1 mg/mL
14 días
B.6e
1 µg/ml 1 µg/ml
Dihidrostreptomicina9
B.3e
-
Eritromicina
Methanol
10 mg/ml
Gentamicina
B.3e
-
-
1 mg/ml
30 días
B.3e
1 mg/ml
14 días
B.3e
1 µg/ml
-
1 mg/ml
30 días
B.3e
0.1 µg/ml
B.3e
B.le
-
-
1 mg/ml
2 días
B.le
2 µg/ml
Natamicina
Dimetil sulfóxido
-
-
1 mg/ml
El mismo día
B.1oe
5 µg/ml
Neomicina9
B.3e
-
-
1 mg/ml
14 días
B.3e
1 µg/ml
Novobiocina
alcohol
1 mg/ml
5 días
B.6e
0,5 µg/ml
Nafcilina
10 mg/ml
B.3e
Dimetilformamida
-
-
1000 U/ml
El mismo día
B.6e
20 U/ml
Paromomicina
B.3e
-
-
1 mg/ml
21 días
B.3e
1 µg/ml
Penicilina G
B. le
-
-
1000 U/ml
4 días
B.F
1 U/ml
Polimixina Bi
Agua
-
10 000 U/ml
14 días
B.6e
10 U/ml
B.3e
-
-
1 mg/ml
14 días
B.3e
0,1 µg/ml
Agua
-
-
1 mg/mL
7 días
B.4e
10 µg/mL
N istati nac,h
Sisomicina Vancomicina
B.6e
ª
Se puede ajustar la mediana de la concentración para optimizar los tamaños de la zona si los datos se mantienen en el intervalo lineal. b µg en esta columna se refiere a µg de actividad. e Preparar el Estándar de Referencia USP y las diluciones de prueba de la muestra al mismo tiempo. d Diluir adicionalmente la solución madre con dimetil sulfóxido para obtener concentraciones de 12,8; 16; 20; 25 y 31,2 µg/mL antes de realizar las diluciones de prueba. La dilución de prueba de la muestra debe contener la misma cantidad de dimetil sulfóxido que las diluciones de prueba del Estándar de Referencia USP. e La letra B se refiere a la solución amortiguadora. Ver Medios y Soluciones, Soluciones amortiguadoras para una descripción de cada solución amortiguadora listada en esta tabla. 1 Cada una de las diluciones de prueba del estándar debe contener la misma cantidad de ácido clorhídrico que la dilución de prueba de la muestra. 9 Se puede usar la valoración turbidimétrica como un procedimiento alternativo. h Diluir adicionalmente la solución madre con dimetilformamida para obtener concentraciones de 256; 320; 400; 500 y 624 U/mL antes de preparar las diluciones de pruebas. Preparar las diluciones de prueba del estándar al mismo tiempo que las diluciones de prueba de la muestra a analizar. La dilución de prueba de la muestra debe contener la misma cantidad de dimetilformamida que las diluciones de prueba del estándar. Usar material de vidrio con protección actínica. i Preparar la solución madre agregando 2 mL de agua por cada 5 mg del Estándar de Referencia USP.
lnóculos: Suspender el organismo de prueba obtenido de un cultivo o cultivo inclinado (slant) recientes en 3 ml de solución salina SR estéril. Se pueden usar perlas de vidrio para facilitar la suspensión. Esparcir la suspensión salina sobre la superficie de dos o más placas de agar (cubriendo toda la superficie) o sobre la superficie de un frasco Roux que contenga 250 ml del medio especificado (ver la Tabla 3). Incubar durante el tiempo y a la temperatura especificados en la Tabla 3, o hasta que el crecimiento sea evidente.
USP 39
158 (81 >Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas / Pruebas Biológicas
Después de incubar, recolectar el organismo de las placas o frasco Roux con aproximadamente 50 ml de solución salina SR estéril (excepto en el caso de bleomicina para el que debe usarse Medio 34; ver la sección Medios y Soluciones), usando una varilla de vidrio doblada en ángulo estéril o perlas de vidrio estériles. Pipetear y transferir la suspensión a un frasco de vidrio estéril. Ésta es la suspensión de recolección. Diluir una cantidad apropiada de la suspensión de recolección con solución salina SR estéril. Usando el espectrofotómetro de UV-visible, medir el % de transmitancia a 580 nm. El valor deseado es aproximadamente 25% de transmitancia a 580 nm. Este valor se usa para estandarizar el volumen de suspensión de recolección agregado a la capa de agar para siembra. Determinar durante la verificación del método, comenzando con los volúmenes sugeridos en la Tabla 3, las proporciones de suspensión madre que se habrán de agregar al medio de inóculo que resulten en zonas satisfactorias de inhibición de aproximadamente 14-16 mm de diámetro para la mediana de la concentración del estándar (5 3 ). [NOTA-Los tamaños de las zonas fuera del intervalo de 11 a 19 mm no son adecuados, debido a que contribuyen a la variabilidad de la valoración.] Si el porcentaje de transmitancia de la dilución está por encima de 25%, se puede usar un cociente para normalizar la adición de microorganismos a la capa de siembra. El factor de normalización se puede determinar dividiendo por 25 el porcentaje de transmitancia obtenido de la dilución. Posteriormente, se puede multiplicar este cociente por la cantidad sugerida de inóculo para obtener el volumen (ml) de suspensión de recolección que se requiere agregar a la capa de siembra. Ajustar la cantidad de inóculo diariamente, si fuera necesario, para obtener una relación de concentración-respuesta óptima. Alternativamente, determinar durante la verificación del método la proporción de suspensión de recolección que se habrá de incorporar al inóculo, comenzando con los volúmenes indicados en la Tabla 3, que resulten en una demarcación satisfactoria de las zonas de inhibición de aproximadamente 14-16 mm de diámetro para la mediana de la concentración del estándar (5 3) y que produzcan una relación de concentración-respuesta reproducible. Preparar el inóculo agregando una porción de suspensión madre a una cantidad suficiente de medio de agar que se ha fundido y enfriado a 45º-50º. Agitar la mezcla por rotación suave sin crear burbujas hasta obtener una suspensión homogénea. Tabla 3 Condiciones de Incubación
Antibiótico
Organismo de Prueba
Númeroª ATCC
Mediob
Temperatura (°)
Composición Sugerida del lnóculo
Tiempo
Mediob
Cantidad (ml/100 ml)
Saccharomyces cerevisiae
9763
19
29-31
48 h
19
1,0
Bacitracina
Micrococcus luteus
10240
1
32-35
24 h
1
0,3
Bleomicina
Mycobacterium smegmatis
607
36
36-37,5
48 h
35
1,0
Pseudomonas aeruginosa
25619
1
36-37,5
24 h
10
0,5
Staphylococcus aureus
29737
1
32-35
24 h
1
0,1
Colistimetato
Bordetella bronchiseptica
4617
1
32-35
24 h
10
0,1
Colistina
Bordete//a bronchiseptica
4617
1
32-35
24 h
10
0,1
Amfotericina B
Carbenicilina< Cloxacilina
Bacilfus subtilis
6633
32
32-35
5 días
5
Según se requiera
Eritromicina
Micrococcus luteus
9341
1
32-35
24 h
11
1,5
Gentamicina
Staphylococcus epidermidis
12228
1
32-35
24 h
11
0,03
Staphy/ococcus aureus
29737
1
32-35
24 h
1
0,3
Neomicina
Staphy/ococcus epidermidis
12228
1
32-35
24 h
11
0,4
Novobiocina
Staphylococcus epidermidis
12228
1
32-35
24 h
1
4,0
Saccharomyces cerevisiae
2601
19
29-31
48 h
19
1,0
Staphylococcus epidermidis
12228
1
32-35
24 h
11
2,0
Staphylococcus aureus
29737
1
32-35
24 h
1
1,0
Bordetel/a bronchiseptica
4617
1
32-35
24 h
10
0,1
Staphy/ococcus epidermidis
12228
1
32-35
24 h
11
0,03
8
Según se requiera
Dihidroestreptomicina
Nafcilina
Nistatina Paromomicina Penicilina G Polimixina B Sisomicina Vancomicina
Bacilfus subtilis
6633
32
32-35
5 días
ª American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas VA 20110-2209 (http://www.atcc.org) b Ver Medios y Soluciones, Medios. e Usar 0,5 ml de una dilución 1:25 de la suspensión madre/100 ml de Medio 1O.
Análisis: Preparar la capa base para el número requerido de placas de Petri para la valoración, usando el medio y el volumen mostrados en la Tabla 4. Dejar que se endurezca formando una capa base lisa de profundidad uniforme. Preparar la cantidad apropiada de inóculo para la capa de siembra (Tabla 5), según se indica para el antibiótico correspondiente (Tabla 3), realizando los ajustes necesarios basándose en el análisis de ensayo preparatorio. Inclinar la placa hacia atrás y hacia adelante para esparcir el inóculo uniformemente sobre la superficie de la capa base y dejar que se endurezca.
Pruebas Biológicas/ (81) Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas 159
USP 39
Tabla 4 (capa base)
Antibiótico
Volumen Objetivo (ml)
Medioª
Amfotericina Bb
-
-
Bleomicina
35
10
Carbenicilina
9
21
Colistimetato
9
21
Colistina
9
21
Dihidroestreptomicina
5
21 21
Eritromicina
11
Gentamicina
11
21
Neomicina
11
21
Nistatinab
-
-
Paromomicina
11
21
Polimixina B
9
21
Sisomicina
11
21
Vancomicina
8
10
Todos los demás
2
21
ª Ver Medios y Soluciones, Medios. b No se usa capa base. [NOTA-La capa base se puede entibiar para facilitar la formación de una capa uniforme.)
Tabla 5 (capa de siembra)
Antibiótico Amfotericina B
Medioª
Volumen Objetivo (ml)
Referirse a la Tabla 3
8
Bleomicina
6
Nistatina
8
Todos los demás
4
ª Ver Medios y Soluciones, Medios.
Dejar caer seis cilindros de valoración sobre la superficie inoculada desde una altura de 12 mm, utilizando una guía mecánica u otro dispositivo para asegurar el espaciado uniforme en un radio de 2,8 cm y tapar las placas para evitar la contaminación. Llenar los seis cilindros en cada placa con diluciones de antibiótico que contengan los niveles de prueba (S 1-S5 y U3) especificados en el párrafo siguiente. Incubar las placas según se especifica en la Tabla 6 durante 16-18 horas y retirar los cilindros. Medir y registrar el diámetro de cada zona de inhibición del crecimiento con una aproximación de 0, 1 mm. Tabla 6 Antibiótico Amfotericina B
Temperatura de Incubación (°)
29-31
Carbenicilina
36-37,5
Colistimetato
36-37,5
Colistina
36-37,5
Dihidroestreptomicina
36-37,5
Gentamicina
36-37,5
Neomicina
36-37,5
Novobiocina
34-36
Nistatina
29-31
Paromomicina
36-37,5
Polimixina B
36-37,5
Sisomicina
36-37,5
Vancomicina
36-37,5
Todos los demás
32-35
Se usarán durante la valoración los estándares (S 1-S5 ) y un solo nivel de prueba de la muestra (U3) correspondiente a S3 de la curva estándar, según se definen en Soluciones estándar y Soluciones muestra. Para derivar la curva estándar, llenar cilindros alternos en tres placas con la dilución correspondiente a la mediana de la dilución de prueba (S 3) del estándar y cada uno de
160 (81) Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas/ Pruebas Biológicas
USP 39
los nueve cilindros remanentes con una de las otras cuatro diluciones de prueba del estándar. Repetir el proceso para las tres diluciones de prueba del estándar. Para la muestra, llenar cilindros alternos en tres placas con la dilución correspondiente a la mediana de la dilución de prueba (5 3) y llenar los nueve cilindros remanentes con la dilución de prueba correspondiente (U 3) de la muestra.
MÉTODO TURBIDIMÉTRICO Control de temperatura: Usar un equipo calificado y calibrado de manera apropiada para obtener los rangos de temperatura especificados en la Tabla 8. [NOTA-El control de la temperatura se puede lograr con circulación de aire o agua. La mayor capacidad térmica del agua representa cierta ventaja sobre el aire circulante.] Espectrofotómetro: La medición de la absorbancia o transmitancia dentro de una banda de frecuencia muy estrecha requiere un espectrofotómetro adecuado en el que se pueda variar o restringir la longitud de onda usando filtros de 580 nm o 530 nm. Como alternativa, se puede usar un espectrofotómetro con longitud de onda variable y ajustar a una longitud de onda de 580 nm o 530 nm. El instrumento se puede modificar de la siguiente manera: 1. Para que acepte el tubo en el que se lleva a cabo la incubación (ver Aparato a continuación). 2. Para que acepte una celda modificada equipada con un drenaje que facilite el cambio rápido del contenido. 3. Para que contenga una celda de flujo para un análisis de flujo continuo. Ajustar automáticamente el instrumento a cero con un caldo no inoculado transparente, preparado según las especificaciones de cada antibiótico, incluyendo la misma cantidad de dilución de prueba (incluyendo formaldehído si se especifica) que se encuentra en cada muestra. Durante la preparación de los inóculos se puede medir tanto la absorbancia como la transmitancia. Aparato: Tubos de ensayo de vidrio o plástico, p.ej., de 16 x 125 mm o de 18 x 150 mm. [NOTA-Usar tubos que tengan una longitud, diámetro y espesor relativamente uniformes y que estén exentos de defectos y rayaduras en la superficie. En el espectrofotómetro, usar tubos idénticos exentos de defectos y rayaduras. Limpiar los tubos minuciosamente para eliminar todos los residuos de antibiótico y restos de soluciones de limpieza. Esterilizar los tubos antes de usar.] Soluciones estándar: Para preparar una solución madre, disolver una cantidad del Estándar de Referencia USP de un antibiótico determinado o todo el contenido de un vial de Estándar de Referencia USP, cuando corresponda, en el disolvente especificado en la Tabla 7 y diluir hasta la concentración requerida. Almacenar a 2º-8º y usar dentro del periodo indicado. En el día de la valoración, preparar a partir de la solución madre cinco o más diluciones de prueba, con un aumento de concentración entre diluciones sucesivas, por lo general, en una proporción de 1 :1,25. [NOTA-Puede ser necesario usar relaciones más pequeñas para diluciones sucesivas de la solución madre para la valoración turbidimétrica.] Usar el diluyente final especificado de manera tal que la mediana de los niveles del estándar (5 3) tenga la concentración sugerida en la Tabla 7. Soluciones muestra: Asignar una potencia supuesta por unidad de peso o volumen a la muestra desconocida y, en el día de la valoración, preparar una solución madre de la misma manera que se especifica para el Estándar de Referencia USP (Tabla 7). Diluir la solución madre de la muestra en el diluyente final especificado a una concentración nominal igual a la mediana de la concentración del estándar (53) según se especifica en la Tabla 7. Tabla 7 Solución Madre
Antibiótico
Disolvente Inicial
Capreomicina
Agua
Cloranfenicol
Alcohol
Clortetraciclina Dihidroestreptomicinab Gramicidina
Ácido clorhídrico 0,01 N
Concentración Inicial -
10 mg/ml -
Dilución de Prueba
Diluyente Adicional
Concentración Madre Final
Usar Dentro de
Diluyente Final
Mediana de la Concentración (S3)ª 100 µg/ml
1 mg/ml
7 días
Agua
1 mg/ml
30 días
Agua
2,5 µg/ml
-
1 mg/ml
4 días
Agua
0,06 µg/ml
-
Agua
Agua
-
-
1 mg/ml
30 días
Agua
30 µg/ml
Alcohol
-
-
1 mg/ml
30 días
Alcohol
0,04 µg/ml
Neomicinab,d
B.3c
-
-
100 µg/ml
14 días
B.3<
1,0 µg/ml
Oxitetraciclina
Ácido clorhídrico O, 1 N
-
-
1 mg/ml
4 días
Agua
0,24 µg/ml
Tetraciclina
Ácido clorhídrico O, 1 N
-
-
1 mg/ml
1 día
Agua
0,24 µg/ml
1 U/ml
El mismo día
Dimetil sulfóxido
0,80 U/ml
Tioestreptona Dimetil sulfóxido
-
-
ª µg en esta columna se refiere a µg de actividad. b Se puede usar la valoración en cilindro-placa como un procedimiento alternativo. e La letra B se refiere a la solución amortiguadora. Ver Medios y Soluciones, Soluciones amortiguadoras para una descripción de cada solución amortiguadora listada en esta tabla. d Diluir la solución madre de 100 µg/ml con Solución amortiguadora B. 3 para obtener una solución con una concentración equivalente a 25 µg/ml de neomicina. Agregar 1,39; 1,67; 2,00; 2,40 y 2,88 ml de esta solución a sendos matraces volumétricos de 50 ml. Agregar 5,0 ml de ácido clorhídrico 0,01 N a cada matraz, diluir con Solución amortiguadora B.3 a volumen y mezclar para obtener soluciones con concentraciones de 0,69; 0,83; 1,0; 1,2 y 1,44 µg/ml de neomicina. Usar estas soluciones para preparar la línea de respuesta estándar.
Pruebas Biológicas/ (81) Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas 161
USP 39
Tabla 7 (Continuación) Solución Madre Disolvente Inicial
Diluyente Adicional
Alcohol isopropílico y agua (4:1)
-
-
Antibiótico Troleandomicina
Dilución de Prueba
Concentración Inicial
Concentración Madre Final
Usar Dentro de
Diluyente Final
Mediana de la Concentración (S3)ª
1 mg/ml
El mismo día
Agua
25 µg/ml
30 días
Metanol y B.3< (1:1)
4 µg/ml
Ti losina Metanol
10 mg/ml
B.16<
1 mg/ml
ª µg en esta columna se refiere a µg de actividad. b Se puede usar la valoración en cilindro-placa como un procedimiento alternativo. e La letra B se refiere a la solución amortiguadora. Ver Medios y Soluciones, Soluciones amortiguadoras para una descripción de cada solución amortiguadora listada en esta tabla. d Diluir la solución madre de 100 µg/ml con Solución amortiguadora 8.3 para obtener una solución con una concentración equivalente a 25 µg/ml de neomicina. Agregar 1,39; 1,67; 2,00; 2,40 y 2,88 ml de esta solución a sendos matraces volumétricos de 50 ml. Agregar 5,0 ml de ácido clorhídrico 0,01 Na cada matraz, diluir con Solución amortiguadora 8.3 a volumen y mezclar para obtener soluciones con concentraciones de 0,69; 0,83; 1,0; 1,2 y 1,44 µg/ml de neomicina. Usar estas soluciones para preparar la línea de respuesta estándar.
lnóculos: Suspender el organismo de prueba obtenido de un cultivo o cultivo inclinado (slant) recientes en 3 ml de solución salina SR estéril. Se pueden usar perlas de vidrio para facilitar la suspensión. Enterococcus hirae (ATCC 10541) y 5taphylococcus aureus (ATCC 9144) se cultivan en un medio líquido, no en agar. Esparcir la suspensión salina sobre la superficie de dos o más placas de agar (cubriendo toda la superficie) o sobre la superficie de un frasco Roux que contenga 250 ml del medio especificado (ver la Tabla 8). Incubar durante el tiempo y a la temperatura especificados en la Tabla 8, o hasta que el crecimiento sea evidente. Después de incubar, recolectar el organismo de las placas o frasco Roux con aproximadamente 50 ml de solución salina SR estéril, usando una varilla de vidrio doblada en ángulo estéril o perlas de vidrio estériles. Pipetear y transferir la suspensión a un frasco de vidrio estéril. Ésta es la suspensión de recolección. Determinar durante la verificación del método la cantidad de suspensión de recolección que se usará como el inóculo, comenzando con el volumen sugerido en la Tabla 8. Preparar también una 53 extra como una prueba de crecimiento. Incubar las pruebas de ensayo durante los tiempos indicados en la Tabla 7 7. Ajustar la cantidad de inóculo a diario, si fuera necesario, para obtener la relación de concentración-respuesta óptima a partir del organismo de prueba en los tubos de valoración. Una vez completados los periodos de incubación especificados, los tubos que contienen la mediana de la concentración del estándar deben presentar los valores de absorbancia especificados en la Tabla 9. Determinar la duración exacta de la incubación, observando el crecimiento en la concentración de referencia (mediana de la concentración) del estándar (53). Tabla 8 Composición Sugerida del lnóculo
Condiciones de Incubación
Organismo de prueba
Antibiótico
Número ATCca
Mediob
Temperatura (º)
Tiempo
Mediob
Cantidad (ml/100 ml}
Capreomicina
K/ebsiel/a pneumoniae
10031
1
36-37,5
16-24 h
3
0,05
Cloranfenicol
Escherichia coli
10536
1
32-35
24 h
3
0,7
Clortetraciclina
Staphylococcus aureus
29737
1
32-35
24 h
3
0,1
Dihidroestreptomicina
Klebsiella pneumoniae
10031
1
36-37,5
16-24 h
3
0,1
3
1,0
Gramicidina
Enterococcus hirae
10541
3
36-37,5
16-18 h
Neomicina
Klebsiella pneumoniae
10031
1
36-37,5
16-24 h
39
2
Oxitetraciclina
Staphylococcus aureus
29737
1
32-35
24 h
3
0,1
Tetraciclina
Staphylococcus aureus
29737
1
32-35
24 h
3
0,1
Enterococcus hirae
10541
40
36-37,5
18-24 h
41
0,2
Troleandomicina
Klebsiel/a pneumoniae
10031
1
36-37,5
16-24 h
3
0,1
Tilosina
Staphylococcus aureus
9144
3
35-39
16-18 h
39
2-3
Tioestreptona
ªAmerican Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas VA 20110-2209 (http://www.atcc.org) b
Ver Medios y Soluciones, Medios.
Tabla 9 Antibiótico
Absorbancia, No menos de (u.a.)
Capreomicina
0,4
Clortetraciclina
0,35
Gramicidina
0,35
Tetraciclina
0,35
USP 39
162 <81) Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas/ Pruebas Biológicas
Tabla 9 (Continuación)
Absorbancia, No menos de (u.a.)
Antibiótico Todos los demás
0,3
Análisis: En el día de la valoración, preparar la concentración necesaria de antibiótico, diluyendo soluciones madre del estándar y de cada una de las muestras, según se especifica en Soluciones estándar y Soluciones muestra. Preparar cinco niveles de prueba, cada uno por triplicado, del estándar (S 7-S5 ) y un solo nivel de prueba ( U3 ), también por triplicado, de hasta 20 muestras correspondientes a S3 (mediana de la concentración) del estándar. Tabla 10
Volumen de Dilución de Prueba (ml)
Volumen de lnóculo (ml)
Gramicidina
0,10
9,0
Tioestreptona
0,10
10,0
Tilosina
0,10
9,0
Todos los demás
1,0
9,0
Antibiótico
Colocar los tubos en gradillas para tubos de ensayo u otro portador. Incluir en cada gradilla 1-2 tubos de control que contengan 1 mL del diluyente de prueba (ver la Tabla 7) pero sin antibiótico. Agregar los volúmenes de las diluciones de prueba del estándar y de la muestra, según se indica en la Tabla 1O. Distribuir aleatoriamente un set completo, incluyendo los controles, en una gradilla para tubos. Agregar el volumen de inóculo especificado en la Tabla 1O a cada tubo en la gradilla, uno por vez, y colocar la gradilla completada inmediatamente en una incubadora o un baño de agua mantenidos a 36,0º-37,5º durante el tiempo especificado en la Tabla 11. Tabla 11
Tiempo de Incubación (h)
Antibiótico Capreomicina
3-4
Cloranfenicol
3-4
Cicloserina
3-4
Dihidroestreptomicina
3-4
Estreptomicina
3-4
Troleandomicina
3-4
Ti losina
3-5
Todos los demás
4-5
Después de la incubación, inhibir inmediatamente el crecimiento del organismo, agregando 0,5 mL de formaldehído diluido a cada tubo, excepto para tilosina. Para tilosina, calentar la gradilla en un baño de agua a 80º-90º durante 2-6 minutos o en un baño de vapor durante 5-1 O minutos y llevar a temperatura ambiente. Leer la absorbancia o la transmitancia a 530 ó 580 nm, analizando una gradilla cada vez.
MEDIOS V SOLUCIONES Los medios requeridos para la preparación de los inóculos de los organismos de prueba se preparan con los ingredientes listados en esta sección. Se permiten pequeñas modificaciones de los ingredientes individuales; asimismo, se pueden usar medios deshidratados reconstituidos, siempre que los medios resultantes tengan propiedades promotoras de crecimiento equivalentes o superiores y que produzcan una curva de respuesta estándar similar. Medios: Disolver los ingredientes en agua para obtener 1 L y ajustar las soluciones con hidróxido de sodio 1 N o ácido clorhídrico 1 N, según se requiera, de modo que, después de la esterilización con vapor, el pH sea el especificado. Medio 1
Peptona
6,0 g
Digerido pancreático de caseína
4,0 g
Extracto de levadura
3,0 g
Extracto de carne
1,5 g
Dextrosa
1,0 g
Agar
15,0 g
Agua
1000 ml
pH después de la esterilización
6,6 ±0,1
USP 39
Pruebas Biológicas/ (81) Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas 163
Medio2
Peptona
6,0 g
Extracto de levadura
3,0g
Extracto de carne
1,5 g
Agar
15,0 g
Agua
1000 ml
pH después de la esterilización
6,6 ± 0,1 Medio 3
Peptona
5,0 g
Extracto de levadura
1,5 q
Extracto de carne
1,5 g
Cloruro de sodio
3,5 g
Dextrosa
1,0 g
Fosfato Dibásico de Potasio
3,68 g
Fosfato monobásico de potasio
1,32 g
Agua
1000 ml
pH después de la esterilización
7,0 ± 0,05 Medio4
Peptona
6,0 g
Extracto de levadura
3,0 g
Extracto de carne
1,5 g
Dextrosa
1,0 g
Agar
15,0 g
Agua
1000 ml
pH después de la esterilización
6,6± 0,1 Medio 5
Peptona
6,0g
Extracto de levadura
3,0g
Extracto de carne
1,5 g
Agar
15,0 g
Agua
1000 ml
pH después de la esterilización
7,9 ± 0,1 Medios
Peptona
6,0g
Extracto de levadura
3,0g
Extracto de carne
1,5 g
Agar
15,0 g
Agua
1000 ml
pH después de la esterilización
5,9 ± 0,1 Medlo9
Digerido pancreático de caseína
17,0 g
Digerido papaínico de soja
3,0g
Cloruro de sodio
5,0q
Fosfato dibásico de potasio
2,5 g
Dextrosa
2,5 g
Agar
20,0 g
Agua
1000 ml
pH después de la esterilización
7,2 ± 0,1 Medio 10
Digerido pancreático de caseína
17,0 g
Digerido papaínico de soja
3,0 q
Cloruro de sodio
5,0 g
164 (81) Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas / Pruebas Biológicas
USP 39
Medio 10 (Continuación)
Fosfato dibásico de potasio
2,5 g
Dextrosa
2,5 g
Agar
12,0 g
Aqua
1000 ml
Polisorbato 80 (agregado después de calentar a ebullición el medio para disolver el agar) pH después de la esterilización
10 ml 7,2 ± 0,1
Medio 11
Peptona
6,0 g
Digerido pancreático de caseína
4,0 g
Extracto de levadura
3,0g
Extracto de carne
1,5 g 1,0 g
Dextrosa
15,0 g
Aqar Agua
1000 ml
pH después de la esterilización
8,3 ±0,1 Medio 13
Peptona
10,0 g
Dextrosa
20,0 g
Agua
1000 ml
pH después de la esterilización
5,6 ± 0,1 Medio 19
Peptona
9,4 g
Extracto de levadura
4,7 g
Extracto de carne
2,4 g
Cloruro de sodio
10,0 g
Dextrosa
10,0 g
Agar
23,5 g
Agua
1000 ml
pH después de la esterilización
6,1 ± 0,1 Medio 32
Peptona
6,0 g
Digerido pancreático de caseína
4,0 g
Extracto de levadura
3,0g
Extracto de carne
1,5 g
Sulfato de manqaneso
0,3 g
Dextrosa
1,0 g
Aqar
15,0 g
Agua
1000 ml
pH después de la esterilización
6,6 ± 0,1 Medio 34
Glicerol
10,0 g
Peptona
10,0 g
Extracto de carne
10,0 g 3,0 g
Cloruro de sodio Agua
1000 ml
pH después de la esterilización
7,0 ± 0,1 Medio 35
Glicerol
10,0 g
Peptona
10,0 g
Extracto de carne
10,0 Q
Cloruro de sodio
3,0q
Pruebas Biológicas/ (81) Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas 165
USP 39
Medio 35 (Continuación) Agar
17,0 g
Agua
1000 ml
pH después de la esterilización
7,0 ± 0,1 Medio 36
Digerido pancreático de caseína
15,0 g
Digerido papaínico de soja
5,0 q
Cloruro de sodio
5,0 g
Agar
15,0 g
Agua
1000 ml
pH después de la esterilización
7,3 ± 0,1 Medio 39
Peptona
5,0 g
Extracto de levadura
1,5 g
Extracto de carne
1,5 g
Cloruro de sodio
3,5 q
Dextrosa
1,0 g
Fosfato Dibásico de Potasio
3,68 g
Fosfato monobásico de potasio
1,32 g
Agua
1000 ml
pH después de la esterilización
7,9 ± 0,1 Medlo40
Extracto de levadura
20,0 g
Poli peptona
5,0 g
Dextrosa
10,0 q
Fosfato monobásico de potasio
2,0q
Polisorbato 80
0,1 g
Agar
10,0 g
Agua
1000 ml
pH después de la esterilización
6,7 ± 0,2 Medlo41
Digerido pancreático de cas.eína
9,0 g
Dextrosa
20,0 g
Extracto de levadura
5,0 g
Citrato de sodio
10,0 g
Fosfato monobásico de potasio
1,0 g
Fosfato Dibásico de Potasio
1,0g
Agua
1000 ml
pH después de la esterilización
6,8± 0,1
Soluciones Soluciones amortiguadoras: Preparar según se indica en la Tabla 72 o por otros medios adecuados. Las soluciones amortiguadoras se esterilizan después de su preparación; el pH especificado en cada caso es el pH después de la esterilización. T a bl a 12 So 1uc i ones amort11guad oras
Solución amortiguadora Solución amortiguadora B.1 (1 %, pH 6,0) Solución amortiguadora B.3 (O, 1 M, pH 8,0)
Concentración de Fosfato Di básico de Potasio (g/L)
Concentración de Fosfato Monobásico de Potasio (g/L)
Volumen de Hidróxido de Potasio 10 N (ml)
pH después de la Esterilización•
2
8 0,523
-
6,0 ± 0,05
16,73
8,0 ± 0,1
Solución amortiguadora B.4 (O, 1 M, pH 4,5)
-
13,61
-
4,5 ± 0,05
Solución amortiguadora B.6 (10%, pH 6,0)
20
80
-
6,0 ± 0,05
• Ajustar el pH con ácido fosfórico 18 N o hidróxido de potasio 1O N.
USP 39
166 (81) Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas / Pruebas Biológicas
Tabla 12. Soluciones amortiguadoras (Continuación)
Solución amortiguadora
Concentración de Fosfato Di básico de Potasio (g/L)
Solución amortiguadora B.1 O (0,2 M, pH 10,5)
35
Solución amortiguadora B.16 (O, 1 M, pH 7,0)
13,6
Concentración de Fosfato Monobásico de Potasio (g/L) -
4
Volumen de Hidróxido de Potasio 10 N (ml)
pH después de la Esterilizaciónª
2
10,5 ± 0,1
-
7,0 ± 0,2
ª Ajustar el pH con ácido fosfórico 18 N o hidróxido de potasio 1O N. Otras soluciones: Ver Reactivos, Indicadores y Soluciones. Agua: Usar Agua Purificada. Solución salina: Usar Solución salina SR. Formaldehído diluido: Solución de formaldehído y agua (1 :3)
CÁLCULOS Introducción: La potencia del antibiótico se calcula mediante la interpolación de una recta estándar o patrón obtenida por transformación logarítmica y ajustada por cuadrados mínimos (ver los detalles sobre los cálculos a continuación). El analista debe considerar tres conceptos esenciales al interpretar los resultados de potencia del antibiótico: 1. Las relaciones biológicas de concentración-respuesta por lo general no son lineales. El método de potencia del antibiótico permite ajustar los datos a una línea recta, evaluando un intervalo de concentración estrecho en el que los resultados se acercan a la linealidad. Los resultados de la valoración se considerarán válidos únicamente si la potencia calculada es 80%-125% de la potencia asumida al preparar la solución madre de la muestra. Cuando la potencia calculada está fuera del intervalo de 80%-125%, el resultado para la muestra puede quedar fuera del intervalo de concentración estrecho en el que se ha establecido la linealidad, en cuyo caso, se debe ajustar la potencia asumida de la muestra según corresponda y repetir la valoración para obtener un resultado válido. 2. El medio más efectivo para reducir la variabilidad del valor de informe (la media geométrica de la potencia de todos los ensayos y duplicados) son los ensayos independientes del procedimiento de valoración. El resultado combinado de una serie de valoraciones independientes más pequeñas realizadas a lo largo de varios días es una estimación de potencia más confiable que la obtenida de una sola valoración grande con el mismo número total placas o tubos. Se requieren tres o más valoraciones independientes para determinaciones de potencia de antibióticos. 3. El número de valoraciones requeridas para obtener una estimación confiable de potencia del antibiótico depende del intervalo de especificación requerido y de la variabilidad de la valoración. El cálculo del límite de confianza descrito a continuación se determina a partir de varios logaritmos de las potencias que son aproximadamente iguales en precisión. Si el valor calculado para la amplitud del intervalo de confianza, W, es demasiado amplio, no será posible tomar una decisión útil con respecto a si la potencia cumple con su especificación. El laboratorio debe determinar de antemano en sus procedimientos operativos estándar un valor máximo aceptable para la amplitud del intervalo de confianza. El valor máximo se debe determinar durante el desarrollo y confirmarse durante la validación o la verificación. Si el intervalo de confianza calculado excede este límite, el analista debe llevar a cabo determinaciones de potencia independientes adicionales para cumplir con el requisito del límite. Se debe tomar en cuenta que la decisión de realizar determinaciones adicionales no depende de la potencia estimada, sino únicamente de la incertidumbre en dicha estimación, según lo determina la amplitud del intervalo de confianza. La variabilidad de la valoración tiene un impacto mayor en el límite de confianza calculado que el número de determinaciones de potencia independientes. Como resultado, el analista debe considerar primeramente reducir la variabilidad en la medida de lo posible antes de realizar determinaciones de potencia. Las siguientes secciones describen los cálculos para determinar la potencia de los antibióticos, así como la realización del cálculo de límite de confianza. Asimismo, se presentan métodos para calcular el error estándar con el propósito de obtener estimaciones de la varianza de la valoración. Cuando se usan logaritmos, resulta aceptable cualquier base logarítmica. El Apéndice 7 proporciona fórmulas para cálculos manuales cuando las concentraciones están equitativamente espaciadas en la escala logarítmica. Se pueden usar métodos estadísticos alternativos siempre que se validen adecuadamente. Valoración en cilindro-placa: Esta sección detalla el análisis de datos de muestra y la determinación de la potencia de una muestra desconocida, usando la valoración en cilindro-placa. Datos de muestra: La Tabla 73 presenta los datos de una valoración que se usarán a manera de ejemplo a lo largo de esta sección. Para cada una de las 12 placas, las zonas 1, 3 y 5 corresponden a la concentración de referencia y las otras tres zonas son para una de las otras cuatro concentraciones, según se indican. Las otras columnas son necesarias para los cálculos y se explican más adelante. Paso 1: Realizar los cálculos iniciales y la verificación de aptitud de variabilidad. Para cada conjunto de tres placas, promediar los nueve valores de referencia y promediar los nueve valores estándar. Ejemplo (ver la Tabla 73) 15,867
=X(l 6, 1; 15,6; ... ; 15,8)
Pruebas Biológicas/ (81 >Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas 167
USP 39
14, 167 = X(l 4,6; 14, 1; ... ; 14,8) Para cada conjunto de tres placas, determinar la desviación estándar de los nueve valores de referencia y de la desviación estándar de los nueve valores estándar. Para cada desviación estándar, determinar la desviación estándar relativa correspondiente. Ejemplo: (ver la Tabla 73) 0,200 = cr(l 6, 1, ... , 15,8) 1,3% = (0,200/15,867)
X
100
0,324 = cr(l 4,6, ... , 14, 1) 2,3% = (0,324/14, 167)
X
100
Para el criterio de aptitud de variabilidad, cada laboratorio debe determinar un valor máximo aceptable para la desviación estándar relativa. Si alguna de las ocho desviaciones estándar relativas (cuatro para la referencia y cuatro para el estándar) sobrepasan este máximo predeterminado, los datos de la valoración no serán adecuados y deben desecharse. [NOTA-El límite sugerido para la desviación estándar relativa es no más de 10%.] Paso 2: Realizar una corrección de variación entre placas. Esta corrección se aplica para convertir la medición de zona promedio obtenida para cada concentración al valor que se obtendría si la medición de la concentración de referencia promedio para dicho conjunto de tres placas repetidas fuera la misma que el valor del punto de corrección:
Xc = media corregida del estándar X5 = XR =
media original del estándar media de la referencia P = punto de corrección Ejemplo: Para el primer conjunto de tres placas en la Tabla 73 (5 7), la corrección es: 14,022 = 14, 167 - (15,867 - 15,722) = 14, 167 - O, 145 Paso 3: Determinar la línea de la curva estándar. Generar la línea de la curva estándar, graficando las mediciones corregidas de la zona en función del logaritmo de los valores de concentración estándar. Calcular la ecuación de la línea de la curva estándar, realizando una regresión lineal no ponderada estándar sobre estos valores, usando software adecuado o los cálculos manuales del Apéndice 7. [NOTA-Usar el logaritmo natural o el logaritmo en base 1O para graficar la curva estándar y determinar la ecuación de regresión; ambos proporcionan el mismo resultado de prueba final.] Cada laboratorio debe determinar un valor mínimo del coeficiente de determinación (%R2 ) para una regresión aceptable. La regresión es aceptable sólo si la %R 2 obtenida excede este valor predeterminado. [NOTA-El límite sugerido para el coeficiente porcentual de determinación es no menos de 95%.]
Tabla 13. Datos de Muestra (Valoración en Cilindro-Placa)
Estándar
(U/mL) 51
52
54
Concentración
3,20
4,00
6,25
Referencia (5,)
Repetición de Pla-
Zona 1
Zona 3
Zona 5
Media
ca
(mm)
(mm)
(mm)
(mm)
Media
Media de la Muestra Corregida
Zona
1
16,l
15,6
15,8
2
16,0
15,9
16,2
15,867
SD
0,200
%RSD
1,3
2 (mm)
Zona4
Zona6
Media
(mm)
(mm)
(mm)
14,6
14,1
13,5
14,5
14, 1
14,4
14,0
14,2
14,1
14,7
15,1
14,8
3
15,7
15,7
15,8
1
15,8
15,6
15,5
2
15,7
15,5
15,6
14,7
14,9
15,2
3
15,7
15,4
15,3
14,8
15,0
14,3
1
15,6
15,8
16,0
16,6
16,8
16,3
2
15,8
15,6
15,7
16,6
16,5
16,2
3
16,1
15,7
15,8
16,9
16,5
16,8
1
15,6
15,6
15,5
17,3
17,0
17,0
2
15,6
15,7
15,5
17,3
17,4
17,2
3
15,9
15,8
15,8
17,3
17,3
16,7
1
15,7
15,8
15,7
15,3
15,8
15,7
2
15,9
15,7
15,7
15,8
15,8
15,5
3
15,5
15,8
15,3
15,2
15,1
15, 1
15,567
15,789
0,158
0,169
1,0
1,1
SD
%RSD
O\ 00
,,..._ 00
(mm)
)> ::::i
14,167
0,324
2,3
14,022
!:r.
14,833
0,265
1,8
14,989
lo
a,.... º~ ¡::¡· o tlJ
...,
16,578
0,233
1,4
16,511
tlJ ("\
o·
::::i (!>
55
7,8125
15,667
0,141
0,9
V>
17,167
0,224
1,3
17,222
desconocida
ª Éste es el valor de la media de referencia general, referida más adelante como el
15,678
...,
o a6º
15,722ª U3
~
¡::¡·
°'
l.C
0,179
"punto de corrección".
1, 1
15,478
0,307
2,0
15,522
¡::¡· tlJ
V>
-.... -o
2
ni
00
V>
O;:J
a· ~
8º V>
eVl v
w
\()
Pruebas Biológicas/ (81) Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas 169
USP 39
Ejemplo:
La Tabla 14 resume la porción de la Tabla 13 requerida para esta parte del cálculo. Tabla 14 Conjunto de Estándares
Mediciones de la Zona Corregida (mm)
51
14,022
3,2
52 Referencia (5 3)
14,989
4,0
15,722
5
5,
16,511
6,25
5,
17,222
7,8125
Concentración (U/ml)
Resultados de la regresión lineal Línea de la curva estándar: Z = [3,551
X
ln(C)] + 9,978
Z = medición de zona corregida e= concentración %R2 = 99,7 Determinación de potencia de la muestra: Para estimar la potencia de la muestra desconocida, promediar las mediciones de la zona del estándar y las mediciones de la zona de la muestra en las tres placas usadas. Corregir por variación entre placas, usando el punto de corrección determinado anteriormente para obtener un promedio corregido para la muestra desconocida, V. [NOTA-Un método alternativo aceptable al uso del punto de corrección consiste en corregir usando el valor en la línea de regresión estimada correspondiente al logaritmo de la concentración de 53 .] Usar la medición de zona promedio corregida en la ecuación de la línea de la curva estándar para determinar el logaritmo de la concentración de la muestra, Lu, mediante:
Lu =(U - a)/b a= intersección de la línea de regresión
b = pendiente de la línea de regresión Para obtener la potencia de la muestra desconocida, tomar el antilogaritmo de Lu y multiplicar el resultado por cualquier factor de dilución aplicable. Este valor también se puede expresar como porcentaje del valor de la concentración de referencia. Ejemplo: Medición corregida de la zona de la muestra (Tabla 13) = 15,522 Logaritmo natural de la concentración de la muestra:
Lu = (15,522 - 9,978)/3,551 = 1,561 Concentración de la muestra: Cu= e 1•561 = 4,765
Porcentaje de concentración de referencia: Resultado= (4,765/5,000) x 100 = 95,3% Valoración turbidimétrica: Esta sección detalla el análisis de los datos de muestra y la determinación de la potencia de una muestra desconocida usando la valoración turbidimétrica. El método asume que los tubos se distribuyen en forma aleatoria dentro del bloque de calentamiento u otro dispositivo de control de temperatura. Si el dispositivo tiene un perfil de temperatura que no es uniforme, se prefiere un diseño en bloques aleatorizados. En dicho diseño, la gradilla se divide en áreas (bloques) de temperatura relativamente uniforme y en cada área se coloca al menos un tubo de cada concentración del Estándar y de cada muestra desconocida. El análisis de datos del diseño en bloques aleatorizados es diferente del siguiente. Datos de muestra: La Tabla 15 presenta los datos de una valoración que se usarán como ejemplo a lo largo de esta sección. Se requieren otras columnas para los cálculos, las cuales se explican a continuación. Tabla 15. Datos de Muestra (Valoración Turbidimétrica) Estándar
5¡
5,
Concentración (µg/ml)
64
80
Repetición
Absorbancia (u.a.)
1
0,8545
2
0,8422
3
0,8495
1
0,8142
2
0,8273
3
0,8392
Promedio (u.a.)
Desviación Estándar
0,8487
0,0062
0,8269
0,0125
170 (81) Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas/ Pruebas Biológicas
USP 39
Tabla 15. Datos de Muestra (Valoración Turbidlmétrica) (Continuación) Concentración (µg/ml)
Estándar
5,
Repetición
Absorbancia (u.a.)
1
0,6284
100
5,
125
156
5s
desconocida
U3
2
0,6947
3
0,7563
1
0,6933
2
0,6850
3
0,6699
1
0,5299
2
0,5779
3
0,5316
1
0,7130
2
0,7960
3
0,7201
Promedio (u.a.)
Desviación Estándar
0,6931
0,0640
0,6827
0,0119
0,5465
0,0272
0,7430
0,0460
Paso 1: Realizar los cálculos iniciales y la verificación de aptitud de variabilidad. Para cada concentración (incluyendo la muestra), promediar los tres valores de absorbancia. Ejemplo: Ver 5 7 en la Tabla 15. o,8487 = X(0,8545; o,8422; o,8495) Para cada concentración, determinar la desviación estándar de las tres lecturas y una desviación estándar combinada para todas las concentraciones. Ejemplo: Ver 5 7 en la Tabla 15. 0,0125
= 50(0,8545; 0,8422; 0,8495)
El valor combinado se calcula tomando la raíz cuadrada del promedio de las cinco varianzas: 0,0325 = {[(0,0062)2 + (0,0125)2 + (0,0640)2 + (0,0119)2 + (0,0272)2]/5}1/2 Para el criterio de aptitud de variabilidad, cada laboratorio debe determinar una desviación estándar combinada máxima aceptable. Si la desviación estándar combinada excede este máximo predeterminado, los datos de valoración no son adecuados y se deben descartar. [NOTA-El límite sugerido para la desviación estándar combinada es no más de 10% del valor de absorbancia promedio a través de las cinco concentraciones.] Si el número de determinaciones repetidas por concentración es al menos cinco, entonces se puede calcular una desviación estándar relativa para cada concentración después de verificar valores atípicos y comparar con una desviación estándar relativa máxima aceptable. [NOTA-El límite sugerido para la desviación estándar relativa es no más de 10%.] Paso 2: Determinar la línea de la curva estándar. Generar la línea de la curva estándar, graficando los valores de absorbancia promedio en función del logaritmo de los valores de concentración del estándar. Calcular la ecuación de la línea de la curva estándar, realizando una regresión lineal no ponderada sobre estos valores usando software apropiado o los cálculos manuales del Apéndice 1. [NOTA-Usar el logaritmo natural o el logaritmo en base 1 O para graficar la curva estándar y determinar la ecuación de regresión; ambos proporcionan el mismo resultado de prueba final.] Cada laboratorio debe determinar un valor mínimo del coeficiente porcentual de determinación (%R2) para una regresión aceptable. La regresión es aceptable únicamente si el valor %R2 obtenido excede este valor predeterminado. [NOTA-El límite sugerido para el coeficiente porcentual de determinación es no menos de 90%.] Ejemplo: La Tabla 16 resume la porción de la Tabla 15 requerida para esta parte del cálculo. Tabla 16 Conjunto de Estándares
Valores Promedio de Absorbancia (u.a.)
Concentración (µg/ml)
51
0,8487
64
57
0,8269
80
53
0,6931
100
54
0,6827
125
5,
0,5465
156
Resultados de la regresión lineal Línea de la curva estándar:
Pruebas Biológicas/ (81) Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas 171
USP 39
Absorbancia = 2,2665 - [0,7735 x log 10 (concentración)] %R2 = 93,0% Para estimar la potencia de la muestra desconocida, promediar las tres mediciones de absorbancia para obtener un promedio para la muestra desconocida, TJ. Usar esta medición promedio en la ecuación de la línea de la curva estándar para determinar el logaritmo de la concentración de la muestra desconocida, Lu, mediante: Determinación de potencia de la muestra:
Lu =(U - a)/b a= intersección de la línea de regresión b = pendiente de la línea de regresión
Para obtener la potencia de la muestra desconocida, tomar el antilogaritmo de Lu y multiplicar el resultado por cualquier factor de dilución aplicable. Este valor también se puede expresar como porcentaje del valor de la concentración de referencia. Ejemplo: Absorbancia promedio de la muestra (Tabla 75) = 0,7430. log 10 (Cu)
= (0,7430- 2,2665)/(- 0,7735) = 1,9696 Cu= 101,9696 = 93,2
Porcentaje de concentración de referencia = (93,2/l 00,0) x 100 = 93,2% Cu= concentración de la muestra Límites de confianza y combinación de los cálculos de las valoraciones:
Debido a la variabilidad entre valoraciones, se requieren tres o más determinaciones independientes para una estimación confiable de la potencia de la muestra. Para cada determinación independiente, comenzar con soluciones madre y diluciones de prueba tanto del Estándar como de la muestra, preparadas por separado, y repetir la valoración de una muestra determinada otro día. Usando un conjunto de al menos tres determinaciones de la potencia desconocida, usar el método del Apéndice 2 para verificar valores atípicos. Esta determinación debe realizarse en la escala logarítmica. Para obtener una estimación combinada de la potencia desconocida, calcular el promedio, M, y la desviación estándar de los logaritmos de las potencias aceptadas. [NOTA-Usar el logaritmo natural o el logaritmo en base 1 O.] Determinar el intervalo de confianza para la potencia, según se indica a continuación: antilog[M - t(0,05, N - 1) x SOJ'l/N], antilog[M + t(0,05, N - 1) x SO /-.JN] M= promedio SO = desviación estándar N = número de valoraciones t(0,05, N-1) =el punto del 5% de dos colas de una distribución t de Student con N-1 grados de libertad NOTA-El valor t está disponible en hojas de cálculos, textos estadísticos y software estadístico.
W = antilog{[t(0,05, N - 1) x SO/-.JN]} W = mitad de la amplitud del intervalo de confianza Comparar la mitad de la amplitud del intervalo de confianza con un valor máximo predeterminado aceptable. Si la mitad de la amplitud es mayor que el límite de aceptación, continuar con valoraciones adicionales. Ejemplo: Suponer que la muestra se valora cuatro veces, con resultados de potencia en la escala logarítmica natural de 1,561; 1,444; 1,517 y 1,535. Entonces:
N=4 M = X(l,561; 1,444; 1,517; 1,535) = 1,514
SO= cr(l ,561; 1,444; 1,517; 1,535) = 0,050
t = 3, 182 El intervalo de confianza en la escala logarítmica es 1,514±(3,182
X
0,050/'l/4) = (1,434, 1,594)
Tomando antilogaritmos, la potencia estimada es e1,514 = 4,546 con un intervalo de confianza de 95% para la potencia de e1,434, ei, 594 =(4,197; 4,924) La mitad de la amplitud del intervalo de confianza para comparar con un valor de aceptación es el cociente 4,924/4,546 = 1,083.
1 72 (81) Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas/ Pruebas Biológicas
USP 39
APÉNDICE 1. FÓRMULAS PARA CÁLCULOS MANUALES DE REGRESIÓN Y CONCENTRACIÓN DE LA MUESTRA Cuando las concentraciones están igualmente espaciadas en la escala logarítmica, los cálculos se pueden realizar usando la siguiente fórmula. Donde: sk = media de la medición de zona corregida (valoración en cilindro-placa) o valor de absorbancia promedio (valoración turbidimétrica) para el conjunto estándar k
k = 1, 2, 3, 4, 5
s = media de los cinco valores sk Lk = logaritmo de la concentración k correspondiente. [NOTA-Usar el logaritmo natural o el logaritmo en base 1O.] La pendiente de la línea de regresión se calcula mediante: b = (Yana - Yba¡a)!(Xª''ª - Xba¡a) Yalta
= lfs(3Ss + 2S4 + S3 - S¡)
ybaja = 1/s(3S¡ + 2S2 + S3 - Ss) Xalta = Ls Xbaja = L¡ Combinar y simplificar a:
El logaritmo de la concentración de la muestra se halla usando: Lu
= Lreferencia +[(U - S)/b]
Por ejemplo, usando los datos para la valoración en cilindro-placa en la Tabla 13 y logaritmos naturales:
•b·,,..[(4 xJ 7,222).+c(~• ?< 16,.511) .;,. (? í<.J4,Q89)f (4.~.J.~.;Q~Q)}/{.5f{p(l:j~l).f !8($,2.)]} =L3¡551•••Rll\Ó1.Ó~t-~~1s)
s= (14,020 + 14,989+15,722+16,511+17,222)/5=15,693 Logaritmo natural de la concentración de la muestra= ln(5) + [(15,522 - 15,693)/3,551] = 1,561 Concentración de la muestra= e1•561 = 4,765
APÉNDICE 2: PROCEDIMIENTO PARA VERIFICAR VALORES ATÍPICOS; RECHAZO DE MEDICIONES ATÍPICAS O ABERRANTES Toda medición que sea claramente cuestionable debido a una falla en el procedimiento de valoración deberá ser rechazada, sin importar si se descubre durante el procedimiento de medición o tabulación. El rechazo o la retención arbitrarios de una medición aparentemente aberrante puede representar una fuente seria de sesgo. Por lo general, el rechazo de mediciones que se basa únicamente en su magnitud relativa es un procedimiento que debe usarse con poca frecuencia. Toda medición de potencia sospechada, o atípica, se puede analizar en función del criterio siguiente, el cual se basa en la variación dentro de un solo grupo de mediciones supuestamente equivalentes a partir de una distribución normal. En promedio, el criterio rechazará una observación válida una vez cada 25 ensayos o una vez cada 50 ensayos. Designar las mediciones en orden de magnitud de y1a yN, donde y1es el posible valor atípico, y N es el número de mediciones en el grupo. Calcular la brecha (gap) relativa usando la Tabla A2-1, Prueba para Detectar Mediciones Atípicas y las fórmulas siguientes: Cuando N = 3 a 7:
Cuando N = 8 a 1O:
Cuando N = 11 a 13:
Si G1, G2 , o G3, según corresponda, excede el valor crítico en la Tabla A2-7, Prueba para Detectar Mediciones Atípicas, para la N observada, existe una base estadística para omitir la(s) medición(es) atípica(s).
USP 39
Pruebas Biológicas/ (85) Prueba de Endotoxinas Bacterianas 1 73
Tabla A2-1. Prueba para Detectar Mediciones Atípicas
En las muestras de una población normal, las brechas iguales o mayores que los valores siguientes de G1, G2 y G3 ocurren con una probabilidad de P = 0,01, cuando las mediciones atípicas pueden ocurrir únicamente en un extremo; o con P = 0,02, cuando éstas pueden ocurrir en cualquiera de los extremos. N
1
3
1
4
1
5
1
6
1
7
G¡
1
0,987
1
0,889
1
0,781
1
0,698
1
0,637
N
1
8
1
9
1
10
1
1
G,
1
0,681
1
0,634
1
0,597
1
1
N
1
11
1
12
1
13
1
1
G3
1
0,674
1
0,643
1
0,617
1
1
Ejemplo: Potencias estimadas de la muestra en escala logarítmica= 1,561; 1,444; 1,517; 1,535 Verificar la potencia más baja para la medición atípica:
G1 = (1,517 - 1,444)/(1,561 - 1,444) = 0,624 < 0,889
Por lo tanto, 1,444 no es una medición atípica. Verificar la potencia más alta para la medición atípica: G1 = (1,561 - 1,535)/(1,561 - 1,444) = 0,222 < 0,889
Por lo tanto, 1,561 no es una medición atípica. Las potencias atípicas deben marcarse como valores atípicos y deben excluirse de los cálculos de la valoración. No se puede excluir más de una potencia como medición atípica.
(85) PRUEBA DE ENDOTOXINAS BACTERIANAS •Partes de este capítulo general han sido armonizadas con los textos correspondientes de la Farmacopea Europea y/o de la Farmacopea japonesa. Aquellas partes que no han sido armonizadas están marcadas con los símbolos(+.) para especificar dicha situación .• La Prueba de Endotoxinas Bacterianas (PEB) es una prueba para detectar o cuantificar endotoxinas de bacterias gramnegativas usando un lisado de amebocitos del cangrejo herradura (Limulus polyphemus o Tachypleus tridentatus). Hay tres técnicas para esta prueba: la técnica de coagulación (gel-clot), la cual está basada en la formación de gel; la técnica turbidimétrica, basada en la producción de turbidez después de la ruptura de uniones de un sustrato endógeno; y la técnica cromogénica que se basa en el desarrollo de color después de la ruptura de un complejo sintético péptido-cromógeno. Efectuar la prueba con cualquiera de las tres técnicas. En caso de duda o controversia, la decisión final se toma basándose en la prueba de límite de coagulación, a menos que se indique algo diferente en la monografía del producto en análisis. La prueba se efectúa de forma tal que se evite la contaminación por endotoxinas.
APARATOS Eliminar los pirógenos de todo el material de vidrio y otros materiales termoestables en un horno de aire caliente, mediante un proceso validado.+\ Habitualmente se usan 30 minutos a 250º como tiempo y temperatura mínimos. Si se emplean materiales de plástico, tales como microplacas y puntas de pipetas para pipeteadores automáticos, usar los que han demostrado estar exentos de endotoxinas detectables y no interferir con la prueba. [NOTA-En este capítulo, el término "tubo" incluye cualquier otro receptáculo, como por ejemplo los pocillos de las placas de microtitulación.]
REACTIVOS V SOLUCIONES DE PRUEBA
Usado de Amebocitos Un producto liofilizado obtenido a partir de un lisado de amebocitos (leucocitos) del cangrejo herradura (Limu/us polyphemus o Tachypleus tridentatus). Este reactivo se refiere sólo a un producto fabricado de conformidad con las reglamentaciones de la Para una prueba de validez del procedimiento para inactivar endotoxinas, ver Esterilización por Calor Seco en Esterilización y Garantía de Esterilidad de Artículos Farmacopeicos (1211 ). Usar un Usado SR con una sensibilidad no menor de O, 15 Unidades de Endotoxina por ml.+
•l
174 (85) Prueba de Endotoxinas Bacterianas/ Pruebas Biológicas
USP 39
autoridad competente. [NOTA-El Usado de Amebocitos reacciona con algunos j3 -glucanos además de reaccionar con las endotoxinas. Existen preparaciones de Usado de Amebocitos que no reaccionan con los glucanos: se preparan retirando del Usado de Amebocitos el factor G que reacciona con los glucanos o inhibiendo el sistema de reacción del factor G del Usado de Amebocitos. Se pueden usar para pruebas de endotoxinas en presencia de glucanos.]
Agua para Prueba de Endotoxinas Bacterianas (PEB) Usar Agua para Inyección o agua producida por otros procedimientos y que no reaccione con el lisado empleado, en el límite de detección del reactivo.
Usado SR Disolver con agitación suave el Usado de Amebocitos en Agua para PEB o en un amortiguador recomendado por el fabricante del lisado. Almacenar el lisado reconstituido, refrigerado o congelado, de acuerdo con las especificaciones del fabricante.
PREPARACIÓN DE LAS SOLUCIONES Solución Madre del Estándar de Endotoxina Preparar una Solución Madre del Estándar de Endotoxina a partir de un Estándar de Referencia de Endotoxina USP que haya sido calibrado con el Estándar Internacional para Endotoxinas vigente de la OMS. Seguir las especificaciones en el prospecto del empaque y en la etiqueta para la preparación y almacenamiento de la Solución Madre del Estándar de Endotoxina. El contenido de endotoxina se expresa en Unidades de Endotoxina (UE). [NOTA-Una Unidad USP de Endotoxina (UE) es igual a una Unidad Internacional (UI) de endotoxina.]
Soluciones Estándar de Endotoxina Después de mezclar vigorosamente la Solución Madre del Estándar de Endotoxina, preparar las diluciones seriales apropiadas de la Solución Estándar de Endotoxina, usando Agua para PEB. Usar las diluciones tan pronto como sea posible para evitar la pérdida de actividad por adsorción.
Soluciones Muestra Preparar las Soluciones Muestra disolviendo o diluyendo los medicamentos, usando Agua para PEB. Algunas sustancias o preparaciones se pueden disolver o diluir adecuadamente en otras soluciones acuosas. Si fuera necesario, ajustar el pH de la solución (o de la dilución) a examinar de modo que el pH de la mezcla del lisado y la Solución Muestra se encuentre dentro del intervalo de pH especificado por el fabricante del lisado, por lo general entre 6,0-8,0. El pH se puede ajustar con un ácido, una base o una solución amortiguadora adecuada según lo recomiende el fabricante del lisado. Los ácidos y las bases se pueden preparar a partir de concentrados o sólidos con Agua para PEB en recipientes exentos de endotoxinas detectables. Las soluciones amortiguadoras se deben validar para garantizar que están exentas de endotoxinas y otros factores de interferencia detectables.
DETERMINACIÓN DE LA MÁXIMA DILUCIÓN VÁLIDA (MDV) La máxima dilución válida es la dilución máxima permisible de una muestra a la que se le puede determinar el límite de endotoxina. Determinar la MDV a partir de la siguiente ecuación: MDV =(límite de endotoxina x concentración de la Solución Muestra)/("-)
Límite de Endotoxina El límite de endotoxina para medicamentos de administración parenteral, definido según la dosis, es igual a K/M• 2 ., donde K es la dosis pirogénica umbral de endotoxina por kg de peso corporal y Mes igual a la dosis máxima recomendada del producto, en bolo, por kg de peso corporal. Cuando el producto se va a inyectar a intervalos frecuentes o por infusión continua, Mes la dosis máxima total administrada durante un periodo de una hora. El límite de endotoxinas para los medicamentos de admi• 2 K es 5 UE-USP/kg de peso corporal para cualquier vía de administración distinta de la intratecal (para la cual K es 0,2 UE-USP/kg de peso corporal). En el caso de productos radiofarmacéuticos que no se administren por vía intratecal, el límite de endotoxina se calcula como 175 UE/V, donde Ves la dosis máxima recomendada en ml. En el caso de radiofármacos administrados por vía intratecal, el límite de endotoxina se obtiene mediante la fórmula 14 UE/V. Para formulaciones (por lo general productos oncológicos) que se administran por metro cuadrado de superficie corporal, la fórmula es K/ M, donde K= 1 00 UE/m 2 y Mes la dosis máxima/m 2 .•
USP 39
Pruebas Biológicas/ (85) Prueba de Endotoxinas Bacterianas 175
nistración parenteral se especifica en la monografía individual en unidades como UE/mL, UE/mg, UE/Unidad de actividad biológica, etc.
Concentración de la Solución Muestra mg/mL: en el caso del límite de endotoxina especificado por peso (UE/mg); Unidades/mL: en el caso del límite de endotoxina especificado por unidad de actividad biológica (UE/Unidad); mL/mL: cuando el límite de endotoxina se especifica por volumen (UE/mL). A-: la sensibilidad declarada en la Técnica de Coagulación (UE/mL) o la concentración más baja usada en la curva estándar para la Técnica Turbidimétrica o la Técnica Cromogénica.
TÉCNICA DE COAGULACIÓN La técnica de coagulación se usa para detectar o cuantificar endotoxinas basándose en la coagulación del lisado empleado como reactivo en presencia de endotoxina. La concentración mínima de endotoxina requerida para hacer que el lisado se coagule en las condiciones estándar es la sensibilidad declarada del lisado empleado como reactivo. Para garantizar tanto la precisión como la validez de la prueba, efectuar las pruebas para confirmar la sensibilidad declarada del lisado y para determinar factores de interferencia según se describe en Pruebas Preparatorias.
Pruebas Preparatorias PRUEBA DE CONFIRMACIÓN DE LA SENSIBILIDAD DECLARADA DEL LISADO Confirmar en cuatro determinaciones repetidas la sensibilidad declarada, A, expresada en UE/mL del lisado antes de usarlo en la prueba. La prueba de confirmación de sensibilidad del lisado se debe llevar a cabo cuando se usa una partida nueva de lisado o cuando hay algún cambio en las condiciones de la prueba que pueda afectar el resultado. Preparar soluciones estándar con al menos cuatro concentraciones equivalentes a 2A-, A, 0,5A y 0,25A-, diluyendo el ER Endotoxina USP con Agua para PEB. Mezclar un volumen del Lisado SR con un volumen igual (como por ejemplo alícuotas de 0, 1 mL) de una de las Soluciones Estándar de Endotoxina en cada tubo de ensayo. Cuando se usen viales o ampollas de prueba individuales que contengan lisado liofilizado, agregar directamente las soluciones al vial o a la ampolla. Incubar la mezcla de reacción durante un período constante según las instrucciones del fabricante del lisado (habitualmente a 37 ± 1º durante 60 ± 2 minutos), evitando vibraciones. Para analizar la integridad del gel, sacar uno a uno los tubos directamente de la incubadora y con un único movimiento suave, invertirlos aproximadamente a 180º. Si se ha formado un gel firme que permanece en su lugar después de invertir los tubos, registrar el resultado como positivo. Un resultado es negativo si no se forma un gel intacto. La prueba se considera válida cuando la concentración más baja de las soluciones estándar presenta un resultado negativo en todas las pruebas repetidas. El punto final es la concentración más baja en la serie de concentraciones decrecientes de endotoxina estándar que coagula el lisado. Determinar la media geométrica del punto final calculando la media de los logaritmos de las concentraciones en el punto final de la serie de cuatro determinaciones repetidas y calculando luego el antilogaritmo de la media, según se indica en la siguiente fórmula: media geométrica de la concentración en el punto final = antilogaritmo ('Le/f) donde 'Le es la suma de los logaritmos de las concentraciones en el punto final de la serie de diluciones utilizadas, y fes el número de tubos de ensayo repetidos. La media geométrica de la concentración en el punto final es la sensibilidad medida del lisado (en UE/mL). Si no es menor de 0,5A- y no es mayor de 2A, se confirma la sensibilidad declarada y se usa en las pruebas realizadas con este lisado. PRUEBA DE FACTORES DE INTERFERENCIA Por lo general, preparar soluciones (A-D) como se muestra en la Tabla 1, y efectuar la prueba de inhibición o potenciación en las Soluciones Muestra con una dilución menor que la máxima dilución válida (MDV), que no contenga endotoxinas detectables, procediendo según se describe en Prueba de Confirmación de la Sensibilidad Declarada del Lisado. La media geométrica de las concentraciones en el punto final de las Soluciones By C se determina usando la fórmula descrita en la Prueba de Confirmación de Ja Sensibilidad Declarada del Usado. La prueba de factores de interferencia deberá repetirse siempre que se presenten cambios en alguna de las condiciones que pudieran influir en el resultado de la prueba.
USP 39
1 76 (85) Prueba de Endotoxinas Bacterianas/ Pruebas Biológicas
Tabla 1. Preparación de Soluciones para la Prueba de Inhibición/Potenciación para Técnicas de Coagulación Concentración de Endotoxina/ Solución a la que se Agrega Endotoxlna
Solución A"
Ninguna/Solución Muestra
Bb
2A/ Solución Muestra
ce
Factor de Dilución
-
-
Solución Muestra
Ninguna/Agua para PEB
-
Concentración de Endotoxlna
Número de Repeticiones
-
4
2A
4
2
n
4
4
0,5/c
4
8
0,25/c
4
1
1
2/c
2
2
n
2
4
0,5/c
2
8
0,25/c
Agua para PEB
2A!Agua para PEB
Dci
Diluyente
-
2 2
-
ª
Solución A: Una Solución Muestra de la preparación en análisis que esté exenta de endotoxinas detectables. Solución B: Prueba de interferencia. e Solución C: Control para sensibilidad declarada del lisado. d Solución D: Control negativo de Agua para PEB b
Esta prueba se considera válida cuando todas las determinaciones repetidas de las Soluciones A y O no muestran ninguna reacción y el resultado de la Solución C confirma la sensibilidad declarada. Si la sensibilidad del lisado determinada en presencia de la Solución B no es menor de 0,5/c y no es mayor de 2A, la Solución Muestra no contiene factores que interfieran en las condiciones experimentales usadas. En caso contrario, la Solución Muestra a examinar interfiere con la prueba. Si la muestra en análisis no cumple con la prueba a una dilución menor que la MDV, se debe repetir la prueba empleando una dilución mayor que no exceda la MDV. El uso de un lisado de mayor sensibilidad permite una dilución mayor de la muestra a examinar y esto puede contribuir a la eliminación de la interferencia. La interferencia se puede resolver mediante un tratamiento adecuado, como filtración, neutralización, diálisis o calentamiento. Para establecer que el tratamiento elegido elimina eficazmente la interferencia sin pérdida de endotoxinas, realizar la valoración descrita anteriormente, utilizando la preparación a examinar, a la que se ha agregado Estándar de Endotoxina y se ha sometido al tratamiento seleccionado.
Prueba de Límite PROCEDIMIENTO Preparar las Soluciones A, B, C y O según se indica en la Tabla 2 y llevar a cabo la prueba en estas soluciones siguiendo el procedimiento indicado anteriormente en la Prueba de Confirmación de la Sensibilidad Declarada del Lisado en Pruebas Preparatorias. Tabla 2. Preparación de Soluciones para la Prueba de Límite de Coagulación Concentración de Endotoxina/ Solución a la que se Agrega Endotoxina
Solución*
Número de Repeticiones
A
Ninguna/ Solución Muestra Diluida
2
B
2A/ Solución Muestra Diluida
2
e
2A/Agua para PEB
2
D
Ninguna/Agua para PEB
2
* Preparar la Solución A y la Solución B de control positivo del producto utilizando una dilución no mayor que la MDV y tratamientos según se indica en la Prueba de Factores de Interferencia en Pruebas Preparatorias. Las Soluciones By C de control positivo contienen la Solución Estándar de Endotoxina a una concentración que corresponde al doble de la sensibilidad declarada del lisado. La Solución D de control negativo consiste en Agua para PEB.
INTERPRETACIÓN La prueba se considera válida cuando ambas determinaciones repetidas de las Soluciones By C son positivas y las de la Solución O son negativas. Cuando se obtiene un resultado negativo para ambas determinaciones repetidas de la Solución A, la preparación en análisis cumple con la prueba. Cuando se obtiene un resultado positivo para ambas determinaciones repetidas de la Solución A, la preparación en análisis no cumple con la prueba.
Pruebas Biológicas/ (85) Prueba de Endotoxinas Bacterianas 177
USP 39
Cuando se obtiene un resultado positivo para una de las determinaciones de la Solución A y un resultado negativo para la otra, repetir la prueba. En la repetición, la preparación en análisis cumple con la prueba si se obtiene un resultado negativo en ambas determinaciones repetidas de la Solución A. La preparación no cumple con la prueba si se obtiene un resultado positivo para una o ambas determinaciones repetidas de la Solución A. Sin embargo, si la preparación no cumple con la prueba a una dilución menor que la MDV, se puede repetir la prueba empleando una dilución mayor que no exceda la MDV.
Prueba Cuantitativa PROCEDIMIENTO La prueba cuantifica endotoxinas bacterianas en las Soluciones Muestra por valoración volumétrica hasta un punto final. Preparar Soluciones A, B, C y D según se indica en la Tabla 3 y analizar siguiendo el procedimiento en la Prueba de Confirmación de la Sensibilidad Declarada del Usado en Pruebas Preparatorias. "' d e So 1uc1ones para 1a Prueba de Coagu 1acI'on Ta bl a 3 Preparac1on
Solución
Aª
Concentración de Endotoxlna/ Solución a la cual se Agrega Endotoxlna Ninguna/Solución Muestra
Diiuyente
Factor de Dlluclón
Concentración de Endotoxlna
Número de Repeticiones
2
4
-
8
-
2
1
21..
2
1
21..
2
2
lA.
2
4
0,51..
2
8
0,251..
2
1
Agua para PEB
2
Bb
21.,/ Solución Muestra
ce
21.,/ Agua para PEB
Dd
Agua para PEB
Ninguna/Aguo para PEB
-
-
-
2 2
2
• Solución A: Solución Muestra en análisis a la dilución, que no debe exceder la MDV, con la cual se completó la Prueba de Factores de Interferencia. Las diluciones subsiguientes de la Solución Muestra no deben exceder la MDV. Usar Agua para PEB para efectuar una serie de diluciones en cuatro tubos que contengan la Solución Muestra en análisis a concentraciones de 1, 1/2, '/•, y 1/s con respecto a la concentración usada en la Prueba de Factores de Interferencia. Se pueden usar otras diluciones hasta la MDV, según sea necesario. b Solución 8: Solución A que contenga endotoxina estándar a una concentración de 2A- (control positivo del producto). e Solución C: Dos series repetidas de cuatro tubos de Agua para PEB que contengan la endotoxina estándar a una concentración de 2A-, A-, 0,5A-, y 0,25A-, respectivamente. d
Solución D: Agua para PEB (control negativo).
CÁLCULO E INTERPRETACIÓN La prueba se considera válida cuando se cumplen las tres condiciones siguientes: (1) ambas determinaciones repetidas de la Solución D de control negativo son negativas; (2) ambas determinaciones repetidas de la Solución B de control positivo del producto son positivas; y (3) la media geométrica de la concentración en el punto final de la Solución C está comprendida en el intervalo de 0,51.. a Para determinar la concentración de endotoxinas de la Solución A, calcular la concentración en el punto final para cada repetición multiplicando cada factor de dilución del punto final por A.. La concentración de endotoxinas en la Solución Muestra es la concentración en el punto final de las repeticiones. Si la prueba se realiza con una Solución Muestra diluida, calcular la concentración de endotoxinas en la Solución Muestra original multiplicando por el factor de dilución. Si ninguna de las diluciones de la Solución Muestra es positiva en un ensayo válido, informar la concentración de endotoxina como menor que 'A (si se analizó la muestra diluida, informar como menor que 'A multiplicado por el factor de dilución más bajo de la muestra). Si todas las diluciones son positivas, la concentración de endotoxina se informa como igual o mayor que el factor de dilución mayor por 'A (p.ej., el factor de dilución inicial multiplicado por 8 y por 'A en la Tabla 3). La preparación cumple con los requisitos de la prueba si la concentración de endotoxinas en ambas determinaciones repetidas es menor que la especificada en la monografía individual.
n.
TÉCNICAS FOTOMÉTRICAS CUANTITATIVAS Técnica Turbidimétrica Esta técnica es una valoración fotométrica que mide los incrementos en turbidez del reactante. Dependiendo del principio empleado en la valoración, esta técnica se puede clasificar como valoración turbidimétrica de punto final o valoración turbidi-
USP 39
178 (85) Prueba de Endotoxinas Bacterianas/ Pruebas Biológicas
métrica cinética. La valoración turbidimétrica de punto final se basa en la relación cuantitativa entre la concentración de endotoxinas y la turbidez (absorbancia o transmisión) de la mezcla de reacción al término de un período de incubación. La valoración turbidimétrica cinética es un método para medir el tiempo necesario para alcanzar una absorbancia o transmisión predeterminada de la mezcla de reacción (tiempo de iniciación) o la velocidad de desarrollo de turbidez. La prueba se efectúa a la temperatura de incubación recomendada por el fabricante del lisado (por lo general 37 ± 1 º).
Técnica Cromogénica Esta técnica es una valoración para medir el cromóforo liberado de un péptido cromogénico adecuado por la reacción de las endotoxinas con el lisado. Dependiendo del principio empleado en la valoración, esta técnica se puede clasificar como valoración cromogénica de punto final o valoración cromogénica cinética. La valoración cromogénica de punto final se basa en la relación cuantitativa entre la concentración de endotoxinas y la liberación del cromóforo al término de un período de incubación. La valoración cromogénica cinética es un método para medir el tiempo (tiempo de iniciación) necesario para alcanzar una absorbancia predeterminada de la mezcla de reacción o la velocidad de desarrollo de color. La prueba se efectúa a la temperatura d_e incubación recomendada por el fabricante del lisado (por lo general 37 ± 1 º).
Pruebas Preparatorias Con el fin de garantizar la precisión o validez de las técnicas turbidimétricas y cromogénicas, se realizan las pruebas preparatorias para verificar que los criterios para la curva estándar son válidos y que la solución muestra no interfiere con la prueba. Cuando cambian las condiciones que pueden influir en el resultado de la prueba es necesaria la validación del método de prueba. GARANTÍA DE LOS CRITERIOS PARA LA CURVA ESTÁNDAR La prueba se debe efectuar para cada lote de lisado empleado como reactivo. Utilizando la Solución Estándar de Endotoxina, preparar por lo menos tres concentraciones de endotoxina dentro del intervalo indicado por el fabricante del lisado para generar la curva estándar. Realizar la valoración usando por lo menos tres determinaciones repetidas de cada concentración de endotoxina estándar, siguiendo las instrucciones del fabricante del lisado (con respecto a relaciones de volumen, tiempo de incubación, temperatura, pH, etc.). Si el intervalo deseado en los métodos cinéticos es mayor de dos logaritmos, se deben incluir estándares adicionales para que cada aumento logarítmico esté comprendido en el intervalo de la curva estándar. El valor absoluto del coeficiente de correlación, r, debe ser mayor o igual a 0,980 para el intervalo establecido de concentraciones de endotoxina. PRUEBA PARA FACTORES DE INTERFERENCIA Seleccionar una concentración de endotoxina en o cerca del centro de la curva estándar de endotoxina. Preparar las Soluciones A, 81 C y D según se indica en la Tabla 4. Llevar a cabo la prueba en las Soluciones A, B, C y D al menos por duplicado, de acuerdo con las instrucciones del lisado empleado, por ejemplo, en lo que respecta al volumen entre la Solución Muestra y el Usado SR, la relación de volumen de la Solución Muestra y el Usado SR, el tiempo de incubación, etc. Tabla 4. Preparación de Soluclones para la Prueba de Inhibición/Potenciación para Técnicas Fotométricas Soluclón N Bb
ce Dd
Concentración de Endotoxlna Ninguna
Soluclón a la cual se Agrega Endotoxlna
Número de Repeticiones
Solución Muestra
No menos de 2
Concentración central de la curva estándar
Solución Muestra
No menos de 2
Al menos 3 concentraciones (la concentración más baja se denomina A.)
Agua para PEB
No menos de 2 para cada una
Ninguna
Agua para PEB
No menos de 2
ª
Solución A: Solución Muestra se puede diluir sin que exceda la MDV. Solución 8: La preparación en análisis a la misma dilución que Ja Solución A, que contenga endotoxina agregada a una concentración igual o cercana a la concentración central de Ja curva estándar. e Solución C: La endotoxina estándar a las concentraciones usadas en Ja validación del método descrito para Garantía de Criterios pora la Curva Estándar en Pruebas Preparatorias (controles positivos). d Solución D: Agua para PEB (control negativo). b
La prueba se considera válida cuando se cumplen las condiciones siguientes. 1. El valor absoluto del coeficiente de correlación de la curva estándar generada usando la Solución Ces mayor o igual a 0,980. 2. El resultado de la Solución D no excede el límite del valor del blanco requerido en la descripción del lisado empleado como reactivo o es menor que el límite de detección de endotoxina del lisado empleado como reactivo.
USP 39
Pruebas Biológicas/ (87) Pruebas de Reactividad Biológica, In Vitro 179
Calcular la recuperación media de la endotoxina agregada restando la concentración media de endotoxina en la solución, si la hubiera (Solución A, Tabla 4), de la que contiene la endotoxina agregada (Solución B, Tabla 4). Para considerar que no presenta factores que interfieran con la valoración en las condiciones de la prueba, la concentración medida de endotoxina agregada a la Solución Muestra debe estar entre 50%-200% de la concentración conocida de endotoxina agregada después de restar la endotoxina detectada en la solución sin endotoxina agregada. Cuando la recuperación de endotoxina se encuentra fuera de los intervalos especificados, se considera que la Solución Muestra en análisis contiene factores de interferencia. Luego, repetir la prueba usando una dilución mayor que no exceda la MDV. Además, la interferencia de la Solución Muestra o de la Solución Muestra diluida que no exceda la MDV se puede eliminar mediante un tratamiento validado apropiado, como filtración, neutralización, diálisis o calentamiento. Para establecer que el tratamiento elegido elimina eficazmente la interferencia sin pérdida de endotoxinas, realizar la valoración descrita anteriormente utilizando la preparación a examinar, a la que se ha agregado Endotoxina Estándar y se ha sometido posteriormente al tratamiento seleccionado.
Procedimiento de Prueba Seguir el procedimiento descrito anteriormente para Prueba de Factores de Interferencia en Pruebas Preparatorias.
Cálculo Calcular la concentración de endotoxina de cada una de las determinaciones repetidas de la Solución A usando la curva estándar generada con la Solución C de control positivo. La prueba se considera válida cuando se cumplen las tres condiciones siguientes. 1. Los resultados de la Solución C de control cumplen con los requisitos de validación definidos en Garantía de Criterios para la Curva Estándar, en Pruebas Preparatorias. 2. La recuperación de endotoxina, calculada a partir de la concentración encontrada en la Solución B después de restar la concentración de endotoxina encontrada en la Solución A está dentro del intervalo de 50%-200%. 3. El resultado de la Solución D de control negativo no excede el límite del valor del blanco requerido en la descripción del lisado empleado o es menor que el límite de detección de endotoxina del lisado empleado como reactivo.
Interpretación En las valoraciones fotométricas, la preparación en análisis cumple con la prueba si la concentración media de endotoxinas de las determinaciones repetidas de la Solución A, después de la corrección por dilución y concentración, es menor que el límite de endotoxina para el producto.
(87) PRUEBAS DE REACTIVIDAD BIOLÓGICA, IN VITRO Las pruebas que se describen a continuación han sido diseñadas para determinar la reactividad biológica de cultivos de células de mamíferos después de entrar en contacto con plásticos elastoméricos y otros materiales poliméricos que, a su vez, están en contacto directo o indirecto con el paciente, o de extractos específicos preparados a partir de los materiales en análisis. Es esencial que las pruebas se realicen en la superficie especificada. Cuando ésta no se puede determinar, utilizar O, 1 g de elastómero o 0,2 g de plástico u otro material por cada mL de líquido de extracción. Tomar precauciones en la preparación de los materiales para evitar la contaminación con microorganismos y otra materia extraña. Se describen tres pruebas (es decir, la Prueba de Difusión en Agar, la Prueba de Contacto Directo y la Prueba de Elución). 1 La decisión acerca del tipo de prueba o el número de pruebas a realizar para la evaluación de la posible respuesta biológica de una muestra o extracto específicos depende del material, el producto final y el uso previsto. Otros factores que también pueden afectar la aptitud de la muestra para un uso específico son: la composición polimérica, los procedimientos de procesamiento y limpieza, el medio de contacto, las tintas, los adhesivos, la absorción, la adsorción y la permeabilidad de los conservantes, y las condiciones de almacenamiento. La evaluación de tales factores se debe realizar con pruebas específicas adicionales adecuadas antes de determinar si un producto fabricado a partir de un material específico es apto para el uso previsto. Los materiales que no cumplen con las pruebas in vitro son candidatos para las pruebas in vivo descritas en Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo (88). Estándares de Referencia USP (11 )-ER Polietileno de Alta Densidad USP. ER Biorreacción Positiva USP.
1
Para más detalles, consulte las siguientes publicaciones de la American Society far Testing and Materials, 1916 Race St., Philadelphia, PA 19103: "Standard Test Method far Agar Diffusion Cell Culture Screening far Cytotoxicity," designación de ASTM F 895-84; "Standard Practice far Direct Contact Cell Culture Evaluation of Materials far Medical Devices," designación de ASTM F 813-83.
180 (87) Pruebas de Reactividad Biológica, In Vitro / Pruebas Biológicas
USP 39
Preparación del Cultivo de Células-Preparar múltiples cultivos de células de fibroblastos de mamífero L-929 (ATCC línea celular CCL 1, NCTC don 929; pueden usarse líneas celulares alternativas obtenidas de un repositorio de estándares siempre que se sometan a una validación adecuada) en un medio de cultivo esencial mínimo suplementado con suero, con una densidad de siembra de aproximadamente 105 células por ml. Incubar los cultivos a 37° ± 1º en una incubadora humidificada durante no menos de 24 horas en una atmósfera de 5 ± 1% de dióxido de carbono hasta obtener una monocapa con una confluencia superior al 80%. Observar al microscopio los cultivos preparados para asegurar que las monocapas sean uniformes y tiendan a la confluencia. [NOTA-La reproducibilidad de las Pruebas de Reactividad Biológica In Vitro depende de la obtención de una densidad uniforme del cultivo celular.] Disolventes de Extracción-Inyección de Cloruro de Sodio (ver monografía-usar una Inyección de Cloruro de Sodio que contenga NaCI al 0,9%). De modo alternativo, se pueden usar medios de cultivo de células de mamífero sin suero o medios de cultivo de células de mamífero suplementados con suero. Se usa el suplemento de suero cuando la extracción se realiza a 37º durante 24 horas. AparatoAutoc/ave-Emplear un autoclave capaz de mantener una temperatura de 121 º ± 2º equipado con un termómetro, un manómetro, una llave de ventilación, una gradilla adecuada para acomodar los recipientes de prueba por encima del nivel del agua y un sistema de refrigeración de agua que permita enfriar los recipientes de prueba hasta aproximadamente 20º, pero no por debajo de 20º, inmediatamente después del ciclo de calentamiento. Estufa-Usar una estufa, preferentemente un modelo de convección mecánica, que mantenga las temperaturas de funcionamiento en un intervalo de 50º-70º ± 2º. Incubadora-Usar una incubadora capaz de mantener una temperatura de 37° ± 1 ºy una atmósfera humidificada de 5 ± 1% de dióxido de carbono en el aire. Recipientes de Extracción-Utilizar únicamente recipientes de vidrio Tipo 1, como por ejemplo, ampollas o tubos de ensayo de cultivo con tapa de rosca, o equivalentes. En caso de utilizar tubos de ensayo para cultivo, o equivalentes, deben cerrarse con una tapa de rosca que tenga un revestimiento elastomérico adecuado. La superficie expuesta del revestimiento elastomérico está completamente protegida con un disco sólido inerte con un espesor de 50-75 µm. Se puede fabricar un disco adecuado de teflón. Preparación del Aparato-Limpiar minuciosamente todo el material de vidrio con una mezcla limpiadora de ácido crómico y, si fuera necesario, con ácido nítrico caliente y luego enjuagar con Agua Estéril para Inyección durante un tiempo prolongado. Esterilizar y secar mediante un proceso adecuado los recipientes y dispositivos usados para la extracción, transferencia o administración del material de prueba. Si se usa óxido de etileno como agente esterilizante, dejar que pasen no menos de 48 horas para la desgasificación total.
ProcedimientoPreparación de Ja Muestra para Extractos-Preparar según se indica en Procedimiento, en Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo (88). Preparación de Extractos-Preparar según se indica para la Preparación de Extractos, en Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo (88) y usar la Inyección de Cloruro de Sodio (NaCI al 0,9%) o el medio de cultivo de células de mamífero sin suero como Disolventes de Extracción. [NOTA-Si la extracción se realiza a 37° durante 24 horas en una incubadora, usar medio de cultivo de células suplementado con suero. Las condiciones de extracción no deben causar en ningún caso cambios físicos como la fusión o el ablandamiento de los trozos de material, excepto una ligera adherencia.]
Prueba de Difusión en Agar Esta prueba está diseñada para cierres elastoméricos de diferentes formas. La capa de agar actúa como protector de las células y evita daños mecánicos mientras permite la difusión de las sustancias químicas lixiviables de las muestras poliméricas. Los extractos de los materiales que se van a analizar se aplican a una pieza de papel de filtro. Preparación de Muestra-Usar extractos preparados según se indica o usar porciones de las muestras de prueba que tengan superficies planas con un área de no menos de 100 mm 2 • Preparación de Control Positivo-Proceder según se indica para la Preparación de Muestra. Preparación de Control Negativo-Proceder según se indica para la Preparación de Muestra. Procedimiento-Usando 7 mL de suspensión de células preparada según se indica en la Preparación del Cultivo de Células, preparar las monocapas en placas de 60 mm de diámetro. Después de la incubación, aspirar el medio de cultivo de las monocapas y reemplazarlo con medio de cultivo suplementado con suero que contenga no más de 2% de agar. [NOTA-La calidad del agar debe ser adecuada para mantener el crecimiento celular. La capa de agar debe ser lo suficientemente delgada para permitir la difusión de las sustancias químicas lixiviables.] Colocar las superficies planas de la Preparación de Muestra, Preparación de Control Negativo y Preparación de Control Positivo o sus extractos en un medio de extracción adecuado, en cultivos duplicados, en contacto con la superficie de agar solidificado. Usar no más de tres muestras por placa preparada. Incubar todos los cultivos durante no menos de 24 horas a 37° ± 1º, preferentemente en una incubadora humidificada que contenga 5 ± 1% de dióxido de carbono. Observar al microscopio, cada cultivo alrededor de cada Muestra, Control Negativo y Control Positivo usando una tinción adecuada, si se desea. Interpretación de Jos Resultados-La reactividad biológica (degeneración y malformación celular) se describe y clasifica en una escala de 0-4 (ver la Tabla 1). Determinar las respuestas de los cultivos de células de la Preparación de Muestra, la Prepara-
Pruebas Biológicas/ (87) Pruebas de Reactividad Biológica, In Vitro 181
USP 39
ción de Control Negativo y la Preparación de Control Positivo. El sistema de prueba de cultivos de células es adecuado si la respuesta observada de la Preparación de Control Negativo es grado O (no reactiva) y la de la Preparación de Control Positivo es al menos grado 3 (moderada). La Muestra cumple con los requisitos de la prueba si la respuesta de la Preparación de Muestra no
es mayor que grado 2 (levemente reactiva). Repetir el procedimiento si la aptitud del sistema no se confirma. Tabla 1. Grados de Reactividad en la Prueba de Difusión en Agar y la Prueba de Contacto Directo Grado
Reactividad
o
Ninguna
1
Escasa
2
Leve
3
Moderada
4
Grave
Descripción de la Zona de Reactividad No se detecta zona reactiva alrededor, ni debajo de la muestra Algunas células malformadas o degeneradas debajo de la muestra Zona limitada al área debajo de la muestra y menos de 0,45 cm alrededor de la muestra Zona reactiva que se extiende de 0,45 cm a 1,0 cm alrededor de la muestra Zona reactiva que se extiende más de 1,0 cm alrededor de la muestra
Prueba de Contacto Directo Esta prueba está diseñada para materiales de diferentes formas. Este procedimiento permite la extracción y el análisis simultáneos de sustancias químicas lixiviables de la muestra en un medio suplementado con suero. El procedimiento no es adecuado para materiales de muy baja o muy alta densidad que puedan causar daños mecánicos a las células. Preparación de Muestra-Usar porciones de la muestra de prueba que tenga superficies planas con un área de no menos de 100 mm 2 • Preparación de Control Positivo-Proceder según se indica para la Preparación de Muestra. Preparación de Control Negativo-Proceder según se indica para la Preparación de Muestra. Procedimiento-Usando 2 mL de suspensión de células preparada según se indica en la Preparación del Cultivo de Células, preparar las monocapas en placas de 35 mm de diámetro. Después de la incubación, aspirar el medio de cultivo de los cultivos y reemplazarlo con 0,8 mL de medio de cultivo recién preparado. Colocar una única Preparación de Muestra, una Preparación de Control Negativo y una Preparación de Control Positivo en cada uno de los cultivos duplicados. Incubar todos los cultivos durante no menos de 24 horas a 37° ± 1ºen una incubadora humidificada que contenga 5±1 % de dióxido de carbono. Observar al microscopio cada cultivo alrededor de cada Preparación de Muestra, Preparación de Control Negativo y Preparación de Control Positivo, usando una tinción adecuada, si se desea. Interpretación de Jos Resultados-Proceder según se indica para la Interpretación de los Resultados en Prueba de Difusión en Agar. La Muestra cumple con los requisitos de la prueba si la respuesta de la Preparación de Muestra no es mayor que grado 2 (levemente reactiva). Repetir el procedimiento si la aptitud del sistema no se confirma.
Prueba de Elución Esta prueba está diseñada para la evaluación de extractos de materiales poliméricos. El procedimiento permite la extracción de muestras a temperaturas fisiológicas o no fisiológicas para distintos intervalos de tiempo. Es adecuada para materiales de alta densidad y para evaluaciones de respuesta a la dosis. Preparación de Muestra-Preparar según se indica en la Preparación de Extractos, usando una Inyección de Cloruro de Sodio (NaCI al 0,9%) o un medio de cultivo de células de mamífero sin suero como Disolventes de Extracción. Si el tamaño de la Muestra no se puede determinar inmediatamente, usar no menos de O, 1 g de material elastomérico o 0,2 g de material plástico o polimérico por mL de medio de extracción. De modo alternativo, usar un medio de cultivo de células de mamífero suplementado con suero como medio de extracción para simular mejor las condiciones fisiológicas. Preparar los extractos calentando la muestra durante 24 horas en una incubadora que contenga 5 ± 1 % de dióxido de carbono. Mantener la temperatura de extracción a 37° ± 1 º,ya que temperaturas superiores pueden desnaturalizar las proteínas séricas. Preparación de Control Positivo-Proceder según se indica para la Preparación de Muestra. Preparación de Control Negativo-Proceder según se indica para la Preparación de Muestra. Procedimiento-Usando 2 mL de suspensión de células preparada según se indica en la Preparación del Cultivo Celular, preparar las monocapas en placas de 35 mm de diámetro. Después de la incubación, aspirar el medio de cultivo de las monocapas y reemplazarlo con extractos de la Preparación de Muestra, Preparación de Control Negativo o Preparación de Control Positivo. Los extractos de los medios de cultivo de células suplementados con suero y sin suero se analizan por duplicado sin dilución (100%). El extracto con Inyección de Cloruro de Sodio se diluye con el medio de cultivo de células suplementado con suero y se analiza por duplicado a una concentración del extracto del 25%. Incubar todos los cultivos durante 48 horas a 37º ± 1º, preferentemente en una incubadora humidificada que contenga 5 ± 1 % de dióxido de carbono. Observar al microscopio cada cultivo a las 48 horas, usando una tinción adecuada, si se desea. Interpretación de Jos Resultados-Proceder según se indica para la Interpretación de Jos Resultados en Prueba de Difusión en Agar, pero usando la Tabla 2. La Muestra cumple con los requisitos de la prueba si la respuesta de la Preparación de Muestra no es mayor que grado 2 (levemente reactiva). Repetir el procedimiento si la aptitud del sistema no se confirma. Para realizar evaluaciones de la respuesta a la dosis, repetir el procedimiento, usando diluciones cuantitativas del extracto de la muestra.
182 (87) Pruebas de Reactividad Biológica, In Vitro / Pruebas Biológicas
USP 39
Tabla 2. Grados de Reactlvldad en la Prueba de Eluclón Grado
Reactlvldad
o
Ninguna
1
Escasa
2
Leve
3
Moderada
4
Grave
Condiciones de todos los Cultivos Gránulos intracitoplasmáticos diferenciados sin lisis celular El 20% o menos de las células son redondas, levemente adheridas, sin gránulos intracitoplasmáticos; hay algunas células lisadas Más del 20% pero menos o hasta el 50% de las células son redondas y desprovistas de gránulos intracitoplasmáticos; no hay lisis celular extensiva ni áreas vacías entre células Más del 50% pero menos del 70% de las capas celulares contienen células redondas o lisadas Destrucción casi total de las capas celulares
(88) PRUEBAS DE REACTIVIDAD BIOLÓGICA, IN VIVO Las siguientes pruebas están diseñadas para determinar la respuesta biológica de animales a materiales elastoméricos, plásticos y otros materiales poliméricos en contacto directo o indirecto con el paciente, o mediante la inyección de extractos específicos preparados a partir del material en análisis. Es esencial conocer el área específica para la extracción. Cuando ésta no se puede determinar, utilizar O, 1 g de elastómero o 0,2 g de plástico u otro material por cada mL de líquido de extracción. También es fundamental tomar las precauciones necesarias en la preparación de los materiales que se van a inyectar o instilar para evitar la contaminación con microorganismos y otra materia extraña. Se describen tres pruebas. La Prueba de Inyección Sistémica y la Prueba lntracutánea se utilizan para materiales elastoméricos, especialmente para cierres elastoméricos para los que las Pruebas de Reactividad Biológica, In Vitro (87) correspondientes han indicado una reactividad biológica significativa. Estas dos pruebas se utilizan para plásticos y otros polímeros además de una tercera prueba, la Prueba de Implantación, para probar la aptitud de estos materiales destinados a la fabricación de envases y accesorios, para uso en preparaciones parenterales y en dispositivos médicos, implantes y otros sistemas. Estas tres pruebas se aplican a materiales o dispositivos médicos, cuando existe la necesidad de clasificar los plásticos y otros polímeros basándose en las pruebas de reactividad biológica in vivo. A los efectos de este capítulo, se aplicarán las siguientes definiciones: la Muestra es la muestra en análisis o un extracto preparado a partir de dicha muestra. Un Blanco consiste en la misma cantidad del mismo medio de extracción usado para extraer la muestra en análisis, tratado de la misma manera que el medio de extracción que contiene dicha muestra. Un Control Negativo1 es una muestra que no produce ninguna reacción en las condiciones de prueba.
CLASIFICACIÓN DE PLÁSTICOS Se definen seis Clases de Plásticos (ver la Tabla 1). Esta clasificación se basa en las respuestas a una serie de pruebas in vivo para las que se especifican extractos, materiales y vías de administración. Estas pruebas están directamente relacionadas con el uso final al que están destinados los artículos de plástico. La elección de extractantes es representativa de los vehículos en preparaciones con las que es probable que los plásticos entren en contacto. La clasificación de la Tabla 1 facilita la comunicación entre proveedores, usuarios y fabricantes de plásticos ya que resume las pruebas a las que deben someterse los envases de inyectables y dispositivos médicos cuando es necesaria su clasificación. Tabla 1. Clasificación de Plásticos Clases de Plásticoª
Pruebas por Realizar
1
11
111
IV
V
VI
X
X
X
X
X
X
Material de Prueba
Animal
Dosis
Procedlmlentob
Ratón
50 ml/kg
A(IV)
Conejo o Cobayo
0,2 ml/animal en cada uno de 1O ó 6 sitios
B(IC)
Ratón
50 ml/kg
A(JP)
Conejo o Cobayo
0,2 ml/animal en cada uno de 1O ó 6 sitios
B (IC)
Ratón
10 g/kg
A (JP)
Conejo o Cobayo
0,2 ml/animal en cada uno de 1O ó 6 sitios
B(IC)
Extracto de Muestra en Inyección de CloX
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
ruro de Sodio Extracto de Muestra en Solución 7 en 20
de Alcohol en Inyección de Cloruro de Sodio Extracto de Muestra en Políetilenglícol
ª
400
Las pruebas requeridas para cada clase de plástico se indican con una "x" en las columnas correspondientes. b Leyenda: A (IP)-Prueba de Inyección Sistémica (intraperitoneal); A (IV)-Prueba de Inyección Sistémica (intravenosa); B (IC)-Prueba lntracutánea (intracutánea); C-Prueba de Implantación (implantación intramuscular o subcutánea).
1
ER Polietileno de Alta Densidad USP.
USP
Pruebas Biológicas/ (88) Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo 183
39
Tabla 1. Clasificación de Plásticos (Continuación) Clases de Plástico• 1
11
Pruebas por Realizar
111
IV
V
VI
X
X
X
X
Material de Prueba
X
Extracto de Muestra en Aceite Vegetal
X
X
Tiras de implante de Muestra
X
X
Implante de Muestra
X
X
Animal
Dosis
Ratón
50 mL/kg
Conejo o Cobayo
0,2 mL/animal en cada uno de 1O ó 6 sitios
Conejo
4 tiras/animal
Rata
2 Muestras/animal
Procedlmientob
A (IP) . B(IC)
c c
ª Las pruebas requeridas para cada clase de plástico se indican con una "x" en las columnas correspondientes. b Leyenda: A (IP)-Prueba de Inyección Sistémica (intraperitoneal); A (IV)-Prueba de Inyección Sistémica (intravenosa); B (IC)-Prueba lntracutánea (intracutánea); (-Prueba de Implantación (implantación intramuscular o subcutánea).
Con excepción de la Prueba de Implantación, los procedimientos se basan en el uso de extractos que, según la resistencia térmica del material, se preparan a una de las tres temperaturas estándar: 50º, 70º y 121 º. Por lo tanto, la designación del tipo de plástico debe estar acompañada por una indicación de la temperatura de extracción (p.ej., IV-121 º, que representa un plástico clase IV extraído a 121 º o 1-50º, que representa un plástico clase 1 extraído a 50º). Los plásticos pueden clasificarse como Clases de Plástico USP 1-VI únicamente sobre la base de los criterios de respuesta prescritos en la Tabla 7• Esta clasificación no es válida para plásticos destinados al uso como envases de productos orales o tópicos o que pudieran utilizarse como una parte integral de la formulación de un medicamento. La Tabla 7 no es válida para elastómeros naturales, los cuales deben analizarse con Inyección de Cloruro de Sodio y aceites vegetales únicamente. La Prueba de Inyección Sistémica y la Prueba lntracutánea están diseñadas para determinar las respuestas biológicas sistémica y local, respectivamente, de animales a plásticos y otros polímeros mediante la inyección monodosis de extractos específicos preparados a partir de una Muestra. La Prueba de Implantación está diseñada para evaluar la reacción del tejido vivo al plástico y a otros polímeros mediante la implantación de la Muestra propiamente dicha en el tejido animal. Para la realización de la Prueba de Implantación, son importantes la preparación y la colocación adecuadas de las muestras en condiciones asépticas. Estas pruebas están diseñadas para la aplicación de plásticos y otros polímeros en la condición en la que se utilizan. Si el material va a exponerse a cualquier proceso de limpieza o esterilización antes de su uso final, las pruebas deben realizarse con una Muestra preparada a partir de una muestra preacondicionada mediante el mismo procesamiento. Ciertos factores, como por ejemplo la composición del material, los procedimientos de procesamiento y limpieza, el contacto con los medios, tintas, adhesivos, absorción, adsorción y permeabilidad de los conservantes y las condiciones de almacenamiento también pueden afectar la aptitud de un material para un uso específico. Para determinar la aptitud de un material para su uso indicado, deben evaluarse estos factores mediante pruebas específicas adicionales. Estándares de Referencia USP (11 )-fR Polietileno de Alta Densidad USP. Medios de ExtracciónINYECCIÓN DE CLORURO DE sorno (ver la monografía). Usar Inyección de Cloruro de Sodio que contenga NaCI al 0,9%. SOLUCIÓN 1 EN 20 DE ALCOHOL EN INYECCIÓN DE CLORURO DE SODIO POLIETILENGLICOL 400 (ver la monografía). ACEITE VEGETAL-Usar Aceite de Sésamo recién refinado (ver la monografía) o Aceite de Semilla de Algodón (ver la monografía) u otros aceites vegetales adecuados. VEHÍCULO DEL PRODUCTO FARMACÉUTICO (donde corresponda). AGUA PARA INYECCIÓN (ver la monografía). NOTA-El Aceite de Sésamo o el Aceite de Semilla de Algodón u otros aceites vegetales cumplen con los siguientes requisitos adicionales. Obtener, si es posible, aceite recientemente refinado. Usar tres animales debidamente preparados e inyectar el aceite por vía intracutánea en una dosis de 0,2 mL en 1 O sitios por animal y observar los animales a las 24, 48 y 72 horas después de la inyección. Calificar las observaciones en cada sitio con la escala numérica indicada en la Tabla 2. Para los 3 conejos o cobayos (30 ó 18 sitios de inyección), en cualquier momento de observación, la respuesta promedio para eritema no es mayor de 0,5 y para edema no es mayor de 1,0; y ningún sitio muestra una reacción tisular de más de 1 O mm de diámetro general. El residuo de aceite en el lugar de la inyección no debe confundirse con edema. El tejido edematoso se blanquea al presionarlo suavemente. Tabla 2. Evaluación de las Reacciones Cutáneasª Eritema y Formación de Escaras
Ausencia de eritema
Puntaje
o
Eritema muy leve (apenas perceptible)
1
Eritema bien definido
2
Eritema de moderado a grave
3
Eritema grave (rojo intenso) a leve formación de escaras (lesiones profundas)
4
ª Draize JH, Woodward G, Calvery HO. Methods far the study of irritation and toxicity of substances applied topically to the skin and mucous membranes. I Pharmaco/ Exp Ther 1944;82:377-390. b
Excluye edemas no inflamatorios (mecánicos) del blanco o líquido de extracción.
184 (88) Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo / Pruebas Biológicas
USP 39
Tabla 2. Evaluación de las Reacciones Cutáneasª (Continuación) Eritema y Formación de Escaras Formación de Edemab
Puntaje Puntaje
Ausencia de edema
o
Edema muy leve (apenas perceptible)
1
Edema leve (los bordes están bien definidos con una elevación clara)
2
Edema moderado (aproximadamente 1 mm de elevación)
3
Edema qrave (más de 1 mm de elevación y extendido más allá del área de exposición)
4
• Draize JH, Woodward G, Calvery HO. Methods for the study of irritation and toxicity of substances applied topically to the skin and mucous membranes. f Pharmacol Exp Ther 1944;82:377-390. b Excluye edemas no inflamatorios (mecánicos) del blanco o líquido de extracción. Aparatos-Los aparatos requeridos para las pruebas incluyen los siguientes. AUTOCLAVE-Usar un autoclave capaz de mantener una temperatura de 121 º ± 2,0º, equipado con un termómetro, un medidor de presión, una llave de ventilación, una gradilla adecuada para acomodar los recipientes de prueba por encima del nivel del agua y un sistema enfriador de agua que permita enfriar los recipientes de prueba hasta aproximadamente, pero no por debajo de 20º inmediatamente después del ciclo de calentamiento. ESTUFA-Usar una estufa, preferentemente un modelo de circulación forzada, que mantenga las temperaturas de funcionamiento de 50º o 70º ±2º. RECIPIENTES DE EXTRACCIÓN-Usar únicamente recipientes, como ampollas o tubos de ensayo para cultivo de vidrio Tipo 1 con tapa de rosca. En caso de usarse, los tubos de ensayo para cultivo deben cerrarse con tapas de rosca que tengan revestimientos elastoméricos adecuados. La superficie expuesta del revestimiento elastomérico está completamente protegida con un disco sólido inerte con un espesor de 0,05-0,075 mm. Puede fabricarse un disco adecuado a partir de una resina de teflón. Preparación del Aparato-Limpiar minuciosamente todos los elementos de vidrio con mezcla limpiadora de ácido crómico o, si fuera necesario, con ácido nítrico caliente y luego enjuagar con agua durante un tiempo prolongado. Limpiar los utensilios para cortar con un método adecuado (por ejemplo, limpieza sucesiva con acetona y cloruro de metileno) antes de utilizarlos para subdividir una muestra. Limpiar todos los demás equipos cepillándolos minuciosamente con un detergente adecuado y enjuagar con agua durante un tiempo prolongado. Esterilizar y secar los recipientes y equipos utilizados para la extracción, transferencia y administración de material de prueba con un proceso adecuado. [NOTA-Si se usa óxido de etileno como agente esterilizante, dejar transcurrir el tiempo suficiente para la desgasificación total.]
ProcedimientoPREPARACIÓN DE LA MUESTRA-Tanto la Prueba de Inyección Sistémica como la Prueba lntracutánea pueden realizarse utilizando el mismo extracto, si se desea, o bien pueden utilizarse extractos diferentes para cada prueba. Seleccionar y subdividir en porciones una Muestra del tamaño indicado en la Tabla 3. Eliminar las partículas, como pelusas y partículas sueltas, tratando cada Muestra subdividida o Control Negativo del siguiente modo. Colocar la Muestra en una probeta graduada limpia de 100 mL con tapón de vidrio Tipo 1y agregar aproximadamente 70 mL de Agua para Inyección. Agitar aproximadamente 30 segundos y escurrir el agua. Repetir este paso y secar las piezas preparadas para la extracción con Aceite Vegetal en una estufa a una temperatura máxima de 50º. [NOTA-No limpiar la Muestra con un paño seco o húmedo ni enjuagando o lavando con un disolvente orgánico, agente tensoactivo, etc.]
Tabla 3. Superficie de la Muestra a Utilizar" Forma del Material Película o lámina
Tubos
Tiras de aprox. 5 x 0,3 cm
0,5-1 mm
Cantidad de Muestra por cada 20 ml de Medio de Extracción 2 Equivalente a 120 cm de superficie total (ambos lados combinados) Equivalente a 60 cm 2 de superficie total (ambos lados combinados)
<0,5 mm (pared)
Longitud (en cm)= 120 cm2 /(suma de las circunferencias del DI y DE)
Secciones de aprox. 5 x 0,3 cm
Piezas hasta aprox. 5 x 0,3 cm
Espesor <0,5 mm
Placas, tubos y elementos moldeados
>1 mm
Longitud (en cm)= 60 cm 2 /(suma de circunferencias del DI y DE) Equivalente a 60 cm 2 de superficie total (todas las superficies expuestas combinadas)
Elastómeros
>1 mm
Equivalente a 25 cm2 de superficie total (todas las superficies expuestas combinadas)
0,5-1 mm (pared)
Subdividida en
No subdividirb
• Cuando la superficie no se puede determinar debido a la configuración de la muestra, usar O, 1 g de elastómero o 0,2 g de plástico u otros polímeros por cada ml de líquido de extracción. b Los cierres elastoméricos moldeados se prueban intactos. PREPARACIÓN DE EXTRACTOS-Colocar una Muestra debidamente preparada para su análisis en un recipiente de extracción y agregar 20 mL del medio de extracción adecuado. Repetir estas indicaciones para cada medio de extracción requerido para la
USP 39
Pruebas Biológicas / (88) Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo 185
prueba. Preparar también un blanco de 20 ml de cada medio para inyecciones paralelas y comparaciones. Extraer calentando en un autoclave a 121 ºdurante 60 minutos, en una estufa a 70º durante 24 horas o a 50º durante 72 horas. Dejar transcurrir suficiente tiempo para que el líquido que se encuentra dentro del recipiente alcance la temperatura de extracción. [NOTA-Las condiciones de extracción no deberían en ningún caso causar cambios físicos, como fusión o ablandamiento de los trozos de Muestra, lo cual provocaría una reducción de la superficie disponible. Puede tolerarse una ligera adherencia de los trozos. Agregar siempre las piezas limpias al medio de extracción en forma individual. Si se utilizan tubos para cultivo para extracciones en autoclave con Aceite Vegetal, sellar las tapas de rosca en forma adecuada con cinta sensible a la presión.] Enfriar hasta una temperatura cercana a la ambiente pero no inferior a 20º, agitar vigorosamente durante varios minutos y decantar cada extracto de inmediato en un recipiente seco estéril, tomando las precauciones asépticas pertinentes. Almacenar los extractos a una temperatura de 20º-30º y no utilizar para las pruebas después de transcurridas 24 horas. Es importante el contacto del medio de extracción con la superficie disponible del plástico y el tiempo y la temperatura durante la extracción, el enfriamiento adecuado, la agitación y el proceso de decantación, así como la manipulación y almacenamiento aséptico de los extractos después de la extracción.
PRUEBA DE INYECCIÓN SISTÉMICA Esta prueba está diseñada para evaluar respuestas sistémicas a los extractos de materiales en análisis después de su inyección en ratones. Pueden usarse vías alternativas de inyección, si se justifican. Animales de Prueba-Utilizar ratones albinos sanos que pesen de 17-23 g y que no hayan sido utilizados previamente. Para cada grupo de prueba, utilizar únicamente ratones del mismo origen. Suministrar agua y comida ad líbitum, del tipo normalmente utilizado para animales de laboratorio y de composición conocida. Procedimiento-[NOTA-Agitar cada extracto vigorosamente antes de retirar las dosis de inyección para asegurar la distribución uniforme de la materia extraída.] Inyectar a cada uno de los cinco ratones del grupo de prueba la Muestra o el Blanco según se indica en la Tabla 4, excepto que se debe diluir cada g del extracto de la Muestra preparada con Polietilenglicol 400 y el Blanco correspondiente con 4, 1 volúmenes de Inyección de Cloruro de Sodio para obtener una solución con una concentración de aproximadamente 200 mg de polietilenglicol por ml. Ta bl a 4. Procedi mento 1 de lnyecc1on-Prue ba de lnyecc1on S1stemlca Extracto o Blanco Dosis por kg Víaª Inyección de Cloruro de Sodio 50 ml IV Solución 1 en 20 de Alcohol en Inyección de Cloruro de Sodio Polietilenglicol 400 Vehículo del producto farmacéutico (cuando corresponda)
Aceite Vegetal
ª
50 ml
IV
10 g
IP
50 ml
IV
50ml
IP
50 ml
IP
IV= intravenosa (muestra acuosa y blanco); IP = intraperitoneal (muestra oleaginosa y blanco).
Observar a los animales de inmediato después de la inyección, nuevamente 4 horas después de la inyección y luego a las 24, 48 y 72 horas como mínimo. Si durante el período de observación ninguno de los animales tratados con el extracto de la Muestra evidencia una reactividad biológica significativamente mayor que los animales tratados con el Blanco, la Muestra cumple con los requisitos de esta prueba. Si dos o más ratones mueren, o si se produce una conducta anormal, como por ejemplo convulsiones o postración, en dos o más ratones, o si se registra una pérdida de peso de más de 2 g en tres o más ratones, la Muestra no cumple con los requisitos de la prueba. Si cualquiera de los animales tratados con la Muestra sólo presenta signos leves de reactividad biológica y no más de un (1) animal presenta síntomas de marcada reactividad biológica o muere, repetir la prueba utilizando grupos de 1 O ratones. Al repetir la prueba, los 1O animales tratados con la Muestra no presentan reactividad biológica significativa superior a la de los animales tratados con el Blanco durante el período de observación.
PRUEBAINTRACUTÁNEA Esta prueba está diseñada para evaluar las respuestas locales a los extractos de materiales en análisis después de su inyección intracutánea en conejos o cobayos. Animales de Prueba-Seleccionar conejos o cobayos sanos que puedan esquilarse bien y cuya piel esté libre de irritación o traumatismos mecánicos. Al manipular los animales, evitar tocar los sitios de la inyección durante los períodos de observación, salvo para discriminar entre edema y residuos de aceite. Procedirniento-[NOTA-Antes de retirar las dosis de inyección, agitar cada extracto vigorosamente para asegurar la distribución uniforme de la materia extraída.] El día de la prueba, esquilar bien el lomo del animal a ambos lados de la columna vertebral sobre un área de prueba suficientemente grande. Evitar la irritación y los traumatismos mecánicos. Eliminar los pelos sueltos mediante aspiración. Si fuera necesario, frotar la piel ligeramente con un hisopo humedecido en alcohol diluido y secar antes de aplicar la inyección. Puede utilizarse más de un extracto de un determinado material por conejo o cobayo, siempre y cuando se haya determinado que los resultados de la prueba no se verán afectados. Para cada Muestra utilizar dos animales e inyectar a cada uno por vía intracutánea, utilizando un lado del animal para la Muestra y el otro lado para el Blanco, según se
186 (88) Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo / Pruebas Biológicas
USP 39
indica en la Tabla 5. [NOTA-Diluir cada g del extracto de la Muestra preparada con Polietilenglicol 400 y el Blanco correspondiente, con 7,4 volúmenes de Inyección de Cloruro de Sodio para obtener una solución con una concentración de aproximadamente 120 mg de polietilenglicol por ml.] Tabla 5. Prueba lntracutánea Número de Sitios (por animal)
Dosis (µL por sitio)
Muestra
5
200
Blanco
5
200
Extracto o Blanco
Examinar los sitios de inyección en busca de evidencia de cualquier reacción del tejido, como por ejemplo eritema, edema y necrosis. En caso de ser necesario, frotar la piel ligeramente con un hisopo con alcohol diluido para facilitar la lectura de los sitios de inyección. Observar a todos los animales 24, 48 y 72 horas después de la inyección. Calificar las observaciones en una escala numérica para el extracto de la Muestra y para el Blanco, utilizando la Tabla 2. Volver a esquilar el pelaje según sea necesario durante el período de observación. Se determinan los puntajes promedio de eritema y edema para los sitios de la Muestra y el Blanco en cada periodo de observación (24, 48 y 72 horas) para cada conejo o cobayo. Después del puntaje de las 72 horas, todos los puntajes de eritema más los puntajes de edema se suman por separado para cada Muestra y Blanco. Dividir cada uno de los totales por 12 (2 animales x 3 períodos de observación x 2 categorías de puntaje) para determinar el puntaje medio de cada Muestra frente al de cada Blanco correspondiente. Los requisitos de la prueba se cumplen si la diferencia entre el puntaje medio de la Muestra y del Blanco es de 1,0 o menos. Si en cualquier período de observación, la reacción promedio a la Muestra es cuestionablemente mayor que la reacción promedio al Blanco, repetir la prueba utilizando tres conejos o cobayos adicionales. Los requisitos de la prueba se cumplen si la diferencia entre el puntaje medio de la Muestra y el Blanco es de 1,0 o menos.
PRUEBA DE IMPLANTACIÓN La prueba de implantación está diseñada para la evaluación de materiales plásticos y otros materiales poliméricos que están en contacto directo con tejido vivo. Es importante la preparación adecuada de las tiras de implante y su adecuada implantación en condiciones asépticas. Se requieren conejos adultos saludables de Nueva Zelanda para la prueba de implantación intramuscular. Las muestras de prueba se colocan dentro de agujas para ser implantadas. Aunque la mayoría de los materiales se ajustan fácilmente a este método, existen algunos materiales que son inadecuados para la implantación intramuscular. El modelo de implantación subcutánea en ratas es una alternativa factible para materiales cuyas características físicas son inadecuadas para la implantación intramuscular de rutina.
Implantación Intramuscular en Conejos Preparar para implantación 8 tiras de la Muestra y 4 tiras de ER Polietileno de Alta Densidad USP. Cada tira debe medir no menos de 1 O mm x 1 mm. Los bordes de las tiras deben ser tan lisos como sea posible para evitar traumatismos mecánicos adicionales durante la implantación. Las tiras del tamaño mínimo especificado se implantan con una aguja hipodérmica (calibre 15-19) con una punta intravenosa y un trocar estéril. Utilizar agujas previamente esterilizadas dentro de las cuales se insertan asépticamente las tiras de plástico estériles o insertar cada tira limpia en una aguja cuya cánula y conector hayan sido protegidos con una cubierta adecuada y sometidos posteriomente al proceso de esterilización adecuado. [NOTA-Permitir la desgasificación adecuada si se usan agentes como óxido de etileno.] Animales de Prueba-Seleccionar conejos adultos sanos con un peso de al menos 2,5 kg y cuyos músculos paravertebrales sean lo suficientemente grandes para permitir la implantación de las tiras de prueba. No utilizar ningún tejido muscular que no sea el sitio paravertebral. Los animales deben anestesiarse con un agente anestésico de uso común hasta un grado suficiente como para evitar los movimientos musculares, como espasmos. Ver las pautas de la Asociación Internacional para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio (AAALAC, por sus siglas en inglés). Procedimiento-Realizar la prueba en un área limpia. El día de la prueba, o hasta 20 horas antes del análisis, esquilar a los animales a ambos lados de la columna vertebral. Eliminar los pelos sueltos mediante aspiración. Frotar la piel ligeramente con un hisopo con alcohol diluido y secar antes de aplicar la inyección. Implantar cuatro tiras de la Muestra en el músculo paravertebral a un lado de la columna de cada uno de dos conejos, 2,5-5 cm respecto a la línea media y en forma paralela a la columna vertebral, con una separación de aproximadamente 2,5 cm entre sí. De manera similar, implantar dos tiras de ER Polietileno de Alta Densidad USP en el músculo opuesto de cada animal. Insertar un estilete estéril en la aguja para sostener la tira de implante en el tejido mientras se extrae la aguja. En caso de observar sangrado excesivo después de implantar una tira, colocar una tira duplicada en otro lugar. Mantener los animales durante 120 horas como mínimo y luego sacrificarlos al final del período de observación, administrándoles una sobredosis de un agente anestésico u otros agentes adecuados. Dejar transcurrir suficiente tiempo para cortar el tejido sin que se presente sangrado. Examinar macroscópicamente el área del tejido que rodea la porción central de cada tira de implante. Utilizar una lente de aumento y una fuente de luz auxiliar. Observar los sitios de implante de la Muestra y del Control para detectar la presencia de hemorragia, necrosis, cambio de color e infecciones y registrar las observaciones. Medir la
Pruebas Biológicas/ (88) Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo 187
USP 39
encapsulación, si la hubiera, registrando el ancho de la cápsula (desde la periferia del espacio ocupado por el implante Control o Muestra hasta la periferia de la cápsula) redondeado a la décima de mm. Calificar la encapsulación según se indica en la
Tabla 6. Tabla 6. Evaluación de la Encapsulación en la Prueba de Implantación Puntaje
Ancho de la Cápsula
o
Ninguna Hasta 0,5 mm
1
0,6-1,0 mm
2
1,1-2,0 mm
3
Más de 2,0 mm
4
Calcular las diferencias entre puntajes promedio para los sitios de la Muestra y el Control. Los requisitos de la prueba se cumplen si la diferencia no es mayor de 1,0, o si la diferencia entre los puntajes medios de la Muestra y el Control para más de uno de los cuatro sitios de implantación no es mayor de 1 en cualquiera de los animales implantados.
Prueba de Implantación Subcutánea en Ratas Preparar para implantación 1O muestras de prueba y 1O muestras control. El tamaño y la forma de las muestras control deben ser lo más parecido posible a los de las muestras de prueba. Por ejemplo, las muestras preparadas en láminas deben tener un diámetro de 10-12 mm y un espesor de 0,3-1 mm. Los bordes de las muestras deben ser tan lisos como sea posible para evitar traumatismos mecánicos adicionales durante la implantación. Animales de Prueba-Seleccionar ratas albinas saludables con un peso entre 225-350 g al momento de la implantación. Procedimiento-Realizar la prueba en un área limpia. Anestesiar (ver las pautas de la AAALAC) al animal hasta lograr un plano quirúrgico. Esquilar el pelaje de los animales en ambos lados de la columna vertebral. Retirar los pelos sueltos mediante aspiración. Limpiar el área esquilada con solución de yodo-povidona. Usando una técnica aséptica, realizar dos incisiones en la línea media (de aproximadamente 1,0 cm de largo) a través de la piel en las regiones craneal y caudal sobre la superficie dorsal. Mediante disección roma, separar la fascia que conecta la piel con el músculo para formar una bolsa debajo de la piel lateral a cada costado de la incisión (la base de la bolsa es de aproximadamente 20 mm a partir de la línea del implante). Insertar una muestra estéril en cada bolsa y cerrar la incisión mediante sutura o ganchos quirúrgicos. Implantar dos muestras de prueba y dos muestras control en cada una de cinco ratas. Mantener a los animales durante un periodo de al menos siete días y sacrificarlos al final del periodo de observación mediante hipoxia inducida por C0 2 o administrando una sobredosis de un agente anestésico. Dejar transcurrir un tiempo suficiente para que el tejido pueda cortarse sin que sangre. Cortar longitudinalmente la piel (superficie dorsal) y levantarla. Examinar macroscópicamente y con cuidado el área del tejido que rodea el implante. Cortar la muestra por la mitad y retirarla para examinar de cerca el tejido que está en contacto directo con la muestra. Usar una lente de aumento y una fuente de luz auxiliar, si fuera apropiado. Observar los sitios de implante de la Muestra y del Control en busca de hemorragias, necrosis, cambio de color e infecciones y registrar las observaciones. Medir la encapsulación, si la hubiera, registrando el ancho de la cápsula (desde la periferia del espacio ocupado por el implante Control o Muestra hasta la periferia de la cápsula) redondeando a la décima de mm. Registrar el puntaje de la encapsulación de acuerdo con la Tabla 6. Calcular las diferencias entre los puntajes promedio para los sitios de la Muestra y el Control. Los requisitos de la prueba se cumplen si la diferencia no excede de 1,0.
PRUEBAS DE SEGURIDAD-PRODUCTOS BIOLÓGICOS La prueba de seguridad aquí descrita está diseñada para detectar cualquier reactividad biológica imprevista e inaceptable en un artículo. Esta prueba in vivo es para la evaluación de la seguridad de los productos obtenidos por biotecnología.
Prueba de Seguridad Seleccionar cinco ratones sanos que no hayan sido utilizados previamente para pruebas y que pesen de 17-23 g, a menos que se indique algo diferente en la monografía individual correspondiente o en otra parte de este capítulo, mantenidos con una dieta equilibrada adecuada. Preparar una solución de prueba según las indicaciones de la monografía individual correspondiente. A menos que se indique lo contrario en la monografía individual o en otra parte de este capítulo, inyectar una dosis de 0,5 ml de la solución de prueba a cada uno de los ratones, utilizando una aguja de calibre 26 de la longitud adecuada o de la longitud especificada a continuación, según corresponda. Observar a los animales durante las 48 horas posteriores a la inyección. Si al cabo de las 48 horas todos los animales sobreviven y no más de uno de los animales presenta síntomas externos de una reacción inesperada debido al nivel de toxicidad relacionado con el artículo, se cumplen los requisitos de esta prueba. Si uno o más animales mueren o si más de uno de los animales presenta signos de toxicidad anormal o indebida del artículo en análisis, repetir la prueba utilizando al menos otros 1 O ratones similares a los utilizados para la prueba inicial pero con un peso de 20 ± 1 g. En cualquiera de los casos, si todos los animales sobreviven durante 48 horas y no presentan síntomas de una reacción indicativa de un nivel de toxicidad anormal o indebido del artículo, se cumplen los requisitos de la prueba. De-
188 (88) Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo/ Pruebas Biológicas
USP 39
ben obtenerse los pesos corporales de los ratones antes de la prueba y al finalizarse para detectar cualquier efecto inapropiado. Los animales que presenten signos de toxicidad deberán someterse a una necropsia completa y a estudios de histopatología, si fuera necesario. Para los productos biológicos, realizar la prueba según los procedimientos que se describen en el Código de Reglamentos Federales, Sección 610.11.
(89) ENZIMAS USADAS COMO MATERIALES AUXILIARES EN LA FABRICACIÓN DE PRODUCTOS FARMACÉUTICOS INTRODUCCIÓN El propósito de este capítulo es describir los atributos de calidad y las pruebas relacionadas con los criterios de aceptación para preparaciones enzimáticas usadas en la fabricación de productos biofarmacéuticos. La calidad de los materiales auxiliares, incluyendo enzimas, usados en la fabricación de productos biofarmacéuticos puede tener un impacto sobre los productos terapéuticos. Se usan diversas enzimas en este tipo de procesamiento celular. Los ejemplos incluyen tripsina, colagenasa, pepsina y papaína. Este capítulo no trata las aplicaciones de dichas enzimas, sino que se enfoca en las pruebas para evaluar su calidad como materiales del proceso.
Tripsina Recombinante IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHFCGGSLI NSQWVVSAAH CYKSRIQVRL
GEHNID~ NEQFINAAKI
ITHPNFNGNT LDNDIMLIKL SSPATLNSRV
ATVSLPRSCA AAGTECLISG WGNTKSSGSS YPSLLQ¿LKA PVLSDSSCKS
SYPGQITG~ ICVGFLEGGK
DSCQGDSGGP VVCNGQLQGI VSWGYGCAQK
NKPGVYTKVC NYVNWIQQTI AAN
C1020H1s91N2a1Ü321 S14 23 463 (para /3-Tripsina) [9002-07-7].
DEFINICIÓN La tripsina recombinante, una materia prima clave para la fabricación de productos biofarmacéuticos, es una serina proteasa que rompe cadenas de péptidos principalmente en el extremo carboxílico de los aminoácidos arginina y lisina. La secuencia de aminoácidos de la tripsina recombinante es idéntica a la de la tripsina de páncreas porcino y la tripsina recombinante se produce usando métodos basados en tecnología de ADN recombinante en la levadura Pichia pastoris. Por lo tanto, las especificaciones descritas en este capítulo aplican únicamente a la tripsina porcina recombinante producida en levadura. Debido al proceso de producción recombinante, la tripsina recombinante está exenta de quimotripsina. Se conocen dos formas activas de tripsina: j]-tripsina (23 463 daltones) y a-tripsina (23 481 daltones). La autólisis de la j]-tripsina en el enlace peptídico entre Arg99 y Va110°, Lys1 2s y Ser126 o LysB9 y Ala 14º resulta en tres isoformas posibles de a-tripsina. Todas las isoformas se mantienen unidas mediante puentes disulfuro y se conservan correctamente dobladas. Como consecuencia de la hidrólisis de un enlace peptídico, el peso molecular de a-tripsina es mayor que el de f3 -tripsina por 18 daltones. El área del pico de f3 tripsina es no menos de 70% y el área del pico de a-tripsina es no más de 20%, según se determinan en el procedimiento de HPLC descrito en la prueba de Pureza. La actividad específica es no menos de 180 Unidades/mg de proteína usando acetato de carbobenzoxi-valil-glicil-arginina-4-nitril-anilida como el sustrato descrito en la Valoración. [NOTA-Una Unidad de actividad de tripsina usando acetato de carbobenzoxi-valil-glicil-arginina-4-nitril-anilida como el sustrato corresponde a 21 Unidades USP de Tripsina. Una Unidad USP de Tripsina es la actividad que causa un cambio en la absorbancia de 0,003 por minuto en las condiciones especificadas en la Valoración de la monografía de Tripsina Cristalizada usando clorhidrato del éster etílico de N-benzoil-L-arginina como sustrato. Por ende, la actividad específica de 180 Unidades/mg de proteína usando acetato de carbobenzoxi-valil-glicil-arginina-4-nitril-anilida como sustrato para tripsina recombinante corresponde a 3800 Unidades USP de Tripsina/mg de proteína.] IDENTIFICACIÓN • A. Cumple con los requisitos de la Valoración. • B. El tiempo de retención del pico principal de f3 -tripsina en la Solución muestra corresponde al de la Solución estándar, según se obtienen en la prueba de Pureza. VALORACIÓN
• PROCEDIMIENTO
Solución amortiguadora: Disolver 1,21 g de tris(hidroximetil)aminometano y 0,29 g de cloruro de calcio dihidrato en 100 mL de agua, y ajustar con ácido clorhídrico 2 N a un pH de 8,0 (a 25 ± 1º).
USP 39
Pruebas Biológicas/ (89) Enzimas 189
Solución madre de sustrato: Disolver 20 mg de acetato de carbobenzoxi-valil-glicil-arginina-4-nitril-anilida 1 , pesado con exactitud, en 3,0 mL de agua. [NOTA-Usar únicamente una solución recientemente preparada.] Solución de sustrato: Preparar una solución mezclando 28 mL de Solución amortiguadora y 2,8 mL de Solución madre de sustrato. [NOTA-Usar únicamente una solución recientemente preparada.] Soluciones estándar: Enfriar previamente el ER Tripsina Porcina Recombinante USP y el agua hasta aproximadamente 4º. Comenzar a preparar las Soluciones estándar inmediatamente cuando la temperatura haya alcanzado 4º. Preparar cada Solución estándar diluyendo ER Tripsina Porcina Recombinante USP con agua hasta obtener una dilución 1 :68 921. Preparar al menos cinco Soluciones estándar en paralelo. Valorar cada Solución estándar por duplicado. [NOTA-Usar una micropipeta ajustable para cada medición y dilución. Usar tubos de ensayo de poliestireno para preparar las Soluciones estándar y las Soluciones muestra, y usar puntas de pipeta de poliestireno que contengan filtros de polietileno para transferir las muestras. La punta de pipeta no debe mojarse antes de la transferencia y cada punta debe usarse sólo para transferir una muestra.] [NOTA-Se puede lograr una dilución 1 :68 921 mediante tres etapas de dilución sucesivas en las que cada etapa tiene una dilución 1 :41 (1 :41 /l :41 /l :41 ). Por ejemplo, para la dilución inicial, extraer O, 1 mL de ER Tripsina Porcina Recombinante USP usando una micropipeta con punta de poliestireno que contenga filtros de polietileno, limpiar la parte externa de la punta para eliminar cualquier residuo de solución y agregar el Estándar de Referencia a un tubo de ensayo de poliestireno que contenga 4,0 mL de agua previamente enfriada, enjuagar la punta pipeteando la solución hacia arriba y hacia abajo 23 veces, desechar la punta y mezclar la solución en un mezclador de vórtice durante aproximadamente 2 segundos a máxima velocidad. Para la segunda y tercera etapa de dilución, proceder según se describe para la dilución inicial, excepto que se debe transferir O, 1 mL de solución de la etapa de dilución previa.] Soluciones muestra: Preparar al menos cinco Soluciones muestra de tripsina recombinante en paralelo según se indica en Soluciones estándar para obtener una concentración final de al menos O, 16 Unidades/mL usando agua previamente enfriada como diluyente. Cada Solución muestra se valora por duplicado. Condiciones instrumentales (Ver • Espectroscopía Ultravioleta-Visible (857)• (AF oi-may-io 1w) Modo: UV Longitud de onda analítica: 405 nm Longitud de paso: 1 cm Temperatura: 25º Análisis Muestras: Soluciones estándar y Soluciones muestra Transferir 1, 1O mL de Solución de sustrato a una semi-microcubeta de poliestireno, dejar que la temperatura se estabilice, verificar la temperatura especificada en la cubeta y esperar durante 1O minutos. Comenzar la reacción agregando 0,020 mL de Solución estándar o Solución muestra. Registrar la absorbancia durante al menos 5 minutos y determinar el cambio en la absorbancia (l'lA/min) a partir del intervalo lineal de la reacción. Calcular la actividad de tripsina recombinante en Unidades/mL: Resultado= [Vr/Ci: x V x B)] x (l'lA/min) x O =volumen de la mezcla de reacción, 1, 12 mL =coeficiente de extinción para 405 nm, 10,4 (mmol- 1 • 1 cm- 1) V =volumen de la Solución estándar o la Solución muestra, 0,020 mL B = longitud de paso de absorción, 1 cm O = factor de dilución [NOTA-Una unidad liberará el equivalente a 1 mmol de 4-nitril anilina a partir de acetato de carbobenzoxi-valil-glicil-arginina-4-nitril-anilida por minuto en las condiciones de la Valoración.] Calcular la actividad específica de tripsina recombinante en Unidades/mg de proteína:
Vr
¡;
Resultado= Actividad/( C = concentración de proteína en la tripsina recombinante (mg/mL) Aptitud del sistema Muestras: Soluciones estándar y Soluciones muestra Requisitos de aptitud: l'lA/min debe ser 0,03-0,07 para las Soluciones estándar y las Soluciones muestra. La actividad promedio calculada para las Soluciones estándar es de 90%-110% del valor en la etiqueta. Criterios de aceptación Actividad específica: No menos de 180 Unidades/mg de proteína Desviación estándar relativa: No más de 5% para las actividades determinadas a partir de 5 determinaciones repetidas PUREZA • PROCEDIMIENTO
1
Un acetato de carbobenzoxi-valil-glicil-arginina-4-nitril-anilida adecuado es Chromozym TRY de Roche Applied Science (Nº de catálogo 10378496103) o equivalente.
190 (89) Enzimas / Pruebas Biológicas
Solución A: Solución B: Fase móvil:
USP 39
Diluir 1 mL de ácido fosfórico (85%) con agua hasta 1000 ml. Diluir 1 mL de ácido fosfórico (85%) con acetonitrilo hasta 1000 mL. Ver la Tabla 7. Tabla 1 Tiempo (min)
Solución A (%)
Solución B (%)
o
75
25
25
55
45
30 34
10
90
10
90
35
75
25
45
75
25
Solución estándar: Descongelar 100 µL de ER Tripsina Porcina Recombinante USP a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 hora, mezclar y transferir a un vial para HPLC. La concentración deseada de la proteína debe ser 70 ± 1O mg/ml. Solución muestra: Descongelar 100 µL de tripsina recombinante a temperatura ambiente durante 1 hora, mezclar y transferir a un vial para HPLC. La concentración deseada de la proteína debe ser 70 ± 1O mg/ml. [NOTA-Mantener la Solución estándar y la Solución muestra a 2º-8º si no están listas para ser inyectadas inmediatamente después de su preparación.] Sistema cromatográfico (Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.) Modo: HPLC Detector: UV 280 nm Columna: 4,6 mm x 25 cm; relleno L1 de 3 µm con un tamaño de poro de 200 A Temperatura de la columna: 40º Velocidad de flujo: 1,0 mL/min Volumen de inyección: 1 µL Aptitud del sistema Muestra: Solución estándar [NOTA-El tiempo de retención del pico principal de tripsina recombinante es 12-17 minutos.] Requisitos de aptitud Resolución: No menos de 1 entre los picos de a-tripsina y j3 -tripsina Análisis Muestra: Solución muestra Registrar los cromatogramas y medir las áreas de los picos. Evaluar la pureza de la tripsina usando el método de área-%. El tiempo de integración es de 25 minutos. El blanco debe considerarse para la integración. Los picos que no se separan completamente y eluyen antes del pico de a-tripsina se integran mediante una línea perpendicular únicamente si se forma un mínimo. Los picos que no se separan completamente y eluyen luego del pico de j3 -tripsina se integran tangencialmente únicamente si se forma un mínimo. Criterios de aceptación: No menos de 70% para el área del pico de j3 -tripsina y no más de 20% para el área del pico de a-tri psi na
PRUEBAS ESPECÍFICAS
Cambio en la redacción: • CONTENIDO DE PROTEÍNA
Solución de ácido clorhídrico 4 N: Mezclar 10,4 mL de ácido clorhídrico al 25% con 9,6 mL de agua. Solución amortiguadora de almacenamiento: Disolver 2,9 g de cloruro de calcio dihidrato en agua, agregar 2,5 mL de Solución de ácido clorhídrico 4 N y diluir con agua hasta un volumen final de 1000 ml. Ajustar con Solución de ácido clorhídrico 4 N a un pH de 2,0 ± 0,2, si fuera necesario. Soluciones muestra: Agregar 0,025 mL de tripsina recombinante a 3 mL de Solución amortiguadora de almacenamiento. Preparar al menos por triplicado. Solución blanco: Solución amortiguadora de almacenamiento, 3 mL Condiciones instrumentales (Ver • Espectroscopía Ultravioleta-Visible (8$7)• (AFOl-may.2016i.) Modo: UV Longitud de onda analítica: 280 nm Longitud de paso: 1 cm Aptitud del sistema
USP 39
Pruebas Biológicas / (90) Suero Fetal Bovino 191
Muestra: Soluciones muestra Requisitos de aptitud: AA (según se define a continuación) está en el intervalo de O, 13-1,8. Análisis Muestras: Soluciones muestra y Solución blanco Calcular la concentración de proteína en mg/mL:
l
Resultado =
(.MxF) 1%
A
j
XO
2801cm
= absorbancia de la Solución muestra = absorbancia de la Solución blanco ~ 1% =factor de conversión de 1% a mg/mL, 1O 280 1cm =coeficiente de extinción para tripsina, 13,6 O =factor de dilución • PRUEBAS DE RECUENTO MICROBIANO (61): El recuento total bacteriano no excede de 100 ufc/mL, realizando la prueba en 1 mL de tripsina recombinante por duplicado. Au A8
REQUISITOS ADICIONALES • ENVASADO v ALMACENAMIENTO: Almacenar en envases cerrados a -15º a -25º. • ETIQUETADO: El etiquetado indica que el material es de origen de ADN recombinante, junto con el número de producto y el
número de lote, las condiciones de almacenamiento y la fecha de caducidad. • ESTÁNDARES DE REFERENCIA USP (11)
ER Tripsina Porcina Recombinante USP
(90) SUERO FETAL BOVINO-ATRIBUTOS DE CALIDAD Y PRUEBAS DE FUNCIONALIDAD PROCESAMIENTO El Suero Fetal Bovino (FBS, por sus siglas en inglés) es la fracción líquida de color marrón claro de la sangre bovina fetal coagulada de la que se ha eliminado células, fibrina y factores de coagulación. Aunque no se ha definido la composición completa del FBS, éste contiene altos niveles de factores de crecimiento y bajos niveles de inmunoglobulinas. Además, contiene otros ingredientes claves que son esenciales para sustentar la proliferación de células en cultivos. Este producto se usa tanto en la investigación básica de las ciencias biológicas como en la fabricación industrial. El FBS es un subproducto de la industria de la carne y se recolecta a partir de fetos bovinos extraídos del ganado que se encuentra preñado al momento de su faena. El FBS se recolecta en mataderos inspeccionados por la autoridad competente del país de origen. La recolección y el procesamiento deben ser llevados a cabo por personal capacitado siguiendo procedimientos escritos y aprobados. La sangre se recolecta en un sistema cerrado en un área dedicada dentro de la instalación y se procesa rápidamente para evitar la hemólisis. Posteriormente, se permite que la sangre coagule y luego, por lo general, se centrifuga en una centrífuga refrigerada para separar el suero de los demás componentes. Por lo regular, el suero se extrae del coágulo, se transfiere a envases etiquetados, y se congela. Todos los fabricantes emplean filtración estéril antes del envasado final. Además, la radiación gamma proporciona la garantía más alta de ausencia de actividad viral. Las dosis de radiación gamma de 25-40 kGy proporcionan una reducción logarítmica significativa de agentes virales y de otros agentes adventicios, al tiempo que preservan el desempeño para el crecimiento celular. La detección de contaminación viral en el FBS se logra usando todas las pruebas aplicables descritas en el Code of Federal Regulations (Código de Reglamentos Federales) Título 9 CFR 113.53 (conocido como el análisis completo del Título 9 del CFR). Los ensayos para micoplasmas se realizan según se indica en Pruebas para Micoplasmas (63).
ATRIBUTOS DE CALIDAD DEL SUERO FETAL BOVINO Envasado y Almacenamiento:
Almacenar en envases sellados a una temperatura de -1 Oº o menor.
192 (90) Suero Fetal Bovino / Pruebas Biológicas
USP 39
Etiquetado: Etiquetar indicando que contiene Suero Fetal Bovino e indicar el número de lote, la fecha de caducidad y las condiciones de almacenamiento. Asimismo, indicar el país de origen en el etiquetado del producto. Estándares de Referencia USP (11) ER Endotoxina USP ER Suero Fetal Bovino USP pH (791 ): 7,00-8,00 en muestras de suero sin diluir : 280-360 müsmol/kg Contiene no más de 1O Unidades USP de Endotoxina/mL de suero. Contenido de Proteínas Totales (1057): 30-45 mg/mL Pruebas de Esterilidad (71 ): Cumple con los requisitos ldentificación-lnmunodifusión Radial Reactivos - Muestras de prueba de FBS - Suero de caballo, muestras de control negativo - Calibrador de lgG bovina (500 mg/L) - Diluyente de albúmina ovina (albúmina ovina al 1%, EDTA al O, 18%, NaCI al 1,75% y Tris/HCI de pH 7,4 al 1,21 %). Materiales/Aparato: Calibrar el dispositivo de medición de anillos (halos) en incrementos de O, 1 mm. Las placas de inmunodifusión radial (IDR) están disponibles comercialmente y contienen antisuero anti-lgG bovina en un gel de agarosa al 1,5%, solución amortiguadora de fosfato O, 1 M de pH 7,0, azida de sodio al O, 1% como agente bacteriostático y 1 µg/mL de anfotericina B como agente antifúngico. Almacenar a una temperatura de 2º-8º. Usar placas de IDR que puedan medir lgG bovina en el intervalo de 50-500 mg/L. Curva estándar: Usar los calibradores de lgG bovina para la aptitud del sistema y para generar una curva de calibración. Preparar dos diluciones a partir de una solución madre de lgG bovina de 500mg/ml. Diluir 120 µL de la solución madre de 500 mg/L con 80 µL de diluyente (dilución media) y 25 µL de la solución madre de 500 mg/L con 225 µL de diluyente (dilución baja). Etiquetar cada dilución respectivamente como calibradores de 300 mg/L y de 50 mg/L. Usar las soluciones de 500 mg/L, 300 mg/L y 50 mg/L para generar la curva estándar. [NOTA-Preparar y analizar las soluciones calibradoras de lgG bovina por duplicado.] Cargar 5 µL de cada muestra en los pocillos de 2,5 mm de la placa. A las 72 horas de la incubación, medir los diámetros de los anillos con una aproximación de O, 1 mm usando un dispositivo de medición de anillos apropiado. Registrar los resultados y generar una curva estándar. El diámetro del anillo debe desarrollarse completamente a temperatura ambiente durante 72 horas. Usando el resultado de cada punto de la curva estándar, generar una gráfica de linealidad en la que y es el diámetro cuadrado (mm 2) del anillo de precipitina alrededor del pocillo y x es la concentración de lgG bovina (mg/L). Calcular la curva de regresión lineal por cuadrados mínimos de la forma y = m(x) + b con ayuda de un software adecuado y determinar los valores para la pendiente (m), la ordenada al origen y (b) y el coeficiente de determinación (R2). La curva estándar para el método es lineal si R2 es ~0,98. Análisis: Las muestras congeladas sin diluir de FBS se descongelan y analizan dentro de las 24 horas si se almacenan a 4º. El análisis de las muestras de prueba de FBS y de ER Suero Fetal Bovino USP se realiza por triplicado. Preparar placas de IDR que contengan anti-lgG bovina para el análisis de varios tipos de suero. Dejar que las placas y los reactivos se equilibren a temperatura ambiente antes de su uso dejando las placas abiertas durante 10-15 minutos a temperatura ambiente para permitir que se evapore cualquier condensación de humedad en los pocillos o en la superficie del gel. Las muestras no se deben aplicar a los pocillos en los que se observe humedad. Preparar diluciones en serie, si fuera necesario, de las muestras de prueba de FBS y de ER Suero Fetal Bovino USP en diluyente. Diluir el suero de caballo para control negativo en diluyente. Cargar 5 µL de cada muestra en los pocillos de 2,5 mm de la placa e incubar a temperatura ambiente durante 72 horas. [NOTA-Las muestras de prueba y el control negativo se cargan en la misma placa.] Cálculo: Después de 72 horas, medir los diámetros de los anillos usando el dispositivo de medición de anillos y registrar los resultados. Usando la ecuación de regresión desarrollada para la desviación de la curva estándar, calcular la concentración de lgG bovina en las muestras de FBS. La concentración se expresa en mg/L. Criterios de aceptación: El suero de caballo es negativo (no debe presentar un anillo de precipitación). Las muestras de prueba de FBS y de ER Suero Fetal Bovino USP son positivas y deben contener no más de 500 mg/L de lgG. Contenido de hemoglobina: 0Jer11Blflllli. . . . . . . . . . . . Preparación de la muestra: Las muestras de FBS se descongelan, se almacenan a 4º y se analizan dentro del mismo día. Análisis: Determinar la absorbancia de la muestra de suero usando una celda espectrofotométrica con una longitud de paso de 1 cm a las longitudes de onda de absorbancia de 576, 623 y 700 nm y usando agua como blanco. Calcular la concentración de hemoglobina en mg/dL por la fórmula:
,lllJ.)
(Abs 576 x 115) - (Abs 623 x 102) - (Abs 700 x 39, 1) Criterios de aceptación:
No más de 30 mg/dL
USP 39
Pruebas Biológicas/ (90) Suero Fetal Bovino 193
PRUEBAS DE FUNCIONALIDAD DEL FBS En caso de no existir un ensayo de funcionalidad definido por el usuario, las siguientes pruebas son adecuadas para determinar la funcionalidad de lotes específicos de FBS y para ayudar en la optimización de las condiciones de crecimiento de cultivos de células mamíferas en presencia de FBS. Para una confirmación válida de la funcionalidad, independiente de las aplicaciones específicas del usuario, las pruebas se realizan en las líneas celulares especificadas. Para la validación interna de aplicaciones especializadas de cultivos celulares, se deben usar y caracterizar líneas celulares específicas para tales aplicaciones. Usar frascos de cultivo de tejidos apropiados. Las dos pruebas descritas en este capítulo son la Curva de Promoción de Crecimiento y el Ensayo Clona/. La decisión sobre el tipo de prueba o el número de pruebas que se van a realizar para evaluar la aptitud de un lote específico de FBS depende del tipo de línea celular usada. Para líneas celulares adherentes, el número de colonias al final del periodo de cultivo representa una buena evaluación de la capacidad de estas células, a baja concentración, para crecer en presencia de un lote específico de FBS. Para líneas celulares que crecen en cultivos en suspensión, la cinética óptima de crecimiento se mide contando las células viables después de 7 días de cultivo. Líneas celulares: Se recomiendan cinco líneas celulares: (1) HFL 1 (ATCC CCL-153) fibroblasto de pulmón normal (2) Mvl Lu (ATCC CCL-64) epitelio de pulmón de visón (3) HL-60 (ATCC CCL-240) promieloblasto de sangre periférica, suspensión (4) VERO (ATCC CCL-81) fibroblasto de riñón de mono (5) CHO (CCL-61) ovario de hámster chino Las pruebas de funcionalidad descritas se deben realizar en tres líneas celulares, dos de las cuales corresponden a la lista de las cinco líneas celulares recomendadas, mientras que la tercera es la línea celular pertinente a la aplicación del usuario. Las líneas celulares se cultivan con medios específicos según lo recomendado por la ATCC. Materiales - Frasco/recipiente de crecimiento adecuado - Cabina de Seguridad Biológica Clase 11, Tipo A - Contador de células/hemacitómetro - Microscopio invertido con accesorio para cámara digital - Frascos de cultivo de tejidos: T25 cm 2 Preparación de células para ensayos: Descongelar rápidamente un vial en un baño de agua a 37° y determinar el recuento y la viabilidad celular. Preparar múltiples cultivos a partir de cada línea celular en un medio de crecimiento suplementado con suero. Incubar los cultivos a 37° siguiendo las instrucciones provistas por la ATCC para cada una de las líneas celulares usadas para la prueba. Examinar los cultivos celulares en un microscopio para asegurarse de la existencia de monocapas uniformes casi confluentes o suspensiones uniformes. Expandir las células hasta que se tengan suficientes para el ensayo (aproximadamente 1 x 10 7 células totales; >90% viabilidad) Recolección de cultivos 1. Retirar y desechar el medio de crecimiento y luego enjuagar cada cultivo con medio sin FBS. 2. Para las células adherentes, agregar 1 mL de Tripsina/EDTA durante unos pocos minutos para que las células se dispersen. Incubar a 37°, si fuera necesario. Neutralizar con 1 ml de medio de cultivo que contenga por lo menos 10% de FBS. 3. Centrifugar brevemente (spin down) las células en una centrífuga. Aspirar el medio de lavado y resuspender las células en un volumen apropiado para siembra. Siembra de células 1. En el día O: Para las tres líneas celulares que se van a analizar, preparar cultivos múltiples usando densidades de siembra que abarquen el intervalo entre 2 x 103 y 2 x 104 células viables/mL. (En un inicio, se seleccionan inóculos diferentes para determinar las condiciones de crecimiento óptimas. Una vez que se ha seleccionado el inóculo apropiado, dicha condición se usa para propagar las células). A continuación se presentan las densidades de siembra recomendadas: Densidad de siembra baja: 2 x 103 células viables/mL Densidad de siembra media: 6 x 103 células viables/mL Densidad de siembra alta: 2 x 104 células viables/mL 2. Preparar cultivos por triplicado para al menos cinco puntos de tiempo (en días u horas de acuerdo con la línea celular), para determinar la densidad de siembra que producirá condiciones de crecimiento óptimo para cada línea celular usada. 3. Incubar los cultivos a 37° en una incubadora humidificada saturada con C0 2 al 5%. 4. Para cada punto de tiempo de medición (días O, 1, 2, 3, 4 y 7), tomar una fotografía de cada cultivo, por triplicado, tanto para el material de prueba de FBS como del ER Suero Fetal Bovino USP a cada una de las tres concentraciones para cada línea celular y registrar el porcentaje de confluencia para cada una de las condiciones. [NOTA-Realizar esta etapa antes de la tripsinización y del conteo celular.] 5. Recolectar las células de los tres cultivos de diferente densidad de siembra para cada punto de tiempo específico. Para cultivos adherentes, recolectar las células según se describió anteriormente. 6. Realizar y registrar el recuento de células totales y la viabilidad para cada uno de los nueve cultivos de la muestra de FBS y de ER Suero Fetal Bovino USP para cada línea celular usando un contador de células o hemacitómetro apropiado. [NOTAS-Es posible que tenga que cambiarse el programa de recuento para líneas celulares de crecimiento rápido o célu-
194 (90) Suero Fetal Bovino / Pruebas Biológicas
USP 39
las grandes que confluyan antes del día 7 y/o para líneas celulares de lento crecimiento que requieran estar en cultivo 81O días antes de alcanzar una meseta. Algunas líneas celulares adherentes nunca lograran la confluencia.]
Curva de Promoción de Crecimiento Las mediciones de las velocidades de proliferación celular a menudo se usan para determinar la respuesta de las células a estímulos exógenos. La evaluación cuantitativa de las condiciones de crecimiento celular es un factor importante para monitorear la constancia de las condiciones de cultivo. El intervalo de concentración celular óptimo para subcultivos, el inóculo óptimo y el tiempo de duplicación son parámetros que se pueden cuantificar y para los que se pueden establecer tendencias. La información acerca de la cinética del crecimiento de un cultivo es crítica para el diseño de experimentos celulares. Los cultivos varían significativamente en sus propiedades de crecimiento en la fase de latencia, la fase de crecimiento exponencial o logarítmica y la fase estacionaria. Documentar las características de crecimiento del cultivo durante las tres etapas de crecimiento para determinar el tiempo de duplicación de la población y el tiempo del ciclo celular. Las células que han entrado en la fase estacionaria pueden demostrar un potencial de crecimiento reducido y cambios en la morfología. Las células se pueden volver polarizadas y pueden segregar más matriz extracelular, lo que las vuelve difíciles de retirar del sustrato. Al final de la fase de crecimiento exponencial las células presentan su mayor rendimiento y su más alta reproductibilidad. Reactivos - Medios de crecimiento sin FBS - Muestras de prueba de FBS - Medio de crecimiento + 10% de FBS - Solución de Tripsina/EDTA (0,25%/0,53 mM) en Solución Salina Balanceada de Hank (HBSS) Análisis: Una vez que las células hayan alcanzado el final de la fase logarítmica, subcultivar las células para la prueba. Seguir el procedimiento descrito en Siembra de Células y preparar múltiples cultivos para el ER Suero Fetal Bovino USP y analizar el FBS para diferentes líneas celulares a tres densidades de siembra para las que al menos una curva de crecimiento presenta una fase de latencia, una fase logarítmica y una fase estacionaria, y para la cual la fase logarítmica es lineal en tres o más puntos de tiempo. Los recuentos de células viables se determinan en los días O, 1, 2, 3, 4 y 7. Cálculo y Análisis de Datos: Calcular el recuento promedio de células viables [células/cm 2 (adherentes) o células/mL (en suspensión)] y la viabilidad media porcentual para cada punto. Graficar los datos en una gráfica de escala semilogarítmica con el recuento de células viables sobre la escala logarítmica en el eje y y los días (u horas) en cultivo sobre una escala aritmética en el eje x. Estimar el tiempo de duplicación usando una curva de crecimiento que sea lineal sobre tres o más puntos. Criterios de aceptación: El valor R2 de la curva debe ser igual o mayor que 0,98 a fin de respaldar el cálculo de un tiempo de duplicación válido. El tiempo de duplicación correspondiente a la muestra de prueba debe ser no menos de 90% del tiempo de duplicación correspondiente a ER Suero Fetal Bovino USP.
Ensayo Clonal Este ensayo está diseñado para evaluar el crecimiento óptimo de las líneas celulares adherentes. La eficiencia del plaqueo o formación de colonias a baja densidad celular es un método preferido para analizar la capacidad de proliferación y la supervivencia de células individuales en condiciones óptimas de crecimiento. Esta es una prueba muy sensible y a menudo se usa para evaluar la calidad de los lotes de suero. Esta técnica revela diferencias en la velocidad de crecimiento dentro de la población celular y es capaz de distinguir entre cambios en la velocidad de crecimiento (tamaño de colonias) y la supervivencia de las células (número de colonias). Debido a la heterogeneidad de la población celular de algunos cultivos celulares, cabe recordar que las células crecen de manera diferente como colonias aisladas a bajas densidades. Por consiguiente, pocas células sobreviven incluso en condiciones ideales debido a la pérdida de toda interacción celular. La clonación es un ensayo de supervivencia que se usa también para optimizar las condiciones de crecimiento (selección de medio y suero). Si es posible confirmar que una colonia individual surgió de una sola célula, entonces se puede determinar la eficiencia de la clonación. Reactivos - Medio de crecimiento + 10% de FBS (suero de prueba)-Medio esencial mínimo de Eagle (EMEM, por sus siglas en inglés) con L-glutamina 2 mM y BSS de Earle ajustado para que contenga 1,5 g/L de carbonato de sodio, aminoácidos no esenciales O, l mM y piruvato de sodio conteniendo 100 U/mL de penicilina y 100 g/mL de estreptomicina más 10% de FBS. - Solución de Tripsina/EDTA (0,25%/0,53 mM) en HBSS. - Solución Salina Amortiguadora de Fosfato de Dulbecco sin calcio ni magnesio. - Solución de Carbol Fucsina-Azul de Metileno-Mezclar 20 g de carbol fucsina en 2 L de metanol y mezclar durante 1O minutos (carbol fucsina al 1%). Mezclar 50 g de azul de metileno en 5 L de metanol y mezclar durante 1O minutos (azul de metileno al 1%). Preparar una solución de trabajo de Carbol Fuscina-Azul de Metileno mezclando azul de metileno al 1%, metanol y carbol fucsina al 1% en una proporción de 3:2:1. Mezclar durante 20 minutos y filtrar a través de cuatro pliegues de gasa (cheesecloth) en un embudo. Preparar alícuotas y almacenar en frascos de vidrio marrón a una temperatura de 15º a 25º.
Pruebas Biológicas/ (91) Valoración de Pantotenato de Calcio 195
USP 39
Muestra: Se usan múltiples lotes de FBS para este ensayo. Por cada lote de suero a analizar, agregar 20 ml de FBS a 180 ml de EMEM y usar la misma muestra para toda la prueba. Esterilizar usando filtros de baja unión a proteínas de 0,22 µm. Almacenar el medio de crecimiento a 4º hasta el momento de su uso. Preparación de las células: Esta prueba es únicamente para cultivos adherentes y se realiza con las líneas celulares adherentes descritas en Líneas Celulares (HFL 1 y Mv 1 Lu). Una semana antes de analizar el suero, expandir las líneas celulares según se indica en Siembra de Células, cambiar el medio cada 2-3 días, y subcultivar las células cuando presenten una confluencia aproximada de 90%. Determinar el recuento y la viabilidad celular (la viabilidad debe ser >90%) antes de realizar el ensayo. Recolectar las células según se indica en Recolección de Células, lavar dos veces, y resuspender las células en EMEM basal. Análisis: El procedimiento implica el plaqueo de una suspensión unicelular en densidades bajas (2-50 células/cm 2 ) a partir de la cual se formarán colonias discretas. Al final del ensayo, se debe fijar, teñir, y contar el número de colonias según se indica a continuación. 1. Para cada línea celular, etiquetar 1O placas de cultivo de tejidos de 60 mm x 15 mm por cada lote de suero a analizar. Etiquetar el costado de la mitad inferior de cada plato, incluyendo los controles. 2. Transferir 5 ml de medio que contenga 10% del suero de prueba correspondiente (1 O réplicas). Agregar 400 células por placa de cultivo (se busca una concentración celular de aproximadamente 800 células/ml). 3. Incubar durante 10-14 días a 37° en una incubadora humidificada, saturada con C0 2 al 5%. 4. Retirar el sobrenadante y agregar suficiente Solución de Carbol Fucsina-Azul de Metileno para cubrir cada una de las placas de cultivo durante 1 O minutos. 5. Retirar la solución colorante; enjuagar las placas de cultivo con varios enjuagues de agua destilada; invertir los platos en toallas de papel; y dejar que se sequen. 6. Contar y registrar (1) el número de colonias y (2) la superficie total de colonias teñidas (mm 2). Calcular las medias y desviaciones estándar. Criterios de aceptación: La eficiencia de plaqueo porcentual se expresa contando el número de colonias en un área definida, dividido por el número de células sembradas y multiplicado por 1 OO. Comparar los resultados entre los lotes de FBS y seleccionar un lote de suero que sea apropiado para varios tipos de células y óptimo para una aplicación de cultivo celular específica.
(91) VALORACIÓN DE PANTOTENATO DE CALCIO Estándares de Referencia USP (11 )-ER Pantotenato de Calcio USP. Solución Madre del Estándar de Pantotenato de Calcio-En un matraz volumétrico de 1 000 ml, disolver, en aproximadamente 500 ml de agua, 50 mg de ER Pantotenato de Calcio USP, previamente secado y almacenado en un lugar oscuro sobre pentóxido de fósforo, y pesado con exactitud evitando la absorción de humedad durante la pesada. Agregar 1 O ml de ácido acético 0,2 N y 100 ml de solución de acetato de sodio (1 en 60) y diluir a volumen con agua. Cada ml contiene 50 µg de ER Pantotenato de Calcio USP. Almacenar bajo tolueno en un refrigerador. Preparación Estándar-Diluir, el mismo día de la valoración, un volumen medido de Solución Madre del Estándar de Pantotenato de Calcio con una cantidad de agua suficiente para obtener entre 0,01 µg y 0,04 µg de pantotenato de calcio por ml, cuya concentración exacta sea tal que las respuestas obtenidas según se indica en el Procedimiento, utilizando 2,0 y 4,0 ml de la Preparación Estándar, se encuentren en la parte lineal de la curva de respuesta en función del logaritmo de la concentración. Preparación de Valoración-Proceder según se indica en la monografía individual y preparar una solución que se espera que contenga aproximadamente el equivalente a la concentración de pantotenato de calcio en la Preparación Estándar. Solución Madre de Medio BasalSolución de Hidrolizado Ácido de Caseína Solución de Cistina-Triptófano Solución de Polisorbato 80 Dextrosa, Anhidra Acetato de Sodio, Anhidro
25 ml 25 ml 0,25 ml 10 g 5g
Solución de Adenina-Guanina-Uracilo
5 ml
Solución de Riboflavina-Clorhidrato de Tiamina-Biotina
5 ml
Solución de Ácido Paraaminobenzoico-Niacina-Clorhidrato de Piridoxina
5 ml
Solución Salina A
5 ml
Solución Salina B
5 ml
Disolver la dextrosa anhidra y el acetato de sodio en las soluciones previamente mezcladas y ajustar con hidróxido de sodio 1 N a un pH de 6,8. Finalmente, diluir con agua a 250 ml y mezclar.
196 (91 >Valoración de Pantotenato de Calcio / Pruebas Biológicas
USP 39
Solución de Hidrolizado Ácido de Caseína-Mezclar 100 g de caseína sin vitaminas con 500 ml de ácido clorhídrico 6 N y someter la mezcla a reflujo entre 8 y 12 horas. Eliminar el ácido clorhídrico de la mezcla mediante destilación bajo presión reducida hasta que quede una pasta espesa. Redisolver la pasta resultante en agua, ajustar la solución con hidróxido de sodio 1 N a un pH de 3,5 ± O, l y agregar agua para obtener 1000 ml. Agregar 20 g de carbón activado, revolver durante 1 hora y filtrar. Repetir el tratamiento con carbón activado. Almacenar bajo tolueno en un refrigerador a una temperatura no inferior a 1Oº. Filtrar la solución si se formara un precipitado durante el almacenamiento. Solución de Cistina-Triptófano-Suspender 4,0 g de L-cistina y 1,0 g de L-triptófano (o 2,0 g de D,L-triptófano) en un volumen de agua entre 700 y 800 ml, calentar hasta entre 70º y 80º y agregar, gota a gota y agitando, ácido clorhídrico diluido (1 en 2), hasta que los sólidos se disuelvan. Enfriar y agregar agua para obtener 1000 ml. Almacenar bajo tolueno en un refrigerador a una temperatura no inferior a 1Oº. Solución de Adenina-Guanina-Uracilo-Disolver 200 mg de sulfato de adenina, 200 mg de clorhidrato de guanina y 200 mg de uracilo, con ayuda de calor, en 1O ml de ácido clorhídrico 4 N, enfriar y agregar agua para obtener 200 ml. Almacenar bajo tolueno en un refrigerador. Solución de Polisorbato 80-Disolver 25 g de polisorbato 80 en alcohol para obtener 250 ml. Solución de Riboflavina-Clorhidrato de Tiamina-Biotina-Disolver riboflavina, clorhidrato de tiamina y biotina en ácido acético 0,02 N para obtener una solución que contenga 20 µg de riboflavina, 1O µg de clorhidrato de tiamina y 0,04 µg de biotina por ml. Almacenar, protegida de la luz, bajo tolueno en un refrigerador. Solución de Ácido Paraaminobenzoico-Niacina-Clorhidrato de Piridoxina-Preparar una solución en alcohol al 25 por ciento neutralizado para obtener las siguientes concentraciones: 1O µg de ácido paraaminobenzoico, 50 µg de niacina y 40 µg de clorhidrato de piridoxina por ml. Almacenar en un refrigerador. Solución Salina A-Disolver 25 g de fosfato monobásico de potasio y 25 g de fosfato dibásico de potasio en agua para obtener 500 ml. Agregar 5 gotas de ácido clorhídrico y almacenar bajo tolueno. Solución Salina B-Disolver en agua 1O g de sulfato de magnesio, 0,5 g de cloruro de sodio, 0,5 g de sulfato ferroso y 0,5 g de sulfato de manganeso para obtener 500 ml. Agregar 5 gotas de ácido clorhídrico y almacenar bajo tolueno. Cultivo Madre de Lactobacillus plantarum-Disolver 2,0 g de extracto de levadura hidrosoluble en 100 ml de agua, agregar 500 mg de dextrosa anhidra, 500 mg de acetato de sodio anhidro y 1,5 g de agar y calentar agitando en un baño de vapor hasta que el agar se disuelva. Verter porciones de aproximadamente 1O ml de la solución caliente en tubos de ensayo, tapar o cubrir adecuadamente, esterilizar a 121 ºy dejar que se enfríen en posición vertical. Preparar cultivos en cuña en tres o más de los tubos, usando un cultivo puro de Lactobacillus plantarum*, incubar durante 16 a 24 horas a una temperatura seleccionada entre 30º y 37° pero mantenerla constante con una aproximación de± 0,5º y luego almacenar en un refrigerador. Preparar un cultivo madre en cuña nuevo una vez por semana y no usar para inoculación si el cultivo tiene más de 1 semana. Medio de Cultivo-Preparar una serie de tubos de ensayo con 5,0 ml de Solución Madre de Medio Basal y agregar 5,0 ml de agua con 0,2 µg de pantotenato de calcio a cada tubo. Tapar los tubos con algodón, esterilizar en un autoclave a 121 ºy enfriar. lnóculo-Transferir células del cultivo madre de Lactobacillus plantarum a un tubo estéril que contenga 1O ml de medio de cultivo. Incubar este cultivo durante 16 a 24 horas a una temperatura seleccionada entre 30º y 37° pero mantenerla constante con una aproximación de± 0,5º. La suspensión de células así obtenida es el inóculo. Procedimiento-Agregar a tubos de ensayo similares, por duplicado, 1,0 ml y/o 1,5 ml; 2,0 ml; 3,0 ml; 4,0 ml y 5,0 ml, respectivamente, de la Preparación Estándar. A cada tubo y a 4 tubos similares sin Preparación Estándar agregar 5,0 ml de Solución Madre de Medio Basal y agua suficiente para obtener 1O ml. Agregar, por duplicado, a tubos de ensayo similares los volúmenes de Preparación de Valoración correspondientes a tres o más de los niveles especificados anteriormente para la Preparación Estándar, incluidos los niveles de 2,0 ml, 3,0 ml y 4,0 ml. Agregar a cada tubo 5,0 ml de Solución Madre de Medio Basal y agua suficiente para obtener 1O ml. Colocar un conjunto completo de tubos de Estándar y Muestra juntos en una gradilla y el conjunto duplicado en una segunda gradilla o en otra sección de la misma gradilla, preferentemente en orden aleatorio. Cubrir los tubos de ambas series para prevenir la contaminación y colocar en un autoclave a 121 º durante 5 minutos. Enfriar, agregar 1 gota de inóculo a cada uno de los tubos, excepto a dos de los cuatro tubos que no contengan Preparación Estándar (para que sirvan como blancos no inoculados) y mezclar. Incubar los tubos a una temperatura entre 30º y 37º mantenida con variaciones permitidas de ± 0,5º hasta que, una vez incubados durante un período entre 16 y 24 horas, no haya habido un aumento sustancial de la turbidez en los tubos que contienen el nivel más alto de estándar durante un período de 2 horas. Determinar la transmitancia de los tubos de la siguiente manera: Mezclar el contenido de cada tubo y transferir a un recipiente apto para la lectura óptica si fuera necesario. Colocar el recipiente en un espectrofotómetro ajustado a una longitud de onda específica entre 540 nm y 660 nm y tomar la lectura de la transmitancia cuando se alcanza un estado estacionario. Este estado estacionario se observa unos pocos segundos después de agitar cuando la lectura del galvanómetro permanece constante durante 30 segundos o más. Emplear aproximadamente el mismo intervalo de tiempo para la lectura de cada tubo. Con la transmitancia fija en 1,00 para el blanco no inoculado, leer la transmitancia del blanco inoculado. Con la transmitancia fija en 1,00 para el blanco inoculado, leer la transmitancia para cada uno de los tubos restantes. Si hay evidencia de contaminación con un microorganismo extraño, descartar el resultado de la valoración. * La cepa ATCC (American Type Culture Collection) Nº 8014 es apropiada. Esta cepa se conocía anteriormente como Lactobaciflus arabinosus 17-5.
Pruebas Biológicas/ (92) Factores de Crecimiento 197
USP 39
Cálculos-Preparar una curva estándar de concentración-respuesta del siguiente modo. Para cada nivel del estándar, calcular la respuesta a partir de la suma de los valores duplicados de transmitancia como la diferencia y= 2,00 - I (de transmitancia). Graficar la respuesta en la ordenada de un papel cuadriculado contra el logaritmo del volumen de Preparación Estándar en cada tubo, en mL, en la abscisa, usando para la ordenada una escala aritmética o logarítmica (eligiendo entre estas dos la que más se aproxime a una recta). Trazar la línea recta o la curva continua que mejor se ajuste los puntos graficados. Calcular la respuesta, y, sumando las dos transmitancias para cada nivel de la Preparación de Valoración. Leer, a partir de la curva estándar, el logaritmo del volumen de la Preparación Estándar correspondiente a cada uno de los valores de y que estén dentro del intervalo entre los puntos máximos y mínimos graficados para el estándar. Restar de cada logaritmo así obtenido el logaritmo del volumen, en mL, de la Preparación de Valoración para obtener la diferencia, x, de cada nivel de dosificación. Promediar los valores de x para cada uno de tres o más niveles de dosificación para obtener = M', el logaritmo de la potencia relativa de la Preparación de Valoración. Determinar la cantidad, en mg, de ER Pantotenato de Calcio USP correspondiente al pantotenato de calcio en la porción del material tomada para el ensayo como antilog:
x
M = antilog (M' + log R) en donde Res el número de mg de pantotenato de calcio que se supuso que estaban presentes por mg (o cápsula o tableta) del material tomado para valoración. Repetición-Repetir toda la determinación al menos una vez, usando Preparaciones de Valoración preparadas por separado. Si la diferencia entre los dos logaritmos de las potencias M no es mayor de 0,08, su promedio, M, es el logaritmo de la potencia del material de prueba analizado (ver Intervalo de Confianza y Límites de Potencia (111 )). Si las dos determinaciones difieren en más de 0,08, realizar una o más determinaciones adicionales. Del promedio de dos o más valores de M que no difieren en más de O, 15, calcular la potencia media de la preparación objeto de la valoración.
(92) FACTORES DE CRECIMIENTO Y CITOKINAS USADOS EN LA FABRICACIÓN DE PRODUCTOS DE TERAPIA CELULAR INTRODUCCIÓN La calificación de reactivos, de materiales de origen y el control de los procesos de fabricación son elementos claves que aseguran la calidad y seguridad de las terapias celulares. Los factores de crecimiento y las citokinas son importantes para el mantenimiento, crecimiento, selección y purificación de cultivos de productos de terapia celular. Este capítulo describe las pruebas, procedimientos y criterios de aceptación aceptados para factores de crecimiento y citokinas que pueden estar implicados en la fabricación de productos de terapia celular. INTERLEUKINA RECOMBINANTE HUMANA 4 (rhll-4, por sus siglas en inglés) MHKCDITLQE
llKTLNSLTE
QKTLCTELTV
TDIFAASKNT
TEKETFCRAA
TVLRQFYSHH
EKDTRCLGAT
AQQFHRHKQL
IRFLKRLDRN
LWGLAGLNSC
PVKEANQSTL
ENFLERLKTI
MREKYSKCSS 15096 Da
La rhlL-4 es un polipéptido de cadena simple de 130 residuos de aminoácido expresados en Escherichia coli. Se produce como un polvo liofilizado y contiene no menos de 0,5 x 10 7 Unidades USP de IL-4/mg de proteína total. Las impurezas de ADN de la célula anfitriona específicas del proceso en IL-4 con límites de menos de 1 ng/mg se determinan según se indica en Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Enfoques para Detectar Trazas de Ácidos Nucleicos (Análisis de AON Residual) (1130). La IL-4 que se usa como material auxiliar durante la fabricación no requiere licencia de fabricación ni aprobación comercial. A continuación se presentan los atributos de calidad típicos de la IL-4.
IDENTIFICACIÓN
Cambio en la red~clón: • A. El análisis de la secuencia amino-terminal de al menos ocho aminoácidos se realiza con un secuenciador automático. • • (AFól·rnay-2016¡ Los feniltiohidantoín-aminoácidos liberados en etapas se identifican mediante cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa en línea, basándose en sus tiempos de elución. • B. Usar el método de electroforesis seguido del análisis por Western blot para visualizar la proteína IL-4. El método es electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE), descrito en la prueba de Pureza. Solución salina amortiguada con fosfatos; Solución amortiguadora de Laemmli, reductora; y Solución amortiguadora de Laemmli, no reductora: Proceder según se indica en la prueba de Pureza en la Valoración.
198 (92) Factores de Crecimiento/ Pruebas Biológicas
USP 39
Solución madre del estándar: 50 µg/mL de ER rlnterleukina 4 Humana USP reconstituida en Solución salina amortiguada con fosfatos. [NOTA-No agitar mientras se mezcla; mezclar suavemente por rotación.] Solución estándar: 20 µg/mL de IL-4, a partir de Solución madre del estándar, en Solución salina amortiguada con fosfatos Solución estándar, reductora: Combinar 20 µL de Solución estándar y 5 µL de Solución amortiguadora de Laemmli, reductora.
Solución estándar, no reductora:
Combinar 20 µL de Solución estándar y 5 µL de Solución amortiguadora de Laemmli, no
reductora.
Solución madre de la muestra: 50 µg/mL de IL-4 reconstituida en Solución salina amortiguada con fosfatos. [NOTA-No agitar mientras se mezcla; mezclar suavemente por rotación.] Solución muestra: 20 µg/mL de IL-4, a partir de Solución madre de la muestra, en Solución salina amortiguada con fosfatos Solución muestra, reductora: Combinar 20 µL de Solución muestra y 5 µL de Solución amortiguadora de Laemmli, reductora.
Solución muestra, no reductora:
Combinar 20 µL de Solución muestra y 5 µL de Solución amortiguadora de muestra de
Laemmli, no reductora.
Análisis Muestras:
Solución estándar, reductora; Solución estándar, no reductora; Solución muestra, reductora; y Solución muestra, no
reductora
Western blot: Después de la electroforesis, las proteínas se transfieren a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) usando procedimientos estándares. Incubar la membrana durante 1 hora a temperatura ambiente con Solución salina amortiguada con fosfatos que contenga O, 1% de polisorbato 20 y 5% de leche en polvo descremada. Posteriormente, la membrana se incuba con un anticuerpo anti-IL-4 1 (diluido apropiadamente en Solución salina amortiguada con fosfatos), y luego con un anticuerpo secundario, a temperatura ambiente y agitación suave, durante 1 hora para cada uno de los anticuerpos. La banda de la proteína IL-4 se identifica desarrollando la membrana usando un sistema de detección adecuado. 2 Criterios de aceptación: El Western blot desarrollado debe proporcionar una señal positiva equivalente al ER rlnterleukina 4 Humana USP. VALORACIÓN • PUREZA: [NOTA-La pureza se determina sobre la materia prima.] Se lleva a cabo una SDS-PAGE según se indica en Artículos Obtenidos por Biotecnología-Electroforesis en Gel de Poliacrilamida (1056) en condiciones reductoras y no reductoras. Marcador de peso molecular: Usar un marcador de peso molecular adecuado que contenga bandas de proteínas entre 10 y 200 kDa. Solución salina amortiguada con fosfatos: Cloruro de potasio 2,67 mM, fosfato de potasio (KH 2 P0 4 ) 1,47 mM, cloruro de sodio 137,93 mM y fosfato dibásico de sodio 8,06 mM en agua. Ajustar a un pH de 7,0-7,3. Solución amortiguadora de Laemmli, no reductora: TRIS-HCI 100 mM, pH 6,8, 50% de glicerol, 0,25% de indicador de azul de bromofenol y 10% de lauril sulfato de sodio en agua Solución amortiguadora de Laemmli, reductora: Agregar 2,5 µL mercaptoetanol a 50 µL de Solución amortiguadora de Laemmli, no reductora.
Solución madre de la muestra: 400 µg/mL de IL-4 a granel en Solución salina amortiguada con fosfatos Solución muestra 1: Combinar 20 µL de Solución madre de la muestra y 5 µL de Solución amortiguadora de Laemmli, no reductora.
Solución muestra 2:
Combinar 20 µL de Solución madre de la muestra y 5 µL de Solución amortiguadora de Laemmli, reduc-
tora.
Solución madre de control A: 4 µg/mL de IL-4, a partir de Solución madre de la muestra en Solución salina amortiguada con fosfatos. [NOTA-Las soluciones de control A se corren por triplicado tanto en condiciones reductoras como en no reductoras.] Solución 1 de control A: Combinar 20 µL de Solución madre de control A y 5 µL de Solución amortiguadora de Laemmli, no reductora.
Solución 2 de control A:
Combinar 20 µL de Solución madre de control A y 5 µL de Solución amortiguadora de Laemmli,
reductora.
Solución madre de control B:
12 µg/mL de IL-4, a partir de Solución madre de la muestra en Solución salina amortiguada con fosfatos. [NOTA-Las soluciones de control B se corren por duplicado tanto en condiciones reductoras como en no reduc-
toras.] Solución 1 de control B:
Combinar 20 µL de Solución madre de control By 5 µL de Solución amortiguadora de Laemmli, no
reductora.
Solución 2 de control B:
Combinar 20 µL de Solución madre de control By 5 µL de Solución amortiguadora de Laemmli,
reductora.
Condiciones electroforéticas (Ver Artículos Obtenidos por Biotecnología-Electroforesis en Gel de Poliacrilamida (1056).) Modo: Gel para PAGE discontinuo 1 2
Un anticuerpo anti-IL-4 adecuado se puede obtener de fuentes comerciales (p.ej., Dianova lnc.). Un sistema de detección adecuado se puede obtener de fuentes comerciales (p.ej., Pierce/Perbio Science).
USP 39
Pruebas Biológicas/ (92) Factores de Crecimiento 199
Gel concentrador: Acrilamida al 4% Gel de resolución: Acrilamida al 12% Condiciones de corrida: 1 O minutos a 100 V; luego 30 minutos a 200 V Detección de proteínas: Tinción con plata Análisis Muestras: Solución muestra 1, Solución muestra 2, Solución 1 de control A, Solución 2 de control A, Solución 1 de control By Solución 2 de control B Incubar 25 µL de Solución muestra y de Solución control en condiciones no reductoras durante 5 minutos a 60º y cargar en el gel. Incubar 20 µL de Solución muestra y de Solución control en condiciones reductoras durante 5 minutos a 60º, y
cargar en el gel. Después de la tinción con plata y de barrer todo el gel, determinar la intensidad de todas las bandas de proteína detectables por densitometría y calcular el porcentaje de cada banda de proteína detectable en la Solución muestra dos veces comparando la intensidad de los pixeles de cada banda contaminante con el valor promedio de las Soluciones de Control A y B, respectivamente, por las fórmulas: Resultado= (A100) x 1/(A 1); y Resultado = (A100) x 3/(A3) A100 = intensidad de una banda contaminante de la Solución muestra A1 = intensidad promedio de todas las bandas detectables de la Solución de control A A3 = intensidad promedio de todas las bandas detectables de la Solución de control B El análisis de las soluciones de control de IL-4 debe producir una banda detectable con un peso molecular aparente de aproximadamente 15 kDa. Si los valores calculados mediante la Solución de control A son diferentes de los que se obtienen por comparación con la Solución de control B, se debe tomar el valor correspondiente a la cantidad más alta de impureza. Si la intensidad de una de las bandas contaminantes es menor que el valor de la Solución de control A (correspondiente a 1%), el valor de esta contaminación se ajusta a 1%. La pureza de la solución muestra se calcula de la siguiente manera: Resultado = 100 - ¿ Cn C = porcentaje de cada contaminación provista en números enteros redondeados n =número de contaminantes de IL-4 de la Solución muestra Criterios de aceptación: La pureza de IL-4 es no menos de 97%, según se determina mediante SDS-PAGE.
[NOTA-El contenido de proteínas se determina basándose en el producto envasado.] Solución salina amortiguada con fosfatos: Proceder según se indica en la prueba de Pureza. Solución muestra: 50 µg/mL de IL-4 en Solución salina amortiguada con fosfatos. [NOTA-No agitar mientras se mezcla; mezclar suavemente por rotación.] Blanco: Solución salina amortiguada con fosfatos Condiciones Pc1nP1·tronmu>trir::.c
• CONTENIDO DE PROTEÍNAS:
~erllJl!lfllll~ll'•~il~lft!l[tllEm~a;¡i~llllllR~·) Modo: UV Longitud de paso: 1 cm Longitud de onda analítica: 280 nm Análisis Muestras: Solución muestra y Blanco Calcular la concentración de proteínas: C = A280 /0,63 C A280
=concentración de IL-4 de la Solución muestra (mg/mL) = absorbancia a 280 nm
PRUEBAS ESPECÍFICAS
[NOTA-La medición de la actividad biológica se determina basándose en el producto envasado.] Medio RPMI 1640 con L-glutamina: Preparar una mezcla de los ingredientes en las cantidades que se presentan en la siguiente tabla en suficiente agua para obtener 1 L de medio y esterilizar mediante filtración:
• IDENTIDAD BIOLÓGICA:
Material Nitrato de calcio (Ca(N0 3)·4Hp)
Cantidad 100 mg
Sulfato de magnesio (MgS04 ·7H 2 0)
100 mg
Cloruro de potasio
400 mg
200 (92) Factores de Crecimiento / Pruebas Biológicas
USP 39
Material
Cantidad
Cloruro de sodio
6000 mg
Fosfato dibásico de sodio anhidro
800 mg
Bicarbonato de sodio
2000 mg
Glicina
10 mg
L-Arginina
200 mg
L-Asparagina
50 mg
Ácido L-aspártico
20 mg
Diclorhidrato de L-cistina
20 mg
Ácido L-glutámico
20 mg
L-Glutamina
300 mg
L-Histidina
15 mg
L-Hidroxiprolina
20 mg
L-lsoleucina
50 mg
L-Leucina
50 mg
Clorhidrato de L-lisina
40 mg
L-Metionina
15 mg
L-Fenilalanina
15 mg
L-Prolina
20 mg
L-Serina
30 mg
L-Treonina
20 mg
L-Triptófano
5 mg
Sal disódica de L-tirosina dihidrato
20 mg
L-Valina
20 mg
Biotina
0,2 mg
Cloruro de colina
3 mg
D-Pantotenato de calcio
0,25 mg
Ácido fólico
1 mg
í-lnositol
35 mg
Niacinamida
1 mg
Ácido paro-aminobenzoico
1 mg
Clorhidrato de piridoxina
1 mg
Riboflavina
0,2 mg
Clorhidrato de tiamina
1 mg
Vitamina B12
0,005 mg
o-Glucosa (dextrosa)
2000 mg
Glutationa (reducida)
1 mg
Rojo de fenal
5 mg
Medio de crecimiento:
Usando procedimientos asépticos, preparar el siguiente medio de cultivo de tejidos:
RPMl-1640 con L-glutamina
500 ml
Piruvato de sodio 100 mM
5 ml
Suero fetal bovino
50 ml
rFEC-GM humanoª
3 x 1 04 Unidades Internacionales
ª El Factor Estimulante de Colonias de Granulocitos y Macrófagos (FEC-GM) se agrega de manera extemporánea.
Esterilizar mediante filtración y almacenar a una temperatura entre 2º y 8º. Usar dentro del periodo de 1 mes. Agregar el FEC-GM inmediatamente antes de su uso. Medio de valoración: Usar Medio de crecimiento que no contenga FEC-GM. Solución salina amortiguada con fosfatos: Proceder según se indica en la prueba de Pureza en la Valoración. Solución de resazurina : 11 mg de resazurina en 100 ml de Solución salina amortiguada con fosfatos. [NOTA-Esterilizar mediante filtración y almacenar la solución protegida de la luz a 4º. La Solución de resazurina es estable durante al menos 6 meses si se trata en condiciones estériles.] [NOTA-Para todas las Soluciones estándar y Soluciones muestra, la concentración de IL-4 se determina mediante fotometría a 280 nm usando un coeficiente de extinción(¡;) de 0,63 mg- 1cm- 1 .]
Pruebas Biológicas/ (111) Diseño y Análisis de Valoraciones Biológicas 201
USP 39
Solución madre del estándar: 50 µg/mL de ER rlnterleukina 4 Humana USP en Solución salina amortiguada con fosfatos. [NOTA-No agitar mientras se mezcla; mezclar suavemente por rotación.] Soluciones estándar: 36; 12; 4; 1,33; 0,44; 0, 15; 0,05; 0,016; 0,006 ng/mL de IL-4, a partir de Solución madre del estándar en Medio de valoración Solución madre de la muestra: 50 µg/mL de IL-4 en Solución salina amortiguada con fosfatos. [NOTA-No agitar mientras se mezcla; mezclar suavemente por rotación.] Soluciones muestra: 36; 12; 4; 1,33; 0,44; 0, 15; 0,05; 0,016; 0,006 ng/mL de IL-4, a partir de Solución madre de la muestra en Medio de valoración Solución control: Usar el Medio de valoración. Preparación del cultivo celular: Preparar cultivos celulares de la línea celular TF-1 dependiente del factor humano (ATCC Nº CRL-2003), siguiendo el protocolo descrito en la hoja de información de ATCC. Realizar transferencias de los cultivos cada 2-3 días, usando subcultivos 1 :3 de las células durante un máximo de 1 mes. La densidad de siembra debe ser de 0,5 x 106 células/ml y la densidad máxima debe ser de 3 x 106 células/ml. La viabilidad de las células debe ser >90%. El número máximo de pasajes es 24 y el tiempo de cultivo máximo a partir de la descongelación es 28 días. Después de 28 días, iniciar un nuevo cultivo. Las células se propagan usando Medio de cultivo a 37°, suplementado con aire y dióxido de carbono al 5%. Análisis Muestras: Soluciones estándar, Soluciones muestra y Solución control La actividad de la Solución muestra se determina por duplicado. Lavar las células tres veces en Solución salina amortiguada con fosfatos. Colocar en una placa 2 x 104 células TF-1 resuspendidas en 100 µL de Medio de valoración por pocillo en microplacas de fondo plano de 96 pocillos. Incubar durante 72 horas a 37º y en una atmósfera de C0 2 al 5% en un incubador humidificado en presencia o ausencia de diversas concentraciones de Solución estándar, Solución muestra o Solución control agregando 100 µL de la solución correspondiente a cada pocillo. Agregar 30 µL de Solución de resazurina a cada pocillo e incubar durante 24 horas más. Determinar la intensidad de la fluorescencia por pocillo leyendo la placa con un lector de microplaca usando 544 nm (excitación) y 590 nm (emisión). Convertir la intensidad de fluorescencia en cada pocillo a un porcentaje de intensidad de fluorescencia máxima. Para la Solución muestra y la Solución estándar, graficar el porcentaje de la intensidad de fluorescencia en función de la concentración de la solución pertinente. Usando el método de cuadrados mínimos del análisis de regresión, calcular el ED50 en ng/mL de la Solución muestra y la Solución estándar. El coeficiente de determinación para la curva de regresión debe ser?: O, 98. Calcular la potencia en Unidades USP de lnterleukina 4/mg: Resultado = A x E5/Eu A E5 Eu Criterios
=actividad de ER rlnterleukina 4 Humana USP (unidades USP/mg) = ED 50 determinado de la Solución estándar (ng/mL) = ED 50 determinado de la Solución muestra (ng/mL) de aceptación: No menos de 0,5 x 10 7 Unidades USP de IL-4/mg • PRUEBAS DE ESTERILIDAD (71 ): Cumple con los requisitos • PRUEBA DE ENDOTOXINAS BACTERIANAS (85): Contiene no más de 50 Unidades USP de Endotoxina/mg REQUISITOS ADICIONALES • ENVASADO Y ALMACENAMIENTO: Conservar en envases impermeables y almacenar a -80º. • ETIQUETADO: El material se origina de ADN recombinante. • ESTÁNDARES DE REFERENCIA USP (11)
ER Endotoxina USP ER rlnterleukina 4 Humana USP
(111) DISEÑO Y ANÁLISIS DE VALORACIONES BIOLÓGICAS INTRODUCCIÓN La potencia de varios artículos Farmacopeicos debe ser determinada mediante valoraciones biológicas. El objetivo de este capítulo es presentar un resumen conciso de algunos procedimientos biométricos esenciales para las valoraciones biológicas incluidas en los capítulos o monografías de los compendios USP-NF, en particular para la identificación de valores aberrantes, la determinación de los intervalos de confianza para mediciones de potencia relativa y la combinación de valoraciones independientes. Para las valoraciones biológicas que no forman parte de los compendios USP-NF, pueden ser apropiados otros métodos. Se recomienda ver el capítulo de información general Análisis de Valoraciones Biológicas (1034) que puede ser una guía útil, mas no obligatoria.
202 (111) Diseño y Análisis de Valoraciones Biológicas / Pruebas Biológicas
USP 39
RECHAZO DE OBSERVACIONES ABERRANTES Una respuesta que es dudosa debido a que no cumple con el procedimiento durante el curso de una valoración es rechazada. Otros valores aberrantes pueden descubrirse sólo después de tabular las respuestas, pero entonces pueden ser relacionadas con irregularidades en la valoración que justifiquen su omisión. El rechazo o retención arbitraria de una respuesta aparentemente aberrante puede ser una importante fuente de sesgo. Por lo general, el rechazo de observaciones basado únicamente en la magnitud relativa, sin investigar la causa, es un procedimiento que debe usarse con poca frecuencia. Si se entendiera que, ya sea después investigar la causa o basándose en la experiencia práctica del ensayo, es poco probable que la discrepancia en los valores observados surja de una respuesta esperable del ensayo, entonces la respuesta aberrante o atípica debería ser analizada contra uno de dos criterios, los cuales asumen que los datos tienen una distribución aproximadamente normal (la cual podría ser satisfecha sólo después de una transformación adecuada de las respuestas originales). Se pueden usar métodos alternativos estadísticamente sólidos para la detección de valores aberrantes. Las condiciones en las que debe llevarse a cabo el análisis de valores aberrantes y los criterios que deben usarse, deben estar previamente especificados en los procedimientos del laboratorio cuando no se especifiquen en la monografía o el capítulo.
Criterio 1 (Prueba de Dixon) El primer criterio se basa en la variación dentro de un grupo único de respuestas supuestamente equivalentes, tal como las obtenidas de un grupo de animales al que se trato con una concentración habitual de la muestra. A un nivel de confianza de 99%, una observación válida será rechazada en uno de cada 100 ensayos (cuando el valor atípico sospechado pueda presentarse en un solo extremo) o en uno de cada 50 ensayos (cuando el valor atípico pueda presentarse en cualquiera de los dos extremos), siempre y cuando pocas o ninguna de las respuestas dentro del grupo sean idénticas. Ordenar las respuestas en el orden de magnitud desde y1 hasta yN, donde N es el número de observaciones en el grupo. Calcular el intervalo relativo usando las fórmulas de la siguiente Tabla 7. Tabla 1 El valor aberrante candidato es el más pequeño (y 1}
Tamaño de la Muestra (N)
3-7
El valor aberrante candidato es el más grande (YN)
= (Y2 - y¡)l(YN - Y1) = (Y2 - Y1)f(YN-1 - Y1)
= (YN = (YN G, = (YN -
G1
8-10
G2
11-13
G3 =(y, - y,)f(YN-1 - Y1)
G7
YN-1)/(yN - Y1)
G2
YN-1)/(yN - Y2) YN-2)/(yN - Y2)
Si G7, G2 o G3, según corresponda, exceden el valor crítico de la Tabla 2, para el valor N observado, existe una base estadística para identificar la medición discordante como un valor aberrante y para considerar su eliminación. Para un valor N mayor que 13, usar el Criterio 2. En muestras tomadas de una población normal, a un nivel de confianza de 99%, los intervalos iguales o mayores que los siguientes valores de G7, G2 y G3 ocurren con una probabilidad de P == 0,01, en donde las mediciones de valores aberrantes pueden ocurrir sólo en un extremo o con una probabilidad de P == 0,02 en donde pueden ocurrir en cualquiera de los dos extremos. Tabla 2. Prueba para Mediciones de Valores Aberrantes N
1
3
1
4
1
5
1
6
1
7
G1
1
0,988
1
0,889
1
0,780
1
0,698
1
0,637
N
1
8
1
9
1
10
1
-
1
-
G2
1
0,683
1
0,635
1
0,597
1
-
1
-
N
1
11
1
12
1
13
1
1
-
G,
1
0,679
1
0,642
1
0,615
1
1
-
-
Criterio 2 (Grubbs, Prueba Estudentizada de Desviación Extrema) El segundo criterio se puede usar para detectar la presencia de valores aberrantes en grupos de respuestas supuestamente equivalentes y también se puede usar al examinar el conjunto de residuales a partir de un modelo ajustado (lineal o no lineal) cuando existe una varianza constante. El modelo final (que produce residuales para la detección de valores aberrantes) debe incluir todas las variables importantes del diseño. (Para mayor información sobre las variables del diseño, ver el capítulo de información general Diseño y Desarrollo de Valoraciones Biológicas (1032), que puede ser un recurso útil, mas no obligatorio.) (Se debe tener en cuenta que, para su aplicación a residuales, la siguiente información es una aproximación. Si el software estadístico provee residuales estudentizados, dichos valores deben usarse en lugar de los obtenidos con la siguiente ecuación.) Para el valor, R, que está más alejado de la media de la muestra, calcular la desviación estandarizada Z:
USP 39
Pruebas Biológicas/ (111) Diseño y Análisis de Valoraciones Biológicas 203
z = (R -
R)/S
donde Ry S son la media y la desviación estándar, respectivamente, del conjunto de valores. Para residuales obtenidos de un ajuste de cuadrados mínimos, como en el caso de una valoración por el método de líneas paralelas, R=O y Ses la raíz cuadrada del cuadrado medio residual del análisis. Si IZI es mayor que C según se determina a continuación, entonces el valor R se identifica como un valor aberrante estadístico al nivel de 1 %.
donde N es el tamaño de la muestra, tes el punto porcentual 1OOp unilateral a partir de la distribución t con los grados de libertad df los grados de libertad relacionados con 5:
p==l-...Q.Ql 2N Se encuentran disponibles métodos alternativos para valores aberrantes que están diseñados para el análisis de conjuntos de datos que pueden contener múltiples valores aberrantes y para la detección de valores aberrantes relacionados con el diseño o modelo de la valoración biológica. Para mayor información sobre valores aberrantes, ver el capítulo de información general Datos Analíticos-Interpretación y Tratamiento (101 O), que puede ser un recurso útil, mas no obligatorio.
EL INTERVALO DE CONFIANZA V LOS LÍMITES DE POTENCIA El siguiente método (de Fieller) se usa para determinar el intervalo de confianza para una estimación del logaritmo de potencia relativa a partir de una valoración por el método de líneas paralelas o valoración por el método de razón de pendientes. Se supone que M =a/bes el cociente para el cual se requiere un intervalo de confianza. Para las estimaciones, a y b, se cuenta con sus respectivos errores estándar, SE0 y SEb, y una covarianza entre estos, denotada Cov. El intervalo de confianza, (M 80¡0 , MAita), para el logaritmo de potencia relativa estimado es entonces el siguiente:
donde:
t'SE'
g=--" b'
y t = td1,012 es el punto porcentual superior a,/2 (o el punto porcentual a bilateral) con los grados de libertad residuales, df, obtenidos del análisis estadístico y el nivel de confianza seleccionado, 100*(1-a), (por lo regular 95%). Si g?: 1, significa que el denominador, b, desde el punto de vista estadístico, no es significativamente distinto de O y el uso del cociente no es prudente para dichos datos. La longitud, L, de este intervalo de confianza es MAito - M80¡0 • Para aquellos casos en los que las estimaciones de a y b no tenga una correlación estadística (Cov =O), la fórmula del intervalo de confianza se simplifica a la siguiente:
Para mayor información sobre los intervalos de confianza para potencia, ver el capítulo (1034) que puede ser un recurso útil, pero no obligatorio.
COMBINACIÓN DE VALORACIONES INDEPENDIENTES Cuando la monografía o el capítulo lo permitan, se pueden realizar múltiples valoraciones independientes hasta que los resultados combinados reduzcan el ancho del intervalo de confianza hasta que éste quede comprendido dentro de los límites especificados en la monografía o capítulo pertinente. Cuando se requieren dos o más valoraciones independientes y cada una de ellas conduce a un logaritmo de la potencia M, los valores M se combinan usando uno de los dos métodos siguientes.
204 (111) Diseño y Análisis de Valoraciones Biológicas / Pruebas Biológicas
USP 39
Método 1 Se define M; como el logaritmo de potencia relativa de la íma valoración de h resultados de valoración que se van a combinar. Para combinar los resultados h, la media, la desviación estándar y el error estándar del valor M; se calculan siguiendo el procedimento usual : h
Media
M= I.,MJh ; 1
1
/1=-1 f,: (M;
Desviación Estándar S = Error Estándar SE = S /
h
Ñ/) 2
.JFi
Entonces, un intervalo de confianza de 100(1 - a)o/o se encuentra como:
M± th-1,«/2SE donde th-l,a!l es el punto porcentual superior a/2 (o el punto porcentual a bilateral) de una distribución t con h - 1 grados de libertad. El ancho, L, de este intervalo es 2th-l,a/2 SE.
Método 2 Se supone que los resultados de cada una de las h valoraciones han sido analizados para proveer h valores de logaritmo de potencia con límites de confianza relacionados. Para cada valoración, i, se obtiene el intervalo de confianza para el logaritmo de potencia o el logaritmo de potencia relativa. Posteriormente, se calcula el valor L; restando el imo límite de confianza inferior del imo límite de confianza superior. El peso W; para cada valor del logaritmo de la potencia relativa, M;, se calcula según se indica a continuación, donde t; tiene el mismo valor de distribuciónt que el usado en el cálculo de los límites de confianza en la íma valoración y se basa en n; grados de libertad:
4t~
w.=-'-
' e t
Se calculan los productos w;M; para cada valoración, y la suma de estos se divide por el peso total (w) de todas las valoraciones para obtener la media ponderada del logaritmo de potencia relativa y su error estándar según se indica a continuación: -
Media,
h
M=
L W;M; / w i=1
Error Estándar Aproximado, SE = 1 I
JW
(1)
h
donde
w = ,Lw; i=1
A continuación, calcular un chi cuadrado aproximado:
i=l
i=l
Si el valor aproximado de X2 M está bien por debajo del valor de 5% presentado en la Tabla 3, calcular el intervalo de confianza usando las ecuaciones de media y error estándar aproximados en (1) anteriores; de otro modo, usar Pesos alternativos según se describe a continuación. Es necesario que los laboratorios especifiquen en sus procedimientos cómo cuantificar los valores que están "bien por debajo". En ausencia de dicha especificación, se sugieren los valores de 20% de la Tabla 3. Entonces, un intervalo de confianza de 100(1 - a)o/o en la escala logarítmica se encuentra como:
M± L/2
h-2
d=n.-4x--
,
'
h-1
wjj
y df =
/
~w¡/n;
USP 39
Pruebas Biológicas/ (115) Valoración de Dexpantenol 205
donde tN,a!z es el punto porcentual superior u/2 (o el punto porcentual a bilateral) de una distribución t con grados de libertad, df. El ancho de este intervalo es L. Tabla 3. Valores Críticos para la Prueba de Chi Cuadrado Aproximado Valores Críticos h
5%
20%
2
3,841
1,642
3
5,991
3,219
4
7,815
4,642
5
9,488
5,989
6
11,070
7,289
7
12,592
8,558
8
14,067
9,803
9
15,507
11,030
10
16,919
12,242
Pesos Alternativos: La variación observada entre los logaritmos de potencia o de potencias relativas estimados se puede dividir en dos componentes: •variación intravaloración para la valoración i: V;= 1/w; • componente intervaloración de variación: 52
B
=
1 h -2 lh máx{O,-I(M¡ -M) - - ¿v;} h-1 i=l h i=l
Posteriormente, para cada valoración se calcula un coeficiente ponderado como:
Entonces, el intervalo de confianza se encuentra como:
M±txSE', h
donde SE' = 1 /
J;/
y
w'=L:w; i=l
y t, el valor de distribución t, a menudo se aproxima mediante el valor 2. Para mayor información sobre la combinación de valoraciones, ver el capítulo (1034), que puede ser un recurso útil, mas no obligatorio.
APÉNDICE-BIBLIOGRAFÍA IMPORTANTE Bliss, CI. Analysis of the biological assays in USP XV. Drug Standards, 24, 33-67, 1956. Bohrer A. One-sided and two-sided critica! values far Dixon's outlier test far sample sizes up to n = 30. Economic Quality Control 23, 5-13, 2008.
Cochran, WG. The combination of estimates from different experiments. Biometrics 1O, 101-129, 1954. Fieller, EC. Sorne problems in interval estimation. journal of the Royal Statistical Society, B 16, 175-185, 1954. lglewicz, B and Hoaglin, DC. How to Detect and Handle Outliers. Quality Press, Milwaukee, 1993.
(115) VALORACIÓN DE DEXPANTENOL Este procedimiento se utiliza para realizar la valoración de dexpantenol cuando se presenta como ingrediente de preparaciones multivitamínicas. Se aplica también para determinar el componente dextrógiro del pantenol racémico y de otras mezclas que contengan pantenol dextrógiro. Pueden usarse medios preparados según se indica a continuación o mezclas deshidratadas que proporcionen formulaciones similares, siempre y cuando, una vez reconstituidas de acuerdo con las instrucciones del fabricante o del distruidor, posean propiedades de promoción del crecimiento equivalentes o superiores a las obtenidas con las fórmulas incluidas en este capítulo.
USP 39
206 (115) Valoración de Dexpantenol / Pruebas Biológicas
Estándares de Referencia USP (11 )-ER Dexpantenol USP. Solución Madre del Estándar de Dexpantenol-Disolver en agua una cantidad pesada con exactitud de ER Dexpantenol USP, diluir cuantitativamente con agua para obtener una solución con una concentración conocida de aproximadamente 800 µg por ml y mezclar. Almacenar en un refrigerador, al resguardo de la luz, y usar dentro de los 30 días de preparada. Preparación Estándar-El día de la valoración, preparar una dilución de la Solución Madre del Estándar de Dexpantenol en agua para obtener una concentración de 1,2 µg de dexpantenol por ml. Preparación de Valoración-Proceder según se indica en la monografía individual y preparar una solución que se espera que contenga aproximadamente el equivalente a la concentración de dexpantenol en la Preparación Estándar. Medio de Pantotenato ModificadoSolución de Hidrolizado Ácido de Caseína
25 ml
Solución de Cistina-Triptófano
25 ml
Solución de Polisorbato 80 Dextrosa, Anhidra
0,25 ml 10 g
Acetato de Sodio, Anhidro
5g
Solución de Adenina-Guanina-Uracilo
5 ml
Solución de Riboflavina-Clorhidrato de Tiamina-Biotina
5 ml
Solución de Ácido Paraaminobenzoico-Niacina-Clorhidrato de Piridoxina
5 ml
Solución Salina A
5 ml
Solución Salina B
5 ml
Solución de Pantotenato de Calcio-Piridoxal
5 ml
Solución de Polisorbato 40-Ácido Oleico
5 ml
Disolver la dextrosa anhidra y el acetato de sodio en las soluciones previamente mezcladas; ajustar con hidróxido de sodio 1 N a un pH de 6,8. Finalmente, diluir con agua a 250 ml y mezclar. Medio de Pantotenato Modificado de Doble Concentración-Preparar según se indica en Medio de Pantotenato Modificado, pero hacer que la dilución final sea de 125 ml en vez de 250 ml. Preparar a diario. Solución de Hidrolizado Ácido de Caseína-Mezclar 100 g de caseína sin vitaminas con 500 ml de ácido clorhídrico 6 N y someter la mezcla a reflujo entre 8 y 12 horas. Eliminar el ácido clorhídrico de la mezcla mediante destilación bajo presión reducida hasta que quede una pasta espesa. Redisolver la pasta resultante en aproximadamente 500 ml de agua, ajustar la solución con hidróxido de sodio 1 N a un pH de 3,5 ±O, 1 y agregar agua para obtener 1000 ml. Agregar 20 g de carbón activado, revolver durante 1 hora y filtrar. Repetir el tratamiento con carbón activado. Almacenar bajo tolueno en un refrigerador a una temperatura no inferior a 1Oº. Filtrar la solución si se formara un precipitado durante el almacenamiento. Solución de Cistina-Triptófano-Suspender 4,0 g de L-cistina y 1,0 g de L-triptófano (o 2,0 g de D,L-triptófano) en un volumen de agua entre 700 y 800 ml, calentar a 75 ± 5º y agregar, gota a gota y agitando, ácido clorhídrico diluido (1 en 2) hasta que los sólidos se disuelvan. Enfriar, agregar agua para obtener 1000 ml y mezclar. Almacenar bajo tolueno en un refrigerador a una temperatura no inferior a 1Oº. Solución de Adenina-Guanina-Uracilo-Disolver 200 mg de sulfato de adenina, 200 mg de clorhidrato de guanina y 200 mg de uracilo, con ayuda de calor, en 1O ml de ácido clorhídrico 4 N, enfriar, agregar agua para obtener 200 ml y mezclar. Almacenar bajo tolueno en un refrigerador. Solución de Polisorbato 80-Disolver 25 g de polisorbato 80 en alcohol para obtener 250 ml y mezclar. Solución de Riboflavina-Clorhidrato de Tiamina-Biotina-Disolver riboflavina, clorhidrato de tiamina y biotina en ácido acético 0,02 N para obtener una solución que contenga 20 µg de riboflavina, 1O µg de clorhidrato de tiamina y 0,04 µg de biotina por ml. Almacenar, protegida de la luz, bajo tolueno en un refrigerador. Solución de Ácido Paraaminobenzoico-Niacina-Clorhidrato de Piridoxina-Preparar una solución con alcohol neutralizado al 25 por ciento para obtener las siguientes concentraciones: 1O µg de ácido paraaminobenzoico, 50 µg de niacina y 40 µg clorhidrato de piridoxina por ml. Almacenar en un refrigerador. Solución Salina A-Disolver 25 g de fosfato monobásico de potasio y 25 g de fosfato dibásico de potasio en agua para obtener 500 ml. Agregar 5 gotas de ácido clorhídrico, mezclar y almacenar bajo tolueno. Solución Salina B-Disolver en agua 1O g de sulfato de magnesio, 0,5 g de cloruro de sodio, 0,5 g de sulfato ferroso y 0,5 g de sulfato de manganeso para obtener 500 ml. Agregar 5 gotas de ácido clorhídrico, mezclar y almacenar bajo tolueno. Solución de Piridoxal-Pantotenato de Calcio-Disolver 40 mg de clorhidrato de piridoxal y 375 µg de pantotenato de calcio en alcohol al 1O por ciento para obtener 2000 ml y mezclar. Conservar en un refrigerador y usar dentro de los 30 días de preparada. Solución de Polisorbato 40-Ácido Oleico-Disolver 25 g de polisorbato 40 y 0,25 g de ácido oleico en alcohol al 20 por ciento para obtener 500 ml y mezclar. Conservar en un refrigerador y usar dentro de los 30 días de preparada. Cultivo Madre de Pediococcus acidilactici-Disolver con ayuda de calor 6,0 g de peptona, 4,0 g de digerido pancreático de caseína, 3,0 g de extracto de levadura, 1,5 g de extracto de carne, 1,0 g de dextrosa y 15,0 g de agar en aproximadamente 800 ml de agua. Ajustar con hidróxido de sodio O, 1 N o ácido clorhídrico O, 1 N a un pH entre 6,5 y 6,6, agregar agua hasta 1000 ml y mezclar. Agregar porciones de aproximadamente 1O ml de la solución a tubos de cultivo, tapar y esterilizar a
Pruebas Biológicas/ (121) Valoración de Insulina 207
USP 39
121° durante 15 minutos. Enfriar en pendiente y almacenar en un refrigerador. Preparar un cultivo madre de Pediococcus acidilactici* en un tubo conteniendo una cuña de este medio. Incubar a 35º durante 20 a 24 horas y almacenar en un refrigerador. Mantener el cultivo madre realizando transferencias mensuales en tubos con medio en cuña nuevos. lnóculo-lnocular tres porciones de 250 mL de Medio de Pantotenato Modificado de una pendiente de cultivo madre e incubar a 35º durante 20 a 24 horas. Centrifugar la suspensión de las porciones combinadas y lavar las células con Medio de Pantotenato Modificado. Resuspender las células en suficiente Medio modificado de pantotenato de manera que una dilución 1:50, cuando se analiza en un tubo de ensayo de 13 mm de diámetro, proporciona una transmisión de luz de 80% a 530 nm. Transferir porciones de 1,2 mL de esta suspensión madre a ampollas de vidrio, sellar, congelar en nitrógeno líquido y almacenar en un congelador. El día de la valoración, dejar que las ampollas alcancen temperatura ambiente, mezclar el contenido y diluir 1 mL del cultivo descongelado con solución salina estéril SR hasta 150 mL. [NOTA-Esta dilución se puede modificar, cuando sea necesario, para obtener la respuesta deseada.] Procedimiento-Preparar por triplicado series de ocho tubos de cultivo agregando las siguientes cantidades de agua a los tubos de una serie: 5,0 mL, 4,5 mL, 4,0 mL, 3,5 mL, 3,0 mL, 2,0 mL, 1,0 mL y 0,0 ml. A estos mismos tubos y en ese mismo orden agregar 0,0 mL, 0,5 mL, 1,0 mL, 1,5 mL, 2,0 mL, 3,0 mL, 4,0 mL y 5,0 mL de la Preparación estándar. Preparar por duplicado una serie de cinco tubos de cultivo agregando las siguientes cantidades de agua a los tubos de una serie: 4,0 mL, 3,5 mL, 3,0 mL, 2,0 mL y 1,0 ml. A estos mismos tubos y en ese mismo orden, agregar 1,0 mL, 1,5 mL, 2,0 mL, 3,0 mL y 4,0 mL de la Preparación de Valoración. Agregar 5,0 mL de Medio de Pantotenato Modificado de Doble Concentración a cada tubo y mezclar. Cubrir los tubos con tapas metálicas y esterilizar en autoclave a 121 º durante 5 minutos. Enfriar a temperatura ambiente en un baño de agua fría e inocular cada tubo con 0,5 mL del lnóculo. Dejar incubando a 37° durante 16 horas. Detener el crecimiento calentando a una temperatura no inferior a 80º, por ejemplo mediante la aplicación de vapor a presión atmosférica en un esterilizador adecuado durante 5 a 1O minutos. Enfriar y determinar concomitantemente el porcentaje de transmitancia de la suspensión, en celdas de igual paso óptico, en un espectrofotómetro adecuado, a 530 nm. Cálculo-Dibujar una curva de dosis-respuesta en papel para gráficos aritméticos trazando la respuesta promedio, en porcentaje de transmitancia, para cadd conjunto de tubos de la curva estándar en función de las concentraciones del estándar. La curva se traza uniendo cada par adyacente de puntos con una línea recta. A partir de esta curva estándar, determinar la potencia por interpolación, en función del dexpantenol, de cada tubo que contiene porciones de la Preparación de Valoración. Dividir la potencia de cada tubo por la cantidad de Preparación de Valoración agregada para obtener las respuestas individuales. Calcular la respuesta media realizando el promedio de las respuestas individuales que varían de su media en no más de un 15%, utilizando no menos de la mitad del número total de tubos. Calcular la potencia de la porción de material tomada para la valoración, en función del dexpantenol, multiplicando la respuesta promedio por el factor de dilución adecuado.
(121) VALORACIÓN DE INSULINA INTRODUCCIÓN La manifestación más importante de la actividad de la insulina, un brusco descenso de la glucosa en sangre, sirvió de base para valoraciones biológicas desde sus primeros usos clínicos. El procedimiento, si bien es relativamente complejo, tiene el gran mérito de reflejar con exactitud el efecto en el paciente diabético. La aparición de métodos fisicoquímicos prácticos pero sofisticados (por ejemplo la cromatografía líquida) para medir cuantitativamente la potencia de la insulina ha dado lugar a pruebas farmacopeicas más precisas y exactas para la insulina y los productos derivados de la insulina. Sin embargo, no se puede determinar la identidad biológica de la insulina y de sus productos por estos métodos. Por esta razón, se incluye en este capítulo una prueba de bioidentidad en conejos y su uso se especifica en las monografías correspondientes. El Método de Determinación de Glucosa en Sangre de Conejos-Cuantitativo se usa para determinar la potencia de los Estándares de Referencia de la Insulina, para la validación de la estabilidad de nuevas preparaciones de insulina y para determinar las actividades específicas de los análogos de la insulina.
VALORACIÓN •MÉTODO DE DETERMINACIÓN DE GLUCOSA EN SANGRE DE CONEJOS-CUANTITATIVO
Diluyente: Preparar una solución acuosa que contenga de O, 1% a 0,25% (p/v) de cresol o de fenal, de 1,4% a 1,8% (p/v) de glicerina y suficiente ácido clorhídrico para obtener un pH entre 2,5 y 3,5 a menos que se especifique algo diferente en la monografía individual. Solución madre del estándar: Preparar una solución que contenga 40 Unidades USP de lnsulina/mL a partir de ER Insulina USP de las especies apropiadas en Diluyente y con un pH entre 2,5 y 3,5, a menos que se especifique de otro modo en la monografía individual. Para la insulina de especies bovina y porcina mezcladas, preparar una solución que contenga 34,8 Unidades USP de Insulina Bovina/mL y 5,2 Unidades USP de Insulina Porcina/mL en Diluyente con un pH entre 2,5 y 3,5. Almacenar en un lugar frío, proteger contra la congelación y usarla dentro de un período de 6 meses.
* La cepa ATCC (American Type Culture Collection) No. 8042 es adecuada.
208 (121) Valoración de Insulina / Pruebas Biológicas
USP 39
Soluciones estándar: Diluir porciones de la Solución madre del estándar con Diluyente para obtener dos soluciones, una que contenga 1,0 Unidad USP de lnsulina/mL (Solución estándar 7), y otra que contenga 2,0 Unidades USP de lnsulina/mL (Solución estándar 2). Solución madre de la muestra: Proceder según se indica en Solución madre del estándar, excepto que se debe usar una cantidad adecuada de la preparación en análisis en lugar de ER Insulina USP de la especie apropiada. La Solución madre de la muestra contiene aproximadamente 40 Unidades USP de lnsulina/mL. Soluciones muestra: Diluir porciones de la Solución madre de la muestra con Diluyente para obtener dos diluciones de la preparación en análisis, una de las cuales se puede esperar que contenga 1,0 Unidad USP de lnsulina/mL (Solución muestra 7), basándose en la potencia supuesta, y la otra que contenga 2,0 Unidades USP de lnsulina/mL (Solución muestra 2). En el caso de una inyección de insulina neutra, ajustar a un pH entre 2,5 y 3,5 antes de realizar las diluciones. Dosis de las soluciones a inyectar: Seleccionar la dosis de las diluciones a inyectar, basándose en pruebas o experiencias anteriores, cuyo volumen generalmente está entre 0,30 mL y 0,50 ml. Para cada animal, el volumen de la Solución estándar es el mismo que el de la Solución muestra. Preparación de los animales: Seleccionar conejos adecuados y sanos que no pesen menos de 1,8 kg cada uno. Mantener los conejos en el laboratorio durante no menos de 1 semana antes de utilizarlos en la valoración y alimentarlos con una dieta uniforme satisfactoria, con acceso libre al agua en todo momento. Análisis: Dividir los conejos en cuatro grupos iguales, preferentemente de no menos de seis conejos cada uno. El día anterior al procedimiento, aproximadamente 20 horas antes de la valoración, suministrar a cada conejo alimento suficiente para que se consuma en 6 horas. Seguir este mismo programa de alimentación antes de cada día de prueba. Durante la valoración, no suministrar alimentos hasta no haber extraído la última muestra de sangre. Manipular los conejos con cuidado para evitar una excitación indebida e inyectar subcutáneamente las dosis indicadas en el siguiente diseño (ver la Tabla 7), la segunda inyección se debe administrar el día posterior a la primera inyección o no más de 1 semana después. El tiempo entre la primera y la segunda inyección es el mismo para todos los conejos. Tabla 1 Grupo
Primera Inyección
Segunda Inyección
1
Solución estándar 2
Solución muestra 7
2
Solución estándar 7
Solución muestra 2
3
Solución muestra 2
Solución estándar 7
4
Solución muestra 7
Solución estándar 2
Muestras de sangre: A 1 hora ± 5 minutos y 2 1/2 horas± 5 minutos después de la inyección, extraer de cada conejo una muestra adecuada de sangre de una vena marginal de la oreja. La sangre también se puede extraer eficazmente de la arteria auricular central. Determinación de dextrosa: Determinar el contenido de dextrosa en las muestras de sangre mediante un procedimiento adecuado que se adapte a un análisis automatizado. Se puede utilizar el siguiente procedimiento. Solución anticoagulante: Disolver 1 g de edetato sódico y 200 mg de fluoruro de sodio en 1 L de agua y mezclar. Preparaciones estándar de dextrosa: Transferir concentraciones conocidas de ER Dextrosa USP a recipientes adecuados y diluir cuantitativamente y en diluciones sucesivas con Solución anticoagulante (1 :9) para obtener una serie de Preparaciones estándar de dextrosa que contengan entre 20 mg y 100 mg por 100 mL con concentraciones conocidas similares a las concentraciones de las muestras de sangre de los conejos. Preparaciones muestra: Pipetear y transferir a sendos recipientes adecuados 0, 1 mL de cada Muestra de sangre y 0,9 mL de Solución anticoagulante. Análisis: Someter a diálisis las Preparaciones muestra a través de una membrana semipermeable durante un tiempo suficiente de modo que la dextrosa pase a través de la membrana a una solución salina SR que contenga oxidasa de glucosa, peroxidasa de rábano, clorhidrato de 3-metil-2-benzotiazolinona hidrazona SR y N,N-dimetilanilina. Las absorbancias de las Preparaciones muestra se determinan a 600 nm en un colorímetro con registrador. Las absorbancias de las Preparaciones Estándar de Dextrosa se determinan de manera similar al comienzo y al final de cada corrida. Cálculos: Calcular la respuesta de cada conejo a cada inyección a partir de la suma de los dos valores de glucemia y restar su respuesta, sin tomar en cuenta el orden cronológico en el cual se observaron las respuestas, para obtener las diferencias individuales, y, según se indica en la Tabla 2. Cuando falten datos de uno o más conejos en una valoración, no usar las fórmulas de intervalo de confianza que se brindan en la presente valoración, sino usar un procedimiento estadístico. Los datos aún pueden analizarse con un análisis de varianza apropiado. Cuando el número de conejos, f, usado en la valoración sea igual en cada grupo, determinar la suma de y para cada grupo y calcular:
y
Pruebas Biológicas/ (121) Valoración de Insulina 209
USP 39
El logaritmo de la potencia relativa de las diluciones de prueba es M' = 0,301 TufTb. La potencia de la inyección en Unidades USP/mg es igual al antilogaritmo (lag R + M'), donde:
R = Vs/vu =número de Unidades USP/mL de la Solución estándar = número de mg/mL de insulina de la Solución muestra correspondiente Determinar el intervalo de confianza del logaritmo de la potencia relativa con una confianza del 95% usando el Teorema de Fieller (ver el Apéndice y Diseño y Análisis de Valoraciones Biológicas (111 )). Si el intervalo de confianza es mayor de 0,082, que corresponde, a P = 0,95, a límites de confianza de aproximadamente± 10% de la potencia calculada, repetir la valoración hasta que los datos combinados de dos o más valoraciones, redeterminadas según se describe en Combinación de Valoraciones Independientes en Diseño y Análisis de Valoraciones Biológicas (111 ), cumplan con este límite aceptable. Vs
vu
Tabla 2
Diferencias
Grupo
Respuesta Individual (y)
Respuesta Total (7)
Desviaciones Estándar de Diferencias (S)
Y1
T,
S¡
Y2
T2
S2
3
Solución estándar 2 - Solución muestra 1 Solución muestra 2 - Solución estándar 1 Solución muestra 2 - Solución estándar 1
YJ
T3
53
4
Solución estándar 2 - Solución muestra 1
Y1
T4
S4
1 2
Apéndice:Teorema de Fieller para Determinar el Intervalo de Confianza para un Cociente Esta versión del Teorema de Fieller es para el caso en el cual el numerador y el denominador no están correlacionados. La ecuación asume que el numerador y el denominador están normalmente distribuidos y que los grupos de conejos son del mismo tamaño. Entonces, el intervalo de confianza de 95% para el cociente es:
M' ± _t_ ~(1- g) S~+ (M')2 (L, U)= _ _T_b_ _ _ _ __ 1-g
s;
donde f (grados de libertad en los errores estándar)= 4(k - 1), donde k es la cantidad de conejos en un grupo, tes el percentil superior de 97,5 de la distribución t con f grados de libertad, y
_ t s; g-y 2
b
Si g::: 1, el denominador no es significativamente diferente a O y la fórmula no funciona.
sN = 0,301 Jk)s¡ + sg + s; + s:
• PRUEBA DE BIOIDENTIDAD
Proceder según se indica en el Método de Determinación de Glucosa en Sangre de Conejos-Cuantitativo con las siguientes modificaciones. Procedimiento: Dividir los conejos en cuatro grupos iguales de 2 conejos cada uno. Cálculo: Proceder según se indica para Cálculos en Método de Determinación de Contenido de Glucosa en Sangre de Conejos-Cuantitativo, pero no determinar el intervalo de confianza del logaritmo de la potencia relativa, M'. Interpretación: Si el valor de la potencia obtenido no es menor de 15 Unidades USP/mg, se cumple el requisito de la Prueba de Bioidentidad. Si el valor de la potencia es menor de 15 Unidades USP/mg, repetir la prueba usando ocho conejos más. Si la potencia promedio de los 2 conjuntos de pruebas no es menor de 15 Unidades USP/mg, se cumple el requisito de la prueba. REQUISITOS ADICIONALES •ESTÁNDARES DE REFERENCIA USP
ER Dextrosa USP ER Insulina Asparta USP ER Insulina Bovina USP
(11)
21 O (121) Valoración de Insulina/ Pruebas Biológicas
ER ER ER ER
Insulina Insulina Insulina Insulina
USP 39
Glargina USP Humana USP Lispro USP Porcina USP
(121.1) PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS FISICOQUÍMICOS PARA INSULINAS INTRODUCCIÓN Existen diversos procedimientos fisicoquímicos que se utilizan para la evaluación de los atributos de calidad de la Insulina Humana y de diversos análogos de insulina, en lo sucesivo referidos como insulinas. De éstos, el mapeo de péptidos y la determinación de proteínas de alto peso molecular tienen características similares para el análisis de los diversos fármacos y medicamentos basados en insulina. Este capítulo describe las pruebas para mapeo de péptidos y para el análisis cuantitativo de proteínas de alto peso molecular que se pueden usar para las diversas insulinas. Las instrucciones específicas que difieran de los procedimientos generales aquí descritos se proporcionan en las monografías correspondientes de fármacos o medicamentos para las diferentes insulinas. MAPEO DE PÉPTIDOS La digestión de insulina se lleva a cabo usando proteasa de la cepa V8 de Staphylococcus aureus (S. aureus V8), una serin-endoproteineasa que escinde desde el lado e-terminal a nivel de los residuos glutamilo y aspartilo en solución amortiguadora de fosfato de pH 7,8. Esta proteasa es específica para la digestión de Glu-C en bicarbonato de amonio y otras soluciones amortiguadoras de pH 7,8 que no contienen fosfato. La presencia de prolina en el lado carboxi de la unión peptídica inhibe la escición. El sistema amortiguador usado debe escindir todas las uniones glutamilo de la insulina sin escindir las uniones aspartilo. En general, usando el sistema amortiguador descrito en la Solución muestra siguiente, la insulina se digiere en cuatro péptidos. A continuación se muestran las diferencias de aminoácidos entre los análogos de la insulina y la Insulina Humana, y las diferencias in silico en los fragmentos obtenidos luego de la digestión con S. aureus V8. La Figura 7 presenta los cuatro fragmentos de Insulina Humana después de la digestión con proteasa V8 de S. aureus. Fragmento I
Fragmento IV
s A1
Fragmento JI
s A10
1
A20
1
Gly-lle-Val-Glu Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-lle-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu Asn-Tyr-Cys-Asn 1
1
s
/
\s
81
1
s Fragmento III
s 810
1
830
820
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr 1
Figura 1. Insulina Humana: Fragmentos de digerido con proteasa V8 de 5. aureus. La Tabla 7 presenta las diferencias de aminoácidos entre los análogos de insulina e Insulina Humana. Tabla 1. Diferencias de Aminoácidos entre los Análogos de Insulina e Insulina Humana Análogo de Insulina
Diferencias de Aminoácidos con la Insulina Humana
Insulina asparta
B28 Asp
Insulina glargina
A21 Gly, dos Arg agregadas al (-terminal de la cadena B
Insulina glulisina
B3 Lys, B29 Glu
Insulina lispro
B28 Lys, B29 Pro
--------------
La Tabla 2 presenta los fragmentos específicos del digerido de proteasa V8 de S. aureus de los análogos de insulina. Se resaltan las diferencias de aminoácidos en comparación con la Insulina Humana. Tabla 2. Diferencias de Aminoácidos: Insulina Humana y Análogos (Las Diferencias con Insulina Humana Se Análogo de Insulina Insulina asparta Insulina glargina
ª
p,-~sentan
Diferencias de Aminoácidos en Comparación con la Insulina Humanaª Fragmento 111
(B22) Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Asp-Lys-Thr (B3ü)
Fragmento 11
(A18) Asn-Tyr-Cys-Gly (A21)
Fragmento 111
(B22) Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-Arg-Arg (B32)
Las letras A y B indican las cadenas A y B de insulina, respectivamente; los números indican la posición del aminoácido en la cadena.
en Negrilla)
Pruebas Biológicas/ (121.1) Procedimientos para Insulinas 211
USP 39
Tabla 2. Diferencias de Aminoácidos: Insulina Humana y Análogos (Las Diferencias con Insulina Humana Se Presentan en Negrilla) (Continuación)
Diferencias de Aminoácidos en Comparación con la Insulina Humanaª
Análogo de Insulina Fragmento 1
Insulina glulisina Insulina lispro
ª
(B1) Phe-Val-Lys-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu (B11)
Fragmento 111
(B22) Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Glu-Thr (B30)
Fragmento 111
(B22) Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Lys-Pro-Thr (B3o)
Las ietras A y B indican las cadenas A y B de insulina, respectivamente; los números inaican ia posición dei aminoácido en 1a cadena.
• PROCEDIMIENTO PARA MAPEO DE PÉPTIDOS
El siguiente procedimiento se aplica a la preparación de mapas peptídicos de Insulina Humana y análogos de insulina. Solución amortiguadora de HEPES: Disolver 2,38 g de HEPES (ácido N-2-hidroxietilpiperazina-W-2-etanosulfónico) en aproximadamente 90 ml de agua en un mat:az volumétrico de 100 ml. Ajustar con hidróxido de sodio 5 M a un pH de 7,5, dl 1uir co~ agua a volumen y mezclar. Solución amortiguadora de sulfato: Sulfato de amonio 2,0 M y ácido sulfúrico 0,5 M (1 :1). ~/lezc!ar y filtrar. • DIGESTIÓN DE INSULINA
El siguiente procedimiento provee una escisión eficiente de las uniones a nivel del glutamilo de la insulina. [NOTA-Se pueden usar volúmenes hasta 20 veces mayores siempre que la proporción de las soluciones siga siendo la misma. Si al correr un digerido de la enzima sola se obtienen subproductos de autolisis interferentes en el cromatograma, la relación enzima: insulina deberá reducirse y se deberá aumentar el tiempo de digestión.] Solución enzimática: Preparar una solución de proteasa V8 de S. aureus (aproximadamente 500 unidades/mg) de 1 mg/ml en agua. Solución muestra: Preparar una solución de la insulina a examinar de 2,0 mg/ml en ácido clorhídrico 0,01 N. Agregar a un vial limpio 25 µL de la solución de insulina de 2,0 mg/ml, 100 µL de Solución amortiguadora de HEPES y 20 µL de Solución enzimática (relación final 25:100:20). Tapar el vial e incubar a 25º durante 6 horas. Detener la reacción agregando un volumen igual de Solución amortiguadora de sulfato. Puede ser necesario aumentar los tiempos de incubación para los análogos de baja solubilidad a un pH de 7,5. Solución estándar: Preparar al mismo tiempo y de la misma manera una solución del Estándar de Referencia de Insulina USP correspondiente, según se indica en la Solución muestra. • DETERMINACIÓN DE FRAGMENTOS PEPTÍDICOS
Determinar los fragmentos peptídicos usando el siguiente procedimiento de mapeo de péptidos (ver Artículos Obtenidos Por Biotecnología-Mapeo de Péptidos (1055)). Solución A: Acetonitrilo, agua y Solución amortiguadora de sulfato (100:700:200). Filtrar y desgasificar. Solución B: Acetonitrilo, agua y Solución amortiguadora de sulfato (400:400:200). Filtrar y desgasificar. Fase móvil: Ver la Tabla 3. Tabla 3
~---·
Tiempo _(min)
Solución A (%)
o
95
3 30 35 40 50
95 41 20 95 95
Solución B ~ __ _(%)
5 5 59 80 5 5
Sistema cromatográfico (Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.) Modo: HPLC Detector: UV 214 nm Columna: 4,6 mm x 1O cm; relleno L1 de 5 µm Temperatura de la columna: 40º Velocidad de flujo: 1 ml/min Volumen de inyección: 50-100 µL Aptitud del sistema Muestra: Solución estándar Requisitos de aptitud Comparabilidad de los cromatogramas: En el cromatograma obtenido a partir de la Solución estándar, identificar los picos debidos a los fragmentos de digestión 1, 11, 111 y IV. El cromatograma de la Solución estándar corresponde al cromatograma típico provisto con el Estándar de Referencia de Insulina USP correspondiente. Factor de asimetría: No más de 1,5
212 (121.1) Procedimientos para Insulinas/ Pruebas Biológicas
USP 39
Resolución: Debe existir separación completa de los picos debidos a los fragmentos 11 y 111. La resolución se define en la monografía de la insulina correspondiente. Análisis Muestras: Solución estándar y Solución muestra Acondicionar el Sistema cromatográfico mediante una corrida en condiciones iniciales, t = O minutos, durante al menos 15 minutos. Correr un programa de gradientes blanco antes de inyectar los digeridos. Inyectar por separado volúmenes iguales de la Solución estándar y la Solución muestra, y registrar las respuestas de cada pico. Criterios de aceptación: El perfil cromatográfico de la Solución muestra corresponde al de la Solución estándar. LÍMITE DE PROTEÍNAS DE ALTO PESO MOLECULAR • PROCEDIMIENTO
Solución A: 1 mg/ml de L-arginina en agua Fase móvil: Solución A, acetonitrilo y ácido acético glacial (65:20:15). Filtrar y desgasificar. Solución de resolución: Almacenar una cantidad adecuada de fármaco basado en insulina a temperatura ambiente durante un periodo suficiente (5-1 O días, o según sea necesario) para obtener insulina con más de 0,4% de proteínas de alto peso molecular. Preparar una solución de 4 mg/ml en ácido clorhídrico 0,01 N. Almacenar la solución en un refrigerador y usar dentro de los 7 días. Como alternativa, disolver aproximadamente 4 mg de ER Insulina Humana de Alto Peso Molecular USP en 1 ml de ácido clorhídrico 0,01 N. Solución muestra: En un vial pequeño, preparar una solución de insulina de 4 mg/ml en ácido clorhídrico 0,01 N y mezclar hasta disolver. Almacenar en un refrigerador y usar dentro de los 7 días. Sistema cromatográfico (Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.) Modo: HPLC Detector: UV 276 nm Columna: 7,8 mm x 30 cm; relleno L20 de 5 a 1O µm Temperaturas Columna: Ambiente Muestreador automático: Se recomienda usar un muestreador automático refrigerado. Velocidad de flujo: 0,5 ml/min Volumen de inyección: 100 µL Aptitud del sistema Muestra: Solución de resolución Requisitos de aptitud Tiempos de retención: Entre 13 y 17 minutos para los complejos de insulina polimérica, aproximadamente 1 7,5 minutos para el dímero covalente de insulina, y entre 18 y 22 minutos para el monómero de insulina, con sales que eluyen después del monómero de insulina. Cociente entre el pico y el valle: El cociente entre la altura del pico del dímero covalente de insulina y la altura del valle entre el pico del dímero covalente de insulina y el pico del monómero de insulina es no menos de 2,0. Análisis Muestra: Solución muestra No tomar en cuenta los picos que tengan tiempos de retención mayores que el del monómero de insulina. Calcular el porcentaje de proteínas de alto peso molecular en la porción de Insulina tomada: Resultado= 100 x 'frH/C'irH + rM) =suma de las respuestas de todos los picos con tiempos de retención menores que el del monómero de insulina rM = respuesta del pico del monómero de insulina Criterios de aceptación: Según se indica en la monografía de insulina correspondiente. 'frH
REQUISITOS ADICIONALES • ESTÁNDARES DE REFERENCIA USP (11)
ER Insulina Humana de Alto Peso Molecular USP (uso alternativo u opcional)
(123) PRUEBAS DE IDENTIDAD BIOLÓGICA DE GLUCAGÓN DEFINICIÓN
El Glucagón es una hormona polipeptídica que posee la propiedad de incrementar la concentración de glucosa en la sangre mediante su liberación a partir de la reserva de glucógeno del hígado y que se usa en la práctica clínica para tratar la hipoglucemia. El glucagón humano, porcino y bovino comparten la misma secuencia de 29 aminoácidos. Anteriormente, el glucagón disponible comercialmente se purificaba a partir de glándulas pancreáticas bovinas y porcinas. En la actualidad, el glucagón humano es producido recombinantemente (por ADNr) (rGlucagón) con diversos sistemas de fermentación micro-
USP 39
Pruebas Biológicas/ (123) Pruebas de Identidad Biológica de Glucagón 21 3
biana usando la secuencia de aminoácidos humana. La monografía de los compendios USP-NF, Glucagón para Inyección, define las pruebas de identificación para glucagón. La identidad biológica del glucagón se debe determinar usando un método de valoración biológica validado, aprobado por una autoridad competente. La valoración biológica debe demostrar que el proceso de fabricación produce Glucagón con una actividad biológica de no menos de 0,80 Unidades USP/mg de glucagón. Este capítulo describe una prueba de identidad biológica validada que mide la glucosa liberada a partir de células de hígado (hepatocitos) de rata preparadas recientemente, estimuladas in vitro con Glucagón. VALORACIÓN •VALORACIÓN CON CÉLULAS HEPÁTICAS PRIMARIAS
[NOTA-Todas las soluciones amortiguadoras deben estar oxigenadas, preparadas con Agua Estéril para Inyección o Agua Estéril para Irrigación, entibiadas a 37º y ajustadas a un pH final de 7,4, a menos que se indique algo distinto. Se deben realizar por lo menos dos valoraciones independientes (determinaciones repetidas) utilizando dos hígados de rata para cada lote de Glucagón. La Figura 7 demuestra el proceso usado para generar un valor repetido. Se debe combinar como mínimo dos determinaciones repetidas de acuerdo con la sección Cálculos. Los intervalos de concentración de las Preparaciones estándar y las Preparaciones de valoración se pueden modificar para que caigan dentro del intervalo lineal de la Valoración; asimismo, los cálculos se pueden ajustar de manera correspondiente. Como alternativa, se puede emplear un análisis de curva completa usando métodos estadísticos no lineales validados, siempre y cuando se demuestre la similitud cuando los analistas comparen las respuestas de las Preparaciones estándar y las Preparaciones de valoración.]
Suspensión de Hepatocitos de Rata (1 Rata) Dividida en 2 Suspensiones
/ Suspensión 1
Suspensión 2
1 Vial de ER 5 Viales de Muestra
1 Vial de ER 5 Viales de Muestra
Un Resultado de Medición
Un Resultado de Medición
Figura 1. Diagrama de flujo del método de valoración de hepatocitos de rata (ER = Estándar de Referencia). Preparación de Hepatocitos Solución amortiguadora para perfusión sin calcio con dextrosa: Preparar una solución que contenga 7,92 g/L de cloruro de sodio, 0,35 g/L de cloruro de potasio, 1,80 g/L de dextrosa, O, 19 g/L de ácido edético (EDTA) y 2,38 g/L de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico (HEPES). Oxigenar antes de su uso. Solución amortiguadora de colagenasa: Preparar una solución que contenga 3,62 g/L de cloruro de sodio, 23,83 g/L de HEPES, 0,35 g/L de cloruro de potasio, 0,52 g/L de cloruro de calcio y 1,8 g/L de dextrosa. Ajustar a un pH de 7,6. Inmediatamente antes de la perfusión, disolver en esta solución una cantidad de colagenasa para obtener una concentración de 0,02%-0,05%. La concentración exacta de colagenasa se determina empíricamente para cada lote nuevo de enzima y es la cantidad que puede disociar el tejido uniformemente dentro de los 1 O minutos del ingreso de la solución amortiguadora y producir una concentración celular viable de no menos de 3 x 10 6 células/ml. Solución amortiguadora para lavado: Preparar una solución que contenga 7,92 g/L de cloruro de sodio, 0,35 g/L de cloruro de potasio, O, 19 g/L de EDTA, 2,38 g/L de HEPES, O, 11 g/L de cloruro de calcio y 0,06 g/L de sulfato de magnesio.
214 (123) Pruebas de Identidad Biológica de Glucagón / Pruebas Biológicas
USP 39
Solución amortiguadora para incubación: Preparar una solución que contenga 6, 19 g/L de cloruro de sodio, 0,35 g/L de cloruro de potasio, 0,22 g/L de cloruro de calcio, 0, 12 g/L de sulfato de magnesio, O, 16 g/L de fosfato monobásico de potasio, 11,915 g/L de HEPES y 1O g/L de albúmina sérica bovina (BSA al 1 %). Ajustar a un pH de 7,5. Animales de prueba: Mantener ratas macho Sprague-Dawley con una dieta estándar de alimento para rata, con agua a voluntad y permitir que se ajusten a su nuevo ambiente antes del análisis. En la mañana de la prueba, seleccionar una rata sana con un peso aproximado de 300-400 g y administrar 100 Unidades de Heparina Sódica por vía subcutánea. Procedimiento: [NOTA-Efectuar este procedimiento por la mañana para asegurarse de que la rata tenga un nivel óptimo de glucógeno en el hígado y que el procedimiento pueda completarse en un solo día.] Aneslesiar a la rata con un anestésico adecuado. Abrir la cavidad abdominal y aislar la vena porta. Introducir un angiocatéter en la vena porta y ligarlo en la ubicación general de la rama esplénica. Luego conectarlo a una bomba de perfusión. Comenzar la perfusión (25 mL/min) in situ con la Solución amortiguadora para perfusión sin calcio con dextrosa previamente entibiada y oxigenada. Mientras el hígado aumenta de tamaño, cortar la vena cava inferior para permitir que la presión se equilibre. [NOTA-Se requieren aproximadamente 300 mL del líquido de perfusión para limpiar el hígado de glóbulos rojos a una velocidad de flujo de 25-60 mL/min.J Después, hacer que circule Solución amortiguadora de colagenasa a una velocidad de flujo apropiada de manera que el hígado empiece a drenar el líquido de perfusión de los lóbulos en aproximadamente 1O minutos (por lo general 25-60 mL/min). Cuando el hígado aumente significativamente de tamaño, cambie de coior y consistencia, y comience a drenar el líquido de perfusión de los lóbulos, cambiar el sistema a la Solución amortiguadora para lavado previamente entibiada y oxigenada. Se requieren aproximadamente 100 mL de Solución amortiguadora para lavado para lavar el hígado de colagenasa a una velocidad de flujo de 25 mL/min. Retirar quirúrgicamente el hígado del animal y colocarlo en una cápsula de Petri previamente entibiada que contenga una pequeña cantidad de Solución amortiguadora para lavado oxigenada (37º). Peinar suavemente el hígado con un peine de dientes finos de acero inoxidable para liberar los hepatocitos. Filtrar y lavar los hepatocitos con Solución amortiguadora para lavado a través de gasa (con un grosor de 3 capas, o a través de una red de polietileno con un tamaño de malla de 150 µm), previamente humedecida, en un vaso de precipitados. Transferir las células a dos tubos de centrífuga y centrifugar durante aproximadamente 1 minuto a 600 rpm. Desechar el sobrenadante y volver a suspender los dos pellets en Solución amortiguadora para incubación. Combinar los dos pellets en un recipiente adecuado y agregar suficiente Solución amortiguadora para incubación para obtener 150 ml. Aptitud del sistema de la preparación de las células: La concentración de las células puede variar debido a la actividad de colagenasa y a la viabilidad de los hepatocitos. Para verificar la viabilidad de las células y determinar la concentración de células viables, diluir una alícuota de 100 µL de la suspensión celular con 400 µL de Solución amortiguadora para lavado y 500 µL de solución isotónica de azul de tripán al 0,4%. Cargar alícuotas de la suspensión celular en las dos cámaras de un hemocitómetro y contar los ocho cuadrantes. Para cumplir con la aptitud del sistema del método de preparación de las células, se debe obtener una concentración de células viables de 3 x 10 6 células/mL (un intervalo aceptable es de 2,5 x 10 6 a 3,4 x 1 0 6 células/mL) a fin de proseguir con la valoración biológica. Si la concentración de células viables excede el límite superior, se puede agregar a las células un volumen adicional de Solución amortiguadora para incubación para ajustar la concentración a 3 x 10 6 células/mL. En este caso, se realiza un nuevo recuento de las células en un hemocitómetro, según se indicó anteriormente para verificar la concentración. [NOTA-Las células viables son aquéllas que excluyen el azul de tripán.] Determinación de Glucosa Solución de control negativo: Preparar una solución que contenga BSA al 0,5% usando Agua Estéril para Inyección o Agua Estéril para Irrigación.
Matraces para incubación: Usar matraces Erlenmeyer de 25 mL especialmente preparados, cuyos fondos se hayan calentado y empujado hacia adentro para formar un centro elevado cónicamente o matraces similares que permitan un mezclado suficiente al agitar por rotación suave. Colocar los Matraces para incubación en un baño de agua con agitador orbital a 35º. Preparaciones estándar: En el día de la valoración, disolver dos viales de ER rGlucagón USP, medidos con exactitud, en ácido clorhídrico 0,01 N u otro diluyente adecuado (el volumen se basa en la potencia del lote del Estándar de Referencia) para obtener dos soluciones que contengan 1 Unidad USP de rGlucagón/mL cada una. Todas las diluciones posteriores se realizan con Solución de control negativo. Diluir con exactitud volúmenes medidos de cada solución con Solución de control negativo para obtener una concentración intermedia de 400 µU/mL y luego diluir la concentración intermedi;i para producir cinco concentraciones: 200; 100; 50; 25 y 12,5 µU/mL (Preparaciones estándar). Pipetear y transferir O, 1 mL de cada una de las Preparaciones estándar a distintos Matraces para incubación. Pipetear y transferir O, 1 mL de Solución de control negativo a cada uno de dos matraces (Soluciones de control negativo 1 y 2). Preparaciones de valoración: Usando cantidades pesadas con exactitud de muestras de Glucagón, proceder según se indica en Preparaciones estándar o, si se está analizando Glucagón para Inyección, reconstituir 1O viales agregando lentamente el contenido de las jeringas prellenadas adjuntas que contienen un diluyente apropiado para glucagór .. Mezc:ar suavemente cada vial hasta que se disuelva el glucagón. Con las mismas jeringas, extraer el contenido de cinco viales y colocar las soluciones en un matraz volumétrico de 25 mL. Repetir la operación para los cinco viales remanentes, transfiriendo el contenido a un segundo matraz volumétrico de 25 mL. Diluir cada matraz con ácido clorhídr:::o 0,01 N a volumen. Diluir una cantidad exacta de cada solución con BSA al 0,5% hasta obtener una concentración de 400 µU/mL y diluir la concentración intermedia hasta producir cinco concentraciones de Preparaoón de valoración: 200; 100; 50; 25 y 12,5 µU/ml. Luego, proceder según se indica en Preparaciones estándar.
Pruebas Biológicas/ (124) Valoraciones Biológicas de Eritropoyetina 215
USP 39
Solución madre de referencia: Secar ER Dextrosa USP y luego transferir 1,0 g, pesados con exactitud, a un matraz volumétrico de 100 ml. Disolver y diluir con solución saturada de ácido benzoico a volumen. Soluciones de referencia: Transferir cantidades adecuadas de Solución madre de referencia a cuatro matraces y diluir con solución saturada de ácido benzoico hasta obtener Soluciones de referencia con concentraciones de 100; 500; 1000 y 1500 mg/L. Solución de ferrocianuro de potasio: Disolver 1,25 g de ferrocianuro de potasio trihidrato en 125 mL de Agua Estéril para Inyección o usar una fuente comercial apropiada. Aptitud del sistema: Analizar la Solución de ferrocianuro de potasio, las Soluciones de referencia y cinco determinaciones repetidas adicionales de la Solución de referencia de 500 ó 1000 mg/L en un analizador de glucosa adecuado. [NOTA-Las Soluciones de ferrocianuro de potasio son estándares apropiados únicamente para analizadores de glucosa que miden actividad de glucosa oxidasa. El procedimiento también se puede realizar usando plataformas alternativas.] Preparar una curva estándar usando las Soluciones de referencia según se indica en Preparaciones estándar. La raíz cuadrada del error cuadrático medio residual, a partir de la regresión, dividida por el promedio de la respuesta multiplicada por 100% (desviación estándar relativa porcentual [o/oRSD] de la línea) debe ser no más de 2,0%. Asimismo, la respuesta de la Solución de ferrocianuro de potasio debe ser no más de 30 mg/L y la desviación estándar relativa debe ser no más de 2,0% en los análisis repetidos de la Solución de referencia media. Procedimiento: Dispensar 5 mL de Preparación de Hepatocitos en los Matraces para incubación en secuencia desde la concentración más alta de glucagón hasta la concentración más baja de glucagón, alternando las Preparaciones estándar con las Preparaciones de valoración. Agitar los matraces por rotación suave en un baño de agua giratorio a 125 rpm a una temperatura de 30º-35º durante aproximadamente 30 minutos. Después de la incubación, extraer alícuotas de 1,0 mL de cada Matraz para incubación, transferir a tubos de microcentrífuga rotulados y centrifugar a 1 3 000 rpm durante 15 segundos. Colocar cada fracción sobrenadante en un tubo de muestreo rotulado para analizador de glucosa y determinar la concentración de glucosa (mg/L) de cada una de las Preparaciones estándar y Preparaciones de valoración. Medir la lectura de fondo de las Soluciones de control negativo 7 y 2, y calcular el promedio de las dos respuestas. Para cumplir con el intervalo lineal del instrumento que se esté usando, puede ser necesario que los analistas ajusten cada una de las Preparaciones estándar y Preparaciones de valoración mediante dilución. Se debe usar un analizador de glucosa que haya demostrado una especificidad, exactitud, precisión y respuesta lineal apropiadas para el intervalo de las concentraciones que se están determinando. Determinar el incremento en la concentración de glucosa para cada una de las Preparaciones estándar y Preparaciones de valoración en comparación con el valor promedio de la Solución de control negativo.
Cálculos Calcular la potencia relativa de las muestras de Glucagón usando métodos estadísticos para valoraciones de líneas paralelas, comparando la curva del Estándar de Referencia (a partir de las Preparaciones estándar) con la curva de la muestra de Glucagón (a partir de las Preparaciones de valoración). No puede presentarse ninguna inversión de dosis-respuesta dentro de una corrida para las Preparaciones estándar y Preparaciones de valoración de 25; 50 ó 100 µU/ml. [NOTA-Se puede excluir el nivel bajo o alto de dosis, pero no ambos, del cálculo para cumplir con los requisitos de linealidad.] Debido a que se requiere un mínimo de dos valoraciones válidas (ratas), las potencias estimadas se combinan usando los procedimientos del capítulo general Diseño y Análisis de Valoraciones Biológicas (111 ), Combinación de Valoraciones Independientes; asimismo, se calcula la amplitud, L, de un intervalo de confianza de 95% para el logaritmo estimado de la potencia relativa. Los resultados son válidos si Les no más de O, 1938. Si Les >0, 1938, se pueden realizar valoraciones adicionales y combinarlas hasta obtener un término L válido, y posteriormente se calcula la potencia relativa a partir de todas las corridas independientes válidas. Calcular la potencia de las muestras de Glucagón en Unidades USP de rGlucagón/mg, multiplicando el resultado de la potencia relativa por la potencia del ER rGlucagón USP. Cumple con el requisito de identidad biológica si la potencia es no menos de 0,80 Unidades USP de rGlucagón/mg.
REQUISITOS ADICIONALES • ESTÁNDARES DE REFERENCIA
USP (11)
ER Dextrosa USP ER rGlucagón USP
(124) VALORACIONES BIOLÓGICAS DE ERITROPOYETINA INTRODUCCIÓN Este capítulo provee pautas sobre el uso de valoraciones biológicas para medir la actividad biológica de eritropoyetina (EPO, por sus siglas en inglés). Basándose en uno de los enfoques de potencia relativa descritos en el capítulo general Diseño y Desarrollo de Valoraciones Biológicas (1032), la actividad biológica de una preparación de EPO desconocida por lo general se determina mediante comparación con la actividad biológica de un Estándar de Referencia (ER). Para este propósito, se ha desarrolla-
216 (124) Valoraciones Biológicas de Eritropoyetina /Pruebas Biológicas
USP 39
do un ER Eritropoyetina para Valoraciones Biológicas USP. Las valoraciones descritas en el capítulo no son aplicables a formas de EPO modificadas por ingeniería para prolongar su vida media. El ER Eritropoyetina para Valoraciones Biológicas USP se ha calibrado contra el Estándar Internacional para EPO de la Organización Mundial de la Salud (OMS) usando el método de valoración biológica con ratón normocitémico y el método de valoración biológica con ratón policitémico exhipóxico. Por consiguiente, el ER Eritropoyetina para Valoraciones Biológicas USP tiene una medida en unidades asignada en términos de Unidades Internacionales (IU) de EPO conforme a lo definido por la OMS. De estas dos valoraciones biológicas in vivo, el método de valoración biológica con ratón normocitémico es menos complicado y se usa ampliamente para la determinación de la potencia de EPO. La valoración se basa en la medición de la maduración de los reticulocitos estimulados por EPO. Debido a que el ER Eritropoyetina para Valoraciones Biológicas USP se ha calibrado contra el Estándar Internacional para EPO de la OMS mediante una valoración biológica in vivo, se puede usar directamente en el método de valoración biológica con ratón normocitémico para la calibración de cualquier preparación de EPO específica del proceso. Sin embargo, si la intención es usar una valoración biológica in vitro validada para transferir la medida en unidades del ER Eritropoyetina para Valoraciones Biológicas USP a una preparación de EPO específica del proceso, entonces es necesario demostrar que el ER Eritropoyetina para Valoraciones Biológicas USP y la preparación de EPO específica del proceso presentan una relación equivalente entre la potencia in vitro e in vivo. Esto se debe a que la actividad biológica de la EPO presenta una relación compleja entre la estructura y la función. En particular, la relación entre la actividad in vitro e in vivo está inversamente correlacionada con el tipo y el grado de sialilación terminal. Los productos que presentan una alta sialilación tienen un mayor nivel de actividad in vivo; por ende, tienen una relación entre actividad in vitro e in vivo relativamente más baja. Debido a las diferencias en los procesos de fabricación usados en la preparación de EPO, el tipo y el grado de sialilación terminal puede variar entre preparaciones de EPO, incluyendo las preparaciones de EPO que se usan como Estándares de Referencia. Como resultado, el uso de una valoración in vitro para medir la actividad biológica de una preparación de EPO requiere conocer muy bien la relación entre la actividad in vivo e in vitro de la EPO. La mejor manera de lograr dicho conocimiento es comparar la preparación de prueba de EPO con el ER Eritropoyetina para Valoraciones Biológicas USP en la valoración in vivo y en una valoración in vitro específica. El ER Eritropoyetina para Valoraciones Biológicas USP tiene asignada una medida en unidades que representa su actividad en valoraciones in vivo e in vitro. Si las relaciones entre la potencia in vitro e in vivo para el material que se está analizando y el ER Eritropoyetina para Valoraciones Biológicas USP son equivalentes, entonces se puede usar el ER Eritropoyetina para Valoraciones Biológicas USP directamente en la valoración in vitro para calibrar el material que se está analizando. No obstante, si las relaciones no son equivalentes, el material que se está analizando y el ER Eritropoyetina para Valoraciones Biológicas USP tendrán una relación de potencia in vitro e in vivo diferente. Por este motivo el estándar no podrá usarse con su potencia designada en la valoración in vitro. En su lugar, se debe usar esta relación determinada para el material que se está analizando para asignar al ER Eritropoyetina para Valoraciones Biológicas USP una medida en unidades específica para el proceso de valoración in vitro. Posteriormente, el ER Eritropoyetina para Valoraciones Biológicas USP, con sus unidades ajustadas para valoración in vitro, se podrá usar en la valoración in vitro para transferir la medida en unidades del ER Eritropoyetina para Valoraciones Biológicas USP al material que se está analizando.
VALORACIÓN CON RATÓN NORMOCITÉMICO Soluciones Solución A: Disolver 10,75 g de fosfato dibásico de sodio dodecahidrato, 7,6 g de cloruro de sodio y 1Og de albúmina bovina en 1000 mL de agua. Inmediatamente antes de su uso, ajustar con solución de hidróxido de sodio o de ácido fosfórico a un pH de 7,2. Solución estándar 1: Disolver ER Eritropoyetina para Valoraciones Biológicas USP en Solución A hasta una concentración de 80 Ul/ml. Solución estándar 2: Mezclar volúmenes iguales de Solución A y Solución estándar 7. Solución estándar 3: Mezclar volúmenes iguales de Solución A y Solución estándar 2. Solución muestra 1: Preparar la muestra a analizar en Solución A a una concentración de 80 Ul/ml. Solución muestra 2: Mezclar volúmenes iguales de Solución A y Solución muestra 7. Solución muestra 3: Mezclar volúmenes iguales de Solución A y Solución muestra 2. Las concentraciones exactas de cada Solución estándar y Solución muestra pueden requerir ajustes basándose en el intervalo de respuesta en los animales usados. Preparación de los animales: Al inicio del procedimiento de valoración, distribuir de forma aleatoria en seis jaulas ratones de edad y cepa adecuadas (los ratones B6D2F1 de 8 semanas de vida son adecuados). Se recomienda un mínimo de ocho ratones por jaula. Inyectar cada animal por vía subcutánea con 0,5 mL del tratamiento apropiado (una solución por jaula) y colocar al animal en una nueva jaula. Combinar los ratones de tal manera que cada jaula aloje un ratón representativo de cada uno de los seis tratamientos diferentes (cada una de las Soluciones estándar y de las Soluciones muestras; seis ratones por jaula). Análisis: Cuatro días después de las inyecciones, recolectar muestras de sangre de los animales y determinar el número de reticulocitos usando un procedimiento adecuado. Se puede emplear el siguiente método. Puede ser necesario modificar el volumen de sangre, el procedimiento de dilución y el reactivo fluorescente para asegurar el máximo desarrollo y estabilidad de la fluorescencia.
Pruebas Biológicas/ (126) Pruebas de Identidad 217
USP 39
Para solución colorante concentrada, usar una solución de anaranjado de tiazol adecuada para la determinación de reticulocitos. Preparar a una concentración que sea el doble de la necesaria para el análisis. Proceder con los siguientes pasos de dilución. Diluir sangre entera 500 veces en la solución amortiguadora usada para preparar la solución colorante. Diluir esta solución a la mitad en la solución colorante concentrada. Después de teñir durante 3-1 O minutos, determinar el recuento de reticulocitos por microfluorometría en un citómetro de flujo. El porcentaje de reticulocitos se determina usando un histograma biparamétrico: número de células/fluorescencia roja (620 nm). Calcular la potencia usando métodos estadísticos convencionales para valoración de líneas paralelas. Para información adicional, consultar el capítulo general Análisis de Valoraciones Biológicas (1034). Criterios de aceptación: La actividad de cada Solución muestra se compara con la del ER Eritropoyetina para Valoraciones Biológicas USP y se expresa en UI. Los límites de confianza de la potencia estimada (P = 0,95) son no menos de 64% y no más de 156% de la potencia, según se determinó mediante el método provisto anteriormente. La potencia estimada es no menos de 80% y no más de 125% de la potencia declarada.
REQUISITOS ADICIONALES Estándares de Referencia USP (11) ER Eritropoyetina para Valoraciones Biológicas USP
(126) PRUEBAS DE IDENTIDAD BIOLÓGICA DE SOMATROPINA La Somatropina es una hormona proteica que contiene la misma secuencia de aminoácidos que la hormona de crecimiento humana producida por la glándula pituitaria. Se usa un procedimiento cromatográfico fisicoquímico, robusto y preciso en la Valoración para asignar potencia en términos de masa. Ya que la determinación de la identidad biológica sigue siendo necesaria, se presentan a continuación dos procedimientos diferentes: un procedimiento de valoración biológica in vivo basado en el aumento de peso corporal en ratas inducido por somatropina y un enfoque más preciso basado en una línea celular de rata que mide la producción de ATP como un indicador directo del crecimiento celular. [NOTA-La prueba de identidad biológica de somatropina puede realizarse en el fármaco a granel o en el producto farmacéutico.] PROCEDIMIENTO • PRUEBA DE IDENTIDAD BIOLÓGICA IN VIVO
Solución amortiguadora: Bicarbonato de amonio O, 1 M. Ajustar con hidróxido de sodio a un pH de 8,0. Soluciones estándar: 10-1 00 µg/mL de ER Somatropina USP en Solución amortiguadora Soluciones muestra: 10-100 µg/mL de Somatropina en Solución amortiguadora. [NOTA-No agitar mientras se mezcla; agitar por rotación suave.] Control: Solución amortiguadora Animales de prueba: Seleccionar un número apropiado de ratas Sprague Dawley que sean sólo machos o sólo hembras y que hayan sido hipofisectomizadas a los 25-30 días de vida. Después de la hipofisectomía, alimentar las ratas con alimento para ratas y solución de dextrosa al 5% en agua durante al menos 72 horas. Después de 72 horas, alimentar las ratas con alimento para ratas y agua filtrada y desionizada ajustada con ácido clorhídrico 1 N a un pH de 3,0 ± 0,25. Pesar las ratas cuando tengan 37-44 días de vida y conservar únicamente las que estén sanas. Volver a pesar las ratas escogidas 7 días después y utilizar sólo aquellas que estén sanas y cuyo peso no haya aumentado o disminuido más del 10% durante los 7 días anteriores. Análisis: Dividir aleatoriamente las ratas en grupos de control, grupos estándar y grupos de prueba, cada grupo debe contener aproximadamente 1 O ratas. Cada día durante 1O días, inyectar por vía subcutánea O, 1 mL de Control, Soluciones estándar y Soluciones muestra a los grupos de control, estándar y de prueba, respectivamente. Registrar el peso corporal de cada animal al inico de la prueba y aproximadamente 18 horas después de la 1 Oª inyección. Cálculos: Determinar el cambio en el peso corporal de cada rata durante los 1 O días y calcular la potencia de la Solución muestra con respecto a la de la Solución estándar usando un análisis estadístico apropiado. Calcular la potencia media en Unidades USP de Somatropina/mg y, usando métodos estadísticos apropiados, calcular la amplitud, L, de un intervalo de confianza de 95% para el logaritmo en base 1O estimado de la potencia relativa. Si Les más de 0,40, repetir la prueba hasta que los resultados de dos o más pruebas, combinados por métodos estadísticos apropiados, produzcan un valor L de no más de 0,40, correspondiente a límites de confianza del 63%-158% de la potencia calculada. Criterios de aceptación: No menos de 2 Unidades USP de Somatropina/mg, cuando Les no más de 0,40. • PRUEBA DE IDENTIDAD BIOLÓGICA IN VITRO BASADA EN CÉLULAS
218 (126) Pruebas de Identidad / Pruebas Biológicas
USP 39
Medio A: Medio de Fischer1 que contenga suero fetal bovino al 10% inactivado por calor2 , suero de caballo al 10% inactivado por calor 3, bicarbonato de sodio al 1% y 2-mercaptoetanol 0,05 mM. Esterilizar por filtración. [NOTA-Almacenar durante un máximo de 2 semanas a 2º-8º.] Medio B: Medio de Fischer que contenga suero de caballo al 1%, bicarbonato de sodio al 1% y 2-mercaptoetanol 0,05 mM. Esterilizar por filtración. [NOTA-Almacenar durante un máximo de 2 semanas a 2º-8º.] Solución salina amortiguada con fosfatos: 4 Solución salina amortiguada con fosfatos exenta de calcio y magnesio que contenga fosfato monobásico de potasio 1,5 mM, cloruro de sodio 155 mM y fosfato dibásico de sodio 3 mM, de pH 7,27,4. Preparación del cultivo celular: Preparar cultivos de células Nb2- l l 5 en suspensión en Medio A en una incubadora humidificada a 37º que contenga dióxido de carbono al 5%. Las células deben someterse a pasajes dos veces por semana y volver a sembrarse en Medio A con una densidad de 1 x 105 células/mL durante 2 días, 2 x 104 células/mL durante 3 días y 1 x 104 células/mL durante 4 días. [NOTA-Puede ser necesario adaptar las densidades de siembra cuando los analistas califiquen lotes nuevos de suero fetal bovino y suero de caballo.] En el día de la valoración, recolectar las células de los matraces y centrifugarlas durante 7 minutos a aproximadamente 218 x g para formar un pellet. Desechar el sobrenadante y lavar las células dos veces con Solución salina amortiguada con fosfatos, y luego centrifugar. Resuspender las células en Medio B, contarlas y ajustar la concentración de células a 1 x 105 células/mL con Medio B. A exepción de los pocillos de la primera columna, transferir 50 µL de suspensión de células a cada pocillo de una placa negra para cultivo de tejidos de 96 pocillos con fondo transparente. 6 Pipetear y transferir 50 µL de Medio Bacada pocillo de la primera columna de la placa. [NOTACubrir la placa e incubar a 37° durante un máximo de 1 hora mientras se preparan las Soluciones estándar y las Soluciones de prueba.]
Soluciones estándar: Reconstituir ER Somatropina USP en 1 mL de Solución salina amortiguada con fosfatos y luego diluir adicionalmente este material con Medio B hasta una concentración de 2,0 ng/ml. [NOTA-Usar tubos de ensayo de polipropileno para realizar las diluciones. Se requiere aproximadamente 1 mL de esta solución para cada placa. No usar diluciones de una sola etapa mayores de 1:100 ni transferir volúmenes menores de 40 µL.] Soluciones de prueba: Deben obtenerse dos resultados por cada solución de prueba usando dos preparaciones de somatropina independientes. Reconstitutir dos preparaciones de somatropina independientes en Agua para Inyección hasta una concentración de 5 mg/ml. Preparar las soluciones de prueba diluyendo adicionalmente este material con Medio B hasta una concentración de 2,0 ng/mL. [NOTA-Usar tubos de ensayo de polipropileno para realizar las diluciones. Se requiere aproximadamente 1 mL de esta solución para cada placa. No usar diluciones de una sola etapa mayores de 1:100 ni transferir volúmenes menores de 40 µL.] Una preparación es la Solución de prueba A y la otra es la Solución de prueba B. Solución de control positivo: Comenzando con una concentración madre de 5 mg/mL de ER Somatropina USP reconstituida en Agua para Inyección, diluir con Medio B hasta una concentración de 20 ng/mL. [NOTA-Usar tubos de ensayo de polipropileno para realizar las diluciones. No usar diluciones de una sola etapa mayores de 1:100 ni transferir volúmenes menores de 40 µL.] Procedimiento: Dispensar 100 µL de Medio Ben cada pocillo de una placa transparente de 96 pocillos de fondo redondo/ a exepción de los pocillos de la columna 12 (pocillos A12-Hl 2 =control positivo) y los pocillos A2-A 1O. [NOTA-Por cada placa negra de cultivo de tejidos sembrada con células según se describe en Preparación del cultivo celular, se usa una placa con pocillos de fondo redondo diferente para preparar las diluciones de la Solución estándar y la Solución de prueba.] Luego, dispensar 200 µL de Solución estándar de 2,0 ng/mL en los pocillos A3, A6 y A9 de la placa de dilución. Dispensar 200 µL de Solución de prueba A de 2,0 ng/mL en los pocillos A2, AS y A8 de la placa de dilución. Dispensar 200 µL de Solución de prueba B de 2,0 ng/mL en los pocillos A4, Al y A1O de la placa de dilución. Dispensar 100 µL de Solución de control positivo de 20 ng/mL en la última columna de la placa de dilución (pocillos A 12-Hl 2). Usando una pipeta de 12 canales, realizar en la placa diluciones en serie al medio, aspirando 100 µL de la primera hilera (A2-A 1O), transferir a la segunda hilera y mezclar tres veces. Luego, aspirar 100 µL de la segunda hilera, transferir a la tercera y mezclar tres veces, etc. Repetir este procedimineto a lo largo de toda la placa hasta la hilera H. Desechar los 100 µL aspirados de la última hilera. [NOTA---Los pocillos de la columna 11 (pocillos A11--Hl 1) son controles negativos que contienen 100 µL de Medio B; los pocillos de la columna 1 (pocillos A1-Hl) son blancos.] Comenzando con la concentración más baja y usando una pipeta de 12 canales, transferir 50 µL de cada solución en la placa de dilución al pocillo respectivo de la placa negra de cultivo que contiene las células. [NOTA-Durante la transferencia, sumergir las puntas de la pipeta en la suspensión celular. Esta transferencia produce una dilución adicional 1 :2 de somatropina, o una concentración final de 1,O ng/mL para la dosis más alta agregada a las células y 1O ng/mL para la Solución de control positivo. La Tabla 1 muestrn el diagrama (layout) de la placa ] Después de realizar todas las transferencias, agitar suavemente la placa negra durante 30 segundos y luego incubarla en una incubadora humidificada a 37º que contenga dióxido de carbono al 5% durante 30 ± 2 horas. Luego, agregar 100 µL de solución reconstituida de sustrato
1
Quality Biological, Nº de catálogo 112-032-101 o equivalente. Gibco, Nº de catálogo 10082-147 o equivalente. 3 Gibco, Nº de catálogo 26050-088 o equivalente. 4 Amimed, Nº de catálogo 8-05F291; Gibco, Nº de catálogo 20012-019 o equivalente. 5 HPA Culture Collections o Sigma-Aldrich HPA Culture Collection Nº de catálogo #970411 01 o equivalente. 6 Costar, Nº de catálogo 3904 o equivalente. 7 Placa Greiner Nº 650 160 o equivalente. 2
Pruebas Biológicas/ (129) Anticuerpos Monoclonales Terapéuticos 219
USP 39
luminiscente8 a todos los pocillos. Incubar las placas durante 15 minutos a temperatura ambiente mientras se agitan suavemente en un agitador para placas apropiado protegidas de la luz. Incubar las placas sin agitación durante 15 minutos adicionales a temperatura ambiente protegidas de la luz. Leer la luminiscencia de los pocillos de las placas en un lector de placas adecuado con modo de detección de luminiscencia. Tabla 1. Representacíon Esquemática de la Placa de Valoración Final !
[
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A
BL
A,#1
St,#1
B,#1
A,#í
St,#1
B,#1
A,#1
St,#1
B,#1
NEG
POS
B
BL
A,#2
St,#2
B,#2
A,#2
St,#2
B,#2
A,#2
St,#2
B,#2
NEG
POS
C
BL
A,#3
St,#3
B,#3
A,#3
St,#3
B,#3
A,#3
St,#3
B,#3
NEG
POS
2
-¡;--- --BL.TA~4 __s_t_~,#_4_--;___B~,#_4_+-__,l\~~-~--t,__#4_+--_B,_#_4--<__A~,#-4_-+-_st_,#_4_,___B~,_#4_-+-_N_EG_+--_P_O_s--< --E- -¡-Bl. r A:#5-- St,#5 B,#5 A,#5 St,#5 B,#5 A,#5 St,#5 B,#5 NEG POS !
F
BL
A,#5
St,#6
B,#6
A,#6
St,#6
B,#6
A,#6
St,#6
B,#6
NEG
POS
G
BL
A,#7
St,#7
B,#7
A,#7
St,#7
B,#7
A,#7
St,#7
B,#7
NEG
POS
H
BL
A,#8
St,#8
B,#8
A,#8
St,#8
B,#8
A,#8
St,#8
B,#8
NEG
POS
LEYENDA: BL = Blanco: sin >ornatropina, sin células. A= Serie de diluciones de la Solución de prueba A (Concentración inicial de 1,0 ng/ml). St =Serie de diluciones de la Solución estándar (Concentración inicial de 1,0 ng/rnl). B =Serie de diluciones de la Solución de prueba B (Concentración inicial de 1,0 ng/ml). NEG =Control negativo: sin somatropina, con células. POS = Solución de control positivo: concentración máxima de somatropina (1 O ng/ml).
Cálculos: Debe usarse un mínimo de dos preparaciones de Solución de prueba independientes para cada muestra de prueba. Las Soluciones de prueba y las Soluciones estándar se normalizan por el contenido proteico antes de calcular la potencia relativa. [NOTA-Un mg de somatropina anhidra equivale a 3,0 Unidades USP de Somatropina.] Se omiten los valores aberrantes debidos a la técnica (pero no más de 4/curva) y luego se usa el mismo número de respuestas a la dosis de la Solución estándar y la Solución de prueba, incluyendo la respuesta al 50% (EC 50 ) del estándar y la muestra dentro de este intervalo, para calcular la potencia relativa de cada muestra de somatropina usando métodos estadísticos de análisis de líneas paralelas. Para cada Solución de prueba individual comparada con la Solución estándar, los resultados de las pruebas estadísticas de linealidad, pendiente y paralelismo deben pasar al nivel de 95%. El límite de confianza de cada potencia relativa calculada debe estar dentro del 75%-133%. La potencia relativa de una Solución de prueba debe estar dentro del intervalo validado para la valoración (potencia relativa de 50%-200%) de las Soluciones estándar. El logaritmo de la potencia relativa media no ponderada se calcula a partir de muestras individuales válidas y posteriormente se calcula la potencia en Unidades USP/mg relativas a ER Somatropina USP. Criterios de aptitud del sistema: La relación señal-ruido entre la señal de quimioluminiscencia media de la Solución de control positivo y la señal de quimioluminiscencia media de los pocillos de control negativo debe ser no menos de 3. No se pueden omitir más de 4 valores aberrantes debidos a la técnica por curva estándar. Debe rechazarse toda placa que no cumpla con uno o más de estos criterios y el procedimiento deberá repetirse. Criterios de aceptación: No menos de 2 Unidades USP de Somatropina/mg •ESTÁNDARES DE REFERENCIA USP (11) ER Somatropina USP
Agregar lo siguiente:
.. (129) PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS PARA ANTICUERPOS MONOCLONALES RECOMBINANTES DE USO TERAPÉUTICO INTRODUCCIÓN Este capítulo provee procedimientos analíticos para anticuerpos monoclonales murinos, quiméricos y ;1umanizados de isotipo lgG y subtipos (p.ej., lgGl e lgG2). Las subclases presentan diferencias en la secuencia de aminoácidos j en el número de enlaces disulfuro y en algunos casos requieren análisis específicos para subclases. Este capítulo se aplica a anticuerpos monoclonales para uso terapéutico y profiláctico y para uso en diagnósticos in vivo. Este capítulo no es aplicable a anticuerpos monoclonales usados como reactivos en la fabricación de productos medicinales cuyos requisitos aplicables son determinados por la agencia reglamentaría apropiada. Los anticuerpos polidonales que ocurren naturalmente en suero o plasma pueden unirse a muchas dianas diferentes como parte del sistema inmune. Por el contrario, los anticuerpos monoclonales terapéuticos para uso humano son preparaciones de 8
CellTiterGlo Luminescence Kit, p.ej., Promega Nº G7573 o equivalente.
220 (129) Anticuerpos Monoclonales Terapéuticos/ Pruebas Biológicas
USP 39
USP 39
Pruebas Biológicas/ (129) Anticuerpos Monoclonales Terapéuticos 221
Volumen de inyección: 20 µL Tiempo de corrida: 30 min Aptitud del sistema Muestra: Solución de aptitud del sistema [NOTA-Los tiempos de retención aproximados para polímero, dímero, monórnero y especies de bajo peso molecular son 12; 15; 18 y 22 minutos, respectivamente.] Requisitos de aptitud Cromatograma: El cromatograma de la Solución de aptitud del sistema es consistente con el cromatograma típico según se ilustra en el Certificado USP para el ER Aptitud del Sistema de lgG Monoclonal USP. Similitud de los cromatogramas: Los perfiles cromatográficos de las inyecciones de Solución de aptitud del sistema que se realizan antes y después de las inyecciones de las Soluciones muestra en un conjunto de muestra son uniformes entre sí y con el perfil cromatográfico típico según se ilustra en el Certificado USP para el ER Aptitud del sistema de lgG Monoclonal USP. Todos los picos nombrados en el cromatograma típico deben estar presentes, estar bien resueltos y en el mismo orden de elución que en los cromatogramas de la Solución de aptitud del sistema. Criterios cuantitativos: Las inyecciones de la Solución de aptitud del sistema que se realizan antes y después que las de la muestras, (Bracketing), deben cumplir los siguientes criterios cuantitativos: El valor porcentual del área del pico de las especies de alto peso molecular en la Solución de aptitud del sistema debe ser 0,4%-0,67%. El valor porcentual del área del pico principal en la Solución de aptitud del sistema debe ser 99, 1 %-99,6%. El valor porcentual del área del pico de las especies de bajo peso molecular en la Solución de aptitud del sistema debe ser no más de 0,2%. Análisis Muestras: Blanco, Solución de aptitud del sistema y Solución muestra Como mínimo, se deben flanquear (bracket) las inyecciones de la Solución muestra con inyecciones individuales de la Solución de aptitud del sistema. Se debe incluir una inyección de un Blanco como la inyección final antes de la inyección de la
Solución de aptitud del sistema. Usando un integrador electrónico adecuado o un sistema computarizado, analizar las inyecciones de Solución de aptitud del sistema que se realizan antes y después de la inyección de la solución de muestra (Bracketing). Excluir de la integración cualquier pico que esté presente en el Blanco. Los picos relacionados con proteínas que eluyen antes que el pico principal se clasifican como especies de alto peso molecular; aquéllos que eluyen después del pico principal se clasifi-
Cálculos:
can como especies de bajo peso molecular. Informar el valor porcentual de las áreas de los picos para las especies de alto peso molecular, el pico principal, y las especies de bajo peso molecular. • ELECTROFORESIS CAPILAR CON SOS (REDUCTORA Y NO REDUCTORA) La electroforesis capilar con dodecil sulfato de sodio (CE-SOS) es un método sensible y analítico para la estimación cuantitativa de impurezas relacionadas con el producto tales como moléculas no glicosiladas, medio anticuerpos y fragmentos, y es, por consiguiente, útil también como una valoración indicadora de estabilidad. Después de la desnaturalización con SDS, el método permite el análisis del anticuerpo completo en condiciones no reductoras, y el análisis de las cadenas livianas y de las cadenas pesadas (LC y HC, respectivamente) en condiciones reductoras. [NOTA-Pueden ser necesarias pequeñas variaciones en la preparación de la muestra dependiendo de la estabilidad del anticuerpo individual. Si la incubación durante 15 minutos a 70º conlleva a la fragmentación o escisión de enlaces disulfuro para una muestra de anticuerpo particular, ajustar el tiempo de incubación de manera correspondiente.] Solución amortiguadora de muestra de SOS: Preparar una solución que contenga clorhidrato de tris(hidroximetil)aminometano (tris-HCI) 100 mM,de pH8,95 ± 0,05 y SDS al 1% (p/p). Solución amortiguadora de gel de SOS: Solución amortiguadora de pH 8,0 que contenga SDS al 0,2% (p/p) y un polímero hidrófilo apropiado que actúe como tamiz molecular. 1 Solución de alquilación: Yodoacetamida 250 mM en agua, preparada inmediatamente antes de su uso Solución de aptitud del sistema: Reconstituir 1 vial de ER Aptitud del sistema de lgG Monoclonal USP con 0,5 ml de Agua para Inyección a una concentración final de 4 mg/ml. Solución de estándar interno: 5 mg/mL de estándar interno de 1 OkDa 2 en agua que contenga SDS al 0,5% (p/p) y azida sódica al 0,2% (p/v). Solución de aptitud det sistema no reducida: Mezclar 25 µL de Solución de aptitud del sistema con 4 µL de Solución de estándar interno. Mezclar 66 µL de Solucíón amortiguadora de muestra de SOS con 5 µL de Solución de a/qui/ación. Agregar la mezcla de Solución amortiguadora de muestra de SDS y Solución de a/qui/ación a fa mezcla de Solución de aptitud del sistema y Solución de estándar interno. Mezclar bien y calentar la mezcla a 70º durante 15 minutos. Dejar que se enfríe durante 3 minutos a temperatura ambiente, centrifugar a 300 x g durante 1 minuto y transferir 100 µL a viales para muestreador automático. Solución de aptitud del sistema reducida: Mezclar 25 µL de Solución de aptitud del sistema con 66 µL de Solución amortiguadora de muestra de SOS. Agregar 4 µL de Solución de estándar interno y 5 µL de (J-mercaptoetanol sin diluir. Mezclar 1 2
Disponible en Beckman Coulter como un componente del kit de prueba, número de catálogo A10663, o un equivalente adecuado. Disponible en Beckman Coulter como un componente del kit de prueba, número de catálogo A10663, o un equivalente adecuado.
222 (129) Anticuerpos Monoclonales Terapéuticos/ Pruebas Biológicas
USP 39
bien y calentar la mezcla a 70º durante 15 minutos. Dejar que se enfríe durante 3 minutos a temperatura ambiehte, centrifugar a 300 x g durante 1 minuto y transferir 100 µLa viales para muestreador automático. Solución blanco: Mezclar 45 µL de agua con 50 µL de Solución amortiguadora de muestra de SOS. Agregar 4 µL de Solución de estándar interno y 5 µL de f3 -mercaptoetanol sin diluir para condiciones reductoras o 5 µL.de Solución de a/qui/ación para condiciones no reductoras. Mezclar bien y calentar la mezcla a 70º durante 15 minutos. Dejar que se enfríe durante· J minutos a temperatura ambiente, centrifugar a 300 x g durante 1 minuto y transferir 100 µLa viales para muestreador automático. Solución muestra no reducida: Diluir 100 µg de la muestra que se va a analizar con 50-95 µL de la Solución amortiguadora de muestra SOS para obtener un volumen final de 95 µL. Agregar 4 µL de Solución de estándarinterno y 5 µL de Solución de alquilación. Mezclar bien y calentar la mezcla a 70º durante 15 minutos. Dejar que se enfríe durante 3 minutos a temperatura ambiente, centrifugar a 3QO x g durante 1 minuto y transferir 100 µLa viales para muestreador automático. Sofución mue$tra reducida: Diluir TOO µg de la muestra que se va a analizar con 50-95 µL de Solución amortiguadora de muestra de SOS para obtener un volumen final de 95 µL. Agregar 4 µL de Solución de estándar interno y 5 µl de /J-mercaptoetanol sin diluir. Mezclar bien y calentar la mezcla a 70º durante 15 minutos. Dejar que se enfríe dúrante 3 minutos a temperatura ambiente, centrifugar a 300 x g durante 1 minuto y transferir 100 µLa viales para muestreador automático. Condiciones instrumentales Modo: CE-SDS Detector: UV o arreglo de diodos 220 nm Capilar: Capílar de sílice fundida (diámetro interno de 50 µm) cortado hasta una longitud total dt: 30 cm con una longitud efectiva de 20 cm. 3 Se requieren los siguientes pasos de preacondicionamiento y prellenado entre cada corrida. Preacondicionamiento del capilar: Enjuagar durante 3 minutos a 70 psi con hidróxido de sodio 0, 1 N seguido de ácido clorhídrico 0, 1 N durante 1 minuto a 70 psi y agua durante 1 minuto a 70 psi. Prellenado del capilar: Enjuagar durante 1O minutos a 70 psi con Solución amortíguadora de gel de SOS. Inyección de la muestra: Inyección electrocinética, polaridad inversa de 5,0 kV durante 20 segundos Separación por voltaje Condiciones no reductoras: Tiempo de corrida de 40 minutos a 15 kV, polaridad inversa Condiciones reductoras: Tiempo de corrida de 40 minutos a 15 kV, polaridad inversa Temperaturas Almacenamiento de la muestra: Aproximadamente 25º Capilar: Aproximadamente 25º Aptitud del sistema Requisitos de aptitud para condiciones reductoras Muestra: Solución de aptitud del sistema reducida Electroferograma: El electroferograma de la Solución de aptitud del sistema reducida es consistentecon el electroferograma típico ilustrado en el Certificado USP para el ER Aptitud del Sistema de lgG Monoclonal USP. Resolución: El pico principal de la cadena pesada y el pico de la cadena pesada no glicosilada pueden identificarse claramente. La resolución entre la cadena pesada no glicosiladay la cadena pesada intacta es no menos de 1,2. Cociente entre la cadena no glicosilada y el total de los picos de la cadena pesada: Usar las áreas de los picos corregidos por el tiempo (ver Electroforesís Capilar (1053), Cuantificación, que puede ser un recurso útil, mas no obligatorio) para el cálculo. Calcular el cociente entre la cadena no glicosilada y el total de los picos de: la cadena pesada dividiendo la cantidad relativa de cadena pesada no glicosilada por la suma de todos los picos de la cadena pesada y multiplicar por 1OO. El cociente entre la cadena no glicosilada y el total de los picos de la caqena pesada en la Solución de aptitud del sistema debe estar dentro de los límites de 0,75o/o-1,34%. Requisitos de aptitud para condiciones no reductoras Muestra: Solución de aptitud del sistema no reducida Electroferograma: El electroferograrna de la ·solución de aptitud del sistema no reducida es consistente con elelectroferograma típico ilustrado en el Certificado USP para el ER Aptitud del Sistema de lgG Monoclonal USP. Resolución: El pico principal de lgG puede identificarse claramente. La resolución entre el pico principal de lgG y el Fragmento 1 (Fl) es no menos de 1,3. Cantidad del pico principal: Calcular 1a·cantidad relativa del pico principal dividiendo el área del pico principal de lgG (corregido por el tiempo) por la suma de todas las áreas de los picos (corregidos por el tiempo), excluyendo los picos del estándar interno y todos los picos del sistema y multiplicar por 100. La cantidad relativa del pico principal de lgG de la Solucióh de aptítud del sístema debe estar dentro de los límites de 61,4%-86,4%. Desviación estándar relativa: No más de 2% para la migración del estándar interno en la Solución blanco de los extremos (bracketing). No se detecta ningún otro pico que migre después del estándar interno. Análisis Muestras: Solución blanco, Solución de aptítud del :sístema y Solución· muestra [NOTA~Basándose en los requisitos del instrumento, el campo aplicado a través del capilar y las condiciones parala inyección de la muestra pueden ajustarse para lograr la Aptitud del sistema.] Aplicar una potencia de campo de 500 V/cm (polari3
Beckman Coulter, número de catálogo 338472 o equivalente.
USP 39
Pruebas Biológicas/ (129) Anticuerpos Monoclonales Terapéuticos 223
dad inversa) durante 40 minutos, usando la Solución amortiguadora de gel de SOS como electrólito en ambos reservorios de solución amortiguadora. Someter las muestras a electroforesis, usando una polaridad inversa de 20 segundos y una inyección electrocinética a 5,0 kV, en et extremo anódico del capilar y registrar los electroferogramas a 220 nm. Enjuagar durante 3 minutos a 70 psi con hidróxido de sodio 0, 1 N seguido de ácido clorhídrico O, 1 N durante 1 minuto a 70 psi y agua durante 1 minuto a 70 psi. Inyectar al menos por duplicado. Calcular las áreas de los picos corregidos por el tiempo de todos los picos que migran después del pico del estándar interno. Condiciones reductoras: Calcular la cantidad relativa de los picos que pertenecen al anticuerpo monoclonal, presente en el producto, dividiendo la suma de las áreas de los picos (corregidos por el tiempo) de la cadena pesada, de la cadena pesada no glicosilada y de la cadena liviana por ta suma de todas las áreas de los picos (cori:egidos por el tiempo) para los picos que aparecen después del pico del estándar interno y multiplicar por 1OO. Condiciones no reductoras: Calcular la cantidad relativa del pico del producto dividiendo el área del pico princ;,ipal de lgG (corregido por el tiempo) por la suma de todas las áreas de los picos (corregidos por el tiempo) que aparecen después del pico del estándar interno y multiplicar por 1OO. • ANÁLISIS DE ÜLIGOSACÁRIDOS-ANÁLISIS DE ÜLIGOSACÁRIDOS N-LIGADOS DE ANTICUERPOS MONOCLONALES
La inclusión de análisis de oligosacáridos en una especificación para un fármaco de anticuerpo monoclonal debe evaluarse usando enfoques científicos y basados en riesgos, y deben definirse para cada producto específico. Si es aplicable, se puede emplear uno o más de los siguientes enfoques analíticos para determinar el perfil de oligosacáridos o la cuantifü::ación de estructuras individuales. Se pueden usar otros métodos validados que son adecuados para la determinación de glicosi· lación N- ligada usando diferentes modos de separación, marcado o detección. [NOTA~Para anticuerpos monoclonales con oligosacáridos N-ligados en los dominios Fe y Fab, se pueden usar procedimientos adicionales de preparación de la muestra (p.ej., tratamiento con la enzima papaína) para separar los dominios antes de los análisis de modo que se pueda obtener información en los sitios de glicosilación individuales. Todos los pasos adicionales de preparación de la muestra para el método requieren validación.] [NOTA-Se pueden definir criterios de aceptación numéricos para estructuras de glicanos individuales. Si es aplicable, los criterios de aceptación deben derivarse de información específica del producto teniendo en cuenta un rango adecu.ado de datos históricos de partida.] Método A: Electroforesis capilar con detección de fluorescencia inducida por láser Solución amortiguadora de corrida: Preparar trietanolamina (TEA) 100 mM y glicerol al 10% a un pHde 7,5 disolviendo 1,492 g de TEA y 1Og de glicerol en 80 mL de agua. Ajustar con ácido clorhídrico 1. N a un pH de 7,5, y diluir con agua hasta un volumen final de 100 ml. Solución amortiguadora de muestra: Diluir 1 ml de Solución amortiguadora de corrida con 9 ml de ag1.¡a. Solución amortiguadora de reacción enzimática: Preparar fosfato de sodio 50 mM, pH 7,5. Reactivo de marcación con APTS: Disolver 5 mg de 8-aminopireno-1, 3,6-trisu1fonato (APTS) en 48 µl de ácido acético al 15% y mezclar. Solución muestra: Agregar 2 µL de N-glicosidasa F peptídica (PNGasa F, por sus siglas en inglés) (5 unidades/ml) a 50 µg de muestra y ajustar con Solución amortiguadora de reacción enzimática a un volumen de 50 µL [NOTA....:..La definición de unidad para PNGasa F puede diferir entre fuentes comerciales. Puede ser necesario determinar de forma experimental la cantidad apropiada de PNGasa F requerida para la liberación completa de oligosacáridos N-ligados en la muestra.] Incubar a 37° durante 18 horas. Separar los oligosacáridos liberados mediante centrifugación usando una celda de ultrafiltración centrífuga con membrana con un límite de corte de peso molecular de 10 000. Secar los oligosacáridos libérados en una centrífuga evaporadora con vacío. Agregar 2 µL de Reactivo de marcación con APTS y 2 µl de cianoborohidruro de sodio 1 Malos oligosacáridos secos. Incubar a 55º durante 90 minutos. Agregar 46 µl de agua para detener la reacción y mezclar. Agregar 5 µL de muestra marcada con APTS a 95 µL de Solución amortiguadora de muestra. Solución de aptitud del sistema: Resuspender cada uno de los estándares de glicano adecuados (1 O µg) en 50 µL de agua y mezclar usando un mezclador de vórtice. Agregar 5 µL de un estándar de glicano adecuado (1 µg) a un tubo de microcentrífuga. Secar el estándar de glicano usando una centrífuga evaporadora con vacío a temperatura ambiente. Agregar 2 µL de cianoborohidruro de sodio a cada estándar. Agregar 2 µl de Reactivo de marcación con APTS a cada estándar. Mezclar los estándares usando un mezclador de vórtice y centrifugar brevemente para que el líquido reposé antes de la incubación a 55º durante 90 minutos. Detener la reacción agregando 46 µL de agua a cada estándar. los estándares pueden almacenarse a -20º hasta 5 semanas. Condiciones instrumentales Modo: Electroforesis Capilar Detector: Detector de fluorescencia inducida por láser (longitud de onda de exeitación 488 .nm; longitud de ohd.a de emisión de 520 nm) Capilar: Capilar de sílice fundida sin recubrimiento con un diámetro interno de 50 µm y una longitud total de S~ cm. y una longitud de separación de 40 cm Inyección de la muestra: Inyección hidrodinámica de 1O segundos Voltaje de separación: 22kV durante 50 minutos Muestras: Solución muestra y Solución de aptitud del sistema
USP 39
224 (129) Anticuerpos Monoclonales Terapéuticos/ Pruebas Biológicas
Análisis: Integrar los picos en el electroferograma resultante e informar los porcentajes relativos de las áreas de los picos (corregidos por el tiempo) de las estructuras de glicano principales pertinentes al producto. Se puede realizar una comp~racíón con el estándar de referencia adecuado específico .del producto. Método 8: Cromatografía de líquidos con detección de fluorescencia Solución amortiguadora de reacción enzimática: Preparar fosfato de sodio 100 mM con un pH de 7,5. Sofución amort1guadora de marcación: Preparar soluciones de acetato de sodio trihidrato al 8% (p/v) y de ácido bórico al 4% (p/v) en metano! disolviendo 800 mg de acetato de sodio trihidrato y 400 mg de ácido bórico en 1O mL de metano!. Solúción reactivo de marcación: Preparar una solución madre de ácido antranílico (2-M) de l 00 mg/ml en Solución amortiguadora de marcación. Mezclar con un volumen igual de cianoborohídruro de sodio 1 M en metano! para preparar uná Sofución reactivo de marcacíón final que contenga 50 mg/mL de 2-M y danoborohidruro de sodio 0,5 M. [NOTAMantener el reactivo de marcación protegido de la luz.] Sofución A; Preparar formiato de amonio 50 mM, pH 4,4. Solución B: Acetonitrilo Fase móvil: Ver la Tabla 1. Tabla 1 Solución A
SoluciónB
(%)
(%)
o,o
32,S
67,5
48,0
42,5
57,5
49,0
10.0
53,0
100 32,5
o o 67,5
32,5
67,5
Tiempo (rnln)
54,0 60,0
Preparación. de la muestra: Transferir 80 µg de la muestra de prueba a un tubo de microcentrífuga. Agregar 3 µL de l>NGasa F (2,5 unidades/ml). [NOTA-La definición de unidad para PNGasa F puede diferir entre fuentes comerciales. Puede ser necesario determinar experimentalmente la cantidad apropiada de PNGasa f requerida para la liberación completa de Qligosacáridos N-ligadosen .la muestra.] Agregar 14 µL de la So/f.!ción amortiguadora de reacción enzimqtica. Agregar agua hasta 70 µL c;lel.volumen tota!.einq1bar a 37° durante 18 h()ras. Agregar 7.0 µL de Solución reactivo de marcacíón recientemente preparada e incubar a 70º durante 2 horas en una campana de extracción, Dejar que se enfríe y agregar 60 µL de metano! al 50% a cada muestra. Mezclar y luego centrifugar.. Retirar 140 µl del sobrenadante y transferirlos a un tubo de microcentrífuga. Agregar 500 µLde acetonttrilo al tubo que contiene el sobrenadante. Cargar la muestra en un cartucho de extracción en fase sólida para interacció.n hidrofílica para eliminar el exceso de reactivo de marcado. Lavar el cartucho con .acetonitrilo al 95% (aproximadamente 1O ml). Eluir los glicanos marcados del cartucho con 0,5 ml de acetronitrilo al .20%. Diluir el eluato 1:1 con acetonitrilo, Sistema cromatográfico (Ver .Cromatografía {62l), Aptitud del Sistema.) Moqo: HPLC: Columnf:l.: 416 mm x 15 cm; relleno L68 de 3 µm Detectc;>r: Fluorescencia (longitud de onda de. excitación 360 nm; longitud de onda de emisión 420 nm) Temperatura de la co.lumna: Mantener la columna a 30º. Vel9cidad de flujo; 0,8 mL/min Volumen de inyección: 50 µl., Análisis Muestra: Preparación de la muestra Integrar los picos en e.I cromatograma resultante e informar los porcentajes relativos de las áreas de los picos de los glica11os principales pertinentes al producto. Se puede realizar una comparación con el estándar de referencia adecuado espec(fko del producto . • ANÁLISIS QE OLIGOSACÁR!DOS-J\NÁLISIS DE ÁctDO SIAuco [NOTA-Puede ser necesario modificar el intervalo de la curva estándar o de la masa de la muestra de prueba dependiendo del contenido de ácido siálico del anticuerpo monoclonal.) Solución A: Preparar hidróxido de sodio 1 00 mM diluyendo 10,4 mL de una solución de hidróxido de sodio al 50% (p/p) en 2Jitros de agua. [NOTA-Usar agua de alta cali<::lad y alta resistividad (18 MQ-cm o mejor) que contiene la menor cantidad de oxígeno disuelto posible.] Solución 6: Preparar una solución que contenga hidróxido de sodio 100 mM y acetato de sodio 1 M agregando 82,0 g de acetato de sodio a 800 mL de agua. Agregar 5,2 ml de hidróxido de sodio al 50% (p/p) y diluir con agua hasta un volumen final de 1000 ml. Fase móvit: Ver la Tabla 2.
USP 39
Pruebas Biológicas/ (129) Anticuerpos Monoclonales Terapéuticos 225
Tabla<2 Tiempo (min)
S<>lucJóo.A
$oluciónB
(%)
0,0
93
(%) 7
10,0
70
11,0
i'O
12,0
93
15,0
93
30 30 7 7
Preparar soluciof\es 0;2 mM de ER Ácido N-Acetilneuramínico USP (NeuAc)y ERÁd¡¡jq NGlicolilneuramínico USP (NeuGc) en solución amortiguadora de acetato de sodio 20 mM, pH 5,2. Oiluir un volumen apropiado de esta solución con solución amortiguadora de acetato de sodio 20 mM, pH 5,2,hasta obtener una 5oluci6n .madre del estándar 0,02 mM. Solución madre del estándar interno: Preparar una sol11ción 0,1 mM de ácido3~desoxi-o-glicero-o-galacto-2-nonulosóni~ co (KDN) en soluciónamortiguadoráde acetatode sodk>20 mM, ajustada a 11npHdeS;2; Soluciones estándar: Preparar según se indica en la Tabla 3. Solución madre del estándar:
Tabla3
Concentración
V
Volumen de Solución Amortiguadora de Acetat(! de Sodio 20 mM, ptl $,;l. (µL)
Volumen de Solución Mad.-e de1I E.stáJldar Interno (µL)
Estándar
(µM)
1
.10
250
235
1.5
2
5
125
360
15
3
4
100
385
4
2
50
435
l.5 15
5
1
25
460
15
6
0,4
10
475
15
Preparar soll.1ciones 3 µM de NeuAc, NeuGc y KDN en solución amortiguadora de aceta.; to de sodio 20 mM, ajustadaa un pH de 5,2. Almacenar la Solución.de aptitu(./ delsistema a ~70º, Solución muestra: Pipetear y transferir un volumen de muestra de pnJeba equivalente a .015 llJg a un tubq de rriiq:oq.'ntrí: fuga. Díluir con solución amortiguadora de acetato de sodio 2Q.mM 1 pH5,21 hasta unvplurrien total de475µL. Co1:1firrr!~t el pH con una tira de prueba y agregar10 µLdeneuraminidasade lOmi.lb.1nidades/µL lncubardurante5horas aJ7~. Agregar 15 µL de Solución madre del estr:Jndar interno. Mezclar el). un mel;clador de .vórticfil ytransferir la muestra ¡;¡·un vial para muestreador automático.[NorA_,.Puede ser necesario unlígero ajuste en la preparación de.lamu~stra depel1li:liehdo de la muestra de prueba y la calidad de la enzima. Ajustar el tiempo de incubación de manera correspondiente.] Solución de aptitud del. sistema:
Sistema cromatográfico
(yer Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.) Modo: HPLC Detector: Detector amperométrico integrado con electrodo Columna: 4 mm x 25 cm; relleno L46 de 1 O µm Velocidad de flujo: 1 ml/min Volumen de inyección: 50 µL
qe oro
Usar la siguiente forma de onda para el detector electroquímico (ver la Tabla 4). Tabla4
Análisis Muestras:
Tle1mpo
Potencial
(s)
(V)
0,00
+0,10
-
0,20
+0,10
Inicio
ll'lte1gración
0,40
+O, 1O
Flha.I
0,41
-2,00
0,42
-2,00
-
0,43
+0,60
0,44
-0,10
0,50
-0,10
Soluciones estándar, Solución de aptitud del sistema y Solución mL1estra
-
226 (129) Anticuerpos Monoclonales Terapéuticos/ Pruebas Biológicas
USP 39
(130) ATRIBUTOS DE CALIDAD DE LA PROTEÍNA A INTRODUCCIÓN La Proteína A se acopla a un soporte de resina con el fin de crear medios cromatográficos de afinidad con la proteína A, usados comúnmente en la fabricación de anticuerpos monoclonales terapéuticos recombinantes. La proteína A natural se obtiene del Staphylococcus aureus y contiene cinco regiones homólogas de unión a anticuerpos y una región e-terminal de unión a la pared celular. Además de la proteína A de origen natural, existe en el mercado proteína A recombinante producida en Escherichia coli, así como varias versiones de la proteína modificadas por ingeniería, también fabricadas en forma recombinante. Cuando se inmoviliza sobre una columna, la proteína A proporciona un método altamente eficiente y robusto para purificar anticuerpos en diversas escalas. Sin embargo, la proteína A inmovilizada en la columna (ligando de proteína A) puede también coeluir con el anticuerpo durante la purificación, un efecto conocido a menudo como leaching de la proteína A. Esta tendencia aumenta a medida que envejece el medio cromatográfico. Las versiones de la proteína A modificadas por ingeniería podrían mejorar la tolerancia del medio al pH, pero no eliminan el leaching. La expectativa reglamentaria actual se centra en que la proteína A coeluida se elimine durante la purificación de los anticuerpos para uso humano y los procesos de fabricación se validen de acuerdo con ello. Generalmente, durante el desarrollo y validación del proceso se utiliza un Enzimoinmunoensayo (ELISA) para asegurar la eliminación eficiente de la proteína A residual durante las etapas del proceso posteriores a la cromatografía de afinidad con la proteína A. Adicionalmente, el fabricante deberá poseer un claro conocimiento y documentación sobre la calidad de la resina y el ligando, mediante la calificación de las materias primas y estudios de vida útil de la columna. El Capítulo General (130) describe los atributos de calidad de los ligandos de proteína A que se usan en los medios cromatográficos para la fabricación de anticuerpos monoclonales terapéuticos: Proteína A; rProteína A; rProteína A, C-Cys; rProteína A, B4, C-Cys.
PROTEÍNA A C199sH 3163N s97Ü 697S3
46760 Secuencia N-terminal AQHDEA Secuencia C-terminal IMDNK La Proteína A se obtiene del Staphylococcus aureus. La estructura se compone de una única cadena de polipéptidos que contiene cuatro dominios de unión a lgG. Con excepción de lgG 3, todas las demás lgG humanas se unen a la proteína A. Cada molécula de Proteína A es capaz de unirse a dos moléculas de lgG. Se fabrica como una solución a granel con una concentración mayor de 20 mg de proteína A por mL y una potencia de unión a lgG mayor de 95%. Dado que la Proteína A se usa como un material auxiliar en la fabricación de fármacos terapéuticos recombinantes, los requisitos regulatorios difieren de los de productos farmacéuticos terapéuticos. Envasado y almacenamiento-Almacenar en envases cerrados a la temperatura indicada en la etiqueta. Etiquetado-Conservar en envases sellados y almacenar a una temperatura de -20º o menor. Estándares de Referencia USP (11 )-ER Endotoxina USP. ER Proteína A USP. IdentificaciónA: SDS-PAGE-Cumple con los requisitos de la prueba A de Identificación en rProteína A usando ER Proteína A USP. B: Unión a lgG-Cumple con los requisitos de la prueba B de Identificación en rProteína A usando ER Proteína A USP. Pruebas de recuento microbiano (61) y Pruebas de microorganismos específicos (62)-EI recuento total de microorganismos aerobios no excede de 100 ufc por mL y el recuento total combinado de hongos filamentosos y levaduras no excede de 1O ufc por ml.
USP 39
Pruebas Biológicas/ (130) Atributos de Calidad de la Proteína A 227
:~ll'!Y~M1~'ilritdati:~iillit;8IM!lií~lls~i;fi~il1ilii~lilliirNo contiene más de 1 Unidad USP de Endotoxinas por mg de proteína total. [NOTA-La prueba de Endotoxinas bacterianas para Proteína A se usa para describir la calidad de este material auxiliar. Esta prueba no define el nivel aceptable de endotoxina bacteriana en la preparación de las formas farmacéuticas inyectables en las cuales se usa la Proteína A.] Proteína total (ver ~1J$P~(~~ii'11l~U!llli'l~lltiiimi~llifall!l)-Preparar muestras por triplicado para análisis diluyendo Proteína A hasta 3,0 mg por ml en Agua para Inyección. Medir la absorbancia de cada muestra a 275 nm después de corregirla usando Agua para Inyección como blanco. Determinar la concentración de proteína con la siguiente ecuación:
Concentración de proteína (mg por ml) = (A275/0, 149) en donde A es la absorbancia de Proteína A a la longitud de onda de 275 nm y O, 149 es la absortividad molar. Promediar los resultados de las tres muestras y determinar el coeficiente de variación (CV): el CV es :::;5%. Límite de proteína contaminante habitual y valoración correspondienteEnterotoxina 8-La enterotoxina B se determina con un kit de enzimoinmunoensayo en microplaca disponible comercialmente.1 Los pocillos de las microplacas están recubiertos con anticuerpos de oveja anti enterotoxina B. Las curvas estándar se realizan utilizando el kit control de ELISA. Los controles negativos son pocillos recubiertos con suero de oveja no inmunizada. El nivel de enterotoxina se determina a partir de la curva estándar. La especificación para el nivel de la enterotoxina B es :::;1 ng por mg de proteína total. Pureza cromatográfica-[NOTA-La prueba de pureza por cromatografía de exclusión por tamaño resuelve la Proteína A de los contaminantes de alto peso molecular.] Fase móvil-Preparar una solución de fosfato diácido de sodio 50 mM de pH 6,5 de la siguiente manera. Agregar 6,9±O,1 g de fosfato diácido de sodio a un vaso de precipitados de 1000 ml. Diluir con agua a 900 mL y ajustar con hidróxido de sodio 5 M a un pH de 6,50 ± 0,05. Transferir la solución a un matraz volumétrico de 1000 mL y diluir con agua a volumen. Pasar la solución a través de un filtro de membrana de 0,22 µm. Solución regeneradora de columna-Preparar una solución de fosfato diácido de sodio O, 1 M de pH 3,0 de la siguiente manera. Agregar 1 3,8 ± O, 1 g de fosfato diácido de sodio a un vaso de precipitados de 1000 ml. Diluir con agua hasta obtener 900 ml y ajustar con ácido clorhídrico a un pH de 3,0±O,1. Transferir la solución a un matraz volumétrico de 1000 ml y diluir a volumen con agua. Pasar la solución a través de un filtro de membrana de 0,22 µm. Solución de almacenamiento de la columna-Mezclar 100 mL de metanol con 900 ml de agua. Solución de prueba-Diluir Proteína A hasta aproximadamente 1 mg por mL con Fase móvil. Estándares de calibración-Usando Fase móvil, preparar por separado soluciones de 1 mg por mL de cada una de las siguientes proteínas: tiroglobulina (670 kDa), lgG (150 kDa), beta lactoglobulina (36 kDa) y lisozima (14 kDa). Solución estándar-Preparar una solución que contenga 1 mg por mL de ER Proteína A USP en Fase móvil. Sistema cromatográfico (ver Cromatografía (621 ))-Equipar un cromatógrafo de líquidos con un detector a 280 nm y una columna de 7,8 mm x 30 cm rellena con material L33. Equilibrar la columna durante aproximadamente 30 minutos a 0,5 mL de Fase móvil por minuto o hasta que se consiga una línea base estable. Procedimiento-Inyectar por separado 100 µL de cada muestra y correrlas en la siguiente secuencia: Estándares de calibración, tiroglobulina, lgG, beta lactoglobulina y lisozima; la Solución estándar; y la Solución de prueba. Correr la secuencia tres veces isocráticamente usando Fase móvil a 0,5 mL por minuto durante 30 minutos. La absorbancia se detecta a 280 nm. Analizar los datos de los picos a 280 nm y seleccionar el tiempo de retención (TR) con el área de pico más grande. Usando los datos de los Estándares de calibración, graficar la media del TR en función del logaritmo del peso molecular para obtener la curva estándar. La pureza debe ser ~95% en el pico principal. Utilizar la fórmula de la curva estándar para obtener los logaritmos de los pesos moleculares de las Soluciones de prueba. Convertir los logaritmos de los pesos moleculares de las Soluciones de prueba y de las Soluciones estándar a pesos moleculares reales. El peso molecular aparente de la proteína A a partir de la Solución estándar está entre 156 y 205 kDa; y el de la Proteína A a partir de la Solución de prueba está dentro del mismo intervalo. Limpieza y almacenamiento de la columna-Enjuagar la columna con 100 mL de Solución regeneradora de columna y almacenar lavando con 100 mL de Solución de almacenamiento de la columna.
rPROTEÍNA A, C-CYS C141gH2320N43zÜso>S4 34317,5 Da Secuencia N-terminal AQHDEAQQNA La rProteína A, C-Cys es una Proteína A recombinante que carece de la parte C-terminal de unión a la membrana; en cambio, se le ha introducido una cisteína e-terminal para permitir una inmovilización dirigida. Tiene cinco dominios homólogos de unión a lgG idénticos a los de la Proteína A nativa y se produce usando Escherichia coli como célula anfitriona, seguido de purificación por cromatografía convencional. La rProteína A, C-Cys se fabrica como una solución a granel con una potencia de
1 Se puede obtener un kit de enzimoinmunoensayo adecuado de TECRA lnternational Pty Ltd., Australia (Nº SETVIA96).
228 (130) Atributos de Calidad de la Proteína A/ Pruebas Biológicas
USP 39
unión a lgG mayor de 95%. Dado que la rProteína A, C-Cys se usa como material auxiliar en la fabricación de fármacos terapéuticos recombinantes, los requisitos regulatorios difieren de los de productos farmacéuticos terapéuticos. Envasado y almacenamiento-Almacenar en envases cerrados a la temperatura indicada en la etiqueta. Etiquetado-Conservar en envases sellados y almacenar a una temperatura de -20º o menor. Estándares de Referencia USP (11 )-fR Endotoxina USP. ER rProteína A, C-Cys USP. IdentificaciónA: SDS-PAGE-Cumple con los requisitos de la prueba A de Identificación en rProteína A usando ER rProteína A, C-Cys USP. B: Unión a /gG-Cumple con los requisitos de la prueba B de Identificación en rProteína A usando ER rProteína A, C-Cys USP. Pruebas de recuento microbiano (61) y Pruebas de microorganismos específicos (62)-EI recuento total de microorganismos aerobios no excede de 100 ufc por mL y el recuento total combinado de hongos filamentosos y levaduras no excede de 1O ufc por ml. ••lllllllll~,~·•111111111-No contiene más de 1 Unidad USP de Endotoxinas por mg de proteína total. [NOTA-La prueba de Endotoxinas bacterianas para rProteína A, C-Cys se usa para describir la calidad de este material auxiliar. Esta prueba no define el nivel aceptable de endotoxina bacteriana en la preparación de las formas farmacéuticas inyectables en las cuales se usa la rProteína A, C-Cys.] Proteína total (ver \llllipíj!YJll~llllJD-Preparar muestras por triplicado para análisis diluyendo rProteína A, C-Cys hasta 3,0 mg por mL en Agua para Inyección. Medir la absorbancia de cada muestra a 275 nm después de corregirla usando Agua para Inyección como blanco. Determinar la concentración de proteína con la siguiente ecuación: Concentración de proteína (mg por mL) = (A275/0,22) en donde A es la absorbancia de rProteína A, C-Cys a la longitud de onda de 275 nm y 0,22 es la absortividad molar. Promediar los resultados de las tres muestras y determinar el coeficiente de variación (CV): el CV es :'>2,5%. Pureza cromatográfica-[NOTA-La prueba de pureza por cromatografía de exclusión por tamaño resuelve la rProteína A, C-Cys de los contaminantes de alto peso molecular y de los contaminantes de bajo peso molecular.] Fase móvil-Preparar una solución de fosfato de sodio 0,02 M de pH 7,2 que contenga cloruro de sodio O, 15 M, de la siguiente manera. Agregar 0,96 ± 0,02 g de fosfato monobásico de sodio hidrato, 2,32 ± 0,02 g de fosfato dibásico de sodio dihidrato y 8,76 g ± 0,02 g de cloruro de sodio a un vaso de precipitados de 1000 ml. Diluir con agua a 900 mL y ajustar con hidróxido de sodio 1 M a un pH de 7,2 ± 0,05. Transferir esta solución a un matraz volumétrico de 1000 mL y diluir a volumen con agua. Pasar la solución a través de un filtro de membrana de 0,45 µm. Solución de fOTA-Preparar una solución de ácido elitendiaminotetraacético (EDTA) 20 mM, disolviendo 0,74 ± 0,02 g de EDTA en 100 mL de Fase móvil. Solución de OTT-Preparar una solución de DL-ditiotreitol (DTI) 100 mM, disolviendo 1,54 ± 0,02 g de DTI en 100 mL de Fase móvil. Solución de pretratamiento-Preparar una solución que contenga una mezcla de Solución de EDTA y Solución de DTT (1 :1,
v/v). [NOTA-Preparar inmediatamente antes de su uso.] Solución de prueba-Diluir rProteína A, C-Cys 1 a 5 en Solución de pretratamiento, y mezclar suavemente. Incubar la muestra a 40º durante 60 minutos. Sistema cromatográfico (ver Cromatografía (621 ))-Equipar un cromatógrafo de líquidos con un detector a 214 nm y una columna de 1O mm x 30 cm rellena con material L54. Equilibrar la columna con por lo menos dos volúmenes de columna de Fase móvil a una velocidad de flujo de 0,4 mL por minuto. Procedimiento-Inyectar 100 µL de Solución de pretratamiento y dejar que la cromatografía continúe durante por lo menos dos volúmenes de columna. Repetir dos veces antes de inyectar 100 µL de la Solución de prueba. La absorbancia se detecta a 214 nm. Integrar el pico principal de la corrida a partir de la Solución de prueba y todos los demás picos que no estén presentes en las corridas de la Solución de pretratamiento. Calcular el porcentaje de impurezas en la porción de la rProteína A, C-Cys tomada, por la fórmula: 1 OO(r¡/r,) en donde r; es la respuesta del pico de cada impureza; y r, es la suma de las respuestas de todos los picos: la suma de todas las impurezas no es más de 5%; y la Solución de prueba presenta un pico principal aproximadamente a los 35 minutos.
rPROTEÍNAA C1917H3039Ns6s06ssS3 46 618 Secuencia N-terminal FLRPVE La Proteína A es un componente de la pared celular del Staphylococcus aureus. La Proteína A recombinante (rProteína A) consta de cinco dominios homólogos de unión (E, D, A, B, C) a la inmunoglobulina (lgG) seguidos de una secuencia parcial del dominio X. Se expresa en Escherichia coli y se purifica por medio de un proceso de cromatografía en columna. Las colum-
Pruebas Biológicas/ (1 30) Atributos de Calidad de la Proteína A 229
USP 39
nas de lgG no se usan en el proceso de purificación. Se fabrica como una solución a granel con una potencia de unión a lgG mayor de 95%. Los métodos de pruebas para su liberación y las especificaciones se describen a continuación. Dado que la rProteína A se usa como un material auxiliar en la fabricación de fármacos terapéuticos recombinantes, los requisitos regulatorios difieren de los de productos farmacéuticos terapéuticos. Envasado y almacenamiento-Almacenar en envases cerrados a la temperatura indicada en la etiqueta. Etiquetado-El etiquetado indica que el material proviene de ADN recombinante, así como el número de lote, las condiciones de almacenamiento y la leyenda "Formulado en Agua para Inyección". Estándares de Referencia USP (11 )-ER Endotoxina USP. ER rProteína A USP. IdentificaciónA: SDS-PAGEMarcador de peso molecular-Usar un marcador de peso molecular (MWM, por sus siglas en inglés) apropiado, que contenga bandas de proteínas entre 20 y 200 kDa. Solución de PBS-Preparar una solución que contenga 8065,0 mg de cloruro de sodio y 200,0 mg de cloruro de potasio por L de solución amortiguadora de fosfato de sodio 0,01 M de pH 7,4. Solución amortiguadora de la muestra 4X2 -Disolver 0,666 g de tris-clorhídrico, 0,682 g de tris base, 0,800 g de dodecil sulfato de litio (LDS, por sus siglas en inglés), 0,006 g de ácido etilendinitrilotetracético (EDTA) y 4 g de glicerol en 8 ml de agua; agregar 0,75 ml de solución de azul brillante de Coomassie G-250 al 1% (ver Azul de Coomassie G-250 en Reactivos en Reactivos, Indicadores y Soluciones) y 0,25 ml de solución de rojo de fenol al 1%. Mezclar bien y ajustar el volumen con agua a 10 ml. Solución amortiguadora de la muestra 2X-Preparar una mezcla de Solución amortiguadora de la muestra 4X y agua (1 :1 ). Solución amortiguadora de la muestra 7X-Preparar una mezcla de Solución amortiguadora de la muestra 2X y agua (1 :1 ). Solución de ditiotreitol 7 M-Disolver O, 154 g de DL-ditiotreitol (DTT) en 1 ml de agua. Solución amortiguadora reductora de la muestra 2X-Mezclar 180 µL de Solución amortiguadora de la muestra 2X y 20 µL de Solución de ditiotreitol 7 M. Solución amortiguadora de corrida 20X 3-Disolver 104,6 g de ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico (MOPS, por sus siglas en inglés), 60,6 g de tris base, 1Og de dodecil sulfato de sodio (SDS, por sus siglas en inglés) y 3,0 g de EDTA en 400 ml de agua. Mezclar bien y ajustar con agua hasta 500 ml. Solución amortiguadora de corrida 7X-Preparar una solución de agua y Solución amortiguadora de corrida 20X (19:1 ). Solución de tinción del gel-Preparar una solución de azul brillante de Coomassie R-250 (ver Azul Brillante de Coomassie R-250 en Reactivos en Reactivos, Indicadores y Soluciones) que contenga una concentración de 0,5 g por L en una mezcla de agua, isopropanol y ácido acético (6,5:2,5:1,0). Filtrar y almacenar a temperatura ambiente. No se recomienda la tinción con plata. Solución decolorante-Mezclar 100 ml de ácido acético con 900 ml de agua. Preparación estándar-Diluir ER rProteína A USP hasta 0,4 mg por ml con Solución de PBS. Diluir adicionalmente esta solución 1 :1 con Solución amortiguadora reductora de la muestra 2X e incubar en un tubo cerrado durante 5 minutos a 90º. Mezclar y centrifugar brevemente (quick spin) antes de cargar. Preparación de prueba-Diluir rProteína A con Solución de PBS hasta 0,4 mg por ml. Proceder según se indica en Preparación estándar, comenzando donde dice "Diluir adicionalmente". Solución combinada-Diluir rProteína A y ER rProteína A USP con Solución de PBS hasta 0,8 mg por ml. Esta solución contiene 0,4 mg por ml de cada proteína. Proceder según se indica en Preparación estándar, comenzando donde dice "Diluir adicionalmente". Montaje del aparato y gel de SDS-PAGE-Montar el aparato para el gel según las instrucciones del fabricante. Asegurar en su lugar la cuña de presión del gel y llenar la cámara interna con aproximadamente 200 ml de Solución amortiguadora de corrida 7X. Si no se verifican pérdidas de líquido, verter 600 ml de Solución amortiguadora de corrida 7X en la cámara externa. Sacar cuidadosamente el peine del gel para sumergir los pocillos (wells) en la Solución amortiguadora de corrida 7X. Cargar 1O µL de cada preparación según se indica a continuación en Carga del gel en un gel de Bis-Tris SDS-PAGE al 10%.4 Carga del gel-Usar el siguiente esquema de carga del gel al correr una Preparación de prueba (ver la Tabla 7). Cada Preparación de prueba se corre sola y como parte de la Solución combinada que contiene la rProteína A y la ER rProteína A USP. Tabla 1
3
Cantidad de Carga
(µL)
(µg)
1
Solución amortiquadora de Ja muestra 1X
10
N/D
2
MWM
20
N/D
3
Preparación de prueba #1
10
2
4
Solución combinada #1
10
4 (total)
5
Preparación de prueba #1
10
2
Calle
2
Volumen de Carga Muestra
La Solución amortiguadora de la muestra 4X NuPAGE LOS se puede obtener de lnvitogen (Nº NPOOOl). La Solución Amortiguadora de Corrida 20X NuPAGE MOPS SDS se puede obtener de lnvitrogen (N° NPOOO 1).
4 El gel de Bis-Tris SDS-PAGE al 10% se puede obtener de lnvitrogen (Nº NP0301 ).
USP 39
230 (130) Atributos de Calidad de la Proteína A/ Pruebas Biológicas Tabla 1 (Continuación)
Muestra
Calle
6
Volumen de Carga (µL)
Solución amortiguadora de la muestra 1X
10
Cantidad de Carga (µg)
--
N/D
7
Preparación estándar
10
2
8
MWM
20
N/D
9
-
-
-
10
-
-
--
·-
Corrida del gel-Fijar el voltaje en 125 volts y correr a un voltaje constante. Correr los geles hasta que la banda de azul de bromofenol quede aproximadamente a 5 mm del borde inferior del gel (aproximadamente de 120 a 140 minutos). Tinción del gel-Verter aproximadamente 100 mL de Solución de tinción del gel dentro del recipiente de tinción. Colocar el gel dentro del recipiente de tinción y dejar que la solución colorante cubra el gel por completo. Calentar en un horno de microondas durante 30 segundos. Colocar el recipiente de tinción en un agitador orbital y teñir el gel durante 1 hora, agitando suavemente. Decoloración-Escurrir la Solución de tinción del gel y agregar suficiente Solución decolorante al recipiente hasta cubrir el gel. Colocar el recipiente en un agitador orbital y agitar a baja velocidad. Cambiar la Solución decolorante según sea necesario hasta obtener un fondo transparente. Después de decolorar, enjuagar bien el gel con agua y dejarlo en agua durante 1O minutos antes del escaneo. Escaneo del gel-Colocar un poco de agua en la placa de vidrio del escáner y colocar los geles sobre una placa de vidrio humedecida. Eliminar las burbujas. Escanear los geles realizando los ajustes apropiados. Análisis de los datos-Escoger una banda entre las bandas de 20 kDa y 30 kDa del MWM para calcular el porcentaje del factor de retención. Trazar una línea en una calle (la calle que contiene la Solución amortiguadora de muestra 7X) desde el pocillo hasta el ápice (región de mayor intensidad) de la banda escogida. La longitud de esta línea se designa como la distancia total (Dr). En las calles que contienen muestras, trazar una línea desde el pocillo hasta el ápice de cada banda. Para cada banda, la longitud de esta distancia es la distancia de migración (DM) en mm. Registrar la Dr y la DM en la hoja de informe para cada pico o banda. La distancia total debe ser la misma para cada calle en un gel. Calcular el porcentaje del factor de retención (RF) de cada pico o banda principal y documentar en la hoja de informe, usando la siguiente ecuación:
%RF = DM/Dr x 100 También para cada gel, registrar el número de bandas y el peso molecular aproximado de cada banda en cada muestra. Aptitud del sistema-Todas las bandas entre 20 kDa y 70 kDa están presentes. La calle que contiene la Solución amortiguadora de la muestra 7X no contiene ninguna banda. Especificidad-La rProteína A tiene una banda principal y un peso molecular similar que corresponden a los de la ER rProteína A USP. La Solución combinada presenta también una única banda principal. B: Unión a lgG-[NOTA-EI ensayo de unión a lgG es un método funcional para determinar el porcentaje de rProteína A capaz de unirse a inmunoglobulina policlonal humana inmovilizada. Dado que el porcentaje de rProteína A funcional en cada lote no es menor de 95%, el ensayo mide la proteína no unida en función de la proteína total inyectada. Esto se realiza mediante la comparación entre la absorbancia del flujo que atraviesa la columna y la absorbancia de una inyección desviada de la misma.] Pretratamiento de la muestra (desalinización)-Con el fin de eliminar cualquier componente de la solución amortiguadora que pudiera contribuir a la absorbancia en la fracción "no unida" a lgG en la columna, las muestras se desalinizan con Solución A. La desalinización se puede llevar a cabo usando una columna de desalinización adecuadas, dependiendo de los volúmenes requeridos. Columna lgG-Para este ensayo se requiere una columna Sepharose6 de 1 mL con lgG policlonal humana inmovilizada (hlgG, por sus siglas en inglés). [NOTA-La columna de lgG requiere lavado cuando es nueva, cuando se han efectuado varios ciclos de análisis o después de una falla de la aptitud del sistema. No es necesario efectuar el procedimiento de lavado de la columna para cada inyección de muestra.] Solución A para lavado de la columna-Preparar una solución de ácido acético 0,5 M de pH 3,4, agregando 28,6 mL de ácido acético a un vaso de precipitados de 1000 mL, diluyendo a 900 mL con agua y ajustando a pH 3,4 con acetato de amonio. Transferir la solución a un matraz volumétrico de 1000 mL y diluir a volumen con agua. Pasar la solución a través de un filtro de membrana de 0,45 µm. Solución B para lavado de la columna-Preparar una solución de Tris 50 mM de pH 7,6; cloruro de sodio 150 mM y Tween 20 al 0,05% por el siguiente procedimiento. Agregar 6,06 ± 0,01 g de Tris y 8,77 ± 0,01 g de cloruro de sodio a un vaso de precipitados de 1000 ml. Diluir con agua a 900 ml y ajustar con hidróxido de sodio 0,5 M a un pH de 7,60 ± 0,05. Transferir
s Las columnas Zeba se pueden obtener de Pierce; las columnas Nap-1 O se pueden obtener de GE Healthcare. 6 La columna HiTrap lgG Sepharose 6 FF se puede obtener de GE Healthcare (Nº 90-1003-97).
Pruebas Biológicas/ (130) Atributos de Calidad de la Proteína A 231
USP 39
la solución a un matraz volumétrico de 1000 mL y diluir a volumen con agua. Pasar la solución a través de un filtro de membrana de 0,45 µm (solución amortiguadora). Agregar 0,5 mL de Tween 20 a 1 L de la solución amortiguadora y mezclar bien. Solución A-Preparar una solución de fosfato monobásico de sodio 20 mM y cloruro de sodio 150 mM de pH 7,6 por el siguiente procedimiento. Agregar 2,76 ± 0,01 g de fosfato monobásico de sodio hidrato y 8,77 ± 0,01 g de cloruro de sodio a un vaso de precipitados de 1000 ml. Diluir con agua a 900 mL y ajustar con hidróxido de sodio 5 M a un pH de 7,60 ± 0,05. Transferir la solución a un matraz volumétrico de 1000 mL y diluir a volumen con agua. Pasar la solución a través de un filtro de membrana de 0,45 µm. Solución 8-Preparar una solución de ácido fosfórico 100 mM de pH 2,8 por el siguiente procedimiento. Agregar 6,8 mL de ácido fosfórico a un vaso de precipitados de 1000 ml. Diluir con agua a 900 mL y ajustar con hidróxido de potasio 2 M a un pH de 2,80 ± 0,05. Transferir la solución a un matraz volumétrico de 1000 mL y diluir a volumen con agua. Fase móvil-Usar mezclas variables de Solución A y de Solución B, según se indica en el Sistema cromatográfico. Hacer ajustes si fuera necesario (ver Aptitud del Sistema en Cromatografía (621 )). Preparación estándar-Descongelar el ER rProteína A USP y usarlo directamente. Preparación de prueba-Preparar una solución de 4,0 a 6,0 mg por mL de rProteína A en Solución A. Sistema cromatográfico-Equipar el cromatógrafo de líquidos con un detector a 280 nm y una columna de 1 mL con hlgG inmovilizada. Equipar un cromatógrafo con una válvula que permita desviar el flujo de la columna. Cada análisis consta de una serie de dos inyecciones, una donde la muestra se inyecta en la columna y otra donde la muestra se desvía de la columna y fluye directamente al detector. Efectuar tres análisis repetidos. Programar el cromatógrafo (ver la Tabla 2) del siguiente modo. Tabla 2 Velocidad de flujo (ml por minuto)
Tiempo (minutos)
Posición de la Válvula
Solución A
Solución 8
(%)
(%)
0-6
100
o
columna
1,0
6-12
100~0
0~100
columna
reequilibrio
1,0
12-22
100
columna
equilibrio
100
o o
columna
equilibrio isocrática
1,0
Eluclón reequilibrio
0,4
22-25
0,4 (muestra inyectada)
25-35
100
o
columna
1,0
35-49
100~0
0~100
columna
regeneración
1,0
49-63
0~100
100~0
columna
reequilibrio
1
63-65
100
equilibrio
65-68
100
o o
desvío
0,4
desvío
equilibrio
0,4 (muestra inyectada)
68-75
100
o
desvío
isocrática
Inyectar en el cromatógrafo la Preparación estándar, registrar el cromatograma y calcular el porcentaje de unión a hlgG según se indica en el Procedimiento: el porcentaje de unión a hlgG es:?: 95% y la desviación estándar relativa para el análisis repetido no es más de 1%. Procedimiento-Inyectar en el cromatógrafo un volumen (aproximadamente 100 µL) de la Preparación de prueba. Registrar el cromatograma y medir las respuestas de los picos. Calcular el porcentaje de actividad de unión a la hlgG, por la siguiente fórmula: 100 -1 OO(rcfr8) en donde re es la respuesta del pico del material no unido obtenido a partir de la inyección de la columna y r8 es la respuesta del pico obtenido a partir de la inyección desviada de la columna. La unión a hlgG no es menor de 95% en cada análisis repetido de la Preparación de prueba. Informar el valor promedio de los tres análisis repetidos. Pruebas de recuento microbiano (61) y Pruebas de microorganismos específicos (62)-EI recuento total de microorganismos aerobios no excede de 100 ufc por mL y el recuento total combinado de hongos filamentosos y levaduras no excede de 1O ufc por ml. •Pru~badeEn~ot~7Gfnas 0 $adenaf:í~s(8$}ix~it~í~~~li~:¡~>-No contiene más de 0,5 Unidades USP de Endotoxinas por mg de proteína total. [NOTA-La prueba de Endotoxinas bacterianas para rProteína A se usa para describir la calidad de este material auxiliar. Esta prueba no define el nivel aceptable de endotoxina bacteriana en la preparación de las formas farmacéuticas inyectables en las cuales se usa la rProteína A.] Proteína total (ver •(857}. (¡1, 01,~y,201 ¡¡¡)-Preparar muestras por triplicado para análisis diluyendo rProteína A hasta 3,0 mg por mL en Agua para Inyección. Medir la absorbancia de cada muestra a 275 nm después de corregirla usando Agua para Inyección como blanco. Determinar la concentración de proteína con la siguiente ecuación: Concentración de proteína (mg por mL) = (A275 /0, 165) en donde A es la absorbancia de rProteína A a la longitud de onda de 275 nm y O, 165 es la absortividad molar. Promediar los resultados de las tres muestras y determinar el coeficiente de variación (CV): el CV es s5%.
232 (1 30) Atributos de Calidad de la Proteína A/ Pruebas Biológicas
USP 39
Análisis espectral UV-Diluir rProteína A a 1 mg por mL en Agua para Inyección. Usar un espectrofotómetro de barrido UV con Agua para Inyección como blanco, obtener los barridos espectrales en el intervalo de 240 a 360 nm. De los datos resultantes, calcular el valor de la absorbancia a 270 nm y el cociente de absorbancias a 270 y a 250 nm (es decir, E270/E250): la absorbancia a 270 nm de una solución de 1 mg por mL de rProteína A en Agua para Inyección está dentro del intervalo O, 140,20. Pureza cromatográfica-[NOTA-La prueba de pureza por cromatografía de exclusión por tamaño resuelve la rProteína A de los contaminantes de alto peso molecular.] Fase móvil-Preparar una solución de fosfato de sodio 0,3 M de pH 7, mezclando soluciones de fosfato monobásico y dibásico de la siguiente manera. Pesar 21,3 ±O, 1 g de fosfato dibásico de sodio anhidro y disolver en 500 mL de agua hasta obtener una solución de fosfato dibásico de sodio 0,3 M (Solución 7). En otro recipiente, pesar 18,0±O,1 g de fosfato monobásico de sodio anhidro y disolver en 500 mL de agua hasta obtener una solución de fosfato monobásico de sodio 0,3 M (Solución 2). Calibrar un medidor de pH usando calibradores de pH 7 y 1O. Agregar 400 mL de Solución 7 a un vaso de precipitados de 1 L. Transferir la sonda de pH al vaso de precipitados. Agregar lentamente la Solución 2 hasta que el pH sea 7,0 ±O, 1. Pasar la solución a través de un filtro de membrana de 0,45 µm. Solución estándar-Diluir ER rProteína A USP hasta 1 mg por mL en Fase móvil. Solución de prueba-Diluir rProteína A hasta 1 mg por mL en Fase móvil. Sistema cromatográfico (ver Cromatografía (621 ))-Equipar un cromatógrafo de líquidos con un detector a 214 nm y a 280 nm, y una columna de 9,4 mm x 25 cm rellena con material L35. La velocidad de flujo es de 1 mL por minuto. Cromatografiar la Solución estándar según se indica en el Procedimiento: la rProteína A presenta un único pico principal aproximadamente a los 9 minutos y el porcentaje de área es ¿98% a 214 nm y ¿95% a 280 nm. Procedimiento-Inyectar en el cromatógrafo 100 µL de la Solución de prueba, correr isocráticamente durante 15 minutos y registrar el cromatograma. Los valores para la rProteína A a partir de la Solución de prueba corresponden a las especificaciones del ER rProteína A USP a partir de la Solución estándar. lsoformasSolución estándar-Descongelar ER rProteína A USP y usarlo directamente. Solución de prueba-Diluir rProteína A a 4 mg por mL en Agua para Inyección. Marcadores de pi-Usar un set de marcadores adecuado que contenga marcadores entre 3 y 10.7 Gel de IEF (isoelectroenfoque)-Usar un gel adecuado con intervalo de pH 3-1 O y un tamaño de 100 x 125 mm. 8 Procedimiento-Aplicar alícuotas de 5 µL de los Marcadores de pi de la Solución de prueba y de la Solución estándar al gel de IEF y correrlas a 1W de potencia durante aproximadamente 1O minutos. Retirar la máscara de aplicación de la muestra y suministrar potencia, con enfriamiento simultáneo entre 5º y 1Oº de la cámara de enfoque, durante 40 minutos a 1OOOV, 20 mA y 25W. Fijar el gel de IEF durante 1 hora en ácido tricloroacético al 20%, luego teñirlo con una tinción adecuada para geles de IEF. 9 Por último, lavar y secar el gel: el coeficiente de correlación para la línea de mejor ajuste para los Marcadores de pi en función de su migración en cm es ¿0,990, y la rProteína A a partir de la Solución estándar presenta una única banda principal dentro del intervalo de pi de 4,6 a 5,2. En la Solución de prueba se observa una única banda que corresponde al intervalo de pi de la Solución estándar. Límite de Triton X-100Fase móvil-Preparar una mezcla filtrada y desgasificada de agua y acetonitrilo (60:40). Solución de prueba-Diluir rProteína A a 5 mg por mL en Agua para Inyección. Solución de Triton X- 700 con una cantidad conocida agregada-Combinar 5 mg por mL de ER rProteína A USP y Triton X-100 al O, 15% (9:1) para obtener una solución con una concentración conocida de rProteína A y Triton X-100 al 0,015%. Sistema cromatográfico (ver Cromatografía (621 ))-Equipar un cromatógrafo de líquidos con un detector a 214 nm y 280 nm y una columna de 4,6 mm x 25 cm rellena con material L11 de 5 µm. La velocidad de flujo es de 1 mL por minuto. Cromatografiar la Solución de Triton X-100 con una cantidad conocida agregada según se indica en el Procedimiento: el Triton X-100 tiene un único pico principal aproximadamente a los 9 minutos y la rProteína A presenta un pico menor o indetectable con el mismo tiempo de retención. Procedimiento-Inyectar en el cromatógrafo aproximadamente 100 µL de la Solución de prueba, correr isocráticamente durante 35 minutos y registrar el cromatograma. La absorbancia se detecta a 223 nm: el pico de Triton X-1 00 no es mayor de 0,015% (equivalente a la Solución de Triton X-7 00 con una cantidad conocida agregada).
Cambio en la redacción:
rPROTEÍNA A, B4 , C-CYS C1 i nH18s4N326Ü3s4S1
26747,6 Da Secuencia N-terminal AQGTVDAKFD
7 8 9
Los marcadores de pi en el intervalo 3-1 O se pueden obtener de BioRad (Nº 161-031 O). Los geles de IEF en el intervalo 3-1 O se pueden obtener de Cambrex (Nº 56015). ISS Pro-Blue se puede obtener de lntegrated Separation Systems.
USP 39
Pruebas Biológicas/ (130) Atributos de Calidad de la Proteína A 233
La rProteína A, B4 , C-Cys es una proteína recombinante derivada del dominio B de la Proteína A. El dominio de la Proteína A ha sido estabilizado al álcali por mutagénesis sitio-específica y multimerizado en un tetrámero con una cisteína (-terminal para permitir una inmovilización dirigida. La rProteína A, B4, C-Cys se produce usando Escherichia coli como célula anfitriona, seguido de purificación por cromatografía convencional. La rProteína A, B4, C-Cys se fabrica como una solución a granel con una potencia de unión a lgG mayor de 95%. Dado que la rProteína A, 84 , C-Cys se usa como un material auxiliar en la fabricación de fármacos terapéuticos recombinantes, los requisitos regulatorios difieren de los de productos farmacéuticos terapéuticos. Envasado y almacenamiento-Almacenar en envases cerrados a la temperatura indicada en la etiqueta. Etiquetado-Conservar en envases sellados y almacenar a una temperatura de -20º o menor. Estándares de Referencia USP (11 )-ER Endotoxina USP. ER rProteína A, 841 C-Cys USP. IdentificaciónA: SDS-PAGE-Cumple con los requisitos de la prueba A de Identificación en rProteína A usando ER rProteína A, 84 , C-Cys USP. B: Unión a lgG-Cumple con los requisitos de la prueba B de Identificación en rProteína A usando ER rProteína A, 84 , C-Cys USP. Pruebas de recuento microbiano (61) y Pruebas de microorganismos específicos (62)-EI recuento total de microorganismos aerobios no excede de 100 ufc por mL y el recuento total combinado de hongos filamentosos y levaduras no excede de 1O ufc por ml. ~~i!'i',!fji!llilll~Mll~Mlñlllmll~llllJ!llltl-No contiene más de 1 Unidad USP de Endotoxinas por mg de proteína total. [NOTA-La prueba de Endotoxinas bacterianas para rProteína A, 84, C-Cys se usa para describir la calidad de este material auxiliar. Esta prueba no define el nivel aceptable de endotoxina bacteriana en la preparación de las formas farmacéuticas inyectables en las cuales se usa la rProteína A, B4 , C-Cys.] Proteína total (ver ,,~~J~¡¡';¡¡li~iiilil)Solución amortiguadora de formulación-Preparar una solución de fosfato de potasio 0,02 M de pH 7,0, que contenga cloruro de potasio 0, 15 M y ácido elitendiaminotetraacético (EDTA) 2 mM de la siguiente manera. Agregar 2,72 ± 0,01 g de fosfato monobásico de potasio anhidro, 11, 18 g ± 0,22 g de cloruro de potasio y 0,744 ± 0,02 g de EDTA en un vaso de precipitados de 1000 ml. Diluir con agua a 900 mL y ajustar con hidróxido de sodio 1 M a un pH de 7,00 ± 0,05. Transferir la solución a un matraz volumétrico de 1000 mL y diluir a volumen con agua. Pasar la solución a través de un filtro de membrana de 0,45 µm. Preparación de prueba-Diluir la rProteína A, 84 , C-Cys a 3,0 mg por mL con Solución amortiguadora de formulación. Procedimiento-Preparar muestras por triplicado para análisis. Medir la absorbancia de cada Preparación de prueba a 275 nm después de corregirla usando Solución amortiguadora de formulación como blanco. Determinar la concentración de proteína con la siguiente ecuación: Concentración de proteína (mg por mL) = (A275/0,22) en donde A es la absorbancia de rProteína A, B4 , C-Cys a la longitud de onda de 275 nm y 0,22 es la absortividad molar. Promediar los resultados triplicados y determinar el coeficiente de variación (CV): el CV es ~2,5%. Pureza cromatográfica-[NOTA-La prueba de pureza por cromatografía de exclusión por tamaño resuelve la rProteína A, B4 , C-Cys de los contaminantes de alto peso molecular y de los contaminantes de bajo peso molecular.] Fase móvil-Preparar una solución de fosfato de sodio 0,02 M de pH 7,2 que contenga cloruro de sodio O, 15 M, de la siguiente manera. Agregar 0,96 ± 0,02 g de fosfato monobásico de sodio hidrato, 2,32 ± 0,02 g de fosfato dibásico de sodio dihidrato, y 8,76 g ± 0,02 g de cloruro de sodio a un vaso de precipitados de 1000 ml. Diluir con agua a 900 mL y ajustar con hidróxido de sodio 1 M a un pH de 7,2 ± 0,05. Transferir esta solución a un matraz volumétrico de 1000 mL y diluir a volumen con agua. Pasar la solución a través de un filtro de membrana de 0,45 µm. Solución de EDTA-Preparar una solución de EDTA 20 mM, disolviendo 0,74 ± 0,02 g de EDTA en 100 mL de Fase móvil. Solución de OH-Preparar una solución de DL-ditiotreitol (DTI) 100 mM, disolviendo 1,54 ± 0,02 g de DTI en 100 mL de Fase móvil. Solución de pretratamiento----Preparar una solución que contenga una mezcla de Solución de EDTA y Solución de DTT (1 :1, v/v). [NOTA-Preparar inmediatamente antes de su uso.] Solución de prueba-Diluir rProteína A, B4 , C-Cys 1 a 5 en Solución de pretratamiento y mezclar suavemente. Incubar la muestra a 40º durante 60 minutos. Sistema cromatográfico (ver Cromatografía (621 ))-Equipar un cromatógrafo de líquidos con un detector a 214 nm y una columna de 1O mm x 30 cm rellena con material L54. Equilibrar la columna con por lo menos dos volúmenes de columnna de la Fase móvil a una velocidad de flujo de 0,4 mL por minuto. Procedimiento-Inyectar 100 µL de Solución de pretratamiento, y dejar que la cromatografía continúe durante por lo menos dos volúmenes de columna. Repetir dos veces antes de inyectar 100 µL de la Solución de prueba. La absorbancia se detecta a los 214 nm. Integrar el pico principal a partir de la corrida de la Solución de prueba y todos los demás picos que no estén presentes en las corridas de la Solución de pretratamiento. Calcular el porcentaje de impurezas en la porción de rProteína A, 84, C-Cys, por la fórmula:
1OO(r/r,) en donde r; es la respuesta del pico de cada impureza; y r, es la suma de todas las respuestas de todos los picos: la suma de todas las impurezas no es más de 5%; y la Solución de prueba presenta un pico principal aproximadamente a los 37 minutos.
234 (151) Prueba de Pirógenos / Pruebas Biológicas
USP 39
(151) PRUEBA DE PIRÓGENOS La prueba de pirógenos está diseñada para limitar a un nivel aceptable el riesgo de reacción febril en pacie01tes a los que se inyecta un determinado producto. La prueba mide el aumento de la temperatura corporal en conejos a los que se iny0cta :..::;a solución de prueba por vía intravenosa. Este ensayo está diseñado para productos que pueden ser tolerados por conejos en una dosis que no exceda de 1 O mL por kg del peso del conejo, inyectados por vía intravenosa durante un período de no más de 1O minutos. En el caso de productos que requieren una preparación preliminar o que están sujetos a condicione:; esµeciales de administración, se deben seguir las indicaciones adicionales establecidas en la monografía individual o, en el caso de antibióticos o de productos biológicos, seguir las indicaciones adicionales establecidas en las reglamentaciones federales (ver Productos Biológicos (1041) ).
APARATOS Y DILUYENTES Despirogenar jeringas, agujas y material de vidrio por calentamiento a 250º durante no menos de 30 minutos o utilizando otro método adecuado. Todos los diluyentes y soluciones para lavado y enjuague de los dispositivos o sistemas de inyección parenteral, se deben tratar de manera que garanticen la esterilidad y la ausencia de pirógenos. Se deben realizar periódicamente pruebas de control de pirógenos en porciones representativas de los diluyentes y soluciones que se emplean para lavado y enjuague de los aparatos. Cuando se especifique el uso de Inyección de Cloruro de Sodio como diluyente, emplear una Inyección que contenga 0,9 por ciento de NaCI.
REGISTRO DE LA TEMPERATURA Emplear dispositivos sensores de temperatura exactos, tales como termómetros clínicos, sondas termométricas u otra clase de sonda calibrada, que aseguren una exactitud de ±0, 1ºy que faciliten la lectura máxima en menos de 5 minutos. Insertar la sonda sensora de temperatura en el recto del conejo, a una profundidad de no menos de 7,5 cm y, durante un período no menor que el previamente estimado como suficiente, registrar la temperatura corporal del animal de prueba.
ANIMALES DE PRUEBA Emplear conejos adultos y sanos. Mantenerlos individualmente er.i un lugar sin perturbaciones que los puedan excitar y a una temperatura uniforme entre 20º y 23º, con una variación máxima de ±3º respecto de la temperatura seleccionada. Antes de emplear por primera vez un conejo en una prueba de pirógenos, se lo debe acondicionar durante un período de no más de 7 días, realizando un ensayo simulado que incluya todos los pasos indicados en el Procedimiento, pero omitiendo la inyección. No utilizar el mismo conejo para pruebas de pirógenos más de una vez cada 48 horas, ni antes de que hayan transcurrido dos semanas después de una elevación de la temperatura corporal de 0,6º o más, mientras es sometido a la prueba de pirógenos o después de administrarle una sustancia considerada pirogénica.
PROCEDIMIENTO El ensayo se debe llevar a cabo en un área destinada exclusivamente a la prueba de pirógenos, con condiciones ambientales similares a las del espacio donde están alojados los conejos y libres de perturbaciones que puedan excitarlos. Durante el período de prueba se les suspenderá todo alimento. El acceso al agua está permitido en todo momento pero podrá restringirse durante la prueba. Si el dispositivo empleado para medir la temperatura rectal debe dejarse insertado durante el período de prueba, sujetar los conejos mediante sujetadores en el cuello, no muy ajustados, que les permita adoptar una postura natural de descanso. Determinar la "temperatura control" de cada conejo no más de 30 minutos antes de la inyección de la dosis de prueba: ésta es la temperatura base para determinar si existe aumento provocado por la inyección de una solución de prueba. En cada uno de los grupos de conejos de prueba, emplear solamente aquellos cuya temperatura control no varíe más de 1 º respecto de los demás. Descartar los conejos cuya temperatura corporal exceda de 39,8º. A menos que se especifique algo diferente en la monografía correspondiente, inyectar a cada uno de tres conejos, en una vena de la oreja, 1O ml de la solución de prueba por kg de peso, completándose cada inyección dentro de los 1 O minutos desde el inicio de su administración. La solución de prueba es o bien el producto, reconstituido de acuerdo con las especificaciones de la etiqueta, o bien el material en análisis, tratado según se indica en la monografía individual e inyectado en la dosis especificada en la misma. Para la prueba de pirógenos de dispositivos médicos o sistemas de inyección, lavar o enjuagar las superficies del dispositivo o sistema que entran en contacto con el material administrado en forma parenteral, o con el sitio de inyección, o con los tejidos internos del paciente. Asegurarse de que todas las soluciones de prueba estén protegidas de la contaminación. Administrar la inyección después de entibiar la solución de prueba a una temperatura de 37 ± 2º. Registrar la temperatura a intervalos de 30 minutos durante el período de 1 a 3 horas posteriores a la inyección.
USP 39
Pruebas Biológicas/ (161) Dispositivos Médicos 235
INTERPRETACIÓN Y CONTINUACIÓN DE LA PRUEBA Considerar cualquier disminución de la temperatura como elevación cero. El producto cumple con los requisitos de la prueba para determinar la ausencia de pirógenos si ningún conejo muestra un aumento de 0,5º o más por encima de su temperatura de control respectiva. Si algún conejo muestra un aumento de 0,5º o más, continuar la prueba empleando otros cinco conejos. El material en análisis cumple con los requisitos para determinar la ausencia de pirógenos cuando no más de tres de los ocho conejos tienen un aumento de temperatura de 0,5º o más y si la suma del aumento máximo de las temperaturas individuales de los ocho conejos no excede de 3,3º.
PRODUCTOS FARMACÉUTICOS RADIOACTIVOS
Dosis de Prueba para Productos Preformulados, Listos para Usar Marcados con Radioactividad ALBÚMINA AGREGADA Y OTROS PRODUCTOS QUE CONTIENEN PARTÍCULAS Para la prueba de pirógenos en conejos, diluir el producto con Inyección de Cloruro de Sodio a no menos de 100 µCi por mL e inyectar a cada conejo una dosis de 3 mL por kg de peso corporal. OTROS PRODUCTOS Cuando la Vida Media Física de los Radionucleidos Es de Más de Un Día-Calcular el volumen máximo del producto que puede inyectarse a una persona. Este cálculo debe tener en cuenta la dosis radioactiva máxima recomendada del producto, en µCi, y la valoración de la radioactividad, en µCi por mL, del producto a la hora o fecha de su caducidad. Utilizando esta información, se calcula el volumen de la dosis máxima por kg en una persona de 70 kg. Para la prueba de pirógenos en conejos, inyectar a cada conejo un mínimo de 1O veces esta dosis por kg de peso corporal. Si fuera necesario, diluir la dosis con Inyección de Cloruro de Sodio. El volumen total inyectado por conejo no debe ser menor de 1 mL ni mayor de 1O mL de solución. Cuando la Vida Media Física de los Radionucleidos Es de Menos de Un Día-Para productos cuya etiqueta indica que contienen radionucleidos con una vida media inferior a 1 día, los cálculos de dosificación son idénticos a los descritos en el primer párrafo en Otros Productos. Se puede autorizar la distribución de estos productos antes de terminar la prueba de pirógenos en conejos, pero las pruebas se deben comenzar antes de las 36 horas de la autorización a más tardar.
Dosis de Prueba para Componentes de Productos Farmacéuticos o Reactivos a Ser Marcados Se establecen los siguientes requisitos para la dosis de prueba de reactivos a ser marcados o reconstituidos antes del uso por agregado directo de soluciones radioactivas tales como Inyección de Pertecnetato de Sodio Te 99 m, por ejemplo: "equipos fríos". Se debe suponer que el contenido total del vial de reactivo no radioactivo se inyectará a una persona de 70 kg o que se inyectará el 1 / 70 del contenido total por kg. Si el contenido es seco, reconstituirlo con un volumen medido de Inyección de Cloruro de Sodio. Para la prueba de pirógenos en conejos, inyectar ( 1 / 7) del contenido de un vial por kg de peso corporal de cada conejo. La dosis máxima por conejo será igual al contenido completo de un solo vial. El volumen total inyectado por conejo no debe ser de menos de 1 mL ni de más de 1O mL de solución.
(161) DISPOSITIVOS MÉDICOS-PRUEBAS DE ENDOTOXINAS BACTERIANAS Y PIRÓGENOS INTRODUCCIÓN Los métodos y requisitos de este capítulo se aplican a dispositivos o equipos que entran en contacto directo o indirecto con el sistema cardiovascular, el sistema linfático o el líquido cefalorraquídeo y que se etiquetan como estériles y apirógenos. Esto incluye entre otros a los siguientes dispositivos: • Vías para el paso de líquidos de catéteres y de equipos de administración tales como equipos de administración de soluciones, conjuntos de extensión, conjuntos de transferencia, conjuntos de administración de sangre, catéteres intravenosos, implantes, tubuladuras y accesorios de oxigenadores extracorpóreos, tubuladuras para diálisis, catéteres de liberación intramuscular de fármacos, y ensamblajes para transfusión e infusión
236 (161) Dispositivos Médicos/ Pruebas Biológicas
USP 39
• Dispositivos médicos líquidos tales como dializados • Dispositivos médicos implantables tales como válvulas cardíacas, injertos vasculares, otros dispositivos médicos que pueden entrar en contacto con la sangre o líquido cefalorraquídeo y que llevan una declaración de apirogenicidad • Geles con una declaración de apirogenicidad incluyendo matrices óseas desmineralizadas y sistemas de liberación de fármacos
ENDOTOXINAS BACTERIANAS Proceder según se indica en Prueba de Endotoxinas Bacterianas (85) para los parámetros de valoración los procedimientos, estándares y controles de la prueba de endotoxinas bacterianas (PEB) de las pruebas de coagulación, cinéticas y de punto final, usando el eluato del dispositivo médico en lugar de la Solución Muestra.
DEFINICIONES Límite de endotoxina • El límite de endotoxina para el dispositivo terminado es no más de 20 Unidades USP de Endotoxina por dispositivo y no más de 2, 15 Unidades USP de Endotoxina para dispositivos que entran en contacto con líquido cefalorraquídeo. • Para dispositivos que entren en contacto directo o indirecto con el entorno intraocular, se puede aplicar un límite menos estricto de endotoxina. • El límite de endotoxina para el extracto del dispositivo en Unidades de Endotoxina/mL se calcula de la siguiente manera:
(K
X
N)/V
K = límite para cada dispositivo N = número de dispositivos analizados V= volumen total del extracto Kit: Un kit se define como un conjunto de dispositivos individuales en su envase primario o una variedad de dispositivos relacionados. Cada tipo individual de dispositivo puede tener su propio límite de endotoxina y debe analizarse y evaluarse individualmente [ver la Tabla 7. Selección de Unidades de Productos para Análisis-(Referencia ANSl/AAMI ST72)]. Tabla 1. Selección de Unidades de Productos para Análisis Producto
Artículo para Análisis
Dispositivo médico individual en un envase primario en el que cada dispositivo médico se usa individualmente en la práctica clínica
Dispositivo médico individual
Conjunto de componentes en un envase primario en el que los componentes se ensamblan como producto y se usan en conjunto en la práctica clínica
Combinación de componentes
Número de dispositivos médicos idénticos en un envase primario en el que cada dispositivo médico se usa independientemente en la práctica clínica
Dispositivo médico individual tomado del envase primario
Kit de dispositivos médicos relacionados con un determinado procedimiento, donde cada dispositivo médico se usa independientemente en la práctica clínica y donde cada dispositivo médico puede tener un límite de endotoxina diferente
Cada tipo de dispositivo médico que presenta una declaración de apirogenicidad o Todos los artículos juntos
Lambda {le): A es la sensibilidad del método de prueba para técnicas de coagulación. Para la técnica turbidimétrica o cromogénica, A es igual a la concentración más baja de endotoxina en la curva estándar de referencia. Familias de productos: Para los propósitos de la Prueba de Endotoxinas Bacterianas, las familias de productos pueden definirse con respecto a los materiales de construcción comunes y/o componentes comunes. Se debe justificar y documentar la selección de los miembros de la familia. Si una familia de productos contiene dispositivos de muchos tamaños, se selecciona el dispositivo con declaración de apirogenicidad con mayor área superficial como el miembro representativo de la familia que se va a usar en la prueba de aptitud. Solución de extracción o de enjuague: Para extraer o enjuagar el dispositivo médico, se usa Agua para Prueba de Endotoxinas Bacterianas [ver (85), Agua para Prueba de Endotoxinas Bacterianas (PEB)] u otro disolvente adecuado que no interfiera con la Prueba de Endotoxinas Bacterianas. Muestreo 1. Muestra-Una muestra para el análisis de un producto final debe estar en su configuración y envasado finales, incluyendo todos los componentes que constituyen el dispositivo médico final. 2. Muestreo representativo-Un muestreo representativo es un plan de muestreo que se crea y justifica basándose en la suposición de que el proceso de fabricación se encuentra validado y controlado. 3. Tamaño de Ja Muestra-El número de dispositivos seleccionado para el análisis de rutina depende del tamaño del lote, nivel de control, consideraciones estadísticas y desempeño histórico. En la mayoría de los casos, se debe analizar cada lote de producto usando un número de muestras apropiado, no más de 1O, tomadas de manera aleatoria para representar la
Pruebas Biológicas/ (161) Dispositivos Médicos 237
USP 39
calidad del lote. Los planes de muestreo alternativos que usen muestras de pequeños tamaños o que no analicen cada lote de producto deben estar claramente definidos y deben estar fundamentados/justificados por una evaluación de riesgos bien establecida. 4. Muestras previas y posteriores a la esterilización-Al calificar una valoración de la Prueba de Endotoxinas Bacterianas para muestras previas a la esterilización, se debe demostrar la equivalencia con los resultados de las pruebas en las muestras posteriores a la esterilización, para asegurar que la manipulación durante y luego de la esterilización no impacte adversamente sobre la exactitud del resultado de la prueba. El análisis previo a la esterilización es inapropiado para productos que favorecen el crecimiento microbiano. Análisis de aptitud (también conocido como prueba de factores de interferencia): Los estudios de aptitud de los extractos del dispositivo están diseñados para asegurar que el extracto del dispositivo que se está analizando no impacte adversamente sobre la exactitud del resultado de la prueba ya sea por a) ocasionar que la valoración subestime el nivel de endotoxina (inhibición) o b) sobreestime el nivel de endotoxina (potenciación).
REACTIVOS Y SOLUCIONES DE PRUEBA Ver el capítulo (85).
REQUISITOS PREVIOS PARA EL ANÁLISIS Aparato: Todo equipo usado en el proceso de extracción o análisis debe calificarse y/o calibrarse apropiadamente. Los equipos incluyen, entre otros, baños de agua, bloques de calentamiento, pipeteadores mecánicos (pipeteadores fijos, ajustables y de repetición), termómetros y lectores de placas/tubos/cartuchos. Despirogenar todo el material de vidrio y demás materiales termoestables en un horno de aire caliente usando un proceso validado. Si se emplean aparatos de plástico como microplacas y puntas de pipeta para pipeteadores automáticos, usar aparatos que demuestren estar exentos de endotoxinas detectables y que no interfieran con la prueba. Los analistas deben estar apropiadamente capacitados para llevar a cabo la valoración. La sensibilidad de la valoración debe confirmarse según lo descrito en las secciones Prueba de Confirmación de la Sensibilidad Declarada del Usado para reactivos de la técnica coagulación y Garantía de los Criterios para la Curva Estándar para métodos cuantitativos, del capítulo (85). La confirmación de la sensibilidad de la valoración debe llevarse a cabo cuando se usa una nueva partida de reactivo (lisado o endotoxina) o cuando se presenta algún cambio en las condiciones de la prueba que pudiera afectar el resultado de la misma.
PREPARACIÓN DE LOS DISPOSITIVOS: MÉTODOS ESTÁNDAR Límite de endotoxina:
El límite de endotoxina para la solución de extracción o de enjuague es: (K X N)/V
K = cantidad de endotoxina permitida por dispositivo (20 Unidades de Endotoxina por dispositivo; 2, 15 para dispositivos intratecales) N = número de dispositivos analizados V= volumen total del extracto o enjuague NOTA-El volumen del enjuague o extracto puede ajustarse según el tamaño y la configuración del dispositivo. El líquido de extracción estándar para extraer, enjuagar o empapar dispositivos médicos es Agua para Prueba de Endotoxinas Bacterianas (ver el capítulo (85)). Si fuera necesario, se pueden usar otros disolventes después de que se haya demostrado que no interfieren con el desempeño de la valoración. El dispositivo completo, cuando indica una declaración de apirogenicidad, o todos los componentes del mismo con declaración de apirogenicidad, incluyendo las vías de paso de líquidos, deben entrar en contacto con el líquido de extracción durante todo el transcurso de la extracción. El método de extracción estándar consiste en empapar o sumergir el dispositivo o purgar la vía de paso del líquido con líquido de extracción calentado a 37±1,0º, manteniendo el líquido de extracción en contacto con las superficies relevantes durante no menos de 1 hora. Se pueden usar métodos alternativos de extracción o enjuague, pero debe demostrarse que son equivalentes o mejores que el método estándar. Por lo general, los extractos obtenidos a partir de dispositivos médicos individuales se combinan para el análisis. Aptitud: La aptitud de la valoración de la Prueba de Endotoxinas Bacterianas debe demostrarse para cada producto o familia de productos. El número de partidas de producto seleccionado para el estudio de aptitud refleja el nivel de control del proceso y debe justificarse. En el caso de la prueba de aptitud, se considera que los extractos de los dispositivos médicos son las soluciones muestra que se están analizando, y se analizan según lo descrito en el capítulo (85) para la técnica seleccionada en la sección Prueba de Factores de Interferencia.
Si fuera necesario, ajustar el pH de la solución que se va a examinar (o una dilución de la misma) de modo que el pH de la mezcla del lisado y la solución muestra caiga dentro del intervalo de pH especificado por el fabricante del lisado, que general-
238 (161) Dispositivos Médicos/ Pruebas Biológicas
USP 39
mente es un intervalo de pH 6,0-8,0. El pH puede ajustarse usando un ácido, base, o una solución amortiguadora adecuada, según lo recomendado por el fabricante del lisado. Se pueden preparar ácidos y bases a partir de concentrados o sólidos con Agua para Prueba de Endotoxinas Bacterianas (ver el capítulo (85)) en recipientes exentos de endotoxinas detectables. Se debe demostrar que las soluciones amortiguadoras están exentas de endotoxinas detectables y factores de interferencia. Si se determina que la solución de enjuague o extracción sin diluir no es adecuada para realizar la prueba según el capítulo (85), se puede repetir la prueba de factores de interferencia usando dilución, o un método que neutralice o elimine la sustancia i nterferente. Si se sospecha la presencia de una interferencia de glucano, se permite el uso de un agente bloqueante de glucanos o un lisado específico para la endotoxina. Se permite la dilución en Agua para Prueba de Endotoxinas Bacterianas (ver el capítulo (85)) u otro disolvente validado por un factor que no exceda la máxima dilución válida (MDV). La máxima dilución válida para dispositivos médicos es la siguiente: MDV = Límite de endotoxina (de la solución de enjuague o extracción en Unidades de Endotoxina/mL)/A, A, = sensibilidad del método de prueba en Unidades de Endotoxina/mL La interferencia se puede resolver mediante el tratamiento adecuado del extracto del dispositivo. Los métodos para resolver la interferencia y la calificación de dichos tratamientos se describen en el capítulo (85). Para establecer que el tratamiento seleccionado elimina de manera efectiva la interferencia sin pérdida de endotoxinas, realizar la valoración descrita en el capítulo (85) usando la preparación a examinar a la que se le ha agregado el Estándar de Endotoxina y se ha sometido al tratamiento seleccionado.
DEMOSTRACIÓN DE APTITUD CONTINUA La aptitud continua de la valoración debe volver a evaluarse cuando se realicen cambios significativos al producto, proceso, abastecimiento de materias primas, sitio de fabricación y/o de análisis, fuente de reactivos para la Prueba de Endotoxinas Bacterianas, o cualquier otro cambio que pudiera afectar de manera adversa la exactitud del resultado de la Prueba de Endotoxinas Bacterianas. Los resultados de esta reevaluación deben documentarse, y los estudios de aptitud deben llevarse a cabo nuevamente, según se requiera. Los cambios en las técnicas de extracción requieren un nuevo estudio de aptitud. Debido a los posibles cambios en los patrones de interferencia entre los métodos estándar de la Prueba de Endotoxinas Bacterianas, un cambio en la metodología de la Prueba de Endotoxinas Bacterianas (p.ej., cambiar de una prueba de límite por coagulación a una prueba cromogénica cinética) requiere la reejecución del estudio de aptitud. Análisis de rutina: El análisis de rutina de los dispositivos médicos terminados debe usar las mismas técnicas de extracción que se documentaron en el estudio de aptitud exitoso. El análisis de rutina debe llevarse a cabo según lo descrito en el capítulo (85), siguiendo las instrucciones para incubación y los controles indicados en la técnica de valoración seleccionada. Interpretación de los resultados de la prueba: Referirse al capítulo (85). La preparación en análisis cumple con la prueba si la concentración media de endotoxina de determinaciones repetidas de la Solución A, después de corregir por dilución y concentración, es menos de 20 Unidades de Endotoxina por dispositivo médico (2, 15 Unidades de Endotoxina por dispositivo médico para aquellos dispositivos que entran en contacto con el líquido cefalorraquídeo.) Si un dispositivo incumple con este requisito, se puede iniciar una investigación de acuerdo con los procedimientos documentados. Si una valoración válida de la Prueba de Endotoxinas Bacterianas falla, no se puede reemplazar por la Prueba de Pirógenos (151) como repetición.
PIRÓGENOS El capítulo (151) se aplica para las muestras que no puedan analizarse mediante la Prueba de Endotoxinas Bacterianas debido a una intereferencia por inhibición o potenciación de la prueba que no se puede eliminar. Seleccionar un número apropiado de dispositivos, no más de 1O, y obtener un extracto combinado, usando métodos de preparación adecuados para el dispositivo, según se indica para endotoxinas bacterianas, pero con volúmenes de líquido de extracción o de enjuague que no excedan de 40 mL de solución salina SR estéril por dispositivo. Se deben cumplir los requisitos del capítulo (151 ).
REFERENCIAS 1. ANSl/AAMI ST72: 2011, Bacteria/ endotoxins-Test methods, routine monitoring, and alternatives to batch testing. Association for the Advancement of Medica! lnstrumentation, Arlington, VA. 2. United States Food and Drug Administration, Guidance far industry pyrogen and endotoxins testing: questions and answers, June 2012. http://www.fda.gov/Drugs/GuidanceComplianceRegulatorylnformation/Guidances/ucm314718.htm
USP 39
Pruebas Biológicas/ (162) Antitoxina Diftérica 239
AgrégorloslgQlente:
" ¡(162) PRUEBA DE . •POT~NCIA ANTITOXlf';JA •DlFTERICA ·EN INMUNOGL.OBlJLINAS . HUMANAS Se provee un m:étodo in vitro que es adecuado para determinar la potencia de la antitoxina.diftérica (anticuerpos contra la toxina diftérica) en preparaciones de ínmuhoglobulinas humanas derivadas dé plasma. Latokina diftérká es producida por Corynebacterium diphtheriaeytiene la capáddaddeproc;lucír un efecto citopatogéníco en líneas de células epltelialés susceptibles. la prueba se basa en. la. capacidad de la antitoxina diftériC:a para neutralizar la tokií')á diftérica,. red4ciendo su efeC:to cifütóxieo: la•pruebadeterniina específicamente lapotenda.•de··la antitoxina·dlftérlca··basándóse en· su capatidad para·inhiblf el efe'Ctócitotoxieode .la toxinadifférká .en••.célulasVero cultivadas··ccélulas ·epiteliales deriñon de •m<>nó·verde·africano) con respecto a un estándar.de referenda. Las deshidrogenasás mitocondrlales de células Vero vivas pueden.reducir el colorantebrómu.ro de J-{4,S~cjimetilti
Pf(C!>CEOJMIEÑTO
Sofüdón deDMEM-S: Medio de Ei'\glemodíficado por (>ulbecco1,• suplementadopar(l contener 5%de suero fetal bovino (SF~), L-gl.Lltamin~lrnM, 50 µg(rnL.de g.entamltínay 2,5 µg/mlde Jungl,aóna; .[NoTA~A.fternativarnente, sepl}edeusar una combinación de 0,1 ·mg/mLde sulfato de kanamicina., O,l unidades/mL de penicilina yo,1 ·mg/rnL de estreptomicina en•lugar de•.gentamidna.J Solución de DMEM~2: Medio. de Eagle modificado .por Dulbecco1 ,•,suplementado para contener.2% de suero fetalb()vino (SFB), l~glutamina 2 mM, 50 µg/mLde gentamlcina y 2,5 µg/mL de fungízona. [NofA¿Altema.tivamente, se puede usar una· combinación de O,l rng/mldesulfatode kanami!=iná,· O;l···.unidade$/mLde.peniclliria. 'f O,{mg/mLde estreptornítina enluga.r.de.gentamicfoa,J Sóludón.ge Mtr: 5 mglmL de MTT ensolUciÓ(l salina amortiguada con f{)sfatos.z Preparar inmediatamente antes .de su USÓ y rntnfmízarJa ~posicic)n a. la luz ambiental; SC>ludórr ele extrac:c:;ión; Átido clorhfdr!Co 0,4 N enisopropanol Sofución depru.eba det(lxina: Obtener una preparación líquidade toxina. a p¡:¡rtirde un cultivo de C. diph.theriae3 , Se puede esterilizar mediante filtraci.ón yla éstetilidad •puede mantenerse· mediante el agregado de un conservante antimicrobiano éldecuado.Almacenar el .filtrado en la oscuridad a 2º-8q durante varias semanas hasta que la actividad se considere constante¡ $egún$.edetermine mediante aná.lisis. Diluirla tox:i.na en Solución ·de DMEM·Shasta obtener una Solución de pí'l.leba de toxíno
11885-092 Lite Technologíes o equivalente. 2.14190-250 Lite Technologies o equivalente. 3 loxina diftérica código 12/282 de NlBSC o una alternativa adecuada. 4 American Type Culture Collection CCL·81. 1
240 (162) Antitoxina Diftérica / Pruebas Biológicas
USP 39
tear suavemente el frasco de cultivo para liberar las células. Agregar 1O mL de Solución de DMEM-5 a las células tripsinizadas, contar las células y ajustar la suspensión celular a 1 x 1os células/mL en el mismo medio. Soluciones estándar: En tubos estériles, preparar cuatro concentraciones del estándar diluyendo el Estándar de los EE.UU. de Antitoxina Diftérica5 con la Solución de DMEM-2, hasta una concentración de 1 unidad/mL, seguido de diluciones en serie con el mismo medio hasta obtener tres soluciones adicionales de 0,5; 0,25 y O, 1 uni.dades/ml. Soluciones muestra: Diluir en tubos estériles cada una de las muestras de prueba de inmunoglobulinas humanas con Solución de DMEM-2 hasta obtener una concentración de 1,25% de proteína. Usando las muestras diluidas, diluir adicionalmente con Solución de DMEM-2 hasta lograr una concentrqción de '!ntitoxina diftérica esperada que esté dentro del intervalo de las Soluciones. estándar (es decir, 1 a 0,1 unidades/mL), Análisis Muestras: Solución de prueba de toxinaí Soluciones estándar y Soluciones muestra Analízar cada Solución estándar o Solución muestra por duplicado. Rotular placas de .cultivo de 96 pocillos .marcando las columnas de 8 pocillos en grupos de dos¡ se pueden analizar las cuatro Soluciones estándar y una Solución muestra por placa. De acuerdo a lo que se describe seguidamente, las columnas 11 y 12 pueden usarse para el control de células sin tratar y el control de toxina, respectivamente, [NoTA~Se pueden usar diseños de placas alternativos manteniendo las diluciones.] Agregar 112,5 µL de Solución de DMEM,2 a cada pocillo de la fila A, columnas 1~1 O únicamente (estos son controles de toxicidad no específicos de estándar o de muestra). Agregar 75 µL de Solución de DMEM·2 a cada pocillo de las filas B-H, columnas 1- 1O únicamente. Agregar .37,5 µL de una dilución de Solución estándar o una Solución muestrq.a los pocillos Al':"A2 y agregar 75 µL de la misma solución a los pocillos Bl -B2. Agregar 37,5 µL de una segunda dilución de )o/ución estándar o Solución muestra a los pocillos A3-A4 y agregar 75 µL de la misma solución a los pocillos B3-B4. Continuar realizando adiciones similares de diluciones de Solución estándar o Soluciones muestra a cada grupo de dos columnas en las columnas 1-1 O,. Realizar diluciones en serie al medio transfiriendo 75 µL de cada pocillo de la fila B a cada pocillo de la fila C de la misma columna. Mezclar y.luego continuar transfiriendo 75 µL de la misma manera hacia abajo en cada col.umna. Desechar.los últimos 75 µL después de mezclar la fila H. Agregar 75 µL de Solución de prueba de toxina a las filas B-H en las columnas 1-10. Agregar 150 µL de Sofucíón de DMEM-2 a todos los pocillos de la columna 11 (control de células) y agregar 75 µL de Solución de DMEM~2 más 75 µL de Solución de prueba de toxina a todos los pocillos de la columna 12 (control de toxina). Cubrir las placas e incubarlas durante 1 hora a 36 ± 1", en dióxido de carbono al 5% (C0 2) en un ambiente humidificado. Agregar 150 µL de suspensión de células a todos los pocillos, cubrir las placas e incubarlas .a 36 ± 1 º, en dióxido de carbono al 5% (C0 2), y en un ambiente humidificado. Incubar durante 4--5 días, verificando periódicamente la contaminación microbiana mediante examen microscópico. Una vez que los pocillos de control de toxicidad en la fila A que contienen la concentración más baja de una Solución estándar sean casi confluentes, agregar 15 µL de Solución de MTT a cada pocillo. Cubrir las placas e incubarlas en la incubadora de dióxido de carbono (C0 2) a 37" durante 3 horas. Dese.char el:medio y agregar a cada pocillo 150 µL de Solución de extracción. Cubrir las placas y colocar papel aluminio sobre éstas para minimizar la exposición a la luz. Agitar suavemente para solub!lizar el· formazán azúl formado por las células viables. Usando un lector de placas adecuado, leer la absorbancia de cada pocillo a una longitud de onda de 540 nm. Cálculo; La dilución de corte es la dilución más alta en la que aún se presentan células viables en el pocillo pero más allá de ta cual no se encuentra ya ninguna célula viable. La dilución de corte se define mediante una absorbancia correspondiente (Abs). [NOTA~EI valor de absorbancia promedio puede calcularse para los pocillos de control de células en la columna 11 y dividirse por 2 para obtener un valor Abs de control del 50%. Este valor puede usarse para determinar las diluciones de corte. La dilución de corte para cada Solución estándar y Solución muestro puede por ende definirse como la dilueión más álta en la que el valor Abs es mayor que el valor Abs de control del 50%.] Determinar las diluciones de corte para cada S.olución estándar y Solución muestra. Graficar las diluciones de corte obtenidas para todas las.Soluciones estándar (expresadas como la inversa de la diluciórl de corte) en función de las unidades de Antitoxina Diftérica Estándar de los EE.UU. Calcular una lírlea de regresión lineal a partir de los datos. Calcular la media geométrica para las cuatro dUuciones de corte asociadas con cada Solución muestra. Comparar la dilución de corte media cor! la regresión lineal de los datos de la Solución estándar para determinar un título, en unidades/mL, para cada Solución muestra~ Para obtener el valor de potencia final para la Solución muestra, multiplicar el título por cualquier dilución que se haya realizado a la Solución muestra antes de la Vd/oración. Aptitud del sistema: El coeficiente de correlación de la curva estándar debe ser >0,995. La pendiente de la curva estándar debe estar entre 26 y 38. La prueba es válida si las células en los pocillos de la fila A, de las columnas 1-1 O, parecen normales y similares a las células de los pocillos de control de la columna 11 . Además,. los valores de dilución de corte para los duplicados de la Solución estándar y de la Solución muestra deben estar dentro de una dilución en serie entre sí, y la dilución de corte debe estar dentro del intervalo de las diluciones en serie de la Solución muestra. Jt.USP39
S Usar el Estándar de los EE.UU. de Antitoxina Diftérica según lo indicado por el Center for Bíologícs Evaluation and Research (Centro para la Evaluación e Investigación de Productos Biológicos) de la Food and Drug Administration (Administración de Alimentos y Medicamentos).
Pruebas Biológicas/ (171) Valoración de Actividad de Vitamina Bl 2 241
USP 39
(171) VALORACIÓN DE ACTIVIDAD DE VITAMINA B,
2
Estándares de referencia USP (11 )-ER Cianocobalamina USP. Preparación de Valoración-Colocar una cantidad adecuada del material a valorar, previamente reducida a polvo fino si fuera necesario y medida o pesada con exactitud, en un recipiente apropiado que contenga, por cada g o ml del material tomado, 25 ml de una solución acuosa para extracción preparad a justo antes de usar, en donde, cada 100 ml contienen 1,29 g de fosfato disódico, 1, 1 g de ácido cítrico anhidro y 1,0 g de metabisulfito de sodio. Colocar la mezcla en autoclave a 121 º durante 1O minutos. Dejar sedimentar las partículas no disueltas del extracto y filtrar o centrifugar si fuera necesario. Diluir una alícuota de la solución transparente con agua, de manera que la solución de prueba final contenga una actividad de vitamina B12 que equivalga aproximadamente a la actividad de la Solución Estándar de Cianocobalamina que se agrega a los tubos de valoración. Solución Madre del Estándar de Cianocobalamina-A una cantidad adecuada de ER Cianocobalamina USP, pesada con exactitud, agregar suficiente alcohol al 25 por ciento para obtener una solución con una concentración conocida de 1,0 µg de cianocobalamina por ml. Almacenar en un refrigerador. Solución de Cianocobalamina Estándar-Diluir un volumen adecuado de Solución Madre del Estándar de Cianocobalamina con agua hasta un volumen medido tal que después del período de incubación según se indica en el Procedimiento, la diferencia en la transmitancia entre el blanco inoculado y el nivel de 5,0 ml de la Solución de Cianocobalamína Estándar no sea menor de aquella correspondiente a la diferencia de 1,25 mg en peso seco de las células. Generalmente, esta concentración está entre 0,01 ng y 0,04 ng por ml de Solución de Cianocobalamina Estándar. Preparar una solución estándar nueva para cada valoración. Solución Madre de Medio Basal-Preparar el medio de acuerdo con la fórmula y las instrucciones que aparecen a continuación. Puede usarse una mezcla deshidratada que contenga los mismos ingredientes siempre que, una vez reconstituida según se indica en la etiqueta, proporcione un medio comparable al obtenido a partir de la fórmula que aparece en este procedimiento. Agregar los ingredientes en el orden indicado, disolviendo con cuidado la cistina y el triptófano en el ácido clorhídrico antes de agregar las ocho soluciones siguientes a la solución resultante. Agregar 100 ml de agua, mezclar y disolver la dextrosa, el acetato de sodio y el ácido ascórbico. Filtrar, si fuera necesario, agregar la solución de polisorbato 80, ajustar la solución a un pH entre 5,5 y 6,0 con hidróxido de sodio 1 N y agregar agua purificada hasta obtener 250 ml.
o, 1 g
L-Cistina L-Triptófano
0,05 g
Ácido Clorhídrico 1 N
10 ml
Solución de Adenina-Guanina-Uracilo
5 ml
Solución de Xantina
5 ml
Solución Vitamínica
1
10 ml
Solución Vitamínica 11
10 ml
Solución Salina A
5 ml
Solución Salina B
5 ml
Solución de Asparagina
5 ml
Solución de Hidrolizado Ácido de Caseína
25 ml
Dextrosa Anhidra
10 g
Acetato de Sodio, Anhidro
5g
Ácido Ascórbico
1g
Solución de Polisorbato 80
5 ml
Solución de Hidro/izado Ácido de Caseína-Preparar según se indica en Valoración de Pantotenato de Calcio (91 ). Solución de Aspamgina-Disolver 2,0 g de L-asparagina en agua hasta obtener 200 ml. Almacenar bajo tolueno en un refri-
gerador. Solución de Adenína-Guanina-Uracilo-Preparar según se indica en Valoración de Pantotenato de Calcio (91 ). Solución de Xantina-Suspender 0,20 g de xantina en 30 ml a 40 ml de agua, calentar a una temperatura de aproximada-
mente 70º, agregar 6,0 ml de hidróxido de amonio 6 N y mezclar hasta que el sólido se disuelva. Enfriar y agregar agua para obtener 200 ml. Almacenar bajo tolueno en un refrigerador. Solución Salina A-Disolver 1Og de fosfato monobásico de potasio y 1Og de fosfato dibásico de potasio en agua para obtener 200 ml. Agregar 2 gotas de ácido clorhídrico y almacenar bajo tolueno. Solución Salina 8-Disolver 4,0 g de sulfato de magnesio, 0,20 g de cloruro de sodio, 0,20 g de sulfato ferroso y 0,20 g de sulfato de manganeso en agua para obtener 200 ml. Agregar 2 gotas de ácido clorhídrico y almacenar bajo tolueno. Solución de Polisorbato 80-Disolver 20 g de polisorbato 80 en alcohol para obtener 200 ml. Almacenar en un refrigerador.
242 (171) Valoración de Actividad de Vitamina Bl 2 /Pruebas Biológicas
USP 39
Solución Vitamínica /-Disolver 1O mg de riboflavina, 1O mg de clorhidrato de tiamina, 100 µg de biotina y 20 mg de niacina en ácido acético glacial 0,02 N para obtener 400 ml. Almacenar, bajo tolueno protegiendo de la luz, en un refrigerador. Solución Vitamínica //-Disolver 20 mg de ácido paraaminobenzoico, 1O mg de pantotenato de calcio, 40 mg de clorhidrato de piridoxina, 40 mg de clorhidrato de piridoxal, 8 mg de diclorhidrato de piridoxamina y 2 mg de ácido fólico en alcohol neutralizado diluido (1 en 4) para obtener 400 ml. Almacenar, protegiendo de la luz, en un refrigerador. Preparación de Jugo de Tomate-Centrifugar jugo de tomate enlatado comercial para extraer la mayor parte de la pulpa. Suspender aproximadamente 5 g por L de coadyuvante de filtración analítico en el sobrenadante y filtrar, con ayuda de presión reducida, a través de una capa de coadyuvante de filtración. Repetir la filtración, si fuera necesario, hasta obtener un filtrado transparente, color amarillo claro. Almacenar bajo tolueno en un refrigerador. Medio de Cultivo-[NOTA-Se puede usar una mezcla deshidratada que contenga los mismos ingredientes siempre que, una vez reconstituida según las indicaciones del etiquetado, proporcione un medio equivalente al obtenido a partir de la fórmula descrita en este procedimiento.] Disolver 0,75 g de extracto de levadura hidrosoluble, 0,75 g de peptona seca, 1,0 g de dextrosa anhidra y 0,20 g de bifosfato de potasio en 60 ml a 70 ml de agua. Agregar 1O ml de Preparación de jugo de Tomate y 1 ml de Solución de Polisorbato 80. Ajustar la solución con hidróxido de sodio 1 N hasta un pH de 6,8 y agregar agua para obtener 100 ml. Colocar porciones de 1O ml de la solución en tubos de ensayo y tapar con algodón. Esterilizar los tubos y su contenido en autoclave a 121 º durante 15 minutos. Enfriar con la mayor prontitud posible para evitar formación de colores que resultan del sobrecalentamiento del medio. Medio de Suspensión-Diluir un volumen medido de la Solución Madre de Medio Basal con un volumen igual de agua. Colocar porciones de 1O ml del medio diluido en tubos de ensayo. Esterilizar y enfriar según se ha indicado en Medio de Cultivo.
Cultivo Madre de Lactobacillus leíchmannii-Agregar 1,0 g a 1,5 g de agar a 100 ml de Medio de Cultivo y calentar la mezcla en un baño de vapor, con agitación, hasta que el agar se disuelva. Colocar porciones de aproximadamente 1O ml de la solución caliente en los tubos de ensayo, tapar bien los tubos, esterilizarlos a 121 ºdurante 15 minutos en autoclave (temperatura de la salida) y dejar que los tubos se enfríen en posición vertical. Inocular tres o más de los tubos, por transferencias en cuña de un cultivo puro de Lactobacillus leichmannii.* (Antes de usar un cultivo nuevo por primera vez en esta valoración, hacer no menos de 1O transferencias sucesivas del cultivo en un período de 2 semanas.) Incubar durante 16 a 24 horas, a cualquier temperatura seleccionada entre 30º y 40º, pero mantenida termostáticamente dentro de ±0,5º y finalmente almacenar en un refrigerador. Preparar cultivos nuevos en cuña al menos tres veces por semana y no usarlos para preparar el inóculo si tienen más de 4 días. La actividad del microorganismo se puede aumentar mediante transferencias del cultivo en cuña realizadas a diario o dos veces al día, hasta el punto en que se pueda observar una evidente turbidez en el inóculo líquido 2 a 4 horas después de la inoculación. Un cultivo de crecimiento lento raramente proporciona una curva de respuesta adecuada y puede conducir a resultados irregulares. lnóculo-[NoTA-Una suspensión congelada de Lactobacillus leichmannii puede usarse como cultivo madre, siempre que proporcione un inóculo comparable a un cultivo nuevo.] Transferir las células del Cultivo Madre de Lactobacil/us leichmannii a 2 tubos estériles que contengan 1O ml de Medio de Cultivo cada uno. Incubar estos cultivos durante 16 a 24 horas a cualquier temperatura seleccionada entre 30º y 40º, pero mantenida termostáticamente dentro de ±0,5º. En condiciones asépticas, centrifugar los cultivos y decantar el sobrenadante. Suspender las células de cultivo en 5 ml de Medio de Suspensión estéril y mezclar. Usando Medio de Suspensión estéril, ajustar el volumen para que una dilución 1 en 20 en solución salina SR produzca transmitancia de 70% cuando se lee en un espectrofotómetro apropiado a una longitud de onda ajustada a 530 nm, equipado con una celda de 1O mm y se lee contra solución salina SR ajustada a una transmitancia de 100%. Preparar una dilución 1 en 400 de la suspensión ajustada usando Solución Madre de Medio Basal y usarla para el inóculo de prueba. (Esta dilución puede alterarse, cuando sea necesario, para obtener la respuesta deseada.) Calibración del Espectrofotómetro-Comprobar la longitud de onda del espectrofotómetro periódicamente, usando una celda de longitud de onda estándar u otro dispositivo apropiado. Previamente a la lectura de las soluciones, calibrar el espectrofotómetro con agua para fijar el 0% y el 100% de transmitancia, a la longitud de onda de 530 nm. Procedimiento-Limpiar meticulosamente, por medios apropiados, los tubos de ensayo de vidrio duro, de 20 mm x 150 mm de tamaño aproximado y otro material de vidrio necesario, preferentemente seguido de un calentamiento a 250º durante 2 horas, debido a la alta sensibilidad del organismo de prueba a la actividad de cantidades diminutas de vitamina B12 y a trazas de muchos agentes de limpieza. Agregar a los tubos de ensayo, por duplicado: 1,0 ml; 1,5 ml; 2,0 ml; 3,0 ml; 4,0 ml y 5,0 ml, respectivamente, de la Solución de Cianocobalamina Estándar. A cada uno de estos tubos y a cuatro tubos vacíos similares, agregar 5,0 ml de Solución Madre de Medio Basal y agua para completar 1O ml. En tubos de ensayo similares, agregar, por duplicado, respectivamente, 1,0 ml; 1,5 ml; 2,0 ml; 3,0 ml y 4,0 ml de la Preparación de Valoración. Agregar a cada tubo 5,0 ml de Solución Madre de Medio Basal y agua para completar 1O ml. Colocar juntos un juego completo de tubos del estándar y de la valoración en una gradilla y el conjunto duplicado en una segunda gradilla o en otra sección de la misma gradilla, preferentemente en orden aleatorio.
* Se pueden obtener cultivos puros de Lactobacillus /eichmannii, Número 7830, de la American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110.
USP 39
Pruebas Químicas/ (181) Identificación 243
Cubrir los tubos apropiadamente para prevenir la contaminación bacteriana y esterilizar los tubos y su contenido en un autoclave a 121 º durante 5 minutos, procurando alcanzar esta temperatura en no más de 1 O minutos, precalentando el autoclave si fuera necesario. Enfriar tan rápidamente como sea posible para evitar formación de color como resultado del sobrecalentamiento del medio. Tomar precauciones para mantener la uniformidad de las condiciones de esterilización y enfriamiento durante toda la valoración ya que si los tubos se colocan demasiado juntos o si se sobrecarga el autoclave podría variar la velocidad de calentamiento. Agregar asépticamente 0,5 ml de lnóculo a cada tubo así preparado, excepto a dos de los cuatro que no contengan Solución de Cianocobalamina Estándar (los blancos no inoculados). Incubar los tubos a una temperatura entre 30º y 40º, mantenida termostáticamente dentro de ±0,5º, durante 16 a 24 horas. Terminar el crecimiento calentando a una temperatura no inferior a 80º durante 5 minutos. Enfriar a temperatura ambiente. Después de agitar su contenido, colocar el tubo en un espectrofotómetro que se ha fijado a una longitud de onda de 530 nm y leer la transmitancia cuando se alcanza un estado estacionario. Este estado estacionario se observa unos pocos segundos después de agitar, cuando la lectura se mantiene constante durante 30 segundos o más. Emplear aproximadamente el mismo intervalo de tiempo para la lectura de cada tubo. Con la transmitancia fija en 100% para el blanco no inoculado, leer la transmitancia del blanco inoculado. Si la diferencia es mayor de 5% o si hay evidencia de contaminación con un microorganismo extraño, descartar los resultados de la valoración. Con la transmitancia fija en 100% para el blanco no inoculado, leer la transmitancia de cada uno de los tubos restantes. Descartar los resultados de la valoración si la pendiente de la curva estándar indica un problema de sensibilidad. Cálculos-Preparar una curva estándar de concentración-respuesta según el siguiente procedimiento. Examinar los resultados para detectar y reemplazar cualquier valor de transmitancia aberrante. Para cada nivel del estándar, calcular la respuesta a partir de la suma de los valores duplicados de las transmitancias O::) como la diferencia, y = 2,00 - L. Graficar esta respuesta en la ordenada del papel cuadriculado, contra el logaritmo de los ml de Solución de Cianocobalamina Estándar por tubo en la abscisa, usando para la ordenada una escala aritmética o logarítmica, la que produzca una mejor aproximación a una línea recta. Trazar la línea recta o la curva continua que mejor se ajuste a los puntos graficados. Calcular la respuesta, y, sumando las dos transmitancias para cada nivel de la Preparación de Valoración. Leer de la curva estándar el logaritmo del volumen de la Preparación Estándar correspondiente a cada uno de esos valores de y que estén comprendidos en el intervalo entre el punto más bajo y más alto graficados para el estándar. Restar de cada logaritmo así obtenido el logaritmo del volumen, en ml, de la Preparación de Valoración para obtener la diferencia, x, de cada nivel de dosificación. Promediar los valores de x para cada uno de tres o más niveles de dosis para obtener = M', el logaritmo de la potencia relativa de la Preparación de Valoración. Determinar la cantidad, en µg, de ER Cianocobalamina USP correspondiente a la cianocobalamina en la porción de material tomada para la valoración con la ecuación antilog M = antilog (M' + log R), en donde R es el número de µg de cianocobalamina que se supone presente en cada mg (o cápsula o tableta) del material tomado para la valoración. Repetición-Repetir toda la determinación al menos una vez, usando Preparaciones de Valoración preparadas por separado. Si la diferencia entre los dos logaritmos de las potencias M no es mayor de 0,08; su promedio, M, es el logaritmo de la potencia resultado de la valoración del material de prueba (ver Valoración de la Actividad de la Vitamina 812 en Diseño y Análisis de Valoraciones Biológicas (111 )). Si las dos determinaciones difieren en más de 0,08 hay que realizar una o más determinaciones adicionales. Del promedio de dos o más valores de M que no difieren en más de O, 15 calcular la potencia media de la preparación valorada.
x
Pruebas y Valoraciones Químicas PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN (181) IDENTIFICACIÓN-BASES ORGÁNICAS NITROGENADAS INTRODUCCIÓN El propósito de esta prueba es identificar los compuestos de aminas terciarias. Esta prueba espectroscópica tiene un grado limitado de especificidad y, por lo tanto, se debe cumplir con todas las pruebas de identificación adicionales listadas en una monografía particular para asegurar la identidad de la muestra en análisis. VALORACIÓN
244 (181) Identificación / Pruebas Químicas
USP 39
Cambio en la redacción: • PROCEDIMIENTO
Solución estándar: Disolver en un separador 50 mg del Estándar de Referencia USP correspondiente en 25 mL de ácido clorhídrico 0,01 N. Solución muestra: Dependiendo de la naturaleza de la muestra, disolver 50 mg de la sustancia a granel en análisis en 25 mL de ácido clorhídrico 0,01 N, o agitar una cantidad de tabletas reducidas a polvo o el contenido de las cápsulas, equivalente a 50 mg de la sustancia, con 25 mL de ácido clorhídrico 0,01 N durante 1O minutos. Transferir el líquido a un separador, filtrando si fuera necesario y lavando el filtro y el residuo con varias porciones pequeñas de agua. Condiciones instrumentales (Ver • Espectroscopía en el Infrarrojo Medio <854)• (AF oi-may-zo16)·) Modo: IR Intervalo de longitud de onda: 7-15 µm (1430 cm- 1 a 650 cm- 1 ) Celda: 1 mm Blanco: Disulfuro de carbono Análisis Muestras: Solución estándar y Solución muestra Tratar cada solución según se indica a continuación: Agregar 2 mL de hidróxido de sodio 1 N y 4 mL de disulfuro de carbono, y agitar durante 2 minutos. Si fuera necesario, centrifugar hasta que la fase inferior se torne transparente y pasarla a través de un filtro seco, recogiendo el filtrado en un matraz pequeño con tapón de vidrio. Determinar inmediatamente el espectro de absorción de la Solución estándar y la Solución muestra filtradas. Criterios de aceptación: El espectro de la Solución muestra debe presentar todas las bandas de absorción significativas presentes en el espectro de la Solución estándar.
(191) IDENTIFICACIÓN-PRUEBAS GENERALES Bajo este encabezado se describen las pruebas que se mencionan con frecuencia para identificar los artículos oficiales en la Farmacopea. Antes de usar cualquier ácido o base para modificar el pH de la solución muestra, asegurarse de que la sustancia agregada no interferirá con los resultados de la prueba. [NOTA-Estas pruebas no están destinadas a mezclas de sustancias, a menos que se indique específicamente.] Acetatos-Disolver aproximadamente 30 mg de la sustancia a examinar en 3 mL de agua o usar 3 mL de la solución prescrita. Ajustar el pH de la solución con hidróxido de sodio hasta alcalinizar levemente. Agregar 0,25 mL de nitrato de lantano SR. Si se produce un precipitado blanco, filtrar la solución. Agregar sucesivamente 0, 1 mL de yodo y yoduro de potasio SR 3 y O, 1 mL de amoníaco SR 2 a la solución. Si no se observa un color azul, calentar cuidadosamente hasta ebullición. En presencia de acetatos, se desarrolla un color oscuro o se produce un precipitado azul. Con soluciones neutras de acetatos, el cloruro férrico SR produce un color rojo que se elimina con la adición de ácidos minerales. Aluminio-Con hidróxido de amonio 6 N, las soluciones de sales de aluminio producen un precipitado blanco gelatinoso que es insoluble en un exceso de hidróxido de amonio 6 N. El hidróxido de sodio 1 N o el sulfuro de sodio SR producen el mismo precipitado, que se disuelve en un exceso de cualquiera de los reactivos mencionados. Amonio-Agregar 0,2 g de óxido de magnesio a la solución en análisis. Pasar una corriente de aire a través de la mezcla y dirigir el gas que escapa apenas por debajo de la superficie de una solución indicadora, preparada mezclando 1 mL de ácido clorhídrico O, 1 M y 0,05 mL de rojo de metilo SR 2. En presencia de amonio, el color de la solución indicadora cambia a amarillo. Después de dirigir el gas hacia el interior de la solución indicadora durante un periodo suficiente, agregar a la solución indicadora 1 mL de cobaltinitrito de sodio SR preparado recientemente. Con la adición de cobaltinitrito de sodio SR se produce un precipitado amarillo en presencia de amonio. Antimonio-Con el sulfuro de hidrógeno, las soluciones de compuestos de antimonio (111) fuertemente acidificadas con ácido clorhídrico producen un precipitado de sulfuro de antimonio de color anaranjado que es insoluble en hidróxido de amonio 6 N, pero que es soluble en sulfuro de amonio SR. Bario-Las soluciones de sales de bario forman un precipitado blanco con ácido sulfúrico 2 N. Este precipitado es insoluble en ácido clorhídrico y en ácido nítrico. Las sales de bario confieren un color verde amarillento a una llama no luminosa, que parece de color azul cuando se la mira a través de un vidrio verde. Benzoato-En soluciones neutras, los benzoatos forman un precipitado de color salmón con cloruro férrico SR. En soluciones moderadamente concentradas, los benzoatos producen un precipitado de ácido benzoico al acidificarse con ácido sulfúrico 2 N. Este precipitado es fácilmente soluble en éter etílico. Bicarbonato-Ver Carbonatos. Bismutos-Cuando se disuelven en un ligero exceso de ácido nítrico o ácido clorhídrico, las sales de bismuto proporcionan un precipitado blanco al diluirse con agua. Este precipitado se torna de color marrón en presencia de sulfuro de hidrógeno y el compuesto resultante se disuelve en una mezcla tibia de partes iguales de ácido nítrico y agua.
USP 39
Pruebas Químicas / (191) Identificación-Pruebas Generales 245
Bisulfitos-Ver Sulfitos. Boratos-Agregar 3 ó 4 gotas de yodo SR y 3 ó 4 gotas de solución de alcohol polivinílico (1 in 50) a 1 mL de una solución de borato, acidificada con ácido clorhídrico al tornasol: se produce un color azul intenso. Cuando a un borato se le trata con ácido sulfúrico, se le agrega metano! y se incinera la mezcla, arde con una llama de borde verde. Bromuros-Las soluciones de bromuros, con la adición gota a gota de cloro SR, liberan bromo que se disuelve en cloroformo por agitación y colorean el cloroformo de un color rojo a marrón rojizo. El nitrato de plata SR en soluciones de bromuro produce un precipitado blanco-amarillento que es insoluble en ácido nítrico y poco soluble en hidróxido de amonio 6 N. Calcio-Las soluciones de sales de calcio forman oxalatos insolubles cuando se tratan de la siguiente manera. Agregar 2 gotas de rojo de metilo SR a una solución de sal de calcio (1 en 20) y neutralizar con hidróxido de amonio 6 N. Agregar, gota a gota, ácido clorhídrico 3 N hasta que la solución sea ácida frente al indicador. Las soluciones de sales de calcio forman un precipitado blanco al agregar oxalato de amonio SR. Este precipitado es insoluble en ácido acético 6 N pero se disuelve en ácido clorhídrico. Las sales de calcio humedecidas con ácido clorhídrico proporcionan un color rojo amarillento transitorio a una llama no luminosa. Carbonatos-Los carbonatos y bicarbonatos son efervescentes en ácidos, y desprenden un gas incoloro que, cuando se hace pasar por hidróxido de calcio SR, produce inmediatamente un precipitado de color blanco. Una solución fría (1 en 20) de un carbonato soluble se colorea de rojo con fenolftaleína SR, mientras que una solución similar de bicarbonato no se modifica o sólo se colorea ligeramente. Cinc-En presencia de acetato de sodio, las soluciones de sales de cinc forman un precipitado blanco con sulfuro de hidrógeno. Este precipitado es insoluble en ácido acético, pero se disuelve con ácido clorhídrico 3 N. El sulfuro de amonio SR produce un precipitado similar en soluciones neutras y alcalinas. Con ferrocianuro de potasio SR, las sales de cinc en solución forman un precipitado blanco que es insoluble en ácido clorhídrico 3 N. Citratos-Agregar algunos mg de sal de citrato disueltos o suspendidos en 1 mL de agua, a 15 mL de piridina, y agitar. Agregar 5 mL de anhídrido acético a esta mezcla y agitar: se produce un color rojo claro. Cloratos-Las soluciones de cloratos no producen un precipitado con nitrato de plata SR. La adición de ácido sulfuroso a esta mezcla produce un precipitado blanco que es insoluble en ácido nítrico, pero que es soluble en hidróxido de amonio 6 N. Al incinerarlos, los cloratos producen cloruros que se identifican mediante las pruebas correspondientes. Cuando se agrega ácido sulfúrico a un clorato seco, éste crepita y desprende un gas amarillo verdoso. [Precaución-Emplear sólo una pequeña cantidad de clorato para esta prueba
y extremar las precauciones para realizarla.]
Cloruros-Con nitrato de plata SR, las soluciones de cloruros producen un precipitado blanco, grumoso, que es insoluble en ácido nítrico pero soluble en un ligero exceso de hidróxido de amonio 6 N. Cuando se analizan clorhidratos de aminas (incluidos los alcaloides) que no responden a la prueba anterior, agregar una gota de ácido nítrico diluido y 0,5 mL de nitrato de plata SR a una solución de la sustancia que está siendo examinada que contenga, a menos que se indique algo diferente en la monografía, aproximadamente 2 mg de ión cloruro en 2 mL: se forma un precipitado blanco, grumoso. Centrifugar la mezcla sin demora y decantar la capa sobrenadante. Lavar el precipitado con tres porciones de 1 mL de solución de ácido nítrico (1 en 100) y desechar los lavados. Agregar amoníaco SR gota a gota a este precipitado. Se disuelve rápidamente. Cuando una monografía especifica que un artículo responde a la prueba para cloruros secos, mezclar el sólido que se va a analizar con un peso igual de dióxido de manganeso, humedecer con ácido sulfúrico y calentar moderadamente la mezcla: se produce cloro, que es reconocible por la producción de un color azul con papel de yoduro-almidón humedecido. Cobalto-Las soluciones de sales de cobalto (1 en 20) en ácido clorhídrico 3 N producen un precipitado rojo cuando la mezcla se calienta en un baño de vapor, con un volumen igual de una solución caliente, recién preparada, de 1-nitroso-2naftol (1 en 1O) en ácido acético 9 N. Las soluciones de sales de cobalto, cuando se saturan con cloruro de potasio y se tratan con nitrito de potasio y ácido acético, producen un precipitado amarillo. Cobre-Las soluciones de compuestos cúpricos acidificadas con ácido clorhídrico, depositan una película roja de cobre metálico sobre una superficie de hierro brillante y no oxidado. Un exceso de hidróxido de amonio 6 N, agregado a una solución de una sal cúprica, produce al principio un precipitado azulado y posteriormente una solución de color azul intenso. Las soluciones de sales cúpricas con ferrocianuro de potasio SR producen un precipitado de color marrón rojizo insoluble en ácidos diluidos. Fosfatos-[NOTA-Cuando la monografía especifica la prueba de identificación de Fosfatos, utilizar las pruebas para ortofosfatos, a menos que las instrucciones especifiquen que se deben emplear las pruebas para pirofosfatos o que se debe incinerar el producto antes de realizar la prueba.] Con nitrato de plata SR, las soluciones neutras de ortofosfatos producen un precipitado amarillo que es soluble en ácido nítrico 2 N y en hidróxido de amonio 6 N. Con molibdato de amonio SR, las soluciones acidificadas de ortofosfatos producen un precipitado amarillo que es soluble en hidróxido de amonio 6 N. Este precipitado puede tardar en formarse. Con nitrato de plata SR, los pirofosfatos obtenidos por incineración producen un precipitado blanco que es soluble en ácido nítrico 2 N y en hidróxido de amonio 6 N. Con molibdato de amonio SR se forma un precipitado amarillo que es soluble en hidróxido de amonio 6 N. Hierro-Los compuestos férricos y ferrosos en solución producen un precipitado negro con sulfuro de amonio SR. Este precipitado se disuelve en presencia de ácido clorhídrico 3 N frío con desprendimiento de sulfuro de hidrógeno. Sales Férricas-Las soluciones ácidas de sales férricas producen un precipitado azul oscuro con ferrocianuro de potasio SR. Con un exceso de hidróxido de sodio 1 N, se forma un precipitado marrón rojizo. Con tiocianato de amonio SR, las soluciones de sales férricas producen un color rojo intenso que no se elimina con el agregado de ácidos minerales diluidos.
246 (191) Identificación-Pruebas Generales / Pruebas Químicas
USP 39
Sales Ferrosas-Las soluciones de sales ferrosas producen un precipitado azul oscuro con ferricianuro de potasio SR. Este precipitado es insoluble en ácido clorhídrico 3 N pero se descompone con hidróxido de sodio 1 N. Las soluciones de sales ferrosas con hidróxido de sodio 1 N producen un precipitado blanco-verdoso que cambia de color rápidamente a verde y luego, cuando se agita, se torna marrón. Hipofosfitos-Cuando se los calienta enérgicamente, los hipofosfitos desprenden fosfina que es espontáneamente inflamable. Los hipofosfitos en solución producen un precipitado blanco con cloruro mercúrico SR. Este precipitado se torna gris ante la presencia de un exceso de hipofosfito. Las soluciones de hipofosfitos, acidificadas con ácido sulfúrico y calentadas con sulfato cúprico SR, producen un precipitado rojo. Lactatos-Cuando las soluciones de lactatos se acidifican con ácido sulfúrico, se les agrega permanganato de potasio SR y se calienta la mezcla, desprenden acetaldehído. Éste se puede detectar al permitir que los vapores entren en contacto con un papel de filtro humedecido con una mezcla recién preparada de volúmenes iguales de solución acuosa de morfolina al 20% y de nitroferricianuro de sodio SR: se produce un color azul. Litio-Con carbonato de sodio SR, las sales de litio en soluciones moderadamente concentradas, alcalinizadas con hidróxido de sodio, producen un precipitado blanco al llevarlas a ebullición. El precipitado es soluble en cloruro de amonio SR. Las sales de litio humedecidas con ácido clorhídrico proporcionan un color carmesí intenso a una llama no luminosa. Las soluciones de sales de litio no precipitan en ácido sulfúrico 2 N o sulfatos solubles (a diferencia del estroncio). Magnesio-Las soluciones de sales de magnesio en presencia de cloruro de amonio producen solamente un precipitado ligeramente turbio cuando se neutralizan con carbonato de amonio SR, pero con la adición posterior de fosfato dibásico de sodio SR producen un precipitado blanco cristalino, insoluble en hidróxido de amonio 6 N. Manganeso-Con sulfuro de amonio SR, las soluciones de sales manganosas producen un precipitado color salmón que se disuelve en ácido acético. Mercurio-Cuando se aplican sobre una lámina de cobre brillante, las soluciones de sales de mercurio, exentas de un exceso de ácido nítrico, producen un precipitado que, al frotarlo, adquiere una apariencia plateada y brillante. Con sulfuro de hidrógeno, las soluciones de compuestos de mercurio producen un precipitado negro que es insoluble en sulfuro de amonio SR y en ácido nítrico 2 N en ebullición. Sales Mercúricas-las soluciones de sales mercúricas producen un precipitado amarillo con hidróxido de sodio 1 N. En soluciones neutras con yoduro de potasio SR, también producen un precipitado escarlata que es muy soluble en un exceso de reactivo. Sales Mercuriosos-los compuestos mercuriosos se descomponen en hidróxido de sodio 1 N y producen un color negro. Con ácido clorhídrico, las soluciones de sales mercuriosas producen un precipitado blanco que se ennegrece con hidróxido de amonio 6 N. Con yoduro de potasio SR producen un precipitado amarillo que, al quedar en reposo, puede tornarse verde. Nitratos-Cuando una solución de nitrato se mezcla con un volumen igual de ácido sulfúrico, se enfría la mezcla y se superpone una solución de sulfato ferroso, se desarrolla un color marrón en la unión de los dos líquidos. Cuando se calienta un nitrato con ácido sulfúrico y cobre metálico, se desprenden humos de color rojo amarronado. Los nitratos no decoloran el permanganato de potasio SR acidificado (a diferencia de los nitritos). Nitritos-Cuando se los trata con ácidos minerales diluidos o con ácido acético 6 N, los nitritos desprenden humos de color rojo-amarronado. Las soluciones colorean de azul el papel de almidón-yoduro. Oxalatos-Las soluciones neutras y alcalinas de oxalatos forman un precipitado blanco con cloruro de calcio SR. Este precipitado es insoluble en ácido acético 6 N pero se disuelve con ácido clorhídrico. Las soluciones de oxalatos acidificadas y calientes decoloran el permanganato de potasio SR. Permanganatos-Las soluciones de permanganatos acidificadas con ácido sulfúrico se decoloran con peróxido de hidrógeno SR y con bisulfito de sodio SR en frío y con ácido oxálico SR en solución caliente. Peróxidos-Las soluciones de peróxidos acidificadas ligeramente con ácido sulfúrico proporcionan un color azul intenso con la adición de dicromato de potasio SR. Si la mezcla se agita con un volumen igual de éter etílico y se deja que se separen los líquidos, el color azul se encuentra en la capa de éter etílico. Plata-Con ácido clorhídrico, las soluciones de sales de plata producen un precipitado grumoso, blanco, que es insoluble en ácido nítrico pero fácilmente soluble en hidróxido de amonio 6 N. Una solución de una sal de plata a la que se le agrega hidróxido de amonio 6 N y una pequeña cantidad de formaldehído SR, al entibiarla, deposita un espejo de plata metálica en las paredes del recipiente. Plomo-Las soluciones de sales de plomo con ácido sulfúrico 2 N producen un precipitado blanco que es insoluble en ácido clorhídrico 3 N o en ácido nítrico 2 N, pero que es soluble en hidróxido de sodio 1 N tibio y en acetato de amonio SR. Con cromato de potasio SR, las soluciones de sales de plomo, exentas o casi exentas de ácidos minerales, producen un precipitado amarillo que es insoluble en ácido acético 6 N pero que es soluble en hidróxido de sodio 1 N. Potasio-Los compuestos de potasio confieren un color violeta a una llama no luminosa, pero la presencia de pequeñas cantidades de sodio enmascara el color a menos que el color amarillo producido por el sodio se elimine con un filtro azul que bloquee la emisión a 589 nm (sodio) pero que sea transparente a la emisión a 404 nm (potasio). Tradicionalmente se ha usado vidrio cobalto, pero también hay otros filtros satisfactorios que están disponibles comercialmente. En soluciones neutras, concentradas o moderadamente concentradas, de sales de potasio (dependiendo de la solubilidad y del contenido de potasio), el bitartrato de sodio SR produce un precipitado blanco cristalino que es soluble en hidróxido de amonio 6 N y en soluciones de hidróxidos alcalinos y carbonatos alcalinos. La formación del precipitado, que usualmente es lenta, se acelera al agitar o frotar
Pruebas Químicas/
USP 39
(193) ldentificación-Tetraciclinas 247
el interior del tubo de ensayo con una varilla de vidrio. La adición de una pequeña cantidad de ácido acético glacial o alcohol también favorece la precipitación. Salicilatos-En soluciones moderadamente diluidas de salicilatos, el cloruro férrico SR produce un color violeta. La adición de ácidos a soluciones moderadamente concentradas de salicilatos produce un precipitado blanco cristalino de ácido salicílico, que se funde entre 158º y 161 º. Sodio-A menos que se especifique algo diferente en una monografía individual, preparar una solución que contenga O, 1 g del compuesto de sodio en 2 mL de agua. Agregar 2 mL de carbonato de potasio al 15% y calentar hasta ebullición. No se forma precipitado. Agregar 4 mL de piroantimoniato de potasio SR y calentar hasta ebullición. Dejar que se enfríe en agua helada y, si fuera necesario, frotar el interior del tubo de ensayo con una varilla de vidrio. Se forma un precipitado denso. Los compuestos de sodio confieren un intenso color amarillo a una llama no luminosa. Sulfatos-Las soluciones de sulfatos con cloruro de bario SR producen un precipitado blanco que es insoluble en ácido clorhídrico y en ácido nítrico. Con acetato de plomo SR, las soluciones neutras de sulfatos forman un precipitado blanco que es soluble en acetato de amonio SR. El ácido clorhídrico no produce precipitado cuando se agrega a las soluciones de sulfatos (a diferencia de los tiosulfatos). Sulfitos-Cuando se los trata con ácido clorhídrico 3 N, los sulfitos y bisulfitos desprenden dióxido de azufre que ennegrece el papel de filtro humedecido con nitrato mercurioso SR. Tartratos-Disolver algunos mg de sal de tartrato en 2 gotas de solución de metaperyodato de sodio (1 en 20). Agregar 1 gota de ácido sulfúrico 1 N y después de 5 minutos, agregar algunas gotas de ácido sulfuroso seguido de algunas gotas de ácido sulfuroso-fucsina SR: se produce un color rosado rojizo dentro de los 15 minutos. Tiocianatos-Con cloruro férrico SR, las soluciones de tiocianato producen un color rojo que no se elimina con ácidos minerales moderadamente concentrados. Tiosulfatos-Con ácido clorhídrico, las soluciones de tiosulfatos producen un precipitado de color blanco que se torna amarillo rápidamente y dióxido de azufre, que ennegrece el papel de filtro humedecido con nitrato mercurioso SR. La adición de cloruro férrico SR a las soluciones de tiosulfatos produce un color violeta oscuro que desaparece rápidamente. Yoduros-Las soluciones de yoduros, con la adición de cloro SR gota a gota, liberan yodo que colorea la solución de amarillo a rojo. Si esta solución se agita con cloroformo, éste se torna de color violeta. El yodo así liberado proporciona un color azul con almidón SR. El nitrato de plata SR, en soluciones de yoduros, produce un precipitado amarillo grumoso, que es insoluble en ácido nítrico y en hidróxido de amonio 6 N.
(193) IDENTIFICACIÓN-TETRACICLINAS Los procedimientos cromatográficos descritos a continuación se suministran para confirmar la identidad de los fármacos de la Farmacopea que son del tipo tetraciclina, como por ejemplo la doxiciclina, oxitetraciclina y tetraciclina, y para confirmar la identidad de dichos compuestos en sus respectivas formas farmacéuticas de la Farmacopea. Se describen dos procedimientos, uno basado en cromatografía en papel (Método/) y otro en cromatografía en capa delgada (Método 11). Utilizar el Método/ a menos que se especifique algo diferente en la monografía individual. Solución Estándar-A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, disolver el Estándar de Referencia USP del fármaco que se quiere identificar en el mismo disolvente y con la misma concentración que los utilizados para la Solución de Prueba. Solución de Prueba-Preparar según se indica en la monografía individual correspondiente.
MÉTODO 1 Solución amortiguadora de pH 3,5 -Disolver 13,4 g de ácido cítrico anhidro y 16,3 g de fosfato dibásico de sodio en
1000 mL de agua y mezclar. Fase Móvil-El día de la prueba, mezclar 1O volúmenes de cloroformo, 20 volúmenes de nitrometano y 3 volúmenes de piridina. Solución de Prueba Mezclada-Mezclar volúmenes iguales de la Solución Estándar y de la Solución de Prueba. Hoja Cromatográfica-Trazar una línea de aplicación a 2,5 cm de uno de los bordes de una hoja de papel de filtro, (Whatman No. 1, o equivalente) de 20 cm x 20 cm. Impregnar la hoja pasándola a través de una cuba con Solución amortiguadora de pH 3,5, eliminar el exceso de disolvente presionando con firmeza la hoja entre papeles secantes no fluorescentes. Procedimiento-En una cámara cromatográfica adecuada preparada para cromatografía ascendente (ver Cromatografía (621 )), colocar Fase Móvil hasta una altura de 0,6 cm. Aplicar 2 µL de la Solución Estándar, 2 µL de la Solución de Prueba y 2 µL de la Solución de Prueba Mezclada a intervalos de 1,5 cm sobre la línea de aplicación de la Hoja Cromatográfica. Dejar que la hoja se seque parcialmente y, mientras aún esté húmeda, colocarla en la cámara cromatográfica con el borde inferior en contacto con la Fase Móvil. Cuando el frente de la fase móvil haya recorrido aproximadamente 1O cm, retirar la hoja de la cámara y exponerla a vapores de amoníaco. Examinar el cromatograma bajo luz UV de longitud de onda larga. Registrar las posiciones
248 (193) ldentificación-Tetraciclinas / Pruebas Químicas
USP 39
de las manchas amarillas fluorescentes principales: el valor Rr de la mancha principal obtenida a partir de la Solución de Prueba y de la Solución de Prueba Mezclada se corresponde con el de la mancha obtenida de la Solución Estándar.
MÉTODO 11 Solución de Resolución-A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, preparar una solución en metanol que contenga 0,5 mg de ER Clorhidrato de Clortetraciclina USP, 0,5 mg de ER Hiclato de Doxiciclina USP, 0,5 mg de ER Oxitetraciclina USP y 0,5 mg de ER Clorhidrato de Tetraciclina USP por ml. Fase Móvil-Preparar una mezcla de ácido oxálico 0,5 M, previamente ajustado con hidróxido de amonio a un pH de 2,0, acetonitrilo y metanol (80:20:20). Placa Cromatográfica-Utilizar una placa para cromatografía en capa delgada adecuada (ver Cromatografía en Capa Delgada en Cromatografía (621 )) recubierta con una capa de 0,25 mm de mezcla de gel de sílice octilsilanizada para cromatografía. Activar la placa calentándola a 130º durante 20 minutos, dejar que se enfríe y utilizarla mientras aún esté tibia. Procedimiento-Aplicar por separado 1 µL de la Solución Estándar, 1 µL de la Solución de Prueba y 1 µL de la Solución de Resolución a la Placa para Cromatografía. Dejar que las aplicaciones se sequen y desarrollar el cromatograma en la Fase Móvil hasta que el frente de la fase móvil haya recorrido aproximadamente tres cuartos de la longitud de la placa. Retirar la placa de la cámara de desarrollo, marcar el frente de la fase móvil y dejar que la placa se seque al aire. Exponer la placa a vapores de amoníaco durante 5 minutos y localizar rápidamente las manchas en la placa observándola bajo luz UV de longitud de onda larga: el cromatograma de la Solución de Resolución presenta manchas bien separadas y el valor Rr, la intensidad y el aspecto de la mancha principal obtenida de la Solución de Prueba se corresponden con los de la mancha obtenida de la Solución Estándar.
(197) PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA
Las pruebas espectrofotométricas son las de mayor importancia en la identificación de muchas de las sustancias químicas del compendio. Los procedimientos de se indican a continuación se a sustancias absorben radiación infraultravioleta (UV) (ver :11,;MllllM~\'1~~!1'~il•li~illil~~-llll!IBllll!irmílllllllll!llll~f~lll!li~~
lñll~l~lil~~j)
espectro de absorción IR de una sustancia, en comparación con el que se obtuvo concomitantemente para el Estándar de Referencia USP correspondiente, proporciona quizá la evidencia más concluyente de la identidad de la sustancia, que puede obtenerse en una sola prueba. El espectro de absorción UV, por otro lado, no presenta un alto grado de especificidad. La conformidad con las especificaciones de prueba referentes tanto para la absorción IR como con la absorción UV, según se indica en una gran proporción de monografías oficiales, deja pocas dudas, si las hubiera, con respecto a la identidad de la muestra que se está examinando.
ABSORCIÓN EN EL INFRARROJO Se indican siete métodos para la preparación de muestras de prueba y Estándares de Referencia previamente secados para el análisis. La referencia (197K) en una monografía significa que la sustancia que se está examinando se mezcla íntimamente con bromuro de potasio. La referencia (l 97M) en una monografía significa que la sustancia que se está examinando se muele finamente y se dispersa en aceite mineral. La referencia (197F) en una monografía significa que la sustancia que se está examinando se suspende pura entre placas adecuadas (por ejemplo, de cloruro de sodio o bromuro de potasio). La referencia (1975) significa que se prepara una solución de concentración especificada en el disolvente especificado en la monografía individual, y que la solución se examina en celdas de O, 1 mm, a menos que se especifique una longitud de paso diferente para las celdas en la monografía individual. La referencia (197A) significa que la sustancia que se está examinando está en contacto íntimo con un elemento de reflexión interna para el análisis de reflectancia total atenuada (ATR, por sus siglas en inglés). La referencia (l 97E) significa que la sustancia que se está analizando se presiona como una muestra muy delgada contra una placa adecuada para el microanálisis IR. La referencia (l 97D) en una monografía significa que la sustancia que se está examinando se mezcla íntimamente con un material transparente para IR y se transfiere a un recipiente de muestra para análisis por reflexión difusa (DR, por sus siglas en inglés). Las técnicas ATR (l 97A) y (197E) pueden usarse como métodos alternativos para (l 97K), (l 97M), (l 97F) y (1975) cuando la prueba se realiza cualitativamente y los espectros del Estándar de Referencia se obtienen de manera similar. Registrar los espectros de la muestra de prueba y el correspondiente Estándar de Referencia USP en el intervalo de aproximadamente 2,6 µm a 15 µm (3800 cm-1 a 650 cm-1) a menos que se especifique algo diferente en la monografía individual. El espectro de absorción IR de la preparación obtenida a partir de la muestra de prueba, previamente secada bajo las condiciones
USP 39
Pruebas Químicas/ (201) Prueba de Identificación por Cromatografía en Capa Delgada 249
especificadas para el Estándar de Referencia correspondiente, a menos que se especifique algo diferente, o que el Estándar de Referencia se emplee sin secar, presenta máximos sólo a las mismas longitudes de onda que el de una preparación similar del Estándar de Referencia USP correspondiente. Las diferencias que pueden observarse en los espectros así obtenidos a veces se atribuyen a la presencia de polimorfos, lo cual no es siempre aceptable (ver Procedimiento en Por lo tanto, a menos que se especifique algo difeaparece una diferencia en los espectros IR del analito y del rente en la monografía individual, continuar del siguiente estándar, disolver porciones iguales de la muestra de prueba y del Estándar de Referencia en volúmenes iguales de un disolvente apropiado, evaporar la solución hasta sequedad en envases similares, bajo condiciones idénticas, y repetir la prueba con los residuos.
ABSORCIÓN EN EL ULTRAVIOLETA La referencia (197U) en una monografía significa que una solución de prueba y una Solución estándar se examinan espectrofotométricamente, en celdas de 1 cm, sobre el intervalo espectral de 200 nm a 400 nm, a menos que se especifique algo diferente en la monografía individual. Disolver una porción de la sustancia que se está examinando en el Medio especificado para obtener una solución de prueba que tenga la concentración especificada en la monografía para Solución. En forma similar, preparar una Solución Estándar que contenga el Estándar de Referencia USP correspondiente. Registrar y comparar los espectros obtenidos concomitantemente para la solución de prueba y la Solución Estándar. Calcular los cocientes de absortividad y/o absorbancia si estos criterios están incluidos en una monografía individual. A menos que se especifique algo diferente, las absorbancias indicadas para estos cálculos son aquellas medidas a la absorbancia máxima, aproximadamente a la longitud de onda especificada en la monografía individual. Cuando la absorbancia se deba medir aproximadamente a la longitud de onda especificada en lugar de la máxima absorbancia, las abreviaturas (min) y (sh) se utilizan para indicar un mínimo y un hombro (shoulder), respectivamente, en un espectro de absorción. Los requisitos se cumplen si los espectros de absorción UV de la solución de prueba y de la Solución Estándar presentan máximos y mínimos a las mismas longitudes de onda y los cocientes de absortividad y/o absorbancia están dentro de los límites especificados.
(201) PRUEBA DE IDENTIFICACIÓN POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA PROCEDIMIENTO GENERAL El procedimiento descrito a continuación tiene como fin verificar la identificación de muchos fármacos farmacopeicos y de sus formas farmacéuticas correspondientes. Preparar una solución de prueba según las indicaciones de la monografía individual correspondiente. En una placa para cromatografía en capa delgada adecuada, recubierta con una capa de mezcla de gel de sílice para cromatografía de 0,25 mm (ver Cromatografía (621 )), aplicar, en una línea paralela al borde y aproximadamente a 2 cm, 1O µL de esta solución y 1O µL de una Solución estándar; preparada a partir del Estándar de Referencia USP del fármaco que se quiere identificar, en el mismo disolvente y a la misma concentración que para la solución de prueba, a menos que se especifique algo diferente en la monografía individual. Dejar que se sequen las aplicaciones y desarrollar el cromatograma con una fase móvil constituida por una mezcla de cloroformo, metanol y agua (180:15:1 ), a menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, hasta que el frente de la fase móvil haya recorrido aproximadamente tres cuartos de la longitud de la placa. Retirar la placa de la cámara de desarrollo, marcar el frente de la fase móvil y dejar que el disolvente se evapore. A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, localizar las manchas de la placa examinándolas bajo luz UV de longitud de onda corta. El valor RF de la mancha principal obtenida a partir de la solución de prueba se corresponde con el obtenido a partir de la Solución estándar.
PROCEDIMIENTO PARA BACITRACINA, NEOMICINA Y POLIMIXINA B El procedimiento de cromatografía en capa delgada descrito a continuación tiene como fin verificar la identificación de los ingredientes activos bacitracina, neomicina y polimixina By en sus formas farmacéuticas cuando se encuentran presentes de forma aislada o en mezclas de dos o tres componentes. La referencia (201 BNP) en una monografía indica que éste es el procedimiento a seguir. Preparar una Solución de Prueba según se indica a continuación, a menos que se especifique algo diferente en la monografía individual.
250 (201) Prueba de Identificación por Cromatografía en Capa Delgada / Pruebas Químicas
USP 39
Solución de PruebaPARA FÁRMACOS-Disolver una porción de Bacitracina, Bacitracina Cinc, Sulfato de Neomicina o Sulfato de Polimixina Ben ácido clorhídrico O, 1 N para obtener una solución que contenga 500 Unidades USP de Bacitracina por mL, 3,5 mg de neomicina (base) por mL, o 1O000 Unidades USP de Polimixina B por ml. PARA SOLUCIONES-Si la Solución contiene neomicina y polimixina B, diluir una porción de solución con ácido clorhídrico O, 1 N para obtener una solución que contenga, aproximadamente, la cantidad equivalente a 3,5 mg de neomicina (base) por ml. Si la Solución contiene polimixina B pero no neomicina, diluir una porción de solución con ácido clorhídrico O, 1 N para obtener una solución que contenga aproximadamente 1O000 Unidades USP de Polimixina B por mL. PARA CREMAS, LOCIONES Y UNGÜENTOS-Si la Crema, la Loción o el Ungüento contiene Bacitracina o Bacitracina Cinc, transferir una porción que equivalga aproximadamente a 500 Unidades USP de Bacitracina a un tubo de centrífuga de 15 mL. Si la Crema, la Loción o el Ungüento contiene neomicina pero no contiene Bacitracina ni Bacitracina Cinc, transferir una porción que equivalga aproximadamente a 3,5 mg de neomicina (base) por mL a un tubo de centrífuga de 15 ml. Agregar 4 mL de cloroformo al tubo de centrífuga y agitar bien para dispersar la Crema, la Loción o el Ungüento. Agregar 1 mL de ácido clorhídrico O, 1 N, mezclar en un mezclador por vórtice durante 4 minutos, centrifugar y usar el sobrenadante transparente. NOTA-En el Procedimiento Modificado se puede usar la Solución de Prueba Modificada preparada según se indica a continuación en lugar de la Solución de Prueba. Solución de Bacitracina Estándar-Disolver una porción de ER Bacitracina Cinc USP en ácido clorhídrico O, 1 N para obtener una solución que contenga 500 Unidades USP de Bacitracina por ml. Solución de Neomicina Estándar-Disolver una porción de ER Sulfato de Neomicina USP en ácido clorhídrico O, 1 N para obtener una solución que contenga el equivalente a 3,5 mg de neomicina (base) por ml. Solución de Polimixina B Estándar-Disolver una porción de ER Sulfato de Polimixina B USP en ácido clorhídrico O, 1 N para obtener una solución que contenga 1O000 Unidades USP de Polimixina B por ml. Si el artículo en análisis también contiene Bacitracina o Bacitracina Cinc, disolver una porción de ER Sulfato de Polimixina B USP en ácido clorhídrico O, 1 N para obtener una solución que contenga 500} Unidades USP de Polimixina B por mL, donde j es el cociente entre las cantidades de Unidades USP de Polimixina By de Unidades USP de Bacitracina declaradas en la etiqueta por g de Crema, Loción o Ungüento. Fase Móvil-Preparar una mezcla de metano!, alcohol isopropílico, cloruro de metileno, hidróxido de amonio y agua
(4:2:2:2:1,5). Procedimiento-Aplicar 1O µL de Solución de prueba y 1O µL de cada una de las Soluciones Estándar que corresponda a una placa para cromatografía en capa delgada adecuada (ver Cromatografía (621 )), recubierta con una capa de gel de sílice para cromatografía de 0,25 mm de espesor. Colocar la placa en una cámara cromatográfica presaturada y desarrollar los cromatogramas con la Fase Móvil hasta que el frente de la fase móvil haya recorrido aproximadamente tres cuartos de la longitud de la placa. Retirar la placa de la cámara y secar a 105º durante 1O minutos. Rociar la placa con una solución al 0,2% de ninhidrina en alcohol butílico y calentarla a 105º durante 5 minutos. El valor Rr de cada mancha principal en el cromatograma de la Solución de Prueba se corresponde con el de la mancha principal en el cromatograma obtenido a partir de cada Solución Estándar que corresponda según el o los ingredientes activos declarados en la etiqueta. Si el cromatograma de la Solución de Prueba presenta demasiadas bandas, proceder según se indica en el Procedimiento Modificado. Procedimiento Modificado-Transferir la Solución de Prueba a un tubo de centrífuga de 15 mL, agregar 1O mL de solución acuosa de ácido pícrico saturada (1,2%, p/v), mezclar en un mezclador por vórtice durante 1 minuto, centrifugar durante 1 O minutos y desechar el sobrenadante. Lavar el residuo con porciones de agua de 1 mL hasta que no se observe color amarillo en el lavado. Desechar los lavados y secar el residuo bajo una corriente de nitrógeno a 50º. Disolver el residuo en 1 mL de acetona, agregar 1 mL de una solución de ácido sulfúrico en acetona (1 en 100) recién preparada, agitar, centrifugar durante 5 minutos y desechar el sobrenadante. Enjuagar el residuo con 1 mL de acetona, centrifugar brevemente y desechar el lavado. Repetir el lavado hasta que no se observe color amarillo. Secar el residuo bajo una corriente de nitrógeno a 50º. Disolver el residuo en 0,5 mL de ácido clorhídrico O, 1 N (Solución de Prueba Modificada). Repetir el Procedimiento utilizando esta Solución de Prueba Modificada en lugar de la Solución de Prueba. El valor Rr de cada mancha principal en el cromatograma de la Solución de Prueba Modificada se corresponde con el de la mancha principal en el cromatograma obtenido a partir de cada Solución Estándar que corresponda según el o los ingredientes activos declarados en la etiqueta.
(202) IDENTIFICACIÓN DE ACEITES FIJOS POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA INTRODUCCIÓN El siguiente procedimiento para la prueba de Identificación de la USP se usa para identificar aceites fijos usando cromatografía en capa delgada de alta resolución (HPTLC), con un gel de sílice octadecilsilanizado adecuado como sustancia de recubrimiento.
USP 39
Pruebas Químicas / (202) Identificación de Aceites Fijos 251
IDENTIFICACIÓN
1 Fase móvil 1: Éter etílico Fase móvil 2: Cloruro de metileno, ácido acético glacial y acetona (20:40:50) Solución de aptitud del sistema 1: Disolver aproximadamente 20 mg (1 gota) de ER Aceite de Maíz USP en 3 mL de cloruro de metileno. Solución de aptitud del sistema 2: Disolver aproximadamente 20 mg (1 gota) de ER Aceite de Oliva USP en 3 mL de cloruro de metileno. Solución estándar: Disolver aproximadamente 20 mg (1 gota) del Estándar de Referencia USP apropiado en 3 mL de doruro de metileno. Solución muestra: Disolver aproximadamente 20 mg (1 gota) de una muestra de aceite fijo en 3 mL de cloruro de metileno. Sistema cromatográfico (Ver Cromatografía (621 ), Cromatografía en Capa Delgada.) Modo: HPTLC Placa: 20 cm x 1 O cm, capa de geJ de sílice 60 RP-18 de O, 15-0,2 mm, con un tamaño de partícula de 4-8 µm 1 Volumen de aplicación: 1 µL, aplicación manual Solución reveladora: 100 mg/mL de ácido fosfomolíbdico en alcohol al 96% Aptitud del sistema Muestras: Solución de aptitud del sistema 7 y Solución de aptitud del sistema 2 Requisitos de aptitud Resolución: Las cuatro manchas principales de aceite de maíz están claramente identificadas y separadas, al igual que las dos manchas principales de aceite de oliva. [NOTA-Los factores de retardo (Rr) se proveen sólo para propósitos informativos para ayudar en la identificación de las manchas. Los valores Rr de las cuatro manchas principales de ER Aceite de Maíz USP son 0,39; 0,45; 0,51 y 0,56, y los valores Rr de las dos manchas principales del ER Aceite de Oliva USP son 0,39 y 0,45.] Análisis Muestras: Solución estándar y Solución muestra Aplicar las Muestras en bandas separadas en el punto de inicio previamente marcado en una placa para HPTLC y desarrollar la placa en el orden siguiente: (1) Asegurar que las aplicaciones estén al menos 3 mm por encima de la superficie de la fase móvil. Desarrollar dos veces a lo largo de un recorrido de 0,5 cm usando la Fase móvil 7. Retirar la placa de la cámara después de cada corrida y dejar que la placa se seque al aire. (2) Desarrollar dos veces a lo largo de un recorrido de 8 cm usando la Fase móvil 2. Dejar que la placa se seque durante aproximadamente 5 minutos después de cada desarrollo y antes de rociar con la solución reveladora. Rociar la placa con la Solución reveladora. Calentar la placa a 120º durante aproximadamente 1 minuto y observar bajo luz diurna. Criterios de aceptación: Los valores Rr de las manchas principales de la Solución muestra corresponden a los de la Solución
• MÉTODO
estándar. • MÉTODO 11
Fase móvil: Cloruro de metileno, ácido acético glacial y acetona (20:40:50) Solución de aptitud del sistema 1: Disolver 25 µL de ER Aceite de Maíz USP en 3 mL de cloruro de metileno. Solución de aptitud del sistema 2: Disolver 25 µL de ER Aceite de Oliva USP en 3 mL de cloruro de metileno. Solución estándar: Disolver 25 µL del Estándar de Referencia USP apropiado en 3 mL de cloruro de metileno. Solución muestra: Disolver 25 µL de una muestra de aceite fijo en 3 mL de cloruro de metileno. Sistema cromatográfico (Ver Cromatografía (621 ), Cromatografía en Capa Delgada.) Modo: HPTLC Placa: 20 cm x 1 O cm, capa de gel de sílice 60 RP 18 (o RP-18 F254 ) de O, 15-0,2 mm, con un tamaño de partícula de 4-8 µm Acondicionamiento de la placa: Acondicionar la placa a una humedad relativa de aproximadamente 33%. Volumen de aplicación: 2 µLen bandas de 8 mm. Se usa un aparato automatizado adecuado. Solución reveladora: 25 mg/mL de ácido fosfomolíbdico en alcohol al 96% Aptitud del sistema Muestras: Solución de aptitud del sistema 7 y Solución de aptitud del sistema 2 Requisitos de aptitud Resolución: Las cuatro bandas principales de aceite de maíz están claramente identificadas y separadas, al igual que las dos bandas principales de aceite de oliva.
1 Placa de Gel de Sílice para HPTLC 60 RP-18 de Merck EMD o equivalente.
252 (202) Identificación de Aceites Fijos / Pruebas Químicas
USP 39
[NOTA-Los factores de retardo (RF) se proveen sólo para propósitos informativos para ayudar en la identificación de las bandas. Los valores RF de las cuatro bandas principales del ER Aceite de Maíz USP son 0,20; 0,26; 0,30 y 0,34, y los valores RF para las dos bandas principales del ER Aceite de Oliva USP son 0,20 y 0,26.] Análisis Muestras: Solución estándar y Solución muestra Desarrollar previamente la placa con cloruro de metileno hasta el borde superior. Secar la placa a 120º durante 1 O minutos. Aplicar las Muestras en bandas separadas en el punto de inicio previamente marcado en una placa para HPTLC. Asegurar que las bandas estén al menos 3 mm por encima de la superficie de la fase móvil. Desarrollar durante un recorrido de 7 cm usando la Fase móvil. Dejar que la placa se seque al aire. Tratar la placa con la Solución reveladora. Calentar la placa a 120º durante 3 minutos y observar bajo luz diurna. Criterios de aceptación: Los valores RF de las bandas principales de la Solución muestra corresponden a los de la Solución estándar.
REQUISITOS ADICIONALES • ESTÁNDARES DE REFERENCIA USP (11)
ER Aceite ER Aceite ER Aceite ER Aceite ER Aceite ER Aceite ER Aceite ER Aceite ER Aceite ER Aceite ER Aceite ER Aceite ER Aceite ER Aceite
de de de de de de de de de de de de de de
Almendra USP Semilla de Borraja USP Canola USP Maíz USP Semilla de Algodón USP Onagra USP Semilla de Lino USP Oliva USP Palma USP Cacahuate USP Cártamo USP Sésamo USP Soja USP Girasol USP
(203) PROCEDIMIENTO DE CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA DE ALTA RESOLUCIÓN PARA IDENTIFICACIÓN DE ARTÍCULOS DE ORIGEN BOTÁNICO INTRODUCCIÓN Este capítulo describe un procedimiento para uso en una prueba de Identificación de la USP que se basa en la técnica de cromatografía en capa delgada de alta resolución (HPTLC). Se aplica a la identificación de artículos de origen botánico en los compendios USP que sirven como fármaco o medicamento, o como ingrediente dietético o suplemento dietético. Se describe brevemente como controlar cuidadosamente las variables para la técnica de HPTLC incluyendo referencias a información más detallada provista en los manuales de los equipos. La reproducibilidad de los resultados permite comparar materiales botánicos con ingredientes no oficiales aunque estén estrechamente relacionados. La técnica analítica emplea placas para cromatografía de alta resolución, equipo apropiado para controlar variables y una prueba de aptitud del sistema para propósitos de calificación del desempeño. [NOTA-Para información adicional, ver Identificación de Artículos de Origen Botánico por Cromatografía en Capa Delgada de Alta Resolución (1064).]
EQUIPO REQUERIDO El equipo usado para la técnica de HPTLC incluye lo siguiente: • Placas: A menos que se especifique de otro modo en la monografía individual, usar placas recubiertas con una capa uniforme de 200 µm de gel de sílice poroso (con un tamaño de poro de 60 Á) con partículas irregulares de entre 2-1 O µm y un tamaño promedio de partícula de 5 µm, un aglutinante polimérico y un indicador fluorescente (F 254 ) de 20 x ó 1 O cm. [NOTA-Se prefieren los métodos cromatográficos que usan placas de vidrio para cromatografía en capa delgada de alta resolución a los que usan láminas con soporte de aluminio debido a la mayor rigidez y estabilidad mecánica del vidrio.]
USP 39
Pruebas Químicas/ (203) Cromatografía en Capa Delgada 253
• Un dispositivo adecuado para la aplicación de los volúmenes de muestras especificados, en bandas de las longitudes especificadas, y en las posiciones especificadas • Una cámara cromatográfica adecuada (por ejemplo, una cámara de cubetas gemelas) que permita el control de la saturación y de la distancia de desarrollo • Un dispositivo adecuado para controlar la actividad de la fase estacionaria mediante humedad relativa • Un dispositivo adecuado para el secado reproducible de la placa ya desarrollada • Un dispositivo adecuado para el tratamiento de la placa con reactivo de derivatización, si fuera necesario • Un dispositivo adecuado para el calentamiento como parte del procedimiento de derivatización, si fuera necesario • Un sistema adecuado para la documentación de cromatogramas bajo UV 254 nm, UV 366 nm y luz blanca Cada uno de estos dispositivos así como el sistema en su totalidad deben pasar la calificación de la instalación, operación y desempeño ( IQ, OQ y PQ, por sus siglas en inglés) para asegurar que los instrumentos estén funcionando de acuerdo con sus especificaciones para controlar variables dentro de los intervalos designados. [NOTA-Para información adicional, ver Calificación de Instrumentos Analíticos (1058).] Por lo general, los fabricantes del instrumento realizan la calificación de la instalación y de la operación. El analista lleva a cabo la prueba de aptitud del sistema como prueba de la calificación del desempeño.
PROCEDIMIENTO Preparación de la Solución de Prueba A menos que se indique de otro modo en la monografía individual, someter a ultrasonido durante 15 minutos con 1 mL de metanol, 100 mg de un ingrediente botánico reducido a polvo, 1O mg de un extracto o fracción secos, o la cantidad de una forma farmacéutica que contenga el equivalente a las cantidades mencionadas anteriormente del correspondiente ingrediente botánico. Después de centrifugar o flitrar, usar el filtrado o el sobrenadante como la Solución muestra. A menos que se indique de otro modo en la monografía individual, disolver 50 µL de un aceite esencial en 1 mL de tolueno y usar como la Solución muestra.
Preparación de las Soluciones Estándar A menos que se indique de otro modo en la monografía individual, disolver los Estándares de Referencia USP de compuestos marcadores individuales a una concentración de 1 mg/mL en metano!. Agitar y someter a ultrasonido los Extractos Estándares de Referencia USP en metanol a una concentración de 1O mg/mL o, para aceites esenciales, disolver los Materiales de Referencia USP en tolueno a una concentración de 50 µL/mL.
Aplicación de la Muestra
y Distribución de la Placa
Aplicar las muestras en bandas estrechas de 8,0 ± 0,5 mm de longitud a una distancia de 8,0 ± 0,5 mm del borde inferior de la placa. Aplicar los estándares de aptitud del sistema en el carril más cercana al borde lateral a no menos de 20 mm del borde lateral de la placa. La distancia entre los carriles (centro a centro) es no menos de 11,0 ± 0,5 mm. Todos los volúmenes de aplicación se especifican en la monografía individual. Los volúmenes de aplicación por lo regular van de 2,0 a 10,0 µL. La distancia de desarrollo se marca con un lápiz cerca de uno de los bordes laterales de la placa antes del desarrollo, aunque también se puede utilizar un dispositivo electrónico de detección de frente de fase móvil.
Preacondicionamiento de la Placa Después de la aplicación de la muestra y a menos que se indique de otro modo en la monografía individual, acondicionar la placa a una humedad relativa de 33% durante un mínimo de 1O minutos (por ejemplo, dejándola en reposo en una cámara cerrada que contenga una solución saturada de cloruro de magnesio).
Preparación de la Cámara de Desarrollo y Desarrollo de la Placa Cuando se use una cámara de cubetas gemelas, recubrir la pared trasera con papel de filtro inmerso en la cubeta trasera. Cargar la cámara con un volumen suficiente de fase móvil para humedecer completamente el papel de filtro y lograr un nivel de fase móvil de exactamente 5 mm en ambas cubetas. Dejar la cámara con la tapa cerrada durante 20 minutos para lograr la saturación. Introducir la placa en posición vertical en la cubeta delantera de la cámara de modo que la capa de recubrimiento esté orientada hacia el papel de filtro. Cuando la fase móvil haya alcanzado una distancia correspondiente a una distancia de desarrollo de 6 cm, retirar la placa de la cámara y secarla en posición vertical en una corriente de aire frío que no afecte la integridad de las zonas separadas. La monografía individual puede especificar otras configuraciones de cámara y distancias de desarrollo. [NOTA-Se pueden usar otras cámaras de desarrollo si los resultados obtenidos cumplen con todos los requisitos de aptitud del sistema.]
254 (203) Cromatografía en Capa Delgada / Pruebas Químicas
USP 39
Procedimiento de Derivatización Cuando se usen reactivos de derivatización, rociar de manera homogénea volúmenes definidos de reactivos en solución (por lo general 1-2 mL) sobre la placa, o sumergir la placa en la solución reactivo a una velocidad definida y durante un tiempo de inmersión definido. [NOTA-Una velocidad de inmersión de 50 mm/segundo y un tiempo de inmersión de 1 segundo funciona bien para la mayoría de los reactivos no acuosos.]
Visualización Los cromatogramas en la placa se visualizan según se indica en la monografía individual. La observación y la evaluación se pueden realizar bajo luz UV 254 nm, UV 366 nm o luz blanca antes y después de la derivatización.
Aptitud del Sistema Para verificar la aptitud del sistema en lo que respecta a resolución, posición y color de las bandas, a menos que se indique de otro modo en la monografía individual, seleccionar dos o más sustancias de referencia que tengan valores RF similares pero apenas separables en las condiciones cromatográficas que se van a usar; por ejemplo, ácido clorogénico (azul) e hiperósido (anaranjado amarillento) en sistemas cromatográficos usados para flavonoides. Pueden estar disponibles mezclas de Estándares de Referencia USP para aptitud del sistema, o las sustancias designadas para verificar la aptitud del sistema en lo que respecta a resolución, posición y colores de las bandas pueden estar incluidas en los Extractos Estándares de Referencia USP. La descripción de la resolución, posición y colores para las bandas clave de la identificación del material de referencia deben corresponderse con la descripción de la monografía dentro de un intervalo de tolerancia especificado. Los requisitos de aptitud del sistema en una monografía individual se cumplen cuando los resultados obtenidos cumplen con los especificados en la monografía.
Evaluación y Criterios de Aceptación Los cromatogramas de la Solución muestra y la Solución estándar se comparan contra la descripción de la sección Criterios de aceptación de la monografía con respecto a la posición de las zonas, la separación de las zonas, el color y la intensidad relativa.
Documentación La documentación es necesaria para registrar los resultados de manera que se puedan auditar, a fin de cumplir con las buenas prácticas de fabricación vigentes. Se deben usar herramientas apropiadas de documentación; por ejemplo, una cámara adecuada para tomar fotos digitales bajo luz UV y blanca, así como software de generación de imágenes adecuado para archivar, recuperar y analizar los resultados lo que facilita el mantenimiento de registros electrónicos.
PRUEBAS DE LÍMITE (206) ALUMINIO El objetivo de este procedimiento es demostrar que el contenido de aluminio (Al) no excede el límite establecido en la monografía individual de una sustancia cuya etiqueta indica que está destinada a ser usada en hemodiálisis. [NOTA-Las Preparaciones Estándar y la Preparación de Prueba pueden modificarse, si fuera necesario, para obtener soluciones de concentraciones adecuadas adaptables al intervalo lineal o de trabajo del instrumento.] Diluyente de Ácido Nítrico-Transferir 40 mL de ácido nítrico a un matraz volumétrico de 1000 mL y diluir a volumen con agua. Preparaciones Estándar-Tratar un alambre de aluminio con ácido clorhídrico 6 Na 80º durante algunos minutos. Disolver aproximadamente 100 mg del alambre tratado, pesados con exactitud, en una mezcla de 1O mL de ácido clorhídrico y 2 mL de ácido nítrico calentando aproximadamente a 80º durante aproximadamente 30 minutos. Continuar el calentamiento hasta que el volumen se reduzca aproximadamente a 4 ml. Enfriar a temperatura ambiente y agregar 4 mL de agua. Evaporar hasta aproximadamente 2 mL calentando. Enfriar y transferir esta solución, con ayuda de agua, a un matraz volumétrico de 100 mL, diluir a volumen con agua y mezclar. Transferir 10,0 mL de esta solución a un segundo matraz volumétrico de 100 mL, diluir a volumen con agua y mezclar. Transferir 1,0 mL de esta solución a un tercer matraz volumétrico de 100 mL, diluir a volumen con agua y mezclar. La concentración de aluminio en esta Preparación Estándar es aproximadamente 1,0 µg por ml.
Pruebas Químicas/ (207) Prueba para el Derivado 1,6-Anhidro 255
USP 39
Si se requiere una Preparación Estándar más diluida, transferir porciones de 1,0; 2,0 y 4,0 mL de esta solución a sendos matraces volumétricos de 100 mL, diluir a volumen con Diluyente de Ácido Nítrico y mezclar. Estas soluciones contienen 0,01 µg; 0,02 µg y 0,04 µg de Al por mL, respectivamente. Preparación de Prueba-A menos que se indique algo diferente en la monografía correspondiente, transferir una cantidad de la sustancia de prueba pesada con exactitud (en g), según se indica en la monografía, a un matraz volumétrico de plástico de 100 mL, agregar 50 mL de agua y someter a ultrasonido durante 30 minutos. Agregar 4 mL de ácido nítrico, diluir a volumen con agua y mezclar.
Procedimiento-Determinar las absorbancias de las Preparaciones Estándar y de la Preparación de Prueba en la línea de eminm, con un espectrofotómetro de absorción atómica adecuado (ver lllllrl~llli•lllll1Rll sión del aluminio a lllllllmllll~iJBlll>· equipado con una lámpara de aluminio de cátodo hueco y un horno eléctrico sin llama, empleando Diluyente como blanco. Graficar las absorbancias de las Preparaciones Estándar en función del contenido de Al, en µg por mL y trazar la línea recta que mejor se ajuste a los tres puntos graficados. A partir del gráfico así obtenido, determinar la cantidad, en µg, de Al en cada mL de la Preparación de Prueba. Calcular la cantidad de Al en la muestra tomada, en µg por g, multiplicando este valor por 100/W, donde W es el peso, en g, de la sustancia tomada para preparar la Preparación de Prueba.
(207) PRUEBA PARA EL DERIVADO 1,6-ANHIDRO DE ENOXAPARINA SÓDICA El siguiente procedimiento se usa para determinar los niveles de las formas 1,6-anhidro en la enoxaparina sódica. [NOTA-La prueba para el derivado 1,6-anhidro sólo se realiza cuando se especifica en la monografía individual.]
INTRODUCCIÓN Los disacáridos especificados en este capítulo general se listan por nombre y estructura en el Apéndice 7; los oligosacáridos se listan en el Apéndice 2. La despolimerización de la heparina hasta enoxaparina sódica produce una conversión parcial pero característica de glucosaminas en las terminales reductoras de las cadenas de oligosacáridos con glucosamina 6-0 sulfato terminal, produciendo derivados 1,6-anhidro (ver Figura 1).
itS~[i=~~fa,j=S-º"Y" HO
OR1
HO
/H
R2
R,=
HO
OR1
Rp
/H
R2
HO
n
OR1
HO
/H
R2
-H
n=O a 20
Figura 1. Estructura de la enoxaparina sódica que contiene un derivado 1,6-anhidro en el extremo reductor de la cadena. El porcentaje de cadenas de oligosacáridos que se encuentran cíclicos en un anillo 1,6-anhidro es una característica de la enoxaparina sódica.
DESPOLIMERIZACIÓN DE ENOXAPARINA SÓDICA POR LAS HEPARINASAS Y OLIGOSACÁRIDOS RESULTANTES La valoración involucra un análisis de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC, por sus siglas en inglés) de una solución de enoxaparina sódica despolimerizada por una mezcla de heparinasas. Después de la despolimerización enzimática, los residuos 1,6-anhidro principales de la enoxaparina sódica observados son el 1,6-anhidro ~llS, el 1,6-anhidro ~llS•Pi, el 1,6-anhidro ~IS y el 1,6-anhidro ~IS-IS•Pi (ver Apéndice 2).
USP 39
256 (207) Prueba para el Derivado 1,6-Anhidro / Pruebas Químicas
Las heparinasas no escinden completamente el tetrasacárido 1,6-anhidro AIS-IS•Pi (forma de manosamina 2-0-sulfatada). Los dos disacáridos (el 1,6-anhidro AllS y el 1,6-anhidro AllS•Pi), que generalmente coeluyen, tienen mala resolución comparados con AllA (ver Apéndice 7), especialmente porque este último se presenta como dos anómeros: a y fJ. Para poder cuantificar el 1,6-anhidro AllS y el 1,6-anhidro AllS•Pi, la muestra de enoxaparina sódica ya despolimerizada por las heparinasas se reduce con borohidruro de sodio (ver Figura 2).
h oR,
RO~
HO
OH
OH
O
OH~ R,O~H : '
OR
OH NaBH -'-
NHR2
OH
R,O~OH i '
OR
NHR2
NHR2
Figura 2. Reducción de oligosacáridos con borohidruro de sodio
ª
La reducción con borohidruro de sodio elimina el efecto anomérico +-> P al abrir el anillo del oligosacárido terminal. Los cuatro derivados 1,6-anhidro (ver Apéndice 2) no se reducen con el borohidruro de sodio porque el puente 1,6-anhidro bloquea la apertura del anillo. La reducción de los oligosacáridos disminuye su tiempo de retención, mientras que el tiempo de retención de los derivados 1,6-anhidro permanece inmutable. Por esa razón, es posible separar los dos compuestos, el 1,6-anhidro AllS y el 1,6-anhidro AllS•Pi, del pico del disacárido AllA reducido. [NOTA-El 1,6-anhidro AllS y el 1,6-anhidro AllS•Pi eluyen como dos picos sin resolver y se cuantifican juntos como un solo compuesto, el 1,6-anhidro AllS. Por lo tanto, con el objeto de simplificar, la forma epimérica no se menciona en adelante.]
PROCEDIMIENTO Estándares de Referencia USP (11 )-ER Enoxaparina Sódica USP. SolucionesSolución A-Disolver 0,280 g de fosfato monobásico de sodio en 950 mL de agua, ajustar con ácido fosfórico a un pH de 3,0 y diluir con agua a 1000 mL. Solución 8-Disolver 140 g de perclorato de sodio en 950 mL de Solución A, ajustar con ácido fosfórico a un pH de 3,0 y diluir con Solución A a 1000 ml. Fase Móvil-Usar mezclas variables de Solución A y Solución B, filtradas y desgasificadas, según se indica en el Sistema Cromatográfico. Solución de Acetato de Calcio y Sodio de pH 7,0-Disolver 1O mg de albúmina sérica bovina y 32 mg de acetato de calcio en 60 mL de agua. Agregar 580 µL de ácido acético glacial y ajustar con hidróxido de sodio 2 M a un pH de 7,0. Transferir a un matraz volumétrico de 100 mL y diluir a volumen con agua. Pasar la solución a través de un filtro con un tamaño de poro de 0,45 µm o 0,22 µm. Solución Amortiguadora de Fosfato de Potasio de pH 7,0-Disolver 68 mg de fosfato monobásico de potasio y 10 mg de albúmina sérica bovina en 30 mL de agua en un matraz volumétrico de 50 ml. Ajustar con hidróxido de potasio, si fuera necesario, a un pH de 7,0 y diluir a volumen con agua. Pasar la solución a través de un filtro con un tamaño de poro de 0,45 µm o 0,22 µm. Solución de Borohidruro de Sodio-Disolver 12 mg de borohidruro de sodio en 400 µL de agua y mezclar en un mezclador por vórtice. [NOTA-Preparar inmediatamente antes de usar.] Solución de Heparinasa 7-Disolver heparinasa 1 (ver Especificaciones de Reactivos en Reactivos, Indicadores y Soluciones) [referencia: heparina liasa 1, EC 4.2.2.7] en Solución Amortiguadora de Fosfato de Potasio de pH 1,0 para obtener una solución con una actividad de 0,4 UI por ml. Almacenar la solución a -20º hasta el momento de su uso. [NOTA-Las soluciones de heparinasa se pueden almacenar durante 3 meses a -20º.] Solución de Heparinasa 2-Disolver heparinasa 2 (ver Especificaciones de Reactivos en Reactivos, Indicadores y Soluciones [sin número EC] en Solución Amortiguadora de Fosfato de Potasio de pH 7,0 para obtener una solución con una actividad de 0,4 UI por ml. Almacenar la solución a -20º hasta el momento de su uso. Solución de Heparinasa 3-Disolver heparinasa 3 (ver Especificaciones de Reactivos en Reactivos, Indicadores y Soluciones) [referencia: heparitinasa 1, EC 4.2.2.8] en Solución Amortiguadora de Fosfato de Potasio de pH 1,0 para obtener una solución con una actividad de 0,4 UI por ml. Almacenar la solución a -20º hasta el momento de su uso. Solución de Heparinasas 7, 2 y 3-Preparar una mezcla 1 :1 :1 (v:v:v) de Solución de Heparinasa 1, Solución de Heparinasa 2 y Solución de Heparinasa 3. Soluciones para Identificación de los Picos-[NOTA-Las soluciones de prueba y las Soluciones estándar despolimerizadas se deben preparar al mismo tiempo. Las soluciones de prueba despolimerizadas son estables durante 1 mes a -20º. Igualmente, las soluciones de prueba y las Soluciones estándar reducidas se deben preparar al mismo tiempo. Las soluciones reducidas también son estables durante 1 mes a -20º.]
USP 39
Pruebas Químicas/ (207) Prueba para el Derivado 1,6-Anhidro 257
Soluciones de Disacáridos-Preparar por separado una solución con 0,25 mg por mL de cada disacárido 1 L'llA, fl.llA, fl.lllA, fl.IVA, fl.IS, L'lllS, fl.lllS, fl.IVS (ver Apéndice 7). Inyectar en el cromatógrafo cada solución de disacárido y registrar el cromatograma. Soluciones de Disacáridos Reducidos-A 60 µL de cada Solución de Disacárido, agregar 1O µL de Solución de Borohidruro de Sodio recién preparada. Mezclar en un mezclador por vórtice y dejar en reposo a temperatura ambiente durante al menos 4 horas. Inyectar en el cromatógrafo cada solución y registrar el cromatograma. Solución Blanco-Preparar una mezcla de 20 µL de agua, 70 µL de Solución de Acetato de Calcio y Sodio de pH 7,0 y 100 µL de la Solución de Heparinasas 7, 2 y 3. Mezclar suavemente por inversión y dejar en reposo durante al menos 48 horas en un baño de agua a 25º. Preparar una mezcla de 60 µL de esta solución despolimerizada con 1O µL de Solución de Borohidruro de Sodio recién preparada. Homogeneizar y dejar en reposo a temperatura ambiente durante al menos 4 horas. Inyectar en el cromatógrafo la solución resultante y registrar el cromatograma. Solución de Prueba 7-Preparar dos soluciones, cada una con 20 mg de enoxaparina sódica en 1 mL de agua. Solución Estándar 7-Preparar una solución que contenga 20 mg de ER Enoxaparina Sódica USP en 1 mL de agua. Solución de Prueba 2-Para cada solución, preparar una mezcla de 20 µL de Solución de Prueba 1, 70 µL de Solución de Acetato de Calcio y Sodio de pH 7, Oy 100 µL de la Solución de Heparinasas 1, 2 y 3. Mezclar suavemente por inversión y dejar en reposo durante al menos 48 horas en un baño de agua a 25º. Después de 48 horas de despolimerización, inyectar en el cromatógrafo la solución y registrar el cromatograma. Solución Estándar 2- Preparar una mezcla de 20 µL de Solución Estándar 1, 70 µL de Solución de Acetato de Calcio y Sodio de pH 7,0 y 100 µL de la Solución de Heparinasas 7, 2 y 3. Mezclar suavemente y dejar en reposo durante al menos 48 horas en un baño de agua a 25º. Después de 48 horas de despolimerización, inyectar en el cromatógrafo la solución y registrar el cromatograma. Solución de Prueba 3-Para cada solución de prueba despolimerizada, preparar una mezcla de 60 µL de Solución de Prueba 2 y 1O µL de Solución de Borohidruro de Sodio recién preparada. Homogeneizar y dejar en reposo, sin ajustar la tapa, a temperatura ambiente durante al menos 4 horas antes de inyectarla en el cromatógrafo. La Solución de Prueba 3 es estable durante 48 horas a temperatura ambiente. Solución Estándar 3-Preparar una mezcla de 60 µL de Solución Estándar 2 y 1O µL de Solución de Borohidruro de Sodio recién preparada. Homogeneizar, mezclar en un mezclador por vórtice y dejar en reposo, sin ajustar la tapa, a temperatura ambiente durante al menos 4 horas antes de inyectarla en el cromatógrafo. La Solución Estándar 3 es estable durante 48 horas a temperatura ambiente. Sistema Cromatográfico (ver Cromatografía (621 ))-Equipar el cromatógrafo de líquidos con un detector a 234 nm y una columna de 3 mm x 25 cm rellena con material L14 de 5 µm de. Se debe usar también una guarda columna rellena con el mismo material. La velocidad de flujo es de 0,45 mL por minuto, la temperatura de la columna se mantiene a 50º y el volumen de inyección es 1O µL. Programar el cromatógrafo del siguiente modo. Tiempo (minutos)
Solución A(%)
0-20
97--+65
3--+35
gradiente lineal
20-50
65--+0
35--+ 100
gradiente lineal
50-60
o
100
60-61
0--+97
100--+3
61-79
97
3
Solución B (%)
Elución
isocrática gradiente lineal para reequilibrio isocrática para reequilibrio
Inyectar en el cromatógrafo la Solución de Prueba 3 reducida y la Solución Estándar 3 reducida y registrar el cromatograma según se indica en el Procedimiento. Prueba de Aptitud de la Despolimerización-EI cociente de área entre los picos de 1,6-anhidro-fl.IS-IS y 1,6-anhidro fl.IS no es mayor de 1, 15 para la Solución Estándar 2 despolimerizada. Prueba de Aptitud del Desempeño de la Columna-Identificar los picos correspondientes al fl.IA reducido y al 1,6-anhidro-fl.IS para la Solución Estándar 3: el tiempo de retención del fl.IS reducido está entre 27 y 33 minutos para la Solución Estándar 3 despolimerizada y reducida; y la resolución, R, entre el fl.1 A reducido y el 1,6-anhidro-fl.IS no es menor de 1,5. Prueba de Aptitud de la Reducción-El cociente de área entre los picos de disacárido fl.IS y fl.IS reducido en la Solución Estándar 3 despolimerizada y reducida y la Solución de Prueba 3 no es más de 0,02%. Procedimiento y Cálculos-Inyectar por separado en el cromatógrafo volúmenes iguales de la Solución de Prueba 3 reducida y de la Solución Estándar 3 reducida. Usar el método de porcentaje de área normalizada para el cálculo. Los picos se integran desde el pico de volumen muerto hasta el último pico detectado. Medir el área del pico de cada analito excluyendo los picos de los disolventes al comienzo del cromatograma y en la Solución Blanco. Usando los cromatogramas de las Soluciones de Disacáridos Reducidos obtenidos previamente, identificar los picos pertenecientes a los ocho disacáridos reducidos en los cromatogramas de la Solución de Prueba 3 y la Solución Estándar 3. Los picos pertenecientes al 1,6-Anhidro fl.IS, 1,6-Anhidro fl.llS y 1,6-Anhidro fl.IS-ISepi se identifican a partir de los tiempos de retención relativos proporcionados en la Tabla 7 y del Cromatograma de referencia proporcionado con el ER Enoxaparina Sódica USP. Una vez identificados los picos, utilizar los valores en la Tabla 7 Se pueden obtener disacáridos adecuados de Grampian Enzymes (GE-Hl 001, GE-Gl 002, GE-Hl 003, GE-Hl 004, GE-Hl 005, GE-Hl 006, GE-Hl 007, GE-Hl 008), Nisthouse, Harray, Orkney, KWl 7 2LQ, Reino Unido, Te/: 01856 771771, Scottish Local Authority: Orkney /slands.
1
258 (207) Prueba para el Derivado 1,6-Anhidro / Pruebas Químicas
USP 39
para calcular el porcentaje (p/p) de los tres principales derivados 1,6-anhidro, obtenidos después de la despolimerización de la enoxaparina sódica, usando la siguiente fórmula: % 1,6-anhidro i (p/p) = (100 x MW; x A;)/ L(MWx x Ax) en donde MW; y A; son el peso molecular y el área del pico i del 1,6-anhidro, respectivamente; y MWx y Ax son el peso molecular y el área, respectivamente, del pico X o de la zona X especificados por su tiempo de retención. [NOTA-Una vez establecido el método, los picos pertenecientes a los diferentes disacáridos y tetrasacáridos se pueden identificar fácilmente por medio del cromatograma del ER Enoxaparina Sódica USP. Por lo tanto, el uso de los Estándares de disacáridos sólo es necesario durante la etapa de implementación del método.] Calcular el porcentaje molar de los componentes que contienen una estructura 1,6-anhidro en el extremo reductor de su cadena en la muestra de prueba de enoxaparina sódica de acuerdo con la siguiente fórmula: o
.
MW
'fo1,6anh1dro ~100x l:MW, xÁreax x
(Área!11s1,6anhidro+ ÁreaL111s1,6anhidro + ÁreaL11s - ls1,6anhidro)
en donde MW es el peso molecular promedio en peso (ver prueba de Identificación D en Enoxaparina Sódica); MWx y Áreax son el peso molecular y el área, respectivamente, del pico X o del intervalo X, especificados por su tiempo de retención. El porcentaje molar de los componentes que tienen una estructura 1,6-anhidro en el extremo reductor de su cadena está entre 15% y 25%. En la Tabla 1 se proporcionan los tiempos de retención y las masas moleculares típicos atribuidos a las diferentes estructuras de oligosacáridos. Tabla 1. Tiempos de Retención Relativos (tRR) y Masas Moleculares Típicos Atribuidos a los Diferentes Compuestos*
Compuesto
AIVA reducido -
AIVS reducido -
AllA reducido
1,6-Anhidro AllS -
AlllA reducido -
AllS reducido -
AlllS reducido -
AIA reducido -
1,6-Anhidro i'.IS -
AllA-IVSglu reducido -
i'.IS reducido -
AIS -
AllA-!lliJill reducido
1,6-Anhidro i'.IS-IS
-
tRR
Masa Molecular (daltones)
< 0,25
741
0,25
401
0,25
741
0,51
461
0,51 < tRR < 0,55
483
0,55
503
0,55 < tRR < 0,59
503
0,59
443
0,59 < t00 < 0,64
503
0,64
503
0,64 < tRR < 0,72
533
0,72
563
0,72 < tRR < 0,80
563
0,80
563
0,80 < tRR < 0,88
583
0,88
605
0,88 < tRR < 0,90
635
0,90
545
0,90 < tRR < 0,98
635
0,98
1066
0,98< tRR < 1,00
635
1,00
665
1,00< tRR < 1,04
665
1,04
665
1, 04< tRR < 1, 10
1228
1,10
1168
1,10< tRR < 1,27
1228
1,27
1210
tRR > 1,27
1228
*Los tiempos de retención relativos se obtuvieron con una partida de enoxaparina sódica despolimerizada y reducida. Se expresan con respecto al tiempo de retención del pico principal correspondiente al lilS reducido. Se debe tener en cuenta que los tiempos de retención relativos pueden variar un poco, dependiendo de la calidad de la columna.
Pruebas Químicas/ (207) Prueba para el Derivado 1,6-Anhidro 259
USP 39
APÉNDICE 1: ESTRUCTURAS DE DISACÁRIDOS ESTÁNDARES '11VA
O- Na+
'1UA-(l--->4)a-GlcNAc
OH
º1->-oh-oo HO
OH
HO
NH
o=\
CH,
'11VS
O- Na+
OH
ºQ-,b-~ HO
OH
HO
NH
º~/ o-/
i111A
b- N•' '1UA-(l--->4)a-GlcNAc(6S)
O- Na+
O- Na+
i1UA-(l--->4)a-GlcN(NS)
~'o
ºf-"tob-oo HO
OH
HO
NH
o=\
CH,
'1111A
O- Na+
OH
o~oko º" ~\/ O
o
0- Na+
'1115
=<
CH3
'1UA-(l--->4)u-GlcN (NS,65)
O- Na+
O- Na+
'1UA-2S-(l--->4)a-GlcNAc
~¿:s'b
ºP-·b-~ HO
OH
HO
NH
º.::::::::-1
~\O-Na+ '11115
O- Na+
OH
ºf~-ob º " º?< º?< HO
OHO
O
NH
O-Na+
'11A
O
O-
N•'
i1UA-2S-(l--->4)a-GlcNAc(6S)
O- Na+
º~,/
O- Na+
º/b
ºf<ºb=< HO
OHO
º" ?-\/
O
O- Na+
i1UA-2S-(l--->4)u-GlcN (NS)
NH
o
CH3
00
USP 39
260 (207) Prueba para el Derivado 1,6-Anhidro / Pruebas Químicas
APÉNDICE 1: ESTRUCTURAS DE DISACÁRIDOS ESTÁNDARES (Continuación) t.15
UA-25-(1 ~4)a-GlcN (N5,65)
O- Na+
º?s\I
i)-:h-00 HO
OHO
00-j
º~
/
NH
~\-o-::::-\_ O
Na+
O
Na+
APÉNDICE 2: ESTRUCTURAS DE OLIGOSACÁRIDOS 1,6-Anhidro t.15 o 1,6-Anhidro t.15 glucosa
1,6-Anhidro t.115 o 1,6-Anhidro t.115 glucosa
1,6-Anhidro t.115 epi o 1,6-Anhidro t.115 manosa
t.llA-IV5glu
t.l IA-filgill
1,6-Anhidro t.15-15 epi
o 1,6-Anhidro t.15-15 manosa
USP 39
Pruebas Químicas/ (208) Valoración de Actividad Anti-Factor 261
(208) VALORACIÓN DE ACTIVIDAD ANTI-FACTOR Xa Y ANTI-FACTOR lla PARA HEPARINAS NO FRACCIONADAS Y DE BAJO PESO MOLECULAR Este capítulo provee información y procedimientos para determinar la actividad inhibitoria del factor Xa y la actividad inhibitoria del factor lla (trombina) de las heparinas no fraccionadas (HNF) y heparinas de bajo peso molecular (HBPM).
INTRODUCCIÓN Las heparinas no fraccionadas y las heparinas de bajo peso molecular ejercen su efecto anticoagulante mediante la potenciación de la actividad de los inhibidores de coagulación del plasma. De todos los glicosaminoglicanos comúnmente conocidos, sólo las HNF, las HBPM y el heparán sulfato (referidos en lo sucesivo como heparina) contienen una secuencia de pentasacáridos específica que puede unirse al inhibidor de coagulación del plasma, la antitrombina (AT). Por lo tanto, se desarrollan valoraciones que dependen de la AT para asegurar la especificidad de los métodos para medir la actividad anticoagulante de la heparina. La unión de la heparina con la AT provoca un cambio de conformación en la molécula de AT. Este cambio de conformación incrementa la unión del complejo AT-heparina con los factores activados de coagulación, principalmente el factor lla (trombina) y el factor Xa, causando su inhibición. Una vez que la AT ha sido activada por la secuencia de pentasacáridos de la heparina, ésta interactúa con los factores Xa y lla mediante su bucle central reactivo. Para conseguir una inhibición eficiente de trombina, la molécula de heparina también debe unirse a la antritombina y al factor lla. Dicha interacción requiere un segmento extra de aproximadamente 13 monosacáridos, acoplados al extremo no reductor de la secuencia de pentasacáridos de la heparina, que se une a la AT. Este segmento mínimo de la molécula de heparina necesario para inhibir la trombina con AT, conocido como dominio C, tiene un peso molecular aproximado de 5400 Da. Aunque la potenciación de la capacidad de la antitrombina para inactivar el factor Xa también depende del peso molecular, las unidades adicionales de sacáridos del dominio C no son esenciales, y una heparina con un peso molecular menor de 5400 Da puede potenciar la capacidad de la antitrombina para inactivar el factor Xa. Por convención, el cociente de potencia entre el anti-factor Xa y el anti-factor lla para HNF es 1. La HNF es heterogénea y polidispersa, pero contiene poco o ningún material con un peso molecular menor de 5400 Da. Los pesos moleculares promedio de los productos de HBPM son menores que aquéllos de las HNF, y contienen una proporción mayor de material de peso molecular menor de 5400 Da. El cociente entre las potencias de anti-factor Xa y anti-factor llapara HBPM es mayor que 1,5. Este capítulo describe procedimientos de valoración para medir la actividad anti-factor Xa y anti-factor lla de las HBPM en presencia de AT. En el sistema de prueba, la heparina se une a la AT, y el factor lla o el factor Xa agregado a la mezcla se une al complejo de heparina-AT. El factor lla o factor Xa residual no inhibido por el complejo de heparina-AT se cuantifica mediante un sustrato cromogénico que es específico para el factor lla o el factor Xa y se agrega en la etapa final. Los analistas observan una relación inversa en la que una mayor cantidad de enzima residual produce más color, lo cual equivale a una menor actividad de heparina. Al igual que con cualquier valoración enzimática, la temperatura y el tiempo de la reacción, el manejo adecuado de los reactivos y su orden de adición representan aspectos críticos para el desempeño óptimo de la valoración.
VALORACIONES DE ACTIVIDAD ANTI-FACTOR XA Y ANTI-FACTOR HA PARA HEPARINAS NO FRACCIONADAS Actividad Anti-Factor Xa para HNF El siguiente procedimiento se usará siempre que se especifique en las monografías individuales. Esta valoración se puede llevar a cabo manualmente en tubos de plástico usando un bloque termostático o un baño de agua termostatizado. Un equipo para placa de microtitulación con un lector y un coagulómetro automático pueden mejorar la reproducibilidad y el rendimiento. Solución amortiguadora de pH 8,4: Disolver cantidades de tris(hidroximetil)aminometano, ácido edético o edetato sódico y cloruro de sodio en agua que contenga O, 1% de polietilenglicol 6000 para obtener soluciones con concentraciones 0,050 M, 0,0075 M y 0, 175 M, respectivamente. Ajustar, si fuera necesario, con ácido clorhídrico o solución de hidróxido de sodio a un pH de 8,4. Solución de antitrombina: Reconstituir un vial de antitrombina (ver Reactivos, Indicadores y Soluciones-Especificaciones de Reactivos) según lo indicado por el fabricante y diluir esta solución con Solución amortiguadora de pH 8,4 hasta obtener una solución con una concentración de 1,0 UI de Antitrombina/ml. Solución de factor Xa: Reconstituir factor Xa bovino según lo indicado por el fabricante (ver Factor Xa en Reactivos, Indicadores y Soluciones-Especificaciones de Reactivos) y diluir con Solución amortiguadora de pH 8,4 hasta obtener una solución
262 (208) Valoración de Actividad Anti-Factor / Pruebas Químicas
USP 39
que proporcione un valor de absorbancia de 0,65-1,25 a 405 nm cuando se valora según se indica a continuación, pero usando 30 µL de Solución amortiguadora de pH 8,4 en lugar de 30 µL de las Soluciones estándar o de las Soluciones muestra. [NOTALa Solución de factor Xa contiene aproximadamente 3 unidades nanocatalíticas/mL, pero puede variar dependiendo del fabricante del factor Xa o del sustrato usado.] Solución de sustrato cromogénico: Preparar una solución de un sustrato cromogénico adecuado para la prueba amidolítica (ver Reactivos, Indicadores y Soluciones-Especificaciones de Reactivos) específico para factor Xa en agua para obtener una concentración 1 mM. Solución de detención: Solución de ácido acético al 20% (v/v) Soluciones estándar: Reconstituir todo el contenido de una ampolla de ER Heparina Sódica para Valoraciones USP con agua y diluir con Solución amortiguadora de pH 8,4 hasta obtener al menos 5 diluciones en el intervalo de concentración de 0,03-0,375 Unidades USP de Heparina/ml. Soluciones muestra: Disolver o diluir una cantidad medida con exactitud de Heparina Sódica en Solución amortiguadora de pH 8,4 y diluir con la misma solución amortiguadora hasta obtener soluciones con actividades aproximadamente iguales a las de las Soluciones estándar. Análisis: [NOTA-El procedimiento también se puede realizar usando plataformas alternativas. Realizar la prueba con cada Solución estándar y Solución muestra por duplicado.] Transferir 120 µL de Solución amortiguadora de pH 8,4 a cada una de las series de tubos de plástico adecuados colocados en un baño de agua ajustado a 37°. Luego, transferir por separado 30 µL de las diferentes diluciones de las Soluciones estándar o de las Soluciones muestra a los tubos. Agregar 150 µL de Solución de antitrombina, entibiada previamente a 37º durante 15 minutos, a cada tubo, mezclar e incubar durante 2 minutos. Agregar 300 µL de Solución de factor Xa, entibiada previamente a 37º durante 15 minutos, a cada tubo, mezclar e incubar durante 2 minutos. Agregar 300 µL de Solución de sustrato cromogénico, entibiada previamente a 37º durante 15 minutos, a cada tubo, mezclar e incubar durante exactamente 2 minutos. Agregar 150 µL de Solución de detención a cada tubo y mezclar. Preparar un blanco para ajustar a cero el espectrofotómetro, agregando los reactivos en el orden inverso, comenzando con la Solución de detención y finalizando con la adición de 150 µL de Solución amortiguadora de pH 8,4, y omitiendo las Soluciones estándar o las Soluciones muestra. Registrar la absorbancia a 405 nm contra el blanco. Se puede aumentar o reducir el volumen de los reactantes para ajustarse al formato de la valoración, siempre que las proporciones de la muestra de referencia o de la muestra de prueba y de los reactivos se mantengan iguales. Cálculos: Graficar el logaritmo de los valores de absorbancia de las Soluciones estándar y de las Soluciones muestra en función de las concentraciones de heparina, en Unidades USP. Calcular la actividad de heparina sódica, en Unidades USP/mg, usando métodos estadísticos para análisis de razón de pendientes. Calcular la actividad antifactor Xa de la heparina sódica:
A x (Srf S5)
A = potencia del ER Heparina Sódica para Valoraciones USP Sr= pendiente de la recta de las Soluciones muestra S5 = pendiente de la recta de las Soluciones estándar Expresar la actividad anti-factor Xa de la Solución muestra como Unidades USP de Heparina/mg, calculada con respecto a la sustancia seca. Calcular el cociente de la actividad anti-factor Xa en función de la potencia anti-factor lla (ver la Valoración a continuación): actividad anti-factor Xa/potencia anti-factor lla Criterios de aceptación:
0,9-1, 1
Actividad Anti-Factor lla para Heparinas No Fraccionadas Solución amortiguadora de pH 8,4: Disolver 6, 1 O g de tris(hidroximetil)aminometano, 10,20 g de cloruro de sodio, 2,80 g de edetato sódico y, si fuera adecuado, 0-10,00 g de polietilenglicol 6000 y/o 2,00 g de albúmina sérica bovina en 800 mL de agua. [NOTA-Se pueden usar 2,00 g de albúmina humana en lugar de 2,00 g albúmina sérica bovina.] Ajustar con ácido clorhídrico a un pH de 8,4 y diluir con agua hasta 1000 ml. Solución de antitrombina: Reconstituir un vial de antitrombina (ver Reactivos, Indicadores y Soluciones-Especificaciones de Reactivos) en agua para obtener una solución de 5 UI de Antitirombina/ml. Diluir esta solución con Solución amortiguadora de pH 8,4 hasta obtener una solución con una concentración de O, 125 UI de Antitrombina/ml. Solución de trombina humana: Reconstituir trombina humana (factor lla) (ver Reactivos, Indicadores y Soluciones-Especificaciones de Reactivos) en agua para obtener una solución de 20 UI de Trombina/mL y diluir con Solución amortiguadora de pH 8,4 hasta obtener una solución con una concentración de 5 UI de Trombina/ml. [NOTA-La trombina debe tener una actividad específica de no menos de 750 Ul/mg.] Solución de sustrato cromogénico: Preparar una solución de un sustrato cromogénico de trombina adecuado para prueba amidolítica (ver Reactivos, Indicadores y Soluciones-Especificaciones de Reactivos) en agua para obtener una concentración 1,25 mM. Solución de detención: Solución de ácido acético al 20% (v/v)
USP 39
Pruebas Químicas / (208) Valoración de Actividad Anti-Factor 263
Soluciones estándar: Reconstituir todo el contenido de una ampolla de ER Heparina Sódica para Valoraciones USP con agua y diluir con Solución amortiguadora de pH 8,4 hasta obtener al menos cuatro diluciones en el intervalo de concentración de 0,005-0,03 Unidades USP de Heparina/ml. Soluciones muestra: Proceder según se indica en Soluciones estándar para obtener concentraciones de Heparina Sódica similares a las obtenidas para las Soluciones estándar. Análisis: [NOTA-El procedimiento también se puede realizar usando plataformas alternativas.] Para cada una de las diluciones de las Soluciones estándar y de las Soluciones muestra, se deben analizar al menos muestras por duplicado. Etiquetar un número adecuado de tubos dependiendo del número de determinaciones repetidas a analizar. Por ejemplo, si se van a usar cinco blancos: Bl, B2, B3, B4 y B5 para los blancos; Tl, T2, T3 y T4 cada uno al menos por duplicado para las diluciones de las Soluciones muestra; y Sl, S2, S3 y S4 cada uno al menos por duplicado para las diluciones de las Soluciones estándar. Distribuir los blancos sobre las series de manera que representen exactamente el comportamiento de los reactivos durante los experimentos. [NOTA-Tratar los tubos en el siguiente orden: Bl, Sl, S2, S3, S4, B2, Tl, T2, T3, T4, B3, Tl, T2, T3, T4, B4, Sl, S2, S3, S4, B5.] Cabe destacar que después de cada adición de un reactivo, la mezcla de incubación se debe mezclar evitando la formación de burbujas. Agregar el doble del volumen (100-200 µL) de Solución de antitrombina a cada tubo que contenga un volumen (50-100 µL) de Solución amortiguadora de pH 8,4 o de una dilución apropiada de las Soluciones muestra o de las Soluciones estándar. Mezclar evitando la formación de burbujas. Incubar a 37° durante al menos 1 minuto. Agregar a cada tubo 25-50 µL de Solución de trombina humana e incubar durante al menos 1 minuto. Agregar 50-100 µL de Solución de sustrato cromogénico. Es importante destacar que todos los reactivos, Soluciones estándar y Soluciones muestra deben entibiarse previamente a 37° justo antes de su uso. Se puede aumentar o reducir el volumen de los reactantes para ajustarse al formato de la valoración, siempre que las proporciones de la muestra de referencia o de la muestra de prueba y de los reactivos se mantengan iguales. Se pueden registrar dos tipos de mediciones diferentes: 1. Medición del Punto Final: Detener la reacción después de al menos 1 minuto con 50-100 µL de Solución de detención. Medir la absorbancia de cada solución a 405 nm usando un espectrofotómetro adecuado (ver IJlllllllall!Ul~~lllll llillffl~l:llll(,;¡:¡¡1¡1~\íllil&liíi>· La desviación estándar relativa es menos de 10% para las lecturas del blanco. 2. Medición cambio en la absorbancia para cada solución durante 1 minuto a 405 nm usando un espectrofotómetro adecuado (ver Calcular el cambio en la absorbancia/min (~OD/min). Los blancos para la medición cinética también se expresan en y deben proporcionar los valores más altos debido a que se realizan en ausencia de heparina. La desviación estándar relativa es menos de 10% para las lecturas del blanco. Cálculos: Se pueden usar los modelos estadísticos de Método de razón de pendientes o Método de líneas paralelas dependiendo de qué modelo describa mejor la correlación entre concentración y respuesta. Método de razón de pendientes: Para cada una de las series, calcular la regresión del logaritmo de absorbancia o el logaritmo del cambio en la absorbancia/minuto en función de las concentraciones de las Soluciones muestra y de las Soluciones estándar, y calcular la potencia de heparina sódica en Unidades USP/mL, usando métodos estadísticos para los métodos de razón de pendientes. Expresar la potencia de heparina sódica/mg, calculada con respecto a la sustancia seca. Método de líneas paralelas: Para cada una de las series, calcular la regresión de la absorbancia o el cambio en la absorbancia/minuto en función del logaritmo de las concentraciones de las Soluciones muestra y de las Soluciones estándar, y calcular la potencia de heparina sódica, en Unidades USP/mL, usando métodos estadísticos para métodos de líneas paralelas. Expresar la potencia de heparina sódica/mg, calculada con respecto a la sustancia seca. Criterios de aceptación: La potencia de heparina sódica, calculada con respecto a la sustancia seca, es no menos de 180 Unidades USP de Heparina en cada mg. Estándares de Referencia USP (11 ): ER Heparina Sódica para Valoraciones USP
VALORACIONES DE ACTIVIDAD ANTI-FACTOR XA Y ANTI-FACTOR HA PARA HEPARINAS DE BAJO PESO MOLECULAR El siguiente procedimiento se usará siempre que se especifique en las monografías individuales. Esta valoración se puede llevar a cabo manualmente en tubos de plástico usando un bloque termostático o un baño de agua termostatizado. Un equipo para placa de microtitulación con un lector y un coagulómetro automático pueden mejorar la reproducibilidad y el rendimiento. Se usa solución de ácido acético (solución de detención) para la valoración manual y en placa de microtitulación. Los coagulómetros automáticos miden la velocidad cinética inicial y, por consiguiente, no es necesario detener la reacción.
Actividad Anti-Factor Xa para Heparinas de Bajo Peso Molecular Solución de ácido acético: Ácido acético glacial y agua (42:58) Solución amortiguadora de polietilenglicol 6000 de pH 7,4: Disolver 6,08 g de tris(hidroximetil)aminometano y 8,77 g de cloruro de sodio en 500 mL de agua. Agregar 1,0 g de polietilenglicol 6000 ó 10,0 g de albúmina sérica bovina, ajustar con ácido clorhídrico a un pH de 7,4 y diluir con agua hasta 1000 ml.
264 (208) Valoración de Actividad Anti-Factor/ Pruebas Químicas
USP 39
Solución amortiguadora de pH 7,4: Disolver 6,08 g de tris(hidroximetil)aminometano y 8,77 g de cloruro de sodio en 500 mL de agua. Ajustar con ácido clorhídrico a un pH de 7,4 y diluir con agua hasta 1000 mL. Solución amortiguadora de pH 8,4: Disolver 3,03 g de tris(hidroximetil)aminometano, 5, 12 g de cloruro de sodio y 1,40 g de edetato sódico en 250 mL de agua. Ajustar con ácido clorhídrico a un pH de 8,4 y diluir con agua hasta 500 ml. Solución de antitrombina humana: Reconstituir un vial de antitrombina humana (ver Reactivos, Indicadores y Soluciones-Especificaciones de Reactivos) en agua para obtener una solución que contenga 5 Unidades de Antitrombina por ml. Diluir esta solución con Solución amortiguadora de polietilenglicol 6000 de pH 7,4 hasta obtener una solución con una concentración de 1,0 Unidad de Antitrombina/mL. Solución de factor Xa: Reconstituir una cantidad pesada con exactitud de factor Xa bovino (ver Reactivos, Indicadores y Soluciones-Especificaciones de Reactivos) según se indica en las instrucciones del fabricante. Diluir esta solución madre con Solución amortiguadora de polietilenglicol 6000 de pH 7,4 hasta obtener una solución que proporcione un incremento en el valor de absorbancia a 405 nm de no más de 0,20 unidades de absorbancia/min o 0,8 unidades de absorbancia después de 4 minutos de incubación con el sustrato cromogénico cuando se valora según se describe a continuación, pero usando como un volumen apropiado, V, el volumen, en µL, de Solución amortiguadora de pH 7,4 en lugar de V µL de la solución estándar o la solución muestra. Solución de sustrato cromogénico: Preparar una solución de un sustrato cromogénico adecuado para prueba amidolítica (ver Reactivos, Indicadores y Soluciones-Especificaciones de Reactivos) para factor Xa en agua para obtener una concentración aproximadamente 3 mM. Diluir con Solución amortiguadora de pH 8,4 hasta obtener una solución con una concentración de 0,5 mM. [NOTA-Calentar previamente los reactivos a 37 ± 1º 15 minutos antes de su uso.] Soluciones estándar: Reconstituir y diluir todo el contenido de una ampolla de ER Heparina de Bajo Peso Molecular para Valoraciones Biológicas U5P con agua destilada y luego diluir con Solución amortiguadora de pH 1,4 hasta obtener al menos cuatro diluciones en el intervalo de concentración de 0,025-0,2 Unidades U5P de anti-factor Xa/ml. Soluciones muestra: Proceder según se indica en Soluciones estándar para obtener concentraciones de HBPM similares a las obtenidas para las Soluciones estándar. Análisis Muestras: Soluciones estándar, Soluciones muestra, Solución de antitrombina humana, Solución amortiguadora de pH 7,4, Solución de factor Xa, Solución de sustrato cromogénico
y Solución de ácido acético
Etiquetar 18 tubos adecuados: B1 y B2 para los blancos; Tl, T2, T3 y T4 cada uno por duplicado para las diluciones de las Soluciones muestra; y 51, 52, 53 y 54 cada uno por duplicado para las diluciones de las Soluciones estándar. [NOTA-Tratar los tubos en el orden siguiente: Bl, 51, 52, 53, 54, Tl, T2, T3, T4, Tl, T2, T3, T4, 51, 52, 53, 54, B2.] Agregar a cada tubo 50 µL de Solución de antitrombina humana y un volumen igual, V, de la Solución amortiguadora de pH 7,4 (Blanco) o de una dilución apropiada de las Soluciones muestra o de las Soluciones estándar. Mezclar evitando la formación de burbujas. Incubar a 37º durante al menos 1,0 minuto. Agregar a cada tubo 100 µL de Solución de factor Xa e incubar durante 1,0 minuto. Agregar 250 µL de Solución de sustrato cromogénico. Detener la reacción después de aproximadamente 4,0 minutos con 250 µL de Solución de ácido acético. Medir la absorbancia de cada solución a 405 nm usando un espectrofotómetro adecuado (ver •(857) • (AFOl-may. 2016)). Usar cubetas de cuarzo o de poliestireno desechables. Se puede aumentar o reducir el volumen de los reactantes para ajustarse al formato de la valoración, siempre que las proporciones de la muestra de referencia o de la muestra de prueba y de los reactivos se mantengan iguales. Aptitud del sistema: La valoración es válida si se cumplen los siguientes requisitos: 1. Una solución blanco proporciona un incremento en el valor de absorbancia a 405 nm de no más de 0,20 unidades de absorbancia/min (o un total de 0,8 unidades de absorbancia) cuando se valora usando un volumen apropiado (50 µL) de Solución amortiguadora de pH 1,4 en lugar de 50 µL de la Solución estándar o de la Solución muestra. 2. La lectura del blanco B2 no difiere en más de ±0,05 unidades de absorbancia con respecto al blanco Bl. Cálculos: Para esta valoración biológica, se pueden aplicar análisis de líneas paralelas o de razón de pendientes. Calcular la potencia de la muestra de prueba, en Unidades U5P de anti-factor Xa/mL, usando un modelo estadístico para líneas paralelas, graficando la absorbancia en función de las concentraciones logarítmicas de las Soluciones muestra y de las Soluciones estándar. En algunos casos, la transformación logarítmica de la absorbancia puede ser necesaria para obtener la linealidad para las curvas de dosis-respuesta. La valoración es válida cuando los datos cumplen con los criterios de aceptación para regresión, linealidad y paralelismo, conforme a lo requerido para el método de líneas paralelas. Para el análisis de razón de pendientes, graficar la absorbancia en función de las concentraciones de las Soluciones muestra y de las Soluciones estándar. En algunos casos, la transformación logarítmica de la absorbancia puede ser necesaria para obtener la linealidad de las curvas de dosis-respuesta. La valoración es válida cuando los datos cumplen con los criterios de aceptación para regresión, linealidad y ordenada al origen común, conforme a lo requerido para el método de razón de pendientes (ver Diseño y Análisis de Va/oraciones Biológicas (111) y Análisis de Valoraciones Biológicas (1034)). Expresar la actividad anti-factor Xa de la muestra/mg, calculada con respecto a la sustancia seca: Unidades U5P de Anti-factor Xa/mg = [potencia del estándar (Unidades USP/mL) x cociente de potencia]/[concentración de la muestra (mg/mL)]
USP 39
Pruebas Químicas/ (209) Determinaciones de Peso Molecular de Heparinas 265
Actividad Anti-Factor lla para Heparinas de Bajo Peso Molecular Solución de ácido acético, Solución amortiguadora de polietilenglicol 6000 de pH 7,4, Solución amortiguadora de pH 7,4, Solución amortiguadora de pH 8,4 y Solución de antitrombina humana: Proceder según se indica en Actividad AntiFactor Xa, excepto que la concentración de la Solución de antitrombina humana es 0,5 Unidades de Antitrombina/mL. Solución de trombina humana: Reconstituir trombina (ver Reactivos, Indicadores y Soluciones-Especificaciones de Reactivos) en agua y diluir con Solución amortiguadora de polietilenglicol 6000 de pH 7,4 hasta obtener una solución con una concentración de 5 Unidades de Trombina/ml. Usar la Solución de trombina humana inmediatamente después de su preparación. Solución de sustrato cromogénico: Preparar una solución de un sustrato cromogénico adecuado para la prueba amidolítica (ver Reactivos, Indicadores y Soluciones-Especificaciones de Reactivos) para trombina en agua para obtener una concentración aproximadamente 3 mM. Diluir inmediatamente antes de su uso con Solución amortiguadora de pH 8,4 hasta 0,5 mM. Soluciones estándar: Reconstituir y diluir todo el contenido de una ampolla de ER Heparina de Bajo Peso Molecular para Valoraciones Biológicas USP con agua destilada y diluir con Solución amortiguadora de pH 7,4 hasta obtener al menos cuatro diluciones en el intervalo de concentración de 0,015-0,075 Unidades USP de actividad de anti-factor lla/ml. Soluciones muestra: Proceder según se indica en Soluciones estándar para obtener concentraciones de HBPM similares a las obtenidas para las Soluciones estándar. Procedimiento: Proceder según se indica en Actividad Anti-Factor Xa, pero usar Solución de trombina humana en lugar de Solución de factor Xa y usar la Solución de antitrombina humana según se describió anteriormente. Aptitud del sistema: La valoración es válida si se cumple el siguiente requisito: 1. La lectura del blanco B2 no difiere en más de ±0,05 unidades de absorbancia con respecto al blanco Bl. Cálculos: Proceder según se indica en el cálculo de Actividad Anti-Factor Xa. Estándares de Referencia USP (11 ): ER Heparina de Bajo Peso Molecular para Valoraciones Biológicas USP
(209) DETERMINACIONES DE PESO MOLECULAR DE HEPARINAS DE BAJO PESO MOLECULAR Este capítulo provee procedimientos usados para determinar la distribución del peso molecular (PM) y el peso molecular promedio en peso para heparinas de bajo peso molecular (HBPM).
INTRODUCCIÓN Las heparinas de bajo peso molecular se preparan a partir de Heparina Sódica USP mediante despolimerización parcial. Las heparinas de bajo peso molecular son polidispersas, es decir, están compuestas por cadenas de polisacárido con una variedad de pesos moleculares. La distribución del peso molecular es una característica definitoria para cada producto de heparinas de bajo peso molecular. La USP contiene monografías específicas para productos de heparinas de bajo peso molecular, incluyendo límites sobre los parámetros de distribución del peso molecular. La mayoría de las técnicas para la determinación de la distribución del peso molecular de heparinas de bajo peso molecular utilizan cromatografía de permeación en gel (GPC, por sus siglas en inglés), en ocasiones referida como cromatografía de exclusión por tamaño (SEC, por sus siglas en inglés). Para derivar la distribución del peso molecular de una muestra de heparina de bajo peso molecular a partir de un cromatograma, es necesario conocer la relación entre el tiempo de retención y el peso molecular. Este capítulo describe un método de GPC en el cual la calibración se llevó a cabo usando el Estándar de Referencia (ER) Calibrador de Peso Molecular de Heparina de Bajo Peso Molecular USP. Esta preparación es un Estándar individual polidisperso cuya distribución de pesos moleculares se describe en forma de una Tabla Estándar de Amplio Rango (Broad Standard Table) (ver el Certificado USP para el ER Calibrador de Peso Molecular de Heparina de Bajo Peso Molecular USP) que lista el logaritmo del peso molecular (log PM) de varios puntos de referencia y las fracciones porcentuales correspondientes en peso del calibrador superiores o inferiores a estos puntos de referencia. La Tabla Estándar de Amplio Rango se usa junto con un cromatograma del calibrador para ajustar una función adecuada, en este caso, un polinomio de tercer orden, a la relación entre el log PM y el tiempo de retención, con lo que se genera una curva de calibración para el sistema cromatográfico. Con esta curva de calibración, el analista calcula el peso molecular promedio en peso y los parámetros de distribución a partir del cromatograma de una muestra de heparina de bajo peso molecular. Todos los cálculos descritos en este capítulo se pueden realizar usando un programa de hoja de cálculo, aunque dicho método no se recomienda debido a que es laborioso y está abierto a error humano. El software patentado capaz de automatizar la calibración y los cálculos de peso molecular se puede obtener de diversos fabricantes de sistemas cromatográficos.
PROCEDIMIENTO • MEDICIONES DEL PESO MOLECULAR DE HEPARINAS DE BAJO PESO MOLECULAR MEDIANTE CROMATOGRAFÍA DE PERMEACIÓN EN
GEL El siguiente procedimiento, con cualquier variación necesaria, se usa cuando así se especifique en las monografías individuales. Solución madre de acetato de amonio: Acetato de amonio 1 M en agua
266 (209) Determinaciones de Peso Molecular de Heparinas / Pruebas Químicas
USP 39
Solución de azida sódica: Azida sódica al 1% (p/v) en agua Fase móvil: Transferir 100 ml de Solución madre de acetato de amonio a un matraz volumétrico de 1 L, agregar 20 ml de Solución de azida sódica y diluir con agua a volumen. Filtrar usando una membrana de nailon con un tamaño de poro de 0,45 µm antes de su uso. Solución de calibración: Agregar 2 ml de Fase móvil a un vial que contenga ER Calibrador de Peso Molecular de Heparina de Bajo Peso Molecular USP. Filtrar usando una membrana de nailon con un tamaño de poro de 0,45 µm antes de su uso. Solución muestra: 5 mg/ml de muestra de heparina de bajo peso molecular en Fase móvil. Filtrar usando una membrana de nailon con un tamaño de poro de 0,45 µm. Solución de aptitud del sistema: 5 mg/ml de ER Dalteparina Sódica USP en Fase móvil. Filtrar usando una membrana de nailon con un tamaño de poro de 0,45 µm. Sistema cromatográfico (Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.) [NOTA-Se debe ajustar la temperatura del detector de índice de refracción a la misma temperatura que la Temperatura de la columna.] Modo: HPLC Detector: Índice de refracción Columnas Guarda columna: 6 mm x 4 cm; relleno L59 de 7 µm Analítica: 7,8 mm x 30 cm; relleno L59 de 5 µm en serie con una columna de 7,8 mm x 30 cm; relleno L59 de 5 µm 1 Temperatura de la columna: 30º Velocidad de flujo: 0,5 ml/min Equilibración de las columnas: 0,5 ml/min durante al menos 2 horas Volumen de inyección: 20 µL Aptitud del sistema Muestra: Solución de aptitud del sistema Requisitos de aptitud Resolución: Existe una resolución en la línea base entre el último pico del ER Calibrador de Peso Molecular de Heparina de Bajo Peso Molecular USP y el pico de sal, o picos de intercambio negativos. Curva de calibración: El coeficiente de determinación de la curva de calibración ajustado a los valores de la Tabla Estándar de Amplio Rango deben ser no menos de 0,990, cuando se usa una ecuación polinómica de tercer orden. Peso molecular promedio en peso (Mw): Tomar la media del Mw calculado mediante inyecciones por duplicado de la Solución de aptitud del sistema y redondear con una aproximación de 50 Da. El sistema cromatográfico es adecuado si el Mw del ER Dalteparina Sódica USP está dentro de 150 Da del valor declarado según lo indicado en el Certificado USP del ER Dalteparina Sódica USP. Análisis Muestras: Inyectar 20 µL de la Solución de calibración (una sola inyección), la Solución de aptitud del sistema (por duplicado) y la Solución muestra (por duplicado), y registrar los cromatogramas durante el tiempo necesario para asegurar la elución completa, incluyendo los picos de sal y disolvente (aproximadamente 50 minutos). [NOTA-El calibrador, el Estándar o la muestra de heparina de bajo peso molecular presentará un pico ancho a un tiempo entre aproximadamente 25 y 45 minutos, seguido por un pico agudo de sal de elución tardía, según se ilustra en el Certificado USP del ER Calibrador de Peso Molecular de Heparina de Bajo Peso Molecular USP.] Cálculos: Calcular el área total bajo el pico de heparina de bajo peso molecular a partir de la Solución de calibración y el área acumulativa en cada punto debajo del pico como porcentaje del total. No incluir el pico de sal. Usando la Tabla Estándar de Amplio Rango provista en el Certificado USP del ER Calibrador de Peso Molecular de Heparina de Bajo Peso Molecular USP, identificar aquellos puntos en el cromatograma para los que el área acumulativa porcentual sea la más cercana a las fracciones porcentuales listadas en la Tabla Estándar de Amplio Rango y asignar el peso molecular (MW, por sus siglas en inglés) en esta Tabla al tiempo de retención correspondiente (RT, por sus siglas en inglés) en el cromatograma. Para el conjunto de tiempos de retención y pesos moleculares identificados, ajustar el log(PM) en función del tiempo de retención (TR) a una función polinómica de tercer orden usando un software adecuado para cromatografía de permeación en gel o encontrar los valores de a, b, c y d de modo que lag PM =a+ (b x TR) + [c x (TR) 2] + [d x (TR) 3]. Usando el mismo software para GPC, para cada uno de los cromatogramas duplicados de la Solución de aptitud del sistema y de la Solución muestra, y con la función de calibración obtenida según se describió anteriormente, calcular Mw:
Rf; = respuesta del detector en cada punto M; = PM en cada punto
1 El método fue validado usando una guarda columna TSK SWXL de 6 mm x 4 cm; 7 µm en serie con dos columnas analíticas: TSK G3000 SWXL de 7,8-mm x 30 cm; 5 µm en serie con una columna TSK G2000 SWXL de 7,8 mm x 30 cm; 5 µm.
USP 39
Pruebas Químicas/ (211) Arsénico 267
Redondear el valor de la media de Mw con una aproximación de 50 Da. Usando el mismo software para GPC, determinar para cada uno de los cromatogramas duplicados de la Solución muestra el porcentaje de producto con peso molecular según lo indicado en la monografía del producto. Criterios de aceptación: Según se indican en la monografía. REQUISITOS ADICIONALES • ESTÁNDARES DE REFERENCIA USP (11)
ER Dalteparina Sódica USP ER Calibrador de Peso Molecular de Heparina de Bajo Peso Molecular USP
(211) ARSÉNICO Este procedimiento está diseñado para determinar la presencia de trazas de arsénico (As) convirtiendo el arsénico en las sustancias en análisis en arsina, la cual se pasa luego a través de una solución de dietilditiocarbamato de plata y forma un complejo de color rojo. El color rojo producido de esta manera se compara, en forma visual o espectrofotométrica, con el color producido de manera similar en un control que contiene una cantidad de arsénico que equivale al límite especificado en la monografía individual. Los límites se establecen en términos de arsénico (As). El contenido de arsénico no debe exceder el límite indicado en la monografía individual. Existen 2 métodos que sólo difieren en el tratamiento preliminar de la sustancia de prueba y del estándar. Por lo general, el Método I se usa para materiales inorgánicos en tanto que el Método 11 se utiliza para los materiales orgánicos. PROCEDIMIENTOS Aparato El aparato (ver la Ilustración) consta de un generador de arsina (a) equipado con una unidad depuradora (c) y un tubo de absorción (e) con juntas cónicas estándar o juntas de rótula esférica de vidrio esmerilado (by d) entre las unidades. No obstante, se puede usar cualquier otro aparato adecuado cuyo principio de funcionamiento sea el mismo que el del aparato descrito e ilustrado.
e d
e
b
Aparato para la Prueba de Arsénico Solución Madre de Trióxido de Arsénico: Disolver 1 32,0 mg de trióxido de arsénico, previamente secados a 105º durante una hora y pesados con exactitud, en 5 ml de solución de hidróxido de sodio (1 en 5) en un matraz volumétrico de 1000 ml. Neutralizar la solución con ácido sulfúrico 2 N, agregar 1 O ml más de ácido sulfúrico 2 N y luego llevar a volumen con agua recientemente hervida y enfriada, y mezclar. Solución Estándar de Arsénico: Transferir 10,0 ml de la Solución Madre de Trióxido de Arsénico a un matraz volumétrico de 1000 ml, agregar 1 O ml de ácido sulfúrico 2 N, llevar a volumen con agua recientemente hervida y enfriada, y mezclar. Cada ml de la Solución Estándar de Arsénico contiene el equivalente a 1 µg de arsénico (As). Conservar esta solución en un recipiente que sea totalmente de vidrio y usarla durante los tres días posteriores a su preparación. Método 1 Preparación Estándar: Pipetear 3,0 ml de la Solución Estándar de Arsénico y transferir a un matraz generador. Diluir con agua hasta obtener un volumen de 35 ml.
268 (211) Arsénico / Pruebas Químicas
USP 39
Preparación de Prueba: Excepto que se indique algo diferente en la monografía individual, transferir al matraz generador la cantidad, en g, de la sustancia de prueba calculada, por la fórmula:
3,0/L = límite de arsénico (ppm) Disolver en agua y diluir con agua hasta obtener un volumen de 35 mL. Procedimiento: Tratar la Preparación Estándar y la Preparación de Prueba de la misma manera, tal como se describe a continuación. Agregar 20 mL de ácido sulfúrico 7 N, 2 mL de yoduro de potasio SR y 0,5 mL de solución ácida de cloruro estannoso concentrada SR y 1 mL de alcohol isopropílico, y mezclar. Dejar en reposo a temperatura ambiente durante 30 minutos. Rellenar el tubo depurador (e) con dos trozos de algodón previamente impregnados con solución saturada de acetato de plomo, exprimidos para eliminar el exceso de solución y secados al vacío a temperatura ambiente, dejando un pequeño espacio de 2 mm entre los dos trozos de algodón. Lubricar las juntas (by d) con una grasa adecuada para llaves de paso, apropiada para usarse con disolventes orgánicos y conectar la unidad depuradora al tubo de absorción (e). Transferir 3,0 mL de dietilditiocarbamato de plata SR al tubo de absorción. Agregar 3,0 g de cinc granulado (malla Nº 20) a la mezcla del matraz y conectar inmediatamente la unidad depuradora ensamblada y permitir el desprendimiento de hidrógeno y el desarrollo de color a temperatura ambiente durante 45 minutos, agitando el matraz por rotación moderada cada 1O minutos. Desconectar el tubo de absorción de la unidad depuradora y del matraz generador y transferir la solución absorbente a celdas de absorción de 1 cm. La coloración roja producida por la Preparación de Prueba no excederá la producida por la Preparación Estándar. Si fuera necesario o conveniente, determinar la absorbancia a la longitud de onda de máxima absorción entre 535 nm y 540 nm con un espectrofotómetro o colorímetro adecuado, usando dietilditiocarbamato de plata SR como blanco. Sustancias Químicas lnterferentes: Los metales o las sales de metales, como el cromo, cobalto, cobre, mercurio, molibdeno, níquel, paladio y plata, pueden interferir con la formación de arsina. El antimonio, que forma estibina, produce una interferencia positiva en el desarrollo del color con dietilditiocarbamato de plata SR. Cuando se sospecha la presencia de antimonio, el color rojo que se produce en las dos soluciones de dietilditiocarbamato de plata, puede compararse a la longitud de onda de máxima absorción entre 535 nm y 540 nm con un colorímetro apropiado, ya que a esta longitud de onda la interferencia debida a la estibina es inapreciable. Método 11 [NOTAS-] (1) Precaución-Algunas sustancias pueden reaccionar en forma de explosiones violentas cuando se digieren con peróxido de hidró-
L
geno. Extremar las medidas de seguridad en todo momento.
(2) Si se trabaja con compuestos que contienen halógenos, calentar las muestras con ácido sulfúrico a una temperatura más baja evitando que la mezcla entre en ebullición y agregar cuidadosamente el peróxido de hidrógeno antes de que tenga lugar la carbonización para prevenir la pérdida de arsénico trivalente. (3) Si la sustancia de prueba reacciona con demasiada rapidez y comienza a carbonizarse con 5 mL de ácido sulfúrico antes de calentarse, se deberá usar en su lugar 1O mL de ácido sulfúrico diluido frío (1 en 2) y agregar algunas gotas de peróxido de hidrógeno antes de calentar. Preparación Estándar: Pipetear 3,0 mL de Solución Estándar de Arsénico y transferir al matraz generador, agregar 2 mL de ácido sulfúrico, mezclar y agregar la cantidad total de peróxido de hidrógeno al 30 por ciento empleado en la Preparación de Prueba. Calentar la mezcla hasta que se desprenda humo denso. Dejar que se enfríe, agregar cuidadosamente 1O mL de agua y volver a calentar hasta que se produzca humo irritante. Se debe repetir este procedimiento con otros 1O mL de agua para eliminar cualquier traza de peróxido de hidrógeno. Enfriar y diluir con agua hasta obtener 35 ml. Preparación de Prueba: Excepto que se indique algo diferente en la monografía individual, transferir un matraz generador la cantidad, en g, de la sustancia de prueba calculada por la fórmula:
3,0/L L = límite de arsénico (ppm) Agregar 5 mL de ácido sulfúrico y algunas perlas de vidrio y digerir en una campana de extracción, preferentemente en una placa de calentamiento, y a una temperatura de no más de 120º, hasta que se inicie la carbonización. (Agregar más ácido sulfúrico si fuera necesario para humedecer completamente algunas muestras pero teniendo en cuenta que el volumen total agregado no puede exceder de 1O ml.) Agregar cuidadosamente, gota a gota, peróxido de hidrógeno al 30%, y dejar que la reacción disminuya y calentar nuevamente entre una y otra gota. Agregar las primeras gotas muy lentamente mezclando lo suficiente para evitar una reacción rápida. Interrumpir el calentamiento si se produce excesiva espuma. Cuando la reacción ha terminado, calentar cuidadosamente, rotando el matraz ocasionalmente para evitar que algunas porciones de la muestra queden adheridas a las paredes del matraz expuestas a la unidad de calentamiento. Mantener las condiciones de oxidación en todo momento durante Ja digestión agregando pequeñas cantidades de la solución de peróxido de hidrógeno cada vez que la mezcla se torne de color marrón o se oscurezca. Continuar la digestión hasta que la materia orgánica se
destruya, aumentando gradualmente la temperatura de la placa de calentamiento hasta que se desprenda abundante humo de trióxido de azufre y la solución se vuelva incolora o presente solamente un color ligeramente pajizo. Enfriar, agregar cuidadosamente 1O mL de agua, mezclar y volver a evaporar hasta que aparezca humo irritante; repetir este procedimiento
Pruebas Químicas/ (212) Análisis de Oligosacáridos 269
USP 39
para eliminar cualquier traza de peróxido de hidrógeno. Enfriar, agregar cuidadosamente 1O mL de agua, lavar las paredes del matraz con algunos mL de agua y diluir con agua a 35 ml. Procedimiento: Proceder según se indica en el Procedimiento en Método l. Sustancias Químicas lnterferentes: Ver Sustancias Químicas lnterferentes en Método l.
,
,
(212) ANALISIS DE OLIGOSACARIDOS INTRODUCCIÓN El análisis de la composición de oligosacáridos unidos a Asn (también conocidos como oligosacáridos N-ligados o N-glicanos) se ha vuelto necesario para la caracterización de ciertas proteínas terapéuticas recombinantes o para establecer sus especificaciones de liberación. Ver el capítulo de información general Análisis de Glicoproteínas y Glicanos-Consideraciones Generales (1084) para información sobre la caracterización y evaluación de la glicosilación de proteínas. El capítulo (1084) incluye estrategias analíticas generales y resalta criterios para seleccionar métodos apropiados para desafíos analíticos específicos, además de proveer el contexto para este capítulo. Por el momento, este capítulo se enfoca en el análisis de oligosacáridos unidos a Asn escindidos enzimáticamente de proteínas terapéuticas recombinantes glicosiladas que contienen cadenas biantenarias relativamente simples, ricas en manosa, con niveles bajos o nulos de estructuras sialiladas, fosforiladas o sulfatadas. Por lo tanto, se proveen métodos utilizados en los diferentes pasos del análisis de proteínas terapéuticas recombinantes glicosiladas, incluyendo: un procedimiento genérico para la liberación enzimática de N-glicanos usando N-glicosidasa F (PNGasa F) peptídica, dos métodos diferentes para el marcado con fluoróforos de los N-glicanos liberados, y cuatro procedimientos analíticos de separación cromatográfica y electroforética, así como criterios de desempeño para la separación. El capítulo (1084) trata estrategias analíticas alternativas. Aunque los procedimientos de este capítulo están validados, estos deben ser verificados para cada producto específico individual (ver el capítulo Verificación de Procedimientos Farmacopeicos (1226)). Además, la validación es necesaria cuando se modifica el procedimiento para optimizarlo a un producto específico (ver el capítulo Validación de Procedimientos Farmacopeicos (1225)). Las monografías individuales de los productos proveerán el análisis de datos, la cuantificación y las especificaciones de liberación de lote, las cuales se espera sean específicas para cada producto. Por lo tanto, dichos aspectos no se tratan en este capítulo. El marcado de los oligosacáridos con fluoróforo antes del análisis de mejora la detección de los oligosacáridos durante la separación, debido a que estas moléculas tienen baja o nula absortividad de luz UV o visible y tampoco tienen grupos fluoróforos. Este capítulo describe dos métodos diferentes para el marcado con fluoróforos. El primero utiliza derivatización de oligosacáridos con 2-aminobenzamida (2-AB) y se usa cuando la separación es por cromatografía de líquidos; el segundo utiliza marcación con la sal trisódica del ácido 8-aminopireno-1,3,6- trisulfónico (APTS, por sus siglas en inglés) y se usa cuando la separación es por electroforesis capilar (CE, por sus siglas en inglés). Aunque la detección electroquímica (detección amperométrica por pulsos o detección electroquímica por pulsos) también se usa en el análisis de los oligosacáridos separados por cromatografía de intercambio aniónico de alta resolución (HPAEC) a alto pH, este método no se trata en este capítulo. Se han desarrollado muchos métodos de cromatografía y electroforesis diferentes para analizar oligosacáridos, y los procedimientos descriptos en este capítulo han sido usados con éxito para este propósito. La elección de los procedimientos aquí tratados pretende reflejar los enfoques de uso más común y amplio para medicamentos biológicos glicosilados recombinantes que se comercializan en la actualidad. Estos procedimientos analíticos incluyen cromatografía líquida en fase normal (NPLC, por sus siglas en inglés) o cromatografía líquida de interacción hidrofílica {HILIC, por sus siglas en inglés), cromatografía de intercambio aniónico de alta resolución (HPAEC, por sus siglas en inglés) a pH alto y electroforesis capilar. Otros métodos cromatográficos diversos que separan oligosacáridos por tamaño, forma y polaridad también se utilizan rutinariamente, pero no se tratan en este capítulo. Los principios generales de cromatografía se tratan en el capítulo Cromatografía (621) y este capítulo debe considerarse dentro de dicho contexto. Se han desarrollado Estándares de Referencia USP (ER) para evaluar la aptitud del sistema para estos procedimientos analíticos. El ER Mezcla A de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP es un complejo de oligosacáridos biantenarios parcialmente sialilados y parcialmente galactosilados N-enlazados escindidos de inmunoglobulina policlonal humana {lgG) mediante PNGasa F. El ER Mezcla B de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP es un complejo de oligosacáridos N-enlazados de alto contenido en manosa con trazas de cadenas híbridas escindidos de ribonucleasa B (RNasa B) bovina mediante PNGasa F. ASPECTOS GENERALES DE LOS PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS La Tabla 7 describe las aplicaciones y los principios de separación de procedimientos analíticos incluidos en este capítulo. La selección del ER apropiado dependerá del contenido de glicanos esperado del producto que se está analizando.
270 (212) Análisis de Oligosacáridos / Prueb61s Químicas
USP 39
Tabla 1 Procedimientos Analíticos Cromatografía en Fase Normal/HIL/C Procedimiento 1
• Columna: 2,0 mm x 15 cm; relleno L68 de 3 µm • Produce más picos de oligosacáridos en comparación con el Procedimiento 2 en modo HIL/C • Fase móvil en gradientes más llanos (menos empinados) y más prolongados en comparación con el Procedimiento 2 en modo HILIC • Mejor sensibilidad que permite menor tamaño de muestra Cromatografía en Fase Normal/HIL/C Procedimiento 2
• Columna: 4,6 mm x 25 cm; relleno L68 de 5 µm • Produce más picos de oligosacáridos en comparación con el Procedimiento 1 en modo HIL/C • Fase móvil en gradientes más llanos (menos empinados) y más prolongados en comparación con el Procedimiento 1 en modo HIL/C
Tipo de Ollgosacáridos N-ligados Que Se Van a Separar
Estándares de Referencia USP Aplicables
Cadenas biantenarias relativamente simples con niveles bajos o nulos de estructuras sialiladas, después del marcado con 2-AB
ER Mezcla A de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP
Cadenas con alto contenido de manosa, después del marcado con 2-AB
ER Mezcla B de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP
Cadenas biantenarias relativamente simples con niveles bajos o nulos de estructuras sialiladas, después del marcado con 2-AB
ER Mezcla A de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP
Cadenas con alto contenido de manosa, después del marcado con 2-AB
ER Mezcla B de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP
Cadenas biantenarias relativamente simples con HPAEC • Guarda columna: 4,0 mm x 5 cm; niveles bajos o nulos de estructuras sialiladas, después del marcado con 2-AB relleno L46 de 1O µm • Columna: 4,0 mm x 25 cm; relleno L46de10 µm • Fase móvil: Acetato de sodio 0-75 mM en hidróxido de sodio O, 150 N isocrático • La selectividad es diferente a la de los Procedimientos 1 y 2 en modo HILIC con respecto al tamaño y la Cadenas con alto contenido de manosa, descomposición de los oligosacáridos pués del marcado con 2-AB Electroforesis capilar Cadenas biantenarias relativamente simples con niveles bajos o nulos de estructuras sialiladas, • Apropiado para Oligosacáridos después del marcado con APTS APTS • Capilar: Diámetro interno de 50 µm con una longitud total de 50 cm y una longitud de separación de 40 cm • Tiempos de análisis más cortos en comparación con el método de ero- Cadenas con contenido alto de manosa, desmatografía de líquidos pués del marcado con APTS
ER Mezcla A de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP
ER Mezcla B de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP ER Mezcla A de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP
ER Mezcla B de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP
PREPARACIÓN DE MUESTRAS Las muestras deberían estar idealmente exentas de sales, excipientes y otros materiales portadores que pueden interferir con el análisis. Esto se puede lograr mediante: 1) diálisis contra agua o contra una solución amortiguadora con componentes volátiles usando una membrana apropiada, 2) captura de la muestra en un cartucho de extracción en fase sólida (SPE, por sus siglas en inglés) seguido por la eliminación de sales y excipientes mediante lavado y elución de la muestra requerida o 3) ultrafiltración usando una membrana apropiada. [NOTA-Una muestra control con un perfil de glicanos conocido debe incluirse en el procedimiento general para confirmar el desempeño correcto del análisis. También se puede incluir un control o blanco de reacción que contenga la matriz de la muestra de glicoproteína usada en el procedimiento general.] • LIBERACIÓN ENZIMÁTICA DE N-GLICANOS [NOTA-El siguiente es un método genérico que debe optimizarse para productos individuales dependiendo de la cantidad de glicoproteína que se va a digerir y de las estructuras de los glicanos, en particular se debe considerar la relación proteína/ glicano en la molécula y la accesibilidad de la enzima a las uniones de los azúcares con las proteínas.] Procedimiento 1 para separación cromatográfica Solución amortiguadora de reacción enzimática: Fosfato de sodio 50 mM de pH 7,5 o tris(hidroximetil)-aminometano 15 mM ajustado con ácido clorhídrico a un pH de 7,0 Digestión con PNGasa F: Transferir O, 1-2,25 mg de glicoproteína a un vial, disolver y llevar con Solución amortiguadora de reacción enzimática a un volumen final de 30-100 µL. Agregar PNGasa F a la muestra de glicoproteína en una relación
USP 39
Pruebas Químicas/ (212) Análisis de Oligosacáridos 271
de 0,5-15 unidades de PNGasa F/0, 1 mg de glicoproteína. Incubar a 37° durante 12-24 horas. Enfriar a temperatura ambiente durante aproximadamente 5 minutos. Mezclar suavemente usando un mezclador de vórtice y centrifugar brevemente. [NOTA-Una unidad de PNGasa F se define como la cantidad de enzima requerida para catalizar la liberación de oligosacáridos N-ligados de 1,0 nmol de ribonucleasa B desnaturalizada por minuto a un pH de 7,5 a 37º y es igual a 1 miliunidad de la Unión de Bioquímica Internacional (IUB, por sus siglas en inglés).] [NOTA-La totalidad de la digestión mediante PNGasa F se puede evaluar observando un desplazamiento de movilidad de las proteínas desglicosiladas en SDS-PAGE seguida por una tinción con Azul de Coomassie o en SDS-CGE, evidenciada por una reducción de la masa de aproximadamente 2 kDa por cadena de glicano escindida.] A continuación, se describen dos métodos para llevar a cabo la separación de los glicanos liberados de la glicoproteína. Método 1, usando ultrafiltración centrífuga por membrana con un límite de peso molecular de 30 kDa: 1 Eliminar las trazas de glicerina enjuagando la membrana con 0,5 mi de agua y centrifugando a 11 000 x g. Desechar el permeado. Agregar O, 1 mL de agua en el reservorio de la muestra y luego agregar la muestra de glicoproteína digerida al reservorio. Enjuagar el vial de reacción con O, 1 mL de agua y agregar al reservorio de la muestra. Centrifugar a 11 000 x g y recoger el permeado. Enjuagar el reservorio de la muestra dos veces con O, 1 mL de agua para cada lavado, centrifugar a 11 000 x g y recoger el permeado. Combinar los permeados (aproximadamente 0,5 mL) y secar completamente las muestras usando una centrífuga evaporadora sin calor. [NOTA-Se pueden usar membranas de ultrafiltración centrífuga con un límite de peso molecular más bajo para proteínas con un tamaño menor a 150 kDa.] Método 2, usando un cartucho de extracción en fase sólida (SPE) en fase reversa:2 Agregar 2,0 mL de metano! a una jeringa, acoplar la jeringa al cartucho y usar el émbolo de la jeringa para pasar metanol y desecharlo. Agregar 6,0 mL de ácido acético al 5% (v/v) en agua a una jeringa. Acoplar la jeringa al cartucho y usar el émbolo de la jeringa para pasar la solución de ácido acético y desecharla. Aplicar con cuidado la muestra digerida en un cartucho individual. Agregar 0,5 mL de ácido acético al 5% (v/v) a una jeringa de 1 mL, acoplar la jeringa al cartucho y usar el émbolo de la jeringa para pasar el ácido acético y descartar. Agregar 1,5 mL de ácido acético al 5% (v/v) a una jeringa de 2 a 3 ml. Acoplar la jeringa al cartucho y usar el émbolo de la jeringa para pasar el ácido acético, y recoger el eluato en un tubo de 1,5 ml. Secar por completo los eluatos usando una centrífuga evaporadora sin calor. Procedimiento 2 para separación por electroforesis capilar Solución amortiguadora de reacción enzimática: Fosfato de sodio 50 mM, pH 7,5 Digestión con PNGasa F: Agregar 2 µL de PNGasa F (5 unidades/µL) a una muestra de 50 µg de glicoproteína y ajustar con Solución amortiguadora de reacción enzimática a un volumen final de 50 µL. Incubar a 37º durante 18 horas. Separar mediante ultrafiltración centrífuga los oligosacáridos escindidos usando un filtro con límite de peso molecular de 1O kDa. Secar el permeado conteniendo los oligosacáridos usando una centrífuga evaporadora con vacio sin calor. • MARCADO CON 2-AMINOBENZAMIDA (2-A8)3 PARA SEPARACIÓN POR CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS
Solución A: Mezclar ácido acético glacial y dimetil sulfóxido (3:7, v/v). Solución B: Agregar 1,5 mL de Solución A a 75 mg de 2-aminobenzamida (2-AB). Mezclar bien y suavemente con un mezclador de vórtice hasta disolver por completo el 2-AB. Solución de marcado: Agregar 1 mL de Solución B a 63 mg de cianoborohidruro de sodio. Mezclar bien y suavemente con un mezclador de vórtice. Tapar la muestra herméticamente e incubar a 70º durante 1-2 minutos para disolver por completo. Enfriar a temperatura ambiente durante 1O minutos. Usar esta Solución de marcado dentro de la primera hora de su preparación. Proteger la solución de la luz. Solución estándar marcada con 2-AB: Agregar 5-15 µL de Solución de marcado a un vial de ER Mezcla A de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP o de ER Mezcla B de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP y mezclar bien. Solución muestra marcada con 2-AB: Agregar 5-15 µL de Solución de marcado a la muestra de glicano secada y mezclar bien. Procedimiento: Incubar inmediatamente la Solución estándar marcada con 2-AB y la Solución muestra marcada con 2-AB a 37º durante 16-18 horas o a 65º durante 2 horas. Dejar que se enfríe a temperatura ambiente durante 1O minutos. Centrifugar brevemente. [NOTA-Siguiendo las guías citadas en la Tabla 7, seleccionar el ER USP apropiado y marcar.] A continuación se describen dos métodos para eliminar el 2-AB libre. Método 1, usando una columna de filtración en gel para centrifugación: Preparar columnas de filtración en gel para microcentrifugación G-1 O adecuadas4 golpeteando suavemente la columna para asegurar que la resina seca se sedimente en el fondo. Retirar las tapas y colocar la columna en un tubo de recolección de 2 ml. Agregar 0,5 mL de agua a la resina y dejar que se rehidrate durante al menos 15 minutos. Un tiempo de rehidratación más largo (hasta 24 horas) es aceptable si se mantiene la columna a 2º-8º. Centrifugar la columna a máxima velocidad por 5-1 O segundos. Retirar el agua del tubo de recolección. Lavar la resina agregando 0,5 mL de agua y centrifugar la columna. Repetir la etapa de lavado una
1 Una dispositivo apropiado de ultrafiltración centrífuga con membrana con un límite de peso molecular de 30 kDa. es el Microcón YM-30 disponible en Millipore (números de catálogo 42422, 42409 y 4241 O) o equivalente. 2 Un cartucho SPE adecuado es Glyko GlycoClean R Cartridge disponible en Prozyme (número de catálogo GKl-4756) o equivalente. 3 Un kit de marcado con 2-AB adecuado es el Glycko Signal 2-AB Labeling Kit disponible en Prozyme (número de catálogo GKK-404), el kit de marcado LudgerTag 2-AB disponible en QA Bio (número de catálogo LT-KAB-A2) o equivalente. 4 Una columna adecuada preempacada con Sephadex G-1 O es la columna Macro Spin G-1 O mini SEC disponible en Harvard Apparatus (número de catálogo 743900) o en The Nest Group (número de catálogo SMM 501 O) o equivalente.
272 (212) Análisis de Oligosacáridos / Pruebas Químicas
USP 39
vez más. Después de eliminar el agua de la etapa de lavado final, centrifugar a la velocidad máxima durante 1O segundos para retirar el agua residual de la resina. La resina se torna blanca cuando se remueve suficiente agua residual. Colocar la columna en un nuevo tubo de recolección marcado. Agregar 100 µL de agua a la Solución estándar marcada con 2-AB y a la Solución muestra marcada con 2-AB, y luego aplicar toda la solución al centro de cada una de las columnas G-1 O lavadas, respectivamente. Colocar las columnas G-1 O en la microcentrífuga y centrifugar a aproximadamente 200 x g durante 1 minuto. Aplicar el eluato de la primera columna (aproximadamente 90-120 µL) al centro de una segunda columna G-1 O, que no ha sido previamente usada pero ha sido lavada, y centrifugar a aproximadamente 200 x g durante 1 minuto. Colectar este segundo eluato (aproximadamente 60-100 µL) y transferirlo a un tubo de microcentrífuga. Secar los eluatos mediante evaporación centrífuga sin calor. Método 2, usando un cartucho para SPE: Preparar cartuchos para SPE adecuados 5 lavándolos con 1,0 mL de agua, seguido con 5 x 1,0 mL de ácido acético al 30% (v/v) y luego con 1,0 mL de acetonitrilo. Aplicar la Solución estándar marcada con 2-AB y la Solución muestra marcada con 2-AB a la superficie central de los discos de cartucho y dejar que la solución se incube en el disco durante 15-20 minutos. Lavar cada disco con 1 mL de acetonitrilo, seguido por 6 x 1,0 mL de acetronitrilo al 96% (v/v), dejando que escurra cada alícuota antes de aplicar la siguiente. Eluir el estándar marcado con 2-AB y la muestra marcada con 2-AB con 3 x 0,5 mL de agua, dejando que escurra cada alícuota antes de aplicar la siguiente. Secar los eluatos usando una evaporación centrífuga sin calor. [NOTA-Durante este procedimiento, podrían perderse los glicanos hidrófobos muy pequeños.] • MARCADO CON ÁCIDO 8-AMINOPIREN0-1,3,6-TRISULFÓNICO (APTS) PARA SEPARACIÓN POR ELECTROFORESIS CAPILAR Reactivo de marcado con APTS: Disolver 5 mg de 8-aminopireno-1,3,6-trisulfonato (APTS) trisódico en 48 µL de ácido acético al 15% (v/v). Cianoborohidruro de sodio 1 M: Cianoborohidruro de sodio 1 M en tetrahidrofurano Solución amortiguadora de corrida: Disolver 1,492 g de trietanolamina (TEA) y 1Og de glicerol, pesados con exactitud, en 80 mL de agua. Ajustar a un pH de 7,5 con ácido clorhídrico 1 N y diluir con agua a un volumen final de 100 mL. Solución amortiguadora de muestra: Diluir 1,0 mL de Solución amortiguadora de corrida con 9,0 mL de agua. Solución estándar marcada con APTS: Agregar 2 µL de Reactivo de marcado con APTS y 2 µL de Cianoborohidruro de sodio 1 M a un vial de ER Mezcla A de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP o de ER Mezcla B de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP. Incubar a 55º durante 90 minutos. Agregar 46 µL de agua para detener la reacción y mezclar. Transferir 5 µL del ER USP marcado con APTS a 1,995 mL de Solución amortiguadora de muestra antes de la separación. [NOTA-Puede ser necesario ajustar el volumen de la Solución amortiguadora de muestra para que las señales de fluorescencia de los oligosacáridos sean similares a las de la Solución muestra marcada con APTS.] Solución muestra marcada con APTS: Agregar 2 µL de Reactivo de marcado con APTS y 2 µL de Cianoborohidruro de sodio 1 M a la muestra de glicano seca. Incubar a 55º durante 90 minutos. Agregar 46 µL de agua para detener la reacción y mezclar. Transferir 5 µL de la solución de glicanos marcada con APTS a 95 µL de Solución amortiguadora de muestra antes de la separación. [NOTA-Siguiendo las guías citadas en la Tabla 1, seleccionar el ER USP apropiado y marcar.] SEPARACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE OLIGOSACÁRIDOS • CROMATOGRAFÍA EN FASE NORMAL/HILIC Procedimiento 1 Solución de ácido fórmico 1,4 M: Mezclar 273 mL de agua con 15 mL de ácido fórmico al 98%-100%. Solución de amoniaco 1,4 M: Mezclar 155 mL de agua con 40 mL de solución de amoniaco al 26%. Solución amortiguadora de formiato de amonio: Agregar Solución de amoniaco 1,4 M a Solución de ácido fórmico 1,4
M. Solución A: Solución B: Fase móvil:
Acetonitrilo, Solución amortiguadora de formiato de amonio y agua (75: 4,3: 20,7) Acetonitrilo, Solución amortiguadora de formiato de amonio y agua (54: 8,3: 37,7) Ver la Tabla 2. Tabla 2 Tiempo (mln)
Solución A (%)
Solución B (%)
0,0
79
21
80,0
47
53
81,0
o o
100
92,0 93,0
79
21
113,0
79
21
100
Solución estándar: Reconstituir el estándar seco marcado con 2-AB con no más de 500 µL de agua. [NOTA-Puede ser necesario ajustar el volumen de agua para que las señales de fluorescencia de la Solución estándar sean similares a las de la Solución muestra.]
5 Un cartucho adecuado para eliminar el 2-AB libre es Glyko GlycoClean S Cartridge disponible en Prozyme (número de catálogo GKl-4726) o equivalente.
Pruebas Químicas/ (212) Análisis de Oligosacáridos 273
USP 39
Solución muestra: Reconstituir la muestra seca marcada con 2-AB con un volumen apropiado de agua. [NOTA-Usar una relación de 30 µL de agua por cada 100 µg de glicoproteína usada en la prueba de Liberación Enzimática de N-Glicanos como punto de inicio.] Solución blanco: Matriz amortiguadora de muestra de glicoproteína obtenida mediante el procedimiento de Preparación de la muestra Sistema cromatográfico 0/er Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.) Modo: HPLC Detector: Fluorescencia (longitud de onda de excitación de 250 nm y longitud de onda de emisión de 428 nm) Columna: 2,0 mm x 15 cm; relleno L68 de 3 µm Temperaturas Columna: 45º Muestreador automático: 20º Velocidad de flujo: 0,2 ml/min Volumen de inyección: 2 µL Aptitud del sistema Muestras: Solución estándar y Solución blanco Requisitos de aptitud Blanco: No se observan picos en el cromatograma de la Solución blanco dentro de la ventana del tiempo de retención a 5-11 3 minutos Similitud de los cromatogramas: Si se usa el ER Mezcla A de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP, el cromatograma obtenido de la Solución estándar corresponde al cromatograma de referencia provisto con el Certificado USP del ER Mezcla A de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP. Si se usa el ER Mezcla B de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP, el cromatograma obtenido de la Solución estándar corresponde al cromatograma de referencia provisto con el Certificado USP del ER Mezcla B de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP. Presencia de especies de N-glicano: Si se usa el ER Mezcla A de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP, identificar los picos correspondientes a GO, GOF, Gl Fa, Gl Fb, G2F, A1 F y A2F en el cromatograma obtenido de la Solución estándar comparando el cromatograma de referencia provisto con el Certificado USP del ER Mezcla A de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP. Si se usa el ER Mezcla B de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP, identificar los picos correspondientes a MAN-5, MAN-6, MAN-7, MAN-8 y MAN-9 en el cromatograma obtenido de la Solución estándar comparando el cromatograma de referencia provisto con el Certificado USP del ER Mezcla B de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP. Tiempos de retención relativos: Correspondiente a los tiempos de retención relativos de N-glicanos listados en la Tabla 3 o la Tabla 4 Ta bl a 3 So 1ucon I' Et' 'Id os USP san d ar Usan d o e 1 ER Mezc1a Ade A¡pt1tu d d e 1 SI stema d e 0111gosacar N-Glicano
Tiempo de Retención Relativo
GO (NGA2)
0,47
GOF (NGA2F)
0,57
GlFa (NAlF, FA2Gl o NA2GlF)
0,75
GlFb (NAlF, FA2Gl o NA2GlF)
0,78
G2F (NA2F)
1,00
AlF (G2fSl)
1,39
A2F (G2fS2)
1,76
Tabla 4. Solución Estándar Usando el ER Mezcla B de Aptitud del Sistema de Ollgosacárldos USP N-Gllcano
Tiempo de Retención Relativo
MAN-5
0,74
MAN-6
1,00
MAN-7
1,29
MAN-8
1,60
MAN-9
1,85
Análisis: Equilibrar el Sistema cromatográfico durante al menos 1 hora con las condiciones iniciales descritas en la Tabla 2. Inyectar la Solución blanco hasta que la línea base permanezca estable (1-3 inyecciones). Muestra: Solución muestra Integrar los picos en el cromatograma resultante e informar las áreas relativas (con respecto al área total) de los picos pertinentes de estructuras de glicano relevantes al producto. Trazar una línea base desde el primero hasta el último pico. Para información general sobre la integración de los picos cromatográficos, ver Cromatografía (621 ). Procedimiento 2
274 (212) Análisis de Oligosacáridos / Pruebas Químicas
USP 39
Solución A: Mezclar 500 ml de agua con 9,8 ml de ácido fórmico al 96%. Ajustar con hidróxido de amonio al 30% a un pH de 4,0±0,1. Diluir con agua hasta un volumen final de 1000 ml. Filtrar la solución a través de una membrana de acetato de celulosa con un tamaño de poro de 0,22 µm. Solución B: Acetonitrilo Fase móvil: Ver la Tabla 5. Tabla 5 Tiempo (mln)
Solución A (%)
Solución B (%)
0,0
20
80
2,0
30
70
67,0
52
48
67,1
80
20
73,0
80
20
73,1
20
80
85,0
20
80
Solución estándar: Reconstituir el estándar seco marcado con 2-AB con no menos de 500 µL de agua. [NOTA-Puede ser necesario ajustar el volumen de agua para que las señales de fluorescencia de la Solución estándar sean similares a las de la Solución muestra.] Solución muestra: Reconstituir la muestra seca marcada con 2-AB con un volumen apropiado de agua. [NOTA-Usar una relación de 50 µL de agua por cada 100 µg de glicoproteína usada en la prueba de Liberación Enzimática de N-Glicanos como punto de inicio.] Solución blanco: Matriz amortiguadora de muestra de glicoproteína obtenida mediante el procedimiento de Preparación de la muestra
Sistema cromatográfico (Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.) Modo: HPLC Detector: Fluorescencia; ajustar las longitudes de onda de excitación y emisión según se listan en la Tabla 6. Tabla 6 Tiempo (min)
Excitación (nm)
Emisión (nm)
0,00
330
420
1,00
330
420
1,01
400
500
10,00
400
500
10,01
330
420
85,00
330
420
Columna: 4,6 mm x 25 cm; relleno L68 de 5 µm Temperaturas Columna: 35º Muestreador automático: 2º-8º Velocidad de flujo: 0,4 ml/min Volumen de inyección: 1O µL Aptitud del sistema Muestra: Solución estándar Requisitos de aptitud Similitud de los cromatogramas: Si se usa el ER Mezcla A de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP, el cromatograma obtenido de la Solución estándar corresponde al cromatograma de referencia provisto con el Certificado USP del ER Mezcla A de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP. Si se usa el ER Mezcla B de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP, el cromatograma obtenido de la Solución estándar corresponde al cromatograma de referencia provisto con el Certificado USP del ER Mezcla B de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP. Presencia de especies de N-glicano: Si se usa el ER Mezcla A de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP, identificar los picos correspondientes a GO, GOF, Gl Fa, Gl Fb, G2, G2F, Al F y A2F en el cromatograma obtenido de la Solución estándar comparando el cromatograma de referencia provisto con el Certificado USP del ER Mezcla A de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP. Si se usa el ER Mezcla B de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP, identificar los picos correspondientes a MAN-5, MAN-6, MAN-7, MAN-8 y MAN-9 en el cromatograma obtenido de la Solución estándar comparando el cromatograma de referencia provisto con el Certificado USP del ER Mezcla B de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP.
Pruebas Químicas/ (212) Análisis de Oligosacáridos 275
USP 39 Tiempos de retención relativos: Tabla 7 o la Tabla 8
Correspondiente a los tiempos de retención relativos de N-glicanos listados en la
, d ar Usan d o e IEM 'Id os USP stema d e 0111gosacar R ezcIAdAºddlSI a e pt1tu e Ta bl a 7. So1ucI'on Estan
N-Gllcano
Tiempo de Retención Relativo
GO (NGA2)
0,78
GOF (NGA2F)
0,83
GlFa (NAlF, FA2Gl o NA2G1F)
0,91
Gl Fb (NAl F, FA2Gl o NA2Gl F)
0,92
G2 (NA2)
0,96
G2F (NA2F)
1,00
AlF (G2fS1)
1, 11
A2F (G2f52)
1,20
Tabla 8. Solución Estándar Usando el ER Mezcla B de Aptitud del Sistema de Ollgosacárldos USP Tiempo de Retención Relativo
N-Gllcano MAN-S
0,77
MAN-6
0,86
MAN-7
0,93
MAN-8
1,00
MAN-9
1,05
Análisis Muestra: Solución muestra Integrar los picos en el cromatograma resultante e informar las áreas relativas (con respecto al área total) de los picos pertinentes de estructuras de glicano relevantes al producto. Para información general sobre la integración de los picos cromatográficos, ver Cromatografía (621 ). •CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO ANIÓNICO DE PH ALTO CON DETECCIÓN FLUOROMÉTRICA
Solución A: Agua, desgasificar antes de usar. Solución B: Disolver 20,5 g de acetato de sodio anhidro en 450 ml de agua y mezclar bien. Diluir con agua hasta un volumen final de 500 ml. Filtrar la solución a través de una membrana con un tamaño de poro de no más de 0,45 µm y desgasificar antes de usar. Solución C: Agregar 28 ml de solución de hidróxido de sodio al 50% (p/p) a 972 ml de agua. Pasar la solución a través de un filtro de membrana resistente a soluciones alcalinas con un tamaño de poro de no más de 0,45 µm y desgasificar antes de usar. Fase móvil: Ver la Tabla 9. Tabla 9 Solución B (%)
Solución C (%)
Tiempo (min)
Solución A (%)
0,0
70
15,0
70
65,0
55
15
30
66,0
o
50
50
o o
Elución
30
Condición inicial
30
Acetato de sodio 0-75 mM, hidróxido de sodio O, 15 N isocrático
74,0
o
50
50
75,0
70
30
90,0
70
o o
30
Acetato de sodio 250 mM, hidróxido de sodio 0,25 N para lavado
Re-equilibrio
Solución estándar: Reconstituir el estándar seco marcado con 2-AB con no más de 500 µL de agua. [NOTA-Puede ser necesario ajustar el volumen de agua para que las señales de fluorescencia de la Solución estándar sean similares a las de la Solución muestra.]
Solución muestra: Reconstituir la muestra seca marcada con 2-AB con un volumen apropiado de agua. [NOTA-Usar una relación de 20 µL de agua por cada 100 µg de glicoproteína usada en la prueba de Liberación Enzimática de N-Glicanos como punto de inicio.] Solución blanco: Matriz amortiguadora de muestra de glicoproteína obtenida mediante el procedimiento de Preparación de la muestra
Sistema cromatográfico (Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.) Modo: HPLC
276 (212) Análisis de Oligosacáridos / Pruebas Químicas
USP 39
Detector: Fluorescencia (longitud de onda de excitación de 330 nm y longitud de onda de emisión de 420 nm) Columnas Guarda columna: 4,0 mm x 5 cm; relleno L46 de 1 O µm Analítica: 4,0 mm x 25 cm; relleno L46 de 1O µm Temperaturas Columna: 25º Muestreador automático: 4º Velocidad de flujo: 0,8 ml/min Volumen de inyección: 50 µL Aptitud del sistema Muestra: Solución estándar Requisitos de aptitud Similitud de los cromatogramas: Si se usa el ER Mezcla A de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP, el cromatograma obtenido de la Solución estándar corresponde al cromatograma de referencia provisto con el Certificado USP del ER Mezcla A de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP. Si se usa el ER Mezcla B de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP, el cromatograma obtenido de la Solución estándar corresponde al cromatograma de referencia provisto con el Certificado USP del ER Mezcla B de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP. Presencia de especies de N-glicano: Si se usa el ER Mezcla A de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP, identificar los picos correspondientes a GOF, Gl F, GO, G2F, A1 F y A2F en el cromatograma obtenido de la Solución estándar comparando el cromatograma de referencia provisto con el Certificado USP del ER Mezcla A de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP. Si se usa el ER Mezcla B de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP, identificar los picos correspondientes a MAN-5, MAN-6, MAN-7, MAN-8 y MAN-9 en el cromatograma obtenido de la Solución estándar comparando el cromatograma de referencia provisto con el Certificado USP del ER Mezcla B de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP. Tiempos de retención relativos: Correspondientes a los tiempos de retención relativos de N-glicanos listados en la Tabla 7O o la Tabla 7 7 Tabla 10. Solución Estándar Usando el ER Mezcla A de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP N-Glicano
Tiempo de Retención Relativo
GOF (NGA2F)
0,67
GlF (NAlF, FA2Gl o NA2GlF)
0,86
GO (NGA2)
0,92
G2F (NA2F)
1,00
AlF (G2f51)
1,75
A2F (G2f52)
2,22
Tabla 11. Solución Estándar Usando el ER Mezcla B de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP N-Glicano
Tiempo de Retención Relativo
MAN-5
0,86
MAN-6
1,00
MAN-7
1,09
MAN-8
1, 15
MAN-9
1,24
Análisis: Equilibrar el Sistema cromatográfico con las condiciones iniciales de fase móvil descritas en la Tabla 9 durante un mínimo de 15 minutos. Inyectar 50 µL de agua para la primera inyección. Muestra: Solución muestra Integrar los picos en el cromatograma resultante e informar las áreas relativas (con respecto al área total) de los picos pertinentes de estructuras de glicano relevantes al producto. Para información general sobre la integración de los picos cromatográficos, ver Cromatografía (621 ). • ELECTROFORESIS CAPILAR
Solución amortiguadora de corrida: Disolver 1,492 g de TEA y 1 Og de glicerol en 80 ml de agua. Ajustar con ácido clorhídrico 1 N a un pH de 7,5 y diluir con agua a un volumen final de 100 ml. Solución estándar: Solución estándar marcada con APTS que se prepara según se indica en la prueba de Marcado con Ácido 8-aminopireno- 7,3, 6-trisulfónico (APTS) para Separación por Electroforesis Capilar
Solución muestra: Solución muestra marcada con APTS que se prepara según se indica en la prueba de Marcado con Ácido 8-aminopireno- 7, 3, 6-trisulfónico ( APTS) para Separación por Electroforesis Capilar Solución blanco: Matriz amortiguadora de muestra de glicoproteína usada en el procedimiento de Preparación de la muestra
Condiciones instrumentales
Pruebas Químicas/ (212) Análisis de Oligosacáridos 277
USP 39
Modo: Electroforesis Capilar Detector: Fluorescencia inducida por láser (longitud de onda de excitación de 488 nm y longitud de onda de emisión de 520 nm) Capilar: Sílice fundida sin recubrimiento, con un diámetro interno de 50 µm, una longitud total de 50 cm y una longitud de separación de 40 cm Preacondicionamiento del capilar: Entre cada corrida, enjuagar durante 5 minutos a 40 psi con hidróxido de sodio 0,5 N, seguidos de agua durante 1 minuto a 40 psi. [NOTA-Preacondicionamiento del nuevo capilar o según se requiera: Enjuagar durante 5 minutos a 20 psi con metanol, seguidos de agua durante 1 minuto a 50 psi, de ácido clorhídrico 1 N durante 5 minutos a 20 psi, de agua durante 1 minuto a 50 psi, de hidróxido de sodio 0,5 N durante 25 minutos a 20 psi y de agua durante 5 minutos a 50 psi.] Prellenado del capilar: Enjuagar durante 5 minutos a 40 psi con Solución amortiguadora de corrida. Inyección muestra: inyección hidrodinámica (presión) de 1O segundos Voltaje: 22 kV durante 60 minutos Temperaturas Cartucho del capilar: 18º Almacenamiento de la muestra: 20º Aptitud del sistema Muestra: Solución estándar Requisitos de aptitud Similitud de los electroferogramas: Si se usa el ER Mezcla A de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP, el electroferograma obtenido de la Solución estándar corresponde al electroferograma de referencia provisto con el Certificado USP del ER Mezcla A de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP. Si se usa el ER Mezcla B de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP, el electroferograma obtenido de la Solución estándar corresponde al electroferograma de referencia provisto con el Certificado USP del ER Mezcla B de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP. Presencia de especies de N-glicano: Si se usa el ER Mezcla A de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP, identificar los picos correspondientes a G2F, G2, Gl Fa, Gl Fb, GOF, Man-5, GO y Al F en el electroferograma obtenido de la Solución estándar comparando el electroferograma de referencia provisto con el Certificado USP del ER Mezcla A de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP. Si se usa el ER Mezcla B de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP, identificar los picos correspondientes a MAN-5, MAN-6, MAN-7, MAN-8 y MAN-9 en el electroferograma obtenido de la Solución estándar comparando el electroferograma de referencia provisto con el Certificado USP del ER Mezcla B de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP. Tiempos de migración relativos: Correspondientes a los tiempos de migración relativos listados en la Tabla 72 o Ta-
bla 73 Tabla 12. Solución Estándar Usando el ER Mezcla A de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP N-Glicano
Tiempo de migración relativo
G2F (NA2F)
0,79
G2 (NA2)
0,84
GlFa (NAlF, FA2G1 o NA2GlF)
0,87
Gl Fb (NA 1 F, FA2G1 o NA2G1 F)
0,90
GOF (NGA2F)
1,00
MAN-5
1,03
GO (NGA2)
1,12
AlF (G2fS1)
1,18
Tabla 13. Solución Estándar Usando el ER Mezcla B de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP N-Glicano
Tiempo de migración relativo
MAN-9
0,82
MAN-8
0,85
MAN-7
0,91; 0,92; 0,94
MAN-6
1,00
MAN-5
1, 11
Análisis Muestra: Solución muestra Integrar los picos en el electroferograma resultante e informar las áreas relativas (con respecto al área total) de los picos pertinentes de estructuras de glicano relevantes al producto.
REQUISITOS ADICIONALES • ESTÁNDARES DE REFERENCIA USP (11 >
278 (212) Análisis de Oligosacáridos / Pruebas Químicas
USP 39
ER Mezcla A de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP ER Mezcla B de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP APÉNDICE 1 Tabla 14. Descripción de Gllcano Gii cano
Descripción Oligosacárido biantenario asialo-agalacto
GlcNAc¡31---+2Mana 1 \
6 Man (31---+4GlcNAc¡31---+4GlcNAc
3
/ GO (NGA2)
GlcNAc¡31---+2Mana 1 Oligosacárido biantenario asialo-agalacto-fucosilado
Fuca1
GlcNAc¡31---+2Mana1 \
1
6
6
Man (31---+4GlcNAc¡31---+4GlcNAc
3
/ GOF (NGA2F)
GlcNAc¡31---+2Mana 1 Oligosacárido biantenario asialo-monogalactosilado fucosilado con galactosilación en el enlace a(l ,6) Fuca1
Gal p 144GlcNAcp 142Mana 1
\ 6
6
Manp 144GlcNAcp 144GlcNAc
3
/ GlFa (NAlF, FA2G1 o NA2G1F) con enlace a(l,6)
GlcNAcp 142Mana1 Oligosacárido biantenario asialo-, monogalactosilado, fucosilado con galactosilación en el enlace a(l ,3) Fuca1
GlcNAcp142Mana1
\6
6
Manp 144GlcNAcp 144GlcNAc
3
GlFb (NAlF, FA2G1 o NA2G1F) con enlace a(l,3)
Gal p 144GlcNAcp 142Mana1
/
Oligosacárido biantenario asialo, galactosilado Galp144GlcNAcP142Mana1
\6 Manp 144GlcNAcp 144GlcNAc
3
G2 (NA2)
Gal p 144GlcNAcp 142Mana1
/
Pruebas Químicas/ (212) Análisis de Oligosacáridos 279
USP 39
Tabla 14. Descripción de Glicano (Continuación) Descripción
Gllcano
Oligosacárido biantenario asialo-fucosilado
Fuca1 Gal~1-44GlcNAc~1-42Mana1 \
1
6
6
Man~ 1-44GlcNAc~ 1-44GlcNAc
3
G2F (NA2F)
Gal~ 1-44GlcNAc~ 1-42Mana1
/
Oligosacárido biantenario monosialo-fucosilado Fuca1
GalP1->4GlcNAcp1->2Mana1 \
1
6
{
6
/~anp 1->4GlcNAcp 1->4GlcNAc
Neu5Aca2->6
Galp 1->4GlcNAcP1->2Mana1
A 1F (G2f51)
Oligosacárido biantenario disialo-fucosilado Fuca1
Neu5Aca2-->6Galp 1-.4GlcNAcp 1->2Mana 1 \
6
6
Manp 1-.4GlcNAciJ 1-->4GlcNAc
3
A2F (G2f52)
Neu5Aca2->6Galp 1->4GlcNAcp 1--;2Mana 1
/
Oligomanosa 5 Oligomanosa con N-ligada con 5 residuos manosilo
Mana1 \
6 Mana 1---+6Man ~ 1---+4GlcNAc~ 1---+4GlcNAc
3 Mana1
3
/
1
Mana1
MAN-5 Oligomanosa 6 Oligomanosa N-ligada con 6 residuos manosilo
Mana1 \
6 Mana1
3 Mana1
/
\6 Man~ 1---+4GlcNAc~ 1---+4GlcNAc
3
MAN-6
Mana 1---+2Mana 1
/
USP 39
280 (212) Análisis de Oligosacáridos / Pruebas Químicas
Tabla 14. Descripción de Glicano (Continuación) Glicano
Descripción Oligomanosa 7 Oligomanosa N-ligada con 7 residuos manosilo r
Mancx1 \
6 Mancx1 3 Mancx1~2
Mancx1
/
\6 Man~ 1~4GlcNAc~1 ~4GlcNAc
3 Mancx1~2Mancx1
MAN-7
/
Oligomanosa 8 Oligomanosa N-ligada con 8 residuos manosilo r
Mancx1 \
6 Mancx1 3
Mancx1~2
Mana1
/
\6 Man~1~4GlcNAc~1~4GlcNAc
Mancx1~2
MAN-8
3 Mana1~2Mana1
/
Oligomanosa 9 Oligomanosa N-ligada con 9 residuos manosilo Mana1~2Mana1 \
6 Mana1
3 Mano: 1-c>2Mano: 1
/
\
6 Manp 1~4GlcNAcp1 ~4GlcNAc
3
MAN-9
Mano: 1~2Mano:1-c>2Mano:1
/
(221) CLORUROS Y SULFATOS Ca'1tblo en lo redacción: Las siguientes pruebas de límites se utilizan como procedimientos generales en aquellos casos en que se especifican los límites de cloruros y sulfatos en las monografías individuales. Realizar las pruebas y los controles utilizando tubos de vidrio que tengan el mismo diámetro y sean tan semejantes en las restantes características como sea posible (ver • Nefelometría, Turbídimetrfa y Comparación Visual (855);. Comparación Vis.ual • (Arnl-may.2016)). Emplear las mismas cantidades de los mismos reactivos tanto para la solución en análisis como para la solución control que contiene el volumen especificado de cloruro o sulfato. Si, después de la acidificación, la solución no queda totalmente transparente, filtrarla a través de un papel de filtro exento de cloruro y sulfato. Agregar el precipitante, nitrato de plata SR o cloruro de bario SR, según sea necesario, a la solución de prueba y a la solución de control en secuencia inmediata. En aquellos casos en que la monografía individual indique la realización de la prueba sobre un volumen específico de una solución de la sustancia y el límite para cloruro o sulfato corresponda a 0,20 ml o menos de ácido clorhídrico 0,020 N o de ácido sulfúrico 0,020 N, respectivamente, realizar la prueba a la solución sin dilución adicional. En tales casos, mantener las mismas relaciones de volumen para la solución de control y para la solución en análisis. Cuando se realiza la prueba a sales de
USP 39
Pruebas Químicas/ (226) 4-Epianhidrotetraciclina 281
metales pesados, que muestran normalmente una reacción ácida, omitir la acidificación y no neutralizar la solución. Disolver las sales de bismuto en unos pocos mL de agua y 2 mL de ácido nítrico antes del tratamiento con el agente precipitante. Cloruros-Disolver la cantidad especificada de la sustancia en análisis en 30 mL a 40 mL de agua o, si la sustancia ya está en solución, agregar agua para obtener un volumen total de 30 mL a 40 mL y, si fuera necesario, neutralizar la solución al tornasol con ácido nítrico. Agregar 1 mL de ácido nítrico y 1 mL de nitrato de plata SR y agua suficiente para obtener 50 ml. Mezclar y dejar en reposo durante 5 minutos protegido de la luz solar directa. A menos que se especifique algo diferente en la monografía correspondiente, comparar la turbidez, si la hubiera, con la producida en una solución que contenga el volumen de ácido clorhídrico 0,020 N especificado en la monografía. Sulfatos-Disolver la cantidad especificada de la sustancia en análisis en 30 mL a 40 mL de agua, o, si la sustancia ya está en solución, agregar agua para obtener un volumen total de 30 mL a 40 mL y, si fuera necesario, neutralizar la solución al tornasol con ácido clorhídrico. Agregar 1 mL de ácido clorhídrico 3 N, 3 mL de cloruro de bario SR y agua suficiente para obtener 50 ml. Mezclar y dejar en reposo durante 1O minutos. A menos que se especifique algo diferente en la monografía correspondiente, comparar la turbidez, si la hubiera, con la producida en una solución que contenga el volumen de ácido sulfúrico 0,020 N especificado en la monografía.
(223) DIMETILANILINA La siguiente prueba de límite se utiliza como un procedimiento general para la determinación de trazas de dimetilanilina en artículos farmacopeicos utilizando cromatografía de gases, cuando esta determinación se especifica en la monografía individual correspondiente. La dimetilanilina es un depurador del ácido clorhídrico que puede haber sido arrastrado durante el proceso. Solución de Estándar Interno-A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, preparar una solución de naftaleno en ciclohexano que contenga aproximadamente 50 µg por ml. Preparación Estándar-A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, transferir 50,0 mg de N,Ndimetilanilina a un matraz volumétrico de 50 mL, agregar 25 mL de ácido clorhídrico 1 N, agitar por rotación suave hasta disolver, diluir a volumen con agua y mezclar. Transferir 5,0 mL de la solución resultante a un matraz volumétrico de 250 mL, diluir a volumen con agua y mezclar. En un tubo de centrífuga adecuado agregar 1,0 mL de esta solución, 5,0 mL de hidróxido de sodio 1 N y 1,0 mL de Solución de Estándar Interno, agitar vigorosamente durante 1 minuto y centrifugar. Emplear el sobrenadante transparente como Preparación Estándar. Preparación de Prueba-A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, transferir 1,0 g de la sustancia a analizar a un tubo de centrífuga adecuado, agregar 5 mL de hidróxido de sodio 1 N, agitar por rotación suave hasta disolver la muestra, agregar 1,0 mL de Solución de Estándar Interno, agitar vigorosamente durante 1 minuto y centrifugar. Emplear el sobrenadante transparente como Preparación de Prueba. Sistema Cromatográfico (ver Cromatografía (621 ))Equipar el cromatógrafo de gases con un detector de ionización a la llama, mantenido aproximadamente a 250º y una columna capilar de sílice fundida, de 0,53 mm x 30 m, unida con una película de fase G42 de 1,0 µm. El gas transportador es helio, con una velocidad lineal de aproximadamente 30 cm por segundo y una relación de partición de 1O : 1. Mantener la temperatura de la columna a 11 Oº durante los primeros 4 minutos después de inyectar, luego aumentar de 11 Oº a 200º a 8º por minuto, y mantener a 200º durante 5 minutos. Mantener la temperatura del inyector a 250º. Inyectar en el cromatógrafo la Preparación Estándar y registrar las respuestas según se indica en el Procedimiento: identificar los picos de dimetilanilina y naftaleno según sus tiempos de retención relativos, que son 1,0 y 1,3, respectivamente. La relación señal-ruido para el pico de dimetilanilina es no menor de 1O. Procedimiento-Inyectar en el cromatógrafo volúmenes iguales (aproximadamente 1 µL) de la Preparación Estándar y de la Preparación de Prueba, registrar los cromatogramas y medir las áreas de los picos principales. El cociente entre la respuesta de cualquier pico de dimetilanilina y la respuesta del pico de naftaleno obtenido a partir de la Preparación de Prueba no es mayor que el que se obtiene a partir de la Preparación Estándar (0,002%).
(226) 4-EPIANHIDROTETRACICLINA Este procedimiento cromatográfico se utiliza para demostrar que el contenido de 4-epianhidrotetraciclina, un producto de degradación de la tetraciclina, no excede el límite indicado en la monografía individual. Solución Amortiguadora de EDTA-Disolver 37,2 g de edetato disódico en 800 mL de agua, ajustar con hidróxido de amonio hasta un pH de 7,8, diluir con agua a 1000 mL y mezclar. Fase de Soporte-Agregar 5 mL de Solución Amortiguadora de EDTA a 1O g de tierra silícea cromatográfica lavada con ácido para cromatografía en columna y mezclar hasta que la tierra silícea se humedezca uniformemente.
282 (226) 4-Epianhidrotetraciclina / Pruebas Químicas
USP 39
Solución de Prueba-Preparar según se indica en la monografía individual correspondiente. Procedimiento-Preparar un tubo cromatográfico de 15 mm x 170 mm con una salida de 4 mm x 50 mm rellenándolo con Fase de Soporte, en porciones, apisonando firmemente cada porción, hasta que el tubo se llene hasta una altura de aproximadamente 1O cm. En un vaso de precipitados preparar una mezcla de 1 g de tierra silícea cromatográfica lavada con ácido para cromatografía en columna y 1 mL de Solución de Prueba. Transferir la mezcla a la parte superior de la columna. Lavar en seco el vaso de precipitados con Fase de Soporte y transferir a la columna para proporcionar una capa adicional de 1 cm en la parte superior de la mezcla que contiene la Solución de Prueba. Dentro de los 30 minutos, pasar cloroformo a través de la columna y recolectar fracciones sucesivas de 5,0 mL, 5,0 mL, 10,0 mL, 10,0 mL y 5,0 ml. Observar la columna durante la elución y prestar atención a la aparición de dos bandas amarillas separadas. La fracción o fracciones correspondientes a la primera banda amarilla contienen las anhidrotetraciclinas. Descartar estas fracciones. Las fracciones que aparecen después de la primera banda amarilla contienen la 4-epianhidrotetraciclina. Determinar la absorbancia de cada fracción de 4-epianhidrotetraciclina a la longitud de onda de máxima absorción, aproximadamente a 438 nm, con un espectrofotómetro apropiado, diluyendo cada fracción, si fuera necesario, con cloroformo y empleando cloroformo como blanco. Calcular la cantidad, en mg, de 4-epianhidrotetraciclina en cada fracción, por la fórmula: AVD/20,08 en donde A es la absorbancia, V es el volumen, en mL, de la fracción tomada, D es el factor de dilución, si la fracción se diluyó y 20,08 es la absortividad de la 4-epianhidrotetraciclina a 438 nm. A partir de la suma de las cantidades de 4-epianhidrotetraciclina encontrada en las diferentes fracciones, calcular el porcentaje de 4-epianhidrotetraciclina en relación con el equivalente de clorhidrato de tetraciclina contenido en la Solución de Prueba.
(227) 4-AMINOFENOL EN MEDICAMENTOS QUE CONTIENEN ACETAMINOFENO INTRODUCCIÓN Este capítulo de pruebas generales provee un procedimiento y un criterio de aceptación (límite) para controlar el producto de degradación principal de acetaminofeno, el 4-aminofenol, una impureza que se puede formar por la hidrólisis del acetaminofeno. PREPARACIÓN DE LAS SOLUCIONES Todas las soluciones que contienen acetaminofeno o 4-aminofenol deben protegerse de la luz y deben almacenarse sólo durante el tiempo que se pueda sustentar mediante datos de estabilidad de las soluciones adquiridos durante la verificación en las condiciones reales de uso. Solución amortiguadora: 4,0 g/L de citrato de sodio dihidrato y 1,5 g/L de ácido cítrico anhidro, en agua. Diluyente: Solución amortiguadora y acetonitrilo (9:1) Solución A: Solución amortiguadora de fosfato 1O mM, que se prepara agregando 0,60 g de fosfato monobásico de potasio y 0,82 g de fosfato dibásico de sodio a un matraz volumétrico de 1 L, disolviendo y diluyendo con agua a volumen a un pH de 7,0. Solución B: Agua Solución C: Acetonitrilo Fase móvil: Ver la Tabla 7. Tabla 1 Tiempo (mln)
o 5
7 7, 1 10
Solución A (O/o)
Solución B (O/o)
Solución C (O/o)
90 90 10
5
5
5
5
10
80
90 90
5
5
5
5
Solución madre del estándar: 25 µg/mL de ER 4-Aminofenol USP en Diluyente. Preparar en el momento de su uso junto con las otras soluciones descritas a continuación. Desechar después de 4 horas o conforme a los datos de estabilidad de las soluciones. [NOTA-Ver Ajustes Cromatográficos, estabilidad de la solución, a continuación.] Solución de aptitud del sistema: 2,5 µg/mL de ER 4-Aminofenol USP, a partir de Solución madre del estándar en Diluyente Solución madre de la muestra: Nominalmente 1O mg/mL de acetaminofeno, a partir de una cantidad adecuada de medicamento en Diluyente. [NOTA-Se puede incorporar primero cualquiera de los componentes del Diluyente al medicamento, seguido por la adición del otro componente manteniendo las proporciones de Solución amortiguadora y acetonitrilo, y obteniendo el volumen final apropiado definido para el Diluyente.] [NOTA-Se recomienda preparar de manera simultánea la
Pruebas Químicas/ (227) 4-Aminofenol en Medicamentos 283
USP 39
Solución muestra y la Solución estándar dentro de un lapso de tiempo corto (p.ej., 30 minutos) para cada muestra de medicamento.] Solución estándar: Agregar 25,0 mL de Solución madre de la muestra y 15,0 mL de Solución madre del estándar a un matraz volumétrico de 50 mL y diluir con Diluyente a volumen. Pasar a través de un filtro adecuado con un tamaño de poro de 0,45 µm, desechando los primeros 3 mL del filtrado. Solución muestra: Agregar 25,0 mL de Solución madre de la muestra a un matraz volumétrico de 50 mL y diluir con Diluyente a volumen. Pasar a través de un filtro adecuado con un tamaño de poro de 0,45 µm, desechando los primeros 3 mL del filtrado. MÉTODO CROMATOGRÁFICO Sistema cromatográfico (yer Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.) Modo: HPLC Detector: UV 300 nm Columna: 4,6 mm x 15 cm; relleno L85 de 5 µm Temperatura de la columna: 30º Velocidad de flujo: 1 mL/min Volumen de inyección: 1O µL Aptitud del sistema Muestras: Solución de aptitud del sistema y Solución estándar [NOTA-El tiempo de retención típico de 4-aminofenol es aproximadamente 4,2-5,3 minutos.] Requisitos de aptitud Resolución: No menos de 1,0 entre 4-aminofenol y el pico más cercano, Solución estándar Factor de asimetría: No más de 1,5 para el pico de 4-aminofenol, Solución estándar Desviación estándar relativa: No más de 5,0%, Solución estándar Relación señal-ruido: No menos de 20 para el pico de 4-aminofenol, Solución de aptitud del sistema ANÁLISIS Muestras: Solución estándar y Solución muestra Inyectar la Solución muestra y la Solución estándar para cada muestra de medicamento de manera secuencial, es decir, una tras otra. Calcular el porcentaje de 4-aminofenol {C 6 H7NO) con respecto a acetaminofeno en la porción de medicamento tomada: Resultado= [ruf(r5 - ru)] x (Wsf Wu) x 100
ru =respuesta del pico de 4-aminofenol de la Solución muestra r5 = respuesta del pico de 4-aminofenol de la Solución estándar W5 = cantidad de ER 4-Aminofenol USP agregada a la Solución estándar (mg) Wu = cantidad de acetaminofeno en la Solución muestra (mg) Criterios de aceptación: (a menos que se especifique de otro modo en la monografía): No más de O, 15% de 4-aminofenol con respecto a acetaminofeno AJUSTES CROMATOGRÁFICOS Se puede ajustar el tiempo de retención de 4-aminofenol para conseguir la especificidad para una matriz de producto determinada. Esta posibilidad de ajuste reemplaza a las disposiciones del capítulo Cromatografía (621) para el ajuste de condiciones cromatográficas y tiene el propósito de proporcionar una medida de flexibilidad cuando así se requiera. La Tabla 2 proporciona sugerencias para cambiar la retención del 4-aminofenol. El uso de un sistema ternario de fase móvil permite cambios fáciles en la concentración iónica (agua de la Solución 8) y en la concentración orgánica (acetonitrilo de la Solución C), pero éste puede simplificarse a un sistema binario de fase móvil. Tabla 2 Cambio de Condición
Cambio en la Retención del 4-Amlnofenol
Aumento en la concentración orgánica (Solución C)
Reduce la retención del 4-aminofenol
Reducción del pH (Solución A)
Aumenta la retención del 4-aminofenol
Aumento en la concentración iónica (Solución 8)
Reduce la retención del 4-aminofenol
Aumento en la temperatura de la columna
Aumenta la retención del 4-aminofenol
Los ajustes al procedimiento cromatográfico pueden requerir de verificación o validación. Ver los capítulos Validación de Procedimientos Farmacopeicos (1225) y Verificación de Procedimientos Farmacopeicos (1226) para orientación. Las condiciones cromatográficas ajustadas deben cumplir con todos los requisitos de aptitud del sistema.
284 (227) 4-Aminofenol en Medicamentos / Pruebas Químicas
USP 39
La estabilidad de la solución debe verificarse en condiciones reales de uso para asegurar que el 4-aminofenol permanece estable en la Solución muestra y en la Solución estándar según se demuestra por un cambio de no más de ± 10% en las áreas de los picos de 4-aminofenol.
(228) ÓXIDO DE ETILENO Y DIOXANO El siguiente procedimiento se usa para determinar el contenido de óxido de etileno y dioxano residuales en los productos que se preparan a partir de óxido de etileno. A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, usar el
Método l. Método 1 [PRECAUCIÓN-El óxido de etileno es tóxico e inflamable. Preparar estas soluciones en una campana bien ventilada con mucho cuidado. Proteger manos y rostro usando guantes protectores de polietileno y una máscara adecuada. Almacenar todas las soluciones en recipientes herméticos y refrigerar a una temperatura entre 4º y 8º.] [NOTA-Antes de usar el polietilenglicol 200 en esta prueba, eliminar cualquier componente volátil colocando 500 ml de polietilenglicol 200 en un matraz de fondo redondo de 1000 ml y acoplando el matraz a un evaporador rotatorio mantenido a 60º y bajo un vacío de 10-20 mm Hg durante 6 horas.] Solución de acetaldehído: 1O µg/ml de acetaldehído. [NOTA-Preparar inmediatamente antes de su uso.] Solución madre de óxido de etileno: 2,5 mg/g de óxido de etileno. Preparar según se indica a continuación: Tarar un matraz Erlenmeyer con tapón de vidrio, agregar 50 ml de polietilenglicol 200, y volver a pesar el matraz. Transferir 5 ml del óxido de etileno líquido a un vaso de precipitados de 100 ml enfriado en una mezcla de cloruro de sodio y hielo (1 :3). Transferir 300 µL (correspondientes a 250 mg) de óxido de etileno líquido al polietilenglicol 200 y agitar por rotación suave hasta mezclar. Colocar de nuevo el tapón, volver a pesar el matraz, y determinar la cantidad de óxido de etileno absorbido por diferencia de peso. Ajustar el peso de la mezcla con polietilenglicol 200 a 100,0 g, colocar de nuevo el tapón, y agitar por rotación suave hasta mezclar. [NOTA-Llenar con óxido de etileno líquido un frasco resistente a la presión enfriado y almacenar en un congelador cuando no se use. Usar un trozo pequeño de película de polietileno para proteger el líquido del contacto con la junta de caucho. Usar un aparato enfriado adecuadamente cuando sea apropiado. Preparar esta solución madre inmediatamente antes de su uso y almacenar en un refrigerador después de su preparación.] Solución de óxido de etileno: Tarar un matraz Erlenmeyer con tapón de vidrio y enfriarlo en un refrigerador. Agregar 35 ml de polietilenglicol 200 y volver a pesar el matraz. Transferir 1 g de Solución madre de óxido de etileno enfriada al matraz Erlenmeyer tarado. Ajustar el peso de la solución con polietilenglicol 200 a 50,0 g, colocar de nuevo el tapón, y agitar por rotación suave hasta mezclar. Transferir 1Og de esta solución a un matraz volumétrico de 50 ml. Agregar 30 ml de agua y mezclar. Diluir con agua a volumen y mezclar para obtener una solución que contenga 1O µg/ml de óxido de etileno. [NOTA-Usar un aparato enfriado adecuadamente cuando sea apropiado. Preparar inmediatamente antes de su uso.] Solución de dioxano: 500 µg/ml de dioxano Solución estándar A: Transferir O, 1 ml de Solución de óxido de etileno a un vial para muestreo de fase gaseosa de 1O ml. [NOTA-Se pueden usar otros tamaños de vial para muestreo de fase gaseosa, como por ejemplo de 22 ml, dependiendo de las condiciones operativas; sin embargo, se debe usar el mismo tamaño para la Solución estándar A, la Solución estándar By la Solución muestra.] Agregar O, l ml de Solución de acetaldehído y 0, 1 ml de Solución de dioxano, sellar el vial, y mezclar. Solución estándar B: Transferir 1,0 g de la sustancia de prueba a un vial para muestreo de fase gaseosa de 1O ml y agregar O, 1 ml de Solución de óxido de etileno, O, 1 ml de Solución de dioxano y 1,0 ml de N,N-dimetilacetamida. Sellar el vial y mezclar. Solución muestra: Transferir 1,0 g de la sustancia de prueba a un a vial para muestreo de fase gaseosa de 1O ml y agregar 1,0 ml de N,N-dimetilacetamida y 0,2 ml de agua. Sellar el vial y mezclar. Sistema cromatográfico (Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.) Modo: Cromatografía de Gases con muestreador de cámara gaseosa (Headspace GC) Detector: Ionización a la llama Columna: Capilar de vidrio o cuarzo, de 0,32 mm x 30 m, con una capa de fase Gl de 1,0 µm Temperatura Inyector: 150º Detector: 250º Columna: Ver la tabla de temperatura de la columna siguiente. Temperatura Inicial(º) 50
Rampa de Temperatura (º/min) -
Temperatura Final(º) 50
Tiempo de Espera (Hold Time) a la Temperatura Final (min) 5
USP 39
Pruebas Químicas / (228) Óxido de Etileno y Dioxano 285
Rampa de Temperatura (º/min)
Temperatura Final (º)
50
5
180
180
30
230
Temperatura Inicial (°)
Tiempo de Espera (Hold Time) a la Temperatura Final (min) -
5
Gas transportador: Helio Velocidad lineal: 20 cm/s Volumen de inyección: 1 mL (fase gaseosa) Tipo de inyección: Relación de partición 20:1 Muestreador de fase gaseosa Tiempo de equilibrio: 45 min Temperatura de equilibrio 70º para la Solución estándar A 90º para la Solución estándar B 90º para la Solución muestra Temperatura de la línea de transferencia: 150º Tiempo de presurización: 1 min Tiempo de inyección: 12 s Aptitud del sistema Muestra: Solución estándar A [NOTA-Los tiempos de retención relativos para acetaldehído y óxido de etileno son 0,94 y 1,0, respectivamente.] Requisitos de aptitud Resolución: No menos de 2,0 entre acetaldehído y óxido de etileno Relación señal-ruido: No menos de 5, determinado a partir del pico de dioxano Desviación estándar relativa: No más de 15% Análisis Muestras: Solución estándar By Solución muestra [NOTA-Los tiempos de retención relativos para óxido de etileno y dioxano son 1,0 y 2,5, respectivamente.] Calcular el contenido de óxido de etileno, en ppm, en la porción de la sustancia de prueba tomada: Resultado= AE x ru/[(r5 x Wu) - (ru x W5)] AE = cantidad de óxido de etileno agregado a la Solución estándar B (µg) ru =respuesta del pico de óxido de etileno de la Solución muestra r5 = respuesta del pico de óxido de etileno de la Solución estándar B Wu = peso de la sustancia de prueba tomada para preparar la Solución muestra (g) = peso de la sustancia de prueba tomada para preparar la Solución estándar B (g) W5 Calcular el contenido de dioxano, en ppm, en la porción de la sustancia de prueba tomada: Resultado= AD x ru/[(r 5 x Wu) - (ru x W5)] = cantidad de dioxano agregado a la Solución estándar B (µg) AD = respuesta del pico de dioxano de la Solución muestra ru = respuesta del pico de dioxano de la Solución estándar B rs = peso de la sustancia de prueba tomada para preparar la Solución muestra (g) Wu = peso de la sustancia de prueba tomada para preparar la Solución estándar B (g) Ws Método 11 Solución estándar de óxido de etileno: Diluir 0,5 mL de óxido de etileno en cloruro de metileno (50 mg/mL) 1 con agua hasta 50,0 mL. [NOTA-La solución es estable durante 3 meses si se almacena en viales con tapas precintadas de membrana de silicona recubiertas con politetrafluoroetileno (polytef) a -20º.] Dejar que alcance la temperatura ambiente. Diluir 1,0 mL con agua hasta 250,0 mL para obtener una solución con una concentración de 2 µg/mL de óxido de etileno. [NOTAUsar esta solución inmediatamente después de su preparación.] Solución estándar de dioxano: 0,05 µL/mL de dioxano Solución estándar de acetaldehído: 1O µg/mL de acetaldehído. [NOTA-Preparar inmediatamente antes de su uso.] Solución de resolución: Agregar 2,0 mL de Solución estándar de acetaldehído y 2,0 mL de Solución estándar de óxido de etileno a un vial para muestreo de fase gaseosa de 1O mL. Sellar el vial inmediatamente con una membrana de silicona recubierta con teflón y una tapa de aluminio, y mezclar cuidadosamente. Solución estándar A: 0,48 µg/mL de óxido de etileno, a partir de Solución estándar de óxido de etileno y 0,005 µL/mL de dioxano, a partir de Solución estándar de dioxano, en agua
1
Esta es una solución disponible comercialmente.
286 (228) Óxido de Etileno y Dioxano / Pruebas Químicas
USP 39
Solución estándar B: Transferir 1,0 g de la sustancia de prueba a un vial para muestreo de fase gaseosa de 1O ml. Agregar 2,0 mL de Solución estándar A, sellar el vial inmediatamente con una membrana de silicona recubierta con teflón y una tapa de aluminio, y mezclar cuidadosamente. Solución muestra: Transferir 1,0 g de la sustancia de prueba a un vial para muestreo de fase gaseosa de 1 O ml. Agregar 2,0 mL de agua, sellar el vial inmediatamente con una membrana de silicona recubierta con teflón y una tapa de aluminio, y mezclar cuidadosamente. Sistema cromatográfico (Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.) Modo: Cromatografía de Gases con muestreador de cámara gaseosa (Headspace GC) Detector: Ionización a la llama Columna: Capilar de sílice fundida, de 0,53 mm x 50 m, con una capa de fase G27 de 5,0 µm Temperatura Inyector: 85º Detector: 250º Columna: Ver la tabla de temperatura de la columna siguiente. Temperatura Inicial(º)
Rampa de Temperatura (º/min)
Temperatura Final(º)
Tiempo de Espera (Hold Time) a la Temperatura Final (mln)
70
10
250
5
Gas transportador: Helio Velocidad de flujo: 4 mL/min Volumen de inyección: 1 mL (fase gaseosa) Tipo de inyección: Relación de partición 3,5 : 1 Muestreador de fase gaseosa Tiempo de equilibrio: 30 min Temperatura de equilibrio: 80º Aptitud del sistema Muestra: Solución de resolución [NOTA-Los tiempos de retención relativos para acetaldehído y óxido de etileno son 0,9 y 1,0, respectivamente.] Requisitos de aptitud Resolución: No menos de 2,0 entre acetaldehído y óxido de etileno Análisis Muestras: Solución estándar By Solución muestra [NOTA-Los tiempos de retención relativos para óxido de etileno y dioxano son 1,0 y 1,9, respectivamente.] Calcular el contenido de óxido de etileno, en ppm, en la porción de la sustancia de prueba tomada: Resultado= CE x V x ru/[(r5 x Wu) - (ru x W5)] CE = concentración de óxido de etileno en la Solución estándar A (µg/mL) V = volumen de Solución estándar A agregada a la Solución estándar B (2,0 mL) ru = respuesta del pico de óxido de etileno de la Solución muestra r5 = respuesta del pico de óxido de etileno de la Solución estándar B Wu = peso de la sustancia de prueba tomada para preparar la Solución muestra (g) W5 = peso de la sustancia de prueba tomada para preparar la Solución estándar B (g) Calcular el contenido de dioxano, en ppm, en la porción de la sustancia de prueba tomada: Resultado= C0 x V x p x F x ru/[(r5 x Wu) - (ru x W5)] C0 V p
F ru r5 Wu W5
=concentración de dioxano en la Solución estándar A (µL/mL) = volumen de la Solución estándar A agregada a la Solución estándar B (2,0 mL) = densidad de dioxano (1,03 g/mL = 1,03 mg/µL) = factor de conversión (1000 µg/mg) =respuesta del pico de dioxano de la Solución muestra =respuesta del pico de dioxano de la Solución estándar B = peso de la sustancia de prueba tomada para preparar la Solución muestra (g) = peso de la sustancia de prueba tomada para preparar la Solución estándar B (g)
Pruebas Químicas/ (231) Metales Pesados 287
USP 39
Eliminar lo siguiente:
•(231) METALES PESADOS Esta prueba se proporciona para demostrar que el contenido de impurezas metálícas coloreadas por el ión sulfuro, en las condiciones de prueba especificadas, no excede el límite de Metales pesados especificado en la monografía individual correspondiente al porcentaje (en peso} de plomo en la sustancia en análisis, según se determina mediante comparación visual concomítante (ver Comparacíón Visual en la sección Procedímie.nto en Espectrofotometría y Dispersión de Luz (851)) con un control preparado a partir de una Solución Estándar de Plomo. [NOTA-Las sustancias que generalmente responderán a esta prueba son: plomo, mercurio, bismuto, arsénico, antimonio, estaño, cadmio, plata, cobre y molibdeno.] Determinar la cantidad de metales pesados por el Método f, a menos que se especifique algo diferente en la monografía individual. El Método I se emplea para sustancias que producen preparaciones transparentes e incoloras en las condidones de prueba especificadas. El Método 11 se emplea para sustancias que no producen preparaciones transparentes e incoloras en las condiciones de prueba especificadas para el Método 1, o para sustancias que por su naturaleza compleja interfieren con la precipitación de metales mediante el ión sulfuro, o para aceites fijos y volátiles. El Método {lf es un método de digestión húmeda que se usa sólo cuando no se puede usar ni el Método I ni el Método 11.
Reactivos Especiales Solución Madre de Nitrató de Plomo-Disolver 159,8 rng de nitrato de plomo en 100 mL de agua a la que se le ha agregado 1 mL de ácido nítrico, luego diluir con agua hasta 1000 mL. Preparar y almacenar esta solución en recipientes de vidrio libres de sales de plomo solubles. Solución Estándar de Plomo-En el día de uso, diluir con agua 10,0 mL de Solución Madre de Nitrato de Plomo hasta 100,0 mL. Cada ml de la Solucíón Estándar de Plomo contiene el equivalente a 1O µg de plomo. Una solución de comparación preparada sobre la base de 100 µL de Solución Estándar de Plomo por g de sustancia en análisis contiene el equivalente a 1 parte de plomo por millón de partes de la sustancia en análisis.
MÉTODO 1 Solución Amortiguadora de Acetato de pH 3,5-Disolver 25,0 g de acetato de amonio en 25 ml de agua y agregar 38,0 mL de ácido clorhídrico 6 N. Ajustar, si fuera necesario, con hidróxido de amonio 6 N o ácido clorhídrico 6 N hasta un pH de 3,5; diluir con agua hasta 100 ml y mezclar. Preparación Estándar-Pipetear 2 mL de la Solución Estándar de Plomo (20 µg de Pb), transferir a un tubo de comparación de color de 50 ml y diluir con agua hasta 25 mL Usando un medidor de pH o un papel indicador de pH de intervalo corto como indicador externo, ajustar con ácido acético 1 No hidróxido de amonio 6 N hasta un pH entre 3,0 y 4,0; diluir con agua hasta 40 ml y mezclar. Preparación de Prueba-En un tubo de comparación de color de 50 ml, colocar 25 mL de la solución preparada para la prueba según se indica en la monografía individual; o usando el volumen de ácido indicado, cuando se especifica en la monografía individual, disolver y diluir con agua hasta 25 ml la cantidad, en g, de la sustancia a analizar, según se calcula, por la fórmula: 2,0/(1 OOOL)
en donde Les el límite de Metales pesados, expresado como porcentaje. Usando un medidor de pH o un papel indicado.r de pH de intervalo corto como indicador externo, ajustar con ácido acético 1 N o hidróxido de amonio 6 N hasta un pH entre 3,0 y 4,0, diluir con agua hasta 40 ml y mezclar. Preparación Control-En un tercer tubo de comparación de color de 50 ml, colocar 25 ml de una solución preparada según se indica en la Preparación de Prueba y agregar 2,0 mL de la Solución Estándar de Plomo. Usando un medidor de pH o un papel indicador de pH de intervalo corto como indicador externo, ajustar con ácido acético 1 N o hidróxido de amonio 6 N hasta un pH entre 3,0 y 4,0; diluir con agua hasta 40 ml y mezclar. Procedimiento-A cada uno de los tres tubos que contengan la Preparación Estándar, la Preparación de Prueba y la Preparación Control, agregar 2 ml de la Solución Amortiguadora de Acetato de pH 3,5; luego agregar 1,2 ml de tioacetamida-glicerina básica SR, diluir con agua hasta 50 ml, mezclar, dejar en repóso durante 2 minutos y observar hacia abajo sobre una superficie blanca*: el color de la solución de la Preparación de Prueba no es más oscuro que el de la solución de la Preparación Estándar y el color de la solución de la Preparación Control es igual o más oscuro que el color de la solución de la Preparación Estándar. [NOTA-Si el color de la Preparación Control es más claro que el de la Preparación Estándar, usar el Método 11 en lugar det Método I para la sustancia en análisis.] • En aquellos países o jurisdicciones en los que no se pueda usar tioacetamida, agregar a cada uno de los tubos 1O ml de sulfuro de hidrógeno SR recién preparado, mezclar, dejar en reposo durante 5 minutos y observar hacia abajo sobre una superficie blanca.
288 (231) Metales Pesados/ Pruebas Químicas
-
-
USP 39
Pruebas Químicas/ (232) Impurezas Elementales-Límites 289
USP 39
nítrico. Entibiar suavemente hasta que.se inicie la reacción, dejar que la reacción disminuya)' proceder según se indica en Si la
sustancia es un sólido, comenzando donde: dice "agregar: porciones de la misma mezcla de ácidos". Preparación Control-Proceder con.1¡:1 .digestión, usando la misma cantidad de muestra y el mismo procedimiento, según se indica en el párrafo Si la sustancia es un sólido en la sección Preparación de Prueba, hasta el paso ''Enfriar, diluir cuidadosa· mente con unos pocos ml de agua~':;. Agregar2,0 ml de la Solución Estándar de Plomo(20 µg de plomo) y mezclar. Transferir a un tubo de comparación de color de 50 mL, enjuagar eLmatraz con agua, agregando los enjuagues altllbo hasta obtener un volumen de 25 ml y mezclar. Procedimiento-Tratar la Preparación de Prueba,. !i! Preparación Estándar y la Preparación Control del siguiente modo. Usando un medidor de pH o un papel indkador de pH de intervalo corto como indicador externo, ajustar la solución a un pH entre 3,0 y 410 con hk:lróxido d.e. amonio (se puede 1.¡sar una solución de amoníaco djluida, si se desea, él medida que se acerca al pH especificado), diluir con agua hasta. 40 mly mezclar. Agregar a <:ada tubo 2 mLdela ~olvciónAl:t'lortiguadora de Acetato de pH 3,S, 11.¡ego agregar 1,2 mL de tioacetamida...glicerina básíca SR, diluir con agua hasta 50 mL, mezclar, dejar en reposo durante 2 minu~os y obsewar hacia abajo sobre una superficie blanca*: el. color de la Preparoción de PruebQ no esmás; oscuro que el de fil Preparación Estándar, y el color de la Prepara~ ción Controf igual o más oscuro que el de la Preparación Estándar. •Oficial: 01 de enero de 2018 • (BR oi-abr-2o15)
es
•
{Ofi<:íal 01-ene-2018)
(232) IMPUREZAS ELEMENTALES-LÍMITES INTRODUCCIÓN Este capítulo general especifica límites para la cantidad de impurezas elementales en productos farmacéuticos. Las impurezas elementales incluyen catalizadores y contaminantes ambientales que pueden estar presentes en fármacos, excipientes o medicamentos. Estas impurezas pueden presentarse de manera natural, agregarse intencionalmente o introducirse inadvertidamente (p.ej. mediante interacciones con el equipo de procesamiento y el sistema de envase y cierre). Cuando se conoce la presencia de impurezas elementales, cuando se han agregado o cuando se pueden introducir potencialmente, es necesario asegurar el cumplimiento con los límites especificados. Una estrategia de control basada en riesgos puede ser adecuada cuando los analistas determinan la forma en que se va a asegurar el cumplimiento de esta norma. La evaluación de riesgos debe considerar (como mínimo) al arsénico, cadmio, plomo y mercurio, debido a su naturaleza ubicua. Independientemente de la metodología empleada, todos los medicamentos deben cumplir con los límites especificados a menos que se especifique de otro modo en una monografía individual o se excluya en el tercer párrafo de esta introducción. Los medicamentos que contienen proteínas y polipéptidos purificados (incluyendo proteínas y polipéptidos producidos a partir de fuentes recombinantes o no recombínantes), sus derivados y los productos de los que son componentes (p.ej., conjugados) están dentro del alcance de este capítulo, al igual que los medicamentos que contienen polipéptidos, polinucleótidos y oligosacáridos producidos de manera sintética. Este capítulo no se aplica a radiofarmacéuticos, vacunas, metabolitos celulares, productos de ADN, extractos alergénicos, células, sangre entera, componentes celulares o derivados de la sangre, incluido el plasma y los derivados del plasma, soluciones para diálisis no destinadas para circulación sistémica y elementos que se incluyen intencionalmente en el medicamento para beneficio terapéutico. Este capítulo no se aplica a productos basados en genes (terapia génica), células (terapia celular) y tejidos (tejidos modificados por ingeniería). Los límites presentados en este capítulo no se aplican a excipientes ni fármacos, excepto cuando se especifique en este capítulo o en las monografías individuales. Sin embargo, es necesario conocer, documentar y proporcionar en caso de que sean solicitados los niveles de impurezas elementales presentes en fármacos y excipientes. Este capítulo no se aplica a los artículos destinados únicamente para uso veterinario. Los requisitos listados en este capítulo tampoco se aplican a los productos de nutrición parenteral total (TPN, por sus siglas en inglés) y soluciones para diálisis. Los suplementos dietéticos y sus ingredientes se tratan en el capítulo Contaminantes Elementales en Suplementos Dietéticos (2232).
ESPECIACIÓN La determinación del estado de oxidación, complejo orgánico o combinación recibe el nombre de especiación. Cada una de las impurezas elementales tiene el potencial de estar presente en diferentes estados de oxidación o de formación de complejos. No obstante, el arsénico y el mercurio son de especial cuidado debido a las diferentes toxicidades de sus formas inorgánicas y orgánicas complejas. Los límites de arsénico se basan en la forma inorgánica (la más tóxica). El arsénico se puede medir usando un procedimiento para arsénico total asumiendo que todo el arsénico contenido en el material en análisis se encuentra en la forma inorgánica.
USP 39
290 (232) Impurezas Elementales-Límites / Pruebas Químicas
Cuando el límite se excede usando el procedimiento para arsénico total, puede ser posible demostrarlo mediante un procedimiento que cuantifique las diferentes formas en que la forma inorgánica cumple con la especificación. Los límites de mercurio se basan en el estado de oxidación (2+) inorgánico. El metilmercurio (la forma más tóxica de mercurio) no es un problema común para la industria farmacéutica. Por consiguiente, el límite se estableció asumiendo la forma inorgánica más común (mercúrica). Los límites para artículos que tienen el potencial de contener metilmercurio (p.ej., productos obtenidos a partir de peces) se proporcionan en las monografías correspondientes.
VÍAS DE EXPOSICIÓN La toxicidad de una impureza elemental se relaciona con su grado de exposición (biodisponibilidad). Se ha determinado el grado de exposición para cada una de las impurezas elementales de interés para las tres vías de administración: oral, parenteral e inhalatoria. Estos límites se basan en la exposición crónica. Se deben considerar las exposiciones diarias orales permitidas (EDP) de la Tabla 7 como punto de partida para el desarrollo de exposiciones diarias orales permitidas específicas para otras vías de administración, excepto cuando se indique de otro modo en la monografía individual. [NOTA-Las vías de administración de medicamentos se definen en el capítulo general Formas Farmacéuticas (1151 ).]
MEDICAMENTOS Los límites descritos en la segunda, tercera y cuarta columnas de la Tabla 7 son las exposiciones diarias permitidas en la dosis diaria base de las impurezas elementales de interés para un medicamento tomado por un paciente de acuerdo con las vías de administración indicadas.
Productos Parenterales Los medicamentos parenterales con volúmenes máximos diarios de hasta 2 litros pueden usar el volumen máximo diario para calcular las concentraciones permitidas a partir de las exposiciones diarias permitidas. En el caso de los productos cuyos volúmenes diarios, según se especifican en el etiquetado y/o se establecen mediante la práctica clínica, pueden exceder de 2 litros (p.ej., solución salina, dextrosa, productos de nutrición parenteral total, soluciones para irrigación), se puede usar un volumen de 2 litros para calcular las concentraciones permitidas a partir de las exposiciones diarias permitidas. Tabla 1. Impurezas Elementales para Medicamentos
Elemento Cadmio Plomo Arsénico inorgánicoª Mercurio inorgánicoª Iridio Osmio Paladio Platino
EDP para Dosis Diaria Oral" (µg/día)
5 5 15 30 100 100 100 100
Vanadio
100 100 11000 3000 200 100
Cobre
3000
Rodio Rutenio Cromo Molibdeno Níquel
EDP para Dosis Diaria Parenteral (µg/día)
EDP para Dosis Diaria de Inhalación (µg/día)
2
2
5 15 3
5
10
10 10
2 1 1 1 1 1 1 1
10 10 10 1100 1500
3 10
20 10 300
5 1 30
ª Ver la sección Especiación.
Opciones para Demostrar el Cumplimiento OPCIÓN DE ANÁLISIS DEL MEDICAMENTO Los resultados obtenidos a partir del análisis de una unidad de dosificación típica, multiplicados por la dosis diaria máxima, se comparan con la EDP por Dosis Diaria.
USP 39
Pruebas Químicas/ (232) Impurezas Elementales-Límites 291
EDP por Dosis Diaria~ valor medido (µg/g) x dosis diaria máxima (g/día)
La cantidad medida de cada impureza no es mayor que la EDP por Dosis Diaria, a menos que se indique de otro modo en la monografía individual. OPCIÓN DE SUMATORIA Sumar por separado las cantidades de cada impureza elemental (en µg/g) presente en cada uno de los componentes del medicamento usando la siguiente ecuación: EDP por Dosis Diaria~ [LM 7(CM x WM)] x D0
M = cada ingrediente usado para fabricar una unidad de dosificación CM = concentración de elemento en el componente (fármaco o excipiente) (µg/g) WM =peso del componente en una unidad de dosificación (g/unidad de dosificación) D0 = número de unidades en la dosis diaria máxima (unidad/día) El resultado de la sumatoria de cada impureza no es mayor que la EDP para Dosis Diaria, a menos que se indique algo diferente en la monografía individual. Antes de que se puedan evaluar los productos con esta opción, el fabricante debe asegurar que no se hayan agregado impurezas elementales adicionales de manera inadvertida durante el proceso de fabricación o mediante el sistema de envase y cierre durante la vida útil del producto. OPCIÓN DE COMPONENTE INDIVIDUAL Para medicamentos con una dosis diaria de no más de 1Og, si todas los fármacos y excipientes en una formulación cumplen con los límites de concentración mostrados en la Tabla 2, entonces dichos componentes pueden usarse en cualquier proporción. No es necesario realizar cálculos adicionales. Aunque las impurezas elementales derivadas del proceso de fabricación o del sistema de envase y cierre no se preveen específicamente en la Opción de Componente Individual, se espera que el fabricante del medicamento asegure que dichas fuentes no contribuyen de manera significativa con el contenido total de impurezas elementales.
FÁRMACOS V EXCIPIENTES Se debe controlar la concentración de impurezas elementales en fármacos y excipientes y documentarla cuando estén presentes. Los niveles aceptables para estas impurezas dependen del uso final previsto del material. Por consiguiente, los fabricantes de medicamentos deben determinar el nivel aceptable de impurezas elementales en los fármacos y excipientes usados para producir sus productos. Los valores provistos en la Tabla 2 son ejemplos de límites de concentración para componentes (fármacos y excipientes) de medicamentos dosificados a una dosis diaria máxima de 1 Og/día. Estos valores funcionan como límites de concentración predeterminados para facilitar las discusiones entre los fabricantes de medicamentos y los proveedores de los componentes para sus medicamentos. [NOTA-Puede ser necesario limitar los componentes individuales a niveles distintos de los presentados en la tabla, dependiendo de los factores mitigantes específicos de la monografía.] . 1os d e L'1m1tes . d e concentrac I'on para componentes de Me dº1camentos con una Dos1s . D1ar1a Max1ma d e 10 g Ta bl a 2 . E1emp Límites de Concentración (µg/g) para Componentes Usados en Medicamentos Orales
Límites de Concentración (µg/g) para Componentes Usados en Medicamentos Parenterales
Límites de Concentración (µg/g) para Componentes Usados en Medicamentos para Inhalaclón
Cadmio
0,5
0,2
0,2
Plomo
0,5
0,5
0,5
Arsénico inorgánicoª
1,5
1,5
0,2
Elemento
3
0,3
0,1
Indio
10
1
0,1
Osmio
10
1
0,1
Paladio
10
1
0,1
Mercurio inorqánicoª
Platino
10
1
0,1
Rodio
10
1
0,1
Rutenio
10
1
0,1
Cromo
1100
110
0,3
Molibdeno
300
150
1
ª Ver la sección Especiación.
USP 39
292 (232) Impurezas Elementales-Límites / Pruebas Químicas
Tabla 2. Ejemplos de Límites de Concentración para Componentes de Medicamentos con una Dosis Diaria Máxima de 10 g (Continuación)
Límites de Concentración (µg/g) para Componentes Usados en Medicamentos Orales
Límites de Concentración (µg/g) para Componentes Usados en Medicamentos Parenterales
Límites de Concentración (µg/g) para Componentes Usados en Medicamentos para Inhalación
Níquel
20
2
0,5
Vanadio
10
1
0,1
Cobre
300
30
3
Elemento
ª
Ver la sección Especiación.
PRUEBAS ANALÍTICAS Cuando los fabricantes pueden demostrar el cumplimiento, mediante el monitoreo del proceso y control en la cadena de abastecimiento, entonces puede no ser necesario aplicar pruebas adicionales. Cuando las pruebas se realizan para demostrar el cumplimiento, se debe proceder según se indica en el capítulo general Impurezas Elementales-Procedimientos (233) y la evaluación de Elementos Diana debe incluir como mínimo arsénico, cadmio, plomo y mercurio.
(233) IMPUREZAS ELEMENTALES-PROCEDIMIENTOS INTRODUCCIÓN Este capítulo describe dos procedimientos analíticos (Procedimientos 7 y 2) para la evaluación de los niveles de impurezas elementales. Asimismo, el capítulo describe criterios para procedimientos alternativos aceptables. Los analistas confirmarán mediante estudios de validación que los procedimientos analíticos aquí descritos sean adecuados para su uso en el material específico.
Uso de Procedimientos Alternativos Este capítulo también describe criterios para procedimientos alternativos aceptables. Los procedimientos alternativos que cumplen con los requisitos de validación de este capítulo pueden usarse de acuerdo con las Advertencias y Requisitos Generales 6.30, Métodos y Procedimientos Alternativos y Armonizados. La información sobre los Requisitos para la Validación de Procedimientos Alternativos se provee más adelante en este capítulo.
Especiación La determinación del estado de oxidación, complejo orgánico o combinación recibe el nombre de especiación. Los procedimientos analíticos para especiación no se incluyen en este capítulo, pero se pueden encontrar ejemplos en diversas partes de los compendios USP-NF y en la literatura.
PROCEDIMIENTOS FARMACOPEICOS 1 Y 2 La estandarización del sistema y la evaluación de la aptitud usando materiales de referencia aplicables debe realizarse el día del análisis.
Procedimiento y Técnica de Detección El Procedimiento 7 se puede usar para impurezas elementales que por lo general son fáciles de detectar mediante espectroscopía de emisión (óptica) atómica de plasma inductivamente acoplado (ICP-AES o ICP-OES). El Procedimiento 2 se puede usar para impurezas elementales que por lo general son fáciles de detectar mediante ICP-MS. Antes del uso inicial, el analista debe verificar que el procedimiento sea apropiado para el instrumento y la muestra usados (verificación del procedimiento) mediante el cumplimiento de los requisitos de Validación de Procedimiento Alternativo siguientes.
USP 39
Pruebas Químicas/ (233) Impurezas Elementales-Procedimientos 293
Preparación de la Muestra Las formas para la preparación de la muestra incluyen: Sin diluir, Solución Acuosa Directa, Solución Orgánica Directa y Solución Indirecta. La selección de la forma apropiada de preparación de la muestra depende del material en análisis y es responsabilidad del analista. Cuando no se indica una forma de preparación de la muestra en la monografía, el analista puede usar cualquiera de los siguientes procedimientos de preparación adecuadamente validados. Para casos en los que sea necesario agregar cantidades conocidas (spiking) a un material en análisis a fin de proporcionar una señal de intensidad aceptable, el blanco también debe ser adicionado con los mismos Elementos Diana y, cuando sea posible, con la misma solución usada para adicionar la muestra. Las soluciones estándar pueden contener múltiples Elementos Diana. [NOTA-Se deben pesar todas las muestras líquidas.] Sin diluir: Se usa para líquidos o procedimientos alternativos que permiten examinar muestras sin disolventes. Solución acuosa directa: Se usa cuando la muestra es soluble en un disolvente acuoso. Solución orgánica directa: Se usa cuando la muestra es soluble en un disolvente orgánico. Solución indirecta: Se usa cuando un material no es directamente soluble en disolventes acuosos u orgánicos. La extracción total de metales es el método de preparación de la muestra preferido para obtener una Solución indirecta. La muestra debe digerirse usando el procedimiento con vaso de digestión cerrado provisto a continuación o uno similar a éste. El esquema de preparación de la muestra debe proveer una cantidad suficiente de muestra para cuantificar cada elemento en el límite especificado en la monografía o capítulo correspondiente. Vaso de digestión cerrado: El procedimiento de preparación de la muestra se diseña para muestras que deben digerirse en un Ácido Concentrado usando un aparato de vaso de digestión cerrado. El vaso de digestión cerrado minimiza la pérdida de impurezas volátiles. La selección de un Ácido Concentrado depende de la matriz de la muestra. Puede ser apropiado el uso de cualquiera de los Ácidos Concentrados, pero cada uno implica riesgos de seguridad inherentes. Por consiguiente, se deben tomar precauciones de seguridad adecuadas en todo momento. [NOTA-Los pesos y volúmenes provistos se pueden ajustar para cumplir con los requisitos del aparato de digestión usado.] Un procedimiento ilustrativo que ha demostrado una amplia aplicabilidad es el siguiente. Deshidratar y predigerir 0,5 g de muestra primaria en 5 mL de Ácido Concentrado recientemente preparado. Dejar en reposo con la tapa sin ajustar durante 30 minutos en una campana de extracción. Agregar 1 O mL adicionales de Ácido Concentrado y digerir, usando una técnica de vaso cerrado, hasta completar la digestión o la extracción. Repetir, si fuera necesario, agregando 5 mL adicionales de Ácido Concentrado. [NOTA-Cuando se requiera una digestión en vaso cerrado, seguir los procedimientos recomendados por el fabricante para garantizar el uso seguro.] Como alternativa se pueden realizar lixiviados siempre que se justifique mediante estudios científicos validados de disponibilidad de los metales, los cuales pueden incluir estudios en animales, de especiación u otros medios para estudiar la disponibilidad del metal específico desde el producto farmacéutico. Reactivos: Todos los reactivos usados para la preparación de las soluciones estándar y muestra deben estar exentos de impurezas elementales, de conformidad con el capítulo Espectroquímica de Plasma (730).
Procedimiento 1: ICP-OES Solución de estandarización 1: 1,5] de los Elementos Diana en una Matriz Equiparada Solución de estandarización 2: 0,5] de los Elementos Diana en una Matriz Equiparada Solución madre de la muestra: Proceder según se indica anteriormente en Preparación de la Muestra. Si fuera necesario, dejar que la muestra se enfríe. Para la determinación de mercurio, agregar un estabilizador apropiado. Solución muestra: Diluir la Solución madre de la muestra con un disolvente apropiado hasta obtener una concentración final de los Elementos Diana de no más de 1,5]. Blanco: Matriz Equiparada Sistema espectrométrico elemental (Ver Espectroquímica de Plasma (730).) Modo: ICP Detector: Sistema de detección óptica Enjuague: El diluyente usado Estandarización: Solución de estandarización 7, Solución de estandarización 2 y Blanco Aptitud del sistema Muestra: Solución de estandarización 7 Requisitos de aptitud Deriva: Comparar los resultados obtenidos de la Solución de estandarización 7 antes y después del análisis de la Solución muestra.
Criterios de aptitud: No más de 20% para cada Elemento Diana. [NOTA-Si las muestras tienen un alto contenido mineral, enjuagar bien el sistema antes de introducir la Muestra para minimizar el arrastre.] Análisis: Analizar de acuerdo con las sugerencias del fabricante con respecto al programa y la longitud de onda. Calcular e informar los resultados basándose en el tamaño de la muestra original. [NOTA-Se deben tomar medidas apropiadas para corregir por interferencias inducidas por la matriz (p.ej., superposiciones de longitud de onda).]
294 (233) Impurezas Elementales-Procedimientos / Pruebas Químicas
USP 39
Procedimiento 2: ICP-MS Solución de estandarización 1: 1,5/ de los Elementos Diana en una Matriz Equiparada Solución de estandarización 2: 0,5/ de los Elementos Diana en una Matriz Equiparada Solución madre de la muestra: Proceder según se indica anteriormente en Preparación de la Muestra. Si fuera necesario, dejar que la muestra se enfríe. Para la determinación de mercurio, agregar un estabilizador apropiado. Solución muestra: Diluir la Solución madre de Ja muestra con un disolvente apropiado hasta obtener una concentración final de los Elementos Diana de no más de 1,5/. Blanco: Matriz Equiparada Sistema espectrométrico elemental (Ver Espectroquímica de Plasma (730).) Modo: ICP. [NOTA-Se recomienda un instrumento con una cámara de rocío enfriada. (Una celda de colisión o una celda de reacción también puede ofrecer beneficios.)] Detector: Espectrómetro de masas Enjuague: El diluyente usado Estandarización: Solución de estandarización 7, Solución de estandarización 2 y Blanco Aptitud del sistema Muestra: Solución de estandarización 7 Requisitos de aptitud Deriva: Comparar los resultados obtenidos de la Solución de estandarización 7 antes y después del análisis de la Solución muestra. Criterios de aptitud: Deriva no más de 20% para cada Elemento Diana. [NOTA-Si las muestras tienen un alto contenido mineral, enjuagar bien el sistema antes de introducir la Muestra para minimizar el arrastre.] Análisis: Analizar de acuerdo con las sugerencias del fabricante con respecto al programa y a m/ z. Calcular e informar los resultados basándose en el tamaño de la muestra original. [NOTA-Se deben tomar medidas apropiadas para corregir por interferencias inducidas por la matriz (p.ej., interferencia de cloruro de argón en determinaciones de arsénico).]
REQUISITOS PARA LA VALIDACIÓN DE PROCEDIMIENTOS ALTERNATIVOS Si los procedimientos farmacopeicos especificados no cumplen con las necesidades de una aplicación específica, se puede desarrollar un procedimiento alternativo (ver Advertencias y Requisitos Generales 6.30, Métodos y Procedimientos Alternativos y Armonizados). Los procedimientos alternativos deben ser validados y se debe demostrar que son aceptables de acuerdo con los requisitos de validación para procedimientos alternativos descritos a continuación. El nivel de validación necesario para asegurar que un procedimiento alternativo es aceptable depende de si se especifica en la monografíauna prueba de límite o una determinación cuantitativa. A continuación se describen los requisitos para la validación de un procedimiento de impurezas elementales para cada tipo de determinación. Cualquier procedimiento alternativo que ha sido validado y que cumple con los criterios de aceptación siguientes se considera adecuado para uso.
PROCEDIMIENTOS DE LÍMITE La siguiente sección define los parámetros de validación que se deben cumplir para que los procedimientos alternativos de límite sean aceptables. El cumplimiento con estos requisitos se debe demostrar de manera experimental usando un procedimiento de aptitud del sistema y un material de referencia adecuados. La aptitud del método se debe determinar mediante estudios que empleen los materiales o mezclas en análisis adicionados con concentraciones conocidas de cada Elemento Diana de interés a la concentración del límite de aceptación apropiada. Las cantidades conocidas deben agregarse al material o mezcla en análisis antes de llevar a cabo las etapas de preparación de la muestra.
Capacidad de Detección Solución estándar: Una preparación de materiales de referencia para los Elementos Diana a las Concentraciones Diana Solución muestra adicionada 1: Preparar una solución de la muestra en análisis, a la que se le agregan cantidades conocidas de los materiales de referencia apropiados para los Elementos Diana a la Concentración Diana, solubilizada o digerida según se indica en Preparación de la Muestra. Solución muestra adicionada 2: Preparar una solución de la muestra en análisis, a la que se le agregan cantidades conocidas de los materiales de referencia apropiados para los Elementos Diana al 80% de la Concentración Diana, solubilizada o digerida según se indica en Preparación de la Muestra. Solución muestra no adicionada: Una muestra del material en análisis, solubilizado o digerido de la misma manera que las Soluciones muestra
USP 39
Pruebas Químicas/ (233) Impurezas Elementales-Procedimientos 295
Criterios de aceptación Procedimientos no instrumentales: La Solución muestra adicionada 7 proporciona una señal o intensidad equivalente o mayor que la de la Solución estándar. La Solución muestra adicionada 2 debe proporcionar una señal o intensidad menor que la de la Solución muestra adicionada 7. [NOTA-La señal de cada Solución muestra adicionada no es menor que la determinación de la Solución muestra no adicionada.] Procedimientos instrumentales: El valor promedio de las tres mediciones repetidas de la Solución muestra adicionada 7 está dentro de (±15%) del valor promedio obtenido para las mediciones repetidas de la Solución estándar. El valor promedio de las mediciones repetidas de la Solución muestra adicionada 2 debe proveer una intensidad o valor de señal menor que los de la Solución estándar. [NOTA-Corregir los valores obtenidos para cada una de las soluciones adicionadas usando la Solución muestra no adicionada.]
Precisión para Métodos Instrumentales (Repetibilidad) [NOTA-La precisión no instrumental se demuestra cumpliendo con el requisito de Capacidad de Detección anterior.] Soluciones muestra: Seis muestras independientes del material en análisis, a las que se les agregan cantidades conocidas de materiales de referencia apropiados para los Elementos Diana a la Concentración Diana. Criterios de aceptación Desviación estándar relativa: No más de 20% para cada Elemento Diana
Especificidad El procedimiento debe ser capaz de evaluar de manera inequívoca (ver Validación de Procedimientos Farmacopeicos (1225)) cada Elemento Diana ante la presencia de los componentes esperados, incluyendo otros Elementos Diana y componentes de la matriz.
PROCEDIMIENTOS CUANTITATIVOS La siguiente sección define los parámetros de validación que se deben cumplir para que los procedimientos cuantitativos alternativos sean aceptables. El cumplimiento de estos requisitos se debe demostrar de manera experimental usando un procedimiento de aptitud del sistema y materiales de referencia adecuados. El cumplimiento con estos requisitos demuestra que el procedimiento es equivalente al procedimiento farmacopeico con el propósito de cuantificar los Elementos Diana.
Exactitud Soluciones estándar: Preparar soluciones que contengan los Elementos Diana a concentraciones en el intervalo de 50% a 150% de j, usando materiales de referencia apropiados. Muestras de prueba: Preparar muestras del material en análisis, a las que se les agregan cantidades conocidas de materiales de referencia apropiados antes de cualquier etapa de preparación de la muestra (digestión o solubilización), a concentraciones que caigan dentro del intervalo de 50% a 150% de j para cada Elemento Diana. Criterios de aceptación Recuperación de cantidades conocidas agregadas: 70%-150% para la media de tres preparaciones repetidas a cada concentración
Precisión REPETIBILIDAD Muestras de prueba: Seis muestras independientes del material en análisis (tomadas del mismo lote) con materiales de referencia apropiados para los Elementos Diana al nivel indicado. Criterios de aceptación Desviación estándar relativa: No más de 20% (N = 6) para cada Elemento Diana PRECISIÓN INTERMEDIA (TOLERANCIA) Realizar el análisis de Repetibilidad nuevamente en un día diferente, usando un instrumento diferente, un analista distinto, o una combinación de estos. Combinar los resultados de este análisis con el análisis de Repetibilidad de modo que el número total de análisis sea 12. Criterios de aceptación Desviación estándar relativa: No más de 25% (N = 12) para cada Elemento diana
296 (233) Impurezas Elementales-Procedimientos/ Pruebas Químicas
USP 39
Especificidad El procedimiento debe ser capaz de evaluar de manera inequívoca (ver Validación de Procedimientos Farmacopeicos (1225)) cada Elemento Diana en presencia de aquellos componentes que se espera estén presentes, incluyendo otros Elementos Diana y componentes de la matriz.
Límite de Cuantificación, Intervalo y Linealidad Se demuestra cumpliendo con el requisito de Exactitud.
APÉNDICE Ácido Concentrado: Los ácidos nítrico, sulfúrico, clorhídrico o fluorhídrico concentrados ultrapuros o el Agua Regia. Agua Regia: El agua regia es una mezcla de ácidos clorhídrico y nítrico concentrados, por lo general en proporciones de 3:1 ó 4:1, respectivamente. Matriz Equiparada: Son soluciones que tienen la misma composición de disolvente que la Solución muestra. En el caso de una solución acuosa, la Matriz Equiparada indicaría que se están usando los mismos ácidos, concentraciones ácidas y estabilizador de mercurio en ambas preparaciones. Elementos Diana: Elementos que potencialmente estarían presentes en el material en análisis. Cuando el análisis se lleva a cabo para demostrar el cumplimiento, la evaluación de elementos diana incluye arsénico (As), cadmio (Cd), plomo (Pb) y mercurio (Hg). Los Elementos diana también deben incluir cualquier elemento que pudiera agregarse a través del procesamiento o almacenamiento del material. Límite Diana o Concentración Diana: Valor de aceptación para la impureza elemental que se está evaluando. Un exceso en el límite diana indica que un material en análisis excede el valor aceptable. La determinación del cumplimiento se trata en otros capítulos. [NOTA-Cuando este capítulo se aplica a los capítulos Impurezas Elementales-Límites (232) y Contaminantes Elementales en Suplementos Dietéticos (2232), es posible obtener una aproximación de los Límites Diana dividiendo las Exposiciones Diarias Permitidas (EDP) para Dosis Diaria por la dosis diaria máxima para la Opción de Análisis del Medicamento del capítulo (232) o la EDP por Ración Diaria dividida por el tamaño de ración diaria máximo del capítulo (2232).] J: La concentración (p/p) de los elementos de interés en el Límite Diana se diluye apropiadamente hasta el intervalo de trabajo del instrumento. Por ejemplo, si los elementos diana son Pb y As para un análisis de un medicamento sólido oral, con una dosis diaria de 1Og/día, usando espectrometría de masas de plasma inductivamente acoplado (ICP-MS), el límite diana para estos elementos sería 0,5 µg/g y 1,5 µg/g (ver la Tabla 2 del capítulo (232)). No obstante, en este caso, se sabe que el intervalo dinámico lineal de la ICP-MS se extiende desde 0,01 ng/mL hasta O, 1 µg/mL para estos elementos. Por consiguiente, se requiere un factor de dilución de al menos 1:100 para asegurar que el análisis se realice en el intervalo dinámico lineal del instrumento. Jsería, en consecuencia, igual a 5 ng and 15 ng/mL para plomo y arsénico, respectivamente, cuando se suma el factor de dilución. Materiales de Referencia Apropiados: Cuando se especifiquen Materiales de Referencia Apropiados en el capítulo, se deben usar materiales de referencia certificados (CRM) de un instituto nacional de metrología, o materiales de referencia que sean rastreables al material de referencia certificado de un instituto nacional de metrología. Un ejemplo de un instituto nacional de metrología en los Estados Unidos es el National lnstitute of Standards and Technology.
(241) HIERRO Esta prueba de límite se suministra para demostrar que el contenido de hierro, en forma férrica o ferrosa, no excede el límite de hierro especificado en la monografía individual. La determinación se realiza mediante la comparación visual concomitante con un control preparado a partir de una solución de hierro estándar. Reactivos EspecialesSOLUCIÓN DE HIERRO ESTÁNDAR-Disolver 863,4 mg de sulfato férrico amónico [FeNHiS0 4 ) 2 • 12H2 0] en agua, agregar 1O mL de ácido sulfúrico 2 N y diluir con agua hasta 100,0 ml. Pipetear 1O mL de esta solución y transferirlos a un matraz volumétrico de 1000 mL, agregar 1O mL de ácido sulfúrico 2 N, diluir con agua a volumen y mezclar. Esta solución contiene el equivalente a 0,01 mg (1 O µg) de hierro por ml. SOLUCIÓN DE TIOCIANATO DE AMONIO-Disolver 30 g de tiocianato de amonio en agua para obtener 100 ml. Preparación Estándar-Pipetear 1 mL de Solución Estándar de Hierro (1 O µg de Fe) y transferirlos a un tubo para comparación de color de 50 mL, diluir con agua hasta 45 mL, agregar 2 mL de ácido clorhídrico y mezclar. Preparación de Prueba-Colocar en un tubo para comparación de color de 50 mL la solución preparada para la prueba según se indica en la monografía individual y, si fuera necesario, diluir con agua hasta 45 mL; o disolver en agua y diluir con agua hasta 45 mL la cantidad, en g, de la sustancia a analizar, según se calcula por la fórmula:
USP 39
Pruebas Químicas / (251 ) Plomo 29 7
1,0/(l OOOL) en donde L es el límite de Hierro expresado como porcentaje. Agregar 2 ml de ácido clorhídrico y mezclar. Procedimiento-A cada uno de los tubos que contienen la Preparación Estándar y la Preparación de Prueba agregar 50 mg de cristales de peroxidisulfato de amonio y 3 ml de Solución de Tiocianato de Amonio y mezclar: el color de la solución obtenida con la Preparación de Prueba no es más oscuro que el de la solución de la Preparación Estándar.
(251) PLOMO La imposición de límites estrictos para las cantidades de plomo que pueden estar prnsentes en los productos farmacéuticos ha dado como resultado la utilización de dos métodos. El que se presenta en este capítulo se basa en la extracción de plomo mediante soluciones de ditizona. Seleccionar todos los reactivos para esta prueba de forma que tengan un contenido de plomo lo más bajo posible y almacenar todas las soluciones reactivo en recipientes de vidrio de borosilicato. Enjuagar minuciosamente todos los materiales de vidrio con ácido nítrico diluido (1 en 2) tibio y luego con agua.
REACTIVOS ESPECIALES Solución de cianuro y amoníaco: Disolver 2 g de cianuro de potasio en 15 ml de hidróxido de amonio y diluir con agua hasta 100 ml. Solución de citrato de amonio: Disolver 40 g de ácido cítrico en 90 ml de agua. Agregar 2 ó 3 gotas de rojo fenol SR, luego agregar cuidadosamente hidróxido de amonio hasta que la solución adquiera un color rojizo. Eliminar todo el plomo que pueda estar presente extrayendo la solución con porciones de 20 ml de Solución de extracción de ditizona (ver a continuación), hasta que la solución de ditizona retenga su color verde anaranjado. Solución de plomo estándar diluida: Diluir un volumen medido con exactitud de solución estándar de plomo SR (que contenga 1O µg de plomo por ml) con 9 volúmenes de ácido nítrico diluido (1 en 100) para obtener una solución que contenga 1 µg de plomo por ml. Solución de extracción de ditizona: Disolver 30 mg de ditizona en 1000 ml de cloroformo y agregar 5 ml de alcohol. Almacenar la solución en un refrigerador. Antes de usar, agitar un volumen adecuado de la solución de extracción de ditizona con aproximadamente la mitad de su volumen de ácido nítrico diluido (1 en 100), desechando el ácido nítrico. Solución de clorhidrato de hidroxilamina: Disolver 20 g de clorhidrato de hidroxilamina en suficiente agua para obtener aproximadamente 65 ml. Transferir a un separador, agregar 5 gotas de azul de timol SR, luego agregar hidróxido de amonio hasta que la solución adquiera un color amarillo. Agregar 1O ml de solución de dietilditiocarbamato de sodio (1 en 25), mezclar y dejar en reposo durante 5 minutos. Extraer esta solución con porciones sucesivas de 1O a 15 ml de cloroformo hasta que una porción de 5 ml del extracto clorofórmico no presente color amarillo al agitarla con sulfato cúprico SR. Agregar ácido clorhídrico 3 N hasta que la solución adquiera un color rosado (si fuera necesario, agregar 1 ó 2 gotas adicionales de azul de timol SR), luego diluir con agua hasta 100 ml. Solución de cianuro de potasio: Disolver 50 g de cianuro de potasio en suficiente agua para obtener 100 ml. Eliminar el plomo de esta solución extrayendo con porciones sucesivas de Solución de extracción de ditizona, según se describe en Solución de citrato de amonio, luego extraer cualquier ditizona remanente en la solución de cianuro agitando con cloroformo. Finalmente diluir la solución de cianuro con suficiente agua para que cada porción de 100 ml contenga 1Og de cianuro de potasio. Solución de ditizona estándar: Disolver 1O mg de ditizona en 1000 ml de cloroformo. Mantener la solución en un frasco exento de plomo con tapón de vidrio, envuelto adecuadamente para protegerlo de la luz, y almacenar en un refrigerador.
PROCEDIMIENTO Preparación de prueba o Solución muestra [NOTA-Si en la siguiente preparación, la sustancia en análisis reacciona con demasiada rapidez y empieza a carbonizarse con 5 ml de ácido sulfúrico antes del calentamiento, usar en su lugar 1O ml de ácido sulfúrico diluido (1 en 2) enfriado y agregar unas pocas gotas de peróxido de hidrógeno antes del calentamiento.] Cuando la monografía no especifique la preparación de una solución, preparar una Preparación de prueba o Solución muestra, según se indica a continuación. [Precaución-Tomar precauciones de seguridad en este procedimiento, ya que algunas sustancias
pueden reaccionar con violencia explosiva al digerirlas con peróxido de hidrógeno.] Transferir 1,0 g de la sustancia en análisis a un matraz adecuado, agregar 5 ml de ácido sulfúrico y algunas perlas de vidrio, y digerir sobre una placa de calentamiento en una campana hasta que comience la carbonización. Se pueden usar otros medios de calentamiento adecuados. (Agregar ácido sulfúrico adicional, si fuera necesario, para humedecer la sustancia completamente, pero no agregar más de un total de 1O ml.) Agregar, gota a gota y con cuidado, peróxido de hidrógeno al 30%, permi-
298 (251) Plomo / Pruebas Químicas
USP 39
tiendo que la reacción disminuya y calentar después de agregar cada gota. Agregar las primeras gotas muy lentamente, mezclar con cuidado para evitar una reacción rápida y suspender el calentamiento si se produce espuma en exceso. Agitar por rotación suave la solución en el matraz para evitar que la sustancia sin reaccionar se aglutine a las paredes del matraz. [NOTAAgregar peróxido cuando la mezcla se torne de color marrón o se oscurezca.] Continuar la digestión hasta que la sustancia se destruya por completo, se desprendan humos de trióxido de azufre abundantes y la solución se torne incolora. Enfriar y agregar cuidadosamente 1O ml de agua. Evaporar hasta que se genere trióxido de azufre nuevamente y enfriar. Repetir este procedimiento con otros 1O ml de agua para eliminar cualquier traza de peróxido de hidrógeno. Diluir cuidadosamente con 1O ml de agua y enfriar. Análisis: Transferir a un separador la Preparación de prueba o la Solución muestra, enjuagando con 1O ml de agua o con el volumen de la muestra preparada especificado en la monografía y, a menos que se indique algo diferente en la monografía, agregar 6 ml de Solución de citrato de amonio y 2 ml de Solución de clorhidrato de hidroxilamina. (Para la determinación de plomo en sales de hierro, usar 1O ml de Solución de citrato de amonio.) Agregar 2 gotas de rojo fenal SR y alcalinizar la solución (sólo hasta color rojo) agregando hidróxido de amonio. Enfriar la solución, si fuera necesario, y agregar 2 ml de Solución de cianuro de potasio. Extraer de inmediato la solución con porciones de 5 ml de Solución de extracción de ditizona, vaciando cada extracto en otro separador, hasta que la solución de ditizona retenga su color verde. Agitar las soluciones de ditizona combinadas durante 30 segundos con 20 ml de ácido nítrico diluido (1 en 100) y desechar la capa clorofórmica. Agregar 5,0 ml de Solución de ditizona estándar y 4 ml de Solución de cianuro y amoníaco a la solución ácida y agitar durante 30 segundos. Criterios de aceptación: El color de la capa clorofórmica no tiene un tono violeta más intenso que el de un control preparado con un volumen de Solución de plomo estándar diluida, equivalente a la cantidad de plomo permitida en la muestra en análisis, y usando las mismas cantidades de los mismos reactivos y de la misma manera que en la prueba con la muestra.
(261) MERCURIO Método 1 NOTA-El ditizonato mercúrico es fotosensible. Realizar esta prueba en un lugar con luz tenue. ReactivosSOLUCIÓN MADRE DE DITIZONA-Disolver 40 mg de ditizona en 1000 ml de cloroformo. SOLUCIÓN VOLUMÉTRICA DE DITIZONA-Diluir 30,0 ml de Solución Madre de Ditizona con cloroformo hasta 100,0 ml. Esta solución contiene aproximadamente 12 mg de ditizona por litro. SOLUCIÓN MADRE DE MERCURIO-Transferir 135,4 mg de cloruro mercúrico a un matraz volumétrico de 100 ml y diluir a volumen con ácido sulfúrico 1 N. Esta solución contiene la cantidad equivalente a 100 mg de Hg en 100 ml. SOLUCIÓN DE MERCURIO PARA ESTANDARIZAR LA SOLUCIÓN VOLUMÉTRICA DE DITIZONA-Transferir 2,0 ml de Solución Madre de Mercurio a un matraz volumétrico de 100 ml y diluir a volumen con ácido sulfúrico 1 N. Cada ml de esta solución contiene el equivalente a 20 µg de Hg. Las siguientes soluciones son necesarias en la prueba de límite para mercurio que se especifica en las monografías de Fumarato Ferroso, Sulfato Ferroso y Sulfato Ferroso Seco. SOLUCIÓN DE CLORHIDRATO DE HIDROXILAMINA-Preparar según se indica en la prueba para Plomo (251 ). SOLUCIÓN ESTÁNDAR DE MERCURIO-En el día de uso, diluir cuantitativamente 1,0 ml de la Solución Madre de Mercurio con ácido sulfúrico 1 N hasta 1000 ml. Cada ml de la solución resultante contiene el equivalente a 1 µg de mercurio. SOLUCIÓN DE EXTRACCIÓN CON DITIZONA-Preparar según se indica en la prueba para Plomo (251 ). SOLUCIÓN DE EXTRACCIÓN CON DITIZONA DILUIDA-Inmediatamente antes de usar, diluir 5 ml de la Solución de Extracción con Ditizona con 25 ml de cloroformo. Estandarización de la Solución Volumétrica de Ditizona-Transferir 1,0 ml de la Solución de Mercurio para Estandarizar la Solución Volumétrica de Ditizona a un separador de 250 ml y agregar 100 ml de ácido sulfúrico 1 N, 90 ml de agua, 1 ml de ácido acético glacial y 1O ml de solución de clorhidrato de hidroxilamina (1 en 5). Valorar la solución con la Solución Volumétrica de Ditizona transferida desde una microbureta de 1O ml, agitando la mezcla 20 veces después de cada adición y dejando que la capa clorofórmica se separe, y luego desechar la capa clorofórmica. Continuar hasta que una última adición de la Solución Volumétrica de Ditizona haga que la solución tome una coloración verde después de agitarla. Calcular la cantidad, en µg, de Hg equivalente a cada ml de la Solución Volumétrica de Ditizona, por la fórmula: 20/V en donde V es el volumen, en ml, de la Solución Volumétrica de Ditizona agregada. Preparación de Prueba-Transferir aproximadamente 2 g de la sustancia en análisis, pesados con exactitud, a un matraz Erlenmeyer de 250 ml con tapón de vidrio, agregar 20 ml de una mezcla de volúmenes iguales de ácido nítrico y ácido sulfúrico, acoplar un condensador adecuado, someter la mezcla a reflujo durante 1 hora, enfriar, diluir cuidadosamente con agua y
Pruebas Químicas/ (261) Mercurio 299
USP 39
calentar a ebullición hasta que no se perciban vapores de ácido nitroso. Enfriar la solución, diluir cuidadosamente con agua, transferir a un matraz volumétrico de 200 ml, diluir a volumen con agua, mezclar y filtrar. Procedimiento-Transferir 50,0 ml de la Preparación de Prueba a un separador de 250 ml y extraer con pequeñas porciones sucesivas de cloroformo hasta que el último extracto clorofórmico permanezca incoloro. Desechar el extracto clorofórmico y agregar 50 ml de ácido sulfúrico 1 N, 90 ml de agua, 1 ml de ácido acético glacial y 1O ml de solución de clorhidrato de hidroxilamina (1 en 5) a la Preparación de Prueba extraída. Proceder según se indica en Estandarización de la Solución Volumétrica de Ditizona, comenzando donde dice "Valorar la solución". Calcular la cantidad de mercurio.
Método lla y Método llb Instrumento de Detección de Mercurio-Usar cualquier espectrofotómetro de absorción atómica adecuado equipado con un registrador de respuesta rápida y capaz de medir la radiación absorbida por los vapores de mercurio en la línea de resonancia del mercurio a 253,6 nm. [NOTA-Lavar todo el material de vidrio asociado a la prueba con ácido nítrico y enjuagar bien con agua antes de usar.] Aparato de Aireación-El aparato (ver el diagrama adjunto) consiste en un caudalímetro capaz de medir velocidades de flujo entre 500 y 1000 ml por minuto, conectado a través de una llave de paso de tres vías equipada con un tapón de teflón a un vaso de aireación (frasco de lavado de gases de 250 ml), seguido de una trampa, un tubo de secado relleno con perclorato de magnesio, una celda de flujo de 1O cm x 25 mm con ventanas de cuarzo y, por último, un orificio de ventilación a una campana de extracción. Llave de paso de tres vías con tapón de teflón Desvío
Aire o nitrógeno Caudallmetro flujo 5oo a 1000 mi. por minuto
Tubo de secado relleno con Mg(CI04'2
100mL
Trampa
Vaso de Aireación (Frasco lavadora de gases)
Orificio de
Celda de 10 cm. con ventanas de cuano
Las conexiones son de vidrio o de PVC
Aparato de Aireación de Mercurio ReactivosSolución de Permanganato de Potasio-Disolver 5 g de permanganato de potasio en 100 ml de agua. Solución de Clorhidrato de Hidroxilamina-Disolver 1Og de clorhidrato de hidroxilamina en 100 ml de agua. Solución de Cloruro Estannoso-Disolver 1Og de SnCl 2 • 2H 20 en 20 ml de ácido clorhídrico tibio y agregar 80 ml de agua.
Preparar soluciones nuevas cada semana. Solución Estándar de Mercurio-Preparar a partir de la Solución Madre de Mercurio según se indica en Método l. Cada ml de la Solución Estándar de Mercurio contiene el equivalente a 1 µg de mercurio.
Preparación de Prueba-A menos que se indique algo diferente en la monografía individual, usar la cantidad, en g, de la sustancia de prueba calculada por la fórmula:
2,0/L en donde L es el límite de mercurio, en ppm.
Método lla Preparación Estándar-Pipetear 2,0 ml de la Solución Estándar de Mercurio, transferir a un vaso de precipitados de 100 ml
y agregar 35 ml de agua, 3 ml de ácido sulfúrico y 1 ml de solución de permanganato de potasio. Cubrir el vaso de precipitados con un vidrio de reloj, calentar a ebullición durante unos segundos y enfriar. Preparación de Prueba-Transferir la cantidad calculada de la sustancia de prueba a un vaso de precipitados de 100 ml y agregar 35 ml de agua. Mezclar y entibiar para disolver, si fuera necesario. Agregar 2 gotas de fenolftaleína SR y, según sea necesario, neutralizar lentamente revolviendo constantemente, usando hidróxido de sodio 1 N o ácido sulfúrico 1 N. Agregar 3 ml de ácido sulfúrico y 1 ml de la Solución de Permanganato de Potasio. Cubrir el vaso de precipitados con un vidrio de reloj, calentar a ebullición durante unos segundos y enfriar.
300 (261) Mercurio/ Pruebas Químicas
USP 39
Procedimiento-Ensamblar el Aparato de Aireación según se muestra en el diagrama adjunto, con el vaso de aireación y la trampa vacíos y la llave de paso en la posición de desvío. Conectar el aparato a una celda de absorción y ajustar la velocidad de flujo del aire o del nitrógeno de modo que, en el procedimiento siguiente, se obtengan una.absorción y una reproducibilidad máximas sin la formación excesiva de espuma en la solución de prueba. Obtener una lectura inicial estable a 253,6 nm según las instrucciones de funcionamiento del fabricante del instrumento. Tratar la Preparación Estándar y la Preparación de Prueba de modo similar, de la siguiente manera. Eliminar el exceso de permanganato agregando Solución de Clorhidrato de Hidroxilamina, gota a gota, hasta que la solución quede incolora. Lavar inmediatamente con agua la solución en el vaso de aireación y diluir con agua hasta 100 ml. Agregar 2 ml de la Solución de Cloruro Estannoso y reconectar inmediatamente el vaso de aireación al aparato de aireación. Girar la llave de paso de la posición de desvío a la posición de aireación y continuar la aireación hasta que se haya pasado el pico de absorción y la pluma registradora vuelva al valor inicial. Desconectar el vaso de aireación del aparato y lavar con agua después de cada uso. Después de hacer correcciones por cualquier blanco de reactivo, toda absorbancia producida por la Preparación de Prueba no excede la producida por la Preparación Estándar.
Método llb Precaución-Algunas sustancias pueden reaccionar con violencia explosiva cuando se digieren con peróxido de hidrógeno. Tomar precauciones de seguridad en todo momento. Preparación Estándar-Pipetear 2,0 ml de la Solución Estándar de Mercurio y transferir a un matraz Erlenmeyer de 125 ml,
agregar 3 ml de ácido nítrico y 3 ml de ácido sulfúrico, mezclar y agregar una cantidad de peróxido de hidrógeno al 30 por ciento igual a la cantidad total usada para preparar la Preparación de Prueba. Acoplar un condensador enfriado por agua adecuado con una junta ahusada estándar que se ajuste al matraz y someter a reflujo la mezcla en una campana de extracción durante 1 hora. Cortar el agua que circula a través del condensador y calentar hasta que aparezcan humos blancos en el matraz. Enfriar y agregar cuidadosamente 1O ml de agua a través del condensador mezclando, por rotación suave. Volver a calentar hasta que aparezcan humos blancos, enfriar y agregar otros 15 ml de agua. Retirar el condensador y enjuagar las paredes del matraz para obtener un volumen de 35 mL. Agregar 1 ml de la Solución de Permanganato de Potasio, calentar a ebullición durante unos segundos y enfriar. Preparación de Prueba-Transferir la cantidad calculada de la sustancia de prueba a un matraz Erlenmeyer de 125 ml. Agregar 5 ml de ácido nítrico, 5 ml de ácido sulfúrico y algunas perlas de vidrio. Acoplar un condensador refrigerado por agua adecuado con una junta ahusada estándar que se ajuste al matraz y digerir en una campana de extracción, preferentemente sobre una placa de calentamiento, y a una temperatura que no exceda los 120º hasta que comience la carbonización. (Si se necesita ácido sulfúrico adicional para humedecer la muestra por completo, agregarlo cuidadosamente a través del condensador, pero sin permitir que el volumen total agregado exceda de 1O ml.) Después de que el ácido haya descompuesto la sustancia de prueba, agregar cuidadosamente, gota a gota a través del condensador, peróxido de hidrógeno al 30 por ciento, permitir que la reacción disminuya su intensidad, calentar nuevamente entre las gotas (agregar las primeras gotas muy lentamente y mezclando bien para evitar una reacción rápida; detener el calentamiento si la espuma se torna excesiva). Cuando la reacción haya disminuido, calentar cuidadosamente y girar el matraz ocasionalmente para evitar que la muestra se aglutine sobre el vidrio expuesto a la unidad de calentamiento. Mantener las condiciones de oxidación en todo momento durante la digestión agregando pequeñas cantidades de solución de peróxido de hidrógeno cuando la mezcla se vuelva de color marrón o se oscurezca. Continuar la digestión hasta que la materia orgánica se destruya y luego calentar a reflujo la mezcla durante 1 hora. Cortar el agua que circula a través del condensador y calentar hasta que se desprendan abundantes humos de trióxido de azufre y la solución se vuelva incolora o presente solamente un color pajizo claro. Enfriar y agregar cuidadosamente 1O ml de agua a través del condensador, mezclando por rotación suave. Calentar nuevamente hasta que aparezcan humos blancos. Enfriar y agregar cuidadosamente 15 ml de a·gua. Retirar el condensador y enjuagar las paredes del matraz con algunos ml de agua para obtener un volumen de 35 ml. Agregar 1 ml de la Solución de Permanganato de Potasio, calentar a ebullición durante unos segundos y enfriar. Procedimiento-Proceder según se indica en el Procedimiento en Método /la.
(267) POROSIMETRÍA POR INTRUSIÓN DE MERCURIO En general, los diversos tipos de poros se pueden representar como aberturas, canales o cavidades dentro de un cuerpo sólido o como espacios (es decir, intersticios o espacios vacíos) entre partículas sólidas en un lecho, compacto o agregado. Porosidad es un término comúnmente usado para indicar la naturaleza porosa de un material sólido y se define con mayor precisión como la relación entre el volumen de poros y espacios vacíos accesibles y el volumen total ocupado por una cantidad dada del sólido. Además de los poros accesibles, un sólido puede comprender poros cerrados, que están aislados de la superficie externa y a los cuales no son capaces de penetrar los fluidos. Este capítulo general no abarca la caracterización de poros cerrados, es decir, cavidades sin acceso a una superficie externa.
• USP 39
Pruebas Químicas/ (267) Porosimetría por Intrusión de Mercurio 301 ~.
Los materiales porosos pueden presentarse en forma de 'polvos finos o gruesos, compactos, extrudidos, láminas o monolitos, y su caracterización a menudo implica la determinación del volumen total de los poros o porosidad, así como la distribución del tamaño de los poros. Se ha establecido debidamente que el desempeño de un sólido poroso (p.ej., su resistencia, reactividad, permeabilidad o poder adsorbente) depende de la estructura de sus poros. Se ha desarrollado un gran número de métodos distintos para caracterizar la estructura de los poros. En vista de la complejidad de la mayoría de los sólidos porosos, no resulta extraño obtener resultados que no siempre concuerdan y que no exista una técnica definitiva que pueda garantizar una imagen completa de la estructura de los poros. La selección del método más adecuado depende de la aplicación del sólido poroso, de su naturaleza física y química, y del rango de tamaños de poro. Este capítulo ofrece pautas para medir la porosidad y la distribución del tamaño de los poros mediante porosimetría de mercurio, la cual es una prueba comparativa, generalmente destructiva, en la que el volumen de mercurio que penetra en un poro o espacio vacío se determina como una función de la presión hidrostática aplicada, que se puede relacionar con el diámetro del poro. Asimismo, se puede inferir otra información a partir de las curvas de volumen-presión, por ejemplo, la forma de los poros y sus interconexiones, el área de las superficies interna y externa, la granulometría del polvo y la densidad aparente y después del asentamiento; sin embargo, el alcance del presente capítulo no abarca dichos aspectos de la técnica. Las consideraciones prácticas actualmente limitan la presión absoluta máxima aplicada que pueden alcanzar algunos equipos de aproximadamente 400 MPa, que corresponde a un diámetro mínimo de poro equivalente a aproximadamente 0,003 µm. El diámetro máximo estará limitado por el tamaño de la muestra debido a la diferencia del frente hidrostático del mercurio entre los extremos superior e inferior de la muestra. Para la mayoría de los propósitos, se puede considerar que este límite es de aproximadamente 400 µm. Resulta posible determinar la porosidad interparticular e intraparticular, pero el método no distingue entre estas porosidades cuando coexisten. El método es apropiado para el estudio de la mayoría de los materiales porosos. Sin embargo, puede no ser apropiado para materiales que se amalgaman con mercurio, como ciertos metales, o puede ser necesaria una pasivación preliminar. Asimismo, la presión puede deformar o compactar otros materiales. En algunos casos, se pueden aplicar correcciones a la compresibilidad de la muestra y aún así obtener datos comparativos útiles. La porosimetría de mercurio debe considerarse una técnica comparativa, debido a que, para la mayoría de los medios porosos, no se encuentra disponible una teoría que permita un cálculo absoluto de resultados de la distribución del tamaño de los poros. Por lo tanto, esta técnica se recomienda principalmente para estudios de desarrollo. El mercurio es tóxico. Se deben tomar precauciones adecuadas para salvaguardar la salud del operador y de aquéllos que operen en el área. El material de desecho se debe eliminar de una manera adecuada, de conformidad con los reglamentos locales.
PRINCIPIO La técnica se basa en la medición del volumen de mercurio resultante de la intrusión en un sólido poroso como una función de la presión aplicada. La medición incluye únicamente aquellos poros en los que el mercurio puede penetrar a la presión aplicada. Un líquido no humectante penetra en un sistema poroso sólo a presión. La presión aplicada es inversamente proporcional al ancho interno del poro. En poros cilíndricos, la correlación entre el diámetro del poro y la presión se obtiene mediante la ecuación de Washburn:
4. O" dp =---cose
(1)
p
p dP cr 8
presión aplicada, en pascales diámetro del poro, en metros tensión superficial del mercurio, en newtons por metro ángulo de contacto entre el mercurio y la muestra, en grados
APARATO El portamuestras, conocido como penetrómetro o dilatómetro, tiene un tubo capilar calibrado a través del cual se puede evacuar la muestra y por el que puede entrar el mercurio. El tubo capilar está unido a un tubo más ancho en el que se coloca la muestra. El cambio en el volumen de mercurio resultante de la intrusión por lo general se mide por el cambio de la capacitancia entre la columna de mercurio en el tubo capilar y una funda metálica que rodea la parte externa del tubo capilar. Cuando se requieren mediciones precisas, el volumen interno del tubo capilar debe ser entre 20% y 90% del volumen previsto del poro y de los espacios vacíos de la muestra. Debido a que los distintos materiales presentan un amplio rango de porosidad, pueden ser necesarios varios penetrómetros equipados con tubos capilares con diferentes diámetros y volúmenes de muestra. La Figura 7 presenta una configuración típica para un instrumento de porosimetría de mercurio. El porosímetro puede tener
302 (267) Porosimetría por Intrusión de Mercurio / Pruebas Químicas
USP 39
diferentes puertos para la operación a alta y baja presión; también es posible llevar a cabo la medición a baja presión en una unidad distinta. El intervalo de presión es, por lo general, de 4 kPa a 300 kPa para la operación a baja presión, y superior a 300 kPa para la operación a alta presión, lo cual depende particularmente del diseño del aparato y del uso previsto.
Q
1 1 1
1
Mercurio
1 1 1 1 1
Muestra
1
1
3 1. Reservorio para fluido hidráulico de baja presión 2. Bomba hidráulica 3. Multiplicador de presión 4. Transductor de presión
-8
5. Reservorio para fluido hidráulico de alta presión
6. Bomba de vacío con manómetro 7. Reseivorio para mercurio
Figura 1. Ejemplo de la configuración de un instrumento para porosimetría de mercurio.
MÉTODO Preparación de la Muestra Tratar la muestra previamente mediante calentamiento y/o evacuación o con un flujo de gas inerte para eliminar el material adsorbido que pudiera ocultar su porosidad accesible. La pasivación de la superficie de sólidos humectables o amalgamables se puede lograr produciendo una capa fina de óxido o recubriendo con estearato. Pesar la muestra del sólido previamente tratado y transferir al penetrómetro. Luego, desgasificar el sistema de poros de la muestra al vacío hasta una presión residual máxima de 7 Pa.
Llenado del Penetrómetro con Mercurio Usar mercurio de calidad analítica. Cubrir la muestra con mercurio al vacío. El vacío es necesario para asegurar la transferencia del mercurio desde el reservorio al penetrómetro. En un penetrómetro lleno, la presión de llenado comprende la presión aplicada más la contribución de presión generada por el frente de mercurio que entra en contacto con la muestra. La presión de llenado típica es aproximadamente 4 kPa. Se puede minimizar la presión hidrostática del mercurio sobre la muestra llenando el penetrómetro en las posiciones horizontales.
Medición a Baja Presión Aplicar aire o nitrógeno de manera controlada para incrementar la presión en las etapas correspondientes a los tamaños de los poros de interés o de manera continua a una velocidad baja. Registrar el cambio concomitante en la longitud de la columna de mercurio en el tubo capilar. Una vez alcanzada la presión máxima requerida, reducirla hasta presión ambiental.
Medición a Alta Presión Después de medir en condiciones de baja presión, transferir el penetrómetro cargado con mercurio al puerto o unidad de alta presión del instrumento y cubrir con fluido hidráulico. El mercurio penetra en el sistema de poros por medio del fluido hidráulico. Incrementar la presión en el sistema hasta la presión máxima alcanzada en la medición a baja presión y registrar el volumen de intrusión a esta presión, debido a que los volúmenes de intrusión subsiguientes se calculan a partir de este volumen inicial. Incrementar la presión en las etapas correspondientes a los tamaños de poro de interés o de manera continua a
Pruebas Químicas/ (267) Porosimetría por Intrusión de Mercurio 303
USP 39
una velocidad baja. La caída en la columna de mercurio se mide hasta la presión máxima requerida. En caso necesario, se puede reducir la presión por etapas o de manera continua a una velocidad baja para determinar la curva de extrusión del mercurio. Corregir para considerar los cambios en el volumen del mercurio, el penetrómetro y demás componentes del sistema detector de volumen a presión elevada. El grado de las correcciones requeridas se puede determinar a través de mediciones blanco aplicando las mismas condiciones. La Figura 2 presenta una curva de volumen-presión determinada experimentalmente. 300
JtE
240
§. o "O 180 .!!! E o 120 lll e: E 60
" "
"
:g"
o
10"'
10'
10'
Presión (MPa)
Figura 2. Curva de volumen-presión como gráfica semilogarítmica.
INFORME DE LOS RESULTADOS Convertir las lecturas de la presión a diámetro de los poros usando la ecuación de Washburn u otro modelo. La tensión superficial de mercurio, cr, no sólo depende de la temperatura y del material, sino también-en el caso de las áreas superficiales con curvas marcadas-del radio de la curvatura. En general, los valores entre 0,41 N · m·1 y 0,52 N · m·1 se miden a temperatura ambiente. Si no se conoce el valor, se puede usar cr = 0,48 N · m- 1 • El ángulo de contacto del mercurio, e, es más de 90º en la mayoría de los casos y se puede determinar con un instrumento para medir el ángulo de contacto. Si no se conoce el valor e, se puede usar 130º. Informar los valores de ángulo de contacto, tensión superficial, así como el modelo usado para el cálculo. La visualización de los datos se puede realizar mediante varios tipos de gráficas. Frecuentemente, se visualiza la distribución del tamaño de poros representando el diámetro de poro en las abscisas y el volumen específico dependiente de la intrusión en las ordenadas. En este caso, resulta apropiado representar las abscisas en escala logarítmica (ver la Figura 3). Los espacios entre las partículas de la muestra sólida se incluyen como poros en el cálculo. Si los poros difieren en tamaño de los espacios vacíos, éstos últimos se pueden separar seleccionando el intervalo de tamaño de poro pertinente. No se pueden usar las curvas de extrusión para calcular la distribución del tamaño de los poros (para histéresis, ver la Figura 2), debido a que una parte del mercurio resultante de la intrusión siempre permanece en el sistema de poros. La relación de retención puede ser de utilidad para la caracterización cualitativa de los poros a los que únicamente se puede acceder a través de aberturas estrechas ("poros en forma de tintero"). Los valores característicos más comunes, como el volumen específico total resultante de la intrusión, la media y la mediana del diámetro de poro se calculan a partir de la distribución del tamaño de los poros. Asimismo, la documentación del procedimiento debe comprender la muestra, su preparación, las condiciones de evacuación y el instrumento utilizado.
.....
~~...-~~~~~~~~~~~
!?
~
i-i:-----0
¡,.. :; E
ª""
lll
~-
" ~oL..~.-...i:!llCIIllaIIlLIIIICIIIla:Q]lillJ111Jtb:eJ 10'
10'
Diámetro de poro (nm)
Figura 3. Distribución del volumen de los poros como gráfica semilogarítmica.
CONTROL DEL DESEMPEÑO DEL INSTRUMENTO Puesto que la técnica de porosimetría de mercurio es considerada una prueba comparativa, este capítulo no proporciona detalles sobre la misma. Sin embargo, se recomienda analizar un material de comparación estable de manera rutinaria para monitorear la calibración y el desempeño del instrumento.
304 (268) Porosidad Mediante Adsorción-Desorción de Nitrógeno / Pruebas Químicas
USP 39
(268) POROSIDAD MEDIANTE ADSORCIÓN-DESORCIÓN DE NITRÓGENO INTRODUCCIÓN La porosidad es un término comúnmente usado para indicar la naturaleza porosa de un material sólido y se define, con mayor precisión, como la relación entre el volumen de poros y espacios vacíos accesibles y el volumen total ocupado por una cantidad dada del sólido. Los poros cerrados o inaccesibles que están aislados de la superficie externa se excluyen de esta definición de volumen de poro. Los poros (o espacios vacíos) pueden incluir aberturas, canales o cavidades dentro de un cuerpo sólido o espacios entre partículas sólidas en un compacto o agregado. Los poros se presentan en una variedad de materiales sólidos más allá de los compactos y los agregados, tales como polvos y tabletas, y su caracterización a menudo implica la determinación del volumen de poro total o porosidad, así como la distribución del tamaño de poro. Por lo general, la clasificación de los poros se hace por tamaño en los siguientes grupos: • Microporos-menores de 2 nm • Mesoporos-2 a 50 nm • Macroporos-mayores de 50 nm El método del presente capítulo, Porosidad Mediante Adsorción-Desorción de Nitrógeno (268), es complementario al del capítulo general Porosimetría por Intrusión de Mercurio (267). La porosimetría por mercurio puede, en principio (teóricamente), usarse con diámetros de poro de 3 nm a 400 µm, aunque se aplica mayormente para el intervalo de 100 nm a 200 µm. La adsorción-desorción de nitrógeno se puede usar para caracterizar poros con tamaños menores de aproximadamente 300 nm, pero es más apropiado para el análisis de mesoporos y en el intervalo inferior de macroporos de 2 a 100 nm.
APARATO Las mediciones generalmente se llevan a cabo usando el procedimiento volumétrico estático, aunque también se pueden emplear métodos de flujo dinámico. Los usuarios de equipos comercialmente disponibles deben referirse a los documentos y manuales del fabricante para obtener una descripción de su aparato en particular. Por ejemplo, un aparato volumétrico estático debe proveer lo siguiente: sistema de vacío para una presión de menos de 1O Pa, suministro de volúmenes conocidos de nitrógeno y helio de alta pureza, medición exacta de presión y temperatura, y un medio para enfriar la muestra a la temperatura del nitrógeno líquido.
PRINCIPIO DE MEDICIÓN La adsorción de un gas inerte sobre las superficies sólidas a bajas temperaturas es un fenómeno bien conocido y es el fundamento para la medición del área superficial de los sólidos (ver el capítulo general Área Superficial Específica (846)). A medida que el gas se adsorbe sobre una superficie, se puede condensar en el interior de los poros accesibles. El volumen total de poro y la distribución de tamaño de poro se pueden derivar de la isoterma de adsorción de gas, la cual es una medición de la cantidad adsorbida como una función de la presión parcial del adsorbato. Las isotermas de adsorción se dividen en seis categorías generales, dependiendo de la energética relativa de la adsorción y la presencia de poros. La Figura 7 representa las seis categorías generales de isotermas de adsorción. Los microporos (poros con tamaños menores de 2 nm) con frecuencia generan isotermas tipo l. Los mesoporos y macroporos normalmente producen isotermas tipo IV, pero la histéresis puede ser difícil de observar en poros con tamaños mayores a aproximadamente 100 nm, lo que produce una isoterma tipo 11. Aunque es posible derivar cierta información, tal como la porosidad total, para materiales microporosos, la determinación de las distribuciones del tamaño de poro en dicho intervalo de tamaño está fuera del alcance de este capítulo. El adsorbato preferido es nitrógeno, mientras que la isoterma se determina a la temperatura del nitrógeno líquido (77,4 K). Se pueden usar otros adsorbatos para propósitos especiales, aunque no se tratan en este capítulo.
USP 39
Pruebas Químicas / (268) Porosidad Mediante Adsorción-Desorción de Nitrógeno 305
l
111
ro
"O
:o..... oen
"O
ro
"O
ro
"O
:¡::;
V
e ro ü
Presión relativa ---~ Figura 1. Tipos de Isotermas. [Reproducido con autorización y modificado de: Sing KSW, Everett DH, Haul RAW, et al. Reporting physisorption far gas/salid systems with special reference to the determination of surface area and porosity (recommendations 1984)(1nforme de fisisorción para sistemas de gas/sólido con referencia especial a la determinación del área superficial y la porosidad. (Recomendaciones 1984) Pure Appl Chem. 1985;57(4):603-619, Figura 2.]
PROCEDIMIENTO Preparación de la Muestra Antes del análisis, los analistas deben desgasificar la muestra para eliminar gases y vapores que se hayan adsorbido físicamente sobre la superficie. Resulta necesario demostrar las condiciones de desgasificación para obtener una adsorción-desorción reproducible, un peso constante de la muestra y que no se produzcan cambios físicos o químicos detectables en la muestra. La desgasificación de un gran número de sustancias a menudo se consigue mediante vacío, purgando la muestra en una corriente fluida de gas seco no reactivo o aplicando un procedimiento de adsorción-desorción cíclica. Si resultara apropiado, los analistas pueden aplicar temperaturas elevadas para aumentar la velocidad a la que los contaminantes abandonan la superficie. Los analistas deben ser precavidos para evitar que se afecte la naturaleza de la superficie y la integridad de la muestra cuando se desgasifica a temperaturas elevadas. Si se emplea calentamiento, la temperatura y el tiempo de desgasificación recomendados deben ser los mínimos requeridos para lograr una medición reproducible de la isoterma de adsorción-desorción. Los analistas deben determinar la masa de la muestra después de desgasificar o como alternativa, deben determinar la masa después de la medición de adsorción-desorción. El área superficial total de la muestra debe ser mayor que 1 m 2 y de preferencia mayor que 5 mi.
Medición de las Isotermas Los detalles específicos del proceso de medición dependen del procedimiento usado. Los analistas deben seguir las instrucciones del fabricante para el instrumento usado en particular. La siguiente descripción puede aplicarse de manera general: - Los analistas deben determinar la presión de vapor saturado del adsorbato, p0 • Es preferible determinar p0 de manera experimental al momento de la medición, aunque los analistas pueden usar un valor calculado. - Los analistas deben determinar la isoterma de sordón de nitrógeno y deben medir el volumen adsorbido, V0 , a la presión relativa más baja deseada (p/p 0, el cociente entre la presión de adsorbato medida y la presión de su vapor saturado).
306 (268) Porosidad Mediante Adsorción-Desorción de Nitrógeno / Pruebas Químicas
-
USP 39
Los analistas repiten la medición de Vª a valores de presión relativa sucesivamente mayores hasta la máxima presión relati-
va deseada (por lo general, 0,99). Posteriormente, los analistas reducen la presión relativa de manera sucesiva para determinar las cantidades sorbidas en la porción de desorción de la isoterma. Los analistas deben medir al menos 20 puntos en los segmentos de adsorción y desorción, abarcando un intervalo de presión relativa (p/p 0) de aproximadamente 0,050,99. Los valores p/p 0 se pueden distribuir para lograr la mejor resolución de la distribución del tamaño de poro. Cuando se esté usando únicamente el segmento de desorción para calcular la distribución del tamaño de poro, se pueden usar menos puntos en el segmento de adsorción.
ANÁLISIS DE DATOS Análisis de la Isoterma La isoterma se presenta como una gráfica de la cantidad de nitrógeno adsorbido (en volumen, Vª, o moles, nª) en función de p/p0 • Los datos de la isoterma también pueden presentarse en formato de tabla. Los tipos de isoterma e histéresis se determinan a partir de la gráfica, comparándola con los ejemplos de las Figuras 7 y 2. Una isoterma tipo 1 es común para materiales microporosos. Una isoterma tipo IV por lo general se presenta en materiales que contienen mesoporos o macroporos pequeños.
H1
H2
ro 15 ,_ "O
oen
"O
ro
"O
ro
"O
:;::;
e: ro ü
Presión
relativa---~
Figura 2. Tipos de Ciclos de Histéresis. [Reproducido con autorización y modificado de: Sing KSW, Everett DH, Haul RAW, et al. Reporting physisorption for gas/solid systems with special reference to the determination of surface area and porosity (recommendations 1984)(1nforme de fisisorción para sistemas de gas/sólido con referencia especial a la determinación del área superficial y la porosidad. (Recomendaciones 1984). Pure Appl Chem. 1985;57(4):603-619, Figura 3.] Generar una gráfica to a5 para comparar la isoterma de la muestra de prueba con la de una isoterma de referencia también ayuda a ilustrar la presencia de micro y mesoporosidad. La isoterma de referencia se puede calcular usando una expresión matemática, aunque cuando el adsorbente tiene propiedades químicas similares a las de la muestra de prueba, se recomienda usar una isoterma de referencia determinada de manera experimental. El método de la gráfica t se basa en la curva t, que es una gráfica de la cantidad de nitrógeno adsorbido en el sólido no poroso como una función de t, el espesor estadístico de la capa adsorbida. El valor t se calcula mediante:
USP 39
Pruebas Químicas/ (268) Porosidad Mediante Adsorción-Desorción de Nitrógeno 307
nm = cantidad de monocapa Jª =espesor de una capa molecular simple, por lo general tomada como 0,354 nm para nitrógeno En el método de la gráfica a 5, la cantidad de nitrógeno adsorbido por el sólido no poroso de referencia se normaliza usando la cantidad adsorbida a alguna presión relativa fija (n' a), a menudo tomada como 0,4. Posteriormente, la adsorción normalizada a 5 (igual a na! n' ª x) se grafica contra piPo para obtener una curva a 5• La gráfica to la g'ráfica a5 se construye graficando la cantidad de nitrógeno adsorbido por la muestra de prueba en función de to a 5 para el material de referencia, en lugar de p/p 0 • La conversión de p/p 0 a to a 5 se lleva a cabo tomando como referencia la curva to la curva a 5• La forma de la gráfica depende de la naturaleza de la porosidad presente en la muestra de prueba, conforme a lo siguiente: (a) si la gráfica to a 5 es lineal y pasa a través del origen, la muestra de prueba es no porosa o macroporosa. (b) si la muestra de prueba contiene mesoporos, la gráfica presenta una desviación hacia arriba a la presión relativa correspondiente al comienzo de la condensación capilar en los mesoporos más pequeños (c) si la muestra de prueba contiene microporos, la gráfica presenta una desviación hacia abajo debido a que no se pueden desarrollar múltiples capas dentro del espacio limitado en el interior de los microporos. Algunos materiales contienen combinaciones de poros, lo que puede resultar en una gráfica compleja y difícil de interpretar. En dichos casos, los analistas deben tener cuidado al analizar la isoterma.
Cálculo de la Distribución del Tamaño de Poro Este análisis es válido únicamente para cálculos de las distribuciones del tamaño de mesoporos. El cálculo de la distribución del tamaño de poro se basa en la ecuación de Kelvin: 3 r. - 2xCJ1 xv1 xcos(B)x10
--~~------
k -
RxTxln(plp0 )
rK =radio del núcleo del poro (o radio de Kelvin) (nm) a1 =tensión superficial (N/m) del adsorbato líquido (nitrógeno) v1 =volumen molar del adsorbato condensado (nitrógeno) (cm 3/mol) R =constante universal de los gases, 8,3144 (J · K- 1 • mol-1) T = temperatura (K) ()=ángulo de contacto del adsorbato (O para una superficie humedecida) Para nitrógeno, la ecuación 2 se reduce a:
r. k
-0.953
=----
ln(p/po)
El radio real del poro, rP' se calcula a partir del radio de Kelvin, corrigiendo por el espesor, t, del adsorbato en las paredes del poro. Para poros cilíndricos, rP = rk + t, y el diámetro del poro, dP, se obtiene mediante dP = 2(rk + t). Debido a la diferente geometría de los poros en forma de ranura con lados paralelos, el ancho de la ranura se obtiene mediante rk + 2t. Los analistas pueden calcular la distribución del tamaño de poro por volumen usando el método de Barrett, Joyner y Halenda. Este modelo asume que los poros son rígidos y tienen una forma regular (p.ej., cilíndrica o en forma de ranura), que no hay microporos presentes y que la distribución del tamaño de poro no se extiende continuamente sobre los poros más grandes que se pueden medir usando este procedimiento, lo cual implica que todos los poros evaluados se llenan a la presión relativa más alta. Los cálculos de porosidad y de distribución del tamaño de poro que emplean la ecuación de Kelvin deben realizarse usando la isoterma de desorción. La ecuación de Kelvin se derivó para sistemas macroscópicos y no es estrictamente válida a la escala molecular. Por ende, la ecuación de Kelvin se basa en un menisco intacto para describir con exactitud el fenómeno experimentales. Para los sistemas tratados en este capítulo, esto se logra únicamente para la isoterma de desorción. Sin embargo, para la desorción, la aplicación de la ecuación de Kelvin a tamaños de poro menores se ve limitada por la tensión superficial del adsorbato. El límite se ilustra mediante el punto de cierre del ciclo de histéresis en la isoterma. Para nitrógeno, este punto ocurre a una presión relativa de aproximadamente 0,45, que corresponde a un radio de poro cilíndrico limitante de aproximadamente 2 nm. Por consiguiente, la ecuación de Kelvin no es aplicable a los microporos.
Cálculo del Volumen de Microporos Si la gráfica to a5 indica la presencia de microporos, el volumen de los microporos se puede obtener a partir de la intersección de la porción lineal extrapolada de la curva.
308 (268) Porosidad Mediante Adsorción-Desorción de Nitrógeno / Pruebas Químicas
USP 39
Informe de Resultados Por lo general, los resultados informados pueden incluir el volumen o la porosidad total de los poros, el volumen de los microporos, la media o la mediana del diámetro de poro, la distribución del tamaño de poro y el área superficial de los poros.
CALIBRACIÓN V VERIFICACIÓN DEL DESEMPEÑO DEL SISTEMA Los analistas deben llevar a cabo la calibración de los componentes individuales de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. La calibración de transductores de presión y de sensores de temperatura se logra con referencia a dispositivos estándar de medición de temperatura y presión que cuentan con calibraciones rastreables a estándares nacionales. La calibración del volumen del distribuidor múltiple (manifold) se logra a través de las mediciones apropiadas de presión y temperatura, usando espacios volumétricos con temperatura constante o sólidos con volumen rastreable y conocido. Un material de referencia certificado o un material de referencia definido localmente que sea rastreable a un material de referencia certificado debe analizarse de manera regular para monitorear la calibración y el desempeño del instrumento.
(271 > PRUEBA PARA SUSTANCIAS FÁCILMENTE CARBONIZABLES En las pruebas para sustancias fácilmente carbonizables, a menos que se indique algo diferente, agregar la cantidad especificada de la sustancia, reducida a polvo fino si se encuentra en forma sólida, en pequeñas porciones al recipiente para comparación que es de vidrio incoloro resistente a la acción del ácido sulfúrico y contiene el volumen especificado de ácido sulfúrico (ver en Especificaciones de Reactivos en la sección Reactivos, Indicadores y Soluciones). Revolver la mezcla con una varilla de vidrio hasta completar su disolución, dejar la solución en reposo durante 15 minutos, a menos que se indique algo diferente, y comparar el color de la solución con el del Líquido de Comparación especificado (ver Color y Acromatismo (631 )) utilizando un recipiente para comparación, que también es de vidrio incoloro y tiene las mismas dimensiones internas y cruzadas, observando los líquidos transversalmente contra un fondo de porcelana blanca o de vidrio blanco. Cuando se aplica calor para disolver la sustancia en el ácido sulfúrico, mezclar la muestra y el ácido en un tubo de ensayo, calentar según se indica y transferir la solución al recipiente para comparación para observarla con el Líquido de Comparación designado (ver Color y Acromatismo (631 )).
(281 >RESIDUO DE INCINERACIÓN Partes de este capítulo general han sido armonizadas con los textos correspondientes de la Farmacopea Europea y de la Farmacopea japonesa. Las partes que no están armonizadas se indican con los símbolos (\). Los textos armonizados de estas farmacopeas son por lo tanto intercambiables y, en lugar de este capítulo general de la Farmacopea de los Estados Unidos, se pueden usar los métodos de la Farmacopea Europea y/o la Farmacopea japonesa para demostrar el cumplimiento con los requisitos. Estas farmacopeas se han comprometido a no realizar ningún cambio unilateral a este capítulo armonizado. La prueba de Residuo de Incineración/Cenizas Sulfatadas emplea un procedimiento para medir la cantidad de sustancia residual no volatilizada de una muestra cuando ésta se incinera en presencia de ácido sulfúrico conforme al procedimiento que se describe a continuación. Generalmente esta prueba se emplea para determinar el contenido de impurezas inorgánicas en una sustancia orgánica. Procedimiento-Calcinar un crisol adecuado (por ejemplo de sílice, platino, cuarzo o porcelana) a 600 ± 50º durante 30 minutos, enfriar el crisol en un desecador (gel de sílice u otro desecante adecuado) y pesarlo con exactitud. Pesar con exactitud •1 a 2 g de la sustancia º• la cantidad que se especifica en la monografía individual, en el crisol. Humedecer la muestra con una pequeña cantidad (generalmente 1 mL) de ácido sulfúrico y luego calentar suavemente a una temperatura tan baja como sea posible hasta que la sustancia se carbonice totalmente. Enfriar; y luego•, a menos que se indique algo diferente en la monografía individual,. humedecer el residuo con una pequeña cantidad (generalmente 1 mL) de ácido sulfúrico; calentar suavemente hasta que no se generen humos blancos y calcinar a 600 ± 50º •, a menos que se especifique otra temperatura en la monografía individual,. hasta que el residuo esté completamente incinerado. Asegurarse, durante todo el procedimiento, de que no se produzcan llamas en ningún momento. Enfriar el crisol en un desecador (gel de sílice u otro desecante adecuado), pesar con exactitud y calcular el porcentaje del residuo. A menos que se especifique algo diferente, si la cantidad del residuo así obtenido excede el límite especificado en la monografía individual, humedecer nuevamente con ácido sulfúrico, calentar y calcinar como se indicó anteriormente, usando un
USP 39
Pruebas Químicas / (291) Selenio 309
período de incineración de 30 minutos, hasta que dos pesadas consecutivas del residuo no difieran en más de 0,5 mg o hasta que el porcentaje del residuo cumpla con el límite establecido en la monografía individual. •Realizar la incineración en una campana bien ventilada, pero protegida de las corrientes de aire y a la menor temperatura posible para lograr la combustión completa del carbón. Puede usarse una mufla, si se desea, cuyo uso para la calcinación final se recomienda a 600 ± 50º. La mufla se puede calibrar empleando un termómetro digital adecuado y una sonda termopar de trabajo calibrada contra un termopar estándar rastreable al Instituto Nacional de Normas y Tecnología (NIST, por sus siglas en inglés). Verificar la exactitud de los circuitos de medición y control de la mufla mediante la comprobación de la temperatura fijada para el uso previsto en distintas posiciones dentro de la mufla. Seleccionar las posiciones que reflejen el método de uso eventual con respecto a la ubicación de la muestra en análisis. La tolerancia es de± 25º en cada posición medida .•
(291) SELENIO Solución Madre-Disolver 40,0 mg de selenio metálico en 100 mL de ácido nítrico diluido (1 en 2) en un matraz volumétrico de 1000 mL, calentar moderadamente en un baño de vapor, si fuera necesario para completar la disolución, agregar agua a volumen y mezclar. Pipetear 5 mL de esta solución y transferir a un matraz volumétrico de 200 mL, agregar agua a volumen y mezclar. Cada mL de la solución resultante contiene la cantidad equivalente a 1 µg de selenio (Se). Solución de Diaminonaftaleno-Disolver 100 mg de 2,3-diaminonaftaleno y 500 mg de clorhidrato de hidroxilamina en ácido clorhídrico O, 1 N para obtener 100 mL. Preparar esta solución el mismo día de su uso. Solución Estándar-Pipetear 6 mL de Solución Estándar y transferir a un vaso de precipitados de 150 mL, y agregar 25 mL de ácido nítrico diluido (1 en 30) y 25 mL de agua. Solución de Prueba-La combustión completa del material de prueba es un factor importante para realizar la prueba. Para los compuestos que se queman mal y producen hollín, la adición de óxido de magnesio por lo general da como resultado una combustión más minuciosa y reduce la formación de hollín. Cuando se haya detectado la necesidad de agregar óxido de magnesio, ésta se especificará en la monografía individual. Utilizando un matraz de combustión de 1000 mL y empleando 25 mL de ácido nítrico diluido (1 en 30) como líquido absorbente, proceder según se indica en Combustión en Matraz con Oxígeno (471 ), empleando 100 mg a 200 mg de muestra de prueba, a menos que se indique algo diferente en la monografía individual. Al finalizar la combustión, colocar algunos mL de agua en el matraz, aflojar el tapón, luego enjuagar el tapón, el portamuestras y las paredes del matraz con aproximadamente 1O mL de agua. Transferir la solución a un vaso de precipitados de 150 mL con la ayuda de aproximadamente 20 mL de agua y calentar moderadamente hasta temperatura de ebullición. Calentar a ebullición durante 1O minutos y dejar que se enfríe a temperatura ambiente. Procedimiento-Tratar concomitantemente y en paralelo la Solución Estándar, la Solución de Prueba y el blanco de reactivos constituido por 25 mL de ácido nítrico diluido (1 en 30) y 25 mL de agua, según se indica a continuación. Agregar solución de hidróxido de amonio (1 en 2) para ajustar a un pH de 2,0 ± 0,2. Diluir con agua a 60 mL y transferir a un separador de vidrio con protección actínica con la ayuda de 1O mL de agua, agregando los 1O mL al separador. Agregar 200 mg de clorhidrato de hidroxilamina, agitar por rotación moderada para disolver; de inmediato agregar 5,0 mL de Solución de Diaminonaftaleno, tapar y mezclar por rotación suave. Dejar la solución en reposo a temperatura ambiente durante 100 minutos. Agregar 5,0 mL de ciclohexano, agitar vigorosamente durante 2 minutos y dejar que las capas se separen. Desechar la capa acuosa y centrifugar el extracto de ciclohexano para eliminar el agua dispersada. Determinar las absorbancias de los extractos de ciclohexano de la Solución de prueba y de la Solución estándar en una celda de 1 cm, a la longitud de onda de máxima absorción, aproximadamente a 380 nm, con un espectrofotómetro adecuado, usando el extracto de ciclohexano del blanco de reactivos como blanco, y comparar las absorbancias: la absorbancia de la Solución de Prueba no es mayor que la de la Solución Estándar cuando se ha tomado una muestra de prueba de 200 mg, o no es mayor que la mitad de la absorbancia de la Solución Estándar cuando se ha tomado una muestra de prueba de 100 mg.
31 O (301) Capacidad Neutralizante de Ácido / Pruebas Químicas
USP 39
OTRAS PRUEBAS Y VALORACIONES (301) CAPACIDAD NEUTRALIZANTE DE ÁCIDO NOTA-Todas las pruebas se deben realizar a una temperatura de 37 ± 3º. Calibración del Medidor de pH-Calibrar un medidor de pH usando soluciones amortiguadoras de calibración de biftalato de potasio 0,05 m y de tetraoxalato de potasio 0,05 m como se describe en pH (791 ). Mezclador Magnético-Transferir 100 ml de agua a un vaso de precipitados de 250 ml que contenga una barra mezcladora magnética de 40 mm x 1O mm (u otro tamaño adecuado) recubierta con teflón y con un anillo de giro en el centro. Ajustar la velocidad de la barra mezcladora, de forma que cuando la barra mezcladora se centra en el vaso de precipitados, la velocidad de mezclado sea de 300 ± 30 rpm, determinada con un tacómetro óptico adecuado. Preparación de PruebaPolvos-Transferir a un vaso de precipitados de 250 ml, la porción pesada con exactitud de la sustancia especificada en la monografía individual, agregar 70 ml de agua y mezclar en el Mezclador Magnético durante 1 minuto. Sólidos Efervescentes-Transferir a un vaso de precipitados de 250 ml, una cantidad pesada con exactitud, que equivalga a la dosificación mínima declarada en la etiqueta, agregar 1O ml de agua y mezclar por rotación moderada el vaso de precipitados mientras se reduce la intensidad de la reacción. Agregar 1 O ml más de agua y mezclar por rotación suave. Lavar las paredes del vaso de precipitados con 50 ml de agua, y mezclar en el Mezclador Magnético durante 1 minuto. Suspensiones y Otros Líquidos-Agitar el recipiente hasta que el contenido sea uniforme y determinar la densidad. Transferir a un vaso de precipitados de 250 ml una cantidad de la mezcla uniforme, pesada con exactitud, que equivalga a la dosificación mínima declarada en la etiqueta, agregar agua hasta obtener un volumen de aproximadamente 70 ml y mezclar en el Mezclador Magnético durante 1 minuto. Tabletas de Disolución Bucal-Pesar con exactitud no menos de 20 tabletas de disolución bucal y determinar el peso promedio. Seleccionar y pesar 2 tabletas de disolución bucal y transferirlas a un vaso de precipitados de 250 ml que contenga 70 ml de agua. Tabletas No Masticables-Pesar con exactitud no menos de 20 tabletas y determinar el peso promedio de las tabletas. Moler las tabletas hasta un polvo fino, mezclar para obtener una mezcla uniforme y transferir a un vaso de precipitados de 250 ml una cantidad pesada con exactitud, que equivalga a la dosificación mínima declarada en la etiqueta. Si se desea humedecer, agregar no más de 5 ml de alcohol (neutralizado a un pH aparente de 3,5) y mezclar para humedecer bien la muestra. Agregar 70 ml de agua y mezclar en el Mezclador Magnético durante 1 minuto. Tabletas Masticables-Preparar según se indica en Tabletas No Masticables. Tabletas que Deben Masticarse-Transferir 1 Tableta a un vaso de precipitados de 250 ml, agregar 50 ml de agua y mezclar en el Mezclador Magnético durante 1 minuto. Cápsulas-Pesar con exactitud no menos de 20 cápsulas. Extraer completamente el contenido de las cápsulas con la ayuda de un hisopo de algodón si fuera necesario. Pesar con exactitud las cápsulas vacías y determinar el peso promedio del contenido de cada cápsula. Mezclar el contenido combinado de las cápsulas para obtener una mezcla uniforme y proceder según se indica en Tabletas No Masticables, comenzando donde dice "transferir una cantidad pesada con exactitud". Procedimiento para Polvos, Sólidos Efervescentes, Suspensiones y Otros Líquidos, Tabletas de Disolución Bucal, Tabletas No Masticables, Tabletas Masticables y Cápsulas-Pipetear 30,0 ml de ácido clorhídrico 1,0 N SV y transferir a la Preparación de Prueba mientras se continúa mezclando con el Mezclador Magnético. [NOTA-Cuando la capacidad neutralizante de ácido de la muestra en análisis es mayor de 25 mEq, usar 60,0 ml de ácido clorhídrico 1,0 N SV, y hacer las modificaciones correspondientes en los cálculos.] Mezclar durante 15 minutos, cronometrados exactamente, después de agregar el ácido, comenzar a valorar de inmediato y en un período que no exceda los 5 minutos adicionales, valorar el ácido clorhídrico en exceso con hidróxido de sodio 0,5 N SV para obtener un pH de 3,5 estable (durante 1 O a 15 segundos). Calcular el número de mEq de ácido consumido por la fórmula: mEq totales= (30 x NHc
1)
-
(VNaoH x NNaoH)
en donde NHci y NNaoH son las normalidades del ácido clorhídrico SV y del hidróxido de sodio SV, respectivamente; y VNaoH es el volumen de hidróxido de sodio SV usado para la valoración. Expresar el resultado como mEq del ácido consumido por g de la sustancia analizada. Procedimiento para Tabletas que Deben Masticarse-Pipetear 30,0 ml de ácido clorhídrico 1,0 N SV y transferir a la Preparación de Prueba mientras se continúa mezclando con el Mezclador Magnético durante 1 O minutos, cronometrados con exactitud, después de agregar el ácido. Interrumpir el mezclado brevemente y retirar sin demora cualquier base gomosa del vaso de precipitados usando una aguja larga. Enjuagar sin demora la aguja con 20 ml de agua, recogiendo los lavados en el vaso de precipitados y continuar mezclando durante 5 minutos exactamente cronometrados, después comenzar a valorar de inmediato y en un período que no exceda los 5 minutos adicionales, valorar el ácido clorhídrico en exceso con hidróxido de
USP 39
Pruebas Químicas / (311) Valoración de Alginatos 311
sodio 0,5 N SV para obtener un pH de 3,5 estable (durante 1O a 15 segundos). Calcular el número de mEq de ácido consumido por la Tableta analizada por la fórmula: mEq totales= (30 x NHc1) - CVNaOH x NNaoH) en donde los términos son los definidos anteriormente.
(311) VALORACIÓN DE ALGINATOS APARATO El aparato necesario (ver Figura 7) contiene una válvula dosificadora capilar, A, seguida de un caudalímetro, B, para controlar y vigilar el flujo de nitrógeno a través del sistema. Se emplean tubos de plástico vinílico halogenado* y una conexión de caucho, C, para conectar el caudalímetro a un brazo lateral de un matraz de reacción, D. El matraz Des un matraz de fondo redondo, de 250 ml, para ebullición, apoyado en un manto de calefacción adecuado, E. El matraz D está equipado con un condensador de reflujo de bobina Hopkins de 225 mm, F. El condensador termina en una trampa en U, G, que contiene dos bandas de 25 g de cinc de malla 20; estas bandas están limitadas y separadas por tres tapones de lana de vidrio de 3 pulgadas. La trampa termina en un adaptador, H, que por medio de un tubo de plástico vinílico halogenado y un conector con llave de paso por torsión, 1, se conecta con un frasco lavador de gas de 250 ml, J. El tubo de entrada (burbujeo) se extiende casi hasta el fondo del frasco de lavado de gas y termina en un disco sinterizado con una porosidad gruesa. El tamaño de todas las juntas de vidrio es de 24 / 40 , excepto la junta de 45 / 50 del frasco de lavado de gas. G
D
Figura 1 . Aparato para Valoración de Alginatos.
APTITUD DEL SISTEMA Empleando D-glucuronolactona como el estándar, proceder como se indica en el Procedimiento, pero no realizar los pasos previos a la ebullición. El sistema es adecuado si se cumplen los siguientes criterios: (1) la determinación con un blanco da como resultado un valor neto de volumetría, C, de entre 0,02 y 0,06 mEq, calculado de la siguiente manera: Ab - Bb en donde Abes el número de mEq de hidróxido de sodio 0,25 N en los 25 ml utilizados y Bb es el número de mEq de ácido clorhídrico O, 1 N utilizado en la volumetría con un blanco; y (2) el porcentaje de dióxido de carbono, C0 2, obtenido a partir del estándar está entre 24,2% y 25,7%.
*Este tipo de tubos se denominan comúnmente tubos Tygon. Esta nota se agrega a los efectos de una mayor claridad y no implica que la USP avale este producto.
312 (311) Valoración de Alginatos / Pruebas Químicas
USP 39
PROCEDIMIENTO A menos que se indique algo diferente en la monografía individual, transferir una muestra de aproximadamente 250 mg, pesados con exactitud, al matraz de reacción, D, agregar 50 mL de ácido clorhídrico O, 1 N, agregar varias perlas de ebullición y conectar el matraz al condensador de reflujo, F, empleando ácido fosfórico como lubricante. [NOTA-Se puede emplear grasa para llaves de paso para las otras conexiones.] Conectar la línea de nitrógeno al brazo lateral del matraz y ajustar el flujo de agua refrigerante aproximadamente a 2 L por minuto. [NOTA-Los pasos previos a la ebullición que se describen en este párrafo son opcionales y únicamente es necesario realizarlos cuando se sospecha de la presencia de carbonatos inorgánicos.] Mantener el flujo de nitrógeno a través del aparato a una velocidad de 90 mL a 100 mL por minuto. Acercar el manto de calefacción, E, hasta el matraz, calentar la muestra y llevarla a ebullición, y mantener una ebullición moderada durante 2 minutos. Apagar la fuente de calor, bajar el manto, E, y dejar que la muestra se enfríe durante aproximadamente 1O minutos. Conectar el frasco lavador de gas vacío, J, y purgar el sistema con nitrógeno a una velocidad de 90 mL a 100 mL por minuto durante 5 minutos. Reducir el flujo de nitrógeno hasta 60 mL a 65 mL por minuto, agregar al frasco 1Ogotas de alcohol butílico, 25,0 mL de hidróxido de sodio 0,25 N SV y 50 mL de agua destilada, enjuagando hacia el interior del frasco lavador de gas y volver a colocar la tapa. Desconectar la conexión de caucho, C, del brazo lateral y agregar 46 mL de ácido clorhídrico a través del brazo lateral del matraz de ebullición. Volver a unir la línea de nitrógeno, acercar el manto de calefacción y calentar la mezcla de reacción hasta ebullición. Después de 2 horas de ebullición, aumentar el flujo de nitrógeno hasta 90 mL a 100 mL por minuto, suspender el calentamiento y bajar el manto. Dejar que se enfríe durante 1O minutos. Desconectar y desmontar el frasco lavador de gas. Empleando un chorro dirigido de agua destilada, enjuagar bien todas las partes del tubo de burbujeo y tapar, recolectando los lavados en el frasco de lavado de gas. Emplear nitrógeno para forzar suavemente la salida de toda el agua del tubo de burbujeo. Agregar al frasco inmediatamente 1 O mL de solución de cloruro de bario al 10% y una barra de agitación. Tapar herméticamente y mezclar lentamente durante 1 minuto. Dejar en reposo durante un mínimo de 5 minutos. Agregar tres gotas de fenolftaleína SR y valorar con ácido clorhídrico O, 1 N SV. Realizar una determinación con un blanco (ver Valoraciones Volumétricas Residuales en Volumetría (541 )). Calcular el porcentaje de dióxido de carbono, C0 2 , por la fórmula:
2200[(A - B) - C]/(l OOOW)(l - D) en donde A es el número de mEq de hidróxido de sodio 0,25 N en los 25 mL empleados; Bes el número de mEq de ácido clorhídrico O, 1 N empleado para la volumetría de la muestra o del estándar; C es el valor neto de volumetría calculado en la determinación con un blanco; W es el peso, en g, de la muestra o del estándar tomado; y D es el porcentaje expresado hasta la décima de unidad (1 lugar decimal), obtenido en la prueba de Pérdida por Secado para la muestra o para el estándar.
(341) AGENTES ANTIMICROBIANOS-CONTENIDO Un componente esencial de las inyecciones conservadas en envases multidosis es el agente o los agentes que se incorporan para reducir el riesgo de que, en el momento de retirar parte del contenido, se produzca una contaminación microbiana accidental del contenido restante. Es un requisito farmacopeico que la presencia y la cantidad agregada de tal( es) agente(s) consten en la etiqueta del envase. Los métodos proporcionados aquí para los agentes más usados deben emplearse para demostrar que el agente declarado está presente pero no excede la cantidad declarada en la etiqueta en más de 20%. La concentración de un conservante antimicrobiano agregado a una preparación para uso oftálmico, nasal, ótico y parenteral, multidosis o monodosis, puede disminuir durante la vida útil del producto. Por ello, el fabricante debe determinar el nivel mínimo en el que el conservante resulta eficaz y debe formular el producto de modo que se garantice que este nivel de efectividad exceda durante toda la vida útil del producto. En el momento de su fabricación, el producto debe contener la cantidad declarada del conservante antimicrobiano (dentro de un ±20% considerando las variaciones originadas en la fabricación y el análisis). La declaración de la cantidad de conservante que se indica en la etiqueta, no pretende definir la cantidad de conservante a mantener durante la vida útil del producto; sino la cantidad que fue agregada, dentro de las limitaciones del proceso, y que no se excedió en más de 20%. Un ejemplo de tal declaración en la etiqueta es "_(unidad) agregado como conservante." [NOTA-" __(unidad)" es un número seguido de la unidad de medida, por ej. 0,015 mg por mL o O, 1%.] Los agentes más usados incluyen los dos derivados mercuriales, nitrato fenilmercúrico y timerosal, los cuatro ésteres homólogos del ácido p-hidroxibenzoico, fenol, alcohol bencílico y clorobutanol. Para los dos primeros mencionados se emplea el método polarográfico, mientras que para la determinación de los otros agentes se emplea la cromatografía de gases cuantitativa.
MÉTODO GENERAL POR CROMATOGRAFÍA DE GASES Los procedimientos generales que se establecen a continuación son aplicables a la determinación cuantitativa de alcohol bencílico, clorobutanol, fenol y los ésteres metílico, etílico, propílico y butílico del ácido p-hidroxibenzoico; estos últimos se tratan como un grupo pero, si están presentes en forma individual, se los puede determinar por separado. Preparar la Solución
Pruebas Químicas/ (341) Agentes Anti microbianos-Contenido 31 3
USP 39
de Estándar Interno y la Preparación Estándar para cada agente según se indica a continuación. A menos que se indique lo contrario, preparar la Preparación de Prueba a partir de porciones medidas con exactitud de la Solución de Estándar Interno y la muestra de la prueba, de tamaño tal que la concentración del agente y la composición del disolvente se correspondan estrechamente con la concentración y la composición de la Preparación Estándar. En la siguiente tabla se proporcionan los parámetros operativos recomendados para el cromatógrafo de gases; el gas transportador es helio o nitrógeno y el detector es del tipo de ionización a la llama. p ara' metros
operat1vos Recomend a d os para e IC romatograf o d e Gases
Dimensiones de la Columna Agente
Long.
DI
Relleno de la Columna Fases y Soporte
Velocidad de Flujo, mL pormin.
Temperatura de la Columna 140º
Alcohol Benzílico
1,8 m
3mm
5%G16/S1A
50
Clorobutanol
1,8 m
2mm
5%G16/S1A
20
110º
Fenol
1,2m
3mm
5%G16/S1A
50
145º
Parabenos
1,8m
2mm
5%G2/S1A
20
150º
Alcohol Bencílico Solución de Estándar Interno-Disolver aproximadamente 380 mg de fenol en 1O ml de metanol contenido en un matraz volumétrico de 200 ml. Agregar agua a volumen y mezclar. Preparación Estándar-Disolver aproximadamente 180 mg de ER Alcohol Bencílico USP, pesados con exactitud, en 20,0 ml de metanol contenidos en un matraz volumétrico de 100 ml. Agregar la Solución de Estándar Interno a volumen y mezclar. Procedimiento-Inyectar por separado en el cromatógrafo volúmenes iguales (aproximadamente 5 µL) de la Preparación Estándar y de la Preparación de Prueba, registrar los cromatogramas con el aparato ajustado a los parámetros establecidos en la tabla adjunta y medir las áreas correspondientes a los picos de alcohol bencílico y fenol. Calcular el contenido, en mg por ml, de alcohol bencílico (C 7 H8 0) en la muestra tomada, por la fórmula: 1 OO(C/V)(p 1 /p 2 )(Pi/P 1) en donde C es la concentración, en mg por ml, de alcohol bencílico en la Preparación Estándar; V es el volumen, en ml, de la muestra de la prueba usada para preparar cada 100 ml de la Preparación de Prueba; p, y p 2 son las áreas de los picos del alcohol bencílico y el fenol, respectivamente, obtenidos a partir de la Preparación de Prueba; y P1 y P2 son las áreas de los picos del alcohol bencílico y el fenol, respectivamente, obtenidos a partir de la Preparación Estándar.
Clorobutanol Solución de Estándar Interno-Transferir aproximadamente 140 mg de benzaldehído a un matraz volumétrico de 100 ml, agregar 1O ml de metanol y agitar por rotación moderada para disolver. Diluir a volumen con agua y mezclar. Preparación Estándar-Transferir aproximadamente 125 mg de ER Clorobutanol USP, pesados con exactitud, a un matraz volumétrico de 25 ml. Agregar 2 ml de metanol, agitar por rotación moderada para disolver, diluir a volumen con agua y mezclar. Transferir 5,0 ml de esta solución y 5,0 ml de la Solución de Estándar Interno a un matraz de 25 ml y mezclar para obtener una solución con una concentración conocida de aproximadamente 2,5 mg de clorobutanol por ml. Preparación de Prueba-Diluir cuantitativamente, si fuera necesario, un volumen medido con exactitud de la muestra de la prueba con metanol para obtener una solución que no contenga más de aproximadamente 5,0 mg de clorobutanol por ml. Combinar 3,0 ml de esta solución con 3,0 ml de la Solución de Estándar Interno y mezclar. Sistema Cromatográfico (ver Cromatografía (621 ))-[NOTA-Ver la tabla adjunta para determinar las dimensiones de la columna, el relleno de la columna con su fase y soporte, la velocidad de flujo y la temperatura de la columna.] Mantener la temperatura del inyector a 180º y la del detector, a 220º. Inyectar en el cromatógrafo la Preparación Estándar y registrar el cromatograma según se indica en el Procedimiento: los tiempos de retención relativos son aproximadamente 0,8 para el benzaldehído y 1,0 para el clorobutanol; la resolución, R, entre el benzaldehído y el clorobutanol no es menor de 2,0; y la desviación estándar relativa para inyecciones repetidas no es más de 2,0%. Procedimiento-Inyectar por separado en el cromatógrafo volúmenes iguales (aproximadamente 1 µL) de la Preparación Estándar y de la Preparación de Prueba, registrar los cromatogramas y medir las áreas correspondientes a los picos principales. Calcular la cantidad, en mg, de clorobutanol (C4 H7 CIP) en cada ml de la muestra sometida a la prueba, por la fórmula: C(L/D)(Ru/R5)
I
en donde C es la concentración, en mg por ml, de clorobutanol, calculada con respecto a la sustancia anhidra, en la Preparación Estándar; L es la cantidad declarada, en mg, de clorobutanol en cada ml de la muestra de prueba; D es la concentración, en mg por ml, de clorobutanol en la Preparación de Prueba, respecto al volumen de la muestra sometida a la prueba y el grado de dilución; y Ru y R5 son los cocientes entre el pico de clorobutanol y el pico de benzaldehído obtenidos a partir de la Preparación de Prueba y de la Preparación Estándar, respectivamente.
314 (341) Agentes Antimicrobianos-Contenido / Pruebas Químicas
USP 39
Fenol Solución de Estándar Interno-Pipetear 1 ml de ER Alcohol Bencílico USP y transferir a un matraz volumétrico de 500 ml, agregar metanol a volumen y mezclar. Preparación Estándar-Disolver aproximadamente 75 mg de ER Fenal USP, pesados con exactitud, en 7,5 ml de metanol contenidos en un matraz volumétrico de 100 ml. Agregar 20,0 ml de Solución de Estándar Interno, luego agregar agua a volumen y mezclar. Procedimiento-Inyectar por separado en el cromatógrafo volúmenes iguales (aproximadamente 3 µL) de la Preparación Estándar y la Preparación de Prueba, registrar los cromatogramas con el aparato ajustado a los parámetros establecidos en la tabla adjunta y medir las áreas correspondientes a los picos de fenal y alcohol bencílico. Calcular el contenido, en mg por ml, de fenal (C 6 H6 0) en cada ml de la muestra tomada, por la fórmula: 1 OO(C/V)(p 1/p 2 )(P 2/P 1)
en donde C es la concentración, en mg por ml, de fenal en la Preparación Estándar; V es el volumen, en ml, de la muestra de la prueba usada para preparar 100 ml de la Preparación de Prueba; p1 y p 2 son las áreas de los picos de fenal y alcohol bencílico, respectivamente, obtenidos a partir de la Preparación de Prueba; y P1 y P2 son las áreas de los picos de fenal y alcohol bencílico, respectivamente, obtenidos a partir de la Preparación Estándar.
Metilparabeno y Propilparabeno Solución de Estándar Interno-Colocar aproximadamente 200 mg de benzofenona en un matraz volumétrico de 250 ml, diluir a volumen con éter y mezclar. Preparación Estándar-Colocar 100 mg de ER Metilparabeno USP y 1O mg de ER Propilparabeno USP, pesados con exactitud, en un matraz volumétrico de 200 ml, diluir a volumen con Solución de Estándar Interno y mezclar. Colocar 1O ml de esta solución en un matraz Erlenmeyer de 25 ml y proceder según se indica en la Preparación de Prueba, comenzando desde donde dice "Agregar 3 ml de piridina". Preparación de Prueba-Pipetear 1 O ml de la muestra sometida a la prueba y 1 O ml de la Solución de Estándar Interno en un separador pequeño. Agitar vigorosamente, permitir que las capas se separen, retirar la capa acuosa y ponerla en un segundo separador y transferir la capa de éter a un matraz pequeño a través de un embudo que contenga sulfato de sodio anhidro. Extraer la capa acuosa con dos porciones de éter de 1O ml y filtrar también los extractos a través del sulfato de sodio anhidro. Evaporar los extractos combinados en una corriente de aire seco hasta que el volumen se reduzca aproximadamente a 1 O ml y luego transferir el residuo a un matraz Erlenmeyer de 25 ml. Agregar 3 ml de piridina, completar la evaporación del éter y hervir en una placa de calentamiento hasta que el volumen se reduzca aproximadamente a 1 ml. Enfriar y agregar 1 ml de un agente silanizante adecuado, como por ejemplo bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida, bis(trimetilsilil)acetamida o una mezcla de hexametildisilazano y trimetilclorosilano [2:1 ó 3:1 (v/v)]. Mezclar y dejar en reposo durante no menos de 15 minutos. Procedimiento-Inyectar por separado en el cromatógrafo volúmenes iguales (2 µL) de la solución silanizada de la Preparación Estándar y la Preparación de Prueba, registrar los cromatogramas con el aparato ajustado a los parámetros establecidos en la tabla adjunta y medir las áreas correspondientes a los picos de metilparabeno, propilparabeno y benzofenona. Calcular el contenido, en µg por ml, de metilparabeno (C 8 H8 0 3) en la muestra sometida a la prueba, por la fórmula: 1O(CM/V)(pifp3)(P3/P1)
en donde CM es la concentración, en µg por ml, de metilparabeno en la Preparación Estándar; V es el volumen, en ml, de la muestra tomada; p 1 y p 3 son las áreas de los picos del metilparabeno y la benzofenona, respectivamente, obtenidos a partir de la Preparación de Prueba; y P1 y P3 son las áreas de los picos del metilparabeno y la benzofenona, respectivamente, obtenidos a partir de la Preparación Estándar. De modo similar, calcular el contenido, en µg por ml, de propilparabeno (C 10 H1i0 3) en la muestra sometida a la prueba, por la fórmula:
en donde Cp es la concentración, en µg por ml, de propilparabeno en la Preparación Estándar; V es el volumen, en ml, de la muestra tomada; p 2 y p 3 son las áreas de los picos del propilparabeno y la benzofenona, respectivamente, obtenidos a partir de la Preparación de Prueba; y P2 y P3 son las áreas de los picos del propilparabeno y la benzofenona, respectivamente, obtenidos a partir de la Preparación Estándar. El etilparabeno y el butilparabeno pueden determinarse de modo similar.
MÉTODO POLAROGRÁFICO Nitrato Fenilmercúrico Preparación Estándar-Disolver aproximadamente 100 mg de nitrato fenilmercúrico, pesados con exactitud, en una solución de hidróxido de sodio (1 en 250) contenida en un matraz volumétrico de 1000 ml y entibiar si fuera necesario para lo-
USP 39
Pruebas Químicas / (345) Valoración de Ácido Cítrico/Citrato y Fosfato 315
grar una completa disolución, agregar la solución de hidróxido de sodio a volumen y mezclar. Pipetear 1O ml de esta solución, transferir a un matraz volumétrico de 25 ml y proceder según se indica en la Preparación de Prueba, comenzando desde donde dice "agregar 2 ml de solución de nitrato de potasio (1 en 100)." Preparación de Prueba-Pipetear 1O ml de la muestra de la prueba, transferir a un matraz volumétrico de 25 ml, agregar 2 ml de solución de nitrato de potasio (1 en 100) y 1O ml de solución amortiguadora alcalina de borato de pH 9,2 (ver Soluciones Amortiguadoras en la sección Reactivos, Indicadores y Soluciones) y, si fuera necesario, ajustar a un pH de 9,2 agregando ácido nítrico 2 N. Agregar 1,5 ml de solución de gelatina recién preparada (1 en 1000), luego agregar la solución amortiguadora alcalina de borato de pH 9,2 a volumen y mezclar. Procedimiento-Pipetear una porción de la Preparación de Prueba y transferir a la celda polarográfica y desairear burbujeando nitrógeno a través de la solución durante 15 minutos. Insertar el electrodo de goteo de mercurio de un polarógrafo adecuado (ver Po/orografía (801 )) y registrar el polarograma desde -0,6 hasta -1,5 voltios en comparación con el electrodo de calomel saturado. Determinar la corriente de difusión de la Preparación de Prueba, (id)u, como la diferencia entre la corriente residual y la corriente limitante. De forma similar y concomitante, determinar la corriente de difusión, (id) 5, de la Preparación Estándar. Calcular la cantidad, en µg, de nitrato fenilmercúrico {C 6 H5 HgN0 3) en cada ml de la muestra tomada, por la fórmula:
en donde C es la concentración, en µg por ml, de nitrato fenilmercúrico en la Preparación Estándar.
Timerosal Preparación Estándar-En el día de uso, colocar aproximadamente 25 mg de ER Timerosal USP, pesados con exactitud, en un matraz volumétrico de 250 ml, agregar agua a volumen y mezclar. Proteger de la luz. Pipetear 15 ml de esta solución en un matraz volumétrico de 25 ml, agregar 1,5 ml de solución de gelatina (1 en 1000), luego agregar solución de nitrato de potasio 1 en 100 a volumen y mezclar. Preparación de Prueba-Pipetear 15 ml de la muestra en análisis, transferir a un matraz volumétrico de 25 ml, agregar 1,5 ml de solución de gelatina (1 en 1000), agregar solución de nitrato de potasio (1 en 100) a volumen y mezclar. Procedimiento-Transferir una porción de la Preparación de Prueba a la celda polarográfica y desairear burbujeando nitrógeno a través de la solución durante 15 minutos. Insertar el electrodo de goteo de mercurio de un polarógrafo adecuado (ver Po/orografía (801 )) y registrar el polarograma de -0,2 a -1,4 voltios en comparación con el electrodo de calomel saturado. Determinar la corriente de difusión, (id)w como la diferencia entre la corriente residual y la corriente limitante. De forma similar y concomitante, determinar la corriente de difusión, (id) 5, de la Preparación Estándar. Calcular la cantidad, en µg, de timerosal (C 6 H9 HgNa02 S) en cada ml de la muestra sometida a la prueba, por la fórmula: l ,667C[(id)u/{id)s] en donde C es la concentración, en µg por ml, de timerosal en la Preparación Estándar y los otros términos son los definidos anteriormente.
(345) VALORACIÓN DE ÁCIDO CÍTRICO/CITRATO Y FOSFATO INTRODUCCIÓN El siguiente procedimiento general de cromatografía iónica se emplea para determinar el contenido de ácido cítrico/citrato y fosfato en los artículos farmacopeicos, cuando se especifica en las monografías individuales. Con respecto a la teoría y los principios de las mediciones usando cromatografía iónica, ver Cromatografía fónica (1065).
VALORACIÓN • PROCEDIMIENTO
Fase móvil: Hidróxido de sodio o hidróxido de potasio 20 mM, a partir de un volumen apropiado de una solución de hidróxido de sodio o hidróxido de potasio, exentos de carbonato, de concentración conocida y agua (de una resistividad de no menos de 18 Mohmios-cm). Como alternativa, la Fase móvil se puede generar mediante electrolisis usando un generador automático de eluyente. Proteger la Fase móvil del dióxido de carbono atmosférico. Solución estándar 1 (sólo para la valoración de ácido cítrico/citrato): 20 µg/ml de citrato {C 6 H5 0 7) en hidróxido de sodio 1 mM recientemente preparado, a partir de ER Ácido Cítrico USP Solución estándar 2 (para la valoración concomitante de citrato y fosfato): 20 µg/ml de citrato {C 6 H5 0 7) y 12 µg/ml de fosfato (P04 ) en hidróxido de sodio 1 mM recientemente preparado, a partir de ER Ácido Cítrico USP y fosfato monobásico de sodio Solución muestra (para la valoración de ácido cítrico/citrato): Nominalmente 20 µg/ml de citrato en hidróxido de sodio 1 mM recientemente preparado, a menos que se indique algo diferente en la monografía.
316 (345) Valoración de Ácido Cítrico/Citrato y Fosfato / Pruebas Químicas
USP 39
Solución muestra (para la valoración de fosfato): Nominalmente 12 µg/ml de fosfato en hidróxido de sodio 1 mM recientemente preparado, a menos que se indique algo diferente en la monografía. Sistema cromatográfico 0fer Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.) Modo: HPLC Detector: De conductividad con supresión Columnas Guarda columna: 4 mm x 5 cm; relleno L61 de 13 µm Columna analítica: 4 mm x 25 cm; relleno L61 de 13 µm Temperaturas Columna: 30º Detector: 35º Supresor: Membrana autosupresora de aniones de 4 mm o un sistema de supresión química adecuado Velocidad de flujo: 2 ml/min Volumen de inyección: 1O µL Aptitud del sistema Muestras: Solución estándar 7 y/o Solución estándar 2, según corresponda. [NOTA-Los tiempos de retención relativos para fosfato y citrato son 0,57 y 1,0, respectivamente.] Requisitos de aptitud Factor de asimetría: No más de 2,0 para los picos de citrato y/o fosfato, según corresponda. Desviación estándar relativa: No más de 1,5% para los picos de citrato y/o fosfato, en seis inyecciones repetidas, según corresponda. Análisis Muestras: Solución estándar 7 y/o Solución estándar 2, y Solución muestra A menos que se indique algo diferente en la monografía, calcular la concentración de citrato o fosfato en la porción de Solución muestra tomada: Resultado= (ruf r5) x C5 ru r5
C5
= respuesta del pico de citrato o fosfato de la Solución muestra = respuesta del pico de citrato o fosfato de la Solución estándar 7 o la Solución estándar 2 = concentración de citrato o fosfato en la Solución estándar 7 o la Solución estándar 2 (µg/ml)
(351) VALORACIÓN DE ESTEROi DES El siguiente procedimiento se aplica para determinar los esteroides Farmacopeicos que poseen grupos funcionales reductores tales como a-cetoles. Preparación Estándar-Disolver en alcohol una cantidad adecuada del Estándar de Referencia USP especificado en la monografía individual, previamente secado en las condiciones especificadas en la monografía individual y pesado con exactitud, y diluir cuantitativamente y en diluciones sucesivas con alcohol para obtener una solución con una concentración de aproximadamente 1O µg por ml. Pipetear 20 ml de esta solución y transferir a un matraz Erlenmeyer de 50 ml con tapón de vidrio. Preparación de Valoración-Preparar según se indica en la monografía individual. Procedimiento-A sendos matraces que contienen la Preparación de Valoración y la Preparación Estándar, respectivamente, y a un matraz similar que contenga 20,0 ml de alcohol como blanco, agregar 2,0 ml de una solución preparada por disolución de 50 mg de azul de tetrazolio en 1O ml de metanol y mezclar. Agregar después a cada matraz 2,0 ml de una mezcla de alcohol e hidróxido de tetrametilamonio SR (9:1 ), mezclar y dejar en reposo en la oscuridad durante 90 minutos. Sin demora, determinar al mismo tiempo las absorbancias de las soluciones de la Preparación de Valoración y la Preparación Estándar aproximadamente a 525 nm, utilizando un espectrofotómetro adecuado, contra el blanco. Calcular el resultado por la fórmula dada en la monografía individual, en donde Ces la concentración, en µg por ml, del Estándar de Referencia en la Preparación Estándar; y Au y A5 son las absorbancias de las soluciones de la Preparación de Valoración y la Preparación Estándar, respectivamente.
USP 39
Pruebas Químicas/ (371) Valoración de Cobalamina con Marcador Radioactivo 31 7
(371) VALORACIÓN DE COBALAMINA CON MARCADOR RADIOACTIVO Todas las determinaciones de radioactividad requeridas por este método deben hacerse con un equipo de conteo apropiado, durante un período de tiempo que sea óptimo de acuerdo con el equipo de conteo específico empleado. Todos los procedimientos deben realizarse varias veces para obtener la mayor exactitud posible. Estándares de Referencia USP (11 )-fR Cianocobalamina USP. Reactivo Marcador de Cianocobalamina-Diluir con agua un volumen medido con exactitud de una solución de cianocobalamina radioactiva* para producir una solución que tenga una radioactividad entre 500 y 5000 conteos por minuto por ml. Agregar 1 gota de cresol por litro de solución preparada y almacenar en un refrigerador. Estandarización-Preparar en agua una solución de una cantidad de ER Cianocobalamina USP, pesada con exactitud, que contenga 20 µg a 50 µg por ml. Realizar la valoración entera de una porción de 10,0 mL de esta solución, procediendo según se indica en la Preparación de Valoración, comenzando donde dice "Agregar agua para obtener un volumen medido". Solución de Cresol-Tetracloruro de Carbono-Mezclar volúmenes iguales de tetracloruro de carbono y cresol recientemente destilado. Solución de Fosfato-Cianuro-Disolver 100 mg de cianuro de potasio en 1000 mL de una solución saturada de fosfato dibásico de sodio y mezclar. Solución de Butanol-Cloruro de Benzalconio-Diluir una solución de cloruro de benzalconio (17 en 100) con agua (3:1) y mezclar con 36 volúmenes de alcohol butílico. Columna de Alúmina-Resina-Colocar un trozo de lana de vidrio en el fondo de un tubo de vidrio que posea una constricción en uno de sus extremos, como por ejemplo una bu reta de 50 ml. Sosteniendo el tubo en posición vertical, agregar un volumen de una suspensión acuosa espesa de resina de intercambio iónico (ver en la sección Reactivos, Indicadores y Soluciones), suficiente para obtener una columna de resina sedimentada de 7 cm de alto. Cuando el sólido se haya sedimentado parcialmente, dejar que el agua drene, de manera que quede sólo 1 cm de líquido encima de la columna de resina y comprimir la resina suavemente. Luego agregar una suspensión acuosa espesa de alúmina anhidra (que no esté lavada con ácido) suficiente para aumentar la altura de la columna sedimentada a 1O cm; dejar que drene el agua hasta que quede aproximadamente a 1 cm por encima de la alúmina. Agregar un trozo de lana de vidrio y lavar la columna, empleando un total de 50 mL de agua y drenar nuevamente hasta un nivel de 1 cm por encima de la columna. Preparar una columna nueva para cada determinación. Preparación de Valoración-Transferir a un vaso de precipitados una cantidad pesada o un volumen medido de la preparación a valorar, con una actividad de vitamina B12 equivalente a la de 200 µg a 500 µg de cianocobalamina. Agregar agua para obtener un volumen medido de no menos de 25 mL; luego agregar 5,0 mL de Reactivo Marcador de Cianocobalamina. Trabajando bajo una campana, agregar 5 mg de nitrito de sodio y 2 mg de cianuro de potasio por cada mL de la solución resultante. Ajustar la solución con ácido clorhídrico diluido hasta pH 4 aproximadamente y calentar en baño de vapor durante 15 minutos. Enfriar y ajustar la solución con hidróxido de sodio 1 N hasta un pH entre 7,6 y 8,0. Centrifugar o filtrar para eliminar cualquier sólido no disuelto. Procedimiento-Transferir la Preparación de Valoración a un frasco de centrífuga de 250 mL, agregar 1O mL de Solución de Cresol-Tetracloruro de Carbono, cerrar adecuadamente el frasco con un tapón de vidrio, de polietileno o de goma envuelto en papel de aluminio, agitar vigorosamente durante 2 a 5 minutos y centrifugar. Retirar y guardar la capa de disolvente inferior. Repetir la extracción empleando una porción de 5 mL de Solución de Cresol-Tetracloruro de Carbono y combinar los extractos de las capas de disolvente inferiores en un frasco de centrífuga o separador de 50 mL a 100 mL de capacidad. Lavar los extractos combinados con porciones sucesivas de 1O mL de ácido sulfúrico 5 N hasta que el último lavado sea prácticamente incoloro (dos lavados bastan generalmente). Durante cada lavado, agitar durante 2 a 5 minutos, dejar que las capas se separen, centrifugar si fuera necesario y descartar la capa ácida. Lavar luego con dos porciones sucesivas de 1O mL de Solución de Fosfato-Cianuro. Finalmente, lavar con 1O mL de agua. Descartar todos los lavados. Al extracto lavado agregarle 30 mL de una mezcla de Solución de Butanol-Cloruro de Benzalconio y tetracloruro de carbono (2:1). Extraer con dos porciones de agua de 5 mL cada una, agitando vigorosamente cada vez durante 1 minuto, centrifugar, retirar y guardar la capa superior acuosa. Pasar los extractos acuosos combinados a través de la Columna de Alúmina-Resina a una velocidad de aproximadamente 1 mL por minuto, mantener una capa de 1 cm de líquido sobre la parte superior de la columna, agregando agua según sea necesario. Descartar los primeros mL incoloros (generalmente alrededor de 5 mL) y recoger el eluato coloreado (generalmente alrededor de 1O mL) en un tubo de centrífuga o separador de 50 mL que contenga 500 µL de ácido acético diluido. Extraer el eluato agitando durante 2 a 5 minutos con 5 mL de Solución de Cresol-Tetracloruro de Carbono y desechar la capa acuosa superior. Agregar al extracto 5,0 mL de agua, 5 mL de tetracloruro de carbono y 1O mL de alcohol butílico. Agitar, dejar que se separe hasta que la capa superior esté transparente y retirar la capa superior acuosa. Determinar las absorbancias del extracto acuoso en una celda de 1 cm, a 361 nm y 550 nm, con un espectrofotómetro apropiado, empleando una fuente de iluminación de tungsteno. Hacer la lectura a 361 nm empleando un filtro capaz de reducir la luz dispersada. Calcular el cociente A361 /A550 : la pureza del extracto acuoso es aceptable si el cociente es entre 3, l O y * Una solución de cianocobalamina, transformada en radioactiva mediante la incorporación de 6ºCo, está disponible de Merck and Co., lnc., Rahway, NJ 07065.
318 (371) Valoración de Cobalamina con Marcador Radioactivo/ Pruebas Químicas
USP 39
3,40. Si se observa un cociente fuera de este intervalo, purificar el extracto acuoso repitiendo el ciclo de extracción, procediendo según se indica en el párrafo anterior. Si se observa un cociente de absorbancia aceptable en el extracto acuoso, determinar la radioactividad, en conteos por minuto, empleando un equipo de conteo apropiado durante un período de tiempo óptimo de acuerdo al equipo de conteo específico empleado. Promediar los resultados y corregir el promedio por la radioactividad de fondo observada durante dos o más períodos de 30 minutos. Cálculos-Calcular el contenido de cobalamina, expresado en µg de cianocobalamina, de la porción tomada para la valoración, por la fórmula:
en donde Res la cantidad, en µg, de cianocobalamina en la porción de la solución estándar tomada; C5 y Cu son los valores de radioactividad promedio corregidos, expresados en conteos por minuto por mL, de la solución estándar y de la solución de valoración, respectivamente; y Au y A5 son las absorbancias, determinadas a 361 nm, de la solución de valoración y de la solución estándar, respectivamente.
(381) TAPONES ELASTOMÉRICOS PARA INYECTABLES Cambio en la redacción:
INTRODUCCIÓN Los tapones elastoméricos para los envases usados en los tipos de preparaciones definidas en el capítulo de pruebas generales •Medicamentos Inyectables y en Implantes \1)• (AF
USP 39
Pruebas Químicas/ (381) Tapones Elastoméricos para Inyectables 319
de Tipo 11. Todos los tapones elastoméricos adecuados para usar en preparaciones inyectables deben cumplir con los límites de prueba para Tipo 1o Tipo 11. Sin embargo, no se pretende que esta especificación sirva como único criterio de evaluación para la selección de dichos tapones. El uso de este capítulo resulta apropiado al identificar tapones elastoméricos que pueden ser aceptables para usar en preparaciones inyectables basándose en su reactividad biológica, las propiedades fisicoquímicas de su extracto acuoso y su funcionalidad. Los siguientes requisitos para la evaluación de los tapones están fuera del alcance de este capítulo: - El establecimiento de pruebas y especificaciones para la identificación de tapones - La verificación de la compatibilidad fisicoquímica entre el tapón y el producto - La identificación y determinación de seguridad de los lixiviados de los tapones que se encuentran en el producto envasado - La verificación de la funcionalidad del tapón del producto envasado bajo condiciones reales de almacenamiento y uso El fabricante del producto inyectable (el usuario final) debe obtener del proveedor del tapón la garantía de que la composición del tapón no varía y que es igual a la del tapón usado durante las pruebas de compatibilidad. Cuando el proveedor informa al usuario final de cambios en la composición, se deben repetir las pruebas de compatibilidad, total o parcialmente, dependiendo de la naturaleza de los cambios. Los tapones deben almacenarse apropiadamente, limpiarse para remover los contaminantes ambientales y las endotoxinas, y para procesos asépticos, esterilizarse antes de usar en el envasado de productos inyectables.
CARACTERÍSTICAS Los tapones elastoméricos son translúcidos u opacos y no tienen un color característico; éste depende de los aditivos usados. Son homogéneos y prácticamente libres de rebabas y materiales adventicios (p.ej., fibras, partículas extrañas y residuos de goma).
IDENTIFICACIÓN Los tapones se hacen de una gran variedad de materiales elastoméricos y recubrimientos poliméricos opcionales. Por esta razón, está más allá del propósito de este capítulo especificar pruebas de identificación que abarquen todas las posibles presentaciones de los tapones. Sin embargo, es responsabilidad del proveedor del tapón y del fabricante del producto inyectable (el usuario final) verificar la formulación elastomérica del tapón y cualquier recubrimiento o material laminado usado, de acuerdo con las pruebas de identificación apropiadas. Ejemplos de algunas de las metodologías analíticas de prueba que se pueden usar incluyen peso específico, análisis del porcentaje de cenizas, determinación del contenido de azufre, prueba FTIR-ATR, cromatografía en capa delgada de un extracto, espectrofotometría de absorción UV de un extracto o espectrofotometría de absorción IR de un pirolisado.
PROCEDIMIENTOS DE PRUEBA Los tapones elastoméricos deben ajustarse a los requisitos biológicos, fisicoquímicos y de funcionalidad, tanto cuando son enviados por el proveedor de tapones al fabricante del producto inyectable (el usuario final) como cuando el usuario final los pone en su estado definitivo, listos para usar. Para aquellos tapones elastoméricos procesados por el proveedor antes de la distribución al usuario final, el proveedor deberá demostrar el cumplimiento con los requisitos farmacopeicos de los tapones expuestos a dichos pasos de procesamiento y/o esterilización. De igual manera, si los tapones elastoméricos recibidos por el usuario final son posteriormente procesados o esterilizados, el usuario final es responsable de demostrar que los tapones siguen cumpliendo con los requisitos farmacopeicos después de dichas condiciones de procesamiento y/o esterilización (es decir, en su estado listo para usar). Esto es especialmente importante si los tapones se deben exponer a procesos o condiciones que podrían impactar significativamente las características biológicas, fisicoquímicas o de funcionalidad del tapón (p.ej., radiación gamma). Para tapones que normalmente se lubrican con silicona antes de usar, está permitido efectuar las pruebas fisicoquímicas en los tapones no lubricados con el fin de evitar una posible interferencia del método y/o dificultades en la interpretación de los resultados de la prueba. Para tapones suministrados con otros recubrimientos lubricantes sin función de barrera, todas las pruebas se deben efectuar usando el tapón recubierto. Para tapones recubiertos o laminados con recubrimientos destinados a proveer una barrera (p.ej., recubrimientos de PTFE o laca), las pruebas farmacopeicas fisicoquímicas se aplican al elastómero base no recubierto, así como al tapón recubierto. En este caso, los proveedores son responsables de demostrar el cumplimiento con los requisitos fisicoquímicos farmacopeicos tanto del tapón recubierto como del no recubierto, procesado o tratado de forma tal que se simulen las condiciones usadas para los tapones recubiertos antes del envío al usuario final. El tapón no recubierto sujeto a las pruebas fisicoquímicas debería ser similar en tamaño y configuración al tapón recubierto correspondiente. Los usuarios finales de los tapones recubiertos son responsables también de demostrar el continuo cumplimiento con los requisitos fisicoquímicos farmacopeicos del tapón recubierto, procesado o tratado en una forma que simule las condiciones típicas empleadas por el usuario final previo al uso.
USP 39
320 (381) Tapones Elastoméricos para Inyectables/ Pruebas Químicas
En todos los casos, al informar los resultados de las pruebas es apropiado documentar todas las condiciones del procesamiento, pretratamiento, esterilización o lubricación de los tapones. La Tabla 1 resume los requisitos de prueba de los tapones y las responsabilidades del proveedor y del usuario final. Tabla 1 Tipos de Tapones (Tal como se Suministran o Utlllzan) Tapón con o sin Recubrimiento de Silicona
Tapones con Recubrimiento Lubricante (Material Sin Función de Barrera; Diferente de Silicona) Tapones con Recubrimiento de Barrera
Requisitos de Prueba Pruebas Flslcoquímlcas • Estas pruebas son obligatorias.
Pruebas Biológicas
Pruebas de Funcionalidad • Estas pruebas son obligatorias.
• Estas pruebas son obligatorias.
• El uso de silicona es opcional.
• El uso de silicona es opcional.
• El uso de silicona es opcional.
• Responsibilidad: proveedor y usuario final.
• Responsibilidad: proveedor y usuario final.
• Responsibilidad: proveedor y usuario final.
• Estas pruebas se deben realizar sobre el tapón recubierto.
• Estas pruebas se deben realizar sobre el tapón recubierto.
• Estas pruebas se deben realizar sobre el tapón recubierto.
• Responsibilidad: proveedor y usuario final.
• Responsibilidad: proveedor y usuario final.
• Estas pruebas se deben realizar sobre los tapones recubiertos.
• Estas pruebas se deben realizar sobre los tapones recubiertos.
• Estas pruebas se deben realizar sobre los tapones recubiertos.
• Responsibilidad: proveedor y usuario final.
• Responsibilidad: proveedor y usuario final.
O:
• Responsibilidad: proveedor y usuario final.
Y: • Estas pruebas se deben realizar sobre los tapones sin recubrimiento (fórmula base). • Responsibilidad: proveedor.
• Estas pruebas se deben realizar sobre los tapones sin recubrimiento (fórmula base) y al material de laminado/recubrimiento (los resultados se informan por separado). • Responsibilidad: proveedor y usuario final.
PRUEBAS BIOLÓGICAS Se establecen dos etapas de pruebas. La primera etapa es la realización de un procedimiento de prueba in vitro según se describe en el capítulo de pruebas generales Pruebas de Reactividad Biológica, In Vitro (87). Los materiales que no cumplen con los requisitos de la prueba in vitro están sujetos a la segunda etapa de pruebas, que es la realización de pruebas in vivo, Prueba de Inyección Sistémica y Prueba lntracutánea, según los procedimientos presentados en el capítulo de pruebas generales Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo (88). Los materiales que cumplen con los requisitos de las pruebas in vitro no necesitan someterse a pruebas in vivo. Los tapones Tipo 1y Tipo 11 deben cumplir con los requisitos de las pruebas de reactividad biológica in vitro o in vivo. [NOTA-Ver también el capítulo de información general Biocompatibilidad de los Materiales Usados en Envases de Medicamentos, Dispositivos Médicos e Implantes (1031 ).]
PRUEBAS FISICOQUÍMICAS Preparación de la Solución S Colocar dentro de un recipiente de vidrio adecuado, tapones enteros, sin cortar, que equivalgan a un área superficial de
100 ± 1O cm 2. Cubrir los tapones con 200 mL de Agua Purificada o Agua para Inyección. Si no es posible conseguir el área superficial de tapón prescrita (100 ± 1O cm2) usando tapones sin cortar, seleccionar el número de tapones que se aproximen mejor a los 100 cm2, y ajustar el volumen de agua usado al equivalente de 2 mL por cada 1 cm 2 de área superficial real de tapón utilizada. Calentar a ebullición durante 5 minutos y enjuagar cinco veces con Agua Purificada o Agua para Inyección. Colocar los tapones lavados en un matraz Erlenmeyer de vidrio Tipo 1con cuello ancho (ver Envases-Vidrio (660)), agregar la misma cantidad de Agua Purificada o Agua para Inyección agregada inicialmente a los tapones, y pesar. Cubrir la boca del matraz con un vaso de precipitados de vidrio Tipo l. Calentar en un autoclave hasta alcanzar una temperatura de 121 ± 2º dentro de 20 a 30 minutos y mantenerla durante 30 minutos. Enfriar a temperatura ambiente durante un periodo de aproximadamente 30 minutos. Agregar Agua Purificada o Agua para Inyección para completar de nuevo la masa original. Agitar e inmediatamente decantar y recoger la solución. [NOTA-Esta solución se debe agitar antes de usarse en cada una de las pruebas.]
Preparación del Blanco Preparar una solución blanco en forma similar, usando 200 mL de Agua Purificada o de Agua para Inyección, pero omitiendo los tapones.
Pruebas Químicas/ (381) Tapones Elastoméricos para Inyectables 321
USP 39
APARIENCIA DE LA SOLUCIÓN (TURBIDEZ/OPALESCENCIA Y COLOR) Determinación de Turbidez (Opalescencia) NOTA-La determinación de turbidez se puede efectuar por comparación visual (Procedimiento A), o instrumentalmente, con un turbidímetro de relación adecuado (Procedimiento B). Para mayor información sobre turbidimetría, ver •Nefelometría, Turbídímetría y Comparación Visual
Suspensión de Referenda B
Suspensión de Referencia e
Suspensión de Referenda D
Estándar de Opalescencia
5,0 ml
10,0 ml
30,0 ml
50,0 ml
Agua
95,0 ml
90,0 ml
70,0 ml
50,0 ml
3 NTU
6 NTU
18 NTU
30 NTU
Unidades de Turbidez Nefelo métrica
Procedimiento A: Comparación Visual-Usar tubos de prueba idénticos, de vidrio neutro, incoloro y transparente con base plana y un diámetro interno de 15 a 25 mm. Llenar un tubo hasta una altura de líquido de 40 mm con Solución S, un tubo hasta la misma altura con agua, y cuatro tubos más hasta la misma altura con Suspensiones de Referencia A, B, Cy O. Comparar las soluciones bajo luz diurna difusa 5 minutos después de la preparación de las Suspensiones de Referencia, observándolas verticalmente contra un fondo negro. Las condiciones de luz deben ser tales que la Suspensión de Referencia A puede distinguirse fácilmente del agua y la Suspensión de Referencia B puede distinguirse fácilmente de la Suspensión de Referencia A. Requisito-La Solución S no es más opalescente que la Suspensión de Referencia B para tapones Tipo 1y no más opalescente que la Suspensión de Referencia C para tapones Tipo 11. La Solución S se considera transparente si su transparencia es igual que la del agua cuando se examina según se describió anteriormente o si su opalescencia no es más pronunciada que la de Suspensión de Referencia A (ver la Tabla 3). Procedimiento B: Comparación Instrumental-Medir la turbidez de las Suspensiones de Referencia en un turbidímetro calibrado adecuado (ver •(855)e (AF oi-may-2016)). Medir el blanco y corregir los resultados por el blanco. Las Suspensiones de Referencia A, B, Cy O representan 3, 6, 18 y 30 Unidades de Turbidez Nefelométrica (NTU, por sus siglas en inglés), respectivamente. Medir la turbidez de la Solución S con el turbidímetro calibrado. Requisito-La turbidez de la Solución S no es mayor que la de la Suspensión de Referencia B (6 NTU FTU) para tapones Tipo 1y no es mayor que la de la Suspensión de Referencia C (18 NTU FTU) para tapones Tipo 11 (ver la Tabla 3). Tabla 3 Método de Comparación Requisitos de Opalescencia
Procedimiento A (Visual)
Procedimiento B (Instrumental)
Tapones Tipo 1
No más opalescente que la Suspensión B
No más de 6 NTU
Tapones Tipo 11
No más opalescente que la Suspensión C
No más de 18 NTU
Determinación de Color Estándar de Color-Preparar una solución diluyendo 3,0 mL de Líquido de Comparación O (ver Color y Acromatismo (631)) con 97,0 mL de ácido clorhídrico diluido. Procedimiento-Usar tubos idénticos de vidrio neutro, incoloro y transparente con base plana y un diámetro interno de 15 a 25 mm. Llenar un tubo hasta una altura de líquido de 40 mm con Solución S y el segundo con Estándar de Color. Comparar los líquidos bajo luz diurna difusa, observándolos verticalmente contra un fondo blanco. Requisito-La Solución S no está más intensamente coloreada que el Estándar de Color.
322 (381) Tapones Elastoméricos para Inyectables/ Pruebas Químicas
USP 39
Acidez o Alcalinidad Solución de Azul de Bromotimol-Disolver 50 mg de azul de bromotimol en una mezcla de 4 mL de hidróxido de sodio 0,02 M y 20 mL de alcohol. Diluir con agua hasta 100 ml. Procedimiento-A 20 mL de Solución S, agregar O, 1 mL de Solución de Azul de Bromotimol. Si la solución es amarilla, valorar con hidróxido de sodio 0,01 N hasta alcanzar un punto final azul. Si la solución es azul, valorar con ácido clorhídrico 0,01 N hasta alcanzar un punto final amarillo. Si la solución es verde, es neutra y no se requiere una valoración. Corrección del Blanco-Probar 20 mL de Blanco de manera similar. Corregir los resultados obtenidos para la Solución S, sustrayendo o agregando el volumen de la solución volumétrica requerida para el Blanco según sea apropiado. (yer Volumetría (541 ).) Requisito-No más de 0,3 mL de hidróxido de sodio 0,01 N producen un color azul, o no más de 0,8 mL de ácido clorhídrico 0,01 N producen un color amarillo o no se requiere una valoración.
Absorbancia Procedimiento-[NOTA-Efectuar esta prueba dentro de las 5 horas de la preparación de la Solución S.] Pasar la Solución S a través de un filtro con tamaño de poro 0,45 µm, desechando los primeros mL de filtrado. Medir la absorbancia del filtrado a una longitud de onda entre 220 y 360 nm en una celda de 1 cm, usando el blanco en una celda pareada en el haz de referencia. Si se requiere diluir el filtrado antes de medir la absorbancia, corregir los resultados de la prueba por la dilución. Requisito-Las absorbancias a estas longitudes de onda no exceden de 0,2 para tapones Tipo 1o 4,0 para tapones Tipo 11.
Sustancias Reductoras Procedimiento-[NoTA-Efectuar esta prueba dentro de las 4 horas de la preparación de la Solución S.] A 20,0 mL de Solución S, agregar 1 mL de ácido sulfúrico diluido y 20,0 mL de permanganato de potasio 0,002 M. Calentar a ebullición durante 3 minutos. Enfriar, agregar 1 g de yoduro de potasio, y valorar de inmediato con tiosulfato de sodio 0,01 M, usando 0,25 mL de solución de almidón SR como indicador. Efectuar una valoración usando 20,0 mL de blanco y anotar la diferencia en volumen de tiosulfato de sodio 0,01 M requerido. Requisito-La diferencia entre los volúmenes de las valoraciones no es mayor de 3,0 mL para tapones Tipo 1 y no es mayor de 7,0 mL para tapones Tipo 11.
Metales Pesados Procedimiento-Proceder según se indica en Método 7 en Metales Pesados (231 ). Preparar la Preparación de Prueba usando 10,0 mL de Solución S. Requisito-La Solución S contiene no más de 2 ppm de metales pesados como plomo.
Cinc Extraíble Solución de Prueba-Preparar una Solución de Prueba diluyendo 10,0 mL de Solución S con ácido clorhídrico O, 1 N hasta 100 ml. Preparar un blanco de prueba de forma similar, usando el Blanco en lugar de la Solución S. Solución Estándar de Cinc-Preparar una solución (1 O ppm de Zn) disolviendo sulfato de cinc en ácido clorhídrico 0, 1 N. Soluciones de Referencia-Preparar no menos de tres Soluciones de Referencia, diluyendo la Solución Estándar de Cinc con ácido clorhídrico O, 1 N. Las concentraciones de cinc en estas Soluciones de Referencia deben abarcar el límite esperado para la Solución de Prueba. Procedimiento-Usar un espectrofotómetro de absorción atómica apropiado (ver llllllllllllt~fallllBIMllliil•B equipado con una lámpara de cinc de cátodo hueco y una llama de aire-acetileno. Se puede usar un procedital como un análisis de plasma inductivamente acoplado (ICP, por sus siglas en inglés) apropiadamente validado. Probar cada una de las Soluciones de Referencia en la línea de emisión de cinc a 213,9 nm por lo menos tres veces. Registrar las lecturas estables. Enjuagar el aparato con la solución del blanco de prueba cada vez, para garantizar que la lectura retorna al valor inicial del blanco. Preparar una curva de calibración a partir de la media de las lecturas obtenidas para cada Solución de Referencia. Registrar la absorbancia de la Solución de Prueba. Determinar la concentración de cinc en ppm de la Solución de Prueba usando la curva de calibración. Requisito-La Solución S contiene no más de 5 ppm de cinc extraíble.
llllflllllf)
USP 39
Pruebas Químicas/ (381) Tapones Elastoméricos para Inyectables 323 Amonio
Solución de Tetrayodomercuriato de Potasio Alcalina-Preparar una solución de 100 mL que contenga 11 g de yoduro de potasio y 15 g de yoduro mercúrico en agua. Inmediatamente antes de usar, mezclar 1 volumen de esta solución con un volumen igual de una solución de hidróxido de sodio de 250 g por L. Solución de Prueba-Diluir 5 ml de Solución S con agua hasta 14 ml. Alcalinizarla, si fuera necesario, agregando hidróxido de sodio 1 N y diluir hasta 15 ml con agua. Agregar 0,3 mL de Solución de Tetrayodomercuriato de Potasio Alcalina y cerrar el recipiente. Solución Estándar de Amonio-Preparar una solución de cloruro de amonio en agua (1 ppm NH 4 ). Mezclar 1 O ml de la solución de cloruro de amonio de 1 ppm con 5 ml de agua y 0,3 ml de Solución de Tetrayodomercuriato de Potasio Alcalina. Cerrar el recipiente. Requisito-Después de 5 minutos, cualquier color amarillo en la Solución de Prueba no es más oscuro que el de la Solución Estándar de Amonio (no más de 2 ppm de NH 4 en la Solución S).
Sulfuros Volátiles Procedimiento--C.olocar tapones, cortados si fuera necesario, con un área superficial total de 20 ± 2 cm 2 en un matraz de 100 ml y agregar 50 mL de una solución de ácido cítrico de 20 g por L. De la misma manera y en forma simultánea, preparar una solución de control en otro matraz de 100 mL, disolviendo O, 154 mg de sulfuro de sodio en 50 mL de una solución de ácido cítrico de 20 g por L. Colocar un trozo de papel de acetato de plomo sobre la boca de cada matraz y asegurarlo en posición, poniendo sobre él un frasco para pesada invertido. Calentar los matraces en un autoclave a 121 ± 2º durante 30 minutos. Requisito--C.ualquier mancha negra en el papel, producida por la solución de prueba, no es más intensa que la producida por la solución de control.
PRUEBAS DE FUNCIONALIDAD NOTA-Las muestras tratadas según se describió para la preparación de la Soluciór; S y secadas al aire, se deben usar para las Pruebas de Funcionalidad de Penetrabilidad, Fragmentación y Capacidad de Autoseflado. Las Pruebas de Funcionalidad se efectúan en tapones destinados a ser perforados por una aguja hipodérmica. La prueba de Capacidad de Autoseflado se requiere sólo para tapones destinados a envases multidosis. La aguja especificada para cada prueba es una aguja hipodérmica lubricada de bisel largo (ángulo de bisel: 12 ± 2º) 1 •
Penetrabilidad Procedimiento-Llenar con agua 1 O viales adecuados hasta el volumen nominal, colocar los tapones a examinar y asegurar con una tapa. Usando una aguja hipodérmica nueva, según se describió anteriormente, para cada tapón, perforar el tapón con la aguja perpendicular a la superficie. Requisito-La fuerza de la perforación no es mayor que 1O N (1 kgf) para cada tapón, determinada con una exactitud de± 0,25 N (25 gf).
Fragmentación Tapones para Preparaciones Líquidas-Llenar con agua 12 viales limpios hasta 4 ml menos de la capacidad nominal. Colocar los tapones a examinar, asegurarlos con una tapa y dejar en reposo durante 16 horas. Tapones para Preparaciones Secas--C.olocar los tapones a examinar en 12 viales limpios y asegurar cada uno con una tapa. Procedimiento-Usando una aguja hipodérmica según se describió anteriormente, colocada en una jeringa limpia, inyectar dentro de cada vial 1 mL de agua mientras se retira 1 mL de aire. Repetir este procedimiento cuatro veces para cada tapón, perforando cada vez en un sitio diferente. Usar una aguja nueva para cada tapón, verificando que no se vuelva roma durante la prueba. Filtrar el volumen total de líquido en todos los viales a través de un único filtro con un tamaño de poro nominal no mayor que 0,5 µm. Contar los fragmentos de caucho que se puedan ver a simple vista en la superficie del filtro. Requisito-No hay más de cinco fragmentos visibles. Este límite se basa en la suposición de que los fragmentos con un diámetro >50 µm se pueden ver a simple vista. En caso de duda o controversia, examinar las partículas microscópicamente para verificar su naturaleza y tamaño.
1
Consultar ISO 7864, Agujas hipodérmicas estériles para único uso con un diámetro externo de 0,8 mm (Calibre 21 ).
324 (381) Tapones Elastoméricos para Inyectables / Pruebas Químicas
USP 39
Capacidad de Autosellado Procedimiento-Llenar 1O viales adecuados con agua hasta el volumen nominal. Colocar los tapones a examinar y tapar. Usando una jeringa hipodérmica nueva para cada tapón, según se describió anteriormente, perforar cada tapón 1O veces en un sitio diferente cada vez. Sumergir los 1O viales en una solución de azul de metileno al O, 1% (1 g por L) y reducir la presión externa en 27 kPa durante 1O minutos. Restablecer la presión atmosférica y dejar los viales sumergidos durante 30 minutos. Enjuagar el exterior de los viales. Requisito-Ninguno de los viales contiene vestigios de solución azul.
(391) VALORACIÓN DE EPINEFRINA Estándares de Referencia USP (11 )-ER Bitartrato de Epinefrina USP. Solución Ferro-Cítrica-El día en que se va a utilizar, disolver 1,5 g de sulfato ferroso en 200 mL de agua, a los que se ha agregado 1,0 mL de ácido clorhídrico diluido (1 en 12) y 1,0 g de bisulfito de sodio. Disolver 500 mg de citrato de sodio en 1O mL de esta solución y mezclar. Solución Amortiguadora-En un matraz volumétrico de 50 mL, mezclar 4,2 g de bicarbonato de sodio, 5,0 g de bicarbonato de potasio y 18 mL de agua (no todos los sólidos se disolverán en esta etapa). A otros 18 mL de agua, agregar 3, 75 g de ácido aminoacético y 1,7 mL de hidróxido de amonio 6 N; mezclar para disolver y transferir esta solución al matraz volumétrico de 50 mL que contiene la otra mezcla. Diluir a volumen con agua y mezclar hasta dilución completa. Preparación Estándar-Transferir aproximadamente 18 mg de ER Bitartrato de Epinefrina USP pesados con exactitud, a un matraz volumétrico de 100 mL con ayuda de 20 mL de solución de bisulfito de sodio (1 en 50), diluir a volumen con agua y mezclar. Transferir 5,0 mL de esta solución a un matraz volumétrico de 50 mL, diluir a volumen con solución de bisulfito de sodio (1 en 500) y mezclar. [NOTA-Hacer la dilución final en el momento de llevar a cabo la valoración.] La concentración de ER Bitartrato de Epinefrina USP en la Preparación Estándar es aproximadamente 18 µg por ml. Preparación de Valoración-Transferir a un matraz volumétrico de 50 mL un volumen medido con exactitud de la Inyección a valorar, que equivalga aproximadamente a 500 µg de epinefrina, diluir a volumen con solución de bisulfito de sodio (1 en 500), si fuera necesario, y mezclar. [NOTA-La concentración final de bisulfito de sodio está en el intervalo de 1 a 3 mg por mL, teniendo en cuenta todo el bisulfito presente en la Inyección a valorar.] Procedimiento-A tres matraces Erlenmeyer de 50 mL con tapones de vidrio, transferir sendas alícuotas de 20,0 mL de la Preparación Estándar, de la Preparación de Valoración y de la solución de bisulfito de sodio (1 en 500) para proporcionar el blanco. A cada matraz, agregar 200 µL de Solución Ferro-Cítrica y 2,0 mL de Solución Amortiguadora, mezclar y dejar las soluciones en reposo durante 30 minutos. Determinar las absorbancias de las soluciones en celdas de 5 cm a la longitud de onda de máxima absorción, aproximadamente a 530 nm, con un espectrofotómetro apropiado, utilizando el blanco para ajustar el instrumento. Calcular la cantidad, en mg, de epinefrina (C9 H13 N0 3) en cada mL de Inyección, por la fórmula: (183,21 /333,30)(0,05C/V)(Au/As) en donde 183,21 y 333,30 son los pesos moleculares de epinefrina y bitartrato de epinefrina, respectivamente; Ces la concentración, en µg por mL, de ER Bitartrato de Epinefrina USP en la Preparación Estándar; y V es el volumen tomado, en mL, de Inyección.
(401) GRASAS Y ACEITES FIJOS Las siguientes definiciones y procedimientos generales se aplican a grasas, aceites fijos, ceras, resinas, bálsamos y sustancias similares.
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA Si la muestra de aceite se presenta turbia debido a la presencia de estearina, entibiar el recipiente en un baño de agua a 50º hasta que el aceite quede transparente; si el aceite no se clarifica al entibiarlo, filtrarlo a través de un papel de filtro seco en un embudo dentro de una camisa de agua caliente. Mezclar minuciosamente y pesar de una vez tantas porciones como sean necesarias para las distintas determinaciones, empleando preferiblemente una botella que tenga una pipeta gotero o una bureta de pesaje. Si la muestra se solidifica a temperatura ambiente, mantenerla fundida hasta que se hayan tomado las porciones necesarias.
Pruebas Químicas/
USP 39
(401) Grasas y Aceites Fijos 325
PESO ESPECÍFICO Determinar el peso específico de una grasa o aceite según se indica en Peso Específico (841 ).
TEMPERATURA DE FUSIÓN Determinar la temperatura de fusión según se indica para las sustancias de Clase 11 (ver Intervalo o Temperatura de Fusión (741)).
ÍNDICE DE ACIDEZ (ÁCIDOS GRASOS LIBRES) La acidez de las grasas y los aceites fijos en esta farmacopea pueden expresarse como el número de mL de álcali O, 1 N requerido para neutralizar los ácidos libres en 10,0 g de sustancia. La acidez se expresa frecuentemente como el Índice de Acidez, que es el número de mg de hidróxido de potasio necesario para neutralizar los ácidos libres en 1,0 g de la sustancia. A menos que se indique algo diferente en la monografía individual, usar el Método l.
Método 1 Procedimiento-A menos que se especifique algo diferente, disolver aproximadamente 10,0 g de la sustancia, pesados con exactitud, en 50 mL de una mezcla de volúmenes iguales de alcohol y éter (que se haya neutralizado a la fenolftaleína con hidróxido de potasio O, 1 N o hidróxido de sodio O, 1 N, a menos que se especifique algo diferente) contenidos en un matraz. Si la muestra de prueba no se disuelve en el disolvente frío, conectar el matraz a un condensador adecuado y entibiar lentamente, agitando con frecuencia, hasta que la muestra se disuelva. Agregar 1 mL de fenolftaleína SR y valorar con hidróxido de potasio O, 1 N SV o hidróxido de sodio O, 1 N SV hasta que la solución permanezca de color ligeramente rosado después de agitar durante 30 segundos. Calcular el Índice de Acidez o el volumen de álcali O, 1 N requerido para neutralizar 10,0 g de muestra (ácidos grasos libres), según corresponda. Calcular el Índice de Acidez: Resultado= (M, x \/) x (NIW)
M, = peso molecular del hidróxido de potasio, 56, 11 V= volumen (mL) N = normalidad de la solución de hidróxido de potasio o la solución de hidróxido de sodio W = peso de la muestra tomada (g) Si el volumen de hidróxido de potasio O, 1 N SV o hidróxido de sodio O, 1 N SV requerido para la volumetría es menos de 2 mL, puede utilizarse una solución volumétrica más diluida o ajustar el tamaño de la muestra de acuerdo con las necesidades. Los resultados pueden expresarse en términos del volumen de solución volumétrica utilizado o en términos del volumen equivalente de hidróxido de potasio O, 1 N o hidróxido de sodio O, 1 N. Si se ha saturado el aceite con dióxido de carbono para preservarlo, someter la solución de alcohol-éter a reflujo suavemente durante 1O minutos antes de la volumetría. También se puede eliminar el dióxido de carbono del aceite, exponiéndolo al vacío durante 24 horas dentro de una cápsula de poca profundidad en un desecador, antes de pesar las muestras de prueba.
Método 11 Procedimiento-Preparar 125 mL de una mezcla de disolventes que contenga volúmenes iguales de alcohol isopropílico y tolueno. Antes de su uso, agregar 2 mL de una solución de fenolftaleína al 1% en alcohol isopropílico a la mezla de 125 mL y neutralizar con álcali hasta que se produzca un color rosado leve pero permanente. Pesar con exactitud la cantidad adecuada de una muestra líquida bien mezclada, indicada en la Tabla 7 y disolverla en la mezcla de disolventes neutralizada. Si la muestra de prueba no se disuelve en el disolvente frío, conectar el matraz a un condensador adecuado y entibiar lentamente, agitando con frecuencia, hasta que la muestra se disuelva. Agitar vigorosamente mientras se valora con hidróxido de potasio O, 1 N SV o hidróxido de sodio O, 1 N SV hasta que se produzca el primer color rosado permanente, de la misma intensidad que la del disolvente neutralizado antes de mezclar con la muestra. Calcular el Índice de Acidez según se indica en el Método l. Tabla 1 Índice de Acidez
Peso de Muestra (g)
0-1
20
1-4
10
4-15
2,5
15-74,9
0,5
d5,0
0,1
326 (401) Grasas y Aceites Fijos/ Pruebas Químicas
USP 39
ÍNDICE DE ESTERIFICACIÓN El Índice de Esterificación es el número de mg de hidróxido de potasio necesario para saponificar los ésteres en 1,0 g de la sustancia. Si se han determinado el Índice de Saponificación y el Índice de Acidez, la diferencia entre éstos dos representa el Índice de Esterificación, es decir, Índice de Esterificación = Índice de Saponificación - Índice de Acidez. Procedimiento-Colocar 1,5-2 g de la sustancia, pesados con exactitud, en un matraz tarado de 250 ml, agregar 20-30 ml de alcohol neutralizado y agitar. Agregar 1 ml de fenolftaleína SR y valorar con hidróxido de potasio alcohólico 0,5 N SV hasta que se neutralice el ácido libre. Agregar 25,0 ml de hidróxido de potasio alcohólico 0,5 N SV y proceder según se indica en Índice de Saponificación, comenzando donde dice "Calentar el matraz", pero omitiendo la adición posterior de fenolftaleína SR. Calcular el Índice de Esterificación: Resultado= [M, x (V8
-
Vr) x N]!W
M, = peso molecular del hidróxido de potasio, 56, 11 V8 =volumen de ácido clorhídrico 0,5 N consumido en la prueba del blanco (ml) Vr =volumen de ácido clorhídrico 0,5 N consumido en la prueba real (ml) N = normalidad exacta del ácido clorhídrico W = peso de la sustancia tomada para la prueba (g)
ÍNDICE DE HIDROXILO El Índice de Hidroxilo es el número de mg de hidróxido de potasio equivalente al contenido de hidroxilo de 1,0 g de la sustancia. Reactivo de Piridina-Anhídrido Acético-Antes de usar, mezclar 3 volúmenes de piridina recientemente abierta o recién destilada con 1 volumen de anhídrido acético recién abierto o recién destilado. Procedimiento-Transferir una cantidad de la sustancia, pesada con exactitud y ajustada a la Tabla 2, a un matraz Erlenmeyer de 250 ml con tapón de vidrio y agregar 5,0 ml de Reactivo Piridina-Anhídrido Acético. Transferir 5,0 ml de Reactivo Piridina-Anhídrido Acético a un segundo matraz Erlenmeyer de 250 ml con tapón de vidrio para proporcionar el blanco del reactivo. Equipar ambos matraces con condensadores de reflujo con juntas de vidrio adecuadas, calentar en un baño de vapor durante 1 hora, agregar 1O ml de agua a través de cada condensador y calentar en el baño de vapor durante 1O minutos adicionales. Enfriar y agregar 25 ml de alcohol butílico previamente neutralizado a la fenolftaleína SR con hidróxido de potasio alcohólico 0,5 N a cada matraz, vertiendo 15 ml a través de cada condensador y lavando las paredes de cada matraz con las porciones de 1O ml restantes después de retirar los condensadores. Agregar 1 ml de fenolftaleína SR a cada matraz y valorar con hidróxido de potasio alcohólico 0,5 N SV, registrando el volumen, en ml, consumido por el ácido residual en la solución de prueba como Ty el consumido por el blanco como B. En un matraz Erlenmeyer de 125 ml, mezclar aproximadamente 1Og de la sustancia, pesada con exactitud, con 1O ml de piridina recién destilada y previamente neutralizada a la fenolftaleína SR, agregar 1 ml de fenolftaleína SR y valorar con hidróxido de potasio alcohólico 0,5 N SV, registrando el volumen, en ml, consumido por el ácido libre en la muestra de prueba como A. Calcular el Índice de Hidroxilo: Resultado= [(M, x N)!W] x {B + [(W x A)/q - 7} M, = peso molecular del hidróxido de potasio, 56, 11 N = normalidad exacta del hidróxido de potasio alcohólico W = peso de la sustancia tomada para la acetilación (g) e= peso de la sustancia tomada para la determinación de ácido libre (g) Si se conoce el Índice de Acidez para la sustancia de prueba, calcular el Índice de Hidroxilo:
Resultado= [(M, x N)!W] x (B - T) + Índice de Acidez M, = peso molecular del hidróxido de potasio, 56, 11 N = normalidad exacta del hidróxido de potasio alcohólico W = peso de la sustancia tomada para la acetilación (g) Tabla 2 Intervalo del Índice de Hidroxilo
Peso de la Muestra de Prueba
0-20
10
20-50
5
(g)
50-100
3
100-150
2
150-200
1,5
200-250
1,25
250-300
1,0
Pruebas Químicas/ (401) Grasas y Aceites Fijos 327
USP 39
Tabla 2 (Continuación) Intervalo del Índice de Hidroxilo
Peso de la Muestra de Prueba (g)
300-350
0,75
ÍNDICE DE YODO El Índice de Yodo representa el número de g de yodo absorbido, en las condiciones prescritas, por 100 g de la sustancia. A menos que se especifique de otro modo en la monografía individual, determinar el Índice de Yodo mediante el Método l.
Método 1 (Método de Hanus) Procedimiento-Transferir una cantidad de la muestra pesada con exactitud, según se determina en la Tabla 3, a un matraz para yodo de 250 mL, disolver en 1O mL de cloroformo, agregar 25,0 mL de yodobromuro SR, tapar el vaso en forma segura y dejar en reposo durante 30 minutos, protegido de la luz, agitando ocasionalmente. Luego agregar, en este orden, 30 mL de yoduro de potasio SR y 100 mL de agua, valorar el yodo liberado con tiosulfato de sodio O, 1 N SV, agitando minuciosamente después de cada adición de tiosulfato. Cuando el color del yodo se torne muy pálido, agregar 3 mL de almidón SR y continuar la valoración con tiosulfato de sodio 0, 1 N SV hasta que el color azul desaparezca. Realizar una prueba blanco al mismo tiempo con las mismas cantidades de los mismos reactivos y de la misma forma (ver Volumetría (541 ), Valoraciones Residuales). Calcular el Índice de Yodo: Resultado = [A, x (V8
-
V5) x N]/(l O x W)
A,= peso atómico del yodo, 126,90 V8 =volumen de tiosulfato de sodio O, 1 N SV consumido por la prueba del blanco (mL) V5 =volumen de tiosulfato de sodio 0, 1 N SV consumido por la prueba real (mL) N = normalidad exacta del tiosulfato de sodio SV W = peso de la sustancia tomada para la prueba (g) NOTA-Si la porción de sustancia tomada absorbe más de la mitad del yodobromuro SR, repetir la determinación empleando una porción más pequeña de la sustancia en análisis. Tabla 3. Peso de las Muestras Índice de Yodo Esperado
Peso (g) ±0,1
<5
3,0
5-20
1,0
21-50
0,4
51-100
0,2
101-150
o, 13
151-200
0,1
Método 11 Solución de Yoduro de Potasio-Disolver 10,0 g de yoduro de potasio en agua para obtener 100 mL. Almacenar en recipientes resistentes a la luz. Solución Indicadora de Almidón-Mezclar 1 g de almidón soluble con suficiente agua fría para obtener una pasta fina. Agregar, mezclando, a 100 mL de agua hirviendo. Mezclar y enfriar. Emplear sólo la solución transparente. Procedimiento-Fundir la muestra si no estuviera líquida todavía. [NOTA-La temperatura durante la fusión debe exceder el punto de fusión de la muestra en no más de 1Oº.] Pasar a través de dos trozos de papel de filtro para eliminar cualquier impureza sólida y los últimos restos de humedad. El filtrado puede realizarse en un horno de aire a 100º pero debe completarse dentro de los 5 minutos± 30 segundos. La muestra debe estar absolutamente seca. Todo el material de vidrio debe estar absolutamente limpio y completamente seco. Después del filtrado, dejar que la muestra filtrada alcance una temperatura de 68º-71 ± 1ºantes de pesar la muestra. Una vez que la muestra alcance una temperatura de 68º-71 ± 1º, pesar inmediatamente la muestra en un matraz para yodo de 500 mL, ajustándose a los pesos y la exactitud de pesada de la tabla adjunta. [NOTA-El peso de la sustancia debe ser tal que se produzca un exceso de yodocloruro SR de 50-60% de la cantidad agregada, es decir, del 100-150% de la cantidad absorbida.] Agregar 15 mL de una mezcla recién preparada de ciclohexano y ácido acético glacial (1 :1) y agitar por rotación suave hasta disolver la muestra. Agregar 25,0 mL de yodocloruro SR, tapar el matraz de forma segura y agitar por rotación suave para mezclar. Dejar en reposo a 25 ± 5º, protegido de la luz, agitando ocasionalmente, durante 1,0 ó 2,0 horas, dependiendo del Índice de Yodo (IV) de la muestra: IV< 150, 1,0 hora; IV 2 150, 2,0 horas. Luego, dentro de los 3 minutos después del tiempo de reacción indicado, agregar en este orden, 20 mL de Solución de Yoduro de Potasio y 150 mL de agua recién hervida y enfriada, y mezclar. Dentro de los 30 minutos, valorar el yodo liberado con tiosulfato de
328 (401) Grasas y Aceites Fijos/ Pruebas Químicas
USP 39
sodio O, 1 N SV mientras se mezcla mecánicamente después de cada adición de tiosulfato. Cuando el color amarillo del yodo haya desparecido casi por completo, agregar 1-2 m L de Solución Indicadora de Almidón y continuar la valoración con tiosulfato de sodio O, 1 N SV hasta que desaparezca el color azul. Realizar una prueba blanco al mismo tiempo, con las mismas cantidades de los mismos reactivos y de la misma forma (ver Volumetría (541) Valoraciones Residuales). Calcular el Índice de Yodo, según se indica en Método /.
ÍNDICE DE PERÓXIDO El Índice de Peróxido es el número que expresa, en miliequivalentes de oxígeno activo, la cantidad de peróxido contenido en 1000 g de la sustancia. [NOTA-Esta prueba debe realizarse inmediatamente después de tomar la muestra para evitar la oxidación de la muestra de prueba.] Procedimiento-A menos que se indique algo diferente, colocar aproximadamente 5 g de la sustancia, pesada con exactitud, en un matraz Erlenmeyer de 250 ml con tapón de vidrio esmerilado. Agregar 30 ml de una mezcla de ácido acético glacial y cloroformo (3:2), agitar hasta disolver y agregar 0,5 ml de solución de yoduro de potasio saturada. Agitar durante 1 minuto exactamente y agregar 30 ml de agua. Valorar con tiosulfato de sodio 0,01 N SV, agregando lentamente la solución volumétrica y agitando continuamente, hasta que el color amarillo desaparezca casi por completo. Agregar 5 ml de almidón SR y continuar la valoración, agitando enérgicamente, hasta que desaparezca el color azul. Realizar una determinación con un blanco en las mismas condiciones. [NOTA-El volumen de solución volumétrica empleada en la determinación con el blanco no debe exceder O, 1 ml.] Calcular el Índice de Peróxido: Resultado= [1000 (Vr - Va) x N]!W Vr= volumen de tiosulfato de sodio 0,01 N consumido en la prueba real (ml) Va= volumen de tiosulfato de sodio 0,01 N consumido en la prueba del blanco (ml) N = normalidad exacta de la solución de tiosulfato de sodio W = peso de la sustancia tomada para la prueba (g)
ÍNDICE DE SAPONIFICACIÓN El Índice de Saponificación es el número de mg de hidróxido de potasio necesario para neutralizar los ácidos libres y saponificar los ésteres existentes en 1,0 g de la sustancia. Procedimiento-Colocar 1,5-2 g de la sustancia, pesados con exactitud, en un matraz tarado de 250 ml y agregar 25,0 ml de hidróxido de potasio alcohólico 0,5 N. Calentar el matraz en un baño de vapor, bajo un condensador adecuado para mantener el reflujo durante 30 minutos, rotando el contenido con frecuencia. [NOTA-El tiempo de reflujo puede ser de hasta 90 minutos para asegurar la saponificación completa, dependiendo del tipo de éster a analizar.] Agregar a continuación 1 ml de fenolftaleína SR y valorar el exceso de hidróxido de potasio con ácido clorhídrico 0,5 N SV. Realizar una determinación con un blanco en las mismas condiciones (ver Volumetría (541 ), Valoraciones Residuales). La valoración también puede realizarse potenciométricamente. Calcular el Índice de Saponificación: Resultado= [M, x (Va - Vr) x N]/W
M, = peso molecular del hidróxido de potasio, 56, 11 Va= volumen de ácido clorhídrico 0,5 N consumido en la prueba del blanco (ml) Vr =volumen de ácido clorhídrico 0,5 N consumido en la prueba real (ml) N = normalidad exacta del ácido clorhídrico W = peso de la sustancia tomada para la prueba (g) Si el aceite se ha saturado con dióxido de carbono con el propósito de conservarlo, dejarlo en una cápsula poco profunda en un desecador de vacío durante 24 horas antes de pesar las muestras de prueba.
MATERIA INSAPONIFICABLE El término "materia insaponificable" en aceites o grasas, se refiere a aquellas sustancias que no son saponificables por medio de hidróxidos alcalinos, pero que son solubles en disolventes de grasas ordinarios, y a los productos de saponificación que son solubles en dichos disolventes. Procedimiento-Transferir aproximadamente 5,0 g del aceite o grasa, pesados con exactitud, a un matraz Erlenmeyer de 250 ml, agregar 50 ml de una solución de hidróxido de potasio alcohólico preparada disolviendo 12 g de hidróxido de potasio en 1O ml de agua y diluyendo esta solución con alcohol hasta 100 ml, y calentar el matraz en un baño de vapor bajo un condensador adecuado para mantener el reflujo durante 1 hora, agitando frecuentemente por rotación suave. Enfriar a una temperatura inferior a 25º y transferir el contenido del matraz a un separador con una llave de paso de teflón, enjuagando el matraz con dos porciones de 50 ml de agua que se agregan al separador (no usar grasa en la llave de paso). Extraer con tres porciones de 100 ml de éter, combinando los extractos de éter en otro separador que contenga 40 ml de agua. Rotar o agitar suavemente el separador durante unos minutos. [NOTA-Si se agita con demasiada fuerza, puede formarse una emulsión
Pruebas Químicas/ (401) Grasas y Aceites Fijos 329
USP 39
difícil de separar.] Dejar que la mezcla se separe y desechar la fase acuosa inferior. Lavar el extracto de éter con dos porciones adicionales de 40 mL de agua y desechar la fase acuosa inferior. Lavar el extracto de éter sucesivamente con una porción de 40 mL de solución de hidróxido de potasio (3 en 100) y una porción de 40 mL de agua. Repetir tres veces esta secuencia de lavado con solución de hidróxido de potasio y agua. Lavar el extracto de éter con porciones de 40 mL de agua hasta que el último lavado no se torne rojo con la adición de 2 gotas de fenolftaleína SR. Transferir el extracto de éter a un matraz tarado y enjuagar el separador con 1O mL de éter, agregando los enjuagues al matraz. Evaporar el éter en un baño de vapor y agregar 6 mL de acetona al residuo. Extraer la acetona en una corriente de aire y secar el residuo a 105º hasta que las pesadas sucesivas difieran en no más de 1 mg. Calcular el porcentaje de materia insaponificable en la porción de aceite o grasa tomada: Resultado= 100 x (WR/W5)
WR = peso del residuo (g) W 5 = peso del aceite o grasa tomado para la prueba (g) Disolver el residuo en 20 mL de alcohol, neutralizado previamente en el punto final de la fenolftaleína, agregar fenolftaleína SR y valorar con hidróxido de sodio alcohólico O, 1 N SV hasta la primera aparición de un color rosado pálido que permanezca durante no menos de 30 segundos. Si el volumen requerido de hidróxido de sodio alcohólico O, 1 N es superior a 0,2 mL, la separación de las capas no fue completa; el residuo pesado no puede considerarse como "materia insaponificable" y debe repetirse la prueba.
TEMPERATURA DE SOLIDIFICACIÓN DE ÁCIDOS GRASOS Preparación de los Ácidos Grasos-Calentar 75 mL de solución de glicerina-hidróxido de potasio (preparada disolviendo 25 g de hidróxido de potasio en 100 mL de glicerina) en un vaso de precipitados de 800 mL a 150º y agregar 50 mL de la grasa clarificada, fundida si fuera necesario. Calentar la mezcla durante 15 minutos mezclando con frecuencia, pero sin permitir que la temperatura sobrepase los 150º. La saponificación se considera completa cuando la mezcla es homogénea, sin partículas que se adhieran al vaso de precipitados en el menisco. Verter el contenido del vaso de precipitados en 500 mL de agua próxima a su punto de ebullición, en una cápsula con mango o un vaso de precipitados de 800 mL, agregar lentamente 50 mL de ácido sulfúrico diluido [preparado agregando agua y ácido sulfúrico (3: 1 )] y calentar la solución, mezclando con frecuencia, hasta que los ácidos grasos se separen claramente, formando una capa transparente. Lavar los ácidos con agua hirviendo hasta que queden libres de ácido sulfúrico, recogerlos en un vaso de precipitados pequeño, colocar en un baño de vapor hasta que el agua se haya sedimentado y los ácidos grasos se vuelvan transparentes, filtrar en un vaso de precipitados seco mientras esté caliente y secar a 105º durante 20 minutos. Colocar los ácidos grasos aún calientes en un recipiente adecuado y enfriar en un baño de hielo hasta que se solidifiquen. Prueba de Saponificación Completa-Colocar 3 mL de los ácidos secos en un tubo de ensayo y agregar 15 mL de alcohol. Calentar la solución a ebullición y agregar un volumen igual de hidróxido de amonio 6 N. Se obtiene una solución transparente. Procedimiento-Empleando un aparato similar al Aparato de Temperatura de Solidificación especificado en el capítulo Temperatura de Solidificación (651 ), proceder según se indica en Procedimiento, leyendo "temperatura de solidificación" por "punto de solidificación" (los términos son sinónimos). El promedio de no menos de cuatro lecturas consecutivas del punto más alto al que llega la temperatura es la temperatura de solidificación de los ácidos grasos.
COMPOSICIÓN DE ÁCIDOS GRASOS Solución Estándar-Preparar una mezcla de éster de composición conocida que contenga los ésteres requeridos en la monografía individual. Esta Solución Estándar puede contener otros componentes. [NOTA-Las mezclas de ésteres están disponibles comercialmente en Nu-Chek-Prep, lnc., PO Box 295, Elysian, MN 56028. Las mezclas de ésteres habituales que son útiles para esta prueba incluyen Nu-Chek 17A y Nu-Chek 19A.] La mezcla Nu-Chek 17A tiene la siguiente composición: Tabla4 Porcentaje
Éster de Ácido Graso
Longitud de la Cadena de Carbono
1,0
Miristato de metilo
14
4,0
Palmitato de metilo
16
3,0
Estearato de metilo
18
3,0
Araquidato de metilo
20
3,0
Behenato de metilo
22
3,0
Nº de Enlaces Dobles
o o o o o o
Lignocerato de metilo
24
45,0
Oleato de metilo
18
1
15,0
Linoleato de metilo
18
2
Linolenato de metilo
18
3
Erucato de metilo
22
1
3,0 20,0
330 (401) Grasas y Aceites Fijos/ Pruebas Químicas
USP 39
La mezcla Nu-Chek 19A tiene la siguiente composición: Tabla 5 Porcentaje
Éster de Ácido Graso
Longitud de la Cadena de Carbono
7,0
Caprilato de metilo
8
5,0
Caprato de metilo
10
Nº de Enlaces Dobles
o o o o o o
48,0
Laurato de metilo
12
15,0
Miristato de metilo
14
7,0
Palmitato de metilo
16
3,0
Estearato de metilo
18
O/eato de metilo
18
1
Linoleato de metilo
18
2
12,0 3,0
Solución de Hidróxido de Sodio Metanólico 0,5 N-Disolver 2 g de hidróxido de sodio en 100 mL de metano!. Solución de Prueba-[NOTA-Si en la muestra de prueba hay ácidos grasos que contengan más de 2 enlaces dobles, extraer el aire del matraz purgándolo con nitrógeno durante unos minutos.] Transferir aproximadamente 100 mg de la muestra de prueba a un matraz Erlenmeyer de 50 mL equipado con un condensador de reflujo adecuado enfriado con agua y una barra mezcladora magnética. Agregar 4 mL de Solución de Hidróxido de Sodio Metanólico 0,5 N y someter a reflujo hasta que desaparezcan los glóbulos de grasa (generalmente 5-1 O minutos). Agregar 5 mL de una solución preparada disolviendo 14 g de trifluoruro de boro en metano! para obtener 100 mL, agitar por rotación suave para mezclar y someter a reflujo durante 2 minutos. Agregar 4 mL de n-heptano cromatográfico, a través del condensador y someter a reflujo durante 1 minuto. Enfriar, retirar el condensador, agregar aproximadamente 15 mL de solución de cloruro de sodio saturada, agitar y dejar que las capas se separen. Pasar la capa de n-heptano a través de O, 1 g de sulfato de sodio anhidro (lavado previamente con n-heptano cromatográfico) a un matraz apropiado. Transferir 1,0 mL de esta solución a un matraz volumétrico de 10 mL, diluir con n-heptano cromatográfico a volumen y mezclar. Solución de Aptitud del Sistema-Transferir aproximadamente 20 mg de ácido esteárico, de ácido palmítico y de ácido oleico a un matraz Erlenmeyer de 25 mL equipado con un condensador a reflujo enfriado por agua adecuado y una barra mezcladora magnética, y proceder según se indica para la Solución de Prueba, empezando donde dice "Agregar 5,0 mL de una solución preparada disolviendo". Sistema Cromatográfico (ver Cromatografía (621 >)-Equipar un cromatógrafo de gases con un detector de ionización a la llama, mantenido a una temperatura de aproximadamente 260º, un sistema de inyección no dividido y una columna capilar de sílice fundida de 0,53 mm x 30 m, ligada con una capa de fase Gl 6 de 1,0 µm. Programar el cromatógrafo para que mantenga una temperatura de columna de 70º durante aproximadamente 2 minutos después de la inyección, luego para que aumente la temperatura a una velocidad de 5º /min hasta 240º y finalmente para que mantenga esta temperatura durante 5 minutos. Mantener la temperatura del inyector aproximadamente a 220º. El gas transportador es helio con una velocidad lineal de aproximadamente 50 cm/s. Cromatografiar la Solución de Aptitud del Sistema y registrar las respuestas de los picos según se indica en Procedimiento: los tiempos de retención relativos son aproximadamente 0,87 para el palmitato de metilo, 0,99 para el estearato de metilo y 1,0 para el oleato de metilo; la resolución, R, entre el estearato de metilo y el oleato de metilo es no menos de 1,5; y la desviación estándar relativa de las respuestas de las áreas de los picos de palmitato y estearato en inyecciones repetidas es no más de 6,0%. La desviación estándar relativa del cociente entre las respuestas de los picos del palmitato y del estearato en inyecciones repetidas es no más de 1,0%. Procedimiento-Inyectar por separado volúmenes iguales (aproximadamente 1 µL) de la Solución Estándar y la Solución de Prueba en el cromatógrafo, registrar los cromatogramas, identificar los picos de éster de los ácidos grasos en el cromatograma de la Solución de Prueba, comparando los tiempos de retención de estos picos con los del cromatograma de la Solución Estándar y medir las áreas de los picos para todos los picos de éster de los ácidos grasos en el cromatograma de la Solución de Prueba. Calcular el porcentaje de cada componente de ácido graso en la muestra de prueba: Resultado= 100 x (AIB) A = área de la respuesta de los picos obtenidos para cada componente de éster de ácido graso individual B = suma de las áreas de todos los picos, excluido el pico del disolvente, en el cromatograma de la Solución de Prueba
DETERMINACIÓN V PERFIL DE ÁCIDOS GRASOS OMEGA-3 El siguiente procedimiento se puede usar para la determinación de ácido eicosapentaenoico (EPA) (C20:5 n-3), ácido docosahexaenoico (DHA) (C22:6 n-3) y ácidos omega-3 totales que se obtienen de peces, plantas o fuentes microbianas en aceites a granel y aceite encapsulado, ya sea como triglicéridos o como ésteres etílicos. El término "triglicérido" es aplicable a aceites de algas, aceites de pescado, aceites de hígado de pescado y productos que contienen ácidos omega-3 en forma de triglicéridos. Los resultados se expresan como ácidos grasos libres o ésteres etílicos. Realizar las pruebas lo más rápidamente posible. Proteger las soluciones de la luz actínica, agentes oxidantes, catalizadores de oxidación y aire.
Pruebas Químicas/ (401) Grasas y Aceites Fijos 331
USP 39
Contenido de EPA y DHA Estándares de Referencia USP (11) ER Éster Etílico del Ácido Docosahexaenoico USP ER Éster Etílico del Ácido Eicosapentaenoico USP ER Tricosanoato de Metilo USP Solución Antioxidante-Disolver una cantidad, pesada con exactitud, de butil hidroxitolueno en 2,2,4-trimetilpentano para obtener una solución con una concentración de 0,05 mg por ml. Solución de Estándar Interno-Transferir una cantidad de ER Tricosanoato de Metilo USP, pesada con exactitud, a un matraz volumétrico. Disolver en Solución Antioxidante y diluir con el mismo disolvente hasta obtener una solución con una concentración de aproximadamente 7,0 mg/ml. [NOTA-Proteger la solución de la evaporación durante su uso.] Tabla6 Suma Aproximada EPA+ DHA
30%-50%
Cantidad de Muestra a Pesar
(g)
0,4-0,5
50%-70%
0,3
>70%
0,25
Solución de Prueba 1 (para triglicéridos)-En un matraz volumétrico de 1O mL, disolver la masa de la muestra a examinar, de acuerdo con la Tabla 6, en Solución Antioxidante y diluir con la misma solución a volumen. Transferir 2,0 mL de esta solución a un tubo de vidrio y evaporar el disolvente con una corriente suave de nitrógeno. Agregar 1,5 mL de una solución de hidróxido de sodio en metanol al 2% (p/v), tapar herméticamente con una tapa con recubrimiento interno de politetrafluoroetileno, mezclar y calentar en un baño de agua hirviendo durante 7 minutos. Enfriar, agregar 2 mL de solución de tricloruro de boro-metanol (120 g en 1000 mL de metanol), cubrir con nitrógeno, tapar herméticamente, mezclar y calentar en un baño de agua hirviendo durante 30 minutos. Enfriar a una temperatura de 40º-50º, agregar 1,0 mL de 2,2,4-trimetilpentano, tapar y mezclar en un mezclador de vórtice o agitar vigorosamente durante al menos 30 segundos. Agregar inmediatamente 5 mL de solución saturada de cloruro de sodio que contenga 1 volumen de cloruro de sodio y 2 volúmenes de agua. [NOTA-Agitar de vez en cuando. Antes de usar, decantar la solución de cualquier sustancia no disuelta y filtrar si fuera necesario.] Cubrir con nitrógeno, tapar y mezclar en un mezclador de vórtice o agitar minuciosamente durante al menos 15 segundos. Dejar que la capa superior se torne transparente y transferir a otro tubo. Agitar la capa de metanol una vez más con 1,0 mL de 2,2,4-trimetilpentano y combinar los extractos de 2,2,4-trimetilpentano. Lavar los extractos combinados dos veces, cada una con 1 mL de agua, y secar sobre sulfato de sodio anhidro. Solución de Prueba 2 (para triglicéridos)-Transferir la cantidad equivalente de la muestra usada para preparar la Solución de Prueba 7 a un matraz volumétrico de 1O mL, disolver y diluir con Solución de Estándar Interno a volumen. Puede aplicarse calor suave (hasta un máximo de 60º) para obtener una solución transparente. Después, proceder según se indica en Solución de Prueba 7, comenzando donde dice "Transferir 2,0 mL". Solución de Prueba 3 (para ésteres etílicos)-En un matraz volumétrico de 1O mL, disolver la masa de la muestra a examinar, ajustándose a la Tabla 6, en Solución de Estándar Interno y diluir con la misma solución a volumen. Puede aplicarse calor suave (hasta un máximo de 60º) para obtener una solución transparente. Solución de Prueba 4 (para ésteres etílicos)-Transferir la cantidad equivalente de la muestra usada para preparar la Solución de Prueba 3 a un matraz volumétrico de 1O mL, disolver y diluir con Solución Antioxidante a volumen. Solución Estándar 1a-Transferir 60 mg de ER Éster Etílico del Ácido Docosahexaenoico USP, pesados con exactitud, a un matraz volumétrico de 1O mL, disolver y diluir con Solución de Estandar Interno a volumen. Puede aplicarse calor suave (hasta un máximo de 60º) para obtener una solución transparente. Solución Estándar 1b-Transferir 90 mg de ER Éster Etílico del Ácido Eicosapentaenoico USP, pesados con exactitud, a un matraz volumétrico de 1O mL, disolver y diluir con Solución de Estandar Interno a volumen. Puede aplicarse calor suave (hasta un máximo de 60º) para obtener una solución transparente. La Solución Estándar 7a y la Solución Estándar 7b están listas para el análisis de ésteres etílicos. Para el análisis de triglicéridos, continuar con la Solución Estándar 2a y la Solución Estándar 2b. Solución Estándar 2a-Transferir 2,0 mL de Solución Estándar 7a a un tubo de vidrio y evaporar el disolvente con una corriente suave de nitrógeno. Después, proceder según se indica en Solución de Prueba 7, comenzando donde dice, "Agregar 1,5 mL". Solución Estándar 2b-Transferir 2,0 mL de Solución Estándar 7b a un tubo de vidrio y evaporar el disolvente con una corriente suave de nitrógeno. Después, proceder según se indica en Solución de Prueba 7, comenzando donde dice, "Agregar 1,5 mL". Solución de Aptitud del Sistema 1-Transferir 0,300 g de palmitato de metilo, 0,300 g de estearato de metilo, 0,300 g de araquidato de metilo y 0,300 g de behenato de metilo, pesados con exactitud, a un matraz volumétrico de 1O mL, disolver y diluir con Solución Antioxidante a volumen. Solución de Aptitud del Sistema 2-[NOTA-Esta solución debe prepararse sólo para triglicéridos y sólo si el éster metílico del ácido tetracos-15-enoico no se observa claramente en el cromatograma obtenido con la Solución de Prueba 2.] Transferir
332 (401) Grasas y Aceites Fijos/ Pruebas Químicas
USP 39
55,0 mg de éster metílico del ácido docosahexaenoico y aproximadamente 5,0 mg de éster metílico del ácido tetracos-15-enoico (ácido nervónico), pesados con exactitud, a un matraz volumétrico de 1 O ml, disolver y diluir con Solución Antioxidante a volumen. Sistema cromatográfico (Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.) Modo: Cromatografía de gases Detector: Ionización a la llama Columna: Capilar de sílice fundida, de 0,25 mm x 25 m; ligada con una película de fase Gl 6 de 0,20 µm Temperaturas Inyector Inyección dividida: 250º Inyección no dividida: 90º-250º Detector: 270º Columna: Ver la Tabla la o la Tabla lb. Tabla 7a (Inyección Dividida)
Temperatura Inicial (º)
Tiempo de Espera (Hold Time) a 170º (min)
Rampa de Temperatura (º/min)
Temperatura Final (°)
Tiempo de Espera (Hold Time) ala Temperatura Final (min)
170
2
3
240
2,5
Tabla 7b (Inyección no Dividida)
Temperatura Inicial (º)
Tiempo de Espera (Hold Time) a 90º (min)
Rampa de Temperatura Número 1 (º/min)
Hasta Temperatura (°)
Rampa de Temperatura Número 2 (º/min)
Hasta Temperatura Final (°)
Tiempo de Espera (Hold Time) ala Temperatura Final (min)
90
2
30
170
3
240
2
Gas transportador: Helio Velocidad de flujo: 1 ml/min Relación de partición del flujo: 200:1. [NOTA-Si fuera necesario, ajustar la relación de partición y/o la dilución de la muestra para obtener un factor de asimetría de 0,8-1,5 para los picos de los ésteres metílicos de ácidos grasos en la Solución de Aptitud del Sistema 7, los picos de éster metílico o éster etílico del ácido eicosapentaenoico y ácido docosahexaenoico en la Solución de Prueba 7 y Solución de Prueba 4, observando al mismo tiempo que para la Solución de Prueba 7 o Solución de Prueba 4 los picos debidos a los ésteres correspondientes de Cl 8:3 n-3, Cl 8:4 n-3, C20:4 n-3, C21 :5 n-3 y C22:5 n-3 son claramente detectables. Si se utiliza la modalidad de inyección no dividida, las soluciones deben diluirse adicionalmente 1 en 200 con Solución Antioxidante.]
Volumen de inyección: 1 µL Aptitud del sistema (para triglicéridos) Muestras: Solución de Aptitud del Sistema 7 y Solución de Prueba 2 o Solución de Aptitud del Sistema 2 (si es aplicable) Aptitud del sistema (para ésteres etílicos) Muestra: Solución de Aptitud del Sistema 7 Requisitos de aptitud del sistema Porcentajes de área teóricos (Solución de Aptitud del Sistema 7): Los porcentajes de las áreas, después de ajustar por el peso real, de los picos de palmitato de metilo, estearato de metilo, araquidato de metilo y behenato de metilo, deben estar cada uno dentro de± 1,0% (absoluto) de los valores teóricos provistos en la Tabla 8. Tabla 8 Éster Metílico del Ácido Graso Palmitato de metilo
Área Teórica(%) en una Solución de Pesos Iguales de Palmitato de Metilo, Estearato de Metilo, Araquidato de Metilo y Behenato de Metilo 24,37
Estearato de metilo
24,84
Araquidato de metilo
25,23
Behenato de metilo
25,56
USP 39
Pruebas Químicas/ (401) Grasas y Aceites Fijos 333
[NOTA-El área teórica (%)en una solución de pesos iguales (Tabla 8) se deriva de los factores de respuesta teórica calculados, que son 1,049; 1,029; 1,013 y 1,000 para palmitato de metilo, estearato de metilo, araquidato de metilo y behenato de metilo, respectivamente.] Resolución: Para triglicéridos (Solución de Prueba 2 o Solución de Aptitud del Sistema 2): No menos de 1,2 entre los picos de éster metílico del ácido docosahexaenoico y éster metílico del ácido tetracos-15-enoico Analisis (para triglicéridos) Muestras: Solución Estándar 2a, Solución Estándar 2b, Solución de Prueba 1 y Solución de Prueba 2 Inyectar cada muestra por duplicado y medir las respuestas de los picos. Comparar el perfil cromatográfico de la Solución de Prueba 2 con el de la Solución de Prueba 1 e identificar el pico del estándar interno presente en la Solución de Prueba 2. Calcular el porcentaje de EPA o DHA en la muestra de triglicéridos tomada: Resultado= (Ruf R5) x (W5/Wu) x F x 100 Ru = cociente entre la respuesta del pico de EPA o DHA y la respuesta del pico corregida del estándar interno en el cromatograma de la Solución de Prueba 2, calculado:
Resultado= 1J[(rU2/rri) - (ru 11rn)] [NOTA-Si ru 1 = O debido a que no se observan picos en el sitio del estándar interno en el cromatograma de la Solución de Prueba 1, entonces Ru = rr21rU2.] ru2 = respuesta del pico del estándar interno en el cromatograma de la Solución de Prueba 2 rr2 = respuesta del pico de EPA o DHA en el cromatograma de la Solución de Prueba 2 ru 1 = respuesta de cualquier pico en el sitio del estándar interno en el cromatograma de la Solución de Prueba 7 rn = respuesta del pico de EPA o DHA en el cromatograma de la Solución de Prueba 1 R5 = cociente entre la respuesta del pico de DHA o EPA y la respuesta del pico del estándar interno en el cromatograma de la Solución Estándar 2a o la Solución Estándar 2b W5 = peso del DHA tomado para preparar la Solución Estándar 1a o peso del EPA tomado para preparar la Solución Estándar 7b (mg) Wu = peso de la muestra tomada para preparar la Solución de Prueba 2 (mg) F =factor para expresar el contenido de DHA como ácidos grasos libres, 0,921; y factor para expresar el contenido de EPA como ácidos grasos libres, O, 915 Análisis (para ésteres etílicos) Muestras: Solución Estándar 7a, Solución Estándar 1b, Solución de Prueba 3 y Solución de Prueba 4 Inyectar cada muestra por duplicado y medir las respuestas de los picos. Comparar el perfil cromatográfico de la Solución de Prueba 3 con el de la Solución de Prueba 4 e identificar el pico del estándar interno presente en la Solución de Prueba 3. Calcular el porcentaje de EPA o DHA en la muestra de ésteres etílicos tomada: Resultado= (Ruf R5) x (W5/Wu) x 100 Ru = cociente entre la respuesta del pico de EPA o DHA y la respuesta del pico corregida del estándar interno en el cromatograma de la Solución de Prueba 3, calculada según se indica a continuación:
Resultado= 1 /[(rU3/rn) - (ru 4 f rr4)] [NOTA-Si ru4 = O debido a que no se observan picos en el sitio del estándar interno en el cromatograma de la Solución de Prueba 4, entonces Ru = rnf ru 3 .] ru 3 = respuesta del pico del estándar interno en el cromatograma de la Solución de Prueba 3 rn = respuesta del pico de EPA o DHA en el cromatograma de la Solución de Prueba 3 ru4 = respuesta de cualquier pico en el sitio del estándar interno en el cromatograma de la Solución de Prueba 4 rr4 = respuesta del pico de EPA o DHA en el cromatograma de la Solución de Prueba 4 R5 = cociente entre la respuesta del pico de DHA o EPA y la respuesta del pico del estándar interno en el cromatograma de la Solución Estándar 7a o Solución Estándar 7b W5 = peso del DHA tomado para preparar la Solución Estándar 7a o peso del EPA tomado para preparar la Solución Estándar 7b (mg) Wu =peso de la muestra tomada para preparar la Solución de Prueba 3 (mg)
Contenido de Ácidos Omega-3 Totales (para triglicéridos) Calcular el porcentaje de los ácidos omega-3 totales en la porción de muestra de triglicéridos tomada: Resultado= EPA+ DHA + [(An_ 3 x (EPA+ DHA)/(AEPA + A0HJ] EPA = contenido de EPA de la prueba de Contenido de EPA y DHA (%) DHA =contenido de DHA de la prueba de Contenido de EPA y DHA (%)
334 (401) Grasas y Aceites Fijos/ Pruebas Químicas
USP 39
An- 3 =suma de las áreas de los picos correspondientes a los ésteres metílicos Cl 8:3 n-3, Cl 8:4 n-3, C20:4 n-3, C21 :5 n-3
y C22:5 n-3 en el cromatograma obtenido con la Solución de Prueba 1 AEPA = área del pico correspondiente al éster metílico de EPA en el cromatograma obtenido con la Solución de Prueba 1 AoHA = área del pico correspondiente al éster metílico de DHA en el cromatograma obtenido con la Solución de Prueba 1
Contenido de Ácidos Omega-3 Totales (para ésteres etílicos) Calcular el porcentaje de los ácidos omega-3 totales en la porción de muestra de ésteres etílicos tomada: Resultado= EPA+ DHA + [(An- 3 x (EPA+ DHA)/(AEPA + AoHA)] EPA= contenido de EPA de la prueba de Contenido de EPA y DHA (%) DHA = contenido de DHA de la prueba de Contenido de EPA y DHA (%) An _3 =suma de las áreas de los picos correspondientes a los ésteres etílicos Cl 8:3 n-3, Cl 8:4 n-3, C20:4 n-3, C21 :5 n-3 y C22:5 n-3 en el cromatograma obtenido con la Solución de Prueba 4 AEPA =área del pico correspondiente al éster etílico de EPA en el cromatograma obtenido con la Solución de Prueba 4 AoHA = área del pico correspondiente al éster etílico de DHA en el cromatograma obtenido con la Solución de Prueba 4
AGUA Y SEDIMENTOS EN ACEITES FIJOS Aparato-La centrífuga preferida tiene un diámetro de giro (d = distancia entre los extremos de los tubos cuando éstos están girando) de 38-43 cm y opera a una velocidad aproximada de 1500 rpm. Si se emplea una centrífuga de dimensiones diferentes, calcular la velocidad deseada de las revoluciones: rpm = 1500.J40,6/d Los tubos de la centrífuga tienen forma de pera y se les puede colocar tapones. La capacidad total de cada tubo es de aproximadamente 125 ml. Las graduaciones son claras y diferenciadas, y se leen hacia arriba desde el fondo del tubo, según la escala mostrada en la Tabla 9. Tabla 9 Volumen (mL)
División de la Escala (mL)
0-3
0,1
3-5
0,5
5-10
1,0
10-25
5,0
25-50
25,0
50-100
50,0
Procedimiento-Colocar 50,0 mL de benceno en cada uno de dos tubos de centrífuga y agregar a cada tubo 50,0 mL de aceite, entibiado, si fuera necesario, para reincorporar la estearina separada y mezclar minuciosamente a 25º. Tapar con firmeza los tubos y agitarlos enérgicamente hasta que el contenido se mezcle minuciosamente y sumergir los tubos en un baño de agua a 50º durante 1O minutos. Centrifugar durante 1O minutos. Leer el volumen combinado de agua y sedimento en el fondo de cada tubo. Centrifugar repetidamente en períodos de 1O minutos hasta que el volumen combinado de agua y sedimento permanezca constante en 3 lecturas consecutivas. La suma de los volúmenes de agua y sedimento combinados en los dos tubos representa el porcentaje, en volumen, de agua y sedimento en el aceite.
ÍNDICE DE ANISIDINA El Índice de Anisidina se define como 100 veces la densidad óptica medida en una celda de 1 cm de una solución que contiene 1 g de la sustancia a examinar en 100 mL de una mezcla de disolventes y reactivos, según el método que se describe a continuación. [NOTA-Realizar las operaciones lo más rápidamente posible, evitando la exposición a la luz actínica.] Solución de Prueba A-Disolver 0,500 g de la sustancia a examinar en isooctano y diluir con el mismo disolvente hasta 25,0 ml. Solución de Prueba B-Agregar 1,0 mL de una solución de 2,5 g/L de p-anisidina en ácido acético glacial a 5,0 mL de la Solución de Prueba A, agitar y almacenar protegida de la luz. Solución Estándar-Agregar 1,0 mL de una solución de 2,5 g/L de p-anisidina en ácido acético glacial a 5,0 mL de isooctano, agitar y almacenar protegida de la luz. Procedimiento-Medir la absorbancia de la Solución de Prueba A a 350 nm usando isooctano como blanco. Medir la absorbancia de la Solución de Prueba B a 350 nm, exactamente 1O minutos después de su preparación, usando la Solución Estándar como el líquido de compensación. Calcular el Índice de Anisidina a partir de la expresión:
Pruebas Químicas/ (401) Grasas y Aceites Fijos 335
USP 39
Resultado= [25 x (1,2A 5 - A8)]/m A5 = absorbancia de la Solución de Prueba B a 350 nm A8 = absorbancia de la Solución de Prueba A a 350 nm m = peso de la sustancia a analizar en la Solución de Prueba A (g)
ÍNDICE DE OXIDACIÓN TOTAL (TOTOX) El Índice de Oxidación Total se define: Resultado = 2PV + AV
PV = Índice de Peróxido AV= Índice de Anisidina
TRAZAS DE METALES Aparato El aparato generalmente consiste en lo siguiente: Matraces de Digestión-Usar un matraz de politetrafluoroetileno con un volumen de aproximadamente 120 ml, equipado con un tapón impermeable, una válvula para ajustar la presión en el interior del recipiente y un tubo de politetrafluoroetileno para permitir la liberación de gas. Sistema-Cerrar los matraces de forma impermeable usando la misma fuerza de torsión para cada uno de ellos. Horno de Microondas-Tiene una frecuencia de magnetrón de 2450 MHz, con una potencia de salida seleccionable de O a 630 ± 70 vatios en incrementos de 1%, una computadora digital programable, una cámara de microondas recubierta con politetrafluoroetileno con un ventilador para extracción con velocidad variable, un sistema de transmisión con plato giratorio y tubos de escape para permitir la salida de humos. Espectrómetro de Absorción Atómica-Equipado con una lámpara de cátodo hueco como fuente de radiación y una lámpara de deuterio como corrector de fondo. El sistema se equipa con lo siguiente: 1. Un horno de grafito como el dispositivo de atomización para cadmio, cobre, hierro, plomo, níquel y cinc. 2. Un sistema automatizado de generación de vapores de hidruros de flujo continuo para arsénico y mercurio.
Procedimiento General Precaución-Cuando se usan vasos de digestión de alta presión cerrados y equipo de laboratorio de microondas, se deben seguir las precauciones e intrucciones de operación y seguridad suministradas por el fabricante. [NOTA-Si se utiliza un aparato alternativo, es posible que se requiera ajustarle los parámetros.]
Limpieza-Limpiar todo el material de vidrio y el equipo de laboratorio con una solución de 1O mg/ml de ácido nítrico antes de usarlo. Ácido Nítrico Libre de Trazas de Metal-El ácido nítrico cumple con los requisitos cuando los valores máximos para arsénico (As), cadmio (Cd), cobre (Cu), hierro (Fe), mercurio (Hg), plomo (Pb), níquel (Ni) y cinc (Zn) son iguales a 0,005; 0,005; 0,001; 0,02; 0,002; 0,001; 0,005 y 0,01 ppm, respectivamente. Ácido Clorhídrico Libre de Trazas de Metal-El ácido clorhídrico cumple con los requisitos cuando los valores máximos para As, Cd, Cu, Fe, Hg, Pb, Ni y Zn son iguales a 0,005; 0,003; 0,003; 0,05; 0,005; 0,001; 0,004 y 0,005 ppm, respectivamente. Ácido Sulfúrico Libre de Trazas de Metal-El ácido sulfúrico cumple con los requisitos cuando los valores máximos para As, Cd, Cu, Fe, Hg, Pb, Ni y Zn son iguales a 0,005; 0,002; 0,001; 0,05; 0,005; 0,001; 0,002 y 0,005 ppm, respectivamente. Solución Madre de Prueba-Colocar en un matraz de digestión aproximadamente 0,5 g de aceite graso, pesados con exactitud, según se indica en cada monografía individual. Agregar 6 ml de Ácido Nítrico Libre de Trazas de Metal y 4 ml de Ácido Clorhídrico Libre de Trazas de Metal. Cerrar el matraz. Solución Madre del Blanco-Mezclar 6 ml de Ácido Nítrico Libre de Trazas de Metal y 4 ml de Ácido Clorhídrico Libre de Trazas de Metal en un matraz de digestión. Solución de Prueba 1-Colocar el matraz de digestión que contiene la Solución Madre de Prueba en el horno de microondas. Llevar a cabo la digestión en tres etapas, según el siguiente programa: 80% de potencia durante 15 minutos, 100% de potencia durante 5 minutos y 80% de potencia durante 20 minutos. Al final del ciclo, dejar que el matraz se enfríe. Agregar 4 ml de Ácido Sulfúrico Libre de Trazas de Metal al matraz. Repetir el programa de digestión. Después de completar la digestión, dejar que el matraz se enfríe a temperatura ambiente. Abrir el matraz de digestión y transferir la solución transparente e incolora obtenida a un matraz volumétrico de 50 ml. Enjuagar el matraz de digestión dos veces, cada una con 15 ml de agua, y recoger los enjuagues en el matraz volumétrico. Agregar 1,0 ml de una solución de 1O mg/ml de nitrato de magnesio y 1,0 ml de una solución de 100 mg/ml de fosfato diácido de amonio al matraz volumétrico. Diluir con agua a volumen y mezclar. La solución resultante es la Solución de Prueba 7.
336 (401) Grasas y Aceites Fijos/ Pruebas Químicas
USP 39
Solución Blanco 1-Colocar el matraz de digestión que contiene la Solución Madre del Blanco en el horno de microondas. Proceder según se indica en Solución de Prueba 7, comenzando donde dice "llevar a cabo la digestión en tres etapas, según el siguiente programa". Calibración Directa- [NOTA-Las concentraciones de las soluciones estándar dependerán de los contenidos de metal de la sustancia de prueba.] Para mediciones de rutina, se preparan y examinan tres soluciones estándar, la Solución Blanco 7 y la Solución de Prueba 7. Emplear la Solución de Prueba 7 y la Solución Blanco 7 preparadas según se indica anteriormente o según se indica en la monografía. Preparar no menos de 3 soluciones estándar que contengan todos los metales a analizar. El valor de absorbancia esperado en la Solución de Prueba 7 para cada metal deberá estar comprendido dentro del intervalo de absorbancia calibrado correspondiente, de preferencia en la parte media de dicho intervalo. Cualquier reactivo usado en la preparación de la Solución de Prueba 7 se agrega en la misma concentración en las soluciones estándar. Introducir cada una de las soluciones en el instrumento usando el mismo número de repeticiones para cada una de las soluciones para obtener una lectura estable. Preparar una curva de calibración a partir de la media de las lecturas obtenidas con las soluciones estándar, graficando las medias en función de la concentración. Determinar la concentración del elemento en la Solución de Prueba 7 a partir de la curva obtenida. Estándar Agregado-Agregar volúmenes iguales de la Solución de Prueba 7, preparada según se indica anteriormente o según se indica en la monografía, a por lo menos cuatro matraces volumétricos idénticos. Agregar a todos los matraces menos a uno volúmenes progresivamente mayores de una solución estándar que contenga una concentración conocida del elemento de prueba para obtener una serie de soluciones con concentraciones crecientes de manera estable del elemento que se sabe produce respuestas en la parte lineal de la curva. Diluir el contenido de cada matraz con el disolvente especificado en la monografía a volumen y mezclar. Etiquetar el matraz sin el estándar adicionado como la solución de prueba. Introducir cada una de las soluciones en el instrumento, usando el mismo número de repeticiones para cada una de las soluciones, para obtener una lectura estable. Graficar las absorbancias de las soluciones estándar y de la solución de prueba en función de la cantidad agregada del elemento de prueba. [NOTA-La solución de prueba debe graficarse como si tuviera un contenido del elemento de prueba agregado equivalente a O mg o µg]. Extrapolar la línea uniendo los puntos en la gráfica hasta que se encuentre con el eje de concentración. La distancia entre este punto y la intersección de los ejes representa la concentración del elemento de prueba en la solución de prueba.
Pruebas Específicas CADMIO (CD), COBRE (cu), HIERRO (FE), PLOMO (PB), NÍQUEL (NI) y CINC (ZN) Solución Madre del Estándar-Preparar una solución con concentraciones conocidas de 5 µg/mL de cada elemento de prueba. Soluciones Estándar-En tres matraces volumétricos idénticos de 1O mL, introducir 1O, 20 y 40 µL, respectivamente, de Solución Madre del Estándar. Agregar a cada matraz 5,0 ml de la Solución de Prueba 1, diluir con agua a volumen y mezclar. Solución de Prueba 2-En un matraz volumétrico de 1 O mL, agregar 5,0 mL de la Solución de Prueba 1, diluir con agua a volumen y mezclar. Solución Blanco 2-En un matraz volumétrico de 1O mL, agregar 5,0 ml de Solución Blanco 1, diluir con agua a volumen y mezclar. Procedimiento-Medir el contenido de Cd, Cu, Fe, Pb, Ni y Zn usando un espectrofotómetro de absorción atómica equipado con un horno de grafito adecuado. Determinar concomitantemente las absorbancias de la Solución Blanco 2, las Soluciones Estándar y Solución de Prueba 2 por lo menos tres veces cada una. El valor de absorbancia de la Solución Blanco 2 se resta del valor obtenido usando las Soluciones Estándar y la Solución de Prueba 2. Proceder según se indica en el método de Estándar Agregado en el Procedimiento General anterior. La Tabla 7O indica los parámetros instrumentales que pueden usarse. Tabla 10
Cd
Cu
Fe
Pb
NI
Zn
228,8
324,8
248,3
283,5
232
213,9
0,5
0,5
0,2
0,5
0,2
0,5
6
7
5
5
10
7
Temperatura de incineración (º)
800
800
800
800
800
800
Temperatura de atomización (º)
1800
2300
2300
2200
2500
2000
Encendido
Apagado
Apagado
Apagado
Apagado
Apagado
3
3
3
3
3
3
Longitud de onda (nm) Ranura (nm) Corriente de la lámpara (mA)
Corrector de fondo Flujo de nitrógeno (L/min)
Pruebas Químicas/ (401) Grasas y Aceites Fijos 337
USP 39
ARSÉNICO Y MERCURIO Medir el contenido de arsénico y mercurio contra sus soluciones estándar de arsénico o mercurio a una concentración conocida empleando el método de Calibración Directa de la sección Procedimiento General anterior, con un sistema automatizado de generación de vapores de hidruros de flujo continuo. Para el límite de especificación de 1 ppm para arsénico y el límite de especificación de 1 ppm para mercurio, preparar tres soluciones de calibración de trabajo con concentraciones conocidas de aproximadamente 5, 1 O y 20 ng/ml, respectivamente, para cada elemento de prueba. El valor de absorbancia de Ja solución blanco se resta automáticamente del valor obtenido usando la solución de prueba. ArsénicoSolución Blanco 3-Agregar 1,0 ml de una solución de 200 mg/ml de yoduro de potasio a 19,0 ml de la Solución Blanco 7 preparada según se indica anteriormente. Dejar esta solución en reposo a temperatura ambiente durante aproximadamente 50 minutos o a 70º durante aproximadamente 4 minutos. Solución de Prueba 3-Agregar 1,0 ml de una solución de 200 mg/ml de yoduro de potasio a 19,0 ml de la Solución de Prueba 7 preparada según se indica anteriormente. Dejar esta solución en reposo a temperatura ambiente durante aproximadamente 50 minutos o a 70º durante aproximadamente 4 minutos. Reactivo Ácido 7: Ácido Clorhídrico Libre de Trazas de Metal Reactivo Reductor 7: Una solución de 6 mg/ml de tetrahidroborato de sodio en una solución de 5 mg/ml de hidróxido de sodio Se pueden utilizar los parámetros instrumentales de la Tabla 7 7. MercurioSolución Blanco 4-Proceder según se indica en Solución Blanco 3. Solución de Prueba 4-Proceder según se indica en Solución de Prueba 3. Reactivo Ácido 2: Una solución de 515 mg/ml de Ácido Clorhídrico Libre de Trazas de Metal Reactivo Reductor 2: Una solución de 1 O mg/ml de cloruro estannoso en una solución de 200 mg/ml de Ácido Clorhídrico Libre de Trazas de Metal Se pueden utilizar los parámetros instrumentales de la Tabla 7 7. Tabla 11 As
Hg
193,7
253,7
Ancho de ranura (nm)
0,2
0,5
Corriente de la lámpara (mA)
10
4
Velocidad de flujo del reactivo ácido (ml/min)
1,0
1,0
Velocidad de flujo del reactivo reductor (ml/min)
1,0
1,0
Velocidad de flujo para las soluciones blanco, estándar y de prueba (ml/min)
7,0
7,0
Celda de absorción
Cuarzo (calentado)
Cuarzo (sin calentar)
Corrector de fondo
Apagado
Apagado
0,1
0,1
Longitud de onda (nm)
Velocidad de flujo de nitrógeno (L/min)
COMPOSICIÓN DE ESTEROLES Separación de la Fracción de Esteroles Solución de Referencia A-Disolver una cantidad de colesterol, pesada con exactitud, en cloroformo para obtener una solución al 5% (p/v). Fase Móvil: Una mezcla de tolueno y acetona (95:5) o una mezcla de hexano y éter (65:35) Solución de Prueba A-Pesar con exactitud 5 g de la sustancia de prueba en un matraz de 250 ml. Agregar 50 ml de hidróxido de potasio alcohólico SR 2 (hidróxido de potasio alcohólico 2 N) y calentar hasta ebullición suave, agitando vigorosamente y de manera continua, hasta que ocurra la saponificación (la solución se torna transparente). Continuar calentando durante 20 minutos adicionales y agregar 50 ml de agua desde la parte superior del condensador. Enfriar el matraz hasta aproximadamente 30º. Transferir el contenido del matraz a un embudo de separación de 500 ml con varios enjuagues de agua, hasta un volumen total de aproximadamente 50 ml. Agregar aproximadamente 80 ml de éter, agitar vigorosamente durante aproximadamente 30 segundos y dejar que sedimente. [NOTA-Cualquier emulsión puede destruirse mediante el rociado de pequeñas cantidades de alcohol etílico o alcohol metílico.] Separar la fase acuosa inferior y recogerla en un segundo embudo de separación. Realizar de la misma forma dos extracciones adicionales en la fase de agua-alcohol, usando 60-70 ml de éter en cada ocasión. Combinar los extractos etéreos en un solo embudo de separación y realizar lavados con agua, de 50 ml cada uno, hasta que el agua de lavado no presente reacción alcalina frente a la fenolftaleína. Secar la fase etérea con sulfato de sodio anhidro y filtrar a través de sulfato de sodio anhidro recolectando en un matraz de 250 ml previamente pesado, lavando el embudo y filtrando con pequeñas cantidades de éter. Destilar el éter hasta que el contenido del matraz se reduzca a
338 (401) Grasas y Aceites Fijos/ Pruebas Químicas
USP 39
unos pocos mL y llevar a sequedad aplicando un ligero vacío o una corriente de nitrógeno. Completar el secado a 100º durante aproximadamente 15 minutos, luego pesar después de enfriar en un desecador. Disolver la materia insaponificable así obtenida en cloroformo para obtener una solución con una concentración de aproximadamente 5%. Solución de Prueba 8-Tratar 5 g de aceite de canola de la misma forma que se indica para la sustancia de prueba en Solución de Prueba A, comenzando donde dice "Agregar 50 mL de hidróxido de potasio alcohólico SR 2 (hidróxido de potasio alcohólico 2 N)". Solución de Prueba (-Tratar 5 g de aceite de girasol de la misma forma que se indica para la sustancia de prueba en Solución de Prueba A, comenzando donde dice "Agregar 50 mL de hidróxido de potasio alcohólico SR 2 (hidróxido de potasio alcohólico 2 N)". Procedimiento-Sumergir por completo en hidróxido de potasio alcohólico 0,2 N durante 1O segundos una placa de gel de sílice para cromatografía en capa delgada (ver Cromatografía (621 )), de 20 cm x 20 cm con un espesor de capa de 200 µm y un tamaño de partícula de 5-17 µm 1 sobre poliéster, luego dejar que se seque en una campana de extracción durante 2 horas y finalmente colocar a 100º durante 1 hora. [NOTA-Retirar del dispositivo de calentamiento validado y mantener la placa en un desecador hasta que se requiera su uso. Las placas deben usarse dentro de los 15 días. También se encuentran disponibles comercialmente placas para cromatografía en capa delgada que no requieren de preacondicionamiento]. Usar una placa individual para cada solución de prueba. Colocar en la cámara una mezcla de tolueno y acetona (95:5) o una mezcla de hexano y éter (65:35) hasta una profundidad de aproximadamente 1 cm. Cerrar la cámara con la cubierta apropiada y dejar en reposo durante al menos 30 minutos. Se pueden colocar tiras de papel de filtro sumergidas en el eluyente sobre las superficies internas de la cámara. [NOTA-La fase móvil debería reemplazarse para cada prueba para asegurar condiciones de elución reproducibles.] Aplicar 0,3 mL de Solución de Prueba A aproximadamente a 2 cm a partir del borde inferior formando una franja que sea lo más delgada y uniforme posible. Colocar 2-3 µL de Solución de Referencia A en un extremo de la placa, alineados con la franja. Desarrollar los cromatogramas en una cámara equilibrada con la Fase Móvil hasta que el frente de la fase móvil haya recorrido aproximadamente 1 cm desde el borde superior de la placa. Retirar la placa de la cámara de desarrollo y evaporar la fase móvil empleando una corriente de aire caliente [NOTA-Evitar el calor excesivo.] o dejando la placa bajo una campana durante un periodo corto. Rociar la placa con una solucion alcohólica de 2,7-diclorofluoresceína al 0,2% y examinar bajo luz UV a 254 nm. [NOTA-También se encuentran disponibles comercialmente placas previamente tratadas con indicador de UV y se usan en forma equivalente]. En cada una de las placas, marcar los límites de la banda de esteroles, identificada mediante su alineación con la mancha obtenida a partir de la Solución de Referencia A a lo largo de los bordes de la fluorescencia e incluir además el área de las zonas que se encuentran a 2-3 mm por encima y por debajo de las zonas visibles que corresponden a la Solución de Referencia A. Retirar el gel de sílice de las áreas marcadas y colocarlo en un embudo de filtración provisto de un septo poroso G3.2 Agregar 1O mL de cloroformo caliente, mezclar cuidadosamente con la espátula de metal, filtrar empleando vacío y recoger el filtrado en el matraz Erlenmeyer acoplado al embudo de filtración. Lavar el residuo en el embudo tres veces con éter, aproximadamente 1O mL cada vez, y recoger el filtrado en el mismo matraz acoplado al embudo. Evaporar el filtrado hasta un volumen de 4-5 mL, transferir la solución residual a un tubo de ensayo de 1O mL, previamente pesado, con fondo cónico y tapón de cierre hermético, y evaporar hasta sequedad mediante calentamiento moderado en una corriente suave de nitrógeno. Disolver el residuo en unas pocas gotas de acetona y evaporar de nuevo hasta sequedad. Colocar a 105º durante aproximadamente 1O minutos, dejar que se enfríe en un desecador y pesar. Tratar la Solución de Prueba By la Solución de Prueba C de la misma forma que se indica para la Solución de Prueba A.
Determinación de Esteroles Solución de Prueba O-Agregar al tubo de ensayo que contiene la fracción de esteroles separada de la sustancia de prueba mediante cromatografia en capa delgada, una mezcla preparada recientemente de piridina anhidra, hexametildisilazano y clorotrimetilsilano (9:3:1) [NOTA-Este reactivo también se encuentra comercialmente disponible y se utiliza de manera equivalente.], en una relación de 50 µL por cada mg de esteroles, evitando cualquier absorción de humedad. Tapar el tubo de ensayo y agitar cuidadosamente hasta disolver completamente los esteroles. Dejar en reposo durante al menos 15 minutos a temperatura ambiente y centrifugar durante unos pocos minutos si fuera necesario. Usar el sobrenadante. [NOTA-Es normal que se produzca una leve opalescencia y no causa anomalía. Sin embargo, la formación de un flóculo blanco o la aparición de un color rosado indica la presencia de humedad o el deterioro del reactivo. Si algo de esto ocurre, se debe repetir la prueba]. Solución de Referencia E-Agregar a 9 partes de los esteroles separados del aceite de canola mediante cromatografía en capa delgada, 1 parte de colesterol. Tratar la mezcla de la misma forma que se indica para la Solución de Prueba D. Solución de Referencia F-Tratar los esteroles separados del aceite de girasol mediante cromatografia en capa delgada de la misma forma que se indica para la Solución de Prueba D. Sistema Cromatográfico (ver Cromatografía (621 ))-Equipar el cromatógrafo de gases con un detector de ionización a la llama y una columna capilar de vidrio o de sílice fundida de 20-30 m de largo, con un diámetro interno de 0,25-0,32 mm, totalmente recubierta con una capa de fase estacionaria G27 o G36 de 0, 1O a 0,30 µm. Mantener la temperatura del inyector a 280º, la temperatura del detector a 290º y la temperatura de la columna a 260 ± 5º. El gas transportador es helio con una 1 2
Se puede obtener una placa para TLC de grado comercial en Sigma-Aldrich, Nº de catálogo zl 22785. Se puede obtener un producto comercial en Kimble/Kontes como un filtro buchner con disco sinterizado, Kimax 28400-1 52.
Pruebas Químicas/ (411) Valoración de Ácido Fólico 339
USP 39
velocidad lineal de 20-35 cm/s o hidrógeno con una velocidad lineal de 30-50 cm/s. Se usa una relación de partición de 1 :50 a 1 :100. Inyectar en el cromatógrafo Solución de Referencia Ey Solución de Referencia Fy registrar el cromatograma según se indica en Procedimiento: el tiempo de retención debería ser de 20 ± 5 minutos para fJ -sitosterol y todos los esteroles presentes deben estar separados. El cromatograma obtenido con la Solución de Referencia E presenta cuatro picos principales correspondientes a colesterol, brasicasterol, campesterol y fJ -sitosterol; y el cromatograma obtenido con la Solución de Referencia F presenta cuatro picos principales correspondientes a campesterol, estigmasterol, /J-sitosterol y L'l7-estigmastenol. Los tiempos de retención de los esteroles con referencia a fJ -sitosterol se indican en la Tabla 72. Tabla 12. Tiempos de Retención Relativos de Esteroles para Dos Columnas Diferentes Identificación
Columna G36
Columna G27
Colesterol
0,67
0,63
Brasicasterol
0,73
0,71
24-Metileno-colesterol
0,82
0,80
Campesterol
0,83
0,81
Campestanol
0,85
0,82
Estigmasterol
0,88
0,87
t...7-Campesterol
0,93
0,92
tJ.5,23-Estigmastadienol
0,95
0,95
Clerosterol
0,96
0,96
f3 -5itosterol
1,00
1,00
Sitostanol
1,02
1,02
!J.5-Avenasterol
1,03
1,03
!J.5,24-Estigmastadienol
1,08
1,08
t...7-Estigmastenol
1,12
1, 12
t...7-Avenasterol
1,16
1,16
Procedimiento-Inyectar por separado en el cromatógrafo volúmenes iguales (aproximadamente 1 µL) de Solución de Prueba O, Solución de Referencia E y Solución de Referencia F, registrar los cromatogramas y medir las áreas de los picos de esteroles. Calcular el porcentaje de cada esterol individual en la fracción de esteroles de la sustancia de prueba tomada: Resultado= 100 x (AIS) A= área del pico debido al componente de esteroles a determinar S = suma de las áreas de los picos debidos a los componentes indicados en la Tabla 12
Cambio en la redacción:
"
,,.
,,.
.. (411) VALORACION DE ACIDO FOLICO INTRODUCCIÓN Los siguientes procedimientos de cromatografía de líquidos se usan para la determinación de ácido fólico como un ingrediente farmacéutico activo, un ingrediente de suplemento dietético o un componente de suplementos dietéticos o de formas farmacéuticas. Durante estos procedimientos, proteger de la atmósfera y la luz las soluciones que contengan y se deriven de la muestra de prueba y los Estándares de Referencia, de preferencia usando material de vidrio con protección actínica. VALORACIÓN • PROCEDIMIENTO 1
Este procedimiento se puede usar para determinar ácido fólico en los siguientes artículos: •Tabletas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales • Cápsulas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales •Tabletas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles • Cápsulas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles •Tabletas de Vitaminas Hídrosolubles con Minerales • Cápsulas de Vitaminas Hidrosolubles con Minerales •Tabletas de Vitaminas Hidrosolubles • Cápsulas de Vitaminas Hidrosolubles
340 (411 > Valoración de Ácido Fólico / Pruebas Químicas
USP 39
Este procedimiento implica la extracción de analitos de la formulación usando una Solución de estándar interno que contenga metilparabeno, hidróxido de tetrabutilamonio y ácido pentético en solución amortiguadora de fosfato alcohólica y mediante agitación mecánica para liberar los analitos de las matrices. A menos que se especifique de otro modo en las monografías individuales, las soluciones reactivo, la Solución de estándar interno, lo Solución estándar y las Soluciones muestra se preparan según se indica a continuación. Reactivo A: Solución de hidróxido de tetrabutilamonío al 25% en metano! Reactivo B: Transferir 5,0 g de ácido pentético a un matraz volumétrico de 50 mL. Usando ultrasonido si fuera necesario, disolver y diluir con hidróxido de sodio 1 Na volumen. Fase móvil: 2 g de fosfato monobásico de potasio en 650 ml de agua. Agregar 12,0 ml de Reactivo A, 7,0 ml de ácido fosfórico 3 N y 240 ml de metano!. Enfriar a temperatura ambiente, ajustar con ácido fosfórico o amoniaco SR a un pH de 7,0, diluir con agua hasta 1000 mL y filtrar. Volver a verificar el pH antes de usar agregando agua o metano! a fa Fase móvil preparada para obtener la separación de ácido fólico y el estándar interno a la altura de la línea de base. El pH puede aumentarse hasta 7, 15 para obtener una mejor separación. [NOTA-El contenido de metano! y de agua puede modificarse (1 o/o-3%).J Solución de estándar interno: Transferir 40 mg de metilparabeno a un matraz volumétrico de 1000 mL y agregar 220 mL de metano! para disolver. Disolver 2,0 g de fosfato monobásico de potasio en 300 mL de agua en un vaso de precipitados separado, transferir cuantitativamente esta solución al matraz que contenga la solución de metílparabeno y agregar 300 ml adicionales de agua. Agregar 19 ml de Reactivo A, 7 ml de ácido fosfórico 3 N y 30 ml de Reactivo B. Ajustar con amoniaco SR a un pH de 9,8, burbujear nitrógeno a través de la solución durante 30 minutos, díluír con agua a volumen y mezclar. Solución estándar: 0,016 mg/ml de ER Ácido Fólico USP en la Solución de estándar interno Solución muestra para Tabletas: Triturar no menos de 30 Tabletas hasta reducirlas a polvo fino. Transferir una porcíón de polvo, equivalente a 0,4 mg de ácido fólico, a un tubo de centrífuga de color ámbar de 50 mL. Agregar 25,0 ml de So/Ución de estándar interno, agitar mecánicamente durante 1O minutos y centrifugar. Filtrar una porción del sobrenadante transparente y usar el filtrado. Solución muestra para Cápsulas: Pesar no menos de 20 Cápsulas en un frasco de pesada tarado. Abrir las Cápsulas, sin perder el material de la cubierta, y transferir el contenido a un vaso de precipitados de 100 ml. Retirar todo el contenido adherido a las cubiertas de las Cápsulas vacías lavando, si fuera necesario, con varias porciones de éter. Desechar los lavados y secar las cubiertas de las Cápsulas con ayuda de una corriente de aire hasta que deje de percibirse el olor a éter. Pesar las cubiertas de las cápsulas vacías en el frasco de pesada tarado y calcular el peso neto promedio por Cápsula. Transferir una cantidad del contenido de las Cápsulas a un tubo de centrífuga adecuado y agregar un volumen de Solución de estándar interno para obtener una concentración de 0,016 mg/ml de ácido fólico. Agitar mecánicamente durante 1O minutos y centrifugar. Filtrar una porción del sobrenadante transparente y usar el filtrado. Sistema cromatográflco (l/er Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.) Modo: HPLC Detector: UV 280 nm Columna: 4,6 mm x 25 cm; relleno L1 Velocidad de flujo: 1 mL/min Volumen de Inyección: 15 µL Aptitud del sistema Muestra: Solución estándar [NOTA-Los tiempos de retención relativos para ácido fólico y metilparabeno son aproximadamente 0,8 y 1,0, respectivamente.] Requisitos de aptitud Desviación estándar relativa: No más de 3,0% Análisis Muestras: Solución estándary Solución muestra correspondiente Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de ácido fólico (C 19 H19 N70 6) en la porción de Muestra tomada: Resultado= (Ruf Rs) x (C5/Cu) x 100 Ru
R5 C5
Cu
=cociente de estándar interno {respuesta del pico de ácido fólico/respuesta del pico del estándar interno) de la Solución muestra correspondiente = cociente de estándar interno (respuesta del pico de ácido fólico/respuesta del pico del estándar .interno) de la Solución estándar = concentración de ER Ácido Fólico USP en la Solución estándar (µg/mL) =concentración nominal de ácido fólico en la Solución muestra correspondiente (µg/mL)
• PROCEDIMIENTO 2
Este procedimiento se puede usar para determinar el ácido fólico en los siguientes artículos: • Tabletas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolub!es con Minerales •Cápsulas de Vitaminas Oleosolubtes e Hidrosolubles con Minerales
USP 39
Pruebas Químicas / (411 ) Valoración de Ácido Fólico 341
• Tabletas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles • Cápsulas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles •Tabletas de Vitaminas Hidrosolubles con Minerales •Cápsulas de Vitaminas Hidrosolubles con Minerales •Tabletas de Vitaminas Hidrosolubles •Cápsulas de Vitaminas Hidrosolubles Este procedimiento implica la extracción de analitos de la formulación usando una solución de extracción que contenga una mezcla de edetato disódico e hidróxido de amonio o una mezcla de metanol, ácido acético glacial y etilenglicol, y mediante agitación mecánica para liberar los analitos de las matrices. A menos que se especifique de otro modo en las monografías individuales, la solución reactivo, el Diluyente, la Solución madre del estándar, las Soluciones estándar y las Soluciones muestra se preparan según se indica a continuación. Reactivo: Disolver 7,5 g de edetato disódico, mezclando, en 500 ml de agua que contenga lO ml de hidróxido de amonio. Diluyente: 60 µg/ml.de hidróxido de amonio Fase móvil: Transferir 0,4 ml de trietilamina, 15 ml de ácido acético glacial y 350 ml de metano! a .un matraz volumétrico de 2000 mL, y diluir con 1-hexanosulfonato de sodio 0,008 M a volumen. Solución madre del estándar: 60 µg/ml de ER Ácido Fólico USP en Diluyente. Preparar esta solución a diario. Solución estándar para Tabletas: Mezclar 5,0 ml de Solución madre del estándar con 10,0 ml de metano! y 35,0 ml de Reactivo. Agitar durante 15 minutos en un baño de agua mantenido a 60° y enfriar. Filtrar, desechando los primeros ml del filtrado. Solución estándar para Cápsulas: Mezclar 5,0 ml de Solución madre del estándar con 10,0 mL de una mezcla de metano! y ácido acético glacial (9:1) y 30,0 ml de una mezcla de metanol y etilenglicol (1 :1). Agitar durante 15 minutos en un baño de agua mantenido a 60º y enfriar. Filtrar, desechando los primeros mL del filtrado. Solución muestra para Tabletas: Transferir una porción de Tabletas reducidas a polvo fino, equivalente a 0,3 mgde ácido fólico, a un matraz de 125 ml con tapón. Agregar 10,0 ml de metano! y 35,0 ml de Reactivo. Agitar durante 15 minutos en un baño de agua mantenido a 60º y enfriar. Filtrar, desechando los primeros mL del filtrado. Solución muestra para Cápsulas: Pesar no menos de 20 Cápsulas en un frasco de pesada tarado. Abrir las Cápsulas, Sin perder el material de la cubierta, y transferir el contenido a un vaso de precipitados de 100 ml. Retirar todo el contenido adherido a las cubiertas de las Cápsulas vacías lavando, si fuera necesario, con varias porciones de éteL Desechar los lavados y secar las cubiertas de las Cápsulas con ayuda de una corriente de aire hasta que deje de percibirse el olor a éter. Pesar las cubiertas de las cápsulas vacías en el frasco de pesada tarado y ca!Cular el peso neto promedio por Cápsula. Transferir una cantidad del contenido de las Cápsulas, equivalente a 0,3 mg de ácido fálico, a un matraz de 125 ml con tapón. Agregar 10,0 ml de una mezcla de metano! y ácido acético glacial (9:1) y 30,0 ml de una mezcla de metanol y etílenglicol (1 :1 ). Agitar durante 15 minutos en un baño de agua mantenido a 60º y enfriar. Filtrar, desechando los primeros ml del filtrado. Sistema cromatográfico (Ver Cromatografía (621 }, Aptitud del Sistema.) Modo: HPLC Detector: UV 270 nm Columna: 4,6 mm x 25.cm; relleno L7 Temperatura de la columna: 50º Velocidad de flujo: 2 ml/min Volumen de Inyección: 5 µL Aptitud del sistema Muestra: Solución estándar Requisitos de aptitud Desviación estándar relativa: No más de 2,0% Análisis Muestras: Solución estándar correspondiente y Solución muestra correspondiente Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de ácidofólico (C19 H19 N,0 6 ) en la porción de Muestra tomada: Resultado= (ruf r5) x (Cs!Cu) x 100 ru r5 C5 Cu
= respuesta del pico de ácido fólico de la Solución muestra correspondiente
= respuesta del pico de ácido fálico de la Solución estándar correspondiente = concentración de ER Ácido Fálico USP en la Solución estándar corresp0ndiente (µg/ml)
= concentración nominal de ácido fálico en la Solución muestra correspondiente (µg/ml)
• PROCEDIMIENTO 3
Este procedimiento se puede usar para determinar el ácido fálico en los siguientes artículos: • Ingrediente farmacéutico activo • Ingrediente dietético Este procedimiento implica la disolución de analitos y estándar interno en Fase móvil.
342 (411) Valoración de Ácido Fálico/ Pruebas Químicas
USP 39
A menos que se especifique de otro modo en las monografías individu(!les, las soluciones reactivo, la Solución de estándar interno, la Sólución mar:Jre del e$tándar, la Solución estándar, la Solución mádre de la muestra y la Solución muestra se preparan según se indica a continuación. Ácido fosfórico 3 N: 98 g/L de ácido fosfórico en agua Hidróxido de amonio 6 N: Diluir 40 ml de hidróxido de amonio con agua hasta 100 mL. Fa$e.móvU: Transferir2,0g de fosfato monobásico de potasio a un matraz volumétrico del OOOmL y disolver en 650 ml de agua, Agregar 15,0 mt de una soluqiónde hidróxido de tetrabutilamonio 0,5 M en metano!, 7,0 ml de Ác(do fosfórico J N y270 ml de metano!: Enfriar atemperatura ambiente, aju$tar con Ácido fosfórico JN o Hidróxidó de amónio 6N a un pH de 5,0 y diluir con agua a volumen. Volver a verificar el pH antes de usar. Solución de estándar interno: 2 mg/mL de metilparabenó enFase móvil. Disolver el metHparabeno primero con metanol (aproximadarnente4% del volumen final)ydih,iir con Fase móvil a volumen. Solüi:ión madre del estándar: 1 mg/rnl de ER Áddó Fólicó USP en Fase móvil. Disolver el ácido fólico con ayuda de hidróxido de amonio al 10% (aproximadamente lo/o del volumen final) y diluir con Fase móvil a volumen. Solución estándar: Transferir 4,0 ml de Solución madre del estándar y 4,0 rnlde Solución de estándar interno a un matraz volumétrico de 50 ml y diluir con Fase móvíl a volumen. Solución madre de la muestra: Transferir 100 mg de ácido fólko a un matraz volumétrico de 100 mL y dísolver en 40 ml de Fase móvíl y1 ml de hidróxido de amonio al 10%.. Diluir con Fase móvíl a volumen. Soludón muestra: Transferir 4,0 ml de Solución madre de la muestra y 4,0 ml de Solución de estándar interno a un matraz volumétrico deSOmLy dilllir con Fase móvil a volumen. Sistema cromatográfico
<25 cm¡relleno L1 Velocidad de flujo: l,2ml/min Volumen de Inyección: 1O µL Aptitud del sistema Muestra: Solución estándar Requisitos de·aptitud Resolución: No menos de 3,6 entre metilparabenoyácido fólico Desviadón estándar relativa: No más de 2,0% para los cocientes de respuesta entre los picos de ácido fólico y están" dar interno Análisis Muestras: Solución estándar y Solución .muestra Calcular el porcentaje de ácido fálico (C19 H19 N70 6) en la porción de Muestra tomada: Resultado= (Ruf Rs) x (CsfCu)x 100
Ru R5 C5 Cu
=cociente de estándar interno (respuesta del pico de ácido fálico/respuesta del pico deLestándar interno) dela Solución muestra = cociente de estándar interno (respuesta del pico de ácido fólico/respuesta del pico del estándar interno) de. la Solución estándar = concentración de ER Ácido Fólico USP en la Solución madre del estándar (mg/rnl) =concentración de ácido fólico en la Solucíón madre de la muestra(mg/ml)
• PROCEDIMIENTO 4
Este procedimiento se puede usar para determinar el ácido fólico en los siguientes artículos: •Tabletas de ÁcidoJÓlico •Inyección de Ácido Fólico E~te procedimiento implica la disoludón de analitos en un Diluyente que contenga 2 ml de hidróxido de amonio y lg de perclorato de sodio porcada 100 mL de agua. A menos que se especifique de. otro modo en las monog rañas individuales, preparar el Diluyente, la Soludón de aptitud del sístemCI, la Solución estándaryla$ Soluciones .muestra según seihdica a continuación. Fase móvil: Transferir 35,l g de perdorato de sodio y lAO g de fosfató monobásko de potasio a un matraz \lol\,lmétrico de 1 litro. Agregar 7,0 mL de hidróxido de potasio l Ny40 ml de metanól, diluir con agua a volumen y mezclar. Ajustar con hidróxido de potasio 1 N o ácido fosfórico .uh pH de 7,2. Diluyente: SolUción acuosa que contenga 2mlde. hidróxido de>arnonioy 1 g de perclotáto de sodio por cada 1oo mL Solución de aptitud del sistema: 0,.2 mg/mLdeERÁcido.FólicoUSPy de ERCompuesto ReladonadoA de Ácido Fólico \,.JSP en Diluyente, [NotA.,._Antes de usar, pasar a través de un filtro con un tamaño de poro del µm o menor.] Solución estándar: 0,20 mg/mL de ERÁcido .F<)li<;o USP enDífuyénte SolUción muestra .para Tabletas: Equivalente a 0,2 mg/ml de ácido fólko, a partk de no menos de 20 Tabletas reducidas polvo en Diluyente. Agitar suavemente parafacilitélr la disolución y filtrar, desechando lós primeros mL del filtrado.
a
a
Pruebas Químicas/ (413) Análisis de Impurezas en Gases Medicinales 343
USP 39
Diluir con Diluyente un volumen de Inyección medido con exactitud, cuantitativamente y en diluciones sucesivas, hasta obtener una solución con una concentración cercana a la de la Solución estándar y entre
Solución muestra para Inyección:
0,20 y 0,80 mg/ml. Sistema cromatográfico
0fer Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.) Modo: HPLC Detector: UV 254 nm Columna: 4,6 mm x 25 cm; relleno L1 Velocidad de flujo: 1 mL/min Volumen de Inyección: 25 µL Aptitud del sistema Muestras: Solución de aptitud del sistema y Solución estándar Requisitos de aptitud Resolución: No menos de 3,6 entre compuesto relacionado A de ácido fólico y ácido fólico,
Solución de aptitud del sís·
tema Desviación estándar relativa: No más de 2,0%, Solución estándar Análisis Muestras: Solución estándar y Solución muestra correspondiente
Calcular el porcentaje de ácido fólico (C 19 H19 NP6) en la porción de Tabletas tomada: Resultado= (ruf r5) x (Csf Cu) x 100
ru r5 C5 Cu
= respuesta del pico de ácido fólico de la Solución muestra para Tabletas = respuesta del pico de ácido fólico de la Solución estándar = concentración de ER Ácido Fólico USP en la Solución estándar (mg/ml) =concentración nominal de ácido fálico en la Solución muestra para Tabletas (mg/ml) Calcular la cantidad, en mg, de ácido fólico (C 19H19 NP 6) en cada mL de Inyección tornado:
Resultado= (ruf r5) x (C5/Vu) x V
ru r5 ( 5
Vu V
= respuesta del pico de ácido fólico de la Solución muestra para Inyección = respuesta del pico de ácido fólico de la
Solución estándar
= concentración de ER Ácido Fálico USP en la Solución estándar (mg/mL) = volumen de Inyección tomado para preparar la Solución muestra para Inyección (rnl) "" volumen total usado para diluir la Inyección (mL)
REQUISITOS ADICIONALES • ESTÁNDARES DE REFERENCIA
USP (11)
ER Ácido Fólico USP ER Compuesto Relacionado A de Ácido Fólico USP Formiltetrahidrofolato de calcio. í>.USP39
(413) ANÁLISIS DE IMPUREZAS EN GASES MEDICINALES INTRODUCCIÓN El presente capítulo de prueba general define los medios seguros y apropiados para el muestreo de envases de gases a alta presión conteniendo distintas composiciones de gases medicinales usando tubos detectores de acuerdo con las monografías USP, y utilizando el volumen total de gas recomendado por el fabricante del tubo detector. Ver Reactivos en la sección Reactivos, Indicadores y Soluciones para información sobre cada tubo detector referido. En la actualidad se fabrican dos tipos de tubos detectores: aquellos que se utilizan con una bomba manual de volumen fijo (p.ej., 100 ml/bombeo) y aquellos que se usan en un sistema de flujo continuo que se puede ajustar para pasar un volumen de gas a través del tubo detector a aproximadamente 1 atmósfera. Es importante usar un tipo de tubo detector que corresponda con el modo de intercambio de volumen de gas. Para asegurar el paso del volumen de gas requerido a través del tubo detector, medir el volumen de gas al momento del análisis usando una bomba manual o un caudalírnetro calibrado para el gas que se analiza o corregido mediante un gráfico de calibración. Los fabricantes de caudalímetros por lo general proveen gráficos de volumen de flujo para gases comunes con ca-
344 (413) Análisis de Impurezas en Gases Medicinales/ Pruebas Químicas
USP 39
da uno de los tubos identificados en este capítulo general. [NOTA-Ver el capítulo general Valoración de Gases Medicinales (415) para el muestreo.]
SISTEMA DE FLUJO CONTINUO Identificar el gas contenido en el envase y seleccionar el regulador de gas apropiado. Conectar el regulador al envase del gas. No aplicar lubricante o cinta de Teflón a las conexiones entre el envase y el regulador. Purgar el regulador con el gas en análisis. Ajustar el nivel del flotador para obtener Ja velocidad de flujo adecuada a fin de lograr el volumen total de gas recomendado por el fabricante. Acoplar el tubo detector, Juego ajustar la velocidad de flujo al nivel requerido, según se indica en los gráficos que acompañan al caudalímetro y al tubo detector. Cronometrar para alcanzar el volumen total de gas requerido ±1 O segundos al flujo fijado. En el tiempo establecido, cerrar Ja válvula del regulador y luego Ja válvula principal del envase. Observar el tubo mientras continúe conectado para determinar el grado de cambio de color y registrar el resultado. Retirar el tubo y desconectar el aparato, equilibrar la presión de gas en el regulador permitiendo que el gas se libere a Ja atmósfera y desconectar el regulador del envase. Desechar el tubo después de su uso.
BOMBA MANUAL DE VOLUMEN FIJO El método alternativo consiste en aplicar Ja bomba manual detectora de gases. El sistema extrae un volumen constante con cada bombeo. Para asegurar Ja exactitud del volumen total de gas, el usuario debe seguir las recomendaciones de bombeo sugeridas por el fabricante de Ja bomba.
(415) VALORACIÓN DE GASES MEDICINALES Cambio en 1a·redaccJ6n:
INTRODUCCIÓN Las monografías de gases medicinales USP tienen como propósito evaluar la pureza de un gas usado para tratamiento médico o como componente de un proceso farmacéutico. En general, la pureza se evalúa mediante una valoración del contenido del artículo y mediante análisis de trazas de impurezas. La aplicación de cromatografía de gases, análisis paramagnético y tubos detectores para gases medicinales varía con respecto a los procedimientos tradicionales usados para analitos en fase líquida y, por lo tanto, requiere de una descripción separada. Este capítulo de pruebas generales se centra en Ja valoración para pruebas de contenido. El muestreo de impurezas se trata en el capítulo general Análisis de Impurezas en Gases Medicinales (41 3). Este capítulo incluye los aspectos relacionados con el muestreo y la calificación para el análisis por cromatografía de gases y análisis paramagnético de gases medicinales. Asimismo, este capítulo incluye una descripción de Ja configuración, validación y calibración iniciales de estos instrumentos. Los procedimientos específicos de valoración se definen en la monografía específica para cada gas. Las definiciones básicas sobre calificación y validación instrumental se incluyen en los capítulos de información general Calificación de Instrumentos Analíticos (1058) y •.Vafídación de Procedimieilros Farmacopeicos (1225),• {AFOJ-may-tm 6¡ respectivamente, por lo que no se repiten en este capítulo. No obstante, cuando debido a la naturaleza del analito se requieran variaciones de los materiales presentados en los capítulos mencionados, tales variaciones serán definidas en este capítulo.
MÉTODOS Cromatografía de Gases (GC) Ver Cromatografía (621 ).
Detectores para Valoración de Gases Medicinales Los dos detectores más comunes usados en Jos análisis de gases medicinales son el detector de conductividad térmica (TCD, por sus siglas en inglés) y el detector de ionización a la llama (FID, por sus siglas en inglés). El TCD detectará cualquier gas o vapor que tenga una conductividad térmica que difiera significativamente de la alta conductividad térmica del gas de referencia, por lo regular helio, y por lo tanto, es prácticamente universal. Sin embargo, el límite de detección más bajo generalmente aceptado para el TCD es 50 ppm v/v. Esto representa una limitación para Ja evaluación de trazas de impurezas en gases medicinales.
USP 39
Pruebas Químicas/ (415) Valoración de Gases Medicinales 345
El FID también se usa para la evaluación de trazas de impurezas en gases medicinales, debido a que es más sensible a compuestos orgánicos pero no produce señales para los gases medicinales más comunes.
CALIFICACIÓN Calificación de la Instalación (IQ, por sus siglas en inglés) Los requisitos de la IQ aseguran que el hardware y el software (o dispositivo de lectura) del cromatógrafo de gases se instale de manera segura y de acuerdo con las instrucciones del fabricante del Cromatógrafo de Gases. Se debe tener en cuenta lo siguiente según sea aplicable: •Aptitud del sistema de la muestra (incluyendo conexiones); • Fugas (debe estar exento de fugas); • Muestreo representativo; •Velocidad de flujo de la muestra; • Tiempo de respuesta; • Señales de encendido correcto; • Suministro de energía (incluyendo regulación de voltaje); y • Condiciones ambientales apropiadas del instrumento y de la muestra misma (p.ej., temperatura y presión).
Calificación Operativa (OQ, por sus siglas en inglés) La OQ verifica que el desempeño del Cromatógrafo de Gases sea el previsto dentro de su intervalo de operación esperado. Para el análisis de producto final del gas medicinal, el Cromatógrafo de Gases se prueba para asegurar la repetibilidad (verificación de que la desviación estándar relativa se corresponde con lo declarado) para cada analito de interés. Debido a la naturaleza específica del análisis de gases medicinales y al número limitado de analitos, en lugar de la OQ inicial o periódica, se pueden usar la calibración de rutina y la verificación de calibración periódica del Cromatógrafo de Gases, así como el procedimiento de análisis. Cuando un instrumento se usa para un rango más amplio de analitos, resulta inapropiado realizar la calibración y la verificación de calibración periódica en lugar de la OQ.
Calificación de Desempeño (PQ, por sus siglas en inglés) Para el análisis de producto final de los gases medicinales, el Cromatógrafo de Gases se verifica de manera periódica en intervalos apropiados durante los análisis con un gas de calibración (es decir, verificando que los resultados se correspondan con una determinada concentración en un intervalo de exactitud y precisión aceptables después de un número específico de inyecciones de la muestra).
Medición Paramagnética de Oxígeno TEORÍA El analizador paramagnético mide el desplazamiento de un gas diamagnético (nitrógeno) ocasionado por un gas paramagnético (oxígeno), en un campo magnético fuerte. Una celda de medición por lo general emplea dos esferas de vidrio conectadas por un tubo rellenas de nitrógeno, que se suspenden sobre una cinta de torsión entre imanes que concentran el flujo alrededor de las esferas de vidrio. Cuando las moléculas de oxígeno ingresan a la celda de medición, las esferas de vidrio se mueven por la fuerza ejercida por las moléculas de oxígeno, que son atraídas a la parte más fuerte del campo magnético. Mediante el uso de sensores ópticos, una bobina de retroalimentación y aparatos electrónicos adecuados, los analistas miden una respuesta que es directamente proporcional a la presión parcial de oxígeno. El oxígeno es el único gas paramagnético de la atmósfera que se encuentra por encima de los niveles de trazas. No obstante, los analizadores paramagnéticos se pueden ver afectados por la susceptibilidad magnética del gas acompañante. Por lo tanto, se debe evitar hacer cambios a los gases acompañantes en las monografías USP.
Consideraciones del Diseño Las consideraciones del diseño para la adquisición de nuevos instrumentos pueden incluir los siguientes parámetros: DERIVA Cambio de la respuesta del instrumento para una concentración determinada durante un tiempo establecido en condiciones constantes y sin ajustes del instrumento por medios externos. La deriva es la suma de dos componentes, deriva del cero y deriva de medición. La deriva determina la frecuencia con que se debe calibrar el instrumento.
346 (415) Valoración de Gases Medicinales/ Pruebas Químicas
USP 39
DERIVA DEL CERO Cambio en la respuesta cuando se mide gas cero. DERIVA DE MEDICIÓN Cambio en la respuesta con respecto a la concentración de oxígeno durante la medición del gas. TEMPERATURA DE OPERACIÓN El intervalo de temperatura ambiente en el que continuará siendo válida la especificación de desempeño declarada del instrumento. Un coeficiente de temperatura mayor indicará que se permite un cambio más pequeño en la temperatura ambiente antes de que se requiera la recalibración. PRESIÓN OPERATIVA El instrumento debe operar a las presiones de entrada de las muestras a analizar.
Aspectos de la Calificación CALIFICACIÓN DE LA INSTALACIÓN (IQ) Los requisitos de la IQ aseguran que el hardware y el software (o dispositivo de lectura) del analizador de oxígeno se instale de manera segura y de acuerdo con las instrucciones del fabricante del analizador de oxígeno. Se debe tener en cuenta lo siguiente según sea aplicable: •Aptitud del sistema de la muestra (incluyendo conexiones); •Fugas (debe estar exento de fugas); • Muestreo representativo; • Velocidad de flujo de la muestra; • Tiempo de respuesta; • Señales de encendido correcto; • Suministro de energía (incluyendo regulación de voltaje); y • Condiciones ambientales apropiadas del instrumento y de la muestra misma (p.ej., temperatura y presión). CALIFICACIÓN OPERATIVA (OQ) Los requisitos de la OQ verifican que el desempeño del analizador paramagnético sea el previsto dentro de su intervalo de operación esperado y que sea adecuado para las condiciones reales de uso. Los instrumentos y aparatos se deben calibrar y usar de acuerdo con las instrucciones del fabricante del analizador de oxígeno. Debido a la naturaleza específica del instrumento, en lugar de la OQ inicial y periódica, se puede usar la calibración de rutina. CALIFICACIÓN DEL DESEMPEÑO (PQ) Los requisitos de la PQ verifican que el desempeño del analizador paramagnético sea el esperado en su ambiente normal operativo. Para el análisis de producto final de los gases medicinales, el analizador paramagnético se calibra inicialmente [ajustando a cero y calibrando (spanning) mediante un estándar certificado] de acuerdo con las instrucciones del fabricante del analizador de oxígeno y se recalibra periódicamente para asegurar un desempeño continuo aceptable. AJUSTE A CERO DEL INSTRUMENTO (ESTABLECIMIENTO DEL LÍMITE INFERIOR) Usando el estándar certificado definido en la monografía, ajustar a cero el analizador pasando el gas cero en el analizador a la velocidad de flujo recomendada por el fabricante del analizador de oxígeno. Mantener el flujo hasta que se observe una lectura estable en el instrumento. Conforme se requiera, ajustar la configuración de la posición del cero a un valor de 0,0% de acuerdo con las instrucciones del fabricante del analizador de oxígeno. Confirmar que la lectura sea estable. [NOTA-Dependiendo del uso previsto del instrumento, una alternativa aceptable a este procedimiento es cambiar la configuración de la posición del cero a un valor diferente de 0,0%, siempre que proporcione una mayor precisión en la medición.]
USP 39
Pruebas Químicas/ (415) Valoración de Gases Medicinales 347 CALIBRACIÓN (SPANNING) DEL INTERVALO DE USO
Establecer el límite superior (span) con un gas de calibración (span gas) definido en la monografía y apropiado para el intervalo de uso. Pasar el gas de calibración a través del instrumento a la velocidad de flujo sugerida por el fabricante. Confirmar que la lectura sea estable. Ajustar la configuración de la calibración al valor certificado del estándar de referencia de acuerdo con las instrucciones del fabricante del analizador de oxígeno. Confirmar que la lectura sea estable.
VALIDACIÓN La validación de este instrumento por lo general se completa durante el proceso (IQ/OQ). La verificación de rutina se lleva a cabo según se describe en las secciones OQ/PQ de este capítulo y, por lo tanto, no se requiere de información específica sobre la validación del instrumento.
PROCEDIMIENTO Para Instrumentos Fuera de Línea Antes del análisis, ajustar el cero del instrumento y calibrar (span) según se describe en la sección PQ. [NOTA-La calibración no debe correrse concomitantemente con las muestras de prueba.] Conectar el gas muestra al instrumento y establecer un flujo constante en el analizador a la velocidad de flujo recomendada por el fabricante del analizador. Mantener el flujo hasta que se observe una lectura constante en el instrumento. La definición de lectura constante se incluye en las instrucciones del fabricante del analizador o en la documentación para calificación del instrumento del usuario.
Para Instrumentos en Línea Los intervalos de calibración son definidos por el fabricante del analizador, por el historial o por medios estadísticos. Establecer un flujo constante en el analizador a la velocidad de flujo recomendada por el fabricante.
MUESTREO Muestreo de Fase Líquida Los cilindros que contienen un tubo de inmersión permiten obtener una muestra líquida a partir de la salida de la válvula con el cilindro en posición vertical. Si no se cuenta con un tubo de inmersión, el cilindro debe colocarse en posición invertida con el cilindro y la válvula principal sostenidas de manera segura (de modo que la fase líquida esté en contacto con la válvula). El muestreo de gases medicinales siempre debe realizarse usando el regulador requerido. Los reguladores deben purgarse con el gas que se va a muestrear. Cuando sea necesario, se debe medir el flujo hacia el analizador usando un caudalímetro calibrado.
Muestreo de Fase Gaseosa Los cilindros que no cuentan con un tubo de inmersión permiten obtener una muestra gaseosa de la salida de la válvula con el cilindro en posición vertical. Si se cuenta con un tubo de inmersión, el cilindro debe colocarse en posición invertida con el cilindro y la válvula principal sostenidas de manera segura (de modo que la fase gaseosa esté en contacto con el tubo de inmersión). El muestreo de gases medicinales siempre debe realizarse usando el regulador requerido.
ESTÁNDARES CERTIFICADOS PARA EL ANÁLISIS DE GASES MEDICINALES Las monografías USP para gases medicinales requieren de pruebas que usan estándares certificados para la calibración del instrumento y determinaciones analíticas. Tales análisis farmacopeicos se pueden llevar a cabo usando materiales de referencia rastreables al U.S. National lnstitute of Standards and Technology (Instituto Nacional de Estándares y Tecnología de EE.UU., [NIST]) u otras organizaciones de estándares nacionales, p.ej., el lnstitute for National Measurement Standards (Instituto Nacional de Estándares de Medición, Canadá). Las monografías individuales, así como la sección de reactivos, indicadores y soluciones hacen referencia al porcentaje nominal de diversos estándares certificados requeridos para llevar a cabo los análisis de gases medicinales. Los requisitos para las concentraciones certificadas reales en términos de varianza del valor nominal se indican en la sección Reactivos, Indicadores y Soluciones para cada estándar certificado pertinente.
348 (425) Antibióticos-Valoración Yodométrica / Pruebas Químicas
USP 39
(425) ANTIBIÓTICOS-VALORACIÓN YODOMÉTRICA El siguiente método se utiliza para la valoración de la mayoría de los medicamentos antibióticos farmacopeicos derivados de la penicilina y sus formas farmacéuticas, cuando la valoración yodométrica resulta particularmente apropiada. Preparación Estándar-Disolver en el disolvente especificado en la tabla de Disolventes y Concentraciones Finales una cantidad adecuada del Estándar de Referencia USP especificado en la monografía individual, previamente secado bajo las condiciones citadas en la monografía individual y pesado con exactitud, y diluir cuantitativamente y en diluciones sucesivas, con el mismo disolvente hasta obtener una solución con una concentración conocida aproximada a la que se especifica en la tabla. Pipetear 2,0 ml de esta solución y transferir a cada uno de dos matraces Erlenmeyer de 125 ml con tapón de vidrio. Disolventes y Concentraciones Finales Antibiótico
DI solvente*
Concentración Final
Amoxicilina
Agua
1,0 mg por ml
Ampicilina
Agua
1,25 mg por ml
Ampicilina Sódica
Solución Amortiguadora Nº 7
1,25 mg por ml
Cloxacilina Sódica
Agua
1,25 mg por ml
Ciclacilina
Agua
1,0 mg por ml
Dicloxacilina Sódica
Solución Amortiguadora Nº 7
1,25 mg por ml
Meticilina Sódica
Solución Amortiguadora Nº 7
1,25 mg por ml
Nafcilina Sódica
Solución Amortiguadora Nº 7
1,25 mq por ml
Oxacilina Sódica
Solución Amortiguadora Nº 7
1,25 mg por ml
Penicilina G Potásica
Solución Amortiguadora Nº 7
2000 unidades por ml
Penicilina G Sódica
Solución Amortiguadora Nº 7
2000 unidades por ml
Penicilina V Potásica
Solución Amortiguadora Nº 7
2000 unidades por ml
Feneticilina Potásica
Solución Amortiguadora Nº 7
2000 unidades por ml
* A menos que se indique algo diferente, las Soluciones Amortiguadoras son las soluciones amortiguadoras de fosfato de potasio definidas en la sección Medios y Diluyentes en Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas (81 ), excepto que no se requiere su esterilización antes de usarlas.
Preparación de Valoración-A menos que se especifique de otro modo en la monografía individual, disolver en el disolvente especificado en la tabla de Disolventes y Concentraciones Finales una cantidad adecuada, pesada con exactitud, de la muestra en análisis y diluir cuantitativamente con el mismo disolvente hasta obtener una solución con una concentración final conocida aproximada a la que se especifica en la tabla. Pipetear 2 ml de esta solución y transferir a cada uno de dos matraces Erlenmeyer de 125 ml con tapón de vidrio. Procedimiento/nactivación y Volumetría-Agregar 2,0 ml de hidróxido de sodio 1,0 Na 2,0 ml de la Preparación Estándar y de la Preparación de Valoración, en sus respectivos matraces, mezclar por rotación moderada y dejar en reposo durante 15 minutos. Agregar a cada matraz 2,0 ml de ácido clorhídrico 1,2 N y 10,0 ml de yodo 0,01 N SV. Tapar de inmediato y dejar en reposo durante 15 minutos. Valorar con tiosulfato de sodio 0,01 N SV. Agregar 1 gota de pasta de almidón yoduro SR al acercarse al punto final y continuar la volumetría hasta que el color azul desaparezca. Determinación con un Blanco-En un matraz que contenga 2,0 ml de la Preparación Estándar, agregar 10,0 ml de yodo 0,01 N SV. Si la Preparación Estándar contiene amoxicilina o ampicilina, agregar de inmediato O, 1 ml de ácido clorhídrico 1,2 N. Valorar de inmediato con tiosulfato de sodio 0,01 N SV. Agregar 1 gota de pasta de almidón yoduro SR cerca del punto final y continuar la volumetría hasta que el color azul desaparezca. Tratar en forma similar un matraz que contenga 2,0 ml de la Preparación de Valoración. Cálculos-Calcular los microgramos (o unidades) equivalentes (F) a cada ml de tiosulfato de sodio 0,01 N consumido por la Preparación Estándar, por la fórmula: (2CP)/(B - 1) en donde C es la concentración, en mg por ml, de Estándar de Referencia en la Preparación Estándar; P es la potencia, en µg (o unidades) por mg, del Estándar de Referencia; B es el volumen, en ml, de tiosulfato de sodio 0,01 N consumido en la Determinación con un Blanco; e 1es el volumen, en ml, de tiosulfato de sodio 0,01 N consumido en la lnactivación y Volumetría. Calcular la potencia de la muestra en análisis por la fórmula especificada en la monografía individual.
USP 39
Pruebas Químicas/ (429) Medición del Tamaño de Partícula por Difracción de Luz 349
(429) MEDICIÓN DEL TAMAÑO DE PARTÍCULA POR DIFRACCIÓN DE LUZ INTRODUCCIÓN El método se basa en las normas ISO 13320-7(7999)
y 9276-1(7998).
Este capítulo general ha sido armonizado con los textos correspondientes de la Farmacopea Europea y/o la Farmacopea japonesa.
La técnica de difracción de luz láser usada para la determinación de la distribución del tamaño de las partículas se basa en el análisis del patrón de difracción producido cuando las partículas se exponen a un haz de luz monocromática. Históricamente, los primeros instrumentos de difracción láser usaban sólo dispersión en ángulos pequeños. No obstante, desde entonces la técnica se ha ampliado para incluir dispersión de la luz láser en un intervalo angular más amplio y la aplicación de la teoría de Mie, además de la aproximación de Fraunhofer y de la difracción anómala. La técnica no puede distinguir entre dispersión por partículas individuales y dispersión por grupos de partículas primarias, es decir por aglomerados o agregados. Dado que la mayoría de las muestras de partículas contienen aglomerados o agregados y como el foco de interés generalmente se centra en la distribución del tamaño de las partículas primarias, los grupos por lo general se dispersan en partículas primarias antes de la medición. Para partículas no esféricas, se obtiene una distribución de tamaño de esferas equivalentes, debido a que la técnica supone en su modelo óptico que las partículas son esféricas. La distribución de tamaño de partícula resultante puede diferir de la obtenida por métodos que se basan en otros principios físicos (p.ej., sedimentación, tamizado). Este capítulo proporciona una guía para la medición de las distribuciones de tamaño de las partículas en diferentes sistemas dispersos (p.ej., polvos, atomizaciones, aerosoles, suspensiones, emulsiones y burbujas de gas en líquidos) por medio del análisis de sus patrones angulares de dispersión de luz. No se consideran en este capítulo los requisitos particulares de la medición del tamaño de las partículas de productos específicos.
PRINCIPIO Una muestra representativa, dispersada a una concentración adecuada en un líquido o gas apropiado, se pasa a través de un haz de luz monocromática, generalmente un láser. La luz dispersada por las partículas a diversos ángulos se mide con un detector de multielementos. Se registran los valores numéricos que representan el patrón de dispersión para su posterior análisis. Estos valores del patrón de dispersión se transforman luego, por medio de un modelo óptico y un procedimiento matemático adecuados, para obtener la proporción entre el volumen total y un número discreto de clases de tamaño, formando una distribución volumétrica del tamaño de partículas.
INSTRUMENTO El instrumento se ubica en un entorno donde no se vea afectado por el ruido eléctrico, las vibraciones mecánicas, las fluctuaciones de temperatura, la humedad o la luz brillante directa. En la Figura 7 se muestra un ejemplo de configuración de un instrumento de difracción de luz láser. Se puede usar otro equipo. 9
11
8
10
7
(/)
5 1. Detector de oscurecimiento 2. Haz dispersado 3. Haz directo 4. Lente de Fourier
5. Luz dispersa no captada por la lente (4) 6. Conjunto de partículas 7. Fuente de luz láser Unidad de procesamiento del haz
9. Distancia de trabajo de la lente (4) 1O. Detector de mullielementos 11. Distancia focal de la lente (4)
a.
Figura 1 . Ejemplo de configuración de un instrumento de difracción de luz láser. El instrumento está compuesto por una fuente de luz láser, un sistema óptico para procesar el haz de luz, una región de medición de la muestra (o celda), una lente de Fourier y un detector de multielementos para medir el patrón de la luz disper-
350 (429) Medición del Tamaño de Partícula por Difracción de Luz / Pruebas Químicas
USP 39
sada. También se requiere un sistema de datos para la deconvolución de los datos de dispersión en una distribución volumétrica de tamaños, así como el análisis e informe de los datos asociados. Las partículas pueden entrar al haz láser en dos posiciones. En el caso convencional, las partículas entran al haz paralelo antes de la lente colectora y dentro de su distancia de trabajo. En la llamada óptica de Fourier inversa, las partículas entran por detrás de la lente colectora y por lo tanto, en un haz convergente. La ventaja de la configuración convencional es que queda un paso de longitud razonable para la muestra dentro de la distancia de trabajo de la lente. La segunda configuración admite sólo longitudes de paso pequeñas, pero permite la medición de luz dispersa en ángulos más grandes, lo cual es útil cuando hay presencia de partículas submicrométricas. La interacción del haz de luz incidente con el conjunto de las partículas dispersas da como resultado un patrón de dispersión con distintas intensidades de luz en diversos ángulos. La distribución de intensidad angular total, constituida por la luz directa y la dispersa, se enfoca entonces sobre un detector de multielementos por medio de una lente o una serie de lentes. Estas lentes crean un patrón de dispersión que, dentro de ciertos límites, no depende de la ubicación de las partículas en el haz de luz. Por consiguiente, la distribución de intensidad angular continua se convierte en una distribución de intensidad espacial discreta en un set de elementos detectores. Se supone que el patrón de dispersión medido del conjunto de partículas es idéntico a la suma de los patrones de todas las partículas dispersivas individuales presentadas en posiciones relativas aleatorias. Se debe tener en cuenta que las lentes y por lo tanto, el detector, sólo captan un intervalo angular limitado de luz dispersa.
DESARROLLO DEL MÉTODO La medición del tamaño de las partículas por difracción láser puede arrojar datos reproducibles, incluso en la región submicrométrica, siempre que el instrumento usado y la muestra analizada sean cuidadosamente controlados para limitar la variabilidad de las condiciones de la prueba (p.ej., medio de dispersión, método de preparación de la dispersión de la muestra). Tradicionalmente, la medición del tamaño de partícula utilizando difracción láser se ha limitado a partículas comprendidas en un intervalo de aproximadamente O, 1 µm a 3 mm. Debido a los recientes avances en el diseño de lentes y equipos, los instrumentos modernos son habitualmente capaces de exceder este intervalo. Con el informe de validación, el usuario demuestra la aplicabilidad del método para el uso previsto.
Muestreo La técnica de muestreo debe ser adecuada para obtener una muestra representativa de un volumen apropiado para la medición del tamaño de partículas. Se pueden aplicar técnicas de división de muestras tales como la del separador rotatorio de muestras o el método de cono y división por cuarteo.
Evaluación del Procedimiento de Dispersión La muestra a analizar se inspecciona, visualmente o con la ayuda de un microscopio, para estimar su intervalo de tamaño y forma de partículas. El procedimiento de dispersión debe ajustarse al propósito de la medición. El propósito puede ser tal, que se prefiera desaglomerar los grupos en partículas primarias tanto como sea posible o, por el contrario, conservar los grupos tan intactos como sea posible. En este sentido, las partículas de interés pueden ser partículas primarias o grupos de partículas. Para el desarrollo de un método, es aconsejable verificar que no ocurra la conminución de las partículas y, a la inversa, que la dispersión de las partículas o grupos sea satisfactoria. Por lo general, esto puede hacerse cambiando la energía de dispersión y monitoreando el cambio de la distribución del tamaño de las partículas. La distribución de tamaño medida no debe cambiar de manera significativa si la muestra está bien dispersada y las partículas no son frágiles ni solubles. Por otra parte, si el proceso de fabricación (p.ej., cristalización, molienda) del material ha cambiado, se debe verificar la aplicabilidad del método (p.ej., por comparación microscópica). Las atomizaciones, aerosoles y burbujas de gas en un líquido se deben medir directamente, siempre que su concentración sea adecuada, puesto que el muestreo o la dilución generalmente alteran la distribución del tamaño de las partículas. En otros casos (como por ejemplo emulsiones, pastas y polvos), se pueden dispersar muestras representativas en los líquidos adecuados. A menudo se usan aditivos dispersantes (humectantes, estabilizadores) y/o fuerzas mecánicas (p.ej., agitación, ultrasonido) para la desaglomeración o desagregación de grupos de partículas y la estabilización de la dispersión. Para estas dispersiones líquidas, lo que se usa más comúnmente es un sistema de recirculación, que consiste en una celda de medición óptica, un baño de dispersión por lo general equipado con un mezclador y un generador de ultrasonido, una bomba y tuberías. Las celdas de agitación sin sistema recirculante son útiles cuando se dispone sólo de pequeñas cantidades de muestra o cuando se utilizan líquidos especiales en la dispersión. Los polvos secos también pueden convertirse en aerosoles por medio del uso de dispersadores de polvo seco adecuados, los cuales aplican fuerzas mecánicas para la desaglomeración o desagregación. Por lo general, los dispersadores usan la energía del gas comprimido o la presión diferencial de un sistema de vacío para dispersar las partículas hasta convertirlas en un aerosol que es soplado a través de la zona de medición, habitualmente hacia la entrada de una unidad de vacío que recolecta las partí-
USP 39
Pruebas Químicas/ (429) Medición del Tamaño de Partícula por Difracción de Luz 351
culas. Sin embargo, en el caso de partículas o gránulos más gruesos y de libre fluidez, el efecto de la gravedad puede ser suficiente para dispersar las partículas adecuadamente. Si el tamaño máximo de las partículas de la muestra excede el intervalo de medición del instrumento, el material que es demasiado grueso se puede retirar por tamizado, informándose la masa y el porcentaje del material retirado. Sin embargo, cabe señalar que después del pretamizado la muestra deja de ser representativa, a menos que se compruebe lo contrario.
Optimización de la Dispersión Líquida Los líquidos, surfactantes y dispersantes usados para dispersar polvos deben: - ser transparentes a la longitud de onda del láser y estar prácticamente exentos de burbujas de aire o partículas; - tener un índice de refracción que difiera del correspondiente al material de prueba; - no ser disolventes del material de prueba (líquido puro o solución saturada, prefiltrada); - no alterar el tamaño de los materiales de prueba (p.ej., por efecto de la solubilidad, aumento de la solubilidad o recristalización); - favorecer la fácil formación y estabilidad de la dispersión; - ser compatibles con los materiales usados en el instrumento (como juntas tóricas, juntas de estanqueidad, tuberías, etc.); y - poseer una viscosidad apropiada para facilitar la recirculación, agitación y filtración. Para humedecer las partículas y estabilizar la dispersión a menudo se usan agentes tensoactivos y/o dispersantes. Para el caso de ácidos y bases débiles, la amortiguación del medio dispersante a un pH bajo o alto, respectivamente, puede ayudar a la identificación de un dispersante adecuado. Se puede hacer una verificación preliminar de la calidad de la dispersión por medio de una inspección visual o microscópica. También es posible tomar muestras fraccionadas de una dispersión madre bien mezclada. Dichas dispersiones madre se forman agregando un líquido a la muestra mientras se mezcla, por ejemplo, con una varilla de vidrio, una espátula o un mezclador por vórtice. Se debe tener cuidado de asegurar la transferencia de una muestra representativa y de que no se sedimenten las partículas más grandes. Por lo tanto, se prepara una pasta de la muestra o se lleva a cabo un muestreo rápido de una suspensión que se mantiene bajo agitación.
Optimización de la Dispersión con Gas Para atomizaciones y dispersiones de polvo seco se puede utilizar un gas comprimido exento de aceite, agua y partículas. Para retirar dichos materiales del gas comprimido se puede usar una secadora provista de filtro. Toda unidad de vacío debe estar localizada lejos de la zona de medición, de forma que no altere la medición.
Determinación del Intervalo de Concentración Con el fin de producir una relación señal-ruido aceptable en el detector, la concentración de partículas en la dispersión debe exceder un nivel mínimo. De igual manera, debe estar por debajo de un nivel máximo con el fin de evitar la dispersión múltiple. El intervalo de concentración está influenciado por el ancho del haz láser, la longitud de paso de la zona de medición, las propiedades ópticas de las partículas y la sensibilidad de los elementos detectores. En vista de lo anterior, se deben efectuar las mediciones con diferentes concentraciones de partículas para determinar el intervalo apropiado de la concentración para cualquier muestra típica de material. [NOTA-En diferentes instrumentos, las concentraciones de partículas se representan habitualmente mediante magnitudes y escalas diferentes, p.ej., oscurecimiento, concentración óptica, número proporcional de la masa total.]
Determinación del Tiempo de Medición El tiempo de medición, el tiempo de lectura del detector y la frecuencia de adquisición se determinan experimentalmente, de acuerdo con la precisión requerida. Por lo general, el tiempo de medición permite un gran número de barridos o escaneos en intervalos de tiempo cortos.
Selección de un Modelo Óptico Apropiado La mayoría de los instrumentos usan la aproximación de Fraunhofer o la teoría de Mie, aunque a veces se aplican otras aproximaciones para el cálculo de la matriz de dispersión. La elección del modelo teórico depende de la aplicación prevista y las diferentes suposiciones (tamaño, absorbancia, índice de refracción, rugosidad, orientación cristalina, mezcla, etc.) hechas para el material de prueba. Si los valores del índice de refracción (partes real e imaginaria para la longitud de onda usada) no se conocen exactamente, entonces se puede usar la aproximación de Frauenhofer o la teoría de Mie con una estimación realista del índice de refracción. La primera tiene la ventaja de que es simple y no necesita valores del índice de refracción; la segunda por lo general arroja distribuciones menos sesgadas del tamaño de las partículas, en el caso de partículas pequeñas. Por ejem-
352 (429) Medición del Tamaño de Partícula por Difracción de Luz/ Pruebas Químicas
USP 39
plo, si se usa el modelo Fraunhofer para muestras que contienen una cantidad apreciable de partículas pequeñas, transparentes, la cantidad de partículas pequeñas calculada puede resultar significativamente sobreestimada. Con el fin de obtener resultados rastreables, es esencial documentar los valores del índice de refracción usados, porque pequeñas diferencias en los valores supuestos para la parte real e imaginaria del índice de refracción complejo pueden ocasionar diferencias significativas en las distribuciones de tamaño de las partículas resultantes. A menudo se aplican valores bajos de la parte imaginaria del índice de refracción (aproximadamente 0,01 a O, 1 i) para permitir la corrección de la absorbancia en función de la rugosidad de superficie de las partículas. En general, cabe anotar que las propiedades ópticas de la sustancia a analizar, así como la estructura (p.ej., forma, rugosidad de superficie y porosidad) influyen en el resultado final.
Validación Típicamente, la validación de un procedimiento se puede determinar por la evaluación de su especificidad, linealidad, intervalo, exactitud, precisión y robustez. En el análisis del tamaño de partículas por difracción de luz láser no aplica la especificidad, según la definición de la ICH, y no es posible discriminar los diferentes componentes en una muestra, ni discriminar entre aglomerados y partículas dispersas a menos que se complemente adecuadamente con técnicas microscópicas. No se puede aplicar a este procedimiento la exploración de una relación lineal entre concentración y respuesta o un modelo matemático de interpolación. Más que evaluar la linealidad, este método requiere la definición de un intervalo de concentración dentro del cual el resultado de las mediciones no varíe significativamente. Las concentraciones por debajo de ese intervalo producen un error debido a la deficiente relación señal-ruido, mientras que las concentraciones por encima de ese intervalo producen un error debido a la dispersión múltiple. El intervalo depende principalmente del hardware del instrumento. La exactitud se debe confirmar a través de una apropiada calificación del instrumento y de una comparación con un análisis microscópico, mientras que la precisión se puede evaluar por medio de una determinación de repetibilidad. La repetibilidad que se consiga con el método depende principalmente de las características del material (molido o sin moler, robusto o frágil, ancho de la distribución de su tamaño, etc.) mientras que la repetibilidad requerida depende del propósito de la medición. Los límites obligatorios no se pueden especificar en este capítulo puesto que la repetibilidad (diferentes preparaciones de la muestra) puede variar apreciablemente de una sustancia a otra. Sin embargo, una buena práctica consiste en aspirar a criterios de aceptación para repetibilidad, tales como % RSD <::: 10% [n = 6] para cualquier valor central de la distribución (p.ej., para x 50 ). Los valores a los lados de la distribución (p.ej., x 10 y x 90 ) serán sometidos a criterios de aceptación menos estrictos, como % RSD <::: 15% [n = 6]. Por debajo de 1O µm, estos valores deben duplicarse. La robustez se puede analizar durante la selección y optimización de los medios y fuerzas de dispersión. El cambio de la energía dispersante se puede monitorear por el cambio en la distribución del tamaño de las partículas.
MEDICIÓN Precauciones Seguir las instrucciones en el manual del instrumento: - no mirar nunca de frente el haz láser directo o sus reflexiones; - conectar a tierra todos los componentes del instrumento para prevenir la ignición de los disolventes o explosiones del polvo; - verificar la configuración del instrumento (p.ej., calentamiento, intervalo de medición y lentes requeridos, distancia de trabajo apropiada, posición del detector, ausencia de luz diurna brillante directa); y - en el caso de dispersiones húmedas, evitar burbujas de aire, evaporación de líquidos, efecto schlieren u otras inhomogeneidades en la dispersión; de igual manera, evitar una relación masa-flujo inapropiada del dispersador o un flujo de aire turbulento en el caso de dispersiones secas; dichos efectos pueden ocasionar distribuciones erróneas del tamaño de partículas.
Medición de la Dispersión de la Luz de las Muestras Dispersadas Después de la alineación adecuada de la parte óptica del instrumento se debe efectuar una medición blanco del medio de dispersión exento de partículas, usando el mismo método utilizado para la medición de la muestra. La señal de ruido de fondo debe estar por debajo del umbral apropiado. Los datos suministrados por el detector se guardan con el fin de restarlos posteriormente de los datos obtenidos con la muestra. La dispersión de la muestra se mide de acuerdo con el método desarrollado. Para cada elemento del detector se calcula una señal promedio, a veces junto con su desviación estándar. La magnitud de la señal de cada elemento del detector depende del área de detección, de la intensidad de la luz y de la eficiencia cuántica. Las coordenadas (tamaño y posición) de los elementos del detector junto con la distancia focal de la lente determinan el intervalo de los ángulos de dispersión para cada elemento. La mayoría de los instrumentos miden también la intensidad del haz láser central (sin dispersar). La relación entre la intensidad de una muestra dispersada y la obtenida en su ausencia (la medición blanco) indica la proporción de luz dispersada y por lo tanto la concentración de partículas.
USP 39
Pruebas Químicas/ (429) Medición del Tamaño de Partícula por Difracción de Luz 353 Conversión del Patrón de Dispersión en Distribución del Tamaño de Partícula
Este paso de deconvolución es la inversa del cálculo de un patrón de dispersión para una distribución dada del tamaño de partícula. La suposición de la forma esférica de las partículas es especialmente importante por cuanto la mayoría de los algoritmos usan la solución matemática para la dispersión por partículas esféricas. Además, los datos medidos siempre contienen errores aleatorios y sistemáticos que podrían viciar las distribuciones de tamaño. Se han desarrollado varios procedimientos matemáticos para usar en los instrumentos disponibles. Estos permiten cierta ponderación de las desviaciones entre los patrones de dispersión medidos y calculados (p.ej., cuadrados mínimos), algunas restricciones (p.ej., no negatividad para cantidades de partículas), y/o cierta suavización de la curva de distribución de tamaño. Los algoritmos utilizados son específicos para cada marca y modelo de equipo y están amparados por una licencia. Las diferencias en los algoritmos entre distintos instrumentos pueden dar lugar a diferencias en las distribuciones de tamaños de las partículas calculadas.
Repeticiones El número de mediciones repetidas (con preparaciones de muestras individuales) a efectuar depende de la precisión requerida en la medición. Se recomienda fijar este número en el método específico de una sustancia.
INFORME DE RESULTADOS Los datos de distribución del tamaño de las partículas por lo general se informan como una distribución acumulada de los tamaños inferiores y/o como distribución de la densidad por volumen. El símbolo x se usa para indicar el tamaño de la partícula, que a su vez se define como el diámetro de una esfera de volumen equivalente. Q3(x) indica la fracción en volumen de las partículas de tamaño menor a x. En una representación gráfica, x se representa sobre la abscisa y la variable dependiente Q3 sobre la ordenada. Los valores característicos más comunes se calculan por interpolación de la curva de distribución del tamaño de partículas. Con frecuencia se usan tamaños de partículas de las fracciones acumuladas del 10%, 50%, y 90% (x 10, x50, y x90, respectivamente); x50 se conoce también como la mediana del tamaño de partícula. Se reconoce que el símbolo d se usa también ampliamente para designar el tamaño de partícula, por lo cual el símbolo x podría reemplazarse por d. Por otra parte, se debe documentar suficiente información sobre la muestra, la preparación de la muestra, las condiciones de dispersión y el tipo de celda. Dado que los resultados dependen del instrumento particular, el programa de análisis de datos y el modelo óptico usado, estos detalles también se deben documentar.
CONTROL DEL DESEMPEÑO DEL INSTRUMENTO Usar el instrumento según las instrucciones del fabricante y llevar a cabo las calificaciones prescritas con la frecuencia adecuada, de acuerdo con el uso del instrumento y las sustancias a examinar.
Calibración Los sistemas de difracción láser, aunque suponen propiedades idealizadas de las partículas, se basan en los principios fundamentales de la dispersión de la luz láser. Por eso, no se requiere una calibración en el sentido estricto. Sin embargo, es necesario confirmar que el instrumento funciona correctamente. Esto puede efectuarse usando cualquier material de referencia certificado que sea aceptable en la práctica industrial. Se examina el procedimiento de medición completo, incluidos la recolección de la muestra, la dispersión de la muestra, el transporte de la muestra a través de la zona de medición, la medición y el procedimiento de deconvolución. Es fundamental que el procedimiento operativo total se describa en detalle. Los materiales de referencia certificados preferidos constan de partículas esféricas de una distribución conocida. Deben estar certificados en lo que respecta a la distribución del tamaño en porcentaje de masa por medio de una técnica absoluta, si estuviese disponible, y usarse junto con un procedimiento operativo acordado y detallado. Si se aplica la teoría de Mie en el análisis de datos, es fundamental que se indiquen las partes real e imaginaria del índice de refracción complejo del material. La representación de la distribución del tamaño de partículas por volumen igualará a la de la distribución por masa, siempre que la densidad de las partículas sea la misma para todas las fracciones de tamaños. La respuesta de un instrumento de difracción láser cumple con los requisitos si el valor medio de x50 de por lo menos tres mediciones independientes no se desvía en más de 3% del intervalo de valores certificado del material de referencia certificado. Los valores medios para x10 y x90 no se deben desviar del intervalo de valores certificado en más del 5%. Por debajo de 1 O µm, estos valores deben duplicarse. Pese a que se prefiere el uso de materiales compuestos por partículas esféricas, también pueden usarse partículas no esféricas. Preferentemente, éstas deben tener valores certificados o típicos provenientes de análisis de difracción láser efectuados según un procedimiento operativo acordado y detallado. El uso de valores de referencia obtenidos por métodos distintos de la difracción láser puede ocasionar una desviación significativa. El motivo de esta desviación es que los distintos principios inhe-
354 (429) Medición del Tamaño de Partícula por Difracción de Luz/ Pruebas Químicas
USP 39
rentes a los diversos métodos pueden conducir a diferentes diámetros de esferas equivalentes para la misma partícula no esférica. Aunque se prefiere el uso de de materiales de referencia certificados, se pueden emplear también otros materiales de referencia bien definidos. Estos consisten en sustancias de composición y distribución de tamaño de partículas típicas para una clase especificada de sustancias. La distribución del tamaño de partículas de los mismos ha demostrado ser estable con el tiempo. Los resultados deben cumplir con los datos previamente determinados, con la misma precisión y desviación que el material de referencia certificado.
Calificación del Sistema Además de la calibración, el desempeño del instrumento debe calificarse a intervalos regulares o tan frecuentemente como sea apropiado. Esto se puede llevar a cabo usando un material de referencia apropiado, como se mencionó en el párrafo anterior. La calificación del sistema se basa en el concepto de que el equipo, la electrónica, el software y las operaciones analíticas constituyen un sistema integral que se puede evaluar como una entidad. Se examina el procedimiento de medición completo, incluidos la recolección de la muestra, la dispersión de la muestra, el transporte de la muestra a través de la zona de medición, la medición y el procedimiento de deconvolución. Es fundamental que el procedimiento operativo total se describa en detalle. En general, a menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, se considera que la respuesta de un instrumento de difracción láser cumple con los requisitos si el valor x50 no se desvía en más de 10% del intervalo de valores del material de referencia. Si se evalúan opcionalmente los valores a los lados de la distribución (p.ej., x10 y x90 ), estos valores no se deben desviar en más de 15% del intervalo de valores certificado. Por debajo de 1O µm, estos valores deben duplicarse. NOTA-Para la calibración del instrumento, en el párrafo sobre Calibración se especifican requisitos más estrictos.
(431) DETERMINACIÓN DE GRUPOS METOXILO APARATO El aparato para la determinación de grupos metoxilos se muestra esquemáticamente en la figura adjunta. El matraz de ebullición, A, cuenta con un brazo lateral capilar para la introducción de dióxido de carbono o nitrógeno y está conectado a una columna, 8, que sirve para separar el ácido yodhídrico acuoso del yoduro de metilo que es más volátil. El yoduro de metilo pasa a través de agua en una trampa depuradora, C, y finalmente es absorbido en la solución de bromo-ácido acético en el tubo de absorción O. El dióxido de carbono o nitrógeno se introduce a través de un dispositivo que regula la presión y se conecta al aparato por medio de un capilar pequeño que contiene un pequeño trozo de algodón. [NOTA-Evitar el uso de disolventes orgánicos al limpiar este aparato, ya que las trazas remanentes pueden afectar la determinación. Esta prueba se emplea también para la determinación de grupos etoxilo con un tiempo de reacción de 80 minutos y un equivalente de solución volumétrica de 0,751 mg de (OC 2 H5).] Para mayor comodidad en el uso y la limpieza, una junta esférica de vidrio esmerilado conecta las dos columnas verticales del aparato. La parte superior del depurador C consta de una junta esférica 35/20, cuya mitad superior está conectada por medio del brazo lateral al tubo O. Esto permite separar el aparato en partes y facilita el agregado de agua a la trampa. Además, permite el acceso al tubo de ensayo (de 1 O mm) suelto e invertido que sirve como trampa sobre el tubo interno del depurador
c.
Pruebas Químicas/ (431) Determinación de Grupos Metoxilo 355
USP 39
11 mm DE
Robinete 2 mm de paso
Aparato para la Determinación de Grupos Metoxilos
REACTIVOS Solución de Bromo-Ácido Acético Disolver 100 g de acetato de potasio en 1000 ml de una solución constituida por 900 ml de ácido acético glacial y 100 ml de anhídrido acético. En el día de su utilización, agregar 5 ml de bromo a 145 ml de esta solución.
Ácido Yodhídrico Está disponible comercialmente una solución reactivo incolora o casi incolora de punto de ebullición constante preparada para este fin. Si no se obtiene comercialmente, puede prepararse destilando ácido yodhídrico sobre fósforo rojo, pasando dióxido de carbono o nitrógeno a través del aparato durante la destilación. Usar la mezcla de punto de ebullición constante (entre 55% y 58% de HI) que destila entre 126º y 127º, que es incolora o casi incolora. [Precaución-Se deben tomar medidas de seguridad al destilar Ácido Yodhídrico.] Colocar el ácido en frascos pequeños de color ámbar con tapón de vidrio purgados con dióxido de carbono o nitrógeno, sellarlos con parafina y almacenar en un sitio fresco y oscuro.
PROCEDIMIENTO Preparar el aparato desconectando la junta esférica y vertiendo agua en la trampa C hasta la mitad. Conectar las dos partes, empleando una cantidad mínima de una grasa de silicona apropiada para sellar la junta esférica. Agregar 7 ml de Solución de Bromo-Ácido Acético en el tubo de absorción D. Pesar la muestra en una cápsula de gelatina tarada y colocarla en el matraz de ebullición junto con unas pocas perlas de ebullición o pedazos de plato poroso. Finalmente agregar 6 ml de Ácido Yodhídrico y juntar el matraz a la columna, empleando una cantidad mínima de grasa de silicona apropiada para sellar la unión. Burbujear dióxido de carbono o nitrógeno a través del aparato a una velocidad de 2 burbujas por segundo; colocar el matraz de ebullición en un baño de aceite o manto de calentamiento a 150º y continuar la reacción durante 40 minutos para la determinación
356 (431) Determinación de Grupos Metoxilo /Pruebas Químicas
USP 39
de grupos metoxilo, u 80 minutos para la determinación de grupos etoxilo. Drenar el contenido del tubo de absorción en un matraz Erlenmeyer de 500 mL que contenga 1 O mL de solución de acetato de sodio (1 en 4). Lavar el tubo con agua, agregar los líquidos de lavado al matraz y finalmente, diluir con agua hasta aproximadamente 125 ml. Agregar ácido fórmico, gota a gota, agitando por rotación moderada hasta que el color marrón rojizo del bromo desaparezca; luego agregar 3 gotas adicionales. Por lo general, se requiere un total de 12 a 15 gotas. Dejar en reposo durante 3 minutos y agregar 15 mL de ácido sulfúrico diluido y 3 g de yoduro de potasio y valorar de inmediato con tiosulfato de sodio O, 1 N SV usando 3 mL de almidón SR como indicador. Realizar una determinación con un blanco, incluyendo también una cápsula de gelatina y hacer las correcciones necesarias. Cada mL de tiosulfato de sodio O, 1 N equivale a 0,517 mg de (OCH 3).
,,
(441) VALORACION DE NIACINA O NIACINAMIDA Estándares de Referencia USP (11) ER Ácido 6-Hidroxinicotínico USP (ver el Procedimiento 4) ER Niacina USP ER Niacinamida USP NOTA-Los Estándares de Referencia secados previamente se pueden almacenar en un desecador sobre gel de sílice. Proteger de la luz.
MÉTODO QUÍMICO El siguiente procedimiento fotométrico implica la reacción colorimétrica de niacina o niacinamida con bromuro de cianógeno en presencia de ácido sulfanílico. Se puede usar para la determinación de niacina o niacinamida en las monografías como Niacina, Inyección; Niacinamida, Inyección
y Niacinamida,
Tabletas.
[NOTA-Determinar a partir de la información del etiquetado si la vitamina presente en la muestra de valoración es niacina o niacinamida y emplear la preparación estándar correspondiente (ya sea Preparación estándar de niacina o Preparación estándar de niacinamida) según se indica en el Procedimiento.] Solución de bromuro de cianógeno: Disolver 5 g de bromuro de cianógeno en agua para obtener 50 ml. [PRECAUCIÓN-Preparar esta solución bajo una campana, ya que el bromuro de cianógeno se volatiliza a temperatura ambiente y el vapor es sumamente irritante y venenoso.]
Solución de ácido sulfanílico: Agregar 15 mL de agua y 3 mL de hidróxido de amonio 6 N a 2,5 g de ácido sulfanílico. Mezclar y, si fuera necesario, agregar mezclando más hidróxido de amonio 6 N hasta que el ácido se disuelva. Ajustar el pH de la solución con ácido clorhídrico 3 N a aproximadamente 4,5 empleando verde de bromocresol SR como indicador externo, y diluir con agua hasta 25 ml. Solución madre de niacina estándar: Transferir 25,0 mg de ER Niacina USP a un matraz volumétrico de 500 mL, disolver en solución de alcohol (1 en 4), diluir a volumen con solución de alcohol (1 en 4) y mezclar. Almacenar en un refrigerador. Cada mL de esta solución contiene 50 µg de ER Niacina USP. Preparación estándar de niacina: Transferir 10,0 mL de Solución madre de niacina estándar a un matraz volumétrico de 100 mL, diluir con agua a volumen y mezclar. Cada mL de esta solución contiene 5 µg de ER Niacina USP. Solución madre de niacinamida estándar: Transferir 50,0 mg de ER Niacinamida USP a un matraz volumétrico de 500 mL, disolver en solución de alcohol (1 en 4), diluir con solución de alcohol (1 en 4) a volumen y mezclar. Almacenar en un refrigerador. Cada mL de esta solución contiene 100 µg de ER Niacinamida USP. Preparación estándar de niacinamida: Transferir 10,0 mL de Solución madre de niacinamida estándar a un matraz volumétrico de 100 mL, diluir con agua a volumen y mezclar. Cada mL de esta solución contiene 1 O µg de ER Niacinamida USP. Preparación de valoración: Preparar según se indica en la monografía individual. Procedimiento: Pipetear y transferir a cuatro tubos marcados las cantidades de la Preparación estándar correspondiente, de la Preparación de valoración, de la Dilución de amoníaco y de Agua según se indican en la Tabla 1. Luego agregar los demás componentes, respectivamente, según se indican en la tabla, conforme a las instrucciones que se proporcionan en este capítulo. Tabla 1. Mezclas de Reacción para la Valoraclón de Niacina o Nlaclnamlda-Método Químico Tubo 3 (ml)
Tubo4 (ml)
Tubo 1 (ml)
Tubo2 (ml)
Preparación estándar
1,0
1,0
-
-
Preparación de valoración
-
-
1,0
1,0
Dilución de amoníaco (hidróxido de amonio, diluido a 1 en 50)
0,5
0,5
0,5
0,5
Agua
6,5
1,5
6,5
1,5
Componente
Pruebas Químicas/ (441) Valoración de Niacina o Niacinamida 357
USP 39
Tabla 1. Mezclas de Reacción para la Valoraclón de Nlaclna o Nlaclnamlda-Método Químico (Continuación) Componente
Tubo 1 (ml)
Tubo2 (ml)
Tubo 3 (ml)
Tubo4 (ml)
Solución de bromuro de cianógeno
-
5,0
-
5,0
Solución de ácido sulfanílico
2,0
2,0
2,0
2,0
Ácido clorhídrico
1 gota
-
1 qota
-
Agregar al Tubo 7 la Solución de ácido sulfanílico, agitar bien, agregar el Ácido clorhídrico, mezclar, colocar en un espectrofotómetro adecuado y ajustar a absorbancia cero a 450 nm. Agregar al Tubo 2 la Solución de bromuro de cianógeno, mezclar y a los 30 segundos, cronometrados con exactitud, después de completar la adición del bromuro de cianógeno, agregar la Solución de ácido su/fanílico, agitando por rotación suave. Cerrar el tubo, colocarlo en el espectrofotómetro y después de 2 minutos medir su absorbancia a 450 nm contra el Tubo 7 utilizado como blanco, designando la absorbancia como A5• Repetir el procedimiento con el Tubo 3 (como blanco) y el Tubo 4, designando la absorbancia del Tubo 4 como Au. Calcular la cantidad de niacina o niacinamida en la muestra según se indica en la monografía individual.
MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS Los siguientes procedimientos de cromatografía de líquidos se proveen para la determinación de niacina o niacinamida como un ingrediente farmacéutico activo, como un ingrediente de suplemento dietético o como un componente de suplementos dietéticos o de formas farmacéuticas. Usar el Estándar de Referencia USP apropiado para la niacina o niacinamida presente en la formulación. A lo largo de estos procedimientos, proteger de la atmósfera y de la luz todas las soluciones que contienen y que se derivan de la muestra de prueba y de los Estándares de Referencia, usando preferiblemente material de vidrio con protección actínica. Procedimiento 1 • Este procedimiento se puede usar para la determinación de niacina o niacinamida en: - Vitaminas olesolubles e hidrosolubles con minerales, tabletas • Este procedimiento implica la extracción de analitos de la formulación usando agua caliente o agitación mecánica • A menos que se especifiquen en las monografías individuales, la Solución estándar, la Solución muestra y las soluciones reactivo se preparan según se indica a continuación. Diluyente: Acetonitrilo, ácido acético glacial y agua (5:1 :94) Fase móvil: Una mezcla de metanol, ácido acético glacial y agua (27:1 :73) que contenga 140 mg de 1-hexanosulfonato de sodio por cada 100 ml Solución estándar: Transferir 80 mg de ER Niacina USP o ER Niacinamida USP a un matraz volumétrico de 200 ml y agregar 180 ml de Diluyente. Sumergir el matraz en un baño de agua caliente mantenido a 65º-70º durante 1O minutos agitando regularmente o usando un mezclador de vórtice, hasta que se disuelvan todos los materiales sólidos. Enfriar rápidamente en un baño de agua fría durante 1O minutos a temperatura ambiente y diluir con Diluyente a volumen. Solución muestra: Para tabletas, reducir a polvo fino no menos de 30 tabletas. Transferir una porción del polvo, equivalente a 1O mg de niacinamida y 2,5 mg de clorhidrato de piridoxina, de riboflavina y de clorhidrato de tiamina a un tubo de centrífuga de 50 ml. Agregar 25,0 ml de Diluyente y mezclar usando un mezclador de vórtice durante 30 segundos para suspender el polvo completamente. Sumergir el tubo de centrífuga en un baño de agua caliente mantenido a 65º-70º, calentar durante 5 minutos y mezclar en un mezclador de vórtice durante 30 segundos. Volver a sumergir el tubo en el baño de agua caliente, calentar durante otros 5 minutos y mezclar en un mezclador de vórtice durante 30 segundos. Filtrar una porción de la solución, enfriar a temperatura ambiente y usar el filtrado transparente. [NOTA-Usar el filtrado dentro de las 3 horas de la filtración.] Sistema cromatográfico (Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.) Modo: HPLC Detector: UV 280 nm Columna: 3,9 mm x 30 cm; relleno L1 Velocidad de flujo: 1 ml/min Volumen de inyección: 1O µL Aptitud del sistema Muestra: Solución estándar Requisitos de aptitud Desviación estándar relativa: No más de 3,0% Análisis Muestras: Solución estándar y Solución muestra Medir las áreas de los picos de niacina o niacinamida.
358 (441) Valoración de Niacina o Niacinamida / Pruebas Químicas
USP 39
Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de niacina (C 6 H5 N02 ) o niacinamida (C 6 H6 NzÜ) en la porción de la Muestra tomada: Resultado= (ruf r5) x (C5/Cu) x 100 ru = respuesta del pico de niacina o niacinamida de la Solución muestra r5 = respuesta del pico de niacina o niacinamida de la Solución estándar C5 = concentración de ER Niacina USP o ER Niacinamida USP en la Solucin estándar (mg/ml) Cu= concentración nominal de niacina o niacinamida en la Solución muestra (mg/ml) Procedimiento 2 • Este procedimiento se puede usar para la determinación de niacina o niacinamida en: - Vitaminas oleosolubles e hidrosolubles con minerales, tabletas • Este procedimiento implica la extracción de analitos de la formulación mediante el Disolvente de extracción, calor y agitación mecánica. • A menos que se especifiquen en las monografías individuales, la Solución estándar, la Solución muestra y las soluciones reactivo se preparan según se indica a continuación. Solución A: Transferir 1 ml de ácido acético glacial y 2,5 g de edetato disódico a un matraz volumétrico de 100 ml. Disolver y diluir con agua a volumen. Disolvente de extracción: Solución A y metanol (3:1) Fase móvil: Solución de acetato de sodio O, 1 M (13,6 mg/ml de acetato de sodio en agua). Ajustar con ácido acético a un pH de 5,4. [NOTA-Se puede agregar una pequeña cantidad de metanol (hasta 1%) a la Fase móvil para mejorar la resolución.] Solución madre del estándar: 1 mg/ml de ER Niacina USP o ER Niacinamida USP en Disolvente de extracción Solución estándar: Transferir 5,0 ml de Solución madre del estándar a un matraz volumétrico de 25 ml y diluir con Disolvente de extracción a volumen. Solución muestra: [NOTA-Esta preparación es adecuada para la determinación de niacina o niacinamida, piridoxina y riboflavina, cuando se encuentran presentes en la formulación.] Para tabletas, reducir a polvo fino no menos de 20 tabletas. Transferir una porción del polvo, equivalente a 2 mg de riboflavina, a un matraz volumétrico de 200 ml. Si la riboflavina no se encuentra presente en la formulación, transferir una porción del polvo, equivalente a 2 mg de piridoxina. Si la piridoxina no se encuentra presente en la formulación, transferir una porción del polvo, equivalente a 20 mg de niacina o niacinamida. Agregar 100,0 ml de Disolvente de extracción y mezclar durante 20 minutos, usando un agitador de movimiento tipo muñeca (wrist action). Sumergir el matraz en un baño de agua mantenido a 70º-75º y calentar durante 20 minutos. Mezclar en un mezclador de vórtice durante 30 segundos, enfriar a temperatura ambiente y filtrar. Usar el filtrado transparente. Sistema cromatográfico (Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.) Modo: HPLC Detector: UV 254 nm Columna: 4,6 mm x 25 cm; relleno L1 Velocidad de flujo: 1 ml/min Volumen de inyección: 20 µL Aptitud del sistema Muestra: Solución estándar Requisitos de aptitud Desviación estándar relativa: No más de 3,0% [NOTA-Si fuera necesario, purgar la columna con metano! entre inyecciones.] Análisis Muestras: Solución estándar y Solución muestra Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de niacina (C 6 H5 N0 2) o niacinamida (C 6 H6 N 2 0) en la porción de la Muestra tomada: Resultado= (ruf r5) x (CsfCu) x 100 ru = respuesta del pico de niacina o niacinamida de la Solución muestra r5 = respuesta del pico de niacina o niacinamida de la Solución estándar C5 =concentración de ER Niacina USP o ER Niacinamida USP en la Solución estándar (mg/ml) Cu= concentración nominal de niacina o niacinamida en la Solución muestra (mg/ml) Procedimiento 3 • Este procedimiento se puede usar para la determinación de niacina o niacinamida en: - Vitaminas oleosolubles e hidrosolubles con minerales, tabletas • Este procedimiento implica la extracción de analitos de la formulación mediante mezclas de disolventes orgánicos, calor y agitación mecánica. • A menos que se especifiquen en las monografías individuales, la Solución estándar, la Solución muestra y las soluciones reactivo se preparan según se indica a continuación. Reactivo: 25 mg/ml de edetato disódico en agua
USP 39
Pruebas Químicas/ (441) Valoración de Niacina o Niacinamida 359
Fase móvil: Transferir 0,4 ml de trietilamina, 15,0 ml de ácido acético glacial y 350 ml de metanol a un matraz volumétrico de 2000 ml. Diluir con 1-hexanosulfonato de sodio 0,008 M a volumen. Solución madre del estándar: 1,5 mg/ml de ER Niacina USP o ER Niacinamida USP en Reactivo, calentando si fuera necesario. Solución estándar: Transferir 5,0 ml de Solución madre del estándar a un matraz de 125 ml con tapón. Agregar 10,0 ml de un a mezcla de metanol y ácido acético glacial (9:1) y 30,0 ml de una mezcla de metanol y etilenglicol (1 :1 ). Tapar, agitar durante 15 minutos en un baño de agua mantenido a 60º y enfriar. Filtrar, desechando los primeros ml del filtrado. Solución muestra: Para tabletas, pesar y reducir a polvo fino no menos de 20 tabletas. Transferir una porción del polvo, equivalente a 7,5 mg de niacina o niacinamida, a un matraz de 125 ml con tapón. Agregar 10,0 ml de una mezcla de metano! y ácido acético glacial (9:1) y 30,0 ml de una mezcla de metanol y etilenglicol (1 :1 ). Tapar, agitar durante 15 minutos en un baño de agua mantenido a 60º y enfriar. Filtrar, desechando los primeros ml del filtrado. Sistema cromatográfico (Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.) Modo: HPLC Detector: UV 270 nm Columna: 4,6 mm x 25 cm; relleno L7 Temperatura de la columna: 50º Velocidad de flujo: 2 ml/min Volumen de inyección: 5 µL Aptitud del sistema Muestra: Solución estándar Requisitos de aptitud Desviación estándar relativa: No más de 2,0% Análisis Muestras: Solución estándar y Solución muestra Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de niacina (C 6 H5 N0 2) o niacinamida (C 6 H6 N 2 0) en la porción de la Muestra tomada: Resultado= (ruf r5) x (C5/Cu) x 100 ru = respuesta del pico de niacina o niacinamida de la Solución muestra r5 = respuesta del pico de niacina o niacinamida de la Solución estándar C5 = concentración de ER Niacina USP o ER Niacinamida USP en la Solución estándar (mg/ml) Cu= concentración nominal de niacina o niacinamida en la Solución muestra (mg/ml)
Procedimiento 4 • Este procedimiento se puede usar para describir niacina como: - Un ingrediente farmacéutico activo - Un ingrediente de suplemento dietético - Un ingrediente en las tabletas de liberación prolongada de niacina •Este procedimiento implica disolver el analito en Diluyente, una mezcla de metanol y agua (82:18), o extraer el analito de la formulación con Diluyente y agitación mecánica •A menos que se especifiquen en las monografías individuales, la Solución de aptitud del sistema, la Solución estándar A, la Solución estándar B, la Solución muestra A, la Solución muestra By las soluciones reactivo se preparan según se indica a continuación. Diluyente: Metanol y agua (82:18) Fase móvil: Metanol y agua (82:18), ajustada con ácido acético glacial a un pH de 3, 15 ± 0,05 Solución de aptitud del sistema: 0,25 mg/ml de ER Niacina USP, 0,050 mg/ml de ER Ácido 6-Hidroxinicotínico USP y 0, 1O mg/ml de piridina en Diluyente Solución estándar A: Para un ingrediente farmacéutico activo o ingrediente de suplemento dietético, usar 0,25 mg/ml de ER Niacina USP en Diluyente. Solución estándar B: Para tabletas de liberación prolongada, usar 0,25 mg/ml de ER Niacina USP, 0,050 mg/ml de ER Ácido 6-Hidroxinicotínico USP y 0,0978 mg/ml de piridina en Diluyente. Solución muestra A: Para un ingrediente farmacéutico activo o ingrediente de suplemento dietético, usar 0,25 mg/ml de Niacina en Diluyente. Solución muestra B: Para tabletas de liberación prolongada, transferir una cantidad del polvo, equivalente a 50 mg de niacina, a partir de no menos de 20 tabletas reducidas a polvo fino, a un matraz adecuado. Agregar Diluyente y mezclar durante 2 horas. Diluir con Diluyente hasta una concentración final de 0,25 mg/ml de niacina. Sistema cromatográfico (Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.) Modo: HPLC Detector: UV 260 nm Columna: 4,6 mm x 15 cm; relleno L8 de 5 µm
360 (441) Valoración de Niacina o Niacinamida / Pruebas Químicas
USP 39
Velocidad de flujo: 1 ml/min Volumen de inyección: 25 µL Aptitud del sistema Muestras: Solución de aptitud del sistema y Solución estándar A o Solución estándar B [NOTA-Los tiempos de retención relativos para piridina, ácido 6-hidroxinicotínico y niacina son O, 14; 0,64 y 1,0, respectivamente, Solución de aptitud del sistema.] Requisitos de aptitud Resolución: No menos de 1,5 entre piridina y ácido 6-hidroxinicotínico y no menos de 1,5 entre ácido 6-hidroxinicotínico y niacina, Solución de aptitud del sistema Desviación estándar relativa: No más de 2,0% para el pico de niacina en inyecciones repetidas, Solución estándar A o
Solución estándar B Análisis Muestras: Solución estándar A y Solución muestra A o Solución estándar By Solución muestra B Calcular el porcentaje de niacina (C 6 H5 N0 2 ) en la porción de la Muestra tomada:
Resultado= (ruf r5) x (C5/Cu) x 100
ru = respuesta del pico de niacina de la Solución muestra A o Solución muestra B r5 = respuesta del pico de niacina de la Solución estándar A o Solución estándar B C5 =concentración de ER Niacina USP en la Solución estándar A o Solución estándar B (mg/ml) Cu= concentración de Niacina en la Solución muestra A o concentración nominal de niacina en la Solución muestra B (mg/ml) Procedimiento 5 • Este procedimiento se puede usar para la determinación de niacinamida como: - Un ingrediente farmacéutico activo - Un ingrediente de suplemento dietético • Este procedimiento implica disolver niacinamida como el ingrediente farmacéutico activo o ingrediente de suplemento dietético en Fase móvil •A menos que se especifiquen en las monografías individuales, la Solución de aptitud del sistema, la Solución estándar, la Solución de niacina, la Solución muestra y las soluciones reactivo se preparan según se indica a continuación. Fase móvil: Metanol y 1-heptanosulfonato de sodio 0,005 M (30:70) Solución estándar: Transferir 50 mg de ER Niacinamida USP a un matraz volumétrico de 100 ml. Agregar 3 ml de agua para disolver y diluir con Fase móvil a volumen. Diluir con Fase móvil hasta 0,04 mg/ml. Solución de niacina: Preparar según se indica en Solución estándar, usando ER Niacina USP en lugar de ER Niacinamida USP. Solución de aptitud del sistema: Mezclar volúmenes iguales de Solución estándar y Solución de niacina. Solución muestra: Preparar según se indica en Solución estándar, usando Niacinamida en lugar de ER Niacinamida USP. Sistema cromatográfico (Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.) Modo: HPLC Detector: UV 254 nm Columna: 3,9 mm x 30 cm; relleno L1 Velocidad de flujo: 2 ml/min Volumen de inyección: 20 µL Aptitud del sistema Muestras: Solución de aptitud del sistema y Solución estándar Requisitos de aptitud Resolución: No menos de 3,0 entre niacina y niacinamida, Solución de aptitud del sistema Desviación estándar relativa: No más de 2,0% para el pico de niacinamida en inyecciones repetidas, Solución estándar Análisis Muestras: Solución estándar y Solución muestra Calcular el porcentaje de niacinamida (C 6 H6 N 2 0) en la porción de la Muestra tomada: Resultado= (ruf r5) x (C5/Cu) x 100
ru = respuesta del pico de niacinamida de la Solución muestra r5 = respuesta del pico de niacinamida de la Solución estándar C5 = concentración de ER Niacinamida USP en la Solución estándar (mg/ml) Cu= concentración de Niacinamida en la Solución muestra (mg/ml) Procedimiento 6 • Este procedimiento se puede usar para la determinación de niacina como: - Un ingrediente activo en las tabletas de niacina • Este procedimiento implica la extracción de la niacina de la formulación usando agua, calor y agitación mecánica. •A menos que se especifiquen en las monografías individuales, la Solución estándar, la Solución muestra y las soluciones reactivo se preparan según se indica a continuación.
USP 39
Pruebas Químicas/ (451) Volumetría con Nitrito 361
Solución A: Solución 5 mM de 1-hexanosulfonato de sodio en agua Fase móvil: Metanol, acetonitrilo, ácido acético glacial y Solución A (14:7:1 :78) Solución estándar: 0,050 mg/mL de ER Niacina USP en agua. Disolver con ayuda de calor en un baño de vapor. Solución muestra: Para tabletas, transferir el equivalente a 500 mg de niacina, a partir de no menos de 20 tabletas reducidas a polvo fino, a un matraz adecuado. Agregar 50 mL de agua y calentar en un baño de vapor durante 30 minutos. Someter a ultrasonido durante 2 minutos, agitar mecánicamente durante 15 minutos y enfriar a temperatura ambiente. Diluir con agua hasta 0,050 mg/mL y filtrar. Sistema cromatográfico (Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.) Modo: HPLC Detector: UV 262 nm Columna: 3,9 mm x 30 cm; relleno Ll Velocidad de flujo: 1,3 mL/min Volumen de inyección: 20 µL Aptitud del sistema Muestra: Solución estándar Requisitos de aptitud Eficiencia de la columna: No menos de 1000 platos teóricos para el pico de niacina Factor de asimetría: No menos de 2,0 para el pico de niacina Desviación estándar relativa: No más de 2,0% para el pico de niacina en inyecciones repetidas, Solución estándar Análisis Muestras: Solución estándar y Solución muestra Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de niacina (C 6 H5 N02) en la porción de la Muestra tomada: Resultado= (rufr5) x (C5/Cu) x 100
ru = respuesta del pico de niacina de la Solución muestra r5 = respuesta del pico de niacina de la Solución estándar C5 =concentración de ER Niacina USP en la Solución estándar (mg/mL) Cu= concentración nominal de niacina en la Solución muestra (mg/mL)
(451) VOLUMETRÍA CON NITRITO El siguiente método general se utiliza para la determinación de la mayoría de los medicamentos farmacopeicos con sulfonamidas y sus formas farmacéuticas, así como de otros medicamentos farmacopeicos para los cuales la volumetría con nitrito resulta particularmente apropiada. Estándares de referencia USP (11 )-fR Sulfanilamida USP. Procedimiento-Pesar con exactitud aproximadamente 500 mg en el caso de una sulfonamida, o la cantidad especificada en la monografía individual y transferir a un recipiente apropiado abierto. Agregar 20 mL de ácido clorhídrico y 50 mL de agua, mezclar hasta disolver, enfriar hasta aproximadamente 15º, lentamente valorar con nitrito de sodio O, 1 M SV, previamente normalizado frente a ER Sulfanilamida USP. Determinar electrométricamente el punto final empleando electrodos apropiados (de platino-calomel o platino-platino). Colocar la punta de la bureta debajo de la superficie de la solución para evitar la oxidación del nitrito de sodio por efecto del aire y agitar la solución suavemente, usando un agitador magnético, evitando la formación de un vórtice de aire bajo la superficie y manteniendo la temperatura aproximadamente a 15º. La volumetría puede llevarse a cabo manualmente, o con un titulador automático. En la volumetría manual, agregar la solución volumétrica hasta que la volumetría esté cerca de 1 mL del punto final y luego, agregar porciones de O, 1 mL, dejando que transcurra no menos de 1 minuto entre cada adición. (La aguja del instrumento se desvía y luego regresa aproximadamente a su posición original hasta que se alcanza el punto final). El peso, en mg, de la sustancia al que equivale cada mL de nitrito de sodio O, 1 M SV es el indicado en la monografía individual. Para la valoración de Tabletas de sulfonamidas u otros fármacos, reducir a polvo fino no menos de 20 tabletas, pesar con exactitud una porción del polvo, que equivalga aproximadamente a 500 mg si es una sulfonamida, o a la cantidad de fármaco especificada en la monografía individual y proceder según se indica previamente, desde donde dice "transferir a un recipiente apropiado abierto". Para la valoración de Inyectables y otras formas líquidas para las que se especifica la volumetría con nitrito, pipetear una porción, que equivalga aproximadamente a 500 mg si es una sulfonamida, o a la cantidad de fármaco especificada en la monografía individual, y transferir a un recipiente abierto apropiado y proceder según se indica previamente, desde donde dice "Agregar 20 mL de ácido clorhídrico".
362 (461) Determinación de Nitrógeno/ Pruebas Químicas
USP 39
(461) DETERMINACIÓN DE NITRÓGENO Algunos alcaloides y otros compuestos orgánicos que contienen nitrógeno no proporcionan todo el nitrógeno que contienen al someterlos a digestión con ácido sulfúrico; en consecuencia, estos métodos no pueden emplearse para la determinación de nitrógeno en todos los compuestos orgánicos.
MÉTODO 1 Nitratos y Nitritos Ausentes-Colocar aproximadamente 1 g de la sustancia, pesado con exactitud, en un matraz de Kjeldahl de 500 ml de vidrio de borosilicato duro. El material a analizar, si es sólido o semisólido, puede envolverse en una hoja de papel de filtro exento de nitrógeno para transferirlo mas cómodamente al matraz. Agregar 1O g de sulfato de potasio en polvo o sulfato de sodio anhidro, 500 mg de sulfato cúprico en polvo y 20 ml de ácido sulfúrico. Inclinar el matraz en un ángulo de aproximadamente 45º y calentar moderadamente la mezcla, manteniendo la temperatura debajo del punto de ebullición hasta que deje de producir espuma. Aumentar el calor hasta que el ácido llegue a una ebullición intensa y continuar el calentamiento hasta que la solución se torne casi incolora o adquiera un color verde transparente durante 30 minutos. Dejar que se enfríe, agregar 150 ml de agua, mezclar el contenido del matraz y volver a enfriar. Agregar cuidadosamente 100 ml de solución de hidróxido de sodio (2 en 5), de tal manera que la solución fluya hacia abajo por la pared interna del matraz y forme una capa bajo la solución ácida. Agregar inmediatamente unos pedazos de cinc granulado y, sin demorarse, conectar el matraz a un bulbo de conexión (trampa) Kjeldahl, previamente unido a un condensador, cuyo tubo de salida esté sumergido debajo de la superficie de 100 ml de solución de ácido bórico (1 en 25) contenidos en un matraz Erlenmeyer o en un frasco de boca ancha de aproximadamente 500 ml de capacidad. Mezclar el contenido del matraz de Kjeldahl mediante rotación moderada y destilar hasta que se hayan destilado aproximadamente cuatro quintas partes del contenido del matraz. Valorar con ácido sulfúrico 0,5 N SV, determinando el punto final potenciométricamente. Realizar una determinación con un blanco y hacer las correcciones necesarias. Cada ml de ácido sulfúrico 0,5 N SV equivale a 7,003 mg de nitrógeno. Cuando se sabe que el contenido de nitrógeno de la sustancia es bajo, el ácido sulfúrico 0,5 N SV puede reemplazarse por ácido sulfúrico O, 1 N SV. Cada ml de ácido sulfúrico O, 1 N SV equivale a 1,401 mg de nitrógeno. Nitratos y Nitritos Presentes-Colocar una cantidad de la sustancia, pesada con exactitud, que corresponda aproximadamente a 150 mg de nitrógeno, en un matraz de Kjeldahl de 500 ml de vidrio de borosilicato duro y agregar 25 ml de ácido sulfúrico en el cual se ha disuelto previamente 1 g de ácido salicílico. Mezclar el contenido del matraz y dejar reposar la mezcla durante 30 minutos agitando frecuentemente. Agregar a la mezcla 5 g de tiosulfato de sodio en polvo y volver a mezclar; luego, agregar 500 mg de sulfato cúprico en polvo y proceder según se indica en Nitratos y Nitritos Ausentes, desde donde dice "Inclinar el matraz a un ángulo de aproximadamente 45º". Cuando se sabe que el contenido de nitrógeno de la sustancia excede de 10%, pueden agregarse entre 500 mg y 1 g de ácido benzoico, antes de la digestión, para facilitar la descomposición de la sustancia.
MÉTODO 11 Aparato-Seleccionar un matraz de Kjeldahl de 300 ml adecuado, del cual se libera el nitrógeno por digestión ácida en primer lugar y luego se transfiere cuantitativamente al recipiente de volumetría mediante destilación con vapor. Procedimiento-Colocar en el matraz de digestión del aparato una cantidad del material pesada o medida con exactitud, equivalente a 2 a 3 mg de nitrógeno. Agregar 1 g de una mezcla pulverizada de sulfato de potasio y sulfato cúprico (10:1) y lavar el cuello del matraz con un chorro fino de agua para desprender cualquier material adherido a él. Agregar 7 ml de ácido sulfúrico, dejando que se escurra por las paredes del matraz; luego, girando el matraz con rotación suave, agregar cuidadosamente 1 ml de peróxido de hidrógeno al 30 por ciento de manera tal que resbale por la pared del matraz. (No agregar peróxido de hidrógeno durante la digestión). Calentar el matraz sobre una llama libre o sobre un calentador eléctrico hasta que la solución tome un color azul transparente y las paredes del matraz estén exentas de material carbonoso. Agregar cuidadosamente 70 ml de agua a la mezcla de digestión, enfriar la solución y preparar para destilación con vapor. Agregar 30 ml de solución de hidróxido de sodio (2 en 5) a través de un embudo, de manera tal que la solución fluya hacia abajo por la pared interna del matraz para formar una capa bajo la solución ácida; enjuagar el embudo con 1O ml de agua, cerrar herméticamente el aparato y comenzar la destilación con vapor inmediatamente. Recibir el destilado en 15 ml de solución de ácido bórico (1 en 25), a la cual se le han agregado 3 gotas de rojo de metilo-azul de metileno SR y agua suficiente para cubrir el extremo del tubo condensador. Continuar la destilación hasta que el destilado mida de 80 a 100 ml. Retirar el matraz de absorción, enjuagar el extremo del tubo condensador con una cantidad pequeña de agua y valorar volumétricamente el destilado con ácido sulfúrico 0,01 N SV. Realizar una determinación con un blanco y hacer las correcciones necesarias. Cada ml de ácido sulfúrico 0,01 N SV equivale a 140, 1 µg de nitrógeno. Cuando se toma una cantidad de material que contiene más de 2 mg a 3 mg de nitrógeno, puede emplearse ácido sulfúrico 0,02 N o O, 1 N, siempre y cuando se requieran al menos 15 ml para la volumetría. Si el peso seco total de material tomado es mayor de 100 mg, aumentar proporcionalmente las cantidades de ácido sulfúrico y de hidróxido de sodio.
USP 39
Pruebas Químicas/ (466) Impurezas Comunes 363
(466) IMPUREZAS COMUNES Esta prueba tiene como fin evaluar la presencia de impurezas comunes en artículos oficiales y se utiliza cuando una monografía individual así lo indica. Las impurezas comunes se definen como aquellas especies en fármacos y/o productos farmacéuticos que no poseen una actividad biológica indeseable significativa en las cantidades presentes. Estas impurezas pueden surgir de la síntesis, preparación o degradación de los artículos farmacopeicos. En algunos casos, se pueden detectar impurezas que representan un riesgo potencial para la salud. Dado que dichas impurezas no serían identificadas individualmente por el uso estricto de este Capítulo General, puede ser necesario realizar otra evaluación diferente para garantizar que las impurezas detectadas cumplen con los requisitos establecidos en la definición de Impurezas Comunes. La selección de pruebas y valoraciones admite cantidades previstas de impurezas que no son objetables para el uso habitual del artículo. Informe y Especificaciones-A menos que la monografía individual indique algo diferente, se seleccionó el valor 2,0% como límite general para la cantidad total de impurezas comunes en monografías en las que la documentación no respaldaba la adopción de otros valores. Cuando una monografía establece límites para componentes concomitantes y/o impurezas/productos de degradación especificados, estas especies no deben incluirse en la estimación de impurezas comunes a menos que así lo especifique la monografía individual. Los componentes concomitantes se definen como especies características de muchos fármacos que no se consideran impurezas en el sentido Farmacopeico. Son ejemplos de componentes concomitantes los isómeros geométricos y ópticos (o racematos) y los antibióticos que son mezclas. Cualquier componente que pueda considerarse una impureza tóxica debido a su efecto biológico indeseable significativo no se considera un componente concomitante. Metodología-A menos que se indique algo diferente en la monografía individual, la estimación de la cantidad y número de impurezas comunes se hace mediante métodos relativos en lugar de la comparación estricta con Estándares de Referencia individuales. La detección no específica de impurezas comunes también es consecuente con esta clasificación. Los métodos de evaluación típicos empleados para las impurezas comunes son las técnicas por cromatografía en capa delgada (TLC, por sus siglas en inglés). Ver en Cromatografía (621) una explicación general de la técnica por cromatografía en capa delgada. Las pruebas para sustancias relacionadas o pureza cromatográfica también pueden usarse para evaluar la presencia de impurezas comunes. También pueden emplearse, con la debida justificación, otros métodos alternativos (p.ej., HPLC, HPTLC, etc.). A menos que se indique algo diferente en la monografía individual, usar el siguiente método. Solución de Prueba-Preparar una solución de la sustancia en análisis en el disolvente especificado en la monografía para obtener una concentración final conocida con exactitud de aproximadamente 1O mg por ml. [NOTA-Para disolver el fármaco se puede utilizar calor o ultrasonido, siempre y cuando dichos procedimientos no afecten negativamente el compuesto.] Soluciones Estándar-Preparar soluciones del Estándar de Referencia USP o de la sustancia indicada en el disolvente especificado en la monografía, para obtener concentraciones conocidas con exactitud de 0,01 mg por mL, 0,05 mg por mL, 0, 1 mg por mL y 0,2 mg por ml. [NOTA-Para disolver el fármaco se puede utilizar calor o ultrasonido, siempre y cuando dichos procedimientos no afecten negativamente el compuesto.] Procedimiento-Utilizar una placa para cromatografía en capa delgada recubierta de una capa de mezcla de gel de sílice para cromatografía de 0,25 mm de espesor y la Fase móvil especificada en la monografía. Aplicar a la placa volúmenes iguales (de 20 µL) de la Solución de Prueba y de las Soluciones Estándar, empleando una corriente de nitrógeno para secar las manchas. Desarrollar el cromatograma en una cámara preequilibrada hasta que el frente de la fase móvil haya recorrido aproximadamente tres cuartos de la longitud de la placa. Retirar la placa de la cámara y secar al aire. Examinar la placa utilizando las técnicas de visualización especificadas. Localizar en el cromatograma de la Solución de Prueba cualquier mancha diferente de la mancha principal y determinar las intensidades relativas por comparación con las manchas obtenidas en los cromatogramas de las Soluciones Estándar correspondientes. Ver la discusión anterior en cuanto al informe y especificación de impurezas comunes totales. CLAVE DE LAS TÉCNICAS DE VISUALIZACIÓN (1) Utilizar luz UV a 254 nm y aproximadamente a 366 nm. (2) Utilizar Yodoplatinato SR. (3) Solución A-Mezclar 850 mg de subnitrato de bismuto con 40 mL de agua y 1O mL de ácido acético glacial. Solución 8-Disolver 8 g de yoduro de potasio en 20 mL de agua. Mezclar A y B para obtener una Solución Madre, la cual se puede almacenar durante varios meses en un frasco oscuro. Para preparar el reactivo para rociado, mezclar 1O mL de la Solución Madre con 20 mL de ácido acético glacial y diluir con agua hasta 100 ml. (4) Solución de Ninhidrina para Rociado-Disolver 200 mg de ninhidrina en 100 mL de alcohol. Calentar la placa después de rociarla. (5) Solución de Ácido para Rociado-En un baño de hielo, agregar lenta y cuidadosamente, y mezclando, 1O mL de ácido sulfúrico a 90 mL de alcohol. Rociar la placa y calentarla hasta que se carbonice. (6) Solución de Ácido-Dicromato para Rociado-Agregar suficiente dicromato de potasio a 100 mL de ácido sulfúrico para obtener una solución saturada. Rociar la placa y calentarla hasta que se carbonice. (7) Vainillina-Disolver 1 g de vainillina en 100 mL de ácido sulfúrico.
364 (466) Impurezas Comunes/ Pruebas Químicas
USP 39
(8) Cloramina T-Ácido Tricloroacéticcr-Mezclar 1O mL de una solución acuosa de cloramina Tal 3% con 40 mL de una solución alcohólica de ácido tricloroacético al 25%. Preparar inmediatamente antes de usar. (9) Fo/in-C-Agregar 1O g de tungstato de sodio y 2,5 g de molibdato de sodio a 70 mL de agua, agregar 5 mL de ácido fosfórico al 85% y 1O mL de ácido clorhídrico al 36% y someter esta solución a reflujo durante 1 O horas. (1 O) KMn0 4-Disolver 100 mg de Permanganato de Potasio en 100 mL de agua. (11) DAB-Mezclar 1 g de p-dimetilaminobenzaldehído en 100 mL de ácido clorhídrico 0,6 N. (12) OAC-Mezclar 100 mg de p-dimetilaminocinamaldehído en 100 mL de ácido clorhídrico 1 N. (13) Ferricianurcr-Mezclar volúmenes iguales de una solución de cloruro férrico al 1% y de una solución de ferricianuro de potasio al 1%. Usar inmediatamente. (14) Fast Blue 8-Reactivo A-Disolver 500 mg de Sal de Fast Blue B en 100 mL de agua. Reactivo B-Hidróxido de sodio O, 1 N. Rociar primero con el Reactivo A y luego con el Reactivo B. (15) Cianuro Férrico A/ca/incr-Diluir 1,5 mL de una solución de ferricianuro de potasio al 1 % con agua hasta 20 mL y agregar 1O mL de una solución de hidróxido de sodio al 15%. (16) Solución de Yodo para Rociadcr-Preparar una solución de yodo al 0,5% en cloroformo. (17) Exponer la placa durante 1O minutos a los vapores de yodo en una cámara cerrada preequilibrada que tenga cristales de yodo en el fondo. (18) Solución A-Disolver 0,5 g de yoduro de potasio en 50 mL de agua. Solución 8-Preparar una solución de 0,5 g de almidón soluble en 50 mL de agua caliente. Mezclar volúmenes iguales de la Solución A y de la Solución B inmediatamente antes de usar. (19) PTSS-Disolver 20 g de ácido p-toluensulfónico en 100 mL de alcohol, rociar la placa, secarla durante 15 minutos a 11 Oº y examinarla bajo luz UV a 366 nm. (20) Solución de o-Tolidina para Rociadcr-Disolver 160 mg de o-tolidina en 30 mL de ácido acético glacial, diluir con agua hasta 500 mL, agregar 1 g de yoduro de potasio y mezclar hasta que el yoduro de potasio se haya disuelto. (21) Para preparar el reactivo para rociado, mezclar 3 mL de solución de ácido cloroplatínico (1 en 1 O) con 97 mL de agua, seguido del agregado de 100 mL de una solución de yoduro de potasio (6 en 100). (22) Solución de Yodo-Metano/ para Rociadcr-Preparar una mezcla de yodo SR y metano! (1: 1).
(467) DISOLVENTES RESIDUALES INTRODUCCIÓN Este capítulo general se aplica a fármacos, excipientes y productos existentes. Toda sustancia o producto se encuentra sujeto al control pertinente de disolventes que pudieran estar presentes en una sustancia o producto. Generalmente no se mencionan las pruebas de disolventes residuales en las monografías específicas cuando los límites a aplicar cumplen con los que se especifican más adelante, ya que los disolventes empleados pueden variar de un fabricante a otro. El objetivo de este capítulo general es proporcionar las cantidades aceptables de disolventes residuales en productos farmacéuticos para la seguridad del paciente. El capítulo recomienda el uso de disolventes menos tóxicos y describe niveles considerados toxicológicamente aceptables para algunos disolventes residuales. Para propósitos farmacopeicos, los disolventes residuales en productos farmacéuticos se definen como las sustancias químicas orgánicas volátiles que se emplean o producen durante la fabricación de fármacos o excipientes, o en la preparación de productos farmacéuticos. Los disolventes residuales no se eliminan por completo mediante las técnicas prácticas de fabricación. La selección adecuada del disolvente para la síntesis de un fármaco o un excipiente puede mejorar el rendimiento o determinar características tales como la forma cristalina, la pureza y la solubilidad. Por lo tanto, a veces el disolvente puede ser un elemento crítico en el proceso de síntesis. Este capítulo general no trata los disolventes que se emplean deliberadamente como excipientes ni los solvatos. No obstante, se debe evaluar y justificar el contenido de disolventes en tales productos. Dado que los disolventes residuales no proporcionan ningún beneficio terapéutico, deben eliminarse en lo posible, para cumplir con las especificaciones del producto y de sus ingredientes, las buenas prácticas de fabricación u otros requisitos basados en la calidad. Los productos farmacéuticos no deben contener niveles de disolventes residuales superiores a los que permitan los datos de seguridad. Evitar el uso de disolventes que ocasionen una toxicidad inaceptable (Clase 1, Tabla 7) en la producción de fármacos, excipientes o productos farmacéuticos, a menos que su uso pueda justificarse fehacientemente mediante una evaluación de riesgo-beneficio. Se deberá limitar el uso de disolventes asociados a una toxicidad menos grave (Clase 2, Tabla 2) para proteger a los pacientes de posibles efectos adversos. En una situación ideal, se deberían emplear los disolventes menos tóxicos (Clase 3, Tabla 3). En el Apéndice 7 se proporciona la lista de todos los disolventes incluidos en este capítulo general. Estas tablas y el listado no son exhaustivos. Para los fines de esta Farmacopea, cuando un fabricante recibe la aprobación por parte de una autoridad reglamentaria competente para usar un disolvente nuevo que no se indica actualmente en este capítulo, es responsabilidad del fabricante notificar a la USP la identidad del disolvente, el límite de disolvente residual aprobado en el artículo y el procedimiento de prueba adecuado para dicho disolvente residual en el artículo. La USP considera-
Pruebas Químicas/ (467) Disolventes Residuales 365
USP 39
rá entonces este tema en la monografía individual. Cuando se aprueba un disolvente nuevo a través del proceso de ICH, este disolvente nuevo se agregará a la lista correspondiente en este capítulo general. En ese momento, se considerará la eliminación del requisito de la prueba para el disolvente específico en la monografía individual. Se deberán analizar los fármacos, excipientes y productos farmacéuticos para detectar la presencia de disolventes residuales cuando se sepa que los procesos de purificación o producción dan como resultado la presencia de tales disolventes residuales. Solamente es necesario realizar pruebas para los disolventes residuales que se emplean o producen en la purificación o fabricación de fármacos, excipientes o productos. Aunque los fabricantes pueden optar por realizar una prueba al producto farmacéutico, se puede emplear un procedimiento acumulativo para calcular los niveles de disolventes residuales en el producto farmacéutico a partir de los niveles en los ingredientes usados para producir el producto farmacéutico. Si los cálculos dan como resultado un nivel igual o inferior al proporcionado en este capítulo general, no es necesario considerar la realización de la prueba de disolventes residuales al producto farmacéutico. Sin embargo, si el nivel calculado está por encima del nivel recomendado, se debe analizar el producto farmacéutico para determinar si el proceso de formulación redujo el nivel del disolvente correspondiente hasta la cantidad aceptable. También se debe analizar un producto farmacéutico si durante su fabricación se utiliza un disolvente residual. Para los fines de esta Farmacopea, cuando el fabricante recibe la aprobación por parte de una autoridad reglamentaria competente de un nivel superior de disolvente residual, es responsibilidad de dicho fabricante notificar a la USP la identidad del disolvente y el límite de disolvente residual aprobado en el artículo. La USP considerará entonces este tema en la monografía individual. Ver el Apéndice 2 para obtener información de referencia adicional sobre disolventes residuales.
CLASIFICACIÓN DE DISOLVENTES RESIDUALES POR EVALUACIÓN DE RIESGO El Programa Internacional de Seguridad de las Sustancias Químicas (lnternational Program on Chemical Safety, IPCS, por sus siglas en inglés) emplea la expresión ingesta diaria tolerable (IDT) para describir los límites de exposición a sustancias químicas tóxicas, y la Organización Mundial de la Salud (OMS) y otros institutos y autoridades sanitarias nacionales e internacionales emplean la expresión ingesta diaria admisible (IDA). La expresión exposición diaria permitida (EDP) se define como la ingesta farmacéuticamente admisible de disolventes residuales para evitar crear confusiones con valores diferentes de IDA de una misma sustancia. Los disolventes residuales que se evalúan en este capítulo general se listan en el Apéndice 1 según su estructura y nombre común. Los mismos han sido evaluados en función del riesgo que pueden suponer para la salud humana y colocados en una de las tres clases que figuran a continuación: Clase de Disolvente Residual
Evaluación Disolventes que deben evitarse.
Clase 1
Sustancias conocidas como carcinógenas para los seres humanos. Sustancias seriamente sospechosas de ser carcinógenas para los seres humanos. Sustancias que representan riesgos ambientales. Disolventes que deben limitarse.
Clase 2
Sustancias carcinógenas y no genotóxicas, o posibles agentes causantes de otras toxicidades irreversibles tales como neurotoxicidad o teratogenicidad, en animales. Disolventes sospechosos de causar otras toxicidades importantes pero reversibles. Disolventes con bajo potencial tóxico
Clase 3
Disolventes con bajo potencial tóxico para los seres humanos; no es necesario un límite de exposición basado en el riesgo para la salud. [NOTA-Los disolventes residuales de Clase 3 tienen EDP de 50 mg o más por día.]*
• Para disolventes residuales con EDP superior a 50 mg por día, ver las consideraciones presentadas en la sección Clase 3 en Límites de Disolventes Residuales.
MÉTODOS PARA ESTABLECER LÍMITES DE EXPOSICIÓN El método empleado para establecer la EDP respecto a disolventes residuales se presenta en el Apéndice 3. Para los artículos designados como "sólo para uso veterinario", se pueden justificar niveles más elevados de EDP y de límite de concentración en casos excepcionales, basados en la dosis diaria real, la especie para la cual están destinados y los datos toxicológicos pertinentes, considerando el impacto sobre la seguridad del consumidor. Para los fines de esta Farmacopea, cuando un fabricante recibe la aprobación por parte de una autoridad reglamentaria competente de un límite superior, es responsabilidad del fabricante notificar a la USP el límite de disolvente residual aprobado en el artículo y la justificación. La USP considerará entonces este tema en la monografía individual.
USP 39
366 (467) Disolventes Residuales/ Pruebas Químicas
OPCIONES PARA DESCRIBIR LOS LÍMITES DE DISOLVENTES RESIDUALES DE CLASE 2 Existen dos opciones para establecer los límites de disolventes residuales de Clase 2.
Opción 1 Se emplean los límites de concentración en ppm indicados en la Tabla 2. Éstos se calcularon empleando la ecuación que figura a continuación, suponiendo un peso de producto de 1O g administrado diariamente. Concentración (ppm) = (1000 µg/mg x EDP)/dosis En este caso, la EDP se expresa en mg por día y la dosis se expresa en g por día. Estos límites se consideran aceptables para todos los fármacos, excipientes y productos farmacéuticos. Por lo tanto, esta opción se puede aplicar si la dosis diaria no se conoce o no ha sido fijada. Si todos los fármacos y excipientes de una formulación cumplen con los límites que se proporcionan en la Opción 1, estos componentes se pueden usar en cualquier proporción. No es necesario realizar cálculos adicionales siempre que la dosis diaria no exceda de 1O g. Los productos que se administran en dosis superiores a 1O g por día se contemplan en la Opción 2.
Opción 2 No se requiere que cada componente del producto farmacéutico cumpla con los límites proporcionados en la Opción 1. Se puede emplear la EDP expresada en mg por día según se indica en la Tabla 2 con la dosis diaria máxima conocida y la ecuación anteriormente mencionada, para determinar la concentración de disolvente residual permitida en un producto farmacéutico. Tales límites se consideran aceptables, si se demuestra que el disolvente residual se ha reducido al mínimo factible. Los límites deben ser realistas en cuanto a la precisión analítica, la capacidad de fabricación y la variación razonable en el proceso de fabricación. Los límites también deben reflejar las normas de fabricación actuales. La Opción 2 se puede aplicar sumando las cantidades de disolventes residuales presentes en cada uno de los componentes del producto farmacéutico. La suma de las cantidades de disolvente por día debe ser menor que la indicada por la EDP. A continuación, se ofrece un ejemplo de la aplicación de la Opción 7 y la Opción 2 para la concentración de acetonitrilo en un producto farmacéutico. La exposición diaria permitida al acetonitrilo es 4, 1 mg por día; por lo tanto, el límite de la Opción 1 es 41 O ppm. El peso diario máximo administrado de un producto farmacéutico es 5,0 g y el producto farmacéutico contiene dos excipientes. La composición del producto farmacéutico y el contenido máximo calculado de acetonitrilo residual se muestran en la siguiente tabla.
Componente
Cantidad en la Formulación (g)
Contenido de Acetonitrilo (ppm)
Exposición Diaria (mg)
Fármaco
0,3
800
0,24
Excipiente 1
0,9
400
0,36
Excipiente 2
3,8
800
3,04
Producto farmacéutico
5,0
728
3,64
El Excipiente 1 cumple con el límite de la Opción 1, pero el fármaco, el excipiente 2 y el producto farmacéutico no cumplen con el límite de la Opción 1. No obstante, el producto farmacéutico cumple con el límite de la Opción 2 de 4, l mg por día y de ese modo se ajusta a los criterios de aceptación de este capítulo general. A continuación, se ofrece otro ejemplo que emplea acetonitrilo como disolvente residual. El peso diario máximo administrado de un producto farmacéutico es 5,0 g y el producto farmacéutico contiene dos excipientes. La composición del producto farmacéutico y el contenido máximo calculado de acetonitrilo residual se muestran en la siguiente tabla.
Componente
Cantidad en la Formulación (g)
Contenido de Acetonitrilo (ppm}
Exposición Diaria (mg} 0,24
Fármaco
0,3
800
Excipiente 1
0,9
2000
1,80
Excipiente 2
3,8
800
3,04
Producto farmacéutico
5,0
1016
5,08
En este ejemplo, el producto farmacéutico no cumple con el límite de la Opción 1 ni con el de la Opción 2 según esta suma. El fabricante podría analizar el producto farmacéutico para determinar si el proceso de formulación redujo el nivel de acetonitrilo. Si, durante la formulación, el nivel de acetonitrilo no se redujo a los límites permitidos, el producto no cumple con los límites de disolventes según se describen en este capítulo y el fabricante del producto farmacéutico debe tomar otras medidas para reducir la cantidad de acetonitrilo en el producto farmacéutico. En algunos casos, el fabricante puede haber recibido la aprobación por parte de una autoridad reglamentaria competente sobre dicho nivel más elevado de disolvente residual. Si éste fue-
Pruebas Químicas/ (467) Disolventes Residuales 367
USP 39
ra el caso, es responsabilidad del fabricante notificar a la USP la identidad del disolvente y el límite de disolvente residual aprobado en el artículo. La USP considerará entonces este tema en la monografía individual.
PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS Normalmente, los disolventes residuales se determinan empleando técnicas cromatográficas tales como la cromatografía de gases. Los métodos oficiales para analizar el contenido de disolventes residuales se describen en la sección Identificación, Control y Cuantificación de Disolventes Residuales de este capítulo general. Las Advertencias Generales tratan el uso de otros métodos en circunstancias especiales (ver 6.30. Métodos y Procedimientos Alternativos y Armonizados). Si están presentes disolventes de Clase 3, se puede usar un método no específico como por ejemplo pérdida por secado.
INFORME DE NIVELES DE DISOLVENTES RESIDUALES Los fabricantes de productos farmacéuticos necesitan cierta información acerca del contenido de disolventes residuales en fármacos o excipientes para cumplir con los criterios de este capítulo general. Las siguientes declaraciones se proporcionan como ejemplos aceptables de la información que podría ofrecer un proveedor de fármacos o excipientes a un fabricante de productos farmacéuticos. El proveedor podría escoger alguna de las que se presentan a continuación, según corresponda: • Es probable que estén presentes sólo disolventes de Clase 3. La pérdida por secado es menos de 0,5%. •Es probable que estén presentes sólo los disolventes X, Y, ... de Clase 2. Todos se encuentran por debajo del límite de la Opción 7. (Aquí el fabricante mencionaría los disolventes de Clase 2 representados por X, Y, ... ) • Es probable que estén presentes sólo los disolventes X, Y, ... de Clase 2 y disolventes de Clase 3. Los disolventes residuales de Clase 2 se encuentran por debajo del límite de la Opción 7 y los disolventes residuales de Clase 3 se encuentran por debajo de 0,5%. La frase "es probable que estén presentes", según se usa en los ejemplos anteriores, hace referencia al disolvente usado o producido en la etapa final de fabricación y a los disolventes usados o producidos en las etapas iniciales de fabricación y que no son eliminados uniformemente mediante un proceso validado. Si es probable que estén presentes los disolventes de Clase 1, éstos se deberían identificar y cuantificar. Si los disolventes de Clase 2 ó 3 están presentes en cantidades superiores a los límites de la Opción 7 ó 0,5%, respectivamente, éstos se deben identificar y cuantificar.
LÍMITES DE DISOLVENTES RESIDUALES Clase 1 (Disolventes que deben evitarse) Los disolventes residuales de Clase 1 (Tabla 7) no deben emplearse en la fabricación de fármacos, excipientes o productos farmacéuticos debido a su inaceptable toxicidad o sus efectos ambientales perjudiciales. No obstante, si es inevitable su uso en la fabricación de un medicamento con una ventaja terapéutica significativa, sus niveles deben estar restringidos tal como se muestra en la Tabla 7, a menos que se indique algo diferente en la monografía individual. El disolvente 1, 1, 1-tricloroetano se ha incluido en la Tabla 7 debido a que representa un riesgo ambiental. El límite indicado de 1500 ppm está basado en la revisión de datos de seguridad. Cuando se emplean o producen disolventes residuales de Clase 1 en la fabricación o purificación de fármacos, excipientes o productos farmacéuticos y no son eliminados durante el proceso, estos disolventes se deben identificar y cuantificar. Los procedimientos que se describen en la sección Identificación, Control y Cuantificación de Disolventes Residuales de este capítulo general se deben aplicar siempre que sea posible. Si éste no fuera el caso, se debe emplear un procedimiento validado apropiado. Tabla 1. Disolventes Residuales de Clase 1 (Disolventes que deben evitarse)
DI solvente
Límite de Concentración (ppm)
Motivo
Benceno
2
Carcinógeno
Tetracloruro de carbono
4
Tóxico
1,2-Dicloroetano
5
Tóxico
8
Tóxico
1, 1-Dicloroeteno 1, 1, 1-Tricloroetano
1500
y presenta riesgos para el medio ambiente
Presenta riesgos para el medio ambiente
Clase 2 Los disolventes residuales de Clase 2 (Tabla 2) deben estar limitados en los fármacos, excipientes y productos farmacéuticos debido a su toxicidad inherente. Las EDP se proporcionan con una aproximación de O, 1 mg por día y las concentraciones con
USP 39
368 (467) Disolventes Residuales/ Pruebas Químicas
una aproximación de 1O ppm. Los valores indicados no reflejan la precisión analítica necesaria del proceso de determinación. La precisión se debe determinar como parte de la validación del procedimiento. Si los disolventes residuales de Clase 2 están presentes en cantidades superiores a los límites de la Opción 7, éstos se deben identificar y cuantificar. Los procedimientos que se describen en la sección Identificación, Control y Cuantificación de Disolventes Residuales de este capítulo general se deben aplicar siempre que sea posible. Si éste no fuera el caso, se debe emplear un procedimiento validado apropiado. [NOTA-Los siguientes disolventes residuales de Clase 2 no se detectan con facilidad mediante las condiciones de inyección de fase gaseosa que se describen en la sección Identificación, Control y Cuantificación de Disolventes Residuales de este capítulo general: formamida, 2-etoxietanol, 2-metoxietanol, etilenglicol, N-metilpirrolidona y sulfolano. Es necesario emplear otros procedimientos validados apropiados para la cuantificación de estos disolventes residuales. Tales procedimientos se deberán remitir a la USP para su revisión y posible inclusión en la monografía individual correspondiente. Además, puede usarse ER Mezcla C-Disolventes Residuales de Clase 2 USP para desarrollar un procedimiento alternativo.] Tabla 2. Disolventes Residuales de Clase 2
Disolvente
EDP (mg/día)
Límite de Concentración (ppm)
Acetonitrilo
4,1
410
Ciclohexano
38,8
3880 360
Clorobenceno
3,6
Cloroformo
0,6
60
Cloruro de metileno
6,0
600
Cu meno
0,7
70
1,2-Dicloroeteno
18,7
1870
N,N-Dimetilacetamida
10,9
1090
N,N-Dimetilformamida
8,8
880
1,2-Dimetoxietano
1,0
100
1,4-Dioxano
3,8
380
Etilenglicol
6,2
620
2-Etoxietanol
1,6
160
Forma mida
2,2
220
Hexano
2,9
290
Metanol
30,0
3000
Metilbutilcetona
0,5
50
Metilciclohexano
11,8
1180
N-Metilpirrolidona
5,3
530
2-Metoxietanol
0,5
50
Nitro metano
0,5
50
Piridina
2,0
200
Sulfolano
1,6
160
Tetrahidrofurano
7,2
720
Tetralina
1,0
100
Tolueno
8,9
890
Tricloroetileno
0,8
80
Xi le no*
21,7
2170
* Generalmente 60% de m-xileno, 14% de p-xileno, 9% de o-xileno con 1 7% de etilbenceno
Clase 3 Se considera que los disolventes residuales de Clase 3 (Tabla 3) son menos tóxicos y representan un riesgo menor para la salud humana que los disolventes residuales de Clase 1 y Clase 2. La Clase 3 no incluye disolventes que representen un riesgo para la salud humana a los niveles normalmente aceptados en productos farmacéuticos. Sin embargo, no hay estudios de carcinogenicidad o toxicidad a largo plazo para muchos de los disolventes residuales de Clase 3. Los datos disponibles indican que son menos tóxicos en estudios de toxicidad a corto plazo o agudos y que son negativos en estudios de genotoxicidad. Se considera que aquellas cantidades de disolventes residuales de 50 mg por día o menos (correspondientes a 5000 ppm o 0,5% en la Opción 7) serían aceptables sin necesidad de justificación. Cantidades superiores pueden también ser aceptables siempre que sean realistas en relación con la capacidad de fabricación y las buenas prácticas de fabricación. Para los fines de esta Farmacopea, cuando un fabricante recibe la aprobación por parte de una autoridad reglamentaria competente sobre un nivel superior de disolvente residual, es responsibilidad de dicho fabricante notificar a la USP la identidad del disolvente y el
Pruebas Químicas/ (467) Disolventes Residuales 369
USP 39
límite de disolvente residual aprobado para el artículo. La USP considerará entonces este tema en la monografía individual. Si el límite de disolvente de Clase 3 en una monografía individual es superior a 50 mg por día, ese disolvente residual se debe identificar y cuantificar. Los procedimientos que se describen en la sección Identificación, Control y Cuantificación de Disolventes Residuales de este capítulo general, con las debidas modificaciones a las soluciones estándar, se deben aplicar siempre que sea posible. Si éste no fuera el caso, se debe emplear un procedimiento validado apropiado. Tabla 3. Disolventes Residuales de Clase 3
. . t es y pro d uct os f armaceu , f 1cos (L"1m1ta . d os por 1as b uenas practicas d e f ab ncac1on . . "tos b asa d osen 1aca1l"d ad en f'armacos, exc1p1en u otros requ1s1
Acetato de butilo
Etanol
Acetato de etilo
Éter terc-butilmetílico
Acetato de isobutilo
Éter etílico
Acetato de isopropilo
Formiato de etilo
Acetato de metilo
Heptano
Acetato de propilo
3-Metil-1-butanol
Acetona
Metiletilcetona
Ácido acético
Metilisobutilcetona
Ácido fórmico
2-Metil-1-propanol
Anisol
Pentano
1-Butanol
1-Pentanol
2-Butanol
1-Propanol
Dimetil sulfóxido
2-Propanol
Otros Disolventes Residuales Los disolventes residuales que figuran en la Tabla 4 también podrían interesar a los fabricantes de fármacos, excipientes o productos farmacéuticos. No obstante, no se han encontrado datos toxicológicos adecuados para fundamentar una EDP. Tabla 4. Otros Disolventes Residuales (Para los cuales no se han encontrado datos toxicológicos adecuados) Ácido tricloroacético
Éter isopropílico
Ácido trifluoroacético
Éter de petróleo
1, 1-Dietoxipropano
lsooctano
1, 1-Dimetoximetano
Metil isopropil cetona
2,2-Dimetoxipropano
Metiltetrahidrofurano
IDENTIFICACIÓN, CONTROL V CUANTIFICACIÓN DE DISOLVENTES RESIDUALES Siempre que sea posible, la sustancia en análisis debe disolverse para liberar el disolvente residual. Dado que la USP se ocupa de productos farmacéuticos, así como de ingredientes activos y excipientes, a veces puede ser aceptable que algunos de los componentes de la formulación no se disuelvan por completo. En tales casos, puede ser necesario reducir el producto farmacéutico primero a polvo fino, de manera que se pueda liberar cualquier disolvente residual que pudiera estar presente. Esta operación debe realizarse lo más rápido posible para evitar la pérdida de disolventes volátiles durante el procedimiento. [NOTA-El agua exenta de sustancias orgánicas que se especifica en los siguientes procedimientos no produce picos que interfieran significativamente cuando se lleva a cabo una cromatografía.]
Disolventes Residuales de Clase 1 y Clase 2 Los siguientes procedimientos son útiles para identificar y cuantificar disolventes residuales cuando no esté disponible la información acerca de los disolventes residuales que pudieran estar presentes en el material. Cuando la información acerca de la presencia de disolventes residuales específicos está disponible, sólo es necesario llevar a cabo el Procedimiento C para cuantificar la cantidad de disolventes residuales presentes. La Figura 1 muestra un diagrama de flujo para la aplicación de las pruebas de límite de disolventes residuales.
370 (467) Disolventes Residuales/ Pruebas Químicas
¿Los picos correspondientes a los disolventes residuales tienen áreas menores que
USP 39
si
las de los estándares?
¿Los picos SÍ correspondientes a los disolventes > - - - - - - · l l CUMPLE CON LA PRUEBA, NO residuales tienen áreas menores que REQUIERE ACCIÓN POSTERIOR las de los estándares?
tlquetar tn 1can o la cantidad del disolvente residual encontrado
Fig. 1. Diagrama relativo a la identificación de disolventes residuales y la aplicación de pruebas de límite. ARTÍCULOS SOLUBLES EN AGUA Procedimiento A Solución Madre del Estándar de Clase 7-[NOTA-AI transferir las soluciones, colocar la punta de la pipeta justo por debajo de la superficie del líquido y mezclar.] Transferir 1,0 mL de ER Mezcla de Disolventes Residuales de Clase 1 USP a un matraz volumétrico de 100 mL, al que previamente se han agregado aproximadamente 9 mL de dimetil sulfóxido, diluir con agua a volumen y mezclar. Transferir 1,0 mL de esta solución a un matraz volumétrico de 100 mL, al que previamente se le han agregado aproximadamente 50 mL de agua, diluir con agua a volumen y mezclar. Transferir 1O mL de esta solución a un matraz volumétrico de 100 mL, al que previamente se le han agregado aproximadamente 50 mL de agua, diluir con agua a volumen y mezclar. Solución Estándar de Clase 7-Transferir 1,0 mL de Solución Madre del Estándar de Clase 7 a un vial para muestreo de fase gaseosa apropiado que contenga 5,0 mL de agua (colocar la punta de la pipeta justo por debajo de la superficie del líquido para dispensar), tapar y mezclar. Soluciones Madre del Estándar de Clase 2-Transferir 1,0 mL de ER Mezcla A-Disolventes Residuales de Clase 2 USP a un matraz volumétrico de 100 mL, diluir con agua a volumen y mezclar. Ésta es la Solución Madre A del Estándar de Clase 2. Transferir 1,0 mL de ER Mezcla B-Disolventes Residuales de Clase 2 USP a un matraz volumétrico de 100 mL, diluir con agua a volumen y mezclar. Ésta es la Solución Madre B del Estándar de Clase 2. Solución Estándar Mezcla A de Clase 2-Transferir 1,0 mL de Solución Madre A del Estándar de Clase 2 a un vial para muestreo de fase gaseosa adecuado, agregar 5,0 mL de agua, tapar y mezclar.
Pruebas Químicas/ (467) Disolventes Residuales 371
USP 39
Solución Estándar Mezcla B de Clase 2-Transferir 5,0 mL de Solución Madre B del Estándar de Clase 2 a un vial para muestreo de fase gaseosa adecuado, agregar 1,0 mL de agua, tapar y mezclar. Solución Madre de Prueba-Transferir aproximadamente 250 mg del artículo en análisis, pesados con exactitud, a un matraz volumétrico de 25 mL, disolver y diluir con agua a volumen, y mezclar. Solución de Prueba-Transferir 5,0 mL de Solución Madre de Prueba a un vial para muestreo de fase gaseosa adecuado, agregar 1,0 mL de agua, tapar y mezclar. Solución de Aptitud del Sistema de Clase 7-Transferir 1,0 mL de Solución Madre del Estándar de Clase 7 a un vial para muestreo de fase gaseosa adecuado, agregar 5,0 mL de la Solución Madre de Prueba, tapar y mezclar. Sistema Cromatográfico (ver Cromatografía (621 ))-Equipar un cromatógrafo de gases con un detector de ionización a la llama y una columna de sílice fundida de 0,32 mm x 30 m recubierta con una capa de fase G43 de 1,8 µm o una columna macrocapilar de 0,53 mm x 30 m recubierta con una capa de fase G43 de 3,0 µm. El gas transportador es nitrógeno o helio con una velocidad lineal de aproximadamente 35 cm/s y una relación de partición de 1:5. [NOTA-La relación de partición puede modificarse para optimizar la sensibilidad.] Mantener la temperatura de la columna a 40º durante 20 minutos, luego elevarla a una velocidad de 1Oº por minuto hasta 240º y mantenerla a 240º durante 20 minutos. Mantener las temperaturas del inyector y del detector a 140º y 250º, respectivamente. Inyectar en el cromatógrafo la Solución Estándar de Clase 7, la Solución de Aptitud del Sistema de Clase 7 y la Solución Estándar Mezcla A de Clase 2, y registrar el cromatograma según se indica en Procedimiento: la relación señal-ruido del 1, 1, 1-tricloroetano en la Solución Estándar de Clase 7 no es menor de 5; la relación señal-ruido de cada pico en la Solución de Aptitud del Sistema de Clase 7 no es menor de 3; y la resolución, R, entre acetonitrilo y cloruro de metileno en la Solución Estándar Mezcla A de Clase 2 no es menor de 1,0. Procedimiento-[NOTA-Se recomienda incrementar la temperatura de la línea de transferencia entre corridas para eliminar cualquier condensación potencial de los disolventes.] Inyectar por separado en el cromatógrafo (siguiendo alguno de los sets de parámetros operativos para el inyector de fase gaseosa descritos en la Tabla 5) volúmenes iguales de la fase gaseosa (aproximadamente 1,0 mL) de Solución Estándar de Clase 7, Solución Estándar Mezcla A de Clase 2, Solución Estándar Mezcla B de Clase 2 y Solución de Prueba, registrar los cromatogramas y medir las respuestas de los picos principales. Si la respuesta de cualquier pico diferente del pico de 1, 1, 1-tricloroetano en la Solución de Prueba es mayor o igual a la del pico correspondiente en la Solución Estándar de Clase 7 o en cualquiera de las dos Soluciones Estándar Mezcla de Clase 2, o si la respuesta del pico de 1, 1, 1-tricloroetano es mayor o igual a 150 veces la respuesta del pico correspondiente a 1, 1, 1-tricloroetano en la Solución Estándar de Clase 7, llevar a cabo el Procedimiento B para verificar la identidad del pico; si esto no sucediera, el artículo cumple con los requisitos de esta prueba. Tabla 5. Parámetros Operativos para el Inyector de Fase Gaseosa Sets de Parámetros Operativos para el Inyector de Fase Gaseosa Temperatura de equilibrio(°)
1
2
3
80
105
80
Tiempo de equilibrio (min)
60
45
45
Temperatura de línea de transferencia(°) (si corresponde)
85
11 o
105
80-90
105-115
80-90
2:60
2:60
2:60
1
1
1
Temperatura de la jeringa(º) (si corresponde) Gas transportador: nitrógeno o helio a una presión adecuada Tiempo de presurización (s) (si corresponde) Volumen de inyección (ml)*
* O seguir las recomendaciones del fabricante del instrumento, siempre y cuando se cumplan los criterios del método. Se permite inyectar una cantidad menor a la citada siempre y cuando se logre la sensibilidad adecuada.
Procedimiento B Solución Madre del Estándar de Clase 7, Solución Estándar de Clase 7, Soluciones Madre del Estándar de Clase 2, Solución Estándar Mezcla A de Clase 2, Solución Estándar Mezcla B de Clase 2, Solución Madre de Prueba, Solución de Prueba y Solución de Aptitud del Sistema de Clase 7-Preparar según se indica en Procedimiento A. Sistema Cromatográfico (ver Cromatografía (621 ))-Equipar un cromatógrafo de gases con un detector de ionización a la lla-
ma y una columna de sílice fundida de 0,32 mm x 30 m recubierta con una capa de fase Gl 6 de 0,25 µm o una columna macrocapilar de 0,53 mm x 30 m recubierta con una capa de fase Gl 6 de 0,25 µm. El gas transportador es nitrógeno o helio con una velocidad lineal de aproximadamente 35 cm/s y una relación de partición de 1 :5. [NOTA-La relación de partición puede modificarse para optimizar la sensibilidad.] Mantener la temperatura de la columna a 50º durante 20 minutos, luego elevarla a una velocidad de 6º por minuto hasta 165º y mantenerla a 165º durante 20 minutos. Mantener las temperaturas del inyector y del detector a 140º y 250º, respectivamente. Inyectar en el cromatógrafo la Solución Estándar de Clase 7 y la Solución de Aptitud del Sistema de Clase 7, y registrar el cromatograma según se indica en Procedimiento: la relación señal-ruido del benceno en la Solución Estándar de Clase 7 no es menor de 5; la relación señal-ruido de cada pico en la Solución de Aptitud del Sistema de Clase 7 no es menor de 3; y la resolución, R, entre acetonitrilo y cis-dicloroeteno en la Solución Estándar Mezcla A de Clase 2 no es menor de 1,0. Procedimiento-[NOTA-Se recomienda incrementar la temperatura de la línea de transferencia entre corridas para eliminar cualquier condensación potencial de los disolventes.] Inyectar por separado en el cromatógrafo (siguiendo alguno de los sets
372 (467) Disolventes Residuales / Pruebas Q1.,1ímicas
USP 39
de parámetros operativos para el inyector de fase gaseosa, descritos en la Tabla 5) volúmenes iguales de la fase gaseosa (aproximadamente 1,0 mL) de Solución Estándar de Clase 1, Solución Estándar Mezcla A de Clase 2, Solución Estándar Mezcla B de Clase 2 y Solución de Prueba, registrar los cromatogramas y medir las respuestas de los picos principales. Si las respuestas de los picos en la Solución de Prueba de los picos identificados en el Procedimiento A son iguales o mayores que los picos correspondientes en la Solución Estándar de Clase 1 o en cualquiera de las dos Soluciones Estándar Mezcla de Clase 2, llevar a cabo el Procedimiento C para cuantificar los picos; si esto no sucediera, el artículo cumple con los requisitos de esta prueba. Procedimiento C Solución Madre del Estándar de Clase 1, Solución Estándar de Clase 1, Solución Madre A del Estándar de Clase 2, Solución Estándar Mezcla A de Clase 2, Solución Madre de Prueba, Solución de Prueba y Solución de Aptitud del Sistema de Clase 7-Preparar según se indica en Procedimiento A. Solución Madre del Estándar-[NOTA-Preparar por separado una Solución Madre del Estándar para cada pico identificado y verificado mediante los Procedimientos A y B. Para los disolventes de Clase 1 diferentes de 1, 1, 1-tricloroetano, preparar la primera dilución según se indica para la primera dilución en Solución Madre del Estándar de Clase 1, Procedimiento A.] Transferir un volumen, medido con exactitud, de cada Estándar de Referencia USP individual correspondiente a cada pico de disolvente residual identificado y verificado mediante los Procedimientos A y B a un recipiente adecuado y diluir cuantitativamente con agua, y si fuera necesario en diluciones sucesivas, para obtener una solución con una concentración final de 1/20 del valor indicado en la Tabla 1 ó 2 (en Límite de Concentración). Solución Estándar-Transferir 1,0 mL de esta solución a un vial para muestreo de fase gaseosa apropiado, agregar 5,0 mL de agua, tapar y mezclar. Solución de Prueba con una Cantidad Conocida Agregada--{NOTA-Preparar por separado una Solución de Prueba con una Cantidad Conocida Agregada para cada pico identificado y verificado mediante los Procedimientos A y B.] Transferir 5,0 mL de Solución Madre de Prueba a un vial para muestreo de fase gaseosa apropiado, agregar 1,0 mL de Solución Madre del Estándar, tapar y mezclar. Sistema Cromatográfico (ver Cromatografía (621 ))-[NOTA-Si se verifica que los resultados de la cromatografía del Procedimiento A son inferiores a los del Procedimiento 81 se puede sustituir el Sistema Cromatográfico del Procedimiento B.] Equipar un cromatógrafo de gases con un detector de ionización a la llama y una columna de sílice fundida de 0,32 mm x 30 m recubierta con una capa de fase G43 de 1,8 µm o una columna macrocapilar de 0,53 mm x 30 m recubierta con una capa de fase G43 de 3,0 µm. El gas transportador es nitrógeno o helio con una velocidad lineal de aproximadamente 35 cm/s y una relación de partición de 1 :5. [NOTA-La relación de partición puede modificarse para optimizar la sensibilidad.] Mantener la temperatura de la columna a 40º durante 20 minutos, luego elevarla a una velocidad de 1Oº por minuto hasta 240º y mantenerla a 240º durante 20 minutos. Mantener las temperaturas del inyector y del detector a 140º y 250º, respectivamente. Inyectar en el cromatógrafo la Solución Estándar de Clase 1, la Solución de Aptitud del Sistema de Clase 1 y la Solución Estándar Mezcla A de Clase 2, y registrar el cromatograma según se indica en Procedimiento: la relación señal-ruido del 1, 1, 1-tricloroetano en la Solución Estándar de Clase 1 no es menor de 5; la relación señal-ruido de cada pico en la Solución de Aptitud del Sistema de Clase 1 no es menor de 3; y la resolución, R, entre acetonitrilo y cloruro de metileno en la Solución Estándar Mezcla A de Clase 2 no es menor de 1,0. Procedimiento-[NOTA-Se recomienda incrementar la temperatura de la línea de transferencia entre corridas para eliminar cualquier condensación potencial de los disolventes.] Inyectar por separado en el cromatógrafo (siguiendo alguno de los sets de parámetros operativos para el inyector de fase gaseosa descritos en la Tabla 5) volúmenes iguales de fase gaseosa (aproximadamente 1,0 mL) de Solución Estándar, Solución de Prueba y Solución de Prueba con una Cantidad Conocida Agregada, registrar los cromatogramas y medir las respuestas de los picos principales. Calcular la cantidad, en ppm, de cada disolvente residual encontrado en el artículo en análisis, por la fórmula:
5(C/W)[ru /(r5r - fu)] en donde Ces la concentración, en µg por mL, del Estándar de Referencia USP correspondiente en la Solución Madre del Estándar; W es el peso, en g, del artículo en análisis tomado para preparar la Solución Madre de Prueba; y ru y r5r son las respuestas de los picos de cada disolvente residual obtenidas a partir de la Solución de Prueba y la Solución de Prueba con una Cantidad Conocida Agregada, respectivamente. ARTÍCULOS INSOLUBLES EN AGUA Procedimiento A-[NOTA-Se puede usar dimetil sulfóxido como disolvente alternativo en lugar de dimetilformamida.] Solución Madre del Estándar de Clase 7-Transferir 1,0 mL de ER Mezcla de Disolventes Residuales de Clase 1 USP a un matraz volumétrico de 100 mL, al que previamente se han agregado aproximadamente 80 mL de dimetilformamida, diluir con dimetilformamida a volumen y mezclar. Transferir 1,0 mL de esta solución a un matraz volumétrico de 100 mL, al que previamente se han agregado aproximadamente 80 mL de dimetilformamida, diluir con dimetilformamida a volumen y mezclar (reservar una porción de esta solución para la Solución de Aptitud del Sistema de Clase 1). Transferir 1,0 mL de esta solución a un matraz volumétrico de 1O mL, diluir con dimetilformamida a volumen y mezclar. Solución Estándar de Clase 7-Transferir 1,0 mL de Solución Madre del Estándar de Clase 1 a un vial para muestreo de fase gaseosa adecuado, que contenga 5,0 mL de agua, tapar y mezclar.
USP 39
Pruebas Químicas/ (467) Disolventes Residuales 373
Soluciones Madre del Estándar de Clase 2-Transferir 1,0 mL de ER Mezcla A-Disolventes Residuales de Clase 2 USP a un matraz volumétrico de 100 mL, al que previamente se han agregado aproximadamente 80 mL de dimetilformamida, diluir con dimetilformamida a volumen y mezclar. Ésta es la Solución Madre A del Estándar de Clase 2. Transferir 0,5 mL de ER Mezcla BDisolventes Residuales de Clase 2 USP a un matraz volumétrico de 1O mL, diluir con dimetilformamida a volumen y mezclar. Ésta es la Solución Madre B del Estándar de Clase 2. Solución Estándar Mezcla A de Clase 2-Transferir 1,0 mL de Solución Madre A del Estándar de Clase 2 a un vial para muestreo de fase gaseosa adecuado, que contenga 5,0 mL de agua, tapar y mezclar. Solución Estándar Mezcla B de Clase 2-Transferir 1,0 mL de Solución Madre B del Estándar de Clase 2 a un vial para muestreo de fase gaseosa adecuado, que contenga 5,0 mL de agua, tapar y mezclar. Solución Madre de Prueba-Transferir aproximadamente 500 mg del artículo en análisis, pesados con exactitud, a un matraz volumétrico de 1O mL, disolver y diluir con dimetilformamida a volumen, y mezclar. Solución de Prueba-Transferir 1,0 mL de Solución Madre de Prueba a un vial para muestreo de fase gaseosa adecuado, que contenga 5,0 mL de agua, tapar y mezclar. Solución de Aptitud del Sistema de Clase 7-Mezclar 5 mL de la Solución Madre de Prueba con 0,5 mL de la dilución intermedia reservada de la Solución Madre del Estándar de Clase 1. Transferir 1,0 mL de esta solución a un vial para muestreo de fase gaseosa adecuado, que contenga 5,0 mL de agua, tapar y mezclar. Sistema Cromatográfico (ver Cromatografía (621 ))-Equipar el cromatógrafo de gases con un detector de ionización a la llama y una columna macrocapilar de 0,53 mm x 30 m recubierta con una capa de fase G43 de 3,0 µm. El gas transportador es helio con una velocidad lineal de aproximadamente 35 cm/s y una relación de partición de 1 :3. [NOTA-La relación de partición puede modificarse para optimizar la sensibilidad.] Mantener la temperatura de la columna a 40º durante 20 minutos, luego aumentarla a una velocidad de 1Oº por minuto hasta 240º y mantenerla a 240º durante 20 minutos. Mantener las temperaturas del inyector y del detector a 140º y 250º, respectivamente. Inyectar en el cromatógrafo la Solución Estándar de Clase 1, la Solución de Aptitud del Sistema de Clase 1 y la Solución Estándar Mezcla A de Clase 2, y registrar el cromatograma según se indica en Procedimiento: la relación señal-ruido de 1, 1, 1-tricloroetano en la Solución Estándar de Clase 1 no es menor de 5; la relación señal-ruido de cada pico en la Solución de Aptitud del Sistema de Clase 1 no es menor de 3; y la resolución, R, entre acetonitrilo y cloruro de metileno en la Solución Estándar Mezcla A de Clase 2 no es menor de 1,0. Procedimiento-[NOTA-Se recomienda incrementar la temperatura de la línea de transferencia entre corridas para eliminar cualquier condensación potencial de los disolventes.] Inyectar por separado en el cromatógrafo (usar los sets de parámetros operativos para el inyector de fase gaseosa descritos en la columna 3 de la Tabla 5 con una presión del vial de 1O psi) volúmenes iguales de la fase gaseosa (aproximadamente 1,0 mL) de Solución Estándar de Clase 1, Solución Estándar Mezcla A de Clase 2, Solución Estándar Mezcla B de Clase 2 y Solución de Prueba, registrar los cromatogramas y medir las respuestas de los picos principales. Si la respuesta de cualquier pico diferente del pico de 1, 1, 1-tricloroetano, en la Solución de Prueba es mayor o igual al pico correspondiente en la Solución Estándar de Clase 1 o en cualquiera de las dos Soluciones Estándar Mezcla de Clase 2, o si la respuesta del pico de 1, 1, 1-tricloroetano es mayor o igual a 150 veces la respuesta del pico correspondiente a 1, 1, 1-tricloroetano en la Solución Estándar de Clase 1, llevar a cabo el Procedimiento B para verificar la identidad del pico; si esto no sucediera, el artículo cumple con los requisitos de esta prueba. Procedimiento B Solución Madre del Estándar de Clase 1, Solución Estándar de Clase 1, Solución de Aptitud del Sistema de Clase 1, Soluciones Madre del Estándar de Clase 2, Solución Estándar Mezcla A de Clase 2, Solución Estándar Mezcla B de Clase 2, Solución Madre de Prueba y Solución de Prueba-Preparar según se indica en Procedimiento A. Sistema Cromatográfico-Proceder según se indica en Procedimiento Ben Artículos Solubles en Agua con una relación de partición de 1:3. [NOTA-La relación de partición puede modificarse para optimizar la sensibilidad.] Procedimiento-{NOTA-Se recomienda incrementar la temperatura de la línea de transferencia entre corridas para eliminar cualquier condensación potencial de los disolventes.] Inyectar por separado en el cromatógrafo (usar los sets de parámetros operativos para inyector de fase gaseosa descritos en la columna 3 de la Tabla 5 con una presión del vial de 1O psi) volúmenes iguales de la fase gaseosa (aproximadamente 1,0 mL) de Solución Estándar de Clase 1, Solución Estándar Mezcla A de Clase 2, Solución Estándar Mezcla B de Clase 2 y Solución de Prueba, registrar los cromatogramas y medir las respuestas de los picos principales. Si la respuesta de los picos identificados en la Solución de Prueba en el Procedimiento A son mayores o iguales a los picos correspondientes en la Solución Estándar de Clase 1 o en cualquiera de las dos Soluciones Estándar Mezcla de Clase 2, llevar a cabo el Procedimiento C para cuantificar los picos; si esto no sucediera, el artículo cumple con los requisitos de esta prueba. Procedimiento C Solución Madre del Estándar de Clase 1, Solución Estándar de Clase 1, Solución de Aptitud del Sistema de Clase 1, Solución Madre A del Estándar de Clase 2 y Solución Estándar Mezclo A de Clase 2-Proceder según se indica en Procedimiento A. Solución Madre del Estándar-[NOTA-Preparar por separado una Solución Madre del Estándar para cada pico identificado y verificado mediante los Procedimientos A y B. Para disolventes de Clase 1 diferentes de 1, 1, 1-tricloroetano, preparar la primera dilución según se indica para la primera dilución en Solución Madre del Estándar de Clase 1 en el Procedimiento A.] Transferir un volumen, medido con exactitud, de cada Estándar de Referencia USP individual correspondiente a cada pico de disolvente residual identificado y verificado mediante los Procedimientos A y B a un recipiente adecuado y diluir cuantitativamente con agua, y si fuera necesario en diluciones sucesivas, para obtener una solución con una concentración final de 1/20 del valor especificado en la Tabla 1 o Tabla 2 (en Límite de Concentración).
374 (467) Disolventes Residuales/ Pruebas Químicas
USP 39
Solución Estándar-Transferir 1,0 mL de la Solución Madre del Estándar a un vial para muestreo de fase gaseosa adecuado, que contenga 5,0 mL de agua, tapar y mezclar. Solución Madre de Prueba-Proceder según se indica en Procedimiento A. Solución de Prueba-Transferir 1,0 mL de la Solución Madre de Prueba a un vial para muestreo de fase gaseosa adecuado, que contenga 5,0 mL de agua, tapar y mezclar. Solución de Prueba con una Cantidad Conocida Agregada-[NOTA-Preparar por separado una Solución de Prueba con una Cantidad Conocida Agregada para cada pico identificado y verificado mediante los Procedimientos A y B.] Transferir 1,0 mL de Solución Madre de Prueba a un vial para muestreo de fase gaseosa adecuado, agregar 1 mL de Solución Madre del Estándar y 4,0 mL de agua, tapar y mezclar. Sistema Cromatográfico-Proceder según se indica en Procedimiento C en Artículos Solubles en Agua. Procedimiento-[NOTA-Se recomienda incrementar la temperatura de la línea de transferencia entre corridas para eliminar cualquier condensación potencial de los disolventes.] Inyectar por separado en el cromatógrafo (usar los sets de parámetros operativos para el inyector de fase gaseosa descritos en la columna 3 de la Tabla 5 con una presión del vial de 1O psi) volúmenes iguales de la fase gaseosa (aproximadamente 1,0 mL) de Solución Estándar, Solución de Prueba y Solución de Prueba con una Cantidad Conocida Agregada, registrar los cromatogramas y medir las respuestas de los picos principales. Calcular la cantidad, en ppm, de cada disolvente residual encontrado en el artículo en análisis, por la fórmula:
en donde Ces la concentración, en µg por mL, del Estándar de Referencia USP correspondiente en la Solución Madre del Estándar; W es el peso, en g, del artículo en análisis tomado para preparar la Solución Madre de Prueba; y ru y r5r son las respuestas de los picos de cada disolvente residual obtenidas a partir de la Solución de Prueba y la Solución de Prueba con una Cantidad Conocida Agregada, respectivamente.
Disolventes Residuales de Clase 3 Si están presentes los disolventes de Clase 3, el nivel de disolventes residuales se puede determinar según se indica en Pérdida por Secado (731) cuando la monografía del artículo en análisis incluye un procedimiento de pérdida por secado que especifique un límite superior de no más de 0,5% (de acuerdo con la Opción 7 en este capitulo general), o se puede realizar una determinación específica del disolvente. Si la monografía del artículo en análisis no incluye un procedimiento de pérdida por secado o si el límite de disolvente de Clase 3 en una monografía individual es superior a 50 mg por día (lo que corresponde a 5000 ppm ó 0,5% en la Opción 1), el disolvente residual de Clase 3 individual o los disolventes presentes en el artículo en análisis se deben identificar y cuantificar, aplicando los procedimientos descritos anteriormente, con las debidas modificaciones a las soluciones estándar, siempre que sea posible. Si éste no fuera el caso, se debe emplear un procedimiento validado apropiado. En estos procedimientos se deben usar Estándares de Referencia USP, siempre que estén disponibles.
GLOSARIO Carcinógenos genotóxicos: Son carcinógenos que producen cáncer al afectar los genes o cromosomas. Exposición diaria permitida (EDP): La máxima ingesta diaria admisible de un disolvente residual en productos farmacéuticos. Factor de modificación: Un factor determinado según el criterio profesional de un toxicólogo y que se aplica a datos de valoraciones biológicas de manera que los datos se puedan relacionar con seres humanos de manera segura. lngesta diaria admisible (IDA): La máxima ingesta diaria admisible de sustancias químicas tóxicas. Este término es empleado por la Organización Mundial de la Salud (OMS). lngesta diaria tolerable (IDT): La exposición diaria tolerable a sustancias químicas tóxicas. Este término es empleado por el Programa Internacional para la Seguridad de las Sustancias Químicas (IPCS). Neurotoxicidad: La capacidad de una sustancia de ocasionar efectos adversos en el sistema nervioso. Nivel mínimo de efecto observable (LOEL, por sus siglas en inglés): La dosis mínima de una sustancia en un estudio o grupo de estudios que produce un incremento biológicamente significativo en la frecuencia o gravedad de los efectos causados a los seres humanos o animales expuestos a esta sustancia. Nivel sin efecto observable (NOEL, por sus siglas en inglés): La dosis máxima de una sustancia que no produce un incremento biológicamente significativo en la frecuencia o gravedad de los efectos causados a los seres humanos o animales expuestos a esta sustancia. Sustancias seriamente sospechosas de carcinogenidad para los seres humanos: Una sustancia para la cual no hay evidencia epidemiológica de carcinogénesis pero de la que existen datos de genotoxicidad positivos y clara evidencia de carcinogénesis en roedores. Teratogenicidad: La presencia de malformaciones estructurales en un feto en desarrollo ocasionadas cuando se administra una sustancia durante el embarazo. Toxicidad reversible: La presencia de efectos nocivos ocasionados por una sustancia que desaparecen cuando termina la exposición.
USP 39
Pruebas Químicas/ (467) Disolventes Residuales 375
APÉNDICES Apéndice 1: Lista Ver la tabla Apéndice 7. Lista de Disolventes Residuales Incluidos en Este Capítulo General. APÉNDICE 1. LISTA DE DISOLVENTES RESIDUALES INCLUIDOS EN ESTE CAPÍTULO GENERAL
Disolvente
Otros nombres
Acetato de butilo
Éster butílico del ácido acético
Estructura
Clase
CH,COO(CH,),CH,
Clase 3
CH 3 COOCH,CH,
Clase 3
CH 3 COOCH 2 CH(CH 3)i
Clase 3
Acetato de etilo
Éster etílico del ácido acético
Acetato de isobutilo
Éster isobutílico del ácido acético
Acetato de isopropilo
Éster isopropílico del ácido acético
CH,COOCH(CH,),
Clase 3
Acetato de metilo
Éster metílico del ácido acético
CH,COOCH,
Clase 3
Acetato de propilo
Éster propílico del ácido acético
CH,COOCH,CH 2 CH,
Clase 3
Acetona
2-Propanona Propan-2-ona
Acetonitrilo Ácido acético
Ácido etanoico
Ácido fórmico
Anisol
Metoxibenceno
Benceno
Benzol
1-Butanol
Alcohol n-butílico Butan-1-ol
2-Butanol
Alcohol sec-butílico Butan-2-ol
Ciclohexano
Hexametileno
Clorobenceno
CH,COCH,
Clase 3
CH,CN
Clase 2
CH 3 COOH
Clase 3
HCOOH
Clase 3
UOCH, "' h
o
Clase 3
Clase 1
CH,(CH,hOH
Clase 3
CH 3 CH 2CH(OH)CH 3
Clase 3
o UCI
Clase 2
h
Clase 2
Cloroformo
Triclorometano
CHCI,
Clase 2
Cloruro de metileno
Diclorometano
Clase 2
Cu meno
lsopropilbenceno (1-Metiletil)benceno
CH, d'CH,
1,2-Dicloroetano
sim-Dicloroetano Dicloruro de etileno Cloruro de etileno
CH 2 CICH 2 CI
Clase 1
1, 1-Dicloroeteno
1, 1-Dicloroetileno Cloruro de vinilideno
H7 C=CCl 7
Clase 1
1,2-Dicloroeteno
1,2-Dicloroetileno Dicloruro de acetileno
CIHC=CHCI
Clase 2
N,N-Dimetilacetamida
DMA
CH,CON(CH,),
Clase 2
N,N-Dimetilformamida
DMF
HCON(CH,),
Clase 2
Dimetil sulfóxido
Metilsulfinilmetano Metil sulfóxido DMSO
(CH,),SO
Clase 3
1,2-Dimetoxietano
Éter dimetílico de etilenglicol Monoglima Dimetil celosolve
H,COCH 7 CH 7 0CH,
Clase 2
1,4-Dioxano
p-Dioxano [1,4]Dioxano
Etanol
Alcohol etílico
Éter terc-butilmetílico
2-Metoxi-2-metilpropano
• Usualmente 60% de m-xileno, 14% de p-xileno, 9% de o-xileno con 17% de etil benceno.
CH 7 Cl 7
Clase 2
(°) o
Clase 2
CH,CH,OH
Clase 3
(CH,),COCH,
Clase 3
USP 39
376 (467) Disolventes Residuales/ Pruebas Químicas
APÉNDICE 1. LISTA DE DISOLVENTES RESIDUALES INCLUIDOS EN ESTE CAPÍTULO GENERAL (Continuación)
Disolvente
Otros nombres
Éter etílico
Éter dietílico Etoxietano 1, l '-Oxibisetano
Etilenglicol
1,2-Dihidroxietano 1,2-Etanodiol
2-Etoxietanol
Celosolve
Estructura
Clase
CH,CH,OCH,CH,
Clase 3
HOCH,CH,OH
Clase 2
CH,CH,OCH,CH 2 0H
Clase 2
Formamida
Metanamida
HCONH,
Clase 2
Formiato de etilo
Éster etílico del ácido fórmico
HCOOCH,CH,
Clase 3
Heptano
n-Heptano
CH,(CH,)
Clase 3
Hexano
n-Hexano
CH,(CH,)ACH,
Clase 2
Metanol
Alcohol metílico
CH,OH
Clase 2
3-Metil-1-butanol
Alcohol isoamílico Alcohol isopentílico 3-Metilbutan-1-ol
(CH,),CHCH,CH,OH
Clase 3
Metilbutilcetona
2-Hexanona Hexan-2-ona
CH 3 (CH 2 ),COCH,
Clase 2
Metilciclohexano
Ciclohexilmetano
Metiletilcetona
2-Butanona MEK Butan-2-ona
Metil isobutil cetona
4-Metilpentan-2-ona 4-Metil-2-pentanona MIBK
()CH,
Clase 2
CH 3 CH 2 COCH 3
Clase 3
CH,COCH,CH(CH.),
Clase 3
?H3
Lrº
N-Metilpirrolidona
1-Metilpirrolidin-2-ona 1-Metil-2-pirrolidinona
2-Metil-1-propanol
Alcohol isobutílico 2-Metilpropan-1-ol
(CH,),CHCH,OH
Clase 3
2-Metoxietanol
Metil celosolve
CH,OCH,CH,OH
Clase 2
CH,N0 2
Clase 2
CH,(CH,) 3 CH 3
Clase 3
CH,(CH,).CH,OH
Clase 3
Nitrometano Pentano
n-Pentano
1-Pentanol
Alcohol amílico Pentan-1-ol Alcohol pentílico
Piridina 1-Propanol
Propan-1-ol Alcohol propílico
2-Propanol
Propan-2-ol Alcohol isopropílico
o
Clase 2
Clase 2
CH,CH,CH,OH
Clase 3
(CH.),CHOH
Clase 3
º,;,º \'/
Sulfolano
1, 1-Dióxido de tetrahidrotiofeno
o
Clase 2
Tetracloruro de carbono
Tetraclorometano
CCIA
Clase 1
Tetrahidrofurano
Óxido de tetrametileno Oxaciclopentano
ó
Clase 2
Tetralina
1,2, 3,4-Tetrahidronaftaleno
Tolueno
Metilbenceno
1, 1, 1-Tricloroetano
Metilcloroformo
Tricloroetileno
1, 1,2-Tricloroeteno
* Usualmente 60% de m-xileno, 14% de p-xileno, 9% de o-xileno con 1 7% de etil benceno.
co VCH, "'
Clase 2
""
Clase 2
CH,CCI,
Clase 1
HCIC=CCI,
Clase 2
Pruebas Químicas/ (467) Disolventes Residuales 377
USP 39
APÉNDICE 1. LISTA DE DISOLVENTES RESIDUALES INCLUIDOS EN ESTE CAPÍTULO GENERAL (Continuación)
Disolvente
Otros nombres
Estructura
Clase
CH,
Xileno*
Dimetilbenceno Xilol
• Usualmente 60% de m-xileno, 14% de p-xileno, 9% de o-xileno con 1 7% de etil benceno.
ºº"'
Clase 2
Apéndice 2: Referencia Adicional
REGLAMENTACIÓN AMBIENTAL DE DISOLVENTES ORGÁNICOS VOLÁTILES Varios de los disolventes residuales empleados con frecuencia en la elaboración de productos farmacéuticos figuran como productos químicos tóxicos en las monografías de los Criterios Sanitarios Ambientales (EHC, por sus siglas en inglés) y en el Sistema Integrado de Información de Riesgo (IRIS, por sus siglas en inglés). Entre los objetivos de grupos tales como el Programa Internacional para la Seguridad de las Sustancias Químicas (IPCS, por sus siglas en inglés), la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos (EPA, por sus siglas en inglés) y la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA, por sus siglas en inglés) se incluye la determinación de niveles de exposición admisibles. Su propósito es mantener la integridad medioambiental y proteger la salud de los seres humanos frente a los posibles efectos nocivos de las sustancias químicas ocasionados por una exposición medioambiental a largo plazo. Los procedimientos relativos a la estimación de los límites de exposición máxima segura están basados generalmente en estudios a largo plazo. Cuando no hay disponibles datos de estudios a largo plazo, se pueden emplear datos de estudios a plazos más cortos modificando el método, por ejemplo empleando factores de seguridad mayores. El enfoque descrito en esos documentos se refiere en primer lugar a la exposición a largo plazo o durante toda la vida de la población general al medio ambiente (es decir, el aire ambiental, la comida, el agua potable y otros medios). DISOLVENTES RESIDUALES EN PRODUCTOS FARMACÉUTICOS Los límites de exposición que figuran en este capítulo general están establecidos con respecto a metodologías y datos de toxicidad descritos en monografías del EHC e IRIS. Sin embargo, se deben tener en cuenta al establecer los límites de exposición las siguientes suposiciones específicas sobre los disolventes residuales que se emplearán en la síntesis y formulación de productos farmacéuticos. 1. Los pacientes (no la población en general) emplean los productos farmacéuticos para tratar sus enfermedades o como profilaxis para prevenir infecciones o enfermedades. 2. La suposición de una exposición del paciente durante toda su vida no es necesaria para la mayoría de los productos farmacéuticos, pero puede ser adecuada como hipótesis de trabajo para reducir el riesgo para la salud de los seres humanos. 3. Los disolventes residuales son componentes inevitables en la producción de productos farmacéuticos y a menudo son parte de los productos medicinales. 4. No se debe exceder el nivel recomendado de disolventes residuales salvo en circunstancias excepcionales. 5. Los datos de los estudios toxicológicos que se emplean para determinar los niveles admisibles de disolventes residuales deben provenir de protocolos apropiados, como por ejemplo los que describen la Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económico (OECD, por sus siglas en inglés), la EPA y el Libro Rojo de la FDA.
Apéndice 3: Procedimientos para Establecer Límites de Exposición El método Gaylor-Kodell para la evaluación del riesgo (Gaylor, D. W. y Kodell, R. L., Linear lnterpolation Algorithm for Low Dose Assessment of Toxic Substance. journal of Environmental Pathology and Toxicology, 4:305, 1980) es apropiado para los disolventes carcinogénicos de Clase 1. Solamente cuando se dispone de datos fiables sobre carcinogenicidad puede hacerse una extrapolación mediante modelos matemáticos para fijar límites de exposición. Los límites de exposición para los disolventes residuales de Clase 1 podrían determinarse empleando un factor de seguridad mayor (es decir, de 1O000 a 100 000) con respecto al nivel sin efecto observable (NOEL). La detección y la cuantificación de estos disolventes residuales se efectúan mediante técnicas analíticas de última generación. Los niveles de exposición admisibles que figuran en este capítulo general para los disolventes residuales de Clase 2 se establecieron mediante el cálculo de los valores de EDP conforme a los procedimientos para fijar límites de exposición en productos farmacéuticos (página 5748 del PF 15(6) [nov.-dic. 1989]) y el método adoptado por la IPCS para la Evaluación del Riesgo para la Salud Humana de los Productos Químicos [Assessing Human Health Risk of Chemicals (Environmental Health Criterio 770, OMS, 1994)]. Estos procedimientos son similares a los que emplea la EPA de los Estados Unidos (IRIS), la FDA de los Estados Unidos (Libro Rojo) y otros organismos. El método se describe en este documento para facilitar la comprensión del origen de los valores de EDP. No es necesario realizar estos cálculos para emplear los valores de EDP que figuran en la Tabla 2 de este documento.
378 (467) Disolventes Residuales/ Pruebas Químicas
USP 39
La EDP proviene del nivel sin efecto observable (NOEL) o del nivel mínimo de efecto observable (LOEL), en los estudios más importantes en animales, de la siguiente manera: EDP = (NOEL x Ajuste por Peso)/(Fl x F2 x F3 x F4 x F5)
(1)
La EDP se calcula preferentemente a partir de un NOEL. Si no se obtiene un NOEL, se puede emplear el LOEL. Los factores de modificación que se proponen en este documento para relacionar datos con seres humanos son del mismo tipo que los "factores de incertidumbre" empleados en los Criterios Sanitarios Ambientales (Environmental Health Criteria 170, OMS, Ginebra, 1994) y los "factores de modificación" o los "factores de seguridad" en el Pharmacopeial Forum. La suposición de una exposición sistémica del 100% se emplea en todos los cálculos sin tener en cuenta la vía de administración. Los factores de modificación son los siguientes: Fl
=
Un factor que representa la extrapolación entre especies Fl Fl Fl Fl Fl Fl
= = = = = =
2 para extrapolación de perros a seres humanos 2,5 para extrapolación de conejos a seres humanos 3 para extrapolación de monos a seres humanos
5 para extrapolación de ratas a seres humanos 1O para extrapolación de otros animales a seres humanos 12 para extrapolación de ratones a seres humanos
El factor Fl tiene en cuenta la relación comparativa entre el área de superficie y el peso corporal de las especies involucradas y de los seres humanos. El área de superficie (5) se calcula como:
S = kMo,61
(2)
en donde M = peso corporal; y la constante k se ha tomado con valor 1O. Los pesos corporales empleados en la ecuación figuran a continuación en la Tabla A3.1. F2 =
F3
=
Un factor de 1 O representa la variabilidad entre individuos. Por lo general, se proporciona un factor de 1O para todos los disolventes orgánicos y 1 O se usa en todo este capítulo general. Un factor de variabilidad que representa los estudios de toxicidad por exposición a corto plazo. F3
=
= = F3 = F3 =
1 para estudios con una duración de al menos la mitad del ciclo vital (1 año para roedores o conejos; 7 años para gatos, perros y monos).
F3
1 para estudios reproductivos que cubren el periodo completo de organogénesis.
F3
2 para un estudio de 6 meses en roedores o de 3,5 años en no roedores.
5 para un estudio de 3 meses en roedores o de 2 años en no roedores. 1O para estudios de más corta duración.
En todos los casos, se ha empleado el factor más alto para los estudios con una duración intermedia (p.ej., un factor de 2 para un estudio de 9 meses en roedores). F4
=
Un factor que se puede aplicar en casos de toxicidad grave, p.ej., carcinogenicidad no genotóxica, neurotoxicidad o teratogenicidad. En estudios de toxicidad reproductiva, se emplean los siguientes factores:
= = F4 = F4 = F5 =
F4
1 para toxicidad fetal asociada a toxicidad materna
F4
5 para toxicidad fetal sin toxicidad materna 5 para un efecto teratogénico con toxicidad materna 1O para un efecto teratogénico sin toxicidad materna
Un factor variable que se puede aplicar si no se ha establecido un nivel sin efecto.
Cuando sólo está disponible un LOEL, se puede emplear un factor de hasta 1 O dependiendo de la gravedad de la toxicidad. Para el ajuste por peso, se supone un peso corporal arbitrario para humanos adultos para ambos sexos de 50 kilogramos (kg). Este peso relativamente bajo proporciona un factor de seguridad adicional con respecto a los pesos estándar de 60 ó 70 kg que se usan a menudo en este tipo de cálculos. Se reconoce que algunos pacientes adultos pesan menos de 50 kg; se considera que estos pacientes se incluyen mediante los factores de seguridad empleados para determinar una EDP. Si el disolvente estaba presente en una formulación específicamente destinada para uso pediátrico, sería apropiado realizar un ajuste para un peso corporal inferior. Como ejemplo de la aplicación de esta ecuación, se considera un estudio de toxicidad de acetonitrilo en ratones que está resumido en Pharmeuropa, Vol. 9, Nº 1, Suplemento, abril 1997, página S24. Se calcula que el NOEL es de 50,7 mg kg-1 día-1 • La EDP para el acetonitrilo en este estudio se calcula de la siguiente manera: EDP
= (50,7 mg kg-1 día-1 x
50 kg)/(12 x 1O x 5 x 1 x 1)
= 4,22 mg día-1
USP 39
Pruebas Químicas/ (469) Etilenglicol, Dietilenglicol y Trietilenglicol 379
En este ejemplo, Fl
=
F2 = F3
=
F4 = FS
=
12 representa la extrapolación de ratones a seres humanos 1O representa las diferencias entre seres humanos individuales
5 porque la duración del estudio fue de sólo 13 semanas 1 porque no se encontró toxicidad grave 1 porque se determinó el nivel sin efecto
Valores Empleados en los Cálculos en este Documento Peso corporal de ratas
425 g
Peso corporal de ratas preñadas
330 g
Peso corporal de ratones
28 g
Peso corporal de ratonas preñadas
30 g
Peso corporal de cobayos
500 g
Peso corporal de monos Rhesus
2,5 kg
Peso corporal de conejas (preñadas o no)
4 kg
Peso corporal de perros Beagle
11,5 kg
Volumen respiratorio de ratas
290 L/día
Volumen respiratorio de ratones
43 L/día
Volumen respiratorio de conejos
1440 L/día
Volumen respiratorio de cobayos
430 L/día
Volumen respiratorio de humanos
28 800 L/día
Volumen respiratorio de perros
9000 L/día
Volumen respiratorio de monos
1150 L/día
Consumo de agua de ratones
5 ml/día
Consumo de agua de ratas
30 ml/día
Consumo de alimentos de ratas
30 g/día
Se emplea la ecuación de gases ideales, PV = nRT, para convertir las concentraciones de gases empleados en estudios de inhalación de unidades en ppm a unidades en mg/L o mg/m 3. Se propone como ejemplo un estudio de toxicidad reproductiva en ratas por inhalación de tetracloruro de carbono (peso molecular 153,84) resumido en Pharmeuropa, Vol. 9, Nº 1, Suplemento, abril 1997, página S9. n
P
300 x 10-6 atm x 153 840 mg mo1- 1
V
RT
0.082 L a mK- 1 mo1- 1 x 298K
46.15mg =1.89m /L 24,45 L g
La relación 1000 L = 1 m 3 se emplea para convertir los valores a mg/m3.
(469) ETILENGLICOL, DIETILENGLICOL Y TRIETILENGLICOL EN SUSTANCIAS ETOXILADAS El siguiente procedimiento se usa para determinar la concentración de etilenglicol, dietilenglicol y trietilenglicol residuales en productos etoxilados. Los productos etoxilados pueden contener etilenglicol, dietilenglicol y trietilenglicol residuales como resultado del proceso de fabricación. El procedimiento es adecuado para las siguientes sustancias: 1 . Polietilenglicol 200 2. Polietilenglicol 300 3. Polietilenglicol 400 4. Polietilenglicol 600 5. Polietilenglicol 1000 6. Polisorbato 20 7. Polisorbato 40 8. Polisorbato 60 9. Polisorbato 80 1O. Polietilenglicol monometil éter 350 11 . Polietilenglicol monometil éter 550 12. Aceite de ricino polioxilado 35 13. Hidroxiestearato de polioxilo 15
USP 39
380 (469) Etilenglicol, Dietilenglicol y Trietilenglicol / Pruebas Químicas
14. 15. 16. 17.
Polioxil 20 cetoestearil éter Estearato de polioxilo 8 Octoxinol 9 Nonoxinol 9
IMPUREZAS • PROCEDIMIENTO
Diluyente: Acetona Solución estándar: 25 µg/ml de ER Etilenglicol USP, 40 µg/ml de ER Dietilenglicol USP, 40 µg/ml de ER Trietilenglicol USP y 40 µg/ml de ER 1,3-Butanodiol USP (estándar interno) en Diluyente Solución muestra: 40 mg/ml de la sustancia de prueba y 40 µg/ml de ER 1,3-Butanodiol USP (estándar interno) en Diluyente Sistema cromatográfico 0/er Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.) Modo: Cromatografía de Gases Detector: Ionización a la llama Columna: Capilar, de 0,53 mm x 30 m; ligada con una capa de fase G3 de 1,0 µm Temperaturas Detector: 290º Inyector: 270º Columna: Ver la Tabla 7. Tabla 1 Temperatura Inicial (°)
Rampa de Temperatura (º/mln)
Tiempo de Espera (Hold Time) a la Temperatura Final (mln)
Temperatura Final (º)
40
10
60
60
10
170
o
170
15
280
O; 60ª
5
ª El tiempo de espera fue de O minutos para la Solución estándar y 60 minutos para la Solución muestra y el Diluyente.
Gas transportador: Helio Velocidad de flujo: 5,0 ml/min Volumen de inyección: 1,0 µL Tipo de inyección: Dividida; relación de partición, 2:1 Camisa del inyector (liner): Dispositivo común desactivado, para sistemas de inyección con o sin división, ahusado (taper) y con lana de vidrio, para propósitos generales Tiempo de corrida: 26 minutos para la Solución estándar; 86 minutos para la Solución muestra y el Diluyente Aptitud del sistema Muestra: Solución estándar [NOTA-Ver la Tabla 2 para los tiempos de retención relativos.] Tabla 2
Nombre
Tiempo de Retención Relativo
Etilenglicol
0,45
1,3-Butanodiol (estándar interno)
1,00
Dietilenglicol
1,25
Trietilenglicol
1,70
Requisitos de aptitud del sistema Resolución: No menos de 20 entre etilenglicol y 1,3-butanodiol; no menos de 20 entre 1,3-butanodiol y dietilenglicol; no menos de 20 entre dietilenglicol y trietilenglicol Factor de asimetría: 0,8-1,8 para cada uno de los cuatro picos asignados a etilenglicol, 1, 3-butanodiol, dietilenglicol y trietilenglicol Desviación estándar relativa: No más de 5,0% para el cociente de respuesta entre los picos del glicol pertinente (etilenglicol, dietilenglicol o trietilenglicol) y el estándar interno Análisis Muestras: Solución estándar y Solución muestra Identificar los picos de etilenglicol, dietilenglicol y trietilenglicol en la Solución muestra por comparación con los de la Solución estándar.
Pruebas Químicas/ (471) Combustión en Matraz con Oxígeno 381
USP 39
Calcular el contenido de etilenglicol, dietilenglicol o trietilenglicol, en µg/g, en la porción de la sustancia de prueba tomada: Resultado= (Ruf R5) x (C5/Cu) x F
Ru R5
C5 Cu F
=cociente de respuesta entre los picos del glicol pertinente y el estándar interno (respuesta del pico del glicol pertinente/respuesta del pico del estándar interno) de la Solución muestra = cociente de respuesta entre los picos del glicol pertinente y el estándar interno (respuesta del pico del glicol pertinente/respuesta del pico del estándar interno) de la Solución estándar =concentración del glicol pertinente (etilenglicol, dietilenglicol o trietilenglicol) en la Solución estándar (µg/mL) =concentración de la sustancia de prueba en la Solución muestra (mg/mL) =factor de conversión (1000 mg/g)
REQUISITOS ADICIONALES •ESTÁNDARES DE REFERENCIA USP (11)
ER 1,3-Butanodiol USP ER Dietilenglicol USP ER Etilenglicol USP ER Trietilenglicol USP
(471) COMBUSTIÓN EN MATRAZ CON OXÍGENO El procedimiento de combustión en matraz con oxígeno constituye el paso preparatorio en la determinación de bromo, cloro, yodo, selenio y azufre en algunos artículos farmacopeicos. La combustión del material en análisis (generalmente orgánico) produce compuestos inorgánicos hidrosolubles, los cuales se analizan para determinar los elementos específicos, según se indica en la monografía individual o en el capítulo general. La advertencia que figura en el Procedimiento sólo indica las precauciones de seguridad mínimas y subraya la necesidad de proceder con extremo cuidado en todas las etapas. Aparato-El aparato, consta de un matraz Erlenmeyer de paredes gruesas, con boca de bordes elevados o en forma de copa, de 500 mL de capacidad (salvo que se indique un matraz de mayor capacidad), equipado con un tapón de vidrio esmerilado al que se ha soldado un dispositivo para colocar la muestra de prueba, formado por un alambre de platino grueso y un pieza de malla de platino soldada de aproximadamente 1,5 x 2 cm.
Punto de Muestra en
ignición
envoltorio de papel
Líquido absorbente Tapón esmerilado estandardizado
Aparato para la Combustión en Matraz con Oxígeno
Procedimiento-[Precaución-Usar lentes de seguridad y colocar una protección de seguridad adecuada entre el aparato y usted. Tomar las precauciones necesarias para asegurar que el matraz esté perfectamente limpio y no contenga ni siquiera trazas de disolventes orgánicos.] Si se trata de un sólido, pesar la sustancia colocándola sobre un trozo de papel de filtro exento de haluros de aproximadamente 4 cm cuadrados y plegar el papel de forma tal que el sólido quede envuelto por aquel. Si se trata de sustancias líquidas, pesarlas en cápsulas taradas; las cápsulas de policarbonato 1 se utilizan para líquidos cuyos volúmenes no excedan de 200 µL, mientras que las cápsulas de gelatina resultan adecuadas para volúmenes mayores. [NOTA-Es posible que las cápsulas de gelatina contengan cantidades significativas de azufre o haluros combinados. Si se utiliza este tipo de cápsulas, efectuar una determinación con un blanco y realizar las correcciones necesarias.] Colocar la muestra y una tira de papel de filtro, a modo de mecha, en el soporte de malla de platino. Colocar en el matraz el líquido absorbente especificado en la monografía individual o en el capítulo general, humedecer la junta del tapón con agua y desplazar el aire del matraz con una corriente rápida de oxígeno, agitando el líquido por rotación moderada para favorecer la absorción de oxígeno. [NOTA-La saturación del líquido con oxígeno es clave para el éxito del procedimiento de combustión.] Encender la tira de papel de filtro por medios adecuados. Si se enciende la tira fuera del matraz, introducir inmediatamente el soporte de la muestra en el maThomas Scientific, localizado en 99 High Hill Road, Swedesboro, N) 08085 provee un aparato [Números de Catálogo 6513-C20 (de 500 ml de capacidad) y 6513-C30 (de 1000 ml de capacidad)] y cápsulas [Número de Catálogo 6513-84 (1000 cápsulas)) adecuados.
1
382 (471) Combustión en Matraz con Oxígeno/ Pruebas Químicas
USP 39
traz, invertir el matraz para que la solución de absorción selle el tapón y sostener el tapón en su lugar con firmeza. Se puede omitir la inversión del matraz si se enciende en un sistema cerrado. Una vez finalizada la combustión, agitar el matraz vigorosamente y dejarlo en reposo durante no menos de 1O minutos agitando intermitentemente. Luego proceder según se indica en la monografía individual o en el capítulo general.
(481) VALORACIÓN DE RIBOFLAVINA El siguiente procedimiento es apropiado para las preparaciones donde la riboflavina es un elemento constitutivo de una mezcla de varios ingredientes. Al emplearlo, se debe mantener el pH de las soluciones por debajo de 7,0 y proteger las soluciones de la luz solar directa en todo momento. Estándares de Referencia USP (11 )-ER Riboflavina USP. Solución Madre del Estándar de Riboflavina-A 50,0 mg de ER Riboflavina USP, previamente secados y protegidos de la luz en un desecador sobre pentóxido de fósforo, agregar aproximadamente 300 mL de ácido acético 0,02 N y calentar la mezcla en un baño de vapor agitando frecuentemente hasta que la riboflavina se haya disuelto. Luego enfriar, agregar ácido acético 0,02 N para obtener 500 mL y mezclar. Almacenar bajo tolueno en un refrigerador. Diluir una porción medida con exactitud de esta solución, usando ácido acético 0,02 N, hasta una concentración de 10,0 µg de ER Riboflavina USP seca por mL para obtener la Solución Madre del Estándar de Riboflavina. Almacenar bajo tolueno en un refrigerador. Preparación Estándar-Diluir a volumen con agua 10,0 mL de la Solución Madre del Estándar de Riboflavina en un matraz volumétrico de 100 mL y mezclar. Cada mL representa 1,0 µg de ER Riboflavina USP. Preparar una Preparación Estándar nueva para cada valoración. Preparación de Valoración-Colocar una cantidad del material a valorar en un matraz de tamaño adecuado y agregar un volumen de ácido clorhídrico O, 1 N igual en mL a no menos de 1O veces el peso seco del material en g, aunque la solución resultante no debe contener más de 100 µg de riboflavina por ml. Si el material no es fácilmente soluble, pulverizarlo para que pueda dispersarse uniformemente en el líquido. Luego agitar vigorosamente y lavar las paredes del matraz con ácido clorhídrico O, 1 N. Calentar la mezcla en un autoclave entre 121 ºy 123º durante 30 minutos y enfriar. Si el material se aglutina, agitar la mezcla hasta que las partículas se dispersen uniformemente. Ajustar la mezcla, agitando vigorosamente, a un pH de 6,0 a 6,5 con solución de hidróxido de sodio* y, de inmediato, agregar solución de ácido clorhídrico* hasta que no haya más precipitación (por lo general a un pH de aproximadamente 4,5, el punto isoeléctrico de muchas de las proteínas presentes). Diluir la mezcla con agua para obtener un volumen medido que contenga aproximadamente O, 11 µg de riboflavina en cada mL y filtrar a través de papel que se sepa que no adsorbe riboflavina. A una alícuota del filtrado, agregar, agitando vigorosamente, una solución de hidróxido de sodio* para producir un pH de 6,6 a 6,8, diluir la solución con agua para obtener un volumen final medido que contenga aproximadamente O, 1 µg de riboflavina en cada mL y, si la solución se enturbia, filtrar nuevamente. Procedimiento-Agregar a cada uno de cuatro o más tubos (o recipientes de reacción) 10,0 mL de la Preparación de Valoración. Agregar a cada uno de dos o más de estos tubos 1,0 mL de la Preparación Estándar y mezclar y luego agregar a cada uno de los dos o más tubos restantes 1,0 mL de agua y mezclar. Agregar a cada tubo 1,0 mL de ácido acético glacial y mezclar; luego agregar, mezclando, 0,50 mL de solución de permanganato de potasio (1 en 25) y dejar en reposo durante 2 minutos. Agregar a cada tubo, mezclando, 0,50 mL de solución de peróxido de hidrógeno, con lo cual el color del permanganato desaparecerá en 1O segundos. Agitar vigorosamente los tubos hasta expulsar todo el exceso de oxígeno. Cuando haya cesado la producción de espuma, eliminar las burbujas de gas que queden en las paredes de los tubos por inclinación de los tubos para que la solución fluya lentamente de un extremo a otro. En un fluorofotómetro adecuado que tenga un filtro de entrada con un estrecho intervalo de transmitancia y un máximo aproximadamente a 440 nm y un filtro de salida con un estrecho intervalo de transmitancia y un máximo aproximadamente a 530 nm, medir la fluorescencia de todos los tubos y designar la lectura promedio de los tubos que contienen solamente la Preparación de Valoración como lu y el promedio de los tubos que contienen la Preparación de Valoración y la Preparación Estándar como Is. Luego, a uno o más tubos de cada tipo, agregar, mezclando, 20 mg de hidrosulfito de sodio y medir nuevamente la fluorescencia a los 5 segundos; designar la lectura promedio como 18 • Cálculo-Calcular la cantidad, en mg, de C17 H20 N4 0 6 en cada mL de la Preparación de Valoración tomado, por la fórmula: 0,0001 (lu- 18)/(ls - lu). Calcular la cantidad, en mg, de C17 H20 N 4 0 6 en cada cápsula o tableta.
* Las concentraciones de las soluciones de ácido clorhídrico e hidróxido de sodio empleadas no se indican en cada caso porque estas concentraciones pueden variar según la cantidad de material tomado para la valoración, el volumen de la solución de prueba y el efecto amortiguador del material.
Pruebas Químicas/ (503) Ácido Acético en Péptidos 383
USP 39
(501) SALES DE BASES ORGÁNICAS NITROGENADAS Preparación Estándar-A menos que se indique algo diferente, preparar una solución en ácido sulfúrico diluido (1 en 70) que contenga, en cada mL, aproximadamente 500 µg del Estándar de Referencia USP especificado, calculados con respecto a la sustancia anhidra y pesados con exactitud. Preparación de Valoración-Si la forma farmacéutica es una tableta, pesar y reducir a polvo fino no menos de 20 tabletas, pesar con exactitud una porción del polvo, que equivalga aproximadamente a 25 mg del ingrediente activo y transferir a un separador de 125 mL; o, si la forma farmacéutica es un líquido, transferir un volumen de éste, que equivalga aproximadamente a 25 mg del ingrediente activo y medido con exactitud, a un separador de 125 mL. Luego agregar al separador 20 mL de ácido sulfúrico diluido (1 en 350) y agitar vigorosamente durante 5 minutos. Agregar 20 mL de éter, agitar cuidadosamente y filtrar la fase ácida, recogiéndola en un segundo separador de 125 ml. Agitar la fase etérea con dos porciones de 1 O mL de ácido sulfúrico diluido (1 en 350), filtrar cada porción del ácido y recolectarla en el segundo separador y desechar el éter. Agregar 1O mL de hidróxido de sodio SR y 50 mL de éter al extracto ácido, agitar cuidadosamente y transferir la fase acuosa a un tercer separador de 125 mL que contenga 50 mL de éter. Agitar cuidadosamente el tercer separador y desechar la fase acuosa. Lavar sucesivamente las dos soluciones etéreas con una única porción de 20 mL de agua y desechar el agua. Extraer cada una de las dos soluciones etéreas con porciones de 20 mL, 20 mL y 5 mL de ácido sulfúrico diluido (1 en 70), en el orden indicado, pero siempre extrayendo primero la solución etérea del tercer separador y después la del segundo separador. Combinar los extractos ácidos en un matraz volumétrico de 50 mL, diluir a volumen con el ácido y mezclar. NOTA-El éter puede sustituirse por hexano o heptano si el coeficiente de partición de la base nitrogenada entre el agua y el hexano, o entre el agua y el heptano, favorece una extracción completa hacia la fase orgánica. Procedimiento-A menos que se indique algo diferente, diluir 5,0 mL de la Preparación Estándar y 5,0 mL de la Preparación de Valoración con ácido sulfúrico diluido (1 en 70) hasta 100,0 mL y determinar la absorbancia de cada solución a la longitud de onda especificada, usando ácido sulfúrico diluido (1 en 70) como blanco. Designar la absorbancia de la solución de la Preparación Estándar como A5 y la de la Preparación de Valoración como Au y calcular el resultado de la valoración según se indique en la monografía individual.
(503) ÁCIDO ACÉTICO EN PÉPTIDOS INTRODUCCIÓN Este capítulo provee procedimientos que se deben usar para determinar la cantidad de ácido acético en péptidos. El ácido acético/acetato es un contraión común en las preparaciones de péptidos . • MÉTODO 1
Solución de ml. Solución A: a un pH de Solución B: Fase móvil:
hidróxido de sodio concentrado:
Disolver 42 g de hidróxido de sodio en agua y diluir con agua hasta 100
Agregar 0,7 mL de ácido fosfórico a 1000 mL de agua y ajustar con Solución de hidróxido de sodio concentrado
3,0. Metanol Ver la Tabla 7. Tabla 1 Tiempo (min)
o s
Solución A
Solución B
(%)
(%)
9S
s s so so s
9S
20
so so
22
9S
10
Diluyente: Preparar una mezcla de Solución A y Solución B (95:5). Solución estándar: Disolver en Diluyente una cantidad, pesada con exactitud, de ER Ácido Acético Glacial USP para obtener una solución con una concentración conocida de aproximadamente O, 1 mg/ml. [NOTA-La concentración puede ajustarse dependiendo de la cantidad de acetato o ácido acético que se espera esté presente en el material de prueba.] Solución muestra: Preparar según se indica en la monografía individual. La cantidad de material usado puede adaptarse dependiendo de la cantidad de ácido acético esperada. Sistema cromatográfico (Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.) Modo: HPLC Detector: UV 21 O nm
384 (503) Ácido Acético en Péptidos / Pruebas Químicas
USP 39
Columna: 4,6 mm x 25 cm; relleno L1 de 5 µm Velocidad de flujo: 1,2 ml/min Volumen de inyección: 1 O µL Aptitud del sistema Muestra: Solución estándar Requisitos de aptitud Desviación estándar relativa: No más de 5% Tiempo de retención de ácido acético: 3-4 min Análisis Muestras: Solución estándar y Solución muestra Calcular el porcentaje de ácido acético en la porción de material de prueba tomada: Resultado= (rufr5) x (C5/Cu) x 100
ru r5 C5 Cu
= respuesta del pico de la Solución muestra = respuesta del pico de la Solución estándar =concentración de ER Ácido Acético Glacial USP en la Solución estándar (mg/ml) = concentración de la Solución muestra (mg/ml)
Agregar lo siguiente: ••MÉTODO 2
Solución A, Solución B, Fase móvil, Diluyente y Sistema cromatográfico: Ver. Ácido Trifluoroacétíco en Péptidos (503.1 ). Solución estándar: 0,7 mg/ml de ER Acetato de Sodio Trihidrato USP en Diluyente Calcular la concentración, en mg/ml, dé ácido acético en la Solucíón estándar ( C5) tomada: C5 =0,441.xc· 0,441 =factor de conversión de peso molecular (60,05/136,08) == concentración de ER Acetato de Sodio Trihidrato USP en la Solución estándar (mg/ml) C Solución muestra: Aproximadamente 4 mg/ml de muestra de prueba en Oiluyente. [NOTA-La concentración de la muestra puede adaptarse dependiendo de la cantidad de ácido acético esperada.] [NOTA-Como alternativa, se puede preparar fa Solución estándar y la Solución muestra según se describe en Método 1.] Aptitud del sistema Muestra: Solución estándar Requisitos de aptitud Desviación estándar relativa: No más de 5% Análisis: Proceder según se indica en Método 1.•usm REQUISITOS ADICIONALES
Cambio en la redacción: USP (11> ER Ácido Acético Glacial USP •ER Acetato de Sodio Trihidrato USP &usp39
•ESTÁNDARES DE REFERENCIA
Agregar lo siguiente: /
/
/
•(503.1) ACIDO TRIFLUOROACETICO EN PEPTIDOS INTRODUCCIÓN Los siguientes procedimientos se deben usar para determinar la cantidad de ácido trífluoroacético (TFA, por sus siglas.en inglés) en péptidos. El TFA/Trifluoroacetato es una impureza residual común del proce~o de preparación de péptidos o un contraión en ingredientes farmacéuticos activos (API, por sus siglas en inglés). • PROCEDIMIENTO
Solución A: Agregar 7,0 mL de ácido fosfórico y 5,0 mL de hidróxido de amonio a 900 mt de agua. Mezclar y diluir con agua hasta 1000 ml. [NOTA-El pH de la solución es aproximadamente 2,5.] Pasar a través de un filtro éon un tamaño de poro de 0,45 µm y desgasificar. Agregar 20 ml de metanol, mezclar y desgasificar durante 2 minutos adicionales. Solución B: Acetonitrilo y agua (50:50). Mezclar y desgasificar. Fase móvil: Ver la TabJa 1.
Pruebas Químicas/ (503.1) Ácido Trifluoroacético 385
USP 39
Tabla 1 Tiempo (min)
o 5 6 14 15 25
SoludónA
Soluc:lón B
(%)
(%)
100 100
o
o o
100
100
100
o 100
o o
Diluyente: Ácido fosfórico al 0,5% en agua (v/v) Solución madre de TFA (opción 1): 12 mg/ml de ER Trirluoroacetato de SOdio USP en agua Calcul.ar la cqncentración (C5), en mg/mL1 . de TFA en la Solución ma.dre de TPA tomada:
t 5 =o,838 ·><.e 0,838
::: factor de conversión de peso molecular (114,02/136,01) == concentración de ER Trifh,ioroacetato qe S!:>dio USP en. la Solución madre.de TFA(mg/ml) Solu~.ión madre de TFA (opción 2): 1Omg/mLQe TfA en agua, preparada segúr).se inclica a. c:.ontinuai;:ión. Agregar aproximadamente 50. rnL de agµa a 4n matraz volumétrico de loo mL con t~pón..Tarar el matraz tapado en lÍna .balanza analítica hasta que no haya cambios significativos en Ja lectura.Transferir 670 µLdeTM al matraz, taparde in.mediato y pesar. Diluir i;:on agua a volumen, Solución de aptitt,id deJ sis~ema: 0,()25 mg/mLde TFA en Diluyente, preparada a partir de la Solución madre de TFA Solución estándar (cuando el contenido de TFA se analiza como una impureza.del procesq): 0,01 mg/ml de TFA en DHuyente, preparada a partir de la Solució.n madre de TFA Solución estándar (cuando el contenido de JFA se analiza como un co.11traión en. un ingrediente farmacéutico ~ctivo): 0,25 mg/ml,, de TFA en Diluyente, preparada a partir de la Solución madre d.e TEA. [NOTA-:La concen.tración puede ser ajustada dependiendo de la cantidad deTFA que se .espera esté presente en el materied de prueba.] Solución muestra: No menos de 4mg/ml de. la muestra de pr4eb
Resultaqo = (ruf r5) x (CsfCu) x 100 ru r5 ( 5
Cu
=respuestas de los picos deTfA de la Sofuciónmuestra = respuestas de tos picos de TFA de la Solución estóndar = concentración de TFA en la Solución estándar (mg/rnl) =concentración de la Solución muestra (mg/mL)
REQUISITOS ADICIONALES USP (11) ER Trifluoroacetato de Sodio USP
•ESTÁNDARES DE REFERENCIA
1>.USP39
386 (511) Valoración de un Esteroide Aislado/ Pruebas Químicas
USP 39
(511) VALORACIÓN DE UN ESTEROIDE AISLADO En el siguiente procedimiento, el esteroide a valorar se separa de los esteroides extraños relacionados y excipientes mediante cromatografía en capa delgada y se determina después de la recuperación a partir del cromatograma. Preparación de la Placa-Preparar una suspensión espesa con 30 g de gel de sílice para cromatografía y una sustancia fluorescente adecuada agregando gradualmente aproximadamente 65 mL de una mezcla de agua y alcohol (5:2), y mezclando. Transferir la suspensión espesa a una placa limpia de 20 cm x 20 cm, extender hasta obtener una capa uniforme de 250 µm de espesor y dejar que se seque a temperatura ambiente durante 15 minutos. Calentar la placa a 105º durante 1 hora y almacenar en un desecador. Disolvente A-Mezclar cloruro de metileno con metanol (180:16). Disolvente B-Mezclar cloroformo con acetona (4: 1). Preparación Estándar-Disolver en una mezcla de volúmenes iguales de cloroformo y alcohol una cantidad adecuada del Estándar de Referencia USP especificado en la monografía individual, previamente secada según se indicó (ver Estándares de Referencia USP (11 )) y pesada con exactitud, para obtener una solución con una concentración conocida de aproximadamente 2 mg por ml. Preparación de Valoración-Preparar según se indica en la monografía individual. Procedimiento-Dividir el área de la placa cromatográfica en tres secciones iguales y usar las secciones izquierda y derecha para la Preparación de Valoración y la Preparación Estándar, respectivamente, y la sección central para el blanco. Aplicar 200 µL de la Preparación de Valoración y 200 µL de la Preparación Estándar en franjas alejadas en 2,5 cm del borde inferior de la sección correspondiente de la placa. Secar la solución a medida que se aplica, con ayuda de una corriente de aire. Usando el Disolvente especificado en la monografía individual, desarrollar el cromatograma en una cámara adecuada, previamente equilibrada y con recubrimiento interno de papel absorbente, hasta que el frente de la fase móvil haya recorrido 15 cm por encima de las franjas iniciales. Retirar la placa, evaporar el disolvente y localizar la banda principal ocupada por la Preparación Estándar observándola bajo luz UV. Marcar esta banda, además de las bandas correspondientes en la Preparación de Valoración y en las secciones del blanco de la placa. Quitar el gel de sílice de cada banda por separado, ya sea raspando sobre papel satinado o usando un dispositivo adecuado recolector por vacío y transferirlo a un tubo de centrífuga de 50 mL con tapón de vidrio. Agregar 25,0 mL de alcohol a cada tubo y agitar durante no menos de 2 minutos. Centrifugar los tubos durante 5 minutos, pipetear 20 mL del sobrenadante de cada tubo y transferir a un matraz Erlenmeyer de 50 mL con tapón de vidrio, agregar 2,0 mL de una solución preparada por disolución de 50 mg de azul de tetrazolio en 1O mL de metano! y mezclar. Proceder según se indica en el Procedimiento en Valoración de Esteroides (351 ), comenzando donde dice "Luego a cada matraz".
(525) DIÓXIDO DE AZUFRE Los siguientes métodos se proporcionan a efectos de la determinación de dióxido de azufre en excipientes farmacéuticos.
MÉTODO 1 Procedimiento Mezclar 20 g de la muestra de prueba, pesados con exactitud, con 200 mL de un disolvente adecuado, según se indica en la monografía individual, y mezclar hasta obtener una suspensión homogénea. Dejar en reposo la mezcla de prueba hasta que la mayor parte de la muestra se haya sedimentado y filtrar la porción acuosa a través de papel (Whatman Nº 1 o equivalente). A 100 mL del filtrado transparente, agregar un disolvente adicional según se indica en la monografía individual, agregar 3 mL de almidón SR y valorar con solución de yodo 0,01 N SV hasta el primer color azul o púrpura permanente. Cada mL de solución de yodo 0,01 N SV consumido corresponde a 0,003% de dióxido de azufre encontrado.
MÉTODO 11 Procedimiento Transferir aproximadamente 50 a 100 g de la sustancia en análisis, pesados con exactitud, a un matraz Erlenmeyer de 250 mL, agregar 100 a 150 mL de agua y mezclar. Enfriar entre 5º y 1Oº. Mientras se mezcla con un mezclador magnético, agregar 1O mL de hidróxido de sodio 1,5 N frío (a una temperatura entre 5º y 1Oº). Mezclar durante 20 segundos adicionales y agregar 1O mL de solución indicadora de almidón, preparada de la siguiente manera: mezclar 1O g de almidón soluble con 50 mL
Pruebas Químicas/ (525) Dióxido de Azufre 387
USP 39
de agua fría, transferir a 1000 ml de agua en ebullición, mezclar hasta que se disuelva por completo, enfriar y agregar 1 g de ácido salicílico como conservante. [NOTA-Desechar la solución después de 1 mes.] Agregar 1O ml de ácido sulfúrico 2,0 N (a una temperatura entre 5º y 1Oº) y valorar inmediatamente con yodo 0,005 N SV hasta que persista un color azul claro durante 1 minuto (ver Volumetría (541 )). Realizar una determinación con un blanco, usando 200 ml de agua tratada de manera similar que la solución en análisis y hacer las correcciones necesarias. Cada ml de yodo 0,005 N equivale a O, 16 mg de S0 2 •
MÉTODO 111 Procedimiento Disolver 20,0 g de la muestra de prueba en 150 ml de agua caliente en un matraz de fondo redondo y cuello largo, agregar 5 ml de ácido fosfórico y 1 g de bicarbonato de sodio, e inmediatamente conectar el matraz a un condensador. [NOTA-Se puede reducir la producción excesiva de espuma mediante el agregado de unas pocas gotas de un agente antiespumante adecuado.] Destilar 50 ml, recibiendo el destilado bajo la superficie de 50 ml de yodo 0, 1 N. Acidificar el destilado con unas pocas gotas de ácido clorhídrico, agregar 2 ml de cloruro de bario SR y calentar en un baño de vapor hasta que el líquido sea casi incoloro. El precipitado de sulfato de bario, si lo hubiera, una vez filtrado, lavado e incinerado, pesa no más de 3 mg, que corresponde a no más de 0,004% de dióxido de azufre, haciendo las correcciones para cualquier sulfato que pudiera estar presente en 50 ml del yodo 0, 1 N.
MÉTODO IV En esta prueba, el dióxido de azufre se libera a partir de la muestra de prueba en un medio ácido en ebullición y se extrae con una corriente de dióxido de carbono. El gas separado se recoje en una solución de peróxido de hidrógeno diluida, en la que el dióxido de azufre se oxida a ácido sulfúrico y se valora con álcali estándar, usando un medidor de pH para controlar el valor de pH y la valoración. Esta prueba se realiza en condiciones tales que se cumpla con los requisitos especificados en la prueba de aptitud del sistema.
Reactivos Especiales DIÓXIDO DE CARBONO Usar dióxido de carbono con un regulador de flujo que mantenga un flujo de 100 ± 1 O ml por minuto. SOLUCIÓN DE PERÓXIDO DE HIDRÓGENO Diluir peróxido de hidrógeno al 30% con agua para obtener una solución al 3%. Neutralizar la solución de peróxido de hidrógeno al 3% con hidróxido de sodio 0,01 N a un pH de 4, 1 determinado potenciométricamente. SOLUCIÓN DE METABISULFITO DE POTASIO Transferir 0,87 g de metabisulfito de potasio (K2 S2 0 5 ) y 0,2 g de edetato disódico a un matraz volumétrico de 1000 ml. Diluir con agua a volumen antes de mezclar. [NOTA-Se usa edetato disódico para proteger al ión sulfito de la oxidación.]
Aparato El diagrama adjunto muestra un aparato adecuado para la determinación de dióxido de azufre (Figura 1). El aparato consiste en un matraz de ebullición de 500 ml de fondo redondo con tres cuellos, A; un embudo de separación, 8, con una capacidad de 100 ml o mayor; un tubo de entrada de gas de longitud sificiente para permitir la introducción de dióxido de carbono a 2,5 cm del fondo del matraz de ebullición; un condensador de reflujo, C, con una longitud de la camisa de 200 mm; y un tubo de salida, E, que conecta el extremo superior del condensador de reflujo con el fondo de un tubo de ensayo receptor, O. Aplicar una película fina de grasa para llaves de paso a las superificies de sellado de todas las juntas, excepto la junta que está entre el embudo de separación y el matraz de ebullición, y sujetar las juntas con abrazaderas para garantizar la hermeticidad.
USP 39
388 (525) Dióxido de Azufre / Pruebas Químicas
E
D
Figura 1. Aparato para el Método IV.
Prueba de Aptitud del Sistema PRUEBA A Usando la Solución de Metabisulfito de Potasio como el estándar, proceder según se indica en Procedimiento, excepto que se deben reemplazar 25,0 g de la sustancia de prueba por 20 mL de Solución de Metabisulfito de Potasio. Calcular el contenido, en µg por mL, de dióxido de azufre en la Solución de Metabisulfito de Potasio tomada por la fórmula: 1000(32,03)VN/Vp en donde 1000 es el factor de conversión de mg a µg; 32,03 es el peso miliequivalente de dióxido de azufre; V es el volumen, en mL, de solución volumétrica consumida; N es la normalidad de la solución volumétrica; y Vp es el volumen, en mL, de la Solución de Metabisulfito de Potasio tomada para la prueba. PRUEBA B En un matraz Erlenmeyer de 100 mL, agregar 20 mL de solución de yodo 0,02 N y 5 mL de ácido clorhídrico 2 N. Agregar 1 mL de almidón SR y valorar con la Solución de Metabisulfito de Potasio hasta que se observe la primera decoloración. Calcular el contenido, en µg por mL, de dióxido de azufre en la Solución de Metabisulfito de Potasio por la fórmula: 1000(32,03)V¡N¡/Vp en donde 1000 y 32,03 se definieron anteriormente; V1 es el volumen, en mL, de solución de yodo usado en la prueba; N 1 es la normalidad de la solución de yodo; y Vp es el volumen, en mL, de la Solución de Metabisulfito de Potasio consumida. La diferencia entre los contenidos de dióxido de azufre obtenidos a partir de la Prueba A y la Prueba Bes no más de 5% de su valor promedio. La Prueba B se debe realizar dentro de los 15 minutos posteriores a la finalización de la Prueba A. [NOTA-Esto evita una variación potencial del contenido de dióxido de azufre en la Solución de Metabisulfito de Potasio cuando se almacena a temperatura ambiente.]
Procedimiento Agregar 150 mL de agua al matraz de ebullición (A). Cerrar la llave de paso del embudo de separación y comenzar el flujo de dióxido de carbono a una velocidad de 100 ± 5 mL por minuto a través del aparato. Iniciar el flujo refrigerante del condensador. Colocar 1 O mL de Solución de Peróxido de Hidrógeno en el tubo de ensayo receptor (O). Después de 15 minutos, sin haber interrumpido el flujo de dióxido de carbono, retirar el embudo de separación (8) del matraz de ebullición y transferir 25,0 g de la muestra de prueba al matraz de ebullición con ayuda de 100 mL de agua. Aplicar grasa para llaves de paso a la junta externa del embudo de separación y volver a colocar el embudo de separación en el matraz de ebullición. Cerrar la llave de paso del embudo de separación y agregar 80 mL de ácido clorhídrico 2 N al embudo de separación. Abrir la llave de paso
Pruebas Químicas/ (525) Dióxido de Azufre 389
USP 39
del embudo de separación para permitir que la solución de ácido clorhídrico fluya en el matraz de ebullición, cerrando la llave de paso antes de que escurran los últimos ml de ácido clorhídrico para evitar que el dióxido de azufre escape hacia el embudo de separación. Calentar la mezcla a ebullición durante 1 hora. Abrir la llave de paso del embudo, detener el flujo de dióxido de carbono, discontinuar el calentamiento del matraz, y detener el flujo de agua refrigerante en el condensador. Retirar el tubo de ensayo receptor y transferir su contenido a un matraz Erlenmeyer de 200 ml de cuello ancho. Enjuagar el tubo de ensayo receptor con una pequeña porción de agua, agregar el enjuague al matraz Erlenmeyer de 200 ml, y mezclar. Calentar en un baño de agua durante 15 minutos y dejar que se enfríe. Agregar O, 1 ml de azul de bromofenol SR y valorar el contenido con hidróxido de sodio O, 1 N SV hasta que el color cambie de amarillo a azul violáceo y el cambio de color persista durante al menos 20 segundos. Realizar una determinación con un blanco y hacer las correcciones necesarias (ver Volumetría (541 )). Calcular el contenido, en µg por g, de dióxido de azufre en la muestra de prueba tomada por la fórmula: 1000(32,03)VN/W en donde 1000 es el factor de conversión de mg a µg; 32,03 es el peso miliequivalente de dióxido de azufre; V es el volumen, en ml, de solución volumétrica consumida; N es la normalidad de la solución volumétrica; y W es el peso, en g, de la muestra de prueba tomada.
MÉTODO V En este método, de manera similar al Método IV, el dióxido de azufre se libera a partir de la muestra de prueba en un medio ácido en ebullición y se extrae con una corriente de nitrógeno. El gas separado se recoje en una solución de peróxido de hidrógeno diluida, en la que el dióxido de azufre se oxida a ácido sulfúrico y se valora con álcali estándar, usando rojo de metilo como indicador. Esta prueba se realiza en condiciones tales que se cumpla con los requisitos especificados en la prueba de aptitud del sistema.
Reactivos Especiales SOLUCIÓN DE PERÓXIDO DE HIDRÓGENO Diluir una porción de peróxido de hidrógeno al 30 por ciento con agua para obtener una solución al 3%. Justo antes de su uso, agregar 3 gotas de rojo de metilo SR y neutralizar hasta un punto final amarillo con hidróxido de sodio 0,01 N. No exceder el punto final. NITRÓGENO Usar nitrógeno de alta pureza con un regulador de flujo que mantenga un flujo de 200 ± 1O ml por minuto. Evitar la presencia de oxígeno pasando el nitrógeno a través de un depurador, tal como pirogalol alcalino, que se prepara según se indica a continuación: agregar 4,5 g de pirogalol a un frasco de lavado de gases, purgar el frasco con nitrógeno durante 3 minutos, y agregar una solución que contenga 85 ml de agua y 65 g de hidróxido de potasio mientras se mantiene una atmósfera de nitrógeno en el frasco. SOLUCIÓN DE METABISULFITO DE POTASIO Transferir 0,87 g de metabisulfito de potasio (K 2 SP5 ) y 0,2 g de edetato disódico a un matraz volumétrico de 1000 ml. Diluir con agua a volumen antes de mezclar. [NOTA-Se usa edetato disódico para proteger al ión sulfito de la oxidación.]
Aparato El aparato (ver la Figura 2) está diseñado para realizar la transferencia selectiva de dióxido de azufre de la muestra en ácido clorhídrico acuoso en ebullición a la Solución de Peróxido de Hidrógeno en el vaso G. La contrapresión se limita a la presión inevitable debida a la altura de la Solución de Peróxido de Hidrógeno por encima del extremo del burbujeador, F. Mantener la contrapresión lo más baja posible reduce la probabilidad de pérdida de dióxido de azufre por fugas. Calentar a ebullición previamente los tubos de vinilo y silicona. Aplicar una película fina de grasa para llaves de paso a las superficies de sellado de todas las juntas, excepto la junta entre el embudo de separación y el matraz, y sujetar las juntas para garantizar la hermeticidad. El embudo de separación, 8, tiene una capacidad de 100 ml o mayor. El adaptador de entrada, A, con una manguera conectora, permite aplicar presión de carga a la solución. [NOTA-No se recomienda el uso de un embudo de goteo que equilibre la presión debido a que el condensado, que puede contener dióxido de azufre, se deposita en el embudo y en el brazo lateral.]
390 (525) Dióxido de Azufre / Pruebas Químicas
USP 39
A___..
E---+
s-
, '
' '' '' ' '' ' ''
Figura 2. Aparato para el Método V. El matraz de fondo redondo, C, es un matraz de 1000 ml con tres juntas cónicas tipo 24/40. El tubo de entrada de gas, D, tiene una longitud suficiente para permitir la introducción del nitrógeno a 2,5 cm del fondo del matraz. El condensador Allihn, E, tiene una longitud de camisa de 300 mm. El burbujeador, F (ver la Figura 3), está fabricado con vidrio según las dimensiones proporcionadas en la Figura 3. La Solución de Peróxido de Hidrógeno está contenida en el vaso, G, con un diámetro interno de aproximadamente 2,5 cm y una profundidad de aproximadamente 18 cm. Hacer que circule un refrigerante, como por ejemplo una mezcla de agua y metanol (4:1) mantenida a 5º, para enfriar el condensador.
T24/40
1
185 mm
l
Figura 3. Burbujeador (F) para el aparato del Método V.
USP 39
Pruebas Químicas / (525) Dióxido de Azufre 391
Prueba de Aptitud del Sistema PRUEBA A Usando la Solución de Metabisulfito de Potasio como el estándar, proceder según se indica en Procedimiento, excepto qe se deben reemplazar los 50,0 g de la sustancia de prueba por 20 mL de Solución de Metabisulfito de Potasio. Calcular el contenido, en µg por mL, de dióxido de azufre en la Solución de Metabisulfito de Potasio tomada por la fórmula: 1000(32,03)VN/Vp en donde 1000 es el factor de conversión de mg a µg; 32,03 es el peso miliequivalente de dióxido de azufre; V es el volumen, en mL, de solución volumétrica consumida; N es la normalidad de la solución volumétrica; y Vp es el volumen, en mL, de Solución de Metabisulfito de Potasio tomada para la prueba. PRUEBA B En un matraz Erlenmeyer de 100 mL, agregar 20 mL de solución de yodo 0,02 N y 5 mL de ácido clorhídrico 2 N. Agregar 1 mL de almidón SR y valorar con la Solución de Metabisulfito de Potasio hasta que se observe la primera decoloración. Calcular el contenido, en µg por mL, de dióxido de azufre en la Solución de Metabisulfito de Potasio por la fórmula: 1000(32,03)V¡N¡/Vp en donde 1000 y 32,03 se definieron anteriormente; V1 es el volumen, en mL, de solución de yodo usado en la prueba; N 1 es la normalidad de solución de yodo; y Vp es el volumen, en mL, de Solución de Metabisulfito de Potasio consumida. La diferencia entre el contenido de dióxido de azufre obtenido a partir de la Prueba A y la Prueba Bes no más de 5% de su valor promedio. La Prueba B deberá realizarse dentro de los 15 minutos posteriores a la finalización de la Prueba A. [NOTA-Esto evita la variación potencial del contenido de dióxido de azufre en la Solución de Metabisulfito de Potasio cuando se almacena a temperatura ambiente.]
Procedimiento Colocar el aparato en un manto de calentamiento controlado por un dispositivo regulador de energía. Agregar 400 mL de agua al matraz. Cerrar la llave de paso del embudo de separación y agregar 90 mL de ácido clorhídrico 4 N al embudo de separación. Comenzar el flujo de nitrógeno a una velocidad de 200 ± 1O mL por minuto. Iniciar el flujo refrigerante del condensador. Agregar 30 mL de Solución de Peróxido de Hidrógeno al vaso (G). Después de 15 minutos, retirar el embudo de separación y transferir al matraz una mezcla de 50,0 g de la muestra de prueba, pesados con exactitud, y 100 mL de solución alcohólica (5 en 100). Aplicar grasa para llaves de paso a la junta externa del embudo de separación, volver a colocar el embudo de separación al matraz de junta cónica, y reanudar concomitantemente el flujo de nitrógeno. Aplicar presión de carga sobre la solución de ácido clorhídrico en el embudo de separación con una pera de goma provista de una válvula. Abrir la llave de paso del embudo de separación para permitir que la solución de ácido clorhídrico fluya en el matraz. Continuar manteniendo por encima de la solución de ácido clorhídrico una presión suficiente para forzarla hacia el interior del matraz. [NOTA-Si fuera necesario, se puede cerrar la llave de paso temporalmente para incrementar la presión.] Para evitar fugas de dióxido de azufre hacia el embudo de separación, cerrar la llave de paso antes de que escurran los últimos mL de ácido clorhídrico. Aplicar suficiente energía al manto de calentamiento para generar aproximadamente 85 gotas de reflujo por minuto. Después de someter a reflujo durante 1,75 horas, retirar el vaso (G), agregar 3 gotas de rojo de metilo SR, y valorar el contenido con hidróxido de sodio 0,01 N SV, usando una bureta de 1O mL con un tubo de desborde y una manguera que conecte a un tubo de absorción de dióxido de carbono, hasta un punto final amarillo que persista durante al menos 20 segundos. Realizar una determinación con un blanco y hacer las correcciones necesarias (ver Volumetría (541 )). Calcular la cantidad, en µg, de S0 2 en cada g de la muestra de prueba tomada por la fórmula: 1000(32,03)VN/W en donde el factor 1000 convierte mg a µg; 32,03 es el peso miliequivalente de dióxido de azufre; V es el volumen, en mL, de solución volumétrica consumida; N es la normalidad de la solución volumétrica; y W es el peso, en g, de la muestra de prueba tomada.
392 (531) Valoración de Tiamina /Pruebas Químicas
USP 39
(531) VALORACIÓN DE TIAMINA Estándares de Referencia USP (11 )-ER Clorhidrato de Tiamina USP. El siguiente procedimiento se proporciona para la determinación de tiamina como ingrediente de Preparaciones farmacopeicas que contengan otros componentes activos. Soluciones y Disolventes EspecialesSOLUCIÓN DE FERRICIANURO DE POTASIO-Disolver 1,0 g de ferricianuro de potasio en agua para obtener 100 ml. Preparar la solución el mismo día de su uso. REACTIVO DE OXIDACIÓN-Mezclar 4,0 ml de la Solución de Ferricianuro de Potasio con suficiente hidróxido de sodio 3,5 N para obtener 100 ml. Usar esta solución dentro de las 4 horas posteriores. SOLUCIÓN MADRE DE SULFATO DE QUININA-Disolver 1 O mg de sulfato de quinina en ácido sulfúrico O, 1 N para obtener 1000 ml. Conservar esta solución, protegida de la luz, en un refrigerador. SOLUCIÓN ESTÁNDAR DE SULFATO DE QUININA-Diluir ácido sulfúrico 0, 1 N con Solución Madre de Sulfato de Quinina (39:1 ). Esta solución emite fluorescencia aproximadamente en el mismo grado que el tiocromo obtenido de 1 µg de clorhidrato de tiamina y se usa para corregir el fluorómetro a intervalos frecuentes debido a la variación en la sensibilidad entre una lectura y otra dentro de una valoración. Preparar esta solución el mismo día de su uso. Solución Madre de Clorhidrato de Tiamina Estándar-Transferir aproximadamente 25 mg de ER Clorhidrato de Tiamina USP, pesados con exactitud, a un matraz volumétrico de 1000 ml. Disolver el Estándar pesado en aproximadamente 300 ml de solución de alcohol diluido (1 en 5) ajustada con ácido clorhídrico 3 N hasta un pH de 4,0 y llevar a volumen con el alcohol diluido acidificado. Almacenar en un envase resistente a la luz, en un refrigerador. Preparar esta solución madre nueva cada mes. Preparación Estándar-Diluir cuantitativamente y en diluciones sucesivas una porción de la Solución Madre de Clorhidrato de Tiamina Estándar con ácido clorhídrico 0,2 N para obtener la Preparación Estándar, cada ml de la cual representa 0,2 µg del ER Clorhidrato de Tiamina USP. Preparación de Valoración-Colocar en un matraz volumétrico adecuado una cantidad suficiente del material a valorar, pesada con exactitud o medida por volumen según se indique, de modo que al diluir a volumen con ácido clorhídrico 0,2 N, la solución resultante contenga aproximadamente 100 µg de clorhidrato (o mononitrato) de tiamina por ml. Si la muestra es difícil de disolver, se puede calentar la solución en un baño de vapor y luego enfriar y diluir a volumen con el ácido. Diluir cuantitativamente y en diluciones sucesivas 5 ml de esta solución usando ácido clorhídrico 0,2 N hasta una concentración estimada de 0,2 µg de clorhidrato (o mononitrato) de tiamina por ml. Procedimiento-Pipetear 5 ml de la Preparación Estándar y transferir a cada uno de tres o más tubos (u otros recipientes adecuados) de aproximadamente 40 ml de capacidad. A cada uno de dos de estos tubos agregar rápidamente (en 1 ó 2 segundos) mezclando, 3,0 ml del Reactivo de Oxidación y dentro de 30 segundos agregar 20,0 ml de alcohol isobutílico, luego mezclar vigorosamente durante 90 segundos por agitación manual de los tubos tapados, o haciendo burbujear una corriente de aire en la mezcla. Preparar un blanco en el tubo restante del estándar sustituyendo el Reactivo de Oxidación por un volumen equivalente de hidróxido de sodio 3,5 N y procediendo de la misma manera. Pipetear 5 ml de la Preparación de Valoración y transferir a cada uno de tres o más tubos similares. Tratar estos tubos de manera similar a como se indica para los tubos que contienen la Preparación Estándar. Pipetear 2 ml de alcohol deshidratado y transferir a cada uno de seis tubos, agitar por rotación suave durante algunos segundos, permitir que las fases se separen y decantar o extraer aproximadamente 1 O ml de solución de alcohol isobutílico sobrenadante transparente a celdas estandarizadas, luego medir la fluorescencia en un fluorómetro adecuado que tenga un filtro de entrada de intervalo de transmitancia estrecho con un máximo aproximadamente a 365 nm y un filtro de salida con un intervalo de transmitancia estrecho con un máximo aproximadamente a 435 nm. Cálculos-La cantidad de µg de C12 H17 CIN 4 0S · HCI en cada 5 ml de la Preparación de Valoración está dada, por la fórmula:
(A - b)/(S - d) en donde A y S son las lecturas promedio del fluorómetro de las porciones de la Preparación de Valoración y la Preparación Estándar tratadas con el Reactivo de Oxidación, respectivamente, y b y d son las lecturas de los blancos de la Preparación de Valoración y la Preparación Estándar, respectivamente. Calcular la cantidad, en mg, de clorhidrato de tiamina (C 12 H17 CIN 4 0S · HCI) en el material de valoración sobre la base de las alícuotas tomadas. Cuando se indique, la cantidad, en mg, de mononitrato de tiamina (C 12 H17 N 5 0 4 S) se puede calcular por multiplicación de la cantidad encontrada de C12 H 17 CINPS · HCI por 0,9706.
Pruebas Químicas/ (541) Volumetría
USP 39
393
(541) VOLUMETRÍA Valoraciones Volumétricas Directas-La volumetría directa es el tratamiento de una sustancia soluble en solución, y contenida en un recipiente adecuado, con una solución estandarizada apropiada (la solución volumétrica), donde el punto final se determina en forma instrumental, o visualmente con ayuda de un indicador adecuado. La solución volumétrica se agrega desde una bureta de capacidad adecuada que se elige de acuerdo con la concentración (normalidad), de modo tal que el volumen consumido sea de entre 30% y 100% de la capacidad nominal de la bureta. [NOTA-En los casos en que se requiera menos de 1 O mL de solución volumétrica, se debe utilizar una microbureta adecuada.] La aproximación al punto final se hace directamente pero con cuidado, y finalmente la solución volumétrica se agrega gota a gota desde la bureta para que la última gota no sobrepase el punto final. La cantidad de sustancia valorada se puede calcular a partir del volumen, el factor de normalidad o molaridad de la solución volumétrica, y el factor de equivalencia de la sustancia que se especifica en la monografía correspondiente. Valoraciones Volumétricas Residuales-Algunas valoraciones farmacopeicas requieren la adición de un volumen determinado de una solución volumétrica, en exceso del necesario para reaccionar con la sustancia a valorar. Después, el excedente de esta solución se valora con una segunda solución volumétrica. Esto constituye una volumetría residual y también se conoce como "retrovaloración" o "valoración por retorno". La cantidad de la sustancia valorada se puede calcular a partir de la diferencia entre el volumen de la solución volumétrica que se agregó originalmente corregida por medio de una valoración con un blanco y el consumido por la solución volumétrica en la retrovaloración, teniendo en cuenta los respectivos factores de molaridad o normalidad de las dos soluciones y el factor de equivalencia para la sustancia indicado en la monografía correspondiente. Valoraciones Complejométricas-EI éxito de las valoraciones complejométricas depende de varios factores. La constante de equilibrio de formación del complejo del reactivo en la solución volumétrica-analito debe ser lo suficientemente grande como para que, en el punto final, casi el 100% del analito haya formado el complejo. El complejo final se debe formar lo suficientemente rápido para que el tiempo de análisis sea práctico. Cuando la reacción analítica no es rápida, algunas veces puede resultar útil realizar una volumetría residual. En general, los indicadores para valoraciones complejométricas son en sí mismos agentes formadores de complejos. La reacción entre el ión metálico y el indicador debe ser rápida y reversible. La constante de equilibrio de formación del complejo metal-indicador debe ser lo suficientemente grande como para producir un cambio de color marcado pero debe ser menor que la correspondiente al complejo metal-valorante. La elección del indicador también está limitada por el intervalo de pH en el que se debe efectuar la reacción de formación del complejo y por la interferencia de otros iones presentes en la muestra o de la solución amortiguadora. Los iones que interfieren, a menudo se pueden enmascarar o "secuestrar" mediante la adición de otro agente formador de complejos. (La técnica de enmascaramiento también se usa en las valoraciones redox). Valoraciones por Óxido-Reducción (Redox)-Con frecuencia, se pueden llevar a cabo determinaciones de manera conveniente mediante el uso de un reactivo que provoque la oxidación o la reducción del analito. Muchas curvas de valoración redox no son simétricas respecto al punto de equivalencia y, de ese modo, no es posible la determinación gráfica del punto final; pero se dispone de indicadores para muchas determinaciones y además, frecuentemente los reactivos redox pueden servir como sus propios indicadores. Igual que en cualquier tipo de volumetría, el indicador ideal cambia de color en un punto final que está lo más próximo posible al punto de equivalencia. En consecuencia, cuando la solución volumétrica sirve como su propio indicador, la diferencia entre el punto final y el punto de equivalencia sólo está determinada por la habilidad del analista para detectar el cambio de color. Un ejemplo común es el uso del ión permanganato como componente de una solución volumétrica de oxidación ya que un leve exceso se puede detectar por su color rosado. Otras soluciones volumétricas que pueden servir como sus propios indicadores son el yodo, las sales de cerio (IV} y el dicromato de potasio. En la mayoría de los casos, sin embargo, el uso de un indicador redox producirá un punto final mucho más marcado. Puede ser necesario ajustar el estado de oxidación del analito antes de la volumetría mediante el uso de un agente oxidante o reductor adecuado; después, el exceso de reactivo se debe eliminar, por ejemplo, mediante precipitación. Esta es casi siempre la práctica habitual en la determinación de agentes oxidantes, ya que la mayoría de soluciones volumétricas de agentes reductores son oxidadas lentamente por el oxígeno atmosférico. Valoraciones Volumétricas en Disolventes No Acuosos-Los ácidos y las bases han sido definidas durante mucho tiempo como sustancias que cuando se disuelven en agua, proporcionan iones de hidrógeno e hidroxilo, respectivamente. Esta definición, introducida por Arrhenius, no reconoce el hecho de que propiedades características de los ácidos o las bases también se pueden desarrollar en otros disolventes. Una definición más generalizada es la de Bronsted, quien definió un ácido como una sustancia que proporciona protones y una base como una sustancia que se combina con protones. Una definición aún más amplia es la de Lewis, quien definió un ácido como cualquier sustancia que acepta un par de electrones, una base como cualquier sustancia que dona un par de electrones y la neutralización como la formación de una unión de coordinación entre un ácido y una base. La fuerza aparente de un ácido o una base se determina por su grado de reacción con un disolvente. En solución acuosa todos los ácidos fuertes parecen ser igualmente fuertes porque reaccionan con el disolvente para sufrir una conversión casi completa en el ión oxonio y el anión del ácido (efecto nivelador). En un disolvente débilmente protófilo como el ácido acético,
394 (541) Volumetría / Pruebas Químicas
USP 39
el grado de formación del ión acidonio del acetato, indica que el orden decreciente de la fuerza para ácidos es perclórico, brornhídrico, sulfúrico, clorhídrico y nítrico (efecto diferenciador). El ácido acético reacciona de forma incompleta con el agua para formar ión oxonio y por lo tanto es un ácido débil. En contraste, se disuelve en una base corno etilendiarnina y reacciona en forma tan completa con el disolvente que se comporta corno un ácido fuerte. Lo mismo es válido para el ácido perclórico. Este efecto nivelador también se observa en el caso de las bases. En ácido sulfúrico, casi todas las bases parecen tener la misma fuerza. A medida que las propiedades del disolvente disminuyen en la serie constituida por ácido sulfúrico, ácido acético, fenol, agua, piridina y butilarnina, las bases se vuelven progresivamente más débiles hasta que todas, excepto las más fuertes, pierden sus propiedades básicas. En orden de fuerza decreciente, las bases más fuertes son 2-arninoetóxido de sodio, rnetóxido de potasio, rnetóxido de sodio y rnetóxido de litio. Muchos compuestos insolubles en agua adquieren mejores propiedades ácidas o básicas cuando se disuelven en disolventes orgánicos. De esta manera, la elección del disolvente adecuado permite la determinación de una variedad de tales sustancias mediante valoración en medios no acuosos. Además, dependiendo de cual sea la parte fisiológicamente activa del compuesto, con frecuencia es posible valorarla selectivamente, eligiendo el disolvente y el valorante adecuados. Los compuestos puros se pueden valorar directamente, pero en preparaciones farmacéuticas a menudo es necesario aislar el ingrediente activo de los excipientes y vehículos que interfieran. Entre los tipos de compuestos que se pueden valorar corno ácidos están los ácidos de haluros, anhídridos de ácidos, ácidos carboxílicos, aminoácidos, enoles corno barbituratos y xantinas, irnidas, fenoles, pirroles y sulfonamidas. Entre los tipos de compuestos que se pueden valorar corno bases están las aminas, compuestos heterocíclicos que contienen nitrógeno, oxazolinas, compuestos de amonio cuaternario, sales alcalinas de ácidos orgánicos, sales alcalinas de ácidos inorgánicos débiles y algunas sales de aminas. Muchas sales de ácidos halogenados se pueden valorar en ácido acético o anhídrido acético después de agregar acetato de mercurio, que elimina iones haluros formando un complejo de halógeno-mercurio sin ionizar e introduce el acetato ionizado. Para la volurnetría de un compuesto básico se prefiere una solución volumétrica de ácido perclórico en ácido acético glacial, aunque en casos especiales se usa ácido perclórico en dioxano. El sistema de electrodos de vidrio-calomel resulta útil en este caso. En ácido acético corno disolvente, este sistema de electrodos funciona de acuerdo con la teoría. Para la volurnetría de un compuesto ácido, se dispone de dos clases de soluciones volumétricas: los alcóxidos de metales alcalinos y los hidróxidos de tetraalquilarnonio. Con frecuencia se usa una solución volumétrica de rnetóxido de sodio en una mezcla de metano! y tolueno, aunque en algunos casos, cuando se produce un precipitado gelatinoso con el rnetóxido de sodio, se emplea rnetóxido de litio en un disolvente de rnetanol-benceno. Cuando se emplean soluciones volumétricas de alcóxidos de metales alcalinos se produce un error alcalino que limita el empleo de un electrodo de vidrio, en particular en disolventes básicos. El electrodo indicador de antimonio, aunque algo errático, resulta útil en estos casos. El uso de hidróxidos de amonio cuaternario, por ej., el hidróxido de tetra-n-butilarnonio y el hidróxido de trirnetilhexadecilarnonio (en benceno-metano! o alcohol isopropílico), presenta dos ventajas sobre las otras dos soluciones volumétricas: (a) la sal de tetraalquilarnonio del ácido valorado es soluble en el medio de valoración y (b) se puede emplear un par de electrodos de vidrio calomel, de uso corriente en la mayoría de los laboratorios analíticos, para llevar a cabo valoraciones volumétricas potenciornétricas. Debido a la interferencia producida por el dióxido de carbono, los disolventes empleados en la valoración de sustancias ácidas se deben proteger de la exposición excesiva al aire atmosférico durante la valoración mediante una protección adecuada o una atmósfera inerte. La absorción de dióxido de carbono se puede determinar mediante la volurnetría con un blanco. El blanco no debe exceder más de 0,01 rnL de rnetóxido de sodio SV O, 1 N por rnL de disolvente. El punto final se puede determinar visualmente por el cambio de color de un indicador, o potenciornétricarnente, según se especifique en la monografía correspondiente. Si se usa un electrodo de calomel corno referencia, es recomendable sustituir la solución acuosa de cloruro de potasio del puente salino con perclorato de litio O, 1 N en ácido acético glacial para valoraciones en disolventes ácidos o cloruro de potasio en metano! para valoraciones en disolventes básicos. Cuando en la monografía correspondiente se indica el uso de estas u otras mezclas, el electrodo de calomel de referencia se modifica retirando en primer lugar la solución acuosa de cloruro de potasio y el cloruro de potasio residual, si lo hubiera, enjuagando con agua y luego eliminando el agua residual enjuagando con el disolvente no acuoso indicado y finalmente, llenando el electrodo con la mezcla no acuosa indicada. En casi todos los casos, excepto en aquellos en los que el ión de plata podría interferir, el electrodo de calomel se puede sustituir por un electrodo de referencia de plata-cloruro de plata. El electrodo de plata-cloruro de plata es más resistente y su uso ayuda a eliminar sales de mercurio tóxicas del laboratorio. En general se puede utilizar un puente salino para evitar la interferencia del ión plata. Los sistemas más útiles para volurnetría en disolventes no acuosos se indican en la Tabla 1.
Pruebas Químicas/ (541) Volumetría 395
USP 39
Tabla 1. Sistemas para Valoraciones Volumétricas No Acuosas Tipo de DI solvente Disolvente 1
Ácido (para valoración de bases y sus sales)
Relativamente Neutro (para valoración diferencial de bases)
Básico (para valoración de ácidos)
Relativamente Neutro (para valoración diferencial de ácidos)
Ácido acético glacial
Acetonitrilo
Dimetilformamida
Acetona
Anhídrido acético
Alcoholes
n-Butilamina
Aceton itrilo
Ácido fórmico
Cloroformo
Piridina
Metil etil cetona
Ácido propiónico
Benceno
Etilendiamina
Metil isobutil cetona
Cloruro de sulfurilo
Tolueno
Morfolina
Alcohol terc-butílico
Azo violeta
Clorobenceno Acetato de etilo Dioxano Indicador
Electrodos
Cristal violeta
Rojo de metilo
Azul de timol
Rojo de quinaldina
Naranja de metilo
Timolftaleína
Azul de bromotimol
p-Naftolbenceína
p-Naftolbenceína
Azo violeta
p-Hidroxiazobenceno
Alfazurina 2-G
o-Nitroanilina
Azul de timol
Verde de malaquita
p-Hidroxiazobenceno
Vidrio-calomel
Vidrio-calomel
Antimonio-calomel
Antimonio-calomel
Vidrio-plata-cloruro de plata
Calomel-plata-cloruro de plata
Antimonio-vidrio
Vidrio-calomel
Antimonio-antimonio2
Vidrio-platino2
Mercurio-acetato mercúrico
Platino-calomel Vidrio-calomel Los disolventes relativamente neutros de baja constante dieléctrica como benceno, tolueno, cloroformo o dioxano se pueden emplear junto con cualquier disolvente ácido o básico para aumentar la sensibilidad del punto final de la valoración. 2 En solución volumétrica. 1
Indicadores y Detección Potenciométrica del Punto Final-El método más simple y conveniente para determinar el punto de equivalencia, es decir, el punto en el que la reacción analítica estequiométrica está terminada, es mediante el uso de indicadores. Estas sustancias químicas, generalmente coloreadas, responden a cambios en la solución antes y después del punto de equivalencia presentando cambios de color que se pueden detectar visualmente como el punto final de la reacción, lo que constituye una estimación confiable del punto de equivalencia. Un método útil de determinación del punto final es mediante mediciones electroquímicas. Si un electrodo indicador, sensible a la concentración de la especie sometida a la reacción volumétrica y un electrodo de referencia cuyo potencial no es sensible a ninguna especie disuelta, se sumergen en la solución a valorar para formar una celda galvánica, la diferencia de potencial entre los electrodos se puede medir con un medidor de pH que permite seguir el curso de la reacción. Cuando es posible graficar correctamente dichas series de cambios (por ejemplo, para el caso de una valoración ácido-base, el pH en función de los ml de solución volumétrica agregada; para valoraciones de precipitación, complejométricas o de óxido-reducción, los mV en función de los ml de solución volumétrica agregada), se obtiene una curva sigmoidea con una porción que cambia rápidamente (punto de "ruptura") cerca del punto de equivalencia. El punto medio de esta porción vertical o punto de inflexión se puede considerar como punto final. El punto de equivalencia también se puede determinar matemáticamente sin trazar una curva de valoración. Sin embargo, se debe tener en cuenta que en reacciones asimétricas en las que el número de aniones que reaccionan no es igual al número de cationes que reaccionan, el punto final definido por la inflexión de la curva de volumetría no ocurre exactamente en el punto de equivalencia estequiométrico. En consecuencia, la detección potenciométrica del punto final mediante este método no es adecuada para reacciones asimétricas, como por ejemplo la reacción de precipitación, 2Ag+ + Cr0 4 - 2 y la reacción de óxido-reducción, 5Fe• 2 + Mn04-. Todas las reacciones ácido-base, sin embargo, son simétricas. De este modo, la detección potenciométrica del punto final se puede emplear en valoraciones volumétricas ácido-base y en otras valoraciones volumétricas que comprendan reacciones simétricas reversibles donde se especifique un indicador, a menos que se indique lo contrario en la monografía correspondiente. Existen dos tipos de tituladores electrométricos. El primero agrega la solución volumétrica automáticamente y registra las diferencias de potencial del electrodo durante el curso de la titulación dando la curva sigmoidea esperada. En el segundo tipo, el agregado de solución volumétrica se lleva a cabo automáticamente hasta que se alcanza un potencial o pH preseleccionado, que representa el punto final y en ese momento cesa el agregado de solución volumétrica. Varios sistemas de electrodos, apropiados para valoraciones volumétricas potenciométricas, se resumen en la Tabla 2.
396 (541) Volumetría / Pruebas Químicas
USP 39
Tabla 2. Sistemas de Electrodos para Valoraciones Volumétricas Potenciométrlcas Valoración volumétrica
Electrodo indicador
Ecuación 1
Electrodo de referencia
Aplicaciones 2
Ácido-base
Vidrio
E= k + 0,0591 pH
Calomel o plata-cloruro de plata
Valoración volumétrica de ácidos y bases
Precipitimetría (plata)
Plata
E= Eº+ 0,0591 log [Ag +]
Calomel (con puente salino de nitrato de potasio)
Valoración volumétrica con plata o de plata que comprende haluros o tiocianatos
Complejometría
Mercurio-mercurio (11)
E= Eº+ 0,0296(1og k'- pM)
Calomel
Valoración volumétrica de diversos metales (M), p.ej., Mg+ 2, Ca+ 2, Al+ 3, Bi+ 3, con EDTA
Óxido-reducción
Platino
E= Eº+ (0,0591 /n) x log [ox]/[red]
Calomel o plata-cloruro de plata
Valoraciones volumétricas con arsenito, bromo, cerato, dicromato, hexacianoferrato (111), yodato, nitrito, permanganato, tiosulfato
1 Forma apropiada de la ecuación de Nernst que describe el sistema de electrodos indicado: k = constante del electrodo de vidrio; k' = constante derivada del equilibrio Hg-Hg(ll)-EDTA; M =cualquier metal que se pueda valorar con EDTA; [ox] y [red] de la ecuación, ox +ne±:> red. 2 La lista es representativa pero no está completa.
Correcciones con un Blanco-Como se hizo notar anteriormente, el punto final determinado en una volumetría es una estimación del punto de equivalencia de la reacción. La validez de esta estimación depende, entre otros factores, de la naturaleza de las sustancias a valorar y de la concentración de la solución volumétrica. Para aumentar la confiabilidad de la determinación del punto final en valoraciones volumétricas, se realiza una corrección con un blanco adecuado. Dicha corrección con un blanco se obtiene habitualmente mediante una valoración residual del blanco, en la que el procedimiento indicado se repite en todos los detalles excepto que la muestra en análisis se omite. En tales casos, el volumen real de solución volumétrica, equivalente a la sustancia analizada, es la diferencia entre el volumen consumido en la valoración residual del blanco y el consumido en la valoración de la muestra. El volumen corregido que se obtiene de esta manera se utiliza para calcular la cantidad de sustancia valorada, de la misma manera que se indica en Valoraciones volumétricas residuales. Cuando el punto final se determina potenciométricamente, la corrección del blanco en general es inapreciable.
(551) VALORACIÓN DE VITAMINA E INTRODUCCIÓN Los siguientes procedimientos de cromatografía de líquidos se usan para la determinación de vitamina E como ingrediente farmacéutico activo, como ingrediente de suplemento dietético o como componente de formas farmacéuticas farmacopeicas en las formas alfa tocoferol (C 29 Hs 00 2), acetato de alfa tocoferilo (C 31 H52 0 3), o succinato ácido de alfa tocoferilo (C 33 H54 0 5). Durante toda esta valoración, proteger de la atmósfera y la luz todas las soluciones que contengan la muestra de prueba y el Estándar de Referencia y las que deriven de éstos, usando preferentemente una atmósfera de gas inerte y material de vidrio con protección actínica. Cuando se especifique vitamina E (alfa tocoferol, acetato de alfa tocoferilo, o succinato ácido de alfa tocoferilo) en el siguiente procedimiento, usar la forma química presente en la formulación y el Estándar de Referencia USP pertinente. VALORACIÓN • PROCEDIMIENTO 1
• Este procedimiento se puede usar para la determinación de vitamina E en: •Tabletas de Vitaminas Oleosolubles • Cápsulas de Vitaminas Oleosolubles •Tabletas de Vitaminas Oleosolubles con Minerales • Cápsulas de Vitaminas Oleosolubles con Minerales •Tabletas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles • Cápsulas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles •Tabletas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales • Cápsulas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales • Éste es un procedimiento neutro que implica el uso de dimetil sulfóxido para disolver los excipientes en la muestra, seguido de una extracción líquido-líquido de la vitamina E con hexano. Luego, el extracto de hexano se evapora al vacío hasta sequedad, y el residuo se reconstituye con metano! antes de inyectarlo en el cromatógrafo. • A menos que se especifiquen en las monografías individuales, la Solución de aptitud del sistema, la Solución estándar, las Soluciones muestra y las soluciones reactivo se preparan según se indica a continuación. Solución A: Solución de ácido fosfórico (1 en 100) en agua
USP 39
Pruebas Químicas/ (551) Valoración de Vitamina E 397
Fase móvil: Metanol y Solución A (19: 1) Solución de aptitud del sistema: Preparar una solución de 0,65 mg/ml de ER Ergocalciferol USP en metano!. Transferir 1,0 ml de esta solución a un matraz volumétrico de 100 ml que contenga 100 mg de ER Acetato de Alfa Tocoferilo USP. Disolver en 30 ml de metano!, con ayuda de ultrasonido, si fuera necesario, y diluir con metanol a volumen. Almacenar esta solución en un refrigerador. Solución estándar: 2 mg/ml de ER Alfa Tocoferol USP, ER Acetato de Alfa Tocoferilo USP o ER Succinato Ácido de Alfa Tocoferilo USP en metanol Solución muestra para Tabletas: Reducir a polvo fino no menos de 20 Tabletas. Transferir una porción del polvo, típicamente equivalente a 20 mg de la forma de vitamina E en análisis, pero que no exceda de 7,5 g del polvo, a un tubo de centrífuga con tapa de rosca con recubrimiento interno de teflón. Agregar aproximadamente 2 ml de dimetil sulfóxido y aproximadamente 3 ml de n-hexano por cada g de Tabletas reducidas a polvo y agitar durante 45 minutos en un agitador en un baño de agua mantenido a 60º. [NOTA-Ajustar el agitador para asegurar que el contenido del recipiente se mezcle de manera vigorosa y minuciosa.] Centrifugar a 3000 rpm durante 1O minutos y transferir la capa de hexano con una pipeta a un matraz volumétrico. [NOTA-Capacidad del matraz volumétrico: no menos de 20 mL.] Agregar 3 ml de n-hexano por cada g de Tabletas reducidas a polvo a la capa de dimetil sulfóxido, agitar minuciosamente durante 5 minutos y transferir la capa de hexano con una pipeta al mismo matraz volumétrico. Repetir esta extracción con tres porciones adicionales de n-hexano. Diluir los extractos en el matraz volumétrico con n-hexano a volumen. Transferir no menos de 20 ml de esta solución a un recipiente adecuado y evaporar al vacío a temperatura ambiente hasta sequedad. Transferir el residuo con ayuda de metano! a un matraz volumétrico adecuado y diluir con metano! a volumen hasta obtener una concentración de 2 mg/ml de alfa tocoferol, acetato de alfa tocoferilo o succinato ácido de alfa tocoferilo. Solución muestra para Cápsulas: Transferir el contenido de no menos de 20 Cápsulas a un recipiente adecuado, mezclar y pesar. Transferir una porción de la mezcla, típicamente equivalente a 20 mg de la forma de vitamina E en análisis, pero que no exceda de 7,5 g de la mezcla, a un tubo de centrífuga con tapa de rosca con recubrimiento interno de teflón. [NOTA-Para Cápsulas de gelatina dura, retirar, tanto como sea posible, el contenido de no menos de 20 Cápsulas cortando las cubiertas de las Cápsulas para abrirlas, transfiriendo las cubiertas y su contenido a un recipiente adecuado y triturando hasta formar una masa homogénea. Transferir una porción de la masa, típicamente equivalente a 20 mg de la forma de vitamina E en análisis, pero que no exceda de 7,5 g de la mezcla, a un tubo de centrífuga con tapa de rosca con recubrimiento interno de teflón.] Agregar aproximadamente 2 ml de dimetil sulfóxido por cada g del contenido de las Cápsulas y aproximadamente 3 ml de n-hexano por cada g del contenido de las Cápsulas, y agitar durante 45 minutos en un agitador en un baño de agua mantenido a 60º. [NOTA-Ajustar el agitador para asegurar que el contenido del recipiente se mezcle de manera vigorosa y minuciosa.] Centrifugar a 3000 rpm durante 1O minutos y transferir la capa de hexano con una pipeta a un matraz volumétrico. [NOTA-Capacidad del matraz volumétrico: no menos de 20 ml.] Agregar 3 ml de nhexano por cada g del contenido de las Cápsulas a la capa de dimetil sulfóxido, agitar minuciosamente durante 5 minutos y transferir la capa de hexano con una pipeta al mismo matraz volumétrico. Repetir esta extracción con tres porciones adicionales de n-hexano. Diluir los extractos en el matraz volumétrico con n-hexano a volumen. Transferir no menos de 20 ml de esta solución a un recipiente adecuado y evaporar al vacío a temperatura ambiente hasta sequedad. Transferir el residuo con ayuda de metanol a un matraz volumétrico adecuado y diluir con metanol a volumen hasta obtener una concentración de 2 mg/ml de alfa tocoferol, acetato de alfa tocoferilo o succinato ácido de alfa tocoferilo. Sistema cromatográfico (Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.) Modo: HPLC Detector: UV 254 nm Columna: 8 mm x 1O cm; relleno L1 de 5 µm Velocidad de flujo: 2 ml/min Volumen de inyección: 100 µL Aptitud del sistema Muestras: Solución de aptitud del sistema y Solución estándar [NOTA-Los tiempos de retención relativos para ergocalciferol y acetato de alfa tocoferilo son aproximadamente 0,5 y 1,0, respectivamente.] Requisitos de aptitud Resolución: No menos de 12 entre ergocalciferol y acetato de alfa tocoferilo, Solución de aptitud del sistema Factor de asimetría: 0,8-1,2, Solución de aptitud del sistema Desviación estándar relativa: No más de 3,0%, Solución estándar Análisis Muestras: Solución estándar y Solución muestra Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de alfa tocoferol, acetato de alfa tocoferilo, o succinato ácido de alfa tocoferilo en la porción de la muestra tomada: Resultado= (ruf r5) x (C5/Cu) x 100 ru r5
= respuesta del pico de la forma de vitamina E pertinente de la Solución muestra = respuesta del pico de la forma de vitamina E pertinente de la Solución estándar
398 (551) Valoración de Vitamina E / Pruebas Químicas
C5
Cu
USP 39
=concentración de la forma de vitamina E pertinente del Estándar de Referencia USP correspondiente en la Solución estándar (mg/mL) =concentración nominal de la forma de vitamina E correspondiente en la Solución muestra (mg/mL)
• PROCEDIMIENTO 2
• Este procedimiento se puede usar para las formulaciones que contienen vitaminas A, D y E. La aplicación incluye: •Tabletas de Vitaminas Oleosolubles • Cápsulas de Vitaminas Oleosolubles •Tabletas de Vitaminas Oleosolubles con Minerales • Cápsulas de Vitaminas Oleosolubles con Minerales •Tabletas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles • Cápsulas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles •Tabletas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales • Cápsulas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales • Este procedimiento emplea el tratamiento de la muestra con ácido sulfúrico metanólico, seguido de una extracción con 2,2,4-trimetilpentano. • A menos que se especifiquen en las monografías individuales, la Solución de aptitud del sistema, la Solución estándar, las Soluciones muestra y las soluciones reactivo se preparan según se indica a continuación. Fase móvil: Mezclar 240 mL de metanol con 1O mL de agua, seguido de 0,5 mL de ácido fosfórico al 50%, y diluir con acetonitrilo hasta 1000 ml. Solución de ácido sulfúrico metanólico 3 N: Agregar cuidadosamente 9 mL de ácido sulfúrico a 80 mL de metanol en un matraz volumétrico de 100 ml. Enfriar y diluir con metanol a volumen. Solución de ascorbato de sodio-pirogalol: Transferir 1Og de ascorbato de sodio y 5 g de pirogalol a un matraz volumétrico de 100 mL y agregar agua suficiente para disolver. Agregar 1,7 mL de ácido sulfúrico y diluir con agua a volumen. Solución de lecitina: 5 mg/mL de lecitina en 2,2,4-trimetilpentano Solución de aptitud del sistema: 2 mg/mL de ER Alfa Tocoferol USP, de ER Acetato de Alfa Tocoferilo USP y de ER Succinato Ácido de Alfa Tocoferilo USP en metanol Solución estándar: 2 mg/mL de ER Alfa Tocoferol USP, ER Acetato de Alfa Tocoferilo USP, o ER Succinato Ácido de Alfa Tocoferilo USP en metanol Solución muestra para Tabletas: [NOTA-Esta preparación es adecuada para la determinación de vitamina A, vitamina D y vitamina E, cuando se encuentran presentes en la formulación. La cantidad de muestra se puede ajustar dependiendo de la presencia o ausencia de las vitaminas apropiadas.] Reducir a polvo fino no menos de 20 Tabletas. Usar una porción del polvo, nominalmente equivalente a una cantidad de 90 mg de alfa tocoferol, acetato de alfa tocoferilo o succinato ácido de alfa tocoferilo. Agregar 0,5 g de bicarbonato de sodio, 1,5 mL de Solución de Jecitina y 12,5 mL de 2,2,4-trimetilpentano, y dispersar en un mezclador de vórtice. Agregar 6 mL de Solución de ascorbato de sodio-pirogalol, agitar lentamente y dejar que la solución se desgasifique. Continuar agitando hasta que haya cesado la emisión de gases y luego agitar durante 12 minutos adicionales. Agregar 6 mL de dimetil sulfóxido, mezclar en un mezclador de vórtice hasta formar una suspensión y agitar durante 12 minutos. Agregar 6 mL de Solución de ácido sulfúrico metanó/ico 3 N, mezclar en un mezclador de vórtice hasta formar una suspensión y agitar durante 12 minutos. Agregar 12,5 mL de 2,2,4-trimetilpentano, mezclar en un mezclador de vórtice hasta formar una suspensión y agitar durante 1O minutos. Centrifugar durante 1O minutos para romper la emulsión y hasta que el sobrenadante se torne transparente. Transferir un volumen de la capa de 2,2,4-trimetilpentano sobrenadante a un matraz volumétrico adecuado; el volumen de la muestra retirada de la capa de 2,2,4-trimetilpentano y la capacidad del matraz volumétrico son tales que la concentración final de la Solución muestra es equivalente a la de la Solución estándar. Evaporar casi hasta sequedad, agregar varios mL de metanol y evaporar el 2,2,4-trimetilpentano remanente. Diluir con metano! a volumen. Solución muestra para Cápsulas: [NOTA-Esta preparación es adecuada para la determinación de vitamina A, vitamina D y vitamina E, cuando se encuentran presentes en la formulación. La cantidad de muestra se puede ajustar dependiendo de la presencia o ausencia de las vitaminas apropiadas.] Pesar no menos de 20 Cápsulas en un frasco de pesada tarado. Usando una cuchilla afilada, si fuera necesario, abrir cuidadosamente las Cápsulas, sin perder material de la cubierta, y transferir el contenido a un vaso de precipitados de 100 mL. Retirar cualquier contenido adherido a las cubiertas de las cápsulas vacías lavando con varias porciones de éter. Desechar los lavados y secar las cubiertas de las Cápsulas con ayuda de una corriente de aire seco. Pesar las cubiertas de las Cápsulas vacías en un frasco de pesada tarado y calcular el peso neto del contenido de las Cápsulas. Transferir una porción del contenido de las Cápsulas, equivalente a 55 mg de vitamina E, a un recipiente con tapa de rosca con recubrimiento interno de teflón. Agregar 0,5 g de bicarbonato de sodio, 1,5 mL de Solución de /ecitina y 12,5 mL de 2,2,4-trimetilpentano, y dispersar en un mezclador de vórtice. Agregar 6 mL de Solución de ascorbato de sodio-pirogalol, agitar lentamente y dejar que la solución se desgasifique. Continuar agitando hasta que haya cesado la emisión de gases y luego agitar durante 12 minutos adicionales. Agregar 6 mL de dimetil sulfóxido, mezclar en un mezclador de vórtice hasta formar una suspensión y agitar durante 12 minutos. Agregar 6 mL de Solución de ácido sulfúrico metanólico 3 N, mezclar en un mezclador de vórtice hasta formar una suspensión y agitar durante 12 minutos. Agregar 12,5 mL de 2,2,4-trimetilpentano, mezclar en un mezclador de vórtice hasta formar una suspensión y agitar durante 1O minutos. Centrifugar durante 1O minutos para romper la emulsión y hasta que el sobrenadante se torne transparente. Transferir un volumen de la capa de 2,2,4-trimetilpentano sobrenadante a un matraz volumétrico adecuado, el volumen de
USP 39
Pruebas Químicas/ (551) Valoración de Vitamina E 399
la muestra retirada de la capa de 2,2,4-trimetilpentano y el tamaño del matraz volumétrico son tales que la concentración final de la Solución muestra es equivalente a la de la Solución estándar. Evaporar casi hasta sequedad, agregar varios ml de metano! y evaporar el 2,2,4-trimetilpentano remanente. Diluir con metano! a volumen. Sistema cromatográfico (Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.) Modo: HPLC Detector: UV 280 nm Columna: 4,6 mm x 25 cm; relleno L1 de 5 µm Velocidad de flujo: 1,5 ml/min Volumen de inyección: 25 µL Aptitud del sistema Muestras: Solución de aptitud del sistema y Solución estándar [NOTA-Los tiempos de retención relativos para succinato ácido de alfa tocoferilo, alfa tocoferol y acetato de alfa tocoferilo son aproximadamente 0,6; 0,8 y 1,0, respectivamente.] Requisitos de aptitud Resolución: No menos de 4,0 entre succinato ácido de alfa tocoferilo y alfa tocoferol; no menos de 3,0 entre alfa tocoferol y acetato de alfa tocoferilo, Solución de aptitud del sistema Desviación estándar relativa: No más de 3,0%, Solución estándar Análisis Muestras: Solución estándar y Solución muestra Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de alfa tocoferol, acetato de alfa tocoferilo o succinato ácido de alfa tocoferilo en la porción de la muestra tomada: Resultado= Crulr5) x (C5/Cu) x 100
ru r5 C5
= respuesta del pico de la forma de vitamina E pertinente de la Solución muestra = respuesta del pico de la forma de vitamina E pertinente de la Solución estándar = concentración de la forma de vitamina E pertinente del Estándar de Referencia USP correspondiente en la Solución estándar (mg/ml) Cu =concentración nominal de la forma de vitamina E correspondiente en la Solución muestra (mg/ml) [NOTA-Para calcular la concentración nominal, tomar en cuenta el volumen de extracción inicial de 26,5 ml de 2,2,4-trimetilpentano y el factor de dilución al cambiar el disolvente de 2,2,4-trimetilpentano a metano!.] • PROCEDIMIENTO 3
• Este procedimiento se puede usar para la determinación de vitamina E en: •Tabletas de Vitaminas Oleosolubles • Cápsulas de Vitaminas Oleosolubles •Tabletas de Vitaminas Oleosolubles con Minerales • Cápsulas de Vitaminas Oleosolubles con Minerales •Tabletas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles • Cápsulas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles •Tabletas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales • Cápsulas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales • Solución Oral de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles • Solución Oral de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales • Este procedimiento emplea la saponificación de la muestra, seguida de una extracción líquido-líquido de vitamina E a partir de la muestra con n-hexano. Evaporar el extracto de hexano hasta sequedad y reconstituir el residuo en una mezcla de acetonitrilo y acetato de etilo (1: 1). •A menos que se especifiquen en las monografías individuales, la Solución estándar, las Soluciones muestra y las soluciones reactivo se preparan según se indica a continuación. Fase móvil: Metano!, acetonitrilo y n-hexano (46,5: 46,5: 7,0) Diluyente: Acetonitrilo y acetato de etilo (1: 1) Solución de hidróxido de potasio: [NOTA-Usada en la muestra para Solución Oral.] Transferir 90 g de pellets de hidróxido de potasio a un matraz volumétrico de 100 ml que contenga 60 ml de agua. Mezclar hasta disolver, enfriar y diluir con agua a volumen. Solución estándar: 0,3 mg/ml de ER Alfa Tocoferol USP en Diluyente Solución muestra para Tabletas: Reducir a polvo fino no menos de 20 Tabletas. Transferir una porción del polvo, equivalente a 8 mg de alfa tocoferol, a un matraz de 125 ml equipado con una junta de vidrio esmerilado. Agregar 25,0 ml de agua, 25,0 ml de alcohol deshidratado y 3,5 g de pellets de hidróxido de potasio. Agitar durante 1 hora en un baño de agua mantenido a 55º. Enfriar y transferir con ayuda de un volumen mínimo de agua a un embudo de separación de 125 ml. Enjuagar el matraz con 50 ml de n-hexano y agregar el enjuague al embudo de separación. Tapar, agitar vigorosamente durante 60 segundos y dejar que las capas se separen. Escurrir la capa acuosa a un segundo embudo de separación de 250 ml y repetir la extracción con 50 ml de n-hexano. Desechar la capa acuosa y combinar los extractos de hexano.
400 (551) Valoración de Vitamina E/ Pruebas Químicas
USP 39
Lavar los extractos combinados con 25 mL de agua, dejar que las capas se separen y desechar la capa acuosa. Agregar 3 gotas de ácido acético glacial y repetir el procedimiento de lavado dos veces más. Filtrar la capa de hexano lavada a través de sulfato de sodio anhidro en un matraz de fondo redondo de 250 ml. Enjuagar el embudo y el sulfato de sodio con unos pocos mL de n-hexano, y agregar el enjuague a la solución de hexano en el matraz. Colocar el matraz en un baño de agua mantenido a 50º y evaporar la solución de hexano con ayuda de un evaporador rotatorio hasta sequedad. Inmediatamente, agregar 25,0 mL de Diluyente y agitar por rotación suave hasta disolver el residuo. Solución muestra para Cápsulas: Pesar no menos de 20 Cápsulas en un frasco de pesada tarado. Abrir las Cápsulas, sin perder material de la cubierta, y transferir el contenido a un vaso de precipitados de 100 ml. Retirar cualquier contenido adherido a las cubiertas de las cápsulas vacías lavando con varias porciones de éter. Desechar los lavados y secar las cubiertas de las Cápsulas con ayuda de una corriente de aire seco. Pesar las cubiertas de las Cápsulas vacías en un frasco de pesada tarado y calcular el peso neto del contenido de las Cápsulas. Transferir una porción del contenido de las Cápsulas, equivalente a una cantidad de 8,0 mg de alfa tocoferol, a un matraz Erlenmeyer con tapón de vidrio. Agregar 25,0 mL de agua, 25,0 mL de alcohol deshidratado y 3,5 g de pellets de hidróxido de potasio. Agitar durante 1 hora en un baño de agua mantenido a 55º. Enfriar y transferir con ayuda de un volumen mínimo de agua a un embudo de separación de 125 mL. Enjuagar el matraz con 50 mL de n-hexano y agregar el enjuague al embudo de separación. Tapar, agitar vigorosamente durante 60 segundos y dejar que las capas se separen. Escurrir la capa acuosa a un segundo embudo de separación de 250 mL y repetir la extracción con 50 mL de n-hexano. Desechar la capa acuosa y combinar los extractos de hexano. Lavar los extractos combinados con 25 mL de agua, dejar que las capas se separen y desechar la capa acuosa. Agregar 3 gotas de ácido acético glacial y repetir el procedimiento de lavado dos veces más. Filtrar la capa de hexano lavada a través de sulfato de sodio anhidro en un matraz de fondo redondo de 250 mL. Enjuagar el embudo y el sulfato de sodio con unos pocos mL de n-hexano, y agregar el enjuague a la solución de hexano en el matraz. Colocar el matraz en un baño de agua mantenido a 50º y evaporar la solución de hexano hasta sequedad con ayuda de un evaporador rotatorio. Inmediatamente, agregar 25,0 mL de Diluyente y agitar por rotación suave hasta disolver el residuo. Solución muestra para Solución Oral: Transferir una cantidad de Solución Oral, equivalente a 1,5 mg de alfa tocoferol, a un matraz Erlenmeyer de 125 mL equipado con una junta de vidrio esmerilado y agregar 25,0 mL de alcohol deshidratado. Conectar un condensador de reflujo y someter a reflujo en un baño de agua en ebullición durante 1 minuto. Agregar con cuidado 3 mL de Solución de hidróxido de potasio a través del condensador y continuar sometiendo a reflujo durante 30 minutos. Retirar el matraz del baño y enjuagar el condensador con aproximadamente 15 mL de agua. Enfriar y transferir con un volumen mínimo de agua a un embudo de separación de 250 ml. Enjuagar el matraz con 50 mL de n-hexano y agregar los enjuagues al embudo de separación. Tapar, agitar vigorosamente durante 1 minuto y dejar que las capas se separen. Escurrir la capa acuosa a un segundo embudo de separación de 250 mL y repetir la extracción con 50 mL de nhexano. Desechar la capa acuosa y combinar los extractos de hexano. Lavar los extractos combinados con 25 mL de agua, dejar que las capas se separen y desechar la capa acuosa. Agregar 3 gotas de ácido acético glacial y repetir el procedimiento de lavado dos veces más. Filtrar la capa de hexano lavada a través de sulfato de sodio anhidro en un matraz de fondo redondo de 250 ml. Enjuagar el embudo y el sulfato de sodio con n-hexano, y agregar el enjuague a la solución de hexano en el matraz. Evaporar la solución de hexano hasta sequedad con ayuda de un evaporador rotatorio sobre un baño de agua mantenido a aproximadamente 50º. Inmediatamente, agregar 5,0 ml de Diluyente y agitar por rotación suave hasta disolver el residuo. Sistema cromatográfico (Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.) Modo: HPLC Detector: UV 291 nm Columna: 4,6 mm x 25 cm; relleno L1 Temperatura de la columna: 40º Velocidad de flujo: 3 mL/min Volumen de inyección: 20 µL Aptitud del sistema Muestra: Solución estándar Requisitos de aptitud Desviación estándar relativa: No más de 0,5% Análisis Muestras: Solución estándar y Solución muestra Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de vitamina E, como alfa tocoferol, en la porción de la muestra tomada: Resultado= (ruf r5) x (C5/Cu) x 100 = respuesta del pico de alfa tocoferol de la Solución muestra = respuesta del pico de alfa tocoferol de la Solución estándar C5 = concentración de ER Alfa Tocoferol USP en la Solución estándar (mg/mL) Cu = concentración nominal de vitamina E, como alfa tocoferol, en la Solución muestra (mg/mL) [NOTA-Calcular el alfa tocoferol equivalente a acetato de alfa tocoferilo o succinato ácido de alfa tocoferilo, multiplicando sus contenidos por los factores 0,91 ó 0,81, respectivamente.] ru r5
USP 39
Pruebas Químicas/ (551) Valoración de Vitamina E 401
• PROCEDIMIENTO 4
• Este procedimiento de cromatografía de gases se usa para la determinación de vitamina E como ingrediente farmacéutico activo, como ingrediente de suplemento dietético o como componente de formas farmacéuticas farmacopeicas. Puede usarse para: •Vitamina E • Cápsulas de Vitamina E • Preparación de Vitamina E • A menos que se especifiquen en las monografías individuales, las Soluciones estándar, las Soluciones muestra y las soluciones reactivo se preparan y se usan apropiadamente según se indica a continuación. Solución de estándar interno: 1O mg/mL de escualano en ciclohexano Solución de aptitud del sistema: O, 1 mg/mL de ER Alfa Tocoferol USP y de ER Acetato de Alfa Tocoferilo USP en ciclohexano Solución estándar 1: 1O mg/mL de ER Alfa Tocoferol USP en Solución de estándar interno Solución estándar 2: 1O mg/mL de ER Acetato de Alfa To~oferilo USP en Solución de estándar interno Solución estándar 3: Transferir 30,0 mg de ER Succinato Acido de Alfa Tocoferilo USP a un vial de 20 ml. Agregar 2,0 mL de metano!, 1,0 mL de 2,2-dimetoxipropano y O, 1 mL de ácido clorhídrico al vial. Tapar herméticamente y someter a ultrasonido. Dejar en reposo en la oscuridad durante 1 hora ± 5 minutos. Retirar de la oscuridad, destapar y evaporar justo hasta sequedad en un baño de vapor con ayuda de una corriente de nitrógeno. Agregar 3,0 mL de Solución de estándar interno y mezclar en un mezclador de vórtice hasta disolver. Soluciones muestra para Ingredientes Activos Farmacéuticos Solución muestra 1 (vitamina E como alfa tocoferol o acetato de alfa tocoferilo): 1O mg/mL de Vitamina E (d- o di-alfa tocoferol o acetato de d- o di-alfa tocoferilo) en Solución de estándar interno Solución muestra 2 (vitamina E como succinato ácido de alfa tocoferilo): Transferir 30,0 mg de Vitamina E (succinato ácido de d- o di-alfa tocoferilo) a un vial de 20 ml. Agregar 2,0 mL de metano!, 1,0 mL de 2,2-dimetoxipropano y 0, 1 mL de ácido clorhídrico al vial. Tapar herméticamente y someter a ultrasonido. Dejar en reposo en la oscuridad durante 1 hora ± 5 minutos. Retirar de la oscuridad, destapar y evaporar justo hasta sequedad en un baño de vapor con ayuda de una corriente de nitrógeno. Agregar 3,0 mL de Solución de estándar interno y mezclar en un mezclador de vórtice hasta disolver. Soluciones muestra para Preparaciones de Vitamina E Solución muestra 1 (vitamina E como alfa tocoferol o acetato de alfa tocoferilo en forma líquida): Disolver una porción de Preparación en Solución de estándar interno para preparar una solución de Vitamina E (d- o di-alfa tocoferol o acetato de d- o di-alfa tocoferilo) con una concentración nominal de 1O mg/ml. Solución muestra 2 (vitamina E como succinato ácido de alfa tocoferilo en forma líquida): Transferir una porción de Preparación, equivalente a 30,0 mg de Vitamina E (succinato ácido de d- o di-alfa tocoferilo), a un vial de 20 ml. Agregar 2,0 mL de metano!, 1,0 mL de 2,2-dimetoxipropano y O, 1 mL de ácido clorhídrico al vial. Tapar herméticamente y someter a ultrasonido. Dejar en reposo en la oscuridad durante 1 hora ± 5 minutos. Retirar de la oscuridad, destapar y evaporar justo hasta sequedad en un baño de vapor con ayuda de una corriente de nitrógeno. Agregar 3,0 mL de Solución de estándar interno y mezclar en un mezclador de vórtice hasta disolver. Solución muestra 3 (vitamina E como alfa tocoferol o acetato de alfa tocoferilo en forma sólida): Transferir una porción de Preparación, equivalente a 50 mg de alfa tocoferol o acetato de alfa tocoferilo, a un matraz adecuado para reflujo. Agregar 5 mL de agua y calentar en un baño de agua a 60º durante 1O minutos. Agregar 25 mL de alcohol y someter a reflujo durante 30 minutos. Enfriar y transferir a un separador con ayuda de 50 mL de agua y 50 mL de éter. Agitar vigorosamente, dejar que las capas se separen y recoger cada capa en sendos separadores. Extraer la capa acuosa con dos porciones de 25 mL de éter, combinando los extractos con la capa etérea original. Lavar los extractos combinados con una porción de 25 mL de agua, filtrar las soluciones etéreas a través de 1 g de sulfato de sodio anhidro y, con ayuda de una corriente de nitrógeno, evaporar la solución etérea en un baño de agua controlado a una temperatura que no cause que la solución etérea se derrame por ebullición. Retirar el recipiente del baño de agua cuando queden 5 mL y completar la evaporación sin aplicar calor. Disolver el residuo en Solución de estándar interno para preparar una solución de Vitamina E (d- o di-alfa tocoferol o acetato de d- o di-alfa tocoferilo) con una concentración nominal de 1O mg/ml. Solución muestra 4 (vitamina E como succinato ácido de alfa tocoferilo en forma sólida): Transferir una porción de Preparación, equivalente a 30 mg de Vitamina E (succinato ácido de d- o di-alfa tocoferilo), a un matraz adecuado para reflujo. Agregar 5 mL de agua y calentar en un baño de agua a 60º durante 1O minutos. Agregar 25 mL de alcohol y someter a reflujo durante 30 minutos. Enfriar y transferir a un separador con ayuda de 50 mL de agua y 50 mL de éter. Agitar vigorosamente, dejar que las capas se separen y recoger cada capa en sendos separadores. Extraer la capa acuosa con dos porciones de 25 mL de éter, combinando los extractos con la capa etérea original. Lavar los extractos combinados con una porción de 25 mL de agua, filtrar las soluciones etéreas a través de 1 g de sulfato de sodio anhidro y, con ayuda de una corriente de nitrógeno, evaporar la solución etérea en un baño de agua controlado a una temperatura que no cause que la solución etérea se derrame por ebullición. Retirar el recipiente del baño de agua cuando queden 5 ml. Transferir cuantitativamente el remanente a un vial de 20 mL y completar la evaporación sin aplicar calor. Agregar 2,0 mL de metano!, 1,0 mL de 2,2-dimetoxipropano y O, 1 mL de ácido clorhídrico al vial. Tapar herméticamente y someter a ultrasonido. Dejar en reposo en la oscuridad durante 1 hora ± 5 minutos. Retirar de la oscuridad, destapar y evaporar justo hasta se-
402 (551) Valoración de Vitamina E / Pruebas Químicas
USP 39
quedad en un baño de vapor con ayuda de una corriente de nitrógeno. Agregar 3,0 ml de Solución de estándar interno y mezclar en un mezclador de vórtice hasta disolver. Soluciones muestra para Cápsulas de Vitamina E Solución muestra 1 (vitamina E como alfa tocoferol o acetato de alfa tocoferilo): Pesar no menos de 1 O Cápsulas en un frasco de pesada tarado. Usando una cuchilla afilada u otro medio apropiado, abrir cuidadosamente las Cápsulas, sin perder material de la cubierta, y transferir el contenido combinado de las Cápsulas a un vaso de precipitados de 100 ml. Retirar cualquier sustancia adherida a las Cápsulas vacías lavando con varias porciones pequeñas de n-hexano. Desechar los lavados y dejar que las Cápsulas vacías se sequen en una corriente de aire seco hasta que ya no se perciba olor a nhexano. Pesar las Cápsulas vacías en el frasco de pesada tarado original y calcular el peso neto promedio por Cápsula. Disolver una porción del contenido combinado de las Cápsulas en Solución de estándar interno para preparar una solución de Vitamina E (d- o di-alfa tocoferol o acetato de d- o di-alfa tocoferilo) con una concentración nominal de 1 O mg/ml. Solución muestra 2 (vitamina E como succinato ácido de alfa tocoferilo): Pesar no menos de 1O Cápsulas en un frasco de pesada tarado. Usando una cuchilla afilada u otro medio apropiado, abrir cuidadosamente las Cápsulas, sin perder material de la cubierta, y transferir el contenido combinado de las Cápsulas a un vaso de precipitados de 100 ml. Retirar cualquier sustancia adherida a las Cápsulas vacías lavando con varias porciones pequeñas de n-hexano. Desechar los lavados y dejar que las Cápsulas vacías se sequen en una corriente de aire seco hasta que ya no se perciba olor a n-hexano. Pesar las Cápsulas vacías en el frasco de pesada tarado original y calcular el peso neto promedio por Cápsula. Transferir una porción del contenido combinado de las Cápsulas, equivalente a 30,0 mg de Vitamina E (succinato ácido de d- o di-alfa tocoferilo), a un vial de 20 ml. Agregar 2,0 ml de metano!, 1,0 ml de 2,2-dimetoxipropano y O, 1 ml de ácido clorhídrico al vial. Tapar herméticamente y someter a ultrasonido. Dejar en reposo en la oscuridad durante 1 hora ± 5 minutos. Retirar de la oscuridad, destapar y evaporar justo hasta sequedad en un baño de vapor con ayuda de una corriente de nitrógeno. Agregar 3,0 ml de Solución de estándar interno y mezclar en un mezclador de vórtice hasta disolver. Sistema cromatográfico (Ver Cromatografía (621 >, Aptitud del Sistema.) Modo: Cromatografía de Gases Detector: Ionización a la llama Columna: Capilar de sílice fundida, de 0,25 mm x 30 m; ligada con una película de fase G2 de 0,25 µm Temperaturas Columna: 280º Inyector: 290º Detector: 290º Gas transportador: Helio Velocidad de flujo: 1 ml/min Relación de partición: 100:1 Volumen de inyección: 1 µL Aptitud del sistema Muestras: Solución de aptitud del sistema y Solución estándar apropiada Requisitos de aptitud Resolución: No menos de 3,5 entre alfa tocoferol y acetato de alfa tocoferilo, Solución de aptitud del sistema Desviación estándar relativa: No más de 2,0% para los cocientes entre las respuestas de los picos de la forma de vitamina E pertinente y el estándar interno en inyecciones repetidas, Solución estándar apropriada Análisis Muestras: Solución estándar y Solución muestra apropiadas Calcular el porcentaje de vitamina E en términos de alfa tocoferol, acetato de alfa tocoferilo o succinato ácido de alfa tocoferilo en la porción de la muestra tomada: Resultado= (Ruf R5) x (C5/Cu) x 100 Ru R5
C5 Cu
=cociente de respuesta entre los picos de la forma de vitamina E pertinente y estándar interno de la Solución muestra apropiada = cociente de respuesta entre los picos de la forma de vitamina E pertinente y estándar interno de la Solución estándar apropiada =concentración del Estándar de Referencia USP correspondiente en la Solución estándar apropiada (mg/ml) =concentración nominal de la forma de vitamina E correspondiente en la Solución muestra apropiada (mg/ml)
• PROCEDIMIENTO 5
•Este procedimiento de cromatografía de gases se usa para la determinación de Vitamina E (como d- o di-alfa tocoferol) en: • Succinato de Vitamina E y Polietilenglicol (Succinato de vitamina E y polietilenglicol es una mezcla que se forma mediante la esterificación de succinato ácido de d-alfa tocoferilo y polietilenglicol). •A menos que se especifiquen en las monografías individuales, las Soluciones estándar, las Soluciones muestra y las soluciones reactivo se preparan según se indica a continuación. Disolvente: 0,25 ml de fenolftaleína SR en 1 L de alcohol
Pruebas Químicas/ (551) Valoración de Vitamina E 403
USP 39
Solución de estándar interno: 12 mg/ml de araquidato de etilo en isooctano Solución estándar: Transferir 32,5 mg de ER Alfa Tocoferol USP a un matraz de reacción adecuado. Agregar 2 ml de piridina y 0,5 ml de N,0-bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida con trimetilclorosilano al 1%, y calentar el matraz a 100º durante 1O minutos. Enfriar el matraz, agregar 5,0 ml de Solución de estándar interno seguido de 20 ml de isooctano y agitar. Solución muestra: Transferir una cantidad equivalente a O, 100-0, 160 g de Succinato de Vitamina E y Polietilenglicol fundido a 60º a un tubo de cultivo (de aproximadamente 20 cm de longitud y 2,5 cm de diámetro) equipado con un tapón de rosca. Agregar 40-50 mg de ácido ascórbico y unas pocas perlas de ebullición, seguido de 20 ml de Disolvente. [NOTA-Someter la solución a reflujo suavemente sin que se produzca emisión del contenido. Colocar el tubo en un bloque de calentamiento ajustado a 100º-150º.] Cuando la muestra se disuelva por completo, agregar 0,25 g de hidróxido de potasio y continuar sometiendo a reflujo durante 30 minutos. Retirar el tubo del calor y, mientras el contenido esté caliente, agregar 1-2 ml de ácido clorhídrico, gota a gota, hasta que la coloración rosada desaparezca. [PRECAUCIÓN-Reacción exotérmica. Dejar que el ácido se deslice poco a poco dentro del tubo para evitar salpicaduras.] Enfriar el tubo, luego lavar las paredes del tubo con 20 ml de agua. Agregar 5,0 ml de Solución de estándar interno, tapar y agitar para asegurar un mezclado minucioso. Dejar el tubo en reposo hasta que se formen dos capas diferenciadas. Transferir 2,5-3,5 ml de la capa superior a un matraz de reacción adecuado y agregar 2,0 ml de piridina seguida de 2,5 ml de N,0-bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida con trimetilclorosilano al 1%. Calentar el matraz a 100º durante 1O minutos. Enfriar y luego agregar 12 ml de isooctano. Sistema cromatográfico (Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.) Modo: Cromatografía de Gases Detector: Ionización a la llama Columna: Capilar de sílice fundida, de 0,25 mm x 15 m; ligada con una película de fase G27 de 0,25 µm Temperaturas Inyector: 280º Detector: 345º Columna: Ver la Tabla 1. Tabla 1
Temperatura Inicial (º)
Rampa de Temperatura (°/mln)
Temperatura Fin al (º)
Tiempo de Espera (Hold Time) a la Temperatura Final (mln)
260
20
340
1
Gas transportador: Helio Velocidad de flujo: 1,5 ml/min Relación de partición: 200:1 Volumen de inyección: 1 µL Aptitud del sistema Muestra: Solución estándar Requisitos de aptitud Factor de asimetría: No más de 2,0 para el pico de alfa tocoferol Desviación estándar relativa: No más de 2,0% para el cociente entre las respuestas de los picos de alfa tocoferol y el estándar interno en inyecciones repetidas Análisis Muestras: Solución estándar y Solución muestra Calcular el porcentaje de vitamina E como d-alfa tocoferol en la porción de la muestra tomada: Resultado= (Ruf R5) x (W5/Wu) x 100
Ru R5 W5 Wu
= = = =
cociente de respuesta entre los picos de alfa tocoferol y estándar interno de la Solución muestra cociente de respuesta entre los picos de alfa tocoferol y estándar interno de la Solución estándar peso de ER Alfa Tocoferol USP usado para preparar la Solución estándar (mg) peso de Succinato de Vitamina E y Polietilenglicol tomado para preparar la Solución muestra (mg)
REQUISITOS ADICIONALES • ESTÁNDARES DE REFERENCIA USP (11) ER Alfa Tocoferol USP ER Acetato de Alfa Tocoferilo USP ER Succinato Ácido de Alfa Tocoferilo USP ER Ergocalciferol USP
404 (561) Artículos de Origen Botánico/ Pruebas Químicas
USP 39
(561) ARTÍCULOS DE ORIGEN BOTÁNICO MUESTREO Con el fin de reducir el efecto de la desviación sistemática de muestreo en los resultados cualitativos y cuantitativos, es necesario asegurar que la composición de la muestra usada sea representativa de la partida de material que está siendo examinada. Los procedimientos de muestreo siguientes son el mínimo que se considera aplicable a artículos de origen vegetal. Algunos artículos o algunas pruebas pueden requerir procedimientos más rigurosos que involucren el muestreo de más envases o de más muestras por envase.
Muestra Bruta Cuando el examen externo de envases, marcas y etiquetas indica que la partida se puede considerar homogénea, tomar muestras individuales del número de envases seleccionados de forma aleatoria que se indica a continuación. Cuando la partida no se puede considerar homogénea, dividirla en subpartidas que sean tan homogéneas como sea posible y, a continuación, muestrear cada una como una partida homogénea. Cuando el número de envases en la partida (N) es 11 o más y cada envase de la partida está marcado en orden con un número o una letra, se recomienda incluir muestras de los envases primero, intermedio y último. Nº de Envases en la Partida (N)
Nº de Envases que Deben Ser Muestreados (n)
1-1 o
Todos
11-19
11
>19
n = 1 O + (N/1 O)
(Redondear "n" al siguiente número entero más alto.) Las muestras se toman de las secciones superior, media e inferior de cada envase. Si el material sin procesar está formado por partes componentes que tienen 1 cm o menos en cualquier dimensión, y en el caso de todos los materiales molidos o en polvo, retirar la muestra por medio de un dispositivo de muestreo que quite un centro de la parte superior a la inferior del envase, tomando no menos de dos centros desde ángulos diferentes. Para materiales con partes componentes de más de 1 cm en cualquier dimensión, retirar las muestras manualmente. En el caso de fardos o paquetes grandes, las muestras se deben tomar a una profundidad de 1O cm porque el contenido de humedad de la capa superficial puede ser diferente del de las capas interiores. Preparar la muestra bruta combinando y mezclando las muestras individuales tomadas de cada envase abierto, teniendo cuidado de no aumentar el grado de fragmentación ni de afectar significativamente el contenido de humedad. Para artículos en envases que contienen menos de 1 kg, mezclar el contenido y retirar una cantidad suficiente para las pruebas. Para artículos en envases que contienen entre 1 y 5 kg, retirar porciones iguales de la parte superior, media e inferior del envase, de modo que cada una de las muestras sea suficiente para realizar las pruebas. Mezclar meticulosamente las muestras y retirar una cantidad suficiente para realizar las pruebas. Para envases que contienen más de 5 kg, retirar tres muestras, de modo que cada una pese no menos de 250 g, de la parte superior, media e inferior del envase. Mezclar minuciosamente las muestras y retirar una porción suficiente para realizar las pruebas.
Muestra de Laboratorio Preparar la Muestra de Laboratorio por cuarteo repetido de la muestra bruta. NOTA-La reducción de muestra por cuarteo consiste en la distribución pareja de la muestra, adecuadamente mezclada, en la forma de un cuadrado, y la posterior división por las diagonales en cuatro partes iguales. Luego se toman las dos partes opuestas y se mezclan cuidadosamente. El proceso se repite según sea necesario hasta obtener la cantidad requerida. La Muestra de Laboratorio debe ser de un tamaño suficiente como para realizar todas las pruebas necesarias.
Muestra de Prueba A menos que se indique algo diferente en la monografía individual o en el procedimiento de prueba siguiente, preparar la Muestra de Prueba según se indica a continuación. Reducir por cuarteo el tamaño de la Muestra de Laboratorio, teniendo cuidado de que cada una de las porciones retiradas
continúe siendo representativa. En el caso de artículos sin moler o que no se presentan en polvo, moler la muestra tomada de modo que pase a través de un tamiz de malla estándar Nº 20 y mezclar bien el polvo resultante. Si el material no se puede moler, reducirlo a un estado tan fino como sea posible, mezclarlo haciéndolo rodar sobre un papel o paño de muestreo, extenderlo hasta formar una capa delgada y retirar la porción para analizar.
USP 39
Pruebas Químicas/ (561) Artículos de Origen Botánico 405
MÉTODOS DE ANÁLISIS Materia Orgánica Extraña MUESTRA DE PRUEBA A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, pesar las cantidades siguientes de la Muestra de Laboratorio, teniendo cuidado de que la porción tomada sea representativa (reducir la muestra por cuarteo si fuera necesario). Raíces, rizomas, corteza y hierbas
500 g
Hojas, flores, semillas y frutos
250 g
Cortar los fármacos vegetales (el peso promedio de las piezas es menos de 0,5 g)
50 g
Extender la muestra hasta formar una capa delgada y separar a mano la materia orgánica extraña tanto como sea posible. Pesar y determinar el porcentaje de materia orgánica extraña en el peso del artículo tomado.
Cenizas Totales Pesar con exactitud, en un crisol tarado, una cantidad de la Muestra de Prueba, que represente 2-4 g del material secado al aire e incinerar, suavemente al principio, y aumentar gradualmente la temperatura a 675 ± 25º, hasta que no quede carbón y determinar el peso de la ceniza. Si de esta forma no se puede obtener ceniza sin carbón, extraer la masa carbonizada con agua caliente, recoger el residuo insoluble en un papel de filtro exento de ceniza, incinerar el residuo y el papel de filtro hasta que la ceniza quede blanca o casi blanca, luego agregar el filtrado, evaporar hasta sequedad y calentar todo a una temperatura de 675 ± 25º. Si de esta forma no se puede obtener ceniza sin carbón, enfriar el crisol, agregar 15 ml de alcohol, deshacer la ceniza con una varilla de vidrio, quemar el alcohol y volver a calentar todo a una temperatura de 675 ± 25º. Enfriar en un desecador, pesar la ceniza y calcular el porcentaje de ceniza total con referencia al peso del artículo tomado.
Cenizas Insolubles en Ácido Calentar a ebullición la ceniza obtenida según se indica anteriormente en Cenizas Totales con 25 ml de ácido clorhídrico 3 N durante 5 minutos, recoger la materia insoluble en un crisol de filtrado tarado o un filtro exento de ceniza, lavar con agua caliente, incinerar y pesar. Determinar el porcentaje de ceniza insoluble en ácido calculada con referencia al peso del artículo tomado.
Cenizas Solubles en Agua Calentar a ebullición la ceniza obtenida según se indica en Cenizas Totales con 25 ml de agua durante 5 minutos. Recoger la materia insoluble en un crisol de vidrio sinterizado o sobre un papel de filtro exento de ceniza. Lavar con agua caliente e incinerar durante 15 minutos a una temperatura que no exceda de 450º. Restar el peso de este residuo, en mg, obtenido en Cenizas Totales, y calcular el porcentaje de ceniza soluble en agua con referencia al peso de la muestra según se determinó en
Cenizas Totales. Extractos Solubles en Alcohol MÉTODO 1 (MÉTODO DE EXTRACCIÓN EN CALIENTE) Transferir aproximadamente 4 g, pesados con exactitud, de material en polvo grueso secado al aire a un matraz Erlenmeyer con tapón de vidrio. Agregar 100 ml de alcohol y pesar el matraz. Agitar y dejar en reposo durante 1 hora. Acoplar un condensador de reflujo al matraz y calentar a ebullición suave durante 1 hora, enfriar y pesar. Volver a ajustar al peso original con alcohol. Agitar y filtrar rápidamente a través de un filtro seco. Transferir 25 ml del filtrado a una cápsula tarada de fondo plano y evaporar en un baño de agua hasta sequedad. Secar a 105º durante 6 horas, enfriar en un desecador durante 30 minutos y pesar sin demora. Calcular el contenido, en mg/g, de materia extraíble en alcohol en la muestra de prueba. MÉTODO 2 (MÉTODO DE EXTRACCIÓN EN FRÍO)) Transferir aproximadamente 4 g, pesados con exactitud, de material en polvo grueso secado al aire a un matraz Erlenmeyer con tapón de vidrio. Agregar 100 ml de alcohol, tapar el matraz y macerar durante 24 horas, agitando frecuentemente durante las primeras 8 horas y, a continuación, dejar en reposo. Filtrar rápidamente, procurando no perder alcohol. Evaporar 25 ml del filtrado hasta sequedad en una cápsula tarada, poco profunda y de fondo plano, y secar a 105º hasta peso constante. Calcular el contenido, en mg/g, de materia extraíble en alcohol en la muestra de prueba.
406 (561) Artículos de Origen Botánico/ Pruebas Químicas
USP 39
Extractos Solubles en Agua MÉTODO 1 (MÉTODO DE EXTRACCIÓN EN CALIENTE) Proceder según se indica en el Método 7 (Método de Extracción en Caliente) en Extractos Solubles en Alcohol, excepto que se debe usar agua en lugar de alcohol. MÉTODO 2 (MÉTODO DE EXTRACCIÓN EN FRÍO) Proceder según se indica en el Método 2 (método de extracción en frío) en Extractos Solubles en Alcohol, excepto que se debe usar agua en lugar de alcohol.
Fibra Cruda Agotar una cantidad pesada de la Muestra de Prueba, que represente aproximadamente 2 g del artículo, con éter. Agregar 200 mL de ácido sulfúrico diluido en ebullición (1 en 78) al residuo agotado con éter, en un matraz de 500 mL, y conectar el matraz a un condensador de reflujo. Calentar a reflujo la mezcla durante 30 minutos, cronometrados con exactitud, luego pasar a través de un filtro de tela o papel endurecido y lavar el residuo en el filtro con agua hirviendo hasta que el lavado efluente ya no sea ácido. Volver a colocar el residuo en el matraz enjuagando con 200 mL de solución de hidróxido de sodio en ebullición, ajustada a 1,25% por valoración volumétrica y sin carbonato de sodio. Someter a reflujo nuevamente la mezcla durante 30 minutos, cronometrados con exactitud, y luego, pasar rápidamente a través de un filtro tarado, lavar el residuo con agua hirviendo hasta que el último lavado sea neutro y secar a 11 Oº hasta peso constante. Incinerar el residuo seco hasta peso constante, enfriar en un desecador y pesar la ceniza: la diferencia entre el peso obtenido mediante el secado a 11 Oº y el de la ceniza representa el peso de fibra cruda. NOTA-La ebullición con ácido y álcali debe continuar durante 30 minutos, cronometrados con exactitud, desde el momento en que el líquido (que se enfría por debajo del punto de ebullición al agregarlo al matraz frío) vuelve a alcanzar su punto de ebullición. Después de llevar la solución al punto de ebullición, se debe disminuir el calor lo suficiente como para mantener la ebullición. Durante la ebullición, el matraz se debe rotar suavemente a intervalos regulares para reincorporar a la solución toda partícula que pueda adherirse a las paredes del matraz. Una corriente de aire suave introducida en el matraz durante la operación de ebullición ayuda a evitar la formación excesiva de espuma.
Contenido de Almidón MÉTODO 1 El siguiente es un procedimiento general para todos los azúcares reductores y se puede utilizar para determinar el contenido de almidón en artículos botánicos. Extracto de Malta: Usar malta de cebada nueva, limpia y de eficacia conocida y moler inmediatamente antes de usar. Preparar el extracto de malta inmediatamente antes de usar. Por cada 80 mL de extracto de malta que se necesiten, digerir 5 g de malta molida con 100 mL de agua a temperatura ambiente durante 2 horas. [NOTA-Si se usa un mezclador eléctrico, mezclar durante 20 minutos.] Filtrar para obtener un extracto transparente, volver a filtrar, si fuera necesario, y mezclar bien la infusión. Solución de prueba: Extraer aproximadamente 5 g de la muestra de prueba finamente molida con cinco porciones de 1O mL de éter, usando un filtro que retenga completamente el gránulo de almidón más pequeño. Dejar evaporar el éter del residuo y lavar con 250 mL de solución de alcohol acuosa (1 O en 100). Lavar cuidadosamente el residuo del papel y verterlo en un vaso de precipitados de 500 mL con aproximadamente 100 mL de agua. Calentar aproximadamente a 60º (evitando, si es posible, gelatinizar el almidón) y dejar en reposo durante aproximadamente 1 hora, mezclando frecuentemente para lograr una disolución completa de los azúcares. Transferir a un frasco de boca ancha, enjuagar el vaso de precipitados con un poco de agua tibia y enfriar. Agregar un volumen equivalente de alcohol, mezclar y dejar en reposo durante no menos de 1 hora. Centrifugar hasta que el precipitado quede bien compacto en el fondo del frasco y decantar el sobrenadante. Lavar el precipitado con porciones sucesivas de 50 mL de solución de alcohol (50 en 100) centrifugando y decantando a través de un filtro adecuado hasta que los lavados estén exentos de azúcar. [NOTA-Para comprobar la presencia de azúcar, transferir unas gotas de los lavados a un tubo de ensayo y agregar 3 ó 4 gotas de una solución de 1-naftol en alcohol al 20%, preparada por disolución de 200 mg de 1-naftol en 1 mL de alcohol y 2 mL de agua. Agitar bien el tubo de ensayo para que la mezcla quede uniforme, dejar fluir entre 2-4 mL de ácido sulfúrico por las paredes del tubo de ensayo y sostener el tubo de ensayo en posición vertical. Si hay presencia de azúcar, la interfase de los dos líquidos pasa de color violeta claro a violeta oscuro, y al agitar toda la solución se torna violeta azulado.] Transferir el residuo del frasco y del filtro endurecido a un vaso de precipitados con aproximadamente 50 mL de agua. Sumergir el vaso de precipitados en agua hirviendo y mezclar constantemente durante 15 minutos o hasta que se gelatinice todo el almidón. Enfriar el vaso de precipitados a 55º, agregar 20 mL de Extracto de Malta y mantener a esta temperatura durante 1
USP 39
Pruebas Químicas/ (561) Artículos de Origen Botánico 407
hora. Volver a calentar a ebullición durante algunos minutos, enfriar a 55º, agregar 20 mL de Extracto de Malta y mantener a esta temperatura durante 1 hora o hasta que el residuo, cuando se trata con yodo SR, no muestre un matiz azulado en el examen microscópico. Enfriar, diluir con agua hasta 250 mL y filtrar. Procedimiento general: Transferir 200 mL de la Solución de prueba a un matraz equipado con un condensador de reflujo, agregar 20 mL de ácido clorhídrico y calentar en un baño de agua hirviendo durante 2 1/2 horas. Enfriar, llevar a pH casi neutro con hidróxido de sodio SR, completar la neutralización con carbonato de sodio SR, diluir con agua hasta 500 mL, mezclar y filtrar. El volumen de la alícuota tomada depende del contenido de almidón de la muestra en análisis (ver la Tabla 1). La alícuota debería contener entre 100 y 200 mg de dextrosa. Transferir 50 mL del filtrado a un vaso de precipitados de vidrio de 400 mL resistente a los álcalis, agregar 50 mL de tartrato cúprico alcalino SR, cubrir el vaso de precipitados con un vidrio de reloj y calentar. Ajustar la llama del quemador para que el contenido del matraz comience a hervir en 4 minutos y continuar la ebullición durante 2 minutos exactos. Filtrar la solución caliente de inmediato a través de un filtro de vidrio sinterizado. Lavar minuciosamente el precipitado de óxido cuproso con agua aproximadamente a 60º, luego con 1O mL de alcohol y finalmente con 1O mL de éter. Tabla 1. Determinación de la Alícuota Óptima Contenido de Almidón Esperado (%)
Alícuota (mL}
60
25
50
35
40
50
30
50
20
50
Para soluciones de azúcares reductores de relativamente alta pureza, proceder según se indica en el Método 1A para determinar la cantidad de cobre reducido obtenido pesando el óxido cuproso seco. Para soluciones de azúcares reductores que contienen grandes cantidades de impurezas orgánicas, incluida sacarosa, proceder según se indica en el Método 1B para determinar la cantidad de cobre reducido obtenido por valoración volumétrica con tiosulfato de sodio. Método 1A-Secar el precipitado obtenido en el Procedimiento General en un horno durante 30 minutos a 11 O± 2º, enfriar a temperatura ambiente en un desecador y pesar. Consultar la Tabla 2 para obtener la cantidad de dextrosa, en mg, correspondiente al peso del óxido cuproso hallado. Determinar el porcentaje de dextrosa y, luego, el contenido de almidón por la siguiente fórmula: Porcentaje de dextrosa = (peso de dextrosa en mg x O, 1 x 500)/(peso de la muestra en g x alícuota en mL) Contenido de almidón=% de dextrosa x 0,9 Tabla 2. Cálculo de Dextrosa (Aplicable cuando se pesa directamente Cu 2 0) (Expresado en mg) Dextrosa (D-Glucosa)
Óxido Cu proso (Cu 2 0)
Dextrosa (D-Glucosa)
Óxido Cu proso (Cu 2 0)
Dextrosa (o-Glucosa)
Óxido Cu proso (Cu 2 0)
Dextrosa (D-Glucosa)
10
4,0
90
38,9
170
75,l
250
112,8
330
12
4,9
92
39,8
172
76,0
252
113,7
332
14
5,7
94
40,6
174
76,9
254
114,7
334
16
6,6
96
41,5
176
77,8
256
115,7
18
7,5
98
42,4
178
78,8
258
116,6
20
8,3
100
43,3
180
79,7
260
117,6
340
157,3
420
199,0
22
9,2
102
44,2
182
80,6
262
118,6
342
158,3
422
200,1
24
10,0
104
45,1
184
81,5
264
119,5
344
159,3
424
201,l
26
10,9
106
46,0
186
82,5
266
120,5
346
160,3
426
202,2
28
11,8
108
46,9
188
83,4
268
121,5
348
161,4
428
203,3
30
12,6
110
47,8
190
84,3
270
122,5
350
162,4
430
204,4
32
13,5
112
48,7
192
85,3
272
123,4
352
163,4
432
205,5
34
14,3
114
49,6
194
86,2
274
124,4
354
164,4
434
206,5
36
15,2
116
50,5
196
87,1
276
125,4
356
165,4
436
207,6
38
16,1
118
51,4
198
88,1
278
126,4
358
166,5
438
208,7
40
16,9
120
52,3
200
89,0
280
127,3
360
167,5
440
209,8
Óxido Cu proso (Cu 2 0)
Óxido Cu proso (Cu 2 0)
Dextrosa (o-Glucosa)
Óxido Cu proso (Cu 2 0)
Dextrosa (D-Glucosa)
152,2
410
193,7
153,2
412
194,7
154,2
414
195,8
336
155,2
416
196,8
338
156,3
418
197,9
USP 39
408 (561) Artículos de Origen Botánico/ Pruebas Químicas
,,.
Tabla 2 Cálculo de Dextrosa (Aplicable cuando se pesa directamente Cu O) (Expresado en mg) (Continuación) Óxido Cu proso (Cu 2 0)
Dextrosa (o-Glucosa)
Óxido Cu proso (Cu 2 0)
Dextrosa (o-Glucosa)
Óxido Cu proso (Cu,O)
42
17,8
122
53,2
44
18,7
124
54,1
46
19,6
126
48
20,4
Óxido Cu proso (Cu 7 0)
Dextrosa (o-Glucosa)
168,5
442
210,9
169,6
444
212,0
170,6
446
213,1
368
171,6
448
214,1 215,2
Óxido Cu proso (Cu,O)
Dextrosa (o-Glucosa)
Óxido Cu proso (Cu,O)
Dextrosa (o-Glucosa)
202
89,9
282
128,3
362
204
90,9
284
129,3
364
55,0
206
91,8
286
130,3
366
128
55,9
208
92,8
288
131,3
Dextrosa (o-Glucosa)
50
21,3
130
56,8
210
93,7
290
132,3
370
172,7
450
52
22,2
132
57,7
212
94,6
292
133,2
372
173,7
452
216,3
54
23,0
134
58,6
214
95,6
294
134,2
374
174,7
454
217,4
56
23,9
136
59,5
216
96,5
296
135,2
376
175,8
456
218,5
58
24,8
138
60,4
218
97,5
298
136,2
378
176,8
458
219,6
140
61,3
220
98,4
300
137,2
380
177,9
460
220,7
302
138,2
382
178,9
462
221,8
60
25,6
62
26,5
142
62,2
222
99,4
64
27,4
144
63,1
224
100,3
304
139,2
384
180,0
464
222,9
66
28,3
146
64,0
226
101,3
306
140,2
386
181,0
466
224,0
68
29,2
148
65,0
228
102,2
308
141,2
388
182,0
468
225,1
70
30,0
150
65,9
230
103,2
310
142,2
390
183,1
470
226,2
72
30,9
152
66,8
232
104,1
312
143,2
392
184,1
472
227,4
74
31,8
154
67,7
234
105,1
314
144,2
394
185,2
474
228,3
76
32,7
156
68,6
236
106,0
316
145,2
396
186,2
476
229,6
78
33,6
158
69,5
238
107,0
318
146,2
398
187,3
478
230,7
80
34,4
160
70,4
240
108,0
320
147,2
400
188,4
480
231,8
82
35,3
162
71,4
242
108,9
322
148,2
402
189,4
482
232,9
84
36,2
164
72,3
244
109,9
324
149,2
404
190,5
484
234,1
86
37, 1
166
73,2
246
110,8
326
150,2
406
191,5
486
235,2
88
38,0
168
74,1
248
111,8
328
151,2
408
192,6
488
236,3
Método 78 SOLUCIÓN DE TIOSULFATO DE sorno: Transferir 3,9 g de tiosulfato de sodio, pesados con exactitud, a un matraz volumétrico de 100 ml, disolver y diluir a volumen con agua y mezclar. SOLUCIÓN DE YODURO DE POTASIO: Disolver 42 g de yoduro de potasio en 100 ml de agua. SOLUCIÓN DE ACETATO DE SODIO: Disolver 5,74 g de acetato de sodio en 1O ml de agua. SOLUCIÓN DE COBRE: Transferir aproximadamente 0,3 g de cobre electrolítico puro, pesados con exactitud, a un matraz de 250 ml, agregar 5 ml de ácido nítrico para disolver el cobre, agregar aproximadamente 25 ml de agua y calentar a ebullición para expulsar humos rojos. Agregar aproximadamente 5 ml de bromo SR y calentar a ebullición hasta eliminar completamente el bromo. Enfriar, agregar 1O ml de Solución de acetato de sodio seguidos de 1O ml de Solución de yoduro de potasio y valorar con la Solución de tiosulfato de sodio hasta obtener un color amarillo claro. Agregar suficiente almidón SR para producir un marcado color azul y continuar con la valoración. A medida que se aproxima el punto final, agregar 2 g de tiocianato de potasio y mezclar hasta disolver completamente. Continuar la valoración hasta que el precipitado quede totalmente blanco. Un ml de Solución de tiosulfato de sodio equivale aproximadamente a 1 O mg de cobre. [NOTA-Es esencial que la concentración de la Solución de yoduro de potasio se regule cuidadosamente. Si la solución contiene menos de 320 mg de cobre al finalizar la volumetría, agregar 4,2-5 g de yoduro de potasio para obtener una solución total de 100 ml. Si hay presentes cantidades mayores de cobre, agregar lentamente Solución de yoduro de potasio desde una bureta con agitación constante en cantidades proporcionalmente mayores.] PROCEDIMIENTO: Lavar con agua el precipitado de óxido cuproso obtenido en el Procedimiento general, cubrir este filtro con un vidrio de reloj y disolver el óxido cuproso con 5 ml de ácido nítrico vertidos con una pipeta por debajo del vidrio de reloj. Recoger el filtrado en un matraz de 250 ml, lavar el vidrio de reloj y el filtro con agua. Recoger todos los lavados en el matraz. Calentar a ebullición el contenido del matraz para expulsar humos rojos. Agregar aproximadamente 5 ml de bromo SR y calentar a ebullición hasta eliminar completamente el bromo. Enfriar y proceder según se indica en Solución de cobre comenzando donde dice "agregar 1O ml de Solución de acetato de sodio". A partir del volumen de Solución de tiosulfato de sodio consumido, obtener el peso de cobre, en mg, multiplicándolo por 1, 1259 para obtener el peso, en mg, de óxido cuproso. Basándo-
USP 39
Pruebas Químicas/ (561) Artículos de Origen Botánico 409
se en la Tabla 2, obtener la cantidad de dextrosa, en mg, correspondiente al peso de óxido cuproso. El contenido de almidón equivale al peso, en mg, de dextrosa obtenida multiplicado por 0,9. Realizar una determinación con un blanco usando 50 ml de tartrato cúprico alcalino SR y 50 ml de Extracto de malta. Si el peso del óxido cuproso así obtenido excede 0,5 mg, corregir el resultado de la determinación de forma adecuada. [NOTA-El tartrato cúprico alcalino SR se deteriora en reposo y la cantidad de óxido cuproso obtenida en la determinación con un blanco aumenta.] MÉTODO 2
El método siguiente es específico para la dextrosa (glucosa) y, dado que es extremadamente sensible, puede explicar las diferencias detectadas entre valores obtenidos a partir de una misma muestra. Las determinaciones duplicadas no varían en más de 2%. Solución de glucoamilasa: Preparar una solución de glucoamilasa en agua que contenga 30 Unidades Internacionales (Ul)/ml. Usar glucoamilasa obtenida preferentemente de Rhizopus delemar. El total de actividad de glucoamilasa en la muestra de prueba utilizada debe ser no menos de 150 UI. Solución amortiguadora de acetato: Disolver 16,4 g de acetato de sodio en 100 ml de agua, agregar 12,0 ml de ácido acético glacial y mezclar. El pH de esta solución es 4,8. Solución amortiguadora de fosfato: Disolver 3,63 g de tris (hidroximetil) aminometano y 5,0 g de fosfato monobásico de sodio en 50,0 ml de agua. Ajustar con ácido fosfórico a un pH de 7,0 a una temperatura de 37º, diluir con agua hasta 100,0 ml y mezclar. [NOTA-El pH del medio de la solución amortiguadora es sensible a la temperatura y se debe ajustar al pH deseado a la temperatura que se utilizará durante la incubación.] Solución enzimática: Disolver 30 mg de glucosa oxidasa (Tipo 11 de Aspergillus niger), 3 mg de peroxidasa (Tipo 1 de rábano picante) y 1 O mg de ferrocianuro de potasio en 100 ml de Solución amortiguadora de fosfato. [NOTA-Esta mezcla se puede almacenar en un refrigerador durante un período de hasta 1 O días.] Ácido sulfúrico 18 N: Agregar lentamente, mezclando, 54 ml de ácido sulfúrico a 102 ml de agua, dejar que se enfríe a 25º y mezclar. Soluciones estándar: Disolver una cantidad pesada con exactitud de ER Dextrosa USP en agua para obtener una solución que contenga 1,0 mg de ER Dextrosa USP por ml. Diluir cuantitativamente un volumen conocido de esta solución en agua para obtener las Soluciones Estándares A, B, C, D y E, con concentraciones conocidas de 1 O, 20, 25, 40 y 50 µg/ml de ER Dextrosa USP, respectivamente. [NOTA-Esperar 4 horas para que termine la mutarrotación antes de usar.] Soluciones de prueba: Extraer aproximadamente 5 g de muestra de prueba finamente molida con cinco porciones de 25 ml de alcohol al 80% y filtrar. Eliminar todo el alcohol del residuo mediante secado en un horno de aire a 105º durante aproximadamente 8 horas. [NOTA 1-Cualquier traza de alcohol que quede en el residuo inhibirá la glucoamilasa.] Enfriar y transferir el matraz que contiene la muestra de prueba seca a un desecador. Transferir aproximadamente 1 g de la muestra de prueba, pesado con exactitud, a un matraz previamente tarado, agregar 25 ml de agua y ajustar con ácido fosfórico a un pH entre 5,0-7,0; si fuera necesario. Calentar a ebullición la suspensión durante aproximadamente 3 minutos, transferir el matraz a un autoclave y calentar a 135º durante 2 horas. Retirar el matraz del autoclave, mantener la temperatura próxima a 55º y agregar 2,5 ml de Solución amortiguadora de acetato y agua suficiente para ajustar el peso total de la solución a 45 ± 1 g. Sumergir el matraz en un baño de agua mantenido a 55 ± 1 ºy agregar 5 ml de Solución de glucoamilasa. Agitar el matraz por rotación suave y de forma continua durante 2 horas para lograr la hidrólisis, pasar a través de un papel de filtro a un matraz volumétrico de 250 ml, lavar cuantitativamente con agua y recoger todos los lavados en el matraz. Diluir el contenido del matraz con agua a volumen y mezclar. Transferir 1 ml de una alícuota que contenga entre 20-60 µg de o-glucosa a cada uno de cinco tubos de ensayo. [NOTA 2-Para obtener el intervalo de concentración de glucosa en el hidrolizado, diluir cuantitativamente con agua a volumen, si fuera necesario.] Agregar 2 ml de Solución Enzimática a cada uno de los cinco tubos de ensayo y colocarlos en la oscuridad a 37 ± 1 ºdurante exactamente 30 minutos para que se forme el color. Una vez transcurridos los 30 minutos, agregar 2 ml de Ácido sulfúrico 78 Na cada uno de los tubos de ensayo para detener la reacción y mezclar. Solución control: Transferir una cantidad pesada con exactitud de aproximadamente 0,4 g de almidón a un matraz tarado previamente y proceder según se indica en Soluciones de prueba, comenzando donde dice "agregar 25 ml de agua y ajustar el pH con ácido fosfórico". Procedimiento: Determinar concomitantemente las absorbancias de las Soluciones estándar y las Soluciones de prueba a la longitud de onda de absorbancia máxima aproximadamente a 540 nm, con un espectrofotómetro apropiado, utilizando la Solución control como blanco para ajustar el instrumento. Graficar los valores de absorbancia de las Soluciones estándar en función de la concentración, en µg/ml, de dextrosa, y trazar la línea recta que mejor se ajuste a los cinco puntos graficados. A partir de la gráfica así obtenida, determinar la concentración, C, en µg/ml, de dextrosa en cada una de las Soluciones de Prueba y calcular la concentración promedio, en µg/ml, de la solución en análisis. El porcentaje del contenido de almidón en el peso de la muestra de prueba tomada se calcula por la fórmula: (0,9C/l 0 6 )(V7)(250/Va)(l 00/E)(l 00/W) = 2,25CV7/VaEW en donde E es el peso, en g, de la muestra de prueba tomada; Va es el volumen, en ml, de la alícuota tomada del matraz volumétrico de 250 ml; W es el porcentaje de peso en seco de la muestra de prueba; y V7 es el volumen, en ml, si se realiza una dilución adicional (ver Nota 2 en Soluciones de prueba). [NOTA-Va es 1,0 cuando no se realiza ninguna dilución adicional.]
USP 39
410 (561) Artículos de Origen Botánico/ Pruebas Químicas
Determinación de Aceite Volátil Colocar un matraz de 1 L de fondo redondo y cuello corto en un manto de calentamiento sobre un mezclador magnético. Introducir en el matraz una barra de agitación magnética de forma ovoide y acoplar un condensador de camisa fría por agua y una trampa para aceite volátil apropiada del tipo que se ilustra (ver la Figura 7).
Graduado: 0,1 mL -
Graduado -
0,1 ml
Para aceites más livianos que el agua
Para aceites más pesados que el agua
Figura 1. Trampas para Aceite Volátil Triturar en granos gruesos una cantidad suficiente del artículo para producir entre 1 y 3 mL de aceite volátil. Normalmente no es necesario triturar semillas, frutos pequeños u hojas quebradas de hierbas. Se deben evitar los polvos muy finos. Si esto no fuera posible, puede que sea necesario mezclarlos con serrín purificado o arena purificada. Colocar una cantidad adecuada del artículo, pesada con exactitud, en un matraz y llenarlo con agua hasta la mitad. Acoplar el condensador y el separador adecuado. Calentar a ebullición el contenido del matraz, con una cantidad adecuada de calor para mantener una ebullición suave durante 2 horas, o hasta que el aceite volátil se haya separado completamente del artículo y ya no se recoja en el tubo graduado del separador. Si se ha obtenido una cantidad adecuada de aceite volátil en el tubo graduado del separador, se puede leer en décimos de 1 mL, y se puede calcular el volumen de aceite volátil por cada 100 g del artículo usando el peso del artículo tomado para el análisis. Las graduaciones en el separador "para aceites más pesados que el agua" se colocan de manera que el aceite permanezca por debajo del condensado acuoso que fluye automáticamente de regreso al matraz.
Contenido de Agua Para artículos sin moler o que no se presentan en polvo, preparar aproximadamente 1Og de la Muestra de Laboratorio cortando, granulando o desmenuzando de modo que las partes tengan aproximadamente 3 mm de grosor. Las semillas o los frutos más pequeños de 3 mm deben partirse. Evitar el uso de molinos de alta velocidad para preparar la muestra. Procurar que no se pierda una cantidad apreciable de humedad durante la preparación y que la porción tomada sea representativa de la Muestra de Laboratorio. Determinar el contenido de agua según se indica en Procedimiento para Artículos de Origen Botánico en Determinación de Agua (921 ), Método 111 (Gravimétrico).
PRUEBA DE AFLATOXINAS PRECAUCIÓN-Las aflatoxinas son muy peligrosas, por lo que se debe tener sumo cuidado cuando se manipulan materiales que contienen aflatoxinas. Cuando la monografía individual requiere el cumplimiento con los límites de aflatoxinas, los límites son no más de 5 ng/g para aflatoxina B1 (AFB 1 ) y no más de 20 ng/g para la suma de aflatoxinas B1 (AFB 1 ), B2 (AFB 2), G1 (AFG 1 ) y G2 (AFG 2 ). Se puede usar un enfoque basado en el riesgo de contaminación para determinar el alcance de la prueba. Al determinar el cumplimiento, se considera la presencia inesperada de aflatoxinas. Se proporcionan los siguientes procedimientos analíticos para determinar el cumplimiento. A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, usar el Método l. Si la aptitud del sistema no cumple con los requisitos, usar el Método 11 o el Método 111.
Pruebas Químicas/ (561) Artículos de Origen Botánico 411
USP 39
Método 1 La prueba de TLC se suministra para detectar la posible presencia de AFB 1, AFB 2, AFG, y AFG 2 en cualquier material de origen vegetal. REACTIVO DE ACETATO DE CINC-CLORURO DE ALUMINIO Disolver 20 g de acetato de cinc y 5 g de cloruro de aluminio en agua suficiente para obtener 100 ml. SOLUCIÓN DE CLORURO DE SODIO Disolver 5 g de cloruro de sodio en 50 mL de agua. SOLUCIÓN DE PRUEBA 1 Moler aproximadamente 200 g de material vegetal para formar un polvo fino. Transferir aproximadamente 50 g pesados con exactitud de material en polvo a un matraz con tapón de vidrio. Agregar 200 mL de una mezcla de metanol y agua (17:3). Agitar mecánicamente en forma vigorosa durante no menos de 30 minutos y filtrar. [NOTA-Si la solución contiene pigmentos vegetales que interfieren, proceder según se indica para la Solución de Prueba 2.] Desechar los primeros 50 mL del filtrado y recoger la porción siguiente de 40 ml. Transferir el filtrado a un embudo de separación. Agregar 40 mL de Solución de Cloruro de Sodio y 25 mL de éter de petróleo y agitar durante 1 minuto. Dejar que las capas se separen y transferir la capa acuosa inferior a un segundo embudo de separación. Extraer dos veces la capa acuosa en el embudo de separación, cada vez con 25 mL de cloruro de metileno, agitando durante 1 minuto. Dejar que las capas se separen cada vez, separar la capa orgánica inferior y recoger las capas orgánicas combinadas en un matraz Erlenmeyer de 125 ml. Evaporar el disolvente orgánico en un baño de agua. Transferir el extracto remanente a un tubo de muestra adecuado y evaporar hasta sequedad en un baño de agua. Enfriar el residuo. Si existen interferencias con el residuo, proceder según se indica para Procedimiento de limpieza en Solución de Prueba 2; de lo contrario, disolver el residuo obtenido anteriormente en 0,2 mL de una mezcla de cloroformo y acetonitrilo (9,8:0,2) y agitar mecánicamente si fuera necesario. SOLUCIÓN DE PRUEBA 2 Recoger 100 mL de filtrado del inicio del flujo y transferir a un vaso de precipitados de 250 ml. Agregar 20 mL de Reactivo de Acetato de Cinc-Cloruro de Aluminio y 80 mL de agua. Mezclar y dejar en reposo durante 5 minutos. Agregar 5 g de un coadyuvante de filtración adecuado, como por ejemplo tierra de diatomeas, mezclar y filtrar. Desechar los primeros 50 mL del filtrado y recoger la porción siguiente de 80 ml. Proceder según se indica para la Solución de Prueba 7, comenzando donde dice "Transferir el filtrado a un embudo de separación". Procedimiento de limpieza: Colocar un disco de vidrio sinterizado de porosidad media o un tapón de lana de vidrio en el fondo de un tubo cromatográfico de 1 O mm x 300 mm. Preparar una suspensión espesa de 2 g de gel de sílice con una mezcla de éter etílico y éter de petróleo (3:1 ), verter la suspensión espesa en la columna y lavar con 5 mL de la misma mezcla de disolventes. Dejar que el absorbente sedimente y agregar a la parte superior de la columna una capa de 1,5 g de sulfato de sodio anhidro. Disolver el residuo obtenido anteriormente en 3 mL de cloruro de metileno y transferir a la columna. Enjuagar el matraz dos veces con porciones de 1 mL de cloruro de metileno, transferir los enjuagues a la columna y eluir a una velocidad de no más de 1 mL/min. Agregar sucesivamente a la columna 3 mL de éter de petróleo, 3 mL de éter etílico y 3 mL de cloruro de metileno, eluir a una velocidad de no más de 3 mL/min y desechar los eluatos. Agregar a la columna 6 mL de una mezcla de cloruro de metileno y acetona (9:1) y eluir a una velocidad de no más de 1 mL/min, preferentemente sin la ayuda de vacío. Recoger este eluato en un vial pequeño, agregar una perla de ebullición si fuera necesario y evaporar hasta sequedad en un baño de agua. Disolver el residuo en 0,2 mL de una mezcla de cloroformo y acetonitrilo (9,8:0,2) y agitar mecánicamente si fuera necesario. SOLUCIÓN DE PRUEBA 3 Si existen interferencias con el residuo, proceder según se indica en Procedimiento de Limpieza con IAC en Solución de Prueba en Método 11. SOLUCIÓN DE AFLATOXINAS PRECAUCIÓN-Las aflatoxinas son muy tóxicas. Manipular con cuidado. Diluir el ER Aflatoxinas USP 1 :5 con acetonitrilo para obtener una solución con una concentración de 0,4 µg/mL de AFB 1 y de AFG 1, y O, 1 µg/mL de AFB 2 y de AFG 2 •
412 (561) Artículos de Origen Botánico / Pruebas Químicas
USP 39
PROCEDIMIENTO Aplicar por separado 2,5; 5; 7,5 y 1O µL de la Solución de Af/atoxinas y tres aplicaciones de 1O µL de la Solución de Prueba 1, Solución de Prueba 2, o Solución de Prueba 3 a una placa adecuada para cromatografía en capa delgada (ver Cromatografía (621)) recubierta con una capa de mezcla de gel de sílice para cromatografía de 0,25 mm. Superponer 5 µL de la Solución de Aflatoxinas a una de las tres aplicaciones de 1O µL de la Solución de Prueba. Dejar que se sequen las aplicaciones y desarrollar el cromatograma en una cámara no saturada que contenga una fase móvil constituida por una mezcla de cloroformo, acetona y alcohol isopropílico (85:10:5) hasta que el frente de la fase móvil haya recorrido no menos de 15 cm desde el origen. Retirar la placa de la cámara de desarrollo, marcar el frente de la fase móvil y dejar que la placa se seque al aire. Localizar las manchas en la placa bajo luz UV a 365 nm. APTITUD DEL SISTEMA Las cuatro aplicaciones de la Solución de Aflatoxinas aparecen como cuatro manchas azules fluorescentes separadas claramente. Observar cualquier mancha obtenida de la Solución de Prueba que concide en tono y ubicación con aquéllas de la Solución de Aflatoxinas. Cualquier mancha obtenida de la Solución de Prueba con la Solución de Aflatoxinas superpuesta no es de menor intensidad que la de la Solución de Aflatoxinas correspondiente. CRITERIOS DE ACEPTACIÓN Ninguna mancha de las aplicaciones de la Solución de Prueba corresponde a las manchas obtenidas con las aplicaciones de la Solución de Aflatoxinas. Si se obtiene alguna mancha de aflatoxinas en la Solución de Prueba, comparar la ubicación de cada mancha fluorescente de la Solución de Prueba con las de la Solución de Aflatoxinas para identificar el tipo de aflatoxina presente. La intensidad de la mancha de aflatoxina, si estuviera presente en la Solución de Prueba, cuando se compara con la de la aflatoxina correspondiente en la Solución de Aflatoxinas representa la concentración aproximada de aflatoxina en la Solución de Prueba. Cuando la monografía individual requiere el cumplimiento con los límites de aflatoxinas, los límites son no más de 5 ng/g para AFB 1 y no más de 20 ng/g para la suma de AFB 1, AFB 2, AFG 1 y AFG 2, a menos que se especifique algo diferente.
Método 11 SOLUCIÓN DE CLORURO DE SODIO Ver el Método l. SOLUCIÓN SALINA AMORTIGUADA CON FOSFATO Preparar una solución amortiguadora de fosfato 1 O mM que contenga cloruro de sodio O, 1 38 M y cloruro de potasio 0,0027 M en agua, y ajustar con hidróxido de sodio 2 M a un pH de 7,4. 1 COLUMNA DE INMUNOAFINIDAD (IAC, POR SUS SIGLAS EN INGLÉS) Antes de acondicionar, ajustar la IAC a temperatura ambiente. Para acondicionar, aplicar 1O mL de Solución Salina Amortiguada con Fosfato sobre la columna y dejar que fluya a través de la columna por gravedad a una velocidad de 2-3 mL/min. Dejar 0,5 mL de la Solución Salina Amortiguada con Fosfato sobre la parte superior de la columna hasta que se aplique la Solución de Prueba. SOLUCIÓN DE PRUEBA Extracción de la muestra: Transferir aproximadamente 5 g de una muestra representativa en polvo, pesada con exactitud, a un matraz con tapón de vidrio. Agregar 20 mL de una mezcla de metanol y agua (17:3). Agitar mecánicamente en forma vigorosa durante no menos de 30 minutos y filtrar. Desechar los primeros 5 mL del filtrado y recoger la porción siguiente de 4 ml. Transferir el filtrado a un embudo de separación. Agregar 4 mL de Solución de Cloruro de Sodio y 2,5 mL de hexano y agitar durante 1 minuto. Dejar que las capas se separen y transferir la capa acuosa inferior a un segundo embudo de separación. Extraer la capa acuosa en el embudo de separación dos veces, cada vez con 2,5 mL de cloruro de metileno, agitando durante 1 minuto. Dejar que las capas se separen cada vez, separar la capa orgánica inferior, y recoger las capas orgánicas combinadas en un matraz Erlenmeyer de 50 ml. Evaporar el disolvente orgánico en un baño de agua. Transferir el extracto remanente a un tubo de muestra adecuado y evaporar hasta sequedad en un baño de agua. Enfriar el residuo. Si existen inter-
1
Se puede obtener una mezcla de polvo adecuada en Sigma como PBS P-381 3.
Pruebas Químicas/ (561) Artículos de Origen Botánico 413
USP 39
ferencias en el residuo, proceder según se indica en Procedimiento de Limpieza con IAC. De otra manera, disolver el residuo obtenido anteriormente en 200 µL de acetonitrilo y agitar mecánicamente, si fuera necesario. Procedimiento de limpieza con IAC: Disolver el residuo en 5 mL de una mezcla de metanol y agua (60:40) y luego diluir con 5 mL de agua. Aplicar este extracto sobre una IAC acondicionada. Enjuagar la IAC dos veces con 1O mL de Solución Salina Amortiguada con Fosfato y eluir lentamente con 2 mL de metanol. Evaporar el eluato con nitrógeno y disolver el residuo en 200 µL de acetonitrilo. SOLUCIÓN DE AFLATOXINAS PRECAUCIÓN-Las aflatoxinas son muy tóxicas. Manipular con cuidado. Diluir cuantitativamente el ER Aflatoxinas USP 1 :50 con acetonitrilo para obtener una solución que contenga 0,04 µg/mL de AFB 1 y de AFG 1, y 0,01 µg/mL de AFB 2 y de AFG 2 • ANÁLISIS Aplicar por separado 5; 7,5 y 1O µL de Solución de Af/atoxinas y tres aplicaciones de 1O µL de la Solución de Prueba a un placa para HPTLC adecuada (ver Cromatografía (621)) recubierta con una capa de mezcla de gel de sílice para cromatografía de 200 µm. Superponer 5 µL de Solución de Aflatoxinas sobre una de las tres aplicaciones de 1O µL de la Solución de Prueba. Dejar que las aplicaciones se sequen y desarrollar el cromatograma en una cámara saturada que contenga una fase móvil constituida por una mezcla de cloroformo, acetona y agua (140:20:0,3) hasta que el frente de la fase móvil haya recorrido no menos de 72 mm desde el origen (80 mm del borde inferior de la placa). Retirar la placa de la cámara de desarrollo, marcar el frente de la fase móvil y dejar que la placa se seque al aire durante 5 minutos. Localizar las manchas en la placa mediante el barrido de la densidad de fluorescencia (> 400 nm) bajo luz UV a 366 nm. Comparar la ubicación de cada mancha fluorescente de la Solución de Prueba con las de la Solución de Aflatoxinas para identificar el tipo de aflatoxinas presente. La concentración de aflatoxinas en la Solución de Prueba se puede calcular a partir de la curva de calibración obtenida de los datos de barrido con Solución de Aflatoxinas. APTITUD DEL SISTEMA Las cuatro aplicaciones de Solución de Aflatoxinas aparecen como cuatro manchas azules fluorescentes separadas claramente. Observar cualquier mancha obtenida de la Solución de Prueba que coincida en tono y ubicación con las de Solución de Aflatoxinas. Cualquier mancha obtenida de la Solución de Prueba con la Solución de Aflatoxinas superpuesta no es de menor intensidad que la de la Solución de Aflatoxinas correspondiente. La recuperación media de la cantidad agregada conocida de AFB 1 y AFG 1 es no menos de 70%. CRITERIOS DE ACEPTACIÓN Cuando la monografía individual requiere el cumplimiento con los límites de aflatoxinas, los límites son no más de 5 ng/g para AFB 1 y no más de 20 ng/g para la suma de AFB 1, AFB 2, AFG 1 y AFG 2, a menos que especifique algo diferente.
Método 111 Se proporciona este método de prueba como un ejemplo para la detección de la presencia posible de AFB 1 y de aflatoxinas totales (AF: suma de AFB 1, AFB 2, AFG 1 y AFG 2). Se ha demostrado que este método es adecuado para ginseng y jengibre en polvo. Se debe demostrar su aptitud para otros artículos de origen botánico. SOLUCIÓN AMORTIGUADORA DE FOSFATO O, 1 M Disolver 8,69 g de fosfato disódico anhidro y 4,66 g de fosfato monosódico anhidro o 5,36 g de fosfato monosódico monohidrato en 800 mL de agua, ajustar con hidróxido de sodio 2 M a un pH de 7,4, agregar 1O mL de polisorbato 20, y diluir hasta 1 L. SOLUCIÓN SALINA AMORTIGUADA CON FOSFATO Preparar según se indica en el Método JI.
USP 39
414 (561) Artículos de Origen Botánico / Pruebas Químicas
SOLUCIONES ESTÁNDAR DE TRABAJO DE AFLATOXINAS Preparar seis soluciones en sendos matraces volumétricos de 1O mL según la Tabla 3. Diluir con una mezcla de metanol y agua (1 :1, v/v) a volumen. Almacenar en un refrigerador y equilibrar a temperatura ambiente antes de su uso. Preparar las soluciones en el día de su uso. Tabla 3. Preparación de Soluciones Estándar de Trabajo de Aflatoxlnas
Soluciones Estándar de Trabajo de Aflatoxlnas
ER Aflatoxinas USP (µL)
Concentración Final de Aflatoxinas de la Solución Estándar de Trabajo de Aflatoxlnas (ng/mL) AFB 1
AFB,
AFG 1
AFG 2
LAF
1
o
o
o
o
o
o
2
12,5
0,25
0,0625
0,25
0,0625
0,625
3
25
0,5
0,125
0,5
0,125
1,25
4
50
1
0,25
1
0,25
2,5
5
100
2
0,5
2
0,5
5
6
200
4
1
4
1
10
COLUMNA DE INMUNOAFINIDAD {IAC) 2 Usar una columna de inmunoafinidad que contenga anticuerpos monoclonales de reactividad cruzada con AFB 1, AFB 2, AFG, y AFG 2 • Las columnas de inmunoafinidad tienen una capacidad mínima de no menos de 100 ng de aflatoxinas totales y proporcionan una recuperación de no menos de 80% para AFB 1, AFB 2, AFG, y AFG 2 cuando se aplican 5 ng de AFB,, de AFB 2, de AFG, y de AFG 2 en 1 O mL de metano! al 10% en Solución Salina Amortiguada con Fosfato {v/v). SOLUCIÓN DE PRUEBA Extracción: Pesar 5 g de una muestra de prueba representativa en un tubo de centrífuga de 50 ml. Agregar 1 g de cloruro de sodio y 25 mL de una mezcla de metanol y bicarbonato de sodio al 0,5% (700:300). Mezclar en un mezclador de vórtice hasta que las partículas de muestra y el disolvente de extracción se mezclen bien. Agitar a 400 rpm durante 1O minutos. Centrifugar durante 1 O minutos a 7000 rpm (valor g = 5323 mm/s 2) o a una velocidad que pueda producir un pellet de residuos firme. Pipetear y transferir de inmediato 7 mL a un tubo de centrífuga de 50 mL, agregar 28 mL de Solución Amortiguadora de Fosfato O, 7 M, mezclar y filtrar a través de papel de microfibra de vidrio. Recoger 25 mL del filtrado (equivalente a 1 g de la muestra de prueba) en una probeta graduada de 25 mL y proceder inmediatamente con la cromatografía de IAC. Limpieza de IAC: [NOTA-Para la limpieza de IAC, las columnas deben mantenerse a temperatura ambiente durante al menos 15 minutos antes de su uso.] Retirar la tapa superior de la columna y conectarla con el reservorio de solvente. Retirar la tapa inferior de la columna y acoplarla al colector de la columna (el ajuste debe ser hermético). Dejar que el líquido pase a través de la columna hasta dejar aproximadamente 2-3 mm de líquido por encima del lecho de la columna. Transferir los 25 mL del filtrado, obtenido en Extracción, al reservorio de solvente. Dejar que el filtrado fluya a través de la columna por gravedad. Dejar que la columna se seque. Retirar la columna del colector para comenzar el flujo de nuevo con facilidad, agregar aproximadamente 2 mL de Solución Salina Amortiguada con Fosfato a la columna, volver a acoplar la columna al reservorio de solvente, lavar la columna con 3 mL adicionales de Solución Salina Amortiguada con Fosfato y luego con 5 mL de agua (se puede agregar 5 mL de Solución Salina Amortiguada con Fosfato directamente al reservorio de solvente de la columna si se usan otras técnicas para desprender las burbujas de aire en el extremo de la columna y para comenzar el flujo de nuevo con facilidad). Dejar que la columna se seque, luego forzar 3 mL de aire a través de la columna con una jeringa. Eluir con 1 mL de metanol y recoger los analitos en un matraz volumétrico de 3 mL, dejando que el eluato gotee libremente. Dejar que la columna se seque. Dejar en reposo durante 1 minuto, luego eluir con 1 mL adicional de metanol, y recoger en el mismo matraz volumétrico. Dejar que la columna se seque y forzar 1O mL de aire a través de la columna. Diluir el eluato con agua a volumen. Usar esta dilución como la Solución de Prueba y realizar el análisis de aflatoxinas de inmediato. SOLUCIÓN DE APTITUD DEL SISTEMA Preparar una muestra adicionada, agregando 5 mL de Solución Estándar de Trabajo de Aflatoxinas 5 a una muestra de 5 g, repitiendo el procedimiento para la Solución de Prueba, usando 20 mL en lugar de 25 mL de la mezcla de metanol y bicarbonato de sodio al 0,5% (700:300).
2 Columna de AflaOchraTest (G1017; Vicam, Watertown, MA, USA) o equivalente. Las columnas de inmunoafinidad de Aflatoxina/OTA son adecuadas.
USP 39
Pruebas Químicas/ (561) Artículos de Origen Botánico 415 SISTEMA CROMATOGRÁFICO
Velocidad de flujo: 0,8 mL/minuto Detección: Detector de fluorescencia; ajustar la longitud de onda de excitación (Ex) a 362 nm y la longitud de onda de emisión (Em) a 440 nm. Columna: 4,6 mm x 15 cm; relleno L1 de 3 µm Fase móvil: !socrática Para derivatización post-columna con celda fotoquímica 3-Agua, metanol y acetonitrilo (600:250:150) Para derivatización post-columna con celda electroquímica4 -Una solución preparada mezclando 1 L de una mezcla de agua, metanol y acetonitrilo (600:250:150); 350 µL de ácido nítrico 4 M; y 120 mg de bromuro de potasio Sistemas de derivatización post-columna (PCD, por sus siglas en inglés) Celda PHRED--Celda fotoquímica para derivatización post-columna Celda Kobra--Celda electroquímica, celda de bromación para derivatización post-columna. ANÁLISIS Derivatización post-columna para aflatoxinas: Usar una celda fotoquímica o electroquímica. Inyectar 50 µL de blanco de reactivo (Solución Estándar de Trabajo de Aflatoxinas 7), las Soluciones Estándares de Trabajo de Aflatoxinas 2-6 o la Solución de Prueba en la columna de HPLC. Identificar los picos de aflatoxinas en la Solución de Prueba comparando los tiempos de retención con los de los estándares de trabajo. Las aflatoxinas eluyen en el orden AFG 2, AFG 1, AFB 2 y AFB 1 • Después de pasar a través de la celda fotoquímica o electroquímica, AFG 1 y AFB 1 han derivatizado para formar AFG 2• (derivado de AFG 1) y AFB 2• (derivado de AFB 1). [NOTA-Las estructuras químicas de los derivados que resultan de bromación electroquímica y fotólisis no son iguales. Las estructuras de los productos de fotólisis de AFB 1 y AFG 1 no se han definido.] Los tiempos de retención de AFG 2 , AFG 2., AFB 2 y AFB 2• están entre aproximadamente 14 y 27 minutos usando la celda fotoquímica; los tiempos de retención usando la celda electroquímica resultan en períodos de tiempo más breves. Los picos se deben resolver hasta la línea base. Construir una curva estándar para cada aflatoxina. Determinar la concentración de cada aflatoxina en la Solución de Prueba a partir de la curva de calibración. Curvas de calibración de aflatoxinas: Se preparan las curvas de calibración para cada una de las aflatoxinas usando las Soluciones Estándar de Trabajo de Aflatoxinas que contengan las cuatro aflatoxinas descritas. Estas soluciones abarcan el intervalo de 0,25-4 ng/mL para AFB 1 y AFG 1, y el intervalo de 0,0625-1 ng/mL para AFB 2 y AFG 2 • Construir las curvas de calibración antes de su análisis según la Tabla 3 y verificar la linealidad de la gráfica. Si el área de respuesta de la porción de prueba se encuentra fuera (más alto) del intervalo de la calibración, entonces la Solución de Prueba debe diluirse con una mezcla de metano! y agua (1 :1; v/v) y volver a inyectarse en la columna de HPLC. Cuantificación de Aflatoxinas: Se realiza la cuantificación de aflatoxinas midiendo las áreas de los picos a cada tiempo de retención de aflatoxina y comparándolos con la curva de calibración correspondiente. APTITUD DEL SISTEMA La recuperación media de la cantidad agregada conocida de AFB 1 (2 µg/kg) y de aflatoxinas totales (5 µg/kg) es no menos de 68% y 70%, respectivamente. La desviación estándar relativa (RSD, por sus siglas en inglés) es no más de 10% para AFB 1 y para aflatoxinas totales. CÁLCULOS Graficar el área del pico (respuesta, eje y) de cada estándar de toxina en función de la concentración (ng/mL, eje x) y determinar la pendiente (5) y la intersección con el eje y (a). Calcular el nivel de toxina en la muestra por la siguiente fórmula: Toxina (µg/kg) = {[(R - a)/ S] x V/W} x F en donde Res el área del pico de la Solución de Prueba; V es el volumen final de la Solución de Prueba inyectada (mL); y Fes el factor de dilución. F = 1 cuando V= 3 ml. W es 1 g de la muestra de prueba pasada a través de la columna de inmunoafinidad. Las aflatoxinas totales son la suma de AFG 2 , AFG 1, AFB 2 y AFB 1 • CRITERIOS DE ACEPTACIÓN Cuando la monografía individual requiera cumplimiento con los límites para aflatoxinas, los límites son no más de 5 ng/g para AFB 1 y no más de 20 ng/g para la suma de AFB 1 , AFB 2, AFG 1 y AFG 2 , excepto cuando se indique algo diferente. 3 Celda fotoquímica para derivatización post-columna, tipo PHRED'" Reactor Fotoquímico (AURA Industries, New York, NY, USA) o equivalente. Procurar no mirar directamente la lámpara UV. 4 Celda electroquímica para derivatización post-columna, tipo Kobra'" (R-Biopharm lnc., Marshall, MI, USA) o equivalente. Ajustado a 100 mA. No prender la corriente hasta que el bombeo de HPLC funcione para evitar el sobrecalentamiento de la membrana celular.
USP 39
416 (561) Artículos de Origen Botánico/ Pruebas Químicas
ANÁLISIS DE RESIDUOS DE PLAGUICIDAS Definición Siempre que se emplee en esta Farmacopea, la denominación de plaguicida se aplica a cualquier sustancia o mezcla de sustancias destinadas a evitar, destruir o controlar plagas, especies de plantas no deseadas, hongos, o animales que provocan daños durante la producción, el procesamiento, el almacenamiento, el transporte o la comercialización de artículos puros, o que interfieren de algún otro modo con estos procesos. La denominación incluye sustancias elaboradas para ser usadas como reguladores de crecimiento, defoliantes o desecantes, y cualquier sustancia que se aplica a los cultivos antes o después de la cosecha para proteger el producto del deterioro durante el almacenamiento y el transporte.
Límites Dentro de los Estados Unidos, muchos productos botánicos se tratan como suplementos dietéticos y por eso están sujetos a las disposiciones reglamentarias que rigen sobre los alimentos pero no rigen sobre los medicamentos en la Ley Federal sobre Alimentos, Medicamentos y Productos Cosméticos (Federal Food, Drug and Cosmetic Act). Los límites de plaguicidas en alimentos están determinados por la Agencia de Protección Ambiental del los Estados Unidos (EPA - Environmental Protection Agency) según se indica en el Reglamento sobre Alimentos y Medicamentos [Code of Federal Regulations (40 CFR Part 180)) o el Diario Oficial (FR - Federal Register). Además, la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA - Food and Drug Administration) establece niveles de acción para residuos inevitables de plaguicidas (21 CFR Part 109 y 21 CFR Part 509). Para plaguicidas químicos sin niveles de tolerancia establecidos por la EPA o niveles de acción de la FDA, los residuos deben estar por debajo del límite de detección del método especificado. Los resultados con valores menores a los límites de detección de la EPA se consideran cero. Por lo tanto, los límites aquí detallados no son válidos en los Estados Unidos cuando los artículos de origen botánico están etiquetados para fines alimentarios. Sin embargo, los límites se pueden aplicar en otros países. A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, el artículo a examinar debe cumplir con los límites provistos en la Tabla 4. Los límites de plaguicidas, de los que se sospecha su presencia, que no se indican en la Tabla 4 deben cumplir las reglamentaciones de la EPA. En casos en donde un plaguicida no se indica en la Tabla 4 ni en las reglamentaciones de la EPA, calcular el límite por la fórmula: Límite (mg/kg) = AM/l 008 en donde A es la ingesta diaria admisible (IDA), publicada por FAO-OMS, en mg/kg de peso corporal; Mes el peso corporal, en kg (60 kg); y 8 es la dosis diaria del artículo, en kg. Si el artículo está destinado para la preparación de extractos, tinturas o otras formas farmacéuticas de la cual el método de preparación modifica el contenido de plaguicidas en el producto final, calcular los límites por la fórmula: Límite (mg/kg)
= AME/l 008
donde E es el factor de extracción de pesticida en el método de preparación, determinado experimentalmente como la relación entre el contenido original de plaguicida en el material botánico y el contenido final de plaguicida en la preparación; 8 es la dosis diaria de la preparación en kg; y A y M se definen anteriormente. Puede concederse una exención total o parcial de la prueba cuando se conoce toda la historia (naturaleza y cantidad de los plaguicidas usados, la fecha de cada tratamiento durante el cultivo y después de cosechar) del tratamiento de la partida y se puede verificar precisamente de acuerdo con las buenas prácticas agrícolas y de recolección (GACP, por sus siglas en inglés). Tabla4 Sustancia
Límite (mg/kg)
Acefato
0,1
Alaciar
0,05
Aldrina y dieldrina (suma de)
0,05
Azi nfos-etíl ico
0,1
Azinfos-metílico
1
Bromuro inorgánico (calculado como ión bromuro)
125
Bromofos-etílico
0,05
Bromofos-metílico
0,05
Bromopropilato
3
Clordano (suma de cis-, trans- y oxiclordano)
0,05
Clorfenvinfos
0,5
Clorpirifos-etílico
0,2
Clorpirifos-metílico
0,1
Pruebas Químicas/ (561) Artículos
USP 39
de Origen Botánico 41 7
Tabla 4 (Continuación) Límite (mg/kg)
Sustancia Clortal-dimetílico
0,01
Ciflutrina (suma de)
o, 1 1
?c-Cihalotrina Cipermetrina e isómeros (suma de)
1
DDT (suma de o,p'-DDE, p,p'-DDE, o,p'-DDT, p,p'-DDT, o,p'-TDE y p,p'-TDE)
1
Deltametrina
0,5
Diazinón
0,5
Diclofluanida
0,1 1
Diclorvos Dicotal
0,5
Dimetoato y ometoato (suma de)
0,1 2
Ditiocarbamatos (expresado como CS2) Endosulfán (suma de isómeros y sulfato de endosulfano)
3 0,05
Endrina
2
Etión Etrimtas
0,05
Fenclorotas (suma de fenclorotas y fenclorotas-oxón)
o, 1
Fenitrotión
0,5
Fenpropatrina
0,03
Fensultatión (suma de fensultatión, fensultatión-oxón, fensultatión-oxón-sultana y fensultatión sultana)
0,05
Fentión (suma de fentión, fentión-oxón, fentión-oxón-sultana, fentión-oxón-sulfóxido, fentión sultana y fentión-sulfóxido)
0,05
Fenvalerato
1,5
Flucitrinato
0,05
T-Fluvalinato
0,05
Fo notas
0,05
Heptaclor (suma de heptaclor, cis-heptaclorepóxido y tmns-heptaclorepóxido)
0,05
o, 1
Hexaclorbenceno Hexaclorociclohexano (suma de isómeros a-,
fJ -, B- y E-)
Lindano (y-hexaclorociclohexano) Malatión y malaoxón (suma de)
0,3 0,6 1
Mecarbam
0,05
Metacritas
0,05
Metamidotas
0,05
Metidatión
0,2
Metoxiclor
0,05
Mirex
0,01
Monocrototas
O, 1
Paratión-etílico y Paraoxón-etílico (suma de)
0,5
Paratión-metílico y Paraoxón-metílico (suma de)
0,2
Pendimetalina
o, 1
Pentacloranisol
0,01
Permetrina e isómeros (suma de)
1
Fosa lona
O, 1
Fosmeto
0,05
Butóxido de piperonilo Pirimitas-etílico Pirimitas-metílico (suma de pirimitas-metílico y N-desetil-pirimitas-metílico) Procimidona Profenotas Protiotas
3 0,05
4
o, 1 o, 1 0,05
418 (561) Artículos de Origen Botánico / Pruebas Químicas
USP 39
Tabla 4 (Continuación) Límite (mg/kg)
Sustancia Piretro (suma de cinerina 1, cinerina 11, jasmolina 1, jasmolina 11, piretrina 1y piretrina 11)
3
Quinalfos
0,05
Quintoceno (suma de quintoceno, pentacloroanilina
y metil pentaclorofenil sulfuro)
1
S-421
0,02
Tecnaceno
0,05
Tetradifona
0,3
Vinclozolina
0,4
Análisis cualitativo y cuantitativo de residuos de plaguicidas: Emplear procedimientos analíticos validados, p.ej. de acuerdo con la versión más actualizada de la guía de la UE sobre procedimientos analíticos de control de calidad y de validación para el análisis de residuos de plaguicidas [NOTA-La versión vigente del Documento Núm. SANC0/12571 /2013, http:// ec.europa.eu/food/plant/resources/qualcontrol_en.pdf] o los principios de validación del método de la EPA (OPPTS 860.1340) que cumplan con los siguientes criterios. El método, especialmente con respecto a los pasos de purificación, es adecuado para la combinación de residuos de plaguicidas y la sustancia en análisis, y no es susceptible a interferencias de sustancias coextraíbles. El límite de cuantificación para cada combinación de matriz de plaguicidas que se va a analizar no debe exceder el límite de tolerancia correspondiente: el método demuestra una recuperación de entre 70% y 120% de cada plaguicida con una repetibilidad de no menos de 20% de desviación estándar relativa [NOTA-en algunos casos, se pueden aceptar recuperaciones más bajas conforme a lo tratado en el documento SANC0/12571 /2013]; y las concentraciones de las soluciones de prueba y de referencia, y la calibración del aparato son tales que se obtiene una respuesta lineal del detector analítico.
LÍMITES DE IMPUREZAS ELEMENTALES Los niveles de impurezas elementales deben restringirse conforme a lo indicado en la Tabla 5 a menos que se indique de otro modo en la monografía individual. Ciertas monografías específicas pueden proveer diferentes límites para artículos que por lo regular se usan en grandes cantidades. Tabla 5. Límites de Impurezas Elementales Límites (µg/g)
Elemento
2
Arsénico (inorgánico)ª
0,5
Cadmio Plomo
5
Mercurio (total)
1
Metilmercurio (como Hg)b
0,2
ª El arsénico puede medirse usando un procedimiento sin especiación suponiendo que todo el arsénico contenido en el suplemento se encuentra en forma inorgánica. Cuando se excede el límite al usar un procedimiento sin especiación, se deberá demostrar el cumplimiento con el límite para arsénico inorgánico teniendo como fundamento un procedimiento con especiación. b La determinación de metilmercurio no es necesaria cuando el contenido de mercurio total es menor que el límite para metilmercurio.
Los artículos se analizan de acuerdo con los procedimentos establecidos en Impurezas Elementales-Procedimientos (233). Cuando se requiera especiación, se usan para el análisis los procedimientos del capítulo Contaminantes Elementales en Suplementos Dietéticos (2232).
(563) IDENTIFICACIÓN DE ARTÍCULOS DE ORIGEN BOTÁNICO INTRODUCCIÓN La identificación de materias primas vegetales que se utilizan en la fabricación de medicamentos, excipientes, o suplementos dietéticos se lleva a cabo examinando las características morfológicas e histológicas del artículo en análisis y realizando pruebas de diagnóstico químicas. Las características botánicas y químicas obtenidas del examen del artículo de prueba se comparan luego con las características botánicas y químicas conocidas de la especie vegetal. Se pueden especificar artículos de referencia para ayudar a la adecuada identificación botánica y química de la planta y de las partes de la planta. Un artículo de referencia puede ser un Material de Referencia Autenticado USP, que se puede utilizar tanto para la identificación química como botánica, o un Estándar de Referencia USP, que se usa sólo para la identificación química.
USP 39
Pruebas Químicas/ (563) Identificación de Artículos de Origen Botánico 419
MATERIALES DE REFERENCIA AUTENTICADOS USP Los Materiales de Referencia Autenticados USP son órganos o tejidos vegetales certificados por provenir de una planta identificada adecuadamente como perteneciente a la especie declarada en la etiqueta. La autenticación es realizada por especialistas en taxonomía botánica, anatomía vegetal, fitoquímica u otros científicos especialistas en plantas contratados por la USP. Un Material de Referencia Autenticado USP es habitualmente un órgano o tejido vegetal seco y pulverizado que se puede obtener de la USP. Se archivan muestras de herbario de las plantas autenticadas, que pueden incluir raíces, tallos, hojas, flores, frutos y semillas. Las muestras del archivo se pueden solicitar para su examen. Generalmente, una muestra de herbario estándar consiste en la planta adulta entera. Los Materiales de Referencia Autenticados USP se someten a las mismas pruebas de diagnóstico botánico y químico que se aplican en el análisis de materias primas. Un artículo de prueba debe tener todas las características botánicas y químicas especificadas que se encuentran en el Material de Referencia Autenticado USP. Para que sirva al propósito al que está destinado, cada Material de Referencia Autenticado USP se debe almacenar, manipular y usar de manera apropiada. Por lo general, los Materiales de Referencia Autenticados USP se almacenan en sus envases originales en un ambiente fresco, seco y protegidos de la luz y de la infestación de insectos. Cuando se requieren condiciones de almacenamiento especiales, las instrucciones se indican en la etiqueta. Por lo general, los principios activos y los compuestos marcadores se degradan con el tiempo; por lo tanto, se asignan fechas de caducidad a los Materiales de Referencia Autenticados USP para su uso en identificación química. Los Materiales de Referencia Autenticados USP no están destinados para emplearse en la fabricación de productos farmacéuticos, excipientes ni suplementos dietéticos.
IDENTIFICACIÓN BOTÁNICA La identificación botánica de las materias primas vegetales que se emplean en la fabricación de productos farmacéuticos, excipientes, o suplementos dietéticos consiste en determinar las características macroscópicas e histológicas (microscópicas) de la parte de la planta, como por ejemplo, raíz, tallo, hoja, flor, fruto o semilla, que se utiliza en la fabricación del artículo. La identificación puede incluir también la inspección de las características organolépticas del tejido vegetal, como la presencia o ausencia de un olor característico. Las monografías oficiales individuales pueden incluir información botánica de posibles especies adulterantes para asegurar su ausencia en la materia prima. Para identificar adecuadamente la planta, el órgano o el tejido vegetal, es necesario tener un conocimiento básico de anatomía vegetal.
Morfología y Anatomía Vegetal Diagnóstica Esta sección trata exclusivamente las características morfológicas y anatómicas diagnósticas de plantas vasculares y de las diversas partes de las plantas, tales como raíces, tallos, hojas, flores, frutos y semillas, a partir de las que se obtienen productos farmacéuticos, excipientes o suplementos dietéticos. Las plantas vasculares comprenden las Pteridofitas (helechos y plantas relacionadas con los helechos; por ejemplo, los géneros Aspidium, Equisetum y Lycopodium), las Gimnospermas (plantas de semilla, en las que la semilla no está encerrada dentro del fruto; por ejemplo, los géneros Ephedra, Gingko y Pinus) y las Angiospermas (plantas de semilla, donde la semilla está encerrada dentro del fruto; por ejemplo, los géneros Allium, Dígito/is, Panax, Matricaria y Rauwolfia). Algunas de las características anatómicas diagnósticas que se especifican en una monografía individual (ver Características botánicas en monografías individuales) pueden incluir, entre otras, la presencia de un tejido particular en un órgano; la disposición y el tipo de células de un tejido; la presencia y el tipo de canal secretor, la presencia de aceite, resina o conductos laticíferos dentro de un órgano; el número de células epiteliales que rodea un canal secretor; y la presencia y tipo de sustancias ergásticas como por ejemplo almidón, inulina, glóbulos de grasa, aceites esenciales, cristales de oxalato de calcio, cistolitos, polifenoles, líquidos u otros materiales que se producen en el citoplasma, organelos, vacuolas, cavidades o pared celular. RAÍCES Los tejidos presentes en raíces jóvenes, comenzando desde el tejido más externo, comprenden una epidermis con pelos radiculares, corteza, endodermis, periciclo, floema, xilema y, en algunas especies, médula. En algunas especies, la capa o capas más externas de la corteza son diferentes de las capas internas, en cuyo caso se denominan hipodermis. En especies que presentan crecimiento secundario de la raíz, es habitual que se desprendan todos los tejidos externos al periciclo. Las raíces que presentan crecimiento secundario tienen un peridermo o corteza, compuesto de súber (tejido suberoso), felógeno (cámbium suberoso) y felodermo como el tejido más externo. Debajo del peridermo se pueden encontrar restos de floema primario, floema secundario, cámbium vascular, xilema primario y xilema secundario. Los tejidos vasculares secundarios tienen radios medulares que separan en grupos a las principales células conductoras del floema (elementos cribosos o células cribosas) y a las principales células conductoras del xilema (vasos y traqueidas). La mayoría de las especies de plantas que presentan crecimiento secundario carecen de médula en la raíz. El tipo y la disposición de las células conductoras principales de los tejidos vasculares puede permitir el diagnóstico de la especie. Las raíces de muchas especies se desarrollan como órganos de almacenamiento alimenticio. Este tipo de raíces se caracteriza por la presencia de abundante parénquima y grandes cantidades de almidón u otros polisacáridos. La presencia, el tipo y la disposición de fibras, esclereidas y otros tejidos, y la presencia y ubicación de ma-
420 (563) Identificación de Artículos de Origen Botánico / Pruebas Químicas
USP 39
terial ergástico también pueden ser características diagnósticas. Desde el punto de vista morfológico, las raíces se pueden distinguir de los rizomas (los tallos subterráneos) principalmente por la ausencia de nodos e internodos, que están presentes en los rizomas. TALLOS Varias características macroscópicas externas de los tallos que pueden permitir el diagnóstico de la especie comprenden los atributos de los nodos, internodos, cicatrices de las hojas, cicatrices de los haces vasculares, lenticelas y yemas; el patrón de crecimiento de las yemas; la posición y disposición de las hojas a lo largo del tallo y la presencia de zarcillos, aguijones, púas o espinas. Comenzando con el tejido más externo, la disposición interna de tejidos en los tallos jóvenes de la mayoría de las especies es epidermis, corteza, un anillo concéntrico de haces vasculares separados entre sí por haces medulares parenquimatosos y médula. Según la especie, en la epidermis puede haber estomas o tricomas, o ambas estructuras. La corteza de algunas especies puede incluir una hipodermis o una endodermis, o ambas. En muchas monocotiledóneas, la disposición de los haces vasculares no es concéntrica, sino que los haces están esparcidos a través de toda una masa de tejido parenquimatoso en la parte interior de la epidermis. Debido a esta disposición, no se puede distinguir la corteza, los haces medulares, ni la médula. En los tallos de plantas leñosas que presentan crecimiento secundario, es habitual que la epidermis se desprenda y se reemplace con un peridermo que consta de súber, felógeno y felodermo. Algunas especies se caracterizan por presentar múltiples peridermos (ritidoma). En el peridermo puede haber lenticelas y sus atributos pueden servir como características diagnósticas. Por debajo del peridermo están los restos de la corteza, el floema primario, el floema secundario, el cámbium vascular, el xilema secundario, el xilema primario y la médula. También hay haces medulares. Igual que en la raíz, el tipo y la disposición de las células conductoras principales de los tejidos vasculares, la presencia, el tipo y la disposición de fibras, esclereidas y otros tejidos, y la presencia y ubicación de material ergástico, también pueden ser características diagnósticas. Los rizomas pueden tener algunas características morfológicas similares a las de las raíces y por lo tanto se pueden confundir con raíces. Sin embargo, los rizomas se pueden identificar correctamente como tallos porque tienen nodos e internodos evidentes. HOJAS Algunas características macroscópicas de las hojas que pueden permitir el diagnóstico de la especie comprenden los atributos de las láminas foliares, el pecíolo, las estípulas y la filotaxia. El tejido más externo de la lámina foliar es la epidermis, seguida por los tejidos mesófilo y vascular. Entre las características diagnósticas microscópicas de las células epidérmicas están el grosor y las marcas de la cutícula, la forma y disposición de los estomas y las células guardianas, la disposición y tamaño de células subsidiarias, el número de estomas (número de estomas por unidad de superficie) y el índice estomático (número de estomas por número de unidades de células epidérmicas). Otras características útiles en la identificación de material foliar consisten en los tipos y la disposición de los tricomas (pelos de los vegetales) presentes; el tipo y la disposición de los tejidos mesófilo y vascular; la relación de mesófilo en empalizada; la presencia y el aspecto de tejidos accesorios tales como vainas de haces parenquimatosos o esclerenquimatosos, mesófilo paraveinal, endodermis y tejido de transfusión; el tipo y la disposición de las células conductoras principales de los tejidos vasculares, la presencia, el tipo y la disposición de fibras, esclereidas y otros tejidos; y la presencia, la ubicación y el aspecto físico del material ergástico. FLORES Las flores son las mejores características morfológicas diagnósticas de cualquier planta floral y la estructura floral es el criterio principal que se usa en taxonomía vegetal. Las características diagnósticas de las flores comprenden el tipo de inflorescencia; la presencia, el número y el aspecto de las partes florales principales (sépalos, pétalos, estambres y carpelos); el tipo de simetría que presentan las partes florales; la posición relativa de los ovarios con respecto a las demás partes de la flor; el número de óvulos por ovario; el tipo de placentación del ovario; el aspecto físico de los granos de polen; la presencia de nectarios, la presencia de recubrimientos o tricomas glandulares; y características físicas de estructuras accesorias, como el receptáculo y las brácteas. Las características histológicas y la presencia de materiales ergásticos en los tejidos de las partes florales permiten también el diagnóstico de la especie. FRUTOS La identificación de la especie vegetal a partir de la que se obtiene un fruto se puede determinar mediante la observación de varios criterios macroscópicos. Estos criterios comprenden el número de pistilos que tiene el fruto; el número de carpelos dentro de cada pistilo; el número de semillas dentro de cada carpelo, la placentación del fruto; y si el fruto es dehiscente, indehiscente o carnoso. Algunas otras características diagnósticas son las referentes al número de suturas en un fruto dehiscente, la determinación de si las semillas están unidas o no a la pared del pericarpio, las características físicas de las tres capas del pericarpio de los frutos carnosos (epicarpio, mesocarpio y endocarpio) y la presencia y el aspecto físico de tejidos accesorios como el receptáculo y las brácteas. Las características histológicas de los tejidos del fruto pueden ayudar a la identificación. Las características de las semillas dentro del fruto también son caracteres distintivos que permiten diagnosticar la especie.
USP 39
Pruebas Químicas/ (563) Identificación de Artículos de Origen Botánico 421
SEMILLAS Las características macroscópicas de las semillas que se utilizan en la identificación comprenden la forma y el tamaño de la semilla; el aspecto de la superficie del recubrimiento de la semilla; la posición del hilio y del micrópilo; y la presencia de estructuras accesorias del recubrimiento de la semilla, tales como los arilos, carúncula, o cuerpos oleosos. Las características físicas del embrión, tales como su tamaño, forma, posición y el número y aspecto de los cotiledones, al igual que la presencia y el aspecto de tejidos nutritivos accesorios como los restos de un megagametofito (en Gimnospermas), perisperma (nucela) o endosperma, permiten también diagnosticar la especie. Las características histológicas del recubrimiento de la semilla y otras estructuras y tejidos de la semilla también se pueden utilizar para identificar la especie.
Microtécnica El análisis histológico de muestras botánicas se puede realizar en material vegetal entero o pulverizado. Puede ser necesario el empleo de tinciones citológicas u otros reactivos para visualizar determinadas características histológicas. Se pueden emplear polarizadores cruzados para detectar estructuras que rotan la luz polarizada plana. Estas estructuras comprenden granos de almidón, cristales de oxalato de calcio, algunas fibras y granos de arena (presentes como un contaminante) que se pueden observar como objetos brillantes contra un fondo oscuro. Generalmente se coloca un polarizador en el condensador o la fuente de iluminación y el segundo polarizador se coloca en el ocular. La luz que entra al portaobjetos desde abajo es polarizada plana, lo que permite que pasen solamente algunas ondas luminosas en un plano específico. El campo se torna brillante cuando los dos polarizadores se alinean y cuando los dos polarizadores están cruzados, el campo se oscurece. PROCEDIMIENTO PARA MONTAJES TEMPORALES Y MATERIAL PULVERIZADO Procedimiento general: Las muestras vegetales se observan bajo el microscopio mediante el empleo de diferentes medios de montaje, tinciones u otras soluciones que ayudan a la correcta identificación del artículo de prueba. Si se dispone de un Material de Referencia Autenticado USP, se debe preparar con los mismos medios de montaje o soluciones reactivo utilizados para el artículo de prueba. Colocar 1 ó 2 gotas de agua, Solución de alcohol-glicerina, Solución de hidrato de cloral, u otra solución reactivo en el centro de un portaobjetos limpio (ver Preparación y uso de soluciones reactivo, dispositivos ópticos y medios de montaje). Transferir una pequeña sección de tejido vegetal o una porción de polvo de la planta al medio de montaje o solución reactivo y cubrirla con un cubreobjetos limpio. (Para obtener más información sobre técnicas de preparación específicas, ver Preparación de montajes temporales y cortes manuales, Maceración o Preparación de material pulverizado, según corresponda). Para evitar la formación de burbujas de aire, el cubreobjetos se debe colocar cuidadosamente en un ángulo adecuado, de tal manera que su borde entre primero en contacto con el portaobjetos y luego presionar hasta que cubra la muestra. Eliminar el exceso de líquido del extremo del cubreobjetos con un trozo de papel de filtro. Las burbujas de aire se pueden eliminar colocando el portaobjetos en un desecador de vacío. Cuando se emplea hidrato de cloral, las burbujas de aire se pueden eliminar calentando la muestra a ebullición suave sobre una llama pequeña, como la de una lámpara de alcohol. Para reemplazar el medio de montaje o solución reactivo, colocar gotas del nuevo medio de montaje o solución reactivo en un borde del cubreobjetos. Colocar una tira de papel de filtro en el extremo opuesto del cubreobjetos para eliminar el medio de montaje o solución reactivo anterior y hacer que el nuevo medio de montaje o solución reactivo corra sobre el tejido o material pulverizado. Los aceites vegetales también pueden ser arrastrados del tejido de esta manera, lavando el portaobjetos con éter de petróleo o acetona seguido luego por agua, y si fuera necesario, por Solución de hidrato de cloral. No usar Solución de hidrato de cloral inmediatamente después de tratar el tejido vegetal con disolventes inflamables sin haber lavado minuciosamente el tejido con agua. De este modo se evita que el disolvente residual se inflame cuando el portaobjetos se coloque sobre una llama pequeña para calentar el tejido a ebullición. Se debe tener cuidado al usar soluciones reactivo que sean volátiles o corrosivas para el microscopio. Para evitar que las soluciones acuosas o de hidrato de cloral se sequen durante la observación, agregar al portaobjetos una pequeña gota de glicerina. Observar la muestra montada bajo un microscopio óptico (ver Microscopía Óptica (776)) y examinar las características histológicas. Preparación y uso de soluciones reactivo, dispositivos ópticos y medios de montaje: Los siguientes reactivos, dispositivos ópticos y medios de montaje se emplean en la identificación de células, tejidos, características estructurales y sustancias ergásticas en el tejido o material pulverizado (ver la Tabla 1 y la Tabla 2). Tabla 1. Uso de Soluciones Reactivo y Dispositivos Ópticos Soluciones Reactivo y Dispositivos Ópticos
Detección Concreción de Carbonato de calcio
Ácido acético diluido
Cristales de oxalato de calcio
Polarizadores cruzados
Celulosa
Solución de carmín-alumbre-verde de metilo Ácido yodhídrico Solución de yodcrcloruro de cinc
Citoplasma
Solución de ácido pícrico alcohólico
1,8-Dihidroxiantraquinonas
Solución de hidróxido de potasio 7 M
422 (563) Identificación de Artículos de Origen Botánico / Pruebas Químicas
USP 39
Tabla 1. Uso de Soluciones Reactivo y Dispositivos Ópticos (Continuación) Soluciones Reactivo y Dispositivos Ópticos
Detección Aceites esenciales
Solución de tetróxido de osmio Solución de sudán 111
lnulina
Solución de naftol--Ocido sulfúrico
Lignina
Solución de carmín-alumbre-verde de metilo Solución de floroglucinol--Ocido clorhídrico Reactivo universal
Lípidos (cutina, ceras y suberina incluidas)
Solución de carmín-alumbre-verde de metilo Solución de tetróxido de osmio Solución de sudán 111 Reactivo universal
Pectina y mucílago
Solución de rojo de rutenio Solución de tionina Solución de azul de toluidina
Fitoglicógeno
Solución de rojo de rutenio
Cuerpos proteicos
Solución de ácido pícrico alcohólico Solución de tetróxido de osmio
Saponina
Mezcla de sangre-gelatina Solución de yodo-glicerina (confirmar mediante prueba con Mezcla de sangre-gelatina)
Almidón
Polarizadores cruzados Solución de yodo Reactivo universal
Taninos y otros polifenoles
Solución de cloruro férrico Solución de tetróxido de osmio
Tabla 2. Agentes Blanqueadores y Clariflcantes y Medios de Montale Medios de Montaje y Agentes
Usar Agentes Blanqueadores
Solución de hipoclorito de sodio
Agentes Clarificantes
Solución de hidrato de cloral Solución de lactocloral Solución de lactofenol
Medios de Montaje
Glicerina Solución de glicerina-alcohol Mezcla de glicerina-gelatina Agua
Solución de ácido pícrico alcohólico-Preparar una solución de ácido pícrico al 1% en alcohol. El ácido pícrico es útil para teñir células que tienen un citoplasma denso, como las células de aleurona en semillas. Colocar una pequeña cantidad del material vegetal pulverizado en un tubo de ensayo y agitarla con aproximadamente 1 mL de éter de petróleo para eliminar aceites vegetales que interferirían con la reacción. Centrifugar y desechar el éter de petróleo. Empapar el polvo vegetal en Solución de ácido pícrico alcohólico durante aproximadamente 30 minutos. Transferir una porción del polvo a un portaobjetos y observar al microscopio. El citoplasma y los cuerpos proteicos se tornan de un color amarillo brillante. [PRECAUCIÓN-El ácido pícrico es explosivo cuando se seca. Manipular de manera adecuada.] Mezcla de sangre-gelatina-Agregar 4,5 g de gelatina en polvo a 100 mL de una solución de cloruro de sodio al 0,9% y dejar hinchar durante 30 minutos. Calentar el gel mezclándolo hasta aproximadamente 80º, en un baño de agua. Enfriar a 40º y agregar 6 mL de sangre bovina desfibrinada. Calentar a 45º-50º y verter sobre un portaobjetos para microscopio en una capa delgada de aproximadamente 1 mm manteniendo el portaobjetos en posición horizontal. Para evitar pérdidas de la mezcla de sangre-gelatina por los lados del portaobjetos, sellar los bordes con cinta adhesiva de 1 cm de ancho para formar una bandeja. Después de enfriarse y solidificarse, la mezcla está lista para usar. [NOTA-Almacenar en una cámara húmeda durante no más de 1-2 días, a 3º-4º.] Para realizar la prueba de saponinas, colocar grupos pequeños del material vegetal en polvo sobre la capa de sangre-gelatina, dejando una separación de algunos mm entre ellos, transferir a un humidificador durante algunas horas y observar. Las partículas que contengan saponinas originarán zonas claras transparentes en la sangre-gelatina. Solución de carmín-alumbre-verde de metí/o-Calentar a ebullición 1,5 g de carmín durante 30 minutos en una solución de sulfato de potasio y aluminio al 15%. Enfriar, filtrar y agregar mezclando 1 O mL de una solución de verde de metilo al 0,75%. Agregar de 1-2 gotas al material vegetal. La lignina y la suberina se tornan de color verde y la celulosa se torna de color violeta rojizo. Solución de hidrato de cloral-Usar hidrato de cloral SR. Cuando se use la solución como agente clarificante, agregar algunas gotas al material vegetal y calentar a ebullición brevemente sobre una llama pequeña. El hidrato de cloral disuelve el contenido celular y las sustancias intercelulares, y permite observar fácilmente las paredes y las formas celulares. Se puede utilizar para
USP 39
Pruebas Químicas/ (563) Identificación de Artículos de Origen Botánico 423
ayudar a la identificación de súber, fibras, vasos, cristales de oxalato de calcio (con ayuda de polarizadores cruzados), tricomas, estomas y polen. Polarizadores cruzados-Este dispositivo óptico se emplea para detectar cristales de oxalato de calcio y granos de almidón (amiloplastos). Bajo la luz polarizada, los cristales de oxalato de calcio y los granos de almidón aparecen como objetos brillantes, birrefringentes, sobre un fondo oscuro. Los granos de almidón observados bajo la luz polarizada también presentan el efecto de la cruz de Malta, cuyos brazos se cruzan en el hilio. En general, los cristales de oxalato de calcio se ven mejor después de clarificar la muestra con Solución de hidrato de cloral u otro agente clarificante. Ácido acético diluido-Agregar de 1-2 gotas al material vegetal y observar inmediatamente al microscopio. Los depósitos de carbonato de calcio se disuelven con efervescencia. Solución de cloruro férrico-Diluir 1 mL de cloruro férrico SR con 9 mL de agua. Para la detección de grupos hidroxilo fenólicos, como taninos y flavonoides, agregar la solución a la muestra acuosa desde la parte lateral del cubreobjetos. Los taninos y otros polifenoles se tornan de color de negro azulado a verde. Glicerina-Usar como medio de montaje para evitar que las soluciones acuosas y de hidrato de cloral se sequen. Solución de glicerina-alcohol-Mezclar volúmenes iguales de glicerina y alcohol. Usar como medio de montaje. Mezcla de glicerina-gelatina-Agregar 10,0 g de gelatina en polvo a 60 mL de agua. Dejar en reposo durante 2 horas y agregar 70 mL de glicerina que contenga 1,5 g de fenol disuelto. Calentar en un baño de agua y filtrar a través de un embudo precalentado que contenga lana de vidrio. La mezcla filtrada se licúa antes de usar y sirve como medio de montaje. Agregar algunas gotas al material vegetal pulverizado o cortado y cubrir con un cubreobjetos calentado. Esta preparación se utiliza para el almacenamiento a largo plazo de montajes de muestras. Los extremos del cubreobjetos se pueden sellar con bálsamo de Canadá después de algunos meses de secado. Ácido yodhídrico-Agregar de 1-2 gotas al material vegetal. Las paredes celulares de celulosa se tornan de color azul a violeta azulado. Solución de yodo-Agregar de 1-2 gotas de yodo O, 1 N SV al material vegetal. Las partículas de almidón se tornan de color azul oscuro a violeta azulado; esta reacción es reversible si se calienta. [NOTA-Las proteínas, los lípidos y la celulosa se tornan de amarillo a marrón. Las partículas de polvo de guayaco se tornan de verde a azul, pero este reactivo no se usa para la identificación diagnóstica de estas características.] Solución de yodo-glicerina-Disolver 0,3 g de yodo y 1,0 g de yoduro de potasio en una pequeña cantidad de agua y agregar 1O mL de una mezcla de glicerina y agua (1 :1 ). Agregar 1-2 gotas al material vegetal en polvo. Las muestras que contienen saponinas forman grumos o agregados de color amarillo. Si la prueba de una muestra diera un resultado positivo para saponina, el resultado se debe confirmar realizando también una prueba a la muestra con la Mezcla de sangre-gelatina. Solución de lactocloral-Disolver 50,0 g de hidrato de cloral en 50 mL de ácido láctico, calentando suavemente. Agregar algunas gotas al material vegetal. Si fuera necesario, colocar el portaobjetos del microscopio en un pequeño desecador al vacío para eliminar las burbujas de aire. La Solución de hidrato de cloral y la Solución de lactocloral se usan para el mismo tipo de identificación, excepto que la Solución de lactocloral es un agente clarificante más fuerte y se usa para el material vegetal que es más difícil de clarificar. Solución de lactofenol-Mezclar 20 g de ácido láctico, 40 g de glicerina y 20 mL de agua. Agregar 20 g de fenol y mezclar. Éste es un agente clarificante fuerte adecuado para el examen de granos de polen. Solución de naftol-ácido sulfúrico-Preparar una solución al 20% de 1-naftol en alcohol. Agregar al material vegetal 1 gota de solución de 1-naftol y 1 gota de ácido sulfúrico. Los cristales de inulina se tornan de color rojo amarronado y luego se disuel-
ven. Solución de tetróxido de osmio-Disolver O, 1 g de tetróxido de osmio en 5 mL de agua destilada. Agregar 1-2 gotas de la solución así obtenida al material vegetal. Los aceites esenciales, los aceites grasos y otros lípidos, los taninos y los cuerpos proteicos se tornan de color marrón a negro. Solución de floroglucinol-ácido clorhídrico-Esta solución se utiliza para la identificación de la lignina y otros derivados de hidroxifenilpropano; tejidos lignificados como esclereidas, vasos, fibras y células pétreas; y parénquima lignificado. Humedecer el polvo o la muestra cortada con floroglucinol SR y dejar que se seque durante 2-3 minutos antes de colocar el cubreobjetos. Agregar algunas gotas de solución de ácido clorhídrico al 25% y cubrir con el cubreobjetos. Las paredes de las células lignificadas se tornan de color rojo carmín. [NOTA-Este colorante no es estable.] Las células que presentan derivados de hidroxifenilpropano, como vainillina y ácido ferúlico, también se tornan de color rojo. Alternativamente, los derivados del hidroxifenilpropano se pueden extraer del material vegetal y luego éste puede ser examinado. Para extraer los derivados del hidroxifenilpropano, sumergir repetidamente en alcohol el material sin tratar, mezclar en un mezclador de vórtice, centrifugar y desechar el alcohol entre los lavados. A continuación tratar el material vegetal según la especificación provista anteriormente, comenzando con el agregado de floroglucinol SR. Solución de hidróxido de potasio 1 M-Agregar 1 gota al material vegetal. Las células que contienen 1,8-dihidroxiantraquinonas se tiñen de rojo. Solución de rojo de rutenio-Agregar algunas gotas de hidróxido de amonio a rojo de rutenio SR. [NOTA-Almacenar esta solución protegiéndola de la luz.] Agregar 1-2 gotas al material vegetal. Las membranas celulares que contienen pectina, el mucílago ácido y el fitoglicógeno se tornan de color rojo. Solución de hipoclorito de sodio-Esta solución se usa para blanquear cortes con una coloración intensa. Sumergir el material vegetal en la solución durante algunos minutos hasta que esté suficientemente blanqueado. Lavar el tejido con agua y montar
424 (563) Identificación de Artículos de Origen Botánico / Pruebas Químicas
USP 39
con un agente de montaje adecuado. [NOTA-El hipoclorito de sodio extraerá la lignina; el tejido vegetal tratado de esta manera dará un resultado negativo para lignina.] Solución de sudán /1/-Disolver 0,5 g de sudán 111 en 50 mL de alcohol o alcohol isopropílico con ebullición a reflujo. Enfriar, filtrar y agregar 50 mL de glicerina. Agregar de 1-2 gotas de esta solución al polvo vegetal. Los aceites esenciales, las ceras, la cutina, la suberina, los aceites grasos y otros lípidos se combinan con este colorante lipofílico y se tornan de un color rojo anaranjado a un color rojo después de un período corto. Solución de tionina-Preparar una solución de acetato de tionina al 0,2% en alcohol al 25%. Sumergir la muestra seca en esta solución. Después de aproximadamente 15 minutos, lavar el exceso de colorante con alcohol al 25%. El mucílago se habrá hinchado formando glóbulos esféricos y se habrá tornado de color violeta rojizo, mientras que la celulosa, la pectina y los tabiques lignificados se tornarán de color azul o violeta azulado. Solución de azul de toluidina-Utilizando azul de toluidina, proceder según se indica en Solución de tionina.
Reactivo universa/ SOLUCIÓN A: Diluir 20 mL de una solución de sudán 111 saturada con ácido láctico con 30 mL de ácido láctico. SOLUCIÓN B: Disolver 0,55 g de sulfato de anilina en 35 mL de agua. SOLUCIÓN C: Disolver 0,55 g de yoduro de potasio y 0,05 g de yodo en 5 mL de agua y agregar 5 mL de alcohol. PROCEDIMIENTO: Combinar la Solución A, la Solución 8 y la Solución C y agregar mezclando 2,5 mL de ácido clorhídrico. [NOTA-La solución se usa sin filtrar.] Para identificación, agregar 2-3 gotas a la muestra y calentar a ebullición suave sobre una llama pequeña. Si fuera necesario, se pueden agregar cantidades pequeñas de Reactivo universal durante la ebullición. Cubrir con el cubreobjetos. Los elementos lignificados se tornan de color amarillo, la suberina de color marrón rojizo, los lípidos de color rojo y el almidón de color violeta azulado. Agua-Usar como medio de montaje. [NOTA-Todos los grados de agua son aceptables para este propósito.] Solución de cloruro de cinc-yodo-Disolver 20,0 g de cloruro de cinc y 6,5 g de yoduro de potasio en 10,5 mL de agua. Agregar 0,5 g de yodo O, 1 N SV y agitar durante 15 minutos. Filtrar si fuera necesario. Almacenar en recipientes de vidrio con protección actínica. Agregar 1-2 gotas al material vegetal y dejar en reposo durante algunos minutos. Las paredes celulares de celulosa se tiñen de color azul a violeta azulado. Preparación de montajes temporales y cortes manuales: Cuando se use tejido vegetal seco, empapar o calentar a ebullición suave en agua hasta que se ablande. No dejar que se ablande demasiado. El material se puede tratar entonces como material vegetal fresco. Cuando corresponda, usar los medios de montaje o soluciones reactivo indicadas para usar con plantas en polvo para ayudar a visualizar las características del tejido (ver Preparación y uso de soluciones reactivo, dispositivos ópticos y
medios de montaje). Para sacar una película epidérmica de la hoja, pétalo, sépalo, bráctea u otro apéndice similar a la hoja, enrollar el tejido formando un cilindro y hacer una muesca con una cuchilla afilada, revestida de teflón, que haya sido humedecida con agua. Con una pinza tomar el trozo de tejido cortado y tirando hacia atrás, remover un corte transparente de la epidermis. Montar en agua sobre un portaobjetos, colocar un cubreobjetos sobre el tejido, y examinarlo al microscopio Si resulta difícil obtener una película epidérmica mediante el procedimiento anterior, proceder del siguiente modo. Empapar el tejido en una solución de ácido nítrico al 40%- 60%, a 60º durante 3-4 minutos, o hasta que la epidermis se pueda pelar con facilidad. La película epidérmica después se lava en agua de 3-5 veces para eliminar el exceso de ácido nítrico. Neutralizar el tejido en una solución de hidróxido de potasio al 1 % o una solución de hidróxido de sodio al 1 %. Lavar nuevamente el tejido con agua, montar en agua sobre un portaobjetos, colocar un cubreobjetos sobre el tejido, y examinarlo al microscopio. Un método alternativo para preparar tejido foliar para el examen de la epidermis es calentar un fragmento de la hoja (aproximadamente 5 mm x 5 mm) durante 15 minutos en Solución de hidrato de cloral en un baño de agua. Transferir el tejido a un portaobjetos, agregar una gota de agua y cubrirlo con un cubreobjetos. Se pueden emplear estos procedimientos para determinar el tipo, la distribución y el número de estomas, al igual que el índice estomático. El número de estomas se determina contando el número de estomas por unidad de superficie de un campo microscópico. Determinar el número de estomas en al menos 1O sitios diferentes de la muestra y calcular el valor medio. Registrar la superficie foliar que se está observando, si es abaxial o adaxial, ya que con frecuencia el número de estomas de las distintas superficies es muy diferente. Para calcular el índice estomático, la muestra se observa al microscopio con poco aumento. El tamaño de la superficie se define con un micrómetro ocular calibrado y se determina el número de estomas y el número de células epidérmicas para esa superficie. El índice estomático se calcula: Resultado = (100 x S)/(E + S)
S = número de estomas para una superficie determinada E= número de células epidérmicas de la misma superficie Determinar el índice estomático en al menos 1 O sitios diferentes de la muestra y calcular el valor medio. Nuevamente registrar la superficie foliar que se está observando, si es abaxial o adaxial, ya que con frecuencia los índices estomáticos de las distintas superficies son muy diferentes Para hacer un corte transversal de una hoja o raíces delgadas, tallos u otros apéndices delgados, poner el apéndice que se va a cortar sobre un portaobjetos. Colocar otro portaobjetos sobre el apéndice con una porción del tejido expuesto. Con una cuchilla afilada, revestida de teflón, humedecida, cortar derecho hacia abajo a lo largo del borde del portaobjetos superior. Sin mover el portaobjetos superior, cortar de nuevo hacia abajo colocando la cuchilla en ángulo. Se puede necesitar cierta práctica
USP 39
Pruebas Químicas/ (563) Identificación de Artículos de Origen Botánico 425
para poder obtener cortes lo suficientemente delgados, de modo que cuando se monten y se cubran con un cubreobjetos, estos cortes se puedan utilizar para determinar la organización del tejido (por ejemplo, el número de capas en empalizada en la hoja, el grosor de la cutícula, los tipos de tricomas, los tipos de haces vasculares y otros similares). Debido a que las cuchillas se desafilan rápidamente, se deben reemplazar con frecuencia. Usar el corte transversal del tejido foliar así obtenido para determinar la relación de mesófilo en empalizada. Alternativamente, calentar a ebullición fragmentos de hoja de aproximadamente 2 mm 2 en Solución de hidrato de cloral, montar, cubrir con un cubreobjetos y observar al microscopio. Identificar grupos de cuatro células epidérmicas adaxiales y contar las células de mesófilo en empalizada que se extiendan por debajo y estén cubiertas al menos en el 50% por las células epidérmicas. Este valor dividido entre 4 es la relación de mesófilo en empalizada. Determinar la relación de mesófilo en empalizada de al menos 1Ogrupos de células epidérmicas y calcular el valor medio. La relación de mesófilo en empalizada también se puede determinar en material foliar en polvo. Para hacer un corte transversal de tallos o raíces gruesas, u otras partes de la planta, incluidos los tejidos leñosos, sostener el tejido con una mano y utilizando una cuchilla afilada revestida de teflón, previamente humedecida con agua, rebanar un corte transversal del apéndice. Montar en agua, otro medio o solución reactivo, colocar un cubreobjetos sobre el material y examinar al microscopio. En general, con un poco de práctica se pueden hacer cortes que sean lo suficientemente delgados como para determinar la organización del tejido vascular, el tipo de rayos, la distribución del parénquima, la presencia de cristales y similares. Maceración: Para la adecuada identificación del material vegetal, algunas veces es necesario macerar el tejido en sus células individuales antes del examen microscópico. Esta técnica puede ser particularmente útil para tejidos leñosos u otros tejidos duros. El material se corta en pequeños trozos de aproximadamente 2 mm de grosor y 5 mm de largo o se rebana en trozos de aproximadamente 1 mm de grosor. Según la naturaleza de la pared celular, se emplea uno de los métodos siguientes. Para tejidos duros o muy lignificados, usar el Método l. Para tejidos que no están muy lignificados, usar el Método //. Método I
SOLUCIÓN A: Usar solución de ácido nítrico 4 N. SOLUCIÓN B: Preparar una mezcla de solución de trióxido de cromo 1,2 M y ácido sulfúrico (7:4). PROCEDIMIENTO: Colocar el material vegetal en un tubo de ensayo que contenga aproximadamente 5 mL de una mezcla de la Solución A y de la Solución B (1 :1 ). Calentar en un baño de agua durante 20 minutos. Lavar varias veces el tejido con agua y transferir a un portaobjetos. Desmenuzar el tejido con una aguja de disección, agregar 1-2 gotas de medio de montaje, cubrir con un cubreobjetos y examinar al microscopio. Si fuera necesario, las células se pueden separar más entre sí al presionar el cubreobjetos con un movimiento suave y deslizante. El tejido macerado dará un resultado negativo en la prueba para lignina. Método 11
PROCEDIMIENTO: Colocar el material vegetal en un tubo de ensayo que contenga aproximadamente 5 mL de una solución de hidróxido de potasio 2 M. Calentar en un baño de agua durante 30 minutos. Lavar varias veces el tejido con agua y transferir a un portaobjetos. Agregar 1-2 gotas de medio de montaje. Colocar un cubreobjetos sobre el tejido, presionar hacia abajo, aplastando el tejido y examinar al microscopio. El tejido macerado dará un resultado negativo en la prueba para lignina. Preparación de materiales en polvo: Colocar 1 ó 2 gotas de agua, otro medio de montaje o una solución reactivo en el centro de un portaobjetos limpio. Humedecer la punta de una aguja de disección con agua y sumergir en el polvo en análisis. Transferir una pequeña cantidad de material que se adhiera a la aguja al líquido en el portaobjetos y mezclar minuciosamente y con cuidado. Cubrir con un cubreobjetos limpio. Debido a que se ha destruido la organización de las estructuras del tejido dentro del tejido vegetal, las características importantes a observar del material vegetal en polvo son las características físicas y químicas de los tejidos y los tipos celulares, al igual que la presencia y las características químicas y físicas de sustancias ergásticas. Los tejidos, células y sustancias ergásticas específicas que se van a examinar se especifican en la monografía individual. PROCEDIMIENTO PARA MONTAJES PERMANENTES DELGADOS Cuando sea necesario revelar características histológicas detalladas de una muestra vegetal, se deben obtener cortes delgados del tejido. Los cortes deben ser lo suficientemente delgados para transmitir luz y se deben cortar en un plano que permita exponer las características deseadas. El material vegetal se mata, fija y deshidrata en forma adecuada y se incluye en parafina u otro medio de inclusión. El medio de inclusión se usa como una matriz de soporte sólido durante el corte del tejido. Después de efectuar el corte y el montaje, frecuentemente se realiza la tinción de la muestra para ayudar a la diferenciación de determinadas estructuras.[NoTA-EI proceso de fijación, deshidratación, inclusión y tinción se puede acelerar significativamente si se utiliza un horno de microondas diseñado específicamente para trabajo histológico.] Muerte y fijación: El primer paso en la preparación de material vegetal para corte es matar las células vivas y conservar el tejido. Con mucha frecuencia, esto se hace mediante el empleo de un fijador químico. Un buen fijador de uso general para material vegetal es una mezcla de formaldehído, ácido acético y alcohol (FAA). Solución FAA-Mezclar 50 mL de alcohol, 5 mL de ácido acético glacial, 1 O mL de solución de formaldehído y 35 mL de agua. [NOTA-Preparar periódicamente una solución nueva, ya que con el almacenamiento pierde su eficacia.] Procedimiento-Sumergir completamente el material vegetal en la Solución FAA. Dejar el material sumergido durante 18-24 horas a temperatura ambiente. El material vegetal se puede conservar indefinidamente en Solución FAA, siempre que el mismo permanezca completamente sumergido y no se deje secar. Determinados tejidos pueden requerir infiltración al vacío para facilitar la penetración del fijador. La infiltración al vacío es necesaria si el tejido tuviera abundantes espacios de aire o pelos epidér-
426 (563) Identificación de Artículos de Origen Botánico / Pruebas Químicas
USP 39
micos, o si flotara en la superficie de la solución de fijación. Colocar el tejido en un vial pequeño que contenga el fijador. Colocar el vial sin tapar en una campana de cristal o desecador que esté conectado a una fuente de vacío, preferentemente una bomba de vacío con sello de aceite. Conectar la salida del sistema de vacío a una campana de extracción para evitar que los vapores de fijación llenen la habitación. Encender lentamente el vacío. No usar un vacío fuerte porque el fijador puede comenzar a hervir y dañar el tejido. A medida que el aire residual es extraído del tejido, éste subirá a la superficie. Encender y apagar durante varios ciclos de vacío hasta que el tejido quede en el fondo del recipiente durante un ciclo "encendido". Deshidratación del tejido: La parafina y otros medios de inclusión son hidrófobos. Por lo tanto, se debe eliminar el agua del tejido vegetal después de la fijación. Esto se lleva a cabo sumergiendo el tejido fijado en soluciones de deshidratación, siendo estas soluciones una serie de mezclas de alcohol y agua con concentraciones de alcohol en aumento. La solución final de la serie es alcohol deshidratado. Comenzar lavando el tejido fijado una o dos veces con alcohol nuevo al 50% para eliminar trazas de FAA. Eliminar esta solución y eliminar a continuación cualquier otra solución de deshidratación decantando la solución o eliminándola con ayuda de una pipeta de vidrio. Agregar la primera solución de deshidratación (alcohol al 70%) al vial, sumergiendo el tejido completamente. La serie graduada alcohol-agua y los tiempos sugeridos para la inmersión del tejido se listan en la Tabla 3. Tabla 3 Solución de Deshidratación
Tiempo (h)
Alcohol al 50%
1-2
Alcohol al 70%
1-2
Alcohol al 90%
1-2
Alcohol al 95%
1-2
Alcohol deshidratado con O, 1% de safranina O
2-4
Alcohol deshidratado
1
Se agrega safranina O a la penúltima solución de deshidratación de la serie para visualizar el tejido cuando ha quedado incluido en parafina. Si el tejido que se va a cortar es duro o leñoso, es posible que el tiempo de cada uno de los pasos de la serie se deba aumentar hasta 24 horas. Si fuera necesario, el tejido se puede almacenar durante varios días en alcohol al 70% o en soluciones con concentraciones de alcohol aún más altas. Inclusión Preparación para inclusión REMOCIÓN DE ALCOHOL: La parafina es el medio de inclusión más común, aunque se dispone de otros medios de inclusión. Después de la deshidratación, el alcohol se elimina del tejido por medio de una serie graduada de soluciones de alcohol deshidratado-xileno, debido a que la parafina no es soluble en alcohol. La serie graduada de alcohol deshidratado-xileno y los tiempos sugeridos para la inmersión del tejido se listan en la Tabla 4. Tabla 4 Solución de Remoción de Alcohol
Tiempo (h)
Una mezcla de alcohol deshidratado y xi le no (3: 1)
1
Una mezcla de alcohol deshidratado y xileno (1 :1)
1
Una mezcla de alcohol deshidratado y xileno (1 :3)
1
Xileno
1
Xileno
1
REMOCIÓN DE XJLENO: Una vez que el xileno haya reemplazado completamente al alcohol, agregar lentamente parafina para infiltrar el tejido y eliminar el xileno. Proceder del siguiente modo: 1. Por cada mL de xileno, agregar aproximadamente 1 perla de parafina al vial del tejido, tapar y dejar en reposo a temperatura ambiente durante 4 horas. Agregar más perlas de parafina hasta que no se disuelvan más perlas. 2. Colocar el tejido en un horno mantenido a 42º-45º. Agregar 2-3 perlas de parafina cada hora hasta que a esa temperatura no se disuelvan más perlas. 3. Verter un tercio del volumen y reemplazar con un volumen igual de parafina fundida. No tapar y transferir el vial a un horno mantenido a 58º-60º. 4. Después que la parafina se vuelva a fundir (aproximadamente 4 horas más tarde), verter la mitad del volumen y reemplazar con un volumen igual de parafina fundida. Transferir el vial al horno mantenido a 58º-60º si la parafina comienza a solidificarse. 5. Repetir el cuarto paso dos veces más, después verter todo el volumen de parafina-xileno. Reemplazar con parafina pura fundida. Aproximadamente 4 horas más tarde, verter la parafina y reemplazarla con parafina pura fundida nueva. Volver a verter y reemplazar 4 horas más tarde, y dejar en reposo durante toda la noche. [NOTA-Transferir el vial al horno mantenido a 58º-60º si la parafina comienza a solidificarse en algún momento.] Procedimiento de inclusión-Verter el tejido con la parafina en un molde de inclusión. La parafina debe cubrir el tejido por completo aproximadamente 3-5 mm. Colocar el molde de inclusión en una plataforma de calentamiento precalentada, diseñada para trabajo histológico. Ajustar el tejido en el molde con la orientación adecuada para realizar el corte. Lentamente, en-
USP 39
Pruebas Químicas/ (563) Identificación de Artículos de Origen Botánico 427
friar la parafina deslizando el molde hacia abajo, hacia el lado frío de la plataforma, hasta que la parafina se solidifique. Sumergir el bloque de parafina en agua helada para enfriarlo rápidamente y evitar que se formen cristales de parafina. Almacenar el bloque de parafina a 4º. Corte y montaje: Cortar el bloque de parafina en trozos, cada uno de los cuales debe contener una muestra de tejido. Recortar el bloque de parafina lo más cerca posible de la masa de tejido, para formar un rectángulo o una forma casi trapezoidal. Este recorte evitará problemas de corte debidos al exceso de parafina alrededor del tejido. Para hacer cortes transversales, orientar el tejido en un ángulo recto respecto a un bloque de tejido de madera cuya superficie se haya empapado en parafina fundida. Fijar el bloque de parafina a la superficie del bloque de tejido. Agregar una pequeña cantidad de parafina fundida a la base del bloque de parafina para facilitar la formación de un sello más impermeable. Enfriar el bloque a 4º. Montar y ajustar en forma apropiada el tejido y el bloque de parafina en un micrótomo. Usar una cuchilla de micrótomo de acero inoxidable adecuadamente afilada. Ajustar el micrótomo para hacer cortes de 8-15 µm de grosor (1 O µm es el grosor óptimo para la mayoría de los tejidos). Hacer cortes individuales o en serie. Preparar un portaobjetos para microscopio del siguiente modo. Se puede preparar un adhesivo en forma de solución con 1 % de gelatina y 0,5% de benzoato de sodio que se calienta a 30º-35º para disolver la gelatina. Hacer un frotis de una película delgada del adhesivo así obtenido sobre el portaobjetos, dejar que se seque, enjuagar con una solución de formaldehído SR al 4% y agregar una pequeña cantidad de agua. Colocar al revés las secciones cortadas sobre el portaobjetos, de modo que floten en agua e inundar con una solución de formaldehído SR al 4%. Los cortes se extienden inmediatamente y desaparecen las arrugas. Colocar el portaobjetos sobre una plataforma de calentamiento, mantenida a 42º, para que los cortes se expandan. Pipetear y secar el exceso de agua y solución de formaldehído. Secar durante toda la noche en un horno a 42º para asegurar la adherencia del corte de tejido al portaobjetos. Tinción Preparación para tinción-Sumergir dos veces en xileno el portaobjetos con el tejido fijado, durante 10-15 minutos cada vez para eliminar la parafina. Luego sumergir el portaobjetos en la siguiente secuencia de soluciones, dejándolo durante 5 minutos en cada solución y teniendo cuidado de no sacar el tejido: una mezcla de alcohol deshidratado y xileno (1 :1 ), alcohol deshidratado, alcohol y una solución de alcohol al 70%. El tejido se blanquea antes de la tinción si está opaco debido a la presencia de taninos u otros materiales ergásticos. Para blanquear, sumergir el portaobjetos en una solución de permanganato de potasio al 1% durante 1 minuto, enjuagar con agua, sumergir en una solución de ácido oxálico al 5% durante 1 minuto y enjuagar minuciosamente con agua. El material está ya listo para la tinción. Para la mayoría de los trabajos de identificación botánica se recomienda usar uno de los dos procedimientos de tinción siguientes. El primer procedimiento de tinción emplea safranina O contrastada con fast green. Un procedimiento alternativo emplea safranina O contrastada con anaranjado G. Tinción de safranina 0-fast green SOLUCIÓN DE TINCIÓN DE SAFRANINA O: Preparar una mezcla de metoxietanol, alcohol deshidratado, agua y solución de formaldehído (50:25:25:2). Agregar una cantidad suficiente de acetato de sodio para obtener una solución que contenga 1% de acetato de sodio y mezclar. Agregar una cantidad suficiente de safranina O para obtener una solución que contenga 1% de safranina O y mezclar. SOLUCIÓN DE TINCIÓN DE FAST GREEN: Preparar una mezcla de metoxietanol, alcohol deshidratado y salicilato de metilo (1 :1 :1) que contenga 0,05% de fast green FCF. PROCEDIMIENTO: Una vez que el tejido haya sido rehidratado con alcohol al 70% según se describe en Preparación para tinción, sumergir durante 2-24 horas, dependiendo del tejido, en Solución de tinción de safranina O. Eliminar el exceso de colorante sumergiendo varias veces el portaobjetos en agua. Transferir el portaobjetos a una solución de alcohol que contenga 0,5% de ácido pícrico durante 2-1 O segundos para eliminar aún más el exceso de colorante del corte y ayudar a la diferenciación de las estructuras del tejido. Para detener la acción del ácido pícrico, transferir el portaobjetos durante 1O segundos a 1 minuto a una solución de alcohol que contenga 4 gotas de hidróxido de amonio por cada 100 mL de alcohol. Transferir el portaobjetos al alcohol deshidratado durante 1O segundos. Inspeccionar visualmente al microscopio el tejido teñido para comprobar si es necesaria una mayor decoloración con ácido pícrico. Contrastar durante 10-15 segundos en Solución de tinción de fast green. Pasar el portaobjetos por dos cambios de una mezcla de salicilato de metilo, alcohol deshidratado y xileno (2:1 :1 ); cada cambio dura 5-1 O segundos. Luego transferir el portaobjetos a una mezcla de xileno y alcohol deshidratado (95:5) durante 1 minuto. Pasar por dos cambios de xileno. Almacenar en xileno hasta que esté listo para montar el cubreobjetos. Los cromosomas, los núcleos y las paredes celulares lignificadas, cutinizadas o suberizadas, se teñirán de color rojo. El citoplasma y las paredes celulares de celulosa se teñirán de color verde a azul, dependiendo del pH del tejido. Tinción de anaranjado G-safranina O SOLUCIÓN DE TINCIÓN DE SAFRANINA O: Preparar una solución de safranina o al 0,004%. SOLUCIÓN DE TINCIÓN DE ANARANJADO G: Disolver 2 g de anaranjado G, 5 g de ácido tánico y 4 gotas de ácido clorhídrico en agua y diluir con agua hasta 1 00 ml. PROCEDIMIENTO: Una vez que el tejido haya sido rehidratado con alcohol al 70%, según se describe en Preparación para Tinción, transferir en forma secuencial el portaobjetos por la serie de soluciones en la Tabla 5. Tabla 5 Solución
Tiempo
Alcohol al 35%
5 min
Una solución filtrada de cloruro de cinc al 2%
1 min
428 (563) Identificación de Artículos de Origen Botánico/ Pruebas Químicas
USP 39
Tabla 5 (Continuación) Solución Agua
Tiempo 5s 5 min
Solución de tinción de safranina O
5 s
Agua
1 min
Solución de tinción de anaranjado G
5 s
Agua Una solución filtrada de ácido tánico al 5%
5 min
Agua
3s
Una solución de sulfato férrico amónico al 1%
2 min
Agua
15 s
Alcohol al 45%
10 s
Alcohol al 90%
10 s
Alcohol deshidratado
10 s 1-2 min
Una mezcla de alcohol deshidratado y xileno (1 :1)
Finalmente, almacenar en xileno hasta que esté listo para colocar el cubreobjetos. Las paredes celulares de celulosa se teñirán de negro azulado, los núcleos de color amarillo, los granos de almidón de color negro y las paredes celulares lignificadas de color rojo. Montaje del cubreobjetos: El montaje del cubreobjetos sobre el tejido completa la preparación del portaobjetos. Como adhesivo se puede usar bálsamo de Canadá, diluido con una pequeña porción de xileno. En el mercado existen otros medios de montaje disponibles. Cuando se seca el medio de montaje, el portaobjetos puede examinarse al microscopio. Todo el proceso de preparación de extensiones permanentes sobre portaobjetos puede llevar 5 días o más. Microscopía electrónica de barrido: Los productos botánicos comercializados por lo general se encuentran en forma de polvo o en trozos, lo que dificulta y generalmente imposibilita la autenticación mediante un método rutinario de corte transversal del artículo. Las estructuras tales como los vasos del xilema y las traqueidas se pueden partir en trozos más pequeños, lo que dificulta y en ocasiones imposibilita la detección de puntuaciones y lignificaciones en las paredes usando un microscopio óptico. Las estructuras que son resistentes a estos procesos son más útiles en la identificación. La microscopía electrónica de barrido (SEM, por sus siglas en inglés) es útil para caracterizar el tamaño y la morfología de muestras microscópicas. Mediante la SEM es posible observar e identificar las características diferenciales más detalladas en la estructura de los tricomas, elementos peculiares en la epidermis, junto con material granular superficial que contenga compuestos específicos, lo cual ayuda en la identificación de especies particulares. La SEM se ha usado ampliamente para investigar la topología superficial de una extensa variedad de materiales vegetales y puede desempeñar un papel vital en la autenticación de un producto botánico completo, aquéllos en forma de polvo, distinguiendo entre especies estrechamente relacionadas, y se puede usar para examinar una mezcla de polvos. El capítulo general de USP Microscopía Electrónica de Barrido (1181) proporciona una introducción e información general acerca de la SEM con respecto a su aplicación a artículos farmacopeicos. La SEM produce una resolución más alta en comparación con la resolución obtenible usando un microscopio óptico y las imágenes obtenidas son tridimensionales. La SEM tiene la ventaja de proporcionar imágenes con una gran profundidad de campo, lo cual premite enfocar un espesor importante de la muestra de una sola vez. Asimismo, permite el análisis de muestras de tamaños tan grandes como 50 mm, lo que permite producir micrografías electrónicas con los detalles topográficos de un objeto claramente visibles para el ojo humano. La resolución máxima para la SEM (la distancia mínima por la cual se pueden separar y observar los dos objetos como objetos distintos) es de 10-20 nm en comparación con 200-300 nm para la microscopía óptica. El aumento típico de la SEM varía de xl O a x300 000. Los instrumentos comerciales SEM también están disponibles con aumentos tan bajos como x5 y tan altos como x2 000 000. En comparación, los microscopios ópticos modernos típicos tienen un intervalo de aumento de xl O a x2000. A un aumento bajo, las imágenes obtenidas con la SEM proporcionan más información que aquéllas obtenidas mediante microscopía óptica. La SEM puede producir imágenes cuyos constrastes se basan en variaciones composicionales de las muestras.
IDENTIFICACIÓN QUÍMICA Para tener la certeza de que se logra la autenticidad del artículo, se realiza la identificación química junto con la identificación botánica descrita anteriormente. La identificación química generalmente emplea procedimientos cromatográficos para detectar la presencia de compuestos indicadores o marcadores especificados en la monografía individual. Se pueden emplear perfiles espectroscópicos o cromatográficos para obtener la identificación química mediante la comparación de huellas dactilares o caracterizaciones con un estándar o muestra de referencia. Algunos ejemplos de métodos espectroscópicos son ultravioleta (UV, por sus siglas en inglés), infrarrojo (IR) e IR por transformada de Fourier (ver Pruebas de Identificación Espectrofotométrica (197)). Algunos ejemplos de métodos cromatográficos son cromatografía líquida de alta presión (HPLC, por sus siglas en inglés), cromatografía en capa delgada (TLC, por sus siglas en inglés), TLC bidimensional y cromatografía de gases (GC, por sus
USP 39
Pruebas Químicas/ (563) Identificación de Artículos de Origen Botánico 429
siglas en inglés) (ver Cromatografía (621 )). Los métodos analíticos utilizados para producir huellas dactilares deben ser capaces de detectar tantos componentes químicos como sea posible. Puede resultar útil emplear huellas dactilares múltiples, tales como una combinación de métodos analíticos con principios de separación y condiciones de prueba diferentes. Además de los métodos cromatográficos espectroscópicos, en la monografía individual también se pueden especificar métodos cualitativos de química húmeda.
Quimiotaxonomía La quimiotaxonomía es la clasificación de las plantas, basada en sus componentes químicos, y la misma puede resultar útil para la identificación de artículos botánicos. Los compuestos metabólicos que se encuentran en los tejidos vegetales se pueden dividir en dos amplias categorías, en base a sus funciones. La primera categoría comprende los metabolitos primarios-metabolitos que participan en los procesos fisiológicos vegetales, que son absolutamente necesarios para la vida y están presentes en todo el reino vegetal. Estos procesos comprenden la fotosíntesis, la respiración y el metabolismo de los ácidos nucleicos, las proteínas, los carbohidratos y los lípidos. La segunda categoría comprende metabolitos secundarios-compuestos que no se consideran absolutamente necesarios para los procesos vegetales, aunque pueden tener funciones importantes en las interacciones de las plantas con otros organismos, como interacciones alelopáticas; en la defensa química contra herbívoros y patógenos vegetales, y en las señales para atraer animales que polinizan y propagan las semillas. Se sabe que muchos metabolitos secundarios tienen actividad farmacológica. También representan la base de la quimiotaxonomía vegetal. Los metabolitos secundarios pertenecen a varias clases químicas diferentes, tales como aminoácidos no proteicos, flavonoides, xantonas, cumarinas, poliacetilenos, policétidos cíclicos, monoterpenos, sesquiterpenos, iridoides, triterpenos, esteroles, terpenos que contienen nitrógeno y alcaloides. Estas clases químicas no se encuentran en todo el reino vegetal, sino que tienden a ser específicas para determinadas clases, órdenes y familias botánicas. Por otra parte, muchas subclases químicas y compuestos secundarios particulares son específicos para determinadas subfamilias, géneros o especies. Estas subclases químicas y compuestos particulares son los que se pueden usar como compuestos marcadores para ayudar a la identificación adecuada del material vegetal.
Principios Activos y Compuestos Marcadores Para la identificación química de artículos botánicos se preparan extractos. Dichos extractos son generalmente mezclas complejas de varios componentes químicos. En la gran mayoría de los extractos botánicos no se conoce con certeza cuál de los diferentes componentes es responsable del efecto farmacológico informado. En general, se cree que los distintos componentes actúan en forma sinérgica para proporcionar el efecto informado. En el caso de artículos para los que existen monografías oficiales, se eligen determinados componentes químicos del artículo y se proporcionan procedimientos de pruebas cuantitativas para determinar su contenido. La elección de dichos componentes, generalmente conocidos como compuestos marcadores, se basa en ciertas consideraciones. Actualmente, en las monografías oficiales se especifican los siguientes tipos de compuestos marcadores y pueden ser identificados en materias primas: PRINCIPIOS ACTIVOS Estos son componentes que han demostrado ser los responsables de la actividad clínica. Generalmente, en la monografía individual se especifica un intervalo o contenido mínimo de los principios activos. Una determinación cuantitativa de los principios activos durante estudios de estabilidad de formas farmacéuticas botánicas provee la información necesaria para determinar fechas de caducidad apropiadas. MARCADORES ACTIVOS Estos componentes tienen actividad farmacológica conocida que contribuye en cierto grado a la eficacia. Sin embargo, la eficacia clínica de estos componentes puede no estar demostrada. Generalmente, en las monografías individuales se especifica un contenido o intervalo mínimo de los marcadores activos. Una determinación cuantitativa de los marcadores activos durante estudios de estabilidad de formas farmacéuticas botánicas provee la información necesaria para determinar fechas de caducidad apropiadas. MARCADORES ANALÍTICOS Cuando no se conocen ni los principios activos ni los marcadores activos, se eligen otros componentes del extracto botánico a los que se les puedan realizar determinaciones cuantitativas. Estos marcadores ayudan a la identificación positiva del artículo en análisis. Además, mantener un contenido mínimo o un intervalo específico de los marcadores analíticos ayuda a lograr la normalización del extracto vegetal y a determinar una fecha de caducidad apropiada durante los estudios de estabilidad.
430 (563) Identificación de Artículos de Origen Botánico / Pruebas Químicas
USP 39
MARCADORES NEGATIVOS Estos componentes pueden tener propiedades alergénicas o tóxicas. La presencia de estos componentes resulta indeseable en el extracto botánico. Por ejemplo, los ácidos ginkgólicos del ginkgo pertenecen a esta categoría. Las monografías individuales pueden tener especificado un límite estricto para estos marcadores negativos.
Uso de Artículos de Referencia USP Se usan artículos de referencia para ayudar a la identificación de compuestos marcadores dentro del artículo de prueba. Los artículos de referencia son Materiales de Referencia Autenticados USP o Estándares de Referencia USP (ver Estándares de Referencia USP (11 )), según lo que especifique en la monografía individual. Los Estándares de Referencia USP utilizados para identificar compuestos indicadores o marcadores en los artículos de prueba pueden ser una entidad química purificada única, una mezcla de entidades químicas purificadas o un extracto estandarizado preparado a partir del artículo vegetal autenticado. Además se pueden utilizar Estándares de Referencia USP para cuantificar compuestos marcadores, según se especifique en la monografía individual. Se somete un artículo de prueba pulverizado a un procedimiento de extracción especificado (ver Métodos de Extracción en Extractos Botánicos (565)) y se prepara para el análisis cromatográfico o de química húmeda. Cuando se dispone de un Material de Referencia Autenticado USP, se somete al mismo procedimiento de extracción que al artículo de prueba. Luego se someten la preparación de prueba y los artículos de referencia al mismo procedimiento cromatográfico o de química húmeda especificado en la monografía individual. Se compara la respuesta de la preparación de prueba con la respuesta de los artículos de referencia para determinar la presencia de los compuestos indicadores o marcadores en el artículo de prueba.
MÉTODOS BASADOS EN ADN PARA LA AUTENTIFICACIÓN DE ARTÍCULOS DE ORIGEN BOTÁNICO Debido a que a menudo resulta imposible la identificación morfológica cuando el material vegetal original consta de partes de la planta secas, cortadas y modificadas o procesadas, o cuando el material consiste únicamente en una sola parte entera de la planta sin caracteres taxonómicos, estos tipos de muestras por lo regular requieren métodos de identificación adicionales, tales como identificación basada en ADN. Los métodos basados en ADN han demostrado ser eficientes para distinguir materiales vegetales genuinos de materiales adulterantes en matrices botánicas complejas y pueden complementar a los métodos de identificación botánica tradicionales que se basan en características morfológicas o químicas. Además, los métodos basados en ADN a menudo son más confiables que los métodos tradicionales, en especial cuando se aplican a muestras de un sólo órgano que carecen de caracteres taxonómicos de diagnóstico, a materiales en polvo en los que ya no son apreciables las características que los distinguen o cuando es difícil distinguir entre especies estrechamente relacionadas o morfológicamente similares.
Código de Barras de ADN (DNA Barcoding) El código de barras de ADN es un método de identificación particular basado en secuenciación de ADN que emplea secuencias específicas cortas de loci de ADN nuclear o de plástidos para la identificación de especies de plantas. Las pruebas se basan en la comparación de las secuencias de nucleótidos de un tramo específico de ADN (secuencias de ADN o código de barras de ADN) para realizar una identificación basada en secuencias del ADN. Asimismo, los métodos basados en ADN, tales como las tecnologías de secuenciación de nueva generación (NGS, por sus siglas en inglés), son capaces de identificar múltiples especies en una mezcla, incluyendo especies esperadas e inesperadas.
Identificación de Productos Botánicos Usando Secuenciación del ADN (Sanger) El proceso de identificación de productos botánicos que usa secuenciación del ADN (Sanger) incluye selección de marcadores, extracción del ADN, cebadores y amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), secuenciación del ADN y comparación con materiales de referencia, tal como se describe en las secciones siguientes. Ver Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Extracción, Detección y Secuenciación (1126), Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Amplificación (1127) y Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Genotipificación (1129) para información adicional. SELECCIÓN DE MARCADORES La secuencia seleccionada debe ser lo suficientemente específica para capturar cualquier especie primaria adulterante y potencial en la muestra, pero también lo suficientemente universal para evitar reacciones de falsos negativos para especies estrechamente relacionadas. Por ejemplo, un cebador específico para una especie no es apropiado para la mayoría de los procedimientos de identificación, debido a que no pueden detectarse los adulterantes y porque una falla en la amplificación puede ser el resultado tanto de la ausencia de las especies o de la degradación del ADN. En muchos casos, un solo marcador puede ser suficiente para la identificación, pero múltiples marcadores de diversas partes del genoma (p.ej. material nuclear o de los plás-
USP 39
Pruebas Químicas/ (563) Identificación de Artículos de Origen Botánico 431
tidos) aseguran la detección de los híbridos. Por lo regular, las regiones usadas para la identificación de secuencias de ADN tienen una longitud de 100 a 1500 pares de bases. Los fragmentos de ADN más pequeños pueden ser menos susceptibles a la degradación del ADN. EXTRACCIÓN DEL ADN Antes de que se pueda llevar a cabo la amplificación del marcador deseado, se debe extraer el ADN genómico en su totalidad. La aptitud de un procedimiento de extracción genómica depende del material inicial y de la pureza del ADN requerido para las aplicaciones posteriores. Los procedimientos principales se describen a continuación, además de que se encuentran disponibles diversos kits comerciales para ajustarse a diferentes tipos de muestras y aplicaciones. Se debe extraer del material vegetal molido todo el ADN genómico. Los materiales vegetales pueden homogeneizarse manualmente usando un mortero y una mano de mortero, una moledora mecánica u otro aparato, dependiendo de la naturaleza del material. La extracción y purificación de la totalidad del ADN genómico puede ser complicada debido a la abundancia de metabolitos secundarios (polisacáridos, taninos, aceites esenciales, fenoles, alcaloides y ceras) en muchas especies de plantas medicinales. Algunos metabolitos secundarios pueden coprecipitar con el ADN durante la extracción y pueden inhibir otras reacciones enzimáticas, incluyendo la digestión por restricción y la PCR. En particular, grandes cantidades de polisacáridos complejos pueden imposibilitar la extracción de ADN utilizable, volviendo la porción acuosa del extracto demasiado viscosa como para permitir que el ADN se separe eficientemente de los polisacáridos contaminantes. Este tipo de contaminación puede llevar a una escasa extracción de ADN y puede evitar el acceso de enzimas modificadoras. Resultan apropiados numerosos métodos de extracción de ADN usados comúnmente para una amplia variedad de materiales vegetales frescos y secos, incluyendo bromuro de cetiltrimetilamonio, métodos basados en sílice y una variedad de kits disponibles comercialmente que emplean columnas de sílice o perlas magnéticas recubiertas con vidrio. Aunque muchos de estos métodos funcionan bien en materiales frescos y secos y en cualquier parte de la planta, aquéllos que se degradan o que contienen niveles significativos de compuestos secundarios u otros inhibidores de la PCR pueden requerir ajustes menores en los protocolos estándar de extracción. CEBADORES Y AMPLIFICACIÓN POR PCR Por lo regular, los cebadores para PCR tienen una longitud de 18 a 30 bases y amplifican una región con una longitud de 100 a 1500 pares de bases. Como se indicó anteriormente, los cebadores para PCR pueden ser universales, es decir, capaces de amplificar cualquier organismo potencial presente en una muestra de prueba (incluyendo hongos, plantas y animales o un subconjunto importante y predecible) o pueden ser específicos de taxón, lo que significa que han sido diseñados para amplificar sólo organismos de un conjunto determinado (es decir, familia, géneros, especies o subespecies). Para la amplificación universal, se utilizan diversas regiones génicas nucleares, mitocondriales y de plástidos, incluyendo nrlTS, nrlTSl, nrlTS2, matK, rbcL, espaciador intergénico psbA-trnH, cox3, COI (también conocido como coxl), espaciador externo transcrito, 18S, 5S, espaciador intergénico trnL-trnF e intrón trnL. Los cebadores específicos de taxón pueden estar diseñados basándose en las proteínas encontradas en grupos vegetales específicos (p.ej., el gen de lecitina de soja encontrado en la soja) u obteniendo secuencias de cualquier región variable de ADN para el taxón determinado y cebadores diseñados para unirse única y específicamente a las secuencias del taxón de interés. SECUENCIACIÓN DEL ADN Resulta más común llevar a cabo la secuenciación del ADN usando el protocolo de Sanger, que se ha modificado para usar terminadores colorantes fluorescentes en un aparato de electroforesis capilar, aunque en este momento, se están abriendo paso diversas tecnologías emergentes de secuenciación [p.ej., secuenciación de nueva generación (NGS)]. Una vez que el colorante fluorescente se ha incorporado en el ADN amplificado, se identifican las bases mediante su emisión de luz a diferentes longitudes de onda. Los datos resultantes son un cromatograma que se puede visualizar y analizar usando diversos programas computarizados de análisis de secuencias. COMPARACIÓN CON MATERIALES DE REFERENCIA Las secuencias de ADN de los artículos de prueba se comparan con secuencias obtenidas de diversos materiales de referencia en una matriz alineada (proceso comúnmente referido como alineación), lo cual permite examinar visualmente las secuencias para identificar posiciones de nucleótidos diagnósticas. Aunque una buena cantidad de programas computarizados son capaces de automatizar las comparaciones entre secuencias derivadas de artículos de prueba y secuencias de referencia, el desempeño varía considerablemente. Se recomienda que los investigadores verifiquen siempre de forma manual los resultados sugeridos por los programas computarizados para confirmar la identidad. Las identificaciones positivas no son posibles cuando las secuencias de los artículos de prueba caen fuera del intervalo de variación conocido representado en las secuencias de referencia. Si se ha utilizado un número suficientemente grande de materiales de referencia para desarrollar la prueba, la mayoría de los materiales de prueba deberían identificarse sin ambigüedad basándose en los datos de secuencias de ADN.
432 (565) Extractos Botánicos / Pruebas Químicas
USP 39
(565) EXTRACTOS BOTÁNICOS En la práctica de extracción para artículos de origen botánico, los componentes de interés se separan total o parcialmente de los otros componentes con ayuda de agua, alcohol, mezclas de alcohol y agua u otros disolventes adecuados. El proceso de extracción implica la extracción de los componentes deseados de la materia de origen vegetal con disolventes adecuados, la evaporación de todo o casi todo el disolvente y el ajuste de los líquidos, masas o polvos residuales a los estándares prescritos. Se pueden agregar sustancias inertes adecuadas como vehículos o diluyentes para mejorar las características físicas. Se pueden agregar agentes antimicrobianos y otros conservantes adecuados para preservar la integridad. Los extractos pueden estar sujetos a procesos que aumentan el contenido de los componentes caracterizados, que disminuyan el contenido de componentes no deseados, o ambos. Los extractos que no tienen sustancias inertes agregadas ni procesamientos más allá de la extracción se llaman extractos naturales. En algunas preparaciones, la materia de origen vegetal puede tener un tratamiento previo mediante la inactivación de enzimas y contaminantes microbianos, molienda, desengrasado o un procedimiento similar. Los extractos se pueden definir como preparaciones con consistencia líquida, sólida o semisólida. Los productos obtenidos mediante extracción son extractos líquidos, extractos en polvo, extractos semisólidos y tinturas.
MÉTODOS DE EXTRACCIÓN Percolación En la fabricación de extractos, la percolación es un método comúnmente usado. El material sin refinar a extraer se reduce a trozos de un tamaño adecuado, si fuera necesario, luego se mezcla bien con una porción del disolvente especificado y se deja en reposo durante aproximadamente 15 minutos. La mezcla se transfiere a un percolador, se agrega una cantidad suficiente del disolvente especificado para cubrir toda la masa sólida y se deja percolar la mezcla lentamente (a una velocidad no mayor de 1 mL por minuto por 1000 g de material), manteniendo la materia a extraer siempre recubierta con una capa de disolvente. El residuo se puede prensar y el líquido obtenido se combina con el percolado. Los percolados totales se concentran, generalmente por destilación a presión reducida, a fin de someter los contenidos de interés en el artículo bajo extracción al menor calor posible.
Maceración A menos que se especifique algo diferente, el material crudo a extraer se reduce a trozos del tamaño adecuado, se mezcla bien con el disolvente de extracción especificado y se deja en reposo a temperatura ambiente en un recipiente cerrado durante un tiempo adecuado, agitando frecuentemente hasta que la materia soluble se disuelva. La mezcla se filtra, la materia insoluble se lava con el mismo disolvente usado para la maceración y los filtrados se combinan y concentran, por lo general a presión reducida, hasta lograr la consistencia deseada.
Cambio en la redacción:
PREPARACIONES Extractos Líquidos Los EXTRACTOS LÍQUIDOS son preparaciones de materia de origen vegetal que contienen alcohol como disolvente o como conservante, o ambos, y están hechos de forma que cada mL contiene los componentes extraídos de 1 g del material crudo que representa, a menos que se especifique algo diferente en la monografía individual. Se pueden preparar a partir de extractos adecuados y pueden contener conservantes antimicrobianos o de otro tipo que sean adecuados. Los extractos líquidos farmacopeicos se producen por percolación, a menudo después de un período de maceración. El disolvente requerido se especifica en la monografía individual. El procedimiento de fabricación común incluye la concentración de las porciones más diluidas de percolado por evaporación o destilación al vacío a temperaturas por debajo de 60º. El tiempo de maceración y la velocidad de flujo durante la percolación se pueden modificar para ajustarlos a la cantidad y naturaleza del material sin refinar que se extrae, siempre que la composición de los componentes de interés extraídos no se altere negativamente. La velocidad de flujo del percolado puede ser lenta, moderada o rápida. Con referencia a la extracción de 1000 g del material inicial, a una velocidad lenta, no se produce más de 1 mL de percolado por minuto; a una velocidad moderada, se producen entre 1 y 3 mL por minuto; y a una velocidad rápida, se producen entre 3 y 5 mL por minuto. Los extractos líquidos que tienden a depositar sedimentos se pueden dejar en reposo por un tiempo y luego filtrar, o se puede decantar la porción transparente, siempre que el líquido transparente resultante cumpla con las normas de la Farmacopea.
USP 39
Pruebas Químicas/ (565) Extractos Botánicos 433 Extractos en Polvo
Los EXTRACTOS EN POLVO son preparaciones sólidas que tienen una consistencia polvorienta obtenida por evaporación del disolvente usado para la extracción. Pueden contener sustancias adecuadas agregadas, como por ejemplo excipientes, estabilizantes y conservantes. Los extractos en polvo estandarizados se ajustan al contenido definido de componentes, usando materiales inertes adecuados o un extracto en polvo de la materia de origen vegetal usada para la preparación. Cuando corresponda, se especifica un límite para el disolvente en la monografía individual.
Extractos Semisólidos Los EXTRACTOS SEMISÓLIDOS, también conocidos como extractos blandos o extractos pilulares, son preparaciones que tienen una consistencia entre la de los extractos líquidos y la de los extractos en polvo y se obtienen por evaporación parcial del disolvente, agua, alcohol o mezclas hidroalcohólicas usadas como disolventes de extracción. Pueden contener conservantes antimicrobianos o de otro tipo que sean adecuados. Un extracto semisólido y un extracto en polvo obtenidos del mismo material son intercambiables como fármacos o complementos, pero cada uno tiene sus propias ventajas.
Requisitos Farmacopeicos Generales A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, los requisitos Farmacopeicos para los extractos líquidos, extractos en polvo y extractos semisólidos son los siguientes. Envasado y Almacenamiento-Almacenar en envases impermeables resistentes a la luz. [NOTA-Ver Conservación, Envasado, Almacenamiento y Etiquetado en Advertencias y Requisitos Generales.] Etiquetado-Etiquetar indicando el nombre de la parte de la planta usada, el nombre de los disolventes, con excepción de los disolventes hidroalcohólicos, usados en la preparación, el contenido, en porcentaje, de los principios activos o compuestos marcadores identificados en la monografía individual, y el nombre y la concentración de cualquier conservante antimicrobiano o de otro tipo. Cuando se desconocen los principios activos, se declara la relación entre el material inicial y el producto final. Para los extractos semisólidos y extractos en polvo, se indica la identidad y la cantidad de todos los excipientes agregados. En tales casos, se puede declarar el porcentaje de extracto natural. Residuo de Evaporación-Transferir rápidamente aproximadamente 2 mL, determinados con exactitud, de Extracto Líquido, aproximadamente 0,5 g de Extracto en Polvo, o aproximadamente 2 g de Extracto Semisólido a un matraz de fondo redondo tarado adecuado. Evaporar hasta sequedad en un baño de agua y secar el residuo entre 100º y 105º durante 3 horas. Dejar que se enfríe en un desecador sobre pentóxido de fósforo y determinar el peso del residuo obtenido: no menos del 95% de la muestra de Extracto en Polvo permanece como residuo; o no menos del 70% de la muestra de Extracto Semisólido permanece como residuo. [NOTA-Los límites para los Extractos Líquidos se especifican en las monografías individuales.] Disolventes Residuales-Si se prepara con disolventes que no sean alcohol, agua o mezclas de alcohol y agua, cumplen con los requisitos para Disolventes Residuales (467). [NOTA-Ver en el documento de la ICH Impurezas: Disolventes Residuales para obtener información relacionada.] Residuos de Plaguicidas-Los extractos botánicos, tinturas u otras formas farmacéuticas pueden contener residuos de plaguicidas a niveles elevados o bajos en comparación con su forma nativa como material botánico. A menos que se indique de otro modo en la monografía individual, los límites para plaguicidas en extractos de artículos botánicos se calculan mediante la siguiente fórmula: Si ES: 1O: Límite (mg/kg) = L x E Si E> 1O: Límite (mg/kg) = AM/1008 donde L es el límite en el artículo original según se lista en la Tabla 4 (ver Análisis de Residuos de Plaguicidas en Artículos de Origen Botánico (561 )), o la tolerancia admitida por la EPA o el nivel de acción aprobado por la FDA; E es la relación entre material botánico y extracto (es decir, la relación entre la cantidad de artículo botánico usado en la fabricación del extracto y la cantidad del extracto obtenido); A es la ingesta diaria admisible (IDA), conforme a lo publicado por la FAO-OMS, en mg/kg de peso corporal; Mes el peso corporal, en kg (60 kg); y Bes la dosis diaria del extracto, en kg. NOTA-Se pueden justificar límites más altos de pesticidas para extractos usados como ingredientes botánicos si la ingesta o dosis sugerida de extracto se reduce por un factor que sea mayor que E. Se puede otorgar una exención parcial o total de la prueba cuando se conoce el historial completo (naturaleza y cantidad de pesticidas usados, fecha de cada tratamiento durante el cultivo y después de la cosecha) del tratamiento de la partida y éste puede verificarse con precisión de acuerdo con las buenas prácticas agrícolas y de recolección (GACP, por sus siglas en inglés). '1Bgflill:illlill!l1Mlllll\Rl.l!lmlilmllllrl• (si estuviera presente): Entre 90% y 110% de la cantidad declarada en la etiqueta de C2 H50H se encuentra en Extracto Líquido y Extracto Semisólido.
USP 39
434 (565) Extractos Botánicos/ Pruebas Químicas
Tinturas Las TINTURAS son preparaciones líquidas, por lo general preparadas por extracción de materia vegetal con alcohol o mezclas hidroalcohólicas. Tradicionalmente, las tinturas de artículos potentes de origen botánico representan la actividad de 1Og del fármaco en 100 mL de tintura, ajustándose la concentración después de la prueba para ajustar el contenido de principios activos o compuestos marcadores. La mayoría de las demás tinturas vegetales representan 20 g de la respectiva materia vegetal en 100 mL de tintura. Las diferentes tinturas no siempre se diluyen para obtener la misma relación de materia vegetal inicial con la tintura final. Esta relación depende de los requisitos indicados en las pruebas específicas para contenido de principios activos o de compuestos marcadores incluidos en las monografías individuales. A medida que se preparan las tinturas, se valoran de acuerdo con estas pruebas de contenido. Utilizando los valores obtenidos a partir de tales valoraciones, la concentración final de una tintura se ajusta agregando más disolvente o evaporándolo parcialmente. A menos que se especifique algo diferente, las tinturas generalmente se preparan a partir de polvo grueso o cortes finos de materia vegetal, ya sea mediante un proceso de percolado o un proceso de maceración. PROCESO DE PERCOLACIÓN Mezclar cuidadosamente la mezcla de ingredientes molidos con una cantidad suficiente del disolvente de extracción indicado para humedecerlo de forma completa y uniforme, dejar en reposo durante 15 minutos, trasladar la mezcla a un percolador adecuado y compactar la masa con firmeza. Verter una cantidad suficiente del disolvente de extracción indicado para saturar el material a extraer y cubrir la parte superior del percolador. Cuando el líquido esté a punto de gotear, cerrar el orificio inferior y dejar macerar durante 24 horas o durante el tiempo especificado en la monografía. Si la monografía individual no requiere prueba de contenido de principios activos o compuestos marcadores, dejar que la percolación proceda lentamente o a la velocidad indicada (ver definiciones de velocidad de flujo en Extractos Líquidos), agregar gradualmente una cantidad suficiente de disolvente para producir 1000 mL de tintura y mezclar. Si se requiere una prueba de principios activos o compuestos marcadores, recolectar sólo 950 mL del percolado, mezclar y analizar una porción según se indica en la monografía individual. Diluir el resto del percolado con la cantidad de disolvente de extracción que indique la prueba de contenido que es necesaria para producir una tintura que cumple con los requisitos y mezclar. PROCESO DE MACERACIÓN Macerar el material a extraer con 750 mL del disolvente de extracción indicado en un recipiente cerrado y colocar en un lugar tibio. Agitarlo con frecuencia durante 3 días o hasta que el material soluble se disuelva. Transferir la mezcla a un filtro. Cuando se haya filtrado la mayor parte del líquido, lavar el residuo sobre el filtro con una cantidad suficiente del disolvente de extracción indicado, combinar los filtrados para producir 1000 mL de tintura y mezclar. REQUISITOS FARMACOPEICOS GENERALES A menos que se especifique algo diferente en las monografías individuales, los requisitos Farmacopeicos para las tinturas son los siguientes. Envasado y Almacen.amiento-Almacenar en envases impermeables y resistentes a la luz y protegerlos de la exposición a la luz solar directa y al calor excesivo. [NOTA-Ver Conservación, Envasado, Almacenamiento y Etiquetado en Advertencias y Requisitos Generales.] Etiquetado-Declarar en la etiqueta el nombre de la parte de la planta usada para la preparación, el nombre del disolvente o de la mezcla disolvente usada para la extracción, el contenido de los componentes de interés y la relación entre el material inicial y el producto final.
(571) VALORACIÓN DE VITAMINA A Cambio en la redacción:
MÉTODOS QUÍMICOS Procedimiento 1 El siguiente procedimiento se utiliza para la determinación de vitamina A en ingredientes dietéticos o ingredientes farmacéuticos. Cumple con el procedimiento adoptado en 1956 para uso internacional por la lnternational Union of Pure and Applied Chemistry (Unión Internacional de Química Pura y Aplicada).
Pruebas Químicas/ (571) Valoración de Vitamina A 435
USP 39
Realizar la valoración sin demora y tomar precauciones a lo largo del procedimiento para reducir al mínimo la exposición a la luz actínica y al oxígeno atmosférico y otros agentes oxidantes, usando preferentemente material de vidrio con protección actínica y una atmósfera de gas inerte. Para los artículos de prueba que contienen tocoferol, se debe usar un método cromatográfico apropiado. Solución muestra: Pesar, contar o medir con exactitud una porción de la muestra de prueba, que se espera contenga el equivalente a no menos de O, 15 mg de retinol, pero que no contenga más de 1 g de grasa. Si se presenta en forma de cápsulas, tabletas u otro sólido, de modo que no se puede saponificar de manera eficiente según las instrucciones descritas a continuación, someter a reflujo la porción tomada en 1 O ml de agua en un baño de vapor durante aproximadamente 1 O minutos, triturar el sólido remanente con una varilla de vidrio de punta roma y entibiar durante aproximadamente 5 minutos más. Transferir a un matraz de vidrio de borosilicato adecuado y agregar 30 ml de alcohol, seguidos por 3 ml de solución de hidróxido de potasio (9 en 1O). Someter a reflujo en un aparato que sea completamente de vidrio de borosilicato durante 30 minutos. Enfriar la solución, agregar 30 ml de agua y transferir a un separador cónico. Agregar 4 g de sulfato de sodio decahidrato reducido a polvo fino. Extraer agitando con una porción de 150 ml de éter durante 2 minutos y luego, si se forma una emulsión, con tres porciones de 25 ml de éter. Combinar los extractos etéreos, si fuera necesario, y lavar agitando por rotación suave con 50 ml de agua. Repetir el lavado de manera más vigorosa con tres porciones adicionales de 50 ml de agua. Transferir el extracto etéreo lavado a un matraz volumétrico de 250 ml, agregar éter a volumen y mezclar. Evaporar una porción de 25,0 ml del extracto etéreo hasta aproximadamente 5 ml. Sin aplicar calor y con ayuda de una corriente de gas inerte o vacío,continuar la evaporación hasta aproximadamente 3 ml. Disolver el residuo en un volumen de alcohol isopropílico suficiente para obtener una concentración esperada equivalente a 3 µg-5 µg de vitamina A por ml o para obtener una absorbancia en el intervalo de 0,5-0,8 a 325 nm. Condiciones instrumentales ~er!Jlllmlll~r~""~411r~lllrilri!til~lll~l~lll~I.) Modo: UV Longitudes de onda analíticas: 31 O; 325 y 334 nm Celda: 1 cm Blanco: Alcohol isopropílico Análisis Muestra: Solución muestra Determinar las absorbancias de la Solución muestra a 31 O; 325 y 334 nm. Calcular la vitamina A, como contenido de retino! (C 20 H300), en mg, en la porción de muestra tomada, usando una de las siguientes fórmulas: Resultado = (0,549 x A325 )/(L x C)
o Resultado = (0,549 x [A 325 ])/(L x C) L = longitud de la celda de absorción (cm)
C = concentración en la solución final de alcohol isopropílico de la muestra de prueba (g/l 00 ml) o cápsulas o tabletas (unidades/l 00 ml) [A 325 ] = absorbancia corregida a 325 nm, calculada: Resultado= (6,815 x A325 )
-
(2,555 x A310 )
-
(4,260 x A334 )
Cada mg de vitamina A, como retino! (C 20 H3o0), representa 3333 Unidades USP de vitamina A. Usar la primera fórmula cuando A325, la absorbancia observada a 325 nm, esté entre [A 325 ]/l ,030 y [A 325 ]/0,970. Usar la segunda fórmula cuando [A 325 ] tenga un valor menor que A325 /l ,030. [NOTA-El intervalo de los límites de error para este procedimiento analítico, en el que se indica el grado de discrepancia que se puede esperar en los resultados de diferentes laboratorios a P = 0,05, es aproximadamente ±8%.] Procedimiento 2 Este procedimiento se usa para ingredientes dietéticos o ingredientes farmacéuticos en forma de ésteres de retinilo puro o preparados a partir de ésteres de retinilo puro en un vehículo excipiente. Solución muestra: Disolver 25-100 mg, pesados con exactitud, en 5 ml de pentano y diluir con alcohol isopropílico hasta obtener una concentración esperada equivalente a 3-4,5 µg/ml de retinol. Condiciones instrumentales (Ver ,!fi~f~.~@lii';:1{,j~fl:~:~t?Jl~fl~11?'MJ~~it(~1~i1:\i1~~¡~~mf~.) Modo: UV Longitud de onda analítica: 326 nm Celda: 1 cm Blanco: Alcohol isopropílico Análisis Muestra: Solución muestra Calcular la vitamina A, como contenido de retino! (C 20 H300), en mg, en la porción de muestra tomada:
436 (571) Valoración de Vitamina A/ Pruebas Químicas
USP 39
Resultado= (0,570 x A326 )/(L x C)
A326 = absorbancia a 326 nm L =longitud de la celda de absorción (cm) C = concentración de la Solución muestra (gil 00 ml) Cada mg de vitamina A, como retinol (C 20 H300), representa 3333 Unidades USP de vitamina A.
MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS Los siguientes procedimientos de cromatografía de líquidos se usan para la determinación de vitamina A como un ingrediente farmacéutico activo, como un ingrediente de suplemento dietético o como un componente de suplementos dietéticos o de medicamentos terminados. A lo largo de estos procedimientos, proteger de la atmósfera y de la luz todas las soluciones que contienen y que se derivan de la muestra de prueba y de los Estándares de Referencia, usando preferiblemente una atmósfera de gas inerte y material de vidrio con protección actínica. Cuando se especifique una forma de éster de vitamina A (acetato de retinilo o palmitato de retinilo) en el siguiente procedimiento, usar la forma química presente en la formulación y el Estándar de Referencia USP correspondiente. Estándares de Referencia USP (11) ER Acetato de Retinilo USP ER Palmitato de Retinilo USP Procedimiento 1 Éste es un procedimiento neutro que implica simplemente la disolución de la muestra directamente en hexano y su inyección en el cromatógrafo de líquidos o la extracción de la muestra disolviéndola primero en dimetil sulfóxido, seguida por una extracción líquido-líquido de la vitamina A con hexano. Aunque su sistema cromatográfico puede separar los isómeros 13-cis y todo trans de vitamina A, únicamente se usa el pico del isómero todo trans para la cuantificación de vitamina A. El procedimiento se puede usar para determinar la vitamina A en una materia prima, en Tabletas de Vitaminas Oleosolubles, en Cápsulas de Vitaminas Oleosolubles, en Tabletas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles, en Cápsulas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles, en Tabletas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales y en Cápsulas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales. A menos que se especifiquen en las monografías individuales, las Soluciones estándar, las Soluciones muestra y la Solución de aptitud del sistema se preparan según se indica a continuación. Fase móvil: n-Hexano Solución estándar 1: 15 µg/ml de retinol, 1 a partir de ER Acetato de Retinilo USP en n-hexano Solución estándar 2: 15 µg/ml de retinol,2 a partir de ER Palmitato de Retinilo USP en n-hexano Solución de aptitud del sistema: Mezclar volúmenes iguales de Solución estándar 1 y de Solución estándar 2. Solución muestra para materias primas: Transferir acetato de retinilo o palmitato de retinilo, pesados con exactitud, equivalente a 15 mg de retinol, a un matraz volumétrico de 100 ml, disolver y diluir con n-hexano a volumen y mezclar. Pipetear y transferir 5,0 ml de esta solución a un matraz volumétrico de 50 ml, diluir con n-hexano a volumen y mezclar. Solución muestra para Tabletas: Reducir a polvo fino no menos de 20 Tabletas. Transferir una porción del polvo, que no exceda de 7,5 g, equivalente a no menos de 1 mg de vitamina A, como retinol (C 20 H30 0), a un tubo de centrífuga con tapa de rosca con recubrimiento interno de teflón. Agregar aproximadamente 2 ml de dimetil sulfóxido y aproximadamente 3 ml de n-hexano por cada g de Tabletas reducidas a polvo y agitar durante 45 minutos en un agitador en un baño de agua mantenido a 60º. [NOTA-Ajustar el agitador para asegurar que el contenido del recipiente se mezcle de manera vigorosa y minuciosa.] Centrifugar a 3000 rpm durante 1O minutos y transferir la capa de hexano con una pipeta a un matraz volumétrico. Agregar 3 ml de n-hexano por cada g de Tabletas reducidas a polvo a la capa de dimetil sulfóxido, agitar minuciosamente durante 5 minutos y transferir la capa de hexano con una pipeta al mismo matraz volumétrico. Repetir esta extracción con tres porciones adicionales de n-hexano. Diluir los extractos en el matraz volumétrico con n-hexano a volumen. Diluir un volumen de esta solución con n-hexano hasta obtener una solución con una concentración nominal de 15 µg/ml de vitamina A, como retinol (C 20 H30 0). [NOTA-Podría no ser necesaria la dilución.] Solución muestra para Cápsulas: Transferir el contenido de no menos de 20 Cápsulas a un recipiente adecuado, mezclar y pesar. Transferir una porción de la mezcla, que no exceda de 7,5 g, equivalente a no menos de 1 mg de vitamina A, como retinol (C 20 H300), a un tubo de centrífuga con tapa de rosca con recubrimiento interno de teflón.[NOTA-Para Cápsulas de gelatina dura, retirar, tanto como sea posible, el contenido de no menos de 20 Cápsulas, cortando las cubiertas de las Cápsulas para abrirlas, transfiriendo las cubiertas y su contenido a un recipiente adecuado, y triturando hasta formar una masa homogénea. Transferir una porción de la masa, equivalente a no menos de 1 mg de vitamina A, como retino! (C 20 H300), a un tubo de centrífuga con tapa de rosca con recubrimiento interno de teflón.] Agregar aproximadamente 2 ml de dimetil sulfóxido y aproximadamente 3 ml de n-hexano por cada g de contenido de las Cápsulas y agitar durante 45 minutos en un agitador en un baño de agua mantenido a 60º. [NOTA-Ajustar el agitador para asegurar que el contenido del recipiente se mezcle
1 2
Usar el valor de 0,872 para convertir acetato de retinilo en su equivalente de retinol. Usar el valor de 0,546 para convertir palmitato de retinilo en su equivalente de retinol.
USP 39
Pruebas Químicas/ (571) Valoración de Vitamina A 437
de manera vigorosa y minuciosa.] Centrifugar a 3000 rpm durante 1O minutos y transferir la capa de hexano con una pipeta a un matraz volumétrico. Agregar 3 mL de n-hexano por cada g de contenido de las Cápsulas a la capa de dimetil sulfóxido, agitar minuciosamente durante 5 minutos y transferir la capa de hexano con una pipeta al mismo matraz volumétrico. Repetir esta extracción con tres porciones adicionales de n-hexano. Diluir los extractos en el matraz volumétrico con n-hexano a volumen. Diluir un volumen de esta solución con n-hexano hasta obtener una solución con una concentración nominal de 15 µg/mL de vitamina A, como retino! (C20 H300). [NOTA-Podría no ser necesaria la dilución.] Sistema cromatográfico (yer Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.) Modo: HPLC Detector: UV 325 nm Columna: 4,6 mm x 15 cm; relleno L8 de 3 µm Velocidad de flujo: 1 mL/min Volumen de inyección: 40 µL Aptitud del sistema Muestras: Solución de aptitud del sistema y Solución estándar 7 o Solución estándar 2 Requisitos de aptitud Resolución: No menos de 1O entre la forma todo trans de acetato de retinilo y la forma todo trans de palmitato de retinilo, Solución de aptitud del sistema Desviación estándar relativa: No más de 3,0%, Solución estándar 7 o Solución estándar 2 Análisis Muestras: Solución estándar 7 o Solución estándar 2 y la Solución muestra correspondiente Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de vitamina A, como retino! (C 20 H300), en la porción de muestra tomada: Resultado= (rufr5) x (C5/Cu) x 100
ru = respuesta del pico de la forma todo trans de éster de retinilo de la Solución muestra correspondiente r5 = respuesta del pico de la forma todo trans de éster de retinilo de la Solución estándar 7 o la Solución estándar 2 C5 = concentración de retino! (C 20 H3o0) en la Solución estándar 7 o la Solución estándar 2 (µg/mL) Cu= concentración de vitamina A, como retino! (C 20 H300), en la Solución muestra (µg/mL) Procedimiento 2 Este procedimiento emplea el tratamiento de la muestra con ácido sulfúrico metanólico, seguido por extracción con 2,2,4-trimetilpentano. La preparación muestra se puede usar para la formulación que contiene vitaminas A, D y E. La aplicación incluye Tabletas de Vitaminas Oleosolubles, Cápsulas de Vitaminas Oleosolubles, Tabletas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles, Cápsulas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles, Tabletas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales y Cápsulas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales. A menos que se especifiquen en las monografías individuales, las Soluciones estándar, las Soluciones muestra, la Solución de aptitud del sistema y las soluciones reactivo se preparan según se indica a continuación. Fase móvil: n-Hexano y acetato de etilo (99,7: 0,3) Solución de ácido sulfúrico metanólico 3 N: Agregar cuidadosamente 9 mL de ácido sulfúrico a 80 mL de metanol en un matraz volumétrico de 100 ml. Enfriar y diluir con metano! a volumen. Solución de ascorbato de sodio-pirogalol: Transferir 1Og de ascorbato de sodio y 5 g de pirogalol a un matraz volumétrico de 100 mL y agregar agua suficiente para disolver. Agregar 1,7 mL de ácido sulfúrico y diluir con agua a volumen. Solución de lecitina: 5 mg/mL de lecitina en 2,2,4-trimetilpentano Solución estándar 1: 15 µg/mL de retinoP, a partir de ER Acetato de Retinilo USP en 2,2,4-trimetilpentano Solución estándar 2: 15 µg/mL de retinol 2, a partir de ER Palmitato de Retinilo USP en 2,2,4-trimetilpentano Solución de aptitud del sistema: Mezclar volúmenes iguales de Solución estándar 7 y de Solución estándar 2. Solución muestra para Tabletas: [NOTA-Esta preparación es adecuada para la determinación de vitamina A, vitamina D y vitamina E, cuando se encuentran presentes en la formulación. La cantidad de muestra se puede ajustar dependiendo de la presencia o ausencia de las vitaminas apropiadas.] Reducir a polvo fino no menos de 20 Tabletas. Usar una porción del polvo nominalmente equivalente a una cantidad entre 0,4 mg y 2,5 mg retino!. Agregar 0,5 g de bicarbonato de sodio, 1,5 mL de Solución de lecitina y 12,5 mL de 2,2,4-trimetilpentano y dispersar en un mezclador de vórtice. Agregar 6 mL de Solución de ascorbato de sodio-pirogalol, agitar lentamente y dejar que la solución se desgasifique. Continuar agitando hasta que haya cesado la emisión de gases y luego agitar durante 12 minutos adicionales. Agregar 6 mL de dimetil sulfóxido, mezclar en un mezclador de vórtice hasta formar una suspensión y agitar durante 12 minutos. Agregar 6 mL de Solución de ácido sulfúrico metanólico 3 N, mezclar en un mezclador de vórtice hasta formar una suspensión y agitar durante 12 minutos. Agregar 12,5 mL de 2,2,4-trimetilpentano, mezclar en un mezclador de vórtice hasta formar una suspensión y agitar durante 1O minutos. Centrifugar durante 1O minutos para romper la emulsión y para que el sobrenadante se torne transparente. Si fuera necesario, diluir cuantitativamente un volumen del sobrenadante con 2,2,4-trimetilpentano hasta obtener una concentración cercana a la de la Solución estándar. Solución muestra para Cápsulas: [NOTA-Esta preparación es adecuada para la determinación de vitamina A, vitamina D y vitamina E, cuando se encuentran presentes en la formulación. La cantidad de muestra se puede ajustar dependiendo de la presencia o ausencia de las vitaminas apropiadas.] Pesar no menos de 20 Cápsulas en un frasco de pesada tarado. Usando una
438 (571) Valoración de Vitamina A/ Pruebas Químicas
USP 39
cuchilla afilada si fuera necesario, abrir cuidadosamente las Cápsulas, sin perder material de la cubierta, y transferir el contenido a un vaso de precipitados de 100 ml. Retirar cualquier contenido adherido a las cubiertas de las cápsulas vacías lavando con varias porciones de éter. Desechar los lavados y secar las cubiertas de las Cápsulas con ayuda de una corriente de aire seco. Pesar las cubiertas de las Cápsulas vacías en un frasco de pesada tarado y calcular el peso neto del contenido de las Cápsulas. Transferir una porción del contenido de las Cápsulas, equivalente a 2,5 mg de la cantidad declarada de vitamina A, como retinol. Agregar 0,5 g de bicarbonato de sodio, 1,5 ml de Solución de lecitina y 12,5 ml de 2,2,4-trimetilpentano y dispersar en un mezclador de vórtice. Agregar 6 ml de Solución de ascorbato de sodio-pirogalol, agitar lentamente y dejar que la solución se desgasifique. Continuar agitando hasta que haya cesado la emisión de gases y luego agitar durante 12 minutos adicionales. Agregar 6 ml de dimetil sulfóxido, mezclar en un mezclador de vórtice hasta formar una suspensión y agitar durante 12 minutos. Agregar 6 ml de Solución de ácido sulfúrico metanólico 3 N, mezclar en un mezclador de vórtice hasta formar una suspensión y agitar durante 12 minutos. Agregar 12,5 ml de 2,2,4-trimetilpentano, mezclar en un mezclador de vórtice hasta formar una suspensión y agitar durante 1 O minutos. Centrifugar durante 1 O minutos para romper la emulsión y para que el sobrenadante se torne transparente. Si fuera necesario, diluir cuantitativamente un volumen del sobrenadante con 2,2,4-trimetilpentano hasta obtener una concentración cercana a la de la Solución estándar. Sistema cromatográfico (yer Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.) Modo: HPLC Detector: UV 325 nm Columna: 4,6 mm x 25 cm; relleno L24 de 5 µm Velocidad de flujo: 1,5 ml/min Volumen de inyección: 40 µL Aptitud del sistema Muestra: Solución de aptitud del sistema Requisitos de aptitud Resolución: No menos de 8,0 entre la forma todo trans de acetato de retinilo y la forma todo trans de palmitato de retinilo Desviación estándar relativa: No más de 3,0% Análisis Muestras: Solución estándar 7 o Solución estándar 2 y Solución muestra Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de vitamina A, como retinol (C 20 H300), en la porción de muestra tomada: Resultado= (ruf r5) x (C5/Cu) x 100 ru =respuesta del pico de la forma todo trans de éster de retinilo de la Solución muestra r5 = respuesta del pico de la forma todo trans de éster de retinilo de la Solución estándar 7 o la Solución estándar 2 C5 = concentración de retinol (C20 H300) en la Solución estándar 7 o la Solución estándar 2 (µg/ml) Cu= concentración nominal de vitamina A, como retinol (C 20 H300), en la Solución muestra (µg/ml). [NOTA-Usar 26,5 ml como el volumen final de la Solución muestra para calcular la concentración nominal.]
Procedimiento 3 Este procedimiento emplea la saponificación del estándar y de la muestra, seguida por una extracción líquido-líquido de vitamina A a partir de la muestra con una mezcla de n-hexano y cloruro de metileno (3: 1). Se pueden caracterizar y cuantificar los isómeros 13-cis y todo trans de vitamina A. El procedimiento se puede usar para Tabletas de Vitaminas Oleosolubles, Cápsulas de Vitaminas Oleosolubles, Tabletas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles, Cápsulas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles, Tabletas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales y Cápsulas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales. A menos que se especifiquen en las monografías individuales, la Solución estándar, las Soluciones muestra y las soluciones reactivo se preparan según se indica a continuación. Fase móvil: n-Hexano y alcohol isopropílico (92:8) Disolvente de extracción: n-Hexano y cloruro de metileno (3:1) Solución de hidróxido de potasio: 800 mg/ml de hidróxido de potasio en agua. [NOTA-Agregar cuidadosamente el hidróxido de potasio al agua. Mezclar y enfriar.] Diluyente: 1O mg/ml de pirogalol en alcohol Solución estándar: Diluir ER Acetato de Retinilo USP o ER Palmitato de Retinilo USP con Diluyente hasta obtener una concentración de 8,5 µg/ml de retino11,2 (C 20 H3p). Transferir 10,0 ml de esta solución a un matraz de 125 ml con tapón y agregar 5 ml de agua, 5 ml de Diluyente y 3 ml de Solución de hidróxido de potasio. Ajustar bien el tapón, agitar durante 15 minutos sobre un baño de agua mantenido a 60 ± 5º y enfriar a temperatura ambiente. Agregar 7 ml de agua y 25,0 ml de Disolvente de extracción. Ajustar bien el tapón y agitar vigorosamente durante 60 segundos. Enjuagar las paredes del matraz con 60 ml de agua y dejar en reposo durante 1 O minutos hasta que las capas se separen. Retirar una porción de la capa orgánica para inyectarla en el cromatógrafo. Esta Solución estándar contiene 3,4 µg/ml de retinol. Solución muestra para Cápsulas: Pesar no menos de 20 Cápsulas en un frasco de pesada tarado. Abrir las Cápsulas, sin perder material de la cubierta, y transferir el contenido a un vaso de precipitados de 100 ml. Retirar cualquier contenido adherido a las cubiertas de las cápsulas vacías lavando con varias porciones de éter. Desechar los lavados y secar las cubiertas de las
USP 39
Pruebas Químicas/ (571) Valoración de Vitamina A 439
Cápsulas con ayuda de una corriente de aire seco. Pesar las cubiertas de las Cápsulas vacías en un frasco de pesada tarado y calcular el peso neto del contenido de las Cápsulas. Transferir una porción del contenido de las Cápsulas, equivalente a 1,3 mg de retinol, a un matraz de 125 ml con tapón. Agregar 5 ml de agua, 15 ml de Diluyente y 3 ml de Solución de hidróxido de potasio. Ajustar bien el tapón, agitar durante 15 minutos sobre un baño de agua mantenido a 60 ± 5º y enfriar a temperatura ambiente. Agregar 7 ml de agua y 25,0 ml de Disolvente de extracción. Ajustar bien el tapón y agitar vigorosamente durante 60 segundos, o más si fuera necesario, para completar la extracción. Enjuagar las paredes del matraz con 60 ml de agua y dejar en reposo durante 1O minutos hasta que las capas se separen. [NOTA-No agitar porque podría formarse una emulsión.] Retirar una porción de la capa orgánica y diluir cuantitativamente, y en diluciones sucesivas si fuera necesario, con Disolvente de extracción para obtener una concentración de 3,4 µg/ml de retinol. Solución muestra para Tabletas: Reducir a polvo fino un número contado de Tabletas. Transferir una porción del polvo, equivalente a 1,3 mg de retinol, a un matraz de 125 ml con tapón. Agregar 5 ml de agua, 15 ml de Diluyente y 3 ml de Solución de hidróxido de potasio. Tapar herméticamente, agitar durante 15 minutos sobre un baño de agua mantenido a 60 ± 5º y enfriar a temperatura ambiente. Agregar 7 ml de agua y 25,0 ml de Disolvente de extracción. Ajustar bien el tapón y agitar vigorosamente durante 60 segundos, o más si fuera necesario, para completar la extracción. Enjuagar las paredes del matraz con 60 ml de agua y dejar en reposo durante 1O minutos hasta que las capas se separen. [NOTA-No agitar porque podría formarse una emulsión.] Retirar una porción de la capa orgánica y diluir con Disolvente de extracción para obtener una concentración de 3,4 µg/ml de retinol. Sistema cromatográfico (Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.) Modo: HPLC Detector: UV 335 nm Columna: 6,2 mm x 8 cm; relleno L3 Temperatura de la columna: 40º Velocidad de flujo: 4 ml/min Volumen de inyección: 50 µL Aptitud del sistema Muestra: Solución estándar Requisitos de aptitud Desviación estándar relativa: No más de 3,0% Análisis Muestras: Solución estándar y Solución muestra Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de vitamina A, como retinol (C20 H30 0), en la porción de muestra tomada: Resultado= (rnlrr2 ) x (C5/Cu) x 100 rn = suma de las respuestas de los picos de la forma todo trans de éster de retinilo y 13-cis de éster de retinilo de la Solución muestra rr2 = suma de las respuestas de los picos de la forma todo trans de éster de retinilo y 13-cis de éster de retinilo de la Solución estándar C5 = concentración de retinol (C 20 H300) en la Solución estándar (µg/ml) Cu= concentración nominal de vitamina A, como retinol (C 20 H300), en la Solución muestra (µg/ml) Procedimiento 4 Este procedimiento emplea una extracción líquido-líquido de vitamina A a partir de la muestra con hexano, seguida por la evaporación de hexano y la reconstitución del residuo en una mezcla de tetrahidrofurano y acetonitrilo (1 :1 ). Se puede usar para la determinación de vitamina A en la Solución Oral de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles y la Solución Oral de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales. A menos que se especifiquen en las monografías individuales, la Solución estándar, la Solución muestra y el Diluyente se preparan según se indica a continuación. Fase móvil: Metanol, acetonitrilo y n-hexano (46,5: 46,5: 7,0) Diluyente: Tetrahidrofurano y acetonitrilo (1 :1) Solución estándar: 0,33 mg/ml de retinoP, 2 (C 20 H30 0), a partir de ER Acetato de Retinilo USP o ER Palmitato de Retinilo USP en Diluyente Solución muestra para formas farmacéuticas líquidas: Transferir un volumen medido con exactitud de Solución Oral, equivalente a 3,3 mg de retinol, a un embudo de separación de 500 ml que contenga 1 O ml de agua y 20 ml de alcohol deshidratado. Agregar 150 ml de éter de petróleo, tapar y agitar durante 1 minuto. Agregar otros 150 ml de éter de petróleo, tapar, agitar y dejar que las capas se separen. Desechar la capa acuosa y filtrar el extracto de éter de petróleo en un matraz de fondo redondo de 500 ml a través de sulfato de sodio anhidro. Evaporar la solución hasta sequedad con ayuda de un evaporador rotatorio sobre un baño de agua mantenido a aproximadamente 65º. Agregar inmediatamente 10,0 ml de Diluyente, agitar por rotación suave hasta disolver el residuo y filtrar. Sistema cromatográfico (Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.) Modo: HPLC
440 (571) Valoración de Vitamina A/ Pruebas Químicas
USP 39
Detector: UV 265 nm Columna: 4,6 mm x 50 cm (dos columnas concatenadas de 4,6 mm x 25 cm cada una); relleno L1 Temperatura de la columna: 40º Velocidad de flujo: 1,5 ml/min Volumen de inyección: 20 µL Aptitud del sistema Muestra: Solución estándar Requisitos de aptitud Desviación estándar relativa: No más de 5,0% Análisis Muestras: Solución estándar y Solución muestra Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de vitamina A, como retinol (C 20 H30 0), en la porción de muestra tomada: Resultado= (ruf r5) x (C5/Cu) x 100
ru = respuesta del pico de la forma todo trans de éster de retinilo de la Solución muestra r5 = respuesta del pico de la forma todo trans de éster de retinilo de la Solución estándar C5 = concentración de retinol (C 20 H300) en la Solución estándar (µg/ml) Cu= concentración nominal de vitamina A, como retinol (C 20 H30 0), en la Solución muestra (µg/ml) Agregar lo siguiente:
1.(580) VALORACIÓN DEVITAMINA C INTRODUCCIÓN
Los siguientes procedimientos se proveen para llevar a cabo el análisis de d.iferentes formas de vitamina C como ácido ascórbico (C 6H80 6), ascorbato de sodio (C 6 H7 Na0 6) y ascorbato de calcio dihidrato (C 12H14Ca012 • 2H 2 0) o sus mezclas en formas farmacéuticas terminadas, tales como Cápsulas, Tabletas o Soluciones Orales. MÉTODO 1-MÉTODO VOLUMÉTRICO • PROCEDIMIENTO
A menos que se especifique de otro modo en la mónografíá iridívidual, proceder según se indica a continuación. Solución muestra para Cápsulas: Pesar no menos de 20 Cáps4las en un frasco de pesada tarado. Abrir las Cápsulas, sin perder el material de la cubierta, y transferir el contenido a un vaso de. precipitados de 100 mL. Retirar todo el contenido adherido a las cumertas de las Cápsulas vacías lavando, si fL:ieta. necesario; con v.arlas poréiones de éter. Desechar los lavados y secar las cubiertas de las Cápsulas con ayuda de una ~orriente de aire .seco .hasta que deje de percibirse el olor a éter. Pesar las cubíertas de las cápsulas vacías en el·frasco de pesada tarado y calcular el peso neto promedio por Cápsula. Transferir una porción del contenido de las Cápsulas, equivalente a. l.00 mg de ácido. ascórbko, a un matraz volumétrico de .200 ml y agregar 75 ml de ácido metafosfórico.:-ácido acético SR. Tapar el matraz y agitar mecánicamente dt1rantce 30 minutos. Diluir con agua a volumen. Solución muestra para Soluciones Orales: Transferir un volumen de Solución Oral equivalente a 50 mg de ácido ascórbico, previamente diluido con agua si fuera necesarid, a un matraz volumétrico de i 00 ml. Agregar 20 ml ae ácido metafo:Sfóric~ácido acético SR, diluir con agua a volúmen y mezclar, Solución muestra para Tabletas: Reducir a polvo fino rlo menos de :lo Tabletas. Transferir una porción del polvoí equivalente a 100 mg de ácido ascórbico, a un matraz volumétrico de 200 mL y agregar 75 ml de ácido metafosfórico-ácido acético SR. Tapar ef matraz y agitar mecánicamente durante 30 minutos. Diluir con agua a volumen. Blanco: Una mezcla ae 5,5 ml de ácido metafosfóri.co-áddo acético SR y 15ml de agua Sistema volumétrico (Ver Volumetría (541 ).) Modo: Valoración directa Solución volumétrica: Solución estándar de diclorofenol-indofenol SV Detección del punto final: Visual Análisis: Transferir una porción de ta Solución muestra a un tubt;i de centrífuga y éentrifugar hasta obtener un sobrenadante transparente. Transferir un v.C>Jutnehde la Solución muestra, equivalente a 2 mg de ácido ascórbico a un matraz Er· tenmeyer de 50 mLyagregar 5mLde ácido metafüsfórico-ácido acétiéo SR. Valorar con SolU<;íón volumétrica hasta un color rosáceo que persista dur<1nte al menos 5 segundos. C:orregir por el volumim ae ~oM;ión volumétrica tonsumido por el Blanco. Calcular el porcentaje de áddo ascórbico (C 6H80 6)en la porción de muestra tomada: Resultado = {[(V5 - V8) x F)/W} x 100
USP 39
Pruebas Químicas/ (580) Valoración de Vitamina C 441
= volumen. de Solución volumétrica consumido por I(} Solución muestra (ml) =volumen de Solución vofumétrica consumidoporel8/anco F = concentración. de. Solución volumétrica en térrninosde su equivalente de. ácido ascórl:i.ito (mglml) W = cantidad nominal de ácido ascórbico tomada para el Análísis(mg) MÉTODO 11-MÉTODO CROM.ATOGRÁflCO V5
V8
• PllóCEDIMU:NTO 1
A menos que se especifique de otro modo en las monografías individuales, preparar el· Diluyente, la So/fJción estándar y lás Soluciones muestra según se indita a continuación. [NOTA:.:....Proteger las muestras del aire, de fa luz y del calor.]
Solución·arnortiguadora: 2,04g/L de fosfato monobásico de potasio en.agua.Ajustar conácidofosfórko.a Un pH de
3,o. Fase móvil: Solución amortiguadora Diluyente: Oi59 g de edetato di sódico dihidrato y 2,04.g defosfato monotiásito de potaS[ó pórlOOO •mi:. dé· agua. Ájjjstar con ácidofosfóricoáun pHde3,0. SoluciQn ~stánciar: 0,25 mg/mL de ER Ácido Ascórli:>ico U$P eri•. Díluyent~ Solución muestra para Cápsulas: Pesar no rnenos de 20 Cápsulas en ün frasco de pesada tarado, Abrirl rciories de.éter; Qesechar los.1<:1vadosy secar las q.1biertas de.·la$· Cápsulas con ayuda de una· C:::or:riente·de. aire se.e;<> hasta que deje depercibirse el olor a éter.Pesarlas .cubiertas.delas cápsulas vacías en•el frasco· de pesada tar;,tcio y calcular. el peso· neto promedioporCápsula. Transferir una porción del conten1dodelas·.Cápslllas, .equivalente a apróxirn¡¡dame.nfo 25m9 de á()idt) ascórbico,· a up matraz volumétrico de TOO mL Agregar .60IT\L de Diluyente,• agitar mecáni<:amente dl!rantel$JT!Inufos, di.l1;1ir cpn [)iluyente·a vot!imen, mezclar bien y pa~at a través de un füttode membrana con un Jama fío de pqro de 0,45 µ!il, desechando lo~ primeros 4mL. Sóludónmuestra para Soluciónes Orales: Diluir un volumen medido con exactitud .de Solud()n Oral con Diluyentehasta obtener uría solución con una concentración• de 0,25 mg/ml de ácido ascprbico. Mezclar:con <;.:uidado. Solución muestrª para Tablet¡;¡s: Transferir a Un.matraz Y<:>lumétrico de.loo .r'tll una pordón.de no ménosde• 20 Tabletas . reducidas a. polvo fino, que equivalga norninalménte ·a aproxirnadafl1etite 2Smg de>ácic!o ascórqiCO; Agregar 60 m L de. Diluyente, agitar. mecánicamente durante 15 minutos, .diluir con Diluyente a volumen, rnez:dart>íen y pasar a trav~s de un filtro de membrana con• 1;1n •tamaño de poro de 0,45 µm, desec::hando>lós prlmems4 rnt. Sl$tema cromatográfico (Ver (;romatografía \621 ),. Aptitud del Sistema.} Modo: HPLC Detector: UV 245 nm Columna: 4,6 mm x 25 cm; relleno Ll de 5 µm Velocidad de Flujo: l,0 ml/min Vt>fürnen de inyección: 5 µL Aptitud· del· sistema Muestra: Solución estándar Requisitos de aptitud Desviación estándar relativa: No más de 2,0% Análisis Muestras: Solución estándar y Solución muestra Calcular el porcentaje de vitamina C, como ácido ascórbico (C6 H80 6)en la porción de rnue$tra tom
Cu
= área del pico dé ácido .ascórbico de la Solución..muestra "" área del pico de ácido ascórbieo de la· Solucf6n estándar = concentración de ER Ácido Ascórbico USP en ta Solucíón estándar (mg/mL) =concentración nominal de ácido ascórbico en la Solución muestra (mg/ml)
• PROCEDIMIENTO 2
A menos que se especifique de otro rnodo en las monografías individuales, preparar efDifuyente, la Sóll.lclonestándary las acontinuación. [NOTA-Proteger las muestras del aire, de la luz y del calor. Todas las muestras preparadas deben anali?arse c!en.tro deJas4 horas.] Solución amortiguadora: 7,8 g/Lde fosfato diácido de sodio díhidrato en agua. Ajustar con áddofosfóricO a>unpHde 2,5. Fase móvil: Solución amortiguadora y metano!. Ver la Tabla 7 para gradiente. Soluciones muestra según se indica
442 (580) Valoración de Vitamina C / Pruebas Químicas
Tiempo (mln)
USP 39
Tabla 1 Solución amortiguadora
Metano!
("lo)
(O/o)
o
100
o
3
100
o
s
o
100
6
so
7
100
10
100
so o o
Diluyente: Disolver 73 g de ácido metafosfórico en 800 ml de agua, agregar 84 ml de ácido acético glacial y diluir con agua hasta 1000 ml. Solución madre del estándar: 1 mg/ml de ER Ácido Ascórbico USP en Díluyente. [NOTA-Si fuera necesario, someter a ultrasonido con agitación intermitente para facilitar la disolución. Preparar en el momento de su uso.] Solución estándar: Diluir Solución madre del estándar con Diluyente hasta obtener una solución que contenga 0,05 mg/mL de ER Ácido Ascórbico USP. Solución muestra para Cápsulas: Pesar no menos de 20 Cápsulas en un frasco de pesada tarado. Abrir las Cápsulas, sin perder el material de la cubierta, y transferir el contenido a un vaso de precipitados de 100 ml. Retirar todo el contenido adherido a las cubiertas de las Cápsulas vacías lavando, si fuera necesario, con varias porciones de éter. Desechar los lavados y secar las cubiertas de las Cápsulas con ayuda de una corriente de aire seco hasta que deje de percibirse el olor a éter. Pesar las cubiertas de las cápsulas vacías en el frasco de pesada tarado y calcular el peso neto promedio por Cápsula. Transferir una porción del contenido de las Cápsulas, equivalente a aproximadamente 25 mg de ácido ascórbico, a un tubo de centrífuga de 50 ml. Agregar 25,0 ml de Diluyente, someter a ultrasonido durante 15 minutos y centrifugar a aproximadamente 2000 rpm durante 5 minutos. Diluir cuantitativamente el sobrenadante transparente con Diluyente hasta obtener una solución que contenga 0,05 mg/ml de ácido ascórbico. Mezclar y pasar la solución a través de un filtro de membrana con un tamaño de poro de 0,45 µm. Solución muestra para Soluciones Orales: Diluir un volumen medido con exactitud de Solución Oral con Diluyente hasta obtener una solución con una concentración de 0,05 mg/ml de ácido ascórbico. Mezclar con cuidado. Solución muestra para Tabletas: Transferir una porción a partir de no menos de 20 Tabletas molidas, que equivalga nominalmente a aproximadamente 25 mg de ácido ascórbico, a un tubo de centrífuga de 50 ml. Agregar 25,0 rnL de Diluyente, someter a ultrasonido durante 15 minutos y centrifugar a aproximadamente 2000 rpm durante 5 minutos. Diluir cuantitativamente el sobrenadante transparente con Diluyente hasta obtener una solución que contenga 0,05 mg/ml de ácido ascórbico. Mezclar y pasar la solución a través de un filtro de membrana con un tamaño de poro de 0,45 µm. Sistema cromatográfico (Ver Cromatografía (621 )1 Aptitud del Sistema.) Modo: HPLC Detector: UV 245 nm Columna: 4,6 mm x 15 cm; relleno L7 de 3,5 µm Velocidad de Flujo: 0,8 ml/min Volumen de inyección: 1O µL Aptitud del sistema Muestra: Solución estándar Requisitos de aptitud Desviación estándar relativa: No más de 2,0% Análisis Muestras: Solución estándar y Solución muestra Calcular el porcentaje de vitamina C, como ácido ascórbico {C6 H8 0 6) en la porción de muestra tomada:
Resultado= (rulrs) x (C5/Cu) x 100 ru r5 C5 Cu
== área del pico de ácido ascórbico de la Solución muestra
= área del pico de ácido ascórbico de la Solución estándar
= concentración de ER Ácido Ascórbico USP en la Solución estándar (mg/ml) =concentración nominal de ácido ascórbico en la Solución muestra (mg/ml)
REQUISITOS ADICIONALES •ESTÁNDARES DE REFERENCIA USP {11)
ER Ácido Ascórbico USP AUSP39
USP 39
Pruebas Químicas/ (581) Valoración de Vitamina D 443
(581) VALORACIÓN DE VITAMINA D MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS Los siguientes procedimientos de cromatografía de líquidos se usan para la determinación de vitamina D como ingrediente farmacéutico activo, como ingrediente de suplemento dietético o como componente de formas farmacéuticas farmacopeicas. Durante toda esta valoración, proteger de la atmósfera y la luz todas las soluciones que contengan la muestra de prueba y el Estándar de Referencia y las que deriven de éstos, usando preferentemente una atmósfera de gas inerte y material de vidrio con protección actínica. Cuando se especifique vitamina D (colecalciferol o ergocalciferol) en el siguiente procedimiento, usar la forma química presente en la formulación y el Estándar de Referencia USP pertinente. Estándares de Referencia USP (11) ER Colecalciferol USP ER Ergocalciferol USP ER Aptitud del Sistema de Valoración de Vitamina O USP Procedimiento 1 Este procedimiento usa una preparación de la muestra sin ajuste de pH y conlleva el uso de dimetil sulfóxido para disolver los excipientes en la muestra, seguido por una extracción líquido-líquido de la vitamina D con hexano. La separación cromatográfica se logra usando modo de fase normal sobre una columna L8. Se puede usar para determinar vitamina D sola o en combinación con otras vitaminas y minerales en formas farmacéuticas farmacopeicas. A menos que se especifiquen en las monografías individuales, la Solución estándar, la Solución muestra y la Solución de aptitud del sistema se preparan según se indica a continuación. Fase móvil: n-Hexano y alcohol isopropílico (99:1) Solución estándar: 2 µg/mL de ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP en n-hexano Solución de aptitud del sistema: Calentar un volumen de Solución estándar a 60º durante 1 hora para isomerizar parcialmente la vitamina D (colecalciferol o ergocalciferol) a su precursor correspondiente. Solución muestra para Tabletas: Reducir a polvo fino no menos de 20 Tabletas. Transferir una porción del polvo, que no exceda de 7,5 g, equivalente a no menos de O, 1 mg de vitamina D como colecalciferol o ergocalciferol, a un tubo de centrífuga con tapa de rosca con recubrimiento interno de teflón. Agregar aproximadamente 2 mL de dimetil sulfóxido y aproximadamente 3 mL de n-hexano por cada g de Tabletas reducidas a polvo y agitar durante 45 minutos en un agitador en un baño de agua mantenido a 60º. [NOTA-Ajustar el agitador para asegurar que el contenido del recipiente se mezcle de manera vigorosa y minuciosa para lograr recuperaciones exactas.] Centrifugar a 3000 rpm durante 1 O minutos y transferir la capa de hexano con una pipeta a un matraz volumétrico. Agregar 3 mL de n-hexano por cada g de Tabletas reducidas a polvo a la capa de dimetil sulfóxido, agitar minuciosamente durante 5 minutos y transferir la capa de hexano con una pipeta al mismo matraz volumétrico. Repetir esta extracción con tres porciones adicionales de n-hexano. Diluir los extractos en el matraz volumétrico con n-hexano a volumen. Diluir un volumen de esta solución con n-hexano hasta obtener una solución con una concentración de 2 µg/mL de colecalciferol o ergocalciferol. [NOTA-Podría no ser necesaria la dilución.] Solución muestra para Cápsulas: Transferir el contenido de no menos de 20 Cápsulas a un recipiente adecuado, mezclar y pesar. Transferir una porción de la mezcla, que no exceda de 7,5 g, equivalente a no menos de O, 1 mg de vitamina D, como colecalciferol o ergocalciferol, a un tubo de centrífuga con tapa de rosca con recubrimiento interno de teflón. [NOTA-Para Cápsulas de gelatina dura, retirar, tanto como sea posible, el contenido de no menos de 20 Cápsulas cortando las cubiertas de las Cápsulas para abrirlas, transfiriendo las cubiertas y su contenido a un recipiente adecuado y triturando hasta formar una masa homogénea. Transferir una porción de la masa, equivalente a no menos de O, 1 mg de vitamina D, como colecalciferol o ergocalciferol, a un tubo de centrífuga con tapa de rosca con recubrimiento interno de teflón.] Agregar aproximadamente 2 mL de dimetil sulfóxido y aproximadamente 3 mL de n-hexano por cada g de contenido de las Cápsulas y agitar durante 45 minutos en un agitador en un baño de agua mantenido a 60º. [NOTA-Ajustar el agitador para asegurar que el contenido del recipiente se mezcle de manera vigorosa y minuciosa para lograr recuperaciones exactas.] Centrifugar a 3000 rpm durante 1 O minutos y transferir la capa de hexano con una pipeta a un matraz volumétrico. Agregar 3 mL de n-hexano por cada g de contenido de las Cápsulas a la capa de dimetil sulfóxido, agitar minuciosamente durante 5 minutos y transferir la capa de hexano con una pipeta al mismo matraz volumétrico. Repetir esta extracción con tres porciones adicionales de n-hexano. Diluir los extractos en el matraz volumétrico con n-hexano a volumen. Diluir un volumen de esta solución con n-hexano hasta obtener una solución con una concentración de 2 µg/mL de vitamina D como colecalciferol o ergocalciferol. [NOTA-Podría no ser necesaria la dilución.] Sistema cromatográfico (Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.) Modo: HPLC Detector: UV 265 nm Columna: 4,6 mm x 15 cm; relleno L8 de 3 µm Velocidad de flujo: 1 mL/min
444 (581) Valoración de Vitamina D /Pruebas Químicas
USP 39
Volumen de inyección: 100 µL Aptitud del sistema Muestras: Solución estándar y Solución de aptitud del sistema Requisitos de aptitud Resolución: No menos de 1O entre la forma presente de vitamina D y su precursor correspondiente, Solución de aptitud del
sistema Desviación estándar relativa: No más de 3,0%, Solución estándar Análisis Muestras: Solución estándar y Solución muestra Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de colecalciferol (C 27 H44 0) o ergocalciferol (C 28 H44 0) en la porción de muestra tomada: Resultado= Crufr5) x (C5/Cu) x F x 100
ru = respuesta del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solución muestra r5 = respuesta del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solución estándar C5 = concentración de ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP en la Solución estándar (µg/mL) Cu= concentración nominal de colecalciferol o ergocalciferol en la Solución muestra (µg/mL) F= factor de corrección que se debe tomar en cuenta para la cantidad promedio de previtamina D presente en la Solución muestra, 1,09 Procedimiento 2 Este procedimiento emplea el tratamiento de la muestra con bicarbonato de sodio, una solución ácida antioxidante que genera la emisión de gas; lecitina como surfactante; y dimetil sulfóxido, seguido por ácido sulfúrico metanólico para crear una dispersión y extraer de manera eficiente la vitamina D de los componentes de la matriz en la fase de 2,2,4-trimetilpentano. La separación se logra en un modo de fase normal sobre una columna L24. La preparación muestra y el Sistema cromatográfico usados en este procedimiento también son adecuados para determinar vitamina A y E cuando se encuentran presentes en la formulación; los analistas deben realizar los ajustes correspondientes en el tamaño de la muestra y longitud de onda de detección. A menos que se especifiquen en las monografías individuales, la Solución estándar, la Solución muestra, la Solución de aptitud del sistema y las soluciones reactivo se preparan según se indica a continuación. Fase móvil: n-Hexano y alcohol butílico terciario (98,75: 1,25) Solución de ácido sulfúrico metanólico 3 N: Agregar cuidadosamente 9 mL de ácido sulfúrico a 80 mL de metanol en un matraz volumétrico de 100 ml. Enfriar y diluir con metanol a volumen. Solución de ascorbato de sodio-pirogalol: Transferir 1 Og de ascorbato de sodio y 5 g de pirogalol a un matraz volumétrico de 100 mL y agregar agua suficiente para disolver. Agregar 1,7 mL de ácido sulfúrico y diluir con agua a volumen. Solución de lecitina: 5 mg/mL de lecitina en 2,2,4-trimetilpentano Solución estándar: 1 µg/mL de ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP en 2,2,4-trimetilpentano Solución de aptitud del sistema: Calentar un volumen de Solución estándar a 60º durante 1 hora para isomerizar parcialmente la vitamina D (colecalciferol o ergocalciferol) a su precursor correspondiente. Solución muestra para Tabletas: [NOTA-Esta preparación es adecuada para la determinación de vitamina A, vitamina D y vitamina E, cuando se encuentran presentes en la formulación. La cantidad de muestra se puede ajustar dependiendo de la presencia o ausencia de las vitaminas apropiadas.] Reducir a polvo fino no menos de 20 Tabletas. Usar una porción del polvo nominalmente equivalente a una cantidad de no menos de O, 1 mg de vitamina D. Agregar 0,5 g de bicarbonato de sodio, 1,5 mL de Solución de lecitina y 12,5 mL de 2,2,4-trimetilpentano y dispersar en un mezclador de vórtice. Agregar 6 mL de Solución de ascorbato de sodio-pirogalol, agitar lentamente y dejar que la solución se desgasifique. Continuar agitando hasta que haya cesado la emisión de gases y luego agitar durante 12 minutos adicionales. Agregar 6 mL de dimetil sulfóxido, mezclar en un mezclador de vórtice hasta formar una suspensión y agitar durante 12 minutos. Agregar 6 mL de Solución de ácido sulfúrico metanólico 3 N, mezclar en un mezclador de vórtice hasta formar una suspensión y agitar durante 12 minutos. Agregar 12,5 mL de 2,2,4-trimetilpentano, mezclar en un mezclador de vórtice hasta formar una suspensión y agitar durante 1O minutos. Centrifugar durante 1 O minutos para romper la emulsión y para que el sobrenadante se torne transparente. Si fuera necesario, diluir cuantitativamente un volumen del sobrenadante con 2,2,4-trimetilpentano hasta obtener una concentración cercana a la de la Solución estándar. Solución muestra para Cápsulas: [NOTA-Esta preparación es adecuada para la determinación de vitamina A, vitamina D y vitamina E, cuando se encuentran presentes en la formulación. La cantidad de muestra se puede ajustar dependiendo de la presencia o ausencia de las vitaminas apropiadas.] Pesar no menos de 20 Cápsulas en un frasco de pesada tarado. Usando una cuchilla afilada si fuera necesario, abrir cuidadosamente las Cápsulas, sin perder material de la cubierta, y transferir el contenido a un vaso de precipitados de 100 ml. Retirar cualquier contenido adherido a las cubiertas de las cápsulas vacías lavando con varias porciones de éter. Desechar los lavados y secar las cubiertas de las Cápsulas con ayuda de una corriente de aire seco. Pesar las cubiertas de las Cápsulas vacías en un frasco de pesada tarado y calcular el peso neto del contenido de las Cápsulas. Transferir una porción del contenido de las Cápsulas, equivalente a no menos de O, 1 mg de la cantidad declarada de vitamina D, como colecalciferol o ergocalciferol. Agregar 0,5 g de bicarbonato de sodio, 1,5 mL de Solución de lecitina y 12,5 mL de 2,2,4-trimetilpentano, y dispersar en un mezclador de vórtice. Agregar 6 mL de Solución de ascorbato de sodio-pirogalol,
USP 39
Pruebas Químicas/ (581) Valoración de Vitamina D 445
agitar lentamente y dejar que la solución se desgasifique. Continuar agitando hasta que haya cesado la emisión de gases y luego agitar durante 12 minutos adicionales. Agregar 6 mL de dimetil sulfóxido, mezclar en un mezclador de vórtice hasta formar una suspensión y agitar durante 12 minutos. Agregar 6 mL de Solución de ácido sulfúrico metanólico 3 N, mezclar en un mezclador de vórtice hasta formar una suspensión y agitar durante 12 minutos. Agregar 12,5 mL de 2,2,4-trimetilpentano, mezclar en un mezclador de vórtice hasta formar una suspensión y agitar durante 1O minutos. Centrifugar durante 1O minutos para romper la emulsión y para que el sobrenadante se torne transparente. Si fuera necesario, diluir cuantitativamente un volumen del sobrenadante con 2,2,4-trimetilpentano hasta obtener una concentración cercana a la de la Solución estándar. Sistema cromatográfico (Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.) Modo: HPLC Detector: UV 265 nm Columna: 4,6 mm x 25 cm; relleno L24 de 5 µm Velocidad de flujo: 1 mL/min Volumen de inyección: 40 µL Aptitud del sistema Muestras: Solución estándar y Solución de aptitud del sistema Requisitos de aptitud Resolución: No menos de 4,0 entre la forma de vitamina D presente y su precursor correspondiente, Solución de aptitud del sistema
Desviación estándar relativa: No más de 3,0%, Solución estándar Análisis Muestras: Solución estándar y Solución muestra Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de colecalciferol (C 27 H44 0) o ergocalciferol (C 28 H44 0) en la porción de muestra tomada: Resultado== (ru/r5) x (C5/Cu) x 100 ru == respuesta del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solución muestra r5 == respuesta del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solución estándar C5 == concentración de ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP en la Solución estándar (µg/mL) Cu== concentración nominal de colecalciferol o ergocalciferol en la Solución muestra (µg/mL)
Procedimiento 3 Este procedimiento es adecuado para matrices con excipientes que son solubles o degradables en condiciones alcalinas. Emplea la saponificación de la solución muestra, seguida por una extracción líquido-líquido con hexano y una limpieza por extracción en fase sólida (EFS) usando una mezcla de cloruro de metileno y alcohol isopropílico (99,8: 0,2) como eluyente. La Solución estándar se somete a un tratamiento similar para compensar pérdidas en la recuperación debidas a la isomerización. Posteriormente, el eluato se evapora y el residuo se reconstituye en acetonitrilo antes de inyectarlo en el cromatógrafo. La separación se logra en modo de fase reversa. A menos que se especifiquen en las monografías individuales, la Solución estándar, la Solución muestra y las soluciones reactivo se preparan según se indica a continuación. Fase móvil: Acetonitrilo y metanol (91 :9) Ácido acético diluido: Solución de ácido acético glacial (1 en 1O) en agua Solución de fenolftaleína: 1O mg/mL de fenolftaleína en alcohol Solución de hidróxido de potasio: Disolver lentamente 14 g de hidróxido de potasio en una mezcla de 31 mL de alcohol deshidratado y 5 mL de agua. Preparar en el día de su uso. Disolvente de extracción: Cloruro de metileno y alcohol isopropílico (99,8:0,2) Columna de extracción: Relleno de sílice con una relación entre la masa del sorbente y el volumen de la columna de 500 mg a 2,8 mL o equivalente. [NOTA-Acondicionar la columna lavándola inicialmente con 4,0 mL de una mezcla de cloruro de metileno y alcohol isopropílico (4:1 ), seguida de 5,0 mL de Disolvente de extracción. No dejar que la columna se seque.] Solución madre del estándar: 0,2 mg/mL de ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP en alcohol deshidratado. [NOTA-Preparar cada 4 semanas. Almacenar en un congelador.] Solución estándar: Diluir un volumen de Solución madre del estándar con alcohol deshidratado hasta obtener una concentración de 5 µg/mL de ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP. Preparar esta solución en el día de su uso. Transferir 2,0 mL de esta solución a un matraz de 125 mL con tapón. Agregar 15,0 mL de agua y 15,0 mL de Solución de hidróxido de potasio, tapar y agitar durante 30 minutos en un baño de agua mantenido a 60º. Dejar que se enfríe a temperatura ambiente y transferir el contenido del matraz a un embudo de separación de 250 mL. Agregar 15,0 mL de agua al matraz, tapar, agitar vigorosamente y transferir esta solución al embudo de separación. Enjuagar el matraz con 60 mL de n-hexano y transferir el enjuague al embudo de separación. Tapar, agitar vigorosamente durante 90 segundos y dejar en reposo durante 15 minutos hasta que las capas se separen. Escurrir y desechar la capa acuosa. Agregar 15,0 mL de agua a la capa de hexano en el embudo de separación, tapar y agitar vigorosamente. Dejar en reposo durante 1O minutos hasta que las capas se separen y desechar la capa acuosa. Agregar 1 gota de Solución de fenolftaleína y 15,0 mL de agua al embudo de separación. Agregar Ácido acético diluido, gota a gota, agitando, hasta que el lavado sea neutro. Dejar en reposo durante 1O minutos hasta que las capas se separen.
446 (581) Valoración de Vitamina D / Pruebas Químicas
USP 39
Escurrir y desechar la capa acuosa. Filtrar la capa de hexano a través de sulfato de sodio anhidro, colocado sobre un pequeño trozo de algodón, en un matraz de fondo redondo de 100 ml. Enjuagar el embudo y el sulfato de sodio con unos pocos ml de n-hexano y recoger los enjuagues en el mismo matraz. Evaporar el hexano en el matraz en un evaporador rotatorio a 50º hasta sequedad. Agregar inmediatamente 2,0 ml de Disolvente de extracción para disolver el residuo. Transferir esta solución a una Columna de extracción en fase sólida recientemente acondicionada, enjuagar el matraz de fondo redondo con 1,0 ml de Disolvente de extracción y transferir a la columna. Eluir la Columna de extracción con 2,0 ml de Disolvente de extracción y desechar esta fracción. Eluir la columna con 7,0 ml de Disolvente de extracción y recoger el eluato en un matraz adecuado. Colocar el matraz en un baño de agua tibia mantenido a 42º y evaporar el disolvente con ayuda de una corriente de nitrógeno. Agregar inmediatamente 2,0 ml de acetonitrilo al residuo y usar la solución para inyectarla en el cromatógrafo. Solución muestra para Tabletas: Reducir a polvo fino no menos de 20 Tabletas. Transferir una porción del polvo, equivalente a 1O µg de colecalciferol o ergocalciferol, a un matraz de 125 ml con tapón. Agregar 15,0 ml de agua y 15,0 ml de Solución de hidróxido de potasio, tapar y agitar durante 30 minutos en un baño de agua mantenido a 60º. Dejar que se enfríe a temperatura ambiente y transferir el contenido del matraz a un embudo de separación de 250 ml. Agregar 15,0 ml de agua al matraz, tapar, agitar vigorosamente y transferir esta solución al embudo de separación. Enjuagar el matraz con 60 ml de nhexano y transferir el enjuague al embudo de separación. Tapar, agitar vigorosamente durante 90 segundos y dejar en reposo durante 15 minutos hasta que las capas se separen. Escurrir y desechar la capa acuosa. Agregar 15,0 ml de agua a la capa de hexano en el embudo de separación, tapar y agitar vigorosamente. Dejar en reposo durante 1 O minutos hasta que las capas se separen y desechar la capa acuosa. Agregar 1 gota de Solución de fenolftaleína y 15,0 ml de agua al embudo de separación. Agregar Ácido acético diluido, gota a gota, agitando, hasta que el lavado sea neutro. Dejar en reposo durante 1O minutos hasta que las capas se separen. Escurrir y desechar la capa acuosa. Filtrar la capa de hexano a través de sulfato de sodio anhidro, colocado sobre un pequeño trozo de algodón, en un matraz de fondo redondo de 100 ml. Enjuagar el embudo y el sulfato de sodio con unos pocos ml de n-hexano y recoger los enjuagues en el mismo matraz. Evaporar el hexano en el matraz en un evaporador rotatorio a 50º hasta sequedad. Agregar inmediatamente 2,0 ml de Disolvente de extracción para disolver el residuo. Transferir esta solución a una Columna de extracción en fase sólida recientemente acondicionada, enjuagar el matraz de fondo redondo con 1,0 ml de Disolvente de extracción y transferir a la columna. Eluir la Columna de extracción con 2,0 ml de Disolvente de extracción y desechar esta fracción. Eluir la columna con 7,0 ml de Disolvente de extracción y recoger el eluato en un matraz adecuado. Colocar el matraz en un baño de agua tibia mantenido a 42º y evaporar el disolvente con ayuda de una corriente de nitrógeno. Agregar inmediatamente 2,0 ml de acetonitrilo al residuo y usar la solución para inyectarla en el cromatógrafo. Solución muestra para Cápsulas: Pesar no menos de 20 Cápsulas en un frasco de pesada tarado. Abrir las Cápsulas, sin perder material de la cubierta, y transferir el contenido a un vaso de precipitados de 100 ml. Retirar cualquier contenido adherido a las cubiertas de las cápsulas vacías lavando con varias porciones de éter. Desechar los lavados y secar las cubiertas de las Cápsulas con ayuda de una corriente de aire seco. Pesar las cubiertas de las Cápsulas vacías en un frasco de pesada tarado y calcular el peso neto del contenido de las Cápsulas. Transferir una porción del contenido de las Cápsulas, equivalente a 1O µg de ergocalciferol o colecalciferol, a un matraz de 125 ml con tapón. Agregar 15,0 ml de agua y 15,0 ml de Solución de hidróxido de potasio, tapar y agitar durante 30 minutos en un baño de agua mantenido a 60º. Dejar que se enfríe a temperatura ambiente y transferir el contenido del matraz a un embudo de separación de 250 ml. Agregar 15,0 ml de agua al matraz, tapar, agitar vigorosamente y transferir esta solución al embudo de separación. Enjuagar el matraz con 60 ml de n-hexano y transferir el enjuague al embudo de separación. Tapar, agitar vigorosamente durante 90 segundos y dejar en reposo durante 15 minutos hasta que las capas se separen. Escurrir y desechar la capa acuosa. Agregar 15,0 ml de agua a la capa de hexano en el embudo de separación, tapar y agitar vigorosamente. Dejar en reposo durante 1 O minutos hasta que las capas se separen y desechar la capa acuosa. Agregar 1 gota de Solución de fenolftaleína y 15,0 ml de agua al embudo de separación. Agregar Ácido acético diluido, gota a gota, agitando, hasta que el lavado sea neutro. Dejar en reposo durante 1O minutos hasta que las capas se separen. Escurrir y desechar la capa acuosa. Filtrar la capa de hexano a través de sulfato de sodio anhidro, colocado sobre un pequeño trozo de algodón, en un matraz de fondo redondo de 100 ml. Enjuagar el embudo y el sulfato de sodio con unos pocos ml de n-hexano y recoger los enjuagues en el mismo matraz. Evaporar el hexano en el matraz en un evaporador rotatorio a 50º hasta sequedad. Agregar inmediatamente 2,0 ml de Disolvente de extracción para disolver el residuo. Transferir esta solución a una Columna de extracción en fase sólida recientemente acondicionada, enjuagar el matraz de fondo redondo con 1,0 ml de Disolvente de extracción y transferir a la columna. Eluir la Columna de extracción con 2,0 ml de Disolvente de extracción y desechar esta fracción. Eluir la columna con 7,0 ml de Disolvente de extracción y recoger el eluato en un matraz adecuado. Colocar el matraz en un baño de agua tibia mantenido a 42º y evaporar el disolvente con ayuda de una corriente de nitrógeno. Agregar inmediatamente 2,0 ml de acetonitrilo al residuo y usar la solución para inyectarla en el cromatógrafo. Sistema cromatográfico 0/er Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.) Modo: HPLC Detector: UV 265 nm Columna: 4,6 mm x 25 cm; relleno L1 de 5 µm Temperatura de la columna: 27° Velocidad de flujo: 0,7 ml/min Volumen de inyección: 15 µL
USP 39
Pruebas Químicas/ (581) Valoración de Vitamina D 447
Aptitud del sistema Muestra: Solución estándar Requisitos de aptitud Desviación estándar relativa: No más de 4,0% Análisis Muestras: Solución estándar y Solución muestra Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de colecalciferol (C 27 H44 0) o ergocalciferol (C 28 H44 0) en la porción de muestra tomada: Resultado= (ruf r5) x (C5/Cu) x F x 100 ru = respuesta del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solución muestra r5 = respuesta del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solución estándar C5 = concentración de ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP en la Solución estándar (µg/mL) Cu= concentración nominal de colecalciferol o ergocalciferol en la Solución muestra (µg/mL) F = factor de corrección que se debe tomar en cuenta para la cantidad promedio de previtamina D presente en la Solución muestra, 1,09
Procedimiento 4 Este procedimiento se aplica a formas farmacéuticas líquidas. Emplea una extracción líquido-líquido de la muestra con hexano, seguida por la evaporación del hexano y la reconstitución del residuo en una mezcla de tetrahidrofurano y acetonitrilo (1: 1). La separación se logra en modo de fase reversa. A menos que se especifiquen en las monografías individuales, la Solución estándar, la Solución muestra y el Diluyente se preparan según se indica a continuación. Fase móvil: Metanol, acetonitrilo y n-hexano (46,5: 46,5: 7,0) Diluyente: Tetrahidrofurano y acetonitrilo (1 :1) Solución estándar: 5 µg/mL de ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP en Diluyente Solución muestra: Transferir un volumen medido con exactitud de la muestra, equivalente a 50 µg de colecalciferol o ergocalciferol, a un embudo de separación de 500 mL que contenga 1O mL de agua y 20 mL de alcohol deshidratado. Agregar 150 mL de éter de petróleo, tapar y agitar durante 1 minuto. Agregar otros 150 mL de éter de petróleo, tapar, agitar y dejar que las capas se separen. Desechar la capa acuosa. Escurrir el extracto de éter de petróleo en un matraz de fondo redondo de 500 mL a través de sulfato de sodio anhidro. Evaporar la solución hasta sequedad con ayuda de un evaporador rotatorio sobre un baño de agua mantenido a aproximadamente 65º. Agregar inmediatamente 10,0 mL de Diluyente, agitar por rotación suave hasta disolver el residuo y filtrar. Sistema cromatográfico (Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.) Modo: HPLC Detector: UV 265 nm Columna: Dos columnas, 4,6 mm x 25 cm, conectadas en serie; ambas con relleno L1 Temperatura de la columna: 40º Velocidad de flujo: 1,5 mL/min Volumen de inyección: 20 µL Aptitud del sistema Muestra: Solución estándar Requisitos de aptitud Desviación estándar relativa: No más de 5,0% Análisis Muestras: Solución estándar y Solución muestra Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de colecalciferol (C 27 H4P) o ergocalciferol (C 28 H44 0) en la porción de muestra tomada: Resultado= (ruf r5) x (C5/Cu) x F x 100 ru = respuesta del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solución muestra r5 = respuesta del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solución estándar C5 = concentración de ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP en la Solución estándar (µg/mL) Cu= concentración nominal de colecalciferol o ergocalciferol en la Solución muestra (µg/mL) F =factor de corrección que se debe tomar en cuenta para la cantidad promedio de previtamina D presente en la Solución muestra, 1,09
Procedimiento 5 Este procedimiento emplea la disolución de vitamina D en tolueno y la solución se inyecta en el cromatógrafo de líquidos. Se puede aplicar a matrices simples tales como vitaminas puras e ingredientes que no requieren saponificación y que son solubles en tolueno. La separación se logra en modo de fase normal.
448 (581) Valoración de Vitamina D / Pruebas Químicas
USP 39
A menos que se especifiquen en las monografías individuales, la Solución estándar, la Solución muestra y la Solución de aptitud del sistema se preparan según se indica a continuación. Hexano deshidratado: Preparar una columna cromatográfica rellenando un tubo cromatográfico, de 8 cm x 60 cm, con 500 g de tierra silícea para cromatografía de 50 a 250 µm, activada mediante secado a 150º durante 4 horas. 0/er Cromatografía (621 ), Cromatografía en Columna.) Pasar 500 mL de hexano a través de la columna y recoger el eluato en un matraz con tapón de vidrio. Fase móvil: Alcohol n-amílico en Hexano deshidratado (3 en 1000) Solución de aptitud del sistema: 250 mg de ER Aptitud del Sistema de Valoración de Vitamina D USP en 1O mL de una mezcla de tolueno y Fase móvil (1 :1 ). Calentar esta solución a reflujo a 90º durante 45 minutos y enfriar. [NOTA-Esta solución contiene colecalciferol, precolecalciferol y trans-colecalciferol. Para las soluciones madre, seguir estos procedimientos: usar material de vidrio con protección actínica, disolver las muestras sin calentar y preparar las soluciones en el día de su uso.] Solución madre del estándar: 0,6 mg/mL de ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP en tolueno Solución estándar: 120 µg/mL de ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP en Fase móvil, preparada a partir de Solución madre del estándar Solución madre de la muestra: 0,6 mg/mL of colecalciferol o ergocalciferol en tolueno Solución muestra: 120 µg/mL de colecalciferol o ergocalciferol en Fase móvil, preparada a partir de Solución madre de Ja muestra Sistema cromatográfico 0/er Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.) Modo: HPLC Detector: UV 254 nm Columna: 4,6 mm x 25 cm; relleno L3 Temperatura de la columna: 40º Velocidad de flujo: Se puede variar para cumplir con los Requisitos de aptitud del sistema Volumen de inyección: 5-1 O µL Aptitud del sistema Muestra: Solución de aptitud del sistema [NOTA-Los tiempos de retención relativos para precolecalciferol, trans-colecalciferol y colecalciferol son 0,4; 0,5 y 1,0, respectivamente.] Requisitos de aptitud Resolución: No menos de 1,O entre trans-colecalciferol y precolecalciferol Desviación estándar relativa: No más de 2,0% para la respuesta del pico de colecalciferol Análisis Muestras: Solución estándar y Solución muestra Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de colecalciferol (C27 H44 0) o ergocalciferol (C 28 H44 0) en la porción de muestra tomada: Resultado= (rufr5) x (C5/Cu) x 100
ru = respuesta del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solución muestra r5 = respuesta del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solución estándar C5 = concentración de ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP en la Solución estándar (µg/mL) Cu= concentración nominal de colecalciferol o ergocalciferol en la Solución muestra (µg/mL) Procedimiento 6 El procedimiento emplea la disolución de la muestra en Fase móvil y la solución se inyecta en el cromatógrafo de líquidos. La aplicación incluye colecalciferol y ergocalciferol disueltos en aceite vegetal comestible, polisorbato 80 o propilenglicol, ninguno de los cuales interferirá con el precursor correspondiente de modo que éste pueda cuantificarse. La separación se logra en modo de fase normal sobre una columna L3 y la Aptitud del sistema requiere la separación de las formas trans de los precursores de vitamina D. A menos que se especifiquen en las monografías individuales, las Soluciones estándar y la Solución muestra se preparan según se indica a continuación. Fase móvil: Hexano y pentanol (997:3) Solución madre del estándar: Disolver ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP en tolueno y diluir con Fase móvil hasta 50 µg/ml. [NOTA-Preparar esta solución en el día de su uso.] Solución estándar A: 5 µg/mL, a partir de Solución madre del estándar en Fase móvil. [NOTA-Almacenar a una temperatura que no exceda de Oº.] Solución estándar B: Transferir 5,0 mL de Solución madre del estándar a un matraz de fondo redondo equipado con un condensador de reflujo. Desplazar el aire con nitrógeno y someter a reflujo durante 1 hora en un baño de agua bajo una atmósfera de nitrógeno para obtener una solución que contenga colecalciferol y precolecalciferol. Enfriar, transferir la solución con ayuda de varias porciones de Fase móvil a un matraz volumétrico de 50 mL y diluir con Fase móvil a volumen. Solución muestra: Equivalente a 5 µg/mL de colecalciferol o ergocalciferol en Fase móvil, a partir de un volumen de muestra medido con exactitud
Pruebas Químicas/ (581) Valoración de Vitamina D 449
USP 39
Sistema cromatográfico 0/er Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.) Modo: HPLC Detector: UV 254 nm Columna: 4,6 mm x 25 cm; relleno L3 Velocidad de flujo: 1-2 mL/min Volumen de inyección: 10-20 µL Aptitud del sistema Muestra: Solución estándar B (ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP) [NOTA-Los tiempos de retención relativos para precolecalciferol y colecalciferol son aproximadamente 0,4 y 1,0, respectivamente, y aproximadamente 0,8 y 1,0 para pre-ergocalciferol y ergocalciferol, respectivamente.] Requisitos de aptitud Resolución: No menos de 1,0 entre los picos de precolecalciferol y colecalciferol. No menos de 1,0 entre los picos de preergocalciferol y ergocalciferol Desviación estándar relativa: No más de 2,0% para la respuesta del pico de colecalciferol o ergocalciferol Análisis Muestras: Solución estándar A, Solución estándar By Solución muestra Factor de respuesta de colecalciferol o ergocalciferol Calcular el factor de respuesta de colecalciferol o ergocalciferol, Fe:
Fe= C5/r5 C5 = concentración de ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP en la Solución estándar A (µg/mL) r5 = área del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solución estándar A Factor de respuesta de precolecalciferol o pre-ergocalciferol Calcular la concentración, C 5, en µg/ml, de colecalciferol o ergocalciferol en la Solución estándar B: Cs =Fe x r's Fe = factor de respuesta de colecalciferol o ergocalciferol r' s = área del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solución estándar B Calcular la concentración, CP'" en µg/mL, de precolecalciferol o pre-ergocalciferol: Cpre= Cs- Cs C5 = concentración de ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP en la Solución estándar A (µg/mL) C' s = concentración de colecalciferol o ergocalciferol en la Solución estándar B (µg/mL) Calcular el factor de respuesta, FP,., para precolecalciferol o pre-ergocalciferol: Fpre = C'pr.f rP C'pre =concentración de precolecalciferol o pre-ergocalciferol (µg/mL) rP = respuesta del pico de precolecalciferol o pre-ergocalciferol de la Solución estándar B Contenido de vitamina D Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de vitamina D como colecalciferol (C 27 H4P) o como ergocalciferol (C 28 H44 0) en la porción de muestra tomada: Resultado= {[(Fe
X
fe)+ (Fpre
X
rpre)]/Cu}
X
100
Fe= factor de respuesta de colecalciferol o ergocalciferol re= área del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solución muestra Fpre =factor de respuesta de precolecalciferol o pre-ergocalciferol rpre = área del pico de precolecalciferol o pre-ergocalciferol de la Solución muestra Cu= concentración nominal de colecalciferol o ergocalciferol en la Solución muestra (µg/mL) Procedimiento 7 Este procedimiento emplea la saponificación de la muestra, seguida por una extracción líquido-líquido con éter-éter de petróleo y por la evaporación del éter-éter de petróleo y la reconstitución del residuo en una mezcla de tolueno y Fase móvil (1 :4). Se aplica a soluciones en aceite y cápsulas que contengan soluciones de vitamina D en aceite, en las que el aceite no interfiera con el precursor correspondiente de modo que éste pueda cuantificarse. La separación se logra en modo de fase normal sobre una columna L3 y la Aptitud del sistema requiere la separación de las formas trans de los precursores de vitamina D. A menos que se especifiquen en las monografías individuales, las Soluciones estándar, la Solución muestra y las soluciones reactivo se preparan según se indica a continuación. Hexano deshidratado: Preparar una columna cromatográfica rellenando un tubo cromatográfico, de 8 cm x 60 cm, con 500 g de tierra silícea para cromatografía de 50 a 250 µm, activada mediante secado a 150º durante 4 horas. 0/er Cromatogra-
450 (581) Valoración de Vitamina D / Pruebas Químicas
USP 39
fía (621 ), Cromatografía en Columna.) Pasar 500 ml de hexano a través de la columna y recoger el eluato en un matraz con tapón de vidrio. Fase móvil: Alcohol n-amílico en Hexano deshidratado (3 en 1000) Solución de butil hidroxitolueno: 1O mg/ml de butil hidroxitolueno en hexano para cromatografía Solución acuosa de hidróxido de potasio: 1 g/ml de hidróxido de potasio en agua recientemente calentada a ebullición. [NOTA-Preparar esta solución en el día de su uso.] Solución alcohólica de hidróxido de potasio: 3 g de hidróxido de potasio en 50 ml de agua recientemente calentada a ebullición. Agregar 1O ml de alcohol y diluir con agua recientemente calentada a ebullición hasta 100 ml. [NOTA-Preparar esta solución en el día de su uso.] Solución de ascorbato de sodio: Disolver 175 mg/ml de ácido ascórbico en hidróxido de sodio 1 N. [NOTA-Preparar en el día de su uso.] Solución de sulfuro de sodio: 12 g de sulfuro de sodio en 20 ml de agua. Diluir con glicerina hasta 100 ml. Solución madre del estándar: 0,5 mg/ml de ER Ergocalciferol USP o ER Colecalciferol USP en tolueno. [NOTA-Preparar esta solución en el día de su uso.] Solución estándar A: 20 µg/ml, a partir de Solución madre del estándar en Fase móvil. [NOTA-Almacenar esta solución a una temperatura que no exceda de Oº.] Solución estándar B: Pipetear y transferir 4 ml de Solución madre del estándar a un matraz de fondo redondo equipado con un condensador de reflujo y agregar 2 ó 3 cristales de butil hidroxitolueno. Desplazar el aire con nitrógeno y calentar en un baño de agua mantenido a una temperatura de 90º con luz tenue bajo una atmósfera de nitrógeno durante 45 minutos para obtener una solución que contenga vitamina D y pre-vitamina D. Enfriar, transferir con ayuda de varias porciones de Fase móvil a un matraz volumétrico de 100 ml y diluir con Fase móvil a volumen. Solución de aptitud del sistema: Agregar 100 mg de ER Aptitud del Sistema de Valoración de Vitamina D USP a un matraz volumétrico de 1O ml. Agregar una mezcla (1 en 5) de tolueno y Fase móvil a volumen y mezclar. Calentar una porción de esta solución a reflujo a 90º durante 45 minutos y enfriar. Solución muestra: Someter a reflujo no menos de 1O Cápsulas con una mezcla de 1O ml de Solución de ascorbato de sodio y 2 gotas de Solución de sulfuro de sodio en un baño de vapor durante 1O minutos, triturar los sólidos remanentes con una varilla de vidrio de punta roma y continuar el calentamiento durante 5 minutos. Enfriar y agregar 25 ml de alcohol y 3 ml de Solución acuosa de hidróxido de potasio. Someter la mezcla a reflujo en un baño de vapor durante 30 minutos. Enfriar rápidamente bajo una corriente de agua y transferir la mezcla saponificada a un separador cónico, enjuagando el matraz de saponificación con dos porciones de 15 ml de agua, 1O ml de alcohol y dos porciones de 50 ml de éter. [NOTA-Usar el éter dentro de las 24 horas después de abrir el envase.] Agitar vigorosamente la mezcla saponificada y los enjuagues combinados durante 30 segundos y dejar en reposo hasta que ambas capas se tornen transparentes. Transferir la fase acuosa a un segundo separador cónico, agregar una mezcla de 1O ml de alcohol y 50 ml de éter de petróleo y agitar vigorosamente. Dejar que se separen, transferir la fase acuosa a un tercer separador cónico y transferir la fase de éter de petróleo al primer separador, enjuagando el segundo separador con dos porciones de 1O ml de éter de petróleo y agregando los enjuagues al primer separador. Agitar la fase acuosa en el tercer separador con 50 ml de éter de petróleo y agregar la fase de éter de petróleo al primer separador. Lavar los extractos combinados de éter-éter de petróleo agitando vigorosamente con tres porciones de 50 ml de Solución alcohólica de hidróxido de potasio y lavar vigorosamente con porciones de 50 ml de agua hasta que el último lavado sea neutro frente a la fenolftaleína. Escurrir las gotas de agua remanentes de los extractos combinados de éter-éter de petróleo, agregar 2 láminas de papel de filtro de 9 cm en tiras al separador y agitar. Transferir los extractos lavados de éter-éter de petróleo a un matraz de fondo redondo, enjuagando el separador y el papel con éter de petróleo. Combinar los enjuagues de éter de petróleo con los extractos de éter-éter de petróleo, agregar 100 µL de Solución de butil hidroxitolueno y mezclar. Evaporar hasta sequedad al vacío agitando por rotación suave en un baño de agua mantenido a una temperatura no superior a 40º. Enfriar bajo una corriente de agua e introducir nitrógeno suficiente para restaurar la presión atmosférica. Disolver y diluir el residuo sin demora en un volumen medido con exactitud de una mezcla (1 en 5) de tolueno y Fase móvil, hasta que la concentración de vitamina D sea aproximadamente 25 µg/ml. Sistema cromatográfico (Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.) Modo: HPLC Detector: UV 254 nm Columna: 4,6 mm x 25 cm; relleno L3 Velocidad de flujo: 1-2 ml/min Volumen de inyección: 10-20 µL Aptitud del sistema Muestra: Solución de aptitud del sistema NOTA-Los tiempos de retención relativos para precolecalciferol, trans-colecalciferol y colecalciferol son 0,4; 0,5 y 1,0, respectivamente. Requisitos de aptitud Resolución: No menos de 1,0 entre trans-colecalciferol y precolecalciferol Desviación estándar relativa: No más de 2,0% para la respuesta del pico de colecalciferol
USP 39
Pruebas Químicas/ (581 >Valoración de Vitamina D 451
Análisis Muestras: Solución estándar A, Solución estándar By Solución muestra Factor de respuesta de colecalciferol o ergocalciferol Calcular el factor de respuesta de colecalciferol o ergocalciferol, F0 : F0 = C5/r5
C5 =concentración de ER Ergocalciferol USP en la Solución estándar A (µg/ml) r5 =área del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solución estándar A Factor de respuesta de precolecalciferol o pre-ergocalciferol Calcular la concentración, C' 5, en µg/ml, de colecalciferol o ergocalciferol en la Solución estándar B:
C's=Foxr's F0 = factor de respuesta de colecalciferol o ergocalciferol r' 5 = área del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solución estándar B Calcular la concentración, C'pre' en µg/ml, para pre-ergocalciferol:
C5 = concentración de ER Ergocalciferol USP en la Solución estándar A (µg/ml) C' 5 = concentración de colecalciferol o ergocalciferol en la Solución estándar B (µg/ml) Calcular el factor de respuesta, Fpre1 para precolecalciferol o pre-ergocalciferol:
Fpre = C' pref rP C'pre =concentración de precolecalciferol o pre-ergocalciferol (µg/ml)
rP = respuesta del pico de precolecalciferol o pre-ergocalciferol de la Solución estándar B Contenido de vitamina D Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de vitamina D como ergocalciferol (C 28 H44 0) o como colecalciferol (C 27 H44 0) en la porción de muestra tomada: Resultado= {[(F0 x re) + (Fpre x r' pre)l/Cu} x 100
F0 = factor de respuesta de colecalciferol o ergocalciferol
re= área del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solución muestra Fpre = factor de respuesta de precolecalciferol o pre-ergocalciferol r' pre= área del pico de precolecalciferol o pre-ergocalciferol de la Solución muestra Cu= concentración nominal de colecalciferol o ergocalciferol en la Solución muestra (µg/ml) Procedimiento 8 Este procedimiento es adecuado para la determinación de colecalciferol en aceites y matrices grasas. Emplea dos sistemas cromatográficos, uno para la limpieza de la muestra y el otro para la determinación de vitamina D. El estándar, estándar interno y las soluciones muestra se someten a saponificación, seguida por una extracción líquido-líquido con una mezcla de éter y hexano (1 :1 ). El extracto se evapora y reconstituye en la Solución de butil hidroxitolueno. A menos que se especifiquen en las monografías individuales, la Solución estándar, las Soluciones muestra, la Solución de estándar interno y las soluciones reactivo se preparan según se indica a continuación. Solución A: Alcohol n-amílico y hexano deshidratado (3:997) Solución B: Acetonitrilo, agua y ácido fosfórico (96: 3,8: 0,2) Solución de butil hidroxitolueno: 1O mg/ml de butil hidroxitolueno en hexano para cromatografía Solución acuosa de hidróxido de potasio: Disolver 800 mg de hidróxido de potasio en 1000 ml de agua recientemente calentada a ebullición, mezclar y enfriar. [NOTA-Preparar esta solución en el día de su uso.] Solución alcohólica de hidróxido de potasio: Disolver 3 g de hidróxido de potasio en 50 ml de agua recientemente calentada a ebullición, agregar 1O ml de alcohol y diluir con agua recientemente calentada a ebullición hasta 100 ml. [NOTAPreparar esta solución en el día de su uso.] Solución de ácido ascórbico: 100 mg/ml de ácido ascórbico en agua. [NOTA-Preparar esta solución en el día de su uso.] Solución de estándar interno: 5 µg/ml de ER Ergocalciferol USP en alcohol Solución madre del estándar: 5 µg/ml de ER Colecalciferol USP en alcohol Solución estándar: Transferir 2,0 ml de Solución madre del estándar y 2,0 ml de Solución de estándar interno a un matraz de fondo redondo. Proceder según se indica en Solución muestra 1 comenzando donde dice "Agregar 5 ml de ... ". Solución muestra 1: Transferir 4,00 g de aceite a un matraz de fondo redondo. Agregar 5 ml de Solución de ácido ascórbico, 100 ml de alcohol y 1O ml de Solución acuosa de hidróxido de potasio y mezclar. Someter la mezcla a reflujo en un baño de vapor durante 30 minutos. Agregar 100 ml de una solución de cloruro de sodio de 1O mg/ml. Enfriar rápidamente bajo una corriente de agua y transferir la mezcla saponificada a un separador de 500 ml, enjuagando el matraz de saponificación con 75 ml de una solución de cloruro de sodio de 1O mg/ml y luego con 150 ml de una mezcla de éter y hexano (1 :1 ). Agitar vigorosamente la mezcla saponificada y los enjuagues combinados durante 30 segundos y dejar en reposo hasta que ambas
452 (581) Valoración de Vitamina D / Pruebas Químicas
USP 39
capas se tornen transparentes. Desechar la capa inferior. Lavar los extractos de éter y hexano agitando vigorosamente con 50 mL de Solución alcohólica de hidróxido de potasio y luego lavando con tres porciones de 50 mL de una solución de cloruro de sodio de 1O mg/ml. Filtrar la capa superior a través de 5 g de sulfato de sodio anhidro sobre un papel de filtración rápida en un matraz de 250 mL adecuado para un evaporador rotatorio. Lavar el filtro con 1O mL de una mezcla de éter y hexano (1 :1 ), y combinar con el extracto. Evaporar el disolvente a presión reducida a una temperatura que no exceda de 30º y llenar con nitrógeno cuando la evaporación se haya completado. Alternativamente, evaporar el disolvente bajo una corriente suave de nitrógeno a una temperatura que no exceda de 30º. Disolver el residuo en 1,5 mL de Solución de butil hidroxitolueno. [NOTAPuede ser necesario calentar suavemente en un baño ultrasónico. Una fracción grande del residuo blanco es colesterol.] Solución muestra 2: Agregar 2,0 mL de Solución de estándar interno a 4,00 g de aceite y proceder según se indica en Solución muestra 1 comenzando donde dice "Agregar 5 mL de ... ". Sistema cromatográfico de limpieza (Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.) Modo: HPLC Detector: UV 265 nm Fase móvil: Solución A Columna de limpieza: Acero inoxidable; de 4,6 mm x 25 cm; relleno L1O Volumen de inyección: 350 µL Análisis (limpieza) Muestras: Solución estándar, Solución muestra 1 y Solución muestra 2 Recoger por separado los eluatos desde 2 minutos antes hasta 2 minutos después del tiempo de retención de colecalciferol en un tubo de vidrio que contenga 1 mL de Solución de butil hidroxitolueno y equipado con un cierre hermético. Evaporar cada tubo bajo una corriente de nitrógeno a una temperatura que no exceda de 30º. Disolver cada residuo en 1,5 mL de acetonitrilo e inyectar en el sistema cromatográfico analítico siguiente. Sistema cromatográfico analítico (Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.) Modo: HPLC Detector: UV 265 nm Fase móvil: Solución B Columna analítica: Acero inoxidable; de 4,6 mm x 15 cm; relleno L1 de 5 µm Volumen de inyección: 200 µL Aptitud del sistema Muestra: Solución estándar (después de la limpieza) Requisitos de aptitud Resolución: No menos de 1,4 entre colecalciferol y ergocalciferol Desviación estándar relativa: No más de 2,0% para el pico de colecalciferol, en inyecciones repetidas Análisis Muestras: Solución estándar, Solución muestra 1 y Solución muestra 2 (después de la limpieza) Calcular el contenido de vitamina D, en µg/g, en la porción de muestra tomada: Resultado= (Ruf R5) x (C5/Cu)
R5 = respuesta del pico de colecalciferol con respecto al estándar interno de la Solución estándar C5= concentración de ER Colecalciferol USP en la Solución estándar (µg/mL) Cu= concentración de aceite en la Solución muestra 2 (g/mL) Ru = respuesta del pico de colecalciferol con respecto al estándar interno de la Solución estándar 2, según se calcula a continuación: Ru = ruif[r1s2 - (r1s1 x fu2f fu1)] [NOTA-Si r,57 = O debido a que no se observa ningún pico en el sitio del estándar interno en el cromatograma de la Solución muestra 1, entonces Ru = ru2f r1s2·l ru2 = respuesta del pico de colecalciferol de la Solución muestra 2 r152 = respuesta del pico del estándar interno de la Solución muestra 2 r151 = respuesta del pico del estándar interno de la Solución muestra 1 ru 1 = respuesta del pico de colecalciferol de la. Solución muestra 1
USP 39
Pruebas Químicas/ (591) Determinación de Cinc 453
(591) DETERMINACIÓN DE CINC La necesidad de establecer una determinación cuantitativa de cinc en las Preparaciones farmacopeicas de insulina refleja el hecho de que este elemento es un componente esencial de los cristales de insulina-cinc. De la misma manera que el plomo, se puede determinar el contenido de cinc por el método de la ditizona o mediante absorción atómica.
Método de Ditizona Para esta prueba, seleccionar todos los reactivos que contengan el menor contenido posible de metales pesados. Si fuera necesario, destilar el agua y otros disolventes en aparatos de vidrio duro o vidrio de borosilicato. Enjuagar bien todos los materiales de vidrio con ácido nítrico diluido tibio (1 en 2) y luego con agua. Evitar el uso en el separador de cualquier lubricante que se disuelva en cloroformo. Soluciones y Disolventes EspecialesSOLUCIÓN ALCALINA DE CITRATO DE AMONIO-Disolver 50 g de citrato dibásico de amonio en agua para obtener 100 ml. Agregar 100 ml de hidróxido de amonio. Eliminar los metales pesados que podrían estar presentes, por extracción de la solución con porciones de 20 ml de Solución de Extracción de Ditizona (ver Plomo (251)) hasta que la solución de ditizona retenga un color verde transparente, luego extraer la ditizona remanente en la solución de citrato por agitación con cloroformo. CLOROFORMO-Destilar el cloroformo en un aparato de vidrio duro o vidrio de borosilicato, recibiendo el destilado en suficiente alcohol deshidratado para obtener una concentración final de 1 ml de alcohol por cada 100 ml de destilado. SOLUCIÓN DE DITIZONA-Emplear Solución Estándar de Oitizona (ver Plomo (251 )), preparada con el Cloroformo destilado. SOLUCIÓN ESTÁNDAR DE CINC-Disolver 625 mg de óxido de cinc, pesados con exactitud y previamente incinerados suavemente hasta peso constante, en 1 O ml de ácido nítrico y agregar agua hasta obtener 500,0 ml. Esta solución contiene 1,0 mg de cinc por ml. SOLUCIÓN ESTÁNDAR DE CINC DILUIDA-Diluir 1 ml de Solución Estándar de Cinc, medido con exactitud, con 2 gotas de ácido nítrico y suficiente agua para obtener 100,0 ml. Esta solución contiene 1 O µg de cinc por ml. Usar esta solución dentro del periodo de 2 semanas. SOLUCIÓN DE ÁCIDO TRICLOROACÉTICO-Disolver 100 g de ácido tricloroacético en agua hasta obtener 1000 ml. Procedimiento-Transferir de 1 a 5 ml de la preparación a analizar, medidos con exactitud, a un tubo de centrífuga graduado de 40 ml. Si fuera necesario, agregar ácido clorhídrico 0,25 N, gota a gota, hasta obtener una solución transparente. Agregar 5 ml de Solución de Ácido Tricloroacético y suficiente agua para obtener 40,0 ml. Mezclar y centrifugar. Transferir a un separador de vidrio duro un volumen exactamente medido del sobrenadante que, se supone, contiene de 5 µg a 20 µg de cinc y agregar agua hasta obtener aproximadamente 20 ml. Agregar 1,5 ml de Solución Alcalina de Citrato de Amonio y 35 ml de Solución de Ditizona. Agitar vigorosamente 100 veces. Permitir que la fase clorofórmica se separe. Insertar un trozo cilíndrico de algodón en el vástago del separador para extraer el agua que esté emulsionada en el cloroformo. Recoger en un tubo de ensayo el extracto clorofórmico (descartando la primera porción que pase) y determinar la absorbancia a 530 nm, con un espectrofotómetro apropiado. Calcular la cantidad de cinc contenida por referencia a una curva estándar de absorbancia-concentración obtenida utilizando 0,5 ml, 1,0 ml, 1,5 ml y, si el contenido de cinc de la muestra extraída excede 15 µg, también 2,0 ml de la Solución Estándar de Cinc Diluida. Corregir la curva estándar mediante una determinación concomitante de un blanco según se indica, donde se usan todos los reactivos pero no se agrega cinc.
454 (601) Medicamentos Nasales y para Inhalación / Pruebas Físicas
USP 39
Pruebas y Determinaciones Físicas (601) MEDICAMENTOS NASALES Y PARA INHALACIÓN: PRUEBAS DE CALIDAD DE DESEMPEÑO DE AEROSOLES, ATOMIZADORES Y POLVOS TABLA DE CONTENIDO Introducción A. Uniformidad de Dosis Liberada A.1 Aerosoles Nasales y Atomizadores Nasales A.1.1 Uniformidad de Dosis Liberada de Producto A.1.1.1 Muestreo de la Dosis Liberada de Atomizadores Nasales A.1.1.2 Muestreo de la Dosis Liberada de Aerosoles Nasales A.2 Aerosoles para Inhalación
y Atomizadores para Inhalación
A.2.1 Uniformidad de Dosis Liberada de Producto A.2.1.1 Muestreo de la Dosis Liberada de Aerosoles para Inhalación y Atomizadores para Inhalación A.3 Polvos Nasales A.3.1 Uniformidad de Dosis Liberada de Producto A.3.1.1 Muestreo de la Dosis Liberada de Polvos Nasales A.4 Polvos para Inhalación A.4.1 Uniformidad de Dosis Liberada de Producto A.4.1.1 Muestreo de la Dosis Liberada de Polvos para Inhalación B. Distribución del Tamaño de Gotitas/Partículas-Aerosoles, Atomizadores y Polvos Nasales B. l Medición del Tamaño de Partícula por Difracción de Láser C. Distribución del Tamaño Aerodinámico-Aerosoles, Atomizadores y Polvos para Inhalación C.1 Principios Generales de la Medición del Tamaño Aerodinámico de Partículas C.1.1 Medición de Estación C.1.2 Pérdida de Fármaco entre Estaciones (Pérdidas en las Paredes) C.1.3 Reingreso por Arrastre C.1.4 Balance de Masa C.2 Aparato 1 para Aerosoles y Atomizadores para lnhalación-lmpactador Andersen (sin preseparador) C.2.1 Diseño-Aparato 1 C.2.2 Procedimiento-Aparato 1 C.3 Aparato 2 para Polvos para lnhalación-lmpactador Marple-Miller C.3.1 Diseño-Aparato 2 C.3.2 Procedimiento-Aparato 2 C.4 Aparato 3 para Polvos para lnhalación-lmpactador Andersen (con preseparador) C.4.1 Diseño-Aparato 3 C.4.2 Procedimiento-Aparato 3
C.5 Aparato 4 para Polvos para lnhalación-lmpactador (lmpinger) Multiestación en Fase Líquida
Pruebas Físicas/ (601) Medicamentos Nasales y para Inhalación 455
USP 39
C.5.1 Diseño-Aparato 4 C.5.2 Procedimiento-Aparato 4 C.6 Aparato 5 para Polvos para lnhalación-lmpactador de Nueva Generación (con preseparador) C.6.1 Diseño-Aparato 5 C.6.2 Procedimiento-Aparato 5 C.7 Aparato 6 para Aerosoles y Atomizadores para lnhalación-lmpactador de Nueva Generación (con preseparador) C.7.1 Diseño-Aparato 6 C.7.2 Procedimiento-Aparato 6
INTRODUCCIÓN Las principales mediciones de desempeño para aerosoles, atomizadores y polvos nasales y para inhalación se relacionan con la dosis liberada al paciente, incluyendo la uniformidad de la dosis liberada y las mediciones pertinentes de tamaño de partícula (óptico o aerodinámico) dependiendo de la forma farmacéutica. Las secciones siguientes presentan descripciones de cada una de éstas. El capítulo Medicamentos Nasales y para Inhalación-Información General y Pruebas de Calidad del Producto (5), provee una tabla de nomenclatura de la que se pueden obtener los términos descriptivos para varias formas farmacéuticas.
A. UNIFORMIDAD DE DOSIS LIBERADA
A.1 Aerosoles Nasales y Atomizadores Nasales La siguiente prueba se aplica a aerosoles y atomizadores nasales, formulados como suspensiones no acuosas o acuosas o soluciones de fármacos que generalmente se presentan en envases multidosis y provistos de válvulas o bombas dosificadoras. En todos los casos y para todas las pruebas, preparar y probar el atomizador según se indica en el etiquetado y en las instrucciones de uso. A.1 .1 UNIFORMIDAD DE DOSIS LIBERADA DE PRODUCTO
A menos que se indique algo diferente en la monografía individual, el contenido de fármaco de la dosis mínima liberada recolectada al inicio de la vida de la unidad y al final de la vida de la misma, se determinará en 1 O envases distintos. Esto representa un total de 20 determinaciones. Estas mediciones deben realizarse después de cebar el sistema según se describe en el etiquetado o en las instrucciones de uso. El número de dosis no debe exceder de 2 atomizaciones (es decir, un total de 20 determinaciones).
A.1.1.1 Muestreo de la dosis liberada de atomizadores nasales Procedimiento-Para garantizar una recolección de dosis in vitro reproducible, se recomienda emplear un medio mecánico de accionamiento del sistema dosificador o bomba para liberar las dosis que se van a recolectar. El procedimiento de accionamiento mecánico debe tener controles adecuados para los parámetros críticos de accionamiento mecánico (p.ej., fuerza de accionamiento, velocidad de accionamiento, longitud del desplazamiento y periodos de descanso). La prueba debe realizarse en unidades que hayan sido minuciosamente agitadas y cebadas de acuerdo con las instrucciones de uso para el paciente. La unidad de prueba debe accionarse en una posición vertical o casi vertical con la válvula hacia arriba. La dosis recolectada al inicio de cada uno de los 1 O envases de prueba debe ser la dosis inmediatamente posterior al cebado, y la dosis recolectada al final de la vida de cada envase debe corresponder al último número de dosis declarado en la etiqueta del envase. Las dosis entre las dos muestras de prueba secuenciales deben desecharse apropiadamente. Para productos en suspensión, la dosis debe ser liberada en un envase adecuado (por ejemplo, un vial de centelleo) en el cual se pueda lograr la transferencia cuantitativa desde el envase en análisis. Se utiliza un método analítico validado para determinar la cantidad de fármaco en cada dosis liberada y los datos se informan como porcentaje de la cantidad declarada. Para productos en solución, la dosis liberada se puede determinar gravimétricamente a partir del peso de la dosis liberada y de la concentración y la densidad de la solución de llenado del producto en análisis.
A.1.1.2 Muestreo de la dosis liberada de aerosoles nasales: Ver A.2. 7. 7 Muestreo de la dosis liberada de aerosoles para inhalación
y atomizadores para inhalación.
456 (601) Medicamentos Nasales y para Inhalación / Pruebas Físicas
USP 39
A.2 Aerosoles para Inhalación y Atomizadores para Inhalación Las siguientes pruebas se aplican a aerosoles para inhalación (comúnmente conocidos como inhaladores de dosis fija) y atomizadores para inhalación. Los aerosoles para inhalación se formulan como suspensiones o soluciones de un fármaco en propelentes y posiblemente en otros excipientes adecuados, y se presentan como unidades multidosis. Los atomizadores para inhalación son, por lo regular, formulaciones líquidas acuosas envasadas en un sistema compacto de envase-cierre que contiene una bomba atomizadora integral. Consultar el capítulo (5) para información adicional. Los siguientes métodos de prueba son específicos para estos productos y pueden requerir modificaciones cuando los analistas analizan tecnologías de inhalación alternativas (por ejemplo, aerosoles para inhalación o atomizadores para inhalación activados por la respiración). No obstante, los requisitos farmacopeicos para todas las formas farmacéuticas de dosis fija para inhalción requieren determinar la dosis liberada y la distribución del tamaño aerodinámico. En todos los casos y para todas las pruebas, el producto debe ser preparado y probado de acuerdo con las instrucciones de la etiqueta y las instrucciones de uso. Cuando el fabricante del producto no provea dichas instrucciones, se deben seguir las instrucciones de descarga de dosis precisas que se incluyen en las pruebas siguientes. A.2.1 UNIFORMIDAD DE DOSIS LIBERADA DE PRODUCTO La prueba de Uniformidad de Dosis Liberada se requiere para aerosoles para inhalación y atomizadores para inhalación que contienen formulaciones de fármacos (p.ej., solución o suspensión) en presentaciones con dosis medidas por el dispositivo o con dosis premedidas o prefijadas. La prueba de Uniformidad de Dosis Liberada incluye la uniformidad de dosis durante toda la vida de la unidad. (Para productos envasados en unidades de dosificación prefijadas/premedidas, consultar también el capítulo Uniformidad de Unidades de Dosificación (905).) En esta prueba, una dosis se define como el número mínimo recomendado de atomizaciones especificado en el etiquetado o en las instrucciones de uso del producto, pero no más de dos atomizaciones. Para aerosoles para inhalación y atomizadores para inhalación, la dosis liberada esperada se especifica en la etiqueta, a menos que se especifique algo distinto en la monografía individual. Su valor refleja el contenido medio de fármaco esperado para un gran número de dosis liberadas recolectadas de muchas unidades del producto, empleando el método especificado en la monografía. A menos que se indique algo diferente en la monografía individual, el contenido de fármaco de las dosis liberadas recolectadas al comienzo de la vida de la unidad (después de realizar el cebado según se describe en la etiqueta o en las instrucciones de uso) y al final de la vida de la unidad declarada en la etiqueta, se determinará a partir de 1O envases distintos (es decir, un total de 20 determinaciones). A.2.1.1 Muestreo de la dosis liberada de aerosoles para inhalación y atomizadores para inhalación Procedimiento-Para determinar el contenido de ingrediente activo en la nube descargada de un aerosol para inhalación y de un atomizador para inhalación, usar el Aparato A de muestreo (ver la Figura 7) descrito a continuación. Preparar el producto para su uso de acuerdo con las instrucciones del etiquetado para agitar, cebar y disparar. A menos que se indique algo diferente en la monografía individual, con la bomba de vacío en funcionamiento y asegurando una velocidad de flujo de aire a través del dispositivo del producto de 28,3 L de aire por minuto (±5%), descargar en el aparato los accionamientos mínimos recomendados a través del adaptador de boquilla, accionando el sistema de medición durante un tiempo suficiente para garantizar que la dosis se haya descargado por completo. El volumen de aire muestreado no debe exceder de 2,0 L. La dosis recolectada de cada uno de los 1O envases de prueba debe ser la dosis inmediatamente posterior al cebado y la dosis recolectada al final de la vida de cada envase debe ser la última dosis de acuerdo con lo declarado en la etiqueta. A menos que se indique algo diferente en las instrucciones de uso para el paciente, agitar el producto durante 5 segundos y recolectar el primer accionamiento posterior al cebado. Esperar 5 segundos y recolectar el siguiente accionamiento, cuando se justifique. Las dosis entre las dos muestras de prueba secuenciales (es decir, el comienzo y el final de la vida del envase) deben desecharse de manera apropiada. Se debe tener en cuenta que, para los aerosoles para inhalación, la velocidad de las descargas (número de descargas por unidad de tiempo) que se van a desechar no debe ocasionar un enfriamiento excesivo del envase. Después de las recolecciones individuales del número mínimo de accionamientos de cada unidad en cada muestra de prueba secuencial, retirar el producto del Aparato A (ver la Figura 7) y desconectar el vacío. Valorar por separado el contenido de fármaco en el aparato al comienzo y al final de las muestras de prueba secuenciales después de enjuagar el filtro y el interior del aparato con un disolvente adecuado. Aparato A-El aparato de muestreo (ver la Figura 7) consta de una base para soporte de filtro con un soporte de filtro de malla abierta, como una criba de acero inoxidable, un tubo de recolección fijado o atornillado a la base para soporte de filtro y un adaptador de boquilla para garantizar un sellado hermético entre el tubo de recolección y la boquilla. Usar un adaptador de boquilla que garantice que la abertura de la boquilla del producto esté nivelada con la cara frontal o con el borde indentado de 2,5 mm que está en el tubo de recolección de muestra, según sea apropiado. El conector de vacío está conectado a un sistema compuesto por una fuente de vacío, un regulador de flujo y un caudalímetro. La fuente debe ser capaz de arrastrar aire a través de todo el dispositivo, incluyendo el filtro y el producto a analizar, a la velocidad de flujo deseada. Durante las pruebas de aerosoles para inhalación, el aire debe extraerse de forma continua a través del sistema de manera que se evite la pérdida del medicamento por fuga al medio ambiente que lo rodea. La base para soporte de filtro está diseñada para soportar discos de filtro de 25 mm de diámetro. Con el flujo de aire empleado, el tubo de recolección de muestra y el disco de filtro deben ser capaces de recolectar cuantitativamente la dosis liberada. El disco de filtro y los restantes materiales utilizados en la construc-
Pruebas Físicas/ (601) Medicamentos Nasales y para Inhalación 457
USP 39
ción del aparato deben ser compatibles con el fármaco y los disolventes empleados para extraer el fármaco del filtro. Un extremo del tubo de recolección está diseñado para sostener firmemente el filtro contra la base para soporte de filtro. Una vez montado, las uniones entre los componentes del aparato son herméticas, de forma que cuando se aplica vacío a la base del filtro, todo el aire extraído a través del aparato de recolección pasa a través del dispositivo del producto. Rosca Interna ~26,7
~
31,8
Tubo
Cotas de 103 89 5
rnmoooOóo
~~
Rosca Externa
ffi
Rosca Interna
4
:-n
Descanso de Rosca
Conector de Vacío
20
J_
~apa
16,6
:::__J_
8,5
1 1
t
Tapa
Adaptadores de Boquilla
~
Tubo de recolección de Muestra Tapa
Las dimensiones son en mm, salvo que se especifique lo contrario.
~
lohalad0
Dosis Fija
Figura 1. Aparato de muestreo para aerosoles y atomizadores para inhalación
A.3 Polvos Nasales La siguiente prueba se aplica a polvos nasales presentados en unidades de dosis premedidas o medidas por el dispositivo. En todos los casos y para todas las pruebas, preparar y probar el polvo según se indica en el etiquetado y en las instrucciones de uso. A.3.1 UNIFORMIDAD DE DOSIS LIBERADA DE PRODUCTO A menos que se indique algo diferente en la monografía individual, el contenido de fármaco de las dosis mínimas liberadas de 1O envases individuales se determinará al inicio de la vida de la unidad y nuevamente al número correspondiente de dosis medidas declarado en la etiqueta. Esto representa un total de 20 determinaciones. Para polvos nasales envasados en unidades monodosis, la Uniformidad de Dosis Liberada se puede aplicar a 1O unidades de dosificación. A.3.1.1 Muestreo de la dosis liberada de polvos nasales: Para garantizar una recolección de dosis in vitro reproducible, se recomienda emplear un medio adecuado de accionamiento del dispositivo para liberar las dosis a recolectar. Las unidades de
458 (601) Medicamentos Nasales y para Inhalación / Pruebas Físicas
USP 39
prueba se deben accionar en posición vertical o casi vertical. Las dos dosis separadas recolectadas incluyen la primera dosis y la dosis correspondiente a la última dosis declarada de cada una de 1O unidades. Las dosis entre las dos muestras de prueba secuenciales para cada unidad se deben desechar apropiadamente. Se emplea un método analítico validado para determinar la cantidad de fármaco en cada dosis liberada y los datos se registran como porcentaje de la cantidad declarada en la etiqueta. Para polvos nasales, se recomienda el aparato B (Figura 2).
A.4 Polvos para Inhalación Las siguientes pruebas se aplican a polvos para inhalación (comúnmente conocidos como inhaladores de polvo seco) presentados como unidades de dosis premedidas o medidas por el dispositivo. Los requisitos farmacopeicos para todos estos medicamentos requieren la determinación de la dosis liberada y de la distribución de tamaño aerodinámico. En todos los casos y para todas las pruebas, preparar y probar el producto según se indica en el etiquetado y en las instrucciones de uso. Cuando el fabricante del producto no provea dichas instrucciones, seguir las instrucciones de descarga de dosis precisas que se incluyen en las pruebas siguientes. A.4.1 UNIFORMIDAD DE DOSIS LIBERADA DE PRODUCTO La prueba de Uniformidad de Dosis Liberada se requiere para polvos para inhalación en presentaciones con dosis medida por el dispositivo y premedidas (incluyendo multidosis ordenadas) cuyo etiquetado indica que se deben usar con el sistema de liberación especificado. La prueba de Uniformidad de Dosis Liberada incluye la uniformidad de dosis durante toda la vida de la unidad. (Para formulaciones envasadas en unidades de dosis premedidas, consultar también el capítulo (905).) Se debe tener en cuenta que la dosis liberada esperada es el contenido medio de fármaco de un gran número de dosis liberadas recolectadas de muchas unidades en condiciones experimentales definidas. En muchos casos, el valor esperado puede depender de la forma en que se realice la prueba para la dosis liberada. Para polvos para inhalación, en los que la cantidad que se declara en la etiqueta es usualmente la dosis premedida o medida del fármaco, la dosis liberada esperada se especifica en la monografía individual y generalmente es menor que la cantidad que se declara en la etiqueta. Su valor refleja el contenido medio de fármaco esperado para un gran número de dosis liberadas recolectadas del producto, empleando el método especificado en la monografía. A menos que se indique algo diferente en la monografía individual, el contenido de fármaco de la dosis mínima liberada de 1 O envases individuales se determina de acuerdo con el procedimiento descrito a continuación. La prueba de Uniformidad de Dosis Liberada durante toda la vida de la unidad se requiere para medicamentos envasados en unidades de dosis medida por el dispositivo o unidades de dosis premedidas con dosis múltiples ordenadas que tienen una secuencia de dosis predeterminada. A menos que se indique algo diferente en la monografía individual, el contenido de fármaco de las dosis liberadas se recolectará al inicio de la vida de la unidad y nuevamente al número de dosis declarado en la etiqueta. Se obtendrán dos determinaciones de 1 O unidades individuales de medicamento. Esto representa un total de 20 determinaciones. Para polvos para inhalación envasados en unidades monodosis, la Uniformidad de Dosis Liberada se puede aplicar a 1 O unidades de dosificación. A.4.1.1 Muestreo de la dosis liberada de polvos para inhalación: Emplear el Aparato B (ver la Figura 2) para determinar el contenido del ingrediente activo emitido de la boquilla de un polvo para inhalación. Este aparato puede muestrear las dosis emitidas a distintas velocidades de flujo de aire. G
g
H Válvula de Control de Flujo
\
PI"'-.
Temp_··----· " " '
Adaptador de Boquilla
"..
Bomba de Vací F
B E
e
D
Filtro Tubo de Recolección de Muestra A
Figura 2. Aparato B: Aparato de muestreo para polvos para inhalación. (Ver la Tabla 7 para especificaciones de los componentes.)
Pruebas Físicas/ (601) Medicamentos Nasales y para Inhalación 459
USP 39
Tabla 1. Especificaciones de Componentes para el Aparato B (ver la Figura 2) Código
Artículo
Descripción
Dimensiones
A
Tubo de recolección de muestra•
Ver la Figura 2
34,85 mm de diámetro interno x 12 cm de longitud
B
Filtrob
Ver la Figura 2
Filtro de fibra de vidrio de 47 mm
Conector
(p.ej., acoplamiento corto de metal con ramificación a P3 de diámetro menor)
28 mm de diámetro interno
D
Tubería de vacío
(p.ej., tubería de silicona con un diámetro externo de 14 mm y un diámetro interno de 8 mm)
Un tubo de longitud adecuada de diámetro interno 28 mm con un volumen interno de 25 mL ±5 ml.
E
Válvula solenoide de dos vías<
Ver la Figura 2
Válvula solenoide de 2 vías, 2 puertos, con un diámetro interno 28 mm y un tiempo de respuesta de apertura de $100 milisegundos.
c
F
Bomba de vacíod
Ver la Figura 2
La bomba debe ser capaz de extraer a la velocidad de flujo requerida a través del aparato ensamblado con el polvo para inhalación en el adaptador de boquilla. Conectar la bomba a la válvula solenoide empleando una tubería de vacío corta y ancha (2 1O mm de diámetro interno) y canectores para minimizar los requisitos de capacidad de la bomba.
G
Temporizador"
Ver la Figura 2
El temporizador interrumpe o permite el paso de corriente a la válvula solenoide durante el lapso de tiempo requerido.
Ver la Figura 2
2,2 mm de diámetro interno, 3, 1 mm de diámetro externo, a nivel con la superficie interna del tubo de recolección de muestra, centrado y sin rebabas, a 59 mm de su entrada. Las llaves de presión Pl, P2 y P3 no se deben abrir al exterior durante la recolección de la dosis.
Pl
Llave de paso de presión
Pl, P2, P3
Mediciones de presión1
H
Válvula de control de flujo9
-
Ver la Figura 2
-
Válvula reguladora ajustable con máximo Cv 2 1h.
ª A modo de ejemplo, un producto Millipore número XX4004700 (Millipore Corporation, 80 Ashby Road, Bedford, MA 01 732), modificado de forma que el tubo de salida tenga un diámetro interno de 28 mm, equipado con un producto Gelman número 61631. b A/E (Gelman Sciences lnc., 600 South Wagner Road, Ann Arbor, MI 48106) o equivalente. e Producto ASCO número 8030G13, Automatic Switch Company, 60 Hanover Road, Florham Park, NJ 07932. d Producto Gast tipo 1023, 1423 ó 2565 (Gast Manufacturing lnc., PO Box 97, Benton Harbar, MI 49022) o equivalente. e Producto Eaton número 45610-400 (Eaton Corporation, Automotive Products Division, 901, South 12th Street, Watertown, WI 53094) o equivalente. f A modo de ejemplo, un manómetro PDM 21 O (Air-Neotronics Ltd., Neotronics Technology ple, Parsonage Road, Takeley, Bishop's Stortford, CM226PU, Gran Bretaña) o equivalente. g Un producto Parker Hannifin tipo 8FV12LNSS (Parker Hannifin ple., Riverside Road, Barnstable, Devon EX31 1 NP, Gran Bretaña) o equivalente. h Coeficiente de Flujo, según lo define la norma ISA S75.02 Control valve capacity test procedure en Standards and Recommended Practices far lnstrumentation and Control, 1Orna. edición, Vol. 2; 1989. Publicada por lnstrument Society of America, 67 Alexander Orive, PO Box 1227, Research Triangle Park, NC 27709, EE.UU. Aparato 8-EI aparato es similar al que se describe en la Figura 1 para analizar los aerosoles para inhalación. Sin embargo, en este caso el filtro y el tubo de recolección tienen un diámetro interno mayor para poder alojar discos de filtro de 47 mm de diámetro. Esta característica permite la recolección de las dosis a mayores velocidades de flujo de aire-hasta 100 L de aire/ minuto-cuando resulta necesario. Un adaptador de boquilla garantiza un sellado hermético entre el tubo de recolección y la boquilla del polvo para inhalación en análisis. El adaptador de boquilla debe garantizar que el extremo de la boquilla del producto esté a nivel con el extremo abierto del tubo de recolección de la muestra. Los conectores de tubería, si se emplean, deben tener un diámetro interno :?:8 mm para evitar que sus propios diámetros internos creen una resistencia significativa al flujo de aire. Se debe seleccionar una bomba de vacío con un exceso de capacidad para extraer aire a la velocidad de flujo volumétrico especificada a través del aparato de muestreo y del producto simultáneamente. Una válvula de dos vías, operada mediante solenoide, de baja resistencia y controlada por un temporizador está interpuesta entre la bomba de vacío y la válvula de control de flujo para controlar la duración del flujo. Este tipo de válvula permite que se extraigan 4,0 L de aire (±5%) desde la boquilla del producto a la velocidad de flujo especificada. El control del flujo se logra asegurando que se produzca un flujo crítico (sónico) en la válvula de control de flujo (la relación de presión absoluta P3/P2 es:.,:; 0,5 en condiciones de flujo estacionario). Procedimiento-Operar el aparato a un flujo de aire que produzca una caída de presión de 4 kPa (40,8 cm de H20) en el producto a analizar y durante un lapso de tiempo que sea congruente con la extracción de 2,0 L de aire desde la boquilla del producto. [NOTA-Si la velocidad de flujo y la duración se definieran de forma diferente en la monografía, ajustar el sistema con una aproximación de 5% con respecto a esos valores.] El volumen del aire muestreado no debe exceder de 2,0 L. Determinar la velocidad de flujo de prueba usando el Aparato B de la siguiente manera. Insertar el producto en el adaptador de boquilla para asegurar un sellado hermético. En los casos en que el envase del medicamento modifique la resistencia del producto al flujo de aire, usar un dispositivo con el envase cargado, sin el medicamento (con el envase previamente vaciado). En los otros casos, usar un dispositivo sin carga (sin el medicamento). Conectar un puerto de un transductor de presión diferencial a la llave de presión, Pl, y dejar el otro abierto a la atmósfera exterior. Encender la bomba y abrir la válvula solenoide de dos vías. Ajustar la válvula de control de flujo hasta que la caída de presión a través del producto sea de 4,0 kPa (40,8 cm de H2 0).
460 (601) Medicamentos Nasales y para Inhalación / Pruebas Físicas
USP 39
Asegurarse de que se produzca un flujo crítico (sónico) en la válvula de control de flujo determinando los valores individuales de presión absoluta P2 y P3 de manera que la relación P3/P2 sea ::>0,5. Si no se logra la relación P3/P2, cambiar la bomba por una más potente y medir nuevamente la velocidad de flujo. Las condiciones de flujo crítico (sónico) en la válvula de control de flujo son necesarias para asegurar que el flujo volumétrico de aire extraído de la boquilla no se vea afectado por fluctuaciones de la bomba y modificaciones de la resistencia al flujo de aire en el producto. Retirar el producto del adaptador de boquilla sin alterar la válvula de control de flujo, medir la velocidad del flujo de aire extraído desde la boquilla, Q0 u11 conectando herméticamente un caudalímetro al adaptador de boquilla. Emplear un caudalímetro calibrado para medir el flujo volumétrico que sale del medidor de manera hermética para determinar directamente Oout o, si tal medidor no se pudiera obtener, calcular el flujo volumétrico que sale del medidor (Oout) empleando la ley de los gases ideales. Por ejemplo, para un medidor calibrado para el flujo volumétrico de entrada (Q;n) calcular:
P0 = presión atmosférica !lP = caída de la presión en el medidor Si la velocidad de flujo es >100 L de aire/minuto, ajustar la válvula de control de flujo hasta que Oout sea igual a 100 L/minuto; de lo contrario, registrar el valor de Ooutt sin modificar la válvula de control de flujo. Definir la duración del flujo de prueba, p.ej., a 60 L/minuto T = 120/Q0 u11 en segundos, de manera que un volumen de 2,0 L de aire (±5%) se extraiga del producto a la velocidad de flujo de prueba Oout y ajustar de manera correspondiente el temporizador que controla la operación de la válvula solenoide de dos vías. Cebar o cargar el dispositivo con polvo para inhalación conforme a las instrucciones que figuran en la etiqueta. Con la bomba de vacío en funcionamiento y la válvula solenoide cerrada, insertar la boquilla del producto horizontalmente en el adaptador de boquilla. Descargar el polvo en el aparato de muestreo activando el temporizador que controla la válvula solenoide y extrayendo 2,0 L de aire desde el producto a la velocidad de flujo previamente definida. Repetir la operación completan - 1 veces, comenzando donde dice "Cebar o cargar el dispositivo con polvo", en donde n es el número de veces definido en el etiquetado como la dosis mínima recomendada. Desmontar el envase del dispositivo de polvo para inhalación del aparato de muestreo y desconectar la tubería de vacío D. Valorar el contenido de fármaco en el aparato después de enjuagar el filtro y el interior del aparato con un disolvente adecuado. Cuando se especifique en la monografía individual, realizar esta prueba en condiciones de temperatura y humedad controladas.
B. DISTRIBUCIÓN DEL TAMAÑO DE GOTITAS/PARTÍCULAS-AEROSOLES, ATOMIZADORES Y POLVOS NASALES En el caso de aerosoles, atomizadores y polvos nasales en suspensión y en solución, la distribución del tamaño de las gotitas/ partículas se debe determinar para la nube liberada subsiguiente a la descarga en condiciones experimentales especificadas. Si se usa un método de difracción de láser (para más detalles, consultar la descripción de este método en la sección siguiente), la distribución del tamaño de las gotitas se puede controlar en términos de intervalos para el 1Oº (0 10 ), 50º (050 ) y 90° (0 90 ) percentil de la distribución de tamaño acumulativa ponderada por volumen (masa), así como el alcance de la distribución, expresado como [(0 90 - 0 10 )/050 ], y el porcentaje de gotitas de menos de 1O µm. Se debe tomar en cuenta que 0 50 es idéntico al diámetro medio del volumen (masa) cuando la distribución es unimodal. Los procedimientos analíticos apropiados y validados o calibrados para la determinación del tamaño de las gotitas/partículas emitidas deben describirse a detalle suficiente para permitir una evaluación exacta y reproducible que incluya lo siguiente: • información completa sobre el aparato y los accesorios • modo teórico (aproximación de Lorenz-Mie o de Fraunhofer) • la aplicación de la opción de desactivación para uno o más de los detectores más internos para mitigar los efectos del direccionamiento del haz (sólo se aplica a aerosoles nasales) • versión del software • colocación de la muestra con respecto al banco óptico del difractómetro del láser • intervalo de medición • ancho del haz • condición de accionamiento del láser con respecto al inicio y el término de la secuencia de medición • límite inferior de detección (si no se usa el accionamiento del láser) • y límite de obstrucción de luz (límite superior del intervalo de detección en términos de la concentración de partículas).
B.1 Medición del Tamaño de Partícula por Difracción de Láser Los medicamentos nasales destinados para aplicación tópica en la cavidad nasal producen gotitas líquidas que a menudo son mucho más grandes que el intervalo de operación de los impactadores inerciales multiestación. Por ende, la difracción de láser (en ocasiones llamada dispersión de luz láser en ángulo bajo) es una alternativa aceptable para determinar la distribución del tamaño debido a que no hay necesidad de relacionar la escala del tamaño con el diámetro aerodinámico. La teoría y los principios operativos para la difracción de láser se encuentran adecuadamente descritos en la norma ISO 13320:2009. Estos sistemas usan el patrón de dispersión de luz producido por el paso de una nube de gotitas a través de la
USP 39
Pruebas Físicas/ (601) Medicamentos Nasales y para Inhalación 461
zona de medición para desarrollar la distribución de tamaño ponderada por volumen en un proceso iterativo en el que se usa un modelo teórico (ya sea de Fraunhofer o de Lorenz-Mie) para interpretar los datos. El proceso se resume esquemáticamente en la figura Figura 3. [NOTA-Si se selecciona la opción del modelo de Lorenz-Mie, será necesario ingresar valores para los componentes reales (refracción) e imaginarios (absorción) del índice de refracción para el líquido que se está estudiando. Los fabricantes de equipos de difracción de láser proveen esta información para medios líquidos comúnmente encontrados, a través de su sitio Web o a solicitud.]
fabricante de instrumento.
Figura 3. Conversión de los datos de dispersión de luz en una distribución del tamaño de las gotitas por difractometría de láser. Se requiere un aparato que sea capaz de evaluar aerosoles o atomizadores. [NOTA-no todos los equipos de difracción de láser disponibles comercialmente tienen dicha capacidad.] Configurar el sistema de medición de acuerdo con el procedimiento descrito esquemáticamente en la Figura 4.
Figura 4. Configuración para difractometría de láser con un medicamento nasal. Los atomizadores para medicamentos nasales por lo general se miden usando un arreglo de banco abierto con una configuración de estación de accionamiento automático de manera que se pueda optimizar la reproducibilidad de la operación del inhalador de un accionamiento al siguiente. Esta precaución es particularmente importante para mediciones más exactas con bombas para atomizadores nasales. Verificar la alineación del inhalador con la configuración óptica del difractómetro de láser usando las herramientas provistas por el fabricante para optimizar el banco óptico. Verificar que la obstrucción del haz de luz esté dentro de los límites superior e inferior especificados por el fabricante, consultando el manual del operador para el sistema de difracción de láser que se esté usando. Es necesaria la extracción de vacío para eliminar las gotitas de manera eficiente después de que pasan a través del láser. Se podría presentar un resultado no representativo si el ajuste de este valor es demasiado bajo (por lo general <5%). Asimismo, ocurrirá un error no cuantificable debido a la dispersión múltiple si la obstrucción de la luz está por encima del límite superior recomendado. [NOTA-Este límite varía entre fabricantes y además puede variar entre los sistemas de difracción de láser del mismo fabricante.] Realizar tantas determinaciones repetidas como sea necesario para lograr un conjunto de datos representativo. Inspeccionar cada distribución de tamaño presentada, idealmente en formato diferencial ponderado por volumen o equivalente para eva-
462 (601) Medicamentos Nasales y para Inhalación / Pruebas Físicas
USP 39
luar si es o no unimodal y simétrica. [NOTA-El siguiente análisis de datos asume el cumplimiento con estos criterios. En caso contrario, puede ser necesario un análisis adicional que tome en cuenta la presencia de más de un modo en la distribución o sesgo.] Asumiendo que la densidad del líquido que se investiga es constante independientemente del tamaño de las gotitas, las distribuciones de tamaño ponderadas por volumen se pueden tratar como distribuciones de tamaño ponderadas por masa con el propósito de interpretar los datos. A partir de los datos acumulativos de distribución del tamaño-volumen, calcular la media y una desviación estándar para los tamaños que correspondan a fracciones de masa de menos del 10%, 50% y 90% de la distribución (0 10, 0 50 Y 090).
C. DISTRIBUCIÓN DEL TAMAÑO AERODINÁMICO-AEROSOLES, ATOMIZADORES Y POLVOS PARA INHALACIÓN C.1 Principios Generales de la Medición del Tamaño Aerodinámico de Partículas La distribución del tamaño de partículas o gotitas en la nube descargada por los aerosoles y atomizadores para inhalación y la distribución del tamaño de partículas en la nube descargada de los polvos para inhalación son parámetros importantes para evaluar el desempeño del producto. Aunque se puede usar la medición del tamaño de partícula por microscopía para evaluar el número de partículas grandes, de aglomerados y de partículas extrañas en las emisiones de los aerosoles y atomizadores para inhalación, cuando sea posible, esta prueba debe reemplazarse con un método para determinar la distribución del tamaño aerodinámico del aerosol del fármaco que abandona el producto. El diámetro aerodinámico de una partícula de aerosol es igual al diámetro de una esfera de densidad unitaria con la misma velocidad gravimétrica de asentamiento. La distribución de tamaño aerodinámico define la forma en que un aerosol se deposita durante la inhalación. En la práctica, muchos inhaladores descargan fármaco en forma de partículas o gotitas de gran tamaño (la fracción balística) que salen del inhalador a gran velocidad e impactan quedando capturadas en las superficies húmedas de la boca y garganta. El remanente de la descarga del inhalador es aerosol útil, una "fracción no balística" que se inhala en el resto del tracto respiratorio. Los dispositivos de impacto en cascada clasifican las partículas y las gotas de los aerosoles de acuerdo con los diámetros aerodinámicos. El principio de operación de estos dispositivos, mediante el cual las partículas y gotitas de aerosol se separan de la corriente de aire en movimiento por su inercia, se muestra en la Figura 5. Debido a que las dimensiones del tubo de admisión utilizado para conectar los productos a impactadores en cascada y a impactadores en fase líquida (que se muestran en los Aparatos 7; 2; 3; 4; 5 y 6) también definen la masa del fármaco que ingresa en el dispositivo para clasificar el tamaño aerodinámico, estas dimensiones se definen cuidadosamente y, cuando es posible, se mantienen constantes entre aparatos (ver las Figuras 6; 7; 8; 9; 7Oy 7 7).
USP 39
Pruebas Físicas/ (601) Medicamentos Nasales y para Inhalación 463
Partículas en aerosol
Estación inicial de la descarga Sello-----~
Placa colectora
Última estación de la descarga - - - - • / Placa colectora
Vacío Figura 5. Representación esquemática del principio de operación de los impactadores en cascada. (Se muestra un solo chorro por estación del impactador. Los impactadores con chorros múltiples en cada estación funcionan de la misma manera.) C.1.1 MEDICIÓN DE ESTACIÓN Los fabricantes de dispositivos de impacto en cascada proporcionan una calibración definitiva para las características de separación de cada estación de impacto en términos de la relación entre la eficiencia de recolección a dicha estación y el diámetro aerodinámico de las partículas y gotitas que la atraviesan en forma de aerosol. La calibración es una propiedad que depende de la dimensión y la disposición espacial del chorro, de la superficie sobre la que se recoge, y de la velocidad del flujo de aire que atraviesa. Debido a que los chorros pueden causar corrosión y desgaste a lo largo del tiempo, las dimensiones críticas de cada estación, que definen la calibración de la estación de impacto, deben medirse periódicamente. Este proceso conocido como medición de estación evita la necesidad de la calibración repetida usando aerosoles estándar y asegura que, en el análisis de las emisiones de los productos, sólo se utilicen aquellos dispositivos que cumplen con las especificaciones. El proceso incluye la medición y el ajuste de las dimensiones críticas del instrumento. C.1.2 PÉRDIDA DE FÁRMACO ENTRE ESTACIONES (PÉRDIDAS EN LAS PAREDES) Cuando sean posibles variaciones en la metodología y no se especifique un aparato en la monografía, el procedimiento seleccionado debe asegurar que se pierda no más del 5% de la masa de fármaco total descargada del producto (dentro del impactador) entre las superficies de recolección de muestra del dispositivo de impacto. En el caso de que se sepa que las pérdidas de fármaco entre estaciones son >5%, se debe usar otro aparato alternativo o bien el procedimiento debe realizarse de tal forma que las pérdidas en las paredes se incluyan junto con la recolección de la placa asociada. A modo de ejemplo, los siguientes procedimientos descritos para los Aparatos 7 y 3 han sido redactados incluyendo las pérdidas en las paredes junto con la placa de recolección asociada. No obstante, siempre que se sepa que tales pérdidas son :"0:5% de la masa total de fármaco descargada dentro del impactador y que no haya instrucciones contrarias en una monografía individual, el procedimiento puede simplificarse valorando sólo el fármaco que está sobre las placas de recolección.
464 (601) Medicamentos Nasales y para Inhalación /Pruebas Físicas
USP 39
C.1.3 REINGRESO POR ARRASTRE Cuando sea posible variar la metodología, el método seleccionado debe apuntar a minimizar el reingreso de partículas por arrastre (desde una estación de impacto superior a una inferior) en las estaciones que contribuyan a fracciones del tamaño definido en la monografía individual, especialmente cuando esto pueda alterar las cantidades recolectadas de fármaco. Minimizar el número de dosis muestreadas, usar superficies de recolección de partículas recubiertas y probar que los procedimientos para dosis múltiples producen resultados estadísticamente similares a los obtenidos a partir de un número de dosis menor son métodos que se pueden emplear para este propósito. En el caso de que no se pueda evitar el reingreso por arrastre, se deben normalizar el número de dosis recolectadas, el intervalo de tiempo entre dosis y la duración total del flujo de aire a través del dispositivo de impacto en cascada. En estas circunstancias, la presentación de los datos de impacto no debe asumir la validez de la calibración del impactador (es decir, los rangos de diámetros aerodinámicos no deben ser asignados a masas de fármacos recolectadas en estaciones específicas). Usando métodos de valoración apropiados y un dispositivo de impacto medido adecuado, los analistas pueden determinar la distribución de tamaño aerodinámico de partículas de los fármacos que salen de las boquillas de los aerosoles y atomizadores para inhalación o polvos para inhalación. Si los límites de temperatura o humedad para el uso del producto están indicados en la etiqueta, puede ser necesario controlar la temperatura y la humedad del aire del entorno del dispositivo y del aire que lo atraviesa para que se ajusten a esos límites. Se presumen las condiciones ambientales, salvo que se especifique algo diferente en las monografías individuales. C. 1 .4 BALANCE DE MASA Además de la distribución de tamaño, las buenas prácticas analíticas dictan que se debe lograr un balance de masa completo para confirmar que toda la cantidad de fármaco descargada desde el producto y que se captura y se mide en el tubo de admisión a través del filtro terminal del mpactador en cascada, esté comprendida en el intervalo aceptable con respecto a la dosis liberada medida. El resultado para la masa recuperada se puede expresar en términos de cada accionamiento como porcentaje de la dosis liberada declarada, la cual representa la dosis liberada desde la boquilla. La masa total de fármaco recolectada en todos los componentes (balance de material) dividida por el número total de dosis mínimas recomendadas descargadas es por lo regular no menos de 85% y no más de 115% de la cantidad declarada que se espera liberar. Ésta no es una prueba del producto pero sirve para asegurar que los resultados de la prueba son válidos. Procedimiento
Usar uno de los siguientes dispositivos de impacto multiestación, o uno equivalente, para determinar la distribución de tamaño aerodinámico de partículas de los fármacos que salen de las boquillas de aerosoles y atomizadores para inhalación o polvos para inhalación. Los Aparatos 1 y 6 [Figuras 6 y 11 (sin preseparador), respectivamente] están destinados para su uso con aerosoles y atomizadores para inhalación a una sola velocidad de flujo de aire. Los Aparatos 2, 3, 4 y 5 (Figuras 8, 9, 1Oy 11, respectivamente) están destinados para uso con polvos para inhalación a la velocidad de flujo de aire apropiada, Q0 w determinada anteriormente, siempre que el valor Oout esté comprendido en el intervalo de 30-100 L/minuto. [NOTA-Si Oout es >100 L/minuto, la prueba debe ser realizada ajustando Oout a 100 L/minuto; si Oout es menor que 30 L/minuto, la prueba se realiza con Oout a 30 L/minuto.] La Tabla 2 indica el aparato usado para determinar el tamaño aerodinámico de partículas y los productos que se pueden evaluar. Tabla 2. Aparato para Tamaño Aerodinámico de Partícula: Su Descripción y los Productos que se Pueden Evaluar Aparato
Descripción
Producto
1
lmpactador (no viable de 8 estaciones) Andersen (sin preseparador)
Aerosoles y atomizadores para inhalación
2
lmpactador Marple-Miller
Polvos para inhalación
3
lmpactador (no viable de 8 estaciones) Andersen (con preseparador)
Polvos para inhalación
4
lmpactador Multiestación en Fase Líquida
Polvos para inhalación
5
lmpactador de Nueva Generación (con preseparador)
Polvos para inhalación
6
lmpactador de Nueva Generación (sin preseparador)
Aerosoles
y atomizadores para inhalación
Tabla 3. Valores Límite para Todos los lmpactadores a Velocidades de Flujo Especificadas a. Puntos de Corte para los Aparatos 1 y 3 con Configuración Estándar para Operación a 28,3 L/mlnuto en Comparación con • Configuraciones Especializadas para Uso a 60 L/ minuto y 90 L/m 1nulo Estación -2
28,3 mL/minuto
60 L/mlnuto
90 L/mlnuto
-
-
8,0
-1
-
8,6
6,5
ºª
9,0
6,5
5,2
ª La versión de la estación O usada a 60 y 90 L/minuto presenta modificación externa que permite otra estación en lugar de equiparla con el cono adaptador de admisión. Sus características y desempeño internos se mantienen sin cambios.
Pruebas Físicas/ (601) Medicamentos Nasales y para Inhalación 465
USP 39
Tabla 3. Valores Límite para Todos los lmpactadores a Velocidades de Flujo Especificadas a. Puntos de Corte para los Aparatos 1 y 3 con Configuración Estándar para Operación a 28,3 L/minuto en Comparación con Configuraciones Especializadas para Uso a 60 L/mlnuto y 90 L/mlnuto (Continuacion) Estación
28,3 mL/mlnuto
60 L/minuto
1
5,8
4,4
90 L/mlnuto
3,5
2
4,7
3,2
2,6 1,7
3
3,3
1,9
4
2,1
1,2
1,0
5
l, 1
0,55
0,22
6
0,7
0,26
7
0,4
-
-
-
ª
La versión de la estación O usada a 60 y 90 L/minuto presenta modificación externa que permite otra estación en lugar de equiparla con el cono adaptador de admisión. Sus características y desempeño internos se mantienen sin cambios.
b . Puntos d e corte µm ) para e Aparato 2a6 0y9 0L/m 1 nuto
Estación
Velocidad de Flujo 60 L/mlnuto
Velocidad de Flujo 90 L/mlnuto
1
10,0
8,1
2
5,0
4,0
3
2,5
2,0
4
1,25
1,0
5
0,63
0,5
c. Puntos de Corte (µm) para el Aparato 4 a 60 L/mlnuto
Estación
Estación
Velocidad de Flujo (60 L/mlnuto)
1
13,0
2
6,8
3
3,1
4
1,7
d puntos d e corte ( µm para e IA.parato 5 y 6 a 30I 60 y 100 L/ mnu 1 to Velocidad de Flujo Velocidad de Flujo (30 L/mlnuto) (60 L/mlnuto)
Velocidad de Flujo (100 L/mlnuto)
1
11,76
8,06
6,12
2
6,40
4,46
3,42 2,18
3
3,97
2,82
4
2,30
1,66
1,31
5
1,36
0,94
0,72
6
0,83
0,55
0,40
7
0,54
0,34
0,24
Moca
0,36
0,14
0,07
ª
MOC =colector con microorificios (MOC, por sus siglas en inglés). Los tamaños corresponden a una eficiencia de recolección del 80% para esta estación de respaldo.
C.2 Aparato 1 para Aerosoles y Atomizadores para lnhalación-lmpactador Andersen (sin preseparador) Usar el Aparato 7 o un equivalente, a una velocidad de flujo de 28,3 L/minuto (±5%) conforme a lo especificado por el fabricante del impactador en cascada.
466 (601) Medicamentos Nasales y para Inhalación / Pruebas Físicas
USP 39
C.2.1 DISEÑO-APARATO 1 El diseño y montaje de este aparato y del tubo de admisión para conectar el impactador a un producto se muestran en las
Figuras 6, 6a y 6b.1 Boquilla del -Inhalador
Figura 6. Aparato 1: Montaje del tubo de admisión y del cono de ingreso sobre el impactador en cascada.
f>erfor!runorifkbyoclulr
10º± 1· 30º± 1· / / / /
14,3
/ /
/
La junta DEBE ser a prueba de fugas
/
/
/~ 45't1'
tomillo de cabeza roscada Número 8-32 6 M-4~--"" Nota 1) El material puede ser aluminio, acero
38
inoxidable u otro material adecuado 2) Tornear a partir de una barra estándar de 38 mm (1,5*) 3) Hacer un orificio de 19 mm en la barra ' 4) Cortar el tubo en un ángulode45º exactos como se muestra :.. -10º± 1º 5) La parte interna de los orfficios y de los estrechamientos debe estar pulida La rugosidad de la superficie (Ra) es de aproximadamente 0,40 micrones (16 micropulgadas) 6) Pulir las juntas en la barra para generar un sello sin fugas para los liquidos 7) Montar un soporte para alinear el interior del orificio de 19 mm y para taladrar las roscas M-4 x 0,7 ó 8-32 y obturarlas. Prácticamente no debe haber defectos de alineación entre el interior de los orificios en la junta
Vista isométrica del tubo de admisión
Figura 6a. Aparato 1: Vista expandida del tubo de admisión para uso con aerosoles y atomizadores para inhalación y polvos para inhalación.
1 Se puede obtener un impactador en cascada adecuado como Modelo Mk 11 de Thermo-Electron, 27 Forge Parkway, Franklin, MA 02038. El impactador se usa sin el preseparador. El producto se conecta al impactador a través del tubo de admisión, por encima del cono de ingreso que se muestra en la Figura 6. Si se emplea un impactador equivalente, se debe utilizar el tubo de admisión de la Figura 6a, aunque el cono de ingreso (Figura 6b) debe ser reemplazado por otro que se ajuste al impactador en cuestión. Se debe tener en cuenta que las superficies internas del tubo de admisión (Figura 6a) están diseñadas para ajustarse a nivel con sus contrapartes en el cono de ingreso (Figura 6b). Este diseño evita la captura del aerosol en la junta entre los dos tubos.
Pruebas Físicas/ (601) Medicamentos Nasales y para Inhalación 467
USP 39
• 6,4 Romper todos los bordes EXCEPTO este borde interno
+25,4± ,1
Puerto de entrada del muestreador de Andersen
R 9,5
12,3
30.2
l
! Profundidad: 2,5 hasta el _ _ _~ fondo del estrechamiento del agujero
Las medidas están en mm a menos que se indique algo diferente Figura 6b. Aparato 1: Vista expandida del cono de ingreso para montar el tubo de admisión en el impactador en cascada Andersen sin preseparador. El material puede ser aluminio, acero inoxidable u otro material adecuado. La rugosidad de la superficie (R0 ) debe ser aproximadamente de 0,4 µm. Las dimensiones críticas de ingeniería de los fabricantes para las estaciones del Aparato 7 figuran en la Tabla 4. Durante el uso, puede producirse la oclusión y bloqueo de las toberas de chorros y, por lo tanto, es necesario justificar las tolerancias de medición durante el uso. Tabla 4. Dimensiones Críticas para las Toberas de Chorro del Aparato 1 Número de Estación
o
Número de Chorros
Diámetro de Tobera (mm)
96
2,55 ± 0,025
1
96
1,89 ± 0,025
2
400
0,914 ± 0,013
3
400
0,711 ± 0,013
4
400
0,533 ± 0,013
5
400
0,343 ± 0,013
6
400
0,254 ± 0,013
7
201
0,254 ± 0,013
C.2.2 PROCEDIMIENTO-APARATO 1 Ajustar el impactador en cascada de múltiples estaciones según se describe en las instrucciones del fabricante, con un filtro terminal debajo de la última estación para capturar todas las partículas finas que de otra manera escaparían del dispositivo. Para asegurar una captura eficiente de partículas, recubrir la superficie de recolección de partículas de cada estación con glicerol, aceite siliconado u otro líquido adecuado generalmente depositado a partir de un disolvente volátil, a menos que se haya demostrado que esto es innecesario. Unir el tubo de admisión y el adaptador de boquilla de manera que se produzca un sellado hermético entre la boquilla del producto y el tubo de admisión según se muestra en la Figura 6. Emplear un adaptador de boquilla que garantice que el extremo de la boquilla del producto está a nivel con el extremo abierto del tubo de admisión. Asegurarse de que las diferentes estaciones del impactador en cascada están conectadas y selladas herméticamente para evitar fugas. Encender la bomba de vacío para extraer el aire a través del impactador en cascada y calibrar el flujo de aire a través del sistema con un caudalímetro apropiado unido al extremo abierto del tubo de admisión. Ajustar la válvula de control de flujo en la bomba de vacío para lograr un flujo constante a través del sistema a la velocidad requerida y asegurarse de que el flujo de
468 (601) Medicamentos Nasales y para Inhalación / Pruebas Físicas
USP 39
aire a través del sistema quede comprendido en un intervalo de ±5% con respecto a la velocidad de flujo especificada por el fabricante. A menos que se indique algo diferente en las instrucciones de uso para el paciente, agitar el producto durante 5 segundos y accionar el disparador para desechar una descarga. Con la bomba de vacío en funcionamiento, insertar la boquilla en su adaptador e inmediatamente pulsar para descargar la dosis mínima recomendada en el impactador en cascada. Mantener la válvula presionada durante el tiempo suficiente para garantizar que la dosis se haya descargado por completo. Si se requieren atomizaciones adicionales para recolectar la muestra, esperar 5 segundos antes de desmontar el producto del adaptador de boquilla, agitar el producto, colocarlo nuevamente en el adaptador e inmediatamente pulsar para descargar la siguiente dosis mínima recomendada. Repetir hasta que se haya descargado el número de dosis requerido. El número de dosis mínimas recomendadas debe ser tal que permita una determinación exacta y precisa de la distribución de tamaño aerodinámico. [NOTA-Usualmente, el número de dosis mínimas recomendadas no es >1 O.] Después de descargar la última dosis, retirar el producto del adaptador de boquilla. Enjuagar el adaptador de boquilla y el tubo de admisión con un disolvente adecuado, y diluir los enjuagues cuantitativamente hasta un volumen apropiado. Desmontar el impactador en cascada, colocar cada estación y su respectiva placa de recolección o filtro asociado en sendos recipientes y enjuagar para extraer el fármaco de cada uno de éstos. [NOTA-Si se ha determinado que las pérdidas en las paredes del impactador son ~5%, entonces se necesita analizar solamente el material recolectado en las placas.] Diluir cada uno cuantitativamente hasta un volumen apropiado. Empleando el método de análisis especificado en la monografía individual, determinar la masa de fármaco recolectada en cada uno de los componentes. Para analizar los datos, proceder según se indica en Análisis de Datos.
C.3 Aparato 2 para Polvos para lnhalación-lmpactador Marple-Miller C.3.1 DISEÑO-APARATO 2 El diseño y el montaje del Aparato 2 y del tubo de admisión para conectar el impactador al producto se muestran en la Figura 8. 2 [NOTA-El tubo de admisión se muestra en detalle en la Figura 6a.] El impactador tiene cinco estaciones de impactación y un filtro terminal. A una velocidad de flujo volumétrico de aire de 60 L/minuto (la velocidad del flujo nominal, Q"), los diámetros aerodinámicos límite D5 o,Qn de las Estaciones 1-5 son 1O; 5; 2,5; 1,25 y 0,625 µm, respectivamente. El filtro terminal retiene eficazmente el fármaco suspendido en el aerosol en el rango de tamaño de partícula de hasta 0,625 µm. Colocar el impactador en cascada multiestación con el sistema de control según se especifica en la Figura 7. Para asegurar una captura eficiente de partículas, recubrir la superficie de recolección de partículas de cada estación con glicerol, aceite siliconado u otro líquido adecuado generalmente depositado a partir de un disolvente volátil, a menos que se haya demostrado que esto es innecesario. Ensamblar el impactador, según se describe en las instrucciones del fabricante, con un filtro terminal por debajo de la estación final para capturar todas las partículas finas que de otra manera escaparían del dispositivo. Unir el tubo de admisión y el adaptador de boquilla, de manera que se produzca un sellado hermético entre la boquilla del producto y el tubo de admisión. Emplear un adaptador de boquilla que garantice que el extremo de la boquilla del producto está a nivel con el extremo abierto del tubo de admisión. Asegurarse de que las diferentes estaciones del impactador en cascada están conectadas y selladas herméticamente para evitar fugas. Poner en marcha la bomba de vacío, abrir la válvula solenoide y calibrar el flujo de aire a través del sistema según se indica a continuación. Conectar un caudalímetro al tubo de admisión. Emplear un caudalímetro calibrado para medir el flujo volumétrico que sale del medidor para determinar directamente Oaut o, si tal medidor no se pudiera obtener, calcular el flujo volumétrico que sale del medidor (Qout) empleando la ley de los gases ideales. Por ejemplo, para un medidor calibrado para el flujo volumétrico de entrada (Q;n), calcular:
P0 = presión atmosférica !J.P = caída de la presión en el medidor Ajustar la válvula de control de flujo para lograr un flujo constante a través del sistema a la velocidad requerida, Oaut' de manera que el valor de Oout está dentro del ±5% del valor determinado durante la prueba de Uniformidad de Dosis Liberada. Asegurar que se produzca el flujo crítico en la válvula de control de flujo a la velocidad de flujo que se va a emplear durante la prueba, empleando el siguiente procedimiento. Con el producto montado en su lugar y el flujo de aire deseado en circulación, medir la presión absoluta a ambos lados de la válvula de control de flujo (P2 y P3 en la Figura 7). Una relación de P3/P2 ~0,5 indica flujo crítico. Si no se alcanza esta relación de P3/P2, cambiar la bomba por una más potente y medir nuevamente la velocidad de flujo de prueba. Ajustar el temporizador que controla la operación de la válvula solenoide de dos vías, de manera que abra esta válvula durante un lapso de T segundos, según se determinó durante la prueba de Uniformidad de Dosis Liberada. Cebar o cargar el polvo para inhalación conforme a las instrucciones que figuran en la etiqueta. Con la bomba de vacío en funcionamiento y la válvula solenoide de dos vías cerrada, insertar la boquilla del producto en forma horizontal en el adaptador de boquilla del tubo de admisión. Descargar el polvo dentro del aparato, abriendo la válvula solenoide de dos vías durante un lapso de T segundos. Después de que la válvula solenoide de dos vías se haya cerrado, retirar el producto del adaptador de boquilla. Si se requieren dosis adicionales para recolectar la muestra, recargar el producto según las instrucciones que figuran 2 Se puede obtener el impactador en cascada como Modelo 160 Marple-Miller lmpactor en MSP Corporation, Minneapolis, MN. El producto debe conectarse al impactador mediante el tubo de admisión que se muestra en la Figura 6a.
Pruebas Físicas/ (601) Medicamentos Nasales y para Inhalación 469
USP 39
en la etiqueta, reinsertar la boquilla en el adaptador de boquilla y repetir la operación hasta que el número de dosis requerido haya sido descargado. Después de la descarga de la ultima dosis, apagar la bomba de vacío. Enjuagar el adaptador de boquilla y el tubo de admisión con un disolvente adecuado y diluir los enjuagues cuantitativamente hasta un volumen apropiado. Desmontar el impactador en cascada y colocar el filtro terminal en un recipiente aparte. Enjuagar para extraer el fármaco de cada una de las estaciones y del filtro y diluir cuantitativamente cada uno hasta un volumen apropiado. Empleando el método de análisis especificado en la monografía individual, determinar la masa de fármaco recolectada en cada uno de los componentes.
F E
Adaptador de boquilla
Válvula de control de flujo
Aparatos 2, 3ó4
Bomba de vacío D
P3
solenoide de dos vías
e
A
P2
B
Figura 7. Aparatos 2; 3, 4 ó 5: Equipos de control general. 0Jer la Tabla 6 para especificaciones de los componentes.)
Recipiente de cubeta recolectora de la
Figura 8. Aparato 2: Montaje del tubo de admisión, colector de estaciones y portafiltro. (lmpactador Marple-Miller, Modelo 160 con tubo de admisión USP.) Tabla 5. Dimensiones Críticas para las Toberas de Chorro del Aparato 2 Número de Estación
Número de Chorros
Diámetro de Tobera (mm)
1
1
16,8 ± 0,05
2
20
3,40 ± 0,03
3
40
1,70 ± 0,01
4
80
0,84 ± 0,01
5
160
0,41±0,01
470 (601) Medicamentos Nasales y para Inhalación / Pruebas Físicas
USP 39
C.3.2 PROCEDIMIENTO-APARATO 2 Realizar la prueba utilizando el Aparato 2 a la velocidad de flujo de aire, Oout determinada anteriormente, durante la prueba de Uniformidad de Dosis Liberada, siempre que Oout sea :s;l 00 L/minuto. [NOTA-Si Oout es> 100 L/minuto, utilizar una velocidad de flujo de aire de 100 L/minuto.] Conectar el aparato al sistema de control de flujo basado en el flujo crítico (sónico) según se especifica en la Figura 7 (ver también la Tabla 6). Tabl a 6. Especlf"1cac ones d e 1os Componentes para a Figura 7 Código
A
Artículo
Conector
Descripción
p.ej., acoplamiento corto de metal con ramificación a P3 de diámetro menor p.ej., tubería de silicona con un diámetro externo de 14 mm y un diámetro interno de8mm
Dimensiones
2:8 mm de diámetro interno
Un tubo de longitud adecuada de diámetro interno 2:8 mm con un volumen interno de 25 ml ± 5 ml Válvula solenoide de 2 vías, 2 puertos, con un diámetro inVálvula solenoide de dos terno 2:8 mm y un tiempo de respuesta de apertura de c Ver la Figura 7 ~100 milisegundos. víasª La bomba debe ser capaz de extraer a la velocidad de flujo requerida a través del aparato ensamblado con el inhalador de polvo seco en el adaptador de boquilla. Conectar la bomba a la válvula solenoide empleando una tubería de vacío corta y ancha (2:1 O mm de diámetro interno) y conectores para minimizar los requisitos de capacidad de la D Bomba de vacíob Ver la Figura 7 bomba. El temporizador interrumpe o permite el paso de corriente a la válvula solenoide durante el lapso de tiempo requeriTemporizador<= E Ver la Figura 7 do. Determinadas en condiciones de flujo estacionario con un P2, P3 transductor de presión absoluta. Mediciones de Presión Válvula de control de flujod Ver la Fiqura 7 F Válvula reguladora ajustable con Cv 2:1 máximo. ª Amodo de ejemplo, el producto ASCO número 8030Gl 3 (Automatic Switch Company, 60 Hanover Road, Florham Park, NJ 07932) o equivalente. Ver también la nota al pie h en la Tabla 1. b Producto Gast tipo 1023, 1423 ó 2565 (Gast Manufacturing lnc., PO Box 97, Benton Harbor, MI 49022) o equivalente. e Amodo de ejemplo, el producto Eaton número 45610-400 (Eaton Corporation, Automotive Products Division, 901, South 12th Street, Watertown, WI 53094) o equivalente. d Producto Parker Hannifin tipo 8FV12LNSS o equivalente (Parker Hannifin ple, Riverside Road, Barnstable, Devon EX31 1NP, Gran Bretaña). Ver también la nota al pie h en la Tabla 1. B
Tubería de vacío
En condiciones de flujo constante, a la velocidad de flujo de aire volumétrico apropiada a través de todo el aparato, asegurarse de que se ocasione un flujo crítico (sónico) en la válvula de control de flujo determinando los valores de presión absoluta, P2 y P3, de manera que la relación P3/P2 sea :s;0,5. Si no se alcanza esta relación de P3/P2, cambiar la bomba por una más potente y medir nuevamente la velocidad de flujo de prueba. Recubrir la superficie de recolección de partículas de cada una de las estaciones del impactador en cascada para asegurar que las partículas que hayan impactado en una estación dada no se reintroduzcan por arrastre en la corriente de aire que fluye a menos que se haya demostrado que esto no es necesario. Analizar los datos según se indica en Análisis de Datos.
C.4 Aparato 3 para Polvos para lnhalación-lmpactador Andersen (con preseparador) C.4.1 DISEÑO-APARATO 3 El Aparato 3 es idéntico al Aparato 1 (Figura 6), excepto que el preseparador del fabricante se instala encima de la Estación O para recolectar masas grandes de polvo no inhalable antes de que ingresen al impactador; y la conexión de salida, que se utiliza para conexión al tubo de vacío B (Figura 7), se reemplaza por otra que tenga un diámetro interno ~8 mm. Para conectar el preseparador del impactador al tubo de admisión (Figura 6a), usar una pieza superior especialmente diseñada para el preseparador. Esto se muestra en la Figura 93 • Por lo tanto, el impactador tiene ocho estaciones, un preseparador (para recolección de partículas grandes) y un filtro terminal. Puede no requerirse un preseparador para ciertos polvos modificados por ingeniería, en especial aquéllos con baja densidad aparente. Conectar el impactador en cascada al sistema de control especificado en la Figura 7. Omitir la Estación 6 y la Estación 7 del impactador si la velocidad de flujo de prueba, Oout• usada durante el análisis de Uniformidad de Dosis Liberada fue ~60 L/minuto. Para asegurar una captura eficiente de partículas, recubrir la superficie de recolección de partículas de cada estación con glicerol, aceite siliconado u otro líquido adecuado generalmente depositado a partir de un disolvente volátil, a menos que se haya demostrado que esto es innecesario. Ensamblar el impactador, según se El impactador en cascada está disponible como el producto Andersen 1ACFM Non-Viable Cascade Impactar (Mark 11) de Thermo-Electron, 27 Forge Parkway, Franklin, MA 02038. El impactador se usa con el preseparador.
3
USP 39
Pruebas Físicas/ (601) Medicamentos Nasales y para Inhalación 471
describe en las instrucciones del fabricante, con un filtro terminal por debajo de la estación final para capturar todas las partículas finas que de otra manera escaparían del dispositivo. Colocar un volumen adecuado (hasta 1 O ml) de un disolvente apropiado en el preseparador o recubrir las superficies de recolección de partículas del preseparador para prevenir el reingreso de las partículas impactadas por arrastre. [Precaución-Algunos disolventes pueden producir mezclas de aire-vapor inflamables que se pueden incendiar durante su pasaje a través de la bomba de vacío. Tomar las precauciones correspondientes (disolventes alternativos, uso de trampas de vapor, tiempos de operación de la bomba mínimos, etc.) para garantizar la protección del operador durante la prueba.] Conectar un adaptador de boquilla moldeado al extremo del tubo de admisión de manera que se produzca un sellado hermético entre la boquilla del producto y el tubo de admisión. Emplear un adaptador de boquilla que garantice que el extremo de la boquilla del producto esté a nivel con el extremo abierto del tubo de admisión. Asegurarse de que las diferentes estaciones del impactador en cascada estén conectadas y selladas herméticamente para evitar fugas. Poner en marcha la bomba de vacío, abrir la válvula solenoide de dos vías y calibrar el flujo de aire a través del sistema según se indica a continuación. Cebar o cargar el polvo para inhalación conforme a las instrucciones que figuran en la etiqueta. Con la bomba de vacío en funcionamiento y la válvula solenoide de dos vías cerrada, insertar la boquilla del producto en forma horizontal en el adaptador de boquilla del tubo de admisión. Una vez que el inhalador esté en posición, descargar el polvo dentro del aparato activando el temporizador y abriendo la válvula solenoide de dos vías durante el lapso de tiempo requerido, T ± 5%, según se determinó durante la prueba de Uniformidad de Dosis Liberada. Después de que la válvula solenoide de dos vías se haya cerrado, retirar el producto del adaptador de boquilla. Si se requieren dosis adicionales para la muestra, recargar el polvo para inhalación según las instrucciones que figuran en la etiqueta, reinsertar la boquilla en el adaptador de boquilla y repetir la operación hasta que el número de dosis requerido haya sido descargado. Después de la descarga de la última dosis, retirar el inhalador del adaptador de boquilla y apagar la bomba de vacío. Desmontar cuidadosamente el aparato. Usando un disolvente adecuado, enjuagar para extraer el fármaco del adaptador de boquilla, el tubo de admisión y el preseparador, y diluir los enjuagues cuantitativamente hasta un volumen apropiado. Enjuagar para extraer el fármaco de cada estación y de la placa de impacto situada inmediatamente debajo y recoger los enjuagues en matraces de tamaño apropiado. Diluir cuantitativamente cada matraz hasta un volumen apropiado. Empleando el método de análisis especificado en la monografía individual, determinar la masa de fármaco recolectada en cada una de las muestras.
472 (601) Medicamentos Nasales y para Inhalación / Pruebas Físicas
44_1 19-1 13-1
USP 39
Los radios se muestran en vista superior y en sección transversal para mayor claridad
38,s+~-1
Sección transversal
1514,4-
R 12,7
R 15
a-
-R15,87~~
ll!2l+-- R 14,4
r;r_, 1--....__Ranura para la
-R19
junta tórica
R 12,7
-Re
R6,70 ± ,03
R38,3~.~
-R6,70±,03
45°±3'
Excepto cuando se indique lo contrario, todos los bordes se deben romper y eliminar los rebordes Las superficies deben estar bien pulidas a máquina,
=
~
Junta tórica: Dimensiones nominales: DI= 29 mm, DE= 32 mm, Ancho= 1,8 mm Las medidas están en mm a menos que se indique algo diferente
Figura 9. Aparato 3: Vista expandida de la parte superior del preseparador Andersen adaptado al tubo de admisión USP. El material puede ser aluminio, acero inoxidable u otro material adecuado; el interior debe estar pulido hasta una rugosidad de superficie (R0 ) de aproximadamente 0,4 µm. C.4.2 PROCEDIMIENTO-APARATO 3 Proceder según se indica en el Procedimiento en Aparato 2, excepto que se debe utilizar el Aparato 3.
C.5 Aparato 4 para Polvos para lnhalación-lmpactador (lmpinger) Multiestación en Fase Líquida NOTA-El Aparato 4, un impactador multiestación en fase liquida, tiene un número reducido de estaciones y su uso está ampliamente difundido fuera de los Estados Unidos. Se proporciona en este documento para beneficio de los usuarios de otros países. C.5. 1 DISEÑO-APARATO 4 El diseño y el montaje del Aparato 4 se muestran en las Figuras 1O, 1Oa y 1Ob. 4 El tubo de admisión, empleado para conectar el impactador (impinger) multiestación en fase líquida a un producto, se muestra en la Figura 6a. El dispositivo es un impactador multiestación en fase líquida que consiste en las Estaciones de impacto 1; 2; 3 y 4 y un filtro terminal integrado (Estación 5). Las estaciones de recolección del impactador multiestación en fase líquida (ver la Figura 1Oy la Tabla 1) se mantienen hú· medas, a diferencia de los impactadores tradicionales, como por ejemplo los Aparatos 1; 2; 3; 5 y 6. Este humedecimiento puede producir un efecto similar al recubrimiento de las estaciones de los Aparatos 2; 3; 5 y 6 a determinadas velocidades de flujo, aunque esto debe confirmarse demostrando el control del reingreso por arrastre según se ha descrito previamente. Una estaEl impactador en fase líquida de cinco estaciones está disponible en Copley lnstruments, ple, Nottingham, Gran Bretaña. El producto debe conectarse al impactador mediante el tubo de admisión que se muestra en la Figura 8 y la Figura 6a.
4
USP 39
Pruebas Físicas/ (601) Medicamentos Nasales y para Inhalación 473
ción de impacto comprende una pared divisoria metálica horizontal y superior (B) a través de la cual sobresale un tubo metálico de entrada de chorro (A) con su placa de impacto (D); un cilindro de vidrio (E) con una abertura de muestreo (F), que forma la pared vertical de la estación; y una pared divisoria metálica horizontal inferior (G) a través de la cual un tubo (H) se conecta a la estación inferior. El tubo que entra en la estación 4 (U) termina en una disposición de chorros múltiples. La placa de impacto (D) se asegura en un marco metálico (J), el cual se ajusta mediante dos alambres (K) a un manguito (L) asegurada sobre el tubo de chorro (C). Para más detalles sobre el tubo de chorro y la placa de impacto, ver la Figura 7Oa. El plano horizontal de la placa de recolección es perpendicular al eje del tubo de chorro y se alinea centralmente. La superficie superior de la placa de impacto se eleva levemente por encima del borde del marco metálico. Un surco alrededor del perímetro de la pared divisoria horizontal guía la posición del cilindro de vidrio. Los cilindros de vidrio se sellan con juntas (M) contra las paredes divisorias horizontales y se sujetan mediante seis pernos (N). Las aberturas de muestreo se sellan con tapones. El fondo de la pared divisoria inferior de la Estación 4, tiene una protuberancia concéntrica fijada con una junta tórica de goma (P) que la sella contra el borde de un filtro colocado en el portafiltro. El portafiltro (R), es una cubeta con un hueco concéntrico en el que se calza un soporte de filtro perforado (S). El portafiltro está diseñado para filtros de 76 mm de diámetro. El montaje completo de la estación de impacto se ajusta al portafiltro mediante dos cierres de funcionamiento ultrarrápido (T). El impactador multiestación en fase líquida está equipado con un tubo de admisión (Figura 6a) que se ajusta al tubo de entrada de chorro de la Estación 1. Una junta tórica de goma en el tubo de chorro proporciona un sellado hermético al tubo de admisión. Un adaptador de boquilla elastomérico para insertar el producto en análisis proporciona un sellado hermético entre la boquilla del producto y el tubo de admisión. Asegurarse de que el Aparato 4 esté limpio y exento de solución del fármaco proveniente de pruebas anteriores. Colocar un filtro de 76 mm de diámetro en la estación de filtro y montar el aparato. Usar un filtro de baja presión capaz de recolectar cuantitativamente el aerosol del fármaco que lo atraviesa, que también permita una recuperación cuantitativa del fármaco recolectado. Armar el Aparato 4 empleando el sistema de control especificado en la Figura 7. Unir el tubo de admisión (Figura 6a) y el adaptador de boquilla para que se produzca un sellado hermético entre la boquilla del producto y el tubo de admisión. Emplear un adaptador de boquilla que garantice que el extremo de la boquilla del producto esté a nivel con el extremo abierto del tubo de admisión. Asegurarse de que las diferentes estaciones del aparato estén conectadas herméticamente para evitar fugas. Poner en marcha la bomba de vacío, abrir la válvula solenoide de dos vías y calibrar el flujo de aire a través del sistema según se indica a continuación. Conectar al tubo de admisión un caudalímetro calibrado para medir la velocidad del flujo volumétrico que sale del medidor. Ajustar la válvula de control de flujo para lograr un flujo constante a través del sistema a la velocidad requerida, ºº"" de manera que el valor de Q00 , esté dentro del ±5% del valor determinado durante la prueba de Uniformidad de Dosis Liberada. Asegurar que se produzca el flujo crítico en la válvula de control de flujo al valor Q00 , que se va a emplear durante la prueba, empleando el siguiente procedimiento. Con el producto montado en su lugar y el flujo de aire deseado en circulación, medir la presión absoluta a ambos lados de la válvula de control de flujo (P2 y P3 en la Figura 7). Una relación de P3/P2 :S:0,5 indica flujo crítico. Si no se alcanza esta relación de P3/P2, cambiar la bomba por una más potente y medir nuevamente la velocidad de flujo de prueba. Ajustar el temporizador que controla la operación de la válvula solenoide de dos vías, de manera que abra esta válvula durante el mismo lapso de tiempo, T, que el que se empleó durante la prueba de Uniformidad de Dosis Liberada. Dispensar 20 mL de un disolvente capaz de disolver el fármaco dentro de cada una de las cuatro estaciones superiores del Aparato 4 y colocar nuevamente los tapones. [Precaución-Algunos disolventes pueden producir mezclas de airevapor inflamables que se pueden incendiar durante su pasaje a través de la bomba de vacío. Tomar las precauciones correspondientes (disolventes alternativos, uso de trampas de vapor, tiempos de operación de la bomba mínimos, etc.) para garantizar la protección del operador durante la prueba.] Inclinar el aparato para humedecer los tapones y de esa forma neutralizar sus cargas elec-
troestáticas. Ajustar el temporizador que controla la operación de la válvula solenoide de dos vías, de manera que abra la válvula durante el mismo lapso de tiempo, T, que el que se empleó durante la prueba de Uniformidad de Dosis Liberada. Cebar o cargar el polvo para inhalación conforme a las instrucciones que figuran en la etiqueta. Con la bomba de vacío en funcionamiento y la válvula solenoide de dos vías cerrada, insertar la boquilla del producto en forma horizontal en el adaptador de boquilla del tubo de admisión. Descargar el polvo dentro del aparato, activando el temporizador y abriendo la válvula solenoide de dos vías durante el lapso requerido, T ±5%. Después de que la válvula solenoide de dos vías se haya cerrado, retirar el producto del adaptador de boquilla. Si se requieren dosis adicionales para la muestra, recargar el polvo para inhalación según las instrucciones que figuran en la etiqueta, reinsertar la boquilla en el adaptador de boquilla y repetir la operación hasta que el número de dosis requerido haya sido descargado. Después de descargar la ultima dosis, apagar la bomba de vacío. Desarmar la estación de filtro del Aparato 4. Cuidadosamente retirar el filtro (Figura 7Ob) y extraer el fármaco con disolvente. Enjuagar el adaptador de boquilla y el tubo de admisión con un disolvente adecuado y diluir los enjuagues cuantitativamente hasta un volumen apropiado. Enjuagar el interior del tubo de chorro de entrada que va a la Estación 1 (Figura 7O), permitiendo que el disolvente fluya dentro de la estación. Enjuagar para extraer el fármaco de las paredes internas y de la placa de recolección de cada una de las cuatro estaciones superiores del aparato y transferir a la solución de la estación respectiva, inclinando y rotando el aparato, asegurándose de que no haya transferencia de líquido entre las estaciones. Empleando el método de análisis especificado en la monografía individual, determinar la masa de fármaco recolectada en cada uno de los seis volúmenes de disolvente. Asegurarse de que el método corrija la posible evaporación de disolvente durante la prueba. Esto puede involucrar el uso de un estándar interno (de concentración original conocida en el disolvente y valorado al mismo tiempo que el fármaco) o la transferencia cuantitativa del contenido líquido de cada una de las estaciones, seguida por una dilución hasta un volumen conocido. Empleando el método de análisis especificado en la monografía individual, determinar la masa de fármaco recolectada en cada una de las muestras.
474 (601) Medicamentos Nasales y para Inhalación / Pruebas Físicas
USP 39
Q~~A
ti_____1__j ,,,r- e Estación 1
Estación 2
Estación 3
¡ - :- -( 1
1
Estación 4
Estación 5 (filtro)
V--+--_.,
Figura 1O. Aparato 4: Esquema del impactador multiestación en fase líquida. (Ver la Tabla 7 para especificaciones de los componentes.) Tabla 7. Unidades Componentes del lmpactador (lmplnger) Multlestaclón en Fase Líquida (ver la Figura 1O, la Figura 1Oa y la Figura 1Ob)
Código
Dimensiones (en mm a menos que se Indique algo diferente)
Descripción
Artículo
A,H
Tubo de chorro
Tubo de metal atornillado a una pared divisora seliada por una junta (C), superficie interna pulida
B, G
Pared divisoria
Placa circular de metal, diámetro
120
Grosor
Ver la Figura 1Oa
p.ej., de PTFE
Para adaptarse al tubo del chorro
e
junta
D
Placa de impacto
Disco de vidrio sinterizado de porosidad O Diámetro
E
J
Cilindro de vidrio
Marco de metal
Ver la Figura 1Oa
Ver la Figura 1Oa
Tubo de vidrio cortado pulido plano Altura, incluyendo juntas
46
Diámetro externo
100
Espesor de pared
3,5
Diámetro (F) de la abertura de muestreo
18
Tapón de la abertura de muestreo
ISO 24/25
Marco circular con perfil en L con ranura Diámetro interno
Para adaptarse a la placa de impacto
Altura
4
Grosor de la sección horizontal
0,5
Grosor de la sección vertical
2
Pruebas Físicas/ (601) Medicamentos Nasales y para Inhalación 475
USP 39
Tabla 7. Unidades Componentes del lmpactador (lmpinger) Multiestaclón en Fase Líquida (ver la Figura 1O, la Figura 1Oa y la Figura 1Ob) (Continuación)
Artículo
Código K
Dimensiones (en mm a menos que se Indique algo diferente)
Descripción Alambre de acero que interconecta el marco de metal y el manguito (dos por cada marco)
Alambre
Diámetro L
Manguito
1
Manguito metálico fijado al tubo de chorro mediante tornillos Diámetro interno
Para adaptarse al tubo del chorro
Altura
6
Grosor
5
M
junta
p.ej., de silicona
Para adaptarse al cilindro de vidrio
N
Perno
Perno con tuerca de metal (seis pares), longitud
205
Diámetro
4
p
junta tórica
junta tórica de goma, diámetro x grosor
66,34
Q
junta tórica
junta tórica de goma, diámetro x grosor
29,1
R
Portafiltro
Bastidor de metal con pie y salida
Ver la Figura 1Ob
s
Soporte de filtro
Lámina de metal perforada, diámetro
65
Diámetro de orificio
3
Distancia entre orificios (puntos centrales)
4
X
X
2,62
1,6
T
Cierres de funcionamiento ultrarrápido
u
Tubo de chorros múltiples
Tubo de chorro (H) que termina en disposición de chorros múltiples
Ver insertos en Figura 1Oa
V
Salida
Salida y tobera para conexión a vacío
Diámetro interno 2'.l O (Figura 1Ob)
Centro de la estación
s
Figura 1Oa. Aparato 4: Detalles del tubo de chorro y la placa de impacto. Los insertos muestran el extremo del tubo de chorros múltiples (U) que lleva a la Estación 4. 0fer la Tabla 8 para especificaciones de dimensiones.) Tabla 8. Aparato 4--Dimensiones del lmpactador Multiestación en Fase Líquida.
Estación
ª
Número de Toberas
Diámetro (mm) Valor Nominal
Tolerancia (±)
1
1
25,0
o, ¡a
2
1
14,0
3
1
8,0
o,ia o,ia
Cortesía de Copley Scientific Ltd,. Nottingham, Gran Bretaña.
476 (601 > Medicamentos Nasales y para Inhalación / Pruebas Físicas
USP 39
Tabla 8. Aparato 4-Dimensiones del lmpactador Multiestación en Fase Líquida. (Continuación)
Número de Toberas
Estación 4
1
Entrada
1
Salida
Diámetro (mm)
7
6,3ª
1
o,,.
2,7ª
1
0,05ª
ª Cortesía de Copley Scientific Ltd,. Nottingham, Gran Bretaña.
10mm
Smm
Figura 1Ob. Aparato 4: Vista expandida de la Estación 5. (Ver la Tabla 7 para especificaciones de los componentes.) C.5.2 PROCEDIMIENTO-APARATO 4 Proceder según se indica en Procedimiento en Aparato 2, excepto que se debe utilizar el Aparato 4.
C.6 Aparato 5 para Polvos para lnhalación-lmpactador de Nueva Generación (con preseparador) C.6.1 DISEÑO-APARATO 5 El diseño y montaje del Aparato 5 5 se muestran en las Figuras 7 1, 7 7a, 7 7b, 7 7e y 7 7d. El tubo de admisión, empleado para conectar el impactador a un producto, se muestra en la Figura 6a. El dispositivo es un impactador en cascada con siete estaciones y un colector con microorificios (MOC, por sus siglas en inglés). Las curvas de eficiencia de recolección para cada estación son marcadas y minimizan la superposición entre estaciones. El material puede ser aluminio, acero inoxidable u otro material adecuado. El diseño del impactador presenta cubetas de impacto extraíbles con todas las cubetas en un mismo plano (Figuras 7 7- 7 7e). El impactador tiene tres secciones principales: el marco inferior que aloja las cubetas de impacto, el cuerpo sellador que mantiene en su lugar los chorros y la tapa que contiene los pasajes entre estaciones (que se muestran en las Figuras 7 7- 7 7b). Se emplean múltiples toberas en todas las estaciones salvo en la primera ( 7 7e). El flujo pasa a través del impactador siguiendo un patrón en forma de dientes de sierra. La medición de la estación se realiza periódicamente junto con la confirmación de otras dimensiones críticas para el eficaz funcionamiento del impactador. Las dimensiones críticas se proporcionan en la Tabla 9. Ta bl a 9
o·1mens1ones e· rit 1cas para
Descripción
os A paratos 5 y 6 Dimensiones (mm)
Preseparador (ver la Dimensión a en la Figura 7 7d)
12,80 ± 0,05
Estación 1 ª -Diámetro de tobera
14,30 ± 0,05
Estación 2" -Diámetro de tobera
4,88 ± 0,04
Estación 3ª -Diámetro de tobera
2,185 ± 0,02
Estación 4ª -Diámetro de tobera
1,207 ± 0,01
Estación 5ª -Diámetro de tobera
0,608 ± 0,01
Estación 6ª-Diámetro de tobera
0,323 ± 0,01
Estación 7ª-Diámetro de tobera MOCª Profundidad de cubeta opcional (ver la Dimensión ben la Figura 77b)
0,206 ± 0,01 Aproximadamente 0,070 14,625±0,10
ª Ver la Figura 77c. MOC = colector con microorificios (MOC, por sus siglas en inglés). b Ver la Figura 77b.
5
El impactador en cascada puede obtenerse como Next Generation Pharmaceutical lmpactor en MSP Corporation, Minneapolis, MN.
Pruebas Físicas/ (601) Medicamentos Nasales y para Inhalación 477
USP 39
Tabla 9. Dimensiones Críticas para los Aparatos 5 y 6 (Continuación) Rugosidad de la superficie de la cubeta recolectora
0,5-2 µm
Estación 1-Distancia de la tobera al cuerpo sellador (ver la Dimensión c)b
o± 1,18
Estación 2-Distancia de la tobera al cuerpo sellador (ver la Dimensión c)b
5,236 ± 0,736
Estación 3-Distancia de la tobera al cuerpo sellador (ver la Dimensión c)b
8,445 ± 0,41 o
Estación 4-Distancia de la tobera al cuerpo sellador (ver la Dimensión c)b
11,379 ± 0,237
Estación 5-Distancia de la tobera al cuerpo sellador (ver la Dimensión c)b
13,176 ± 0,341
Estación 6-Distancia de la tobera al cuerpo sellador (ver la Dimensión c)b
13,999 ± 0,071
Estación 7-Distancia de la tobera al cuerpo sellador (ver la Dimensión c)b
14,000 ± 0,071
Opcional: MOC-Distancia de la tobera al cuerpo selladorb
14,429 - 14,571
ª
Ver Ja Figura 77c. MOC b Ver la Figura 1 7b.
=
colector con microorificios (MOC, por sus siglas en inglés).
En las operaciones de rutina, el cuerpo sellador y la tapa se mantienen juntos entre sí como un solo dispositivo. Se tiene acceso a las cubetas de impacto cuando se abre este equipo al final de una prueba de un producto. Las cubetas se mantienen en una bandeja que hace de soporte, de manera que todas las cubetas se pueden sacar simultáneamente del impactador levantando la bandeja. Un tubo de admisión con dimensiones internas idénticas a las que se definen en la Figura 6a se conecta a la entrada del impactador. Cuando sea necesario, con los polvos para inhalación, se puede agregar un preseparador para evitar sobrecargar la primera estación. El preseparador se conecta entre el tubo de admisión y el impactador. Se emplea un adaptador de boquilla adecuado para proporcionar un sellado hermético entre la boquilla del producto y el tubo de admisión. El aparato contiene un colector con microorificios (MOC) terminal que, para la mayoría de las formulaciones, puede eliminar la necesidad de un filtro final, según se determine mediante la validación del método. El MOC es la placa de toberas y cubeta de recolección del impactador. La placa de toberas contiene, nominalmente, 4032 orificios, cada uno con un diámetro de aproximadamente 70 µm. La mayoría de las partículas que no fueron capturadas en la Estación 7 del impactador serán capturadas en la superficie de la cubeta que está debajo del MOC. Para formulaciones con una fracción significativa de partículas no capturadas por el MOC, hay un portafiltro opcional que puede reemplazar al MOC. Como alternativa se puede colocar un filtro terminal (a menudo, la fibra de vidrio es adecuada) en un portafiltro externo al Aparato 5 y 6, que se ubica a continuación del MOC. Tubo de admisión
( Preseparador
/
Cuerpo del impactador
Figura 11. Aparato 5 (se muestra con el preseparador colocado en su lugar).
478 (601) Medicamentos Nasales y para Inhalación / Pruebas Físicas
Boquilla de estación 1
USP 39
Conexión entre estaciones
Colector de microorificios (MOC)
Tapa con sello unida al cuerpo
Encaje para la saliente de colocación Marro inferior oon la bandeja para las cubetas montada
Figura 11 a. Componentes del Aparato 5.
Conexión a la estación previa
Conexión a la siguiente estación
Tapa Sello del cuerpo Bandeja de cubetas Marco inferior Cubeta de recolección Estación multi tobera Figura 11 b. Disposición de los pasajes entre estaciones del Aparato 5. estación 2
6 orificios
estación 4
52 orificios
estación 6 396 orificios
estación 1
estación 3
estación 5
1 orificio
24 orificios
152 orificios
estación 7 630 orificios
Figura 11 c. Configuración de toberas del Aparato 5.
MOC 4032 orificios
Pruebas Físicas/ (601) Medicamentos Nasales y para Inhalación 479
USP 39
Cuerpo del preseparador __....._____..____ /
Diámetro de tobera (dimensión a)
ubeta central
t =
t n
~-~u-~,-~
Inserto del preseparador
" ' Base del preseparador Figura 11 d. Disposición del preseparador para el Aparato 5.
C.6.2 PROCEDIMIENTO-APARATO 5 Ensamblar el aparato con el preseparador (Figura 77d), a menos que se haya demostrado experimentalmente que su omisión no da como resultado un incremento en la pérdida de fármaco entre estaciones (>5%) o en el reingreso de partículas por arrastre, en cuyo caso se puede omitir el preseparador. Colocar las cubetas en las aberturas de la bandeja de cubetas. Para asegurar una captura eficiente de partículas, recubrir la superficie de recolección de partículas de cada estación con glicerol, aceite siliconado u otro líquido adecuado generalmente depositado a partir de un disolvente volátil, a menos que se haya demostrado que esto es innecesario. Insertar la bandeja de cubetas en el marco inferior y bajarla para colocarla en su lugar. Cerrar la tapa del impactador con el cuerpo sellador unido a ésta y operar la manija para cerrar ambas partes del impactador de forma que el sistema sea hermético. El preseparador puede prepararse del siguiente modo. Montar el inserto del preseparador en la base del preseparador; conectar la base del preseparador a la entrada del impactador; agregar hasta aproximadamente 15 ml del disolvente empleado para la recuperación de la muestra a la cubeta central del inserto del preseparador; colocar el cuerpo del preseparador encima de este montaje; y cerrar las dos grampas sujetadoras. [Precaución-Algunos disolventes pueden producir mezclas de aire-vapor
inflamables que se pueden incendiar durante su pasaje a través de la bomba de vacío. Tomar las precauciones correspondientes (p.ej., disolventes alternativos, uso de trampas de vapor, tiempos mínimos de operación de la bomba, etc.) para garantizar la protección del operador durante la prueba.] Conectar un tubo de admisión con dimensiones internas según se definen en la Figura 6a a la entrada del impactador o a la entrada del preseparador ubicado encima del impactador en cascada (Figura 7 7d). Colocar en posición un adaptador de boquilla adecuado al final del tubo de admisión de manera que el extremo final de la boquilla del producto, cuando se inserta, esté alineado a lo largo del eje horizontal del tubo de admisión. La cara frontal de la boquilla del producto está a nivel con la cara frontal del tubo de admisión, produciendo un sellado hermético. Cuando se une al adaptador de boquilla, el producto debe colocarse en la misma orientación en la que está previsto que se use. Conectar el aparato al sistema de flujo conforme al esquema especificado en la Figura 7. A menos que se indique algo diferente, realizar la prueba a la velocidad de flujo empleada en la prueba para Uniformidad de Dosis Liberada, extrayendo 4,0 L de aire desde la boquilla del producto a través del aparato. Conectar un caudalímetro al tubo de admisión. Emplear un caudalímetro calibrado para medir el flujo volumétrico que sale del medidor o calcular el flujo volumétrico que sale del medidor (Qout) utilizando la ley de los gases ideales. Para un medidor calibrado para el flujo volumétrico de entrada (Q;n), calcular:
P0 =presión atmosférica f:i.P = caída de la presión en el medidor Ajustar la válvula de control de flujo para lograr un flujo estable a través del sistema a la velocidad requerida, Oout (±5%). Asegurar que se produzca flujo crítico en la válvula de control de flujo mediante el Procedimiento descrito para el Aparato 2. Ajustar el temporizador que controla la operación de la válvula solenoide de dos vías, de manera que abra la válvula durante el mismo lapso de tiempo, T, que el que se empleó durante la prueba de Uniformidad de Dosis Liberada. Cebar o cargar el polvo para inhalación conforme a las instrucciones que figuran en la etiqueta. Con la bomba de vacío en funcionamiento y la válvula solenoide de dos vías cerrada, insertar la boquilla del producto en forma horizontal en el adaptador de boquilla del tubo de admisión. Descargar el polvo dentro del aparato, activando el temporizador y abriendo la válvula solenoide de dos vías durante el lapso requerido, T (±5%). Después de que la válvula solenoide de dos vías se haya cerrado, retirar el producto del adaptador de boquilla. Si se requieren dosis adicionales para la muestra, recargar el polvo para inhalación según las instrucciones que figuran en la etiqueta, reinsertar la boquilla en el adaptador de boquilla y repetir la operación hasta que el número de dosis requerido haya sido descargado. Después de descargar la última dosis, apagar la bomba de vacío.
480 (601) Medicamentos Nasales y para Inhalación / Pruebas Físicas
USP 39
Desarmar el aparato y recuperar el fármaco a analizar de la siguiente manera. Retirar el tubo de admisión y el adaptador de boquilla del preseparador y extraer el fármaco en una alícuota de disolvente; si se hubiera empleado el preseparador, retirarlo del impactador sin derramar el disolvente dentro de éste último; y recuperar el ingrediente activo de todas las superficies internas. Abrir el impactador liberando el mecanismo de enganche y levantando la tapa. Retirar la bandeja de cubetas con las cubetas de recolección y recuperar el ingrediente activo de cada cubeta con una alícuota de disolvente. Empleando el método de análisis especificado en la monografía individual, determinar la masa de fármaco contenida en cada alícuota de disolvente.
C.7 Aparato 6 para Aerosoles y Atomizadores para lnhalación-lmpactador de Nueva Generación (sin preseparador) C.7.1 DISEÑO-APARATO 6 El Aparato 6 es idéntico al Aparato 5 (Figuras 11-11 d) excepto que no se utiliza el preseparador. Emplear este aparato a una velocidad de flujo de 30 L/minuto (±5%), a menos que se indique algo diferente en la monografía individual. C.7.2 PROCEDIMIENTO-APARATO 6 Montar el aparato sin el preseparador. Colocar las cubetas en las aberturas de la bandeja de cubetas. Para asegurar una captura eficiente de partículas, recubrir la superficie de recolección de partículas de cada estación con glicerol, aceite siliconado u otro líquido adecuado generalmente depositado a partir de un disolvente volátil, a menos que se haya demostrado que esto es innecesario. Insertar la bandeja de cubetas en el marco inferior y bajarla para colocarla en su lugar. Cerrar la tapa del impactador con el cuerpo sellador unido a ésta y operar la manija para cerrar ambas partes del impactador de forma que el sistema sea hermético. Conectar a la entrada del impactador un tubo de admisión con las dimensiones internas que se definen en la Figura 6a. Emplear un adaptador de boquilla que garantice que el extremo de la boquilla del producto esté a nivel con el extremo abierto del tubo de admisión. Encender la bomba de vacío para extraer el aire a través del impactador en cascada y calibrar el flujo de aire a través del sistema con un caudalímetro apropiado unido al extremo abierto del tubo de admisión. Ajustar la válvula de control de flujo de la bomba de vacío para lograr un flujo constante a través del sistema a la velocidad requerida, y asegurarse de que el flujo de aire que recorre el sistema está dentro del ±5% de esa velocidad de flujo. A menos que se indique algo diferente en las instrucciones de uso para el paciente, agitar el producto durante 5 segundos y accionar el disparador para desechar una descarga. Con la bomba de vacío en funcionamiento, insertar la boquilla en su adaptador de boquilla e inmediatamente disparar para descargar la dosis mínima recomendada en el impactador en cascada. Mantener la válvula presionada durante el tiempo suficiente para garantizar que la dosis se haya descargado por completo. Si se requieren atomizaciones adicionales para recolectar la muestra, agitar el producto, reinsertarlo en el adaptador de boquilla e inmediatamente pulsar para descargar la siguiente dosis mínima recomendada. Repetir hasta que se haya descargado el número de dosis requerido. El número de dosis mínimas recomendadas debe ser tal que permita una determinación exacta y precisa de la Distribución de Tamaño Aerodinámico. [NOTA-Usualmente, el número de dosis mínimas recomendadas no es >1 O.] Después de que la última dosis haya sido descargada, retirar el producto del adaptador de boquilla. Enjuagar el adaptador de boquilla y el tubo de admisión con un disolvente adecuado y diluir los enjuagues cuantitativamente hasta un volumen apropiado. Desarmar el aparato y recuperar el fármaco para su análisis de la siguiente manera. Retirar el tubo de admisión y el adaptador de boquilla del aparato y recuperar el fármaco depositado en una alícuota de disolvente; abrir el impactador liberando el mecanismo de enganche y levantando la tapa; retirar la bandeja de cubetas con las cubetas de recolección; y extraer el ingrediente activo de cada cubeta con una alícuota de disolvente. Empleando el método de análisis especificado en la monografía individual, determinar la cantidad de ingrediente activo contenida en cada alícuota de disolvente.
<602) PROPELENTES Precaución-Los propelentes que son hidrocarburos son extremadamente inflamables y explosivos. Tomar las precauciones necesarias y realizar el muestreo y las operaciones analíticas bajo una campana de extracción bien ventilada.
PROCEDIMIENTO GENERAL DE MUESTREO Este procedimiento se utiliza para obtener muestras de prueba de propelentes que son gases a aproximadamente 25º y que se almacenan en cilindros presurizados. Emplear un cilindro para muestras de acero inoxidable equipado con una válvula de acero inoxidable con una capacidad de no menos de 200 ml que soporte 240 psi o una presión mayor. Secar el cilindro con la válvula abierta a 11 Oº durante 2 horas y vaciar el cilindro caliente hasta menos de 1 mm de mercurio. Cerrar la válvula, enfriar y pesar. Conectar un extremo de una tubería de carga al envase del propelente ajustando bien y conectar sin ajustar el otro
Pruebas Físicas/ (602) Propelentes 481
USP 39
extremo al cilindro para muestras. Abrir con cuidado el envase del propelente y dejar que el propelente purgue la tubería de carga y salga a través de la conexión sin ajustar. Evitar una purga excesiva, ya que esto provoca la congelación de humedad en la tubería de carga y las conexiones. Ajustar la conexión del cilindro para muestras, abrir la válvula del cilindro para muestras y dejar que el propelente fluya hacia el interior del cilindro vacío. Continuar el muestreo hasta que se obtenga la cantidad deseada de muestra, luego cerrar la válvula del envase del propelente y, finalmente, cerrar la válvula del cilindro para muestras. [Precaución-No sobrecargar el cilindro para muestras. La expansión hidráulica ocasionada por los cambios de temperatura puede causar la explosión de un cilindro sobrecargado.] Pesar nuevamente el cilindro para muestras cargado y calcular el peso de la
muestra.
TEMPERATURA DE EBULLICIÓN APROXIMADA Transferir una muestra de 100 ml a un tubo de centrífuga tarado en forma de pera de 100 ml que contenga algunas piedras de ebullición y pesar. Suspender un termómetro en el líquido y colocar el tubo en un medio mantenido a una temperatura de 32º por encima de la temperatura de ebullición esperada. Cuando la lectura del termómetro permanezca constante, registrar como temperatura de ebullición la lectura del termómetro después de que se haya destilado como mínimo el 5% de la muestra. Conservar el resto de la muestra para la determinación de residuos de alto punto de ebullición.
RESIDUOS DE ALTO PUNTO DE EBULLICIÓN, MÉTODO 1 Dejar que destilen 85 ml de la muestra según se indica en la prueba para Temperatura de Ebullición Aproximada y transferir el tubo de centrífuga que contiene los 15 ml remanentes de la muestra a un medio mantenido a una temperatura de 1Oº por encima de la temperatura de ebullición. Después de 30 minutos, retirar el tubo del baño de agua, secarlo con material absorbente y pesar. Calcular el peso del residuo.
RESIDUOS DE ALTO PUNTO DE EBULLICIÓN, MÉTODO 11 Preparar una serpentina de enfriamiento con una tubería de cobre (de aproximadamente 6 mm de diámetro exterior x aproximadamente 6, l m de largo) para que entre en un matraz con camisa al vacío. Sumergir la serpentina de enfriamiento en una mezcla de hielo seco y acetona en el matraz con camisa al vacío y conectar un extremo de la tubería al cilindro para muestras con propelente. Abrir cuidadosamente la válvula del cilindro para muestras, purgar la serpentina de enfriamiento con aproximadamente 50 ml de propelente y desechar esta porción de propelente licuado. Continuar descargando el propelente licuado desde la serpentina de enfriamiento y recogerlo en un cono de sedimentación de 1000 ml previamente enfriado hasta que el cono se llene hasta la marca de 1000 ml. Dejar que el propelente se evapore, usando un baño de agua tibia mantenido a aproximadamente 40º para reducir el tiempo de evaporación. Cuando todo el líquido se haya evaporado, enjuagar el cono de sedimentación con dos porciones de 50 ml de pentano y combinar los enjuagues en una cápsula de evaporación tarada de 150 ml. Transferir 100 ml de pentano a una segunda cápsula de evaporación tarada de 150 ml, colocar ambas cápsulas de evaporación en un baño de agua; evaporar hasta sequedad y calentar las cápsulas en una estufa a 100º durante 60 minutos. Enfriar las cápsulas en un desecador y pesar. Repetir el calentamiento durante periodos de 15 minutos hasta que la variación de peso entre pesadas sucesivas no sea más de O, 1 mg y calcular el peso del residuo obtenido a partir del propelente como la diferencia entre los pesos de los residuos en las dos cápsulas de evaporación.
CONTENIDO DE AGUA Proceder según se indica en el capítulo Determinación de Agua (921 ), con las siguientes modificaciones: (a) Utilizar un recipiente de sistema cerrado para volumetría con una abertura a través de la cual pasa un tubo de dispersión de gases de porosidad gruesa conectado a un cilindro para muestreo. (b) Diluir el Reactivo con metano! anhidro hasta obtener un factor de equivalencia de agua de entre 0,2 y 1,0 mg/ml, y dejar reposar esta solución diluida durante no menos de 16 horas antes de la estandarización. (c) Obtener una muestra de 100 g según se indica en Procedimiento General de Muestreo e introducir la muestra en el vaso de valoración a través del tubo de dispersión de gases a una velocidad de aproximadamente 100 ml de gas por minuto. Si fuera necesario, calentar suavemente el cilindro para muestras para mantener esta velocidad de flujo.
OTRAS DETERMINACIONES Para los aerosoles que utilizan propelentes, realizar las pruebas que se especifican en las monografías individuales de propelentes del NF.
USP 39
482 (603) Aerosoles Tópicos/ Pruebas Físicas
(603) AEROSOLES TÓPICOS INTRODUCCIÓN Los aerosoles tópicos contienen fármacos en solución o en suspensión, envasados a presión, que se liberan al activar un sistema de válvulas apropiado. Los aerosoles tópicos deben seguir los requisitos de las pruebas de calidad descritos en los capítulos de pruebas generales Medicamentos Nasales y para Inhalación-Información General y Pruebas de Calidad del Producto (5), Pruebas de Recuento Microbiano (61 ), Pruebas de Microorganismos Específicos (62), Llenado Mínimo (755) y Velocidad de Fuga (604). Los aerosoles tópicos incluyen espumas y atomizadores dermatológicos. Las espumas de los aerosoles tópicos deben incluir la apariencia física de la espuma y de la espuma colapsada.
VELOCIDAD DE DESCARGA Y CANTIDAD DESCARGADA Realizar estas pruebas exclusivamente en envases equipados con válvulas de descarga continua. Velocidad de Descarga: Seleccionar no menos de cuatro envases de aerosol, agitar si la etiqueta incluye esta instrucción, retirar las tapas y las cubiertas, y accionar cada válvula durante 2-3 segundos. Pesar cada envase con exactitud y sumergir en un baño de temperatura constante hasta que la presión interna se equilibre a una temperatura de 25º, determinada por la constancia de la presión interna, según se indica más adelante en Prueba de Presión. Retirar los envases del baño, eliminar el exceso de humedad secando con una toalla de papel, agitar, si la etiqueta incluye esta instrucción, accionar cada válvula durante 5,0 segundos (medidos con exactitud, empleando un cronómetro) y pesar nuevamente cada envase. Devolver los envases al baño de temperatura constante y repetir el procedimiento previo tres veces más para cada envase. Calcular el promedio de Velocidad de Descarga, en g/s, para cada envase. Cantidad Descargada: Devolver los envases al baño de temperatura constante, continuar descargando en accionamientos de 5 segundos hasta vaciar los envases. [NOTA-Asegurar que pase suficiente tiempo entre los accionamientos para evitar un enfriamiento significativo del envase.] Calcular la pérdida total de peso de cada envase. Ésta es la Cantidad Descargada.
PRUEBA DE PRESIÓN Realizar esta prueba sólo en aerosoles tópicos equipados con válvulas de descarga continua. Seleccionar no menos de cuatro envases de aerosol, retirar las tapas y las cubiertas, y sumergir en un baño de temperatura constante hasta que la presión interna sea constante a una temperatura de 25º. Retirar los envases del baño, agitar y retirar el disparador y el agua, si la hubiera, del vástago de la válvula. Colocar cada envase en posición vertical y determinar la presión en cada envase colocando un manómetro calibrado sobre el vástago de la válvula, sosteniéndolo con firmeza y accionando la válvula de manera que quede completamente abierta. El manómetro se calibra para presiones aproximadas a las esperadas y está equipado con un adaptador apropiado para las dimensiones particulares del vástago de la válvula. Leer la presión directamente del manómetro.
LLENADO MÍNIMO Los aerosoles tópicos cumplen con los requisitos para aerosoles que figuran en Llenado Mínimo (755).
PRUEBA DE FUGA Proceder según se indica en Velocidad de Fuga (604).
NÚMERO TOTAL DE DESCARGAS POR ENVASE Realizar esta prueba sólo en aerosoles tópicos equipados con válvulas dosificadoras, simultáneamente con la prueba de Uniformidad de Dosis Liberada y en los mismos envases utilizados en dicha prueba. Determinar el número total de descargas o entregas contando el número de descargas para cebado más las usadas para determinar el contenido del rocío y continuar accionando el disparador hasta completar el número de descargas declarado en la etiqueta. Los requisitos se cumplen si todos los envases o inhaladores analizados contienen un número de descargas que no sea menor al declarado en la etiqueta.
UNIFORMIDAD DE DOSIS LIBERADA La prueba de Uniformidad de Dosis Liberada se requiere para aerosoles tópicos equipados con válvulas dosificadoras. Para recoger la dosis mínima, proceder según se indica en la prueba de Uniformidad de Dosis Liberada en Inhaladores de Dosis Fija e Inhaladores de Polvo Seco, según se describe en el capítulo (601 ), excepto que se debe modificar el aparato de muestreo de
Pruebas Físicas/ (61 O) Métodos de Muestreo Microbiológico Alternativos 483
USP 39
dosis de manera que sea capaz de capturar cuantitativamente la dosis descargada de la preparación que se está analizando. A menos que se indique algo diferente en la monografía individual, aplicar los criterios de aceptación para Inhaladores de Dosis Fija e Inhaladores de Polvo Seco según se describe en el capítulo (601 ).
(604) VELOCIDAD DE FUGA Seleccionar 12 envases de aerosol y registrar la fecha y la hora con una aproximación de media hora. Pesar cada envase con una aproximación de 1 mg y registrar el peso de cada uno, en mg, como W 1• Dejar en reposo los envases en posición vertical a una temperatura de 25,0 ± 2,0º durante no menos de 3 días, y pesar nuevamente cada envase, registrar el peso de cada uno, en mg, como W2 y registrar la fecha y la hora con una aproximación de media hora. Determinar el tiempo, T, en horas, durante el que se analizaron los envases. Calcular la velocidad de fuga, en mg por año, de cada envase tomado, por la fórmula: (365)(24/7)(W7 - W2). Cuando se analizan envases de aerosol de vidrio recubiertos de plástico, secar los envases en un desecador durante 12-18 horas y dejarlos en reposo en una atmósfera de humedad constante durante 24 horas antes de determinar el peso inicial según se indicó anteriormente. Realizar la prueba bajo las mismas condiciones de humedad constante. Vaciar el contenido de cada envase analizado empleando una técnica segura (por ejemplo, enfriar para reducir la presión interna, retirar la válvula y verter). Retirar el contenido residual enjuagando con disolventes adecuados y luego enjuagar con algunas porciones de metano!. Mantener el envase, la válvula y todas las partes relacionadas como una unidad, y calentar todo junto a 100º durante 5 minutos. Enfriar, pesar, registrar el peso como W3 y determinar el peso neto de llenado (W 1 - W3) para cada envase analizado. [NOTA-Si el peso neto de llenado promedio se ha determinado previamente, dicho valor puede emplearse en lugar del valor (W, - W3) mencionado anteriormente.] Los requisitos se cumplen si la velocidad de fuga promedio por año para los 12 envases no es más de 3,5% del peso neto de llenado, y ninguno de los envases tiene fugas de más de 5,0% del peso neto de llenado por año. Si 1 envase tiene fugas de más de 5,0% por año y si ninguno de los envases tiene fugas de más de 7,0% por año, determinar la velocidad de fuga para 24 envases adicionales, según se indica en esta prueba. No más de 2 de los 36 envases tienen fugas de más de 5,0% del peso neto de llenado por año y ninguno de los 36 envases tiene fugas de más de 7,0% del peso neto de llenado por año. Cuando el peso neto de llenado es menos de 15 g y la etiqueta contiene una fecha de caducidad, los requisitos se cumplen si la velocidad de fuga promedio de los 12 envases no es mayor de 525 mg por año y ninguno de los envases tiene fugas mayores de 750 mg por año. Si 1 envase tiene fugas de más de 750 mg por año pero de no más de l, 1 g por año, determinar la velocidad de fuga sobre 24 envases adicionales, según se indica en esta prueba. No más de 2 de los 36 envases tiene fugas mayores de 750 mg por año y ninguno de los 36 envases tiene fugas mayores de l, l g por año. Esta prueba es adicional a la prueba de fuga habitual que se realiza en línea a cada envase.
/
/
(61 O) METODOS DE MUESTREO MICROBIOLOGICO ALTERNATIVOS PARA PRODUCTOS NASALES E INHALADORES NO ESTÉRILES INTRODUCCIÓN El muestreo apropiado de productos no estériles susceptibles a la contaminación microbiana puede ser complicado, debido a que estos productos a menudo se llenan en envases primarios especiales, diseñados para proteger al producto de la contaminación inadvertida durante su almacenamiento y uso. Estos diseños especiales pueden hacer más difícil la toma de muestras asépticas de tamaño o volumen suficientes para el análisis microbiológico. A menos que se utilicen metodologías especiales, puede resultar difícil realizar el muestreo de productos tales como formas farmacéuticas en polvo, líquidos nasales o para inhalación, sin exponerlos potencialmente a contaminación microbiana extraña. El presente capítulo de pruebas generales proporciona tales metodologías especiales para el muestreo de formas farmacéuticas para inhalación o nasales de alto y bajo contenido. Las metodologías de muestreo alternativas pueden ofrecer mejores maneras para muestrear envases de forma aséptica. Toda metodología alternativa debe utilizar técnicas asépticas y se debe llevar a cabo en condiciones ambientales y de otro tipo, apropiadas para el muestreo aséptico.
FORMAS FARMACÉUTICAS PARA INHALACIÓN V NASALES Los productos farmacéuticos nasales e inhaladores de bajo contenido (en lo sucesivo, PFNI de bajo contenido) son productos que presentan un llenado esperado de menos de 100 mg de polvo o 1 mL de formulación líquida por unidad (envase
484 (61 O) Métodos de Muestreo Microbiológico Alternativos/ Pruebas Físicas
USP 39
primario). Ejemplos de estos productos incluyen polvos para inhalación previamente medidos, más comúnmente conocidos como inhaladores de polvo seco, y atomizadores nasales monodosis. Los PFNI de alto contenido son productos farmacéuticos multidosis que presentan un llenado esperado de más de 100 mg de polvo o más de 1 mL de formulación liquida por unidad. Ejemplos de estos productos incluyen aerosoles para administración por inhalación y vía nasal, conocidos como inhaladores de dosis fija; polvos para inhalación con dosis medidas para dispositivos; y aerosoles nasales multidosis. La cantidad o volumen apropiado de muestra debe basarse en la metodología de prueba, incluido cualquier capítulo de pruebas generales pertinente, como los capítulos (61) Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano y (62) Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Microorganismos Específicos. El análisis se puede llevar a cabo en el polvo seco a granel sin envasar, en la formulación líquida o en el producto terminado. Si el análisis se realiza sólo en el material a granel, entonces se debe validar la capacidad del proceso para prevenir la contaminación microbiana desde el lote a granel hasta el producto terminado. El análisis se debe llevar a cabo en el producto terminado cuando el proceso no esté validado.
DETERMINACIÓN DEL TAMAÑO DE LA MUESTRA Para cada prueba microbiológica, muestrear 1O envases o unidades del producto farmacéutico o un número de unidades que sea representativo de la partida y que pueda proporcionar como mínimo 1 gramo de producto. Para tamaños de partida menores de 200 unidades (p.ej., partidas usadas en ensayos clínicos), el tamaño de la muestra se puede reducir al 1% de las unidades o a 1 unidad, lo que resulte mayor. Se puede combinar el contenido de envases individuales para el análisis.
ANÁLISIS DEL GRANEL PARA PFNI DE BAJO CONTENIDO Es preferible el análisis de lote a granel para PFNI de bajo contenido en lugar del análisis del producto terminado, debido a que permite tomar muestras de mayores tamaños que son representativas de la partida, sin incrementar indebidamente el riesgo de contaminación microbiana inadvertida. El análisis del granel se puede llevar a cabo en polvos o en preparaciones líquidas justo antes del llenado. Cuando se realiza el análisis del granel en lugar del análisis del producto terminado, se debe validar la capacidad de los procesos de fabricación posteriores al muestreo (p.ej., llenado y envasado) para prevenir contaminación microbiana de conformidad con las buenas prácticas de fabricación vigentes (CGMP). Para pruebas de recuento microbiano, se pueden muestrear al menos 1 Og o 1O mL de material a granel o, para las pruebas de microorganismos específicos, se puede muestrear 1 g o 1 mL de material de prueba. Para tamaños pequeños de partida (es decir, menos de 1000 g o 1000 mL), el tamaño de muestra recomendado es 1o/o de la partida para las pruebas de recuento microbiano y de microorganismos específicos.
MÉTODOS DE MUESTREO PARA PFNI DE AL TO CONTENIDO Inhaladores de Polvo Seco Los inhaladores de polvo seco tienen un reservorio interno que contiene una cantidad suficiente de formulación para dosis múltiples que son dosificadas por el dispositivo durante la activación por parte del paciente. En estos casos, se deben emplear procedimientos validados apropiados para muestrear un envase de producto farmacéutico no estéril.
Aerosoles para Inhalación Tomar en cuenta las cuestiones de seguridad relacionadas con la inhalación del producto farmacéutico y el posible peligro de inflamación. Evitar la contaminación de las muestras usando técnicas asépticas siempre que sea necesario. MÉTODO DE ACCIONAMIENTO AUTOMÁTICO El contenido de los envases de los aerosoles para inhalación se puede recolectar accionando automáticamente cada envase de aerosol y recolectando la formulación liberada en un filtro estéril adecuado. MÉTODO A TEMPERATURA AMBIENTE Desinfectar la parte exterior de los envases de prueba con un desinfectante apropiado y dejar que los envases se sequen en un ambiente controlado. Vaciar el contenido del envase de aerosol en un vaso estéril usando un dispositivo con aguja u otro dispositivo similar (p.ej., el conducto de ingreso de agua de una máquina para hacer hielo). Si se ha demostrado que el propelente no inhibe el crecimiento de microorganismos, se puede agregar el contenido del vaso estéril directamente a los medios líquidos o a las soluciones amortiguadoras para la prueba. De otro modo, esperar a que el propelente se evapore del vaso, dejando el vaso a temperatura ambiente durante varios minutos. Eliminar el propelente gaseoso residual inclinando ligeramen-
USP 39
Pruebas Físicas/ (611) Determinación de Alcohol 485
te el vaso o permitiendo el paso de una corriente lenta de gas estéril microbiológicamente inerte sobre la superficie del mismo. En el caso de algunos propelentes menos volátiles, por ejemplo, combinaciones de clorofluorocarbono (CFC) 11 /12, se puede calentar el vaso suavemente (a temperatura~ 45º) para ayudar a la evaporación. Una vez evaporado el propelente, agregar los medios líquidos o las soluciones amortiguadoras y mezclar el contenido para preparar para el análisis. La expulsión directa en los caldos de cultivo o las soluciones amortiguadoras puede ser factible siempre que se cuente con un dispositivo con aguja que sea lo suficientemente fino y fuerte como para perforar el envase y permitir que el contenido salga lentamente. En este caso, el contenido puede ser expulsado y mezclado en el medio acuoso. Existe la posibilidad de que se formen capas de propelente y de medio acuoso, lo cual puede requerir un mayor periodo de espera y calentamiento suave (que no exceda de 45º) para evaporar el propelente. MÉTODO CON ENFRIAMIENTO Colocar los envases de aerosol desinfectados en hielo seco o en una suspensión espesa de hielo seco (garantizar la calidad microbiana del hielo seco y del líquido para formar la suspensión espesa), o en un criocongelador durante el periodo necesario para licuar el contenido. Desinfectar la parte exterior de los envases de prueba con un desinfectante apropiado y dejar que los envases se sequen en un ambiente aséptico. Abrir asépticamente los envases de aerosol usando una herramienta apropiada. Se debe tener en cuenta que la congelación puede afectar la viabilidad de los microorganismos. Para productos basados en CFC, verter el contenido de los envases en vasos estériles. Dejar que escape el propelente y combinar el residuo con un diluyente adecuado para el producto farmacéutico. También se pueden emplear otros procedimientos específicos para el fármaco. Para productos basados en hidrofluoroalcanos, verter el contenido de los envases en vasos estériles parcialmente sumergidos en vasos más grandes que contengan hielo seco. Expulsar el propelente, por ejemplo, evaporando el material hasta sequedad con una corriente lenta de aire comprimido estéril, filtrado y libre de aceite. Combinar el residuo con un diluyente apropiado para el producto farmacéutico. Un método alternativo para analizar todo el contenido de un envase previamente enfriado consiste en verter el contenido del envase abierto en una unidad de filtración por membrana estéril, dejar que escape el propelente y luego enjuagar con una cantidad adecuada de diluyente estéril.
Atomizadores Nasales Multidosis Los envases de atomizadores nasales multidosis a menudo tienen una tapa de rosca, precintada, o de anclaje hermético. El envase se puede abrir desenroscando la tapa, cortando el sello o usando una herramienta para retirar el precinto, con cuidado de evitar la contaminación microbiana durante el proceso. Después de retirar la tapa, por lo general resulta apropiado el uso de los métodos de muestreo tradicionales, como los descritos en los capítulos de pruebas generales (61) Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano y (62) Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Microorganismos Específicos.
(611) DETERMINACIÓN DE ALCOHOL MÉTODO 1-MÉTODO DE DESTILACIÓN El método 1 se utiliza para la determinación de alcohol a menos que se especifique algo diferente en la monografía individual. Es adecuado para examinar la mayoría de los extractos líquidos y las tinturas, siempre que la capacidad del matraz de destilación sea suficiente (normalmente de dos a cuatro veces el volumen del líquido a calentar) y la velocidad de destilación sea la necesaria para producir destilados transparentes. Los destilados turbios pueden clarificarse mediante agitación con talco o con carbonato de calcio y filtración, después de lo cual la temperatura del filtrado se ajusta y el contenido de alcohol se determina a partir del peso específico. Durante todas las manipulaciones, tomar precauciones para minimizar la pérdida de alcohol por evaporación. Tratar los líquidos que forman una cantidad inconveniente de espuma durante la destilación acidificándolos fuertemente con ácidos fosfórico, sulfúrico o tánico, o tratarlos con un leve exceso de solución de cloruro de calcio o con una pequeña cantidad de parafina o aceite de silicona antes de comenzar la destilación. Evitar las proyecciones durante la destilación agregando trozos de material poroso insoluble, como carburo de silicio, o perlas. Para Líquidos que se Supone que Contienen 30% de Alcohol o Menos-Con una pipeta, transferir a un aparato de destilación adecuado no menos de 25 mL del líquido en el que se debe determinar el contenido de alcohol y observar la temperatura a la que se midió el volumen. Agregar un volumen igual de agua, destilar y recoger un volumen de destilado que sea aproximadamente 2 mL menor que el volumen tomado de líquido de prueba original, ajustar a la temperatura a la cual se midió el líquido de prueba original, agregar suficiente agua hasta medir con exactitud el volumen original del líquido de prueba y mezclar. El destilado es transparente o no más que levemente turbio y no contiene más que trazas de sustancias volátiles,
486 (611) Determinación de Alcohol / Pruebas Físicas
USP 39
además de alcohol y agua. Determinar el peso específico del líquido a 25º, según se indica en Peso Específico (841 ), y usar este resultado para establecer el porcentaje, en volumen, de C2 H5 0H contenido en el líquido examinado por referencia a la Tabla Alcoholimétrica en la sección Tablas de Referencia. Para Líquidos que se Supone que Contienen Más de 30% de Alcohol-Proceder según se indica en el párrafo anterior, excepto que se debe hacer lo siguiente: diluir la muestra con aproximadamente el doble de su volumen en agua, recoger un volumen de destilado que sea aproximadamente 2 mL menor que el doble del volumen del líquido de prueba original, ajustar a la temperatura a la cual se midió el líquido de prueba original, agregar suficiente agua hasta medir con exactitud el doble del volumen original del líquido de prueba, mezclar y determinar el peso específico. La proporción de C2H50H, en volumen, en este destilado, según se determina a partir de su peso específico, equivale a la mitad del C2 H50H contenido en el líquido examinado. Tratamiento EspecialÁCIDOS Y BASES VOLÁTILES-Acidificar levemente las preparaciones que contengan bases volátiles con ácido sulfúrico diluido antes de destilar. Si hay ácidos volátiles presentes, alcalinizar levemente la preparación con hidróxido de sodio SR. GLICERINA-A los líquidos que contengan glicerina, agregar suficiente agua para que el residuo, después de la destilación, contenga no menos de 50% de agua. YODO-Antes de la destilación, tratar todas las soluciones que contengan yodo libre con cinc en polvo o decolorar con una cantidad apenas suficiente de solución de tiosulfato de sodio (1 en 1O), seguida de algunas gotas de hidróxido de sodio SR. OTRAS SUSTANCIAS VOLÁTILES-Los alcoholados, elíxires, tinturas y preparaciones similares que contienen proporciones apreciables de sustancias volátiles, además de alcohol y agua, tales como aceites volátiles, cloroformo, éter, alcanfor, etc., requieren tratamiento especial, como se describe a continuación: Para Líquidos que se Supone que Contienen 50% de Alcohol o Menos-Mezclar en un separador 25 mL de la muestra en análisis, medidos con exactitud, con aproximadamente el mismo volumen de agua. Saturar esta mezcla con cloruro de sodio, luego agregar 25 mL de éter de petróleo y agitar la mezcla para extraer los ingredientes volátiles que interfieran. Transferir la capa separada inferior a un segundo separador y repetir la extracción dos veces con dos porciones más de 25 mL de éter de petróleo. Extraer las soluciones combinadas de éter de petróleo con tres porciones de 1O mL de una solución saturada de cloruro de sodio. Combinar las soluciones salinas y destilar de la manera habitual, recogiendo un volumen de destilado que presente un cociente simple en relación al volumen de la muestra original. Para Líquidos que se Supone que Contienen Más de 50% de Alcohol-Ajustar la muestra en análisis a una concentración de aproximadamente 25% de alcohol diluyendo con agua y luego proceder según se indica en Para Líquidos que se Supone que Contienen 50% de Alcohol o Menos, comenzando donde dice "Saturar esta mezcla con cloruro de sodio". En la preparación de Colodión o Colodión Flexible para destilación, usar agua en lugar de la solución saturada de cloruro de sodio que se indica anteriormente. Si hay aceites volátiles presentes sólo en pequeñas proporciones y se obtiene un destilado turbio, y no se ha empleado el tratamiento con éter de petróleo, se puede clarificar el destilado y adecuarlo para la determinación de peso específico agitándolo con aproximadamente un quinto de su volumen de éter de petróleo o filtrándolo a través de una capa fina de talco.
MÉTODO 11-MÉTODO DE CROMATOGRAFÍA DE GASES Usar el Método /la cuando el Método 11 se especifica en la monografía individual. Para obtener un análisis de los principios en los que se basa, ver Cromatografía de Gases en Cromatografía (621 ). Estándares de referencia USP-ER Determinación de Alcohol-Acetonitrilo USP. ER Determinación de Alcohol-Alcohol USP.
Método lla Aparato-En condiciones típicas, usar un cromatógrafo de gases equipado con un detector de ionización a la llama y una columna cromatográfica de vidrio de 4 mm x 1,8 m rellena con soporte 53 de malla 100 a 120, usando nitrógeno o helio como gas transportador. Antes de usar, acondicionar la columna durante la noche a 235º con un flujo lento de gas transportador. Mantener la temperatura de la columna a 120º y la temperatura del inyector y el detector a 21 Oº. Ajustar el flujo del gas transportador y la temperatura de modo que el acetonitrilo, el estándar interno, eluya entre 5 y 1O minutos. SolucionesPreparación Madre de Prueba-Diluir la muestra en análisis en diluciones sucesivas con agua para obtener una solución que contenga aproximadamente 2% (v/v) de alcohol. Preparación de Prueba-Pipetear 5 mL de la Preparación Madre de Prueba y de ER Determinación de Alcohol-Acetonitrilo USP [NOTA-Alternativamente, se puede usar una solución acuosa de acetonitrilo al 2% de calidad adecuada como solución de estándar interno], transferir a un matraz volumétrico de 50 mL, diluir a volumen con agua y mezclar. Preparación Estándar-Pipetear 5 mL de ER Determinación de Alcohol-Alcohol USP y de ER Determinación de AlcoholAcetonitrilo USP [NOTA-Alternativamente, se puede usar una solución acuosa de acetonitrilo al 2% de calidad adecuada como solución de estándar interno], transferir a un matraz volumétrico de 50 mL, diluir a volumen con agua y mezclar. Procedimiento-Inyectar por duplicado en el cromatógrafo de gases aproximadamente 5 µL de la Preparación de Prueba y de la Preparación estándar, registrar los cromatogramas y determinar los cocientes entre las respuestas de los picos. Calcular el porcentaje de alcohol (v/v) en la muestra en análisis, por la fórmula:
USP 39
Pruebas Físicas/ (616) Densidad Aparente y por Asentamiento 487
en donde Ces la concentración declarada de ER Determinación de Alcohol-Alcohol USP; Des el factor de dilución (cociente entre el volumen de la Preparación Madre de Prueba y el volumen de muestra tomado); y Ru y R5 son los cocientes de respuesta entre los picos obtenidos a partir de la Preparación de Prueba y de la Preparación Estándar, respectivamente. Prueba de Aptitud del Sistema-En un cromatograma adecuado, el factor de resolución, R, no es menor de 2; el factor de asimetría del pico de alcohol no es mayor de 2,0; y seis inyecciones repetidas de la Preparación Estándar presentan una desviación estándar relativa de no más de 2,0% en el cociente entre los picos de alcohol y del estándar interno.
Método llb Aparato-Equipar un cromatógrafo de gases con un inyector partido con una relación de partición de 5 : 1, un detector de ionización a la llama y una columna capilar de 0,53 mm x 30 m recubierta con una película de 3,0 µm de fase G43. Usar helio como gas transportador a una velocidad de flujo de 34,0 cm por segundo. Programar el cromatógrafo para mantener la temperatura de la columna a 50º durante 5 minutos, luego aumentar la temperatura a una velocidad de 1 Oº por minuto hasta 200º, y mantener a esa temperatura durante 4 minutos. Mantener la temperatura del inyector a 21 Oº y la del detector a 280º. SolucionesPreparación Madre de Prueba-Diluir la muestra en análisis en diluciones sucesivas con agua para obtener una solución que contenga aproximadamente 2% (v/v) de alcohol. Preparación de Prueba-Pipetear 5 mL de la Preparación Madre de Prueba y de ER Determinación de Alcohol-Acetonitrilo USP [NOTA-Alternativamente, se puede usar una solución acuosa de acetonitrilo al 2% de calidad adecuada como solución de estándar interno], y transferir a un matraz volumétrico de 25 mL, diluir a volumen con agua y mezclar. Preparación Estándar-Pipetear 5 mL de ER Determinación de Alcohol-Alcohol USP y de ER Determinación de AlcoholAcetonitrilo USP [NOTA-Alternativamente, se puede usar una solución acuosa de acetonitrilo al 2% de calidad adecuada como solución de estándar interno], y transferir a un matraz volumétrico de 25 mL, diluir a volumen con agua y mezclar. Procedimiento-Inyectar por duplicado en el cromatógrafo de gases aproximadamente de 0,2 a 0,5 µL de la Preparación de Prueba y de la Preparación Estándar, registrar los cromatogramas y determinar los cocientes de respuesta de los picos. Calcular el porcentaje de alcohol (v/v) en la muestra en análisis, por la fórmula: CD(Ru/R 5) en donde Ces la concentración declarada de ER Determinación de Alcohol-Alcohol USP; Des el factor de dilución (cociente entre el volumen de la Preparación Madre de Prueba y el volumen de muestra tomado); y Ru y R5 son los cocientes de respuesta entre los picos obtenidos a partir de la Preparación de Prueba y de la Preparación Estándar, respectivamente. Prueba de Aptitud del Sistema-En un cromatograma adecuado, el factor de resolución, R, entre alcohol y el estándar interno no es menor de 4; el factor de asimetría del pico de alcohol no es mayor de 2,0; y seis inyecciones repetidas de la Preparación Estándar presentan una desviación estándar de no más de 4,0% en el cociente entre los picos de alcohol y del estándar interno.
(616) DENSIDAD APARENTE Y DENSIDAD POR ASENTAMIENTO DE LOS POLVOS DENSIDAD APARENTE Este capítulo general ha sido armonizado con los textos correspondientes de la Farmacopea Europea y/o la Farmacopea japonesa. •La porción que no está armonizada se marca con los símbolos (•.) para especificar este hecho .• La densidad aparente de un polvo es la relación de la masa de una muestra de polvo sin asentar y su volumen, incluida la contribución del volumen del espacio vacío entre las partículas. En consecuencia, la densidad aparente depende tanto de la densidad de las partículas de polvo como de la distribución espacial de las partículas en el lecho de polvo. La densidad aparente se expresa en gramos por mL (g/mL) aunque la unidad internacional es el kilogramo por metro cúbico (1 g/mL = 1000 kg/m 3) porque las mediciones se hacen usando probetas. También se puede expresar en gramos por centímetro cúbico (g/cm 3). Las propiedades que determinan la densidad aparente de un polvo dependen de la preparación, el tratamiento y el almacenamiento de la muestra, es decir la forma en que se manipuló. Las partículas se pueden compactar para que tengan un intervalo variable de densidades aparentes; sin embargo, la más ligera perturbación del lecho de polvo puede producir un cambio en la densidad aparente. Por lo tanto, a menudo es muy difícil medir la densidad aparente de un polvo con buena reproducibilidad y, al informar los resultados, es fundamental especificar cómo se hizo la determinación. La densidad aparente de un polvo se determina midiendo el volumen de una muestra de polvo de peso conocido, que puede haber sido pasada a
488 (616) Densidad Aparente y por Asentamiento/ Pruebas Físicas
USP 39
través de un tamiz, en una probeta graduada (Método /) o midiendo la masa de un volumen conocido de polvo que haya sido pasado a través de un volúmetro a un vaso (Método //) o un recipiente de medidas (Método 111). Se prefieren el Método I y el Método 111.
Método 1-Medición en una Probeta Graduada PROCEDIMIENTO Pasar una cantidad de material suficiente para completar la prueba a través de un tamiz con aperturas mayores o iguales a 1,0 mm, de ser necesario, para deshacer los aglomerados que pudieran haberse formado durante el almacenamiento; esto se debe hacer cuidadosamente para evitar cambios en la naturaleza del material. Introducir sin compactar aproximadamente 100 g de la muestra de prueba, M, pesada con una exactitud de O, 1%, en una probeta graduada, seca, de 250 ml (legible hasta 2 ml). Si fuera necesario, nivelar cuidadosamente el polvo, sin compactarlo, y tomar la lectura del volumen aparente sin asentar (V0 ) con una aproximación a la unidad más cercana de la escala. Calcular la densidad aparente en g/ml por la fórmula M/V0 • En general, se recomienda determinar esta propiedad efectuando mediciones repetidas. Si la densidad del polvo es demasiado baja o demasiado alta, de tal forma que la muestra de prueba tenga un volumen aparente sin asentamiento de más de 250 ml o menos de 150 ml, no es posible usar una muestra de polvo de 100 g. Por lo tanto, se debe seleccionar una cantidad diferente de polvo como muestra de prueba, de manera que su volumen aparente sin asentamiento sea de 150 a 250 ml (volumen aparente mayor o igual a 60% del volumen total de la probeta); el peso de la muestra de prueba se especifica en la expresión de los resultados. Para muestras de prueba que tengan un volumen aparente entre 50 y 100 ml, se puede usar una probeta de 100 ml, legible hasta 1 ml; el volumen de la probeta se especifica en la expresión de los resultados.
Método 11-Medición en un Volúmetro APARATO El aparato (Figura 7) consta de un embudo superior provisto de un tamiz de 1,0 mm. 1 El embudo está montado sobre una caja deflectora que contiene cuatro placas deflectoras de vidrio sobre las que se desliza el polvo y rebota a medida que pasa. El embudo que se encuentra en el fondo de la caja deflectora recoge el polvo y lo vierte en un vaso de capacidad especificada colocado directamente debajo del embudo. El vaso puede ser cilíndrico (con una capacidad de 25,00 ± 0,05 ml y con un diámetro interno de 30,00 ± 2,00 mm) o cúbico (con una capacidad de 16,39 ±0,20 ml cuyas dimensiones internas son de 25,400 ± 0,076 mm). Tamiz de 1,0 mm _ _ _ ___,_, Embudo para polvos ___.
Caja deflectora
Vaso colector de muestra
Figura 1. PROCEDIMIENTO Dejar que un exceso de polvo fluya a través del aparato y recogerlo en el vaso colector de la muestra hasta que éste se desborde, usando al menos 25 cm3 de polvo con el vaso cúbico y 35 cm3 de polvo con el vaso cilíndrico. Quitar cuidadosamente el exceso de polvo de la parte superior del vaso pasando suavemente el filo de la hoja de una espátula ubicada en dirección perpendicular a la superficie y apoyada en el borde superior del vaso, tomando las precauciones necesarias para que la espátula esté siempre perpendicular y así evitar la compactación o la remoción del polvo del vaso. Limpiar el material que hubiera 1
El aparato (Volúmetro de Scott) se ajusta a las dimensiones que aparecen en ASTM B329-06(2012).
Pruebas Físicas/ (616) Densidad Aparente y por Asentamiento 489
USP 39
podido quedar adherido a las paredes laterales del vaso y determinar el peso del polvo, M, con una aproximación de O, 1%. Calcular la densidad aparente, en g/mL, por la fórmula:
en donde V0 es el volumen del vaso, en mL. Registrar el promedio de tres determinaciones usando tres muestras de polvo diferentes.
Método 111-Medición en un Recipiente APARATO El aparato consta de un recipiente cilíndrico de acero inoxidable de 100 mL, con las dimensiones que se especifican en la Figura 2.
D
--54.o-.
2~0 +
[~:;~]__.
1 52,0
l
1
50,0 10f
54,0
l
Figura 2. PROCEDIMIENTO Pasar una cantidad de polvo suficiente para completar la prueba a través de un tamiz de 1,0 mm, si fuera necesario, para deshacer los aglomerados que pudieran haberse formado durante el almacenamiento y permitir que la muestra obtenida fluya libremente hacia el recipiente de medición hasta que se desborde. Quitar cuidadosamente el exceso de polvo de la parte superior del recipiente como se describió para el Método JI. Determinar el peso (M0 ) del polvo con una aproximación de O, 1%, restando la masa, previamente determinada, del recipiente de medición vacío. Calcular la densidad aparente (g/mL) por la fórmula M 0/l 00 y registrar el promedio de tres determinaciones, usando tres muestras de polvo diferentes.
DENSIDAD POR ASENTAMIENTO La densidad por asentamiento es una densidad aparente aumentada, obtenida después de golpetear mecánicamente un recipiente que contiene la muestra de polvo. La densidad por asentamiento se obtiene golpeteando mecánicamente una probeta o un recipiente de medición graduado que contenga una muestra de polvo. Después de determinar el volumen o peso inicial del polvo, se golpetea mecánicamente la probeta o recipiente de medición y se toman las lecturas de volumen o peso hasta que sean prácticamente constantes. El asentamiento mecánico se obtiene levantando la probeta o recipiente y dejándolo caer por su propio peso desde una altura especificada, por alguno de los tres métodos que se describen a continuación. Puede ser preferible emplear dispositivos que rotan la probeta o recipiente durante el golpeteo a fin de reducir al mínimo la posibilidad de que la masa se separe durante el asentamiento.
Método 1 APARATO El aparato (Figura 3) consta de lo siguiente: • Una probeta graduada de 250 mL (legible hasta 2 mL, con una masa de 220 ± 44 g) • Un aparato de asentamiento capaz de producir, en 1 minuto, nominalmente, 250 ± 15 golpes desde una altura de 3 ± 0,2 mm o, nominalmente, 300 ± 15 golpes desde una altura de 14 ± 2 mm. El soporte de la probeta graduada, con su dispositivo de fijación, tiene una masa de 450 ± 1O g.
490 (616) Densidad Aparente y por Asentamiento/ Pruebas Físicas
.L
-::¡:-
_z. Probeta graduada
--~tt-
..:t-.
~
:±: -$
Soporte de la probeta
~
-r
E E
__¡
E o
E E
N
o o
U')
Ql
"O
"O
e:!
Cl Ql
t
N
Ql
"O
"'oe
USP 39
§ e:!
U') (")
(")
Ql
"O
.a "' <( ·
Ql
o e
E
o e
rD
a.
¡"
E E EN
E (")o-
Yunque Esta dimensión es tal que la caída G) cumple con las especificaciones y que, en el punto más bajo de la leva, el soporte de la probeta se apoya libremente sobre la parte superior del yunque.
¡ Leva
Figura 3. PROCEDIMIENTO
Proceder según se describió anteriormente para la determinación del volumen aparente (V0 ). Fijar la probeta en el soporte. Realizar 1O, 500 y 1250 golpes en la misma muestra de polvo y leer los volúmenes correspondientes V10, V500 y V1250 con una aproximación a la unidad más cercana de la escala. Si la diferencia entre V500 y V1250 es menor o igual a 2 ml, V1250 es el volumen por asentamiento. Si la diferencia entre V500 y V1250 excede de 2 ml, repetir en incrementos, por ejemplo, de 1250 golpes, hasta que la diferencia entre las mediciones sucesivas sea menor o igual a 2 mL Para algunos polvos, puede ser apropiado un número menor de golpes, si se ha validado. Calcular la densidad por asentamiento (g/ml), usando la fórmula m/VF en donde VF es el volumen final por asentamiento. En general, se recomienda determinar esta propiedad efectuando mediciones repetidas. Especificar la altura de caída con los resultados. Si no es posible utilizar una muestra de prueba de 100 g, usar una cantidad reducida y una probeta graduada apropiada de 100 ml (legible hasta 1 ml) que pese 130 ± 16 g y esté montada en un soporte que pese 240 ± 12 g. Si la diferencia entre V500 y V1250 es menor o igual a 1 ml, V1250 es el volumen por asentamiento. Si la diferencia entre V500 y V1250 excede de 1 ml, repetir en incrementos, por ejemplo, de 1250 golpes, hasta que la diferencia entre las mediciones sucesivas sea menor o igual a 1 mL Las condiciones de la prueba modificada se especifican en la expresión de los resultados.
Método 11 APARATO Y PROCEDIMIENTO
Proceder según se indicó en Método /, excepto que el analizador mecánico proporciona una caída fija de 3 ± 0,2 mm a una velocidad nominal de 250 golpes por minuto.
Pruebas Físicas/
USP 39
(621) Cromatografía 491
Método 111 APARATO Y PROCEDIMIENTO Proceder según se indicó en el Método 111-Medición en un Recipiente para medir la densidad aparente en un recipiente de medición equipado con la tapa que se muestra en la Figura 2. El recipiente de medición con la tapa se levanta 50-60 veces por minuto mediante un aparato medidor de densidad por asentamiento adecuado. Efectuar 200 golpes, retirar la tapa y quitar cuidadosamente el exceso de polvo de la parte superior del recipiente de medición según se describe en el Método 111-Medición en un Recipiente para medir la densidad aparente. Repetir el procedimiento con 400 golpes. Si la diferencia entre las dos masas obtenidas después de 200 y 400 golpes excede el 2%, realizar una prueba efectuando 200 golpes adicionales hasta que la diferencia entre las mediciones sucesivas sea menos de 2%. Calcular la densidad por asentamiento (g/mL) usando la fórmula M/100, donde MF es la masa del polvo en el recipiente de medición. Registrar el promedio de tres determinaciones usando tres muestras de polvo diferentes. Especificar las condiciones de la prueba en los resultados, incluyendo la altura de la caída.
MEDIDAS DE LA COMPRESIBILIDAD DE UN POLVO Dado que las interacciones entre las partículas que afectan las propiedades que determinan la densidad aparente de un polvo también afectan el flujo del polvo, una comparación entre la densidad aparente y la densidad por asentamiento puede proporcionar una medida de la importancia relativa de estas interacciones en un polvo determinado. A menudo, este tipo de comparación se usa como un índice de la capacidad de flujo del polvo, por ejemplo, el Índice de Compresibilidad o el Índice de Hausner, según se describe a continuación. El Índice de Compresibilidad y el Índice de Hausner son medidas que expresan la propensión de un polvo a la compresión, según se describió antes. Como tales, son medidas de la capacidad de asentamiento de un polvo y permiten evaluar la importancia relativa de las interacciones entre partículas. En un polvo que fluye libremente, dichas interacciones son menos relevantes, y la densidad aparente y la densidad por asentamiento tendrán valores más cercanos. En el caso de materiales de menor fluidez, generalmente existen interacciones mayores entre las partículas y se observa una diferencia mayor entre la densidad aparente y la densidad por asentamiento. El Índice de Compresibilidad y el Índice de Hausner reflejan estas diferencias. ÍNDICE DE COMPRESIBILIDAD Calcular por la fórmula:
V0 = volumen aparente sin asentar VF =volumen final asentado
ÍNDICE DE HAUSNER Vo/VF
Dependiendo del material, el índice de compresibilidad se puede determinar usando V10 en vez de V0 • [NOTA-Si se usa Vw debe especificarse claramente en los resultados.]
(621) CROMATOGRAFÍA INTRODUCCIÓN Las técnicas de separación cromatográfica son métodos de separación de múltiples etapas en los que los componentes de una muestra se distribuyen entre dos fases, una de las cuales es estacionaria y la otra móvil. La fase estacionaria puede ser un sólido, un líquido absorbido sobre un sólido o un gel. La fase estacionaria puede estar empacada en una columna, extendida como una capa, distribuida como película o aplicada mediante otras técnicas. La fase móvil puede ser gaseosa o líquida o un fluido supercrítico. La separación puede basarse en adsorción, distribución de masa (partición) o intercambio iónico; o puede basarse en diferencias entre las propiedades fisicoquímicas de las moléculas, tales como tamaño, masa o volumen. Este capítulo contiene procedimientos generales, definiciones y cálculos de parámetros comunes y describe requisitos generales para aptitud del sistema. Los tipos de cromatografía útiles en el análisis cualitativo y cuantitativo que se emplean en los procedimientos cromatográficos de la USP son: cromatografía en columna, de gases, en papel, en capa delgada (incluyendo la cromatografía
492 (621) Cromatografía/ Pruebas Físicas
USP 39
en capa delgada de alta resolución) y de líquidos presurizados (comúnmente llamada cromatografía líquida de alta presión o alta resolución).
PROCEDIMIENTOS GENERALES Esta sección describe los procedimientos básicos usados cuando se describe un método cromatográfico en una monografía. Se deben seguir los siguientes procedimientos a menos que se indique algo distinto en la monografía individual.
Cromatografía en Papel FASE ESTACIONARIA La fase estacionaria es una hoja de papel de textura y espesor adecuados. El desarrollo puede ser ascendente, en cuyo caso el disolvente se desplaza hacia arriba por el papel mediante fuerzas de capilaridad, o descendente, en cuyo caso el flujo del disolvente se ve ayudado por la fuerza de gravedad. La orientación de las fibras del papel con respecto al flujo del disolvente se debe mantener constante en una serie de cromatogramas. (Por lo general, el fabricante indica la dirección de máquina). APARATO El equipo esencial para cromatografía en papel comprende una cámara hermética al vapor provista de entradas para agregar el disolvente y una gradilla de material resistente a la corrosión aproximadamente 5 cm más corta que la altura interior de la cámara. La gradilla sirve como soporte para la cubeta de disolvente y para las varillas antisifón que, a su vez, sostienen las hojas cromatográficas. El fondo de la cámara está cubierto con la mezcla de disolventes o fase móvil indicada. La saturación de la cámara con el vapor del disolvente se facilita revistiendo las paredes del interior con un papel humedecido con la fase móvil indicada. SIEMBRA La sustancia o sustancias a ser analizadas se disuelven en un disolvente adecuado. Se aplican volúmenes convenientes, medidos con micropipetas adecuadas, de la solución resultante que contengan normalmente de 1-20 µg del compuesto, en zonas de 6 a 1 O mm de diámetro y con una separación de no menos de 3 cm. PROCEDIMIENTO PARA CROMATOGRAFÍA DESCENDENTE EN PAPEL 1. Suspender la hoja cromatográfica sembrada en el aparato, usando la varilla antisifón para sostener el extremo superior de la hoja en la cubeta de disolvente. [NOTA-Asegurar que la porción de la hoja que cuelga por debajo de las varillas esté suspendida libremente en la cámara sin tocar la gradilla o las paredes de la cámara o el líquido que está en el interior de la cámara.] 2. La cámara se sella para permitir su equilibrio (saturación) y el del papel con el vapor del disolvente. Liberar cualquier exceso de presión, si fuera necesario. 3. Después de equilibrar la cámara, la fase móvil previamente preparada se introduce en la cubeta a través de la entrada. 4. Cerrar la entrada y dejar que la fase móvil se desplace hacia abajo la distancia deseada sobre el papel. 5. Retirar la hoja de la cámara. 6. Marcar rápidamente la ubicación de la fase móvil y secar la hoja. 7. Observar el cromatograma y medir directamente o después del revelado adecuado para localizar las manchas del fármaco o de los fármacos aislados. PROCEDIMIENTO PARA CROMATOGRAFÍA ASCENDENTE EN PAPEL 1. Agregar la fase móvil al fondo de la cámara. 2. La cámara se sella para permitir su equilibrio (saturación) y el del papel con el vapor del disolvente. Liberar cualquier exceso de presión, si fuera necesario. 3. Sumergir el borde inferior de la fase estacionaria en la fase móvil para permitir que la fase móvil ascienda en la hoja cromatográfica por capilaridad. 4. Cuando la fase móvil haya alcanzado la altura deseada, abrir la cámara, retirar la hoja, marcar rápidamente la ubicación del frente de la fase móvil, y secar la hoja. 5. Observar el cromatograma y medir directamente o después del revelado adecuado para localizar las manchas del fármaco o de los fármacos aislados.
Pruebas Físicas/
USP 39
(621) Cromatografía 493
Cromatografía en Capa Delgada FASE ESTACIONARIA La fase estacionaria es una capa relativamente delgada y uniforme de material seco y reducido a polvo fino que se aplica sobre una lámina o placa de vidrio, plástico o metal (generalmente conocida como la placa). La fase estacionaria para TLC tiene un tamaño de partícula promedio de 10-15 µm, y la de TLC de alta resolución (HPTLC) tiene un tamaño de partícula promedio de 5 µm. Se pueden usar placas disponibles comercialmente con una zona preadsorbente si se especifican en una monografía. La muestra aplicada a la región preadsorbente se desarrolla en forma de bandas estrechas y definidas en la interfase entre el preadsorbente y el sorbente. Las separaciones logradas pueden basarse en la adsorción, la partición o una combinación de ambos efectos, según el tipo específico de fase estacionaria. APARATO Usar una cámara cromatográfica de material inerte y transparente con las siguientes especificaciones: una cubeta de fondo plano o cubetas gemelas, una tapa que cierre herméticamente y un tamaño adecuado para las placas. Revestir como mínimo una pared de la cámara cromatográfica con papel de filtro. Agregar una cantidad suficiente de fase móvil a la cámara cromatográfica de modo que proporcione, después de impregnar el papel de filtro, un nivel de profundidad apropiado a la dimensión de la placa utilizada. Cerrar la cámara cromatográfica y dejar que se equilibre. [NOTA-A menos que se indique algo diferente, las separaciones se realizan en una cámara saturada.] DETECCIÓN/VISUALIZACIÓN A menudo se usa una fuente de luz ultravioleta (UV) adecuada para observaciones bajo luz UV de longitud de onda corta
(254 nm) y larga (365 nm), así como una variedad de soluciones reveladoras para visualizar las manchas. SIEMBRA Aplicar las soluciones en forma de zonas sobre la superficie de la fase estacionaria (placa) en el volumen prescrito en porciones lo suficientemente pequeñas para obtener manchas circulares de 2-5 mm de diámetro (1-2 mm sobre placas de HPTLC) o bandas de 10-20 mm x 1-2 mm (5-1 O mm x 0,5-1 mm sobre placas de HPTLC) a una distancia adecuada del borde inferior y de los bordes laterales de la placa. [NOTA-Durante el desarrollo, la posición de la aplicación debe estar por lo menos 5 mm (TLC) o 3 mm (HPTLC) por encima del nivel de la fase móvil.] Aplicar las soluciones sobre una línea paralela al borde inferior de la placa con una separación mínima de 1O mm (5 mm en placas de HPTLC) entre los centros de las manchas o 4 mm (2 mm en placas de HPTLC) entre los bordes de las bandas y dejar que se sequen. PROCEDI M 1ENTO 1. Colocar la placa en la cámara, asegurando que las manchas o bandas estén por encima de la superficie de la fase móvil. 2. Cerrar la cámara. 3. Dejar que la fase móvil ascienda en la placa hasta que el frente de la fase móvil haya recorrido tres cuartos de la longitud de la placa o la distancia indicada en la monografía. 4. Retirar la placa, marcar el frente de la fase móvil con un lápiz, y dejar que se seque. 5. Visualizar los cromatogramas según se indica. 6. Determinar los valores del factor de retardo cromatográfico (RF) para las manchas o zonas principales. 7. Se puede realizar una identificación presuntiva mediante la observación de las manchas o zonas con valores RF idénticos y de magnitud similar, obtenidas respectivamente cromatografiando una muestra desconocida y un estándar en la misma placa. Una comparación visual del tamaño o intensidad de las manchas o zonas puede servir para una estimación semicuantitativa. La mediciones cuantitativas se pueden efectuar mediante densitometría (mediciones de absorbancia o fluorescencia).
Cromatografía en Columna SOPORTE SÓLIDO Usar tierra silícea purificada para separación de fase normal. Usar tierra silícea cromatográfica silanizada para cromatografía de partición en fase reversa.
494 (621) Cromatografía/ Pruebas Físicas
USP 39
FASE ESTACIONARIA Modificar el soporte sólido agregando la fase estacionaria especificada en la monografía individual. Si se emplea una mezcla de líquidos como fase estacionaria, mezclarlos antes de la introducción del soporte sólido. FASE MÓVIL La fase móvil se especifica en la monografía individual. Si la fase estacionaria es una solución acuosa, equilibrar con agua. Si la fase estacionaria es un líquido orgánico polar, equilibrar con ese líquido. APARATO A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, el tubo cromatográfico tiene un diámetro interno de aproximadamente 22 mm y una longitud de 200-300 mm. Acoplado al tubo cromatográfico se encuentra un tubo de salida sin llave de paso con un diámetro interno de aproximadamente 4 mm y una longitud de aproximadamente 50 mm. Preparación del aparato: Apisonar un trozo de lana de vidrio fina en la base del tubo. Combinar el volumen especificado de fase estacionaria y la cantidad especificada de soporte sólido para producir una mezcla homogénea y liviana. Transferir esta mezcla al tubo cromatográfico y apisonar empleando presión suave, hasta obtener una masa uniforme. Si la cantidad especificada de soporte sólido es más de 3 g, transferir la mezcla a la columna en porciones de aproximadamente 2 g y apisonar cada porción. Si la valoración o la prueba requieren una columna multisegmentada, con una fase estacionaria diferente especificada para cada segmento, apisonar después de la adición de cada segmento y agregar cada segmento directamente sobre el anterior. Apisonar un trozo de lana de vidrio fina por encima del relleno de la columna. [NOTA-La fase móvil debe fluir a través de una columna rellena adecuadamente como una corriente moderada o, si se lleva a cabo una cromatografía en fase reversa, como un goteo lento.] Si se incorpora la solución del analito en la fase estacionaria, completar la transferencia cuantitativa al tubo cromatográfico raspando el vaso de precipitados usado para la preparación de la mezcla de prueba con una mezcla de aproximadamente 1 g de Soporte Sólido y varias gotas del disolvente usado para preparar la solución muestra antes de agregar el trozo final de lana de vidrio por encima del relleno. PROCEDIMIENTO 1. Transferir la fase móvil al espacio de la columna por encima del relleno y dejar que fluya a través de la columna por acción de la gravedad. 2. Enjuagar la punta de la columna cromatográfica con aproximadamente 1 mL de fase móvil antes de cada cambio en la composición de la fase móvil y después de completar la elución. 3. Si se introduce el analito en la columna como una solución en la fase móvil, dejar que pase completamente al relleno de la columna, luego agregar fase móvil en varias porciones pequeñas, dejando que cada porción drene completamente, antes de agregar el grueso de la fase móvil. 4. Cuando el procedimiento indique el uso de múltiples columnas cromatográficas montadas en serie y se especifique la adición de fase móvil en porciones divididas, dejar que cada porción drene por completo a través de cada columna, y enjuagar la punta de la columna con fase móvil antes de la adición de cada porción sucesiva.
Cromatografía de Gases (GC) FASE ESTACIONARIA LÍQUIDA Este tipo de fase está disponible en columnas rellenas o capilares. CROMATOGRAFÍA DE GASES EN COLUMNA RELLENA La fase estacionaria líquida se deposita sobre un soporte sólido inerte finamente dividido, como por ejemplo tierra de diatomeas, polímeros porosos, o carbono grafito, con el que se rellena la columna que por lo regular tiene un diámetro interno de 2-4 mm y una longitud de 1-3 m. CROMATOGRAFÍA DE GASES EN COLUMNA CAPILAR En las columnas capilares, las cuales no están rellenas con soporte sólido, la fase estacionaria líquida se deposita sobre la superficie interna de la columna y puede unirse químicamente a ella.
Pruebas Físicas/ (621) Cromatografía 495
USP 39
FASE ESTACIONARIA SÓLIDA Este tipo de fase está disponible únicamente en columnas rellenas. En estas columnas, la fase sólida es un adsorbente activo, como por ejemplo alúmina, sílice o carbono, con el que se rellena una columna. Las resinas poliaromáticas porosas, que a veces se emplean en las columnas rellenas, no se recubren con una fase líquida. [NOTA-Las columnas capilares y rellenas deben acondicionarse antes del uso, hasta que la línea base y otras características sean estables. Los distribuidores de columnas y materiales de relleno proveen instrucciones relativas al acondicionamiento recomendado.] APARATO Un cromatógrafo de gases consta de una fuente de gas transportador, un inyector, una columna, un detector y un dispositivo registrador. El inyector, la columna y el detector tienen temperaturas controladas y se puede variar como parte del análisis. Los gases transportadores típicos son helio, nitrógeno o hidrógeno, dependiendo de la columna y el detector en uso. El tipo de detector que se usa depende de la naturaleza de los compuestos que se analizan y se especifica en la monografía individual. La señal de salida de los detectores se registra como la respuesta del instrumento en función del tiempo y la medida del área o altura del pico, es una función de la cantidad presente. PROGRAMA DE TEMPERATURA La longitud y la calidad de una separación por GC se pueden controlar alterando la temperatura de la columna cromatográfica. Cuando sea necesario un programa de temperatura, la monografía individual indica las condiciones en formato de tabla. La tabla indica la temperatura inicial, la velocidad de cambio de temperatura (rampa), la temperatura final y el tiempo de espera (hold time) a la temperatura final. PROCEDIMIENTO 1. Equilibrar la columna, el inyector y el detector con un flujo de gas transportador hasta obtener una señal constante. 2. Inyectar una muestra a través del septo del inyector, o usar un muestreador automático. 3. Comenzar el programa de temperatura. 4. Registrar el cromatograma. 5. Analizar según se indica en la monografía.
Cromatografía de Líquidos (HPLC) El término cromatografía de líquidos, según se usa en los compendios, es sinónimo de cromatografía líquida de alta presión y de cromatografía líquida de alta resolución. La cromatografía de líquidos es una técnica de separación basada en una fase estacionaria sólida y una fase móvil líquida. FASE ESTACIONARIA Las separaciones se logran por procesos de partición, adsorción o intercambio iónico, según el tipo de fase estacionaria empleada. Las fases estacionarias más comúnmente usadas son la sílice modificada o las microperlas de polímero. Las microperlas se modifican agregando hidrocarburos de cadena larga. El tipo de relleno específico necesario para completar un análisis se indica mediante la designación "L" en la monografía individual (ver también la sección Columnas Cromatográficas más adelante). A menudo, el tamaño de las microperlas también se describe en la monografía. Los cambios en el tipo y tamaño de relleno se analizan en la sección Aptitud del Sistema de este capítulo. COLUMNA CROMATOGRÁFICA El término columna incluye columnas de acero inoxidable, de acero inoxidable con recubrimiento interno y poliméricas, rellenas con una fase estacionaria. La longitud y el diámetro interno de la columna afectan la separación y, por lo tanto, las dimensiones típicas de la columna se incluyen en la monografía individual. Los cambios en las dimensiones de la columna se analizan en la sección Aptitud del Sistema de este capítulo. Las monografías farmacopeicas no incluyen el nombre comercial de las columnas apropiadas; esta omisión evita la interpretación de cualquier tipo de respaldo para un producto de un proveedor y permite la adaptación a cambios normales en el mercado. Ver la sección Columnas Cromatográficas para más información. En los procedimientos de HPLC, se puede usar una guarda columna siempre que se cumplan los siguientes requisitos, a menos que se indique algo diferente en la monografía individual: (a) la longitud de la guarda columna debe ser no mayor de 15% de la longitud de la columna analítica, (b) el diámetro interno debe ser igual o menor que el de la columna analítica y (c) el material de relleno debe ser el mismo que en la columna analítica (p.ej., sílice) y contener la misma fase ligada (p.ej., Cl 8).
496 (621) Cromatografía / Pruebas Físicas
USP 39
En todo caso, se deben cumplir todos los requisitos de aptitud del sistema especificados en el procedimiento oficial con la guarda columna instalada. FASE MÓVIL La fase móvil es un disolvente o mezcla de disolventes, según se define en la monografía individual. APARATO Un cromatógrafo de líquidos consta de un recipiente que contiene la fase móvil, una bomba para forzar el paso de la fase móvil a través del sistema a alta presión, un inyector para introducir la muestra en la fase móvil, una columna cromatográfica, un detector y un dispositivo de recolección de datos. ELUCIÓN EN GRADIENTE Se denomina elución en gradiente o programación del disolvente a la técnica de cambiar continuamente la composición del disolvente durante la cromatografía. El perfil de elución en gradiente se presenta en la monografía individual como una tabla de gradientes, que indica el tiempo y la composición proporcional de la fase móvil en el tiempo indicado. PROCEDI M1ENTO 1. Equilibrar la columna y el detector con fase móvil a la velocidad de flujo especificada hasta obtener una señal constante. 2. Inyectar una muestra a través del inyector o usar un muestreador automático. 3. Comenzar el programa de gradientes. 4. Registrar el cromatograma. 5. Analizar según se indica en la monografía.
COLUMNAS CROMATOGRÁFICAS Una lista completa de rellenos (L), fases (G) y soportes (S) usados en las pruebas y valoraciones de USP-NF se encuentra en la sección Reactivos, Indicadores y Soluciones-Columnas Cromatográficas de USP-NF y PF. Esta lista pretende ser una referencia útil para el técnico en cromatografía en la identificación de la columna cromatográfica correspondiente especificada en la monografía individual.
DEFINICIONES E INTERPRETACIÓN DE CROMATOGRAMAS Cromatograma: Un cromatograma es una representación gráfica de la respuesta del detector, concentración de analito en el efluente u otra cantidad usada como una medida de concentración del efluente en función del volumen de efluente o del tiempo. En la cromatografía planar se puede usar el término, cromatograma para referirse al papel o capa con las zonas separadas. La Figura 7 representa una separación cromatográfica típica de dos sustancias, 1 y 2. tR 7 y tR 2 son los tiempos de retención respectivos; h es la altura, h/ 2 es la mitad de la altura y Wh 12 es el ancho a la mitad de la altura, para el pico 1. W1 y W2 son los anchos de los picos 1 y 2, respectivamente, en la línea base. Los picos de aire son una característica de los cromatogramas de gases y corresponden al frente de la fase móvil en la cromatografía de líquidos. El tiempo de retención de estos picos de aire o componentes no retenidos se denomina tM. ll:'.
Pico del disolvente
~
ü w f-
w
o
--'
Cola del disolvente
w
o ~ (/) w
::J
Q_ (/)
w
ll:'.
TIEMPO - - - - -
Figura 1.
Separación cromatográfica de las dos sustancias.
Pruebas Físicas/ (621) Cromatografía 497
USP 39
Volumen de Residencia (D): El volumen de residencia (también conocido como volumen de demora en elución a gradiente) es el volumen entre el punto en el que se encuentran los eluyentes y la entrada de la columna. Tiempo Muerto (tM): El tiempo muerto es el tiempo requerido para la elución de un componente no retenido (ver la Figura 1, mostrado como un pico de aire o de componente no retenido, con la escala de la línea base en minutos). Volumen Muerto (VM): El volumen muerto es el volumen de fase móvil requerido para eluir un componente no retenido. Se puede calcular a partir del tiempo muerto y la velocidad de flujo F, en mL/min: VM = tM
X
F
En la cromatografía de exclusión por tamaño, se usa el símbolo V0 • Número de Platos Teóricos (N) 1: N es una medida de eficiencia de la columna. Para los picos gaussianos, se calcula por la ecuación:
en donde tR es el tiempo de retención de la sustancia y W es el ancho del pico en su base, que se obtiene extrapolando los lados relativamente rectos del pico hasta la línea base. El valor de N depende de la sustancia cromatografiada así como de las condiciones operativas, tales como la velocidad de flujo y la temperatura de la fase móvil o gas transportador, la calidad del relleno, la uniformidad del relleno dentro de la columna, y, para columnas capilares, el espesor de la película de fase estacionaria, el diámetro interno y la longitud de la columna. Cuando se usan integradores electrónicos, puede ser conveniente determinar el número de platos teóricos por la ecuación:
donde Wh12 es el ancho del pico a la mitad de la altura. Sin embargo, en caso de discrepancias, sólo se deben usar las ecuaciones basadas en el ancho del pico en la línea base. Pico: El pico es la porción del cromatograma que registra la respuesta del detector cuando un componente individual eluye de la columna. Si la separación es incompleta, se puede registrar la elución de dos o más componentes como un pico no resuelto. Relación Pico/Valle (p/v): La p/v se pueden emplear como un criterio de aptitud del sistema en una prueba de sustancias relacionadas cuando no se logra la separación entre dos picos en la línea base. La Figura 2 representa una separación incompleta de dos sustancias, donde HP es la altura del pico menor por encima de la línea base extrapolada y Hv es la altura en el punto más bajo de la curva que separa los picos menor y mayor por encima de la línea base extrapolada:
p/v= H/Hv
Figura 2.
Determinación de la relación pico/valle.
Retardo Relativo (R,.t): El retardo relativo es el cociente entre la distancia recorrida por el analito y la distancia recorrida simultáneamente por un compuesto de referencia (ver la Figura 3) y se usa en una cromatografía planar.
Los parámetros k, N, r y rG se desarrollaron para separaciones por GC isotérmicas y separaciones por HPLC isocráticas. Debido a que estos términos son parámetros termodinámicos, son válidos únicamente para separaciones realizadas a temperatura, composición de la fase móvil y velocidad de flujo constantes. No obstante, para separaciones realizadas con un programa de temperatura o gradiente de disolventes, estos parámetros se pueden usar simplemente como medio de comparación para asegurar que existen las condiciones cromatográficas adecuadas para llevar a cabo los métodos según se indican en las monografías. 1
498 (621) Cromatografía/ Pruebas Físicas
USP 39
Rret = b/c
•-¡~-----• Frente de Fase Móvil
•
Muestra Referencia
Figura 3. Cromatografía planar típica. Retención Relativa (r) 1 : Es el cociente entre el tiempo de retención ajustado de un componente y el de otro usado como referencia obtenido en condiciones idénticas:
r=
tR2 - tM/tR1 - tM
donde tR2 es el tiempo de retención medido desde el punto de inyección del compuesto de interés; tR 1 es el tiempo de retención medido a partir del punto de inyección del compuesto usado como referencia; y tM es el tiempo de retención de un marcador no retenido definido en el procedimiento, todos determinados en condiciones experimentales idénticas en la misma columna. Tiempo de Retención Relativo (RR1): También conocido como tiempo relativo no ajustado. Las comparaciones en la USP normalmente se realizan en términos de retención relativa no ajustada, a menos que se indique de otro modo.
RRT = tR)tR1 El símbolo re también se usa para designar los valores de retención relativa no ajustados. Desviación Estándar Relativa Porcentual
I( x¡-xf ] = 1~0 [~i~1
112
%RSD
-
X
N-1
Factor de Retardo (RF): El factor de retardo es el cociente entre la distancia recorrida por el centro de la mancha y la distancia recorrida simultáneamente por la fase móvil y se usa en cromatografía planar. Usando los símbolos de la Figura 3:
RF = Factor de Retención (k) 1 :
b/a
El factor de retención también se conoce como el factor de capacidad (k'). Se define como: k
cantidad de sustancia en la fase estacionaria cantidad de sustancia en la fase móvil
o k = tiempo de la sustancia en la fase estacionaria
tiempo de la sustancia en la fase móvil
El factor de retención de un componente se puede determinar a partir del cromatograma:
k = (tR - tM)/tM Tiempo de Retención (tR): En cromatografía líquida y cromatografía de gases, el tiempo de retención, tR, se define como el tiempo transcurrido entre la inyección de la muestra y la aparición de la respuesta máxima. Se puede usar tR como un parámetro para identificación. Los tiempos de retención cromatográficos son característicos de los compuestos que representan, pero no son únicos. La coincidencia de los tiempos de retención de una muestra y de una sustancia de referencia puede usarse como un criterio parcial en la construcción de un perfil de identidad, pero es insuficiente por sí misma para establecer la identidad. Los tiempos de retención absolutos de un compuesto dado varían de un cromatograma al siguiente. Volumen de Retención (VR): El volumen de retención es el volumen de fase móvil requerido para la elución de un componente. Se puede calcular a partir del tiempo de retención y de la velocidad de flujo en mL/min:
Pruebas Físicas/ (621) Cromatografía 499
USP 39
VR = tR X F Resolución (R5):
La resolución es la separación de dos componentes en una mezcla, calculada por:
R5 = 2 x (tR 2 - tR 1)/(W1 + W2) donde tR2 y tR 1 son los tiempos de retención de los dos componentes; y W2 y W 7 son los anchos correspondientes en las bases de los picos obtenidos extrapolando los lados relativamente rectos de los picos hasta la línea base. Cuando se usan integradores electrónicos, puede ser conveniente determinar la resolución, mediante la ecuación: Rs = 1, 18 x (tR2 - tR¡)/(W1,h12 + W2,h;2) Factor de Separación (a): El factor de separación es la retención relativa calculada para dos picos adyacentes (por convención, el valor del factor de separación siempre es >1 ): a= kifk 1
Factor de Simetría (A 5) 2 :
El factor de simetría (también conocido como factor de asimetría) de un pico (ver la Figura 4) se
calcula por: As= Wo,os/2f donde W0 ,05 es el ancho del pico al 5% de la altura y fes la distancia del máximo del pico hasta el borde inicial del pico, midiendo la distancia en un punto ubicado al 5% de la altura desde de la línea base.
T h
0,05h
Figura 4. Factor de Asimetría (7):
Pico cromatográfico asimétrico.
Ver Factor de Simetría.
APTITUD DEL SISTEMA Las pruebas de aptitud del sistema son una parte integral de los métodos de cromatografía de líquidos y de gases. Estas pruebas se usan para verificar que el sistema cromatográfico sea adecuado para el análisis que se pretende efectuar. Las pruebas se basan en el concepto de que el equipo, los sistemas electrónicos, las operaciones analíticas y las muestras analizadas constituyen un sistema integral que se puede evaluar como tal. Los factores que pueden afectar el comportamiento cromatográfico incluyen lo siguiente: • Composición, fuerza iónica, temperatura y pH aparente de la fase móvil •Velocidad de flujo, dimensiones de la columna, temperatura de la columna y presión • Las características de la fase estacionaria, incluyendo el tipo de soporte cromatográfico (basado en partículas o monolítico), tamaño de partícula, tamaño de poro y área superficial específica • En fase reversa y otras modificaciones superficiales de las fases estacionarias, el grado de modificación química (según se expresa mediante recubrimiento exhaustivo (end-capping), carga de carbono, etc.) La resolución, R5, es una función del número de platos teóricos, N (también referido como eficiencia), el factor de separación, a, y el factor de capacidad, k. [NOTA-Todos los términos y símbolos se definen en la sección anterior Definiciones e Interpretación de Cromatogramas.] Para una fase móvil y una fase estacionaria determinadas, se puede especificar N para asegurar que los compuestos que eluyen muy cerca entre sí se resuelvan unos de otros, para establecer el poder de resolución general del sistema y para asegurar que el estándar interno se resuelva del fármaco. Este es un medio menos confiable para asegurar la resolución que la medición directa de la misma. La eficiencia de la columna es, en parte, un reflejo de la agudeza del pico, que es también importante para la detección de trazas de componentes. Las inyecciones repetidas de una preparación estándar u otras soluciones estándar se comparan entre sí para determinar si se cumplen los requisitos de precisión. A menos que se especifique de otro modo en la monografía individual, se usan los datos 2
Una práctica común consiste en medir el Factor de Asimetría como el cociente entre la distancia entre la línea vertical que conecta el ápice del pico con la línea base interpolada y el frente del pico, y la distancia entre dicha línea y el pico medido a la inversa al 10% de la altura del pico (ver la Figura 4) sería (W0 10 - f010 )/ f0 ,10 . No obstante, para los propósitos de la USP, únicamente es válida la fórmula (A 5) según se presenta en este capítulo. ' '
500 (621) Cromatografía / Pruebas Físicas
USP 39
de cinco inyecciones repetidas del analito para calcular la desviación estándar relativa, %RSD, si el requisito es 2,0% o menos; se usan los datos de seis inyecciones repetidas si el requisito de desviación estándar relativa es más de 2,0%. Para la Valoración en una monografía de un fármaco, donde el valor es 100% para la sustancia pura, y no se especifica una desviación estándar relativa máxima, se calcula la %RSD máxima permitida para una serie de inyecciones de la solución de referencia como:
%RSD = KB'ÍÍilt90%,n-i donde K es una constante (0,349), obtenida a partir de la expresión K = (0,61-12.) x (t90 % 15 l'Í6), en la que 0,61-12. representa la desviación estándar relativa porcentual requerida después de seis inyecciones para B = 1,0; Bes el límite superior provisto en la definición de la monografía individual menos 100%; n es el número de inyecciones repetidas de la solución de referencia (3 sn s 6); y t90 %,n-i es el valor t de Student al 90% del nivel de probabilidad (dos colas) con n - 7 grados de libertad. A menos que se indique de otro modo, la desviación estándar relativa máxima permitida no excede del valor apropiado provisto en la tabla de requisitos de repetibilidad. Este requisito no se aplica a las pruebas para sustancias relacionadas. Requisitos para Desviación Estándar Relativa Número de Inyecciones Individuales
3
4
B (%)
5
6
RSD Máxima Permitida
2,0
0,41
0,59
0,73
0,85
2,5
0,52
0,74
0,92
1,06
3,0
0,62
0,89
1,10
1,27
El factor de simetría, A5, una medición de la simetría del pico, la unidad es el valor que adquiere para picos perfectamente simétricos; y su valor se incrementa conforme la asimetría se vuelve más pronunciada (ver la Figura 4). En algunos casos, pueden observarse valores menores a la unidad. A medida que la simetría del pico se aleja de valores de 1, la integración y por lo tanto la precisión se tornan menos confiables. La relación señal-ruido (SIN) es un parámetro útil de aptitud del sistema. La SIN se calcula según se indica a continuación:
SIN= 2Hlh donde Hes la altura del pico medido a partir del ápice del pico hasta la línea base extrapolada sobre una distancia ?:5 veces el ancho del pico a su altura media; y hes la diferencia entre el valor de ruido más grande y más pequeño observados sobre una distancia ?:5 veces el ancho del pico a su altura media y, si fuera posible, igualmente distribuida a ambos lados del pico de interés (ver la Figura 5).
Figura 5.
Ruido y pico cromatográfico, componentes de la relación SIN.
Estas pruebas de aptitud del sistema se realizan recolectando datos a partir de inyecciones repetidas del estándar u otras soluciones según se especifica en la monografía individual. La especificación de parámetros definidos en una monografía no excluye el uso de otras condiciones de operación aptas. Puede ser necesario realizar ajustes al sistema cromatográfico especificado para cumplir con los requisitos de aptitud del sistema. Los ajustes realizados a los sistemas cromatográficos para cumplir con los requisitos de aptitud del sistema no deben hacerse para compensar fallas en la columna o malfuncionamiento del sistema. Se permiten ajustes únicamente cuando se encuentran disponibles estándares adecuados (incluyendo Estándares de Referencia) para todos los compuestos usados en la prueba de aptitud; y los ajustes o el cambio de columna generan un cromatograma que cumple con todos los requisitos de aptitud del sistema especificados en el procedimiento oficial. Si es necesario realizar ajustes a las condiciones operativas para cumplir con los requisitos de aptitud del sistema, cada uno de los parámetros en la lista siguiente es la variación máxima que se puede considerar, a menos que se indique algo distinto en la monografía; estos cambios pueden requerir datos de verificación adicionales. Para verificar la aptitud del método en estas nuevas condiciones, evaluar las características de desempeño analítico pertinentes que sean potencialmente afectadas por el cambio. Múltiples ajustes pueden tener un efecto acumulativo en el desempeño del sistema y deben considerarse cuidadosa-
USP 39
Pruebas Físicas/ (621) Cromatografía
501
mente antes de implementarlos. En algunas circunstancias, puede ser deseable usar una columna para HPLC con dimensiones distintas a las prescritas en el procedimiento oficial (longitud, diámetro interno y/o tamaño de partícula diferentes). En todo caso, los cambios en las características químicas (designación "L") de la fase estacionaria deberán considerarse como una modificación del método y requerirán validación completa. No se recomienda realizar ajustes a la composición de la fase móvil en la elución en gradiente puesto que puede ocasionar cambios en la selectividad. Si se requieren ajustes, se permiten cambios en el relleno de la columna (manteniendo las mismas propiedades químicas), en la duración del tiempo de espera isocrático inicial (cuando se indique) y/o ajustes en el volumen de residencia. Las concesiones adicionales para el ajuste de gradientes se tratan a continuación. pH de la Fase Móvil (HPLC): El pH de la solución amortiguadora acuosa usada en la preparación de la fase móvil se puede ajustar dentro de ±0,2 unidades del valor o intervalo especificado. Se aplica a las separaciones en gradiente e isocráticas. Concentración de Sales en la Solución Amortiguadora (HPLC): La concentración de las sales usadas en la preparación de la solución amortiguadora acuosa empleada en la fase móvil se puede ajustar dentro de ±10% siempre que se cumpla con la variación del pH permitida (ver arriba). Se aplica a las separaciones en gradiente e isocráticas. Relación de los Componentes en la Fase Móvil (HPLC): Los siguientes límites de ajuste aplican a componentes minoritarios de la fase móvil (especificados a 50% o menos). La cantidad de estos componentes se puede ajustar en un ±30% relativo. Sin embargo, el cambio en cualquier componente no puede exceder de ±10% absoluto (es decir, en relación a la fase móvil total). Se puede ajustar un componente minoritario en una mezcla ternaria. A continuación se presentan ejemplos de ajustes para mezclas binarias y ternarias. Mezclas Binarias RELACIÓN ESPECIFICADA DE 50:50: 30% de 50 es 15% absoluto, pero esto excede el cambio máximo permitido de ±10% absoluto en cada componente. Por lo tanto, sólo se puede ajustar la relación de la fase móvil dentro del intervalo de 40:60-
60:40. RELACIÓN ESPECIFICADA DE 2:98: 30% de 2 es 0,6% absoluto. Por lo tanto, el ajuste máximo permitido se encuentra dentro del intervalo de 1,4: 98,6-2,6: 97,4. Mezclas Ternarias RELACIÓN ESPECIFICADA DE 60:35:5: Para el segundo componente, 30% de 35 es 10,5% absoluto, que excede el cambio máximo permitido de ±10% absoluto en cualquier componente. Por lo tanto, el segundo componente sólo puede ajustarse dentro del intervalo de 25%--45% absoluto. Para el tercer componente, 30% de 5 es 1,5% absoluto. En todos los casos, usar una cantidad suficiente del primer componente para obtener un total de 100%. Como consecuencia, los intervalos de mezclas de 50:45:5-70:25:5 ó 58,5: 35: 6,5-61,5: 35: 3,5 cumplirán con el requisito. Longitud de Onda del Detector UV-Visible (HPLC): No están permitidas las desviaciones de las longitudes de onda especificadas en el procedimiento. Se usa el procedimiento especificado por el fabricante del detector, u otro procedimiento validado, para verificar que el error en la longitud de onda del detector sea, como máximo, ±3 nm. Fase Estacionaria LONGITUD DE LA COLUMNA (Ge): Se puede ajustar tanto como ±70%. LONGITUD DE LA COLUMNA (HPLC): Ver Tamaño de Partícula (HPLC) más adelante. DIÁMETRO INTERNO DE LA COLUMNA (HPLC): Se puede ajustar siempre que la velocidad lineal se mantenga constante. Ver Velocidad de Flujo (HPLC) más adelante. DIÁMETRO INTERNO DE LA COLUMNA (GC)-Se puede ajustar tanto como ±50%. ESPESOR DE LA PELÍCULA (GC CAPILAR)-Se puede ajustar tanto como -50% a 100%. Tamaño de Partícula (HPLC): Para separaciones isocráticas, se puede modificar el tamaño de partícula y/o la longitud de la columna siempre que la relación entre la longitud de la columna (L) y el tamaño de partícula (dp) permanezca constante o dentro del intervalo entre -25% y +50% de la relación L/dp prescrita. Como alternativa (igual que para la aplicación del ajuste de tamaño de partícula para partículas con superficies porosas), se pueden usar otras combinaciones de L y dp siempre que el número de platos teóricos (N) esté dentro del intervalo -25% a +50%, con respecto a la columna prescrita. Se debe tener cuidado cuando el ajuste resulte en un número mayor de platos teóricos pues esto genera volúmenes de pico menores y puede requerir ajustes para minimizar el ensanchamiento de la banda extra columna originado por factores tales como la tubuladura del instrumento, el volumen de celda del detector y la velocidad de muestreo, y el volumen de inyección. Cuando no se mencione el tamaño de partícula en la monografía, la relación se debe calcular usando el tamaño de partícula más grande designado en la definición USP de la columna. Para separaciones en gradiente, no se permiten cambios en la longitud de la columna, en el diámetro interno de la columna ni en el tamaño de partícula. Tamaño de la Partícula (GC): Es aceptable cambiar la malla de un soporte para GC de un tamaño de partícula mayor a uno menor o de uno menor a uno mayor siempre que la cromatografía cumpla con los requisitos de aptitud del sistema y se mantenga la misma relación del intervalo de tamaño de partícula. La relación del intervalo del tamaño de partícula se define como el diámetro de la partícula más grande dividida por el diámetro de la partícula más pequeña. Velocidad de Flujo (GC): La velocidad de flujo se puede ajustar tanto como ±50%. Velocidad de Flujo (HPLC): Cuando se modifica el tamaño de partícula, puede ser necesario ajustar la velocidad de flujo debido a que las columnas con un tamaño de partícula menor requerirán de velocidades lineales más altas para el mismo desempeño (medido por una reducción de la altura del plato). Los cambios en la velocidad de flujo para un cambio en el diámetro de la columna y en el tamaño de partícula se pueden realizar mediante:
USP 39
502 (621) Cromatografía / Pruebas Físicas
F2
= F1 x [(de/ x
dp 1)/(de 12 x dp2 )]
donde F1 y F2 son las velocidades de flujo para las condiciones originales y modificadas, respectivamente; de, y de2 son los diámetros de columna respectivos; y dp 1 y dp2 son los tamaños de partícula. Cuando se realiza un cambio de partículas de :?:3 µm a <3 µm en separaciones isocráticas, se puede justificar un aumento adicional en la velocidad lineal (ajustando la velocidad de flujo), siempre que la eficiencia de la columna no caiga en más del 20%. De manera similar, un cambio de partículas de <3 µm a :?:3 µm puede requerir la reducción adicional de la velocidad lineal (velocidad de flujo) para evitar una reducción en la eficiencia de la columna de más del 20%. No se permiten cambios en F, de y dp para separaciones en gradiente. Además, la velocidad de flujo se puede ajustar en ±50% (sólo en separación isocrática). EJEMPLOS: Los ajustes en la longitud de la columna, el diámetro interno, el tamaño de partícula y la velocidad de flujo se pueden usar de manera combinada para proveer condiciones equivalentes (mismo N), pero con diferencias en la presión y el tiempo de corrida. La tabla siguiente lista algunas de las configuraciones de columna más populares para proveer una eficiencia equivalente (N) mediante el ajuste de estas variables. Valores Relativos
Longitud (l, mm)
Diámetro de la Columna (de, mm)
Tamaño de Partícula (dp, µm)
l/dp
F
N
250
4,6
10
25000
0,5
0,8
0,2
3,3
150
4,6
5
30000
1,0
1,0
1,0
1,0
150
2,1
5
30000
0,2
1,0
1,0
1,0 0,5
Presión
Tiempo de Corrida
100
4,6
3,5
28600
1,4
1,0
1,9
100
2,1
3,5
28600
0,3
1,0
1,9
0,5
75
4,6
2,5
30000
2,0
1,0
4,0
0,3
75
2,1
2,5
30000
0,4
1,0
4,0
0,3
50
4,6
1,7
29400
2,9
1,0
8,5
0,1
50
2,1
1,7
29400
0,6
1,0
8,5
0,1
Por ejemplo, si una monografía especifica una columna de 150 mm x 4,6 mm, de 5 µm, operada a 1,5 mL/minuto, se puede esperar la misma separación con una columna de 75 mm x 2, 1 mm, de 2,5 µm operada a 1,5 mL/minuto x 0,4 = 0,6 mL/ minuto, junto con un aumento en la presión de aproximadamente cuatro veces y una reducción en el tiempo de corrida hasta aproximadamente 30% del original. Volumen de Inyección (HPLC): El volumen de inyección se puede ajustar siempre que sea congruente con la precisión, la linealidad y los límites de detección aceptados. Se debe tomar en cuenta que un volumen excesivo de inyección puede llevar a un ensanchamiento inaceptable de la banda, ocasionando una reducción en N y en la resolución. Aplica a las separaciones en gradiente e isocráticas. Volumen de Inyección y Volumen de División (Split Volume) (GC): El volumen de inyección y el volumen de división se pueden ajustar si la detección y la repetibilidad son satisfactorias. Temperatura de la Columna (HPLC): La temperatura de la columna se puede ajustar tanto como ±1 Oº. Se recomienda la termostatización de la columna para mejorar el control y la reproducibilidad del tiempo de retención. Se aplica a las separaciones en gradiente e isocráticas. Temperatura del Horno (GC): La temperatura del horno se puede ajustar tanto como ± 10%. Programa de Temperatura del Horno (GC): Se permiten ajustes de la temperatura según se especificó anteriormente. Cuando la temperatura especificada se debe mantener o cuando la temperatura debe cambiarse de un valor a otro, se permite un ajuste de hasta ±20%. A menos de se indique algo distinto en la monografía, los parámetros de aptitud del sistema se determinan a partir del pico del analito. Los valores medidos de R, o RF o tR para la muestra no se desvían de los valores obtenidos para el compuesto o la mezcla de referencia en más que los estimados de confiabilidad estadísticamente determinados en valoraciones repetidas del compuesto de referencia. Los tiempos de retención relativos, si se proporcionan en las monografías, son con fines informativos únicamente para facilitar la identificación de los picos. No existen criterios de aceptación pertinentes a los tiempos de retención relativos. El sistema operativo final debe someterse a una prueba de aptitud para determinar su eficiencia. Realizar inyecciones de las preparaciones apropiadas según se requiera para demostrar una adecuada Aptitud del sistema en toda la corrida (según se describe en la sección Sistema cromatográfieo del procedimiento en una monografía). La preparación puede ser una preparación estándar o una solución que contenga una cantidad conocida de analito y cualquier material adicional (por ejemplo, excipientes o impurezas) útiles para el control del sistema analítico. Siempre que haya un cambio significativo en el sistema cromatográfico (equipo, componentes de la fase móvil, u otros componentes) o en un reactivo crítico, debería restablecerse la Aptitud del sistema. Ningún análisis de muestras es aceptable a menos que se haya demostrado la aptitud del sistema.
USP 39
Pruebas Físicas/ (631) Color y Acromatismo 503 CUANTIFICACIÓN
Durante la cuantificación, no tomar en cuenta los picos producidos por disolventes y reactivos o generados por la fase móvil o la matriz de la muestra. En el intervalo lineal, el área del pico y la altura del pico son generalmente proporcionales a la cantidad de compuesto eluido. Las áreas y las alturas de los picos se miden comúnmente mediante integradores electrónicos, pero se pueden determinar de modos más clásicos. En general, se emplean las áreas de los picos pero pueden ser menos exactas si se producen interferencias. Los componentes medidos se separan de cualquier componente interferente. Se deben minimizar las asimetrías tanto en la parte anterior como en la posterior del pico y se debe evitar la medición de picos dentro de las colas de otros picos. Aunque se prefiere la comparación de los picos de impurezas con los del cromatograma de un estándar de la impureza a una concentración similar, las pruebas de impurezas pueden basarse en la medición de las respuestas de los pico debidos a impurezas y expresarse como un porcentaje del área del pico del fármaco. El estándar puede ser el mismo fármaco a un nivel correspondiente de impurezas, por ejemplo, a 0,5%, asumiendo respuestas idénticas de los picos. Cuando las impurezas deben determinarse con una mayor certeza, usar un estándar de la misma impureza o aplicar un factor de corrección basado en la respuesta de la impureza relativa a la del componente principal. MÉTODO DE ESTÁNDAR EXTERNO La concentración del componente cuantificado se determina comparando las respuestas obtenidas a partir de la solución muestra con las respuestas obtenidas a partir de una solución estándar. MÉTODO DEL ESTÁNDAR INTERNO Se introducen cantidades iguales del estándar interno en la solución muestra y en una solución estándar. El estándar interno se selecciona de modo que no reaccione con el material de prueba, se resuelva de los componentes cuantificados (analitos), y no contenga impurezas con el mismo tiempo de retención que los analitos. Las concentraciones de los analitos se determinan comparando los cocientes entre las áreas de sus picos o las alturas de sus picos y el estándar interno en la solución muestra, con los cocientes entre las áreas o alturas de sus picos y el estándar interno en la solución estándar. PROCEDIMIENTO DE NORMALIZACIÓN El contenido porcentual de un componente del material de prueba se calcula determinando el área del pico correspondiente como un porcentaje del área total de todos los picos, excluyendo aquellos debidos a disolventes o reactivos o que surgen de la fase móvil o de la matriz de la muestra y aquellos por debajo del límite en el que pueden descartarse. PROCEDIMIENTO DE CALIBRACIÓN Se determina la relación entre la señal medida o evaluada y y la cantidad de la sustancia x (por ejemplo, concentración, masa) y se calcula la función de calibración. Los resultados analíticos se calculan a partir de la señal del analito medida o evaluada y su posición en la curva de calibración. En las pruebas para impurezas tanto para el Método del Estándar Externo, cuando se usa una dilución de la solución muestra para comparación, como para el Procedimiento de Normalización, se aplica cualquier factor de corrección indicado en la monografía (por ejemplo, cuando el factor de respuesta relativa está fuera del intervalo de 0,8-1,2). Cuando la prueba de impurezas indica el total de impurezas o cuando existe una determinación cuantitativa de una impureza, es importante seleccionar un ajuste de umbral apropiado y condiciones apropiadas para la integración de las áreas de los picos. En tales pruebas, el límite en el cual, o por debajo del cual se descarta un pico, es generalmente 0,05%. De esta forma, el ajuste de umbral del sistema de recolección de datos corresponde al menos a la mitad de este límite. Integrar el área del pico de cualquier impureza que no se separe por completo del pico principal, preferiblemente mediante extrapolación valle a valle de la línea base (extrapolación tangencial).
(631) COLOR Y ACROMATISMO Definición-A los efectos de este capítulo, el color se puede definir como la percepción o la respuesta subjetiva de un observador al estímulo objetivo de energía radiante en el espectro visible que se extiende en el intervalo de longitudes de onda de 400 nm a 700 nm. El color percibido es una función de tres variables: las propiedades espectrales del objeto, tanto absorbentes como reflectantes; las propiedades espectrales de la fuente de iluminación; y las características visuales del observador.
504 (631) Color y Acromatismo/ Pruebas Físicas
USP 39
Se dice que dos objetos poseen colores iguales para una fuente específica de iluminación cuando un observador no puede detectar una diferencia de color. Cuando un par de objetos presenta colores iguales, con una fuente de iluminación y no con otra, constituyen un par metamérico. El color de dos objetos es igual para todas las fuentes de iluminación si los espectros de absorción y de reflectancia de los dos objetos son idénticos. El acromatismo o falta de color es un extremo de cualquier escala de color para la transmisión de luz. Esto implica la ausencia completa de color y, en consecuencia, el espectro visible del objeto carece de absorbancias. A efectos prácticos, el observador en este caso percibe poca o ninguna absorción en el espectro visible. Atributos del Color-Como la sensación de color tiene un componente subjetivo y otro objetivo, el color no puede describirse exclusivamente en términos espectrofotométricos. Por lo tanto, los atributos comunes del color no pueden corresponder uno a uno con la terminología espectral. Por lo general se utilizan tres atributos para identificar un color. (1) el matiz, o la cualidad según la cual una familia de colores se distingue de otra, como por ejemplo rojo, amarillo, azul, verde y términos intermedios; (2) el valor, o la cualidad que distingue un color claro de uno oscuro; y (3) la cromaticidad, o la cualidad que distingue un color fuerte de uno débil, o el grado en el cual un color difiere de un gris del mismo valor. Los tres atributos del color se pueden utilizar para definir un espacio de color tridimensional, en el cual se ubica cualquier color por sus coordenadas. El espacio de color elegido es visualmente uniforme si la distancia geométrica entre dos colores en el espacio de color es directamente una medida de la distancia del color entre ellos. A menudo se eligen coordenadas cilíndricas por conveniencia. Los puntos a lo largo del eje longitudinal representan valores del oscuro al claro o del negro al blanco y poseen un matiz indeterminado y ninguna cromaticidad. Centrándose en una sección transversal perpendicular al eje del valor, el matiz se determina por el ángulo con respecto al eje longitudinal y la cromaticidad se determina por la distancia desde el eje longitudinal. Los matices rojos, amarillos, verdes, azules, morados e intermedios están dados por diferentes ángulos. Los colores a lo largo de un radio de una sección transversal tienen el mismo matiz, que se convierte en un matiz más intenso a medida que se aleja. Por ejemplo, el agua incolora o acromática tiene un matiz intermedio, valor alto y ninguna cromaticidad. Si se agrega un soluto de color, el agua adopta un matiz específico. A medida que se agrega más soluto, el color se torna más oscuro, más intenso, o más profundo; es decir, generalmente la cromaticidad aumenta y el valor disminuye. Sin embargo si el soluto es de color neutro, es decir, gris, el valor disminuye, no se observa un aumento en la cromaticidad y el matiz permanece indeterminado. Las mediciones espectroscópicas de laboratorio pueden convertirse en mediciones de los tres atributos de color. Los resultados espectroscópicos para tres luces o estímulos elegidos se ponderan mediante tres funciones de distribución para producir los valores tricromáticos, X, Y, Z (ver Color-Medición Instrumenta/ (1061 )). Las funciones de distribución se determinaron en experimentos de comparación de color con sujetos humanos. Los valores tricromáticos no son coordenadas en un espacio de color visualmente uniforme; sin embargo, se han propuesto varias transformaciones que son cercanas a la uniformidad, una de las cuales se describe en el capítulo citado (1061) ColorMedición Instrumental. El valor es a menudo una función solamente del valor de Y. La obtención de uniformidad en el subespacio de matiz y cromatismo ha sido menos satisfactoria. En un sentido práctico, esto significa que en una comparación visual de colores, cuando dos objetos difieren significativamente en matiz, resulta difícil decidir cuál tiene mayor cromaticidad. Esto señala la importancia de elegir un estándar de comparación lo más parecido posible al color de la muestra, especialmente para los atributos de matiz y cromaticidad. Determinación de Color y Estándares-La percepción del color y de la igualdad de colores depende de las condiciones de observación e iluminación. Las determinaciones deben hacerse usando iluminación difusa y uniforme bajo condiciones que reduzcan al mínimo las sombras y la reflectancia no espectral. La superficie de los polvos debe alisarse con presión suave para que puedan presentar una superficie plana sin irregularidades. Los líquidos deben compararse en tubos para comparación de color iguales, contra un fondo blanco. Si se descubre que los resultados varían con la iluminación, se considerarán correctos los valores obtenidos con luz de día natural o artificial. En lugar de la determinación visual debe emplearse un método instrumental apropiado. Los colores de los estándares deben ser lo más parecidos posibles a los de las muestras de prueba para cuantificar las diferencias de color. Los estándares para materiales opacos están disponibles como conjuntos de muestras indicadoras de color que se disponen en un espacio visualmente uniforme.* Estándares para comparaciones de color de líquidos, identificados mediante una letra, se pueden preparar según la tabla adjunta. Para preparar el líquido de comparación requerido, pipetear y transferir los volúmenes prescritos de las soluciones de prueba calorimétricas [ver en Soluciones Colorimétricas (SC) en la sección Reactivos, Indicadores, y Soluciones] y agua en uno de los recipientes para comparación y mezclar la solución en el recipiente. Hacer la comparación según se indica en la monografía individual, bajo las condiciones de observación previamente descritas. Los líquidos de comparación u otras combinaciones de las soluciones calorimétricas pueden emplearse en concentraciones muy bajas para medir desviaciones del acromatismo.
* Las colecciones de muestras de color, ordenadas según matiz, valor y cromatismo en un espacio visualmente uniforme y apropiado para su uso en la designación de colores de muestras por comparación visual están disponibles en GretagMacbeth LLC, 617 Little Britain Road, New Windsor, NY 12553-6148.
Pruebas Físicas/ (643) Carbono Orgánico Total 505
USP 39
Líquidos de Comparación Líquido de Comparación
Partes de Cloruro Cobaltoso SC
Partes de Cloruro Férrico SC
Partes de Sulfato Cúprico SC
Partes de Agua
A
0,1
0,4
0,1
4,4
B
0,3
0,9
0,3
3,5
e
0,1
0,6
0,1
4,2
D
0,3
0,6
0,4
3,7
E
0,4
1,2
0,3
3,1
F
0,3
1,2
0,0
3,5
G
0,5
1,2
0,2
3, 1
H
0,2
1,5
0,0
3,3
1
0,4
2,2
0,1
2,3
J
0,4
3,5
0,1
1,0
K
0,5
4,5
0,0
0,0
L
0,8
3,8
0,1
0,3
M
0,1
2,0
0,1
2,8 0,0
N
0,0
4,9
0,1
o
0,1
4,8
0,1
0,0
p
0,2
0,4
0,1
4,3
Q
0,2
0,3
0,1
4,4
R
0,3
0,4
0,2
4,1
s
0,2
0,1
0,0
4,7
T
0,5
0,5
0,4
3,6
(641) TOTALIDAD DE LA DISOLUCIÓN Colocar la cantidad de la sustancia especificada en la monografía individual en una probeta de vidrio de 1O mL, de aproximadamente 13 mm x 125 mm de tamaño, con tapón de vidrio, meticulosamente limpia. Utilizando el disolvente especificado en la monografía o en la etiqueta del producto, llenar la probeta casi hasta el estrechamiento del cuello. Agitar suavemente para disolver: La solución no es menos transparente que un volumen igual del mismo disolvente contenido en un recipiente similar y examinado de modo similar.
(643) CARBONO ORGÁNICO TOTAL El carbono orgánico total (COT) es una medida indirecta de las moléculas orgánicas presentes en las aguas para uso farmacéutico, determinadas como carbono. Las moléculas orgánicas se introducen en el agua junto con el agua original, desde los materiales del sistema de purificación y distribución, desde biopelículas que se desarrollan en el sistema y desde los envases de agua estéril y de agua no estéril. El COT también puede emplearse como un atributo de control del proceso, para monitorear el funcionamiento de las operaciones unitarias que conforman el sistema de purificación y distribución. Una medición de COT no es un reemplazo de la prueba de control microbiológico o de endotoxinas. Aunque puede haber una relación cualitativa entre el COT y la actividad microbiológica, no existe una correlación numérica directa. Existen varios métodos aceptables para analizar el COT. Este capítulo no respalda, limita ni impide el empleo de tecnologías alternativas, sino que ofrece una orientación para calificar estas tecnologías analíticas para su uso, así como también una guía para interpretar los resultados de los instrumentos para emplearlos como una prueba de límite. Los aparatos que se usan comúnmente para determinar el COT en aguas para uso farmacéutico comparten el objetivo de oxidar las moléculas orgánicas del agua para producir dióxido de carbono, seguido de la medición de la cantidad de dióxido de carbono producido. Posteriormente, la cantidad determinada de C0 2 producido se usa para calcular la concentración de carbono orgánico en el agua. Todas las tecnologías deben distinguir entre el carbono inorgánico, que puede estar presente en el agua proveniente de fuentes como C0 2 y bicarbonato disueltos, y el C0 2 generado por la oxidación de moléculas orgánicas en la muestra. La distinción se puede lograr determinando el carbono inorgánico y restándolo del carbono total (que es la suma de carbono orgánico
506 (643) Carbono Orgánico Total / Pruebas Físicas
USP 39
y carbono inorgánico), o eliminando el carbono inorgánico de la muestra antes de oxidarla. Aunque el paso de eliminación también puede eliminar moléculas orgánicas, este carbono orgánico eliminable se encuentra presente en cantidades inapreciables en las aguas para uso farmacéutico.
AGUA A GRANEL Las siguientes secciones se aplican a las pruebas para Agua Purificada, Agua para Inyección, Agua para Hemodiálisis y el condensado de Vapor Puro a granel. Requisitos del Aparato: Este método de prueba se lleva a cabo como una prueba en línea (on-line test) o como una prueba de laboratorio fuera de la línea de producción (off-line test), empleando un instrumento calibrado. La aptitud del aparato debe demostrarse periódicamente, según se describe a continuación. Además, debe tener especificado un límite de detección, establecido por el fabricante, de 0,05 mg/L (0,05 ppm) de carbono o menor. Cuando se analiza agua para propósitos de control de calidad, se debe asegurar que el instrumento y sus datos estén bajo un control apropiado y que los métodos y lugares de muestreo tanto de las mediciones en línea como de las mediciones fuera de línea sean representativos de la calidad del agua usada. Se debe tomar en cuenta el carácter de la producción, distribución y uso del agua al momento de seleccionar una medición en línea o fuera de línea. Estándares de Referencia USP (11 ): ER 1,4-Benzoquinona USP. ER Sacarosa USP. Agua Reactivo: Emplear agua con un nivel de COT de no más de O, 1O mg/L. [NOTA-Puede ser necesario establecer un requisito de conductividad para asegurar la confiabilidad del método.] Preparación de Envases: La contaminación orgánica de los envases da lugar a valores de COT más altos. Por lo tanto, se deben usar materiales de laboratorio y envases que hayan sido meticulosamente limpiados para eliminar los residuos orgánicos. Se puede emplear cualquier método eficaz para eliminar la materia orgánica (ver Limpieza de Material de Vidrio (1051 )). Utilizar Agua Reactivo para el enjuague final. Solución Estándar: A menos que se indique algo diferente en la monografía individual, disolver en el Agua Reactivo una cantidad, pesada con exactitud, de ER Sacarosa USP, para obtener una solución con una concentración de 1, 19 mg/L de sacarosa (0,50 mg/L de carbono). Solución de Aptitud del Sistema: Disolver en Agua Reactivo una cantidad pesada con exactitud de ER 1,4-Benzoquinona USP para obtener una solución con una concentración de 0,75 mg/L (0,50 mg/L de carbono). Control de Agua Reactivo: Usar una cantidad adecuada de Agua Reactivo obtenida al mismo tiempo que la utilizada en la preparación de la Solución Estándar y de la Solución de Aptitud del Sistema. Muestra de Agua: Obtener una muestra en línea o fuera de línea que refleje de manera apta la calidad del agua usada. Otras Soluciones de Control: Preparar soluciones apropiadas de blanco de reactivos u otras soluciones especificadas necesarias para establecer la línea de base del aparato o para realizar ajustes en la calibración siguiendo las instrucciones del fabricante, y correr los blancos apropiados para ajustar a cero el instrumento, si fuera necesario. Aptitud del Sistema: Analizar el Control de Agua Reactivo en el aparato y registrar la respuesta, rw. Repetir la prueba utilizando la Solución Estándar y registrar la respuesta, r5• Calcular la respuesta corregida de la Solución Estándar, que es también la respuesta límite, restando la respuesta del Control de Agua Reactivo de la respuesta de la Solución Estándar. El límite teórico de 0,50 mg/L de carbono es igual a la respuesta corregida de la Solución Estándar, r5 - rw. Analizar la Solución de Aptitud del Sistema en el aparato y registrar la respuesta, r55 • Calcular la respuesta corregida de la Solución de Aptitud del Sistema, restando la respuesta del Control de Agua Reactivo de la respuesta de la Solución de Aptitud del Sistema, r55 - rw. Calcular la eficiencia de la respuesta porcentual de la Solución de Aptitud del Sistema: eficiencia de la respuesta%= 1OO[(r55 - rw)f(r5 - rw)] en donde r55 es la respuesta del instrumento para la Solución de Aptitud del Sistema; rw es la respuesta del instrumento para el Control de Agua Reactivo y r5 es la respuesta del instrumento para la Solución Estándar. El sistema es apto si la eficiencia de la respuesta porcentual no es menos de 85% ni más de 115%. Procedimiento: Realizar la prueba usando la Muestra de Agua y registrar la respuesta, ru. La Muestra de Agua cumple con los requisitos si runo es mayor que la respuesta límite, r5 - rw. Este método se puede realizar usando instrumental en línea o fuera de línea que cumpla con los Requisitos del Aparato.
AGUA ESTÉRIL Las siguientes secciones se aplican a las pruebas para Agua Estéril para Inyección, Agua Estéril Purificada, Agua Estéril para Irrigación y Agua Estéril para Inhalación. Seguir los requisitos en Agua a Granel, con las siguientes excepciones. Requisitos del Aparato: Además de cumplir con los Requisitos del Aparato en Agua a Granel, el aparato debe tener un límite de detección especificado por el fabricante de O, 1 O mg/L (O, 1O ppm) de carbono o menor. Control de Agua Reactivo: Emplear agua con un nivel de COT de no más de 0,50 mg/L. [NOTA-Puede ser necesario establecer un requisito de conductividad para asegurar la confiabilidad del método.]
USP 39
Pruebas Físicas/ (645) Conductividad del Agua 507
Solución Estándar: A menos que se indique algo diferente en la monografía individual, disolver en el Agua Reactivo una cantidad, pesada con exactitud, de ER Sacarosa USP, para obtener una solución con una concentración de 19,0 mg/L de sacarosa (8,0 mg/L de carbono). Solución de Aptitud del Sistema: Disolver en Agua Reactivo una cantidad, pesada con exactitud, de ER 1,4-Benzoquinona USP para obtener una solución con una concentración de 12,0 mg/L (8,0 mg/L de carbono). Muestra de Agua: Obtener una muestra que refleje de manera apta la calidad del agua usada. Antes de abrir, agitar vigorosamente el envase para homogeneizar la muestra de agua. Puede que se requieran varios envases para contar con suficiente agua para analizar. Aptitud del Sistema: Analizar el Control de Agua Reactivo en el aparato y registrar la respuesta, rw. Repetir la prueba utilizando la Solución Estándar y registrar la respuesta, r5 • Calcular la respuesta corregida de la Solución Estándar, que es también la respuesta límite, restando la respuesta del Control de Agua Reactivo de la respuesta de la Solución Estándar. El límite teórico de 8,0 mg/L de carbono es igual a la respuesta corregida de la Solución Estándar, r5 - rw. Analizar la Solución de Aptitud del Sistema en el aparato y registrar la respuesta, r55 • Calcular la respuesta corregida de la Solución de Aptitud del Sistema, restando la respuesta del Control de Agua Reactivo de la respuesta de la Solución de Aptitud del Sistema, r55 - rw. Calcular la eficiencia de la respuesta porcentual de la Solución de Aptitud del Sistema: eficiencia de la respuesta%= 1OO[(r55
-
rw)l(r5 - rw)]
en donde r55 es la respuesta del instrumento para la Solución de Aptitud del Sistema; rw es la respuesta del instrumento para el Control de Agua Reactivo; y r5 es la respuesta del instrumento para la Solución Estándar. El sistema es apto si la eficiencia de la respuesta porcentual es no menos de 85% ni más de 115%. Procedimiento: Realizar la prueba usando la Muestra de Agua y registrar la respuesta, ru. La Muestra de Agua cumple con los requisitos si runo es mayor que la respuesta límite, r5 - rw, determinada en los requisitos de Aptitud del Sistema, en Agua Estéril
(645) CONDUCTIVIDAD DEL AGUA INTRODUCCIÓN La conductividad eléctrica del agua es una medida del flujo de electrones facilitado con iones. Las moléculas de agua se disocian en iones en función del pH y la temperatura, produciéndose una conductividad fácil de predecir. Algunos gases, especialmente el dióxido de carbono, se disuelven fácilmente en el agua e interactúan para formar iones, lo que también afecta la conductividad en forma predecible. Para los fines de este capítulo, estos iones y la conductividad resultante se pueden considerar como intrínsecos al agua. La presencia de iones extraños también afecta la conductividad del agua. Los iones extraños usados para determinar las especificaciones de conductividad que se describen a continuación son los iones cloruro y amonio. En cuanto al nivel de impurezas iónicas permitidas en el agua, la mayor proporción corresponde a la conductividad del ión cloruro ubicuo (en una concentración teórica final de 0,47 ppm cuando el cloruro constituía una prueba de calidad requerida en la USP 22 y en versiones anteriores) y al ión amonio (con un límite de 0,3 ppm). Para mantener la electroneutralidad el nivel de impurezas permitido incluye una cantidad balanceada de aniones (tales como cloruro, para contrarrestar el ión amonio) y cationes (tales como sodio, para contrarrestar el ión cloruro). Los iones extraños como los mencionados, pueden tener un efecto significativo en la pureza química del agua y en la aptitud para su uso en aplicaciones farmacéuticas. El procedimiento en la sección Agua a Granel está especificado para medir la conductividad de aguas como el Agua Purificada, el Agua para Inyección, el Agua para Hemodiálisis y el condensado de Vapor Puro. El procedimiento en la sección Agua Estéril está especificado para medir la conductividad de aguas como el Agua Purificada Estéril, Agua Estéril para Inyección, Agua Estéril para Inhalación y Agua Estéril para Irrigación. Los procedimientos siguientes se deben realizar usando instrumental que haya sido calibrado, cuyas constantes de celda del sensor de conductividad hayan sido determinadas con exactitud y cuya función de compensación de temperatura haya sido desactivada para la Etapa 1 del análisis de Agua a Granel. Para las mediciones en línea y fuera de línea, la aptitud del instrumento para las pruebas de control de calidad depende también de los sitios de muestreo en el sistema del agua. Los sitios seleccionados para el instrumento de muestreo deben reflejar la calidad del agua empleada.
ESPECIFICACIONES DEL INSTRUMENTO V PARÁMETROS DE FUNCIONAMIENTO La conductividad del agua debe medirse con exactitud usando instrumentos calibrados. Una medición de la conductividad eléctrica consiste en la determinación de la conductancia, G (o su inversa, la resistencia, R), del fluido entre y alrededor de los electrodos. La conductancia (1 / R) se ve directamente afectada por las propiedades geométricas de los electrodos; es decir, la conductancia es inversamente proporcional a la distancia (d) entre los electrodos y proporcional al área (A) de los mismos. Esta
508 (645) Conductividad del Agua / Pruebas Físicas
USP 39
relación geométrica (d/A) se conoce como constante de celda, 0. Por consiguiente, la conductancia medida se normaliza para la constante de celda a fin de determinar la conductividad, K, de acuerdo con la siguiente ecuación: conductividad,
K
(S/cm) =e (cm-1)/R (n)
Si fuera necesario, se deben ajustar y verificar la constante de celda y la medida de resistencia. Constante de celda: La constante de celda debe conocerse con una aproximación de ±2%. La constante de celda puede ser verificada directamente, usando una solución de conductividad conocida o rastreable, o indirectamente, comparando la lectura del instrumento obtenida con el sensor de conductividad en cuestión con las lecturas obtenidas con un sensor de conductividad con constante de celda conocida o rastreable. Si fuera necesario, ajustar la constante de celda siguiendo el protocolo del instrumento provisto por el fabricante del mismo. La frecuencia de la verificación/calibración se determina en función del diseño del sensor. Medición de resistencia: La calibración (o verificación) de la medición de resistencia se logra reemplazando los electrodos del sensor de conductividad con resistores de precisión que tengan estándares rastreables al NIST o a autoridades nacionales equivalentes en otros países (con una exactitud que no se aleje en más de ±0, 1% del valor declarado) para obtener una respuesta de conductividad prevista del instrumento. La exactitud de la medición de resistencia es aceptable si la conductividad medida con el resistor rastreable se encuentra dentro de ±0, 1 µS/cm del valor calculado, de acuerdo con la ecuación anterior. Por ejemplo, el resistor rastreable es 50 kn y la constante de celda, e, es 0, 1 O cm-1. El valor calculado es 2,0 x 10-6 S/cm ó 2,0 µS/cm. El valor medido debe ser 2,0 ± O, 1 µS/cm. El instrumento debe tener una resolución mínima de O, 1 µS/cm en el intervalo más bajo. Los valores de conductividad deseados deben basarse en el tipo de agua que se va a analizar y deben ser iguales o menores que el límite de conductividad del agua para dicho tipo de agua. Se pueden incluir múltiples circuitos de medición en el medidor o el sensor y cada circuito puede requerir de verificación o calibración independiente antes del uso. La frecuencia de la recalibración se determina en función del diseño del instrumento. Verificación del sistema: La constante de celda del sensor del usuario se puede determinar con el sistema de medición de resistencia del usuario, o la constante de celda se puede determinar con un sistema de medición de resistencia independiente. Si la constante de celda se determina con un sistema de medición de resistencia independiente, se recomienda que el usuario verifique que el sensor ha sido apropiadamente conectado al sistema de medición de resistencia para asegurar un funcionamiento adecuado. La verificación puede hacerse comparando los valores de conductividad (o resistividad) presentados en la pantalla del equipo de medición, con los de un dispositivo externo calibrado medidor de conductividad. Los dos valores de conductividad (o resistividad) no compensados por temperatura deben ser equivalentes entre sí o tener una aproximación de ±5%, o bien deben tener una diferencia que sea aceptable con respecto a la criticidad del agua producida y/o a los intervalos de conductividad del agua en los que se realizaron las mediciones. Los dos sensores de conductividad se deben posicionar lo suficientemente juntos para medir la misma muestra de agua a la misma temperatura y calidad del agua. Compensación de temperatura y mediciones de temperatura: Debido a que la temperatura tiene un efecto sustancial sobre las lecturas de conductividad de las muestras a temperaturas altas y bajas, muchos instrumentos corrigen automáticamente la lectura real para mostrar el valor que teóricamente se observaría a la temperatura nominal de 25º. Normalmente, la corrección se efectúa mediante un sensor de temperatura incluido junto con el sensor de conductividad y un algoritmo informático incluido en el instrumento. Este algoritmo de compensación de temperatura puede no ser exacto para los distintos tipos de agua e impurezas. Por esta razón, los valores de conductividad usados en la prueba de la Etapa 1 para Agua a Granel son mediciones no compensadas por temperatura. Otras pruebas de conductividad que se especifican para la medición a 25º pueden usar mediciones compensadas por temperatura o mediciones no compensadas por temperatura. Se requiere una medición de temperatura para la prueba de la Etapa 1 o para las otras pruebas a 25º. Ésta puede realizarse usando el sensor de temperatura incluido en el sensor de la celda de conductividad. También es aceptable un sensor de temperatura externo colocado cerca del sensor de conductividad. La exactitud de las mediciones de temperatura debe ser de ±2º.
AGUA A GRANEL El procedimiento y los límites de prueba en esta sección están destinados para Agua Purificada, Agua para Inyección, Agua para Hemodiálisis, el condensado de Vapor Puro y cualquier otra monografía que especifique esta sección. Se trata de un método de prueba de tres etapas para realizar el análisis en línea o fuera de línea. La prueba de conductividad en línea proporciona mediciones en tiempo real y oportunidades para controlar, tomar decisiones e intervenir en el proceso en tiempo real. Se deben tomar las precauciones necesarias en la recolección de muestras de agua para las mediciones de conductividad fuera de línea. El método de muestreo, el envase de muestreo y los factores ambientales, tales como la concentración ambiental de dióxido de carbono y los vapores orgánicos pueden afectar la muestra. El procedimiento se puede iniciar en la Etapa 2 si se prefiere el análisis fuera de línea.
Pruebas Físicas/ (645) Conductividad del Agua 509
USP 39
Procedimiento ETAPA 1 La Etapa 7 está destinada para la medición en línea o puede realizarse fuera de línea en un recipiente apropiado. 1 . Determinar la temperatura y la conductividad del agua usando una lectura de conductividad que no haya sido compensada por temperatura. 2. Mediante la Tabla 7, determinar el valor de temperatura que no sea mayor que la temperatura medida, es decir, la temperatura inmediatamente inferior. El valor de conductividad correspondiente en esta tabla es el límite. [NOTA-No interpolar.] 3. Si la conductividad medida no es mayor que el valor especificado en la tabla determinado en la etapa 2, el agua cumple con los requisitos de la prueba de conductividad. Si la conductividad es mayor que el valor especificado en la tabla, pasar a la Etapa 2. Tabla 1. Etapa 1-Requisitos de Temperatura y Conductividad (sólo para mediciones de conductividad no compensadas por temperatura) Temperatura
Requisito de Conductividad (µS/cm)
o
0,6
5
0,8
10
0,9
15
1,0
20
1,1
25
1,3
30
1,4
35
1,5
40
1,7
45
1,8
50
1,9
55
2,1
60
2,2
65
2,4
70
2,5
75
2,7
80
2,7
85
2,7
90
2,7
95
2,9
100
3, 1
ETAPA 2 4. Transferir una cantidad de agua suficiente a un recipiente adecuado y mezclar la muestra de prueba. Ajustar la temperatura, si fuera necesario, y mientras se mantiene a 25 ± 1 º, comenzar a agitar la muestra de prueba vigorosamente mientras se observa la conductividad de manera periódica. Cuando el cambio neto en la conductividad (producido por la absorción de dióxido de carbono atmosférico) es menos de O, 1 µS/cm por 5 minutos, registrar la conductividad. [NOTA-Las mediciones de conductividad en esta etapa pueden ser compensadas por temperatura a 25º o no compensadas por temperatura.] 5. Si la conductividad no es mayor de 2, 1 µS/cm, el agua cumple con los requisitos de la prueba de conductividad. Si la conductividad es mayor de 2, 1 µS/cm, pasar a la Etapa 3. ETAPA 3 6. Efectuar esta prueba dentro de los 5 minutos aproximadamente de haber efectuado la determinación de conductividad en el paso 5, manteniendo la temperatura de la muestra a 25 ± 1 º. Agregar una solución saturada de cloruro de potasio a la misma muestra de agua (0,3 ml por cada 100 ml de la muestra de prueba) y determinar el pH con una aproximación de O, 1 unidades de pH según se indica en pH (791 ). 7. Empleando la Tabla 2, determinar el límite de conductividad en el valor de pH medido. Si la conductividad medida en el paso 4 no es mayor que el valor especificado en la tabla determinado en el paso 6, el agua cumple con los requisitos de la prueba de conductividad. Si la conductividad medida es mayor que este valor o si el pH está fuera del intervalo de 5,0-7,0, el agua no cumple con los requisitos de la prueba de conductividad.
51 O (645) Conductividad del Agua/ Pruebas Físicas
USP 39
Tabla 2. Etapa 3-Requisitos de pH y Conductividad (sólo para muestras equilibradas con la temperatura y la atmósfera)
pH
Requisito de Conductividad (µS/cm)
5,0
4,7
5, 1
4,1
5,2
3,6
5,3
3,3
5,4
3,0
5,5
2,8
5,6
2,6
5,7
2,5
5,8
2,4
5,9
2,4
6,0
2,4
6, 1
2,4
6,2
2,5
6,3
2,4
6,4
2,3
6,5
2,2
6,6
2, 1
6,7
2,6
6,8
3, 1
6,9
3,8
7,0
4,6
AGUA ESTÉRIL El procedimiento y los límites de prueba están destinados para Agua Purificada Estéril, Agua Estéril para Inyección, Agua Estéril para Inhalación y Agua Estéril para Irrigación y cualquier otra monografía que especifique esta sección. Las aguas estériles proceden de Agua Purificada o Agua para Inyección y por lo tanto se ha determinado que cumplen con los requisitos para Agua a Granel antes de ser envasadas. La especificación proporcionada representa el valor máximo de conductividad permitido, tomando en cuenta la limitación del método de medición y una razonable lixiviación (leaching) del envase. La elección de la especificación y del volumen de muestreo se debe definir y validar de acuerdo con el propósito previsto del agua.
Procedimiento Obtener una muestra que refleje de manera adecuada la calidad del agua usada. Antes de abrir, agitar vigorosamente el envase para homogeneizar la muestra de agua. Se pueden requerir varios envases para recolectar suficiente agua para el análisis. Transferir una cantidad de agua suficiente a un recipiente adecuado y mezclar la muestra de prueba. Ajustar la temperatura, si fuera necesario, y mientras se mantiene a 25 ± 1º, comenzar a agitar la muestra de prueba vigorosamente mientras se observa la conductividad de manera periódica. Cuando el cambio neto en la conductividad (producido por la absorción de dióxido de carbono atmosférico) es menos de O, 1 µS/cm por 5 minutos, registrar la conductividad. Para envases con un volumen nominal de 1O mL o menos, si la conductividad no es mayor que 25 µS/cm, el agua cumple con los requisitos. En envases con un volumen nominal mayor que 1O mL, si la conductividad no es mayor que 5 µS/cm, el agua cumple con los requisitos.
(651) TEMPERATURA DE SOLIDIFICACIÓN La temperatura a la cual una sustancia pasa del estado líquido al sólido cuando se enfría es un índice útil de su pureza si se libera calor al producirse la solidificación, siempre que toda impureza presente se disuelva sólo en el líquido y no en el sólido. Las sustancias puras tienen un punto de congelación bien definido, pero generalmente las mezclas se congelan a diferentes temperaturas. Para muchas mezclas, la temperatura de solidificación, determinada siguiendo estrictamente los siguientes métodos empíricos, es un índice útil de su pureza. El método para determinar las temperaturas de solidificación que se describe en este documento se aplica a sustancias que funden entre -20º y 150º, que es el intervalo del termómetro usado en el baño.
Pruebas Físicas/ (651) Temperatura de Solidificación 511
USP 39
La temperatura de solidificación es el punto máximo (o en caso de no existir un máximo, el punto de inflexión) en la curva de temperatura-tiempo. Cambio en la redacción:
APARATO Ensamblar un aparato similar al ilustrado,
--- ----T Nivel de llenado
5cm
-- º-'~~ j
15cm
_______ _j _____ _
-3.75cm
1,25cm
3,75 cm
3,75 cm
Aparato de Temperatura de Solidificación donde el recipiente para la sustancia es un tubo de ensayo de 25 x 100 mm en el que se coloca un termómetro adecuado de intervalo corto, suspendido en el centro y un mezclador de alambre, aproximadamente de 30 cm de largo, que se dobla en su extremo inferior en un anillo horizontal que rodea el termómetro. Emplear un termómetro con un intervalo que no exceda de 30º, graduado en divisiones de O, 1ºy calibrado para una inmersión a 76 mm pero no usado a esa profundidad. La serie ASTM El 89C a 96C es una serie disponible y adecuada de termómetros, que abarcan un intervalo desde -20º hasta+ 150º. Se pueden usar otros aparatos para medir temperaturas siempre y cuando estén validados para este procedimiento (ver •Advertencias y Requísítos Generales, 6.80.30, Disposítivos de Medición áe Temperatura• (AFoi-may-2016,). Las dimensiones deben estar comprendidas entre± 20% con respecto a las que se muestran en la figura. El recipiente para la muestra se encuentra sostenido, mediante un corcho, dentro de un cilindro adecuado, impermeable al agua, con un diámetro interno de aproximadamente 50 mm y 11 cm de longitud. A su vez, el cilindro se apoya en un baño con una altura suficiente como para proporcionar una capa de no menos de 37 mm alrededor de los lados y del fondo del cilindro. El baño externo tiene un termómetro apropiado.
PROCEDIMIENTO Fundir la sustancia, si es un sólido, a una temperatura que no exceda de 20º por encima del punto de solidificación esperado y verterla en el tubo de ensayo hasta una altura de 50 mm a 57 mm. Armar el aparato con el bulbo del termómetro del tubo
512 (651) Temperatura de Solidificación/ Pruebas Físicas
USP 39
de ensayo inmerso en un punto medio entre la parte superior e inferior de la muestra en el tubo de ensayo. Llenar el baño hasta aproximadamente 12 mm desde la parte superior del tubo con un líquido apropiado a una temperatura de 4º a 5º por debajo del punto de solidificación esperado. En caso de que la sustancia sea un líquido a temperatura ambiente, llevar a cabo la determinación empleando un baño a una temperatura de aproximadamente 15° por debajo del punto de solidificación esperado. Cuando la muestra de prueba esté enfriada aproximadamente a 5º por encima del punto de solidificación esperado, ajustar el baño a una temperatura de 7° a 8º por debajo del punto de congelación esperado. Revolver continuamente la muestra hasta terminar la prueba moviendo el agitador de alambre hacia arriba y hacia abajo entre la parte superior e inferior de la muestra, a una velocidad constante de 20 ciclos completos por minuto. Frecuentemente, la congelación puede inducirse frotando las paredes internas del tubo de ensayo con el termómetro, o introduciendo un fragmento pequeño de la sustancia previamente solidificada. Un sobreenfriarniento pronunciado puede causar una desviación respecto del patrón normal de cambios de temperatura. Si esto último ocurre, repetir la prueba, introduciendo partículas pequeñas del material en análisis en forma sólida a intervalos de 1º a medida que la temperatura se acerca al punto de solidificación esperado. Registrar la lectura del termómetro del tubo de ensayo cada 30 segundos. Continuar revolviendo sólo mientras baje gradualmente la temperatura; dejar de revolver cuando la temperatura se vuelva constante o comience a subir levemente. Continuar registrando la temperatura en el tubo de ensayo cada 30 segundos, al menos durante 3 minutos, después de que la temperatura comience a caer nuevamente después de haber permanecido constante. El promedio de no menos de cuatro lecturas consecutivas comprendidas dentro de un intervalo de 0,2º constituye la temperatura de solidificación. Estas lecturas se encuentran cerca de un punto de inflexión o un máximo, en la curva de ternperaturatiernpo, que se produce después de que la temperatura se vuelva constante o comience a subir y antes de que empiece a bajar nuevamente. El promedio de las lecturas con una aproximación de O, 1 º constituye la temperatura de solidificación.
(659) REQUISITOS DE ENVASADO Y ALMACENAMIENTO (Este capítulo será oficial el 1º de mayo de 2016)
ENVASADONT Los envases no deben interactuar física o químicamente con los artículos oficiales de modo que se ocasione el incumplimiento de sus requisitos de seguridad, identidad, contenido, calidad o pureza. En este capítulo se proporcionan opciones de los distintos tipos de envase. Para medicamentos e ingredientes farmacéuticos activos, las opciones de envases son impermeable, bien cerrado, o si fuera necesario, resistente a la luz. Para los excipientes, dado que generalmente se manejan en grandes volúmenes (cuyos envases pueden ser desde tambores a vagones cisterna), el envase bien cerrado es, por defecto, el envase apropiado. Para artículos que no sean fármacos ni medicamentos, para los que no se proporcionan instrucciones o limitaciones específicas, los artículos deben protegerse de la humedad, la congelación y el calor excesivo y, si fuera necesario, de la luz durante su transporte y distribución. Los requisitos farrnacopeicos para el uso de envases especificados también se aplican a artículos envasados por el farmacéutico u otro dispensador, a menos que la monografía individual indique algo diferente.
DEFINICIONES GENERALES Sistema de envasado (también referido corno sistema de envase-cierre): Se refiere al conjunto de los componentes de los envases que contienen y protegen el artículo, e incluye los componentes de los envases primarios y los componentes de los envases secundarios, si éstos últimos se utilizaran para ofrecer protección adicional. Envases: Receptáculo que contiene un compuesto intermedio, ingrediente farmacéutico activo, excipiente o forma farmacéutica, y que está o puede estar en contacto directo con el artículo. El envase inmediato o primario es aquél que está en contacto directo con el artículo constantemente. El cierre es una parte del envase. El envase debe estar limpio antes de llenarse. Puede ser necesario tomar precauciones y emplear procedimientos de limpieza especiales para asegurar que cada envase esté limpio y que no se introduzca materia extraña en el artículo o sobre el mismo. Componentes del envase: Cualquier parte del envase o del sistema de envase-cierre, incluyendo el envase primario (p.ej., ampollas, jeringas prellenadas, viales, frascos); el recubrimiento interno del envase primario (p.ej., recubrimiento interno en cartucho tubular); el cierre (p.ej., tapas de rosca, tapones); los casquillos y sobresellos; recubrimiento interno del cierre; sellos internos; puertos de administración; envolturas; accesorios de administración; y etiquetas.
NT ES IMPORTANTE DESTACAR QUE LAS OPERACIONES REFERIDAS AL "ENVASADO" INCLUYEN EL ENVASADO PRIMARIO PROPIAMENTE DICHO, ASÍ COMO LAS OPERACIONES DE EMPACADO (ENVASADO SECUNDARIO) Y EMBALAJE (ENVASADO TERCIARIO PARA EL TRANSPORTE).
USP 39
Pruebas Físicas/ (659) Requisitos de Envasado y Almacenamiento 513
Componentes de los envases primarios: Componentes de los envases que están en contacto directo o que pueden entrar en contacto directo con el artículo. Componentes de los envases secundarios (empaque): Componentes de los empaques que no están y que no entrarán en contacto directo con el artículo. Envase terciario (embalaje): Componentes de los envases que no están en contacto directo con el artículo pero que facilitan su manipulación y transporte para evitar daños derivados de la manipulación física y de las condiciones de almacenamiento a las que se somete el artículo. Materiales de construcción: Se refiere a los materiales (p.ej., vidrio, plástico, elastórneros, metal) usados para fabricar componentes de los envases (envases primarios, empaques y embalajes). Envases multidosis (o de dosis múltiple): Sistemas de envasado que permiten retirar porciones sucesivas de un artículo para administración parenteral sin alterar la seguridad, el contenido, la calidad o la pureza de la porción remanente. Ver Envases Multidosis en Contenido en Envases para Inyectables (697). Envases de unidades múltiples: Sistemas de envasado que permiten retirar porciones sucesivas de un artículo sin alterar la seguridad, la concentración o potencia, la calidad o la pureza de la porción remanente. Envases unitarios: Sistemas de envasado que contienen una cantidad de un artículo destinado para administración como dosis única o corno un dispositivo terminado individual destinado para ser utilizado inmediatamente luego de la apertura del envase. Preferiblemente, el envase primario o el secundario, o el empaque protector utilizado debe estar diseñado de forma tal que se evidencie cualquier alteración en el contenido. Envases monodosis: Envases monodosis son envases de medicación estéril para administración parenteral (inyección o infusión) que no están sujetos a cumplir con los requisitos de los criterios de eficacia antirnicrobiana. [NOTA-Únicamente para esta definición, el envase es sinónimo de sistema de envase y sistema de envase-cierre.] Un envase monodosis está diseñado para su uso en un paciente individual como una inyección/infusión individual. 1 Un envase monodosis se etiqueta como tal y debe incluir instrucciones de desecho apropiadas en la etiqueta, si hubiera espacio disponible. Los viales, ampollas y jeringas prellenadas son ejemplos de envases rnonodosis. Envases de dosis única: Sistemas de envasado unitarios para un artículo destinado a su administración como dosis única por una vía que no sea la parenteral. Envases de unidad de uso: Sistemas de envasado que contienen una cantidad específica de un artículo que está destinado a dispensarse como tal, sin ninguna modificación posterior, excepto la adición de un etiquetado adecuado. El envase de unidad de uso no se puede reenvasar para su venta. Envases a granel para farmacias: Sistemas de envase de una preparación estéril para uso parenteral que contienen muchas monodosis. El contenido está destinado para su uso en programas de preparación de mezclas en farmacias y está restringido a la preparación de mezclas para infusión o al llenado de jeringas estériles vacías con un dispositivo de transferencia estéril. El cierre debe ser penetrado sólo una vez después de la reconstitución, si fuera necesario, usando un dispositivo de transferencia estéril adecuado o equipo dispensador que permita la dosificación medida del contenido. El Envase a granel para farmacias sólo se empleará en un área de trabajo adecuada, por ejemplo, una campana de flujo laminar (o un área equivalente de aire limpio para preparación magistral). La nomenclatura Envase a granel para farmacias se limita a las formas farmacéuticas denominadas Inyección, para Inyección o Emulsión Inyectable, según se establece en el capítulo Nomenclatura (1121 ), Estructuras Generales de Nomenclatura. El envase a granel para farmacias, aunque contenga más de una monodosis, está exento del límite de volumen de 30 mL para envases multidosis y del requisito de contener una sustancia o mezcla de sustancias adecuada para prevenir el crecimiento de microorganismos. Para requisitos de etiquetado, ver el capítulo Etiquetado (7). Inyecciones de pequeño volumen: Una inyección que se envasa en envases que declaran contener 100 mL o menos. Inyecciones de gran volumen: Una inyección destinada para uso intravenoso y que se envasa en envases que declaran contener más de 100 ml. Envases seguros para niños: Sistemas de envase diseñados o construidos para cumplir con las normas de la Consumer Product Safety Commission (Comisión de Seguridad del Consumidor) relacionadas con la apertura de envases por parte de niños (16 CFR § 1700.20). Envases adecuados para la tercera edad: Sistemas de envase diseñados o construidos para cumplir con las normas de la Consurner Product Safety Commission (Comisión de Seguridad para el Consumidor) relacionadas con la apertura de envases por parte de personas de edad avanzada (16 CFR § 1700.20). Envases que evidencian su alteración intencional: Sistemas de envase que no pueden ser abiertos sin la destrucción evidente del sello o de alguna parte del sistema de envase. El envase que evidencia su alteración intencional debe usarse para un artículo estéril destinado para uso oftálmico u ótico, excepto cuando se trata de una preparación magistral extemporánea para su dispensación inmediata según receta médica. Los artículos destinados a la venta sin prescripción médica también deben cumplir, cuando corresponda, con los requisitos de la FDA relativos al etiquetado y envasado que evidencie la alteración intencional. El envase primario y/o el empaque o envase secundario, o el embalaje protector utilizado por fabricantes o distribuidores para todas las formas farmacéuticas, salvo excepciones específicas, se diseña, preferentemente para evidenciar cualquier alteración en el contenido.
1
Pueden aceptarse excepciones, sólo en las condiciones descritas en el capítulo Preparación Magistral-Preparaciones Estériles (797).
514 (659) Requisitos de Envasado y Almacenamiento/ Pruebas Físicas
USP 39
Envases herméticos: Sistemas de envase que impiden la penetración del aire o cualquier otro gas en las condiciones usuales o habituales de manejo, transporte, almacenamiento o distribución. Envases impermeables: Sistemas de envase que protegen el contenido de la contaminación por líquidos, sólidos o vapores extraños; de la pérdida del artículo; y de eflorescencia, delicuescencia o evaporación en condiciones habituales o usuales de manejo, transporte, almacenamiento y distribución, pudiéndose volver a cerrar de forma impermeable una vez abierto. Cuando se especifique un envase impermeable, éste puede sustituirse con un envase hermético para una sola dosis de un artículo. [NOTA-Cuando en una monografía individual se especifique el envasado y almacenamiento en un envase impermeable o bien cerrado, el envase usado para dispensar el artículo prescrito cumple con los requisitos en el capítulo Envases-Pruebas de Desempeño (671 ).] Envases bien cerrados: Sistemas de envase que protegen el contenido de la contaminación por sólidos extraños y de la pérdida del artículo en condiciones habituales o usuales de manejo, transporte, almacenamiento y distribución. Ver Envases-Pruebas de Desempeño (671 ). Envases resistentes a la luz: Sistemas de envase que protegen el contenido de los efectos de la luz por medio de las propiedades específicas del material que los compone, incluyendo los recubrimientos aplicados sobre los mismos. Un envase transparent e incoloro o translúcido puede ser convertido en un envase resistente a la luz mediante una cubierta exterior opaca o mediante el uso de un envase secundario, en cuyo caso la etiqueta del envase debe indicar que es imprescindible el uso de la cubierta opaca o que se requiere el envase secundario hasta que el artículo se haya usado o administrado. Cuando en una monografía individual se indique "proteger de la luz", se entiende que el artículo se debe conservar en un envase resisitente a la luz. Ver el capítulo Envases-Pruebas de Desempeño (671 ), Prueba de Transmisión de Luz. Sistema de cierre negro o bandas negras: El uso de un sistema de cierre negro en un vial (es decir, una tapa de sobresello negra y un casquillo negro para sostener el cierre elastomérico) o el uso de una banda o serie de bandas negras sobre el estrechamiento del cuello de una ampolla se reserva sólo para el Concentrado de Cloruro de Potasio para Inyección y está prohibido su uso en cualquier otra inyección. Ver el capítulo Etiquetado (7).
ENVASADO DE INYECTABLES La validación de la integridad del envase-cierre debe demostrar la ausencia de la introducción de contaminación microbiana y de impurezas físicas o químicas. Además, se deben mantener las cantidades o concentraciones totales y relativas especificadas de solutos y vehículos frente a la exposición a las condiciones extremas previstas en la fabricación y procesamiento, almacenamiento, transporte y distribución. Los cierres para envases multidosis deben permitir la extracción del contenido sin retirar o destruir el cierre. El cierre debe permitir la penetración de una aguja y el cierre inmediato tras retirarla, protegiendo el envase de la contaminación. La validación de la integridad del envase-cierre del envase multidosis debe incluir una verificación de que un envase de ese tipo impide la contaminación microbiana o la pérdida del contenido del producto en las condiciones previstas de múltiples entradas y usos. Los sistemas de envase para venoclisis en tándem (piggyback containers) son por lo general sistemas de envase-cierre de infusión intravenosa empleados para administrar una segunda infusión a través de algún tipo de conector o a través de un puerto inyector en el equipo de administración del primer líquido, evitándose así la necesidad de inyectar en otro sitio al paciente. Los envases para venoclisis en tándem son también conocidos como envases de infusión secundaria. El volumen de inyección en un sistema de envase monodosis proporciona la cantidad especificada para administración parenteral única y no debe ser superior a 1 L. Las preparaciones destinadas para administración intrarraquídea, intracisternal o peridural se envasan sólo en sistemas de envase monodosis. A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, un sistema de envase multidosis contiene un volumen de inyección suficiente para permitir la extracción de no más de 30 ml. Las siguientes inyecciones están exentas de la restricción de 1 L de los requisitos anteriores relacionados con el envasado: 1. Inyecciones envasadas para uso extravascular como soluciones de irrigación o diálisis peritoneal. 2. Inyecciones envasadas para uso intravascular como nutrición parenteral o como líquido de reemplazo o sustitución para ser administrado en forma continua durante una hemofiltración. Las inyecciones envasadas para uso intravascular que pudieran usarse como líquido durante una hemodiálisis u otros procedimientos de reemplazo mediante administración intermitente, continua o en bolo, deben cumplir con la restricción de 1 L a menos que se trate de una excepción mencionada anteriormente. Cuando se declara que las inyecciones están destinadas para uso veterinario, éstas están exentas de los requisitos de envasado y almacenamiento en lo referente a las limitaciones para sistemas de envase monodosis y de las limitaciones de volumen para los envases multidosis. Envases para sólidos estériles: Los envases, incluyendo los cierres, para sólidos secos destinados para inyección no deben presentar ninguna interacción física o química con la preparación que altere de alguna manera la concentración o potencia, la calidad o la pureza más allá de los requisitos oficiales, en condiciones habituales de manejo, transporte, almacenamiento, venta y uso. Un sistema de envase para un sólido estéril debe permitir la adición de un disolvente adecuado y la extracción de porciones de la solución o suspensión resultante de tal modo que se mantenga la esterilidad del producto. Cuando la Valoración en una monografía indica un procedimiento para la Solución muestra, donde se deba tomar el contenido total extraíble de un sistema de envase monodosis con una jeringa y aguja hipodérmicas, se extraerá ese contenido en la forma más completa posible con una jeringa hipodérmica seca, de una capacidad nominal que no exceda de tres veces el volumen a extraer, y
USP 39
Pruebas Físicas/ (659) Requisitos de Envasado y Almacenamiento 515
equipada con una aguja número 21 de una longitud no menor de 2,5 cm (1 pulgada), tomando la precaución de expeler cualquier burbuja de aire, y se descargará en un recipiente para dilución y valoración.
ENVASADO DE GASES MEDICINALES Cilindro de gas: Un cilindro de gas es un sistema de envase metálico construido de acero o aluminio diseñado para contener gases medicinales a presión. Los gases medicinales incluyen Dióxido de Carbono USP, Helio USP, Aire Medicinal USP, óxido nítrico, Óxido Nitroso USP, Nitrógeno NF y Oxígeno USP. Como medida de seguridad, se recomienda el Sistema de Seguridad de encaje pareado "Pin-lndex" para dióxido de carbono, ciclopropano, helio, aire medicinal, óxido nitroso y oxígeno en cilindros de Tamaño E o menor.
COMPONENTES RELACIONADOS Muchos componentes relacionados se gradúan para administración en dosis determinadas. Es responsabilidad del fabricante garantizar que se provea el componente de dosificación apropiado o que se especifique un componente para propósitos generales, como los descritos en esta sección, para la administración de la dosis apropiada con la exactitud prevista. Las graduaciones deben ser legibles e indelebles. Los componentes relacionados graduados que se decriben en esta sección son de uso general. Las marcas de graduación deben ser legibles, indelebles y deben estar sobre una superficie que no tenga contacto con la boca o producto. En condiciones ideales de uso, el error de volumen en el que se incurre al medir líquidos para la administración de dosis individuales por medio de dichos componentes graduados no debe exceder de 10% de la cantidad indicada de la preparación líquida con la que se usará el componente graduado. Pocas preparaciones líquidas comparten las mismas características superficiales y de flujo. Por tanto, el volumen administrado varía considerablemente de una preparación a otra. Los polímeros e ingredientes agregados a los polímeros que se usan en la fabricación de componentes relacionados deben cumplir con los requisitos de las secciones aplicables del Code of Federal Regulations (Código de Reglamentos Federales), Título 21, lndirect Food Additives (Aditivos Alimentarios Indirectos). Dosificador: Dispositivo de medición que consiste en un vaso pequeño que se incluye en el envase de los artículos líquidos orales o que se puede vender y comprar por separado. Cuchara dosificadora: Dispositivo de medición que consiste en una parte cóncava con un mango que se incluye en el envase de los artículos líquidos orales o que se puede vender y comprar por separado. El mango puede ser un tubo graduado. Gotero para medicamentos: Dispositivo de medición que consiste en un cuerpo o tubo transparente o translúcido que generalmente está equipado con un bulbo depresible. Se incluye en el envase de artículos líquidos orales o se puede vender y comprar por separado. Aunque la capacidad de los goteros generalmente varía, el extremo de descarga debe ser una abertura redonda con un diámetro externo de aproximadamente 3 mm. El cuerpo puede estar graduado. [NOTA-Pocos líquidos medicinales comparten las mismas características superficiales y de flujo con el agua, por lo que el tamaño de las gotas varía considerablemente de una preparación a otra.] Jeringa para administración oral: Dispositivo de medición que consiste en un cuerpo y un émbolo fabricados con material de plástico rígido y transparente o translúcido adecuado y que tiene un sello en el extremo. Se incluye en el envase de artículos líquidos orales o se puede vender y comprar por separado. La jeringa debe expulsar una cantidad medida del artículo líquido directamente en la boca del paciente. Las alas para los dedos ubicadas en el extremo abierto del cuerpo deben tener un tamaño, forma y resistencia apropiados y deben permitir que la jeringa se pueda sostener de manera segura durante el uso. El cuerpo puede estar graduado. Cucharita de té: Dispositivo de medición que consiste en una parte cóncava poco profunda, de forma ovalada o redonda, que se encuentra al final de un mango. Se ha establecido que una cucharadita de té contiene 4,93 ± 0,24 ml. Para la administración de artículos, se puede considerar que la cucharadita de té representa un volumen de 5 ml. Los artículos destinados para administración mediante cucharita de té se deben formular tomando en cuenta una dosificación en unidades de 5 mL, por lo que, siempre que se indique una calibración basada en una cucharadita de té, el componente usado para administrar artículos líquidos deberá liberar 5 ml. Una cuchara disponible en el hogar no es una alternativa aceptable a la cucharita de té graduada descrita en este capítulo.
LEY DE ENVASADO PARA LA PREVENCIÓN DE ENVENENAMIENTO O PPPA (POISON PREVENTION PACKAGING ACT) Esta ley exige el uso de envases especiales para la mayoría de los medicamentos de administración por vía oral para humanos de venta bajo receta, medicamentos de administración por vía oral controlados, algunos medicamentos de administración por vía oral de venta sin receta médica, algunos suplementos dietéticos y para muchas preparaciones farmacéuticas de venta libre para proteger al público de lesiones o enfermedades causadas por el uso incorrecto de estas preparaciones (16 CFR §1700.14).
516 (659) Requisitos de Envasado y Almacenamiento/ Pruebas Físicas
USP 39
El envase primario para sustancias reglamentadas por la PPPA debe cumplir con las normas de los envases especiales (16 CFR §1700.15 y 16 CFR §1700.16) las cuales rigen para todos los tipos de envases, incluidos los que pueden volver a cerrarse, los que no se cierran y los de dosis única. No se requieren envases especiales para los medicamentos que se dispensan en hospitales a pacientes hospitalizados. Los fabricantes o envasadores de medicamentos a granel de venta bajo receta no necesitan usar envases especiales si el medicamento ha de ser reenvasado por el farmacéutico. Los medicamentos de venta bajo receta reglamentados por la PPPA se pueden dispensar en envases que no sean seguros para niños si el comprador lo solicita o si una receta válida así lo indica (15 u.s.c. §1473). Los fabricantes o envasadores de preparaciones farmacéuticas de venta libre reglamentados por la PPPA están autorizados a envasar un tamaño de producto en envases que no sean seguros para niños siempre que también provean envases especiales de tamaño habitual. Los envases que no sean seguros para niños requieren un etiquetado especial (16 CFR §1700.5).
CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO En algunas monografías se establecen instrucciones específicas con respecto a las condiciones de almacenamiento, p.ej., la temperatura o humedad a las que se debe almacenar y transportar el artículo. Estas condiciones se aplican excepto cuando la etiqueta del artículo indica condiciones de almacenamiento diferentes que se basan en estudios de estabilidad. Cuando no se proporcionan condiciones de almacenamiento específicas en la monografía individual, pero la etiqueta de un artículo establece condiciones de almacenamiento basadas en estudios de estabilidad, tales instrucciones de almacenamiento son las que se deben aplicar. Congelador: Es un lugar con una temperatura mantenida entre -25º y -1 Oº (-13º y 14 ºF). Refrigerador: Es un lugar frío con una temperatura mantenida entre 2º y 8º (36º y 46 ºF). Frío: Toda temperatura que no exceda de 8º (46 ºF). Fresco: Toda temperatura entre 8º y 15º (46º y 59 ºF). [NOTA-Cuando se indique que un artículo debe almacenarse en un lugar fresco, puede almacenarse o transportarse, alternativamente, refrigerado, a menos que se especifique algo diferente en la monografía individual.] Temperatura ambiente: La temperatura predominante en un área de trabajo. Temperatura ambiente controlada: La temperatura mantenida termostáticamente que abarca la prevalente en el ambiente usual de trabajo de 20º-25º (68º-77 ºF). También se deben cumplir las siguientes condiciones. La temperatura cinética media no debe exceder de 25º. Se permiten desviaciones entre 15º y 30º (59º y 86 ºF) experimentadas en farmacias, hospitales y depósitos, y durante el transporte. Siempre que la temperatura cinética media no exceda de 25º, se permiten elevaciones pasajeras de temperatura no superiores a 40º siempre que no duren más de 24 horas. Sólo se permiten elevaciones superiores a 40º cuando el fabricante así lo instruye. Los artículos pueden etiquetarse para almacenamiento a "temperatura ambiente controlada" o "hasta 25º", u otra referencia escrita con base en la misma temperatura cinética media. Un artículo para el que se indique almacenamiento a Temperatura ambiente controlada puede almacenarse o distribuirse alternativamente en un lugar fresco o refrigerado, a menos que se especifique algo diferente en la monografía individual o en la etiqueta. Cálido (tibio): Toda temperatura entre 30º y 40º (86º y 104 ºF) Calor excesivo: Toda temperatura por encima de 40º (104 ºF) Lugar seco: El término "lugar seco" se refiere a un sitio con una humedad relativa promedio que no exceda de 40% a 20º (68 ºF) o de la presión de vapor de agua equivalente a otras temperaturas. La determinación puede hacerse por medición directa en el lugar o basándose en información de las condiciones climáticas. La determinación se basa en no menos de 12 mediciones espaciadas equitativamente y realizadas ya sea durante una estación del año, durante un año, o si los registros los demostrasen, durante el periodo de almacenamiento del artículo. Puede haber valores de hasta 45% de humedad relativa siempre que el promedio no exceda de 40%. Se considera almacenamiento en un lugar seco al almacenamiento de un envase que haya sido validado para proteger al artículo del vapor de agua, incluyendo el almacenamiento a granel. Protección de la congelación: Cuando además del riesgo de rotura del envase, la congelación de un artículo pueda ocasionar la pérdida de contenido o potencia, o la alteración destructiva de sus características, la etiqueta del envase indica las instrucciones apropiadas para proteger al artículo de la congelación. Protección de la luz: Cuando la luz pueda ocasionar la pérdida de contenido o potencia de un artículo, o la alteración destructiva de sus características, la etiqueta del envase indica las instrucciones apropiadas para proteger al artículo de la luz.
USP 39
Pruebas Físicas/ (659) Requisitos de Envasado y Almacenamiento 517
(659) REQUISITOS DE ENVASADO Y ALMACENAMIENTO (Este capítulo será oficial hasta el 30 de abril de 2016)
Todas las monografías USP y NF deben contar con requisitos de envasado y almacenamiento. Las opciones de los distintos tipos de envase, para la porción de la leyenda referida a envasado, se consignan en este capítulo. Asimismo, se proporcionan definiciones como pautas para la selección y adaptación de los requisitos de envasado de productos farmacéuticos. Para los ingredientes farmacéuticos activos (API, por sus siglas en inglés), el envase de elección sería impermeable, bien cerrado o, si fuera necesario, resistente a la luz. Para los excipientes, dado que generalmente se manejan en grandes volúmenes (cuyos envases pueden ser desde tambores a vagones cisterna), el envase bien cerrado es, por defecto, el envase apropiado. Cuando no se proporcionen instrucciones o limitaciones específicas en el etiquetado del artículo, los artículos deben protegerse de la humedad, congelación y calor excesivo y, si fuera necesario, de la luz durante su transporte y distribución. Los fármacos están exentos de dicha norma.
ENVASES El envase no debe interaccionar física o químicamente con los artículos oficiales de modo que se ocasionen fallas en el cumplimiento de los requisitos de seguridad, identidad, contenido, calidad o pureza de dichos artículos. Este capítulo provee definiciones para envases y almacenamiento.
DEFINICIONES GENERALES Sistema de Envase (también referido como sistema de envase-cierre): Se refiere al conjunto de los componentes del envase que contienen y protegen al artículo, e incluye los componentes del envase primario y los componentes del envase secundario, si éste último se utilizara para ofrecer protección adicional. Envase Primario: Receptáculo que contiene un compuesto intermedio, ingrediente farmacéutico activo, excipiente o forma farmacéutica, y que está en contacto directo con el artículo. Componentes del Envase: Cualquier parte del envase o del sistema de envase-cierre, incluido el envase primario (p.ej., ampollas, jeringas prellenadas, viales, frascos); el recubrimiento interno del envase primario (p.ej., recubrimiento interno en cartucho tubular); el cierre (p.ej., tapas de rosca, tapones); los casquillos y sobresellos; recubrimiento interno del cierre; sellos internos; puertos de administración; envolturas; accesorios de administración; y etiquetas. Componentes Primarios de los Envases: Componentes de envases que están en contacto directo o que pueden entrar en contacto directo con el artículo. Componentes Secundarios de los Envases: Componentes de envases que no están y que no entrarán en contacto directo con el artículo, pero que pueden proveer protección adicional. Envase Terciario (embalaje): Componentes de envases que no están en contacto directo con el artículo pero que facilitan su manipulación y transporte para evitar daños derivados de la manipulación física y de las condiciones de almacenamiento a las que se somete el artículo. Materiales de Construcción: Se refiere a los materiales (p.ej., vidrio, plástico, elastómeros, metal) usados para fabricar componentes de envases. Envases Multidosis (o de dosis múltiple): Sistemas de envases que permiten retirar porciones sucesivas de un artículo para administración parenteral sin alterar la seguridad, contenido, calidad o pureza de la porción remanente. Ver !~Bl,~(!!r;i!!'lD /4Í1:~;,$~~1~!fr~ra~1~ft~~:'tilll~l1~~~:1. Envases de Unidades Múltiples: Sistemas de envases que permiten retirar porciones sucesivas de un artículo sin alterar la seguridad, contenido, calidad o pureza de la porción remanente. Envases Unitarios: Sistemas de envases que contienen una cantidad de un artículo destinado para administración como dosis única o un dispositivo terminado individual destinado un solo uso. Envases Monodosis (ver también ·~~lm~íll~[l~!!tlill~Hi~:~g¡Bftllll~U~~~"J~~ifi~·~~';'ª~i~ff~~1~fi'~~~ -~~;fl;:,~~-?~t~i): Envases unitarios para un artículo destinado a su administración parenteral. Deben ser etiquetados como envases monodosis. Entre los ejemplos de envases monodosis se incluyen jeringas prellenadas, cartuchos, envases sellados por fusión y envases con cierres sellados cuando se los etiqueta como tales. Envases de Dosis Única: Sistemas de envases unitarios para un artículo destinado a su administración como dosis única por una vía que no sea parenteral. Envases de Unidad de Uso: Sistemas de envases que contienen una cantidad específica de un artículo que está destinado a dispensarse como tal, sin ninguna modificación posterior excepto por la adición de un etiquetado adecuado. El envase de Unidad de Uso no se puede reenvasar para su venta.
518 (659) Requisitos de Envasado y Almacenamiento/ Pruebas Físicas
USP 39
Envases a Granel Para Farmacias: Envases de una preparación estéril para uso parenteral que contienen muchas monodosis. El contenido está destinado para su uso en programas de preparación de mezclas en farmacias y está restringido a Ja preparación de mezclas para infusión o al llenado de jeringas estériles vacías con un dispositivo de transferencia estéril. Luego de Ja reconstitución, su cierre debe ser perforado sólo una vez usando un dispositivo de transferencia estéril o equipo dispensador que permita Ja dosificación medida del contenido. El Envase a Granel Para Farmacias sólo se empleará en un área de trabajo adecuada, por ejemplo, una campana de flujo laminar (o un área equivalente de aire limpio para preparación magistral). La nomenclatura Envase a Granel Para Farmacias se limita a Inyecciones, artículos para Inyección o Emulsiones Inyectables según se define en ·~~(~~!1i~llqi~~~a:!1é~.1!i)'~;¡¡1:~&;;oí:~,;¡~¡~~~¡~¡. Los Envases a Granel Para Farmacias, aunque más de una monodosis, están exentos del límite de volumen de 30 mL para envases multidosis, y del requisito de contener una sustancia o mezcla de sustancias adecuada para prevenir el crecimiento de microorganismos. Cuando un envase se ofrece como Envase a Granel Para Farmacias, la etiqueta debe (a) indicar explícitamente "Envase a Granel para Farmacias-No usar para infusión directa", (b) contener o hacer referencia a información sobre técnicas apropiadas para ayudar a garantizar el uso seguro del producto, y (c) llevar una declaración que limite el tiempo en el que el envase se puede usar una vez perforado el cierre, siempre que su contenido se haya mantenido en las condiciones de almacenamiento declaradas. Inyecciones de Pequeño Volumen: Inyección monodosis destinada para uso intravenoso y que se envasa en envases que declaran contener 100 mL o menos. Inyecciones de Gran Volumen: Inyección monodosis destinada para uso intravenoso y que se envasa en envases que declaran contener más de 100 ml. Envases Seguros para Niños: Sistemas de envases diseñados o construidos para cumplir con las normas de la Consumer Product Safety Commission (Comisión de Seguridad para el Consumidor) relacionadas con la apertura de envases por parte de niños (16 CFR § 1700.20). Envases Adecuados para la Tercera Edad: Sistemas de envases diseñados o construidos para cumplir con las normas de la Consumer Product Safety Commission (Comisión de Seguridad para el Consumidor) relacionadas con la apertura de envases por parte de personas de edad avanzada (16 CFR § 1 700.20). Envases Que Evidencian su Alteración Intencional: Sistemas de envases que no pueden ser abiertos sin la destrucción evidente del sello o de alguna otra parte del sistema de envase. Envases Impermeables: Sistemas de envases que protegen a los artículos de la contaminación por líquidos, sólidos o vapores extraños; de la pérdida del artículo; y de eflorescencia, delicuescencia o evaporación en condiciones habituales o acostumbradas de manejo, transporte, almacenamiento y distribución. Ver Envases-Pruebas de Desempeño (671 ). Envases Bien Cerrados: Sistemas de envases que protegen a los artículos de la contaminación por sólidos y líquidos extraños y de la pérdida del artículo en condiciones habituales o acostumbradas de manejo, transporte, almacenamiento y distribución. Ver (671 ). Envases Resistentes a la Luz: Sistemas de envases que protegen el contenido de los efectos de la luz por medio de las propiedades específicas del material que los compone, incluyendo los recubrimientos aplicados sobre los mismos. Un envase translúcido o incoloro y transparente puede convertirse en un envase resistente a la luz mediante una cubierta exterior opaca o mediante un envase secundario, en cuyo caso la etiqueta del envase debe indicar que es imprescindible el uso de la cubierta opaca o que se requiere el envase secundario hasta que el artículo se haya usado o administrado. Ver (671 ), Prueba de Transmisión de Luz.
ENVASES PARA GASES MEDICINALES Cilindro de Gas: Un cilindro de gas es un sistema de envase metálico construido de acero o aluminio diseñado para contener gases medicinales a presión. Los gases medicinales incluyen Dióxido de Carbono USP, Helio USP, Aire Medicinal USP, óxido nítrico, Óxido Nitroso USP, Nitrógeno NF y Oxígeno USP. Como medida de seguridad, se recomienda el Sistema de Seguridad de encaje pareado "Pin-lndex" para dióxido de carbono, ciclopropano, helio, aire medicinal, óxido nitroso y oxígeno en cilindros de Tamaño E o menor.
COMPONENTES RELACIONADOS Muchos componentes relacionados se gradúan para administración en dosis determinadas. Es responsabilidad del fabricante garantizar que se provea el componente de dosificación apropiado o que se especifique un componente para propósitos generales, como los descritos en esta sección, para la administración de la dosis apropiada con la exactitud prevista. Las graduaciones deben ser visibles e indelebles. Los componentes graduados que se decriben en esta sección son de uso general. Las marcas de graduación deben ser legibles, indelebles y deben estar sobre una superficie que no tenga contacto con la boca o producto. En condiciones ideales de uso, el error de volumen en el que se incurre al medir líquidos para la administración de dosis individuales por medio de dichos componentes graduados no debe exceder de 10% de la cantidad indicada de la preparación líquida con la que se usará el componente graduado. Pocas preparaciones líquidas comparten las mismas características superficiales y de flujo. Por tanto, el volumen administrado varía considerablemente de una preparación a otra.
USP 39
Pruebas Físicas/ (659) Requisitos de Envasado y Almacenamiento 519
Los polímeros e ingredientes agregados a los polímeros que se usan en la fabricación de componentes relacionados deben cumplir con los requisitos de las secciones aplicables del Code of Federal Regulations (Código de Reglamentos Federales), Título 21, lndirect Food Additives (Aditivos Alimentarios Indirectos). Dosificador: Dispositivo de medición que consiste en un pequeño vaso que se incluye en el envase de los artículos líquidos orales o que se puede vender o comprar por separado. Cuchara dosificadora: Dispositivo de medición que consiste en una parte cóncava con un mango que se incluye en el envase de los artículos líquidos orales o que se puede vender o comprar por separado. El mango puede ser un tubo graduado. Gotero para Medicamentos: Dispositivo de medición que consiste en un cuerpo o tubo transparente o translúcido que generalmente está equipado con un bulbo depresible. Se incluye en el envase de artículos líquidos orales o se puede vender o comprar por separado. Aunque la capacidad de los goteros generalmente varía, el extremo de descarga debe ser una abertura redonda con un diámetro externo de aproximadamente 3 mm. El cuerpo puede estar graduado. [NOTA-Pocos líquidos medicinales comparten las mismas características superficiales y de flujo que el agua, por lo que el tamaño de las gotas varía considerablemente de una preparación a otra.] Jeringa para Administración Oral: Dispositivo de medición que consiste en un cuerpo y un émbolo fabricados con material de plástico rígido y transparente o translúcido y que tiene un sello en el extremo. Se incluye en el envase de artículos líquidos orales o se puede vender o comprar por separado. La jeringa debe expulsar una cantidad medida del artículo líquido directamente en la boca del paciente. Las alas para los dedos ubicadas en el extremo abierto del cuerpo deben tener un tamaño, forma y resistencia apropiados y deben permitir que la jeringa se pueda sostener de manera segura durante el uso. El cuerpo puede estar graduado. Cucharita de Té: Dispositivo de medición que consiste en una parte cóncava poco profunda, de forma ovalada o redonda, que se encuentra al final de un mango. Se ha establecido que una cucharadita de té contiene 4,93 ± 0,24 mL. Para la administración de artículos, se puede considerar que la cucharadita de té representa 5 mL. Los artículos destinados para administración mediante cucharita de té se deben formular tomando en cuenta una dosificación en unidades de 5 mL, por lo que, siempre que se indique una calibración basada en una cucharadita de té, el componente usado para administrar artículos líquidos deberá liberar 5 ml. Una cuchara disponible en el hogar no es una alternativa aceptable a la cucharita de té graduada descrita en este capítulo.
POISON PREVENTION PACKAGING ACT (LEY DE ENVASES PARA PREVENIR ENVENENAMIENTOS O PPPA) Esta ley exige el uso de envases especiales para la mayoría de los medicamentos de administración por vía oral para humanos de venta bajo receta, medicamentos de administración por vía oral controlados, algunos medicamentos de administración por vía oral de venta sin receta médica, algunos suplementos dietéticos y para muchas preparaciones farmacéuticas de venta libre para proteger al público de lesiones o enfermedades causadas por el uso incorrecto de estas preparaciones (16 CFR §1700.14). El envase primario para sustancias reglamentadas por la PPPA debe cumplir con las normas de los envases especiales (16 CFR §1700.15 y 16 CFR §1700.16, las cuales rigen para todos los tipos de envases, incluidos los que pueden volver a cerrarse, los que no se cierran y los de dosis única. No se requieren envases especiales para los medicamentos que se dispensan en hospitales a pacientes hospitalizados. Los fabricantes o envasadores de medicamentos a granel de venta bajo receta no necesitan usar envases especiales si el medicamento ha de ser reenvasado por el farmacéutico. Los medicamentos de venta bajo receta reglamentados por la PPPA se pueden dispensar en envases inseguros para niños si el comprador lo solicita o si la receta original así lo indica (15 U.S.C. §1473). Los fabricantes o envasadores de medicamentos de venta libre reglamentados por la PPPA están autorizados a envasar un tamaño de producto en envases inseguros para niños siempre que provean el tamaño de venta habitual en envases especiales. Los envases inseguros para niños requieren un etiquetado especial (16 CFR §1 700.5).
CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO En algunas monografías se establecen instrucciones específicas con respecto a las condiciones de almacenamiento, p.ej., la temperatura o humedad, a las que se debe almacenar y transportar el artículo. Estas condiciones aplican excepto cuando la etiqueta del artículo indique condiciones de almacenamiento diferentes que se basan en estudios de estabilidad. Cuando no se proporcionan condiciones de almacenamiento específicas en la monografía individual, pero la etiqueta de un artículo establece condiciones de almacenamiento basadas en estudios de estabilidad, tales instrucciones de almacenamiento son las que se deben aplicar. Las condiciones de almacenamiento vigentes para artículos se definen de acuerdo con los siguientes términos. Congelador: Es un lugar con una temperatura mantenida entre -25º y -1 Oº (-13º y 14 ºF). Refrigerador: Es un lugar con una temperatura mantenida entre 2º y 8º (36º y 46 ºF). Frío: Toda temperatura que no exceda de 8º (46 ºF). Fresco: Toda temperatura entre 8º y 15º (46º y 59 ºF). [NOTA-Cuando se indique que un artículo debe almacenarse en un lugar fresco, puede almacenarse o transportarse, alternativamente, en un refrigerador, a menos que se especifique algo diferente en la monografía individual.]
520 (659) Requisitos de Envasado y Almacenamiento/ Pruebas Físicas
USP 39
Temperatura Ambiente: La temperatura predominante en un área de trabajo. Temperatura Ambiente Controlada: La temperatura mantenida entre 20º y 25º (68º y 77 ºF) prevalente en el ambiente usual de trabajo. También se deben cumplir las siguientes condiciones: La temperatura cinética media no debe exceder de 25º. La temperatura cinética media es un valor calculado que corresponde a la temperatura isotérmica que simula los efectos no isotérmicos de las variaciones de temperatura de almacenamiento. Se permiten desviaciones entre 15º y 30º (59º y 86 ºF) experimentadas en farmacias, hospitales y depósitos y durante el transporte, siempre que la temperatura cinética media no exceda de 25º. Se permiten elevaciones pasajeras de temperatura no superiores a 40º siempre que no duren más de 24 horas. Sólo se permiten elevaciones superiores a 40º cuando el fabricante así lo instruye. Los artículos pueden etiquetar para almacenamiento a "temperatura ambiente controlada" o "hasta 25º", u otra referencia escrita con base en la misma temperatura cinética media. Un artículo para el que se indique almacenamiento a Temperatura Ambiente Controlada alternativamente puede almacenarse o distribuirse en un lugar fresco o refrigerado, a menos que se especifique algo diferente en la monografía individual o en la etiqueta. Cálido: Toda temperatura entre 30º y 40º (86º y 1 04 ºF). Calor Excesivo: Toda temperatura por encima de 40º (1 04 ºF). Lugar Seco: El término "lugar seco" se refiere a un sitio con una humedad relativa promedio que no exceda de 40% a 20º (68 ºF) o de la presión de vapor de agua equivalente a otras temperaturas. La determinación puede hacerse por medición directa en el lugar o basándose en información de las condiciones climáticas. La determinación se basa en por lo menos 12 mediciones espaciadas equitativamente y realizadas ya sea durante una estación del año, durante un año, o si los registros los demostrasen, durante el periodo de almacenamiento del artículo. Puede haber valores de hasta 45% de humedad relativa siempre que el promedio no exceda de 40%. Se considera almacenamiento en un lugar seco al almacenamiento de un envase que haya sido validado para proteger al artículo del vapor de agua, incluyendo el almacenamiento a granel. Protección contra la congelación: Cuando además del riesgo de rotura del envase, la congelación de un artículo pueda ocasionar la pérdida de contenido o potencia, o la alteración destructiva de sus características, la etiqueta del envase indica las instrucciones apropiadas para proteger al artículo contra la congelación. Protección contra la Luz: Cuando la luz pueda ocasionar la pérdida de contenido o potencia de un artículo, o la alteración destructiva de sus características, la etiqueta del envase indica las instrucciones apropiadas para proteger al artículo de la luz.
(660) ENVASES-VIDRIO DESCRIPCIÓN Los envases de vidrio para uso farmacéutico están destinados a entrar en contacto directo con los productos farmacéuticos. El vidrio usado para los envases farmacéuticos es de borosilicato (neutro) o de soda, cal y sílice. El vidrio de borosilicato contiene cantidades significativas de óxido bórico, óxido de aluminio y óxidos alcalinos y/o alcalino térreos en el entramado vítreo. Debido a su composición química, el vidrio de borosilicato presenta una alta resistencia hidrolítica y una alta resistencia al impacto térmico; está clasificado como vidrio Tipo l. El vidrio de soda, cal y sílice es un vidrio de sílice que contiene óxidos de metales alcalinos, principalmente óxido de sodio y óxidos alcalino térreos, principalmente óxido de calcio en el entramado vítreo. Debido a su composición química, el vidrio de soda, cal y sílice presenta una resistencia hidrolítica moderada; está clasificado como vidrio Tipo 111. El tratamiento adecuado de la superficie interna de los envases de vidrio de soda, cal y sílice Tipo 111 aumentará su resistencia hidrolítica de un grado moderado a alto, cambiando así la clasificación del vidrio a Tipo 11. A continuación, se presentan recomendaciones con respecto a la aptitud del tipo de vidrio para envases de productos farmacéuticos, basadas en las pruebas de resistencia hidrolítica. Los envases de vidrio Tipo 1 son adecuados para la mayoría de los productos para uso parenteral y no parenteral. Los envases de vidrio Tipo 11 son adecuados para la mayoría de los productos acuosos ácidos y neutros para uso parenteral y no parenteral. Los envases de vidrio Tipo 11 se pueden usar para productos parenterales alcalinos siempre que se demuestre su aptitud mediante datos de estabilidad. Los envases de vidrio Tipo 111 por lo general no se usan para productos parenterales ni para polvos para uso parenteral, excepto cuando se cuenta con datos de pruebas de estabilidad adecuados que indican que el vidrio Tipo 111 es satisfactorio. Se puede tratar la superficie interna de los envases de vidrio para mejorar su resistencia hidrolítica. Asimismo, se puede tratar la superficie externa de los envases de vidrio para reducir la fricción o para proteger de la abrasión o rotura. El tratamiento de la superficie externa se realiza de manera que no contamine la superficie interna del envase. El capítulo Envases de Vidrio-Evaluación de la Durabilidad de la Superficie Interna (1660) proporciona información sobre la composición química de los tipos de vidrio, la formación de los envases de vidrio y los factores que afectan la durabilidad de la superficie interna de los envases de vidrio. Este capítulo también contiene metodología recomendada para evaluar el potencial que tiene un medicamento para ocasionar la formación de partículas de vidrio y descamación.
Pruebas Físicas/ (660) Envases-Vidrio 521
USP 39
El vidrio se puede colorear para que ofrezca protección de la luz mediante la adición de pequeñas cantidades de óxidos de metales y se analiza según se indica en Transmisión Espectral para Envases de Vidrio Coloreado. Un envase transparente e incoloro que se convierte en un envase resistente a la luz mediante una envoltura opaca (ver el capítulo Requisitos de Envasado y Almacenamiento (659), Envases Resistentes a la Luz) está exento de los requisitos de transmisión espectral.
PRUEBAS ESPECÍFICAS La Prueba de Vidrio Granulado en combinación con la Prueba de Vidrio Superficial para resistencia hidrolítica determina el tipo de vidrio. La resistencia hidrolítica se determina por la cantidad de álcali que libera el vidrio en las condiciones especificadas. Dicha cantidad de álcali es extremadamente pequeña en el caso de los vidrios más resistentes, por lo que es muy importante prestar la debida atención a todos los detalles de las pruebas y utilizar aparatos de alta calidad y precisión. La utilización de material de referencia estándar (SRM, por sus siglas en inglés) de vidrio en forma rutinaria al realizar estas pruebas, ayuda a asegurar la exactitud del método. Los materiales de referencia para vidrio de borosilicato (SRM 623) y vidrio de soda, cal y sílice (SRM 622) están disponibles en el Instituto Nacional de Normas y Tecnología del gobierno de EE.UU. (National lnstitute of Standards and Technology, NIST). Estas pruebas deben realizarse en un área relativamente exenta de humos y polvo excesivo. La selección de la prueba se presenta en la Tabla 7 y la Tabla 2. Tabla 1. Determinación de Tipos de Vidrio Tipo de Envase 1, 11, 111
Prueba Prueba de Vidrio Granulado
Propósito Distingue el vidrio de borosilicato Tipo 1del vidrio de soda, cal y sílice Tipos 11 y 111
La superficie interna de los envases de vidrio es la superficie de contacto para las preparaciones farmacéuticas, y la calidad de esta superficie se determina mediante la Prueba de Vidrio Superficial para resistencia hidrolítica. La Prueba de Atacado de Superficie se puede usar para determinar si la alta resistencia hidrolítica se debe a la composición química o al tratamiento de la superficie. Como alternativa, la comparación de los datos de la Prueba de Vidrio Granulado y la Prueba de Vidrio Superficial se puede usar en la Tabla 2. Tabla 2. Determinación de la Resistencia Hldrolítica de la Superficie Interna Tipo de Envase
1, 11, 111
1, 11
Prueba
Propósito
Prueba de Vidrio Superficial
Determina la resistencia hidrolítica de la superficie interna; distingue entre envases Tipo /y Tipo 11 con alta resistencia hidrolítica, y envases Tipo 111 con resistencia hidrolítica moderada
Prueba de Atacado de Superficie o comparación de los datos de la Prueba de Vidrio Granulado y la Prueba de Vidrio Superficial
Cuando resulta necesario, determina si la alta resistencia hidrolítica se debe al tratamiento de la superficie interna o a la composición química de los envases de vidrio
Los envases de vidrio deben cumplir con sus especificaciones respectivas de identidad y resistencia hidrolítica superficial para ser clasificados como vidrio Tipo 1, 11 o 111. Los envases Tipo 1o Tipo 11 para productos parenterales acuosos se analizan para determinar la presencia de arsénico extraíble.
Resistencia Hidrolítica APARATO Autoclave: Para estas pruebas, usar un autoclave capaz de mantener una temperatura de 121 ± 1º, equipado con un termómetro, o un termopar calibrado que permita una medición de la temperatura independente del sistema de autoclave; un registrador adecuado; un manómetro, una válvula de ventilación y una bandeja con suficiente capacidad para acomodar el número de envases requeridos para llevar a cabo la prueba por encima del nivel del agua. Limpiar el autoclave y demás aparatos minuciosamente con Agua Purificada antes de usar. Mortero y mano de mortero: Usar un mortero y una mano de mortero de acero endurecido, construidos de acuerdo con las especificaciones de la Figura 7.
522 (660) Envases-Vidrio/ Pruebas Físicas
USP 39
40
1{>48 1{>50
60
1{>75
Figura 1. Mortero y mano de mortero para pulverizar vidrio. Otros aparatos: También se requiere un juego de tres tamices enmarcados, de malla cuadrangular de acero inoxidable Nº 25, 40 y 50, según la numeración de EE.UU. (ver Estimación de la Distribución del Tamaño de Partícula por Tamizado Analítico (786), Tabla 7. Tamaños de las Series de Tamices Estándar según el Intervalo de Interés); un agitador mecánico para tamices o una máquina de tamizado que pueda usarse para tamizar los granos; un martillo magnético de acero templado; un imán permanente; frascos de pesada; tapones; lámina metálica (p.ej. aluminio, acero inoxidable); un horno de aire caliente con capacidad de mantener una temperatura de 140 ± 5°; una balanza capaz de pesar hasta 500 g con una exactitud de 0,005 g; un desecador y un baño ultrasónico.
REACTIVOS Agua exenta de dióxido de carbono: Se trata de Agua Purificada que se ha calentado a ebullición vigorosa durante 5 minutos o más y se ha dejado enfriar protegiéndola de la absorción de dióxido de carbono de la atmósfera, o Agua Purificada con una resistividad no menor de 18 Mohm-cm. Solución de rojo de metilo: Disolver 50 mg de rojo de metilo en 1,86 mL de hidróxido de sodio O, l M y 50 mL de etanol (96%), y diluir con Agua Purificada hasta 100 mL. Para analizar la sensibilidad, agregar 100 mL de agua exenta de dióxido de carbono y 0,05 mL de ácido clorhídrico 0,02 M a O, 1 mL de la solución de rojo de metilo. La solución resultante debe ser roja. No se requieren más de 0, 1 mL de hidróxido de sodio 0,02 M para cambiar el color a amarillo. El cambio de color de rojo a amarillo corresponde a un cambio en el pH de 4,4 (rojo) a 6,0 (amarillo).
Prueba de Vidrio Granulado La Prueba de Vidrio Granulado se puede realizar sobre los envases o sobre las cañas que se usan para fabricar envases tubulares de vidrio. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA Enjuagar los envases a analizar con Agua Purificada y secar en el horno. Envolver al menos tres de los artículos de vidrio en papel limpio y triturar hasta obtener dos muestras de aproximadamente 100 g cada una en trozos con un tamaño de no más de 30 mm. Colocar en el mortero 30-40 g de las piezas con un tamaño de entre 1 O y 30 mm tomadas de una de las muestras, insertar la mano del mortero y golpearla firmemente con el martillo una sola vez. Como alternativa, transferir las muestras a un molino de bolas, agregar las bolas y triturar el vidrio. Transferir el contenido del mortero o del molino de bolas al tamiz más grueso (Nº 25) de los tamices. Repetir la operación hasta que todos los fragmentos hayan sido transferidos al tamiz. Agitar manualmente los tamices durante un periodo breve y retirar el vidrio remanente en los tamices Nº 25 y Nº 40. Triturar de nuevo estas porciones, repitiendo la operación hasta que queden aproximadamente 1Og de vidrio en el tamiz Nº 25. Desechar esta porción y la porción que pase a través del tamiz Nº 50. Volver a montar los tamices y agitar durante 5 minutos. Transferir a un frasco de pesada los granos de vidrio que pasaron a través del tamiz Nº 40 y que quedaron retenidos en el tamiz Nº 50. Repetir el procedimiento de triturado y tamizado con la segunda muestra de vidrio hasta obtener dos muestras de granos, cada una con un peso mayor de 1Og.
USP 39
Pruebas Físicas/ (660) Envases-Vidrio 523
Extender cada muestra sobre una pieza de papel satinado limpio y extraer las partículas de hierro pasándo el imán sobre ellas. Transferir cada muestra a un vaso de precipitados para limpiarlas. Agregar 30 ml de acetona a los granos en cada vaso de precipitados y frotar los granos usando medios adecuados, como por ejemplo, una varilla de vidrio con punta de goma o recubierta de plástico. Después de frotar los granos, dejar que sedimenten y decantar la mayor cantidad de acetona posible. Agregar 30 ml adicionales de acetona, agitar por rotación suave, decantar y agregar una nueva porción de acetona. Llenar el vaso del baño ultrasónico con agua a temperatura ambiente, luego colocar el vaso de precipitados en la gradilla y sumergirlo hasta que el nivel de acetona esté al mismo nivel que el agua; aplicar ultrasonido durante 1 minuto. Agitar por rotación suave el vaso de precipitados, dejar que sedimente y decantar la mayor cantidad de acetona posible; luego repetir la operación de limpieza ultrasónica. Si persiste una leve turbidez, repetir la limpieza ultrasónica y el lavado con acetona hasta que la solución permanezca transparente. Agitar por rotación suave y decantar la acetona. Secar los granos colocando el vaso de precipitados primero sobre una placa tibia y luego calentando a 140º durante 20 minutos en un horno de secado. Transferir los granos secos de cada vaso de precipitados a sendos frascos de pesada, tapar y enfriar en un desecador. MÉTODO Llenado y calentamiento: Pesar 10,00 g de los granos limpios y secos en dos matraces Erlenmeyer diferentes. Pipetear y transferir 50 ml de Agua Purificada exenta de dióxido de carbono a cada uno de los matraces Erlenmeyer (soluciones de prueba). Pipetear y transferir 50 ml de Agua Purificada exenta de dióxido de carbono a un tercer matraz Erlenmeyer que servirá como blanco. Distribuir los granos de manera uniforme sobre las bases planas de los matraces agitando suavemente. Cubrir los matraces con placas de vidrio neutro o papel aluminio enjuagados con Agua Purificada o con vasos de precipitados invertidos de modo tal que las superficies internas de los vasos de precipitados se ajusten fácilmente a los bordes superiores de los matraces. Colocar los tres matraces en el autoclave que contiene el agua a temperatura ambiente y asegurar que se mantengan sujetos por encima del nivel del agua en el vaso. Realizar las siguientes operaciones: 1. Insertar el extremo de un dispositivo termométrico calibrado en un envase lleno a través de un agujero de aproximadamente el diámetro del termopar y conectarlo a un dispositivo de medición externo. Si el envase es demasiado pequeño para insertar un termopar, aplicar un termopar en un envase similar adecuado. Como alternativa, usar el termómetro interno del autoclave. 2. Cerrar firmemente la puerta o la tapa del autoclave, dejando la válvula de venteo abierta. 3. Iniciar el registro automático de la temperatura en función del tiempo y calentar el autoclave a una velocidad regular tal que se libere vapor vigorosamente por la válvula de venteo después de 20-30 minutos, y se mantenga la liberación vigorosa de vapor durante 1O minutos adicionales. Para los autoclaves que usan un generador de vapor, no es necesario mantener la temperatura durante 1O minutos a 100º. 4. Cerrar la válvula de venteo y aumentar la temperatura de 100º a 121 ºa una velocidad de 1º /min durante 20-22 minutos. 5. Mantener la temperatura a 121 ± 1º durante 30 ± 1 minutos, desde el momento en que se alcanza la temperatura de espera. 6. Enfriar hasta 100º a una velocidad de 0,5º /min, ventilando para evitar la formación de vacío, durante 40-44 minutos. 7. No abrir el autoclave hasta que se haya enfriado hasta 95º. 8. Retirar las muestras calientes del autoclave tomando las precauciones de seguridad apropiadas y enfriar las muestras con cuidado a temperatura ambiente durante 30 minutos, evitando el impacto térmico. Valoración: Agregar 0,05 ml de Solución de rojo de metilo a cada uno de los tres matraces. Valorar la solución blanco inmediatamente con ácido clorhídrico 0,02 M, luego valorar las soluciones de prueba hasta que el color sea idéntico al obtenido con la solución blanco. Restar el volumen de valoración para la solución blanco del volumen de valoración de las soluciones de prueba. Calcular el valor medio de los resultados, en ml, de ácido clorhídrico 0,02 M por gramo de la muestra. Repetir la prueba si los valores más altos y más bajos observados difieren en más del intervalo permisible provisto en la Tabla 3. Tabla 3. Intervalo Permisible de los Valores Obtenidos Media de los Valores Obtenidos para el Consumo de Solución de Ácido Clorhídrico por gramo de Granos de Vidrio (ml/g)
Intervalo Permisible de los Valores Obtenidos
No más de 0,10
25% de la media
0,10-0,20
20% de la media
No menos de 0,20
10% de la media
NOTA-Cuando se necesite obtener un punto final bien definido, decantar la solución transparente en un matraz diferente de 250 ml. Enjuagar los granos agitando por rotación suave con tres porciones de 15 ml de agua exenta de dióxido de carbono y agregar los lavados a la solución principal. Agregar 0,05 ml de la Solución de rojo de metilo. Valorar y calcular según se indicó anteriormente. En este caso, agregar también 45 ml de Agua Purificada exenta de dióxido de carbono y 0,05 ml de Solución de rojo de metilo a la solución blanco. LÍMITES El volumen no excede los valores indicados en la Tabla 4.
524 (660) Envases-Vidrio/ Pruebas Físicas
USP 39
Tabla 4. Límites de Prueba para la Prueba de Vidrio Granulado Volumen Máximo de HCI 0,02 M por g de Vidrio de Prueba (ml) Volumen de Llenado (ml)
Tipol
1
0,1
1
Todos
Tipos 11 y 111 0,85
Prueba de Vidrio Superficial DETERMINACIÓN DEL VOLUMEN DE LLENADO El volumen de llenado es el volumen de Agua Purificada que se debe agregar al envase para los fines de la prueba. Para viales, frascos, cartuchos y jeringas, el volumen de llenado es 90% de la capacidad de desbordamiento. Para ampollas, se refiere al volumen hasta la altura del hombro. Viales y frascos: Seleccionar seis viales o frascos secos del lote de muestra, o tres si su capacidad excede de 100 mL, y eliminar toda suciedad o residuo. Pesar los envases vacíos con una exactitud de O, 1 g. Colocar los envases sobre una superficie horizontal y llenarlos con Agua Purificada hasta aproximadamente el borde superior, evitando el desbordamiento y la introducción de burbujas de aire. Ajustar los niveles de líquido hasta la línea de desbordamiento. Pesar los envases llenos para obtener la masa de agua expresada con dos decimales para envases con un volumen nominal menor o igual a 30 mL, y expresada con un decimal para envases con un volumen nominal mayor de 30 mL. Calcular el valor medio de la capacidad de desbordamiento en mL y multiplicarlo por 0,9. Este volumen, expresado con un decimal, es el volumen de llenado para el lote de envases particular. Cartuchos y jeringas: Seleccionar seis jeringas o cartuchos secos y sellar la pequeña abertura (la boca de los cartuchos; el cierre Luer o la aguja insertada de las jeringas), usando un material inerte. Determinar la capacidad de desbordamiento media y el volumen de llenado de acuerdo con Viales y frascos. Ampollas: Colocar al menos seis ampollas secas sobre una superficie horizontal plana y llenarlas con Agua Purificada usando una bureta hasta que el agua alcance el punto A, donde el cuerpo de la ampolla comienza a estrecharse para formar el hombro de la ampolla (ver la Figura 2). Leer las capacidades, expresadas con dos decimales y calcular el valor medio. Este volumen, expresado con un decimal, es el volumen de llenado para el lote de ampollas particular. El volumen de llenado se puede determinar también por peso.
A
Figura 2. Volúmenes de llenado de ampollas hasta el punto A. PRUEBA La determinación se lleva a cabo en envases sin usar. Los volúmenes de la solución de prueba requeridos para la determinación final se presentan en la Tabla 5. Tabla 5. Volumen de Solución de Prueba y Número de Valoraciones Volumen de Llenado (ml)
Volumen de Solución de Prueba para Una Valoración (ml)
No más de 3
25,0
1
3-30
50,0
2
30-100
100,0
2
No menos de 100
100,0
3
Número de Valoraciones
Pruebas Físicas/ (660) Envases-Vidrio 525
USP 39
MÉTODO Limpieza: Eliminar cualquier residuo o polvo. Poco antes de la prueba, enjuagar cada envase cuidadosamente al menos dos veces con Agua Purificada, llenar con Agua Purificada y dejar en reposo hasta su análisis. Inmediatamente antes del análisis, vaciar los envases; enjuagarlos una vez con Agua Purificada, luego con agua exenta de dióxido de carbono y dejar que escurran. Completar el procedimiento de limpieza dentro de los 20-30 minutos desde el momento del primer enjuage. Las ampollas cerradas se pueden entibiar en un baño de agua o en una estufa de aire a no más de 40º durante aproximadamente 2 minutos antes de abrirlas para evitar el aumento de presión en el envase. No enjuagar antes de analizar. Llenado y calentamiento: Llenar los envases con agua exenta de dióxido de carbono hasta el volumen de llenado. Cerrar los envases en forma de cartucho o jeringas prellenables de manera adecuada con material que no interfiera con la prueba. Se debe cerrar holgadamente cada envase, incluidas las ampollas, con un material inerte, como por ejemplo, una tapa de vidrio neutro o papel aluminio previamente enjuagados con Agua Purificada. Colocar los envases en la bandeja del autoclave, el cual contiene una cantidad de agua tal que la bandeja permanece por encima del agua. Cerrar el autoclave y realizar los pasos 1-8 del procedimiento de autoclavado según se indica en la Prueba de Vidrio Granulado, excepto que la temperatura debe mantenerse a 121 ± 1º durante 60 ± 1 minutos. Si se usa un baño de agua para enfriar las muestras, procurar que el agua no entre en contacto con las cubiertas de papel aluminio que las cubren sin ajustar, para evitar la contaminación de la solución de extracción. Las soluciones de extracción se analizan valorando de acuerdo con el método descrito a continuación. Valoración: Llevar a cabo la valoración dentro de la primera hora después de retirar los envases del autoclave. Combinar los líquidos obtenidos de los envases y mezclar. Introducir el volumen prescrito (ver la Tabla 5) en un matraz Erlenmeyer. Transferir el mismo volumen de agua exenta de dióxido de carbono a un segundo matraz similar para usarlo como blanco. Agregar a cada matraz 0,05 mL de Solución de rojo de metilo por cada 25 mL de líquido. Valorar el blanco con ácido clorhídrico 0,01 M. Valorar la solución de prueba con el mismo ácido hasta que el color de la solución resultante sea igual que el obtenido para el blanco. Restar el valor encontrado para la valoración con el blanco, del encontrado para la solución de prueba y expresar los resultados en mL de ácido clorhídrico 0,01 M por 100 mL de solución de prueba. Expresar los valores de la valoración menores de 1,0 mL con dos decimales; expresar los valores de la valoración mayores o iguales a 1,0 mL con un decimal. LÍMITES Los resultados, o el promedio de los resultados si se realiza más de una valoración, no exceden los valores declarados en la Tabla 6. Tabla 6. Valores Límite para la Prueba de Vidrio Superficial Volumen de Llenado (mL}
Volumen Máximo de HCI 0,01Mpor100 mL de Solución de Prueba (mL} Tipos I y 11
Tipo 111
No más de 1
2,0
20,0
1-2
1,8
17,6
2-3
1,6
16,1
3-5
1,3
13,2
5-10
1,0
10,2
10-20
0,80
8,1
20-50
0,60
6,1 4,8
50-100
0,50
100-200
0,40
3,8
200-500
0,30
2,9
No menos de 500
0,20
2,2
Prueba de Atacado de Superficie La Prueba de Atacado de Superficie se usa de manera adicional a la Prueba de Vidrio Superficial cuando es necesario determinar si se ha tratado la superficie de un envase y/o para distinguir entre envases de vidrio Tipo 1y Tipo 11. Como alternativa, se puede usar la Prueba de Vidrio Granulado y la Prueba de Vidrio Superficial. La Prueba de Atacado de Superficie puede realizarse con muestras sin usar o con muestras usadas en la Prueba de Vidrio Superficial. MÉTODO Viales y frascos: Los volúmenes de solución de prueba requeridos se presentan en la Tabla 5. Enjuagar los envases dos veces con Agua Purificada, llenar hasta el punto de desbordamiento con una mezcla de un volumen de ácido fluorhídrico y nueve volúmenes de ácido clorhídrico, y dejar en reposo durante 1O minutos. Vaciar los envases y enjuagar cuidadosamente cinco
526 (660) Envases-Vidrio/
Pruebas Físicas
USP 39
veces con Agua Purificada. Inmediatamente antes de la prueba, enjuagar una vez más con Agua Purificada. Someter estos envases al mismo procedimiento de esterilización en autoclave y determinación según se indica en la Prueba de Vidrio Superficial. Si los resultados son considerablemente más altos que los obtenidos de las superficies originales (por un factor de aproximadamente 5-1 O), significa que la superficie de las muestras ha sido tratada. [Precaución-El ácido fluorhídrico es extremadamente agresivo. Incluso en cantidades pequeñas puede ocasionar lesiones que ponen en riesgo la vida.] Ampollas, cartuchos y jeringas: Aplicar el método de prueba según se indica en Viales y frascos. Si la superficie de las ampollas, cartuchos y jeringas no ha sido tratada, entonces los valores obtenidos serán ligeramente más bajos que los obtenidos en las pruebas previas. [NOTA-La superficie interna de las ampollas, cartuchos y jeringas fabricadas con tubos de vidrio Tipo 1 normalmente no se somete a tratamiento.] DISTINCIÓN ENTRE ENVASES DE VIDRIO TIPO 1 Y TIPO 11 Los resultados obtenidos de la Prueba de Atacado de Superficie se comparan con los obtenidos de la Prueba de Vidrio Superficial. Para envases de vidrio Tipo 1, los valores obtenidos son cercanos a los obtenidos en la Prueba de Vidrio Superficial. Para envases de vidrio Tipo 11, los valores obtenidos exceden en gran medida a los obtenidos en la Prueba de Vidrio Superficial; y son similares pero no mayores que los obtenidos para envases de vidrio Tipo 111 con el mismo volumen de llenado.
IMPUREZAS
Arsénico (211) Usar como Preparación de Prueba 35 mL de agua de un envase de vidrio Tipo 1o Tipo 11, o para envases más pequeños, 35 mL del contenido combinado de varios envases de vidrio Tipo 1o Tipo 11, preparados según se indica en la Prueba de Vidrio Superficial. El límite no excede de O, 1 µg/g.
FUNCIONALIDAD
Transmisión Espectral para Envases de Vidrio Coloreado APARATO Un espectrofotómetro UV-Vis, equipado con un detector de fotodiodos o un tubo fotomultiplicador acoplado con una esfera de integración. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA Romper el envase de vidrio o cortarlo con una sierra circular equipada con un disco abrasivo en húmedo, como por ejemplo, un disco de carborundo o diamante. Seleccionar las secciones representativas del espesor de la pared y cortarlas de un tamaño adecuado para montarlas en un espectrofotómetro. Después de cortar, lavar y secar cada muestra, procurando no rayar las superficies. Si la muestra es demasiado pequeña para cubrir la abertura del portamuestras, cubrir la porción descubierta de la abertura con cinta o papel opaco, siempre que la longitud de la muestra sea mayor que la de la abertura. Antes de colocar en el portamuestras, lavar, secar y limpiar la muestra con un paño para lentes. Montar la muestra con ayuda de cera u otros medios adecuados, procurando no dejar huellas dactilares u otras marcas. MÉTODO Colocar la muestra en el espectrofotómetro con su eje cilíndrico paralelo a la abertura y de tal manera que el haz de luz sea perpendicular a la superficie de la sección y que las pérdidas por reflexión sean mínimas. Medir la transmisión de la muestra con respecto al aire en la región espectral 290-450 nm, de manera continua o en intervalos de 20 nm. LÍMITES La transmisión espectral observada para envases de vidrio coloreado para productos no parenterales no excede del 10% a cualquier longitud de onda en el intervalo 290-450 nm, independientemente del tipo y capacidad del envase de vidrio. La transmisión espectral observada en los envases de vidrio coloreado para productos parenterales no excede los límites provistos en la Tabla 7.
Pruebas Físicas/ (661) Sistemas de Envases Plásticos 527
USP 39
Tabla 7. Límites de Transmisión Espectral para Envases de Vidrio Coloreado para Productos Parenterales Volumen Nominal (mL)
Percentaje Máximo de Transmisión Espectral a Cualquier Longitud de Onda entre 290 nm y 450 nm Envases Sellados a la Llama
Envases con Cierres
No más de 1
50
25
1-2
45
20
2-5
40
15
5-10
35
13
10-20
30
12
No menos de 20
25
10
Cambio en la redacción:
(661) ~SISTEMAS DE ENVASES PLÁSTICOS Y SUS MATERIALES DE CONSTRUCCIÓN INTRODUCCIÓN El capítulo Requisitos de Envasado y Almacenamiento <659/ considera y define los sistemas, y sus materiales y componentes de construcción asociados, que se usan para envasar productos terapéuticos (farmacéuticos, productos biológicos, suplementos dietéticos y dispositivos). Dichos sistemas pueden construirse con materiales y componentes plásticos. Los plásticos usados en los sistemas de envases están compuestos por polímeros homólogos con una variedad de pesos moleculares y contienen aditivos tales como antioxidantes, estabilizantes, lubricantes, plastificantes, colorantes, entre otros. La naturaleza y la cantidad de aditivos en los plásticos usados para los sistemas de envases son dictadas por el tipo de polímero, el uso del polímero y el proceso usado para convertir el polímero en componentes, envases o sistemas de envase. Los productos terapéuticos entran en contacto directo con los sistemas de envases y sus materiales plásticos de construcción a medida que el producto es fabricado, almacenado y administrado. Dicho contacto puede resultar en una interacción entre los productos terapéuticos y los sistemas de envase y sus materiales o componentes de construcción. Estas interacciones deben ser de tal manera que la aptitud de uso (incluyendo su seguridad y eficacia) del producto terapéutico y de los sistemas de envases no se vea afectada de manera adversa por la interacción. Aunque la aptitud de uso incluye varios aspectos relacionados con la calidad del medicamento envasado y su desempeño, la aptitud de uso tratada en este capítulo es la seguridad del paciente. La obtención de un resultado necesario y deseable se facilita mediante el uso de materiales plásticos de construcción bien caracterizados en componentes, envases y sistemas de envases, y mediante el análisis apropiado de los sistemas de envase.
ALCANCE El establecimiento de la aptitud de sistemas de envases plásticos para productos terapéuticos implica múltiples pruebas y procedimientos de análisis, tal como se describe brevemente a continuación: •Evaluación del material: Caracterización de los materiales de construcción de un sistema de envase para evaluar los ingredientes como posibles sustancias extraíbles y potenciales sustancias lixiviables. Dicha caracterización facilita la identificación de materiales que son adecuados para su uso en sistemas de envases. • Estudio de extracción controlada (simulación): Estudio de extracción controlada (simulación) en las condiciones más exigentes para determinar el grado en el que las sustancias extraíbles pueden convertirse en probables sustancias lixiviables (para información adicional, ver el capítulo Evaluación de Sustancias Extraíbles Relacionadas con Envases Farmacéuticos y Sis-
temas de Administración (1663)). • Evaluación del producto: Medición en circunstancias reales de las sustancias lixiviables confirmadas en el producto terapéutico en el envase farmacéutico y el sistema de administración destinado para la comercialización (para información adicional, ver el capítulo Evaluación de Sustancias Lixiviables en Medicamentos Relacionadas con Envases Farmacéuticos y Sis-
temas de Administración (1664)). Además, la información provista por el proveedor de los sistemas de envase plásticos y sus materiales relacionados o componentes de construcción pueden facilitar las evaluaciones de aptitud, puesto que dicha información puede representar adiciones apropiadas o sustitutos de los resultados obtenidos al realizar las pruebas citadas anteriormente. El proceso de fabricación de un producto terapéutico envasado es complejo. Considerando específicamente el sistema de envase, los sistemas de envases por lo regular constan de componentes que se fabrican de manera individual a partir de materiales plásticos de construcción. Estos materiales plásticos de construcción individuales inicialmente se generan a partir de reac-
528 (661) Sistemas de Envases Plásticos/ Pruebas Físicas
USP 39
tivos que se hacen reaccionar para producir un polímero base, que posteriormente se mezcla con diversos aditivos para producir una resina base. Las resinas base individuales son por sí mismos materiales de construcción o pueden combinarse con aditivos adicionales y coadyuvantes de procesamiento para formar un material plástico de construcción. El análisis de estos materiales plásticos de construcción para establecer que han sido bien caracterizados y que son adecuados para su uso, específicamente considerando la seguridad, en sistemas de envases está dentro del alcance de esta serie de capítulos y se trata en el capítulo Materiales Plásticos de Construcción (661.1 ). Los materiales plásticos de construcción individuales se combinan para formar componentes del sistema de envase. El sistema de envase se completa ensamblando sus diversos componentes para obtener la forma final. El análisis de los sistemas de envase para establecer que son adecuados para sus usos pretendidos, específicamente en lo que concierne a la seguridad, está dentro del alcance de esta serie de capítulos y se trata en el capítulo Sistemas de Envases Plásticos para Uso Farmacéutico (661.2). Los sistemas de envases ensamblados se llenan con el producto terapéutico mediante diversos métodos y en varios puntos en el proceso de fabricación del sistema de envase, con lo que se genera el producto terapéutico envasado. El análisis de los productos terapéuticos envasados para establecer que son adecuados para su uso pretendido se trata en las monografías farmacopeicas pertinentes al producto terapéutico específico y está fuera del alcance de esta serie de capítulos. Para mayor inforrnqción sobre el alcance, la aplicabilidad y otros temas rel¡u;:ionados con el conjunto de capítulos generales (661), ver el capítulo Evaluación de Sistemas de Envases Pfásticos y sus· Materiales de Construcción con Respecto a su Impacto sobre la Seguridad del Usuario (1661 >·•usr39
Agregar lo siguiente:
•(661.1) MATERtALES PLÁSTICOS DE CONSTRUCCIÓN INTRODUCCIÓN El uso de materiales bien caracterizados para construir sistemas de envases es una de las principales formas para asegurar que el sistema de envase sea apto para su uso previsto. Los materiales se ca.racterizan de modo tal que sus propiedades y características puedan coi.ncidir con los requisitos del sistema de envase, con lo que se facilita la selección íntencional de materiales apropiados. Para los propósitos de este capítµlo, se considera que un material plástico de construcción está bien caracterizado para su uso previsto si se han establécido de manera adecuada las siguientes características: su identidad, biocompatibilidad (reactívidád biológica), propiedades f.isicoquímicas generales y composición (es decir, aditivos y metales e:xtraíbles que pudieran estar presentes). Establecer el efecto potencial quetiene un material de construcción sobre la seguridad no puede basarse en una sola estrategia de análisis individual, debido a que una sola estrategia de análisis no puede abarcar todos los atributos dél material que pueden tener un impacto potencial sobre la seguridad. El análisis químico prescrito en el capítulo es ortogonal en el sentido de que las secciones de Pruebas Fisícoquímícas proveen una perspectiva general de las sustancias extraídas, las secciones Metales Extrafbles tratan tas fuentes potenciales de impurezas elementales; y la información provista por las pruebas de Aditivos Plásticos tratan las potenciales sustancias extraíbles orgánicas. Debido a que el análisis químico por sí solo puede no ser adecuado para establecer.la aptitud de uso de un material, el análisis químico se complementa con el enfoque ortogonal de establecer la reactividad biológica.
ALCANCE El propósito de este capítulo es proveer métodos y especificaciones de prueba para materiales plásticos de construcción usados en .sistemas dé envases. Este capítulo se aplica únicamente a matéría:les plásticos individuales y no debe aplicarse a sistemas dé envases o componentes que consten de. múltiples materiales plásti.cos individuales. El análisis y la calificación de los sistemas de envases plásticos y sus componentes para uso farmacéutico se tratan en el capítulo Sistemas de Envases Plásticos para Uso Farma.céutico {661.2}. Este cápítulo contiene pruebas, métodos y especificaciones para los siguientes materiales: olefinas cíclicas, polletileno, poliprop.ileno, tereftalato de pólietileno, tereftalato C d.e polietiléno y éloru.to de polivinilo plastificado. Se pueden usar otros materíales plásticos en los sistemas de envases si se establece su aptitud de uso mediante análisis consistentes con los procedimientos y especificaciones generales provistos en este capítulo para los materiales mencionados previamente. Como alternativa, los materiales plásfü;:os individuales de cónstrücción se consider<')n bien caracterizados y apropiados para su uso siempre que se utilicen en uri sistema de envase que cumpla con los requisitos del capítulo (661.2) o si el sistema de envase ha sido considerado apropiado para uso farmacéutico por la .autoridad reglamentaria apropiada. Dicha conclusión sólo es válida para el sistema de envas.e específico que cumple con .los requisitos del capítulo {661.2) y no puede extenderse a otros sistemas de envases
USP 39
Pruebas Físicas / (661 .1) Materiales Plásticos de Construcción 529
llllllllallllll P:lllltlill
530 (661.1) Materiales Plásticos de Construcción/ Pruebas Físicas
USP 39
Calorimetría de barrido diferencial-El termograma de la muestra es similar al termograma del ER Polietileno de Baja Densidad USP y la temperatura de transición (T9) obtenida a partir del termograma de la muestra no difiere de aquella del Estándar de Referencia en más de 8,0º. Polietileno de alta densidad Espectrofotometrfa en el Infrarrojo-Determinar el espectro infrarrojo desde 3800 cm-1 hasta 650 cm- 1 (2,6-15 µm). La muestra presenta un espectro de absorción que es sustancialmente equivalente al del ER Polietileno de Alta Densidad USP. La equivalencia sustancial, al contrario de la exacta, permite diferencias espectrales menores que surgen de la variación natural de la composición y/o variación física entre polímeros de esta clase. La equivalencia sustancial se logra cuando todas las diferencias entre los espectros de la muestra y del Estándar de Referencia pueden ser explicadas en el contexto de dichas variaciones naturales de la composición y/o variaciones físicas. Calorimetría de barrido diferencial-El termograma de la muestra es similar al termograma del ER Polietileno de Alta Densidad USP y la temperatura de transición (T9) obtenida a partir del termograma de la muestra no difiere de aquella del Estándar de Referencia en más de 6,0º. PRUEBAS FISICOQUÍMICAS
Absorbanda: La absorbancia máxima es 0,2. Acidez o alcalinidad: Se requieren no más de 1,5 mL de hidróxido de sodio 0,01 N para cambiar el color del indicador a azul. Se requiere no más de 1,O mL de ácido clorhídrico 0,01 N para alcanzar el inicio del cambio de color del indicador de amarillo a anaranjado. Carbono orgánico total: La diferencia entre las concentraciones de carbono orgánico total de la muestra y el blanco es no más de 5 mg/L. METALES EXTRAÍBLES
Aluminio: La Solución S3 (ver la Tabla 3) contiene no más de 0,4 mg/L (ppm), correspondientes a 1 µg/g. Arsénico, cadmio, plomo, mercurio, cobalto y níquel: Informar el valor medido en la Solución S3 de valores por encima de 0,01 mg/L (ppm), correspondientes a 0,025 µg/g. Si los valores medidos están por debajo de estos valores, informar el resultado como menos de 0,01 mg/L (ppm}, correspondientes a menos de 0,025 µg/g. Cromo: La Solución S3 contiene no más de 0,02 mg/L (ppm), correspondientes a 0,05 µg/g. Titanio: La Solución S3 contiene no más de 0,4 mg/L (ppm), correspondientes a 1 µg/g. Vanadio: La Solución S3 contiene no más de 0,04 mg/L (ppm), correspondientes a O, 1 µg/g. Cinc: La Solución S3 contiene no más de 0,4 mg/L (ppm), correspondientes a 1 µg/g. Circonio: La Solución S3 contiene no más de 0,04 mg/L (ppm), correspondientes a O, 1 µg/g. Los resultados de prueba para metales extraíbles relevantes adicionales se informan de manera similar. ADITIVOS PLÁSTICOS. ANTIOXIDANTES FENÓLICOS. ANTIOXIDANTES NO FENÓLICOS. COPOLÍMERO DE SUCCINATO DE DIMETILO Y (4-HIDROXl-2,2,6,6-TETRAMETILPIPERIDIN-1-IL)ETANOL, AMIDAS Y ESTEARATOS Se deben informar los resultados de prueba de estos análisis.
Olefinas Cíclicas IDENTIFICACIÓN
Espectrofotometría en el infrarrojo: Determinar el espectro infrarrojo desde 3800 cm-1 hasta 650 cm- 1 (2,6-15 µm). La muestra presenta un espectro de absorción que es sustancialmente equivalente al del ER Polímero de Olefina Cíclica USP o al ER Copolímero de Olefina Cíclica USP. La equivalencia sustancial, al contrario de la exacta, permite diferencias espectrales menores que surgen de la variación natural de la composición y/o variación física entre polímeros de esta clase. La equivalencia sustancial se logra cuando todas las diferencias entre los espectros de la muestra y del Estándar de Referencia pueden ser explicadas en el contexto de dichas variaciones naturales de la composición y/o variaciones físicas. Calorimetría de barrido diferencial: Debido a la naturaleza amorfa de estos polímeros y a su variedad en su composición, se pueden anticipar variaciones entre materiales en la temperatura de transición (T9). Por ende, no se recomienda ni se requiere realizar una calorimetría de barrido diferencial. PRUEBAS FISICOQUÍMJCAS
Absorbancia:
La absorbancia máxima es 0,2.
USP 39
Pruebas Físicas/ (661.1) Materiales Plásticos de Construcción 531
532 (661.1) Materiales Plásticos de Construcción/ Pruebas Físicas
USP 39
Tereftalato de Polietileno y Tereftalato G de Polietileno IDENTIFICACIÓN
Determinar el espectro infrarrojo desde 3800 cm-1 hasta 650 cm- 1 (2,6-15 µm). La muestra presenta un espectro de absorción que es sustancialmente equivalente al del ER Tereftalato de Polietileno USP o del ER Tereftalato G de Polietileno USP. La equivalencia sustancial, al contrario de la exacta, permite diferencias espectrales menores que surgen de la variación natural de la composición y/o variación física entre polímeros de esta dase. La equivalencia sustancial se logra cuandotodaslas diferencias entre los espectros de la• muestra y del Estándar de Referencia pueden ser explicadas en el contexto de dichasvariaeiones naturales de la.composición y/o variaciones físicas. Espectrofotometría en el infrarrojo:
Calorhnetría de barrido· diferendal Tereftalato de polietlleno-EI termograma de la muestra es similar al termograma del ER Tereftalato de Polietileno USP. La temperatura de transición vítrea (T9 ) obtenida partir deltermograma de la muestra no difiere de aquella del Estándar de Ref.eren·
a
da en más de 4,0 9 • Tereftalato G de polietileno~EI term()grama de la muestra es similar al termograma del ER Tereftalato G de Polietileno. USP. La temperatura de transición vítrea (T9 ) obtenida a partir del termograma de la muestra no difiere de aquella del Estándar de Referencia en más de 6,0.º, PRUEBAS FISICOQUÍMICAS
Absorbancia: Las absorbancia máxima es 0,2 para Ja Solución S1y0,05 para la Solucíón SS. Para el tereftalato de polietileno con color, la absorbancia máxima entre 400y 800 nm es 0105 par¡da Solución S1. Acidez. o alcalinidad: Se requieren nó más de 0,5 ml de hidróxiclo de sódio 0,01 N para cambiar el color del indicador a azul. Se requieren no más de·0,5 ml de ácido clorhídricoO,Ol.N para alcanzar el.inicio del cambio de colordel indicador de amarillo a>anaranjado, Carbono orgánico total: La diferencia entre las con<;entracione.s de q:1rbono orgánico total de la muestra y el blanco es no más·•de5mg/k; METALES EXTAAÍBLES
Aluminio: La Solución SJ(ver la Tabla 3) contiene no más de 0,4 mg/l (ppm), cQrrespQndientes a T µg/g. Antlmonio;•·•·kaSo/up;ónS4.c0 ntil;!neno.másdeQ,4mg/L{pprn),·correspondientesa l·µg/g. ArséniCo, cadmio, plomó, 111erc1Jrio, fobalto, níquel y vanadio:.. Informar el valor medido. en la Solución .53 de valores por encima de o,OT rng/L (ppm), correspondientes a 0,025 µg/g. Si los valores medidos están por debajo de estos valores, infor. mar el resultado C:Omo menos de O,Ol. mg/L(ppm), i:;orrespondientes .a menos de 0,025. µg/g, Bario: La SoluciónS3contiene nomásde 0;4mg/L{ppm), correspondientes a 1 µg/g, Germanio: La· Solución S4 contiene no más de 0,4 mg/L (ppm), correspondientes a• l µg/g. M
Cloruro de PolivinUo Plastificado IDtNTI FICtXCJÓN
Oeterrnínar .el espectro infrarroj.o desde 3800 cm~ 1 . hasta 600 cm- 1. (2,6-16 µm). La muestra presenta 1;10 e~pec~ro .de ¿¡bsorción que es sustancialmente eql!ivalente al del·. tR Cloruro de Po!ivinilo Plastificado USP. La. equivalencia smtancial, .a1· contrario de la>exacta, PE:rtnite dlfereocias espectrales menores que ~urgen. de la variación n~tural de la composición y/o variación fl~ica entre polímeros de esta clase. La eq1Jivale9ciasustancial se l()gra cuando todas tas dife· rencias entre los espectros de la muestra y del ~tándar de Referencia pueden ser explicadas en el contexto de dichas variado· nes naturales de la composicióny/ovaríacioriesfísicás. Calorimetría de barrido d~erenc,al: . ti termograrna de la muestra. es similar al terrnograma del ER Cloruro de Polivinilo Plastificado USP y. la temperatura de transición(T9) obtenida a partir del termograma de la muestra no difiere de aquella .del Estándar de Referencia en 1)1.ásde 8;0º. Teoer en cuenta .ql!e los resultados del análisis porcalorimetría de barrido diferencial dependen en· grar\ medida de la· cantidad de plastífícante en el artículo de prueba. Espec;trofoto01etrí<1 ep eUnfral"r~jo:
PRUEBAS FISICOQUÍMICAS
Absorbancia: No más de 0,25 para la Solución 51
USP 39
Pruebas Físicas/ (661 .1) Materiales Plásticos de Construcción 533
Acidez o alcalinidad: Se requieren no más de 1,5 ml de hidróxido de sodio 0,01 N para cambia(el color del indicador a azul. Se requiere no más de l,O mL de ácido clorhídrico 0,01 N para alcanzar el inicio del cambio de color del indicador de amarillo a anaranjado. Carbono orgánico total: La diferencia· entre las concentraciones de carbono orgánico total de la muestra y el blanco es· no más de 5 mg/L.
METALES EXTRAÍBLES Arsénico, cadmio, plomo, mercurio, cobalto, níquel y vanadio: Informar el valor medido en la Solución 53 de valores por encima. de• O,Ol. mg/L (ppm), correspondientes a 0,025 µg/g. Si· los valores medidos están por debajo de estos valores, infor• mar el resultado como menos de 0,01 mg/L (ppm), correspondientes a menos de 0,025 µg/g. Bario: ·La Solución S3 (ver la· Tabla 3)cor\tiene no más de 0,25 mg/L (ppm}, correspondientes as µg/g. Calcio: La So/uciónS3 contiene no más de 35 mg/L (ppm), correspondientes a 0;07 % en peso. Estaño: La Solución S3 contiene no más de 1 mg/L (ppm), correspondientes a 20 µg/g: Cinc;:: La Solución 53 contiene no más de 100 mg/L (ppm), correspondientes a 0,2 % en peso. Los resultados de prueba para metales extraíbles relevantes adicionales se informan de manera similar. ADITIVOS PLÁSTICOS
Di(2cetilhexil)ftalato: El residuo erno más de 40 mg. NIN''-Diaciletilenediaminas: El residuo erno más de 20 mg, Aceite de soja· epoxidéldo: la diferencia entre las l'nasas de ambos residu:Os es• no más de 1O. mg. Aceite de linaza epoxidado: La difereneia entre· las rnasás de arnbos residuos es no más dé 1O mg: Cloruró devinllo: No más del ppm; Tener en cuenta que el Cloruro de vinilo no es úf1.aditívo, pero sé mórlitoreá como monómero residual.
MÉTODOS· DE PRUEBA Identificación La· prueba de .identific::ación descrita. en .este capítulo es requerida para todos los materiales dé constr'ücdóri ·usados en ros sistemas de envases.· La prueba de identificacion debe realizarse usando los procedimientos indicados en este capítufo (éspectrofotometría en el infrarrojo y análisis térmico). Sí estos procedimientos no son aplicables párá unmaterial particúlar, ehtbhces se.puede usar un procedimiento alternativo. El procedimiento alternativo debe establecer la identidad en base ala obtención de resultados sustancialmente equivalentes para el artículo de prueba y su Estándar de Referencia USP apropiado. Se deb.en establecer especificaciones para materiales que no estén indicados en e~e capítulo, las cuales deben.ser consistentes eón las especificaciones estableddas para los materiales especificados éri este capftulo. Pórejemplo,úna éspeclfiói:ciónde ca!orimefríáde bárrido diferencial para ·url material que no se encuentre listado en este cápffulo debe ser C:onsisteí1te, ef)J¿¡ tjüé respecta a for\güaje y rigor, con u na especificadón de calorimetría de barrido diferencial paraún rhateriáJ que esté li$tá.dd ~n este capítulo [por ejemplo, el índice de concordancia de la temperatura de traásieión ( T9) entre la muestra y e/rhateriál de referencia]. lasidentídades de Jos materiales de construcción sólo necesitan ser establecidas mediante uh procedimiehto de prueba.
Espectrofotometría. en el 1nfrarrojo Aparato: Usar l1n·espectrofotómetro infrarrojo capaz de corregir por el espectro del blanco y capaz de medir en ·modo de transmisión o equipado con un accesorio de reflectancia interno y una placa de reflectancia interna apropiada. Preparación de la muestra Modo de transmisión-Preparar una muestra con un espesor apropiado (aproximadamente 250 µm para polietileno; aproximadamente 100 µm para polipropileno) sin defectos visibles (grietas u orificios). Las muestras pueden compactarse para formar una película delgada y uniforme mediante exposición a temperaturas y presiones elevadas (2000 psi o más). Las temperaturas a las que se generan las películas delgadas representan un cOmpromiso entre producir un fundido (lo cual lo dicta la temperatura necesaria más baja) y degradar la muestra (lo cual lo dicta la temperatura más alta permitida). En último caso, las temperaturas que se usan son apropiadas si la película producida es conductiva para el análisis IR. Modo de reflectancia interna-Preparar una sección plana y cortarla según sea necesario para obtener un segmento que sea conveniente para el montaje en el accesorio de reflectancia interna. limpiar la muestra con papel seco o, si fuera necesario, con un trapo suave empapado con metano!, teniendo cuidado de no rayar las superficies, y dejar que éstas se sequen. Antes de montar la muestra en la placa, compactarla para formar una película uniforme exponiéndola a temperaturas elevadas bajo alta presión (2000 psi o más). Posteriormente, asegurar la muestra sobre la placa de reflexión interna asegurando el contacto adecuado con la superficie.
USP 39
534 (661.1) Materiales Plásticos de Construcción / Pruebas Físicas
Procedimiento~ Colocar los cortes de muestra montados en el compartimiento de la muestra del espectrofotómetro infrarrojo o en el accesorio de reflectancia interna, y colocar el montaje en el haz de la muestra del espectrofotómetro infrarrojo. Para reflectancia interna, ajustar la posición de la muestra y los espejos dentro del accesorio para permitir la máxima transmisión de luz del haz de referencia sin atenuar. (Para un instrumento de doble haz, atenuar el haz de referencia después de completar el ajuste en el accesorio para permitir la deflexión a escala completa durante el barrido de la muestra.)
Análisis Térmico Referirse al capítulo Análisis Térmico {891 ). Colocar aproximadamente 12 mg de muestra en la bandeja colectora de muestra. [NOTA-El contacto íntimo entre la bandeja colectora y el termopar es esencial para obtener resultados reproducibles.] Determinar el termograma bajo nitrógeno, usando condiciones de calentamiento/enfriamiento especificadas para el tipo de polímero y usando equipo capaz de realizar determinaciones según lo descrito en el capítulo (891 ). Los termogramas se obtienen para los materiales de prueba y sus Estándares de Referencia USP asociados. Preparación de la muestra:
Procedimiento
Políetileno-Determinar el termograma bajo nitrógeno a temperaturas de entre 40º y 200º a un intervalo de calentamiento de entre 2º y 1 Oº/minuto, seguido por enfriamiento, a una velocidad de entre 2º y 10º/minuto, hasta 40º. Tereftafato de pofieti/eno-Calentar la muestra desde temperatura ambiente hasta 280º a una velocidad de calentamiento de aproximadamente 20º /minuto. Mantener la muestra a 280º durante 1 minuto. Enfriar rápidamente la muestra hasta temperatura ambiente y volver a calentarla a 280º a una velocidad de calentamiento de Sº /minuto. Tereftalato G de po/ietileno-Calentar la muestra desde temperatura ambiente hasta 120º a una velocidad de calentamiento de aproximadamente 20º /minuto. Mantener la muestra a 120º durante 1 minuto. Enfriar rápidamente la muestra hasta temperatura ambiente y volver a calentarla a 120º a una velocidad de calentamiento de 1Oº /minuto. Olefina cfclica-Determinar el termograma bajo nitrógeno a temperaturas que vayan desde temperatura ambiente hasta 30º por arriba del punto de fusión. Mantener la temperatura durante 1O minutos, fuego enfriar a 50º por debajo del pico de. la temperatura de cristalización a una velocidad de 1 Oº a 20º/minuto. Polipropileno-Determinar el termograma bajo nitrógeno a temperaturas que vayan desde temperatura ambiente hasta 30º por arriba del punto de fusión. Mantener la temperatura durante 1O minutos, luego enfriar a 50º por debajo del pico de la temperatura de cristalización a una velocidad de 1Oº a 20º /minuto. Cloruro de polivinilo plastificado-Calentar la muestra desde -20º hasta 120º a una velocidad de calentamiento de aproximadamente l Oº/minuto. Enfriar rápidamente la muestra .a temperatura ambiente. Otros materiales-Las muestras deben calentarse y enl'ríarse de una manera apropiada para el material de prueba y que facilite la generación un termograll1a utilizable.
Extracciones El análisis füicoquímico del material plástico requiere la extracción o disolución del mismo. Se proveen diversas pruebas basadas en varios métodos de extracción. La Tabla 3 describe los extractos que se generan y las pruebas que se realizan a dichos extractos. Las secciones subsiguientes tratan sobre métodos para producir los extractos. Se debe tener en cuenta que estos extractos pueden usarse para otras pruebas distintas a las pruebas fisicoquímicas. Tabla 3. Extracciones Realizadas para Varias Pruebas Químicas Pruebas Realizadas en Plásticos Usando la Solución de Extracción Especificada
Extracción
51
52
Solución de Extracción
Agua
Tolueno
Polietileno, Olefina Cíclica y Pollpropileno
Absorban cía Acidez/alcalinidad Carbono orgánico total
Tereftalato de Polietlleno y Tereftalato G de Polletileno
Absorbancia Acidez/alcalinidad Carbono orgánico total
Antioxidantes fenólicos, antioxidantes no fenólicos, amidas y estearatos N/A Metales extraíbles: Al, Sb, Metales extraíbles: Al, As, Cd, Co, Crb, Hg, Ni, Pb, Ti, As, Ba, Cd, Co, Ge, Hg, V, Zn y Zr' Mn, Ni, Pb, Tí, V y Zn
Cloruro de Polivinllo Plastificado
Absorbanciaª Acidez/alcalinidad Carbono orgánico total
N/A Metales extraíbles: As, Ba, Ca, Cd, Co, Hg, Ni, Pb, Sn, V y Zn
53 Ácido Metales extraíbles: Sb y Ge N/A 54 Álcali N/A Absorbancia Alcohol N/A N/A 55 ª Aunque este extracto es adecuado para su uso con estos métodos para ingredientes específicos, dicho extracto puede ser útil para otras pruebas diseñadas a establecer la composición de un material. 0 Para políetileno no plastificado únicamcinte. e No aplicable para olefinas cíclicas.
USP 39
Pruebas Físicas/ (661.1) Materiales Plásticos de Construcción 535 EXTRACCIÓN CON AGUA, SOL{.JCJÓN S1
Polietileno, olefinas cíclicas y polipropileno: Colocar 25 g del material de prueba en un matraz de vidrio de borosilicato con cuello de vidrio esmerilado. Agregar 500 mL de Agua Purificada y calentar a ebullición en condidones de réflujo durante 5 horas. Dejar que se enfríe y filtrar la solución de extracción a través de un filtro devidrio sinterizad<:); Recolectar el filtrado en un matraz volumétrico de 500 mL ydiluir con Agua Purificada a volumen; la solución diluida se de/lamina Solución 51. Usar la Solución S1 dentro de las 4 horas de su preparación. Tereft¡¡Jato de polietileno y tereftalato G de polietileno: Colocar 1Og del material de prueba en un matraz de vidrio de borosilicato con cuello de vidrio esmerilado. Agregar 200 mL de Agua Purificada y calentar a 50 durante 5 horas. Dejar que se enfríe, decantar la solución en un matraz volumétrico de 200 mly diluir con Agua Purificada a volumen; la muestra diluida se denomina Solución S1. Usar la Solución Sl dentro de las 4 horas de su preparación. Cloruro de po/ívínilo plastificado-Colocar 25 g del material de prueba en un matraz de vidrio de borosilicato. Agregar 500 ml de Agua Purificada, tapar el cuello del matraz con papel aluminio o un vaso de precipitados de borosilicato y calentaren un autoclave a 121 ± 2º durante 20 minutos. Dejar que la solución se enfríe y que los sólidos sedimenten, de<;antar.Ja. soluc:;ión en un matraz volumétrico de 500 ml y diluifcon Agua Purificada a volumen; la solución diluida se denomina Solución .S 1. EXTRACCIÓN CON TOLUENO, .SOLUCIÓN S2 Polietileno, olefinas cíclicas y polipropileno: Colocar 2,0 g del material de prueba en un matraz de vidr.io de borosilicato de 250 mL con cueUo de vidrio esmerilado. Agregar 80ml de tolueno y calentar a ebullición en un condensador de reflujo duran· te 1,5 horas, mezclando constantemente. Dejar que se enfríe a 60º y agregar, mezclando cbntinuamente, l 20 mL de metano!. Pasar la solución resultante a través de un filtro de vidrio sinterizado. Enjuagar el matraz y el filtro con 25 ml de una mezcla de 40 mLde toli.Jeno y 60mL de metano!, agregar los enjuagues alfiltradóy diluir hasta 250 mi... con la mismame.;zc:;la de disol~ ventes para producir la Solución S2. Preparar una solución blanco. EXTRACCIÓN CON ÁCIDO, SOLUCIÓNS.3 Polietileno, olefinas cíclicas y polipropileno: · Colocar 100 g del material de prueba en un matraz de vidrio de botosilicato con un cuello de vidrio esmerilado. Agregar 250 mi... de ácido clorhídrico O, l N y calentar a ebullición en un condensador de reflujo durante 1 hora mezclando constantemente. Dejar que se enfríe, decantar la solución en un matraz volumétrico de 250 mL y diluir con ácido clorhídrico O, 1 N a volumen; la solución diluida se denomina Solución S3. Tereftalato de polietileno y tereftalato G de polietileno: Colocar 20 g del material de prueba en un matraz de vidrio de borosilicato con cuello de vidrio esmerilado. Agregar 50 ml de ácido clorhídrico O, 1 N y calentar a 50º durante 5 horas. Dejar que se enfríe, decantar la solución en un matraz volumétrico de 50 ml y diluir con ácido clorhídrico·O,l Na volumen; la solu~ ción diluida se denomina Solución S3. Usar la Solución S3 dentro de las 4 horas de su preparación. Cloruro de polivinilo plastificado: Colocar 5 g en un matraz de vidrio de borosilicato con un cuello de vidrio esmerilad(). Agregar 100 mi... de ácido clorhídrico O, 1 N y calentar a ebullición en un condensádor de reflujo durante 1 hórá mezclando constantemente. Dejar que se enfríe y que los sólidos sedimenten, decantar la solución en un matraz volumétrico de 100 mL y diluir con ácido clorhídrico O, 1 N a volumen; la solución diluida se denomina Solución S3. EXTRACCIÓN CON ÁLCAU, SOLUCIÓN S4 Tereftalato de polietileno y tereftalato G de polietileno: Colocar 20 g del material de prueba en un matraz de vidrio de borosilicato con cuello de vidrio esmerilado. Agregar 50 mL de hidróxido de sodio 0,01 N y calentar a 50º durante 5 horas. Dejar que se enfríe y que los sólidos sedimenten, decantar la solución en un matrazvolumétriéo de 50 ml ydiluircon hidróxido de sodio 0,01 Na volumen; ta solución diluida se denomina Solución S4. Usar la Solución S4 dentro de las 4 horas de su preparación. EXTRACCIÓN CON ALCOHOi..., SOLUCIÓN SS Tereftalato de polietileno y tereftalato G de polietileno: Colocar 1Og del material de prueba en un matraz de vidrio de borosilicato con cuello de vidrio esmerilado. Agregar 100 mL de alcohol absoluto, y calentar a 50 durante 5 horas. Dejar que se enfríe y que los sólidos sedimenten, luego decantar la solución para producir la Solución SS. Usar la Solución SS dentro de las 4 horas de su preparación.
Pruebas Fisicoquímicas ABSORBANCIA Referirse al capítulo Espectroscopía Ultravioleta-Visible <857).
536 (661.1) Materiales Plásticos de Construcción/ Pruebas Físicas
USP 39
Polietileno, olefinas cíclicas y polipropileno: Determinar el espectro entre 220 y 340 nm en la Solución S1. Tereftalato de polietileno y tereftalato G de polietileno: Determinar el espectro entre 220 y 340 nm en la Solución S1. Para tereftalato de polietileno de color, determinar el espectro entre 400 y 800 nm en la Solución S1. Para tereftalato de polietileno de color y sin color, determinar el espectro entre 400 y 800 nm en la Solución 55. Cloruro de polivinilo plastificado: Evaporar 100 mL de Solución S1 hasta sequedad. Disolver el residuo resultante en 5 mL de hexano para producir la muestra de hexano. Pasar la muestra de hexano, si fuera necesario, a través de un filtro previamente enjuagado con hexano. Determinar el espectro entre 250 y 31 O nm en la muestra de hexano. Adicionalmente, sólo para materiales de cloruro de polivinilo no plastificado, determinar el espectro entre 250 y 330 nm en la muestra de alcohol asociada con la Solución S3. ACIDEZ O ALCALINIDAD
Solución indicadora de BRP: 1,0 mg/mL de azul de bromofenol, 0,2 mg/ml de rojo de metilo y 0,2 mg/ml de fenolftalefna en alcohol. Filtrar la solución resultante. Solución de anaranjado de metilo: Disolver 100 mg de anaranjado de metilo en 80 mL de Agua Purificada y diluir con alcohol R hasta 100 mL. Prueba de sensibilidad: Agregar O, 1 mL de Solución de anaranjado de metilo a l 00 mL de Agua Purificada exenta de dióxido de carbono. Se requiere no más de O, 1 ml de ácido clorhídrico 1 N para cambiar el color de amarillo a rojo. PoHetiJeno, olefinas cíclicas y polipropileno: Agregar O, 15 ml de Solución indicadora de BRP a 100 ml de Solución S1. Determinar el volumen consumido de hidróxido de sodio 0,01 N requerido para cambiar el color del indicador a azul. Agregar 0,2 mL de Solución de anaranjado de metilo a u na porción separada de 100 m L de Solución 51. Determinar el volumen consumido de ácido clorhídrico 0,01 N para alcanzar el inicio del cambio de color del indicador de amarillo a anaranjado. Tereftalato de polietileno y tereftalato G de polietileno: Agregar O, 15 mL de Solución indicadora de BRP a 50 mL de Solución S7. Determinar el volumen consumido de hidróxido de sodio 0,01 N requerido para cambiar el color del indicador a azul. Agregar 0,2 mL de Solución de anaranjado de metilo a una porción separada de 50 rnL de Solución s7. Determinar el volumen consumido de ácido clorhídrico 0,01 N para alcanzar el inicio del cambio de color del indicador de amarillo a anaranjado. Cloruro de polivinilo plastificado: Agregar O, 15 mL de Solución indicadora de BRP a 100 mL de Solución 51. Determinar el volumen consumido de hidróxido de sodio 0,01 N requerido para cambiar el color del indicador a azul. Agregar 0,2 ml de Solución de anaranjado de metilo a 100 mL de Solución S1 ..Determinar el volumen consumido de ácido clorhídrico 0,01 N para alcanzar el inicio del cambio de color del indicador de amarillo a anaranjado. CARBONO ORGÁNICO TOTAL
El contenido de carbono orgánico total de la Solución S1 se. mide de acuerdo con las metodologías generales descritas en el capítulo Carbono Orgánico Total {643). Sin embargo, aunque el capítulo {643) está diseñado .para el análisis de agua de alta pureza con valores bajos de carbono orgánico total, los extractos de materiales pueden tener valores de carbono orgánico to· tal que son superiores a los del agua purificada debido a las sustancias orgánicas extraídas. Por consiguiente, el método usado para realizar los análisis de carbono orgánico total debe tener un límite de detección de 0¡2 mg/L (ppm) y debe tener un ínter· valo dinámico lineal demostrado de 0,2 a 20 mg/L (ef cuaf abarque ef límite de carba.no orgánico total). Se puede usar un intervalo lineal con una concentración superior siempre que se establezca la linealidad. Si los extractos de la muestra exceden este intervalo lineal superior, deben ser diluidos apropiadamente para el análisis.
Metales Extraíbles El análisis de· Metales Extraíbles descrito en este capítulo es requerido para todos los materiales plásticos de construcc.i.ón usados en sistemas de envases, independientemente de si el. material está especificado en este capítulo. Específicamente, todos los materiales deben ser analizados para detectar aquellos metales listados en la Tabla 3 y cualquier otro metal que sea relevante en el sentido de que se conoce o se puede anticipar razonablemente su presencia en el material de prueba. PROCEDIMIENTO DE EXTRACCIÓN
Los materiales plásticos usados en sistemas de envases para artículos médicos no se disuelven en condiciones de uso, sino que las sustancias derivadas de los sistemas de envase se acumulan en los artículos envasados a través del proceso de lixiviación (extracción). Por consiguiente, el proceso de preparación de muestras apropiado y pertinente para evaluar metales en los materiales de construcción de un sistema de envase es la extracción del material de plástico, al contrario de la digestión completa. La Solución S3 (extracción con ácido) y la Solución S4 {extracción con álcali) preparadas para las Pruebas Fisicoquímicas (Tabla 2) son los extractos de material que se analizan para determinar la presencia de metales extraíbles.
USP 39
Pruebas Físicas/ (661.1) Materiales Plásticos de Construcción 537
538 (661.1) Materiales Plásticos de Construcción/ Pruebas Físicas
USP 39
USP 39
Pruebas Físicas/ (661.1) Materiales Plásticos de Construcción 539
540 (661.1) Materiales Plásticos de Construcción/ Pruebas Físicas
USP 39
Sistema cromatográfico {Ver Cromatografía (621), Cromatografía en Capa Delgada.) Placa: Gel de sílice para cromatografía en capa delgac;la GF254 (1 mm de espesor) Método: Aplicar 0,5 ml de Solución A 1 a la placa como una banda de 30 mm x 3 mm. Aplicar 5 µL de cada So/ucíón de referencia a la placa. Desarrollar ta placa con un recorrido .de 15 cm usando tolueno. Secar la placa con cuidado. Aditivo Ftalato de di(2-etilhexilo): UV 254 nm; localizar la zona correspondiente al aditivo ftalato de di(2-etilhexilo) (R1 aproximadamente 0,4). Retirar el área del gel de sílice correspondiente a esta zona, mezclar con 40 ml de éter etílico y agitar durante l minuto. Filtrar, enjuagar con dos cantidades de éter etílico, cada un;'l c;le 1O mL, agregar los enjuagues al filtrado y evaporar hasta sequedad. El residuo pesa no más de 40 mg. Aditivo Aceite de soja epoxidado y aditivo aceite de linaza epoxidado: Exponer la placa a vapor de yodo durante 5 mi· nutos. Observar elcromatograma y localizar la banda correspondiente al aditivo aceite de soj!'l epoxidado y al aditivo ;'lceite de linaza epoxidado (R1 "" O). Retirar el área del gel de sílice correspondiente a esta banda. De manera similar, retirar l.m área correspondiente del gel de sílice como blanco de referencia. Mezclar por separado ambas muestras con porciones separac;las de 40 ml de metano!, agitando durante 15 minutos. Filtrar, enjuagar el filtr() con dos volúmenes de 10 mL de metano!, agregar los. enjuagues al filtrado y evaporar hasta sequedad. La diferencia entre las masas de ambos resíduos es no más de 1 O mg. Aditivo N,N'-diaciletilendiaminas: Lavar el precipitado B2 con alcohol absoluto. Secar hasta peso constante sobre pentóxido de difósforo y pesar el filtro. El precipitado pesa no más de 20 mg. • CLORURO DE VINILO
Solución de estándar interno: Usando una microjeringa,inyectar 10 µLde éteretílicoen20,0 ml deN1 N"dimetilacetami~ da, sumergiendo la punta de la aguja en el disolvente, Inmediatamente antes de su uso, diluir la solución hasta 1000 veces su volumen con N,N-dimetilacetamída. Solución muestra: Colocarl ,O g del material de prueba en un vial de 50 ml vial, y agregar 10,0 ml de Soluciónde estándar interno. Cerrar el vial y asegurar con un tapón. Agitar, evitando el contacto entre el tapón y el líquido, Colocar el vial en un baño de agua a 60 ± 1º durante 2 horas. Solución primaria de cloruro de vinilo: [NOTA-Preparar en una campana ventilada.] Colocar 50,0 ml de N,N-dimetilace· tamida en un vial de 50 ml, tapar el vial, asegurar el tapón y pesar con una aproximación de 0,1 mg. Llenar urájeringa de polietileno o polipropileno de 50 ml con cloruro de vinilo gaseoso, dejar que el gas permanezca en contacto con la jeringa durante aproximadamente 3 minutos, vaciar la jeringa y llenar nuevamente con 50 ml de cloruro de vinilo gaseoso. Equipar la jeringa con una aguja hipodérmica y reducir el volumen de gas en la jeringa de 50 a. 25 mL Inyectar los 25 mL remanentes de cloruro de vinilo lentamente en el vial, agitando suavemente y evitando el contacto entre eUíquído y la aguja. Pesar el vial nuevamente; el aumento en el peso es de aproximadamente 60 mg (1 µL de la solución obtenida contiene aproximadamente 1,2 µg de cloruro de vinilo). Dejar en reposo durante 2 horas; Almacenar la solución primara en un refrigerador. Solución estándar de cloruro de vinilo: Agregar 3 volúmenes de N,N-dimetílacetamida a 1 volumen de Solución primaria de cloruro de vinilo. Soluciones de referencia: Colocar 10,0 mL de Solución de estándar interno en C;'lda uno de seisviale~ de 50ml. Cerrarlos viales y asegurar los tapones. Inyectar 1; 2; 3; 5 y 1O µL, respectivamente, de So/ución:estándar de Cloruro devinílo en cinco de los viales. Por consiguíente, las seis soluciones obtenidas contíenen1respectivamente, 0;.0,3; 0,6; 0,9; 1,5 y 3 µg de cloruro de vinilo.Agitar, evitando el contacto entre el tapón y el líquido. Colocarlos viales en un baño·deagua a.60±1º.durante2·horas. Sistema• cromatográfico (Ver Cromatografía (621 ), Cromatografía de Gases.) <:otümna: .•Acero inoxidable de 3. m x3. mm· rellena con tierra diatomácea silanizada para cromatógrafo de gases.impregnadac:on 5%·m/m de dimetilestearilamida y5%m/m depolietilenglicol 400 Gas transportador: Nitrógeno para cromatografía Velocidad de flujo: 30 ml/min Temperaturas Columna: 45º Inyector: 100º C>etector: 150º Análisis Muestra: Inyectar 1 mt de la fase gaseosa de cada vial que contiene la Solución muestra y las Soluciones de.referencia. Calcular la cantidad de cloruro de vinilo en la ~olución muestrQ comparando el. resultado de prueba de la Solución muestra con los resultados de las Soluciones dé reférencia. Calcular la cantidad de cloruro de vinilo en el materia[de prueba dividiendo la cantidad de cloruro de vinilo eh la Sofuciónmuestraporl,0 g, produciendo un resúltado en µg/g o ppm. •Estándares de Referencia USP (1 l) ER Butil Hidroxitolueno USP ER. Polfmerode Olefina Cíclica lJSP ER Copolírnero de OJefína Cíclica USP ERPoHetileno. de Alta Densidad· USP ER Homopolímero de Polipropileno USP ERPolietileno de Baja Densidad USP ER Aditivo Plástico 01 USP
USP 39
Pruebas Físicas/ (661.2) Sistemas de Envases Plásticos 541
¡¿~:.sist~fflas:Qe··ei:l.va~$ .~lá$:tit;as'.P'~~·oS9. ~arffla(;eufüfolocl~~n; '~~~t:e''atrl;)si 'qQls~s;;tl'~$c~s,'vlat•t''am~~JJi:mlllBl!lii tíal~dóí;es de polvo secó y dé dosis;fíja, Jeringas
preUenadas; bifSteres, ·oo1s11s. (po1.11:hes)~ así coi:río s~~, <:;ter~si··~~i'ij~i~~
542 (661.2) Sistemas de Envases Plásticos/ Pruebas Físicas
USP 39
o
00°
mllllllli!ll!lllllll llll1l,liloll~llJll1llqit
0000
&
USP 39
Pruebas Físicas/ (661.2) Sistemas de Envases Plásticos 543
Acidez o alcalinidad: Realizar la prueba de Acidez o alcalinidad únicamente cuando los sistemas de envases estén destinados a contener un producto líquido o un producto que se disuelva en su envase antes de su uso. Agregar O, 1 mL de fenolftaleína SR a 20 mL de Solución C1 obtenida ya sea como una porción de la solución de llenado o combinando la solución de llenado de distintos envases; tener en cuenta el color de la solución. Agregar 0,4 ml de hidróxido de sodio 0,01 N; tener en cuenta el color de la solución. Agregar 0,8 mL de ácido clorhídrico 0,01 N y 0, 1 mL de rojo de metilo SR 2; tener en cuenta el color de la solución. Rojo de Metífo SR 2: Prueba de sensibilidad: Agregar 0, 1 mL de solución de rojo de metilo a 100 mL de Agua Purificada exenta de dióxido de carbono y 0,05 mL de ácido clorhídrico 0,02 N. Se requiere no más de 0, 1 ml de ácido clorhídrico 0,02 N para cambiar el color de rojo a amarillo. CARBONO ORGÁNICO TOTAL Referirse al capítulo Carbono Orgánico Total (643). El contenido de carbono orgánico total (TOC, por sus siglas en inglés) de la Solución C1 se mide de acuerdo al capítulo (643). Sin embargo, el capítulo (643) está diseñado para analizar agua de alta pureza con valores bajos de carbono orgánico total. Debido a las sustancias orgánicas extraídas, los extractos de materiales pueden tener valores de carbono orgánico total mucho más altos que los del Agua Purificada. Por ende, los análisis de carbono orgánico total realizados tienen un límite de detección de 0,2 mg/L (ppm) y tienen un intervalo dinámico lineal demostrado de 0,2-20 mg/L (que abarca el límite de carbono orgánico total). Se puede usar un inteNalo lineal con una concentración superior más alta siempre que se establezca la linealidad. Si los extractos de la muestra exceden este intervalo lineal superior, entonces deben diluirse apropladamente para su análisis. SUBUNIDADES TEREHALOÍLO TOTALES EN SISTEMAS DE ENVASES DE TEREFTALATO DE POLIETILENO Y DE TEREFTALATO DE POUHILENO
G
Preparaciones Medios de extracción de tereftafato de polietileno: Alcohol al 50% (diluir 125 ml de alcohol R deshidratado con Agua Purificada hasta 238 ml y mezclar), n-heptano y Agua Purificada. Para cada medio de extracción, llenar un número suficiente de sistemas de envases de prueba hasta el 90% de su capacidad nominal para obtener no menos de 30 ml. Llenar un número correspondiente de frascos de vidrio con cada medio de extracción para usarlos como blancos. Equipar los frascos con sellos impermeables tales como papel de aluminio y colocar los cierres. Incubar los sistemas de envases de prueba y los frascos de vidrio a 49º durante 1O días. Retírar los sistemas de prueba y los frascos de vidrio y almacenar a temperatura ambiente. No transferir las muestras de medio de extracción a vasos de almacenamiento alternativos. Medios de extracción de tereftalato G de polietileno: Alcohol al 25% (diluir 125 ml de alcohol al 50% con Agua Purificada hasta 250 ml y mezclar), n-heptano y Agua Purificada. Proceder según se indica en Medios de extracción de tereftalato de polietileno. Procedimiento: Determinar la absorbancia de los extractos de alcohol al 50% o alcohol al 25% en una celda de 1 cm a la longitud de onda de absorbancia máxima a aproximadamente 244 nm (ver Espectroscopía Ultravioleta-Visible (857)). Para el blanco, usar el blanco de medio de extracción correspondiente. Determinar la absorbancia del extracto de n-heptano en una celda de 1 cm a la longitud de onda de absorbancia máxima a aproximadamente 240 nm (ver el capítulo (857>). Para el blanco, usar el medio de extracción de n-heptano. ETILENGLICOL EN SISTEMAS DE ENVASES DE TEREFTALATO DE POLIETILENO Y DE TEREFTALATO G DE POLIETILENO Preparaciones Solución de ácido peryódico: Disolver 125 mg de ácido peryódico en 1 O ml de Agua Purificada. Ácido sulfúrico diluido: Agregar lentamente y mezclando constantemente 50 ml de ácido sulfúrico a 50 ml de Agua Purificada y dejar que se enfríe a temperatura ambiente. Solución de bisulfito de sodio: Disolver O, 1 g de bisulfito de sodio en 1O ml de agua. Usar esta solución dentro de los 7 días. Solución de cromotropato disódico: Disolver l 00 mg la sal disódica del ácido cromotrópico R en 100 ml de ácido sulfúrico. Proteger esta solución de la luz y usar dentro de los 7 días. Solución estándar: Disolver una cantidad pesada con exactitud de etilengJicol en Agua Purificada y diluir cuantitativamente y en diluciones sucesivas si fuera necesario hasta obtener una solución con una concentración conocida de aproximadamente 1 µg/mL. Solución muestra: Usar el extracto de Agua Purificada de Subunidades Tereftafoflo Totales en Sistemas de Envases de Tereftalato de Políetileno y de Tereftalato G de Polietíleno. Procedimiento: Transferir 1,0 mL de Sofución estándar a un matraz volumétrico de 10 ml. Transferir 1,0 ml de Solución muestra a un segundo matraz volumétrico de 1O mL. Transferir 1,O ml de medio de extracción de Agua Purificada a un tercer matraz volumétrico de 1O ml que siNa como blanco del método. Agregar 100 µL de Solución de ácido peryódico a cada uno de los tres matraces, agitar por rotación suave hasta mezclar y dejar en reposo durante 60 minutos. Agregar 1,0 ml de Solución de bísu/fíto de sodio a cada matraz y mezclar. Agregar 100 µL de Solución de cromotropato dísódico a cada matraz y mezclar.
544 (661.2) Sistemas de Envases Plásticos/ Pruebas Físicas
USP 39
[NOTA-Todas las soluciones deben analizarse dentro de la primera hora posterior a la adición de la Solución de cramotropato dísódico.] Agregar cuidadosamente 6 mL de ácido sulfúrico a cada matraz, mezclar y dejar que las soluciones se enfríen a temperatura ambiente. PRECAUCIÓN-La dilución del ácido sulfúrico produce calor significativo y puede ocasionar que Ja solución hierva. Realizar dicha adición con cuidado. Se emitirán gases de dióxido de azufre. Se recomienda usar una campana de extracción. Diluir cada solución con Ácido sulfúrico diluido a volumen y mezclar. Determinar concomitantemente las absorbancias de las soluciones a partir de fa Solución estándar y de la Solución muestra en celdas de 1 cm a la longitud de onda de absorbancia máxima a aproximadamente 5 75 nm (ver el capítulo {85 7}), usando como blanco del método el medio la solución de extracción de Agua Purificada.
Evaluación de Seguridad Química Se debe establecer la seguridad del sistema de envase con fundamento en el análisis químico relevante y apropiado 1) del sistema de envase, 2) de sus materiales de construcción, 3) de sus componentes de construcción, según corresponda, o 4) del medicamento envasado. El análisis químico apropiado de materiales de construcción se especifica en el capítulo (661.1} y puede incluir la demostración de cumplimiento con las secciones apropiadas de las reglamentaciones del Título 21 del CFRsobre Aditivos Alimentarios Indirectos (lndirect Food Additives). Con respecto al análísis del sistema de envase (y/o sus componentes de construcción según corresponda) y al medicamento envasado, una evaluación de seguridad química rigurosa incluiría el análisis de sustancias extraíbles del sistema de envase y el análísis de Jixiviab1es del medicamento envasado. Se espera que el diseño del estudio de sustancias exttaíbles y lixiviables se base en principios científicos rigurosos y justificables, y que los estudios mismos sean uniformes con respecto a 1) la naturaleza del sistema de envase y del medicamento envasado, 2) al uso clínico del medicamento envasado y 3) al riesgo de seguridad percibido, asociado con el sistema de envase y la forma farmacéutica. Aunque ninguna forma farmacéutica está exenta de este requisito de análisis¡, se anticipa que el carácter y el grado .del análisis dependerían de la forma farmacéutica y sería congruente con un enfoque basado en riesgos. En vista de la considerable diversidad de los sistemas de envases, de las formas farmacéuticas y de los medicamentos envasados, no es posible proveer condiciones de prueba específicas para realizar los estudios de sustancias extraíbles y lixiviables. Sin embargo, se pueden encontrar principios básicos generales y recomendaciones sobre las mejores prácticas demostradas para estudios de sustancias extraíbles y lixiviables en los capítulos Evaluación de Sustancias Extralbles Relacionadas con Envases Farmacéuticos y Sistemas de Administración (1663) y Evaluación de Sustancias Lixiviables en Medir:;amentos Relpcionadas con Envases farmar:;éuticos y Sistemas de Administración {1664), respectivamente. Estos capítulos pueden servir como recursos útiles para el diseño y la justificación de estudios rigurosos y apropiados. Pueden ser apropiadas estrategias alternativas de análisis para la evaluación cie seguridac:f. química en circu.nstancias justificadas, las cuales están sujetas a un convenio con la autoridad reglamentaria .apropiada.
ESPECIFICACIONES Reactividad Biológica Los resultados de la prueba son consistentes con los capítulos pertinentes ((87) u (88)).
Pn.1ebas Fisicoquímicas Apariencia de la solución: La Solución C1 es transparente e incolora. Absorbancia: No más de 0,20 Acidez o alcalinidad: La solución es incolora después de la adición de solución de fenolftaleína, rosada después de la adición de hidróxido de sodio 0,01 N y roja anaranjada o roja después de la adición de ácido clorhídrico 0,01 N y de O, 1 mL de solución de rojo de metilo. Contenido orgánico total: La diferencia en las concentraciones de carbono orgánico total entre la Solución C1 y el blanco adecuado es no más de 8 mg/L Etilenglicol en sistemas de envases de tereftalato de polietileno y de tereftalato G de polietileno: La absorbancia de la solución a partir de la Solución muestra no excede la de la solución a partir de la Solución estándar, correspondiente a nó más de 1 ppm de etilenglicol. Subunidades tereftaloílo totales en sistemas de envases de tereftalato de polietileno y de tereftalato G de polietileno: La absorbancia de los extractos de alcohol al 50%, del alcohol al 25% y de n,heptano no exceden de O, 150, correspondiente a no más de 1 ppm de subunidades tereftaloílo totales.
Evaluación de Seguridad Química Los datos y la información obtenida en la Evaluación de Seguridad Química deben interpretarse en el contexto de establecer los riesgos para la seguridad del paciente relacionados con el uso del sistema de envase y la administración del medicamento
Pruebas Físicas/ (670) Envases-Componentes Auxiliares 545
USP 39
(670) ENVASES-COMPONENTES AUXILIARES
Los componentes auxiliares de los envases son artículos que se usan para respaldar o mejorar los sistemas de envase-cierre. Estos artículos incluyen, entre otros, torunda farmacéutica (pharmaceutical coil) ll°i&lliEM''.1111 para envases. Los componentes que se describen en este capítulo deben cumplir con los requisitos aplicables aquí provistos y los requisitos aplicables adicionales provistos en otros capítulos especificados.
TORUNDA FARMACÉUTICA La torunda farmacéutica se usa como material de relleno en envases de unidades múltiples para formas farmacéuticas sólidas orales a fin de evitar la ruptura de tabletas o cápsulas durante el transporte. El material de relleno se debe desechar una vez que se ha abierto el frasco.
Soluciones Solución yodada de cloruro de cinc: Disolver 20 g de cloruro de cinc y 6,5 g de yoduro de potasio en 10,5 mL de agua purificada. Agregar 0,5 g de yodo y agitar durante 15 minutos. Filtrar si fuera necesario. Proteger de la luz. Solución de cloruro de cinc-ácido fórmico: Disolver 20 g de cloruro de cinc en 80 g de una solución de 850 g/L de ácido
fórmico anhidro. Solución al 1% de colorante Nº 4 para identificación de fibras DuPont 1:
Disolver 3,8 g de colorante en polvo en 378,5
mL de agua desionizada.
Torunda Farmacéutica de Algodón El algodón purificado es el pelo de la semilla de las variedades cultivadas de Gossypium hirsutum L. u otras especies de Gossypium (Fam. Malvaceae). Se elimina la materia grasa y se blanquea, y no contiene más que trazas de residuo de hojas, pericarpio, recubrimiento de la semilla u otras impurezas. La torunda farmacéutica de algodón se usa en frascos de formas farmacéuticas sólidas orales para evitar la ruptura.
1
El Colorante Nº 4 para Identificación de Fibras DuPont está disponible en Pylam Products Co., 2175 East Cedar Street, Tempe, AZ. 85281: www.pylamdyes.com.
546 (670) Envases-Componentes Auxiliares/ Pruebas Físicas
USP 39
IDENTIFICACIÓN
A:
Cuando se examinan al microscopio, se observa que cada fibra consiste en una célula individual, de hasta aproximadamente 4 cm de longitud y 40 µm de ancho, en forma de un tubo aplanado con paredes gruesas y redondeadas que están a menudo retorcidas. B: Cuando se tratan con Solución yodada de cloruro de cinc, las fibras se tornan de color violeta. C: Agregar 1 O mL de Solución de cloruro de cinc-ácido fórmico a O, 1 g de fibras, calentar a 40º y dejar en reposo durante 2 horas, agitando ocasionalmente: las fibras no se disuelven. D: Pesar aproximadamente 5 g de fibras, humedecer con agua y exprimir el exceso. Agregar las fibras a 100 mL de Solución al 7% de colorante Nº 4 para identificación de fibras DuPont en ebullición y calentar a ebullición suave durante al menos 1 minuto. Retirar las fibras, enjuagar bien en agua fría y exprimir el exceso de líquido: las fibras se tornan de color verde. ACIDEZ O ALCALINIDAD Sumergir aproximadamente 1 Og de fibras en 100 mL de agua purificada recientemente calentada a ebullición y enfriada, y dejar que se macere durante 2 horas. Decantar en dos cápsulas sendas porciones de 25 mL del agua con ayuda de una varilla de vidrio. Agregar a una porción 3 gotas de fenolftaleína SR y agregar a la otra porción 1 gota de anaranjado de metilo SR. Ninguna porción se presenta de color rosa cuando se observa contra un fondo blanco. FLUORESCENCIA Examinar una capa de aproximadamente 5 mm de espesor bajo luz UV a 365 nm. Presenta solamente una ligera fluorescencia de color violeta amarronado y unas pocas partículas de color amarillo. No presenta una fluorescencia de color azul intenso, excepto por la que pueden presentar unas pocas fibras aisladas. CONCENTRACIÓN DE PERÓXIDO DE HIDRÓGENO RESIDUAL Colocar 1 g de fibras en un vaso de precipitados que contenga 30 mL de agua purificada y mezclar durante 3 minutos con una varilla de vidrio. Verter el contenido en otro recipiente limpio (no exprimir la muestra), o como alternativa, retirar las fibras de la solución con tenacillas limpias. Retirar una tira de prueba analítica de peróxido 2 de su envase y sumergir el extremo de prueba en el líquido de muestra durante 2 segundos. Agitar para eliminar el exceso de líquido, insertar inmediatamente la tira de prueba en un instrumento de reflectometría adecuado y registrar la lectura en mg/kg (ppm), y calcular la concentración de peróxido de hidrógeno residual en ppm. Como método alternativo, colocar 20 g en un vaso de precipitados, agregar 400 mL de agua purificada, mezclar, agregar 20 mL de ácido sulfúrico al 20% y mezclar el contenido. Valorar con solución de permanganato de potasio O, 100 N hasta un color rosado pálido que permanezca durante 30 segundos. Registrar la cantidad de contenido y calcular la concentración en ppm. Se encuentra no más de 50 ppm usando cualquiera de los métodos. Pérdida por Secado (731) Análisis: Secar 5 g de fibras en un horno a 105º hasta peso constante. Criterios de aceptación: No más de 8,0% Residuo de Incineración (281) Análisis: Colocar 5 g de fibras en una cápsula de porcelana o platino y humedecer con ácido sulfúrico 2 N. Calentar suavemente el algodón hasta que se carbonice, luego incinerar con mayor intensidad hasta que el carbono se haya consumido completamente. Criterios de aceptación: No más de 0,20% SUSTANCIAS SOLUBLES EN AGUA Colocar 1 Og de fibras en un vaso de precipitados que contenga 1000 mL de agua purificada y calentar a ebullición suave durante 30 minutos, agregando agua según se requiera para mantener el volumen. Verter el agua a través de un embudo en otro vaso y exprimir el exceso de agua del algodón con una varilla de vidrio. Lavar el algodón en el embudo con dos porciones de 250 mL de agua en ebullición, presionando el algodón después de cada lavado. Filtrar el extracto y los lavados combinados y lavar el filtro minuciosamente con agua caliente. Evaporar el extracto y los lavados combinados hasta un volumen pequeño, transferir a una cápsula de porcelana o platino tarada, evaporar hasta sequedad, y secar el residuo a 105º hasta peso constante. El residuo pesa no más de 0,35%.
Un sistema de análisis adecuado que consiste en tiras de prueba de peróxido Reflectoquant® y un instrumento de reflectometría RQflex® se puede obtener de EMD Chemicals lnc., 480 S. Democrat Road, Gibbstown, NJ 08027: www.emdchemicals.com.
2
USP 39
Pruebas Físicas/ (670) Envases-Componentes Auxiliares 547
MATERIA GRASA Compactar 1 Og de fibras en un extractor Soxhlet equipado con un receptor tarado y extraer con éter etílico durante 4 horas a una velocidad tal que permita que el éter se descargue por sifón no menos de 4 veces por hora. La solución de éter etílico en el matraz no presenta trazas de color azul, verde o marrón. Evaporar el extracto hasta sequedad y secar a 105º durante 1 hora. El peso del residuo no excede de 0,7%. COLORANTES Compactar aproximadamente 1 Og de fibras en un percolador estrecho y extraer lentamente con alcohol hasta que el percolado alcance 50 mL. Cuando se observa hacia abajo a través de una columna de 20 cm de profundidad, el percolado puede presentar un color amarillento, pero no una coloración azul o verde. OTRA MATERIA EXTRAÑA Al inspeccionar visualmente los pequeños trozos de algodón no contienen manchas de aceite o partículas metálicas.
Torunda Farmacéutica de Rayón La torunda farmacéutica de rayón es una forma fibrosa de celulosa regenerada blanqueada que se usa como relleno en frascos de formas farmacéuticas sólidas orales para evitar la ruptura. Consiste exclusivamente en fibras de rayón excepto por unas pocas fibras extrañas aisladas que pueden estar presentes. [NOTA-Se ha demostrado que la torunda farmacéutica de rayón es una fuente potencial de problemas de disolución para cápsulas de gelatina o tabletas recubiertas de gelatina que resultan del entrecruzamiento de la gelatina.] IDENTIFICACIÓN A: Cuando se tratan con Solución yodada de cloruro de cinc, las fibras se tornan de color violeta. B: Agregar 1 O mL de Solución de cloruro de cinc-ácido fórmico a O, 1 g de fibras, calentar a 40º y dejar en reposo durante 2 horas, agitando ocasionalmente: las fibras se disuelven por completo, excepto por las fibras de rayón mate en las que permanecen partículas de titanio. C: Pesar aproximadamente 5 g de fibras, humedecer con agua y exprimir el exceso. Agregar fibras a 100 mL de Solución al 7% de colorante Nº 4 para identificación de fibras DuPont en ebullición y calentar a ebullición suave durante al menos 1 minuto. Retirar las fibras, enjuagar bien en agua fría y exprimir el exceso de líquido: las fibras se tornan de color verde azulado. Acidez o Alcalinidad, Fluorescencia, Materia Grasa, Colorantes y Otra Materia Extraña: Proceder según se indica en Torunda Farmacéutica de Algodón, excepto que se debe usar torunda farmacéutica de rayón. El peso de la muestra para materia grasa es 5 g y el peso del residuo no excede de 0,5%. Pérdida por Secado (731) Análisis: Secar 5 g de fibras en un horno a 105º hasta peso constante. Criterios de aceptación: No más de 11,0% Residuo de Incineración (281 ): No más de 1,50%, determinado en una muestra de prueba de 5 g Cenizas Insolubles en Ácido: Agregar 25 mL de ácido clorhídrico 3 N al residuo obtenido en la prueba de Residuo de Incineración y calentar a ebullición durante 5 minutos. Recoger la materia insoluble en un crisol de filtración tarado, lavar con agua caliente, incinerar, y pesar: el residuo pesa no más de 1,25%. Sustancias Solubles en Agua: Proceder según se indica en Torunda Farmacéutica de Algodón, excepto que se debe usar torunda farmacéutica de rayón. El residuo pesa no más de 1,0%.
Torunda Farmacéutica de Poliéster La torunda farmacéutica de poliéster es un material blanco e inodoro que se usa como relleno en frascos de formas farmacéuticas sólidas orales para evitar la ruptura. IDENTIFICACIÓN A: Proceder según se indica en Espectroscopía Infrarroja en la sección de Métodos de Prueba. Determinar el espectro IR de 4000 a 650 cm- 1 (2,5-15 µm). El espectro obtenido de la muestra presenta bandas de absorción principales solo a las mismas longitudes de onda que el espectro de ER Tereftalato de Polietileno USP. B: Pesar aproximadamente 5 g de fibras, humedecer con agua y exprimir el exceso. Agregar fibras a 100 mL de Solución al 7% de colorante Nº 4 para identificación de fibras DuPont en ebullición y calentar a ebullición suave durante al menos 1 minuto. Retirar las fibras, enjuagar bien en agua fría, y exprimir el exceso de líquido: las fibras se tornan de color anaranjado pálido.
548 (670) Envases-Componentes Auxiliares/ Pruebas Físicas
USP 39
Acidez o Alcalinidad: Proceder según se indica en Torunda Farmacéutica de Algodón, excepto que se debe usar torunda farmacéutica de poliéster. Pérdida por Secado (731) Análisis: Secar 5 g de fibras en un horno a 105º hasta peso constante. Criterios de aceptación: No más de 1,0% Residuo de Incineración (281 ): No más de 0,5%, determinado en una muestra de prueba de 5 g Acabado sobre Fibras: El acabado sobre las fibras usado para el procesamiento debe cumplir con los reglamentos de la FDA para el contacto con alimentos.
Métodos de Prueba ESPECTROSCOPÍA INFRARROJA3 Aparato: FTIR o un espectrofotómetro de doble haz capaz de barrer de 4000 a 650 cm- 1 (2,5-15 µm). Preparación de la Muestra Método 1 (disco de bromuro de potasio): Usar tijeras para cortar las fibras de poliéster (1-3 mg) en longitudes cortas (menos de 1 mm de longitud), mezclar con 200 mg de bromuro de potasio en polvo y moler en un molino de bolas durante 1-2 minutos. Transferir a una matriz para discos de bromuro de potasio y formar un disco. Método 2 (película fundida): Generar una película presionando fibras de poliéster entre láminas de TFE-fluorocarbono y colocar entre placas calientes.
-
3 Se puede encontrar información adicional sobre métodos de identificación para fibras en "Standard Test Methods for ldentification of Fibers in Textiles" (Métodos de Prueba Estándar para Identificación de Fibras en Textiles). Versión actual del Método 0276 de ASTM, publicada por ASTM lnternational, 100 Barr Harbor Orive, P.O. Box C700, West Conchohocken, PA 19428-2959. www.astm.org.
USP 39
Pruebas Físicas/ (670) Envases-Componentes Auxiliares 549
MÉTODOS DE PRUEBA Identificación-Difracción de Rayos X Preparación muestra A: Agregar 2 g en pequeñas porciones a 100 ml de agua, agitando intensamente. Dejar en reposo durante 12 horas para asegurar una hidratación completa. Colocar 2 ml de la muestra así obtenida en un portaobjetos de vidrio adecuado y dejar que se seque al aire a temperatura ambiente para producir una película orientada. Colocar el portaobjetos en un desecador de vacío sobre una superficie libre de etilenglicol. Aplicar vacío al desecador y cerrar la llave de paso de modo que el etilenglicoJ sature la cámara del desecador. Dejar el portaobjetos en reposo durante 12 horas. Preparación muestra B: Preparar una muestra aleatoria de polvo. Análisis: Preparación muestra A y Preparación muestra B. Registrar el patrón de difracción de rayos X de las muestras y determinar los valores d. Identificación-Precipitación Muestra: 5 g Análisis: Agregar 1 g de nitrato de potasio y 3 g de carbonato de sodio anhidro a la Muestra contenida en un crisol de metal, calentar hasta que la mezcla funda y dejar que se enfríe. Agregar al residuo 20 mL de agua en ebullición, mezclar, .filtrar y lavar el residuo con 50 ml de agua. Agregar al residuo l ml de ácido clorhídrico y 5 ml de agua, y filtrar. Agregar al filtrado 1 ml de hidróxido de sodio 1O N, filtrar y agregar 3 ml de cloruro de amonio 2 M. Arsénico Solución muestra: Transferir 8,0 g de muestra seca a un vaso de precipitados de 250 ml que contenga 100 ml de ácido clorhídrico diluido (1 en 25), mezclar y cubrir con un vidrio de reloj. Calentar a ebullición suave, mezclando ocasionalmente, durante 15 minutos evitando la formación excesiva de espuma. Pas¡¡r el sobrenadante líquido caliente a través de un papel de filtro de flujo rápido a un matraz volumétrico de 200 rnl y lavar el filtro con cuatro porciones de 25 mL de ácido clorhídrico diluido (1 en 25) caliente, recogiendo los lavados en el matraz volumétrico. Enfriar los filtrados combinados a temperatura am~ biente, agregar ácido clorhídrico diluido (1 en 25) a volumen y mezclar. Solución madre de trióxido de arsénico: Pesar con exactitud 132,0 mg de trióxido de arsénico, previamente secados a 105º durante 1 hora, y disolver en 5 mL de solución de hidróxido de sodio (1 en 5) en un matraz volumétrico de 1000 ml. Neutralizar la solución con ácido sulfúrico 2 N, agregar 10 ml adicionales de ácido sulfúrico 2 N y llevar a volumen con agua recientemente calentada a ebullición y enfriada, y mezclar. Solución estándar de arsénico: Diluir Solución madre de trióxido de arsénico hasta obtener soluciones con concentraciones adecuadas, adaptables al intervalo lineal o de trabajo del instrumento. Mantener en un recipiente que sea totalmente de víd:rio y usar dentro de los 3 días. Análisis: Proceder según se indica en Impurezas Elementales-Procedimientos (233). Plomo Solución muestra: Transferir 3,75 g de muestra a un vaso de precipitados de 250 mL que contenga 100 .mL de ácido clorhídrico diluido (1 en 25), mezclar y cubrir con un vidrio de reloj. Calentar a ebullición durante 15 minutos, luego enfriaJ a temperatura ambiente y pasar a través de un papel de filtro de flujo rápido a un vaso de precipitados de 400 ml. Lava.r el filtro con cuatro porciones de 25 ml de agua caliente, recogiendo los lavados .en el vaso de precipitados de 400 ml. Concentrar los extractos combinados, calentando a ebullición suave, hasta aproximadamente 20 ml. Si .se forma precipitado, agregar 23 gotas de ácido nítrico, calentar a ebullición y enfriar a temperatura ambiente. Pasar los extractos concentrados a trav~s de (ln papel de filtro de flujo rápido a un matraz volumétrico de 50 mL. Transferir el contenido remanente del vaso de precipitadQs de 400 mL a través del papel de filtro al matraz con agua. Diluir con agua a volumen. Solución madre de nitrato de plomo: Disolver 159,8 mg de nitrato de plomo en 100 ml de agua, a la que se ha i}gregado 1 ml de ácido nítrico, luego diluir con agua hasta 1000 ml. Preparar y alm.acenar esta solución en recipientes dev.idrio libres de sales de plomo solubles. Solución estándar de plomo: En el día de su uso, diluir Solución mac/re de nitrato de plomo hasta obtener soluciones .con concentraciones adecuadas, adaptables al .intervalo lineal o de trabajo del instrumento. Análisis: Proceder según se indica en Impurezas Elementales-Procedimientos (233). Capacidad de Adsorción de Humedad Equipo: Cámaras de humedad y temperatura capaces de mantener una humedad controlada de 40% ± 5% HR y 80% ± 5% HR a 25 ± 2º o un desecador que contenga sales saturadas con agua que provea un %HR al nivel requerido y un horno capaz de mantener una temperatura de 25 ± 2º. Método: 5~1Og. Retirar la muestra del material de envasado. Cuando los adsorbentes se incorporan directamente en la pared o tapa de los envases usar un desecante no incorporado. Agregar la muestra a la cámara de humedad o al desecador y medir la ganancia de peso hasta que se alcance el equilibrio cuando dos pesadas sucesivas consecutivas no difieran en más de 3 mg/g de sustancia tomada y la segunda pesada se realiza después de un periodo adicional de 3±1 horas de almacenamiento en las condiciones requeridas de temperatura y humedad. Calcular la capacidad de adsorción como% de la ganancia de peso en relación con el peso inicial de la muestra. Cuando se empaca una combinación de dos adsorbentes, fa especificación de capacidad de adsorción de humedad debe calcularse en proporción a la mezcla. Por ejemplo, para una mezcla de 60% de tamiz molecular y 40% de gel de sílice, la capacidad de adsorción de humedad sería no menos de 16,6% (9,0% + 7,6%) cuando las condiciones de prueba son 40% ± 5% HR y 25 ± 2º y las capacidades de adsorción de humedad se toman con respecto a las especificaciones mínimas.
550 (670) Envases-Componentes Auxiliares / Pruebas Físicas
USP 39
USP 39
Pruebas Físicas/ <670) Envases-Componentes Auxiliares 551
agua helada. Agregar 15 mL de citrato de sodio 1 M y 1 O rr\L de EDTA disódico 0,2 M1 y mezclar. Ajustar el pH a 5,5 ± 01 lcon ácido clorhídrico 1 N o hidróxido de sodio 1 N, si fuera necesario. Transferir a un matraz vqlumétrico de 100 mL, diluir con agua a volumen y mezclar. Transferir una porción de 50 mL de esta solución a .unv.aso de precipitados de plástico de 125 mL y medir el potencial de la solución usando el aparato descrito en Curva de calibradon. Determinare! contenido de flüoruro, en µg, en la muestra, a partir de la Curva de calibración. Determinar el porcentaje de fluoruro en la muestra tomada: Resultado = (C/WS)
x
0,000001
x
l 00%
en la que Ces el contenidodefluoruro, en µg, en la muestra1 determinado a partir de .la Curva de calibraciqn; W.S es el peso de la muestra, en g;y 0,000001es el factor de conversión de µg a gramos. Plomo Solución muestra: 1 gen 20 mL Soluciones Madre y Estándar: Proceder según se indica en Bentonita. Análisis: Proceder según se indica en Bentonita. Magnesio y Sales Alcalinas Muestra: 1 g Análisis: Disolver la Muestra en 50 mL de agua, agregar 500 mg de cloruro qe.amonio, mezclar y calentar a ebullición durante l minuto. Agregar rápidamente 40 mL ácido oxálico SR y mezclar.vigorosamente hasta completar' la preeipitadón. Agregar de inmediato 2 gotas de rojo de metilo SR. Luego agregar hidróxido de amonio 6 N, gota a gota, hasta que la metda se torne alcalina y enfriar. Transferir la mezcla a una probeta graduada de 100 mL, diluir con agua hastalOO mLYdejar.en reposo durante A horas o durante toda la noche....Decantar el líquido sobrenadante transparente a través de un papeldefíltro seco y transferir 50 ·mL del filtrado transparente a una cápsula de platino; Agrega.r 0,5mL de ácido sulfúrieo a.Ja. cápsula y evaporar la mezcla en un baño de vapor hasta un volumen pequeño. Evaporar cuidadosamente elliquidoretnanente hasti;i sequedad sobre una llama directa y ¡:ontinuar calentando hasta completar la descotnposici
Óxido.deCalcio Identificación-Calcio: Cumple con las pruebas. Valoración: No menos de 95,0% y no más de 100,5% de CaO, con respecto a la sustam:ia incinerada Impurezas Inorgánicas Sustancias insolubles en ácido: No más de 1% Arsénico: No más de 3 ppm Fluoruro: No más de 0,015% Plomo: No más dé 2 mg/kg Magnesioy sales alcalinas; No más de 3,6% Pruebas Específicas Pérdida por incineración: No más de 10,0% Capacidad de Adsorción de Humedad: No menos de 28% a 80% ± 5% HR y 25 :1:2º MÉTODOS DE PRUEBA Identificación-Calcio Solución muestra: Agitar 1 g de muestra con 20 mL de agua y agregar ácido acético glacial hasta que la muestra se disuelva. Análisis: Proceder según se indica en.Cloruro de CalcioAnhídro. Valoración Muestra: 1 g de muestra incinerada hasta peso constante (ver ¡:>erdida por Incineración a continuación.) Análisis: Disolver la Muestra en 20 mL de ácido clorhídrico 2,7 N. Enfriar la solución, diluir con agua hasta 500,0 mLy mezclar. Pipetear y transferir 50,0 mL de esta solución a un recipiente adecuado y agregar 50 m[ de agua. Mientras se mezcla, preferiblemente con un agitador magnético, agregar aproximadamente 30 mL de EDTA disódíco 0,05 M desde una bureta de 50 ml. Luego, agregar 15 mL de hidróxido de sodio 1N y 300 mg de indicador azul de hidroxinaftol. Continuar la valoración volumétrica conEDTA disódico hasta un punto final azul. Cada mL de EDTA disódico 0,05 M equivale a 2,804 mg de CaO. Arsénico Solución muestra: 1 g en 15 mL de ácido dorhíd rico 2, 7 N Soluciones Madre y Estándar: Proceder según se indica en Bentoníta. Análisis: Proceder según se indica en Bentonita. Fluoruro Muestra: 1,0 g Análisis: Proceder según se indica en Cloruro de Calcio Anhidro.
552 (670) Envases-Componentes Auxiliares / Pruebas Físicas
lllllllil1Jlllilllll
USP 39
USP 39
Pruebas Físicas/ (670) Envases-Componentes Auxiliares 553
554 (670) Envases-Componentes Auxiliares / Pruebas Físicas
USP 39
(671) ENVASES-PRUEBAS DE DESEMPEÑO INTRODUCCIÓN El propósito de este capítulo es proporcionar normas para las propiedades funcionales de los sistemas de envases que se usan para formas farmacéuticas orales sólidas y líquidas para medicamentos y suplementos dietéticos. Las definiciones aplicables a este capítulo se encuentran en el capítulo Requisitos de Envasado y Almacenamiento (659). Las siguientes pruebas sirven para determinar la velocidad de transmisión de vapor de agua (velocidad de permeabilidad al vapor de agua) y la transmisión espectral de los envases de plástico. Los métodos de prueba para medir las velocidades de transmisión de vapor de agua que se detallan en este capítulo pueden ser útiles para los fabricantes de medicamentos y de suplementos dietéticos para determinar el nivel de protección provisto por los sistemas de envases de formas farmacéuticas orales sólidas. Además, se proveen métodos adicionales para determinar la clasificación de sistemas de envases para formas farmacéuticas orales sólidas y líquidas que se reenvasan en envases unitarios y envases de unidades múltiples (Tabla 7), ya sea por organizaciones o por farmacéuticos al momento de la dispensación de acuerdo con lo indicado en la receta médica. Pueden existir otros sistemas de envases a los que podrían aplicarse los métodos de prueba de esta sección; sin embargo, se debe describir cualquier tipo de desviación. Si se usan otros métodos para medir la velocidad de transmisión de vapor de agua, deben describirse con suficiente detalle para justificar su uso. Tabla 1. Métodos de Prueba de Transmisión de Vapor de Agua en Sistemas de Envases Formas Farmacéuticas Orales Sólidas
Formas Farmacéuticas Orales Líquidas
Título de la Sección
Determinación del Nivel de Barrera de Protección
Clasificación para Envases de Unidades Múltiples
Clasificación para Envases Unitarios y Envase de Dosis Única
Clasificación para Envases de Uni~ades Múltiples y Envase de Dosis Unica
Aplicación
Envases de unidades múltiples con sello intacto o dañado y envases unitarios y de dosis única
Envases de unidades múltiples con cierre aplicado y sello en estado intacto o dañado
Envases unitarios y de dosis única en estado sellado
Envases de unidades múltiples y unitarios
USP 39
Pruebas Físicas/ (671 >Envases-Pruebas de Desempeño 555
Tabla 1. Métodos de Prueba de Transmisión de Vapor de Agua en Sistemas de Envases (Continuación) Formas Farmacéuticas Orales Sólidas
Usuarios
Fabricantes
Fabricantes Envasadores Reenvasadores Farmacias
Formas Farmacéuticas Orales Líquidas Fabricantes Envasadores Reenvasadores Farmacias
Fabricantes Envasadores Reenvasadores Farmacias
Definiciones Blíster-Domo de plástico o laminado, moldeado, tapado y sellado que contiene la cápsula o la tableta (por lo general, en un envase unitario o de dosis única). Blíster de barrera baja-Blísteres hechos con materiales de baja protección (a la humedad), moldeados y sellados de tal manera que la velocidad de transmisión de vapor de agua al analizarla a 40º/75% de humedad relativa (HR) sea mayor de 1,0 mg/cavidad-día. Blíster de barrera alta-Blísteres hechos con materiales de alta protección (a la humedad), moldeados y sellados de tal manera que la velocidad de transmisión de vapor de agua al analizarla a 40º/75% de humedad relativa sea menor de 1,0 mg/cavidad-día. Blíster de barrera ultra alta-Blísteres hechos con materiales de ultra alta protección (a la humedad), moldeados y sellados de tal manera que la velocidad de transmisión de vapor de agua al analizarla a 40º/75% de humedad relativa sea menor de 0,01 mg/cavidad-día. Tira de blísteres-Grupo contiguo de blísteres moldeados y sellados con una tapa. El número de blísteres por tira por lo regular va de uno a diez, pero puede tener un número mayor. En ocasiones, se puede hacer referencia a la tira de blísteres como un sistema de envase. Cavidad o burbuja-Domo de plástico o laminado, moldeado, tapado y sellado (ver Blíster). Velocidad de transmisión de vapor de agua-Es la transmisión de vapor de agua por unidad de tiempo a través de un sistema de envase, en estado estacionario y en condiciones específicas de temperatura y humedad. Estos métodos de prueba emplean medición gravimétrica para determinar la velocidad de ganancia en peso como resultado de la transmisión de vapor de agua hacia el interior del sistema de envase y la captación subsiguiente mediante un desecante dentro del sistema de envase. Muestra de prueba (o muestra)-Para envases de unidades múltiples, el frasco es la muestra de prueba; mientras que para envases unitarios o de dosis única, la tira de blíster que contiene múltiples cavidades es la muestra de prueba. Cuando se prueban blísteres, se pueden agrupar varias tiras (es decir, varias muestras) en una unidad de prueba para realizar la prueba. Unidad de prueba-Para envases de unidades múltiples, el frasco es tanto la unidad de prueba como la muestra de prueba, y para envases unitarios o monodosis, la unidad de prueba es un grupo de muestras de prueba (tiras de blísteres) que se procesan juntas para medir su exposición a la temperatura y humedad y para pesarlas en cada tiempo de muestreo. El propósito de la unidad de prueba para envases unitarios o monodosis es sacar ventaja de la ganancia de peso aditiva que resulta de una mayor cantidad de cavidades que las presentes en una sola tira. Cuando se habla de la unidad de prueba, en el caso de los frascos, se hace para mantener la congruencia en la denominación de los tres métodos de prueba.
TRANSMISIÓN DE VAPOR DE AGUA
Determinación de la Barrera de Protección para Sistemas de Envases para Formas Farmacéuticas Orales Sólidas Esta sección describe los métodos de prueba de transmisión de vapor de agua para envases de unidades múltiples (Método 7), envase unitarios y de dosis única de alta barrera (Método 2) y envases unitarios y de dosis única de baja barrera (Método 3) usados por los fabricantes de formas farmacéuticas orales sólidas. El propósito de este método es obtener velocidades de transmisión de vapor de agua confiables y específicas que se puedan usar para diferenciar entre el desempeño de la barrera de los sistemas de envases usados para artículos reglamentados; el método se basa en el método ASTM 07709.1 Este método presenta las siguientes características: a. Informa un valor de transmisión de vapor de agua específico para un envase en lugar de una clasificación b. Provee sensibilidad y precisión suficientes para permitir diferenciar el desempeño de la barrera entre los envases c. Las condiciones de uso para analizar estos sistemas de envases son las mismas que las usadas para el análisis de estabilidad acelerado del envase primario de artículos reglamentados (por lo regular, humedad relativa de 75% a 40º).
1 ASTM D7709. Standard Test Methods for Measuring Water Vapor Transmission Rate (WVTR) of Pharmaceutical Bottles and Blisters published by ASTM lnternational, 100 Barr Harbar Drive, P.O. Box C700, West Conshohocken, PA 19428-2959.
556 (671) Envases-Pruebas de Desempeño/ Pruebas Físicas
USP 39
EQUIPO Se debe contar con los siguientes elementos: • Una balanza de capacidad suficiente para pesar las muestras de prueba durante todo el periodo de la prueba (ver Pesada en una Balanza Analítica (1251 )). La balanza debe tener una sensibilidad adecuada para detectar las pequeñas diferencias de peso que se producen entre tiempos de análisis consecutivos. La incertidumbre de la pesada deberá ser menor que el 5% de la ganancia en peso de un tiempo de muestreo al siguiente. La incertidumbre de la pesada es por lo regular tres veces la resolución/sensibilidad de la balanza. Por ejemplo, una balanza con una resolución de O, 1 mg es aceptable para sistemas de envases cuya ganancia en peso por intervalo de tiempo sea mayor o igual a 6 mg [(O, l x 3)/5%], que es 60 veces la sensibilidad de la balanza. • Una cámara capaz de mantener una temperatura de 40 ± 2º y una humedad relativa de 75 ± 5%. DESECANTE Método 1: El desecante es cloruro de calcio anhidro en forma de gránulos. Pueden resultar adecuados otros desecantes, tales como el tamiz molecular o el gel de sílice. Si se usa cloruro de calcio anhidro, presecar a 215 ± 5º durante 71/4 ± 1/4 horas para asegurar que todo hexahidrato presente se convierta completamente a la forma anhidra. Enfriar el desecante en un desecador durante al menos 2 horas antes de su uso. Métodos 2 y 3: El desecante es gel de sílice moldeado de tal forma que se ajuste al tamaño y forma de la cavidad de blíster usada. Pueden resultar adecuados otros desecantes, por ejemplo, un tamiz molecular. Si se usa gel de sílice, presecarlo en una estufa con circulación de aire forzado usando una de las siguientes condiciones: 155 ± 5º durante 31/4 ± 1/4 horas ó 150 ± 5º durante 4 1/4 ± 1/4 horas. Si se usa un tamiz molecular, presecarlo en una mufla a 595 ± 25º. Secar los tamices 4Áy 3Á durante 31/4 ± 1/4 horas; secar el tamiz 13X durante 51/4 ± 1/4 horas. Enfriar el desecante en un desecador durante al menos 2 horas antes de su uso. [NOTA-Se ha demostrado2 que el cloruro de calcio anhidro puede contener calcio hexahidrato, que pierde agua sólo cuando la temperatura alcanza los 200º.]
PROCEDIMIENTO Método 1: Usar 15 envases de unidades múltiples y 15 cierres que sean representativos del sistema a analizar. Preparar las muestras de prueba llenando cada envase de unidades múltiples hasta dos tercios de su capacidad con desecante y luego, para cierres de rosca, cerrar usando el torque especificado en la Tabla 2. Para otros tipos de cierre, aplicar de acuerdo con el método de incumbencia. Asegurar que se haya aplicado la membrana correcta en el área de colocación del acabado del frasco, logrando el sellado apropiado. Identificar cada envase de unidades múltiples con tinta indeleble. No usar etiquetas. Si hay necesidad de incrementar la precisión del método, el usuario puede probar el sistema sin el cierre siempre que un sello impermeable permanezca en el envase. Si se desea, pesar cada envase de unidades múltiples a temperatura y humedad relativa ambientales. Registrar este peso para el tiempo cero, pero no usarlo en el cálculo de la permeación. Colocar todos los envases en la cámara de prueba (humedad relativa de 75% a 40º) dentro de la primera hora de la pesada. Pesar todos los envases de unidades múltiples en intervalos de tiempo de 7 días ± 1 hora. Pesar los envases de unidades múltiples en los días 7; 14; 21; 28 y 35 para obtener los datos en estado estacionario. (El intervalo de tiempo inicial desde el tiempo O hasta el día 7 es el periodo para lograr el equilibrio.) Antes de pesar los envases en cada intervalo de tiempo, equilibrar los envases durante aproximadamente 30 minutos a la temperatura y humedad relativa de pesada. Limitar el tiempo fuera de la cámara a menos de 2 horas. Registrar los pesos de manera apropiada para luego calcular la línea de regresión. Tabla 2. Torque aplicable al Envase con Tapa de Rosca
Diámetro del Cierre• (mm)
Intervalo de Afuste Sugerido con Torque Aplicado Manualmenteb (pulqada-libras)
Intervalo de Ajuste Sugerido con Torque Aplicado Manualmenteb (Newton-metros)
8
5
0,56
10
6
0,68
13
8
0,90
• Para probrar envases con diámetros de cierre intermedios, usar el torque asignado al diámetro de cierre de mayor tamaño siguiente. b Un aparato adecuado se encuentra disponible en SecurePak, PO Box 905, Maumee, Ohio 43552-0905; www.secure-pak.com. El Modelo MRA con indicadores en ambos lados de retiro y aplicación está disponible con los siguientes intervalos: 1) 0-25 pulgada por libras, lectura en incrementos de 1 pulgada por libra, 2) 0-50 pulgada por libras, lectura en incrementos de 2 pulgadas por libra y 3) 0-1 00 pulgada por libra, lectura en incrementos de 5 pulgadas por libra. Para más detalles sobre las instrucciones, se puede consultar el documento "Standard Test Method for Application and Removal Torque of Threaded or Lug-Style Closures" ASTM Method 03198, publicado por la ASTM lnternational, 100 Barr Harbor Orive, P.O. Box C700, West Conshohocken, PA 19428-2959.
Oetermination of water vapor transmission rate (WVTR) of HOPE bottles for pharmaceutical products. Chen, Yisheng and Yanxia Li, lnternational journal of Pharmaceutics, 358 (2008) 137-143.
2
Pruebas Físicas/ (671) Envases-Pruebas de Desempeño 557
USP 39
Tabla 2. Torque aplicable al Envase con Tapa de Rosca (Continuación) Intervalo de Ajuste Sugerido con Torque Aplicado Manualmenteb (pulgada-libras)
Intervalo de Ajuste Sugerido con Torque Aplicado Manualmenteb (Newton-metros)
15
5-9
0,56-1,02
18
7-10
0,79-1, 13
20
8-12
0,90-1,36
22
9-14
1,02-1,58
24
10-18
1,13-2,03
28
12-21
1,36-2,37
30
13-23
1,47-2,60
33
15-25
1,69-2,82
38
17-26
1,92-2,94
43
17-27
1,92-3,05
48
19-30
2,15-3,39
Diámetro del Cierreª (mm)
53
21-36
2,37-4,07
58
23-40
2,60-4,52
63
25-43
2,82-4,86
66
26-45
2,94-5,08
70
28-50
3,16-5,65
83
32-65
3,62-7,35
86
40-65
4,52-7,35
89
40-70
4,52-7,91
100
45-70
5,09-7,91
110
45-70
5,09-7,91
120
55-95
6,22-10,74
132
60-95
6,78-10,74
ª
Para probrar envases con diámetros de cierre intermedios, usar el torque asignado al diámetro de cierre de mayor tamaño siguiente. b Un aparato adecuado se encuentra disponible en SecurePak, PO Box 905, Maumee, Ohio 43552-0905; www.secure-pak.com. El Modelo MRA con indicadores en ambos lados de retiro y aplicación está disponible con los siguientes intervalos: 1) 0-25 pulgada por libras, lectura en incrementos de 1 pulgada por libra, 2) 0-50 pulgada por libras, lectura en incrementos de 2 pulgadas por libra y 3) 0-100 pulgada por libra, lectura en incrementos de 5 pulgadas por libra. Para más detalles sobre las instrucciones, se puede consultar el documento "Standard Test Method for Application and Removal Torque of Threaded or Lug-Style Closures" ASTM Method 03198, publicado por la ASTM lnternational, 100 Barr Harbar Drive, P.O. Box C700, West Conshohocken, PA 19428-2959.
Método 2: Usar 1O unidades de prueba para este método. Proveer un mínimo de 1O cavidades de blíster por cada unidad de prueba. Si la tira contiene menos de 1O cavidades, agrupar suficientes tiras para formar una unidad de prueba que contenga al menos 1O cavidades. Esto es necesario para proveer una ganancia en peso suficiente en cada intervalo de tiempo. Llenar con un desecante previamente secado y sellar los blísteres en un equipo capaz de llenar y sellar correctamente el blíster. El desecante debe llenar la cavidad. El peso total del desecante debe ser la cantidad suficiente para cumplir con el requisito de evitar la saturación parcial del desecante antes de completar la prueba. Llenar los blísteres en una atmósfera de humedad baja (lo más baja posible, pero con una humedad relativa de no más de 50%). No exponer los desecantes a la humedad ambiental por más de 30 minutos antes de sellar. Identificar cada muestra de prueba con tinta indeleble; no usar etiquetas. Una unidad de prueba constará de una o más muestras de prueba. Agrupar las muestras de prueba en unidades de prueba. Pesar cada unidad de prueba a temperatura y humedad relativa ambientales. Registrar este peso para el tiempo cero. Colocar todas las unidades de prueba en la cámara de prueba (humedad relativa de 75% a 40º) dentro de la primera hora de la pesada. Pesar todas las unidades de prueba en intervalos de tiempo de 7 días ±1 hora. Pesar las unidades de prueba en los días 7; 14; 21; 28 y 35 para obtener 5 datos en estado estacionario. (El intervalo de tiempo inicial desde el tiempo O hasta el día 7 es el periodo para lograr el equilibrio.) Antes de pesar a cada intervalo de tiempo, equilibrar los envases durante 30 ± 5 minutos a la temperatura y humedad relativa de pesada controladas. Limitar el tiempo fuera de la cámara a menos de 2 horas. Registrar los pesos de manera apropiada para luego calcular la línea de regresión. Puede ser que no se consiga alcanzar toda la precisión y sensibilidad que este método puede proveer al medir los blísteres de barrera ultra alta. Para blísteres de barrera ultra alta, las unidades de prueba deben tener no menos de 1 O cavidades, pero no más de 30. Los ejemplos incluyen blísteres de aluminio-aluminio o blísteres muy pequeños hechos de otros materiales. Alternativamente, se puede duplicar o triplicar el tiempo de los intervalos de pesada para lograr una ganancia en peso de la muestra de prueba de al menos 6 mg por intervalo. Método 3: Preparar las unidades de prueba según se indica en el Método 2. Colocar todas las unidades de prueba en la cámara de prueba (humedad relativa de 75% a 40º) dentro de la primera hora de la pesada. Pesar las unidades de prueba luego de 2 días (48 ±1 hora). En ese momento, la diferencia en peso (la ganancia en peso) se divide por el número de blísteres y días
558 (671) Envases-Pruebas de Desempeño/ Pruebas Físicas
USP 39
(2) en cada unidad de prueba y esto se toma como la velocidad de transmisión de vapor de agua en mg/blíster/día. El número de blísteres analizados depende de las características del material de barrera, del tamaño del blíster y de la sensibilidad de la balanza usada en la prueba. Para este método, se puede obviar el requisito de cinco pesadas consecutivas debido a que el desecante se satura rápidamente cuando se envasa en un envase de barrera baja y se almacena a una humedad relativa de 75% a 40º. [NOTA-Para envases unitarios y de dosis única de barrera baja, la ganancia en peso después del segundo día muestra un perfil curvilíneo típico de la cercanía a la saturación del desecante. Obtener cinco pesadas dentro de los 2 días no es viable y podría aumentar la variabilidad. Los Métodos 2 y 3 pueden requerir el uso de múltiples tiras de blísteres agrupadas para obtener ganancias en peso con una magnitud suficiente para usar la sensibilidad de la balanza que se usa. Al agruparlas, estas tiras o muestras de prueba se denominan unidades de prueba. La ganancia en peso en cada periodo de pesada deberá ser 20 veces la sensibilidad de la balanza y la sensibilidad de la balanza es 3 veces la precisión de la balanza. En otras palabras, la ganancia en peso mínima por intervalo de tiempo debe ser al menos 60 veces la precisión de la balanza.] CÁLCULOS Para los Métodos 1 y 2, realizar el análisis de regresión para cada unidad de prueba. Por lo regular, el punto de datos inicial (en el día O) no se incluye en el ajuste de la línea de regresión. La pendiente de la línea de regresión es la velocidad de transmisión de vapor de agua de cada unidad de prueba. Para el Método 1, la pendiente es la velocidad de transmisión de vapor de agua para el envase de unidades múltiples correspondiente. Para el Método 2, la velocidad de transmisión de vapor de agua de cada cavidad de blíster se calcula dividiendo la pendiente por el número de cavidades en cada unidad de prueba. Para el Método 3, calcular la ganancia en peso en mg/día desde el día O hasta el día 2 usando las 1 O unidades de prueba. La velocidad de transmisión de vapor de agua de cada blíster se calcula dividiendo la ganancia en peso por 2 (para 2 días) y el número de blísteres en cada unidad de prueba. Ecuación de Regresión: W= I+ MT
Cálculos: N
_
_
N
_
Pendiente(M)= L[(w;-W)(T¡-T)]/L(T¡-T) 2 i=1
i=1
Intersección (/) = W - MT donde M = pendiente de la línea de regresión N =número de datos (cada dato consta de un peso y un tiempo) W = peso medido W = media del peso total T = tiempo de muestreo T = media del tiempo de muestreo total I =ordenada al origen de la línea de regresión (punto en el que la línea de regresión se intersecta con el eje vertical) N
-
-
L[(W¡-W)(T¡-T)] i=1
igual a la suma de productos cruzados (por ejemplo, para cada uno de los puntos de datos N, restar la media del peso total del valor en peso y la media del tiempo total del valor de tiempo y multiplicar las dos diferencias para obtener un producto cruzado. Posteriormente, sumar todos los productos cruzados N). N
I
igual a la suma de las desviaciones al cuadradro (por ejemplo, para cada uno de los puntos de datos N, restar el tiempo medio total del valor de tiempo y elevar al cuadrado la diferencia. Posteriormente, sumar todas las N diferencias al cuadrado). RESULTADOS Método 1: Informar la velocidad de transmisión de vapor de agua como el valor promedio, en mg/día por envase, y la desviación estándar de las 15 pendientes. Describir apropiadamente el sistema de envase cierre analizado. Método 2: Informar la velocidad de transmisión de vapor de agua como el valor promedio, en mg/día por cavidad, y la desviación estándar de las 1 O pendientes de unidad de prueba. Describir apropiadamente el sistema de envase cierre analizado.
USP 39
Pruebas Físicas/ (671) Envases-Pruebas de Desempeño 559
Método 3: Informar la velocidad de transmisión de vapor de agua como el valor promedio desde el día O hasta el día 2, en mg/día por blíster, y la desviación estándar de las 1 O pendientes de unidad de prueba. Describir apropiadamente el sistema de envase cierre analizado.
Clasificación para Sistemas de Envases para Envases de Unidades Múltiples para Formas Farmacéuticas Orales Sólidas El procedimiento y esquema de clasificación siguientes se proveen para evaluar las características de transmisión de vapor de agua de envases de unidades múltiples. La información recopilada debe usarse para tomar una decisión informada con respecto a la aptitud del sistema de envase para formas farmacéuticas orales sólidas. DESECANTE Colocar una cantidad de cloruro de calcio anhidro de malla 4 a 8 3 en un recipiente poco profundo, procurando excluir el polvo fino, secar a 11 Oº durante 1 hora y enfriar en un desecador. PROCEDIMIENTO Seleccionar 12 envases de tamaño y tipo uniformes, limpiar las superficies de sellado con un paño libre de pelusa y cerrar y abrir cada envase 30 veces. Cerrar el envase firme y uniformemente cada vez. Cerrar los envases con tapa de rosca con un torque dentro del intervalo especificado en la Tabla 2. Agregar Desecante a 1 O de los envases, designados como envases de prueba, llenando cada uno hasta 1 3 mm por debajo del cierre si el volumen del envase es 20 mL o más, o llenando cada uno hasta dos tercios de su capacidad si el volumen del envase es menos de 20 ml. Si el interior del envase tiene más de 63 mm de profundidad, puede colocarse un relleno inerte o un espaciador en el fondo para minimizar el peso total del envase y Desecante; la capa de Desecante en dicho envase no debe ser de menos de 5 cm de profundidad. Cerrar cada envase inmediatamente después de agregar el Desecante, aplicando el torque especificado en la Tabla 2 cuando se cierran envases con tapa de rosca. A cada uno de los 2 envases restantes, designados como controles, agregar un número suficiente de perlas de vidrio para lograr un peso aproximadamente igual al de cada uno de los envases de prueba y cerrarlos, aplicando el torque especificado en la Tabla 2 cuando se cierran envases con tapa de rosca. Registrar el peso de los envases individuales así preparados con una aproximación de O, 1 mg si el volumen del envase es menos de 20 mL, con una aproximación de 1 mg si el volumen del envase es mayor o igual a 20 mL pero menos de 200 mL, o con una aproximación de 1 centigramo (1 O mg) si el volumen del envase es mayor o igual a 200 mL y almacenar a una humedad relativa de 75 ± 3% y a una temperatura de 23 ± 2º. [NOTAUn sistema saturado de 35 g de cloruro de sodio por cada 100 ml de agua colocado en el fondo de un desecador mantiene la humedad especificada. Se pueden emplear otros métodos para mantener estas condiciones.] Después de 336 ± 1 hora (14 días), registrar el peso de los envases individuales de la misma manera. Llenar completamente cinco envases vacíos del mismo tipo y tamaño que los envases en análisis con agua o con un sólido no compresible y de libre fluidez, como perlas de vidrio pequeñas bien apisonadas, hasta el nivel indicado por la superficie del cierre cuando está colocado en su lugar. Transferir el contenido de cada envase a una probeta graduada y determinar el volumen promedio de los envases, en mL. Calcular la velocidad de transmisión de vapor de agua, en mg/día/L:
(1000/14\l)[(TF- T,) - (CF- C¡)]
V= volumen del envase (mL) TF = peso final de cada envase de prueba (mg) T; = peso inicial de cada envase de prueba (mg) CF = peso promedio final de los dos controles (mg) C; = peso promedio inicial de los dos controles (mg) Clasificación: Los sistemas de envases son impermeables si no más de 1 de los 1O envases de prueba excede 100 mg/día/L en la transmisión de vapor de agua, y ninguno excede 200 mg/día/L. Los sistemas de envases son bien cerrados si no más de 1 de los 1 O envases de prueba excede 2000 mg/día/L en la transmisión de vapor de agua, y ninguno excede 3000 mg/día/L. ENVASES DE POLIETILENO Y POLIPROPILENO Sellar los envases con sellos impermeables mediante sellado térmico de un laminado de aluminio-polietileno, u otro sello apropiado. 4 Analizar según se indica en la sección Procedimiento. 3 Cloruro de calcio anhidro de malla 4 a 8 adecuado está disponible comercialmente como el Artículo JT1313-1 en VWR lnternational (www.vwr.com; teléfono 1-800-952-5000). 4 Un laminado adecuado para sellado tiene una capa de polietileno como capa de contacto con el envase de no menos de 0,025 mm (0,001 pulgadas) y una segunda capa de papel de aluminio de no menos de 0,018 mm (0,0007 pulgadas), con capas adicionales de materiales de refuerzo adecuados. Se puede obtener también un sellado apropiado mediante el empleo de placas de vidrio y una cera para sellado constituida por 60% de cera amorfa refinada y 40% de cera de parafina cristalina refinada.
560 (671) Envases-Pruebas de Desempeño/ Pruebas Físicas
USP 39
Clasificación: Los envases de polietileno de alta densidad analizados cumplen con los requisitos si la transmisión de vapor de agua excede de 1 O mg/día/L en no más de 1 de los 1 O envases de prueba y ninguno excede de 25 mg/día/L. Los envases de polietileno de baja densidad analizados cumplen con los requisitos si la transmisión de vapor de agua excede de 20 mg/día/L en no más de 1 de los 1 O envases de prueba y ninguno excede de 30 mg/día/L. Los envases de polipropileno analizados cumplen con los requisitos si la transmisión de vapor de agua no excede de 15 mg/día/L en más de 1 de los 1 O envases de prueba y ninguno excede de 25 mg/día/L.
Clasificación para Sistemas de Envases para Envases de Unitarios y Envases de Dosis Única para Formas Farmacéuticas Orales Sólidas El procedimiento y esquema de clasificación siguientes se proveen para evaluar las características de transmisión de vapor de agua de envases unitarios y envases de dosis única. La información obtenida debe usarse para tomar una decisión informada con respecto a la aptitud del sistema de envase para formas farmacéuticas orales sólidas. DESECANTE Secar pellets de desecante adecuados a 11 Oº durante 1 hora antes de su uso y enfriar en un desecador. Usar pellets que pesen aproximadamente 400 mg cada uno y con un diámetro de aproximadamente 8 mm. [NOTA-Si fuera necesario, debido al tamaño limitado de los envases de dosis única, se pueden usar pellets que pesen menos de 400 mg cada uno y que tengan un diámetro menor de 8 mm.] PROCEDIMIENTO Método 1: Sellar no menos de 1 O envases de dosis única con un pellet en cada uno y sellar 1 O envases de dosis única vacíos adicionales que servirán de control, usando dedales o pinzas con extremos acolchados para manipular los envases sellados. Enumerar los envases y registrar los pesos individuales 6 con una aproximación de 1 mg. Pesar los controles de la misma unidad y dividir el peso total por el número de controles para obtener el promedio. Almacenar todos los envases a una humedad relativa de 75 ± 3% y a una temperatura de 23 ± 2º. [NOTA-Un sistema saturado de 35 g de cloruro de sodio por cada 100 mL de agua colocado en el fondo de un desecador mantiene la humedad especificada. Se pueden emplear otros métodos para mantener estas condiciones.] Después de un intervalo de 24 horas, y a cada intervalo múltiplo de éste (ver Clasificación), retirar los envases de la cámara y permitir que se equilibren durante 15 a 60 minutos en el área de pesada. Registrar nuevamente el peso de los envases individuales y de los controles combinados de la misma manera. [NOTA-Si algún pellet indicador se torna de color rosado durante este procedimiento, o si el aumento de peso del gránulo excede de 10%, terminar la prueba y considerar válidas sólo las determinaciones anteriores.] Devolver los envases a la cámara de humedad. Calcular, con dos cifras significativas, la velocidad de transmisión de vapor de agua, en mg/día, de cada envase tomado: (l/N)[(WF- W1) - (CF- C1)] N =número de días transcurridos en el periodo de prueba (comenzando con el periodo de equilibrio inicial de 24 horas)
WF = peso final de cada envase de prueba (mg) W1 = peso inicial de cada envase de prueba (mg) CF = peso promedio final de los controles (mg) C1 = peso promedio inicial de los controles (mg) [NOTA-Cuando las velocidades de transmisión de vapor de agua son menores de 5 mg/día y cuando se observa que los controles llegan a un estado de equilibrio dentro de los 7 días, las velocidades individuales de transmisión de vapor de agua pueden determinarse con mayor exactitud empleando en el cálculo los valores obtenidos a los 7 días para los pesos del envase de prueba y del envase de control como W1 y C1, respectivamente. En tal caso, un intervalo de prueba adecuado para la Clase A (ver Clasificación) sería no menos de 28 días después del periodo de equilibrio inicial de 7 días (un total de 35 días).] Método 2: Usar este procedimiento para empaques (por ejemplo, tarjetas de blísteres) que incorporen varios envases de dosis única o blísteres sellados por separado. Sellar un número suficiente de empaques, de modo que se sometan a la prueba no menos de cuatro empaques y un total de no menos de 1 O envases de dosis única o blísteres llenados con un pellet en cada unidad. Sellar el mismo número de empaques vacíos, de los que cada uno contenga el mismo número de envases de dosis única o blísteres que los usados en los empaques de prueba, para utilizarlos como control. Almacenar todos los envases a una humedad relativa de 75 ± 3% y a una temperatura de 23 ± 2º. [NOTA-Un sistema saturado de 35 g de cloruro de sodio por cada 100 mL de agua colocado en el fondo de un desecador mantiene la humedad especificada. Se pueden emplear otros
5
Los pellets de desecante indicadores de humedad adecuados se encuentran disponibles comercialmente en fuentes tales como Unit Dose Supply, P.O. Box 104, Ringoes, NJ 08551-01 04 (www.unitdose.net; telephone 609-31 0-1456), como lndicating Desiccant Pellets (Pellets de Desecante Indicadores), Artículo Nº TK-1002. 6 Las comparaciones exactas de envases Clase A pueden requerir periodos de prueba de más de 28 días si las pesadas se realizan en una balanza para preparar medicamentos recetados Clase A (ver Balanzas y Aparatos Volumétricos para Prescripciones (11 76)). El uso de una balanza analítica que permita registrar los pesos con una sensibilidad de décima o centésima de miligramo lleva a una caracterización más precisa entre envases y/o períodos de prueba más cortos.
Pruebas Físicas/ (671) Envases-Pruebas de Desempeño 561
USP 39
métodos para mantener estas condiciones.] Después de un intervalo de 24 horas, y a cada intervalo múltiplo de éste (ver Clasificación), retirar los empaques de la cámara y dejar que se equilibren durante aproximadamente 45 minutos. Registrar los pesos de los empaques individuales y devolverlos a la cámara. Pesar los empaques control como una sola unidad y dividir el peso total por el número de empaques control para obtener el peso promedio del empaque vacío. [NOTA-Si algún pellet indicador se torna de color rosado durante este procedimiento, o si el aumento de peso promedio del pellet en cualquiera de los empaques excede de 10%, terminar la prueba y considerar válidas sólo las determinaciones anteriores.] Calcular, con dos cifras significativas, la velocidad promedio de transmisión de vapor de agua, en mg/día, para cada envase de dosis única o blíster en cada empaque tomado: [1 /{N
X
X)][(WF- W,) - (CF - C,)]
N =número de días transcurridos en el periodo de prueba (comenzando con el periodo de equilibrio inicial de 24 horas) X= número de unidades por empaque selladas por separado WF = peso final de cada empaque de prueba (mg)
W; = peso inicial de cada empaque de prueba (mg) CF = peso final de los empaques de control (mg)
C; = peso inicial de los empaques de control (mg) Usando el Desecante indicado para el Método 1 y el Método 2, pesar los envases o empaques de prueba y de control después de cada 24 horas y después de los intervalos de prueba adecuados para las pesadas finales. WF y CF son según se indica a continuación: 24 horas para la Clase D; 48 horas para la Clase C; 7 días para la Clase B; y no menos de 28 días para la Clase A. Clasificación: Los envases de dosis única individuales analizados según el Método 1 se designan de la siguiente manera: Clase A si no más de 1 de 1 O envases analizados excede de 0,5 mg/día en la velocidad de transmisión de vapor de agua y ninguno excede de 1 mg/día; Clase B si no más de 1 de 1O envases analizados excede de 5 mg/día y ninguno excede de 1 O mg/día; Clase C si no más de 1 de 1 O envases analizados excede de 20 mg/día y ninguno excede de 40 mg/día; y Clase D si los envases analizados no cumplen con ninguno de los requisitos de velocidad de transmisión de vapor de agua. Los envases analizados según el Método 2 se designan de la siguiente manera: Clase A si ningún envase analizado excede de 0,5 mg/día en la velocidad de transmisión de vapor de agua promedio para blíster; Clase B si ningún envase analizado excede de 5 mg/día en la velocidad de transmisión de vapor de agua promedio para blíster; Clase C si ningún envase analizado excede de 20 mg/día en la velocidad de transmisión de vapor de agua promedio para blíster; y Clase D si los envases analizados no cumplen con ninguno de los requisitos de velocidad de transmisión de vapor de agua promedio para blíster.
Clasificación para Siste~as de Envases para Envases de Unidades Múltiples y Envases de Dosis Unica para Formas Farmacéuticas Orales Líquidas El procedimiento y esquema de clasificación siguientes se proveen para evaluar las características de transmisión de vapor de agua de envases de unidades múltiples. La información recopilada debe usarse para tomar una decisión informada con respecto a la aptitud del sistema de envase para formas farmacéuticas líquidas orales. [NOTA-Determinar los pesos de los sistemas de envase-cierre individuales (frasco, sello interno, si se usa, y cierre), tanto el peso de tara como el peso de llenado, con una aproximación de O, 1 mg si la capacidad del frasco es menos de 200 mL; con una aproximación de 1 mg si la capacidad del frasco es 200 mL o más, pero menos de 1000 mL; o al centigramo más cercano (1 O mg) si la capacidad del frasco es 1000 mL o más.] PROCEDIMIENTO Seleccionar 12 frascos de tamaño y tipo uniformes y limpiar las superficies de sellado con un paño libre de pelusa. Acondicionar cada frasco con un cierre, recubrimiento interno del cierre (si corresponde) y un sello. Numerar cada sistema de envasecierre y registrar el peso de tara. Retirar los cierres y, usando una pipeta, llenar 1 O frascos con agua hasta la capacidad de llenado. Llenar dos envases con perlas de vidrio hasta el mismo peso de los envases de prueba llenos. Si se emplean cierres de rosca, aplicar una fuerza de torsión que esté dentro del intervalo especificado en la Tabla 2 y almacenar los envases sellados a una temperatura de 25 ± 2º y una humedad relativa de 40 ± 2%. Después de 336±1 horas (14 días), registrar el peso de los envases individuales y calcular la velocidad de pérdida de peso en agua, en porcentaje por año, para cada frasco tomado: [(W 1; - Wr) - (W 14 ; - Wr) - (Wc 1 - Wm)] x 365 x {[100/(W1; - Wr)] x 14}
W¡¡ = peso inicial de cada frasco individual (1) Wr = peso de tara W 14 ; = peso de cada frasco individual (1) a los 14 días Wc 1 = peso inicial del envase de control en el día 1 Wm = peso del envase de control a los 14 días
Clasificación: El sistema de envase cumple con los requisitos para ser impermeable si el porcentaje de pérdida de peso en agua no excede de 2,5% por año en no más de 1 de los 1 O envases de prueba y ninguno excede de 5,0% por año.
562 (671) Envases-Pruebas de Desempeño/ Pruebas Físicas
USP 39
TRANSMISIÓN ESPECTRAL Aparato 7 Utilizar un espectrofotómetro de sensibilidad y exactitud adecuadas, adaptado para medir la cantidad de luz transmitida a través de los materiales plásticos usados en los envases farmacéuticos. Además, el espectrofotómetro tiene la capacidad de medir y registrar la luz transmitida tanto en rayos difusos como en paralelos.
Procedimiento Seleccionar trozos que representen el promedio del espesor de la pared. Cortar secciones circulares de dos o más áreas del envase y recortarlas, según sea necesario, para obtener segmentos de un tamaño adecuado para montarlos en el espectrofotómetro. Después de cortarlas, lavar y secar cada muestra, procurando no rayar las superficies. Si la muestra fuera demasiado pequeña para abarcar la abertura del portamuestras, tapar el espacio sobrante de la abertura con un papel opaco o una cinta adhesiva, siempre y cuando la longitud de la muestra exceda la de la ranura del espectrofotómetro. Limpiar la muestra inmediatamente antes de montarla en el portamuestras con papel para limpiar objetivos. Montar la muestra con ayuda de una cera adherente, o empleando otro medio adecuado, y tomar las precauciones necesarias para evitar dejar huellas digitales u otras marcas en las superficies a través de las cuales debe pasar la luz. Colocar la sección en el espectrofotómetro con su eje cilíndrico paralelo al plano de la ranura y aproximadamente centrado en relación a la ranura. Cuando está correctamente colocada, el haz de luz es normal en relación a la superficie de la sección y las pérdidas por reflexión son mínimas. Medir continuamente la transmitancia de la sección en relación al aire en la región espectral de interés con un instrumento de registro o en intervalos de aproximadamente 20 nm con un instrumento manual, en la región de 290-450 nm.
Límites La transmisión espectral observada no excede los límites que se proporcionan en la Tabla 3 para envases destinados para uso parenteral. La transmisión espectral observada para envases de plástico para productos destinados a la administración oral o tópica no excede de 10% a cualquier longitud de onda en el intervalo de 290-450 nm. Tabla 3. Límites para Plásticos de Clases 1 a VI
Tamaño Nominal (en mL)
Porcentaje Máximo de Transmisión Espectral a Cualquier Longitud de Onda entre 290 y 450 nm
1
50
2
45
5
40
10
35
20
30
50
15
[NOTA-Ningún envase con un tamaño intermedio a los listados anteriormente presenta una transmisión espectral mayor que la del envase de tamaño inmediatamente superior listado en la Tabla 3. Para envases con tamaños superiores a 50 mL, se aplican los límites establecidos para envases de 50 mL.]
7 Para más detalles sobre el aparato y los procedimientos, se pueden consultar las siguientes publicaciones de la ASTM lnternational, 100 Barr Harbor Orive, West Conshohocken, PA 19428-2959: "Standard Test Method of Test for Haze and Luminous Transmittance of Transparent Plastics", ASTM Method D1003-11 el; "Standard Practice for Computing the Colors of Objects by Using the CIE System", ASTM Method E308-08.
USP 39
Pruebas Físicas/ (691) Algodón 563
(691) ALGODÓN Antes de determinar la absorbencia y la longitud de la fibra, extraer el Algodón de su envoltorio y acondicionarlo durante no menos de 4 horas en una atmósfera estándar a una humedad relativa de 65 ± 2% a 21 ± 1, 1º (70 ± 2ºF).
PRUEBA DE ABSORBENCIA Procedimiento Preparar una canastilla de prueba usando alambre de cobre de aproximadamente 0,4 mm de diámetro (Nº 26 B. & S.) que no pese más de 3 g, con forma de cilindro de aproximadamente 5 cm de diámetro y 8 cm de profundidad y con espacios de aproximadamente 2 cm entre cada alambre. Tomar porciones de algodón purificado que pesen 1 ± 0,05 g de cinco partes diferentes del paquete, tirando pero sin cortar. Colocar las porciones combinadas en la canastilla y pesar. Sostener la canastilla por uno de los lados aproximadamente a 12 mm por encima de la superficie del agua a 25 ± 1 ºy, luego, dejarla caer en el agua. Determinar, preferentemente mediante el uso de un cronómetro, el tiempo requerido en segundos hasta que la canastilla se sumerja completamente. Retirar la canastilla del agua, dejar que se escurra durante 1 O segundos en la misma posición horizontal; luego colocarla de inmediato en un recipiente tarado cubierto y pesarla. Restar el peso de la canastilla de prueba y del algodón purificado para determinar el peso del agua absorbida.
LONGITUD DE FIBRA Para determinar la longitud y la distribución de la longitud de las fibras de algodón en el algodón purificado emplear el siguiente método: Llevar a cabo todas las operaciones asociadas con la determinación de la longitud de fibra del algodón purificado en una atmósfera estable de humedad relativa de 65 ± 2% a 21 ± 1, 1 º (70 ± 2ºF). Estas instrucciones describen la modalidad de procedimiento que se adecúa bien al clasificador* de mayor uso en la actualidad en los Estados Unidos.
Aparato El clasificador (ver ilustración)
Clasificador Doble de Fibra de Algodón consta de dos bancos de peines rígidamente montados uno al lado del otro sobre una base común. Cada banco de peines consta de por lo menos 12 peines individuales, separados 3,2 mm uno detrás de otro y montados en ranuras para que a medida que se acercan durante el proceso de fraccionamiento y cuando ya no sean necesarios, puedan descender debajo del plano de trabajo. Cada peine individual tiene una sola fila de dientes puntiagudos de 12 mm de largo exactamente alineados, que son agujas de 0,38 mm de diámetro. Los dientes están espaciados a una distancia de 62 a 25 mm entre sí a lo largo de una extensión de aproximadamente 50 mm. El equipo accesorio consta de pinzas para clasificar las fibras, una rejilla para comprimir la fibra, una placa lisa para comprimir la fibra y placas recubiertas de terciopelo. Las pinzas clasificadoras constan de dos piezas de latón de aproximadamente 75 mm de largo unidas en uno de sus extremos y ligeramente curvadas en forma de pico en el otro para agarrar las fibras que sobresalgan cerca de la superficie de los peines. Por lo general, uno de los bordes sujetadores posee un almohadillado de cuero o de otro material fibroso. El borde por el que se toman las fibras tiene un ancho de aproximadamente 19 mm.
• [NOTA-El método aquí descrito se adapta especialmente al aparato clasificador Suter-Webb Duplex Cotton Fiber, pero introduciendo alteraciones más o menos obvias en el procedimiento, también se puede llevar a cabo con dos clasificadores Baer dispuestos en serie, o con un aparato Johannsen u otro aparato similar.]
USP 39
564 (691) Algodón / Pruebas Físicas
La rejilla que comprime las fibras consta de una serie de varillas de latón separadas a una distancia de 3,2 mm entre sí para que puedan colocarse entre los peines a fin de apretar las fibras entre los dientes. La placa lisa para comprimir las fibras consta de una placa pulida de latón de aproximadamente 25 x 50 mm con una perilla o mango en la superficie superior, mediante el cual la placa puede pasarse sobre las fibras cuando éstas se colocan en la superficie de las placas recubiertas de terciopelo. Las placas recubiertas de terciopelo, sobre las cuales se pueden distribuir las fibras, son láminas de aluminio de aproximadamente 100 mm x 225 mm x 2,4 mm de espesor, recubiertas sobre ambos lados con terciopelo de alta calidad, preferentemente de color negro.
Selección del Algodón Después de desenrollar el algodón, preparar una muestra de prueba representativa tomando, de un paquete que contenga de 8 a 16 onzas, 32 trozos pequeños (de aproximadamente 75 mg cada uno) bien distribuidos en todo el volumen del rollo, tomando 16 trozos representativos de cada mitad longitudinal del rollo. Evitar los extremos cortados del rollo y tener la precaución de tomar porciones de todo el espesor del rollo. Para evitar que se seleccionen sólo las fibras largas o las cortas, extraer todas las fibras tomadas del grupo cuidando que no se resbalen entre los dedos. De los paquetes de no más de 4 onzas de peso, tomar 8 trozos y de los envases de más de 4 onzas pero no más de 8 onzas, tomar 16 trozos, en forma bien distribuida. Mezclar muy bien los trozos en pares y combinar cada par tirando y enrollando suavemente entre los dedos. Luego fraccionar cada par combinado dividiéndolos longitudinalmente en dos partes aproximadamente iguales y utilizar una parte en el mezclado adicional. (La otra parte puede descartarse o reservarse para cualquier prueba o control adicional.) Repetir el proceso descrito en el párrafo anterior con las sucesivas mitades de la serie bifurcada hasta que sólo se obtenga un trozo: la porción de prueba final integrada. Enderezar suavemente y colocar en forma paralela las fibras de la porción de prueba final integrada extrayéndolas y enrollándolas entre los dedos. Tomar la precaución de retener todas las fibras, en lo posible incluyendo aquellas que forman botones (partículas de fibras enmarañadas) y lanillas (masas apelmazadas de fibras), desechando sólo las motas (fragmentos de semillas inmaduras con fibras) y todo material extraño que no sea fibra, como por ejemplo tallos, hojas y fragmentos de las cáscaras de las semillas. De la porción final integrada descrita en el párrafo anterior, separar longitudinalmente una porción de prueba de 75 ± 2 mg, pesada con exactitud. Retener el residuo para cualquier prueba de control que pudiera ser necesaria.
Procedimiento Con la rejilla para comprimir las fibras, insertar cuidadosamente la porción de prueba pesada en un banco de peines del clasificador de algodón de modo tal de que se extienda a través de los peines en ángulos aproximadamente rectos. Con las pinzas clasificadoras, tomar por los extremos libres una porción pequeña de las fibras extendiéndolas a través de los dientes del peine más cercano al operador. En forma suave y pareja, halar las fibras para que emerjan de los peines hacia adelante y transferirlas a las puntas de los dientes en el segundo banco de peines; colocarlas en forma paralela entre sí y en un ángulo aproximadamente recto con respecto a las caras de los peines, liberando los extremos sujetos tan cerca de la cara del peine frontal como sea posible. Con la rejilla para comprimir las fibras, apretar cuidadosamente las fibras transferidas a los dientes de los peines. Continuar la operación hasta que se hayan transferido todas las fibras al segundo banco de peines. Durante esta transferencia de las fibras, soltar en forma sucesiva los peines del primer banco una vez que todas las fibras sobresalientes hayan sido retiradas. Girar la máquina a 180º y transferir las fibras de algodón nuevamente al primer banco de peines de la manera descrita en el párrafo anterior. Asegurarse bien de emparejar los extremos de las fibras durante las dos transferencias anteriores, acomodándolas lo más cerca posible a la superficie frontal del peine próximo. Este emparejamiento de las puntas de las fibras sobresalientes también puede incluir la extracción de fibras desparejas del frente o de la parte de atrás de los bancos de peines, para volver a colocarlas dentro o sobre el manojo principal de algodón en los peines. Girar nuevamente la máquina a 180º. Soltar en forma sucesiva los peines, si fuera necesario, para exponer los extremos de las fibras más largas. Puede ser necesario volver a depositar algunas fibras desparejas. Con las pinzas extraer las pocas fibras que más sobresalgan. Continuar extrayendo de esta manera las fibras sobresalientes que queden en la parte opuesta a la cara frontal del peine más próximo. Soltar este peine y repetir la serie de operaciones de la misma manera hasta que se hayan extraído todas las fibras. Para no alterar excesivamente la porción de prueba y de ese modo viciar el fraccionamiento de longitudes en grupos, hacer varias tracciones (8 a 1O) entre cada par de peines. Colocar las tracciones sobre las placas recubiertas con terciopelo una al lado de la otra, tan derechas como sea posible, con los extremos lo mejor definidos que sea posible y con los extremos distales colocados en una línea recta. Presionar luego hacia abajo suavemente y en forma homogénea con la placa para comprimir fibras antes de liberar la tracción de las pinzas. Emplear no menos de 50 y no más de 100 tracciones para fraccionar la porción de prueba. Agrupar todas las fibras que midan 12,5 mm (aproximadamente media pulgada) o más de longitud y pesar el grupo con una aproximación de 0,3 mg. De la misma manera, agrupar todas las fibras de 6,25 mm (aproximadamente 1/4 de pulgada) o menos de longitud y pesar de la misma manera. Finalmente, agrupar las fibras restantes de longitudes intermedias y pesarlas. La suma de los tres pesos no difiere del peso inicial de la porción de prueba en más de 3 mg. Dividir el peso de cada uno de
Pruebas Físicas/ (696) Sólidos Cristalinos 565
USP 39
los dos primeros grupos por el peso de la porción de prueba para obtener el porcentaje, en peso, de fibra en los dos intervalos de longitud.
(695) CRISTALINIDAD Esta prueba se realiza para determinar el cumplimiento con los requisitos de cristalinidad establecidos en la monografía individual de un fármaco.
PROCEDIMIENTO En Microscopía Óptica (776) se describe un detallado procedimiento de la prueba.
(696) CARACTERIZACIÓN DE SÓLIDOS CRISTALINOS POR MICROCALORIMETRÍA Y CALORIMETRÍA DE DISOLUCIÓN Para Jos propósitos de este capítulo, Jos materiales cristalinos, parcialmente cristalinos y amorfos se consideran sólidos.
INTRODUCCIÓN-EL CONCEPTO DE CRISTALINIDAD Una retícula cristalina perfectamente ordenada, donde cada molécula ocupa su lugar esperado en la retícula es un ideal que casi nunca se logra. El otro extremo es el estado amorfo, en el que un sólido contiene la mayor densidad posible de imperfecciones (defectos de diversas dimensionalidades), donde se pierde todo el orden de largo alcance y donde sólo permanece el orden de corto alcance, impuesto por las moléculas adyacentes más cercanas. Los cristales reales están en algún punto entre estos dos extremos. La posición de un cristal en una escala delimitada por estos dos extremos se denomina cristalinidad. Todos los cristales reales, incluso los que están en estado puro, poseen algunas imperfecciones o defectos en su retícula, que incrementan tanto la energía (entalpía en condiciones de presión atmosférica constante) como el desorden (expresado como la entropía) de su retícula cristalina. Se dice que un cristal es altamente cristalino cuando posee una densidad relativamente baja de imperfecciones y una cristalinidad alta. Por el contrario, una partícula con una densidad de imperfecciones relativamente alta se dice que es parcialmente amorfa y que posee una baja cristalinidad. En términos ideales, a una partícula totalmente amorfa le corresponde una cristalinidad de cero. Las partículas amorfas pueden contener dominios ordenados de alguna manera que pueden actuar como núcleos para la cristalización; de tales partículas denominadas amorfas se dice que poseen una cristalinidad de bajo nivel pero finita. La capacidad de detectar y cuantificar la cantidad de material amorfo dentro de una sustancia altamente cristalina es de gran importancia durante el desarrollo y la fabricación subsiguiente de una preparación farmacéutica. En realidad, un polvo probablemente contiene partículas con diferentes grados de cristalinidad, así como puede contener partículas con formas y tamaños variados. Cuanto más baja es la cristalinidad de un sólido, mayor es su entalpía y su entropía. El aumento de la entalpía nunca se compensa totalmente con el incremento en la entropía; por lo tanto, la energía libre de Gibbs, que refleja el equilibrio entre ambas, tiene un aumento neto. Así, cuanto más baja es la cristalinidad de un material (polvo), y consecuentemente, cuanto mayor es su carácter amorfo, mayor es su solubilidad intrínseca aparente y su velocidad de disolución, pero menor es su estabilidad termodinámica. Debido a la gran relevancia de estas propiedades, la cristalinidad es asimismo una propiedad importante y es necesario medirla mediante un método adecuado. En este capítulo, la cristalinidad o el contenido de partes amorfas de un polvo se miden mediante métodos de calorimetría, tales como microcalorimetría o calorimetría de disolución, aunque se pueden emplear otros métodos (p.ej., ver el capítulo general Caracterización de Sólidos Cristalinos y Parcialmente Cristalinos por Difracción de Rayos X Sobre Polvo (DRXP) (941 )). Muchas sustancias son capaces de cristalizar en más de un tipo de retícula cristalina, lo que se conoce como polimorfismo. Cuando se incorpora agua o un disolvente en la retícula cristalina, a los cristales se les denomina hidratos o solvatos. Debido al diferente orden cristalino y/o conformación molecular y energía de la retícula, las distintas formas cristalinas a menudo presentan distintas propiedades físicas. Por cuestiones de simplicidad, las mediciones de calorimetría para determinar el grado de cristalinidad discutida en este capítulo asumen una forma cristalina sólida que se halla presente sólo en el material de interés. La teoría y técnica experimental se pueden expandir fácilmente a sistemas polimórficos tomando las consideraciones adecuadas de las diferencias de entalpía entre los polimorfos.
566 (696) Sólidos Cristalinos / Pruebas Físicas
USP 39
MÉTODO 1-MICROCALORIMETRÍA (DETERMINACIÓN DE CONTENIDO AMORFO) La mayoría de los procesos químicos, físicos y biológicos tienen un intercambio de calor asociado. La microcalorimetría es una técnica altamente sensible para monitorear y cuantificar los cambios exotérmicos (que producen de calor) y endotérmicos (que absorben calor) asociados con tales procesos. La técnica permite determinar la velocidad y extensión de las reacciones químicas, los cambios de fase o los cambios de estructura. Se pueden observar eventos térmicos que producen únicamente una fracción de un microvatio usando microcalorimetría. Esto significa que se deben detectar diferencias de temperatura menores de 10·6 K. La microcalorimetría por lo regular emplea el principio de flujo de calor {pérdida de calor), donde, en un vaso definido térmicamente, el calor producido (o absorbido) fluye desde (o hacia dentro del) vaso en un esfuerzo por restablecer el equilibrio térmico con su entorno. La estabilidad térmica excepcional con sus alrededores debe obtenerse mediante un aislador de calor (heat sink) o un entorno regulado electrónicamente. La energía térmica de una muestra activa en el vaso de reacción se canaliza generalmente a través de elementos Peltier; dichos elementos actúan como generadores termoeléctricos usando el efecto Seebeck. La energía térmica se convierte en una señal de voltaje proporcional al flujo de calor. Por lo general, los resultados se presentan como una medición de la energía térmica producida por unidad de tiempo (Vatio) en función del tiempo.
Aparato Los microcalorímetros a menudo se diseñan como sistemas gemelos con un vaso de medición y un vaso de referencia. Los vasos generalmente están hechos de vidrio o acero inoxidable. Para ciertas aplicaciones, se pueden usar vasos especialmente diseñados que permiten la adición de un material gaseoso, líquido o sólido.
Calibración El microcalorímetro se calibra para el flujo de calor (energía por unidad de tiempo) usando fuentes de calor eléctrico externas o internas o una reacción estándar adecuada.
Sensibilidad La sensibilidad del método micocalorimétrico se puede evaluar con respecto a una muestra estándar apropiada, que se analiza de acuerdo con el método correspondiente en conjunto con la determinación del ruido de la línea base del instrumento.
Procedimiento Pesar una cantidad apropiada del material en un vaso adecuado. Cerrar el vaso cuidadosamente para evitar cualquier evaporación de disolventes y colocar los vasos en el portamuestras. Si resulta apropiado, permitir que el vaso se equilibre a la temperatura de la medición antes de colocarlo en la posición de medición. Comenzar el análisis y registrar el flujo de calor con el tiempo sobre la abscisa y el flujo de calor sobre la ordenada (especificar la dirección del flujo de calor exotérmico o endotérmico).
Detección y Cuantificación de Contenido Amorfo en Polvos El estado amorfo es metaestable con respecto al estado cristalino; por consiguiente, puede producirse recristalización. La medición del calor de recristalización permite determinar el contenido amorfo mediante el área del pico de recristalización. Resulta posible cuantificar el contenido amorfo de la muestra relacionando el resultado del microcalorímetro para una muestra con el obtenido a partir de un estándar amorfo. El intervalo de contenido amorfo abarcado por este método depende de la sustancia individual que se va a analizar. En casos favorables, se pueden alcanzar límites de detección por debajo de 1%. Es posible iniciar la recristalización sometiendo la muestra a una humedad relativa más alta o a una atmósfera que contenga vapor orgánico. La muestra generalmente se coloca en una ampolla que también contiene un pequeño tubo de ensayo que a su vez contiene una solución salina acuosa saturada, un disolvente orgánico o una mezcla de disolventes. El calor de recristalización por lo regular se mide usando una masa de muestra fija colocada en un vaso de vidrio o acero. Al seleccionar el tubo de ensayo que contiene la solución salina saturada o el disolvente orgánico se debe optar por un tubo lo suficientemente largo para permitir una saturación total de la atmósfera sobre la muestra. La masa de la muestra y la naturaleza de la atmósfera de vapor sobre la muestra deben permitir que la recristalización ocurra de tal forma que se observe un pico definido, claramente separado de los eventos térmicos iniciales ocasionados por la introducción de la muestra. Las condiciones en las que ocurra la transición de la fase amorfa a un estado cristalino termodinámicamente más estable tendrán un impacto significativo sobre el tiempo de recristalización. En particular, las mezclas físicas de material puramente
USP 39
Pruebas Físicas/ (696) Sólidos Cristalinos 567
amorfo y cristalino se comportarán de forma diferente a un material parcialmente cristalino. Estos efectos se deben tomar en cuenta al desarrollar un método. La Figura 1 muestra una respuesta típica para la recristalización de un material mayoritariamente amorfo. La primera parte de la curva representa diversos procesos concurrentes que ocurren de manera simultánea, tales como la absorción de vapor de agua en las partes amorfas del polvo y por la generación de vapor de agua a partir del tubo de ensayo. Después de esta respuesta inicial, se presenta una gran respuesta exotérmica ocasionada por la recristalización del material amorfo. También incluida, aunque inobservable, está la expulsión del exceso de agua de las partes recristalizadas y su condensación. Por consiguiente, el área bajo esta respuesta de recristalización exotérmica es proporcional al calor de recristalización. 2,5 11
2
ia 1,5 111
·ei Cll
e 1 w
0,5
o o
1
2
Tiempo (Horas)
3
Figura 1. Resultado microcalorimétrico típico de energía (en µW) en función del tiempo (en horas): pico de colapso amorfo (1) y pico de recristalización (11) para lactosa mayoritariamente amorfa a 25º y a una humedad relativa de 75%.
MÉTODO 2-CALORIMETRÍA DE DISOLUCIÓN (DETERMINACIÓN DE CRISTALINIDAD) La calorimetría de disolución proporciona un medio para determinar la entalpía de disolución (es decir, el calor de disolución a presión atmosférica constante) de una sustancia. La entalpía de disolución se define como la entalpía de la sustancia disuelta en la solución a una concentración definida, menos la entalpía de la sustancia original. El disolvente para el proceso de disolución debe ser tal que la masa del sólido se disuelva dentro de un intervalo de tiempo que corresponda con el tiempo de respuesta del calorímetro, según se analiza a continuación. La entalpía de una disolución es proporcional a la cantidad de sólido que se disuelve. Esta cantidad se puede definir como un mol para la entalpía molar o un gramo para la entalpía específica. Si la sustancia posee una pureza adecuada (según se determina mediante el grado de exactitud requerida) y se conoce su masa molecular, se prefiere la entalpía molar; en caso contrario, se emplea la entalpía específica. La entalpía de disolución depende levemente tanto de la temperatura, que generalmente es de 25,0º, como de la concentración final del soluto disuelto. Por lo general, se prefiere expresar la cristalinidad, P0 de una sustancia en una escala porcentual. Este procedimiento requiere de dos estándares de referencia, a saber, una muestra altamente cristalina para la que se asume una cristalinidad de 100% y que posea una entalpía de disolución medida de t-..Hs0 y una muestra amorfa para la que se asume una cristalinidad de 0% y que posea una entalpía de disolución medida de b..H'0 • A partir de estos valores y de la entalpía, AH',, la disolución medida del sólido en análisis, se puede calcular la cristalinidad porcentual del sólido, P0 según se indica a continuación: pe(%)= 1 OO(t-...Hs, - t-..H'a)f(b..H'c- b..H'a)
Resulta claro que la cristalinidad expresada en una escala porcentual depende de tres valores medidos y que las entalpías de disolución se pueden reemplazar por otras cantidades físicas correspondientes que dependan de la cristalinidad. Sin embargo, el valor de la cristalinidad porcentual de una muestra depende no sólo de la naturaleza y del método de preparación de los dos estándares de referencia, sino también de la elección de la cantidad física que se mide. La entalpía de la disolución se mide ya sea mediante un calorímetro de disolución isoperibólico (con perímetro constante, es decir, camisa) o mediante un calorímetro de disolución isotérmico (con temperatura constante). Por lo general, se realizan como mínimo tres mediciones con cada muestra. Posteriormente, se calcula la media aritmética de estos tres valores. Los requisitos exactos dependerán de la capacidad del equipo y del grado de exactitud requerido.
Calorimetría de Disolución lsoperibólica En el calorímetro de disolución isoperibólico, el cambio de temperatura durante el proceso de disolución ocasiona un cambio correspondiente en la temperatura del sistema disolvente-soluto (es decir, en la solución). Este cambio de temperatura se mide con un sensor de temperatura, que está conectado a un circuito eléctrico que registra una señal eléctrica que correspon-
568 (696) Sólidos Cristalinos/ Pruebas Físicas
USP 39
de al cambio de temperatura. Por lo regular, este cambio de temperatura en forma electrónica se mide a intervalos de tiempo definidos con precisión para proporcionar datos de temperatura-tiempo que una computadora recoge, analiza y posteriormente grafica. Una corrida con un blanco sin la adición del soluto sólido al disolvente normalmente no muestra un cambio discernible en la pendiente de la gráfica de temperatura-tiempo. Para los calorímetros de disolución isoperibólicos, la respuesta es lo suficientemente rápida, pero se deben hacer correcciones por cualquier pérdida o ganancia de calor originada a partir del baño. Por lo tanto los calorímetros de disolución isoperibólicos tienen más ventajas que los calorímetros de disolución isotérmica cuando el proceso de disolución es relativamente rápido. Para todas las mediciones de la entalpía de la disolución empleando calorímetros de disolución isoperibólicos, la elección del disolvente es un paso crítico. La naturaleza y la masa del disolvente y la masa de la muestra se eligen de forma que el cambio de calor total correspondiente a la disolución total del sólido se complete en el plazo de cinco minutos agitando vigorosamente a una velocidad de rotación constante dentro del intervalo de 400-600 revoluciones/minuto. Se determina la capacidad de calor efectiva de la celda del calorímetro y su contenido para cada corrida del calorímetro. Esta determinación se logra mediante el calentamiento eléctrico del contenido de la celda del calorímetro. La capacidad térmica efectiva se determina de acuerdo con uno de dos protocolos-realizando una determinación después del rompimiento de la ampolla o realizando una determinación antes y una segunda determinación después del rompimiento de la ampolla, y posteriormente promediando los dos resultados. La exactitud y confiabilidad del calentamiento eléctrico se establecen mediante la exactitud y confiabilidad de las calibraciones químicas anteriormente mencionadas.
Calorimetría de Disolución Isotérmica En el calorímetro de disolución isotérmico (temperatura constante), el cambio de temperatura durante el proceso de disolución se compensa mediante un cambio de energía igual pero opuesto, de tal manera que la temperatura del sistema disolvente-soluto (es decir, en la solución) se mantenga esencialmente constante. Este cambio igual pero opuesto de energía se mide y, cuando se invierte su signo, proporciona la entalpía de disolución. Para calorímetros isotérmicos, la respuesta es relativamente lenta, pero el proceso de compensación elimina el efecto de pérdidas o ganancias de calor causadas por el baño. Por lo tanto, los calorímetros de disolución isotérmicos son más ventajosos que los calorímetros de disolución isoperibólicos cuando el proceso de disolución es relativamente lento.
Solución de Calibración del Calorímetro Para asegurar la exactitud del calorímetro, se deben realizar calibraciones químicas regularmente. Para una disolución endotérmica, la calibración del calorímetro se verifica midiendo el calor absorbido durante la disolución de cloruro de potasio en agua destilada a 298, 15 K (25,0º). El cambio de entalpía establecido en este proceso endotérmico es 235,5 J/g (17,56 kj/mol). Para una disolución exotérmica, el calorímetro se verifica midiendo el calor producido durante la disolución de 5 g/L de trometamina [tris(hidroximetil)aminometano, THAM] en una solución acuosa de ácido clorhídrico O, 1 M a 298, l 5 K (25,0º). El calor establecido para el proceso mencionado anteriormente es de -246,0 J/g (-29,80 kJ/mol).
Manejo de la Muestra La estabilidad química y física de los sólidos puede verse reducida al disminuir la cristalinidad. En particular, los sólidos de baja cristalinidad, especialmente los sólidos amorfos, tienden a absorber vapor de agua de la atmósfera, lo que provoca cristalización y un aumento correspondiente en la cristalinidad. Por estos motivos, las muestras anhidras cuya cristalinidad se va a determinar, deben almacenarse en condiciones de cero humedad o a niveles inferiores a la humedad crítica en cámaras selladas que contengan un desecante que preferentemente contenga un indicador de eficacia. Cuando se van a llevar a cabo estudios de cristalinidad-humedad, la muestra se almacena en una cámara sellada que contenga una solución salina saturada para proporcionar una humedad relativa definida.
(697) CONTENIDO EN ENVASES PARA INYECTABLES Cada envase de inyección debe contener un exceso suficiente que permita extraer del mismo la cantidad declarada de fármaco (ver Formas Farmacéuticas (1151 ), Exceso de Volumen en Inyectables). Dicha extracción se debe realizar de acuerdo a las instrucciones del etiquetado, cuando se provean.
DETERMINACIÓN DEL VOLUMEN DE INYECCIÓN EN LOS ENVASES Esta sección está armonizada con los textos correspondientes de la Farmacopea Europea y/o la Farmacopea japonesa. Estas farmacopeas se han comprometido a no realizar ningún cambio unilateral a esta sección armonizada. Una porción del presen-
Pruebas Físicas/ (698) Volumen de Entrega 569
USP 39
te texto (ver más adelante) es texto USP nacional, y, por lo tanto, no forma parte del texto armonizado; está marcada con símbolos (•.) para especificar este hecho. Las suspensiones y emulsiones deben agitarse antes de extraer el contenido y antes de determinar la densidad. Las preparaciones viscosas y oleosas pueden entibiarse siguiendo las instrucciones de la etiqueta, si fuera necesario, y agitar minuciosamente justo antes de extraer el contenido. Luego, el contenido se enfría a una temperatura de 20º-25º antes de medir el volumen. •Las formulaciones de sólidos estériles se deben reconstituir de acuerdo a las instrucciones del etiquetado antes de retirar su contenido. Luego se debe medir el contenido siguiendo los procedimientos para suspensiones, emulsiones o soluciones, según sea apropiado .• Envases Monodosis-Seleccionar 1 envase si el volumen del envase es de 1O mL o más, 3 envases si el volumen nominal es más de 3 mL y menos de 1O mL, o 5 envases si el volumen nominal es 3 mL o menos. Tomar individualmente el contenido total de cada envase seleccionado con una jeringa seca de una capacidad que no exceda de tres veces el volumen a medir y provista con una aguja de calibre 21 con una longitud de no menos de 2,5 cm (1 pulgada). Expulsar cualquier burbuja de aire de la jeringa y la aguja, y luego descargar el contenido de la jeringa, sin vaciar la aguja, en una probeta calibrada y seca (calibrada para contener más que para verter los volúmenes marcados) de un tamaño tal que el volumen que se va a medir ocupe al menos el 40% de su volumen graduado. Como alternativa, el volumen del contenido, en mL, puede calcularse como la masa, en g, dividida por la densidad. Para envases con un volumen nominal de 2 mL o menos, el contenido de una cantidad suficiente de envases puede combinarse para obtener el volumen requerido para la medición, siempre que, para cada envase, se emplee un conjunto diferente y seco de jeringa y aguja. El contenido de los envases de 1O mL o más se puede determinar abriéndolos y vaciando el contenido directamente en una probeta graduada o un vaso de precipitados tarado. El volumen no es menor que el volumen nominal en el caso de envases examinados individualmente o, en el caso de envases con un volumen nominal de 2 mL o menos, no es menor que la suma de los volúmenes nominales de los envases tomados colectivamente. Envases Multidosis-Para Inyecciones en envases multidosis que declaran rendir un número específico de dosis de un volumen determinado, seleccionar 1 envase y proceder según se indica para los envases monodosis, empleando el mismo número de conjuntos diferentes de jeringa y aguja que el de dosis especificadas. El volumen es tal que cada jeringa no descarga menos de la dosis indicada. Inyecciones en Cartuchos o Jeringas Prellenadas-Seleccionar 1 envase si el volumen es 1O mL o más, 3 envases si el volumen nominal es más de 3 mL y menos de 1O mL, o 5 envases si el volumen nominal es 3 mL o menos. Si fuera necesario, equipar los envases con los accesorios requeridos para su uso (aguja, émbolo, jeringa) y transferir a un vaso de precipitados tarado y seco todo el contenido de cada envase sin vaciar la aguja, empujando el émbolo en forma lenta y continua. Determinar el volumen, en mL, calculado como la masa, en g, divida por la densidad. El volumen medido de cada envase no es menor que el volumen nominal. Soluciones Intravenosas de Gran Volumen-Para soluciones intravenosas, seleccionar 1 envase. Transferir el contenido a una probeta graduada seca, de una capacidad tal que el volumen que se va a medir ocupe al menos el 40% del volumen nominal de la probeta. Medir el volumen transferido. El volumen no es menor que el volumen nominal.
(698) VOLUMEN DE ENTREGA PROPÓSITO Las siguientes pruebas están diseñadas para garantizar que las preparaciones líquidas orales, cuando se transfieren desde su envase original, entreguen el volumen de la forma farmacéutica que se declara en la etiqueta del artículo.
ALCANCE Estas pruebas se aplican a productos que se dispensan vertiendo desde el envase. Estas pruebas se aplican a productos que se suministran como preparaciones líquidas o como preparaciones líquidas reconstituidas a partir de sólidos mediante el agregado del volumen determinado del diluyente especificado. Estas pruebas no son obligatorias para los artículos envasados en envases unitarios cuando la monografía incluye la prueba de Uniformidad de Unidades de Dosificación (905).
DETERMINACIÓN DE DENSIDAD Debido a la tendencia de las preparaciones líquidas orales a atrapar aire al ser agitadas o transferidas, determinar primero la masa entregada resulta un método más exacto de determinación del volumen entregado, usando luego la densidad del material para convertir la masa en volumen entregado. Para usar este método, se requiere una determinación de la densidad del material. A continuación se indica un método para determinar la densidad:
USP 39
570 (698) Volumen de Entrega/ Pruebas Físicas
1. Tarar un matraz volumétrico de 100 ml que contenga 50,0 ml de agua. 2. Agregar aproximadamente 25 g de producto bien agitado, agitando el contenido por rotación suave hasta mezclar. 3. Volver a pesar el matraz.
4. Agregar desde una bureta, una cantidad de agua medida con exactitud hasta llevar el contenido del matraz a volumen, mientras se agita por rotación suave. Registrar el volumen agregado desde la bureta.
5. Calcular la densidad de la muestra: W/V en donde W es el peso, en g, del material tomado; y V es 50,0 ml menos el volumen de agua necesario para ajustar el contenido del matraz a volumen, en ml. Se pueden usar otros métodos para determinar la densidad, dependiendo de la formulación (p.ej., formulaciones sustancialmente no acuosas).
PREPARACIONES DE PRUEBA Para determinar el volumen de entrega, seleccionar no menos de 30 envases y proceder del siguiente modo para la forma farmacéutica correspondiente. Soluciones Orales y Suspensiones Orales-Agitar individualmente el contenido de 1 O envases. Polvos Cuyas Etiquetas Declaran el Volumen de la Preparación Líquida Oral que Resulta cuando el Polvo se Reconstituye con el Volumen de Diluyente Declarado en el Etiquetado-Reconstituir 1 O envases con el volumen de diluyente declarado en el etiquetado, medido con exactitud, y agitar individualmente.
PROCEDIMIENTO El volumen de entrega se puede determinar por peso, según se indica a continuación:
1. Vaciar el contenido del envase en un recipiente tarado adecuado (dejando que escurra durante no más de 5 segundos para envases unitarios, y no más de 1 O minutos para envases de unidades múltiples). 2. Determinar la masa del contenido. 3. Calcular el volumen usando la densidad . Como alternativa, se puede usar el siguiente procedimiento por volumen: 1 . De acuerdo con las condiciones de uso, o según se indique en el etiquetado, vaciar cuidadosamente el contenido de cada envase en sendas probetas individuales, graduadas y secas, con una capacidad marcada que no exceda de dos veces y media el volumen a medir, y calibradas "para contener" (ver Aparatos Volumétricos (31 )). Se debe tener cuidado de evitar que se formen burbujas de aire durante el proceso. Si el etiquetado carece de instrucciones, sujetar los envases en un ángulo de aproximadamente 30º con respecto a la horizontal y vaciar, cuidadosamente, el contenido en la probeta graduada. 2. Dejar escurrir cada envase durante un periodo que no exceda de 1 O minutos para envases de unidades múltiples y 5 segundos para envases unitarios, a menos que se especifique de otra manera en la monografía. 3. Cuando no haya burbujas, medir el volumen de cada mezcla.
CRITERIOS DE ACEPTACIÓN Usar los siguientes criterios para determinar el cumplimiento de esta prueba. Para Envases de Unidades Múltiples (ver la Figura 7)-EI volumen promedio de líquido obtenido a partir de los 1 O envases es no menos de 100% y el volumen de ningún envase es menos de 95% del volumen declarado en el etiquetado. Realizar la prueba en 20 envases adicionales si A, el volumen promedio es menos de 100% del declarado en el etiquetado pero el volumen de ningún envase es menos de 95% de la cantidad declarada, o si B, el volumen promedio es no menos de 100% y el volumen de no más de 1 envase es menos de 95%, pero es no menos del 90% del volumen declarado. El volumen promedio de líquido obtenido de los 30 envases es no menos de 100% del volumen declarado en el etiquetado; y el volumen de líquido obtenido de no más de 1 de los 30 envases es menos de 95%, pero no menos de 90% del volumen declarado en el etiquetado.
Pruebas Físicas/ (698) Volumen de Entrega 571
USP 39
Menos de 100% del V decl.
El volumen de 1 envase es menos de 95% del V decl.
No menos de 100% del V decl.
El volumen de ningún envase es menos de 95% del V decl.
No cumple con la prueba
El volumen de 1 o más envases es menos de 95% del V decl.
El volumen de no más de 1 envase es menos de 95% del V decl. pero no menos de 90% del V decl.
A
El volumen de más de 1 envase es menos de 95% del V decl.
Cumple con la prueba
B
Analizar 20 envases más
Menos de 100% del V decl.
No cumple con la prueba
El volumen de ningún envase es menos de 95% del V decl.
No cumple con la prueba
No menos de 100% del V decl.
El volumen de más de 1 envase es menos de 95 % del decl.
El volumen de no más e 1 envase es meno de 95% del V decl. pero no menos de 90% del V decl.
No cumple con la prueba
Cumple con la prueba
v
Figura 1. Esquema de decisión para envases de unidades múltiples.
,Y= Volumen promedio. V decl. =Volumen declarado)
Para Envases Unitarios (ver la Figura 2)-EI volumen promedio de líquido obtenido a partir de los 1O envases es no menos de 100% y el volumen de cada uno de los 1O envases se encuentra dentro del intervalo de 95%-110% del volumen declarado en el etiquetado. Realizar la prueba en 20 envases adicionales si A, el volumen promedio es menos de 100% del declarado en el etiquetado, pero el volumen de ningún envase se encuentra fuera del intervalo de 95%-110%, o si B, el volumen promedio es no menos de 100% y el volumen de no más de 1 envase se encuentra fuera del intervalo de 95%-110%, pero dentro del intervalo de 90o/o-115%. El volumen promedio de líquido obtenido de los 30 envases es no menos de 100% del volumen declarado en el etiquetado y el volumen obtenido de no más de 1 de los 30 envases se encuentra fuera del intervalo de 95%110% pero dentro del intervalo de 90%-115% del volumen declarado en el etiquetado.
572 (698) Volumen de Entrega/ Pruebas Físicas
Menos de 100% del
El volumen de 1 o más envases cae afuera del intervalo de 95% a 110% del Vdecl.
USP 39
V decl.
No menos de 100% del V decl.
El volumen de ningún envase cae afuera del intervalo de 95% a 110% del V decl.
No cumple con la prueba
El volumen de 1 o más envases cae afuera del intervalo de 95% a 110% del Vdecl.
El volumen de no más de 1 envase cae afuera del intervalo de 95% a 110% del V decl. pero dentro del intervalo de 90% a 115%
A
El volumen de más de 1 envase cae afuera del intervalo de 95% a 110% del V decl.
Cumple con la prueba
B
Analizar 20 envases más
Menos de 100% del
El volumen de cada uno de los envases cae afuera del intervalo de 95% a 110% del Vdecl.
V decl.
No cumple con la prueba
Figura 2. Esquema de decisión para envases unitarios.
No cumple con la prueba
No menos de 100% del V decl.
El volumen de más de 1 envase cae afuera del intervalo de 95% a 110% del V decl.
El volumen de no más de 1 envase cae afuera del intervalo de 95% a 110% del V decl. pero dentro del intervalo de 90% a 115%
No cumple con la prueba
Cumple con la prueba
(699) DENSIDAD DE SÓLIDOS TÉRMINOS Y DEFINICIONES El término densidad se refiere a la distribución espacial promedio de la masa en un material. La densidad de los sólidos típicamente se expresa en g por cm 3, mientras que en los líquidos la densidad se expresa generalmente en g por mL a una temperatura de referencia establecida. La densidad de una partícula sólida puede tomar diferentes valores según el método empleado para medir el volumen de la partícula. Es importante distinguir entre tres posibilidades diferentes. La densidad verdadera de una sustancia es la masa promedio por unidad de volumen, excluyendo todos los espacios vacíos que no son parte fundamental de la disposición tridimensional molecular. Es una propiedad de cada material particular y, por lo tanto, debe ser independiente del método de determinación. La densidad verdadera de un cristal perfecto puede determinarse a partir del tamaño y la composición de la unidad celular. La densidad picnométrica, medida por picnometría de gases, es una medición de la densidad conveniente para polvos farmacéuticos. En un picnómetro de gases, el volumen ocupado por una masa conocida de polvo se determina mediante la medición del volumen de gas desplazado por el polvo. El cociente entre la masa y el volumen de gas desplazado es la densidad picnométrica. La densidad picnométrica equivale a la densidad verdadera a menos que el material contenga espacios vacíos impenetrables, o poros cerrados que sean inaccesibles al gas empleado en el picnómetro. La densidad granular incluye las contribuciones al volumen de la partícula de poros abiertos que son más pequeños que un tamaño límite, que depende del método de medición. Una técnica común de medición es la porosimetría de mercurio, donde
Pruebas Físicas/ (699) Densidad de Sólidos 573
USP 39
el tamaño límite del poro depende de la presión máxima de penetración. Debido a la contribución adicional del volumen de poro, la densidad granular nunca será mayor que la densidad verdadera. Un concepto relacionado es la densidad aerodinámica, que es la densidad de la partícula con un volumen definido por la envoltura aerodinámica de la partícula en una corriente de flujo. Tanto los poros cerrados como los abiertos contribuyen a este volumen, pero los poros abiertos se llenan con el líquido impregnante. Por lo tanto, si la partícula es porosa, la densidad aerodinámica depende de la densidad del líquido utilizado en la prueba. En síntesis, tanto la densidad picnométrica como la densidad verdadera se denominan "densidad". Si es necesario, se pueden distinguir estas cantidades según el método de medición. La densidad de un material depende de la cohesión molecular. En el caso de los gases y los líquidos, la densidad depende de la temperatura y la presión. En el caso de los sólidos, la densidad también variaría según la estructura del cristal y el grado de cristalinidad. Si los sólidos son amorfos, la densidad también puede depender de los antecedentes de preparación y tratamiento de esta sustancia. En consecuencia, a diferencia de los líquidos, las densidades de dos sólidos químicamente equivalentes pueden ser diferentes debido a una diferencia en la estructura del estado sólido. La densidad de las partículas constitutivas es una característica física importante de los polvos farmacéuticos. Más allá de estas definiciones sobre densidad de la partícula, la densidad aparente de un polvo incluye la contribución al volumen del espacio vacío entre las partículas. En consecuencia, la densidad aparente depende tanto de la densidad como de la compactación de las partículas de polvo.
PICNOMETRÍA DE GASES PARA LA MEDICIÓN DE DENSIDAD La picnometría de gases es un método conveniente y apropiado para la medición de la densidad de partículas de polvo. En la Figura 1 se muestra un diagrama sencillo de un tipo de picnómetro de gases.
Vr =Volumen de referencia Ye= Volumen de celda V8 = Volumen de muestra M =Manómetro
Fig. 1. Esquema de Picnómetro de Gases. La muestra, con una masa w y un volumen V51 se coloca dentro de una celda de prueba sellada que tiene un volumen de celda sin contenido de Ve La presión de referencia del sistema, P, se determina en el manómetro mientras la válvula que conecta el volumen de referencia con la celda de prueba está abierta. Se cierra la válvula para separar el volumen de referencia, V,, de la celda de prueba. La celda de la prueba se presuriza con el gas de medición a una presión inicial, P;. Luego, se abre la válvula para conectar el volumen de referencia, V,, con la celda de la prueba y la presión desciende a la presión final, P1• Si el gas de medición se comporta idealmente en las condiciones de medición, el volumen de la muestra, V51 se calcula mediante la siguiente expresión:
(1)
La densidad, p, se calcula por la ecuación: w
p=-(2)
v,
Los detalles del diseño instrumental pueden diferir, pero todos los picnómetros de gases dependen de la medición de los cambios de presión a medida que se agrega o se elimina un volumen de referencia de la celda de prueba. La densidad medida es una media ponderada por volumen de las densidades de las partículas individuales que constituyen el polvo. La densidad será errónea si el gas de la prueba se adsorbe o se absorbe en el polvo o si se producen contaminantes volátiles a partir del polvo durante la medición. La adsorción o absorción se evitan mediante una elección apropiada del gas de prueba. Normalmente se elige helio. Los contaminantes volátiles del polvo se eliminan mediante la desgasificación del polvo a través de una purga constante con helio antes de la medición. Ocasionalmente, los polvos pueden desgasificarse al vacío. Si los
USP 39
574 (699) Densidad de Sólidos/ Pruebas Físicas
contaminantes volátiles no interfieren con la medición, los volúmenes de muestra proporcionados por dos lecturas consecutivas no difieren en más del 0,2%. Debido a que se pueden producir contaminantes volátiles durante la medición, el peso de la muestra debe tomarse después de la medición picnométrica del volumen.
Método Asegurarse de que el volumen de referencia y el volumen de calibración se hayan determinado para el picnómetro de gases mediante un procedimiento apropiado de calibración. El gas a utilizar en la prueba debe ser helio, a menos que se especifique otro gas en la monografía individual correspondiente. La temperatura del picnómetro de gases debe estar entre 15º y 30º y no debe variar en más de 2° durante el curso de la medición. Cargar la celda de prueba con la sustancia en análisis que se ha preparado según la monografía individual correspondiente. Secar la sustancia en análisis, cuando se indica (699D), según se describe en Pérdida por secado en la monografía correspondiente, a menos que se especifiquen otras condiciones de secado en la prueba de Densidad de sólidos de la monografía. Cuando se indica (699U), la sustancia en análisis se emplea sin secar. Emplear una cantidad de polvo recomendada en el manual operativo para el picnómetro. Sellar la celda de prueba del picnómetro y purgar el sistema del picnómetro con el gas de prueba según el procedimiento indicado en las instrucciones de funcionamiento del fabricante. Si la muestra debe desgasificarse al vacío, seguir las recomendaciones de las monografías individuales correspondientes y las instrucciones del manual operativo del picnómetro. La secuencia de medición anterior describe el procedimiento para el picnómetro de gases que aparece en la Figura 1. Si el picnómetro tiene una operación o construcción diferentes, del que se muestra en la Figura 1, seguir el procedimiento operativo indicado en el manual de uso del picnómetro. Repetir la secuencia de medición para la misma muestra de polvo hasta que las mediciones consecutivas del volumen de muestra, V,, no difieran en más del 0,2%. Descargar la celda de la prueba y medir el peso final de polvo, w. Calcular la densidad picnométrica, p, de la muestra según la Ecuación 2.
(701) DESINTEGRACIÓN Este capítulo general está armonizado con los textos correspondientes de la Farmacopea Europea y/o la Farmacopea Japonesa. Los textos de estas farmacopeas son por lo tanto intercambiables y en lugar de este capítulo general, se pueden usar los métodos de la Farmacopea Europea y/o la Farmacopea japonesa para demostrar el cumplimiento de los requisitos. Estas farmacopeas se han comprometido a no realizar ningún cambio unilateral a este capítulo armonizado. Las partes del texto de este capítulo general que son texto USP nacional y, por lo tanto, no forman parte del texto armonizado, están indicadas con símbolos (..) para especificar este hecho. Esta prueba sirve para determinar si las tabletas o cápsulas se desintegran dentro del tiempo establecido cuando se las coloca en un medio líquido en las condiciones experimentales que se presentan a continuación. •Se requiere el cumplimiento con los límites de Desintegración establecidos en las monografías individuales excepto cuando la etiqueta indica que las tabletas o cápsulas están destinadas para su uso como trociscos (troches) o para ser masticadas o están diseñadas como formas farmacéuticas de liberación prolongada o formas farmacéuticas de liberación retardada. Determinar el tipo de unidades en análisis según lo que indique el etiquetado o por observación y aplicar el procedimiento correspondiente a 6 o más unidades de dosificación .• A los efectos de esta prueba, la desintegración no implica la disolución completa de la unidad ni de su ingrediente activo. Se define como desintegración completa al estado en el cual los residuos de la unidad, excepto la cubierta insoluble de una cápsula o los fragmentos del recubrimiento insoluble, que permanezcan en el tamiz del aparato de prueba o se adhieran a la superficie inferior del disco, constituyen una masa blanda sin un núcleo firme y palpable.
APARATO El aparato consta de un montaje de canastilla-gradilla, un vaso de precipitados bajo de 1000 mL, con una altura entre 138 mm y 160 mm y con un diámetro interno de 97 mm a 115 mm para el líquido de inmersión, una disposición termostática para calentar el líquido entre 35º y 39º y un dispositivo para elevar y sumergir la canastilla en el líquido de inmersión a una frecuencia constante entre 29 y 32 ciclos por minuto recorriendo una distancia de no menos de 53 mm y no más de 57 mm. El volumen del líquido en el recipiente es tal que en el punto más alto del recorrido ascendente, la malla de alambre permanece al menos 15 mm por debajo de la superficie del líquido y desciende a no menos de 25 mm desde el fondo del recipiente en el recorrido descendente. En ningún momento debe quedar sumergida la parte superior del montaje de canastilla-gradilla. El tiempo requerido para el recorrido ascendente es igual al tiempo del recorrido descendente y el cambio de sentido se produce en una transición suave y no con un movimiento abrupto. El montaje de canastilla-gradilla se mueve verticalmente a lo largo de su eje. No hay un movimiento horizontal significativo ni un movimiento del eje que no sea vertical.
USP 39
Pruebas Físicas/ (701) Desintegración 575
Montaje de Canastilla-Gradilla-El montaje de canastilla-gradilla consiste en seis tubos transparentes abiertos en sus extremos, de 77,5 ± 2,5 mm de longitud cada uno, con un diámetro interno de aproximadamente 20,7 mm a 23 mm y una pared de 1,0 mm a 2,8 mm de espesor; los tubos están sostenidos en posición vertical por dos placas, de 88 mm a 92 mm de diámetro y de 5 mm a 8,5 mm de espesor cada una, con seis orificios de 22 mm a 26 mm de diámetro cada uno, equidistantes del centro de la placa y equidistantes entre sí. Debajo de la superficie de la placa inferior, se fija una tela de alambre de acero inoxidable tramado que posee una trama cuadrada simple con aberturas de 1,8 mm a 2,2 mm y con un diámetro de alambre de 0,57 mm a 0,66 mm. Las piezas del aparato se arman y se sostienen rígidamente por medio de tres pernos que pasan a través de las dos placas. Se proporciona un medio adecuado para suspender el montaje de canastilla-gradilla del dispositivo de ascenso y descenso, utilizando un punto de su eje. El diseño del montaje de canastilla-gradilla se puede variar de alguna forma, siempre que se mantengan las especificaciones para los tubos de vidrio y el tamaño del tamiz de la malla. El montaje de canastilla-gradilla se ajusta a las dimensiones que se encuentran en la Figura 7. Discos-El uso de discos está permitido exclusivamente cuando está especificado o autorizado •en la monografía. Si se especifica en la monografía individual,. cada tubo presenta un disco cilíndrico de 9,5 ± O, 15 mm de espesor y 20, 7 ± O, 15 mm de diámetro. El disco está hecho de un material plástico transparente adecuado, con un peso específico entre 1, 18 y 1,20. Cinco orificios paralelos de 2±O,1 mm se extienden entre los extremos del cilindro. Uno de los orificios está centrado en el eje cilíndrico. Los otros orificios están centrados a 6 ± 0,2 mm del eje en líneas imaginarias perpendiculares al eje y paralelas entre sí. Se cortan cuatro planos idénticos de forma trapezoidal en la pared del cilindro, casi perpendiculares a los extremos del cilindro. La forma trapezoidal es simétrica; sus lados paralelos coinciden con los extremos del cilindro y son paralelos a una línea imaginaria que conecta los centros de dos orificios adyacentes de 6 mm desde el eje cilíndrico. El lado paralelo del trapezoide en la parte inferior del cilindro tiene un largo de 1,6 ± O, 1 mm y sus bordes inferiores se encuentran a una profundidad de 1,5 a 1,8 mm de la circunferencia del cilindro. El lado paralelo del trapezoide en la parte superior del cilindro tiene un largo de 9,4 ± 0,2 mm y su centro se encuentra a una profundidad de 2,6±O,1 mm de la circunferencia del cilindro. Todas las superficies del disco son lisas. Si se especifica el uso de discos •en la monografía individual,. agregar un disco a cada tubo y hacer funcionar el aparato según se indica en el Procedimiento. Los discos se ajustan a las dimensiones que se encuentran en la Figura 11.
El uso de detección automática empleando discos modificados está permitido cuando se especifica o se autoriza el uso de discos. Tales discos deben cumplir con los requisitos de densidad y dimensión que se proporcionan en este capítulo.
1
576 (701) Desintegración / Pruebas Físicas
USP 39
Disco
Montaje de Canastilla-Gradilla
1,91121,8511 ± 0,9 ±1,15
superior
_l_
~f ti
lO f'..
e.O lO
"':. .....
-,~,-:-:-,~, --~l~ Vista ,' : : ' ' : : ',
lateral
~¡ lO
al
20,7 ± 0,15
Vista inferior
Figura 1. Aparato de desintegración. (Todas las dimensiones están expresadas en mm.)
PROCEDIMIENTO •Tabletas Sin Cubierta-. Colocar 1 unidad de dosificación en cada uno de los seis tubos de la canastilla y, si se indica, agregar un disco. Hacer funcionar el aparato, usando •agua º• el medio especificado como el líquido de inmersión; mantener a 37 ± 2º. Al final del tiempo especificado •en la monografía,• levantar la canastilla del líquido y observar las tabletas: todas las tabletas se han desintegrado completamente. Si 1 ó 2 tabletas no se desintegran completamente, repetir la prueba con 12 tabletas adicionales. El requisito se cumple si se desintegran no menos de 16 tabletas del total de 18 tabletas analizadas. •Tabletas Con Cubierta Simple-Aplicar la prueba de Tabletas Sin Cubierta, haciendo funcionar el aparato durante el tiempo especificado en la monografía individual. Tabletas de Liberación Retardada (Recubrimiento Entérico)-Colocar 1 tableta en cada uno de los seis tubos de la canastilla y, si la tableta tiene una cubierta externa de azúcar soluble, sumergir la canastilla en agua a temperatura ambiente durante 5 minutos. Poner el aparato en funcionamiento utilizando fluido gástrico simulado SR a 37 ± 2º como el líquido de inmersión. Al cabo de 1 hora de inmersión en el fluido gástrico simulado SR, levantar la canastilla y observar las tabletas: las tabletas no muestran signos de desintegración, resquebrajamiento o ablandamiento. Poner el aparato en funcionamiento utilizando fluido intestinal simulado SR a 37 ± 2º como líquido de inmersión, durante el tiempo especificado en la monografía. Sacar la canastilla del líquido y observar las tabletas: todas las tabletas se desintegran completamente. Si 1 ó 2 tabletas no se desintegran completamente, repetir la prueba con 12 tabletas adicionales: no menos de 16 del total de 18 tabletas analizadas se desintegran completamente. Tabletas Bucales-Aplicar la prueba para Tabletas Sin Cubierta. Después de 4 horas, sacar la canastilla del líquido y observar las tabletas: todas las tabletas se han desintegrado. Si 1 ó 2 tabletas no se desintegran completamente, repetir la prueba con 12 tabletas adicionales: no menos de 16 del total de 18 tabletas analizadas se desintegran completamente.
USP 39
Pruebas Físicas/ (705) Tabletas con Ranurado Funcional 577
Tabletas Sublinguales-Aplicar la prueba para Tabletas Sin Cubierta. Al final del tiempo especificado en la monografía individual: todas las tabletas se han desintegrado. Si 1 ó 2 tabletas no se desintegran completamente, repetir la prueba con 12 tabletas adicionales: no menos de 16 del total de 18 tabletas analizadas se desintegran completamente. Cápsulas de Gelatina Dura-Aplicar la prueba para Tabletas Sin Cubierta. Fijar a la superficie de la placa superior del montaje de canastilla-gradilla, una tela de alambre que se pueda desprender, que tenga una trama cuadrada simple con aberturas de 1,8 mm a 2,2 mm y con un diámetro de alambre de 0,60 mm a 0,655 mm, según se describe en Montaje de Canastilla-Gradilla. Observar las cápsulas dentro del tiempo especificado en la monografía individual: todas las cápsulas se han desintegrado excepto los fragmentos de las cubiertas. Si 1 ó 2 cápsulas no se desintegran completamente, repetir la prueba con 12 cápsulas adicionales: no menos de 16 del total de 18 cápsulas analizadas se desintegran completamente. Cápsulas de Gelatina Blanda-Proceder según se indica en Cápsulas de Gelatina Dura .•
(705) ATRIBUTOS DE CALIDAD PARA TABLETAS CUYO ETIQUETADO INDICA RANURADO FUNCIONAL PROPÓSITO Este capítulo provee atributos de calidad para productos cuyo etiquetado aprobado indica que las tabletas se pueden partir para producir múltiples porciones que tienen una dosis fraccionada (cuyo etiquetado indica ranurado funcional) exacta. La cantidad declarada en la etiqueta de las porciones partidas debe ser una fracción simple de la cantidad declarada para la tableta intacta basándose en el número de ranuras y el tamaño de la porción partida (p.ej., una mitad, un tercio o un cuarto). Al momento de partirlas, las tabletas intactas deben cumplir con la especificación de la monografía. Con excepción de la dosis, se espera que cada porción partida de las tabletas cuyo etiquetado indica ranurado funcional cumpla con los atributos de calidad de las tabletas enteras. Las porciones partidas que resultan de subdividir una tableta ranurada funcionalmente deben cumplir con las pruebas de Partición de las Tabletas con Ranurado Funcional y Disolución o Desintegración provistas en este capítulo.
ALCANCE Este capítulo se aplica a tabletas cuyo etiquetado indica ranurado funcional y a las porciones partidas que representan cualquier fracción declarada de la dosis completa de la tableta ranurada funcionalmente. Las tabletas deben partirse como parte del procedimiento de prueba y se deben definir las condiciones de almacenamiento de las porciones partidas como parte de dicho procedimiento. Para las pruebas de Disolución o Desintegración, los analistas deben usar sólo las porciones partidas de las tabletas que se consideran aceptables mediante la prueba de Partición de las Tabletas con Ranurado Funcional.
PARTICIÓN DE LAS TABLETAS CON RANURADO FUNCIONAL Procedimiento de Prueba 1. Tomar una muestra aleatoria de 30 tabletas intactas y proceder según se indica a continuación. 2. Pesar con exactitud cada tableta y registrar su peso. 3. Para cada tableta intacta, determinar el peso esperado de las porciones partidas dividiendo el peso de la tableta entera por el número designado de porciones partidas indicado en el etiquetado. 4. Partir manualmente cada tableta (sin ayuda mecánica) en el número designado de porciones partidas y pesar cada porción partida. 5. Para cada tableta, determinar el porcentaje del peso esperado en cada porción partida. Una tableta aceptable se parte en el número designado de porciones y cada porción partida tiene no menos de 75% y no más de 125% del peso esperado para la porción de tableta partida. (NOTA-Separar las porciones de tableta partida obtenidas de las tabletas aceptables para someterlas al análisis subsiguiente de disolución o desintegración.] Criterios de aceptación: No menos de 28 de las 30 tabletas son aceptables.
DISOLUCIÓN Usar porciones partidas de las tabletas que son aceptables de acuerdo con la prueba de Partición de las Tabletas con Ranurado Funcional.
578 (705) Tabletas con Ranurado Funcional / Pruebas Físicas
USP 39
Tabletas de Liberación Inmediata La disolución para tabletas de liberación inmediata se realiza en la etapa S2 (ver Disolución (711 )). Analizar 12 porciones de tableta partida de acuerdo con las especificaciones para Medio, Aparato, Tiempos y Análisis. El promedio de los 12 resultados es no menor que Q y ningún resultado es menor que Q- 15%.
Tabletas de Liberación Prolongada Realizar el análisis de disolución de porciones de tableta partida a partir de tabletas de liberación prolongada usando uno de los dos procedimientos alternativos. La monografía especifica el procedimiento que se debe usar. Procedimiento 1 (Procedimiento para Formas Farmacéuticas de Liberación Prolongada, Disolución (711 )): Analizar individualmente 12 porciones de tableta partida y 12 tabletas intactas. Medio, Aparato y Análisis: Proceder según se indica en la monografía siguiendo la prueba apropiada que se indica en el etiquetado. Los tiempos de muestreo de la prueba del perfil de disolución se determinan según se indica a continuación. Usar los tiempos de muestreo provistos en la prueba de disolución apropiada de la monografía. Como mínimo, usar tres tiempos de muestreo, de modo que no más de uno de ellos exceda el 85% disuelto. Calcular el factor de similitud (f2) para los resultados de las tabletas intactas y los resultados de la porción partida de tableta:
Rt = porcentaje acumulativo del fármaco disuelto con respecto a la cantidad declarada para las tabletas intactas en cada uno de los tiempos de muestreo n seleccionados Tt = porcentaje acumulativo del fármaco disuelto con respecto a la cantidad declarada para las porciones de tableta partida en cada uno de los tiempos de muestreo n seleccionados Criterios de aceptación: El valor calculado f2 es no menos de 50 (intervalo aceptable: 50-100). Procedimiento 2 (Procedimiento para Formas Farmacéuticas de Liberación Prolongada, Disolución (711 )): Usar una porción partida de tableta como la unidad de dosificación. Analizar individualmente 12 unidades de dosificación. Medio, Aparato, Tiempos y Análisis: Conforme a lo provisto en la monografía siguiendo el número de prueba apropiado que se indica en el etiquetado. Criterios de aceptación: Las cantidades liberadas, como porcentajes de la cantidad declarada, en los tiempos especificados, cumplen con los criterios de aceptación para el nivel L2 de la Tabla de Aceptación 2 del capítulo (711 ).
DESINTEGRACIÓN La prueba de desintegración sólo es necesaria cuando se usa como sustituta de la prueba de disolución conforme a lo especificado en la monografía. Seguir el procedimiento usando porciones de las tabletas partidas que sean aceptables de acuerdo con la prueba de Partición de fas Tabletas con Ranurado Funcional como la unidad de dosificación (ver Desintegración (701 )).
(711) DISOLUCIÓN Cambio en la redacción: El capítulo general Disolución (711) está siendo armonizado con los textos correspondientes de la Farmacopea Europea y/o la Farmacopea japonesa. Estas farmacopeas se han comprometido a no realizar ningún cambio unilateral a este capítulo armonizado. Las partes del texto de este capítulo general que son texto USP nacional y, por lo tanto, no forman parte del texto armonizado, están indicadas con símbolos (•.) para especificar este hecho. Esta prueba se realiza para determinar el cumplimiento de los requisitos de disolución •si estuvieran indicados en la monografía individual. de las formas farmacéuticas administradas oralmente. Para los fines de este capítulo general, una unidad de dosificación está definida como 1 tableta, 1 cápsula o la cantidad que se especifique. •De los tipos de aparatos que se describen en este capítulo, utilizar el que se especifica en la monografía individual. Cuando la etiqueta indica que el artículo tiene recubrimiento entérico, y cuando la monografía individual incluye una prueba de disolución o desintegración sin establecer específicamente que se aplica a artículos de liberación retardada, emplear el procedimiento y la interpretación indicados para Formas Farmacéuticas de Liberación Retardada a menos que se especifique algo diferente en la monografía individual.
USP 39
Pruebas Físicas/ (711) Disolución 579
•PARA FORMAS FARMACÉUTICAS QUE CONTIENEN O ESTÁN RECUBIERTAS CON GELATINA Si la forma farmacéutica que contiene gelatina no cumple con los criterios de la Tabla de Aceptación correspondiente (ver Interpretación, Formas Farmacéuticas de Liberación Inmediata, Formas Farmacéuticas de Liberación Prolongada o Formas Farmacéuticas .de Liberación Retardada) debido a que existe evidencia de entrecruzamiento, el procedimiento de disolución debe repetirse agregando enzimas al medio, según se describe a continuación, y los resu.ltados de la disolución deben evaluarse comenzando por la primera etapa de la Tabla de Aceptación correspondiente. No es necesario continuar el análisis hast<1 la última et<1pa (hasta 24 unidades) cuando los criterios no se cumplen durante la primera etapa del análisis y se observa evidencia de entrecruwmiento. La gelatina puede experimentar entrecruzamiento en presencia de ciertos compuestos y/o en ciertas condiciones de almacenamiento, incluidas entre otras, temperatura y humedad elevadas. Puede formarse una película en la superficie externa y/o interna de la cubierta de la cápsula de gelatina o en la forma farmacéutica que impida la liberación del fármaco durante la prueba de disolución (para más información ver Cápsulas-Pruebas de Disolución y Atributos de Calídad Relacionados (1094}). NOTA-Todas las referencias a capítulos con números superiores a <1000} se proveen únic<1mente para propósitos informativos que se pueden usar <;orno recursos útiles. Estos capítulos no son obligatorios a menos que se exija explícitamente su aplicación.
Medio de Disolución de pH ~4,0 Enzima: Pepsina, cuya actividad ha sido determinada mediante el procedimiento en pepsina purificada de la sección Especificaciones de Reactivos Cantidad! Una cantidad de pepsina que resulta en uria actividad de no más de 750 000 Unidades/l de medio de disolu-
ción.
Medio de Disolución de pH >4,0
y <6,8
Enzimas: Papaína, cuya actividad ha sido determinada mediante la prueba de Valoración en la monografía de Papaína; o bromelina, cuya actividad ha sido determinada mediante el procedimiento en bromelina de la sección Especificaciones de
Reactivos. Cantidad: Una cantidad de papaína que resulta en una actividad de no más de 550 000 Unidades/l de medio de disolu-
ción, o una cantidad de bromelina que resulta en una actividad de no más de 30 unidades de digestión de gelatina (GDU, por sus siglas en inglés)/L de medio de disolución.
Medio de Disolución de pH :::::6,8 Enzima: Pancreatina, cuya actividad de proteasa ha sido determinada mediante el procedimiento de Valoración de actividad de proteasa (Poder de digestión de caseína) en 1<1 monografía de Pancreatina Cantidad: Una cantidad de pancreatína que resulta en una activid<1d de no más de 2000 Unidades/L de proteasa en el
medio de disolución
Medios de Disolución que Contienen Aqentes Tensoactivos u Otros Ingredientes que Desnaturalizan las Enzimas Sí el medio de disolución contiene agentes tensoactivos u otros ingredientes que desnaturalizan la enzima usada, se puede implementar una etapa de pretratamiento en la prueba de disolución de la forma farmacéutica. Esta etapa de pretratamiento se realiza usando el medio de disolución especificado sin el agente tensoactivo o ingrediente y agregando la cantidad apropiada de enzima según el pH del medio. La cantidad de enzima agregada es apropiada para el volumen de medio de disolución usado en el pretratamiento. Para obtener el volumen de medio especificado para la prueba de disolución final, la etapa de pretratamiento se puede realizar con un volumen más pequeño de medio sin el ingrediente, de manera que el volumen final se obtenga al agregar el ingrediente al final de la etapa de pretratamiento. Todas las demás condiciones de prueba (aparato, rotación o velocidad de flujo) deben mantenerse conforme a lo descrito en el método o la monografía. Típicamente, la duración de la etapa de pretratamiento es no mayor de 15 minutos. El tiempo requerido de pretratamiento debe evaluarse para cada caso en particular y justificarse con bases científicas. Este tiempo debe incluirse en el tiempo total de fa prueba. Por ejemplo, si el tiempo total de la prueba es 45 minutos y 15 minutos se usan para la etapa de pretratamiento, la prueba continuará durante 30 minutos después de agregar el ingrediente. 4 usm Estándares de Referencia USP (11 )-ER Tabletas de Prednisona USP .•
USP 39
580 (711) Disolución / Pruebas Físicas
APARATO
Aparato 1 (Aparato con Canastilla) El aparato consta de: un vaso, con o sin tapa, de vidrio u otro material inerte y transparente; 1 un motor; un eje propulsor metálico y una canastilla cilíndrica. El vaso está parcialmente sume"rgido en un baño de agua adecuado de cualquier dimensión conveniente o recibe calor de un dispositivo adecuado, como por ejemplo una camisa de calentamiento. Durante el transcurso de la prueba, el baño de agua o el dispositivo de calentamiento mantienen la temperatura en el interior del vaso a 37 ± 0,5º y garantizan que el fluido del baño se mantenga en movimiento suave y constante. Ninguna parte del equipo, ni el entorno en el cual está colocado, aumenta significativamente el movimiento, agitación o vibración, por encima de los producidos por el elemento de agitación que gira con suavidad. Es preferible emplear un aparato que permita observar la muestra y el elemento de agitación durante la prueba. El vaso es cilíndrico y de fondo semiesférico •con las siguientes dimensiones y capacidades:. para 1 L de capacidad •nominal., la altura es de 160-21 O mm y el diámetro interno es de 98-106 mm; •para 2 L de capacidad nominal, la altura es de 280-300 mm y el diámetro interno es de 98-106 mm; y para 4 L de capacidad nominal, la altura es de 280-300 mm y el diámetro interno es de 145-155 mm •. Las paredes del vaso cilíndrico tienen un reborde en el extremo superior. Se puede utilizar una tapa para retardar la evaporación. 2 Colocar el eje propulsor de forma tal que su eje central guarde una distancia máxima de 2 mm con respecto a cualquier punto del eje vertical del vaso y rote suavemente sin fluctuaciones significativas que pudieran afectar los resultados. Emplear un dispositivo para regular la velocidad con el objeto de seleccionar y mantener la velocidad de rotación del eje propulsor a la velocidad especificada •en la monografía individual. con una aproximación de ±4%. Los componentes del eje y de la canastilla del elemento de agitación son de acero inoxidable tipo 316 o de otro material inerte, según las especificaciones de la Figura 7. Se puede emplear una canastilla con un recubrimiento de oro de aproximadamente 0,0001 pulgadas (2,5 µm) de espesor. La unidad de dosificación se coloca en una canastilla seca al comienzo de cada prueba. La distancia entre el fondo interno del vaso y el fondo de la canastilla se mantiene a 25 ± 2 mm durante la prueba.
1 2
Los materiales deben ser tales que no produzcan sordón, reacciones ni interferencias con la muestra en análisis. Si se usa una tapa, verificar que cuenta con orificios para insertar fácilmente un termómetro y para retirar las muestras.
Pruebas Físicas/ (711) Disolución 581
USP 39
6,3 9,4
a 6,5 ó a 10,1 mm
Orificio de ventilación
2,0 ± 0,5 mm de diámetro
Seguro de retención con 3 lengüetas radiales a 120º entre sí
~
Abertura libre 20,2 ±1,0 mm
5,1±0,5 mm
___Jr.==='1_,_,lP1
37,0 ± 3,0mm
t
27,0 ± 1,0 mm malla abierta
_l~
A/
[Nota- La máxima desviación permisible en "A" es ± 1,0 mm cuando la parte se gira sobre un eje lineal central con la cantastilla montada.]
Tamiz O.D. 22,2 ± 1,0 mm
Tamiz con entramado soldado: 0,22-0,31 mm de diámetro del alambre con aberturas en el alambre de 0,36-0,44 mm. [Nota-La malla podría alterarse ligeramente después de soldarla.]
25,0 ± 3,0 mm
Figura 1 . Elemento de agitación de canastilla
Aparato 2 (Aparato con Paleta) Emplear el Aparato 7, excepto que se usa una paleta compuesta por un aspa y un eje como elemento de agitación. Colocar el eje propulsor de forma tal que su eje central guarde una distancia máxima de 2 mm con respecto a cualquier punto del eje vertical del vaso y rote suavemente sin fluctuaciones significativas que pudieran afectar los resultados. La línea central vertical del aspa está alineada con el eje propulsor de forma tal que el extremo inferior del aspa está nivelado con el extremo inferior del eje propulsor. La paleta cumple con las especificaciones que se indican en la Figura 2. La distancia entre el fondo interno del vaso y el borde inferior del aspa se mantiene a 25 ± 2 mm durante la prueba. El aspa y el eje rígidos, metálicos o de otro material inerte adecuado forman una sola unidad. En algunos casos, se puede usar un dispositivo desmontable de dos partes adecuado, siempre y cuando las partes permanezcan firmemente ajustadas durante la prueba. El eje y el aspa de la paleta pueden estar recubiertos con un material inerte adecuado. Dejar que la unidad de dosificación se hunda hasta el fondo del vaso antes de empezar a rotar el aspa. A las unidades de dosificación se les puede agregar una pieza pequeña, suelta, de algún material no reactivo, como por ejemplo un par de vueltas de alambre, para evitar que floten. La Figura 2a ilustra un dispositivo de sumersión alternativo. También se pueden emplear otros dispositivos de sumersión validados.
USP 39
582 (711) Disolución / Pruebas Físicas
Diámetro de 9,4 a 10,1 mm
NOTAS (1) Las dimensiones A y B no deben variar en más de 0,5 mm cuando esta pieza se gira sobre el eje lineal central. (2) Las tolerancias son de ± 1,O mm, a menos que se indique lo contrario. 1
Radio41,5mm
Radlo1,2±0,2~ ,-.
j:t_
'~
¡,:L
7¡-•------~
i
A
35,Bmm
________:i ..•
±0,5mm
"'--~~!--~-'
..L. 4,0±1,0mm
1
J-.............__---.-------.1 _ L
l.__~--............,,. • 74,0 mma 75,0 mm
.,~ - .
Figura 2. Elemento de agitación de paleta
t
I3.s-4,o
3,5-4,o:f=
¡.
12,0±0,2 A: Tapa de alambre resistente a los ácidos B: Soporte de alambre resistente a tos ácidos
Figura 2a. Dispositivo de sumersión alternativo. Todas las dimensiones están expresadas en mm.
Aparato 3 (Cilindro Oscilante) NO ACEPTADO POR LA FARMACOPEA JAPONESA El equipo se compone de un grupo de vasos cilíndricos de vidrio de fondo plano, un grupo de cilindros oscilantes de vidrio, accesorios de un material inerte (de acero inoxidable tipo 316 o de otro material adecuado) y mallas de un material adecuado no absorbente ni reactivo, que se fijan a la parte superior e inferior de los cilindros oscilantes; un motor y una transmisión que hacen oscilar los cilindros en sentido vertical dentro de los vasos y, de ser necesario, traslada los cilindros oscilantes en sentido horizontal hacia otra hilera de vasos. Los vasos están parcialmente sumergidos en un baño de agua adecuado de un tamaño conveniente que permita mantener la temperatura a 37 ± 0,5º durante la prueba. Ninguna parte del equipo, ni el entorno en el cual el equipo está colocado, produce una cantidad importante de movimiento, agitación o vibración, que exceda la oscilación vertical suave del cilindro oscilante. Se usa un dispositivo que permite elegir la velocidad de oscilación y mantenerla a la velocidad de inmersión •especificada en la monografía individual,. dentro de ±5%. Es preferible emplear un aparato que permita observar las muestras y los cilindros oscilantes. Los vasos cuentan con una tapa de evaporación que permanece colocada durante la prueba. Los componentes se ajustan a las dimensiones que se indican en la Figura 3, a menos que se especifique algo diferente •en la monografía individual •.
USP 39
Pruebas Físicas/ (711) Disolución 583
¡•
50,8± 1
~--rl 1 +I CXl
¡g-
:
1
Orificios para aire Diámetro 3,9 ± O, 1
-¡
1
1 1
' I/ 1 1
Tapa para evaporación
1
Cilindro de oscilación vertical de vidrio
+I
oQ)
Vaso de vidrio
L..--
__ .J
Figura 3. Aparato 3 (cilindro oscilante)
Aparato 4 (Celda de Flujo) El equipo se compone de un depósito y una bomba para el Medio de disolución, una celda de flujo y un baño de agua que mantiene el Medio de disolución a 37 ± 0,5º. Usar la celda del tamaño especificado •en la monografía individual •. La bomba desplaza el Medio de disolución a través de la celda de flujo en dirección ascendente. La bomba tiene un intervalo de operación de 240 a 960 mL/h y las velocidades de flujo estándares son de 4 mL, 8 mL y 16 mL/min. La bomba debe suministrar un flujo constante (±5% de la velocidad de flujo nominal); el perfil del flujo es sinusoidal con una pulsación de 120 ± 1O pulsos por minuto. Se puede usar también una bomba no pulsátil. Los procedimientos de la prueba de disolución en los que se usa una celda de flujo deben estar caracterizados con respecto a la velocidad y a las pulsaciones. La celda de flujo (ver Figura 4 y Figura 5) de un material transparente e inerte, está montada verticalmente con un sistema de filtro (especificado en la monografía individual) que impide que se escapen partículas no disueltas de la parte superior de la celda; el diámetro estándar de la celda se ubica entre 12 mm y 22,6 mm; la base cónica de la celda está generalmente llena de pequeñas perlas de vidrio de aproximadamente 1 mm de diámetro y una de esas perlas, de aproximadamente 5 mm, está ubicada en el ápice para proteger el tubo de entrada del fluido; se dispone de un portatabletas (ver Figura 4 y Figura 5) para colocar formas farmacéuticas especiales, p.ej., tabletas estratificadas. La celda se sumerge en un baño de agua y se mantiene la temperatura a 37±0,5º.
584 (711) Disolución / Pruebas Físicas
USP 39
Cámara del filtro Tamiz con malla Nº 40 Diámetro del alambre = 0,2 Apertura = 0,45 U)
ci +I U)
'--...
~
Muesca para el soporte de tabletas
(03) 1
- __ J ___ ' min3
t __L
0 0,8 ± 0,05 0 =Diámetro
V__ ·3 24,0±0,5 Figura 4: Celda grande para tabletas y cápsulas (arriba) y portatabletas para la celda grande (abajo) del Aparato 4. (Todas las dimensiones están expresadas en mm a menos que se indique algo diferente.)
Pruebas Físicas / (711) Disolución 585
USP 39
Cámara del fihro
-.----'-- 'Y""~~.;i,~~J~-Tamiz con malla Nº 40 Diámetro del alambre Apertura 0,45
=
=0,2
"'o+I· "'o+I
"'ari
o
"' ~
12112 ±0 •2 "-Muesca para el soporte · de tabletas
0=Diámetro
13,5
± 0,5
Figura 5: Celda pequeña para tabletas y cápsulas (arriba) y portatabletas para celda pequeña (abajo) del Aparato 4. (Todas las dimensiones están expresadas en mm a menos que se indique algo diferente.) El aparato emplea un mecanismo de abrazadera y dos juntas tipo anillo (0-rings) para fijar la celda. La bomba está separada de la unidad de disolución a fin de proteger a esta última de las vibraciones que pueda originar la bomba. La bomba no debe estar colocada en un nivel superior al de los recipientes de depósito. Las conexiones entre tubos son lo más cortas posible. Emplear tuberías de material inerte adecuado, como por ejemplo teflón de aproximadamente 1,6 mm de diámetro interno y conexiones con terminaciones aplanadas químicamente inertes. APTITUD DEL APARATO La determinación de la aptitud del aparato que se utilizará en Ja prueba de disolución debe incluir el cumplimiento de las dimensiones y tolerancias indicadas anteriormente. Además, los parámetros de prueba cruciales que es necesario controlar periódicamente mientras se usa el aparato incluyen el volumen y la temperatura del Medio de disolución, la velocidad de rotación (Aparato 1 y Aparato 2), la velocidad de inmersión (Aparato 3) y la velocidad de flujo del medio (Aparato 4). Controlar periódicamente que el desempeño del equipo de disolución sea aceptable. •Comprobar la aptitud de un aparato individual mediante la Prueba de verificación del desempeño.
586 (711) Disolución / Pruebas Físicas
USP 39
Prueba de verificación del desempeño, Aparato 1 y Aparato 2: Analizar el ER Tabletas de Prednisona USP, de acuerdo con las condiciones operativas especificadas. El aparato es apto si los resultados obtenidos están dentro del intervalo aceptable que se indica en la hoja de datos técnicos específica para el lote usado y el aparato analizado. Prueba de verificación del desempeño, Aparato 3: [Se incluirá más adelante.] Prueba de verificación del desempeño, Aparato 4: [Se incluirá más adelante.].
PROCEDIMIENTO Aparato 1 y Aparato 2 FORMAS FARMACÉUTICAS DE LIBERACIÓN INMEDIATA Colocar el volumen indicado de Medio de disolución(± 1%) en el vaso del aparato indicado •en la monografía individual., ensamblar el aparato, equilibrar el Medio de disolución a 37 ± 0,5º y retirar el termómetro. Colocar 1 unidad de dosificación en el aparato, verificando que no queden burbujas de aire en su superficie y poner el aparato en funcionamiento inmediatamente a la velocidad indicada •en la monografía individual •. Dentro del intervalo de tiempo especificado, o a cada tiempo especificado, retirar una muestra de una zona equidistante entre la superficie del Medio de disolución y la parte superior de la canastilla o aspa rotatoria que no esté a menos de 1 cm de la pared del vaso. [NOTA-Si se indica tomar más de una muestra, usar volúmenes iguales de Medio de disolución nuevo a 37º en lugar de las alícuotas tomadas para el análisis o, si se demuestra que no es necesario reemplazar el medio, corregir el cálculo por el cambio de volumen. Mantener el vaso cubierto durante el transcurso de la prueba y verificar la temperatura de la mezcla en análisis con una frecuencia adecuada.] Realizar el análisis •según se indica en la monografía individual. empleando un método de valoración adecuado. 3 Repetir la prueba con otras unidades de la forma farmacéutica. Si se emplean equipos automáticos para muestreo o si se introducen otras modificaciones en el aparato, es necesario verificar que los resultados obtenidos con el aparato modificado son equivalentes a los obtenidos con el aparato estándar descrito en este capítulo general. Medio de disolución: Emplear un medio de disolución adecuado. Emplear el disolvente especificado •en la monografía individual •. El volumen especificado se refiere a mediciones realizadas entre 20º y 25º. Si el Medio de disolución es una solución amortiguada, ajustar el pH al valor indicado con una aproximación de 0,05 unidades con respecto al pH indicado •en la monografía individual.. [NOTA-Los gases disueltos pueden causar la formación de burbujas que pueden alterar los resultados de la prueba. Si los gases disueltos interfieren en los resultados de la disolución, eliminarlos antes de iniciar las pruebas. 4 ) Tiempo: Cuando se especifica un solo tiempo, la prueba se puede concluir en un período más corto, siempre y cuando se cumpla el requisito de cantidad mínima disuelta. Tomar las muestras sólo en los tiempos indicados con una tolerancia de ±2%. •Procedimiento para una muestra combinada para formas farmacéuticas de liberación inmediata: Usar este procedimiento cuando se especifica un Procedimiento para una Muestra Combinada en la monografía individual. Proceder según se indica en Procedimiento para Aparato 7 y Aparato 2 en Formas Farmacéuticas de Liberación Inmediata. Combinar volúmenes iguales de soluciones filtradas de las seis o doce muestras individuales tomadas y emplear la muestra combinada como la muestra de prueba. Determinar la cantidad promedio del ingrediente activo disuelto en la muestra combinada .• FORMAS FARMACÉUTICAS DE LIBERACIÓN PROLONGADA Proceder según se indica en Formas Farmacéuticas de Liberación Inmediata. Medio de disolución: Proceder según se indica en Formas Farmacéuticas de Liberación Inmediata. Tiempo: Los tiempos de prueba, que generalmente son tres, se expresan en horas. FORMAS FARMACÉUTICAS DE LIBERACIÓN RETARDADA, NO ACEPTADO POR LA FARMACOPEA JAPONESA Emplear el Método A o el Método By el aparato especificado •en la monografía individual •. Todos los tiempos de prueba especificados deben cumplirse con una tolerancia de ±2%, a menos que se especifique algo diferente.
3 Filtrar las muestras de prueba inmediatamente después de tomarlas, salvo que se demuestre que la filtración no es necesaria. Usar un filtro inerte que no adsorba el ingrediente activo y que no contenga sustancias extraíbles que pudieran interferir en el análisis. 4 Un método para eliminar los gases es el siguiente: Calentar el medio, mezclando suavemente, hasta aproximadamente 41 º; inmediatamente filtrar al vacío utilizando un filtro con un tamaño de poro de 0,45 µm o menor, mezclando vigorosamente y continuar mezclando al vacío durante aproximadamente 5 minutos. También se puede emplear otra técnica de desgasificación validada para eliminar los gases disueltos.
Pruebas Físicas/ (711) Disolución 587
USP 39
Método A Procedimiento •(a menos que se indique algo diferente en la monografía individual). ETAPA ÁCIDA Colocar 750 mL de ácido clorhídrico O, l N en el vaso y ensamblar el aparato. Dejar que el medio se equilibre a una temperatura de 37 ± 0,5º. Colocar 1 unidad de dosificación en el aparato, cubrir el vaso y poner en funcionamiento el aparato a la velocidad especificada •en la monografía•. Después de funcionar 2 horas con ácido clorhídrico O, 1 N, retirar una alícuota del líquido y proceder de inmediato según se indica para la Etapa Amortiguada. Realizar un análisis de la alícuota empleando un método de valoración adecuado. •El procedimiento se especifica en la monografía individual •. ETAPA AMORTIGUADA [NOTA-Completar la adición de la solución amortiguadora y ajuste de pH dentro de los 5 minutos.] Con el aparato en funcionamiento a la velocidad indicada •en la monografía., agregar 250 mL de fosfato tribásico de sodio 0,20 M previamente equilibrado a 37 ± 0,5º al líquido del vaso. Ajustar, si fuera necesario, con ácido clorhídrico 2 N o hidróxido de sodio 2 N a un pH de 6,8 ± 0,05. Dejar el aparato funcionando durante 45 minutos o durante el tiempo especificado •en la monografía individual •. Al finalizar ese período, retirar una alícuota del líquido y efectuar el análisis empleando un método de valoración adecuado. •El procedimiento se especifica en la monografía individual. La prueba puede concluir en un período más corto que el especificado para la Etapa Amortiguada si el requisito de cantidad mínima disuelta se cumple antes de lo previsto .•
Método B Procedimiento •(a menos que se indique algo diferente en la monografía individual). ETAPA ÁCIDA Colocar 1000 mL de ácido clorhídrico O, 1 N en el vaso y ensamblar el aparato. Dejar que el medio se equilibre a una temperatura de 37 ± 0,5º. Colocar 1 unidad de dosificación en el aparato, cubrir el vaso y poner en funcionamiento el aparato a la velocidad especificada •en la monografía •. Después de funcionar 2 horas con ácido clorhídrico O, 1 N, retirar una alícuota del líquido y proceder de inmediato según se indica para la Etapa Amortiguada. Realizar un análisis de la alícuota empleando un método de valoración adecuado. •El procedimiento se especifica en la monografía individual •. ETAPA AMORTIGUADA [NOTA-Para esta etapa del procedimiento, emplear una solución amortiguadora previamente equilibrada a una temperatura de 37 ± 0,5º.] Escurrir el ácido del vaso y agregarle 1000 mL de una solución amortiguadora de fosfato de pH 6,8, preparada mezclando ácido clorhídrico O, l N con fosfato tribásico de sodio 0,20 M (3:1) y ajustando, si fuera necesario, con ácido clorhídrico 2 N o con hidróxido de sodio 2 N a un pH de 6,8 ± 0,05. [NOTA-Este paso también puede llevarse a cabo retirando del aparato el vaso que contiene el ácido, reemplazándolo con otro vaso que contenga la solución amortiguadora y transfiriendo la unidad de dosificación al vaso que contiene la solución amortiguadora.] Dejar funcionar el aparato durante 45 minutos o durante el tiempo especificado •en la monografía individual •. Al cabo de ese período, retirar una alícuota del líquido y analizarla empleando un método de valoración adecuado. •El procedimiento se especifica en la monografía individual. La prueba puede concluir en un período más corto que el especificado para la Etapa Amortiguada si el requisito de cantidad mínima disuelta se cumple antes de lo previsto .•
Aparato 3 (Cilindro Oscilante) FORMAS FARMACÉUTICAS DE LIBERACIÓN INMEDIATA, NO ACEPTADO POR LA FARMACOPEA JAPONESA Colocar el volumen indicado del Medio de disolución en cada vaso del aparato, ensamblar el aparato, equilibrar el Medio de disolución a 37 ± 0,5º y retirar el termómetro. Colocar 1 unidad de la forma farmacéutica en cada uno de los seis cilindros oscilantes, procurando eliminar las burbujas de aire de la superficie de cada unidad de dosificación y poner en funcionamiento el aparato inmediatamente, según se especifica •en la monografía individual •. Durante el recorrido ascendente y descendente, los cilindros oscilantes recorren una distancia total de 9,9-1O,1 cm. Dentro del intervalo de tiempo especificado, o en cada tiempo especificado, elevar los cilindros oscilantes y retirar una porción de la solución en análisis de una zona equidistante entre la superficie del Medio de disolución y el fondo de cada vaso. Efectuar el análisis según se indica •en la monografía individual •. Si fuera necesario, repetir la prueba con otras unidades de forma farmacéutica. Medio de disolución: Proceder según se indica en Formas Farmacéuticas de Liberación Inmediata en Aparato 7 y Aparato 2. Tiempo: Proceder según se indica en Formas Farmacéuticas de Liberación Inmediata en Aparato 7 y Aparato 2.
USP 39
588 (711) Disolución / Pruebas Físicas
FORMAS FARMACÉUTICAS DE LIBERACIÓN PROLONGADA Proceder según se indica en Formas Farmacéuticas de Liberación Inmediata en Aparato 3. Medio de disolución: Proceder según se indica en Formas Farmacéuticas de Liberación Prolongada en Aparato 1 y Aparato
2. Tiempo:
Proceder según se indica en Formas Farmacéuticas de Liberación Prolongada en Aparato 1 y Aparato 2. FORMAS FARMACÉUTICAS DE LIBERACIÓN RETARDADA
Proceder según se indica en Formas Farmacéuticas de Liberación Retardada, Método Ben Aparato 1 y Aparato 2 usando una fila de vasos para los medios de la etapa ácida y la siguiente fila de vasos para los medios de la etapa amortiguada, y usando los volúmenes de medio especificados (generalmente 300 ml). Tiempo: Proceder según se indica en Formas Farmacéuticas de Liberación Inmediata en Aparato 1 y Aparato 2.
Aparato 4 (Celda de Flujo) FORMAS FARMACÉUTICAS DE LIBERACIÓN INMEDIATA Colocar las perlas de vidrio en la celda especificada •en la monografía•. Colocar 1 unidad de dosificación sobre las perlas o, si así se especifica •en la monografía,. sobre un soporte de alambre. Ensamblar la tapa del filtro y unir las partes mediante una abrazadera adecuada. Introducir con la bomba el Medio de disolución entibiado a 37 ± 0,5º a través del extremo inferior de la celda a fin de obtener la velocidad de flujo especificada •en la monografía individual. y medida con una exactitud del 5%. Recoger el eluato en fracciones en cada tiempo indicado. Efectuar el análisis según se indica •en la monografía individual •. Repetir la prueba con otras unidades de forma farmacéutica. Medio de disolución: Proceder según se indica en Formas Farmacéuticas de Liberación Inmediata en Aparato 1 y Aparato 2. Tiempo: Proceder según se indica en Formas Farmacéuticas de Liberación Inmediata en Aparato 1 y Aparato 2. FORMAS FARMACÉUTICAS DE LIBERACIÓN PROLONGADA Proceder según se indica en Formas Farmacéuticas de Liberación Inmediata en Aparato 4. Medio de disolución: Proceder según se indica en Formas Farmacéuticas de Liberación Inmediata en Aparato 4. Tiempo: Proceder según se indica en Formas Farmacéuticas de Liberación Inmediata en Aparato 4. FORMAS FARMACÉUTICAS DE LIBERACIÓN RETARDADA Proceder según se indica en Formas Farmacéuticas de Liberación Retardada en Aparato 1 y Aparato 2 empleando los medios indicados. Tiempo-Proceder según se indica en Formas Farmacéuticas de Liberación Retardada en Aparato 1 y Aparato 2.
INTERPRETACIÓN
Formas Farmacéuticas de Liberación Inmediata A menos que se especifique algo diferente •en la monografía individual,. se cumplen los requisitos si las cantidades de ingrediente activo disuelto a partir de las unidades de dosificación analizadas se ajustan a la Tabla de Aceptación 1. Continuar con las tres etapas de prueba a menos que los resultados se ajusten a 51 o 52 • La cantidad, Q, es la cantidad de ingrediente activo disuelto •especificada en la monografía individual,. expresada como un porcentaje del contenido declarado de la unidad de dosificación; los valores de 5%, 15% y 25% en la Tabla de Aceptación 1 son los porcentajes del contenido declarado de forma que estos valores y Q están expresados en unidades equivalentes. "' 1 Ta bl a d e Aceptac1on
Etapa
Nºde Unidades Anallzadas
Criterios de Aceptación
5,
6
Ninquna unidad es menor que Q + 5%.
5,
6
El promedio de 12 unidades (5 1 + 5,) es :?.Q, y ninguna unidad es
5,
12
El promedio de 24 unidades (5 1 + 52 +53) es :?.Q, no más de 2 unidades son
y ninguna unidad
Pruebas Físicas/ (711) Disolución 589
USP 39
•Muestra Combinada para Formas Farmacéuticas de Liberación Inmediata A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, se cumple con los requisitos si las cantidades de ingrediente activo disuelto a partir de la muestra combinada se ajustan a la Tabla de Aceptación para una Muestra Combinada adjunta. Continuar con las tres etapas de prueba a menos que los resultados se ajusten a 51 o 52 • La cantidad, Q, es la cantidad de ingrediente activo disuelto especificada en la monografía individual, expresada como un porcentaje del contenido declarado. Tabla de Aceptación para una Muestra Combinada
Etapa
Nº de Unidades Analizadas
5,
6
La cantidad disuelta promedio no es menor que Q + 10%.
57
6
La cantidad disuelta promedio (5 7 + 57) es zQ + 5%.
53
12
La cantidad disuelta promedio (5 1 + 52 + 5 1) es zQ.
Criterios de Aceptación
Formas Farmacéuticas de Liberación Prolongada A menos que se especifique algo diferente •en la monografía individual., se cumplen los requisitos si las cantidades de ingrediente activo disuelto a partir de las unidades de dosificación analizadas se ajustan a la Tabla de Aceptación 2. Continuar con los tres niveles de prueba a menos que los resultados se ajusten a L1 o L2 • Los límites de la cantidad de ingrediente activo disuelto se expresan como porcentajes del contenido declarado. Los límites comprenden cada valor de Q;, que representa la cantidad disuelta en cada intervalo fracciona! de dosificación especificado. Si se especifica más de un intervalo •en la monografía individual., los criterios de aceptación se aplican por separado a cada intervalo. Tabla de Aceptación 2
Nivel L,
L,
L,
Nºde Unidades Anallzadas
Criterios
6
Ningún valor individual se encuentra fuera de los intervalos especificados y, en el momento final de la prueba, ningún valor individual es menor que la cantidad especificada.
6
El valor promedio de las 12 unidades (L 1 + L2) se encuentra dentro de cada intervalo especificado y no es menor que la cantidad especificada en el momento final de la prueba; ningún valor representa >del 10%, del contenido declarado, fuera de los intervalos especificados; y ningún valor representa> del 10%, del contenido declarado, por debajo de la cantidad especificada en el momento final de la prueba.
12
El valor promedio de las 24 unidades (L 1 + L2 + L3) se encuentra dentro de los intervalos especificados y no es menor que la cantidad especificada en el momento final de la prueba; no más de 2 de las 24 unidades presentan más del 10%, del contenido declarado, fuera de los intervalos especificados; no más de 2 de las 24 unidades presentan > del 10%, del contenido declarado, por debajo de la cantidad especificada en el momento final de la prueba; y ninguna de las unidades presenta > del 20% del contenido declarado fuera de cada uno de los intervalos especificados ni presenta >del 20% del contenido declarado por debajo de la cantidad especificada en el momento final de la prueba.
Formas Farmacéuticas de Liberación Retardada NO ACEPTADO POR LA FARMACOPEA JAPONESA
Etapa ácida: A menos que se especifique algo diferente •en la monografía individual., se cumplen los requisitos de esta parte de la prueba si las cantidades, basadas en el porcentaje de contenido declarado, de ingrediente activo disuelto a partir de las unidades analizadas, se ajustan a la Tabla de Aceptación 3. Continuar con todos los niveles de prueba a menos que los resultados de la Etapa ácida y la Etapa amortiguada se ajusten en un nivel previo. Tabla de Aceptación 3
Nivel
Nº de Unidades Analizadas
A,
6
Ningún valor individual de la cantidad disuelta excede el 10%.
A?
6
El promedio de la cantidad disuelta de las 12 unidades (A 1 + A2) no es más del 10% y ninguna unidad individual se disuelve > del 25%.
A,
12
El promedio de la cantidad disuelta de las 24 unidades (A 1 + A2 + A3) no es más del 10% y ninguna unidad individual se disuelve > del 25%.
Criterios
USP 39
590 (711) Disolución / Pruebas Físicas
Etapa amortiguada: A menos que se especifique algo diferente •en la monografía individual., se cumplen los requisitos si las cantidades de ingrediente activo disuelto a partir de las unidades analizadas se ajustan a la Tabla de Aceptación 4. Continuar con los tres niveles de prueba a menos que los resultados de las dos etapas se ajusten antes de lo previsto. El valor de Q en la Tabla de Aceptación 4 es el 75% disuelto a menos que se especifique algo diferente •en la monografía individual •. La cantidad, Q, •especificada en la monografía individual., representa la cantidad total de ingrediente activo disuelto en la Etapas acida y la Etapa amortiguada, expresada como un porcentaje del contenido declarado. Los valores de 5%, 15% y 25% que aparecen en la Tabla de Aceptación 4 son los porcentajes del contenido declarado de forma que estos valores y Q estén expresados en los mismos términos. Tabla de Aceptación 4
Nivel
Nº de Unidades Anallzadas
81
6
Cada unidad no es menor que Q + 5%.
82
6
El promedio de 12 unidades (8 1 + 82) es ?:Q y ninguna unidad es
83
12
El promedio de 24 unidades (8 1 + 82 + 83) es ?:Q, no más de 2 unidades son
Criterios
(721) INTERVALO DE DESTILACIÓN Para determinar el intervalo de temperaturas dentro del cual se destila un líquido oficial, o el porcentaje de material que se destila entre dos temperaturas especificadas, emplear el Método 1 o el Método 11 según se indica en la monografía individual. El límite inferior del intervalo es la temperatura indicada por el termómetro cuando la primera gota del condensado deja la punta del condensador y el límite superior es el Punto Seco, es decir, la temperatura a la cual la última gota de líquido se evapora del fondo del matraz de destilación, sin tener en cuenta el líquido que pueda quedar en las paredes del matraz, o la temperatura observada al recogerse la proporción especificada en la monografía individual. NOTA-Enfriar todos los líquidos que destilan por debajo de 80º a entre 1 Oº y 15º antes de medir la muestra a destilar.
MÉTODO 1 Aparato-Emplear un aparato similar al especificado para el Método 11, excepto que se debe usar un matraz de destilación que tenga una capacidad de 50 a 60 mL y que tenga un cuello de 1 O a 12 cm de largo y 14 a 16 mm de diámetro interno. La perforación de la placa aislante superior, si se emplea una, debe ser tal que cuando el matraz se fija en ella, la porción del matraz que queda por debajo de la superficie superior del material aislante tenga una capacidad de 3 a 4 ml. Procedimiento-Proceder según se indica en el Método 11, pero colocar en el matraz sólo 25 mL del líquido a analizar.
Cambio en la redacción:
MÉTODO 11 Aparato-Emplear un aparato que conste de las siguientes partes: Matraz de Destilación-Un matraz de destilación de fondo redondo, de vidrio resistente al calor, de 200 mL de capacidad y con una longitud total de 17 a 19 cm y un cuello de 20 a 22 mm de diámetro interno. A media distancia del cuello, aproximadamente a 12 cm del fondo del matraz, tiene conectado un brazo lateral de 1 O a 12 cm de largo y 5 mm de diámetro interno, que forma un ángulo de 70º a 75º con la parte inferior del cuello. Condensador-Un condensador recto de vidrio de 55 a 60 cm de largo con una camisa de agua de aproximadamente 40 cm de largo, o un condensador de otro diseño con una capacidad de condensación equivalente. El extremo inferior del condensador puede ser curvo para que actúe como tubo de salida, o puede conectarse a un adaptador acodado que cumpla con el mismo propósito. Placas Aislantes-Dos piezas de placas aislantes cuadradas de 5 a 7 mm de espesor y de 14 a 16 cm de lado, apropiadas para concentrar el calor en la parte inferior del matraz. Cada placa tiene un orificio en el centro y las dos placas difieren sólo en el diámetro del orificio, es decir, los diámetros son 4 cm y 1 O cm, respectivamente. Cuando se utilizan, las placas se colocan una sobre la otra en un trípode u otro soporte adecuado, con la placa que tiene el orificio más grande colocada sobre la otra. Receptor-Una probeta graduada de 100 mL con subdivisiones de 1 ml. Termómetro-Para evitar la necesidad de corrección por vástago emergente, se recomienda un termómetro exactamente normalizado, de inmersión parcial con subdivisiones lo más pequeñas posibles (no más de 0,2º). Los termómetros adecuados están disponibles como series ASTM E-1 de 37C a 41Cyde102C a 107C (ver •Advertencias y Requisitos Generales, 6.80.30. Dispositivos de Medición de Temperatura• (AFOl-may-2016¡). Cuando se coloca en posición, el vástago queda ubicado en el centro
Pruebas Físicas/ (724) Liberación de Fármacos 591
USP 39
del cuello y la parte superior de la cámara de contracción (o bulbo, si se emplea uno de 37C o 38C) está a la altura del borde inferior de la salida del brazo lateral. Fuente de Calor-Un mechero Bunsen pequeño, o un calentador o manto eléctricos con una capacidad de ajuste comparable a la de un mechero Bunsen. Procedimiento-Ensamblar el aparato y colocar en el matraz 100 ml del líquido a analizar, evitando que penetre líquido por el brazo lateral. Insertar el termómetro, proteger todo el ensamble de mechero y matraz de las corrientes de aire externas y aplicar calor, regulándolo para que transcurran entre 5 y 1O minutos hasta que la primera gota del destilado caiga del condensador. Continuar la destilación a una velocidad de 4 a 5 ml de destilado por minuto, recogiendo el destilado en el receptor. Observar la temperatura cuando la primera gota del destilado caiga del condensador y nuevamente cuando la última gota de líquido se evapora del fondo del matraz o cuando el porcentaje especificado haya destilado. A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, aplicar la corrección por vástago emergente cuando sea necesario e informar las temperaturas ajustando la presión barométrica por la siguiente fórmula: t = t 0 +[(t0 10-4 + 0,033)(760 - p)] en donde tes la temperatura de ebullición corregida, en la escala Celsius; t 0 es la temperatura de ebullición medida, en la escala Celsius; y p es la presión barométrica al momento de la medición, en mm Hg.
(724) LIBERACIÓN DE FÁRMACOS ALCANCE Esta prueba se provee para determinar el cumplimiento con los requisitos de liberación o disolución de fármacos cuando se declara en las monografías individuales para sistemas transdérmicos (STO) y otras formas farmacéuticas. A partir de los tipos de aparatos aquí descritos, usar el especificado en la monografía individual.
NORMAS GENERALES DE LIBERACIÓN DE FÁRMACOS
Aparato 5 (Paleta sobre Disco) Usar la paleta y el vaso del Aparato 2 según se describe en Disolución (711 ), agregando un dispositivo en forma de disco diseñado para mantener el STO en el fondo del vaso. El dispositivo en forma de disco está diseñado para minimizar todo volumen "muerto" entre el disco y el fondo del vaso. El dispositivo en forma de disco mantiene el STO plano y se coloca de tal manera que la superficie de liberación sea paralela a la parte inferior del aspa de la paleta (ver la Figura 1a, la Figura 1by la Figura 1e). Se mantiene una distancia de 25 ± 2 mm entre el aspa de la paleta y la superficie del dispositivo en forma de disco durante la prueba. Se pueden usar otros dispositivos adecuados (ver la Figura 2), siempre que no adsorban o absorban, reaccionen o interfieran con la muestra en análisis. Aparato:
USP 39
592 (724) Liberación de Fármacos / Pruebas Físicas
Vaso de disolución
4-------l'--- Paleta
Dispositivo en forma de disco
Dispositivo en forma de disco
Figura 1a. Paleta sobre disco. (Todas las mediciones se expresan en mm a menos que se indique de otro modo.) Tamiz de malla 17 090mm
Paleta (Ver <711>)
idrio c;te reloj 090mm
Figura 1b. Paleta sobre disco (malla
y vidrio de reloj).
Pruebas Físicas/ (724) Liberación de Fármacos 593
USP 39
O 76mm x 45º
d~ perímetro -
Material:
PVDF
Figura 1 c. Broche para sujetar la malla y el vidrio de reloj.
Figura 2. Malla de alambre de sujeción. Aptitud del aparato: Proceder según se indica en Aparato 2 en Disolución (711 ), Aptitud del Aparato, Prueba de Verificación del Desempeño, Aparatos 7 y 2. Medio: Proceder según se indica en Medio de Disolución en Disolución (711 ), Procedimiento, Aparato 7 y Aparato 2, Formas Farmacéuticas de Liberación Inmediata. Procedimiento Colocar el volumen declarado de Medio en el vaso y equilibrar a 32 ± 0,5º.
Aplicar el STD al dispositivo en forma de disco, asegurándose de que la superficie de liberación esté lo más lisa posible y que el STD esté completamente sujeto al disco con firmeza. El STD con la superficie de liberación hacia arriba puede sujetarse al disco usando un procedimiento apropiado y validado tal como un adhesivo, una cinta adhesiva de doble cara, una malla o una membrana. Se debe tener cuidado de evitar fa presencia de burbujas de aire entre la membrana, si se usa, y el STD, o la presencia de arrugas en la superficie del STD. Retirar con cuidado la capa protectora del STD sin dañar la superficie de éste último. Colocar el dispositivo en forma de disco de forma plana en el fondo del vaso con la superficie de liberación hacia arriba y paralela borde del aspa de la paleta y de la superficie del Medio. Asegurarse de que la superficie del STD esté libre de burbujas de aire. El borde inferior de la paleta está a 25 ± 2 mm de la superficie del dispositivo en forma de disco. Se puede cubrir el vaso durante la prueba para minimizar la evaporación. Poner en funcionamiento inmediatamente el aparato a la velocidad especificada en la monografía. En cada intervalo de muestreo, retirar una muestra de una zona intermedia entre la superficie del Medio y la parte superior del aspa, y a no menos de 1 cm de la pared del vaso. Realizar el análisis en cada alícuota de muestra según se indica en la monografía individual, corrigiendo por cualquier pérdida de volumen, según sea necesario. Repetir esta prueba con tantos STD adicionales como sean necesarios.
594 (724) Liberación de Fármacos/ Pruebas Físicas
USP 39
Tiempo: Los tiempos de muestreo de prueba, al menos tres, se expresan en horas. Las muestras se deben retirar dentro de una tolerancia de ±15 minutos o ±2% del tiempo indicado, seleccionando la tolerancia que resulte en el intervalo de tiempo más corto. Interpretación: A menos que se indique de otro modo en la monografía individual, los requisitos se cumplen si las cantidades de ingrediente activo liberado del sistema se ajustan a la Tabla de Aceptación 7 siguiente. Continuar analizando a lo largo de los tres niveles a menos que los resultados se ajusten a L1 o L2 • Tabla de Aceptación 1 Nivel
Número de Unidades Analizadas
L1
6
Ningún valor individual se encuentra fuera del intervalo especificado.
6
El valor promedio de las 12 unidades (L 1 + L2) se encuentra dentro del intervalo especificado. Ningún valor individual se encuentra fuera del intervalo especificado en más de 10% del promedio del intervalo especificado.
12
El valor promedio de las 24 unidades (L 1 + L2 + L3) se encuentra dentro del intervalo especificado. No más de 2 de las 24 unidades se encuentran fuera del intervalo especificado en más de 10% del promedio del intervalo especificado; y ninguna de las unidades se encuentra fuera del intervalo especificado en más de 20% del promedio del intervalo especificado.
L2
Li
Criterios
Aparato 6 (Cilindro) Aparato: Usar el vaso según se describe en Disolución (711 ), Aparato, Aparato 7 (Aparato con Canastilla), excepto que se debe reemplazar la canastilla y el eje con un elemento mezclador cilíndrico de acero inoxidable con las especificaciones mostradas en la Figura 3. Este elemento mezclador cilíndrico consta de dos partes, una comprende el eje y el cilindro superior, y la otra es la extensión del cilindro. Puesto que ambas partes se enumeran en serie, se recomienda mantenerlas pareadas, debido a que el ajuste de fricción se realiza de manera individual para cada cilindro, lo que permite un calce muy ajustado. La distancia entre la parte inferior interna del vaso y el cilindro se mantiene a 25 ± 2 mm durante la prueba.
Pruebas Físicas/ (724) Liberación de Fármacos 595
USP 39
Radio máximo 0,300
Tolerancias:
±0,0127 -+--4,064± 0,051 1
Terminación: Todas las superficies deben tener 32 micropulgadas en promedio geométrico. Desengrasar antes del ensamblaje final de la varilla y del cilindro.
Material: Acero inoxidable 316L
Esta sección del adaptador se debe
-¡
usar para sistemas
grandes.
·~
5,740
~11 --4,45±0,02--
Figura 3. Elemento mezclador cilíndrico. (Todas las medidas se expresan en cm a menos que se indique de otro modo.)
Medio: Ver Medio de Disolución en Disolución (711 ), Procedimiento, Aparato 1 y Aparato 2, Formas Farmacéuticas de Liberación Inmediata. Procedimiento Colocar el volumen indicado de Medio en el vaso y equilibrar a 32 ± 0,5º. Aplicar el STO al cilindro, asegurándose de que la superficie de liberación esté lo más lisa posible y que el STO esté completamente sujeto al cilindro con firmeza. El STO con la superficie de liberación hacia el Medio puede sujetarse al cilindro usando un procedimiento apropiado y validado tal como un adhesivo, una cinta adhesiva de doble cara, una membrana o una red de nailon. Se debe tener cuidado de evitar la presencia de burbujas de aire entre la membrana, si se usa, y el STO, o la presencia de arrugas en la superficie del STO. Retirar con cuidado la capa protectora del STO sin dañar la superficie. Si se requiere reforzar más la sujeción del STO al cilindro, se puede usar un alambre de metal inerte o un anillo de polímero. Colocar el cilindro en el aparato y hacer rotar inmediatamente a la velocidad especificada en la monografía individual. Se puede cubrir el vaso durante la prueba para minimizar la evaporación. En cada intervalo de tiempo de muestreo, retirar una muestra de una zona intermedia entre la superficie del Medio y la parte superior del cilindro rotatorio, y a no menos de 1 cm de la pared del vaso. Realizar el análisis en cada alícuota de muestra según se indica en la monografía individual, corrigiendo por cualquier pérdida de volumen, según sea necesario. Repetir esta prueba con tantos STO adicionales como sean necesarios. Tiempo: Los tiempos de muestreo de prueba, al menos tres, se expresan en horas. Las muestras deben retirarse dentro de una tolerancia de ± 15 minutos o ±2% del tiempo indicado, seleccionando la tolerancia que resulte en el intervalo de tiempo más corto.
USP 39
596 (724) Liberación de Fármacos/ Pruebas Físicas
Interpretación: A menos que se indique de otro modo en la monografía individual, los requisitos se cumplen si las cantidades de ingrediente activo liberado del sistema se ajustan a la Tabla de Aceptación 7 anterior. Continuar analizando a lo largo de los tres niveles a menos que los resultados se ajusten a L, o L2 •
Aparato 7 (Soporte Oscilante) El ensamblaje consta de (1) un grupo de recipientes para soluciones volumétricamente calibrados o tarados hechos de vidrio o de otro material inerte adecuado que no deben adsorber o absorber, reaccionar ni interferir con la muestra que se está analizando; (2) un motor y una transmisión que hacen oscilar el sistema en sentido vertical y que, si se desea, trasladan automáticamente el sistema en sentido horizontal hacia otra hilera de vasos; y (3) un grupo de portamuestras adecuados (ver la Figura 4 y las Figuras Sa, Sb, Se y Sd).
Aparato:
H\
r
:::-Radio 0,1143
~e
.. -¡.+
Diámetro 0,3175 -Presionar para ajustar el cabezal
T (Dibujo típico - el diseño o la forma puede variar)
.. 1-s
D Las dimensiones están indicadas en centímetros VARILLA
CABEZAL
ARGOLLA
Sistemaª
A (Diámetro)
B
e
D
Materia!C
1,6cm2
1,428
0,9525
0,4750
SSNT
30,48
SS/P
Parker 2-113-V884-75
2,5cm2
1,778
0,9525
0,4750
SSNT
30,48
SS/P
Parker 2-016-V884-75
5cm2
2,6924
0,7620
0,3810
SSNT
8,890
SS/P
Parker 2-022-V884-75
7cm2
3,1750
0,7620
0,3810
SSNT
30,48
SS/P
Parker 2-124-V884-75
10cm2
5,0292
0,6350
0,3505
SSNT
31,01
SS/P
Parker 2-225-V884-75
Materiait>
·(no se muestra)
a Medidas de sistemas típicos =acero inoxidable (SS) o TeflÓn virgen (VT) e SS/P = acero inoxidable (SS) o Plexiglás (P)
b SSNT
Figura 4. Disco oscilante portamuestras.
Argolla Parker
Placa 1,98 0 usar junta tipo anillo 2-225-V884-75
o Placa 1,42 0 usar junta tipo anillo 2-218-V884-75
Tubo de acero inoxidable 12" X 3116" O
"= diámetro Figura Sa. Portamuestras de sistemas transdérmicos-disco angular.
Pruebas Físicas/ (724) Liberación de Fármacos 597
USP 39
Cilindro de Teflón virgen 3 518" x 1 3/8" 0
I Junta tipo anillo Parker 2-026-V884-75
Varilla de acero inoxidable 8" X 1/8" 0
" = diámetro Figura 5b. Portamuestras de sistemas transdérmicos-cilindro.
/
e
Varilla de acrílico 12" x 1/8" "
" =diámetro Figura 5c. Portatabletas para tabletas orales de liberación prolongada-varilla, puntiaguda para encolado.
Resorte de acero inoxidable
Tubo de acero inoxidable 11" X 1/8" 0
Dimensiones del resorte de acero inoxidable A 8 1,45 ,580 1,40 ,31 0 ,96 ,330 ,60 ,250 0 = diámetro
Figura 5d. Portatabletas para tabletas orales de liberación prolongada-soporte de resorte. Durante la prueba, los recipientes para soluciones se sumergen parcialmente en un baño de agua adecuado de cualquier tamaño conveniente que permite mantener la temperatura dentro de los recipientes a 32 ± 0,5º para STD o a 37 ± 0,5º para otras formas farmacéuticas. Ninguna parte del equipo, incluyendo el entorno en el que éste se coloca, contribuye con movimiento, agitación o vibración importante más allá de la debida al movimiento oscilante suave y vertical del portamuestras. Se prefiere un aparato que permita la observación del sistema y del portamuestras durante la prueba. Usar un portamuestras y recipiente del tamaño especificado en la monografía individual. Medio: Ver Medio de Disolución en Disolución (711 ), Procedimiento, Aparato 7 y Aparato 2, Formas Farmacéuticas de Liberación Inmediata. Preparación de la muestra A (para tabletas de bomba osmótica):
Sujetar cada unidad a analizar a un portamuestras adecuado usando un procedimiento apropiado y validado tal como el uso de un adhesivo para adherir el borde de la tableta al portamuestras (p.ej., Figura Se), al soporte de resorte (Figura Sd), a una pequeña bolsa de red de nailon o a una membrana. Preparación de la muestra B (para STO): Aplicar el STO al portamuestras adecuado, asegurándose de que la superficie de liberación esté lo más lisa posible y que el STO esté completamente sujeto al portamuestras con firmeza. El STO puede sujetarse al portamuestras con la superficie de liberación contra el Medio usando un procedimiento apropiado y validado tal como un adhesivo, una cinta adhesiva de doble cara, una membrana o una red de nailon. Se debe tener cuidado de evitar la presencia de burbujas de aire entre la membrana, si se usa, y el STD, o la presencia de arrugas en la superficie del STD. Retirar con cuidado la capa protectora del STO sin dañar la superficie de éste último. Si se requiere reforzar más la sujeción del STO al portamuestras, se puede usar un alambre de metal inerte o un anillo de polímero.
598 (724) Liberación de Fármacos/ Pruebas Físicas
Preparación de la muestra C (para otras formas farmacéuticas):
USP 39
Sujetar cada forma farmacéutica a analizar al portamuestras
adecuado. Procedimiento: Colocar el volumen declarado de Medio en los recipientes para soluciones y equilibrar a la temperatura de prueba. Suspender cada portamuestras preparado en un agitador de oscilación vertical de modo que cada sistema se sumerja continuamente en Medio durante toda la prueba. Hacerlos oscilar a una frecuencia de aproximadamente 30 ciclos/minuto con una amplitud de aproximadamente 2 cm, o conforme se especifique en la monografía individual, durante el tiempo especificado. En cada intervalo de tiempo de muestreo, retirar los recipientes para solución del baño, enfriar a temperatura ambiente y agregar suficiente disolvente (es decir, agua, en la mayoría de los casos) para corregir por pérdidas por evaporación. Realizar el análisis en cada muestra según se indica en la monografía individual. Repetir esta prueba con tantos sistemas transdérmicos adicionales como sean necesarios. Tiempo: - Los tiempos de muestreo de prueba, al menos tres, se expresan en horas. Las muestras deben retirarse dentro de una tolerancia de± 15 minutos o ±2% del tiempo indicado, seleccionando la tolerancia que resulte en el intervalo de tiempo más corto. Interpretación: A menos que se indique de otro modo en la monografía individual, los requisitos se cumplen si las cantidades de ingrediente activo liberado del STD se ajustan a la Tabla de Aceptación 7 anterior o a la tabla de aceptación apropiada en Disolución (711) para las demás formas farmacéuticas. Continuar analizando a lo largo de los tres niveles a menos que los resultados se ajusten a L1 o L2 .
(729) DISTRIBUCIÓN DEL TAMAÑO DE GLÓBULOS EN EMULSIONES INYECTABLES DE LÍPIDOS INTRODUCCIÓN Las emulsiones inyectables para administración intravenosa, que se utilizan en la terapia de nutrición parenteral total (TPN, por sus siglas en inglés), son emulsiones estériles de aceite de soja en agua utilizadas para proveer un suministro amplio de ácidos grasos esenciales, linoleico y linolénico, que se dispersan con la ayuda de un agente emulsionante en Agua para Inyección. Como alternativa, se puede mezclar el aceite de soja con otros aceites adecuados (triglicéridos neutros), como el aceite de cártamo, triglicéridos de cadena media (MCT, por sus siglas en inglés) derivados de aceites de coco o de semilla de palma, aceite de oliva o un aceite marino como el de arenque. El tamaño de las gotitas de lípidos es crítico: debido a la filtración mecánica, los glóbulos de grasa de mayor tamaño (>5 µm) pueden quedar atrapados en los pulmones. Las características esenciales del tamaño de una emulsión inyectable de lípidos para uso intravenoso incluyen el diámetro medio de las gotitas de lípidos y el intervalo de los distintos diámetros de gotitas que se distribuyen alrededor del diámetro medio, lo que se expresa como la desviación estándar. Específicamente, las cantidades de glóbulos de grasa que constituyen la cola de la curva de distribución correspondiente al mayor tamaño de glóbulos son particularmente importantes con respecto a la seguridad de la infusión. Se debe controlar que estas dos regiones de la distribución del tamaño de glóbulos (el tamaño medio de las gotitas y la cola de la curva de distribución correspondiente al mayor tamaño de gotitas) se mantengan dentro de los límites especificados. Para la determinación del diámetro medio de las gotitas de lípidos y la distribución de los tamaños de glóbulos de mayor diámetro en las emulsiones inyectables de lípidos se utilizan los dos métodos que se describen a continuación. El Método I y el Método 11 deben ser validados. Los métodos que se describen a continuación para evaluar la calidad de las emulsiones inyectables de lípidos se deben realizar en dos etapas.
MÉTODO 1-MÉTODO DE DISPERSIÓN DE LA LUZ Para la determinación del tamaño medio de las gotitas de las emulsiones inyectables de lípidos, puede usarse una de las dos técnicas de dispersión de la luz más comunes: (1) dispersión dinámica de la luz (DDL), conocida también como espectroscopía de correlación fotónica (ECF) o (2) dispersión clásica de la luz, basada en la teoría de dispersión de Mie. La técnica DDL o ECF se basa en el análisis de las fluctuaciones temporales rápidas en la intensidad de la luz dispersada que se producen debido al movimiento Browniano aleatorio, o difusión, de cualquier partícula, incluidas las gotitas de lípidos, suspendidas en un líquido. La intensidad se mide a un ángulo determinado (por lo general 90º) por medio de un detector adecuado (p.ej., un tubo fotomultiplicador) capaz de medir la intensidad de la luz dispersada, que fluctúa rápidamente, producida por las gotitas en difusión, suspendidas. Generalmente, estos datos de intensidad de luz dispersada se utilizan para calcular la función de autocorrelación de intensidad, que es una función de decaimiento exponencial simple en función del tiempo para gotitas de tamaño uniforme. La distribución de los tamaños de las gotitas se expresa por funciones exponenciales de distintos tiempos de decaimiento. La función de autocorrelación que generan los datos de intensidad de luz dispersada obtenidos a partir de una emul-
USP 39
Pruebas Físicas/ (729) Distribución del Tamaño de Glóbulos 599
sión dada puede ser "invertida" por medio de un algoritmo adecuado de deconvolución para obtener la distribución aproximada de coeficientes de difusión ponderados por intensidad. A partir de ésta, se calcula la distribución de gotitas de diámetro pequeño, mediante la ecuación de Stokes-Einstein y las reglas de la dispersión clásica de la luz (Mie). Por el contrario, la dispersión clásica de la luz basada en la teoría de Mie analiza la variación espacial, no la temporal, de la intensidad de la luz dispersada al medir a la última como una función del ángulo de dispersión, típicamente a lo largo de un gran intervalo de ángulos detectados. Las fluctuaciones temporales en la intensidad de dispersión debidas al movimiento Browniano se promedian en el tiempo para cada medición angular. Esta variación angular se produce como consecuencia de la interferencia mutua de las ondas individuales dispersadas que llegan al detector con fases distintas desde puntos diferentes dentro de una gotita de lípidos dada así como desde otras partículas. La amplitud de la variación angular es significativa toda vez que el diámetro de la gotita no sea pequeño en comparación con la longitud de onda de la luz láser (típicamente, 635 nm). Las gotitas de un tamaño e índice de refracción determinados producen una curva única de intensidad de dispersión en función del ángulo de dispersión. La distribución de los tamaños de gotitas origina una dependencia angular final que representa la superposición o suma de las curvas individuales (distintas) de intensidad en función del ángulo. La dependencia angular medida de la intensidad de dispersión obtenida a partir de una muestra de emulsión dada puede ser invertida por medio de un algoritmo adecuado de deconvolución y la teoría de dispersión de Mie para obtener la distribución aproximada del tamaño de gotitas. Así, la dispersión de la luz, mediante la dispersión dinámica de la luz (es decir, fluctuaciones temporales debidas a la difusión de las gotitas) o la dispersión clásica de la luz/teoría de Mie (es decir, intensidad promedio en función del ángulo), puede proporcionar resultados aceptables para el diámetro medio y la desviación estándar de la distribución del tamaño de las gotitas. Para ilustrar el método usado en el Método 1, se describe una técnica de dispersión dinámica de la luz. Para una guía sobre los instrumentos que utilizan la dispersión clásica de la luz - teoría de Mie, ver Medición del Tamaño de Partícula por Difracción de Luz (429). Aparato-Un instrumento DDL/ECF adecuado, con o sin la capacidad de dilución automática de muestra, y controlado por un software validado, se utiliza para llevar a cabo la medición con el ángulo de dispersión generalmente ajustado a 90º. Se informan los resultados ponderados por intensidad (diámetro medio y desviación estándar), siempre que se indique claramente cuáles son los valores que se proveen y que también se den los valores de los parámetros necesarios para los cálculos requeridos. Agua-Pasar agua destilada a través de un filtro con un tamaño de poro de 0,2 µm y desgasificar por ultrasonido o usar Agua Estéril para Inyección almacenada en un envase de vidrio. Preparación Estándar-Agregar una cantidad adecuada de suspensión concentrada, conteniendo partículas estándar de látex de poliestireno rastreables al NIST u otras nanoesferas adecuadas, a un volumen preestablecido de Agua. Mezclar suavemente los líquidos para obtener una suspensión homogénea. La suspensión diluida tendrá un aspecto levemente turbio. Si el instrumento DDL/ECF está equipado con un sistema de dilución automático, se puede analizar la muestra concentrada inicial por inyección directa en el instrumento con una jeringa, produciéndose automáticamente una dilución adicional para optimizar la concentración de gotitas para el análisis. Alternativamente, la muestra requeriría una dilución manual mayor con Agua (típicamente por un factor de 1O, por lo menos, sobre la primera dilución) y su instilación posterior en una celda de goteo. Las especificaciones del instrumento determinarán el esquema óptimo de dilución que logre la intensidad de dispersión adecuada para el análisis por celda. Así, se debe optimizar la concentración de látex en la muestra final para el instrumento DDL/ECF utilizado. Esto se deberá llevar a cabo separadamente para tres estándares de tamaño distintos de aproximadamente 100 nm, 250 nm y 400 nm (análisis triplicado por tamaño) y los resultados correspondientes del diámetro medio ponderado por intensidad y la desviación estándar deben coincidir con los valores esperados dentro de errores aceptables. Preparación de Prueba-Agregar un volumen adecuado de muestra de la emulsión inyectable de lípidos a un volumen preestablecido de agua. Mezclar suavemente los líquidos para obtener una suspensión homogénea. La suspensión diluida tendrá un aspecto levemente turbio. Si el instrumento DDL/ECF está equipado con un sistema de dilución automático, se puede analizar la muestra concentrada inicial por inyección directa en el instrumento con una jeringa. Automáticamente se producirá una dilución adicional de la muestra para optimizar la concentración de gotitas para el análisis, lo que asegura que no se produzcan artefactos debidos a la dispersión múltiple o las interacciones entre las gotitas. Alternativamente, la muestra podría requerir una dilución manual mayor con Agua (típicamente por un factor de 1O, por lo menos, sobre la primera dilución) y su instilación posterior en una celda "de goteo". Las especificaciones del instrumento determinarán el esquema óptimo de dilución que logre la intensidad de dispersión adecuada para el análisis por celda. Así, se debe optimizar la concentración de la emulsión inyectable de lípidos en la muestra final para el instrumento DDL/ECF utilizado. Aptitud del Sistema-Usando la Preparación Estándar, medir el diámetro medio de partículas ponderado por intensidad y la desviación estándar correspondiente. El sistema es apto una vez que la temperatura de la muestra alcanza el equilibrio y los resultados se han estabilizado y se obtienen por triplicado las mediciones del diámetro medio de las gotitas. El coeficiente de variación (CV) no debe superar el 10% del diámetro medio de las gotitas rastreables al NIST. Un valor mayor de CV indica que las microesferas de látex no son aptas como estándar porque carecen inherentemente de uniformidad o se han aglomerado a un nivel inaceptable. En este caso, se debe seleccionar y probar otra suspensión látex estándar. Procedimiento e Interpretación-Si el instrumento DDL/ECF está equipado con un sistema de dilución automático, usar una jeringa desechable para cargar la Preparación Estándar o la Preparación de Prueba. Si no se utiliza un sistema de dilución automático, transferir la preparación adecuadamente diluida a una celda y colocarla en el espectrómetro. Dejar que la muestra se equilibre a una temperatura controlada preestablecida cercana a la temperatura ambiente (entre 20º y 25º, como en la defi-
600 (729) Distribución del Tamaño de Glóbulos / Pruebas Físicas
USP 39
nición de la USP que se encuentra en Requisitos de Envasado y Almacenamiento (659)). Ajustar el ángulo de dispersión del instrumento a 90º y llevar a cabo las mediciones. En tanto que la bondad del ajuste chi cuadrado (x 2 ) se mantenga aceptablemente bajo (de acuerdo con las especificaciones del instrumento), los resultados para la Preparación de Prueba son aceptables. Los valores excesivos del parámetro x2 sugieren que la distribución de gotitas no es normal y pueden indicar una emulsión inestable. El diámetro medio de las gotitas ponderado por intensidad (MDD) para las emulsiones inyectables de lípidos debe ser inferior a 500 nm o 0,5 µm, independientemente de la concentración de la fase lípida dispersa.
MÉTODO 11-MEDICIÓN DEL CONTENIDO DE GLÓBULOS GRANDES POR EL MÉTODO DE OBSTRUCCIÓN O EXTINCIÓN DE LUZ Para la determinación de la extensión de la cola de la curva de distribución correspondiente al mayor tamaño de gotita (>5 µm) de las emulsiones inyectables de lípidos se usa un método de obstrucción de la luz (LO, por sus siglas en inglés) o extinción de la luz (LE, por sus siglas en inglés) que emplea la técnica de determinación óptica del tamaño de partículas individuales (glóbulos) (SPOS, por sus siglas en inglés). Durante la aplicación de la técnica LE/SPOS, el pasaje de una gotita a través de una zona estrecha de detección óptica causa el bloqueo de una porción del haz de luz incidente, lo que provoca la reducción momentánea de la intensidad de la luz que alcanza al detector de "extinción". Idealmente, la magnitud de esta reducción en la señal es proporcional al área de sección transversal de la gotita (considerada más pequeña que el espesor de la zona de detección), es decir, al cuadrado del diámetro de la gotita. Durante la optimización del instrumento LE/SPOS para una muestra de emulsión determinada, debe probarse una serie de diluciones para lograr uniformidad entre las muestras. El objetivo es la identificación de un intervalo estándar de diluciones que produzcan datos uniformes y sean las más adecuadas para la formulación evaluada. Idealmente, cuando se comparan emulsiones distintas, se utiliza el mismo número aproximado de glóbulos en cada determinación de tamaño y una vez que se alcanza un estándar, se lo incorpora al plan de muestreo de rutina para las pruebas de validación. Siempre que la concentración de glóbulos de grasa esté por debajo del "límite de coincidencia" del sensor (determinado por la celda de flujo y el diseño óptico), sólo pasará un glóbulo, como máximo, a través de la zona de detección en un momento determinado, lo que permite que se lo cuente y se mida con exactitud (con menos de 1o/o de eventos de coincidencia). Es necesario conocer el límite de coincidencia y la velocidad óptima del flujo para el sensor LE/SPOS usado. Además, es prudente que se realicen las mediciones de diámetro grande a una concentración reducida de la emulsión para que la concentración mensurable de gotitas desde un umbral de detección (p.ej., > 1,8 µm) hasta un límite superior (p.ej., 50 µm) sólo sea aproximadamente un tercio del límite nominal de coincidencia para el sensor usado. Las alturas resultantes de los pulsos individuales se convierten en diámetros de gotitas mediante una curva de calibración estándar construida previamente a partir de microesferas de poliestireno de tamaño uniforme rástreables al NIST con diámetros conocidos. Para una guía adicional en el uso de la metodología de obstrucción de la luz, consultar el capítulo general Partículas en Inyectables (788). Aparato-Para la medición se usa un instrumento de obstrucción de la luz adecuado, con o sin capacidad de dilución automática de la muestra y controlado por un ordenador personal (PC). Se informan los datos de distribución del tamaño de partículas ponderado por número y volumen, siempre que se indique claramente cuáles son los valores que se proveen y que también se den los valores de los parámetros necesarios para todos los cálculos requeridos. Agua-Pasar agua destilada a través de un filtro con un tamaño de poro de 0,2 µm o usar Agua Estéril para Inyección almacenada en un envase de vidrio. Preparación Estándar-Agregar una cantidad adecuada de suspensión concentrada, conteniendo partículas estándar de látex de poliestireno rastreables al NIST u otras microesferas adecuadas, a un volumen preestablecido de Agua. Mezclar suavemente los líquidos para obtener una suspensión homogénea. Si el instrumento de obstrucción de la luz está equipado con un sistema de dilución automático, se puede analizar la muestra concentrada inicial por inyección directa en el instrumento con una jeringa o una línea de muestreo de Teflón. Luego, se produce automáticamente una dilución adicional de la muestra para optimizar la concentración de partículas para el análisis. Alternativamente, la muestra requeriría una dilución manual mayor con agua (típicamente por un factor de 1 O, por lo menos, sobre la primera dilución). La muestra diluida resultante se instila luego en un recipiente limpio y adecuado, como un recipiente de vidrio estéril Tipo 1, antes de pasarla por el sensor. En cualquiera de los casos, la concentración final de partículas debe estar por debajo del límite de coincidencia del sensor. Se debe obtener la exactitud de la determinación de tamaño y recuento del instrumento de obstrucción de la luz mediante dos estándares de tamaño distintos de aproximadamente 5 µm y 1 O µm (análisis triplicado por tamaño). Para los estándares después de la calibración del sistema, ajustar el umbral de detección del instrumento a 1,8 µm, extendido a un límite superior de 50 µm. Los resultados correspondientes del diámetro medio deben coincidir con los valores esperados, dentro de 10% de la desviación estándar relativa y una exactitud de tamaño de 90%-110%. Además, el número de recuento de partículas obtenido por mL también debe coincidir dentro de ±10% con los valores de concentración certificados en la documentación provista con cada estándar de tamaño rastreable al NIST. Preparación de Prueba-Agregar un volumen adecuado de muestra de la emulsión inyectable de lípidos (análisis triplicado por muestra) a un volumen preestablecido de Agua. Mezclar suavemente los líquidos para obtener una suspensión homogénea. La emulsión diluida tendrá un aspecto levemente turbio. Si el instrumento de obstrucción de la luz está equipado con un sistema de dilución automático, se puede analizar la muestra concentrada inicial por inyección directa en el instrumento con
USP 39
Pruebas Físicas/ (730) Espectroquímica de Plasma 601
una jeringa o línea de muestreo de Teflón no reactiva*. Luego, se produce automáticamente una dilución adicional de la muestra para optimizar la concentración de gotitas/glóbulos para el análisis. Alternativamente, la muestra requeriría una dilución manual mayor con agua (típicamente por un factor de por lo menos 1 O sobre la primera dilución). La muestra diluida resultante se instila en un recipiente limpio y adecuado, como un recipiente de vidrio estéril Tipo l. En cualquiera de los casos, la concentración final de gotitas/glóbulos debe estar por debajo del límite de coincidencia del sensor. Aptitud del Sistema-Realizar antes del procedimiento de prueba, usando la Preparación Estándar de partículas de 5 y de 1O µm rastreables al NIST. Medir por triplicado el diámetro de partícula ponderado por número y los conteos/mL del estándar. El sistema es adecuado cuando las mediciones por triplicado del diámetro medio de partícula ponderado por número están dentro de 10% del valor estipulado, tanto en términos de repetibilidad (CV) como de la cercanía al tamaño certificado en la etiqueta del estándar rastreable al NIST. Procedimiento e Interpretación-Si el instrumento de obstrucción de la luz está equipado con un sistema de dilución automático, usar una jeringa o línea de muestreo de Teflón desechable para cargar la Preparación Estándar o la Preparación de Prueba. Si no se utiliza un sistema de dilución automática, transferir la muestra a un recipiente limpio y adecuado, de gran volumen, como un vaso de vidrio estéril Tipo 1 conteniendo un volumen adecuado de agua. Dejar que la muestra y el agua se mezclen bien para obtener una suspensión homogénea. Ajustar el umbral de detección del instrumento a 1,8 µm, extendido a un límite superior de 50 µm, y variar la concentración y/o los tiempos de la recolección de datos de tal manera que haya al menos un factor de dos en la diferencia del número total de glóbulos que miden >5 µm entre al menos dos corridas de la muestra. En cualquier caso, el número de glóbulos que miden >5 µm debe ser lo suficientemente grande para representar un número de glóbulos adecuado que sea estadísticamente representativo de la población de diámetro mayor de la cola de la curva de distribución correspondiente a la emulsión nativa. Los límites de la fase dispersa para los glóbulos de grasa de diámetro mayor ponderado por volumen, expresados como el porcentaje de grasa en glóbulos mayores de 5 µm (PFAT5) para una emulsión inyectable de lípidos dada, no deben exceder de 0,05%.
(730) ESPECTROQUÍMICA DE PLASMA Cambio en la redacción:
,\INTRODUCCIÓN Las técnicas instrumentales basadas en plasma que son útill;!.s en el análisisfarmacéutico se clasifican en dos grandes grupos: a) tas técnicas que se basan en plasma inductivamente acoplado yb) las técnicas en las que el plasma se genera en la superficie de la muestra o cerca de ella. El plasma inductivamente acoplado (ICP, por sus siglas en inglés) es una fuente de excita<:ión de afta temJ)eratura que desolvata, vaporiza y ato.miza muestras aerosolizadas e io.nl:za los átomos réSultantéS. EStos.iet1és y átomós excitados pueden deteetárse posteriormente . mediante la o.bser'vadón. de sus líneas de emisión, un método den()mlna: do espectroscopfa de emisión óptiéa de plasma iriductivámente acoplado {1cp::.:....0ES1 por. sus siglas en inglés), que tarntifén se conoce como espectfoscopía de emisión atómica dé plasma inductivamente acoplado (ICP::.:....AES, por sus siglas ~rdriglés}, ó los iónes exdtadós o en estádo fundamental pueden determinarse mediante una técnica que. se denomina espectrbtn~tría'de masas de plasma inductivamente acoplado (JCP,;,.MS1 por sus siglas en inglés)>bteP:...oES y fíJI ICP-MS son téenieás que. permi~ ten analizar uno o varios elementos y se .usan tanto en análisis secuendales cómo para análisis simultáneos; cori bUena senslbf~ lidad en un amplio intervalo lineal. Para mayor información sobre la teoría y los principios de mediciones, ver el capítulo Espectroquímica de Plasma-Teoría y Práctica (1730).
CALIFICACIÓN DE ESPECTRÓMETROS .DE·PLASMA La calificación de los ICP-OES o de los ICP-MS se puede Oividir eri tres elementos: calificadón .de la instaladón (IQ, por sus siglas en inglés), calificación operativa (OQ, por sus siglas en inglés) y calificación del desempeño {PQ, por sus siglas .en in· glés)-Vertambién el capítulo general Calífícación de Instrumentos Analíticos (1058/,
Calificación de la Instalación Los requisitos de califieación de la instalación proveen pruebas de que el hardware y el software se han instaladó de manera apropiada en el lugar deseado, y de que el ambiente en el que se usará el instrumento es adecuado.
* El cloruro de polivinilo (PVC, por sus siglas en inglés) con dietilhexilftalato (DEHP, por sus siglas en inglés) demostró inducir el rompimiento de las emulsiones inyectables de lípidos (Sistema de Presentación de Informes sobre Problemas con Productos Farmacéuticos. Acceso a Archivo No. 111 73 de la USP, el 15 de mayo, 1991).
602 (730) Espectroquímica de Plasma / Pruebas Físicas
USP 39
Calificación Operativa El propósito de la calificación operativa es demostrar que el desempeño· del instrumento es adecuado. En la califieación ope~ rativa, se caracteriza el desempeño de un ínstrutnento usando estándares con propiedades espectrales conocidas para.verificar que el sistema opera dentro de Jils especificaciones esperadas.. la calíficación operativa es una verificación de los· parámetros operativos clave que seJleva accabo después de la instalación, de reparaciones y¡o de mantenrllliento.los proveedores de ins-' trumentos a menudo tienen disponibles muestras y parámetros de. pruebas como parte del paquete de calificación de la insta" lación/calificación Qperativa.
Calificación del Desempeño La calificación del desempeño determina si el instrumento es capaz de cumplir con los requisitos del usuario para todos los parámetros que pueden afectar la calidad de la medición. Dependiendo del usó típico, las especificaciones.de calificación del desempeño püeden·serdiferentes a las especificaciones del fabricante. Para métodos validados, se pueden usar pruebas de ca" Hficacióndel desempeña específicas, también conocidas comopruébasdé aptitud.del sistema, en lugar delOsrequisitos de califícaci<)n del desempeño .. Se debe volver a valorar una solución usada paratrazar la curva estándar ifücialde un instrumento ICP,-OES oJCP-MS a modo.de verifü:adón a intervalos apropiados prestableddos durante el· análisis de todo el conjunto de mvestras. Para Jos análisis Jcp;:.oES de un único>elemento, cO:n longitudes de onda anafíticas comprendidas entre 200 y 500 nm o ton contentraciorres de >1 . µg/mL, el estándar revalorado debe concordar con su valor esperado i::qn una· aproxrmación de ::l::l0%, o según lo espedfitado en un.a mom;>grafía individual. ·Para los análisis ICP"-'OES de múltiples elementos,· con longitudes de onda analíticas de <200 o :>500 nm o con concentraciones de <:T µg/mL, .el estándar revalorado debe concordar con st1valor teórico con una aproidmación de :1:20%~ o según lo especificado eh una monografía individual. Para los análisis ICP-!)llS de un único ~lemento 1 con masaranallticas exentas de interferencias y con concentraciones de > 1 ng/m[, eLestándar revalorado. de. be concordar con su valor esper¡;¡cló <:;.on una aproximaciór:i de ±l0%, o según. lo especificado en una monografía individual. Para los análisis ICP-MS de múltiples elementos, o con concenttadorjes de d ng/ml, o panfanálisis de .un solo elemento en los que pudieran presentarse interferencias, él estándar revalorado debe concordar con su va.lar esperado con una aproximación de ±20%, o según lo especificado en una monografía individual. Si la monografía Individual proporciona pautas diferentes .co11 respecto al estándar de verificación rey;;ilqrado para lCP-:-OE$ o ICP,-MS, deberán cµmplirse los requisitos de la monografía. Los procedimientos especfücos, criterios de aceptación e intervalos de tiempo para la caracterización del desempeño de la lCfl..OE$ o ICfl,..MS dependen del instrumento y de la aplicación prevista.
PROCEDIMIENTO Los üsuarlos deben evaluar y. sele¿donarel tipc) de material ·de construcción,· el tratamiento pl'.eVioy.lalimpieza del material deJabprátorio al1alíticoempJeado en los
Solución .Estándar Las soluciones estándar se usan para estandarizar el. instrumento en el momento de su uso; estas sOluciónes deben prepararse según se indic;;i en la m.onogr"lfía índiYiduilk [NOTAr---Se pu.edenvsar solu¡;:iqnes de elementos individuales o de múltiples efem.efltós disponibles comercialmente, rastreables al N1sr o a una otganiZ~Kión. metrológka nacional, en la preparación de soluciones. estándar.] las.soluciones. estándar, especialmente aquell(ls empleadas en los análisis a nivel deultratraza, pueden tener un(l.vjda (jtil límitada. La estabilidad de las soluciones estándar puede variar dependiendo de la concentración, delanijfi· to de interés, del tipo de recipiente de álmacenamlentoy de las condición~s. de. almacenamiento, Pqr estas tª.zones, la$ soluciones estándar cori mncentradones <10 ppm (p/v) no deben conservarsepormás qe 24 •horas, a menos que se demuestre su estabilidad poda vía experimental. El método de estándar agregado puede emplearse para la estandarización del instrumento. Este método implica agregar a la muestra una concen~raqíón c()noc;idadelelemento.analito a no menos dedos niveles de concentración•eh comparnci()n con una preparad611 pe la muestra sin e[agregado de cantidades conocidas. Lq respuesta del instrumento se grafü:a en función de la concentración del elemento analifo. agregado5r se traza Ja recta de regresión lineal correspondiente a Jos datos. El valor abso.luto de la intersección x multiplicado por cualquier factor de dilución es la concentración del anallto en Ja muestra; muchos instrumentos realizarán el cálculo del anáHto au~omáticamente. Una vez que el método se ha desarrollado y se emplea. de forma.rutínari¡:í, eJit¡strumentose puede calibrar con. un blanco)' Un único estándar; Es apropiado emplear Ja· calibradón. de .un
USP 39
Pruebas Físicas/ (730) Espectroquímica de Plasma 603
único punto en las pruebas de límite de materiales de producdón yproductos finales si la m{ltodología se ha validado de forma rigurosa· en cuanto a su suficiente especificidad, sensibilidad, linealidad, exactitud, precisión, tolerancia y robustez.
Solución Muestra Aunque se pueden analizar muestréls sólidas o sernisólidas, porlo gener~I ernecesario preparar las sol4ciones de las muestr¡:ts para análísis según lo. indícado en. la monografía individQal. Las muestras pueden disolverse en cüal.quier dísolvente,iticluyendo disolventes orgánicos o ácidos/bases, que seancompatibles con el sistema instrumental. Las müestrá$ que no son~olublé~ en un disolvente requieren digestión. Se pueden usar diversas técnicas de digestión para disolver una .muestra, .la.s. cuales lriciuyen digestiones en placa caliente y digestiones asistidas pormicroondas,con métodos de recipiente abierto o de recipiente cerrado. Debe tenerse en cuenta que no se recomienda la digestión en recipientes abiertos en los análisis de metales volátiles; por ejemplo, selenio y mercurio,
Análisis El instrumento debe estandarizarse pata cuantificación almomento de su uso, siguiendo el procedimiento indicado eli la monografíaindividual para los parámetros instrumentales. la respuesta· de las soluciones estáhdatque abarcan los extremos de concentración esperada de .un analito en .una muestra se determina en función de únblanco apropiado; lti! respuesta del de• tector se grafka como una función de la concentración de analito. Al realizar un análisis en o cerca del límite de detecciór'¡, el analistt'! no siempre puede usar un estándar que abarque los extremos de concentración. Eht.al c;::aso, se debe correr por triplicado un estándar preparado en o cerca (con una aproximación de ±10%) del límite de detección, con un criterio de acepta" ción de ±10% del. valor teórico del estándar en el caso de estándares de elementos individuales, yde ±20% del valor teórico del estándar en el caso de estándares de elementos múltiples. Para demostrar la estabilidad de la estandarización inicit'!I del. sistema, el analista debe volver a valorar una solúc;ión usada para trazar la curva estándar inicial como un estándar de verificación a intervalos apropiados previamente establecidos durante el análisis de todo el conjunto de muestras. A menos que se ir)dique dé otro. modo en la monografía individuál, el estándar revalorado debe cumplir con los mismos criterios de aceptación que los descritos en la sección de calificación del desempeño detallada anteriormente. Las concentraciones de la muestra se calculan enfunción de li:i curva de trabajo que se oi:)tiene graficando la respuesta del detector en función de la concentración del analitoen las soluciones estánclar,Muchos instrumentos realizan este cálculo automáticamente.
VALIDACIÓN Y VERIFICACIÓN Validación La valic::l
604 (730) Espectroquímica de Plasma / Pruebas Físicas
USP 39
Precisión REPETIBIUDAD El procedímiento analítico se evalúa midiendo las concentraciones de seis soluciones muestras preparadas de forma independiente al· 1 00% de la concentración de prueba de la valoración, Criterios de validación: .La desviación estándar relativa es no más de 510% pará la valoración del fármaco, no más de 5,0% para la valoración del medicamento y no más de 20% para el análisis de impurezas, PRECISIÓN INTERMEDIA Se debe establecer el efecto de los eventos aleatorios sobre la precisión analítica del procedimiento. Las variables típicas írr' cluyen realizar los análisis en días distintos, usando instrumentos diferentes o que el método sea realizado por dos () más analistas. Como mínimo, cualquier combinación de estos factores que totalice tres experimentos proveerá una estimación de Ja precisión intermedia. Por ejemplo, esta combinación puede ser un analista en 3 días diferentes, o un analista usando dos sets de equipos en dos días diferentes, uno para cada instrumento; o tres analistas ppdrían trabajar c<:>o el.mismo equipo. Criterios ele validación:· Lá desviación estándar r€lativa es no más de 8,0% para la valoración del fármaco, no más de 8~0% para la valoración del medicamento y no más de 25,0% para elanálisis dé Impurezas. ESPECIFICIDAD
El procedimiento debe ser capaz de evaluar inequívocamente i::ada elemento analito en presencia de córnponentes que se espera estarán presentes, incluido cualquier componente de la matriz. Criterios de validación: Se demuestran mediante el cumplimiento del requisito de exactitud. LÍMITE bE CUANTIFICACIÓN El límite de cüantifü::ación (QL, por sus siglas en inglés) se estima calculando la desviación estándar de nó menos. dé 10 qeterminaciones repetidas de una solución blanco y multiplicando por 10. Al validar un procedimiento usando el metodode estándar agregado, se usa la pendiente de estándares aplicados a una solución del material de prueba. Se pueden usar otrós enfoques adecuados (ver el capítulo (1225)). Para confirmar fa exactitud se debe realizar la medición de una solución. de prueba preparada a partir de una matriz de muestra representativa con cantidades agregadas conocidas a la concentración del límite de cuantificación estimado, Al validar un procedimiento usando el método de estándar agregado, lós criterios de validación se aplican al resultado experimental final, no a la recuperación de cantidades agregadas conocidas en cada nivel de adición del estándar. Criterios de validación: .El procedimiento analítico debe ser capaz de determinar el anatltC1 <;on precisión y exactitud a un nivel €quívalente al 50% de la especificación. LINEALIDAD Preparar una curva de respuesta entre la concentración de analito y i;ibsórbanda a partir de no menos. de dos soluciones estándar y un blancó (para urr total de tres puntos de datos), a.éoncentraciones que abarquen la concentraéión arrtklpada de la solución de prueba. Posteriormente, evaluar la curva estándar usando métodos .estadístkos apropfodos, tales>coi:no la regresión de mínimos cuadrados. Para experimentos que río producen una relación lineal entre la concentración de analíto y fa respuesta del ICP;..;OES o lCPMS, se deben aplicar métodos estadísticos apropiados para describir la respuesta ánalftíca. Criterios de validación: El coefidente de correladón (R), es no menos de 0,995pal'a valóradones deCategotíaiy no menos de 0,99 para pruebas cuantitativas de Categoría 11. INTERVALO El intervalo se refiere al intervalo entre las concentraciones (cantidades) superí<:>r e inferior de.an:alíto en: la muestra (íncluyen~ do esas concentraciones) para las que se ha demostrado que el procedimiento arialítico tiene tln riívef adecuado de precisióH, exactitud y linealidad que se demuestra cumpliendo con los requisitos de precisión, exactiti.ld y linealidad. Criterios de validación: Para pruebas de Categoría 1, el intervalo .de validación para critei:ios.de aceptación centrádt)s en 100,0% es 80,0%-120,0%. Para criteríos de aceptación no centrados, el intervalo de validadón es. 10,00/o por debajó del límite inferior ha.sta 10,0% por encima del límite superior. Para uniformidad de contenido, el intervalo de validación es 70,0%130,0%. Para las pruebas de Categoría 11, el intervalo de validación abarca 70,0%-130,0% de los criterios de aceptación.
Pruebas Físicas/ (731) Pérdida por Secado 605
USP 39
ROBUSTEZ La confíabilidad de la medición analítica se demuestra mediante cambios deliberados en los.parámetros exp~rímentales. De~ bido a que ciertos cambios en los parámetros experimentales pueden resultar en problemas potenciales de seguricjad o daños en el equipo, la robustez se demuestra cumpliendo con los requisitos de precisión intermedia establecidos anteriormente.
Verificadóll Las reglamentaciones sobre las Buenas Prácticas de Fabricación Vigentes en los EE.UU. (Título 21 del CFR 2.11.194(a)(2)] indican que los usuarios de los procedimientos analíticos, según se indica en el compe:ndío LISP-,.f:\IF1 no estáh obligados a validar estos procedimientos siempre que se provean en una monografía. En .su lugar1 .los. usuarios simplemente deeen verificar su ap• titud en las condiciones reales de uso. El objetivo de li't verificación del procedimiento de ICP-OES o ICP-MS es demostrar que el procedimiento, segútllo des.crito en la monografía, debe ser reali;¡!:ado por.el usuario con lil e.l(actitud; especifi:eldad y precisión adecuadas; usando los instrumentos, analistas y matrices de muestra disponibles. De a:cuerc;fo con el capítulo verificación de Procedlmientosfarmatopeitos (1226), si la verificación del procedimiento farmacor:>eico siguiendo la monografíél no es exitosa; el procedimiento podría no sei: adecuapo Pilra su uso con el artículo en análisis. Puede ser. necesario desarrollar y validar un procedírniento altema:tivo con~ forme .a lo permitido en las Adve.rtencias y RequisitQsGenerafes.6.30. La verificación de métodos farmacopetcos lCP-()ES o ICP-MS debe, como mínimo, incluir la ejecución de. los. parámetros de validación sobre especificidad, exactitud, precisión, linea:lidad y límJte de cuantificación, cuando resulte apropiado, segú,:¡. se indica en Validación ..t..USPJ9
(731) PÉRDIDA POR SECADO El procedimiento que se establece en este capítulo determina la cantidad de materia volátil de cualquier tipo que se elimina en las condiciones especificadas. Para sustancias que parecen contener agua como único constituyente volátil, es apropiado aplicar el procedimiento que se indica en el capítulo Determinación de Agua (921) y así se especifica en la monografía individual. A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, realizar la determinación en una muestra de prueba de 1 a 2 g. Mezclar la sustancia a examinar y, si estuviera en forma de partículas grandes, reducir el tamaño de las partículas aproximadamente a 2 mm, triturando rápidamente la muestra antes de pesarla. Tarar un frasco para pesada adecuado, de poca profundidad, con tapón de vidrio que se haya secado durante aproximadamente 30 minutos bajo las mismas condiciones que deben emplearse en la determinación y enfriado a temperatura ambiente en un desecador. Colocar la muestra a analizar en el frasco, volver a colocar el tapón y pesar con exactitud el frasco y el contenido. Distribuir la muestra a analizar tan uniformemente como sea posible, agitando suavemente hacia los lados, hasta lograr una profundidad de aproximadamente 5 mm por lo general, y no más de 1 O mm en caso de materiales voluminosos. Colocar el frasco cargado en la cámara de secado, retirando el tapón y dejándolo también en la cámara. Secar la muestra de prueba a la temperatura y durante el tiempo especificado en la monografía. [NOTA-La temperatura especificada en la monografía debe considerarse comprendida en el intervalo de ±2º de la cifra especificada.] Cuando en una monografía se especifica "secar hasta peso constante", el secado deberá continuarse hasta que dos pesadas consecutivas no difieran en más de 0,50 mg por g de sustancia tomada, realizando la segunda pesada después de una hora adicional de secado. Al abrir la cámara, cerrar rápidamente el frasco, permitiendo que llegue a temperatura ambiente en un desecador antes de pesarlo. Si la sustancia se funde a una temperatura inferior a la que se especifica para la determinación de la Pérdida por Secado, mantener el frasco y su contenido durante 1 a 2 horas a una temperatura de 5º a 1Oº inferior a la temperatura de fusión y luego secar a la temperatura especificada. Si se van a analizar cápsulas, utilizar una porción del contenido mezclado de no menos de 4 cápsulas. Si se van a analizar tabletas, utilizar el polvo de no menos de 4 tabletas. En caso de que la monografía individual indique que la pérdida por secado debe determinarse mediante análisis termogravimétrico, utilizar una electrobalanza sensible. En el caso de que la monografía individual indique secado al vacío sobre un desecador, utilizar un desecador al vacío, una pistola de secado al vacío u otro aparato de secado al vacío adecuado. En el caso de que se especifique secado en un desecador, debe tenerse especial cuidado para asegurarse de que el desecante se mantenga siempre completamente eficaz mediante su recambio frecuente. En caso de que la monografía individual indique secar en un frasco con tapón con perforación capilar1 al vacío, utilizar un frasco o tubo con un tapón con un capilar de 225 ± 25 µm de diámetro y mantener la cámara de calentamiento a una presión
1
Disponible como "antibiotic moisture content flask" de Kimble-Kontes, 1022 Spruce St., Vineland, NJ 08362-1502.
606 (731) Pérdida por Secado / Pruebas Físicas
USP 39
de 5 mm de mercurio o menor. Al final del periodo de calentamiento, dejar entrar aire seco a la cámara de calentamiento, retirar el frasco y con el tapón con perforación capilar todavía en su sitio, permitir que se enfríe a temperatura ambiente en un desecador antes de pesar.
/
/
(733) PERDIDA POR INCINERACION Este procedimiento tiene como objeto determinar el porcentaje del material de prueba que se volatiliza y se elimina en las condiciones especificadas. El procedimiento, tal como se aplica generalmente, no es destructivo para la sustancia que se analiza; sin embargo, la sustancia puede transformarse, por ejemplo, produciendo un anhídrido. Realizar la prueba sobre material finamente pulverizado y deshacer los grumos, si fuera necesario, con ayuda de un mortero antes de pesar la muestra. Pesar la muestra a analizar sin aplicar más tratamientos, a menos que se especifique un secado preliminar a una temperatura inferior u otro pretratamiento especial en la monografía individual. A menos que se especifique otro equipo en la monografía individual, efectuar la incineración en una mufla o un horno adecuado que pueda mantener la temperatura dentro de los 25º de variación con respecto a la temperatura requerida para la prueba, y emplear un crisol adecuado, completo con su tapa, previamente incinerado durante 1 hora a la temperatura especificada para la prueba, enfriado en un desecador y pesado con exactitud. A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, transferir al crisol tarado una cantidad pesada con exactitud, en g, de la sustancia que se va a analizar, aproximadamente igual a la calculada por la fórmula: 10/L en donde Les el límite (o el valor de la media de los límites) para la Pérdida por incineración, en porcentaje. Incinerar el crisol destapado cargado y cubrir a la temperatura (±25º) y durante el periodo de tiempo indicado en la monografía individual. Incinerar durante periodos sucesivos de 1 hora cuando se indique incineración hasta peso constante. Una vez completada cada incineración, cubrir el crisol y dejar enfriar en un desecador hasta temperatura ambiente antes de pesar.
(735) ESPECTOMETRÍA DE FLUORESCENCIA DE RAYOS X INTRODUCCIÓN La espectrometría de fluorescencia de rayos X (XRF, por sus siglas en inglés) es un método instrumental basado en la medición de fotones de rayos X característicos originados por excitación de electrones de las capas internas atómicas mediante una fuente primaria de rayos X. El método de XRF se puede usar para análisis cualitativos y cuantitativos de líquidos, polvos y materiales sólidos. Los rayos X producidos por un tubo de rayos X incluyen líneas características que corresponden al material del ánodo y un continuo conocido como radiación Bremsstrahlung. Se pueden usar ambos tipos de rayos X para excitar átomos e inducir así los rayos X. El instrumental para XRF se puede dividir en dos categorías: Fluorescencia de Rayos X Dispersiva de Longitud de Onda (WDXRF, por sus siglas en inglés) y Fluorescencia de Rayos X Dispersiva de Energía (EDXRF, por sus siglas en inglés). El factor principal que distingue a estas tecnologías es el método usado para separar el espectro emitido por los átomos en la muestra. La energía de los fotones de rayos X es característica para una transición electrónica dada en un átomo y es de carácter cualitativo. La intensidad de la radiación emitida indica el número de átomos excitados en la muestra y constituye el carácter cuantitativo del método.
CALIFICACIÓN DE ESPECTRÓMETROS PARA XRF Calificación de la Instalación Ver el capítulo general USP Calificación de Instrumentos Analíticos (1058).
Calificación Operativa El propósito de la calificación operativa (OQ, por sus siglas en inglés) es verificar que el sistema opere dentro de las tolerancias esperadas usando muestras apropiadas con propiedades espectrales conocidas. La calificación operativa es una verificación de los parámetros críticos de operación y debe realizarse después de llevar a cabo la instalación, reparaciones o mantenimientos importantes que pudiera afectar el desempeño de los instrumentos. Es importante tomar en cuenta que todas las muestras
Pruebas Físicas/ (735) Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X 607
USP 39
de calibración deben manejarse con guantes de algodón o nitrilo y deben almacenarse en envases plásticos sellados. Alternativamente, pueden estar integradas en el instrumento. Las pruebas y especificaciones de calificación operativa en las secciones siguientes representan únicamente ejemplos típicos (ver las Tablas 7 y 3). Se pueden usar otras pruebas y estándares para establecer tolerancias para estos propósitos. El proveedor del instrumento a menudo pone a disposición muestras y parámetros de prueba como parte del paquete de calificación de la instalación. Tabla 1. Especificaciones de Calificación Operativa para EDXRF Procedimiento
Criterios de Aceptación
Posición del pico
Adquirir un espectro de energía de una muestra de calibración de Al-Cu.
El espectro debe tener un conteo de al menos 3000 en los máximos de los picos de Al Ka y Cu Ka. La energía correspondiente a los picos de Al Ka y Cu Ka no debe diferir en más de O, 1% de los valores tabulados.
Resolución del detector
Calcular la resolución (ancho total a la mitad de su altura máxima) a la misma energía y a la misma velocidad de conteo usada para la calificación de la instalación.
El valor de resolución no debe cambiar en más de 10% del valor determinado en la calificación de la instalación.
Velocidad de recuento
Medir la velocidad de recuento en las líneas de Al Ka de la muestra de calibración de energía.
Prueba
y Cu
Cambia
Para propósitos de calibración de espectrómetros EDXRF se ha seleccionado una muestra de calibración de energía que consiste en un disco de aleación Al-Cu (EN AW-AICu6BiPb; Alloy (Aleación) 2011, ASTM B211 ). Esta aleación por lo general se encuentra disponible, es resistente a la corrosión y provee intensidades adecuadas tanto para Al Ka como para Cu Ka. Estas líneas características abarcan las energías típicas usadas para los análisis de XRF. Asimismo, se puede obtener información suficiente de los espectros registrados en este material para evaluar la resolución del detector. La Tabla 2 proporciona una especificación más completa sobre la composición de esta muestra de calibración. Tabla 2. Especificación de la Concentración de los Elementos de la Aleación Al-Cu (el balance remanente es aluminio) Límites de Concentración (en % en peso)
Elemento Cu
5-6
Zn
0,3 máximo
Fe
0,7 máximo
Bi
0,2-0,6
Pb
0,2-0,6
Si
0,4 máximo
Cuando el intervalo de energía de las líneas analíticas para las que se usará el espectrómetro incluya energías superiores a 50 keV, se deberá usar tungsteno metálico puro W (99,5% mínimo) en lugar de la aleación Al-Cu. Este metal es estable, está fácilmente disponible y provee líneas características bien definidas a 8,40 keV (línea L) y 59,3 keV (línea K). Tabla 3. Especificaciones de Calificación Operativa para WDXRF Prueba
Procedimiento
Criterios de Aceptación
Ángulo del pico
Llevar a cabo de acuerdo con el procedimiento del fabricante. Repetir para cada cristal.
El ángulo correspondiente al pico máximo no debe diferir en más de O, 1O grados 28 del ángulo medido en la calificación de la instalación.
Resolución del detector
Ancho total a la mitad de su altura máxima a longitudes de onda especificadas a las mismas condiciones de medición que al momento de la calificación de la instalación. Repetir para cada detector disponible.
No cambia más de 20%
Velocidad de recuento
Medir la velocidad de conteo en la muestra de monitoreo específica a una longitud de onda especificada a las mismas condiciones de medición que al momento de la calificación de la instalación. Repetir para cada detector disponible.
Cambia
Usar lnconel 625 (Special Metals Corporation, New Hartford, NY) como una muestra para espectrómetros de WDXRF. Otras designaciones para esta aleación son UNS N06625, DIN 2.4856, ASTM B443, ASME SB-443 y AMS 5599. Se trata de una aleación basada en níquel que incluye cromo, molibdeno y niobio como los elementos más importantes de la aleación. La Tabla 4 proporciona una especificación más completa sobre la composición.
608 (735) Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X/ Pruebas Físicas
USP 39
Tabla 4. Concentraciones Elementales del lnconel 625 Elemento
Límites de Concentración (en O/o en Peso)
Ni
58,0 mínimo
Cr
20,0-23,0
Fe
5,0 máximo
Mo
8,0-10,0
Nbª
3, 15-4, 15
ª Éste puede incluir Ta.
Una pieza pulida de lnconel 625 jamás debería requerir trabajo de superficie siempre que se almacene y use apropiadamente. Todos los detectores usados en la WDXRF secuencial, sin importar si se trata de detectores de flujo proporcional, de gas sellado o de centelleo, pueden detectar las características de radiación del níquel. En combinación con la radiación Mo K (y L), las pruebas relacionadas con la posición del pico y la respuesta del detector de los espectrómetros de WDXRF pueden completarse fácilmente. La Tabla 5 incluye las longitudes de onda o energías típicas que se usan en el análisis de XRF. Ta bl a 5 Ener ~1asy Long 1tu d es d e Ond a• para Al NI Cu, M oy W
'
'
Mo
w
Transición de la línea Ka 1
K-L,,
K-L,,
K-L,,
K-L,
K-L,
Energía de Ka, (eV)
1487
7473
8041
17479
59310
Longitud de onda de Ka 1 (Á)
8,340
1,659
1,542
0,709
0,209
Transición de la línea La 1
N/Ab
N/A
N/A
L,-M,
L.-M,
Energía de La 1 (eV)
N/A
N/A
N/A
2293,2
8398,2
Longitud de onda de La 1 (Á)
N/A
N/A
N/A
5,4066
1,47632
Al
NI
Cu
ª Obtenido de: Deslattes RD, Kessler EG, lndelicato P, et al. X-ray transition energies: new approach to a comprehensive evaluation. (Energías de transición de rayos X: nuevo enfoque para una evaluación integral) Rev Mod Phys. 2003;75(1 ):35-99. Para Al, Ni y Cu, las energías Ka 1 y Ka2 de la Tabla V se promediaron con la ponderación 2:1. La conversión de longitud de onda usa el valor he/E de la página 94. Los valores para Mo y W se toman de la Tabla VI. b N/A =no aplica.
Calificación del Desempeño El propósito de la calificación del desempeño (PQ, por sus siglas en inglés) es determinar que el instrumento es capaz de cumplir con los requisitos del usuario para todas las mediciones críticas que impacten en la calidad. Dependiendo del uso típico, las especificaciones para la calificación de desempeño pueden ser diferentes de las especificaciones del fabricante. Se pueden usar pruebas de calificación de desempeño específicas para cada método, también conocidas como pruebas de aptitud del sistema, en lugar de los requisitos de calificación de desempeño para métodos validados. Los procedimientos específicos, criterios de aceptación e intervalos de tiempo para caracterizar el desempeño de la XRF dependen del instrumento y de la aplicación que se va a usar. La demostración de un desempeño estable del instrumento durante periodos prolongados provee cierta garantía de que pueden obtenerse mediciones confiables a partir de los espectros de muestra, usando experimentos de XRF previamente validados.
PROCEDIMIENTO Recomendaciones Generales Los analistas deben verificar la aptitud de todos los reactivos y materiales con respecto a la posibilidad de contaminación antes de usarlos dependiendo del método usado. El análisis de un elemento ubicuo a menudo requiere el uso del grado más puro de reactivo o material disponible. Los portamuestras y las ventanas de soporte deben ser apropiadas para el análisis y la configuración del instrumento. Los analistas deben evaluar la limpieza del equipo usado para preparar muestras para análisis de XRF a fin de evitar la contaminación cruzada de las muestras. MUESTRAS Líquidos: Las muestras líquidas pueden introducirse directamente en el espectrómetro XRF siempre y cuando la solución conste de una sola fase y su volatilidad sea suficientemente baja. El análisis de muestras líquidas requiere el uso de un portamuestras especial para líquidos y de una ventana de soporte disponible comercialmente compuesta por una película de polímero adecuado. Alternativamente, las muestras líquidas pueden transferirse a la superficie de un disco y secarse antes de su
USP 39
Pruebas Físicas/ (735) Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X 609
análisis. Por lo general, el experimento se lleva a cabo usando un gas para purga. Se pueden agregar cantidades conocidas de estándares en solución directamente a la muestra líquida en concentraciones apropiadas para facilitar la exactitud, la precisión y las pruebas de especificidad según se requiera para la validación del método. Polvos: Los polvos preparados pueden medirse directamente en un portamuestras para líquidos. Alternativamente, se pueden comprimir en forma de pellets. Si el polvo tiene propiedades autoaglutinantes deficientes, puede ser necesario un aglutinante tal como una cera o etilcelulosa. Asimismo, los polvos pueden prepararse para análisis de XRF fundiendo el material de muestra en un vidrio usando un fundente, por lo general tetraborato de sodio, tetraborato de litio y metaborato de litio. Debido a que las temperaturas requeridas para fundir el fundente y disolver la muestra son relativamente elevadas (800º-1300º), este procedimiento no es adecuado para el análisis de elementos volátiles tales como mercurio y arsénico. Las muestras de polvos se pueden mezclar con cantidades apropiadas de un material estándar de referencia certificado para mejorar la exactitud, la precisión y las pruebas de especificidad según se requiera para la validación del método. Alternativamente, se pueden agregar cantidades conocidas apropiadas de estándares en solución a las muestras en polvo y posteriormente secarlas, molerlas si fuera necesario y mezclarlas minuciosamente antes del análisis. Las adiciones de estándares se pueden usar en los casos en que las propiedades físicas o químicas del polvo pueden introducir un sesgo en la respuesta del analito.
Estándares Se pueden usar materiales de referencia apropiados que sean rastreables al National lnstitute of Standards and Technology {Instituto Nacional de Normas y Tecnología)) o equivalentes en la preparación de estándares de XRF.
Análisis Para los parámetros instrumentales (si fuera aplicable) seguir el procedimiento de la monografía individual. Debido a las diferencias entre fabricantes con respecto a las configuraciones de los equipos, los analistas pueden usar las condiciones predeterminadas sugeridas por el fabricante. Al momento de su uso, el instrumento debe estandarizarse para el uso pretendido. Los analistas deben usar estándares de calibración que abarquen el intervalo esperado de concentraciones típicas de analito. Al llevar a cabo un análisis en o cerca del límite de detección, los analistas no siempre pueden usar un estándar que abarque todo el intervalo, lo cual es aceptable para prueba de límites. Los analistas deberían usar análisis de regresión de la gráfica estándar para evaluar la linealidad de la respuesta del detector, mientras que las monografías individuales pueden establecer criterios para el error residual de la línea de regresión. Para demostrar la estabilidad de la estandarización inicial del sistema, los analistas deben volver a valorar el estándar de calibración usado en la curva estándar inicial como estándar de verificación a intervalos apropiados durante el análisis de la totalidad de un conjunto de muestras. También resulta aceptable el uso de un estándar preparado de manera independiente. A menos que se indique de otro modo en la monografía individual, el estándar revalorado debe coincidir con su valor esperado con una aproximación de ±2% para la Valoración o de ±20% para un análisis de impurezas. Las concentraciones de muestra se calculan en función. de la curva de trabajo que se genera al graficar la respuesta del instrumento en función de la concentración del analito en las soluciones estándar.
VALIDACIÓN Y VERIFICACIÓN Las normativas de las Buenas Prácticas de Fabricación Vigentes [Título 21 del CFR 211. l 94(a)(2)] indican que los usuarios de los métodos analíticos descritos en la USP-NF no están obligados a validar la exactitud y confiabilidad de dichos métodos, sino que deben verificar su aptitud en condiciones reales de uso. En este contexto, y de acuerdo con dichas normativas, se requiere de validación cuando se usa un procedimiento de XRF para analizar un artículo no oficial y cuando dicho procedimiento se usa como una alternativa al procedimiento oficial para analizar un artículo oficial (ver las Advertencias Generales 6.30 de la USP-NF). Por otra parte, la verificación se debe realizar la primera vez que se analiza un artículo oficial usando un procedimiento USP (para fines informativos únicamente, referirse al capítulo Verificación de Procedimientos Farmacopeicos (1226)).
Validación El objetivo de la validación de un método de XRF es demostrar que el procedimiento de medición sea adecuado para su propósito esperado, incluyendo la determinación cuantitativa del componente principal en un fármaco o forma farmacéutica (valoraciones de Categoría 1), la determinación cuantitativa de impurezas o límites de prueba (Categoría 11) y las pruebas de identificación (Categoría IV). Dependiendo de la categoría de la prueba (ver la Tabla 2 en el capítulo Validación de Procedimientos Farmacopeicos (1225)), el proceso de validación del método analítico para XRF requiere el análisis de linealidad, intervalo, exactitud, especificidad, precisión, límite de cuantificación y robustez. Las características de desempeño que demuestran la aptitud de un método de XRF son similares a las requeridas para cualquier procedimiento analítico. El capítulo (1225) trata los principios generales aplicables. Los criterios de aceptación específicos
61 O (735) Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X/ Pruebas Físicas
USP 39
para cada parámetro de validación deben ser congruentes con el uso pretendido del método. Las muestras para validación deben ser independientes del conjunto de calibración. EXACTITUD Para valoraciones de Categoría 1o pruebas de Categoría 11, los analistas pueden determinar la exactitud realizando estudios de recuperación mediante el uso de la matriz apropiada que tenga concentraciones conocidas agregadas de elementos. Asimismo, se puede usar un material estándar certificado apropiado provisto por la USP. Además, se considera una práctica aceptable comparar los resultados de la valoración obtenidos usando el método XRF que se está validando con aquéllos obtenidos de un método analítico establecido. Cuando los analistas usan el método de estándar agregado, las evaluaciones de exactitud se basan en la concentración calculada a partir de la intersección de la curva, con el eje de concentración a ordenada cero, no en la recuperación calculada a partir de las adiciones de estándares individuales. Criterios de aceptación: Recuperación de 98,0%-102,0% para valoración de fármacos y formas farmacéuticas, recuperación del 70,0%-150,0% para análisis de impurezas. Estos criterios de aceptación deben cumplirse en todo el intervalo validado. PRECISIÓN Repetibilidad: Los analistas deben evaluar el método analítico midiendo las concentraciones de seis estándares distintos al 100% de la concentración de prueba de la valoración. Alternativamente, los analistas pueden medir las concentraciones de tres determinaciones repetidas de tres muestras distintas a diferentes concentraciones. Las tres concentraciones deben ser lo suficientemente cercanas de modo que la repetibilidad sea constante en todo el intervalo de concentración. En este caso, se combina la repetibilidad a las tres concentraciones para compararla con los criterios de aceptación. Criterios de aceptación: La desviación estándar relativa es no más de 1,0% para la valoración de fármacos, no más de 2,0% para la valoración de formas farmacéuticas y no más de 20,0% para el análisis de impurezas. Precisión intermedia: Los analistas deben establecer el efecto de eventos aleatorios sobre la precisión analítica del método. Las variables típicas incluyen realizar el análisis en días distintos, usando diferentes instrumentos, o que dos o más analistas realicen el método. Como mínimo, cualquier combinación de al menos dos de estos factores para totalizar seis experimentos proveerá una estimación de la precisión intermedia. Criterios de aceptación: La desviación estándar relativa es no más de 1,0% para la valoración de fármacos, no más de 3,0% para la valoración de formas farmacéuticas y no más de 25,0% para el análisis de impurezas.
ESPECIFICIDAD El procedimiento debe poder determinar de manera inequívoca cada analito elemental en presencia de otros componentes que se esperan encontrar, incluyendo cualquier componente de la matriz. Criterios de aceptación: Se demuestra cumpliendo el requisito de Exactitud.
LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN El límite de cuantificación (LOQ, por sus siglas en inglés) se puede estimar calculando la desviación estándar de no menos de 6 mediciones repetidas de un blanco y multiplicando por 1O. Se pueden usar otros enfoques adecuados (ver (1225)). Para confirmar la exactitud, se debe realizar una medición de una muestra de prueba preparada a partir de una matriz de muestra representativa y a la que se le agregan cantidades conocidas de tal manera que la concentración sea similar a la concentración de límite de cuantificación. Criterios de aceptación: El procedimiento analítico debe ser capaz de determinar de manera precisa y exacta al analito en un nivel equivalente al 50% de la especificación. LINEALIDAD Los analistas deben demostrar una relación lineal entre la concentración del analito y la respuesta de XRF corregida preparando no menos de cinco estándares a concentraciones que abarquen la concentración anticipada de la muestra de prueba. Posteriormente, la curva estándar debe evaluarse usando métodos estadísticos apropiados tales como la regresión de cuadrados mínimos. Se deben determinar el coeficiente de correlación (R), la ordenada al origen y la pendiente de la línea de regresión. Para experimentos que no tienen una relación lineal entre la concentración de analito y la respuesta de XRF, se deben aplicar métodos estadísticos apropiados para describir la respuesta analítica. Criterios de aceptación: Res no menos de 0,995 para valoraciones de Categoría 1y no menos de 0,99 para pruebas cuantitativas de Categoría 11.
Pruebas Físicas/ (736) Espectrometría de Masas 611
USP 39
INTERVALO El intervalo se define como el intervalo entre la concentración superior e inferior (cantidades) de analito en la muestra (incluyendo concentraciones superior e inferior) para el que se ha demostrado que el procedimiento analítico tiene un nivel adecuado de precisión, exactitud y linealidad. El intervalo se demuestra cumpliendo con los requisitos de linealidad y exactitud. Criterios de aceptación: Para criterios de aceptación centrados en 100,0%: 80,0%-120,0%. Para criterios de aceptación no centrados: 10% por debajo del límite inferior de la especificación hasta 10% por encima del límite superior de la especificación. Para uniformidad de contenido: 70,0-130,0%. Para la Categoría 11 los requisitos del intervalo son 50,0%-120,0% de los criterios de aceptación. ROBUSTEZ La confiabilidad de una medición analítica se debe demostrar realizando cambios deliberados a los parámetros experimentales. Para la XRF esto puede incluir la medición de la estabilidad del analito en condiciones de almacenamiento especificadas. Criterios de aceptación: La medición de la respuesta de un estándar o de una muestra después de un cambio en los parámetros experimentales no debe diferir de la medida obtenida con el mismo estándar usando parámetros establecidos en más de ±2,0% para una valoración de una forma farmacéutica y no más de ±20,0% para un análisis de impurezas.
Verificación El objetivo de una verificación de un método XRF es demostrar que el procedimiento descrito en la monografía específica, se está llevando a cabo con una exactitud, sensibilidad y precisión adecuadas. De acuerdo con el capítulo (1226), si no se consigue verificar el procedimiento farmacopeico de acuerdo con la monografía, el procedimiento puede no ser adecuado para su uso con el artículo en análisis. Puede ser necesario desarrollar y validar un procedimiento alternativo conforme a lo permitido en las Advertencias Generales 6.30 de la USP-NF. Aunque no se requiere la revalidación completa de un método de XRF farmacopeico, la verificación de métodos de XRF farmacopeicos debe incluir por lo menos la ejecución de los parámetros de validación para especificidad, exactitud, precisión y límite de cuantificación, cuando resulte apropiado, según se indica en la sección Validación (anterior).
(736) ESPECTROMETRÍA DE MASAS INTRODUCCIÓN La espectrometría de masas (MS, por sus siglas en inglés) es una técnica analítica basada en la medición de la relación masa/ carga de especies iónicas relacionadas con el analito que se está investigando. La MS se puede usar para determinar la masa molecular y la composición elemental de un analito, así como para elucidar en detalle la estructura del analito. Además de ser reconocida como una poderosa herramienta de elucidación estructural, la MS también se usa ampliamente para mediciones cuantitativas. Para información adicional, ver el capítulo de información general Aplicaciones de la Espectrometría de Masas (1736), el cual provee una discusión detallada sobre MS. El instrumental para MS disponible actualmente ofrece múltiples capacidades para análisis cualitativo y cuantitativo, lo que resulta en una amplia variedad de enfoques experimentales disponibles para cada necesidad analítica. Debido a la diversidad de enfoques, este capítulo no presenta procedimientos específicos, sino que provee información sobre el diseño experimental y sobre la aptitud del sistema para los procedimientos de MS.
ANÁLISIS CUALITATIVO La MS es una técnica sensible y altamente específica para la identificación de analitos. La identificación o verificación de estructuras (es decir, la comparación contra un estándar auténtico) mediante MS es particularmente potente cuando se usa junto con una técnica de separación tal como cromatografía de gases (GC, por sus siglas en inglés) o cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC, por sus siglas en inglés). Se puede obtener mayor especificidad en el análisis usando espectrometría de masas en tándem (MS/MS, por sus siglas en inglés) o espectrometría de masas de alta resolución (HRMS, por sus siglas en inglés). Además, utilizando HRMS se puede cumplir con requerimientos más estrictos en cuanto a la exactitud de la masa determinada.
Parámetros Experimentales Se deben definir los siguientes parámetros experimentales de MS para un procedimiento cualitativo (p.ej., identificación).
612 (736) Espectrometría de Masas/ Pruebas Físicas
USP 39
RESOLUCIÓN DE MASAS La resolución de masa unitaria es suficiente para la mayoría de las pruebas de identificación. Cuando se requiere mayor resolución, ésta se especifica en el procedimiento y la demostración de la resolución adecuada se incluye en las pruebas de aptitud del sistema para el procedimiento. EXACTITUD DE MASAS Una exactitud o concordancia de masas de ±0,50 unidades de masa para iones con una sola carga con un estándar conocido debería ser suficiente para la mayoría de las aplicaciones. En las pruebas de identificación, una exactitud o concordancia de masas de ±0,05% con un estándar conocido debería ser suficiente para la identificación de moléculas grandes (mayores de miz 2000) cuando se utilizan iones con cargas múltiples. Cuando se requiere una exactitud de masas mayor, la exactitud de masas se especifica en el procedimiento. Posteriormente, se incluye una demostración de este requerimiento en las pruebas de aptitud del sistema para el procedimiento o como parte del protocolo establecido para la calificación del desempeño del instrumento (PQ, por sus siglas en inglés) tema que se trata más adelante en este capítulo. INTERVALO DE MASAS El intervalo de masas que se va a barrer también se presenta en el procedimiento. El intervalo de masas debe abarcar todos los iones usados como parte de la confirmación de la identificación.
Aptitud del Sistema La aptitud del sistema para el procedimiento de MS debe incluir la demostración del desempeño adecuado para los siguientes atributos experimentales. RESOLUCIÓN DE MASAS Se incluye una demostración de la resolución apropiada en las pruebas de aptitud del sistema para un procedimiento. La prueba de desempeño establecida en el protocolo de calificación del desempeño del instrumento que se realiza diariamente o previo al procedimiento, puede ser suficiente. Cuando se requieren resoluciones mayores a las de masa unitaria para un procedimiento, la prueba de aptitud del sistema incluye la demostración de una resolución adecuada junto con sus criterios de aceptación. EXACTITUD DE MASAS Las pruebas de aptitud del sistema del procedimiento incluyen una demostración de la exactitud de masas, o alternativamente, ésta forma parte del protocolo de calificación del desempeño del instrumento. Una exactitud o concordancia de ±0,50 unidades de masa para iones con una sola carga respecto a un estándar conocido debería ser suficiente para la mayoría de las aplicaciones. Cuando se requiera una mayor exactitud de masas para un procedimiento dado, se deben especificar los criterios de aceptación apropiados.
Instrucciones para la Interpretación Un experimento de identificación o verificación implica la comparación del compuesto de interés con un estándar auténtico (p.ej., un Estándar de Referencia USP). Para esta forma de identificación o verificación, el estándar y la muestra se analizan en condiciones idénticas y deben presentar resultados que estén dentro del error experimental aceptable para el procedimiento. Las aplicaciones de la MS para propósitos de identificación en una monografía oficial pueden incorporar los datos de los espectros de masa únicamente, o pueden combinar esta información con el tiempo de retención cromatográfico si las necesidades de identificación de una monografía en particular indican una mayor especificidad. Además, el procedimiento debe incluir los criterios establecidos para considerar que existe una correpondencia entre el espectro de masas del compuesto y del estándar auténtico. Si el procedimiento representa la única prueba de identificación espectroscópica o si ninguna otra prueba de identificación (p.ej., mapeo de péptidos o análisis de aminoácidos) provee información estructural, el espectro del estándar debe tener una alta similitud con el de la muestra y se debe usar para la comparación un mínimo de tres iones estructuralmente relevantes, de preferencia uno de los cuales sea un ión que represente la masa molecular del analito. Cuando sólo se produzca el ión que representa la molécula intacta, se puede usar la masa exacta o el espectro MS/MS del ión molecular para fortalecer la identificación. En caso de que también se lleven a cabo otras pruebas de identificación pertinentes desde el punto de vista estructural, la comparación se puede realizar con menos iones, siempre y cuando uno de ellos represente la masa molecular del analito. Por ejemplo, la prueba de identificación por MS para una proteína pue-
Pruebas Físicas/ (736) Espectrometría de Masas 613
USP 39
de examinar sólo un ión que represente la masa molecular si se realizan otras pruebas para confirmar la estructura de la proteína.
ANÁLISIS CUANTITATIVO La sensibilidad y especificidad de la MS también la vuelve una herramienta analítica adecuada para la cuantificación de analitos. La cuantificación es particularmente potente cuando se usa junto con una técnica de separación tal como GC o HPLC. Se puede obtener mayor especificidad en el análisis usando MS/MS o HRMS.
Parámetros Experimentales Los siguientes parámetros experimentales deben definirse dentro de un procedimiento cuantitativo de MS (p.ej., identificación). RESOLUCIÓN DE MASAS La resolución de masa unitaria es suficiente para la mayoría de las pruebas cuantitativas. Cuando se requiere una resolución mayor, ésta se especifica en el procedimiento y se incluye una demostración de la exactitud de masas en las pruebas de aptitud del sistema para el procedimiento. EXACTITUD DE MASAS Las exactitudes de masas citadas en la sección de análisis cualitativo anterior deberían ser suficientes para la mayoría de las aplicaciones cuantitativas. Cuando se requiere una exactitud de masas mayor, ésta se especifica en el procedimiento. Se incluye una demostración de la exactitud de masas en las pruebas de aptitud del sistema para el procedimiento o como parte del protocolo establecido para la calificación del desempeño del instrumento. SELECCIÓN DE MASAS Las masas que se van a monitorear (p.ej., intervalo de masas, masas individuales o transiciones MS/MS) se detallan en el procedimiento.
Aptitud del Sistema La aptitud del sistema para el procedimiento de MS debe incluir una demostración del desempeño adecuado para los siguientes atributos experimentales, según sea lo apropiado para el procedimiento. RESOLUCIÓN DE MASAS Se incluye una demostración de la resolución apropiada para el procedimiento en las pruebas de aptitud del sistema o como parte del protocolo establecido para la calificación del desempeño del instrumento. Cuando se requieran resoluciones mayores que la masa unitaria para un procedimiento, la prueba de aptitud del sistema incluye la demostración de la resolución adecuada junto con sus criterios de aceptación. EXACTITUD DE MASAS Las pruebas de aptitud del sistema del procedimiento incluyen una demostración de la exactitud de masas, o alternativamente ésta forma parte del protocolo de calificación del desempeño del instrumento. Una exactitud o concordancia de ±0,50 unidades de masa para iones con una sola carga de un estándar conocido debería ser suficiente para la mayoría de las aplicaciones. Si se requiere una exactitud de masas mayor para un procedimiento dado, se deben especificar los criterios de aceptación apropiados. PRECISIÓN La aptitud del sistema incluye una demostración de precisión adecuada. Ver la Tabla 1 para límites máximos de precisión. Por lo regular, los límites de aptitud del sistema se ajustan a límites más estrictos que los empleados para asegurar la precisión adecuada para los experimentos de validación. (Ver también la sección sobre Validación y Verificación de Procedimientos Analíticos de Espectrometría de Masas.)
614 (736) Espectrometría de Masas/ Pruebas Físicas
USP 39
LINEALIDAD La aptitud del sistema incluye una demostración de la linealidad adecuada. Ver la Tabla 7 para límites de linealidad apropiados. (Ver también la sección sobre Validación y Verificación de Procedimientos Analíticos de Espectrometría de Masas.) EXACTITUD En ciertos casos, las muestras de control de calidad (o de verificación) también pueden ser apropiadas para incluirse en el procedimiento para asegurar la calidad de la medición. Normalmente, estas muestras de control de calidad tienen una concentración de analito conocida y se preparan de manera idéntica a las muestras de prueba. En caso de utilizarse, las muestras de control de calidad (o de verificación) se preparan también como forma de verificación de la exactitud del método en el momento de su realización. El procedimiento especifica el número u orden del análisis de las muestras de control de calidad (o de verificación) requeridas. Los criterios de aceptación de los resultados de las muestras de control de calidad (o de verificación) deben alinearse con los requisitos de la validación según el tipo de aplicación (es decir, Categoría 1o 11) como se describe en la Tabla 7. LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN En ciertas aplicaciones (p.ej., pruebas de límites), puede ser necesario incluir una demostración de la capacidad para detectar el analito a un nivel establecido. Para estas aplicaciones, el procedimiento especifica el límite y los criterios de aceptación (p.ej., relación señal-ruido).
CALIFICACIÓN DE INSTRUMENTOS DE ESPECTROMETRÍA DE MASAS La calificación de un instrumento de MS se puede dividir en tres elementos: calificación de la instalación (IQ, por sus siglas en inglés), calificación operativa (OQ, por sus siglas en inglés) y calificación del desempeño (PQ, por sus siglas en inglés). Para información adicional, ver el capítulo Calificación de Instrumentos Analíticos (1058), que puede ser un recurso útil, aunque no obligatorio.
Calificación de la Instalación La calificación de la instalación provee evidencia de que los aparatos y el software se instalan de manera tal que se garantice el uso seguro y efectivo del instrumento en la ubicación deseada.
Calificación Operativa En la calificación operativa, se caracteriza el desempeño de un instrumento usando estándares para verificar que el sistema opera dentro de las especificaciones deseadas. El propósito de la calificación operativa es demostrar que el desempeño del instrumento es adecuado para una aplicación dada. Dado que existe una gran variedad de estrategias para la medición de los espectros de MS, se recomienda la calificación operativa mediante estándares con propiedades espectrales conocidas. Debido a la diversidad del instrumental de MS, de las interfases y de los enfoques experimentales, los instrumentos de MS deben calificarse en función de las especificaciones deseadas para la aplicación de interés, no sólo respecto a las especificaciones provistas por el fabricante.
Calificación del Desempeño La calificación del desempeño ayuda a determinar la capacidad del instrumento para cumplir con los requisitos del usuario para todas las mediciones críticas. La documentación sobre calificación del desempeño debe describir lo siguiente: • la definición de los criterios de desempeño específicos y los procedimientos de prueba detallados, incluyendo muestras de prueba y parámetros instrumentales; • los elementos que se medirán para evaluar los criterios y las especificaciones predefinidas; • el intervalo de prueba, que pueden ser mediciones diarias o en el momento de su utilización; • el uso de muestras para enmarcar la muestra problema o grupos de muestras; y • acciones correctivas a implementar si el espectrómetro no cumple con las especificaciones. La calificación periódica del desempeño debe incluir un subconjunto de las pruebas de calificación operativa para asegurar que el desempeño del instrumento esté a un nivel en el que produzca datos que sean adecuados para el uso pretendido. Dependiendo del uso típico del instrumento, las especificaciones para la calificación del desempeño pueden ser superiores o inferiores a las especificaciones de instalación provistas por el fabricante. Se pueden usar pruebas de calificación del desempeño específicas para el método, también conocidas como pruebas de aptitud del sistema, en lugar de los requisitos de calificación del desempeño para procedimientos validados.
Pruebas Físicas/ (736) Espectrometría de Masas 615
USP 39
Debido a la diversidad de las configuraciones instrumentales y a las estrategias experimentales de la MS, podría no estar disponible una muestra o experimento estándar para todas las evaluaciones de calificación del desempeño. Por ende, a menudo se necesitan pruebas de calificación del desempeño específicas para el método o pruebas de aptitud del sistema. El diseño experimental de la calificación del desempeño debe ser lo suficientemente robusto para asegurar el desempeño adecuado del instrumento para la aplicación pretendida, incluyendo las especificaciones asociadas con la medición. Como mínimo, los experimentos de calificación del desempeño deben incluir lo siguiente. • Para aplicaciones cualitativas, el experimento de calificación del desempeño incluye una verificación de la exactitud de masas obtenida con el instrumento. Una exactitud o concordancia de ±0,50 unidades de masa para iones con una sola carga respecto a un estándar conocido debería ser suficiente para la mayoría de las aplicaciones. • Para aplicaciones cuantitativas, el experimento de calificación del desempeño incluye verificaciones de exactitud de masas y precisión. Una exactitud o concordancia de ±0,50 unidades de masa para iones con una sola carga respecto a un estándar conocido debería ser suficiente para la mayoría de las aplicaciones. Los criterios de aceptación para la precisión se establecen considerando la capacidad del instrumento y del método, y proveen controles suficientes con respecto a las especificaciones de la medición en cuestión.
Caracterización del Desempeño del Instrumento Los procedimientos específicos, los criterios de aceptación y los intervalos de tiempo para la caracterización del desempeño del espectrómetro de masas dependen del instrumento y de las aplicaciones pretendidas. Muchas aplicaciones de MS emplean experimentos previamente validados que relacionan los espectros de masas con una propiedad química de interés. Típicamente se busca demostrar un desempeño estable del instrumento durante periodos prolongados. Esta práctica provee cierta garantía de que se pueden tomar mediciones confiables de los espectros de muestra usando experimentos de MS previamente validados.
VALIDACIÓN V VERIFICACIÓN DE PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS DE ESPECTROMETRÍA DE MASAS La validación se requiere únicamente cuando un procedimiento de MS es una alternativa al procedimiento oficial para analizar un artículo oficial. El objetivo de validar un procedimiento de MS es demostrar que la medición es adecuada para su propósito, incluyendo la determinación cuantitativa del componente principal en un fármaco o en un medicamento (valoraciones de Categoría 1), determinación cuantitativa de impurezas (Categoría 11) y pruebas de identificación (Categoría IV). [NOTA-Para información adicional sobre las diferentes definiciones de categorías, ver el capítulo Validación de Procedimientos Farmacopeicos (1225).] Dependiendo de la categoría de la prueba, la validación del procedimiento analítico requiere un análisis de linealidad, intervalo, exactitud, especificidad, precisión, límite de cuantificación y robustez. Estas características de desempeño analítico se aplican a métodos con estándar externo y al método de estándar agregado. El capítulo (1225) provee definiciones y pautas generales sobre la validación de procedimientos analíticos sin indicar criterios específicos de validación para cada característica. La intención de las siguientes secciones es proveer al usuario criterios específicos de validación que representen las expectativas mínimas para esta tecnología. Para cada aplicación particular, pueden requerirse criterios más estrictos para demostrar la aptitud para el uso pretendido.
Categorías de Medición para Procedimientos Analíticos de Espectrometría de Masas Las características de desempeño requeridas para la validación de un procedimiento analítico de MS, asumiendo las especificaciones de la USP típicas para la Categoría 1 de 98,0%-1 02,0% para fármacos y 95,0%-105,0% para medicamentos, se listan en la Tabla 7. Las características reales de desempeño de la validación dependerán de las especificaciones empleadas y deberán proveer evidencia suficiente de que la capacidad de medición es suficiente para dichas especificaciones. Un protocolo de validación del procedimiento debe especificar los experimentos de validación y los criterios de validación requeridos. Estos criterios se determinan de acuerdo con el propósito del procedimiento analítico. Tabla 1. Requisitos para Mediciones Analíticas Características del Desempeño Analítico
Categoría 1
Categoría 11 Cuantitativa
Especificidad
Se asegura usando un estándar de referencia, cuando resulte posible, y por una ausencia demostrable de interfe. rencia de otros componentes
Linealidad
Coeficiente de correlación, (R), no menos de 0,995
Coeficiente de correlación, (R), no menos de 0,99
616 (736) Espectrometría de Masas/ Pruebas Físicas
USP 39
Tabla 1. Requisitos para Mediciones Ana r1tlcas (Continuacion) Características del Desempeño Analítico
Categoría 11 Cuantitativa
Categoría 1 Para criterios de aceptación centrados en 100,0%:
80,0o/o-120,0%. Para criterios de aceptación no centrados: 10,0% por debajo del límite inferior hasta 10,0% por encima del límite superior. Para uniformidad de contenido: Intervalo
70,0o/o-130,0%
50%-120%
Exactitud
98,0o/o-l 02,0% (fármaco) 95,0o/o-105,0% (medicamento)
80,0%-120,0%
Repetibilidad
No más de 1,0% (fármaco) No más de 2,0% (medicamento)
No más de 20,0%
Precisión intermedia
No más de 1,0% (fármaco) No más de 3,0% (medicamento)
Límite de cuantificación Robustez
-
No más de 25,0% El procedimiento analítico debe ser capaz de determinar el analito con precisión y de manera exacta a un nivel equivalente al 50% de la especificación.
La confiabilidad de una medición analítica debe demostrarse mediante cambios deliberados en los parámetros experimentales.
Validación del Procedimiento Analítico El objetivo de la validación del procedimiento analítico es demostrar que éste es adecuado para su propósito mediante la realización de experimentos y obteniendo resultados que cumplan con los criterios de aceptación predefinidos. Los procedimientos analíticos de MS pueden incluir pruebas cuantitativas para componentes principales y contenido de impurezas, pruebas de límite para la presencia de impurezas, cuantificación de un componente en un producto o formulación o pruebas de identificación. PARÁMETROS DE VALIDACIÓN Las características de desempeño que demuestran la aptitud de un procedimiento analítico son similares a las requeridas para cualquier procedimiento analítico. Para información adicional sobre los principios generales aplicables, ver el capítulo (1225). Los criterios de aceptación específicos para cada parámetro de validación deben ser congruentes con el uso pretendido del procedimiento analítico. La Tabla 7 provee las características de desempeño que se requieren como parte de una validación para cada categoría de procedimientos analíticos. Especificidad: El propósito de una prueba de especificidad es demostrar que las mediciones de las señales pretendidas del analito están libres de interferencia de componentes e impurezas en el material de prueba. Se pueden realizar pruebas de especificidad para comparar los espectros de los componentes y de las impurezas que se conocen a partir de procesos sintéticos, formulaciones y preparaciones de prueba. La especificidad también debe demostrarse para cualquier material agregado como parte del procedimiento (p.ej., especificidad frente a estándares internos marcados con isótopos). Para procedimientos analíticos de identificación por MS (Categorías 1y 11), los experimentos de validación pueden incluir experimentos de MS multidimensionales a fin de validar las asignaciones correctas de la estructura u origen de los iones. Linealidad: La concentración de analito y la respuesta del instrumento presentan una relación lineal. Ésta se demuestra midiendo las respuestas del analito a partir de no menos de cinco soluciones estándar a concentraciones que abarquen el intervalo de concentración anticipado de los analitos en la solución de prueba. Para la Categoría 1, las soluciones estándar pueden prepararse a partir de materiales de referencia en disolventes apropiados. Para la Categoría 11 (procedimientos analíticos de MS que se usan para cuantificar impurezas), las muestras para demostrar linealidad se preparan fortificando muestras de prueba (que contengan bajas concentraciones de analito) con cantidades conocidas de analito, o fortificando muestras de la matriz a concentraciones en el rango esperado. Posteriormente, se construye la curva de calibración usando procedimientos analíticos estadísticos apropiados tales como regresión de cuadrados mínimos. Luego, se determinan el coeficiente de correlación (R), la ordenada al origen y, la pendiente de la línea de regresión y el valor cuadrático medio de los residuos. Los valores absolutos determinados para estos factores son apropiados para el procedimiento que se está validando. Intervalo: El intervalo entre las concentraciones alta y baja de analito está dado por el procedimiento analítico de MS cuantitativo. Éste por lo regular se basa en las especificaciones del artículo de prueba de la monografía de la USP. Se trata del intervalo dentro del cual el procedimiento analítico puede demostrar un grado aceptable de linealidad, exactitud y precisión, y se puede obtener a partir de una evaluación de dicho procedimiento analítico. Los intervalos recomendados para los diversos procedimientos analíticos de MS son los siguientes. • Para la Categoría 1-valoración de un fármaco (o producto terminado): 80%-120% de la concentración de prueba;
USP 39
Pruebas Físicas/ (7 41) Intervalo o Temperatura de Fusión 61 7
• Para la Categoría 1-uniformidad de contenido: un mínimo de 70%-130% de la concentración de prueba; • Para la Categoría 11-determinación de una impureza: 50%-120% de los criterios de aceptación; Exactitud: La exactitud de un procedimiento analítico de MS cuantitativo se determina para todo el intervalo analítico requerido. Por lo regular, los niveles de concentraciones se evalúan usando preparaciones por triplicado en cada nivel. Preparación de muestras para exactitud: Para valoraciones de fármacos (Categoría 1), la exactitud se determina analizando un estándar de referencia de pureza conocida. Para valoraciones de medicamentos (Categoría 1), se debe usar una muestra compuesta de un estándar de referencia u otros componentes en un producto farmacéutico terminado para la validación del procedimiento analítico. Los resultados de la valoración se comparan con el valor teórico del estándar de referencia para estimar errores o recuperación porcentual. Para la cuantificación de impurezas (Categoría 11), la exactitud del procedimiento analítico se puede determinar realizando estudios con fármacos o productos fortificados con cantidades conocidas del analito en estudio. Los resultados de la valoración obtenidos del procedimiento analítico que se está validando pueden compararse con los de un procedimiento analítico alternativo establecido. Precisión: Repetibilidad: El procedimiento analítico se evalúa midiendo las concentraciones de tres determinaciones repetidas de soluciones estándar en tres concentraciones distintas que abarcan el intervalo analítico. Como alternativa, se pueden medir las concentraciones de seis soluciones estándar distintas al 100% de la concentración de prueba. Posteriormente, se evalúa la desviación estándar relativa a partir de las mediciones de las determinaciones repetidas para determinar si las soluciones cumplen con los criterios de aceptación. Precisión intermedia: Se debe establecer el efecto de eventos aleatorios sobre la precisión analítica del procedimiento analítico. Las variables típicas incluyen realizar el análisis en días distintos, usando diferentes instrumentos que sean adecuados conforme a lo especificado en el procedimiento analítico, o siendo dos o más los analistas que lleven a cabo el procedimiento analítico. Límite de cuantificación: El límite de cuantificación se valida midiendo seis determinaciones repetidas de muestras de prueba con cantidades agregadas conocidas de analito al 50% de la especificación. A partir de estas determinaciones repetidas, se pueden determinar la exactitud y la precisión. Los ejemplos de especificaciones para determinaciones cuantitativas de Categoría 11 consisten en que la concentración medida esté dentro del 70%-130% de la concentración de las cantidades agregadas conocidas y la desviación estándar relativa sea no más de 15%. Robustez: La confiabilidad de una medición analítica se demuestra mediante cambios deliberados en los parámetros experimentales críticos. Estos pueden incluir la medición de la estabilidad del analito en condiciones de almacenamiento, cromatográficas y de ionización específicas.
Verificación del Procedimiento Analítico La Buenas Prácticas de Fabricación Vigentes de los EE.UU. [Título 21 del CFR 211.194(a)(2)] indican que los usuarios de los procedimientos analíticos descritos en los compendios USP-NF no necesitan validar los procedimientos que se provean en una monografía. En su lugar, simplemente deben verificar la aptitud de los procedimientos en condiciones reales de uso. El objetivo de una verificación de un procedimiento de MS es demostrar que el procedimiento tal como se especifica en una monografía específica puede ser realizado por el usuario con una exactitud, especificidad y precisión adecuadas usando los instrumentos, analistas y matrices de muestra disponibles. De acuerdo con el capítulo de información general Validación de Procedimientos Farmacopeicos (1226), si la verificación del procedimiento farmacopeico siguiendo la monografía no es exitosa, el procedimiento puede no ser adecuado para su uso con el artículo en análisis. Puede ser necesario desarrollar y validar un procedimiento alternativo conforme a lo permitido en las Advertencias y Requisitos Generales 6.30. La verificación de un procedimiento farmacopeico de MS incluye como mínimo la ejecución de los parámetros de validación para especificidad, exactitud, precisión y límite de cuantificación, cuando resulte apropiado, conforme lo indicado en la sección Validación y Verificación de Procedimientos Analíticos de Espectrometría de Masas del presente capítulo.
(741) INTERVALO O TEMPERATURA DE FUSIÓN Para fines Farmacopeicos, el intervalo de fusión, la temperatura de fusión o el punto de fusión se definen como los puntos de temperatura entre los cuales o el punto en el que se detecta la primera fase líquida detectable hasta la temperatura en la cual no hay fase sólida aparente, excepto para las Clases 11 y 111, según se aclara más adelante. Una transición de fusión puede ser instantánea para un material altamente puro, pero por lo general se observa un intervalo desde el comienzo hasta el final del proceso. Los factores que influyen en esta transición incluyen el tamaño de la muestra, el tamaño de las partículas, la eficacia de la difusión del calor y la velocidad de calentamiento, entre otras variables, que se controlan a través de instrucciones del procedimiento. Se deben aplicar las siguientes condiciones para lograr uniformidad y repetibilidad durante las determinaciones del punto de fusión. Usar material secado, que ha sido reducido a polvo cuidadosamente e introducido en un tubo capilar
618 (741) Intervalo o Temperatura de Fusión/ Pruebas Físicas
USP 39
hasta una altura nominal de 3 mm, y realizar la determinación del punto de fusión a una velocidad de calentamiento de 1º / min. En algunos artículos, el proceso de fusión va acompañado por descomposición simultánea, la cual se evidencia visualmente como un efecto secundario como oscurecimiento del material, carbonización, burbujeo u otro incidente. El impacto visual de esta reacción secundaria con frecuencia oscurece el final del proceso de fusión, por lo cual puede ser imposible determinarlo con exactitud. En esas circunstancias, sólo el comienzo de la fusión se puede establecer con exactitud y se debe informar como la temperatura de fusión. La exactitud del aparato usado según se describe a continuación debe verificarse a intervalos adecuados mediante el uso de uno o más de los Estándares de Referencia de Punto de Fusión USP disponibles, preferentemente aquéllos que fundan a temperaturas lo más cercanas posible a las temperaturas de fusión de los compuestos en análisis (ver Estándares de Referencia USP (11 )). Los Estándares de Referencia de Punto de Fusión USP están destinados para verificar la exactitud del dispositivo y no son adecuados para la calibración. A continuación se describen ocho procedimientos para la determinación del intervalo o temperatura de fusión, los cuales varían según la naturaleza de la sustancia. Cuando no se designa ninguna clase en la monografía, emplear el procedimiento para la Clase la para sustancias cristalinas o amorfas y el procedimiento para la Clase 11 para sustancias cerosas. El procedimiento conocido como determinación del punto de fusión de mezcla, en el cual el intervalo o temperatura de fusión de un sólido en análisis se compara con el de una mezcla íntima de partes iguales del sólido y de una muestra auténtica del mismo, p.ej., el Estándar de Referencia USP correspondiente, si estuviera disponible, puede emplearse como una prueba de identificación confirmatoria. La coincidencia de las observaciones del original y de la mezcla constituye una evidencia confiable de identidad química.
APARATOS Se pueden usar aparatos con cámaras u otro equipo computarizado que proporcionen ventajas en cuanto a exactitud, sensibilidad o precisión siempre que hayan sido debidamente calificados. Aparato 1: Un ejemplo de Aparato I adecuado para la determinación del intervalo de fusión consiste en un recipiente de vidrio para un baño de líquido transparente, un dispositivo mezclador apropiado, un termómetro exacto y una fuente controlada de calor. El líquido del baño se selecciona de acuerdo con la temperatura requerida pero, por lo general, se utiliza parafina líquida liviana y ciertas siliconas líquidas que se adaptan bien a intervalos más altos de temperatura. El líquido del baño tiene la suficiente profundidad para permitir la inmersión del termómetro a la profundidad especificada de manera que el bulbo quede aproximadamente a 2 cm del fondo del baño. El calor puede ser suministrado por una llama abierta o eléctricamente. El tubo capilar tiene aproximadamente 1O cm de largo y 0,8-1,2 mm de diámetro interno, con paredes de 0,2-0,3 mm de espesor. Aparato 11: Se puede emplear un instrumento en los procedimientos para las Clases/, la y lb. Un ejemplo de Aparato 11 adecuado para la determinación del intervalo de fusión consiste en un bloque de metal que puede calentarse a velocidad controlada, con su temperatura monitoreada mediante un sensor. El bloque permite alojar el tubo capilar que contiene la sustancia de prueba y controlar el proceso de fusión, normalmente por medio de un haz de luz y un detector. Se puede procesar la señal del detector a través de una microcomputadora para determinar y mostrar el punto o intervalo de fusión, o bien la señal del detector se puede graficar para permitir el cálculo visual del punto o intervalo de fusión.
PROCEDIMIENTOS Procedimiento para la Clase 1, Aparato 1: Reducir la sustancia en análisis a un polvo muy fino y, a menos que se indique algo diferente, deshidratar la sustancia secándola a la temperatura especificada en la monografía correspondiente cuando contiene agua de hidratación. Si la sustancia no contiene agua de hidratación, secarla sobre un desecante apropiado durante no menos de 16 horas (o en las condiciones indicadas en Pérdida por Secado (731 ), si fuera apropiado). Cargar un tubo capilar de vidrio con un extremo cerrado con suficiente polvo seco para que forme una columna en el fondo del tubo que tenga 3 mm de altura al compactarla tanto como sea posible golpeteando suavemente sobre una superficie sólida. El fabricante del instrumento puede especificar variaciones en el tamaño de las muestras en función del diseño del mismo. Calentar el baño hasta que la temperatura esté aproximadamente a 1Oº por debajo del punto de fusión esperado. Retirar el termómetro y acoplar rápidamente el tubo capilar al termómetro mojando ambos con una gota del líquido del baño o de alguna otra manera y ajustar su altura para que el material en el capilar quede al nivel del bulbo del termómetro. Colocar el termómetro nuevamente en el baño y continuar el calentamiento, mezclando constantemente, de manera que la temperatura ascienda a una velocidad de aproximadamente 3º/min. Cuando la temperatura esté aproximadamente a 3º por debajo del límite inferior del intervalo de fusión esperado, reducir el calentamiento para que la temperatura ascienda a una velocidad de aproximadamente 1º/min. Continuar el calentamiento hasta que se complete la fusión. La temperatura a la cual la columna de la sustancia en análisis se colapsa claramente contra las paredes del tubo en cualquier punto indica el comienzo de la fusión y la temperatura a la cual la sustancia de prueba se torna completamente líquida corresponde al final de la fusión o punto de fusión. Las dos temperaturas caen dentro de los límites del intervalo de fusión. Si la fusión ocurre con descomposición, la temperatura de fusión correspondiente al comienzo de la fusión está dentro del intervalo especificado. Procedimiento para la Clase la, Aparato 1: Preparar la sustancia de prueba y cargar el capilar según se indica en Procedimiento para la Clase/, Aparato /. Calentar el baño hasta que la temperatura esté aproximadamente a 1Oº por debajo del punto de fusión esperado y aumente a una velocidad de aproximadamente 1 º /min. Insertar el capilar según se indica en Procedimien-
USP 39
Pruebas Físicas/ (741) Intervalo o Temperatura de Fusión 619
to para Clase/, Aparato I cuando la temperatura esté aproximadamente a 5º por debajo del límite inferior del intervalo de fusión esperado y continuar el calentamiento hasta completar la fusión. Registrar el intervalo de fusión según se indica en Procedimiento para la Clase 1, Aparato l.
Procedimiento para la Clase lb, Aparato 1: Colocar la sustancia de prueba en un recipiente cerrado y enfriarla a una temperatura de 1Oº o menor, durante al menos 2 horas. Sin reducir a polvo previamente, cargar el material enfriado en el tubo capilar según se indica en Procedimiento para la Clase 1, Aparato l. Luego, colocar inmediatamente el tubo capilar cargado en un desecador al vacío y secar a una presión que no exceda de 20 mm de mercurio durante 3 horas. Inmediatamente después de retirar del desecador, sellar a la llama el extremo abierto del tubo y, tan pronto como sea practicable, proceder con la determinación del intervalo de fusión según se indica a continuación. Calentar el baño hasta que la temperatura esté aproximadamente a 1Oº por debajo del intervalo de fusión esperado. Luego, introducir el tubo cargado y calentar a una velocidad de ascenso de aproximadamente 1º /min hasta completar la fusión. Registrar el intervalo de fusión según se indica en Procedimiento para la Clase 1, Aparato l.
Si el tamaño de partícula del material es demasiado grande para el tubo capilar, enfriar previamente la sustancia de prueba según se indicó anteriormente. Luego, aplicando la menor presión posible, triturar cuidadosamente las partículas hasta un tamaño adecuado para que entren en el tubo capilar y cargar de inmediato el tubo. Procedimiento para la Clase 1, Aparato 11: Preparar la sustancia en análisis y cargar el tubo capilar según se indica en Procedimiento para Ja Clase 1, Aparato l. Operar el aparato según las indicaciones del fabricante. Calentar el bloque hasta que la temperatura esté aproximadamente a 1Oº por debajo del punto de fusión esperado. Insertar el tubo capilar en el bloque de calentamiento y continuar el calentamiento a una velocidad de ascenso de temperatura de aproximadamente 1º/min hasta completar la fusión. La temperatura a la cual la señal del detector se desvía por primera vez de su valor inicial indica el comienzo de la fusión y la temperatura a la cual la señal del detector alcanza su valor definitivo corresponde al final de la fusión o punto de fusión. Las dos temperaturas caen dentro de los límites del intervalo de fusión. Si la fusión ocurre con descomposición, la temperatura de fusión correspondiente al comienzo de la fusión está dentro del intervalo especificado. Procedimiento para la Clase la, Aparato 11: Preparar la sustancia de prueba y cargar el tubo capilar según se indica en Procedimiento para la Clase 1, Aparato l. Operar el aparato según las indicaciones del fabricante. Calentar el bloque hasta que la temperatura esté aproximadamente a 1Oº por debajo del punto de fusión esperado y aumente a una velocidad de aproximadamente 1º/min. Insertar el tubo capilar según se indica en Procedimiento para la Clase/, Aparato I cuando la temperatura esté aproximadamente a 5º por debajo del límite inferior del intervalo de fusión esperado y continuar calentando hasta completar la fusión. Registrar el intervalo de fusión según se indica en Procedimiento para la Clase /, Aparato l. Si la fusión ocurre con descomposición, la temperatura de fusión correspondiente al comienzo de la fusión está dentro del intervalo especificado. Procedimiento para la Clase lb, Aparato 11: Colocar la sustancia de prueba en un recipiente cerrado y enfriarla a una temperatura de 1Oº, o menor, durante al menos 2 horas. Sin reducir a polvo previamente, cargar el material enfriado en el tubo capilar según se indica en Procedimiento para la Clase 1, Aparato l. Luego, colocar inmediatamente el tubo capilar cargado en un desecador al vacío y secar a una presión que no exceda de 20 mm de mercurio durante 3 horas. Inmediatamente después de retirar del desecador, sellar a la llama el extremo abierto del tubo, y tan pronto como sea practicable, proceder con la determinación del intervalo de fusión según se indica a continuación. Operar el aparato según las indicaciones del fabricante. Calentar el bloque hasta que la temperatura esté aproximadamente a 1Oº por debajo del intervalo de fusión esperado. Luego, introducir el tubo cargado y calentar a una velocidad de ascenso de aproximadamente 1º/min hasta completar la fusión. Registrar el intervalo de fusión según se indica en Procedimiento para la Clase 1, Aparato l. Si el tamaño de partícula del material es demasiado grande para el tubo capilar, enfriar previamente la sustancia de prueba según se indicó anteriormente. Luego, aplicando la menor presión posible, triturar cuidadosamente las partículas hasta un tamaño adecuado para que entren en el tubo capilar y cargar de inmediato el tubo. Procedimiento para la Clase 11: Fundir cuidadosamente el material que se desea probar a la menor temperatura posible y colocarlo en un tubo capilar con ambos extremos abiertos, a una profundidad de aproximadamente 1O mm. Enfriar el tubo cargado a 1Oº o menos durante 24 horas, o mantenerlo en contacto con hielo durante no menos de 2 horas. Luego unir el tubo capilar al termómetro por medios adecuados, ajustarlo en un baño de agua de manera que el borde superior del material quede 1O mm por debajo del nivel del agua y calentar según se indica en Procedimiento para la Clase 1, Aparato I excepto que se debe regular la velocidad de ascenso de temperatura a razón de aproximadamente 1,0º/min, dentro de los 5º de la temperatura de fusión esperada. La temperatura a la cual el material comienza a subir en el tubo capilar es la temperatura de fusión. Procedimiento para la Clase 111: Fundir lentamente una cantidad de la sustancia de prueba, mientras se mezcla, hasta que alcance una temperatura de 90º-92º. Retirar la fuente del calor y dejar que la sustancia fundida se enfríe a una temperatura de 8º-10º por encima del punto de fusión esperado. Enfriar el bulbo de un termómetro adecuado a 5º, secarlo y mientras todavía esté frío colocarlo en la sustancia fundida hasta que quede sumergida aproximadamente la mitad inferior del bulbo. Retirarlo de inmediato y mantenerlo en posición vertical lejos del calor hasta que se opaque la superficie de la cera. Luego, sumergirlo durante 5 minutos en un baño de agua con una temperatura que no exceda de 16º. Fijar el termómetro firmemente a un tubo de ensayo de manera que el punto inferior quede 15 mm por encima del fondo del tubo de ensayo. Suspender el tubo de ensayo en un baño de agua ajustado a aproximadamente 16º y aumentar la temperatura del baño a una velocidad de aproximadamente 2º/min hasta 30º. Luego, cambiar a una velocidad de aproximadamente 1º/min y observar la temperatura a la cual se desprende del termómetro la primera gota de sustancia fundida. Repetir la determinación dos veces con una porción recién fundida de la sustancia de prueba. Si la variación de las tres determinaciones es de
620 (741) Intervalo o Temperatura de Fusión/ Pruebas Físicas
USP 39
menos de 1º, tomar el promedio de las tres como punto de fusión. Si la variación de las tres determinaciones es 1ºo mayor de 1º, hacer dos determinaciones adicionales y tomar el promedio de las cinco.
Ellmimir lo $iguiente:
"
..
"
'
'
;
'
•{751) PARTICULAS METALICAS EN UNGUENTOS OFTALMICOS La siguiente prueba está diseñada para limitar á un nível que se considera no objetable el número y tamaño de partículas metálicas que puede haber presentes en ungüentos oftálmicos. Procedimiento-Extrudir tanto como sea posible, en forma individual, el contenido de 1 O tubos en sendas placas de Petri de 60 mm transparentes, de fondo plano y exentas de marcas de cualqUler tipo. Cubrir las placas y cafetitar a 85º durante 2 horas, aumentando la temperatura levemente,· si fuera necesario, para asegurar la ootendón del estádo líquido. Tomando precauciones para no perturbar la muestra fundida, defar enfriar cada una de fas platas a temperatura ambiente hasta lograr ra solidificación. Retirar las tapas e invertir cada placa de Petri en la .platina de un microscopio apropiado ajustado para pí'oporeionar tm aumento de 30x y eqUipado con un oc\Jlar con micrómetro dé disto calibrado para el aumentó empleado; Además dé la fuente de luz usual, dirigir otra fuente de iluminación por encima del ungüentó a un ángulo de 45 º. Exam.inar el fondo de. la placa de Petri en su totalidad pára verificar la presencia de partículas metálicas; La variación dela intensidad de lafüerite de ilu.mlnaeión superior permite que sé réconozcan estas partículas metálicas pór su reflexión caí-act.erística d'é la luz. C:ontar el núrnero de partículas metálicas de 50 µm o de mayor tamaño. en cualquier dirnensióri~ los rAAuisitos se cumplen si el número total de tales partículas en los JO. tul:fos no excede de soy si no hay riJás.de. f tubó que. contenga rnás'de 8 partículas metálícas. Si·no se obtienen estos resultados, repetir la prueba éh 2() tubos adiéié¡nales: los réqbisitos se complen si el nu• mero total de. partícolas metálkas que tienen un tamaño de .so µm o rmfyor¡ en cualquier cfirnensí6ri 1 no excede de 150 en ros 30 tubos analizados y si no hay más de 3 tubos, individualmente, que contengan más de. 8 partículas de este tipo..,;.t)sp39
<755) LLENADO MÍNIMO ALCANCE Las siguientes pruebas y especificaciones se aplican a artículos tales como cremas, geles, lociones, ungüentos, pastas, polvos, aerosoles y atomizadores envasados. Para minimizar el impacto del aire atrapado en los productos donde el contenido declarado se expresa en volumen, la determinación del llenado se lleva a cabo usando el peso a partir del cual se calcula el volumen usando la densidad de la preparación.
PROPÓSITO La prueba de llenado mínimo asegura que la cantidad de material llenado en el producto cumple con la cantidad declarada.
PROCEDIMIENTO PARA FORMAS FARMACÉUTICAS DIFERENTES DE AEROSOLES Para envases donde el contenido declarado se expresa en peso: Seleccionar una muestra de 1O envases llenos y quitar todas las etiquetas cuyo peso pueda variar cuando se extrae el contenido del envase. Limpiar a fondo y secar minuciosamente la parte externa de los envases con un medio apropiado y pesar individualmente. Extraer cuantitativamente el contenido de cada envase, cortándolo de manera tal que quede abierto y lavándolo con un disolvente apropiado, si fuera necesario, teniendo cuidado de retener el cierre y las otras partes de cada envase que estuvieron presentes durante el pesaje inicial. Secar y volver a pesar cada uno de los envases vacíos junto con sus partes correspondientes. Determinar el peso neto del contenido del envase mediante la diferencia. Para envases donde el contenido declarado se expresa en volumen: Proceder según se indica anteriormente para envases donde el contenido declarado se expresa en peso, pero convertir el peso en volumen usando la densidad de la preparación. A continuación se presenta un procedimiento para determinar la densidad de los materiales: 1. Tarar un matraz volumétrico de 100 mL que contenga 50,0 mL de líquido que sea miscible con la formulación. 2. Agregar aproximadamente 25 mL de una muestra representativa del producto y mezclar agitando por rotación suave el contenido de la mezcla. 3. Volver a pesar el matraz.
USP 39
Pruebas Físicas/ (761) Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear 621
4. Desde una bureta, agregar una cantidad medida con exactitud del líquido miscible para llevar el contenido del matraz a volumen mientras se agita suavemente por rotación suave. Registrar el volumen tomado de la bureta. 5. Calcular la densidad de la muestra: W/V W = peso del material tomado (g) V= 50,0 mL menos el volumen, en mL, del líquido miscible necesario para ajustar el contenido del matraz a 100 mL Se pueden emplear otros métodos para determinar la densidad dependiendo de la formulación (p.ej., formulaciones sustancialmente no acuosas). De manera similar, si el contenido del envase es de menos de 25 mL, se pueden usar vasos graduados más pequeños, ajustando las cantidades de líquido miscible de manera correspondiente. Como alternativa, verter el contenido de 1O envases en 1O probetas graduadas adecuadas y dejar que escurra por completo. Registrar el volumen del contenido de cada uno de los 1O envases.
Criterios de Aceptación Esta prueba cumple con los criterios de aceptación en la Etapa 1 o la Etapa 2: Etapa 1: 1. El contenido neto promedio de los 1O envases es no menor que la cantidad declarada y el contenido neto de cualquier envase individual es no menos de 90% de la cantidad declarada cuando la cantidad declarada es 60 g o 60 mL o menos, o no menos de 95% de la cantidad declarada en la que la cantidad declarada es más de 60 g o 60 ml. Si no se cumplen estos criterios y el contenido neto de no más de 1 envase es menos de 90% de la cantidad declarada cuando la cantidad declarada es 60 g o 60 mL o menos, o 95% de la cantidad declarada cuando la cantidad declarada es más de 60 g o 60 mL, proceder con la Etapa 2. Etapa 2: 1. Determinar el contenido de 20 envases adicionales. 2. El contenido promedio de los 30 envases es no menor que la cantidad declarada y el contenido neto de no más de 1 de los 30 envases es menos de 90% de la cantidad declarada cuando la cantidad declarada es 60 g o 60 mL o menos, o menos de 95% de la cantidad declarada cuando la cantidad declarada es más de 60 g o 60 ml.
PROCEDIMIENTO PARA AEROSOLES Y ATOMIZADORES Seleccionar una muestra de 1O envases llenos y quitar cualquier etiquetado cuyo peso podría variar durante la remoción del contenido del envase. Limpiar a fondo y secar minuciosamente la parte externa de los envases con medios apropiados y pesar individualmente. Retirar el contenido de cada envase empleando una técnica segura (por ejemplo, enfriar para reducir la presión interna, retirar la válvula y verter). Retirar el contenido residual con disolventes apropiados y luego enjuagar con unas pocas porciones de metano!. Retener el envase, la válvula y todas las partes del mismo como una unidad y calentarlas a 100º durante 5 minutos. Enfriar y volver a pesar cada uno de los envases junto con sus partes correspondientes. La diferencia entre el peso original y el peso del envase vacío es el peso neto de llenado. Determinar el peso neto de llenado para cada envase analizado.
Criterios de Aceptación Los requisitos se cumplen si el peso neto del contenido de cada uno de los 1O envases es no menor que la cantidad declarada.
(761) ESPECTROSCOPÍA DE RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR INTRODUCCIÓN La espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN) es un método analítico basado en las propiedades magnéticas de ciertos núcleos atómicos. Al igual que con otros tipos de espectroscopía, la absorción o emisión de energía electromagnética a frecuencias características proporciona información sobre la estructura. La RMN difiere de otros tipos de espectroscopía en que los niveles discretos de energía entre los que ocurren las transiciones se presentan sólo cuando el núcleo se somete a un campo magnético. Aunque se la reconoce ampliamente como una de las más poderosas herramientas de elucidación de estructuras químicas disponibles, también se la puede usar para mediciones cualitativas y cuantitativas exactas, siempre que se use un diseño expe-
622 (761) Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear / Pruebas Físicas
USP 39
rimental apropiado. Consultar el capítulo de información general (1761) Aplicaciones de la Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear. [NOTA-Los capítulos con números superiores a 1000 se proveen únicamente para fines informativos.]
CALIFICACIÓN DE INSTRUMENTOS DE RMN La calificación de un instrumento de RMN se puede dividir en tres etapas: Calificación de Instalación (IQ, por sus siglas en inglés), Calificación Operativa (OQ, por sus siglas en inglés) y Calificación de Desempeño (PQ, por sus siglas en inglés). Para un análisis más detallado, ver el capítulo de información general Calificación de Instrumentos Analíticos (1058).
Calificación de Instalación Los requisitos de Calificación de Instalación proveen evidencia de una instalación adecuada de hardware y software para el instrumento de manera segura y efectiva en la ubicación deseada.
Calificación Operativa En la Calificación Operativa se caracteriza el desempeño del instrumento usando estándares para verificar que el sistema opera de acuerdo con las especificaciones esperadas. El propósito de la Calificación Operativa es demostrar que el desempeño del instrumento es apto para una aplicación determinada. Debido a que se encuentran disponibles una gran cantidad de modos distintos para medir espectros de RMN, se recomienda usar estándares con propiedades espectrales conocidas durante la Calificación Operativa. Por lo general, se encuentran disponibles estándares de referencia en tubos para RMN sellados para determinar la relación señal-ruido y la forma de la línea espectral.
Calificación de Desempeño La Calificación de Desempeño ayuda a determinar que el instrumento sea capaz de cumplir con los requisitos del usuario para todas las mediciones críticas para la calidad. La documentación de la Calificación del Desempeño debe describir lo siguiente: 1. Criterios de desempeño específicos definidos y procedimientos de prueba detallados, incluyendo muestras de prueba y parámetros del instrumento. 2. Los elementos a medir para evaluar los criterios y las especificaciones definidas a priori para dichos criterios. 3. El intervalo de prueba, que puede ser al momento de usar. 4. El uso de muestras extremas (bracketing) o de un grupo de varias muestras. 5. Una lista definida de las acciones correctivas que podrían implementarse si el espectrómetro no cumpliera con las especificaciones. La Calificación de Desempeño periódica debe incluir un subconjunto de pruebas de Calificación Operativa para asegurar que el instrumento se desempeña produciendo datos adecuados para el uso que se le intenta dar. Dependiendo del uso típico, las especificaciones de la Calificación de Desempeño pueden ser más o menos estrictas que las especificaciones de instalación del fabricante. Las mediciones críticas para la calidad de los espectros incluyen una medición de la relación señal-ruido y pruebas de resolución para todos los núcleos de interés. Las pruebas de Calificación de Desempeño específicas para un método, también conocidas como pruebas de aptitud del sistema, se pueden usar como requisitos de Calificación de Desempeño en el caso de procedimientos validados. Las pruebas y muestras para la Calificación de Desempeño citadas en las secciones siguientes son sólo ejemplos típicos. Se pueden usar otras pruebas y muestras para establecer especificaciones para propósitos específicos. Los proveedores de instrumentos a menudo suministran muestras y parámetros de prueba que se pueden usar como parte del paquete de Calificación de Desempeño. MEDICIÓN DE LA RESOLUCIÓN y DE LA FORMA DE LA LÍNEA-RMN DE 1 H (ver la Figura 1) Muestra: Cloroformo al 1% en acetona-d 6 (~ 500 MHz), cloroformo al 3% en acetona-d 6, desgasificada y sellada Ancho del espectro: < 1 KHz Tiempo de adquisición de datos: No menos de 1 O segundos Ángulo de deflexión: 90º Tiempo de relajación: 60 segundos Velocidad de giro: Estática ó 20 Hz Secuencia de pulso: Espera-pulso-adquisición sin desacoplamiento Procesamiento: Sin ensanchamiento de línea, completado de ceros hasta 128 k
Pruebas Físicas/ (761) Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear 623
USP 39
* #
Satélite de 13C Artefactos de Giro
~
#
~¡
!
.#
*
* t~
~
#
#
lº
··-T-·
,.-r·
-~r-
-··1
8,2
('"'
f' . -
·-r' .·r 8,1
'")" """ w-·r·· -- -,-----"¡ ··-. r ---.... r···-"' ........."'"""'f" "'" ·r·--· -y--··;r-- ·y·-·-•r<>·-·1-··-°'1 _, -.,-,~. "---·-"! """
8,0
7~
7,8
-1
(ppmJ
Figura 1. Espectro de RMN de 1 H de cloroformo en acetona-d 6 obtenido a 400 MHz. El ancho de la línea medido a 0,55% y a O, 11 % de los satélites 13 C fue 2, 7 y 5,5 Hz, respectivamente. Compensar el magneto con especial atención a las compensaciones fuera de eje, obtener una sola adquisición, someter a corrección de fase para obtener una absorción pura y medir el ancho de la línea a 50%, 0,55% y O, 11 % de la intensidad máxima. El ancho de la línea debe cumplir con las especificaciones para estas alturas y, además, la forma de la línea debe ser lorentziana. Con frecuencia, en los espectrómetros de RMN modernos, la forma de la línea se obtiene en muestras sin girar, puesto que es posible compensar muy bien fuera de eje, tanto que no existe ninguna diferencia fundamental entre los espectros obtenidos girando la muestra y con la muestra sin girar. Además, los espectros bidimensionales se deben obtener sobre muestras estáticas. MEDICIONES DE RELACIÓN SEÑAL-RUIDO-RMN DE 1H (ver la Figura 2) Muestra: Etilbenceno al O, 1% en cloroformo-d, etilbenceno al 1% en cloroformo-d (< 200 MHz) desgasificado y sellado Ancho del espectro: 1O ppm Tiempo de adquisición de datos: 400 milisegundos Ángulo de deflexión: 90º Tiempo de espera para relajación: 60 segundos Velocidad de giro: O ó aproximadamente 20 Hz Secuencia de pulso: Espera-pulso-adquisición sin desacoplamiento Procesamiento: Exponencial con un ensanchamiento de la línea de 1 Hz Referencia: Tetrametilsilano {TMS) = 0,0 ppm o el centro del cuarteto= 2,65 ppm
624 (761) Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear / Pruebas Físicas
USP 39
6
-º·
""
2,3,4
5
"'·o t
f .
w
..
f
6
'
~
' - '
1
5
~~,..-....-~---.---,---,-~-,---,--....,-...,.....-,--,--,---,-·.....,..---.---,-·-,-,~--.--,·
4
1
(ppm)
Figura 2. Espectro de RMN de 1 H de etilbenceno al O, 1% obtenido a 400 MHz con una relación señal-ruido de 550:1 Se debe elegir la concentración de etilbenceno para lograr mediciones de relación señal-ruido especificadas en el intervalo de 20-1000. Las concentraciones que generalmente resultan en mediciones fuera de dicho intervalo tienen una utilidad limitada para la evaluación del desempeño del instrumento. Sin embargo, convencionalmente se utilizan soluciones estándar establecidas. Se debe compensar el magneto lo mejor posible. Idealmente, esta prueba debe realizarse inmediatamente después de la prueba de la forma de la línea puesto que la mayoría de las compensaciones estarán casi maximizadas. Obtener una sola adquisición, someter el espectro a corrección de fase en el modo de absorción pura y medir la relación señal-ruido del cuarteto de etilbenceno. Este experimento se puede realizar girando la muestra o con la muestra estática. Si las compensaciones fuera de eje están bien ajustadas, el valor de la relación señal-ruido medido sobre muestras giradas sólo debe ser aproximadamente 10% mayor que el obtenido con muestras estáticas. Una relación mayor indica que se puede lograr una compensación fuera de eje adicional. Los espectrómetros modernos tienen un software que lleva a cabo la medición de la relación señal-ruido una vez que el operador ha identificado las regiones de la señal y del ruido. Los cálculos también pueden realizarse manualmente. Medir la amplitud (A) desde el centro de la línea base hasta el pico de la más alta de las dos líneas centrales en el cuarteto. Medir la altura del ruido entre picos Uf) desde el pico de ruido inferior hasta el pico de ruido superior en la región de 3-5 ppm. El ruido puede multiplicarse verticalmente por un factor para obtener una medición exacta de los espectros con relación señal-ruido alta. Calcular la relación señal-ruido según se indica a continuación: S/N = k
X
2,5
X
Al H
[1]
donde k es el factor de expansión vertical de la región de ruido usada. El factor de 2,5 convierte la relación señal-ruido entre picos en la media cuadrática (rms, por sus siglas en inglés) del ruido, que es la convención estándar para informar la señalruido en la espectroscopía de RMN. Se pueden usar cálculos de señal-ruido computarizados siempre que las especificaciones se establezcan y analicen usando el mismo procedimiento. El uso de un valor de relación señal-ruido menor que el especificado por el fabricante es permisible, a discreción del espectroscopista, siempre y cuando se determine que dicho valor es suficiente para la aplicación en uso. MEDICIONES DE RELACIÓN SEÑAL-RUIDO DE RMN DE
13 C
(ver la Figura 3)
Muestra: p-Dioxano al 40% en benceno-d 6 (v/v) (desgasificada y sellada) Ancho del espectro: Aproximadamente 200 ppm Ángulo de deflexión: 90º Tiempo de espera para relajación: 300 segundos Velocidad de giro: Aproximadamente 20 Hz Secuencia de pulso: Espera-pulso-adquisición sin desacoplamiento Procesamiento: Exponencial con un ensanchamiento de línea de 3,5 Hz, completado de ceros hasta 32k Referencia: TMS = 0,0 ppm o el centro del triplete del benceno= 128,4 ppm
Pruebas Físicas/ (761) Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear 625
USP 39
.i Benceno-d6
~~~·--· . ·· ·········· + ··· ·
Dioxano
120
100
~~~~~~~....-~·~---~~~~~-.-~.....-~..---.~--..---...~r---t-----r---~.~
140
120
80
100
60
(ppm)
Figura 3. Espectro de RMN de BC del estándar ASTM de p-dioxano al 40% en benceno-d 6 (v/v) obtenido a 100,6 MHz, con una relación señal-ruido de 140:1 Usando un magneto bien compensado, obtener una sola adquisición después de un tiempo de espera mínimo de 300 segundos, colocar el espectro en fase de absorción pura y medir la altura del triplete del benceno a aproximadamente 128,4 ppm desde el centro de la línea base. El ruido entre picos se puede medir según se indicó anteriormente con una expansión vertical apropiada a 80-120 ppm. Los cálculos de la relación señal-ruido se pueden realizar tal como indica la Ecuación 7 o mediante cálculo computarizado. El triplete del benceno-d 6 no se intensifica por efecto nuclear de Overhauser (NOE, por sus siglas en inglés). Por consiguiente, esta prueba verifica sólo el desempeño del canal 13 C. DESEMPEÑO DE LOS CANALES
13 C
y 1 H (ver la Figura 4)
Muestra: Etilbenceno hasta al 10% en cloroformo-d (desgasificada y sellada) Ancho del espectro: 200 ppm Duración de la adquisición de datos: 64k puntos Ángulo de deflexión: 90º Tiempo de espera para relajación: 300 segundos Velocidad de giro: Aproximadamente 20 Hz Secuencia de pulso: Espera-pulso-adquisición con desacoplamiento de pulso compuesto ajustado al centro del espectro de 1H Procesamiento: Exponencial con ensanchamiento de línea de 0,3 Hz Referencia: TMS = 0,0 ppm o el centro del triplete del cloroformo-d = 77,23 ppm
626 (761) Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear / Pruebas Físicas
USP 39
2,3
CH
~C,.,..6 3 -~
':::::-.....
(;J 4
CDCl 3
1
5
6
-,---.-·~~-.--~-.---.--..-
120
100
Figura 4. Espectro de RMN de BC de etilbenceno al 10% obtenido con una sonda dual 1 H/BC enfriada criogénicamente a 150,9 MHz, con una relación señal-ruido de 640:1 La compensación debe ser suficiente para cumplir con las pruebas de resolución y de forma de la línea descritas anteriormente. La medición de la relación señal-ruido se realiza a partir de la altura del pico de la mayor de las dos resonancias cercanas a 128 ppm. El ruido se mide según se indicó anteriormente en la región de 80-120 ppm, con una expansión vertical apropiada. La relación señal-ruido es calculada por la computadora o conforme a la Ecuación 1. MEDICIONES DE RELAXOMETRÍA-RMN DE CAMPO BAJO La Calificación de Desempeño debe realizarse antes de la recolección de datos experimentales. Disolver una cantidad pesada con exactitud de cloruro de manganeso (11) tetrahidrato (peso molecular 197,91) en agua y diluir cuantitativamente con agua para obtener soluciones de comprobación con concentraciones conocidas de 0,9; 2,7 y 4,5 mM. Colocar una porción de cada una de las soluciones en portamuestras adecuados para el modelo de espectrómetro de RMN de campo bajo en uso. Entibiar a 40º durante no menos de 1 O minutos y medir el tiempo de relajación espín-entorno (T,) del agua. El promedio T1 para mediciones repetidas debe estar dentro del 5% de 156; 52 y 32 ms para las soluciones de 0,9; 2,7 y 4,5 mM, respectivamente.
Caracterización del Desempeño del Instrumento Los procedimientos específicos, criterios de aceptación e intervalos de tiempo para caracterizar el desempeño del espectrómetro de RMN dependen del instrumento y del uso que se pretende dar. Muchas aplicaciones de RMN emplean experimentos previamente validados que relacionan los espectros de RMN con una propiedad física o química de interés. Se debe demostrar el desempeño estable del instrumento durante periodos prolongados. Esta práctica ofrece cierta garantía sobre la confiabilidad de las mediciones de muestra tomadas a partir de espectros usando experimentos de RMN previamente validados.
ANÁLISIS DE RMN CUALITATIVO Y CUANTITATIVO La espectroscopía de RMN se ha utilizado en un amplio rango de aplicaciones tales como elucidación de estructuras, estudios termodinámicos, cinéticos y mecanísticos, y análisis cuantitativo. Algunas de estas aplicaciones están más allá del alcance de los métodos farmacopeicos. Todas las características de las señales-desplazamiento químico, multiplicidad, ancho de línea, constantes de acoplamiento, intensidad relativa y tiempo de relajación- proveen información analítica.
USP 39
Pruebas Físicas/ (761) Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear 627 Aplicaciones Cualitativas
La comparación de un espectro existente en la bibliografía o de un estándar auténtico con el de una muestra de prueba puede usarse para confirmar la identidad de un compuesto y detectar la presencia de impurezas que generan señales extrañas. Los espectros de RMN con estructuras simples pueden describirse adecuadamente mediante el uso de los valores numéricos para los desplazamientos químicos y las constantes de acoplamiento, y mediante el número relativo de núcleos representados por la integral de cada señal. (Los instrumentos modernos cuentan con software que genera espectros simulados con estos datos). También deben proporcionarse detalles experimentales, como por ejemplo el disolvente usado y la referencia para el desplazamiento químico. Para muestras desconocidas, el análisis de RMN, usualmente combinado con otras técnicas analíticas, es una herramienta poderosa para la elucidación de estructuras. Los desplazamientos químicos proporcionan información del entorno químico de los núcleos. Existe una amplia bibliografía de referencia con tablas y reglas de correlación para predecir los desplazamientos químicos. La multiplicidad de las señales proporciona información estructural importante. La magnitud de la constante de acoplamiento escalar, j, entre protones residuales en estructuras aromáticas, olefínicas o cicloalquílicas sustituidas se usa para identificar la posición relativa de los sustituyentes. Los espectros de rutina de 13 C se obtienen en condiciones de desacoplamiento protónico, lo que anula todos los acoplamientos heteronucleares BC- 1 H. Como resultado de este desacoplamiento, las señales de carbono aparecen como singuletes, a menos que estén presentes otros núcleos no desacoplados (p.ej., 19 F,3 1 P). El intercambio químico es un ejemplo del efecto de la velocidad de los procesos intermoleculares e intramoleculares en los espectros de RMN. Si un protón puede experimentar diferentes ambientes en virtud de tal proceso (tautomerismo, rotación en torno a un enlace, equilibrios de intercambio, inversión de anillo, etc.), la apariencia del espectro será una función de la velocidad del proceso. Los procesos lentos (en una escala de tiempo de RMN) proporcionan más de una señal de las especies que se interconvierten, los procesos rápidos promedian estas señales en una línea, y los procesos intermedios producen señales anchas, que en ocasiones son difíciles de encontrar en los espectros. Los programas de los espectrómetros modernos de RMN por Transformada de Fourier toman en cuenta secuencias de pulsos mucho más complejas que la acumulación repetitiva de transientes descrita anteriormente. Tales experimentos incluyen análisis multidimensionales homonucleares o heteronucleares que determinan la correlación de acoplamientos y pueden simplificar la interpretación de espectros complejos. Ver el capítulo (1761) para descripciones detalladas de los experimentos bidimensionales más comunes.
Aplicaciones Cuantitativas l. Consideraciones generales de la RMN cuantitativa: ver el capítulo (1761 ). 11. El alcance de esta sección se limita a la cuantificación mediante RMN unidimensional. Aunque se puede usar cualquier núcleo activo de RMN para obtener datos cuantitativos, la información de este capítulo se limita al 1H. Existen dos tipos de cuantificación mediante RMN: relativa y absoluta. (A) La cuantificación relativa implica medir cantidades relativas de las especies en una muestra basándose en la integración de picos debidos a cada una de las especies medidas. Las integrales se normalizan mediante el factor N, es decir, la integral se divide por el número de núcleos equivalentes representados por dicho pico para proporcionar la concentración molar relativa de cada componente. (B) La cuantificación absoluta es la medición directa de la cantidad real de analito independiente de otros componentes contenidos en dicha muestra. Existen dos métodos básicos de cuantificación absoluta basados en el tipo de estándar de referencia usados para calibrar la señal de RMN. (1) Estándar de referencia interno: (a) Definición: El estándar de referencia se disuelve conjuntamente con el analito en la solución de prueba. (b) Procedimiento Preparación de la solución típica para RMN: Una solución para RMN se prepara con pesos exactos del analito y del estándar de referencia. La fuente de error más grande en este método de RMN cuantitativo se deriva del pesaje, por lo que se recomienda usar pesos más grandes para minimizar errores. Este método cuantitativo se basa en una comparación del estándar de referencia y los picos de RMN del analito y sus respectivas concentraciones. Debido a que el analito y el estándar de referencia se encuentran en la misma solución, el volumen donde el analito y el estándar de referencia están contenidos es el mismo, por lo que únicamente se comparan sus masas. Por lo tanto, no es necesario un volumen exacto. Por lo general, las soluciones se preparan por triplicado como mínimo. Adquisición de datos: Los datos se adquieren en condiciones cuantitativas, ver el capítulo (1761 ). Por ejemplo, se debe esperar al menos 5 veces el T1 más largo cuando se usa un pulso de 90º antes de repetir el pulso. Procesamiento de datos: Procesar los datos, usando completado de ceros si fuera necesario, de modo que haya un número suficiente de puntos para definir un pico. Por ejemplo, la experiencia ha demostrado que se necesitan al menos 16 puntos para obtener una buena representación cuantitativa de un pico.
628 (761) Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear /Pruebas Físicas
USP 39
Análisis: Integrar los picos apropiados. Por ejemplo, evitar el uso de picos superpuestos o los que se deban a hidrógenos susceptibles de intercambio. La determinación de la cantidad de analito se deriva de la proporcionalidad básica entre la intensidad del pico y la concentración del soluto.
[A]1H
JA/NA
=
[RSJ1H
[2]
/Rs/NRS
donde / = integral; N = factor de normalización; y [ ]lH = 1H concentración molar relativa y los subíndices A y RS representan el analito y el estándar de referencia, respectivamente. Por consiguiente, la masa del analito se calcula de acuerdo con la siguiente ecuación.
donde MA = masa del analito, MM= masa molar y P = pureza del estándar de referencia. (c) Una aplicación común de la cuantificación absoluta es la determinación de la pureza de una muestra. La pureza porcentual en peso se calcula mediante
M
pureza %en peso =-A x100%
[4]
Ms donde M 5 es la masa total de la muestra con contribuciones del analito más cualquier contaminante que pudiera estar presente en la muestra como por ejemplo agua y sales. Al combinar las Ecuaciones 3 y 4, la pureza porcentual en peso se calcula mediante
(2) Estándar de referencia externo (a) Definición: El método clásico de estándar de referencia externo consiste en soluciones de un estándar de referencia y un analito que se encuentran en tubos para RMN separados. Una variación del método del estándar de referencia externo es insertar la solución de prueba del estándar contenida en un tubo coaxial en la solución de prueba del analito contenida en un tubo para RMN. Otra variación consiste en la introducción de una señal generada por computadora en el espectro de una solución estándar de referencia de concentración conocida para calibrar la respuesta de la señal (intensidad por concentración molar 1H, en el caso de la RMN de 1H), seguida por la inserción de una señal calibrada generada por computadora en el espectro de una solución de prueba del analito. Esta sección tratará el uso de una referencia externa en el sentido clásico. (b) Procedimiento Preparación de la solución para RMN: Las soluciones para RMN con concentraciones conocidas de analito y de estándar de referencia se preparan usando pesos y volúmenes exactos. Nuevamente, se recomienda el uso de pesos más grandes para minimizar el error de pesaje. Por lo regular, se preparan soluciones repetidas del analito y del estándar de referencia. El analito y el estándar de referencia deben prepararse usando el mismo disolvente para minimizar las diferencias de ajuste. Adquisición y procesamiento de datos: Igual que en 11.B.1.b, estándar de referencia interno. Aplicar los mismos parámetros de adquisición y procesamiento a los espectros del analito y del estándar de referencia. Análisis: Integrar los picos apropiados en los espectros del analito y del estándar de referencia. La cantidad de analito se calcula de acuerdo con la siguiente ecuación:
MA_!A_x NRS x~x MMA xM xP IRS NA VRS MMRS ~
[6]
donde V= volumen. Aplicación a la pureza porcentual en peso: Los valores de pureza porcentual en peso se pueden calcular de manera similar a la indicada en la Ecuación 5. (C) Los métodos de estándar de referencia interno y externo tienen cada uno sus propias ventajas y desventajas. (1) Interacciones químicas: La preparación del estándar de referencia y del material de prueba en soluciones separadas previene interacciones químicas entre la muestra de prueba y el estándar de referencia que de otro modo podrían ocurrir con un estándar de referencia interno. (2) Superposición de espectros: El uso de un estándar de referencia externo también previene la superposición potencial entre los picos del estándar de referencia y de la muestra de prueba que puede ocurrir con un estándar interno.
USP 39
Pruebas Físicas/ (761) Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear 629 (3) Calibración: Una vez que se ha calibrado la respuesta de RMN con soluciones de estándares de referencia externos, dicha calibración puede aplicarse a cualquier otra muestra en el mismo disolvente siempre que i) se haya demostrado la estabilidad del instrumento durante el tiempo entre el que se lleva a cabo la calibración y el momento en que se adquieren los datos en el material de prueba, ii) se haya establecido la aptitud del sistema en el día en que se realiza la medición del material de prueba y iii) se comparen las integrales absolutas. Para los estándares de referencia internos, la medición del estándar de referencia y de la muestra de prueba se lleva a cabo en condiciones absolutamente idénticas. (4) Exactitud y precisión: Se pueden preparar soluciones múltiples de estándares de referencia para promediar los errores en las mediciones de masa y volumen durante la preparación de la muestra, con lo que se mejora la exactitud de la respuesta de RMN calibrada. Para los estándares de referencia internos, se realizan mediciones individuales del estándar de referencia y del analito para cada solución de prueba duplicada. Los errores combinados que se derivan de las mediciones de masa del estándar de referencia y de la muestra de prueba, así como las variaciones electrónicas de los instrumentos determinan la desviación estándar del promedio MA o de los valores de pureza porcentual en peso.
VALIDACIÓN Y VERIFICACIÓN DE PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS DE RMN Cuando se proporciona un procedimiento de RMN en una monografía, es necesario verificar su aptitud en las condiciones reales de uso (ver el capítulo (1226)). La validación es necesaria únicamente cuando un método de RMN se presenta como alternativa al procedimiento oficial para el análisis de un artículo oficial. El objetivo de la validación de un procedimiento de RMN es demostrar que la medición es adecuada para su propósito deseado, incluyendo lo siguiente: determinación cuantitativa del componente principal en un fármaco o producto farmacéutico (valoraciones de Categoría 1), determinación cuantitativa de impurezas (valoraciones de Categoría 11) y pruebas de identificación (valoraciones de Categoría IV). [NOTA-Para definiciones sobre las diferentes categorías, consultar el capítulo (1225) Validación de Procedimientos Farmacopeicos.] Dependiendo de la categoría de la prueba, la validación del procedimiento analítico requerirá el análisis de la especificidad, linealidad, intervalo, exactitud, precisión, límite de cuantificación y robustez. Dichas características de desempeño analítico se aplican a métodos estandarizados externamente y los métodos de estándares agregados. El capítulo (1225) ofrece definiciones y pautas generales sobre la validación de procedimientos analíticos sin indicar criterios de validación específicos para cada característica. La intención de las secciones siguientes es proveer al usuario de criterios de validación específicos que representan las expectativas mínimas para esta tecnología. Podrían requerirse criterios de aceptación más rigurosos para cada aplicación particular a fin de demostrar la aptitud para el uso deseado.
Validación de Procedimientos Analíticos El objetivo de la validación de un procedimiento analítico es demostrar que dicho procedimiento es adecuado para el propósito al que está destinado, mediante la realización de experimentos y que los resultados obtenidos a partir de ellos cumplan con criterios de aceptación predefinidos. Los procedimientos analíticos de RMN pueden incluir lo siguiente: pruebas cuantitativas para componentes principales y contenido de impurezas, pruebas de límite para detectar la presencia de impurezas, cuantificación de componentes en un producto o formulación y/o pruebas de identificación. Las características de desempeño que demuestran la aptitud de un procedimiento analítico son similares a las requeridas para cualquier procedimiento analítico. El capítulo (1225) presenta una discusión sobre los principios generales aplicables. Los criterios de aceptación específicos para cada parámetro de validación deben ser congruentes con el uso pretendido del procedimiento analítico. A continuación se proporcionan las características de desempeño requeridas como parte de una validación para cada una de las categorías de procedimientos analíticos. ESPECIFICIDAD El propósito de una prueba de especificidad es demostrar que las mediciones de las señales del analito a medir están exentas de interferencia proveniente de los componentes e impurezas en el material de prueba. La especificidad se puede aplicar a todas las categorías y es un requisito de la Categoría IV. Como prueba de especificidad se pueden comparar los espectros de RMN del analito con los de otros componentes de las formulaciones y las preparaciones de prueba, así como los de impurezas conocidas derivadas de los procesos sintéticos. Para un procedimiento analítico de identificación por RMN (Categoría IV), las pruebas de validación pueden incluir experimentos de RMN multidimensionales para validar las correctas asignaciones de los desplazamientos químicos y así confirmar la estructura del analito. Criterios de validación: La especificidad se asegura mediante el uso de un estándar de referencia, siempre que sea posible, así como la demostración de la ausencia de interferencias procedentes de otros componentes.
630 (761) Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear / Pruebas Físicas
USP 39
LINEALIDAD La relación de linealidad es aquélla exhibida entre la concentración de analito y la respuesta del instrumento, la cual se debe demostrar midiendo las respuestas del analito de no menos de cinco soluciones estándar a concentraciones que abarquen el intervalo de concentración anticipado de analitos de la solución de prueba. Para la Categoría 1, las soluciones estándar se pueden preparar a partir de materiales de referencia en un disolvente para RMN apropiado. Para la Categoría 11, en procedimientos analíticos de RMN que se usan para cuantificar impurezas, se pueden preparar muestras de linealidad agregando cantidades conocidas de muestras de prueba adecuadas que contengan bajas cantidades de analito o agregando cantidades conocidas de una matriz conteniendo el analito en concentraciones incluidas en el intervalo esperado. Posteriormente, se debe construir la curva estándar usando procedimientos analíticos y estadísticos adecuados tales como la regresión de cuadrados mínimos. Asimismo, se debe determinar el coeficiente de correlación (R), la ordenada al origen y la pendiente de la línea de regresión. Los valores absolutos determinados para dichos factores deben ser apropiados para el procedimiento que se está validando. Criterios de validación: El coeficiente de correlación (R) debe ser no menos de 0,995 para las valoraciones de Categoría 1, y no menos de 0,99 para las pruebas cuantitativas de Categoría 11. INTERVALO El intervalo entre las concentraciones alta y baja de analito se proporciona mediante el procedimiento analítico de RMN cuantitativa. Por lo regular, éste se basa en las especificaciones del artículo de prueba de la monografía USP. Se trata del intervalo dentro del cual el procedimiento analítico puede demostrar un grado aceptable de linealidad, exactitud y precisión, obteniendo de este modo un valor confiable de dicho procedimiento analítico. A continuación se proporcionan intervalos recomendados para varios procedimientos analíticos de RMN. Criterios de validación: Para pruebas de Categoría 1, cuando los criterios de aceptación está centrados en 100,0%, el intervalo de validación es 80,0%-120,0%. Para criterios de aceptación no centrados, el intervalo de validación comprende desde 10,0% por debajo del límite inferior hasta 10,0% por encima del límite superior. Para uniformidad de contenido, el intervalo es 70,0%-1 30,0%. Para las pruebas cuantitativas de Categoría 11, el intervalo de validación abarca 50,0%-120,0% de los criterios de aceptación. EXACTITUD La exactitud de un procedimiento analítico de RMN cuantitativo se debe determinar a través del intervalo analítico requerido. Por lo general, se evalúan tres niveles de concentración usando preparaciones por triplicado en cada nivel. Para valoraciones de fármacos (Categoría 1), la exactitud se puede determinar analizando un estándar de referencia de pureza conocida. Para productos farmacéuticos (Categoría 1), se debe usar una muestra compuesta de estándar de referencia y de otros componentes de un producto farmacéutico terminado para la validación del procedimiento analítico. Los resultados de la valoración se comparan con el valor teórico del estándar de referencia para estimar errores o recuperación porcentual. Para la cuantificación de impurezas (Categoría 11), la exactitud del procedimiento analítico se puede determinar mediante estudios con fármacos o productos con cantidades agregadas y concentraciones conocidas del analito en análisis. También resulta aceptable comparar los resultados de valoración del procedimiento analítico que se está validando con los de un procedimiento analítico alternativo ya establecido. Criterios de validación: 98,0%-102,0% de recuperación para fármacos, 95,0o/o-l 05,0% de recuperación para valoración de productos farmacéuticos terminados preparados magistralmente y 80,0%-120,0% de recuperación para los análisis cuantitativos de impurezas. Estos criterios deben cumplirse durante todo el intervalo pretendido. PRECISIÓN Repetibilidad: El procedimiento analítico debe ser evaluado midiendo las concentraciones de seis soluciones estándar distintas al 100% de la concentración de prueba. Se debe evaluar el cumplimiento de la desviación estándar relativa de las determinaciones repetidas con los criterios de aceptación. Como alternativa, es posible medir las concentraciones de tres determinaciones repetidas de tres soluciones muestra distintas a diferentes concentraciones. Las tres concentraciones deben ser lo suficientemente cercanas para que la repetibilidad sea constante en todo el intervalo de concentración. Si esto se lleva a cabo, se combina la repetibilidad de las tres concentraciones para compararla con los criterios de aceptación. Criterios de validación: La desviación estándar relativa es no más de 1,0% para fármacos, no más de 2,0% para productos farmacéuticos terminados preparados magistralmente y no más de 20,0% para los análisis cuantitativos de impurezas. Precisión intermedia: Se debe establecer el efecto que tienen los eventos aleatorios sobre la precisión analítica del procedimiento analítico. Las variables típicas incluyen llevar a cabo el análisis en diferentes días usando diferentes instrumentos que sean adecuados de acuerdo con lo especificado en el método analítico y/o que dos o más analistas realicen el procedimiento analítico. Como mínimo, cualquier combinación de al menos dos de estos factores para un total de seis experimentos ofrecerán una estimación de la precisión intermedia.
USP 39
Pruebas Físicas/ (761) Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear 631
Criterios de validación: La desviación estándar relativa es no más de 1,0% para fármacos, no más de 3,0% para productos farmacéuticos terminados preparados magistralmente y no más de 25,0% para análisis cuantitativos de impurezas. LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN (QL, POR SUS SIGLAS EN INGLÉS) El límite de cuantificación se puede validar midiendo seis determinaciones repetidas de muestras de prueba con cantidades agregadas conocidas de analito al 50% de la especificación. A partir de estas determinaciones repetidas es posible determinar la exactitud y la precisión. Algunos ejemplos de especificaciones para las determinaciones cuantitativas de Categoría 11 son que la concentración medida está dentro del 70,0%-130,0% de la concentración agregada conocida y la desviación estándar relativa es no más de 15%. ROBUSTEZ La confiabilidad de una medición analítica se debe demostrar mediante cambios deliberados en parámetros experimentales críticos. Esto puede incluir la medición de la estabilidad del analito en condiciones de almacenamiento especificadas, retraso entre pulsos con una ligera variación, temperatura de la sonda y posibles muestras interferentes, por citar algunos ejemplos. La robustez es necesaria para los métodos cuantitativos de Categoría 1y Categoría 11.
Verificación de Procedimientos Analíticos Los reglamentos de las Buenas Prácticas de Fabricación Vigentes de los EE.UU. [Título 21 del CFR 21 l .194(a)(2)] indican que los usuarios de procedimientos analíticos descritos en los compendios USP-NF no requieren validar dichos procedimientos cuando se proporcionen en una monografía, sino que simplemente deben verificar su aptitud ante condiciones reales de uso. El objetivo de la verificación de un procedimiento de RMN es demostrar que éste, conforme a lo descrito en una monografía específica, puede ser realizado por el usuario con una exactitud, especificidad y precisión adecuadas usando los instrumentos, analistas y matrices de muestras disponibles. De acuerdo con el capítulo de información general (1226) Verificación de Procedimientos Farmacopeicos, cuando falla la verificación del procedimiento farmacopeico siguiendo la monografía, el procedimiento podría no ser adecuado para su uso con el artículo de prueba. Puede ser necesario desarrollar y validar un procedimiento alternativo según lo permitido por las Advertencias y Requisitos Generales 6.30. La verificación de un procedimiento de RMN farmacopeico debe como mínimo incluir la ejecución de los parámetros de validación para especificidad, exactitud, precisión y límite de cuantificación, cuando resulte apropiado, según se indica en esta sección.
GLOSARIO Estándar interno: Un estándar interno (IS, por sus siglas en inglés) es una sustancia que se agrega a una solución muestra en una concentración conocida. Se debe seleccionar un estándar interno que presente al menos una resonancia de RMN que no se superponga con las del analito. El cociente entre las áreas de los picos de un estándar interno específico y un analito se usa para determinar la concentración del analito. Se debe conocer el número de núcleos correspondiente a los picos integrados en el estándar interno y los espectros de analito. Referencia de RMN: Una referencia de RMN, también conocida como referencia de desplazamiento de RMN, es una sustancia agregada a una muestra y a partir de la cual se establece el desplazamiento químico para la escala o. Los ejemplos comunes de análisis de protones y de carbono por RMN incluyen tetrametilsilano (TMS) para su uso en disolventes orgánicos y la sal sódica del ácido 2,2-dimetil-2-silapentan-5-sulfónico (DSS) o 3-trimetilsililpropionato de sodio (TMSP) para su uso en medios acuosos. En ambos casos, el desplazamiento químico de los picos de metilo se define como 0,0 ppm. Estándar de referencia: Un estándar de referencia es una sustancia cuya estructura química específica se confirma por medios experimentales. En la espectroscopía de RMN, un estándar de referencia generalmente se usa para los análisis cualitativos de un material de prueba. La estructura se puede confirmar al comparar directamente los desplazamientos químicos y las multiplicidades de los picos en el espectro de RMN del material de prueba contra el espectro del estándar de referencia adquirido en condiciones experimentales comparables.
632 (771) Productos Oftálmicos / Pruebas Físicas
(771) PRODUCTOS
USP 39
Pruebas Físicas/ (771) Productos Oftálmicos 633
USP 39
poliacrílico-y muchos derivados de celulosa, tales como la hipromelosa y la hidroxietikelulosa-se usan comúnmente como mejoradores de la viscosidad debido a su compatibilidad fisiológica y a sus propiedades fisicoquímicas satisfactorias. Otra fc>nna de incrementar el .·tiempo .de contacto córneo· implica eLüso d(;lpolímerosq!Je pr()v~eo alá fQrrnula~jonJíq!.Jida una· consisténcia semisóHdasólo cuando se coloca· en.•el· áréaS. El contenido de agua de los hidrogeles puede ajustarse modula11do l
[:NóTA...-En esta sección se incluyen aquellos .productos sólidos que, al.recpnstitui~os d~acuerdo con las instrucciones enAa etiqueta, dan lugara una suspensión.] Se puede considerar el uso. de wspensiones acuo$aS u. qteosas.por ur:la: v~ri{1dad de razones, tales como)as siguiente5;1) medicarnento5. pqco•solubles en·.agua;·2) medicamentos.con bajaest¡¡i.blliéfa;d•·acuosa;y•3Jen.casos.en •. lo(quee§Oe!!:~saf~º ini::rernentar.el tiempo de.contacto con.elojo e< incrementar la humectlli::iqnéfel ojd.El ~amaño de pattículadelrn~~icamentq a menud() se ~educe a niveles
Un.güehtos Los ungüentos oftálmicos son productos semisólidos que pqrlo generafestán destinados a aplicáeión en la t()rijúntiva; la córnea o el párpado.Tienen un mayor Herripo de contacto en comparad
Geles Los productos semisólidos de tipo gel son una alternativa a los· ungüéritos tradicionales y se basan e11 el efecto. de incrementar la viscosidad para prolongar la retención del fármaco én. el 0 jo. se pueden· usar varios tipos de agentes gelantes, tales como derivados del ácido poliacrílíco, carbómero e hipromelosa.
Eroulsiones Las emulsiones oftálmicas tópicas por· lo general se preparan disolviendo o. dispersand.p el fármacq en una fáse>Qleosa¡~g~e ganclo agentes emulsii:mahtes y de suspensión. adecuados, y mezclando co1;1 aguavigor()samente para formaf1Jn
634 (771) Productos Oftálmicos / Pruebas Físicas
USP 39
Pruebas Físicas/ (771) Productos Oftálmicos 635
USP 39
Este capítulo se aplica sólo al componente de la forma farmacéutica del producto de combinación de medicamento oftálmíco-dispositivo. Las reglamentaciones apropiadas de la FDA con respecto a los dispositivos médicos deben usarse para el componente del dispositivo.
CALIDAD DEL MEDICAMENTO Los procedimientos y los criterios de aceptación para el análisis de productos oftálmkos se dividen en dos categorías: 1) aquellos que evalúan los atributos generales de calidad, p.ej., identificación, potencia, pureza (e impurezas), esterilidad y partículas; y 2) aquellos que evalúan el desempeño in vitro del producto, es decir, disolución o liberación de los fármacos a partir del producto. Las pruebas de calidad evalúan la integridad de la forma farmacéutica, mientras que las pruebas de desempeño evalúan la liberación de fármacos y otros atributos que se relacionan con el desempeño in vivo. En con}unto, las pruebas de calidad y de desempeño aseguran la identidad, contenido, calidad, pureza y eficacia del. medicamento. Este capítulo trata las pruebas de calidad para productos oftálmicos. las pruebas de desempeño (disolución/liberación defármacos) se tratan eó el capítulo Productos Oftálmicos-Pruebas de Desempeño (l 771 ).
Pruebas Universales En este capítulo, la división de las pruebas de calidad del producto en pruebas universales.y en pruebas específicas no sigue de manera estricta la guía de la ICH Q6A Specifications: Test Pmcedures ami Acceptané;e Criterio for New Dtug Substavce.s. and New Drug Products: Chemical Substances (disponible en inglés en www.ich.org). En este <:;apítulo, .pruebas universales..se refiere a l.as pruebas que son aplicables a todos los productos oftálmicos, independientemente. del. tipo de forma farmac~utica. DESCRIPCIÓN Se d~l;>e proveer una descripción cualitativa del medicamento. Los criterios de aceptación deben coliteoer la apariencia final aceptable, que induyá la transparenda y el color de la forma farmacéutica y del envasad(); SI el .color cambia .dura!'.lte el ~ma._ cenamierito, puede ser apropiado un pro<:edimiento cuantitativo. Esta no es una prueba farmacopeica,. aunque forma part¡;¡ de lá especifli::acióri del fabricante del medicamento. IDENTIFICACIÓN
Las prul;!bas de. identifi.tación. se tratan en las Advertencias yRequisitos Gener{;Jles. $A o. ~s pruebas de identificación qeben la identidad· del. fármáeo o.fármacos presentes en el artíéulo y deben discriminar entre cofí:lpuestos d:in estru<:füras estrecf'!a[Tiente ·rélaciC;>na<;i~s potencialmente presentes. Las pruebas de identidad· deben· ser específicas para los fármacos [p\ej., espéctr9sc0pía en el infi"arr()jo (lR, por sus siglas en li)glt'!s)]. Los métt:>dos espectrofofométritosen éli1'.}ft11rrojocéryano (NlR; por SúS i;igl(ls erfjriglés) o Ra:mafi pueden ser aceptables para la identificación del medicarrie!'.ltO. tos procedimientos de iderlti~ ficación de· uso más amplio para fármacos contenidos en formas farmacéuticas son los procedimientos cromatográficos que incluyen una comparación con los estándares apropiados (ver los capítulos Cromatpgraffa (621) y Prueba. de Identificación por Cromatografía en Capa Delgada (201)). La identificación mediante un solo tiempo de reten.ción cromatográfico no constituye una·pruebaespeeífica. establece~
VAi.ORACiÓN
Se debe usar una prueba específica e indicadora de la estabilidad para deter01inar la contentratión (tortt!'énido) del.Medica:~ mento. Para casos en los que se justifique el uso de una valoración no específica, se deben usar otroiprocedfmientos analíticos para lograr la especificidad general. Se debe usar un procedimiento específico cuando exista evidencia de interferencia de exeipientes con la prueba de valoración no específica. Se. encuentra disponible información adicional sobre valoraciones específicas en los capítulos Antibióticos-Va/oraciones Microbiológicas (81 ), Cromatografía {621) y Cromatografía fónica (1065). IMPUREZAS Pueden estar presentes impurezas del proceso, subproductos sintéticos y otras impurezas orgánicas e inorgánicas en el Jár· maco y en los excipientes usados en la fabricación del medicamento. Estas impurezas son controladas por las monografías de fármacos y excipientes. Se deben monitorear las impurezas orgánicas que surgen de la degradación del fármaco en el medicamento y aquellas impurezas que surgen durante el proceso de fabricación del medicamento. Todos los artículos cumplen tori los requisitos de los capítulos Impurezas Elementales-Límites {232) y Disolventes Residuales (467).
636 (771) Productos Oftálmicos / Pruebas Físicas
USP 39
Pruebas Físicas/ (771) Productos Oftálmicos 637
USP 39
de irrigación·oftálmica y no más de 2,0 UE/dosis/qjo.paralos. medicamentos inyectado.so implantados .. Por lo general,esta prueba no es requerida para los productos oftálmicos de aplicación tópica. Este capítulo no trata los límites de endotoxina para los dispositivos que se inyectan o implantan. UNIFORMIDAD DE UNIDADES DEDOSIFICACIÓN
Esta· prueba es aplicable a.lasJorrnasfarrnacéuticas erwasadas en envases un itari~s.Jndt,iye taflto la rnasa de la formafarma· céutica y el contenido deHármaco en la forma farmacéutica. La prueba puede realizarse mediante uniformidad de contenido o variación.de peso(ver ei··capítulo Uhitormidad de Unidades.deOosifícqción\905)), CONTENIDO DE LOS ENVASES
Se debe determinar el contenido de los envases de los productos oftálmicos (ver el· capítulo Llenado Míriirno <755));
El sistema de envase no debe interactuar física niqufmieafüente ci:mel producto de ninguna manera que altere el contenido, la calidad o la pureza d~I medicamento. El sistema de envase debe cumplir con los requisitos de los capítulosTaponesBastoméricospam•lnyett(;Jb/es (38.l ), Env(JseS .• Viaiio{66Q), Materiales Plásticos de CqnstrµC:ciori\661.1 }y Sistemas deEriva~es; PJa.stfc cos paraUsoFatmacé'LJticO \p61.2/; ·.Se puede· enco11trar información.adicionalsobre ·lossistemas de envase en losC:apítulos Evatuaeíón. qeSustancias Extraíble.S· Relacionada$ con.Ehvases·fqrmacéuticos.y.Sistemas de Administrqció111·<1 p63~.·.y .EvalLJ(íción de Sustancias Lixiviables Refacionadas .• e:on:Envases • Farrm:ttéutfto~ ·y Sistemas de·,4dministra(:i6n(1664).·.La eválüácíón·de.posiblesisus•
tandas lixiviables y sustándas extraíbles y el establecimiento de C:riterios de aceptación pabtestos c:ompüestos deben)enérén c:uenta.la evaluación de riesgos del producto, su Indicación y el sistema de envase. Además,sedebeteneren cuenta que una evaluación de riesgos del impacto de las sustancias·extraíbles/sustancias lixlviables, en una vía de administración tópica o intraocular .es una actividad desafiante. Las evaluaciones toxicológicas o de seguri• dad de las sustancias lixiviables o de las sustancias exfraíbles en Jos cofoponentes de envases primarios o secundarios por lo regular no están disponibles para vías de admi11istración oftálmicas. Una evaluación de riesgos puede incluir la evaluación de la toxicología y la seguridad a partir de otras vías de administración y una evaluación de la lngesta Diaria Total de las sustanC:ias extrafbles/sustanciaslixiviables que se están eva1uando .. La preponderancia de dich.asevaluaciones conlleva a una estimación del riesgo de las s1,1standas extrafb!es/sustancias lixiviables mediante la administradón ocul¡;¡r al paciente, INTEGRIDAD DEL ENVASFCIERRE
El sistema de envase debe cerrarse o sellarse de manera tal que se prevenga la contaminación o la pérdida de contenidos y debe demostrar que es a prueba de alteración intencional. La validación de la integridad del envase debe .demostrar la ausi;!ncia de pene~ración de. conta;minadpn mlcrobiana ode impurezas químicas o físicas (ver el. capítulo Envases de Pro(iuctosEStériles-Evq/uacíón de la Integridad (1207)).
Pruebas Específicas VISCOSIDAD
Un incremento en la vistosidad aumenta el tiempo de residencia en el ojo. Sin embargo, la difusión del fármaco desde la formulación hacia el ojo podría verse inhibida debido a la alta viscosidad del producto, los ungüentos oftálmicos están diseña" dos para tener una viscosidad muy alta a fin de prolongar el tiempode·residencia en el ojo.·la inclusión dela evaluación de l.;i viscosidad en la especificación del producto debe basarse en el tipo de forma farmacéutica y en si. los cambios en la vistosidad del producto afectarán su desempeño. Esta no es una prueba farmacopeica, aunque forma parte de la especificación deUabri· cante del medicamento. Ver los capítulos Víscosidad~Métodós Capilares \911 ), Viscosidad---:"Métodos RotatorióS (912) y Viscosidad--Método de Bola Rodante (913). CONTENIDO DE ANTIOXIDANTES
Si el mediéamento presenta antioxidantes, se deben· establecer pruebas para detel'minar el contenido delos mismos, a menos que se pueda detectar la degradación por oxidación usando otro método de prueba, tal como un· al1álisis de impurezas, se deben establecer criterios de aceptación para· el contenido de antioxidantes, los éuales deben basarse en los hi\leles de antíQ~i dantes necesarios para mantener la estabilidad del producto en todas las etapas a lo largo del uso propuesto y de su vida útil.
638 (771) Productos Oftálmicos / Pruebas Físicas
USP 39
(776) MICROSCOPÍA ÓPTICA La microscopía óptica para la caracterización de partículas por lo general es una técnica adecuada para partículas con un tamaño de 1 µm o mayor. El límite inferior está determinado por la resolución del microscopio. El límite superior es menos estricto y está determinado por las dificultades que presenta para caracterizar partículas de mayor tamaño. Además de la microscopía óptica, existen diversas técnicas alternativas para la caracterización de partículas. La microscopía óptica es una técnica sumamente recomendable para caracterizar partículas que no son esféricas, método que también puede constituir la base de otros métodos de calibración más rutinarios y más rápidos. Aparato-Emplear un microscopio estable y protegido de vibraciones. Es necesario que el aumento del microscopio (resultado del aumento del objetivo, ocular y de otros componentes adicionales) sea suficiente para caracterizar adecuadamente hasta la partícula más pequeña de la muestra en análisis. Buscar para cada intervalo de aumento, el mayor valor de apertura numérica del objetivo. En algunos casos, se recomienda usar los filtros polarizadores con analizadores y placas de retardo adecuadas. Con objetivos acromáticos se recomienda emplear un filtro cromático de poca transmisión espectral, de preferencia apocromáticos, y son necesarios para obtener los colores que correspondan en la microfotografía. Con la lámpara y los accesorios colocados debajo de la platina del microscopio se deben emplear condensadores corregidos al menos por aberración esférica. La apertura real del diafragma del condensador y la presencia de aceites de inmersión afectan la apertura numérica del condensador de los accesorios ubicados por debajo de la platina y es necesario que ésta coincida con la del objetivo en las condiciones de uso. Ajuste-Es de suma importancia que todos los elementos del sistema óptico estén alineados con precisión y que el enfoque sea el adecuado. Enfocar los elementos según las recomendaciones del fabricante del microscopio. Se recomienda alinear el eje con precisión. Iluminación-Para que la iluminación sea adecuada, es necesario que la intensidad de la luz sea uniforme y regulable en todo el campo visual. Se recomienda emplear la iluminación de Kohler. Si se trabaja con partículas coloreadas, elegir el color de los filtros para controlar el contraste y el detalle de la imagen. Caracterización Visual-Es necesario que el aumento y la apertura numérica sean suficientes para permitir la correcta resolución de las imágenes de las partículas a caracterizar. Determinar el aumento real con un micrómetro de objetivo calibrado para ajustar un micrómetro ocular. Una forma de reducir los errores al mínimo es trabajar con un aumento suficiente para que la imagen de la partícula sea de al menos 1 O divisiones del ocular. Calibrar cada objetivo por separado. Para calibrar la escala del ocular, verificar que la escala del micrómetro del objetivo y la escala del ocular estén alineadas. De esta forma, se puede determinar con precisión la distancia entre las divisiones del ocular del portaobjeto. En algunos casos, es necesario emplear distintos aumentos para caracterizar materiales con una amplia distribución de tamaños. Caracterización Fotográfica-Si se emplean métodos fotográficos para determinar el tamaño de las partículas, tomar las precauciones necesarias para que el objetivo esté bien enfocado en el plano de la emulsión fotográfica. Fotografiar un micró-
USP 39
Pruebas Físicas/ (776) Microscopía Óptica 639
metro de objetivo calibrado con una película fotográfica de velocidad, resolución y contraste adecuados para determinar el aumento real. La exposición y el procesamiento deben ser idénticos para las fotografías de la muestra de prueba y para la determinación del aumento. Tanto la resolución del microscopio como la exposición y los procesos de revelado e impresión influyen en el tamaño aparente de la imagen fotográfica. Preparación del Medio de Montaje-El medio de montaje se selecciona según las propiedades físicas de la muestra de prueba. Para ver los detalles de los bordes de la muestra, es necesario un contraste adecuado, aunque no excesivo, entre la muestra y el medio de montaje. Para distinguir las partículas individuales en estudio, es necesario que estén dispuestas en un mismo plano y con la dispersión adecuada. Además, es necesario que las partículas sean representativas de la distribución del tamaño de las partículas y que no sufran ninguna alteración durante la preparación del medio de montaje. Tomar las precauciones necesarias para que se cumpla este importante requisito. Para seleccionar el medio de montaje adecuado, considerar la solubilidad del analito. Caracterización de la Cristalinidad-Si la monografía individual de un fármaco indica caracterizar la cristalinidad, se puede determinar por microscopía óptica. Montar algunas partículas de la muestra en aceite mineral y colocar el preparado sobre un portaobjetos de vidrio limpio, a menos que la monografía individual especifique algo diferente. Analizar el preparado con un microscopio de luz polarizada: al girar la platina del microscopio, las partículas presentan birrefringencia (interferencia de colores) y posiciones de extinción. Prueba de Límite del Tamaño de Partículas por Microscopía-Pesar una cantidad adecuada del polvo a analizar (entre 1O mg y 100 mg, por ejemplo) y suspenderla en 1O mL de un medio adecuado, en el que el polvo no se disuelva y agregar, si fuera necesario, un agente humectante. Suspender las partículas en un medio de densidad igual o similar y agitar para mantener la homogeneidad de la suspensión de partículas. Introducir una porción de la suspensión homogénea en una celda de conteo adecuada, observar en un área del microscopio que corresponda a no menos de 1O µg del polvo a analizar. Contar las partículas cuya dimensión máxima supera el límite de tamaño indicado. El límite de tamaño y el número máximo de partículas que exceden el límite se definen para cada sustancia. Caracterización del Tamaño de Partículas-La complejidad de la medición del tamaño de las partículas varía según la forma de la partícula, y el número de partículas caracterizadas debe ser suficiente para garantizar un grado de incertidumbre aceptable en los parámetros de medición. La norma ISO 9276, por ejemplo, proporciona información adicional sobre la medición del tamaño de las partículas, tamaño de la muestra y análisis de los datos. Si se trata de partículas esféricas, el tamaño está definido por el diámetro. Si se trata de partículas irregulares, hay distintas definiciones del tamaño de partícula. En general, para partículas de forma irregular, la caracterización del tamaño debe incluir información sobre el tipo de diámetro medido y sobre la forma de la partícula. A continuación se describen varias medidas usadas comúnmente para el tamaño de partículas (ver la Figura 7):
Diámetro de Feret
Diámetro de Martin Diámetro del área proyectada Intercepción máxima horizontal
Figura 1: Medidas comúnmente usadas para el tamaño de partículas. Diámetro de Feret-La distancia entre líneas paralelas imaginarias tangentes a una partícula orientada de forma aleatoria y perpendicular a la escala del ocular. Diámetro de Martín-El diámetro de la partícula en el punto en el que divide una partícula orientada de forma aleatoria en dos áreas proyectadas iguales. Diámetro del Área Proyectada-El diámetro de un círculo cuya área proyectada es la misma que la de la partícula. Longitud-La medida más larga tomada de extremo a extremo de la partícula orientada en paralelo a la escala del ocular. Ancho-La medida más larga de la partícula tomada en ángulo recto a la longitud.
640 (776) Microscopía Óptica/ Pruebas Físicas
USP 39
Caracterización de la Forma de la Partícula-Si se trata de partículas de forma irregular, la caracterización del tamaño debe incluir información sobre la forma de la partícula. Verificar la homogeneidad del polvo usando el aumento que corresponda. A continuación se describen algunos de los descriptores usados comúnmente para la forma de la partícula (ver la Figura 2):
0---0
Cubos o Esferas
Escama
¿J-~~ ~~ Placa
Columnar
Figura 2: Medidas usadas comúnmente para la forma de la partícula. Acicular-Partícula fina, en forma de aguja, de ancho y espesor similares. Columnar-Partícula larga y fina, de ancho y espesor superiores a los de una partícula acicular. Escama-Partícula fina y plana, de longitud y ancho similares. Placa-Partículas planas de longitud y ancho similares pero de mayor espesor que las escamas. Listón-Partícula larga y fina en forma de hoja. Cubos o esferas-Partículas cúbicas o esféricas, de largo, ancho y espesor de dimensiones similares. Consideraciones Generales-La partícula se considera, en general, la unidad discreta más pequeña. Una partícula puede estar en estado de gotita líquida o semisólida, un cristal único o policristalina, en estado amorfo o como aglomerado. En algunos casos, las partículas están asociadas. El grado de asociación se puede describir en los siguientes términos: Laminar-Placas superpuestas. Agregado-Masa de partículas adheridas. Aglomerado-Partículas amalgamadas o cementadas. Conglomerado-Mezcla de dos o más tipos de partículas. Esferulita-Crupo con estructura radial. Drusa-Partícula recubierta de pequeñísimas partículas. La partícula se puede describir en los siguientes términos: Bordes-Angulares, redondeados, lisos, filosos o fragmentados. Óptico-Color (usando filtros de compensación del color apropiados), transparente, translúcida, opaca. Defectos--Oclusiones, inclusiones. Las características de la superficie se pueden describir en los siguientes términos: Resquebrajada-División parcial, rotura o fisura. Lisa-Sin irregularidades, proyecciones ni áreas rugosas. Porosa-Con orificios o canales. Áspera-No lisa, con protuberancias o dispareja. Punteada-Con pequeñas hendiduras.
(781) ROTACIÓN ÓPTICA INTRODUCCIÓN Muchas sustancias farmacéuticas son ópticamente activas dado que rotan el plano incidente de la luz polarizada de manera que la luz transmitida emerge en un ángulo cuantificable con respecto al plano de la luz incidente. Esta propiedad es característica de algunos cristales y de muchos líquidos o soluciones de sólidos de uso farmacéutico. En aquellos casos en que un líquido o un soluto en solución posea esta propiedad, por lo general se debe a la presencia de uno o varios centros asimétricos,
Pruebas Físicas/ (781) Rotación Óptica 641
USP 39
normalmente un átomo de carbono con cuatro sustituyentes diferentes. El número de isómeros ópticos es 2", en donde n es el número de centros asimétricos. La polarimetría, medición de la rotación óptica de un artículo farmacéutico, puede ser el único medio conveniente para distinguir entre sí isómeros ópticamente activos y, por lo tanto, es un criterio importante de identidad y pureza. Las sustancias que poseen la capacidad de mostrar propiedades ópticas rotatorias son quirales. Aquéllas que rotan la luz en el sentido de las agujas del reloj, observando hacia la fuente de iluminación, son dextrógiras, o isómeros ópticos(+), y aquéllas que rotan la luz en el sentido contrario a las agujas del reloj se llaman levógiras o isómeros ópticos(-). (Los símbolos d- y/- que anteriormente se empleaban para indicar isómeros dextro- y levógiros ya no se utilizan, debido a la confusión con los símbolos D- y L-, que se refieren a las configuraciones relacionadas con el o-gliceraldehído. Los símbolos R y S así como a y fJ también se emplean para indicar la configuración, es decir, el ordenamiento de los átomos o grupos de átomos en el espacio.) Las propiedades físicoquímicas de las sustancias quirales no superponibles que rotan el plano de la luz polarizada la misma cantidad de grados pero en direcciones opuestas, llamadas enantiómeros, son idénticas, salvo por esta propiedad y por sus reacciones con otras sustancias quirales. Los enantiómeros presentan a menudo diferencias profundas en sus características farmacológicas y toxicológicas, debido al hecho de que los receptores biológicos y las enzimas son quirales. Muchos artículos de origen natural, como por ejemplo los aminoácidos, las proteínas, los alcaloides, los antibióticos, los glicósidos y los azúcares, existen como compuestos quirales. La síntesis de estos compuestos a partir de materiales no quirales usualmente resulta en cantidades iguales de enantiómeros, es decir, los racematos. Los racematos tienen una rotación óptica neta nula y sus propiedades físicas pueden diferir de las de los enantiómeros que los componen. Para obtener los isómeros ópticos individuales pueden emplearse métodos de síntesis estereoselectivos o estereoespecíficos o de separación de mezclas racémicas. La medición de la rotación óptica se realiza empleando un polarímetro. 1 La ecuación general usada en polarimetría es:
[a]'
,
=
1OOa
le
en donde [a] es la rotación específica a la longitud de onda 'A, tes la temperatura, a es la rotación observada en grados(º), I es la longitud de paso en decímetros y e es la concentración del analito en g por 100 ml. Por lo tanto, [a] es 100 veces el valor medido, en grados (º), para una solución que contiene 1 g en 100 mL, medido en una celda con una longitud de paso de 1,0 decímetro en determinadas condiciones de longitud de onda de luz incidente y temperatura. Para algunos artículos Farmacopeicos, especialmente los líquidos, tales como los aceites esenciales, el requisito de rotación óptica se expresa en función de la rotación observada a, medida en las condiciones definidas en la monografía correspondiente. Históricamente, la polarimetría se realizaba empleando un instrumento en el cual se estimaba el grado de rotación óptica al igualar visualmente la intensidad de los campos divididos. Por este motivo, se empleaba con mayor frecuencia la línea D de la lámpara de sodio a la longitud de onda de 589 nm en el espectro visible. 2 La rotación específica determinada en la línea o se expresa con el símbolo:
y gran parte de los datos disponibles se expresan de esta forma. El empleo de longitudes de onda menores, como por ejemplo las obtenibles con las líneas de la lámpara de mercurio, aisladas a través de filtros de máxima transmitancia, aproximadamente a 546; 436; 405; 365 y 325 nm en un polarímetro fotoeléctrico, ha demostrado proporcionar ventajas en sensibilidad con una reducción consiguiente de la concentración del compuesto de prueba. En general, la rotación óptica observada a 436 nm es aproximadamente el doble y a 365 nm aproximadamente tres veces la observada a 589 nm. 2 La reducción de la concentración del soluto requerida para la medición a veces puede lograrse mediante la conversión de la sustancia en análisis en una sustancia que tenga una rotación óptica significativamente mayor. La rotación óptica también resulta afectada por el disolvente empleado para la medición y esto debe especificarse en todos los casos. En la actualidad, es práctica común emplear otras fuentes de luz, tales como lámparas de xenón o halógenas de tungsteno, con filtros apropiados, puesto que éstas pueden ser menos costosas, además de ser de larga duración y tener un amplio rango de longitudes de onda de emisión con respecto a las fuentes de luz tradicionales.
PROCEDIMIENTOS Rotación Específica La referencia Rotación Específica (781 S) en una monografía significa que esa rotación específica se calculará a partir de las rotaciones ópticas observadas en la Solución de prueba o Solución muestra, obtenidas según se indica en ese mismo texto. A
1 Pueden encontrarse calibradores adecuados disponibles en la Office of Standard Reference Materials, National lnstitute of Standards and Technology, NIST (Oficina de Materiales de Referencia Estándar, Instituto Nacional de Normas y Tecnología), Gaithersburg, MD 20899, como lotes vigentes de Materiales de Referencia Estándar, Dextrosa y Sacarosa. Como alternativa, la calibración puede controlarse empleando un Estándar de Referencia de Polarización, que consiste en una placa de cuarzo montada sobre un soporte perpendicular al paso de la luz. Estos estándares, normalizados respecto a estándares del NIST, se encuentran disponibles en Rudolph Research Analytical, ubicado en 55 Newburgh Road, Hackettstown, NJ 07840, EE.UU. 2 Todas las referencias a longitudes de onda son en vacío. La línea D de sodio es 589,44 en vacío y 589,3 en aire.
642 (781) Rotación Óptica / Pruebas Físicas
USP 39
menos que se indique de otro modo, las mediciones de rotación óptica se realizan en un tubo de 1,0 dm a 589 nm y a 25º C. 2 Cuando se emplea un polarímetro fotoeléctrico, se hace una sola medición corregida por el blanco de disolvente. Cuando se emplea un polarímetro visual, se utiliza el promedio de no menos de cinco determinaciones, corregidas por la lectura del mismo tubo con un blanco de disolvente. La temperatura, que se aplica a la solución o al líquido en análisis, debe mantenerse con una aproximación de 0,5º del valor establecido. Emplear la misma celda para la muestra y el blanco. Mantener la misma orientación angular de la celda en cada lectura. Colocar la celda de tal manera que la luz la atraviese en la misma dirección cada vez. La rotación específica, a menos que se especifique algo diferente, se calcula con respecto a la sustancia seca cuando se especifica Pérdida por Secado en la monografía correspondiente o con respecto a la sustancia anhidra cuando se especifica Determinación de Agua. La rotación óptica de las soluciones se debe determinar dentro de los 30 minutos posteriores a la preparación. En el caso de sustancias que puedan sufrir racemización o mutarotación, se deben tomar precauciones para estandarizar el tiempo entre la adición del soluto al disolvente y la introducción de la solución en el tubo polarimétrico.
Rotación Angular A menos que se indique de otro modo, la referencia Rotación Angular (781 A) en una monografía significa que la rotación óptica del líquido sin diluir se mide en un tubo de 1,0 dm a 589 nm y a 25º C, corregida por la lectura del tubo vacío y seco.2
(785) OSMOLALIDAD Y OSMOLARIDAD INTRODUCCIÓN La presión osmótica tiene una importancia fundamental en todos los procesos biológicos donde hay difusión de solutos o transferencia de líquidos a través de membranas. La ósmosis sucede cuando un disolvente, pero no las moléculas de soluto, pasa a través de una membrana semipermeable desde regiones de menor a mayor concentración para llegar al equilibrio. Es muy importante para los profesionales conocer las presiones osmóticas para poder determinar si una solución parenteral es hipoosmótica, isoosmótica o hiperosmótica. Una medición cuantitativa de la presión osmótica facilita la dilución requerida para producir una solución isoosmótica con respecto a la sangre entera.
PRESIÓN OSMÓTICA La presión osmótica de una solución depende del número de partículas en la solución y, por lo tanto, se la considera como una propiedad coligativa. Una partícula puede ser una molécula o unión o una especie agregada (por ejemplo, un dímero) que puede existir en forma diferenciada en solución. Una solución presenta un comportamiento ideal cuando no hay interacción entre los solutos y el disolvente, excepto cuando las moléculas del disolvente están unidas a los solutos mediante enlaces de hidrógeno o enlaces covalentes coordinados. En el caso de tales soluciones que contienen un soluto no disociado, la presión osmótica (re) es directamente proporcional a su molalidad (el número de moles de soluto por kilogramo de disolvente): re
=(pRT/1 OOO)m
en donde pes la densidad del disolvente a la temperatura T (en la escala absoluta); R es la constante universal del gases; y m es la molalidad de la solución. Para el caso de una solución real que contiene más de un soluto, la presión osmótica se calcula por la fórmula:
en donde v; es el número de partículas formadas por la disociación de una molécula del iésimo soluto (el número ordinal del soluto); v; = 1 para solutos no iónicos (que no se disocian); m; es la molalidad del iésimo soluto (el número ordinal del soluto); y m; es el coeficiente osmótico molal del iésimo soluto. El coeficiente osmótico molal tiene en cuenta la desviación de una solu¿ión con respecto al comportamiento ideal. Su valor depende de la concentración del soluto o los solutos en la solución, de sus propiedades químicas y de sus características iónicas. El valor del coeficiente osmótico molal de un soluto se puede determinar experimentalmente midiendo el descenso del punto de congelación a diferentes concentraciones molales. A concentraciones de interés farmacéutico, el valor del coeficiente osmótico molal es menos de uno. El coeficiente osmótico molal disminuye al aumentar la concentración del soluto (Tabla 7).
OSMOLALIDAD La osmolalidad de una solución ~m se representa mediante la fórmula
USP 39
Pruebas Físicas/ (785) Osmolalidad y Osmolaridad 643
La osmolalidad de una solución real se corresponde con la molalidad de la solución ideal que contiene solutos que no se disocian y se expresa en osmoles o miliosmoles por kilogramo de disolvente (Osmol por kg o mOsmol por kg, respectivamente), una unidad que es similar a la molalidad de una solución. Así, la osmolalidad es la medida de la presión osmótica ejercida por una solución real a cada lado de una membrana semipermeable. Al igual que la presión osmótica, otras propiedades coligativas de la solución, tales como la disminución de la presión de vapor, la elevación del punto de ebullición y el descenso del punto de congelación, también están directamente relacionadas con la osmolalidad de la solución. Así, la osmolalidad de una solución se determina típicamente con la mayor exactitud y conveniencia midiendo el descenso del punto de congelación (i'. T1):
i'.T1= k1sm en donde k1 es la constante crioscópica molal, que es una propiedad del disolvente. Para el agua, el valor de k1 es 1,860º por Osmol. Es decir, 1 Osmol de un so luto agregado a 1 kg de agua hace descender el punto de congelación en 1,860º.
OSMOLARIDAD La osmolaridad de una solución es una cantidad teórica expresada en osmoles por L (Osmol por L) de una solución y se usa ampliamente en la práctica clínica porque expresa los osmoles en función del volumen. La osmolaridad no se puede medir pero se calcula teóricamente a partir del valor de osmolalidad medido experimentalmente. A veces, la osmolaridad (sJ se calcula teóricamente a partir de las concentraciones molares:
Se= LV¡C¡ en donde v; es la que se define anteriormente y C; es la concentración molar del iésimo soluto (el número ordinal del soluto) en solución. Por ejemplo, la osmolaridad de una solución que se prepara disolviendo 1 g de vancomicina en 100 mL de solución de cloruro de sodio al 0,9% se puede calcular de la siguiente manera: [3 x 1Og/L/l449,25(peso mol. de vancomicina) + 2 x 9 g/L/58,44(peso mol. de cloruro de sodio)] x 1000 = 329 mOsmol/L El resultado sugiere que la solución es ligeramente hiperosmótica dado que la osmolalidad de la sangre está entre 285 y 31 O mOsmol por kg. Sin embargo, la solución ha resultado ser hipoosmótica y tiene una osmolalidad determinada experimentalmente de 255 mOsmol por kg. 1 El ejemplo ilustra que los valores de osmolaridad calculados teóricamente a partir de la concentración de una solución se deben interpretar con cautela y este valor puede no representar las propiedades osmóticas de las soluciones de infusión. La discrepancia entre los resultados teóricos (osmolaridad) y los experimentales (osmolalidad) se debe, en parte, al hecho de que la presión osmótica está relacionada con la osmolalidad y no con la osmolaridad. Más significativamente, la discrepancia entre los resultados experimentales y los cálculos teóricos se debe a que la presión osmótica de una solución real es menor que la de una solución ideal debido a las interacciones entre las moléculas del soluto o entre las moléculas del soluto y del disolvente en una solución. Estas interacciones reducen la presión que ejercen las moléculas del soluto sobre la membrana semipermeable, lo que reduce los valores experimentales de la osmolalidad en comparación con los valores teóricos. Esta diferencia está relacionada con el coeficiente osmótico molal (
MEDICIÓN DE LA OSMOLALIDAD Normalmente, el valor de osmolalidad de una solución se determina midiendo el descenso del punto de congelación de una solución. Aparato-El aparato, un osmómetro para medir el descenso del punto de congelación, consiste en lo siguiente: un medio para enfriar el recipiente utilizado para la medición; un resistor sensible a la temperatura (termistor), con un dispositivo adecuado para medir la diferencia de potencial o de corriente y que puede graduarse en función de cambios de temperatura o en osmolalidad; y un mecanismo para mezclar la muestra. Los osmómetros que miden la presión de vapor de las soluciones se emplean con menor frecuencia. Requieren un volumen de muestra más pequeño (generalmente aproximadamente 5 µL), aunque la exactitud y precisión de los resultados de las determinaciones de osmolalidad son comparables a las obtenidas mediante el uso de osmómetros que dependen de la observación del punto de congelación de las soluciones. Soluciones Estándar-Preparar las Soluciones Estándar como se indica en la Tabla 7, según sea necesario. 2
Kastango, E.S. y Hadaway, L. lnternational journal of Pharmaceutica/ Compounding 5, (2001) 465-469. Se pueden usar soluciones comercialmente disponibles para calibración de osmómetros, con osmolalidades iguales o diferentes a las que se listan en la Tabla 1 y estandarizadas con métodos rastreables al NIST. 1
2
644 (785) Osmolalidad y Osmolaridad / Pruebas Físicas
USP 39
Tabla 1. Soluciones Estándar para Calibración del Osmómetro* Soluciones Estándar (Peso en g de cloruro de sodio por kg de agua)
Osmolalldad (mOsmol/kg)
Coeficiente Osmótico Molal
Descenso del Punto de Congelación (º)
(~ro)
(
!J.Tr
3,087
100
0,9463
0,186
6,260
200
0,9337
0,372 0,558
9,463
300
0,9264
12,684
400
0,9215
0,744
15,916
500
0,9180
0,930
19,147
600
0,9157
1,116
22,380
700
0,9140
1,302
* Adaptado de la Farmacopea Europea, 4a Edición, 2002, pg. 50.
Solución de Prueba-En el caso de un sólido para inyección, reconstituir con el diluyente apropiado según se indica en las instrucciones del etiquetado. En el caso de soluciones, usar la muestra tal como se encuentra. [NOTA-Se puede diluir una solución para que quede dentro del intervalo de medición del osmómetro, si fuera necesario, pero el resultado se deberá expresar como el resultado de la solución diluida y NO se debe multiplicar por un factor de dilución para calcular la osmolalidad de la solución original, a menos que se especifique algo diferente en la monografía. El coeficiente osmótico molal es una función de la concentración. Por lo tanto, cambia con la dilución.] Procedimiento-Primero, calibrar el instrumento según las instrucciones del fabricante. Confirmar la calibración del instrumento con, por lo menos, una solución de la Tabla 1 de manera que la osmolalidad de la Solución Estándar se encuentre dentro de 50 mOsmol/kg del valor esperado de la Solución de Prueba o en el centro del intervalo esperado de osmolalidad de la Solución de Prueba. La lectura del instrumento debe estar dentro de ±4 mOsmol por kg de la Solución Estándar. Introducir un volumen adecuado de cada Solución Estándar en la celda de medición conforme a las instrucciones del fabricante y poner en marcha el sistema de enfriamiento. En general, el dispositivo de mezcla se programa para que opere a una temperatura inferior a la temperatura más baja esperada de descenso del punto de congelación. El aparato indica cuando se ha logrado el equilibrio. Si fuera necesario, calibrar el osmómetro utilizando un dispositivo de ajuste adecuado de modo que la lectura corresponda a la osmolalidad o al valor de descenso del punto de congelación de la Solución Estándar que aparece en la Tabla 1. [NOTASi la lectura del instrumento indica el descenso del punto de congelación, la osmolalidad se puede derivar usando la fórmula apropiada en Osmolalidad.] Repetir el procedimiento con cada Solución de Prueba. Leer la osmolalidad de la Solución de Prueba directamente o calcularla a partir del valor obtenido para el descenso del punto de congelación. Suponiendo que el valor del coeficiente osmótico es esencialmente el mismo ya sea que la concentración se exprese en molalidad o molaridad, la osmolalidad de una solución determinada experimentalmente se puede convertir en osmolaridad de la misma manera que la concentración de una solución se convierte de molalidad a molaridad. A menos que una solución esté muy concentrada, la osmolaridad de una solución (~e) se puede calcular a partir de su osmolalidad determinada experimentalmente (~ro): ~e= 1000~m f
(1000 / p + LW¡V¡)
donde W; es el peso en g; y v; es el volumen específico parcial, en mL por g, del iésimo soluto (el número ordinal del soluto). El volumen específico parcial de un soluto es el cambio en volumen de una solución cuando se disuelve 1 g adicional de soluto en la solución. Este volumen se puede determinar midiendo las densidades de la solución antes y después de agregar el soluto. Los volúmenes específicos parciales de las sales son generalmente muy pequeños, alrededor de O, 1 mL por g. Sin embargo, los otros solutos son generalmente mayores. Por ejemplo, los volúmenes específicos parciales de los aminoácidos están entre 0,6 mL y 0,9 mL por g. Se puede demostrar por la ecuación anterior que correlaciona la osmolaridad con la osmolalidad que,
donde pes la densidad de la solución y e es la concentración de soluto total, ambas expresadas en g por ml. Por lo tanto, alternativamente, la osmolaridad puede calcularse también a partir de la osmolalidad determinada experimentalmente a partir de la medición de la densidad de la solución mediante un método adecuado y el peso total del soluto, después de la corrección por contenido de agua, disuelto por mL de la solución.
USP 39
Pruebas Físicas/ (786) Estimación de la Distribución del Tamaño de Partícula 645
(786) ESTIMACIÓN DE LA DISTRIBUCIÓN DEL TAMAÑO DE PARTÍCULA POR TAMIZADO ANALÍTICO El tamizado es uno de los métodos más antiguos para clasificar los polvos y los gránulos según la distribución del tamaño de partícula. El tamizado utilizando un lienzo tejido como tamiz, consiste básicamente en clasificar las partículas según su tamaño intermedio (es decir, según su ancho o amplitud). Se recomienda el tamizado mecánico si la mayoría de las partículas superan los 75 µm aproximadamente. Si se trata de partículas más pequeñas, durante el tamizado se observa que su escaso peso no ejerce la fuerza suficiente para contrarrestar las fuerzas de adhesión y cohesión superficial, que hacen que las partículas se aglutinen unas con otras y al tamiz. Por este motivo, las partículas que se esperaría que pasaran por el tamiz, en realidad no lo hacen. Para este tipo de materiales se recomienda emplear otros métodos de agitación, como por ejemplo el tamizado con un chorro de aire o el tamizado sónico. No obstante, el tamizado se puede emplear en algunos casos para algunos polvos o gránulos cuya mediana de tamaño de partícula sea inferior a 75 µm, siempre que el método se pueda validar. En términos farmacéuticos, el tamizado es el método de preferencia para clasificar polvos o gránulos sin mezclas más gruesos. El método es especialmente atractivo ya que tanto los polvos como los gránulos se clasifican solamente en función del tamaño de partícula y en la mayoría de los casos el análisis se puede efectuar con el material seco. Entre los factores limitantes que presenta el método se encuentran la necesidad de contar con una cantidad de muestra apreciable (según sea la densidad del polvo o de los gránulos y el diámetro de los orificios del tamiz, generalmente como mínimo 25 g) y la dificultad que presentan polvos o gránulos oleosos o cohesivos que obstruyen los orificios del tamiz. En esencia, el método estima el tamaño en dos dimensiones ya que el pasaje a través del orificio del tamiz a menudo presenta mayor dependencia del ancho y del espesor máximos que del largo. Este método está destinado a estimar la distribución del tamaño de partícula total de un material sin mezclar. No está diseñado para determinar la proporción de partículas que pasan o que se retienen por uno o dos tamices. A menos que la monografía individual especifique algo diferente, estimar la distribución del tamaño de partícula según se describe en Método de Tamizado en Seco. Si se presentan dificultades para alcanzar el punto final (es decir, el material no pasa fácilmente por los tamices) o si fuera necesario emplear los tamices con los orificios más pequeños del intervalo de tamizado (de menos de 75 µm), se debe evaluar si no sería conveniente emplear otro método para determinar el tamaño de partícula. Se debe tamizar en condiciones tales que no generen ni pérdida ni aumento del contenido de humedad de la muestra. Controlar la humedad relativa ambiente del lugar donde se efectúa el tamizado de forma de impedir que la muestra absorba o pierda humedad. El tamizado analítico de prueba normalmente se realiza en condiciones de humedad ambiente salvo que hubiera pruebas que indicaran lo contrario. Cualquier condición especial aplicable al material en cuestión debe estar detallada en la monografía individual.
PRINCIPIOS DEL TAMIZADO ANALÍTICO Los tamices analíticos constan de una malla de alambre, de tejido simple, que se asume deja aberturas casi cuadrangulares y que está sellada en la base de un recipiente cilíndrico abierto. El método analítico de base consiste en apilar los tamices uno sobre el otro, encimándolos en orden ascendente de tamaño de orificio y luego colocar el polvo de muestra en el tamiz superior. Someter a agitación el grupo de tamices apilados durante un tiempo normalizado y luego determinar con exactitud el peso del material retenido en cada tamiz. Por este método se calcula el porcentaje, en peso, del polvo retenido en cada uno de los tamices utilizados. El procedimiento para estimar la distribución del tamaño de partícula de un único polvo farmacéutico está diseñado, en general, para trabajar con polvos en los que al menos el 80% de las partículas supera los 75 µm. El parámetro dimensional que se emplea para determinar la distribución del tamaño de partícula por tamizado analítico es el largo de uno de los lados del orificio cuadrangular más pequeño a través del cual pasará la partícula.
TAMICES ANALÍTICOS Los tamices analíticos adecuados para efectuar las pruebas farmacopeicas cumplen con las especificaciones contenidas en la versión más actualizada de la Norma ISO 3310-1 de la Organización Internacional de Normalización: Tamices Analíticos-Requisitos Técnicos y Pruebas (ver la Tabla 1). A menos que la monografía especifique algo diferente, emplear los tamices ISO que se enumeran como tamaño principal en la Tabla 1. A menos que la monografía especifique algo diferente, emplear los tamices ISO que figuran en la Tabla 1 según la recomendación indicada para ese tamiz.
646 (786) Estimación de la Distribución del Tamaño de Partícula / Pruebas Físicas
USP 39
Tabla 1. Tamaños de las Serles de Tamices Estándar según el Intervalo de Interés Abertura Nominal ISO Tamaños Principales
Tamaños Adicionales
R20/3
R20
R40/3
11,20 mm
ll,20mm
11,20mm
Tamiz No. EE.UU.
Tamices USP Recomendados (micrones)
Tamiz Europeo No.
Tamiz faponés No.
11200
10,00 mm 9,50 mm 9,00 mm 8,00 mm
8,00 mm
8,00 mm
7,lOmm 6,70 mm 6,30 mm 5,60 mm
5,60 mm
5,60 mm
5600
3,5
5,00 mm 4,75 mm
4
4,50 mm 4,00 mm
4,00mm
4,00 mm
5
3,35 mm
6
2,80 mm
7
2,36 mm
8
2,00 mm
10
1,70 mm
12
1,40mm
14
1,18 mm
16
1,00mm
18
850 µm
20
710 µm
25
600 µm
30
500 µm
35
425 µm
40
355 µm
45
300 µm
50
250 µm
60
212 µm
70
180µm
80
4000
4000
4,7
3,55 mm 5,5
3,15 mm 2,80 mm
2,80 mm
2800
2800
6,5
2,50 mm 7,5
2,24 mm 2,00 mm
2,00 mm
2000
2000
8,6
1,80 mm 10
1,60mm 1,40 mm
1,40 mm
1400
1400
12
1,25 mm 14
1,12mm 1,00mm
1,00mm
1000
1000
16
900µm 18
800µm 710 µm
710µm
710
710
22
630 µm 26
560µm 500 µm
500 µm
500
500
30
450µm 36
400 µm 355 µm
355 µm
355
355
42
315 µm 50
280 µm 250µm
250µm
250
250
60
224 µm 70
200µm 180 µm
180µm 160 µm
180
180
83
Pruebas Físicas/ (786) Estimación de la Distribución del Tamaño de Partícula 647
USP 39
Tabla 1. Tamaiíos de las Series de Tamices Estándar según el Intervalo de Interés (Continuación) Abertura Nominal ISO Tamaiíos Principales R20/3
Tamaiíos Adicionales R20
R40/3
Tamiz No. EE.UU.
150µm
100
125 µm
120
106µm
140
90µm
170
75 µm
200
63 µm
230
53 µm
270
45 µm
325
Tamices USP Recomendados (micrones)
Tamiz Europeo No.
Tamiz Japonés No. 100
140µm 125 µm
125 µm
125
125
119
112 µm 140
100 µm 90 µm
90 µm
90
90
166
80 µm 200
71 µm 63 µm
63 µm
63
63
235
56µm 282
50 µm 45 µm
45 µm
45
45
330
38
391
40 µm 38µm
Seleccionar los tamices de forma que todos los tamaños de partícula de la muestra de prueba estén comprendidos en el intervalo. Se recomienda emplear un grupo de tamices encajados con una progresión de "2 del área de los orificios del tamiz. Encajar los tamices de forma que la malla con orificios más grandes quede en el extremo superior y la que tenga los orificios más pequeños en el extremo inferior. Clasificar los orificios del tamiz asignándoles un valor en micrómetros o en milímetros. [NOTA-Los números de malla que figuran en la tabla se proporcionan exclusivamente para realizar conversiones.] Los tamices analíticos son preferentemente de acero inoxidable o, en su defecto, de bronce o de otro alambre no reactivo adecuado. Tanto la primera calibración del tamiz analítico como las subsiguientes se realizan según lo dispuesto en la versión más actualizada de la norma ISO 3310-1. Antes de emplear un tamiz, examinarlo cuidadosamente en busca de fracturas y distorsiones considerables, sobre todo en las juntas de la malla y el cilindro. En algunos casos, se pueden emplear métodos ópticos para calibrar el tamiz, estimando el tamaño promedio del orificio y la variabilidad que pudieran presentar los orificios de la malla. Alternativamente también se pueden emplear Esferas de Vidrio Estándar para medir los orificios reales de los tamices analíticos en el intervalo de 212 µm a 850 µm. A menos que la monografía individual especifique algo diferente, analizar el tamiz con temperatura ambiente controlada y en condiciones de humedad relativa ambiente.
Limpieza de los Tamices Analíticos En condiciones ideales se recomienda limpiar los tamices solamente con un chorro de aire o con un chorro de líquido. Si después del chorro de líquido o de aire, todavía se observan orificios obstruidos por partículas del material en estudio, emplear un cepillo como último recurso pasándolo suavemente y tomando las precauciones necesarias para no dañar el tamiz.
Muestra de Prueba Si la monografía del material en estudio no indica el peso de la muestra de prueba, emplear una muestra de prueba de 25 g a 100 g, dependiendo de la densidad aparente, y tamices analíticos de 200 mm de diámetro. Para tamices de 76 mm calcular la cantidad de material adecuada considerando que es aproximadamente 1/7 de la cantidad que puede colocarse en un tamiz de 200 mm. Determinar el peso más apropiado para un material dado, tamizando muestras de distintos tamaños pesadas con exactitud, por ejemplo 25 g, 50 g y 100 g colocadas en un agitador mecánico durante el mismo periodo de tiempo. [NOTA-Si los resultados obtenidos con las muestras de 25 g y 50 g son similares, pero el porcentaje obtenido en el tamiz de orificios más pequeños con la muestra de 100 g es menor, la muestra de 100 g es demasiado grande.] Si sólo se dispone de una muestra de 1Og a 25 g, se pueden emplear tamices analíticos de menor diámetro que cumplan con las mismas especificaciones de la malla. En este caso, volver a determinar el punto final. En algunos casos, puede ser necesario emplear muestras con una masa menor (por ejemplo, hasta 5 g). Para materiales con densidad de partículas aparente baja, o de materiales compuestos principalmente por partículas de forma muy isodiamétrica, puede ser necesario emplear una muestra de menos de 5 g en un tamiz de 200 mm, para así evitar la obstrucción excesiva de los orificios del tamiz. En la validación de un método de tamizado analítico en particular, se asume que el problema de la obstrucción de los orificios se tomó en consideración.
648 (786) Estimación de la Distribución del Tamaño de Partícula / Pruebas Físicas
USP 39
Si el material en estudio es propenso a absorber o a perder cantidades de agua considerables con las variaciones de humedad, efectuar la prueba en un ambiente controlado apropiado. De forma análoga, si se sabe que el material en estudio genera carga electrostática, tomar las precauciones necesarias para garantizar que esa carga no altere los resultados del análisis. En algunos casos, se recomienda agregar un 0,5 por ciento (m/m) de un agente anti-estático, como un dióxido de silicio coloidal u óxido de aluminio, para reducir el efecto a un mínimo. Si no se puede eliminar la carga estática ni la absorción o pérdida de agua, es necesario emplear otra técnica para determinar el tamaño de partícula.
Métodos de Agitación Todos los distintos tipos de dispositivos de agitación para tamices y polvos están disponibles comercialmente y son adecuados para el tamizado analítico. Sin embargo, las distintas fuerzas y las diferencias de magnitud de estas fuerzas sobre las partículas en estudio que emplean los distintos métodos de agitación producirán resultados distintos y tendrán puntos finales distintos. Algunos métodos emplean la agitación mecánica o electromagnética que induce un cierto grado de oscilación vertical o de movimiento circular en el plano horizontal o golpes suaves o una combinación de golpes suaves y de movimiento circular en el plano horizontal. Otro método consiste en arrastrar las partículas en un chorro de aire. Es necesario indicar en los resultados qué método de agitación se empleó y con qué parámetros (si están sujetos a variación), ya que los cambios en las condiciones de agitación generan cambios en los resultados del tamizado analítico y en la determinación del punto final y en algunos casos la variación es lo suficientemente amplia como para dar resultados que no cumplan con los requisitos en ciertas circunstancias.
Determinación del Punto Final El tamizado analítico se da por concluido cuando el peso de cualquiera de los tamices no presenta variaciones de más de 5% o de O, 1 g (10% si se emplean tamices de 76 mm) del peso previo obtenido en ese mismo tamiz. Si en cualquiera de los tamices hay menos del 5% del total de la muestra, aumentar el punto final para ese tamiz hasta un cambio de peso de no más de 20% del peso previo obtenido en ese tamiz. Si se encuentra más del 50% del peso total de la muestra en cualquiera de los tamices, a menos que esta circunstancia esté indicada en la monografía, repetir la prueba agregando a ese conjunto de tamices un tamiz con orificios más grandes, de tamaño intermedio entre el tamaño del tamiz que contiene el exceso de peso y el siguiente tamiz en el orden del grupo original, es decir, agregando el tamiz de la serie ISO omitido en el conjunto de tamices.
MÉTODOS DE TAMIZADO Agitación Mecánica MÉTODO DE TAMIZADO EN SECO Tarar cada tamiz con una aproximación de O, 1 g. Colocar una cantidad de la muestra de prueba pesada con exactitud en el tamiz superior (el de orificios más grandes) y tapar. Agitar el conjunto de tamices durante 5 minutos. A continuación desmontar cuidadosamente cada tamiz del conjunto de tamices sin que haya pérdida de material. Volver a pesar cada tamiz y determinar el peso del material en cada uno de ellos. Determinar el peso del material utilizando una bandeja recolectora u otro adminículo similar para recolectar el material. Volver a montar el conjunto de tamices y agitar durante 5 minutos. Desmontar y pesar cada uno de los tamices como se describió anteriormente. Repetir los pasos hasta obtener los resultados del punto final (ver Determinación del Punto Final en Tamices Analíticos) Una vez completado el análisis, conciliar los pesos del material. Las pérdidas totales no exceden de 5% del peso de la muestra original. Repetir el análisis con una muestra nueva, pero usando un solo tiempo de tamizado igual a la sumatoria de los tiempos mencionados anteriormente. Confirmar que este tiempo de tamizado cumple con los requisitos de la determinación de punto final. Una vez validado el punto final para un material específico, ese tiempo único de tamizado fijado se puede usar en los próximos análisis, siempre y cuando la distribución del tamaño de partícula esté comprendida dentro de los límites de la variación normal. Si se observara que las partículas retenidas en uno cualquiera de los tamices están en forma de agregados y no de partículas individuales, es poco probable que el tamizado mecánico en seco proporcione una buena reproducibilidad. En ese caso se debe emplear otro método de análisis del tamaño de partícula.
Métodos de Arrastre por Aire TAMIZADO CON UN CHORRO DE AIRE O TAMIZADO SÓNICO Hay disponibles comercialmente varios tipos distintos de equipos para tamizar que utilizan una corriente de aire circulante. El sistema que emplea un único tamiz por vez se denomina tamizado por chorro de aire. En líneas generales, la metodología es
Pruebas Físicas/ (787) Partículas Subvisibles en Inyectables 649
USP 39
similar a la descrita para el Método de Tamizado en Seco con un chorro de aire normalizado en lugar del mecanismo de agitación descrito. La distribución del tamaño de partícula se obtiene mediante análisis secuenciales en tamices individuales comenzando por el tamiz con orificios más pequeños. A menudo, el tamizado por chorro de aire se realiza con tamices de orificios más pequeños que los empleados en el tamizado en seco. La técnica resulta más adecuada si sólo es necesario cuantificar las fracciones que estén por encima o por debajo de un límite de tamaño. El método de tamizado sónico emplea un conjunto de tamices y la muestra circula en un columna de aire que oscila verticalmente y eleva la muestra y la devuelve a los orificios de la malla a un cierto número de pulsos por minuto. En algunos casos, si se emplea el tamizado sónico es necesario disminuir el tamaño de la muestra a 5 g. Los métodos de tamizado por chorro de aire y sónico pueden ser útiles para polvos o gránulos con los que no se obtienen un análisis significativo empleando las técnicas de tamizado mecánico. Estos métodos dependen en gran medida de que la dispersión del polvo en la corriente de aire sea apropiada. Puede ocurrir que se encuentren dificultades para cumplir con este requisito si el método se emplea con los tamices en el extremo inferior del intervalo (es decir, de menos de 75 µm), cuando las partículas tienden a tener mayor cohesión y en particular si el material presenta una tendencia a cargarse electrostáticamente. Los motivos expuestos subrayan la importancia de la determinación del punto final y que es crucial confirmar que el material cuyo tamaño excede el previsto está compuesto de partículas aisladas y no de agregados.
INTERPRETACIÓN Los datos sin procesar deben incluir el peso de la muestra en análisis, el tiempo total de tamizado y la descripción precisa de la metodología de tamizado empleada así como los valores fijados para todo parámetro variable, además de los pesos del material retenido en cada tamiz individual y del peso en la bandeja. En algunos casos se recomienda convertir estos datos en una distribución acumulativa del peso y, si se desea expresar la distribución en términos del peso acumulado de partículas de tamaño inferior al esperado, el intervalo de tamices empleados debe incluir un tamiz por cuyos orificios pasa todo el material. Si se observan indicios de que el material retenido en los tamices está compuesto por agregados formados durante el proceso de tamizado, el análisis no es válido.
,
,
(787) PARTICULAS SUBVISIBLES EN INYECTABLES DE PROTEINAS TERAPÉUTICAS
Este capítulo se puede usar como alternativa al capítulo general Partculas en Inyectables (788) de la USP. Este capítulo trata específicamente de inyectables de proteínas terapéuticas y preparaciones relacionadas, lo cual permite el uso de volúmenes de los productos y alícuotas de prueba más pequeñas para determinar el contenido de partículas, con instrucciones para la manipulación de las muestras que toman en cuenta las cuestiones asociadas con el análisis de estos materiales. Aunque la metodología y los límites presentados en este capítulo son los preferidos para inyectables de proteínas terapéuticas, se considera aceptable el uso de métodos analíticos alternativos aceptados por las autoridades reglamentarias con límites de partículas subvisibles adecuadamente desarrollados. Los inyectables de proteínas terapéuticas son productos de proteínas o péptidos, obtenidos por biotecnología, 11 así como otros inyectables de proteínas terapéuticas tales como proteínas terapéuticas obtenidas de fuentes naincluyendo sus preparaciones finales para infusión. No se incluyen en este capítulo ciertas preparaciones que no se pueden adaptar a estas pruebas, tales como las vacunas profilácticas. Las partículas en inyectables de proteínas terapéuticas son sustancias móviles no disueltas que pueden originarse de diversas fuentes. Las partículas pueden ser (a) verdaderamente extrañas o "extrínsecas", p.ej., material extraño inesperado, tal como celulosa; (b) "intrínsecas" resultantes del proceso de fabricación, mediante incorporación o por limpieza deficiente, tales como metales o juntas del tanque, lubricantes, equipo de llenado, o que resultan de la inestabilidad, p.ej., cambios por el paso del tiempo, tales como formas salinas insolubles de fármacos o degradación del empaque; y (c) "inherentes", tales como partículas de la proteína o de los componentes de la formulación. Todos estos tipos de partículas se pueden detectar y contar usando el método de prueba descrito en este capítulo. Asimismo, para los métodos de obstrucción de luz (OL), las burbujas de gas por lo regular se cuentan durante el análisis de partículas y se consideran artefactos del recuento. Para la determinación de partículas subvisibles en inyectables de proteínas terapéuticas, el método preferido es la Prueba de Conteo de Partículas por Obstrucción de Luz. La Prueba de Conteo Microscópico de Partículas similar a la descrita en el capítulo (788) puede ser útil para casos en los que las partículas que se están analizando sean en su mayoría no proteináceas, o para casos en los que pudiera considerarse importante examinar las características de las partículas. Los resultados de esta prueba no son equivalentes a los de la prueba de OL.
11iflll!Wl:rlli¡¡¡I
650 (787) Partículas Subvisibles en Inyectables / Pruebas Físicas
USP 39
No todos los inyectables de proteínas terapéuticas pueden examinarse directamente para determinar la presencia de partículas subvisibles con el método de OL. Cuando el método de prueba no se puede aplicar de forma directa a muestras de prueba específicas, según se determine por cualquier problemática con la verificación del método (reproducibilidad, linealidad), se puede realizar una dilución cuantitativa con un diluyente apropiado para permitir el análisis mediante obstrucción de luz. La verificación del método puede ser necesaria para garantizar la idoneidad de los procedimientos de manejo de la muestra y el desempeño del método para cada medicamento. En las pruebas descritas a continuación, los resultados obtenidos al examinar una unidad discreta o grupo de unidades para determinar la presencia de partículas no pueden extrapolarse con certeza a otras unidades que aún no han sido analizadas. Por consiguiente, se deben desarrollar planes de muestreo basándose en factores operativos conocidos para sustentar inferencias válidas derivadas de los datos observados a fin de caracterizar el nivel de partículas en un grupo grande de unidades. Los planes de muestreo se deben basar considerando el volumen de producto, número de partículas históricamente encontradas en comparación con los límites, distribución del tamaño de partícula y variabilidad de los recuentos de partículas entre unidades. Los productos que se usan con un filtro final durante su administración (en línea) están exentos de estos requisitos, siempre que se cuente con datos científicos para justificar la exención.
PRUEBA DE CONTEO DE PARTÍCULAS POR OBSTRUCCIÓN DE LUZ Los analistas deben usar un instrumento adecuado que se base en el principio de bloqueo de luz y que permita una determinación automática del tamaño y del número de partículas. El sensor seleccionado debe ser apropiado para el intervalo de tamaño de partícula que se quiere determinar y el número de partículas esperado. Diversas etapas de estandarización, tales como exactitud del volumen de muestra, velocidad de flujo de la muestra, resolución del sensor, calibración y exactitud del recuento de partículas, resultan importantes para la operación apropiada del aparato y se discuten con mayor detalle en el capítulo de información general Métodos para Ja Determinación de Partículas en Inyectables y Soluciones Oftálmicas (1 788). 1 Para propósitos de calibración del equipo, usar estándares de tamaño de partícula rastreables al NIST o estándares rastreables equivalentes; ver el capítulo (1788). Estos estándares por lo general son de entre 2 y 100 µm. Los analistas deberían verificar el desempeño del aparato usando el ER Recuento de Partículas USP dispersado en agua exenta de partículas usando un volumen apropiado. Se debe tener cuidado de evitar la aglomeración de partículas durante la dispersión en el proceso de calibración. La definición de Agua Exenta de Partículas se encuentra en la sección introductoria de Reactivos, Indicadores y Soluciones.
Precauciones Generales Llevar a cabo la prueba en condiciones que limiten el ingreso de partículas, de preferencia en una cabina de flujo laminar. Se debe limpiar y manipular adecuadamente todo el material de vidrio y el equipo usado para evitar la introducción de partículas. Se debe tener cuidado de minimizar la agitación y demás situaciones de estrés para las preparaciones (para líquidos o polvos reconstituidos) y de prevenir la introducción de burbujas de aire en la preparación en análisis. Esto último es de particular importancia al combinar o transferir las preparaciones al recipiente en el que se llevará a cabo la determinación.
Etapas Preparatorias El material de vidrio seleccionado para el método debe ser adecuado para el volumen de las alícuotas de blanco y de muestra, permitir un mezclado fácil y una limpieza repetitiva a fin de prevenir cualquier contribución significativa a los recuentos de partículas. Por lo regular, se utilizan vasos dedicados única y exclusivamente para esta prueba. La limpieza y enjuague del material de vidrio del método debe realizarse en una zona contigua al área del recuento. El área de trabajo y el equipo deben estar separados del tráfico general del laboratorio. Debe disponerse de un buen suministro de agua filtrada (que cumpla con el requisito de Agua Exenta de Partículas) y de un equipo de soporte mantenido en buenas condiciones para el trabajo de rutina. Consultar el capítulo de información general (1788). 1 Se recomiendan dos tipos de controles del sistema: una Prueba Blanco y una Verificación de la Aptitud del Sistema. 1 . La Prueba Blanco involucra lo siguiente: a. La que se realiza al inicio del día o del análisis para asegurar que se ha tenido especial cuidado durante la preparación del sitio y del aparato que se va a usar (Blanco Ambienta0. b. Todos los blancos adicionales que se realizan durante el día (por ejemplo entre familias de productos) también deben cumplir con los requisitos de la Prueba Blanco (Blanco de Procedimiento). 2. La Verificación de Ja Aptitud del Sistema se realiza para verificar el recuento/mL apropiado y la relación con respecto al ER Recuento de Partículas USP vigente o el estándar comercial equivalente. Ver el capítulo de información general (1788). 1
1
Sólo para propósitos de información, los analistas pueden referirse al capítulo (1 788), el cual puede ser útil, aunque no obligatorio.
USP 39
Pruebas Físicas/ (787) Partículas Subvisibles en Inyectables 651
Prueba Blanco La siguiente prueba se lleva a cabo para verificar que (a) el ambiente es adecuado para Ja prueba, (b) el material de vidrio se ha limpiado apropiadamente y que (c) el agua o disolvente adecuado que se va a usar se encuentra exento de partículas (by c constituyen el "blanco"). Determinar el recuento en cinco alícuotas de agua exenta de partículas o disolvente adecuado desgasificados, que sean representativas del volumen de prueba del producto (pero no menos de 1 mL). Si el número de partículas con un tamaño de 1 O µm o mayor excede de 1 partícula por mL para el volumen combinado de las alícuotas, entonces no han sido suficientes las precauciones tomadas para Ja prueba. Repetir las etapas preparatorias hasta que el entorno, el material de vidrio y el agua sean adecuados para la determinación de Ja prueba. En principio, Ja Prueba Blanco debe realizarse cada día (entorno) y se recomienda durante toda la rutina diaria, en especial entre familias de productos (procedimiento).
Verificación de la Aptitud del Sistema Para verificar la aptitud del sistema, el Agua Exenta de Partículas y el ER Recuento de Partículas USP o la suspensión acuosa estándar comercial equivalente se analizan en el mismo tipo de envase, o similar a los de las muestras de producto, se desgasifican de la misma manera y, por lo general, se manipulan de la misma manera que el artículo de prueba. Asegurar que el sistema puede cumplir con el requisito de la Prueba Blanco. Determinar las partículas en una muestra del ER Recuento de Partículas USP que corresponda al volumen de prueba del producto, de acuerdo con el método descrito a continuación. Los resultados obtenidos de Ja Preparación estándar deben caer dentro de las especificaciones establecidas del Estándar de Referencia.
Método Las muestras de producto se analizan de Ja manera que represente Ja entrega lo más adecuadamente posible (p.ej., el contenido descargado de una jeringa). Para productos parenterales con un volumen suficiente (es decir, un volumen lo suficientemente grande para facilitar el análisis), el análisis de unidades individuales tiene a menudo un carácter diagnóstico. Para productos parenterales que no cuentan con un volumen suficiente, mezclar con cuidado y de manera minuciosa cada unidad, luego combinar el contenido de un número adecuado de unidades en un recipiente distinto para obtener el volumen requerido para una sola prueba (por lo general, 0,2-5,0 mL). Si se lleva a cabo una dilución, asegurar que el recipiente del blanco tenga un volumen suficiente para el producto y los diluyentes y que se introduzca el menor número de partículas posible durante el proceso. Abrir cada unidad con cuidado, retirar el cierre sellante y evitar la contaminación del contenido antes del muestreo, de Ja dilución o, si fuera necesario, de la combinación. Cuando se especifique un disolvente del producto, p.ej., para sólidos liofilizados o polvos para uso parenteral, la reconstitución o dilución debe realizarse con Ja cantidad apropiada de disolvente especificado. En este caso, se puede analizar el disolvente mismo para asegurar que no representa una fuente significativa de partículas. No se permite restar el recuento de partículas del disolvente al recuento total. La eliminación de burbujas de gas es un paso clave, en especial para productos proteináceos que atrapan gas fácilmente. Se recomiendan dos métodos: dejar en reposo el fluido del producto bajo presión ambiental o aplicando un vacío suave (p.ej., 75 Torr). Se pueden usar otros métodos siempre que se demuestre su idoneidad. Se debe evitar el uso de ultrasonido. Una vez que las muestras han sido desgasificadas, se deben volver a mezclar suavemente para suspender todas las partículas, mezclando suavemente, pero de manera minuciosa, el contenido de Ja muestra usando medios adecuados, tal como Ja agitación manual del envase por rotación suave y lenta. No es recomendable mezclar el fluido del producto mediante inversión en ningún momento. Inmediatamente después de mezclar, retirar no menos de cuatro alícuotas, cada una con un volumen apropiado para la capacidad del instrumento (por lo general, 0,2-5,0 mL). Contar el número de partículas que están por encima del intervalo de tamaño seleccionado, incluyendo las partículas con tamaños iguales o mayores de 1O y 25 µm. No tomar en cuenta el resultado obtenido para Ja primera alícuota y calcular el número promedio de partículas en cada intervalo de tamaño para las alícuotas remanentes de Ja preparación en análisis. Asimismo, se puede aplicar un volumen de tara para controlar el muestreo que debe ser representativo del intervalo dinámico del sensor y del volumen de la aguja.
Consideraciones Generales Se permite diluir siempre que se demuestre que el diluyente y los métodos son apropiados y que se utilice el menor nivel de dilución que permita un análisis reproducible. En ciertas circunstancias, puede ser necesario diluir las muestras para obtener resultados confiables. Éste puede ser el caso de productos con altas concentraciones y/o productos de alta viscosidad que no se puedan retirar para su transferencia apropiada al instrumento; productos que ocasionen Ja saturación del sensor del instrumento debido a recuentos elevados, en especial para los intervalos de tamaño menores de 1O µm; y en casos en los que la alta concentración resulte en diferencias muy pequeñas en el índice de refracción entre la solución y Jos agregados proteicos, entre otros. En situaciones en las que se lleve a cabo Ja dilución de Ja muestra, se debe demostrar que la dilución y la aptitud del esquema de dilución seleccionado, incluida la selección del diluyente, están justificadas. La aptitud del esquema de dilución y del diluyente se puede evaluar demostrando la uniformidad de los resultados a lo largo de un intervalo de dilución. Se deben
652 (787) Partículas Subvisibles en Inyectables / Pruebas Físicas
USP 39
considerar estudios que relacionen el recuento de partículas con y sin dilución en los intervalos de tamaño esperados. Asimismo, se deberían realizar estudios que exploren el impacto de la dilución sobre la reducción del número de agregados o el incremento de las partículas debidas a los cambios en la proporción de proteína con respecto a los excipientes. Se puede verificar el impacto de la dilución usando una técnica ortogonal para justificar la aptitud del método.
Evaluación Los valores siguientes se derivan históricamente de los capítulos generales (788) y (789). Si las especificaciones son distintas a las establecidas a continuación, se indicarán en las monografías individuales siempre que estuvieran disponibles. Para productos parenterales que son inyectables de proteínas terapéuticas para infusión o inyección provistos en envases con un contenido nominal menor o igual a 100 mL: El número promedio de partículas con un tamaño igual o mayor de 1O µm presentes en las unidades analizadas no debe exceder de 6000 por envase, y las de tamaño igual o mayor de 25 µm no debe exceder de 600.
Para inyectables de proteínas terapéuticas provistos en envases con un contenido nominal de más de 100 mL, y preparaciones o inyectables para infusión parenteral con un contenido nominal de más de 100 mL: El número promedio de partículas con un tamaño igual o mayor de 1O µm presentes en las unidades analizadas no debe exceder de 25/ml, y las de tamaño igual o mayor de 25 µm no debe exceder de 3/ml. Asimismo, la carga total de partículas con un tamaño igual o mayor de 1O µm no debe exceder de 6000 por envase y las de tamaño igual o mayor de 25 µm no debe exceder de 600 por envase.
Los productos que se usan con un filtro final durante su administración (en línea) están exentos de estos requisitos, siempre que se cuente con datos científicos para justificar la exención. No obstante, se espera que los filtrados cumplan con este capítulo. Para productos que se proveen en <100 mL o que se reconstituyen primero en <100 mL y luego se diluyen para infusión en un volumen > 1 00 mL, se debe evaluar el contenido de partículas antes y después de la dilución, y evaluarse según su volumen final.
PRUEBA DE RECUENTO MICROSCÓPICO DE PARTÍCULAS Como se indicó anteriormente, el método de obstrucción de luz es el método preferido para inyectables de proteínas terapéuticas e infusiones parenterales. No obstante, se puede usar el método microscópico cuando resulte necesario, como en el caso de la determinación exclusiva de partículas de tipo extrínseco e intrínseco. Sin embargo, al utilizar este método, se debe demostrar que también se están contando otras clases de partículas (p.ej., inherentes). Para la determinación de la aceptabilidad del producto, aplicar los límites para la prueba microscópica con membrana del capítulo general (788). Debido a la interferencia de algunas partículas de proteínas y de sus características físicas (frágiles o translúcidas), los resultados de la Prueba de Conteo Microscópico de Partículas no son equivalentes a los de la Prueba de Conteo de Partículas por Obstrucción de Luz, y dichos métodos no pueden considerarse intercambiables.
(788) PARTÍCULAS EN INYECTABLES Cambio en '" redactión: Este capítulo general está armonizado con los textos correspondientes de la Farmacopea Europea y/o la Farmacopea japonesa. Estas farmacopeas se han comprometido a no realizar ningún cambio unilateral a este capítulo armonizado. Las partes del texto de este capítulo general que son texto USP nacional y, por lo tanto, no forman parte del texto armonizado, están indicadas con símbolos (.. ) para especificar este hecho. Las partículas en inyectables e infusiones parenterales consisten en partículas no disueltas móviles extrañas, que no son burbujas gaseosas, accidentalmente presentes en las soluciones. •Según se indica en •Medicamentos Inyectables y en Implantes {1 (AFo 1.rmiy-m16l, las soluciones para inyección que se administran por vía intramuscular o subcutánea deben cumplir con los requisitos de Partículas en Inyectables (788). Este requisito ha sido pospuesto indefinidamente para productos de uso veterinario. Las preparaciones parenterales envasadas y etiquetadas exclusivamente para usar como soluciones de irrigación están exentas de los requisitos de Partículas en Inyectables (788). Las preparaciones radiofarmacéuticas están exentas de los requisitos de Partículas en Inyectables (788). Los productos parenterales cuyo etiquetado especifica el uso de un filtro final antes de la administración están exentos de los requisitos de Partículas en Inyectables (788), siempre que se disponga de datos científicos que justifiquen dicha exención .• Para la determinación de las partículas, se especifican a continuación dos procedimientos, el Método 1 (Prueba de Conteo de Partículas por Obstrucción de Luz) y el Método 2 (Prueba de Conteo Microscópico de Partículas). Cuando se examinan inyecciones e infusiones parenterales para detectar la presencia de partículas subvisibles, es preferible aplicar el Método 1. Sin embargo,
>•
USP 39
Pruebas Físicas/ (788) Partículas en Inyectables 653
puede ser necesario analizar algunas preparaciones mediante la Prueba de Conteo de Partículas por Obstrucción de Luz seguida de la Prueba de Conteo Microscópico de Partículas para determinar en forma concluyente si cumple con los requisitos. No todas las preparaciones parenterales se pueden examinar con uno de estos métodos o con ambos para detectar la presencia de partículas subvisibles. Cuando el Método 1 no es aplicable, p.ej., en el caso de preparaciones que presenten una transparencia reducida o una viscosidad aumentada, se debe llevar a cabo la prueba según el Método 2. Las emulsiones, coloides y preparaciones liposomales son algunos ejemplos. De la misma manera, los productos que producen burbujas de aire u otro gas cuando se aspiran dentro del sensor también pueden requerir un análisis de conteo microscópico de partículas. Si la viscosidad de la preparación a analizar es lo suficientemente alta como para impedir el análisis por cualquiera de los dos métodos, se puede realizar una dilución cuantitativa con un diluyente adecuado para reducir su viscosidad, según sea necesario, y así permitir la realización del análisis. Los resultados obtenidos al analizar una unidad discreta o un grupo de unidades para detectar la presencia de partículas no pueden extrapolarse con certeza a otras unidades que no fueron examinadas. Por lo tanto, si se desean realizar inferencias válidas a partir de los datos observados para caracterizar el nivel de partículas en un grupo grande de unidades, se deben desarrollar planes de muestreo estadísticamente confiables. •A los fines de este capítulo, preparación parenteral de pequeño volumen es sinónimo de inyección de pequeño volumen, y preparación parenteral de gran volumen es sinónimo de inyección de gran volumen .•
MÉTODO 1 PRUEBA DE CONTEO DE PARTÍCULAS POR OBSTRUCCIÓN DE LUZ Usar un aparato adecuado basado en el principio de bloqueo de la luz que permita una determinación automática del tamaño de las partículas y el número de partículas según el tamaño. La definición de agua exenta de partículas se proporciona en
Especificaciones de Reactivos-Reactivos, Indicadores y Soluciones. Calibrar el aparato usando dispersiones que contengan partículas esféricas de tamaños conocidos entre 1 O µm y 25 µm. Dispersar el estándar de partículas en agua exenta de partículas. Se deben tomar las precauciones necesarias para evitar el agregado de partículas durante la dispersión. •La aptitud del sistema puede verificarse usando el ER Partículas para Conteo USP .•
Precauciones Generales Llevar a cabo la prueba en condiciones que limiten la presencia de partículas, preferentemente en un gabinete con flujo de aire laminar. Lavar muy cuidadosamente el material de vidrio y equipo de filtración usados, excepto los filtros de membrana, con una solución de detergente tibia, y enjuagar con cantidades abundantes de agua para eliminar todo rastro de detergente. Inmediatamente antes de usar, enjuagar el equipo desde arriba hacia abajo, por afuera y luego por adentro, con agua exenta de partí-
culas. Procurar no introducir burbujas de aire en la preparación a analizar, especialmente cuando se transfieren porciones de la preparación al recipiente en el cual se llevará a cabo la determinación. Para verificar que el ambiente es adecuado para la prueba, que el material de vidrio se ha limpiado correctamente y que el agua a usar se encuentra exenta de partículas, llevar a cabo la siguiente prueba: determinar la presencia de partículas en cinco muestras de agua exenta de partículas de 5 mL cada una, según el método que se describe más adelante. Si el número de partículas con un tamaño igual o mayor de 1O µm excede de 25 para la muestra combinada de 25 mL, las precauciones tomadas para la prueba no son suficientes. Se deben repetir las etapas preparatorias hasta que el ambiente, material de vidrio y agua sean adecuados para la prueba.
Método Mezclar el contenido de la muestra invirtiendo el envase lentamente 20 veces sucesivas. Si fuera necesario, quitar cuidadosamente el cierre de sellado. Limpiar la superficie exterior de la apertura del envase empleando un chorro de agua exenta de partículas y quitar el cierre, evitando la contaminación del contenido. Eliminar las burbujas gaseosas mediante las medidas apropiadas tales como dejar en reposo durante 2 minutos o someter a ultrasonido. Para preparaciones parenterales de gran volumen, se analizan unidades individuales. Para preparaciones parenterales de pequeño volumen de menos de 25 mL, combinar el contenido de 1 O o más unidades en un recipiente limpio para obtener un volumen de no menos de 25 mL; la solución de prueba puede prepararse mezclando el contenido de un número adecuado de viales y diluyéndolo hasta 25 mL con agua exenta de partículas o con un disolvente exento de partículas adecuado cuando el agua exenta de partículas no es adecuada. Las preparaciones parenterales de pequeño volumen con un volumen de 25 mL o más pueden analizarse individualmente. Reconstituir los polvos para uso parenteral con agua exenta de partículas o con un disolvente exento de partículas apropiado cuando el agua exenta de partículas no es adecuada. •En el caso de envases a granel para farmacias para uso parenteral etiquetados con la leyenda "No Destinado para Infusión Directa", proceder según se indica para preparaciones parenterales de pequeño volumen cuando el volumen sea 25 mL o más. Calcular el resultado de la prueba en una porción que sea equivalente a la dosis máxima provista en el etiquetado. Por ejem-
654 (788) Partículas en Inyectables /
Pruebas Físicas
USP 39
plo, si el volumen total del envase a granel es 100 ml y el volumen de dosis máxima es 1O ml, entonces el conteo promedio de partículas por ml se multiplicaría por 1O para obtener el resultado de prueba basándose en la dosis máxima de 1O ml. [NOTA-Para los cálculos de los resultados de la prueba, considerar esta porción de dosis máxima equivalente al contenido de un envase lleno.] los productos envasados con compartimentos duales diseñados para contener un producto farmacéutico y un disolvente deben ser preparados y analizados según se indica para preparaciones parenterales de gran volumen o preparaciones parenterales de pequeño volumen, dependiendo del volumen del envase. Mezclar cada unidad según se indica en el etiquetado, activando y agitando para asegurar el mezclado minucioso de los componentes individuales y la disolución del medicamento .• El número de muestras de prueba debe ser suficiente para proporcionar una evaluación estadísticamente válida. Para preparaciones parenterales de gran volumen o de pequeño volumen con un volumen de 25 ml o más, se pueden analizar menos de 1 O unidades, empleando un plan de muestreo adecuado. Tomar cuatro porciones, de no menos de 5 ml cada una, y contar el número de partículas iguales o mayores de 1O µm y 25 µm. No tomar en cuenta el resultado obtenido para la primera porción y calcular el número medio de partículas para la preparación a examinar.
Evaluación Para preparaciones suministradas en envases con un volumen nominal de más de 100 ml, aplicar los criterios de la Prueba 1.A. Para preparaciones suministradas en envases con un volumen nominal de menos de 100 ml, aplicar los criterios de la Prueba 1.8. Para preparaciones suministradas en envases con un volumen nominal de 100 ml, aplicar los criterios de la Prueba 1.8. [NOTA-la Farmacopea Japonesa usa la Prueba 1.A..] Si el número promedio de partículas excede los límites, analizar la preparación mediante la Prueba de Conteo Microscópico de Partículas. Prueba 1.A (Soluciones para infusión parenteral o soluciones para inyección suministradas en envases con un contenido nominal de más de 100 mL)-la preparación cumple con la prueba si el número promedio de partículas presentes en las unidades analizadas no excede de 25 partículas iguales o mayores de 1O µm por ml y no excede de 3 partículas iguales o mayores de 25 µm por ml. Prueba 1.B (Soluciones para infusión parenteral o soluciones para inyección suministradas en envases con un contenido nominal de menos de 100 mL)-la preparación cumple con la prueba si el número promedio de partículas presentes en las unidades analizadas no excede de 6000 partículas iguales o mayores de 1O µm por envase y no excede de 600 partículas iguales o mayores de 25 µm por envase.
MÉTODO 2 PRUEBA DE CONTEO MICROSCÓPICO DE PARTÍCULAS Usar un microscopio binocular adecuado, un dispositivo de filtración para retener partículas y un filtro de membrana para el análisis. Ajustar el microscopio con aumentos de 100 ± 1Ox y equiparlo con un micrómetro ocular calibrado con un micrómetro objetivo, una platina mecánica capaz de sostener y recorrer toda la superficie de filtración del filtro de membrana y dos iluminadores adecuados para proporcionar iluminación episcópica además de la iluminación oblicua. El micrómetro ocular es una retícula circular para la medición del diámetro de partículas (ver la Figura 1) y consiste en un círculo grande que tiene filamentos señaladores que lo dividen en cuadrantes, círculos de referencia transparentes y de color negro, con diámetros de 1O µm y 25 µm en aumentos de 1OOx, y una escala lineal con graduaciones en incrementos de 1O µm. Calibrar empleando un micrómetro de platina, certificado por una institución de normalización nacional o internacional. Un error relativo de la escala lineal de la retícula dentro de ±2% es aceptable. El círculo grande se denomina campo reticular (GFOV, por sus siglas en inglés). Se requieren dos iluminadores. Uno es un iluminador episcópico interno de campo brillante, el otro es un auxiliar externo de foco regulable para dar iluminación oblicua reflejada en un ángulo de incidencia de 10º-20º. El dispositivo de filtración para retener las partículas consiste en un soporte de filtro, de vidrio u otro material adecuado, provisto de una fuente de vacío y un filtro de membrana adecuado. El filtro de membrana tiene un tamaño adecuado, de color negro o gris oscuro, reticulado o no y con un tamaño nominal de poro de 1,0 µm o menor.
Pruebas Físicas / (788) Partículas en Inyectables 655
USP 39
O••e
- - Círculo GFOV •O
O•
Cruce de filamentos _ - señaladores
9 1 - - - - - - - - + " ' " ' - - - - - - l 9_ Círculo de i ~m~
i
O•
•O
/
O••e
Escala lineal
11111[1111111111111111111[1111111111111111111111111111111n1¡1111111111111111111111111111111111111111
o
~
w
~
~
w w ro oo m
~
Fig. 1. Retícula circular para la medición del diámetro de partículas. El círculo grande que está dividido por filamentos en cuadrantes se denomina campo reticular (GFOV, por sus siglas en inglés). Los círculos transparentes y de color negro, con diámetros de 1 O µm y 25 µm en 1OOx, se proporcionan como elementos de comparación para clasificar las partículas por tamaño.
Precauciones Generales Llevar a cabo la prueba en condiciones que limiten la presencia de partículas, preferentemente en un gabinete con flujo de aire laminar. Lavar muy cuidadosamente el material de vidrio y de ensamblaje para filtración usados, excepto los filtros de membrana, con una solución de detergente tibia, y enjuagar con cantidades abundantes de agua para eliminar todo rastro de detergente. Inmediatamente antes de usar, enjuagar ambos lados del filtro de membrana y el equipo desde arriba hacia abajo, por afuera y luego por adentro, con agua exenta de partículas. Para verificar que el ambiente es adecuado para la prueba, que el material de vidrio y el filtro de membrana se han limpiado correctamente y que el agua a usar se encuentra exenta de partículas, llevar a cabo la siguiente prueba: determinar la presencia de partículas en 50 mL de agua exenta de partículas, según el método que se describe más adelante. Si más de 20 partículas con un tamaño igual o mayor de 1O µm o si más de cinco partículas con un tamaño igual o mayor de 25 µm están presentes dentro del área de filtración, las precauciones tomadas para la prueba no son suficientes. Se deben repetir las etapas preparatorias hasta que el ambiente, material de vidrio, filtro de membrana y agua sean adecuados para la prueba.
Método Mezclar el contenido de las muestras invirtiendo el envase lentamente 20 veces sucesivas. Si fuera necesario, quitar cuidadosamente el cierre de sellado. Limpiar la superficie exterior de la apertura del envase empleando un chorro de agua exenta de partículas y quitar el cierre, evitando la contaminación del contenido. Para preparaciones parenterales de gran volumen, se analizan unidades individuales. Para preparaciones parenterales de pequeño volumen de menos de 25 mL, combinar el contenido de 1O o más unidades en un recipiente limpio; la solución de prueba puede prepararse mezclando el contenido de un número adecuado de viales y diluyéndolo hasta 25 mL con agua exenta de partículas o con un disolvente exento de partículas apropiado cuando el agua exenta de partículas no es adecuada. Las preparaciones parenterales de pequeño volumen con un volumen de 25 mL o más pueden analizarse individualmente. Reconstituir los polvos para uso parenteral con agua exenta de partículas o con un disolvente exento de partículas adecuado cuando el agua exenta de partículas no es adecuada. El número de muestras de prueba debe ser suficiente para proporcionar una evaluación estadísticamente válida. Para preparaciones parenterales de gran volumen o de pequeño volumen con un volumen de 25 mL o más, se pueden analizar menos de 1O unidades, empleando un plan de muestreo adecuado. Humedecer con varios mL de agua exenta de partículas el interior del soporte de filtro provisto con el filtro de membrana. Transferir al embudo de filtración el volumen total de una solución combinada o una unidad individual y aplicar vacío. Si fuera necesario, agregar gradualmente porciones de la solución hasta filtrar todo el volumen. Después de la última adición de solución, empezar a enjuagar las paredes internas del soporte de filtro empleando un chorro de agua exenta de partículas. Mantener el vacío hasta que la superficie del filtro de membrana se encuentre exenta de líquidos. Colocar el filtro de membrana en una placa de Petri y dejarlo secar al aire con la tapa ligeramente abierta. Después de que el filtro de membrana se haya secado, colocar la placa de Petri en la platina del microscopio, recorrer todo el filtro de membrana bajo la luz reflejada por un dispositivo de iluminación y contar el número de partículas mayores o iguales a 1O µm y el número de partículas mayores o iguales a
656 (788) Partículas en Inyectables / Pruebas Físicas
USP 39
25 µm. Como alternativa, se permite el conteo parcial del filtro de membrana y la determinación del conteo total del filtro por cálculos. Calcular el número medio de partículas para la preparación que se va a analizar. El proceso de medición del tamaño de partículas usando la retícula circular se lleva a cabo estimando el diámetro equivalente de la partícula en comparación con los círculos de referencia de 1O µm y 25 µm de la retícula. De esta forma, no se mueven las partículas de sus lugares originales dentro del campo reticular y no se superponen en los círculos de referencia para la comparación. El diámetro interno de los círculos de referencia transparentes de la retícula se usa para medir las partículas blancas y transparentes, mientras que el diámetro externo de los círculos de referencia negro opaco de la retícula se usa para medir el tamaño de las partículas oscuras. Cuando se realiza la Prueba de Conteo Microscópico de Partículas, no se debe intentar la medición o el conteo de materiales amorfos, semilíquidos, o morfológicamente indiferenciados y que tengan la apariencia de una mancha o decoloración en el filtro de membrana. Estos materiales muestran poco o ningún relieve y presentan un aspecto gelatinoso o similar al de una película. En tales casos, puede facilitarse la interpretación del conteo analizando una muestra de la solución mediante la Prueba
de Conteo de Partículas por Obstrucción de Luz.
Evaluación Para preparaciones suministradas en envases con un volumen nominal de más de 100 mL, aplicar los criterios de la Prueba
2.A. Para preparaciones suministradas en envases con un volumen nominal de menos de 100 mL, aplicar los criterios de la Prueba 2.8.
Para preparaciones suministradas en envases con un volumen nominal de 100 mL, aplicar los criterios de la Prueba 2.8. [NOTA-La Farmacopea japonesa usa la Prueba 2.A.] Prueba 2.A (Soluciones para infusión parenteral o soluciones para inyección suministradas en envases con un contenido nominal de más de 700 ml)-La preparación cumple con la prueba si el número promedio de partículas presente en las unidades analizadas no excede de 12 partículas iguales o mayores de 1 O µm por mL y no excede de 2 partículas iguales o mayores de 25 µm por ml. Prueba 2.8 (Soluciones para infusión parentera/ o soluciones para inyección suministradas en envases con un contenido nominal de menos de 700 ml)-La preparación cumple con la prueba si el número promedio de partículas presente en las unidades analizadas no excede de 3000 partículas iguales o mayores de 1O µm por envase y no excede de 300 partículas iguales o mayores de 25 µm por envase.
(789) PARTÍCULAS EN SOLUCIONES OFTÁLMICAS Las partículas están formadas por sustancias extrañas, móviles, de diversos orígenes, que no son burbujas de gas, que no pueden cuantificarse por medio de un análisis químico debido a la pequeña cantidad de material que representan y debido a su composición heterogénea. Las soluciones oftálmicas deben estar esencialmente exentas de partículas que se puedan observar en una inspección visual. Las pruebas aquí descritas son pruebas físicas desarrolladas con el propósito de contar las partículas extrañas dentro de intervalos específicos de tamaño. Cada solución oftálmica está sujeta a los límites de partículas establecidos para la prueba que se esté aplicando, a menos que se especifique algo diferente en la monografía individual. Cuando sean adecuados límites más altos, éstos estarán especificados en la monografía individual. Las preparaciones oftálmicas que sean suspensiones, emulsiones o geles están exentas de estos requisitos, al igual que lo están los dispositivos médicos. Consultar la monografía específica cuando surja alguna duda sobre la aplicación de la prueba. Los procedimientos de obstrucción de luz y microscópico para la determinación de partículas en soluciones oftálmicas son idénticos a los de las inyecciones; por lo tanto, cuando corresponda, habrá una referencia cruzada con Partículas en Inyectables (788). Este capítulo describe un método de prueba consistente en dos etapas. En primer lugar, la solución oftálmica se analiza por medio del procedimiento de obstrucción la luz (etapa 1). Si no cumple con los límites establecidos, se debe pasar a la prueba microscópica (etapa 2) con sus límites propios. Cuando por razones técnicas la solución oftálmica no pueda ser analizada por obstrucción de luz, se podrá utilizar la prueba microscópica exclusivamente. Se requiere documentación que demuestre que no se puede analizar la solución oftálmica por el procedimiento de obstrucción de luz, o que éste produce resultados inválidos. Se espera que la mayoría de los artículos cumplan con los requisitos usando simplemente la prueba de obstrucción de luz; sin embargo podría ser necesario someter algunos artículos a la prueba de obstrucción de luz seguida de la prueba microscópica para determinar en forma concluyente si se cumple con los requisitos. Todo producto que no sea una solución pura y que tenga una transparencia y viscosidad que se aproximen a las del agua puede proporcionar datos erróneos cuando se lo analiza con el método de conteo por obstrucción de luz. Estos materiales pueden analizarse por medio del método de conteo microscópico. En ciertos casos, la viscosidad de un material a analizar puede ser lo suficientemente alta como para impedir el análisis
Pruebas Físicas/ (789) Partículas en Soluciones Oftálmicas 657
USP 39
por cualquiera de los dos métodos de prueba. En este caso, se puede realizar una dilución cuantitativa con un diluyente adecuado para reducir la viscosidad lo necesario y permitir la realización del análisis. En las pruebas descritas a continuación, los resultados obtenidos al examinar una unidad discreta o un grupo de unidades para detectar la presencia de partículas no pueden extrapolarse con certeza a otras unidades que no fueron examinadas. Por lo tanto, si se desean realizar inferencias válidas a partir de los datos observados para caracterizar el nivel de partículas en un grupo grande de unidades, se deben desarrollar planes de muestreo estadísticamente confiables basados en factores de operación conocidos. Los planes de muestreo deben basarse en el volumen de producto, el número de partículas encontrado históricamente en comparación con los límites, la distribución de tamaños de partículas presentes y la variabilidad del conteo de partículas entre unidades.
PRUEBA DE CONTEO DE PARTÍCULAS POR OBSTRUCCIÓN DE LUZ Esta prueba se aplica a las soluciones oftálmicas, incluidas las soluciones que han sido reconstituidas a partir de sólidos estériles, para los cuales se especifica una prueba de detección de Partículas en la monografía individual. La prueba cuenta las partículas sólidas o líquidas en suspensión.
Aparato de Prueba, Normalización del Instrumento, Entorno de Prueba, Procedimiento de Prueba y Cálculos Proceder como se indica en la Prueba de Conteo de Partículas por Obstrucción de Luz en Partículas en Inyectables (788).
Interpretación La solución oftálmica cumple con los requisitos de la prueba si el número promedio de partículas presente en las unidades analizadas no excede del valor adecuado que se indica en la Tabla 1. Si el número promedio de partículas excede del límite, analizar el artículo mediante la Prueba de Conteo de Partículas Microscópicas .. Ta bl a 1 Prueb a d e Con t eo de Part1cu ' 1as por Obstrucc I'on de Luz Diámetro Número de partículas
:2'.10µm
1
:2'.50µm
50 por mL
1
2/ml
PRUEBA DE CONTEO MICROSCÓPICO DE PARTÍCULAS Algunos artículos no pueden analizarse en forma satisfactoria con el método de obstrucción de luz. En dichos casos, las monografías individuales especifican claramente que sólo se debe realizar un recuento microscópico de partículas. La prueba de recuento de partículas microscópicas enumera partículas subvisibles, esencialmente sólidas, en soluciones oftálmicas, luego de recogerlas sobre un filtro de membrana microporosa. Algunas soluciones oftálmicas, tales como soluciones que no se filtran fácilmente debido a su alta viscosidad, pueden quedar exentas de análisis utilizando la prueba microscópica. Cuando se realiza la prueba microscópica, no se debe intentar la medición o el conteo de materiales amorfos, semilíquidos o morfológicamente indiferenciados de algún otro modo y que tengan la apariencia de una mancha o coloración en la superficie de la membrana. Estos materiales muestran poco o ningún relieve en la superficie y presentan un aspecto gelatinoso o similar al de una película. Debido a que este material en solución consiste en unidades en el orden de 1 µm o menores, que se pueden contar sólo después de la agregación o deformación en una membrana analítica, puede facilitarse la interpretación del recuento analizando una muestra de la solución por medio del método de recuento de partículas por obstrucción de luz.
Aparato de Prueba, Entorno de Prueba, Procedimiento de Prueba
y Enumeración de Partículas
Proceder según se indica para la Prueba de Conteo de Partículas Microscópicas en Partículas en Inyectables (788).
1nterpretación La solución oftálmica cumple con los requisitos de la prueba si el número promedio de partículas presente en las unidades analizadas no excede del valor adecuado que se indica en la Tabla 2. Tabla 2. Conteo de Partículas por Método Microscópico Diámetro Número de partículas
:2'.10µm
1
:2'.25 µm
1
:2'.50µm
50 por ml
1
5 por ml
1
2 por ml
658 (790) Partículas Visibles en Inyectables/ Pruebas Físicas
USP 39
(790) PARTÍCULAS VISIBLES EN INYECTABLES Cambio en la redacción:
•INTRODUC(IÓN._usm Todos los productos destinados para administración parenteral deben inspeccionarse visualmente para determinar la presencia de partículas conforme a lo especificado en el capítulo •Medicamentos Inyectables y en Implantes (1 ).• (AF Ol-may.2016) Los sólidos secos, a partir de los cuales se preparan las soluciones reconstituidas para inyección, cumplen con los requisitos para • Totalidad y transparencia de soluciones• (AF 01 _may- 2016) en •Medicamentos Inyectables y en Implantes (1) • (AF ol-may.2016i cuando se preparan justo antes de su uso. A lo largo de este capítulo, el término esencialmente libre de significa que, cuando los medicamentos inyectables se inspeccionan conforme a lo descrito en este capítulo, no se observan partículas visibles en un número de unidades mayor al especificado. Las partículas se definen en el capítulo Partículas en Inyectables (788) como partículas extrañas móviles no disueltas, que no son burbujas de gases, involuntariamente presentes en las soluciones. •Ver Partículas Subvisibles en Inyectables de Proteínas Terapéuticas (787) para información adicional sobre partículas inherentes, intrínsecas y extrínsecas .._usP39 Entre los ejemplos de dichas partículas se incluye, entre otros, fibras, vidrio, metal, materiales elastoméricos y precipitados. No obstante, algunos productos "'•USP39 pueden contener partículas inherentes o aglomerados; en tales casos, los requisitos para "'estas específicas._usm partículas visibles se especifican en la monografía individual o en la solicitud reglamentaria aprobada •pero son aplicables los criterios de control y aceptación para partículas extrañas que se describen en este capítu'º·•usP39
Cuando las características del contenido o del sistema de envase-cierre limita la capacidad de inspección del contenido total, se debe inspeccionar una muestra de los envases de la partida como complemento de la inspección al 100%, mediante la inspección del contenido reconstituido o retirado de los envases (polvos secos, envases ámbar oscuros, suspensiones, o líquidos con colores intensos) de una muestra de los envases de la partida. Las características destructivas de estas pruebas requiere el uso de una muestra más pequeña 1 que el muestreo aceptable tradicionalmente utilizado en pruebas no destructivas luego de la inspección al 100%. Aunque las pruebas descritas en este capítulo pueden ser útiles durante la realización de estudios para examinar la estabilidad del producto, este capítulo no pretende establecer requisitos nuevos de análisis para estudios de estabilidad.
PROCEDIMIENTO DE INSPECCIÓN Cuando se usa junto con una inspección al 100% durante el proceso de fabricación, este procedimiento resulta suficiente para demostrar que la partida está esencialmente exenta de partículas visibles. No obstante, un programa completo para el control y monitoreo de partículas continúa siendo un prerrequisito esencial. Las unidades inspeccionadas deben estar exentas de partículas visibles cuando se examinan sin aumento (excepto la corrección óptica, según se requiera para establecer una visión normal) contra un fondo negro y contra un fondo blanco. La iluminación en el punto de inspección se mantiene a una intensidad mínima de entre 2000 y 3750 lux, lo cual se puede lograr mediante el uso de dos lámparas fluorescentes de 13 W ó 15 W (p.ej., Fl 3/T5 ó Fl 5/T8). Se recomienda el uso de un balastro de alta frecuencia para reducir el parpadeo de las lámparas fluorescentes. Asimismo, son aceptables las fuentes de luz alternativas (p.ej., incandescentes, diodo emisor de luz o LED, por sus siglas en inglés) que proveen iluminación en el punto de inspección dentro del intervalo de intensidad mínimo especificado. Se recomienda una intensidad de iluminación mayor para examinar soluciones coloreadas o productos en envases de materiales diferentes al vidrio transparente. Antes de realizar la inspección, retirar cualquier etiqueta adherida al envase, y lavar y secar el exterior del mismo. La unidad que se va a inspeccionar debe agitarse por rotación suave y/o invertirse, asegurando que no se produzcan burbujas de aire, e inspeccionarse durante aproximadamente 5 segundos contra cada fondo. Se debe registrar la presencia de cualquier partícula.
MUESTREO PARA LA LIBERACIÓN DE PARTIDAS (A CONJINUACIÓN DE LA INSPECCIÓN AL 100% DE LA FABRICACION) Muestrear e inspeccionar la partida usando las normas ANSl/ASQ Zl .4 (ó ISO 2859-1 ). Inspección General de Nivel 11, planes de muestreo individual para inspección normal con un límite de calidad de aceptación (AQL, por sus siglas en inglés) de 0,65%. Resultan aceptables los planes de muestreo alternativos con una protección equivalente o mejor. No más que el número de unidades especificadas contiene partículas visibles.
1 Los planes de muestreo con niveles especiales descritos en las normas ANSl/ASQ Z1 .4-2008 o ISO 2859 son apropiados para su uso como guías en la selección del tamaño de la muestra y de los criterios de aceptación para este propósito.
Pruebas Físicas/ (791) pH 659
USP 39
PRODUCTO EN DISTRIBUCIÓN 2 Si fuese necesario evaluar el producto que se ha enviado a los clientes (p.ej., debido a una queja o interés reglamentario), muestrear e inspeccionar 20 unidades. Si no se observan partículas en la muestra, la partida se considera esencialmente libre de partículas visibles. Si se encuentran disponibles, pueden examinarse unidades adicionales para obtener mayor información sobre el riesgo de presencia de partículas en la partida.
(791) pH INTRODUCCIÓN Para propósitos farmacopeicos, el pH se define como el valor dado por un sensor potenciométrico adecuado, apropiadamente estandarizado, y un sistema de medición. [NOTA-El sistema de medición comúnmente recibe el nombre de "medidor de pH". Aunque el medidor de pH aún es de uso común, el sistema de medición también puede incluirse dentro del sensor de pH y la señal de pH se puede transmitir de manera digital a un dispositivo externo tal como una computadora, Controlador Lógico Programable (PLC, por sus siglas en inglés), Sistema de Control Distribuido (DCS, por sus siglas en inglés), sistema de adquisición de datos, terminal u otro dispositivo controlado por microprocesador.] Por definición, el pH es igual a -log 10 [aH+] donde aH+ es la actividad del hidrógeno (H+) o del ión hidronio (Hp+) y la actividad de iones de hidrógeno se aproxima de manera muy cercana a la concentración de iones de hidrógeno. La escala práctica del pH se define de la manera siguiente: pH = pH, +[(E - Es)!k]
E= potencial medido cuando la celda galvánica contiene la solución en análisis (pH) Es= potencial medido cuando la celda galvánica contiene la solución amortiguadora de normalización apropiada (pH,) k =cambio en el potencial por cambio de unidad en el pH y se deriva de la ecuación de Nernst (según se indica a continuación) k = loge(l O) x (RT/nF)
R = 8, 314 j/mol/°K T =temperatura (ºK)
n = moles por reacción media F = constante de Faraday, 96485 C/mol La ecuación resultante es [0,05916 + 0,0001984(T - 25º)] voltios a la temperatura T. Los valores de k de 15º-35º se proveen en la Tabla 7. Tabla 1. Valores de k para Diversas Temperaturas Temperatura (ºC}
k (V)
15,00
0,05718
20,00
0,05817
25,00
0,05916
30,00
0,06016
35,00
0,06115
Los valores de k a otras temperaturas pueden determinarse a partir de la ecuación anterior. Para propósitos prácticos, los valores de k se determinan a partir de la calibración del sensor de pH.
SISTEMA DE MEDICIÓN DE PH El sistema de medición consta de: (1) un electrodo de medición sensible a la actividad de los iones hidrógeno, por lo regular un electrodo de vidrio, aunque son posibles otros tipos de electrodos, (2) un electrodo de referencia adecuado, por ejemplo, un electrodo de plata-cloruro de plata y (3) un sistema de medición de voltaje con una resistencia de entrada capaz de medir a una impedancia de entrada alta del sensor de pH. El electrodo de medición y de referencia pueden estar separados o combinados. El sistema de medición de voltaje puede estar separado del sensor de pH o integrado en el sensor. Para la mayoría de las aplicaciones, será necesaria una medición de la temperatura para compensar la influencia de la temperatura descrita anteEl análisis descrito en Producto en Distribución es permisible únicamente si el Muestreo paro la Liberación de Partidas (A Continuación de la Inspección al 700% de la Fabricación) se ha realizado exitosamente.
2
660 (791) pH / Pruebas Físicas
USP 39
riormente en la ecuación de Nernst. Se puede incluir un dispositivo de temperatura en el sensor de pH, o se puede usar un dispositivo de temperatura externo.
REQUISITOS INSTRUMENTALES El sistema de medición debe ser capaz de llevar a cabo una calibración del pH de 2 puntos (ver más adelante). La exactitud del sistema de medición de pH se describe en la sección Calibración. La resolución del sistema de medición de pH debe ser al menos un pH de 0,01. El instrumento deberá ser capaz de compensar la temperatura en la medición del sensor de pH para convertir la señal de milivoltios en unidades de pH a cualquier temperatura, ya sea de forma automática usando un dispositivo de temperatura incorporado en el sistema del sensor o mediante el ingreso manual de la temperatura de la muestra en el sistema de medición. La exactitud del sistema de medición de la temperatura deberá ser± 1 ºC. La resolución del sistema de medición de la temperatura deberá ser de al menos O, 1º C. Las mediciones de pH realizadas en laboratorio por lo regular se realizan a 25 ± 2º C a menos que se especifique de otro modo en la monografía individual o en este capítulo. No obstante, resultan aceptables temperaturas fuera de este rango si la preparación de las muestras es más conveniente a temperaturas alternativas. Los ejemplos de mediciones no realizadas en laboratorio incluyen muestras de prueba del interior de los tubos del proceso, contenedores y tanques, así como otras condiciones de procesamiento no estándar. [NOTA-Las definiciones de pH, de la escala de pH y de los valores asignados a las soluciones amortiguadoras de estandarización se proveen con el propósito de establecer un sistema práctico y operativo, de modo que los resultados puedan compararse entre laboratorios. Los valores de pH así medidos no se corresponden exactamente con los obtenidos por la definición, pH = -log aH+, sino que los valores obtenidos están estrechamente relacionados con la actividad del ión hidrógeno en soluciones acuosas.] [NOTA-Cuando un sistema de medición de pH se estandariza usando una solución amortiguadora acuosa y luego se usa para medir el "pH" de sistemas no acuosos, la constante de ionización del ácido o de la base, la constante dieléctrica del medio, el potencial de unión líquida (que puede originar errores de aproximadamente 1 unidad de pH), así como la respuesta del ión hidrógeno del electrodo de vidrio, cambian totalmente. Por estas razones, los valores así obtenidos con soluciones que sólo son de naturaleza parcialmente acuosa se pueden considerar únicamente como valores aparentes de pH.]
SOLUCIONES AMORTIGUADORAS DE NORMALIZACIÓN DEL SISTEMA DE MEDICIÓN DE PH Las soluciones amortiguadoras de normalización se preparan conforme a lo indicado en la Tabla 2. 1 Las sales amortiguadoras de pureza requerida se pueden obtener del Instituto Nacional de Normas y Tecnología, de otras autoridades nacionales o de otros proveedores. Las soluciones amortiguadoras deben almacenarse en envases adecuados que aseguren la estabilidad del pH hasta la fecha de caducidad y que estén equipados con un cierre hermético. Para soluciones amortiguadoras con valores superiores a 11, el almacenamiento debe realizarse en envases que sean resistentes al dióxido de carbono o que minimicen su intrusión, ya que esto podría disminuir el pH de la solución amortiguadora. En el caso de soluciones amortiguadoras con valores menores de 11, deben prepararse en intervalos que no excedan de 3 meses. Las soluciones amortiguadoras con valores superiores a 11, comúnmente deben prepararse y usarse en el momento a menos que se restrinja el ingreso de dióxido de carbono. Todas las soluciones amortiguadoras deben prepararse usando Agua Purificada. La Tabla 2 indica el pH de las soluciones amortiguadores como una función de la temperatura. Las instrucciones presentadas en este capítulo están destinadas a la preparación de soluciones con concentraciones molales (m) designadas. Sin embargo, para facilitar su preparación, las instrucciones se proveen en molaridad. La diferencia entre la concentración de preparaciones molales y molares para estas soluciones amortiguadoras es menos del 1 % y la diferencia de pH es inapreciable. La calibración usando soluciones amortiguadoras debe realizarse en el intervalo de temperatura de las soluciones amortiguadoras citadas en la Tabla 2. [NOTA-La compensación de temperatura en la ecuación de Nernst corrige únicamente el cambio que produce la temperatura en los milivoltios de salida del electrodo, no el cambio real del pH de la solución amortiguadora con la temperatura, el cual es único para cada solución amortiguadora.] Se encuentran disponibles características tales como reconocimiento automático de solución amortiguadora o corrección del pH-temperatura de la solución amortiguadora que proveen la conveniencia al acomodar la influencia de la temperatura sobre las soluciones amortiguadoras. La respuesta de pH-temperatura se puede determinar a partir de los valores de la Tabla 2.
1 Se pueden usar soluciones amortiguadoras disponibles comercialmente para el sistema de medición de pH, normalizadas mediante métodos rastreables al Instituto Nacional de Normas y Tecnología (NIST) u otras autoridades nacionales, cuya etiqueta indique un valor de pH con una exactitud de 0,02 unidades de pH. Se pueden usar soluciones preparadas a partir de los materiales de grado reactivo de la ACS u otros materiales adecuados, siempre y cuando el pH de la solución resultante sea el mismo que el de la solución preparada a partir del material certificado del NIST (u otras autoridades nacionales). Las soluciones amortiguadoras con valores superiores a 12 deben usarse inmediatamente o se deben preparar usando agua recientemente calentada a ebullición y almacenarse en condiciones que minimicen la absorción y el ingreso de dióxido de carbono.
Pruebas Físicas/ (791) pH 661
USP 39
Tabla 2. Valores de pH de Soluciones Amortiguadoras de Normalización Fosfato Diácido de Potasio, 0,0087 M y Fosfato Ácido Disódico, 0,0303 M
Carbonato de Sodio, 0,025 My Bicarbo nato deSodio, 0,025 M
(ºC)
Tetra oxalato de potaslo, 0,05m
10
1,67
-
3,80
4,00
6,90
7,45
9,28
10,12
12,81
3,79
4,00
6,88
7,43
9,23
10,06
12,63
Temperatura
Tartrato Ácido de Potasio Saturado a 25º
Citrato Diácido de Potasio, 0,05M
Biftalato de Potasio, 0,05 m
Fosfato Equlmolal, 0,05m
-
4,00
6,92
-
Tetra borato desodio, 0,01 m 9,33
-
Hidróxido de Calcio, Saturado a 25º 13,00
15
1,67
-
20
1,68
-
25
1,68
3,56
3,78
4,01
6,86
7,41
9,18
10,01
12,45
30
1,68
3,55
3,77
4,02
6,85
7,40
9,14
9,97
12,29
3,55
3,76
7,39
9,10
9,93
35
1,69
40
1,69
-
45
1,70
-
50
1,71
-
55
1,72
60
1,72
-
ilpH/ilºC
0,0010
-0,0014
4,02
6,84
-
4,04
6,84
-
9,07
-
11,98
4,05
6,83
-
9,04
6,83
-
9,01
-
11,84
4,06
-
4,08
6,83
-
8,99
-
11,57
-
4,09
6,84
-
8,96
-
11,45
0,0018
-0,0016
-0,0028
-0,0074
-0,0022
-0,0096
12,13
11,71
-0,0310
La preparación de volúmenes alternativos a las mismas concentraciones que las indicadas más adelante es aceptable. Tetraoxalato de potasio, 0,05 m: Disolver 12,61 g de KH 3(CP 4 ) 2 • 2HP y diluir con agua hasta obtener 1000,0 mL. Tartrato ácido de potasio, saturado a 25º: Agregar C4 H5 K0 6 a agua hasta exceder la saturación a 25º. Posteriormente, filtrar o decantar. Citrato diácido de potasio, 0,05 M: Disolver 11,41 g de C6 H7 K0 4 y diluir con agua hasta obtener 1000,0 ml. Biftalato de potasio, 0,05 m: Disolver 1O,12 g de KHC 8 HP4, previamente secados a 11 Oº durante 1 hora y diluir con agua hasta obtener 1000,0 ml. Fosfato equimolal, 0,05 m: Disolver 3,53 g de Na 2 HP04 y 3,39 g de KH 2 P0 4 , cada uno previamente secado a 120º durante 2 horas y diluir con agua hasta obtener 1000,0 mL. Fosfato diácido de potasio, 0,0087 M y fosfato ácido disódico, 0,0303 M: Disolver 1, 18 g de KH 2 P0 4 y 4,30 g de Na 2 HP04 , ambos secados durante 2 horas a 120 ± 2º, y diluir con agua hasta obtener 1000,0 ml. Tetraborato de sodio, 0,01 m: Disolver 3,80 g de Na 2 B4 0 7 • 1OH 2 0 y diluir con agua hasta obtener 1000,0 ml. Proteger de la absorción de dióxido de carbono. Carbonato de sodio, 0,025 M y bicarbonato de sodio, 0,025 M: Disolver 2,64 g de Na 2 C0 3 y 2,09 g de NaHC0 3 y diluir con agua hasta obtener 1000,0 ml. Hidróxido de calcio, saturado a 25º: Agregar Ca(OH) 2 a agua hasta exceder la saturación a 25º. Usar agua recientemente calentada a ebullición y protegida de la atmósfera para limitar la absorción de dióxido de carbono. Posteriormente, filtrar o decantar.
CALIBRACIÓN Debido a las variaciones en la naturaleza y la operación de los sistemas de medición de pH disponibles, resulta poco práctico proveer instrucciones universales para la estandarización del sistema de medición. Sin embargo, los párrafos siguientes establecen los principios generales a seguir. Examinar los electrodos, especialmente el electrodo de referencia y el nivel de electrólito, cuando se usa electrólito líquido. Si fuera necesario, volver a llenar el suministro de electrolito y tomar las demás precauciones indicadas por los fabricantes del instrumento y el electrodo. La calibración o verificación del sistema de medición de pH debe realizarse periódicamente. El desempeño histórico del sistema de medición, la criticidad de la medición de pH, el mantenimiento del sensor de pH y la frecuencia de la operación de medición se usan para determinar la frecuencia de la calibración/verificación. Si el pH de la solución amortiguadora es sensible al dióxido de carbono ambiental, entonces usar Agua Purificada que se haya calentado a ebullición recientemente y que se haya almacenado posteriormente en un envase diseñado para minimizar el ingreso de dióxido de carbono. 1. Para estandarizar el sistema de medición de pH, seleccionar tres soluciones amortiguadoras de normalización, de preferencia las provistas en la Tabla 2, de modo que el pH esperado del material en análisis caiga dentro de su intervalo. Se usan dos de las soluciones amortiguadoras para el proceso de calibración, y la tercera solución amortiguadora se usa para la verificación. El valor de la solución amortiguadora de verificación debe estar entre los valores de las soluciones amortiguadoras de calibración. Si el intervalo operativo del sensor de pH está por encima del intervalo de pH de las soluciones
662 (791) pH / Pruebas Físicas
USP 39
amortiguadoras en la Tabla 2, entonces 1) seleccionar dos soluciones amortiguadoras de la Tabla 2 con pH cercano o 2) seleccionar una de la Tabla 2 y otra solución amortiguadora preparada y documentada que esté fuera del intervalo. 2. Enjuagar el sensor de pH varias veces con agua y luego con la primera solución amortiguadora. 3. Sumergir el sensor de pH en la primera solución amortiguadora a una temperatura dentro del intervalo de la Tabla 2. 4. Si la medición de temperatura y la compensación automática no se incluyen en el sistema de medición, ingresar manualmente en el instrumento la temperatura de la solución amortiguadora y el valor de pH de la solución amortiguadora a dicha temperatura. Para las temperaturas que no se encuentren listadas en la Tabla 2, usar interpolación lineal para determinar el valor de pH como una función de temperatura. 5. Iniciar la secuencia de calibración de 2 puntos con la primera solución amortiguadora de acuerdo con las instrucciones del fabricante. 6. Retirar el sensor de pH de la primera solución amortiguadora y enjuagar los electrodos con agua y luego la segunda solución amortiguadora. 7. Sumergir el sensor de pH en la segunda solución amortiguadora a una temperatura dentro del intervalo de la Tabla 2. 8. Si la medición de temperatura y la compensación automática no se incluyen en el sistema de medición, ingresar manualmente en el instrumento la temperatura de la solución amortiguadora y el valor de pH de la solución amortiguadora a dicha temperatura. 9. Continuar la secuencia de calibración de 2 puntos con la segunda solución amortiguadora de acuerdo con las instrucciones del fabricante. 1O. Después de completar el proceso de calibración de 2 puntos, verificar que la pendiente y el desplazamiento de pH estén dentro de los parámetros aceptables. Los parámetros típicos aceptables son pendientes en el intervalo del 90%-105% y un desplazamiento de ±30 mV (0,5 unidades de pH a 25º C). Dependiendo del instrumental de pH, la pendiente y el desplazamiento de pH se pueden determinar mediante software o métodos manuales. Si estos parámetros no están dentro de los parámetros aceptables, se debe limpiar el sensor adecuadamente, volver a llenar, realizar un servicio de mantenimiento o reemplazarlo, y se debe repetir el proceso de calibración de 2 puntos. 11. Retirar el sensor de pH de la segunda solución amortiguadora y enjuagar minuciosamente con agua y, posteriormente, con la solución amortiguadora de verificación. 12. Sumergir el sensor de pH en la solución amortiguadora de verificación a una temperatura dentro del intervalo de la Tabla
2. 1 3. Si la medición de temperatura y la compensación automática no se incluyen en el sistema de medición, ingresar manualmente en el instrumento la temperatura de la solución amortiguadora y el valor de pH de la solución amortiguadora a dicha temperatura. 14. La lectura de pH deberá estar dentro de ±0,05 unidades de pH del valor en la Tabla 2 a la temperatura de la solución amortiguadora.
OPERACIÓN Todas las muestras de prueba deben prepararse usando Agua Purificada, a menos que se especifique algo diferente en la monografía. Todas las mediciones de prueba deben usar compensación de temperatura en la ecuación de Nernst manual o automática. 1. Preparar el material de prueba de acuerdo con los requisitos en la monografía o de acuerdo con procedimientos específicos. Si el pH de la muestra de prueba es sensible al dióxido de carbono ambiental, entonces usar Agua Purificada que se haya calentado a ebullición recientemente y que se haya almacenado posteriormente en un envase diseñado para minimizar el ingreso de dióxido de carbono. 2. Enjuagar el sensor de pH con agua, luego con algunas porciones del material de prueba. 3. Sumergir el sensor de pH en el material de prueba y leer el valor de pH y la temperatura. En todas las mediciones de pH, permitir un tiempo suficiente para la estabilización de la temperatura y la medición de pH. Las funciones de diagnóstico tales como la medición de la resistencia del electrodo de vidrio o de referencia pueden estar disponibles para determinar las deficiencias del equipo. Consultar con el proveedor del electrodo para información sobre herramientas de diagnóstico para asegurar la función apropiada del electrodo. Cuando sean suficientes los valores de pH aproximados, pueden ser adecuados los indicadores y papeles de prueba (ver Indicadores y Papeles Indicadores de Prueba, en la sección de Reactivos, Indicadores y Soluciones). Para información sobre soluciones amortiguadoras y sobre la composición de las soluciones amortiguadoras estándar requeridas en las pruebas y valoraciones farmacopeicas, ver Soluciones Amortiguadoras en la sección Soluciones. Esta sección referida no tiene el propósito de reemplazar el uso de las soluciones amortiguadoras de calibración de pH listadas en la Tabla 2.
USP 39
Pruebas Físicas/ (795) Preparación Magistral-Preparaciones No Estériles 663
(795) PREPARACIÓN MAGISTRAL-PREPARACIONES NO ESTÉRILES INTRODUCCIÓN El propósito de este capítulo es proporcionar a los preparadores pautas sobre la aplicación de buenas prácticas de preparación magistral para la preparación magistral de formulaciones no estériles para su dispensación y/o administración en humanos o animales. La preparación magistral es una parte integral de la práctica farmacéutica y es esencial para brindar atención médica. Este capítulo y las monografías aplicables sobre formulación ayudan a definir las buenas prácticas de preparación magistral. Asimismo, este capítulo proporciona información general para mejorar la capacidad del preparador en las instalaciones de preparación magistral para que elabore preparaciones magistrales extemporáneas de contenido, calidad y pureza aceptables. Los farmacéuticos, profesionales de la salud y demás personas implicadas en la preparación magistral de medicamentos deben cumplir con las legislaciones, reglamentaciones y pautas estatales y federales sobre preparación magistral.
CATEGORÍAS DE LA PREPARACIÓN MAGISTRAL Cada una de las tres categorías generales de preparaciones no estériles descritas en esta sección está asociada con diferentes niveles de experiencia, capacitación e instalaciones físicas. Los criterios usados para determinar la clasificación general incluyen: • grado de dificultad o complejidad del proceso de preparación magistral • información y advertencias sobre la estabilidad • requisitos de envasado y almacenamiento • formas farmacéuticas • complejidad de los cálculos • disposición biológica local contra sistémica • nivel de riesgo para el preparador • potencial de riesgo de daños al paciente Ver Preparación Magistral-Preparaciones Estériles (797) para niveles de riesgo relacionados con preparaciones estériles. Las áreas de especialidad tales como la de preparados radiofarmacéuticos requieren de capacitación especial y sobrepasan el alcance del presente capítulo. Los preparadores deberán adquirir y mantener conocimientos y habilidades en todas las áreas (p.ej., formas farmacéuticas, población de pacientes y especialidad médica) para las que elaboran preparaciones.
Descripción de las Categorías SIMPLE Elaboración de una preparación que cuenta con una monografía de preparación magistral en la Farmacopea de los Estados Unidos de América (USP) o que se presenta en un artículo de una publicación de referencia que contiene cantidades específicas de todos los componentes, un procedimiento y equipo de preparación magistral y datos de estabilidad para dicha formulación con las FLU apropiadas; o reconstitución o manipulación de productos comerciales que puedan requerir el agregado de uno o más ingredientes según lo indicado por el fabricante. Entre los ejemplos se incluye Captopril, Solución Oral, lndometacina, Gel Tópico y Bromuro de Potasio, Solución Oral para Uso Veterinario. MODERADA Elaboración de una preparación que requiere de cálculos o procedimientos especiales (tales como calibración de cavidades en moldes de unidades de dosificación) para determinar las cantidades de los componentes por cada preparación o por cada unidad de dosificación individualizada; o elaborar una preparación que carece de datos de estabilidad para su formulación específica. Entre los ejemplos se incluye Sulfato de Morfina, Supositorios, trociscos de clorhidrato de difenhidramina y mezcla de dos o más cremas fabricadas cuando no se conoce la estabilidad de la mezcla. COMPLEJA Elaboración de una preparación que requiere de capacitación, entorno de trabajo, instalaciones, equipo y procedimientos especiales para asegurar resultados terapéuticos apropiados. Entre los ejemplos de posibles tipos de preparaciones complejas se incluyen formas farmacéuticas transdérmicas, preparaciones de liberación modificada y algunos insertos y supositorios para efectos sistémicos.
664 (795) Preparación Magistral-Preparaciones No Estériles/ Pruebas Físicas
USP 39
RESPONSABILIDADES DEL PREPARADOR La responsabilidad del preparador es obtener preparaciones magistrales de contenido, calidad y pureza aceptables de conformidad con la receta u orden de medicación. Además, es responsabilidad del preparador dispensar la preparación terminada, con el envasado y etiquetado apropiados y conforme a los requisitos establecidos por las agencias estatales, consejos de farmacia estatales, legislaciones federales y demás agencias reglamentarias aplicables, cuando corresponda. Los individuos que participen en la preparación magistral de medicamentos o suplementos dietéticos deberán tener la competencia necesaria en preparación magistral y deberán expandir sus conocimientos continuamente sobre la preparación magistral participando en seminarios y/o estudiando la literatura apropiada. Además, deberán tener conocimiento sobre el contenido de este capítulo y estar familiarizados con los capítulos (797), Formas Farmacéuticas (1151 ), Cálculos en la Práctica Farmacéutica (1160), Garantía de Calidad en la Preparación Magistral (1163),Balanzas y Aparatos Volumétricos para Prescripciones (1176), (1191 ), Información Escrita de los Medicamentos Recetados-Guías (1265) y demás legislaciones, pautas y normas sobre preparación magistral aplicables. Para asegurar la calidad de las preparaciones magistrales, los preparadores deberán apegarse a los siguientes principios generales (se proporciona información adicional sobre estos principios generales en la sección siguiente).
Principios Generales de Preparación Magistral 1. El personal está capacitado de manera apropiada y tiene la competencia y calificaciones necesarias para realizar las tareas asignadas. Dicha capacitación debe estar documentada. 2. Los ingredientes para la preparación magistral tienen la identidad, pureza y calidad apropiadas, se adquieren de fuentes confiables, y se almacenan de manera apropiada de acuerdo con las especificaciones del fabricante o las normas USP. 3. Los envases de componentes a granel cuentan con las etiquetas apropiadas de comunicación de riesgo de la Occupational Safety and Health Administration (OSHA) (ver www.OSHA.gov) y las Hojas de Datos de Seguridad de los Materiales (MSDS, por sus siglas en inglés) para todos los fármacos y químicos usados en la preparación están disponibles para el personal de preparación magistral. 4. Todo el equipo usado en la preparación magistral se conserva limpio, recibe el mantenimiento apropiado y se usa de manera apropiada. 5. El ambiente de preparación magistral es adecuado para su propósito previsto; y se implementan procedimientos para prevenir la contaminación cruzada, especialmente cuando se elaboran preparaciones con fármacos (p.ej., fármacos peligrosos y alérgenos conocidos como la penicilina) que requieren de precauciones especiales. 6. Sólo se permite personal autorizado en las inmediaciones de las operaciones de preparación magistral. 7. Existe garantía de que los procesos siempre se llevan a cabo según se especifica o en la forma prevista y que son reproducibles. 8. Las condiciones de la preparación magistral son adecuadas a fin de prevenir errores. 9. Todos los aspectos de la preparación magistral se documentan de manera apropiada. 1 O. Existen procedimientos y registros adecuados para investigar y corregir fallas o problemas en la preparación magistral, el análisis o la preparación misma.
PROCESO DE PREPARACIÓN MAGISTRAL El preparador es responsable de asegurar que cada preparación magistral individual cumpla con los criterios provistos en esta sección (se proporciona información adicional sobre estos criterios en las secciones siguientes).
Criterios para la Elaboración de una Preparación Magistral para Cada Fármaco 1. Se ha evaluado la aptitud de la dosis, la seguridad y el uso previsto de la preparación o dispositivo en términos de: • las propiedades químicas y físicas de los componentes • forma farmacéutica • aptitud terapéutica y vía de administración, incluyendo la disposición biológica local y sistémica • limitaciones legales, si las hubiera. 2. Se debe crear un Registro Maestro de Formulación antes de elaborar la preparación por primera vez. Este registro deberá seguirse cada vez que se elabore dicha preparación. Además, debe completarse un Registro de Preparación Magistral cada vez que se elabore una preparación. 3. Los ingredientes usados en la formulación deberán tener la identidad, calidad y pureza esperadas. Si la formulación es para uso en humanos, los ingredientes no deberán estar incluidos en la lista de fármacos o medicamentos específicos reconocidos en instancias federales que hayan sido retirados o extraídos del mercado por razones de seguridad o eficacia (ver www.FDA.gov). Si la formulación es para animales con los que se producen alimentos, los ingredientes no deberán estar incluidos en una lista de componentes prohibidos para su uso en animales con los que se producen alimentos. Se han consultado los Certificados de Análisis, cuando sea aplicable, y las MSDS para todos los ingredientes usados.
USP 39
Pruebas Físicas/ (795) Preparación Magistral-Preparaciones No Estériles 665
4. La preparación magistral se elabora en un área limpia y sanitizada de manera apropiada, dedicada a esta actividad (ver la sección Instalaciones de Preparación Magistra0. 5. Se elabora únicamente una preparación a la vez en un espacio de trabajo específico. 6. Se ha seleccionado el equipo de preparación magistral apropiado y se ha inspeccionado su limpieza y funcionamiento correcto, y se usa de manera apropiada. 7. Se establece una FLU confiable para asegurar que la preparación terminada tiene su potencia, pureza, calidad y características aceptadas, al menos hasta la FLU indicada en el etiquetado. 8. El personal que participa en la preparación magistral mantiene una buena higiene de manos y usa vestimenta limpia, apropiada para el tipo de preparación magistral que se elabora (p.ej., protectores para el cabello, chaquetas, batas, guantes, máscaras faciales, zapatos, delantales u otros artículos) según sea necesario para proteger al personal de la exposición a sustancias químicas y para prevenir la contaminación de los fármacos. 9. La preparación se elabora de acuerdo con este capítulo, otras normas oficiales referidas en este capítulo, e información y datos científicos pertinentes. 1 O. El preparador verifica los procesos críticos (incluyendo, entre otros, pesaje, medición y mezclado) para asegurar que los procedimientos, cuando se usen, darán constantemente como resultado la calidad esperada de la preparación terminada. 11. La preparación final se evalúa usando factores tales como peso, aptitud de mezclado, claridad, olor, color, consistencia, pH y análisis analítico, según sea apropiado; y esta información se registra en el Registro de Preparación Magistral (ver (1163)). 12. La preparación se envasa según se recomienda en la sección Envasado y Envases de Preparaciones Magistrales de este capítulo. 1 3. El envase de la preparación se etiqueta de conformidad con todas las legislaciones estatales y federales aplicables. El etiquetado deberá incluir la FLU y la información de almacenamiento y manipulación. El etiquetado debe indicar que "ésta es una preparación magistral". 14. El preparador ha revisado el Registro Maestro de Formulación y el Registro de Preparación Magistral para asegurarse que no hayan ocurrido errores en el proceso de preparación magistral y que la preparación es adecuada para su uso. 15. La preparación se entrega al paciente o al proveedor de cuidados con la consulta apropiada.
INSTALACIONES DE PREPARACIÓN MAGISTRAL Las instalaciones de preparación magistral deberán tener un espacio adecuado específicamente diseñado para preparar las prescripciones. Este espacio deberá mantener la colocación ordenada del equipo y materiales para prevenir confusiones entre ingredientes, envases, etiquetas, materiales en proceso y preparaciones terminadas; asimismo, su diseño, disposición y uso se enfoca en prevenir contaminación cruzada accidental. Las áreas destinadas a las preparaciones estériles deberán estar separadas y ser distintas de las usadas para las preparaciones no estériles (ver Preparación Magistral-Preparaciones Estériles (797), Calidad
y Control Ambienta0.
Se debe proveer agua potable para el lavado de manos y equipo. Esta agua cumple con normas establecidas en National Primary Drinking Water Regulations (Reglamentaciones Básicas sobre Agua Potable) de la Environmental Protection Agency (Agencia de Protección Ambiental) (40 CFR Parte 141). Se deberá usar Agua Purificada (ver la monografía de Agua Purificada) para elaborar preparaciones de medicamentos no estériles cuando las formulaciones indiquen el uso de agua. Se debe usar Agua Purificada para enjuagar el equipo y los utensilios. Cuando se usa agua para elaborar una preparación estéril, se deben seguir las monografías y los capítulos generales apropiados (ver Agua para Uso Farmacéutico (1231 )). El sistema de cañerías deberá estar libre de defectos que pudieran contribuir a la contaminación de las preparaciones magistrales. Se debe contar con acceso fácil a instalaciones de lavado de manos y equipo en las áreas de preparación magistral. Dichas instalaciones deberán incluir, entre otros, agua caliente y fría, jabón o detergente y secadores de aire o toallas desechables o de un solo uso. Las áreas usadas para la preparación magistral deberán mantenerse limpias, ordenadas y en condiciones sanitarias, y deberán mantenerse en buenas condiciones de mantenimiento. La basura debe depositarse y desecharse de manera sanitaria y oportuna y de conformidad con las pautas locales, estatales y federales. Toda el área de preparación magistral y de almacenamiento debe mantenerse bien iluminada. Hay que controlar los sistemas de calefacción, de ventilación y de aire acondicionado para evitar la descomposición y contaminación de los productos químicos (ver Requisitos de Envasado y Almacenamiento (659) y las condiciones de almacenamiento dispuestas por el fabricante). Se debe mantener un monitoreo adecuado de temperatura y humedad según se requiera para ciertos componentes y formas farmacéuticas preparadas. Todos los componentes, equipos y envases deben almacenarse alejados del piso a fin de prevenir la contaminación y permitir la inspección y limpieza del área de elaboración y almacenamiento de la preparación magistral. Los fármacos peligrosos deben ser almacenados, preparados y manipulados por personal adecuadamente capacitado en condiciones que protejan a los trabajadores del cuidado de la salud y demás personal. A continuación se presentan referencias para la manipulación segura de fármacos antineoplásticos y peligrosos en instalaciones de cuidados de la salud: • OSHA Technical Manual (Manual Técnico de OSHA)-Sección VI: Capítulo 2, Controlling Occupational Exposure to Hazardous Drugs (Control de Exposición Ocupacional a Fármacos Peligrosos)
• NIOSH Alert (Alerta de NIOSH): Preventing Occupational Exposure to Antineoplastic and Other Hazardous Drugs in Health Care Settings(Prevención de Exposición Ocupacional a Fármacos Antineoplásticos y Otros Fármacos Peligrosos en Instalaciones de Cuidados de la Salud) [DHHS (NIOSH) Publicación No. 2004-165) y actualizaciones.
666 (795) Preparación Magistral-Preparaciones No Estériles/ Pruebas Físicas
USP 39
La eliminación de todos los fármacos peligrosos debe cumplir con todas las reglamentaciones federales y estatales correspondientes. Todo el personal que lleve a cabo la eliminación de desechos y actividades de limpieza rutinaria en las áreas de almacenamiento y preparación de fármacos peligrosos deberá estar capacitado en los procedimientos adecuados para protegerse a sí mismos y prevenir la contaminación.
EQUIPO PARA ELABORAR LA PREPARACIÓN MAGISTRAL El equipo y los utensilios usados para elaborar la preparación magistral de un medicamento deberán tener un diseño y capacidad apropiados. Para no afectar ni alterar la pureza de las preparaciones, la composición del equipo deberá ser adecuada, de modo que las superficies que entran en contacto con los componentes no reaccionen, no provoquen adiciones, ni los adsorban. El tipo y las dimensiones del equipo dependen de las formas farmacéuticas y las cantidades que se preparen (ver (1176) y los manuales de instrucciones suministrados por el fabricante del equipo). El equipo deberá almacenarse para protegerlo de la contaminación y deberá estar ubicado de forma tal que se facilite su uso, mantenimiento y limpieza. El equipo automatizado, mecánico, electrónico y de otros tipos usado en la elaboración o análisis de preparaciones magistrales deberá inspeccionarse de manera rutinaria, calibrarse según sea necesario, y verificarse para asegurar el desempeño adecuado. El preparador deberá inspeccionar el equipo para determinar su aptitud de uso inmediatamente antes de realizar las operaciones de preparación magistral. El equipo deberá limpiarse apropiadamente después de su uso. Se debe tener extremo cuidado al limpiar el equipo usado en la elaboración de preparaciones magistrales que requieran de precauciones especiales (p.ej., antibióticos, materiales citotóxicos y otros materiales peligrosos). Cuando sea posible, se debe destinar equipo especial para tal propósito, o cuando se use el mismo equipo para todos los productos farmacéuticos, se debe contar con procedimientos adecuados para permitir la limpieza meticulosa del equipo antes de usarlo con otros medicamentos. Cuando sea posible, se debe usar equipo desechable para reducir la probabilidad de biocarga o contaminación cruzada.
SELECCIÓN, MANIPULACIÓN V ALMACENAMIENTO DE COMPONENTES Las siguientes pautas se deben seguir al seleccionar, manipular y almacenar componentes para las preparaciones magistrales. 1. Se recomienda una sustancia de calidad Farmacopea de los Estados Unidos de América (USP), Formulario Nacional (NF) o Food Chemicals Codex (FCC) como fuente de ingredientes para elaborar todas las preparaciones. 2. Los preparadores deben intentar primero usar componentes fabricados en una instalación registrada con la FDA. Cuando no sea posible obtener componentes de una instalación registrada con la FDA, los preparadores deben usar su criterio profesional al seleccionar una fuente aceptable y confiable y deben establecer la pureza y la seguridad mediante métodos razonables, los cuales deben incluir un Certificado de Análisis, reputación del fabricante y confiabilidad de la fuente. 3. Las preparaciones magistrales oficiales se elaboran a partir de ingredientes individuales que cumplen con los requisitos de la monografía oficial para los ingredientes que cuentan con monografía. Estas preparaciones se pueden etiquetar con las siglas USP o NF, según corresponda. 4. Cuando no sea posible obtener componentes de calidad farmacopeica, se pueden usar componentes de alta calidad tales como aquéllos que son químicamente puros, de grado reactivo analítico o certificados por la American Chemical Society. No obstante, estos componentes se deben usar con cuidado puesto que los estándares para reactivos analíticos o los materiales de grado certificado por la American Chemical Society no consideran si una impureza presente implica riesgos de seguridad para humanos o animales. 5. Para componentes en envases con una fecha de caducidad proporcionada por el fabricante o distribuidor, el material puede usarse en la preparación magistral antes de dicha fecha de caducidad (a) cuando el material se almacene en su envase original en condiciones que eviten la descomposición de las sustancias químicas (ver (1191) y (659), a menos que se citen otras condiciones en la etiqueta), (b) cuando exista una exposición mínima del material remanente cada vez que se extrae material del envase y (c) cuando cualquier extracción del envase es llevada a cabo por personal capacitado en la manipulación adecuada del material. Si el componente ha sido transferido a un envase distinto, dicho envase deberá identificarse con el nombre del componente, proveedor original, lote o número de control, fecha de transferencia y fecha de caducidad, y deberá ofrecer una integridad equivalente o mejor que la del envase original. 6. Para componentes que no tienen fechas de caducidad asignadas por el fabricante o el proveedor, el preparador deberá etiquetar el envase con la fecha de recepción y asignar una fecha de caducidad prudente al componente que no exceda de tres años a partir de la fecha de recepción (ver Fecha de Caducidad y Fecha Límite de Uso en Etiquetado en Conservación, Envasado, Almacenamiento y Etiquetado en Advertencias y Requisitos Generales) basándose en la naturaleza del componente y su mecanismo de degradación, el envase en el que está envasado y las condiciones de almacenamiento. 7. Cuando se usa un medicamento fabricado como fuente del ingrediente activo, el medicamento deberá haber sido fabricado en una instalación registrada con la FDA y el envase del producto provisto por el fabricante deberá estar etiquetado con un número de control de partida y una fecha de caducidad. Cuando se elaboran preparaciones magistrales con medicamentos fabricados, el preparador debe considerar todos los ingredientes, incluidos los excipientes presentes en el medicamento con respecto al uso previsto de la preparación magistral, así como el efecto que tendrá la manipulación del medicamento sobre la aptitud terapéutica y la estabilidad de los componentes.
USP 39
Pruebas Físicas/ (795) Preparación Magistral-Preparaciones No Estériles 667
8. Cuando la preparación esté destinada para su uso como suplemento dietético o nutricional, el preparador deberá respetar este capítulo y deberá cumplir con todos los requisitos federales y estatales. En general, los suplementos dietéticos se preparan con ingredientes que cumplen con las normas USP, FCC o NF. Cuando no existan tales estándares, se pueden usar sustancias con una calidad de grado alimenticio comprobada usando otros procedimientos adecuados. 9. Cuando un componente se deriva de animales rumiantes (p.ej., bovinos, caprinos, ovinos), el proveedor deberá proporcionar garantía por escrito de que el componente cumple con todas las leyes federales que rigen los requisitos de procesamiento, uso e importación para estos materiales. 1 O. Cuando se elaboran preparaciones magistrales para humanos, el preparador deberá consultar la lista de componentes que han sido retirados o extraídos del mercado por la FDA por razones de seguridad o eficacia (ver www.FDA.gov). Cuando se elaboran preparaciones magistrales para animales con los que se producen alimentos, el preparador debe consultar la lista de componentes prohibidos para su uso en animales con los que se producen alimentos. 11. Todos los componentes usados en la elaboración de preparaciones magistrales deben almacenarse según las instrucciones del fabricante o de acuerdo con los requisitos de la monografía USP, NF o FCC, en un área limpia y en condiciones de temperatura y humedad apropiadas (temperatura ambiente controlada, refrigerador o congelador). Todos los componentes deben almacenarse alejados del piso, manipularse y almacenarse para prevenir contaminación, y rotarse de modo que se use primero el componente más antiguo. Todos los envases deben etiquetarse apropiadamente.
CRITERIOS DE ESTABILIDAD Y DETERMINACIÓN DE LA FECHA LÍMITE DE USO La FLU es la fecha después de la cual la preparación magistral no debe usarse y se determina a partir de la fecha de elaboración de la preparación. Debido a que las preparaciones magistrales están destinadas a administrarse inmediatamente o luego de un período de almacenamiento corto, las fechas límite de uso pueden determinarse en función de criterios distintos a los utilizados para determinar las fechas de caducidad de los medicamentos fabricados. Las FLU deben fijarse de manera conservadora. Para determinar la FLU, los preparadores deben consultar y aplicar la información disponible en la documentación y literatura sobre la estabilidad en general y la del fármaco en particular, y deben considerar: • la naturaleza del fármaco y su mecanismo de degradación • la forma farmacéutica y sus componentes • el potencial de proliferación microbiana en la preparación • el envase en el que está envasado • las condiciones de almacenamiento esperadas •la duración prevista de la terapia (ver Fecha de Caducidad y Fecha Límite de Uso en Etiquetado en Conservación, Envasado, Almacenamiento y Etiquetado en Advertencias y Requisitos Generales). Cuando se usa un producto fabricado como fuente del ingrediente activo farmacéutico para una preparación magistral no estéril, la fecha de caducidad del producto no podrá usarse como único elemento para fijar una FLU para la preparación magistral, sino que el preparador deberá referirse a la información de estabilidad provista por el fabricante y a la literatura para obtener información aplicable sobre estabilidad, compatibilidad y degradación de ingredientes, además de considerar los factores de estabilidad presentados en (1191 ); asimismo, deberá usar sus conocimientos de preparación magistral y experiencia. Todos los datos de estabilidad deben ser cuidadosamente interpretados en función de la formulación preparada real. Es necesario que el preparador observe el medicamento preparado para detectar signos de inestabilidad durante todas las etapas del proceso de preparación, dispensación y almacenamiento. En (1191 ), Consideraciones sobre Estabilidad en la Práctica de Dispensación, se encuentran detalles más específicos sobre algunos signos de deterioro físico comunes. Sin embargo, la degradación química excesiva y otras pérdidas de concentración del fármaco ocasionadas por reacciones suelen ser invisibles.
Pautas Generales Para Fijar la Fecha Límite de Uso Ante la ausencia de información de estabilidad del fármaco y de la preparación específicos, la siguiente tabla presenta las fechas límite de uso máximas recomendadas para preparaciones magistrales de fármacos no estériles que se envasan en envases impermeables y resistentes a la luz y se almacenan a temperatura ambiente controlada, a menos que se indique algo distinto (ver (659)). Los fármacos o químicos que tienden a descomponerse requerirán de FLU más cortas. FLU por Tipo de Formulaciónª Para Formulaciones No Acuosas-La FLU no deberá ser mayor al tiempo restante hasta la fecha de caducidad más cercana de cualquier ingrediente activo farmacéutico o 6 meses, lo que ocurra primero. Para Formulaciones Orales que Contienen Agua-La FLU no deberá ser mayor de 14 días cuando se almacenan a temperaturas frías controladas. Para Formulaciones Líquidas o Semisólidas que Contienen Agua, de aplicación Tópica/Dérmica o sobre Mucosas-La FLU no deberá ser mayor de 30 días.
ª
Las siguientes FLU máximas se recomiendan para preparaciones magistrales de medicamentos no estériles cuando no se cuenta con información de estabilidad del fármaco o la preparación específicos. La FLU no deberá ser mayor a la fecha de caducidad indicada en el envase de cualquier componente.
668 (795) Preparación Magistral-Preparaciones No Estériles/ Pruebas Físicas
USP 39
Las preparaciones susceptibles deben contener agentes anti microbianos adecuados que las protejan de la contaminación por bacterias, levaduras y hongos introducidos inadvertidamente durante o después del proceso de preparación magistral. Cuando existe una contraindicación para conservantes antimicrobianos en estas preparaciones magistrales, será necesario almacenar la preparación a temperatura fría controlada; para asegurar el almacenamiento y la manipulación adecuados de tales preparaciones magistrales por parte del paciente o el proveedor de cuidados, resulta esencial instruir y ofrecer consulta apropiada al paciente. No se deben usar conservantes antimicrobianos como sustitutos de las buenas prácticas de preparación magistral. Para información sobre asignación de FLU para medicamentos reenvasados para dispensación o administración, ver Fecha de Caducidad y Fecha Límite de Uso en Etiquetado en Conservación, Envasado, Almacenamiento y Etiquetado en Advertencias y Requisitos Generales y Envasado y Reenvasado-Envases Unitarios (11 36). Es obligatorio garantizar la esterilidad de una preparación magistral estéril. La preparación y el envasado de medicamentos estériles, (incluidas las preparaciones oftálmicas) requieren un cumplimiento estricto de las pautas contenidas en (797) y en las instrucciones de etiquetado del fabricante.
Cambio en la redacción:
ENVASADO Y ENVASES DE PREPARACIONES MAGISTRALES El preparador debe asegurar que los envases y cierres de envases usados en el envasado de preparaciones magistrales cumplen con los requisitos de USP (ver (659); Envases-Vidrio (660); •Sistemas de Envases Plásticos y sus tytateríales
DOCUMENTACIÓN SOBRE PREPARACIÓN MAGISTRAL La documentación, escrita o electrónica, permite al preparador rastrear, evaluar y repetir sistemáticamente los pasos incluidos en todo el proceso de elaboración de una preparación magistral, siempre que lo necesite. Todos los preparadores que dispensan recetas deben cumplir con los requisitos de manutención de registros de sus consejos estatales de farmacia. No se requiere documentación adicional cuando el preparador elabora una preparación magistral de acuerdo con las instrucciones del etiquetado provistas por el fabricante. Todas las demás preparaciones magistrales requerirán de documentación adicional según se describe en esta sección. El período de conservación de los registros es idéntico al período dispuesto por la legislación estatal para cualquier receta médica. El registro puede ser una copia de la prescripción, escrita o en forma de registro electrónico, que incluya el Registro Maestro de Formulación y el Registro de Preparación Magistral.
Registro Maestro de Formulación Este registro deberá incluir: • nombre oficial o asignado, contenido y forma farmacéutica de la preparación • cálculos requeridos para determinar y verificar cantidades de componentes y dosis de ingredientes farmacéuticos activos • descripción de todos los ingredientes y sus cantidades • información sobre compatibilidad y estabilidad, incluyendo referencias cuando estén disponibles • equipo necesario para elaborar la preparación, cuando corresponda • instrucciones de mezclado que deberán incluir: 1. orden de mezclado 2. temperaturas de mezclado u otros controles ambientales 3. duración del mezclado 4. otros factores pertinentes a la reproducción de la preparación a medida que se elabora. • información de etiquetado de la muestra, que deberá contener, además de la información legalmente requerida: 1 . nombre genérico y cantidad o concentración de cada ingrediente activo 2. FLU asignada
USP 39
• • • •
Pruebas Físicas/ (795) Preparación Magistral-Preparaciones No Estériles 669
3. condiciones de almacenamiento 4. número de prescripción o de control, según corresponda. envase usado para la dispensación requisitos de envasado y almacenamiento descripción de la preparación final procedimientos de control de calidad y resultados esperados.
Registro de Preparación Magistral El • • • • • • • • • • • • •
Registro de Preparación Magistral deberá contener: el nombre oficial o asignado, contenido y dosis de la preparación referencia al Registro Maestro de Formulación para la preparación nombres y cantidades de todos los componentes fuentes, números de lote y fechas de caducidad de los componentes cantidad total preparada nombre de la persona que elaboró la preparación, nombre de la persona que llevó a cabo los procedimientos de control de calidad y nombre del preparador que aprobó la preparación fecha de preparación número de control o prescripción asignado FLU asignada doble etiqueta según se describe en el Registro Maestro de Formulación descripción de la preparación final resultados de los procedimientos de control de calidad (p.ej., intervalo de peso de las cápsulas llenadas, pH de líquidos acuosos) documentación de cualquier problema de control de calidad y cualquier reacción adversa o problema de la preparación informados por el paciente o el proveedor de cuidados.
Procedimientos Operativos Estándar Todos los procedimientos significativos realizados en el área de preparación magistral deben estar cubiertos por procedimientos operativos estándar (POE) escritos. Deben desarrollarse procedimientos para instalaciones, equipo, personal, preparación, envasado y almacenamiento de preparaciones magistrales para asegurar la confiabilidad, exactitud, calidad, seguridad y uniformidad de la preparación magistral. La aplicación de POE establece una uniformidad en los procedimientos, además de proveer referencias para la orientación y capacitación del personal.
Archivos de Hojas de Datos de Seguridad de los Materiales Las Hojas de Datos de Seguridad de los Materiales (MSDS, por sus siglas en inglés) deben ser de fácil acceso para todos los empleados que trabajan con medicamentos o productos químicos a granel ubicados en las instalaciones de preparación magistral. Debe instruirse a los empleados acerca de cómo conseguir e interpretar la información necesaria.
CONTROL DE CALIDAD La seguridad, la calidad y el desempeño de las preparaciones magistrales dependen de una correcta utilización de los ingredientes, cálculos bien hechos, mediciones precisas y exactas, condiciones y procedimientos de formulación adecuados y el ejercicio prudente del criterio farmacéutico. El preparador deberá realizar una última verificación de cada procedimiento utilizado en el proceso de preparación magistral. El preparador, con el fin de asegurar la exactitud y la integridad, deberá observar la preparación terminada para determinar que su apariencia es la esperada y deberá investigar cualquier discrepancia, adoptando las medidas necesarias para corregirlas antes de dispensar la receta médica al paciente.
Controles para la Preparación Magistral 1. Es necesario seguir el Registro Maestro de Formulación, el Registro de Preparación Magistral, y los procedimientos escritos relacionados durante la ejecución del proceso de preparación magistral. Cualquier desviación en los procedimientos debe ser documentada. 2. El preparador deberá realizar una verificación y posteriormente volver a verificar cada procedimiento en cada etapa del proceso. Cuando sea posible, una segunda persona capacitada debe verificar cada etapa crítica del proceso de preparación. 3. El preparador deberá contar con procedimientos establecidos por escrito que describan las pruebas o exámenes realizados a la preparación magistral (p.ej., el grado de variación de peso entre cápsulas) para asegurar su uniformidad e integridad.
670 (795) Preparación Magistral-Preparaciones No Estériles/ Pruebas Físicas
USP 39
4. Se deben establecer procedimientos de control adecuados para monitorear los resultados y para verificar el desempeño de los procesos de preparación y equipos que pudieran ser responsables de las variaciones en las preparaciones magistrales finales. 5. Para más información y pautas sobre los procesos de control de calidad recomendados, ver (1163).
CONSEJOS AL PACIENTE Al momento de dispensar la receta, se debe aconsejar al paciente o al representante del paciente sobre el uso, almacenamiento, manipulación y desecho apropiados de la preparación. Además, se debe instruir al paciente o al representante del paciente para que informe sobre cualquier evento adverso y para que observe e informe al preparador sobre cualquier cambio en las características físicas de la preparación magistral (ver (1191 ), Responsabilidad del Farmacéutico). El preparador deberá investigar y documentar cualquier problema informado que se relacione con una preparación magistral, y deberá tomar las medidas correctivas.
CAPACITACIÓN Todo el personal implicado en la preparación, evaluación, envasado y dispensación de preparaciones magistrales deberá recibir capacitación adecuada para el tipo de preparación magistral realizada. Es responsabilidad del preparador asegurar la implementación de un programa de capacitación y que éste se aplique de manera continua. El personal de preparación magistral debe ser evaluado por lo menos una vez al año. Las etapas en el proceso de capacitación incluyen lo siguiente: •Todos los empleados implicados en la preparación magistral farmacéutica deberán leer y familiarizarse con este capítulo. Además, deben estar familiarizados con el contenido de la USP Pharmacists' Pharmacopeia y demás publicaciones pertinentes, lo cual incluye cómo leer e interpretar las MSDS. •Todos los empleados deberán leer y familiarizarse con cada uno de los procedimientos relacionados con la preparación magistral, incluyendo aquéllos que involucren las instalaciones, equipo, personal, preparación magistral en sí misma, evaluación, envasado, almacenamiento y dispensación. •Todo el personal que elabore preparaciones magistrales de fármacos peligrosos deberá estar totalmente capacitado en almacenamiento, manipulación y desecho de estos fármacos. Esta capacitación se debe dar antes de preparar o manipular fármacos peligrosos. Para información sobre capacitación de personal que elabora preparaciones magistrales de fármacos peligrosos, ver las referencias en la sección Instalaciones de Preparación Magistral de este capítulo. •Todas las actividades de capacitación deberán quedar documentadas. El preparador deberá reunirse con los empleados para revisar su trabajo y responder cualquier pregunta de los empleados en relación con los procedimientos de preparación magistral. • El preparador deberá hacer una demostración de los procedimientos para el empleado y deberá observar y guiar al empleado durante todo el proceso de capacitación. Posteriormente, el empleado repetirá el procedimiento sin recibir ayuda alguna por parte del preparador pero bajo su supervisión directa. • Cuando el empleado haya demostrado al preparador un conocimiento verbal y funcional del procedimiento se le permitirá realizar el procedimiento sin supervisión directa. No obstante, el preparador deberá estar presente físicamente y deberá aprobar todos los ingredientes y sus cantidades, así como la preparación final. • Cuando el preparador esté satisfecho con el conocimiento y competencia del empleado, el preparador deberá firmar los registros de documentación para demostrar que el empleado ha recibido la capacitación adecuada. • El preparador deberá monitorear continuamente el trabajo del empleado y asegurar que los cálculos y el trabajo del empleado sean exactos y se realicen de manera adecuada. • El preparador es el único responsable de la preparación terminada.
PREPARACIONES MAGISTRALES PARA PACIENTES ANIMALES La responsabilidad del preparador para proporcionar preparaciones magistrales de alta calidad a los pacientes se extiende más allá de los seres humanos. Todas las partes de este capítulo se aplican a preparaciones magistrales formuladas para pacientes animales. Se deberá determinar antes de realizar la preparación magistral si la misma está destinada al uso de un paciente animal (p.ej., de compañía, de competición, para alimento). Debido a que el alimento derivado de pacientes animales puede ser consumido por seres humanos, se debe tener cuidado para prevenir que los residuos del fármaco ingresen en la cadena alimenticia humana cuando se elaboran preparaciones magistrales para su uso en pacientes animales. Por esta razón, todos los preparadores que preparan formulaciones para animales deben tener conocimientos funcionales sobre regulación y aplicación de fármacos en pacientes animales. Por ley, los veterinarios están obligados a proporcionar a los cuidadores de animales con los que se producen alimentos un periodo de retención de los tejidos de animales tratados (p.ej. carne, leche, huevo) antes de introducirlos en el suministro alimenticio humano. Este periodo se denomina tiempo de retiro (WDT, por sus siglas en inglés) y, por ley, también se debe incluir en la etiqueta de dispensación de cada prescripción preparada para especies que se usan en la producción de alimentos.
USP 39
Pruebas Físicas/ (795) Preparación Magistral-Preparaciones No Estériles 671
El uso de fármacos en cualquier animal de competición está estrictamente regulado por los gobiernos federal y estatales, además de los órganos que rigen cada una de las disciplinas específicas. Las penas por infringir dichas reglas pueden ser severas para todos los que contribuyan con la falta, incluidos veterinarios, farmacéuticos y cuidadores. El farmacéutico deberá estar apercibido de las limitantes para las especies específicas en su capacidad fisiológica y metabólica que pudieran resultar en toxicidad cuando se usan ciertos fármacos o excipientes en las preparaciones magistrales. Por esta razón, los preparadores que elaboran preparaciones para animales deben usar, cuando sea posible, formulaciones desarrolladas específicamente para pacientes animales. Cuando dichas formulaciones no estén disponibles, el preparador deberá revisar la literatura para determinar si un componente específico de la fórmula es tóxico para las especies a tratar. La extrapolación de formulaciones que se preparan magistralmente destinadas para su uso en humanos puede no ser adecuada para especies animales y puede ocasionar resultados negativos. Los veterinarios y farmacéuticos que elaboran preparaciones para pacientes animales deben estar familiarizados con todas las legislaciones estatales y federales relacionadas con el uso de fármacos en animales, incluyendo, entre otras, la Food, Drug, and Cosmetic Act (Ley de Alimentos, Fármacos y Cosméticos); la Animal Drug Amendment (Enmienda sobre Fármacos en Animales); la Animal Medicinal Drug Use Clarification Act (Ley de Aclaración del Uso Medicinal de Fármacos en Animales); y la Compliance Policy Guideline for Compounding of Drugs for Use in Animal Patients (Guía sobre las Políticas de Preparación Magistral de Fármacos para su Uso en Pacientes Animales) de la FDA.
GLOSARIO Ingrediente Farmacéutico Activo (API, por sus siglas en inglés): Cualquier sustancia o mezcla de sustancias destinadas a su uso en una preparación magistral de medicamentos, convirtiéndose así en el ingrediente activo de dicha preparación y que proporciona una actividad farmacopeica u otro efecto directo en el diagnóstico, cura, mitigación, tratamiento o prevención de enfermedades en humanos y animales o que afecta la estructura y función del cuerpo. Sustancias Agregadas: Son ingredientes necesarios para elaborar una preparación pero sin la intención ni la expectativa de causar una respuesta farmacológica si se administran aisladamente en la cantidad o concentración contenida en una dosis única de la preparación magistral. El término se usa como sinónimo con los términos ingredientes inactivos, excipientes e ingredientes farmacéuticos.
Fecha Límite de Uso (FLU): Es la fecha después de la cual no debe usarse una preparación magistral y se determina a partir de la fecha de elaboración de la preparación. Componente: Cualquier ingrediente usado en la elaboración de una preparación magistral de fármacos, incluyendo cualquier ingrediente activo o sustancia agregada que se usa en su preparación. Preparador: Profesional autorizado por la jurisdicción apropiada para elaborar preparaciones magistrales de acuerdo con una receta u orden de medicación de un prescriptor autorizado. Preparación magistral: La preparación, mezcla, reconstitución, alteración, envasado y etiquetado de un medicamento, dispositivo de administración del medicamento o dispositivo de acuerdo con la prescripción, orden de medicación o iniciativa de un profesional autorizado basado en la relación entre el profesional, el paciente, el farmacéutico y el preparador en el curso de una práctica profesional. La preparación magistral incluye lo siguiente: • La preparación de formas farmacéuticas para pacientes humanos y animales • La preparación de medicamentos o dispositivos anticipando recetas de medicamentos basadas en patrones rutinarios de prescripción observados con regularidad • La reconstitución o manipulación de productos comerciales que puedan requerir el agregado de uno o más ingredientes •La preparación de medicamentos o dispositivos con el propósito de investigación (clínica o académica), enseñanza o análisis químico, o como resultado incidental de los mismos • La preparación de medicamentos y dispositivos para uso en el lugar de trabajo del prescriptor cuando así lo permita la legislación federal y estatal Fármaco Peligroso: Cualquier fármaco identificado por al menos uno de los seis criterios siguientes: • Carcinogenicidad • Teratogenicidad o toxicidad en el desarrollo •Toxicidad reproductiva en humanos •Toxicidad en órganos a dosis bajas en humanos o animales • Genotoxicidad • Nuevos fármacos que reproduzcan fármacos peligrosos en su estructura o toxicidad [se pueden encontrar ejemplos en las publicaciones vigentes del National lnstitute for Occupational Safety and Health (NIOSH)] Fabricación: La producción, propagación, conversión o procesamiento de un fármaco o dispositivo médico, ya sea directa o indirectamente, mediante extracción del fármaco de sustancias de origen natural o mediante síntesis química o biológica. La fabricación también puede incluir cualquier envasado o reenvasado de las sustancias o etiquetado o reetiquetado de envases para su reventa en farmacias, por parte de profesionales u otras personas. Preparación: A los efectos de este capítulo, se refiere a una forma farmacéutica o suplemento dietético elaborado por preparación magistral o un dispositivo en el que el preparador ha introducido un fármaco. Este término se usará para describir formulaciones preparadas magistralmente; el término producto se usará para describir formas farmacéuticas fabricadas. (Para las definiciones de sustancia oficial y productos oficiales, ver Advertencias y Requisitos Generales.)
USP 39
672 (795) Preparación Magistral-Preparaciones No Estériles/ Pruebas Físicas
Estabilidad: Se define como la conservación, dentro de ciertos límites específicos y durante todo el periodo de almacenamiento y utilización, de las mismas propiedades y características que poseía la preparación cuando se elaboró (ver en Consideraciones sobre Estabilidad en la Práctica de Dispensación (1191 ), la tabla Criterios de Niveles Aceptables de Estabilidad). Vehículo: Componente de uso interno o externo empleado como portador o diluyente en el que se suspenden o disuelven líquidos, semisólidos o sólidos. Ejemplos de vehículos incluyen, entre otros, agua, jarabes, elíxires, líquidos oleaginosos, portadores sólidos y semisólidos y productos de propiedad exclusiva.
(797) PREPARACIÓN MAGISTRAL-PREPARACIONES ESTÉRILES Cambio en Ja redacción:
INTRODUCCIÓN El objetivo de este capítulo es describir las condiciones y prácticas para evitar lesiones, e incluso la muerte de pacientes como resultado de (1) contaminación microbiana (no esterilidad), (2) endotoxinas bacterianas en exceso, (3) variabilidad en la concentración pretendida de los ingredientes correctos, que exceda bien sea los límites de la monografía para artículos oficiales (ver "Oficial" y "Artículos Oficiales" en las Advertencias y Requisitos Generales) o 10% para los artículos no oficiales, (4) contaminantes químicos y físicos no esperados, y (5) ingredientes de calidad inadecuada en las preparaciones magistrales estériles (PME). Las PME contaminadas son potencialmente más riesgosas para los pacientes cuando se administran en cavidades corporales, los sistemas nervioso y vascular, los ojos y las articulaciones y cuando se usan como baños para órganos y tejidos vivos. Cuando las PME contienen endotoxinas bacterianas en exceso (ver Prueba de Endotoxinas Bacterianas (85)) son potencialmente más riesgosas para los pacientes cuando se administran dentro del sistema nervioso central. A pesar de la exhaustiva atención dedicada en este capítulo a la provisión, mantenimiento y evaluación de la calidad de aire, resulta fundamental evitar la contaminación directa o por contacto físico. Por lo general, se reconoce que el contacto físico o directo de sitios críticos de las PME con contaminantes, especialmente fuentes microbianas, representa la más alta probabilidad de riesgo para los pacientes. Por lo tanto, el personal que trabaja en las preparaciones magistrales debe ser meticulosamente cuidadoso en evitar la contaminación por contacto de las PME, tanto dentro de las áreas ISO Clase 5 (ver Tabla 7), como fuera de ellas. Con el fin de conseguir las cinco condiciones y prácticas descritas anteriormente, este capítulo proporciona las normas mínimas de práctica y calidad para las PME de fármacos y nutrientes, basadas en la información científica actual, así como en las mejores prácticas para preparaciones magistrales estériles. El uso de tecnologías, técnicas, materiales y procedimientos distintos de los descritos en este capítulo no está prohibido mientras se pruebe que son equivalentes o superiores, con significación estadística, a los descritos aquí. Las normas de este capítulo no se refieren a la administración clínica de PME a pacientes mediante aplicación, implantación, infusión, inhalación, inyección, inserción, instilación e irrigación, que son las rutas de administración. En este capítulo se describen cuatro categorías específicas de PME: nivel de riesgo bajo, nivel de riesgo mediano y nivel de riesgo alto, y uso inmediato. La preparación magistral estéril difiere de la preparación no estéril (ver Preparación MagistralPreparaciones No Estériles (795) • • (Atol-may-2016¡) principalmente al requerir el mantenimiento de la esterilidad cuando se preparan exclusivamente con ingredientes y componentes estériles (es decir, PME de uso inmediato, PME de nivel de riesgo bajo y PME de nivel de riesgo mediano) y la consecución de esterilidad al prepararlas con ingredientes y componentes no estériles (es decir, PME de nivel de riesgo alto). Algunas diferencias entre las normas para la preparación magistral estéril en este capítulo y aquellas de las preparaciones magistrales no estériles en Preparación Magistral-Preparaciones No Estériles (795) incluyen, entre otras, ambientes de aire con clasificación ISO (ver Tabla 1); vestimenta y guantes del personal; capacitación del personal y pruebas sobre principios y prácticas de manipulaciones asépticas y esterilización; especificaciones de calidad ambiental y monitoreos; y desinfección de guantes y superficies de fuentes ISO Clase 5 (ver Tabla 1). Tabla 1. Clasificación ISO de Partículas en el Aire Ambiental (los límites se expresan en partículas mayores o iguales a 0,5 µm por metro cúbico [ISO actual] y pie cúbico [anteriormente Norma Federal Nº 209E, y en Jo sucesivo FS 209E (siglas en inglés)])* Nombre de la Clase
Recuento de Partículas FS 209E, pie3
FS 209E de EE.UU.
ISO, m 3
3
Clase 1
35,2
1
4
Clase 1O
352
10
Clase ISO
5
Clase 100
3520
100
6
Clase 1000
35 200
1000
7
Clase 10 000
352 000
10000
* Adaptado de la FS Nº 209E, Administración de Servicios Generales, Washington, DC, 20407 (11 de septiembre de 1992) y de ISO 14644-1 :1999, Cleanrooms and associated controlled environments-Part 1: Classification of air cleanliness. Por ejemplo, 3520 partículas mayores o iguales a 0,5 µm por m 3 (ISO Clase 5) equivalen a 100 partículas por pie 3 (Clase 100) (1 m3 = 35,2 pies 3).
Pruebas Físicas/ (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles 673
USP 39
Tabla 1. Clasificación ISO de Partículas en el Aire Ambiental (los límites se expresan en partículas mayores o iguales a 0,5 µm por metro cúbico [ISO actual] y pie cúbico [anteriormente Norma Federal Nº 209E, y en lo sucesivo FS 209E (siglas en inglés)])* (Continuación)
Nombre de la Clase Clase ISO 8
1 1
Recuento de Partículas
FS 209E de EE.UU.
ISO, m 3
1
Clase 1 00 000
3 520000
1
FS 209E, ple3 100000
• Adaptado de la FS Nº 209E, Administración de Servicios Generales, Washington, DC, 20407 (11 de septiembre de 1992) y de ISO 14644-1 :1999, Cleanrooms and associated controlled environments-Part 1: Classification of air cleanliness. Por ejemplo, 3520 partículas mayores o iguales a 0,5 µm por m 3 (ISO Clase 5) equivalen a 1 00 partículas por pie3 (Clase 100) (1 m 3 = 35,2 pies 3).
Las normas en este capítulo están destinadas a todas las personas que elaboren PME y todos los sitios donde se preparen PME (p.ej., hospitales y otras instituciones de salud, clínicas de tratamiento de pacientes, farmacias, instituciones de práctica médica y otras instalaciones y sitios en donde se preparen, almacenen y transporten PME). Entre las personas que hacen las preparaciones magistrales estériles se cuentan farmacéuticos, enfermeras, técnicos de farmacia y médicos. Estos términos reconocen que la mayoría de las preparaciones magistrales estériles las realizan o supervisan farmacéuticos en farmacias y también que este capítulo aplica a todo el personal de salud que prepara, almacena y transporta PME. A los efectos de este capítulo, PME incluye cualquiera de las siguientes: (1) Preparaciones magistrales de productos biológicos, de diagnóstico, fármacos, nutrientes y productos radiofarmacéuticos, incluyendo, entre otras, a las siguientes formas farmacéuticas que deben estar estériles cuando se administran a pacientes: inhalaciones bronquiales y nasales acuosas, baños y soluciones para órganos y tejidos vivos, inyecciones (p.ej., dispersiones coloidales, emulsiones, soluciones, suspensiones), irrigaciones para heridas y cavidades corporales, gotas y ungüentos oftálmicos e implantes tisulares. (2) Productos estériles fabricados, que se preparan estrictamente de acuerdo con las instrucciones que aparecen en el etiquetado aprobado del fabricante (prospectos adjuntos del producto) o se preparan en forma diferente a lo publicado en dicho etiquetado. [NOTA-La FDA estipula que "la Preparación Magistral no incluye mezclado, reconstitución o acciones similares que se efectúen de acuerdo con las instrucciones contenidas en el etiquetado aprobado suministrado por el fabricante del producto, así como otras instrucciones del fabricante que concuerden con el etiquetado" [21 USC 321 (k) y (m)]. Sin embargo, el etiquetado aprobado por la FDA (prospecto adjunto del producto) rara vez describe la calidad ambiental (p.ej., designación de Clase ISO del aire, la duración de la exposición a aire no clasificado por ISO, la vestimenta y guantes del personal, ni otras precauciones asépticas bajo las cuales se preparan los productos estériles para administración). La fecha o el tiempo límite de uso y almacenamiento (ver Advertencias y Requisitos Generales y Preparación Magistral-Preparaciones No Estériles (795)) para productos estériles que han sido abiertos o preparados para administración no se especifican en todos los prospectos adjuntos de todos los productos estériles. Además, cuando se especifican, tales duraciones pueden referirse a la estabilidad química y no necesariamente a la pureza o seguridad microbiológicas.]
ORGANIZACIÓN DE ESTE CAPÍTULO Las secciones de este capítulo están organizadas para facilitar a los profesionales de salud la comprensión de las prácticas fundamentales relativas a la exactitud y calidad requeridas para preparar las PME. Proporcionan la base para el desarrollo e implementación de procedimientos esenciales para la elaboración segura de PME de niveles de riesgo bajo, mediano y alto, y PME de uso inmediato, las cuales se clasifican según el potencial de contaminación microbiana, química y física. El capítulo se divide en las siguientes secciones principales: • Responsabilidad del Personal de Preparación Magistral • Niveles de Riesgo de Contaminación Microbiana en las PME •Capacitación y Evaluación del Personal en Técnicas de Manipulación Aséptica • PME de Uso Inmediato • Envases Monodosis y Multidosis • Fármacos Peligrosos como PME • Preparados Radiofarmacéuticos como PME • Extractos de Alérgenos como PME • Verificación de la Exactitud y Esterilidad de la Preparación Magistral • Calidad y Control Ambiental • Procedimientos Operativos Estándares (POE) Sugeridos • Elementos de Control de Calidad • Verificación de Dispositivos Automatizados de Preparación Magistral (DAP) para Nutrición Parenteral • Controles y Pruebas de Liberación de las Preparaciones Terminadas •Almacenamiento y Fechado de Límite de Uso • Mantenimiento de la Esterilidad, Pureza y Estabilidad de las PME Dispensadas y Distribuidas. • Capacitación del Paciente o Persona Encargada de Su Cuidado • Monitoreo del Paciente e Informe de Eventos Adversos • Programa de Garantía de Calidad (QA) • Abreviaturas y Acrónimos
674 (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles/ Pruebas Físicas
USP 39
•Glosario • Apéndices 1-V Los requisitos y recomendaciones en este capítulo se resumen en el Apéndice /. Al final del texto principal, antes de los Apéndices, se incluye una lista de abreviaturas y acrónimos. Todo el personal que participa en la elaboración de PME tiene la responsabilidad de comprender estas prácticas y precauciones fundamentales, para desarrollar e implementar los procedimientos apropiados y evaluar en forma constante dichos procedimientos y la calidad de la PME final para evitar daños.
Cambio en la redacción:
RESPONSABILIDAD DEL PERSONAL DE PREPARACIÓN MAGISTRAL El personal de preparación magistral tiene la responsabilidad de asegurar que las PME estén debidamente identificadas, medidas, diluidas y mezcladas, y correctamente purificadas, esterilizadas, envasadas, selladas, etiquetadas, almacenadas, dispensadas y distribuidas. Estas responsabilidades incluyen el mantenimiento de condiciones higiénicas apropiadas y el suministro de etiquetado e instrucciones suplementarias para la administración clínica correcta de las PME. Los supervisores de preparación magistral deben asegurar, ya sea mediante la evaluación directa o a través de fuentes de información apropiadas, que cada PME mantiene el contenido declarado hasta su FLU dentro de los límites de la monografía correspondiente de USP, o dentro de un 10% de variación en los casos no especificados. Todas las PME deben prepararse de manera tal que se mantenga la esterilidad y se reduzca al mínimo la introducción de partículas. Todo procedimiento escrito de garantía de calidad debe incluir los siguientes controles de proceso, los cuales deberán aplicarse, según corresponda, a las PME específicas: exactitud y precisión de la medición y pesado; requisitos de esterilidad; métodos de esterilización y purificación; intervalos y límites seguros de concentración de ingredientes, endotoxinas bacterianas y partículas; pH; totalidad y exactitud de la información incluida en el etiquetado; asignación de la FLU; y requisitos de empaque y almacenamiento. El dispensador deberá, cuando corresponda y sea factible, obtener y evaluar los resultados de las pruebas de identidad, contenido, pureza y esterilidad antes de dispensar una PME. Los profesionales de la salud, calificados y autorizado, a cargo de supervisar la preparación magistral y la dispensación de las PME deberán asegurar que se cumplan los siguientes objetivos: 1. El personal de preparación magistral debe contar con las habilidades, educación, instrucción y capacitación apropiadas para realizar y documentar correctamente las siguientes actividades relacionadas con sus responsabilidades en la preparación estéril: a. realizar la limpieza antiséptica de manos y desinfección de las superficies de preparación no estériles; b. seleccionar y colocarse la vestimenta en forma apropiada; c. mantener o conseguir la esterilidad de las PME en dispositivos CIP, ISO Clase 5 (ver Tabla 1) y proteger al personal y a los ambientes de preparación magistral de la contaminación por fármacos radioactivos, citotóxicos y quimiotóxicos (ver Fármacos Peligrosos como PME y Preparados Radiofarmacéuticos como PME); d. identificar, pesar y medir los ingredientes; y e. manipular los productos estériles en forma aséptica, esterilizar las PME de nivel de riesgo alto y etiquetar e inspeccionar la calidad de las PME. 2. Los ingredientes deben tener la identidad, calidad y pureza correctas. 3. Los envases de ingredientes abiertos o parcialmente usados que se van a emplear posteriormente en PME deben almacenarse apropiadamente bajo condiciones de acceso restringido en las instalaciones donde se realiza la preparación magistral. Dichos envases no podrán utilizarse cuando se detecte en una inspección visual que hay roturas no autorizadas en el envase, cierre y sello; cuando el contenido no posea el aspecto, aroma y textura esperados; cuando el contenido no pase las pruebas de identificación especificadas por la institución responsable de la preparación magistral, y cuando haya excedido la FLU o fecha de caducidad. 4. Las PME que contienen agua y que son no estériles durante cualquier fase del procedimiento de preparación deben esterilizarse dentro de las 6 horas posteriores a la finalización de la preparación, para reducir al mínimo la generación de endotoxinas bacterianas. 5. Los métodos de esterilización deben lograr la esterilidad de las PME, manteniendo el contenido declarado de los ingredientes activos y la integridad física del envase. 6. Los dispositivos utilizados para medición, mezclado, esterilización y purificación deben estar limpios y ser apropiadamente exactos y eficaces para los usos a los que están destinados. 7. Se debe evaluar cuidadosamente el daño potencial relacionado con las sustancias agregadas, y las diferencias en el grado y la velocidad de biodisponibilidad de los ingredientes activos para las vías de administración no oral antes de dispensar y administrar dichas PME. 8. El envase seleccionado para las PME debe ser apropiado para conservar la esterilidad y el contenido hasta la FLU. 9. Durante su uso, el entorno de preparación magistral debe mantener la esterilidad o la pureza previa a la esterilización de la PME, según corresponda. 1O. Las etiquetas de las PME deben indicar los nombres y las cantidades o concentraciones de los ingredientes activos; y las etiquetas o etiquetado de inyecciones (ver Conservación, Envasado, Almacenamiento y Etiquetado en las Advertencias y Re-
Pruebas Físicas/ (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles 675
USP 39
quisitos Generales) enumeran los nombres y las cantidades o concentraciones de todos los ingredientes (ver 1~!11~111 iRl1!1Jl~ilfiiil>· Antes de su dispensación o administración, debe verificarse visualmente la transparencia de las solucio-
nes y, además, deben revisarse la identidad y la cantidad de los ingredientes, los procedimientos de preparación y esterilización de las PME y los criterios de liberación específicos para asegurarse de que sean exactos y completos. 11. Las FLU deben asignarse basándose en pruebas directas o por extrapolación de publicaciones de referencia y otra documentación confiables (ver Criterios de Estabilidad y Fecha Límite de Uso en Preparación Magistral-Preparaciones No Estériles (795)).
12. Los procedimientos para medir, mezclar, diluir, purificar, esterilizar, envasar y etiquetar deben ajustarse a la secuencia correcta y al nivel de calidad establecido para cada PME en particular. 13. Las deficiencias en la preparación magistral, etiquetado, envasado y pruebas e inspección de calidad deben poder detectarse y corregirse rápidamente. 14. Cuando el tiempo y la disponibilidad de personal lo permitan, las manipulaciones y los procedimientos de preparación magistral deben estar separados de la inspección y revisión de calidad postpreparación que se llevan a cabo antes de la dispensación de las PME. Este capítulo enfatiza la necesidad de mantener estándares elevados de calidad y control en relación con los procesos, componentes y ambientes de preparación, y en relación con las habilidades y los conocimientos del personal a cargo de la elaboración de las PME. El rigor de los controles de calidad durante el proceso, de la inspección y pruebas de calidad posteriores a la preparación, aumenta en forma proporcional al nivel de riesgo potencial que supone la vía de administración. Por ejemplo, la falta de esterilidad, la contaminación excesiva con endotoxinas bacterianas, los errores significativos en la concentración de los ingredientes y el uso de ingredientes incorrectos en las PME son potencialmente más peligrosos para los pacientes cuando éstas se administran en el sistema vascular y en el sistema nervioso central que cuando se lo hace a través de las otras vías.
NIVELES DE RIESGO DE CONTAMINACIÓN MICROBIANA EN LAS PME Las tres categorías de contaminación descritas para PME en esta sección se asignan principalmente de acuerdo con el potencial de contaminación microbiana durante la preparación magistral de PME de nivel de riesgo bajo y nivel de riesgo mediano o el potencial que representa la falta de esterilización de las PME de nivel de riesgo alto, en donde cualesquiera de éstas podría ocasionar daños, o incluso la muerte del paciente. Las PME de nivel de riesgo alto se deben esterilizar antes de administrarlas a los pacientes. Para asignar a una PME el nivel de riesgo correspondiente-bajo, mediano o alto-deben tenerse en cuenta las probabilidades de que ésta sufra (1) contaminación microbiana (p.ej., microorganismos, esporas y endotoxinas) y (2) contaminación química y física (p.ej., sustancias químicas y materias físicas extrañas). Las fuentes potenciales de contaminación incluyen, entre otras, sustancias sólidas y líquidas provenientes del personal y los objetos utilizados en la preparación magistral; componentes no estériles empleados e incorporados antes de la esterilización terminal; las condiciones inapropiadas dentro del ambiente controlado de preparación; los procedimientos de preesterilización prolongados en el caso de preparaciones acuosas; y formas farmacéuticas no estériles usadas en la elaboración de las PME. Las características que se describen a continuación para PME de nivel de riesgo bajo, mediano y alto deben considerarse como una guía sobre el grado y rigor de cuidado necesario en la preparación magistral, pero no es exhaustiva ni prescriptiva. Los profesionales de la salud autorizados, a cargo de supervisar las preparaciones magistrales tienen la responsabilidad de determinar las prácticas de calidad de los procedimientos y del ambiente, y los atributos necesarios para el nivel de riesgo asignado a cada PME. Estos niveles de riesgo se aplican a la calidad de las PME inmediatamente después del mezclado o llenado asépticos finales o inmediatamente después de la esterilización final, a menos que lo impidan las características específicas de la preparación. Después del almacenamiento y transporte de las PME recién terminadas, debe esperarse un aumento en los riesgos de degradación química de los ingredientes, contaminación por daños físicos en los envases y permeabilidad de los envases de plástico y elastoméricos. En estos casos, el personal de preparación magistral tiene la responsabilidad de considerar los riesgos adicionales potenciales para la integridad de las PME al momento de asignar las FLU. La duración del almacenamiento previo a la administración y los límites de temperatura especificados en las siguientes subsecciones se aplican cuando no existan resultados directos de pruebas de esterilidad que justifiquen límites diferentes para las PME específicas.
PME de Nivel de Riesgo Bajo Las PME preparadas en las siguientes condiciones tienen un riesgo bajo de contaminación. Condiciones de Riesgo Bajo-
1. Las PME se preparan mediante manipulación aséptica y en un ambiente con una calidad de aire ISO Clase 5 (ver Tabla 1) o una calidad de aire superior usando únicamente ingredierites, productos, componentes y dispositivos estériles. 2. La preparación magistral sólo incluye manipulaciones de transferencia, medición y mezclado usando no más de tres empaques de productos estériles fabricados comercialmente y no más de dos ingresos en cualquier envase estéril o empaque (p.ej., bolsa, vial) del producto estéril o envase/dispositivo de administración para preparar la PME. 3. Las manipulaciones se limitan a la apertura aséptica de ampollas, la penetración de tapones desinfectados de viales con agujas y jeringas estériles, y la transferencia de líquidos estériles en jeringas estériles a dispositivos de administración estéril, envases de otros productos estériles y envases para almacenamiento y dispensación.
676 (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles / Pruebas Físicas
USP 39
4. En el caso de preparaciones de nivel de riesgo bajo, cuando no se someten a una prueba de esterilidad (ver Pruebas de Esterilidad (71 )), los períodos de almacenamiento no pueden superar los siguientes tiempos: antes de su administración, las PME deben almacenarse de forma apropiada y exponerse durante no más de 48 horas a temperatura ambiente controlada (ver Advertencias y Requisitos Generales), durante no más de 14 días a temperatura fría (ver Advertencias y Requisitos Generales) y durante 45 días en estado sólido de congelación entre -25º y -1 Oº. Ejemplos de Preparación Magistral de Riesgo Bajo1. Transferencias únicas de formas farmacéuticas estériles desde ampollas, frascos, bolsas y viales, usando jeringas estériles con agujas estériles, otros dispositivos de administración y otros envases estériles. El contenido de la solución de las ampollas debe pasarse a través de un filtro estéril para retirar cualquier partícula. 2. Medición y transferencia aséptica simple con no más de tres empaques de productos estériles fabricados comercialmente, incluyendo una solución para infusión o diluyente para elaborar las mezclas de fármacos y soluciones nutricionales. PME de Nivel de Riesgo Bajo con FLU de 12 Horas o Menos-Si el CIP es un CAi o un CACI que no cumple con los requisitos descritos en Colocación de Controles de Ingeniería Primarios o es una cabina de flujo laminar (CFL) o una cabina de seguridad biológica (CSB) que no puede ubicarse dentro de una zona amortiguadora ISO Clase 7 (ver Tabla 1), entonces sólo se pueden preparar PME no peligrosas y preparados radiofarmacéuticos de nivel de riesgo bajo, según las órdenes de un médico para un paciente específico y la administración de tales PME debe comenzar dentro de las 12 horas de la preparación o según lo recomendado en el prospecto adjunto del fabricante, cualquiera que sea menor. Las PME de nivel de riesgo bajo y con FLU de 12 horas o menos deben cumplir con los cuatro criterios siguientes: 1. Los CIP (CFL, CSB, CAi, CACI) deben certificarse y mantenerse como ISO Clase 5 (ver Tabla 1) según se describe en Diseño de la Instalación y Controles Ambientales para la exposición de sitios críticos y deben estar en un área segregada de preparación magistral y restringida a actividades de preparación estéril que minimicen el riesgo de contaminación de la PME. 2. El área segregada de preparación magistral no debe estar en una instalación que tenga ventanas o puertas sin sellar que conecten con el exterior o que tenga un flujo de tráfico alto, o que esté adyacente a sitios de construcción, almacenamiento o preparación de alimentos. Se debe tener en cuenta que ésta no pretende ser una lista exhaustiva. 3. El personal debe seguir los procedimientos descritos en Limpieza y Vestimenta del Persona/y Requisitos Adiciona/es del Personal antes de la preparación magistral. Los lavabos no deben estar ubicados adyacentes al CIP de ISO Clase 5 (ver Tabla 1). los lavabos deben estar separados del área inmediata del dispositivo de CIP de ISO Clase 5 (ver Tabla 7). 4. Según se describe en el capítulo, se deben seguir las especificaciones de Limpieza y Desinfección de las Áreas de Preparación Magistral Estéril, Capacitación del Personal y Evaluación de la Competencia en Vestimenta, Prácticas Asépticas de Trabajo y Procedimientos de Limpieza y Desinfección, así como Pruebas de Muestreo Ambiental (MA) para Partículas Viables y No Viables. El personal de preparación magistral debe reconocer que la ausencia de una zona amortiguadora ISO Clase 7 (ver Tabla 7)
en un ambiente general no controlado aumenta la probabilidad de contaminación microbiana, y que la duración de la administración de PME contaminadas con microbios que exceda de unas cuantas horas aumenta el potencial de colonización microbiana clínicamente significativa y por lo tanto de daño para el paciente, especialmente si se trata de pacientes críticamente enfermos o inmunocomprometidos. Garantía de Calidad-Las prácticas de garantía de calidad incluyen, entre otras, las siguientes: 1. Desinfección rutinaria y pruebas de calidad del aire del entorno de preparación directo para reducir al mínimo la contaminación microbiana de las superficies y mantener una calidad de aire ISO Clase 5 (ver Tabla 1). 2. Verificación visual de que el personal de preparación magistral está usando correctamente los elementos y los tipos de vestimenta protectora apropiados, incluyendo gafas y máscaras. 3. Revisión de todas las órdenes y envases de ingredientes para asegurar que la identidad y cantidad de los ingredientes incorporados en la preparación magistral fueron los correctos. 4. Inspección visual de las PME para asegurar la ausencia de partículas en las soluciones, la ausencia de fugas en los viales y bolsas y la información exacta y completa del etiquetado. Procedimiento de Prueba de Llenado de Medios-Esta prueba, u otra equivalente, debe ser efectuada al menos una vez al año por cada persona autorizada para realizar una preparación en un entorno de nivel de riesgo bajo, en condiciones que simulen las situaciones más difíciles o extremas que se encuentran durante la elaboración de PME de nivel de riesgo bajo. Una vez iniciada, esta prueba debe completarse sin interrupciones. Ejemplo de procedimiento de prueba: dentro de un entorno de calidad de aire ISO Clase 5 (ver Tabla 1), transferir tres series de cuatro alícuotas de 5 ml de Medio de Digerido de Caseína y Soja estéril (también conocido como caldo tripticasa de soja o agar tripticasa de soja [TSA]), con la misma combinación de jeringa de 1O ml y aguja con venteo estériles, a viales separados de 30 ml, transparentes, vacíos, sellados y estériles (es decir, cuatro alícuotas de 5 ml a cada uno de los tres viales de 30 ml). Fijar asépticamente sellos adhesivos estériles a los tapones de goma de los tres viales llenados y luego incubar los viales entre 20º y 25º o entre 30º y 35º durante un mínimo de 14 días. Si se usan dos temperaturas para la incubación de muestras de llenado de medios, entonces tales envases llenos deberán incubarse durante al menos 7 días a cada temperatura (ver Control Microbiológico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento Aséptico (1116)). Inspeccionar los viales durante 14 días para detectar cualquier crecimiento microbiano, según se describe en la sección Capacitación del Personal y Evaluación de la Competencia en Vestimenta, Prácticas Asépticas de Trabajo y Procedimientos de Limpieza y Desinfección.
USP 39
Pruebas Físicas/ (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles 677
PME de Nivel de Riesgo Mediano Cuando las PME se preparan asépticamente bajo Condiciones de Riesgo Bajo, y existe una o más de las siguientes condiciones, dichas PME tienen un riesgo mediano de contaminación. Condiciones de Riesgo Mediano1. Se combinan o agrupan múltiples dosis individuales o pequeñas de productos estériles para preparar una PME que se administrará a varios pacientes o a un solo paciente en varias ocasiones. 2. El proceso de preparación magistral incluye manipulaciones asépticas complejas, aparte de la transferencia de volumen única. 3. El proceso de preparación magistral tiene una duración inusualmente prolongada, como la requerida para completar la disolución o el mezclado homogéneo. 4. En el caso de preparaciones de nivel de riesgo mediano, cuando no se someten a una prueba de esterilidad (ver Pruebas de Esterilidad (71 )), los períodos de almacenamiento no pueden superar los siguientes tiempos: antes de su administración, las PME deben almacenarse de forma apropiada y exponerse durante no más de 30 horas a temperatura ambiente controlada (ver Advertencias y Requisitos Generales), durante no más de 9 días a temperatura fría (ver Advertencias y Requisitos Generales) y durante 45 días en estado sólido de congelación entre -25º y -1 Oº. Ejemplos de Preparación Magistral de Riesgo Mediano1. Preparación magistral de líquidos para nutrición parenteral total usando dispositivos manuales o automatizados durante la que se realizan varias inyecciones, desconexiones y conexiones de los productos que se usan como fuente de nutrientes al dispositivo o máquina para suministrar todos los componentes nutricionales a un envase estéril final. 2. Llenado de los reservorios de dispositivos de inyección e infusión con más de tres productos farmacéuticos estériles y evacuación del aire presente en dichos reservorios antes de dispensar el dispositivo llenado. 3. Transferencia de volúmenes de múltiples ampollas o viales a uno o más envases estériles finales. Garantía de Calidad-Los procedimientos para garantizar la calidad de las PME de riesgo mediano incluyen los mismos procedimientos utilizados para las PME de riesgo bajo y, además, una prueba de llenado de medios más exigente, que debe realizarse en forma anual o con mayor frecuencia. Procedimiento de Prueba de Llenado de Medios-Esta prueba, u otra equivalente, debe realizarse al menos anualmente en condiciones que simulen las situaciones más difíciles o extremas que se encuentran durante la elaboración de preparaciones magistrales. Una vez iniciada, esta prueba debe completarse sin interrupciones. Ejemplo de procedimiento de prueba: dentro de un entorno de calidad de aire ISO Clase 5 (ver Tabla 1), transferir asépticamente por gravedad seis alícuotas de 100 mL de Medio Digerido de Caseína y Soja estéril a través de tubuladuras separadas, a sendos recipientes estériles evacuados. A continuación, distribuir los seis recipientes en tres pares y usar una combinación estéril de jeringa de 1O mL y aguja de calibre 18 para intercambiar dos alícuotas de 5 mL de medio de un recipiente al otro del par. Por ejemplo, después de agregar una alícuota de 5 mL del primer recipiente al segundo recipiente del par, agitar este último durante 1O segundos, tomar una alícuota de 5 mL y volver a colocarla en el primer recipiente del par. Luego, agitar el primer recipiente durante 1 O segundos y transferir la siguiente alícuota de 5 mL de vuelta al segundo recipiente del par. Después de los dos intercambios de alícuotas de 5 mL en cada par de recipientes, inyectar asépticamente una alícuota de 5 mL de medio de cada recipiente en un vial de 1 O mL, transparente, vacío, sellado y estéril, usando una jeringa de 1O mL y una aguja con venteo estériles. Fijar asépticamente sellos adhesivos estériles a los tapones de goma de los tres viales llenados y luego incubar los viales entre 20º y 25º o entre 30º y 35º por un mínimo de 14 días. Si se usan dos temperaturas para la incubación de las muestras de llenado de medios, entonces tales envases llenos deberán incubarse durante al menos 7 días a cada temperatura (ver Control Microbiológico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento Aséptico (1116)). Inspeccionar los viales durante 14 días para detectar cualquier crecimiento microbiano, según se describe en la sección Capacitación del Personal y Evaluación de la Competencia en Vestimenta, Prácticas Asépticas de Trabajo y Procedimientos de Limpieza y Desinfección.
PME de Nivel de Riesgo Alto Las PME elaboradas bajo cualquiera de las condiciones indicadas a continuación están contaminadas o tienen un riesgo alto de contaminarse. Condiciones de Riesgo Alto1. Se incorporan ingredientes no estériles, incluyendo productos fabricados comercialmente que no están destinados para vías de administración estériles (p.ej., oral) o se emplea un dispositivo no estéril antes de la esterilización terminal. 2. Cualquiera de los siguientes elementos se exponen a calidad de aire inferior a ISO Clase 5 (ver Tabla 1) durante más de 1 hora (ver PME de Uso Inmediato): • contenido estéril de productos fabricados comercialmente, • PME que carecen de conservantes antimicrobianos eficaces, y • superficies estériles de dispositivos y envases para la preparación, transferencia, esterilización y envasado de PME. 3. El personal de preparación magistral tiene vestimenta y guantes inapropiados (ver Limpieza del Personal y Uso de Equipo Protector de Barrera).
4. Las preparaciones no estériles que contienen agua se almacenan durante más de 6 horas antes de su esterilización.
678 (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles / Pruebas Físicas
USP 39
5. Se presume, sin verificar el etiquetado y la documentación de los proveedores o sin determinación directa, que la pureza química y el contenido de los ingredientes cumplen con sus especificaciones originales o farmacopeicas en envases no abiertos o abiertos de ingredientes a granel (ver Selección de Ingredientes en Preparación Magistral-Preparaciones No Estériles (795)). Si las preparaciones esterilizadas de nivel de riesgo alto no han pasado una prueba de esterilidad, los períodos de almacenamiento no pueden superar los siguientes tiempos: antes de su administración, las PME deben almacenarse de forma apropiada y exponerse durante no más de 24 horas a temperatura ambiente controlada (ver Advertencias y Requisitos Generales), durante no más de 3 días a temperatura fría (ver Advertencias y Requisitos Generales) y durante 45 días en estado sólido de congelación entre -25º y -1 Oº. [NOTA-No se requieren pruebas de esterilidad para PME esterilizadas en autoclave, a menos que se preparen en lotes de más de 25 unidades.] Todos los dispositivos de medición, mezclado y purificación no estériles deben enjuagarse bien con agua estéril apirógena y luego deben escurrirse o secarse en su totalidad inmediatamente antes de utilizarlos para realizar preparaciones magistrales de riesgo alto. Todas las soluciones PME de nivel de riesgo alto sometidas a esterilización terminal deben prefiltrarse, pasándolas por un filtro con un tamaño de poro nominal de no más de 1,2 µm, antes o durante el llenado de los envases finales, con el fin de retirar las partículas. La esterilización por filtración de las PME de nivel de riesgo alto debe realizarse con un filtro estéril de tamaño de poro nominal de 0,2 µm o 0,22 µm, totalmente en un entorno con calidad de aire ISO Clase 5 (ver Tabla 1) o superior. Ejemplos de Condiciones de Riesgo Alto1. Disolución de polvos de fármacos y nutrientes a granel no estériles para preparar soluciones que se esterilizarán en forma terminal. 2. Exposición de los ingredientes y componentes estériles usados para preparar y envasar PME en una calidad de aire inferior a ISO Clase 5 (ver Tabla 1) durante más de 1 hora (ver PME de Uso Inmediato). 3. Medición y mezclado de ingredientes estériles en dispositivos no estériles antes de su esterilización. 4. Se supone, sin evidencia apropiada ni determinación directa, que los envases de ingredientes a granel contienen al menos un 95% en peso de su parte química activa y que no se han contaminado ni adulterado entre un uso y otro. Garantía de Calidad-Los procedimientos para garantizar la calidad de las PME de riesgo alto incluyen los mismos procedimientos que para las PME de riesgo bajo. Además, cada persona autorizada para elaborar PME de riesgo alto, debe realizar semestralmente una prueba de llenado de medios que represente una preparación magistral de nivel de riesgo alto. Procedimiento de Llenado de Medios para PME Esterilizadas por Filtración-Esta prueba, u otra equivalente, debe realizarse en condiciones que simulen las situaciones más difíciles o extremas que se encuentran durante la elaboración de preparaciones magistrales de nivel de riesgo alto. Una vez iniciada, esta prueba debe completarse sin interrupciones. Ejemplo del procedimiento de prueba (en la siguiente secuencia): 1. Disolver en 100 mL de agua no bacteriostática 3 g de Medio de Digerido de Caseína y Soja no estéril disponible comercialmente para preparar una solución no estéril al 3%. 2. Extraer 25 mL del medio en tres jeringas estériles de 30 ml. Transferir 5 mL de cada jeringa a sendos viales de 1 O mL estériles. Estos viales son los controles positivos para generar un crecimiento microbiano exponencial, el cual se evidencia por una turbidez visible después de su incubación. 3. Bajo condiciones asépticas y utilizando técnicas asépticas, fijar a cada jeringa una unidad de filtración estéril con un tamaño de poro nominal de 0,2 µm o 0,22 µm y una aguja de calibre 20. Inyectar los siguientes 1 O mL de cada jeringa en tres viales de 1 O mL estériles. Repetir el proceso en tres viales más. Etiquetar todos los viales, fijar sellos adhesivos estériles al cierre de los nueve viales e incubarlos a una temperatura de 20º a 25º o de 30º a 35º durante un mínimo de 14 días. Si se usan dos temperaturas para la incubación de muestras de llenado de medios, entonces tales envases llenos deberán incubarse durante al menos 7 días a cada temperatura (ver Control Microbiológico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento Aséptico (1116)). Inspeccionar los viales durante 14 días para detectar cualquier crecimiento microbiano, según se describe en la sección Capacitación del Personal y Evaluación de la Competencia en Vestimenta, Prácticas Asépticas de Trabajo y Procedimientos de Limpieza
y Desinfección.
CAPACITACIÓN Y EVALUACIÓN DEL PERSONAL EN TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN ASÉPTICA El personal encargado de la preparación de las PME deberá recibir capacitación competente y a conciencia por parte de personal experto, con ayuda de instrucción audiovisual y publicaciones profesionales, sobre los principios teóricos y los conocimientos prácticos en las manipulaciones asépticas, así como en la forma de conseguir y mantener condiciones ambientales ISO Clase 5 (ver Tabla 1) antes de empezar a preparar las PME. Inicialmente, el personal de preparación magistral deberá realizar una revisión didáctica y pasar pruebas escritas y de llenado de medios para evaluar la destreza en la manipulación aséptica; en adelante, se someterán a dichas pruebas al menos una vez al año, en el caso de preparaciones magistrales de niveles de riesgo bajo y mediano, y semestralmente, en el caso de preparaciones de nivel de riesgo alto. El personal de preparación magistral que no pase las pruebas escritas o cuyos viales de prueba de llenado de medios produzcan una colonización microbiana profusa, deberá recibir de inmediato una nueva capacitación y someterse a una nueva evaluación a cargo de personal experto en preparación magistral, para asegurarse de que hayan corregido todas sus deficiencias en materia de práctica aséptica.
USP 39
Pruebas Físicas/ (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles 679
Prueba de Desafío de Llenado de Medios-La destreza del personal para preparar PME asépticamente se puede evaluar usando una verificación de llenado de medios de cultivos bacterianos líquidos y estériles 1 (es decir, transferencia de un medio de cultivo bacteriano estéril a través de una jeringa y aguja estériles). La prueba de llenado de medios se utiliza para evaluar la práctica aséptica del personal de preparación magistral. Las pruebas de llenado de medios representan las condiciones más exigentes o difíciles con las que el personal en proceso de evaluación puede encontrarse durante la elaboración de PME de un determinado nivel de riesgo y durante la esterilización de PME de nivel de riesgo alto. Las pruebas de desafío de llenado de medios que simulan la elaboración de PME de nivel de riesgo alto se usan también para verificar la capacidad del ambiente y del proceso de preparación magistral para producir una preparación estéril. Los medios líquidos de cultivo estériles disponibles comercialmente, como el Medio de Digerido de Caseína y Soja (ver Pruebas de Esterilidad (71 )), deberán promover la colonización exponencial de las bacterias que el personal de preparación magistral y el entorno suelen transmitir a las PME. Los viales llenados con medios deben incubarse a una temperatura de 20º a 25º o de 30º a 35º durante 14 días como mínimo. Si se usan dos temperaturas para la incubación de muestras de llenado de medios, entonces tales envases llenos deberán incubarse durante al menos 7 días a cada temperatura (ver Control Microbiológico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento Aséptico (1116)). Si el medio desarrolla una turbidez visible dentro de los 14 días, significa que no se ha pasado la prueba.
PME DE USO INMEDIATO La provisión de uso inmediato está destinada sólo a aquellas situaciones en las cuales es necesario administrar de emergencia o en forma inmediata una PME a un paciente. Dichas situaciones pueden incluir reanimación cardiopulmonar, tratamiento en sala de emergencias, preparación de agentes de diagnóstico, o terapia crítica donde la preparación de la PME bajo las condiciones descritas para PME de Nivel de Riesgo Bajo somete al paciente a un riesgo adicional debido a las demoras en la terapia. Las PME de uso inmediato no están destinadas a almacenamiento para necesidades anticipadas o preparación magistral de lotes. Las preparaciones magistrales que tienen nivel de riesgo mediano y nivel de riesgo alto no deben prepararse como PME de uso inmediato. Las PME de uso inmediato están eximidas de los requisitos descritos para PME de Nivel de Riesgo Bajo, sólo cuando se cumplen todos los criterios siguientes: 1. El proceso de preparación magistral incluye la transferencia simple de no más de tres empaques fabricados comercialmente de productos estériles no peligrosos o productos radiofarmacéuticos de diagnóstico desde los envases originales del fabricante, y no más de dos ingresos dentro de cualquier envase estéril o empaque individual (p.ej., bolsa, vial) de solución estéril para infusión o envase/dispositivo de administración. Por ejemplo, los antineoplásticos no deben prepararse como PME de uso inmediato porque son fármacos peligrosos. 2. A menos que la preparación lo requiera, el procedimiento de preparación magistral es un proceso continuo que no debe exceder 1 hora. 3. Durante la preparación, se sigue una técnica aséptica y, de no administrarse inmediatamente, la PME terminada permanece bajo supervisión continua para minimizar el potencial de contacto con superficies no estériles, la introducción de partículas o líquidos biológicos, la mezcla con otras PME y el contacto directo de las superficies externas. 4. La administración comienza a más tardar una hora después de haber comenzado la preparación de la PME. 5. A menos que el prepador administre inmediata y completamente la PME, o el preparador vigile la administración inmediata y completa de la misma, la PME debe llevar una etiqueta que indica la información de identificación del paciente, los nombres y las cantidades de todos los ingredientes, el nombre o iniciales de la persona que preparó la PME, así como la FLU de 1 hora y la hora exactas. 6. Si la administración no ha comenzado dentro de 1 hora de haberse iniciado la preparación de la PME, ésta debe descartarse de inmediato en forma segura y adecuada. La preparación en condiciones inferiores a ISO Clase 5 (ver Tabla 1) aumenta la probabilidad de contaminación microbiana, y la duración de la administración de PME contaminadas con microbios cuando excede de unas cuantas horas aumenta el potencial de colonización microbiana clínicamente significativa y por lo tanto de daño para el paciente, especialmente si se trata de pacientes críticamente enfermos o inmunocomprometidos.
ENVASES MONODOSIS Y MULTIDOSIS Los envases monodosis abiertos o perforados con aguja, tales como bolsas, frascos, jeringas y viales de productos estériles y PME se deben usar dentro de 1 hora si se abren en aire de calidad inferior a ISO Clase 5 (ver Tabla 1) (ver PME de Uso Inmediato) y desechar cualquier contenido restante. Los viales monodosis expuestos a aire ISO Clase 5 (ver Tabla 1) o más limpio se pueden usar hasta 6 horas después de la perforación inicial con la aguja. Las ampollas monodosis abiertas no se deben almacenar por ningún período. Los envases multidosis (p.ej., viales) están formulados para retirar porciones en múltiples ocasiones, porque generalmente contienen conservantes antimicrobianos. La FLU después de abrir o perforar (p.ej., con aguja) envases multidosis es de 28 días (ver Pruebas de Eficacia Antimicrobiana (51 )), a menos que el fabricante especifique algo distinto. 1 U.S. Food and Drug Administration, Guidance far lndustry, Steri/e Drug Products Produced by Aseptic Processing-Current Good Manufacturing Practice, septiembre de 2004.
680 (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles/ Pruebas Físicas
USP 39
FÁRMACOS PELIGROSOS COMO PME Aunque los beneficios terapéuticos potenciales de las preparaciones magistrales estériles de fármacos peligrosos por lo general sobrepasan los riesgos de sus efectos adversos en pacientes enfermos, los profesionales de la salud expuestos se arriesgan a efectos adversos similares, sin ningún beneficio terapéutico. La exposición ocupacional a fármacos peligrosos pueden llevar a (1) efectos agudos, como erupciones cutáneas; (2) efectos crónicos, incluso eventos adversos reproductivos; y (3) posiblemente cáncer (ver Apéndice A de NIOSH Publication Nº 2004-165). Los fármacos peligrosos se deben preparar para administración sólo bajo condiciones que protejan a los profesionales de la salud y a otro personal en las áreas de preparación y almacenamiento. Los fármacos peligrosos se deben almacenar separados de otro inventario, de manera que se evite la contaminación y la exposición del personal. Muchos fármacos peligrosos tienen presiones de vapor suficientes que permiten la volatilización a temperatura ambiente; por lo tanto, se prefiere el almacenamiento dentro de un área de contención, tal como un cuarto de presión negativa. El área de almacenamiento debe tener suficiente ventilación general de salida, con al menos 12 cambios de aire por hora (CAPH) 2 para diluir y retirar cualquier contaminante aéreo. Los fármacos peligrosos se deben manejar con precaución en todo momento, usando guantes apropiados para quimioterapia durante la recepción, distribución, aprovisionamiento, inventariado, preparación para administración y eliminación. Los fármacos peligrosos deben prepararse en un ambiente ISO Clase 5 (ver Tabla 7), con controles de ingeniería protectores y siguiendo las prácticas asépticas especificadas para los niveles de riesgo de contaminación apropiados definidos en este capítulo. Se debe limitar el acceso a las áreas donde se almacenen y elaboren preparaciones de fármacos para proteger a las personas que no están involucradas en tal proceso. Todos los fármacos peligrosos se deben preparar en una CSB3 o un CACI que cumple o excede los estándares para CACI en este capítulo. Las CSB o los CACI ISO Clase 5 (ver Tabla 7) deben ubicarse en un área ISO Clase 7 (ver Tabla 7) que esté físicamente separada (es decir, un área diferente de las áreas de preparación) y que tenga óptimamente una presión negativa de no menos de 0,01 pulgadas de columna de agua con respecto a las antesalas adyacentes de presión positiva ISO Clase 7 (ver Tabla 7) o mejor, proporcionando así un flujo hacia adentro para contener cualquier partícula de fármaco presente en el aire. Se debe instalar un indicador de presión en el que pueda consultarse fácilmente la correcta presurización del cuarto. Las CSB y los CACI deben estar óptimamente ventilados en un 100% al exterior a través de filtración HEPA. Si un CACI que cumple los requisitos de este capítulo se usa fuera de una zona amortiguadora, el área de preparación magistral debe mantener una presión negativa mínima de 0,01 pulgadas de columna de agua y tener un mínimo de 12 CAPH. Cuando se usan dispositivos de sistema cerrado para transferencia de vial (CSTD, por sus siglas en inglés) (es decir, sistemas de transferencia del vial que no permiten ventilación ni exposición de la sustancia peligrosa al ambiente), deben estar dentro del ambiente ISO Clase 5 (ver Tabla 7) de una CSB o un CACI. Se prefiere el uso de un CSTD debido a su proceso de sistema cerrado inherente. En instalaciones que preparan un volumen bajo de fármacos peligrosos, se acepta el uso de dos niveles de contención (p.ej., un CSTD dentro de una CSB o un CACI que esté ubicado en un cuarto de presión no negativa). Cuando se usan CSTD y se realiza una preparación magistral en una CSB o un CACI, debe usarse equipo protector para el personal (EPP) apropiado. El EPP debe incluir batas, máscaras, gafas protectoras, gorras, cubrecalzado o calzado destinado a ese propósito, doble enguantado con guantes estériles similares a los usados en quimioterapia y el cumplimiento con las recomendaciones del fabricante al usar un CACI. Todo el personal que elabora preparaciones con fármacos peligrosos debe capacitarse ampliamente en el almacenamiento, manipulación y eliminación de estos fármacos. La capacitación debe ocurrir antes de preparar o manipular PME peligrosas y su eficacia debe ser verificada probando técnicas específicas de preparación para fármacos peligrosos. Dicha verificación debe ser documentada para cada persona al menos anualmente. Esta capacitación debe incluir el repaso didáctico de los fármacos peligrosos, incluyendo las propiedades mutagénicas, teratogénicas y carcinogénicas, y debe incluir capacitación continua para cada nuevo fármaco peligroso que entre al mercado. El personal de preparación magistral que esté en edad reproductiva debe confirmar por escrito que entiende los riesgos de manipular los fármacos peligrosos. La capacitación debe incluir al menos los siguientes puntos: (1) prácticas de manipulación aséptica segura; (2) técnicas de presión negativa cuando se utiliza una CSB o un CACI; (3) uso correcto de dispositivos CSTC; (4) procedimientos de contención, limpieza y eliminación en caso de rupturas y derramamientos; y (5) tratamiento del personal en caso de exposición por contacto o inhalación. NOTA-Dado que las normas de valoración y las cantidades inaceptables de contaminación de cada fármaco no han sido establecidos en la literatura, el siguiente párrafo es sólo una recomendación. A medida que se desarrollen y prueben estos métodos de ensayo se adoptarán las normas apropiadas. Con el fin de garantizar la contención, especialmente en operaciones de preparación que involucren grandes volúmenes de fármacos peligrosos, se deben tomar muestras ambientales rutinariamente para detectar fármacos peligrosos no contenidos (p.ej., inicialmente como punto de referencia y al menos cada 6 meses o más a menudo según sea necesario para verificar la contención). Este muestreo ambiental debe incluir la obtención de muestras con paños (wipe sampling) de la superficie del área de trabajo de una CSB y un CACI; mostradores donde se colocan las preparaciones terminadas; áreas adyacentes a una CSB y un CACI, incluso el piso directamente debajo del área de trabajo; y áreas de administración a pacientes. Los marcadores
Guidelines for Environmental lnfection Control in Health-Care Facilities, Recommendations of CDC and the Healthcare lnfection Control Practices Advisory Committee (HICPAC), MMWR, vol. 52, no. RR-1 O, junio 6, 2003, figura 3, pág. 12. 3 NSF/ANSI 49.
2
USP 39
Pruebas Físicas/ (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles 681
comunes de fármacos peligrosos que se pueden analizar incluyen ciclofosfamida, ifosfamida, metotrexato y fluorouracilo. Si se encuentra alguna contaminación mensurable (se ha visto que concentraciones de ciclofosfamida mayores que 1,00 ng por cm 2 causan captación del fármaco en humanos) por cualquiera de estos procedimientos de garantía de calidad, los profesionales de salud deben tomar la decisión de identificar, documentar y contener la causa de la contaminación. Tal acción puede incluir la recapacitación, limpieza cuidadosa (utilizando un jabón de pH elevado y agua) y mejora de los controles de ingeniería. Algunos ejemplos de formas de mejorar los controles de ingeniería incluyen (1) ventilar la CSB o el CACI 100% hacia el exterior; (2) implementar un CSTD; o (3) reevaluar los tipos de CSB o CACI. La eliminación de desechos de fármacos peligrosos debe cumplir con todas las reglamentaciones federales y estatales. Todo el personal que efectúa las actividades rutinarias de eliminación de desechos y limpieza en las áreas de almacenamiento y preparación con fármacos peligrosos debe recibir capacitación en los procedimientos apropiados para protegerse y prevenir la contaminación.
PREPARADOS RADIOFARMACÉUTICOS COMO PME En el caso de la producción de preparados radiofarmacéuticos para tomografía por emisión de positrones (PET), el capítulo Preparados Radiofarmacéuticos para Tomografía por Emisión de Positrones-Preparación Magistral (823) reemplaza este capítulo. Después de la liberación de un preparado radiofarmacéutico para PET como producto farmacéutico terminado de una instalación de producción, el posterior manejo, manipulación o uso del producto será considerado como preparación magistral y el contenido de esta sección y capítulo es aplicable. A los efectos de este capítulo, los preparados radiofarmacéuticos magistrales elaborados a partir de componentes estériles en envases estériles cerrados y con un volumen de 100 mL o menos monodosis o no más de 30 mL tomados se deben nombrar según las norde un envase multidosis (ver mas para PME de Nivel de Riesgo Bajo y cumplir con ellas. Al preparar magistralmente estos productos radiofarmacéuticos, se deben usar jeringas y viales apropiadamente blindados dentro de un CIP que funcione adecuadamente y que esté certificado como ISO Clase 5 (ver Tabla 1), localizado en un ambiente de aire ISO Clase 8 (ver Tabla 1) o más limpio, que permita el cumplimiento con los requisitos especiales de manipulación, protección y flujo de aire negativo. Los viales de productos radiofarmacéuticos destinados a múltiples usos, preparados magistralmente con tecnecio 99m, expuestos a un ambiente ISO Clase 5 (ver Tabla 1) y perforados por agujas sin contaminación por contacto directo, pueden usarse hasta la fecha indicada en las recomendaciones del fabricante. El almacenamiento y transporte de los viales adecuadamente blindados de PME radiofarmacéuticas puede ocurrir en un ambiente de acceso limitado sin una designación especifica de clase ISO. Los sistemas generadores de tecnecio 99m/molibdeno 99 deben almacenarse y eluirse (manejarse) bajo las condiciones recomendadas por el fabricante y las reglamentaciones estatales y federales aplicables. Dichos sistemas generadores deben eluirse en un ambiente de aire ISO Clase 8 (ver Tabla 1) o más limpio que permita cumplir con los requisitos especiales de manipulación, protección y flujo de aire. Para limitar la exposición aguda y crónica del personal de inspección a un nivel de radiación tan bajo como sea razonablemente posible (ALARA), se debe efectuar la inspección visual directa, de acuerdo con ALARA, de las PME radiofarmacéuticas que contengan concentraciones altas de dosis de radioactividad. Los preparados radiofarmacéuticos elaborados como PME de Nivel de Riesgo Bajo con FLU de 12 Horas o Menos se deben preparar en un área segregada. Se debe fijar una línea de demarcación que defina el área de preparación magistral segregada. Los materiales y la vestimenta expuestos en el área de atención y tratamiento del paciente no deben cruzar una línea de demarcación dentro del área de preparación magistral segregada.
EXTRACTOS DE ALÉRGENOS COMO PME Los extractos de alérgenos como PME son inyecciones monodosis y multidosis para uso intradérmico o subcutáneo, preparados por médicos especialmente capacitados y el personal bajo su supervisión directa. Los extractos de alérgenos como PME quedan exentos de los requisitos indicados para el personal, ambiente y almacenamiento de todos los Niveles de Riesgo de Contaminación Microbiana en las PME descritos en este capítulo, sólo cuando se cumplen todos los criterios siguientes: 1. El proceso de preparación magistral involucra la transferencia simple por medio de agujas y jeringas de productos estériles comerciales de alérgenos y sustancias estériles apropiadas agregadas (p.ej., glicerina, fenol y cloruro de sodio para inyección). 2. Todos los extractos de alérgenos como PME deben contener sustancias apropiadas en concentraciones eficaces para prevenir el crecimiento de microorganismos. Los extractos de alérgenos no conservados deben cumplir con los requisitos apropiados de nivel de riesgo para PME en este capítulo. 3. Antes de comenzar las actividades de preparación magistral, el personal sigue un procedimiento cuidadoso de lavado de manos para quitar los detritos bajo las uñas con un limpiador de uñas bajo agua tibia corriente, seguido por un lavado vigoroso de manos y brazos hasta el codo, durante al menos 30 segundos, con un jabón antimicrobiano o no antimicrobiano y agua.
682 (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles/ Pruebas Físicas
USP 39
4. El personal de preparación magistral se coloca gorras, mascarillas que cubran el vello facial, batas y máscaras. 5. El personal de preparación magistral realiza el lavado antiséptico de manos con un exfoliante quirúrgico a base de alcohol con actividad persistente. 6. El personal de preparación magistral utiliza guantes estériles exentos de polvo que sean compatibles con alcohol isopropílico al 70% (IPA) antes de comenzar las manipulaciones de la preparación magistral. 7. El personal de preparación magistral desinfecta los guantes intermitentemente con IPA estéril al 70% cuando prepara múltiples extractos de alérgenos como PME. 8. Los cuellos de las ampollas y los tapones de viales en los envases de ingredientes estériles fabricados comercialmente se desinfectan frotándolos cuidadosamente con hisopos empapados en IPA estéril al 70% para garantizar que los sitios críticos estén húmedos durante al menos 1 O segundos y se dejen secar antes de usarlos para la preparación de extractos de alérgenos como PME. 9. Las manipulaciones asépticas de las preparaciones magistrales minimizan la contaminación directa por contacto (p.ej., de las puntas de los dedos de los guantes, sangre, secreciones orales y nasales, piel y cosméticos descamados, otros materiales no estériles) con sitios críticos (p.ej., agujas, ampollas abiertas, tapones de viales). 1 O. La etiqueta de cada vial multidosis (VMD) de extractos de alérgenos como PME incluye el nombre de un paciente específico así como la FLU y el intervalo de temperatura de almacenamiento que se asignan basándose en las recomendaciones del fabricante o publicaciones de referencia. 11. Las ampollas monodosis de extractos de alérgenos como PME no se deben almacenar para uso adicional subsiguiente. El personal que prepara extractos de alérgenos como PME debe ser consciente del mayor riesgo potencial de contaminación microbiana y con materia extraña cuando los extractos de alérgenos como PME se preparan cumpliendo con criterios anteriores en vez de seguir las normas más rigurosas de este capítulo para Niveles de Riesgo de Contaminación Microbiana en las PME. Aunque los extractos de alérgenos como PME pueden representar riesgos para la salud de los pacientes cuando se inyectan intradérmica o subcutáneamente, estos riesgos son sustancialmente mayores si el extracto se inyecta por vía intravenosa inadvertidamente.
VERIFICACIÓN DE LA EXACTITUD V ESTERILIDAD DE LA PREPARACIÓN MAGISTRAL Los procedimientos de preparación magistral y los métodos de esterilización de PME deben corresponder con los especificados en la documentación escrita, debidamente confeccionada y verificada por la institución responsable de la preparación magistral. La verificación requiere pruebas planificadas, monitoreo y documentación que permitan demostrar el cumplimiento de los requisitos de calidad ambiental, las prácticas del personal y los procedimientos críticos para conseguir y mantener la esterilidad, exactitud y pureza de las PME terminadas. Por ejemplo, pueden realizarse pruebas de esterilidad (ver Prueba de Esterilidad para el Producto a Examinar en Pruebas de Esterilidad (71 )) con muestras de PME de riesgo bajo y mediano, y deben agregarse indicadores biológicos (IB) estándar autocontenidos a muestras no dispensables de PME de nivel de riesgo alto antes de su esterilización terminal para determinar en la evaluación posterior si el ciclo de esterilización fue adecuado (ver Indicadores Biológicos para Esterilización (1035)). Las PME envasadas y etiquetadas deben inspeccionarse visualmente para verificar su integridad física y aspecto esperado, incluyendo la cantidad de llenado final. La exactitud de las identidades, concentraciones, cantidades y purezas de los ingredientes de las PME se deben confirmar revisando las etiquetas en los envases, observando y documentando las mediciones correctas con los dispositivos aprobados y correctamente estandarizados, y revisando la información en el etiquetado y en los certificados de análisis proporcionados por los proveedores. Cuando no se pueda confirmar la identidad, la pureza, el contenido y la esterilidad correctas de los ingredientes y componentes de las PME (por ejemplo, en caso de jeringas sin etiquetado, ampollas abiertas, tapones de viales y bolsas perforados, envases de ingredientes con etiquetado incompleto), dichos ingredientes y componentes se deben desechar de inmediato. Algunos ingredientes individuales, como fármacos a granel, no se etiquetan con las fechas de caducidad cuando se mantienen estables indefinidamente en sus empaques comerciales, bajo las condiciones de almacenamiento declaradas. Sin embargo, a pesar de conservar estabilidad química completa, dichos ingredientes pueden ganar o perder humedad durante el almacenamiento y uso. Los cambios en el contenido de humedad pueden requerir pruebas (ver Pérdida por Secado (731 )) para determinar la cantidad correcta que se debe pesar para obtener el contenido exacto de las partes químicas activas en las PME (ver Cálculos en Ja Práctica Farmacéutica (1160)). Aunque no se requiere, se recomienda realizar un ensayo químico cuantitativo indicador de estabilidad para garantizar la exactitud de la preparación de las PME, especialmente de aquellas que contienen ingredientes farmacéuticos con un estrecho intervalo de concentración terapéutica en plasma.
Métodos de Esterilización Los profesionales de la salud autorizados que están a cargo de supervisar las preparaciones magistrales son responsables de asegurar que el método de esterilización seleccionado (ver Métodos de Esterilización en Esterilización y Garantía de Esterilidad de Artículos Farmacopeicos (1211 )) esterilice y mantenga el contenido, pureza, calidad e integridad del envase de las PME. El proceso de esterilización seleccionado se obtiene a partir de la experiencia y de las fuentes de información apropiadas (p.ej., ver Esterilización y Garantía de Esterilidad de Artículos Farmacopeicos (1211 )) y, preferentemente, se verifica hasta donde sea posible
USP 39
Pruebas Físicas/ (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles 683
para conseguir la esterilidad de las PME específicas. Éstas son algunas guías generales para asignar un método de esterilización apropiado a una PME y sus componentes: 1. Debe comprobarse que las PME se mantienen física y químicamente estables cuando se las somete al método de esterilización seleccionado. 2. Los dispositivos de vidrio y metal pueden cubrirse herméticamente con papel de aluminio y luego exponerse a calor seco en un horno a una temperatura media de 250º durante 30 minutos para lograr la esterilidad y despirogenización (ver Esterilización por Calor Seco en Esterilización y Garantía de Esterilidad de Artículos Farmacopeicos (1211 )) y Prueba de Endotoxinas Bacterianas (85)). Dichos artículos deben usarse de inmediato o almacenarse hasta su uso en un ambiente adecuado para la elaboración de las PME de Nivel de Riesgo Bajo y Mediano. 3. El personal debe determinar, a partir de fuentes de referencia apropiadas, si el filtro de membrana microporosa estéril usado para esterilizar las soluciones de PME, ya sea durante su preparación magistral o su administración, es química y físicamente compatible con la PME. ESTERILIZACIÓN DE PME DE NIVEL DE RIESGO ALTO POR FILTRACIÓN Los filtros estériles disponibles comercialmente deben estar aprobados para la esterilización de líquidos farmacéuticos de uso en seres humanos. Los filtros estériles usados para esterilizar las PME deben estar exentos de pirógenos y tener un tamaño nominal de poro de 0,2 ó 0,22 µm. El fabricante debe certificar que retienen al menos 10 7 microorganismos de una cepa de Brevundimonas (Pseudomonas) diminuta en cada centímetro cuadrado del área superficial de la cara superior del filtro en condiciones similares a las que se utilizarán para esterilizar las PME (ver Condiciones de Alto Riesgo en PME de Nivel de Riesgo Alto). El supervisor de preparación magistral debe asegurar, en forma directa o a partir de documentación apropiada, que los filtros sean química y físicamente estables en las condiciones de presión y temperatura que se utilizarán, que tengan capacidad suficiente para filtrar los volúmenes requeridos y que logren la esterilidad y mantengan la calidad farmacéutica previa a la filtración, incluida la concentración de ingredientes de la PME específica. Las dimensiones del filtro y el líquido a esterilizar deben permitir que el proceso de esterilización se complete rápidamente sin reemplazar el filtro durante el proceso. Cuando se sabe que la PME contiene una cantidad excesiva de partículas, debe colocarse un prefiltro de membrana con un tamaño nominal de poro mayor, antes del filtro de esterilización, para eliminar las partículas contaminantes grandes y aumentar al máximo la eficacia del filtro de esterilización. Las unidades de filtración usadas para esterilizar las PME también deben someterse a las pruebas de integridad recomendadas por el fabricante, como la prueba de punto de burbuja. El personal de preparación magistral debe verificar que los filtros seleccionados logren la esterilización de las PME que se están esterilizando. Las desviaciones significativas respecto de las propiedades químicas y físicas normales o esperadas de las PME (p.ej., alcoholes miscibles en agua) podrían causar daños no detectables en la integridad del filtro y la reducción de los microorganismos a un tamaño más pequeño que el de los poros del filtro. ESTERILIZACIÓN DE PME DE NIVEL DE RIESGO ALTO POR VAPOR El proceso de esterilización térmica utilizando vapor saturado bajo presión, o esterilización en autoclave, es el método preferido para la esterilización terminal de preparaciones acuosas que, según se ha verificado, mantienen su estabilidad química y física bajo las condiciones empleadas (ver Esterilización por Vapor en Esterilización y Garantía de Esterilidad de Artículos Farmacopeicos (1211 )). Para lograr la esterilidad, todos los materiales deben exponerse al vapor a una temperatura de 121 º, bajo una presión de aproximadamente 1 atmósfera o 15 psi, durante un tiempo que, según se haya verificado mediante pruebas, logre la esterilidad de los artículos. Por lo general, este tiempo es de 20 a 60 minutos en el caso de las PME. Debe contemplarse el tiempo requerido para que el material alcance los 121 º antes de medir la duración de la exposición de esterilización. Si no se exponen directamente los artículos a vapor presurizado, pueden sobrevivir algunos microorganismos y esporas. Antes de su esterilización, los dispositivos de plástico, vidrio y metal deben envolverse herméticamente en un papel o tela de bajo desprendimiento de partículas o sellarse en sobres que impidan la penetración microbiana después de su esterilización. Inmediatamente antes de llenar las ampollas y viales que se esterilizarán con vapor, las soluciones deben pasarse por un filtro con un tamaño nominal de poro de no más de 1,2 µm para eliminar las partículas. Los envases sellados deben poder generar vapor internamente; en consecuencia, los viales vacíos con tapón y precintados deben contener una pequeña cantidad de humedad para generar vapor. La descripción de las condiciones y duración de la esterilización por vapor para cada PME debe estar documentada por escrito en la institución responsable de la preparación magistral. La eficacia de la esterilización con vapor debe verificarse utilizando IB apropiados de Bacillus stearothermophilus (ver Indicadores Biológicos (1035)) y otros métodos de verificación, como los dispositivos sensores de temperatura (ver Esterilización y Garantía de Esterilidad de Artículos Farmacopeicos (1211) y Pruebas de Esterilidad (71 )).
684 (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles/ Pruebas Físicas
USP 39
ESTERILIZACIÓN DE PME DE NIVEL DE RIESGO ALTO POR CALOR SECO La esterilización por calor seco se realiza por lo general como un proceso por lotes en un horno destinado a esterilización. El aire caliente filtrado debe distribuirse uniformemente a través de la cámara, por medio de un dispositivo ventilador. El horno debe equiparse con un sistema para controlar la temperatura y el tiempo de exposición. La esterilización por calor seco requiere temperaturas más altas y tiempos de exposición más prolongados que la esterilización por vapor. El calor seco se debe usar sólo para aquellos materiales que no se puedan esterilizar por vapor, cuando la humedad daña el material o éste es impermeable. Durante la esterilización se debe dejar suficiente espacio entre los materiales para permitir una buena circulación del aire caliente. La descripción de las condiciones y duración de la esterilización por calor seco para cada PME debe estar documentada por escrito en la institución responsable de la preparación magistral. La eficacia de la esterilización por calor seco debe verificarse utilizando IB apropiados de Bacillus subtilis (ver Indicadores Biológicos (1035)) y otros métodos de verificación, como los dispositivos sensores de temperatura (ver Esterilización y Garantía de Esterilidad de Artículos Farmacopeicos (1211) y Pruebas de Esterilidad (71 )). [NOTA-La esterilización por calor seco se puede efectuar a una temperatura más baja de la que podría ser eficaz para la despirogenización].
Despirogenización por Calor Seco La despirogenización por calor seco se debe usar para eliminar los pirógenos y los microbios viables de los materiales o envases de vidrio, como los viales. Un ciclo típico sería de 30 minutos a 250º. La descripción del ciclo de despirogenización por calor seco y su duración para artículos de una carga específica debe estar documentada por escrito en la institución responsable de la preparación magistral. La eficacia del ciclo de despirogenización por calor seco se debe verificar usando viales para desafío de endotoxinas (VDE). La prueba de endotoxinas bacterianas se debe efectuar en los VDE para verificar que el ciclo es capaz de conseguir una reducción de 3 log en endotoxinas (ver Esterilización y Garantía de Esterilidad de Artículos Farmacopeicos (1211) y Prueba de Endotoxinas Bacterianas (85)).
CALIDAD Y CONTROL AMBIENTAL Lograr y mantener la esterilidad y la ausencia total de contaminación de una PME depende de la calidad de los componentes incorporados, del proceso utilizado, del desempeño del personal y de las condiciones ambientales en las que se realiza el proceso. Los niveles de exigencia requeridos en relación con las condiciones ambientales dependen del grado de exposición esperado de la PME al entorno inmediato durante su procesamiento. En esta sección se describen la calidad y el control de las condiciones ambientales para cada nivel de riesgo de operación. Además, las operaciones que utilizan componentes no estériles requieren el uso de un método de preparación diseñado para obtener una preparación estéril.
Exposición de Sitios Críticos Mantener la esterilidad y la limpieza (es decir, ausencia de materia extraña estéril) de los sitios críticos es una salvaguarda importante para las PME. Los sitios críticos son aquellos que incluyen cualquier componente o superficie de recorrido de líquidos (p.ej., septos de viales, puertos de inyección, vasos de precipitados) o aberturas (p.ej., ampollas abiertas, conos conectores de agujas) expuestos y en riesgo de contacto directo con el aire (p.ej., ambiental o filtrado por HEPA), humedad (p.ej., secreciones orales o mucosas), o contaminación por contacto. El riesgo o probabilidad de que los sitios críticos se contaminen con microorganismos y materia extraña se incrementa con el aumento del área expuesta de los sitios críticos, la densidad o concentración de los contaminantes y la duración de la exposición a una calidad de aire inferior a ISO Clase 5 (ver Tabla 1). Los ejemplos incluyen una ampolla abierta o un tapón en un vial de 1O mL o de mayor volumen o un puerto de inyección en un envase de solución intravenosa que tiene un área más grande que la punta de la aguja o de una jeringa. Las características del sitio crítico también influyen en el grado de riesgo de contaminación. Después de frotarla con una gasa embebida en IPA estéril al 70%, la superficie relativamente áspera y permeable de un tapón elastomérico retiene microorganismos y otros contaminantes con más facilidad que la superficie de vidrio más lisa del cuello de una ampolla. En consecuencia, puede esperarse que la desinfección de la superficie sea más eficaz en el caso de una ampolla. En la práctica de preparación magistral estéril, se debe dar la más alta prioridad a la protección de los sitios críticos, evitando el contacto físico y los contaminantes aéreos. Los contaminantes aéreos, especialmente aquellos generados por el personal de preparación magistral estéril, tienen muchas más probabilidades de llegar a los sitios críticos que los contaminantes que están adheridos al piso o a otras superficies por debajo del nivel de trabajo. Más aún, las partículas grandes y de alta densidad que se generan e introducen mediante las manipulaciones de la preparación magistral y el personal tienen el potencial de asentarse en los sitios críticos incluso cuando dichos sitios están expuestos a aire ISO Clase 5 (ver Tabla 1).
Fuentes de Aire ISO Clase 5, Zonas Amortiguadoras y Antesalas Las fuentes más comunes de aire de calidad ISO Clase 5 (ver Tabla 1) para exposición de sitios críticos son CFL horizontales y verticales, CAi y CACI. Un cuarto limpio (ver Control Microbiológico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento Aséptico (1116))
USP 39
Pruebas Físicas/ (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles 685
es un ambiente para preparaciones magistrales provisto con HEPA o aire filtrado con HEPA, el cual cumple con ISO Clase 7 (ver Tabla 7), y cuyo acceso está limitado al personal capacitado y autorizado para realizar la preparación magistral estéril y la limpieza de las instalaciones. Una zona amortiguadora es un área provista con aire de calidad ISO Clase 7 (ver Tabla 7) como mínimo. La Figura 7 es una representación conceptual de la colocación de un CIP ISO Clase 5 (ver Tabla 7) en un área de preparación magistral segregada, usada para PME de nivel de riesgo bajo con FLU de 12 horas o menos. Este plano muestra el área de operación más crítica localizada dentro del CIP en un área designada (ver definición de Área de Preparación Magistral Segregada) separada de las actividades no esenciales para la preparación de las PME. La colocación de dispositivos (p.ej., computadoras, impresoras) y objetos (p.ej., carros, gabinetes) que no son esenciales para la preparación magistral en el área segregada debe estar restringida o limitada, dependiendo de su efecto sobre la calidad del aire en el CIP ISO Clase 5 (ver Tabla 1). Representación conceptual de los requisitos de las instalaciones del Capítulo <797> de la USP
Figura 1. Representación conceptual de la colocación de un CIP ISO Clase 5 en un área de preparación magistral segregada, usada para PME de nivel de riesgo bajo con FLU de 12 horas o menos. La Figura 2 es una representación conceptual de la distribución de una instalación para la preparación de PME clasificadas como de nivel de riesgo bajo, mediano y alto. La calidad del aire ambiental aumenta con el movimiento desde el límite externo hacia el área directa de preparación magistral (ADP). La colocación de dispositivos en las antesalas y las zonas amortiguadoras está dictada por su efecto sobre la calidad ambiental designada de las atmósferas y superficies, que debe ser verificada por monitoreo (ver Pruebas de Muestreo Ambiental (MA) de Partículas Viables y No Viables). Cada instalación de preparación magistral tiene la responsabilidad de garantizar que las fuentes de ambientes ISO Clase 5 (ver Tabla 1) para exposición de sitios críticos y esterilización por filtración estén adecuadamente ubicadas, manejadas, mantenidas, supervisadas y verificadas.
Figura 2. Representación conceptual de la distribución de una instalación para la preparación de PME clasificadas como de riesgo bajo, mediano y alto. La colocación de los dispositivos (p.ej., computadoras, impresoras) y objetos (p.ej., carros, gabinetes) que no son esenciales para la preparación magistral en las antesalas y las zonas amortiguadoras está dictada por su efecto sobre la calidad ambiental requerida para las atmósferas y superficies, que debe ser verificada por monitoreo (ver Pruebas de Muestreo Ambiental (MA) de Partículas Viables y No Viables). Cada instalación de preparación magistral tiene la responsabilidad de garantizar que las fuentes de ambientes ISO Clase 5 (ver Tabla 7) para exposición de sitios críticos y esterilización por filtración estén adecuadamente ubicadas, manejadas, mantenidas, supervisadas y verificadas.
686 (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles / Pruebas Físicas
USP 39
Diseño de la Instalación y Controles Ambientales Las instalaciones de preparación magistral están físicamente diseñadas y ambientalmente controladas para minimizar el contacto de la contaminación aérea con los sitios críticos. Estas instalaciones deben proporcionar también un ambiente de trabajo cómodo y bien iluminado, por lo general con una temperatura de 20º o menos, para brindar condiciones de comodidad al personal de preparación magistral para que se desempeñe correctamente mientras está ataviado con la vestimenta requerida para la preparación magistral aséptica. Los CIP por lo general incluyen, entre otros, CFL, CSB, CAi y CACI, los cuales brindan un ambiente ISO Clase 5 (ver Tabla 7) para la exposición de sitios críticos. Los CIP deben mantener las condiciones ISO Clase 5 (ver Tabla 7) o mejores para las partículas de 0,5 µm (condiciones dinámicas de funcionamiento) mientras se preparan PME. Los controles de ingeniería secundarios, tales como zonas amortiguadoras y antesalas, por lo general sirven como centro para la ubicación del CIP. Las zonas amortiguadoras están diseñadas para mantener condiciones ISO Clase 7 (ver Tabla 7) como mínimo, para partículas de 0,5 µm bajo condiciones dinámicas, y condiciones ISO Clase 8 (ver Tabla 7) para partículas iguales o mayores de 0,5 µm bajo condiciones dinámicas para las antesalas. El control de contaminación aérea se logra en el CIP por medio de filtros HEPA. El flujo de aire en el CIP debe ser unidireccional (flujo laminar) y debido a la eficiencia de recolección de partículas del filtro, cuando se trata de preparación magistral aséptica, el "primer aire" en la cara del filtro está libre de contaminación por partículas aéreas. El aire filtrado por HEPA debe suministrarse en las áreas críticas (ISO Clase 5, ver Tabla 7) a una velocidad suficiente para arrastrar las partículas lejos del área de preparación magistral y mantener el flujo de aire unidireccional durante las operaciones. El diseño y control apropiados evitan la turbulencia y el aire estancado en el área crítica. En el área crítica se debe realizar un análisis del patrón de aire in situ por medio de estudios con humo para demostrar el flujo unidireccional del aire y la acción de arrastre sobre el producto bajo condiciones dinámicas. Los principios del flujo unidireccional de aire filtrado por HEPA en el ambiente de trabajo se deben comprender y practicar en el proceso de preparación magistral, con el fin de conseguir las condiciones ambientales deseadas. Las políticas y procedimientos para el mantenimiento y trabajo dentro del área del CIP se deben poner por escrito y cumplir. Las políticas y procedimientos estarán determinados por el alcance y niveles de riesgo de las actividades de preparación magistral aséptica utilizadas durante la preparación de las PME. El ambiente de trabajo de la PME está diseñado para tener las superficies de trabajo más limpias (CIP) localizadas en una zona amortiguadora. La zona amortiguadora deberá mantener condiciones ISO Clase 7 (ver Tabla 7) como mínimo, para las partículas iguales o mayores de 0,5 µm bajo condiciones de operación dinámicas. El cuarto debe estar segregado de los espacios circundantes no clasificados, para reducir el riesgo de que se soplen, arrastren o introduzcan de otra manera contaminantes dentro del ambiente de flujo unidireccional de aire filtrado y tal segregación debe monitorearse en forma constante. Para cuartos que proporcionan una separación física por medio de paredes, puertas y cabinas de transferencia de materiales (pass-throughs), se requiere una presión positiva diferencial mínima de 0,02 a 0,05 pulgadas de columna de agua. Para zonas amortiguadoras no físicamente separadas de las antesalas, se debe emplear el principio de desplazamiento del flujo de aire. Este concepto utiliza un principio de baja presión diferencial y alto flujo de aire. El uso de desplazamiento del flujo de aire requiere por lo general una velocidad de aire igual o mayor a 40 pies por minuto desde la zona amortiguadora, pasando por la línea de demarcación hacia la antesala. El concepto de desplazamiento no debe usarse para preparación magistral de alto riesgo. 4 El CIP debe estar ubicado dentro de una zona amortiguadora de tal manera que se eviten condiciones que podrían afectar adversamente su funcionamiento. Por ejemplo, las corrientes de aire fuertes provenientes de las puertas abiertas, el tráfico del personal o los flujos de aire provenientes de los sistemas de HVAC pueden alterar el flujo de aire unidireccional en cabinas de frente abierto. Los operadores también pueden producir alteraciones en el flujo de aire con sus propios movimientos y al colocar objetos sobre la superficie de trabajo. El CIP debe ubicarse fuera del flujo de tráfico y de manera que el sistema de HVAC y las corrientes de aire del cuarto no causen perturbaciones. Los intercambios de aire del cuarto por lo general se expresan como CAPH. Se necesita un adecuado flujo de aire filtrado por HEPA y suministrado a la zona amortiguadora y a la antesala, con el fin de mantener la clasificación de limpieza durante la actividad operativa a través de los CAPH. Los factores que deben considerarse al determinar los requisitos de cambio de aire incluyen la cantidad de personas que trabajan en el cuarto y los procesos de preparación magistral que generan partículas, así como los efectos de la temperatura. Una zona amortiguadora y una antesala ISO Clase 7 (ver Tabla 7) provistas de aire filtrado por HEPA deben recibir no menos de 30 CAPH. El CIP es una buena forma de incrementar los cambios de aire en el suministro de aire de un área, pero no puede ser la única fuente de aire filtrado por HEPA. Cuando el área cuenta con un dispositivo de recirculación ISO Clase 5 (ver Tabla 7) se considera adecuado un mínimo de 15 CAPH a través de los filtros HEPA que abastecen el área, siempre y cuando los CAPH combinados no sean menores de 30. Se pueden requerir más intercambios de aire, dependiendo de la cantidad de personas y procesos. El suministro de aire filtrado por HEPA se debe introducir por el cielo raso y los retornos se deben montar a un nivel bajo en la pared, creandose así una dilución general, de arriba hacia abajo, del aire del área con el aire filtrado por HEPA. No se recomienda ubicar los retornos en el cielo raso. Debe probarse la eficacia de todos los filtros HEPA, usando el tamaño de partícula más penetrante y deben probarse por fugas en la fábrica y de nuevo in situ después de la instalación.s Las actividades y tareas desarrolladas dentro de la zona amortiguadora deben limitarse a aquellas necesarias cuando se trabaja en un ambiente controlado. Sólo pueden llevarse a este cuarto los muebles, equipos, suministros y otros materiales requeISO 14644-4:2001 Cleanrooms and associated controlled environments-Design, construction, and start-up, Case Posta/e 56, CH-1211 Geneve 20, Switzerland, tel. +41 22 749 0111. 5 Por definición {IEST RP CC 0001.4), los filtros HEPA tienen como mínimo una eficacia de 99,97% cuando se prueban usando un fotómetro y partículas de 0,3 µm generadas termalmente o clasificadas según el tamaño de partícula más penetrante, usando un contador de partículas. 4
USP 39
Pruebas Físicas/ (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles 687
ricios para realizar las actividades de preparación magistral y éstos deben ser impermeables, lavables, resistentes a los desinfectantes y no desprender partículas. Cada vez que se lleva alguno de estos elementos al cuarto, primero se lo debe limpiar y desinfectar. Siempre que sea posible, los equipos y otros elementos usados en la zona amortiguadora no deben retirarse del cuarto, salvo para su calibración, reparación u otras actividades asociadas con el mantenimiento correcto del equipo. Las superficies de los cielos rasos, paredes, pisos, artefactos, estantes, mostradores y gabinetes en la zona amortiguadora deben ser lisos e impermeables, no deben tener grietas y no deben desprender partículas para facilitar su limpieza y reducir al mínimo los espacios en los que podrían acumularse microorganismos y otros contaminantes. Las superficies deben ser resistentes a los daños causados por agentes desinfectantes. Las uniones de los cielos rasos con las paredes deben ser abovedadas o enmasilladas para evitar la formación de grietas donde pueda acumularse polvo. Si los cielos rasos constan de paneles incrustados, éstos se deben impregnar con un polímero para hacerlos impermeables e hidrófobos y, además, se debe enmasillar todo su perímetro para sellar la unión con el armazón que hace de soporte. Las paredes pueden ser de material flexible (p.ej., polímero de alta densidad), paneles unidos entre sí y sellados o placas de yeso con revestimiento epóxico. Preferentemente, los pisos deben cubrirse con planchas anchas de revestimiento vinílico, térmicamente soldadas y arqueadas hacia los zócalos. Debe evitarse la presencia de elementos salientes que junten polvo, como las tuberías de servicios que pasan por el cielo raso o las repisas de las ventanas. La superficie externa de los artefactos de iluminación embutidos en el cielo raso debe ser lisa y estar sellada y al ras del cielo raso. Cualquier otro elemento que penetre en el cielo raso o las paredes debe estar sellado. La zona amortiguadora no debe contener fuentes de agua (lavabos) ni drenajes en el piso. Las superficies de trabajo deben estar construidas con materiales lisos impermeables, como acero inoxidable o plástico moldeado, para que puedan limpiarse y desinfectarse fácilmente. Los carros deben ser de alambre de acero inoxidable, plástico no poroso o planchas metálicas, con ruedas de buena calidad y fáciles de limpiar para facilitar su movilidad. Los estantes de almacenamiento, mostradores y gabinetes deben ser lisos, de material impermeable y fáciles de limpiar y desinfectar y, además deben estar libres de grietas y no desprender partículas; la cantidad, el diseño, y la forma de instalación deben ser tales que faciliten una limpieza y sanitización eficaces.
Colocación de los Controles de Ingeniería Primarios Los CIP (CFL, CSB, CAi y CACI) deben ubicarse dentro de una zona amortiguadora ISO Clase 7 (ver Tabla 1) de acceso restringido (ver Figura 1), con las siguientes excepciones para CAl/CACI: • Sólo el personal autorizado y los materiales requeridos para la preparación magistral y la limpieza deben permitirse en la zona amortiguadora. • Los procedimientos de preesterilización para las PME de alto riesgo, como por ejemplo pesar y mezclar, se deben completar en un ambiente no inferior a ISO Clase 8 (ver Tabla 1). • Los CIP deben ubicarse fuera de las vías de tráfico y lejos de las corrientes de aire del cuarto que pudieran perturbar los patrones de flujo de aire deseados. Los CAi y los CACI deben ubicarse dentro de una zona amortiguadora ISO Clase 7 (ver Tabla 7) a menos que cumplan con todas las condiciones siguientes: • El aislador debe proporcionar aislamiento del cuarto y mantener la ISO Clase 5 (ver Tabla 7) durante las condiciones dinámicas de operación, incluso la transferencia de ingredientes, componentes y dispositivos dentro y fuera del aislador y durante la preparación de PME. • Los recuentos de partículas de muestras tomadas aproximadamente 6 a 12 pulgadas más arriba del sitio de exposición crítica deben mantener niveles ISO Clase 5 (ver Tabla 1) durante la preparación magistral. • No se deben contar más de 3520 partículas (0,5 µm y más grandes) por m 3 durante la transferencia de material, con la sonda del contador de partículas ubicada tan cerca de la puerta de transferencia como sea posible, sin obstruir la transferencia.6 El personal de preparación magistral tiene la responsabilidad de obtener del fabricante la documentación indicando que los CAl/CACI cumplirán con esta norma cuando se ubiquen en ambientes donde los recuentos de partículas excedan ISO Clase 8 (ver Tabla 1) para partículas iguales o mayores de 0,5 µm. Cuando se usen aisladores para la preparación magistral estéril, el tiempo de recuperación para alcanzar la calidad de aire ISO Clase 5 (ver Tabla 1) se debe documentar y se deben desarrollar los procedimientos internos para garantizar que deje transcurrir el tiempo de recuperación adecuado después de transferir los materiales, antes y durante las operaciones de preparación magistral. Si el CIP es un CAi o un CACI que no cumple con los requisitos arriba mencionados o es una CFL o una CSB que no se puede ubicar dentro de una zona amortiguadora ISO Clase 7 (ver Tabla 1), entonces sólo se pueden preparar PME no peligrosas y radiofarmacéuticas de nivel de riesgo bajo, según las órdenes de un médico, para un paciente específico, y la administración de tales PME debe comenzar dentro de las 12 horas de la preparación o según lo recomendado en el prospecto del empaque del fabricante, cualquiera que sea menor.
Pruebas de Muestreo Ambiental (MA) de Partículas Viables y No Viables El programa de muestreo ambiental debe proporcionar información al personal y a los directivos para demostrar que el CIP mantiene un ambiente dentro del área de preparación magistral, que garantiza en forma constante niveles de partículas via6
Los procedimientos de muestreo se detallan en CETA Applications Guide CAG-002-2006, sección 2.09.
688 (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles / Pruebas Físicas
USP 39
bles y no viables aceptablemente bajas. El área de preparación magistral incluye los CIP ISO Clase 5 (ver Tabla 7) (CFL, CSB, CAi y CACI), las zonas amortiguadoras, las antesalas y las áreas segregadas de preparación magistral. El muestreo ambiental se debe tomar como parte de un programa integral de gestión de la calidad y se llevará a cabo, como mínimo, bajo cualquiera de las siguientes condiciones: • como parte de la puesta en servicio y certificación de nuevas instalaciones y equipo; • después de cualquier reparación de las instalaciones y equipos; •como parte de la recertificación de las instalaciones y equipos (es decir, cada 6 meses); • en respuesta a problemas identificados en los productos terminados o técnicas del personal; o •en respuesta a problemas con las PME, prácticas de trabajo observadas del personal de preparación magistral o infecciones relacionadas con el paciente (donde la PME se considera una fuente potencial de la infección). PROGRAMA DE PRUEBAS PARA PARTÍCULAS AMBIENTALES NO VIABLES Un programa de muestras de partículas aéreas no viables difiere del de partículas viables en que está planeado para que mida directamente el desempeño de los controles de ingeniería usados para crear los diversos niveles de limpieza de aire, por ejemplo, ISO Clase 5, 7, u 8 (ver Tabla 7). Verificación del Desempeño de los Controles de Ingeniería-Los CIP (CFL, CSB, CAi y CACI) y los controles de ingeniería secundarios (zonas amortiguadoras y antesalas) son componentes esenciales de la estrategia de control general de contaminación para la preparación magistral aséptica. Por lo tanto, es fundamental que funcionen tal como están diseñados y que los niveles de contaminación resultantes estén dentro de límites aceptables. Los procedimientos de certificación, como aquellos señalados en Certification Guide for Sterile Compounding Facilities (CAG-003-2006)7 deben ser efectuados por una persona calificada, por lo menos cada 6 meses y siempre que el dispositivo o cuarto se reubique o altere o se haga una reparación mayor en las instalaciones. Recuento Total de Partículas-La certificación que cada área con clasificación ISO, por ejemplo, ISO Clase 5, 7 y 8 (ver Tabla 7) está dentro de las normas establecidas, se debe realizar al menos cada 6 meses y siempre que la CFL, la CSB, el CAi o el CACI se reubiquen o la estructura física de la zona amortiguadora o de la antesala se alteren. Las pruebas deben ser efectuadas por operadores calificados, usando equipo electrónico de última tecnología con los siguientes resultados: • ISO Clase 5: no más de 3520 partículas iguales o mayores de 0,5 µm por metro cúbico de aire para cualquier CFL, CSB, CAi y CACI; • ISO Clase 7: no más de 352 000 partículas iguales o mayores de 0,5 µm por metro cúbico de aire para cualquier zona amortiguadora; • ISO Clase 8: no más de 3 520 000 partículas iguales o mayores de 0,5 µm por metro cúbico de aire para cualquier antesala. El personal de supervisión u otros empleados designados deben mantener y revisar todos los registros de certificación para garantizar que los ambientes controlados cumplan con la limpieza de aire, las presiones del cuarto y CAPH apropiados. MONITOREO DE LA PRESIÓN DIFERENCIAL Se debe instalar un manómetro o velocímetro para supervisar el diferencial de presión o flujo de aire entre la zona amortiguadora y la antesala y entre la antesala y el ambiente general fuera de la zona de preparación magistral. Los resultados deberán revisarse y documentarse en un cuaderno de bitácora por lo menos en cada cambio de turno (la frecuencia mínima debe ser diariamente) o mediante un dispositivo de grabación continua. La presión entre el área ISO Clase 7 (ver Tabla 7) y el área general de farmacia no debe ser menor que 5 Pa (0,02 pulgadas de columna de agua). En instalaciones donde se preparan PME de nivel de riesgo bajo y mediano, el flujo de aire diferencial debe mantener una velocidad mínima de 0,2 metros por segundo (40 pies por minuto) entre la zona amortiguadora y la antesala. PROGRAMA DE PRUEBAS PARA PARTÍCULAS AÉREAS AMBIENTALES VIABLES El riesgo de contaminar una PME preparada en condiciones de nivel de riesgo bajo y mediano depende en gran medida de la higiene de las manos y de las prácticas de vestuario apropiadas, de la técnica aséptica del personal de preparación magistral y de la presencia de contaminación superficial, asumiendo que todo el trabajo se desempeña en un CIP ISO Clase 5 (ver Tabla 7) y controles de ingeniería secundarios, zona amortiguadora ISO Clase 7 (ver Tabla 7) y antesala ISO Clase 8 (ver Tabla 7), certificados y que funcionen de manera adecuada. Las PME de nivel de riesgo alto presentan el mayor peligro para los pacientes porque el personal de preparación magistral se enfrenta a la tarea de procesar los componentes y dispositivos no estériles con el fin de conseguir la esterilidad. Un programa de muestreo junto con una auditoría de observación están diseñados para evaluar la competencia de las prácticas de trabajo del personal de preparación magistral, permitiendo la implementación de las acciones correctivas de manera continua (ver Capacitación del Personal y Evaluación de la Competencia en Vestimenta, Prácticas Asépticas de Trabajo y Procedimientos de Limpieza y Desinfección). 7 Controlled Environment Testing Association, 1500 Sunday Orive, Ste. 102, Raleigh, NC 27607; www.CETAinternational.org.
USP 39
Pruebas Físicas/ (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles 689
Plan de Muestreo-Se debe desarrollar un plan de muestreo ambiental apropiado para las partículas aéreas viables, basado en la evaluación de riesgo de las actividades de preparación magistral efectuadas. Los sitios de muestreo seleccionados deben incluir lugares dentro de cada ambiente ISO Clase 5 (ver Tabla 1) y en las zonas ISO Clase 7 y 8 (ver Tabla 1), así como en las zonas segregadas de preparación magistral con más alto riesgo de contaminación (p.ej., zonas de trabajo cerca del ambiente ISO Clase 5 [ver Tabla 7], mostradores cercanos a las puertas, cabinas de transferencia de materiales (pass-through boxes)). El plan debe incluir: ubicación de la muestra, método de recolección, frecuencia de muestreo, volumen de aire muestreado y hora del día, en lo que respecta a la actividad de la zona de preparación magistral y los niveles de acción. La revisión de los datos generados durante un muestreo puede detectar cantidades elevadas de biocarga microbiana aérea; dichos cambios pueden ser indicio de cambios adversos en el ambiente. Se recomienda que el personal de preparación magistral se remita a Control Microbiológico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento Aséptico (1116) y a las "Guidelines for Environmental lnfection Control in Healthcare Facilities, 2003", de los CDC (Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades) para más información. Medio de Crecimiento-Para facilitar el crecimiento bacteriano se debe utilizar un medio de crecimiento microbiológico general, como el Medio de Digerido de Caseína y Soja. En los ambientes de preparación magistral con nivel de riesgo alto se debe usar un agar con extracto de malta u otro medio que facilite el crecimiento de hongos. Los medios usados para el muestreo de superficies deben complementarse con aditivos para neutralizar los efectos de los agentes desinfectantes (p.ej., TSA con lecitina y polisorbato 80). Muestreo de Partículas Aéreas Viables-La evaluación de microorganismos aéreos usando métodos volumétricos de recolección en los ambientes de aire controlado (CFL, CAi, cuarto limpio o zonas amortiguadoras y antesalas) debe efectuarla personal capacitado para todos los niveles de riesgo de las preparaciones magistrales. El método de impacto debe ser el método preferido de muestreo volumétrico de aire. El uso de placas de sedimentación para muestreo cualitativo de aire puede no ser capaz de determinar adecuadamente la calidad del aire en el ambiente controlado. La sedimentación de partículas por gravedad en placas de cultivo depende del tamaño de la partícula y puede estar influenciada por el movimiento del aire. Por consiguiente, la cantidad de unidades formadoras de colonias (ufc) en una placa de sedimentación puede no siempre estar relacionada con las concentraciones de las partículas viables en el ambiente muestreado. Para preparaciones magistrales de nivel de riesgo bajo, mediano y alto, el muestreo de aire se debe efectuar en lugares propensos a la contaminación, durante las actividades de preparación magistral y otras actividades como clasificación de componentes, etiquetado, vestimenta y limpieza. Los lugares de muestreo deben incluir zonas de turbulencia de reflujo de aire dentro de la CFL y otras áreas donde la turbulencia de reflujo de aire puede ingresar a la zona de preparación magistral (puertas de entrada, dentro y alrededor del CIP y ambientes ISO Clase 5 [ver Tabla 1]). Debe considerarse el efecto general que el método de muestreo escogido tendrá sobre el flujo de aire unidireccional dentro de un ambiente de preparación magistral. Para PME de nivel de riesgo bajo con FLU de 12 horas o menos, preparada en un CIP (CFL, CSB, CAi) que mantiene una ISO Clase 5 (ver Tabla 1), el muestreo del aire se debe efectuar en lugares dentro del ambiente ISO Clase 5 y otras áreas (ver Tabla 1) que estén muy cerca del ambiente ISO Clase 5 (ver Tabla 1) durante la certificación del CIP. Dispositivos de Muestreo de Aire-Existe una gran cantidad de fabricantes de equipos electrónicos para muestreo de aire. Es importante que el personal consulte los procedimientos recomendados por el fabricante al usar un equipo para efectuar el muestreo volumétrico de aire. Se deben seguir las instrucciones en el manual del usuario provisto por el fabricante en lo que respecta a la verificación y uso de muestreadores eléctricos de aire que recolectan activamente volúmenes de aire para análisis. Se debe evaluar un volumen suficiente de aire (400 a 1000 litros) en cada lugar seleccionado, con el fin de maximizar la sensibilidad. Los dispositivos volumétricos para muestreo de aire tienen que calibrarse y repararse según lo recomendado por el fabricante. Se recomienda que el personal de preparación magistral se remita también a Metodología e Instrumental para Cuantificación de Microorganismos Viables Transportados por el Aire en Control Microbiológico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento Aséptico (1116), que proporciona más información sobre el uso de muestreadores volumétricos de aire y el volumen de aire que se debe recolectar para detectar variaciones de la biocarga ambiental. Proceso y Frecuencia de Muestreo del Aire-Como parte de la recertificación de instalaciones y equipos, el muestreo del aire se debe efectuar al menos dos veces al año (es decir, cada 6 meses). Si la preparación magistral se realiza en múltiples ubicaciones dentro de una institución (p.ej., farmacia principal, satélites), se requiere el muestreo ambiental para cada área de preparación individual. Se debe tomar un volumen suficiente de aire y seguir las normas del fabricante para el uso de equipo electrónico para muestreo de aire. Cualquier actividad de construcción o de reparación de equipos dentro de una instalación puede requerir que se tomen muestras de aire durante esas actividades. Período de Incubación-Al final del período de muestreo o exposición indicado para la toma de muestras de aire se recuperan las placas de medio de crecimiento microbiano, se aseguran sus tapas (p.ej., con cinta) y luego se invierten e incuban a una temperatura y por un tiempo que conduzca a la multiplicación de microorganismos. El TSA se debe incubar a una temperatura de 30º a 35º durante un período de 48 a 72 horas. El agar con extracto de malta u otro medio apto para hongos se debe incubar entre 26º y 30º durante 5 a 7 días. Se debe contar e informar la cantidad de colonias discretas de microorganismos como unidades formadoras de colonias (ufc) en un formulario de muestreo ambiental. Los recuentos de las muestras de aire se deben transformar en ufc por metro cúbico de aire y evaluar las tendencias adversas.
690 (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles / Pruebas Físicas
USP 39
Niveles de Acción, Documentación y Evaluación de Datos-El muestreo microbiano viable del aire en el ambiente de preparación magistral adquiere valor cuando los datos se usan para identificar y corregir una situación inaceptable. Los datos de muestreo se deben recolectar y revisar en forma periódica como una manera de evaluar el control general del ambiente de preparación magistral. Si una actividad muestra sistemáticamente niveles elevados de crecimiento microbiano, se debe consultar al personal competente de microbiología. Cualquier recuento de ufc que exceda su respectivo nivel de acción (ver Tabla 2) debe dar lugar a una reevaluación de la aptitud de las prácticas de trabajo del personal, los procedimientos de limpieza, los procedimientos operativos y la eficacia de la filtración de aire dentro de las instalaciones de preparación magistral aséptica. Se debe investigar la fuente de la contaminación. Las posibles fuentes incluyen los sistemas de HVAC, filtros HEPA dañados y cambios en la vestimenta o prácticas de trabajo del personal. Se debe eliminar la fuente del problema, limpiar el área afectada y tomar nuevas muestras. Los recuentos de ufc se usan como una medida aproximada de la biocarga microbiana ambiental. Los niveles de acción se determinan de acuerdo con los datos de ufc recolectados en cada sitio de muestreo y se establece la tendencia en el tiempo. Las cifras en la Tabla 2 deben usarse sólo como guía. Sin importar la cantidad de ufc identificadas en la farmacia, las acciones correctivas futuras se tomarán de acuerdo con la identificación de los microorganismos recuperados (al menos el género) hecha por un laboratorio acreditado sobre cualquier biocarga microbiana capturada como una ufc, usando un muestreador de aire por impacto. Los microorganismos altamente patógenos (p.ej., bacilos gramnegativos, estafilococos coagulasa positivo, hongos filamentosos y levaduras) pueden ser potencialmente letales para los pacientes que reciben PME y deben ser eliminados de inmediato, independientemente del recuento de ufc, con la ayuda de un microbiólogo competente, un profesional de control de infecciones o un higienista industrial. Tabla 2. Niveles de Acción Recomendados para Contaminación Microbiana• t(ufc por metro cúbico [1000 litros] de aire por placa)
Claslflcaclón
Muestra de Airet
ISO Clase 5
>1
ISO Clase 7
>10
ISO Clase 8 o menor calidad
> 100
* Guidance for lndustry-Sterile Drug Products Produced by Aseptic Processing-Current Good Manufacturing Practice-US HHS, FDA, septiembre de 2004.
Requisitos Adicionales para el Personal Los alimentos, bebidas y materiales expuestos en áreas de cuidado y tratamiento de pacientes no deben introducirse en antesalas, zonas amortiguadoras o áreas segregadas para preparación magistral en las que haya componentes e ingredientes de PME. Cuando las actividades de preparación magistral requieran la manipulación de materiales derivados de la sangre del paciente u otros materiales biológicos (p.ej., marcado radioactivo de leucocitos de un paciente o donante), las manipulaciones deben hacerse claramente aparte de los procedimientos de rutina para manejo de material y equipo usado en las actividades de preparación de PME y deben controlarse por medio de POE específicos con el fin de evitar contaminaciones cruzadas. Los suministros y componentes empacados para preparación magistral, como agujas, jeringas, sets de tubos y soluciones parenterales de pequeño y gran volumen deben sacarse de las cajas y frotarse con un desinfectante que no deje residuo (p.ej., IPA estéril al 70%) de ser posible en una antesala de calidad de aire ISO Clase 8 (ver Tabla 1), antes de pasarlos a las zonas amortiguadoras. La higiene de manos y los procedimientos de vestimenta del personal se efectúan también en la antesala, la cual puede contener un lavabo que se pueda accionar sin usar las manos y un sistema cerrado dispensador de jabón para minimizar el riesgo de contaminación extrínseca. Deberá existir algún tipo de demarcación que separe la antesala de la zona amortiguadora. Después de entrar a la zona amortiguadora deben tomarse las medidas adecuadas para efectuar la limpieza antiséptica de manos usando un exfoliante quirúrgico a base de alcohol con actividad persistente, seguido del uso de guantes estériles.
Limpieza y Desinfección del Área de Preparación Magistral El contacto ambiental es una fuente importante de contaminación microbiana de las PME. Por consiguiente, se requiere atención escrupulosa en la limpieza y desinfección de las áreas de preparación magistral estéril para minimizar dicha fuente de contaminación de las PME. Las prácticas de limpieza y desinfección, así como las frecuencias mencionadas en esta sección aplican a las zonas de preparación magistral ISO Clase 5 (ver Tabla 1) para exposición de sitios críticos, así como a las zonas amortiguadoras, antesalas y zonas segregadas de preparación magistral. El personal de preparación magistral es responsable de garantizar que la frecuencia de limpieza esté de acuerdo con los requisitos estipulados en la Tabla 3 y determinar los productos para limpieza y desinfección que se van a usar (ver Apéndice 11). El personal de preparación magistral debe tener en cuenta toda política organizacional o institucional relacionada con la selección de desinfectantes. Todas las prácticas y políticas de limpieza y desinfección para la preparación de PME se deben incluir por escrito en los POE y las debe seguir todo el personal de preparación magistral.
Pruebas Físicas/ (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles 691
USP 39
Tabla 3. Frecuencia Mínima de Limpieza y Desinfección de las Zonas de Preparación Magistral Lugar
Frecuencia Mínima
Control de Ingeniería Primario ISO Clase 5 (ver Tabla 7) (p.ej., CFL, CSB, CAi, CACI)
Al comenzar cada turno, antes de cada lote, a más tardar 30 minutos después de la desinfección previa de la superficie cuando se están llevando a cabo actividades de preparación magistral, después de derramamientos y cuando se sepa o sospeche que la superficie está contaminada
Mostradores y superficies de trabajo fácilmente limpiables
Diariamente
Pisos
Diariamente
Paredes
Mensualmente
Cielos rasos
Mensualmente
Estantes de almacenamiento
Mensualmente
La selección y uso de desinfectantes en instituciones de salud está dictada por varias propiedades, tales como actividad microbicida, inactivación por materia orgánica, residuos y vida útil (ver Apéndice JI). En general, los desinfectantes altamente tóxicos, como el glutaraldehído no se usan sobre las superficies del ambiente (p.ej., pisos, mostradores). Muchos desinfectantes registrados por la EPA son de un solo paso. Esto significa que el desinfectante está formulado para ser eficaz en presencia de suciedad leve a moderada, sin un paso previo de limpieza. Las superficies en CFL, CSB, CAi y CACI, a las que están expuestos los sitios críticos, requieren desinfección más frecuente que las superficies del ambiente como paredes y cielos rasos. La desinfección de zonas de preparación magistral estéril debe hacerse de manera periódica con los intervalos mencionados en la Tabla 3 cuando ocurren derramamientos, cuando las superficies están visiblemente sucias y cuando se sabe o se sospecha que se ha introducido contaminación microbiana en las zonas de preparación magistral. Cuando la superficie que se va a desinfectar está muy sucia, se recomienda una limpieza antes de la aplicación del desinfectante. El personal de preparación magistral capacitado es responsable de desarrollar, implementar y poner en práctica los procedimientos de limpieza y desinfección del área directa de preparación magistral (ADP) escritos en los POE. La limpieza y desinfección deben hacerse antes de la preparación magistral. Para hacer la limpieza, se deben quitar todos los artículos y limpiar las superficies, retirando el material suelto y los residuos de derramamientos; por ejemplo, los residuos sólidos solubles en agua se quitan con agua estéril (para inyección o irrigación) y paños que no desprendan partículas. Luego se pasa un paño con un agente desinfectante que no deje residuos, como IPA al 70%, el cual se deja secar antes de comenzar la preparación magistral. Las prácticas más críticas antes de la preparación de las PME son la limpieza y desinfección de las superficies en CFL, CSB, CAi y CACI. Por consiguiente, dichas superficies se deben limpiar y desinfectar con frecuencia: al comenzar cada turno de trabajo, antes de la preparación de cada lote, cada 30 minutos durante los períodos continuos de preparación de PME individuales, cuando haya derramamientos y cuando se sepa o sospeche que la superficie está contaminada debido a fallas procedimentales. Las superficies de trabajo en las zonas amortiguadoras ISO Clase 7 (ver Tabla 1) y las antesalas ISO Clase 8 (ver Tabla 1), así como las zonas segregadas de preparación magistral se deben limpiar y desinfectar por lo menos diariamente, y el polvo y los detritos se deben retirar cuando sea necesario de los sitios de almacenamiento de ingredientes y suministros de preparación magistral, usando un método que no degrade la calidad de aire ISO Clase 7 u 8 (ver Tabla 1) (ver Desinfectantes y Antisépticos (1072)). Los pisos en la zona amortiguadora o limpia, antesala y zona de preparación magistral segregada se friegan con un agente limpiador y desinfectante una vez al día, a una hora en que no se esté realizando ninguna operación aséptica. La limpieza del suelo debe ser realizada por personal capacitado, usando los agentes y procedimientos aprobados que se describen en los POE escritos. El personal de preparación magistral tiene la responsabilidad de garantizar que dicha limpieza se haga apropiadamente. En la zona amortiguadora o limpia, antesala y zona segregada de preparación magistral, se deben limpiar y desinfectar mensualmente las paredes, cielos rasos y estanterías. Sólo deben utilizarse agentes de limpieza y desinfección aprobados teniendo en cuenta su compatibilidad, eficacia y la generación de residuos inapropiados o tóxicos (ver Apéndice //). Sus cronogramas de uso y métodos de aplicación deben concordar con los POE escritos y el personal de apoyo y el de preparación magistral deben cumplirlos. Todos los materiales de limpieza, como paños, esponjas y trapeadores, no deben desprender partículas, y deben estar compuestos preferentemente por microfibras sintéticas y destinados al uso en las zonas amortiguadoras o limpias, antesalas y áreas segregadas de preparación magistral, de las cuales no deben retirarse a menos que sea para desecharlos. Pueden usarse trapeadores, tanto en la zona amortiguadora o cuarto limpio como en la antesala, pero únicamente en ese orden. Lo ideal sería que todas los enseres de limpieza se descartaran después de un uso, recolectándolos en bolsas plásticas apropiadas y retirándolos del lugar con la mínima agitación. Si los materiales de limpieza (p.ej., trapeadores) se reutilizan, se deben desarrollar procedimientos (basándose en las recomendaciones de los fabricantes) que garanticen que la eficacia del dispositivo de limpieza se mantiene y el uso repetido no incrementa la biocarga del área que se está limpiando. Los suministros y equipos retirados de su embalaje original se deben limpiar con un agente desinfectante apropiado (p.ej., IPA estéril al 70%), empleando un frasco rociador u otro método de aplicación adecuado. Después de rociar o limpiar con el desinfectante la superficie a desinfectar, ésta se debe dejar secar y durante este tiempo el artículo no se debe usar para la preparación magistral.
692 (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles / Pruebas Físicas
USP 39
Para desinfectar puntos de entrada de bolsas y viales, es preferible limpiar con hisopos pequeños estériles impregnados en IPA al 70%, los cuales se consiguen comercialmente en envases laminados sellados individuales (o un método comparable), dejando secar el IPA antes de perforar los tapones con agujas estériles y de romper los cuellos de las ampollas. La superficie de los hisopos estériles con IPA al 70% usados para desinfectar puntos de entrada de envases y dispositivos estériles no debe entrar en contacto con ningún otro objeto antes de tocar la superficie del punto de entrada. No se deben utilizar compresas de gasa empapadas en IPA estéril al 70% ni otros materiales que desprendan partículas para desinfectar los puntos de entrada estériles de envases y dispositivos. Cuando se reciben suministros estériles en bolsas selladas destinadas a conservarlos estériles hasta el momento de abrirlos, los suministros estériles se pueden retirar de las bolsas que los recubren cuando se introducen en el CIP (CFL, CSB, CAi, CACI) ISO Clase 5 (ver Tabla 1) sin que sea necesario desinfectar los artículos individuales del suministro estéril. No se pueden llevar cajas de embalaje ni otros envases externos a la zona amortiguadora o limpia ni al área segregada de preparación magistral.
Limpieza y Vestimenta del Personal La cuidadosa limpieza de manos y brazos y el uso correcto del adecuado equipo protector para el personal (EPP) por parte del personal de preparación magistral constituye el primer paso más importante en la prevención de contaminación microbiana de las PME. Además, el personal debe ser completamente competente y estar muy motivado para realizar manipulaciones asépticas impecables con ingredientes, dispositivos y componentes de las PME. Del cuerpo humano normalmente se desprenden células escamosas a una velocidad de 106 o más por hora y esas partículas de la piel están cargadas de microorganismos. 8 •9 Cuando los individuos tienen prurito, quemaduras de sol, úlceras exudantes, conjuntivitis, infección respiratoria activa o usan cosméticos, estas partículas se desprenden incluso a mayor velocidad. Las partículas desprendidas por el personal de preparación magistral representan un incremento en el riesgo de contaminación microbiana de los sitios críticos de PME. Por lo tanto, el personal de preparación magistral que presenta alguna de las afecciones antes mencionadas debe ser excluido del trabajo en zonas de preparación magistral ISO Clase 5 (ver Tabla 7) e ISO Clase 7 (ver Tabla 7), hasta que dichas afecciones desaparezcan. Antes de ingresar en una zona amortiguadora o en una zona segregada de preparación magistral (ver PME de Nivel de Riesgo Bajo con FLU de 72 Horas o Menos), el personal de preparación magistral debe quitarse las prendas personales exteriores (p.ej., bandanas, abrigos, sombreros, chaquetas, bufandas, suéteres, chalecos), todos los cosméticos, porque desprenden escamas y partículas, y todas las joyas de las manos y muñecas, así como otras joyas y accesorios visibles (p.ej., aretes, pendientes para labios o cejas (pirsins)) que puedan interferir con la eficacia del EPP (p.ej., ajuste de guantes y puños de mangas). El uso de uñas postizas o prolongaciones está prohibido mientras se trabaja en el ambiente estéril de preparación magistral. Las uñas naturales se deben mantener limpias y recortadas. El personal debe usar el siguiente EPP en un orden que vaya de las actividades consideradas más sucias hasta las más limpias. Las actividades de vestimenta consideradas más sucias incluyen el calzado de zapatos destinados a la preparación magistral o cubrecalzado, gorras y mascarillas que cubran el vello facial (p.ej., cubiertas para la barba, además de máscaras), máscaras protectoras para la cara y ojos. Los protectores para los ojos son opcionales, a menos que se trabaje con irritantes como agentes germicidas desinfectantes o se elaboren preparaciones con fármacos peligrosos. Después de ponerse el calzado especial o cubrecalzado, gorras y mascarillas que cubran el vello facial, y máscaras, se debe realizar un procedimiento de limpieza de manos para retirar los detritos debajo de las uñas con un limpiador de uñas, bajo agua tibia corriente, seguido de una limpieza meticulosa de las manos. Las manos y los antebrazos se deben lavar hasta los codos con agua y jabón (bien sea antimicrobiano o no), durante 30 segundos al menos, mientras se está en la antesala. No se recomienda el uso de cepillos antimicrobianos porque causan irritación y lesiones cutáneas. Se secan las manos y los antebrazos completamente hasta los codos, bien sea con toallas desechables sin pelusas o con un secador de manos electrónico. Después de completar el lavado de manos, se viste una bata con mangas que no desprenda partículas, que ajuste de manera cómoda alrededor de las muñecas y cierre en el cuello. Se deben usar batas destinadas para la zona amortiguadora, que sean de preferencia desechables. Si se visten batas reutilizables, se deben lavar apropiadamente para uso en la zona amortiguadora. Una vez dentro de la zona amortiguadora o del área segregada de preparación magistral (ver PME de Nivel de Riesgo Bajo con FLU de 72 Horas o Menos) y antes de calzar guantes estériles sin talco, se debe efectuar una limpieza antiséptica de manos con un exfoliante quirúrgico para manos exento de agua, a base de alcohol y con actividad persistente 10, siguiendo las recomendaciones del fabricante. Las manos se deben dejar secar completamente antes de calzar los guantes estériles. Los guantes estériles deben ser el último artículo puesto antes de comenzar la preparación magistral. Los guantes se contaminan cuando entran en contacto con superficies no estériles durante las actividades de preparación magistral. La desinfección de las manos enguantadas se debe hacer frotando o untando IPA estéril al 70% en todas las superficies de contacto de los guantes y dejando secar completamente las manos enguantadas. Usar sólo guantes cuya compatibilidad con la desinfección con alcohol haya sido probada por el fabricante. Durante todo el procedimiento de preparación magistral se debe aplicar IPA estéril al 70% en forma rutinaria, al igual que siempre que se toquen superficies no estériles (p.ej., viales, mostradores, sillas,
Agalloco ], Akers JE. Aseptic Processing: A Vision of the Future. Pharmaceutical Technology, 2005. Aseptic Processing supplement, sl 6. Eaton T. Microbial Risk Assessment for Aseptically Prepared Products. Am Pharm Rev. 2005; 8 (5, Sep/Oct): 46-51. Guideline for Hand Hygiene in Hea/th care Settings, MMWR, el 25 de octubre de 2002, vol. 51, Nº RR-16 disponible en Internet en http://www.cdc.gov/handhygiene/.
8
9 1
º
USP 39
Pruebas Físicas/ (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles 693
carros). Los guantes se deben inspeccionar rutinariamente, durante el uso, en busca de orificios, pinchazos o rasgones, reemplazándolos de inmediato si éstos se detectan. La limpieza antiséptica de manos se debe efectuar como se indicó anteriormente. Se debe capacitar y evaluar al personal de preparación magistral sobre cómo evitar el contacto con los sitios críticos. Cuando el personal de preparación magistral sale del área de preparación durante un turno de trabajo, se debe quitar la bata exterior, conservándola en el área de preparación magistral si no está visiblemente sucia, para volvérsela a poner durante ese mismo turno únicamente. Sin embargo, los cubrecalzado, las mascarillas que cubran el vello facial y gorras, máscaras protectoras para la cara y ojos, así como los guantes se deben reemplazar por otros nuevos antes de volver a entrar al área de preparación magistral y se debe efectuar de nuevo la higiene de las manos. Durante las actividades de preparación magistral de alto riesgo que preceden a la esterilización terminal, como son el pesado y mezclado de ingredientes no estériles, el personal de preparación magistral debe estar vestido y enguantado igual que si estuviera realizando una preparación magistral en un ambiente ISO Clase 5 (ver Tabla 1). El personal de preparación magistral adecuadamente vestido y enguantado que se exponga a un aire cuya calidad se sepa o sospeche inferior a ISO Clase 7 (ver Tabla 1) debe cambiar EPP, además de lavarse las manos apropiadamente, efectuando limpieza antiséptica de la manos con un exfoliante quirúrgico a base de alcohol, sin agua, y calzar guantes estériles al volver a ingresar a la zona amortiguadora ISO Clase 7 (ver Tabla 1). Cuando las fuentes del ambiente ISO Clase 5 (ver Tabla 1) son CAi o CACI, los requisitos de vestimenta y guantes para el personal de preparación magistral deben ser iguales a los descritos anteriormente, a menos que el fabricante del aislador pueda proporcionar documentación por escrito, basada en pruebas ambientales validadas, de que no se requiere algún componente del EPP o de la limpieza del personal.
Capacitación del Personal y Evaluación de la Competencia en Vestimenta, Prácticas Asépticas de Trabajo y Procedimientos de Limpieza y Desinfección El personal encargado de la preparación de las PME deberá recibir capacitación competente y a conciencia por parte de personal experto, con ayuda de instrucción multimedia y publicaciones profesionales, sobre los principios teóricos y los conocimientos prácticos de los procedimientos de vestimenta, prácticas asépticas de trabajo, así como en la forma de conseguir y mantener condiciones ambientales ISO Clase 5 (ver Tabla 1) y procedimientos de limpieza y desinfección. Esta capacitación se debe completar y documentar antes de que cualquier miembro del personal comience la elaboración de PME. El personal de preparación magistral debe completar la capacitación didáctica, aprobar las evaluaciones escritas de competencia, someterse a evaluaciones de destreza usando herramientas de auditoría de observación y pruebas de llenado de medios (ver Apéndices 111V). Las pruebas de las destrezas para el trabajo aséptico mediante el llenado de medios se efectúan inicialmente antes de comenzar a preparar PME y luego anualmente, al menos, para preparaciones magistrales de nivel de riesgo bajo y mediano y semestralmente para preparaciones magistrales de nivel de riesgo alto. El personal de preparación magistral que no pase las pruebas escritas o las auditorías de observación o cuyos viales de prueba de llenado de medios tengan una o más unidades que muestren contaminación microbiana visible deberá recibir de inmediato una nueva capacitación y someterse a una nueva evaluación a cargo de personal experto en preparación magistral, para asegurarse de que hayan corregido todas sus deficiencias en materia de práctica aséptica. El personal de preparación magistral debe aprobar todas las evaluaciones antes de reiniciar la práctica de preparación magistral estéril. Además de la evaluación didáctica y llenado aséptico de medios, el personal de preparación magistral debe demostrar competencia en la higiene apropiada de las manos, vestimenta y procedimientos de limpieza. En caso de que el personal de apoyo (p.ej., personal de limpieza/mantenimiento y servicios ambientales institucionales) efectúe también procedimientos de limpieza y desinfección, un experto calificado en preparación magistral aséptica debe capacitarlos en la higiene de las manos, vestimenta y procedimientos de limpieza y desinfección. Después de terminar la capacitación, el personal de apoyo debe someterse rutinariamente a una evaluación de desempeño en la higiene apropiada de las manos, vestimenta y todos los procedimientos de limpieza y desinfección, que llevará a cabo un experto calificado en preparación magistral aséptica. EVALUACIÓN DE COMPETENCIA EN VESTIMENTA Y PRÁCTICAS ASÉPTICAS DE TRABAJO El riesgo de contaminar una PME preparada en condiciones de nivel de riesgo bajo y mediano depende en gran medida de la higiene de las manos y de las prácticas de vestuario apropiadas; de la técnica aséptica del personal de preparación magistral y de la presencia de contaminación superficial, asumiendo que todo el trabajo se realiza en un CIP ISO Clase 5 (ver Tabla 1) y controles de ingeniería secundarios, zona amortiguadora ISO Clase 7 (ver Tabla 1) y antesala ISO Clase 8 (ver Tabla 1), certificados y que funcionen de manera adecuada. Las PME de nivel de riesgo alto presentan el mayor peligro para los pacientes porque el personal de preparación magistral se enfrenta a la tarea de procesar los componentes y dispositivos no estériles con el fin de conseguir la esterilidad. El personal de preparación magistral debe ser evaluado inicialmente antes de comenzar la elaboración de PME y siempre que se efectúe un llenado de medios aséptico, usando un formulario como el Formulario de Muestra para Evaluación de la Higiene de las Manos y Prácticas Relacionadas con la Vestimenta del Personal de Preparación Magistral (ver Apéndice llf) y el procedimiento de muestreo de las puntas de los dedos enguantados del personal, según se indica a continuación.
694 (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles / Pruebas Físicas
USP 39
Evaluación de la Práctica Aséptica de Trabajo por Medio del Muestreo de las Puntas de los Dedos Enguantados del Personal-El muestreo de las puntas de los dedos enguantados del personal de preparación magistral se debe realizar en la elaboración de PME de todos los niveles de riesgo, dado que la contaminación por contacto directo es la fuente más probable de introducción de microorganismos en las PME preparadas por seres humanos. El muestreo de las puntas de los dedos enguantados se debe usar para evaluar la competencia del personal en los procedimientos de higiene de las manos y vestimenta, así como para educar al personal de preparación magistral en las prácticas de trabajo apropiadas, las cuales incluyen desinfección frecuente y repetida de guantes, usando IPA estéril al 70% durante la preparación de las PME. Todo el personal debe demostrar competencia en los procedimientos adecuados de higiene de las manos y vestimenta, así como en las prácticas asépticas de trabajo (p.ej., desinfección de las superficies de los componentes, desinfección rutinaria de manos enguantadas, etc.). Se deben usar placas estériles de contacto con agar para tomar las muestras de las puntas de los dedos enguantados del personal de preparación magistral después de vestirse, con el fin de evaluar la competencia en el uso de vestimenta, y después de completar la preparación de llenado de medios (sin aplicar IPA estéril al 70%) con el fin de evaluar si las prácticas asépticas de trabajo son adecuadas, antes de que se les permita comenzar a elaborar PME para uso humano y para que el personal más experimentado mantenga su calificación en el proceso mencionado. Evaluación de Competencia en Uso de Vestimenta y Guantes-El personal de preparación magistral debe ser inspeccionado visualmente durante los procedimientos de higiene de las manos y uso de vestimenta (ver Limpieza y Vestimenta del Persona/ en Capacitación y Evaluación del Personal en Técnicas de Manipulación Aséptica, arriba). La inspección visual debe documentarse en un formulario como el Formulario de Muestra para Evaluación de la Higiene de las Manos y Prácticas Relacionadas con la Vestimenta del Personal de Preparación Magistral (ver Apéndice 111) y mantenerse para tener un registro permanente y evaluación a largo plazo de la competencia del personal. Muestreo de las Puntas de los Dedos Enguantados-Todo el personal de preparación magistral debe completar exitosamente una evaluación inicial de competencia y un procedimiento de muestreo de las puntas de los dedos enguantados (cero ufc) no menos de tres veces antes de que se le permita comenzar a elaborar PME para uso humano. Inmediatamente después de que el empleado de preparación magistral complete la higiene de las manos y el procedimiento de vestimenta (p.ej., calzado de guantes estériles antes de cualquier desinfección con IPA estéril al 70%), el evaluador recolectará una muestra de las puntas de los dedos y pulgares enguantados de ambas manos del empleado en placas de agar apropiadas, presionando ligeramente el agar con cada dedo. Las placas se incubarán durante un período de incubación apropiado a la temperatura adecuada (ver Período de Incubación). Después de completar la evaluación inicial de competencia en el uso de vestimenta y guantes, una vez al año, como mínimo, se debe hacer una reevaluación de la competencia de todo el personal de preparación magistral que elabore PME de nivel de riesgo bajo y mediano, y semestralmente al personal que elabore PME de nivel de riesgo alto, usando una o más muestras recolectadas durante cualquier procedimiento de prueba de llenado de medios, antes de que se les permita continuar elaborando PME para uso humano. No se deben desinfectar los guantes con IPA estéril al 70% inmediatamente antes de la toma de muestras. La desinfección de los guantes inmediatamente antes de la toma de muestras proporcionará resultados falsos negativos. Cuando se tomen muestras de las puntas de los dedos del personal se usarán placas que contengan agar nutritivo con agentes neutralizantes como lecitina y polisorbato 80. El personal debe "tocar" el agar con las puntas de los dedos de ambas manos en placas separadas, de manera que se cree una ligera impresión en el agar. Después de la toma de muestras, los guantes se deben desechar de inmediato y efectuar la higiene apropiada de las manos. Las placas con agar nutritivo se deben incubar como se estipula a continuación (ver Período de Incubación). Los resultados se deben informar por separado como la cantidad de ufc por empleado por mano (mano izquierda, mano derecha). El nivel de acción de ufc para las manos enguantadas estará basado en la cantidad total de ufc en ambos guantes, no por cada mano. Período de Incubación-Al final del período de muestreo indicado para las actividades de evaluación de la competencia del personal de preparación magistral (superficie o personal), se recuperan las placas de agar, se aseguran sus tapas y luego se invierten e incuban a una temperatura y por un tiempo que conduzca a la multiplicación de microorganismos. El TSA con lecitina y polisorbato 80 se debe incubar a una temperatura de 30º a 35º durante un período de 48 a 72 horas. Evaluación de la Competencia en Manipulación Aséptica-Después de completar exitosamente una Evaluación de Competencia en Higiene de las Manos y Vestimenta, todo el personal de preparación magistral debe someterse una evaluación de su competencia en la técnica aséptica y prácticas relacionadas, inicialmente durante el Procedimiento de Prueba de Llenado de Medios y en los subsiguientes Procedimientos de Prueba de Llenado de Medios, anual o semestralmente. Los registros de estas evaluaciones se mantendrán usando un formulario como el Formulario de Muestra para Evaluación de Técnicas Asépticas y Prácticas Relacionadas del Personal de Preparación Magistral (ver Apéndice IV) y se conservarán para tener un registro permanente de la evaluación a largo plazo de la competencia del personal. Procedimiento de Prueba de Llenado de Medios-La destreza del personal para preparar PME asépticamente se debe evaluar usando la verificación de llenado de medios de cultivos bacterianos líquidos y estériles (es decir, transferencia de un medio de cultivo bacteriano estéril por medio de una jeringa y aguja estériles). La prueba de llenado de medios se utiliza para evaluar la práctica aséptica del personal de preparación magistral. Las pruebas de llenado de medios deben representar las condiciones más exigentes o difíciles con las que el personal puede encontrarse durante la elaboración de PME de nivel de riesgo bajo y mediano y durante la esterilización de PME de nivel de riesgo alto. Las pruebas de desafío de llenado de medios se usan también para verificar la aptitud del ambiente de preparación magistral y de los procesos para producir una preparación estéril.
Pruebas Físicas/ (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles 695
USP 39
Por lo general, se usa un medio líquido de cultivo estéril disponible comercialmente, como el Medio de Digerido de Caseína y Soja (ver Pruebas de Esterilidad (71 )), que sea capaz de promover la colonización exponencial de las bacterias que el personal de preparación magistral y el entorno suelen transmitir a las PME. Para PME de nivel de riesgo alto se puede usar un Medio de Digerido de Caseína y Soja no estéril, disponible comercialmente, para preparar una solución al 3%. Se deben imitar los pasos de procesamiento normales, incluyendo la esterilización por filtración. Los viales llenados con medios deben incubarse a una temperatura de 20º a 25º o de 30º a 35º durante 14 días como mínimo. Si se usan dos temperaturas para la incubación de muestras de llenado de medios, entonces tales envases llenos deberán incubarse durante al menos 7 días a cada temperatura (ver Control Microbiológico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento Aséptico (1116)). Si cualquiera de las unidades llenas de medio desarrolla una turbidez visible dentro de los 14 días, significa que no se ha pasado la prueba. Se pueden considerar otros métodos recomendados por un microbiólogo competente para mejorar el tiempo de recuperación y la sensibilidad para detectar contaminación microbiana (ver ejemplos de procedimientos de llenado de medios en Niveles de Riesgo de Contaminación Microbiana en las PME).
MUESTREO Y EVALUACIÓN DE LIMPIEZA Y DESINFECCIÓN DE SUPERFICIES La toma de muestras de superficies es un componente importante del mantenimiento de un ambiente microbiológicamente controlado para elaboración de PME, especialmente si se considera que la transferencia de contaminación microbiana a partir del contacto inadvertido por parte del personal de preparación magistral con superficies desinfectadas inadecuadamente, puede ser una fuente potencial de contaminación para las PME. Además, se considera útil para evaluar los procedimientos de limpieza y desinfección de las instalaciones y superficies de trabajo, así como la competencia de los empleados en las prácticas de trabajo como la desinfección de superificies de componentes/viales. En todas las áreas ISO se deben tomar muestras de las superficies en forma periódica. Los muestreos se pueden hacer usando placas de contacto o hisopos y se deben realizar al terminar la preparación magistral. Se deben definir los lugares en donde se van a tomar muestras en un plan o formulario de muestreo. El tamaño de la placa que se va a usar para cada lugar muestreado tiene, por lo general, entre 24 y 30 cm2. Las placas de contacto se llenan con medio agar sólido de crecimiento general y agentes neutralizantes por encima del borde de la placa y se usan para tomar muestras de superficies parejas o planas. Se pueden usar hisopos para tomar muestras de superficies irregulares, especialmente para equipos (ver Control Microbiológico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento Aséptico (1116)). Evaluación de Competencia en Limpieza y Desinfección-Se debe inspeccionar visualmente al personal de preparación magistral y demás personal responsable de la limpieza durante la realización de los procedimientos de limpieza y desinfección, durante la capacitación inicial del personal en los procedimientos de limpieza, durante los cambios de personal de limpieza y después de la terminación de cualquier procedimiento de prueba de llenado de medios (ver Limpieza y Desinfección del Área de Preparación Magistra0.
La inspección visual debe documentarse en un formulario como el Formulario de Muestra para Evaluación de Procedimientos y Desinfección (ver Apéndice \/) y conservarse para tener un registro permanente y la evaluación a largo plazo de la competencia del personal. Métodos de Recolección en la Superficie-Para tomar muestras usando una placa de contacto, se debe tocar suavemente el área de muestreo con la superficie del agar y deslizar la placa sobre la superficie a muestrear. La placa de contacto dejará un residuo de medio de crecimiento; por lo tanto, inmediatamente después de tomar la muestra con la placa de contacto, el área muestreada se debe limpiar cuidadosamente con un paño que no desprenda partículas, empapado en IPA estéril al 70%. Si se toma una muestra con el método del hisopo, la recolección de la muestra se hace con los procedimientos apropiados que determinen un área superficial equivalente a la de la placa de contacto. Después de pasar los hisopos por la superficie muestreada, los hisopos se colocan en un diluyente apropiado y una alícuota se siembra en el agar nutritivo especificado. Los resultados se deben informar como ufc por unidad de área superficial. de Limpieza
Niveles de Acción, Documentación y Evaluación de Datos El monitoreo microbiano viable de las puntas de los dedos enguantados y de las superficies de los componentes, así como del ambiente de preparación magistral adquieren valor cuando los datos se usan para identificar y corregir una práctica de trabajo inaceptable. Los datos de muestreo se deben recolectar y revisar en forma periódica como una manera de evaluar el control general del ambiente de preparación magistral. Si una actividad muestra sistemáticamente niveles elevados de crecimiento microbiano, se debe consultar al personal competente de microbiología. Cualquier recuento de ufc que exceda su respectivo nivel de acción (ver Tabla 4) debe dar lugar a una reevaluación de la aptitud de las prácticas de trabajo del personal, los procedimientos de limpieza, los procedimientos operativos y la eficacia de la filtración de aire dentro de las instalaciones de preparación magistral aséptica. Se debe investigar la fuente de la contaminación. Las posibles fuentes de contaminación incluyen los sistemas de HVAC, filtros HEPA dañados y cambios en la vestimenta o prácticas de trabajo del personal. Se debe eliminar la fuente del problema, limpiar el área afectada y tomar nuevas muestras. Cuando los resultados de la muestra de las puntas de los dedos enguantados exceden los niveles de acción después de la incubación apropiada, se debe efectuar y documentar una revisión de los procedimientos de higiene de las manos y de vestimenta, así como de los procedimientos de desinfección de guantes y superficies y prácticas de trabajo. Puede ser necesario capacitar al empleado para corregir la fuente del problema.
USP 39
696 (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles / Pruebas Físicas
Los recuentos de ufc se usan como una medida aproximada de la biocarga microbiana ambiental. Los niveles de acción se determinan de acuerdo con los datos de ufc recolectados en cada sitio de muestreo y se establece la tendencia en el tiempo. Las cifras en la Tabla 4 deben usarse sólo como guía. Sin importar la cantidad de ufc identificadas en la instalación de preparación magistral, las acciones correctivas futuras se tomarán de acuerdo con la identificación de los microorganismos recuperados (al menos el género), hecha por un laboratorio acreditado sobre cualquier biocarga microbiana capturada como una ufc, usando un muestreador de aire por impacto. Los microorganismos altamente patógenos (p.ej., bacilos gramnegativos, estafilococos coagulasa positivo, hongos filamentosos y levaduras) pueden ser potencialmente letales para los pacientes que reciben PME y deben ser eliminados de inmediato, independientemente del recuento de ufc, con la ayuda de un microbiólogo competente, un profesional de control de infecciones o un higienista industrial. Tabla 4. Niveles de Acción Recomendados para Contaminación Microbiana• Muestra de las Puntas de los Dedos
Claslficaclón
Muestra de Superficie (Placa de Contacto) (ufc por placa)
ISO Clase 5
>3
>3
ISO Clase 7
N/D N/D
>5
ISO Clase 8 o menor calidad
> 100
• Pharmaceutical lnspection Co-operation Scheme (PIC/S) Guide to Good Manufacturing Practice for Medicinal Products Annexes PE 009-6, 5 de abril de 2007.
PROCEDIMIENTOS OPERATIVOS ESTÁNDARES (POE) SUGERIDOS La instalación de preparación magistral debe tener POE escritos y debidamente aprobados, diseñados para asegurar la calidad del entorno en el que se elabora la PME. Se recomienda adoptar los siguientes procedimientos: 1. Restringir el acceso a la zona amortiguadora a personal calificado con responsabilidades específicas o tareas asignadas en el área de preparación magistral. 2. Descontaminar en el área todos los materiales empacados, retirándolos de sus cajas y limpiándolos o rociándolos con un agente desinfectante que no deje residuos, mientras se los transfiere a un carro limpio y adecuadamente desinfectado o a otro medio de transporte para su introducción en la zona amortiguadora. Se seguirán las instrucciones del fabricante o los datos publicados para el tiempo mínimo de contacto. No es necesario limpiar los materiales que vienen en bolsas individuales estériles, ya que las bolsas pueden retirarse a medida que se introducen los materiales en la zona amortiguadora. 3. Los suministros requeridos con frecuencia o que deben tenerse a mano pero que no son necesarios para las operaciones programadas en un determinado turno deben descontaminarse y almacenarse en los estantes de la antesala. 4. Los carros usados para llevar materiales desde la sala de almacenamiento no pueden desplazarse más allá de la línea de demarcación de la antesala y aquellos usados en la zona amortiguadora no pueden llevarse más allá de la línea de demarcación a menos que se limpien y desinfecten antes de volverlos a introducir. 5. Por lo general, los materiales requeridos para las operaciones programadas en cada turno deben limpiarse con un agente desinfectante apropiado y llevarse a la zona amortiguadora, preferiblemente en uno o más carros móviles. Los materiales de reserva o de uso general para las operaciones pueden almacenarse en el estante designado en la zona amortiguadora, pero debe evitarse la acumulación excesiva de materiales. 6. Los objetos no esenciales que desprendan partículas no pueden llevarse a la zona amortiguadora, incluyendo lápices, cajas de cartón, toallas de papel y artículos de algodón (p.ej., compresas de gasa). 7. Los productos esenciales a base de papel (p.ej., envolturas de papel de las jeringas, registros de trabajo guardados en una funda protectora), se deben limpiar con un agente desinfectante apropiado antes de llevarlos a la zona amortiguadora. 8. Debe reducirse al mínimo el flujo de tráfico hacia y desde la zona amortiguadora. 9. El personal que se prepara para entrar a la zona amortiguadora debe retirarse todas las prendas personales externas, cosméticos (porque desprenden escamas y partículas) y todas las joyas de manos y muñecas, así como otras joyas y accesorios visibles que puedan interferir con la eficacia del EPP. 1 O. El personal que entra en la antesala debe vestir la ropa descrita en Limpieza y Vestimenta del Personal y Capacitación del Personal y Evaluación de la Competencia en Vestimenta, Prácticas Asépticas de Trabajo y Procedimientos de Limpieza y Desinfección.
11. El personal deberá luego lavarse cuidadosamente las manos y los antebrazos hasta el codo con agua y jabón, por lo menos durante 30 segundos. Después de lavarse, se debe usar un secador de aire o toallas desechables que no desprendan partículas para secarse las manos y los antebrazos. 12. El personal que entra en la zona amortiguadora debe efectuar la limpieza antiséptica de manos con un exfoliante quirúrgico exento de agua, a base de alcohol y con actividad persistente, antes de calzarse guantes estériles. 13. No se puede ingresar con goma de mascar, bebidas, golosinas ni ningún tipo de alimentos a la zona amortiguadora ni a la antesala. Los materiales expuestos en áreas de cuidado y tratamiento de pacientes nunca deben introducirse en áreas en las que hayan presentes componentes e ingredientes para la elaboración de PME. 14. Al comienzo de cada sesión de preparación magistral, y siempre que se derrame un líquido, las superficies del ambiente directo de preparación magistral deben limpiarse primero con Agua Purificada USP para eliminar los residuos hidrosolubles. Inmediatamente después, se desinfectan las mismas superficies con un agente que no deje residuos, usando un paño que no suelte pelusa.
USP 39
Pruebas Físicas/ (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles 697
15. Los controles de ingeniería primarios deben estar en funcionamiento continuo durante la actividad de preparación magistral. Cuando el sistema ventilador está apagado, y antes de que ingrese otro personal para realizar actividades de preparación magistral, sólo una persona debe ingresar en la zona amortiguadora a los efectos de encender el ventilador (durante al menos 30 minutos) y desinfectar las superficies de trabajo. 16. El tráfico en el área directa de preparación magistral (ADP) debe reducirse al mínimo y controlarse. 17. Se deben juntar los materiales a usar en el ADP para los procedimientos planificados y luego descontaminarse limpiando o rociando la superficie externa de los mismos con solución de IPA al 70% o retirando el envoltorio externo en el límite del ADP a medida que se introduce el artículo en el área aséptica de trabajo. 18. Los materiales deben disponerse en el ADP de manera tal que se evite su acumulación y que se logre el flujo de trabajo más eficiente y ordenado posible. 19. Después de introducir en forma correcta en el ADP únicamente los materiales requeridos para las operaciones asignadas, deben organizarse de manera tal que un flujo ininterrumpido transparente de aire filtrado por HEPA bañe todos los sitios críticos en todo momento durante los procedimientos planificados. Es decir, no se debe colocar ningún objeto entre el primer aire de los filtros HEPA y un sitio crítico expuesto. 20. Todos los procedimientos deben realizarse de manera tal de reducir al mínimo el riesgo de contaminación por contacto. Los guantes deben desinfectarse con la frecuencia necesaria con un desinfectante aprobado, como IPA estéril al 70%. 21. Todos los tapones de goma de los viales y frascos y el cuello de las ampollas se desinfectan pasándoles un paño con IPA estéril al 70% durante al menos 1O segundos antes de usarlos para preparar PME. 22. Después de la preparación de cada PME, el contenido del envase se debe mezclar bien y luego inspeccionar para asegurarse de que no tenga partículas, signos de incompatibilidad u otros defectos. 23. Una vez finalizados los procedimientos, se retiran las jeringas, frascos, viales y otros materiales utilizados, pero con un mínimo de salidas y entradas al ADP para reducir al mínimo las probabilidades de introducir contaminación en el espacio aséptico de trabajo.
ELEMENTOS DE CONTROL DE CALIDAD En cada centro debe desarrollarse una descripción por escrito del programa de capacitación específica y de evaluación del desempeño para todo el personal que utiliza técnicas asépticas en la preparación de productos estériles. Este programa debe preparar al personal otorgándole los conocimientos apropiados y la instrucción necesarias en el desarrollo de las habilidades requeridas para realizar las tareas asignadas. Cada una de las personas asignadas al área aséptica para la preparación de productos estériles debe completar con éxito un curso de capacitación especializado en técnicas asépticas y prácticas del área aséptica antes de poder elaborar PME (ver la sección Capacitación y Evaluación del Personal en Técnicas de Manipulación Aséptica y Capacitación del Personal y Evaluación de la Competencia en Vestimenta, Prácticas Asépticas de Trabajo y Procedimientos de Limpieza y Desinfección).
Ingredientes y Dispositivos El personal de preparación magistral debe establecer que los ingredientes utilizados en la elaboración de las PME tengan la identidad y calidad correctas, utilizando la siguiente información: etiquetas del proveedor, etiquetado del producto, certificados de análisis, análisis químico directo y conocimiento de las condiciones de almacenamiento de las instalaciones de preparación. INGREDIENTES Y DISPOSITIVOS ESTÉRILES Los productos farmacéuticos estériles disponibles comercialmente y los envases y dispositivos estériles listos para usar son ejemplos de componentes estériles. Debe seguirse un procedimiento escrito para la inspección física de cada unidad antes de su uso para asegurarse de que estos componentes sean estériles, estén libres de defectos y sean adecuados para el uso al que están destinados. INGREDIENTES Y DISPOSITIVOS NO ESTÉRILES Si se usan componentes no estériles, incluyendo envases e ingredientes, para elaborar una PME, dicha PME debe ser de alto riesgo. Los ingredientes activos y sustancias agregadas o excipientes no estériles utilizados en la elaboración de PME deben ser preferentemente artículos que cumplan con las normas oficiales de la USP o NF. Cuando se utilizan ingredientes no oficiales, deben estar acompañados por certificados de análisis de sus proveedores para que el personal de preparación magistral pueda evaluar su identidad, calidad y pureza en relación con el uso que se les dará en cada PME. Es necesario realizar una inspección física del envase de los ingredientes para asegurarse de que no tenga roturas, tapas o cierres flojos y que el contenido no tenga ninguna desviación en relación con el aspecto, aroma y textura esperados. Las sustancias farmacéuticas a granel, o no formuladas, y las sustancias agregadas o excipientes deben almacenarse en envases herméticamente cerrados bajo las condiciones de temperatura, humedad e iluminación indicadas en las monografías oficia-
698 (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles / Pruebas Físicas
USP 39
les o aprobadas por los proveedores. La fecha de recepción en la instalación de preparación magistral debe estar clara e indeleblemente marcada en cada envase del ingrediente. Una vez recibidos por la institución responsable de la preparación magistral, los envases de ingredientes que no tienen una fecha de caducidad del proveedor no podrán utilizarse después de transcurrido un año, a menos que una inspección o análisis apropiado indique que el ingrediente ha conservado su pureza y calidad para su uso en la elaboración de PME. Deberán considerarse y evaluarse cuidadosamente las fuentes de ingredientes no estériles, especialmente cuando la PME ha de administrarse en el sistema vascular, en el sistema nervioso central o en los ojos. La persona a cargo de la preparación magistral debe realizar una inspección visual de cada lote de fármaco o excipiente a granel recibido que se utilizará en la elaboración de las PME para detectar cualquier deterioro, otras características de calidad inaceptable o identificación errónea. La inspección visual de la sustancia farmacéutica o excipiente a granel debe realizarse periódicamente según se describe en el protocolo escrito correspondiente.
Equipos Es necesario que los equipos, aparatos y dispositivos utilizados en la preparación magistral de una PME funcionen correctamente en todo momento y dentro de los límites de tolerancia aceptables. Deben establecerse por escrito, y seguirse, los procedimientos de calibración del equipo, mantenimiento anual, monitoreo de funcionamiento correcto, y procedimientos controlados para el uso del equipo, así como las frecuencias específicas para todas estas actividades. En estos POE se deben describir el mantenimiento de rutina y las frecuencias. Los resultados de la calibración de los equipos, informes de mantenimiento anual y mantenimiento de rutina deben conservarse en los archivos durante toda la vida útil del equipo. Se prepara al personal mediante una combinación apropiada de capacitación específica y experiencia, para hacer funcionar o manipular cualquier equipo, aparato o dispositivo que pudieran tener que usar para la elaboración de PME. La capacitación debe incluir los conocimientos necesarios para determinar si un equipo determinado está funcionando correctamente o si tiene algún desperfecto.
VERIFICACIÓN DE DISPOSITIVOS AUTOMATIZADOS DE PREPARACIÓN MAGISTRAL (DAP) PARA NUTRICIÓN PARENTERAL Los DAP para la preparación de mezclas para nutrición parenteral son ampliamente utilizados por los farmacéuticos en hospitales y otros ámbitos de atención de la salud. Están diseñados para agilizar los procesos más engorrosos requeridos para la preparación magistral de estas formulaciones de varios componentes, administrando automáticamente los componentes nutricionales individuales en una secuencia predeterminada bajo control computarizado. Por lo general, las mezclas para nutrición parenteral contienen 20 o más aditivos individuales que representan hasta 50 o más componentes individuales (p.ej., 15 a 20 aminoácidos cristalinos, dextrosa monohidrato y lípidos; 1O a 12 sales electrolíticas; 5 a 7 oligominerales y 12 vitaminas). En consecuencia, los DAP pueden mejorar la exactitud y precisión del proceso de preparación magistral en comparación con los métodos de preparación magistral manuales tradicionales.
Exactitud La exactitud de un DAP puede determinarse de varias maneras para asegurar que se suministren las cantidades correctas de nutrientes, electrólitos u otros componentes nutricionales al envase de infusión final. Inicialmente, debe evaluarse el DAP para verificar la exactitud del volumen y peso. Para verificar la exactitud del volumen, debe programarse el DAP para administrar un volumen adecuado de Agua Estéril para Inyección USP, que represente un volumen típico de aditivo (p.ej., 40 mL para un intervalo de volumen pequeño de 1 a 100 mL; o 300 mL para un intervalo de volumen grande de 100 a 1000 mL) y administrarse al recipiente volumétrico apropiado. Luego, el personal de preparación magistral debe consultar en la sección Aparatos Volumétricos (31) los parámetros apropiados para evaluar el desempeño volumétrico del DAP. Para verificar la exactitud gravimétrica, debe evaluarse la balanza utilizada junto con el DAP, usando diferentes tamaños de pesas que representen las cantidaadministrar los diferentes aditivos. El personal de preparación magistral debe consultar en la secdes normalmente usadas ción las tolerancias aceptables de las pesas usadas. Además, debe pesarse posteriormente el mismo volumen de Agua para usado para evaluar la exactitud volumétrica en la balanza usada con el DAP. Por ejemplo, si se utilizaron 40 mL de agua en la evaluación volumétrica, su peso correspondiente debería ser de aproximadamente 40 g (suponiendo que la densidad relativa del agua es de 1,0). Además, durante el uso del DAP, también pueden probarse ciertos aditivos, como cloruro de potasio (corregido según las diferencias de densidad) como si fuera una prueba realizada durante el proceso. Por último, pueden realizarse pruebas adicionales de exactitud para determinar el contenido de ciertos ingredientes en el volumen final de la mezcla para nutrición parenteral. Por lo general, los departamentos de una farmacia no tienen la capacidad para realizar en forma rutinaria análisis químicos, como análisis de concentraciones de dextrosa o electrólitos. En consecuencia, es posible que los laboratorios de los hospitales o instituciones deban encargarse de realizar estas pruebas de garantía de calidad. No obstante, los métodos utilizados por dichos laboratorios suelen estar diseñados para sistemas biológicos, no farmacéuticos. En consecuencia, debe verificarse que sus procedimientos de prueba cumplan con los requisitos USP especificados en la
USP 39
Pruebas Físicas/ (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles 699
monografía individual correspondiente al componente que se desea analizar. Por ejemplo, en Dextrosa, Inyección, se especifica lo siguiente: Contiene no menos de 95,0% y no más de 105,0% de la cantidad declarada de C6 H1P 6 • H20. Los laboratorios de química de la institución u hospital pertinente deben validar sus métodos para aplicarlos a este intervalo y corregirlos según su medición típica de dextrosa anhidra en relación con dextrosa monohidrato. Existen intervalos y cuestiones similares, por ejemplo, para las inyecciones de gluconato de calcio, sulfato de magnesio y cloruro de potasio. El punto crítico es el uso de referencias USP y posibles diferencias de procedimiento entre laboratorios.
Precisión La precisión intermedia del DAP puede determinarse teniendo en cuenta las variaciones diarias en los resultados de las mediciones de exactitud. En consecuencia, el personal de preparación magistral debe llevar un registro diario de las evaluaciones de exactitud antes descritas y revisar los resultados a lo largo del tiempo. Esta revisión debe realizarse al menos cada semana para evitar errores acumulativos clínicamente significativos con el tiempo, especialmente en el caso de aditivos con un índice terapéutico estrecho, como el cloruro de potasio.
CONTROLES Y PRUEBAS DE LIBERACIÓN DE LAS PREPARACIONES TERMINADAS Las siguientes mediciones de calidad se deben efectuar para todas las PME antes de dispensarlas o administrarlas.
Inspección de Formas Farmacéuticas en Solución y Revisión de los Procedimientos de Preparación Magistral Todas las PME que se preparan como soluciones deben examinarse visualmente para asegurarse de que no contengan partículas y, en caso afirmativo, no deben administrarse ni dispensarse. Antes de administrar o dispensar las PME de cualquier nivel de riesgo de contaminación, se deben inspeccionar las recetas, los procedimientos escritos de preparación magistral, los registros de preparación y los materiales usados en su elaboración, para verificar las identidades y cantidades correctas de sus ingredientes, el mezclado aséptico y esterilización, el envasado, etiquetado y aspecto físico esperado. INSPECCIÓN FÍSICA Después de su preparación magistral, las PME terminadas deben inspeccionarse en forma individual, según los procedimientos por escrito. Si no se distribuyen de inmediato, estas PME deben inspeccionarse en forma individual justo antes del momento en que abandonan el área de almacenamiento. Las PME que no se distribuyen de inmediato deben almacenarse en un lugar apropiado según se describe en los procedimientos escritos. Inmediatamente después de su preparación magistral y como condición para su liberación, se debe inspeccionar cada unidad de PME, siempre que sea posible, contra un fondo blanco o negro iluminado, o ambos, para asegurarse de que no contenga partículas visibles ni otras materias extrañas. La inspección previa a la liberación también incluye la inspección de la integridad del sistema de envase-cierre y cualquier otro defecto visual evidente. Las PME que presenten defectos deben desecharse de inmediato o marcarse y aislarse de los productos aceptables de manera que evite su administración. Cuando las PME no se distribuyan de inmediato después de su preparación, debe realizarse una inspección previa a la distribución para asegurarse de que una PME con defectos como precipitado, turbidez y pérdidas, que pueden desarrollarse entre el momento de su liberación y su distribución, no sea liberada.
Controles de Exactitud de la Preparación Magistral Deben seguirse los procedimientos por escrito para verificar la exactitud de la preparación magistral de cada PME durante su preparación e inmediatamente antes de su liberación. El sistema de doble verificación debe cumplir con las reglamentaciones estatales e incluir la exactitud de la información incluida en la etiqueta y de la adición de todos los productos farmacéuticos o ingredientes usados para preparar el producto terminado, así como sus volúmenes o cantidades. Los envases de los aditivos usados y, en el caso de aditivos para los que no se consumió la totalidad del envase, las jeringas usadas para medir el aditivo deben dejarse en cuarentena con los productos finales hasta haber terminado el control del producto final. El personal de preparación magistral debe confirmar visualmente que los ingredientes medidos en las jeringas coincidan con los indicados en la receta escrita que se está preparando. Preferentemente, una persona que no sea la que realizó la preparación magistral debe verificar que se hayan medido correctamente los volúmenes de ingredientes utilizados en la elaboración de cada PME. Por ejemplo, el personal de preparación magistral debería colocar de nuevo el émbolo de la jeringa en el volumen medido. En aquellos casos en que sea factible, debe confirmarse la exactitud de las mediciones, pesando un volumen del líquido medido y calculando luego ese volumen, dividiendo el peso por el valor exacto de la densidad, o peso específico, del líquido medido. Debe confirmarse que los valores de densidad o peso específico programados en los DAP, que miden según el peso usando el cociente del volumen programado dividido por la densidad o peso específico, sean exactos antes y después de administrar los volúmenes de los líquidos asignados a cada canal o puerto. Estos controles de exactitud del volumen y los siguien-
700 (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles / Pruebas Físicas
USP 39
tes controles adicionales de seguridad y exactitud que se describen en esta sección deben.incluirse en el manual de POE de la institución responsable de la elaboración de PME.
Pruebas de Esterilidad Todas las PME de nivel de riesgo alto que se preparan en grupos de más de 25 envases individuales monodosis idénticos (p.ej., ampollas, bolsas, jeringas, viales) o en viales multidosis (VMD) para administración a múltiples pacientes o que están expuestos por más de 12 horas a temperaturas entre 2º y 8º y por más de 6 horas a temperaturas superiores a 8º antes de ser esterilizados deben cumplir con Ja prueba de esterilidad (ver Prueba de Esterilidad (71 )) antes de ser dispensadas o administradas. El método de Filtración por Membrana es el método preferido en los casos en que sea factible (p.ej., cuando los componentes son compatibles con la membrana). Puede usarse un método no descrito en Ja USP si los resultados de la verificación demuestran que la alternativa es al menos tan eficaz y confiable como el método de Filtración por Membrana USP o el método de Inoculación Directa del Medio de Cultivo USP cuando el método de Filtración por Membrana no es factible. Cuando las PME de nivel de riesgo alto se dispensan antes de que Jos resultados de sus pruebas de esterilidad estén disponibles, debe haber un procedimiento escrito que exija la observación diaria de las muestras de prueba en incubación y el retiro inmediato de la PME dispensada cuando exista evidencia de crecimiento microbiano en las muestras de prueba. Además, el paciente al que se pudo haber administrado una PME contaminada, y su médico, deben ser notificados acerca del riesgo potencial. Si los resultados de la prueba de esterilidad son positivos, debe realizarse una investigación inmediata y sistemática de la técnica aséptica, control ambiental y otros controles de garantía de esterilidad para identificar las fuentes de contaminación y solucionar los problemas existentes en los métodos o procesos.
Prueba de Endotoxinas Bacterianas (Pirógenos) Todas las PME de nivel de riesgo alto, excepto las destinadas a inhalación o administración oftálmica, que se preparan en grupos de más de 25 envases individuales monodosis idénticos (p.ej., ampollas, bolsas, jeringas, viales) o en viales multidosis (VMD) para administración a múltiples pacientes o que están expuestos por más de 12 horas a temperaturas entre 2º y 8º y por más de 6 horas a temperaturas superiores a 8º antes de ser esterilizados deben examinarse para garantizar que no contienen endotoxinas bacterianas en exceso (ver Prueba de Endotoxinas Bacterianas (85) y Prueba de Pirógenos (151 )). En caso de que no se indique un límite de endotoxinas bacterianas en la monografía oficial o en otra fuente de la formulación de la PME, aquel no deberá exceder la cantidad de Unidades USP de Endotoxinas (Unidades por hora por kg de peso corporal o metros cuadrado de superficie corporal) especificadas en Prueba de Endotoxinas Bacterianas (85), mencionada anteriormente, según la vía de administración apropiada.
Verificación de la Identidad
y Concentración de los Ingredientes
La institución responsable de Ja elaboración de preparaciones magistrales debe contar como mínimo con los siguientes procedimientos escritos para verificar la identidad y calidad de las PME antes de dispensarlas y administrarlas: 1. Que las etiquetas de las PME tengan Jos nombres y cantidades o concentraciones de ingredientes correctos, el volumen total, la FLU, las vías de administración apropiadas, las condiciones de almacenamiento y otra información para su uso seguro. 2. Que las identidades, purezas y cantidades de ingredientes sean correctas, comparando la receta original con el registro de preparación magistral escrito de la PME. 3. Que se han obtenido los volúmenes de llenado correctos en las PME y las cantidades correctas de unidades llenadas de las PME. Cuando no se puede confirmar que el contenido de las PME terminadas es exacto, según las tres inspecciones que se describen más arriba, las PME deben valorarse utilizando métodos específicos para los ingredientes activos.
ALMACENAMIENTO Y FECHADO DE LÍMITE DE USO Por lo general, las FLU para preparaciones magistrales se asignan basándose en la experiencia profesional, que debería incluir la cuidadosa interpretación de las fuentes de información apropiadas para las mismas formulaciones u otras formulaciones similares (ver Criterio de Estabilidad y Fechado de Límite de Uso en Preparación Magistral-Preparaciones No Estériles (795)). Las fechas límite de uso de las PME rara vez se basan en los resultados de valoraciones químicas específicas a cada preparación, las cuales se usan con la ecuación de Arrhenius para determinar las fechas de caducidad (ver Advertencias y Requisitos Generales) de productos fabricados. La mayoría de las PME son soluciones acuosas en las que la reacción de degradación química más común es la hidrólisis de los ingredientes disueltos. El grado de hidrólisis y otras reacciones de degradación catalizadas por calor en cualquier momento en particular de Ja vida útil de una PME representan Ja suma termodinámica de las temperaturas y duraciones de exposición. Dicha exposición de la estabilidad de la vida útil del producto está representada en el cálculo de Ja temperatura cinética media (ver Cálculos en la Práctica Farmacéutica (1160)). Las velocidades de hidrólisis de los fárrnacos aumentan en forma exponencial con el.aumento aritmético de la temperatura; en consecuencia, la exposición de una solución de un antibiótico beta-lactámico durante un día a temperatura ambiente controlada (ver Advertencias y Requisitos Generales)
USP 39
Pruebas Físicas/ (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles 701
tendrá un efecto equivalente sobre el grado de hidrólisis de aproximadamente 3 a 5 días a temperaturas frías (ver Advertencias y Requisitos Generales). El personal a cargo de preparar, dispensar y administrar las PME debe almacenarlas estrictamente conforme a las condiciones especificadas en la etiqueta de los ingredientes y PME terminadas. Cuando se sabe que las PME han estado expuestas a temperaturas superiores al límite declarado o a temperaturas ,por encima de 40º (ver Advertencias y Requisitos Generales) durante más de 4 horas, dichas PME deberían desecharse a menos que se verifique su estabilidad a través de la documentación apropiada o una valoración directa.
Determinación de las Fechas Límite de Uso Las fechas límite de uso y fecha de caducidad no son lo mismo (ver Advertencias y Requisitos Generales). Las fechas de caducidad para la estabilidad química y física de los productos estériles fabricados comercialmente se determinan a partir de los resultados de rigurosas pruebas analíticas y de desempeño y son específicas de una formulación en particular en su envase y a las condiciones de exposición indicadas de iluminación y temperatura. Cuando las PME se desvían de las condiciones indicadas en el etiquetado aprobado de los productos fabricados contenidos en las PME, el personal de preparación magistral puede solicitar al fabricante del producto en cuestión asesoramiento sobre la asignación de FLU basada en parámetros de estabilidad química y física. Las FLU de las PME que se preparan estrictamente conforme al etiquetado del producto del fabricante deben ser las especificadas en dicho etiquetado o deben basarse en la literatura apropiada o en pruebas directas. Las FLU para las PME que carecen de justificación proveniente de fuentes de literatura apropiadas o de pruebas directas se deben asignar según se describe en Criterios de Estabilidad y Fechas Límite de Uso en Preparación Magistral-Preparaciones No Estériles (795). El personal de preparación magistral podrá también consultar las publicaciones pertinentes para obtener información acerca de la estabilidad, compatibilidad y degradación del fármaco o de fármacos similares. Al asignar una fecha límite de uso, el personal de preparación magistral debería consultar la documentación y literatura específicas sobre la estabilidad en general y la del fármaco en particular en aquellos casos en que se cuente con ellas, y debería considerar la naturaleza del fármaco y su mecanismo de degradación, el envase en el que está contenido, las condiciones de almacenamiento esperadas y la duración prevista de la terapia (ver Fecha de Caducidad y Fecha Límite de Uso en Etiquetado en las Advertencias y Requisitos Generales). La información de estabilidad debe interpretarse cuidadosamente en relación con la formulación preparada y sus condiciones de almacenamiento y uso. Las predicciones basadas en otra evidencia como publicaciones, cuadros, tablas sólo permiten obtener fechas límite de uso teóricas. El fechado de límite de uso estimado en forma teórica está sujeto a diferentes grados de hipótesis y, en consecuencia, a una probabilidad de error o al menos de inexactitud. El grado de error o inexactitud dependería del grado de las diferencias entre las características de la PME (p.ej., composición, concentración de ingredientes, volumen de llenado o tipo y material del envase) y las características de los productos de los que deben extrapolarse los datos o información de estabilidad. Cuanto mayor sea la duda respecto de la exactitud de las fechas límite de uso estimadas en forma teórica, mayor será la necesidad de determinar el fechado de períodos en forma experimental. Las fechas límite de uso estimadas en forma teórica deberían considerarse con cuidado para las PME preparadas a partir de ingredientes activos a granel no estériles que tienen actividad terapéutica, especialmente en aquellos casos en que se prevé que la preparación de la PME se realizará en forma rutinaria. Cuando las PME son para distribución y administración en domicilios particulares y no en centros de salud, al asignar las FLU debe tenerse en cuenta el efecto de las condiciones de temperatura potencialmente no controladas y no vigiladas. Debe establecerse que las PME no estén expuestas a temperaturas cálidas (ver Advertencias y Requisitos Generales) a menos que la institución responsable de la preparación magistral tenga evidencia que justifique la estabilidad de las PME a esas temperaturas. Debe reconocerse que la única evidencia válida de estabilidad para predecir el fechado de límite de uso puede obtenerse solamente a través de estudios experimentales específicos con cada producto. Los procedimientos semicuantitativos, como una cromatografía en capa delgada (TLC), pueden ser aceptables para muchas PME. No obstante, los ensayos cuantitativos indicadores de estabilidad, como las valoraciones por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), serían más apropiados para ciertas PME, como por ejemplo aquellas con un índice terapéutico reducido, en las que se requiere un monitoreo ovaloración estrictos de las dosis para asegurar su eficacia terapéutica y evitar la toxicidad; aquellas en que el período de fechado de límite de uso estimado en forma teórica sólo es avalado por evidencia marginal, o en aquellos casos en que no se puede verificar un margen significativo de seguridad para el período de fechado de límite de uso propuesto. En síntesis, debido a que los períodos de fechado de límite de uso establecidos a partir de datos específicos de un producto obtenidos mediante análisis con instrumental apropiado son sin duda más confiables que los determinados en forma teórica, se recomienda enfáticamente utilizar el primer enfoque para avalar los períodos que superen los 30 días. Para asegurar prácticas constantes en la determinación y asignación de fechas límite de uso, la instalación de preparación magistral debe contar con normas y procedimientos escritos para la determinación de las fechas límite de uso para todos los productos preparados magistralmente. Cuando se intente predecir una fecha límite de uso teórica, un producto preparado o mezclado magistralmente debe considerarse como un sistema único que tiene propiedades físicas y químicas y características de estabilidad que difieren de las de sus componentes. Por ejemplo, las propiedades antioxidantes, de amortiguación o antimicrobianas de un vial estéril para inyección (VEI) pueden perderse al diluirlo y podrían afectar seriamente la estabilidad química del ingrediente activo del VEI o la estabilidad física o microbiológica de la formulación de dicho vial. En consecuencia, por lo general no puede esperarse que las propiedades estabilizadas en la formulación del VEI se trasladen al producto preparado o
702 (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles / Pruebas Físicas
USP 39
mezclado magistralmente. Se prefieren los protocolos de evaluación de datos de estabilidad determinados en forma experimental para cada preparación, en lugar de la información sobre estabilidad publicada. Cuando se carece de resultados de valoraciones químicas directas, el personal de preparación magistral que asigna fechas límite de uso a PME debe interpretar y evaluar en forma crítica las fuentes de información disponibles más apropiadas para determinar una FLU conservadora y segura. El manual de POE de la institución responsable de la preparación magistral y los registros de formulación de cada PME deben describir los fundamentos generales sobre los que debe basarse la asignación de la FLU y las condiciones de almacenamiento. Cuando se usan viales multidosis (ver Envases Multidosis en Conservación, Envasado, Almacenamiento y Etiquetado en las Advertencias y Requisitos Generales) de ingredientes estériles fabricados comercialmente en la elaboración de PME, se inspecciona la integridad física de los tapones de los VMD y se desinfectan frotándolos con un hisopo empapado en IPA estéril al 70% antes de cada penetración con un dispositivo estéril para retirar el contenido. Cuando se sospechan u observan contaminantes o propiedades anormales en un VMD, éste deberá descartarse. La FLU después de abrir o perforar (p.ej., con aguja) envases multidosis es de 28 días (ver Pruebas de Eficacia Antimicrobiana (51 )), a menos que el fabricante especifique algo distinto.
Sistemas de Bolsas y Viales de Propiedad Exclusiva Las fechas límites de uso para la estabilidad, esterilidad y almacenamiento de pares de envases de productos farmacéuticos para administración intravascular (p.ej., ADD-Vantage®, Mini Bag Plus®) conectados y activados (activado significa que se produjo el contacto entre el diluyente y el fármaco que estaban separados previamente) se deben aplicar según lo indica el fabricante. Es decir, se deben seguir las instrucciones del fabricante para manipular y almacenar los productos ADD-Vantage®, Mini Bag Plus®, Add A Vial®, Add-Ease® y cualquier otro.
Monitoreo de Áreas de Almacenamiento Controladas Para asegurarse de que el producto conserva su potencia hasta la fecha de caducidad indicada por el fabricante en la etiqueta, el personal de preparación magistral debe monitorear las áreas de almacenamiento de fármacos dentro de las instalaciones de preparación magistral. Las áreas de temperatura controlada en las instalaciones de preparación magistral incluyen temperatura ambiente controlada, entre 20º y 25º con temperatura cinética media de 25º; temperatura fría controlada, entre 2º y 8º con temperatura cinética media de 8º; temperatura fría, entre 2º y 8º; temperatura de congelación, entre -25º y -1 Oº (ver Advertencias y Requisitos Generales) si se necesita alcanzar la congelación, y el intervalo de temperatura específico del medio para medios de cultivo microbianos. Un área de temperatura controlada se debe monitorear al menos una vez al día, documentando los resultados en una bitácora de temperatura. Asimismo, el personal de preparación magistral debe observar la temperatura de almacenamiento al colocar el producto en la unidad de almacenamiento o al retirarlo de ella a fin de controlar cualquier desvío en la temperatura. Los dispositivos de registro de temperatura adecuados pueden incluir un dispositivo de registro continuo calibrado o un termómetro calibrado según las normas del National lnstitute of Standards and Technology (Instituto Nacional de Normas y Tecnología, NIST) que tenga una exactitud y sensibilidad satisfactorias para el propósito al que está destinado y sea calibrado correctamente a intervalos adecuados. Si la instalación de preparación magistral usa un dispositivo continuo de registro de la temperatura, el personal debe verificar al menos una vez al día que dicho dispositivo esté funcionando correctamente. Los mecanismos detectores de temperatura deben colocarse en forma adecuada en el área de almacenamiento de temperatura controlada para que reflejen de forma exacta su temperatura real. Asimismo, la instalación de preparación magistral debe seguir procedimientos apropiados para todas las áreas de almacenamiento controlado, para asegurar que dichos espacios no estén sometidos a fluctuaciones de temperatura significativamente prolongadas como las que podrían ocurrir, por ejemplo, al dejar la puerta de un refrigerador abierta demasiado tiempo.
MANTENIMIENTO DE LA ESTERILIDAD, PUREZA Y ESTABILIDAD DE LAS PME DISPENSADAS Y DISTRIBUIDAS Esta sección resume las responsabilidades de las instalaciones de preparación magistral para mantener la calidad y el control de las PME que se dispensan y administran dentro de sus organizaciones matrices de salud. El personal de preparación magistral debe garantizar el adecuado almacenamiento y la seguridad de las PME preparadas o dispensadas por la instalación de preparación magistral hasta que se alcance su FLU o sean administradas a los pacientes. Como parte de esta responsabilidad general, la instalación de preparación magistral es responsable del envasado, manipulación, transporte y almacenamiento correctos de las PME que prepara o dispensa, incluyendo la enseñanza, capacitación y supervisión apropiadas del personal de preparación magistral asignado a dichas funciones. La instalación de preparación magistral debería colaborar en la enseñanza y capacitación del personal ajeno a la preparación magistral responsable de llevar a cabo cualquier aspecto de estas funciones. La instalación de preparación magistral también tiene la responsabilidad de establecer, mantener y asegurar el cumplimiento de las políticas y procedimientos escritos relacionados con dichas responsabilidades. Cuando se asigna personal que no es de preparación magistral a tareas que involucran cualquiera de estas responsabilidades, las políticas y procedimientos que abarcan
USP 39
Pruebas Físicas/ (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles 703
estas tareas deben ser desarrolladas por los supervisores de preparación magistral. Las actividades de calidad y control relacionadas con la distribución de las PME se resumen en las cinco subsecciones siguientes. Las actividades o asuntos que debe atender la instalación de preparación magistral como parte de dichas responsabilidades son los que se indican a continuación.
Envasado, Manipulación y Transporte Los procesos o técnicas inapropiados relacionados con el envasado, manipulación y transporte pueden afectar adversamente la calidad y la integridad del envase de las PME. Aunque el personal de preparación magistral realiza en forma rutinaria muchas de las tareas asociadas con estas funciones, algunas de ellas, como el transporte, manipulación y almacenamiento, pueden realizarlas personal ajeno a la preparación magistral que no se encuentra bajo el control administrativo directo de la instalación de preparación magistral. En estos casos, la instalación de preparación magistral deberá establecer POE apropiados, en colaboración con los departamentos o servicios cuyo personal sea responsable de llevar a cabo las tareas relacionadas con las PME en las que la instalación de preparación magistral tiene un interés directo. Se debe controlar el desempeño del personal ajeno a la preparación magistral para asegurarse de que cumpla con las políticas y procedimientos establecidos. Los requisitos fundamentales que son exclusivos de las PME y necesarios para asegurar la calidad de la PME y la integridad del envase se deben tratar por escrito en POE. Por ejemplo, deberían especificarse técnicas para evitar el empuje de los émbolos de las jeringas o que las puntas de las jeringas se salgan durante su manipulación y transporte. Además, debe evitarse la desconexión de los componentes de un sistema (p.ej., cuando las PME se dispensan con equipos de administración conectados a estas) hasta la FLU de la PME. Los insertos o rellenos de espuma resultan particularmente útiles cuando las PME deben transportarse mediante sistemas de tubos neumáticos. Independientemente de los métodos usados, la instalación de preparación magistral debe evaluar la eficacia y la confiabilidad de la protección utilizada. La evaluación debería ser continua, por ejemplo, mediante un sistema de vigilancia, incluyendo un sistema de reporte de problemas a la instalación de preparación magistral. El transporte y la manipulación inapropiados pueden afectar adversamente la calidad de ciertas PME que tienen requisitos de estabilidad únicos. Por ejemplo, la agitación física que puede tener lugar durante el transporte mediante tubo neumático, o la exposición indebida al calor o a la luz, debe tratarse en cada preparación de forma específica. Podrían ser necesarios modos de transporte alternativos o medidas de embalaje adicionales para asegurar debidamente la calidad de estas PME. El uso de cierres y sellos que evidencian alteración intencional en los puertos de las PME puede ser una medida adicional de seguridad para asegurar la integridad del producto independientemente del método de transporte usado. Las PME quimiotóxicas u otras PME peligrosas requieren salvaguardas para mantener su integridad y reducir al mínimo el potencial de exposición de estos productos al entorno y al personal que podría entrar en contacto con ellos. El transporte por tubo neumático no es recomendable debido a posibles roturas y contaminación. Los requisitos especiales asociados con el envasado, transporte y manipulación de estos agentes incluyen la prevención de exposición o derrame accidentales y la capacitación del personal en caso de una exposición o derrame. Otros ejemplos de requisitos especiales para estos agentes incluyen las estrategias de reducción de la exposición, como el uso de jeringas con cierre Luer y conexiones, tapas para jeringas, tapas en los puertos de los envases, bolsas plásticas selladas, envases resistentes a los impactos y etiquetas con las precauciones pertinentes.
Uso y Almacenamiento La instalación de preparación magistral es responsable de asegurar que las PME que se encuentran en el entorno en que se prestan cuidados al paciente mantengan su calidad hasta el momento de su administración. El etiquetado inmediato del envase de la PME debe mostrar en forma prominente y clara los requisitos para su almacenamiento correcto y su fecha de caducidad. El personal de suministro y del entorno de cuidado del paciente debe estar debidamente capacitado para colocar la PME en el lugar de almacenamiento apropiado. Las PME vencidas y no utilizadas deben devolverse a la instalación de preparación magistral para su eliminación. Debe contarse con POE para asegurar que las condiciones de almacenamiento en el entorno en que se prestan cuidados al paciente sean adecuadas para los requisitos específicos de cada PME. Estos procedimientos incluyen la supervisión y documentación diaria de los refrigeradores de almacenamiento de las preparaciones de fármacos para asegurarse de que mantienen una temperatura entre 2º y 8º y la inspección mensual de todos los lugares de almacenamiento de preparaciones de fármacos por el personal de preparación magistral. Las inspecciones deben confirmar el cumplimiento de las condiciones de almacenamiento apropiadas, la separación de fármacos y alimentos, el uso correcto de VMD y que no se usen productos monodosis como VMD. Las PME, así como todos los demás productos farmacéuticos, deben almacenarse en el área en donde se prestan cuidados al paciente de tal manera que el personal no autorizado, los visitantes y los pacientes no tengan acceso a ellos.
Preparación para Administración Los procedimientos esenciales para asegurar la calidad general del producto, especialmente su esterilidad, al preparar una PME para su posterior administración, incluyen el lavado apropiado de las manos, el uso de técnica aséptica, el cuidado del sitio y el cambio de los equipos de administración. También pueden ser fundamentales otros procedimientos adicionales para
704 (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles / Pruebas Físicas
USP 39
ciertas PME, dispositivos o técnicas, por ejemplo, en la filtración en línea, la operación de dispositivos de control de infusión automáticos y la reposición de PME en los reservorios de bombas de infusión implantables o portátiles. Cuando es probable que las PME se expongan a temperaturas superiores a 30º por más de 1 hora durante su administración a pacientes, se debe confirmar que mantengan su esterilidad y estabilidad, bien sea por medio de fuentes confiables y relevantes o por pruebas directas.
Redispensación de PME La instalación de preparación magistral debe tener toda la autoridad de determinar cuándo se pueden volver a dispensar las PME devueltas, sin abrir. Las PME devueltas pueden volverse a dispensar sólo cuando el personal responsable de la preparación magistral estéril pueda garantizar que dichas PME son estériles, puras y estables (contienen la concentración de ingredientes declarada). Puede considerarse que una PME brinda dicha garantía si: la PME se mantuvo bajo refrigeración continua y protegida de la luz, de ser necesario, y no presenta evidencia de alteración intencional ni de ninguna preparación para el uso fuera de la instalación de preparación magistral. La asignación de nuevas fechas de almacenamiento y fechas límites de uso que excedan las fechas originales para las PME devueltas se permite tan sólo cuando existe evidencia de respaldo proveniente de pruebas de esterilidad y valoración cuantitativa de los ingredientes. En consecuencia, la preparación inicial y los tiempos de descongelación deben documentarse y realizarse mediciones confiables para evitar y detectar cualquier alteración intencional. El cumplimiento con todos los procedimientos asociados con el mantenimiento de la calidad del producto es fundamental. Las PME no deben volver a dispensarse si no puede asegurarse de manera satisfactoria que se mantuvieron en forma continua la calidad de la preparación y la integridad del envase (incluyendo las conexiones de los dispositivos, cuando corresponda) entre el momento en que la PME egresó de la instalación de preparación magistral y el momento en que volvió a ella. Asimismo, las PME no deben volver a dispensarse si la redispensación no puede respaldarse con la FLU originalmente asignada.
Educación y Capacitación La garantía de calidad de la PME y de la integridad del envasado depende en gran medida de que todo el personal cumpla con los POE pertinentes. El personal de preparación magistral debe diseñar, implementar y mantener un programa formal de enseñanza, capacitación y evaluación de competencia que cubra todas las funciones y tareas descritas en las secciones anteriores y que incluya a todo el personal al que se asignen dichas funciones y tareas. Este programa incluye la evaluación y documentación de incumplimientos del procedimiento, errores de administración, efectos colaterales, reacciones alérgicas y complicaciones asociadas con la dosificación o administración, como la extravasación. Este programa debe coordinarse con los programas de informe de eventos adversos e incidentes de la institución responsable.
Envase y Transporte de PME Las siguientes secciones describen cómo mantener la esterilidad y estabilidad de las PME hasta que sean entregadas en los sitios de atención del paciente para su administración. EMBALAJE DE PME PARA SU TRANSPORTE Cuando las PME se distribuyen a lugares fuera de las instalaciones en las que se preparan, el personal de preparación magistral debe seleccionar envases y materiales de embalaje que mantengan la integridad física, esterilidad y estabilidad de las PME durante su transporte. Debe seleccionarse un embalaje que proteja las PME contra daños, pérdidas, contaminación y degradación y, al mismo tiempo, que proteja de posibles lesiones al personal a cargo de transportarlas. El manual de POE de la institución responsable de la preparación magistral describe específicamente los envases de embalaje y los materiales de aislamiento y relleno apropiados, según las especificaciones del producto, la información de los proveedores y la experiencia del personal de preparación magistral. Se proporcionan instrucciones escritas a los pacientes y otros destinatarios que explican claramente cómo abrir en forma segura los envases de las PME embaladas. TRANSPORTE DE PME Las instituciones responsables de la preparación magistral que envían PME a otros lugares deben seleccionar modos de transporte que permitan entregarlas debidamente embaladas sin que sufran daños, y en condiciones estériles y estables a sus destinatarios. El personal de preparación magistral debe verificar que las temperaturas de las PME durante el transporte por el medio seleccionado no excedan las temperaturas más altas especificadas en el intervalo de temperatura de almacenamiento indicado en las etiquetas de las PME. Se recomienda que el personal de preparación magistral se comunique directamente con la empresa de transporte para conocer la duración del transporte y las condiciones de exposición que pueden encontrar las PME. El personal de preparación magistral debe incluir instrucciones de manipulación y exposición específicas en la parte externa de los embalajes que contienen las PME que se deben transportar, y debe obtener una garantía razonable de cumplimiento de
USP 39
Pruebas Físicas/ (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles 705
dichas condiciones por parte de los transportistas. El personal de preparación magistral debe evaluar periódicamente el desempeño de las empresas de transporte para verificar que las PME se están transportando en forma eficiente y apropiada.
Almacenamiento en Sitios Fuera de las Instalaciones de Preparación Magistral Las instituciones responsables de la preparación magistral que envían PME a pacientes y otros destinatarios que se encuentran en otros lugares deben verificar o garantizar, según sea apropiado, lo siguiente: 1. Las etiquetas y etiquetado accesorio de las PME incluyen en forma claramente legible las FLU, instrucciones de almacenamiento e instrucciones de eliminación para las unidades vencidas. 2. Los pacientes u otros destinatarios pueden almacenar las PME en forma correcta, incluyendo el uso de un refrigerador y congelador que funcionen adecuadamente si el etiquetado indica que las PME necesitan dicho tipo de almacenamiento.
CAPACITACIÓN DEL PACIENTE O PERSONA ENCARGADA DE SU CUIDADO Debe proporcionarse un programa de capacitación formal a fin de que el paciente o la persona encargada de su cuidado pueda entender y cumplir con las numerosas responsabilidades especiales y complejas que tiene en cuanto al almacenamiento, manipulación y administración de PME. Los objetivos instructivos del programa de capacitación incluyen todas las responsabilidades del cuidado domiciliario de la PME que se espera que asuma el paciente o la persona encargada del cuidado de éste y deben especificarse en términos de competencias del paciente o de la persona encargada de su cuidado. Al terminar el programa de capacitación, el paciente o la persona encargada de su cuidado debería estar en condiciones de hacer lo siguiente, en forma correcta y consistente: 1. Describir la terapia en cuestión, incluyendo la enfermedad o trastorno para la que se receta la PME, los objetivos de la terapia, el resultado terapéutico esperado y los efectos colaterales potenciales de la PME. 2. Inspeccionar todos los productos farmacéuticos, PME, dispositivos, equipos y materiales en el momento de recibirlos para asegurarse de que se han mantenido las temperaturas correctas durante el transporte y que los artículos recibidos no presentan evidencia de deterioro o defectos. 3. Manipular, almacenar y controlar todos los productos farmacéuticos, PME y materiales y equipos relacionados en la casa, incluyendo todos los requisitos especiales relacionados con ellos. 4. Inspeccionar visualmente todos los productos farmacéuticos, PME, dispositivos y otros elementos que el paciente o la persona encargada de su cuidado debe utilizar inmediatamente antes de la administración, en una forma que garantice que todos los elementos estén en condiciones de ser utilizados. Por ejemplo, las PME deben estar libres de pérdidas, grietas en los envases, partículas, precipitado, turbidez, decoloración u otras desviaciones respecto de su aspecto normal esperado y los envases inmediatos de los dispositivos estériles deben estar completamente sellados sin que haya evidencia de deterioro de la integridad del envase. 5. Verificar las etiquetas inmediatamente antes de su administración para asegurar que se trate del medicamento, la dosis, el paciente y el momento de administración correctos. 6. Limpiar el área de preparación en el domicilio, lavar y refregar las manos, usar la técnica aséptica apropiada y manipular todos los envases, equipos, aparatos, dispositivos y materiales usados para la administración. 7. Emplear todas las técnicas y precauciones asociadas con la administración de PME, por ejemplo, preparación de materiales y equipos, manipulación de dispositivos, preparación de las tuberías e interrupción de una infusión. 8. Cuidar los catéteres, cambiar vendajes y mantener la patencia del sitio según lo indicado. 9. Monitorear y detectar las ocurrencias de complicaciones terapéuticas, tales como infecciones, flebitis, desequilibrio elec. trolítico y mala colocación del catéter. 1O. Responder de inmediato a situaciones de emergencia o críticas, como rotura o salida de su lugar del catéter, desconexión de una tubería, formación de coágulos, bloqueo del flujo y mal funcionamiento de equipos. 11. Saber cuándo y cómo recurrir a servicios de emergencia profesional o asesoramiento profesional. 12. Manipular, contener y eliminar el material desechado, como agujas, jeringas, dispositivos, derrames o residuos tjue constituyan un riesgo biológico y sustancias infecciosas. Los programas de capacitación deben incluir demostraciones prácticas y la práctica con elementos reales que el paciente o la persona encargada de su cuidado deberán utilizar, como envases de PME, dispositivos y equipos. El paciente o la persona encargada de su cuidado debe practicar las técnicas asépticas y de inyección bajo la observación directa del profesional de la salud. La instalación de preparación magistral, junto con el personal de enfermería o médico, es responsable de asegurar inicialmente y en forma continua que el paciente o la persona encargada de su cuidado comprenda, domine y esté en condiciones y dispuesto a cumplir con todas estas responsabilidades relacionadas con el cuidado domiciliario. Esto se logra a través de un programa de evaluación formal por escrito. Todas las competencias especificadas en el programa de capacitación del paciente o la persona encargada de su cuidado deben evaluarse de manera formal. El paciente o la persona encargada de su cuidado debe demostrar al personal pertinente del cuidado de la salud su dominio de las actividades asignadas antes de que se le permita administrar la PME sin la supervisión de un profesional de la salud. El material impreso, como listas de control o instrucciones proporcionadas durante la capacitación, pueden servir como refuerzo del aprendizaje después de la capacitación o como recordatorio de las responsabilidades específicas del paciente o la
706 (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles / Pruebas Físicas
USP 39
persona encargada de su cuidado. También puede utilizarse periódicamente el asesoramiento oral después de la capacitación, según sea apropiado, para reforzar la capacitación y asegurar el cumplimiento correcto y completo de las responsabilidades.
MONITOREO DEL PACIENTE E INFORME DE EVENTOS ADVERSOS Las instituciones responsables de la preparación magistral deben monitorear clínicamente a los pacientes tratados con PME según las reglamentaciones y guías establecidas por las juntas reguladoras del ejercicio de la medicina de su respectivo estado o las normas de práctica aceptadas. Las instituciones responsables de la preparación magistral deben proporcionar a los pacientes y otros destinatarios de PME alguna manera de obtener respuestas a sus preguntas e informar cualquier inquietud que pudieran tener en relación con las PME y sus dispositivos de administración. Los manuales de POE de la institución responsable de la preparación magistral deben describir las instrucciones específicas para recibir, acusar recibo y fechar los informes recibidos, y para registrar, o archivar, y evaluar los informes de eventos adversos y de la calidad de la preparación asociada con las PME. Los informes de eventos adversos con PME deben ser analizados de inmediato y a fondo por los supervisores de preparación magistral para tomar medidas correctivas y evitar que se vuelvan a repetir en el futuro. Se recomienda al personal de preparación magistral que participe en los programas de informe de eventos adversos y defectos de productos de la FDA y la USP.
PROGRAMA DE GARANTÍA DE CALIDAD Un proveedor de PME debe implementar un programa formal de garantía de calidad destinado a ofrecer un mecanismo para monitorear, evaluar, corregir y mejorar las actividades y procesos descritos en este capítulo. El énfasis del programa de garantía de calidad debe centrarse en mantener y mejorar la calidad de los sistemas y la provisión de cuidados al paciente. Además, el programa de garantía de calidad asegura que cualquier plan enfocado a corregir los problemas identificados incluya también el seguimiento apropiado para garantizar que se tomaron las acciones correctivas eficaces. 11 Un plan de garantía de calidad debe incluir las siguientes características: 1. Formalización por escrito; 2. Consideración de todos los aspectos de las preparaciones y dispensación de los productos según se describe en este capítulo, incluyendo las pruebas ambientales y los resultados de la verificación; 3. Descripción de las actividades específicas de monitoreo y evaluación; 4. Especificación de cómo se deben informar y evaluar los resultados; 5. Identificación de los mecanismos de seguimiento apropiados cuando se exceden los límites o umbrales de acción; y 6. Descripción de las personas responsables de cada aspecto del programa de garantía de calidad. Al desarrollar un plan específico, debe ponerse énfasis en establecer indicadores objetivos y mensurables para las actividades de monitoreo y los procesos considerados de alto riesgo, de volumen elevado o propensos a problemas. En general, la selección de indicadores y la eficacia del programa de garantía de calidad deben reevaluarse anualmente.
ABREVIATURAS Y ACRÓNIMOS
11
ADP
área directa de preparación magistral
IPA
alcohol isopropílico
ALARA
tan bajo como sea razonablemente posible
ASHRAE
American Society of Heating, Refrigerating and Air-Conditioning Engineers
CACI
aislador aséptico de contención para preparación magistral
CAi
aislador aséptico para preparación magistral
CAPH
cambios de aire por hora
CDC
Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades
CETA
Controlled Environment Testing Association
CFL
cabina de flujo laminar
CIP
control de ingeniería primario
CSB
cabina de seguridad biológica
CSTD
dispositivo de sistema cerrado para transferencia de vial
HVAC
calefacción, ventilación y aire acondicionado
DAP
dispositivo automatizado de preparación magistral
EPP
equipo protector para el personal
FDA
Food and Drug Administration (Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos)
El uso de recursos adicionales, tales como el Accreditation Manual for Home Care de la joint Commission on Accreditation of Healthcare Organizations, pueden resultar útiles en el desarrollo de un plan de garantía de calidad.
Pruebas Físicas/ (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles 707
USP 39
FLU
fecha límite de uso
HEPA
alta eficiencia para partículas aéreas
HICPAC
Healthcare lnfection Control Practices Advisory Committee
IB
indicador biológico
ISO
lnternational Organization far Standardization (Organización Internacional para la Normalización)
MMWR
Morbidity and Mortality Weekly Report
NIOSH
Instituto Nacional para la Seguridad y Salud Ocupacional
NIST
National lnstitute of Standards and Technology (Instituto Nacional de Normas y Tecnología)
PME
preparación magistral estéril
psi
libras por pulgada cuadrada
QA
garantía de calidad
POE
procedimiento operativo estándar
PET
tomografía por emisión de positrones
TSA
agar tripticasa de soja
UE
Unidad de Endotoxina
ufc
unidad( es) formadora(s) de colonias
USP
Farmacopea de los Estados Unidos de América (United States Pharmacopeia)
VDE
vial para desafío de endotoxinas
VEI
vial estéril para inyección
VMD
viales multidosis
Cambio en la redacción:
GLOSARIO Aislador Aséptico de Contención para Preparación Magistral (CACI, por sus siglas en inglés): Un aislador aséptico para preparación magistral (CAi, por sus siglas en inglés) diseñado para proteger al trabajador de la exposición a concentraciones indeseables de fármacos dispersados en el aire durante los procesos de preparación y transferencia del material y para proporcionar un ambiente aséptico para la elaboración de preparaciones magistrales estériles. No debe ocurrir intercambio de aire con el medio que lo rodea, a menos que el aire pase primero a través de un sistema de filtro de retención microbiana (HEPA, como mínimo) capaz de retener las concentraciones de partículas aéreas del tamaño y estado físico del fármaco que se está preparando magistralmente. Cuando se trabaja con fármacos volátiles peligrosos, el aire de salida del aislador se debe extraer a través de una ventilación debidamente diseñada en el edificio. Aislador Aséptico para Preparación Magistral (CAi, por sus siglas en inglés): Una forma de aislador específicamente diseñado para la elaboración magistral de ingredientes o preparaciones farmacéuticas. Está diseñado para mantener un ambiente aséptico de preparación dentro del aislador, durante los procesos de preparación magistral y transferencia de material. No debe ocurrir intercambio de aire entre el aislador y el medio que lo rodea, a menos que el aire haya pasado primero a través de un filtro de retención microbiana (HEPA, como mínimo). 12 Antesala-Una sala ISO Clase 8 (ver Tabla 7) o mejor, donde el personal efectúa procedimientos de higiene de manos y vestimenta, clasificación de componentes, ingreso de órdenes, etiquetado de PME y otras actividades que producen gran cantidad de partículas. Es también un área de transición que (1) brinda la garantía de que las relaciones de presión se mantienen constantemente de forma que el aire fluya de las zonas limpias a las sucias y (2) reduce la necesidad de que el control del sistema de calefacción, ventilación y aire acondicionado (HVAC) responda a perturbaciones grandes.13 Área Crítica: Un ambiente ISO Clase 5 (ver Tabla 7). Área Directa de Preparación Magistral (ADP): Un área crítica dentro de un control de ingeniería primario (CIP) ISO Clase 5 (ver Tabla 7) donde los sitios críticos se exponen a aire unidireccional filtrado por HEPA, conocido también como primer aire. Área Segregada para Elaboración de Preparaciones Magistrales: Un espacio reservado, bien sea un área demarcada o un cuarto, que se restringe a la preparación de PME de nivel de riesgo bajo con FLU de 12 horas o menos. Dicha área debe contener un dispositivo que proporcione flujo de aire unidireccional de calidad ISO Clase 5 (ver Tabla 7) para la elaboración de PME y no debe destinarse a actividades ni contener materiales que sean extraños a la preparación magistral estéril. Cabina de Seguridad Biológica (CSB): Una cabina ventilada para protección ambiental, de la PME, del personal y del producto, que tiene un frente abierto, con flujo de aire hacia el interior para protección del personal, flujo de aire laminar descendente con filtración de alta eficiencia para partículas aéreas (HEPA, por sus siglas en inglés) para protección del producto y salida de aire con filtración HEPA para protección ambiental.
12 CETA Applications Cuide far the Use of Compounding lsolators in Compounding Sterile Preparations in Healthcare Facilities, CAG-001-2005, Controlled Environment Testing Association (CETA), 8 de noviembre de 2005. 13 Ver Laboratory Design Cuide (Guía de diseño del laboratorio) de la American Society of Heating, Refrigerating and Air-Conditioning Engineers, /ne. (ASHRAE).
708 (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles / Pruebas Físicas
USP 39
Control de Ingeniería Primario {CIP): Un dispositivo o cuarto que brinda un ambiente ISO Clase 5 (ver Tabla 7) para la exposición de sitios críticos cuando se elaboran las PME. Dichos dispositivos incluyen, entre otros, cabinas de flujo laminar (CFL), cabinas de seguridad biológica (CSB), aisladores asépticos para preparación magistral (CAi) y aisladores asépticos de contención para preparación magistral (CACI). Cuarto de Presión Negativa: Un cuarto que está a presión más baja que los espacios adyacentes; por lo tanto, el flujo neto de aire es hacia el cuarto. 2 Cuarto de Presión Positiva: Un cuarto que está a presión más alta que los espacios adyacentes; por lo tanto, el flujo neto de aire es hacia afuera del cuarto. 2 Cuarto Limpio: (ver Control Microbiológico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento Aséptico (1116) y también la definición de Zona Amortiguadora) Un cuarto en el que se controla la concentración de partículas en el aíre para que cumpla con una clasificación de limpieza especificada de partículas aéreas. Se monítorean los microorganismos en el ambiente para que la concentración microbiana en el aíre, las superficies y el atuendo del personal no exceda el límite de limpieza especificado. Desinfectante: Un agente, generalmente un agente químico pero en ocasiones físico, que libra de la infección y destruye los patógenos causantes de enfermedad u otros microorganismos peligrosos, pero que no necesariamente elimina esporas bacterianas o fúngicas. Se refiere a sustancias aplicadas a objetos inanimados. Empaque a Granel para Farmacias: (ver •(659)• CAFoi.may-ao 16~ Un envase de una preparación estéril para uso parenteral que contiene muchas dosis únicas. El contenido está destinado para su uso en un programa de mezclas de farmacia y está restringido a la preparación de mezclas para infusión o, a través de un dispositivo de transferencia estéril, para el llenado de jeringas estériles vacías. El cierre se perforará sólo una vez después de la reconstitución, usando un dispositivo de transferencia o set de dispensación estéril y adecuado que permita la distribución medida del contenido. El empaque a granel para farmacias sólo se empleará en un área de trabajo adecuada, como por ejemplo una campana de flujo de aíre laminar (o un área equivalente de preparación magistral de aire limpio). Cuando se ofrezca un envase como empaque a granel para farmacias, la etiqueta debe (a) indicar en forma visible "Empaque a Granel para Farmacias, No Usar para Infusión Directa," (b) contener o referir a información sobre las técnicas apropiadas para ayudar a garantizar el uso seguro del producto, y (c) llevar una leyenda que limite el plazo dentro del cual se puede utilizar el envase una vez que ha sido perforado, siempre y cuando se mantenga bajo las condiciones de almacenamiento declaradas. Envase Monodosis: (ver Advertencias y Requisitos Generales y •(659)• (AF oi-may-2016¡) Un envase monodosis es un envase unitario para artículos (ver Advertencias y Requisitos Generales) o preparaciones destinadas solamente a la administración por vía parenteral. Está destinado a un solo uso. Debe estar etiquetado como envase monodosís. Ejemplos de envases monodosís son: jeringas prellenadas, cartuchos, envases sellados por fusión y envases con cierres sellados, cuando se los etiquete como tales. Envase Multidosis: (ver Advertencias y Requisitos Generales y •\659/• woi-may-w16¡) Un envase de unidades múltiples para artículos o preparaciones destinadas a administración parenteral solamente y que por lo general contiene conservantes antímícrobíanos. La fecha límite de uso (FLU) para un envase multidosís abierto o perforado (p.ej., perforado con aguja), que tiene conservantes anti microbianos, es de 28 días (ver Pruebas de Eficacia Antimicrobiana (51 )), a menos que el fabricante especifique algo distinto. Esterilización por Filtración: Paso de un líquido o solución a través de una membrana de grado de esterilización para producir un efluente estéril. Esterilización Terminal: Aplicación de un proceso letal (p.ej., vapor bajo presión o autoclavado) a los envases sellados, con el fin de conseguir un nivel de garantía de esterilidad predeterminado, generalmente menor que 10-6, o una probabilidad de menos de uno en un millón de que haya una unidad no estéríl.3 Etiquetado: [ver Advertencias y Requisitos Generales y 21 USC 321 (k) y (m)] Término que se refiere a todas las etiquetas o marbetes y demás materiales escritos, impresos o gráficos que aparezcan directamente sobre el envase primario de un artículo o preparación, sobre o dentro de cualquier empaque o envoltorio en que esté incluido, con excepción de los embalajes externos destinados al transporte. El término "etiqueta" designa la parte del etiquetado que se encuentra sobre el envase primario. Fármacos Peligrosos: Los fármacos se clasifican como peligrosos si los estudios en anímales o humanos indican que la exposición a ellos tiene potencial para causar cáncer, toxicidad reproductiva o del desarrollo, o daños a los órganos. (Ver la publicación actual de NIOSH). Fecha Límite de Uso (FLU): (ver Advertencias y Requisitos Generales y Preparación Magistral-Preparaciones No Estériles (795)) A los efectos de este capítulo, la fecha u hora después de la cual no se debe almacenar o transportar una PME. Esta fecha se determina a partir de la fecha u hora de preparación. Flujo Unidireccional: (ver nota 3 al pie de página) Un flujo de aire que se mueve en una sola dirección de una forma robusta y uniforme y a una velocidad suficiente como para barrer las partículas lejos del área crítica de prueba o procesamiento, en forma reproducible. Membranas de Grado de Esterilización: Membranas para las que se ha documentado que retienen 100% de un cultivo de 10 7 microorganismos de una cepa de Brevundimonas (Pseudomonas) diminuta por centímetro cuadrado de superficie de membrana bajo una presión de no menos de 30 psi (2,0 bar). Dichas membranas de filtro tienen tamaño de poro nominal de 0,22 µm o 0,2 µm, dependiendo de la práctica utilizada por el fabricante. Preparación: Una preparación, o una PME, que es un medicamento o nutriente estéril preparado magistralmente en una farmacia autorizada u otra institución relacionada con la salud, de acuerdo con la orden de un prescriptor autorizado; el artículo puede contener productos estériles o no.
Pruebas Físicas/ (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles 709
USP 39
Primer Aire: El aire que sale del filtro HEPA en una corriente unidireccional que carece prácticamente de partículas. Procesamiento Aséptico: (ver Control Microbiológico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento Aséptico (1116)) Una modalidad de procesar productos farmacéuticos y médicos que involucra la esterilización por separado del producto y del empaque (envases y cierres o material de empaque para dispositivos médicos) y la transferencia del producto al envase y su cierre en condiciones ISO Clase 5 (ver Tabla 1) como mínimo. Producto: Un medicamento o nutriente estéril fabricado comercialmente, cuya seguridad y eficacia han sido evaluadas por la FDA. Los productos van acompañados de información completa para prescribir, la cual se conoce comúnmente como el etiquetado del fabricante aprobado por la FDA o prospecto adjunto del producto. Prueba de Llenado de Medios: (ver Control Microbiológico y Monitoreo de Ambientes de Procesamient9 Aséptico (1116)) Una prueba utilizada para calificar los procesos o la técnica aséptica del personal que elabora la preparación magistral, y con el fin de garantizar que con los procesos usados se puedan elaborar productos estériles sin contaminación microbiana. Durante esta prueba, se sustituye el producto farmacéutico real con un medio de crecimiento microbiano, como el Medio de Digerido de Caseína y Soja, para simular la mezcla de la preparación magistral. 1 Los puntos que se deben considerar en el desarrollo de la prueba de llenado de medios son: procedimientos de llenado de medios, selección de medios, volumen de llenado, incubación, tiempo y temperatura, inspección de las unidades llenas, documentación, interpretación de los resultados y posibles acciones correctivas requeridas. Sitio Crítico: Un sitio que incluye cualquier componente o superficies de recorrido de líquidos (p.ej., septos de viales, puertos de inyección, vasos de precipitados) o aberturas (p.ej., ampollas abiertas, conos conectores de agujas) expuestos y en riesgo de contacto directo con el aire (p.ej., ambiental o filtrado por HEPA), humedad (p.ej., secreciones orales o mucosas) o contaminación por contacto. En el sitio crítico, el riesgo de contaminación microbiana por partículas aumenta con el tamaño de las aberturas y el tiempo de exposición. Zona Amortiguadora: El sitio donde está localizado físicamente el control de ingeniería primario (CIP). Las actividades que ocurren en esta área incluyen la preparación y clasificación de componentes y suministros usados al preparar la PME.
APÉNDICES Appendlx l. Competencias Principales, Condiciones, Prácticas y Garantías de Calidad que se requieren (t "deben") y se recomiendan (:1: "debieran") en el Capítulo (797) de la USP NOTA-Este apéndice tabular resume y condensa selectivamente el texto completo del capítulo (797) sólo para referencia rápida. El personal de preparación magistral es responsable de leer, comprender y cumplir con el texto completo y toda la terminología, contenido y condiciones oficiales de la USP. INTRODUCCIÓN
t El propósito del capítulo consiste en evitar daños y muerte a pacientes tratados con PME. t El capítulo se refiere a la preparación, el almacenamiento y el transporte de PME, mas no a su administración. t Personal e instituciones a las cuales se aplica el (797); por lo tanto, para quién y para las cuáles puede ser ejecutable por las autoridades reglamentarias y de acreditación.
t Los tipos de preparaciones diseñadas como PME según sus formas físicas y los sitios y rutas de administración a los pacientes. t El personal que trabaja en las preparaciones magistrales debe ser meticulosamente cuidadoso en evitar la contaminación por contacto de las PME, tanto dentro como fuera de las áreas ISO Clase 5. ORGANIZACIÓN
t Todo el personal que participa en la elaboración de PME tiene la responsabilidad de comprender las prácticas y precauciones fundamentales que se encuentran en el capítulo (797) de la USP, para desarrollar e implementar los procedimientos apropiados y evaluar en forma constante dichos procedimientos y la calidad de la PME final para evitar daños. RESPONSABILIDAD DEL PERSONAL DE PREPARACIÓN MAGISTRAL
t Las prácticas y garantías de calidad requeridas para preparar, almacenar y transportar PME que son estériles y aceptablemente precisas, puras y estables. NIVELES DE RIESGO DE CONTAMINACIÓN MICROBIANA EN LAS PME
t La capacitación apropiada y la evaluación del personal, la limpieza y vestimenta adecuada del personal, la limpieza y desinfección adecuada de los ambientes de trabajo de preparación magistral y el mantenimiento y monitoreo apropiados de las instalaciones de ambiente controlado (todas las cuales se detallan en sus respectivas secciones). PME de Nivel de Riesgo Bajo
t Manipulaciones asépticas dentro de un ambiente ISO Clase 5 usando tres, o menos de tres, productos estériles y entradas en cualquier envase. t En ausencia de pruebas de esterilidad, almacenar no más de 48 horas a temperatura ambiente controlada, 14 días a temperatura fría y 45 días en estado congelado sólido entre -25º y -1 Oº o más frío.
t Prueba de llenado de medios al menos anualmente, hecha por el personal de preparación magistral. PME de Nivel de Riesgo Bajo con FLU de 12 Horas o Menos
t Cumplir totalmente con los cuatro criterios específicos. t Los lavabos no deben estar ubicados adyacentes al CIP ISO Clase 5.
t Los lavabos deben estar separados del área inmediata del CIP ISO Clase 5. PME de Nivel de Riesgo Mediano
71 O (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles/ Pruebas Físicas
USP 39
Appendix l. Competencias Principales, Condiciones, Prácticas y Garantías de Calidad que se requieren (t "deben") y se recomiendan (:!: "debieran") en el Capítulo (797) de la USP (Continuación)
t Manipulaciones asépticas dentro de un ambiente ISO Clase 5, usando mezclado y transferencia prolongados y complejos, más de tres productos estériles y entradas dentro de cualquier envase, y combinación de ingredientes de múltiples productos estériles para preparar múltiples PME.
t En ausencia de pruebas de esterilidad, almacenar no más de 30 horas a temperatura ambiente controlada, 9 días a temperatura fría y 45 días en estado congelado sólido entre -25º y -1 Oº o más frío.
t Prueba de llenado de medios al menos anualmente, hecha por el personal de preparación magistral. PME de Nivel de Riesgo Alto
t Presencia confirmada de ingredientes y dispositivos no estériles, o exposición confirmada o sospechada de ingredientes estériles por más de una hora a calidad de aire inferior a ISO Clase 5 antes de la esterilización final.
t t t t
Método de esterilización verificado para conseguir la esterilidad para la cantidad y tipo de envases. Cumplir Jos límites permisibles para endotoxinas bacterianas. Mantener la concentración y pureza aceptables de Jos ingredientes y la integridad de Jos envases involucrados después de Ja esterilización. En ausencia de pruebas de esterilidad, almacenar no más de 24 horas a temperatura ambiente controlada, 3 días a temperatura fría y 45 días en estado congelado sólido entre -25º y -1 Oº o más frío.
t Prueba de llenado de medios al menos semestralmente, hecha por el personal de preparación magistral. CAPACITACIÓN Y EVALUACIÓN DEL PERSONAL EN TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN ASÉPTICA
t Inicialmente, aprobar la evaluación didáctica y práctica de destrezas y llenado de medios, seguida por una evaluación anual para preparación magistral de nivel de riesgo bajo y mediano, y semestral para preparación magistral de nivel de riesgo alto.
t El personal de preparación magistral que no pase las pruebas escritas o cuyos viales de prueba de llenado de medios produzcan una colonización microbiana profusa, deberá recibir de inmediato una nueva capacitación y someterse a una nueva evaluación a cargo de personal experto en preparación magistral, para asegurarse de que hayan corregido todas sus deficiencias en materia de práctica aséptica. PME DE USO INMEDIATO
t Cumplir totalmente con Jos seis criterios especificados. ENVASES MONODOSIS Y MULTJDOSJS
t Fecha límite de uso de 28 días, a menos que el fabricante especifique Jo contrario, para envases multidosis de cierre sellado, después de Ja apertura o entrada inicial.
t Fecha límite dP uso de 6 horas, a menos que el fabricante especifique Jo contrario, para envases monodosis de cierre sellado en aire ISO Clase 5 o más limpio, después de la apertura o entrada inicial.
t Fecha límite de uso de 1 hora para envases monodosis de cierre sellado después de su apertura o entrada bajo un aire de calidad inferior a ISO Clase 5.
t No se permite el almacenamiento de ampollas monodosis abiertas. FÁRMACOS PELIGROSOS COMO PME
t t t t
Equipo protector apropiado para el personal. Los controles de ingeniería primarios apropiados (CSB y CACI) se usan para la protección simultánea del personal y la exposición de sitios críticos. Los fármacos peligrosos se deben almacenar separados de otro inventario, de manera que se evite la contaminación y la exposición del personal. Presión negativa al menos de 0,01 pulgadas de columna de agua y 12 cambios de aire por hora en cuartos no limpios en donde se ubiquen los CACJ.
t Los fármacos peligrosos se deben manejar con precaución en todo momento, usando guantes apropiados para quimioterapia durante la recepción, distribución, aprovisionamiento, inventariado, preparación para administración y eliminación.
t Los fármacos peligrosos deben prepararse en un ambiente ISO Clase 5, con controles de ingeniería protectores y siguiendo las prácticas asépticas especificadas para los niveles de riesgo de contaminación apropiados.
t El acceso a áreas de elaboración de preparaciones de fármacos debe estar limitado al personal autorizado. t Se debe instalar un indicador de presión que pueda monitorear fácilmente Ja presurización del cuarto, que se documenta diariamente. t Documentación anual para Ja capacitación completa del personal en Jo que respecta a almacenamiento, manipulación y eliminación de fármacos pe/ ig rosos.
t Si se usa un CSTD, éste se empleará en un dispositivo de control de ingeniería primario ISO Clase 5. t Se requiere presión negativa de al menos 0,01 pulgadas de columna de agua para la preparación magistral de fármacos peligrosos. :j: La zona amortiguadora de presión negativa no se requiere para preparaciones magistrales de bajo volumen cuando se usa un CSTD en una CSB o un CACI.
t El personal de preparación magistral que esté en edad reproductiva debe confirmar por escrito que entiende los riesgos de manipular los fármacos peligrosos.
t La eliminación de todos los desechos de fármacos peligrosos debe cumplir con todas las reglamentaciones federales y estatales. :j: Salida externa total de Jos controles de ingeniería primarios. :j: Ensayo de muestras de frotación de superficies cada 6 meses.
PREPARADOS RADIOFARMACÉUTJCOS COMO PME
t Tomografía de Emisión de Positrones se rige por el capítulo (823) de Ja USP. t Controles de ingeniería primarios apropiados y contención y blindaje de radioactividad.
Pruebas Físicas/ (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles 711
USP 39
Appendix l. Competencias Principales, Condiciones, Prácticas y Garantías de Calidad que se requieren (t "deben") y se recomiendan (:j: "debieran") en el Capítulo (797) de la USP (Continuación)
t Los preparados radiofarmacéuticos elaborados a partir de componentes estériles en recipientes estériles cerrados y con un volumen de 100 mL o menos para inyección monodosis, o no más de 30 mL tomados de envases multidosis se deben nombrar según las normas para PME de nivel de riesgo bajo y cumplir con ellos.
t Los viales de preparados radiofarmacéuticos destinados a múltiples usos, preparados con tecnecio 99m, expuestos a ambiente ISO Clase 5 y perforados por agujas, sin contaminación directa, pueden usarse hasta la fecha indicada en las recomendaciones del fabricante.
t Ubicación de controles de ingeniería primarios permitidos en un ambiente controlado ISO Clase 8. t Generadores de Tecnecio 99m/Molibdeno 99 usados de acuerdo con los requisitos federales, estatales y del fabricante. t Los preparados radiofarmacéuticos como PME de nivel de riesgo bajo, con fecha límite de uso de 12 horas o menos se deben preparar en un área segregada.
t Los materiales y la vestimenta expuestos en el área de atención y tratamiento del paciente no deben cruzar una línea de demarcación dentro del área de preparación magistral segregada.
t Los generadores de Tecnecio 99m/Molibdeno 99 se deben eluir en condiciones ISO Clase 8. t El área de preparación magistral segregada se indicará con una línea de demarcación. :j: El almacenamiento y transporte de los viales debidamente blindados de PME radiofarmacéuticas puede ocurrir en un ambiente de acceso limitado
sin una designación específica de clase ISO. EXTRACTOS DE ALÉRGENOS COMO PME
t Los extractos de alérgenos como PME no están sujetos a los requisitos descritos para personal, ambiente y almacenamiento de PME de todos los Niveles de Riesgo de Contaminación Microbiana cuando se cumplen ciertos criterios. VERIFICACIÓN DE LA EXACTITUD Y ESTERILIDAD DE LA PREPARACIÓN MAGISTRAL
t Revisar etiquetas y documentar las mediciones, manipulaciones asépticas y procedimientos de esterilización correctos para confirmar la identidad, pureza, concentración de ingredientes y esterilidad de la PME. :j: Valorar las PME terminadas para confirmar la identidad correcta y/o concentración de ingredientes. :j: Prueba de esterilidad para PME terminadas.
Métodos de Esterilización
t Verificar que los métodos permiten lograr la esterilidad a la vez que mantienen el contenido, pureza, calidad e integridad del envase apropiados. :j: Probar la eficacia según el capítulo (71) de la USP, o mediante pruebas de esterilidad equivalentes o superiores.
Esterilización de PME de Nivel de Riesgo Alto por Filtración
t Membranas estériles de tamaño nominal de poro de 0,2 µm que sean química y físicamente compatibles con la PME. t Completar rápidamente sin reemplazar el filtro. t Someter el filtro a la prueba de integridad recomendada por el fabricante (p.ej., prueba del punto de burbuja) después de filtrar la PME. Esterilización de PME de Nivel de Riesgo Alto por Vapor
t Probar hasta verificar que todos los envases que se van a esterilizar queden estériles después del tiempo de exposición seleccionado en el autoclave particular.
t Garantizar que el vapor vivo entre en contacto con todos los ingredientes y superficies que se van a esterilizar. t Pasar las soluciones a través de un filtro de tamaño nominal de poro de 1,2 µm o menor a los envases finales para retirar las partículas antes de la esterilización.
t El aire caliente filtrado debe distribuirse uniformemente a través de la cámara, por medio de un ventilador. t El calor seco se debe usar sólo para aquellos materiales que no se puedan esterilizar por vapor, cuando la humedad daña el material o éste es impermeable.
t Se debe dejar suficiente espacio entre los materiales para permitir una buena circulación del aire caliente. t La descripción de las condiciones y duración de la esterilización por calor seco para cada PME debe estar documentada por escrito en la institución responsable de la preparación magistral. La eficacia de la esterilización por calor seco se debe verificar usando los indicadores biológicos apropiados y otros métodos de confirmación. :j: El horno debe equiparse con un sistema para controlar la temperatura y el tiempo de exposición.
Despirogenización por Calor Seco
t La despirogenización por calor seco se debe usar para eliminar los pirógenos y los microbios viables de los artículos o envases de vidrio, como viales. t La descripción del ciclo de despirogenización por calor seco y su duración para una carga específica de artículos debe estar documentada por escrito en la institución responsable de la preparación magistral.
t La eficacia del ciclo de despirogenización por calor seco se debe verificar usando viales para desafío de endotoxinas (VDE). :j: La prueba de endotoxinas bacterianas debe efectuarse en los VDE con el fin de verificar si el ciclo es capaz de conseguir una reducción de 3 log en
endotoxinas. CALIDAD Y CONTROL AMBIENTAL Exposición de Sitios Críticos
t Aire ISO Clase 5 o mejor. t Evitar la contaminación por contacto directo (p.ej., tacto y secreciones). Fuentes de Aire ISO Clase 5, Zonas Amortiguadoras y Antesalas
t Una zona amortiguadora es un área provista con aire de calidad ISO Clase 7 como mínimo.
712 (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles / Pruebas Físicas
USP 39
Appendlx l. Competencias Prlnclpales, Condiciones, Prácticas y Garantías de Calidad que se requieren (f "deben") y se recomiendan (:1: "debieran") en el Capítulo (797) de la USP (Continuación) t Nuevas representaciones de la distribución de la instalación. t Toda instalación de preparación magistral debe garantizar que cada fuente de ambiente ISO Clase 5 para exposición de sitios críticos y esterilización por filtración esté adecuadamente ubicada, manejada, mantenida, supervisada y verificada. t Los dispositivos (p.ej., computadoras e impresoras) y objetos (p.ej., carros y gabinetes) se pueden ubicar en zonas amortiguadoras y deben verificarse mediante pruebas o monitoreo. Pruebas de Muestreo Ambiental (MA) de Partículas Viables y No Viables t El muestreo ambiental se debe realizar como parte de un programa integral de gestión de la calidad y deberá ocurrir como mínimo cuando existan varias condiciones. t El programa de muestreo ambiental debe proporcionar información al personal y directivos para demostrar que los controles de ingeniería mantienen un ambiente dentro del área de preparación magistral que garantiza en forma constante concentraciones de partículas viables y no viables aceptablemente bajas. Programa de Pruebas para Partículas Ambientales No Viables t La certificación y pruebas de los controles de ingeniería primarios (CFL, CSB, CAi y CACI) y secundarios (zonas amortiguadoras y antesalas) las debe efectuar una persona calificada por lo menos cada seis meses y siempre que el dispositivo o cuarto se reubique, altere o se haga una reparación importante a la instalación. Se deben usar los procedimientos de certificación, como aquellos señalados en Certification Guide for Sterile Compounding Facilities (CAG-003-2006) de CETA. Recuento Total de Partículas t La certificación por medio de la cual se certifica que cada área con clasificación ISO, (p.ej., ISO Clase 5, 6, 7 y 8) está dentro de las normas establecidas, se debe hacer por lo menos cada 6 meses y siempre que la CFL, la CSB, el CAi o el CACI se reubiquen o la estructura física de la zona amortiguadora o de la antesala se alteren. t Las pruebas las deben efectuar operadores calificados, usando equipo electrónico de última tecnología con resultados que cumplan con ISO Clase 5, 7 u 8, dependiendo de los requisitos de la zona. t El personal de supervisión y otros empleados designados deben mantener y revisar todos los registros de certificación para garantizar que los ambientes controlados cumplan con la limpieza de aire, presiones del cuarto y CAPH apropiados. Monitoreo de la Presión Diferencial t Se debe instalar un manómetro o velocímetro para supervisar el diferencial de presión o flujo de aire entre la zona amortiguadora y la antesala y entre la antesala y el ambiente general fuera de la zona de preparación magistral. t Los resultados deberán revisarse y documentarse en un cuaderno de bitácora por lo menos en cada cambio de turno (la frecuencia mínima debe ser diaria) o en un dispositivo de grabación continua. t La presión entre el área ISO Clase 7 y la zona general de farmacia no debe ser menor que 5 Pa (0,02 pulgadas de columna de agua (w.c.)). t En instalaciones donde se preparan PME de nivel de riesgo bajo y mediano, el flujo de aire diferencial debe mantener una velocidad mínima de 0,2 metros por segundo (40 pies por minuto) entre la zona amortiguadora y la antesala. Programa de Pruebas para Partículas Aéreas Ambientales Viables-Plan de Muestreo t Se debe desarrollar un plan de muestreo ambiental apropiado para las partículas aéreas viables, basado en la evaluación de riesgo de las actividades de preparación magistral efectuadas. t Los sitios de muestreo seleccionados deben incluir lugares dentro de cada ambiente ISO Clase 5 y en las zonas ISO Clase 7 y 8, así como en las zonas segregadas de preparación magistral con más alto riesgo de contaminación (p.ej., zonas de trabajo cerca del ambiente ISO Clase 5, mostradores cerca de las puertas, cabinas de transferencia de materiales (pass-through boxes)). t El plan debe incluir: ubicación de la muestra, método de recolección, frecuencia de muestreo, volumen de aire muestreado y hora del día, relativa a la actividad de la zona de preparación magistral, y niveles de acción. t Se recomienda que el personal de preparación magistral consulte el Capítulo Control Microbiológico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento Aséptico (1116) de la USP y las Guidelines for Environmental lnfection Control in Healthcare Facilities-2003 de los CDC para más información. Medio de Crecimiento t Se debe utilizar un medio de crecimiento microbiano como el Medio de Digerido de Caseína y Soja (también conocido como caldo (TSB) o agar (TSA) tripticasa de soja) para propiciar el crecimiento de bacterias. t En los ambientes de preparación magistral con nivel de riesgo alto se debe usar un agar con extracto de malta (MEA) u otro medio que facilite el crecimiento de hongos. t Los medios usados para el muestreo de superficies deben suplementarse con aditivos para neutralizar los efectos de los agentes desinfectantes (p.ej., TSA con lecitina y polisorbato 80). Muestreo de Partículas Aéreas Viables t La evaluación de microorganismos aéreos usando métodos volumétricos de recolección en los ambientes de aire controlado debe efectuarla personal capacitado para todos los niveles de riesgo de las preparaciones magistrales. t El método de impacto debe ser el método preferido de muestreo volumétrico de aire. t Para preparaciones magistrales de nivel de riesgo bajo, mediano y alto, el muestreo de aire se debe efectuar en lugares propensos a la contaminación durante actividades de preparación magistral y otras actividades como preparación, etiquetado, vestimenta y limpieza. t Los lugares de muestreo deben incluir zonas de turbulencia de reflujo de aire dentro de la cabina de flujo laminar y otras áreas en donde la turbulencia de reflujo de aire pueda ingresar en el área de preparación magistral. t Para PME de nivel de riesgo bajo con FLU de 12 horas o menos, el muestreo de aire se debe hacer en sitios dentro del ambiente ISO Clase 5 y otras áreas que estén muy cerca del ambiente ISO Clase 5, durante la certificación del control de ingeniería primario.
Pruebas Físicas / (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles 71 3
USP 39
Appendlx l. Competencias Principales, Condiciones, Prácticas y Garantías de Calidad que se requieren (t "deben") y se recomiendan (:1: "debieran") en el Capítulo (797} de la USP (Continuación)
t Debe considerarse el efecto general que el método de muestreo escogido tendrá sobre el flujo de aire unidireccional dentro de un ambiente de preparación magistral. Dispositivos de Muestreo de Aire
t
Se deben seguir las instrucciones en el manual de usuario del fabricante en lo que respecta a la verificación y uso de muestreadores eléctricos de aire que recolectan activamente volúmenes de aire para evaluación.
t Se debe evaluar un volumen suficiente de aire (400 a 1000 litros) en cada lugar de muestreo, con el fin de maximizar la sensibilidad. t
Se recomienda que el personal de preparación magistral consulte también el Capítulo USP (1116} que puede proporcionar más información sobre el uso de muestreadores volumétricos de aire y el volumen de aire que debe tomarse para detectar variaciones en la biocarga ambiental.
Proceso y Frecuencia de Muestreo del Aire
t t
Como parte de la recertificación de instalaciones y equipos, se debe efectuar el muestreo del aire al menos dos veces al año (es decir, cada 6 meses) en el área donde estén ubicados los controles de ingeniería primarios. Se debe tomar un volumen suficiente de aire y seguir las normas del fabricante para el uso de equipo electrónico para muestreo de aire.
t Cualquier construcción o reparación de equipo en una instalación puede requerir que se tomen muestras de aire durante esas actividades. Período de Incubación
t
Las placas de medio para crecimiento microbiano usadas para recolectar muestreos ambientales se recuperan, se aseguran las tapas (p.ej., con cinta), se invierten e incuban a una temperatura y por un tiempo que conduzca a la multiplicación de microorganismos.
t
Se debe contar e informar el número de colonias discretas de microorganismos como unidades formadoras de colonias (ufc) en un formulario de monitoreo ambiental. Los recuentos de las muestras de aire se deben transformar en ufc por metro cúbico de aire y evaluar las tendencias adversas.
t El TSA se debe incubar a una temperatura de 35º ±2 º durante un período de 2 a 3 días. t
MEA u otro medio apto para hongos se debe incubar a 28º ± 2 ºdurante 5 a 7 días.
Niveles de Acción, Documentación y Evaluación de Datos
t
Los datos de muestreo se deben recolectar y revisar en forma periódica como una manera de evaluar el control general del ambiente de preparación magistral.
t Si una actividad muestra sistemáticamente niveles elevados de crecimiento microbiano, se debe consultar al personal competente de microbiología. t Se debe investigar la fuente de la contaminación. t
Cualquier recuento de ufc que exceda su respectivo nivel de acción debe dar lugar a una reevaluación de la idoneidad de las prácticas de trabajo del personal, los procedimientos de limpieza y operativos y la eficacia de la filtración de aire dentro de la instalación de preparación magistral aséptica.
t La tabla titulada Niveles de Acción Recomendados para Contaminación Microbiana se debe usar sólo como guía. Diseño de la Instalación y Controles Ambientales
t Las instalaciones de preparación magistral están físicamente diseñadas y ambientalmente controladas para minimizar el contacto de la contaminación aérea con los sitios críticos.
t
Las instalaciones de preparación magistral deben proporcionar un ambiente de trabajo cómodo y bien iluminado, por lo general con una temperatura de 20º o menos, para brindar condiciones de comodidad al personal de preparación magistral mientras está ataviado con la vestimenta requerida para la preparación magistral aséptica.
t Los controles de ingeniería primarios proporcionan aire HEPA unidireccional (es decir, laminar) a una velocidad suficiente para prevenir el contacto de partículas aéreas con los sitios críticos.
t
En el área crítica se debe realizar un análisis del patrón de aire in situ por medio de estudios de humo para demostrar el flujo unidireccional del aire y la acción de barrido sobre el producto bajo condiciones dinámicas.
t
Las políticas y procedimientos para mantener y trabajar dentro del área de control de ingeniería primario se deben poner por escrito y cumplir. Las políticas y procedimientos estarán determinados por el alcance y niveles de riesgo de las actividades de preparación magistral aséptica utilizadas durante la preparación de las PME.
t
Los principios del flujo unidireccional de aire filtrado por HEPA en el ambiente de trabajo se deben comprender y practicar en el proceso de preparación magistral, con el fin de conseguir las condiciones ambientales deseadas.
t Los cuartos limpios para PME no peligrosas y no radioactivas se suministran con HEPA que entra desde el cielo raso, con ventilaciones de retorno en la parte baja de las paredes,
t t t t t t
y proporciona no menos de 30 cambios de aire por hora.
Las zonas amortiguadoras mantienen una presión positiva de 0,02 a 0,05 pulgadas de columna de agua y no contienen lavabos ni drenajes. La velocidad de aire de las zonas o cuartos amortiguadores a las antesalas es al menos 40 pies/minuto. El control de ingeniería primario debe estar ubicado dentro de una zona amortiguadora, de tal manera que se eviten condiciones que podrían afectar adversamente su funcionamiento. El control de ingeniería primario debe ubicarse fuera del flujo de tráfico y de manera que el sistema de HVAC y las corrientes de aire del cuarto no causen perturbaciones. El suministro de aire filtrado por HEPA se debe introducir por el cielo raso. Debe probarse la eficacia de todos los filtros HEPA, usando el tamaño de partícula más penetrante y someterlos a pruebas contra fugas en la fábrica, y nuevamente in situ después de la instalación.
t
Las actividades y tareas desarrolladas dentro de la zona amortiguadora deben limitarse a aquellas necesarias cuando se trabaja en un ambiente controlado.
t
Al cuarto sólo se deben llevar los muebles, equipos, suministros y otros materiales requeridos para las actividades de preparación magistral que se van a desempeñar.
714 (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles / Pruebas Físicas
USP 39
Appendlx l. Competencias Principales, Condiciones, Prácticas y Garantías de Calidad que se requieren (t "deben") y se recomiendan (:t: "debieran") en el Capítulo (797) de la USP (Continuación) t Las superficies y el amoblado esencial en los cuartos o zonas amortiguadoras y en los cuartos limpios deben ser lisos, impermeables, limpiables, resistentes a desinfectantes y no ser porosos ni desprender partículas. t Las superficies de los cielos rasos, paredes, pisos, artefactos, estantes, mostradores y gabinetes en la zona amortiguadora deben ser lisos e impermeables, no deben tener grietas o rajaduras, y no deben desprender partículas para facilitar su limpieza y reducir al mínimo los espacios en los que podrían acumularse microorganismos y otros contaminantes. t Las superficies deben ser resistentes a los daños causados por agentes desinfectantes. t Las uniones de los cielos rasos con las paredes deben ser abovedadas o enmasilladas para evitar la formación de grietas donde pueda acumularse polvo. t Los paneles del cielo raso se deben enmasillar en todo su perímetro para sellarlas al armazón de soporte. t La superficie externa de los artefactos de iluminación embutidos en el cielo raso debe ser lisa y estar sellada y al ras del cielo raso. t Cualquier otro elemento que penetre en el cielo raso o las paredes debe estar sellado. t La zona amortiguadora no debe contener fuentes de agua (lavabos) ni drenajes en el piso. Las superficies de trabajo deben estar construidas con materiales lisos impermeables, como acero inoxidable o plástico moldeado, para que puedan limpiarse y desinfectarse fácilmente. t Los carros deben ser de alambre de acero inoxidable, plástico no poroso o planchas metálicas, con ruedas de buena calidad y fáciles de limpiar para facilitar su movilidad. t Los estantes de almacenamiento, mostradores y gabinetes deben ser lisos, de material impermeable y fáciles de limpiar y desinfectar y, además deben estar libres de grietas y no desprender partículas. t La cantidad, el diseño y la forma de instalación de los artículos antes mencionados debe facilitar la limpieza y desinfección eficaces. :j: Si los cielos rasos tienen paneles incrustados, éstos deben impregnarse con un polímero para hacerlos impermeables e hidrófobos. :j: Debe evitarse la presencia de elementos salientes que junten polvo, como las tuberías de servicio que pasan por el techo o las repisas de las ventanas. :j: Los retornos de aire deben estar instalados en la parte inferior de la pared para crear una dilución general de arriba hacia abajo del aire ambiental con el aire filtrado por HEPA. Colocación de los Controles de Ingeniería Primario dentro de Zonas Amortiguadoras ISO Clase 7 t Los controles de ingeniería primarios para PME no peligrosas y no radiactivas se colocan en las zonas amortiguadoras, excepto en el caso de CAi que prueben mantener aire ISO Clase 5 cuando los recuentos de partículas se hacen entre 6 y 12 pulgadas más arriba de las áreas de exposición del sitio crítico durante la realización de la transferencia normal de materiales hacia adentro y afuera, y durante manipulaciones de preparación magistral, cuando dichos CAi se ubican bajo un aire de calidad inferior a ISO Clase 7. t Los procedimientos de preesterilización para las PME de alto riesgo, como el pesado y mezclado, se deben completar en un ambiente no inferior a ISO Clase 8. t Los controles de ingeniería primarios deben ubicarse fuera de las vías de tráfico y lejos de corrientes de aire que pudieran perturbar los patrones de flujo de aire deseados del cuarto. t Cuando se usen aisladores para la preparación magistral estéril, el tiempo de recuperación para alcanzar la calidad de aire ISO Clase 5 se debe documentar y desarrollar los procedimientos internos para garantizar que se permita el tiempo de recuperación adecuado después de la transferencia de materiales, antes y durante las operaciones de preparación magistral. t Cuando las actividades de preparación magistral requieran la manipulación de materiales derivados de la sangre del paciente u otros materiales biológicos (p.ej., marcado radioactivo de leucocitos de un paciente o donante), las manipulaciones deben hacerse claramente aparte de los procedimientos de rutina para manejo de material y equipos usados en las actividades de preparación de PME y deben controlarse por medio de POE específicos con el fin de evitar contaminaciones cruzadas. t Alimentos, bebidas y artículos expuestos en las zonas de atención de paciente, así como desempacar suministros a granel y actividades de aseo y vestimenta del personal están prohibidos en los cuartos o zonas amortiguadores. t Designación de demarcación entre cuartos o zonas amortiguadoras y antesalas. t Limpieza antiséptica de manos y guantes estériles en los cuartos o zonas amortiguadoras. :j: Los suministros y componentes empacados para preparación magistral, como agujas, jeringas, conjuntos de tubos y soluciones parenterales de pequeño y gran volumen deben sacarse de las cajas y frotarse con un desinfectante que no deje residuo (p.ej., IPA estéril al 70%) de ser posible en una antesala de calidad de aire ISO Clase 8, antes de pasarlos a las zonas amortiguadoras. Limpieza y Desinfección del Área de Preparación Magistral Estéril t El personal capacitado escribe los procedimientos detallados que incluyen limpiadores, desinfectantes y materiales para refregar y trapear que no desprenden partículas. t Las superficies de la CFL, la CSB, el CAi y el CACI se deben limpiar y desinfectar con frecuencia, incluyendo: al comenzar cada turno de trabajo, antes de la preparación de cada lote, cada 30 minutos durante los períodos continuos de preparación de PME individuales, cuando haya derramamientos y cuando se sepa o sospeche que la superficie está contaminada debido a fallas procedimentales. t El personal de preparación magistral capacitado es responsable de desarrollar, implementar y poner en práctica los procedimientos de limpieza y desinfección del área directa de preparación (ADP) escritos en los POE. t La limpieza y desinfección deben hacerse antes de la preparación magistral. Se deben quitar todos los artículos de las áreas a limpiar y a continuación limpiar las superficies, retirando el material suelto y los residuos de derramamientos; por ejemplo, los residuos sólidos solubles en agua se quitan con Agua Estéril (para Inyección o Irrigación) y paños que no desprendan partículas. Luego se pasa un paño con un agente desinfectante que no deje residuos, como IPA estéril al 70%, el cual se deja secar antes de comenzar la preparación magistral. t Las superficies de trabajo en zonas ISO Clase 7 y 8 y en las zonas de preparación magistral segregadas se limpian al menos una vez al día. t El polvo y los detritos se deben retirar cuando sea necesario de los sitios de almacenamiento de ingredientes y suministros de preparación magistral, con un método que no degrade la calidad de aire ISO Clase 7 u 8.
USP 39
Pruebas Físicas/ (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles 715
Appendlx l. Competencias Principales, Condiciones, Prácticas y Garantías de Calidad que se requieren (t "deben") y se recomiendan (:1: "debieran") en el Capítulo (797) de la USP (Continuación) t Los pisos en las áreas ISO Clase 7 y 8 se limpian diariamente cuando no hay preparación magistral en proceso. t El IPA (alcohol isopropílico al 70%) permanece en las superficies que se van a desinfectar al menos durante 30 segundos antes de que se usen para elaborar PME. t Los estantes vacíos, las paredes y los cielos rasos en las antesalas se limpian y desinfectan al menos una vez al mes. t La limpieza del suelo debe ser realizada por personal capacitado, usando los agentes y procedimientos aprobados que se describen en los POE escritos. t Los agentes limpiadores y desinfectantes, sus cronogramas de uso y métodos de aplicación deben concordar con los POE escritos y el personal de apoyo y/o el de preparación magistral debe cumplirlos. t Todos los materiales de limpieza, como paños, esponjas y trapeadores deben ser del tipo que no desprenda partículas, de preferencia compuestos por microfibras sintéticas y destinados al uso en las zonas amortiguadoras, antesalas y áreas segregadas de preparación magistral, de las cuales no deben retirarse a menos que sea para desecharlos. t Si los materiales de limpieza (p.ej., trapeadores) se reutilizan, se deben desarrollar procedimientos (basándose en las recomendaciones del fabricante) que garanticen que la eficacia del dispositivo de limpieza se mantiene y que el uso repetido no incrementa la biocarga del área que se está limpiando. t Los suministros y equipos retirados de su embalaje original se deben limpiar con un agente desinfectante apropiado (p.ej., IPA estéril al 70%), aplicado con un frasco rociador u otro método de aplicación adecuado. t Después de rociar o limpiar con el desinfectante la superficie a desinfectar, se debe dejar secar y durante este tiempo el artículo no se debe usar para preparación magistral. t Las compresas de gasa empapadas en IPA estéril al 70% u otro material que desprenda partículas no se deben usar para desinfectar los puntos de entrada estériles de paquetes y dispositivos. Limpieza y Vestimenta del Personal t El personal debe ser también competente y estar muy motivado para desempeñar manipulaciones asépticas impecables con ingredientes, dispositivos y componentes de las PME. t El personal con prurito, quemaduras de sol, úlceras exudantes, conjuntivitis, infección respiratoria activa y cosméticos tiene prohibido preparar PME. t El personal de preparación magistral debe retirarse los atuendos personales exteriores, cosméticos, uñas postizas, joyas de las manos, muñecas y cuerpo que puedan interferir con el uso de batas y guantes; también debe retirarse los pirsins visibles por encima del cuello. t Orden para asearse y vestir atuendo de preparación magistral en la antesala: zapatos y cubrecalzado, gorras y mascarillas que cubran la barba, máscaras, limpieza de uñas, lavado y secado de manos y antebrazos, bata que no desprende partículas. t Orden para asearse y calzarse los guantes en el cuarto o zona amortiguadora: lavado de manos con un producto de actividad persistente a base de alcohol, dejar secar las manos, calzar guantes estériles. t Desinfectar rutinariamente los guantes con IPA estéril al 70% después de tocar objetos no estériles. t Inspeccionar los guantes para determinar que no estén agujereados y reemplazarlos cuando se detecten fallas. t El personal repite los procedimientos apropiados después de exponerse a contaminación por contacto directo o aire inferior a ISO Clase 8. t De estos requisitos están eximidos las PME de uso inmediato y los CAi para los cuales los fabricantes proporcionan documentación escrita, basada en pruebas validadas, de que dichas prácticas no son necesarias para mantener la esterilidad en las PME. Capacitación del Personal y Evaluación de la Competencia en Vestimenta, Prácticas Asépticas de Trabajo y Procedimientos de Limpieza y Desinfección t El personal encargado de la preparación de las PME deberá recibir capacitación competente y a conciencia por parte de personal experto, con ayuda de instrucción multimedia y publicaciones profesionales, sobre los principios teóricos y los conocimientos prácticos de los procedimientos de vestimenta, prácticas asépticas de trabajo, así como en la forma de conseguir y mantener condiciones ambientales ISO Clase 5 y procedimientos de limpieza y desinfección. t Esta capacitación se debe completar y documentar antes de que ningún miembro del personal comience a elaborar PME. t El personal de preparación magistral debe completar la capacitación didáctica, aprobar las evaluaciones escritas de competencia, someterse a evaluaciones de destreza usando herramientas de auditoría de observación y pruebas de llenado de medios. t Las pruebas de las destrezas asépticas de trabajo mediante el llenado de medios se efectúan inicialmente antes de comenzar a preparar PME y al menos anualmente, en adelante, para preparaciones magistrales de nivel de riesgo bajo y mediano y semestralmente para preparaciones magistrales de nivel de riesgo alto. t El personal de preparación magistral que no pase las pruebas escritas o las auditorías de observación o cuyos viales de prueba de llenado de medios tengan una o más unidades que muestren contaminación microbiana visible deberá recibir de inmediato una nueva capacitación y someterse a una nueva evaluación a cargo de personal experto en preparación magistral, para asegurarse de que hayan corregido todas sus deficiencias en prácticas asépticas de trabajo. t El personal de preparación magistral debe pasar todas las evaluaciones antes de reiniciar la práctica de preparación magistral estéril. t Además de la evaluación didáctica y llenado aséptico de medios, el personal de preparación magistral debe demostrar competencia en higiene apropiada de las manos, vestimenta y procedimientos de limpieza congruentes. t Cuando los procedimientos de limpieza y desinfección los efectúa personal de apoyo, éste debe recibir de un experto calificado en preparación magistral aséptica, capacitación cuidadosa en procedimientos apropiados de higiene de las manos, vestimenta, limpieza y desinfección. t El personal de apoyo debe someterse rutinariamente a una evaluación de desempeño en la apropiada higiene de las manos, vestimenta y todos los procedimientos de limpieza y desinfección, la que llevará a cabo un experto calificado en preparación magistral aséptica. Evaluación de Competencia en Vestimenta y Prácticas Asépticas de Trabajo
716 (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles / Pruebas Físicas
USP 39
Appendix l. Competencias Principales, Condiciones, Prácticas y Garantías de Calidad que se requieren (t "deben") y se recomiendan (:1: "debieran") en el Capítulo (797) de la USP (Continuación) t El personal de preparación magistral debe ser evaluado inicialmente antes de comenzar la elaboración de PME y siempre que se efectúe un llenado de medios aséptico, usando un Formulario para Evaluación de la Higiene de las Manos y Prácticas Relacionadas con la Vestimenta del Personal de Preparación Magistral y los procedimientos de muestreo de las puntas de los dedos enguantados del personal. Evaluación de la Práctica Aséptica de Trabajo por Medio de Muestreo de las Puntas de los Dedos Enguantados del Personal t El monitoreo de las puntas de los dedos enguantados del personal de preparación magistral se debe efectuar para todos los niveles de riesgo de elaboración de PME. t El muestreo de las puntas de los dedos enguantados se debe utilizar para evaluar la competencia del personal en los procedimientos de higiene de las manos y vestimenta, así como para educar al personal de preparación magistral en las prácticas de trabajo apropiadas. t Todo el personal debe demostrar competencia en procedimientos apropiados de higiene de las manos y vestimenta, además de las prácticas asépticas de trabajo. t Las placas estériles de contacto con agar se deben usar para tomar las muestras de las puntas de los dedos enguantados del personal de preparación magistral después de vestirse para evaluar la competencia en el uso de vestimenta y después de completar la preparación de llenado de medios. t Los guantes no se deben desinfectar con IPA estéril al 70% inmediatamente antes de la toma de muestras. Evaluación de Competencia en Uso de Vestimenta y Guantes t El personal de preparación magistral debe ser inspeccionado visualmente durante el proceso de higiene de las manos y uso de vestimenta. t La inspección visual debe documentarse en un Formulario para Evaluación de la Higiene de las Manos y Prácticas Relacionadas con la Vestimenta del Personal de Preparación Magistral y conservarse para tener un registro permanente y una evaluación a largo plazo de la competencia del personal. Muestreo de las Puntas de los Dedos Enguantados t Inmediatamente después de que el preparador magistral completa el procedimiento de higiene de las manos y vestimenta, el evaluador debe recolectar una muestra de la punta de los dedos y pulgar enguantados de ambas manos del preparador en placas de agar apropiadas, presionando ligeramente el agar con cada dedo. t Las placas se deben incubar durante un período de incubación apropiado a la temperatura adecuada. t Todos los empleados deben completar exitosamente una evaluación inicial de competencia y un procedimiento de muestreo de las puntas de los dedos enguantados (cero ufc) no menos de tres veces antes de que se les permita comenzar a elaborar PME para uso humano. t Después de completar la evaluación inicial de competencia en el uso de vestimenta y guantes, se debe hacer una reevaluación de todo el personal de preparación magistral al menos anualmente para PME de nivel de riesgo bajo y mediano y semestralmente para PME de nivel de riesgo alto antes de permitírsele continuar elaborando PME. t Los guantes no se deben desinfectar con IPA estéril al 70% antes de la prueba. t Después de la toma de muestras, los guantes se deben desechar de inmediato y efectuar la higiene apropiada de las manos. Las placas con agar nutritivo se deben incubar como se estipula más adelante. t El nivel de acción de ufc para las manos enguantadas estará basado en la cantidad total de ufc en ambos guantes, no por cada mano. :j: Los resultados se deben informar por separado como la cantidad de ufc por empleado por mano (mano izquierda, mano derecha). Período de Incubación t Al final del período de muestreo designado, las placas de agar se recuperan, se aseguran las tapas, se invierten e incuban a una temperatura y por un tiempo que conduzca a la multiplicación de microorganismos. El agar tripticasa de soja (TSA) con lecitina y polisorbato 80 se debe incubar a 35º ± 2º por 2 a 3 días. Evaluación de la Competencia en Manipulación Aséptica t Todo el personal de preparación magistral deberá someterse a la evaluación de su competencia en técnicas asépticas y prácticas relacionadas, inicialmente durante el procedimiento de prueba de llenado de medios, así como en los subsiguientes procedimientos de prueba de llenado de medios anuales o semestrales, mediante el Formulario para Evaluación de Técnicas Asépticas y Prácticas relacionadas del Personal de Preparación Magistral. Procedimiento de Prueba de Llenado de Medios t La destreza del personal en la elaboración aséptica de PME se debe evaluar por medio de una verificación de llenado de medios líquidos de cultivo bacteriano estéril. t Los viales llenos de medio se deben incubar a 35º ± 2º durante un período de 14 días. Muestreo y Evaluación de Limpieza y Desinfección de Superficies t La toma de muestras de superficies se debe hacer en todas las áreas clasificadas ISO en forma periódica y por medio de placas de contacto y/o hisopos, al momento de terminar la preparación magistral. t Se deben definir los lugares donde se van a tomar muestras en un plano o formulario de muestreo. Evaluación de Competencia en Limpieza y Desinfección t Se debe inspeccionar visualmente al personal de preparación magistral y demás personal responsable de la limpieza durante el proceso de limpieza y desinfección, durante la capacitación inicial del personal en los procedimientos de limpieza, durante los cambios de personal de limpieza y al terminar cualquier Procedimiento de Prueba de Llenado de Medios. t La inspección visual debe documentarse en un Formulario para Evaluación de Procedimientos de Limpieza y Desinfección y conservarse para tener un registro permanente y una evaluación a largo plazo de la competencia del personal. Métodos de Recolección en la Superficie t Inmediatamente después de tomar la muestra de una superficie con la placa de contacto, el área muestreada se debe frotar cuidadosamente con un paño que no desprenda partículas, empapado en IPA estéril al 70%. :j: Los resultados se deben informar como ufc por unidad de área superficial. Niveles de Acción, Documentación y Evaluación de Datos
Pruebas Físicas/ (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles 717
USP 39
Appendlx l. Competencias Principales, Condiciones, Prácticas y Garantías de Calidad que se requieren (t "deben") y se recomiendan (:1: "debieran") en el Capítulo (797) de la USP (Continuación)
t t t t
Los datos de muestreo ambiental se deben recolectar y revisar en forma periódica como una manera de evaluar el control general del ambiente de preparación magistral. Si una actividad muestra sistemáticamente niveles elevados de crecimiento microbiano, se debe consultar el personal competente de microbiología. Se debe investigar la fuente de la contaminación. Cuando los resultados de la muestra de las puntas de los dedos enguantados exceden los niveles de acción después de la incubación apropiada, se debe efectuar y documentar una revisión de los procedimientos de higiene de las manos y uso de vestimenta, así como de los procedimientos de desinfección de guantes y superficies y las prácticas de trabajo.
:j: Cualquier recuento de ufc que exceda su respectivo nivel de acción debe dar lugar a una reevaluación de la idoneidad de las prácticas de trabajo del personal, los procedimientos de limpieza y operativos y la eficacia de la filtración de aire dentro de las instalaciones en las que se elaboran preparaciones magistrales asépticas. PROCEDIMIENTOS OPERATIVOS ESTÁNDAR SUGERIDOS
t
Todas las instalaciones deben contar con los mismos y los procedimientos deben incluir al menos los puntos enumerados en esta sección.
CONTROLES Y PRUEBAS DE LIBERACIÓN DE LAS PREPARACIONES TERMINADAS Inspección de Formas Farmacéuticas en Solución y Revisión de los Procedimientos de Preparación Magistral
t t
Revisar procedimientos y documentos para garantizar la esterilidad, pureza, identidades y cantidades de ingredientes correctas, y estabilidad. Inspeccionar visualmente para determinar que no tenga partículas y color anormales, y que los envases y sellos estén intactos.
Pruebas de Esterilidad
t PME de nivel de riesgo alto preparadas en lotes de más de 25 envases idénticos o expuestas por más de 12 horas entre 2º y 8º y 6 horas a más de 8º antes de ser esterilizadas. Prueba de Endotoxinas Bacterianas (Pirógenos)
t
PME de nivel de riesgo alto, excluyendo aquellas para administración oftálmica o inhalación, preparadas en lotes de más de 25 envases idénticos o expuestas por más de 12 horas entre 2º y 8º y 6 horas a más de 8º antes de ser esterilizadas.
Verificación de la Identidad y Concentración de los Ingredientes
t t
Procedimientos escritos para verificar la identidad, calidad, cantidad y pureza correctas de los ingredientes usados en PME. Procedimientos escritos para garantizar que las etiquetas de las PME contengan los nombres correctos y las cantidades o concentraciones de ingredientes, volúmenes totales, fechas límite de uso, condiciones de almacenamiento y vías de administración.
ALMACENAMIENTO Y FECHADO DE LÍMITE DE USO Determinación de la Fecha Límite de Uso
t
Usar los criterios generales del capítulo (795) de la USP en ausencia de ensayos directos indicadores de estabilidad o literatura autorizada que respalde la duración más prolongada.
MANTENIMIENTO DE LA ESTERILIDAD, PUREZA Y ESTABILIDAD DE LAS PME DISPENSADAS Y DISTRIBUIDAS.
t Procedimientos escritos para envasado, almacenamiento y condiciones de transporte apropiados para mantener la esterilidad, calidad, pureza y contenido de las PME. Redispensación de PME
t t
Cuando se pueden garantizar la esterilidad, pureza, contenido y calidad aceptables. La asignación de tiempos de almacenamiento en esterilidad y fechas límite de uso en estabilidad posteriores a las de las PME originalmente dispensadas debe basarse en resultados de pruebas de esterilidad y valoración cuantitativa de ingredientes.
Envase y Transporte de las PME
t t
El envase mantiene la integridad física, esterilidad, estabilidad y pureza de las PME. Modos de transporte que mantienen las temperaturas apropiadas y evitan daños a las PME.
CAPACITACIÓN DEL PACIENTE O PERSONA ENCARGADA DE SU CUIDADO
t
Programa formal de capacitación en múltiples componentes para garantizar que los pacientes y las personas encargadas de su cuidado entienden el almacenamiento, manipulación, uso y eliminación apropiados para las PME.
MONITOREO DEL PACIENTE E INFORME DE EVENTOS ADVERSOS
t Los procedimientos estándar escritos describen la manera en que los pacientes pueden preguntar e informar inquietudes y eventos adversos relacionados con PME y, en el caso de los supervisores de preparación magistral, la forma de corregir y prevenir futuros problemas.
:j: Los eventos adversos y los defectos de las PME se informan a los programas MedWatch de la FDA y a MEDMARX de la USP. GLOSARIO
t
Se definen veintiocho términos que forman parte integral del cumplimiento con el capítulo (797) de la USP.
718 (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles/ Pruebas Físicas
USP 39
Apéndice 11. Desinfectantes Comunes Usados en la Atención de Salud para Superficies Inanimadas ' 1cos y su Aet 1V Id ad MI ero bl ana y Prop1e 1 da d es 1 y DI spos1t1vos no Cr1t Categoría Química del Desinfectante
Alcohol lsopropílico
Peróxido de hidrógeno acelerado
Amonio Cuaternario (p.ej., cloruro de dodecll dimetll amonlo)
60-95%
0,5°/o 3
Bacterias
+
Virus lipofílicos
+
Concentraclón Usada
lnactivación Microbiana2
Propiedades Físicas & Químicas Importantes
Fenólicos
Cloro (p.ej., hipoclorito de sodio)
Yodóforos (p.ej., povidona-yodo)
0,4-1,60/o aq
0,41,6% aq
100-5000 oom
30-50 oom
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
± ±
±
+
+
+
± ± ±
Virus hidrofílicos
±
+
M.tuberculosis
+
+
Agentes micóticos (hongos)
+
+
+
+
+
Esporas Bacterianas
-
-
-
-
+
-
Vida útil > 1 semana
+
+
+
+
+
+
Efectos corrosivos o perjudiciales
±
-
-
-
±
±
Residuo no evaporable
-
-
+
+
-
+ +
lnactivado por materia orgánica
+
±
+
±
± -
+
Irritante cutáneo
+
+
+
±
Irritante ocular
+
-
+
+
+
+
Irritante respiratorio
-
-
-
-
+
-
Toxicidad sistémica
+
-
+
+
+
+
Clave para las abreviaturas y símbolos: aq
= diluido en agua; oom = partes por millón; + = sí; - = no; ± = resultados variables.
Modificado de World Health Organization, Laboratory Bio Safety Manual 1983 y Rutala WA, "Antisepsis, disinfection and sterilization in the hospital and related institutions," Manual of Clinical Microbiology, American Society for Microbiology, Washington, DC, 1995, páginas 227-245. 2 La inactivación de los microorganismos más comunes (es decir, bacterias) ocurre con un tiempo de contacto de o>l minuto; la inactivación de esporas requiere tiempos de contacto más prolongados (p.ej., 5 a 1O minutos para solución de cloro a 5000 ppm contra esporas de C. difficile). Referencia: Perez /, Springthorpe VS, Sattar SA, "Activity of selected oxidizing microbicides against the spores of Clostridium diffici/e: Relevance to environmental control", American /ournal of lnfection Control, August 2005, páginas 320-325. 3 El peróxido de hidrógeno acelerado pertenece a una nueva generación de germicidas basados en peróxido de hidrógeno en los cuales la potencia y el desempeño del ingrediente activo se ha mejorado y acelerado por medio del uso de ácidos y detergentes apropiados. 1
Apéndice 111. Formulario de Muestra para Evaluación de la Higiene de las Manos y Prácticas Relacionadas con la Vestimenta del Personal de Preparación Magistral Nombre en letras de imprenta y cargo o título de la persona evaluada: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ __ Nombre de la institución o instalación:
------------------
Higiene de las Manos y Prácticas de la Vestimenta: El evaluador calificado pondrá una marca de visto bueno en cada espacio en el que la persona evaluada ha completado aceptablemente la actividad descrita, anotará N/A si la actividad no es aplicable a la sesión de evaluación o N/O si la actividad no se observó.•
Se presenta aseado y con ropa limpia apropiada. No usa cosméticos ni joyas (reloj, anillos, aretes, etc., incluidos pirsins) al entrar en las antesalas. No lleva ni conserva alimentos o bebidas en las antesalas o zonas amortiguadoras. Está consciente de la línea de demarcación que separa los lados limpios y sucios y observa las actividades requeridas. Se pone el cubrecalzado o los zapatos destinados al área limpia, uno a la vez, colocando el pie cubierto o calzado en el lado limpio de la línea de demarcación, según sea apropiado. Utiliza mascarillas para cubrir la barba, de ser necesario. Usa gorra y se asegura de que todo el cabello esté cubierto. Se pone máscara para cubrir el puente de la nariz e incluir la barbilla. Efectúa el procedimiento de higiene de manos humedeciendo las manos y antebrazos y lavándolos con agua tibia y jabón durante 30 segundos por lo menos. Se seca las manos y los antebrazos con una toalla que no suelte pelusa o con un secador de manos.
Pruebas Físicas/ (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles 719
USP 39
Apéndice 111. Formulario de Muestra para Evaluación de la Higiene de las Manos y Prácticas Relacionadas con la Vestimenta del Personal de Preparación Magistral (Continuación) Selecciona la bata de talla apropiada y revisa que no tenga agujeros, rasgones u otros defectos. Se pone la bata y se asegura de que esté bien cerrada. Se desinfecta las manos de nuevo con un exfoliante quirúrgico a base de alcohol, sin agua, y con actividad persistente, y las deja secar completamente antes de ponerse los guantes estériles. Calza guantes estériles del tamaño apropiado, asegurándose que queden bien ajustados y no sobre material del guante en las puntas de los dedos. Examina los guantes, verificando que no tengan defectos, agujeros o rasgones. Mientras desempeña actividades de preparación magistral estéril, desinfecta periódicamente los guantes con IPA estéril al 70% antes de trabajar en el área directa de preparación magistral (ADP) y después de tocar artículos o superficies que podrían contaminar los guantes. Se quita el EPP en el lado limpio de la antesala. Se quita los guantes y se higieniza las manos. Se quita la bata y la descarta o la cuelga en un gancho si la va a reutilizar el mismo día de trabajo. Se quita y descarta la máscara, gorra y mascarilla que protege la barba (si la usa). Se quita el cubrecalzado o los zapatos, uno a la vez, asegurándose de colocar el pie descubierto en el lado sucio de la línea de demarcación y se higieniza las manos nuevamente. (Se quita y desecha los cubrecalzado todas las veces que sale del área de preparación magistral). *Se informa de inmediato a la persona evaluada todas las actividades inaceptables (es decir, los espacios donde falta el visto bueno, N/A o N/O) y se le muestran e informan las correcciones específicas.
Firma de la Persona Evaluada
Nombre en letra de imprenta
Fecha
Firma del Evaluador Calificado
Nombre en letra de imprenta
Fecha
Apéndice IV. Formularlo de Muestra para Evaluación de las Técnicas Asépticas y Prácticas Relacionadas del Personal de Preparación Magistral Nombre en letras de imprenta y cargo o título de la persona evaluada: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ __ Nombre de la institución o instalación:
-----------------
Técnica Aséptica, Seguridad y Prácticas de Garantía de Calidad: El evaluador calificado pondrá una marca de visto bueno en cada espacio en el que la persona evaluada ha completado aceptablemente la actividad descrita, anotará N/A si la actividad no es aplicable a la sesión de evaluación o N/O si la actividad no se observó.* _ _ _ _ _ Completa el Formulario de Evaluación de Competencia en Higiene de Manos y Procedimientos de Vestimenta. Efectúa los procedimientos apropiados de higiene de manos, vestimenta y enguantado de acuerdo con los POE. Desinfecta las superficies de los dispositivos ISO Clase 5 con un agente apropiado. Desinfecta los componentes/viales con un agente apropiado antes de colocarlos en áreas de trabajo ISO Clase 5. Introduce sólo los materiales esenciales en un orden apropiado en el área de trabajo ISO Clase 5. No interrumpe, obstaculiza o desvía el flujo de primer aire a los sitios críticos. Se asegura de que las jeringas, agujas y tubos permanezcan en su empaque individual y sólo se abran en un área de trabajo ISO Clase 5. Efectúa las manipulaciones sólo en el ADP apropiada del dispositivo ISO Clase 5. No expone los sitios críticos a contaminación por contacto o aire de calidad infeior a ISO Clase 5. Desinfecta los tapones, los puertos de inyección y los cuellos de las ampollas, frotándolos con IPA estéril al 70% y los deja secar durante el tiempo suficiente. Fija las agujas a las jeringas sin contaminación por contacto. Perfora los tapones de viales y conecta los puertos de infusión sin contaminación por contacto. Etiqueta las preparaciones correctamente. Desinfecta los guantes estériles en forma periódica, frotándolos con IPA estéril al 70% durante manipulaciones de preparación magistral prolongadas. Limpia, gradúa y calibra el dispositivo automatizado de preparación magistral (p.ej., "preparador magistral de NPT") de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Desecha los elementos cortantes y desperdicios de acuerdo con las políticas institucionales o las guías reconocidas.
USP 39
720 (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles / Pruebas Físicas
Apéndice IV. Formularlo de Muestra para Evaluación de las Técnicas Asépticas y Prácticas Relacionadas del Personal de Preparación Magistral (Continuación) *Se informa de inmediato a la persona evaluada todas las actividades inaceptables (es decir, los espacios donde falta el visto bueno, N/A o N/0) y se le muestran e informan las correcciones específicas. Firma de la Persona Evaluada
Nombre en letra de imprenta
Fecha
Firma del Evaluador Calificado
Nombre en letra de imprenta
Fecha
Apéndice V. Formularlo de Muestra para Evaluación de Procedimientos de Limpieza y Desinfección Nombre en letras de imprenta y cargo o título de la persona evaluada: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ __ Nombre de la institución o instalación: Prácticas de Limpieza y Desinfección: El evaluador calificado pondrá una marca de visto bueno en cada espacio en el que la persona evaluada ha completado aceptablemente la actividad descrita, anotará N/A si la actividad no es aplicable a la sesión de evaluación o N/O si la actividad no se observó.* Tareas Diarias: Prepara la concentración correcta de solución desinfectante de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Usa un envase apropiadamente etiquetado para el tipo de superficie que va a limpiar (piso, pared, tolvas de producción, etc.). Documenta la preparación de solución desinfectante. Sigue los procedimientos de vestimenta cuando efectúa cualquier actividad de limpieza. Al comienzo de cada turno, limpia todos los dispositivos ISO Clase 5 antes de la preparación magistral, en el siguiente orden: paredes, barra IV, preparadores magistrales automatizados y superficies de trabajo. Utiliza un paño que no suelte pelusa, empapado en IPA estéril al 70% u otra solución desinfectante aprobada y deja secar por completo. Al final de cada turno, retira todos los componentes del preparador y limpia todas las áreas ISO Clase 5 como se especificó anteriormente. Limpia todos los mostradores y superficies de trabajo fácilmente limpiables. Friega pisos, usando los trapeadores etiquetados como "pisos", comenzando en la pared opuesta a la puerta de entrada del cuarto, con movimientos uniformes del trapeador, hacia el operador. Mueve los carros según sea necesario para limpiar toda la superficie del piso. El uso de un sistema de limpieza de microfibra es una alternativa aceptable a los trapeadores. En la antesala, limpia los lavabos y todas las superficies de contacto; limpia el piso con una solución desinfectante o usa un sistema de limpieza de microfibra. Tareas Mensuales: Efectúa la limpieza mensual en un día designado. Prepara una solución desinfectante según se especificó en las tareas diarias, que es apropiada para las superficies que se van a limpiar. Limpia el cielo raso de las zonas amortiguadoras y las antesalas, las paredes y los estantes de almacenamiento con una solución desinfectante y un trapeador o un sistema de limpieza de microfibra. Una vez que el área ISO Clase 5 está limpia, limpia el cielo raso del cuarto de preparación magistral, seguido de las paredes y por último el piso. Usa los trapeadores o el sistema de limpieza de microfibra debidamente etiquetados. Limpia todas las cajas y los estantes de almacenamiento de la zona amortiguadora, retirando el contenido y, usando un paño que no suelte pelusa, empapado en detergente germicida, limpia las superficies internas de la caja y luego toda la superficie externa. Deja secar las cajas. Antes de volver a poner el contenido dentro de las mismas, las frota con IPA estéril al 70% para quitar el residuo de desinfectante. Usa paños nuevos de ser necesario. Limpia todos los carros de la zona amortiguadora, retirando el contenido y usando paños que no suelten pelusa empapados en detergente germicida, limpia todos los carros, comenzando desde el estante superior y la parte superior de la barra, avanzando hacia abajo, hasta las ruedas. Limpia la parte de abajo de los estantes de la misma manera. Usa un paño nuevo para cada carro. Deja secar. Frota los carros con un paño que no suelte pelusa, empapado en IPA estéril al 70% para quitar cualquier residuo de desinfectante. Usa paños nuevos de ser necesario. Limpia las sillas de la zona amortiguadora, el interior y exterior de los recipientes de basura, usando un paño que no suelte pelusa, empapado en solución desinfectante. Documenta todas las actividades de limpieza anotando quién las efectuó, con fecha y hora. *La persona evaluada es informada de inmediato de todas las actividades inaceptables (es decir, los espacios donde falta el visto bueno, N/A o N/O) y se le muestran e informan las correcciones específicas.
USP 39
Pruebas Físicas/ (801) Polarografía 721
Apéndice V. Formulario de Muestra para Evaluación de Procedimientos de Limpieza y Desinfección (Continuación) Firma de la Persona Evaluada
Nombre en letras de imprenta
Fecha
Firma del Evaluador Calificado
Nombre en letra de imprenta
Fecha
(801) POLAROGRAFÍA La polarografía es un método de análisis electroquímico basado en la medición del flujo de corriente resultante de la electrólisis de una solución en un microelectrodo polarizable, en función de un voltaje aplicado. El polarograma (ver Figura 7) obtenido por esta medición proporciona información cualitativa y cuantitativa de sustancias electro-reducibles y electro-oxidables. El intervalo normal de concentraciones para las sustancias que se analizan es de 10-2 molar a 1 molar. En la polarografía de corriente directa (cd), el microelectrodo es un electrodo de goteo de mercurio (EGM) que consiste en pequeñas gotas de mercurio reproducibles que fluyen del orificio de un tubo capilar conectado a un reservorio de mercurio. El electrodo de referencia más comúnmente empleado es un electrodo de calomel saturado (ECS) que posea una superficie extensa. El voltaje aplicado a la celda se aumenta gradualmente y sólo fluye una corriente residual muy pequeña hasta que la sustancia que se valora experimenta reducción u oxidación. Al principio la corriente aumenta gradualmente, luego lo hace de manera casi lineal con el voltaje y gradualmente alcanza un valor límite, como se muestra en la Figura 7.
o-s
-- --
VOLTAJE APLICADO
Fig. 1. Polarograma típico que muestra el cambio en el flujo de corriente en función del aumento del potencial aplicado al electrodo de goteo de mercurio. En la porción ascendente inicial de la onda polarográfica, el aumento del flujo de corriente provoca una disminución en la concentración de las especies electroactivas en la superficie del electrodo. A medida que aumentan el voltaje y la corriente, la concentración de las especies reactivas disminuye aún más hasta alcanzar un valor mínimo en la superficie del electrodo. La corriente queda limitada entonces por la velocidad de difusión de las especies reaccionantes desde el seno de la solución hasta la superficie del microelectrodo. El incremento final de la corriente es provocado por la reacción del electrólito soporte. Esta gran concentración de electrólito es inerte dentro del intervalo de potencial utilizado para el análisis e impide que las especies reactivas alcancen el electrodo por migración eléctrica. De este modo, se asegura que la corriente limitante esté controlada por la difusión.
722 (801) Polarografía / Pruebas Físicas
USP
39
Dado que, en el caso del EGM, la superficie del electrodo se renueva constantemente en forma cíclica, la corriente aumenta desde un valor pequeño, cuando la gota comienza a formarse, hasta alcanzar un valor máximo cuando la gota cae. Mediante el empleo de un registrador apropiado para medir la corriente, se obtiene el registro característico con perfil dentado. La corriente limitante es la suma de las corrientes residual y de difusión. La corriente residual se resta de la corriente limitante para obtener la altura de la onda. Ecuación de llkovic-La relación lineal entre la corriente de difusión (id) y la concentración de especies electro-activas se muestra por la ecuación de llkovic: id
= 708nD112cm2J3t1i6
en la cual id es la corriente máxima en microamperios; n es el número de electrones requeridos por molécula de sustancia electro-activa; D es el coeficiente de difusión, en centímetros cuadrados por segundo; C es la concentración, en milimoles por L; m es la velocidad de flujo de mercurio del EGM, en mg por segundo; y t es el tiempo de caída de la gota, en segundos. Los polarógrafos modernos están equipados con registradores capaces de determinar la corriente hasta la última porción de la vida de la gota; en consecuencia, registran la máxima fluctuación de corriente. Cuando la corriente se mide sólo al final de la vida de la gota, la técnica se denomina polarografía cd por muestreo. En este caso, sólo se registran los máximos de corriente y no se observan las oscilaciones debidas al crecimiento de la gota. Para instrumentos equipados con galvanómetros para medir la corriente, o en el caso de los registradores operados en modalidad de curva suavizada, las ondas dentadas son oscilaciones alrededor de la corriente promedio. En el último caso, la medida de la corriente es el promedio de las oscilaciones. Para los polarogramas obtenidos de esta manera, la id dada por la ecuación de llkovic es la corriente promedio en microamperios observada durante la vida de la gota en lugar de la corriente máxima, y entonces el coeficiente 708 se reemplaza por 607. Control de la Corriente de Difusión-La ecuación de llkovic identifica las variables que deben ser controladas para asegurar que la corriente de difusión sea directamente proporcional a la concentración de material electro-activo. A 25º los coeficientes de difusión para soluciones acuosas de muchos iones y moléculas orgánicas aumentan 1o/o a 2% por grado de aumento en la temperatura. Por lo tanto, la temperatura de la celda polarográfica debe controlarse en un margen de± 0,5º. Las cantidades m y t dependen de las dimensiones del capilar y de la altura de la columna de mercurio por encima del electrodo. Si bien es posible comparar resultados obtenidos con capilares diferentes si se conoce el producto m2i3t1i6, es recomendable utilizar el mismo capilar con una altura de mercurio constante durante una serie de análisis. La corriente de difusión es proporcional a la raíz cuadrada de la altura de la columna de mercurio. Un reservorio de mercurio con un diámetro de más de 4 cm previene una disminución significativa del nivel de mercurio durante una serie de determinaciones. El capilar para el EGM tiene un orificio de aproximadamente 0,04 mm y una longitud de 6 cm a 15 cm. La altura de la columna de mercurio, medida desde el extremo del capilar hasta la parte superior del depósito de mercurio, oscila entre 40 cm y 80 cm. La longitud exacta del capilar y la altura de la columna de mercurio se ajustan de modo que el tiempo de caída esté entre 3 y 5 segundos con el circuito abierto y con el capilar inmerso en la solución de prueba. Se encuentran disponibles equipos que permiten controlar los tiempos de goteo desde fracciones de segundo hasta varios segundos. Como el detalle dentro de un polarograma se relaciona con el número de gotas proporcionadas durante un cambio de potencial dado, los tiempos cortos de goteo permiten un registro más rápido del polarograma. La corriente que fluye a través de la solución de prueba durante el registro de un polarograma está en el orden de los microamperios. Por lo tanto, el flujo de corriente produce cambios inapreciables en la solución de prueba y es posible realizar varios polarogramas con la misma solución de prueba sin obtener diferencias significativas. Potencial de Media Onda-El potencial de media onda (E 112) tiene lugar, en el polarograma, al punto medio de la distancia entre la corriente residual y la meseta de la corriente limitante. Este potencial es característico de las especies electro-activas y, por lo general, es independiente de su concentración o del capilar empleado para obtener la onda. Depende de la composición de la solución y puede cambiar con variaciones en el pH o en el sistema de disolventes, o con la adición de agentes formadores de complejos. El potencial de media-onda, por lo tanto, sirve como criterio para la identificación cualitativa de una sustancia. El potencial del EGM es igual al voltaje aplicado frente al electrodo de referencia después de la corrección para la caída iR (el potencial necesario para pasar la corriente, i, a través de la solución con una resistencia R). Resulta especialmente importante hacer esta corrección para soluciones no acuosas, las cuales suelen poseer alta resistencia, si se necesita un potencial exacto para el EGM. No se necesita la corrección del potencial de media-onda para el análisis cuantitativo. A menos que se indique de otro modo, se entiende que los potenciales representan mediciones realizadas frente al ECS. Eliminación del Oxígeno Disuelto-Puesto que el oxígeno se reduce en el EGM en dos pasos, primero a peróxido de hidrógeno y después a agua, interfiere cuando los polarogramas deben realizarse a potenciales más negativos que aproximadamente O voltio en función de ECS, y por lo tanto debe ser eliminado. Esto puede realizarse introduciendo burbujas de nitrógeno libre de oxígeno a través de la solución durante 1O a 15 minutos inmediatamente antes de registrar la onda; el nitrógeno primero debe pasarse a través de una porción separada de la solución para "acondicionarlo" y de este modo reducir al mínimo los cambios debidos a la evaporación. Es necesario que la solución esté en reposo y libre de vibraciones durante el tiempo en que se registra la onda, a fin de asegurar que la corriente dependa solamente de la difusión. Por lo tanto, el burbujeo con nitrógeno debe detenerse y el gas se debe dirigir para que fluya sobre la superficie de la solución antes de registrar un polarograma.
USP 39
Pruebas Físicas / (801) Polarografía 723
En medios alcalinos, se puede agregar bisulfito de sodio para eliminar el oxígeno, siempre que el reactivo no reaccione con otros componentes del sistema. Medición de la Altura de la Onda-Para usar un polarograma cuantitativamente, es necesario medir la altura de la onda. Como ésta es una medida de la magnitud de la corriente de difusión, se mide verticalmente. Para compensar la corriente residual, el segmento de la curva que precede al aumento de la onda se extrapola más allá del ascenso en la onda. Para una onda bien formada donde esta extrapolación es paralela a la meseta de la corriente limitante, la medición no es ambigua. Para ondas no muy bien definidas, puede utilizarse el siguiente procedimiento a menos que se especifique algo difrente en la monografía individual. Se extrapolan con líneas rectas tanto la corriente residual como la corriente limitante, tal como se muestra en el gráfico (Figura 7). La altura de la onda se toma como la distancia vertical entre las líneas extrapoladas medida a nivel del potencial de media onda. Procedimiento-[ Precaución-El vapor de mercurio es tóxico y el mercurio metálico tiene una presión de vapor significativa a temperatura ambiente. El lugar de trabajo donde se utiliza mercurio debe construirse de modo que cualquier salpicadura o gota de mercurio derramada pueda recuperarse completamente con relativa facilidad. Limpiar meticulosamente los derrames de mercurio después de cada uso del instrumento. Trabajar en un laboratorio bien ventilado, teniendo cuidado de limpiar cualquier derrame de mercurio.] Transferir una porción de la dilución final de la sustancia valorada a una celda polarográfica apropiada inmersa en un
baño de agua regulado a 25 ± 0,5º. Pasar una corriente de nitrógeno a través de la solución durante 1O a 15 minutos para eliminar el oxígeno disuelto. Comenzar el goteo de mercurio desde el capilar, insertar el capilar en la solución de prueba y ajustar la altura del reservorio de mercurio. Modificar el flujo de nitrógeno de modo que pase sobre la superficie de la solución y registrar el polarograma en el intervalo de potencial indicado en la monografía individual, empleando un registrador o galvanómetro de sensibilidad adecuada para obtener una onda apropiada. Medir la altura de la onda y, a menos que se indique de otro modo en la monografía, compararla con la altura de la onda obtenida con el Estándar de Referencia USP apropiado, medida bajo las mismas condiciones. Polarografía de Pulsos-En la polarografía de cd convencional, la corriente se mide continuamente mientras se aplica un potencial como una rampa lineal (ver Figura 2).
imedlda continuamente
TIEMPO
Fig. 2. Polarografía de Corriente Directa (cd). Esta corriente se compone de dos elementos. El primero, la corriente de difusión (faradaica), que se produce por la sustancia que experimenta la reducción u oxidación en el electrodo de trabajo y es directamente proporcional a la concentración de esta sustancia. El segundo elemento es la corriente capacitativa (relacionada con la carga de la doble capa electroquímica). Ambas corrientes cambian a medida que varía el tamaño de la gota de mercurio. Estos cambios producen las oscilaciones presentes en los típicos polarogramas de cd. En la polarografía de pulso normal, se aplica un pulso de potencial al electrodo de mercurio cerca del final de la vida de la gota, manteniendo el potencial inicial durante el período de crecimiento de la gota (ver Figura 3).
imedida
~ !-TIEMPO DE GOTEO+ TIEMPO DE GOTEO+ TIEMPO DE GOTEO-j
Fig. 3. Polarografía de pulso.
724 (801) Polarografía / Pruebas Físicas
USP 39
A cada gota siguiente se le aplica un pulso ligeramente mayor, con una constante de incremento determinada por la velocidad de barrido seleccionada. La corriente se mide al final del pulso cuando la corriente capacitativa es cercana a cero y, por lo tanto, se mide principalmente la corriente faradaica (ver Figura 4). PULSO
---------t
w
!zw
ce
a:
8
TIEMPO
•
l medida
1 1
Fig. 4 Gráfico de corriente en función del tiempo en polarografía de pulso. Además, como el pulso que se aplica es de corta duración, la capa de difusión no se agota tanto como en la polarografía de cd, y se obtienen niveles de corriente más elevados para concentraciones equivalentes. Se pueden medir concentraciones de tan sólo 1 Q-6 M, lo que permite una sensibilidad aproximadamente 1 O veces mayor que la polarografía de cd. Los valores de la corriente limitante se miden más fácilmente, dado que las ondas están libres de oscilaciones. La polarografía de pulso diferencial es una técnica mediante la cual se aplica un pulso de altura fija al final de la vida de cada gota, superpuesta a una corriente directa aumentada linealmente (ver Figura 5).
f.--nEMPO DE GOTEO
--1-- TIEMPO DE GOTEO---!
Fig. 5. Polarografía de pulso diferencial. El flujo de corriente se mide justo antes de la aplicación del pulso y nuevamente al final del pulso. La diferencia entre estas dos corrientes se mide y se representa en el registrador. Dicha señal diferencial proporciona una curva que se aproxima a la derivada de la onda polarográfica y presenta un pico. El potencial del pico es equivalente a: E112 -AE/2 en donde AE es la altura del pulso. La altura del pico es directamente proporcional a la concentración a velocidades de barrido constantes y a alturas de pulso constantes. Esta técnica es especialmente sensible (pueden determinarse concentraciones de 10-7M) y proporciona mejor resolución entre ondas poco espaciadas. Voltamperometría de Redisolución Anódica-La voltamperometría de redisolución anódica es una técnica electroquímica por la cual se concentran (reducen) vestigios de sustancias en solución sobre un electrodo y luego se redisuelven (oxidan) en la
Pruebas Físicas/ (811) Finura de Polvos 725
USP 39
solución barriendo anódicamente el voltaje aplicado. La medición del flujo de corriente como una función de este voltaje y la velocidad de barrido proporcionan información cualitativa y cuantitativa sobre dichas sustancias. El paso de concentración permite realizar análisis a concentraciones de 10-7M a 10-9 M. El instrumental básico incluye un generador de rampa de voltaje, un conjunto de circuitos para medición de corriente, una celda con electrodos de trabajo, electrodos de referencia y contraelectrodos, y un registrador u otro dispositivo de lectura. Los instrumentos que tienen capacidades polarográficas de cd o de pulso generalmente son muy adecuados para aplicación en redisolución. El electrodo de trabajo comúnmente utilizado es el electrodo de gota de mercurio colgante (EGMC), si bien el electrodo de capa fina de mercurio (ECFM) ha sido aceptado. Para el análisis de metales como por ejemplo plata, platino y oro, cuyos potenciales de oxidación son más positivos que los del mercurio, y del mercurio mismo, se requiere el uso de electrodos sólidos como por ejemplo platino, oro y carbón. Un electrodo de calomel saturado o un electrodo de plata-cloruro de plata sirve como electrodo de referencia excepto para el análisis de mercurio o de plata. Como contraelectrodo se suele utilizar un alambre de platino. Las muestras que contienen el electrólito adecuado se colocan con pipeta en la celda. El oxígeno disuelto se elimina haciendo burbujear nitrógeno en la celda durante 5 a 1 O minutos. En general, se aplica un potencial de electrólisis equivalente a 200 a 300 mV más negativo que el potencial de media onda del material que se debe analizar (aunque este potencial se debe determinar experimentalmente), con agitación durante 1 a 1 O minutos. Para obtener resultados reproducibles, hay que mantener condiciones constantes (a saber, tiempo de deposición, velocidad de agitación, temperatura, volumen de la muestra y tamaño de la gota, si se utiliza EGMC). Después de la deposición, la agitación se suspende y la solución y el electrodo se dejan equilibrar durante un breve período. El potencial luego se barre anódicamente con rapidez (1 O mV/segundo o más en polarografía de cd y 5 mV/segundo en polarografía de pulso diferencial). Al igual que en la polarografía, la corriente limitante es proporcional a la concentración de las especies (altura de la onda en cd y pulso, altura del pico en pulso diferencial), mientras que el potencial de media onda (cd, pulso) o el potencial de pico (pulso diferencial) identifica la especie. Para obtener un desempeño satisfactorio, es fundamental elegir cuidadosamente el electrólito de soporte. Por lo general, la cuantificación se logra por el método de adición del estándar o por calibración. Esta técnica es apropiada para el análisis de vestigios de metales pero tiene un uso limitado en las determinaciones orgánicas, dado que muchas de estas reacciones son irreversibles. Al analizar sustancias tales como el cloruro, se puede emplear voltamperometría de redisolución catódica. La técnica es la misma que la voltamperometría de redisolución anódica, excepto en que la sustancia se deposita anódicamente y luego se redisuelve mediante un barrido de voltaje catódico.
(811) FINURA DE POLVOS La distribución del tamaño de partícula se debe calcular mediante Estimación de la Distribución del Tamaño de Partícula por Tamizado Analítico (786) o aplicando otros métodos, cuando resulte conveniente. En este capítulo, se proporciona una clasificación de finura de polvos, en términos descriptivos y sencillos. La medida de la finura de los polvos se realiza, por motivos prácticos, mediante tamices. El tamizado es el método más adecuado si la mayoría de las partículas superan aproximadamente los 75 µm, aunque también se puede usar para algunos polvos cuyos tamaños de partícula son inferiores, cuando el método se pueda validar. La difracción de luz es otra técnica que también se utiliza ampliamente para medir el tamaño de una gran variedad de partículas.
CLASIFICACIÓN DE FINURA DE POLVOS Cuando la distribución acumulativa se determina mediante tamizado analítico u otros métodos, la finura de los polvos se puede clasificar de la siguiente manera: x90 = dimensión de partícula correspondiente al 90% de la distribución acumulativa de partículas de tamaño inferior al esperado x50 = mediana de la dimensión de partícula (es decir, 50% de las partículas son de menor tamaño y 50% de las partículas son de mayor tamaño) x10 = dimensión de partícula correspondiente al 10% de la distribución acumulativa de partículas de tamaño inferior al esperado Se reconoce que el símbolo d también se utiliza ampliamente para designar estos valores. Por tanto, se pueden emplear los símbolos d90, d5 oy dio· Los siguientes parámetros se pueden definir basándose en la distribución acumulativa. QR(x) = distribución acumulativa de partículas con una dimensión menor o igual a x, donde el subíndice R representa el tipo de distribución. R
Tipo de Distribución
o
Número
1
Longitud
726 (811) Finura de Polvos / Pruebas Físicas
USP 39
R
Tipo de Distribución
2
Área
3
Volumen
Por consiguiente, por definición: 1. QR(x) = 0,90 cuando x = X90 2. QR(x) = 0,50 cuando x = x50 3. QR(x) = 0, 1 O cuando x = x 10 La tabla que figura a continuación presenta un método alternativo, aunque menos informativo, para clasificar la finura de los polvos. Clasificación de los Polvos según su Finura Término Descriptivo Grueso
Distribución Acumulativa Basada en Volumen, Ql(x)
X,n (µm) >355
Q,(355) <0,50
Moderadamente Fino
180-355
Q,(180) <0,50 y Q,(355) 20,50
Fino
125-180
Q,(125) <0,50 y Q,(180) 20,50
,,;125
Qil 25) 20,50
Muy Fino
(821) RADIOACTIVIDAD Los productos farmacéuticos radioactivos requieren técnicas especializadas para su manejo y análisis para poder obtener resultados correctos y reducir al mínimo los riesgos para el personal. Todas las operaciones deben ser llevadas a cabo o supervisadas por personal capacitado en el manejo de materiales radioactivos. Por lo general, las instalaciones para la producción, uso y almacenamiento de productos farmacéuticos radioactivos están sujetas a la obtención de una licencia que otorga la Comisión de Reglamentación Nuclear Federal (Nuclear Regulatory Commission), aunque en ciertos casos esta atribución ha sido delegada a agencias estatales. El Departamento de Transporte, en el orden federal, reglamenta las condiciones del transporte de materiales radioactivos. Las agencias estatales y locales suelen aplicar reglamentaciones especiales adicionales. Todos los fabricantes o usuarios deben conocer exhaustivamente las reglamentaciones federales aplicables de la Ley sobre Alimentos, Medicamentos y Cosméticos (Food, Drug, and Cosmetic Act), así como los requisitos adicionales del Servicio de Salud Pública de los Estados Unidos (U. S. Public Health Service) y de los organismos estatales y locales relativos a los artículos en cuestión. En este capítulo se establecen definiciones, consideraciones especiales y procedimientos relativos a las monografías de la Farmacopea sobre medicamentos radioactivos. Cambio en lo redacción:
CONSIDERACIONES GENERALES Ley Fundamental de Desintegración La velocidad de desintegración de una fuente radioactiva se describe por la ecuación:
en donde N1 es el número de átomos de la sustancia radioactiva en el tiempo transcurrido t, N0 es el número de átomos cuando t = O y le es la constante de transformación o desintegración, la cual tiene un valor característico para cada radionucleido. La vida media, T112, es el tiempo requerido para que una actividad dada de un radionucleido alcance la mitad de su valor inicial y está relacionada con la constante de desintegración por la ecuación: T112 = 0,69315/'A La actividad de una fuente radioactiva (A) está relacionada con el número de átomos radioactivos presentes, por la ecuación: A='AN a partir de la cual puede calcularse el número de átomos radioactivos en el tiempo t y, por lo tanto, puede determinarse la masa del material radioactivo.
Pruebas Físicas/ (821 > Radioactividad 727
USP 39
La actividad de una sustancia radioactiva pura en función del tiempo puede obtenerse a partir de la ecuación exponencial o de tablas de desintegración, o bien por medio de gráficas basadas en la vida media (ver Gráfica Normalizada de Desintegración, Figura 7).
VIDA MEDIA
Figura 1. Gráfica Normalizada de Desintegración. La actividad de un material radioactivo se expresa como el número de transformaciones nucleares por unidad de tiempo. La unidad fundamental de radioactividad, el curio (Ci), se define como 3,700 x 1010 transformaciones nucleares por segundo. El milicurio (mCi) y el microcurio (µCi) son subunidades de uso común. El "número de transformaciones nucleares por unidad de tiempo" es la suma de las velocidades de desintegración de todos los modos de desintegración concurrentes del nucleido de origen. Antes de que la actividad de cualquier radionucleido en una muestra medida pueda expresarse en curios, suele ser necesario conocer las abundancias de las radiaciones emitidas y medidas.
Geometría La validez de la calibración y medición relativas de radionucleidos depende de la reproducibilidad de la relación de la fuente con el detector y su entorno. Debe tenerse en cuenta la configuración de la fuente.
Radiación de Fondo Los rayos cósmicos, la radioactividad presente en el detector y en los materiales de protección y la radiación proveniente de fuentes radioactivas que no cuentan con un blindaje adecuado y que están en las inmediaciones del equipo de medición son factores que contribuyen al conteo de la radiación de fondo. Todas las mediciones de radioactividad deben corregirse restando el conteo de radiación de fondo del conteo bruto de la muestra de prueba.
Estadísticas de Conteo Dado que el proceso de desintegración radioactiva es un fenómeno aleatorio, los eventos a contar también forman una secuencia aleatoria en función del tiempo. Por esta razón, el conteo durante un tiempo definido sólo permite obtener una estimación del conteo real. La precisión de esta estimación, sujeta a fluctuaciones estadísticas, depende del número de cuentas acumuladas en una medición dada y puede expresarse en función de la desviación estándar cr. Una estimación de cr es
m en donde n es el número de conteos acumulados en una medición dada. La probabilidad de que una sola medición se encuentre dentro de
USP 39
728 (821) Radioactividad / Pruebas Físicas
±1001-Vn% con respecto a la media de una serie de mediciones es 0,68. Es decir, si se realizara una serie de mediciones de un número n de conteos cada una, aproximadamente dos tercios de las observaciones se encontrarían dentro de ±1001-Vn% de la media y el resto quedaría fuera. Debido a la naturaleza estadística de la desintegración radioactiva, el conteo repetido de una fuente no alterada en un dispositivo para conteo produce valores de conteo que se ajustan a la frecuencia de una distribución normal. Las desviaciones de estos valores respecto de la distribución normal responden a la prueba de xi. Por este motivo, suele aplicarse la prueba de xi para determinar el rendimiento y correcto funcionamiento de un dispositivo para conteo. En la selección de instrumentos y condiciones para la valoración de fuentes radioactivas, debe maximizarse la cifra del valor ei/B (en donde e= eficiencia del contador = velocidad observada de conteo/velocidad de desintegración de la muestra y B = velocidad de conteo de radiación de fondo).
Pérdidas en el Conteo El tiempo mínimo requerido para que el contador resuelva dos pulsos de señal consecutivos se denomina tiempo muerto. Por lo general, el tiempo muerto varía entre unos microsegundos, en el caso de contadores proporcionales y de centelleo, hasta cientos de microsegundos, en el caso de contadores de Geiger-Müller. Los eventos nucleares producidos durante el tiempo muerto del contador no se registrarán. Para obtener la velocidad de conteo corregida, R, a partir de la velocidad de conteo observada, r, es necesario emplear la fórmula:
R = r/(l - r,) en donde -r es el tiempo muerto. La fórmula de corrección anterior supone un tiempo muerto no prolongable. Por lo tanto, para la validez general, el valor de r, no debe exceder de O, 1. La velocidad de conteo observada, r, se refiere a la velocidad de conteo bruto de la muestra y no se debe corregir por la radiación de fondo antes de su uso en la ecuación anterior.
Estándares de Calibración Realizar todas las valoraciones de radioactividad empleando sistemas de medición calibrados con estándares de radioactividad debidamente certificados. Estos estándares de calibración pueden adquirirse directamente del Instituto Nacional de Normas y Tecnología (NIST, por sus siglas en inglés) o de otras fuentes con valores rastreables al Instituto Nacional de Normas y Tecnología mediante su participación en un programa de mediciones intercomparadas. En aquellos casos en que estos estándares de calibración no se encuentren disponibles, la Farmacopea proporciona los datos de desintegración nuclear requeridos para la calibración. Estos datos, así como los valores de vida media, se obtienen del Archivo de Datos sobre Estructura Nuclear Evaluada del Proyecto de Datos Nucleares de Oak Ridge (Evaluated Nuclear Structure Data File of the Oak Ridge Nuclear Data Project) y reflejan los últimos valores disponibles a la fecha de publicación.
Transportador La masa total de átomos o moléculas radioactivas en una fuente radioáctiva dada es directamente proporcional a la actividad del radionucleido para una vida media dada y, por lo general, la cantidad presente en los preparados radiofarmacéuticos es demasiado pequeña para ser medida por métodos químicos o físicos comunes. Por ejemplo, la masa de 131 1 con una actividad de 100 mCi es 8 x 10-7 g. Como cantidades tan pequeñas de material se comportan químicamente de manera anómala, se pueden agregar isótopos no radioactivos del mismo radionucleido para actuar como transportadores durante el procesamiento para facilitar su manipulación. En muchos casos, la adsorción puede impedirse simplemente aumentando la concentración de iones hidrógeno en la solución. Sin embargo, las cantidades de este material deben ser lo suficientemente pequeñas como para que no se produzcan efectos fisiológicos indeseables. La expresión "sin transportador" se refiere únicamente a preparaciones radioactivas donde no hay isótopos no radioactivos del radionucleido. Esto implica que los preparados radiofarmacéuticos producidos a través de (n, y) reacciones no pueden considerarse exentas de transportador. La actividad por unidad de volumen o peso de un medio o vehículo que contiene un radionucleido, ya sea con o sin transportador, se denomina concentración radioactiva, en tanto que el término actividad específica se refiere a la actividad de un radionucleido por gramo de su elemento.
Pureza Radioquímica La pureza radioquímica de una preparación radiofarmacéutica se refiere a la fracción del radionucleido declarado presente en la forma química declarada. Las impurezas radioquímicas en preparados radiofarmacéuticos pueden ser el resultado de la descomposición y de procedimientos de preparación indebidos. La radiación causa la descomposición del agua, uno de los
USP 39
Pruebas Físicas / (821) Radioactividad 729
ingredientes principales de la mayoría de los preparados radiofarmacéuticos, lo cual produce átomos reactivos de hidrógeno y radicales hidroxilo, electrones hidratados, hidrógeno, iones hidrógeno y peróxido de hidrógeno. Este último se forma en presencia de radicales oxígeno, los cuales se originan a partir de la descomposición radiolítica del oxígeno disuelto. Muchos preparados radiofarmacéuticos tienen mejor estabilidad si se excluye el oxígeno. La radiación también puede afectar al preparado radiofarmacéutico en sí mismo, produciendo un aumento de iones, radicales y estados excitados. Estas especies se pueden combinar entre sí o con las especies activas formadas a partir del agua. La descomposición por radiación puede reducirse al mínimo mediante el uso de agentes químicos que captan electrones o radicales. Los electrones atrapados en sólidos provocan un cambio de color debido a la formación de centros F y un ejemplo del caso es el oscurecimiento de los envases de vidrio que contienen preparados radiofarmacéuticos. La pureza radioquímica de los preparados radiofarmacéuticos se determina por cromatografía en columna, papel o en capa delgada u otras técnicas apropiadas de separación analítica, según se especifique en la monografía individual correspondiente.
Pureza Radionucléidica La pureza radionucléidica de una preparación radiofarmacéutica se refiere a la proporción de radioactividad debida al radionucleido deseado en la radioactividad total medida. La pureza radionucléidica es importante para la estimación de la dosis de radiación recibida por el paciente cuando se le administra la preparación. Las impurezas radionucléidicas pueden surgir de impurezas en los materiales originales, diferencias en los valores de diferentes secciones cruzadas de producción competentes y funciones de excitación a la energía o energías de las partículas bombardeantes durante la producción.
Términos y Definiciones La fecha de fabricación es la fecha en la cual se completa el ciclo de fabricación del producto terminado. La fecha de valoración es la fecha (y hora, si fuera aplicable) en la cual se realiza la valoración concreta de la radioactividad. La fecha de calibración es una fecha y hora arbitrariamente asignadas, momento en el que se calcula la radioactividad del producto para la comodidad del usuario. La fecha de caducidad es la fecha límite para el uso del producto. El período de caducidad (es decir, el tiempo transcurrido entre la fecha de fabricación y la fecha de caducidad) se basa en el conocimiento de las propiedades radioactivas del producto y los resultados de los estudios de estabilidad de la forma farmacéutica terminada.
Etiquetado Las monografías correspondientes a cada producto radiofarmacéutico indican la fecha de caducidad, la fecha de calibración y la advertencia "Precaución-Material Radioactivo". El etiquetado indica que, al realizar los cálculos de dosificación, deben hacerse las correcciones necesarias por desintegración radioactiva y asimismo indica cuál es la vida media radioactiva del radionucleido. Los artículos que son Inyecciones deben cumplir con los requisitos de'''". ·, ,.. · ·' .• '"b ;,:'' "·~ . ', , '.:, .. ·. . " . • mientras que los que son Productos Biológicos deben cumplir con los requisitos de Etiquetado en Productos Biológicos (1041 ).
lllll!llllltl"rlll-lllllrll,
IDENTIFICACIÓN Y VALORACIÓN DE RADIONUCLEIDOS Instrumental CÁMARAS DE IONIZACIÓN Una cámara de ionización es un instrumento donde se aplica un campo eléctrico a través de un volumen de gas con el propósito de recoger los iones producidos por un campo de radiación. Los iones positivos y los electrones negativos migran a lo largo de las líneas de fuerza del campo eléctrico y se captan en electrodos, produciendo una corriente de ionización. En una cámara de ionización de tipo pozo adecuadamente diseñada, la corriente de ionización no debe depender demasiado de la posición de la muestra radioactiva y el valor de la corriente por unidad de actividad, conocido como factor de calibración, es característico de cada radionucleido emisor de rayos gamma. La corriente de ionización producida en una cámara de ionización está relacionada con la energía media de la radiación emitida y es proporcional a la intensidad de la radiación. Si se emplean fuentes estándar de velocidad de desintegración conocida para calibrar la eficiencia, se puede utilizar la cámara de ionización para determinaciones de actividad entre algunos microcurios y varios cientos de milicurios o más. Por lo general, el límite superior de actividad que puede medirse en una cámara de ionización no está definido con exactitud y puede estar limitado por consideraciones relativas a la saturación, la capacidad del amplificador y el diseño de la cámara en sí. Deben revisarse los datos suministrados u obtenidos de un instrumento específico , para evaluar los intervalos útiles de energías e intensidades del dispositivo.
730 (821) Radioactividad / Pruebas Físicas
USP 39
Se puede alcanzar fácilmente una reproducibilidad con un margen de aproximadamente un 5% en alrededor de 1 O segundos, con una cámara de pozo profundo re-entrante. La forma más comúnmente empleada de cámara de ionización para medir las actividades de preparados radiofarmacéuticos se conoce como calibrador de dosis. Aunque el factor de calibración para un radionucleido puede interpolarse a partir de la curva de respuesta a la energía de la cámara de ionización, en este procedimiento hay varias fuentes posibles de error. Por lo tanto, se recomienda que todas las calibraciones de la cámara de ionización se lleven a cabo con el uso de fuentes auténticas de referencia de los radionucleidos individuales, según se describe más adelante. La calibración de un calibrador de dosis debe mantenerse relacionando la respuesta medida de un estándar con la de un estándar de larga vida, como es el caso del radio 226 en equilibrio con sus productos de desintegración. El instrumento debe verificarse diariamente con 226Ra u otra fuente para evaluar su estabilidad durante un período prolongado. Esta verificación debe incluir lecturas del estándar de funcionamiento en todas las posiciones de radionucleido empleadas. Para obtener la actividad (A.) del radionucleido medido, emplear la relación: Ax= RxRIRn en donde Rn es la nueva lectura para el radio u otra fuente, Rx es la lectura para la misma fuente obtenida durante el procedimiento de calibración inicial y R es la lectura observada para la muestra del radionucleido. Obviamente, primero hay que aplicar las correcciones necesarias por desintegración radioactiva de la fuente de referencia. El uso de este procedimiento debe reducir al mínimo cualquier efecto debido a la desviación en la respuesta del instrumento. La actividad recomendada del 226 Ra u otro indicador usado en el procedimiento descrito anteriormente es entre 75 µCi y 150 µCi. Se recomienda también verificar la reproducibilidad o estabilidad de instrumentos de intervalos múltiples para todos los intervalos con el uso de estándares apropiados. El tamaño y la forma de una fuente radioactiva pueden afectar la respuesta de un calibrador de dosis y suele ser necesario realizar una pequeña corrección cuando se mide una muestra voluminosa. DETECTORES DE CENTELLEO Y DETECTORES SEMICONDUCTORES Cuando se disipa la totalidad o parte de la energía de la radiación beta o gamma dentro de los centelladores, se producen fotones de intensidad proporcional a la cantidad de energía disipada. Un fototubo multiplicador de electrones detecta estos pulsos y los convierte en pulsos eléctricos, que posteriormente se analizan con un analizador de altura de pulso para obtener un espectro de altura de pulso relacionado con el espectro de energía de la radiación emitida por la fuente. En general, un espectro de altura de pulso por centelleo de partículas beta se aproxima al espectro verdadero de energía beta, siempre que la fuente de partículas beta esté preparada de tal manera que la autoabsorción se reduzca al mínimo. Se pueden obtener espectros de rayos beta utilizando fluoruro de calcio o antraceno como centellador, mientras que los espectros de rayos gamma suelen obtenerse con un cristal de yoduro de sodio activado con talio o con un detector semiconductor de gran volumen de germanio desplazado por litio. Los espectros de partículas cargadas también pueden obtenerse empleando detectores semiconductores de silicio y/o contadores proporcionales de gas. Los detectores semiconductores son, en esencia, cámaras de ionización de estado sólido, pero la energía requerida para crear un par electrón-hueco o para elevar un electrón desde la capa de valencia a la capa de conducción en el semiconductor es aproximadamente de un décimo de la energía requerida para crear un par iónico en una cámara de ionización llena de gas o un contador proporcional y es mucho menor que la requerida para producir un fotón en un cristal Nal{TI) de centelleo. En la espectrometría de rayos gamma, un detector de Ge(Li) puede producir una resolución de energía de 0,33% para rayos gamma de 1,33 MeV provenientes de 6ºCo, mientras que un cristal de Nal{TI) de 3 x 3 pulgadas (7,6 x 7,6 cm) permite obtener un valor de 5,9% para la misma energía de rayos gamma. La resolución de energía es una medida de la capacidad para distinguir la presencia de dos rayos gamma estrechamente espaciados en energía y se define por convención como el ancho total del fotopico a la mitad de su altura máxima (FWHM por sus siglas en inglés), expresado como porcentaje de la energía del fotopico. Los espectros de rayos gamma presentan uno o más fotopicos nítidos típicos o picos de energía total, como resultado de la absorción total en el detector de la energía completa de radiaciones gamma provenientes de la fuente; estos fotopicos son útiles para fines de identificación. Otros picos secundarios se observan como consecuencia de retrodispersión, radiación de aniquilación, suma de coincidencia, rayos X fluorescentes, etc., acompañados por una banda amplia conocida como el efecto continuo Compton que surge de la dispersión de los fotones en el detector y de los materiales circundantes. Dado que la respuesta del fotopico varía con la energía del rayo gamma, la calibración de un espectrómetro de rayos gamma debe realizarse con estándares de radionucleidos que tengan energías de rayos gamma y velocidades de emisión conocidas. La forma del espectro de rayos gamma depende de la forma y tamaño del detector y los tipos de materiales de blindaje empleados. Para verificar la identidad de un radionucleido por espectrometría de rayos gamma, es necesario hacer una comparación del espectro de la muestra con el de una muestra de pureza conocida del mismo radionucleido obtenida con parámetros instrumenta/es idénticos e idéntica geometría de muestra. Cuando los radionucleidos emiten radiaciones coincidentes X o gamma, el carácter de la distribución de la altura de pulso suele cambiar drásticamente debido al efecto de suma de estas radiaciones coincidentes en el detector a medida que aumenta la eficiencia de la detección (por ejemplo, al acercar la fuente al detector). Este efecto es particularmente evidente en el caso del yodo 125. Entre las aplicaciones más útiles de la espectrometría de rayos gamma están aquellas que sirven para la identificación de radionucleidos y la determinación de impurezas radionucléidicas.
Pruebas Físicas/ (821) Radioactividad 731
USP 39
Cuando no es posible confirmar la identidad de un radionucleido dado a través de una comparación directa con el espectro de una muestra del mismo radionucleido de pureza conocida, la identidad del radionucleido en cuestión debe establecerse con el siguiente método. Deben medirse dos o más de los siguientes parámetros del esquema de desintegración nuclear de la muestra del radionucleido que se desea identificar, los cuales deben concordar dentro de ±10%: (1) vida media, (2) energía de rayos gamma o rayos X emitidos, (3) la abundancia de cada emisión y (4) el Emáx para aquellos radionucleidos que se desintegren con emisión de partículas beta. Estas mediciones deben realizarse según se indica en las secciones Identificación y Va/oración de este capítulo. La coincidencia de dos o más de los parámetros medidos con los datos correspondientes publicados del esquema de desintegración nuclear constituye la confirmación de la identidad del radionucleido. CONTADORES DE CENTELLEO LÍQUIDO Los radionucleidos emisores de radiación alfa y beta pueden analizarse con un sistema de detectores de centelleo líquido. En el líquido de centelleo, la energía de radiación se transforma finalmente en cuantos de luz que son detectados generalmente por dos fototubos multiplicadores preparados para contar sólo radiación de coincidencia. El líquido de centelleo es una solución constituida por un disolvente, solutos primarios y secundarios, y aditivos. La partícula cargada disipa su energía en el disolvente y una fracción de esta energía se transforma en fluorescencia en el soluto primario. La función del soluto secundario es desplazar la radiación de fluorescencia a longitudes de onda más largas que son detectadas más eficientemente por los fototubos multiplicadores. Los disolventes empleados con más frecuencia son tolueno y p-xileno; los solutos primarios son 2,5-difeniloxazol (PPO) y 2-(4'-terc-butilfenil)-5-(4-bifenilil)-1,3,4-oxadiazol (butil-PBD) y los solutos secundarios son 2,2'-p-fenilenbis[4-metil-5-feniloxazol] (dimetil-POPOP) y p-bis(o-metilestrilil)benceno (bis-MSB). Para lograr compatibilidad y miscibilidad con muestras acuosas a analizar, se incorporan también en el centellador muchos aditivos, tales como agentes tensoactivos y agentes de solubilización. Para una determinación exacta de la radioactividad de la muestra se debe prestar atención al preparar una muestra verdaderamente homogénea. La presencia de impurezas o color en la solución disminuye la producción de fotones del centellador, lo cual se denomina extinción. Una medición exacta de la radioactividad requiere una corrección por pérdida de velocidad de conteo debida a extinción. La velocidad de desintegración de una fuente de partículas beta puede determinarse mediante un procedimiento que consiste en medir el conteo total de la muestra en función del umbral discriminador de la altura de pulso y la velocidad de emisión se obtiene luego extrapolando a un umbral de cero. Los emisores de partículas alfa energéticas pueden medirse de forma similar utilizando este método.
Identificación Un radionucleido puede identificarse por su modo de desintegración, su vida media y las energías de sus emisiones nucleares. La vida media radioactiva se determina fácilmente mediante el conteo sucesivo de una fuente dada del radionucleido durante un período más prolongado que su vida media. La respuesta del dispositivo para conteo cuando se emplea para la medición de la desintegración de radionucleidos de larga vida debe supervisarse con una fuente de referencia de vida aún más larga para evaluar y compensar errores que surjan de la derivación electrónica del aparato. Para radionucleidos de vida corta, cuando el período de conteo es una fracción significativa de la vida media del radionucleido, la velocidad de conteo registrada debe corregirse al tiempo en que se inicia el conteo, del siguiente modo: Rt
= rA.t/(1
- e-1.t)
en donde R1 es la velocidad de conteo al comienzo de un período de conteo, res la velocidad del conteo observada a través del período total de conteo, t es la duración del período total de conteo, /..., es la constante de desintegración del radionucleido y e es la base del logaritmo natural. Cuando t es pequeño en comparación con la vida media del radionucleido en análisis, de tal modo que /. .,1 < 0,05, (1 - e-u) se aproxima a /...,t y no se necesita corrección. La energía de emisiones nucleares suele determinarse por el intervalo máximo de penetración de la radiación en la materia (en el caso de partículas alfa y beta) y por el pico o fotopico de energía total en el espectro de rayos gamma (en el caso de rayos X y rayos gamma). Puesto que las partículas beta son emitidas con un espectro de energía continuo, la energía beta máxima, EmáXI es un índice único para cada radionucleido emisor beta. Además del intervalo máximo y del espectro de energía de las partículas beta, el coeficiente de absorción, cuando se obtiene bajo condiciones de conteo reproducibles, puede servir como un índice confiable para la identificación de un emisor beta. Fortuitamente, las partículas beta se absorben en la materia de una manera aproximadamente exponencial y la gráfica del logaritmo de la velocidad de conteo de partículas beta en función del espesor del absorbente se conoce como la curva de absorción. La porción inicial de la curva de absorción muestra linealidad, a partir de la cual puede obtenerse el coeficiente de absorción. El intervalo máximo está determinado por el uso de absorbentes de espesor variable y el espectro de energía se mide por espectrometría de centelleo de rayos beta. La absorción de rayos gamma en la materia es estrictamente exponencial pero las capas de valor medio de atenuación no han sido muy útiles para la caracterización de radionucleidos. Los rayos gamma de ~ada transición isomérica son monoenergéticos; su energía puede ser medida directamente por espectrometría de rayos gamma. Debido a su resolución de alta energía, los detectores de estado sólido [Ge(Li)] son muy superiores a los detectores de centelleo [Nal(TI)] en la espectrometría de rayos gamma.
732 (821) Radioactividad / Pruebas Físicas
USP 39
Las actividades de las soluciones radiofarmacéuticas suelen aproximarse a los milicurios por ml. Por lo general, estas soluciones deben diluirse considerablemente antes de que puedan valorarse con exactitud. El diluyente debe ser compatible con el preparado radiofarmacéutico en lo que se refiere a factores como pH y potenciales redox, para que no ocurra ninguna hidrólisis o cambio en el estado de oxidación con la dilución, lo que podría conducir a adsorción y separación del radionucleido de la solución. RADIONUCLEIDOS EMISORES DE RAYOS BETA Procedimiento del Coeficiente de Absorción de Masa-Depositar y secar una alícuota de la solución de fósforo 32 radioactivo sobre una película plástica delgada para reducir al mínimo la retrodispersión y colocar la alícuota bajo un contador apropiado. Determinar sucesivamente las velocidades de conteo, empleando no menos de seis "espesores" diferentes de aluminio, cada uno entre 20 mg/cm 2 y 50 mg/cm 2 y un solo absorbente de espesor no mayor de 800 mg/cm 2 , que se emplea para medir la radiación de fondo. (Los absorbentes se insertan entre la muestra de prueba y el contador pero se colocan más cerca de la ventana del contador para reducir al mínimo la dispersión.) El conteo neto de partículas beta se obtiene después de restar la velocidad de conteo hallada con el absorbente de espesor de 800 mg/cm 2 o mayor. Graficar el logaritmo de la velocidad neta de conteo de partículas beta en función del "espesor" total del absorbente. El "espesor" total del absorbente es el "espesor" de los absorbentes de aluminio más el "espesor" de aire equivalente (la distancia en centímetros entre la muestra y la ventana del contador multiplicada por 1,205 mg/cm 3 a 20º y 76 cm de mercurio), expresado en mg/cm 2 • El resultado es una línea aproximadamente recta. Elegir dos "espesores" totales del absorbente que difieran en 20 mg/cm 2 o más y que caigan sobre la gráfica lineal y calcular el coeficiente de absorción de masa, µ, por medio de la ecuación: µ = 1 /(t2
-
t 1)
•
In (N 11 /N 12) = (2,303/(t2
-
t 1 )) x (log Ntl - log N12)
en donde t 1 y t 2 representan el total de los "espesores," en mg/cm 2, siendo t 2 el absorbente de mayor espesor; y Nt1 y Nt2 son las velocidades de conteo neto de partículas beta con los absorbentes t 1 y t 2, respectivamente. Para la caracterización del radionucleido, el coeficiente de absorción de masa debe estar dentro de un ±5% del valor encontrado para una muestra pura del mismo radionucleido cuando se determina bajo condiciones idénticas de conteo y geometría. Otros Métodos de Identificación-Otros métodos para la determinación de la identidad de un emisor beta también dependen de la determinación de la fmáx· Se puede llevar a cabo de varias maneras. Por ejemplo, (1) mediante la utilización de relaciones de intervalos de energía entre partículas beta en un absorbente o (2) mediante la determinación de Emáx a partir de un espectro de partículas beta obtenido con un espectrómetro para radiación beta calibrado por energía empleando una fuente delgada del radionucleido (ver Detectores de Centelleo y Detectores Semiconductores en este capítulo). RADIONUCLEIDOS EMISORES DE RAYOS GAMMA El espectro de rayos gamma de un radionucleido es una herramienta valiosa para la identificación cualitativa de radionucleidos emisores de rayos gamma. Se identifica el pico de energía total, o el fotopico, por la energía de transición de rayos gamma que se libera en el esquema de desintegración del radionucleido. Para determinar la pureza e identidad de un radionucleido, se obtiene el espectro de rayos gamma de una sustancia radioactiva por medio de un cristal de Nal(TI) o un detector semiconductor de Ge(Li). La resolución de este último es mayor en más de una orden de magnitud que el anterior y es el preferido para fines analíticos. El espectro obtenido es idéntico en forma al de una muestra del radionucleido puro, medido con el mismo sistema de detección y en la misma geometría. El espectro de rayos gamma del producto radiofarmacéutico deberá contener sólo fotopicos identificables por las energías de transición de los rayos gamma encontrados en el esquema de desintegración del mismo radionucleido. En el caso de eficiencias geométricas bajas, las áreas bajo los fotopicos, después de corregir por la eficiencia de medida del detector, son proporcionales a la abundancia o velocidad de emisión de los respectivos rayos gamma en el radionucleido. IMPUREZAS RADIONUCLÉIDICAS Debido a que los nucleidos emisores de rayos alfa son sumamente tóxicos, debe limitarse su uso en preparaciones radiofarmacéuticas. Los procedimientos para la identificación de radionucleidos activos gamma y beta, según se ha indicado previamente, se aplican a la detección de contaminantes gamma y, comúnmente, contaminantes beta. La actividad bruta de partículas alfa en preparaciones radiofarmacéuticas puede medirse mediante el uso de un contador proporcional sin ventanas o un detector de centelleo que emplee un detector fosforescente de sulfuro de cinc activado por plata o por las técnicas de conteo de centelleo líquido. La gran ionización causada por partículas alfa facilita la medición de radionucleidos emisores de rayos alfa en presencia de grandes cantidades de nucleidos beta y gamma activos mediante el uso de técnicas apropiadas para diferenciar la amplitud de los pulsos de señal. En el conteo proporcional, la región de voltaje operativo para conteo de partículas alfa denominada "meseta alfa" es considerablemente menor que la "meseta beta" para conteo de radiaciones beta y gamma. La calibración de voltaje
Pruebas Físicas/ (821) Radioactividad 733
USP 39
típica para la "meseta alfa" y la "meseta beta" con gas de conteo P-1 O es de 900 voltios a 1300 voltios y de 1600 voltios a 2000 voltios, respectivamente. Cuando se emplean detectores fosforescentes de sulfuro de cinc activado por plata para la detección de partículas alfa, éstas pueden distinguirse de otras radiaciones de interferencia por la diferenciación de la altura de pulso. Se debe tomar la precaución de reducir al mínimo la autoabsorción en la fuente cuando se preparan las muestras para el conteo de partículas alfa.
Valoración RADIONUCLEIDOS EMISORES DE RAYOS BETA Procedimiento-La velocidad de desintegración (A) de una muestra emisora de partículas beta se obtiene mediante el conteo de una alícuota cuantitativamente depositada en una geometría fija según la fórmula: A= R/(E
X
f,
X
fb
X
f,)
en donde a es la eficiencia del contador, f, es el factor de corrección por tiempo muerto del contador, fb es el factor de corrección por retrodispersión y f, es el factor de corrección por autoabsorción. La velocidad de conteo para un absorbente cero se obtiene por extrapolación de la porción lineal inicial de la curva de absorción a un "espesor" cero del absorbente, considerando los mg/cm2 de "espesor" de cubierta de la muestra, la ventana del contador y el espacio de aire presente entre la muestra y la ventana del contador. La eficiencia del contador, e, se determina mediante el uso de un estándar secundario de larga vida con características espectrales similares. RaD + E se ha utilizado con frecuencia para la calibración de eficiencia de los contadores para fósforo 32. Mediante el uso de condiciones de medición idénticas para la muestra y el estándar (y extrapolación a absorbente cero), el cociente entre los valores de f,, fb y f, para el estándar y la muestra se acerca a la unidad. La relación anterior es válida también cuando se ha calibrado el contador con un estándar del radionucleido que se va a analizar. En este caso, sin embargo, no se requieren las extrapolaciones a "espesor" cero del absorbente para la muestra y el estándar, ya que las dos correcciones para absorción se cancelan para una geometría dada. Otro método útil que se emplea con frecuencia para la determinación de la velocidad de desintegración de radionucleidos emisores de rayos beta es el conteo por centelleo líquido, que también utiliza una extrapolación del conteo de la muestra a un umbral cero para el discriminador de altura de pulso. RADIONUCLEIDOS EMISORES DE RAYOS GAMMA Se proporcionan tres métodos para la valoración de radionucleidos emisores de rayos gamma. La selección del método preferido depende de la disponibilidad de un estándar de calibración del radionucleido a analizar y la pureza radionucléidica del producto en sí. Se requiere la comparación directa con un estándar de calibración si el estándar de calibración del radionucleido a analizar está disponible y si se ha determinado que el límite superior de error aceptable en la determinación de las actividades debido a la presencia de impurezas radionucléidicas es menos de 3%. Cuando el estándar de calibración requerido no es fácil de obtener, como probablemente sea el caso para un radionucleido de vida corta, pero ha estado disponible en algún momento previo a la ejecución de la valoración para determinar la eficiencia del sistema de conteo del radionucleido a analizar, emplear un sistema de conteo calibrado siempre que el contenido de impurezas radionucléidicas de la muestra cumpla los requisitos establecidos para el método de comparación directa. Si los requisitos de cualquiera de los dos primeros métodos no se pueden cumplir, emplear el método para determinación de la actividad a partir de una curva de calibración. Con excepción del primer método, se realiza un seguimiento de los sistemas de conteo empleados para verificar la estabilidad. Este requisito se cumple mediante verificaciones diarias con una fuente de larga vida para verificar el funcionamiento y verificaciones semanales con al menos tres fuentes que cubran una gama amplia de energías de emisión de rayos gamma (por ejemplo, s1co, mcs y 60(o). Si se encuentra una discrepancia en cualquiera de las medidas antedichas, recalibrar completamente el sistema o reparar y recalibrar el sistema antes de volver a usarlo. Valoración por Comparación Directa con un Estándar de Calibración-Para este procedimiento no se requiere un sistema de medición selectiva de energía (por ejemplo, un analizador de altura de pulso). Se emplea una cámara de ionización o un sistema integral de conteo con un detector de Nal(TI). Para obtener resultados exactos es esencial un factor de geometría reproducible de manera constante de muestra a muestra. Tomando precauciones adecuadas, la exactitud de este método se aproxima a la exactitud con la cual se determina la velocidad de desintegración del estándar de calibración. Determinar la velocidad de conteo del sistema de detectores para un estándar de calibración del radionucleido a valorar (por ejemplo, suficientemente activo para dar estadísticas confiables de medición dentro de un lapso razonable, pero no tan activo como para causar problemas graves de tiempo muerto), seleccionando un estándar que permita una exactitud óptima con el equipo específico utilizado. Colocar una alícuota exactamente medida de la muestra desconocida a valorar (diluida, si fuera necesario) en un recipiente idéntico al usado para el estándar y medir la muestra aproximadamente al mismo tiempo y bajo las mismas condiciones geométricas que el estándar. Si el tiempo transcurrido entre las mediciones del estándar de calibración y la muestra excede las 12 horas, verificar la estabilidad del sistema de medición dentro de las 8 horas a partir del momento en que se midió la muestra, con una fuente de larga vida para verificación del funcionamiento. Registrar la respuesta del sistema
USP 39
734 (821) Radioactividad/ Pruebas Físicas
con respecto a la misma fuente de verificación en el momento de la calibración y, si las verificaciones posteriores exceden la respuesta original registrada en más de ±3%, recalibrar el sistema. Corregir ambas determinaciones de actividad por radiación de fondo y calcular la actividad, en µCi por mL, por la fórmula: SD(g/b) en donde S es la concentración µCi del estándar; D es el factor de dilución; y g y b son los valores medidos de la velocidad de conteo para la muestra y el estándar, respectivamente. Valoración con un Sistema de Conteo Integral Calibrado-Se aplican el procedimiento y las precauciones mencionadas para el método anterior de comparación directa, excepto que se debe determinar y registrar la eficiencia del sistema de detectores para cada radionucleido que se desea analizar, en lugar de registrar simplemente la velocidad de conteo del estándar. Por lo tanto, la eficiencia para un radionucleido determinado, x, se determina por ex = bxf sx, en donde bx es la velocidad de conteo, corregida por radiación de fondo y tiempo muerto, para el estándar de calibración del radionucleido, x, y sx es la actividad correspondiente al estándar de calibración certificado en transformaciones nucleares por segundo. Para valoraciones posteriores de la muestra, la actividad está dada por la fórmula: Ax= Dgxfex en donde Des el factor de dilución, gx es la velocidad de conteo de la muestra (corregida por la radiación de fondo y el tiempo muerto) y ex es la eficiencia correspondiente para el radionucleido. Determinación de la Actividad a Partir de una Curva de Calibración-La versatilidad en las mediciones de intensidad absoluta de rayos gamma puede lograrse mediante un análisis de altura de pulso en canales múltiples. La eficiencia de un sistema de detección para fotopicos puede determinarse como una función de la energía de los rayos gamma a través de una serie de muestras de estándares de emisores de rayos gamma; la velocidad de emisión de rayos gamma de un radionucleido para el cual no se disponga de ningún estándar puede determinarse por la interpolación en la curva de eficiencia. Sin embargo, es necesario definir la curva de eficiencia para el sistema de detección adecuadamente sobre la región total de interés, usando un número suficiente de puntos de calibración a lo largo del eje de energía del fotopico. Selección de un Equipo de Conteo-Para la identificación de radionucleidos que emiten rayos X o gamma en su desintegración se emplea un espectrómetro de rayos gamma. Los requisitos para un equipo apropiado para la identificación y valoración de los radionucleidos empleados en productos radiofarmacéuticos son: (a) que la resolución del detector basada en el fotopico de 137 Cs- 137mBa de 662-keV sea 8,0% o mejor, (b) que el detector cuente con un soporte de muestra diseñado para facilitar la repetición exacta de la geometría de conteo y (c) que el analizador de altura de pulso tenga canales suficientes para delinear claramente el fotopico bajo observación. Procedimiento--Los requisitos mínimos para el mantenimiento de las calibraciones del instrumento son verificaciones semanales de funcionamiento con una fuente apropiada de referencia y una recalibración semestral completa. Si la verificación de funcionamiento semanal se desvía del valor determinado en el momento de la calibración en más de 4,0%, debe recalibrarse totalmente el instrumento. Este método se divide en tres pasos básicos: la integración del fotopico, la determinación de la curva de eficiencia para fotopicos y el cálculo de la actividad de la muestra. INTEGRACIÓN DEL FOTOPICO-EI método para determinar el área de un fotopico utiliza una aproximación gausiana para el ajuste del fotopico. Puede obtenerse una fracción fija del número total de conteos del fotopico tomando el ancho del pico, a, a una fracción del máximo donde se ha determinado experimentalmente que la forma es muy cercana a la gausiana y multiplicándolo por el canal de conteo máximo, P, después de corregir por contribuciones por el efecto Compton y la radiación de fondo. Por lo general, esta radiación de fondo puede determinarse correctamente mediante una interpolación lineal. Este procedimiento se ilustra en la Figura 2.
Pruebas Físicas/ (821) Radioactividad 735
USP 39
90
80
~
¡::::
s
70
o:
60
w
fil ....
~
0,606Pf- -· 50
(.J
w
e •o e <(
Q 30
g g;!
20
'º ENERGÍA--+
Fig. 2 Espectro Típico de Rayos Gamma que muestra la Selección del Canal de Conteo Máximo, P, después de la Corrección por Contribuciones por el Efecto Compton y la Radiación de Fondo. La curva del fotopico adopta una forma cercana a una línea recta a 0,606P y la contribución al valor de a de los canales fraccionarios puede calcularse exactamente por interpolación. Calcular a por la ecuación: a= D' - D + [(d - 0,606P)/(d - c)] + [(d' - 0,606P)/(d' - c')] en donde c y d y también c' y d' son los canales de conteo individuales a cada lado de 0,606P y D y D' son los números de los canales (ubicación) de d y d', respectivamente. La posición de las variables requeridas sobre el fotopico se ilustra en la Figura 3.
--1-'------~1---
ow .... z o(.J w
e e
;:§
~ ~
0,606 p
.J
!
llººIJ
d. 0,606 p
-d--c-
d' • 0,606 p
~
ENERGÍA-
Fig. 3 Ubicación de las Variables Requeridas para la Determinación del Ancho del Pico, a, a 0,606P. A partir de los valores conocidos de velocidad de conteo P en el canal de conteo máximo del fotopico y el ancho del pico 0,606P, a, se obtiene una fracción calibrada del área del fotopico a partir del producto, (aP). Para resumir los procedimientos utilizados para obtener una fracción calibrada del área del fotopico empleando este método, las etapas o cálculos necesarios se detallan paso a paso a continuación: (1) Restar del fotopico que se desea medir cualquier contribución por efecto Compton y radiación de fondo. (2) Determinar la velocidad de conteo P del canal de conteo máximo (máxima velocidad de conteo del canal después de restar el valor Compton y la radiación de fondo). (3) Multiplicar P por 0,606 y ubicar la línea horizontal correspondiente al ancho del pico, a. (4) Obtener el ancho del pico, a, asignando los valores de las variables (obtenidos según se muestra en la figura precedente) en la ecuación correspondiente para calcular a. (5) La fracción calibrada del área del pico es igual al producto de a por P o F = aP, en donde F es un área fraccionaria del pico proporcional a la velocidad de emisión de la fuente.
736 (821) Radioactividad / Pruebas Físicas
USP 39
Este método proporciona un medio rápido y exacto para determinar la velocidad de emisión de los rayos gamma de las fuentes mientras que evita, en gran medida, las estimaciones subjetivas de la forma detallada de las colas de Jos picos. El error debido al empleo de Ja máxima velocidad de conteo del canal, en lugar del canal de conteo máximo teórico, es del orden de 1,0% si a es 6 o mayor. CALIBRACIÓN DE LA EFICIENCIA DEL FOTOPICO-Los radionucleidos como los listados en la tabla siguiente junto con algunos de sus datos de desintegración nuclear, se encuentran disponibles como estándares certificados de referencia.* Debe seleccionarse un número suficiente de fuentes radioactivas de referencia estándar para obtener la curva de calibración en el intervalo deseado. En lo posible, se deben incluir fuentes estándar de los radionucleidos que se desean analizar. Propiedades Nucleares de los Estándares de Calibración Selecclonados
Fotones por 100 Desintegraciones
Kº1
30,97
63,4
Kº2
30,62
34,2
Kn
35,0
22,8
Emisiones de Fotones Principales 13 3Ba (T112
= 10,5 años)
y,
53,15
2,14
y,
79,62
2,55
y,
80,99
33,0
Y<
276,39
6,9
Y1
302,83
17,8
Y•
356,0
60,0
Yo
383,85
8,7
137Cs-137mBa (T,,,
= 30, 1 7 años)
KN,
32,19
3,82
KN,
31,82
2,07
KR
36,4
1,39
Media Ponderada(4)
(32,9)
(7,28)
Y1
661,6
89,98
hv
511
179,80(5)
y,
1274,54
99,94
Y1
1173,2(6)
100,0
Y2
1332,5(6)
100,0
LXK
7,0
56,0
Y1
14,4
9,5
y,
122,06
85,51
22Na (T,,,
60Co (T112
= 2,60 años)
= 5,27 años)
= 270,9 días)
s1co (T112
y,
136,47
10,60
Media Ponderada
(125,0)
(96, 11)
(y,+ 54 Mn (Tw
y,)(4)
= 312,7 días)
LXK
6,0
25,0
y,
834,83
99,98
109cd-109Ag (T,, 2
= 464 días)
En mediciones de rayos gamma (o rayos X), a los fines de la valoración, la radiación fluorescente de blindaje de plomo (específicamente, rayos X -76 ke V por K de plomo) puede interferir con los resultados cuantitativos. Debe tenerse en cuenta para estos efectos, o debe suprimirse la radiación; una manera satisfactoria de absorber esta radiación es cubrir el plomo expuesto con una hoja de cadmio de 0,06 a 0,08 pulgadas (1,5 a 2 mm) de espesor y luego cubrir el cadmio con cobre de 0,02 a 0,04 pulgadas (0,5 a 1 mm) de espesor. <2> Por lo general, sólo se incluyen aquellas emisiones del fotón que tienen ~1 % de abundancia. <3) la notación K se refiere a emisiones de rayos X. <4 ) Se proporcionan las energías medias ponderadas e intensidades totales para grupos de fotones que no se resuelven mediante un detector de Nal(TI). (S) Para que esta intensidad de fotones pueda ser utilizable, se deben eliminar todos los positrones emitidos en el material de origen. (6) Cascada. (l)
• Se pueden obtener estos estándares de referencia certificados del Instituto Nacional de Normas y Tecnología (NIST, por sus siglas en inglés), Washington, DC 20234.
Pruebas Físicas/ (821) Radioactividad 737
USP 39
Propiedades Nucleares de los Estándares de Calibración Seleccionados< 1•2) (Continuación) Fotones porlOO Desintegraciones
Emisiones de Fotones Principales
Energía (ke V)
K,,1
22,16
35,3
Ka2
21,99
18,6
Ka
24,9
11,4
Media Ponderada(4)
63,5 88,0
Y1
3,72
1291(T, 12 = 1,57 x 10 7 años) K
(3)
29,78
37,0
29,46
20,0
KR
13,2
37,0
Y1
39,58
7,52
'nl
Ka2
(31,3) (77,80) Media Ponderada<4l (l) En mediciones de rayos gamma (o rayos X), a los fines de la valoración, la radiación fluorescente de blindaje de plomo (específicamente, rayos X -76 ke Vpor K de plomo) puede interferir con los resultados cuantitativos. Debe tenerse en cuenta para estos efectos, o debe suprimirse la radiación; una manera satisfactoria de absorber esta radiación es cubrir el plomo expuesto con una hoja de cadmio de 0,06 a 0,08 pulgadas (1,5 a 2 mm) de espesor y luego cubrir el cadmio con cobre de 0,02 a 0,04 pulgadas (0,5 a 1 mm) de espesor. ( 2 ) Por lo general, sólo se incluyen aquellas emisiones del fotón que tienen ;> 1o/o de abundancia. <3) La notación K se refiere a emisiones de rayos X. (4) Se proporcionan las energías medias ponderadas e intensidades totales para grupos de fotones que no se resuelven mediante un detector de Nal(TI). (S) Para que esta intensidad de fotones pueda ser utilizable, se deben eliminar todos los positrones emitidos en el material de origen. <6l Cascada.
Calcular la velocidad de emisión de rayos gamma por la ecuación:
r
= A,b
en donde A, es la actividad, en desintegraciones por segundo, del estándar usado y bes el número de rayos gamma por desintegración a ese nivel de energía. Medir con exactitud cantidades de soluciones estándar de cada radionucleido en recipientes idénticos y determinar el área fraccionaria del fotopico (F) para cada uno de los estándares. Empleando la ecuación EP = F/í, calcular la eficiencia del fotopico, EP y construir una gráfica log-log de EP en función de la energía de rayos gamma como se muestra en la Figura 4. 1,0
~~ ~
_,
--..;;;: ~
~.
' "°'~
\\
0,5
\'\'\ ~
o o::
(.)
w
en
\
\
0,2
a: 1-
POZO DE 1 3/4 X 2; 518 X 1 1/2 pulgadas
~
<
zw
1\
\
\\
z
(.)
\
\' \.'\ ~ ::i;i
...J
w
o < (.)
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 POZO DE 3x3; ' 1/2 x 1 1/2 pulgadas
~
~
\
V
-e~
r.. 1'111'\ l\.l'..-3x3_
!\~ \
~
0,1
~
""
\
r'éí-3x2 i'o-2x2 1\.
3Xi-
\.
ü
\.
¡¡:
\
w
o
0,05 CRISTALES SÓLIDOS: FUENTE A 9,3 cm
---¡---¡--
CRISTALES DE POZO: FUENTE EN EL POZO ~
0,02 0,1
0,2
-¡¡-
0,5
---
1,0
2,0
ENERGIA (Mev) Fig. 4. Curvas Típicas de Calibración de la Eficiencia de Fotopicos para Varios Detectores de Nal(TI). DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LA MUESTRA-De la misma manera que en la preparación de la curva de calibración, determinar el área fraccionaria (F) del fotopico principal de la muestra valorada o una alícuota medida con exactitud ajustada al
738 (821) Radioactividad / Pruebas Físicas
USP 39
mismo volumen en un recipiente idéntico al usado para los estándares. A partir de la curva de calibración, determinar el valor de eP para este radionucleido. Empleando la ecuación r = F/ep, calcular la velocidad de emisión de los rayos gamma (r). Calcular la actividad (A), en desintegraciones por segundo, de la muestra empleando la ecuación A= {r/b)(D), en donde bes el número de rayos gamma por desintegración y D es el factor de dilución. Para obtener la actividad, en µCi o mCi, dividir A por 3,7 x 10 4 ó 3,7 x 10 7, respectivamente. La relación anterior es igualmente válida para la obtención de la actividad de una muestra no diluida o una cápsula; en este caso, el factor de dilución, D, es la unidad.
(823) FÁRMACOS PARA TOMOGRAFÍA DE EMISIÓN DE POSITRONES PARA USO EN PREPARACIONES MAGISTRALES, INVESTIGACIÓN CLÍNICA Y ESTUDIOS CIENTÍFICOS INTRODUCCIÓN Los radionucleidos usados para la tomografía de emisión de positrones {TEP) a menudo tienen vidas medias físicas cortas, T112 (p.ej., T, 12 de iso = 2,03 min, 62Cu = 9,67 min, BN = 9,96 min, 11c = 20,4 min, 6BGa = 67,7 min, 1sF = 109,8 min, 64Cu = 12,7 h). Como resultado, estos radionucleidos a menudo se obtienen mediante técnicas de aceleración de partículas (p.ej., ciclotrones) o en generadores, y luego se procesan para fabricar el producto farmacéutico terminado para TEP, muy cerca del sitio donde se llevará a cabo el procedimiento de TEP. Las cortas vidas medias de los radionucleidos para TEP derivan en limitaciones únicas para la preparación y análisis de productos farmacéuticos para TEP. Este capítulo describe guías para la elaboración y análisis de productos farmacéuticos para TEP, basándose en las siguientes limitaciones: • No es posible completar todo el análisis antes de usar los productos farmacéuticos para TEP. • Un solo vial puede contener una partida o subpartida completa de producto farmacéutico para TEP. Las muestras retiradas para el análisis de control de calidad (CC) son representativas de toda la partida o subpartida. • Una partida o subpartida completa puede administrarse a un único paciente. • La masa del fármaco para TEP en un producto farmacéutico para TEP a menudo se encuentra en cantidades que varían desde nanogramos hasta microgramos. • Los productos farmacéuticos para TEP no entran en una cadena de distribución de medicamentos tradicional, sino que estos se usan internamente o se entregan en el lugar de uso por servicios de distribución especializados. • Las instalaciones de producción a pequeña escala para la preparación de productos farmacéuticos para TEP cuentan con personal y recursos limitados, los cuales requieren lo siguiente: - Facilitar la realización de operaciones múltiples en un área con controles adecuados; - Facilitar la fabricación y el análisis de múltiples productos farmacéuticos para TEP usando equipo compartido; - Requerimientos apropiados para operaciones asépticas; - Requerimientos apropiados para la aptitud del equipamiento y demás actividades en el día de uso; - Requisitos de control de calidad para componentes, materiales e insumos; - Autoverificación de etapas importantes en la producción de radionucleidos, producción de fármacos para TEP o preparación magistral y análisis; y - Supervisión de la producción y preparación magistral, revisión de registros de partida y autorización para la liberación por parte de una sola persona. El alcance de este capítulo incluye la producción y preparación magistral de productos farmacéuticos para TEP para administración en humanos para su uso (a) de conformidad con la práctica médica y farmacéutica regulada por el estado, (b) de conformidad con una solicitud de nuevo fármaco en investigación aprobada {IND, por sus siglas en inglés) (ver el Título 21 del CFR 312) y (c) de conformidad con los requisitos para uso en estudios científicos bajo la supervisión de un Comité de Estudios Científicos para Fármacos Radioactivos (Radioactive Drug Research Committee o RDRC; ver el Título 21 del CFR 361 ). El alcance de este capítulo no incluye actividades de dispensación conforme a lo definido en otros capítulos generales de la USP.
DEFINICIONES Las siguientes definiciones se aplican a los términos y frases empleados en este capítulo. Actividad Específica: La radioactividad de un radionucleido por unidad de masa del elemento o compuesto. La unidad de actividad específica se expresa en unidades de radioactividad por unidad de masa en gramos o en moles, (p.ej., mCi/µg [MBq/µg], Ci/mmol [GBq/mmol]). Certificación del Fabricante: Documentación que incluye, entre otros, certificados de análisis, certificados de cumplimiento o certificados de calidad obtenidos del fabricante, proveedor o vendedor de un material o componente, el cual describe las características de calidad críticas usadas para determinar la aceptabilidad de uso.
USP 39
Pruebas Físicas/ (823) Fármacos para Tomografía de Emisión de Positrones 739
Concentración: La concentración de radioactividad del fármaco para TEP en el producto farmacéutico para TEP por unidad de volumen, determinada al momento de la calibración. La unidad de concentración es la cantidad de radioactividad por unidad de volumen al momento de la calibración (p.ej., mCi/mL [MBq/mL]). Control de Calidad (CC): Sistema para analizar la calidad de los componentes, materiales, insumos y productos farmacéuticos para TEP mediante procedimientos, pruebas, métodos analíticos y criterios de aceptación. Fármaco para TEP: Sustancia radioactiva (ingrediente farmacéutico activo) que presenta núcleos inestables de desintegración espontánea mediante la emisión de positrones y que se incorpora en un producto farmacéutico para TEP para producir un efecto directo en el diagnóstico o seguimiento de una enfermedad o manifestación de una enfermedad en humanos, o para el seguimiento del tratamiento de una enfermedad o procedimientos terapéuticos (p.ej., terapia para tumores). Fuera de la Especificación (OOS, por sus siglas en inglés): Resultado de la prueba de control de calidad para un producto farmacéutico para TEP que no cumple con los criterios de aceptación establecidos. Garantía de Calidad (GC): Sistema planeado para asegurar, mediante procedimientos, pruebas y métodos analíticos, que un producto farmacéutico para TEP posee la identidad, concentración, calidad y pureza requeridos para el propósito esperado. Liberación Condicionada Final: Se refiere a una liberación final para administración en pacientes antes de haber completado las pruebas requeridas debido a una falla del equipo analítico. Liberación de Línea: Segregación y limpieza de diferentes áreas de procesamiento y trabajo para evitar la contaminación cruzada y las mezclas entre la producción y/o la preparación magistral de diferentes productos farmacéuticos para TEP. Lote: Cantidad de materiales (p.ej., reactivos, disolventes, gases, columnas de purificación y demás materiales auxiliares) que tienen un carácter y calidad uniformes dentro de los límites especificados y que se usan para fabricar un producto farmacéutico para TEP. Partida: Cantidad de producto farmacéutico para TEP que se supone tiene un carácter y calidad uniformes, dentro de los límites especificados, y que se prepara en un solo ciclo operativo de acuerdo con una o más órdenes de producción. Preparación Magistral: Conforme a lo descrito en la Ley de Alimentos, Medicamentos y Cosméticos, (Food, Drug and Cosmetic Act) (1997) Capítulo 11, Sección 121 (a) (ii) (1) (B), se refiere a la práctica de sintetizar o formular un producto farmacéutico para TEP, por parte o por orden de un profesional acreditado por un Estado para preparar magistralmente o para ordenar la preparación magistral de un producto farmacéutico para TEP, y que se prepara magistralmente de conformidad con la ley de dicho Estado, para un paciente o con propósitos de estudios científicos, de enseñanza o de control de calidad. Producto Farmacéutico para TEP: Forma farmacéutica terminada que contiene un fármaco para TEP, sin importar si se encuentra o no en asociación con uno o más ingredientes. Producción: Proceso de síntesis o formulación de un producto farmacéutico para TEP que incluye procesamiento, envasado, etiquetado, reprocesamiento y análisis para investigación médica o estudios científicos. Subpartida: Cantidad de producto farmacéutico para TEP con carácter y calidad uniformes, dentro de los límites especificados, que se produce durante una sucesión de irradiaciones múltiples, usando una operación de síntesis o purificación determinada. Un grupo de subpartidas forman colectivamente una partida que se supone cuenta con un carácter y calidad uniformes, dentro de los límites especificados. Las subpartidas pueden ser necesarias para productos farmacéuticos para TEP con radionucleidos con vidas muy cortas (p.ej., 13 N y 15 0) debido a que no es posible completar las pruebas de control de calidad antes de su uso. Validación: Confirmación mediante evidencia documental de que un método, proceso o sistema cumple con los requisitos de desempeño esperados. Verificación: Confirmación de que un método, proceso o sistema establecido cumple con los criterios de aceptación predeterminados.
PERSONAL Se debe contar con un número suficiente de personal con educación, capacitación y experiencia apropiadas para la preparación y análisis de productos farmacéuticos para TEP. El número depende del tamaño y la complejidad de las operaciones efectuadas en cada instalación. Requisitos de Capacitación: Se debe capacitar al personal antes de que comience a fabricar y a analizar productos farmacéuticos para TEP. La capacitación se puede llevar a cabo mediante diversos métodos, que incluyen la instrucción presencial, la instrucción audiovisual y el estudio de publicaciones. La capacitación debe tratar, pero no limitarse a, técnicas de producción de radionucleidos, métodos de síntesis y purificación, materiales, componentes, reactivos, soluciones madre, aparatos automatizados y manuales usados para fabricar productos farmacéuticos para TEP, así como métodos de ce, incluyendo equipos, software y documentación. La capacitación se debe documentar. Capacitación en Operaciones Asépticas: La capacitación debe tratar las manipulaciones asépticas y las técnicas y equipos usados para lograr y mantener las condiciones ambientales Clase 5 de la lnternational Organization far Standardization (ISO). La capacitación también debe tratar todas las operaciones asépticas, incluyendo el ensamble de componentes estériles, la preparación magistral y el filtrado. Las manipulaciones de soluciones estériles deben ser llevadas a cabo por operadores calificados para el uso de técnicas asépticas (ver Instalaciones y Equipo a continuación).
740 (823) Fármacos para Tomografía de Emisión de Positrones/ Pruebas Físicas
USP 39
Se debe evaluar periódicamente al personal implicado en operaciones asépticas mediante simulaciones asépticas en las que se utilice medio de crecimiento microbiológico para evaluar la calidad de la operación aséptica. Las simulaciones asépticas deben cumplir con lo siguiente: • Incluir todas las manipulaciones requeridas para el montaje aséptico del ensamble del vial de producto farmacéutico para TEP (p.ej., vial, filtro y ensamble de jeringa, entre otros). • Representar los casos más extremos para operaciones asépticas. • Deben realizarse por triplicado para calificar a un nuevo operador. Cada operador debe someterse anualmente a una recalificación mediante por lo menos un llenado de medios. • Se debe realizar siempre que se presenten cambios significativos en los procedimientos. Después del proceso de simulación, los medios deben estar exentos de contaminación después de la incubación a una temperatura adecuada durante 14 días. Un operador que no apruebe las evaluaciones escritas o cuyas simulaciones asépticas presenten crecimiento microbiano deberá ser inmediatamente reinstruido y reevaluado a fin de asegurar la corrección de las deficiencias en su práctica aséptica.
GARANTÍA DE CALIDAD La GC es un concepto amplio que abarca todos los aspectos que influyen en la identidad, concentración, calidad y pureza de un producto farmacéutico para TEP. El control de calidad es un subconjunto de la GC que trata el análisis de materiales y de productos farmacéuticos para TEP para determinar si cumplen con los criterios de aceptación. La función de la GC por lo general consiste en actividades de supervisión, mientras que la función del control de calidad se basa en actividades de ejecución. Las funciones del control de calidad incluyen lo siguiente. • Evaluar cada lote de material entrante para asegurar que cumple con las especificaciones establecidas antes de su uso en la preparación o análisis de productos farmacéuticos para TEP. • Evaluar cada partida de un producto farmacéutico para TEP para asegurar que ésta cumple con las especificaciones establecidas antes de autorizar su liberación final. Las funciones de supervisión relacionadas con la GC incluyen lo siguiente: • Revisar los registros de partida una vez completos para verificar su exactitud y que estén completos. •Aprobar procedimientos, especificaciones, procesos y métodos. • Asegurar que el personal esté apropiadamente capacitado y calificado, según corresponda. •Asegurar que los productos farmacéuticos para TEP posean una identidad, concentración, calidad y pureza suficientemente definidos. •Asegurar que los cambios en la calidad de los componentes, proveedores, cambios en los procedimiento de producción y los cambios en los procedimientos de análisis y especificaciones sean apropiados y que se implementen de manera correspondiente. • Investigar errores y asegurar que se tomen las acciones correctivas y de prevención correspondientes para prevenir su recurrencia. • Gestión de quejas. • Asegurar que la producción, análisis, etiquetado, liberación y distribución de los productos farmacéuticos para TEP se lleven a cabo de conformidad con los procedimientos y prácticas establecidos en la instalación para productos farmacéuticos para TEP. • Llevar a cabo auditorías periódicas para monitorear el cumplimiento de los procedimientos y prácticas establecidos para productos farmacéuticos para TEP. El personal de la instalación puede ejercer funciones tanto de GC como de CC.
INSTALACIONES V EQUIPO Las instalaciones deben ser adecuadas para la producción, preparación magistral y análisis de productos farmacéuticos para TEP. Las áreas de trabajo deben mantenerse organizadas para evitar contaminación cruzada, mezclas y errores, especialmente en las áreas usadas para la fabricación de múltiples productos farmacéuticos para TEP. El personal debe limpiar las áreas de trabajo periódicamente para prevenir la contaminación de equipos, materiales, componentes o productos farmacéuticos para TEP o aquellas condiciones del entorno, que pudieran tener un impacto negativo sobre la calidad del producto farmacéutico para TEP. Estos requisitos deben describirse mediante procedimientos escritos y se debe documentar el ejercicio rutinario de los mismos. Controles Ambientales para Productos Farmacéuticos Parenterales para TEP: Debido a que los resultados de las pruebas de esterilidad para productos farmacéuticos parenterales para TEP se obtienen después de la liberación, las instalaciones y equipos deben salvaguardar la esterilidad de un producto farmacéutico para TEP. Estación de Trabajo Aséptica-El control ambiental primario para operaciones asépticas es un filtro de partículas del aire de alta eficiencia (HEPA, por sus siglas en inglés) capaz de producir aire con un nivel de limpieza ISO Clase 5. Esto se puede lograr con una estación de trabajo con flujo de aire laminar, aislador aséptico, cabina de seguridad biológica u otro dispositivo adecuado (reciben el nombre genérico de estaciones de trabajo asépticas). La estación de trabajo aséptica debe estar protegida de fuentes de contaminación microbiana y se debe situar en un área en la que el tránsito de personal sea limitado. El área circundante
USP 39
Pruebas Físicas/ (823) Fármacos para Tomografía de Emisión de Positrones 741
a la estación de trabajo aséptica no debe usarse para el almacenamiento de materiales que desprendan grandes cantidades de partículas (p.ej., cajas corrugadas). La operación adecuada de la estación de trabajo aséptica se debe certificar midiendo las partículas en el aire, analizando la integridad del filtro HEPA, analizando la presión diferencial, o por otros medios. Las pruebas específicas a realizar dependen del tipo de estación de trabajo aséptica. La certificación debe llevarse a cabo al inicio de las operaciones y, posteriormente, por lo menos una vez al año o después de reparar o reemplazar el filtro HEPA. Estos requisitos reemplazan cualquier otro requisito provisto en los capítulos de información general de la USP (p.ej., Control Microbiológico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento Aséptico (1116)). El área de trabajo dentro de la estación de trabajo aséptica debe estar limpia. Las superficies internas deben ser fáciles de limpiar y desinfectar. Las superficies internas se deben limpiar y desinfectar usando desinfectantes apropiados esterilizados por filtración o con certificación de esterilidad demostrada mediante certificado del fabricante. Pruebas Microbiológicas-Se deben llevar a cabo pruebas microbiológicas del ambiente para evaluar la calidad del aire y la desinfección de la superficie de las áreas asépticas. Esto se puede lograr mediante placas de muestreo por sedimentación o con placas activas para muestreo de aire. La desinfección de superficies críticas (p.ej., la superficie de trabajo de la estación de trabajo aséptica o los dedos del operador) se debe evaluar con un hisopo o placas de contacto. Para el análisis microbiológico de la estación de trabajo aséptica, se debe analizar el aire como parte de la calificación de la estación de trabajo (p.ej., semestralmente), mientras que la superficie se debe evaluar (usando un hisopo o placas de contacto) después de su uso, cada día de uso. Los recuentos de partículas no viables se pueden determinar con menor frecuencia después de la certificación de la Estación de Trabajo Aséptica (ver anteriormente). Se deben establecer límites de alerta e intervención para muestras obtenidas durante las pruebas microbiológicas. Los niveles de alerta típicos se establecen a menos de tres unidades formadoras de colonias (ufc) por placa. Más de tres ufc requieren acciones correctivas que pueden incluir la recapacitación del operador, recertificación de la estación de trabajo aséptica u otras acciones. Los resultados de las pruebas microbiológicas también deben usarse para la investigación de pruebas de esterilidad positivas. Equipo: El equipo usado para fabricar y analizar productos farmacéuticos para TEP debe ser apropiado para el propósito al que se destina y se debe instalar, limpiar y mantener de la manera correspondiente. El equipo debe ser capaz de producir resultados uniformes. Los siguientes requisitos deben describirse mediante procedimientos escritos y se debe documentar el ejercicio de los mismos. 1 . Instalación de Equipo Nuevo-El equipo recién instalado debe ser calificado con suficiente detalle antes de usarlo en la fabricación o análisis de productos farmacéuticos para TEP, basándose en la complejidad del equipo. Todas las actividades de calificación deben documentarse de manera apropiada, incluyendo la fecha y el nombre de la persona que llevó a cabo la calificación. Para equipos más complejos, la calificación consiste en tres fases: • Calificación de la Instalación (Cl)-La CI es una verificación de los puntos requeridos para la instalación apropiada del equipo, los cuales incluyen ubicación física, servicios e insumos requeridos, interfases y condiciones ambientales. La CI debe describir el procedimiento de instalación para el equipo. • Calificación Operativa (CO)-La CO es una verificación de las especificaciones operativas del equipo, las cuales incluyen configuración del equipo, pruebas de funcionalidad de subsistemas y la operación general adecuada. La CO debe describir los procedimientos operativos para el equipo. • Calificación del Desempeño (CD)-La CD demuestra que el equipo es capaz de realizar las tareas requeridas para la fabricación y análisis de productos farmacéuticos para TEP en el ambiente operativo y que el equipo proporciona los resultados pretendidos. La CD debe describir las tareas que el equipo debe desempeñar. 2. Calibración del Equipo-La calibración del equipo analítico se debe llevar a cabo antes de su uso, según corresponda. Se debe desarrollar un programa de recalibración que cuente con una frecuencia suficiente para asegurar resultados exactos. Las actividades de calibración deben documentarse de manera apropiada, incluyendo la fecha y el nombre de la persona que llevó a cabo la calibración. 3. Mantenimiento Preventivo del Equipo-Se debe desarrollar un programa de mantenimiento preventivo para equipo importante de producción y análisis, incluyendo módulos de análisis químicos automatizados, cromatógrafos de gases, cromatógrafos de líquidos de alta resolución, entre otros. El programa debe contar con una frecuencia suficiente para minimizar el tiempo de inactividad del equipo. Las reparaciones serias pueden requerir recalibración y recalificación. Las actividades de mantenimiento preventivo deben documentarse de manera apropiada, incluyendo la fecha de la acción y el nombre de la persona que la llevó a cabo. Limpieza de Equipos y Componentes: El equipo usado en la producción o preparación magistral de productos farmacéuticos para TEP incluye dispositivos automatizados controlados por computadoras, así como aparatos de operación manual. Antes de su uso en la fabricación de productos farmacéuticos para TEP, el equipo debe limpiarse de manera apropiada para asegurar que el producto farmacéutico para TEP resultante cumpla con las especificaciones establecidas de identidad, concentración, calidad y pureza (ver Controles y Criterios de Aceptación para Productos Farmacéuticos para TEP Terminados a continuación). Una vez limpio, el equipo debe mantenerse en dicho estado antes de su uso. Es posible utilizar el equipo para fabricar múltiples partidas de uno o más productos farmacéuticos para TEP. Por lo que se debe demostrar mediante estudios documentados la efectividad de los procesos de limpieza entre partidas. Se deben controlar todas las impurezas a niveles que cumplan con las especificaciones establecidas para identidad, concentración, calidad y pure-
742 (823) Fármacos para Tomografía de Emisión de Positrones/ Pruebas Físicas
USP 39
za. Los procedimientos escritos para la liberación de líneas entre partidas de diferentes productos farmacéuticos para TEP deben describir la realización de los procesos de limpieza. Verificaciones en el Día de Uso: Son necesarias ciertas verificaciones en el día de uso para asegurar el funcionamiento apropiado del equipo de procesamiento. Se deben establecer y seguir procedimientos escritos para las verificaciones en el día de uso. Estos procedimientos deben estar diseñados para verificar parámetros clave al inicio de cada ciclo de operaciones (p.ej., temperatura, integridad de la presión, suministro de gas, suministro de vacío, selección de línea de entrega apropiada, volúmenes de entrega de reactivos, velocidades de flujo de gases, monitores de radiación y demás sensores del proceso). Algunos parámetros pueden verificarse periódicamente como parte de los programas de calibración y mantenimiento preventivo, según se describió anteriormente. Aptitud del Sistema para Equipo de CC: Las pruebas de aptitud del sistema para el equipo de CC son necesarias para asegurar que el conjunto de equipo, sus componentes y el personal operador (es decir, el sistema considerado como un todo) funcionen apropiadamente para ejecutar el método analítico deseado. Las pruebas de aptitud del sistema se deben realizar antes de usar el equipo de acuerdo con los procedimientos establecidos. Se deben establecer y seguir procedimientos escritos para las pruebas de aptitud del sistema, y se deben documentar los resultados de dichas pruebas. Las pruebas de aptitud del sistema requeridas para métodos cromatógraficos incluyen factor de asimetría, inyecciones repetidas y resolución. Cuando el cromatograma de prueba usado para la aptitud del sistema contiene un único pico, entonces el factor de asimetría, las inyecciones repetidas y la eficiencia de la columna (platos teóricos) son suficientes. Para estas determinaciones, es necesario el uso de estándares internos o externos con una concentración conocida. Los estándares deben prepararse a partir de materiales bien caracterizados o materiales certificados por el fabricante. A continuación se presentan dos enfoques aceptables que se pueden usar para métodos cromatográficos: 1. Crear una curva de calibración a partir de una serie de estándares en un intervalo de concentraciones conocidas. Las concentraciones de los estándares deben comprender las condiciones de uso para el método cromatográfico. La curva de calibración se debe utilizar durante un periodo adecuadamente especificado (p.ej., seis meses), después del cual se debe crear una nueva curva de calibración. Se debe crear una nueva curva de calibración cada vez que se altere el sistema cromatográfico. La aptitud del sistema de rutina para inyecciones repetidas consiste en una sola inyección de un estándar conocido y una medición de la concentración basada en la curva de calibración. Si la concentración medida concuerda con la concentración conocida dentro de un intervalo predefinido (p.ej., 10% para inyecciones manuales y 5% para inyecciones automatizadas) esto demuestra la aptitud del sistema en inyecciones repetidas y asegura que la curva de calibración es apropiada para su uso en inyecciones de muestra subsiguientes. El factor de asimetría y la resolución (o eficiencia de la columna, según corresponda) se deben determinar a partir del mismo cromatograma. 2. Al inicio de cada ciclo de análisis, crear una calibración de un solo punto, a partir de dos inyecciones de un estándar conocido. El área medida de los picos para estas inyecciones debe concordar dentro de un intervalo predefinido (p.ej., 10% para inyecciones manuales y 5% para inyecciones automatizadas). Posteriormente, los resultados se promedian y utilizan con la concentración estándar para proporcionar un factor de calibración que se usa en inyecciones de muestra subsiguientes para ese día. El factor de asimetría y la resolución (o eficiencia de la columna, según corresponda) se deben determinar a partir de uno de los dos cromatogramas. Otros parámetros cromatográficos, tales como la relación señal-ruido, el límite de detección y el límite de cuantificación, se pueden determinar como parte de un análisis rutinario de la aptitud del sistema. Las pruebas de aptitud del sistema también pueden ser apropiadas para otro equipo de CC, incluyendo calibradores de dosis, escáneres para radio-cromatografía en capa delgada (radio-TLC) y analizadores multicanal. Cuando se utilizan, estas pruebas deben realizarse al momento de instalar, reubicar y, posteriormente, en intervalos apropiados. En estas pruebas, se deben usar estándares conocidos para demostrar el funcionamiento apropiado del equipo, por ejemplo: 1. Calibrador de Dosis-La exactitud, geometría y linealidad se deben evaluar al momento de la instalación y, posteriormente, en intervalos apropiados. El instrumento debe calibrarse de conformidad con estándares reconocidos a nivel nacional o con las instrucciones del fabricante. Las pruebas de aptitud del sistema de rutina deben incluir una verificación de constancia con una fuente de radionucleidos de alta energía adecuada. 2. Escáner para Radio-TLC-La unformidad, exactitud posicional, linealidad del detector y resolución se deben evaluar con una fuente de radionucleido adecuada. La prueba de aptitud del sistema de rutina debe incluir verificaciones para estos parámetros. 3. Analizador Multicanal-La sensibilidad y la resolución se deben evaluar al momento de la instalación y, posteriormente, en intervalos apropiados. Las pruebas de aptitud del sistema de rutina deben incluir una verificación de constancia con una fuente de radionucleidos de alta energía adecuada.
CONTROL DE COMPONENTES, MATERIALES E INSUMOS Se deben controlar los componentes, materiales e insumos que se usan en la preparación de productos farmacéuticos para TEP para evitar la contaminación, mezclas y errores. Se debe designar a una persona como responsable de asegurar que estas actividades se lleven a cabo y se completen de manera apropiada. Los registros de exámenes y pruebas completados para componentes, materiales e insumos se deben conservar durante un año después de su vencimiento o durante un año después de la liberación del lote, lo que represente el periodo más largo. Es necesario establecer y llevar a cabo las siguientes actividades:
USP 39
Pruebas Físicas/ (823) Fármacos para Tomografía de Emisión de Positrones 743
1. Establecer especificaciones escritas para la identidad, concentración, calidad y pureza de ingredientes, reactivos, materiales diana y gases. 2. Establecer especificaciones escritas para la identidad y calidad de viales vacíos estériles, líneas de transferencia, llaves de paso estériles, agujas estériles, filtros de membrana estériles y otros componentes usados en el ensamble del vial del producto farmacéutico para TEP. 3. Establecer especificaciones escritas para la identidad, concentración, calidad y pureza de insumos analíticos (p.ej., disolventes, columnas cromatográficas y estándares auténticos), medios de pruebas de esterilidad y reactivos para pruebas de endotoxinas usados en el análisis de productos farmacéuticos para TEP. 4. Establecer condiciones de almacenamiento apropiadas (basadas en calor, luz, humedad y otros factores) para componentes, materiales e insumos usados para fabricar y analizar productos farmacéuticos para TEP. 5. Almacenar componentes, materiales e insumos en un área con acceso controlado, de acuerdo con las condiciones de almacenamiento establecidas. Segregar componentes, materiales e insumos, según corresponda, para evitar mezclas y errores. 6. Anotar cada lote de envío de componentes, materiales e insumos, y registrar la fecha de recepción, cantidad recibida, fabricante, número de lote del fabricante y fecha de caducidad. Si el fabricante no designa una fecha de caducidad, asignar una basándose en el conocimiento de sus propiedades físicas y químicas y en la experiencia de uso previa. Para sustratos orgánicos y reactivos que son potencialmente susceptibles a la degradación o a cambios en su composición, la fecha de caducidad se debe basar en la estabilidad del material. 7. Determinar que cada lote de componentes, materiales e insumos cumple con las especificaciones escritas establecidas. El cumplimiento de las especificaciones se puede demostrar inspeccionando el etiquetado o inspeccionando la certificación del fabricante. La identidad de cada lote de componentes, materiales e insumos debe ser verificada mediante procedimientos y pruebas definidas, o con la certificación documentada del fabricante, según corresponda. Realizar una prueba de identidad para precursores (p.ej., determinación del punto de fusión u otras pruebas adecuadas). Como alternativa, se puede usar la certificación del fabricante como el único criterio de aceptación para un precursor, si se asegura mediante el análisis del producto farmacéutico para TEP que se ha utilizado el precursor correcto. Los estándares de referencia usados en los procedimientos cromatográficos deben contar con documentación adecuada sobre identidad y pureza. Se pueden aceptar otros componentes basándose únicamente en la certificación del fabricante. 8. Los filtros de membrana usados con productos farmacéuticos parenterales para TEP deben contar con la certificación del fabricante. Examinar la certificación del fabricante para cada lote a fin de asegurar el cumplimiento de la especificaciones escritas. 9. Los medios usados en las pruebas de esterilidad de productos farmacéuticos para TEP se pueden obtener de fuentes comerciales. Si los medios se obtienen de fuentes comerciales, entonces la prueba de promoción de crecimiento que emplea una sola especie de organismo adecuada se debe llevar a cabo durante la calificación inicial del proveedor y, en adelante, periódicamente (p.ej., trimestralmente).
CONTROLES DE PROCESO Y OPERATIVOS Controles de Proceso: Los siguientes controles de proceso deben establecerse y resumirse en una fórmula maestra para el producto farmacéutico para TEP. Se debe designar a una persona como responsable de asegurar que estas actividades se lleven a cabo y se completen de manera apropiada. 1. Se deben establecer criterios de aceptación escritos para la identidad, concentración, calidad y pureza de cada producto farmacéutico para TEP. Para productos farmacéuticos para TEP destinados para administración parenteral, las especificaciones deben incluir esterilidad y endotoxinas bacterianas. Cuando existe una monografía de la USP o cuando existen especificaciones previamente aceptadas por la agencia reglamentaria correspondiente (p.ej., FDA), entonces estos estándares, si corresponde, pueden utilizarse como los criterios de aceptación mínimos. 2. Los procedimientos escritos para la preparación de cada producto farmacéutico para TEP deben incluir lo siguiente: • Incorporar, para cada producto farmacéutico para TEP destinado para administración parenteral, filtración por membrana estéril (0,22 µm) o esterilización por vapor; • Incorporar, para cada producto farmacéutico para TEP destinado para inhalación, filtración de partículas (0,45 µm); • Describir procedimientos de limpieza de rutina para el equipo y las instalaciones; • Describir componentes, materiales e insumos usados para fabricar productos farmacéuticos para TEP, incluyendo precursores, estándares, reactivos, soluciones madre y artículos relacionados; • Describir el proceso y los pasos empleados para fabricar el producto farmacéutico para TEP; • Describir el proceso de formulación, incluyendo el uso de estabilizadores, soluciones amortiguadoras y otros agentes; • Describir los cálculos realizados para parámetros cuantitativos relacionados con la fabricación y el análisis de CC del producto farmacéutico para TEP (p.ej., incluir rendimiento radioquímico, pureza radioquímica, actividad específica, cantidades de disolvente, etc.); • Describir pruebas de control de calidad para el producto farmacéutico final para TEP (ver Controles y Criterios de Aceptación para Productos Farmacéuticos para TEP Terminados a continuación), incluyendo un programa que defina las pruebas que se deben realizar para cada partida y que indique si los resultados deben estar completados al momento de la liberación.
744 (823) Fármacos para Tomografía de Emisión de Positrones/ Pruebas Físicas
USP 39
3. Se debe verificar la calidad de cada partida de un producto farmacéutico para TEP, mediante el análisis del producto terminado total, antes de su uso para asegurar que el producto cumple con todas las especificaciones. 4. Para los casos en los que no sea posible o práctico llevar a cabo el análisis descrito en el párrafo anterior, la calidad de un producto farmacéutico para TEP también se puede asegurar mediante estudios de validación documentados, en lugar de pruebas previas a la liberación. Estos estudios deben cumplir con lo siguiente: • Demostrar que el proceso es uniforme y adecuado para la preparación del producto farmacéutico para TEP deseado; • Realizarse en tres partidas fabricadas de acuerdo con la fórmula maestra, en donde todas estas partidas deben cumplir con los criterios de aceptación; • Incluir la evaluación de identidad y pureza radioquímica, identidad y pureza radionucléidica, actividad específica, esterilidad (para productos farmacéuticos parenterales para TEP), endotoxinas bacterianas (para productos farmacéuticos parenterales para TEP), pH, apariencia, pureza estereoquímica (para compuestos aplicables), disolventes residuales, otros productos químicos tóxicos que pudieran haberse usado durante el procedimiento de síntesis o purificación, concentración efectiva de un estabilizante (si lo hubiere), pureza química del producto farmacéutico para TEP y equivalencia de subpartidas iniciales y finales (ver la sección anterior, Definiciones); • Repetirse si el proceso y los pasos descritos en la fórmula maestra han sido alterados de alguna manera que pudiera cambiar la identidad, concentración, calidad o pureza del producto farmacéutico para TEP; 5. Los procesos y pasos descritos en la fórmula maestra deben actualizarse según se requiera y revisarse anualmente para asegurar su vigencia. Antes de implementar cualquier actualización, será necesario llevar a cabo y aprobar una validación y/o verificación. Los controles apropiados de los equipos controlados por computadora deben asegurar que los cambios en el proceso sean instituidos únicamente por personal autorizado y que tales cambios sean documentados y verificados. Es indispensable crear copias de seguridad y controlar los métodos de producción, preparación magistral y análisis para evitar el uso accidental de métodos desactualizados. En lo que respecta a procesos o métodos de prueba de un proveedor que se usan sin alteraciones, es aceptable basarse en la certificación del proveedor para la verificación del software y la operación adecuada. Controles Operativos: Los controles operativos siguientes deben establecerse y resumirse en un registro de partida que es una parte de la fórmula maestra para el producto farmacéutico para TEP. El registro de partida debe documentar de manera adecuada el proceso de rutina para la fabricación del producto farmacéutico para TEP. Se debe designar a una persona como responsable de asegurar que estas actividades se lleven a cabo y se completen de manera apropiada. Los registros de partida completados y la documentación relacionada deberá conservarse durante un año después de la liberación de partida. 1. Se deben ejecutar los procedimientos de liberación de línea adecuados para evitar mezclas y contaminación cruzada, que incluyan la inspección de áreas usadas para fabricar y analizar productos farmacéuticos para TEP y la inspección de la limpieza y aptitud de todo el equipo antes de su uso. Retirar materiales y etiquetas que no correspondan a la partida de estas áreas y equipos. 2. Asegurar la identidad, concentración, calidad y pureza correctos de componentes, materiales e insumos usados en la preparación del producto farmacéutico para TEP. Etiquetar componentes según corresponda para propósitos de identidad y rastreabilidad. 3. Ejecutar procedimientos de limpieza de rutina para los equipos e instalaciones. 4. Preparar el producto farmacéutico para TEP de acuerdo con la fórmula maestra vigente y mantener un registro de partida para cada partida. Los registros de partida pueden constar de documentación en papel, registros electrónicos o una combinación de los mismos. Se deben verificar las planillas de cálculo y demás herramientas electrónicas para conservación de registros, a fin de asegurar la rastreabilidad, integridad de los datos, exactitud de resultados para cálculos, entre otros. El registro de partida debe incluir lo siguiente: • Los número de lote u otros identificadores únicos para todos los componentes, materiales e insumos usados para fabricar el producto farmacéutico para TEP; • Una descripción de los procedimientos individuales realizados; • Las iniciales, firma u otro identificador del individuo responsable de confirmar que se hayan completado los pasos y procesos críticos usados para fabricar y analizar el producto farmacéutico para TEP; • El rendimiento porcentual calculado con respecto a la cantidad conocida o esperada del radionucleido inicial que se incorpora sintéticamente al producto farmacéutico para TEP; • Los datos analíticos brutos de cada partida de producto farmacéutico para TEP; • Etiquetado para el producto farmacéutico para TEP (ver Etiquetado a continuación); • Cálculos para parámetros clave definidos en la fórmula maestra; • Resultados obtenidos de las pruebas de control de calidad del producto farmacéutico para TEP, incluyendo cromatogramas, listados impresos y demás datos de prueba; • Las iniciales del analista que realizó cada prueba de control de calidad; • Indicación del resultado de cada prueba de control de calidad, indicando si el resultado cumple o no con los criterios de aceptación; • La fecha y hora de la liberación y la firma del individuo que asume la responsabilidad general y el cumplimiento con los procedimientos definidos para fabricar la partida y que autoriza la liberación de la partida para administración en humanos; y • Documentación de las desviaciones del proceso en el registro de partida, cuando corresponda.
USP 39
Pruebas Físicas/ (823) Fármacos para Tomografía de Emisión de Positrones 745
Las entradas en los registros de partida se deben realizar inmediatamente después de haber llevado a cabo la actividad y deben incluir las iniciales, firma u otro identificador de la persona que registra la entrada. Las correcciones a las entradas en papel deben incluir fechas e iniciales, firmas o anotaciones con un identificador de la persona que efectúa las correcciones pero dejando la entrada original legible. Operaciones Asépticas para Productos Farmacéuticos Parenterales para TEP: Debido a que los resultados de las pruebas de esterilidad para productos farmacéuticos parenterales para TEP se obtienen después de la liberación para administración en humanos, las operaciones y procedimientos asépticos deben asegurar de manera adecuada la esterilidad del producto farmacéutico para TEP estéril. Todos los productos farmacéuticos para TEP preparados asépticamente para administración parenteral se deben filtrar a través de un filtro de membrana estéril con un tamaño de poro de 0,22 µm o menor en un vial o envase cerrado estéril o esterilizado mediante esterilización por vapor. Aunque la síntesis química de un producto farmacéutico parenteral para TEP se puede llevar a cabo en un aparato abierto o cerrado, la filtración por membrana del producto farmacéutico para TEP se debe realizar en un sistema cerrado posterior al filtro de membrana. Este sistema se debe ensamblar asépticamente, usando componentes preesterilizados, disponibles comercialmente. Componentes-Los componentes estériles usados en el aparato ensamblado asépticamente, por lo general, consisten en un vial vacío, agujas, filtros de membrana, agujas de venteo, jeringas, sistemas de tubos, llaves de paso, entre otros. Todos los componentes deben ser artículos preesterilizados disponibles comercialmente y de un solo uso. Si los componentes del aparato ensamblado asépticamente se esterilizan en la instalación donde se lleva a cabo la TEP, se deben verificar los procesos de esterilización. La configuración exacta del ensamble del vial de producto farmacéutico para TEP depende de cada proceso. Un ejemplo típico es un vial vacío, estéril, con un filtro de membrana con un tamaño de poro de 0,22 µm, unido a una aguja que se inserta a través del septo del vial para filtración, un filtro de membrana con un tamaño de poro de 0,22 µm unido a una aguja que se inserta a través del septo del vial para ventear el vial durante la filtración, y una jeringa con una aguja insertada a través del septo del vial para retirar la muestra de control de calidad después de completar la filtración. Ensamble del Vial de Producto Farmacéutico para TEP-Se deben usar técnicas asépticas en el ensamblaje del vial de producto farmacéutico para TEP, especialmente en el ensamble de todos los componentes subsiguientes al filtro de esterilización por membrana. Estas operaciones deben llevarse a cabo en un ambiente ISO Clase 5 (ver la sección anterior, Instalaciones y Equipo).
Después de ensamblar el vial de producto farmacéutico para TEP en el ambiente ISO Clase 5, el ensamble puede ser retirado hacia otra localización para filtración. Esta ubicación puede ser un ambiente no controlado siempre que no se comprometa durante el proceso la integridad del ensamble del vial de producto farmacéutico para TEP. Todo ensamble de vial de producto farmacéutico para TEP cuya integridad se vea comprometida durante dicho proceso, deberá ser desechado. Técnicas Asépticas-Cualquier componente estéril posterior al filtro de membrana que entre en contacto con el producto farmacéutico para TEP, deberá manipularse usando técnicas asépticas adecuadas, dentro de la estación de trabajo aséptica. Durante las operaciones asépticas, los operadores deben usar vestimentas adecuadas, que incluyen una bata de laboratorio limpia, mangas para antebrazos, cubre cabello, guantes higienizados que cubran las muñecas y cubrebarbas/bigote (según corresponda). Durante un solo ciclo operativo aséptico es posible preparar múltiples ensambles de viales de productos farmacéuticos para TEP. Las condiciones de almacenamiento y el tiempo de ensamble de los viales debe basarse en datos obtenidos de simulaciones asépticas. Inoculaciones para Pruebas de Esterilidad-Se deben llevar a cabo pruebas de esterilidad para evaluar la calidad de los productos farmacéuticos para TEP destinados para administración parenteral. La inoculación de los medios para pruebas de esterilidad se debe realizar de tal manera que se ajuste a los requisitos de exposición del personal a la radiación, al tiempo que minimice el riesgo de falsos positivos ocasionados por contaminación adventicia durante el proceso de inoculación. Para tubos de medios con abertura mediante tapa de rosca, la inoculación se debe realizar en la estación de trabajo aséptica. Los tubos de medios con una tapa de septo se pueden inocular en un área blindada que no contenga un filtro HEPA.
ESTABILIDAD Se deben establecer especificaciones escritas para la fecha de caducidad y las condiciones de almacenamiento de cada producto farmacéutico para TEP. La fecha de caducidad debe basarse en los resultados de las pruebas de estabilidad (y en requisitos de actividad específicos, según corresponda). Las pruebas de estabilidad del producto farmacéutico para TEP se deben llevar a cabo a la concentración más alta del producto farmacéutico para TEP y en el vial o envase final previsto. Se deben almacenar por lo menos tres partidas del producto farmacéutico para TEP de acuerdo con las condiciones propuestas y deberán examinarse una vez transcurrido un periodo equivalente a la vida útil propuesta. Asimismo, el producto farmacéutico para TEP debe cumplir con los criterios de aceptación para pureza radioquímica, apariencia (color y claridad), pH y efectividad del estabilizante (según corresponda) y pureza química al momento de la caducidad. Los métodos analíticos deben ser confiables, significativos y específicos. Los estudios de estabilidad deben repetirse si se presenta un cambio en la concentración, en el contenido de estabilizante (o conservante) que pudiera afectar la estabilidad, el vial o envase final, las condiciones de almacenamiento o la fecha de caducidad. Se deben documentar los resultados de las pruebas de estabilidad.
746 (823) Fármacos para Tomografía de Emisión de Positrones/ Pruebas Físicas
USP 39
CONTROLES Y CRITERIOS DE ACEPTACIÓN PARA PRODUCTOS FARMACÉUTICOS PARA TEP TERMINADOS Se deben establecer especificaciones escritas para la identidad, concentración, calidad y pureza de cada producto farmacéutico para TEP. Para productos farmacéuticos para TEP destinados para administración parenteral, se deben incluir especificaciones sobre esterilidad y endotoxinas bacterianas. Se deben desarrollar procedimientos escritos para pruebas de control de calidad. Se deben establecer requisitos sobre control de calidad y documentación para cada partida o subpartida de un producto farmacéutico para TEP (ver la sección anterior, Controles de Proceso y Operativos). Todas las pruebas de control de calidad deben ser ejecutadas por personal calificado y capacitado de acuerdo con los procedimientos escritos. La corta vida media de los radionucleidos para TEP con frecuencia impide completar todas las pruebas de control de calidad antes del envío del producto farmacéutico para TEP, lo que genera dos niveles de liberación, uno para distribución y el otro para administración en humanos. Lo anterior es aceptable siempre y cuando las pruebas de control de calidad requeridas para la liberación del producto farmacéutico para TEP para administración en humanos (ver a continuación) se completen antes de la administración. Los controles usados en la liberación para distribución deberán establecerse previamente por escrito y documentarse de manera rutinaria. No es necesario conservar muestras de reserva de productos farmacéuticos para TEP. Cuando se usa un procedimiento farmacopeico de la USP, éste deberá ser verificado para demostrar que la prueba funciona en las condiciones de uso reales. Los procedimientos de prueba no farmacopeicos usados para analizar un producto farmacéutico para TEP deben ser confiables y específicos. Los datos que respaldan todos los métodos analíticos deben estar documentados. Algunas pruebas de control de calidad se pueden omitir basándose en datos obtenidos de controles realizados durante el proceso o de estudios realizados sobre el proceso. Un ejemplo de este tipo de procedimiento es la exención de la determinación de clorodesoxiglucosa cuando se analiza PªF]fludesoxiglucosa. Se deben documentar los controles durante el proceso y los datos que respaldan los estudios realizados sobre los procesos. Pruebas de Control de Calidad: Las siguientes pruebas de control de calidad se deben llevar a cabo en cada partida antes de su liberación para adminstración: 1. Apariencia mediante inspección visual del color y transparencia (ausencia de partículas) para formas farmacéuticas parenterales. 2. Medición del pH para formas farmacéuticas parenterales. 3. Determinación de la pureza radioquímica e identidad para todas las formas farmacéuticas. 4. Determinación de la identidad radionucléidica de todas las formas farmacéuticas por medición de vida media. 5. Determinación de la concentración. 6. Determinación de la actividad específica de productos farmacéuticos para TEP cuya localización sea dependiente de la masa o cuya toxicidad sea preocupante. 7. Determinación de disolventes residuales usados en los procesos de síntesis o purificación. 8. Determinación de la pureza química y compuestos residuales usados en los procesos de síntesis o purificación (p.ej., el criptando [2.2.2]). 9. Determinación de conservante o estabilizante, si estuvieran presentes. Para productos farmacéuticos para TEP con radionucleidos con vidas muy cortas, preparar una subpartida inicial para control de calidad que sea representativa de las subpartidas subsiguientes que se preparan en un ciclo operativo definido. Las pruebas de control de calidad descritas en el párrafo anterior se deben tomar en cuenta para la subpartida de control de calidad antes de la liberación de subpartidas subsiguientes para administración en humanos. Para partidas subsiguientes de formas farmacéuticas parenterales y de inhalación, se debe llevar a cabo una inspección visual antes de la administración en humanos. En algunos casos, puede ser apropiado realizar un análisis limitado de cada subpartida antes de su administración (p.ej., determinación de pH en el caso de [BN]amoníaco producido por la aleación de Devarda). Pruebas Periódicas Indicadoras de Calidad: En todos los productos farmacéuticos para TEP, se debe medir periódicamente la pureza radionucléidica de muestras desintegradas del producto, a fin de evaluar la presencia de radionucleidos de vida larga producidos durante el bombardeo con el acelerador de partículas. En productos farmacéuticos para TEP marcados con ciertos radionucleidos (p.ej., 94mTc, 124 1, 64 Cu, 76Br, entre otros), se deberá considerar la medición de pureza radionucléidica mediante espectrometría por emisión de rayos gamma. Las pruebas periódicas indicadoras de calidad de productos farmacéuticos para TEP también incluyen impurezas no tóxicas de bajo nivel (p.ej., disolventes residuales Clase 3). Las pruebas periódicas deben llevarse a cabo en intervalos predeterminados en lugar de partida por partida. Pruebas Microbiológicas para Productos Farmacéuticos para TEP Estériles: Para productos farmacéuticos para TEP destinados para administración parenteral, realizar las siguientes pruebas de control de calidad, además de las descritas anteriormente: 1. Determinar la integridad del filtro de membrana. Las unidades de filtro usadas para esterilizar productos farmacéuticos para TEP deben someterse a las pruebas de integridad recomendadas por el fabricante, como por ejemplo, la prueba de punto de burbuja. La prueba de integridad del filtro se realiza después de completar la filtración y antes de liberar el producto farmacéutico para TEP para administración en humanos. En el caso de productos farmacéuticos para TEP con T, 12 < 1 O minutos, el producto farmacéutico para TEP se puede liberar para administración en humanos antes de completar la prueba de integridad del filtro. En este caso, la prueba debe completarse lo más pronto posible, después de la liberación.
USP 39
Pruebas Físicas/ (823) Fármacos para Tomografía de Emisión de Positrones 747
2. Efectuar una prueba de endotoxinas bacterianas en cada partida o subpartida de control de calidad de un producto farmacéutico para TEP. La prueba se puede llevar a cabo usando los procedimientos reconocidos en la USP (ver Prueba de Endotoxinas Bacterianas (85)). Independientemente de la prueba que se utilice, ésta debe iniciarse antes de la liberación de cada partida para administración en humanos. Para productos farmacéuticos para TEP con radionucleidos con vidas muy cortas, completar la prueba en la subpartida de control de calidad antes de la liberación de subpartidas subsiguientes para administración en humanos. Luego de haber registrado el éxito de una prueba de endotoxinas bacterianas en un producto farmacéutico para TEP en particular, sólo será necesario analizar la primera partida de cada día para dicho producto. 3. Efectuar una prueba de esterilidad en cada partida o en cada subpartida de control de calidad. La prueba de esterilidad consiste en la inoculación e incubación de una muestra en cada uno de dos medios: caldo tripticasa de soja y tioglicolato líquido. El volumen inoculado se puede ajustar para evitar pérdidas excesivas debidas a la prueba de esterilidad (p.ej., O, 1 mL inoculados en 1O mL de medio). El periodo de incubación para pruebas de esterilidad debe comenzar dentro de las 30 horas posteriores a la filtración por membrana. Las muestras se pueden inocular inmediatamente después de completar la filtración por membrana, o se puede dejar que se deterioren en un área blindada durante un máximo de 30 horas antes de la inoculación. Se permite exceder el periodo de 30 horas debido a fines de semana o días feriados siempre y cuando se demuestre que dicha extensión no reduce de manera significativa la viabilidad de un organismo indicador adecuado en la muestra. La prueba de esterilidad se puede llevar a cabo usando otros procedimientos reconocidos en la USP (ver Pruebas de Esterilidad (71 )). Las muestras deben analizarse individualmente y no se pueden combinar. Una vez que se haya establecido el registro de una prueba de esterilidad exitosa para un producto farmacéutico para TEP en particular, sólo será necesario analizar la primera partida preparada cada día para dicho producto farmacéutico para TEP. Pruebas de Liberación Condicionada Final: Puede ser apropiado liberar condicionalmente una partida cuando no sea posible completar una prueba de control de calidad requerida para un producto farmacéutico para TEP debido a una falla en el equipo de análisis. Los productos farmacéuticos para TEP no pueden ser liberados sin determinar su identidad y pureza radioquímicas. La partida puede liberarse siempre que se cumplan las siguientes condiciones: 1. Revisar los datos históricos de control de calidad para evaluar la frecuencia de resultados fuera de la especificación o fallas relacionadas con la prueba de control de calidad. La liberación condicionada es apropiada únicamente cuando los datos históricos develan un registro de culminación exitosa de la prueba de control de calidad. 2. Confirmar que los criterios de aceptación se cumplen para todas las demás pruebas de control de calidad para la partida. 3. Conservar una muestra de la partida que es objeto de liberación condicionada. 4. Corregir lo antes posible la falla del equipo de prueba. 5. Completar la prueba de control de calidad omitida en la muestra lo más pronto posible, después de que se haya corregido la falla. Este último paso no será necesario si el resultado del control de calidad omitido es intrascendente una vez que el producto farmacéutico para TEP se haya desintegrado. 6. Si la muestra no pasa la prueba de control de calidad omitida, notificar inmediatamente al médico o a la instalación receptora que ordenó el producto farmacéutico para TEP. 7. Documentar todas las acciones relacionadas con la liberación condicionada del producto farmacéutico para TEP, incluyendo la justificación de la liberación, los resultados de la prueba completada, así como cualquier notificación y acción correctiva y preventiva que haya resultado del incidente. Además de la prueba de control de calidad terminada, otras determinaciones de laboratorio apropiadas pueden implicar lo siguiente: análisis durante el proceso de un atributo que sea equivalente al análisis del producto terminado de dicho atributo; monitoreo estadístico continuo del proceso; o una combinación de estos procedimientos con el análisis concluido de cada producto farmacéutico para TEP.
PRODUCTOS FARMACÉUTICOS PARA TEP QUE NO CUMPLEN CON LAS ESPECIFICACIONES Cuando el resultado de una prueba de control de calidad para un producto farmacéutico para TEP no cumple con los criterios de aceptación establecidos, el resultado se considera fuera de la especificación. Un resultado fuera de la especificación no necesariamente significa que el producto farmacéutico para TEP es fallido y que debe rechazarse, sino que se debe llevar a cabo una investigación para resultados fuera de la especificación a fin de determinar si dicho resultado indica una falla real o un error analítico. Si la investigación de los resultados fuera de especificación determina que dicho resultado fue ocasionado por un error analítico, se debe invalidar la prueba original. Si hay una impresión de los resultados de la prueba, se debe marcar dicho resultado impreso como inválido, conservarlo en el registro de partida y repetir la prueba. Si la investigación de los resultados fuera de especificación determina que dicho resultado fue una falla real, la partida deberá ser rechazada y no se podrá liberar para administración en humanos. Segregar la partida para evitar que sea utilizada. Investigar todas las fallas y documentar los resultados de acuerdo con los procedimientos escritos. La investigación debe incluir, entre otros elementos, la evaluación de procesos, operaciones y registros de partidas previas, así como quejas y demás fuentes de información pertinentes. De ser posible, se debe asignar una causa real o probable a la falla, además de documentar las acciones correctivas tomadas como resultado de la investigación. Dependiendo de la naturaleza de la falla, el producto farmacéutico para TEP puede reprocesarse de acuerdo con los procedimientos escritos preestablecidos (ver la sección Reprocesamiento a continuación).
748 (823) Fármacos para Tomografía de Emisión de Positrones/ Pruebas Físicas
USP 39
Cuando una prueba de esterilidad de un producto farmacéutico para TEP presenta señales de crecimiento microbiano, el resultado de la prueba se considera fuera de especificación, por lo que deberá ser investigado. Una vez completada la investigación, notificar de inmediato a todas las instalaciones receptoras si el producto no cumple con el criterio de esterilidad, incluyendo los hallazgos microbiológicos de la investigación.
REPROCESAMIENTO Si un producto farmacéutico para TEP es rechazado debido a una falla real, la partida podría reprocesarse de acuerdo con los procedimientos establecidos. Aunque resulta imposible describir todas las operaciones de reprocesamiento, a continuación se presentan algunos ejemplos: • Ajuste de pH; • Cuando se presente una prueba de integridad del filtro fallida, un segundo pasaje a través de un filtro de membrana; y • Un segundo pasaje por una columna de purificación para eliminar una impureza. Cuando se reprocesa un producto farmacéutico para TEP, la partida reprocesada debe someterse a pruebas para asegurar que cumple con los criterios de aceptación establecidos para el producto farmacéutico para TEP antes de su liberación para administración en humanos.
ETIQUETADO La siguiente información debe aparecer en la etiqueta adherida al envase final del producto farmacéutico para TEP: • El nombre del producto farmacéutico para TEP, incluyendo la forma farmacéutica; • El número de partida asignado; y • Declaraciones o símbolos de advertencia (p.ej., exclusivamente para uso en investigación clínica, radioactivo). La siguiente información debe aparecer en el blindaje del producto farmacéutico para TEP: • El nombre del producto farmacéutico para TEP, incluyendo la forma farmacéutica; • El número de partida asignado; • La fecha y hora de la calibración; • Declaraciones o símbolos de advertencia (p.ej., exclusivamente para uso en investigación clínica, radioactivo); •La radioactividad total en MBq (o mCi) o la concentración en MBq/mL (o mCi/mL) al momento de la calibración, según corresponda; • Fecha y hora de caducidad; • Sustancias agregadas (p.ej., ingredientes inactivos del estabilizante); • El nombre del establecimiento productor donde se fabricó el producto farmacéutico para TEP o el nombre del distribuidor; • Cualquier otra advertencia aplicable (p.ej., "No usar si presenta turbidez o si contiene partículas" o etiquetado para uso en investigación clínica); y • Cualquier otra información relevante (si se requiere), como por ejemplo, condiciones de almacenamiento y vida media.
(831) ÍNDICE DE REFRACCIÓN El índice de refracción (n) de una sustancia es la relación entre la velocidad de la luz en el aire y la velocidad de la luz en la sustancia. Es valioso en la identificación de sustancias y en la detección de impurezas. La temperatura estándar en las determinaciones farmacopeicas es 25º pero a menudo las especificaciones en las monografías individuales indican que es necesario calcular el valor del índice de refracción a 20º. Es necesario ajustar y mantener la temperatura cuidadosamente ya que el índice de refracción varía considerablemente con la temperatura. Los valores del índice de refracción indicados en esta Farmacopea son para la línea D de sodio (doblete a 589,0 nm y 589,6 nm). La mayoría de los instrumentos disponibles están diseñados para usarse con luz blanca pero están calibrados para expresar el índice de refracción con respecto a la línea D de la luz de sodio. El refractómetro Abbé mide la gama de índices de refracción de los materiales farmacopeicos para los cuales se indican dichos valores. Se pueden utilizar otros refractómetros de igual o mayor precisión. Para lograr la exactitud teórica de ±0,0001, es necesario calibrar el instrumento contra un estándar suministrado por el fabricante y comprobar con frecuencia el control de temperatura y la limpieza del instrumento mediante la determinación del índice de refracción de agua destilada, cuyos valores son 1,3330 a 20º y 1,3325 a 25º.
USP 39
Pruebas Físicas / (841) Peso Específico 749
(841) PESO ESPECÍFICO A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, la determinación del peso específico sólo se aplica a líquidos y, a menos que se especifique algo diferente, se calcula como el cociente entre el peso de un líquido en el aire a 25º y el de un volumen igual de agua a la misma temperatura. Si en la monografía individual se indica una temperatura, el peso específico es el cociente entre el peso del líquido en el aire a la temperatura indicada y el de un volumen igual de agua a la misma temperatura. Si la sustancia es un sólido a 25º, determinar el peso específico del material fundido a la temperatura indicada en la monografía individual y referirse al agua a 25º. A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, la densidad se define como la masa de una unidad de volumen de la sustancia a 25º, expresada en kilogramos por metro cúbico o en gramos por centímetro cúbico (1 kg/m3 = 10-3 g/cm 3). Cuando se conoce la densidad, la masa se puede convertir a volumen o viceversa, mediante la fórmula: volumen = masa/densidad. A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, usar el Método /.
MÉTODO 1 Procedimiento-Seleccionar un picnómetro escrupulosamente limpio y seco que haya sido previamente calibrado mediante la determinación de su peso y el peso de agua recién hervida contenida en él a 25º. Ajustar la temperatura del líquido aproximadamente a 20º y llenar el picnómetro. Ajustar la temperatura del picnómetro lleno a 25º, retirar todo exceso de líquido y pesar. Cuando la monografía especifique una temperatura diferente a 25º, los picnómetros llenos deben elevarse a la temperatura de la balanza antes de ser pesados. Restar el peso de tara del picnómetro del peso llenado. El peso específico del líquido es el cociente que se obtiene al dividir el peso del líquido contenido en el picnómetro por el peso del agua contenida en éste, ambos determinados a 25º, a menos que en la monografía individual se especifique algo diferente.
MÉTODO 11 El procedimiento incluye el uso del densímetro transductor oscilante. El aparato consiste en lo siguiente: • un tubo en forma de U, por lo general de vidrio de borosilicato, que contiene el líquido que se va a examinar; • un sistema de excitación magnetoeléctrico o piezoeléctrico que hace oscilar al tubo como un oscilador en voladizo a una frecuencia característica que depende de la densidad del líquido que se va a examinar; • un medio para determinar el período de oscilación (7), que el aparato puede convertir para arrojar una lectura directa de densidad o que puede ser utilizado para calcular densidades a través de las constantes A y B descritas más adelante; y • un medio para determinar y/o controlar la temperatura del transductor oscilante que contenga el líquido que se va a probar. El período de oscilación es una función de la constante del resorte (e) y de la masa del sistema:
T2
= {{M/c) + [{p x V)/c]} x 4rr2
en donde pes la densidad del líquido que se va a analizar, Mes la masa del tubo y V es el volumen del tubo lleno. La introducción de dos constantes A= c/{4rr 2 x V) y B = (M/V), lleva a la ecuación clásica del transductor oscilante:
p=Ax T2-B El peso específico del líquido se provee mediante la fórmula: PrL/PrwJ
en donde P!L! y Prw¡ son las densidades del líquido y del agua, respectivamente, ambas determinadas a 25º, a menos que se especifique algo diferente en la monografía individual. Calibración-Las constantes A y B se determinan al operar el instrumento con el tubo en forma de U llenado con dos muestras diferentes con densidad conocida (p.ej., agua desgasificada y aire). Llevar a cabo las mediciones de control diariamente usando agua desgasificada. Los resultados mostrados para la medición de control usando agua desgasificada no se desvían del valor de referencia {p25 = 0,997043 g/cm 3) más allá del error especificado. La precisión es una función de la capacidad de repetición y de la estabilidad de la frecuencia del oscilador. Los densímetros pueden obtener mediciones con un error del orden de 1xl0-3 g/cm3 a 1 xl g/cm3 y una capacidad de repetición de 1xl0-4 g/cm3 a 1xl0-6 g/cm3. Por ejemplo, un instrumento especificado a ±1xl0-4 g/cm 3 debe mostrar 0,9970 ± 0,0001 g/cm 3 para poder usarse en mediciones posteriores o, de lo contrario, necesitará un ajuste. Se debe llevar a cabo la calibración regular con materiales de referencia certificados. Procedimiento-Seguir las instrucciones del fabricante para llevar a cabo mediciones empleando el mismo procedimiento utilizado para la Calibración. Si fuera necesario, equilibrar el líquido que será examinado a 25º antes de introducirlo en el tubo para evitar la formación de burbujas y reducir el tiempo necesario para obtener la medición. Los factores que afectan la precisión incluyen los siguientes:
o-s
750 (841 ) Peso Específico / Pruebas Físicas
• • • •
USP 39
uniformidad de la temperatura en todo el tubo, falta de linealidad en un rango de densidad, efectos resonantes parásitos, y viscosidad, si los densímetros transductores oscilantes empleados no proporcionan compensación automática para la influencia de la viscosidad de la muestra.
(846) ÁREA SUPERFICIAL ESPECÍFICA INTRODUCCIÓN El área superficial específica de un polvo se determina mediante la adsorción física de un gas sobre la superficie del sólido, calculando la cantidad de gas adsorbida que corresponde a una capa monomolecular en la superficie. La adsorción física es el resultado de fuerzas relativamente débiles (fuerzas de van der Waals) entre las moléculas del gas adsorbato y la superficie adsorbente del polvo de prueba. Generalmente, la determinación se lleva a cabo a la temperatura del nitrógeno líquido. La cantidad de gas adsorbido puede medirse por un procedimiento volumétrico o de flujo continuo.
TEORÍA DE BRUNAUER, EMMETT Y TELLER {BET) Y DETERMINACIÓN DE ÁREA ESPECÍFICA Medición de Múltiples Puntos Los datos se tratan según la ecuación de la isoterma de adsorción de Brunauer, Emmett y Teller (BET):
p
=
Po
v.
= =
vm e
= =
presión parcial de vapor de gas adsorbato en equilibrio con la superficie a 77,4 K (punto de ebullición del nitrógeno líquido), en Pa, presión de saturación del gas adsorbato, en Pa; volumen de gas adsorbido a temperatura y presión estándar (STP, por sus siglas en inglés) [273, 15 K y presión atmosférica de (1,013 x 1os Pa)], en ml; volumen de gas adsorbido a STP que produce una monocapa aparente en la superficie de la muestra, en ml; una constante adimensionada relacionada con la entalpía de adsorción del gas adsorbato sobre la muestra de polvo.
Se mide un valor de Luego, el valor BET
v. en cada uno de no menos de tres valores de P/P
0•
se grafica en función de P/P 0 , conforme a la ecuación (1 ). Este gráfico debe producir una línea recta en el intervalo de presión relativo aproximado de 0,05 a 0,3. Los datos se consideran aceptables si el coeficiente de correlación, r, de la regresión lineal no es menor de 0,9975; es decir, r2 no es menor de 0,995. A partir de la gráfica lineal resultante, la pendiente, que es igual a (C - 1)/Vme y la intersección, que es igual a 1/Vme, se evalúan por análisis de regresión lineal. A partir de estos valores, Vmse calcula como 1/(pendiente+ intersección), mientras que C se calcula como (pendiente/ intersección) + 1. A partir del valor de Vm así determinado se calcula el área específica, S, en mz · g-1 , por la ecuación: S = (VmNa)/(m x 22 400) N
a m
22400
= = = =
(2)
constante de Avogadro (6,022 x 1023 mol-1), área efectiva de sección transversal de una molécula de adsorbato, en nanómetros cuadrados (O, 162 nm 2 para el nitrógeno y O, 195 nm 2 para el criptón), masa de polvo de prueba, en g volumen, en ml, ocupado por 1 mol de qas adsorbato a STP, admitiendo pequeñas desviaciones del estado ideal.
Es necesario un mínimo de tres datos. Se pueden llevar a cabo mediciones adicionales, especialmente cuando falta linealidad a un valor P/P 0 cercano a 0,3. Como la no linealidad se obtiene a menudo con valores P/P0 por debajo de 0,05, no se recomiendan los valores en esta región. La prueba de linealidad, el tratamiento de los datos y el cálculo del área superficial específica de la muestra se han descrito anteriormente.
USP 39
Pruebas Físicas/ (846) Área Superficial Específica 751
Medición con un Único Punto Normalmente se necesitan como mínimo tres mediciones de v., cada una a distintos valores de P/P 0 , para determinar el área superficial específica mediante la técnica de la adsorción de gas por flujo dinámico (Método /) o mediante la técnica volumétrica de adsorción de gas (Método 11). Sin embargo, bajo ciertas circunstancias que se describen a continuación, puede ser aceptable determinar el área superficial específica de un polvo con un único valor de v. medido a un único valor de P/P0 como por ejemplo 0,300 (correspondiente a 0,300 moles de nitrógeno o a una fracción molar de criptón de 0,001038), empleando la siguiente ecuación para calcular vm:
Luego se calcula el área superficial específica a partir del valor de Vm con la ecuación (2) indicada anteriormente. El método de un único punto puede emplearse directamente para una serie de muestras de polvo de un material dado cuando la constante del material C es mucho mayor que la unidad. Estas circunstancias pueden verificarse por comparación de los valores de área específica determinados por el método de un único punto con los valores determinados por el método de puntos múltiples para una serie de muestras de polvo. La semejanza estrecha entre los valores obtenidos con un único punto y con múltiples puntos sugiere que 1 /C se aproxima a cero. El método de un único punto puede emplearse indirectamente para una serie de muestras de polvo similares de un material dado cuando la constante del material C no es infinita, pero se puede suponer que no varía. En estas circunstancias, el error asociado al método de un único punto puede reducirse o eliminarse empleando el método de puntos múltiples para evaluar C para una de las muestras de las serie a partir del gráfico de BET, en el cual C se calcula como (1 +pendiente /intersección). Luego se calcula Vm a partir del valor único de v. medido a un único valor de P/P 0 , por la ecuación: vm = v.[(Po/P)-1] [(l/C) + ((C -1)/C)
X
(P/Po)l
(4)
Luego se calcula el área específica a partir del valor de Vm con la ecuación (2) antedicha.
TÉCNICAS EXPERIMENTALES Esta sección describe los métodos que se utilizan para la preparación de la muestra, la técnica de adsorción de gas por flujo dinámico (Método /)y la técnica volumétrica de adsorción de gas (Método 11).
Preparación de la Muestra DESGASIFICACIÓN Antes de determinar el área superficial específica de la muestra, es necesario eliminar los gases y vapores adsorbidos físicamente en la superficie después de la fabricación y durante el tratamiento, manipulación y almacenamiento. Si no se logra la desgasificación, el área superficial específica podría reducirse o variar, puesto que parte de la superficie estaría cubierta con moléculas de los gases o vapores previamente adsorbidos. Las condiciones de desgasificación son de vital importancia para obtener la precisión y la exactitud requeridas de las mediciones de área específica de sustancias farmacéuticas debido a la sensibilidad de la superficie de los materiales. Se debe demostrar que las condiciones de desgasificación proporcionan gráficos BET reproducibles, un peso constante de polvo de prueba y ningún cambio físico o químico detectable en el polvo de prueba. Las condiciones de desgasificación definidas por la temperatura, la presión y el tiempo deben elegirse de tal modo que la superficie original del sólido se reproduzca lo más posible. Con frecuencia, la desgasificación de muchas sustancias se logra mediante la aplicación de vacío o purgando la muestra en una corriente de un gas no reactivo, seco o aplicando un método de ciclos de desorción y adsorción. En cualquiera de los casos, algunas veces se aplican temperaturas elevadas para aumentar la velocidad de eliminación de los contaminantes desde la superficie. Se debe tener cuidado cuando se desgasifiquen muestras de polvo con temperaturas elevadas, con el fin de evitar la degradación de la muestra. Si se emplea calor, la temperatura y el tiempo de desgasificación recomendados deben ser tan bajos como sea posible para lograr mediciones de área superficial específica reproducibles dentro de un plazo aceptable. Para desgasificar muestras sensibles, se pueden emplear otros métodos de desgasificación, tal como el método de los ciclos de deserción y adsorción. ADSORBATO La técnica estándar es la adsorción de nitrógeno de calidad analítica a la temperatura del nitrógeno líquido. Para polvos de área superficial específica pequeña (<0,2 m2g-1), la proporción adsorbida es pequeña. En tales casos, se prefiere usar criptón a la temperatura del nitrógeno líquido porque su baja presión de vapor reduce el error en gran medida. El uso de cantidades mayores de muestra, cuando fuera posible (equivalentes a áreas totales de 1 m 2 o mayores empleando nitrógeno), pueden compensar los errores para determinar áreas pequeñas. Todos los gases empleados deben estar exentos de humedad.
752 (846) Área Superficial Específica / Pruebas Físicas
USP 39
CANTIDAD DE MUESTRA Medir con exactitud una cantidad de polvo de prueba desgasificado de forma tal que el área de la superficie total sea como mínimo de 1 m 2 cuando el adsorbato es nitrógeno y de 0,5 m 2 cuando el adsorbato es criptón. Se pueden emplear cantidades menores de muestra después de la validación correspondiente.
Mediciones Como la cantidad de gas adsorbido a una presión dada tiende a aumentar cuando disminuye la temperatura, las mediciones de adsorción por lo general se realizan a temperaturas bajas. Las mediciones se realizan a 77,4 K, el punto de ebullición del nitrógeno líquido.
Método 1: Método de Flujo Dinámico PRINCIPIO En el método de flujo dinámico (ver Figura 1), el gas adsorbato recomendado es criptón o nitrógeno secos, mientras que se emplea helio como gas diluyente, el cual no se adsorbe bajo las condiciones recomendadas. Se requiere un mínimo de tres mezclas del gas adsorbato apropiado con helio dentro de un intervalo de P/P 0 entre 0,05 y 0,30. El detector de gas-integrador debe proporcionar una señal que sea aproximadamente proporcional al volumen de gas que lo atraviesa en condiciones definidas de presión y temperatura. Con este fin, entre los distintos tipos de dispositivos adecuados se cuenta un detector de conductividad térmica con un integrador electrónico. Se determina un mínimo de tres puntos dentro del intervalo recomendado de 0,05 a 0,30 de P/P 0 • Conexión rápida autosellante
Argollas de sello Válvula de control de flujo
¡
Septo de calibración
fr
Flujómetro Válvula selectora de paso
='
J Difusor
o="
¡:¡.
"'
"' .e
= =:
;:
trampa fri
::i. o
....
Controlador de flujo diferencial Válvula de encendido/ apagado Entrada de Gas
"''
ª
::;· o
Celda de muestra
Estación de desgasificación
Balastro de paso Balastro corto de paso ,._--._largo
A
B
Detector
Detector
Venteo
Figura 1. Diagrama esquemático del aparato para el método por flujo dinámico. PROCEDIMIENTO Se hace pasar una mezcla conocida de gases, por lo general nitrógeno y helio, a través de una celda de conductividad térmica, nuevamente a través de la muestra, a través de la celda de conductividad térmica y posteriormente hasta un potenciómetro registrador. La celda de muestra se sumerge en nitrógeno líquido y la muestra adsorbe nitrógeno de la fase móvil. Esto desequilibra la celda de conductividad térmica y se genera un pulso en la gráfica del registrador. Se retira la muestra del refrigerante; esto proporciona un pico de desorción igual en área y en dirección opuesta al pico de adsorción. Debido a que éste está mejor definido que el pico de adsorción, es el que se emplea para la determinación. Para efectuar la calibración, se inyecta en el sistema una cantidad conocida de adsorbato, suficiente para proporcionar un pico de magnitud similar al pico de desorción y se obtiene la proporción de volumen de gas por unidad de área de pico. Para una determinación en un único punto se emplea una mezcla de nitrógeno y helio; y para la determinación de puntos múltiples se usan varias mezclas similares o mezclas previas de dos corrientes de gas. Los cálculos son los mismos que en el método volumétrico.
Pruebas Físicas/ (846) Área Superficial Específica 753
USP 39
Método 11: Método Volumétrico PRINCIPIO En el método volumétrico (ver Figura 2), el gas adsorbato recomendado es nitrógeno, que puede acceder al espacio vacío ubicado encima de la muestra de polvo previamente desgasificada para proporcionar una presión de equilibrio definida, P, del gas. El empleo de un gas diluyente, tal como helio, es por lo tanto innecesario, a pesar de que el helio puede emplearse para otros fines, como por ejemplo para medir el volumen muerto. Dado que se emplea solamente gas adsorbato puro, en lugar de una mezcla de gases, al emplear este método se evitan los efectos de interferencia de la difusión térmica.
A las trampas frías vacío
y bombas de vacío
7. 8 Reservorio de helio
Manómetro de presión de vapor
Figura 2.
Diagrama esquemático del aparato para el método volumétrico. PROCEDIMIENTO
Colocar una cantidad pequeña de nitrógeno seco en el tubo de la muestra para evitar la contaminación de la superficie limpia, retirar el tubo de la muestra, taparlo y pesarlo, y calcular el peso de la muestra. Conectar el tubo de la muestra al aparato volumétrico. Cuidadosamente aplicar vacío sobre la muestra a la presión especificada (por ejemplo, entre 2 Pa y 1O Pa). Alternativamente, algunos instrumentos se operan aplicando vacío a una velocidad definida de cambio de presión (por ejemplo, menos de 1 3 Pa/30 s) y manteniéndola durante un período de tiempo antes de comenzar el siguiente paso. Si el principio de operación del instrumento requiere la determinación del volumen muerto en el tubo de la muestra, por ejemplo, mediante la admisión de un gas no adsorbido, tal como helio, este procedimiento se lleva a cabo en este momento, seguido de la aplicación de vacío a la muestra. La determinación del volumen muerto se puede evitar usando mediciones diferenciales: es decir, por medio de tubos de referencia y de muestra conectados mediante un transductor diferencial. Luego se mide la adsorción de nitrógeno gaseoso como se describe a continuación. Elevar el vaso Dewar que contiene nitrógeno líquido a 77,4 K hasta un punto definido en la celda de muestra. Dejar entrar una cantidad suficiente de gas adsorbato para proporcionar la presión relativa deseada más baja. Medir el volumen adsorbido, Para mediciones de múltiples puntos, repetir la medición de a valores P/P0 sucesivamente mayores. Cuando se utiliza nitrógeno como gas adsorbato, los valores de P/P 0 de O, l O; 0,20 y 0,30 son a menudo adecuados.
v•.
v.
Materiales de Referencia Verificar periódicamente el funcionamiento del aparato empleando materiales de referencia apropiados de áreas conocidas que tengan un área superficial específica similar a la de la muestra que se debe examinar.
754 (851) Espectrofotometría y Dispersión de Luz/ Pruebas Físicas
USP 39
Eliminar lo siguiente:
·(851) ESPECTROFOTOMETRÍA Y DISPERSIÓN DE LUZ MEDICIONES EN EL ULTRAVIOLETA, VISIBL,E, INFRARROJO, ~BSORCIÓN ATÓMICA, FLUORESCENCIA, TURBIDIMETRIA, NEFELOMETRIA V RAMAN La espectrofotometría de absorción es la medición de una interacción entre una radiación electromagnética y las moléculas o átomos de una sustancia química. Las técnicas que se emplean frecuentemente en el análisis farmacéutico incluyen la espectroscopia de absorción atómica, en el espectro UV, en el visible y en el IR. La medición espectrofotométrica en la región visible anteriormente se denominaba colorimetría; sin embargo, es más preciso emplear el término "colorimetría" sólo en aquellos casos en que se considera la percepción humana del color. La Espectrofotometría de Fluorescencia es la medición de la emisión de luz de una sustancia química cuando se expone a la radiación UV, visible u otra radiación electromagnética. Por lo general, la luz emitida por una solución fluorescente tiene una intensidad máxima a una longitud de onda mayor que la de la radiación de excitación, por lo general en aproximadamente 20 ó 30 nm. La Dispersión de Luz implica la medición de la luz dispersada debido a inhomogeneidades submicroscópicas de densidad óptica de las soluciones y es útil para la determinación de pesos moleculares promedio de sistemas polidispersos en el intervalo de pesos moleculares que varían desde 1000 a varios cientos de millones. Dos de estas técnicas utilizadas en el análisis farmacéutico son la turbidimetría y la nefelometría. La Espectroscopia Raman (dispersión de luz inelástica) es un proceso de dispersión de luz en el que la muestra a examinar se irradia con luz monocromática intensa (generalmente luz láser) y luego se analiza la luz dispersada por Ja muestra para detectar cambios de frecuencia. El intervalo de longitud de onda disponible para estas mediciones se extiende desde las longitudes de onda corta del UV hasta el IR. Por conveniencia, este intervalo espectral está aproximadamente dividido en el UV (190 a 380 nrn), el visible (380 a 780 nm), el IR cercano (780 a 3000 nm) y el IR (2,5 a 40 µm o 4000 a 250 cm- 1).
UTILIDAD COMPARATIVA DE INTERVALOS ESPECTRALES En el caso de muchas sustancias farmacéuticas, las mediciones pueden hacerse con mayor exactitud y sensibilidad en las regiones del UVy visible del espectro que en las del IR cercano e IR. Cuando se observan soluciones en celdas de 1 cm, las concentraciones de aproximadamente 1 O µg de muestra por ml a menudo producen absorbancias entre 0,2 y 0,8 en el UV o la región de luz visible. En el IR e IR cercano, pueden ser necesarias concentraciones de 1 a 1O mg por rnL y de hasta 100 mg por mL, respectivamente, para que se produzca una absorción suficiente; para estos intervalos espectrales, se utilizan celdas con longitudes de 0,01 mm a más de 3 mm. Por lo general, los espectros UV y visible de las sustancias no tienen un alto grado de especificidad. Sin embargo, son muy apropiados para realizar valoraciones cuantitativas y, en el caso de muchas sustancias, son útiles como medios adicionales de identificación. Se ha observado un creciente interés en el uso de la espectroscopia del IR cercano en análisis farmacéuticos, especialmente para la identificación rápida de un gran número de muestras y también para la determinación del agua. La región del IR cercano es especialmente apropiada para la determinación de grupos -OH y-NH, como por ejemplo agua en alcohol, -OH en presencia de aminas, alcoholes en hidrocarburos y aminas primarias y secundarias en presencia de aminas terciarias. El espectro IR es único para cualquier compuesto químico dado, con la excepción de los isómeros ópticos que tienen espectros idénticos. Sin embargo, en algunas ocasiones, el polimorfismo puede ser responsable de una diferencia en el espectro IR de un compuesto en estado sólido. Con frecuencia, pequeñas diferencias en la estructura producen diferencias significativas en los espectros. Debido al gran número de valores máximos en un espectro de absorción IR, a veces es posible medir cuantitati· vamente los componentes individuales de una mezcla con una composición cualitativa conocida sin separación previa. El espectro Raman y el espectro IR proporcionan datos similares, aunque las intensidades de los espectros están gobernadas por diferentes propiedades moleculares. La espectroscopia Raman y la IR muestran diferentes sensibilidades relativas para diferentes grupos funcionales; por ejemplo, la espectroscopia Rarnan es particularmente sensible a enlaces múltiples C-S y C-C y algunos compuestos aromáticos se identifican más fácilmente mediante sus espectros Raman. El agua tiene un espectro de absorción IR muy intenso, pero un espectro Raman particularmente débil. En consecuencia, el agua tiene únicamente "ventanas" limitadas en el IR, que se pueden utilizar para examinar solutos acuosos, mientras que su espectro Raman es casi completamente transparente y útil para la identificación de solutos. Las dos limitaciones principales de la espectroscopia Raman son que la concentración mínima detectable de la muestra generalmente es de 10-1 M a 10-2 M y que las impurezas presentes en muchas sustancias son fluorescentes e interfieren con la detección de la señal Raman dispersada. Las mediciones de reflectancia óptica proporcionan información espectral similar a la obtenida por mediciones de transmisión. Dado que las mediciones de reflectancia investigan sólo la composición superficial de la muestra, las dificultades asocia-
USP 39
Pruebas Físicas / (851) Espectrofotometría y Dispersión de Luz 755
das con el espesor óptico y las propiedades de dispersión de luz de la sustancia se eliminan. De esta manera, frecuentemente es más sencillo realizar mediciones de reflectancia en materiales que absorben intensamente la radiación. Una técnica particularmente común empleada para las mediciones de .reflectancia IR se denomina reflectancia total atenuada (ATR, por sus siglas en inglés}, también conocidá com.o reflectancia interna múltiple (MIR, por sus siglas en inglés). En la técnica de ATR, el haz del espectrómetro IR se. hace pasar a través de una ventana construida con un material apropiado para la radiación IR (por ejemplo, KRS-5, una mezcla eutéctica de TIBr-Tll), que está cortado con un ángulo tal que el haz IR atraviesa la primera superficie de la ventana (frente) pero se refleja totalmente cuando incide en la segunda superficie (posterior); es decir, el ángulo dé incidencia de la radiación sobre la segunda superficie de la ventana. excede el ángulo crítico para esé material. Mediante fa construcción de ventanas adecuadas es posible obtener muchas reflexiones internas del haz IRantes de que éste se transmita fuera de la ventana. Si una muestra se coloca en contacto con la ventana a lo largo de los lados que reflejan totalmente el haz 1R, la intensidad de la radiación reflejada se reduce con· cada longitud de onda {frecuenc;:ia) que absorbe fa muestra. De este modo, la técnica de ATR proporciona un espectro de.reflectancia que se ha incrementado en intensidad, en compara<::ión con una medición de reflectancia sencilla, el número de veces que el haz IR se refleja dentro de la ventana. La técnica de ATR proporciona una sensibilidad excelente, pero produce mala reproducibilidad y no es una técnica cuantitativa confiable a menos que cada muestra de prueba se mezcle muyhien con un estándar interno. La Espectrofotometría de Fluorescencia es a menudo más sensible que la espectrofotometría de absorción; En mediciones d~ absorción, se compara la transmitancia de la muestra con la de un blanco y a concentraciones bajas, ambas soluciones.proporcionan señales altas; Por el éontrario, en la espectrofotometría de fluorescéncia, el blanco de disolvente tiene émisiones bajas en vez de altas, de manera que la radiación de fondo, que puede interferir con las determinaciones a concentraciones bajas, es mucho menor. Debido a que pocos compuestos pueden determinarse de manera conveniente mediante absorción de luz.a concentraciones por debajo de 10-5 M, no es inusual emplear concentraciones de 10-7 M a 1o-sM en la espectrofotometría de fluorescencia.
TEORÍA Y DEFINICIONES La potencia de un haz de luz radiante disminuye en relación con la distancia que recorre en un medio de absorción. También disminuye en relación a la concentración de moléculas o iones absorbentes con los que se encuentra en ese medio. Estos dos factores determinan la proporción de la energía incidente total que emerge. La disminución de la potencia de una radiación monocromática que atraviesa un medio de absorción hómogéneo se determina cuantitativamente mediante la ley de Beer, log 10(1 /T) =A= abe, en donde los términos son los definidos a continuación. Absorbancia [Símbolo: A]--Es el logaritmo, en base 1O, del recíproco de la transmitancia (T). [NOTA-Los términos descriptivos empleados anteriormente inch,iyen densidad óptica, absorbencia y extinción.} Absortividad [Símbolo: a]-Es el cociente de la absorbanda (A) dividido por el producto de la concentración de la sustancia (c), expresada en g por L, y la longitud de paso de absorción (b) en cm. [NOTA'-NO debe confundirse con el índite de absorbancia, la extinción específica o el coeficiente de extinción.} Absortividad Molar [Símbolo: s}-.,-Es el c;:ociente de la absorbancia (A) dividido por el producto de la concentración de la sustancia, expresado en molespor Ly la longitud de paso de absorción en cm. También es el producto entre la absortividad.(a) y el peso molecular de la sustancia. [NorA--'"'clos términos empleados anteriormente incluyen el índice de absorbancia molar, el coeficiente de extinción molar y el coeficiente de absorción molar.] Para la mayoría de los sistemas empleados en espectrofotometría de absorción, la absortividad de una sustancia es tma constante independiente de la intensídad de la radiación incidente, la longitud interna de las celdas y. la concentración, por lo cual la concentración puede determinarse fotométricamente. La ley de Beer no da indicaciones del efecto de la temperatura, la longitud de onda o el tipo de disolvente. Para la mayoría de los trabajos analíticos, los efectos de la variación normal de la temperatura son inapreciables. Las desviaciones de la ley de Beer pueden ser causadas por varial{les químicas o instrumentales. Una falla aparente de la ley de Beer puede ser el resultado de un cambio de concentración en las moléculas de soluto debido·a la asociación entre las moléculas de soluto o entre el soluto y las moléculas del disolvente, o debido a disociación o ionización. Otras desviaciones pueden estar causadas por efectos instrumentales, como por ejemplo la radiación policromática, los efectos de ancho de rendija o de luz espuria. Incluso a una temperatura fija en un disolvente dado, es posible que la absortividad no sea verdaderamente constante. Sin embargo, en el caso de muestras que tienen un solo componente absorbente, no es necesario que el sistema de absorción se ajuste a la ley de Beer para utilizarlo en análisis cuantitativos. La concentración de una sustancia desconocida se puede determinar mediante la comparación con una curva estándar determinada experimentalmente. Aunque, en el sentido más estricto, la ley de seer no es aplicable en la espectrofotometría de absorción atómica qebiqo a la falta de propiedades cuantitativas de la longitud de la celda y la concentración, el proceso de absorción que tiene lugar en la llama bajo condiciones de aspiración reproducibles, en principio, se ajusta a la relación de Beer. Espetíficamente, eHogaritmo negativo de la transmitancia, o de la absorbancia, es directamente proporcional al coeficiente· de absorción y, por consiguiénte, es proporcional al número de átomos absorbentes: Sobre esta base, pueden elaborarse curvas de calibración para permitir la evaluación de v¡:¡lores de absorción desconocidos en función de la concentración del elemento en solución. Espectro de Absorción-Es una representación gráfica de la absorban cía, o cualquier función de absorbancia, en función de la longitud de onda o a una función de la longitud de onda.
756 (851) Espectrofotometría y Dispersión de Luz / Pruebas Físicas
USP 39
Transmitancia [Símbolo; IJ-.,.Es el cociente entre la potencia radiante transmitid;:¡ por una muestra y la potencia radiante incidente s(,>bre la muestra, [NOTA-Los términos empleados anteri.ormente incluyen la transmitancia y la transmisión.] Intensidad• de Fluoresc:en.cia[Símbolo: #]-Es una expresión empírica de la actividad fluorescente, comúnmente expresada en función de unidades arbitrarias proporcionales a la respuesta del detector. El espectro de emisión de.ffuorescencia es una representadóngráfica.dela distribución.espectral de la radiación emitida por una sustancia activada, que muestra la intensidad de fa radí.ación emitida como la ordenada y la longitud de onda como la abscisa. El espectro de éxcitación de..flvorescencia es una representación gráfica del espectro de activación~ que muestra la intensidad de· 1a radiación emitida por una 11ustancia activada como la ordenada y la longitud de onda de la radiación incidente (activante) como la abscisa. Como en la espectrofotometría de absorción, las regíc>nes importantes del espectro electrómagnético abarcadas .por la fluorescencia de compuestos orgánifos son elUV, el Visfüleyel.lRcercano; es decir, la región de 250 a 800 nm. Despuésde que una molécula ha absorbido radiación, la energía puede perder5e tomo calor ó puede liberarse en forma de radiación de la misma longitud de onda que la absórbidac>mayor; Tanto laabsc>l'ción como la emisión de radiación se deben a las transiciones de electrones entre diferentes nlvelesdeer:lergía,uorbitales, ('lela.rnoléc:ula. Existe una demora de tiempo entre la absorción y la emisión de luz; esteintervalo;.la duradórl del estadc> de exdtación, se ha medido 'J dura aproximadamente de l 0-9 segundos a 10-8 segundos para la mayoría de las soluciones flúorescentes orgánicas. La corta vida de la fluorescencia distingue este tipo de luminiscencia de ta fo$f9resc~ncia; que es una posluminiscencia que excede el tiempo de excitación y que puede durar de l 0~ 3 segundos hasta varios minutos. Turbidantia {Símboló: S]LEs elefecto de dispersión de luz causado por partículas en suspensión. La cantidad de materia en süsp.ensión sepuedemeditmediante la observación de la luz transmitida· (turbidimetría) o. de. la luz dispersada {nefelome· tría}~
Turi)iciez[Símbólo:.i-]...;..En mediciones de dispersión.de luz; ·la turbidez es la medida de·la disminución de intensidad del haz inddentepor unidad de longitud de una suspensión dada; Actividad. Dispersante RamanLEs la propiedad rnc>lecular (expresada en unidades de cm 4 por g) que gobierna la intensidad de una banda observada en el espectro Raman para una rnllestra orientada aleatoriamente. La• actividad dispersante se determináápartir de la derivada de lapolarizabilidad molecular en to· que se refiere al movimiento.molecular.que eleva la band:9.desplaz9da d~ Raman. En g.enernl,.la intensidad de la banda· Raman es linealmente proporc;ional ala concentración. del analito.
USO DE ESTÁNDARES DE REFERENCIA ton pocas excepciones, las pruebasy\1aloraciof'les espectrofotornétl'icas Farmacó•pekasreqüiereM ·unatornparación coh···un Estándar de Referencia USP, ·Esto tiene como propl!ísito asegurar ·la.rnedidón ertcohdidones Idénticas pata. la muestra de prueba y l¡¡rsustanda de" refefenda, Estas c:c>9diclone:s it]ctoyen el:ajúste cléla lofl.gitud de oni;ta, elaloste det ancho cie .rendija, la Ubita{,:ióh y(S(.ir~ecci(}h delas celdas}' los nívele$.deitrarls1Jlitar:lcia•. ·l)ei:)e óbservar'seque • •las Celdas quépresentántina·.tránSmitanda idéntica a üna lorig!tud de onda Ciada pueden diferir conslderáb!emente en. tral1smital1cia aotrás fongitudes de ónda. cuando se~ tjecesári(),se··deb~n esl'. raciones relacionadas ccfü 'i'l espe:ctrof0tl)n1étfía, indicartquelaníues~tá de referencia~ generalmente un Estándar de Referencia USP;. debe.·prepararse }'observarse·de·maneraidéntica,paratodoslos·propósitos.práctico:s;a1aqt1eseernpleépara,1;1n1oestl'adeprüeba.Cieneralttienteial prepa~atlasóll.ICiórídel·Estáridar l'.le.••·Rererencia· es.peclflcació,.• se•prepara·••ona··solución.• deapro1
APARATOS Están dísponifües muchos típós de espectrofoton1etrds. Fündárneotalmente1 ta mayoríade ellos, excepto lós.empleados para espedrófotometría IR, pfoportjonahun pasa¡e·de •energía radiante esencialmente monocromática a trnvés de una muestra en forma adecuada y una medíc:;ion de la fracción de la intensidad que se tránsmite: Lós espectfofotófoetros IRportl'ánsformada de í=oul'iefen1plean uhaternprehdeh una tuente deenergíafúfrdlsposítivo de dispersión (por ejemplo,· ün prisma o red de difracción),· ranuras. para selecdoí:1ar lá banda de longitúddéóM8,úná celda o Un sóporte·· para• la muestra de prueba, un detector de energía radiante, amplíficadores ásociado5yd¡sposfüvosde medición. •··Enfos espectrofotómetros ·con red de diódos, fa energía dela foénteatraviesa la muestra deprueba ylvego sedispetsa através de un retículo, incidiendo sobrevaric>s cientos de diódos sensibles a la 1uz·y cada Uno de estos diódos genera a su vez una señal proporcional al número de fotones dentro de un pequeño intervalo de longitudes de onda. Luego, estas señales pueden ser computadas a intervalos de tiempo cortos, seleccionados para obtener
USP 39
o:
Pruebas Físicas / (851) Espectrofotometría y Dispersión de Luz 75 7
758 (851) Espectrofotometría y Dispersión de Luz/ Pruebas Físicas
USP 39
tamaño de muestra de prueba adecuado para la medición es de 2 a 3 mL, pero algunos instrumentos pueden equiparse con celdas pequeñas que contienen de 100 a 300µL o con un soporte capilar que requiere una cantidad aún más pequeña de muestra. Existen instrumentos para la medición de la dispersión de luz y por lo general consisten en una lámpara de mercurio con filtros para las líneas espectrales verdes o azules fuertes, un obturador, un conjunto de filtros neutros con transmitancia conocida y un fotomultiplicador sensible, montado en un brazo que puede rotarse alrededor de la celda con la solución y fijarse en cualquier ángulo de -135º a Oº a +135º mediante un comando exterior al receptáculo hermético. las celdas para la solución son de diversas formas: cuadradas para mediciones de dispersión a 90º; semioctagonales para mediciones de dispersión a 45º, 90º y 135º y cilíndricas para mediciones de dispersión en todos los ángulos. Dado que la determinación del peso molecular requiere una medida precisa de la diferencia de índice de refracción entre la solución y el solvente [(n - n0)/cJ, se necesita un segundo instrumento, un refractómetro diferencial, para medir esta pequeña diferencia. los espectrómetros Raman incluyen los siguientes componentes principales: una fuente de radiación monocromátíca intensa (invariablemente un rayo láser); un sistema óptico para recoger la luz dispersada por la muestra de prueba; un monocromador (doble) para disipar la luz dispersada y rechazar la frecuencia incidente intensa; y un sistema apropiado para la detección y amplificación de luz. la medición Raman es sencilla ya que la mayor parte de las muestras se examinan directamente en capilares para punto de fusión. Debido a que la fuente láser puede concentrarse en un punto, se necesitan solamente unos pocos microlitros de muestra.
PROCEDIMIENTO Espectrofotometría de Absorción Los fabricantes proporcionan instrucciones detalladas para operar los espectrofotómetros. Para lograr resultados significativos y válidos, el operador de un espectrofotómetro debe conocer los límites de éste y las fuentes potenciales de error y variación. El manual de instrucciones debe seguirse con suma atención en lo que se refiere al cuidado, limpieza y calibración del instrumento y las técnicas de manipulación de las celdas de absorción, así como también las instrucciones para la operación. Se debe poner un énfasis especial en Jos siguientes puntos. Controlar la exactitud de la calibración del instrumento. Cuando se emplee una fuente de energía radiante continua, se debe prestar atención tanto a la longitud de onda como a la escala fotométrica; en el caso de que se emplee una fuente con una línea espectral, sólo se necesitará controlar la escala fotométrica. Hay varias fuentes de energía radiante que tienen líneas espectrales de intensidad adecuada, espaciadas apropiadamente en todo el intervalo espectral seleccionado. La mejor fuente de espectros de calibración de UVy visible es el arco de cuarzo-mercurio, del cual pueden emplearse las líneas a 253,7; 302,25; 313, 16; 334, 15; 365,48; 404,66 y 435,83 nm. El arco de vidrio-mercurio es igualmente útil por encima de 300 nm. También se pueden emplear las líneas a 486, 13 nm y 656,28 nm de una lámpara de descarga de hidrógeno. La escala de longitud de onda puede calibrarse también a través de filtros de vidrio apropiados, que tengan bandas de absorción útiles a través de las regiones visible y UV. Se han empleado ampliamente vidrios estándar que contienen didimio (una mezcla de praseodimio y neodimio), a pesar de que los vidrios que contienen holmio se consideran superiores. Recientemente, la solución de óxido de holmio estándar ha reemplazado el empleo del vidrio con holmio. 1 Las escalas de longitud de onda de los espectrofotómetros IR e IR cercano se controlan fácilmente mediante el uso de bandas de absorción proporcionadas por películas de poliestireno, dióxido de carbono, vapor de agua o amoníaco gaseoso. Para verificar la escala fotométrica se encuentran disponibles diferentes filtros de vidrio inorgánico estándar, así como soluciones estándar de transmitancias conocidas, como por ejemplo el dicromato de potasio. 2 Por lo general, las mediciones cuantitativas de absorbancias se realizan en soluciones de la sustancia colocadas en celdas para contener líquidos. Como el disolvente y la ventana de la celda absorben luz, debe hacerse un ajuste para compensar esta contribución a la absorbancia medida. Comercialmente se pueden obtener celdas iguales para comparación para espectrofotometría UV y visible, para las cuales no se necesita ninguna corrección de celda. Sin embargo, en los procedimientos con espectrofotometría IR, por lo general se deben realizar correcciones por causa de las diferencias de los valores de las celdas. En tales casos, se llenan pares de celdas con el disolvente seleccionado y se determina la diferencia en sus absorbancias a la longitud de onda seleccionada. la celda que presenta una mayor absorbancia se emplea para la solución de la muestra de prueba y la absorbancia medida se corrige restando la diferencia entre las celdas. Esta corrección no es necesaria cuando se usa un sistema IR por transformada de Fourier computarizado, ya que la misma celda puede emplearse tanto para el blanco de disolvente como para la solución de prueba. Sin embargo, es necesario asegurarse de que las propiedades de transmisión de la celda sean constantes. Una muestra de prueba se podrá comparar mejor con un Estándar de Referencia en un pico de absorción espectral para el compuesto relevante. las valoraciones que prescriben el uso de espectrofotometría proporcionan la longitud de onda comúnmente aceptada para los picos de absorción espectral de la sustancia en cuestión. Se sabe que diferentes espectrofotómetros 1 National lnstitute of Standards and Technology (NIST), Gaithersburg, MD 20899: "Spectral Transmittance Characteristics of Holmium Oxide in Perchloric Acid,"
f. Res. Nati. Bur. Stds. 90, No. 2; 115 (1985). Se debe verificar el rendimiento de un filtro no certificado por comparación con un estándar certificado. 2 Para más detalles referentes a la verificación de la escala fotométrica de un espectrofotómetro, consultar las siguientes publicaciones del NIST: /. Res. Nalt. Bur. Stds. 76A, 469 (1972) (re: SRM 931, "Liquid Absorbance Standards for UV and Visible Spectrophotometry" y también la información referente a los patrones de cromato de potasio y dicromato de potasio]; NIST Spec. Pub!. 260-116 (1994) [re: SRM 930 and SRM 1930, "Glass Filters for Spectrophotometry".
USP 39
Pruebas Físicas/ (851) Espectrofotometría y Dispersión de Luz 759
pueden mostrar una variación pequeña en la longitud de onda aparente de este pico. Las buenas prácticas requieren que las comparaciones se lleven a cabo a la longitud de onda en la que ocurra un pico de absorción. Si esto difiriere en más de ±1 nm de la longitud de onda especificada en la monografía individual, se puede requerir la recalibración del instrumento. PREPARACIÓN DE PRUEBA En las determinaciones que utilizan espectrofotometría UV o visible, la muestra usualmente se disuelve en un disolvente. A menos que se indique otra cosa en la monografía, las determinaciones se hacen a temperatura ambiente empleando una longitud de paso de 1 cm. Hay muchos disolventes apropiados para estos intervalos, incluyendo agua, alcoholes, cloroformo, hidrocarburos de cadena corta, éteres y soluciones diluidas de ácidos y álcalis fuertes. Se deben tomar precauciones para utilizar disolventes libres de contaminantes que absorban en la región espectral que se utiliza. Por lo general, es aconsejable emplear como disolvente metanol o alcohol libre de agua, o alcohol desnaturalizado mediante la adición de metano! pero que no contenga benceno u otras impurezas que interfieran con la prueba. Existen en el comercio disolventes de calidad espectrofotométrica especial que garantizan la ausencia de contaminantes. Otros disolventes orgánicos de grado reactivo analítico pueden contener trazas de impurezas que tienen alto grado de absorción en la región UV. Deberá verificarse la transparencia de lotes nuevos de estos disolventes y se debe tener cuidado de usar el mismo lote de disolvente para la preparación de la solución de prueba, la solución estándar y el blanco. Ningún disolvente con un espesor apreciable es completamente transparente en todo el espectro IR cercano e IR. El tetracloruro de carbono (hasta 5 mm de espesor) es prácticamente transparente a 6 µm (1666 cm-1). El dísulfuro de carbono (1 mm de espesor) es adecuado como disolvente a 40 µm (250 cm- 1) con la excepción de la región de 4,2 µm a 5,0-µm (2381 cm-1 a 2000 cm- 1) y de Ja región de 5,5 µm a 7,5 µm (1819 cm-1 a 1333 cm-1), donde presenta una fuerte absorción. Otros disolventes tienen regiones relativamente estrechas de transparencía. Otra condición adicíonal para que un disolvente se considere apropiado para espectrofotometría IR es que no debe afectar el material del que está hecha la celda (generalmente cloruro de sodio). La muestra de prueba también se puede preparar dispersando en aceite mineral la muestra sólida reducida a polvo fino o mezclándola muy bien con una sal de haJuro alcalino previamente secada (por lo general bromuro de potasio). Las mezclas con sales de haluros alcalinos pueden examinarse directamente o como discos transparentes o perlas obtenidos mediante Ja compresión de dichas mezclas en una matriz. Las condiciones de secado típicas para el bromuro de potasio son 105º al vacío durante 12 horas, aunque existen grados comercialmente disponibles que no requieren secado. Es preferible la microscopía de infrarrojo o una dispersión en aceite mineral cuando haya una desproporción entre el haluro alcalino y la muestra de prueba. En el caso de materiales adecuados, la muestra de prueba se puede preparar pura como una muestra delgada para microscopía IR o puede suspenderse pura como una película delgada para dispersión en aceite mineral. La mayoría de los disolventes más comunes son apropiados para la espectrometría Raman, en la cual pueden emplearse celdas normales de vidrio (no fluorescente). La región IR del espectro electromagnético se extiende desde 0,8 hasta 400 µm. La región de 800 a 2500 nm (0,8 a 2,5µm) se considera generalmente como la región IR cercano (NIR, por sus siglas en inglés); la región de 2,5 a 25 µm, (4000 a 400 cm-1) se considera generalmente como la región intermedia (mid-IR, por sus siglas en inglés); y la región de 25 a 400 µm es considerada la región de IR lejano (FIR, por sus siglas en inglés). A menos que se indique otra cosa en la monografía individual, se debe utilizar la región de 3800 a 650 cm- 1 (2,6 a 15 µm) para asegurar el cumplimiento con las especificaciones de la monografía para absorción IR. Cuando se proporcionan los valores de los picos del espectro IR en una monografía individual, las letras s, m y w significan absorción fuerte, mediana y débil, respectivamente; sh significa un hombro, bd significa una banda y v significa "muy". Los valores pueden variar tanto como O, 1 µm o 1 O cm-1, según el instrumento específico empleado. El polimorfismo aumenta las variaciones en los espectros IR de muchos compuestos en estado sólido. En consecuencia, cuando se realicen pruebas de absorción IR, si aparece una diferencia en los espectros IR del analito y del estándar, disolver en volúmenes iguales de un disolvente apropiado porciones iguales de la sustancia en análisis y del estándar, evaporar las soluciones hasta sequedad en envases similares bajo condiciones idénticas y repetir la prueba con los residuos. En la espectroscopía NIR la mayor parte del interés actual está centrado en fa facilidad del análisis. Se pueden analizar muestras en polvo o, mediante técnicas de reflectancia, con poca o ninguna preparación. El cumplimiento de las especificaciones internas del laboratorio puede determinarse mediante una comparación computarizada de los espectros previamente obtenidos a partir de materiales de referencia. Muchos de los materiales farmacéuticos muestran poca absortividad en esta región del espectro, lo que permite que la radiación del JR cercano incidente penetre las muestras más profundamente que la radiación UV, visible o IR. La espectrofotometría NIR se puede emplear para observar modificaciones en las matrices y con una calibración apropiada se puede usar en análisis cuantitativos. En la espectrofotometría de absorción atómica se debe prestar especial atención a la naturaleza del disolvente y Ja concentración de sólidos. Un disolvente ideal es aquel que interfiere en grado mínimo en la absorción o en los procesos de emisión y que produce átomos neutros en la llama. Si hay una diferencia significativa entre la tensión en la superficie o la viscosidad de la solución de prueba y la solución estándar, las soluciones se aspiran o atomizan a velocidades diferentes, lo que causa diferencias significativas en las señales generadas. La concentración de ácidos de las soluciones también afecta a los procesos de absorción. Así, los disolventes empleados en la preparación de la muestra de prueba y el estándar deben ser los mismos, o tan parecidos como sea posible, y deben producir soluciones que se aspiren fácilmente a través del tubo de muestra del mechero-aspirador. Dado que los sólidos no disueltos presentes en las soluciones pueden producir interferencias de matriz o de volumen, el contenido total de los sólidos no disueltos en todas las soluciones debe mantenerse, en lo posible, debajo de 2%.
.......
°' o
,,,,..._ 00 Vi
D;1 "U (1) ("\
~
o 3
(1)
qQj'
'<
o
¡:;;· "U (1)
V: o: ::J
Q_ (1)
r
e:
-N
~
[
...,,
:ti
ñ"
El
eVl ""C
w
\()
USP 39
Pruebas Físicas/ (851) Espectrofotometría y Dispersión de Luz 761
nuación. En las aplicaciones analíticas, es preferible que la señalde fluorescencia esté relacionada linealmente con la concentra· ción; pero si una muestra dé prueba estuviera demasiado concentrada, una parte significativa de la luz entrante será. absorbida por la muestra. más prfüüma a la superficie de la celda y la Juz que llega al centro sé reduce. Es decirí la. misma muestra act~a cómo un "filtro internd' .Sin embargo, la espectrofófometría deJluorescencia es intdnsicaITJente una técnica de alta sensibilidad y, con frecuencia., se emplean concentraciones de 10-5.M a 10~1 M. Para cualquierprocedimiento analítico, es necesario realizar .una curva de trabajo de intensidad de fluorescencia en fun('.ión de la con('.entración para.establecer una relación lineaL Todas las lecturas deben corregirse para un blanco de disolvente. Las mediciones de fluorescencia son sensibles a la. presencia de polvo y otras partículas sólidas en la muesfüfd.é prüeba. Tales impurez:aspueden reducir la intensidad del haz de excitación o proporcionar lecturas erróneamente altas del::!ido a los reflej9s múltiples en la celda de la muestra. Por lo tanto, es conveniente eliminar las partículas sólidas mediante centrifugación; también se puede emplear la filtración, aunque algunos papeles de filtro contienen impurezas fluorescentes. A menudo, la regulación de la temperatura es importante en laespectrofotometría de fluoresceneia. Para algunas sustancias, la eficiencia de la fluorescencia puede reducirse hasta entre 1 % y 2% por grado de ascenso de temperatura. En tales casos, si se desea mayor precisión, es conveniente el uso.de celdasparamu.estra:contemperatura·contrólada. Para los análisis de rutina, puede ser suficiente realizar las mediciones con la rapidez necesaria como para que la muestra no se caliente demasiado debido a la exposición a la fuente de iluminación intensa.Muchos compuestos fluorescentes son fotosensibles. Expuestos en 1.Jn fluorómetro, pueden ser fotodegradados en productos más o .menos fluorescentes. Dichos efectos pueden detectarse a través de la observación de la respuesta del detector en relación al tiempo ypüeden reducirse atenuando la fuente de ilí.irninación conflltros o pantallas. Los cambios de disolvente pueden afectarnotablemente la intensidad y distribúdón espectral de la fluorescencia, Poflo tanto, rio es aconsejable alterar el dísolventé especificado· en los métodos establecidos sin una cuidadosa Jnvestlgac:ióri ·prelirnlnar. Muchos compuestos son fluorescentes en disolventes orgánicos pero prácticamente no son fluorescentes en aglla;.podo tanto, se deben probar varios disolventes antes dé que se decida si un compuéstoes o no fluorescente. En muchos djsol\/'erites orgánicos, lafntensidad de la fluorescencia aumenta mediante la elíminació.n del oxígeno disuelto, que ejerce un fuerte efecto de extinción. El oxígeno puede eliminarse mediante burbujeo de uri gas inerte, como por ejemplo nitrógeno ó helio, a fra;vés de la muestra de prueba. Una medida sernicuantitativa de la f1,1erza de. la fltJorescencia. está.dada por el cociente ¡;ntre.fo ifitensidad de fluorescencia de una muestra de prueb<1 y la de un éstálldat obtetlido con los mismos parámetros de ajust:ede los instrumentos. Frecuente~ mente, se emplea como estándar de referencia una solución de concentración conocida de quinina en ácidosulfúrico O,l No de fluoresceína en hidróxido de sodio O,l N.
Dispersión de Luz La turbidez puede medirse con un espectrofotómetro o un fotómetro de filtro fotoeléctrico estándar, preferentemente con iluminación en la porción azul del espectro. Las mediciones nefelométricas requieren un instrumento con una fotocél.ula situada para recibir la luz dispersada en lugar de la luz transmitida; esta geometría se aplica tarr)biéna los fluórórnetros, dé manera que, en general, los fluorómetros pueden emplearse como nefelómetros, mediante la selección de fíltrosadecuados. Un turbidímetro de relación combina la tecnología de la nefelometría a 90º y la de la turbídimetría: contiene fotocélulas que reciben y miden la luz dispersada a un ángulo de 90º de la muestra así corno también reciben y miden· 1a dispersión directa frente a la muestra; también rnide la luz transmitida dí rectamente a través de la muestra. La linealidad se obtiene al calcular la rél¡¡ción entre la medición de la luz dispersada· a un ángulo de 90º y la suma de la medida de la luz dispersada directa y la medida de la luz transmitida. La ventaja de emplear un sistema de turbJdimetría de relación es que la medida de la luz perdida es inapreciable. En la práctica, es aconsejable asegurarse de que la sedimentación de las partículas que serán medidas sea inapreciable. Generalmente esto se logra incluyendo un coloide protector en el medio de suspensión líquido. Es importante que los resultados sean interpretados mediante comparación de lecturas con las de un material en suspensión de concentración conocid¡¡, producidas exactamente bajo las mismas condiciones. La turbidímetría o nefelornetrfa puede ser útil para la medición de precipitados formados por la interacción de soluciones altamente diluidas de reactivos u otras partículas, como por ejemplosuspensiones de células bacterianas. Para que puedan lograrse resultados consistentes, todas las variables deben controlarse cuidadosamente. En los casos en los que dicho control sea posible, se pueden medir suspensiones sumamente diluidas. La muestra se disuelve en eldisolvente a varias concentraciones diferentes conocidas con· exactitud, la elección de las concentraciones depende del peso molecular del so luto y varía desde 1% para Mw = 1O000 a 0,01 % para Mw = 1 000 000. Cada solución debe limpiarse muy cuidadosamente antes de lamedición mediante filtración repetida a través de filtros finos. Una partícula de polvo en la solución vida la intensid¡¡d de. la luz dispersada medida. Un criterio. para tJna solución transparente .es que la disimetría, la relación. de inténsidad dispersada a 45º/135º, haya alcanzado un mínimo. Se miden la turbidez y el índice de refracción de las soluciones. A partir de la ecuación general de dispersión de luz a 90º, se traza un gráfico de HC/t en función de C y se extrapola a dilución infinita y se calcula el peso molecular promedio, M, a partir de la intersección, 1 / M.
USP 39
762 (851) Espectrofotometría y Dispersión de Luz/ Pruebas Físicas
Comparación Visual Cuando se indica una comparación de color o una comparación de turbidez, deben utilizarse tubos para comparación de color que sean tan idénticos como sea posible en diámetro interno y en cualquier otra característica. Para la comparación de color, los tubos deben observarse hacia abajo, contra un fondo blanco, con la ayuda de una fuente de iluminación dirigida desde debajo de la parte inferior de los tubos, mientras que para la comparación de turbidez los tubos deben observarse horizontalmente, contra un fondo oscuro, con la ayuda de una fuente de iluminación lateral. Al realizar pruebas de límites que incluyan una comparación de color en dos recipientes iguales (por ejemplo, tubos para comparación de color iguales), podrá utilizarse un instrumento apropiado, en lugar de realizar una observación visual directa. AUSP39
(852) ESPECTROSCOPÍA DE ABSORCIÓN ATÓMICA INTRODUCCIÓN La espectroscopía de absorción atómica (AA) es un método analítico para la identificación y/o la cuantificación de elementos. Para estas aplicaciones, el método de AA se utiliza en procedimientos que miden la absorbancia de radiación a una longitud de onda característica por parte de un vapor compuesto de átomos en estado fundamental. Un instrumento típico consta de una fuente de energía primaria que produce el espectro del elemento en análisis, un monocromador y un detector adecuado. Para obtener información sobre teoría y principios de mediciones, ver el capítulo Espectroscopía de Absorción Atómica-Teoría y Práctica (1852), recurso que puede ser útil, aunque no es obligatorio.
CALIFICACIÓN DE ESPECTROFOTÓMETROS DE ABSORCIÓN ATÓMICA La calificación de un espectrofotómetro de AA puede dividirse en tres elementos: calificación de la instalación (IQ, por sus siglas en inglés), calificación operativa (OQ, por sus siglas en inglés) y calificación de desempeño (PQ, por sus siglas en inglés); ver también el capítulo de información general Calificación de Instrumentos Analíticos (1058).
Calificación de la Instalación Los requisitos de calificación de la instalación proveen evidencia de que el hardware y el software se han instalado adecuadamente en el lugar deseado.
Calificación Operativa En la calificación operativa, se caracteriza el desempeño de un instrumento usando estándares con propiedades espectrales conocidas para verificar que el sistema opera dentro de las especificaciones esperadas (ver la Tabla 7 y la Tabla 2). El propósito de la calificación operativa es demostrar que el desempeño del instrumento es adecuado. La calificación operativa es una verificación de los parámetros operativos clave que se realiza después de la instalación y después de las reparaciones y/o el mantenimiento. Las pruebas de calificación operativa discutidas en las secciones siguientes son ejemplos típicos. Se pueden usar otras pruebas y muestras para establecer las especificaciones para la calificación operativa. Los proveedores de instrumentos a menudo proveen muestras y parámetros de prueba como parte del paquete de Calificación de la Instalación/Calificación Operativa. Tabla 1. Prueba de Calificación Operativa y Criterios de Aceptación para Espectrofotómetros de AA a la Llama Prueba
Procedimiento
Criterios de Aceptación
Sensibilidad
Aspirar un estándar de Zn de 0,3 µg/ml y registrar la absorbancia.
±20% de UN especificada por el fabricante del instrumento
Linealidad
Aspirar el blanco y estándares de Zn de 0,05; 0,075; O, 1 O; 0,25 y 0,50 µg/ml. Generar una curva de calibración y registrar el coeficiente de correlación (R).
Coeficiente de correlación, no menos de 0,995
Precisión
Valorar por separado 5 determinaciones repetidas del estándar de Zn de O, 1 O µg/ml en función de la curva estándar generada para la prueba de Linealidad. Calcular la %RSD de los 5 %RSDb, no más de 3% resultados en µg/ml.
ª
UA = unidad de absorbancia. b %RSD = desviación estándar relativa porcentual.
Pruebas Físicas/ (852) Espectroscopía de Absorción Atómica 763
USP 39
Tabla 2. Prueba de Calificación Operativa y Criterios de Aceptación para Espectrofotómetros de AA con Horno de Grafito Procedimiento
Criterios de Aceptación
Sensibilidad
Preparar un estándar de Cu y medir la masa característica según lo descrito por el fabricante.
±20% de masa característica de Cu según lo especificado por el fabricante
Linealidad
Generar una curva de calibración a partir de un blanco y estándares de Cu de 25; 50; 75 y 100 µg/L. Inyectar cada estándar por triplicado y registrar la o/oRSD.
o/oRSD para inyecciones por triplicado de cada estándar de Cu, no más de 5% (sin incluir el blanco)
Precisión
Valorar por separado 5 determinaciones repetidas del estándar de Cu de 50 ftg/L en función de la curva estándar generada para la prueba de Linealidad. Inyectar cada determinación repetida por triplicado.
Prueba
Coeficiente de correlación, no menos de 0,995
o/oRSD para 5 determinaciones repetidas, no más de 3%
o/oRSD para inyecciones por triplicado, no más de 5%
Calificación de Desempeño La calificación de desempeño determina que el instrumento es capaz de cumplir con los requisitos del usuario para todos los parámetros que pueden afectar la calidad de la medición. Dependiendo del uso típico, las especificaciones de calidad de desempeño pueden diferir de las especificaciones del fabricante. Para métodos validados, las pruebas de calidad de desempeño específicas, también conocidas como pruebas de aptitud del sistema, se pueden usar en lugar de los requisitos de calificación de desempeño. Los procedimientos específicos, criterios de aceptación e intervalos de tiempo para caracterizar el desempeño de un espectrofotómetro de AA dependen del instrumento y de la aplicación para la que se utiliza. Demostrar el desempeño estable del instrumento durante periodos prolongados provee cierta garantía de que se pueden tomar mediciones confiables a partir de los espectros de la muestra de prueba usando procedimientos validados de AA.
PROCEDIMIENTO Evaluar y seleccionar el tipo de material de fabricación, y métodos de pretratamiento y limpieza del material de laboratorio analítico usado en los análisis de AA. El material debe ser inerte y, dependiendo de la aplicación específica, resistente a disolventes cáusticos, ácidos u orgánicos. Para algunos análisis, se debe tomar adecuada precaución para prevenir la adsorción de analitos en la superficie del recipiente, especialmente en los análisis a nivel de ultratraza. La contaminación de las soluciones de muestra derivada de metales e iones presentes en el recipiente también puede generar resultados inexactos. Para el análisis de un elemento ubicuo, a menudo resulta necesario usar el grado más puro disponible de un reactivo o disolvente. Verificar todas las soluciones (diluyentes, soluciones modificadoras de matriz, soluciones para supresión de ionización, reactivos y otros) para detectar contaminación elemental antes de usarlas en un análisis.
Solución Estándar Preparar según se indica en la monografía individual. [NOTA-Se pueden usar soluciones estándar de elementos individuales o multielementos disponibles comercialmente, rastreables al Instituto Nacional de Normas y Tecnología) (National lnstitute of Standards and Technology o a una organización de metrología nacional equivalente, para la preparación de las soluciones estándar.] Las soluciones estándar, en especial aquéllas usadas en el análisis a nivel de ultratraza, pueden tener una vida útil limitada. Las soluciones estándar deben conservarse durante no más de 24 horas, a menos que su estabilidad se demuestre experimentalmente. Asimismo, se puede usar el método de estándar agregado. Este método implica agregar a la muestra una concentración conocida del elemento analito a no menos de dos niveles de concentración con respecto a una preparación de la muestra sin el agregado de cantidades conocidas. La respuesta del instrumento se grafica en función de la concentración del elemento analito agregado y se traza una línea de regresión lineal con los puntos correspondientes a los datos. La concentración del analito de la muestra se obtiene multiplicando el valor absoluto del punto donde la recta corta el eje x-por el factor de dilución que corresponda.
Solución Muestra Preparar según se indica en la monografía individual. Pueden indicarse diversas técnicas de digestión para disolver la muestra. Éstas pueden incluir digestiones en placa caliente o digestiones asistidas por microondas, y mediante aproximaciones con recipiente abierto o cerrado. Debe tomarse en cuenta que la digestión en recipientes abiertos por lo general no se recomienda en los análisis de metales volátiles, p.ej., selenio y mercurio.
764 (852) Espectroscopía de Absorción Atómica/ Pruebas Físicas
USP 39
Análisis Seguir el procedimiento según se indica en la monografía individual con respecto a los parámetros instrumentales. El instrumento debe estandarizarse para cuantificación al momento de su uso. La absorbancia de las soluciones estándar que abarcan la concentración esperada se determina en función de un blanco apropiado. La respuesta del detector se grafica como una función de la concentración del analito. Al realizar un análisis en el límite de detección o en su cercanía, no siempre es posible usar un estándar que abarque la concentración esperada (bracketing standard). Esto es aceptable para pruebas cualitativas, pero no para pruebas cuantitativas. El análisis de regresión de la gráfica estándar debe usarse para evaluar la linealidad de la respuesta del detector, y las monografías individuales pueden establecer criterios para el error residual de la línea de regresión. Para demostrar la estabilidad de la estandarización inicial del sistema, se debe volver a valorar una solución usada en la curva estándar inicial como un estándar de verificación en intervalos apropiados durante todo el análisis del conjunto de muestras. A menos que se indique de otro modo en la monografía individual, el estándar nuevamente analizado debe concordar con su valor esperado con una aproximación de ±3% para una valoración, o de ±20% para un análisis de impurezas. Las concentraciones de la muestra se calculan en función de la curva de calibración que se genera graficando la respuesta del detector en función de la concentración del analito en las soluciones estándar.
VALIDACIÓN V VERIFICACIÓN
Validación La validación es necesaria cuando un método de AA se destina para su uso como una alternativa al procedimiento oficial para el análisis de un artículo oficial. El objetivo de una validación de un procedimiento de AA es demostrar que la medición es adecuada para su propósito previsto, incluyendo la determinación cuantitativa del componente principal en un fármaco o medicamento (valoraciones de Categoría 1), la determinación cuantitativa de impurezas o pruebas de límite (Categoría 11) y las pruebas de identificación (Categoría IV). [NOTA-Para definiciones sobre las diversas categorías, ver el capítulo Validación de Procedimientos Farmacopeicos (1225).) Dependiendo de la categoría de la prueba, la validación del procedimiento analítico para AA puede requerir el análisis de la linealidad, el intervalo, la exactitud, la especificidad, la precisión, el límite de detección, el límite de cuantificación y la robustez. Estas características de desempeño analítico se aplican a métodos con estándar externo y a métodos de estándar agregado. El capítulo de información general (1225) provee definiciones y pautas generales sobre la validación de procedimientos analíticos sin indicar criterios de validación específicos para cada parámetro. La intención de las secciones siguientes es proveer al usuario criterios específicos de validación representativos de las expectativas mínimas para esta tecnología. Para cada aplicación particular, pueden requerirse criterios más estrictos para demostrar la aptitud para el uso previsto. EXACTITUD Para valoraciones de Categoría 1o pruebas de Categoría 11, la exactitud se puede determinar realizando estudios de recuperación con la matriz apropiada adicionada con concentraciones conocidas del elemento a analizar. También es una práctica aceptable comparar los resultados de la valoración obtenidos usando el procedimiento de AA que se está validando con aquéllos de un procedimiento analítico establecido. En los métodos de estándar agregado, la evaluación de la exactitud se basa en la concentración final calculada a partir de la ordenada al origen, y no en la recuperación calculada a partir de las adiciones de estándar individuales. Criterios de validación: 95,0%-105,0% de recuperación media para la valoración del fármaco y la valoración del medicamento, y 70,0%-150,0% de recuperación para el análisis de impurezas. Estos criterios se aplican a todo el intervalo previsto.
Precisión REPETIBILIDAD El procedimiento analítico debe evaluarse midiendo las concentraciones de seis soluciones muestra preparadas de manera independiente al 100% de la concentración de la prueba de valoración. Alternativamente, se pueden usar tres determinaciones repetidas de tres soluciones muestra independientes a diferentes concentraciones. Las tres concentraciones deben ser lo suficientemente cercanas para que la repetibilidad sea constante en todo el intervalo de concentraciones. En este caso, la repetibilidad en las tres concentraciones se combina para compararla con los criterios de aceptación. Si se valida un procedimiento usando el método de estándar agregado, el criterio de precisión se aplica al resultado experimental final, no a la exactitud de los niveles individuales de estándar agregado. Criterios de validación: La desviación estándar relativa es no más de 5,0% para la valoración del fármaco, no más de 5,0% para la valoración del medicamento y no más de 20% para el análisis de impurezas.
USP 39
Pruebas Físicas/ (852) Espectroscopía de Absorción Atómica 765 PRECISIÓN INTERMEDIA
Se debe establecer el efecto que tienen los eventos aleatorios sobre la precisión analítica del procedimiento. Las variables típicas incluyen realizar el análisis en días diferentes, con diferentes instrumentos o que dos o más analistas realicen el método. Como mínimo, el procedimiento analítico debe evaluarse realizando la prueba de repetibilidad en cualquiera de las condiciones mencionadas previamente (con un total de 12 mediciones). Criterios de validación: La desviación estándar relativa es no más de 8,0% para la valoración del fármaco, no más de 8,0% para la valoración del medicamento y no más de 25,0% para el análisis de impurezas. ESPECIFICIDAD El procedimiento debe ser capaz de evaluar inequívocamente cada analito elemental en presencia de componentes que se espera encontrar, incluyendo cualquier componente de la matriz. Criterios de validación: Se demuestran mediante el cumplimiento con el requisito de exactitud. LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN El límite de cuantificación (QL, por sus siglas en inglés) se puede estimar calculando la desviación estándar de no menos de seis mediciones repetidas de una solución blanco, dividida por la pendiente de una curva estándar y multiplicando por 1O. Si se valida un procedimiento usando el método de estándar agregado, se usa la pendiente de los estándares aplicados a una solución del material de prueba. Se pueden usar otros enfoques adecuados (ver el capítulo (1225>). Se debe llevar a cabo una medición de una solución de prueba, preparada a partir de una matriz de muestra representativa a la que se le han agregado cantidades conocidas, a la concentración de límite de cuantificación para confirmar la exactitud. Si se valida un procedimiento usando el método de estándar agregado, el criterio de validación se aplica al resultado experimental final, no a la recuperación de cantidades agregadas conocidas de los niveles de adición de estándar individuales. Criterios de validación: El procedimiento analítico debe ser capaz de determinar el analito con precisión y exactitud a un nivel equivalente al 50% de la especificación. LINEALIDAD Se prepara una curva de respuesta entre la concentración del analito y la absorbancia, a partir de no menos de cinco soluciones estándar con concentraciones que abarquen la concentración anticipada de la solución de prueba. Posteriormente, la curva estándar se evalúa usando métodos estadísticos apropiados, tales como la regresión de cuadrados mínimos. Para experimentos que no generen una relación lineal entre la concentración de analito y la respuesta de AA, se deben aplicar métodos estadísticos apropiados para describir la respuesta analítica. Criterios de validación: Coeficiente de correlación (R), no menos de 0,995 para valoraciones de Categoría 1y no menos de 0,99 para pruebas cuantitativas de Categoría 11. INTERVALO El término intervalo se refiere al rango entre las concentraciones superior e inferior (cantidades) de analito en la muestra (incluyendo estas concentraciones) para las que se ha demostrado que el procedimiento analítico tiene un nivel adecuado de precisión, exactitud y linealidad. El intervalo se demuestra cumpliendo con los requisitos de linealidad, precisión y exactitud. Criterios de validación: Para pruebas de Categoría 1, el intervalo de validación para criterios de aceptación centrados en 100,0% es 80,0%-120,0%. Para criterios de aceptación no centrados, el intervalo de validación es 10,0% por debajo del límite inferior hasta 10,0% por encima del límite superior. Para uniformidad de contenido, el intervalo de validación es 70,0%1 30,0%. Para pruebas de Categoría 11, el intervalo de validación abarca 50,0%-120,0% de los criterios de aceptación. ROBUSTEZ La confiabilidad de una medición analítica se demuestra mediante cambios deliberados en los parámetros experimentales. Para la AA esto puede incluir, entre otros, las etapas de preparación de la muestra y los programas de calentamiento, incluyendo el tiempo de espera de atomización o la temperatura de atomización. Se debe tener cuidado al cambiar los flujos de combustible y gas de oxidación así como las partes del mechero, ya que podrían crearse condiciones de retroceso de la llama.
Verificación Las reglamentaciones de las Buenas Prácticas de Fabricación Vigentes para los EE.UU. [título 21 del CFR 211.194(a)(2)] indican que los usuarios de los procedimientos analíticos, según se describen en los compendios USP-NF, no están obligados a
766 (852) Espectroscopía de Absorción Atómica / Pruebas Físicas
USP 39
validar dichos procedimientos cuando se provean en una monografía. En vez de esto, los usuarios simplemente deben verificar su aptitud en condiciones reales de uso. El objetivo de una verificación del procedimiento de AA es demostrar que el usuario puede llevar a cabo el procedimiento, según se describe en la monografía específica, con una exactitud, especificidad, linealidad y precisión adecuadas usando los instrumentos, analistas y matrices de muestra disponibles. De acuerdo con el capítulo Verificación de Procedimientos Farmacopeicos (1226), si la verificación del procedimiento farmacopeico, siguiendo la monografía, no resulta exitosa, el procedimiento puede no ser adecuado para su uso con el artículo en análisis. Por consiguiente, puede ser necesario desarrollar y validar un procedimiento alternativo conforme a lo permitido en las Advertencia Generales 6.30. La verificación de los métodos farmacopeicos de AA deben, como mínimo, incluir la ejecución de los parámetros de validación para especificidad, linealidad, exactitud, precisión y límite de cuantificación, cuando resulte apropiado, conforme a lo indicado en Validación.
(853) ESPECTROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA INTRODUCCIÓN La fluorescencia es un proceso de dos etapas que requiere la absorción de luz a una longitud de onda específica (excitación) seguida de emisión de luz, por lo regular a una longitud de onda mayor. La emisión de luz se denomina fluorescencia. El tipo más común de muestra fluorescente es una solución transparente submicromolar que absorbe la luz siguiendo la Ley de Lambert-Beer-Bouguer y emite fluorescencia con una intensidad que es directamente proporcional a la concentración, a la absortividad y al rendimiento cuántico de fluorescencia de las especies fluorescentes o del fluoróforo. A diferencia de la espectroscopía de absorción, en donde la desviación de la linealidad es la excepción, la linealidad de la fluorescencia puede verse afectada por una variedad de efectos relacionados con la muestra. Para obtener información adicional, ver el capítulo Espectroscopía de Fluorescencia-Teoría y Práctica (1853). Los métodos de fluorescencia también se denominan exentos de fondo debido a la poca luz de excitación que alcanza el detector. Esta característica hace que la detección de fluorescencia sea altamente sensible, hasta el punto de lograr la detección de una sola molécula en algunos casos. La detección de fluorescencia también puede ser altamente específica debido a que un fluoróforo tiene un patrón de emisión característico. La especificidad y la sensibilidad son dos de los puntos fuertes más importantes de los métodos de fluorescencia.
CALIFICACIÓN DE INSTRUMENTOS DE FLUORESCENCIA Los analistas aseguran la aptitud de un instrumento específico para un procedimiento dado usando una evaluación paso a paso para la aplicación deseada, desde la selección, hasta el retiro del instrumento: calificación del diseño (DQ, por sus siglas en inglés); calificación de la instalación (IQ, por sus siglas en inglés); una calificación inicial del desempeño con respecto a la especificación, también conocida como calificación operativa (OQ, por sus siglas en inglés); y una continua calificación del desempeño (PQ, por sus siglas en inglés). Para obtener información adicional, ver el capítulo general Calificación de Instrumentos Analíticos (1058). La calificación del diseño y la calificación de la instalación quedan fuera de la consideración de este capítulo. El propósito de esta sección es proveer métodos de prueba y criterios de aceptación para asegurar que el instrumento es adecuado para su uso previsto (calificación operativa) y que continuará funcionando adecuadamente durante periodos extensos (calificación del desempeño). Al igual que con cualquier dispositivo espectrométrico, se debe calificar la exactitud y precisión de la longitud de onda (eje x) y la intensidad relativa (eje y o eje de señal) de un espectrofluorómetro. Asimismo, se debe establecer la sensibilidad. La calificación operativa debe abarcar los intervalos de operación requeridos para las escalas de intensidad y de longitud de onda.
Calificación Operativa de Instrumentos Las tolerancias provistas en la calificación de la operación y del desempeño del instrumento son aplicables para su uso general. Las especificaciones para instrumentos y aplicaciones particulares pueden variar dependiendo del procedimiento analítico usado y la exactitud deseada en el resultado final. Los proveedores de instrumentos a menudo ponen a disposición muestras y parámetros de prueba como parte del paquete de Calificación de la Instalación/Calificación Operativa. Siempre que sea posible, para las etapas que se detallan a continuación, deben usarse materiales de referencia certificados para propósitos de calibración en lugar de soluciones preparadas en el laboratorio. Cuando los materiales de referencia certificados se obtengan de una fuente acreditada reconocida, deberán tener asignaciones de valores rastreables y verificados de manera independiente y con incertidumbres asociadas ya calculadas.
Pruebas Físicas/ (853) Espectroscopía de Fluorescencia 767
USP 39
En este capítulo se diferencian dos tipos generales de mediciones instrumentales: espectrales (es decir, aquéllas que miden la intensidad en función de la longitud de onda) y fijas (es decir, aquéllas que miden la intensidad a una longitud de onda y ancho de banda fijos). CONTROL DE LONGITUDES DE ONDA El nivel de confianza de las posiciones observadas de los picos se define mediante la exactitud de la longitud de onda para mediciones espectrales. La determinación de la exactitud de una gran cantidad de longitudes de onda a lo largo del intervalo de longitud de onda deseado demuestra si es necesaria la calibración adicional en más de un solo punto. La calibración en múltiples puntos implica medir los sesgos de la longitud de onda a múltiples longitudes de onda y corregir por la dependencia de la longitud de onda del sesgo. A menudo, se puede aplicar una calibración en un solo punto al eje de la longitud de onda en el software de un instrumento antes de recopilar los datos, pero una calibración en múltiples puntos puede requerir que se aplique la corrección a los espectros después de recopilarlos. Para mediciones fijas, la posición de la longitud de onda y el ancho de banda deben ser reproducibles. Para la selección de longitudes de onda basadas en filtros, se requiere únicamente usar el mismo filtro al comparar datos a lo largo del tiempo. Si se debe usar un filtro distinto (p.ej., cuando los datos se comparan entre instrumentos y laboratorios), entonces deben compararse las curvas de transmisión de los filtros. La precisión de la longitud de onda debe determinarse sobre el intervalo de operación usando al menos seis mediciones repetidas. La desviación estándar no debe exceder de ± 1 nm. ESPECTROS DE LÍNEAS ATÓMICAS Este procedimiento se describe como la aplicación primaria debido a que las líneas de emisión producidas a partir de una lámpara de descarga son características del elemento fuente y, como estándar físico fundamental, dichas longitudes de onda han sido medidas con una incertidumbre de no más de ± 0,01 nm. En la espectrofluorometría en solución, el sesgo de la longitud de onda requerida raramente excede de 1,0 nm. Por estas razones, los valores del estándar atómico de línea se citan sin la incertidumbre. La lámpara debe colocarse en la posición de la fuente del espectrofluorómetro. Una lámpara de mercurio de baja presión comúnmente empleada tiene una variedad de líneas intensas que abarcan una gran parte del intervalo UV y visible. Los fabricantes usan a menudo dos líneas de xenón a partir de la fuente a 260,5 y 541,9 nm como una verificación interna de la calibración, debido a que es posible verificar la exactitud de los monocromadores de excitación y de emisión y usarla para propósitos de diagnóstico (ver la Tabla 7). 1 Tabla 1. Longitudes de Onda de Espectros de Lineas de E ementos Elemento
Longitud de Onda (nm)
Hg
253,7
Xe
260,5
Hq Hq Hq Hq
296,7 365,0 404,7 435,8
Xe
541,9
Hg Hg Hg
546,1 577,0 579,1
USO DE SOLUCIONES DE ÓXIDOS DE TIERRAS RARAS Este procedimiento emplea una solución de óxido de tierras raras que se prepara mediante disolución en medio ácido. La más frecuente está compuesta de óxido de holmio en ácido perclórico en combinación con un reflector difuso localizado en la posición de la muestra. Se encuentran disponibles comercialmente materiales de referencia certificados adecuados. 2 Se debe retirar el selector de longitud de onda que no está siendo escaneado; si no resulta práctico retirarlo, se deberá ajustar a orden cero (en esta posición una red de difracción se comporta como un espejo que refleja todas las longitudes de onda). El reflector difuso se escanea con y sin la muestra de tierra rara en posición, y se calcula el cociente entre las dos intensidades para obtener un espectro de transmitancia efectiva. Los mínimos en el cociente entre las intensidades corresponden a los picos de absorción
1
Los valores redondeados se toman de la Norma E388-04 (2009) de la ASTM.
2 La norma NIST SRM 2034 ya no está disponible.
768 (853) Espectroscopía de Fluorescencia/ Pruebas Físicas
USP 39
de la muestra. Para una solución al 4% (p/p) de óxido de holmio en ácido perclórico a un ancho de banda espectral de 1,0 nm y una longitud de paso de 1 cm, estos mínimos se encuentran en la Tabla 2.3 Tabla 2 Longitud de Onda (nm) 241,1 249,9 278,1 287,2 333,5 345,4 361,3 385,6 416,3 451,4 467,8 485,2 536,6 640,5
Si el intervalo operativo del espectrofotómetro se encuentra fuera de 240-650 nm, se usan otros óxidos de tierras raras certificados u otras soluciones. El didimio (una mezcla de neodimio y praseodimio) se encuentra disponible como un estándar rastreable en presentaciones tanto en solución como vidrio. El didimio es similar en su preparación a los materiales de holmio y tiene características de pico útiles en la región de 730-870 nm. Los picos útiles se encuentran en la solución de didimio a aproximadamente 731,6; 740,0; 794, 1; 799,0 y 864,4 nm. USO DE REFERENCIAS DOPADAS CON POLIMETILMETACRILATO Este procedimiento usa materiales de referencia sólidos fabricados mediante la polimerización de una variedad de compuestos activos fluorescentes de anillo aromático en una matriz de polimetilmetacrilato (PMMA) inerte. Estos materiales se proveen en forma de bloques pulidos para su uso en un portacubetas estándar (ver la Tabla 3). Tabla 3. Datos de Dopante, Excitación y Emisión para Materiales de Referencia Seleccionados Dopante
Excitación le (nm)
Emisión le (nm)
p-Terfenilo
295
338
Ovaleno
342
482
Tetrafenilbutadieno
348
422
Antraceno
360
402
Verificación del Desempeño Los resultados obtenidos del análisis diario de estándares de intensidad fotoestable se usan para verificar el desempeño de un instrumento. Si la intensidad medida no cambia con respecto a la observada al momento de calificar el instrumento, entonces se considera que el desempeño del instrumento no ha cambiado y continúa en estado calificado. Usar dichos estándares para determinar una escala de intensidad casi absoluta o basada en artefactos permite que las intensidades y la sensibilidad de los instrumentos medidas puedan compararse con el paso del tiempo o entre instrumentos. Las mediciones de las intensidades deben estar dentro del intervalo lineal del sistema de detección del instrumento antes de que los analistas intenten realizar comparaciones de las intensidades, y se verán afectadas por cualquier efecto instrumental directamente relacionado con la señal de fluorescencia, p.ej., cambios en la intensidad de la fuente, respuesta del detector, entre otros. Para instrumentos con selección de longitud de onda basada en filtros, se usan estándares de fluorescencia para corrección espectral a fin de determinar las diferencias esperadas entre intensidades ocasionadas por filtros con diversos perfiles de transmisión. Mediante la compensación de estas diferencias de intensidad debidas a la falta de correspondencia espectral, es posible determinar una escala de intensidad casi absoluta para dichos instrumentos. Los analistas deben abordar las comparaciones
3 Los valores redondeados se toman de los datos de banda de absorción estándar a la longitud de onda intrínseca provistos en Travis et al.} Phys Chem Ref Data 2005; 34(1 ):41. La incertidumbre de la medición del 95% del máximo es ±0,06 nm.
Pruebas Físicas/ (853) Espectroscopía de Fluorescencia 769
USP 39
entre instrumentos con particular precaución debido a que las incertidumbres implicadas son relativamente grandes y difíciles de cuantificar. USO DE AGUA DE BAJA CONDUCTIVIDAD (18
MO)
La banda Raman del agua se usa para medir las relaciones señal-ruido en instrumentos de fluorescencia. La banda Raman del agua es inherentemente reproducible y no se degrada con el tiempo. El agua es conveniente de obtener en un estado puro y permite realizar comparaciones entre laboratorios con un alto nivel de confianza. No se requiere preparación o dilución. La banda Raman es una señal de bajo nivel que provee una buena prueba para los componentes ópticos y electrónicos de un sistema instrumental. La banda Raman del agua no se debe a un fenómeno de fluorescencia, sino que es el resultado de la dispersión Raman. Para el agua, la banda Raman siempre presenta un desplazamiento hacia el rojo de 3382 cm-1 con respecto a la excitación. 4 Esta banda por lo regular se mide mediante excitación a 350 nm, lo que resulta en un pico Raman a 397 nm, aunque también se puede usar radiación de hasta 500 nm como longitud de onda de excitación, y el pico de emisión correspondiente es 602 nm. USO DE ESTÁNDARES DE INTENSIDAD Se encuentran disponibles diversos materiales fluorescentes dopados con sólidos. 5 Estos polímeros o materiales vítreos permiten la corrección espectral relativa y la calificación diaria del desempeño de instrumentos de fluorescencia a lo largo de las regiones UV, visible e infrarrojo cercano de 320 a 830 nm. La alta fotoestabilidad de los materiales los hace particularmente útiles como estándares de intensidad para uso diario, incluso cuando no se requiere la corrección espectral o cuando la longitud de onda de excitación difiere de la usada para certificación. Se provee un espectro de emisión en estado estacionario certificado con cada material de referencia certificado, junto con las incertidumbres totales estimadas. La referencia está disponible en forma de cubeta de vidrio sólido, de tamaño estándar (12,5 mm x 12,5 mm x 45 mm) con tres caras largas pulidas para detección a 90º y una cara larga esmerilada para detección de cara frontal o de epifluorescencia. Como alternativa, se pueden usar soluciones de fluoróforos que hayan demostrado ser estables. 6•7
MEDICIONES CUALITATIVAS V CUANTITATIVAS DE FLUORESCENCIA Por lo regular se llevan a cabo dos clases de procedimientos de medición generales mediante espectrometría de fluorescencia: cualitativa y cuantitativa.
Mediciones Cualitativas de Fluorescencia Las mediciones cualitativas de fluorescencia se usan para detectar la presencia de analitos particulares y brindar una respuesta positiva o negativa. Las longitudes de onda de excitación y de emisión a menudo se seleccionan en el máximo del pico del fluoróforo que se va a detectar. Se debe considerar la cantidad mínima de analito requerida para obtener un resultado positivo que asegure que el método es apropiado para la aplicación particular. La observación de fluorescencia en la posición del pico por encima del límite de detección (generalmente 3 veces el nivel de ruido) indica un resultado positivo.
Mediciones Cuantitativas de Fluorescencia Las mediciones cuantitativas de fluorescencia se usan para determinar las cantidades o concentraciones de analitos en muestras desconocidas. Estas cantidades pueden determinarse en unidades absolutas, tales como moles o moles por L, o en unidades relativas, tales como el cociente entre las concentraciones de dos analitos fluorescentes contenidos en una sola solución desconocida. Dichas determinaciones usan la siguiente proporcionalidad, que relaciona la señal de fluorescencia (S) con la concentración de analito fluorescente (e) en un par dado de longitudes de onda de excitación y de emisión O"ex, A.,m) :
5 oc / 0 x n x Rd x a
x x
e
= intensidad del haz de excitación recolectada por el sistema de detección Rd = capacidad de respuesta del sistema de detección a = coeficiente de absorción /0
n =fracción de la fluorescencia
4 El valor de desplazamiento hacia el rojo se toma de Parker CA. Raman spectra in spectrofluorimetry. Analyst. 1959; 84:446-453. s Disponibles a través de proveedores comerciales y en el NIST como SRMs 2940 (emisión naranja), 2941 (emisión verde), 2942 (emisión UV), 2943 (emisión azul) y 2944 (emisión roja/IR). 6 Los proveedores comerciales proporcionan una solución de 1 mg/L de sulfato de quinina deshidratado en ácido perclórico O, 105 M que ha sido completamente caracterizada por el NIST como SRM 936a. 7 Se encuentra disponible una serie de Estándares de Intensidad para uso diario en el Instituto Federal Alemán para Investigación y Análisis de Materiales (BAM, por sus siglas en alemán).
770 (853) Espectroscopía de Fluorescencia/ Pruebas Físicas
USP 39
= rendimiento cuántico de fluorescencia e = concentración del analito fluorescente Esta proporcionalidad lineal con la concentración se aplica a muestras ópticamente diluidas (p.ej., soluciones con una absorbancia de menos de 0,05 a una longitud de paso de 1 cm).
BUENA PRÁCTICA ESPECTROSCÓPICA La mejor manera de realizar comparaciones de una muestra de prueba con un Estándar de Referencia es en un pico de emisión espectral para el compuesto de interés. Los ensayos basados en espectrofluorometría proveen las longitudes de onda comúnmente aceptadas para la excitación y para la emisión de pico espectral de la sustancia de interés. Espectrofluorómetros diferentes pueden presentar variaciones menores en la longitud de onda aparente de este pico. Las comparaciones deben realizarse a la longitud de onda en la que ocurre el pico de emisión. Si ésta difiere de la longitud de onda especificada en la monografía en más de ±1 nm en el intervalo de 200-400 nm o en más de ±2 nm en el intervalo de 400-800 nm, puede ser una indicación de la necesidad de recalibrar el instrumento.
Uso de Estándares de Referencia Salvo algunas excepciones, los procedimientos espectrofluorométricos farmacopeicos proveen resultados mediante comparación contra un Estándar de Referencia USP. Esto asegura una medición en condiciones idénticas para la muestra de prueba y el Estándar de Referencia. Dichas condiciones pueden incluir el ajuste de la longitud de onda, la selección del ancho de banda espectral, la colocación y corrección de la celda, y los niveles de intensidad. Las celdas que presentan características de fluorescencia óptica idénticas a una longitud de onda específica pueden diferir considerablemente a otras longitudes de onda. Se deben establecer y usar correcciones de celda apropiadas cuando así se requiera. Los términos preparación similar y solución similar en pruebas y valoraciones que implican espectrofluorometría indican que el Estándar de Referencia debe prepararse y observarse de una manera idéntica a la usada para la muestra en análisis. Por lo regular, cuando se prepara una solución del Estándar de Referencia especificado a (es decir, dentro del 10% de) la concentración deseada, la intensidad de fluorescencia se calcula basándose en la cantidad exacta pesada. Cuando no se haya usado una muestra previamente secada del Estándar de Referencia, esta intensidad deberá corregirse con respecto a la sustancia anhidra. Las expresiones determinar concomitantemente y medidos(as) concomitantemente según se usan en los procedimientos que implican espectrofluorometría indican que la fluorescencia de la solución muestra y de la solución estándar, con respecto al blanco de prueba especificado, deben medirse de manera sucesivamente inmediata.
Preparación de la Solución Muestra Para determinaciones en las que se usa espectrofluorometría UV o visible, la muestra por lo general se disuelve en un disolvente. A menos que se indique de otro modo en la monografía, las determinaciones se realizan a temperatura ambiente usando una longitud de paso de 1 cm. Muchos disolventes son adecuados para estos intervalos, incluyendo agua, alcoholes, cloroformo, hidrocarburos pequeños, éteres y soluciones diluidas de ácidos fuertes y álcalis. Los disolventes deben estar libres de contaminantes que emitan fluorescencia en la región espectral que se está analizando. Para el disolvente, se debe usar metanol o alcohol exentos de agua, o alcohol que se haya desnaturalizado mediante la adición de metano!, pero que no contenga benceno u otras impurezas interferentes. Los disolventes de calidad espectrofotométrica que garantizan estar exentos de contaminantes están disponibles comercialmente de diversos proveedores, pero algunos disolventes analíticos orgánicos de grado reactivo pueden contener trazas de impurezas que emiten una fuerte fluorescencia en la región UV. Se debe verificar la transparencia de los nuevos lotes de estos disolventes, y se debe tener cuidado de usar el mismo lote de disolvente para la preparación de la solución muestra, de la solución estándar y del blanco. Se deben usar disolventes que no tengan una señal de fluorescencia interferente a las longitudes de onda de interés. En el uso normal, la intensidad de la línea base de fluorescencia no debe ser más del 2% de la señal de la medición esperada a menos que se haya justificado previamente un valor mayor. Las valoraciones en la región visible por lo regular exigen comparar concomitantemente las intensidades de fluorescencia producidas por la solución muestra con la producida por una solución estándar que contenga una cantidad aproximadamente igual de un Estándar de Referencia USP. En algunos casos, se puede permitir la omisión del uso de un Estándar de Referencia. Lo anterior es posible cuando las valoraciones espectrofluorométricas se llevan a cabo con una frecuencia de rutina, cuando hay una curva estándar adecuada disponible, preparada con el Estándar de Referencia USP adecuado, y cuando la sustancia valorada cumple con la Ley de Lambert-Beer-Bouguer dentro del intervalo de aproximadamente 75%-125% de la concentración final usada en la valoración. En estas circunstancias, la intensidad de fluorescencia encontrada en la valoración se puede interpolar en la curva estándar y se puede calcular el resultado de la valoración. Dichas curvas estándar deben ser confirmadas con frecuencia y siempre que se vayan a utilizar nuevos espectrofluorómetros o nuevos lotes de reactivos.
USP 39
Pruebas Físicas/ (853) Espectroscopía de Fluorescencia 771
VALIDACIÓN V VERIFICACIÓN Validación La validación es necesaria cuando se pretende usar un procedimiento basado en espectroscopía de fluorescencia como alternativa al procedimiento oficial. El objetivo de una validación es demostrar que la medición es adecuada para su propósito deseado, lo cual incluye lo siguiente: la determinación cuantitativa del componente principal en un fármaco o un medicamento (valoraciones de Categoría 1), la determinación cuantitativa de impurezas o pruebas de límite (Categoría 11) y las pruebas de identificación (Categoría IV). Dependiendo de la categoría de la prueba (para información adicional, ver la Tabla 2 del capítulo Validación de Procedimientos Farmacopeicos (1225)), el proceso de validación del procedimiento analítico para fluorescencia requiere analizar la linealidad, el intervalo, la exactitud, la especificidad, la precisión, el límite de detección, el límite de cuantificación y la robustez. Estas características de desempeño analítico se aplican a procedimientos con estándar externo y a aquéllos que emplean estándar agregado. El capítulo (1225) provee definiciones y pautas generales sobre la validación de procedimientos analíticos sin indicar criterios de validación específicos para cada parámetro. La intención de las secciones siguientes es proveer al usuario criterios específicos de validación que representan las expectativas mínimas para la tecnología de fluorescencia. Para cada aplicación particular, pueden requerirse criterios más estrictos para demostrar la aptitud para el uso previsto. EXACTITUD Para procedimientos de Categoría I , Categoría 11 y Categoría 111, la exactitud se determina realizando estudios de recuperación agregando concentraciones conocidas del analito a la matriz apropiada. Asimismo, se pueden comparar los resultados de la valoración obtenidos usando el procedimiento de fluorescencia que se está validando con aquéllos de un procedimiento analítico establecido. Criterios de validación: 98,0%-102,0% de recuperación media para un fármaco, 95,0%-105,0% de recuperación media para la valoración de un medicamento y 80,0%-120,0% de recuperación media para el análisis de impurezas. Estos criterios deben cumplirse en todo el intervalo previsto.
Precisión REPETIBILIDAD La repetibilidad del procedimiento analítico se evalúa midiendo las concentraciones de seis soluciones muestra preparadas de manera independiente al 100% de la concentración de prueba de la valoración. Alternativamente, la repetibilidad puede evaluarse midiendo las concentraciones de tres determinaciones repetidas de tres soluciones muestra independientes a diferentes concentraciones. Las tres concentraciones deben ser lo suficientemente similares para que la repetibilidad sea similar en todo el intervalo de concentración. Si esto se lleva a cabo, la repetibilidad en las tres concentraciones se puede combinar para compararla con los criterios de aceptación. Criterios de validación: La desviación estándar relativa es no más de 1,0% para la valoración de un fármaco, no más de 2,0% para un medicamento y no más de 20,0% para el análisis de impurezas.
Precisión Intermedia Se debe evaluar el efecto que tienen los eventos aleatorios sobre la precisión analítica del procedimiento. Las variables típicas incluyen realizar el análisis en días diferentes, con diferentes instrumentos y que dos o más analistas realicen el método. Como mínimo, cualquier combinación de al menos dos de estos factores para un total de seis experimentos proveerán una estimación de la precisión intermedia. Criterios de validación: La desviación estándar relativa es no más de 1,0% para un fármaco, no más de 3,0% para la valoración de un medicamento y no más de 25,0% para el análisis de impurezas. ESPECIFICIDAD En las mediciones de fluorescencia, la especificidad se asegura mediante el uso de un Estándar de Referencia siempre que sea posible y se demuestra por la ausencia de interferencia de otros componentes presentes en la matriz. Criterios de validación: Se demuestran cumpliendo con los requisitos de exactitud. LÍMITES DE DETECCIÓN El límite de detección (DL, por sus siglas en inglés) se puede estimar calculando la desviación estándar de no menos de seis mediciones repetidas de una solución blanco y multiplicando por 3,3. Como alternativa, la desviación estándar puede determi-
772 (853) Espectroscopía de Fluorescencia / Pruebas Físicas
USP 39
narse a partir del error de la ordenada al origen de una curva de calibración o demostrando que la relación señal-ruido es >3,3. Además, se debe confirmar el límite de detección estimado analizando muestras a la concentración calculada. LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN El límite de cuantificación (QL, por sus siglas en inglés) se puede estimar calculando la desviación estándar de no menos de seis mediciones repetidas de una solución blanco y multiplicando por 1 O. Como alternativa, la desviación estándar puede determinarse a partir del error en la ordenada al origen de una curva de calibración o demostrando que la relación señal-ruido es
>10. Para confirmar una sensibilidad suficiente y una precisión adecuada, se mide una solución de muestra preparada a partir de una matriz de muestra representativa a la que se le han agregado cantidades conocidas a la concentración del límite de cuantificación requerido. La relación señal-ruido observada en el límite de cuantificación requerido debe ser >1 O. Criterios de validación: Para considerar que el límite de cuantificación estimado es válido, la concentración medida debe ser exacta y precisa a un nivel igual o menor al 50% de la especificación. LINEALIDAD Se prepara una curva de respuesta entre la concentración del analito y la señal de fluorescencia a partir de no menos de cinco Soluciones estándar con concentraciones que abarquen la concentración anticipada de la solución muestra. Posteriormente, se debe evaluar la linealidad de la curva estándar usando métodos estadísticos apropiados, tales como la regresión de cuadrados mínimos. La desviación de la linealidad pude derivarse de factores instrumentales o de la muestra, o ambos, y puede reducirse a niveles aceptables mediante la reducción de la concentración del analito y, por consiguiente, de los valores de absorbancia relacionados. Criterios de validación: El coeficiente de correlación (R) debe ser no menos de 0,995 para valoraciones de Categoría 1 y no menos de 0,99 para pruebas cuantitativas de Categoría 11. INTERVALO El intervalo de operación de un instrumento analítico (y el procedimiento analítico en su totalidad) es el intervalo entre las concentraciones superior e inferior (cantidades) de analito en la muestra (incluyendo estas concentraciones) para las que se ha demostrado que la función de la respuesta del instrumento tiene un nivel adecuado de precisión, exactitud y linealidad. Criterios de validación: Para pruebas de Categoría 1, el intervalo de validación para criterios de aceptación centrados en 100,0% es 80,0%-120,0%. Para criterios de aceptación no centrados, el intervalo de validación es 10,0% por debajo del límite inferior hasta 10,0% por encima del límite superior. Para uniformidad de contenido, el intervalo de validación es 70,0o/o1 30,0%. Para pruebas de Categoría 11, el intervalo de validación abarca 50,0%-120,0% de los criterios de aceptación. ROBUSTEZ Se debe demostrar la confiabilidad de una medición analítica mediante cambios deliberados en los parámetros experimentales. En el caso de la fluorescencia, estos cambios pueden incluir la medición de la estabilidad del analito en condiciones de almacenamiento especificadas, la variación del pH, la eliminación del oxígeno y la adición de posibles muestras interferentes, por citar algunos ejemplos. Los analistas deben determinar la robustez de manera simultánea usando un diseño experimental adecuado.
Verificación Los procedimientos analíticos descritos en los compendios USP-NF no requieren validación. En vez de esto, se usa una verificación para determinar la aptitud de un procedimiento en condiciones reales de uso. Por lo tanto, el objetivo de la verificación del procedimiento de fluorescencia es demostrar la aptitud de un procedimiento de prueba en condiciones reales de uso. Las características de desempeño que verifican la aptitud de un procedimiento de fluorescencia son similares a las requeridas para cualquier procedimiento analítico. Para información adicional, el capítulo Verificación de Procedimientos Farmacopeicos (1226) incluye un análisis sobre los principios generales aplicables. La verificación debe realizarse usando material de referencia y una matriz bien definida. La verificación de los procedimientos farmacopeicos de fluorescencia deben, como mínimo, incluir la ejecución de los parámetros de validación para especificidad, exactitud, precisión y límite de cuantificación, cuando resulte apropiado, conforme a lo indicado en Validación.
Requisitos para Mediciones Indirectas Algunos procedimientos de fluorescencia emplean reacciones cromogénicas. Por lo general, se deben usar los requisitos para los parámetros de desempeño analítico. En algunos casos, puede no ser posible conseguir la exactitud y la precisión requeridas
USP 39
Pruebas Físicas/ (854) Espectroscopía en el Infrarrojo Medio 773
para las mediciones directas. En dichas circunstancias, los requisitos de exactitud y precisión pueden ampliarse hasta un 50%. Sin embargo, cualquier ampliación de este tipo debe justificarse con bases científicas y pruebas documentadas. En tales casos, podría incrementarse la cantidad de repeticiones requeridas para producir un valor de informe científicamente sólido.
(854) ESPECTROSCOPÍA EN EL INFRARROJO MEDIO INTRODUCCIÓN La espectroscopía en el infrarrojo medio es un método instrumental que se usa para medir la absorción de la radiación electromagnética sobre el intervalo de número de onda entre 4000 y 400 cm-1 (correspondiente a longitudes de onda entre 2,5 y 25 µm). A menos que se especifique algo diferente en una monografía u otro procedimiento validado, se debe usar la región de 3800 a 650 cm-1 (correspondiente a longitudes de onda de 2,6 a 15 µm) para asegurar el complimiento con las especificaciones de la monografía para absorción IR. La absorción de fotones ocasiona la promoción de moléculas de un estado fundamental de su modo vibratorio a un estado vibratorio excitado. Los modos vibratorios se definen por el movimiento de todos los átomos en una molécula. Cuando las moléculas contienen ciertos grupos funcionales, la absorción IR a menudo ocurre en intervalos espectrales estrechos específicos. En estos casos, los números de onda en los que ocurren dichas transiciones se conocen como frecuencias de grupos funcionales. Cuando un modo vibratorio implica movimientos atómicos de más de unos pocos átomos, las frecuencias ocurren en intervalos espectrales más amplios y no son característicos de un grupo funcional particular, sino que son más característicos de las moléculas en conjunto. Dichas bandas se conocen como bandas de huella dactilar. Todas las bandas fuertes que absorben a números de onda por encima de 1500 cm- 1 son frecuencias de grupos funcionales. Las bandas fuertes que absorben por debajo de 1500 cm- 1 pueden ser frecuencias de grupos funcionales o bandas de huella dactilar. Para obtener información sobre la teoría y principios de las mediciones, ver Espectroscopía en el Infrarrojo Medio-Teoría y Práctica (1854), que puede ser un recurso útil aunque no es obligatorio.
CALIFICACIÓN DE ESPECTROFOTÓMETROS IR La calificación de espectrofotómetros en el infrarrojo medio se divide en tres componentes: Calificación de la Instalación (IQ, por sus siglas en inglés), Calificación Operativa (OQ, por sus siglas en inglés) y Calificación del Desempeño (PQ, por sus siglas en inglés). Para obtener información adicional, ver el capítulo Calificación de Instrumentos Analíticos (1058).
Calificación de la Instalación Los requisitos de calificación de la instalación proveen evidencia de que el hardware y el software se han instalado adecuadamente en el lugar deseado.
Calificación Operativa Debido a que la mayoría de los espectros de IR medio se miden mediante espectrofotómetros IR por transformada de Fourier (FTIR, por sus siglas en inglés), este capítulo únicamente trata de dichos instrumentos. [NOTA-Este capítulo no incluye valores recomendados para la relación señal-ruido o estabilidad de la línea al 100% debido a que pueden variar dependiendo del fabricante, modelo y edad del instrumento.] EXACTITUD DEL NÚMERO DE ONDA El estándar de número de onda de uso más común para espectrofotometría IR es una película de poliestireno mate de aproximadamente 35 µm de espesor. El espectro de dicha película presenta varias bandas pronunciadas a 3060,0; 2849,5; 1942,9; 1601,2; 1583,0; 1154,5 y 1028,3 cm- 1 • La banda que se selecciona con mayor frecuencia para la determinación de la exactitud del número de onda se encuentra a 1601,2 cm- 1 • Usando una película de poliestireno adecuada u otro estándar de número de onda bien caracterizado, barrer números de onda desde 3800 hasta 650 cm- 1 y comparar el número de onda de la respuesta máxima de la banda seleccionada, usando el centro de gravedad, el procedimiento de polinomios spline u otros algoritmos de selección de picos, con el número de onda de absorción conocido del estándar. La tolerancia aceptable para el número de onda medido es ±1,0 cm- 1 •
774 (854) Espectroscopía en el Infrarrojo Medio/ Pruebas Físicas
USP 39
Calificación del Desempeño El propósito de la calificación del desempeño (PQ, por sus siglas en inglés) es determinar que el instrumento es capaz de cumplir con los requisitos del usuario para todos los parámetros que pueden afectar la calidad de la medición.
PROCEDIMIENTO Los espectros en el infrarrojo medio se pueden medir mediante transmisión, reflexión externa, reflexión interna (a menudo denominada reflexión atenuada total), reflexión difusa y espectroscopía fotoacústica. Se encuentran disponibles diversas técnicas de preparación de la muestra para dichas opciones. A continuación se presentan las técnicas más comunes de preparación de muestra.
Discos de Bromuro de Potasio (KBr) Algunos haluros alcalinos en polvo tales como bromuro de potasio, cloruro de potasio y yoduro de cesio se fusionan a alta presión y pueden formar discos autoportantes que son transparentes a la radiación en el infrarrojo medio. El haluro alcalino que se usa más comúnmente es el bromuro de potasio seco en polvo de alta pureza, que es transparente a una radiación en el infrarrojo medio por encima de 400 cm- 1 • Se encuentran disponibles prensas y matrices comerciales en una variedad de diámetros para la preparación de discos de haluros alcalinos y similares.
Suspensiones de Aceite Mineral Un procedimiento típico para preparar una suspensión es colocar 10-20 mg de la muestra en un mortero de ágata y luego moler la muestra hasta obtener un polvo con un tamaño fino de partícula aplicando un movimiento rotatorio y vigoroso con la mano del mortero. Se agrega una pequeña gota del agente de suspensión al mortero. El movimiento rotatorio de la mano del mortero se usa para mezclar los componentes hasta formar una pasta uniforme, la cual se transfiere al centro de una ventana limpia y transparente para IR (p.ej., bromuro de potasio, cloruro de sodio, bromuro de plata o yoduro de cesio). Se coloca una segunda ventana igual, que calce sobre la parte superior de la suspensión y se aplica presión a la suspensión para formar una película delgada y translúcida libre de burbujas. El agente de suspensión más usado para la región del infrarrojo medio es aceite mineral de hidrocarburos saturados (parafina líquida, Nujol).
Películas de Polímero Autoportantes En ocasiones, el espectro de transmisión en el infrarrojo medio de muchos polímeros usados como materiales de envasado se registra a partir de muestras preparadas a manera de películas delgadas autoportantes usando moldeado por compresión en calor o microtomía.
Películas Capilares Los líquidos no volátiles pueden examinarse sin diluirlos, usando una capa delgada colocada entre dos ventanas iguales que sean transparentes a la radiación en el infrarrojo medio. La capa de líquido debe estar exenta de burbujas y cubrir completamente el diámetro del haz del infrarrojo que se enfoca sobre la muestra.
Líquidos
y Soluciones en Celdas de Transmisión
Para examinar muestras líquidas y en solución, se encuentran disponibles comercialmente montajes de celdas de transmisión que constan de un par de ventanas, un espaciador, puertos de llenado y un soporte, en configuraciones para macro y micro muestras. Para aplicaciones de laboratorio, los espaciadores por lo regular están hechos de plomo, poli(tetrafluoroetileno) o poli(etilén tereftalato) y, dependiendo de los materiales del espaciador, se pueden ofrecer en longitudes de paso con espesores estándar que van de aproximadamente 6 µm hasta 1 mm o más.
Gases Las celdas de transmisión de infrarrojo medio para muestreo estático o en flujo de gases y vapor están disponibles en una amplia variedad de materiales que se ajustan a la aplicación, desde escalas de laboratorio hasta escalas de proceso. En el laboratorio, la celda tradicional para gas ha sido un cilindro de 1O cm de largo hecho de vidrio de borosilicato o acero inoxidable con una apertura de aproximadamente 40 mm en cada extremo. Cada extremo abierto está cubierto con una tapa que con-
USP 39
Pruebas Físicas/ (854) Espectroscopía en el Infrarrojo Medio 775
tiene una ventana transparente para infrarrojo medio hecha de, por ejemplo, bromuro de potasio, selenio de cinc o fluoruro de calcio.
Reflexión Total Atenuada La espectroscopía de reflectancia total atenuada se basa en el fenómeno óptico de la radiación pasando a través de un medio con un alto índice de refracción a un cierto ángulo de incidencia que se refleja totalmente de manera interna en un borde que está en contacto con un material con un índice de refracción más bajo. El medio con alto índice de refracción también se conoce como elemento de reflexión interna. La muestra en análisis debe colocarse en contacto cercano con el elemento de reflexión interna, por ejemplo, diamante, germanio, selenuro de cinc u otro material adecuado con un alto índice de refracción. El contacto cercano y uniforme entre la sustancia y toda la superficie de cristal debe asegurarse mediante la aplicación de presión para las muestra sólidas o disolviendo la sustancia en el disolvente apropiado y luego cubriendo el elemento de reflexión interna con la solución y evaporándola hasta sequedad.
Reflexión Difusa La forma más importante y de uso común para la preparación de muestras para reflexión difusa es diluir la muestra mezclándola íntimamente con diluyentes transparentes al infrarrojo al 90%-99% tales como bromuro de potasio o cloruro de potasio reducidos a polvo fino. Diluir la muestra tiene el beneficio adicional de reducir las intensidades de las bandas de absorción hasta un nivel apropiado.
Muestreo Microscópico Acoplar un microscopio de luz a un espectrofotómetro de infrarrojo medio permite obtener espectros a partir de muestras muy pequeñas. Esto generalmente se aplica a modos de transmitancia o reflectancia y provee, por ejemplo, una herramienta poderosa para obtener datos espectroscópicos de contaminantes en muestras farmacéuticas.
VALIDACIÓN V VERIFICACIÓN Validación La validación es necesaria cuando se pretende usar un método IR como alternativa al procedimiento oficial para analizar un artículo oficial. El objetivo de una validación de un método IR es demostrar que la medición es adecuada para su propósito deseado, el cual incluye la determinación cuantitativa del componente principal en un fármaco o medicamento (valoraciones de Categoría 1), la determinación cuantitativa de impurezas o pruebas de límite (Categoría 11) y las pruebas de identificación (Categoría IV, ver la Tabla 2 en Validación de Procedimientos Farmacopeicos (1225)). Dependiendo de la categoría de la prueba, la validación del proceso para IR puede requerir el análisis de la linealidad, el intervalo, la exactitud, la especificidad, la precisión, el límite de detección, el límite de cuantificación y la robustez. Si el procedimiento IR emplea un modelo quimiométrico calculado en función de la respuesta de otra tecnología analítica (p.ej., HPLC), entonces se deberán aplicar los principios del capítulo Espectroscopía en el Infrarrojo Cercano (1119), específicamente la sección Validación del Método. El capítulo (1225) provee definiciones y pautas generales sobre la validación de procedimientos analíticos sin indicar criterios de validación específicos para cada parámetro. La intención de las secciones siguientes es proveer al usuario criterios específicos de validación representativos de las expectativas mínimas para esta tecnología. Para cada aplicación particular, pueden requerirse criterios más estrictos para demostrar la aptitud para el uso previsto. EXACTITUD Para procedimientos de Categoría 1y 11, la exactitud se puede determinar realizando estudios de recuperación agregando concentraciones conocidas del analito a la matriz apropiada. También es una práctica aceptable comparar los resultados de la valoración obtenidos usando el procedimiento IR que se está validando con aquéllos obtenidos de un procedimiento analítico alternativo establecido. Criterios de validación: 98,0%-102,0% de recuperación media para fármacos, 95,0%-105,0% de recuperación media para la valoración de un medicamento y 70,0%-150,0% de recuperación media para el análisis de impurezas. Estos criterios deben cumplirse en todo el intervalo previsto.
776 (854) Espectroscopía en el Infrarrojo Medio/ Pruebas Físicas
USP 39
PRECISIÓN Repetibilidad: El procedimiento analítico se evalúa midiendo las concentraciones de seis preparaciones muestra preparadas de manera independiente al 100% de la concentración de prueba de la valoración. Alternativamente, se puede basar en mediciones de tres determinaciones repetidas de tres soluciones muestra independientes a diferentes concentraciones. Las tres concentraciones deben ser lo suficientemente cercanas para que la repetibilidad sea constante en todo el intervalo de concentración. En ese caso, la repetibilidad en las tres concentraciones se combina para compararla con los criterios de aceptación. Criterios de validación: La desviación estándar relativa es no más de 1,0% para un fármaco, no más de 2,0% para un medicamento y no más de 20,0% para el análisis de impurezas. Precisión intermedia: Es necesario evaluar el efecto de la precisión analítica ocasionado por cambios en las variables tales como realizar el análisis en días diferentes, con diferentes instrumentos o que dos o más analistas realicen el método. Como mínimo, cualquier combinación de al menos dos de estos factores en un total de seis experimentos proveerán una estimación de la precisión intermedia. Criterios de validación: La desviación estándar relativa es no más de 1,0% para un fármaco, no más de 3,0% para la valoración de un medicamento y no más de 25,0% para el análisis de impurezas. ESPECIFICIDAD Para las pruebas de Categoría IV, se debe asegurar la identidad del analito. Con respecto a los procedimientos de Categoría 1 y 11, el requisito de exactitud también demuestra la especificidad para los analitos esperados. En el caso de las pruebas de identificación, se debe demostrar la capacidad de seleccionar entre compuestos cuyas estructuras están estrechamente relacionadas y que probablemente estarán presentes. Esto debe confirmarse obteniendo resultados positivos (quizás mediante comparación con un material de referencia conocido) a partir de muestras que contengan el analito, junto con resultados negativos obtenidos de muestras que no contengan el analito y confirmando que los materiales con estructura similar o estrechamente relacionados con el analito no generan una respuesta positiva. LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN El límite de cuantificación se puede estimar calculando la desviación estándar de no menos de 6 mediciones repetidas de una solución blanco, dividida por la pendiente de la línea de calibración y multiplicando por 1 O. Se pueden usar otros enfoques adecuados (ver el capítulo (1225)). Se debe llevar a cabo una medición de una matriz de muestra representativa a la concentración de límite de cuantificación estimada para confirmar la exactitud. Criterios de validación: Para considerar que el límite de cuantificación estimado es válido, la concentración medida debe ser exacta y precisa a un nivel igual o menor al 50% de la especificación. LINEALIDAD Una relación lineal entre la concentración del analito y la respuesta del espectro IR se demuestra preparando no menos de 5 preparaciones estándar con concentraciones que abarquen la concentración anticipada de la preparación de prueba. Posteriormente, la curva estándar debe evaluarse usando métodos estadísticos apropiados, tales como la regresión de cuadrados mínimos. Para experimentos que no generen una relación lineal entre la concentración de analito y la respuesta del espectro IR, se deben aplicar métodos estadísticos apropiados para describir la respuesta analítica. Criterios de validación: Coeficiente de correlación (R), no menos de 0,995 para valoraciones de Categoría 1y no menos de 0,99 para pruebas cuantitativas de Categoría 11 INTERVALO Este parámetro se demuestra cumpliendo con los requisitos de linealidad, precisión y exactitud. Criterios de validación: Para pruebas de Categoría 1, el intervalo de validación para criterios de aceptación centrados en 100,0% es 80,0%-120,0%. Para criterios de aceptación no centrados, el intervalo de validación es 10,0% por debajo del límite inferior hasta 10,0% por encima del límite superior. Para uniformidad de contenido, el intervalo de validación es 70,0%130,0%. Para pruebas de Categoría 11, el intervalo de validación abarca 50,0%-120,0% de los criterios de aceptación. ROBUSTEZ La confiabilidad de una medición analítica se demuestra mediante cambios deliberados en los parámetros experimentales. Para el infrarrojo medio, esto puede incluir cambios en el procedimiento de preparación de la muestra o cambios en la configuración del hardware, entre otros.
USP 39
Pruebas Físicas/ (855) Nefelometría, Turbidimetría y Comparación Visual 777 Verificación
Las reglamentaciones de las Buenas Prácticas de Fabricación Vigentes para los EE.UU. [Título 21 del CFR 211. l 94(a)(2)] indican que los usuarios de los procedimientos analíticos, según se describen en los compendios USP-NF, no están obligados a validar dichos procedimientos cuando se provean en una monografía. En su lugar, los usuarios simplemente deben verificar su aptitud en condiciones reales de uso. El objetivo de una verificación del procedimiento IR es demostrar que el método, según se describe en las monografías específicas, se está ejecutando con una exactitud, sensibilidad y precisión adecuadas. El capítulo Verificación de Procedimientos Farmacopeicos (1226) indica que si la verificación del procedimiento farmacopeico, siguiendo la monografía, no resulta exitosa, el procedimiento no es adecuado para su uso con el artículo en análisis. Por consiguiente, puede ser necesario desarrollar y validar un procedimiento alternativo conforme a lo permitido en las Advertencias y Requisitos Generales 6.30. Aunque no se requiere una revalidación completa de un procedimiento farmacopeico, la verificación del procedimiento farmacopeico de infrarrojo medio incluye la ejecución de ciertos parámetros críticos. Cuando el método que se esté verificando sea para propósitos de identificación, el único parámetro requerido será la especificidad. Para aplicaciones cuantitativas, se estudian parámetros de validación adicionales, los cuales, por lo general, incluyen exactitud, precisión y límite de cuantificación, conforme a lo indicado en Validación.
f!tllll~M1IDl:tl ~i!6~~li:·11,1:1~l.I ~~111i'''~,~-~~t'1t"1~~1:~111!1111:;'giill!lr:~•m~r010 1u1'1í:ít~ft·~¡:;,:~~111'.('íi~:f~.~~¡fi:1~911~~10'.~~,¡Jt';1~~s~r,~1w1~~-
111¡¡M1~~~~·in,1i!•~~•1.~i!i1'.~l·~.~¡;¡:~ll9;rUJ:i:M~Q'1vg¡~s .n~tl~M~rrí~~sr~fÍu~~n •ijo•rr:f&t(ij!J!i!.~Bto·.~~r:i.ij¡~·~~tQi:i~lg~.~i11~ ~~IQ~~iim11'~1rfJijl!!.f:t~li''!~~1:~~~i:in::~~il'i:!:de,tra11~Mitlda;•'~t~;•1:imettíi.'tif;!:lpié;irtr.~!i!'~Pli'i:ii 1~l~~·fJtl1i~M~ttl;i:~•t~ll:!~ij~t. eiif•iie~1~fü~$t~$.=~d~~·'"lir11e·r~~~,;~fEif~liJM~~m$.f;!:le$ante 1.Ü!··~t1ec~ióo';:ii;it9E:l~q~'~··filtt9~;···.ti~:fi~idím~~r:Q,.qj'.ff~l~~1Q'j ~mf;,!~iJ·;;ll1.~~~r11:1'l;l'a:!~r:~f!d:imem'.~,:i\·;1~~.:ri~~10:ooeb~ía.•a ·9Q~; . c<;!nfl:E!oe·tcit9celi\i~ .qijé•.~~1~an'§';míde.fi:·1i1>11u~··.a;1~parsi1if::i:Jri ~0.!1í'~!6:•G11\%:.~Q~'·ipi1~~:1~·m~~r;~;:,¡¡~:1~::~e:1ree:1p¡r··y.: f1ledif: :4,$:Parsión .fr~nt~1:~m·llt·frenta·:dela:~üe$~~,:~emá~;·•oo1rJ:e.:1~ t~:t~jr:jijf;!:lí,gilijirj~ma.~~:a~~\t~s·~:lil:m:i-!é~~ta· .~a ilnéalldaQ sa:íogra t:all!uj~t:I~ la rela<:j6fi'Eífilt!S1la:~:fj;¡~i(it:lde.lli't •dls. ~iildiférl~:un~;9t,1t~~'.9Q~.:y:;lais~ma ~t:r;«·:~qí~tcíf:l l;fe·ltjz arspe!'Sada ttór,i'1f jrfá. medit:i.óo~1~~ttan$Ml.tli(i1: El:b~n~fl~o dé.b~iiurl·~!~~aml ~··~liidim~tf~~e~a[a:tláoas.que la 'medidón .qe ·1uz:p~dlda sev1;Jel~ifla:P~ia:P~•'las.4.rtiQ.aC!es 1:µe.~utbi~ de!ad:e U:n nefalrómatr.() ~liPií'adcf~~ deril!Jf;!:lin¡¡h unidades de turbidez nefelortiétric:as (NTU,~r sus sigla~ .eri íngl~s). Las f'.l'f!J
'ª
778 (855) Nefelometría, Turbidimetría y Comparación Visual / Pruebas Físicas
USP 39
exigen específicamente una técnica de medición a 90º y también se basan en la turbidez generada por formazina (una suspensión que se prepara mezclando soluciones de sulfato de hidrazina y hexametílentetramína en agua), aunque en la actualidad, se encuentran disponibles comercialmente suspensiones de perlas de polímeros más seguras que se reconocen como una alternativa aceptable. Otras unidades reconocidas para turbidez incluyen la unidad de turbidez de formazina (FTU, por sus siglas en inglés) y la unidad nefelométrica de formazina (FNU, por sus siglas en inglés) y cuando las mediciones en estas unidades se realizan a 90ºconforme a lo descrito anteriormente, dichas unidades son comparables a las NTU. En la práctica, se recomienda estar seguro de que la sedimentación de las partículas que se están midiendo sea inapreciable. Por lo general, se logra asegurar que la sedimentación de las partículas es inapreciable incluyendo un coloide protector en el medio de suspensión líquido. Es importante que los resultados se interpreten mediante comparación de las lecturas con aquéllas que representan concentraciones conocidas de materia suspendida, producidos exactamente en las mismas condiciones. La turbidimetría o nefelometría puede ser útil para la medición de precipitados formados mediante la interacción de soluciones altamente diluidas de reactivos u otras partículas tales como suspensiones de células bacterianas. Para lograr resultados consistentes, todas las variables deben controlarse cuidadosamente. Cuando es posible lograr dicho control, se pueden medir suspensiones extremadamente diluidas. El soluto de muestra se disuelve en el disolvente a diversas concentraciones diferentes conocidas con exactitud, en donde la selección de concentraciones depende del peso molecular del soluto y van desde 1% para Mw = 1O000 hasta 0,01 % para Mw = 1 000 000. Antes de obtener las mediciones, cada solución debe limpiarse con sumo cuidado mediante filtración repetida a través de filtros finos (las monografías específicas proveerán instrucciones para la filtración de la muestra). Una partícula de polvo en la solución vicia la intensidad de la luz dispersa medida. Un criterio para una solución transparente es que la disimetría, cociente de intensidad dispersa a 45º/135º, haya alcanzado un mínimo. Se mide la turbidez y el índice de refracción de las soluciones. A partir de la ecuación general de dispersión de luz a 90º, se genera una gráfica de HC/r. en función de C y se extrapola hasta dilución infinita, y el peso molecular pron;)edio en peso, M, se calcula a partir de la intersección, 1 /M. En los sistemas polidispersos, la concentración, la turbidez y el peso molecular promedio se relacionan mediante la ecuación: HC/t = 1/M H = grupo de constantes [(16itK)/3] a partir de las ecuaciones de dispersión usadas para relacionar intensidades con la turbi-
dez C = concentración r. = coeficiente de turbidez M= peso molecular promedio en peso
Comparación Visual Cuando se indica la comparación de un color o turbidez, se deben usar tubos para comparación de color lo más parecidos posible con respecto al diámetro interno y a todas las demás características. Para la comparación de color, los tubos deben observarse hacia abajo, contra un fondo blanco, con ayuda de una fuente de luz dirigida desde abajo de la parte inferior de los tubos. Sin embargo, para la comparación de turbidez, los tubos deben observarse de manera horizontal contra un fondo oscuro con ayuda de una fuente de luz dirigida desde los costados de los tubos. Al realizar pruebas de límite que impliquen una comparación de colores en dos recipientes similares (p.ej., tubos idénticos para comparación de color), se puede usar un instrumento adecuado en lugar de la observación visual directa. Cuando se indica una comparación de turbidez: • Recipientes para comparación: Se deben usar tubos para comparación de color lo más parecidos posible con respecto al diámetro interno y a todas las demás características. • Condiciones de observación: Los tubos deben observarse .de manera horizontal contra un fondo oscuro con ayuda de una fuente de luz dirigida desde los costados de los tubos. Cuando se instruye una comparación de color: • Recipientes para comparación: Se deben usar tubos para comparación de color lo más parecidos posible con respecto al diámetro interno y a todas las demás características. • Condiciones de observación: La iluminación típica de cuarto es adecuada para llevar a cabo la evaluación. Se puede usar una fuente de luz si Ja práctica es uniforme entre los materiales que se están comparando. 4USP39
Pruebas Físicas/ (857) Espectroscopía UV-Vis 779
USP 39
(857) ESPECTROSCOPÍA ULTRAVIOLETA-VISIBLE INTRODUCCIÓN Los espectros en el ultravioleta-visible (UV-Vis) se obtienen cuando la interacción entre la radiación incidente y la nube de electrones en un cromóforo resulta en una transición de electrones, la cual implica la promoción de uno o más de los electrones de la capa externa o de unión de un estado fundamental a un estado de energía más elevado. Las bandas de los espectros UV y visibles de las sustancias por lo general son amplias y sin un alto grado de especificidad para identificación de compuestos. Sin embargo, son adecuados para valoraciones cuantitativas y, en el caso de muchas sustancias, son útiles como formas adicionales de identificación. En la ley de Lambert-Beer, la absorbancia (A;) de una solución a una longitud de onda dada, A, se define como el logaritmo en base 1O de la inversa de la transmitancia (T,):
I; = intensidad de la radiación transmitida a la misma longitud de onda A fw = intensidad de la radiación incidente a la longitud de onda A Ante la ausencia de cualquier otro factor físico o químico, A; es proporcional a la longitud del paso o camino óptico, b, a través del cual pasa la radiación, y a la concentración, e, de la sustancia en la solución de acuerdo con lo siguiente:
= absortividad molar e= concentración de soluto (mol/L) b =longitud de paso (cm) Si la concentración, e, se expresa en g/L, la constante La expresión IJ;.
IJ;_
se vuelve a;, la cual se denomina absortividad. .111% ~cm
que representa la absorbancia específica de una sustancia disuelta, se refiere a la absorbancia de una solución de 1Og/L (al 1% m/v) en una celda de 1 cm medida a una longitud de onda definida, de modo que:
M = concentración molar de la solución Cuando se miden soluciones en celdas de 1 cm, las concentraciones de aproximadamente 1 O µg de la muestra por mL a menudo producen absorbancias de 0,2-0,8 en la región UV o visible. Para obtener información sobre teoría y principios de mediciones, ver el capítulo de información general Espectroscopía Ultravioleta-Visible-Teoría y Práctica (1857), el cual no es un recurso obligatorio.
CALIFICACIÓN DE ESPECTROFOTÓMETROS UV-VIS La aptitud de un instrumento específico para un procedimiento dado se asegura usando una evaluación paso a paso del ciclo de vida para la aplicación deseada desde la selección hasta el retiro del instrumento: calificación del diseño (DQ, por sus siglas en inglés); calificación de la instalación (IQ, por sus siglas en inglés); una calificación inicial del desempeño con respecto a la especificación, también conocida como calificación operativa (OQ, por sus siglas en inglés); y una calificación continua del desempeño (PQ, por sus siglas en inglés). Para más detalles, ver el capítulo Calificación de Instrumentos Analíticos (1058). El propósito de este capítulo es proveer métodos de prueba y criterios de aceptación para asegurar que el instrumento es adecuado para su uso previsto (calificación operativa) y que continuará funcionando adecuadamente durante periodos extensos como parte de la calificación del desempeño. Al igual que con cualquier dispositivo espectrométrico, se debe calificar la exactitud y precisión de la longitud de onda (eje x) y fotométrica (eje y o eje de señal) de un espectrofotómetro UV-Vis, además de que se deben establecer los parámetros fundamentales de luz espuria y de resolución. La calificación operativa debe abarcar los intervalos operativos requeridos en el laboratorio para las escalas de absorbancia y de longitud de onda.
Calificación de la Instalación Los requisitos de calificación de la instalación proveen evidencia de que el hardware y el software se han instalado adecuadamente en el lugar deseado.
780 (857) Espectroscopía UV-Vis /Pruebas Físicas
USP 39
Calificación Operativa Los criterios de aceptación para parámetros críticos del instrumento que establecen la "aptitud para su propósito" se verifican durante la calificación de la instalación y la calificación operativa. Las especificaciones para instrumentos y aplicaciones particulares pueden variar dependiendo del procedimiento analítico usado y la exactitud deseada en el resultado final. Los proveedores de instrumentos a menudo proveen muestras y parámetros de prueba como parte del paquete de Calificación de la Instalación/Calificación Operativa. Siempre que sea posible para los procedimientos detallados a continuación, se deben usar materiales de referencia certificados (CRM, por sus siglas en inglés) en lugar de soluciones preparadas en el laboratorio. Dichos materiales de referencia certificados deben obtenerse de una fuente acreditada reconocida, y deben incluir asignaciones de valores rastreables y verificados de manera independiente y con incertidumbres asociadas ya calculadas. Los materiales de referencia certificados deben mantenerse limpios y libres de polvo. La recertificación debe llevarse a cabo periódicamente para mantener la validez de la certificación.
Control de Longitudes de Onda Se debe asegurar que la exactitud del eje de la longitud de onda (eje x) en todo el intervalo operativo deseado sea correcto dentro de los límites aceptables. Para instrumentos sin detectores de arreglo de diodos, la exactitud y la precisión de la longitud de onda se determinan en todo el intervalo operativo usando al menos seis mediciones repetidas. Para la exactitud de la longitud de onda, la diferencia entre el valor medio medido y el valor certificado del CRM no debe exceder ±1 nm en la región UV (200-400 nm), mientras que en la región visible (400-700 nm) no debe exceder ±2 nm. Para la precisión de la longitud de onda, la desviación estándar de la media no debe exceder 0,5 nm. Para instrumentos con arreglo de diodos, se requiere únicamente la medición de la exactitud de una longitud de onda, y no es necesario realizar la determinación de la precisión. La diferencia entre el valor certificado y el medido del material de referencia certificado no debe exceder ± 1 nm en la región UV (200-400 nm), mientras que en la región visible (400-700 nm) no debe exceder ±2 nm. ESPECTROS DE LÍNEAS ATÓMICAS Este procedimiento se describe como la aplicación primaria debido a que las líneas de emisión producidas a partir de una lámpara de descarga son características del elemento fuente y, como estándar físico fundamental, dichas longitudes de onda han sido medidas con una incertidumbre de no más de± 0,01 nm. En la espectrometría en solución, la exactitud de la longitud de onda requerida raramente excede 0,5 nm. Por estas razones, los valores del estándar de líneas atómicas se citan sin la incertidumbre. La lámpara debe colocarse en la posición de la fuente del espectrofotómetro; por lo tanto, sólo se puede usar en espectrofotómetros que puedan operarse en un modo de simple haz y en la práctica, sólo debe implementarse en un sistema diseñado para acomodar dichas fuentes, por ejemplo, como un accesorio. Las lámparas de mercurio de baja presión comúnmente empleadas tienen una variedad de líneas intensas que abarcan una gran parte de los espectros UV y visibles. Los fabricantes usan a menudo dos líneas de deuterio de la fuente a 486,0 y 656, l nm como una verificación interna de la calibración y se pueden usar para propósitos de diagnóstico (ver la Tabla 7). 1 Tabla 1. Líneas Atómicas Recomendadas a partir de Lámparas de Mercurio y Deuterio de Baja Presión para Calibración de Longitudes de Onda Elemento
nm
Hg Hg Hg Hg Hg
253,7
435,8
D2
486,0
Hg Hg Hg
546,l
D2
656,1
296,7 365,0 404,7
577,0 579,1
SOLUCIONES DE ÓXIDOS DE TIERRAS RARAS Este procedimiento emplea soluciones de óxidos de tierras raras que se preparan mediante disolución en medios ácidos. La más utilizada está compuesta de óxido de holmio en ácido perclórico. La solución de óxido de holmio ha sido aceptada inter1 Los valores redondeados se toman de la Norma E275-08 de la ASTM.
Pruebas Físicas/ (857) Espectroscopía UV-Vis 781
USP 39
nacionalmente como un estándar de longitud de onda intrínseco, y se encuentran disponibles comercialmente materiales de referencia certificados. 2 Los máximos de picos observados se determinan usando el modo de barrido normal en el espectrofotómetro. Los máximos de picos para una solución al 4% m/v de óxido de holmio en ácido perclórico a un ancho de banda espectral de 1,0 nm y una longitud de paso de 1 cm se presentan en la Tabla 2.3 Tabla 2. Máximos de Picos Recomendados a partir de una Solución al 40/o de Óxido de Holmio en Ácido Perclórico para Calibración de Longitudes de Onda nm 241,1 249,9 278,1 287,2 333,5 345,4 361,3 385,6 416,3 451,4 467,8 485,2 536,6 640,5
Si el intervalo operativo del espectrofotómetro se encuentra fuera del intervalo de 240-650 nm, se pueden usar otros óxidos de tierras raras certificados u otras soluciones siempre que sean rastreables a un estándar nacional o internacional. El didimio (una mezcla de neodimio y praseodimio) se encuentra disponible como un estándar rastreable tanto en solución como en vidrio. El didimio es similar en su preparación a los materiales de holmio y tiene picos característicos útiles en la región de 730870 nm. Los picos útiles se encuentran en la solución de didimio a aproximadamente 731,6; 740,0; 794, 1; 799,0 y 864,4 nm. MATERIALES VÍTREOS DE TIERRAS RARAS Este procedimiento usa vidrios que se fabrican fundiendo el óxido de tierra rara en una matriz vítrea base. El material de uso más frecuente es el holmio, cuyas longitudes de onda de referencia han sido bien definidas. Aunque la fabricación puede ocasionar variación entre las partidas de estos vidrios, pueden utilizarse materiales de referencia certificados comercialmente disponibles. Los valores típicos para vidrio de holmio usando un ancho de banda espectral de 1,0 nm son los siguientes: 241,5; 279,2; 287,5; 333,8; 360,9; 418,8; 445,8; 453,7; 460,2; 536,5 y 637,7 nm.
Control de Absorbancia Para establecer la exactitud, la precisión y la linealidad de la transmitancia de un sistema dado, es necesario verificar la exactitud de la absorbancia de un sistema a lo largo de su intervalo operativo usando los siguientes procedimientos según corresponda para los intervalos requeridos de longitud de onda y absorbancia. SOLUCIONES DE DICROMATO DE POTASIO ÁCIDO EN ÁCIDO PERCLÓRICO 0,001 M En el intervalo de 0-200 mg/L, las soluciones de dicromato de potasio proveen valores de referencia de hasta 3 unidades de absorbancia a uno de los valores certificados de 235; 257; 313 ó 350 nm. Estas soluciones están disponibles como materiales de referencia certificados o se pueden preparar de acuerdo con el estándar SRM 935a del NIST. Cuando se usan soluciones de dicromato de potasio, la exactitud de la absorbancia debe ser ± 1%A (para valores por encima de l ,OA) o ±0,01 OA (para valores por debajo de l ,OA), lo que sea mayor. La precisión de la absorbancia se puede determinar como la desviación estándar de al menos seis mediciones repetidas en dos o más niveles de absorbancia a lo largo del intervalo operativo. La desviación estándar no debe exceder ±0,5%A (para valores por encima de l ,OA) o ±0,005A (para valores por debajo de l ,OA), lo que sea mayor.
2 La norma NIST SRM 2034 ya no está disponible. 3 Los valores redondeados se toman de los datos de banda de absorción estándar a la longitud de onda intrínseca disponibles en: Travis JC, Acosta JC, Andor G, et
al. lntrinsic wavelength standard absorption bands in holmium oxide solution for UV/visible molecular absorption spectrophotometry. f Phys Chem Ref Data. 2005;34(1 ):41-57. La incertidumbre máxima de la medición al 95% es ±0,06 nm.
782 (857) Espectroscopía UV-Vis / Pruebas Físicas
USP 39
FILTROS DE VIDRIO DE DENSIDAD ÓPTICA NEUTRA Estos filtros de vidrio grises se fabrican con vidrio dopado y tienen un espectro nominalmente plano en la región de las longitudes de onda de calibración. Además, proveen valores de referencia de hasta 3 unidades de absorbancia a los valores certificados de 440; 465; 546, 1; 590 y 635 nm. Estos filtros están disponibles como materiales de referencia certificados que son rastreables a los estándares SRM 930e, 1930 y 2930 del NIST. Se pueden usar otras soluciones estándar o filtros ópticos certificados siempre que sean rastreables a un estándar nacional o internacional. Cuando se usan filtros grises, la exactitud de la absorbancia debe ser ±0,8%A (para valores por encima de l ,OA) o ±0,00BOA (para valores por debajo de l ,OA), lo que sea mayor. La precisión de la absorbancia se puede determinar como la desviación estándar de al menos seis mediciones repetidas en dos o más niveles de absorbancia a lo largo del intervalo operativo. La desviación estándar no debe exceder ±0,5%A (para valores por encima de 1,0A) o ±0,005A (para valores por debajo de l ,OA), lo que sea mayor.
Límite de Luz Espuria (Energía Radiante Espuria) Aunque la medición de absorbancia o transmitancia es una medición de cocientes de intensidades y, por lo tanto, es teóricamente independiente de la fuente intensidad monocromática, la presencia de radiación no deseada llamada "energía radiante espuria" o ;'luz espuria" afecta las mediciones en la práctica. Además, el efecto adverso de la luz espuria se incrementa con el envejecimiento de los componentes ópticos y lámparas de un espectrofotómetro. Los efectos son más pronunciados en los extremos de los intervalos operativos del detector y de la lámpara. Se debe monitorear el nivel de luz espuria a las longitudes de onda apropiadas como parte de la calificación del desempeño. La luz espuria puede detectarse a una longitud de onda dada con un filtro líquido adecuado. Estas soluciones están disponibles como materiales de referencia certificados o se pueden preparar a las concentraciones presentadas en la Tabla 3 usando materiales de grado reactivo. Ta bl a 3 . 1nterva os Espectra es d e M ater1a 1es se 1ecc ona d os para Mon 1toreo d e Luz Espura
Intervalo Espectral (nm)
Líquido o Solución
190-205
Cloruro de potasio acuoso (12 g/L)
210-259
Yoduro de sodio o yoduro de potasio acuosos (1 O g/L)
250-320
Acetona
300-385
Nitrito de sodio acuoso (50 g/L)
Cuando se usa una celda con longitud de paso de 5 mm (rellena con el mismo filtro) como celda de referencia y luego se mide la celda de 1O mm en todo el intervalo espectral requerido, es posible calcular el valor de luz espuria a partir de la absorbancia máxima observada, usando la fórmula: 5,
= 0,25 X
10-lA;t
A.:t = máxima absorbancia observada Criterios de aceptación: 5.:t es :o;0,01. A.:t °?.0,7 A. El procedimiento simplemente requiere contrastar la medición de la celda de 1O mm con la de la celda de 5 mm (rellena con el mismo filtro) y, por lo tanto, se puede lograr mediante referencia espacial o cronológica en cualquier tipo de espectrofotómetro. Como alternativa, se puede medir la absorbancia de los filtros especificados en la Tabla 3 contra la referencia apropiada y registrar el valor de máxima absorbancia. (Un valor de 5.:t de 0,01 se produce con un valor A.:t de 0,7 A, lo cual corresponde a un valor de máxima absorbancia de 2A, medida usando este procedimiento alternativo.) [NOTA-Para algunos instrumentos en los que no es posible informar directamente los valores de absorbancia mayores a 3A, este procedimiento puede requerir un proceso de dos etapas en el que el haz de la muestra se atenúa inicialmente usando un filtro de 1 a 2A, cuyo valor se mide y registra. Después de ajustar a cero el instrumento con este filtro colocado, medir el filtro de luz espuria y registrar nuevamente el valor de absorbancia. El valor de luz espuria estimado es ahora la suma de estas dos lecturas de absorbancia.]
Resolución Si se deben llevar a cabo mediciones de absorbancia exactas en compuestos bencenoides u otros compuestos con bandas de absorbancia pronunciadas (ancho medio de banda natural de menos de 15 nm), el ancho de banda espectral del espectrofotómetro usado no debe ser mayor que 1/8 del ancho medio de banda natural de la absorción del compuesto. Determinar la resolución del espectrofotómetro usando el procedimiento siguiente. Medir el cociente de absorbancias de una solución al 0,020% (v/v) de tolueno en hexano (de grado UV) en el máximo y el mínimo a aproximadamente 269 y 266 nm, respectivamente, usando hexano como referencia. El cociente de absorbancias obtenido depende del ancho de banda espectral del instrumento. Para la mayoría de los propósitos cuantitativos farmacopeicos, es suficiente un ancho de banda espectral de 2 nm y el criterio de aceptación para el cociente es no menos de 1,3. El efecto que tienen el ancho de banda espectral y la temperatura de medición sobre el cociente se presenta en la Tabla 4.4 4
ASTM E958 2011.
USP 39
Pruebas Físicas/ (857) Espectroscopía UV-Vis 783
Tabla 4. Ancho de Banda Espectral y Temperatura de Medición Temperatura de Medición
Ancho de Banda Espectral
0,5 nm ± 0,1 nm
1,0 nm ± 0,1 nm
1,5 nm ± 0,1 nm
20 ± 1º
2,4-2,5
2,0-2,1
1,6-1,7
1,3-1,4
1,0-1,1
25 ± 1º
2,3-2,4
1,9-2,0
1,6-1,7
1,3-1,4
1,0-1,1
30 ± lº
2,1-2,2
1,8-1,9
1,5-1,6
1,3-1,4
1,0-1,1
2,0 nm ± 0,2 nm
3,0 nm ± 0,2 nm
También se pueden usar materiales de referencia certificados adecuados para esta medición. Como alternativa, se puede barrer una línea atómica adecuada en el modo de haz individual y se puede determinar el ancho del pico a la altura media del pico. Este ancho del pico a la altura media del pico es igual al ancho de banda del espectrofotómetro.
Calificación del Desempeño El propósito de la calificación del desempeño (PQ, por sus siglas en inglés) es determinar que el instrumento es capaz de cumplir con los requisitos del usuario para todos los parámetros que pueden afectar la calidad de la medición y asegurar que éste funcionará adecuadamente durante periodos extensos.
PROCEDIMIENTO Salvo algunas excepciones, las pruebas y valoraciones espectrofotométricas farmacopeicas requieren una comparación contra un Estándar de Referencia USP. Esto ayuda a asegurar una medición en idénticas condiciones para la muestra de prueba y la sustancia de referencia. Dichas condiciones pueden incluir el ajuste de la longitud de onda, la selección del ancho de banda espectral, la colocación y corrección de la celda y los niveles de transmitancia. Las celdas que presentan características de transmitancia idénticas a una longitud de onda dada pueden diferir considerablemente en otras longitudes de onda. Se deben establecer y usar correcciones de celda apropiadas cuando así se requiera. La mejor manera de realizar comparaciones entre una muestra de prueba y un estándar de referencia es en un máximo de absorción espectral para el compuesto de interés. Las valoraciones que se realizan mediante espectrofotometría proveen la longitud de onda comúnmente aceptada para el pico de absorción espectral de la sustancia en cuestión. Diferentes espectrofotómetros pueden presentar una variación menor en la longitud de onda aparente de este pico. Las buenas prácticas requieren que las comparaciones se realicen a la longitud de onda en la que ocurre el pico de absorción. Si ésta difiere de la longitud de onda especificada en la monografía individual en más de ±1 nm (en el intervalo de 200-400 nm) o ±2 nm (en el intervalo de 400-800 nm), puede ser una indicación de la necesidad de recalibrar el instrumento. Los términos "preparación similar" y "solución similar", según se usan en pruebas y valoraciones que implican espectrofotometría, indican que la referencia para comparación, que es por lo regular un Estándar de Referencia USP, debe prepararse y observarse, para todos los propósitos prácticos, de una manera idéntica a la usada para la muestra de prueba. Generalmente, al preparar una solución del estándar de referencia especificado, se prepara una solución de aproximadamente (es decir, dentro del 10% de) la concentración deseada y se calcula la absortividad basándose en la cantidad exacta pesada. Cuando no se haya usado una muestra del estándar de referencia previamente secada, la absortividad se calcula con respecto a la sustancia anhidra. Las expresiones "determinar concomitantemente" y "medir concomitantemente", según se usan en las pruebas y valoraciones que implican espectrofotometría, indican que las absorbancias de la solución que contiene la muestra de prueba y la solución que contiene la muestra de referencia, con respecto al blanco de prueba especificado, deben medirse en sucesión inmediata.
Preparación de la Solución Muestra Para determinaciones usando espectrofotometría UV o visible, la muestra por lo general se disuelve en un disolvente. A menos que se indique de otro modo en la monografía, las determinaciones se realizan a temperatura ambiente, usando una longitud de paso de 1 cm. Muchos disolventes son adecuados para estos intervalos, incluyendo agua, alcoholes, hidrocarburos pequeños, éteres y soluciones diluidas de ácidos y álcalis fuertes. Se debe tener cuidado de usar disolventes que estén exentos de contaminantes que absorban en la región espectral que se está analizando. Para el disolvente, se utiliza típicamente metano! o alcohol exentos de agua, o alcohol desnaturalizado mediante la adición de metanol pero sin benceno u otras impurezas interferentes. Los disolventes de calidad espectrofotométrica especial, que garantizan estar exentos de contaminantes, están disponibles comercialmente de diversos proveedores. Algunos otros disolventes analíticos orgánicos de grado reactivo pueden contener trazas de impurezas que absorben fuertemente en la región UV. Se debe verificar la transparencia de los nuevos lotes de estos disolventes, y se debe tener cuidado de usar el mismo lote de disolvente para la preparación de la solución de prueba, de la solución estándar y del blanco. La mejor práctica consiste en usar disolventes que tengan una transmitancia de no menos de 40% (39,9% T = 0,399A) a la longitud de onda de interés. Las valoraciones en la región visible por lo regular exigen comparar concomitantemente la absorbancia producida por la preparación de valoración con la producida por una preparación estándar que contenga una cantidad aproximadamente igual de un Estándar de Referencia USP. En algunas situaciones, se puede omitir el uso de un estándar de referencia (p.ej., cuando
USP 39
784 (857) Espectroscopía UV-Vis /Pruebas Físicas
las valoraciones espectrofotométricas se llevan a cabo rutinariamente) cuando se dipone de una curva estándar adecuada, preparada con el Estándar de Referencia USP adecuado, y cuando la sustancia valorada cumple con la Ley de Lambert-Beer dentro del intervalo de aproximadamente 75%-125% de la concentración final usada en la valoración. En estas circunstancias, la absorbancia medida en la valoración se puede interpolar en la curva estándar y se puede calcular el resultado de la valoración. Dichas curvas estándar deben ser confirmadas con frecuencia y siempre que se vayan a utilizar nuevos espectrofotómetros o nuevos lotes de reactivos.
VALIDACIÓN Y VERIFICACIÓN
Validación La validación es necesaria cuando se pretende usar un procedimiento UV-Vis como alternativa al procedimiento oficial para analizar un artículo oficial. El objetivo de una validación de un procedimiento UV-Vis es demostrar que la medición es adecuada para su propósito previsto, el cual incluye la determinación cuantitativa del componente principal en un fármaco o un medicamento (valoraciones de Categoría 1), la determinación cuantitativa de impurezas o pruebas de límite (Categoría 11) y las pruebas de identificación (Categoría IV). Dependiendo de la categoría de la prueba (ver la Tabla 2 del capítulo Validación de Procedimientos Farmacopeicos (1225)), el proceso de validación del método analítico para UV-Vis requiere analizar la linealidad, el intervalo, la exactitud, la especificidad, la precisión, el límite de detección, el límite de cuantificación y la robustez. Estas características de desempeño analítico se aplican a procedimientos con estándar externo y a métodos de estándar agregado. El capítulo (1225) provee definiciones y pautas generales sobre la validación de procedimientos analíticos sin indicar criterios de validación específicos para cada parámetro. La intención de las secciones siguientes es proveer al usuario criterios específicos de validación representativos de las expectativas mínimas para esta tecnología. Para cada aplicación particular, pueden requerirse criterios más estrictos para demostrar la aptitud para el uso previsto. EXACTITUD Para procedimientos de Categoría 1, 11 y 111, la exactitud se puede determinar realizando estudios de recuperación agregando concentraciones conocidas del analito a la matriz apropiada. Asimismo, se pueden comparar los resultados de la valoración obtenidos usando el procedimiento de UV-Vis que se está validando con aquéllos de un procedimiento analítico establecido. Criterios de validación: 98,0o/o-l 02,0% de recuperación media para fármacos, 95,0%-105,0% de recuperación media para la valoración de un medicamento y 80,0%-120,0% de recuperación media para el análisis de impurezas. Estos criterios deben cumplirse en todo el intervalo previsto.
Precisión REPETIBILIDAD La repetibilidad del procedimiento analítico se evalúa midiendo las concentraciones de seis soluciones muestra preparadas de manera independiente al 100% de la concentración de prueba de la valoración. Alternativamente, se puede evaluar midiendo las concentraciones de tres determinaciones repetidas de tres soluciones muestra independientes a diferentes concentraciones. Las tres concentraciones deben ser lo suficientemente cercanas para que la repetibilidad sea constante en todo el intervalo de concentraciones. En ese caso, la repetibilidad en las tres concentraciones se combina para compararla con los criterios de aceptación. Criterios de validación: La desviación estándar relativa es no más de 1,0% para el fármaco, no más de 2,0% para la valoración del medicamento y no más de 20,0% para el análisis de impurezas. PRECISIÓN INTERMEDIA Se debe establecer el efecto que tienen los eventos aleatorios sobre la precisión analítica del método. Las variables típicas incluyen realizar el análisis en días diferentes, con diferentes instrumentos y que dos o más analistas realicen el método. Como mínimo, cualquier combinación de al menos dos de estos factores para un total de seis experimentos proveerá una estimación de la precisión intermedia. Criterios de validación: La desviación estándar relativa es no más de 1,5% para el fármaco, no más de 3,0% para la valoración del medicamento y no más de 25,0% para el análisis de impurezas. ESPECIFICIDAD En las mediciones UV-Vis, la especificidad se asegura mediante el uso de un estándar de referencia siempre que sea posible y se demuestra por la ausencia de interferencia de otros componentes presentes en la matriz.
Pruebas Físicas/ (857) Espectroscopía UV-Vis 785
USP 39
LÍMITES DE DETECCIÓN El límite de detección (DL, por sus siglas en inglés) se puede estimar calculando la desviación estándar de no menos de 6 mediciones repetidas de una solución blanco y multiplicando por 3,3. Como alternativa, la desviación estándar puede determinarse a partir del error de la ordenada al origen de una curva de calibración o determinando que la relación señal-ruido es >3,3. Además, se debe confirmar el límite de detección estimado analizando muestras a la concentración calculada. LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN El límite de cuantificación (QL, por sus siglas en inglés) se puede estimar calculando la desviación estándar de no menos de 6 mediciones repetidas de una solución blanco y multiplicando por 1 O. Como alternativa, la desviación estándar puede determinarse a partir del error de la ordenada al origen de una curva de calibración o determinando que la relación señal-ruido es >10. Se debe llevar a cabo una medición de una solución de prueba preparada a partir de una matriz de muestra representativa a la que se han agregado cantidades conocidas a la concentración del límite de cuantificación requerida para confirmar una sensibilidad y exactitud suficientes. La relación señal-ruido observada en el límite de cuantificación requerido debe ser> 1 O. [NOTA-La norma ASTM 1657-98 (2006) Standard Practice for the Testing of Variable-Wave/ength Photometric Detectors Used in Liquid Chromatography provee un procedimiento adecuado para medir la relación señal-ruido.] Criterios de validación: Para considerar que el límite de cuantificación estimado es válido, la concentración medida debe ser exacta y precisa a un nivel ~50% de la especificación. LINEALIDAD Se debe demostrar una relación lineal entre la concentración del analito y la respuesta UV-Vis preparando no menos de cinco soluciones estándar con concentraciones que abarquen la concentración anticipada de la solución de prueba. Posteriormente, la curva estándar se evalúa usando métodos estadísticos apropiados, tales como la regresión de cuadrados mínimos. La desviación de la linealidad es el resultado de factores instrumentales o de la muestra, o ambos, y puede reducirse a niveles aceptables mediante la reducción de la concentración del analito y, por consiguiente, de los valores de absorbancia relacionados. Criterios de validación: El coeficiente de correlación (R) debe ser no menos de 0,995 para valoraciones de Categoría 1 y no menos de 0,99 para pruebas cuantitativas de Categoría 11. INTERVALO El intervalo operativo de un instrumento analítico (y el procedimiento analítico en su totalidad) es el intervalo entre las concentraciones superior e inferior (cantidades) de analito en la muestra (incluyendo estas concentraciones) para las que se ha demostrado que la función de la respuesta del instrumento tiene un nivel adecuado de precisión, exactitud y linealidad. Criterios de validación: Para pruebas de Categoría 1, el intervalo de validación para criterios de aceptación centrados en 100,0% es 80,0%-120,0%. Para criterios de aceptación no centrados, el intervalo de validación es 10,0% por debajo del límite inferior hasta 10,0% por encima del límite superior. Para uniformidad de contenido, el intervalo de validación es 70,0%130,0%. Para pruebas de Categoría 11, el intervalo de validación abarca 50,0%-120,0% de los criterios de aceptación. ROBUSTEZ La confiabilidad de una medición analítica se demuestra mediante cambios deliberados en los parámetros experimentales. En el caso de la UV-Vis, esto puede incluir la medición de la estabilidad del analito en condiciones de almacenamiento especificadas, la variación del pH y la adición de posibles muestras interferentes, por citar algunos ejemplos. La robustez se determina de manera paralela usando un diseño adecuado para el procedimiento experimental. REQUISITOS PARA MEDICIONES INDIRECTAS Para ciertos procedimientos UV-Vis, se emplean reacciones cromogénicas. Por lo general, se usan los requisitos para las características de desempeño analítico. En algunos casos, puede que no sea posible cumplir con los criterios de exactitud y precisión requeridos para las mediciones directas. En dichas circunstancias, los requisitos de exactitud y precisión pueden ampliarse hasta un 50%. Cualquier ampliación de este tipo debe justificarse con bases científicas y pruebas documentadas. Puede ser necesario incrementar la cantidad de determinaciones repetidas requeridas para producir un valor de informe científicamente sólido.
786 (857) Espectroscopía UV-Vis / Pruebas Físicas
USP 39
Verificación Las reglamentaciones de las Buenas Prácticas de Fabricación Vigentes para los EE.UU. [Título 21 del CFR 211.194(a)(2)] indican que los usuarios de los procedimientos analíticos, según se describen en los compendios USP-NF, no están obligados a validar dichos procedimientos cuando se provean en una monografía. En su lugar, los usuarios simplemente deben verificar su aptitud en condiciones reales de uso. El objetivo de la verificación del procedimiento de UV-Vis es demostrar la aptitud de un procedimiento de prueba en condiciones reales de uso. Las características de desempeño que verifican la aptitud de un procedimiento de UV-Vis son similares a las requeridas para cualquier procedimiento analítico. El capítulo Verificación de Procedimientos Farmacopeicos (1226) incluye un análisis sobre los principios generales aplicables. La verificación por lo general se realiza usando un material de referencia y una matriz bien definida. La verificación de los métodos farmacopeicos de UV-Vis incluye como mínimo la ejecución de los parámetros de validación para especificidad, exactitud, precisión y límite de cuantificación, cuando resulte apropiado, conforme a lo indicado en Validación.
(861) SUTURAS-DIÁMETRO El calibrador para determinar el diámetro de las suturas es del tipo de peso muerto, mecánico o eléctrico, y está equipado con un dial de lectura directa, un visor digital o una impresora. Emplear un calibrador graduado a 0,002 mm o un calibrador más pequeño. El yunque del calibrador tiene aproximadamente 50 mm de diámetro y el pie compresor es de 12,70 ± 0,02 mm de diámetro. El pie compresor y las partes móviles conectadas a éste se gradúan de manera que se aplique una carga total de 21 O± 3 g a la muestra. Las superficies del pie compresor y del yunque son planas, con desviaciones no mayores de 0,005 mm, y paralelas entre sí con una aproximación de 0,005 mm. Para medir el diámetro de las suturas de 0,4 y menor tamaño métrico, retirar el peso adicional del pie compresor para que la carga total sobre la sutura no exceda de 60 g.
SUTURA QUIRÚRGICA ABSORBIBLE DE COLÁGENO Determinar el diámetro inmediatamente después de haberla retirado del envase primario y sin estirarla. Colocar el hilo a través del centro del yunque y el pie compresor y bajar suavemente el pie hasta que todo su peso descanse sobre la sutura. Medir el diámetro de cada hilo en tres puntos correspondientes, aproximadamente, a un cuarto, a la mitad y a tres cuartos de su longitud.
SUTURA QUIRÚRGICA ABSORBIBLE SINTÉTICA Proceder según se indica para Sutura Quirúrgica No Absorbible:
SUTURA QUIRÚRGICA NO ABSORBIBLE Colocar el hilo a través del centro del yunque y el pie compresor y bajar suavemente el pie hasta que todo su peso descanse sobre la sutura. Medir las suturas no absorbibles, ya sea que estén envasadas en seco o en líquido, inmediatamente después de haberlas retirado del envase, sin secado ni acondicionamiento previos. Medir el diámetro de la sutura en tres puntos correspondientes, aproximadamente, a un cuarto, a la mitad y a tres cuartos de su longitud. En el caso de suturas trenzadas de tamaños mayores de 3-0 (tamaño métrico 2), hacer dos mediciones en cada punto, una en ángulo recto respecto de la otra, y emplear el promedio como el diámetro observado en ese punto. Cuando se midan suturas de multifilamento, fijar una porción de la sección designada del hilo en una pinza fija, de manera que el hilo pase a través del centro del yunque. Mientras se sostiene el hilo en el mismo plano que la superficie del yunque, someter el hilo a tensión por medios adecuados, como por ejemplo, pasando el extremo libre del hilo alrededor de un cilindro o polea y uniendo dicho extremo libre a una pesa de aproximadamente la mitad del límite de nudo-tracción para la sutura de Clase 1 no esterilizada del tamaño en cuestión, con cuidado de no dejar que el hilo, si fuera retorcido, pierda la torsión. Medir el diámetro en los puntos designados en el hilo y calcular el diámetro promedio según las indicaciones dadas.
(871) SUTURAS-SUJECIÓN DE AGUJAS Las suturas quirúrgicas absorbibles (de colágeno) y las no absorbibles con Sujeción de Aguja Estándar tienen las agujas sujetas firmemente y están diseñadas para que éstas no se desprendan. Las suturas suministradas con sujeción de agujas sin ojo corres-
Pruebas Físicas/ (871) Suturas-Sujeción de Agujas 787
USP 39
ponden a las categorías de suturas con Sujeción de Aguja Estándar o con Sujeción de Aguja Desprendible. La Sujeción de Aguja Desprendible, tanto de las suturas quirúrgicas absorbibles como de las no absorbibles, permite separar la aguja a voluntad con un simple tirón. Ambos tipos de sujeción son sometidos a pruebas con un equipo, según se especifica en Resistencia a la Tensión (881 ).
PROCEDIMIENTO Tomar 5 suturas y colocar una por una en el tensiómetro, sujetando la aguja con la pinza fija, dejando toda la parte embutida expuesta, y en la misma dirección de la fuerza que ejerce la pinza móvil sobre la sutura. Determinar la fuerza necesaria para desprender la sutura de la aguja. En el caso de suturas con Sujeción de Aguja Estándar, la sutura puede romperse sin desprenderse de la aguja.
Sujeción de Aguja Estándar Cumple con los requisitos si ni el promedio de los 5 valores ni ningún valor individual es inferior al límite fijado para el tamaño especificados en la Tabla 7. Tabla 1. Sujeción de Aguja Estándar para Suturas Absorbibles y No Absorbibles Tamaño Métrico (Calibre Nº) Sutura Absorbible de Colágeno
Límites de la Sujeción de Aguja
Sutura No Absorbible y Absorbible SintétlTamaño USP
Promedio (en kgf) (Mín.)
0,1
11-0
0,007
0,005
0,069
0,049
0,2
10-0
0,014
0,010
0,137
0,098 0,147
ca
Individual (en kgf) (Mín.)
Promedio (en N) (Mín.)
Individual (en N) (Mín.)
0,4
0,3
9-0
0,021
0,015
0,206
0,5
0,4
8-0
0,050
0,025
0,490
0,245
0,7
0,5
7-0
0,080
0,040
0,784
0,392
1,67
0,784
1
0,7
6-0
0,17
0,08
1,5
1
5-0
0,23
0,11
2,25
1,08
2
1,5
4-0
0,45
0,23
4,41
2,25
3
2
3-0
0,68
0,34
6,67
3,33
3,5
3
2-0
1,10
0,45
10,8
4,41
4
3,5
o
1,50
0,45
14,7
4,41
5
4
1
1,80
0,60
17,6
5,88
6 y superior
5 y superior
2 y superior
1,80
0,70
17,6
6,86
Sujeción de Aguja Desprendible Cumple con los requisitos si los valores individuales de las 5 suturas se encuentran dentro de los límites establecidos en la Tabla 2. [NOTA-Para ambos tipos de sutura, si no más de uno de los valores individuales se encuentra fuera de los límites establecidos, repetir la prueba con 1O suturas adicionales: cumple con los requisitos si ninguno de los 1O valores adicionales se encuentra fuera de los requisitos del límite individual.] Tabla 2. Sujeción de Aguja Desprendible para Suturas Absorbibles y No Absorbibles Tamaño Métrico (Calibre) Sutura Absorbible de Colágeno
Límites de la Sujeción de Aguja
Sutura No Absorbible y Absorbible Sintéti-
ca
Tamaño USP
Mínimo (en kgf)
Máximo (en kgf)
Mínimo (en N)
Máximo (en N)
1,5
1
5-0
0,028
1,59
0,274
15,6
2
1,5
4-0
0,028
1,59
0,274
15,6 15,6
3
2
3-0
0,028
1,59
0,274
3,5
3
2-0
0,028
1,59
0,274
15,6
4
3,5
o
0,028
1,59
0,274
15,6
5
4
1
0,028
1,59
0,274
15,6
6
5
2
0,028
1,59
0,274
15,6
788 (881) Resistencia a la Tensión/ Pruebas Físicas
USP 39
(881) RESISTENCIA A LA TENSIÓN Los dispositivos para la medición de la resistencia a la tensión empleados en los Estados Unidos pueden calibrarse en unidades del sistema inglés de medidas. Las siguientes instrucciones se dan en unidades métricas con la comprensión de que pueden emplearse los equivalentes ingleses correspondientes.
SUTURA QUIRÚRGICA Determinar la resistencia a la tensión de las suturas quirúrgicas en una máquina a motor para medir la resistencia a la tensión, que tenga pinzas adecuadas para sostener la muestra con firmeza, y emplear el principio de velocidad de carga constante sobre la muestra o el principio de velocidad de elongación constante de la muestra, según se describe a continuación. El aparato tiene dos pinzas para sostener el hilo de la sutura. Una de estas pinzas es móvil. Las pinzas están diseñadas para que la sutura que se va a probar pueda ser fijada sin posibilidad de que se deslice. La longitud calibrada de prueba se define como la distancia interior entre las dos pinzas. Para longitudes calibradas de prueba entre 125 y 200 mm, la pinza móvil es accionada a una velocidad de elongación constante de 30 ± 5 cm por minuto. Para longitudes calibradas de menos de 125 mm, la velocidad de elongación por minuto se ajusta para que equivalga a 2 veces la longitud calibrada por minuto. Por ejemplo, si la longitud es de 5 cm, la velocidad de elongación será de 1O cm por minuto. Determinar la resistencia a la tensión de la sutura, ya sea que esté envasada en seco o con líquido, inmediatamente después de haberlas retirado del envase, sin secado ni acondicionamiento previos. Sujetar uno de los extremos de la sutura a la pinza del extremo de carga de la máquina, pasar el otro extremo a través de la pinza opuesta, aplicando tensión suficiente para que la muestra quede tirante entre las pinzas, y cerrar la segunda pinza. Realizar tantas rupturas como se especifiquen en la monografía individual. Si la ruptura ocurre en la pinza, descartar la lectura de la muestra.
Procedimiento para una Máquina que Opera por el Principio de Velocidad de Carga Constante sobre la Muestra Esta descripción se aplica a la máquina conocida como Comprobador de Plano Inclinado ("Incline Plane Tester"). El carro empleado en cualquier prueba es de un peso tal que al ocurrir la ruptura, la posición de la pluma registradora sobre la gráfica queda entre el 20% y el 80% de la capacidad que pueda registrarse en la gráfica. La fricción en el carro es suficientemente baja como para permitir que la pluma registradora se aparte de la línea cero de la gráfica en un grado que no exceda de 2,5% de la capacidad de la gráfica cuando no haya ninguna muestra sujeta en las pinzas. Para suturas quirúrgicas de tamaños intermedios y más grandes, la pinza para sostener la muestra es del tipo rodillo, con una superficie de sujeción plana. El rodillo tiene un diámetro de 19 mm y la superficie de sujeción plana no es menor de 25 mm de longitud. La longitud de la muestra, una vez que se inserta en las pinzas, es de por lo menos 127 mm de un extremo a otro. La velocidad de inclinación del plano del comprobador es tal que alcanza su inclinación máxima de 30º sobre la horizontal en 20 ± 1 segundos desde el comienzo de la prueba. Para suturas quirúrgicas de tamaños pequeños, la pinza apropiada tiene una superficie de sujeción plana de no menos de 13 mm de longitud. La velocidad de inclinación del plano es tal que alcanza su inclinación máxima de 30º sobre la horizontal en 60 ± 5 segundos desde el comienzo de la prueba. Excepto cuando en la monografía de la sutura se indique tracción recta (no se requiere nudo), atar la sutura de prueba realizando un nudo de cirujano con una vuelta de sutura, alrededor de un tubo de goma flexible con un diámetro interno de 6,5 mm y un espesor de pared de 1,6 mm. El nudo de cirujano es un nudo cuadrado en el cual el extremo libre se pasa primero dos veces por el lazo, en lugar de una vez, y se ajusta tirante, luego se pasa una vez por un segundo lazo y se tensan los extremos de manera que quede un nudo sencillo superpuesto a un nudo doble. Comenzar el primer nudo con el extremo izquierdo sobre el extremo derecho, ejerciendo tensión suficiente para atar el nudo con firmeza. Cuando la muestra de prueba incluya un nudo, colocar la muestra en el dispositivo de prueba con el nudo aproximadamente a media distancia entre las pinzas. Dejar el tubo de goma flexible en su lugar mientras dure la prueba.
Procedimiento para una Máquina que Opera por el Principio de Velocidad de Elongación Constante de la Muestra Esta descripción se aplica a cualquier máquina adecuada para determinar la resistencia a la tensión que opera según el principio de velocidad constante de elongación de la muestra. Excepto cuando en las monografías de las suturas se indique tracción recta (no se requiere nudo), atar la sutura de prueba por medio de un nudo simple, colocando un extremo del hilo, sostenido con la mano derecha, por encima del otro extremo, sostenido con la mano izquierda, pasando un extremo sobre el hilo y a través del lazo que se formó y luego ajustando el nudo con firmeza. La muestra se coloca en el dispositivo de prueba con el nudo aproximadamente a media distancia entre las pinzas.
Pruebas Físicas/ (891) Análisis Térmico 789
USP 39
TELAS TEXTILES Y PELÍCULAS Determinar la resistencia a la tensión de las telas textiles, incluyendo la cinta adhesiva, en un aparato comprobador de velocidad constante o de tipo péndulo, con la siguiente descripción general. Las pinzas para sostener la muestra son mordazas lisas, planas y paralelas, de no menos de 25 mm de longitud en paralelo a la dirección de aplicación de la carga. Cuando el ancho de la tira a probar no excede de 19 mm, las mordazas de la pinza deben tener al menos 25 mm de ancho. Si el ancho de la tira es mayor de 19 mm y no mayor de 44 mm, el ancho de las mordazas de la pinza debe ser de no menos de 50 mm. Si el ancho de la muestra es más de 44 mm, cortar una tira de 25 mm y usar una pinza con mordazas de no menos de 50 mm de ancho. Redondear todos los bordes que puedan tener una acción cortante sobre la muestra hasta un radio de 0,4 mm. Las mordazas tienen una separación entre sí de 76,2 mm al comienzo de la prueba y se separan a una velocidad de 30,5 cm ± 13 mm por minuto. La máquina tiene una capacidad tal que cuando se produce la ruptura, la desviación del péndulo de la vertical está entre 9º y 45º.
(891) ANÁLISIS TÉRMICO INTRODUCCIÓN Los sucesos termodinámicos determinados con precisión, como por ejemplo un cambio de estado, pueden indicar la identidad y la pureza de los fármacos. Desde hace mucho tiempo se han venido estableciendo normas farmacopeicas para las temperaturas de fusión y de ebullición de las sustancias. Estas transiciones ocurren a temperaturas características y de esta manera las normas farmacopeicas contribuyen a la identificación de las sustancias. Dado que las impurezas afectan a estos cambios de manera predecible, las mismas normas farmacopeicas contribuyen al control de la pureza de las sustancias. El análisis térmico, en el sentido más amplio, es la medición de las propiedades físicas y químicas de los materiales en función de la temperatura. Los métodos instrumentales han suplantado, en gran medida, a métodos más antiguos, que dependían de la inspección visual y de mediciones bajo condiciones fijas o arbitrarias, debido a que los métodos instrumentales son objetivos, proporcionan más información, generan registros permanentes, y por lo general son más sensibles, precisos y exactos. Además, pueden suministrar información sobre la desolvatación, la deshidratación, la descomposición, la perfección del cristal, el polimorfismo, la temperatura de fusión, la sublimación, las transiciones vítreas, la evaporación, la pirólisis, las interacciones sólido-sólido y la pureza. Tales datos resultan útiles para la caracterización de sustancias en lo que respecta a la compatibilidad, estabilidad, envasado y control de calidad. A continuación se describen las mediciones que se utilizan con mayor frecuencia en el análisis térmico, es decir, temperaturas de transición y punto de fusión mediante calorimetría diferencial de barrido (DSC, por sus siglas en inglés), análisis termogravimétrico, microscopía de platina caliente y análisis de impurezas eutécticas.
TEMPERATURAS DE PUNTO DE FUSIÓN Y DE TRANSICIÓN Cuando se calienta una muestra, se pueden observar las transiciones usando DSC, análisis térmico diferencial (DTA, por sus siglas en inglés), o microscopía de platina caliente (hot-stage microscopy). La DSC por flujo de calor (heat-flux DSC) sirve para determinar el diferencial de calor entre la muestra y el material de referencia. En la DSC por compensación de calor (power compensation DSC), la muestra y los materiales de referencia se mantienen a la misma temperatura, usando elementos de calentamiento individuales, y se registra la diferencia en el consumo de energía de los dos calentadores. La DTA monitorea la diferencia de temperaturas entre la muestra y la referencia. Las transiciones que se pueden observar incluyen aquellas que se presentan en la Tabla 7 a continuación. En el caso de la fusión, puede determinarse en forma objetiva y reproducible tanto el "inicio" como el "pico" de temperatura, a menudo con una aproximación de unas pocas décimas de grado. Aunque estas temperaturas son útiles para la caracterización de sustancias y la diferencia entre las dos temperaturas es un indicador de pureza, los valores no pueden compararse directamente con valores de "intervalos de fusión" o de "punto de fusión" visuales ni con constantes tales como el punto triple del material puro. Asimismo, se debe tener cuidado al comparar los resultados obtenidos a través de diferentes métodos de análisis. Los métodos ópticos pueden medir el punto de fusión como la temperatura en la que se funde la última traza de material sólido. Por el contrario, los puntos de fusión medidos con DSC pueden referir a la temperatura de inicio o a la temperatura en la que se observó la velocidad de fusión máxima (vertex). No obstante, el vertex es sensible al peso de la muestra, a la velocidad de calentamiento y a otros factores, mientras que la temperatura de inicio se ve menos afectada por tales factores. Cuando se emplean técnicas térmicas, es necesario considerar las limitantes de la formación de soluciones sólidas, la insolubilidad en la fusión, el polimorfismo y la descomposición durante el análisis. Tabla 1 Sólido a líquido
Fusión
Endotérmica
Líquido a gas
Vaporización
Endotérmica
USP 39
790 (891) Análisis Térmico/ Pruebas Físicas
Tabla 1 (Continuación) Líquido a sólido Sólido a gas
Sólido a sólido
Conqelación
Exotérmica
Cristalización
Exotérmica
Sublimación
Endotérmica
Transición vítrea
Evento de sequndo orden
Desolvatación
Endotérmica
Amorfo a cristalino
Exotérmica
Polimorfo
Endotérmica o Exotérmica
Informe de Resultados de Métodos Instrumentales-Cada termograma debería estar acompañado por una descripción completa de las condiciones empleadas, incluyendo la marca y el modelo del instrumento; el registro de la última calibración; el tamaño y la identificación de la muestra (incluyendo el historial térmico); el envase; la identidad, la velocidad de flujo y la presión de la atmósfera gaseosa; la dirección y la velocidad de cambio de temperatura; y la sensibilidad del instrumento y del registrador.
DETERMINACIÓN DE TEMPERATURA DE TRANSICIÓN (TEMPE~TURA DE INICIO DE FUSIÓN) V TEMPERATURA DE PUNTO DE FUSION Aparato-Usar instrumental para DTA o DSC equipado con un dispositivo de programación de temperatura, detector(es) térmico(s) y un sistema de registro que se pueda conectar a una computadora, a menos que la monografía individual para la que se emplea el capítulo indique algo distinto. Calibración-Calibrar el instrumental para cambios de temperatura y entalpía usando indio u otro material adecuado certificado. La calibración de la temperatura se lleva a cabo calentando un estándar a través de la transición de fusión y comparando el inicio extrapolado del punto de fusión del estándar con el inicio certificado de punto de fusión. La calibración de la temperatura se debería realizar a la misma velocidad de calentamiento que el experimento. La calibración de la entalpía se lleva a cabo calentando un estándar a través de la transición de fusión y comparando el calor de fusión calculado con el valor teórico. Procedimiento-Pesar con exactitud una cantidad apropiada de la sustancia a examinar en el receptáculo de la muestra (sample pan), según se describe en la monografía específica. Ajustar la temperatura inicial, la velocidad de calentamiento, la dirección del cambio de temperatura y la temperatura final según se especifica en la monografía. Si no se especifican en la monografía, estos parámetros se determinan según se indica a continuación: realizar un análisis preliminar sobre un amplio intervalo de temperaturas (por lo general, desde la temperatura ambiente hasta la temperatura de descomposición, o aproximadamente 1Oº a 20º por encima del punto de fusión) y sobre un amplio intervalo de velocidades de calentamiento (1 º a 20º por minuto) para evidenciar cualquier efecto inesperado. Posteriormente, determinar una velocidad de calentamiento más baja de modo que se minimice la descomposición y que no se comprometa la temperatura de transición. Determinar un intervalo de temperatura que comprenda la transición de interés de modo que la línea base se pueda extender hasta intersectar con la tangente de la fusión (ver Figura 7).
1ss.1g•c ·102,3J/g
\
(
·• 190.3PC
·170 •+--------------------< 210 Exo Up
T1mpu1tur1C-C)
Figura 1. Termograma. Al examinar materiales cristalinos puros, pueden ser apropiadas velocidades tan bajas como 1 º por minuto, mientras que para materiales poliméricos y demás materiales semicristalinos resultan más apropiadas velocidades de hasta 20º por minuto. Comenzar el análisis y registrar la curva del análisis térmico diferencial con la temperatura en el eje x y el cambio de energía en el eje y. La temperatura de fusión (temperatura de inicio de fusión) es la intersección (188,79º) de la extensión de la línea base con la tangente al punto de mayor pendiente (punto de inflexión) de la curva (ver Figura 7). El vértice es la temperatura en el pico de la curva (190,31 º). La entalpía del evento es proporcional al área bajo la curva después de aplicar una corrección de la línea base.
USP 39
Pruebas Físicas/ (891) Análisis Térmico 791
ANÁLISIS TERMOGRAVI MÉTRICO El análisis termogravimétrico incluye la determinación de la masa de una muestra como una función de la temperatura, o del tiempo de calentamiento, o ambos. Por lo general se usa para investigar los procesos de deshidratación/desolvatación y la descomposición de compuestos. Cuando la termogravimetría se aplica apropiadamente, ésta suministra información de mayor utilidad que la pérdida por secado a temperatura fija, que frecuentemente se realiza durante un tiempo fijo y por lo general en una atmósfera mal definida. Por lo general, la pérdida de disolvente absorbido en la superficie puede distinguirse del disolvente en la red cristalina y de las pérdidas por degradación. Las mediciones pueden llevarse a cabo en atmósferas con una humedad y una concentración de oxígeno controladas para revelar interacciones con el fármaco, entre fármacos y entre sustancias activas y excipientes o materiales del envase. Aparato-Mientras que los detalles dependen del fabricante, las características esenciales del equipo son una balanza que registra los pesos y una fuente de calor programable. Los equipos difieren en la capacidad para manejar muestras de diversos tamaños, la manera en que se registra la temperatura de la muestra y el intervalo de control de la atmósfera. Calibración-Se requiere una calibración para todos los sistemas; es decir, la balanza se calibra usando pesas estándar, y la calibración de temperatura implica el uso de materiales estándar, puesto que se asume que la temperatura de la muestra es la temperatura del horno. La calibración de peso se lleva a cabo midiendo la masa de una pesa certificada o estándar y comparando la masa medida con el valor certificado. La calibración de la temperatura se lleva a cabo analizando un estándar magnético de alta pureza, tal como níquel, para determinar su temperatura de Curie y comparando el valor medido con el valor teórico. Procedimiento-Aplicar el método a la muestra, empleando las condiciones descritas en la monografía, y calcular la ganancia o pérdida de masa, expresando el cambio de masa como porcentaje. Alternativamente, colocar una cantidad adecuada de material en el portamuestras y registrar el peso. Debido a que la atmósfera de análisis es crítica, se especifica la presión o velocidad de flujo y la composición del gas. Ajustar la temperatura inicial, la velocidad de calentamiento y la temperatura final de acuerdo con las instrucciones del fabricante, e iniciar el aumento de temperatura. Alternativamente, analizar el termograma sobre un amplio intervalo de temperaturas (por lo general, desde la temperatura ambiente hasta la temperatura de descomposición, o 1 Oº a 20º por encima del punto de fusión a una velocidad de calentamiento de 1 º a 20º por minuto). Calcular la ganancia o pérdida de masa, expresando el cambio de masa como porcentaje.
MICROSCOPÍA DE PLATINA CALIENTE La microscopía de platina caliente es una técnica analítica que implica el monitoreo de las propiedades ópticas de la muestra como una función de la temperatura usando un microscopio. La microscopía de platina caliente se puede usar como técnica complementaria de otras técnicas de análisis térmico, tales como DSC, DTA y difracción de rayos X de temperatura variable para polvos, para la caracterización del estado sólido de compuestos farmacéuticos. Resulta de utilidad para confirmar transiciones tales como fusiones, recristalizaciones y transformaciones al estado sólido usando una técnica visual. El microscopio de platina caliente debe someterse a una calibración de temperatura.
ANÁLISIS DE IMPUREZAS EUTÉCTICAS La base de cualquier método de pureza calorimétrica es la relación entre la disminución del punto de fusión y de congelación y el nivel de impurezas. La fusión de un compuesto está caracterizada por la absorción del calor latente de fusión, LiH 1, a una temperatura específica, T0 • En teoría, una transición de fusión para un compuesto cristalino totalmente puro debe ocurrir dentro de un intervalo infinitamente estrecho. Una ampliación del intervalo de fusión, debido a impurezas, proporciona un criterio de pureza sensible. El efecto es evidente mediante el examen visual de termogramas de muestras que difieren por unas pocas décimas de porcentaje en el contenido de impurezas. Un material con 99% de pureza se funde aproximadamente en un 20% a una temperatura de 3º por debajo del punto de fusión del material puro (ver Figura 2).
USP 39
792 (891) Análisis Térmico / Pruebas Físicas
-
Temperatura
Acido Benzoico
Patrón Primario (NIST)
Figura 2. Termogramas superpuestos en los que se muestra el efecto de las impurezas sobre la forma del pico de fusión en una DSC. Los parámetros de fusión (intervalo de fusión, dH1 y la pureza eutéctica calculada) se obtienen fácilmente a partir del termograma de un solo evento de fusión empleando una muestra de prueba pequeña y el método no requiere mediciones múltiples de temperatura reales y precisas. Las unidades del termograma se convierten directamente a transferencia de calor, en milicalorías por segundo. El descenso del punto de congelación en soluciones diluidas por moléculas de tamaño casi igual se expresa mediante la ecuación de van't Hoff modificada:
en donde T = temperatura absoluta en grados Kelvin; X2 =fracción molar del componente menor (soluto; impureza), dH 1 = calor molar de fusión del componente principal en joules por mol: R = constante de gases en joules por mol x grados Kelvin; y K0 = cociente de distribución del soluto entre la fase sólida y la fase líquida. Asumiendo que el intervalo de temperatura es pequeño y que no se forman sólidos en solución (K 0 = O), la integración de la ecuación de van't Hoff proporciona la siguiente relación entre la fracción molar de la impureza y la disminución del punto de fusión: (2) en donde T0 = punto de fusión del compuesto puro, en grados Kelvin, y Tm = punto de fusión de la muestra de prueba, en grados Kelvin. Sin formación de sólidos en la solución, la concentración de la impureza en la fase líquida, a cualquier temperatura durante la fusión, es inversamente proporcional a la fracción fundida a esa temperatura y la disminución del punto de fusión es directamente proporcional a la fracción molar de la impureza. Un gráfico de la temperatura observada de la muestra de prueba, T,, frente al recíproco de la fracción fundida, 1/ F, a una temperatura T,, debe producir una línea recta con una pendiente igual a la disminución del punto de fusión (T0 - Tm>· El punto de fusión teórico del compuesto puro se obtiene mediante extrapolación a 1/F = O:
La sustitución de los valores obtenidos en forma experimental para T0 - Tm• dH 1 y T0 en la ecuación (2) produce la fracción molar de la impureza eutéctica total, la cual, cuando se multiplica por 100 da el porcentaje molar de impurezas eutécticas totales. Las desviaciones del gráfico lineal teórico también pueden ser producto de la formación de soluciones sólidas (K 0 O), por lo tanto se debe prestar atención al interpretar estos datos. Para observar el efecto lineal de la concentración de impurezas sobre la disminución del punto de fusión, la impureza debe ser soluble en la fase líquida o la fase fundida del compuesto, pero insoluble en la fase sólida, es decir, no se forma ninguna solución sólida. Para que se produzca la solubilidad en el material fundido son necesarias algunas semejanzas químicas. Por ejemplo, la presencia de compuestos iónicos en compuestos orgánicos neutros y la descomposición térmica quizá no se reflejen en las estimaciones de pureza. El alcance de estas limitaciones teóricas se ha estudiado sólo en forma parcial.
*
USP 39
Pruebas Físicas/ (905) Uniformidad de Unidades de Dosificación 793
Las impurezas presentes provenientes de la ruta sintética a menudo son similares al producto final, en consecuencia no hay generalmente ningún problema de solubilidad en el material fundido. Las impurezas compuestas por moléculas de igual forma, tamaño y carácter que las del componente principal pueden acomodarse en la matriz del componente principal sin modificar la retícula, formando soluciones sólidas o inclusiones; tales impurezas no son detectables por DSC. En tales casos, las estimaciones de pureza son demasiado altas. Esto es más común con cristales menos ordenados, según lo indican los valores bajos de calor de fusión. Además, el método es confiable cuando la pureza del componenete principal es mayor de 98,5 mol% y los materiales no se descomponen durante la fase de fusión. Los niveles de impurezas calculados a partir de los termogramas son reproducibles y generalmente confiables con una aproximación de O, 1% para compuestos ideales. Los compuestos que existen en forma polimorfa no pueden usarse en la determinación de pureza a menos que el compuesto se convierta completamente a una forma. Por otro lado, la DSC y el DTA son intrínsicamente útiles para detectar y en consecuencia realizar el seguimiento del polimorfismo. Procedimiento-El procedimiento vigente y los cálculos a emplear para el análisis de impurezas eutécticas dependen del instrumento específico usado. Consultar la técnica más apropiada para un instrumento dado en la bibliografía del fabricante y/o en la bibliografía de análisis térmico. De todas formas, es imperativo recordar las limitaciones de formación de soluciones sólidas, la insolubilidad en el material fundido, el polimorfismo y la descomposición durante el análisis.
.. (905) UNIFORMIDAD DE UNIDADES DE DOSIFICACIÓN Este capítulo de pruebas generales ha sido armonizado con los textos correspondientes de la Farmacopea Europea y la Farmacopea japonesa. Los textos del capítulo que son textos USP de aplicación nacional y que no forman parte del texto armonizado están marcados con los símbolos (•.) para indicar esta situación. •NOTA-En este capítulo, los términos unidad y unidad de dosificación son sinónimos .• Para garantizar la uniformidad de las unidades de dosificación, cada unidad en un lote debe tener un contenido de fármaco dentro de un intervalo estrecho alrededor de la cantidad declarada. Las unidades de dosificación se definen como formas farmacéuticas que contienen una única dosis o parte de una dosis de un fármaco en cada unidad. Para suspensiones, emulsiones o geles en envases de dosis única destinadas para administración externa o cutánea no se aplica la especificación de uniformidad de unidades de dosificación. El término "uniformidad de unidades de dosificación" se define como el grado de uniformidad en el contenido del fármaco entre las unidades de dosificación. Por lo tanto, los requisitos de este capítulo son aplicables a cada fármaco incluido en unidades de dosificación que contengan uno o más fármacos, a menos que se especifique algo diferente en otra parte de esta Farmacopea. La uniformidad de las unidades de dosificación se puede demostrar mediante uno de los siguientes métodos, Uniformidad de Contenido o Variación de •Peso. (ver la Tabla 1). La prueba de Uniformidad de Contenido para preparaciones que se presentan en unidades de dosificación se basa en la valoración individual del contenido de un fármaco o fármacos en un número de unidades de dosificación para determinar si el contenido individual se encuentra dentro de los límites fijados. El método de Uniformidad de Contenido se puede aplicar en todos los casos. La prueba de Variación de •Peso. es aplicable para las siguientes formas farmacéuticas: (Wl)
Soluciones contenidas en envases de dosis única y en cápsulas blandas;
(W2)
Sólidos (incluidos los polvos, gránulos y sólidos estériles) envasados en envases unitarios y que no contienen sustancias activas o inactivas agregadas;
(W3)
Sólidos (incluidos los sólidos estériles) envasados en envases unitarios, con o sin sustancias activas o inactivas agregadas, que hayan sido preparados por liofilización a partir de soluciones verdaderas en sus envases finales y que declaran este método de preparación; y
(W4)
Cápsulas duras, tabletas sin cubierta o tabletas recubiertas con películas que contengan 25 mg o más de un fármaco que corresponda al 25% o más, en peso, de la unidad de dosificación o, en el caso de cápsulas duras, el contenido de las cápsulas, excepto que se demuestre la uniformidad de otros fármacos presentes en proporciones menores en cumplimiento de los requisitos de Uniformidad de Contenido.
794 (905) Uniformidad de Unidades de Dosificación / Pruebas Físicas
USP 39
La prueba de Uniformidad de Contenido se requiere para todas las formas farmacéuticas que no cumplen las condiciones enumeradas anteriormente para la prueba de Variación de •Peso•. 1 Ta bl a 1 A p11caeI'on d e 1as Prue bas d e Umºform1ºd add e eonten Ido (UC) y V ar1acI'on d e Peso (VP) para Formas Farmaceut1cas Dosis y Proporción de Fármaco Forma Farmacéutica
~25
Tloo
Tabletas
Subtipo
Cápsulas
<25mg o <25°/o
VP
Otras
uc
Suspensión, emulsión o gel
uc
uc uc uc uc uc
Soluciones
VP
VP
VP
VP
Solución liofilizada en envase final
VP
VP
Otros
VP
Duras
VP
Blandas
Sólidos en envases unitarios
mg
~250/o
Película
Sin cubierta Recubiertas
y
Componente único Varios componentes
•
uc
uc
Soluciones en envases de dosis única •y en cápsulas blandas.
VP
VP
Otros
uc
uc
UNIFORMIDAD DE CONTENIDO Seleccionar no menos de 30 unidades y proceder según se indica a continuación para cada forma farmacéutica especificada. Cuando se utilizan procedimientos diferentes para la valoración de la preparacion y para la prueba de Uniformidad de Contenido, puede ser necesario establecer un factor de corrección que deberá aplicarse a los resultados de esta última.
Formas Farmacéuticas Sólidas Valorar 1O unidades individualmente usando un método analítico apropiado. Calcular el valor de aceptación (ver la Tabla 2).
Formas Farmacéuticas Líquidas o Semisólidas Valorar 1O unidades individualmente usando un método analítico apropiado. Realizar la valoración sobre la cantidad de material bien mezclado que se retira de un envase individual en condiciones normales de uso y expresar los resultados como la dosis entregada. Calcular el valor de aceptación (ver la Tabla 2).
Cálculo del Valor de Aceptación Calcular el valor de aceptación, por la fórmula:
en donde los términos se definen en la Tabla 2. Tabla 2 Variable
X:
Definición
Condiciones
Valor
Media de los contenidos individuales (x 1, Xi- ... , Xn), expresados como el porcentaje de la cantidad declarada
•Textos de la Farmacopea Europea y la Farmacopea japonesa no aceptados por la Farmacopea de los Estados Unidos: Como alternativa, para los productos listados en el punto (4) anterior que no cumplen con el límite de umbral de 25 mg/25%, se puede analizar la uniformidad de las unidades de dosificación mediante Variación de Masa en lugar de la prueba de Uniformidad de Contenido si la desviación estándar relativa (RSD) de la concentración del fármaco en las unidades de dosificación finales no es más de 2%, basándose en los datos de validación del proceso y en los datos de desarrollo, y si existiese una aprobación reglamentaria para dicho cambio. La RSD de la concentración es la RSD de la concentración por unidad de dosificación (p/p o p/v), en donde la concentración por unidad de dosificación es igual al resultado de la valoración por unidad de dosificación dividido por el peso de la unidad de dosificación individual. Ver la fórmula para la RSD en la Tabla 2 .• 1
Pruebas Físicas/ (905) Uniformidad de Unidades de Dosificación 795
USP 39
Tabla 2 (Continuación) Variable
Definición
X¡, X2, ···, Xn
Contenido individual de las unidades analizadas, expresado como porcentaje de la cantidad declarada
n
Tamaño de la muestra (número de unidades en una muestra)
k
Constante de aceptabilidad
s
Condiciones
Valor
Si n = 1O, entonces k =
2,4
Si n = 30, entonces k =
2,0 1
Desviación estándar de la muestra
~(x;-X)
r. RSD
Desviación estándar relativa (la desviación estándar de la muestra expresada como porcentaje de la media)
M (caso 1) a aplicar cuando
Valor de referencia
T~lOl,5
M (caso 2) a aplicar cuando T>101,5
n-1
'J'
lOOs/X
Si 98,5% ~X ~101,5%, entonces
M =X (AV= ks)
Si X <98,5%, entonces
M = 98,5% (AV= 98,5 - X+ ks)
Valor de referencia
Si X >101,5%, entonces
M = 101,5% (AV= X - 101,5 + ks)
Si 98,5 ~X ~T, entonces
M=X (AV= ks)
Si X <98,5%, entonces Si X>T, entonces
M =98,5% (AV= 98,5 - X+ ks) M=T% (AV= X- T + ks) Fórmula general:
Valor de aceptación (AV)
IM-Xl+ks (Más arriba se especifican cálculos para cada uno de los casos.)
L1
Máximo valor de aceptación permitido
L2
Máximo intervalo permitido para la desviación de cada unidad de dosificación analizada a partir del valor calculado de M
T
Contenido deseado por unidad de dosificación al momento de la fabricación, expresado como porcentaje de la cantidad declarada. A menos que se indique de otro modo, T es 100,0% o Tes el contenido deseado aprobado por el fabricante por unidad de dosificación.
L1 = 15,0 a menos que se especifique algo diferente Para los valores inferiores, ningún resultado de unidad de dosificación puede ser menor de [1-(0,01 )(L2)]M, mientras que para los valores superiores, ningún resultado de unidad de dosificación puede ser mayor de [1 + (0,01 )(L2)]M. (Esto está basado en un valor de L2 de 25,0.)
L2 = 25,0 a menos que se especifique algo diferente
VARIACIÓN DE •PESO. Llevar a cabo una valoración del (de los) fármaco(s) en una muestra representativa del lote usando un método analítico apropiado. Este valor es el resultado A, expresado como porcentaje de la cantidad declarada (ver Cálculo del Valor de Aceptación). Se debe asumir que la concentración (peso del fármaco por peso de unidad de dosificación) es uniforme. Seleccionar no menos de 30 unidades de dosificación y proceder según se indica a continuación para la forma farmacéutica designada.
USP 39
796 (905) Uniformidad de Unidades de Dosificación/ Pruebas Físicas
Tabletas sin Cubierta o Recubiertas con Película Pesar con exactitud 1O tabletas individualmente. Calcular el contenido, expresado como porcentaje de la cantidad declarada, a partir del •peso• de la tableta individual y del resultado de la Valoración. Calcular el valor de aceptación.
Cápsulas Duras Pesar con exactitud 1O cápsulas individualmente, teniendo cuidado de preservar la identidad de cada cápsula. Retirar el contenido de cada cápsula por un medio adecuado. Pesar individualmente con exactitud las cubiertas vacías y calcular para cada cápsula el •peso• neto de su contenido restando el •peso• de la cubierta del •peso• bruto respectivo. Calcular el contenido de fármaco de cada cápsula a partir del •peso neto• del •contenido• de la cápsula individual y del resultado de la Valoración. Calcular el valor de aceptación.
Cápsulas Blandas Pesar con exactitud 1O cápsulas intactas individualmente para obtener sus •pesos• brutos, teniendo cuidado de preservar la identidad de cada cápsula. Luego cortar y abrir las cápsulas con ayuda de un instrumento cortante seco, limpio y adecuado, como por ejemplo una tijera o una cuchilla afilada, y retirar el contenido lavando con un disolvente adecuado. Dejar que el disolvente ocluido se evapore de las cubiertas a temperatura ambiente durante un periodo de aproximadamente 30 minutos, tomando precauciones para evitar la absorción o la pérdida de humedad. Pesar las cubiertas individuales y calcular el contenido neto. Calcular el contenido de fármaco en cada cápsula a partir del •peso• del producto retirado de la cápsula individual y del resultado de la Valoración. Calcular el valor de aceptación.
Formas Farmacéuticas Sólidas Diferentes de Tabletas y Cápsulas Proceder según se indica para Cápsulas Duras, tratando cada unidad como allí se describe. Calcular el valor de aceptación.
Formas Farmacéuticas Líquidas Pesar con exactitud la cantidad de líquido que se retira de cada uno de 1O envases individuales en condiciones normales de uso. Si fuera necesario, calcular el volumen equivalente después de determinar la densidad. Calcular el contenido de fármaco en cada envase a partir de la masa de producto retirada de los envases individuales y del resultado de la Valoración. Calcular el valor de aceptación.
Cálculo del Valor de Aceptación Calcular el valor de aceptación como se muestra en Uniformidad de Contenido con la excepción de que el contenido individual de las unidades se reemplaza por el contenido estimado individual, como se define a continuación. x A/ W,
X1, X7, ... , Xn
=
contenido estimado individual de las unidades analizadas, en donde X;=
w1,wJ, ... ,wn
=
•pesos. individuales de las unidades analizadas
A
=
contenido de fármaco (% de la cantidad declarada) obtenido usando un método analítico apropiado
w
=
media de •pesos. individuales
W;
(w 1, w,, ... , wn)
CRITERIOS Aplicar los siguientes criterios, a menos que se especifique algo diferente.
Formas Farmacéuticas Sólidas, Líquidas y Semisólidas Se cumple con los requisitos de uniformidad de dosificación si el valor de aceptación de las primeras 1O unidades de dosificación es menor o igual a L1%. Si el valor de aceptación es mayor que L1%, analizar las siguientes 20 unidades y calcular el valor de aceptación. Se cumple con los requisitos si el valor de aceptación final de las 30 unidades de dosificación es menor o igual a L1%, y si el contenido individual de •ninguna. unidad de dosificación es menor de [1 - (0,01 )(L2)]M ni mayor de [1 + (0,01 )(L2)]M •como se especifica. en Cálculo del Valor de Aceptación en Uniformidad de Contenido o en Variación de •Peso•. A menos que se especifique algo diferente, L1 es 15,0 y L2 es 25,0.
Pruebas Físicas/ (911) Viscosidad-Métodos Capilares 797
USP 39
"' (911) VISCOSIDAD-METODOS CAPILARES Los siguientes procedimientos se usan para determinar la viscosidad de un fluido newtoniano, es decir, un fluido con una viscosidad que es independiente de la velocidad de corte o cizallamiento. [NOTA-Para más información, ver el capítulo Reometría (1911 ).] •MÉTODO
l.
Aparato:
VISCOSÍMETRO CAPILAR DE NIVEL SUSPENDIDO (O TIPO UBBELOHDE)
La determinación se puede llevar a cabo con un viscosímetro capilar de nivel suspendido (Figura 7).
L M
N
Figura 1. Viscosímetro capilar de nivel suspendido (o tipo Ubbelohde). Se pueden usar otros viscosímetros, siempre que la exactitud y la precisión no sean menores que las obtenidas con los viscosímetros descritos en este capítulo. Procedimiento: Llenar el viscosímetro a través del tubo (L) con una cantidad suficiente del fluido muestra, que sea apropiada para el viscosímetro en uso, o siguiendo las instrucciones del fabricante. Llevar a cabo el experimento con el tubo en posición vertical. Llenar el bulbo (A) con el líquido y asegurarse también de que el nivel del líquido en el bulbo (B) esté por debajo de la salida al tubo de venteo (M). Sumergir el viscosímetro en un baño de agua o aceite estabilizado a la temperatura especificada en la monografía individual y controlar la temperatura a ±0, 1 º, a menos que se especifique algo distinto en la monografía individual. Mantener el viscosímetro en posición vertical durante un periodo de no menos de 30 minutos para permitir que la temperatura de la muestra alcance el equilibrio. Cerrar el tubo (M) y elevar el nivel del líquido en el tubo (N) hasta un nivel de aproximadamente 8 mm por encima de la marca (E= h 1). Mantener el líquido a este nivel cerrando el tubo (N) y abriendo el tubo (M). Abrir el tubo (N) y medir el tiempo requerido para que el nivel del líquido baje desde la marca (E= h,) hasta la marca (F = h2), usando un dispositivo apropiado para la medición exacta del tiempo. [NOTA-El tiempo de flujo mínimo debe ser 200 segundos.] Calibración: Calibrar cada viscosímetro a la temperatura de prueba usando fluidos con viscosidades conocidas de estándares de viscosidad apropiados para determinar la constante del viscosímetro, k. Los valores de viscosidad de los estándares de calibración deben abarcar el valor de viscosidad esperado del fluido muestra. Calcular la constante del viscosímetro, k, en mm2;s2:
k = r¡f(p r¡ p
t
X
t)
=viscosidad conocida del líquido (mPa · s) = densidad del líquido (g/mL) = tiempo de flujo requerido para que el líquido pase desde la marca superior hasta la marca inferior (s)
USP 39
798 (911) Viscosidad-Métodos Capilares / Pruebas Físicas
Cálculo de las viscosidades cinemática y newtoniana del fluido muestra: Seleccionar un viscosímetro capilar de modo que el tiempo de flujo, t, sea no menos de 200 segundos; y la corrección de energía cinemática sea, por lo regular, menos de 1%. Si se conoce la constante de viscosidad, k, usar la siguiente ecuación para calcular la viscosidad cinemática, v, en mm 2 /s, a partir del tiempo de flujo, t, en segundos.
V=kxt Si se conoce la densidad del fluido a la temperatura de la medición de la viscosidad, entonces la viscosidad newtoniana, r¡, en mPa · s, se calcula:
r¡=vxp p = densidad del fluido (g/mL) El tiempo de flujo del fluido en análisis es la media de no menos de tres determinaciones consecutivas. El resultado es válido si la desviación estándar relativa porcentual (%RSD) para las tres lecturas es no más de 2,0%. •MÉTODO
Aparato:
11.
VISCOSÍMETRO CAPILAR SIMPLE DE TUBO EN FORMA DE
U (O
TIPO 0STWALD)
La determinación se puede llevar a cabo con un viscosímetro capilar simple de tubo en forma de U (Figura 2).
V
L
l_ Figura 2. Viscosímetro capilar simple de tubo en forma de U (o tipo Ostwald). Las variables y los números de las líneas en la Figura 2 se definen como: Línea 1 = marca superior en el tubo V = volumen dado del fluido (m3) Línea 2 = marca inferior en el tubo L = longitud del tubo capilar (m) Se pueden usar otros viscosímetros, como los viscosímetros capilares tipo Ostwald modificados, 1 siempre que la exactitud y la precisión no sean menores que las obtenidas con los viscosímetros descritos en este capítulo. Procedimiento: Llenar el tubo con una cantidad de la muestra que sea apropiada para el viscosímetro en uso o siguiendo las instrucciones del fabricante. El volumen de fluido usado debe ser tal que el bulbo inferior no se vacíe completamente cuando el fluido se direcciona hacia arriba a través del tubo capilar hasta la marca de graduación más alta. Llevar a cabo el experimento con el tubo en posición vertical. Sumergir el viscosímetro en un baño de agua o aceite estabilizado a la temperatura especificada en la monografía individual y controlar la temperatura a ±0, 1 º, a menos que se especifique algo distinto en la monografía individual. Mantener el viscosímetro en posición vertical durante un periodo de no menos de 30 minutos para permitir que la temperatura de la muestra alcance el equilibrio. Usando succión, direccionar hacia arriba el fluido a través del tubo capilar hasta que el menisco alcance el nivel de la graduación más alta. Con el tubo de llenado y el Por ejemplo, el viscosímetro capilar Cannon-Fenske es uno de los viscosímetros capilares simples de tubo en forma de U y también se conoce como viscosímetro capilar tipo Ostwald modificado.
1
USP 39
Pruebas Físicas / (912) Viscosidad-Métodos Rotatorios 799
tubo capilar abiertos a la presión atmosférica, registrar el tiempo, en segundos, requerido para que el líquido fluya desde la marca superior hasta la marca inferior en el tubo capilar. [NOTA-El tiempo de flujo mínimo debe ser 200 segundos.] Calibración y Cálculo de las viscosidades cinemática y newtoniana del fluido muestra: Proceder según se indica en el Método l. Para ciertos viscosímetros capilares simples de tubo en forma de U, determinar la constante del viscosímetro a la misma temperatura que el líquido de muestra en análisis.
(912) VISCOSIDAD-MÉTODOS ROTATORIOS El principio del método se basa en medir la fuerza (torque) que actúa sobre un rotor cuando éste rota a una velocidad angular constante o velocidad de rotación en un líquido. Los reómetros o viscosímetros rotatorios se usan para medir la viscosidad de fluidos newtonianos y no newtonianos. Los siguientes procedimientos se usan para determinar la viscosidad de fluidos newtonianos o la viscosidad aparente de fluidos no newtonianos. La viscosidad calculada de los fluidos newtonianos debe ser la misma (dentro del error experimental), independientemente de la velocidad de corte (o velocidad de rotación). Dada la dependencia de la viscosidad con respecto a la temperatura, la temperatura de la sustancia que se está midiendo se debe controlar dentro de ±0, 1 º, a menos que se especifique algo distinto en la monografía individual. [NOTA-Para más información, ver el capítulo Reometría (1911 ).] • MÉTODO l. VISCOSÍMETROS DE ROTOR Aparato: En el viscosímetro de rotor, la viscosidad aparente se determina haciendo girar un rotor con forma de cilindro o disco, según se muestra en la Figura 1 y la Figura 2, respectivamente, sumergido en un gran volumen de líquido.
Figura 1. Rotores con forma de cilindro.
Figura 2. Rotores con forma de disco. No se puede calcular una viscosidad absoluta debido a la gran distancia existente entre el rotor y la pared del recipiente, o a la geometría del rotor. El torque empleado para mantener una velocidad angular dada proporciona una medida de la resistencia del líquido a fluir, pero a menudo esto se describe como una viscosidad aparente. Se pueden usar otros tipos de viscosímetros de rotor, siempre que la exactitud y la precisión no sean menores que las obtenidas con los viscosímetros descritos en este capítulo.
800 (912) Viscosidad-Métodos Rotatorios / Pruebas Físicas
USP 39
Cuando la medición de la viscosidad se realiza en un vaso de precipitados o vaso, y debido a que la velocidad de corte es desconocida, para poder conseguir reproducibilidad entre laboratorios que miden la viscosidad usando instrumentos diferentes, deben informarse los siguientes parámetros junto con la medida de la viscosidad: 1. Tamaño y especificaciones geométricas del rotor 2. Velocidad angular o velocidad de rotación del rotor 3. Temperatura de la sustancia de prueba El rotor debe sumergirse a la profundidad recomendada, manteniendo al menos 1 cm de distancia con el fondo y con las paredes del recipiente. La preparación de la muestra de prueba, incluyendo la equilibración de temperatura, se especifica en cada monografía individual. Seguir las recomendaciones del fabricante del instrumento con respecto a la carga de la muestra, la selección del rotor y la operación del viscosímetro. Comprobación de la calibración: Comprobar la calibración de la configuaración de un viscosímetro particular a la temperatura de prueba, usando uno o más fluidos de viscosidad conocida (estándares de viscosidad newtoniana). Los valores de viscosidad de los estándares de calibración deben contener el valor de viscosidad esperado del líquido de muestra. [NOTAPara ayudar a verificar la linealidad del aparato, se sugiere realizar mediciones de un estándar de viscosidad newtoniana a distintas velocidades de rotación a la temperatura de prueba.] Se considera que un viscosímetro está calibrado cuando las viscosidades aparentes medidas están dentro de ±5% de los valores indicados. En general, la calibración, operación y limpieza del viscosímetro se deben llevar a cabo de acuerdo con las recomendaciones del fabricante del instrumento. • MÉTODO 11. REÓMETROS DE CILINDROS CONCÉNTRICOS Aparato: En los reómetros de cilindros concéntricos, la viscosidad aparente se determina colocando el líquido en el espacio entre el cilindro interno y el cilindro externo. Los reómetros rotatorios de tensión controlada y de velocidad controlada están disponibles comercialmente en configuraciones con especificaciones geométricas absolutas (p.ej., espacios anulares muy pequeños entre los cilindros concéntricos) que permiten calcular las viscosidades aparentes de fluidos no newtonianos. Los reómetros de tensión de corte controlada miden las velocidades de corte resultantes al aplicar una fuerza o torque dado (la tensión). Los reómetros de velocidad de corte controlada miden la tensión de corte (del torque sobre el eje del rotor) resultante de la aplicación de una velocidad de corte dada (o velocidad de rotación). Los reómetros rotatorios de cilindros concéntricos en ocasiones reciben el nombre de reómetros de vaso y cilindro ("cup-and-bob"). El uso de estos reómetros implica consideraciones adicionales de diseño, dependiendo de si lo que gira es el cilindro externo (el vaso) o el cilindro interno (el cilindro). Los reómetros de vaso rotatorio reciben el nombre de sistemas Couette, mientras que los reómetros de cilindro interno rotatorio se denominan sistemas Searle, según se muestra en la Figura 3 y la Figura 4, respectivamente. Las variables en la Figura 3 y la Figura 4 se definen como: M = torque que actúa sobre la superficie del cilindro (N · m) R0 = radio del cilindro externo (m) R, = radio del cilindro interno {m) h = altura de inmersión del cilindro interno en el medio líquido (m) w = velocidad angular (radianes/s) r¡ = viscosidad (Pa · s) v =velocidad (m/s) Procedimiento: Colocar una cantidad suficiente de fluido de prueba en el reómetro y dejar que la muestra alcance el equilibrio térmico, según se indica en la monografía individual. Poner en funcionamiento el reómetro siguiendo el procedimiento recomendado por el fabricante del instrumento. Para sistemas no newtonianos, la monografía indica el tipo de reómetro que se debe usar y las velocidades de corte a las que se deben realizar las mediciones. Determinar las viscosidades aparentes, cambiando la velocidad de corte (o la tensión de corte, si se usa un reómetro de tensión de corte controlada) en un intervalo apropiado para el uso del material en análisis. A partir de una serie de este tipo de mediciones de viscosidad, se puede obtener la relación entre la velocidad de corte y la tensión de corte de un líquido no newtoniano. Procedimiento:
Pruebas Físicas/ (912) Viscosidad-Métodos Rotatorios 801
USP 39
M
Ro Ri~
T-h
J_ -
,,,------ ~
w
r¡
V
Figura 3. Sistema de cilindros concéntricos Couette para reometría rotacional.
802 (912) Viscosidad-Métodos Rotatorios / Pruebas Físicas
USP 39
-r _ ¡_ _ _ ~ h
Figura 4. Sistema de cilindros concéntricos Searle para reometría rotacional. • MÉTODO
111. REÓMETROS DE CONO Y PLACA
Aparato: En los reómetros de cono y placa, el líquido se introduce en el espacio fijo entre un disco o placa planos y un cono los cuales forman un ángulo definido. El ángulo del cono garantiza una velocidad de corte constante debido al aumento del espacio y de la velocidad lineal conforme aumenta la distancia desde el origen. La medición de viscosidad se puede realizar haciendo girar el cono o la placa, según se muestra en la Figura 5 y la Figura 6, respectivamente. (NOTAPuesto que el volumen de muestra es pequeño, incluso una pequeña pérdida absoluta de disolventes puede ocasionar un gran cambio porcentual en la viscosidad. Dicha pérdida tiene una importancia particularmente relevante para disolventes volátiles pero puede ser significativa incluso para disolventes no volátiles como el agua.]
Pruebas Físicas/ (912) Viscosidad-Métodos Rotatorios 803
USP 39
M
Figura 5. Reómetro rotatorio de cono y placa con cono giratorio. M
R_: 1 1 1
Figura 6. Reómetro rotatorio de cono y placa con placa giratoria. Las variables en la Figura 5 y la Figura 6 se definen como: =velocidad angular (radianes/s) M = torque que actúa sobre la superficie de la placa plana o del cono (N · m) a =ángulo entre la placa plana y el cono (radianes) R = radio del cono (m) Procedimiento: Proceder según se indica en el Método //. Reómetros de Cilindros Concéntricos.
w
•MÉTODO
IV.
REÓMETROS DE PLACAS PARALELAS (O DE DISCOS PARALELOS)
Aparato: Los reómetros de placas paralelas son similares a los reómetros de cono y placa, salvo que la muestra que se va medir se introduce en el espacio entre las dos placas o discos planos paralelos. Las mediciones se realizan normalmente manteniendo la placa o disco inferior estacionario mientras que la placa o disco superior rota a una velocidad angular constante, w (Figura 7).
804 (912) Viscosidad-Métodos Rotatorios / Pruebas Físicas
USP 39
(!)
r= R
Figura 7. Reómetro rotatorio de placas paralelas. Las variables en la Figura 7 se definen como: =velocidad angular (radianes/s) = radio de la placa (m) =distancia entre las dos placas paralelas (m) A diferencia de lo que ocurre con el reómetro de cono y placa, la velocidad de corte entre las placas paralelas aumenta con la distancia desde el origen del eje de rotación debido a que las velocidades lineales aumentan para una velocidad angular dada con un espacio constante. De esta manera, se obtiene una velocidad de corte promedio. A pesar de esto, algunas de las ventajas del reómetro de placas paralelas incluye la facilidad de carga de la muestra (especialmente para líquidos muy viscosos o semisólidos blandos) y su aptitud para suspensiones de partículas. Para suspensiones, el espacio debe fijarse a una altura suficiente para evitar que las partículas se muelan entre las placas. El usuario puede definir el espacio entre las placas paralelas (dentro de límites prácticos) y por lo tanto, ante la ausencia de partículas grandes, se pueden usar espacios más estrechos. Al igual que con los reómetros de cono y placa, la pérdida de disolvente por evaporación puede afectar en gran medida la viscosidad de la muestra, por lo que deben tomarse precauciones para minimizar la pérdida de disolvente. Procedimiento: Proceder según se indica en Método 11. Reómetros de Cilindros Concéntricos. co R h
(91 3) VISCOSIDAD-MÉTODO DE BOLA RODANTE El siguiente procedimiento se usa para determinar la viscosidad de un fluido newtoniano, es decir, un fluido con una viscosidad que es independiente de la tensión o velocidad de corte. [NOTA-Para más información, ver el capítulo Reometría (1911 ).]
APARATO Ver la Figura 1. El diseño básico de un viscosímetro de bola rodante consiste en un tubo (o capilar) que contiene el líquido de muestra en análisis y una bola cuyo tiempo de rodado deberá ser al menos 20 segundos en el ángulo de medición en el líquido de muestra.
USP
Pruebas Físicas/ (913) Viscosidad-Método de Bola Rodante 805
39
Fv: Fuerza de viscosidad F8: Fuerza de flotación Fe: Gravedad
Figura 1. Diseño básico para un viscosímetro de bola rodante.
PRINCIPIO DE MEDICIÓN La medición de viscosidad por medio de la bola rodante se basa en la Ley de Stokes y se ve influenciada por el ángulo de inclinación del tubo (o capilar). Calcular la viscosidad newtoniana, YJ, en mPa · s: 1J = [(p 1 - p 2 ) x g x
r2 x sinBJ/v
00
p 1 = densidad de la bola usada (g/mL)
p 2 =densidad del líquido de muestra (g/mL)
g = constante gravitacional (mm/s2) r = radio de la bola (mm) B =ángulo de inclinación del tubo (o capilar) v =velocidad terminal de la bola (mm/s) Determinar la viscosidad del líquido, observando el tiempo de rodado de una esfera sólida (bola) bajo la influencia de la gravedad en un tubo cilíndrico inclinado relleno del líquido de muestra. Medir el tiempo que la bola tarda en recorrer la distancia establecida entre dos marcas de anillo o sensores de medición. Para cada uno de los tiempos de rodado medidos, la viscosidad resultante se puede expresar como viscosidad dinámica (mPa · s) o como viscosidad cinemática (mm2/s) para una muestra con una densidad conocida. 00
PROCEDIMIENTO Seleccionar un sistema de medición [combinación de tubo (o capilar) y bola] dentro del intervalo anticipado de viscosidad del líquido de muestra. Calentar el tubo limpio y seco y la bola del viscosímetro a la temperatura especificada en la monografía individual y controlar la temperatura a ±0, 1ºsegún sea necesario, a menos que se especifique algo distinto en la monografía individual. Seleccionar un ángulo de medición para obtener un tiempo de rodado mínimo de 20 segundos. Llenar el tubo con el líquido de muestra, procurando evitar la formación de burbujas. Cerrar el tubo y colocarlo en el instrumento. Para un viscosímetro de bola rodante con un tubo de diámetro grande, dejar que se equilibre a la temperatura especificada durante no menos de 15 minutos. Para un viscosímetro de microbola rodante, seguir las instrucciones del fabricante con respecto al equilibrio de la temperatura. Soltar la bola y registrar el tiempo requerido para que la bola ruede desde la marca de anillo superior hasta la marca de anillo inferior (o sensor de medición). Repetir la prueba al menos cuatro veces. El tiempo de rodado en el fluido en análisis es la media de no menos de cuatro determinaciones consecutivas. El resultado es válido si la desviación estándar relativa porcentual (%RSD) para las cuatro lecturas es no más de 2,0%.
CÁLCULO V CALIBRACIÓN Calcular la viscosidad newtoniana, YJ, en mPa · s: Y]
= k X (p,
- P2)
X
t
k =constante de calibración del instrumento (mm 2/s 2) a un ángulo y temperatura de medición especificados p 1 = densidad de la bola usada (g/mL) p 2 =densidad del líquido de muestra (g/mL)
t = tiempo de rodado de la bola (s) Calibrar cada combinación de tubo (o capilar) y bola a la temperatura y ángulo de prueba usando fluidos con viscosidades y densidades conocidas (estándares de viscosidad) para determinar la constante del sistema de medición, k. [NOTA-Algunos viscosímetros automatizados emplean una función polinómica para determinar la calibración para diversos ángulos y temperaturas.] Los valores de viscosidad de los estándares de calibración deben contener el valor de viscosidad esperado del líquido de muestra.
806 (91 3) Viscosidad-Método de Bola Rodante / Pruebas Físicas
USP 39
Las calibraciones son específicas para el radio y densidad de la bola, la temperatura y el ángulo de prueba. Siempre que se cambie alguno de estos parámetros será necesaria una recalibración. Cuando no se dispone de valores de referencia a la temperatura de prueba requerida, se deben seguir las instrucciones del fabricante para aplicar las correcciones matemáticas a la función de calibración. Cuando los materiales de la bola y el tubo no son similares, se deben aplicar correcciones calculadas usando los coeficientes de expansión térmica lineal de los materiales.
Agregar lo siguiente:
·(914) VISCOSIDAD-MÉTODOS POR MEDIDA DE PRESIÓN INTRODUCCIÓN Los viscosímetros/reómetros que se incluyen en este capítulo pueden usarse para medir la viscosidad de los fluidos newtonianos y no newtonianos. Los dispositivos incluyen viscosímetros/reómetros de ranura y viscosímetros capilares de extrusión. Los viscosímetros capilares que se describen en el capítulo Viscosidad-Métodos Capilares (911) se basan en el principio de que el flujo está controlado por la gravedad y estos viscosímetros pueden clasificarse bajo uno de los métodos por medida de presión. Sin embargo, las limitaciones de los viscosímetros capilares de vidrio los vuelven inherentemente·inadecuadospara su uso en la caracterización de fluidos no newtonianos, además de que su uso en mediciones de fluidos de alta viscosidad también resulta impráctico. El presente capítulo (914) no trata dichos viscosímetros. [NOTA-Para información adicional, ver Reometría (1911 ).] • MÉTODO l. VISCOSÍMETROS/REÓMETROS DE RANURA Aparato: Ver la figura 1. El diseño básico de un viscosímetro/reómetro de ranura consta de un canal ranurado rectangular con un área de sección transversal uniforme. Se bombea un líquido de prueba a una velocidad de flujo constante a través de este canal. Múltiples sensores de presión que se montan empotrados al ras a distancias lineales a lo largo de la dirección. de 1<1 t::orriente miden la caíd
Figura l. Diseño básico del visrnsímetro/reómetro de ranura.: Principio c;le medición: El víscosímetro/reómetro de ranura está basado en el principio fundamental de que un líquídq vise coso resiste el flujo, por lo que presenta una presión que disminuye a lo Jarg.o dela ranura. La reducción ocaída de lél presión (LlP) se correlaciona con ta tensión dexorte enJa unión de las paredes. La velocjdad de corte.aparente está directa., mente relacionada con la velocidad de flujo y la dimensión de la ranura. La velocid<1d de corte aparente (y.), la. tensión de corte (o) y la viscosidad aparente (r¡J, respectivamente, se calculan de la siguiente manera:
y;, Q w
h rr LlP
= velocidad de corte aparente (s~1) = velocidad de flujo {µL/s) = áncho del canaldeflujo(mm) = profundidad de' canal c:le flujo (mm) = tensión de corte (Pa) = diferencia de presión entre el sensor de presión inicial y el último sensor de presión (Pa)
Pruebas Físicas/ (921) Determinación de Agua 807
USP 39
=distancia entre el sensor de presión inicial y el último sensor de presión (mm) = viscosidad aparente (Pa · s) Para determinar la viscosidad de un líquido, bombear la muestra líquida a través del canal ranurado a una velocidad de flujo constante y medir la caída de la presión. Usando las ecuaciones mostradas anteriormente, calcular la viscosidad aparente para la velocidad de corte aparente. Para un líquido newtoniano, la viscosidad aparente es la misma que la viscosidad verdadera, y es suficiente la medición de una velocidad de corte individual. Para líquidos no newtonianos, la viscosidad aparente no es la viscosidad.verdadera. Para obtener la viscosidad verdadera, medir las viscosidades aparentes a múltiples velocidades de corte aparentes .. Calcular las viscosidades verdaderas, r¡, a diversas velocidades de corte usando el factor de corrección Weissenberg-Rabinowitsch-Mooney:
r¡0
.!."'_l_x( 2 + dlnf")
t¡
2x17
dlno-
0
La viscosidad verdadera calculada deber ser igual al valor que se obtiene usando un reómetro de cono y placa a la misma velocidad de corte. Procedimiento: Seleccionar dimensiones de ranura y presión máxima de los sensores de presión para obtener el intervalo deseado· de viscosidad y velocidades de corte. Cargar una muestra de prueba en una jeringa de vidrio con una bomba de jeringa que controle la velocidad de flujo o intercambiablemente la velocidad de corte. Según sea necesario, controlar la temperatura de la muestra con una aproximación de ±0, 1 ºcon la jeringa y el viscosímetro de ranura especificado eh el procedimiento individual, a menos que se especifique de otro modo. Dejar que se equilibre a la temperatura especificada durante aproximadamente 3-5 minutos. Ajustar cada sensor de presión a cero. Seleccionar la primera velocidad de flujo o velocidad de corte. Bombear la muestra a la velocidad de flujo y medir las lecturas de presión una vez que se hayan alcanzado valores de estado estacionario. Incrementar la velocidad de flujo (o velocidad de corte) hasta que la lectura de presión del sensor ltiicial sea >5% del valor de la escala completa. Tomar el promedio de cada sensor de presión con el paso del tiempo y calcular las caídas de presión. Calcular la viscosidad aparente. Si el procedimiento lo requiere, repetir las medítiones cuatro veces. Si la muestra de prueba es no newtoniana, variar la velocidad de corte y calcular las viscosidades aparen· tes correspondientes. Cáfculo y calibración: Calcular la viscosidad aparente dividiendo la tensión de corte por la velocidad de corte aparente. Para líquidos no newtonianos, aplicar las correcciones Weissenberg-Rabinowitsch-Mooney para obtener la curva de viscosidad verdadera. los viscosímetros comerciales incluyen un sistema de corrección en el mismo equipo. Calibrar los sensores individuales de presión siguiendo las recomendaciones del fabricante. No obstante, el viscosímetro de ranura puede calibrarse con un estándar newtoniano de viscosidad conocida. Seleccionar un estándar que abarque el in~ tervalo de viscosidad de interés para la ranura seleccionada y para los sensores de presión. Medir las viscosidades a las velocidades de corte para el 10%, 50% y 90% de la escala completa del sensor de presión inicial y obtener el promedio. Calcular una constante (k) como el cociente entre el valor de referencia (r¡re1) y el valor medido (T/meas) y registrar.
k == llrer 17mcos
=viscosidad de referencia (Pa. s) r¡meas =viscosidad medida (Pa · s) Multiplicar los nuevos datos de viscosidad por k, debido a que el valor de k corregirá la incertidumbre y la variación de la geometría de la ranura. Idealmente, el valor de k debe permanecer constante dentro de un cambio de temperatura de 100º. Si el valor k varía en> 1%, consultar con el fabrícante respecto a la compensación de temperatura de los sensores de presión. Tfref
AUSP39
(921) DETERMINACIÓN DE AGUA Numerosos artículos farmacopeicos son hidratos o contienen agua en forma adsorbída. Como consecuencía, la determinación del contenido de agua es importante para demostrar el cumplimiento con las normas farmacopeicas. Por lo general, en cada monografía se exige uno de los métodos que se describen a continuación, en funcíón de la naturaleza del artículo. En algunos casos poco comunes se permite elegir entre dos métodos. Si el artículo contiene agua de hidratación, se utiliza el Método /(Volumétrico), el Método 11 (Azeotrópico) o el Método 111 (Gravimétrico), según se indica en la monografía individual, y el requísito se especifica bajo el encabezado Agua. El encabezado Pérdida por Secado (ver Pérdida por Secado (731)) se utiliza en aquellos casos en los que la pérdida por calentamiento puede no ser totalmente de agua.
USP 39
808 (921) Determinación de Agua / Pruebas Físicas
MÉTODO 1 (VOLUMÉTRICO) Determinar el agua mediante el Método la, a menos que se especifique algo diferente en la monografía individual.
Método la (Valoración Volumétrica Directa) Principio-La determinación volumétrica del agua está basada en la reacción cuantitativa del agua con una solución anhidra de dióxido de azufre y yodo en presencia de una solución amortiguadora que reacciona con los iones hidrógeno. En la solución volumétrica original, conocida como Reactivo de Karl Fischer, el dióxido de azufre y el yodo se disuelven en piridina y metanol. La muestra de prueba puede valorarse con el Reactivo directamente o el análisis puede realizarse mediante un procedimiento de valoración residual. La estequiometría de la reacción no es exacta y la reproducibilidad de la determinación depende de factores tales como las concentraciones relativas de los ingredientes del Reactivo, la naturaleza del disolvente inerte utilizado para disolver la muestra de prueba y la técnica utilizada en la determinación en cuestión. Por lo tanto, para conseguir la exactitud deseada se utiliza una técnica empíricamente estandarizada. La precisión del método depende en gran parte de la medida en que la humedad atmosférica es eliminada del sistema. Normalmente la valoración de agua se realiza utilizando metanol anhidro como disolvente para la muestra de prueba. En algunos casos pueden utilizarse otros disolventes adecuados para muestras de prueba especiales o no habituales. En estos casos, se recomienda la adición de al menos 20% de metanol u otro alcohol primario. Aparato-Puede utilizarse cualquier aparato que garantice una exclusión de la humedad atmosférica y una determinación del punto final adecuadas. En el caso de una valoración directa de una solución incolora, el punto final se puede observar visualmente como un cambio de color de amarillo canario a ámbar. El caso inverso se observa cuando se realiza una valoración residual de una muestra de prueba. Sin embargo, de forma más habitual el punto final se determina de forma electrométrica utilizando un aparato con un circuito eléctrico simple que genera un potencial aplicado de aproximadamente 200 mV entre un par de electrodos de platino sumergidos en la solución que se desea valorar. En el punto final de la valoración un ligero exceso de reactivo aumenta el flujo de corriente entre 50 y 150 microamperios durante un período de 30 segundos a 30 minutos, dependiendo de la solución que se esté valorando. Este período es menor en el caso de sustancias que se disuelven en el reactivo. En algunos valoradores volumétricos automáticos el cambio abrupto de corriente o de potencial en el punto final hace cerrar una válvula operada por solenoide que controla la bureta que suministra la solución volumétrica. Los aparatos disponibles comercialmente comprenden por lo general un sistema cerrado que consta de una o dos buretas automáticas y un vaso de valoración cubierto herméticamente equipado con los electrodos necesarios y un mezclador magnético. El aire en el sistema se mantiene seco con un desecante adecuado y el vaso de valoración puede purgarse mediante una corriente de nitrógeno seco o de aire seco. Reactivo-Preparar el Reactivo de Karl Fischer según se indica a continuación. Agregar 125 g de yodo a una solución que contenga 670 mL de metanol y 1 70 mL de piridina, y enfriar. Colocar 100 mL de piridina en una probeta graduada de 250 mL y, manteniendo la piridina fría en un baño de hielo, introducir dióxido de azufre seco hasta alcanzar un volumen de 200 ml. Agregar lentamente esta solución a la mezcla de yodo enfriada, agitando. Agitar hasta disolver el yodo, transferir la solución al aparato y dejar la solución en reposo durante la noche antes de estandarizar. Un mL de esta solución recientemente preparada equivale aproximadamente a 5 mg de agua; como esta solución se deteriora gradualmente, se recomienda estandarizarla dentro de un período de 1 hora antes de su uso o diariamente si su uso es continuo. Proteger la solución de la luz mientras se esté utilizando. Almacenar el reactivo preparado a granel en un recipiente con tapón de vidrio adecuadamente sellado, totalmente protegido de la luz y refrigerado. Para determinar agua en cantidades de trazas (menos de 1%), es preferible usar un Reactivo con un factor de equivalencia de agua de no más de 2,0, el cual generará el consumo de un volumen más significativo de solución volumétrica. Puede utilizarse una solución estabilizada de reactivo de tipo Karl Fischer disponible comercialmente. También pueden utilizarse reactivos disponibles comercialmente que contengan disolventes o bases diferentes a la piridina o alcoholes diferentes al metanol. Éstos pueden ser soluciones individuales o reactivos formados in situ combinando los componentes de los reactivos presentes en dos soluciones distintas. El Reactivo diluido requerido en algunas monografías debe diluirse de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Como diluyente puede utilizarse metanol u otro disolvente adecuado, como el éter monometílico de etilenglicol. Preparación de Prueba-A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, utilizar una cantidad pesada o medida con exactitud de la muestra en análisis con un contenido de agua estimado de 2-250 mg. La cantidad de agua depende del factor de equivalencia de agua del Reactivo y del método de determinación del punto final. En la mayoría de los casos, se puede estimar la cantidad mínima de la muestra, en mg, por la fórmula:
FCV/KF en donde Fes el factor de equivalencia de agua del Reactivo, en mg por mL; Ces el volumen usado, en porcentaje, de la capacidad de la bureta; V es el volumen de la bureta, en mL; y KF es el límite o contenido razonable de agua esperado en la muestra, en porcentaje. C está generalmente entre 30% y 100% para la valoración manual, y entre 10% y 100% para el método instrumental de determinación del punto final. [NOTA-Se recomienda que el producto de FCV sea mayor o igual a 200 para el cálculo, a fin de asegurar que la cantidad mínima de agua valorada sea mayor o igual a 2 mg.]
Pruebas Físicas/ (921) Determinación de Agua 809
USP 39
Si la muestra en análisis es un aerosol con propelente, conservarla en el congelador durante no menos de 2 horas, abrir el envase y analizar 10,0 ml de la muestra bien mezclada. Para valorar la muestra, determinar el punto final a una temperatura de 1Oº o mayor. Si la muestra en análisis son cápsulas, utilizar una porción del contenido mezclado de no menos de 4 cápsulas. Si la muestra en análisis son tabletas, utilizar el polvo de no menos de cuatro tabletas molidas hasta polvo fino en una atmósfera con valores de temperatura y humedad relativa que se sepa que no afectan los resultados. En los casos en los que la monografía especifique que la muestra en análisis es higroscópica, colocar una porción del sólido, pesada con exactitud, en un vaso de valoración, procediendo inmediatamente y procurando evitar la absorción de humedad atmosférica. Si la muestra está constituida por una cantidad definida de sólido como producto liofilizado o polvo dentro de un vial, utilizar una jeringa seca para inyectar un volumen adecuado de metanol, u otro disolvente adecuado, medido con exactitud, en un recipiente tarado y agitar hasta disolver la muestra. Con la misma jeringa, retirar la solución del recipiente y transferirla a un vaso de valoración preparado según se indica en Procedimiento. Repetir el procedimiento con una segunda porción de metanol u otro disolvente adecuado, medido con exactitud, agregar este lavado al vaso de valoración y valorar inmediatamente. Determinar el contenido de agua, en mg, de una porción de disolvente con el mismo volumen total que el utilizado para disolver la muestra y para lavar el recipiente y la jeringa, según se indica en Estandarización de la Solución de Agua para Valoraciones Volumétricas Residuales, y restar este valor del contenido de agua, en mg, obtenido en la valoración de la muestra en análisis. Secar el recipiente y su cierre a 100º durante 3 horas, dejar que se enfríen en un desecador y pesar. Determinar el peso de la muestra analizada a partir de la diferencia en peso con respecto al peso inicial del recipiente. Cuando sea apropiado, el agua puede ser desorbida o liberada de la muestra mediante calor en un horno externo conectado al vaso, al que se transfiere con ayuda de un gas inerte y seco como nitrógeno puro. Se debe tomar en cuenta y corregirse cualquier deriva debida al gas transportador. Se deben seleccionar con cuidado las condiciones de calentamiento para evitar la formación de agua como resultado de la deshidratación debida a la descomposición de los componentes de la muestra, lo cual puede invalidar este método. Estandarización del Reactivo-Colocar una cantidad suficiente de metanol o de otro disolvente adecuado en el vaso de valoración para cubrir los electrodos y agregar suficiente Reactivo para obtener el color característico del punto final, o 100 ± 50 microamperios de corriente continua con un potencial aplicado de aproximadamente 200 mV. Se puede usar Agua Purificada, tartrato de sodio dihidrato, un Estándar de Referencia USP, o estándares comerciales con un certificado de análisis rastreable hasta un estándar nacional para estandarizar el Reactivo. El factor de equivalencia del reactivo, el volumen de valoración recomendado, el tamaño de la bureta y la cantidad de estándar que se va a medir son factores a considerar al momento de seleccionar el estándar y la cantidad que se va a usar. 1 Para Agua Purificada o estándares de agua, agregar rápidamente el equivalente a entre 2 y 250 mg de agua. Calcular el factor de equivalencia del agua, F, en mg de agua por ml de reactivo, por la fórmula:
W/V en donde W es el peso, en mg, del agua contenida en la alícuota de estándar usado; y V es el volumen, en ml, del Reactivo usado en la valoración. Para tartrato de sodio dihidrato, agregar rápidamente 20-125 mg de tartrato de sodio dihidrato (C4 H4 Nap6 • 2H 2 0), pesados con exactitud por diferencia, y valorar hasta el punto final. El factor de equivalencia de agua F, en mg de agua por ml de reactivo, se calcula por la fórmula:
WIV (36,04/230,08) en donde 36,04 es dos veces el peso molecular de agua y 230,08 es el peso molecular de tartrato de sodio dihidrato; W es el peso, en mg, del tartrato de sodio dihidrato; y Ves el volumen, en ml, del Reactivo consumido en la segunda valoración. Tomar en cuenta que la solubilidad del tartrato de sodio dihidrato en metanol es tal que podría necesitarse metanol nuevo para valoraciones adicionales del estándar de tartrato de sodio dihidrato. Procedimiento-A menos que se especifique algo diferente, transferir suficiente metanol u otro disolvente adecuado al vaso de valoración asegurándose de que el volumen sea suficiente para cubrir los electrodos (aproximadamente 30-40 ml) y valorar con el Reactivo hasta el punto final electrométrico o visual para consumir la humedad que pudiera estar presente. (No tomar en cuenta el volumen consumido, ya que no se utiliza en los cálculos). Agregar rápidamente la Preparación de Prueba, mezclar, y volver a valorar con el Reactivo hasta el punto final electrométrico o visual. Calcular el contenido de agua de la muestra tomada, en mg, por la fórmula:
SF en donde Ses el volumen, en ml, del Reactivo consumido en la segunda valoración; y Fes el factor de equivalencia de agua del Reactivo.
Considerar una configuración en la que el factor de equivalencia del reactivo sea de 5 mg/ml y el volumen' de la bureta sea de 5 ml, así como un punto final instrumental. Se pueden usar cantidades de estándar equivalentes a entre 2,5 mg y 22,5 mg de agua (10%-90% de la capacidad de la bureta) basándose en la bu reta y el factor de equivalencia del reactivo. El límite superior de este intervalo implicaría una cantidad excesiva de tartrato de sodio dihidrato. Si se pesa Agua Purificada o un estándar, se requiere una balanza analítica apropiada para la cantidad pesada.
1
81 O (921) Determinación de Agua/ Pruebas Físicas
USP 39
Método lb (Valoración Volumétrica Residual) Principio-Ver la información que figura en la sección Principio en Método la. En la valoración residual se agrega un exceso de Reactivo a la muestra de prueba, se espera un tiempo suficiente para que se complete la reacción y se valora el Reactivo no consumido con una solución estándar de agua en un disolvente como el metanol. El procedimiento de valoración residual se aplica de forma general y evita los problemas que pueden surgir en la valoración directa de sustancias en las que el agua unida se libera lentamente. Aparato, Reactivo y Preparación de Prueba-Usar el Método la. Estandarización de la Solución de Agua para Valoraciones Volumétricas Residuales-Preparar una Solución de Agua diluyendo 2 mL de agua con metanol u otro disolvente adecuado hasta 1000 ml. Estandarizar esta solución valorando 25,0 mL con el Reactivo, previamente estandarizado según se indica en Estandarización del Reactivo. Calcular el contenido de agua, en mg por mL, de la Solución de Agua tomada, por la fórmula:
V'F/25 en donde V es el volumen del Reactivo consumido y Fes el factor de equivalencia de agua del Reactivo. Determinar el contenido de agua de la Solución de Agua semanalmente y estandarizar periódicamente el Reactivo contra éste según sea necesario. Procedimiento-Si la monografía individual especifica que el contenido de agua debe ser determinado por el Método lb, transferir suficiente metanol u otro disolvente adecuado al vaso de valoración, asegurándose de que el volumen sea suficiente para cubrir los electrodos (aproximadamente 30-40 mL) y valorar con el Reactivo hasta el punto final electrométrico o visual. Agregar rápidamente la Preparación de Prueba, mezclar y agregar un exceso, medido con exactitud, de Reactivo. Esperar un tiempo suficiente para que se complete la reacción y valorar el Reactivo no consumido con la Solución de Agua estandarizada hasta el punto final electrométrico o visual. Calcular el contenido de agua de la muestra tomada, en mg, por la fórmula:
F(X' - XR) en donde Fes el factor de equivalencia de agua del Reactivo; X' es el volumen, en mL, del Reactivo agregado después de introducir la muestra; X es el volumen, en mL, de la Solución de Agua estandarizada necesaria para neutralizar el Reactivo no consumido; y R es el cociente, V /25 (mL de Reactivo/mL de Solución de Agua), determinado a partir de la Estandarización de la Solución de Agua para Valoraciones Volumétricas Residuales.
Método le (Valoración Culombimétrica) Principio-Para la determinación culombimétrica del agua se utiliza la reacción de Karl Fischer. El yodo, sin embargo, no se agrega en forma de solución volumétrica sino que se obtiene por oxidación anódica en una solución que contiene yoduro. La celda de reacción consta normalmente de un amplio compartimiento anódico y de un pequeño compartimiento catódico, separados entre sí por un diafragma. También pueden utilizarse otros tipos adecuados de celdas de reacción (p.ej., sin diafragma). Cada compartimiento tiene un electrodo de platino que conduce la corriente a través de la celda. El yodo, que se produce en el electrodo anódico, reacciona inmediatamente con el agua que está presente en el compartimiento. Cuando se ha consumido toda el agua, se produce un exceso de yodo que normalmente se detecta electrométricamente, lo que indica el punto final. La humedad se elimina del sistema mediante pre-electrólisis. No es necesario cambiar la solución de Karl Fischer después de cada determinación ya que las diferentes determinaciones pueden realizarse de forma sucesiva en la misma solución reactivo. Un requisito de este método es que cada componente de la muestra de prueba sea compatible con los demás componentes y que no se produzcan reacciones secundarias. Normalmente las muestras son transferidas al vaso en forma de solución mediante la inyección a través de un septo. Los gases se pueden introducir en la celda utilizando un tubo de entrada de gas adecuado. La precisión del método depende fundamentalmente del grado de eliminación de la humedad atmosférica en el sistema; por tanto, la introducción de sólidos en la celda puede requerir precauciones tales como trabajar en una cámara cerrada con guantes en una atmósfera de gas inerte seco. El control del sistema se puede efectuar midiendo la deriva de la línea base, lo cual no excluye la necesidad de una corrección con un blanco cuando se usa como vehículo de introducción de la muestra. Este método es especialmente adecuado para sustancias químicas inertes como hidrocarburos, alcoholes y éteres. En comparación con la valoración volumétrica de Karl Fischer, la culombimetría es un micrométodo. Cuando sea apropiado, el agua puede ser desorbida o liberada de la muestra mediante calor en un horno externo conectado al vaso, al que se transfiere con ayuda de un gas inerte y seco como nitrógeno puro. Se debe tomar en cuenta y corregirse cualquier deriva debida al gas transportador. Se deben seleccionar con cuidado las condiciones de calentamiento para evitar la formación de agua como resultado de reacciones de descomposición por la deshidratación de los componentes de la muestra, lo cual puede invalidar este método. Aparato-Resulta adecuado cualquier aparato comercialmente disponible que conste de un sistema absolutamente hermético equipado con los electrodos necesarios y un mezclador magnético. El microprocesador del instrumento controla el procedimiento analítico y muestra los resultados. No es necesario calibrar el instrumento ya que la corriente consumida puede medirse de forma absoluta. Reactivo-Ver las recomendaciones del fabricante. Preparación de Prueba-Cuando la muestra sea un sólido soluble, se puede disolver una cantidad apropiada, pesada con exactitud, en metanol anhidro u otros disolventes adecuados.
Pruebas Físicas/ (921) Determinación de Agua 811
USP 39
Cuando la muestra sea un sólido insoluble, se puede extraer una cantidad apropiada, pesada con exactitud, usando un disolvente anhidro adecuado y se puede inyectar en la solución del anolito. Alternativamente, se puede usar una técnica de evaporación en la que el agua se libere y evapore por calentamiento de la muestra en un tubo en una corriente de gas inerte seco. El gas pasa luego al interior de la celda. Cuando la muestra se va a usar directamente sin disolver en un disolvente anhidro adecuado, se puede introducir una cantidad apropiada, pesada con exactitud, directamente en la cámara. Cuando la muestra es un líquido y es miscible con metano! anhidro u otros disolventes adecuados, se puede agregar una cantidad apropiada, pesada con exactitud, al metanol anhidro u otros disolventes adecuados. Procedimiento-Usando un dispositivo seco, inyectar o agregar directamente en el anolito una cantidad, medida con exactitud, de la muestra o de la preparación de la muestra que se estima contiene entre 0,5 y 5 mg de agua, o la cantidad recomendada por el fabricante del instrumento, mezclar, y llevar a cabo la valoración culombimétrica hasta el punto final electrométrico. Leer el contenido de agua de la Preparación de Prueba líquida directamente de la pantalla del instrumento y calcular el porcentaje presente en la sustancia. Realizar una determinación con un blanco, según sea necesario, y realizar las correcciones necesarias.
MÉTODO 11 (AZEOTRÓPICO-DESTILACIÓN CON TOLUENO) Aparato-Utilizar un matraz de vidrio de 500 mL, A, conectado mediante una trampa, B, a un condensador de reflujo, C, usando juntas de vidrio esmerilado (ver la Figura 7).
E-¡
-D
A---
Figura 1. Aparato para Determinación Azeotrópica con Tolueno Las dimensiones críticas de las piezas del aparato son las siguientes. El tubo de conexión, D, tiene un diámetro interno de 911 mm. La trampa tiene una longitud de 235-240 mm. El condensador, si es del tipo de tubo recto, tiene una longitud aproximada de 400 mm y un diámetro interior de no menos de 8 mm. El tubo receptor, E, tiene una capacidad de 5 mL y su parte cilíndrica, con una longitud de 146-156 mm, está graduada en subdivisiones de O, 1 mL, de forma que el error de lectura no es mayor de 0,05 mL para cualquier volumen indicado. La fuente de calor es preferiblemente un calentador eléctrico con control de reóstato o un baño de aceite. La parte superior del matraz y el tubo de conexión pueden estar aislados. Limpiar el tubo receptor y el condensador con un limpiador adecuado, enjuagar exhaustivamente con agua y secar en un horno. Preparar el tolueno que se va a utilizar agitando con una pequeña cantidad de agua, separando el exceso de agua y destilando el tolueno. Procedimiento-Colocar en un matraz seco una cantidad de la sustancia, pesada con exactitud al centígramo más próximo, para obtener de 2-4 mL de agua. Si la sustancia es de tipo pastoso, pesar sobre una lámina metálica ovalada con un tamaño que pase justo a través del cuello del matraz. Si existe la posibilidad de que al ingresar la sustancia se produzcan proyecciones, agregar una cantidad suficiente de arena lavada y seca para cubrir el fondo del matraz o una serie de tubos capilares de punto de fusión, con una longitud aproximada de 100 mm, sellados por el extremo superior. Colocar aproximadamente 200 mL de tolueno en el matraz, conectar el aparato y llenar el tubo receptor, E, con tolueno vertido a través de la parte superior del condensador. Calentar el matraz suavemente durante 15 minutos y, una vez que el tolueno empiece a hervir, destilar a una velocidad de aproximadamente dos gotas por segundo hasta que la mayor parte del agua haya sido arrastrada y después de aumentar la velocidad de destilación aproximadamente a cuatro gotas por segundo. Cuando aparentemente se haya destilado toda el agua, enjuagar el interior del tubo del condensador con tolueno mientras se cepilla el tubo en forma descendente con
812 (921) Determinación de Agua / Pruebas Físicas
USP 39
un cepillo para tubos fijado a un alambre de cobre y saturado con tolueno. Continuar la destilación durante cinco minutos; luego retirar la fuente del calor y dejar que el tubo receptor se enfríe a temperatura ambiente. Si quedan gotitas de agua adheridas a las paredes del tubo receptor, arrastrarlas hacia abajo con un cepillo formado por una cinta de goma envuelta alrededor de un alambre de cobre y humedecida con tolueno. Una vez que el agua y el tolueno se hayan separado totalmente, leer el volumen de agua y calcular el porcentaje que estaba presente en la sustancia.
MÉTODO 111 (GRAVIMÉTRICO) Procedimiento para Sustancias Químicas-Proceder según se indica en la monografía individual preparando la sustancia química según se indica en Pérdida por Secado (731 ). Procedimiento para Sustancias Biológicas-Proceder según se indica en la monografía individual. Procedimiento para Artículos de Origen Botánico-Colocar en una cápsula de evaporación tarada aproximadamente 1 Og del fármaco, pesados con exactitud, y preparados según se indica (ver Métodos de Análisis en Artículos de Origen Botánico (561 )). Secar a 105º durante 5 horas y pesar. Continuar el secado y la pesada a intervalos de 1 hora hasta que la diferencia entre dos pesadas sucesivas no sea mayor de 0,25%.
(941) CARACTERIZACIÓN DE SÓLIDOS CRISTALINOS Y PARCIALMENTE CRISTALINOS POR DIFRACCIÓN DE RAYOS X SOBRE POLVO (DRXP) INTRODUCCIÓN Toda fase cristalina de una sustancia determinada produce un patrón característico de difracción de rayos X. Los patrones de difracción (o difractogramas) se pueden obtener a partir de un polvo cristalino orientado aleatoriamente, compuesto de cristalitos o fragmentos de cristal de tamaño finito. En esencia, de un patrón de difracción de un polvo se pueden obtener tres tipos de información: la posición angular de las líneas de difracción (dependiendo de la geometría y el tamaño de la celda unidad), las intensidades de las líneas de difracción (dependiendo principalmente del tipo y arreglo de los átomos y de la orientación de las partículas dentro de la muestra) y los perfiles de las líneas de difracción (dependiendo de la resolución instrumental, el tamaño de los cristalitos, la tensión y el espesor de la muestra). Los experimentos que arrojan posiciones angulares e intensidades de las líneas se pueden utilizar para aplicaciones como el análisis cualitativo de las fases (p.ej., la identificación de las fases cristalinas) y el análisis cuantitativo de las fases de materiales cristalinos. También se puede hacer un cálculo de las fracciones amorfas y cristalinas. 1 El método de difracción de rayos X sobre polvo (DRXP) ofrece una ventaja sobre otros métodos de análisis pues por lo general es de naturaleza no destructiva (para garantizar una muestra orientada aleatoriamente, la preparación de la muestra se limita habitualmente a una molienda). Las investigaciones por DRXP se pueden efectuar también bajo condiciones in situ en muestras expuestas a condiciones no ambientales, tales como temperatura y humedad bajas o altas.
PRINCIPIOS La difracción de rayos X resulta de la interacción entre los rayos X y las nubes de electrones de los átomos. Dependiendo del ordenamiento atómico, pueden surgir interferencias de los rayos X dispersados. Estas interferencias son constructivas cuando la diferencia de recorrido entre dos ondas difractadas de rayos X es un múltiplo entero de la longitud de onda. Esta condición selectiva está descrita por la ecuación de Bragg, llamada también ley de Bragg (ver la Figura 1). 2dhkl senehkl
= nA.
1 Existen muchas otras aplicaciones de la técnica de difracción de rayos X sobre polvo que se pueden aplicar a las sustancias farmacéuticas cristalinas, como son la determinación de las estructuras cristalinas, el refinamiento de las estructuras cristalinas, la determinación de la pureza cristalográfica de las fases cristalinas y la caracterización de la textura cristalográfica. Estas aplicaciones no se describen en este capítulo.
Pruebas Físicas / (941) Difracción de Rayos X sobre Polvo 81 3
USP 39
•
•
•
Figura 1. Difracción de rayos X por un cristal, de acuerdo con la ley de Bragg. La longitud de onda, A, de los rayos X es del mismo orden de magnitud que la distancia entre planos sucesivos de la red cristalina, o dhkl (también llamada espaciamiento d). ehkl es el ángulo entre el rayo incidente y la familia de planos reticulares y sen ehkl es inversamente proporcional a la distancia entre planos cristalinos sucesivos o espaciamiento d. La dirección y espaciado de los planos con referencia a los ejes de la celda unidad están definidos por los índices de Miller {hkl}. Estos índices son los recíprocos, reducidos al número entero inmediatamente inferior, de las intersecciones que realiza un plano con los ejes de la celda unidad. Las dimensiones de la celda unidad están dadas por los espaciamientos a, by c, y los ángulos entre ellos a, fJ y y. El espaciado interplanar para un conjunto específico de planos paralelos hkl se indica por dhkl· Cada una de estas familias de planos puede presentar órdenes de difracción mayores cuando los valores d para las familias de planos relacionados nh, nk, ni son reducidos por el factor 1/n (siendo n un número entero: 2, 3, 4, etc.). Cada conjunto de planos en un cristal tiene un ángulo de difracción de Bragg correspondiente, ehkl, asociado con él (para una A específica). Se supone que una muestra de polvo es policristalina, de manera que en cualquier ángulo ehkl hay siempre cristalitos en una orientación que permite la difracción de acuerdo con la ley de Bragg. 2 Para una longitud de rayos X determinada, las posiciones de los picos de difracción (también conocidos como "líneas", "reflexiones" o "reflexiones de Bragg") son características de la red cristalina (espaciamientos d), sus intensidades teóricas dependen del contenido de la celda unidad cristalográfica (naturaleza y posiciones de los átomos) y los perfiles de las líneas dependen de la perfección y extensión de la red cristalina. Bajo estas condiciones, el pico de difracción tiene una intensidad finita que depende del arreglo atómico, tipo de átomos, desplazamiento térmico e imperfecciones estructurales, así como de las características del instrumento. La intensidad depende de muchos factores como la estructura, la temperatura, la cristalinidad, la polarización, la multiplicidad y el factor de Lorentz. Las principales características de los perfiles de las líneas de difracción son: posición 28, altura del pico, área del pico y forma del pico (caracterizada, por ejemplo, por el ancho o asimetría del pico, o por una función analítica o representación empírica). Un ejemplo del tipo de patrones de polvo obtenidos para cinco fases sólidas diferentes de una sustancia se presenta en la Figura 2.
2 Un polvo ideal para experimentos de difracción consta de un gran número de cristalitos pequeños, esféricos, orientados aleatoriamente (dominios cristalinos que difractan coherentemente). Si este número es suficientemente grande, siempre habrá suficientes cristalitos en cualquier orientación difractante para producir patrones de difracción reproducibles.
814 (941) Difracción de Rayos X sobre Polvo/ Pruebas Físicas
USP 39
Forma D
Forma C
Forma B
Forma A
-
_ _ _ __ . . . . . .. _.--- 1-...- - -~~----amorfa .. u -,...,..,,... ... ,.......
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1111111111 1111 111 1 1 1 1 1 11111111 1
~ ~ ~ ~ ~
¡
1 1 1
~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ Ñ ~ ~ ~ ~ ~ ~ 28(A Cu)· Escala
¡
1
i
1 '1 1
~ ~ ~ ~
Figura 2. Patrones de difracción de rayos X sobre polvo obtenidos para cinco fases sólidas diferentes de una sustancia (las intensidades están normalizadas). Además de los picos de difracción, un experimento de difracción de rayos X genera también un ruido de fondo más o menos uniforme sobre el cual se superponen los picos. Aparte de la preparación de la muestra, otros factores contribuyen al ruido de fondo, por ejemplo, el portamuestras, la dispersión difusa del aire y el equipo, y otros parámetros instrumentales como el ruido del detector y la radiación general del tubo de rayos X. La relación pico-ruido puede aumentarse minimizando el ruido de fondo y escogiendo tiempos de exposición prolongados.
INSTRUMENTO Configuración del Instrumento Los experimentos de difracción de rayos X generalmente se efectúan usando difractómetros de polvo o cámaras de polvo. Un difractómetro de polvo por lo general consta de cinco partes principales: una fuente de rayos X; el sistema óptico del haz incidente, el cual puede efectuar la monocromatización, filtrado, colimación y/o enfoque del haz; un goniómetro; el sistema óptico del haz de difracción, que puede incluir monocromatización, filtrado, colimación y enfoque o paralelización del haz; y un detector. También se requieren sistemas de recolección y procesamiento de datos, que por lo general están incluidos en los equipos modernos de medición de difracción. Dependiendo del tipo de análisis que se va a efectuar (identificación de fases, análisis cuantitativo, determinación de los parámetros de la red, etc.) se requieren diferentes configuraciones y niveles de desempeño del instrumento de DRXP. Los instrumentos más simples para medir los patrones de difracción de polvo son las cámaras de polvo. El reemplazo de la película fotográfica, como método de detección, por los detectores fotónicos ha llevado al diseño de difractómetros en los cuales el arreglo geométrico del sistema óptico no hace un enfoque real sino un paraenfoque, tal como en la geometría de Bragg-Brentano. La configuración de paraenfoque de Bragg Brentano es la más usada actualmente y por lo tanto se describe aquí brevemente. Un instrumento dado puede proporcionar una geometría 8/28 horizontal o vertical o una geometría 8/8 vertical. Para ambas geometrías, el haz incidente de rayos X forma un ángulo 8 con el plano de superficie de la muestra y el haz de rayos X difractado forma un ángulo 28 con la dirección del haz de rayos X incidente (un ángulo 8 con el plano de superficie de la muestra). En la Figura 3 se representa el arreglo geométrico básico. El haz de radiación divergente del tubo de rayos X (llamado haz prima-
Pruebas Físicas/ (941) Difracción de Rayos X sobre Polvo 815
USP 39
rio) pasa a través de un conjunto de colimadores de placas paralelas y de una ranura de divergencia e ilumina la superficie plana de la muestra. Todos los rayos difractados por cristalitos adecuadamente orientados en la muestra en un ángulo 20 convergen en una línea en la ranura receptora. Un segundo set de colimadores de placas paralelas y una ranura de dispersión se puede colocar bien sea detrás o delante de la ranura receptora. Los ejes del foco de la línea y de la ranura receptora están a igual distancia del eje del goniómetro. Los cuantos de rayos X se cuentan con un detector de radiación, por lo general un contador de centelleo, un contador proporcional de gas sellado o un detector de estado sólido sensible a la posición, tal como una placa de imágenes o un detector de acoplamiento de carga (CCD, por sus siglas en inglés). El montaje de la ranura receptora y el detector se ensamblan juntos y se mueven tangencialmente al círculo de enfoque. Para barridos 0/20 el goniómetro hace rotar la muestra sobre el mismo eje que el detector, pero a la mitad de la velocidad de rotación, en un movimiento 0/ 20.La superficie de la muestra permanece de esa manera tangencial al círculo de enfoque. El colimador de placas paralelas limita la divergencia axial del haz y por lo tanto controla parcialmente la forma del perfil de la línea difractada. J
I
/
A
B
{ 1
/
/
/
~'
1
\ \'
""F
""-
'
-----
A. tubo de rayos X
I
,.
/
D. ranura de anti-difusión
G. ranura receptora del detector
B. ranura de divergencia
E. ranura receptora
H. detector
C. muestra
F. monocromador
J. circulo de enfoque
Figura 3. Arreglo geométrico de la geometría de paraenfoque de Bragg-Brentano. También se puede usar un difractómetro en modo de transmisión. La ventaja de esta tecnología es que disminuye los efectos debidos a la orientación preferencial. También se puede usar un capilar de aproximadamente 0,5 a 2 mm de espesor para cantidades pequeñas de muestra.
Radiación de Rayos X En el laboratorio, los rayos X se obtienen bombardeando un ánodo metálico con electrones emitidos por efecto termoiónico y acelerados en un campo eléctrico fuerte (usando un generador de alto voltaje). La mayor parte de la energía cinética de los electrones se convierte en calor, lo cual limita la potencia de los tubos y requiere un enfriamiento eficaz del ánodo. Con el uso de ánodos rotatorios y sistemas ópticos de rayos X se puede obtener un aumento de 20 a 30 veces en brillantez. Como alternativa, se pueden producir fotones de rayos X en instalaciones a gran escala (sincrotrón). El espectro emitido por un tubo de rayos X que funciona a un voltaje suficiente consta de un fondo continuo de radiación policromática y una radiación característica adicional que depende del tipo de ánodo. Solo esta radiación característica se usa en experimentos de difracción de rayos X. Las fuentes principales de radiación usadas para difracción de rayos X son tubos de vacío que usan cobre, molibdeno, hierro, cobalto o cromo como ánodos; los rayos X del cobre, molibdeno o cobalto se emplean más comúnmente para sustancias orgánicas (el uso de un ánodo de cobalto puede preferirse especialmente para separar distintas líneas de rayos X). La elección de la radiación que se va a usar depende de las características de absorción de la muestra y la posible fluorescencia de los átomos presentes en la muestra. Las longitudes de onda usadas en la difracción de polvos generalmente corresponden a la radiación Kª del ánodo. Por consiguiente, resulta ventajoso hacer que el haz de rayos X sea "monocromático", eliminando todos los demás componentes del espectro de emisión. Esto puede conseguirse parcialmente con filtros Kp, es decir, con filtros metálicos seleccionados por tener una discontinuidad de absorción entre las longitudes de
816 (941 ) Difracción de Rayos X sobre Polvo / Pruebas Físicas
USP 39
onda Kª y Kp emitidas por el tubo. Dicho filtro usualmente se inserta entre el tubo de rayos X y la muestra. Otra forma más comúnmente usada para obtener un haz de rayos X monocromático consiste en usar un cristal monocromador grande (denominado por lo general "monocromador"). Este cristal se coloca delante o detrás de la muestra y difracta los diferentes picos característicos del haz de rayos X (es decir,~ y Kp) a diferentes ángulos, de forma que sólo uno de ellos puede seleccionarse para ingresar al detector. Incluso es posible separar las radiaciones ~ 1 y ~2 usando un monocromador especializado. Desafortunadamente, la ganancia producida por la obtención de un haz monocromático al usar un filtro o un monocromador se contrarresta por una pérdida en intensidad. Otra forma de separar longitudes de onda ~y Kp consiste en usar espejos curvos para rayos X que puedan simultáneamente monocromar y enfocar o paralelizar el haz de rayos X. PROTECCIÓN CONTRA LA RADIACIÓN La exposición de cualquier parte del cuerpo humano a los rayos X puede ser nociva para la salud. Por lo tanto, siempre que se use equipo de rayos X es fundamental tomar las precauciones adecuadas para proteger al operador y a cualquier persona que se encuentre cerca. La práctica recomendada para protegerse de la radiación, así como los límites de los niveles de exposición a los rayos X son los establecidos por la legislación nacional de cada país. Si no existieran reglamentaciones o recomendaciones oficiales en un país, se deben aplicar las recomendaciones más recientes de la Comisión Internacional de Protección Radiológica.
PREPARACIÓN Y MONTAJE DE LA MUESTRA La preparación del material en polvo y el montaje de la muestra en un soporte adecuado son pasos críticos en muchos métodos analíticos, en particular para el análisis por difracción de rayos X sobre polvo, puesto que pueden afectar en gran medida la calidad de los datos que se van a recolectar.3 Las principales fuentes de error debido a la preparación y montaje de la muestra se discuten brevemente en la siguiente sección para instrumentos que operan en la geometría de paraenfoque de Bragg-Brentano.
Preparación de la Muestra En general, la morfología de muchas partículas cristalinas tiende a dar una muestra que presenta cierto grado de orientación preferencial en el soporte de la muestra. Esto es especialmente evidente para los cristales en forma de aguja o de placa cuando la reducción de tamaño proporciona agujas o plaquetas más finas. La orientación preferencial en la muestra influye sobre la intensidad de las diversas reflexiones, de forma que algunas son más intensas y otras menos intensas, comparado con lo que se esperaría de una muestra completamente aleatoria. Se pueden emplear diversas técnicas para mejorar la aleatoriedad en la orientación de los cristalitos (y por lo tanto para minimizar la orientación preferencial), pero una reducción mayor del tamaño de la partícula es a menudo el mejor y más simple de los métodos. La cantidad óptima de cristalitos depende de la geometría del difractómetro, la resolución requerida y la atenuación del haz de rayos X por la muestra. En algunos casos, tamaños de partículas tan grandes como 50 µm pueden proporcionar resultados satisfactorios en la identificación de las fases. Sin embargo, una molienda excesiva (tamaños de cristalitos de menos de aproximadamente 0,5 µm) puede ocasionar un ensanchamiento de las líneas y cambios significativos en la muestra misma, tales como: • contaminación de la muestra por partículas desprendidas de los instrumentos de molienda (mortero, mano de mortero, bolas, etc.), • reducción del grado de cristalinidad, • transición del estado sólido a otro polimorfo, • descomposición química, • introducción de tensión interna, y • reacciones en estado sólido. Por lo tanto, es aconsejable comparar el patrón de difracción de la muestra sin moler con el patrón correspondiente a una muestra de tamaño de partícula más pequeño (p.ej., una muestra molida). Si el patrón de difracción de rayos X sobre polvo es de la calidad adecuada teniendo en cuenta el uso previsto, entonces es posible que la molienda no sea necesaria. Cabe anotar que si una muestra contiene más de una fase y si se usa el tamizado para aislar partículas de un tamaño específico, se puede alterar la composición inicial.
De manera similar, pueden ocurrir cambios en la muestra durante la recolección de datos, en el caso de muestras que no están en equilibrio (temperatura, humedad).
3
USP 39
Pruebas Físicas / (941 ) Difracción de Rayos X sobre Polvo 81 7
Montaje de la Muestra EFECTO DEL DESPLAZAMIENTO DE LA MUESTRA Una superficie de muestra compensada por D con referencia al eje de rotación del difractómetro causa errores sistemáticos que son muy difíciles de evitar totalmente; para el modo de reflexión, esto produce desplazamientos absolutos D. cos04 en las posiciones 20 (por lo general del orden de 0,01 º en 20 en los ángulos inferiores
[cos8=1] para un desplazamiento D = 15 µm) y ensanchamiento asimétrico del perfil hacia valores 20 bajos. El uso de un estándar interno apropiado permite la detección y corrección de este efecto simultáneamente con el efecto debido a la transparencia de la muestra. Este efecto constituye la mayor fuente de errores en los datos recolectados con difractómetros bien alineados. EFECTO DEL ESPESOR Y TRANSPARENCIA DE LA MUESTRA Cuando el método de DRXP se aplica en modo de reflexión, a menudo es preferible trabajar con muestras de "espesor infinito". Para minimizar el efecto de transparencia, es aconsejable usar un sustrato no difractante (soporte con ruido de fondo nulo); por ejemplo, una placa de silicio monocristalino cortada en paralelo a los planos reticulares 510. 5 Una ventaja del modo de transmisión es que los problemas relacionados con la altura y transparencia de la muestra son menos importantes. El uso de un estándar interno apropiado permite la detección y corrección de este efecto simultáneamente con el efecto debido al desplazamiento de la muestra.
CONTROL DEL DESEMPEÑO DEL INSTRUMENTO El goniómetro y el sistema óptico correspondiente del haz de rayos X incidente y difractado tienen muchas partes mecánicas que necesitan ajuste. El grado de alineación o desalineación influye directamente sobre la calidad de los resultados de una investigación por DRXP. Por lo tanto, los diferentes componentes del difractómetro se deben ajustar cuidadosamente (sistemas ópticos y mecánicos, etc.) para minimizar adecuadamente los errores sistemáticos a la vez que se optimizan las intensidades recibidas por el detector. La búsqueda de intensidad y resolución máximas es siempre antagónica cuando se alinea un difractómetro. Por ello, se debe buscar el mejor equilibrio entre ambas cuando se efectúa el procedimiento de alineación. Existen muchas configuraciones diferentes y los equipos de cada proveedor requieren procedimientos de alineación específicos. El desempeño general del difractómetro se debe examinar y monitorear periódicamente usando materiales de referencia certificados adecuados. Dependiendo del tipo de análisis, también se pueden emplear otros materiales de referencia bien definidos, aunque se prefiere el uso de materiales de referencia certificados.
ANÁLISIS CUALITATIVO DE LAS FASES (IDENTIFICACIÓN DE FASES) La identificación de la composición de las fases de una muestra desconocida por DRXP por lo general se basa en la comparación visual o asistida por computadora, de una porción de su patrón de difracción de rayos X con el patrón experimental o calculado de un material de referencia. Idealmente, estos patrones de referencia se obtienen de muestras monofásicas bien caracterizadas. Este método permite, en la mayoría de los casos, identificar una sustancia cristalina por sus ángulos de difracción 20 o espaciamientos d y por sus intensidades relativas. La comparación asistida por computadora del patrón de difracción de la muestra desconocida con los datos de referencia se puede basar bien sea en un intervalo 20 más o menos extendido del patrón de difracción total o en un conjunto de datos reducidos derivados del patrón. Por ejemplo, la lista de espaciamientos d y de las intensidades normalizadas, lnormi llamada lista (d, lnorm) extraída del patrón, es la huella cristalográfica del material y puede compararse con listas (d, lnorm) de muestras monofásicas compiladas en bases de datos. Para la mayoría de los cristales orgánicos, al usar radiación Cu K"" resulta apropiado registrar el patrón de difracción en un intervalo 20 desde lo más cerca posible a Oº hasta por lo menos 40º. La concordancia en los ángulos de difracción 20 entre la muestra y la referencia está dentro de 0,2º para la misma forma cristalina, mientras que las intensidades relativas entre la muestra y la referencia pueden variar considerablemente debido a los efectos de la orientación preferencial. Por su misma naturaleza, se sabe que los hidratos y solvatos variables tienen dimensiones de celda unidad variables y por esa razón ocurren desplazamientos en las posiciones de los picos de los patrones de DRXP medidos para estos materiales. En estos materiales exclusivos, no es inesperada una discrepancia en las posiciones 20 mayores de 0,2º. Por esa razón, las variaciones dentro de 0,2º en la posición del pico no son aplicables a estos materiales. Para otros tipos de muestras (p.ej., sales inorgánicas), puede ser necesa-
4 Cabe anotar que un desplazamiento en la alineación en cero del goniómetro ocasionaría un desplazamiento constante en todas las posiciones 28 observadas; es decir, todo el patrón de difracción se mueve en este caso por una desviación de Zº en 28. 5 En el caso de una muestra delgada con baja atenuación, se pueden hacer mediciones exactas de las posiciones de las líneas con configuraciones de enfoque del difractómetro en geometría de transmisión o de reflexión. Las mediciones exactas de las posiciones de las líneas sobre muestras con baja atenuación se hacen preferiblemente con difractómetros que tengan sistemas ópticos de haces paralelos. Esto ayuda a reducir los efectos del espesor de la muestra.
81 8 (941 ) Difracción de Rayos X sobre Polvo / Pruebas Físicas
USP 39
río ampliar el barrido de la región 29 hasta bastante más allá de los 40º. Por lo general es suficiente hacer un barrido de las 1O reflexiones más fuertes identificadas en las bases de datos de difracción de rayos X sobre polvo monofásico. En ocasiones es difícil o incluso imposible identificar fases en los siguientes casos: • sustancias no cristalizadas o amorfas, • los componentes a identificar están presentes en bajas fracciones de masa respecto a las cantidades del analito (generalmente menos de 10% m/m), • efectos de orientación preferencial pronunciados, • la fase no está archivada en la base de datos usada, • la formación de soluciones sólidas, • la presencia de estructuras desordenadas que alteran la celda unidad, • la muestra comprende demasiadas fases, • la presencia de deformaciones de la red cristalina, • la similitud estructural de diferentes fases.
ANÁLISIS CUANTITATIVO DE LAS FASES Si la muestra bajo investigación es una mezcla de dos o más fases conocidas, de las cuales no más de una es amorfa, en muchos casos se puede determinar el porcentaje (en volumen o masa) de cada fase cristalina y de la fase amorfa. El análisis cuantitativo de las fases se puede basar en las intensidades integradas, en las alturas de los picos de varias líneas de difracción individuales6 o en el patrón de difracción completo. Estas intensidades integradas, alturas de los picos o datos del patrón completo se comparan con los valores correspondientes de los materiales de referencia. Estos materiales de referencia deben ser monofásicos o una mezcla de fases conocidas. Las dificultades encontradas durante el análisis cuantitativo se deben a la preparación de la muestra (la exactitud y precisión de los resultados requieren, en particular, homogeneidad de todas las fases y una distribución apropiada del tamaño de partículas en cada fase) y a los efectos de la matriz. En casos favorables, en matrices sólidas se pueden determinar cantidades de fases cristalinas tan pequeñas como 10%.
Muestras Polimórficas Para una muestra compuesta de dos fases polimórficas a y b, se puede usar la siguiente expresión para cuantificar la fracción F" de la fase a:
La fracción se obtiene midiendo la relación de intensidad entre las dos fases, si se conoce el valor de la constante K. K es la relación de las intensidades absolutas de las dos fases polimórficas puras l0 ./l 0 b. Su valor puede determinarse midiendo muestras del estándar.
Métodos que Usan un Estándar Los métodos más comúnmente usados para el análisis cuantitativo son: • el método del estándar externo, • el método del estándar interno, y •el método de adición (también llamado a menudo método de adición de estándar o método de estándar agregado). El método del estándar externo es el más general y consiste en comparar el patrón de difracción de rayos X de la mezcla, o las intensidades de las líneas respectivas con las medidas de una mezcla de referencia o con las intensidades teóricas de un modelo estructural, si se conoce totalmente. Para limitar errores debidos a los efectos de la matriz, se puede usar un material de referencia interno que tenga un tamaño de cristalitos y un coeficiente de absorción de los rayos X comparables con los de los componentes de la muestra y un patrón de difracción que no se solape en absoluto con el de la muestra que se va a analizar. Una cantidad conocida de este material de referencia se agrega a la muestra a analizar y a cada una de las mezclas de referencia. Bajo estas condiciones existe una relación lineal entre la intensidad de las líneas y la concentración. Esta aplicación, llamada el método del estándar interno, requiere mediciones precisas de las intensidades de difracción. En el método de adición (o método de adición de estándar), parte de la fase pura a se agrega a la mezcla que contiene la concentración desconocida de a. Se hacen múltiples adiciones para preparar una gráfica de intensidad en función de la concentración en donde la intersección negativa del eje x es la concentración de la fase a en la muestra original.
Si se conocen las estructuras cristalinas de todos los componentes, se puede usar el método de Rietveld para cuantificarlas con una buena exactitud. Si no se conocen las estructuras cristalinas de los componentes se puede usar el método de Pawley o el método de cuadrados mínimos parciales (PLS, por sus siglas en inglés). ·
6
USP 39
Pruebas Físicas / (941) Difracción de Rayos X sobre Polvo 819
CÁLCULO DE LAS FRACCIONES AMORFAS V CRISTALINAS En una mezcla de fases amorfas y cristalinas se pueden calcular las fracciones amorfas y cristalinas de varias maneras. La elección del método usado depende de la naturaleza de la muestra: • Si la muestra consta de fracciones cristalinas y una fracción amorfa de composiciones químicas diferentes, las cantidades de cada una de las fases cristalinas individuales puede calcularse usando sustancias estándar apropiadas, según se describió anteriormente. La fracción amorfa se deduce luego indirectamente por sustracción. • Si la muestra consta de una fracción amorfa y una cristalina, bien sea como una mezcla de 1 fase o 2 fases, con la misma composición elemental, la cantidad de la fase cristalina (el "grado de cristalinidad") se puede calcular midiendo tres áreas del difractograma: A= área total de los picos que surgen de la difracción de la fracción cristalina de la muestra, B = área total por debajo del área A, C =área de ruido de fondo (debido a dispersión del aire, fluorescencia, equipo, etc.). Una vez medidas estas áreas, el grado de cristalinidad se puede calcular en forma aproximada como: % de cristalinidad = 1OOA/(A + B - C) Debe mencionarse que este método no arroja un grado absoluto de valores de cristalinidad y por lo tanto se usa generalmente para propósitos comparativos únicamente. También se cuenta con métodos más sofisticados, como el de Ruland.
ESTRUCTURA DEL MONOCRISTAL En general, la determinación de las estructuras cristalinas se efectúa a partir de los datos de difracción de los rayos X obtenidos usando monocristales. Sin embargo, el análisis de la estructura cristalina de los cristales orgánicos es una tarea exigente, puesto que los parámetros de la red son comparativamente grandes, la simetría es baja y las propiedades de dispersión son normalmente muy bajas. Para cualquier forma cristalina dada de una sustancia, el conocimiento de la estructura cristalina permite el cálculo del patrón correspondiente de DRXP, proporcionando en consecuencia un patrón de referencia de DRXP exento de orientación preferencial, el cual se puede usar para la identificación de las fases.
820 (1005) Emisión Acústica / Información General
USP 39
Capítulos Generales Información General Información General Los capítulos de esta sección son de carácter informativo y no contienen normas, pruebas, valoraciones, ni otras especificaciones de cumplimiento obligatorio para ningún artículo farmacopeico, a excepción de las citas de Leyes y reglamentos federales que puedan ser aplicables. Las citas de Leyes y reglamentos federales se incluyen en esta sección debido a que no son de la autoría de la Farmacopea. Las revisiones o reformas de los requisitos federales que afecten al contenido de estas citas se publicarán en los Suplementos de los compendios USP-NF a la brevedad posible. Los requisitos oficiales de los artículos farmacopeicos se establecen en las Advertencias Generales, las monografías individuales y en los capítulos referentes a Pruebas y Valoraciones Generales de esta Farmacopea.
(1005) EMISIÓN ACÚSTICA INTRODUCCIÓN Las técnicas ultrasónicas se pueden categorizar en dos tipos específicos: emisión acústica (modo pasivo) y espectroscopía ultrasónica (modo activo). Ambas técnicas tienen muchas aplicaciones. La técnica de emisión acústica se basa en la detección y análisis de sonidos producidos por un proceso o sistema. En esencia esto es equivalente a escuchar el proceso o sistema, aunque estos sonidos a menudo están muy por encima de las frecuencias que el oído humano puede detectar. Por lo general, las frecuencias son audibles hasta 15 kHz aproximadamente. En el caso de la espectroscopía ultrasónica, el instrumento está diseñado para generar ondas de ultrasonido en un intervalo de frecuencia definido. Estas ondas viajan a través de la muestra y se miden por medio de un receptor. Se puede establecer una analogía con la espectroscopía UV visible o la espectroscopía IR, por cuanto el espectro ultrasónico detectado refleja cambios en la velocidad o atenuación del sonido debido a la interacción con una muestra a través de un intervalo de frecuencias. Sin embargo, puesto que el alcance de este capítulo se limita a la emisión acústica, no discutiremos en detalle la espectroscopía ultrasónica. La emisión acústica es bien conocida en el estudio de la mecánica de fractura, y por lo tanto, se usa ampliamente entre los científicos de materiales. También se usa mucho como una técnica de pruebas no destructiva y se aplica en forma rutinaria para la inspección de alas de aviones, recipientes de presión, estructuras y componentes de soporte de carga. La emisión acústica también se usa en ingeniería para monitorear el desgaste de máquinas. En términos de aplicaciones farmacéuticas, la dependencia de la medición de la emisión acústica de propiedades físicas como el tamaño de las partículas, la resistencia mecánica y la cohesión de los materiales sólidos permite el uso de esta técnica para el control y detección del punto final de procesos como la granulación de alta velocidad, secado en lecho fluido, molienda y micronización.
Principios Generales Las emisiones acústicas se pueden propagar por diferentes modos. En sólidos, los modos compresionales y de corte o transversales son importantes. Los modos compresionales tienen la velocidad más alta y por lo tanto alcanzan el detector acústico (o transductor de emisión acústica) primero. Sin embargo, en la mayoría de las aplicaciones de emisión acústica en procesos, existen muchas fuentes y cada una de ellas produce descargas cortas de energía; por consiguiente, los diferentes modos no se pueden resolver fácilmente. Por ejemplo, la señal detectada en la pared de un vaso es una mezcla compleja de muchas formas de ondas superpuestas provenientes de muchas fuentes y modos de propagación.
USP 39
Información General/ (1005) Emisión Acústica 821
En las interfases, dependiendo de la impedancia acústica relativa de los dos materiales, mucha de la energía se refleja de vuelta hacia la fuente. En un lecho fluido, por ejemplo, las emisiones acústicas sólo serán detectadas a partir de partículas que impacten directamente las paredes del lecho próximas al transductor. Un método conveniente de estudiar la emisión acústica de los procesos es usar el "nivel medio de señal". Se puede usar un convertidor de valor eficaz a corriente continua (convertidor RMS a CC; RMS-to-DC, por sus siglas en inglés) para convertir la señal portadora de amplitud modulada (AM) en una señal de corriente continua (CC) que varía más lentamente. Esto se conoce como nivel medio de señal (ASL, por sus siglas en inglés). El ASL puede entonces muestrearse digitalmente (por lo general a una frecuencia de muestreo de aproximadamente 50 Hz) y almacenarse electrónicamente para el procesamiento adicional de la señal. La forma más sencilla de estudiar los datos acústicos consiste en examinar cambios en el ASL. Sin embargo, se puede recabar otra información al examinar el espectro de potencia del ASL. El espectro de potencia se calcula tomando el cuadrado complejo del espectro de amplitud y se puede obtener efectuando una Transformada Rápida de Fourier (TRF) sobre el registro de datos digitalizados sin procesar. Los espectros de potencia se pueden promediar para producir un cálculo confiable de la densidad espectral de potencia o para obtener una "huella digital (fingerprint)" de un régimen de proceso particular. La interpretación del espectro de potencia se complica por el hecho de que la señal acústica originada en el sistema se distorsiona por varios factores, incluyendo la transmisión, reflexión y características de la señal de transferencia. La forma del espectro de potencia en el registro del ASL es una función de la dinámica del proceso. Los procesos periódicos (p.ej., mezclado mecánico o burbujeo periódico de un lecho fluido) muestran alta potencia a determinadas frecuencias discretas. Los procesos aleatorios muestran propiedades de tipo parpadeante (flicker noise), donde la potencia es inversamente proporcional a la frecuencia, o propiedades del ruido blanco en donde la potencia es independiente de la frecuencia. La amplitud del espectro de potencia también se ve afectada por la energía de las emisiones acústicas producidas por el proceso. Por ejemplo, si se está procesando un material duro, la emisión acústica producida por el impacto de las partículas será mayor que la producida por un material blando.
INSTRUMENTACIÓN Por lo general, los sensores piezoeléctricos se usan para detectar y cuantificar las señales acústicas producidas por un proceso. Los transductores piezoeléctricos se fabrican a partir de sólidos cristalinos piezoeléctricos conectados a circuitos de control de transductores por contactos eléctricos. Cuando está configurado como un detector, una onda acústica que incide sobre el elemento piezoeléctrico se transforma en una señal eléctrica en el circuito de control del transductor. Cuando se lo configura como generador acústico, una señal eléctrica aplicada al elemento piezoeléctrico por el circuito de control genera una onda acústica que puede propagarse por el medio al cual está conectado el transductor. Por lo general, esto significa que los detectores de emisión acústica pueden funcionar también como generadores de ondas acústicas y esta característica se usa para garantizar el buen desempeño del sensor según se describe más adelante (ver Calificación y Verificación de Instrumentos de Emisión Acústica). En las aplicaciones generales de emisión acústica, a menudo se usan sensores con frecuencias de resonancia diferentes (p.ej., 70 y 190 kHz, aunque frecuencias más altas podrían ser más apropiadas a menores escalas de funcionamiento), que comprenden varios pasos de banda. A medida que el sonido (ultrasonido) del intervalo de frecuencia apropiada alcanza estos sensores, se genera una señal eléctrica cuya amplitud es directamente proporcional a la energía (amplitud) de las ondas de sonido incidentes. Estas señales se procesan por medio de: (1) un preamplificador (que incluye filtrado de señales), (2) un convertidor RMS a CC, (3) un amplificador de ganancia variable y (4) una terminal de recolección de datos conectada a una computadora, la cual cuenta también con un software de control. El equipo de emisión acústica por lo general permite usar varios sensores simultáneamente, con la incorporación de múltiples canales electrónicos en un solo instrumento.
Procesamiento de la Señal La señal de un transductor resonante se asemeja a una señal de radio de amplitud modulada (AM). A la frecuencia de resonancia del transductor, la señal consiste en una onda transportadora cuya amplitud es modulada por el proceso. Para demodular la señal se usa un convertidor RMS a CC. La potencia de salida de este dispositivo es la señal o envolvente de modulación. El envolvente se vuelve a muestrear digitalmente a una frecuencia apropiada para el proceso. Por ejemplo, 50 Hz es la tasa habitual de muestreo digital para un secador de lecho fluido o un granulador de alta velocidad.
FACTORES QUE AFECTAN LA MEDICIÓN Los siguientes factores pueden afectar los datos acústicos obtenidos y deben tenerse en consideración al instalar un sistema de emisión acústica.
822 (1005) Emisión Acústica / Información General
USP 39
1. Falla o Daño Físico-Al igual que cualquier otro tipo de sensor, los sensores de emisión acústica pueden fallar con el tiempo o como resultado de daño físico. Es importante verificar la función del sensor como parte del mantenimiento de rutina del instrumento. Si se instalan múltiples sensores en el mismo recipiente, .se puede generar una señal activa desde un sensor y ésta se puede usar para verificar la detección en otro sensor. Este ejercicio debería garantizar que los sensores estén detectando las señales acústicas generadas por el proceso. Al comenzar, en la mitad y al final del proceso se debe determinar y monitorear también la "señal acústica aceptable mínima" para los sensores, que sea estadísticamente válida, con el fin de garantizar el desempeño de los sensores durante una corrida del proceso. Esto se puede establecer a partir de experimentos rutinarios de la señal de mantenimiento o basándose en los datos históricos de los sensores. 2. Problemas de Interfase del Sensor-Los sensores se instalan por lo general en la pared exterior del recipiente usado en el proceso. Para asegurar el sensor a la pared exterior se pueden usar varios tipos de adhesivos (temporales o permanentes). Durante las limpiezas y movimientos repetidos del recipiente, se puede alterar la unión del sensor al recipiente. La verificación de la integridad de la instalación debe formar parte del mantenimiento rutinario. En forma similar al punto 1 tratado anteriormente, se puede usar una señal activa para garantizar la unión apropiada entre el sensor y el recipiente, lo cual ayuda a confirmar la correspondencia de la impedancia acústica. 3. Influencia del Ruido Mecánico-El uso de altas frecuencias reduce significativamente la contribución del ruido mecánico a la señal acústica detectada, especialmente en funcionamiento a menor escala, aunque no lo elimina completamente. Si se analiza el efecto de varios ajustes de motor, por ejemplo, se puede determinar si la señal acústica detectada es una función del ruido mecánico. Si el efecto es significativo, puede ser necesario usar frecuencias más altas. Es importante reconocer y considerar la contribución del ruido mecánico, no importa qué tan reducido sea, a medida que los motores envejecen o se reemplazan. 4. Influencia de las Características de la Pared del Recipiente-Dado que los sensores se colocan a menudo en la pared exterior del recipiente, el espesor de dicha pared puede afectar la calidad de la señal detectada. Si el recipiente está encamisado, la amplitud de la señal acústica se puede reducir. Si se agregan más sensores al recipiente se puede mejorar la calidad de la señal. Como alternativa, se puede obtener un aumento en la señal si se colocan sensores en un lugar donde exista contacto entre las paredes exteriores e interiores, lo que básicamente proporciona una guía de onda entre el sensor y la fuente de sonido. Las guías de onda se pueden incluir también en el diseño del equipo de fabricación para permitir el monitoreo de la emisión acústica. Es necesario efectuar la validación apropiada para garantizar que esto no afecte adversamente el desempeño del equipo. 5. Efecto de las Propiedades de los Materiales-Durante el funcionamiento, la señal acústica recolectada es una suma de diversos eventos que ocurren en el proceso. Por ejemplo, la señal acústica generada cuando las partículas golpean la pared en un granulador es una función de las propiedades materiales de los gránulos (es decir, densidad, tamaño, porosidad). Por lo tanto, los cambios significativos en cualquiera de estos parámetros pueden afectar la señal acústica y la calidad de la predicción resultante. 6. Influencia de Factores Relacionados con el Proceso-En forma similar al punto 5 mencionado anteriormente, las propiedades relacionadas con el proceso (es decir, fuerza del impacto, frecuencia del impacto, cantidad de material) pueden afectar también la señal acústica y la calidad de la predicción resultante. 7. Impacto de las Condiciones Ambientales-Por último, también se debe tener en cuenta la influencia de los factores ambientales (es decir, temperatura, humedad). Los datos de emisión acústica recolectados son específicos del recipiente o equipo. No es aconsejable aplicar a un equipo un modelo generado en otro, porque la información acústica puede diferir como resultado de los problemas comentados en los puntos 3, 4 y 5.
Calificación y Verificación de Instrumentos de Emisión Acústica Se debe adoptar un enfoque de aptitud del sistema en lo que respecta al desempeño del instrumento, estableciendo la óptima configuración de las mediciones y comparando después el desempeño del instrumento con los valores obtenidos durante el uso rutinario con aquellos obtenidos durante la calificación de la instalación (IQ, por sus siglas en inglés). Este enfoque ofrece respuesta a las inquietudes relacionadas con el muestreo porque, a diferencia de otros sistemas analíticos en línea, los transductores pueden ubicarse óptimamente y conectarse para recibir la señal máxima sin modificación del recipiente. Las tasas de muestreo tienen que cumplir con el teorema de muestreo de Nyquist, el cual afirma que una señal se debe muestrear a una tasa que sea el doble del componente de frecuencia más alto en la señal. Se debe usar un filtro de paso bajo para retirar los componentes de frecuencia que sean mayores que la mitad de la frecuencia de muestreo (frecuencia de Nyquist). Si no se cumple con este criterio se puede incurrir en solapamiento (aliasing). Debido a la naturaleza de los transductores piezoeléctricos y dado que las frecuencias de resonancia son propiedades naturales de los cristales, no es necesario analizar la variación (reproducibilidad) o derivar en el dominio de frecuencia. Esto puede ser necesario si se usan otros tipos de transductores. Cualquier cambio considerable en el dominio de frecuencia se registrará como un descenso en la intensidad de la potencia a la frecuencia de resonancia y por lo tanto está cubierto por los análisis de intensidad de potencia. Las dos áreas principales para la verificación del desempeño del instrumento son la intensidad de la potencia y la temporización. Cualquier cambio en la intensidad de la señal afectará la señal cruda y el ASL y, por lo tanto, afectará también el espectro
USP 39
Información General/ (1005) Emisión Acústica 823
de la potencia. Como consecuencia de los cambios en el proceso (p.ej., variación en dureza o humedad en las partículas que impactan la pared del recipiente) o de los cambios en la conducción acústica del proceso al transductor se pueden presentar cambios en la intensidad de la potencia. La reproducibilidad de la conducción acústica se debe evaluar usando un segundo transductor para registrar un pulso o "ping" en la frecuencia de resonancia del sensor receptor. Este valor de reproducibilidad representa el ruido de la señal y puede usarse en cálculos del límite de detección (LOD, por sus siglas en inglés) y el límite de cuantificación (LOQ, por sus siglas en inglés), donde LOD se define como tres veces el ruido de la señal y LOQ es diez veces el ruido de la señal. El ruido a nivel de la señal de fondo (en la emisión acústica, esta señal de fondo se debe principalmente al ruido del amplificador) se debe calcular a partir de veinte valores secuenciales de ASL adquiridos a la frecuencia de muestreo usada para el funcionamiento normal. Esta prueba se debe repetir a la inversa con el fin de establecer que se pueden obtener valores de intensidad estadísticamente similares en ambos canales. La reproducibilidad a corto plazo permite calcular el ruido. Sin embargo, no proporciona una medida de la integridad de la conducción acústica en el tiempo o, más específicamente, de los cambios causados por el proceso (p.ej., variaciones en las propiedades adhesivas con cambios del proceso tales como calentamiento y enfriado). La prueba de ruido se debe repetir mientras se ejecutan los parámetros normales de procesamiento (usando un recipiente vacío) y se debe calcular la deriva en el ASL. Se deben tomar las precauciones necesarias para garantizar que la deriva en la señal (debido a la variación normal en los parámetros del proceso) no impacte los modelos quimiométricos usados para la determinación del punto final. Para los gráficos de tendencia, se debe demostrar que la deriva no es estadísticamente significativa; caso contrario, se deberá corregir la deriva. Los valores de ruido, deriva y ASL absoluto se deben registrar y guardar, y repetir las pruebas si se hacen cambios al equipo de procesamiento o al sistema de emisión acústica. Si no se hacen cambios, las pruebas se deben repetir todos los meses. De esta forma se puede demostrar que la calidad de la conducción acústica está intacta y cualquier cambio a la intensidad de la señal se puede aislar y atribuir al proceso mismo. Durante el uso rutinario se recomienda ejecutar la prueba de ruido (como se describe anteriormente) antes de cada corrida del proceso y calcular la intensidad de la potencia y el ruido. Estos valores se deben registrar y comparar con los generados tanto durante el uso previo como durante la instalación. El impacto de la desviación con respecto a valores previos dependerá del modelo de predicción y se debe considerar mediante la validación del método. Los datos de ruido (de lo anterior) se pueden usar también para calcular el tiempo de vuelo del pulso. Si la activación del pulso y la recepción de la señal están sincronizados, se puede medir el tiempo tomado por el pulso para transmitir a través del recipiente. Esta es una buena indicación de la medición electrónica, así como de la condición general de la conducción acústica. Sin embargo, esta prueba se debe considerar como una medición de la condición del "sistema" y se debe ejecutar sólo si se han hecho cambios al equipo del proceso o al sistema de emisión acústica, o cada 6 meses. La correlación de los tiempos medidos con los históricos debe ser estadísticamente válida. De no ser así, esto es un indicador de que el sistema de emisión acústica puede necesitar recalificación por parte del fabricante o proveedor del instrumento o de que hay cambios en la conducción acústica. Todas estas pruebas requieren el uso de un pulso acústico generado eléctricamente. Una falla en cualquiera de las pruebas antes mencionadas se puede atribuir a la generación misma de la señal. Se recomienda que el sistema de generación de pulsos eléctricos sea recalificado y certificado de acuerdo con estándares rastreables al Instituto Nacional de Estándares y Tecnología (NIST, por sus siglas en inglés) cada 12 meses.
ANÁLISIS DE LOS DATOS La emisión acústica de granuladores y secadores de lecho fluido se conoce como emisión acústica continua. La emisión acústica continua es afásica (es decir, la señal no tiene comienzo ni interrupción). Esto significa que no es necesario usar las técnicas de procesamiento de la señal que preservan la fase. El análisis espectral de potencia es una técnica útil para procesar las señales de emisión acústica. La información en los espectros de potencia, a diferencia de las señales crudas de emisión acústica, es coherente en el corto plazo, permitiendo promediar la señal. Esto proporciona un mejor cálculo de la densidad espectral de potencia que el proporcionado por un único espectro de potencia. Para detectar puntos finales en procesos de lotes (p.ej., punto final de granulación o secado) es apropiado un modelo multivariado cualitativo (p.ej., PCA o SIMCA). Efectuar la siguiente secuencia de operaciones: (1) Entrenamiento o Calibración-Obtener los espectros de emisión acústica que sean representativos del punto final. (2) Modelado-Crear un modelo multivariado que describa la distribución de las señales de emisión acústica en el punto final. (3) Predicción-Comparar los espectros de emisión acústica contra el modelo. Monitorear el ajuste al modelo (expresado por lo general en términos de un número de desviaciones estándar). A medida que el sistema se aproxima al punto final, el ajuste mejora y se establece la finalización del proceso una vez que el modelo concuerda con los criterios predefinidos. El modelo de predicción se genera a partir de los espectros de emisión acústica obtenidos del proceso funcionando en condiciones normales. Las perturbaciones (p.ej., la aglomeración indeseada en los equipos de recubrimiento) se detectan observando las desviaciones estadísticamente válidas con respecto al modelo. El modelado adaptativo también se ha propuesto para la detección de perturbaciones. Esto implica generar continuamente modelos multivariados a medida que se adquieren las señales de emisión acústica. La desviación inusual de la señal de emisión acústica indica la ocurrencia de una perturbación del proceso. La ventaja del modelo adaptativo es que no es necesario efectuar un paso de calibración por separado.
824 (1005) Emisión Acústica / Información General
USP 39
GLOSARIO Amplitud: La magnitud o potencia de una forma de onda variable. Convertidor RMS a CC (RMS-to-DC, por sus siglas en inglés): Es un dispositivo electrónico que convierte una señal alterna a un nivel de voltaje proporcional a la potencia promedio en la señal. Densidad Espectral de Potencia: La medida de la potencia de emisión acústica en cada elemento de resolución del espectro de potencia. Emisión Acústica Continua: Señales de emisión acústica que no se pueden separar en el tiempo y son típicas de procesos farmacéuticos tales como granulación y secado en lecho fluido. Espectro de Potencia: El espectro de potencia de una señal es una representación de la potencia de la señal en función de la frecuencia. El espectro de potencia se calcula a partir de la señal del dominio tiempo por medio de un algoritmo de Transformada Rápida de Fourier (TRF). Resulta útil estudiar las señales de emisión acústica en el dominio espectral o de frecuencia, ya que a menudo el espectro es característico del mecanismo. Se pueden obtener mejoras en la relación señal-ruido al promediar un número de espectros de potencia, ya que estos son coherentes. Filtrado de Señal: Filtrar una señal significa atenuar las frecuencias por fuera de un rango prescrito. En trabajos de emisión acústica, se usa el filtrado de paso de banda para mejorar la relación señal-ruido al atenuar el ruido fuera del ancho de banda del sensor. El filtrado de paso bajo se usa para eliminar frecuencias más altas que la frecuencia Nyquist con el fin de evitar el solapamiento. Frecuencia Nyquist: La frecuencia Nyquist está definida como la mitad de la tasa de muestreo digital y es la frecuencia más alta que se puede reproducir confiablemente. Frecuencia Resonante: La frecuencia a la cual es más sensible un sensor de emisión acústica. Los sensores de emisión acústica resonantes tienen una frecuencia de resonancia claramente definida, pero por lo general son sensibles a otras frecuencias. Ganancia: El factor de amplificación para un componente, expresado generalmente en términos de decibeles (dB). Ganancia en dB = 20 log 10 (Voltajede salida Voltajedeentrada). Impedancia Acústica: La impedancia acústica (Z) se define como Z = ¡:N (donde pes la densidad y ves la velocidad del sonido). Es un dato importante que informa la proporción de la energía del sonido transmitida de un medio a otro y la cantidad de energía reflejada en la interfase. Modelado Adaptativo: Es un método que predice el estado de un proceso sin el uso de un modelo generado previamente (es decir, no hay un entrenamiento ni un paso de calibración previos). Modo de Corte (Cizalladura): Un modo transverso de transmisión acústica que se presenta solo en sólidos. Modo Compresiona!: Un modo longitudinal de transmisión acústica encontrado en sólidos, líquidos y gases. Modo Transversal: Un modo de propagación de la onda donde el desplazamiento del material es perpendicular a la dirección de la propagación. Estos modos sólo se encuentran en materiales sólidos. Nivel Medio de Señal (ASL}: Una medida de la potencia promedio en una señal de emisión acústica. Paso de Banda: El intervalo de frecuencias dentro de las cuales funciona un componente. Piezoeléctrico: Un material que al comprimirse genera un campo eléctrico. Los materiales piezoeléctricos se usan en la construcción de sensores de emisión acústica. Un material común es el titanato de circonio y plomo (PZT). Propiedades de Tipo Parpadeante (flicker noise): Un tipo de señal asociada con muchos procesos naturales. Las características del ruido parpadeante son: la potencia del ruido es directamente proporcional a la señal y tiene aproximadamente una distribución de densidad espectral de 1/f (f =frecuencia). Ruido Blanco: El ruido blanco se caracteriza por un espectro de potencia de densidad espectral uniforme y está asociado con procesos puramente aleatorios. Solapamiento (aliasing): Los componentes espurios de baja frecuencia que aparecen en la señal y son en realidad frecuencias por encima de la frecuencia Nyquist. Transductor de Emisión Acústica: Un dispositivo en estado sólido que incorpora por lo general un elemento piezoeléctrico para convertir la onda de emisión acústica a una señal eléctrica.
(101 O) DATOS ANALÍTICOS-INTERPRETACIÓN Y TRATAMIENTO INTRODUCCIÓN Este capítulo proporciona información acerca de las prácticas aceptables para el análisis e interpretación uniforme de los datos obtenidos de los análisis químicos y otros análisis. Se describen además algunos métodos estadísticos básicos para la evaluación de datos y se analiza en cierto detalle el tratamiento de los resultados aberrantes y la comparación de procedimientos analíticos. [NOTA-No debe inferirse que las herramientas de análisis mencionadas en este capítulo conforman una lista exhaustiva. Pueden utilizarse otros métodos estadísticos igualmente válidos a criterio del fabricante y demás usuarios de este capítulo.]
USP 39
Información General/ (101 O) Datos Analíticos 825
La garantía de calidad de los productos farmacéuticos se logra combinando una serie de prácticas, que incluyen un diseño robusto de la formulación, validación, análisis de materias primas, análisis durante el proceso y pruebas del producto final. Cada una de estas prácticas depende de procedimientos de prueba confiables. Durante el proceso de desarrollo, se desarrollan y validan procedimientos de prueba para asegurar que los productos fabricados estén perfectamente caracterizados. Las pruebas del producto final permiten comprobar que los productos son uniformemente seguros y eficaces, y que cumplen con sus especificaciones. Las mediciones son intrínsecamente variables y la USP reconoce tal variabilidad para las pruebas biológicas desde hace mucho tiempo. La necesidad de tener en cuenta esta variabilidad cuando se analizan datos de pruebas biológicas, por ejemplo, se trata en el capítulo Análisis de Va/oraciones Biológicas (1034). Las mediciones de análisis químicos comúnmente utilizadas para analizar productos farmacéuticos también son intrínsecamente variables, aunque en menor grado que las pruebas biológicas. No obstante, en muchos casos los criterios de aceptación son proporcionalmente más estrictos y, en consecuencia, debe tenerse en cuenta esta menor variabilidad aceptable cuando se analizan datos obtenidos por procedimientos analíticos. Si no se caracteriza ni se especifica la variabilidad de una medición junto con el resultado obtenido, los datos sólo pueden interpretarse en el sentido más limitado. Por ejemplo, si se especifica que la diferencia entre los promedios de los resultados obtenidos por dos laboratorios al analizar el mismo conjunto de muestras es del 10%, la interpretación es limitada en cuanto a la importancia de dicha diferencia a menos que se especifique la variabilidad dentro de cada laboratorio. Este capítulo proporciona indicaciones para el tratamiento e interpretación científicamente aceptables de los datos. Se describen además herramientas estadísticas que pueden resultar útiles para la interpretación de los datos analíticos. Muchas estadísticas descriptivas, como la desviación estándar y la media, son de uso difundido. Otras herramientas estadísticas, como las pruebas de resultados aberrantes, pueden realizarse utilizando diferentes métodos científicamente válidos, de los cuales también se incluyen ejemplos y sus aplicaciones. El marco dentro del cual se interpretan los resultados de una prueba farmacopeica se describe en detalle en Advertencias y Requisitos Generales 7. Resultados de Pruebas. En el Apéndice G al final de este capítulo, se incluye una selección de referencias útiles para obtener información adicional sobre las herramientas estadísticas aquí descritas. La USP no avala específicamente las referencias citadas, que no constituyen una lista exhaustiva. Puede encontrarse información adicional sobre cualquiera de los métodos citados en este capítulo en la mayoría de los textos de estadística.
PRE-REQUISITOS PARA LAS PRÁCTICAS Y PRINCIPIOS DE LABORATORIO La correcta aplicación de los principios estadísticos a los datos de laboratorio supone que estos datos han sido obtenidos de forma rastreable (es decir, documentada) y sin sesgo. Para asegurarse de ello, son útiles las prácticas siguientes.
Mantenimiento Adecuado de Registros Los registros de laboratorio deben mantenerse con suficiente detalle para que otros analistas igualmente calificados puedan reconstruir las condiciones experimentales y revisar los resultados obtenidos. Por lo general, al obtener datos, deben utilizarse más decimales que los requeridos en la especificación y las cifras sólo deben redondearse una vez realizados los cálculos finales, conforme a lo establecido en las Advertencias y Requisitos Generales.
Consideraciones Relativas al Muestreo Un muestreo eficaz es un paso importante para la evaluación de un atributo de calidad de una población. El objetivo del muestreo es proporcionar datos representativos (la muestra) para estimar las propiedades de la población. La manera en que se obtiene dicha muestra depende totalmente de la pregunta que se busca responder con los datos de la muestra. Por lo general, un proceso aleatorio se considera la manera más adecuada de seleccionar una muestra. De hecho, es necesario utilizar una muestra aleatoria e independiente para asegurar que los datos obtenidos produzcan estimaciones válidas acerca de las propiedades de la población. La generación de una muestra no aleatoria o "de conveniencia" conlleva el riesgo de que las estimaciones estén sesgadas. El tipo de muestreo aleatorio más directo se conoce como muestreo aleatorio simple y es un proceso en el que cada unidad de la población tiene la misma probabilidad de aparecer en la muestra. No obstante, en algunos casos, este método de selección de muestra aleatoria no es óptimo ya que no garantiza la misma representatividad en relación con todos los factores (es decir, tiempo, lugar, máquina) que podrían influir en las propiedades críticas de la población. Por ejemplo, si se requieren 12 horas para fabricar todas las unidades de un lote y es fundamental que la muestra sea representativa de todo el proceso de producción, no sería adecuado tomar una muestra aleatoria simple al finalizar la producción ya que no se puede garantizar que contenga una cantidad similar de unidades fabricadas en cada período del proceso de 12 horas. En estos casos es mejor tomar una muestra aleatoria sistemática, seleccionando al azar una unidad del proceso de producción a intervalos o en lugares sistemáticamente seleccionados (p.ej., muestreando cada 30 minutos, entre las unidades producidas durante ese período) para asegurarse de incluir en la muestra unidades tomadas durante todo el proceso de fabricación. Se requerirá otro tipo de procedimiento de muestreo aleatorio si, por ejemplo, un producto se introduce en los viales usando cuatro máquinas de llenado diferentes. En este caso, sería importante tomar una muestra aleatoria de los viales de cada una de las máquinas de llenado. Una muestra aleatoria estratificada, método que consiste en tomar una muestra al azar del mismo número de viales en cada una de las cuatro máquinas de llenado, cumple con este requisito. Independientemente del motivo del muestreo (p.ej.,
826 (1 01 O) Datos Analíticos / Información General
USP 39
prueba de liberación de partida), debe establecerse un plan de muestreo que indique detalladamente cómo se debe obtener la muestra para asegurar que sea representativa de toda la población y que los datos resultantes tengan la sensibilidad requerida. La estrategia de muestreo óptima depende del conocimiento de los procesos de fabricación y medición analítica. Una vez definido el plan de muestreo, es probable que incluya cierto elemento de selección aleatoria. Por último, debe obtenerse una cantidad de muestra suficiente para el análisis original, los análisis de verificación subsiguientes y otros análisis. Se recomienda consultar a un estadístico para identificar la estrategia de muestreo óptima. Las pruebas que se describen en el resto de este capítulo suponen que se ha realizado un muestreo aleatorio simple.
Uso de Estándares de Referencia Cuando una prueba o valoración de los compendios USP o NF indique el uso de un Estándar de Referencia USP, sólo se considerarán concluyentes los resultados obtenidos usando el Estándar de Referencia USP especificado con respecto a la demostración del cumplimiento de la norma USP o NF. Aunque las normas USP son aplicables durante toda la vida de un artículo, desde su producción hasta su caducidad, la USP no especifica cuando se deben realizar las pruebas ni la frecuencia de análisis. Por lo tanto los usuarios de los compendios USP y NF deben aplicar una variedad de estrategias y prácticas para asegurar que los artículos cumplan con los requisitos farmacopeicos y mantengan dicho cumplimiento, incluyendo el momento y la necesidad de realizar las pruebas. Dichas estrategias y prácticas pueden incluir el uso de estándares secundarios rastreables al Estándar de Referencia USP, para complementar o sustentar cualquier análisis realizado con el propósito de demostrar de manera concluyente el cumplimiento con los estándares farmacopeicos aplicables. Debido a que la asignación de un valor a un estándar es uno de los factores más importantes de la exactitud de un análisis, es fundamental hacerlo correctamente.
Verificación del Desempeño del Sistema La verificación de un nivel del desempeño aceptable de un sistema analítico que se utiliza en forma rutinaria o continua puede ser una práctica valiosa. Esto se puede lograr analizando una muestra de control a intervalos adecuados o examinando otros factores, como la variación entre estándares, las relaciones señal-ruido de fondo, etc. Si se realiza un seguimiento del parámetro medido, por ejemplo graficando los resultados del análisis de una muestra de control, se pueden detectar cambios en el desempeño que requieren el ajuste del sistema analítico. El Apéndice A proporciona un ejemplo de una gráfica de control.
Validación del Procedimiento Todos los procedimientos analíticos deben validarse según se especifica en Validación de Procedimientos Farmacopeicos (1225). Los procedimientos analíticos publicados en la USP-NF se han validado y cumplen con los requisitos reglamentarios de Buenas Prácticas de Fabricación vigentes establecidos en el Código de Reglamentos Federales. Los procedimientos validados pueden utilizarse para analizar una nueva formulación (por ejemplo, un nuevo producto, forma de dosificación o producto intermedio de un proceso) únicamente después de verificar que la nueva formulación no interfiere con la exactitud, linealidad ni precisión del método. No puede suponerse que un procedimiento validado puede medir correctamente el ingrediente activo de una formulación que es diferente a la utilizada para establecer la validez original del procedimiento. [NOTA SOBRE TERMINOLOGÍA-La definición de exactitud en el capítulo (1225) y en ICH Q2 corresponde únicamente a ausencia de sesgo. Para el Vocabulario Internacional de Metrología (VIM, por sus siglas en inglés) y la documentación de la Organización Internacional de Normalización (ISO, por sus siglas en inglés), exactitud tiene un significado distinto. Para ISO, exactitud combina los conceptos de ausencia de sesgo (denominada certeza) y precisión. Este capítulo sigue a la definición del capítulo (1225), que corresponde únicamente a veracidad.]
PRINCIPIOS DE MEDICIÓN Y VARIACIÓN Todas las mediciones son, en el mejor de los casos, estimaciones del valor real ("verdadero" o "aceptado"), ya que contienen una variabilidad aleatoria (también denominada error aleatorio) y, en algunos casos, un error sistemático (sesgo). En consecuencia, el valor medido difiere del valor real debido a la variabilidad intrínseca de la medición. Si un conjunto de mediciones consta de resultados individuales representativos del todo, pueden usarse métodos estadísticos para estimar propiedades informativas de la totalidad y otras pruebas estadísticas para determinar si es probable que dichas propiedades cumplan con los requisitos establecidos. Los análisis estadísticos resultantes deben considerar la variabilidad asociada con el proceso de medición, así como la variabilidad de la entidad que se está midiendo. Las mediciones estadísticas usadas para evaluar la dirección y magnitud de estos errores incluyen la media, la desviación estándar y expresiones derivadas de éstas, como el coeficiente de variación porcentual (%CV, también denominado desviación estándar relativa porcentual o %RSD). La variabilidad estimada puede usarse para calcular intervalos de confianza para la media, o mediciones de variabilidad, e intervalos de tolerancia que capturan una proporción especificada de las mediciones individuales. El uso de mediciones estadísticas debe complementarse con el buen juicio, especialmente con respecto al muestreo representativo. Los datos deberían ser congruentes con las suposiciones estadísticas usadas para el análisis. Puede ser necesario el uso de métodos alternativos para la evaluación de los datos si se considera que una o más de estas suposiciones han sido viola-
USP 39
Información General/ (101 O) Datos Analíticos 827
das. En particular, la mayoría de las mediciones estadísticas y pruebas citadas en este capítulo suponen que la distribución de la población total es una distribución normal y que la muestra analizada es un subconjunto representativo de dicha población. La distribución normal (o gaussiana) tiene forma de campana, es simétrica respecto de su centro y tiene ciertas características requeridas para que estas pruebas sean válidas. No siempre se puede esperar que los datos sigan una distribución normal, pudiéndose requerir de una transformación para que se ajusten a la misma. Por ejemplo, existen variables que tienen distribuciones cuyo gráfico muestra una cola más larga hacia la derecha que hacia la izquierda. Por lo general, estas distribuciones pueden volverse aproximadamente normales mediante una transformación logarítmica. Un método alternativo sería el uso de procedimientos estadísticos "independientes de la distribución" o "no paramétricos" que no requieren que la población tenga una distribución normal. Cuando el objetivo es determinar un intervalo de confianza para la media o para la diferencia entre dos medias, por ejemplo, la suposición de normalidad no es tan importante debido al teorema de límite central. No obstante, debe verificarse la normalidad de los datos para calcular intervalos de confianza válidos para desviaciones estándar y relaciones de las desviaciones estándar, para realizar algunas pruebas de resultados aberrantes y para determinar límites de tolerancia estadística válidos. En este último caso, la normalidad es una suposición fundamental. Los métodos gráficos simples, como gráficos de puntos, histogramas y gráficos de probabilidad normales, son útiles para verificar esta suposición. Una medición analítica simple puede ser útil para evaluar la calidad si la muestra proviene de un lote que se ha preparado utilizando un proceso documentado debidamente validado y si los errores analíticos son bien conocidos. El resultado analítico obtenido puede condicionarse incluyendo una estimación de los errores asociados. En algunos casos puede considerarse el uso de promedios ya que la variabilidad asociada con un valor promedio siempre es menor que la variabilidad de las mediciones individuales. La opción de utilizar mediciones individuales o promedios depende de la aplicación de la medición y su variabilidad. Por ejemplo, cuando se obtienen mediciones múltiples con la misma alícuota de muestra, como en el caso de varias inyecciones de muestra en un método de HPLC, por lo general es aconsejable promediar los datos obtenidos, por la razón que se mencionó anteriormente. La variabilidad se asocia con la dispersión de observaciones en torno al centro de una distribución. El parámetro estadístico más comúnmente utilizado para medir el centro es la media de la muestra (x):
La variabilidad del procedimiento analítico puede estimarse de varias maneras diferentes. La evaluación más común y útil de la variabilidad de un procedimiento es la determinación de la desviación estándar basada en mediciones independientes repetidas1 de una muestra. La desviación estándar de la muestra, s, se calcula por la fórmula:
en donde X; es la medición individual en un conjunto de n mediciones; y ción, se calcula la desviación estándar relativa porcentual (o/oRSD) como:
%RSD =
xes la media de todas las mediciones. A continua-
~X • 100%
y se expresa como un porcentaje. Si los datos requieren la transformación logarítmica para lograr la normalidad (p.ej., para valoraciones biológicas), existen métodos alternativos. 2
1 Las mediciones múltiples (o, por equivalencia, los errores experimentales asociados con las mediciones múltiples) son independientes entre sí cuando se puede suponer que representan una muestra aleatoria de la población. En estas muestras, la magnitud de una medición no está influenciada por otra medición ni influye en la magnitud de ninguna otra medición. La falta de independencia implica que las mediciones están correlacionadas en función del tiempo o del espacio. Consideremos, por ejemplo, una placa de microtitulación de 96 pocillos. Supongamos que, por causa desconocida, se produce un error experimental con valor bajo (error negativo) en una muestra colocada en la primera columna, y que entonces esta misma causa produce un valor bajo para una muestra colocada en la segunda columna; en este caso, las dos mediciones resultantes no son estadísticamente independientes. Una manera de evitar dichas posibilidades sería aleatorizar la colocación de las muestras en la placa. 2 Cuando los datos se han transformado logarítmicamente (base e) para lograr la normalidad, la %RSD es:
%RSD = 100% · -,/e"-1
Esto puede aproximarse razonablemente según: %RSD = 100% • (e'-1)
en donde s es la desviación estándar de los datos transformados logarítmicamente (base e).
USP 39
828 (101 O) Datos Analíticos / Información General
Debe realizarse un estudio de precisión para obtener una mejor estimación de la variabilidad del procedimiento. El estudio de precisión puede diseñarse para determinar la precisión intermedia (que incluye los componentes de variabilidad "entre análisis" e "intra-análisis") y la repetibilidad (variabilidad "intra-análisis"). Los estudios de precisión intermedia deben permitir cambios en las condiciones experimentales que podrían esperarse, como por ejemplo diferentes analistas, diferentes preparaciones de reactivos, diferentes días y diferentes instrumentos. Para realizar un estudio de precisión, la prueba debe repetirse varias veces. Cada análisis debe ser completamente independiente de los demás para obtener estimaciones exactas de los diferentes componentes de variabilidad. Además, dentro de cada análisis, deben realizarse determinaciones repetidas para estimar la repetibilidad. Ver un ejemplo de un estudio de precisión en el Apéndice B. Puede considerarse un intervalo de confianza en la interpretación de los datos. Estos intervalos se calculan a partir de varios datos usando la media (x) y la desviación estándar de la muestra(s) según la fórmula:
(X -
fcx/2, n -1
s s ) .-{n 'X + fcx/2, n -1 .-{n
en donde tª12,n_1 es un número estadístico que depende del tamaño de la muestra (n), el número de grados de libertad (n - 1) y el nivel de confianza deseado (1 - a). Sus valores se obtienen a partir de las tablas publicadas de la distribución t de Student. El intervalo de confianza proporciona una estimación del intervalo donde cae la media de la población "verdadera" (µ) y, además, evalúa la confiabilidad de la media de la muestra como una estimación de la media verdadera. Si se repitiera la misma configuración experimental una y otra vez y se calculara cada vez un intervalo de confianza del 95% (por ejemplo) para la media verdadera, entonces se esperaría que el 95% de dichos intervalos incluyera la media verdadera, µ. No se puede afirmar con seguridad si el intervalo de confianza derivado de un conjunto de datos específicos obtenidos contiene µ. No obstante, suponiendo que los datos representan mediciones independientes entre sí generadas en forma aleatoria a partir de una población normalmente distribuida, el procedimiento usado para determinar el intervalo de confianza garantiza que el 95% de dichos intervalos de confianza contienen µ. Debe tenerse en cuenta que es importante definir la población apropiadamente para capturar todas las fuentes de variación pertinentes. [NOTA SOBRE TERMINOLOGÍA-La documentación de la Organización Internacional de Normalización (ISO) utiliza diferente terminología para algunos de los conceptos aquí descritos. En la documentación de la ISO, al término s/'1n, comúnmente denominado como error estándar de la media, se denomina incertidumbre estándar. Asimismo, la ISO denomina al término tª12 , n-l S/'1n como incertidumbre expandida, mientras que denomina a tª12,n_ 1 como factor de cobertura. Cuando la desviación estándar se calcula combinando los estimados de variabilidad de diversas fuentes, recibe el nombre de incertidumbre estándar combinada. Algunas de estas fuentes podrían tener estimaciones no estadísticas de incertidumbre, denominadas incertidumbres Tipo B, como la incertidumbre en la calibración de una balanza.]
RESULTADOS ABERRANTES Ocasionalmente, los resultados analíticos observados son muy diferentes de los esperados. Las observaciones aberrantes, anómalas, contaminadas, discordantes, falaces, sospechosas o absurdas, así como otros tipos de valores erráticos, se denominan resultados aberrantes. Al igual que todos los resultados de laboratorio, estos resultados aberrantes se deben documentar, interpretar y manejar. Dichos resultados pueden ser mediciones exactas de lo que se está midiendo aunque diferentes de los valores esperados. En otros casos, debido a un error en el sistema analítico, los resultados pueden no ser típicos, aunque la entidad que se mide sea típica. Cuando se obtiene un resultado aberrante, deben realizarse investigaciones sistemáticas del laboratorio y, en algunos casos, de los procesos para establecer la causa de ese resultado. Los factores que deben considerarse al investigar un resultado aberrante incluyen, entre otros, error humano, error de instrumentación, error de cálculo y deficiencias del producto o de sus componentes. Si se encuentra una causa no relacionada con la deficiencia del producto o de sus componentes, pueden repetirse las pruebas con la misma muestra, en lo posible, o con una muestra nueva. Deben examinarse la precisión y exactitud del procedimiento, el Estándar de Referencia USP, las tendencias del proceso y los límites de la especificación. Los datos pueden considerarse no válidos, según esta investigación documentada, y eliminarse de los cálculos posteriores. Si no se encuentra una causa atribuible que se pueda documentar para el resultado aberrante de laboratorio, el resultado puede analizarse, como parte de toda la investigación, para determinar si se trata de un resultado aberrante. No obstante, se requiere una cuidadosa consideración cuando se utilizan estas pruebas. Pueden producirse dos tipos de errores en las pruebas de los resultados aberrantes: (a) identificar observaciones como resultados aberrantes cuando en realidad no lo son; y (b) no identificar resultados aberrantes que sí existen. Cualquier conclusión acerca de la aceptabilidad de los datos en que se observan resultados aberrantes requiere una interpretación cuidadosa. La "designación de resultado aberrante" es el reconocimiento informal de valores de laboratorio sospechosos que deben investigarse con métodos más formales. La elección de la técnica correcta para la identificación de resultados aberrantes suele depender del reconocimiento inicial del número y ubicación de los valores. Frecuentemente, la designación de resultado aberrante se hace visualmente con técnicas gráficas. La "identificación de resultados aberrantes" es el uso de pruebas de significancia estadística para confirmar que los valores no cumplen con el modelo estadístico conocido o supuesto. Cuando se utilizan adecuadamente, las pruebas de resultados aberrantes son herramientas valiosas para los laboratorios farmacéuticos. Existen varias pruebas para detectar resultados aberrantes. Se incluyen en el Apéndice C ejemplos ilustrativos de
Información General/ (101 O) Datos Analíticos 829
USP 39
tres de estos procedimientos: la Prueba de Desviación Estudentizada Extrema (ESD, por sus siglas en inglés), la Prueba de Dixon y la Regla de Hampel. La elección de la prueba de resultados aberrantes adecuada depende del tamaño de la muestra y de las suposiciones de distribución. Muchas de estas pruebas (p.ej., la Prueba ESD) requieren la suposición de que los datos generados por el laboratorio puedan considerarse como una muestra aleatoria de una población normalmente distribuida, posiblemente después de su transformación. Si se realiza una transformación de los datos, la prueba de resultado aberrante se aplica a los datos transformados. Las transformaciones más comunes incluyen tomar el logaritmo o la raíz cuadrada de los datos. Existen otros métodos para la manipulación de un resultado aberrante simple y un resultado múltiple que también pueden utilizarse, e incluyen pruebas que utilizan medidas robustas de dispersión y tendencia central, como por ejemplo la mediana y la desviación absoluta de la mediana y métodos de análisis exploratorio de datos (EDA, por sus siglas en inglés). El "Acomodamiento de resultados aberrantes" es el uso de técnicas robustas, tales como pruebas basadas en el orden o rango de cada valor en el conjunto de datos en lugar del valor real, para producir resultados que no estén adversamente influidos por la presencia de resultados aberrantes. El uso de dichos métodos reduce los riesgos asociados con ambos tipos de error en la identificación de resultados aberrantes. El "rechazo de resultados aberrantes" es la eliminación efectiva del resultado aberrante identificado del conjunto de datos. No obstante, una prueba de resultado aberrante no puede ser el único medio para eliminar un resultado aberrante de los datos de laboratorio. Una prueba de resultado aberrante puede resultar útil como parte de la evaluación de la significancia de ese resultado, junto con otros datos. Las pruebas de resultado aberrante no son válidas en aquellos casos en que se está evaluando la variabilidad del producto, como por ejemplo la uniformidad del contenido, la disolución o la determinación de la velocidad de liberación. En estos casos, un valor considerado como resultado aberrante puede ser en realidad un resultado exacto de un producto no uniforme. Todos los datos, especialmente los resultados aberrantes, deben conservarse para su análisis futuro. Los datos inusuales, cuando se observan en el contexto de otros datos históricos, por lo general no son tales sino que reflejan las influencias de fuentes adicionales de variación. En resumen, el rechazo o la conservación de un resultado aparentemente aberrante puede ser una fuente grave de sesgo. Deben tenerse en cuenta las características de las pruebas, así como el conocimiento científico del proceso de fabricación y el procedimiento analítico, para determinar el origen del resultado aparentemente aberrante. Una prueba de resultado aberrante nunca puede reemplazar una investigación de laboratorio exhaustiva sino que debe realizarse únicamente cuando la investigación no es concluyente y no se observaron desviaciones en la fabricación o pruebas del producto. Incluso si dichas pruebas estadísticas indicaran que uno o más valores son resultados aberrantes, deben conservarse igualmente en los registros. La inclusión o exclusión de resultados aberrantes en los cálculos para evaluar la conformidad del producto con los criterios de aceptación debe basarse en el juicio científico y en las normas internas del fabricante. Suele ser útil realizar los cálculos con y sin los resultados aberrantes para evaluar su impacto. Los resultados aberrantes que se atribuyen a errores en el proceso de medición deben informarse (es decir, mediante una nota al pie de página), pero no incluirse en los cálculos estadísticos posteriores. Al evaluar si el producto cumple con un criterio de aceptación en particular, es importante definir si el resultado a informar (el resultado que se compara con los límites) es un valor promedio, una medición individual u otra cosa. Por ejemplo, si el criterio de aceptación se establece para un promedio, entonces no es estadísticamente apropiado requerir que las mediciones individuales también cumplan con el criterio, ya que la variabilidad asociada con el promedio de una serie de mediciones es menor que la de cualquier medición individual.
COMPARACIÓN DE PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS Con frecuencia es necesario comparar dos procedimientos para determinar si hay una diferencia importante en sus resultados promedios o sus variabilidades. El objetivo de un experimento de comparación de procedimientos es generar datos adecuados que permitan evaluar la equivalencia de los dos procedimientos en toda una gama de valores. En esta sección se describen algunos de los factores que se deben tener en cuenta al realizar dichas comparaciones.
Precisión La precisión es el grado de coincidencia entre los resultados de pruebas individuales cuando el procedimiento analítico se aplica repetidamente a una muestra homogénea. Para considerar que un procedimiento alternativo tiene una precisión "comparable" a la del procedimiento vigente, su precisión (ver Validación de Procedimientos Farmacopeicos (1225), Valoración) no debe ser peor que la del procedimiento vigente en un valor considerado importante. Una disminución en la precisión (o aumento en la variabilidad) puede aumentar el número de resultados que no cumplan con las especificaciones requeridas. Por el contrario, un procedimiento alternativo que proporciona una precisión superior es aceptable. Una manera de comparar la precisión de dos procedimientos es estimando la varianza de cada procedimiento (la varianza de la muestra, s2 , es el cuadrado de la desviación estándar de la muestra) y calculando un intervalo de confianza superior unilateral para la relación de varianzas (verdaderas), en donde relación se define como la varianza del procedimiento alternativo dividida por la varianza del procedimiento vigente. Se incluye un ejemplo basado en esta suposición en el Apéndice D. El límite de confianza superior unilateral debe compararse con un límite superior considerado aceptable, a priori, por el laboratorio analítico. Si el límite de confianza superior unilateral es inferior a este límite aceptable superior, la precisión del procedimiento alternativo se considera aceptable, ya que el uso del procedimiento alternativo no llevará a una pérdida importante de precisión.
830 (101 O) Datos Analíticos/ Información General
USP 39
Debe tenerse en cuenta que si el límite de confianza superior unilateral es inferior a uno, se ha comprobado que el procedimiento alternativo tiene una precisión superior a la del procedimiento vigente. El método de intervalo de confianza que se acaba de describir es preferible a la prueba F en dos muestras para evaluar la significancia estadística de la relación de varianzas. Para realizar la prueba F de dos muestras, la relación de varianzas calculada con las muestras se compara con un valor crítico basado en los valores tabulados de la distribución F para el nivel de confianza deseado y el número de grados de libertad de cada varianza. La mayoría de los textos de estadística incluyen tablas con los valores F. Si la relación calculada excede este valor crítico, se dice que existe una diferencia estadísticamente significativa en la precisión de los dos procedimientos. No obstante, si la relación calculada es inferior al valor crítico, esto no prueba que los procedimientos tienen la misma precisión o una precisión equivalente, sino que no hay suficiente evidencia para probar que existe una diferencia estadísticamente significativa.
Exactitud La comparación de la exactitud de los procedimientos (ver Validación de Procedimientos Farmacopeicos (1225), Valoración) proporciona información útil para determinar si el nuevo procedimiento es equivalente, en general, al procedimiento vigente. Un método sencillo para realizar esta comparación es calcular un intervalo de confianza para la diferencia entre las medias verdaderas, donde la diferencia se calcula restando la media del procedimiento vigente de la media de la muestra obtenida con el procedimiento alternativo. El intervalo de confianza debe compararse con un límite inferior y un límite superior considerados aceptables, a priori, por el laboratorio. Si el intervalo de confianza cae totalmente dentro del rango aceptable, los dos procedimientos pueden considerarse equivalentes, ya que la diferencia promedio entre ellos es insignificante en la práctica. El límite inferior y el superior del intervalo de confianza sólo muestran el tamaño de la posible diferencia real entre los dos procedimientos y no si la diferencia se considera tolerable. Dicha evaluación sólo puede realizarse dentro del contexto científico adecuado. Este enfoque a menudo se denomina Pruebas Unilaterales Dobles (TOST, por sus siglas en inglés; ver Apéndice F). El método del intervalo de confianza que se acaba de describir es preferible a la aplicación de una prueba t para evaluar la significancia estadística de la diferencia en promedios. Una manera de realizar la prueba t es calculando el intervalo de confianza y examinando si contiene o no el valor cero. Los dos procedimientos muestran una diferencia estadísticamente significativa en promedios si el intervalo de confianza excluye el valor cero. Una diferencia estadísticamente significativa puede no tener una magnitud suficiente para tener importancia práctica en el laboratorio ya que puede haber surgido de datos muy precisos o de una muestra de un tamaño mayor. Por otra parte, es posible que no se encuentre ninguna diferencia estadísticamente significativa, lo cual ocurre cuando el intervalo de confianza incluye el valor cero y, de todas maneras, no puede descartarse una diferencia práctica importante. Esto podría ocurrir, por ejemplo, si los datos son muy variables o si el tamaño de la muestra es demasiado pequeño. En consecuencia, si bien el resultado de la prueba t indica si se ha observado o no una diferencia estadísticamente significativa, no determina la presencia o ausencia de una diferencia de importancia práctica.
Determinación del Tamaño de la Muestra La determinación del tamaño de la muestra se basa en la comparación de la exactitud y precisión de los dos procedimientos3 y es similar al método utilizado para evaluar la hipótesis acerca de diferencias de promedio y relaciones de varianza, respectivamente, aunque el significado de algunos de los datos es diferente. El primer componente que se debe especificar es o, la diferencia aceptable más grande entre los dos procedimientos que, si se logra, permite llegar a una conclusión de equivalencia. Es decir, si los dos procedimientos difieren en no más de en el promedio, se consideran aceptablemente similares. La comparación puede ser bilateral como se acaba de expresar, considerando una diferencia de en cualquier dirección, como cuando se comparan medias. Alternativamente, puede ser unilateral, como cuando se comparan varianzas, en cuyo caso es deseable una reducción en la variabilidad y se considera que los métodos son equivalentes si la relación entre las varianzas (método nuevo/método vigente como una proporción) no es más de 1,0 + o. El investigador deberá especificar el obasándose en el conocimiento del procedimiento vigente y/o en su uso, o bien puede calcularlo. Un factor que se debe tener en cuenta cuando hay que cumplir con ciertas especificaciones es que el nuevo procedimiento no debe diferir demasiado del procedimiento vigente para que no se generen resultados fuera de la especificación. En estos casos, se elige un o que represente una baja probabilidad de que esto ocurra, por ejemplo, comparando la distribución de datos para el procedimiento vigente con los límites de especificación. Esto puede hacerse gráficamente o usando un intervalo de tolerancia, del que se incluye un ejemplo en el Apéndice E. En general, la elección de o depende de los requisitos científicos del laboratorio. Los dos componentes siguientes se refieren a la probabilidad de error. Los datos podrían llevar a una conclusión de similitud cuando los procedimientos son inaceptablemente diferentes (según lo definido por el o). Esto se llama falso positivo o error de Tipo l. El error también podría darse en sentido opuesto, es decir, los procedimientos podrían ser similares pero los datos no permiten esa conclusión. Esto se llama falso negativo o error de Tipo 11. Con los métodos estadísticos, no es posible eliminar completamente la posibilidad de cualquiera de estos errores. No obstante, al elegir bien el tamaño de la muestra, la probabilidad de cada uno de estos errores puede reducirse aceptablemente. La probabilidad máxima aceptable de un error de Tipo 1 comúnmente se denomina a y suele considerarse del orden del 5%, pero puede elegirse otro valor. La probabilidad máxima
o,
3
o
En general, el tamaño de la muestra requerido para comparar la precisión de dos procedimientos es mayor que el requerido para comparar su exactitud.
USP 39
Información General/ (101 O) Datos Analíticos 831
deseada de un error de Tipo 11 comúnmente se denomina f3. Con frecuencia, f3 se especifica indirectamente eligiendo un nivel deseado de 1 - f3, que se denomina la "potencia" de la prueba. En el contexto de pruebas de equivalencia, la potencia es la probabilidad de concluir correctamente que dos procedimientos son equivalentes. Normalmente, se toma una potencia del orden del 80% o 90% (correspondiente a un f3 de 20% o 10%), aunque pueden elegirse otros valores. El protocolo para el experimento debe especificar el 8, el a y la potencia. El tamaño de la muestra depende de todos estos componentes. Se incluye un ejemplo en el Apéndice E. Aunque el Apéndice E sólo determina un valor único, suele ser útil determinar una tabla de tamaños de muestras para diferentes opciones de 8, a y potencia. Dicha tabla permite una elección mejor fundamentada del tamaño de la muestra para equilibrar mejor los recursos y los riesgos (conclusiones falsamente negativas y falsamente positivas).
APÉNDICE A: GRÁFICAS DE CONTROL La Figura 7 muestra una gráfica de control para valores individuales. Existen varios métodos diferentes para calcular el límite de control superior (UCL, por sus siglas en inglés) y el límite de control inferior (LCL, por sus siglas en inglés). Un método utiliza el intervalo móvil, que se define como la diferencia absoluta entre dos mediciones consecutivas (x; - x1_ 1). Estos intervalos móviles se promedian (MR) y se usan en las siguientes fórmulas:
x
en donde es la media de la muestra y d2 es una constante comúnmente usada para este tipo de gráfica, que está basada en el número de observaciones asociadas con el cálculo del intervalo móvil. Cuando n = 2 (dos mediciones consecutivas), como aquí, d2 = 1, 128. Para el ejemplo de la Figura 7, el MR era de 1,7:
UCL=102,0+3 1\~ 8 =106,5 LCL=102,0-3 1 \~ =97,5
8
Existen otros métodos que permiten detectar mejor pequeñas variaciones en la media del proceso, como la suma acumulativa (también conocida como "CUSUM") y el intervalo móvil exponencialmente ponderado ("EWMA"). - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - UCL = 106,5
ro 105 ::J
-o :~ -o
.s
Media= 102,0
L..
o
~100 ---------------------------- LCL = 97,5
o
50 100 Número de Observación
Fig. 1. Gráfica de control para cada X o mediciones individuales de muestras de control. En este ejemplo particular, la media de todas las muestras (X) es 102,0, el UCL es 106,5 y el LCL es 97,5.
APÉNDICE B: ESTUDIO DE PRECISIÓN La Tabla 7 muestra datos obtenidos de un estudio de precisión. En este estudio se hicieron cinco análisis independientes y, dentro de cada análisis, se obtuvieron los resultados de tres determinaciones repetidas.
832 (101 O) Datos Analíticos / Información General
USP 39
Tabla 1. Datos de un Estudio de Precisión Nº del Análisis Nº de la Repetición 1 2 1 100,70 99,46 99,37 2 101,05 99,59 3 101,15 99,47 Media 100,97 Desviación Estándar 0,236 O, 111 0,234% 0,111% %RSDª ª %RSD (desviación estándar relativa porcentual)= 100% x (desviación estándar/media)
3
4
s
99,96 100,17 101,01 100,38 0,556 0,554%
101,80 102,16 102,44 102,13 0,321 0,314%
101,91 102,00 101,67 101,86 0,171 0,167%
Tabla lA. Tabla de Análisis de Varianza para los Datos Presentados en la Tabla Fuente de Suma de Cuadrados Cuadrados Mediosª Grados de Libertad (df) (SS) (MS) Variación 14,200 Entre Análisis 4 3,550 lntra-análisis 1,018 0,102 10 Total 15,217 14 ª Los Cuadrados Medios Entre (MSB) = SSEntrefdf¡ntre y los Cuadrados Medios lntra (MSw) = SS ntrafdf ntra 1
1 F=
MSB/MSw 34,886
1
Un análisis de varianza (ANOVA) con los datos de la Tabla 1 genera la tabla ANOVA (Tabla 1A). Como había un número igual de determinaciones repetidas por análisis en el estudio de precisión, los valores de VarianzaAnálisis y VarianzaRep pueden conseguirse directamente de la tabla ANOVA. Las siguientes ecuaciones calculan la variabilidad asociada con los análisis y las determinaciones repetidas, donde MS;nira representa el cuadrado medio de "error" o "intra-análisis" y MSentre representa el cuadrado medio "entre análisis". VarianzaRep = MSintra = O, 102 . \j,ananza = MSentre - MSintra - 3,550-0,102 Análisis Nº repeticiones por análisis 3
- 1 149 '
[NOTA-Una práctica común consiste en utilizar un valor de O para VarianzaAnálisis cuando el valor calculado es negativo]. Las estimaciones también pueden obtenerse con determinaciones repetidas desiguales, pero las fórmulas son más complejas. Muchos programas de software estadístico pueden manejar fácilmente determinaciones repetidas desiguales. Es importante estudiar la magnitud relativa de los dos componentes de la varianza cuando se diseña e interpreta un estudio de precisión. El conocimiento adquirido puede enfocarse en cualquier esfuerzo de mejoramiento del procedimiento continuo y, lo más importante, se puede utilizar para asegurar que los procedimientos tienen la capacidad de respaldar los usos para los que están destinados. Al definir cuidadosamente lo que constituye un resultado (es decir, un valor informable), se está aprovechando el poder de promediar, con lo que se puede lograr prácticamente cualquier precisión deseada. Esto significa que, al basar el valor de informe en un promedio a través de determinaciones repetidas y/o análisis, en vez de en un solo resultado, es posible reducir la %RSD y hacerlo de manera predecible. La Tabla 2 muestra la varianza computada y la %RSD de la media (es decir, del valor de informe) para diferentes combinaciones de número de análisis y número de determinaciones repetidas por análisis, usando las siguientes fórmulas: Varianza de la media = VarianzaAnalisis Varianza Rep -----+-------~--(Nºde análisis) {Nº de anál)(Nºde rep. por anál.) Desviación estándar de la media= .Jvarianza de la media RSD = Desviación estándar de la media x 1OO% Promedio de todos los resultados Por ejemplo, la Varianza de la medía, Desviación estándar de la medía y %RSD de una prueba de dos análisis y tres determinaciones repetidas por cada análisis son 0,592; 0,769 y 0,76%, respectivamente, según se indica a continuación. . . 1 149 o 102 Varianza de la media=-'--+-'-=0 592 (2·3) . 2 Desviación estándar de la media= ~0,592 =0,769 RSD = (0,769/l 00,96)
X
100% = 0,76%
USP 39
Información General/ (101 O) Datos Analíticos 833
en donde 100,96 es la media para todos los datos en la Tabla 7. Como se muestra en la Tabla 2, aumentar el número de análisis de uno a dos permite obtener una reducción más importante en la variabilidad del valor de informe que aumentar el número de determinaciones repetidas por análisis. No se hicieron suposiciones de distribución sobre los datos de la Tabla 7 ya que el propósito de este Apéndice es mostrar los cálculos en un estudio de precisión. Tabla 2. El Impacto Previsto del Plan de Prueba (Nº de Análisis y Nº de Determinaciones Repetidas por Análisis) sobre la Precisión de la Media
ª
Nº de Análisis
Nº de Determinaciones Repetidas por Análisis
Varianza de la Media
Desviación Estándar de la Media
1
1
1,251
1, 118
1,11
1
2
1,200
1,095
1,09
% RSDª
1
3
1,183
1,088
1,08
2
1
0,625
0,791
0,78
2
2
0,600
0,775
0,77
2
3
0,592
0,769
0,76
La o/oRSD se calculó utilizando un valor de la media de 100,96 (como divisor), basado en los 15 puntos de datos presentados en la Tabla 1.
APÉNDICE C: EJEMPLOS DE PRUEBAS DE RESULTADOS ABERRANTES PARA DATOS ANALÍTICOS Considerando el siguiente conjunto de 1 O mediciones: 100,0; 100, 1; 100,3; 100,0; 99,7; 99,9; 100,2; 99,5; 100,0 y 95,7 (media= 99,5, desviación estándar= 1,369), ¿hay algún resultado aberrante?
Prueba de Desviación Estudentizada Extrema (ESO) Generalizada Esta prueba es una versión modificada de la Prueba ESD que permite analizar hasta un número previamente especificado, r, de resultados aberrantes de una población normalmente distribuida. Para la detección de un solo resultado aberrante (r = 1 ), el procedimiento de ESD generalizado también se conoce como prueba de Grubb. No se recomienda la prueba de Grubb para la detección de múltiples resultados aberrantes. Supongamos que res igual a 2 y que n es igual a 1 O. Etapa 1 (n = 10)-Normalizar cada resultado restando la media de cada valor y dividiendo esta diferencia por la desviación estándar (ver la Tabla 3). 4 Tabla 3. Resultados de la Prueba ESO Generalizada n = 10
n=9
Datos
Normalizados
Datos
Normalizados
100,3
+0,555
100,3
+1,361
100,2
+0,482
100,2
+0,953
100,1
+0,409
100,1
+0,544
100,0
+0,336
100,0
+0,136
100,0
+0,336
100,0
+0,136
100,0
+0,336
100,0
+0,136
99,9
+0,263
99,9
-0,272
99,7
+0,117
99,7
-1,089
99,5
-0,029
99,5
-1,905
95,7
-2,805
Media=
99,54
99,95
SD =
1,369
0,245
Tomar el valor absoluto de estos resultados, seleccionar el valor máximo (R 7 = 2,805), y compararlo con un valor crítico tabulado, previamente especificado, /c 1 (2,290) basado en el nivel de significancia seleccionado (por ejemplo, 5%). El valor máximo es más grande que el valor tabulado y se determina que no concuerda con los datos restantes. Las fuentes de los valores le se incluyen en muchos textos de estadística. Las tablas estadísticas deben usarse con cautela para asegurarse de utilizar las notaciones correctas (es decir, el nivel de error aceptable) cuando se extraen los valores de la tabla. Etapa 2 (n = 9)-Eliminar la observación correspondiente al resultado normalizado absoluto máximo del conjunto de datos originales, de modo tal que n sea ahora igual a 9. Nuevamente, determinar la media y desviación estándar (Tabla 3, las dos columnas de la derecha), normalizar cada valor y tomar el valor absoluto de estos resultados. Determinar el máximo de los 4
La diferencia entre cada valor y la media se denomina residual. Existen otras pruebas de resultados aberrantes residuales estudentizados donde el residual, en lugar de dividirse por la desviación estándar, se divide por la desviación estándar multiplicada por la raíz cuadrada den - 1 dividido por n.
USP 39
834 (101 O) Datos Analíticos / Información General
valores absolutos de los 9 resultados normalizados (R2 = 1,905), y compararlo con 1..,2 (2,215). El valor máximo no es mayor que el valor tabulado. Conclusión-El resultado de la primera etapa, 95,7, se declara resultado aberrante, pero el resultado de la segunda etapa, 99,5, no es un resultado aberrante.
Pruebas Tipo Dixon La Prueba de Dixon puede ser unilateral o bilateral, dependiendo de si se decide con anterioridad que únicamente se considerarán resultados aberrantes en uno de los lados. Al igual que con la prueba de ESD, la Prueba de Dixon supone que los datos, en ausencia de resultados aberrantes, provienen de una sola población normal. Siguiendo la estrategia usada para la prueba de ESD, se procede como si no se hubiera tomado una decisión a priori en relación con uno de los lados y se utiliza una Prueba de Dixon bilateral. A partir del análisis de los datos del ejemplo, se observa que los dos más pequeños son los que se examinarán como resultados aberrantes. La Prueba de Dixon permite el análisis de dos resultados aberrantes de manera simultánea; sin embargo, estos procedimientos están más allá del alcance de este Apéndice. El procedimiento por pasos que se discute a continuación no es un procedimiento exacto para realizar una prueba para el segundo resultado aberrante, ya que el resultado de la segunda prueba depende del primero. Debido a que el tamaño de la muestra también se reduce en la segunda etapa, el resultado final es un procedimiento que no suele tener la sensibilidad de los procedimientos exactos de Dixon. Etapa 7 (n = 70)-Los resultados se ordenan según su magnitud (es decir, Xn es la observación más grande, Xn es la segunda observación más grande, etc., y X1 es la observación más pequeña). Las relaciones de la Prueba de Dixon se basan en el tamaño de la muestra (en este ejemplo, n = 1O); para declarar que X1 es un valor aberrante, se calcula la relación, r 11 , según la fórmula siguiente:
Se utilizaría otra relación si el dato más grande se analiza como resultado aberrante. El resultado r11 se compara con un valor r11: 0, 05 en una tabla de valores críticos. Si r11 es mayor que r11: 0, 05, se declara que es un resultado aberrante. Para el conjunto de datos anterior, r11 = (99,5 - 95,7)/(100,2 - 95,7) = 0,84. Esta relación es mayor que r11 : 0, 05, que es 0,52979 al nivel de significancia del 5% para una Prueba de Dixon bilateral. Las fuentes de los valores r11 : 0, 05 se incluyen en muchos textos de estadística.5 Etapa 2-Eliminar la observación más pequeña del conjunto de datos original, de modo que n ahora sea 9. Se utiliza la misma ecuación r11 , pero se requiere un nuevo valor crítico r11 ,o,os paran= 9 r11 ; 0, 05 = 0,56420). Ahora r11 =(99,7-99,5)/ (100,2 - 99,5) = 0,29, que es menor que r11 : 0, 05 y no es significativo al nivel del 5%. Conclusión-Por lo tanto, 95,7 se declara como resultado aberrante, mientras que 99,5 no es un resultado aberrante.
Regla de Hampel Paso 7-EI primer paso para aplicar la Regla de Hampel es normalizar los datos. No obstante, en lugar de restar la media de cada dato y dividir la diferencia por la desviación estándar, se resta la mediana de cada dato y las diferencias resultantes se dividen por la MAD (ver a continuación). El cálculo de MAD se realiza en tres etapas. En primer lugar, se resta la mediana de cada dato. A continuación, se obtienen los valores absolutos de las diferencias, que se denominan desviaciones absolutas. Por último, se calcula la mediana de las desviaciones absolutas y se multiplica por la constante 1,483 para obtener la MAD. 6 Paso 2-EI segundo paso es tomar el valor absoluto de los datos normalizados. Cualquier resultado mayor que 3,5 se declara como un resultado aberrante. La Tabla 4 resume los cálculos. El valor de 95,7 vuelve a identificarse como un resultado aberrante. Luego, este valor puede extraerse del conjunto de datos y volver a aplicarse la Regla de Hampel a los datos restantes. La tabla resultante aparece como la Tabla 5. Al igual que en los ejemplos anteriores, 99,5 no se considera un resultado aberrante. Tabla 4. Resultados de la Prueba Usando la Regla de Hampel
5
Datos
n = 10 Desviaciones dela Mediana
100,3
0,3
0,3
1,35
100,2
0,2
0,2
0,90
100,1
0,1
0,1
0,45
100
o
o
o
Desviaciones Absolutas
Normalizadas Absolutas
Los valores críticos para r en este ejemplo se toman de la Referencia 2 en Apéndice G, Pruebas de Resultados Aberrantes.
6 Suponiendo una distribución normal subyacente, 1,483 es una constante utilizada de modo que la MAD resultante es un estimador uniforme de la desviación
estándar de la población. Esto significa que a medida que aumenta el tamaño de la muestra, MAD se acerca a la desviación estándar de la población.
USP 39
Información General/ (101 O) Datos Analíticos 835
Tabla 4. Resultados de la Prueba Usando la Regla de Hampel (Continuación) n = 10
Datos
Desviaciones dela Mediana
Normalizadas Absolutas
100
o o
o o
o o
99,9
-0,1
0,1
0,45
99,7
-0,3
0,3
1,35
99,5
-0,5
0,5
2,25
95,7
-4,3
4,3
19,33
100
Mediana=
Desviaciones Absolutas
100
0,15 0,22
MAD=
Tabla 5. Resultados de la Prueba Reutilizando la Regla de Hampel n=9
Datos
Desviaciones dela Mediana
100,3 100,2
Desviaciones Absolutas
Normalizadas Absolutas
0,3
0,3
2,02
0,2
0,2
1,35
100,1
0,1
0,1
0,67
100 100
o o o
o o o
o o o
99,9
-0,1
0,1
0,67
99,7
-0,3
0,3
2,02
99,5
-0,5
0,5
3,37
100
Mediana=
100
0,1 0,14
MAD=
APÉNDICE D: COMPARACIÓN DE PROCEDIMIENTOS-PRECISIÓN El siguiente ejemplo muestra el cálculo de un intervalo de confianza del 90% para la relación de varianzas (verdaderas) a fin de comparar la precisión de dos procedimientos. Se supone que la distribución subyacente de las mediciones de la muestra está bien caracterizada por distribuciones normales. Para este ejemplo, supongamos que el laboratorio aceptará el procedimiento alternativo si su precisión (medida por la varianza) no es más de cuatro veces mayor que la del procedimiento vigente. Para determinar el tamaño de muestra adecuado para la precisión, existe un método de tanteos sucesivos utilizando la siguiente fórmula: Potencia= Pr
[ F>
±
Fcx. n- 1, n- 1]
donde n es el tamaño de muestra más pequeño requerido para proporcionar la potencia deseada, que es la probabilidad de afirmar correctamente que el procedimiento alternativo tiene una precisión aceptable cuando los dos procedimientos realmente tienen la misma precisión; a es el riesgo de afirmar erróneamente que el procedimiento alternativo tiene una precisión aceptable; y 4 es el límite superior permitido para un aumento en la varianza. Los valores F se encuentran en tablas comúnmente disponibles de valores críticos de la distribución F. Fa, n- l, n- l es el percentil a superior de una distribución Fcon numerador n 1 y denominador de n - 1 grados de libertad; es decir, el valor excedido con la probabilidad a. Supongamos inicialmente que el laboratorio estimó necesario un tamaño de muestra de 11 por procedimiento (1 O grados de libertad para el numerador y el denominador); el cálculo de la potencia sería el siguiente: 7 Pr [F > 1/4Fa, n- l, n- 11 = Pr [F > 1/4F0, 05,
70, 701
= Pr [F > (2,978/4)1 = 0,6751
En este caso, la potencia fue de sólo 68%; es decir, aunque los dos procedimientos tenían varianzas exactamente iguales, con sólo 11 muestras por procedimiento, existe solamente una probabilidad de 68% de que el experimento lleve a datos que per-
n - 1, n- 1), n 1, n - 1), donde Res la relación de varianzas a las que se determina la potencia (p.ej., R = 1, que fue el valor escogido en los cálculos de potencia provistos en la Tabla 6) y A es la relación máxima para aceptación (p.ej., A= 4). Alfa es el nivel de signifícancía, normalmente 0,05.
7 Esto podría calcularse usando una planilla de cálculo de computadora. Por ejemplo, en Microsoft® Excel la fórmula sería: FDIST((R/A)*FINV(alfa,
USP 39
836
mitan concluir que la varianza ha aumentado no más de cuatro veces. Lo más común es elegir un tamaño de muestra que tenga una potencia de al menos 80% y en algunos casos de 90% o más. Para determinar el tamaño de muestra adecuado, pueden probarse diversos números hasta encontrar una probabilidad que exceda el límite aceptable (p.ej., potencia> 0,90). Por ejemplo, la determinación de la potencia para tamaños de muestra de 12-20 se muestran en la Tabla 6. En este caso, la suposición inicial de un tamaño de muestra de 11 no fue adecuada para comparar la precisión, pero 15 muestras por procedimiento proporcionarían un tamaño de muestra lo suficientemente grande para una potencia del 80%, o 20 por procedimiento para una potencia del 90%. Tabla 6. Determinaciones de Potencia para Diferentes Tamaños de Muestras (Específicas para el Ejemplo del Apéndice D) Tamaño de la Muestra
Pr[F> '/• Foos·n-/·n-1
12
0,7145
13
0,7495
14
0,7807
15
0,8083
16
0,8327
17
0,8543
18
0,8732
19
0,8899
20
0,9044
Típicamente, el tamaño de la muestra para las comparaciones de precisión debe ser mayor que para las comparaciones de exactitud. Si el tamaño de la muestra para comparar la precisión es demasiado grande y no es factible llevar a cabo el estudio en el laboratorio, existen algunas opciones. La primera es reconsiderar la elección de un aumento permitido en la varianza. Para aumentos mayores permitidos en la varianza, el tamaño de la muestra requerida para una potencia fija es más pequeño. Otra alternativa es planificar un análisis intermedio con un tamaño de muestra más pequeño, con la posibilidad de continuar con un tamaño de muestra más grande, si fuera necesario. En este caso, es muy recomendable buscar ayuda profesional de un experto en estadística. Supongamos ahora que el laboratorio opta por una potencia de 90% y obtiene los resultados presentados en la Tabla 7 basados en los datos generados con 20 análisis independientes por procedimiento. Relación =varianza del procedimiento alternativo/varianza del procedimiento vigente = 45,0/25,0 = 1,8 Límite inferior del intervalo de confianza = relación/ ~os= 1,8/2, 168 = 0,83 Límite superior del intervalo de confianza
= relación/ ~ 95 = 1,8/0,461
= 3, 90
Tabla 7. Ejemplo de Mediciones de Varianza para Análisis Independientes (Específicos para el Ejemplo del Apéndice D) Procedimiento
Varianza (desviación estándar)
Tamaño de la Muestra
Grados de Libertad
Alternativo
45,0 (6,71)
20
19
Vigente
25,0 (5,00)
20
19
Para esta aplicación, se utiliza un intervalo de confianza del 90% (bilateral) cuando se busca una prueba unilateral del 5%. Esta prueba es unilateral ya que sólo importa el aumento en la desviación estándar del procedimiento alternativo. Hay que tomar algunas precauciones al usar intervalos bilaterales de esta manera, ya que deben tener colas iguales-los intervalos más comunes tienen esta propiedad. Como el límite de confianza superior unilateral, 3,90, es inferior al límite permitido,4,0, el estudio ha demostrado que el procedimiento alternativo tiene una precisión aceptable. Si se hubieran obtenido los mismos resultados de un estudio con un tamaño de muestra de 15-como si se hubiera elegido una potencia del 80%-el laboratorio no hubiera podido concluir que el procedimiento alternativo tiene una precisión aceptable (límite de confianza superior de 4,47).
APÉNDICE E: COMPARACIÓN DE PROCEDIMIENTOS-DETERMINACIÓN DE LA MÁXIMA DIFERENCIA ACEPTABLE, ó, ENTRE DOS PROCEDIMIENTOS Este Apéndice describe un método para determinar la diferencia, o, entre dos procedimientos (alternativo-vigente), diferencia que, si se logra, también permite concluir que dos procedimientos son equivalentes. Si no existe otra información previa que guíe al laboratorio en la elección del o, ésta es una manera razonable de proceder. En este Apéndice se describen los cálculos del tamaño de la muestra en diferentes situaciones.
Determinación del Intervalo de Tolerancia Suponer que no se conocen la media ni la desviación estándar del proceso, pero una muestra de tamaño 50 produjo una media y una desviación estándar de 99,5 y 2,0, respectivamente. Estos valores se calcularon usando los últimos 50 resultados
USP 39
Información General/ (101 O) Datos Analíticos 837
generados por este procedimiento específico para una muestra (de control) en particular. Con esta información, pueden calcularse los límites de tolerancia según la siguiente fórmula:
x± K
5
x
en donde es la media, s es la desviación estándar, y Kse basa en el nivel de confianza, la proporción de resultados a capturar en el intervalo y el tamaño de la muestra, n. Hay disponibles Tablas que proporcionan los valores de K. En este ejemplo, el valor de K requerido para incluir el 95% de la población con una confianza del 95% para 50 muestras es de 2,382.ª Los límites de tolerancia se calculan de la siguiente manera:
99,5 ± 2,382
X
2,0
en consecuencia, el intervalo de tolerancia es de (94,7; 104,3).
Comparación de los Límites de Tolerancia con los Límites de la Especificación Supongamos que el intervalo especificado para este procedimiento es de (90,0; 110,0) y que la media y la desviación estándar del proceso no han cambiado desde que se estableció este intervalo. Pueden definirse las siguientes cantidades: el límite inferior de la especificación (LSL, por sus siglas en inglés) es 90,0; el límite superior de la especificación (USL, por sus siglas en inglés) es 110,0; el límite de tolerancia inferior (LTL, por sus siglas en inglés) es 94,7 y el límite de tolerancia superior (UTL, por sus siglas en inglés) es 104,3. Calcular la diferencia aceptable, (8), de la siguiente manera:
A= LTL - LSL para LTL ¿ LSL (A= 94,7 - 90,0 = 4,7);
B = USL - UTL para USL ¿ UTL (B = 110,0 - 104,3 = 5,7); y 8 =mínimo (A, B) = 4,7
--s--
+---A--. 90,0
94,7
104,3
110,0
Figura 2. Gráfica de los valores calculados anteriormente. Con esta opción de 8 y suponiendo que los dos procedimientos tienen una precisión comparable, el intervalo de confianza para la diferencia en medias obtenidas con los dos procedimientos (alternativo-vigente) debe encontrarse entre -4,7 y +4,7 para afirmar que no existe ninguna diferencia importante entre los dos procedimientos. Los laboratorios analíticos de control de calidad a veces utilizan límites de tolerancia del 99%, en cuyos casos el intervalo es mayor. Usando el ejemplo anterior, el valor de K requerido para incluir el 99% de la población con una confianza del 99% para 50 muestras es de 3,390. Los límites de tolerancia se calculan de la siguiente manera:
99,5 ± 3,390
X
2,0
El intervalo de tolerancia más amplio resultante es de (92,7; 106,3). De la misma manera, el nuevo LTL de 92,7 y UTL de 106,3 producirían un 8 más pequeño:
A= LTL - LSL para LTL ¿ LSL (A= 92,7 - 90,0
= 2,7);
B = USL - UTL para USL ¿ UTL (B
= 110,0 -106,3 = 3,7); y 8 =mínimo (A, B) = 2,7
Aunque un fabricante puede elegir cualquier 8 que funcione adecuadamente para la determinación de equivalencia, la elección de un 8 más grande, aún cuando lleva a un n más pequeño, presenta el riesgo de una pérdida de capacidad para la discriminación entre procedimientos.
Tamaño de la Muestra Existen fórmulas que pueden utilizarse para un 8 específico, suponiendo que se conocen las varianzas de la población y que son iguales, para calcular el número de muestras que se debe analizar por procedimiento, n. El nivel de confianza y la potencia 8
Existen tablas de factores de tolerancia que indican los valores aproximados y, en consecuencia, difieren ligeramente de los valores aquí informados.
USP 39
838 (1 01 O) Datos Analíticos / Información General
también deben especificarse. [NOTA-Potencia se refiere a la probabilidad de llegar a la conclusión correcta de que dos procedimientos idénticos son equivalentes.] Por ejemplo, si 8 = 4,7 y se supone que las varianzas de las dos poblaciones son iguales a 4,0; entonces, para una prueba de un nivel del 5% 9 y una potencia del 80% (con los correspondientes valores z de 1,645 y 1,282, respectivamente), el tamaño de la muestra aproximado se calcula según la siguiente fórmula:
2cr 2 2 n ~ 82 (za+ Z1312) n ~ 2 (4 )2 (1,645 + 1,282)2 = 3,10 (4,7)
En consecuencia, suponiendo que cada procedimiento tiene una varianza poblacional, cr 2, de 4,0, el número de muestras, n, requerido para concluir con una probabilidad de 80% de que los dos procedimientos son equivalentes (el intervalo de confianza del 90% para la diferencia en las medias verdaderas se encuentra entre -4,7 y +4,7) cuando, en realidad, son idénticos (la diferencia de medias verdadera es cero) es 4. Como se utilizó la distribución normal en la fórmula anterior, 4 es en realidad un límite inferior en el tamaño de muestra requerido. Si es factible, podría convenir un tamaño de muestra más grande. Los valores de z para niveles de confianza comunes se presentan en la Tabla 8. La fórmula anterior se basa en tres suposiciones: 1) la varianza usada en el cálculo del tamaño de la muestra se basa en una cantidad de datos previos suficientemente grande que pueden tratarse como conocidos; 2) se utiliza la varianza conocida previa en el análisis del nuevo experimento, o el tamaño de la muestra para el nuevo experimento es lo suficientemente grande como para que la distribución normal sea una buena aproximación a la distribución t; y 3) el laboratorio está seguro de que no existe ninguna diferencia real en las medias, que es el caso más optimista. No es común que se den estas tres suposiciones. La fórmula anterior debe tratarse con más frecuencia como una aproximación inicial. Las desviaciones de estas tres suposiciones conlleva la necesidad de utilizar un tamaño de muestra más grande. En general, se recomienda recurrir a alguna persona familiarizada con los métodos necesarios. Tabla 8. Valores Comunes para una Distribución Normal Estándar Valores z Nivel de Confianza
Unilateral (a)
Biiaterai (a/2)
99%
2,326
2,576
95%
1,645
1,960
90%
1,282
1,645
80%
0,842
1,282
Cuando se requiere una transformación logarítmica para lograr la normalidad, la fórmula de tamaño de la muestra debe ajustarse ligeramente según se indica a continuación. En lugar de formular los problemas con respecto a la varianza de la población y la diferencia aceptable más grande, 8, entre los dos procedimientos, ahora se formula con respecto a la %RSD de la población y la diferencia proporcional aceptable más grande entre los dos procedimientos.
en donde
a"C = log((%RSD/100) 2 + 1)
y p representa la diferencia proporcional aceptable más grande entre los dos procedimientos(alternativo-vigente)/(vigente) y se supone que las %RSDs de la población son conocidas e iguales.
APÉNDICE F: ANÁLISIS DE EQUIVALENCIA V PRUEBAS UNILATERALES DOBLES En un análisis estadístico clásico de hipótesis, existen dos hipótesis, la nula y la alternativa. Por ejemplo, la hipótesis nula puede indicar que dos medias son iguales, entonces la hipótesis alternativa indicaría que difieren. Con este enfoque clásico, se rechaza la hipótesis nula en favor de la alternativa si la evidencia contra la hipótesis nula es suficiente. Un error común es interpretar la incapacidad de rechazar la hipótesis nula como evidencia de que dicha hipótesis es verdadera, cuando en realidad la incapacidad de rechazar la hipótesis nula sólo quiere decir que la evidencia contra ésta no fue suficiente. Por ejemplo, el procedimiento usado podría tener una variabilidad demasiado alta o el número de determinaciones ser demasiado pequeño.
9
Cuando se analiza la equivalencia, una prueba de nivel del 5% corresponde a un intervalo de confianza del 90%.
Información General/ (101 O) Datos Analíticos 839
USP 39
La consecuencia de esta interpretación es que, cuando se busca demostrar la similitud, como en el caso de la comparación de los resultados obtenidos por dos laboratorios, es necesaria la similitud como hipótesis alternativa. La prueba estadística que emplea la similitud como hipótesis alternativa recibe el nombre de análisis de equivalencia. Es importante entender que "equivalencia" aquí no significa "igualdad". La equivalencia debe entenderse como "suficientemente similar" para la necesidad de los dos laboratorios. Tal como se indicó anteriormente en este capítulo, el nivel de similitud que se considera suficiente es un aspecto que debe decidirse con antelación. Como ejemplo específico, supóngase que se está interesado en comparar resultados promedio, como cuando se transfiere un procedimiento de un laboratorio a otro. (Dicha aplicación probablemente también incluiría una comparación de precisión; ver el Apéndice D.) Se debe definir con antelación que la diferencia entre las medias no debe ser mayor que un valor positivo, o, para que los resultados promedio puedan considerarse equivalentes o suficientemente similares. (El Apéndice E provee recomendaciones para la selección de o.) Entonces, las hipótesis son: Alternativa (H 7):
lµ 1 - µ2 1:<;;o
Nula (H0): 1µ 1 - µ21
>o
donde µ 1 y µ 2 son las dos medias que se están comparando. El enfoque de pruebas unilaterales dobles (TOST, por sus siglas en inglés) consiste en convertir las hipótesis de equivalencia anteriores en dos hipótesis unilaterales. La justificación es que es posible determinar 1µ 1 - µ 21:-;;¡¡siempre y cuando se puedan demostrar tanto µ 1 - µ 2 :-;; +o como µ 1
-
µ2 ~
-o
En su condición de pruebas unilaterales, se pueden tratar como pruebas-t unilaterales estándar. Para que la prueba de las hipótesis de equivalencia tenga el nivel a, ambas pruebas unilaterales deben realizarse al nivel a (por lo regular, aunque no necesariamente, 0,05). A menudo, la prueba unilateral doble se lleva a cabo usando un intervalo de confianza. En este caso, se rechaza la hipótesis nula en favor de la hipótesis de equivalencia si el intervalo de confianza bilateral 100(1 - 2a)% está completamente contenido en (-o, +o). Éste es el enfoque descrito anteriormente en la sección Exactitud.
APÉNDICE G: FUENTES DE INFORMACIÓN ADICIONALES Es posible utilizar una gran variedad de pruebas estadísticas para evaluar un conjunto de datos. Este capítulo presenta varias pruebas que permiten interpretar y manejar datos analíticos, pero pueden emplearse muchas otras pruebas semejantes. En este capítulo simplemente se ilustra el análisis de datos usando métodos estadísticamente aceptables. Como se menciona en la Introducción, las pruebas específicas se incluyen con fines ilustrativos únicamente y USP no avala ninguna de estas pruebas como único método para el tratamiento de los datos analíticos. Puede encontrarse información adicional y pruebas alternativas en las referencias enumeradas a continuación o en muchos textos de estadística. Gráficas de Control: 1. Manual on Presentation of Data and Control Chart Analysis, 6• ed., American Society for Testing and Materials (ASTM), Philadelphia, 1996. 2. Grant, E.L., Leavenworth, R.S., Statistical Quality Control, 7• ed., McGraw-Hill, New York, 1996. 3. Montgomery, D.C., lntroduction to Statistical Quality Control, 3• ed., John Wiley and Sons, New York, 1997. 4. Ott, E., Schilling, E., Neubauer, D., Process Quality Control: Troubleshooting and lnterpretation of Data, 3• ed., McGraw-Hill, New York, 2000. Diferencias Detectables y Determinación del Tamaño de Muestra: 1. CRC Handbook of Tables for Probability and Statistics, 2• ed., Beyer W.H., ed., CRC Press, lnc., Boca Raton, FL, 1985. 2. Cohen, J., Statistical Power Analysis for the Behavioral Sciences, 2• ed., Lawrence Erlbaum Associates, Hillsdale, NJ, 1988. 3. Diletti, E., Hauschke, D., Steinijans, V.W., "Sample size determination for bioequivalence assessment by means of confidence intervals," lnternational journal of Clinical Pharmacology, Therapy and Toxicology, 1991; 29, 1-8. 4. Fleiss, J.L., The Design and Analysis of Clinical Experiments, John Wiley and Sons, New York, 1986, págs. 369-375. 5. juran, J.A., Godfrey, B., juran's Quality Handbook, 5• ed., McGraw Hill, 1999, Sección 44, Basic Statistical Methods. 6. Lipsey, M.W., Design Sensitivity Statistical Power for Experimental Research, Sage Publications, Newbury Park, CA, 1990. 7. Montgomery, D.C., Design and Analysis of Experiments, John Wiley and Sons, New York, 1984. 8. Natrella, M.G., Experimental Statistics Handbook 91; National lnstitute of Standards and Technology, Gaithersburg, MD, 1991 (reimpresión del texto original de agosto de 1963). 9. Kraemer, H.C., Thiemann, S., How Many Subjects?: Statistical Power Analysis in Research,Sage Publications, Newbury Park, CA, 1987. 1 O. van Belle G., Martin, D.C., "Sample size as a function of coefficient of variation and ratio of means", American Statistician 1993; 47(3): 165-167. 11. Westlake, W.J., response to Kirkwood, T.B.L.: "Bioequivalence testing-a need to rethink," Biometrics 1981; 37:589-594. Estadística General Aplicada a Datos Farmacéuticos: 1. Bolton, S., Pharmaceutical Statistics: Practica/ and Clinical Applications, 3• ed., Marcel Dekker, New York, 1997.
840 (1 01 O) Datos Analíticos / Información General
USP 39
2. Bolton, S., "Statistics" Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20• ed., Gennaro, A.R., ed., Lippincott Williams and Wilkins, Baltimore, 2000, págs. 124-158. 3. Buncher, C.R., Tsay, J., Statistics in the Pharmaceutical lndustry, Marcel Dekker, New York, 1981. 4. Natrella, M.G., Experimental Statistics Handbook 91; National lnstitute of Standards and Technology (NIST), Gaithersburg, MD, 1991 (reimpresión del texto original de agosto de 1963). 5. Zar, J., Biostatistical Analysis, 2• ed., Prentice Hall, Englewood Cliffs, NJ, 1984. 6. De Muth, J.E., Basic Statistics and Pharmaceutical Statistical Applications, 3rd ed., CRC Press, Boca Raton, FL, 2014. Estadística General Aplicada a Datos de Laboratorios Analíticos: 1. Gardiner, W.P., Statisticaf Analysis Methods for Chemists, The Royal Society of Chemistry, London, England, 1997. 2. Kateman, G., Buydens, L., Quality Control in Analytical Chemistry, 2• ed., John Wiley and Sons, New York, 1993. 3. Kenkel, J., A Primer on Quality in the Analytical Laboratory, Lewis Publishers, Boca Raton, FL, 2000. 4. Mandel, J., Evaluation and Control of Measurements, Marcell Dekker, New York, 1991. 5. Melveger, A.J., "Statististics in the pharmaceutical analysis laboratory," Analytical Chemistry in a GMP Environment, Miller J.M., Crowther J.B., eds., John Wiley and Sons, New York, 2000. 6. Taylor, J.K., Statistical Techniques for Data Analysis, Lewis Publishers, Boca Raton, FL, 1990. 7. Thode, H.C., Jr., Testing for Normality, Marcel Dekker, New York, NY, 2002. 8. Taylor, J.K., Quality Assurance of Chemical Measurements, Lewis Publishers, Boca Raton, FL, 1987. 9. Wernimont, G.T., Use of Statistics to Develop and Evaluate Analytical Methods, Association of Official Analytical Chemists (AOAC), Arlington, VA, 1985. 1 O. Youden, W.J., Steiner, E.H., Statistical Manual of the AOAC, AOAC, Arlington, VA, 1975. Estadística No Paramétrica: 1. Conover, W.J., Practica/ Nonparametric Statistics, 3• ed., John Wiley and Sons, New York, 1999. 2. Gibbons, J.D., Chakraborti, S., Nonparametric Statistical lnference, 3• ed., Marcel Dekker, New York, 1992. 3. Hollander, M., Wolfe, D., Nonparametric Statistical Methods, 2• ed., john Wiley and So ns, NY, 1999. Pruebas de Resultados Aberrantes: 1. Barnett, V., Lewis, T.,Outliers in Statistical Data, 3• ed., John Wiley and Sons, New York, 1994. 2. Bohrer, Armin, "One-sided and Two-sided Critica! Values for Dixon's Outlier Test for Sample Sizes up to n = 30," Economic Quality Control, Vol. 23 (2008), No. 1, págs. 5-13. 3. Davies, L., Gather, U., "The identification of multiple outliers," journal of the American Statistical Association (with comments), 1993; 88:782-801. 4. Dixon, W.J., "Processing data for outliers," Biometrics 1953; 9(1 ):74-89. 5. Grubbs, F.E., "Procedures for detecting outlying observations in samples," Technometrics 1969; 11 :1-21. 6. Hampel, F.R., "The breakdown points of the mean combined with sorne rejection rules," Technometrics, 1985; 27:95-107. 7. Hoaglin, D.C., Mosteller, F., Tukey, J., eds., Understanding Robust and Exploratory Data Analysis, John Wiley and Sons, New York, 1983. 8. lglewicz B., Hoaglin, D.C., How to Detect and Handle Outliers, American Society for Quality Control Quality Press, Milwaukee, WI, 1993. 9. Rosner, B., "Percentage points for a generalized ESD many-outlier procedure," Technometrics, 1983; 25: 165-172. 1 O. Norma E-178-94: Standard Practice for Dea/ing with Outlying Observations,American Society for Testing and Materials (ASTM), West Conshohoken, PA, septiembre de 1994. 11. Rorabacher, D.B., "Statistical Treatment for Rejections of Deviant Values: Critica! Values of Dixon's "Q" Parameter and Related Subrange Ratios at the 95% Confidence Level," Analytical Chemistry, 1991; 63(2): 1 39-146. Precisión y Componentes de Variabilidad: 1. Hicks, C.R., Turner, K.V., Fundamental Concepts in the Design of Experiments, 5• ed., Oxford University Press, 1999 (sección titulada Repeatability and Reproducibility of a Measurement System). 2. Kirk, R.E., Experimental Design: Procedures for the Behaviora/ Sciences, Brooks/Cole, Belmont, CA, 1968, págs. 61-63. 3. Kirkwood, T.B.L., "Geometric means and measures of dispersion," Letter to the Editor, Biometrics, 1979; 35(4). 4. Milliken, G.A., Johnson, D.E., Analysis of Messy Data, Volumen 1: Designed Experiments, Van Nostrand Reinhold Company, New York, NY, 1984, págs. 19-23. 5. Searle, S.R., Casella, G., McCulloch, C.E., Variance Components, John Wiley and Sons, New York, 1992. 6. Snedecor, G.W., Cochran, W.G., Statistical Methods, 8• ed., lowa State University Press, Ames, IA, 1989. 7. Norma E-691-87: Practice for Conducting an lnterlaboratory Study to Determine the Precision of a Test Method, ASTM, West Conshohoken, PA, 1994. 8. Hauck, W. W., Koch, W., Abernethy, D., Williams, R. "Making Sense of Trueness, Precision, Accuracy, and Uncertainty," Pharmacopeial Forum, 2008; 34(3). Determinación del Intervalo de Tolerancia: 1. Hahn, G.J., Meeker, W.Q., Statistical lnterva/s: A Cuide for Practitioners, John Wiley and Sons, New York, 1991. 2. Odeh, R.E., "Tables of two-sided tolerance factors for a normal distribution," Communications in Statistics: Simulation and Computation, 1978; 7: 183-201.
USP 39
Información General/ (1015) Aparatos Automatizados de Síntesis Radioquímica 841
(1015) APARATOS AUTOMATIZADOS DE SÍNTESIS RADIOQUÍMICA La preparación y el control de calidad de radiofármacos de diagnóstico marcados con nucleidos de vida media muy corta que emiten positrones (p.ej., 15 0, 13 N, 11 ( y 18 F cuyas vidas medias son de 2, 1O, 20 y 11 O minutos, respectivamente), están sujetos a restricciones diferentes de las que se aplican a los fármacos de uso terapéutico: (1) La síntesis debe ser rápida, aunque se deben tomar medidas para proteger al químico o al farmacéutico de la excesiva exposición a la radiación. (2) Excepto en un grado limitado para el 18 F, la síntesis debe producirse en el momento del uso. (3) A excepción del 1ªF, cada partida de radiofármacos generalmente se dirige a una sola administración. Estos factores aumentan la importancia del control de calidad del producto farmacéutico final con relación a la validación del proceso de síntesis. Dado que cada dosis se prepara de forma individual, salvo contadas excepciones, lo ideal sería que cada dosis fuera sometida a pruebas de control de calidad de pureza radioquímica y otros aspectos de calidad esenciales antes de su administración. Debido a que no es posible realizar el control de calidad de cada partida, se seleccionan partidas a intervalos regulares para establecer y caracterizar completamente su pureza radiofarmacéutica. Esta prueba de calidad rutinaria y rigurosa de las partidas seleccionadas constituye la base de la validación del proceso, que es absolutamente esencial para la evaluación anticipada de la calidad y pureza de las partidas cuando se trata de radiofármacos de vida media extremadamente corta. Puesto que los radiofármacos empleados en tomografía por emisión de positrones (TEP) se administran por vía intravenosa o (en el caso de gases radioactivos) por inhalación, la variabilidad entre partidas, en relación con la biodisponibilidad, no constituye un problema. Es más, la síntesis en muy pequeña escala de radiofármacos (casi siempre menos de 1 miligramo y a menudo dentro del rango de los microgramos) y el hecho de que los pacientes generalmente reciben sólo una dosis única de fármaco radioactivo reducen al mínimo la posibilidad de administrar cantidades nocivas de impurezas químicas. Estas afirmaciones no intentan rebatir la necesidad del control de calidad en el manejo de equipos automatizados de síntesis, sino colocar la fabricación de radiofármacos que emiten positrones en una perspectiva adecuada y enfatizar una vez más la enorme importancia de la validación anticipada de procesos y el control de calidad del producto terminado. La síntesis de rutina de radiofármacos puede exponer al personal a dosis innecesariamente altas de radiación. Los dispositivos automatizados de síntesis radioquímica se han ideado, en parte, para cumplir con el concepto de reducir las exposiciones del personal a la radiación "hasta el menor grado razonablemente posible" (ALARA, del inglés "as low as reasonably achievable"). Estos dispositivos automatizados de síntesis pueden ser más precisos y eficaces que los métodos manuales existentes. Dichos métodos automatizados son particularmente útiles cuando una síntesis radioquímica requiere manipulaciones repetitivas y uniformes a diario. Los productos de estos dispositivos automatizados de radiosíntesis deben cumplir los mismos criterios de garantía de calidad que los productos obtenidos mediante síntesis manual convencional. En el caso de radiofármacos que emiten positrones, estos criterios incluyen muchas de las mismas determinaciones que se usan para los radiofármacos utilizados en medicina nuclear convencional, por ejemplo, pruebas de esterilidad y de endotoxinas bacterianas. Se aplican muchas de las mismas limitaciones. En general, no se pueden aplicar los procedimientos típicos, como por ejemplo la espectroscopia, debido a que la cantidad de producto es tan pequeña que cae debajo del nivel de detección mínima del método. En todos los casos, el método farmacopeico aplicable es el árbitro decisivo (ver Procedimiento en Pruebas y Valoraciones en las Advertencias Generales). La preparación de la Inyección de Fludesoxiglucosa F 18 y otros radiofármacos que emiten positrones se puede adaptar fácilmente a la síntesis automatizada. En general, el equipo necesario para los métodos manuales es más sencillo y menos costoso que el que se emplea en los métodos automatizados, pero requiere mayor trabajo. Son de particular interés los métodos relacionados con la validación del rendimiento correcto de un aparato automatizado. En un procedimiento manual, la intervención humana y la corrección mediante inspección pueden evitar muchos errores de procedimiento. En un sistema automatizado, la retroalimentación eficaz también puede comenzar durante la síntesis. Por ejemplo, los detectores de radiación pueden controlar la actividad en varias etapas de la radiosíntesis. Cuando no se logra la actividad adecuada se puede activar un sistema de alarma que conduce a la intervención humana. Radioquímicos frente a Radiofármacos-Se debe establecer una distinción entre un radioquímico y el radiofármaco correspondiente. En los centros de investigación de TEP, los equipos automatizados se emplean para preparar compuestos marcados para experimentos con animales. Estos radioquímicos no se consideran radiofármacos si (1) no están preparados de acuerdo a un proceso validado que proporcione un alto grado de seguridad y garantice que la preparación cumpla todos los requisitos establecidos de calidad y pureza; y (2) no han sido certificados por personal calificado (farmacéuticos y médicos autorizados) de conformidad con los métodos farmacopeicos publicados para los radiofármacos individuales. Equipo Automatizado-Las consideraciones que se hacen en este capítulo corresponden a la síntesis que se lleva a cabo mediante robots de uso general y aparatos especiales. Ambos son dispositivos automatizados que se emplean en la síntesis de radioquímicos. El método exacto de control de los dispositivos de síntesis es variable. Tanto los dispositivos de síntesis controlados electrónicamente como los controlados por programas informáticos caen dentro de la designación general y tienen un espectro que varía desde el equipo manual tradicional, pasando por dispositivos semiautomatizados, hasta dispositivos completamente automáticos. Elementos Comunes de Equipos Automatizados de Síntesis-Para manipular un aparato químico que efectúe la síntesis de un radioquímico, es necesario controlar parámetros tales como el tiempo, la temperatura, la presión, el volumen y la secuencia. Estos parámetros se pueden controlar y restringir para que estén dentro de ciertos límites.
842 (1015) Aparatos Automatizados de Síntesis Radioquímica / Información General
USP 39
Garantía de Calidad del Equipo-El objetivo de la garantía de calidad es ayudar a asegurar que el radiofármaco posterior cumpla las normas farmacopeicas. Aunque los reglamentos sobre las buenas prácticas de fabricación (21 CFR 820) no sean aplicables, pueden resultar útiles para crear un programa de garantía de calidad. En la práctica, esto comprende la medición y el control documentados de todos los parámetros físicos pertinentes controlados por los aparatos de síntesis. Prueba de Control de Calidad de Rutina-La prueba de control de calidad de un equipo automatizado implica el examen periódico de todos los parámetros certificados inicialmente durante la calificación de garantía de calidad. La frecuencia de la prueba puede ser diaria, dependiendo de la importancia y la estabilidad de los parámetros. Esta evaluación del funcionamiento del proceso se debe aumentar por medio de pruebas periódicas del producto final. Por ejemplo, se pueden aceptar las variaciones en la temperatura de un baño de aceite si el radioquímico (producto final) demuestra que cumple todos los criterios pertinentes de la prueba. Auditoría de Verificación de Calidad de los Reactivos-Los materiales y reactivos utilizados para la síntesis de radiofármacos deben ajustarse a las especificaciones y las pruebas establecidas de control de calidad. Se deben establecer los procedimientos para las pruebas, el almacenamiento y el uso de estos materiales. En este contexto, un reactivo se define como cualquier producto químico utilizado en el procedimiento que conduce al producto radioquímico final, mientras que los materiales se definen sólo como suministros complementarios (tubos, materiales de vidrio, viales, etc.). Por ejemplo, en algunos procesos se emplea nitrógeno comprimido para mover reactivos líquidos. En este caso, tanto el nitrógeno como los tubos deben cumplir las especificaciones establecidas. Documentación de Parámetros del Aparato-Se deben identificar, controlar y documentar las variables fundamentales de la síntesis. Estas características comprenden importantes atributos físicos, químicos, eléctricos y de funcionamiento. Para microprocesadores y dispositivos controlados por computadora es particularmente importante un método para especificar, probar y documentar los programas y las piezas de la computadora. Este procedimiento debe incluir un análisis general y periódico de los componentes de la computadora. Además, se debe examinar periódicamente el código del programa informático para determinar que no se haya modificado y que continúa dando como resultado el producto final que cumple todas las especificaciones. La retroalimentación durante el proceso es un medio para confirmar que la síntesis está bajo control. Los cambios de código en los programas deben incluir un procedimiento de autorización formal y se deben documentar. Cada tipo de dispositivo de síntesis radioquímica requiere un conjunto de procedimientos específicos para probar y controlar la confiabilidad y reproducibilidad de los diversos subsistemas que conforman el sistema total de síntesis. Es esencial que la calibración de cada uno de los componentes se confirme de acuerdo con un cronograma de mantenimiento establecido y que las mediciones o el control se realicen bajo las condiciones reales de síntesis. Se deben medir los tiempos de entrega, los volúmenes de reactivo, las temperaturas, las presiones de los gases y las velocidades de flujo y deben demostrar ser estables y reproducibles dentro de los límites establecidos. El agregado de los reactivos y disolventes se debe calibrar periódicamente. Otros componentes que se deben calibrar de forma rutinaria incluyen el sistema de detección de radiaciones y los sensores y el sistema de control de procesos. Como ejemplo, se indican a continuación los elementos de validación de los sistemas de varios componentes representativos de un dispositivo automático de síntesis: Los recipientes de reacción se pueden limpiar e inspeccionar mediante un método establecido y documentado. Los recipientes se pueden enumerar y se puede hacer un seguimiento de su desempeño. Los sistemas de calentamiento y enfriamiento (como por ejemplo los baños de aceite) se pueden controlar por medio de termómetros o termocuplas. Las temperaturas se pueden registrar en una hoja de partida o se pueden imprimir automáticamente como parte de un registro computarizado. El mantenimiento implica la calibración periódica. Los gases y el funcionamiento del sistema de entrega de gas se pueden controlar por medio de manómetros y flujómetros. La pureza del gas se puede establecer por medio de certificados de análisis emitidos por el proveedor o se puede verificar mediante una prueba independiente. El mantenimiento de los manómetros y flujómetros implica la calibración periódica con estándares. El desempeño motriz dependiente de la posición se puede verificar por medio de interruptores de límite. El mantenimiento podría implicar la medición real de la distancia recorrida y el tiempo transcurrido. Las válvulas solenoides se pueden controlar eléctricamente, por medio de pruebas de flujo y presión. El rendimiento del calentador se evidencia por medio de lecturas adecuadas de la termocupla. Otras pruebas podrían incluir determinaciones de resistencia. Los reactivos se pueden aceptar sobre la base de los certificados de análisis del proveedor. Como alternativa, el producto químico se podría analizar internamente o enviar a un laboratorio independiente. Según el grado de estabilidad, puede ser necesaria la repetición periódica de pruebas. Los programas informáticos se pueden probar mediante la documentación del tiempo de síntesis transcurrido, con impresos que verifiquen que se efectuaron todas las manipulaciones adecuadas, inclusive impresiones de los parámetros pertinentes como tiempos, temperatura, presiones y actividades. Los patrones de distribución de actividades, como por ejemplo la cantidad absoluta de producto, el porcentaje de rendimiento y los niveles individuales de actividad de las impurezas, brindan al usuario experimentado una oportunidad para localizar fallas del sistema. Cambios en el Método de Síntesis-Algunos cambios en los aparatos de síntesis se pueden considerar no significativos. A menudo, esta categoría incluye cambios que no afectan a ninguno de los parámetros controlados. Sin embargo, es importante tener cuidado para garantizar que los cambios que parecen inofensivos no tengan un efecto inesperado. Por ejemplo, cambios
Información General/ (1024) Suero Bovino 843
USP 39
en una línea de comentario de un programa informático pueden provocar un cambio inadvertido o la eliminación de una instrucción importante. Cualquier cambio en los parámetros controlados puede cambiar el resultado del proceso. Si el radioquímico resultante no cumple con las especificaciones o si el radiofármaco posterior no satisface los criterios farmacopeicos, el cambio del proceso es inaceptable; se debe corregir la falla y volver a validar el proceso.
(1024) SUERO BOVINO INTRODUCCIÓN El suero bovino es la fracción líquida de la sangre coagulada de buey (Bos taurus, entre otras especies), de la que se han eliminado células, fibrina y factores de coagulación. Desde la aparición del cultivo celular moderno, los fabricantes de productos biológicos han usado ampliamente el suero bovino como suplemento de crecimiento para cultivos celulares. Su composición altamente nutricional de proteínas, factores de crecimiento, hormonas, aminoácidos, vitaminas, azúcares, lípidos, oligoelementos y demás componentes sustenta una amplia gama de aplicaciones de cultivo celular para la investigación y fabricación comercial de vacunas, productos biológicos de origen natural y recombinantes (en lo sucesivo, productos biológicos), tejidos obtenidos por ingeniería y otros productos celulares terapéuticos destinados para uso humano o veterinario. El Suero Fetal Bovino (FBS, por sus siglas en inglés) es el tipo predominante de suero usado en las aplicaciones de investigación. El suero de ternero (de animales recién nacidos o mayores) se usa con mucho menor frecuencia, aunque por su bajo costo, sería ampliamente usado en la fabricación comercial. Al igual que con otros productos de origen animal, el suero bovino conlleva el riesgo potencial de introducir agentes extraños en el cultivo celular. Los fabricantes de suero y reguladores deben adoptar procedimientos rigurosos de obtención y análisis, además de estrictas guías de procesamiento y producción para asegurar la calidad del suero bovino. Con el objetivo de incrementar la calidad y seguridad de los productos biológicos producidos con suero bovino, y de mitigar las exigencias reglamentarias, los desarrolladores han investigado alternativas a la suplementación con suero, lo que ha resultado en formulaciones de medios exentos de suero para aplicaciones específicas. Aunque se reconoce que debe evitarse el uso de suero bovino siempre que exista la opción de emplear medio exento de suero, hay casos en los que resulta técnicamente imposible o poco práctico. Este capítulo describe cuestiones relacionadas con la obtención, producción y caracterización de suero bovino para asegurar su uso seguro. El Apéndice 7 presenta una lista de guías y documentos reglamentarios pertinentes. Los fabricantes de suero y los usuarios finales de suero (fabricantes de productos biológicos) deben considerar y aplicar, según se requiera, los controles y procedimientos establecidos en este capítulo para asegurar el uso seguro de componentes de suero bovino en la investigación y fabricación farmacéutica.
Tipos de Suero Bovino • El suero fetal bovino (FBS) se obtiene de fetos, previo al parto, de hembras reproductoras bovinas sanas que se consideran aptas para consumo humano mediante inspección ante y postmortem realizada por veterinarios autorizados. El suero se recolecta en mataderos sujetos a inspección y registro gubernamental. • El suero de ternero recién nacido (también conocido como suero de bovino recién nacido) se obtiene de animales con una edad menor de 20 días en mataderos sujetos a inspección y registro gubernamental. • El suero de ternero se obtiene de animales con una edad entre 20 días y 12 meses en mataderos sujetos a inspección y registro gubernamental. • El suero de bovino donante (también conocido como suero de ternero donante) se obtiene mediante el sangrado repetido de animales donantes pertenecientes a manadas donantes controladas, y sujetas a inspección y registro gubernamental. Los animales tienen entre 12-36 meses de edad. • El suero de bovino adulto se obtiene de ganado con una edad mayor de 12 meses que se declara apto para consumo humano en mataderos sujetos a inspección y registro gubernamental.
SUERO BOVINO: HISTORIA V TIPOS DE USOS Historia del Uso de Suero Bovino El suero animal y demás materiales biológicos complejos se han empleado durante aproximadamente 100 años en el cultivo de células de mamíferos. Fueron varios los factores que llevaron a la adopción de suero bovino como suplemento estándar para el cultivo de tejidos. En comparación con el suero de otras especies animales (caballo, cabra), el suero bovino se obtiene fácilmente por lo que resulta más económico. Muchos investigadores deciden usar suero fetal en sus sistemas experimentales debido a las inquietudes relacionadas con anticuerpos presentes en suero de recién nacido y de adulto que podrían provocar
844 (1024) Suero Bovino/ Información General
USP 39
una reacción cruzada con las células en cultivo y ocasionar lisis celular mediada por complemento. A fin de terminar con tales inquietudes, se comenzó a usar calor para inactivar el complemento potencialmente presente en el suero. Los estudios de FBS realizados en la década de 1950 en el cultivo de células humanas de baja densidad para dilucidar mecanismos de crecimiento celular demostraron que (1) el componente albúmina puede actuar corno portador de moléculas pequeñas esenciales; (2) la fetuína, una glicoproteína que se presenta en altos niveles en la fracción alfa globulina, facilita la adhesión y extensión celular; y (3) la fetuína inhibe considerablemente la tripsina, y tal actividad antiproteolítica puede jugar un papel en la capacidad de la fetuína para estimular el crecimiento celular. Durante las décadas de 1960 y 1970, la suplernentación con suero de los medios de cultivo de tejidos se convirtió en una práctica normal, lo que facilitó tanto la investigación biomédica corno los primeros procesos de fabricación de vacunas a gran escala. La suplernentación con suero redujo la necesidad de optimizar las formulaciones de medios para diferentes tipos de células. Además, se demostró que el FBS proporcionaba una variedad de factores de crecimiento polipeptídicos. Presuntamente, la albúmina promovía el crecimiento celular debido a sus capacidades para funcionar corno proteína portadora de moléculas pequeñas o lípidos, para unir iones metálicos, para servir corno amortiguador del pH, y para proteger a las células de la ruptura. Asimismo, se encontraron funciones similares en otros componentes del suero corno transferrina, hormonas y otros factores de adhesión derivados del suero corno fibronectina, vitronectina y larninina.
Usos del Suero Bovino El suero es una mezcla compleja de rnacrornoléculas requerida para el crecimiento celular y la producción de virus, y su uso corno materia prima presenta diversos retos, entre los que se incluyen su composición lote a lote y el riesgo de contaminación por agentes adventicios. El desarrollo de medios exentos de suero ha reemplazado al suero en algunas aplicaciones biotecnológicas nuevas de fabricación; sin embargo, muchas líneas celulares usadas en la fabricación aún no han sido adaptadas a estos medios exentos de suero. Las restricciones reglamentarias y los retos científicos por lo general vuelven poco práctico alterar los procesos de fabricación existentes en los que se usa suero corno materia prima. En ocasiones, el FBS es necesario para el bioprocesarniento de células y tejidos, lo cual a menudo implica el cultivo de células provenientes de explantes y biopsias de tejidos. Además, para algunos procesos biológicos puede ser necesario mantener características celulares específicas durante el cultivo. El FBS a menudo parece facilitar tales procedimientos y puede afectar el comportamiento biológico de los tipos de células exigentes (fastidious cells). Se ha demostrado que el FBS afecta la transcripción de genes importantes para el desarrollo, la apoptosis y la expresión génica relacionada con la apoptosis, además de que proporciona factores neuroprotectores y antioxidantes, todo lo cual puede ser beneficioso para la supervivencia y el desarrollo de células en cultivo. Por lo tanto, el FBS seguirá jugando un papel importante corno suplemento para cultivos celulares en la producción de terapias celulares y de tejidos. En la mayoría de los procesos de fabricación de vacunas de virus los medios usados para la expansión de cultivos celulares y la infección/producción de virus se suplementan con diferentes tipos de suero a diversas concentraciones. En estos procesos, el suero bovino ayuda a generar una masa de células en un estado fisiológico óptimo para una replicación viral eficiente.
RECOLECCIÓN Y PRODUCCIÓN DE SUERO BOVINO Recolección de Sangre Para todos los tipos de suero bovino, la sangre se debe recolectar en instalaciones sujetas a inspección y registro gubernamental (mataderos y granjas de donantes). La sangre debe ser recolectada por operarios capacitados siguiendo los procedimientos escritos aprobados por el fabricante de suero y usando dispositivos de recolección desechables para un sólo uso o equipo de recolección reutilizable que cuente con procedimientos de limpieza validados. SUERO DE BOVINO DONANTE Para cada lote de suero de animales donantes, los fabricantes de suero deben asegurar la rastreabilidad a la manada donante mediante registros de producción y certificados de salud y de origen de los animales. Los animales donantes están sujetos a inspecciones veterinarias regulares y se les desangra varias veces siguiendo los procedimientos establecidos. Debe ser posible rastrear a los animales introducidos a la manada por origen, raza e historial de crianza. Los recolectores deben introducir nuevos animales a la manada siguiendo procedimientos especificados y aprobados que incluyen inspección y análisis del animal previos a la compra, transporte adecuado, un periodo de cuarentena, examen y análisis veterinario durante el periodo de cuarentena y criterios de liberación de los animales en cuarentena para la producción del suero. Los recolectores no deben vacunar a los animales donantes contra la diarrea viral bovina (DVB). Los recolectores deben someter los animales a análisis para determinar la presencia de cualquier agente y anticuerpo de los que se declara estar exenta la manada.
Información General/ (l 024) Suero Bovino 845
USP 39
SUERO DE TERNERO RECIÉN NACIDO, SUERO DE TERNERO Y SUERO DE BOVINO ADULTO Los certificados de salud y de origen de los animales y/o los registros de producción de suero deben asegurar que los fabricantes de suero puedan rastrear el origen del suero bovino derivado de animales sacrificados hasta el matadero. Los fabricantes de suero deben requerir que los mataderos mantengan la documentación del origen de los animales para sacrificio. La sangre se debe recolectar de animales que hayan sido sacrificados para consumo humano en mataderos inspeccionados por la autoridad competente del país de origen. Los inspectores deben inspeccionar a los animales de manera rutinaria tanto antemortem como postmortem para verificar clínicamente la presencia de infecciones y enfermedades parasitarias, además de otros problemas o condiciones relacionados con la salud de los animales. Los animales deben estar exentos de evidencia clínica de enfermedades infecciosas al momento del sacrificio. Deben implementarse procedimientos de recolección sanguínea que prevengan la contaminación cruzada con otros tejidos y fluidos corporales y el ambiente aledaño. El procedimiento de sacrificio estándar consiste en un método aprobado de aturdimiento del animal seguido de desangrado. SUERO FETAL BOVINO Las especificaciones de producto y los procedimientos de análisis para FBS se presentan en el capítulo general propuesto Suero Fetal Bovino-Atributos de Calidad y Pruebas de Funcionalidad (90). Los fabricantes de suero deben recolectar la sangre fetal bovina a partir de fetos bovinos provenientes de hembras reproductoras que hayan sido sacrificadas. Las hembras reproductoras deben ser declaradas aptas para consumo humano y deben haber sido sacrificadas en mataderos inspeccionados por la autoridad competente del país de origen. Los inspectores deben examinar a todos los animales tanto antemortem como postmortem para verificar clínicamente la presencia de infecciones y enfermedades parasitarias, además de otros problemas o condiciones relacionados con la salud de los animales. Los animales deben estar exentos de evidencia clínica de enfermedades infecciosas al momento del sacrificio. El útero debe extraerse y transportarse a un espacio dedicado para recolección de sangre fetal bovina, en donde el personal de recolección sanguínea evalúa el feto para detectar signos de muerte fetal, que incluyen hinchazón, decoloración de la piel, olor, deformación, y caída del pelaje. Asimismo, los recolectores deben verificar el color, la cantidad y la claridad del fluido amniótico. Los fabricantes de suero deben recolectar la sangre de fetos aceptables mediante punción cardíaca en un sistema cerrado de recolección en condiciones diseñadas para minimizar la contaminación microbiana. Los fabricantes deben implementar procedimientos que prevengan la contaminación cruzada con otros tejidos fetales y fluidos corporales y el ambiente aledaño.
Recolección
y Procesamiento del Suero
La separación (recolección) del suero y demás actividades de procesamiento deben ser realizadas por personal capacitado siguiendo procedimientos escritos y aprobados. El suero primero se separa y combina, y luego se filtra y deposita en envases limpios y desinfectados. Si el suero se somete a uno o más tratamientos de inactivación viral en el proceso de producción, los fabricantes de suero deben validar los procesos de inactivación viral contra una gama de virus pertinentes. Se recomienda incluir al virus de la diarrea viral bovina (VDVB) en cualquier estudio de validación viral debido a que este virus es ubicuo. SEPARACIÓN Y RECOLECCIÓN DEL SUERO El procesamiento de sangre bovina y la separación (recolección) del suero deben realizarse en una manera que minimice la contaminación bacteriana y micoplasmática, lo cual a su vez minimiza los niveles de endotoxinas en el producto del suero. El procesamiento cuidadoso y rápido de la sangre ayuda a minimizar la hemólisis, lo que mejora aún más la calidad del producto del suero. Después de la recolección, primero se deja que la sangre coagule durante un periodo específico y en condiciones controladas, y luego se centrifuga en una centrífuga refrigerada. Posteriormente, el suero se separa del coágulo, generalmente por centrifugación, se combina y mezcla en un recipiente de combinación, se transfiere a envases etiquetados, y se congela, a menos que se esterilice inmediatamente por filtración. Los fabricantes de suero deben describir cada etapa del proceso y realizar las actividades de procesamiento del suero, incluyendo la recolección de muestras y las pruebas de control de calidad durante el proceso, siguiendo los procedimientos aprobados del fabricante. COMBINACIÓN DE SUEROS ANTES DEL FILTRADO Debido a la limitada cantidad de sangre que se puede recolectar de cada animal, los fabricantes de suero combinan el suero bruto de muchos animales para crear lotes de tamaño comercial. Después de descongelar el suero bruto y antes de la filtración, el suero se combina en un recipiente de combinación y se mezcla a una velocidad y temperatura controladas. Las combinaciones o lotes de suero de bovino donante pueden consistir en muchas recolecciones separadas de miembros individuales de la manada. Los lotes de FBS pueden consistir en el suero combinado de miles de animales. Los fabricantes de suero deben describir cada etapa del proceso de combinación de sueros previa al filtrado y deben realizar la descongelación del suero, la combinación previa al filtrado y las actividades de mezclado siguiendo los procedimientos aprobados del fabricante.
USP 39
846 (1024) Suero Bovino/ Información General
FILTRACIÓN El suero combinado se mezcla y se pasa asépticamente a través de filtros con un tamaño de poro de 0,2 µm o menor, dependiendo de la aplicación prevista. Deben validarse los procesos de filtración. Se ha demostrado que la filtración triple usando filtros con un tamaño de poro de O, 1 µm resulta en un alto grado de eliminación de micoplasmas. Aunque la filtración puede eliminar algunos virus de gran tamaño y agregados virales del suero, los virus generalmente no pueden eliminarse por completo mediante esta técnica. Además, no se ha demostrado que los filtros eliminen el agente causante de la encefalopatía espongiforme bovina (BSE, por sus siglas en inglés). Después de la filtración, los fabricantes de suero llenan envases estériles con el suero filtrado mediante procesamiento aséptico en un ambiente adecuadamente controlado. Los fabricantes de suero deben describir cada etapa del proceso de filtración y deben realizar las actividades de filtrado, llenado y recolección de muestras de suero siguiendo los procedimientos aprobados del fabricante.
RADIACIÓN El tratamiento del suero por radiación gamma es muy común y representa uno de los métodos más efectivos de inactivación viral. La dosis mínima usada con más frecuencia es de 25 kilograys (kGy). Algunos países especifican requerimientos de dosis mayores (>30 kGy) para suero importado. La radiación gamma puede inactivar virus, micoplasma y bacterias, pero los usuarios finales del suero deben asegurarse de que el proceso de radiación gamma no afecte negativamente sus aplicaciones específicas. La radiación puede tener efectos adversos sobre la calidad del suero, los cuales tienden a incrementarse a mayores dosis. La validación de la radiación gama presenta dos aspectos: (1) la administración de la dosis en una configuración de carga definida y (2) la capacidad de inactivación. Los parámetros críticos del proceso de radiación incluyen la temperatura del producto (suero), el tamaño y la configuración del envasado, la distribución de dosímetros y la dosis mínima/máxima definida de radiación recibida. Los dosímetros deben usarse para monitorear las posiciones de dosis alta y dosis baja en cada aplicación de radiación. Si el fabricante de suero declara haber realizado inactivaciones, éstas deben estar sustentadas mediante estudios de inactivación viral bien diseñados por el mismo fabricante.
TRATAMIENTO ULTRAVIOLETA
(uv)
Los fabricantes de suero pueden usar tratamiento UV para inactivar virus, micoplasmas y bacterias, sin embargo deben validar el proceso para demostrar su eficacia. Además, los fabricantes deben ser conscientes de que el tratamiento UV puede tener un efecto adverso sobre la calidad del suero y por consiguiente deben considerar los efectos del tratamiento UV para cada aplicación, como deben hacerlo también los usuarios finales del suero.
INACTIVACIÓN CON CALOR La inactivación con calor implica elevar la temperatura del suero a >56º durante al menos 30 minutos para inactivar el complemento. La inactivación con calor también puede inactivar virus, micoplasmas y bacterias, aunque puede tener un efecto adverso sobre la calidad del suero, por lo que los fabricantes deben validar la aptitud del procedimiento para aplicaciones específicas. En comparación con la radiación, la inactivación con calor proporciona una garantía de inactivación significativamente menor.
ESTUDIOS DE DEPURACIÓN VIRAL El capítulo general Evaluación de la Seguridad Viral en Productos Biotecnológicos Obtenidos de Líneas Celulares de Origen Humano o Animal (1050) y otros documentos reglamentarios proporcionan guías sobre la realización de estudios de depuración viral que ayudan a validar los procesos de eliminación/inactivación. Los fabricantes de suero deben también realizar estudios formales con agregado (spiking) de virus pertinentes y representativos (modelo), y deben analizar y comparar muestras de suero con virus agregado e inactivado, controles negativos y controles positivos.
TRATAMIENTO CON CARBÓN Algunos fabricantes de suero usan tratamientos con carbón/dextrano para reducir los niveles de hormonas del suero.
DIÁLISIS Algunos fabricantes utilizan diálisis o diafiltración para eliminar componentes de bajo peso molecular del suero.
USP 39
Información General/ (1024) Suero Bovino 847
LIMPIEZA Y ESTERILIDAD DEL EQUIPO Las tuberias y sistemas de acero inoxidable usados en la fabricación de suero bovino deben limpiarse y esterilizarse para prevenir la contaminación cruzada y el crecimiento de agentes adventicios. Los fabricantes de suero deben validar sus procesos de limpieza para la eliminación e inactivación de agentes de interés. Posteriormente, los fabricantes deben implementar controles de proceso que verifiquen de manera rutinaria los ciclos de limpieza. La esterilización por vapor en el sitio (sterilization-in-place) es una técnica de esterilización común y efectiva. Los fabricantes de suero que usan esta tecnología deben validar los ciclos de vapor para demostrar su uniformidad y capacidad para destruir esporas bacterianas resistentes al calor. Los fabricantes pueden, alternativamente, usar sistemas desechables estériles que no requieren de validación de limpieza.
Control de Calidad RASTREABI LI DAD Recolección en Mataderos: Los materiales recolectados en EE.UU. deben obtenerse de instalaciones registradas en el Departamento de Agricultura de EE.UU. (USDA, por sus siglas en inglés). Los fabricantes de suero deben conservar documentación que permita rastrear un sublote de suero específico hasta el matadero donde se recolectó. Los mataderos mantienen registros del origen del animal. La práctica industrial general es conservar esta información como parte del Registro Maestro del Dispositivo (DMR, por sus siglas en inglés). Los requisitos generales de conservación de registros en mataderos autorizados por el USDA se citan en el Título 9 del Código de Reglamentaciones Federales (en lo sucesivo CFR, por sus siglas en inglés) 320. Los materiales recolectados en países aprobados por el USDA para la importación de productos bovinos a EE.UU. deben cumplir con los requisitos de la autoridad competente del país de origen. Además, los fabricantes de suero deben conservar registros de análisis de seguridad requeridos por el USDA para materiales importados (si fuera requerido) como parte de su Registro Histórico del Dispositivo (DHR, por sus siglas en inglés). Los fabricantes de suero deben consultar el Título 9 del CFR 309 y el Título 9 del CFR 31 O con respecto a los requisitos de inspección de animales para diversas enfermedades antes y después del sacrificio. Se recomienda cumplir con tales requisitos para materiales recolectados fuera de EE.UU. Recolección en Manadas Donantes: Los fabricantes de suero deben mantener la rastreabilidad hasta la granja de animales donantes en la que se recolectó la sangre de los animales donantes. En la mayoría de los casos, los fabricantes de suero identifican de manera individual a los animales de la granja y conservan registros sobre las fechas de sangrado y procesamiento, lo que permite rastrear la recolección sanguínea hasta un animal en particular. Los animales deben ser inspeccionados con regularidad por un veterinario autorizado o individuo designado bajo la guía de un veterinario, quienes deben certificar que los animales están libres de enfermedades y son aptos para consumo humano, de conformidad con el Título 9 del CFR 309. ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD DEL PRODUCTO El suero debe almacenarse en estado de congelación a una temperatura de -1 Oº o menor. El suero se congela tan rápido como sea posible para preservar la calidad del producto y se almacena en condiciones controladas de almacenamiento. Los fabricantes de suero deben establecer la estabilidad del producto del suero para respaldar la fecha de caducidad propuesta. La fecha de caducidad típica para el suero bovino es de 5 años a partir de la fecha de filtración y envasado. El uso de cualquier tipo de suero bovino después de la fecha de caducidad indicada depende de la aplicación y el usuario del suero debe establecer la aptitud continua del producto para su uso.
Etiquetado Las etiquetas del producto terminado deben contener la siguiente información: descripción del producto, número de lote, condiciones de almacenamiento, nombre y dirección del fabricante y una declaración que indique el uso previsto. Los materiales destinados para propósitos de investigación están exentos de las reglamentaciones de etiquetado (Título 21 del CFR 801 ). Por lo general, los fabricantes de suero proporcionan un Certificado de Análisis (COA, por sus siglas en inglés) específico del lote, el cual se clasifica como parte del etiquetado del producto. Ver los requisitos para el COA en la sección siguiente.
Certificación/Documentación CERTIFICADO DE ANÁLISIS El COA debe proveer información sobre un lote de suero específico, incluidas las pruebas realizadas y los resultados de las mismas (de acuerdo con las especificaciones de liberación del fabricante del suero), así como los identificadores críticos del etiquetado tales como número de lote, número de catálogo, descripción del tipo de suero bovino, país de origen y fecha de fabricación o caducidad, o ambas. Este documento es distinto al certificado de salud emitido por la autoridad competente del país de origen.
848 (1024) Suero Bovino/ Información General
USP 39
CERTIFICADO DE ORIGEN Y CERTIFICADO DEL ESTADO DE SALUD DEL ANIMAL El Certificado de Origen establece el país en el que se recolectó la sangre bovina, así como la certificación veterinaria de la salud de los animales antes y después de la recolección (Título 9 del CFR 327.4). DOCUMENTOS DE IMPORTACIÓN/EXPORTACIÓN Los documentos de importación/exportación incluyen una certificación formal del estado de las enfermedades animales en el país de origen y las disposiciones de certificación negociadas/acordadas, las cuales varían de país a país. Cada país define sus requisitos de importación/exportación a fin de controlar la introducción de enfermedades animales exóticas y su impacto económico, así como evaluaciones de seguridad del producto (riesgo vs. investigación, diagnóstico y/o beneficios terapéuticos). INFORMES DE PRODUCCIÓN Los informes de producción son generalmente registros de partidas que documentan las materias primas de manera identificable y rastreable, métodos de producción (centrifugación o filtración) usados en la fabricación, limpieza de equipo e instalaciones, pruebas de control de calidad y personal que realiza las actividades requeridas. La materia prima con Certificados de Origen o registros de producción de suero facilita la rastreabilidad hasta el origen de la sangre que se usó para crear el suero. Cuando se usa suero como una materia prima para fabricación, la documentación del proceso también ayuda a demostrar la fabricación controlada del suero bovino.
EVALUACIÓN DE RIESGO DE BSE A pesar del bajo potencial de riesgo de encefalopatías espongiformes transmisibles (TSE, por sus siglas en inglés) en el suero bovino, diversas agencias reguladoras de EE.UU. e internacionales han desarrollado guías para ayudar a manejar y reducir aún más los riesgos potenciales de transmisión. Ante la ausencia de métodos de prueba apropiados para detectar al agente infeccioso en fluidos como la sangre, la recomendación acordada por varias agencias reguladoras es adoptar buenas estrategias de evaluación de riesgos. Esta sección del capítulo proporciona algunos antecedentes de la enfermedad y los métodos de detección vigentes; además señala estrategias de evaluación de riesgos y de reducción de riesgos para prevenir potencialmente la transmisión de la enfermedad a través del uso de suero en la fabricación de productos medicinales.
Descripción de la Enfermedad Las TSE son enfermedades animales y humanas transmisibles que se caracterizan por una degeneración del cerebro, relacionada con severos signos y síntomas neurológicos. Debido a las epidemias de TSE en ganado bovino, denominadas BSE, las cuales se transmitieron a otras especies, los funcionarios de salud pública están preocupados por el riesgo de infección de TSE, incluida la posibilidad de transmisión de TSE por el uso de productos terapéuticos que se fabrican usando suero bovino. Se han encontrado titulas bajos en el fluido cerebroespinal, pulmón, tejido linfático, bazo, riñón, hígado e íleon del ganado bovino infectado con BSE. Los estudios han demostrado que la transfusión sanguínea a partir de una oveja infectada con BSE o prurito lumbar pero sin enfermedad evidente puede infectar a una oveja que no ha sido expuesta previamente a la infección. Aunque siempre está presente el riesgo de contaminación cruzada, a la fecha, ningún estudio ha demostrado que la enfermedad puede transmitirse a partir de la sangre de ganado bovino con BSE. Los embriones de ganado bovino afectado por BSE no han transmitido enfermedades a ratones. Los terneros nacidos de hembras reproductoras que recibieron embriones de ganado bovino afectado por BSE han sobrevivido por hasta 7 años, y el examen practicado a los cerebros de las hembras reproductoras no afectadas y de sus crías no revelaron encefalopatía espongiforme.
Estrategias de Detección Ninguno de los procedimientos actualmente disponibles cuenta con una sensibilidad validada que sea suficiente para llevar a cabo la detección antemortem en animales asintomáticos, aunque se encuentran en desarrollo métodos analíticos para la detección y cuantificación en materiales de baja infectividad como la sangre. La prueba clásica de diagnóstico para TSE es el examen histológico postmortem de tejido cerebral para confirmar la característica degeneración vacuolar. Otras opciones de análisis incluyen pruebas inmunohistoquímicas que pueden confirmar la presencia de PrPSc, la conformación anormal específica para la enfermedad de la proteína priónica (PrP), en las regiones vacuoladas del cerebro; y pruebas inmunoquímicas como transferencias Western y enzimoinmunoensayos que pueden detectar PrPSc en tejidos con titulas altos o moderadamente altos. Estas pruebas generalmente toman menos tiempo que el examen histológico (6-8 horas vs. semanas, respectivamente) y se pueden automatizar parcial o totalmente. Aunque muchas de éstas pruebas son postmortem, los estudios han demostrado la viabilidad de las pruebas antemortem de muestras de tejido linfoide obtenido de las amígdalas o de la membrana nictitante de animales infectados. Las pruebas inmunoquímicas requieren de una extensa recolección y preparación de muestras y pueden ser demasiado caras para emplearse como pruebas y monitoreos de rutina de la enfermedad en manadas grandes. Las
USP 39
Información General/ (1024) Suero Bovino 849
estrategias de diagnóstico deben considerar la sensibilidad del análisis en ciertos tejidos, así como la capacidad de la prueba para detectar la infectividad en los animales antes del desarrollo de signos clínicos de enfermedad. Los resultados negativos no aseguran la ausencia de infectividad. La detección de infectividad es posible si se inocula el tejido sospechoso en animales experimentales intracranealmente donde el agente causante puede amplificarse. Esta metodología de detección de baja infectividad puede tomar desde meses hasta años para arrojar un resultado positivo.
Estrategias de Evaluación y Reducción de Riesgos Los fabricantes de suero deben emplear estrategias de reducción de riesgos para eliminar el peligro de contaminación cruzada de sangre fetal con otros tejidos, que incluyan la obtención apropiada de artículos de origen animal y el uso de prácticas que han demostrado eliminar o minimizar el riesgo de transmisión de TSE mediante productos alimenticios o para el cuidado de la salud. Los usuarios finales del suero deben realizar una evaluación de riesgos relacionada con su estrategia de obtención del material en la que se considere la cantidad de suero bovino usada en su aplicación, y deben realizar auditorías a los proveedores para asegurar la rastreabilidad del origen, manejo y sistemas de control de calidad apropiados. ORIGEN Y EDAD DE LOS ANIMALES Los fabricantes de suero deben monitorear la rastreabilidad de cada lote de suero para asegurar la calificación del suero bovino, según se describió previamente en las secciones Recolección y Procesamiento del Suero y Control de Calidad. Además de la rastreabilidad, la selección cuidadosa de materiales de origen es el criterio más importante para la seguridad de los productos medicinales. La certificación de origen debe estar disponible por parte del proveedor y los fabricantes deben conservar esta información en sus archivos. Las recomendaciones de la Administración de Alimentos y Medicamentos de EE.UU. (FDA, por sus siglas en inglés) prohíben el uso en productos regulados por la FDA (con excepción de la gelatina) de cualquier material bovino originario de países con casos reportados de BSE autóctona. La regla vigente propuesta califica al FBS como una fuente improbable de material infeccioso de BSE, puesto que la evidencia actual sugiere que la transmisión de BSE de la vaca al ternero es poco probable. La regla propuesta indica además que los materiales de ganado bovino prohibidos no incluyen materiales derivados de fetos de terneros provenientes de vacas inspeccionadas y aprobadas, siempre que los materiales se hayan obtenido mediante procedimientos que puedan prevenir la contaminación con materiales de riesgo especificados. Para productos biológicos veterinarios, los reglamentos vigentes aplicados por el Centro de Productos Biológicos Veterinarios del USDA (USDA's Center for Veterinary Biologics o CVB) indican que los ingredientes de origen animal deben obtenerse de países sin o con un riesgo bajo de BSE, según lo definido por el Centro Nacional de Importaciones y Exportaciones de EE.UU. y el Título 9 del CFR 94.18. Las fuentes de materiales más satisfactorias provienen de países con las siguientes características: • Sin casos reportados de BSE autóctona • Notificación obligatoria de pruebas positivas • Verificación obligatoria clínica y en el laboratorio de casos sospechosos • Prohibición de uso de harina de carne y huesos que contengan proteínas de animales rumiantes como fuente alimentación de animales rumiantes • Sin importación de ganado bovino de países donde se haya presentado una alta incidencia de BSE • Sin importación de progenie de hembras afectadas La infectividad de la BSE puede incrementarse con la edad del animal. Aunque el suero bovino se considera un material de bajo riesgo de transmisión de TSE, algunos usuarios finales consideran prudente obtener el suero a partir de hembras reproductoras menores de una edad máxima establecida. Si los fabricantes no pueden determinar la fecha de nacimiento de la hembra reproductora, deben considerar tanto la fecha de implementación de la prohibición alimentaria en el país de origen y el periodo de incubación de BSE a fin de determinar la seguridad de la fuente. En julio de 1988 se impuso una prohibición alimentaria para animales rumiantes en el Reino Unido. Estas consideraciones son específicas del lote, por lo que las auditorías del proveedor de materia prima deben incluir una revisión de los registros. PROCESO DE PRODUCCIÓN El usuario final debe contar con sistemas de fabricación para monitorear el proceso de producción y para delinear la partida (definición de partida, separación de partidas y limpieza entre partidas). El control de contaminación cruzada potencial con material posiblemente infeccioso es de primera importancia. Debido a la resistencia documentada de los agentes de TSE a la mayoría de los procedimientos de inactivación, la obtención controlada de materiales es el criterio más importante para lograr una seguridad aceptable del producto. Siempre que sea posible, los fabricantes deben identificar las etapas que teórica o demostrativamente eliminen o inactiven agentes durante la fabricación del material. Los fabricantes deben continuar sus investigaciones sobre métodos de eliminación e inactivación para identificar etapas/procesos que ayuden a asegurar la eliminación o inactivación de agentes de TSE. Los fabricantes deben diseñar procesos de producción usando métodos disponibles que presenten la mayor probabilidad de inactivar o eliminar agentes de TSE. Por ejemplo, la exposición prolongada de tejidos a calor húmedo alto y pH elevado inactiva al
USP 39
850 (1024) Suero Bovino/ Información General
agente de BSE. No obstante, dichos tratamientos son inapropiados para la extracción de muchos otros tipos de artículos bovinos tales como el suero, debido a que estos tratamientos conllevan a la destrucción del material. Los procedimientos convencionales químicos y bioquímicos de extracción y aislamiento pueden ser suficientes para eliminar al agente infeccioso. Técnicas similares pueden ser efectivas para otros artículos bovinos. La investigación adicional ayudará a desarrollar una comprensión de la metodología más apropiada para los estudios de validación. Las cuestiones a considerar durante la validación de un proceso para eliminar los agentes de TSE incluyen lo siguiente: • La naturaleza del material contaminado intencionalmente (spiked material) y su relevancia para la situación natural • Diseño del estudio (incluyendo metodologías de reducción de escala de los procesos) • Método para detectar al agente (ensayos in vitro o in vivo) después de la contaminación intencional y después del tratamiento • Caracterización y estandarización de materiales de referencia para la contaminación intencional •Tratamiento y análisis de datos (ver Diseño y Análisis de Valoraciones Biológicas (111 )) Debido a que ningún estudio ha validado con éxito métodos analíticos para la detección de pequeñas cantidades del agente de TSE, los estudios de validación para depuración de TSE por lo general emplean la inyección intracraneal de material en proceso en roedores para la amplificación y detección de infectividad residual potencial.
ANÁLISIS Y CONTROL DE AGENTES ADVENTICIOS Introducción Los procedimientos de análisis rigurosos, las guías estrictas de procesamiento y producción, y las evaluaciones de riesgos apropiadas ayudan a asegurar la seguridad de los diferentes tipos de suero bovino. Esta sección analiza pruebas específicas que pueden detectar y controlar agentes adventicios.
Análisis de Agentes Adventicios Los análisis de agentes adventicios requeridos para la evaluación de siembras maestras, células maestras y productos brutos y finales se describen en el Título 9 del CFR 113.53 y en las directivas de la Agencia Europea para la Evaluación de Productos Medicinales (EMEA, por sus siglas en inglés) (EMEA/CVMP/743/00 y EMEA/CPMP/BWP/1793/02). Los métodos de análisis señalados en estos documentos pueden detectar una amplia gama de agentes microbianos bovinos en productos de suero. Estos métodos de análisis cumplen con los requisitos de la mayoría de las agencias reguladoras mundiales. Los fabricantes de suero deben analizar una muestra representativa de cada lote de suero para determinar la presencia de agentes adventicios. El análisis se realiza después de la filtración pero antes de cualquier procesamiento destinado a inactivar o eliminar virus. La filtración con filtros con un tamaño de poro de 100 nm (O, 1 µm) es un método aceptado de eliminación de micoplasmas, mientras que la radiación gamma(> 25 kGy cuando está congelado) y los tratamientos químicos (p.ej. con betapropiolactona) son métodos aceptados de inactivación de virus y micoplasmas; los fabricantes de suero usan rutinariamente estas herramientas en las instalaciones de producción y análisis. Estos tratamientos no eliminan anticuerpos que puedan interferir con algunas aplicaciones. Además, los tratamientos no aseguran la eliminación ni la inactivación total de virus, pero pueden reducir significativamente el riesgo de actividad viral. La serie de análisis para determinar la ausencia de agentes adventicios en el suero bovino generalmente incluye lo siguiente: • Análisis de esterilidad bacteriana y fúngica, según se describe en el Título 9 del CFR 113.26 • Análisis de micoplasmas según se describe en el Título 9 del CFR 11 3.28 •Análisis viral según se describe en el Título 9 del CFR 113.53 Los procedimientos descritos en Pruebas de Esterilidad (71) confirman la ausencia de infección bacteriana y fúngica. En lo que respecta a virus, únicamente el cultivo usando células sustrato adecuadas puede indicar infectividad y replicación viral. Aquellos que usan suero para investigación o producción deben analizar el suero para demostrar la ausencia de agentes adventicios de una manera que sea congruente con la aplicación prevista del producto, teniendo en cuenta que el análisis únicamente indica la presencia o ausencia de agentes adventicios dentro de los límites de los procedimientos de análisis usados.
Análisis de Micoplasmas La contaminación con micoplasmas en el cultivo de tejidos puede surgir de muchas fuentes de origen animal, incluido el suero, pero resulta con mayor regularidad de la contaminación cruzada de cultivos infectados. Los micoplasmas son contaminantes particularmente insidiosos en el cultivo celular debido a que • no pueden visualizarse mediante microscopia de luz incluso a alta densidad (> 107 unidades formadoras de colonias/mL); • no ocasionan cambios observables de turbidez o pH del fluido de cultivo; • no se pueden eliminar rutinariamente mediante filtros de esterilización individuales, aunque se puede lograr la eliminación a través de una serie de tres filtros de O, 1 µm; • los antibióticos tradicionales que se usan en el cultivo celular no los afectan; y • provocan una variedad extremadamente amplia de efectos adversos en el cultivo de tejidos.
Información General/ (1024) Suero Bovino 851
USP 39
El capítulo Pruebas para Micoplasmas (63) describe la detección clásica de micoplasmas. Además de estos métodos, los procedimientos de detección más recientes incluyen los ensayos luminiscente y de reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés). El capítulo Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Amplificación (1127) describe los principios generales de los ensayos de PCR. El ensayo sensible luminiscente de 20 minutos mide una actividad enzimática específica de molicutes que convierte el difasfato de adenosina a trifasfato de adenosina mediante una reacción de luciferasa/luciferina. Los resultados son inequívocos y semicuantitativos. Los métodos de PCR son rápidos y sensibles y su funcionamiento es bastante fiable, aunque los resultados falsos positivos ocasionales representan una preocupación en lo que respecta a laboratorios de servicios de análisis comerciales. La PCR puede detectar fragmentos de ADN micoplasmáticos no infecciosos.
Análisis Viral Los procedimientos de análisis viral para productos de suero se citan en el Título 9 del CFR 11 3.52 y en el Título 9 del CFR 113.53. Además, existen otros documentos que pueden incluir análisis equivalentes o pertinentes, como por ejemplo EMEA/ CVMP/743/00-Rev.2 del Comité para Productos Medicinales Veterinarios (Committee far Veterinary Medicinal Products o CVMP) Guía Revisada de Requisitos y Controles Aplicados al Suero Bovino Usado en la Producción de Productos Medicinales Veterinarios Inmunológicos (Revised Guideline on Requirements and Controls Applied to Bovine Serum Used in the Production of lmmunological Veterinary Medicinal Products) y EMEA/CPMP/BWP/1793/02 del Comité para Productos Medicinales de Patente (Committee far Proprietary Medicinal Products o CPMP) Guías sobre el Uso de Suero Bovino en la Fabricación de Productos Medicinales Biológicos de Uso Humanos (Note far Guidance on the Use of Bovine Serum in the Manufacture of Human Biological Medicinal Products). Los fabricantes de suero deben realizar análisis de virus que cumplan con esta reglamentación, usando por lo menos dos líneas de células detectoras diferentes y sensibles, de las cuales una debe ser de origen bovino. Las pruebas incluyen el cultivo de células detectoras en medios de cultivo celular suplementados con el suero de prueba al 15% durante al menos 21 días. Las células se subcultivan por lo menos dos veces durante este periodo, generalmente a los 7 y 14 días posteriores a la inoculación. Una vez terminado el último subcultivo (después de un total de al menos 21 días de incubación), las células se examinan para detectar signos generales de amplificación del virus. Los siguientes puntos finales se usan para la detección general de virus: examen microscópico celular para agentes citopatogénicos tales como el virus de la rinotraqueitis bovina infecciosa, tinción celular y examen microscópico para cuerpos de inclusión, y prueba de hemadsorción para detectar agentes hemadsorbentes tales como Pl-3. Además de esta serie de análisis y al finalizar el último subcultivo (después de un total de al menos 21 días de incubación), las células se tiñen con anticuerpos específicos fluorescentes contra los siguientes agentes virales específicos: • BVDV • Parvovirus bovino • Adenovirus bovino • Virus de la lengua azul • Virus respiratorio sincicial bovino • Reovirus • Virus de la rabia Además de los virus listados anteriormente, otros virus pueden ser agentes causantes de enfermedades y que requieren de análisis en diversas aplicaciones del suero bovino. El usuario final del suero es el responsable de determinar si el análisis completo del Título 9 del CFR es suficiente y si se deben analizar otros agentes virales específicos. Ejemplos de virus específicos no cubiertos por la guía de análisis viral vigente pueden incluir akabane, virus del herpes bovino tipo 1 (VHB-1 ), virus de la parainfluenza tipo 3 (Pl-3), leucemia bovina, rotavirus bovino, circovirus bovino, poliomavirus bovino, coronavirus, torovirus, enterovirus bovino, astrovirus bovino, virus de fiebre aftosa (VFA) y peste bovina. El Apéndice 2 proporciona una descripción general de estos virus, así como de aquellos para los que se requiere de análisis. El análisis de riesgos extensivo por parte del usuario final del suero debe determinar el alcance del análisis y las opciones para el tratamiento del suero.
Estrategias de Evaluación
y Detección de Riesgos
Los fabricantes de suero y los usuarios finales de suero deben llevar a cabo evaluaciones integrales de riesgos basadas en datos científicos (p.ej. análisis de modos y efectos de falla) a fin de comprender de mejor manera el perfil de seguridad del producto del suero. Se pueden tomar en cuenta los siguientes elementos de evaluación de riesgos, aunque es posible incluir otros elementos según sea apropiado: país de origen, región del país, estado de enfermedad animal del país/región de origen, edad del animal, proceso de recolección sanguínea, método de aturdimiento del animal y método de desangrado, proceso de fabricación del suero, tipo de sistema de calidad de producción, controles de producción durante el proceso, análisis del producto final, inactivación del virus, segregación del equipo, procedimiento de limpieza del equipo, capacitación del personal, uso/aplicación del suero, tipo de producto farmacéutico y uso previsto. La barrera de especies proporciona un grado de protección en contra de infecciones por algunos agentes etiológicos animales. Esta barrera no es una alternativa para asegurar de manera proactiva que los productos farmacéuticos se fabriquen únicamente a partir de materias primas de origen animal que presentan niveles indetectables de agentes adventicios. La inoculación de organismos viables en especies no anfitrionas conlleva el riesgo de que los organismos puedan cruzar la barrera de especies.
USP 39
852 (1024) Suero Bovino/ Información General
Por lo tanto, un régimen apropiado de análisis del material del suero debe incluir exámenes para determinar la presencia de contaminantes potenciales relacionados con la especie de origen y la especie objetivo. Los tratamientos del suero para inactivar agentes virales son un factor para establecer el régimen de análisis adecuado para un material en particular. El nivel de riesgo más bajo de contaminación se relaciona con materiales biológicos que se esterilizan de manera terminal. Un nivel de riesgo igual a cero es imposible e irrazonable. Los fabricantes de suero deben describir completamente los regímenes de análisis específicos en las especificaciones del producto, los cuales variarán dependiendo del tipo y origen del suero. Por tanto, las pautas de detección descritas en este capítulo únicamente son ejemplificativas y es posible que no se requiera de la detección de todos los virus citados para un material en particular. Algunos fabricantes pueden realizar ciertas pruebas sobre el producto terminado o los materiales en proceso en lugar de realizarlas sobre los componentes individuales. Los fabricantes también deben evaluar el efecto de dilución en relación con el límite de detección del procedimiento de análisis. La interferencia con el crecimiento o neutralización de actividad viral por parte del suero puede ser indicativo de un anticuerpo específico o de ciertos factores inespecíficos de enmascaramiento del agente viral por parte del suero. Se recomienda que los fabricantes de suero consideren esta posibilidad al momento de determinar un nivel adecuado de tratamiento en sus estudios de inactivación viral o aplicaciones de análisis viral. Los fabricantes de suero deben confirmar que la especie de origen es bovina para asegurar la ausencia de otros agentes no bovinos. Los fabricantes deben realizar análisis de virus extraños en cultivos celulares apropiados (ver Métodos de Pruebas Virológicas (1237) para seleccionar adecuadamente las líneas celulares, dependiendo del ensayo y del agente buscado). Si fuera necesario, se deben realizar estudios de seroconversión en especies animales susceptibles al virus, usando una respuesta inmune mediada por anticuerpos en la especie anfitriona como método de detección. Los estudios deben usar este procedimiento después de una etapa de inactivación para detectar si el virus estaba presente antes del proceso de inactivación viral. Los procesos de fabricación de suero deben realizarse de manera congruente, siguiendo los procedimientos de fabricación establecidos, con sistemas de calidad adecuados incorporados al proceso de producción. Además, la segregación de equipo (por especies de origen), los procedimientos de limpieza de equipo e instalaciones, y la capacitación de personal son elementos importantes en la evaluación de riesgos del proceso.
Consideraciones de Seguridad Los usuarios finales de suero bovino de donante pueden requerir que el suero no presente anticuerpos detectables contra el VDVB u otros agentes específicos, de modo que los usuarios puedan propagar cultivos celulares usados en la producción de vacunas, en el análisis de diagnóstico, y en la preparación de kits de pruebas, especialmente para el mantenimiento de reservas de células maestras y de siembra. Se encuentran disponibles más de 40 tipos de células para la producción de productos biológicos veterinarios, pero menos de 1 O tipos de medios para su propagación. Algunos investigadores han propuesto medios exentos de suero como alternativa para propagar ciertas células y virus; sin embargo, esto significa adaptar los procedimientos de cultivo, lo que puede alterar las células y cambiar los resultados de producción. Si se importan sueros nuevos o diferentes a EE.UU., los usuarios finales del suero requerirán confirmación de origen, especies y documentación de origen de los sueros en países libres de FA y peste bovina.
Cambio en la redacción:
CARACTERIZACIÓN DE SUERO BOVINO Introducción Ante la ausencia de requisitos específicos del producto final, se debe analizar cada lote de FBS para confirmar que el suero cumpla con los requisitos del capítulo general propuesto Suero Fetal Bovino-Atributos de Calidad y Pruebas de Funcionalidad (90). Esta sección describe diversos procedimientos claves de caracterización para todos los demás tipos de suero. Estos procedimientos no son obligatorios pero representan guías que los fabricantes pueden considerar para sus aplicaciones individuales. La tabla de la sección Hemoglobina presenta ejemplos de especificaciones para los diversos tipos de suero bovino.
Identificación de Especies El suero bovino debe someterse a ensayos de identificación tanto inter como intraespecies para confirmar la identidad de la especie y la integridad de los productos del suero, así como para asegurar que no se encuentren presentes agentes no bovinos. El ensayo más comúnmente usado para la identificación de la especie bovina se basa en el perfil electroforético de proteínas específicas del suero. Con la electroforesis, las proteínas del suero por lo general se separan hasta en seis fracciones: albúmina, alfa 1, alfa 2, beta 1, beta 2 y gamma globulinas. Otros procedimientos usados para la determinación de especies bovinas incluyen la inmunodifusión radial (IDR) y el método de difusión doble de Ouchterlony. Estos procedimientos permiten mediciones cualitativas o cuantitativas de los niveles de inmunoglobulina G en el suero. El método por IDR se basa en la difusión de un antígeno desde un pocillo circular en un gel homogéneo que contiene un antisuero específico para cada antígeno en particular. Se forma un círculo de antígeno y anticuerpo precipitados y continúa creciendo hasta que alcanza el equilibrio. Los diámetros de los anillos son una función de con-
Información General/ (1024) Suero Bovino 853
USP 39
centración de antígeno. El método de Ouchterlony es una prueba de difusión doble en gel en la que el antígeno y el anticuerpo difunden uno hacia el otro en un medio semisólido hasta un punto en el medio en el que se alcanza una concentración óptima de cada uno, formando un precipitado. Las placas de Ouchterlony contienen pocillos cilíndricos-un pocillo de antígeno central de 8 mm de diámetro, rodeado por seis pocillos de antisuero de 3 mm-que posibilitan el monitoreo simultáneo de múltiples sistemas de antígeno-anticuerpo y la identificación de antígenos particulares en una preparación. El capítulo general propuesto Suero Fetal Bovino-Atributos de Calidad y Pruebas de Funcionalidad (90) describe el procedimiento aceptado.
Hemoglobina La hemoglobina es una proteína de subunidades múltiples que forma una unión inestable y reversible con el oxígeno en los eritrocitos. La forma cargada de oxígeno se denomina oxihemoglobina y es de color rojo brillante. La forma que no está cargada de oxígeno se denomina desoxihemoglobina y es de color azul púrpura. La oxihemoglobina es la forma predominante en los eritrocitos. El bajo contenido de hemoglobina en los sueros es ampliamente aceptado como una buena indicación general de procesamiento rápido y cuidadoso de la sangre que se usará para el suero. Los eritrocitos son frágiles y se rompen fácilmente, liberando hemoglobina en el suero. La manipulación brusca de la sangre recolectada, el pobre control de temperatura o los retrasos en el procesamiento elevan el contenido de hemoglobina en el suero. Los niveles aceptables de hemoglobina pueden variar dependiendo de la aplicación prevista. Los niveles de hemoglobina se miden usando procedimientos espectrofotométricos (ver llllllllllRlllll~-llllllBllilll> según se describe en el capítulo general propuesto Suero Fetal Bovino-Atributos de Calidad y Pruebas de Funcionalidad (90). Suero de Ternero Recién Nacido
FBS
Suero de Ternero
Suero de Bovino Donante
Suero de Bovino Adulto
Prueba de Esterilidad
No se detecta crecimiento
No se detecta crecimiento
No se detecta crecimiento
No se detecta crecimiento
No se detecta crecimiento
Micoplasmas
No se detectan
No se detectan
No se detectan
No se detectan
No se detectan
Análisis de virus
No se detectan
No se detectan
No se detectan
No se detectan
No se detectan
Hemoglobina (mg/dl) Proteínas totales (q/dl)
<30
<30
<30
<30
<30
3,0-4,5
3,5-6,0
5,0-8,0
5,0-8,0
6,0-10,0
pH
7,00-8,00
7,00-8,00
7,00-8,00
7,00-8,00
7,00-8,00
Osmolalidad (mOsmol/Kg)
280-360
240-340
240-340
240-340
240-340
Perfil Químico El análisis de componentes tales como colesterol, alfa globulina, beta globulina, gamma globulina, albúmina, creatinina, bilirubina, glucosa, alanina aminotransferasa, aspartato aminotransferasa, fósforo, potasio, calcio y sodio por lo general no se considera un criterio para liberación del lote de suero bovino. Algunos fabricantes no realizan análisis de manera rutinaria sino únicamente como análisis auxiliares. En algunas ocasiones, los laboratorios clínicos hospitalarios pueden llevar a cabo los análisis. Los niveles de estas sustancias químicas en el suero son importantes para los usuarios finales y se pueden usar también para evaluar la variabilidad de lote a lote.
Niveles de Endotoxinas Aunque los niveles altos de endotoxina no son adecuados para aplicaciones que involucren inyectables, los niveles aceptables en suero bovino varían dependiendo de la aplicación prevista. Algunos fabricantes pueden pasar por alto la importancia de los niveles bajos de endotoxinas en el suero bovino usado en aplicaciones de cultivo celular. Las endotoxinas influyen en más de 30 actividades biológicas, algunas de las cuales incluyen activación de macrófagos, estimulación mitogénica y la inducción de interferones y de factor estimulante de colonias (para algunas aplicaciones, estas pueden ser actividades positivas). Las endotoxinas también pueden conllevar a citoxicidad al iniciar la activación del complemento. Los métodos más comúnmente usados para la detección de endotoxinas son el procedimiento semicuantitativo de coagulación con lisado de amebocitos de Limulus y el método cromogénico cinético cuantitativo descritos en Prueba de Endotoxinas Bacterianas (85). Tanto para el ensayo de coagulación como el ensayo cromogénico cinético, un ensayo válido de endotoxinas requiere de tratamiento apropiado por calor o dilución a fin de evitar efectos adversos de sustancias interferentes en el suero. Los investigadores deben incluir un control de producto positivo en cada ensayo para confirmar que se ha superado cualquier interferencia por el tratamiento por calor o dilución.
854 (1024) Suero Bovino / Información General
USP 39
Osmolalidad La prueba de osmolalidad está diseñada para evaluar la concentración de electrolitos en el suero bovino. Las sustancias químicas que afectan la osmolalidad del suero incluyen sodio, cloruro, bicarbonato, potasio, proteínas y glucosa. Los fabricantes de suero deben medir la osmolalidad de cada partida de suero para verificar el cumplimiento con las especificaciones del producto, usando equipos calibrados con estándares rastreables al Instituto Nacional de Estándares y Tecnología (National lnstitute of Standards and Technology). El capítulo Osmolalidad y Osmolaridad (785) describe la forma en que se determina la osmolalidad mediante disminución del punto de congelamiento de la solución de suero bovino. Los científicos emplean por lo menos dos estándares para calibrar el instrumento. La osmolalidad de cada muestra se calcula y relaciona con el contenido de agua del suero y se expresa en mOsmol/kg H2 0.
Nivel de Proteínas Totales El nivel de proteínas totales en el suero se mide para verificar la edad del animal y el cumplimiento con las especificaciones del producto. El capítulo Artículos Obtenidos por Biotecnología-Valoración de Proteínas Totales (1057) describe dos procedimientos, los métodos de Biuret y de Bradford, para determinar la concentración de proteína. El usuario final debe evaluar el nivel aceptable de proteína en el suero basándose en la aplicación prevista.
Propiedades de Crecimiento Celular Se debe analizar la capacidad de cada lote de suero para sustentar el crecimiento in vitro de líneas celulares específicas. Los sueros bovinos son muy variables por lo que lotes distintos pueden producir resultados diferentes. Debido a esta variabilidad, los usuarios finales deben caracterizar y estandarizar las líneas celulares que usarán para este tipo de análisis. Los usuarios finales deben diseñar procedimientos de crecimiento celular que les ayuden a verificar la eficacia del suero bovino en la promoción del crecimiento celular. Los fabricantes de suero se beneficiarán del monitoreo de la promoción de crecimiento celular durante varias generaciones de subcultivos para detectar cualquier evidencia de citoxicidad o cambios en la morfología celular. Los fabricantes de suero usan distintos tipos de células, y los estudios de crecimiento y las líneas celulares usadas por los fabricantes de suero también pueden variar de aquellos aplicados por los usuarios finales del suero. Al evaluar las propiedades de crecimiento de una línea celular específica en respuesta a un lote específico de suero, los fabricantes de suero deben tomar en cuenta la eficiencia del plaqueo y/o la promoción de crecimiento o algunas otras pruebas de funcionalidad que califiquen al lote de suero para su uso previsto. La eficiencia del plaqueo a baja densidad celular es un método preferido para analizar la capacidad de proliferación y la supervivencia de células individuales en condiciones óptimas de crecimiento. Este procedimiento puede revelar diferencias en la velocidad de crecimiento dentro de la población y es capaz de distinguir entre cambios en la velocidad de crecimiento (tamaño de las colonias) y la supervivencia de las células (número de las colonias). La cinética del crecimiento es otro aspecto importante en el diseño de experimentos celulares. Determinar la curva de crecimiento de cada línea celular ayuda a definir condiciones de cultivo óptimas, debido a que la variación en el suero y otros aditivos de crecimiento pueden tener influencia sobre los parámetros de crecimiento, lo cual puede afectar el resultado del experimento. Ante la ausencia de pruebas específicas diseñadas para sus productos particulares, los usuarios del suero pueden referirse a las pruebas de funcionalidad descritas en el capítulo general propuesto Suero Fetal Bovino-Atributos de Calidad y Pruebas de Funcionalidad (90) para determinar si un lote de suero es adecuado para sus aplicaciones. Este capítulo proporciona guías sobre cómo realizar las pruebas de promoción de crecimiento y de eficiencia del plaqueo.
Citotoxicidad In Vitro Los fabricantes de suero deben usar una línea celular apropiada para analizar cada lote de suero y deben realizar estudios de crecimiento a través de varias generaciones subcultivadas para asegurar que el suero no tenga efectos citotóxicos sobre las células. La elección de una línea celular depende del uso previsto del suero. Los ensayos de crecimiento celular y de citotoxicidad deben realizarse en el lote final de suero después de cualquier etapa de inactivación viral o de cualquier procesamiento adicional.
CONCLUSIÓN Es probable que el suero bovino se mantenga como un componente importante en la fabricación de muchos productos biológicos, en particular de aquellos que dependen del cultivo celular. Al igual que otros materiales similares, la calidad del suero bovino es intrínsecamente variable. Por consiguiente, los usuarios finales del suero deben establecer pruebas, procedimientos y criterios de aceptación adecuados para la introducción de materiales en el proceso de una aplicación particular que utilice suero. Lo anterior puede requerir el análisis de múltiples lotes de suero bovino para determinar aquellos lotes que cumplen con la especificación (ver la sección Caracterización de Suero Bovino).
USP 39
Información General/ (1024) Suero Bovino 855
Los fabricantes de productos terapéuticos que usan suero bovino son responsables de asegurar y documentar su calidad, así como el impacto sobre la calidad, seguridad y eficacia del producto final. Además, es importante asegurar que el desempeño de cada lote de suero sea equivalente durante la fabricación. El suero también puede interferir con la purificación del producto final; por lo tanto, es importante comprender el efecto del suero bovino sobre el proceso de fabricación a fin de entender el efecto que pueden tener varios procesos sobre el producto final. Por último, es posible disminuir los riesgos a través del diseño de procesos que incluyan etapas que eliminen adecuadamente el material bovino mediante dilución, separación o inactivación, así como el desarrollo de ensayos analíticos para evaluar el contenido residual del material bovino durante los procesos y en el producto terapéutico final. Diversos ensayos sensibles pueden proporcionar un medio cuantitativo para detectar el material bovino en niveles de picogramos.
Combio en lo redacción: APÉNDICE Apéndice 1: Referencias Reglamentarias Pertinentes El suero bovino y los productos relacionados con el suero usados en la fabricación de productos biológicos se encuentran reglamentados en el contexto de Requisitos para Ingredientes de Origen Animal Usados en la Producción de Productos Biológicos (Requirements far lngredients of Animal Origin Used far the Production of Biologics), Título 9 del CFR 113.53. En la actualidad, cada fabricante de suero realiza estudios de detección para identificar virus contaminantes. Debido a la potencial comercialización internacional del suero, los fabricantes de suero necesitan tener en cuenta otros requisitos reglamentarios. Los fabricantes pueden usar los documentos listados en este capítulo como guía para la determinación de contaminación por agentes adventicios en sueros bovinos. Debido al riesgo que conllevan los productos de suero derivado de animales, los fabricantes de suero y los usuarios finales deben asegurar que el país de origen del material cumpla con los requisitos reglamentarios aplicables. Aunque en la actualidad ningún ensayo de desempeño celular demuestra la ausencia de BSE en el suero, los fabricantes de suero deben cumplir con los requisitos reglamentarios de los países donde el suero se obtiene y comercializa a fin de asegurar un riesgo mínimo de infección por BSE/TSE. Más allá de los capítulos de USP pertinentes referidos en este capítulo, la siguiente lista incluye documentos reglamentarios así como las mejores prácticas para el desarrollo, fabricación, control de calidad y garantía de calidad del producto y los procesos. CFR •Título 9 del CFR 94.18 (CVB, 2001) •Título 9 del CFR 113.46 •Título 9 del CFR 113.47 • Título 9 del CFR 113.52 •Título 9 del CFR 113.53 • Título 9 del CFR 113.55 • Título 9 del CFR 320 •Título 9 del CFR 327.4 •Título 21 del CFR 211 Subparte E •Título 21 del CFR 801.1 •Título 21 del CFR 809.1 O FDA • FDA. Center for Biologics Evaluation and Research (CBER). 2000. Letter to manufacturers of biological products (Carta a los fabricantes de productos biológicos). Disponible en http://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/SafetyAvailability/ ucml 05877.htm • Use of materials derived from cattle in medicinal products intended for use in humans and drugs intended for use in ruminants (Uso de materiales derivados de ganado bovino en productos medicinales destinados para uso en humanos y medicamentos destinados para uso en animales rumiantes) (Regla propuesta). Federal Register (Registro Federal). 2007; 72(8): 1582-1619. Disponible en http://www.reginfo.gov/public/ Reglamentos Internacionales y Documentos Guía • CPMP/Biotechnology Working Party/EMEA (CPMP/BWP/EMEA). 1996. Note far guidance on virus validation studies (Nota de orientación sobre estudios de validación de virus): the design, contribution and interpretation of studies validating the inactivation and removal of virus es (diseño, contribución e interpretación de estudios para validar la inactivación y eliminación de virus). Disponible en •http://www.ema.europa;eu/docs/enc....GB/document_library/Scientific_guideline/2009/09/
WC500003684.pdfe ERR(01-Qct-W15) • CPMP/BWP/EMEA. 2003. Note far guidance on the use of bovine serum in the manufacture of human biological medicinal products (Nota de orientación sobre el uso de suero bovino en la fabricación de productos medicina/es biológicos para uso humano). Disponible en •http://www.ema.europa.eu/doc$/en_GB/document_libracy/Scientific_guideline/2009/
WC500003675.pdt.
ERR(01-QCt·2015)
856 (1024) Suero Bovino/ Información General
USP 39
• EMEA/CVMP/743/00-Rev.2 del Committee for Veterinary Medicinal Products (Comité para Productos Medicinales Veterinarios o CVMP). Revised guideline on requirements and contro/s applied to bovine serum used in the production of immunological veterinary medicinal products (Guía revisada sobre requisitos y controles aplicados al suero bovino usado en la producción de productos medicina/es inmunológicos para uso veterinario). Disponible en-'.'®'' · "~·:··:··,·:· ·:·· :····.· ::··;· '.~:::.·
1111111111-1111111111_ _ _ _ __
::··.lll'.1111111
• lllllliBfdl
• CPMP/CVMP. Note far guidance on minimising the risk of transmitting animal spongiform encephalopathy agents vía human and veterinary medicinal products (Nota de orientación sobre la minimización del riesgo de transmisión de agentes de encefalopatía espongiforme animal mediante productos medicina/es para uso humano y veterinario). Disponible en -
llrlJllllllllllJlllllilllllll1IUlllll_l_ _. . . . . . . _ . . . . . _. .li
• Organización Mundial de la Salud (OMS), Organización Mundial de Sanidad Animal. Código sanitario para los animales
1
~•~1111~111m111111111111~1-11111mr••11111111•-
• OMS. 2006. WHO guidelines on tissue infectivity distribution in transmissible spongiform encephalopathies (Guías de la OMS sobre la distribución tisular de la infectividad de encefalopatías espongiformes transmisibles). http://www.who.int/bloodproducts/cs/TSEPUBLISHEDREPORT.pdf
Apéndice 2: Virus a Considerar en el Análisis de Suero Bovino A continuación se presenta una descripción general de los virus que los fabricantes pueden considerar al determinar la ausencia de agentes adventicios en suero bovino. La lista se proporciona únicamente para propósitos de información general. La lista de análisis requeridos se proporciona en este capítulo en la sección Análisis Viral. Akabane-Virus transmitido por insectos que ocasiona anormalidades congénitas del sistema nervioso central de animales rumiantes. La enfermedad debida al virus de Akabane ha sido reconocida en Australia, Israel, Japón y Corea. Se han encontrado anticuerpos contra este virus en varios países en el Sureste Asiático, el Medio Oriente y África. La enfermedad afecta a los fetos de ganado bovino, ovejas y cabras. Se ha demostrado serológicamente la infección asintomática en caballos, búfalos y venados (aunque no en humanos ni cerdos) en áreas endémicas. Lengua Azul-Enfermedad viral infecciosa no contagiosa transmitida por artrópodos que afecta principalmente a animales rumiantes domésticos y salvajes. La infección por el virus de la lengua azul es común a nivel mundial pero por lo general es subclínica o moderada. El virus de la lengua azul corresponde a la especie tipo del género Orbivirus de la familia Reoviridae. Se han identificado 24 serotipos a nivel mundial, aunque no todos los serotipos existen en una sola área geográfica: p.ej., se han reportado únicamente 5 serotipos (2, 1 O, 11, 13 y 17) en los EE.UU. La distribución a nivel mundial es análoga a la distribución espacial y temporal de las especies vector de los jejenes Culicoides, que representan el único transmisor natural significativo del virus. Adenovirus bovino-Se relaciona con un amplio espectro de enfermedades. El adenovirus bovino tipo 3 es el serotipo más comúnmente asociado con la enfermedad respiratoria bovina. Los adenovirus bovinos son virus de ADN que se han separado en dos géneros: el Mastadenovirus o adenovirus mamífero y el Aviadenovirus o adenovirus aviar. El género Mastadenovirus comprende numerosos serotipos específicos de especie, de los cuales se han identificado nueve en el ganado bovino. También se han podido aislar adenovirus epiteliotrópicos de animales rumiantes que por lo general son clínicamente inaparentes. La enfermedad clínica está dictada por varios factores que incluyen la cepa del virus, la infección concurrente, el estrés, las condiciones ambientales y las prácticas de manejo. Virus del herpes bovino tipo 1 (VHB-1 )-Se relaciona con diversas enfermedades en el ganado bovino entre las que se incluyen la rinotraqueitis infecciosa bovina, vulvovaginitis pustular infecciosa, balanopostitis, conjuntivitis, aborto, encefalomielitis y mastitis. Las infecciones por VHB-1 están muy extendidas en la población de ganado bovino. La forma respiratoria es la más común en el ganado bovino de engorde a corral. Leucemia bovina-Oncovirus exógeno tipo C de la familia Retroviridae. La leucemia bovina es una enfermedad viral del ganado bovino adulto que se caracteriza por la neoplasia de linfocitos y nodos linfáticos. La infección ocurre por la transferencia iatrogénica de linfocitos infectados seguida por una respuesta de anticuerpos permanente. Aunque la prevalencia de la infección en una manada puede ser elevada, sólo unos pocos animales desarrollan linfosarcoma fatal. La infección se propaga por el contacto con la sangre contaminada de un animal infectado. Reovirus bovino-Virus de ácido ribonucleico de doble cadena (ARNdc) con viriones esféricos sin envoltura de 60-80 nm de diámetro, los cuales ocasionan enfermedades respiratorias bovinas. Virus respiratorio sincicial bovino (VRSB)-Virus de ARN clasificado como pneumovirus de la familia Paramixovirus. El nombre del virus se deriva de su efecto citopático característico: la formación de células sinciciales. Además del ganado bovino, las ovejas y cabras también pueden resultar infectadas por virus respiratorios sinciciales. El virus respiratorio sincicial humano (VRSH) es un patógeno respiratorio importante en infantes y niños pequeños. El VRSH comprende subtipos antigénicos y la evidencia preliminar sugiere la existencia de subtipos antigénicos de VRSB. El VRSB está distribuido por todo el mundo y es autóctono de la población de ganado bovino. Las infecciones por VRSB relacionadas con enfermedades respiratorias ocurren predominantemente en ganado bovino joven para producción de carne y leche. Rotavirus bovino-Virión esférico de ARNdc de 60-80 nm de diámetro que carece de envoltura. Es la causa viral más común de diarrea en terneros y corderos.
USP 39
Información General/ (1025) Pancreatina 857
Virus de la diarrea viral bovina (VDVB)-Virus de ARN clasificado como Pestivirus de la familia Flaviviridae. El BDVB puede atravesar la placenta y parece ser es capaz de inducir la inmunosupresión, lo que permite el desarrollo de neumonía bacteriana secundaria. Se ha informado que el VDVB es el virus asociado con mayor frecuencia con múltiples infecciones virales del tracto respiratorio en terneros. Fiebre aftosa (FA)-Enfermedad viral altamente infecciosa del ganado bovino, cerdos, ovejas, cabras, búfalos y especies de artiodáctilos silvestres. En una población susceptible, la morbilidad se acerca al 100%. La enfermedad sólo es fatal en raras ocasiones, excepto en animales jóvenes. La FA es ocasionada por un Aftovirus de la familia Picornaviridae. Se conocen siete serotipos inmunológicamente distintos y dentro de cada serotipo existe un gran número de cepas que presentan un espectro de características antigénicas. Virus de la parainfluenza tipo 3 (Pl-3)-Virus de ARN clasificado en la familia Paramixovirus. Aunque el Pl-3 es capaz de ocasionar enfermedad, el virus por lo general se asocia con infecciones moderadas a subclínicas. El papel más importante del Pl-3 es actuar como un iniciador que puede llevar al desarrollo de neumonía bacteriana secundaria. Las infecciones ocasionadas por Pl-3 son comunes en el ganado bovino. Parvovirus-Virus de ADN de cadena simple relativamente estable al calor de aproximadamente 20 nm de diámetro que se ha aislado del ganado bovino pero que en condiciones naturales se desconoce si ocasiona enfermedades. Rabia-Encefalomielitis viral aguda que afecta principalmente a carnívoros y murciélagos, aunque puede afectar a cualquier mamífero. La rabia es ocasionada por Lisavirus de la familia Rabdovirus. Aunque generalmente están confinados a una especie principal de reserva en un área geográfica, es común la extensión a otras especies. Peste bovina-Morbillivirus estrechamente relacionado con los virus que ocasionan moquillo canino y sarampión. Las cepas pueden variar en gran medida en cuanto a la gama de huéspedes y virulencia. El suero de ganado recuperado o vacunado provoca una reacción cruzada con todas las cepas en las pruebas de neutralización, aunque se han demostrado diferencias antigénicas menores. El virus es frágil y se inactiva rápidamente con calor y luz, pero permanece viable durante largos periodos en tejidos enfriados o congelados. La peste bovina es endémica en muchos países de Asia y África. Históricamente, el virus se ha distribuido en gran medida en Europa y África, pero a la fecha no se ha establecido por sí mismo en Norteamérica, Centroamérica, las Islas del Caribe, Sudamérica, Australia ni Nueva Zelanda. La peste bovina se incluye en la lista de enfermedades transmisibles de la Organización Mundial de Sanidad Animal (Oficina Internacional de Epizootias) de la OMS que tienen un potencial de propagación muy rápida y seria, sin distinción de fronteras nacionales, que representan serias consecuencias socioeconómicas o de salud pública, y que son de alta importancia en el mercado internacional de ganado y productos ganaderos.
(1025) PANCREATINA ÍNDICE 1 . Introducción 2. Recolección de Páncreas y Producción de Pancreatina 3. Control de Calidad 4. Etiquetado 5. Certificación y Documentación 6. Análisis y Control de Agentes Infecciosos Adventicios 6.1 Información General 6.2 Estrategias de Evaluación de Riesgos 6.3 Pruebas de Identificación para Panel de Virus Relevantes 6.4 Depuración Viral por Etapas del Proceso de Fabricación 6.5 Análisis Viral 7. Caracterización de la Pancreatina 7.1 Descripción de las Propiedades Físico-Químicas 7.2 Contenido Proteico y Enzimático 7.2.1 Proteasas Pancreáticas 7.2.2 Lipasa y Colipasa Pancreática 7.2.3 Fosfolipasa Pancreática A2 7.2.4 Amilasa Pancreática 8. Mediciones de la Actividad Enzimática 8.1 Actividad de Lipasa 8.2 Actividad de Proteasa 8.3 Actividad de Amilasa 9. Apéndice 1: Bibliografía Reglamentaria 1 O. Apéndice 2: Bibliografía de Referencia
USP 39
858 (1 025) Pancreatina / Información General
1. INTRODUCCIÓN La pancreatina es una preparación de enzimas pancreáticas que contiene amilasa, proteasa y lipasa aislada de la glándula pancreática del cerdo Sus scrofa L. var. domesticus Gray (Fam. Suidae). El páncreas es un órgano secretor que desempeña un papel crucial en el proceso digestivo mediante la producción de bicarbonato para neutralizar el ambiente ácido en el duodeno, hormonas que regulan diversas funciones catabólicas, y una variedad de enzimas digestivas para degradar los alimentos en el intestino delgado. La pancreatina y los productos medicinales que contienen pancreatina se usan para facilitar la digestión y absorción de alimentos (carbohidratos, grasa y proteínas) en pacientes con insuficiencia pancreática exocrina ocasionada por fibrosis cística, pancreatitis crónica y otras condiciones que pueden causar una deficiencia en la secreción de enzimas pancreáticas. Los productos de enzimas pancreáticas de origen porcino se han comercializado en los Estados Unidos para el tratamiento de la insuficiencia pancreática exocrina desde antes de la promulgación de la Ley Federal de Alimentos, Medicamentos y Cosméticos (Federal Food, Drug, and Cosmetic Act) de 1938. Las enzimas pancreáticas suplementarias están disponibles en medicamentos de venta con receta y de venta libre. Desde el 2004, la Administración de Alimentos y Medicamentos de los EE.UU. (FDA, por sus siglas en inglés) ha ordenado que todos los medicamentos de enzimas pancreáticas comercializados en los EE.UU. obtengan la aprobación de dicha agencia mediante una Solicitud para Nuevo Medicamento (NDA, por sus siglas en inglés). Aunque los medicamentos de enzimas pancreáticas de venta libre están disponibles sin receta médica, estos se clasifican como suplementos dietéticos en lugar de medicamentos. La pancreatina y la pancreolipasa tienen funciones e indicaciones similares; sin embargo, la pancreolipasa, que está disponible sólo como medicamento de venta con receta médica, contiene más enzima lipasa activa y extracto pancreático purificado que la pancreatina. Este capítulo describe las mejores prácticas relacionadas con la obtención y fabricación de materias primas de pancreatina que se usan en los medicamentos de pancreatina y pancreolipasa; estas mejores prácticas ayudan a asegurar la seguridad y la eficacia de los medicamentos preparados a partir de este ingrediente farmacéutico activo. El Apéndice 7: Bibliografía Reglamentaria provee una lista de documentos guía reglamentarios aplicables.
2. RECOLECCIÓN DE PÁNCREAS V PRODUCCIÓN DE PANCREATINA La materia prima de origen animal (páncreas) destinada para procesamiento farmacéutico es un subproducto de la producción de carne y se recolecta en mataderos aprobados por la autoridad nacional competente e inspeccionados por la autoridad veterinaria pertinente. Los animales a partir de los que se deriva la pancreatina deben cumplir con los requisitos de salud animal adecuados para consumo humano. Un ejemplo de un proceso de fabricación típico se resume en la descripción y en el diagrama de flujo (Figura 7) a continuación. Las glándulas pancreáticas deben mantenerse congeladas para prevenir una pérdida de actividad enzimática durante su conservación y transporte. Después de que el fabricante acepta los materiales congelados, la pancreatina se extrae y se purifica en condiciones que reducen la carga microbiológica y otras impurezas potenciales. Para lograr lo anterior, las glándulas pancreáticas se maceran hasta obtener una suspensión espesa fina, la cual se trata con activadores para convertir los precursores de enzimas pancreáticas inactivas (zimógenos) en enzimas activas. La activación se lleva a cabo en condiciones controladas; los factores tales como tiempo, temperatura, fuerza iónica o concentración se controlan según lo definido en el proceso de cada fabricante. Una vez que se ha completado la activación, esta etapa se detiene agregando acetona, alcohol isopropílico u otros disolventes compatibles con enzimas. Después de separar la materia insoluble (cuando corresponda), la mezcla se combina con disolvente para precipitar la pancreatina. El sobrenadante se separa y el residuo sólido se lava con disolvente. Finalmente, la pancreatina se seca a la temperatura y vacío adecuados. La actividad biológica puede ajustarse y/o estabilizarse agregando aditivos adecuados, tales como lactosa; sacarosa que contenga no más de 3,25% de almidón; pancreatina con bajo poder digestivo; celulosa microcristalina; maltodextrina; o cloruro de sodio.
Información General/ (1025) Pancreatina 859
USP 39
Glándulas pancreáticas de origen porcino
_ _ Residuo insoluble (desechado)
Pancreatina Seca (ingrediente farmacéutico activo) Figura 1. Diagrama de flujo que presenta las etapas del proceso de fabricación de pancreatina.
3. CONTROL DE CALIDAD Cada lote de pancreatina se somete a un análisis de control de calidad apropiado. El análisis de control de calidad debe considerar los requisitos de la monografía correspondiente, así como otros parámetros de calidad identificados. Dichas pruebas deben incluir apariencia, identificación, pureza y actividad de la pancreatina. Se deben tener en cuenta las impurezas relacionadas con el proceso y con el producto tales como los disolventes residuales de la extracción y precipitación, y la grasa. El agua es crítica para la actividad y la estabilidad enzimática, por ende, se debe especificar y monitorear el contenido de agua usando métodos analíticos apropiados como pérdida por secado (ver el capítulo (731) Pérdida por Secado). Las valoraciones que determinan la actividad enzimática se aplican para confirmar que la pancreatina cumple con los límites predefinidos para los niveles de actividad de lipasa, amilasa y proteasas, que se consideran atributos críticos de calidad. Debido al origen biológico de la pancreatina, el control de calidad incluye análisis microbiano así como pruebas para determinar la ausencia de algunos agentes adventicios patógenos para humanos.
USP 39
860 (1 025) Pancreatina / Información General
4. ETIQUETADO El producto debe etiquetarse de conformidad con los requisitos de la monografía y reglamentarios pero también de acuerdo con los requisitos de los clientes cuando corresponda. La etiqueta contiene información tal como el nombre y la dirección del fabricante, la fecha de fabricación, la fecha de reanálisis, la fecha de caducidad, el número de lote, las condiciones de almacenamiento y las precauciones específicas (p.ej., "proteger de la humedad"), y una declaración que indique el uso previsto.
5. CERTIFICACIÓN Y DOCUMENTACIÓN El producto debe estar acompañado por los certificados y la documentación necesarios, cuando corresponda. La documentación debe incluir un certificado de análisis u otro certificado que documente el cumplimiento con los requisitos de la monografía y los resultados de las pruebas de control de calidad; un certificado de origen indicando la especie animal; y certificaciones con respecto a agentes adventicios, incluyendo, cuando corresponda, declaraciones sobre Encefalopatía Espongiforme Transmisible/Encefalopatía Espongiforme Bovina. Asimismo, se debe incluir, cuando corresponda, otra información pertinente y requerida, tal como la fecha de reanálisis o caducidad, almacenamiento y recomendaciones de envasado. El fabricante/proveedor debe ser capaz de proveer documentación para propósitos reglamentarios que contengan la siguiente información: • Información sobre el número de aprobación/autorización de la agencia reglamentaria y la dirección completa del sitio de fabricación de la pancreatina. • Una declaración que indique que las materias primas de origen animal destinadas para procesamiento farmacéutico fueron recolectadas y entregadas bajo la supervisión de las autoridades responsables/competentes. • Una lista de los países de origen de las materias primas recolectadas. • Una declaración que indique que, durante el transporte, las glándulas pancreáticas pueden ser identificadas como subproductos animales para propósitos farmacéuticos mediante documentación apropiada de acuerdo con los reglamentos legales correspondientes (tales como certificados de salud animal expedidos por veterinarios oficiales o documentación técnica de comercio). • Una declaración que indique que las glándulas pancreáticas se recolectan en mataderos aprobados y que los animales de los que se recolectaron las glándulas pancreáticas fueron sometidos a una inspección en conformidad con la legislación vigente correspondiente y que se les declaró adecuados para consumo humano, o que no se detectaron señales visibles de enfermedades transmisibles a humanos o animales al momento de la matanza .
6. ANÁLISIS Y CONTROL DE AGENTES INFECCIOSOS ADVENTICIOS 6.1 Información General Aunque no se han presentado informes que documenten enfermedades infecciosas después del uso de productos medicinales derivados de pancreatina, existe un riesgo teórico de transmisión de patógenos porcinos a partir de la pancreatina. La seguridad de los productos de enzimas pancreáticas de origen porcino debe mejorarse mediante la implementación de múltiples estrategias complementarias y/o superpuestas para el control, depuración y contención de agentes adventicios. Los fabricantes deben emplear continuamente un método basado en posibles riesgos para mejorar la seguridad de estos productos con respecto a los agentes adventicios, el cual incluya incorporar evaluaciones de riesgos, mitigación de riesgos y estrategias de manejo de los materiales del proceso. Cuando resulte apropiado, se debe incluir un análisis que garantice que los beneficios terapéuticos del producto son considerablemente mayores que los riesgos generados por su consumo, y simultáneamente se garantice la disponibilidad del medicamento para los pacientes.
6.2 Estrategias de Evaluación de Riesgos La Guía para la Industria: "Medicamentos para Insuficiencia Pancreática Exócrina" (Guidance for lndustry: Exocrine Pancreatic lnsufficiency Drug Products) de la FDA promueve un método basado en riesgos para tratar el potencial de contaminación viral de los productos de enzimas pancreáticas, de acuerdo con la ICH Q5A(Rl) y el capítulo (1050) Evaluación de la Seguridad Viral de Productos Biotecnológicos Obtenidos de Líneas Celulares de Origen Humano o Animal. En general, el perfil de riesgos de agentes adventicios de productos biológicos está supeditado a una variedad de factores, entre los que se incluye el origen del producto biológico, el tipo de las materias primas usadas, los procesos de fabricación y la vía de administración. Debido a que los procesos de obtención y de fabricación pueden variar entre fabricantes, cada fabricante debe establecer e implementar una evaluación individual de riesgos completa para agentes adventicios. Aunque el alcance de la ICH Q5A(Rl) abarca la evaluación de la seguridad viral de productos biotecnológicos derivados de líneas celulares de origen humano y animal, los principios y los métodos de evaluación de riesgos pueden proveer los fundamentos para una estrategia de evaluación de riesgos en los productos de pancreatina. A través de la aplicación de los principios de la ICH Q5A(Rl ), la estrategia de minimización de riesgos para proteger a los pacientes de la exposición inadvertida a agentes adventicios debe reflejar una combinación de tres componentes:
Información General/ (1025) Pancreatina 861
USP 39
1. Obtención: Uso de procedimientos de obtención cuidadosos para limitar el acceso de agentes adventicios al proceso de
fabricación. Debido a que el material de la pancreatina es un subproducto de la industria de la carne, es importante asegurar que el ingrediente farmacéutico activo de pancreatina se produce únicamente a partir de animales adecuados para consumo humano. 2. Depuración: Incorporación de etapas robustas de depuración en el proceso de fabricación. La eficacia de estas estrategias depende de la resistencia de los agentes adventicios al tipo de inactivación física y química usado. 3. Análisis: El control y análisis de agentes adventicios en etapas adecuadas del proceso de fabricación para dar garantía de que cualquier carga remanente de un agente adventicio potencialmente nocivo se encuentra en niveles suficientemente bajos. Esto se logra usando ensayos de detección adecuados contra un panel de virus relevantes. En esta parte de la evaluación de riesgos, se debe tener en cuenta el riesgo potencial para la salud humana que presentan los virus de origen porcino. Para identificar agentes adventicios potenciales que pudieran estar presentes en una preparación de pancreatina, los fabricantes deben identificar los agentes adventicios que están presentes en el cerdo y evaluar la probabilidad de su presencia en los materiales de partida y en el ingrediente farmacéutico activo. Los capítulos (61) Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano y (62) Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Microorganismos Específicos tratan el análisis de contaminación específica microbiana, según se define en las monografías pertinentes de productos relacionados con pancreatina. Asimismo, los fabricantes deben evaluar específicamente la presencia potencial de virus porcinos. En esta evaluación se deben identificar las etapas de fabricación que son capaces de eliminar o inactivar virus, y se debe demostrar la eficiencia del proceso para eliminar y/o inactivar virus mediante estudios de validación viral que sigan las guías correspondientes. Una vez que se ha establecido la lista de virus críticos potencialmente presentes en el material de partida y/o en el ingrediente farmacéutico activo, los fabricantes deberán decidir cuáles serán las etapas apropiadas del proceso para realizar el análisis viral y establecer el nivel de análisis viral que se va a realizar para cada lote. Se deben desarrollar y validar pruebas para virus específicos, y se deben establecer y usar criterios de aceptación para tomar decisiones de aceptación/rechazo de partidas del ingrediente farmacéutico activo de pancreatina. El potencial carácter zoonótico o no zoonótico del virus debe tenerse en cuenta al establecer criterios de aceptación.
6.3 Pruebas de Identificación para Panel de Virus Relevantes La estrategia de evaluación de riesgos descrita anteriormente requiere la identificación de contaminantes virales potenciales de los materiales de partida de origen porcino. La Tabla 1 provee una descripción general de los virus envueltos y sin envoltura que se conoce están presentes en cerdos y que pueden presentar un riesgo de contaminación al usar cerdos que se consideran adecuados para consumo humano como fuente de materia prima. La evaluación de riesgos debe tratar al menos los virus listados; sin embargo, dependiendo del origen de los animales y de la capacidad del proceso de fabricación, la lista puede adaptarse y se pueden considerar virus adicionales (ver el ejemplo en la Figura 2). Los fabricantes deben implementar sistemas para identificar la emergencia de nuevos virus potencialmente relevantes. Tabla 1. Identificación de Peligros: Virus Presentes en Cerdos Virus con Envoltura Virus de la fiebre porcina clásica
Virus sin Envoltura Virus de la encefalomiocarditis (EMCV, por sus siglas en inglés)
Virus de la fiebre porcina africana (ASFV, por sus siglas en inglés)
Virus de la enfermedad vesicular porcina (SVDV, por sus siglas en inglés)
Virus de la influenza
Virus de la enfermedad de pies
Virus del Nilo Occidental (WNV, por sus siglas en inglés)
Reovirus (REO, por sus siglas en inglés)
Virus de estomatitis vesicular (VSV, por sus siglas en inglés)
Virus de la hepatitis E porcina (swHEV, por sus siglas en inglés)
Virus de la encefalitis equina del este (EEEV, por sus siglas en inglés)
Rotavirus porcinos (pRotaV, por sus siglas en inglés)
Virus de la rabia (RABV, por sus siglas en inglés)
Enterovirus porcino (PEVs, por sus siglas en inglés)
Virus del síndrome respiratorio siglas en inglés)
y boca (FMDV, por sus siglas en inglés)
y reproductivo porcino (PRRSV, por sus
Virus de la gastroenteritis transmisible (TGEV, por sus siglas en inglés)
Parvovirus porcino (PPV, por sus siglas en inglés) Circovirus porcino tipos 1
y 2 (PCV1 /2, por sus siglas en inglés)
Virus de la pseudo rabia (SuHV-1, por sus siglas en inglés) Virus Nipah Retrovirus endógeno porcino (PERV, por sus siglas en inglés)
6.4 Depuración Viral por Etapas del Proceso de Fabricación Demostrar la depuración viral es un componente crítico para asegurar la seguridad general de los productos derivados de pancreatina. El objetivo de los estudios de evaluación de depuración viral no es únicamente evaluar la capacidad del proceso de fabricación para depurar contaminantes virales conocidos y estimar cuantitativamente el nivel general de reducción de virus por parte del proceso de fabricación, sino también estimar la capacidad de las etapas del proceso de fabricación para depurar virus en general. Los estudios de depuración viral para el proceso de fabricación de pancreatina deben llevarse a cabo de acuerdo con la guía correspondiente vigente, ICH QSA(Rl ).
USP 39
862 (1 025) Pancreatina / Información General
Los procesos actuales de producción de pancreatina se consideran efectivos para inactivar virus con envoltura, de acuerdo a los resultados de los estudios de depuración viral. Sin embargo, los virus sin envoltura son más resistentes a la inactivación físico-química, lo que genera una mayor variabilidad en su inactivación. Los ejemplos de virus que se encuentran en la clasificación de alta resistencia viral al tratamiento y que presentan inactivación moderada a limitada, incluyen el parvovirus porcino y el circovirus porcino 1/2 (ver la Figura 2).
Virus presentes) ..
en
•
teJ•dos porcino
Evaluación de riesgos: Probabilidad de ocurrencia debida al
~
origen geográfico,
materiales de obtención, etc.
REO, Virus con envoltura
EMCV, SVDV, PEVs,
PPV, PCV112
pRotaV, swHEV
Evaluación de riesgos: Resistencia viral a la inactivadón fisicoquímica
Capacidad de inactivación del proceso de fabricación individual
EMCV, Virus con envoltura
SVDV, PEVs,
PPV, PCV112
pRotaV, swHEV Ver ICHQ5A(R1 l para la descripción de los niveles de resistencia.
Figura 2. Ejemplo de un método de evaluación de riesgos para la identificación de virus para el panel de prueba.
6.5 Análisis Viral Se requiere una estrategia de análisis cuando no ha sido demostrada la capacidad del proceso para eliminar o inactivar un virus específico a niveles apropiados. El potencial carácter zoonótico o no zoonótico del virus debe tenerse en cuenta al establecer criterios de aceptación, en términos de la sensibilidad del ensayo y del establecimiento de límites de especificación. Se deberán rechazar las partidas de ingrediente farmacéutico activo que den positivo en las pruebas de virus zoonóticos. Como parte del control de calidad, el análisis viral debe realizarse en cada lote de ingrediente farmacéutico activo. Las pruebas usadas deben permitir la exclusión de cualquier carga de niveles potencialmente nocivos de agentes adventicios. El Título 9 del Código de Reglamentos Federales describe los requisitos que se deben cumplir en la valoración de productos biológicos porcinos incluyendo vacunas de virus vivos y productos de anticuerpos, aunque no trata específicamente la pancreatina. La aplicación de los principios del Título 9 del Código de Reglamentos Federales, ensayos para detectar virus porcinos, pueden, por ejemplo, basarse en el monitoreo de cultivo celular con respecto a efectos citopatógenos durante un tiempo de incubación apropiado, análisis de hemoadsorción, técnicas de tinción para virus específicos u otras combinaciones de los mismos (ver también el capítulo (1237) Métodos de Pruebas Virológicas). Además de las tecnologías y virus tratados en el Título 9 del Código de Reglamentos Federales, se pueden usar nuevas tecnologías basadas en biología molecular, y además otros virus con potencial zoonótico que sean identificados pueden requerir de análisis. Los ejemplos de virus específicos no tratados por la guía vigente para el análisis de virus puede incluir el virus de la hepatitis E porcina. El fabricante debe justificar la elección del panel de virus relevantes, la selección de la etapa del proceso apropiada, la aptitud del método de prueba y la sensibilidad del método de prueba. Todas las pruebas para virus específicos deben desarrollarse y validarse de acuerdo con las guías vigentes, por ejemplo, los capítulos (1225) Validación de Procedimientos Farmacopeicos y (1033) Validación de Valoraciones Biológicas, según corresponda, y se deben establecer y usar criterios de aceptación para tomar decisiones de aceptación o rechazo de partidas del ingrediente farmacéutico activo de pancreatina.
7. CARACTERIZACIÓN DE LA PANCREATINA
7.1 Descripción de las Propiedades Físico-Químicas La pancreatina es un polvo amorfo de color ligeramente marrón a bronceado con un olor y sabor a carne cruda. La pancreatina es parcialmente soluble en agua, forma una solución ligeramente turbia y es insoluble en alcohol y éter. Los siguientes compuestos pueden degradar la pancreatina: ácidos minerales, hidróxidos álcali, agentes de oxidación y muchas sales metálicas; adicionalmente la degradación de la pancreatina es favorecida por temperatura y humedad elevadas. Las soluciones que contienen pancreatina deben ser filtradas con precaución, debido a la potencial retención de la lipasa y las proteasas en el filtro. La actividad enzimática alcanza un máximo en soluciones neutras a débilmente alcalinas. La actividad disminuye rápidamente en soluciones ácidas o alcalinas fuertes. Lo mismo se aplica al calentamiento a ebullición de las soluciones acuosas que
Información General/ (1 025) Pancreatina 863
USP 39
contienen pancreatina. En formulaciones sin recubrimiento entérico, no se recomienda exponer el producto a un pH de 4,5 o menos, debido a que se ha observado la pérdida casi total de actividad lipolítica. Debido a que la pancreatina es de origen biológico, se encuentran presentes otros componentes además de las proteínas enzimáticamente activas. Estos otros componentes incluyen proteínas, aminoácidos, péptidos, ácidos nucleicos y fragmentos de los mismos, componentes de tejidos, grasa y sustancias inorgánicas. Estos componentes pueden tener un impacto sobre la calidad del material final.
7.2 Contenido Proteico y Enzimático La pancreatina contiene diferentes enzimas digestivas que en su mayoría son producidas y almacenadas como zimógenos (precursores inactivos) en las células pancreáticas acinares. En condiciones fisiológicas, los zimógenos pancreáticos se transforman en enzimas activas una vez que la secreción pancreática alcanza el intestino delgado superior. Una proteasa intestinal, la enteroquinasa, desencadena el proceso de activación mediante la escisión del zimógeno de tripsina, el cual seguidamente activa a las otras proteasas. Durante el proceso de producción, las enzimas presentes en la pancreatina son activadas por la tripsina (ver la Figura 1). La Tabla 2 resume algunas de las características importantes de las enzimas pancreáticas principales encontradas en la pancreatina. Tabla 2. Características de las Enzimas Conocidas Presentes en la Pancreatina Porcina
Nombre
Tripsina
Quimotripsina
Número E.C.
3.4.21.4
3.4.21.1
UniProtKB/ Swlss-Prot Aumento de Número
P00761.l
GlARD6_plG
Sustratos
Proteínas
Proteínas
Producidos como un Precursor
Peso Molecular (kDa)
Longitud de la Secuencia
Punto lsoeléctrlco
Sí
23,8 (zimógeno), 23,5 (activado)
231 a.a. (zimógeno), 223 a.a. (activado)
9,3 (zimógeno), 10,5 (activado)
Sí
29, 1 (zimógeno), 25,6 (activado)
268 a.a. (zimógeno), 221 a.a. (activado)
8,7
8,5
Elastasa
3.4.21.36
P00772.1
Proteínas
Sí
25,9 (activado)
250 a.a. (zimógeno), 240 a.a. (activado)
Carboxipeptidasa Al
3.4.17.1
P09954
Proteínas
Sí
34,7 (activado)
308 a.a. (activado)
Desconocido
34,7 (activado)
305 a.a. (activado)
6,0
Sí
25-28 kDa
246 a.a. (zimógeno), 239 a.a. (activado)
4,2-4,3
No
50, 1 (dos isoformas de glicosiladón, lipasas A y B)
450 a.a. (madura)
4,9 (lipasa A), 5,0 (lipasa B)
Sí
10,3 (procolipasa A porcina), 1O,1 (procolipasa B porcina)
93 a.a. (procolipasa A), 95 a.a. (procolipasa B)
Desconocido
Sí
14,7 (zimógeno), 14 (activado)
146 a.a. (zimógeno), 123 a.a. (activado)
4,4-4,5
No
Valores carentes de uniformidad en la literatura que van de 65 a 98 kDa. Aunque se han identificado formas proteolíticas, aún se desconoce el peso exacto.
Composición completa de aminoácido aún desconocida en cerdos
Carboxipeptidasa B Calicreína, glandular
Triacilglicerol lipasa
3.4.17.2
3.4.21.35
3.1.1.3
Colipasa
Fosfolipasa A2 Colesterol este rasa, también denominada éster carboxílico lipasa (ECL), éster carboxílico hidrolasa (ECH) o lipasa estimulada por sales biliares (LESB)
a-Amilasa
3.1.1.4
3.1.1.13, 3.1.1 .1
3.2.1.1
P09955.5
P00752.4
Proteínas
Proteínas
P00591.2
Triglicéridos, dic¡licéridos
P02703.3
Sin actividad enzimática, cofactor de lipasa pancreática
P00592
Secuencia completa de aminoácido aún desconocida en cerdos
P00690.3
Fosfolípidos
Ésteres de colesterol, ésteres de vitamina, monoglicéridos, fosfolípidos, galactolípidos, algo de actividad en triglicéricios
Polisacáridos
Sí
No
55,3
496 a.a. (maduro)
4,2-4,8
5,95 (amilasa 1), 5,45 (amilasa 11)
864 (1025) Pancreatina / Información General
USP 39
7.2.1 PROTEASAS PANCREÁTICAS Las proteasas son enzimas que digieren proteínas en fragmentos de péptidos más pequeños y aminoácidos mediante la hidrólisis de los enlaces peptídicos. La pancreatina contiene cinco proteasas principales: tripsina, elastasa, quimotripsina, carboxipeptidasa A 1 y carboxipeptidasa B. La tripsina, la quimotripsina y la elastasa se clasifican como endopeptidasas y serina proteasas debido a que escinden los enlaces peptídicos en el lado e-terminal de un amino ácido y tienen en sus sitios activos un residuo de serina catalíticamente importante. Las carboxipeptidasas catalizan la hidrólisis de los aminoácidos de la posición del extremo e-terminal en polipéptidos y, por lo tanto, se clasifican como exopeptidasas. Las carboxipeptidasas liberan secuencialmente residuos del e-terminal de proteínas y péptidos con una especificidad bien definida. La tripsina actúa específicamente en el lado e-terminal de los residuos de aminoácidos con carga positiva, específicamente lisina y arginina. El tripsinógeno es secretado por el páncreas como un precursor inactivo y se descarga dentro del duodeno donde la enteroquinasa convierte el tripsinógeno en tripsina activa. La enteroquinasa es secretada en el duodeno por células de la mucosa duodenal. La enteroquinasa elimina un octapéptido terminal del tripsinógeno y genera una cadena de polipéptido de tripsina activa entrecruzada por seis puentes disulfuro. La tripsina contiene un sitio de unión de calcio de alta afinidad requerido para la estabilidad de la enzima. La quimotripsina actúa preferentemente en el lado e-terminal de los residuos de tirosina, fenilalanina y triptófano. Se secreta como un zimógeno inactivo, quimotripsinógeno, que es sometido a procesamiento proteólico por la tripsina para formar la enzima activa. La quimotripsina une un ión de calcio por molécula. La elastasa actúa sobre residuos pequeños de aminoácidos neutros tales como glicina y alanina, aunque también hidroliza amidas y ésteres y se distingue porque actúa sobre la elastina. La elastasa es producida como un zimógeno y la forma activada contiene cuatro puentes disulfuro. La elastasa une un ión de calcio por molécula. La carboxipeptidasa A 1 es una exopeptidasa que hidroliza el enlace peptídico adyacente al extremo e-terminal de una cadena de polipéptido, liberando así el aminoácido e-terminal. Escinde residuos aromáticos y voluminosos de aminoácido alifático y presenta una actividad baja o nula con residuos de aminoácido de ácido aspártico, ácido glutámico, arginina, lisina y prolina. Contiene un ión de cinc por molécula. El ión de cinc es esencial para la actividad; si se elimina durante la diálisis, debe ser reemplazado. Por lo tanto, la carboxipeptidasa A 1 también se clasifica como una metaloproteasa. La carboxipeptidasa B cataliza la hidrólisis de los aminoácidos básicos lisina, arginina y ornitina del extremo e-terminal de una cadena polipeptídica. También puede tener una función en la degradación adicional de productos de digestión tríptica. La enzima une un ión de cinc por molécula, que es una parte funcional necesaria para la actividad de la enzima, y, por lo tanto, la carboxipeptidasa B también se clasifica como una metaloproteasa. 7.2.2 LIPASA Y COLIPASA PANCREÁTICA La lipasa pancreática (LP, también conocida como triacilglicerol acil hidrolasa) es una glicoproteína y es producida directamente como una enzima activa por el páncreas. Dos isoformas de glicosilación de la LP, la lipasa A y la lipasa B, están presentes en la pancreatina. Estas dos isoformas tienen composiciones idénticas de aminoácidos pero difieren ligeramente en sus patrones de glicosilación, con lipasa A siendo más ácida que la lipasa B. La LP es una enzima soluble en agua que actúa sobre los sustratos lípidos insolubles, triglicéridos, en la interfase de lípido-agua. Su actividad depende de la superficie específica del sustrato accesible a la enzima, y se incrementa con el estado de emulsificación de los lípidos. La LP hidroliza preferencialmente enlaces éster en las posiciones C-1 y C-3 de triglicéridos y presenta un espectro amplio de especificidad de longitud de cadena de ácido graso. Por lo tanto, la LP se muestra activa contra una amplia variedad de los triglicéridos que por lo general están presentes en la dieta. Asimismo, actúa sobre los diglicéridos, pero su actividad sobre los monoglicéridos es muy baja. Principalmente convierte los triglicéridos en monoglicéridos y ácidos grasos libres; los productos de lipólisis de mayor polaridad se absorben en el intestino delgado. En presencia de diversos amfífilos tales como sales biliares a concentraciones micelares, la absorción de la LP en la interfase de lípido-agua puede verse obstruida, lo que reduce la actividad lipolítica. Un pequeño cofactor proteico también producido por el páncreas, la colipasa, ayuda a la LP a anclarse a interfases ante la presencia de amfífilos competitivos, restaurando así la actividad de la LP. La colipasa también es producida por el páncreas como un precursor, la procolipasa. La procolipasa es activada por la tripsina. 7.2.3 FOSFOLIPASA PANCREÁTICA A2 La fosfolipasa A2 (también conocida como PLA2 secretora tipo IB) es una enzima termoestable soluble en agua que cataliza la hidrólisis dependiente de calcio de los grupos 2-acilo en 3-sn-fosfoglicéridos. Se produce como un precursor, que es activado por la tripsina. 7.2.4 AMILASA PANCREÁTICA La a-amilasa pancreática porcina (glucanohidrolasa 1,4-a-o-glucano) cataliza la hidrólisis de los enlaces glucosídicos 1,4-a-D internos en polisacáridos que contienen tres o más unidades de o-glucosa con enlace a-1,4 para generar una mezcla de dextrinas, maltosa y glucosa. La amilasa existe en dos formas (1 y 11) que tienen propiedades enzimáticas similares pero que difieren
USP 39
Información General/ (1025) Pancreatina 865
en sus puntos isoeléctricos. Ambas formas moleculares de amilasa son glicoproteínas que contienen fucosa, galactosa, manosa y diversos contenidos de glucosamina. Ambas amilasas constan de una sola cadena polipeptídica con cuatro puentes disulfuro y contienen un ión de calcio fuertemente enlazado.
8. MEDICIONES DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Aunque la pancreatina contiene una variedad de enzimas, por lo regular se caracteriza midiendo las actividades de las tres clases de enzimas principales, lipasa, proteasa y amilasa.
8.1 Actividad de Lipasa La actividad de lipasa de la pancreatina sobre los triglicéridos con ácidos grasos de cadena larga se debe principalmente a Ja LP, lo que requiere Ja presencia de su cofactor específico, Ja colipasa, para actuar sobre emulsiones de triglicéridos en presencia de sales biliares que son competidoras para la adsorción de lipasa en la superficie de las gotitas de lípidos. La colipasa y la lipasa forman un complejo activo con una estequiometría 1 a 1 . Las preparaciones comerciales de pancreatina por lo regular contienen colipasa; sin embargo, se recomienda verificar que el proceso de fabricación del ingrediente farmacéutico activo provee suficiente colipasa para la actividad de lipasa. Este control debe ser parte de una caracterización apropiada que se debe realizar durante Ja validación del proceso del ingrediente farmacéutico activo. Además de la LP, la pancreatina también contiene carboxil éster lipasa (CEL) pancreática, que hidroliza diversos sustratos lipidicos. La actividad de la CEL sobre los triglicéridos se considera generalmente muy baja, en comparación con la de la LP, y su contribución con Ja actividad de la lipasa de la pancreatina es inapreciable, según se mide usando la valoración de actividad de lipasa USP. La valoración de actividad de lipasa descrita en la monografía USP de Pancreatina se basa en la determinación de la velocidad con que Ja enzima digiere al aceite de oliva emulsificado con acacia (también conocida como goma arábiga)'. La actividad de la muestra de prueba se calcula comparándola con una preparación estándar de la enzima con actividad conocida. El aceite de oliva contiene triglicéridos con ácidos grasos de cadena larga que son representativos de los triglicéridos dietéticos. La actividad de lipasa se mide basándose en Ja valoración volumétrica de Jos ácidos grasos libres liberados del aceite de oliva por Ja lipólisis producida por la lipasa presente en Ja pancreatina. Esta valoración volumétrica usando hidróxido de sodio se realiza a un pH constante de 9,0 mediante valoración volumétrica de pH o potencioestática, en la que Jos ácidos grasos de cadena larga se ionizan completamente. Vale Ja pena notar que este valor de pH no corresponde a las condiciones fisiológicas (el pH medio del contenido del intestino delgado es cercano a 6,0 durante una comida), pero permite medir la actividad óptima de lipasa in vitro. Debido a que la solución de la valoración de lipasa USP contiene ER Sales Biliares USP, la detección de Ja actividad enzimática requiere que tanto Ja Jipasa como la colipasa estén presentes en la pancreatina. Una Unidad USP de Ji pasa se define como la cantidad de enzima que, en las condiciones definidas con el sustrato definido, libera 1 µmol de ácido graso por minuto. Se encuentran disponibles otras valoraciones de lipasa para monitorear la actividad de lipasa en la pancreatina. Al usar valoraciones de lipasa con sustratos no naturales, tales como tributirina, se recomienda confirmar que la muestra de pancreatina analizada también sea activa sobre los triglicéridos de cadena larga, en particular usando la valoración de actividad de Ji pasa USP con emulsión de aceite de oliva-acacia.
8.2 Actividad de Proteasa La actividad proteolítica de la pancreatina sobre Jos polipéptidos y las proteínas es inherente a las enzimas tripsina, quimotripsina, elastasa, carboxipeptidasa A1 y carboxipeptidasa B. Las dos proteasas pancreáticas principales son la tri psi na y la quimotripsina, y junto con Ja elastasa, estas endopeptidasas generan pequeños polipéptidos a partir de proteínas más grandes. La acción adicional de las exopeptidasas carboxipeptidasa A1 y B genera aminoácidos individuales durante Ja digestión. La valoración espectrofotométrica USP para la actividad de proteasa a partir de pancreatina se basa en la velocidad de digestión de caseína en las condiciones de Ja prueba. La actividad de la muestra de prueba se calcula comparándola con una preparación estándar de la enzima con actividad conocida. La caseína está compuesta por a (sl) y a (s2)-caseínas, j3 -caseína y Kcaseína, las cuales se fosforilan en los residuos de serina y carecen de puentes disulfuro. La conformaciónde la caseína es similar a la de las proteínas globulares desnaturalizadas con poca o sin estructura terciaria .. Se recomienda a los usuarios evaluar a los proveedores de sustrato de caseína con respecto a Ja consistencia de la dispersión. La hidrólisis de caseína por parte de las proteasas pancreáticas genera aminoácidos individuales y péptidos pequeños, y su liberación puede cuantificarse midiendo su absorción a 280 nm. Antes de esta medición, se deben separar las proteínas no hidrolizadas y los péptidos grandes mediante una precipitación selectiva con ácido tricloroacético, seguida de filtración. Posteriormente, el filtrado se usa para la valoración espectrofotométrica de Ja actividad de proteasa, usando tirosina como calibrador. Una Unidad USP de actividad de proteasa está contenida en Ja cantidad de pancreatina que hidroliza Ja caseína a una velocidad inicial de modo que la cantidad de péptidos liberados por minuto y que no sean precipitados por el ácido tricloroacético provea la misma absorbancia a 280 nm que 15 nmol de tirosina.
866 <1025) Pancreatina / Información General
USP 39
Se encuentran disponibles otras valoraciones para monitorear la actividad de proteasas individuales y totales en pancreatina, y las asignaciones de unidades son específicas para cada sustrato. El éster etílico de N-acetil-L-tirosina se usa comúnmente en las valoraciones volumétricas y espectrofotométricas (A= 237 nm) de actividad de quimotripsina. De manera similar, el éster etílico de N-benzoil-L-arginina se usa comúnmente en las valoraciones volumétricas y espectrofotométricas (A= 253 nm) de la actividad de tripsina. En ambos casos, la valoración volumétrica se basa en la hidrólisis de enlaces éster por proteasas y la liberación de grupos ácidos, mientras que la valoración espectrofotométrica se basa en las propiedades cromogénicas de estos ácidos. El éster metílico de tolueno-sulfonil-L-arginina es otro sustrato cromogénico (A= 247 nm) que se usa para medir la actividad de tripsina. Sin embargo, estos sustratos no son proteínas y las valoraciones implican la escisión de un enlace de éster carboxílico en lugar de un enlace peptídico. Se han desarrollado otras valoraciones que usan péptidos cromogénicos como sustratos para mejorar la especificidad y la sensibilidad. Asimismo, se han desarrollado valoraciones de proteasa más específicas y sensibles usando sustratos de péptidos sintéticos cortos (de 3-5 residuos de aminoácidos) con un grupo cromogénico (4-nitroanilina) acoplado al extremo e-terminal mediante un enlace amida. El grupo cromogénico es eliminado específicamente por proteasas y se mide fotométricamente. El cambio en la absorbancia a 405 nm es directamente proporcional a la actividad de proteasa. Los sustratos específicos están disponibles comercialmente para tripsina (acetato de carbobenzoxi-valil-glicil-arginina-4-nitril-anilida) y quimotripsina (clorhidrato de metil-O-succinoil-arginil-prolil-tirosina-4-nitril-anilida). La caseína marcada con isotiocianato de fluoresceína también se usa como sustrato general para proteasa. La valoración se basa en que la fluorescencia de la fluoresceína es disminuida cuando está unida a la caseína. Cuando las proteasas digieren a la caseína marcada con isotiocianato de fluoresceína en péptidos más pequeños, la fluorescencia a 530 nm (excitación a 485 nm) se incrementa y se puede medir para determinar la actividad de proteasa.
8.3 Actividad de Amilasa La actividad glicolítica de la pancreatina se debe a las amilasas tipo a. Dichas enzimas catalizan la hidrólisis de los enlaces internos a-1,4-glucano en polisacáridos que contienen tres o más unidades de o-glucosa con enlace a-1,4, lo que genera una mezcla de maltosa y glucosa. Las dos isoformas principales (1 y 11) de amilasas porcinas tienen propiedades enzimáticas idénticas. En las últimas décadas, se han desarrollado varios métodos para valorar la actividad de amilasa; muchos de estos se basan en la detección de la hidrólisis de almidón, puesto que este polímero es el sustrato natural de amilasa. El almidón consta de dos tipos de moléculas, amilosa (por lo general 20%-30%) y amilopectina (por lo general 70%-80%). Ambos polímeros resultan del ensamble de unidades de glucosa conectadas mediante enlaces de a-1,4-glucano; además, en la amilopectina, 1 de cada 20 residuos aproximadamente, también tiene un enlace a-(1---+6), lo que forma puntos de ramificación. La valoración de actividad de amilasa USP en la monografía de Pancreatina se basa en la velocidad de digestión del almidón por la enzima, y la actividad de la muestra de prueba se calcula comparándola con una preparación estándar de enzima con actividad conocida. El almidón es hidrolizado por la amilasa; los grupos reductores resultantes de la hidrólisis reaccionan con yodo en solución alcalina; y el yodo en exceso se valora con tiosulfato. Una Unidad USP de actividad de amilasa se define como la cantidad de pancreatina que descompone el almidón a una velocidad inicial tal que se hidrolizan O, 16 µEq de enlace glicosídico por minuto en las condiciones de la valoración.
APÉNDICE 1: BIBLIOGRAFÍA REGLAMENTARIA Code of Federal Regulations, title 9 part 113 section 46. Detection of cytopathogenic and/or hemadsorbing agents. US Government Printing Office; 2006. p. 640. Disponible en: http://www.gpo.gov/fdsys/pkg/CFR-2006-title9-voll /pdf/ CFR-2006-title9-voll -chapl-subchapE.pdf Code of Federal Regulations, title 9 part 113 section 47. Detection of extraneous viruses by the fluorescent antibody technique. US Government Printing Office; 2006. p. 640-641. Disponible en: http://www.gpo.gov/fdsys/pkg/CFR-2006-title9-voll /pdf/CFR-2006-title9-voll -chapl-subchapE.pdf Code of Federal Regulations, title 9 part 113 section 53. Requirements far ingredients of animal origin used far production of biologics. US Government Printing Office; 2006. p. 644-645. Disponible en: http://www.gpo.gov/fdsys/pkg/ CFR-2006-title9-vol 1/pdf/CFR-2006-title9-vol 1-chapl-su bchapE. pdf EMEA. CHMP/BWP/398498/2005. Guideline on virus safety evaluation of biotechnological investigational medicinal products. 24 Jul 2008. p. 1-9. Disponible en: http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/documenUibrary/Scientific_guideline/2009/09/WC500003795.pdf EMEA. CHMP/EWP/9147/2008-corr*. Guideline on the clinical development of medicinal products far the treatment of cystic fibrosis. 22 Oct 2009. p. 1-27. Disponible en: http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/documenUibrary/Scientific_guideline/2009/l 2/WC500017055.pdf FDA. Guidance far industry. Exocrine pancreatic insufficiency drug products-submitting NDAs, April 2006. Disponible en: http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatorylnformation/Guidances/ucm071651.pdf FDA. Guidance far industry. ICH Q7A: good manufacturing practice guidance far active pharmaceutical ingredients. Aug 2001. p. 1-52. Disponible en: http://www.fda.gov/downloads/Drugs/ .. ./Guidances/ucm073497 .pdf FDA. Guidance far industry. ICHQl O pharmaceutical quality system. Apr 2009. p. 1-19. Disponible en: http:// www.fda.gov/ downloads/Drugs/Guidances/ucmO 7 351 7. pdf
USP 39
Información General/ (1027) Citometría de Flujo 867
ICH. ICH harmonised tripartite guideline. Viral safety evaluation of biotechnology products derived from cell lines of human or animal origin Q5A (Rl ). 23 Sep 1999. p. 1-27. Disponible en: http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ ICH_Products/Guidelines/Quality/Q5A_R 1 /Step4/Q5A_R l _ Guideline. pdf Uniprot Consortium. Disponible en: www.uniprot.org
APÉNDICE 2: BIBLIOGRAFÍA DE REFERENCIA Auld DS. Carboxypeptidase A. In: Barrett AJ, Rawlings ND, Woessner JF, et al., editors. Handbook of proteolytic enzymes. 2nd ed. Amsterdam: Elsevier; 2004. p. 812-821. Auld DS. Carboxypeptidase A2. En: Barrett AJ, Rawlings ND, Woessner JF, et al., editors. Handbook of proteolytic enzymes. 2nd ed. Amsterdam: Elsevier; 2004. p. 821-851. Avilés FX, Vendrell J. Carboxypeptidase B. In: Barrett AJ, Rawlings ND, Woessner JF, et al., editors. Handbook of proteolytic enzymes. 2nd ed. Amsterdam: Elsevier; 2004. p. 831-833. Bieth JG. Pancreatic elastase. En: Barrett AJ, Rawlings ND, Woessner JF, et al., editors. Handbook of proteolytic enzymes. 2nd ed. Amsterdam: Elsevier; 2004. p. 1504-1508. Bieth JG. Pancreatic elastase 11. In: Barrett AJ, Rawlings ND, Woessner JF, et al., editors. Handbook of proteolytic enzymes. 2nd ed. Amsterdam: Elsevier; 2004. p. 1508-1509. Bieth JG. Pancreatic endopeptidase E. In: Barrett AJ, Rawlings ND, Woessner JF, et al., editors. Handbook of proteolytic enzymes. 2nd ed. Amsterdam: Elsevier; 2004. p. 1510-1511. Borgstrom B. On the interactions between pancreatic lipase and colipase and the substrate, and the importance of bile salts. j Lipid Res. l 975;16(6):411-417. Gráf L, et al. Chymotrypsin. En: Barrett AJ, Rawlings ND, Woessner JF, editors. Handbook of proteolytic enzymes. 2nd ed. Amsterdam: Elsevier; 2004. p. 1495-1501. Lowe ME. The triglyceride lipases of the pancreas. j Lipid Res. 2002;43(2):2007-2016. Desnuelle P, Sjostrom H, Noren O, editors. En: Molecular and cellular basis of digestion. Amsterdam: Elsevier; 1986. p. 539. Peschke GJ. Active components and galenic aspects of enzyme preparations. En: Lankisch PG, editor. Pancreatic enzymes in health and disease. 1 st ed. Berlín: Springer-Verlag:l 991. p. 55-64. Verger R. Pancreatic lipase. En: Lipases. Borgstrom B, Borockman HL, editors. Amsterdam: Elsevier; 1984. p. 84-150. [review] Verger R, de Haas GH, Sarda L, Desnuelle P. Purification from porcine pancreas of two molecular species with lipase activity. Biochim Biophys Acta. l 969;188(2):272-282.
(1027) CITOMETRÍA DE FLUJO INTRODUCCIÓN La citometría de flujo es un método analítico que desempeña un papel crítico en la evaluación cuantitativa y cualitativa de poblaciones de células en muestras de pacientes y de productos celulares. La capacidad de la citometría de flujo se basa en su aptitud para analizar de manera rápida y confiable múltiples atributos de células individuales dentro de poblaciones de células heterogéneas. A pesar del valor de los datos obtenidos mediante citometría de flujo, validar el método presenta desafíos-quizás más que para otros métodos analíticos-debido a los errores y artefactos derivados de múltiples fuentes. Aunque los métodos de la citometría de flujo también se pueden usar para clasificar y aislar células como parte del proceso de fabricación para productos biológicos derivados de células y tejidos, el alcance de este capítulo se limita al uso de la citometría de flujo como método analítico. Este capítulo presenta los aspectos técnicos del método, incluyendo el instrumental, el manejo y la tinción de muestras y el análisis de datos. Las fuentes de error se consideran en el contexto de las características técnicas, y en consideraciones de control de calidad, garantía de calidad y normalización. Por último, se presentan las aplicaciones actuales y principios de resolución de problemas del ensayo. Para información adicional sobre los fundamentos y aspectos prácticos de la citometría de flujo, ver la edición vigente de Practica/ Flow Cytometry (Citometría de Flujo Práctica) (Shapiro, 2003). La citometría de flujo se usa ampliamente en la caracterización de productos derivados de células y tejidos, aunque la mayoría de los métodos de ensayo aún no han sido normalizados. Además de los aspectos relacionados con la complejidad técnica, se presentan desafíos para la normalización de los métodos de citometría de flujo para clases o tipos específicos de productos en relación con la naturaleza heterogénea de los mismos, incluso para aquellos con procesos de fabricación y usos clínicos similares. Es posible que las innovaciones vigentes y futuras relacionadas con los instrumentos, los reactivos analíticos, los algoritmos analíticos y la automatización, mejoren las capacidades de la tecnología, pero es poco probable que eliminen los desafíos (p.ej., valoración biológica, pruebas de identificación y otras aplicaciones).
868 (1 027) Citometría de Flujo / Información General
USP 39
PRINCIPIOS DE OPERACIÓN, MÉTODOS, CALIDAD V NORMALIZACIÓN El proceso de citometría de flujo requiere que las células pasen por una fuente de luz fija que consiste en uno o más láseres, de manera que cada célula, individualmente, se pueda observar o se puedan analizar sus características tales como tamaño, granularidad y presencia de antígenos o moléculas intracelulares o en la superficie de la membrana. Las células se suspenden en un líquido en el que el movimiento se controla mediante el tamaño y la configuración de las conexiones de tubos, cámaras y bombas específicas del instrumento de citometría de flujo. El patrón de las señales de luz producido a partir de la interacción de la luz láser con las células se captura mediante un sistema de detección, también específico del instrumento, y las señales detectadas se transforman en datos que se pueden analizar y combinar con datos de otras células en una muestra dada. Los datos de una suspensión de células se pueden expresar posteriormente en formatos visuales uni, bi o tridimensionales, o en formatos numéricos, para caracterizar la muestra celular y sus subpoblaciones de manera cuantitativa y cualitativa.
Instrumental de Citometría de Flujo A continuación se describen los citómetros de flujo, los cuales incorporan elementos para el procesamiento de señales ópticas, electrónicas y de fluidos. FLUIDOS El sistema de fluidos mueve una mezcla a granel de células de manera que se forme una corriente de células individuales. Dentro del citómetro de flujo, la suspensión de células individuales pasa a través de una región confinada en la que cada célula es iluminada secuencialmente por una fuente de luz uniforme en el punto de observación (punto de análisis). La mayoría de los instrumentos emplean una cámara de flujo (celda de flujo) la cual, después de que la muestra de células se introduce en la punta de inyección de muestra, combina las células con fluido envolvente isotónico, usando un ensamble de boquilla cónica diseñado geométricamente para producir un flujo laminar de fluido (Figura 1). La boquilla de salida de líquido por lo general tiene un orificio de 50-250 µm de diámetro, a través del cual sale el fluido a una alta velocidad de flujo. Las presiones diferenciales entre la corriente de la muestra de células (presión más baja) y la corriente envolvente (presión más alta) trasladan las células/partículas en una corriente confinada. La corriente coaxial resultante dentro de una corriente es altamente eficiente y la corriente de la muestra en el punto de observación es, por lo general, ligeramente más grande que las células o partículas contenidas en el interior. Un fabricante emplea, por lo menos, una metodología alternativa en la que la estrategia de corriente coaxial se reemplaza mediante el uso de microcapilares para enfocar y dirigir las células. Posteriormente, se mide y analiza la señal de luz desviada o emitida por la célula. Punta de Inyección de Muestra
Entradas de Fluido Envolvente
Flujo Laminar
Punto de Observación
Salida de Flujo
Figura 1. Diagrama esquemático de una celda de flujo. ÓPTICA Cuando las células se tiñen con colorantes fluorescentes o con reactivos con anticuerpos fluorescentes, la luz emitida por el láser interacciona con el colorante fluorescente para producir una emisión estimulada que presenta ondas coherentes (paralelas) de luz de longitud de onda, de fase y de polarización uniformes. Las señales de luz fluorescente generadas en la interacción de la luz láser con las células se recolecta mediante un arreglo de detectores orientados en línea directa y a 90º con respecto al rayo láser que ingresa. Los láseres para citómetros de flujo más comunes disponibles comercialmente (con longitudes de onda correspondientes) son el láser de argón azul (488 nm), el láser de diodos rojos (635 nm) y el láser violeta (405 nm).
USP 39
Información General/ (1027) Citometría de Flujo 869
PROCESAMIENTO DE SEÑALES ELECTRÓNICAS Y GENERACIÓN DE DATOS Cuando una célula pasa a través del sistema óptico de un citómetro de flujo, los patrones de dispersión de luz o fluorescencia de cualquier fluorocromo sobre la célula o dentro de la misma son detectados por varios tipos de fotodetectores o tubos fotomultiplicadores (PMT, por sus siglas en inglés) que transforman la información sobre las características de la célula en una lectura computarizada. Cada célula analizada genera un evento en cada parámetro (dispersión frontal, dispersión lateral, fluorescencia) para el cual se mide. La Figura 2 presenta un ejemplo de una configuración típica de un citómetro de flujo de dos colores. Los diferentes tipos de células presentan conjuntos distintivos de señales en los diversos parámetros. Por ejemplo, cuando la célula pasa a través de un haz de luz, a la luz deflectada en dirección frontal (por lo regular aproximadamente 20º de la dirección frontal del láser) se denomina dispersión frontal y se recolecta usando un detector conocido como canal de dispersión frontal (FSC, por sus siglas en inglés). La cantidad de deflexión en el FSC es proporcional al tamaño de la célula. La luz deflectada a un ángulo de 90º se conoce como dispersión lateral y se recolecta mediante el canal de dispersión lateral (SSC, por sus siglas en inglés). Este proporciona una medida de la complejidad estructural de la célula provocada por gránulos, rugosidad de la membrana o núcleo, los cuales se asocian con un SSC más alto. La luz deflectada por otros PMT usando un filtro de paso de banda específico se recolecta mediante canales de fluorescencia específicos (FL 1 y FL2 en la Figura 2). Los pulsos eléctricos, que se originan de la luz detectada por los PMT, se procesan mediante una serie de amplificadores lineales y logarítmicos. La amplificación logarítmica a menudo se usa para medir la fluorescencia de las células. Las Figuras 3-7 presentan histogramas para células teñidas con anticuerpos conjugados con fluorocromos específicos (ver la Tabla 7). Los anticuerpos son específicos para algunos marcadores de grupos de diferenciación (CD, por sus siglas en inglés) analizados en lnmunofenotipificación (ver más adelante).
c~~J ¡ '
1:
Gii!
§ll~t-
_lfl
:f: . . .i
Rayo Láser
Al
i¡
l
!
1
~ Celda de Flujo
Detector del FSC
Figura 2. Citómetro de flujo típico de 2 colores con detectores para FSC, SCC y fluorescencia. Tabla 1. Fluorocromos Usados Comúnmente en Citometría de Flujo
Fluorocromo
Excitación Típica del Láser (nm)
Pico de Emisión (nm)
Azul Cascada
375; 401
423
Azul Pacífico
403
455
480; 565
578
Ficoeritrina-R (R-PE, por sus siglas en inglés) Conjugados PE-Cy5
480; 565; 650
670
Conjugados PE-Cy7
480; 565; 743
767
480; 565
613
Clorofil Peridina (PerCP, por sus siglas en inglés)
490
675
Fluoresceína (FITC)
495
519
Aloficocianina (APC)
650
660
Conjugados APC-Cy7
650; 755
767
Rojo 613 (Rojo Texas)
La versatilidad de la citometría de flujo proviene de la capacidad de marcar con fluorescencia la superficie celular, el citoplasma o el núcleo o productos de la célula. Los marcadores fluorescentes unidos a la célula se pueden excitar usando láseres para emitir luz con longitudes de onda específicas y, posteriormente, esta luz se detecta y analiza de la manera descrita con anterioridad. El tipo y la cantidad de fluorescencia detectada ofrece información cualitativa y cuantitativa sobre la célula. Los fotodetectores convierten la luz en resultados analizables generando una pequeña corriente cuyo voltaje tiene una amplitud proporcional a la cantidad de luz. El voltaje se amplifica y convierte en señales eléctricas lo suficientemente grandes para ser graficadas por la computadora de distintas maneras. De esta forma, el FSC, el SSC y los detectores fluorescentes recolectan
870 (1027) Citometría de Flujo / Información General
USP 39
la luz y la convierten en señales eléctricas que pueden ser analizadas por la computadora. De esta manera, las señales derivadas de cada fotodetector se pueden medir por su intensidad (baja a alta) y clasificarse en canales. Los canales se disponen de manera continua de tal forma que una población de células con muchas células grandes tendrán una gran cantidad de eventos en los canales más altos, y una con muchas células pequeñas tendrá una gran cantidad de evento en los canales más bajos. ANÁLISIS DE DATOS Los datos generados por el citómetro de flujo pueden representarse de diversas maneras, de las cuales la más básica es el histograma de un sólo parámetro (Figura 3), en el que los eventos con intensidades de luz similares (dispersión frontal, dispersión lateral o fluorescencia) se recolectan en canales y posteriormente se grafican. Esta gráfica demuestra el número de células con características ópticas similares. La Figura 4 es un ejemplo de gráficas que presentan dos parámetros de medición, una en el eje x y una en el eje y, y el recuento de células como una gráfica de densidad (puntos) o mapa acotado. Los parámetros podrían ser el SSC, el FSC o la fluorescencia. Estos parámetros se pueden recolectar en un canal.
o
CXl
Positivo
UI O
.8 co e: Q)
:::J
u
Q)
ex:
o
Negativo
'<:!"
o
C\J
Figura 3. Histograma de un sólo parámetro que presenta la expresión del antígeno celular CD3 en una mezcla de células.
8 ~----~.~. . ~.~---~-·~··-=--=··-·=·---~--~--~--~---~-~---~--~-~---·--~--~----~-~ ..
o .-
o o
00
8C\I
O+---------------------------.-' 200 400 600 1000 o 800 Altura del FSC Figura 4. Gráfica de puntos de dos variables de células presentadas por el FSC y el SSC.
Información General/ (1027) Citometría de Flujo 871
USP 39
Una gráfica de puntos presenta un punto para cada célula, mientras que las gráficas de densidad y acotadas presentan un mapa de calor o un mapa topográfico lineal, respectivamente, basándose en el número relativo de células en cada canal. El histograma de dispersión frontal y dispersión lateral es el método más común para la identificación de diferentes tipos de células hematopoyéticas. La Figura 5 presenta una gráfica acotada que es una representación tridimensional del número relativo de células en los diversos canales. "<:!"
e>~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~
T"""
C')
o
T"""
o T"""
C\l
o o
ü
T"""
Figura 5. Gráfica acotada de dos variables que presenta números relativos de células presentes en cada canal que coexpresa 2 marcadores CD. Cuando las células se tiñen con anticuerpos para epitopes diferentes que portan dos fluorocromos diferentes, los datos se presentan como una gráfica en la que los dos parámetros se grafican uno en función del otro. Se pueden establecer cursores en cada eje para separar poblaciones positivas de poblaciones negativas para cada uno de los atributos. Esto resulta en una representación gráfica de células que son positivas para ambos marcadores, negativas para ambos marcadores y positivas para uno de los dos marcadores (Figura 6).
.••••...•.,_ ••
Población P o s i t i v a - - - - . . . - - - - - - - - -..... para 1 Marcador
Población Positiva 2 Marcadores
Población Negativa
Población Positiva para 1 Marcador
Figura 6. Presentación esquemática de un histograma de 2 parámetros. El citómetro de flujo permite al usuario establecer límites positivos y negativos para cada marcador. Los datos del citómetro de flujo se recolectan en forma de lista, en la que cada señal electrónica de una célula respectiva se presenta en la secuencia en la que se adquirió. Los archivos en modo de lista se pueden editar posteriormente para incluir o excluir algún evento. Una
872 (1027) Citometría de Flujo / Información General
USP 39
ventaja básica de la citometría de flujo es la capacidad para separar los datos correspondientes a las células de interés del fondo y células muertas (p.ej., partículas o desechos no celulares) cuando se trata de dispersiones frontales y laterales y células de otras poblaciones. El usuario debe decidir que señales son precisamente resultantes de la luz relacionada con las células, diseñar ventanas electrónicas y ordenar a la computadora que considere positivos únicamente los eventos que caigan dentro de dicha ventana. Las poblaciones celulares pueden variar ampliamente dependiendo de la fuente de tejido o de células y las características del citómetro de flujo usado. El uso de ventanas permite al usuario determinar las señales que se deben considerar eventos reales, por lo que este proceso es de primordial importancia para normalizar los datos de la citometría de flujo (Figura 1).
Se puede usar una técnica conocida como compensación para separar superposiciones espectrales de fluorocromos con longitudes de onda similares. Para citómetros de flujo análogos fabricados antes del final de la década de 1990, la compensación debe establecerse antes de la adquisición de datos. En los instrumentos digitales modernos, la compensación se puede establecer ya sea antes o después de la adquisición de datos. El ajuste de compensación puede ser más un arte que una ciencia, mientras que una gran parte de la literatura se ha enfocado en los méritos relativos de diversos métodos para determinar la compensación correcta para tipos celulares o condiciones experimentales. El analista debe contar con conocimientos considerables acerca del tipo celular en análisis a fin de evitar errores en la fenotipificación que puedan resultar del ajuste inadecuado de compensación. El número de eventos contados debe ser adecuado para generar confianza estadística en los resultados. El instrumento se puede ajustar de manera que la recolección de datos se lleve a cabo hasta que se haya medido cierto número de eventos en un canal. Esta característica permite al operador variar la duración o el número de eventos de la muestra de modo tal que se generen datos estadísticamente confiables. De esta manera, una muestra que mide un evento poco común analizará más células totales que una muestra que mide un evento común. El uso de archivos en forma de lista, los archivos de datos electrónicos que representan a la mayoría de los datos no censurados, ofrece una ventaja debido a que estos archivos se pueden analizar después de la adquisición de datos. Es necesario que los investigadores aseguren que todos los datos sin procesar, la documentación, los protocolos, las muestras y los informes finales se archiven cuando concluye el estudio. Para asegurar la integridad y calidad de los datos brutos recopilados, es necesario que los investigadores se apeguen a las Regulations for Good Laboratory Practices (Reglamentaciones para Buenas Prácticas de Laboratorio o GLP) de la FDA de los EE.UU., conforme a lo prescrito en el Título 21 del CFR Parte 58, Good Laboratory Practice for Nonclinical Laboratory Studies (Buenas Prácticas de Laboratorio para Estudios de Laboratorio No Clínicos); y Parte 11, Electronic Records and Electronic Signatures (Registros y Firmas Electrónicos).
Citometría de Flujo: Elementos de un Procedimiento Los métodos de citometría de flujo incluyen la manipulación, la preparación y la tinción de la muestra; configuración y operación del instrumento; recopilación, análisis y almacenamiento de datos; y medidas de control de calidad asociadas. MANIPULACIÓN Y TINCIÓN DE LAS MUESTRAS Recolección, Manipulación y Anticoagulación de las Muestras Con el objetivo de generar conclusiones exactas sobre el producto farmacéutico derivado de células, el analista debe asegurar que las muestras de productos celulares sean lo más representativas del producto completo. Las muestras de sangre, aféresis y productos de suspensión celular se deben mezclar bien antes del muestreo y se debe tener cuidado de obtener volúmenes de muestra adecuados. Las muestras celulares que contienen sangre/plasma humano deben someterse a un proceso de anticoagulación. La heparina o los anticoagulantes basados en citrato (p.ej., Solución Anticoagulante A de Citrato Dextrosa) se recomiendan más que el EDTA, ya que conservan de manera óptima las muestras que se deben manterner por más de unas pocas horas. En lo que respecta a muestras que deben mantenerse por plazos más largos, pueden ser necesarios medios específicos de transporte/ almacenamiento, y se deben realizar estudios de validación para asegurar que dichas muestras sean equivalentes a las muestras preparadas en el momento de ser analizadas por citometría de flujo. Las muestras destinadas a lisis de sangre entera y tinción de antígenos de superficie se deben transportar y almacenar, de preferencia, en un mezclador de oscilación lenta a temperatura ambiente. Las muestras fijadas o las preparaciones de células vivas se deben almacenar a 4º. Cuando existe la posibilidad de que la muestra sea expuesta a temperaturas extremas, pueden ser necesarios materiales con control de temperatura (empaques para temperatura ambiente, empaques fríos y aislamiento) y se deben llevar a cabo estudios de validación para garantizar la integridad de la muestra. Para muestras críticas o de alto valor, pueden ser necesarios dispositivos de monitoreo de temperatura durante el transporte.
USP 39
Información General/ (1 027) Citometría de Flujo 873
o o o
T"""
o o co 1
o o
o
(j) (j)
o o
""" o o
C\I
ol
o
200
400
600
800
1000
FSC
"""
o~~~~~~~~~·~~~~~~~~~~~~~~~~
T"""
T""" T"""
C\I
o o
o
T"""
T"""
o
T"""
o
O>-=-~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~
~ºº
10 1
102
Lin
103
104
Figura 7. Generación de ventanas para una población celular con dispersión lateral baja y dispersión frontal alta, la cual es diferente de otras poblaciones celulares en la muestra. Una vez obtenidas las muestras, se deben analizar lo más pronto posible. Resulta necesario prestar atención especial a aquellas situaciones en las que la proliferación celular y la depleción metabólica de fuentes de energía dentro del medio de transporte/almacenamiento puedan generar apoptosis. Cuando no se requiere un recuento exacto o cuando se sospecha la presencia de agentes infecciosos, se puede usar una solución comercial para lisado/fijación para aumentar el tiempo de almacenamiento y reducir el riesgo de transmisión de enfermedades. Para muestras separadas mediante centrifugación en gradiente de
874 (1027) Citometría de Flujo/ Información General
USP 39
densidad, se recomienda el almacenamiento en una solución de paraformaldehído amortiguado (O, 1 o/o a 2,0%) después de que ha ocurrido el marcado de las células. Procesamiento, Tinción y Fijación de las Muestras Los reactivos usados en el procesamiento, tinción y fijación de las muestras deben calificarse para su uso previsto. El documento Q6B de la ICH, Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products (Especificaciones: Procedimientos de Prueba y Criterios de Aceptación para Productos Biotecnológicos/Biológicos), proporciona pautas adicionales. Cuando se emplean kits de reactivos, se deben seguir las instrucciones del fabricante para el procesamiento de las muestras. El procesamiento de las muestras que requiere centrifugación, lavado, eliminación o lisis de eritrocitos (RBC, por sus siglas en inglés), o separación en gradiente de densidad, por lo general se usa en muchas de las aplicaciones de la citometría de flujo, pero puede introducir errores y artefactos. Se encuentran disponibles diversas técnicas y reactivos para la eliminación y lisis de RBC. Para una calidad óptima, se recomiendan los reactivos de grado clínico [diagnósticos in vitro (JVD, por sus siglas en inglés) o específicos para analitos (ASR, por sus siglas en inglés)], aunque aún pueden presentarse artefactos. La centrifugación en gradiente de densidad puede introducir errores relacionados con pérdidas de células variables entre las subpoblaciones que se están midiendo. Estas fuentes de error y artefactos se pueden evitar analizando la sangre entera viva siempre que sea posible. La mayoría de las instrucciones para el lisado de la sangre entera recomiendan la tinción a temperatura ambiente y en Ja oscuridad. Muchos métodos incluyen una solución fijadora diluida para evitar el enmascaramiento (capping) y la internalización de fluorocromo. Por el contrario, las preparaciones de células (preparaciones de células en gradiente de densidad, muestras por aféresis, cultivo de tejidos) se deben teñir a 4º, lavarse con solución amortiguadora fría y almacenarse en frío hasta el momento del análisis. La fijación que también conserva los antígenos de la superficie celular se puede conseguir mediante conservantes de leucocitos comerciales o con formaldehído o paraformaldehído amortiguados. Existe muy poca información sobre la validación de los tiempos de almacenamiento, unión de anticuerpos o intensidad de fluorocromo. Cualquier laboratorio que considere el análisis de partidas de muestras fijas debe validar estas técnicas de manera cabal antes de implementarlas. USO Y SELECCIÓN DE FLUOROCROMOS Fluorocromos Los fluorocromos se usan para la tinción directa de células o como agentes unidos a anticuerpos u otros reactivos para teñir antígenos celulares u otras estructuras. La Tabla 7 cita ejemplos de fluorocromos comunes usados en citometría de flujo y sus longitudes de onda de excitación y emisión. Las longitudes de onda (nm) pueden variar ligeramente, dependiendo del entorno. También se encuentran disponibles sondas sintéticas de fabricantes específicos.1 Los fluorocromos deben coincidir con el intervalo espectral para los conjuntos de láseres y filtros específicos del citómetro de flujo del usuario. Al momento de seleccionar fluorocromos para fenotipificación multicolor, el operador debe referirse a los métodos establecidos para el instrumento en particular. En general, los fluorocromos más brillantes se deben usar para detectar antígenos de los que se espera presenten una baja expresión en la superficie de la célula. El brillo de los colorantes en tándem también se puede reducir usando diversos fijadores, algunos de los cuales son menos problemáticos que otros. Cuando se diseña un procedimiento de flujo y de coloración en tándem multicolor que no ha sido previamente validado, el operador debe consultar con el servicio técnico del fabricante, comparar las combinaciones de fijador y colorante en tándem y validar la combinación de fluorocromo final para asegurar la uniformidad de muestra a muestra. Los colorantes fluorescentes en tándem son moléculas fluorescentes conjugadas duales. Cuando las dos marcas están muy cerca una de otra, la energía producida por el láser que excita al fluorocromo dador se transfiere al fluorocromo receptor, liberando un fotón a Ja longitud de onda de emisión del flúor receptor (también conocido como transferencia de energía de resonancia de fluorescencia o FRET, por sus siglas en inglés). Por ejemplo, el PECy5 se excitará a la longitud de onda de excitación para PE (565 nm), transferirá energía a Cy5 y emitirá a la longitud de onda de emisión para Cy5 (670 nm). Anticuerpos Marcados con Fluorescencia La mayoría de los anticuerpos disponibles comercialmente son monoclonales, pero puede haber disponibles reactivos policlonales, recomendados, para algunas aplicaciones. La calidad y especificidad de un anticuerpo puede variar ampliamente. Los anticuerpos dirigidos a un antígeno dado pueden diferir en su especificidad de unión para diferentes epitopes de antígenos o en la fuerza de unión al mismo epitope. De ser posible, emplear combinaciones de fluorocromo-anticuerpo conjugadas de grado IVD o ASR. La optimización de la concentración de los anticuerpos para la población de células deseada es específica del protocolo pero por lo general se consigue usando concentraciones de anticuerpos en aumento con un número fijo de células para establecer el brillo óptimo entre la autofluorescencia y la extinción. La extinción es provocada por el fenómeno de prozona, que se presenta cuando un exceso de anticuerpos genera la inmunoprecipitación y pérdida de intensidad de la fluorescencia. Los manuales de métodos tales como Current Protocols in lmmunology (Protocolos Actuales de Inmunología (Coligan et al. 1994), presentan detalles adicionales.
1
La serie AlexaFluor (Sondas lnVitrogen/Moleculares) o la serie Cy (GE Healthcare).
USP 39
Información General/ (1027) Citometría de Flujo 875
Tinción del Antígeno de la Superficie de la Célula Las técnicas de tinción del antígeno de la superficie varían dependiendo del tipo de muestra. Las técnicas de lisis de sangre entera por lo general requieren el marcado de la superficie a temperatura ambiente en la oscuridad durante 15-30 minutos, seguido por lisis de eritrocitos (RBC, por sus siglas en inglés) y, si se desea, fijación. Las técnicas publicadas utilizan cloruro de amonio (NH 4 CI) para producir la lisis de sangre entera o muestras de médula seguido por el lavado y posterior marcado de anticuerpos para inmunofenotipificación de leucemia. Las muestras de células mononucleares o de cultivo que se tiñen vivas deben conservarse a 4º o en una solución amortiguadora con azida para evitar el enmascaramiento (capping) y la internalización de anticuerpos. Tinción Intracelular Existen también diversos procedimientos normalizados para el marcado de antígenos intracelulares y citoquinas. El operador debe consultar el protocolo del fabricante y los reactivos estandarizados para estos procedimientos. Debido a que los reactivos permeabilizantes varían entre procedimientos y fabricantes, no se deben mezclar ni homologar reactivos. Para el marcado de citoquinas, a menudo se requiere de una etapa de activación y un bloqueo del Golgi para permitir que se acumule una cantidad suficiente de citoquina para su detección. Si no se dispone de reactivos o procedimientos estandarizados por parte del fabricante o si se requiere el análisis de funciones especializadas, existe un gran número de procedimientos y técnicas habituales en fuentes tales como Current Protocols in lmmunology (Protocolos Actuales de Inmunología) (Coligan et al., 1994). Cuantificación de Antígenos Algunas aplicaciones requieren cuantificar el número promedio y la densidad de moléculas de antígenos por célula para proveer una imagen más completa del comportamiento inmunológico de las células (p.ej. en estudios en los que los antígenos extracelulares se expresan de forma diferencial en relación con el estímulo de activación). La intensidad de una preparación de células con anticuerpos marcados con fluorocromos se compara con la intensidad de un conjunto de estándares de microperlas de fluorescencia recolectados a la misma configuración de voltaje del PMT. Los estándares se calibran en unidades de moléculas de fluorescencia soluble (MESF, por sus siglas en inglés), de las que se puede determinar la relación efectiva entre la fluorescencia y el anticuerpo (F/P), el número de moléculas de antígeno por célula y la densidad de los sitios disponibles por célula. CONFIGURACIÓN Y OPERACIÓN DEL INSTRUMENTO Compensación La mayoría de de los fabricantes de instrumentos ofrecen software y reactivos de prueba (por lo regular perlas fluorescentes) para configurar los PMT y la compensación a fin de captar valores hallados con las pruebas clínicas más comunes (p.ej., fenotipificación de linfocitos, análisis de CD34). Asimismo, el operador debe emplear un control biológico tal como sangre conservada o células mononucleares, las cuales se encuentran disponibles comercialmente. La compensación se debe establecer antes de adquirir datos en instrumentos análogos. Los PMT de los instrumentos digitales deben instalarse de manera correcta puesto que los valores para estas configuraciones no podrán cambiarse una vez que haya sido generado el archivo en forma de lista. Cuando se examinan eventos poco comunes y/o se usan colorantes intracelulares (p.ej., 7-amino actinomicina D [7-AAD], yoduro de propidio [PI, por sus siglas en inglés], Syto-16, entre otros.) en conjunto con anticuerpos marcados por fluorescencia, el balance de voltaje de los PMT y la superposición espectral debe monitorearse muy de cerca. La autofluorescencia (AF) es fluorescencia por encima de la línea base en ausencia de tinción con fluorocromo. Lo anterior se presenta en algunas células, por lo regular en células mieloides (especialmente macrófagos alveolares) y en células primarias cultivadas. Cuando resulte deseable o necesario, la AF puede medirse directamente en un voltaje de PMT fijo o se puede calcular a partir de un estándar de referencia de preparaciones de perlas fluorescentes (ver la sección Cuantificación de Antígenos anterior). Evitar el uso de la longitud de onda de excitación a 488 ó 532 nm y la compensación espectral subsiguiente de la AF como un fluorocromo adicional. Adquisición de Datos y Estrategias para la Creación de Ventanas Siempre que sea posible, los eventos deben presentarse en modo de lista, es decir, sin la creación de ventanas selectivas para eventos. Las Ventanas vivas, definidas como la creación de ventanas selectivas para eventos durante la adquisición, se deben emplear sólo cuando el subconjunto deseado es lo suficientemente raro, y se deben analizar >2 millones de eventos totales para contar un número de eventos significativo (100 o mayor) de la población deseada. Los datos en forma de lista se pueden adquirir sin compensar cuando se emplea instrumental digital, pero la mayoría de los operadores indican que el análisis es mucho menos difícil y más rápido si los datos se encuentran en el intervalo de compensación apropiado antes de su adquisición. Además, a menudo se recomienda establecer umbrales para exclusión de desechos. Por ejemplo, si se establece un umbral de dispersión frontal se excluyen eventos por debajo de un tamaño predeterminado a fin de prevenir un archivo en forma de lista de gran tamaño, que podría formarse si se contaran estos eventos. Uso de Controles Las preparaciones de perlas conjugadas con fluorocromo se usan para estandarizar los PMT y la compensación y para cuantificar la expresión de marcadores específicos. Asimismo, se recomienda ampliamente el uso de controles biológicos. Se deben teñir las muestras de células con un control de isotipos y anticuerpos primarios y secundarios para evaluar la unión no específica, a menos que el laboratorio haya determinado mediante procedimientos rigurosos de validación que la unión no específica no interfiere con los resultados del ensayo.
876 (1027) Citometría de Flujo / Información General
USP 39
Las poblaciones de células con antígenos positivos y negativos (preparadas y teñidas de manera idéntica a las de los artículos de prueba) proporcionan estándares internos de aptitud del sistema. Tales poblaciones de células de control también permiten al laboratorio evaluar variaciones entre lotes en preparaciones de anticuerpos y reactivos de tinción. Uso de Colorantes y Ventanas para Viabilidad Celular Los colorantes para viabilidad celular tales como 7-MD, PI y yoduro TO-PRO se usan comúnmente para determinar la proporción de células muertas en un producto de terapia celular. Estos colorantes por lo general se excluyen de las células vivas, pero pasan a través de las membranas celulares de células muertas, tiñendo su ADN. La coloración para viabilidad de las células se puede combinar con la tinción intracelular o de la membrana de la superficie para evaluar subpoblaciones y la proporción de células vivas y muertas teñidas con un marcador determinado. La tinción para viabilidad también se puede usar en conjunto con un colorante de membrana en ensayos de citotoxicidad usando citometría de flujo. Estos colorantes para viabilidad no deben confundirse con la gran cantidad de reactivos para detección de apoptosis disponibles en la actualidad. Las técnicas de validación para colorantes para viabilidad que no se usan en IVD implican la preparación de una población de células muertas que se agregan diluidas en serie a un producto de células vivas y, posteriormente se evalúa la fidelidad de la mezcla de células con respecto a la población conocida tiñendo con el colorante de interés. Enumeración de Células El recuento celular absoluto, expresado como el número de células en un volumen de muestra dado, se puede determinar por métodos de plataforma doble o simple. El método de plataforma doble se basa en un instrumento de recuento automatizado separado o en un método de recuento manual para enumerar primero la población de células. Después, se determina el porcentaje de subgrupos de interés mediante citometría de flujo, el cual se multiplica por el recuento celular y el resultado se divide por 1OO. Los métodos de plataforma simple enumeran la población de células y del subgrupo directamente contando las células de la muestra simultáneamente con perlas de referencia que se han agregado al volumen de muestra en una concentración conocida. Las perlas de referencia a menudo se ofrecen como suspensión de perlas que se agrega a la muestra. De manera alternativa, se puede agregar un volumen dado de muestra a un número conocido de perlas de referencia provistas como una matriz de fase sólida en tubos de poliestireno. Estas metodologías están sujetas a error de pipeteo, por lo que se debe tener mucho cuidado para asegurar la exactitud y reproducibilidad. Configuración del Instrumento y Garantía de Calidad Cada laboratorio debe tener un plan de calidad que defina los procedimientos operativos estándar para la configuración y calibración del instrumento, así como el monitoreo, mantenimiento y limpieza regular del instrumento. Los registros del instrumento deben documentar estas actividades y a los operadores. En general, se debe seguir el programa del calidad del fabricante para el instrumento a menos que se haya establecido una alternativa adecuada. Los parámetros del instrumento, como por ejemplo la corriente láser, el voltaje, la respuesta y los voltajes de PMT durante la calibración, deben ser monitoreados y registrados siempre que se utilice el instrumento. El monitoreo cuidadoso de los parámetros de configuración del instrumento puede ser de utilidad para detectar tendencias y predecir fallas en el láser o el PMT. Asimismo, los resultados de las pruebas de control biológico deben monitorearse y registrarse para detectar y prevenir la deriva del método analítico. El laboratorio también debe participar en un programa de análisis de competencia que refleje su menú de pruebas. Dependiendo de las necesidades, esto puede variar de un programa formal como el administrado por el College of American Pathologists (Colegio de Patólogos Estadounidenses o CAP) a compartir muestras y análisis con otro laboratorio. Asegurar que los operadores estén capacitados, calificados y que su competencia para realizar procedimientos específicos sea evaluada periódicamente ayudará a garantizar la uniformidad de las técnicas y los controles. GESTIÓN DE DATOS Y CONSIDERACIONES ESTADÍSTICAS Gestión y Almacenamiento de Datos Los ensayos de control de calidad y los ensayos de análisis de muestras (en forma de lista) se deben almacenar de tal manera que se cumpla con los requisitos reglamentarios aplicables al laboratorio. Lo anterior se puede lograr mediante transferencia a discos duros, medios extraíbles o a un servidor tal como un sistema de información de laboratorio comercial. El almacenamiento de los resultados deberá ser rastreable en todo momento hasta el archivo en forma de lista FCS, la configuración del instrumento y los parámetros de control de calidad originales para la muestra en particular. Se debe crear un respaldo de datos para evitar la pérdida de archivos. Se deben establecer procedimientos de almacenamiento y respaldo para registros manuales (en papel) que podrán ser usados para cálculos y resumen de datos. Análisis de Datos y Consideraciones Estadísticas Para la mayoría de las aplicaciones de citometría de flujo, el análisis de datos implica presentar los datos de los archivos en forma de lista o de las ventanas en vivo mediante una gráfica (gráfica de histograma de un sólo parámetro, gráfica de puntos de dos parámetros con regiones o gráfica tridimensional) y medir la distribución de eventos dentro de la gráfica. El análisis adicional de datos dentro de poblaciones seleccionadas se puede llevar a cabo mediante ventanas para poblaciones de células específicas. La descripción de los datos por lo regular incluye el porcentaje de eventos dentro de la población con una característica dada (dispersión frontal, dispersión)ateral, marcador fluorescente). El numerador es el número de eventos que presentan la característica, mientras que el denominador puede ser el número de eventos totales contados o el número de eventos contados que caen dentro de la ventana. Para gráficas bidimensionales, el análisis a menudo se lleva a cabo usando un software informático que analiza e informa estadísticas regionales (p.ej., cuadrante). Debido a que los grupos de poblaciones de célu-
USP 39
Información General/ (1027) Citometría de Flujo 877
las pueden cambiar de posición en un archivo de datos con respecto al siguiente, se ha desarrollado un software para el análisis de grupos. El análisis estadístico de las aplicaciones cuantitativas de citometría de flujo difiere de las aplicaciones cualitativas en las que una célula es considerada positiva o negativa para un marcador dado. Para una aplicación cuantitativa típica en la que se estima el número de moléculas en la superficie celular, la intensidad de fluorescencia media o mediana de las células de la muestra marcadas con un anticuerpo fluorescente, unido a la molécula de interés, se puede comparar con controles apropiados, incluyendo curvas estándar de células o partículas con cantidades conocidas de dicha molécula o anticuerpo. Una consideración práctica común para el análisis por citometría de flujo de productos de terapia celular, en especial los productos autólogos y alogénicos relacionados con el donante, es que el tamaño de la muestra que se debe analizar a menudo está restringido debido al contenido limitado de células del producto terapéutico mismo. Esto genera desafíos especiales cuando las células que contienen el marcador de interés se presentan como eventos poco comunes. En tales casos, antes de tomar una decisión con respecto al tamaño de la muestra, el usuario debe considerar las expectativas de detección de eventos poco comunes dentro de un número dado de células totales (es decir, la prevalencia, variabilidad, y el error de muestreo) en relación con la precisión deseada del estimado.
Calidad y Estandarización La estandarización del uso de la citometría de flujo y de los equipos requiere de prácticas de validación, garantía de calidad (QA) y control de calidad (QC). Aunque la citometría de flujo se usa ampliamente tanto en la investigación como en laboratorios clínicos, el análisis de células para el desarrollo de aplicaciones de diagnóstico clínico y terapéutico se encuentra en crecimiento, lo que conlleva a requisitos reglamentarios más amplios y al énfasis en la normalización. Por ejemplo, tradicionalmente, los operadores de citometría de flujo han empleado microesferas fluorescentes (perlas) o celdas para la configuración del instrumento y el QC, a menudo basándose en las recomendaciones del fabricante. Sin embargo, no ha sido posible convenir instrucciones uniformes para la aplicación de estos estándares de control a la configuración del instrumento y al QC. Cuando se aplica de manera apropiada, la validación proporciona evidencia documentada de que el proceso de de fabricación o análisis genera constantemente productos que cumplen con las especificaciones predeterminadas. Cuando se basa en una comprensión cabal de los parámetros críticos del proceso, la validación ayuda a definir la calidad del producto y a garantizar procesos de fabricación o análisis bien controlados y uniformes. La validación de métodos por citometría de flujo debe incluir la calificación del instrumental, la validación del método analítico y la calificación del operador. DOCUMENTACIÓN Los procesos que cumplen con las BPL y las BPF requieren de documentación adecuada tal como procedimientos operativos estándar (SOP, por sus siglas en inglés) para todos los procesos del laboratorio. Los SOP deben ser actualizados periódicamente y aprobados para reflejar las prácticas vigentes. La capacitación y la calificación son indispensables para que el personal de laboratorio tenga el nivel de competencia apropiado para su responsabilidad asignada. Las competencias del operador deben ser revisadas y evaluadas de manera continua en relación con las SOP y los reglamentos. La integración de procesos de calidad internos y externos es un elemento importante para la garantía de calidad. Dichos procesos incluyen la validación del equipo, los controles y límites de fabricación y las especificaciones del producto. Los procesos de validación de procesos y equipo por lo general requieren de calificación de la instalación (IQ, por sus siglas en inglés), la calificación operativa (OQ, por sus siglas en inglés) y la calificación del desempeño (PQ, por sus siglas en inglés). CALIFICACIÓN DE EQUIPOS Y ENSAYOS La IQ establece que el instrumento sea recibido con su diseño y especificaciones originales, y que sea instalado adecuadamente en un ambiente apropiado. Por lo general, esto significa verificar los requisitos físicos y de la instalación para determinar si el citómetro de flujo se puede instalar adecuadamente. Los factores de calificación verificados a menudo incluyen la temperatura, humedad, espacio y capacidades eléctricas de las instalaciones en relación con los requisitos del fabricante para el instrumento. Los procedimientos de IQ también garantizan que todos los componentes de hardware y software se instalen adecuadamente por el representante del fabricante del instrumento. LA OQ demuestra que un instrumento funcionará de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Esto generalmente se refiere al análisis de niveles de componentes por parte del representante del fabricante del instrumento o usando los manuales de validación del fabricante que guía al usuario final para llevar a cabo esta función. Siempre que sea posible, estas pruebas deben contar con especificaciones con límites de control cuantitativos correspondientes. Este análisis asegura que el hardware y software del instrumento esté en condiciones de operar comparándolos con las especificaciones del fabricante. La PQ demuestra que tanto el instrumento como las pruebas tienen un desempeño conforme a las especificaciones. Para citometría de flujo, estas especificaciones, por lo general, son determinadas por el laboratorio que realiza el análisis por citometría de flujo y a menudo incluyen las especificaciones diarias del instrumento y de las pruebas de control de la valoración. Para valoraciones específicas, la PQ debe incorporar metodología normalizada, configuración y compensación específica para la aplicación y especificaciones de linealidad, precisión y exactitud de los resultados informados de la valoración. En algunos citó-
878 (1027) Citometría de Flujo/ Información General
USP 39
metros de flujo digitales, puede ser necesario configurar la línea base del instrumento a fin de determinar la configuración óptima del instrumento para una valoración dada. DESEMPEÑO DEL INSTRUMENTO Las especificaciones de desempeño pueden ser identificadas por el fabricante del citómetro de flujo y posiblemente no abarquen todos los requisitos especificados por el operador. Después de identificar las especificaciones del fabricante, el laboratorio debe establecer especificaciones que sean apropiadas para las configuraciones del hardware que se utilizarán, y se deben normalizar las especificaciones. Por ejemplo, el fabricante puede tener una especificación base para un citómetro de flujo de doble láser y cuatro colores. Si la especificación base requiere un láser de diodo rojo estándar a 635 nm, pero se sustituye con un láser de helio-neón enfriado con aire a 633 nm, la especificación base deja de ser válida para el sistema. De manera similar, si las especificaciones se basan en el uso de un filtro de paso de banda a 660 nm pero se sustituye con un filtro de paso largo a 675 nm, la especificación base deja de ser válida debido a las diferencias en las características del filtro de emisión. MONITOREO DEL DESEMPEÑO El desempeño del instrumento debe monitorearse a diario, usando perlas fluorescentes comercialmente disponibles. Los detectores de luz tales como PMT, fotodiodos (PD, por sus siglas en inglés) y fotodiodos en avalancha (APD, por sus siglas en inglés) se usan en la mayoría de los sistemas para detectar señales y sus ganancias se pueden cambiar para aumentar o disminuir la sensibilidad de los detectores. Por lo tanto, el monitoreo de las configuraciones de estos detectores es tan importante como el monitoreo de las señales, y dichas configuraciones deben asociarse con cada archivo de datos sin procesar. La metodología más simple consiste en mantener diariamente la misma configuración del detector del instrumento para medir la intensidad de las señales de fluorescencia. Esta metodología debe implementarse para todos los parámetros que se deben validar usando las perlas apropiadas. La sensibilidad del instrumento se basa en la capacidad del sistema de detección para resolver la poblaciones de células o perlas con fluorescencia atenuada. Por esta razón, la medición del coeficiente de variación (CV) de poblaciones de perlas con fluorescencia atenuada a moderadamente intensa es una forma de monitorear diariamente la sensibilidad de la fluorescencia. Se deben usar las recomendaciones del fabricante del instrumento para monitorear el desempeño. La temperatura ambiente alta puede afectar el desempeño del láser y del PMT y también debe monitorearse a diario. La compensación incorrecta para la superposición espectral puede afectar en gran medida a los datos durante el análisis multicolor. Se han establecido muchas metodologías para este propósito y se han usado algoritmos matemáticos recientes en lugar del circuito análogo. Los algoritmos, tales como aquéllos que emplean álgebra de matrices, permiten al operador o a los investigadores aplicar criterios objetivos para compensar la superposición espectral después de haber recopilado todos los datos. En sistemas más antiguos, la metodología estándar ha consistido en compensar usando un ajuste de hardware de sustracción para los datos preliminares observados, antes de que se hayan recopilado todos los datos. Esta metodología puede ser subjetiva y puede no generar resultados exactos como la compensación por métodos más novedosos. Las perlas de captura unidas a anticuerpos son herramientas valiosas de compensación debido a que se pueden usar con los mismos colorantes de anticuerpos y en tándem para todos los fluoróforos que se usarán en las células. Se debe validar el uso de perlas en lugar de celdas para propósitos de compensación. ESTÁNDARES Los estándares de fluorescencia basados en microesferas para citometría de flujo han sido categorizados en base a su propósito: • Los estándares Tipo 1son estándares de alineación que se usan para realizar ajustes en la alineación óptica del instrumento. Estos son usados generalmente por los ingenieros de servicio del campo y por los usuarios de sistemas ajustados por el operador para verificar la alineación de la señal óptica a fin de mejorar la sensibilidad del instrumento. Por lo regular, estas partículas son pequeñas ("' 2 µm) y brillantes y proporcionan la iluminación más uniforme. • Los estándares Tipo 11 son perlas de referencia y son los estándares de perlas más comúnmente usados. Estos estándares por lo general se usan a diario, tienen una intensidad de fluorescencia tenue a moderada y pueden obtenerse con varios fluoróforos insertados. Asimismo, se pueden usar para imitar células y, usando un software dedicado, determinar la sensibilidad relativa del instrumento. • Los estándares Tipo 111 se usan para calibrar la fluorescencia. Estos se usan para aplicaciones especializadas que requieren la calibración de uno o más detectores de fluorescencia para cuantificación de moléculas de fluorocromo. La determinación de la relación entre los fluoróforos y el anticuerpo (relación F/P) permite el cálculo subsiguiente del número de anticuerpos unidos por célula.
USP 39
Información General/ (1027) Citometría de Flujo 879
CONFIGURACIÓN DEL INSTRUMENTO Y GARANTÍA DE CALIDAD La configuración del instrumento y la garantía de calidad deben ser actividades independientes de la valoración biológica. Muchas variables relacionadas con el instrumental pueden producir artefactos en los resultados de la valoración biológica. Para garantizar la calidad instrumental se puede usar: la configuración de la línea base y la configuración diaria. Configuración de la Línea Base En los instrumentos digitales más novedosos, se recomienda establecer una configuración de la línea base en la configuración del instrumento que provea una sensibilidad óptima. Esta configuración no es un procedimiento diario, pero debe llevarse a cabo si la configuración del instrumento ha sido cambiada o si se ha dado servicio al instrumento. Debido a que los voltajes del PMT y la configuración del instrumento pueden afectar sobremanera la sensibilidad de éste último, este método debe usarse para generar objetividad y una sensibilidad mejorada. Los voltajes de PMT se pueden aumentar hasta un intervalo que provea un CV menor (Figura 8). Estas configuraciones pueden ser usadas para la valoración biológica, aunque no aplica para todos los casos. 10000
~--------------
490V
605V
1000
--+-- P1 FITC-A CV ---P1 PE-ACV P1 PerCP-Cy5-5-A CV P1 APC-Cy7-A CV --+-- P 1 APC-A CV --+-- P1 PE-Cy7-A CV
10+----~--~---~---~
200
400
600
800
1000
Voltaje de PMT Figura 8. Los voltajes de PMT se pueden aumentar hasta un intervalo que provea una CV menor. Configuración Diaria Se pueden usar estándares Tipo 11, tales como partículas de referencia, para monitorear la intensidad de la señal, la separación de partículas moderadamente brillantes y tenues y la resolución de la señal. Las perlas con fluoróforo homologado proporcionan una herramienta de compensación y un medio para saber si el instrumento es capaz de detectar tales longitudes de onda. Sin embargo, las perlas con fluoróforo homologado no tienen la uniformidad de fluorescencia requerida para medir CV. Basándose en el desempeño óptico del instrumento, los CV se miden mejor usando perlas duras teñidas con brillo moderado y tenue tales como micropartículas teñidas con coumarina que se muestran fluorescentes en un intervalo espectral amplio. Resulta fácil confundir los controles de valoración con los controles instrumentales. Las perlas proveen una fluorescencia uniforme y constante que no es posible obtener con células y, por consiguiente, son útiles para monitorear el desempeño del instrumento. Por esta razón, resulta mejor emplear una preparación de células para control de proceso a fin de verificar la compensación y la aceptabilidad del fluoróforo. Los ajustes que se realizan al instrumento para configurarlo diariamente son, por lo general, los mismos que se usan para los ensayos. No todas las valoraciones se pueden usar con la misma configuración instrumental, y no siempre es necesario llevar a cabo estas actividades para cada configuración instrumental a menos que la validación así lo requiera. Las actividades diarias incluyen configurar el instrumento de manera uniforme día por día, usar una amplia variedad de perlas de intensidad tenue a moderada y monitorear parámetros clave, incluida la intensidad de fluorescencia de las perlas (absoluta y CV%), valores de PMT, temperatura, potencia y longitud de onda del láser. CONTROL Y GARANTÍA DE CALIDAD DE LA VALORACIÓN La configuración instrumental para una valoración específica debe establecerse para demostrar que todas las poblaciones celulares pueden identificarse en gráficas bivariables para fluorescencia y dispersión de luz. Es de suma importancia que las poblaciones positivas estén en escala y apropiadamente compensadas. Esto es crítico cuando las células se excitan con láseres rojos, los cuales no provocan que las células generen autofluorescencia significativa. Por esta razón, es importante verificar que la configuración sea adecuada para que la población positiva se encuentre en la parte superior de su escala de fluorescencia, puesto que puede ser extremamente difícil identificar las células negativas. La compensación de fluorescencia es un ajuste crítico. Los instrumentos digitales ofrecen ajustes objetivos fuera de línea durante el análisis; asimismo, se encuentran disponibles instrucciones detalladas para la configuración adecuada de la compensación. El uso de células o perlas de captura teñidas con un solo fluorocromo unido a anticuerpos es, por lo general, la mejor
880 (1027) Citometría de Flujo / Información General
USP 39
metodología, aunque las mezclas de perlas marcadas con fluorocromo específicas también pueden funcionar bien para compensar la adquisición y el análisis multicolor. CONTROLES DE ISOTIPOS Un control de isotipo es un control negativo de anticuerpo que no debe reaccionar con el antígeno de interés y que es el mismo isotipo que el anticuerpo de prueba. La proteína de mieloma o la inmunoglobulina que no tiene especificidad para las especies que se analizan, tienen la misma clase y subclase de cadena lg a medida que el anticuerpo de prueba se conjuga con un fluorocromo idéntico al del anticuerpo de prueba. Resulta ideal que la unión sea mínima o nula cuando se usa el control de isotipo en paralelo con la prueba. Aunque la unión idiotípica no específica ocurre con frecuencia, ésta es independiente del isotipo del anticuerpo. Esto muy probablemente se relaciona con otras diferencias en la química del anticuerpo y puede ser especialmente problemático con ensayos de detección de eventos poco comunes, tales como aquellos para ensayos de células madre hematopoyéticas en sangre periférica. CONTROLES DE FLUORESCENCIA MENOS UNO Los controles de fluorescencia menos uno (FMO, por sus siglas en inglés) se usan para controlar la tinción no específica durante un ensayo multicolor. Después de que sea establecida la compensación, se analiza un tubo que contiene todos los anticuerpos marcados con fluorocromo, excepto por uno. Si la compensación se ha establecido de manera apropiada, cualquier fluorescencia positiva en el parámetro correspondiente al anticuerpo marcado con fluorocromo faltante es ocasionada por tinción no específica y puede ser indicativa de un exceso de anticuerpos o la degradación de los colorantes en tándem relacionados. Aunque los controles de FMO son muy útiles para estimar la sensibilidad de un detector particular en el contexto de otros reactivos, los controles no toman en cuenta la unión específica que puede presentarse con la adición del anticuerpo de prueba. El uso de los tubos de control de FMO es más apropiado para resolver problemas o para establecer un nuevo cóctel de reactivos multicolor. CONTROLES DURANTE EL PROCESO Los controles durante el proceso, también conocidos como estándares de aptitud del sistema, toman en cuenta la preparación de la muestra y la adquisición de datos. Estos pueden incluir células de control conservadas, líneas de células o líneas de células comercialmente disponibles, tales como sangre periférica común. Asimismo, los controles durante el proceso se pueden usar para analizar nuevos lotes de reactivos de anticuerpos contra lotes antiguos. CONTROLES BIOLÓGICOS Cuando se comparan células tratadas o estimuladas con células sin tratar o sin estimular, en ocasiones, las células sin tratar o sin estimular pueden representar el control más útil para establecer un límite positivo o negativo. No obstante, el uso de controles de isotipo también puede aplicarse a estas situaciones, debido a que la estimulación puede llevar a la regulación creciente de los receptores para Fe, lo que a su vez conlleva a un aumento en la tinción de fondo, cuya presencia puede dilucidarse mediante un control de isotipo.
APLICACIONES DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO PARA MUESTRAS CELULARES Y PRODUCTOS DE TERAPIA CELULAR Se ha desarrollado una gran variedad de aplicaciones de citometría de flujo para investigación, diagnóstico clínico y monitoreo, desarrollo de fármacos y caracterización de productos celulares y evaluación de su calidad (es decir, controles para la liberación del lote). Las aplicaciones clínicas tradicionales incluyen el monitoreo de la enfermedad por VIH y el diagnóstico y monitoreo de leucemia y linfoma. Los laboratorios de investigación farmacéutica y académica han ampliado la aplicación de la citometría de flujo desde inmunofenotipificación hasta ensayos celulares funcionales, así como ensayos multiplex basados en microesferas capaces de medir parámetros funcionales múltiples en células individuales. Los ensayos funcionales de la actualidad incluyen ensayos que permiten el estudio directo del estado de activación celular midiendo la producción de citoquinas intracelulares o la secreción de quimioquinas o citoquinas, usando un ensayo en emparedado de unión a ligandos en microesferas.
lnmunofenotipificación La citometría de flujo permite caracterizar subtipos de leucocitos marcando células con anticuerpos monoclonales conjugados con fluorocromos. El sistema de grupo de diferenciación, CD, define anticuerpos monoclonales que reconocen antígenos únicos en la superficie celular. Muchas aplicaciones clínicas toman ventaja de las capacidades de la citometría de flujo para medir múltiples antígenos CD en miles de células individuales.
USP 39
Información General/ (1027) Citometría de Flujo 881
ENUMERACIÓN DE CD4 Al inicio de la década de 1980, los investigadores descubrieron que el VIH infecta las células T CD4 positivas y que el recuento de células T CD4 de la sangre periférica del paciente es un indicador útil del estado inmune. La enumeración de CD4 se ha convertido en la prueba de diagnóstico más comúnmente usada en pacientes infectados con VIH para determinar la necesidad de terapia antiretroviral (ARV) y para monitorear la efectividad de los fármacos ARV. Los recuentos de subconjuntos de células T a menudo se expresan en términos de células por microlitro y como porcentaje de linfocitos, usando un reactivo estandarizado, software y sistema de instrumentos. LEUCEMIA Y LINFOMA El análisis por citometría de flujo multidimensional permite identificar poblaciones de células aberrantes en la médula ósea, en el tejido linfático y en la sangre periférica de pacientes con leucemia o linfoma. Esto se logra mediante cócteles de anticuerpos monoclonales pertinentes a la oncología o para linajes específicos. Mediante fluoróforos óptimos y configuraciones ópticas/electrónicas mejoradas en instrumental de la citometría de flujo, se pueden detectar marcadores celulares adicionales para identificar de manera más precisa fenotipos de células de leucemia o linfoma y para mejorar la evaluación del médico sobre el estado del paciente. Los métodos de detección de eventos poco comunes han mejorado la capacidad de detectar enfermedades residuales mínimas. CÉLULAS DENDRÍTICAS Las células dendríticas (DC, por sus siglas en inglés) actúan como células que presentan antígenos que pueden influenciar la naturaleza y potencia de la respuesta inmune a antígenos específicos. Este hallazgo ha llevado al desarrollo de las DC como terapias celulares para cáncer, enfermedades infecciosas y enfermedades autoinmunes. Las DC tienen morfologías y fenotipificaciones diversas y se pueden derivar de diferentes tipos de células. Es posible segregar dos linajes de DC principales, conocidas como DC mieloides y plasmocitoides, basándose en su expresión de CDl 1c y CDl 23, respectivamente. Asimismo, la expresión de las moléculas coestimulantes CD80 y CD86 se puede monitorear para determinar el estado de madurez de las DC. CÉLULAS MADRE Y PROGENITORAS La expresión de CD34 a menudo se usa para caracterizar las células madre hematopoyéticas (HSC, por sus siglas en inglés) en sangre periférica, sangre del cordón, médula ósea y preparaciones de HSC purificadas de estas fuentes. La identificación y enumeración por citometría de flujo de HSC es posible mediante el uso de anticuerpos monoclonales específicos para el epítope CD34 clase 111, junto con otros reactivos bien caracterizados, software de análisis y protocolos. La combinación de anticuerpos anti-CD45, anti-CD34 y un colorante de viabilidad tal como 7-MD se usa ampliamente en aplicaciones clínicas. El creciente interés por el desarrollo de terapias celulares a partir de fuentes de tejido embriónico, fetal y adulto ha llevado al uso de una amplia variedad de marcadores convencionales fenotípicos novedosos para caracterizar células de origen y su progenie más diferenciada. Se están desarrollando ensayos por citometría de flujo como parte de baterías de ensayos para evaluar productos celulares diferenciados derivados de fuentes de células madre pluripotentes. Estos ensayos ayudan a definir números apropiados y tipos de poblaciones celulares deseadas, además de que ayudan a detectar células no deseadas tales como células pluripotentes residuales que pueden ser tumorigénicas en el receptor. LEUCOCITOS La leucoreducción de hemoderivados es un proceso que se usa para producir hemoderivados con un contenido de leucocitos residuales de menos de 5 x 106 por unidad. Los datos clínicos sugieren que las reacciones febriles no hemolíticas posteriores a la transfusión se pueden evitar mediante leucodepleción. La leucodepleción también previene la aloinmunización a antígenos HLA en pacientes que requerirán repetidamente transfusión de hemoderivados. La citometría de flujo se usa a menudo para cuantificar la contaminación leucocitaria en hemoderivados sometidos a leucodepleción. PLAQUETAS La citometría de flujo es un método útil y rápido para diagnosticar muchos trombocitopatías primarias asociadas con defectos en glicoproteínas estructurales o funcionales (p.ej., expresión anormal de gpllb/llla en trombastenia de Glanzmann o gplb en el síndrome de Bernard-Soulier). El uso de anaranjado de tiazol, un colorante fluorescente que se une al ARN, permite la cuantificación de plaquetas inmaduras (plaquetas reticuladas). El recuento de plaquetas reticuladas se puede usar para determinar la velocidad de trombopoyesis. Esta medición puede separar las trombocitopenias inexplicables en aquellas con un aumento en la destrucción y aquellas con defectos en la producción de plaquetas.
882 (1027) Citometría de Flujo/ Información General
USP 39
ERITROCITOS Las mujeres Rhesus D negativo reciben inmunoglobulina Rh profiláctica para prevenir la aloinmunización de eritrocitos (RBC) Rh(D)+. Si se sospecha hemorragia fetomaterna, la sangre de la madre se analiza para determinar la presencia y cantidad de RBC fetales, usando anticuerpos contra el antígeno Rh(D) o la hemoglobina F marcados con fluorescencia. El recuento de reticulocitos ayuda a determinar si la médula ósea responde adecuadamente a la necesidad del cuerpo de RBC y ayuda a clasificar diversos tipos de anemia. Los recuentos de reticulocitos se basan en la identificación de ribosomas y ARN residuales en los RBC inmaduros sin núcleo. La enumeración de reticulocitos por citometría de flujo y su discriminación de RBC maduros emplea colorantes fluorescentes que se unen al ARN residual (p.ej., anaranjado de tiazol).
lnmunoensayos Basados en Perlas Los ensayos por citometría de flujo basados en microesferas multiplex combinan una serie de partículas de tamaño discreto y/o intensidad de fluorescencia con pares de anticuerpos homologados que permiten la detección simultánea de analitos solubles múltiples en un citómetro de flujo. La capacidad del citómetro de flujo para discriminar partículas basándose en el tamaño y color permite determinar múltiples resultados de un solo tubo o pocillo. Muchos investigadores emplean tales ensayos para medir quimioquinas o citoquinas, kinasas, y anticuerpos anti-HLA secretados.
Ensayos de Proliferación INCORPORACIÓN DEL COLORANTE EN EL ADN La Bromodesoxiuridina (BrdU) es un análogo de timidina que se puede incorporar en el ADN de las células durante la fase S y que se puede detectar posteriormente usando anticuerpos monoclonales marcados específicos. Mediante la aplicación de pulsos a un cultivo de células estimulado con BrdU, es posible identificar a las células que han proliferado (pasado a través de la fase S) durante el tiempo del pulso. Este ensayo se ha convertido en una alternativa útil a la incorporación de 3 H-timidina como una medición de proliferación debido a su radioactividad nula y a que puede identificar fenotipos de células que proliferan usando marcadores múltiples y citometría de flujo. INCORPORACIÓN DEL COLORANTE EN PROTEÍNAS CELULARES O EN LA MEMBRANA CELULAR Loe colorantes para el rastreo de células tales como succinimidil éster de carboxifluoresceína (CFSE, por sus siglas en inglés) y PKH26 han demostrado ser útiles en la evaluación de la proliferación celular. El CFSE se une de manera covalente al citosol y a las proteínas de la membrana, mientras que el PKH26 se une de manera no covalente a las membranas celulares. Cuando las células se dividen, el marcado con CFSE/PKH26 se divide equitativamente entre las células hijas, las cuales, por consiguiente, tienen la mitad de fluorescencia que las células paternas. La fluorescencia de cada célula se divide adicionalmente por la mitad con cada generación subsiguiente. Esta propiedad hace de los ensayos con CFSE/PKH26 útiles, no solo para determinar la fracción de células que han proliferado en un cultivo estimulado, sino también, en condiciones ideales, el número de generaciones que han transcurrido. De esta manera, se pueden calcular las frecuencias precursoras de poblaciones pequeñas que han proliferado durante varios días en cultivo.
Ensayos Funcionales EXPRESIÓN DE CITOQUINAS INTRACELULARES Las técnicas de marcado de superficies celulares e intracelulares han sido aplicadas a la identificación de subconjuntos de células con características funcionales específicas. Por ejemplo, una estimulación breve de las células, tales como PBMC con antígenos proteicos o peptídicos, puede resultar en la expresión de los marcadores y citoquinas de activación, los cuales puede medirse posteriormente junto con otros marcadores fenotípicos en la superficie de las células que responden. El uso de un inhibidor de secreción tal como brefeldina A o monensina permite la acumulación intracelular de citoquinas. Posteriormente, las células se fijan, permeabilizan y detectan por un método de citrometría de flujo. Dichos ensayos son útiles para monitorear subpoblaciones de células T que responden a vacunas, agentes de enfermedades infeccionas o cáncer. Las propiedades funcionales de otros tipos de células, incluidos monocitos, DC y células NK, también pueden monitorearse usando ensayos funcionales con estímulo apropiado. QUI NASAS Los intermediarios fosforilados de la activación celular se pueden identificar usando anticuerpos fosfoespecíficos y citometría de flujo. Estos reactivos son útiles para mapear mecanismos de señalización intracelulares, a menudo en el contexto de otros marcadores fenotípicos de superficie celular. Por lo tanto, la citometría de flujo multicolor puede proveer una evaluación de
USP 39
Información General/ (1027) Citometría de Flujo 883
células individuales en estados de activación intracelular en poblaciones de células complejas. Estos ensayos pueden ser útiles para la detección de estados de señalización alterados en células cancerosas o en la dirección terapias apropiadas basadas en las propiedades de señalización de las células tumorales de un paciente. APOPTOSIS La apoptosis, comúnmente descrita como muerte celular, es el proceso de muerte celular ocasionada por procesos fisiológicos regulados. El proceso apoptótico se presenta como una serie de cambios morfológicos, bioquímicos y moleculares en la célula y se puede iniciar mediante estímulos externos o internos. Un evento central durante la apoptosis es la activación de caspasas, una familia de enzimas proteolíticas. Las caspasas se sintetizan como proenzimas inactivas y se activan mediante otras caspasas o moléculas similares. Éstas forman una cascada que puede llevar a la ruptura de varias proteínas citoplasmáticas o nucleares. Se ha informado que la caspasa-3 es crucial para el proceso apoptótico, la cual se activa durante las etapas tempranas de la apoptosis. Los métodos por citometría de flujo para detectar células apoptóticas incluyen la medición de la morfología, cambios en la estructura de la membrana, ruptura del ADN por endonucleasas y potencial de la membrana mitocondrial. Se han usado para este propósito sustratos de caspasas naturales o artificiales o anticuerpos contra la forma activada de la enzima. VIABILIDAD DE LA CÉLULA La citometría de flujo a menudo se usa para discriminar células vivas de células muertas. El principio de exclusión con colorante de ácido nucleico es la base de esta aplicación. Un colorante de ácido nucleico tal como PI o 7-AAD se agrega a las células en suspensión. Durante el análisis por citometría de flujo, las células que muestran fluorescencia por encima del fondo se consideran no viables debido a que no pueden excluir el colorante, el cual presenta fluorescencia cuando se une al ADN celular.
Ensayos de lnmunoglobulinas por Citometría de Flujo COMPATIBILIZACIÓN CRUZADA POR CITOMETRÍA DE FLUJO Antes del transplante de órganos, se realiza la compatibilización cruzada por citometría de flujo (FCXM, por sus siglas en inglés) en los receptores para detectar anticuerpos antiHLA que puedan ocasionar el rechazo. Los anticuerpos antiHLA se detectan incubando leucocitos con determinado HLA, líneas de células B o perlas recubiertas con antígenos HLA con la muestra de suero, seguido por anticuerpos marcados con fluorescencia de inmunoglobulina antihumana. Los leucocitos se inmunotiñen para identificar células T y B para distinguir entre la actividad de clase 1y 11 de anti-HLA, respectivamente. Además, también ha aumentado el uso del análisis de donaciones de sangre para detectar anticuerpos anti-HLA para identificar donantes cuyos hemoderivados pueden presentar un mayor riesgo de ocasionar en los receptores lesiones pulmonares agudas relacionadas con la transfusión (TRALI, por sus siglas en inglés). ANTICUERPOS NEUTRÓFILOS HUMANOS Los anticuerpos contra neutrófilos humanos (anti-HNA, por sus siglas en inglés) pueden ocasionar neutropenia y se han relacionado con las TRALI. Las neutropenias autoinmunes se pueden desarrollar en pacientes con trastornos autoinmunes tales como síndrome de Felty, lupus eritematoso sistémico y tiroiditis de Hashimoto. La ausencia de anticuerpos anti-HNA estrecha el diagnóstico diferencial a causas no inmunes tales como deficiencia en la médula ósea, mielodisplasia o procesos de infiltración medular. La citometría de flujo puede detectar anticuerpos antineutrófilos y puede confirmar el origen de la neutropenia o las TRALI. ANTICUERPOS CONTRA PLAQUETAS HUMANAS Los anticuerpos contra plaquetas humanas (anti-HPA, por sus siglas en inglés) se detectan mediante ensayos directos o indirectos de inmunoglobulinas asociadas con plaquetas basados en citometría de flujo. En la púrpura trombocitopénica autoinmune, no se encuentran con tanta frecuencia anticuerpos libres circulantes (en el suero) como los anticuerpos unidos a plaquetas. En los casos de formación de aloanticuerpos, los anticuerpos del suero se pueden detectar sin evidencia de anticuerpos asociados con plaquetas.
RESOLUCIÓN DE PROBLEMAS EN ENSAYOS DE CITOMETRÍA DE FLUJO Cuando se desarrolla un método de citometría de flujo, se debe determinar primero el propósito final del ensayo. Para ensayos con propósitos de investigación, puede ser difícil estandarizar las muestras de células, reactivos y protocolos. Los ensayos destinados para diagnóstico de pacientes o para calificar un producto celular para su liberación antes de la administración a un
884 (1027) Citometría de Flujo / Información General
USP 39
paciente requieren de una estandarización más estricta de ensayos y muestras. Los requisitos reglamentarios, el tipo y etapa de investigación clínica y el propósito final del ensayo determinan el nivel de rigor requerido para el ensayo. El desarrollo de ensayos por citometría de flujo debe incluir el establecimiento y calificación de los parámetros y límites de tinción, manipulación, instrumental y análisis. Si se asume que el método ha sido desarrollado adecuadamente, que los operadores están bien capacitados, que el instrumento se ha ajustado de manera adecuada, que se han aplicado los controles apropiados para el ensayo y el instrumental y, si fuera necesario, que se han llevado a cabo validaciones del instrumental y del método, los operadores pueden toparse con instancias en las que será necesario resolver ciertas problemáticas. Los desafíos más comunes de la citometría de flujo son la alta fluorescencia o fondo con dispersión lateral, tasas anormales de eventos, alta intensidad de fluorescencia y baja señal de fluorescencia. A continuación se describen metodologías para disminuir estos problemas.
Alto Contenido de Partículas de Fondo La manipulación de células en exceso (p.ej., demasiado vórtice), la fijación inadecuada y la contaminación bacteriana de las células pueden incrementar las partículas de fondo. Asimismo, si el umbral frontal del instrumento se configura demasiado bajo, los desechos celulares se detectarán como eventos. La manipulación suave de las células, los reactivos frescos y la configuración adecuada del instrumental ayudan a garantizar perfiles de dispersión lateral uniformes.
Alta Fluorescencia de Fondo La alta intensidad de la fluorescencia se puede atribuir a una concentración de anticuerpos en exceso, al lavado inadecuado de las células o al bloqueo inadecuado del receptor Fe. Además, una ganancia inapropiadamente alta del instrumento PMT puede resultar en un fondo elevado. La concentración de anticuerpos y la densidad celular uniformes, el lavado y bloqueo adecuados y la configuración apropiada del instrumento ayudarán a evitar una fluorescencia de fondo anormalmente elevada
Tasa Alta de Eventos Las tasas anormalmente altas de eventos a menudo se atribuyen a densidades altas de células durante la tinción del anticuerpo o en la muestra de células finales. El mezclado inadecuado y la sedimentación de la muestra de células puede resultar en tasas altas de eventos celulares, al igual que el uso de ventanas inapropiadas o poco uniformes.
Tasa Baja de Eventos La aglomeración celular, las densidades celulares finales bajas, los bloqueos en los fluidos del instrumento o el uso de ventanas inapropiadas pueden, generalmente, resultar en una detección anormalmente baja de eventos. La limpieza, el mantenimiento y la configuración adecuadas del instrumento, así como los protocolos de tinción uniformes, pueden lograr resultados uniformes con sensibilidad suficiente.
Alta Intensidad de Fluorescencia Al igual que con alta fluorescencia del fondo, una alta fluorescencia celular promedio puede resultar de una cantidad en exceso de anticuerpos marcados, del lavado de células inadecuado o poco uniforme o del bloqueo inadecuado. La inclusión de detergente en la solución amortiguadora de lavado, especialmente durante la tinción intracelular, puede ayudar a prevenir la unión no específica de anticuerpos.
Intensidad Débil de Fluorescencia Son muchos los factores que pueden generar una fluorescencia con intensidad débil. Los parámetros del instrumento tales como alineación deficiente del láser, compensación inadecuada, configuración inapropiada, configuraciones de ganancia poco uniformes y respuesta débil del láser, pueden afectar negativamente la intensidad de la fluorescencia. Además, las cuestiones relacionadas con la fisiología celular o la preparación de reactivos, tales como concentración insuficiente de anticuerpos, antígeno blanco lábil o secretado, reactivos de baja calidad o almacenados inadecuadamente (lo que resulta en decaimiento del fluorocromo) o antígeno blanco inaccesible, pueden resultar en una señal débil. El desarrollo adecuado de ensayos, el mantenimiento apropiado del instrumental y el cumplimiento con protocolos calificados pueden mejorar la intensidad de la señal de fluorescencia. La citometría de flujo permite a los investigadores analizar células para una gran cantidad de aplicaciones diversas. El número y alcance de los ensayos inmunofenotípicos y funcionales está en aumento. Es posible estudiar la presencia de proteínas, así como los procesos celulares y la detección de poblaciones poco comunes o anormales. El lector debe referirse a la literatura técnica para obtener detalles sobre la aplicación y el método.
USP 39
Información General/ (1030) Capítulos de Valoraciones Biológicas 885
REFERENCIAS Coligan JE, Kruisbeek AM, Margulies DH, Shevach EM, Strober W. Current Protocols in Jmmunology. Fourth ed. Hoboken, NJ: ]ohn Wiley and Sons; 1994. Shapiro HM. Practica/ Flow Cytometry. Fourth ed. Hoboken, NJ; John Wiley and Sons; 2003.
,,
,,
,,
(1030) CAPITULOS DE VALORACIONES BIOLOGICAS-INFORMACION GENERAL Y GLOSARIO El compendio USP-NF contiene cuatro capítulos generales relacionados con el desarrollo, validación y análisis de valoraciones biológicas: Diseño y Análisis de Va/oraciones Biológicas (111 ), Diseño y Desarrollo de Valoraciones Biológicas (1032), Validación de Va/oraciones Biológicas (1033) y Análisis de Valoraciones Biológicas (1034). Este nuevo capítulo propuesto, Capítulos de Va/oraciones Biológicas-Información General y Glosario (1030), provee información general y algo de material común para los capítulos (1032), (1033) y (1034), e incluye un glosario de términos relacionados con valoraciones biológicas. El conjunto de capítulos de la USP sobre valoraciones biológicas se enfoca en valoraciones de potencia relativa. Estas valoraciones reconocen la variabilidad inherente en los sistemas de pruebas biológicas (tanto en animales como en células) que se puede observar entre laboratorios y de un día a otro, la cual compromete la confiabilidad de una medida absoluta de la potencia. En las valoraciones de potencia relativa, la actividad biológica de un material de Prueba se compara con la actividad de un Estándar en un sistema de valoración en el que el uso de un Estándar reduce la influencia de la variabilidad inherente del sistema en la estimación de la potencia relativa. Las valoraciones de potencia relativa también se enfocan en la variabilidad importante relacionada con la respuesta debida a las diferencias entre los materiales de Prueba y Estándar (si existiese dicha diferencia). Se espera que la Prueba se comporte como una dilución o concentración del Estándar y debe presentar la propiedad de similitud. Aunque están destinados para las valoraciones biológicas de potencia relativa, los principios y prácticas desarrollados en estos capítulos pueden tener una aplicación más amplia-por ejemplo, en inmunoensayos y valoraciones por unión de receptor-ligando usadas para determinar la potencia relativa. El capítulo (1032) provee información para científicos que se encuentren desarrollando una nueva valoración biológica. Conforme a lo mostrado en la Tabla 1, el capítulo abarca una variedad de actividades realizadas durante el ciclo de vida de la valoración, con énfasis en el desarrollo que lleva a la validación, incluyendo la selección del sistema de prueba y las consideraciones del diseño (p.ej., diseño de las placas (plate layout)). Asimismo, el capítulo trata estrategias de análisis de datos que deben considerarse durante el desarrollo (antes de la validación) pero que, de rutina, no se tratan posteriormente. Entre dichas estrategias está la selección de un esquema de ponderación, transformación de datos, si los hubiere, y la selección de un modelo estadístico. Los detalles estadísticos que sustentan estas secciones del capítulo (1032) se encuentran en el capítulo (1034). Tabla 1. Secciones Prlnclpales del capítulo Diseño y Desarrollo de Valoraciones Biológicas (1032) Título de la Sección
Sección 1
Introducción
1.1 1.2 2
Propósito
y Alcance
Partes Interesadas Aptitud de las Valoraciones Biológicas para Su Uso Previsto
2.1
Desarrollo del Proceso
2.2
Caracterización del Proceso
2.3
Liberación de Productos
2.4
Productos Intermedios del Proceso
2.5
Est.:Jbilidad
2.6
Calificación de Reactivos
2.7 3
Integridad de los Productos Aspectos Fundamentales de la Valoración Biolóqica
3.1
Valoraciones Biológicas In Vivo
3.2
Valoraciones Biológicas Ex Vivo
3.3
Valoraciones Biológicas (Basadas en Células) In Vitro
3.4 4
Estándar Aspectos Estadísticos de los Elementos Fundamentales de las Valoraciones Biológicas
4.1
Datos
4.2
Suposiciones
4.3
Heteroqeneidad de la Varianza, Ponderación
y Transformación
886 (1030) Capítulos de Valoraciones Biológicas / Información General
USP 39
Tabla 1. Secciones Principales del capítulo Diseño y Desarrollo de Valoraciones Biológicas (1032) (Continuación) Título de la Sección
Sección 4.4
Normalidad
4.5
Linealidad de los Datos de Concentración-Respuesta
4.6
Modelos Comunes de Valoración Biológica
4.7
Análisis de Aptitud
4.8
Valores Aberrantes
4.9
Efectos Fijos y Aleatorios en Modelos de Respuesta de Valoraciones Biológicas
5
Etapas del Proceso de Desarrollo de la Valoración Biológica Diseño: Planificación de la Valoración, Distribución por Bloques y Aleatorización
5.1 5.2
Desarrollo
5.3
Análisis de Datos durante el Desarrollo de la Valoración
5.4
Validación de la Valoración Biológica
5.5
Mantenimiento de Valoraciones Biológicas
El capítulo (1034) provee información sobre los análisis de datos apropiados para las valoraciones biológicas de potencia relativa comunes, incluyendo modelos de líneas paralelas, de cociente de pendientes, de curvas paralelas y cuantales. El capítulo incluye además análisis que sustentan la evaluación de la aptitud del sistema y de la muestra, y métodos para combinar resultados de valoraciones independientes (ver la Tabla 2). Este capítulo es el más avanzado estadísticamente de los tres capítulos, pero está diseñado para su uso por parte de biólogos y estadísticos. El material conceptual requiere únicamente de experiencia estadística mínima. Las secciones sobre métodos requieren una experiencia estadística al nivel del capítulo Datos AnalíticosInterpretación y Tratamiento (101 O) y estar familiarizado con la regresión lineal. Tabla 2. Secciones Principales del capítulo Análisis de Valoraciones Biológicas (1034) Título de la Sección
Sección 1
Introducción
2
Aspectos Generales del Análisis de los Datos de la Valoración Biológica
3
Modelos de Análisis
3.1
Respuestas de Valoración Cuantitativas y Cualitativas
3.2
Generalidades de los Modelos para Respuestas Cuantitativas
3.3
Modelos de Líneas Paralelas para Respuestas Cuantitativas
3.4
Modelos No Lineales para Respuestas Cuantitativas
3.5
Modelos de Concentración-Respuesta de Cociente de Pendientes
3.6
Valoraciones Dicotómicas (Cuantales)
4
Intervalos de Confianza
4.1
Combinación de Resultados de Múltiples Valoraciones
4.2
Combinación de Valoraciones Independientes (Métodos para Intervalos de Confianza Basados en Muestras)
4.3
Métodos Basados en Modelos Fuentes Adicionales de Información
5
El propósito del capítulo (1033) es dar continuación a los capítulos (1032) (desarrollo de valoraciones) y (1034) (desarrollo de planos para el análisis de datos). En otras palabras, el capítulo (1033) supone una valoración biológica completamente desarrollada (incluyendo un plano para el análisis de datos y al menos valores tentativos para los criterios de aptitud del sistema y de la muestra, y el formato de la valoración biológica) y provee pautas sobre la validación de dicha valoración. El capítulo trata las características de validación pertinentes a las valoraciones biológicas de potencia relativa y provee mayores detalles sobre los métodos estadísticos usados en la validación que el capítulo Validación de Procedimientos Farmacopeicos (1225). Aunque los principios y prácticas desarrollados en el capítulo (1033) están destinados para las valoraciones biológicas de potencia relativa, pueden tener una aplicación más amplia. El capítulo enfatiza las metodologías de validación que proveen flexibilidad para adoptar nuevos métodos de valoración biológica, nuevos medicamentos biológicos, o ambos (ver la Tabla 3). º 1pa 1es d e 1cap1tu ' 1o Va Id ' de Va Ioraciones BioI'ogicas (1033) Ta bl a 3. Secciones Prmc i acion
Sección 1
Título de la Sección Introducción
2
Fundamentos de la Validación de la Valoración Biológica
2.1
Protocolo de Validación para Valoraciones Biológicas
2.2
Documentación de los Resultados de la Validación de la Valoración Biológica
2.3
Diseño de Validación para Valoraciones Biológicas
2.4
Estrategias de Validación de las Características de Desempeño de la Valoración Biológica
USP 39
Información General/ (1030) Capítulos de Valoraciones Biológicas 887
Tabla 3. Secciones Principales del capítulo Validación de Valoraciones Biológicas (1033) (Continuación) Sección 2.5
Título de la Sección Criterios de Aceptación Propuestos para la Validación
2.6
Mantenimiento de la Valoración
2.7
Consideraciones Estadísticas
3.1
Precisión Intermedia
Ejemplo de Validación de una Valoración Biológica
3
3.2
Exactitud Relativa
3.3
Intervalo
3.4
Uso de los Resultados de la Validación para Caracterizar una Valoración Biológica
3.5
Confirmación de la Precisión Intermedia
4
Fuentes Adicionales de Información
Apéndice
Medidas de Localización
y Revalidación
y de Dispersión para Variables de Distribución Logarítmica Normal
GLOSARIO Este glosario corresponde a valoraciones biológicas y provee una perspectiva farmacopeica que es congruente con el conjunto de capítulos sobre valoraciones biológicas del compendio USP-NF; asimismo, se considera complementario al uso autorizado previo y ofrece un enfoque útil para el contexto de las valoraciones biológicas. En muchos casos, los términos aquí citados son de uso común, aunque carezcan de documentación, o se definen en el capítulo Validación de Procedimientos Farmacopeicos (1225) y en la Pauta Q2(Rl) de la lnternational Conference on Harmonization (Conferencia Internacional sobre Armonización o ICH), Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology (Validación de Procedimientos Analíticos: Texto y Metodología).1 (El capítulo (1225) y la Pauta Q2(Rl) de la ICH concuerdan en las definiciones.) Este Glosario pretende apegarse a estos usos precedentes, y se proveen notas cuando exista alguna diferencia basada en el contexto de la valoración biológica. Las definiciones del capítulo (1225) y de la pauta Q2(Rl) de la ICH se identifican, por ejemplo, mediante"(l 225)" si se tomó tal como se encuentra, o "adaptado del capítulo (1225)" si se realizó alguna modificación menor para su aplicación en las valoraciones biológicas. La mayoría de las definiciones se acompañan con notas que proveen mayor detalle sobre el contexto de las valoraciones biológicas. Los términos se organizan alfabéticamente dentro de cinco secciones por temas: l. Términos generales relacionados con las valoraciones biológicas 11. Términos relacionados con la realización de una valoración biológica 111. Términos relacionados con la precisión y la exactitud IV. Términos relacionados con la validación V. Términos relacionados con el diseño y análisis estadístico La Tabla 4 presenta cada término y la sección del Glosario en la que se puede encontrar. Tabla 4. Términos listados en el Glosario Término
Sección
Término
Sección
Exactitud
111
Modelo de efectos mixtos
Análisis de varianza (ANOVA)
V
Generación de modelos estadísticos
V
Procedimiento analítico [adaptado de Q2(Rl )]
1
Anidado
V
Valoración
1
Fuera de la especificación (005, por sus siglas en inglés)
11
Conjunto de datos de la valoración
1
Paralelismo (de las curvas de concentración-respuesta)
V
Valoración biológica
1
Parcialmente cruzado
V
Valoración biológica
1
Estimación puntual
V
Distribución en bloques
V
Potencia [Título 21 del CFR 600.3(s)]
Diseño completo por bloques
V
Precisión
V
1 111
Intervalo de confianza
V
Determinaciones pseudo-repetidas
V
Cruzado (y parcialmente cruzado)
V
Valor P (probabilidad de significancia)
V
Diseño de experimentos (DOE, por sus siglas en inglés) [ICH Q8(R2)]
V
Límite de cuantificación (límite inferior de cuantificación; adaptado del capítulo (1225))
IV
Linealidad de las diluciones (adaptado del capítulo (1225))
IV
Efecto aleatorio
V
Error aleatorio
111
Valoraciones biológicas directas
1
Prueba de equivalencia
V
Factor aleatorio
V
Tipos de errores
111
Aleatorización
V
1 Disponible en: http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Quality/Q2_Rl /Step4/Q2_Rl _Guideline.pdf. Consultada el 29 de marzo de 2012.
USP 39
888 (1030) Capítulos de Valoraciones Biológicas / Información General
Tabla 4. Términos listados en el Glosario (Continuación) Término
Sección V
Término
Sección
Intervalo (adaptado del capítulo (1225))
IV
Diseño experimental
V
Sesgo relativo
111
Unidad experimental
V
Potencia relativa
1
Factor
V
Repetibilidad ((1225))
111
Diseño factorial
V
Determinaciones repetidas
V
Efecto fijo
V
Valor de informe
1
Factor fijo
V
Reproducibilidad (1225)
111
Variabilidad del formato
111
Robustez (adaptado del capítulo (1225))
IV
Cuadrado medio esperado
Formato de la valoración biológica
11
Corrida
1
Diseño factorial fraccionado
V
Aptitud de la muestra
11
Diseño factorial completo
V
Probabilidad de significancia
V
Modelo lineal general
V
Preparaciones similares
1
Coeficiente geométrico de variación
111
Similitud (algebraica)
1
Desviación estándar geométrica (GSD, por sus siglas en inglés)
111
Especificidad (1225)
111
Diseño en bloques incompleto
V
Error estándar de estimación
V V
Independencia
V
Control estadístico del proceso
Valoraciones biolóqicas indirectas
1
Aptitud del sistema
11
1nteracción
V
Error sistemático
111
Precisión intermedia (adaptado del capítulo (1225))
111
Determinaciones repetidas verdaderas
V
Nivel
V
Sesgo por truncado
111
Linealidad de las diluciones (adaptado del capítulo (1225))
IV
Error tipo 1
V
Distribución logarítmica normal
V
Error tipo 11
V
Límite inferior de cuantificación (adaptado del capítulo (1225))
IV
Validación de la valoración
IV
Cuadrado medio
V
Análisis de los componentes de la varianza
V
l. Términos Generales Relacionados con las Valoraciones Biológicas Procedimiento analítico [adaptado de Q2(R1)]: Descripción detallada de las etapas necesarias para realizar el análisis. NOTAS-1. El procedimiento puede incluir, entre otros, la preparación de la muestra, el Estándar de Referencia y los reactivos; el uso de equipo; la generación de la curva estándar; el uso de fórmulas para los cálculos; etcétera. 2. La Pauta de la FDA2 provee una lista de la información que, por lo general, se debe incluir en la descripción de un procedimiento analítico. Valoración: Procedimiento analítico para determinar la cantidad de uno o más componentes o la presencia o ausencia de uno o más componentes. NOTAS-1. El término Valorar a menudo se usa como verbo sinónimo de analizar o evaluar, tal como en "Voy a valorar (analizar, evaluar) la presencia de impurezas en el material". En este glosario, valoración es un sustantivo y es sinónimo de procedimiento analítico (q.v.). 2. La frase correr la valoración significa llevar a cabo el procedimiento analítico conforme a lo especificado. 3. En la práctica común, valoración y corrida (q.v.) a menudo se usan de manera intercambiable. Para propósitos de este glosario, dichos términos son diferentes. Además, se puede consultar valoración biológica y conjunto de datos de la valoración. Conjunto de datos de la valoración: Se refiere al conjunto de datos usado para determinar una potencia o potencia relativa únicas para todas las muestras incluidas en la valoración biológica. NoTAS-1. La definición de un conjunto de datos de la valoración se puede interpretar, según sea necesario, como conjunto mínimo. Puede ser posible determinar una potencia o potencia relativa a partir de un conjunto de datos, pero dicho proceso podría no realizarse adecuadamente. Esta definición no pretende dar a entender que un conjunto de datos de la valoración es el conjunto mínimo de datos que se pueden usar para determinar una potencia relativa. En la práctica, un conjunto de datos de la valoración debe incluir, por lo menos, datos suficientes para evaluar la similitud (q.v.). También puede incluir datos suficientes para evaluar otras suposiciones. 2. Esta definición tampoco implica que los conjuntos de datos de la valoración usados en conjunto para determinar un valor de informe (q.v.) sean necesariamente independientes el uno del otro, aunque podría ser conveniente que lo fueran. Cuando una corrida (q.v.) consta de múltiples conjuntos de datos de la valoración, se debe evaluar la independencia de los conjuntos de la valoración dentro de la corrida. Biovaloración, valoración biológica (En inglés, los términos bioassay y biological assay se usan de manera intercambiable): Análisis (como el de un fármaco) para cuantificar la actividad/actividades biológicas de uno o más compoFDA. Guidance for lndustry. Analytical Procedures and Methods Validation: Chemistry, Manufacturing, and Controls Documentation. 2000. Disponible en: http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatorylnformation/Guidances/UCM070489.pdf. Consultada el 27 de diciembre de 2011.
2
USP 39
Información General/ (1030) Capítulos de Valoraciones Biológicas 889
nentes mediante la determinación de su capacidad para producir una actividad biológica esperada en un cultivo de células vivas (in vitro) o en organismos de prueba (in vivo), la cual se expresa en términos de unidades. NOTAS-1. Los componentes de una valoración biológica incluyen el procedimiento analítico, el diseño estadístico para la recolección de datos y el método de análisis estadístico que eventualmente genera la potencia estimada o la potencia relativa. 2. Las valoraciones biológicas pueden ser directas o indirectas. Valoraciones biológicas directas-Valoraciones biológicas que miden la concentración de una sustancia requerida para obtener una respuesta específica. Por ejemplo, la potencia de la digitalis se puede estimar directamente a partir de la concentración requerida para detener el corazón de un gato. En una valoración directa, la respuesta debe ser clara y sin ambigüedades. La sustancia se debe administrar de tal manera que se pueda medir y registrar fácilmente la cantidad exacta (umbral de concentración) requerida para obtener una respuesta. Valoraciones biológicas indirectas-Valoraciones biológicas que comparan la magnitud de las respuestas para concentraciones nominalmente iguales de las preparaciones de referencia y de prueba en lugar de las concentraciones de referencia y de prueba que son necesarias para lograr una respuesta específica. La mayoría de las valoraciones biológicas en los compendios USP-NF son valoraciones indirectas que se basan en respuestas cuantitativas o cuantales (sí/no). Potencia [Título 21 del CFR 600.3(s)]: Habilidad o capacidad específica del producto, según se indica mediante pruebas de laboratorio apropiadas o mediante datos clínicos adecuadamente controlados y obtenidos a través de la administración del producto de la manera prevista, para provocar un resultado determinado. NOTAS-1. A diferencia de una muestra potente, una muestra impotente no tiene capacidad para producir la respuesta específica esperada. Las muestras equipotentes producen respuestas iguales con dosis iguales. Por lo regular, la potencia se mide con respecto a un Estándar de Referencia o preparación a la que se le ha asignado un valor individual único (p.ej., 100,0) para la valoración; ver potencia relativa. En ocasiones, se usan calificadores adicionales para indicar el estándar físico empleado (p.ej., "unidades internacionales"). 2. Algunos productos biológicos tienen usos múltiples y valoraciones múltiples. Para tales productos, pueden existir diferentes lotes de referencia que no presentan respuestas ordenadas uniformemente en toda una colección de distintas valoraciones pertinentes. 3. [Título 21 del CFR 610.1 O] Las pruebas para potencia consistirán en pruebas in vitro o in vivo, o ambas, que habrán sido específicamente diseñadas para cada producto para indicar su potencia de manera adecuada a fin de satisfacer la interpretación de potencia provista por la definición del Título 21 del CFR 600.3(s). Potencia relativa: Medida que se obtiene a partir de la comparación de una Prueba con un Estándar, basándose en la capacidad para producir la potencia esperada. NOTAS-1. Una perspectiva frecuentemente utilizada se centra en que la potencia relativa es el grado en el que se diluye o concentra la preparación de Prueba con respecto al Estándar. 2. La potencia relativa no tiene unidad y se proporciona en la definición de cualquier material de prueba, únicamente con respecto al material de referencia y a la valoración. Valor de informe: Valor que se comparará con un criterio de aceptación. NOTAS-1. El criterio de aceptación para la comparación puede encontrarse en la monografía USP o haber sido establecido por la compañía, p.ej., para la liberación del producto. 2. El término valor de informe está inseparablemente vinculado con el "uso previsto" de un procedimiento analítico. Las valoraciones se llevan a cabo en muestras para generar resultados que puedan usarse para evaluar algún parámetro. Las valoraciones pueden tener diferentes formatos o valores sumarios para diversos propósitos (p.ej., liberación del lote vs calibración de un nuevo estándar de referencia). El valor de informe probablemente será diferente incluso si la mecánica misma de la prueba es idéntica. La validación es necesaria para sustentar las propiedades de cada tipo de valor de informe. En la práctica, puede existir un documento físico, que es el procedimiento analítico usado para más de una aplicación, aunque dicho documento debe incluir por separado información detallada de cada aplicación. Alternativamente, pueden existir documentos distintos para cada aplicación. 3. Cuando la variabilidad inherente de una respuesta biológica, o la del logaritmo de la potencia, impide obtener con un solo conjunto de datos de la valoración un valor lo suficientemente exacto y preciso como para cumplir con una especificación, el formato de la valoración puede cambiarse, según se requiera. El número de bloques o repeticiones completas requeridas depende de la exactitud y precisión inherentes de la valoración y del uso previsto del valor de informe. Resulta práctico mejorar la precisión de un valor de informe al informar la potencia media geométrica de múltiples valoraciones. El número de valoraciones usado se determina mediante la relación entre la precisión requerida para el uso previsto y la precisión inherente del sistema de valoración. Corrida: Se refiere a la realización del procedimiento analítico con el que se espera obtener precisión y veracidad uniformes; generalmente, es la valoración, es decir, el trabajo que puede llevar a cabo un solo analista en un tiempo establecido con un conjunto determinado único de factores de valoración (p.ej., preparaciones estándar). NOTAS-1. La corrida no necesariamente está relacionada con el conjunto de datos de la valoracion (q.v.). El término corrida es específico para laboratorio y se relaciona con la capacidad física y el ambiente del laboratorio para realizar el trabajo de una valoración. Un ejemplo de corrida sería la valoración simultánea de varias muestras por parte de un analista en un día de trabajo práctico. Durante el transcurso de una sola corrida, puede ser posible determinar múltiples valores de informe. Por el contrario, un solo valor de informe puede incluir datos de múltiples corridas. 2. Desde un punto de vista estadístico, una corrida es la consecución de los factores asociados con la precisión intermedia (q.v.). Por tanto, la variabilidad dentro de la corrida es la repetibilidad. Se considera una buena práctica asociar las corridas con factores que representen fuentes significativas de variación en la valoración. Por ejemplo, si un número de pasajes celulares es una fuente importante de variación en la respuesta obtenida de la valoración, entonces cada cambio en el número de pasajes celulares dará inicio a una nueva corrida. Si la varianza asociada con todos los factores que se pudieran asignar a las corridas fuera inapreciable, entonces se podría ignorar la influencia de las corridas en el análisis y el análisis se podría enfocar en combinar conjuntos de datos de análisis independien-
890 (1030) Capítulos de Valoraciones Biológicas / Información General
USP 39
tes. 3. Cuando una corrida incluye múltiples valoraciones, es necesario tomar precauciones con respecto a la independencia de los resultados de las valoraciones. Los factores que por lo general se asocian a corridas y que pueden generar una falta de independencia incluyen preparaciones celulares, grupos de animales, analista, día, una preparación de un material de referencia común y análisis con otros datos de la misma corrida. Aunque se puede infringir un estricto sentido de independencia debido a que los conjuntos de valoraciones dentro de una corrida comparten ciertos elementos, el grado en el que se compromete la independencia puede tener una influencia insignificante sobre los valores de informe obtenidos, lo cual se debe verificar y monitorear. Preparaciones similares: Se refiere a la propiedad que indica que la Prueba y el Estándar contienen el mismo componente efectivo, o los mismos componentes efectivos en proporciones fijas, y todos los demás componentes no tienen efecto en algún contexto específico de la valoración. NOTAS-1. Contar con preparaciones similares a menudo se resume como la propiedad que indica que la Prueba se comporta como una dilución (o concentración) del Estándar. 2. Las preparaciones similares son fundamentales en los métodos para la determinación de la potencia relativa. El uso de preparaciones similares permite calcular, informar e interpretar una potencia relativa. Ante la ausencia de preparaciones similares, no se puede informar ni interpretar una potencia relativa significativa. 3. La consecuencia práctica de preparaciones similares es la similitud algebraica (q.v.). (Ver también Paralelismo, sección V.) Similitud (algebraica): Las curvas de concentración-respuesta de la Prueba y el Estándar se relacionan algebraicamente de manera constante con preparaciones similares. NOTAS-1. Entre los ejemplos de similitud se incluyen el paralelismo (q.v.) de las curvas de concentración-respuesta y la igualdad de las ordenadas al origen en los modelos de cociente de pendientes. 2. El no poder demostrar estadísticamente la falta de similitud entre una Referencia y una Prueba no se considera una demostración de similitud. Resulta apropiado demostrar la similitud en un enfoque de equivalencia; ver los capítulos (1032) y (1034). 3. La similitud es por lo regular un criterio de aptitud de la muestra (q.v.). No obstante, se debe tomar en cuenta que la aptitud es una condición necesaria, pero no suficiente, para que las preparaciones sean similares. En la práctica, ante el desconocimiento de las diferencias entre los materiales de Prueba y Estándar, la demostración de similitud se acepta como la demostración de preparaciones similares.
11. Términos Relacionados con la Realización de una Valoración Biológica Configuración de la valoración biológica (también conocido como formato de la valoración): Estrategia de replicación dentro de la corrida y entre corridas para la replicación de los conjuntos de datos de la valoración que se han determinado por análisis de varianza para sustentar el uso de las valoraciones biológicas. NOTAS-1. Las modificaciones al formato de la valoración biológica pueden ocurrir a medida que se dispone de nueva información sobre las fuentes de variabilidad. Dichas modificaciones no incluyen cambios en el esquema de dilución de las muestras de Prueba o del Estándar ni en la estrategia de replicación (parte de lo que en ocasiones se denomina configuración de la valoración biológica). La configuración de la valoración puede incluir dimensiones anidadas tales como diseño de la placa, múltiples placas por día, placas individuales en múltiples días, entre otros. 2. La potencia relativa geométrica media determinada a partir del formato de la valoración biológica es el valor de informe, el cual se puede usar para evaluar el cumplimiento con las especificaciones o como un componente de análisis subsiguiente (p.ej., evaluación de la estabilidad). Fuera de la especificación (OOS, por sus siglas en inglés): Se refiere a la propiedad de un valor de informe que cae fuera de su criterio de aceptación especificado. NOTA-El término fuera de la especificación no es una propiedad de la valoración biológica, sino de las muestras de Prueba. El término se introduce en el capítulo (1033) junto con el establecimiento de los criterios de aceptación para la validación que limitan el riesgo de producir resultados de prueba fuera de la especificación debido a las características de desempeño de la valoración biológica. Aptitud de la muestra: Una muestra es apta (se puede usar en la estimación de potencia) si su curva de respuesta cumple con los límites sobre propiedades críticas definidas en el procedimiento de la valoración. NOTA-Las propiedades de la curva de respuesta se deben considerar desde un punto de vista general, es decir, incluyendo valores aberrantes y variabilidad. La más significativa de estas propiedades para las valoraciones biológicas es la similitud (q.v.) con la curva de respuesta del estándar. Asimismo, todos los sistemas de valoración tienen límites para el intervalo de valores sobre los que pueden informar. En el caso de muestras que no cumple con uno o más de los criterios de aptitud de la muestra en una valoración biológica, no se debe usar la estimación de potencia obtenida de dichas muestras como un valor de informe o como un contribuidor para un valor de informe. Para más información consultar también el término sesgo por truncado en este Glosario, así como las secciones Aptitud de la Muestra e Intervalo en el capítulo general (1032). Aptitud del sistema: Un sistema de valoración es adecuado para su uso previsto si es capaz de proveer mediciones legítimas conforme a lo definido en el protocolo de la valoración. NOTA-La aptitud del sistema se puede considerar como la evaluación de la posibilidad de que exista evidencia acerca de un problema en el sistema de valoración. Un ejemplo serían controles positivos y negativos cuando los valores fuera de sus intervalos normales sugieren qué sistema de valoración no trabaja adecuadamente.
111. Términos Relacionados con la Precisión y la Exactitud Exactitud (1225):
Expresión de la proximidad entre los resultados de prueba obtenidos por el procedimiento y el valor real.
USP 39
Información General/ (1030) Capítulos de Valoraciones Biológicas 891
NOTAS-1. La ICH y la USP ofrecen la misma definición de exactitud. No obstante, la ISO específicamente considera que la exactitud tiene dos componentes, el sesgo y la precisión. 3 Esto significa que, para lograr la exactitud conforme a ISO, una medición debe estar dentro de la diana (tener poco sesgo) y ser precisa. Por el contrario, la pauta Q2(R1) de la ICH indica que la exactitud, en ocasiones, se denomina "veracidad", aunque no define dicho término. La ISO define veracidad como "la proximidad de acuerdo entre el valor promedio obtenido a partir de una serie grande de resultados de prueba y un valor de referencia aceptado" e indica que "la veracidad, por lo general, se expresa en términos de sesgo". La pauta Guidance on Bioanalytical Method Validation del año 2001 de la FDA4 define el término exactitud en términos de la "proximidad de los resultados de prueba medios, obtenidos por el método, con el valor verdadero (concentración) del analito" (énfasis agregado) y es, por lo tanto, uniforme con el uso de la ICH. Este glosario adopta el enfoque de USP/ICH. Por tanto, exactitud se define como el acuerdo entre la media (o los resultados esperados) de una valoración y el valor verdadero, y emplea la frase exacto y preciso para indicar un sesgo bajo (exacto) y una variabilidad baja (preciso). 2. Se recomienda tomar precauciones considerables durante la lectura o uso del término exactitud. Además de la falta de uniformidad entre la USP/ICH y la ISO, el uso común también es poco uniforme. 3. Para propósitos de validación de una valoración biológica, los términos exactitud y sesgo han sido reemplazados con exactitud relativa y sesgo relativo. Tipos de errores: Dos fuentes de incertidumbre que afectan los resultados de una valoración biológica son el error sistemático y el error aleatorio. Un error sistemático es aquél que se presenta repetidamente con una magnitud similar y dirección uniforme. Éste introduce un sesgo en la determinación. El diseño experimental efectivo, que incluye aleatorización y/o división en bloques, puede reducir el error sistemático. Un error aleatorio es aquél cuya magnitud y dirección varían sin un patrón. El error aleatorio es una variabilidad o incertidumbre inherente de la determinación. La conversión de error sistemático a aleatorio, a través del diseño experimental o la aleatorización, incrementa la robustez de una valoración biológica y permite un análisis comparativamente simple de los datos de la valoración, aunque puede requerir un tamaño de muestra mayor. Variabilidad del formato: Se refiere a la variabilidad prevista para un formato de valoración biológica particular. Coeficiente geométrico de variación: Determinado como antilog(S)-1, donde Ses la desviación estándar determinada en la escala logarítmica. NOTA-El coeficiente geométrico de variación a menudo se informa como un porcentaje (%GCV, por sus siglas en inglés). Es importante no confundir el %GCV con el %CV. El %GCV es una medición de dispersión pertinente a los datos analizados en la escala [Y= log(X)] transformada logarítmicamente, mientras que el %CV es una medición pertinente a los datos analizados en la escala (X) original. Desviación estándar geométrica (GSD, por sus siglas en inglés): Se refiere a la variabilidad de los valores transformados en logaritmos de una respuesta logarítmica normal expresada como porcentaje en la escala sin transformar. Se determina como antilog(S), donde Ses la desviación estándar determinada en la escala logarítmica. NOTA-Por ejemplo, si la desviación estándar de la potencia logarítmica es S usando logaritmo en base 2, la GSD de la potencia es 100 * 2s. Precisión intermedia (adaptado del capítulo (1225)): Expresa la precisión dentro del laboratorio relacionada con los cambios en las condiciones operativas. NOTAS-1. Los factores que contribuyen a la precisión intermedia implican cualquier aspecto que pudiera cambiar dentro de un laboratorio dado y que podrían afectar la valoración, e incluyen días distintos, analistas distintos, equipo distinto, entre otros. Por consiguiente, la precisión intermedia tiene un alcance "intermedio" entre los extremos de repetibilidad (dentro de la valoración) y reproducibilidad (entre laboratorios). 2. Cualquier declaración de precisión intermedia debe identificar los factores variables. Por ejemplo, "La precisión intermedia asociada con los cambios de equipo y operador es .... " 3. Asimismo, podría ser valioso identificar por separado la precisión asociada con cada fuente (p.ej., precisión entre analistas). Esto puede formar parte del desarrollo y la validación de la valoración cuando tiene algún valor identificar aquellos factores que contribuyen de manera importante a la precisión intermedia. 4. Cuando se informa la precisión intermedia, en particular para fuentes individuales, los analistas deben tener cuidado de distinguir entre la varianza de la precisión intermedia y los componentes de dicha varianza. La varianza de la precisión intermedia incluye la repetibilidad y, por lo tanto, debe ser necesariamente al menos tan grande como la varianza de repetibilidad. Un componente de la varianza, p.ej., para el analista, también forma parte de la varianza de la precisión intermedia para el analista, pero puede ser insignificante y quizás no requiera tener una magnitud mayor que la varianza de repetibilidad. Precisión ((1225)): Medición del grado de concordancia entre los resultados de pruebas individuales cuando el procedimiento se aplica repetidamente a múltiples muestreos de una muestra homogénea. NOTAS-1. La precisión se puede considerar en tres niveles: repetibilidad (q.v.), precisión intermedia (q.v.) y reproducibilidad (q.v.). 2. La precisión se debe investigar usando muestras auténticas y homogéneas. No obstante, si no es posible obtener una muestra homogénea, la precisión puede investigarse usando muestras con cantidades agregadas conocidas que simulen una muestra o solución muestra verdaderas. 3. La precisión a menudo se expresa como la varianza, desviación estándar, coeficiente de variación o coeficiente de variación geométrica. 3 ISO. Norma Internacional 5725-1. Accuracy (Trueness and Precision) of Measurement Methods and Results-Part 1: General Principies and Definitions. Geneva, Switzerland; 1994. 4 FDA. Guidance for lndustry. Bioanalytical Method Validation. May 2001. http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatorylnformation/ Guidances/UCM070107.pdf. Consultada el 7 de diciembee de 2011.
892 (1030) Capítulos de Valoraciones Biológicas/ Información General
USP 39
Sesgo relativo: Medición del grado de diferencia entre el valor esperado (o medio) y el valor verdadero, expresado como porcentaje del valor verdadero. Repetibilidad ((1225)): Se refiere a la expresión de la precisión dentro de un laboratorio en las mismas condiciones operativas durante un intervalo corto de tiempo. NOTAS-1. La pauta ICH Q2A indica que la repetibilidad también recibe el nombre de precisión "intravaloración". En el contexto de la valoración biológica, el mejor término es intra corrida, mientras que un "intervalo corto de tiempo" se usa para describir dentro de la corrida. 2. La idea de un "intervalo corto de tiempo" puede ser problemática con las valoraciones biológicas. Si una corrida toma varias semanas y consta de un solo conjunto de valoraciones, entonces no sería posible determinar la precisión intracorrida. Alternativamente, si una corrida consta de dos conjuntos de datos de las valoraciones y se puede llevar a cabo en un solo día, sería posible evaluar la repetibilidad de la determinación de la potencia relativa. Reproducibilidad (1225): Expresa la precisión entre laboratorios. NOTAS-1. La reproducibilidad incluye contribuciones derivadas de la repetibilidad y de todos los factores que contribuyen a la precisión intermedia, así como cualquier contribución adicional de las diferencias entre laboratorios. 2. La reproducibilidad se aplica a estudios en colaboración, tales como aquéllos realizados para estandarización o portabilidad de la metodología. Dependiendo del diseño del estudio en colaboración, puede ser posible describir por separado los componentes de la varianza asociados con las fuentes de variabilidad intra y entre laboratorios. Especificidad (1225): Se refiere a la capacidad de evaluar de manera inequívoca el analito en presencia de aquellos componentes cuya presencia resulta previsible. NOTAS-1. Por lo general, estos componentes pueden incluir impurezas, productos de degradación, componentes de la matriz, entre otros. Ver el capítulo (1225) para más información. 2. Esta definición también se relaciona con la selectividad en otras pautas para métodos analíticos. 3. La especificidad puede significar la medición del analito específico de interés y no la de otro analito similar. Sesgo por truncado: Se refiere al sesgo que ocurre cuando no se observa o registra alguna porción de la distribución de las respuestas. NoTAS-1. Cuando existe sesgo por truncado, la distribución de observaciones registradas no se corresponde con la distribución real de respuestas. 2. El sesgo por truncado puede ocurrir en una valoración biológica que no informa estimaciones de potencia logarítmica fuera de un intervalo de potencia establecido. Por ejemplo, se espera que una muestra con una potencia real en un límite de este intervalo no produzca (informe) una estimación de potencia en aproximadamente la mitad de las valoraciones en las que aparece. En este ejemplo, la media de las potencias observadas estará sesgada hacia la potencia logarítmica O.
IV. Términos Relacionados con la Validación Linealidad de las diluciones (adaptado del capítulo (1225)): Se refiere a la capacidad (dentro de un intervalo determinado) de una valoración biológica para obtener potencias relativas medidas que sean directamente proporcionales a la potencia relativa verdadera de la muestra. NOTAS-1. Para determinar la linealidad de las diluciones, en ocasiones denominada linealidad analítica de la valoración biológica, a través de un intervalo conocido de valores de potencia relativa, los analistas examinan la relación entre la potencia logarítmica conocida y la potencia logarítmica media observada. Si dicha relación genera una línea esencialmente recta con una ordenada al origen de O y una pendiente de 1, la valoración tiene una proporcionalidad directa. Si la gráfica genera una línea esencialmente recta pero la ordenada al origen no es O o la pendiente no es 1, la valoración tiene una respuesta lineal proporcional. 2. Evaluar si una pendiente es (cercana a) 1,0 requiere una equivalencia o intervalo de indiferencia a priori. Resulta inadecuado en la práctica estadística analizar la hipótesis nula que indica que la pendiente es 1,0 contra la alternativa que indica que no es 1,0 y concluir que una pendiente es 1,0 si esto no se rechaza. La linealidad analítica de la valoración biológica se separa de la consideración de la forma de la curva de concentración-respuesta. La linealidad de la concentración-respuesta no es un requisito de la linealidad analítica de la valoración biológica debido a que ésta última es posible independientemente de la forma de la curva de concentración-respuesta. 3. La linealidad de las diluciones se trata en mayor detalle en el capítulo (1033). Límite de cuantificación (límite inferior de cuantificación; adaptado del capítulo (1225)): Se refiere a la potencia relativa conocida más baja para la que la valoración tiene una precisión y exactitud adecuadas. NOTAS-1. Esto se aplica a los resultados de valoración (potencia logarítmica) en lugar del valor de informe. 2. No es común determinar el límite de cuantificación para las valoraciones biológicas de potencia relativa. Las valoraciones realizadas en animales con puntos finales de determinación serológicos son ejemplos de uso de este término. Intervalo (adaptado del capítulo (1225)): El intervalo entre las potencias relativas conocidas superior e inferior (incluyendo aquellas potencias relativas) por el que se demuestra que la valoración biológica tiene un nivel adecuado de precisión, exactitud y linealidad analítica. NOTA-Esto se aplica a valores de informe (típicamente una media geométrica) en lugar de los resultados individuales de la valoración. Robustez (adaptado del capítulo (1225)): Se refiere a una medida de la capacidad de un procedimiento analítico para mantenerse intacto ante variaciones pequeñas pero deliberadas en los parámetros del método listados en la documentación del procedimiento.
USP 39
Información General/ (1030) Capítulos de Valoraciones Biológicas 893
NOTAS-1. La robustez es una indicación de la confiabilidad de la valoración biológica durante el uso normal. Por ejemplo, un sistema de valoración de cultivo celular que es robusto para el número de pasajes de células puede proveer valores de potencia con exactitud y precisión aceptables en todo un intervalo uniforme de números de pasajes. 2. La norma Q2(Rl) de la ICH indica que: La evaluación de robustez se debe considerar durante la fase de desarrollo y depende del tipo de procedimiento que se está estudiando. Ésta debe mostrar la confiabilidad de un análisis con respecto a las variaciones deliberadas en los parámetros del método. Si las mediciones son susceptibles a variaciones en condiciones analíticas, éstas últimas se deben controlar adecuadamente o se debe incluir una declaración precautoria en el procedimiento. Una consecuencia de la evaluación de la robustez deberá ser que se establezca una serie de parámetros [q.v.] de aptitud del sistema (p.ej., prueba de resolución) para asegurar que la validez del procedimiento analítico se mantiene cada vez que se usa. 1 Validación de la valoración: Proceso mediante el cual se demuestra y documenta que las características de desempeño del procedimiento y su método subyacente cumplen con los requisitos para la aplicación prevista y que la valoración es, por tanto, adecuada para su uso previsto. NOTA-Las validaciones formales se realizan prospectivamente de acuerdo con un plan escrito que incluye criterios de aceptación justificables sobre los parámetros de validación. Ver el capítulo (1033).
V. Términos Relacionados con el Diseño y Análisis Estadístico Análisis de varianza (ANOVA): Herramienta estadística usada para evaluar la contribución de factores experimentales en la variabilidad. Distribución en bloques: Agrupación de unidades experimentales relacionadas en diseños experimentales. NOTAS-1. La distribución en bloques a menudo se usa para reducir la variabilidad relacionada con un factor que no es de interés primario. 2. Los bloques pueden consistir, por ejemplo, en grupos de animales (una jaula, una camada o un cargamento), placas individuales de 96 pocillos, secciones de placas de 96 pocillos o placas enteras de 96 pocilllos agrupadas por analista, día o partida de células. 3. El objetivo es aislar, mediante diseño y análisis estadístico, un efecto sistémico, por ejemplo una jaula, de modo que no obstruya las comparaciones de interés. En un diseño completo por bloques todos los niveles de un factor de tratamiento (en una valoración biológica, los factores de tratamiento primario son la muestra y la concentración) se pueden aplicar a las unidades experimentales para dicho factor dentro de un solo bloque. Se debe tomar en cuenta que los dos factores de tratamiento muestra y concentración pueden tener unidades experimentales diferentes. Por ejemplo, si a todos los animales dentro de una jaula se les asigna la misma concentración, pero se les asignan muestras únicas, entonces la unidad experimental para concentración es la jaula y la unidad experimental para la muestra es el animal; la jaula es un factor de división en bloque para la muestra. En un diseño en bloques incompleto el número de niveles de un factor de tratamiento excede el número de unidades experimentales para dicho factor dentro del bloque. Intervalo de confianza: Se refiere a un intervalo aleatorio producido por un método estadístico que contiene un valor parametral verdadero (fijo pero desconocido) con un nivel de confianza declarado en una aplicación repetida del método estadístico. NOTA-Ver el capítulo (101 O) para más información. Cruzado (y parcialmente cruzado): Se dice que dos factores están cruzados (o completamente cruzados) si cada nivel de cada factor aparece con cada nivel del otro factor. Dos factores están parcialmente cruzados cuando no están completamente cruzados, pero múltiples niveles de un factor aparecen con un nivel común del otro factor. NOTAS-1. Por ejemplo, en una valoración biológica en la que todas las muestras aparecen en todas las diluciones, las muestras y las diluciones están (completamente) cruzadas. En un experimento de validación de valoración biológica en el que dos de cuatro analistas llevan cada uno a cabo valoraciones con el mismo conjunto de muestras durante cada uno de seis días y se usa un par diferente de analistas en cada día, los analistas están parcialmente cruzados con los días. 2. Cada factor se puede aplicar a diferentes unidades experimentales, y los factores pueden ser totalmente cruzados y anidados (q.v.), lo que genera un diseño de unidad dividida o de gráfica dividida (q.v.). 3. Hay que prestar especial cuidado a los experimentos con factores que están parcialmente cruzados para llevar a cabo análisis adecuados. 4. Un diseño en bloques completo aleatorizado (q.v.) es un diseño en el que un factor de bloque (que a menudo se trata como un factor aleatorio) se cruza con el factor de tratamiento (que a menudo se trata como un efecto fijo). Diseño de experimentos (DOE, por sus siglas en inglés) [ICH Q8(R2)]5: Método estructurado y organizado para determinar la relación entre factores que afectan un proceso y el resultado de dicho proceso. NOTA-El DOE se usa en el desarrollo de valoraciones biológicas y en la validación; ver los capítulos (1032) y (1033). Prueba de equivalencia: Se refiere a una prueba para demostrar la equivalencia (p.ej., similitud o cumplimiento con los criterios de aceptación de la validación) de dos cantidades mediante el cumplimiento de un criterio de aceptación para un intervalo. NOTAS-1. Una prueba de equivalencia difiere de las pruebas estadísticas más comunes en la naturaleza de las hipótesis estadísticas. La mayoría de las pruebas estadísticas comunes son pruebas de diferencia-es decir, la hipótesis nula estadística es la 5 ICH. Guidance Q8(R2) Pharmaceutical Development. November 2009. Disponible en http://www.fda.gov/downloads/Drugs/ GuidanceComplianceRegulatorylnformation/Guidances/UCM073507.pdf. Consultado el 27 de diciembre de 2011.
894 (1030) Capítulos de Valoraciones Biológicas / Información General
USP 39
ausencia de diferencias y la alternativa es que existe alguna diferencia, sin importar la magnitud o la importancia de la misma. La diferencia puede estar entre una característica de dos poblaciones o entre una característica de una sola población y un valor aceptado. En el análisis de equivalencia, la hipótesis nula es que la diferencia no es lo suficientemente pequeña, y la hipótesis alternativa es que la diferencia es lo suficientemente pequeña para que no exista diferencia importante. En una prueba de diferencia estadística común, se puede concluir que no existen pruebas suficientes para establecer el incumplimiento con un criterio de aceptación. Éste puede ser el resultado de un exceso de variabilidad y/o un diseño inadecuado. En una prueba de equivalencia, se concluye que los datos cumplen con el criterio de aceptación (p.ej., las pendientes son paralelas). 2. El procedimiento de pruebas doblemente unilaterales {TOST, por sus siglas en inglés) es un procedimiento estadístico común usado para las pruebas de equivalencia. 3. El criterio de aceptación para el intervalo puede ser unilateral o bilateral. Un ejemplo de intervalo unilateral es un criterio de aceptación de validación para una %GCV de no más de XX%. Cuadrado medio esperado: Expresión matemática de las varianzas estimadas mediante un ANOVA de cuadrados medios. Diseño experimental: Se refiere a la estructura de asignación de tratamientos a unidades experimentales. NOTAS-1. La distribución en bloques (q.v.), la aleatorización (q.v.), la replicación (q.v.) y la selección específica del diseño (ver el capítulo (1032)) son algunos aspectos del diseño experimental. 2. Los componentes importantes del diseño experimental incluyen el número de muestras, el número de concentraciones y la forma en que se asignan las muestras y concentraciones a unidades experimentales y su agrupación en bloques. 3. El diseño experimental influye en la selección de la metodología estadística que se debe usar para lograr el objetivo analítico. Unidad experimental: Se refiere a la unidad más pequeña a la que se asigna aleatoriamente un nivel de tratamiento distinto. NOTAS-1. La asignación aleatoria de los factores de tratamiento a unidades experimentales es esencial en las valoraciones biológicas. 2. Los factores de tratamiento diferentes se pueden aplicar a unidades experimentales distintas. Por ejemplo, las muestras se pueden asignar a las filas en una placa de 96 pocillos, y las diluciones se pueden asignar a las columnas de la placa. En este caso, las hileras son las unidades experimentales para las muestras, las columnas son las unidades experimentales para las concentraciones y los pocillos son las unidades experimentales para la interacción entre muestra y concentración. 3. Una unidad experimental debe distinguirse de una unidad de muestreo, en cuya unidad más pequeña se registra una medición distinta (p.ej., un pocillo). Debido a que la unidad de muestreo es a menudo más pequeña que la unidad experimental, tratar unidades de muestreo como si fueran unidades experimentales es un error fácil de cometer. Este error se demonina pseudo-replicación (q.v.). Factor: Parámetro de la valoración o elemento operativo que puede afectar la respuesta de la misma y que varía en un experimento y entre experimentos. NOTA-En una valoración biológica, habrá por lo menos dos factores de tratamiento: muestra y concentración. Un factor fijo (efecto fijo) es un factor que se controla y establece deliberadamente a niveles específicos en una valoración biológica. Se realiza inferencia en los niveles usados en el experimento o en los niveles intermedios. En una valoración biológica, la muestra y la concentración son ejemplos de factores fijos. Un factor aleatorio (efecto aleatorio) es aquél que por lo general no puede ser controlado y cuyos niveles representan una demostración de las formas en que dicho factor puede variar. En una valoración biológica, los organismos de prueba, la placa y el día a menudo se consideran factores aleatorios. Tratar un factor como aleatorio o fijo dependerá del experimento y de las preguntas formuladas. Diseño factorial: Se refiere al diseño experimental en el que se encuentran múltiples factores, los cuales están parcial o totalmente cruzados. En un diseño factorial completo, cada nivel de un factor se presenta con cada combinación de niveles de todos los demás factores. Por ejemplo, si los factores son la partida de reactivo y el tiempo de incubación, para un diseño factorial completo, se deben incluir todas las combinaciones de tiempo de incubación y partida de reactivo. Un diseño factorial fraccionado es un diseño reducido en el que cada nivel de un factor aparece únicamente con un subconjunto de combinaciones de niveles de todos los demás factores, y algunos efectos de factores (efectos y/o interacciones principales) se confunden deliberadamente con otras combinaciones de efectos de factores. Se debe prestar especial cuidado al considerar los diseños factoriales fraccionados para propósitos de detección y optimización. Se considera que este diseño no presenta riesgos de perder información para la validación. Modelo lineal general: Modelo estadístico lineal que relaciona factores de estudio, que pueden ser continuos o discretos, con respuestas experimentales. Independencia: Para que dos mediciones u observaciones A y B (datos brutos, conjuntos de valoraciones o potencias relativas) sean independientes, los valores de A no deben verse afectados por las respuestas de By viceversa. NOTA-Una consecuencia de no reconocer la falta de independencia es la caracterización deficiente de la varianza. En la práctica, esto significa que si dos mediciones de potencia o de potencia relativa comparten un factor común que podría influenciar el resultado de la valoración (p.ej., un analista, preparación celular, incubadora, grupo de animales o alícuota de muestras estándar) entonces la suposición inicial correcta es que estas mediciones de potencia relativa no son independientes. Lo mismo sucede con la falta de independencia cuando se estiman en conjunto dos mediciones de potencia o de potencia relativa a partir del mismo modelo, o si se relacionan de alguna manera sin incluir en el modelo algún término que capture el hecho de que hay dos o más mediciones de potencia. A medida que se gana experiencia en las valoraciones, se puede establecer (y monitorear) un fundamento empírico razonable para tratar las mediciones de potencia como independientes incluso si comparten un nivel común de un factor. Este es el caso cuando se ha demostrado que un factor prácticamente no tiene efecto significativo en los resultados a largo plazo de la valoración biológica.
USP 39
Información General/ (1030) Capítulos de Valoraciones Biológicas 895
Interacción: Se dice que dos factores interactúan cuando la respuesta de un factor depende del nivel del otro. Nivel: Se refiere a la ubicación en la escala de medición de un factor. NOTAS-1. Los factores tienen dos o más niveles distintos. Por ejemplo, si un experimento de validación de valoración biológica emplea tres valores de tiempo de incubación y dos partidas de un reactivo clave, los niveles son las tres veces para el factor tiempo de incubación y las dos partidas para el factor partida. 2. Los niveles de un factor en una valoración biológica pueden ser cuantitativos, tales como concentración, o categóricos, tales como muestra (es decir, de prueba y de referencia). Distribución logarítmica normal: Distribución de valores (respuestas o potencias de la valoración) en las que los logaritmos de los valores tienen una distribución normal. NOTAS-1. La mayoría de las mediciones en la valoración biológica de potencia relativa presentan una distribución logarítmica normal. 2. La distribución logarítmica normal es una distribución sesgada que se caracteriza por un incremento en la variabilidad con un aumento en el nivel de respuesta. Cuadrado medio: Cálculo dentro del ANOVA que representa la variabilidad asociada con un factor experimental. Modelo de efectos mixtos: Modelo estadístico que incluye efectos fijos y aleatorios. Generación de modelos estadísticos: Especificación matemática de la relación entre ingresos (Xs) y salidas (Ys) de un proceso, p.ej., la relación concentración-respuesta en la valoración biológica o la generación de un modelo de los efectos de fuentes importantes de variación en la medición de potencia. NOTAS-1. La generación de modelos incluye métodos para capturar la dependencia que tiene la respuesta de las muestras, la concentración, unidades experimentales y los grupos o distribución de factores en bloques en la configuración de la valoración. 2. La generación de modelo para datos de la valoración biológica requiere tomar una gran cantidad de decisiones, algunas de las cuales se basan en el diseño de la valoración y en los datos. Para datos continuos, se puede seleccionar entre modelos lineales o no lineales. Para datos discretos, se puede seleccionar entre modelos logit/log dentro de una familia más grande de modelos lineales generalizados. Existe literatura enfocada en la limitación de valoraciones con diluciones en la que se aboga por los modelos de Poisson y los modelos de binomios en cadena de Markov. Para los datos de la valoración biológica, se pueden usar modelos de efectos fijos o modelos de efectos mixtos. Por un lado, existe una mayor disponibilidad de software para modelos de efectos fijos cuya configuración es menos exigente para los estadísticos. Por otra parte, los modelos mixtos tienen algunas ventajas sobre los fijos: se acomodan más a los datos faltantes y, lo más importante, pueden permitir que cada bloque tenga distintas pendientes, asíntotas, concentraciones medias efectivas, requeridas para inducir un efecto del 50% (EC 50) o potencias relativas. En particular, cuando el analista emplea modelos de líneas rectas ajustados a respuestas no lineales o en sistemas de valoración en los que la curva de concentración-respuesta varía entre bloques, el modelo mixto captura el comportamiento del sistema de valoración de manera más realista e interpretable. 3. Resulta esencial que cualquier metodología para la generación de modelo para datos de la valoración biológica utilice todos los datos disponibles de manera simultánea para estimar la variación (o, en un modelo mixto, cada una de varias fuentes de variación). Puede ser necesario transformar las observaciones antes de generar el modelo; incluir un modelo de varianza; o ajustar un modelo de medias (en el que existe un efecto previsto para cada combinación de muestra y concentración) para obtener estimaciones combinadas de variación. Anidado: Se dice que un factor A está anidado dentro de otro factor B si los niveles de A son diferentes para cada nivel de B. NOTAS-1. Por ejemplo, en un experimento de validación de valoración biológica, dos analistas pueden cada uno llevar a cabo valoraciones en cinco días. Si los días naturales para el primer analista son distintos de los del segundo analista, los días están anidados dentro del analista. 2. Los factores anidados tienen una relación jerárquica. 3. Para que dos factores estén anidados, deben cumplir con lo siguiente: a) aplicarse a unidades experimentales de diferentes tamaños; b) la unidad experimental más grande contiene más de una de las unidades experimentales más pequeñas; y c) el factor aplicado a la unidad experimental más pequeña no está totalmente cruzado (q.v.) con el factor aplicado a la unidad experimental más grande. Cuando se cumplen las condiciones (a) y (b), y los factores están parcialmente cruzados, entonces el experimento está parcialmente cruzado y parcialmente anidado. Hay que prestar especial cuidado a los experimentos con esta estructura para llevar a cabo análisis adecuados. Paralelismo (de las curvas de concentración-respuesta): Calidad en la que las curvas de concentración-respuesta de la muestra de Prueba y del Estándar de Referencia son idénticas en forma y presentan únicamente una diferencia horizontal que es una función constante de la potencia relativa. NOTAS-1. Cuando las preparaciones de Prueba y de Referencia son similares (q.v.) y las respuestas de la valoración se grafican en función de los logaritmos de las concentraciones, la curva resultante para la preparación de Prueba será la misma que para el Estándar pero desviada horizontalmente por una cantidad que es el logaritmo de la potencia relativa. Debido a esta relación, la similitud (q.v.) a menudo se equipara con paralelismo, pero son conceptos distintos. Ver la sección 3.5, Modelos de Concentración-Respuesta de Cociente de Pendientes, del capítulo (1034), en los que las muestras con relaciones similares de concentración-respuesta tienen una ordenada al origen común (o casi común) pero pueden diferir en sus pendientes. 2. En la práctica, no es posible demostrar que las formas de dos curvas sean idénticas. En lugar de esto, las dos curvas demuestran tener una forma algebraica los suficientemente similar (equivalente). Se debe tomar en cuenta que similar debe interpretarse como "se cuenta con evidencia de que las dos curvas son lo suficientemente cercanas en forma" en lugar de "no se cuenta con evidencia de que las dos curvas sean diferentes en forma". 3. La evaluación de paralelismo depende del tipo de función usada para ajustar la curva de respuesta. El paralelismo para una valoración no lineal que usa un ajuste logístico de cuatro parámetros significa que (a) las pendientes de las curvas de la Prueba y del Estándar de Referencia que cambian rápidamente (es decir, la pendiente de la tangente con la curva, donde la primera derivada es un máximo) deben ser similares; y (b) las asínto-
896 (1 030) Capítulos de Valoraciones Biológicas / Información General
USP 39
tas superior e inferior de las curvas de la respuesta (mesetas) deben ser similares. Para análisis de líneas rectas, las pendientes de las líneas deben ser similares. Estimación puntual: Estimación de un valor individual obtenida a partir de cálculos estadísticos. NOTAS-1. Los ejemplos son el sesgo relativo promedio, la %CVG y la potencia relativa. 2. La estimación puntual puede ser más relevante con una estimación de intervalo (intervalo de confianza; q.v.) que emplea un intervalo para expresar la incertidumbre en la determinación de la estimación puntual. Determinaciones pseudo-repetidas: Se refiere a la identificación incorrecta de muestras obtenidas a partir de unidades experimentales como independientes y, por tanto, como determinaciones repetidas verdaderas cuando en realidad no son independientes. NOTAS-Las determinaciones pseudo-repetidas resultan en inferencias erróneas debido a la asignación incorrecta de variabilidad y a la aparición de un número de determinaciones repetidas aparentemente mayor al real. 2. El no reconocer las determinaciones pseudo-repetidas es peligroso puesto que se trata de un error fácil de cometer y sus consecuencias pueden ser serias. Por ejemplo, las determinaciones pseudo-repetidas comúnmente surgen cuando los analistas realizan una serie de diluciones para cada muestra en tubos (la serie de diluciones se puede realizar mediante diluciones en serie, mediante diluciones de un solo punto o mediante cualquier esquema de dilución conveniente). Posteriormente, el analista transfiere cada dilución de cada muestra a varios pocillos en una o más placas de valoración. Por consiguiente, los pocillos son determinaciones pseudo-repetidas puesto que son simplemente alícuotas de un solo proceso de dilución y por tanto no representan preparaciones independientes. 3. Una manera simple para analizar datos obtenidos de determinaciones pseudo-repetidas es promediar las determinaciones pseudo-repetidas (si se usa una transformación de los datos observados, ésta debe aplicarse antes de promediar las determinaciones pseudo-repetidas) antes de ajustar cualquier tipo de modelo de concentración-respuesta. En muchos sistemas de valoración, promediar determinaciones pseudo-repetidas dejaría a la valoración sin ninguna determinación repetida. Una forma más compleja de usar los datos que contienen determinaciones pseudo-repetidas consiste en emplear un modelo mixto que trate las determinaciones pseudo-repetidas como un efecto aleatorio distinto. Aunque el valor de las determinaciones pseudo-repetidas es generalmente limitado, pueden ser útiles cuando se cumplen dos condiciones: (a) la variación de las determinaciones pseudo-repetidas (es decir, entre pocillos) es muy grande en comparación con la variación asociada con las determinaciones repetidas y (b) el costo de las determinaciones pseudo-repetidas es mucho menor que el costo de las unidades experimentales repetidas. Valor P (probabilidad de significancia): Se refiere a la probabilidad de observar, en ensayos repetidos, que el resultado experimental es tan o más extremo que el observado si la hipótesis nula fuera verdadera. NOTAS-1. Más extremo significa más lejano a la hipótesis nula. 2. Comúnmente, P< 0,05 se considera un umbral para indicar las diferencias estadísticamente significativas, aunque se puede usar cualquier valor para el umbral. Las bases para seleccionar el umbral son los riesgos (costos) de tomar decisiones erróneas; ver error tipo/ y error tipo 11. Aleatorización: Proceso de asignación para tratamiento de unidades experimentales basado en la probabilidad de que todos los subgrupos de unidades de igual tamaño tengan la misma probabilidad de recibir un tratamiento determinado. NOTAS-1. El mecanismo de probabilidad puede ser un proceso físico sin sesgo (tirar dados sin sesgo, lanzar una moneda, sacar de una urna bien revuelta), tablas de números aleatorios o números aleatorizados generados por computadora. Se debe tener cuidado con la selección y uso del método. Resulta una buena práctica utilizar un generador de números aleatorios computarizado validado. 2. El uso de aleatorización puede ayudar a prevenir que el error sistemático se asocie con muestras particulares o con un patrón de dilución y que ocasione sesgo. Por ejemplo, en valoraciones biológicas de 96 pocillos, los efectos de la placa pueden ser importantes y ocasionar sesgo en respuestas observadas o medidas sumarias. En estudios con animales, son varios los factores relacionados con animales individuales que pueden influenciar las respuestas. Si no se demuestra de manera rutinaria que los factores extraños que influencian los estudios que usan placas o los estudios que usan animales han sido eliminados o minimizados hasta un grado que los convierta en insignificantes, la aleatorización será esencial para obtener datos sin sesgo requeridos para el cálculo de la potencia verdadera. 3. La aleatorización es una buena práctica incluso cuando existen pruebas de que factores operativos (p.ej., ubicación, tiempo, lote de reactivo) tienen un efecto menor o nulo sobre el sistema de valoración. Aunque la aleatorización puede no proteger una valoración individual (o quizás un bloque de una valoración) de un factor operativo (quizás recientemente) importante, la aleatorización provee la seguridad de que los resultados de un conjunto de valoraciones no presentan sesgo debido a factores operativos. Determinaciones repetidas: Se refiere al proceso en el que múltiples unidades experimentales independientes reciben el mismo nivel de un factor de tratamiento. NOTAS-1. El propósito de las determinaciones repetidas es minimizar los efectos de fuentes de variabilidad aleatoria incontrolables. 2. Las determinaciones repetidas pueden ocurrir completamente en bloques aleatorios o en todos los bloques. Por lo general, las determinaciones repetidas dentro de bloques se denominan pseudo-replicación (q.v.). 3. La determinación repetida de factores que contribuyen en mayor medida a la variabilidad, o factores que están en los niveles más altos en un diseño anidado, por lo general generan la reducción más efectiva de variabilidad aleatoria. Determinaciones repetidas verdaderas: Se refiere a las muestras basadas en unidades experimentales independientes. Error estándar de estimación: Se refiere a una medición de la incertidumbre de una estimación de un valor de informe u otro parámetro debida a la variación del muestreo NOTAS-1. En las valoraciones biológicas, el enfoque se centra en la precisión (error estándar) de la potencia relativa. 2. Los errores estándar se pueden minimizar con determinaciones repetidas adicionales. 3. Técnicamente, el error estándar de una estimación es la desviación estándar de la distribución de muestreo de la estimación. El término error estándar se usa para dis-
Información General/ (1031) Biocompatibilidad de los Materiales Usados 897
USP 39
tinguir entre este uso de desviación estándar (que depende del tamaño de la muestra) y el uso común en el laboratorio en el que la desviación estándar (o coeficiente de variación) se usa para caracterizar la precisión de mediciones individuales obtenidas de un procedimiento. Esta última precisión no depende del tamaño de la muestra. Control estadístico del proceso: Conjunto de métodos estadísticos empleados para monitorear desviaciones y tendencias en un proceso. Error tipo 1: Se refiere al error cometido al juzgar el análisis de los datos, en el cual se acepta la hipótesis alternativa cuando ésta es falsa. NOTA-La probabilidad de un error tipo 1 por lo general se indica mediante a. Error tipo 11: Se refiere al error cometido al juzgar el análisis de los datos, en el cual se rechaza Ja hipótesis alternativa cuando ésta es verdadera. NOTA-La probabilidad de un error tipo 11 por lo general se indica mediante f3 . Análisis de los componentes de la varianza: Análisis estadístico que separa las contribuciones a la variabilidad total de los componentes asociados con los factores que influyen en la valoración tales como el analista, el día o el instrumento.
(1031) BIOCOMPATIBILIDAD DE LOS MATERIALES USADOS EN ENVASES DE MEDICAMENTOS, DISPOSITIVOS MÉDICOS E IMPLANTES
Este capítulo proporciona pautas para la identificación y realización de los procedimientos para evaluar la biocompatibilidad de los envases de medicamentos, cierres elastoméricos, dispositivos médicos e implantes. La biocompatibilidad se refiere a la tendencia de estos productos a mantenerse biológicamente inertes durante todo su período de contacto con el organismo. Los procedimientos de prueba de biocompatibilidad nombrados en este capítulo están diseñados para detectar las características no específicas de reactividad biológica, físicas o químicas de los productos médicos o de los materiales usados en su construcción. Junto con las pruebas químicas, estos procedimientos biológicos se pueden usar para detectar e identificar la toxicidad inherente o adquirida de los productos médicos antes o durante su fabricación y procesamiento. En los siguientes capítulos generales se hace referencia a los procedimientos de prueba preclínicos para evaluar la seguridad de los elastómeros, plásticos u otros polímeros usados en la elaboración de productos médicos: •Medicamentos Inyectables yen
lmplantes(1 )e .(-!lftil:ma\<-29'.i!i)t Pruebas de Reactividad Biológica, In Vitro (87), Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo (88), Dispositivos Médicos-Pruebas de Endotoxinas Bacterianas y Pirógenos (161 ), Tapones Elastoméricos para Inyectables (381 ), •Sístemás. de Envases Plásticos y sus. Matef'fales de C,. Materiqíes P#1.stit:x>s de CPnstrl,Jcción (661 .1) y Sistemas de Envases Plásticos para Uso Fqrrnacéutfcó(661.2:) ..• C~F~i~m~-21~~ Los procedimientos de prueba in vitro e in vivo específicos para evaluar la biocompatibilidad de productos médicos en pacientes se describen en (87) y en (88). Los procedimientos para evaluar la biocompatibilidad de un producto médico o de los materiales empleados en su elaboración se han categorizado como un panel de efectos biológicos (procedimientos de toxicidad): citotoxicidad, sensibilización, irritación o reactividad intracutánea, toxicidad sistémica aguda, toxicidad subcrónica (repetida), genotoxicidad, implantación, hemocompatibilidad, toxicidad crónica (duración de más de 10% de la expectativa de vida del animal de prueba o mayor de 90 días), carcinogenicidad, toxicidad reproductiva o del desarrollo y biodegradación. 1 En la Tabla 7 se indican los capítulos generales de Ja USP referentes a los procedimientos de toxicidad para estas categorías. Además, la pirogenicidad, un tema de toxicidad especial, se evalúa en Prueba de Pirógenos (151) y en Prueba de Endotoxinas Bacterianas (85). Actualmente no existen capítulos generales que detallen los requisitos2 de las pruebas de toxicidad subcrónica, genotoxicidad, toxicidad crónica, carcinogenicidad, hemotoxicidad, toxicidad reproductiva o biodegradación. Tabla 1. Procedimientos de Determinación de Toxicidad en los Capítulos Generales de la USP Capítulo General de la USP
Efecto Biológico
Pruebas de Reactividad Biológica, In Vitro (87)*
Citotoxicidad
Pruebas de Sensibilización (1184)
Sensibilización Irritación o reactividad intracutánea
Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo (88)t
Toxicidad sistémica (toxicidad aguda)
Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo (88)
Implantación
Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo (88)
* Los capítulos generales adicionales que se refieren a este efecto biológico incluyen (161), (381), •(p6l), (661.1) y<661.2)•• (AF01-may-2106) t Los capítulos generales adicionales que se refieren a este efecto biológico incluyen >e (ÁF Ol"maY-2016)' (161 ), (381 ), •<661), (661.1) y (661.2).
•o
•
IAF U1-mav-2Hl6)
1 Documento ISO 10993-1 :1997 (o versión actualizada) titulado Biological Evaluation of Medica/ Devices-Part 1: Evaluation and Testing. 2
Ver OECD Guidelines for Testing of Chemicals en www.oecd.org.
898 (1031) Biocompatibilidad de los Materiales Usados/ Información General
USP 39
Cambio en la redacción:
ENVASES DE MEDICAMENTOS Biocompatibilidad de los Envases de Plástico y de Otros Polímeros para Medicamentos Los envases farmacéuticos consisten en un recipiente y un cierre. Los envases de plástico pueden estar formados por polímeros que tras su extracción no alteran la estabilidad del producto que contienen ni muestran toxicidad. Los requisitos de la prueba de biocompatibilidad para los envases de medicamentos se especifican en •(1 ), (661 ), {661.1 ¡y {661.2) .• (AF Ol·m•y-2016) Según se indica en estos capítulos, el plástico u otras porciones poliméricas de estos productos se prueban según los procedimientos definidos en (87). Los plásticos u otros polímeros que no cumplan con los requisitos de Pruebas de Reactividad Biológica, in Vitro (87) no son materiales adecuados para envases de medicamentos. Los materiales que cumplen con los requisitos in vitro están calificados como materiales biocompatibles sin la necesidad de pruebas adicionales y se pueden usar para fabricar envases de medicamentos. Si se desea una designación de clase (clases 1-VI) para los plásticos u otros polímeros, hay que realizar los procedimientos de prueba adecuados que se presentan en la sección Pruebas In Vivo y Designación de Clase.
Cierres Elastoméricos Los cierres elastoméricos son cierres que se pueden perforar con una jeringa y mantener su integridad debido a sus propiedades elásticas. Los materiales elastoméricos pueden estar compuestos de varias entidades químicas, incluyendo materiales de relleno, pigmentos, plastificantes, estabilizadores, aceleradores, agentes vulcanizantes y un polímero natural o sintético. Estos materiales se usan para la fabricación de un producto que tenga las propiedades físicas elastoméricas deseadas y a menudo demuestran reactividad biológica-degeneración y malformación celular-cuando se someten a pruebas con cultivos celulares in vitro. La biocompatibilidad de un material elastomérico se evalúa según el protocolo de prueba de dos etapas especificado en Procedimientos para Prueba Biológica en (381 ). A diferencia de los plásticos u otros polímeros, un material elastomérico que no cumple con los requisitos de las pruebas de la primera etapa (in vitro) puede aceptarse como material biocompatible si pasa las pruebas de la segunda etapa (in vivo) que son la Prueba de Inyección Sistémica y la Prueba lntracutánea descritas en (88). No se hace distinción de clase ni de tipo entre los materiales elastoméricos que cumplen con los requisitos de las pruebas de la primera etapa y los aceptables como materiales biocompatibles al cumplir con los requisitos de la segunda etapa. Los materiales elastoméricos no reciben una designación de clase 1-VI.
Cambio en la tedtJcclón:
DISPOSITIVOS MÉDICOS E IMPLANTES Los dispositivos médicos e implantes etiquetados como apirógenos, en contacto directo o indirecto con el sistema cardiovascular u otros tejidos blandos del cuerpo, cumplen con los requisitos descritos en (161 ). Los productos detallados en este capítulo que cumplen con los criterios son equipos de administración de soluciones, equipos de extensión, equipos de transferencia, equipos de administración de sangre, catéteres intravenosos, dializadores y tubos y accesorios para diálisis, equipos para transfusión e infusión y catéteres para la administración intramuscular de fármacos. Los criterios descritos no se aplican a los productos médicos tales como productos ortopédicos, guantes de látex y apósitos para heridas. Los requisitos de prueba descritos o a los que se hace referencia en (161) incluyen los requisitos de Esterilidad, Endotoxinas bacterianas, Pirógenos y Otros requisitos. En (85) se define un procedimiento para evaluar la presencia de endotoxinas bacterianas y los límites se definen en Endotoxinas Bacterianas en (161 ). Para los dispositivos en que no se puede realizar la Prueba de Endotoxinas Bacterianas (85) debido a características de promoción o inhibición no eliminables, se aplica la Prueba de Pirógenos (151 ). Los procedimientos para evaluar dispositivos médicos que contienen vías estériles se definen en Dispositivos Estériles en Pruebas de Esterilidad (71 ). En la Prueba de Seguridad en (88) se define un procedimiento para evaluar la seguridad de los dispositivos médicos. Los componentes de plástico o de otros polímeros de los dispositivos médicos cumplen con los requisitos especificados para los plásticos y otros polímeros en •(661), (661.1) .y(661.2)• (AFOl·may.2106); los fabricados con elastómeros cumplen con los requisitos en (381 ). Según se indica en estos capítulos, la biocompatibilidad de las porciones de plástico, de otros polímeros y los elastómeros de estos productos se analizan conforme a los procedimientos descritos en (87). Si también se requiere la designación de clase para un plástico u otro polímero, se realizan procedimientos de prueba adecuados descritos en (88). Al igual que para los cierres elastoméricos, los materiales elastoméricos que no cumplen con los requisitos in vitro pueden estar calificados como materiales biocompatibles y usarse en la elaboración de dispositivos médicos si cumplen con los requisitos de la Prueba de Inyección Sistémica y la Prueba lntracutánea en (88). Al igual que para los envases de medicamentos, los plásticos y otros polímeros que no cumplen con los requisitos de la prueba in vitro no son materiales aptos para ser utilizados en dispositivos médicos.
USP 39
Información General/ (1031) Biocompatibilidad de los Materiales Usados 899
PRUEBAS IN VITRO, PRUEBAS IN VIVO V DESIGNACIÓN DE CLASE PARA PLÁSTICOS V OTROS POLÍMEROS Los requisitos de prueba especificados en (87) y (88) están diseñados para determinar la reactividad biológica de cultivos celulares de mamíferos y la respuesta biológica de animales a los materiales elastoméricos, plásticos y de otros polímeros que están en contacto directo o indirecto con el paciente. La reactividad biológica de estos materiales puede depender tanto de las características de sus superficies como de sus componentes químicos extraíbles. Los procedimientos de prueba detallados en estos capítulos a menudo se pueden realizar con el material o un extracto del material en análisis, a menos que se especifique algo diferente.
Preparación de Extractos La evaluación de la biocompatibilidad de un producto médico completo a menudo no es realista; por lo tanto, el uso de porciones o extractos representativos de materiales seleccionados puede ser la única alternativa práctica para realizar los ensayos. Cuando se usan porciones representativas de los materiales o extractos de los materiales en análisis, es importante tener en cuenta que las materias primas pueden sufrir cambios químicos durante la fabricación, el procesamiento y la esterilización de un producto médico. Si bien la prueba in vitro de materias primas puede servir como un procedimiento de examen inicial importante, hay que hacer una evaluación final de la biocompatibilidad de un producto médico con porciones del producto terminado y esterilizado. Los extractos se preparan de acuerdo con los procedimientos expuestos en (87) y en (88). Las extracciones se pueden realizar a diversas temperaturas (121 º, 70º, 50º o 37°) durante diferentes intervalos de tiempo (1 hora, 24 horas o 72 horas) y en medios de extracción diferentes. La elección del medio de extracción para los procedimientos de Pruebas de Reactividad Biológica, in Vitro (87) incluye la Inyección de Cloruro de Sodio (0,9% NaCI) o un medio de cultivo de tejidos con o sin suero. Cuando se usa un medio con suero, la temperatura de extracción no puede exceder de 37º. El medio de extracción in vivo incluye los medios descritos en (88) o el disolvente al cual se expone el medicamento o dispositivo médico. Al elegir las condiciones de extracción, hay que seleccionar las variables de temperatura, disolvente y tiempo que mejor simulen las condiciones "de uso" del producto. Se pueden realizar muchas pruebas en diferentes condiciones para simular variaciones en las condiciones "de uso". Si bien la selección cuidadosa de las condiciones de extracción permite la simulación de las condiciones de fabricación y procesamiento en la prueba de materias primas, se realizará una prueba de la biocompatibilidad del producto con el producto terminado y esterilizado.
Pruebas In Vitro Los procedimientos descritos en (87) incluyen una Prueba de Difusión en Agar (prueba de contacto indirecto), una Prueba de Contacto Directo y una Prueba de Elución (prueba de extracción). La muestra es biocompatible si los cultivos celulares no muestran más que una reactividad leve (Grado 2) al material de prueba, como se describe en (87). La Prueba de Difusión en Agar está diseñada para evaluar la biocompatibilidad de los materiales elastoméricos. El material se coloca sobre una capa de agar superpuesta a la monocapa celular, que protege a las células contra el daño físico debido al material y permite que las sustancias químicas o materiales lixiviables difundan desde el elastómero y entren en contacto con la monocapa celular. Los extractos de materiales elastoméricos se analizan colocando papel de filtro saturado con un extracto del elastómero sobre la superficie del agar solidificado. La Prueba de Contacto Directo está diseñada para materiales elastoméricos o plásticos que no dañarán físicamente las células con las que entren en contacto directo. Toda sustancia química lixiviable difunde desde el material al medio de crecimiento suplementado con suero y entra en contacto directo con la monocapa celular. La Prueba de Elución está diseñada para evaluar los extractos de materiales poliméricos. El material se puede aplicar directamente al medio de cultivo de tejidos. La realización de la Prueba de Difusión en Agar o la Prueba de Contacto Directo junto con la Prueba de Elución es el protocolo de prueba preferido. La extracción del producto o los materiales para la Prueba de Difusión en Agar o la Prueba de Elución se efectúa según se describe en Preparación de Extractos.
Pruebas In Vivo
y Designación de Clase
De acuerdo con los requisitos de inyección e implantación especificados en la Tabla 7 en (88), los plásticos y otros polímeros reciben una designación de clase entre la clase 1y la clase VI. Para obtener la designación de clase de un plástico u otro polímero, se producen extractos del material de prueba en diversos medios según los procedimientos especificados. Para evaluar la biocompatibilidad, los extractos se inyectan por vía sistémica e intracutánea en ratones y conejos o cobayos. Según los requisitos de inyección especificados, un plástico u otro polímero puede pertenecer inicialmente a la clase 1, 11, 111 o V. Si además de la prueba de inyección, se realiza una prueba de implantación usando el material en sí, el plástico u otro polímero puede clasificarse como clase IV o clase VI.
900 (1031) Biocompatibilidad de los Materiales Usados / Información General
USP 39
BIOCOMPATIBILIDAD DE DISPOSITIVOS MÉDICOS E IMPLANTES Además de la evaluación de productos médicos para propósitos farmacopeicos según los procedimientos especificados en '
f!:!1\lll'illltlllrtS, (87), (88), (161), (381), Bll'll•l\B'lali•~Plrl~litlll, los dispositivos médicos e implantes se en a su capacidad de sensibilización, toxicidad subcrónica, genotoxicidad, hemocompatibilidad, toxicidad crónica, carcinogenicidad, toxicidad reproductiva o del desarrollo y biodegradación según lo exijan los organismos regulatorios. Las pautas suministradas por los organismos regulatorios indican que el número de pruebas al que se somete un dispositivo médico o un implante depende de los siguientes factores: (1) la similitud y singularidad del producto con respecto a los productos previamente comercializados ("comparables") según se considera en el Diagrama de Flujo de Decisión; (2) la magnitud y duración del contacto entre el producto y el paciente, según se describen en la Categorización de Dispositivos Médicos; y (3) los materiales que componen el producto según se considera en los apartados Diagrama de Flujo de Decisión y Prueba In Vivo y Designación de Clase.
Diagrama de Flujo de Decisión Las pautas para la comparación de un dispositivo médico o un implante con productos previamente comercializados se proporcionan en el Diagrama de Flujo de Biocompatibilidad (ver la Figura J3 ) según la adaptación del Blue Book Memorandum #G95-1 de la FDA. El propósito del diagrama de flujo es determinar si los datos disponibles de dispositivos previamente comercializados son suficientes para asegurar la seguridad del dispositivo en consideración. Según se indica en el diagrama de flujo, los materiales de composición y las técnicas de fabricación de un producto se comparan con aquéllas de productos previamente comercializados para dispositivos que entran en contacto directo con el cuerpo. Además, el diagrama de flujo exige una evaluación de la toxicidad de todo material especial que no se haya usado en dispositivos comparables. Las respuestas a las preguntas formuladas en el diagrama de flujo llevan a la conclusión de si los datos disponibles son suficientes o si se necesitan pruebas adicionales para asegurar la seguridad del producto. Cuando se necesitan pruebas adicionales, en la sección Matriz de Selección de Prueba se proporcionan las pautas para la identificación de los procedimientos de prueba adecuados.
Categorización de Dispositivos Médicos Para facilitar la identificación de los procedimientos de prueba adecuados, los dispositivos médicos se dividen y subdividen según se muestra en la Tabla 2, de acuerdo con el tipo y grado de contacto con el cuerpo. Las principales categorías de dispositivos médicos son los dispositivos de superficie, los dispositivos de comunicación externa y los dispositivos de implante. Éstas a su vez se subcategorizan. En la Tabla 2 también se presentan algunos ejemplos de dispositivos médicos e implantes pertenecientes a cada una de las subcategorías.
3 Adaptado de Blue Book Memorandum #G95-1 de la FDA ("Use of lnternational Standard IS0-10993. 'Biological Evaluation of Medical Devices-Part 1: Evaluation and Testing."')
USP 39
Información General/ (1031) Biocompatibilidad de los Materiales Usados 901
Comienzo
¿Material en contacto
NO
SÍ
NO
¿Es un etal, aleación metálica o un mal. cerámico?
SÍ
sí
¿Coniene sustancias tóxicas:
NO
NO
Consultar el perfil de toxicología específico del NO dispositivo para definir _,___ _ _ _ _ _~~----------<
SÍ
las pruebas adecuadas
SÍ
Requisitos de Biocompatibilidad Cumplidos
Material Tóxico
Fig. 1. Diagrama de flujo de biocompatibilidad
902 (1031) Biocompatibilidad de los Materiales Usados / Información General
USP 39
Tabla 2. Clasificación y Ejemplos de Dispositivos Médicos Categoría del Dispositivo
Subcategoría del Dispositivo
Tipo o Grado de Contacto
Algunos Ejemplos
Dispositivos en contacto sólo con la superficíe de la piel intacta
Electrodos, prótesis externas, cintas de fijación, vendas para compresión y monitores de varios tipos
Membrana Mucosa
Dispositivos que se comunican con membranas mucosas intactas
Lentes de contacto, catéteres urinarios, dispositivos intravaginales e intraintestinales (tubos estomacales, sigmoidoscopios, colonoscopios, gastroscopios), tubos endotraqueales, broncoscopios, prótesis dentales, dispositivos de ortodoncia y dispositivos intrauterinos
Superficies Lesionadas o Afectadas
Dispositivos en contacto con superficies corporales lesionadas o afectadas de algún modo
Dispositivos para curación o apósitos para úlceras, quemaduras y tejido de granulación, y parches oclusivos
Vía Sanguínea, Indirecta
Dispositivos en contacto con la vía sanguínea en un punto y que sirven de conducto para ingresar al sistema vascular
Equipos para administración de soluciones, equipos de extensión, equipos de transferencia y equipos para administración de sangre
En Comunicación con Tejído, Hueso o Dentina
Dispositivos y materiales en comunicación con tejidos, hueso, o el sistema de pulpa y dentina
Laparoscopios, artroscopios, sistemas de drenaje, cementos dentales, materiales de oclusión dental y grapas para piel
Dispositivos en contacto con sangre en circulación
Catéteres intravasculares, electrodos temporales de marcapasos, oxigenadores, tubos y accesorios de oxigenador extracorporeo, dializadores, tubos y accesorios para diálisis, hemoadsorbentes e inmunoadsorbentes
Dispositivos principalmente en contacto con huesos o con tejidos y fluidos de tejídos
Ejemplos de los primeros son clavos ortopédicos, placas, articulaciones de reemplazo, prótesis óseas, cementos y dispositivos intraóseos; ejemplos de los segundos son marcapasos, dispositivos de administración de fármacos, sensores y simuladores neuromusculares, tendones de reemplazo, implantes mamarios, laringes artificiales, implantes subperiosteales y pinzas de ligadura
Dispositivos principalmente en contacto con sangre
Electrodos de marcapasos, fístulas arteriovenosas artificiales, válvulas cardíacas, injertos vasculares, catéteres internos de administración de fármacos y dispositivos de asistencia ventricular
Piel
Dispositivos de Superficie
Dispositivos Externos de Comunicación
Sangre en Circulación
Dispositivos de Implante Tejido o Hueso
Sangre
Matriz de Selección de Prueba La matriz proporciona pautas para la identificación de procedimientos apropiados de pruebas biológicas para las tres categorías de dispositivos médicos: pruebas para Dispositivos de Superficie (ver la Tabla 3), pruebas para Dispositivos Externos de Comunicación (ver la Tabla 4) y pruebas para Dispositivos de Implante (ver la Tabla 5). Cada categoría de dispositivos se subcategoriza y luego se subdivide aún más según la duración del contacto entre el dispositivo y el cuerpo. La duración del contacto se define como (A) limitada (menos de 24 horas); (B) prolongada (de 24 horas a 30 días); o (C) permanente (más de 30 días). Los efectos biológicos que se incluyen en la matriz son citotoxicidad, sensibilización, irritación o reactividad intracutánea, toxicidad sistémica, toxicidad subcrónica, genotoxicidad, implantación, hemocompatibilidad, toxicidad crónica, carcinogenicidad, toxicidad reproductiva o del desarrollo y biodegradación. Los capítulos generales que contienen el procedimiento de prueba de toxicidad para estos efectos biológicos se indican en la Tabla 7. Cada subcategoría de la matriz tiene un panel asociado de requisitos de prueba. Generalmente, la cantidad de pruebas en el panel aumenta cuando aumenta la duración del contacto entre el dispositivo y el cuerpo, y a medida que el dispositivo o implante está en contacto más cercano con el sistema circulatorio. Dentro de varias subcategorías, la opción de realizar pruebas adicionales a las requeridas se deberá considerar caso por caso. Para tomar decisiones con respecto a la inclusión de pruebas reproductivas o de desarrollo, el fabricante deberá tomar en cuenta situaciones específicas, como por ejemplo el uso de dispositivos de implante permanente o dispositivos externos de comunicación para mujeres embarazadas y niños. En la matriz se proporcionan las pautas para la identificación de posibles procedimientos de prueba adicionales para cada subcategoría de dispositivos médicos.
USP 39
Información General/ (1031) Biocompatibilidad de los Materiales Usados 903
PAUTAS PARA LA SELECCIÓN DE LA DESIGNACIÓN DE CLASE DEL PLÁSTICO U OTRO POLÍMERO PARA UN DISPOSITIVO MÉDICO Para proporcionar pautas para la selección de la designación de clase adecuada de un plástico u otro polímero para un dispositivo médico, se asigna a cada subcategoría de los Dispositivos de Superficie (ver la Figura 2) Dispositivos de Superficie
Membranas Mucosas
Piel
Superficies Lesionadas o Afectadas
Limitada*
Permanente
USPClaset
USP Clase VI
1
Fig. 2. Requisitos de USP para la clase de plástico y otros polímeros para dispositivos de superficie. ·Categorización basada en la duración del contacto: limitada-menos de 24 horas; prolongada-de 24 horas a 30 días; permanente-más de 30 días. t Designación de la Clase de Plástico según la USP. y los Dispositivos Externos de Comunicación (ver la Figura 3) Dispositivos Externos de Comunicación
Vía sanguínea indirecta
En comunicación con tejido/hueso/dentina
Sangre en circulación
Limitada*
USP Claset IV
USP Clase VI
Fig. 3. Requisitos de USP para la clase de plástico y otros polímeros para dispositivos externos de comunicación. ·Categorización basada en la duración del contacto: limitada-menos de 24 horas; prolongada-de 24 horas a 30 días; permanente-más de 30 días. t Designación de la Clase de Plástico según la USP. una designación según la Clase de Plástico de la USP (ver (88)). Si las pruebas para cada designación de clase de la USP no son suficientes para un dispositivo específico, el fabricante o profesional debe desarrollar un conjunto de pruebas adecuado. El número de clase numérica indicado aumenta en relación a la duración (riesgo) del contacto entre el dispositivo y el cuerpo. En la categoría de Dispositivos de Implante es obligatorio usar exclusivamente la clase VI. La asignación de la designación de la Clase de Plástico de la USP se basa en las matrices de selección de prueba ilustradas en las Tablas 3, 4 y 5. La asignación de una designación de clase de plástico u otro polímero a una subcategoría no está destinada a restringir el uso de clases superiores de plásticos u otros polímeros. Si bien la clase asignada define la clase numérica más baja de plástico u otro polímero que se puede usar en el dispositivo correspondiente, el uso de una clase numérica superior de plástico es opcional. Cuando un dispositivo se puede definir como perteneciente a más de una categoría de dispositivo, el plástico u otro polímero debe cumplir con los requisitos de la clase numérica más alta.
'°.¡:,..o
Tabla 3. Matriz de Selección de Prueba para Dispositivos de Superficie* Efecto Biológicob
Categoría del Dispositivo
Contacto Corporal Piel
Dispositivos de Superficie
Membrana Mucosa Superficies Lesionadas o Afectadas
Duración del Contactoª
Citotoxi cid ad
Sensibilizaclón
Irritación o Reactivldad Intracutánea
Toxlcidad Sistémica (Aguda)
Toxicldad Subcrónica
Genotoxicldad
Implantaclón
,,.__ Hemocompatlbllldad
Toxicidad Crónica
--'
o
w
Biodegradación
--'
'-./
OJ
6" ()
o 3
A
X
X
X
-
-
-
-
-
-
-
-
-
B
X
X
X
-
-
-
-
-
-
-
-
-
e
X
X
X
-
-
-
-
-
-
-
-
......
A
X
X
X
-
-
-
-
-
X
X
X
o
-
-
-
o:
X
X
X
X
X
o o
-
e
-
o
-
-
-
A
X
X
X
o o o o o
-
-
B
-
-
-
-
-
-
-
-
-
B
X
X
X
e
X
X
X
o
-
X
X
o o
-
-
-
-
-
-
o
-
-
-
ª Leyenda: A-limitada (menos de 24 horas); B-prolongada (de 24 horas a 30 días); C-permanente (más de 30 días). Leyenda: X-pruebas de evaluación ISO a considerar; O-pruebas adicionales que pueden ser aplicables. * Adaptado de Blue Book Memorandum #G95-1 de la FDA (Tabla 1. Pruebas de Evaluación Iniciales a Considerar y Tabla 2. Pruebas de Evaluación Suplementarias a Considerar).
b
Carelnogenicldad
Toxicidad Reproductiva o del Des arrollo
-o ~
Q'. ~
o. o. ro
o V>
~ ~
ni
¡¡;· """'
;:o V>
e
V>
~
o. o
-V>
SO'
ª
e
"o~ :::i (") 11)
:::i 11)
ª-
eVl -¡;¡
w
'°
e
Tabla 4. Matriz de Selección de Prueba para Dispositivos Externos de Comunicación*
Contacto Corporal Vía Sanguínea, Indirecta En Comunicación con Tejido, Hueso o Dentina Sangre en Circulación
ª
v
Efecto Blológicob
Categorías del Dispositivo
Dispositivos Externos de Comunicación
V>
Duración del Contactoª A
Citotoxicidad X
Sensibilización X
Irritación o Reactividad Intracutánea X
Toxicidad Subcrónica
Genotoxicidad
Implantación
X
-
-
-
Toxicidad Sistémica (Aguda)
w
Hemocompatibilidad X
\O
Toxicidad Crónica
Carcinogenicid ad
Toxicidad Reproductiva o del Des arrollo
-
-
-
-
-
Biodegradación
B
X
X
X
X
o
-
-
X
-
-
-
e
X
X
o
X
X
X
o
X
X
X
-
-
A
X
X
X
-
-
-
-
-
-
-
-
B
X
X
X
-
-
-
-
-
X
X
o o
X
e
o o
o o o
X
X
-
X
X
-
-
A
X
X
X
X
-
o
-
X
-
-
-
-
B
X
X
X
X
o
X
-
-
-
-
X
X
X
X
X
X
o o
X
e
X
X
X
-
-
Leyenda: A-limitada (menos de 24 horas); B-prolongada (de 24 horas a 30 días); C-permanente (más de 30 días). b Leyenda: X-pruebas de evaluación ISO a considerar; O-pruebas adicionales que pueden ser aplicables. * Adaptado de Blue Book Memorandum #G95-1 de la FDA (Tabla 1. Pruebas de Evaluación Iniciales a Considerar y Tabla 2. Pruebas de Evaluación Suplementarias a Considerar).
SO'
ª
Q
n o~
::s
(") ~
::s
~
--ª-
__. -----o w
OJ
e» (")
o
3
-o tll
!:!".
g:
Ci tll
Q_ Q_ (!)
o
V>
~
,...,.
tll (!)
....,
¡¡:;·
ro
V>
e
V>
tll
Q_
o V>
\O
o
V1
'° o
Tabla 5. Matriz de Selección de Prueba para Dispositivos de Implante*
Contacto Corporal
Cito toxi cid ad
Sensibilización
Irritación o Reactividad Intracutánea
Toxicidad Sisté mica (Aguda)
Toxicidad Subcrónica
Genotoxicidad
_........_
Implantación
Hemocompatibllidad
Toxicidad Crónica
Carelnogenicid ad
Toxicidad Reproductiva o del Desarrollo
Biodegradación
o
w
A
X
X
X
-
-
-
-
-
-
-
Tejido o Hueso
X
X
X
-
-
-
-
-
X
X
o o
X
e
o o
o o o
-
B
X
X
-
X
X
-
-
Sangre
A
X
X
X
X
-
-
X
X
-
-
-
-
B
X
X
X
X
o
X
X
X
-
-
-
-
e
X
X
X
X
X
X
X
X
X
-
-
Dispositivos de Implante
ª
Duración del Contactoª
°'__.
Efecto Biológicob
Categoría del Dispositivo
Leyenda: A-limitada (menos de 24 horas); B-prolongada (de 24 horas a 30 días); C-permanente (más de 30 días). b Leyenda: X-pruebas de evaluación ISO a considerar; O-pruebas adicionales que pueden ser aplicables. • Adaptado de Blue Book Memorandum #G95-1 de la FDA (Tabla 1. Pruebas de Evaluación Iniciales a Considerar y Tabla 2. Pruebas de Evaluación Suplementarias a Considerar).
X
O:J
o·
n
o 3 -o QJ !:!".
o-
c: QJ
o.. o.. (!)
o
V>
~
QJ
....... (!)
¡¡;· ""' ¡;;V>
e
V> QJ
o..
o
-ª V>
SO'
o a. o, ::::¡ () 1\)
::::¡
1\)
ª-
e
Vl
"w
'°
USP 39
Información General/ (1032) Valoraciones Biológicas 907
(1032) DISEÑO Y DESARROLLO DE VALORACIONES BIOLÓGICAS 1 INTRODUCCIÓN 1.1 Propósito y Alcance El capítulo general Diseño y Desarrollo de Va/oraciones Biológicas (1032) presenta metodologías para el desarrollo de procedimientos de valoración biológica que cuentan con un diseño experimental sólido, capaces de proporcionar datos que pueden ser analizados mediante principios estadísticos bien fundamentados, y adecuados para su uso específico. El capítulo general (1032) forma parte del grupo de cinco capítulos generales enfocados en valoraciones de potencia relativa, en las cuales se cuantifica la actividad de un material de Prueba mediante su comparación con la actividad de un material Estándar. No obstante, muchos de los principios se pueden aplicar a otros sistemas de valoración. El propósito de este capítulo general es servir como guía para el diseño y el desarrollo de una valoración biológica para un fármaco o producto farmacéutico destinado para su distribución comercial. Aunque la adopción de los métodos recomendados en este capítulo puede requerir de una importante inversión de recursos durante el desarrollo de la valoración, su implementación temprana puede generar beneficios. Finalmente, las perspectivas y los métodos descritos en este capítulo son los recomendados entre una gran variedad de alternativas ofrecidas por la teoría y práctica contemporáneas de las valoraciones biológicas. ÉNFASIS EN LA POTENCIA RELATIVA Debido a la variabilidad inherente de los sistemas de análisis biológicos (incluyendo aquellos que emplean animales, células, instrumentos, reactivos y los que se emplean a diario y entre laboratorios), una medición absoluta de la potencia es más variable que una medición de la actividad pertinente a un Estándar, lo cual ha llevado a la adopción de la metodología de la potencia relativa. Para poder suponer que los materiales Estándar y de Prueba son similares biológicamente, debería demostrarse una similitud estadística (una consecuencia de la similitud del material de Prueba y del Estándar), y se podría esperar que la muestra de Prueba se comporte como una concentración o dilución del Estándar. La potencia relativa es una medida sin unidad que se obtiene a partir de la comparación de las relaciones dosis-respuesta de las preparaciones farmacéuticas de Prueba y Estándar. Para los fines de la comparación relativa del material de Prueba con el Estándar, generalmente se asigna a la potencia del Estándar un valor de 1 (o 100%). El Estándar puede ser un material establecido como tal por una organización nacional (p.ej., la USP) o internacional (p.ej., la OMS), o puede tratarse de un Estándar interno.
1.2 Partes Interesadas Este capítulo está dirigido tanto a expertos en estadística, como a analistas dedicados a la práctica de valoraciones biológicas, quienes participan en el desarrollo de una valoración biológica. Este capítulo servirá al analista como guía para implementar la estructura y metodología de la valoración biológica a fin de alcanzar las metas analíticas, a la vez que demuestra de manera fidedigna la actividad biológica de interés; por otra parte, servirá al estadista para obtener información relacionada con las limitaciones biológicas que pudieran ser difíciles de equilibrar con una práctica rigurosa de estadística.
2. APTITUD DE LAS VALORACIONES BIOLÓGICAS PARA SU USO PREVISTO Para evaluar la aptitud de una valoración para su uso previsto, el analista debe especificar claramente los propósitos con los que se lleva a cabo la valoración biológica. Los usos comunes para una valoración biológica incluyen la liberación de lotes de fármacos (ingredientes farmacéuticos activos) y productos farmacéuticos; la evaluación de estabilidad; la calificación del Estándar y de otros reactivos críticos; la caracterización de productos intermedios del proceso y formulaciones; la caracterización de contaminantes y productos de degradación; y la validación de los cambios en el proceso de producción del producto. Los requisitos de exactitud relativa, especificidad, precisión y robustez pueden ser diferentes para cada uno de los usos potenciales. Una buena estrategia consiste en desarrollar y validar una valoración biológica para sustentar múltiples usos previstos; por ejemplo, una valoración biológica desarrollada principalmente para la liberación de partidas puede servir para otros propósitos. Las decisiones relacionadas con la aptitud de uso deben basarse en consideraciones científicas y estadísticas, así como en consideraciones prácticas tales como costos, tiempo de culminación del proceso y requisitos de rendimiento para la valoración. Cuando las valoraciones se usan para la liberación de lotes, una valoración biológica de modelo lineal permitiría evaluar la similitud suficientemente. Para valoraciones biológicas que se usan para sustentar la estabilidad, la comparabilidad, para calificar materiales de referencia o reactivos críticos, o que se relacionan con cambios en los procesos de producción o valoración, generalmente resulta útil evaluar la similitud usando la curva de concentración-respuesta completa, incluyendo las asíntotas (si estuvieran presentes).
908 (1032) Valoraciones Biológicas / Información General
USP 39
2.1 Desarrollo del Proceso Las valoraciones biológicas por lo general son necesarias para el desarrollo y la optimización de la fabricación de productos, incluidos los procesos de formulación y aumento de la escala de producción. Las valoraciones biológicas pueden usarse para evaluar las estrategias de purificación, optimizar el rendimiento del producto y medir la estabilidad del mismo. Dado que las muestras tomadas durante todo el proceso se analizan y comparan con regularidad, es necesario estudiar cuidadosamente los efectos de la matriz de muestras que pudieran afectar la respuesta de la valoración a fin de determinar la aptitud de una valoración para su uso. Para las mediciones de potencia relativa, puede ser necesario diluir el material Estándar en una matriz adecuada para cuantificación. La precisión y exactitud de la valoración biológica deben ser suficientes para medir el desempeño del proceso o para evaluar y comparar la estabilidad de las formulaciones propuestas.
2.2 Caracterización del Proceso Las valoraciones biológicas pueden llevarse a cabo para evaluar los efectos sobre la potencia de la droga relacionados con las diferentes etapas de la fabricación del fármaco o con los cambios en el proceso de fabricación (p.ej. para demostrar la equivalencia del producto antes y después de aplicar cambios en el proceso). Las valoraciones biológicas usadas en este tipo de aplicación pueden ser cualitativas o cuantitativas.
2.3 Liberación de Productos Las valoraciones biológicas se usan para evaluar la potencia del fármaco antes de la liberación del producto comercial. En la medida de lo posible, la valoración debe reflejar o imitar el mecanismo de acción conocido o esperado del producto. Cuando la valoración biológica no incluye la biología funcional directamente relacionada con el mecanismo de acción, puede ser necesario demostrar una relación entre las determinaciones de la potencia estimada por la valoración biológica y las obtenidas con alguna otra valoración que refleje mejor o de manera distinta la actividad funcional hipotética. Para las pruebas de liberación del producto, las especificaciones del mismo se establecen para definir valores mínimos o intervalos de potencia aceptables para el producto. La precisión del valor de informe obtenido de la valoración biológica debe sustentar el número de dígitos significativos establecidos en la especificación (ver el capítulo general Validación de Valoraciones Biológicas (1033)) y, junto con la exactitud relativa, sustentar el intervalo de la especificación. A fin de cumplir con estas especificaciones, el control de calidad de la fabricación deberá contar con especificaciones para la liberación del producto con límites lo suficientemente estrechos como para acomodar cualquier pérdida de actividad por inestabilidad o incertidumbre en la valoración de liberación.
2.4 Productos Intermedios del Proceso La evaluación de la valoración biológica de los productos intermedios del proceso puede proveer información con respecto a la especificidad. Las estrategias de formulación y llenado pueden basarse en valoraciones biológicas para asegurarse de que el producto farmacéutico, incluido aquél que se encuentra en el envase final, cumplirá con las especificaciones establecidas. Por ejemplo, se pueden retener los materiales a granel sin formular y evaluar su potencia. Basándose en los resultados de potencia, se puede decidir si los materiales a granel se combinan con otros lotes de material a granel, si se diluyen, o si se someten a reprocesamiento. Para estos tipos de aplicaciones, las valoraciones biológicas deben ser capaces de medir la actividad del producto en diferentes matrices. En algunos casos, se puede preparar un material Estándar distinto y utilizarlo para calcular la potencia relativa del producto intermedio del proceso.
2.5 Estabilidad Las valoraciones de potencia pueden usarse para evaluar la estabilidad de vacunas y productos obtenidos por biotecnología. La información derivada de los estudios de estabilidad realizados durante el desarrollo en condiciones de almacenamiento reales y/o aceleradas o sometidas a estrés, puede emplearse para establecer la duración de la vida útil, así como para identificar y estimar velocidades y productos de degradación. Asimismo, se pueden usar estudios de estabilidad posteriores al otorgamiento de la licencia, a fin de monitorear la estabilidad del producto. Es importante contar con conocimientos acerca de la variabilidad a corto y largo plazo de la valoración biológica para garantizar un nivel aceptable de incertidumbre en las medidas de potencia obtenidas.
2.6 Calificación de Reactivos La caracterización cuantitativa de un nuevo Estándar requiere una medición exacta y precisa de la actividad biológica del nuevo Estándar. Esta medición se usa para establecer que el lote del nuevo Estándar es equivalente al lote previo o para asignarle una potencia declarada con la que se puedan comparar las muestras de Prueba. Además, puede ser necesaria una determinación repetida adicional (que va más allá del análisis de rutina) para lograr una mayor precisión en la medición de potencia
USP 39
Información General/ (1032) Valoraciones Biológicas 909
del nuevo material Estándar. Asimismo, la valoración biológica se puede usar para calificar un reactivo para cultivo celular tal como suero fetal bovino. La aptitud de uso en dichos casos se vincula con la capacidad de la valoración para examinar lotes de reactivo y para asegurar el rechazo de lotes que pudieran generar sesgo o comprometer las mediciones de potencia relativa.
2.7 Integridad de los Productos Las vacunas, los productos obtenidos por biotecnología y los productos biológicos pueden contener una población de material heterogéneo, incluido el material que se espera predomine en el producto. Algunas impurezas del proceso y productos de degradación pueden ser activos, parcialmente activos, inactivos o antagónicos a la respuesta medida en la valoración biológica. Para variantes o derivados del producto cuyos cambios en la estructura o en la composición relativa pudieran relacionarse con cambios sutiles aunque característicos en la respuesta de la valoración biológica (p.ej., cambio en la pendiente o asíntota), la valoración biológica puede resultar útil para detectar y medir dichos derivados o variantes. Los estudios que identifican cambios característicos asociados con variantes del producto esperado ayudan a garantizar el desempeño uniforme del producto. Siempre que resulte práctico, la valoración biológica debe estar acompañada de métodos ortogonales sensibles a las variantes del producto, a las impurezas del proceso y/o a los productos de degradación.
3. ASPECTOS FUNDAMENTALES DE LA VALORACIÓN BIOLÓGICA 3.1 Valoraciones Biológicas In Vivo Las valoraciones de potencia in vivo son valoraciones biológicas en las que se administran grupos de diluciones de los materiales Estándar y de Prueba a animales, y donde las relaciones de concentración-respuesta se usan para estimar la potencia. Para algunas valoraciones con animales, el punto final es simple (p.ej., una valoración de aumento de peso corporal de la rata para la hormona de crecimiento humano o una valoración de peso de los ovarios de la rata para la hormona estimulante del folículo), pero otras requieren el procesamiento adicional de muestras recolectadas de los animales tratados (p.ej., recuento de reticulocitos para eritropoyetina, esteroideogénesis para gonadotropinas, recuento de neutrófilos para factor estimulante de colonias de granulocitos o titulación de anticuerpos después de la administración de vacunas). Con la llegada de líneas celulares específicas para el mecanismo fisiológico de acción (MOA, por sus siglas en inglés) hipotético, el uso de animales para la medición de potencia ha disminuido de manera importante. Los costos, el bajo rendimiento, así como cuestiones éticas y de otro tipo abogan contra el uso de valoraciones biológicas con animales. Asimismo, las agencias reglamentarias han promovido la limitación responsable, siempre que sea posible, del uso de animales (ver The lnteragency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods, Mission, Vision, and Strategic Priorities; Febrero de 2004). Cuando la actividad in vitro no está plenamente asociada con la actividad in vivo (p.ej., EPO), la combinación de valoraciones in vitro basadas en células y de un método fisicoquímico adecuado (p.ej., IEF, análisis de glicanos) puede ser un reemplazo para las valoraciones in vivo. No obstante, las valoraciones in vivo pueden continuar siendo necesarias cuando las valoraciones in vitro no son capaces de detectar diferencias críticas relacionadas con la función biológica prevista o esperada del fármaco. Las respuestas fisiológicas de los animales a los fármacos biológicos (incluyendo vacunas) pueden predecir las respuestas de los pacientes. La selección de animales de prueba por especie, cepa, género y madurez o intervalo de peso debe guiarse por el objetivo de desarrollar un modelo representativo y sensible con el cual se evalúe la actividad de las muestras de Prueba. Algunos métodos de valoración se adaptan al uso de colonias, en lugar de animales que no hayan sido previamente expuestos. Por ejemplo, las pruebas de pirógenos e insulina se benefician del uso de conejos de colonias que han sido previamente expuestas, los cuales proveen una capacidad de respuesta confiable. Si los animales introducidos de manera reciente en la colonia no responden según lo esperado después de administrarles varias veces un compuesto, se les deberá separar de la colonia para que no provoquen futuros resultados de valoración inválidos o indeterminados. No obstante, para la valoración de compuestos altamente antigénicos para pirógenos, se deben usar animales que no hayan sido previamente expuestos, a fin de evitar resultados inexactos o confusos. Otras ventajas de las colonias incluyen condiciones ambientales controladas (macro/ ambiente y micro/gradilla), programas de alimentación, aprovisionamiento de agua y rutinas de crianza uniformes. Se pueden usar datos históricos que incluyan registros de la colonia y datos de la valoración para identificar factores que pudieran influenciar el desempeño de la valoración. Es posible reducir la influencia de factores que pudieran generar sesgo mediante la aplicación de principios de aleatorización tales como la distribución de intervalos de peso a través de grupos de dosis, asignación de grupos de los contenedores de transporte a jaulas distintas o uso de patrones generados por computadora o de plataforma para inyección/dosificación. Para que el animal de prueba sea adecuado para su uso en una valoración biológica, éste debe estar sano y se le debe dar tiempo para que se estabilice en su ambiente. Los factores que se combinan para influenciar el estado de salud del animal incluyen una nutrición adecuada, hidratación, exención de factores de estrés físicos y sicológicos, saneamiento adecuado del lugar donde se hospeda, ciclo de luz controlado (diurno/nocturno), manipulación experimentada, inyecciones y sangrados diestros y ausencia de ruido o vibración. La observación diaria de los animales de prueba es esencial para mantener su salud, además de que se debe contar con cuidados veterinarios para evaluar cualquier cuestión que pudiera comprometer la validez de los resultados de la valoración biológica.
91 O (1 032) Valoraciones Biológicas / Información General
USP 39
3.2 Valoraciones Biológicas Ex Vivo Las células o tejidos de donantes humanos o animales se pueden cultivar en el laboratorio y usarse para evaluar la actividad de una muestra de Prueba. En el caso de las citoquinas, la mayoría de las valoraciones emplean células del sistema hematopoyético o subconjuntos de células hematopoyéticas de sangre periférica, tales como células mononucleares de la sangre periférica o linfocitos de la sangre periférica. Para proteínas que actúan sobre tejidos sólidos, como por ejemplo factores y hormonas del crecimiento, el tejido específico sobre el que actúan puede ser extraído de animales, disociado y cultivado durante un periodo limitado, ya sea como células adherentes o semiadherentes. Aunque un sistema de valoración ex vivo tiene la ventaja de ser similar al ambiente natural, también puede sufrir de variabilidad importante entre donantes, así como dificultades relacionadas con la disponibilidad de células apropiadas. Las valoraciones biológicas que involucran el uso de tejidos o células de un animal (p.ej., el método de glucagón en hepatocito de rata) requieren un procesamiento similar al de las valoraciones in vivo para minimizar la variabilidad de la valoración y el sesgo. El nivel de esfuerzo para manejar el sesgo (p.ej., mediante aleatorización) debe ser adecuado para los propósitos de la valoración. Los factores adicionales que podrían afectar los resultados de la valoración incluyen la hora del día, el peso o madurez del animal, el anestésico usado, los componentes de las soluciones amortiguadoras/reactivos, la temperatura y posición del baño de incubación y la viabilidad de las células.
3.3 Valoraciones Biológicas (Basadas en Células) In Vitro Resulta posible utilizar valoraciones biológicas que empleen líneas celulares que respondan a ligandos o agentes infecciosos específicos para las valoraciones de liberación de lote. Estas líneas celulares pueden derivarse de tumores, inmortalizarse como líneas celulares dependientes de factores o líneas celulares transfectadas con receptores adecuados obtenidas por ingeniería genética. Asimismo, también es posible utilzar líneas celulares no transformadas que se puedan mantener durante un número suficiente de pasajes (p.ej., fibroblastos). Independientemente de la línea celular, se espera una respuesta de potencia adecuadamente equivalente durante un número de pasajes continuos. Los avances en la tecnología de ADN recombinante y el entendimiento de los mecanismos de señalización celular han permitido la generación de líneas celulares modificadas por ingeniería con respuesta mejorada, expresión estable de receptores y mecanismos de señalización, así como una estabilidad más perdurable. Las respuestas celulares relacionadas con la proteína de interés dependen del mecanismo de acción del fármaco y de la duración de la exposición. Dichas respuestas incluyen la proliferación celular, muerte celular, actividad antiviral, diferenciación, secreción de citoquinas/mediador y activación de enzimas. Para las valoraciones que implican estas respuestas puede ser necesario incubar las células durante varios días, tiempo en el cual puede presentarse contaminación, evaporación poco uniforme y otros efectos de ubicación. Las autoridades reglamentarias han aceptado las respuestas comparativamente rápidas basadas en mecanismos de señalización intracelular, tales como mensajeros secundarios, activación de proteína kinasa o expresión génica del indicador. Finalmente, la mayoría de las líneas celulares usadas para valoraciones biológicas expresan receptores para múltiples citoquinas y factores de crecimiento. Es posible que dicha falta de especificidad no sea perjudicial si se demuestra la especificidad de la muestra de Prueba. El diseño de la valoración biológica basada en células debe reflejar el conocimiento que se tiene sobre los factores que influyen sobre la respuesta de las células con respecto al analito activo. La variabilidad de la respuesta a menudo se refleja en parámetros tales como la pendiente, EC 50 de la curva de concentración-respuesta o el intervalo de respuesta (respuesta máxima menos mínima). Aunque la metodología de la potencia relativa minimiza los efectos de la variación de estos parámetros entre valoraciones y entre bloques dentro de una valoración, en las estimaciones de la potencia relativa, dicha variabilidad de la respuesta puede ocasionar que una valoración sea difícil de administrar (es decir, puede ser difícil evaluar la aptitud del sistema). Por consiguiente, aunque el desarrollo de la valoración se debe enfocar principalmente en las propiedades de potencia, también resultan adecuados los esfuerzos para identificar y controlar la variación en la relación concentración-respuesta. En el caso de valoraciones por bloques (p.ej., múltiples placas de cultivo celular en una valoración) con variación apreciable en la forma de la curva entre bloques, un análisis que no incluya apropiadamente los bloques generaría estimaciones infladas de variación dentro de la valoración, ocasionando que la evaluación de la similitud sea particularmente difícil. Se dispone de dos estrategias para tratar la variación entre bloques: la primera es un esfuerzo del laboratorio para identificar y controlar fuentes de variación, y la segunda es un esfuerzo estadístico para construir y emplear un diseño y análisis en bloques. La combinación de estas estrategias puede resultar particularmente efectiva. El desarrollo de una valoración biológica basada en células comienza con la selección o generación de una línea celular. Uno de los primeros pasos importantes para desarrollar una valoración basada en células para la evaluación de un producto comercial consiste en verificar que el uso de la línea celular de interés no se restrinja únicamente a investigación. De ser posible, para asegurar el abastecimiento adecuado y uniforme de células para el análisis de productos, se debe generar un banco de células. Resulta necesario documentar en la medida de lo posible la información relacionada con las características funcionales y genéticas de la línea celular de la valoración biológica, incluyendo detalles del historial de la línea celular desde el origen hasta su incorporación al banco, por ejemplo, la información sobre una línea celular recombinante que podría incluir la identificación de la fuente de la línea celular madre (banco de células interno, almacén externo, etc.), de las secuencias de ADN usadas para transfección, y del régimen subsiguiente de selección y análisis funcional que resultó en la selección de la línea celular. Aunque no siempre resulta práctico, es convienente contar con información suficiente que permita recrear una línea celular similar en caso necesario. La información pertinente puede incluir: identidad (p.ej., isoenzima, marcadores fenotípicos, análisis genético);
USP 39
Información General/ (1032) Valoraciones Biológicas 911
morfología (p.ej., imágenes fotográficas archivadas); pureza (p.ej., análisis de detección de micoplasmas, bacterias, hongos y virus); crioconservación; condiciones de descongelación y cultivo (p.ej., componentes de los medios, temperatura y método de descongelación, métodos de propagación, densidades de siembra, condiciones de recolección); viabilidad de la descongelación (inmediatamente después de haber sido congelada y después de un tiempo de almacenamiento); características de crecimiento (p.ej., tiempos de duplicación de las células); y estabilidad funcional (p.ej., ploidía). La caracterización de células y la vigilancia relacionada con cuestiones del desempeño de la valoración que se reflejan en el estado de las células son necesarias para asegurar la calidad y longevidad de los bancos de células que se usan en el entorno de Control de Calidad. La salud general y el estado metabólico de las células al momento de la valoración biológica puede influir de manera importante sobre los resultados de las pruebas. Cuando una línea celular ha sido caracterizada y está lista para su inclusión en el banco, los analistas a menudo preparan un banco de dos niveles (Maestro y de Trabajo). El Banco de Células Maestro se crea como fuente para el Banco de Células de Trabajo. El Banco de Células de Trabajo se obtiene a partir de la expansión de uno o más viales del Banco de Células Maestro. El tamaño de los bancos depende de las características de crecimiento de las células, del número de células requerido para cada valoración y de la frecuencia con que se realizará la valoración. Algunas células pueden ser sensibles a la crioconservación, a la descongelación y a las condiciones de cultivo, por lo que los bancos se deben preparar y caracterizar cuidadosamente antes de usarlos en estudios de validación y para su uso regular en el laboratorio de Control de Calidad. Además, existen factores que pueden afectar la respuesta de la valoración biológica y la evaluación de la potencia, los cuales son comunes en muchas valoraciones biológicas basadas en células: tipo de célula (adherente o no adherente); descongelación de las células; densidad de plaqueo (durante la descongelación y durante el mantenimiento de la sucesión de siembra) y confluencia (células adherentes); frascos de cultivo; crecimiento, montaje de placas y medios de valoración; requisitos del suero (fuente, inactivación con calor, irradiación con rayos gamma); condiciones de incubación (temperatura, C0 2 , humedad, tiempos de cultivo desde la descongelación); reactivos y técnicas para recolección de células (para células adherentes, método de disociación); separación y clasificación de células; recuento de células; determinación de la salud de las células (velocidad de crecimiento, viabilidad, rendimiento); número de pasajes de células y programa de pasajes; estabilidad de la línea celular (a nivel genético, de receptor, de marcador, de expresión génica); y etapas de inanición o estimulación. La lista anterior no es definitiva, por lo que el desarrollo de la valoración debe incluir analistas que cuenten con una amplia comprensión y experiencia con respecto a la línea celular. Estos analistas experimentados deben identificar factores que podrían influir en los resultados de la valoración y, siempre que sea posible, establecer estrategias para un nivel de control adecuado.
3.4 Estándar El Estándar es un reactivo crítico en las valoraciones biológicas debido a la necesidad de contar con un material de prueba confiable contra el que se pueda comparar cuantitativamente una preparación de Prueba. Se puede asignar al Estándar una cantidad de unidades o actividad específica que represente un material con una potencia total (100%). Siempre que sea posible, un Estándar debe ser representativo de las muestras que se van a analizar en la valoración biológica. El análisis que se lleva a cabo para calificar un Estándar puede ser más riguroso que el análisis de rutina usado para la liberación del lote. Un Estándar debe almacenarse en condiciones que ayuden a conservar toda su potencia durante el tiempo esperado de uso. Con este propósito, el Estándar se puede almacenar en condiciones diferentes a las del almacenamiento normal del fármaco o producto farmacéutico. Esto puede incluir una temperatura diferente (p.ej., -70º o -20º, en lugar de 2º-8º), un envase diferente (p.ej., viales de plástico en lugar de jeringas), una formulación diferente (p.ej., formulación liofilizable o la adición de proteínas portadoras tales como albúmina sérica humana, estabilizantes, etc.). El material Estándar debe analizarse para determinar su estabilidad en intervalos apropiados. Los criterios de aptitud del sistema para la valoración biológica tales como respuesta máxima o de fondo, pendiente EC 50 o potencia del control de la valoración, pueden usarse para detectar cambios en la actividad del Estándar. Se pueden realizar estudios de estabilidad acelerados para estimar las velocidades de degradación y para establecer características reconocibles de inestabilidad del Estándar. En las etapas posteriores del desarrollo clínico, el Estándar puede prepararse usando el proceso de fabricación empleado en los ensayos clínicos claves. Si la formulación del Estándar es diferente de la usada en el proceso de fabricación del producto farmacéutico, será importante demostrar que la evaluación de la similitud y la estimación de la potencia realizadas en la valoración no son afectadas por las diferencias en la formulación. Un Estándar inicial puede recibir el nombre de Estándar Primario. Los Estándares subsiguientes se pueden preparar usando procesos de fabricación vigentes y se pueden denominar Estándares de Trabajo. Puede ser necesario implementar distintos Procedimientos Operativos Estándares, a fin de establecer tales estándares para cada producto. En ocasiones, las mediciones de potencia pueden presentar sesgo si la actividad del Estándar cambia gradualmente. Asimismo, se puede observar una pérdida de similitud si, con el tiempo, el Estándar sufre cambios en la glicosilación. Resulta prudente archivar alícuotas de cada lote de Estándar para evaluar la comparabilidad con Estándares posteriores y para investigar cualquier desviación en la valoración.
4. ASPECTOS ESTADÍSTICOS DE LOS ELEMENTOS FUNDAMENTALES DE LAS VALORACIONES BIOLÓGICAS Los elementos estadísticos del desarrollo de valoraciones biológicas incluyen el tipo de datos, la medición de la respuesta a concentraciones variadas, el diseño de la valoración, el modelo estadístico, el tratamiento de los datos previo al análisis, los
912 (1032) Valoraciones Biológicas / Información General
USP 39
métodos de análisis de datos, la prueba de aptitud y el análisis de valores aberrantes. Tales componentes forman el sistema de valoración biológica que se utilizará para estimar la potencia de una muestra de Prueba.
4.1 Datos Existen, fundamentalmente, dos tipos de datos de valoración biológica: cuantitativos y cuantales (categóricos). Los datos cuantitativos pueden ser continuos (que no se limitan a observaciones discretas; p.ej., recopilados de un instrumento), de recuento (p.ej., unidades formadoras de placas) o discretos (p.ej., títulos de dilución determinados por punto final). Los datos cuantales a menudo son dicotómicos; por ejemplo, vida/muerte en un modelo de respuesta animal o positivo/negativo en un ensayo de infectividad basado en placa que resulte en la destrucción de una monocapa celular después de la administración de un agente infeccioso. Los datos cuantitativos se pueden transformar en datos cuantales seleccionado un umbral que distinga una respuesta positiva de una respuesta negativa. Dicho umbral se puede calcular a partir de datos obtenidos de un control negativo, por ejemplo, sumando (o restando) una medida de incertidumbre (tal como dos o tres veces la desviación estándar de las respuestas de control negativo) al promedio del control negativo. Los analistas deben ser cuidadosos con respecto a la transformación de datos cuantitativos en datos cuantales, puesto que dicha operación resulta en una pérdida de información.
4.2 Suposiciones Una suposición clave para el análisis de la mayoría de las valoraciones biológicas es que las muestras Estándar y de Prueba contienen el mismo analito efectivo o población de analitos y, por consiguiente, se puede esperar que se comporten de manera similar en la valoración biológica. A esto se le denomina similitud. Tal como se presentará en mayor detalle en el capítulo general Análisis de Datos de Va/oraciones Biológicas (1034) para modelos estadísticos específicos, la similitud biológica implica la presencia de similitud estadística (para modelos de líneas paralelas y curvas paralelas, las curvas del Estándar y de la muestra de Prueba son paralelas; para modelos de cociente de pendiente, las líneas del Estándar y de la muestra de Prueba tienen una misma ordenada al origen). Cualquier afirmación contraria es falsa. La similitud estadística (líneas paralelas, curvas paralelas o misma ordenada al origen, según corresponda) no asegura la similitud biológica. No obstante, incumplir con la similitud estadística puede tomarse como evidencia contra la similitud biológica. Por lo tanto, la existencia de un par Estándar-muestra de Prueba que pase la evaluación de similitud estadística es una condición necesaria, pero no suficiente, para cumplir con la suposición clave de la similitud biológica. En consecuencia, la similitud biológica sigue siendo, inevitablemente, una suposición. Las desviaciones de la similitud estadística que presenten valores constantes a través de valoraciones repetidas pueden indicar efectos de la matriz o diferencias reales entre los materiales Estándar y de Prueba. Lo anterior resulta cierto incluso si la desviación de la similitud estadística es lo suficientemente pequeña como para sustentar la determinación de una potencia relativa. En muchas valoraciones, múltiples compuestos proporcionarán curvas de concentración-respuesta similares, por lo que puede resultar razonable emplear un sistema de valoración biológica para describir o incluso comparar las curvas de respuesta de diferentes compuestos. No obstante, no es apropiado informar la potencia relativa a menos que las muestras Estándar y de Prueba contengan únicamente el mismo analito o población de analitos activos. Los productos biológicos a menudo presentan variaciones entre lotes con respecto a la distribución de analitos (es decir, la mayoría de los productos biológicos contienen un producto de interés y, en niveles aceptablemente bajos, algunos contaminantes del proceso que pueden mostrarse activos en la valoración biológica). Por lo tanto, la evaluación de la similitud es, al menos en parte, una evaluación que determina si la distribución de analitos en la muestra de Prueba es lo suficientemente cercana a la distribución en la muestra Estándar como para que la potencia relativa sea significativa; en otras palabras, la valoración es una comparación de características. Cuando existe evidencia (derivada de métodos diferentes a la valoración biológica) de que las muestras Estándar y de Prueba no contienen los mismos compuestos activos, no se cumple con la suposición de similitud biológica, por lo que no es apropiado informar la potencia relativa. Otras suposiciones estadísticas comunes en el análisis de valoraciones biológicas cuantitativas son la varianza constante de las respuestas alrededor de un modelo ajustado (ver la sección 4.3 Heterogeneidad de la Varianza, Ponderación y Transformación para un análisis más profundo), residuos normalmente distribuidos (un residuo es la diferencia entre una respuesta observada y la respuesta prevista por el modelo) e independencia de los residuos. La varianza constante, normalidad e independencia están interrelacionadas en la práctica de la valoración biológica. Para valoraciones biológicas con una respuesta cuantitativa, se puede usar una transformación de datos bien seleccionada para obtener una varianza aproximadamente constante y una distribución de residuos casi normal. Una vez que se ha impuesto la transformación, queda pendiente tratar la suposición de independencia reflexionando sobre la estructura del diseño de la valoración biológica en el modelo de análisis. La independencia de los residuos es importante para evaluar la aptitud del sistema y de la muestra.
4.3 Heterogeneidad de la Varianza, Ponderación y Transformación Los análisis simples de los datos de valoraciones biológicas cuantitativas requieren que los datos presenten una distribución aproximadamente normal con una varianza casi constante cercana de un extremo a otro del intervalo de los datos. Para los modelos de regresión lineal y no lineal, la varianza referida en este capítulo es la varianza residual derivada del ajuste del mode-
USP 39
Información General/ (1032) Valoraciones Biológicas 91 3
lo. A menudo, no se observa la varianza constante; la heterogeneidad de la varianza se puede manifestar como un incremento en la variabilidad con un incremento en la respuesta. Si las varianzas no son iguales, pero los datos se analizan como si lo fueran, la estimación de la potencia relativa aún podría ser razonable; no obstante, si no se trata la varianza inconstante alrededor del modelo de concentración-respuesta ajustado se obtendrá una estimación poco confiable de la varianza dentro de la valoración. Asimismo, la evaluación de la similitud estadística puede no ser exacta y no se deben usar los errores estándar ni los intervalos de confianza para todos los parámetros (incluyendo un intervalo para la potencia relativa basado en el Teorema de Fieller). Los intervalos de confianza para la potencia relativa que combinan estimaciones de potencia de múltiples valoraciones pueden ser erróneos si se usa el error dentro de la valoración para calcular el intervalo de confianza. La constancia de la varianza se puede evaluar mediante gráficas de residuos, análisis Box-Cox (o ley del poder) o la prueba de Levene. Con la prueba de Levene, en lugar de basarse en el valor p, el cambio obtenido en la estadística es útil como fundamento para juzgar si se ha mejorado o deteriorado la homogeneidad. La varianza se evalúa mejor en un conjunto grande de datos de valoración. Resulta inapropiado usar únicamente la varianza entre determinaciones repetidas de la valoración vigente, debido a que existen muy pocos datos para determinar de manera adecuada varianzas verdaderamente representativas, específicas para cada concentración. Los datos sobre la varianza son escasos durante el desarrollo; resulta prudente reevaluar la varianza durante la validación y monitorearla periódicamente durante el uso continuo de la valoración. Dos métodos usados para mitigar la heterogeneidad de la varianza son la transformación y la ponderación. La falta de varianza constante puede tratarse mediante una transformación adecuada. Asimismo, la transformación puede mejorar la normalidad de los residuos y el ajuste de algunos modelos estadísticos a los datos. Se debe seleccionar una transformación para un sistema de valoración durante el desarrollo, verificarla durante la validación, usarla de manera uniforme en las valoraciones de rutina y verificarla periódicamente. Los datos de la valoración biológica comúnmente se presentan con la concentración transformada por logaritmo; las valoraciones de cociente de la pendiente se presentan con la concentración en la escala original. La transformación se puede aplicar a los datos de la respuesta, así como a los datos de la concentración. Las opciones comunes para una transformación de la respuesta incluyen la transformación logarítmica, por raíz cuadrada (para recuentos), recíproca y, para el recuento de datos con asíntotas conocidas, por logit del porcentaje de máxima respuesta. Las transformaciones logarítmicas son de uso común, debido a que convierten un segmento útil de la relación concentración-respuesta en un segmento casi lineal y debido a su facilidad para transformar de vuelta a la escala original para fines de interpretación. Se puede llevar a cabo un ajuste log-log con datos que presentan un comportamiento no lineal. Asimismo, existen otras alternativas disponibles, p. ej., los datos se pueden transformar mediante la inversa de la función del Poder de la Media (POM, por sus siglas en inglés). Un coeficiente del Poder de la Media de k = 2 corresponde a una transformación logarítmica de los datos. Para un análisis más extenso de las relaciones entre datos transformados por logaritmos y datos sin transformar, ver el Apéndice del capítulo general Validación de Valoraciones Biológicas (1033). Se debe tomar en cuenta que la transformación de los datos requiere la reevaluación del modelo usado para ajustar los datos. Desde el punto de vista estadístico, no existe nada especial con respecto a la escala original de medición; resulta aceptable cualquier transformación que mejore la concordancia con las suposiciones. No obstante, los analistas deben reconocer que las transformaciones, la selección del modelo estadístico y la selección del esquema de ponderación están interrelacionadas. El uso de una transformación puede afectar la selección del modelo estadístico, es decir, transformar la respuesta mediante un logaritmo o raíz cuadrada, por ejemplo, puede cambiar la forma de la curva de respuesta y, para un modelo lineal, puede cambiar el intervalo de concentraciones cuyas respuestas sean casi rectas y casi paralelas. Para valoraciones con varianza no constante, una opción razonable es la adopción de un análisis ponderado. Aunque la ponderación no puede tratar la falta de normalidad residual, se considera una metodología estadística válida para poner énfasis en datos más precisos. Idealmente, las ponderaciones se pueden basar en la inversa de la varianza prevista dentro de la valoración (o dentro de los bloques) de cada respuesta donde los factores que predicen la varianza son independentes de las respuestas observadas en una valoración específica. En la práctica, muchas valoraciones biológicas presentan variaciones relativamente grandes en el logaritmo EC 50 (en comparación con la variación en el logaritmo de la potencia relativa) entre valoraciones (y, en ocasiones, entre bloques dentro de la valoración). Cuando no se trata en el modelo de varianza, esta variación en el logaritmo EC 50 provoca lo que parece ser una gran variación en las respuestas cercanas a la media logarítmica EC 50, lo cual a menudo resulta en ponderaciones demasiado bajas para las observaciones cercanas al EC 50 • Si la valoración es lo suficientemente estable (baja variabilidad en el EC 50), la varianza puede considerarse alternativamente como una función de la concentración. Aunque no es lo ideal, podría ser razonable una metodología que utiliza varianzas dependientes de la concentración cuando las ponderaciones se estiman a partir de un gran número de valoraciones, las varianzas son pequeñas, cualquier desequilibrio en el número de observaciones de todas las concentraciones es tratado en el modelo de varianza y no se presentan observaciones inusuales (valores aberrantes). Esta posibilidad se puede examinar graficando la varianza de la respuesta en cada concentración (de preferencia, combinada a través de múltiples valoraciones) en función de la concentración y luego contra una función de la concentración (p.ej., concentración cuadrada). La varianza será proporcional a la función de concentración donde esta línea trazada se aproxime a una línea recta. La pendiente aparente de esta línea es informativa, debido a que una línea horizontal indica que no es necesaria la ponderación. Si se puede encontrar una función que genere una gráfica lineal, entonces las ponderaciones se consideran proporcionales a la recíproca de dicha función. Dicha función puede no existir, en particular si la variación es mayor (o menor) en ambos extremos del intervalo de concentración estudiado.
914 (1032) Valoraciones Biológicas/ Información General
USP 39
Independientemente de si se emplea un modelo o datos históricos, el objetivo es capturar la variabilidad relativa en cada concentración. No es necesario asumir que el nivel de variabilidad absoluto de la valoración en uso es idéntico al de los datos usados para determinar la ponderación, sino que únicamente los intervalos de las varianzas entre concentraciones sean uniformes con los datos históricos o con los datos usados para determinar la función de la varianza. La capacitación y experiencia apropiadas en métodos estadísticos son esenciales para determinar una estrategia para generar un modelo de varianza adecuada. Las fuentes de variabilidad pueden identificarse de manera errónea si se emplea el modelo incorrecto de varianza. Por ejemplo, los datos pueden presentar una variación constante a lo largo de una curva logística de concentración-respuesta de cuatro parámetros, pero también puede tener una variación apreciable en el parámetro EC 50 entre bloques dentro de la valoración, o entre valoraciones. Si no se reconoce la variabilidad entre bloques o entre valoraciones, podría parecer que esta valoración tiene una gran variación en la respuesta para concentraciones cercanas al valor promedio a largo plazo del EC 50 • Un modelo ponderado con ponderaciones bajas para concentraciones cerca del EC 50 podría representar erróneamente una característica principal del sistema de valoración.
4.4 Normalidad Muchos métodos estadísticos para el análisis de respuestas cuantitativas suponen la normalidad de los residuos. Si no se cumple la suposición de normalidad, la estimación de la potencia relativa y su error estándar pueden considerarse razonables, pero las pruebas de aptitud y un intervalo de confianza para la estimación de la potencia relativa podrían ser inválidos. La mayoría de los métodos usados en este capítulo son razonablemente robustos frente a desviaciones de la normalidad, por lo que el objetivo es detectar anormalidades importantes. Durante el desarrollo de la valoración, y con el objeto de descubrir desviaciones importantes de la normalidad, se pueden usar herramientas gráficas tales como una gráfica de probabilidad normal o un histograma (o una herramienta similar como las gráficas de tallo y hoja o de caja) de los residuos a partir del ajuste del modelo. El histograma debe ser unimodal y simétrico. La gráfica de probabilidad normal debe aproximase a una línea recta; una gráfica de probabilidad normal que no es recta (p.ej., curva en un extremo, en ambos extremos, o en la parte media) indica la presencia de anormalidad. Un patrón sobre una línea recta es indicativo de anormalidad. El comportamiento anormal puede deberse a mediciones que son logarítmicas normales y presentan una variabilidad mayor a niveles más altos de respuesta. Lo anterior se puede considerar un patrón cóncavo en los residuos en una gráfica normal. Las pruebas estadísticas de normalidad pueden no ser útiles. De acuerdo con la discusión previa sobre análisis estadístico de la constancia de la varianza, cambiar el valor de una estadística de la prueba de normalidad, en lugar de basarse en un valor p, funciona para juzgar si la normalidad se ha mejorado o empeorado. En lo que respecta a la evaluación de la varianza, se debe evaluar la normalidad en un conjunto de datos tan grande como sea posible durante el desarrollo, reevaluarlos durante la validación y monitorearlos periódicamente durante el uso de la valoración. Las desviaciones importantes de la normalidad a menudo pueden mitigarse mediante una transformación adecuada. La falta de evaluación y mitigación de desviaciones importantes de la normalidad conlleva el riesgo de inhabilitar la detección apropiada de valores aberrantes, así como una pérdida en la capacidad de obtener estimaciones confiables de variación.
4.5 Linealidad de los Datos de Concentración-Respuesta Algunos análisis de valoraciones biológicas suponen que la forma de la curva de concentración-respuesta es una línea recta o se aproxima a una línea recta para un intervalo limitado de concentraciones. En dichos casos, se puede evaluar un modelo de respuesta lineal para determinar si se justifica para los datos disponibles. Los métodos de análisis de diferencias para evaluar la linealidad enfrentan los mismos problemas que los métodos de análisis de diferencias aplicados al paralelismo-más datos y una mejor precisión incrementan la posibilidad de detectar la falta de linealidad. Debido a que casi siempre la falta de linealidad afecta la estimación de la potencia, los analistas deben evaluar las desviaciones de la linealidad de manera rutinaria si desean emplear un modelo de respuesta lineal para estimar la potencia. Si el examen de una gráfica revela claramente una desviación de la linealidad, es suficiente para concluir la falta de linealidad. Sin embargo, una alta variabilidad de los datos puede ocultar una desviación de la linealidad. Por consiguiente, una metodología general para linealidad puede corresponder con la usada para la similitud, que se desarrolla de manera más elaborada en la sección 4.7 Análisis de Aptitud y Aplicación del Análisis de Equivalencia para Similitud (paralelismo). (1) Especificar una medida de desviación de la linealidad que se pueda combinar con todas las muestras o que sea específica para una muestra. Las posibilidades incluyen la suma de la falta de linealidad de coeficientes cuadrados o cuadráticos. (2) Se puede emplear una de las cuatro metodologías del Paso 2 de Aplicación del Análisis de Equivalencia para Similitud (paralelismo) para determinar, durante el desarrollo, un intervalo de valores aceptables (intervalo de aceptación) para la medida de la falta de linealidad. (3) Determinar un intervalo de confianza bilateral del 90% en la medición de la falta de linealidad, siguiendo el procedimiento de Pruebas Doblemente Unilaterales (TOST, por sus siglas en inglés) y comparar el resultado con el intervalo de aceptación según se determina en (2). A menudo, se seleccionará un subconjunto de concentraciones medidas en la valoración para establecer una curva lineal de concentración-respuesta, el cual puede identificarse gráficamente. Las concentraciones en los extremos del intervalo deben ser examinadas cuidadosamente, debido a que a menudo tienen un gran impacto sobre la pendiente y los cálculos derivados de la pendiente. Si la intención en la valoración final es usar únicamente concentraciones en el intervalo lineal, se debe seleccionar
USP 39
Información General/ (1032) Valoraciones Biológicas 915
un intervalo de concentraciones que genere líneas rectas paralelas para las potencias relativas esperadas durante el uso rutinario de la valoración; de otro modo, la valoración no pasará las pruebas de paralelismo cuando la potencia produzca valores de respuesta de la valoración que estén fuera del intervalo lineal de respuesta. Cuando la potencia está fuera del intervalo lineal, podría resultar apropiado ajustar la concentración de la muestra basándose en dicha potencia estimada y analizar de nuevo para obtener un resultado de potencia válido. Las valoraciones repetidas en conjunto con las valoraciones válidas pueden generar una estimación de potencia sesgada, debido al proceso selectivo de repetir valoraciones cuando la respuesta está en los extremos de la curva de concentración-respuesta. El problema es más complejo para valoraciones en las que existe incluso una modesta variación en la forma o ubicación de la curva de concentración-respuesta de corrida a corrida o entre bloques dentro de una valoración. En tales valoraciones, puede resultar apropiado seleccionar subconjuntos para cada muestra en cada valoración, o incluso en cada bloque dentro de una valoración. Se debe tomar en cuenta que un modelo de efectos fijos eliminará la necesidad de subconjuntos diferentes en bloques diferentes, pero un modelo de efectos mixtos puede revelar y acomodar diferentes subconjuntos en diferentes bloques (ver la sección 4.9 Efectos Fijos y Aleatorios en Modelos de Respuesta de Valoraciones Biológicas). Las pautas adicionales con respecto a la selección de subconjuntos de datos para la estimación de potencia relativa mediante modelo lineal incluyen: usar al menos tres, y de preferencia cuatro, concentraciones adyacentes; que la pendiente del segmento lineal sea lo suficientemente pronunciada; que las líneas que se ajustan a las muestras Estándar y de Prueba sean rectas; y que las líneas de regresión para el ajuste sean paralelas. Una forma de derivar un criterio de pronunciamiento es calcular una estadística t para evaluar si la pendiente es significativamente diferente de cero. Si la pendiente no es significativa, es posible que la valoración biológica tenga un desempeño deficiente; lo anterior se puede observar como un aumento de variación en los resultados de potencia. Otro aspecto que sustenta el requisito de pronunciamiento adecuado de la pendiente es el uso de algoritmos para la selección de subconjuntos. Sin un criterio de pronunciamiento de la pendiente, un algoritmo para la selección de subconjuntos, que busca identificar subconjuntos de tres o más puntos de datos contiguos que sean rectos y paralelos, podría seleccionar concentraciones en una asíntota. Evidentemente, dichos subconjuntos son inapropiados para su uso en la estimación de la potencia. El pronunciamiento o la importancia del pronunciamiento de la pendiente deben depender de la valoración. Este criterio debe establecerse durante el desarrollo de la valoración y, posiblemente, redefinirse durante la validación de la valoración.
4.6 Modelos Comunes de Valoración Biológica La mayoría de las valoraciones biológicas consisten en una serie de concentraciones o diluciones de una muestra de Prueba y de un material Estándar. Un modelo matemático se ajusta a los datos de concentración-respuesta y, posteriormente, se puede calcular una potencia relativa a partir de los parámetros del modelo. La selección del modelo puede depender de si se están analizando datos cuantitativos o cualitativos. Para datos cuantitativos, los modelos que emplean perfiles de respuestas paralelas, los cuales sustentan la evaluación comparativa para determinar la potencia relativa, pueden ofrecer ventajas estadísticas. Si se emplean dichos modelos, las concentraciones o diluciones por lo general se modifican usando una escala geométrica, p.ej., en incrementos duplicativos, logarítmicos o de logaritmo medio. Si se usa el modelo de cociente de la pendiente, las concentraciones o diluciones se pueden espaciar de igual manera en la concentración, en lugar del logaritmo de la concentración. Es posible usar diversas funciones para ajustar un modelo de respuesta paralelo a datos cuantitativos, incluyendo una función lineal, una función polinómica de orden mayor, una función logística de cuatro parámetros (sigmoidea simétrica) y una función logística de cinco parámetros para sigmoideas asimétricas. Dichas funciones requieren un número suficiente de concentraciones o diluciones para ajustarse al modelo. Para evaluar la falta de ajuste de cualquier modelo, es necesario contar con al menos una concentración (o dilución) -preferiblemente varias- más que el número de parámetros que se estimarán en el modelo. Asimismo, por lo regular se usa por lo menos una concentración -de preferencia dos- para sustentar cada asíntota. En ocasiones, se selecciona un modelo lineal debido a su eficiencia aparente y facilidad de procesamiento. Debido a que los perfiles de respuesta de la valoración biológica son, por lo general, no lineales, el laboratorio puede realizar un experimento con un amplio intervalo de concentraciones para identificar la región aproximadamente lineal del perfil de concentración-respuesta. Para datos que siguen un modelo logístico de cuatro parámetros, éstas son las concentraciones cercanas al centro de la región de la respuesta, a menudo una respuesta de 20% a 80% cuando se modifica nuevamente la escala de los datos para las asíntotas. Se deben tomar precauciones apropiadas cuando se emplea un modelo lineal, debido a las diversas razones por las que una región aparentemente lineal podría cambiar. Es posible identificar una región lineal estable después de acumular suficiente experiencia con la valoración y con la variedad de muestras que se espera analizar con la misma. Los datos que siguen la función logística de cuatro parámetros también se pueden linealizar mediante transformación. La región inferior de la función es aproximadamente lineal cuando los datos se transforman con logaritmos (ajuste log-log). Por lo regular, los datos cuantales se ajustan usando modelos matemáticos más complejos. Se puede utilizar un modelo de probita o de logit para estimar un percentilo de la curva de respuesta (a menudo el percentilo 50) o, de manera más directa, la potencia relativa de la Prueba con respecto al Estándar. El análisis Spearman-Karber es un método sin modelo que se puede emplear para la determinación del percentilo 50 de una curva de concentración-respuesta cuantal.
916 (1032) Valoraciones Biológicas / Información General
USP 39
4.7 Análisis de Aptitud La evaluación de la aptitud del sistema y de la aptitud de la muestra son necesarias para asegurar la calidad de los resultados de la valoración biológica. La aptitud del sistema en la valoración biológica, al igual que en otros métodos analíticos, consta de criterios previamente especificados mediante los cuales se evalúa la validez de una valoración (o, posiblemente, una corrida que contenga varias valoraciones). Los analistas pueden evaluar la aptitud del sistema determinando si algunos de los parámetros de la respuesta del Estándar y algunas propiedades (p.ej., variación residual) de los datos se encuentran en sus intervalos habituales. A fin de obtener altas tasas de aceptación en la valoración, se recomienda aceptar grandes fracciones de estos intervalos habituales (99% o más) y evaluar la aptitud del sistema usando únicamente unos pocos parámetros de respuesta del Estándar sin correlación. La selección de los parámetros de aptitud del sistema y de sus intervalos también se puede informar mediante estudios empíricos o de simulación que midan la influencia de los cambios sobre un parámetro en la estimación de la potencia. La aptitud de la muestra en una valoración biológica se evalúa mediante criterios previamente especificados para la validez de la estimación de la potencia de una muestra de Prueba individual y, por lo regular, se enfoca en la evaluación de la similitud. Es necesario establecer los criterios de aptitud del sistema y de la muestra durante el desarrollo de la valoración biológica y antes de su validación. Cuando se cuente con poca experiencia con respecto a la valoración biológica, dichos criterios pueden considerarse provisionales. APTITUD DEL SISTEMA Los parámetros de aptitud del sistema se pueden seleccionar basándose en el diseño y en el modelo estadístico. No obstante, independientemente del diseño o modelo, los parámetros de aptitud del sistema debe estar directamente relacionados con la calidad de la valoración biológica. Dichos parámetros por lo regular se basan en muestras estándar y de control. Por ejemplo, en las valoraciones de líneas paralelas, los valores bajos de la pendiente del Estándar a menudo generan estimaciones de potencia de baja precisión. En lugar de rechazar las valoraciones con pendientes bajas, el uso de valoraciones repetidas adicionales podría resultar más efectivo para los analistas hasta que pueda mejorarse el sistema de valoración para generar estimaciones de potencia con una precisión más alta de manera constante. El monitoreo del intervalo de niveles de respuesta y ubicación de las asíntotas asociadas a controles o con la muestra del Estándar puede ser particularmente importante para establecer niveles de respuesta apropiados. Cualquier desviación o tendencia en alguno de los criterios puede ser indicativa de la degradación de un reactivo crítico o del material Estándar. Se deben implementar métodos de Control Estadístico de Procesos (SPC, por sus siglas en inglés) para detectar tendencias en los parámetros de aptitud del sistema. Dos medidas comunes de aptitud del sistema son la evaluación de la idoneidad del modelo (capacidad de ajuste) y de la precisión. El uso de determinaciones repetidas en un diseño completamente aleatorizado permite separar un término de error puro de la evaluación de falta de ajuste. Se debe tener cuidado al derivar un criterio para la falta de ajuste; el uso de un término de error puro incorrecto puede provocar una evaluación artificial. La falta de ajuste de la suma de cuadrados obtenida a partir del ajuste del modelo al Estándar puede ser una medida útil de idoneidad del modelo, dependiendo de las concentraciones usadas y de cómo difieran los datos obtenidos del modelo. Es posible establecer un umbral basándose en el análisis de sensibilidad (evaluación de la sensibilidad de la valoración a los cambios en el analito) y/o datos históricos, más allá de los cuales el valor de falta de ajuste indica que los datos no son adecuados. Se debe tomar en cuenta que los datos de Prueba no se usan en esta parte; la idoneidad del modelo para la Prueba es parte de la aptitud de la muestra. Existen dos alternativas a considerar para evaluar la precisión. Un método emplea el error cuadrático medio (varianza residual) a partir del ajuste del modelo con el Estándar únicamente. Dado que esta metodología puede tener pocos grados de libertad para la estimación de la varianza, podría resultar más útil emplear un error cuadrado medio combinado a partir de ajustes de modelos separados con el Estándar y la Prueba. Una vez que se haya seleccionado la medida, se usan datos históricos y análisis de sensibilidad para determinar un umbral de aceptación. APTITUD DE LA MUESTRA La aptitud de la muestra en la valoración biológica por lo general consiste en la evaluación de la similitud, la cual únicamente se puede realizar dentro del intervalo de valoración. La potencia relativa se puede informar únicamente a partir de muestras que presenten una similitud con el Estándar, que tengan la calidad requerida para el ajuste del modelo y que hayan sido diluidas para generar un EC 50 (y potencia) dentro del intervalo del sistema de valoración. SIMILITUD En el contexto de evaluación de similitud, el análisis de hipótesis clásico (diferencia) evalúa la hipótesis nula que establece que una medida (un parámetro de no similitud que mide la diferencia entre las curvas de concentración--respuesta del Estándar y de la Prueba) es cero, con una hipótesis alternativa implícita que establece que la medida no es cero o que no se han cumplido las suposiciones estadísticas. El criterio habitual (la "prueba de diferencia") que indica que el valor p debe ser mayor que cierto valor crítico para poder declarar que la muestra es similar a la referencia controla la probabilidad de que las mues-
USP 39
Información General/ (1032) Valoraciones Biológicas 91 7
tras sean falsamente declaradas como no similares; éste es el riesgo del productor, que muestras adecuadas sean rechazadas. El riesgo del consumidor (es decir, el riesgo de que muestras no similares se declaren similares) se controla mediante la precisión de la medida de ausencia de similitud y la cantidad de determinaciones repetidas en la valoración; por lo regular, la evaluación de éstas es muy deficiente, dejando sin control el riesgo del consumidor. En contraste con el análisis de diferencias, el análisis de equivalencia para similitud (es decir, evaluar si un intervalo de confianza del 90% para una medición de ausencia de similitud está contenido dentro de los límites de equivalencia especificados) permite únicamente una probabilidad del 5% de que muestras con medidas de ausencia de similitud que están fuera de los límites de equivalencia sean declaradas similares (controlando así el riesgo del consumidor). Con el análisis de equivalencia, resulta práctico examinar y administrar el riesgo del productor asegurando que la valoración cuente con suficientes determinaciones repetidas para tener una buena precisión al estimar las medidas de ausencia de similitud. Para la comparación de pendientes, se han usado tradicionalmente las pruebas de diferencia para establecer el paralelismo entre una muestra de Prueba y la muestra Estándar. No obstante, el uso de esta metodología no permite al laboratorio concluir que las pendientes sean iguales, puesto que los datos pueden ser demasiado variables o el diseño de la valoración puede ser demasiado débil para establecer una diferencia. Sin embargo, el laboratorio puede concluir que las pendientes son lo suficientemente similares usando la metodología del análisis de equivalencia. El análisis de equivalencia presenta ventajas prácticas en comparación con el análisis de diferencias, incluyendo que una mayor cantidad de determinaciones repetidas resulta en una mejor precisión de la valoración, la cual incrementará las probabilidades de que las muestras cumplan con los criterios de similitud; que una menor cantidad de determinaciones repetidas o de precisión de la valoración reducirá las probabilidades de que las muestras cumplan con los criterios de similitud; y que se obtienen metodologías sólidas para combinar datos de múltiples valoraciones de la misma muestra para comprender de mejor manera si una muestra es verdaderamente similar al Estándar o no. Debido a las ventajas asociadas con el uso del análisis de equivalencia en la evaluación de similitud, los analistas pueden cambiar las valoraciones existentes a análisis de equivalencia o pueden implementar métodos de análisis de equivalencia cuando se realizan cambios a las valoraciones existentes. Con este propósito, es conveniente examinar el riesgo de que la valoración no apruebe muestras adecuadas. Este riesgo depende de la precisión del sistema de valoración, de la estrategia para determinaciones repetidas en el sistema de valoración y de los valores críticos de los parámetros de similitud (esto constituye un análisis de capacidad del proceso). Una metodología para cambiar una valoración establecida a partir del análisis de diferencia a un análisis de equivalencia (para similitud) consiste en usar la capacidad de proceso de la valoración para establecer valores críticos para parámetros de similitud. Esta metodología resulta razonable para una valoración establecida, debido a que los riesgos (de declarar falsamente muestras como similares o no similares) son implícitamente aceptables, dado el historial de uso exitoso de la valoración. Las medidas de similitud se pueden basar en los parámetros de la curva de concentración-respuesta y pueden incluir la pendiente para una valoración de línea paralela recta; la ordenada al origen para una valoración de cociente de la pendiente; la pendiente y asíntotas para una valoración logística de líneas paralelas de cuatro parámetros; o la pendiente, las asíntotas y el parámetro de falta de simetría en un modelo de sigmoideo de cinco parámetros. En algunos casos, estas medidas de similitud tienen un significado interpretable y práctico en la valoración; algunos cambios en la forma de la curva, por ejemplo, pueden relacionarse con cambios específicos (tales como la presencia de un contaminante activo específico) en el producto. Siempre que sea posible, discutir dichos cambios y sus probables efectos será de gran valor para establecer los límites de equivalencia. APLICACIÓN DEL ANÁLISIS DE EQUIVALENCIA PARA SIMILITUD (PARALELISMO) Conforme a lo indicado anteriormente, muchos procedimientos estadísticos para evaluar la similitud se basan en una hipótesis nula que indica la presencia de similitud y en la hipótesis alternativa que indica un estado de ausencia de similitud. Posteriormente, la incapacidad para determinar que la similitud es improbable desde el punto de vista estadístico se toma como una conclusión de similitud. Sin embargo, dicha incapacidad para establecer un fundamento probabilístico de ausencia de similitud en realidad no prueba la existencia de similitud. El análisis de equivalencia ofrece un método para que el analista llegue a una conclusión (si los datos así lo requieren) de similitud suficiente al tiempo que controla el riesgo de hacerlo inadecuadamente. A continuación se proporciona una secuencia para el proceso de aplicación del análisis de equivalencia. Paso 1: Seleccionar una medida de ausencia de símílítud. Para el caso de líneas paralelas, ésta puede ser la diferencia o el cociente de las pendientes. (El cociente de las pendientes puede ser menos sensible al valor de la pendiente. Enmarcar la diferencia de la pendiente como un cambio proporcional a partir del Estándar en lugar de usar unidades de pendiente absolutas tiene la ventaja de ser invariable a las unidades en los ejes de concentración y respuesta.) Para una valoración de cociente de la pendiente, la medida de ausencia de similitud puede ser la diferencia en las ordenadas al origen entre las muestras de Prueba y Estándar. Nuevamente, enmarcar esta diferencia como una proporción del intervalo de respuesta (posiblemente transformado) del Estándar para hacer que la medida sea invariable a las unidades de la respuesta podría presentar ventajas. La determinación de similitud se puede basar en los parámetros individuales, de uno en uno; para el modelo logístico de cuatro parámetros, la similitud entre las muestras Estándar y de Prueba se pueden evaluar de manera discreta para la asíntota superior, la pendiente y la asíntota inferior. Si se utilizan curvas sigmoideas con parámetros adicionales para ajustar los datos de la valoración biológica, también es importante considerar el tratamiento de la similitud entre las preparaciones Estándar y de Prueba de los parámetros de curva adicionales (p.ej., parámetro de asimetría del modelo de cinco pará-
USP 39
918 (1032) Valoraciones Biológicas / Información General
metros). Como alternativa, la evaluación de similitud se puede basar en una sola medida compuesta de falta de paralelismo, tal como la suma de paralelismo de cuadrados. Ésta se determina como la diferencia en la suma residual de errores cuadrados (RSSE, por sus siglas en inglés) entre el valor obtenido del ajuste de las curvas del Estándar y de la Prueba por separado y el valor obtenido de la imposición de paralelismo: Suma de paralelismo de cuadrados
= RSSEP -
RSSE, - RSSE1
donde los subíndices p, s y t denotan el modelo Paralelo, el modelo Estándar y el modelo de Prueba, respectivamente. Para cualquier medida compuesta, el analista debe considerar la ponderación relativa implícita de la importancia de las tres (o más) regiones de la curva y si la ponderación es apropiada para el problema en cuestión. Por ejemplo, para la suma de paralelismo de cuadrados con modelos no lineales, la ponderación provista a la comparación de las asíntotas depende de la cantidad de datos en la valoración en uso sobre y cerca de las asíntotas. Paso 2: Especificar un intervalo de valores aceptables, por lo regular denominado intervalo de equivalencia o "zona de indiferencia", para la medida de falta de similitud. El desafío de implementar un análisis de equivalencia radica en establecer límites de equivalencia apropiados para las medidas de ausencia de similitud. Idealmente, se cuenta con información disponible para vincular la variación en las medidas de similitud con diferencias significativas en la función biológica (según se miden con la valoración biológica). La información puede estar disponible a partir de la evaluación de valoraciones ortogonales. Las cuatro metodologías siguientes pueden usarse para determinar este intervalo. Si se han especificado límites farmacopeicos para una medida definida de falta de similitud, entonces la valoración debe satisfacer dichos requisitos. a. La primera metodología consiste en compilar datos históricos que comparen el Estándar contra sí mismo y usar dichos datos para determinar el intervalo de equivalencia como un intervalo de tolerancia para la medida de falta de paralelismo. La ventaja de usar datos históricos radica en que dan control al laboratorio sobre la tasa de incumplimiento falso (la tasa de incumplimiento de una muestra que es en realidad una muestra aceptable). La desventaja es que no hay control sobre la tasa de cumplimiento falso (la tasa de cumplimiento de una muestra que pudiera tener una diferencia inaceptable en el desempeño con respecto al Estándar). La especificación del intervalo de equivalencia desarrollado de esta manera se basa únicamente en la capacidad de la valoración. Los laboratorios que emplean esta metodología deben ser precavidos debido a que una valoración imprecisa que requiera mejoría podría generar un intervalo de equivalencia tan amplio que no sería posible contar con una discriminación útil para ausencia de similitud. b. La metodología (a) es simple de implementar en la rutina y se puede emplear con diseños de valoraciones que no ofrezcan estimaciones confiables de variación dentro de la valoración y, por ende, intervalos de confianza. No obstante, existe el riesgo de que las valoraciones con cantidades de variación dentro de la valoración, mayores a las habituales, puedan cumplir inapropiadamente. Por consiguiente, la alternativa preferida a la metodología (a) es determinar un intervalo de tolerancia para el intervalo de confianza para la medida de falta de paralelismo. Lo siguiente resulta particularmente apropiado para cambiar una valoración existente, con un conjunto importante de datos históricos sobre las muestras Estándar y de Prueba obtenidos a partir de una metodología de análisis de diferencia, a una metodología de equivalencia: i. Para cada valor de la medida de falta de paralelismo obtenido a partir de los datos históricos, se debe determinar un intervalo de confianza de 95%, (m,n). ii. Para cada intervalo de confianza, determinar su desviación máxima del paralelismo perfecto. Esto es máx(lml, 1 ni) para diferencias, máx(l /m,n) para cocientes y simplemente n para cantidades que deben ser positivas, tales como la suma de cuadrados. iii. Determinar un intervalo de tolerancia para las desviaciones máximas obtenidas en (ii), el cual será un intervalo de tolerancia unilateral para estas cantidades necesariamente positivas. Se prefiere una metodología de intervalo de tolerancia no paramétrico. iv. Se concluye que los nuevos datos son "suficientemente paralelos" si el intervalo de confianza para la medida de falta de paralelismo cae completamente dentro del intervalo determinado en (iii). Las metodologías (a) y (b), basándose en la capacidad del ensayo, controlan únicamente la tasa de incumplimiento falso y pasan por alto la tasa de cumplimiento falso. La incorporación de información de fuentes distintas a la evaluación de la capacidad de la valoración provee control sobre la tasa de cumplimiento falso. Las metodologías (c) y (d) son medios que se pueden usar con este propósito. c. La tercera metodología comienza con datos históricos que comparan el Estándar consigo mismo y agrega datos que comparan el Estándar con fallas conocidas, p.ej., muestras degradadas. Comparar los valores de la medida de ausencia de similitud para datos para los que sea apropiada una conclusión de similitud (Estándar contra sí mismo) y para datos para los que no sea apropiada una conclusión de similitud, p.ej., muestras degradadas. Basándose en esta comparación, determinar un valor de la medida de ausencia de similitud que discrimine entre los dos casos. Si se emplea esta metodología, se debe utilizar un intervalo de muestras para el que no sea apropiada una conclusión de similitud, incluyendo muestras con la más mínima ausencia de similitud importante. Para modelos no lineales, esta comparación también se puede usar para determinar aquellos parámetros que deben evaluarse; algunos pueden no ser sensibles a las fallas que pueden ocurrir con la valoración específica o con la recolección de muestras no similares.
USP 39
Información General/ (1032) Valoraciones Biológicas 919
d. La cuarta metodología se basa en combinar un análisis de sensibilidad de la curva de valoración para parámetros de ausencia de similitud con lo que se conozca acerca del producto y de la valoración. Lo anterior es particularmente útil si se dispone de información que vincule un cambio en una o más medidas de ausencia de similitud con las propiedades del producto. Estas medidas pueden ser directas (p.ej., cambios en la conformación de una proteína) o indirectas (p.ej., cambios en la eficiencia o seguridad de un modelo animal). Otra metodología complementaria es un análisis de sensibilidad limitada, el cual combina el juicio del analista y del biólogo con respecto a la lectura de la magnitud de los cambios en un parámetro de ausencia de similitud que sean significativos, mediante experimentos de simulación y/o en el laboratorio, para demostrar los umbrales para parámetros de similitud que ofrecen protección contra una ausencia de similitud importante. Asimismo, los análisis de riesgo se pueden informar utilizando el índice terapéutico del fármaco. Paso 3. Examinar si el valor de la medida de falta de similitud se encuentra dentro del intervalo de equivalencia de valores aceptables. Para las metodologías (a) y (b), comparar el valor obtenido de la medida de falta de paralelismo (a) o su intervalo de confianza (b) con el intervalo obtenido al inicio del Paso 2. El valor debe estar dentro de los límites si se utiliza (a), o el intervalo de confianza debe estar completamente dentro de los límites si se utiliza (b). Una alternativa a la metodología descrita anteriormente [para (a)] consiste en usar un valor promedio (histórico) para la varianza del cociente o diferencia en un parámetro de similitud-obtenido a partir de algún número de valoraciones individuales-para calcular un intervalo de aceptación para una estimación puntual del parámetro de similitud. Esta metodología es más simple de implementar en la rutina y se puede usar con diseños de valoraciones que no sean capaces de proveer estimaciones fidedignas de variación dentro de la valoración, aunque existe un precio. La metodología de análisis de equivalencia que se basa en las mediciones de variación específica de la valoración (dentro de la valoración) (es decir, los intervalos de confianza) presenta una postura conservadora en el sentido de que no aprobará la similitud de las muestras de valoraciones con cantidades mayores a las habituales de variación dentro de la valoración. El uso de una región de aceptación para un parámetro de similitud -en lugar de una región de aceptación para intervalos de confianza para el parámetro de similitud-pierde dicho conservadurismo y, por ende, no es la opción preferida ante la existencia de alternativas. Para la metodología (c), se puede emplear una metodología que esencialmente trate el paralelismo como un problema de diferenciación. La selección del punto de corte en la metodología (c) debe tomar en cuenta las tasas de decisiones de falsos positivos y falsos negativos (así como los riesgos aceptables para el laboratorio) y debe reflejar con precisión la variabilidad entre valoraciones. Por lo tanto, resulta razonable comparar la estimación puntual de la medida de falta de paralelismo con el punto de corte y no usar intervalos de confianza. Esta metodología es más simple de implementar en la rutina y se puede usar con diseños de valoraciones que no son capaces de proveer estimaciones confiables de variación dentro de la valoración. Para la metodología (d), se debe demostrar que la medida de ausencia de similitud es significativamente mayor que el punto final inferior del intervalo de aceptación y significativamente menor que el punto final superior. (Si el intervalo de aceptación es unilateral, se realiza únicamente la prueba individual aplicable.) Este es el uso de la metodología de Pruebas Doblemente Unilaterales. En la mayoría de los casos, la metodología de Pruebas Doblemente Unilaterales se puede implementar de manera simple calculando un intervalo de confianza bilateral del 90%, que corresponde a una prueba de equivalencia del 5%. Si este intervalo de confianza cae totalmente dentro del intervalo de equivalencia especificado al inicio del Paso 2, entonces se habrá demostrado con suficiencia la similitud. Para modelos de líneas paralelas, se puede usar (1) un intervalo de confianza basado en el valor de la diferencia de las pendientes ±k veces el error estándar de dicho valor o (2) el Teorema de Fieller para el cociente de las pendientes. Para modelos de cociente de pendientes, se emplea el intervalo de confianza para la diferencia de las intersecciones. Para modelos no lineales, existe evidencia de que estos métodos simples de intervalo de confianza no alcanzan el nivel de confianza declarado, mientras que los métodos basados en perfiles de probabilidad o remuestreo son más apropiados. INTERVALO El intervalo para una valoración biológica de la potencia relativa es el intervalo entre las potencias superior e inferior para las que la valoración biológica presenta niveles de precisión adecuados, exactitud relativa, linealidad del logaritmo de potencia y tasas de éxito para la aptitud del sistema y de la muestra. Resulta fácil determinar si una muestra, que es similar a un Estándar, tiene o no una potencia relativa dentro del intervalo (validado) del sistema de valoración. Para muestras que no son similares de conformidad con los criterios establecidos, resulta más complicado determinar si se puede obtener una estimación de la potencia relativa para la muestra. En una valoración no lineal de líneas paralelas, se puede suponer que una muestra que no presenta datos sobre una asíntota está fuera del intervalo de potencia de la valoración. En una valoración de línea recta paralela, una muestra que no tiene tres o más puntos en la porción pronunciada de la curva de respuesta puede estar fuera del intervalo de potencia de la valoración. Para muestras que no hayan mostrado similitud con la referencia, resulta inapropiado informar la potencia o generar un cociente de los EC 50 a partir de ajustes no restringidos. Puesto que dichas muestras pueden estar fuera del intervalo de la valoración, podría ser útil cambiar la dilución de la muestra de prueba para una valoración subsiguiente, basándose en una estimación de la actividad relativa. Esta actividad relativa estimada puede obtenerse mediante el cociente
920 (1032) Valoraciones Biológicas / Información General
USP 39
entre las concentraciones del Estándar y la Prueba que genera respuestas que coinciden con la respuesta de referencia en el EC50 de referencia.
4.8 Valores Aberrantes Es necesario analizar los datos de la valoración biológica para detectar valores aberrantes antes del análisis de la potencia relativa. Los valores aberrantes pueden ser simples eventos aleatorios o una señal de un problema sistemático en la valoración biológica. El error sistemático que genera valores aberrantes puede deberse a un error de dilución en una o más concentraciones de una muestra de Prueba o del Estándar, o debido a un error mecánico (p.ej., mal funcionamiento del sistema). Se pueden tener en cuenta diversas metodologías para detectar valores aberrantes. La inspección visual se utiliza con frecuencia, aunque se debe aumentar su alcance con una metodología más objetiva para prevenir un posible sesgo. Un valor aberrante es un dato que aparentemente está fuera de lugar con respecto a los otros datos presentes. Un valor aberrante puede tener una causa distinta e identificable, como por ejemplo, un error en la práctica, mal funcionamiento del equipo o un error de registro de datos, o simplemente puede ser un valor inusual con respecto a la variabilidad comúnmente observada y puede aparecer sin una causa identificable. La pregunta esencial con respecto a un valor aberrante es: ¿El valor aberrante aparente se obtiene a partir de la misma población que los otros datos menos discrepantes o forma parte de otra población? Si proviene de la misma población y, por lo tanto, el dato es un valor inusual (aunque legítimo) obtenido de casualidad, entonces el dato debe mantenerse. Si proviene de otra población y el valor inusual del dato se debe a un error humano o al mal funcionamiento de un instrumento, entonces el dato debe omitirse de los cálculos. En la práctica, a menudo se desconoce la respuesta a esta pregunta básica y las investigaciones sobre las causas a menudo son inconclusas. La administración de valores aberrantes se basa en procedimientos y prácticas para generar la mejor respuesta posible a dicha pregunta esencial y para guiar hacia una respuesta correcta. El capítulo general Interpretación y Tratamiento de Datos Analíticos (101 O) trata la designación, la identificación y el rechazo de valores aberrantes, e incluye métodos estadísticos. Asimismo, el Capítulo General (101 O) cita fuentes adicionales de información que pueden ofrecer una revisión exhaustiva de la metodología estadística pertinente. El Capítulo General (101 O) no ofrece comentarios explícitos con respecto al análisis de valores aberrantes en regresiones lineales o no lineales. Se pueden usar técnicas de análisis de valores aberrantes apropiadas para datos obtenidos de la regresión de la respuesta sobre la concentración. Este capítulo ofrece algunos comentarios sobre valores aberrantes para el contexto de valoraciones biológicas a fin de enfatizar o complementar la información del capítulo (101 O). De todos los procedimientos empleados para el análisis de compuestos farmacéuticos y fármacos biológicos, se puede esperar que la valoración biológica presente la mayor tendencia a producir datos aberrantes. La administración de valores aberrantes es adecuada para los datos de valoración biológica en al menos dos niveles: cuando se puede verificar un dato individual o un grupo de datos (p.ej., datos a una concentración) en función de las respuestas esperadas para la muestra y la concentración; y, por separado, cuando se pueden verificar la uniformidad de las estimaciones de potencia relativa de una valoración en función de otras estimaciones independientes de la potencia del mismo material. Tres aspectos importantes de la administración de valores aberrantes son la prevención, la designación y la identificación. La prevención de valores aberrantes se prefiere por razones obvias, y se facilita mediante procedimientos que sean menos propensos a errores y mediante verificaciones que sean sensibles a los tipos de errores que, dada la experiencia obtenida en el desarrollo de la valoración, podrían esperarse. En efecto, el error nunca se convierte en un valor aberrante puesto que se prevee su ocurrencia. Una buena práctica requiere examinar los datos para detectar valores aberrantes y designar ("marcado") las observaciones sobre aparentes valores aberrantes para su investigación. Si la investigación detecta una causa, entonces el dato aberrante se puede excluir del análisis. Debido a la presencia común de variabilidad importante en la respuesta de las valoraciones biológicas, es probable que una investigación del laboratorio sobre la observación de valores aberrantes no determine una causa. Sin embargo, la falta de evidencia relacionada con la causa de un valor aberrante no es una indicación clara de que se requiera un análisis estadístico de valores aberrantes. El conocimiento sobre el intervalo típico de la variabilidad de la respuesta de la valoración debe usarse como justificación para utilizar análisis estadísticos para valores aberrantes. La identificación de valores aberrantes consiste en utilizar reglas para confirmar que los valores no son uniformes con el modelo estadístico conocido o asumido. En el caso de valores aberrantes sin una causa determinada, resulta tentador el uso de procedimientos estadísticos de identificación de valores aberrantes para descartar valores inusuales. Descartar datos basándose únicamente en consideraciones estadísticas debe realizarse con la menor frecuencia posible. El descarte falso de datos conlleva a estimaciones de variabilidad demasiado optimistas y puede sesgar las estimaciones de potencia. El laboratorio debe monitorear la tasa de incumplimiento para su procedimiento de valores aberrantes y debe tomar acciones cuando ésta sea significativamente más alta de lo esperado. Los procedimientos estadísticos para la identificación de valores aberrantes depende de suposiciones con respecto a la distribución de datos sin valores aberrantes. La identificación de datos como valores aberrantes podría significar únicamente que la suposición con respecto a la distribución es incorrecta. Si es común la reducción de valores aberrantes debido a consideraciones estadísticas, en particular si los valores aberrantes tienden a presentarse en valores o respuestas altos, entonces esto puede indicar que los datos requieren de algún ajuste, por ejemplo una transformación logarítmica, como parte del procedimiento de valoración. Dos metodologías para la evaluación estadística de valores aberrantes están basadas en determinaciones repetidas y en modelos.
USP 39
Información General/ (1032) Valoraciones Biológicas 921
METODOLOGÍAS BASADAS EN DETERMINACIONES REPETIDAS Cuando se llevan a cabo determinaciones repetidas en concentraciones de una muestra de Prueba y del Estándar, se puede emplear un criterio de "variabilidad extra" (EV, por sus siglas en inglés) para detectar valores aberrantes. Los datos históricos pueden analizarse para determinar el intervalo en la variabilidad comúnmente observada entre determinaciones repetidas y dicha distribución de intervalos se puede usar para establecer un extremo en el intervalo que puede señalar un valor aberrante. Las métricas que pueden emplearse incluyen el intervalo simple (repetición máxima menos repetición mínima), la desviación estándar, o el coeficiente de variación o desviación estándar relativa (RSD, por sus siglas en inglés) entre determinaciones repetidas. No obstante, si la valoración biológica presenta heterogeneidad en la variabilidad, las suposiciones con respecto a la dispersión uniforme de datos son infundadas. Los analistas pueden usar un criterio variable a través de distintos niveles de la valoración biológica, o pueden transformar los datos a una escala que produzca una variabilidad homogénea. La transformación se puede llevar a cabo con una metodología de Poder de la Media, según se discutió con anterioridad. Cuando está presente la heterogeneidad, es muy probable que exista una falta de normalidad, por lo que se debe usar el intervalo en lugar de la desviación estándar o la desviación estándar relativa. Las acciones tomadas al detectar un valor aberrante potencial dependen en parte del número de determinaciones repetidas. Si se detecta una variabilidad extra dentro de un par (n = 2) a una concentración de una muestra de Prueba o del Estándar, no siempre resultará claro cuál de las determinaciones repetidas es aberrante, por lo que el laboratorio deberá eliminar la concentración de cualquier otro procesamiento adicional. Cuando se llevan a cabo más de dos determinaciones repetidas en cada dilución, el laboratorio puede optar por una estrategia que identifique cuál de los extremos puede ser el valor aberrante. Como alternativa, el laboratorio puede optar por eliminar la dilución del procesamiento adicional. METODOLOGÍAS BASADAS EN MODELOS Las metodologías basadas en modelos se pueden usar para detectar valores aberrantes dentro de los datos de la valoración biológica. Estas metodologías emplean los residuos derivados del ajuste de un modelo apropiado. En general, si se emplean métodos basados en modelos para identificar valores aberrantes potenciales, los modelos usados pueden realizar menos suposiciones sobre los datos que los modelos usados para evaluar la aptitud y la potencia estimada. Por ejemplo, un modelo de regresión no paramétrico (suavizado) puede ser útil. Por último, una alternativa para descartar datos aberrantes consiste en usar métodos robustos que sean menos sensibles a la influencia de observaciones de valores aberrantes. El uso de la mediana en lugar de la media para describir el centro de los datos es un ejemplo de una perspectiva robusta. Asimismo, una regresión empleando el método de cuadrados mínimos, que sustenta muchos de los métodos tratados en este capítulo, no es robusta ante la presencia de valores aberrantes. El uso de métodos tales como una regresión robusta puede ser adecuado, pero no está cubierto en los capítulos de valoraciones biológicas de la USP.
4.9 Efectos Fijos
y Aleatorios en Modelos de Respuesta de Valoraciones Biológicas
La elección de tratar factores como fijos o aleatorios es importante para el diseño de las valoraciones biológicas, los experimentos de desarrollo, el análisis estadístico de datos y la validación de la valoración biológica. Los efectos fijos son factores para los que todos los niveles, o todos los niveles de interés, se presentan discretamente, como muestra, concentración, temperatura y duración de la descongelación, y tiempo de incubación. Los datos para una respuesta a cierto nivel o a una combinación de niveles de un factor fijo puede predecir respuestas futuras. Se espera que los efectos fijos ocasionen un cambio uniforme en las respuestas. Los analistas estudian los efectos fijos controlándolos en el diseño y examinando los cambios en las medias a distintos niveles del factor. Los efectos aleatorios son factores cuyos niveles en una corrida particular de una valoración se consideran representativos de los niveles que pudieran estar presentes. Es decir, no se espera que ningún valor específico del factor aleatorio tenga influencia sobre la respuesta, si no que dicho valor pueda variar dependiendo de cierta distribución de valores esperada y que, por consiguiente, pueda ser una fuente de variabilidad. Por ejemplo, no se desea predecir la respuesta de la valoración para un día específico, pero existe interés en predecir la variación en la respuesta relacionada con el factor "día". Los ejemplos de los efectos aleatorios incluyen el lote de reactivo, el operador o el día si no existe interés en lotes de reactivos, operadores o días específicos como fuentes de variabilidad. Los analistas pueden estudiar los efectos aleatorios midiendo los componentes de varianza que corresponden a cada efecto aleatorio. Los componentes de varianza sólo se pueden estimar de manera adecuada si existe un número apreciable de niveles de cada efecto aleatorio. Si, por ejemplo, se cuenta únicamente con dos o tres lotes de reactivo o analistas presentes, la estimación de la variación asociada con dichos factores será deficiente. Realizar una selección correcta con respecto a la forma de tratar un factor como fijo o aleatorio es importante para el diseño de la valoración y para informar apropiadamente su precisión. Por ejemplo, tratar todos los factores como fijos conlleva a subestimar la variabilidad de la valoración, puesto que ignora todas las fuentes de variabilidad distintas a las determinaciones repetidas. El objetivo es identificar las fuentes específicas de variabilidad que puedan ser controladas para incluir de manera apropiada aquellos factores en el diseño y, posteriormente, incluir otros factores como aleatorios. Si el factor puede cambiar de aleatorio a fijo o viceversa, el factor debe incluirse en el modelo generalmente como un efecto aleatorio. Por ejemplo, cuando los lotes de reactivo no pueden ser controlados, por lo regular se considera que diferentes lotes
922 (1032) Valoraciones Biológicas / Información General
USP 39
ocasionan variabilidad, por lo que el lote de reactivo se consideraría un efecto aleatorio. No obstante, si se ha detectado un gran cambio en los valores de respuesta en un lote determinado, se puede llevar a cabo una comparación entre un conjunto de lotes usando un lote de reactivo como efecto fijo. De manera similar, la secuencia o ubicación dentro de la valoración (p.ej., bloque, placa, fila de la placa, columna de la placa o pocillo) se puede considerar como una fuente de variación aleatoria o una fuente de un efecto constante (fijo). Los diseños de valoraciones que constan de múltiples factores son eficientes, pero requieren de las técnicas estadísticas correspondientes que incorporen los factores en el análisis como efectos fijos o aleatorios. Cuando todos los factores son fijos, el modelo estadístico recibe el nombre de modelo de efectos fijos. Si todos son aleatorios, se le denomina modelo de efectos aleatorios. Si algunos factores son fijos y otros son aleatorios, se trata de un modelo de efectos mixtos. Se debe tomar en cuenta que los conceptos de efectos fijos y aleatorios aplican a modelos para respuestas cuantitativas, cualitativas e integrales. Para diseños de valoración que incluyan múltiples unidades experimentales (p.ej., muestras asignadas a conjuntos de tubos y concentraciones asignadas a tubos pre-placas), resulta particularmente efectivo un modelo de efectos mixtos en el que las unidades experimentales se tratan como efectos aleatorios. La presencia de diseños con efectos aleatorios cruzados {p.ej., cada operador usó material de una o más partidas de reactivo, pero muchas partidas de reactivos fueron empleadas por múltiples operadores) agrega todavía más complejidad. Esto puede ocasionar desafíos metodológicos y de cálculo adicionales para el ajuste del modelo, en especial cuando los diseños están desequilibrados.
5. ETAPAS DEL PROCESO DE DESARROLLO DE LA VALORACIÓN BIOLÓGICA Dada la ubicuidad de las valoraciones basadas en células y la motivación para emplear un sistema de valoración biológica para ofrecer un contexto de discusión, el desarrollo de una valoración biológica basada en células se utilizará para ilustrar las etapas del continuum del desarrollo de la valoración biológica.
5.1 Diseño: Distribución de la Valoración, Distribución por Bloques y Aleatorización La mayoría de las valoraciones basadas en células se llevan a cabo usando una placa de cultivo celular (placa de microtitulación de 6; 12; 96 ó 384 pocillos). Idealmente, una placa puede proporcionar un sustrato uniforme para tratamientos experimentales en todos los pocillos, incluyendo las etapas posteriores al lavado e incubación. No obstante, independientemente de las condiciones de la valoración con las que se pretenda minimizar el potencial de sesgo (p.ej., buena técnica del analista, calibración cuidadosa de pipetas, tiempo de incubación controlado y temperatura), se pueden observar gradientes sistemáticos en la placa, independientes de los tratamientos experimentales. Estos gradientes pueden ocurrir a través de filas, columnas o desde el borde hacia el centro de la placa, y a menudo se denominan efectos de placa. Incluso los efectos de placa moderados o inconsistentes deben tratarse durante el desarrollo de la valoración, mediante estrategias de distribución de placa, distribución por bloques, aleatorización y determinaciones repetidas. Los efectos de placa se pueden evaluar en un ensayo de uniformidad en el que se usa en todos los pocillos de la placa un solo tratamiento experimental, como por ejemplo una concentración de valoración seleccionada a partir de la sección media de la curva de concentración-respuesta. La Figura 1 ofrece un ejemplo de lo que puede llegar a observarse; una tendencia de la señal a disminuir de derecha a izquierda es evidente. En este caso, se descubrió que la lavadora de placas estaba lavando de manera más enérgica el lado izquierdo de la placa y fue necesario ajustarla para proveer una intensidad de lavado uniforme y eliminar el gradiente. Otro efecto de placa común es un patrón de crecimiento celular diferencial en el que los pocillos externos de la placa cultivan células de tal manera que se atenúa la señal de la valoración. Éste es un problema tan persistente que a menudo se opta por no utilizar los pocillos externos de la placa de valoración. Debido a que los efectos de ubicación son muy comunes, se deberían evitar los diseños que emplean determinaciones repetidas (p.ej., de muestra por combinaciones de concentración) en pocillos adyacentes.
Información General/ (1032) Valoraciones Biológicas 923
USP 39
Uniformidad
AFU
•2000-2500 01500-2000 "1000-1500 •ro0-1000 •1).500
Figura 1. Gráfica de cambio en la respuesta de la valoración a través de la placa. La Distribución por Bloques es el agrupamiento de unidades experimentales relacionadas en diseños experimentales. Los bloques pueden consistir en placas individuales de 96 pocillos, secciones de placas de 96 pocillos o placas de 96 pocillos agrupadas por analista, por día o por partida de células. El objetivo es aislar cualquier efecto sistemático de modo que no oscurezca los efectos de interés. Un diseño completo en bloques ocurre cuando todos los niveles de un factor de tratamiento (en una valoración biológica, los factores de tratamiento primario son la muestra y la concentración) se aplican a unidades experimentales para dicho factor dentro de un solo bloque. Un diseño incompleto en bloques ocurre cuando el número de niveles de un factor de tratamiento excede el número de unidades experimentales para dicho factor dentro del bloque. La Aleatorización es un proceso de asignación de tratamiento a unidades experimentales basado en probabilidad de tal manera que todas las unidades experimentales tengan la misma probabilidad de recibir un tratamiento determinado. Aunque resulta complicada en la práctica, la aleatorización de tratamientos experimentales ha sido defendida como la mejor metodología para minimizar el sesgo de la valoración o, más precisamente, para proteger los resultados de la valoración de fuentes conocidas y desconocidas de sesgo, convirtiendo el sesgo en varianza. Aunque la aleatorización de muestras y concentraciones en pocillos individuales de placas puede no resultar práctico, la distribución de la placa puede diseñarse para minimizar los efectos de placa, alterando las posiciones de la muestra a través de las placas y el patrón de diluciones dentro y a través de las placas. Cuando se requieren múltiples placas en una valoración, el diseño de distribución de la placa debe, por lo menos, alternar posiciones de muestras a través de las placas dentro de una corrida de valoración para evitar un posible sesgo introducido por los analistas o el equipo en un día determinado. Resulta prudente emplear una rotación equilibrada de distribuciones en las placas de modo que la recolección de determinaciones repetidas (cada una de las cuales utiliza una distribución distinta) proporcione algo de protección contra fuentes problables de sesgo. La Figura 2 presenta un diseño de valoración en patrones que carece de aleatorización y es susceptible al sesgo. Las diluciones y las determinaciones repetidas de las preparaciones de Prueba (A y B) y del Estándar (R) se colocan juntas de manera secuencial en la placa. El sesgo debido a un efecto de placa o incubadora puede influenciar parte o la totalidad de las concentraciones de una de las muestras. Se debe tomar en cuenta que en las Figuras 2 a 5 los pocillos exteriores de la placa se dejan como blancos para proteger contra el efecto del borde.
924 (1032) Valoraciones Biológicas/ Información General
1
2
3
4
5
6
USP 39
7
8
9 10 11 12
A B
e D
E F G
H Figura 2. Placa con patrones muy marcados. Una distribución que ofrece algo de protección de los efectos de placa y que se puede realizar de forma manual es un diseño de gráfica en filas, que se presenta en la Figura 3. En dicha distribución, las muestras se distribuyen aleatoriamente en filas de una placa y se llevan a cabo series de diluciones en distintas direcciones en diferentes secciones (bloques) de la placa para mitigar el sesgo a través de las columnas de la placa. Una ventaja extra del diseño de gráfica en tiras es su capacidad para detectar efectos de ubicación mediante la interacción de la muestra y la dirección de la dilución (de izquierda a derecha o viceversa).
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12
A B
e D
E
F G H Figura 3. Diseño de una gráfica en tiras La Figura 4 presenta una alternación de las posiciones de la Prueba (muestra de Prueba 1 = 11 111 ; muestra de Prueba 2 = 11 2") y del Estándar ( 11 R11 ) en múltiples placas, dentro de una sola corrida de valoración; esto ofrece protección contra los efectos de fila en la placa. Combinar los dos métodos ilustrados en las Figuras 3 y 4 puede ayudar a convertir de manera efectiva el sesgo de la placa en varianza de la valoración. Posteriormente, se puede tratar la varianza de la valoración, según se requiera, mediante un número mayor de determinaciones repetidas de la valoración (mayor número de placas en una valoración).
Información General/ (1032) Valoraciones Biológicas 925
USP 39
Fila de la Placa
Placa 1
Placa 2
Placa 3
B
R
2
1
e o
1
R
2
2
1
R
E
R
2
1
F
1
R
2
G
2
1
R
Figura 4. Valoración de placas múltiples con posiciones de Prueba y Estándar variadas. El diseño de gráfica dividida, una alternativa que asigna muestras a las filas de las placas de manera aleatoria y que distribuye aleatoriamente las diluciones (concentraciones) dentro de cada fila, se presenta en la Figura 5. Dicha estrategia puede ser difícil de implementar, incluso con el uso de instrumentos robóticos.
1
2
3
4
5 6 7
8
9 10 11 12
A
B
e D
E F
G H Figura 5. Diseño de gráfica dividida. ESTRATEGIA DE DILUCIÓN Las concentraciones de valoración de una muestra de Prueba y del Estándar se pueden obtener de diversas maneras. Los laboratorios a menudo llevan a cabo diluciones en serie, en las que cada dilución se prepara a partir de una dilución previa, en sucesión. Como alternativa, el laboratorio puede preparar diluciones completamente independientes a partir de la muestra de Prueba y del Estándar para obtener series de concentraciones independentes. Estas dos estrategias resultan en las mismas concentraciones nominales, pero tienen propiedades distintas con respecto al error. Las diluciones seriales están sujetas a la propagación del error a través de las series de diluciones y un error de dilución cometido en una dilución temprana tendrá como resultado observaciones correlacionadas no independientes. Las correlaciones también se pueden introducir empleando pipetas multicanal. Las diluciones independientes ayudan a mitigar el sesgo que resulta de los errores de dilución. Es importante mencionar que cuando se trabaja para mejorar la precisión, las reducciones más grandes de varianza se logran mediante determinaciones repetidas en los niveles más altos posibles de los efectos aleatorios anidados. Lo anterior resulta particularmente efectivo cuando dichos niveles altos son fuentes de variabilidad. Por ejemplo: llevar a cabo muchas determinaciones repetidas en un día para una valoración que se sabe presenta una gran variación entre días no es una forma efectiva de mejorar la precisión de los valores de informe.
5.2 Desarrollo Una meta del desarrollo de la valoración biológica es obtener una exactitud relativa de la valoración biológica y una precisión de la estimación de potencia óptimas. Un punto final del desarrollo de la valoración consiste en el desarrollo completo del procedimiento de valoración, un protocolo para la realización de la valoración biológica. El procedimiento debe incluir detalles suficientes para que un laboratorio calificado con un analista capacitado pueda realizar el procedimiento de manera rutinaria. Una parte estratégica del desarrollo es buscar que se mantenga el desempeño. Los procedimientos operativos estándar para
926 (1032) Valoraciones Biológicas / Información General
USP 39
calificación de reactivos y de técnicos, así como para la calibración del Estándar de trabajo, ayudan a completar el paquete de desarrollo de la valoración biológica. LA METODOLOGÍA DE UN FACTOR A LA VEZ CONTRA EL DISEÑO DE EXPERIMENTOS El desarrollo de la valoración biológica avanza a través de una serie de experimentos en los que las condiciones y los niveles de los factores de la valoración se varían para identificar aquéllos que sustentan una valoración biológica confiable y robusta, calificada para el uso rutinario. Dichos experimentos se pueden llevar a cabo mediante la metodología de un factor a la vez (OFAT, por sus siglas en inglés), estudiando cada parámetro por separado para identificar condiciones ideales, o mediante el uso de un diseño de experimentos de factores múltiples (DOE, por sus siglas en inglés). El diseño de experimentos de factores múltiples es una estrategia eficiente y efectiva para desarrollar una valoración biológica y mejorar el desempeño de la misma, ayudando de esta manera a obtener un sistema de medición que cumple con los requisitos. En comparación con la metodología de un factor a la vez, el diseño de experimentos de factores múltiples por lo regular requiere una menor cantidad de experimentos y también ofrece una perspectiva sobre las interacciones de los factores que afectan el desempeño de la valoración biológica. El desarrollo de la valoración mediante un diseño de experimentos de factores múltiples puede proseguir a través de una serie de etapas: mapeo del proceso y análisis de riesgos, examen, optimización de la respuesta y confirmación. MAPEO DEL PROCESO Y ANÁLISIS DE RIESGOS La optimización de la valoración biológica puede comenzar con un examen sistemático y una evaluación de riesgos para identificar aquellos factores que podrían influenciar la respuesta de la valoración biológica. Resulta útil visualizar factores de la valoración biológica empleando un mapa del proceso de la misma, como por ejemplo, un diagrama de causa y efecto o de espina de pescado. Mediante el uso del mapa de proceso como guía, el laboratorio puede examinar los factores que podrían afectar el desempeño de la valoración, tales como pH de la solución amortiguadora, temperatura de incubación y tiempo de incubación. Históricamente, la experiencia con una o más de las etapas de la valoración biológica, junto con un juicio científico fundamentado, pueden identificar factores claves que requieran de evaluación adicional. Una herramienta que se puede emplear para priorizar factores es un análisis del modo y los efectos de la falla. Los factores generalmente se contabilizan combinando su potencial para influenciar la respuesta de la valoración y su probabilidad de ocurrir. El laboratorio debe prestar atención para reconocer interacciones potenciales entre los factores de la valoración. EXAMEN Una vez que se han identificado los factores claves mediante el mapeo del proceso y el análisis de riesgos, el laboratorio puede llevar a cabo un experimento inicial para explorar los efectos para los que podría ser necesario aplicar controles. Los diseños de examen como los de tipo factorial y factorial fracciona! se emplean comúnmente con este propósito. Existe software disponible para ayudar al practicante con la selección del diseño y el análisis subsiguiente. No obstante, el analista debe tener cuidado de comprender sus suposiciones sobre la selección del diseño y el análisis para asegurar la identificación exacta de los factores experimentales. OPTIMIZACIÓN DE LA RESPUESTA Un diseño de examen, por lo general, podrá detectar unos cuantos factores importantes de entre aquéllos que se estudian. Dichos factores se pueden estudiar aún más en un diseño de optimización de la respuesta. Los diseños de optimización de la respuesta, tales como los diseños centrales compuestos, se llevan a cabo para determinar las configuraciones óptimas para las combinaciones de factores de la valoración biológica, a fin de obtener la respuesta adecuada. La información obtenida a partir de la optimización de la respuesta se puede representar como una superficie de respuesta y puede emplearse para establecer intervalos que provean un desempeño aceptable de la valoración y que se incorporarán en el procedimiento de la valoración biológica. En el lenguaje de Calidad por Diseño (QbD, por sus siglas en inglés), la "región" en la que los niveles combinados de variables de ingreso y parámetros del proceso han demostrado proveer un desempeño aceptable de la valoración se describe como el espacio del diseño para la valoración biológica. Establecer un verdadero espacio del diseño para una valoración biológica representa un desafío; no todos los factores y niveles de factores aleatorios se incluirán en el Diseño de Experimentos de Factores Múltiples del desarrollo, y no existe certeza de que el espacio del diseño no sea sensible a factores aleatorios no estudiados. De manera similar, no se puede asegurar del todo que la valoración (espacio de diseño) sea robusta para factores aleatorios que se estudian usando muestras pequeñas (o muestras de niveles no aleatorias). Los elementos del Diseño de Experimentos de Factores Múltiples que se pueden considerar incluyen el uso de bloques; confusión deliberada entre interacciones que son de poco interés o que no se consideran importantes; diseño robusto (diseños de superficie de respuesta con efectos aleatorios); y uso de diseños de gráfica dividida, gráfica en tiras o lote dividido.
USP 39
Información General/ (1032) Valoraciones Biológicas 927
CONFIRMACIÓN El modelo matemático que representa el desempeño de la valoración como una función de cambios en los factores claves de la valoración es una aproximación; por consiguiente, se acostumbra a confirmar el desempeño en las configuraciones ideales de la valoración biológica. La confirmación puede adquirir la forma de un ensayo de calificación en el que se lleva a cabo la valoración, de preferencia en múltiples ocasiones independientes usando valores óptimos para factores. Alternativamente, el laboratorio puede determinar que la valoración fue adecuadamente desarrollada y que se puede proseguir con la validación. La calificación es una buena práctica, no un requisito reglamentario. La decisión de llevar a cabo corridas de calificación confirmatorias o de proceder con la validación depende de la fuerza de la información acumulada obtenida durante el desarrollo.
5.3 Análisis de Datos durante el Desarrollo de la Valoración El análisis de los datos de la valoración biológica durante el desarrollo de la valoración permite a los analistas tomar decisiones en relación con el modelo estadístico que se utilizará para el análisis de rutina, incluyendo la transformación y/o la ponderación de datos, así como el desarrollo de criterios de aptitud del sistema y de la muestra. El análisis también ofrece información relacionada con los elementos de la estructura del diseño que deberían usarse durante la detección de valores aberrantes y el ajuste de un modelo completo. Lo anterior puede incluir además un plan para seleccionar subconjuntos de datos, como por ejemplo una porción lineal para análisis, o para valoraciones biológicas no lineales, una estrategia de reducción del modelo para muestras similares al Estándar. Una vez que estas decisiones han sido tomadas y que se muestras sólidas durante la validación, no será necesario volverlas a evaluar con cada desempeño de la valoración. A continuación se presenta una metodología de proceso para permitir la toma de dichas decisiones.
Paso 1: Seleccionar un modelo estadístico apropiado (ver también la sección 4.6 Modelos Comunes de Valoración Biológica). Debido a la complejidad de las valoraciones biológicas y a la motivación para emplear una metodología que se considere fidedigna, los modelos analíticos adecuadamente estandarizados son comunes en el campo de los análisis de valoraciones biológicas. No obstante, existen muchas consideraciones implícitas en la selección del modelo estadístico más apropiado. Primero, el modelo debe ser adecuado para el tipo de punto final de la valoración-continuo, recuento o dicotómico. Segundo, el modelo debe incorporar la estructura del diseño de valoración. Para cualquier diseño distinto al completamente aleatorizado, existirán términos en el modelo para los elementos estructurales. Por ejemplo, la distribución en bloques dentro de las placas, la ubicación de la jaula en la instalación que alberga los animales, el día, entre otros. Una tercera consideración, aplicable a los puntos finales continuos, implica decidir si se usa un modelo de regresión o un modelo de media (un análisis del modelo de varianza que se ajusta a una media distinta en cada nivel de dilución de cada muestra analizada), con términos de error apropiados. Un modelo de media puede ser apropiado en esta etapa debido a que no realiza ninguna suposición sobre la forma de la curva de concentración-respuesta.
Paso 2: Ajustar el modelo estadístico seleccionado a los datos sin la suposición de paralelismo y posteriormente evaluar la distribución de los residuos, examinándolos específicamente para detectar desviaciones de la normalidad y de la varianza constante. Transformar los datos según se requiera o, si fuera necesario, seleccionar un esquema de ponderación (ver la sección 4.3 Heterogeneidad de la Varianza, Ponderación y Transformación). Usar un cuerpo de datos de valoración, a partir de valoraciones independientes, tan grande como sea posible. El objetivo primario es tratar cualquier desviación de la normalidad y de la varianza constante de las respuestas en todo el intervalo de concentraciones en la valoración. El paso 2 probablemente alternará entre imponer una transformación y evaluar la distribución de los residuos.
Paso 3: Examinar para detectar valores aberrantes y eliminarlos de manera apropiada. Esta etapa, por lo regular, sigue a la selección inicial de una transformación adecuada y/o método de ponderación. El modelo usado para detectar valores aberrantes idealmente contiene los elementos importantes de la estructura del diseño de la valoración, permite curvas no similares y realiza menos suposiciones con respecto a la forma funcional de la curva de concentración-respuesta que el modelo usado para evaluar la similitud. Ver la Sección 4.8. Valores Aberrantes y el capítulo general (101 O) para información sobre la detección y eliminación de valores aberrantes. En algunos casos, los valores aberrantes pueden ser tan severos que un modelo razonable podría no ajustarse, por lo que los residuos no estarían disponibles. En tales casos, resulta necesario examinar los datos brutos para detectar valores aberrantes antes de intentar el ajuste del modelo. Durante el desarrollo de la valoración, se debe desarrollar una estrategia para la investigación y tratamiento de una observación de valores aberrantes, incluyendo cualquier límite sobre la cantidad aceptable de valores aberrantes. Estas instrucciones deben incluirse en el Procedimiento Operativo Estándar de la valoración. La buena práctica incluye registrar el proceso de una investigación, las pruebas para valores aberrantes aplicadas y los resultados de las mismas. Se debe tomar en cuenta que los procedimientos para valores aberrantes deben considerarse de manera independiente a la investigación y el tratamiento de un resultado fuera de la especificación (OOS, por sus siglas en inglés) (valor de informe). Las decisiones para eliminar un valor aberrante del análisis de los datos no debe tomarse basándose en el efecto que sufrirá el valor de informe (p.ej., un resultado potencial fuera de la especificación). La eliminación de datos como valores aberrantes no debe practicarse con regularidad. Si se eliminan muchos valores como valores aberrantes de una corrida, dicha corrida se. debe considerar sospechosa.
Paso 4: Reajustar el modelo con la transformación y/o ponderación previamente impuesta (Paso 2) sin las observaciones identificadas como valores aberrantes (Paso 3) y volver a evaluar la idoneidad del modelo.
928 (1032) Valoraciones Biológicas / Información General
USP 39
Paso 5: Cuando resulte necesario o deseable, seleccionar un esquema para identificar los subconjuntos de datos para su uso en la estimación de potencia, ya sea el modelo lineal o no lineal (ver la sección 4.5 Linealidad de los Datos de ConcentraciónRespuesta). Paso 6: Calcular una estimación de potencia relativa analizando los datos de la Prueba y del Estándar al mismo tiempo mediante un modelo que deberá tener líneas o curvas paralelas o intersecciones idénticas.
5.4 Validación de la Valoración Biológica La validación de la valoración biológica es un estudio basado en protocolos que demuestra que el procedimiento es adecuado para su uso. Se puede considerar una metodología por etapas para la validación, tal como en una validación "adecuada para el uso pretendido" para sustentar la liberación de material de ensayo clínico, y una validación final exhaustiva antes de tramitar la Solicitud para Productos Biológicos Terapéuticos (BLA, por sus siglas en inglés) o la Solicitud para Autorización de Comercialización (MM, por sus siglas en inglés). Se deben establecer y describir de manera clara los controles de aptitud del sistema preliminar y de la muestra en el procedimiento de la valoración; dichos factores se pueden determinar basándose en la experiencia adicional obtenida en el ejercicio de validación. El capítulo (1033) ofrece una discusión exhaustiva sobre la validación de valoraciones biológicas.
5.5 Mantenimiento de Valoraciones Biológicas Aunque se trata de operaciones discretas, el desarrollo y la validación de una valoración biológica llevan a la realización de actividades continuas. Las mejoras de la valoración se pueden implementar a medida que cambia la tecnología, conforme el laboratorio se vuelve más versado con el procedimiento y los cambios a la metodología de la valoración biológica requieran la reevaluación del desempeño de la misma. Algunos de estos cambios pueden ser respuestas a un desempeño inesperado durante el procesamiento de rutina. Se deben monitorear las acciones correctivas usando procedimientos de control rutinario. Los cambios importantes pueden requerir de un estudio para verificar que la valoración biológica sigue siendo adecuada para su uso. Se puede emplear una metodología de análisis de equivalencia para demostrar que el cambio ha generado un desempeño adecuado. Asimismo, se puede llevar a cabo un estudio de orientación estadística para demostrar que el cambio no compromete las características de desempeño de la valoración previamente aceptables. TRANSFERENCIA DE LA VALORACIÓN La transferencia de la valoración supone un uso pretendido conocido de la valoración biológica en el laboratorio receptor y la capacidad requerida asociada para el sistema de valoración. Estos dos factores demarcan implícitamente, aunque quizás no precisamente, los límites relacionados con la cantidad de sesgo y la pérdida de precisión permitida entre laboratorios. Para utilizar dos laboratorios de manera intercambiable para sustentar un producto será necesario tomar en cuenta la variación entre laboratorios, además de la precisión intermedia para los requisitos de tamaño de las muestras a fin de determinar la capacidad del proceso. Para información y ejemplos relacionados con la interrelación entre sesgo, capacidad del proceso y validación, ver Ejemplo de Validación de Valoraciones Biológicas en el capítulo general (1033). MEJORAMIENTO O ACTUALIZACIÓN DE UN SISTEMA DE VALORACIÓN BIOLÓGICA Una nueva versión de una valoración biológica puede mejorar la calidad de sesgo, precisión, intervalo, robustez, especificidad, disminuir los costos de operación u ofrecer otras ventajas convincentes. Se puede utilizar un estudio puente al momento de mejorar o actualizar una valoración biológica para comparar el desempeño de la nueva valoración con la ya establecida. Además, se puede usar una variedad de muestras (p.ej., liberación del lote, estabilidad, sometidas a estrés, isoformas críticas) para demostrar la equivalencia de las potencias estimadas. Aunque los sistemas de valoración pueden presentar algunas diferencias (p.ej, una valoración biológica en animales frente a una valoración biológica basada en células), si las valoraciones emplean tanto el mismo Estándar como el mismo mecanismo de acción, existe una expectativa razonable de obtener potencias comparables. Si la nueva valoración emplea un Estándar diferente, el requisito mínimo para una comparación aceptable es una pendiente de uno en la relación logarítimica lineal entre las potencias estimadas. Un aspecto importante a considerar sobre esta recomendación es que cualquier precisión deficiente o valoración con sesgo que se haya usado previamente podría tener un impacto duradero sobre los requisitos de las determinaciones repetidas, incluso si la valoración se reemplaza posteriormente con una valoración mejorada.
USP 39
Información General/ (1033) Validación de Valoraciones Biológicas 929
(1033) VALIDACIÓN DE VALORACIONES BIOLÓGICAS 1. INTRODUCCIÓN Las Valoraciones Biológicas forman una parte integral de la evaluación de calidad requerida para la fabricación y comercialización de muchos productos biológicos y de algunos medicamentos no biológicos. Las valoraciones biológicas que comúnmente se utilizan para estimar la potencia de un fármaco se pueden distinguir de las pruebas químicas por su dependencia de un sustrato biológico (p.ej., animales, células vivas o complejos funcionales de receptores diana). Debido a los múltiples factores operativos y biológicos que surgen de su fundamento biológico, por lo general presentan una mayor variabilidad que las pruebas químicas. Las valoraciones biológicas representan una de las diversas pruebas fisicoquímicas y biológicas con procedimientos y criterios de aceptación que controlan los atributos críticos de calidad de un medicamento biológico. Conforme a lo descrito en las Guías de la ICH titulada Specifications: Test Procedures And Acceptance Criteria For Biotechnological/Biological Products (Q6B), sección 2.1 .2, las técnicas de valoración biológica pueden medir la respuesta biológica de un organismo al producto; una respuesta bioquímica o fisiológica a nivel celular; velocidades de reacción enzimáticas o respuestas biológicas inducidas mediante interacciones inmunológicas; o unión de ligandos y receptores. A medida que surgen nuevos medicamentos biológicos y nuevas tecnologías, es probable que aumente el alcance de las metodologías de valoración biológica. Por lo tanto, el presente capítulo general, Validación de Va/oraciones Biológicas (1033) se centra en metodologías que ofrecen flexibilidad para adoptar nuevos métodos de valoración biológica, nuevos medicamentos biológicos, o la combinación de ambos para evaluar la potencia del fármaco. Las buenas prácticas de fabricación requieren que los métodos de prueba usados para evaluar el cumplimiento de los productos farmacéuticos con los requisitos de calidad cumplan con los estándares apropiados de exactitud y confiabilidad. La validación de la valoración es el proceso de demostrar y documentar que las características de desempeño del procedimiento y de su método de base cumplen con los requisitos para la aplicación prevista y que la valoración es, por lo tanto, adecuada para su uso previsto. El capítulo general de la USP Validación de Procedimientos Farmacopeicos (1225) y la guía ICH Q2(Rl) describen las características (parámetros) de desempeño de la valoración que se deben evaluar para procedimientos que sustenten productos farmacéuticos de pequeñas moléculas. Aunque resulta fácil evaluar estos parámetros de validación para muchos tipos de medicamentos bien caracterizados por procesos químicos, aún no se ha delineado claramente su interpretación y aplicabilidad para algunos tipos de valoraciones biológicas. Este capítulo trata la validación de valoraciones biológicas desde el punto de vista de la medición de actividad, en lugar de mediciones de masa o fisicoquímicas, con el propósito de alinear las características del desempeño de la valoración biológica con los usos en la práctica de las valoraciones biológicas. La evaluación del desempeño de las valoraciones biológicas es un proceso continuo, pero debe realizarse una vez completado el desarrollo. La validación de valoraciones biológicas se guía por un protocolo de validación que describe los objetivos y el diseño del estudio de validación. El capítulo general (1033) ofrece objetivos de validación relacionados con las valoraciones biológicas de la potencia relativa. Las valoraciones biológicas de la potencia relativa se basan en una comparación de las respuestas de la valoración biológica para una muestra de Prueba contra las de un Estándar designado y ofrecen una medida cuantitativa de la actividad biológica de la Prueba con respecto a la del Estándar. Los parámetros de validación discutidos incluyen exactitud relativa, especificidad, precisión intermedia e intervalo. Los laboratorios pueden usar la linealidad de las diluciones para verificar la exactitud relativa y el intervalo del método. Aunque la robustez no es un requisito de validación, el presente capítulo general (1033) recomienda evaluar la robustez de la valoración biológica antes de la validación. Asimismo, el capítulo (1033) describe metodologías para el diseño de la validación (selección de muestras y estrategia para determinaciones repetidas), criterios de aceptación de la validación, análisis e interpretación de datos y, finalmente, monitoreo del desempeño de la valoración biológica a través del control de calidad. Además, se analiza la documentación de los resultados de la validación de la valoración biológica, con respecto a los experimentos previos a la validación que se llevan a cabo para optimizar el desempeño de la valoración biológica. Para los objetivos del presente capítulo general (1033), el término "valoración biológica" deberá interpretarse con el sentido de "valoración biológica de la potencia relativa".
2. FUNDAMENTOS DE LA VALIDACIÓN DE LA VALORACIÓN BIOLÓGICA El objetivo de la validación de la valoración biológica radica en confirmar que las características operativas del procedimiento sean las adecuadas para el uso previsto del procedimiento. Las cuestiones implicadas en el desarrollo de una valoración biológica se describen con mayor detalle en el capítulo general (1032) y se asume que han sido resueltas al momento en que la valoración biológica entra en la etapa de validación. Dichas decisiones deberán incluir una identificación de los componentes de una valoración y de una corrida para la valoración biológica. Las diluciones (concentraciones) múltiples del Estándar y de una o más muestras de Prueba constituyen un conjunto de determinaciones repetidas (también conocido como conjunto mínimo), que contiene un sustrato de prueba (p.ej., un grupo de animales o frascos de células) en cada dilución para cada muestra (Pruebas y Estándar). Una corrida se identifica como el trabajo realizado durante un periodo en el que existe una expectativa razonable de que la exactitud (certeza) y la precisión en el sistema de valoración se mantengan estables. En la práctica, una corrida con frecuencia consiste en el trabajo realizado por un solo analista en un laboratorio, con un conjunto de equipo, en
930 (1033) Validación de Valoraciones Biológicas / Información General
USP 39
un tiempo corto (típicamente un día). Una valoración es el conjunto de datos usados para evaluar la similitud y potencia estimada para cada muestra de Prueba relativa a un Estándar. Una corrida puede contener múltiples valoraciones, una sola valoración o parte de una valoración. Se pueden combinar múltiples valoraciones para generar un valor de informe para una muestra. El valor de informe es el valor que se compara con una especificación de producto. Para valoraciones que implican grupos en cada dilución (p.ej., 6 muestras, cada una en 1O diluciones, en los pocillos no localizados en los bordes de cada una de las placas de cultivo celular de 96 pocillos usadas) los grupos {placas) constituyen bloques estadísticos que deben ser elementos en la valoración y en los análisis de validación (los bloques se analizan en el capítulo (1032)). Las determinaciones repetidas dentro de los bloques para muestras de Prueba no son generalmente rentables. Este capítulo no proporciona un mayor análisis sobre los bloques, pues éste se encuentra disponible en el capítulo general (1032). Inicialmente, se asigna un valor de 1,0 ó 100% a la cantidad de actividad (potencia) del Estándar, y la potencia de la muestra de Prueba se calcula comparando las curvas de concentración-respuesta para el par de la Prueba y el Estándar, cuyo resultado es una medida sin unidad, que es la potencia relativa de la muestra de Prueba con respecto a la potencia del Estándar. En algunos casos, se asigna un valor al Estándar correspondiente a otra propiedad, como por ejemplo, la concentración de proteína. En dicho caso, la potencia de la muestra de Prueba es la potencia relativa multiplicada por el valor asignado del Estándar. Una suposición de las valoraciones biológicas de líneas paralelas o de curvas paralelas (p.ej., logísticas de cuatro parámetros) es que las curvas de dosis-respuesta generadas usando un Estándar y una Muestra de Prueba tienen una forma de curva similar (paralela), que se diferencia únicamente por un cambio horizontal en la dosis logarítmica. Para valoraciones biológicas de cociente de pendientes, las curvas generadas para las muestras Estándar y la Muestra deben ser lineales, pasar a través de una misma ordenada al origen y diferir únicamente en sus pendientes. La información sobre cómo evaluar el paralelismo se proporciona en los capítulos generales (1032) y (1034). Para establecer la exactitud relativa y el intervalo de la valoración biológica, la validación de las muestras de Prueba se puede construir usando una serie de diluciones del Estándar para evaluar la linealidad de las diluciones (linealidad de la relación entre la potencia relativa conocida y la medida). Asimismo, el estudio de validación debe generar una estimación representativa de la variabilidad de la determinación de potencia relativa. Aunque los estudios de robustez por lo general se realizan durante el desarrollo de la valoración biológica, se pueden incluir en la validación factores claves de estos estudios, tales como el tiempo y la temperatura de incubación y, para valoraciones biológicas basadas en células, el número de pasajes de células y el número de células, en particular si interactúan con otro factor que se introduzca durante la validación (p.ej., un reactivo sensible a la temperatura cuya sensibilidad varía entre lotes). Debido a la potencial influencia sobre la valoración biológica de factores como múltiples analistas, instrumentos o procedencia de los reactivos, el diseño de la validación de la valoración biológica debe considerar dichos factores. La variabilidad de la potencia causada por estos elementos combinados define la precisión intermedia {IP, por sus siglas en inglés) de la valoración biológica. Un estudio adecuado de la variabilidad de los valores de potencia obtenidos, incluyendo el impacto de factores intravaloración y entre corridas, puede ayudar al laboratorio a confirmar una estrategia de análisis adecuada y a predecir la variabilidad inherente del valor de informe (que puede ser el promedio de múltiples determinaciones de potencia). Las estimaciones de variabilidad también se pueden usar para establecer la magnitud de las diferencias que se pueden distinguir entre muestras analizadas en la valoración biológica. (Ver la sección 3.4 Uso de los Resultados de la Validación para la Caracterización de Valoraciones Biológicas.) Para demostrar la especificidad (también conocida como selectividad) se requiere evidencia sobre la falta de influencia de los componentes de la matriz tales como componentes del proceso de fabricación o productos de degradación, de modo que las mediciones cuantifiquen únicamente la molécula diana. Otros métodos analíticos pueden complementar una valoración biológica mediante la medición o identificación de otros componentes en una mezcla .
. 2.1 Protocolo de Validación para Valoraciones Biológicas Un protocolo de validación para valoraciones biológicas debe incluir el número y los tipos de muestras que se estudiarán en la validación; el diseño del estudio, incluyendo los factores entre corridas e intracorridas; la estrategia para determinaciones repetidas; los parámetros de validación predeterminados y los criterios de aceptación diana justificados para cada parámetro; y el plan propuesto para el análisis de los datos. Se debe tomar en cuenta que, con respecto al cumplimiento de los criterios de aceptación, el no encontrar un efecto importante desde el punto de vista estadístico no representa una base adecuada para definir un desempeño aceptable en una valoración biológica; el cumplimiento con los criterios de aceptación se puede evaluar de mejor manera usando una metodología de equivalencia. Asimismo, se deben especificar los criterios de aceptación para la valoración, corrida y muestra, tales como la aptitud del sistema y la similitud, antes de realizar la validación. Dependiendo del grado de desarrollo de la valoración biológica, los criterios se pueden proponer como tentativos y se pueden actualizar con los datos de la validación. Los incumplimientos de la valoración, de la corrida o de las muestras se pueden reevaluar de acuerdo con criterios definidos en el protocolo de la validación y, con justificación sólida, incluirse en la evaluación general de la validación. Pueden ser necesarios ensayos de validación adicionales para sustentar cambios en el método. El protocolo de validación de la valoración biológica debe incluir criterios de aceptación diana para los parámetros de validación propuestos. Los pasos a tomar cuando no se cumpla un criterio de aceptación diana se deben especificar en el protocolo de validación y pueden resultar en un límite en el intervalo de potencias que se puede medir en la valoración biológica o en una modificación de la estrategia de determinaciones repetidas en el procedimiento de la valoración biológica.
USP 39
Información General/ (1033) Validación de Valoraciones Biológicas 931
2.2 Documentación de los Resultados de la Validación de la Valoración Biológica Los resultados de la validación de la valoración biológica deben documentarse en un informe de validación. El informe de validación debe sustentar la conclusión que indica que el método es adecuado para su uso o debe indicar una acción correctiva (tal como un incremento en la estrategia de determinaciones repetidas) que se llevará a cabo para generar resultados lo suficientemente confiables como para conseguir que sea apto para uso. El informe debe incluir los datos brutos y los resultados intermedios (p.ej., se deben proveer las estimaciones de los componentes de la varianza además de la precisión intermedia general) que facilitarían la reproducción del análisis de validación de la valoración biológica por parte de un revisor independiente. Las estimaciones de los parámetros de validación se deben informar para cada nivel y a nivel general, según corresponda. Las desviaciones del protocolo de validación deben documentarse con su respectiva justificación. Las conclusiones obtenidas del estudio se deben describir claramente con referencias a las acciones de seguimiento, según sea necesario. Las acciones de seguimiento pueden incluir enmiendas en el sistema o en los criterios de aptitud del sistema o modificaciones a la estrategia de determinaciones repetidas de la valoración biológica. Se pueden incluir referencias a experimentos de prevalidación como parte del informe del estudio de validación. Los experimentos de prevalidación pueden incluir experimentos de robustez, en los que se hayan identificado los parámetros de la valoración biológica y se hayan establecido intervalos para parámetros significativos; asimismo, pueden incluir experimentos de calificación, en los que se haya llevado a cabo el procedimiento final para confirmar el desempeño satisfactorio durante la operación de rutina. Las conclusiones derivadas de los experimentos de prevalidación y calificación realizados durante el desarrollo contribuyen a la descripción de las características operativas del procedimiento de valoración biológica.
2.3 Diseño de Validación para Valoraciones Biológicas La validación de valoraciones biológicas debe incluir muestras representativas de los materiales que se analizarán en la valoración biológica y debe establecer de manera efectiva las características de desempeño del procedimiento. Para evaluar la exactitud relativa, se deben usar los niveles de potencia relativa de la muestra que delimitan el intervalo de potencias y que son susceptibles de análisis en la valoración biológica. De tal manera, se pueden estudiar muestras que abarcan un amplio intervalo de potencias para un medicamento o producto biológico con un amplio intervalo de especificación o para un producto con una inestabilidad inherente, pero se puede usar un intervalo más estrecho para un producto más duradero. Se requiere un mínimo de tres niveles de potencia, pero se recomiendan cinco para una evaluación fidedigna. Si se cumplen los criterios de valoración para exactitud relativa y precisión intermedia, los niveles de potencia seleccionados constituirán el intervalo de la valoración biológica. Como resultado, se obtendrá un intervalo limitado a partir de los niveles que no cumplan con sus criterios de aceptación diana. También se pueden generar muestras para la validación de la valoración biológica sometiendo una muestra a un nivel de estrés que pudiera observarse en la práctica rutinaria (es decir, investigaciones de estabilidad). Asimismo, las influencias de la matriz de la muestra (excipientes, constituyentes del proceso o componentes de combinación) se pueden estudiar estratégicamente variando de manera intencionada dichas influencias con el analito de interés, usando una metodología multifactorial, lo cual a menudo habrá de realizarse durante el desarrollo, antes de generar los datos de liberación y estabilidad. El diseño de la valoración biológica debe considerar todas las facetas del proceso de medición. Las fuentes de variabilidad en las mediciones de la valoración biológica incluyen la preparación de la muestra, factores intracorridas y factores entre corridas. La estimación representativa de la variabilidad de la valoración biológica requiere tomar en cuenta dichos factores. La preparación de la muestra de Prueba y del Estándar se deben llevar a cabo de manera independiente durante cada corrida de validación. La estrategia de determinaciones repetidas usada en la validación debe reflejar el conocimiento adecuado de los factores que pudieran influenciar la medición de la potencia. La variabilidad intracorridas puede verse afectada: por los factores operativos de la valoración biológica que por lo general se establecen durante el desarrollo (temperatura, pH, tiempos de incubación, etc.); por el diseño de la valoración biológica (número de animales, número de diluciones, determinaciones repetidas por dilución, espaciado de diluciones, etc.); por los criterios de aceptación de la valoración y de la muestra; y por el análisis estadístico (cuando los puntos finales primarios son la evaluación de similitud para cada muestra y las estimaciones de potencia para las muestras de referencia). Las restricciones operativas y el diseño de la valoración biológica (fórmulas dentro y entre corridas que resultan en un valor de informe para un material de prueba) por lo general se especifican durante el desarrollo y pueden convertirse en una parte del procedimiento operativo de la valoración biológica. La precisión intermedia se estudia mediante corridas independientes del procedimiento, posiblemente mediante el uso de un diseño experimental que altera aquellos factores que pueden impactar el desempeño del procedimiento. Los experimentos (incluyendo aquéllos que implementan diseños formalizados de experimentos [DOE, por sus siglas en inglés]) con estructuras de diseño anidado o cruzado pueden revelar fuentes importantes de variabilidad en el procedimiento, así como asegurar una estimación representativa de variabilidad a largo plazo. Durante la validación no es necesario emplear el formato requerido para obtener el valor de informe de una solución de Prueba. Un experimento de validación bien diseñado que combine fuentes de variabilidad entre corridas e intracorridas provee estimaciones de componentes independientes de la variabilidad de la valoración biológica. Estos componentes se pueden usar para verificar o pronosticar la variabilidad del formato de la valoración biológica. Un análisis extenso de los datos de validación debe incluir resúmenes gráficos y estadísticos de los resultados de los parámetros de validación y su cumplimiento con los criterios de aceptación diana. El análisis debe seguir las especificaciones del plan
USP 39
932 (1033) Validación de Valoraciones Biológicas / Información General
de análisis de datos descrito en el protocolo de validación. En la mayoría de los casos, el logaritmo de la potencia relativa debe analizarse para cumplir con las suposiciones de los métodos estadísticos (ver la sección 2.7 Consideraciones Estadísticas, Escala del Análisis). Dichas suposiciones incluyen la normalidad de la distribución a partir de la que se muestrearon los datos y la homogeneidad de la variabilidad a través del intervalo de resultados observados en la validación. Es posible explorar tales suposiciones usando técnicas gráficas tales como gráficas de caja y gráficas de probabilidad. La suposición de normalidad se puede investigar usando análisis estadísticos de normalidad a través de una colección de datos históricos de tamaño adecuado. Se deben buscar métodos alternativos de análisis cuando las suposiciones pudieran ser cuestionables. Los intervalos de confianza deben calcularse para los parámetros de la validación usando los métodos descritos en este capítulo y en el capítulo general Datos Analíticos-Interpretación y Tratamiento (101 O).
2.4 Estrategias de Validación de las Características de Desempeño de la Valoración Biológica Los parámetros que deben verificarse en una valoración biológica son: exactitud relativa, especificidad, precisión intermedia (que incorpora la repetibilidad) e intervalo. Otros parámetros discutidos en el capítulo general (1225) y en la guía ICH Q2(Rl ), tales como el límite de detección y el límite de cuantificación, no han sido incluidos en este capítulo debido a que, por lo general, no son relevantes para una valoración biológica que informa la potencia relativa. No obstante, éstos pueden ser relevantes para la validación de una valoración auxiliar, tal como la empleada para contabilizar los elementos que responden o medir la respuesta en conjunto con una valoración de potencia in vivo. Asimismo, la linealidad no forma parte de la validación de una valoración biológica, excepto por su relación con la exactitud relativa (linealidad de las diluciones). A continuación, se presentan estrategias para tratar los parámetros de validación de la valoración biológica. EXACTITUD RELATIVA La exactitud relativa de una valoración biológica de potencia relativa es la relación entre la potencia relativa medida y la potencia relativa conocida. La exactitud relativa en la valoración biológica se refiere a una pendiente unitaria (pendiente = 1) entre el logaritmo de la potencia relativa medida y el logaritmo de la potencia relativa conocida. La metodología más común para demostrar la exactitud relativa para las valoraciones biológicas de potencia relativa es mediante la construcción de potencias diana a través de la dilución del material estándar o de una muestra de Prueba con una potencia conocida. Este tipo de estudio a menudo se denomina estudio de linealidad de las diluciones. Los resultados obtenidos de un estudio de linealidad de las diluciones se deben evaluar usando el sesgo relativo estimado en niveles individuales y mediante una tendencia en el sesgo relativo a través de los niveles. El sesgo relativo en niveles individuales se calcula de la manera siguiente: Sesgo Relativo= 100. (Potencia Medida Potencia Diana
1)%
La tendencia en el sesgo se mide por la pendiente estimada del logaritmo de la potencia medida en función del logaritmo de la potencia diana, el cual se debe ajustar a un criterio de aceptación diana. Si no existe una tendencia en el sesgo relativo a través de los niveles, el sesgo relativo estimado en cada nivel se puede ajustar a un criterio de aceptación diana previamente especificado y definido en el protocolo de validación (ver la sección 3 Ejemplo de Validación de una Valoración Biológica). Especificidad-Para productos o productos intermedios asociados con matrices complejas, la especificidad implica demostrar la ausencia de interferencia de componentes de la matriz o de componentes relacionados con el producto que se esperaría que estuvieran presentes. Lo anterior se puede evaluar mediante la dilución paralela del Estándar con o sin la adición de cantidades conocidas del compuesto potencialmente interferente. Si las curvas son similares y la potencia cumple con las expectativas de una comparación entre Estándares, la valoración biológica es específica para el compuesto. Para estas evaluaciones, tanto la similitud como la potencia se pueden evaluar usando análisis de equivalencia apropiados. La especificidad también se puede referir a la capacidad de la valoración biológica para distinguir entre moléculas biofarmacéuticas diferentes pero relacionadas. Se debe buscar un buen entendimiento con respecto a la molécula y a cualquier forma relacionada, así como de las oportunidades de que moléculas relacionadas se introduzcan en la valoración biológica. Precisión Intermedia-Debido a la potencial influencia sobre la valoración biológica de factores tales como analistas, instrumentos o procedencia de los reactivos, el diseño de la validación de la valoración biológica debe considerar dichos factores. La variabilidad general a partir de las mediciones tomadas en una variedad de condiciones normales de análisis dentro de un laboratorio define la precisión intermedia de la valoración biológica. La precisión intermedia (IP, por sus siglas en inglés) es el término usado por la ICH y la USP para referirse a lo que comúnmente se conoce como variabilidad entre corridas. Las medidas de precisión intermedia analizan la influencia de factores que variarán con el tiempo después de haber implementado la valoración biológica. Dichas influencias, por lo general, son inevitables e incluyen factores tales como cambios de personal (nuevos analistas), recepción de lotes de nuevos reactivos, entre otros. Cuando se ha planeado la valoración usando un Diseño de Experimento multifactorial, se puede explorar el impacto de cada factor gráficamente para establecer contribuciones importantes a la variabilidad de la potencia. La identificación de factores importantes debe guiar hacia los procedimientos que buscan controlar sus efectos, como por ejemplo, ampliar las restricciones para las condiciones operativas intravaloraciones o procedimientos de calificación estratégicos para factores entre corridas tales como analistas, instrumentos y lotes de reactivos.
USP 39
Información General/ (1033) Validación de Valoraciones Biológicas 933
Las contribuciones de los factores de estudio de la validación a la precisión intermedia general de la valoración biológica se pueden determinar mediante un análisis de componentes de la varianza aplicado a los resultados de la validación. La mejor forma de llevar a cabo el análisis de componentes de la varianza es utilizar un software estadístico que sea capaz de realizar un análisis de modelo mixto con una estimación de probabilidad máxima restringida (RMLE, por sus siglas en inglés). Un análisis de componentes de la varianza genera estimaciones de componentes de la varianza tales como
y
que corresponden a la variación intracorridas y entre corridas, y que se pueden usar para estimar la precisión intermedia de la valoración biológica, así como la variabilidad del valor de informe para distintos formatos de valoraciones biológicas (variabilidad del formato). La precisión intermedia expresada como el coeficiente geométrico porcentual de variación (%GCV, por sus siglas en inglés) se obtiene con la siguiente fórmula, usando para este caso el logaritmo natural de la potencia relativa en el análisis (ver la sección 2.7 Consideraciones Estadísticas, Escala del Análisis):
Precisión Intermedia
=100 • ( é'l"'"'+u'~"' -1)%
La variabilidad del valor de informe derivado del análisis realizado con n conjuntos de determinaciones repetidas en cada una de las k corridas (variabilidad del formato) es igual a: Variabilidad del Formato= 100 • ( e~"lo1.,/k
+
,,.,~•• /~k)
-1) %
Esta fórmula se puede usar para determinar un formato de análisis adecuado para varios usos de la valoración biológica (p.ej., análisis de liberación y evaluación de la estabilidad). Intervalo-El intervalo de la valoración biológica se define como las potencias verdadera o conocida para las que se ha demostrado que el procedimiento analítico tiene un nivel adecuado de exactitud relativa y de precisión intermedia. El intervalo es normalmente derivado del estudio de la linealidad de las diluciones y, por lo menos, debe cubrir el intervalo de especificación del producto para la potencia. Para los análisis de estabilidad y para minimizar la necesidad de diluir o concentrar muestras de Prueba con altas o bajas potencias para ajustarlas al intervalo de la valoración biológica, resulta beneficioso validar la valoración biológica usando un intervalo más amplio.
2.5 Validación de los Criterios de Aceptación Diana Se debe optar por una validación de los criterios de aceptación diana para minimizar los riesgos inherentes al tomar decisiones derivadas de las medidas de la valoración biológica y para que la capacidad de la técnica sea razonable. Cuando existe una especificación de producto, los criterios de aceptación deben justificarse basándose en el riesgo de que las medidas podrían caer fuera de la especificación del producto. Se pueden usar las consideraciones derivadas de un índice de capacidad del proceso (Cp, por sus siglas en inglés) para informar los límites del sesgo relativo (RB, por sus siglas en inglés) y la precisión intermedia de la valoración biológica. Este capítulo emplea el siguiente índice de capacidad del proceso:
C m= p
~
USL-LSL 2
2
2
6 ·()'Producto + RB + O'RA
donde el Límite de Especificación Superior (USL, por sus siglas en inglés) y el Límite de Especificación Inferior (LSL, por sus siglas en inglés) son la especificación superior e inferior de liberación, el sesgo relativo, (RB) es un límite para el grado de sesgo relativo en la valoración 2
O Producto
y
02
RA
son la varianza del producto de interés (es decir, la variabilidad entre lotes) y la varianza de la valoración de liberación (RA, por sus siglas en inglés) (con formato asociado) respectivamente. (Ver en la sección 3, Ejemplo de una Validación de Valoración Biológica, un ejemplo de determinación de
934 (1033) Validación de Valoraciones Biológicas / Información General
USP 39
y de la capacidad de procesamiento.) Esta formulación requiere conocer con anticipación la variabilidad diana del producto o la inclusión de una selección aleatoria de lotes para estimar estas características como parte de la validación. Debido al conocimiento limitado sobre el desempeño de la valoración, del historial de fabricación y de las especificaciones finales durante el desarrollo, esta metodología puede usarse simplemente como guía para definir los criterios de aceptación de la validación. La selección de un límite con respecto a la capacidad del proceso es una decisión empresarial. La proporción de lotes que se pronostica estarán fuera de sus límites de especificación es una función de la capacidad de proceso. Algunos laboratorios necesitan una capacidad de proceso correspondiente a un índice de capacidad del proceso mayor o igual a 1,3. Esto corresponde a una posibilidad aproximada de 1 en 1O000 de que un lote con potencia en el centro del intervalo de especificación caiga por fuera de los límites de especificación. Cuando no se hayan establecido las especificaciones para un producto, se puede formular una restricción para el sesgo relativo o la IP basándose en la capacidad de la técnica de la metodología de la valoración biológica. Por ejemplo, aunque las valoraciones químicas y los inmunoensayos a menudo son capaces de obtener un porcentaje de coeficiente de variación (o/oCV, por sus siglas en inglés, o desviación estándar relativa porcentual, o/oRSD) de casi un solo dígito, se puede establecer una restricción más liberal a las valoraciones biológicas, tales como valoraciones biológicas de potencia en animales, que operan con una variabilidad mucho mayor (medida como o/oGCV, que se puede comparar con el o/oCV; ver el Apéndice). En este caso, el objetivo de la validación puede ser la caracterización del método, usando los resultados de la validación para establecer un formato de valoración con el que se espera generar medidas de producto fidedignas. El protocolo de validación debe incluir una justificación sólida para los criterios de aceptación aceptables o para el uso de una caracterización.
2.6 Mantenimiento de la Valoración La implementación de la valoración biológica se lleva a cabo una vez que ésta ha sido validada. No obstante, resulta importante monitorear su comportamiento con el paso del tiempo, lo cual se logra fácilmente manteniendo diagramas de controles estadísticos del proceso (SPC, por sus siglas en inglés) para parámetros adecuados de la curva de respuesta del Estándar y de la potencia de las muestras de Control de Calidad de la valoración. El propósito de estos diagramas es identificar en una etapa temprana cualquier cambio o desvío en la valoración biológica. Si se observa una tendencia en cualquiera de los diagramas de controles estadísticos del proceso, se deberá identificar la razón de dicha tendencia. Si la resolución requiere modificar la valoración biológica o si se ha presentado una modificación seria en la valoración biológica por otras razones (por ejemplo, un cambio tecnológico mayor), la valoración biológica deberá revalidarse o vincularse a la valoración biológica original mediante un estudio puente adecuadamente diseñado con criterios de aceptación que utilicen análisis de equivalencia.
2.7 Consideraciones Estadísticas Algunas consideraciones estadísticas se relacionan con el diseño de la validación de una valoración biológica y con el análisis de los datos. Asimismo, se relacionan con las propiedades de las mediciones de la valoración biológica, así como con las herramientas estadísticas que se pueden usar para resumir e interpretar los resultados de validación de la valoraciones biológicas. ESCALA DEL ANÁLISIS La escala del análisis de la validación de una valoración biológica, en la que los datos son las potencias relativas de las muestras en el estudio de validación, se debe tomar en cuenta para obtener conclusiones fidedignas del estudio. El presente capítulo asume que se han establecido previamente métodos apropiados para calcular la potencia relativa a partir de los datos brutos de la respuesta de la valoración biológica (según se indica en el capítulo general (1034)). Las mediciones de potencia relativa por lo general están normalmente distribuidas en logaritmos. Las medidas distribuidas normalmente en logaritmos presentan sesgo y se caracterizan por la heterogeneidad de Ja variabilidad, donde la desviación estándar es proporcional al nivel de respuesta. Los métodos estadísticos citados en este capítulo requieren que los datos sean simétricos, aproximándose a una distribución normal, aunque algunos otros procedimientos requieren de homogeneidad de la variabilidad en las mediciones a través del intervalo de potencia. Por lo regular, el análisis de potencia posterior a la transformación logarítmica genera datos que se acercan más al cumplimiento de ambos requisitos. La base de la transformación logarítmica no es de importancia, siempre que se mantenga una base uniforme durante todo el análisis. De esta forma, por ejemplo, si el logaritmo natural (logaritmo en base e) se usa para transformar las mediciones de potencia relativa, los resultados recopilados se convierten de nuevo a la escala de la valoración biológica utilizando la base e. La distribución de las mediciones de potencia deben evaluarse como parte del desarrollo de la valoración biológica (según se describe en (1032)). Si se determina que las mediciones de potencia están distribuidas con normalidad, la validación se puede llevar a cabo usando los métodos descritos en el capítulo general Validación de Procedimientos Farmacopeicos (1225). Como consecuencia de la transformación logarítmica habitual (para valoraciones de líneas paralelas) de mediciones de potencia relativa, existen ventajas cuando los niveles seleccionados para el estudio de validación se encuentran espaciados uniformemente en la escala logarítmica. Un ejemplo con cinco niveles sería 0,50; 0,71; 1,00; 1,41 y 2,00. Los niveles intermedios se obtienen como la media geométrica (GM, por sus siglas en inglés) de dos niveles adyacentes. De esta forma, por ejemplo, el nivel medio entre 0,50 y 1,0 se deriva de la manera siguiente:
USP 39
Información General/ (1033) Validación de Valoraciones Biológicas 935
GM=~0.50-1,0 =0,71
Asimismo, las medidas recopiladas de la validación se ven influenciadas por la escala logarítmica normal. La respuesta pronosticada debe informarse como la media geométrica de las mediciones individuales de potencia relativa, mientras que la variabilidad se expresa como %GCV. El GCV se calcula como el antilogaritmo de la desviación estándar, 5109, de mediciones de potencia relativa transformadas. La fórmula provista es:
GCV = antilog(S 109)
-
1
La variabilidad se expresa como GCV en lugar de RSD de la distribución logarítmica normal a fin de conservar la continuidad usando la transformación logarítmica (ver la discusión adicional en el Apéndice de este capítulo). Los intervalos que pueden calcularse a partir de la GCV serán uniformes con respecto a los intervalos calculados a partir de la media y de la desviación estándar de los datos transformados en logaritmos. La Tabla 1 presenta un ejemplo del cálculo de la media geométrica (GM, por sus siglas en inglés) y el sesgo relativo asociado, con el %GCV para una serie de mediciones de potencia relativa realizadas con muestras analizadas en el nivel 1,00. El logaritmo base e se usa en la ilustración. Tabla 1. Ilustración de los Cálculos de Media Geométrica y O/oGCV In de la Potencia Relativa
Potencia Relativa 1 1,1299
0,1221
0,9261
-0,0768
1,1299
0,1221
1,0143
0,0142
1,0027
0,0027
1,0316
0,0311
1,1321
0,1241
1,0499
0,0487
Promedio
0,0485
GM = 1,0497 RB = 4,97%
0,0715
SD
%GCV= 7,4%
1 La potencia relativa es la media geométrica de las potencias duplicadas medidas en las ocho corridas del ejemplo provisto en la
Tabla 4.
En este ejemplo, la media geométrica de las mediciones de potencia relativa se calcula como el antilogaritmo de las mediciones promedio del logaritmo de potencia relativa y luego se expresa como sesgo relativo, la desviación porcentual a partir de la potencia diana:
GM = RB=
ePromedio
=
e0,0485
= 1,0497
100·(~-1J%= 100·(1.0497 -1)% =4,97% Diana 1,00
y el coeficiente de variación geométrico porcentual (%GCV) se calcula como: %GCV = 100. (eDesviación Estándar_ 1)% = 100.
(e0,0715 _
1)% = 7,4%
Se debe tomar en cuenta que el o/oGCV calculado para este ejemplo no es igual a la IP determinada en el ejemplo de validación de valoración biológica para el nivel 1,00 (8,5%); ver la Tabla 6. Este ejemplo utiliza el promedio de determinaciones repetidas dentro de la corrida, mientras que la IP en el ejemplo de validación representa la variabilidad de las determinaciones repetidas individuales. Informe de Resultados de Validación Mediante Intervalos de Confianza-Las estimaciones de los parámetros de validación de la valoración biológica deben presentarse como una estimación puntual junto con un intervalo de confianza. Una estimación puntual es el valor numérico obtenido para el parámetro, como por ejemplo la media geométrica GM o el %GCV. La interpretación más común de un intervalo de confianza es en forma de un intervalo probable del valor verdadero del parámetro. El ejemplo previo determina un intervalo de confianza de 90% para el logaritmo de la potencia relativa promedio, Clin, según se indica a continuación: Cl1n
=Promedio
± td1 • SD ¡ .Jñ
=0,0485±1,89·0,0715/v's =(0,0007; 0,0963) Para el sesgo relativo, esto significa que: 0,0007
)
(
0,0963
)
CIR 8 =100· ( _e__ 1 %;100· _e__ 1 %=(0,07%, 10,1%) 1,00 1.00
936 (1033) Validación de Valoraciones Biológicas / Información General
USP 39
La constante estadística (1,89) se deriva de una tabla t, con grados de libertad iguales al número de mediciones menos uno (grados de libertad = 8 - 1 = 7). Se puede formular un intervalo de confianza para la IP o para la variabilidad del formato usando métodos para componentes de varianza; este capítulo general no abarca dichos métodos. Evaluación del Cumplimiento de los Criterios de Aceptación-Los resultados de la validación de la valoración biológica se comparan con criterios de aceptación diana a fin de demostrar que la valoración biológica es adecuada para su uso. El proceso para establecer el cumplimiento de los parámetros de validación con respecto a los criterios de aceptación para la validación no debe confundirse con establecer el cumplimiento de las mediciones de potencia relativa para las especificaciones del producto. Las especificaciones del producto deben proveer información sobre el proceso para establecer criterios de aceptación para la validación. Una práctica común consiste en aplicar criterios de aceptación al parámetro de validación estimado. Esto, sin embargo, no se toma en cuenta para la incertidumbre en el parámetro de validación estimado. Una solución es mantener el intervalo de confianza en el parámetro de validación con respecto al criterio de aceptación, lo cual es una metodología estadística estándar que se usa para demostrar el cumplimiento con las expectativas y que recibe el nombre de análisis de equivalencia. No se debe confundir con la práctica de realizar una prueba de significancia, como por ejemplo, una prueba t, que busca establecer una diferencia a partir de algún valor diana (p.ej., sesgo relativo de 0%). Una prueba de significancia relacionada con un valor P >0,05 (equivalente a un intervalo de confianza que incluye el valor diana para el parámetro) indica que no existe suficiente evidencia para concluir que el parámetro es diferente al valor diana. Esto no es lo mismo que concluir que el parámetro cumple con el valor diana. El diseño del estudio puede tener muy pocas determinaciones repetidas, o los datos de validación pueden ser demasiado variables para descubrir una diferencia significativa del valor diana. Asimismo, una prueba de significancia puede detectar una pequeña desviación del valor diana que sea de poca importancia. Estos escenarios se ilustran en la Figura 7.
¡
~L---------------------------
a
b
e
Figura 1. Uso de intervalos de confianza para establecer que los resultados de validación cumplen con un criterio de aceptación. La línea sólida horizontal representa el valor diana (posiblemente un sesgo relativo de 0%) y las líneas punteadas forman los límites de aceptación inferior (LAL) y superior (UAL). En el escenario a, el límite de confianza incluye la diana y, por consiguiente, se puede concluir que no existe evidencia suficiente para establecer una diferencia con respecto a la diana (la metodología de la prueba de significancia). No obstante, aunque la estimación puntual (el diamante sólido) cae dentro del intervalo de aceptación, el intervalo se extiende fuera del rango, lo que significa que el sesgo relativo verdadero puede estar fuera del intervalo aceptable. En el escenario b, el intervalo cae dentro del intervalo de aceptación, lo que significa que cumple con el criterio de aceptación. El intervalo en el escenario e también cae dentro del rango de aceptación, pero excluye la diana. Por lo tanto, para el escenario e, aunque la diferencia de la estimación puntual a partir de la diana es estadísticamente significativa, e es aceptable debido a que el intervalo de confianza cae dentro de los límites de aceptación diana. Mediante el intervalo de confianza de 90%, calculado previamente, se puede establecer si la valoración biológica tiene un sesgo relativo aceptable en el nivel 1,00 en comparación con un criterio de aceptación diana no mayor de, por ejemplo, +12%. Debido a que el intervalo de confianza de 90% para el sesgo relativo porcentual (0,07%, 1O,1 %) cae dentro del intervalo (100*[(1/1,12) - 1]%, 100*[(1, 12/1) - 1]%) = (- 11 %, 12%), se puede concluir que existe un sesgo relativo aceptable en el nivel 1,00. Se debe tomar en cuenta que un intervalo de confianza de 90% se usa en una prueba de equivalencia en lugar de un intervalo de confianza convencional de 95%. Esto es una práctica común y es igual que la metodología de pruebas doblemente unilaterales (TOST, por sus siglas en inglés) usada en el análisis de bioequivalencia farmacéutica. Riesgos Implícitos en la Toma de Decisiones y en el Número de Corridas de Validación-La aplicación de análisis estadísticos, incluyendo la evaluación del cumplimiento de un parámetro de validación con sus criterios de aceptación, implica riesgos, uno de éstos es que el parámetro no cumpla con su criterio de aceptación inclusive si la propiedad asociada con dicho parámetro es satisfactoria; mientras que el otro riesgo, por el contrario, consiste en que el parámetro cumpla con su criterio de aceptación aunque dicho parámetro sea verdaderamente insatisfactorio. Un aspecto relacionado con dichos riesgos es el tamaño de la muestra. Los dos tipos de riesgo se pueden controlar simultáneamente mediante un diseño estratégico, incluyendo la selección del número de corridas que se llevarán a cabo en la validación. Específicamente, el número mínimo de corridas requeridas para establecer el cumplimiento con un criterio de aceptación para sesgo relativo se obtiene mediante la fórmula siguiente:
USP 39
Información General/ (1033) Validación de Valoraciones Biológicas 937
donde ta,gl y tp ,91 son los puntos de distribución de una distribución t de Student; a y fJ son errores unilaterales tipo 1y tipo 11, y representan los riesgos asociados con generar la conclusión errónea en la validación; gl son los grados de libertad relacionados con el diseño del estudio (por lo general, n - 1 );
es una estimación preliminar de precisión intermedia; y e es la desviación aceptable (criterio de aceptación diana). Por ejemplo, si un criterio de aceptación para sesgo relativo es± 0, 11 log (es decir, 8=0,11 ), la variabilidad de la valoración biológica es
Ó1P = 0,076 log
y a= fJ = 0,05,
n> -
(1. 89+ 2,36) 2 0,076 2 O, 112
,., 8 corridas
Se debe tomar en cuenta que esta formulación de tamaño de la muestra asume la ausencia de sesgo intrínseco en la valoración biológica. Una solución más conservadora incluye algo de sesgo diferente a cero en la determinación del tamaño de la muestra, lo cual resulta en un mayor tamaño de la muestra para compensar el impacto del sesgo sobre las conclusiones de la validación. En el ejemplo actual, el tamaño de la muestra se incrementa a 1O corridas, si se asume un sesgo intrínseco igual a 2%. Asimismo, debe tomarse en cuenta que este cálculo representa una solución recurrente (puesto que los grados de libertad dependen de n) que requiere software estadístico o un algoritmo que emplee metodología iterativa. Además, es necesario considerar que la selección de a y fJ debe justificarse basándose en los riesgos correspondientes de generar una conclusión errónea a partir de la validación. Generación de un Modelo para Resultados de Validación Usando Modelos de Efectos Mixtos-Muchos análisis relacionados con la validación de una valoración biológica deben tomar en cuenta múltiples factores de diseño, tales como efectos fijos (p.ej., nivel de potencia), así como efectos aleatorios (p.ej., analista, corrida y determinaciones repetidas). Los modelos estadísticos compuestos por efectos fijos y aleatorios reciben el nombre de modelos de efectos mixtos y, por lo general, requieren de software estadístico sofisticado para su análisis. Los resultados del análisis se pueden resumir en una tabla de análisis de varianza (ANOVA, por sus siglas en inglés) o en una tabla de estimaciones de los componentes de la varianza. El objetivo principal del análisis es estimar parámetros críticos en lugar de establecer la significancia de un efecto. Los resultados de la generación del modelo ofrecen estimaciones de parámetros junto con sus errores estándar de estimaciones que se pueden emplear para establecer el cumplimiento del criterio de aceptación. De esta forma, el sesgo relativo promedio en cada nivel se obtiene como una porción del análisis junto con su variabilidad asociada. Éstos constituyen un intervalo de confianza que se compara con el criterio de aceptación, conforme a lo descrito anteriormente. Cuando resulta posible combinar las varianzas de los niveles, la generación de un modelo estadístico también puede determinar el sesgo relativo general y la precisión intermedia, combinando la información obtenida a través de los niveles utilizados en la validación. De manera similar, los modelos de efectos mixtos se pueden usar para obtener los componentes de la varianza para factores del estudio de validación y para combinar los resultados a través de las muestras y niveles del estudio de validación. Diseño Estadístico-Los diseños estadísticos, tales como el Diseño de Experimento multifactorial o anidado, pueden usarse para organizar valoraciones y corridas en una validación de valoración biológica. Resulta útil incorporar aquellos factores que se piense podrían influenciar la respuesta de la valoración biológica y que varían durante el uso a largo plazo del procedimiento en estos diseños. Usando estos métodos de diseño, es posible caracterizar las fuentes de variabilidad y se puede desarrollar un plan de análisis estratégico para administrar la variabilidad de la valoración biológica. La Tabla 2 presenta un ejemplo de un Diseño de Experimento multifactorial que incorpora múltiples analistas, múltiples preparaciones de cultivo celular y múltiples lotes de reactivos en el plan de validación. Tabla 2. Ejemplo de un Diseño de Experimento Multlfactorlal con 3 Factores Corrida
Analista
Preparación de Células
Lote de Reactivo
1
1
1
1
2
1
1
2
3
1
2
1
4
1
2
2
5
2
1
1
6
2
1
2
7
2
2
1
USP 39
938 (1033) Validación de Valoraciones Biológicas / Información General
Tabla 2. Ejemplo de un Diseño de Experimento Multlfactorlal con 3 Factores (Continuación) Corrida
Analista
Preparación de Células
Lote de Reactivo
8
2
2
2
En este diseño, cada analista lleva a cabo la valoración biológica con ambas preparaciones de células y con ambos lotes de reactivo. Éste es un ejemplo de diseño factorial completo debido a que todas las combinaciones de factores se llevan a cabo en el estudio de validación. Para reducir el número de corridas en el estudio, se pueden emplear diseños factorial fraccionarios cuando se hayan identificado más de tres factores. Por ejemplo, si resultara práctico para un analista realizar cuatro valoraciones en una corrida, se podría usar un diseño de unidad dividida considerando a los analistas como el factor de la gráfica completa y la preparación de células y el lote de reactivo como los factores secundarios de la gráfica. A diferencia de los experimentos de comprobación, el diseño de validación debe incorporar la mayor cantidad de factores en la mayor cantidad de niveles posible para obtener una estimación representativa de la precisión intermedia. Siempre que sea posible, se deberán emplear más de dos niveles de un factor en el diseño. Lo anterior se puede lograr de una forma menos estructurada, sin relación alguna con el diseño factorial estricto. Las corridas de validación se deben aleatorizar siempre que sea posible para mitigar las influencias potenciales del orden o tiempo de corrida. La Figura 2 presenta un ejemplo de validación que emplea un diseño anidado (determinaciones repetidas anidadas dentro de la placa; la placa anidada dentro del analista).
Figura 2. Ejemplo de un diseño anidado usando dos analistas. Para estos dos tipos de diseños, así como para las combinaciones de los mismos, se pueden estimar componentes de variabilidad a partir de los resultados de la validación. Estos componentes de variabilidad se pueden usar para identificar las fuentes significativas de variabilidad, así como para derivar un formato de valoración biológica que cumpla con los requisitos de precisión del procedimiento. Se debe tomar en cuenta que las fuentes significativas de variabilidad podrían haber sido identificadas durante el desarrollo. En dicho caso, la validación debe confirmar tanto el impacto de estos factores como el cumplimiento del formato de la valoración con los requisitos de precisión. Cifras Significativas-El número de cifras significativas en un resultado informado a partir de una valoración biológica se relaciona con la precisión de ésta última. En general, una valoración biológica con un %GCV entre 2% y 20% sustentará dos cifras significativas. El número de cifras significativas no debe confundirse con el número de lugares decimales-los valores de informe iguales a 1,2yO,12 tienen el mismo número (dos) de cifras significativas. Este estándar de redondeo es adecuado para mediciones en escala logarítmica que presentan una variación constante en la escala logarítmica y una variabilidad proporcional, no aditiva, en la escala original (o en la escala usada originalmente para interpretación). Se debe tomar en cuenta que el redondeo se presenta al final de una serie de cálculos cuando la medición final se informa y se emplea para tomar decisiones, tales como el cumplimiento con las especificaciones. De esta forma, si la medición final es un valor de informe obtenido a partir de múltiples valoraciones, el redondeo no debe realizarse antes de determinar el valor de informe. Asimismo, las especificaciones deben declararse con el número apropiado de cifras significativas.
3. EJEMPLO DE VALIDACIÓN DE UNA VALORACIÓN BIOLÓGICA A continuación se presenta un ejemplo que ilustra los principios descritos en este capítulo. La valoración biológica se utilizará para sustentar un intervalo de especificación de 0,71 a 1,41 para el producto. Usando la capacidad de proceso descrita en la sección 2.5 Validación de Criterios de Aceptación Diana, se deriva una tabla que muestra la tasa proyectada de resultados fuera de la especificación para diversas restricciones de sesgo relativo y precisión intermedia. La capacidad del proceso se calcula con respecto a la variabilidad de un valor de informe usando tres corridas independientes de la valoración biológica (ver la discusión anterior sobre variabilidad del formato). Se asume que la variabilidad del producto es igual a O en los cálculos. El laboratorio podría optar por incluir una variabilidad de producto diana. Se puede obtener una estimación de la variabilidad del producto diana a partir de los datos de un producto que, por ejemplo, se fabrica usando un proceso similar. Tabla 3. Capacidad del Proceso y Probabllldad de Resultados Fuera de la Especificación para Diversas Restricciones de Sesgo Relativo y Precisión Intermedia Límite de Especificación Inferior-Límite de Especificación Superior
Precisión Intermedia (%)
Sesgo Relativo(%)
Capacidad del Proceso
0,71-1,41
20
20
0,54
10,5
0,71-1,41
8
12
0,94
0,48
Probabilidad (resultados fuera de la especificación) (%)
USP 39
Información General/ (1033) Validación de Valoraciones Biológicas 939
Tabla 3. Capacidad del Proceso y Probabilidad de Resultados Fuera de la Especificación para Diversas Restricciones de Sesgo Relativo y Precisión Intermedia (Continuación) Límite de Especificación Inferior-Límite de Especificación Superior
Precisión Intermedia (%)
Sesgo Relativo (%)
Capacidad del Proceso
10
5
1,55
0,71-1,41
Probabilidad (resultados fuera de la especificación) (%)
0,0003
El cálculo se presenta para una precisión intermedia igual a 8% y un sesgo relativo igual a 12% (n = 3 corridas): Cpm =
ln(1, 41) -ln(O, 71) 6. v[ln(1, 08)] 2 / 3 + [ln(1, 12)]2
=
0, 94
Probabilidad (resultados fuera de la especificación)= 2 ·
/3
= 0,05):
n?: (1, 89 + 2,36)2 . [1~(1, 08)]2 "' 8 corridas [ln(1, 12)] Por consiguiente, serían necesarias ocho corridas para tener un 95% de probabilidad de cumplir con el criterio de aceptación diana para sesgo relativo si el sesgo relativo verdadero es cero. Tomar en cuenta que el cálculo del tamaño de la muestra asume que se llevará a cabo un singulete de las muestras de validación en cada corrida de validación. El uso de múltiples conjuntos para determinaciones repetidas y/o múltiples valoraciones proporcionará información valiosa la cual permitirá separar las estimaciones para variabilidad intracorrida y entre corridas, y reducirá el riesgo de incumplimiento de los criterios de aceptación diana de la validación. En la validación se estudian cinco niveles del analito diana: 0,50; 0,71; 1,00; 1,41 y 2,00. Dos analistas capacitados generan dos corridas en cada nivel usando dos lotes de medios. Se pueden tomar en cuenta otros factores e incorporarlos en el diseño usando una distribución factorial fraccionaria. El laboratorio debe esforzarse para diseñar la validación con la mayor cantidad posible de niveles para cada factor a fin de obtener el mejor modelo para el desempeño a largo plazo de la valoración biológica. En este ejemplo, cada analista lleva a cabo dos corridas en cada nivel usando cada lote de medios. Una corrida consiste en una serie de diluciones completas del Estándar, conforme a lo descrito en el procedimiento operativo de la validación biológica, junto con dos series de diluciones independientes de la muestra de Prueba. Lo anterior genera mediciones por duplicado de la potencia relativa en cada corrida; ver la Tabla 4 para todas las observaciones de potencia relativa. Es necesario considerar que las dos estimaciones de potencia en cada nivel de potencia en una corrida no son independientes debido a los analistas y lotes de medios en común. Tabla 4. Ejemplo de Validación de una Valoración Biológica con Dos Analistas, Dos Lotes de Medios y Corridas por Nivel para cada Combinación de Analista y Lote Lote de Medios/ Analista
1/1
1/2
2/1
2/2
Corrida
1
2
1
2
1
2
1
2
0,50
0,5215
0,4532
0,5667
0,5054
0,5222
0,5179
0,5314
0,5112
0,50
0,5026
0,4497
0,5581
0,5350
0,5017
0,5077
0,5411
0,5488
0,71
0,7558
0,6689
0,6843
0,7050
0,6991
0,7463
0,6928
0,7400
0,71
0,7082
0,6182
0,8217
0,7143
0,6421
0,6877
0,7688
0,7399
1,00
1,1052
0,9774
1,1527
0,9901
1,0890
1,0314
1,1459
1,0273
1,00
1,1551
0,8774
1,1074
1,0391
0,9233
1,0318
1,1184
1,0730
1,41
1,5220
1,2811
1,5262
1,4476
1,4199
1,3471
1,4662
1,5035
1,41
1,5164
1,3285
1,5584
1,4184
1,4025
1,4255
1,5495
1,5422
2,00
2,3529
1,8883
2,3501
2,2906
2,2402
2,1364
2,3711
2,0420
2,00
2,2307
1,9813
2,4013
2,1725
2,0966
2,1497
2,1708
2,3126
940 (1033) Validación de Valoraciones Biológicas/ Información General
USP 39
2,00;..
"'
1.41-
'i5 Q)
2
>
~
a;
1,ooL
+
D:'.
*
a.
Analista 1
m Analista 2
·¡; e:
_Línea Unitaria
0,71-
. 0,50!-
•
1~
~t
1 o.so
1,41
0,71 Potencia Relativa Conocida
Figura 3. Gráfica de los resultados de la validación en función de los niveles de muestra. Se utiliza una gráfica para revelar cualquier irregularidad en los resultados experimentales. En particular, una gráfica adecuadamente preparada puede revelar una falla en la concordancia de los resultados de la validación con los niveles de validación, así como heterogeneidad de la variabilidad a través de los niveles (ver la discusión sobre transformación logarítmica en la sección 2.7 Consideraciones Estadísticas). La gráfica del ejemplo de la Figura 3 incluye la línea unitaria (línea con una pendiente igual a 1, la cual pasa por el origen). Los datos del analista 1 y del analista 2 se desalinearon deliberadamente con respecto a la potencia esperada para permitir una visualización y comparación claras de los conjuntos de datos obtenidos por cada analista. Se puede llevar a cabo un análisis formal de los datos de validación mediante el siguiente procedimiento: (1) una evaluación de la variabilidad (precisión intermedia) debe preceder a una evaluación de la exactitud o especificidad de la potencia relativa a fin de establecer que se cumple la suposición de que se pueden combinar las varianzas a través de los niveles de muestra; y (2) se evalúa la exactitud relativa en niveles separados o mediante un análisis combinado, dependiendo de qué tan bien se puedan combinar los datos a través de los niveles. Estas etapas se demuestran usando los datos de validación del ejemplo, junto con algunos detalles de los cálculos para propósitos ilustrativos. Debe tomarse en cuenta que los cálculos ilustrados en las secciones siguientes son apropiados únicamente con un conjunto de datos equilibrados. Los diseños o conjuntos de datos sin equilibrar y faltos de mediciones de potencia relativa deben analizarse usando un análisis de modelo mixto con estimación de probabilidad máxima restringida (REML, por sus siglas en inglés).
3.1 Precisión Intermedia Los datos en cada nivel se pueden analizar usando un análisis de componentes de la varianza. Con datos equilibrados, como en el ejemplo actual, se pueden medir los componentes de la varianza a partir de un ANOVA estándar de sentido único. La Tabla 5 presenta un ejemplo del cálculo realizado en un solo nivel (0,50). Tabla 5. Análisis de Componentes de la Varianza Realizado a las Mediciones del Logaritmo de la Potencia Relativa en el Nivel 0,5 Fuente
Suma de Cuadrados
Cuadrado Medio
7
0,055317
0,007902
Var(Error) + 2 Var(Corrida)
Error
8
0,006130
0,000766
Var(Error)
Corregida total
15
0,061447
Corrida
gl*
Cuadrado Medio Esperado
Estimaciones de los Componentes de la Varianza Var(Corrida) = 0,003568 Var(Error) = 0,000766 * gl = grados de libertad
La parte superior de la tabla representa un ANOVA estándar. No han sido incluidos los analistas ni los lotes de medios debido al pequeño número de niveles (2 niveles) para cada factor. El factor "Corrida" en este análisis representa las corridas combinadas a través del analista mediante combinaciones de lotes de medios. El Cuadrado Medio Esperado es la combinación lineal de componentes de la varianza que genera el cuadrado medio (MS, por sus siglas en inglés) para cada fuente. Las estimaciones de componentes de la varianza se derivan solucionando la ecuación "Cuadrado Medio Esperado= Cuadrado Medio" para cada componente. Para comenzar, el cuadrado medio para estimaciones de Error Var(Error), el componente de variabilidad dentro de la corrida, es
USP 39
Información General/ (1033) Validación de Valoraciones Biológicas 941
Var(Error)
= MS(Error) = 0,000766
De manera subsiguiente, se calcula el componente de variabilidad entre corridas, Var(Corrida), estableciendo el cuadrado medio por Corrida con la expresión matemática para el cuadrado medio esperado y, posteriormente, resolviendo la ecuación para Var(Corrida) de la manera siguiente: MS(Corrida) = Var(Error) + 2 · Var( Corrida) Var(Corrida) = MS(Corrida) - MS(Error) =
2 0.007902-0,000766 -0 003568 2 .
Estas estimaciones de los componentes de la varianza se combinan para establecer un valor de 0,50 a la precisión intermedia general de la valoración biológica:
IP = 100. (
e.JV"(Comdo)+2V.,(fooc)
-1
)%
= 100. (e,.I0,003568+0.000766 -1)º/o = 6,8% El mismo análisis se realizó con cada nivel de la validación y se presenta en la Tabla 6. . ' y el Promedio Tbl a a 6. Est mac1ones d e Componentes di e a Va rl anza y Vara lbllldd l de Va lld ac1on a Genera para Ca d a Nlve Nivel
Componente Var(Corrida) Var(Error) General
0,50
0,71
1,00
1,41
2,00
Promedio
0,003568
0,000648
0,003639
0,003135
0,002623
0,002723
0,000766
0,004303
0,002954
0,000577
0.002258
0,002172
6,8%
7,3%
8,5%
6,3%
7,2%
7,2%
Se puede realizar un análisis combinado si los componentes de la varianza son similares a través de los niveles. Por lo general, se emplea el método heurístico para esta evaluación. Es posible mantener el cociente de la varianza máxima y la varianza mínima a un valor no mayor de 1O (se usa 1 O debido al número limitado de corridas realizadas en la validación). En este ejemplo, los cocientes asociados con el componente de la varianza entre corridas, 0,003639/0,000648 = 5,6 y con el componente dentro de la corrida, 0,004303/0,000577 = 7,5, cumple con el criterio de 1O veces. Si el cociente hubiese excedido de 1 O y si se hubiese debido a un exceso de variabilidad en uno o otro de los extremos en los niveles analizados, dicho extremo habría de eliminarse de los análisis adicionales y el intervalo tendría que limitarse para excluir dicho nivel. El análisis puede continuar usando un software estadístico capaz de aplicar un modelo de efectos mezclados a los resultados de la validación. Dicho análisis debe tomar en cuenta cualquier desequilibrio en el diseño, los efectos aleatorios como el analista o el lote de medios y los efectos fijos, tales como cada uno de los niveles (ver la sección 2.7 Consideraciones Estadísticas, Generación de un Modelo para los Resultados de la Validación Usando Modelos de Efectos Mixtos). Los componentes de la varianza se pueden determinar por separado para el analista y el lote de medios a fin de caracterizar sus respectivas contribuciones a la variabilidad general de la valoración biológica. En el ejemplo, se puede obtener el promedio de los componentes de la varianza a través de niveles para informar la precisión intermedia de la valoración biológica. Este método de combinación de estimaciones es exacto únicamente, si un diseño balanceado ha sido empleado en la validación (p.ej., la misma estrategia para determinaciones repetidas en cada nivel). Se empleó un diseño balanceado para el ejemplo de validación, de modo que la precisión intermedia se puede informar como 7,2% GCV. Debido a la recomendación para informar los resultados de la validación con alguna medida de incertidumbre, se puede calcular un límite superior de confianza unilateral de 95% para la precisión intermedia de la valoración biológica. La literatura contiene métodos para calcular los límites de confianza para componentes de la varianza. El límite superior en la precisión intermedia para el ejemplo de valoración biológica es 11,8% GCV. El límite superior de confianza no se calculó por separado en cada nivel debido a la limitación de datos un nivel individual con respecto al diseño general del estudio.
3.2 Exactitud Relativa El análisis puede proceder con una evaluación de la exactitud relativa en cada nivel. La Tabla 7 presenta el promedio y el intervalo de confianza de 90% de los resultados de la validación en la escala logarítmica, así como la potencia correspondiente y el sesgo relativo.
USP 39
942 (1033) Validación de Valoraciones Biológicas / Información General
Tabla 7. Potencia Promedio y Sesgo Relativo en Niveles Individuales Potencia
Logaritmo de Potencia
(90% Intervalo de Confianza)
Sesgo Relativo Promedio
(90% Intervalo de Confianza)
(0,49; 0,54)
3,23%
(-1,02; 7,67)
(0,69; 0,74)
0,06%
(-3,42; 3,67)
4,97%
(0,06; 1o,12)
nª
Promedio
(90% Intervalo de Confianza)
0,50
8
-0,6613
(-0,7034, -0,6192)
0,52
0,71
8
-0,3419
(-0,3773, -0,3064)
0,71
1,00b
8
0,0485
(0,0006, 0,0964)
1,05
(1,00, 1, 10)
1,41
8
0,3723
(0,3331; 0,4115)
1,45
(1,40; 1,51)
2,91%
(-1,04; 7,03)
2,00
8
0,7859
(0,7449; 0,8269)
2,19
(2, 11; 2,29)
9,72%
(5,31; 14,32)
Nivel
ª b
Promedio
Análisis realizado a los promedios de los duplicados de cada corrida. Cálculo ilustrado en la sección 2.7 Consideraciones Estadísticos, Escala del Análisis.
El análisis se ha realizado al promedio de los duplicados de cada corrida (n = 8 corridas) puesto que las mediciones duplicadas se correlacionan dentro de una corrida mediante factores compartidos de precisión intermedia (analista, lote de medios y corrida, para este caso). Se puede usar una gráfica de sesgo relativo contra el nivel para examinar los patrones de los resultados experimentales y para establecer el cumplimiento del criterio de aceptación diana para sesgo relativo (12%).
12%
0%
-1i% 0,50
0,71
1,00
1,41
2,00
Figura 4. Gráfica de intervalos de confianza de 90% para sesgo relativo contra el criterio de aceptación. Tomar en cuenta que el criterio de aceptación inferior es igual a 100·[(l/l,12) - 1] = -11 %. La Figura 4 presenta un sesgo positivo promedio en todos los niveles de muestra (es decir, el sesgo relativo promedio es positivo en todos los niveles). Esta uniformidad se debe en parte a la falta de independencia de los resultados de la valoración biológica en todos los niveles. Asimismo, no parece haber una tendencia en el sesgo relativo en todos los niveles. Esto último indicaría que una comparación de muestras con potencias relativas medidas de manera diferente (por ejemplo, muestras de estabilidad) presenta sesgo, lo que posiblemente podría resultar en una conclusión errónea. El análisis de tendencia se puede llevar a cabo usando una regresión del logaritmo de la potencia relativa en función del logaritmo del nivel. Se puede considerar la introducción de un criterio de aceptación durante el desarrollo de la validación de la valoración biológica para una tendencia en la exactitud relativa a través del intervalo. Después de establecer que no existe una tendencia significativa en todos los niveles, el analista procede a realizar una evaluación de la exactitud relativa en cada nivel. La valoración biológica presenta sesgo relativo aceptable en los niveles que van de 0,50 a 1,41, produciendo límites de confianza de 90% (equivalentes a una prueba t doblemente unilateraO que caen dentro de la región de aceptación de sesgo relativo de -11 % a 12%. El intervalo de confianza de 90% en 2,0 cae fuera de la región de aceptación, lo que indica que el sesgo relativo puede exceder de 12%. Se puede realizar un análisis combinado usando un software estadístico capaz de aplicar un modelo de efectos mixtos a los resultados de la validación. El análisis toma en cuenta exactamente el diseño del estudio de validación. Asimismo, el análisis acomoda los efectos aleatorios tales como analista, lote de medios y corrida (ver la sección 2.7 Consideraciones Estadísticas, Generación de un Modelo para Resultados de Validación Usando Modelos de Efectos Mixtos).
3.3 Intervalo Las conclusiones derivadas de la evaluación de la precisión intermedia y la exactitud relativa se pueden usar para establecer el intervalo de la valoración biológica que demuestra un desempeño satisfactorio. Basándose en el criterio de aceptación para una precisión intermedia igual a 8% GCV (ver la Tabla 6) y para un sesgo relativo igual a 12% (ver la Tabla 1), el intervalo de la valoración biológica es de 0,50 a 1,41. En este intervalo, el nivel 1,0 presenta una estimación ligeramente mayor que la estimación de precisión intermedia (8,5% contra el criterio de aceptación diana :'.'.:8,0%), lo cual se puede deber a la variabilidad de la estimación que resulta de un conjunto de datos pequeño. Debido a lo anterior y a otros resultados de la Tabla 6, se puede concluir que se ha demostrado una precisión intermedia satisfactoria a lo largo del intervalo.
USP 39
Información General/ (1033) Validación de Valoraciones Biológicas 943
3.4 Uso de los Resultados de la Validación para Caracterizar una Valoración Biológica Cuando el estudio se ha realizado para estimar las características de la valoración biológica (caracterización), también se pueden usar las estimaciones de Jos componentes de la varianza para predecir la variabilidad en diferentes formatos de valoración biológica y determinar así un formato con el nivel de precisión deseado. La variabilidad pronosticada para k corridas independientes, con n series de diluciones individuales de la preparación de prueba dentro de una corrida, se proporciona mediante la fórmula siguiente para variabilidad del formato: Variabilidad del Formato= 100. (eWar(Carrida)/k + Var(Error)/(nk) - 1) Usando estimaciones de los componentes de la varianza entre corridas e intracorrida a partir de la Tabla 6 [Var(Corrida) =
0,002723 y Var(Error) = 0,002172], si la valoración biológica se realiza en tres corridas independientes, la variabilidad pronosticada del valor de informe (media geométrica de los resultados de potencia relativa) es igual a: Variabilidad del Formato = 100. ( e-lo,002m13 + 0,00211210
3! -
1) = 4, 1%
Este cálculo se puede expandir para que incluya diversas combinaciones de corridas y conjuntos mínimos (asumiendo que los números de muestras, diluciones y determinaciones repetidas en los conjuntos mínimos se mantengan constantes) dentro de las corridas conforme a lo mostrado en la Tabla 8. Tabla 8. Variabilidad del Formato para Diferentes Combinaciones de Número de Corridas (k) y Número de Conjuntos Mínimos dentro de la Corrida (n) Número de Corridas (k) Determinaciones Repetidas (n)
1
2
3
6
1
7,2%
5,1%
4,1%
2
6,4%
4,5%
3,6%
2,6%
3
6,0%
4,2%
3,4%
2,4%
6
5,7%
4,0%
3,3%
2,3%
2,9%
Resulta claro que el medio más efectivo para reducir la variabilidad del valor de informe (la potencia media geométrica en todas las corridas y conjuntos mínimos) es mediante corridas independientes del procedimiento de la valoración biológica. Asimismo, los límites de confianza para los componentes de la varianza usados para derivar la precisión intermedia se pueden usar para establecer la variabilidad del formato de la valoración biológica. Las fuentes significativas de variabilidad deben incorporarse a corridas para lograr la reducción de la varianza. Un análisis más extenso del ejemplo de validación de la valoración biológica incluiría al analista y al lote de medios en el modelo estadístico. Las estimaciones de los componentes de la varianza obtenidos a partir de dichos análisis se presentan en la Tabla 9. Tabla 9. Estimaciones de Probabilidad Máxima Restringida de los Componentes de la Varianza Asociados con el Analista, el Lote de Medios y la Corrida Varianza
Estimado del Componente
Var(Lote de Medios)
0,0000
Var(Analista)
0,0014
Var(Analista*Lote de Medios)
0,0000
Var(corrida(Analista*Lote de Medios))
0,0019
Var(Error)
0,0022
Idealmente, la identificación del analista como un factor significativo de la valoración biológica se debe tratar durante el desarrollo de la valoración biológica. Sin embargo, el laboratorio puede optar por tratar la contribución aparente de la variabilidad entre analistas mediante capacitación o usando múltiples analistas en el desarrollo del formato de la valoración para el desempeño de rutina de la valoración biológica. Las estimaciones de variabilidad entre corridas e intracorrida también se pueden usar para determinar los tamaños de las diferencias (número de diferencias) que se pueden distinguir entre las muestras analizadas de la valoración biológica. Para k corridas, con n conjuntos mínimos dentro de cada corrida, usando un valor crítico bilateral aproximado, a partir de la distribución normal estándar con z = 2, el número de diferencias críticas entre los valores de informe para dos muestras que se analizan en las mismas corridas de la valoración biológica se proporcionan mediante la fórmula siguiente: Número de Diferencias Críticas= e2 . -lvar(Corrido)/k+Vor(Error)/(nk) Cuando las muestras han sido analizadas en corridas diferentes de la valoración biológica (tales como muestras para estabilidad a largo plazo), el número de diferencias críticas se provee (asumiendo que se usa el mismo formato para analizar las dos series de muestras) mediante: Número de Diferencias Críticas = e2 · ,2 · rvar(Corrida)/k+Var(Error)/(nkJJ
944 (1033) Validación de Valoraciones Biológicas/ Información General
USP 39
Para la comparación de muestras, el laboratorio puede seleccionar un diseño (formato de valoración biológica) que cuente con una precisión adecuada para detectar un número de diferencias significativo entre muestras.
3.5 Confirmación de la Precisión Intermedia y Revalidación La estimación de la precisión intermedia derivada de la validación presenta una alta incertidumbre debido al pequeño número de corridas realizadas. Después de que el laboratorio acumula experiencia adecuada con la valoración biológica, la estimación puede ser confirmada o actualizada mediante el análisis de las mediciones de las muestras de control, tal como la variabilidad de un control positivo. Dicho análisis se puede llevar a cabo con el control preparado y analizado al igual que una muestra de Prueba (es decir, una serie de diluciones y estrategia para determinaciones repetidas idénticas o similares). Esta evaluación se realizará después de haber llevado a cabo suficientes valoraciones para obtener una estimación alternativa de la precisión intermedia de la valoración biológica, incluida la implementación de cambios (p.ej., analistas diferentes, lotes de reactivos claves diferentes y preparaciones celulares diferentes) relacionados con el protocolo de valoración estandarizado. La precisión intermedia de la valoración biológica se debe modificar a manera de enmienda en el informe de validación en caso de que la evaluación revele una disparidad importante de los resultados. La valoración biológica debe revalidarse siempre que se apliquen cambios sustanciales en el método, los cuales incluyen, pero no se limitan a cambios tecnológicos o cambios en la lectura. La revalidación puede constar de una repromulgación total de la validación de la valoración biológica o de un estudio puente que compare los métodos actuales y los modificados.
APÉNDICES Apéndice 1: Medidas de Ubicación y Dispersión para Variables Normalmente Distribuidas en Logaritmos Los procedimientos estadísticos comunes, tales como ANOVA o la estimación del intervalo de confianza, presentan dos suposiciones: (1) la variación en la respuesta de la valoración biológica alrededor de su media está normalmente distribuida y (2) la desviación estándar de los valores de la respuesta observados es constante en un intervalo de respuestas que son de interés. Se dice que dichas respuestas tienen una "distribución normal" y una "estructura de error sumatorio". Cuando no se cumplen estas dos condiciones, podría resultar útil considerar una transformación antes de emplear procedimientos estadísticos comunes. A menudo se determina que la variación en las respuestas de la valoración biológica son anormales (sesgadas hacia valores más altos) con una desviación estándar aproximadamente proporcional (o casi) a la respuesta media. Dichas respuestas por lo regular tienen una "estructura de error multiplicativo" y siguen una "distribución normal logarítmica" con un coeficiente de variación porcentual (%CV) que es constante en todo el intervalo de respuesta de interés. En tales casos, se encontrará que una transformación logarítmica de la respuesta de la valoración biológica es aproximadamente normal con una desviación estándar casi constante en el intervalo de respuesta. Después de aplicar la transformación logarítmica, se cumplen las dos suposiciones y se pueden llevar a cabo procedimientos estadísticos comunes con la respuesta transformada en logaritmos. La siguiente discusión asume una distribución normal logarítmica para la respuesta de la valoración biológica. Esto se refiere a un valor de respuesta de valoración biológica observado, X, que se encuentra en la "escala original de medición" y a una respuesta transformada en logaritmos, Y= log(X), que se encuentra en la "escala transformada en logaritmos". Aunque los procedimientos estadísticos comunes pueden ser apropiados únicamente en la escala transformada en logaritmos, se pueden recopilar las respuestas de la valoración biológica estimando las mediciones de ubicación (p.ej., media o mediana), las mediciones de dispersión (p.ej., desviación estándar) o intervalos de confianza en cualquiera de las escalas de medición, siempre que se indique la escala que se está utilizando. El o/oCV es útil en la escala original cuando es constante en el intervalo de respuesta. Por la misma razón, la desviación estándar (SO, por sus siglas en inglés) es relevante en la escala transformada en logaritmos. Informar los resúmenes estadísticos basándose en la escala transformada en logaritmos (Y) ofrece ventajas. No obstante, a menudo se puede obtener información importante al transformar de nuevo las medidas informadas a su escala original de medición (X). Para cualquier valor dado de X, sólo existe un valor único de Y= log(X), y viceversa. Algo similar ocurre con las mediciones de ubicación y dispersión, en donde existe una correspondencia única entre cada medición de ubicación y dispersión obtenidas en la escala original y transformada en logaritmos. Además, así como existe una relación simple entre X e Y= log(X), existen relaciones simples que permiten la conversión entre las medidas correspondientes de cada escala, según se indica a continuación en la Tabla A-7. En dicha tabla, "Promedio" y "Desviación Estándar", siempre que aparezcan, harán referencia a mediciones calculadas en la escala transformada en logaritmos (Y).
USP 39
Información General/ (1033) Validación de Valoraciones Biológicas 945
Tabla A-1. Comparación de Mediciones de Ubicación y Dispersión Escala de Medición Transformada en Logaritmos (Y)
Medición
Original (X) Media geométrica (GM)
= Ubicación
Media (promedio)
Dispersión
Desviación estándar (SD)
Intervalos de confianza (k es una constante apropiada basada en la distribución t o una aproximación grande de la muestra z) Coeficiente de variación porcentual (o/oCV)
fil
X¡
= ePromedio
i=1
Desviación estándar geométrica (GSD) = eSD
Inferior
Promedio - k . SD/m
GM/GSDk/"'1
Superior
Promedio + k · SD/m
GM · GSDk/"'1
Tamaño
ancho (superior - inferior) = 2 · k · SD/m
Cociente( superior/inferior) = GSD2k/"'1
o/oGCV
= 100 · (GSD -
1)
%CV =100Jeso' -1
<: %GCV
La media geométrica (GM, por sus siglas en inglés) no debe malinterpretarse como una estimación de la media de la variable de la escala original (X), sino que es una estimación de la mediana de X. La mediana es una medición más apropiada de ubicación para variables con distribuciones de error sesgadas tales como las distribuciones normales logarítmicas, así como las distribuciones de error simétricas, donde la mediana es igual a la media. De manera similar, la desviación estándar geométrica (GSD, por sus siglas en inglés) no se debe malinterpretar como la desviación estándar de la variable de la escala original (X). Sin embargo, la desviación estándar geométrica es un factor multiplicativo útil para obtener intervalos de confianza en la escala original (X), que se correspondan con los de la escala transformada en logaritmos (Y), según lo presentado en la tabla anterior. Una desviación estándar geométrica con un valor de 1 corresponde a una ausencia de variación (desviación estándar con un valor de Y= O). El cociente entre los límites de confianza Superior e Inferior, en la escala no transformada (X), será igual a la GSD 2kt"'1, según se aprecia en la Tabla A- 7. El coeficiente de variación geométrica porcentual (%GeV) se aproxima al %eV en la escala original (X) cuando el %eV es menos de 20%. Es importante no confundir estas mediciones de dispersión. El o/oGeV es una medida relevante para la escala transformada en logaritmo (Y) y el o/oeV es una medida relevante para la escala original (X). Dependiendo del marco de referencia preferido, puede ser útil una o incluso ambas mediciones.
Apéndice 2: Fuentes de Información 1. Limpert E, Stahel WA, Abbt M. (2001) Log-normal distributions across the sciences: keys and clues. BioScience 51 (5): 341-252. 2. Kirkwood TBL. (1979) Geometric means and measures of dispersion. Biometrics 35: 908-909. 3. Bohidar NR. (1991) Determination of geometric standard deviation for dissolution. Drug Development and Industrial Pharmacy 17(1 O): 1381-1387. 4. Bohidar NR. (1993) Rebuttal to the "Reply". Drug Development and Industrial Pharmacy 19(3): 397-399. 5. Kirkwood TBL. (1993) Geometric standard deviation-reply to Bohidar. Drug Development and Industrial Pharmacy 19(3): 395-396. 6. (101 O) Datos Analíticos- Interpretación y Tratamiento. USP 34. En: USP34-NF 29. Volúmen 1. Rockville (MD): Farmacopea de los Estados Unidos de América; c201 l. p. 419. 7. Tan eY. (2005) RSD and other variability measures of the lognormal distribution. Pharmacopeial Forum 31 (2): 653-655.
Apéndice 3: Fuentes Adicionales de Información Para información adicional y métodos alternativos, se pueden consultar las referencias citadas a continuación. 1. ASTM. Standard Practice for Using Significant Digits in Test Data to Determine eonformance with Specifications, ASTM E29-08. eonshohocken, PA: ASTM; 2008. 2. Berger R, Hsu J. Bioequivalence trials, intersection-union tests and equivalence confidence intervals. Stat Sci 1996;11 (4): 283-319. 3. Burdick R, Graybill F. Confidence lntervals on Variance Components. New York: Marcel Dekker; 1992:28-39. 4. Haaland P. Experimental Design in Biotechnology. New York: Marcel Dekker; 1989;64-66. 5. Schofield TL. Assay validation. In: ehow se, ed. Encyclopedia of Biopharmaceutical Statistics. 2nd ed. New York: Marcel Dekker; 2003. 6. Schofield TL. Assay development. In: ehow se, ed. Encyclopedia of Biopharmaceutical Statistics. 2nd ed. New York: Marcel Dekker; 2003. 7. Winer B. Statistical Principies in Experimental Design. 2nd ed. New York: McGraw-Hill; 1971 :244-251.
946 (1034) Análisis de Valoraciones Biológicas / Información General
USP 39
(1034) ANÁLISIS DE VALORACIONES BIOLÓGICAS 1. INTRODUCCIÓN Aunque los avances en la caracterización química han reducido el uso de las valoraciones biológicas para valorar muchos productos, éstas continúan siendo esenciales para la determinación de la potencia y para garantizar la actividad de una gran cantidad de proteínas, vacunas, mezclas complejas y productos de terapia celular y génica, además de su importante papel en el seguimiento de la estabilidad de productos biológicos. El capítulo general Análisis de Valoraciones Biológicas (1034) pretende abarcar las pautas para el análisis de los resultados de las valoraciones biológicas descritas en la Farmacopea de los Estados Unidos de América (USP) y de las valoraciones biológicas no pertenecientes a la USP, pero que intentan cumplir con las pautas de calidad de los análisis de valoración biológica recomendados por la USP. Se debe tomar en cuenta que el énfasis del diseño y la validación de los análisis se tratan en los capítulos complementarios (Diseño y Desarrollo de Valoraciones Biológicas (1032) y Validación de Valoraciones Biológicas (1033), respectivamente). Los temas tratados en el capítulo (1034) incluyen conceptos y métodos estadísticos de análisis para el cálculo de la potencia y de los intervalos de confianza para una variedad de valoraciones biológicas de potencia relativa, incluyendo aquéllos citados en la USP. El capítulo (1034) está destinado para su uso principalmente por parte de aquéllos que no cuentan con una capacitación o conocimientos extensos en estadística, así como estadísticos que no cuentan con experiencia en el análisis de valoraciones biológicas. Las secciones que presentan principalmente conceptos requieren una mínima base de conocimiento de estadística. No obstante, la mayor parte del capítulo y todas las secciones de métodos requieren que aquéllos que no sean expertos en estadística posean conocimientos mínimos al nivel tratado en el capítulo general de la USP Datos Analíticos-Interpretación y Tratamiento (101 O) y de regresión lineal. La mayor parte de las secciones 3.4 Modelos No Lineales para Respuestas Cuantitativas y 3.6 Valoraciones Dicótomas (Cuanta/es) requieren una base de conocimiento de estadística más extensa y, por consiguiente, está dirigido principalmente a estadísticos. Asimismo, el capítulo (1034) introduce métodos selectos complejos cuya implementación requiere la guía de un estadístico experimentado. Aunque se reconoce la posibilidad de uso de procedimientos alternativos, se recomienda emplear las metodologías del presente capítulo (1034). Asimismo, la información del capítulo (1034) se presenta asumiendo el uso de computadoras y software adecuado para el análisis de datos. Dicha perspectiva no libera al analista de su responsabilidad ni de las consecuencias relacionadas con la selección del diseño y análisis de una valoración biológica.
2. ASPECTOS GENERALES DEL ANÁLISIS DE LOS DATOS DE LA VALORACIÓN BIOLÓGICA A continuación se presenta una lista de pasos a seguir que ayudarán a guiar el análisis de una valoración biológica. La presente sección asume que se ha utilizado un conjunto de pasos similares en la toma de decisiones durante el desarrollo y posterior verificación durante la validación y por lo tanto, no es necesario seguir estos pasos rutinariamente. Dichas etapas y decisiones se tratan en el capítulo de información general Diseño y Desarrollo de Valoraciones Biológicas (1032). La Sección 3, Modelos de Análisis, ofrece información detallada para los diversos modelos considerados. 1. Como parte del análisis elegido, se debe seleccionar el subconjunto de datos que se utilizará para determinar la potencia relativa, usando el esquema previamente especificado. Se deben excluir únicamente aquellos datos que se sepa provienen de problemas técnicos conocidos, tales como pocillos contaminados, curvas de concentración-respuesta no monotónicas, etc. 2. Es necesario ajustar el modelo estadístico para detectar valores aberrantes potenciales, conforme a lo seleccionado durante el desarrollo, incluyendo cualquier ponderación y transformación. Esto se lleva a cabo primeramente sin asumir similitud alguna entre las curvas de la Prueba y del Estándar, pero se deben incluir elementos importantes de la estructura de diseño, idealmente empleando un modelo que realice menos suposiciones acerca de la naturaleza de la función de la respuesta que el modelo usado para evaluar la similitud. 3. Se debe determinar cuáles de los valores aberrantes potenciales se van a eliminar y se debe ajustar el modelo que se va a emplear para la evaluación de la aptitud. Por lo general, antes de eliminar valores aberrantes, se lleva a cabo una investigación de sus causas. Algunos sistemas de valoración pueden emplear una regla estadística de eliminación de valores aberrantes (no investigativa), aunque la eliminación de valores aberrantes mediante dicho método no debe usarse con regularidad. Una metodología para valores aberrantes "extraños" consiste en seleccionar la regla para valores aberrantes de modo que el número esperado de identificaciones de valores aberrantes falsos positivos no sea mayor de uno; p.ej., utilizar una prueba al 1% si el tamaño de la muestra es aproximadamente 100. Si se encuentra un gran número de valores aberrantes por encima del esperado a partir del uso de la regla, se debe cuestionar inmediatamente la valoración. 4. Se debe evaluar la aptitud del sistema. La aptitud del sistema evalúa si la preparación Estándar de la valoración y cualquier control usado se comportaron de manera uniforme con respecto al desempeño anterior de la valoración. Si una valoración (o una corrida) no cumple con la aptitud del sistema, se debe descartar toda la valoración (o corrida) y no se debe informar ningún resultado excepto la falla de la valoración (o corrida). La evaluación de la aptitud del sistema por lo regular incluye la idoneidad del ajuste del modelo usado para evaluar la similitud. Para los modelos lineales, la idoneidad del modelo puede incluir la evaluación de la linealidad de la curva del Estándar. Si no se cumple el criterio de aptitud para
USP 39
Información General/ (1034) Análisis de Valoraciones Biológicas 947
linealidad del Estándar, la exclusión de una o más concentraciones de los extremos podría resultar en el cumplimiento con dicho criterio. Otros ejemplos de posibles criterios de aptitud del sistema incluyen blanco, controles positivos, máx/ mín, máx/fondo, pendiente, IC 50 (o EC 50) y variación alrededor del modelo ajustado. 5. Se debe evaluar la aptitud de la muestra para cada muestra de Prueba. Esto se hace para confirmar que los datos para cada muestra de Prueba cumplen con las suposiciones necesarias. Si una muestra de Prueba no cumple con la aptitud de la muestra, los resultados de dicha muestra se informan como "No Cumple con la Aptitud de la Muestra". No obstante, aún se pueden informar las potencias relativas para otras muestras de Prueba de la valoración. La similitud es el más prominente de los criterios de aptitud de la muestra, como el paralelismo en modelos paralelos o la equivalencia de las ordenadas al origen para modelos de cociente de pendiente. Para modelos no lineales, la evaluación de la similitud implica todos los parámetros de la curva distintos a EC 50 (o IC 50). 6. Para aquellas muestras de Prueba en la valoración que cumplen con el criterio de similitud con el Estándar (es decir, curvas de concentración-respuesta lo suficientemente similares o subconjuntos de concentraciones lineales similares), se deben calcular las estimaciones de potencia relativa asumiendo la similitud entre la Prueba y el Estándar, es decir, analizando los datos de la Prueba y del Estándar de manera conjunta usando un modelo limitado para tener líneas o curvas exactamente paralelas u ordenadas al origen idénticas. 7. Por lo regular, una sola valoración no es suficiente para obtener un valor de informe, mientras que los resultados de potencia de múltiples valoraciones se pueden combinar en una sola estimación de potencia. Repetir los pasos 1-6 la cantidad de veces especificada en el protocolo de valoración o en la monografía, antes de determinar una estimación final de potencia y un intervalo de confianza. 8. Generar una estimación de la varianza y una medición de incertidumbre de la estimación de potencia (p.ej., intervalo de confianza). Ver la sección 4, Intervalos de Confianza. Un paso no mostrado es el reemplazo de datos faltantes. La metodología estadística y el software más modernos no requieren números iguales en cada combinación de concentración y muestra, por lo que, a menos que se indique algo distinto en la monografía específica, el analista no se verá obligado a reemplazar los valores faltantes.
3. MODELOS DE ANÁLISIS Se puede utilizar con éxito una variedad de funciones matemáticas para describir una relación de concentración-respuesta. La primera consideración tenida en cuenta al seleccionar un modelo es la naturaleza de la respuesta de la valoración. ¿Se refiere a un número, un recuento o a una categoría, como por ejemplo, Vivo/Muerto? La naturaleza identificará los posibles modelos que podrán tomarse en consideración. Las demás consideraciones para la selección de un modelo incluyen la necesidad de incorporar elementos del diseño en el modelo y los posibles beneficios de los modelos de medias en comparación con los modelos de regresión. Con el propósito de presentar los puntos esenciales de las opciones de modelos, la sección 3, Modelos de Análisis asume un diseño completamente aleatorio, de modo que no contempla elementos del diseño, y presenta los modelos en su forma de regresión.
3.1 Respuestas de Valoración Cuantitativas y Cualitativas Los términos cuantitativa y cualitativa se refieren a la naturaleza de la respuesta de valoración usada en la construcción del modelo de concentración-respuesta. Se pueden usar valoraciones con respuestas cuantitativas o cualitativas para cuantificar la potencia del producto. Se debe tomar en cuenta que las respuestas de la valoración en las concentraciones medidas no son la potencia relativa de la valoración biológica. Los analistas deben comprender las diferencias entre respuestas, las funciones de concentración-respuesta y la potencia relativa. Una respuesta cuantitativa produce un número en una escala continua. Los ejemplos comunes incluyen las respuestas espectrofotométricas y de luminiscencia, los pesos y medidas corporales y los datos calculados relativos a la curva estándar (p.ej., concentración de citoquina). Los modelos para respuestas cuantitativas pueden ser lineales o no lineales (ver las secciones 3.23.5). Una medición cualitativa resulta en una respuesta clasificable en categorías. Para la valoración biológica, las respuestas cualitativas son generalmente cuantales, lo que significa que conllevan a dos posibles categorías tales como Positiva/Negativa, 0/1, o Muerto/Vivo. Las respuestas cuantales se pueden informar como proporciones (p.ej., la proporción de animales en un grupo que presentan una propiedad). Los modelos cuantales se presentan en la sección 3.6. Las respuestas cualitativas pueden tener más de dos categorías posibles, tales como las determinaciones de título por punto final. Los modelos para más de dos categorías no se consideran en este capítulo general. Las respuestas de la valoración también pueden ser recuentos, tales como el número de placas o colonias. Las respuestas a manera de recuentos en ocasiones se tratan como cuantitativas, en otras ocasiones como cualitativas y en algunas más se utilizan modelos específicos para números enteros. La selección a menudo se basa en el intervalo de recuentos. Si el recuento es en su mayoría Oy en raras ocasiones es mayor de 1, la valoración se puede analizar como cuantal y la respuesta es Alguna/ Ninguna. Si los recuentos son grandes y abarcan un intervalo amplio, tal como de 500 a 2500, entonces la valoración se puede analizar como cuantitativa, posiblemente después de aplicar una transformación a los recuentos. Para dichos análisis, a menudo resulta útil una transformación cuadrática del recuento, a fin de cumplir de mejor manera con la homogeneidad de las varianzas. Si el intervalo de recuentos incluye o es cercano a O, pero O no es el valor preponderante, puede ser preferible em-
948 (1034) Análisis de Valoraciones Biológicas / Información General
USP 39
plear un modelo específico para las respuestas de números enteros. La regresión de Poisson y los modelos de regresión de binomios negativos representan a menudo buenas opciones. El presente capítulo general no proporciona información adicional sobre modelos específicos para números enteros. Las valoraciones con respuestas cuantitativas se pueden convertir en respuestas cuantales. Por ejemplo, lo que podría importar es definir si se excedió algún umbral definido. Entonces, el modelo podría ser cuantal-de umbral excedido o no. En general, los sistemas de valoración presentan estimaciones más precisas de potencia cuando el modelo emplea toda la información en la respuesta. El uso de un umbral superior o inferior, en lugar de las respuestas cuantitativas medidas, podría subestimar el desempeño de una valoración.
3.2 Generalidades de los Modelos para Respuestas Cuantitativas En las valoraciones cuantitativas, la medición es un número en una escala continua. Los valores de densidad óptica obtenidos en las valoraciones basadas en placas son dichas mediciones. Los modelos para valoraciones cuantitativas pueden ser lineales o no lineales. Aunque ambos presentan una diferencia aparente en los niveles de complejidad, los modelos de líneas paralelas (lineales) y de curvas paralelas (no lineales) comparten muchos aspectos en común. Debido a la forma diferente de sus ecuaciones, las valoraciones de cociente de pendiente se consideran por separado (sección 3.5 Modelos de Concentración-Res-
puesta de Cociente de Pendientes). Suposiciones-Los modelos básicos de líneas paralelas, curvas paralelas y cociente de pendiente comparten algunas suposiciones. Todos incluyen un término residual, e, que representa el error (variabilidad), el cual se asume que es independiente de medición a medición y que tiene una varianza constante de concentración a concentración y de muestra a muestra. A menudo, se asume que el término residual también sigue una distribución normal. Las suposiciones de independencia e igualdad de varianzas a menudo se infringen, por lo que el objetivo del análisis es incorporar la falta de independencia y la desigualdad de las varianzas en el modelo estadístico o en el método de estimación. A menudo, la falta de independencia surge a causa del diseño o la realización de la valoración. Por ejemplo, si la valoración consiste en respuestas obtenidas de múltiples placas, es probable que las observaciones de la misma placa compartan alguna influencia en común que no se comparte con las observaciones de otras placas. Éste es un ejemplo de correlación intraplacas. Una metodología simple para tratar esta falta de independencia es incluir un término de bloque en el modelo estadístico para placas. Con tres o más placas, éste debe ser un término de efectos aleatorios de modo que se obtenga una estimación de la variabilidad entre placas. En general, el modelo debe reflejar en detalle el diseño. Las ecuaciones básicas del modelo provistas en las secciones 3.3-3.5 se aplican únicamente a diseños completamente aleatorizados. Cualquier otro diseño requerirá términos adicionales en el modelo estadístico. Por ejemplo, si las placas o porciones de las placas se usan como bloques, serán necesarios los términos para bloques. Cálculo de la Potencia-Una suposición primaria subyacente de los métodos que se usan para el cálculo de la potencia relativa es la suposición de la similitud. Dos preparaciones son similares si contienen el mismo componente efectivo o los mismos componentes efectivos en las mismas proporciones. Si esta condición se mantiene, la preparación de Prueba se comporta como una dilución (o concentración) de la preparación Estándar. La similitud se puede representar matemáticamente de la manera siguiente: FT es la función de concentración-respuesta para la Prueba y F5 es la función de concentración-respuesta para el Estándar. El modelo matemático subyacente para la similitud es: [3.1] donde z representa la concentración y p representa la potencia relativa de la muestra de Prueba con respecto a la muestra Estándar. Los métodos para estimar p en algunos de los modelos de concentración-respuesta comunes se analizan más adelante. Para modelos lineales, la distinción entre modelos de líneas paralelas (sección 3.3 Modelos de Líneas Paralelas para Respuestas Cuantitativas) y modelos de cociente de pendiente (sección 3.5 Modelos de Concentración-Respuesta de Cociente de Pendientes) se basa en si ajustar las líneas rectas al logaritmo de concentración o a la concentración generará un mayor alineamiento entre el modelo y los datos en un intervalo de concentraciones de interés.
3.3 Modelos de Líneas Paralelas para Respuestas Cuantitativas En esta sección, un modelo lineal se refiere a una relación de concentración-respuesta. El logaritmo de la concentración, x, y la respuesta, y, sigue una función de línea recta (lineal). y puede ser la respuesta en la escala conforme se mida o una transformación de la respuesta. La forma funcional de esta relación es y= a + bx. Los ajustes de líneas rectas se pueden usar para porciones de las curvas de concentración-respuesta no lineales, aunque esto requiere de un método para seleccionar las concentraciones a usar para cada una de las muestras de Prueba y Estándar (ver el capítulo general (1032)). Modelo de Medias contra Regresión-Un modelo lineal de concentración-respuesta casi siempre se analiza mediante la regresión de cuadrados mínimos. Dicho análisis genera estimaciones de los coeficientes desconocidos (ordenadas al origen y pendiente) y sus errores estándar, así como mediciones de la aptitud del ajuste [p.ej., R2 y error cuadrático medio (RMSE, por sus siglas en inglés)].
USP 39
Información General/ (1034) Análisis de Valoraciones Biológicas 949
La regresión lineal funciona mejor cuando se pueden usar todas las concentraciones y existe una curvatura inapreciable en los datos de concentración-respuesta. Otro método estadístico para analizar las curvas de concentración-respuesta lineales es el modelo de medias. Éste es un método de análisis de varianza (ANOVA, por sus siglas en inglés) que ofrece algunas ventajas, particularmente cuando no se usan una o más concentraciones de una o más muestras para estimar la potencia. Puesto que el modelo de medias incluye una media distinta para cada combinación única de muestra y dosis (así como un bloque u otros efectos asociados con la estructura del diseño) es equivalente a un modelo de regresión polinómica saturado. Por consiguiente, un modelo de medias provee una estimación del error que es independiente de la falta de ajuste de la regresión. Por el contrario, una estimación de error basada en la regresión residual es una mezcla del error de la valoración, según se estima en el modelo de medias, combinada con la falta de ajuste del modelo de regresión. Al menos en este sentido, el error del modelo de medias es una mejor estimación de la variación del error residual en el sistema de valoración. Modelos de Concentración-Respuesta de Líneas Paralelas-Si el modelo general de concentración-respuesta (3.1 Respuestas de Valoración Cuantitativas y Cualitativas) se puede hacer lineal en x = log(z), entonces la ecuación resultante es: y = a + jJ log(z) + e = a + jJ x + e, donde e es el residuo o término de error y la intersección, a, y la pendiente, jJ, diferirán entre la Prueba y el Estándar. Con la suposición de paralelismo (pendientes iguales), el modelo se vuelve Ys = a+
/3 log(z) +e= a 5 + j3 x +e [3.2]
YT =a+ j3 log(pz) +e= [a+ j3 log(p)] + j3 x +e= ªT + j3 x +e,
donde S es el Estándar, T es la Prueba, a 5 = a es la ordenada al origen para el Estándar y aT = a + fJ log(p) es la ordenada al origen para la Prueba (ver la Figura 3.1).
~---·
, .·'
. ,
stándar -
Prueba
log 10 de la Concentración
Figura 3.1. Ejemplo de un modelo de líneas paralelas. Cuando las líneas de concentración-respuesta son paralelas, según se muestra en la Figura 3.1, una separación o desplazamiento horizontal indica una diferencia en el nivel de actividad biológica que se está valorando. Esta diferencia horizontal es numéricamente log(p), el logaritmo de la potencia relativa, y se encuentra como la distancia vertical entre las líneas aT y a 5 dividida por la pendiente, jJ. La potencia relativa es entonces
p
p=antilog ( a -a ) Estimación de Modelos de Líneas Paralelas-Los modelos de líneas paralelas se ajustan usando el método de cuadrados mínimos. Si se mantiene la suposición de varianzas iguales, se seleccionan los parámetros de la ecuación [3.2] para minimizar
[3.3] donde los acentos circunflejos representan estimaciones. Ésta es una regresión lineal con dos variables independientes, T y x, donde T es una variable que es igual a 1 para observaciones a partir de la Prueba y O para observaciones a partir del Estándar. La sumatoria en la ecuación [3.3] es para todas las observaciones de la Prueba y del Estándar. Si la suposición de varianzas iguales no se mantiene, pero se sabe que la varianza es inversamente proporcional a un valor, w, que no depende de las respuestas en curso, es decir, las y, y se puede determinar para cada observación, entonces el método se pondera con cuadrados mínimos [3.4] La ecuación 3.4 es apropiada únicamente si las ponderaciones se determinan sin usar la respuesta, es decir las y, de los datos en curso (ver el capítulo (1032) para pautas para la determinación de ponderaciones). En las ecuaciones [3.3] y [3.4] fJ es igual que la fJ de la ecuación [3.2] y ó = aT - a 5 = jJ log p. Por tanto, la estimación de la potencia relativa, p, es
950 (1034) Análisis de Valoraciones Biológicas/ Información General
USP 39
p=antilog(%) El software estadístico y las hojas de cálculo comúnmente disponibles ofrecen rutinas para cuadrados mínimos. No todo el software disponible puede proveer análisis ponderados. Ver la sección 4 para información sobre métodos para obtener un intervalo de confianza para la potencia relativa estimada. Para un intervalo de confianza basado en la combinación de las estimaciones de la potencia relativa de múltiples valoraciones, se deben usar los métodos de lq s~cción 4.2. Para un intervalo de confianza a partir de una sola valoración, usar el Teorema de Fieller (sección 4.3) aplicado a ó I /J. Medición de Falta de Paralelismo-El paralelismo para modelos lineales se evalúa considerando la diferencia o el cociente de las dos pendientes. Para la diferencia, esto se puede llevar a cabo ajustando el modelo de regresión, y= a 5 + cST + fJ 5x + yxT +e donde cS = aT - a 5, y= fJ T - fJ 5, y T = 1 para los datos de Prueba y T = O para los datos del Estándar. Posteriormente, se emplea el intervalo de confianza de distribución t estándar para y. Para el cociente de las pendientes, se ajusta y = a 5 + cST + fJ 5x(l - T) + fJ TxT + e y se usa el Teorema de Fieller, ecuación [4.3], para obtener un intervalo de confianza para fJ TIfJ s·
3.4 Modelos No Lineales para Respuestas Cuantitativas Los modelos no lineales de concentración-respuesta son, por lo regular, funciones con forma de S y se presentan cuando el intervalo de concentraciones es lo suficientemente amplio como para que las respuestas sean limitadas por asíntotas superiores e inferiores. El más común de estos modelos es la función logística de cuatro parámetros provista a continuación. y representa la respuesta observada, mientras que z denota la concentración. Una forma del modelo logístico de cuatro parámetros es
A-D 1+(t)
y=D+--8 +e
[3.5]
Una forma alternativa, pero equivalente, es y=a + 0
d +e 1+antilog [M(logz-b)]
Las dos formas se corresponden de la manera siguiente: Asíntota inferior: D = a0 Asíntota superior: A= a0 + d Pendiente: B = M (en relación con la pendiente de la curva en el EC 50 ) Concentración efectiva al 50% (EC 50): C = antilog(b) (también se puede denominar ED 50 ). Resulta adecuada cualquier base logarítmica conveniente; a menudo conviene trabajar con logaritmo en base 2, en particular cuando las concentraciones están en serie duplicativa. La curva logística de cuatro parámetros es simétrica al rededor del EC 50 cuando se grafica en función del logaritmo de concentración, debido a que las velocidades de acercamiento de las asíntotas superior e inferior son las mismas (ver la Figura 3.2). Para valoraciones en las que no se mantiene dicha simetría, se podrían aplicar las funciones del modelo asimétrico. Estos modelos no se analizan en mayor medida en este capítulo general.
log 10 de la Concentración
Figura 3.2. Ejemplos de sigmoides simétricos (logísticos de cuatro parámetros) y asimétricos. En muchos casos, el analista tiene que tomar algunas decisiones estratégicas durante el desarrollo de la valoración (ver Diseño y Desarrollo de Valoraciones Biológicas (1032)). Por ejemplo, las respuestas se pueden transformar y ajustar a un modelo de curva logística de cuatro parámetros o se pueden ponderar y ajustar a una curva sigmoidea asimétrica. Asimismo, a menudo
USP 39
Información General/ (1034) Análisis de Valoraciones Biológicas 951
resulta importante incluir términos en el modelo (por lo general efectos aleatorios) para tratar la variación en las respuestas (o parámetros de la respuesta) asociados con bloques o unidades experimentales en el diseño de la valoración. Para valoraciones simples en las que las observaciones son independientes, estas decisiones estratégicas son bastante sencillas. Para valoraciones realizadas con diluciones agrupadas (como en el caso de pipetas multicanal), valoraciones con diluciones en serie o diseños de valoración que incluyen bloques (como en el caso de múltiples placas por valoración), ignorar la estructura del diseño a menudo se considera una violación seria de las suposiciones estadísticas. Para dichas valoraciones, una buena metodología implica una transformación que aproxime una solución a una varianza no constante, a una falta de normalidad y a una asimetría, combinada con un modelo que capture las partes importantes de la estructura del diseño. Modelos de Concentración-Respuesta de Curvas Paralelas-El concepto de paralelismo no se restringe a modelos lineales. Para curvas no lineales, paralelas o medias similares, las curvas de concentración-respuesta se pueden superponer siguiendo un desplazamiento horizontal de una de las curvas, según se muestra en la Figura 3.3 para curvas logísticas de cuatro parámetros. En términos de los parámetros de la ecuación [3.5], esto significa que los valores de A, D y B para la Prueba son los mismos que para el Estándar.
log 10 de la Concentración
Figura 3.3. Ejemplo de curvas paralelas de un modelo no lineal. Las ecuaciones correspondientes a la figura (con el término de error, e, agregado) son
A-D 1+(t) A-D
Ys=D+--s +e Yr =D+---s +e
1+(~)
o Ys=D+ Yr=D+
A-D
[ ]+e 1+ antilog M(logz-b)
A-D 1+ antilog [M(logz-b + logp )]
+e
Log pes el logaritmo de la potencia relativa y la distancia horizontal entre las dos curvas, al igual que para el modelo de líneas paralelas. Puesto que el EC 50 del estándar es antilog(b) y el de la Prueba es antilog(b - log p) = antilog(b)/p, la potencia relativa es el cociente de EC 50 (estándar sobre Prueba) cuando se mantiene el modelo de curvas paralelas. Estimación del Modelo de Curvas Paralelas-La estimación de modelos de curvas paralelas no lineales es similar a la de los modelos de líneas paralelas, posiblemente después de la transformación de la respuesta y posiblemente con la ponderación. Para el modelo logístico de cuatro parámetros, las estimaciones de los parámetros se determinan minimizando: 2
I
[
y-D
.A.-6
]
1+antilog [ríil(logz-b+iT)]
sin ponderación, o 2
""' [ ¿W y-0-
A-6 .
. 1+ antilog [ M(log z-b +
]
iT) J
[3.6]
con ponderación. (Al igual que para la ecuación [3.4], la ecuación [3.6] es apropiada únicamente si las ponderaciones se determinan sin usar las respuestas, es decir las y, de los datos en curso.) En cualquiera de los casos, la estimación de res la estimación del logaritmo de la potencia relativa. Para algunos paquetes de software, podría ser más fácil trabajar con d =A - D. Los parámetros de la función logística de cuatro parámetros y aquéllos de los modelos sigmoideos asimétricos no son posibles de calcular mediante rutinas de regresión de cuadrados mínimos ordinarias (lineales). Se deben usar programas informáticos con técnicas de estimación no lineales.
952 (1034) Análisis de Valoraciones Biológicas / Información General
USP 39
Los analistas no deben usar el ajuste de regresión no lineal para evaluar el paralelismo o estimar Ja potencia si se presenta alguno de Jos siguientes casos: a) se dispone de información inadecuada sobre las asíntotas; o b) una comparación de Jos errores combinados de una regresión no lineal con los errores combinados de un modelo de medias determina que el modelo no lineal no se ajusta de manera adecuada; o c) otras medidas apropiadas de aptitud del ajuste determinan que el modelo no lineal no es apropiado (p.ej., las gráficas de residuos presentan evidencia de un "gancho"). Ver Ja sección 4 para información sobre métodos para obtener un intervalo de confianza para la potencia relativa estimada. Para un intervalo de confianza basado en la combinación de las estimaciones de la potencia relativa de múltiples valoraciones, se deben usar los métodos de la sección 4.2. Para un intervalo de confianza de una sola valoración, se requieren técnicas avanzadas, tales como perfiles de probabilidad o método de remuestreo (bootstrapping), para obtener un intervalo de confianza para el logaritmo de Ja potencia relativa, r. Medición de Falta de Paralelismo-Evaluar el paralelismo de un modelo logístico de cuatro parámetros significa evaluar el parámetro de Ja pendiente y las dos asíntotas. Durante el desarrollo (ver el capítulo (1032)), se debe tomar una decisión con respecto a qué parámetros son importantes y la forma en que se medirá la falta de paralelismo. Tal como se analiza en el capítulo (1032), Ja medida de falta de similitud puede ser una medida compuesta que considere todos los parámetros juntos en una sola medición, tal como Ja suma de cuadrados de paralelismo (ver el capítulo (1032)), o se puede considerar cada parámetro por separado. En el último caso, Ja medida puede consistir en funciones de los parámetros, tal como una asíntota dividida por la diferencia de asíntotas o el cociente de las asíntotas. Para cada parámetro (o función de parámetros), los intervalos de confianza se pueden calcular mediante métodos de remuestreo o de perfil de probabilidad. Dichos métodos no se presentan en este capítulo general.
3.5 Modelos de Concentración-Respuesta de Cociente de Pendientes Cuando una regresión lineal se ajusta bien a Jos datos de concentración-respuesta no transformados, se puede usar un modelo de cociente de pendientes. Las ecuaciones para el modelo de cociente de pendientes cuando se asume la similitud son: Ys = a + P z + e = a + P 5z + e [3.7] Yr = a + P (pz) + e = a + P sPZ + e = a + P rZ + e
Una característica que identifica el modelo de concentración-respuesta de cociente de pendientes, la cual se puede observar en los resultados de un estudio de intervalos, es que las líneas para diferentes potencias de un estudio de intervalos tienen la misma ordenada al origen y diferentes pendientes. Por consiguiente, una gráfica para el estudio de intervalos tiene forma de abanico. La Figura 3.4 presenta un ejemplo de un modelo de concentración-respuesta de cociente de pendientes. Se debe tomar en cuenta que la ordenada al origen común no necesariamente está en el origen.
Figura 3.4. Ejemplo de un modelo de cociente de pendientes. Una valoración con un modelo de concentración-respuesta de cociente de pendientes para medir la potencia relativa consta, como mínimo, de una muestra Estándar y una muestra de Prueba, cada una medida en una o más concentraciones y, por lo general, una respuesta medida sin muestra (concentración cero). Debido a que las concentraciones no se transforman en logaritmos, a menudo se espacian equitativamente sobre la escala original, en lugar de la escala logarítmica. El modelo consiste en una ordenada al origen común, una pendiente para los resultados de la muestra de Prueba y una pendiente para los resultados de la muestra Estándar como en la ecuación [3.7]. La potencia relativa se determina entonces a partir del cociente de las pendientes: Potencia Relativa= Pendiente de la muestra de Prueba/Pendiente de Ja muestra Estándar= /3 p/fJ = p Suposiciones y Estimación para Modelos de Cociente de Pendientes-Las suposiciones para el modelo de cociente de pendientes son las mismas que para los modelos de líneas paralelas: Los términos residuales son independientes, tienen una varianza constante y podría ser necesario que tuvieran una distribución normal. El método de estimación también es el de cuadrados mínimos. Esto se puede implementar con o sin ponderación, según se demuestra en las ecuaciones [3.8] y [3.9], respectivamente.
USP 39
Información General/ (1034) Análisis de Valoraciones Biológicas 953
[3.8] [3.9]
La ecuación [3.9] es apropiada únicamente si las ponderaciones se determinan sin usar la respuesta, es decir las y, de los datos en curso. Ésta es una regresión lineal con dos variables independientes, z(l - T) y zT, donde T = 1 para los datos de la Prueba, y T = O para los datos del Estándar. ¡J, es la pendiente estimada para la Prueba, /Js es la pendiente estimada para el Estándar y, por tanto, la estimación de la potencia relativa es
Puesto que el modelo de cociente de pendiente es un modelo de regresión lineal, se pueden usar la mayoría de los programas estadísticos y hojas de cálculo para obtener la estimación de la potencia relativa. En algunos sistemas de valoración, en ocasiones resulta apropiado omitir la concentración cero (p.ej., si los controles sin dosis se manejan de manera distinta en la valoración) y algunas veces una o más de las concentraciones altas (p.ej., si existe un efecto de gancho en el que las concentraciones más altas no contienen las respuestas más altas). La discusión sobre el uso de un modelo de medias y la selección de subconjuntos de concentraciones para valoraciones biológicas de líneas rectas paralelas se aplica también a las valoraciones de cociente de pendientes. Ver la sección 4 para información sobre métodos para obtener un intervalo de confianza para la potencia relativa estimada. Para un intervalo de confianza basado en la combinación de las estimaciones de la potencia relativa de múltiples valoraciones, se deben usar los métodos de la sección 4.2. Para un intervalo de confianza a partir de una sola valoración, usar el Teorema de Fieller (sección 4.3) aplicado a
firt Ps Medición de Falta de Similitud-Para modelos de cociente de pendientes, la similitud estadística corresponde a ordenadas al origen iguales para el Estándar y la Prueba. Para evaluar la suposición de similitud, es necesario contar con al menos dos concentraciones diferentes a cero para cada muestra. Si las ordenadas al origen no son iguales, la ecuación [3.7] se convierte en
Ys = ªs + /3 sz + e Yr = ªr + /3 rZ + e
Las desviaciones de la similitud a menudo se miden mediante la diferencia de las ordenadas al origen, fácil de obtener un intervalo de confianza es ajustar el modelo,
ªr - a 5 • Una manera
y =a 5 + 8T + fJ 5z(l - T) + fJ rZT + e, donde 8 = aT - a 5 y usar para 8 el intervalo de confianza estándar basado en la distribución t.
3.6 Valoraciones Dicótomas (Cuantales) Para valoraciones cuantales, la medición de la valoración tiene un resultado dicotómico o binario, p.ej., en valoraciones con animales, el animal está muerto o vivo, o se puede observar o no cierta respuesta fisiológica. Para valoraciones celulares, la respuesta cuantal puede relacionarse con la aparición o no de una respuesta más allá de algún umbral en la célula. En una titulación viral basada en células o en valoraciones de formación de colonias, la respuesta cuanta! puede ser un límite de respuesta en número entero, como por ejemplo un número entero de partículas o colonias. Cuando es posible determinar fácilmente la presencia de algunas partículas-pero no su número real-entonces la valoración se puede analizar como cuantal. Cabe tomar en cuenta que si la reacción se puede cuantificar en una escala continua, por ejemplo, con una densidad óptica, entonces la valoración no es cuantal. Modelos Para Análisis Cuanta/es-la clave para los modelos de respuestas cuantales es trabajar con la probabilidad de una respuesta (p.ej., probabilidad de muerte), al contrario de las respuesta cuantitativas en las que el modelo es para la respuesta misma. Para cada concentración, z, un animal tratado, por ejemplo, tiene una probabilidad de responder a dicha concentración, P(z). A menudo, la curva P(z) se puede aproximar a una curva sigmoidea cuando se grafica en función del logaritmo de concentración, según se muestra en la Figura 3.5. Esta curva muestra que la probabilidad de respuesta se incrementa con la concentración. La concentración que corresponde a una probabilidad de 0,5 es el EC 50 •
USP 39
954 (1034) Análisis de Valoraciones Biológicas/ Información General
,75 "O
"'
"O
;¡¡ e
,50
'1.
,25
2i
log 10 de la Concentración
Figura 3.5. Ejemplo de curva sigmoidea para P(z). El modelo de la curva sigmoidea a menudo se genera basándose en la distribución normal o en la distribución logística. Si se emplea la distribución normal, el análisis resultante se denomina análisis de probitas, y si se emplea la distribución logística, el análisis se denomina análisis logit o logístico. Los modelos de probitas y logit son prácticamente indistinguibles, por lo que cualquiera representa una opción aceptable. La selección de uno u otro se puede basar en la disponibilidad de software que satisfaga las necesidades de análisis e informe del laboratorio. Debido a que los modelos logísticos cuentan con una disponibilidad de software mayor (a menudo denominado de regresión logística) la presente discusión se enfocará en el uso e interpretación del análisis logit. Las consideraciones discutidas en esta sección para el análisis logit (usando una transformación logística) también se aplican a los análisis de probitas (usando una transformación con probitas). Modelo Logit-EI modelo logit para la probabilidad de respuesta, P(z), se puede expresar en dos formas equivalentes. Para la cruva sigmoidea, P(z)=
1 1+anti log
[-/30 -/31 log(z)]
1
donde log(ED 50 ) = - fJ 0 / fJ 1 • Una forma alternativa presenta la relación con los modelos lineales: Transformación logit deP =
log(~) =/3 +/3 log(z) 1-P 0
1
[3. 10]
La forma lineal a menudo se presenta usando logaritmos naturales y es útil recordar que muchas de las consideraciones, en particular la linealidad y el paralelismo, analizadas para los modelos de líneas paralelas en la sección 3.3 Modelos de Líneas Paralelas para Respuestas Cuantitativas también se aplican a los modelos cuantales. Para un análisis logit con preparaciones Estándar y de Prueba, T representa una variable que toma el valor 1 para animales que reciben la preparación de Prueba y O para animales que reciben el Estándar. Entonces, asumiendo el paralelismo de las curvas de Prueba y Estándar, el modelo logit para estimar la potencia relativa es: log (~) = f3 0 + /3, log(z) + /3, T
1-P
El logaritmo de la potencia relativa de la Prueba en comparación con la preparación Estándar es, por lo tanto, fJ iffJ ,. Las dos curvas de la Figura 3.6 son sigmoideas paralelas del Estándar y de la Prueba. (Si se presentaran las formas lineales correspondientes de la ecuación [3.1 O], éstas serían dos líneas rectas paralelas.) El logaritmo de la potencia relativa es la distancia horizontal entre las dos curvas, de la misma forma que para los modelos lineales y logísticos de cuatro parámetros provistos para respuestas cuantitativas (secciones 3.3 Modelos de Líneas Paralelas para Respuestas Cuantitativas y 3.4 Modelos No Lineales para Respuestas Cuantitativas).
,75 "O
"' .e e"' '2 :;:¡ '1.
,50 ,25
10910 de la Concentración
Figura 3.6. Ejemplo de Curvas Sigmoideas Paralelas. Estimación de Jos Parámetros del Modelo y de la Potencia Relativa-Se encuentran disponibles dos métodos para estimar los parámetros de los modelos logit y de probitas: la probabilidad máxima y los cuadrados mínimos ponderados. La diferencia no tiene importancia práctica y el laboratorio puede aceptar la selección realizada por el software. Lo siguiente asume un programa de software de regresión logística general. El software especializado debe ser similar.
USP 39
Información General/ (1034) Análisis de Valoraciones Biológicas 955
Tomando en cuenta la forma de la ecuación [3.10], se observa una similitud con la regresión lineal. Existen dos variables independientes, x = log(z) y T. Para cada animal, existe una variable dependiente sí/no, para la que a menudo se usa el código 1 para sí o respuesta y O para no o sin respuesta. Aunque las valoraciones biológicas a menudo se diseñan con números iguales de animales por concentración, esto no es un requisito de análisis. Utilizando los parámetros estimados por el software, los cuales incluyen jJ 0 , jJ 1 y jJ 2 y sus errores estándar, se obtiene la estimación del logaritmo natural de la potencia relativa: Estimación del logaritmo de la potencia relativa =
~2 /31
Ver la sección 4 para información sobre métodos para obtener un intervalo de confianza para la potencia relativa estimada. Para un intervalo de confianza basado en la combinación de las estimaciones de la potencia relativa de múltiples valoraciones, se deben usar los métodos de lq, se(:ción 4.2. Para un intervalo de confianza a partir de una sola valoración, usar el Teorema de Fieller (sección 4.3) aplicado a /32 f /31. El intervalo de confianza para la potencia relativa es, por lo tanto [antilog(L), antilog(U)], donde [L, U] es el intervalo de confianza para el logaritmo de la potencia relativa. Suposiciones-Las suposiciones para los modelos cuantales tienen dos partes. La primera se relaciona con las suposiciones subyacentes con respecto a la probabilidad de respuesta de cada animal o unidad en la valoración biológica. Éstas son suposiciones difíciles de verificar que dependen del diseño de la valoración. La segunda parte concierne a las suposiciones para el modelo estadístico para P(z). Las más importantes de éstas son el paralelismo y la linealidad. Estas suposiciones se pueden verificar de buena manera al igual que los análisis de líneas paralelas para respuestas cuantitativas. En la mayoría de los casos, los análisis cuantales asumen un modelo de probabilidad binómico estándar, que es una selección común para la distribución de datos dicotómicos. Las suposiciones claves del binomio se basan en que a una concentración dada, cada animal tratado a dicha concentración, tiene la misma probabilidad de responder y los resultados para cualquier animal son independientes de los de los otros animales. Este conjunto básico de suposiciones se puede infringir de muchas maneras. La más destacada de éstas es la presencia de efectos de la camada, donde los animales de la misma camada tienden a presentar una respuesta más parecida entre ellos que los animales de diferentes camadas. Los efectos de la jaula, en los que las condiciones ambientales o el cuidado dado a cualquier jaula específica hace que los animales de dicha jaula sean más o menos propensos a responder al tratamiento experimental, violan las suposiciones de idéntica probabilidad y de independencia. Estas violaciones de las suposiciones y otras similares (que podrían ser una selección deliberada del diseño) no impiden el uso de modelos logit o de probitas. No obstante, son indicaciones de que podría requerirse una metodología más compleja para el análisis que la presentada en este capítulo (ver el capítulo (1032)). Verificación de las Suposiciones-El modelo estadístico para P(z) asume linealidad y paralelismo. Para evaluar el paralelismo, se puede modificar la ecuación [3.1 O] de la manera siguiente:
log(~) =/30 +[3 log(z) +[32 T +/3 T * log(z) 1-P 1
3
En este caso, jJ 3 es la diferencia de pendientes entre la Prueba y el Estándar y debe ser lo suficientemente pequeña. [El término T*log(z) se conoce como un término de interacción en la terminología estadística.] La medición de falta de paralelismo también se puede expresar en términos del cociente de las pendientes, (/3 1 + j3 3 )/ jJ 1 • Para intervalos de confianza basados en modelos para estas mediciones de falta de paralelismo, se recomiendan los métodos de remuestreo o de probabilidad del perfil. Dichos métodos no se presentan en este capítulo general. Para evaluar la linealidad, resulta una buena práctica comenzar con un examen gráfico. De acuerdo con la ecuación [3.1 O], ésta sería una gráfica de log[(y + 0,5)/(n - y+ 0,5)] en función del log(concentración), donde y es el número total de respuestas en la concentración y n es el número de animales en dicha concentración. (Las correcciones 0,5 mejoran las propiedades de este cálculo como una estimación de log[P/(1 - P)].) Las líneas para el Estándar y la Prueba deben ser líneas rectas paralelas, al igual que en el modelo lineal en valoraciones cuantitativas. Si la relación es monotónica pero no parece ser lineal, entonces el modelo de [3.1 O] se puede expandir con otros términos. Por ejemplo, se puede agregar un término cuadrático en log(concentración): [log(concentración)]2. Si fuera necesario transformar la concentración en algo distinto del logaritmo de la concentración, entonces el análogo del modelo cuantal de las valoraciones de cociente de pendientes es una opción. Esto último es posible; sin embargo, debido a que no se usa con frecuencia, no se analizará en mayor profundidad en el presente capítulo general. Valores Aberrantes-La evaluación de valores aberrantes es más difícil en las valoraciones cuantales que en las valoraciones cuantitativas. Debido a que la respuesta de la valoración sólo puede ser sí o no, ninguna respuesta individual puede ser inusual. Lo que parece caer dentro de la categoría de valor aberrante es una sola respuesta a una concentración baja o una sola falta de respuesta a una concentración alta. Asumiendo que no se ha encontrado ninguna causa (p.ej., incapacidad de administrar adecuadamente el fármaco al animal), no existe fundamento estadístico para distinguir un valor aberrante de un evento extraño. Métodos Alternativos-Se pueden aceptar alternativas a los análisis cuantales simples aquí descritos, dependiendo de la naturaleza del desafío analítico. Uno de esos desafíos es la falta de independencia entre unidades experimentales, según se puede apreciar en los efectos de la camada en valoraciones con animales. Algunas de las metodologías que se pueden emplear son las Ecuaciones de Estimación Generalizadas (GEE, por sus siglas en inglés), los modelos lineales generalizados y los modelos de
956 (1034) Análisis de Valoraciones Biológicas/ Información General
USP 39
efectos mixtos lineales generalizados. Un Análisis con Ecuaciones de Estimación Generalizadas producirá errores estándar e intervalos de confianza cuya validez no dependerá del cumplimiento de la suposición de independencia. Además, existen métodos que no realizan ninguna elección particular de la ecuación del modelo para la curva sigmoidea. Un ejemplo que se aprecia comúnmente es el método Spearman-Karber.
4. INTERVALOS DE CONFIANZA El informe del resultado de una valoración debe incluir una medición de la incertidumbre de dicho resultado. Esto es, a menudo, un error estándar o un intervalo de confianza. Un intervalo (e, d), en el que e es el límite de confianza inferior y des el límite de confianza superior, es un intervalo de confianza de 95% para un parámetro (p.ej., la potencia relativa) si el 95% de tales intervalos al repetir el experimento incluyeron el valor real del parámetro. Un intervalo de confianza se puede interpretar como valores indicativos del parámetro que son uniformes con respecto a los datos. Esta interpretación de un intervalo de confianza requiere satisfacer diversas suposiciones. Las suposiciones también deben cumplirse cuando en una monografía se utiliza el ancho o el ancho medio [(d-c)/2] como una medida para determinar si existe la precisión adecuada para informar una potencia. El ancho del intervalo en ocasiones se emplea como un criterio de aptitud sin la interpretación de confianza. En tales casos, no es necesario cumplir con las suposiciones. Los intervalos de confianza pueden ser basados en modelos o basados en muestras. Un intervalo basado en modelos se basa en los errores estándar para cada una o más de las estimaciones del logaritmo de la potencia relativa que provienen del análisis de un modelo estadístico particular. Los intervalos basados en modelos no deberán usarse cuando sea posible utilizar intervalos basados en muestras. Los intervalos basados en modelos requieren que el modelo estadístico incorpore correctamente todos los efectos y correlaciones que influencian la estimación de precisión del modelo. Éstos incluyen, pero no se limitan a diluciones en serie y efectos de placa. La sección 4.3 Métodos Basados en Modelos describe el Teorema de Fieller, un intervalo basado en modelo de uso común. Los métodos basados en muestras combinan estimaciones independientes del logaritmo de la potencia relativa. Pueden surgir múltiples valoraciones debido a que la necesidad de dicho método se determinó durante el desarrollo y la validación, o debido a que el procedimiento de valoración fija un ancho máximo aceptable del intervalo de confianza y podrían ser necesarias dos o más valoraciones independientes para cumplir con el requisito de ancho específico. Algunos métodos basados en muestras no requieren que el modelo estadístico incorpore correctamente todos los efectos y correlaciones. No obstante, esto no debe interpretarse como un descarte del valor de tratar las correlaciones y demás factores que influencian la precisión dentro de la valoración. La precisión dentro de la valoración se emplea en la evaluación de la similitud y es una porción de la variabilidad, la cual es el fundamento para los intervalos basados en muestras. Por lo tanto, es importante minimizar la variabilidad dentro de la valoración hasta donde resulte práctico. Los intervalos basados en muestras se discuten en la sección 4.2 Combinación de Valoraciones Independientes (Métodos para Intervalos de Confianza Basados en Muestras).
4.1 Combinación de Resultados de Múltiples Valoraciones A fin de mitigar los efectos de la variabilidad, resulta adecuado llevar a cabo determinaciones repetidas de valoraciones biológicas independientes y combinar sus resultados para obtener un valor de informe único. Posteriormente, dicho valor de informe único (y no los resultados individuales de la valoración) se compara con cualquier criterio de aceptación aplicable. Durante el desarrollo y validación de la valoración, los analistas deben evaluar si sería útil combinar los resultados de dichas valoraciones y, en caso afirmativo, la forma en que se va a proceder. Existen dos preguntas principales que se deben tratar cuando se considera la forma de combinar los resultados de múltiples valoraciones: ¿Son mutuamente independientes las valoraciones? Un conjunto de valoraciones se puede considerar mutuamente independiente cuando las respuestas de alguna de éstas no depende en ninguna forma de la distribución de las respuestas de las valoraciones restantes. Esto implica que los errores aleatorios en todos los factores esenciales que influencian el resultado (por ejemplo, diluciones del estándar y de la preparación que se va a examinar o la sensibilidad del indicador biológico) en una valoración debe ser independiente de los errores aleatorios correspondientes de las otras valoraciones. Por consiguiente, las valoraciones en días sucesivos que emplean las diluciones originales y reservadas del Estándar no son valoraciones independientes. De manera similar, si las respuestas, en particular la potencia, dependen de otros reactivos compartidos por las valoraciones (p.ej., preparaciones celulares), las valoraciones podrían no ser independientes. Las valoraciones no necesitan ser independientes para que los analistas combinen los resultados. Sin embargo, los métodos para valoraciones independientes son mucho más simples. Asimismo, combinar resultados de valoraciones dependientes puede requerir suposiciones sobre la forma de la correlación entre los resultados de las valoraciones que, en el mejor de los casos, podrían ser difíciles de verificar. Existen métodos estadísticos disponibles para valoraciones dependientes, aunque no se presentan en este capítulo general. ¿Son homogéneos los resultados de las valoraciones? Los resultados homogéneos sólo presentan diferencias debidas a errores aleatorios dentro de las valoraciones. Cualquier contribución de factores asociados con la precisión intermedia impide la homogeneidad de los resultados. Los factores de precisión intermedia son aquéllos que varían entre las valoraciones dentro de un laboratorio y pueden incluir analistas,
Información General/ (1034) Análisis de Valoraciones Biológicas 957
USP 39
equipo y condiciones ambientales. Existen pruebas estadísticas para heterogeneidad, pero la falta de heterogeneidad estadísticamente significativa no se toma como una garantía de homogeneidad, por lo que no se recomienda prueba alguna. Si los analistas emplean un método que supone la homogeneidad, ésta debe ser evaluada durante el desarrollo, documentada durante la validación y monitoreada durante el uso continuo de la valoración. Además, antes de que se puedan combinar los resultados de las valoraciones, los analistas deben considerar la escala en la que se llevará a cabo dicha combinación. En general, la combinación se debe realizar usando la escala en la que las estimaciones de parámetros se distribuyen aproximadamente de manera normal. Así, para las potencias relativas basadas en un método de líneas paralelas, de curvas paralelas o cuanta!, las potencias relativas se combinan en la escala logarítmica.
4.2 Combinación de Valoraciones Independientes (Métodos para Intervalos de Confianza Basados en Muestras) Los analistas pueden usar diversos métodos para combinar los resultados de valoraciones independientes. Un método simple descrito a continuación (Método 1) asume una distribución común de las potencias relativas en todas las valoraciones, por lo que es un método recomendable. Asimismo, se proporciona un segundo procedimiento que puede ser útil si se puede documentar la homogeneidad de la potencia relativa en todas las valoraciones. Se ofrece una tercera alternativa que puede ser útil si no se cumplen las suposiciones para los Métodos 1 y 2. La alternativa de analizar todas las valoraciones juntas usando un modelo de efectos mixtos lineal o no lineal no se discute en este capítulo general. Método 7-Resultados de Valoraciones Independientes a partir de una Distribución de Valoraciones Común-El siguiente es un método simple que asume la independencia de las valoraciones. Se asume que los resultados de la valoración individual (logaritmos de las potencias relativas) se derivan de una distribución normal común con algo de varianza diferente a cero. Esta suposición de distribución común requiere que todas las valoraciones que se van a combinar hayan usado el mismo diseño y procedimientos de laboratorio. Queda implícito que las potencias relativas pueden diferir entre las valoraciones. Por lo tanto, este método captura la variabilidad entre valoraciones con respecto a la potencia relativa. Se debe tomar en cuenta que las potencias relativas individuales no deben redondearse antes de combinar los resultados. Suponiendo que R; es el logaritmo de la potencia relativa de la im• valoración de N resultados de valoraciones que se van a combinar. Para combinar los N resultados, la media, la desviación estándar y el error estándar de la R; se calculan de la manera usual: N
Media
R = L R/N i=1
Desviación Estándar S = - 1-I(R, -R) 2 N-1 i=1 Error Estándar SE= SI .JN Posteriormente, se determina un intervalo de confianza del 100(1 - a)% como
R± tN -l,u/2SE, donde tN - i,a;2 es el punto porcentual superi~r a/2 de una distribución t con N - 1 grados de libertad. La cantidad tN- i,a;2 SE es la incertidumbre expandida de R. El número, N, de valoraciones que se van a combinar es, por lo general, pequeño, y, por consiguiente, el valor de tes a menudo grande. Puesto que los resultados se combinan en la escala logarítmica, el resultado combinado se puede informar en la escala sin transformar como un intervalo de confianza para la potencia media geométrica, estimada mediante antilog(R), antilog
(R- tN-
1,a 12
SE ), antilog
(R ± tN-
1,cx 12
SE)
Método 2-Resultados de Valoraciones Independientes y Suposición de Homogeneidad-Este método se puede usar siempre que se cumplan las siguientes condiciones: (1) Las estimaciones de potencia individual forman un conjunto homogéneo con respecto a la potencia que se está estimando. Se debe tomar en cuenta que esto significa documentar (a menudo durante el desarrollo y la validación) que los factores de precisión intermedia no contribuyen a la variabilidad entre valoraciones. Los resultados individuales deben parecer uniformes con respecto a la homogeneidad. En particular, las diferencias entre éstos debe ser uniforme con respecto a sus errores estándar. (2) Las estimaciones de potencia se derivan de valoraciones independientes. (3) El número de grados de libertad de los errores residuales individuales no es pequeño. Esto es necesario para determinar de manera adecuada todas las ponderaciones. Cuando no se cumplen estas condiciones, no es posible aplicar este método, por lo que deberá usarse el Método 1, el Método 3 o algún otro método. Además, se debe tomar en cuenta que el Método 2 (debido a que asume la ausencia de variabilidad entre valoraciones) a menudo resulta en intervalos de confianza más estrechos que el Método 1, pero esto no es justificación suficiente para usar el Método 2 ante la falta de cumplimiento de las condiciones citadas anteriormente.
958 (1034) Análisis de Valoraciones Biológicas/ Información General
USP 39
Cálculo de Coeficientes de Ponderación-Se asume que los resultados de cada una de las N valoraciones han sido analizados para proporcionar N estimaciones del logaritmo de potencia con límites de confianza asociados. Para cada valoración, i, el intervalo logarítmico de confianza para el logaritmo de potencia o el logaritmo de la potencia relativa y un valor L; se obtienen restando el límite de confianza inferior del límite de confianza superior. (Esta fórmula, usando el L;, acomoda intervalos de confianza asimétricos tales como el Teorema de Fieller, sección 4.3 Métodos Basados en Modelos). Un peso W; para cada valor del logaritmo de la potencia relativa, R;, se calcula de la manera siguiente, donde t; tiene el mismo valor que el usado en el cálculo de los límites de confianza en la im• valoración:
w = 4t~ ,
[4.1]
L~
Cálculo de la Media Ponderada y de los Límites de Confianza-Los productos W;R; se forman para cada valoración y su suma se divide por el peso total para todas las valoraciones para proporcionar el logaritmo de la potencia relativa media ponderada y su error estándar de la manera siguiente:
Media R=
N
N
i=1
i=1
"f.W;R/'f.W;
Error Estándar SE= 1/
~tw;
Posteriormente, se determina un intervalo de confianza del 100(1 - a)% en la escala logarítmica como [4.2] donde tk,a/z es el punto porcentual superior a/2 de una distribución t con grados de libertad, k, igual a la suma del número de grados de libertad para el error de cuadrados medios en las valoraciones individuales. Posteriormente, este intervalo de confianza puede transformarse nuevamente a la escala original, al igual que en el Método 1 , Método 3-Resultados de Valoraciones Independientes Sin la Suposición de una Distribución de Valoraciones Común-El Método 3 es un método aproximado que se puede considerar cuando no se cumplen las condiciones del Método 1 (distribución de valoraciones común) o el Método 2 (homogeneidad). La variación observada tiene entonces dos componentes: • la variación intravaloración para la valoración i: 5 12 =1/W,
• la variación entre valoraciones: 2
1 ~' N-1 1= 1 •
-. 2
f
1 N ='
2
Ss=-.L.IR,-Rj --.L.S,
Posteriormente, se calcula un coeficiente de ponderación para cada valoración como
W'-
1
' - s~ +s~
el cual reemplaza W; en la ecuación [ 4.1] y donde t en la ecuación [ 4.2] a menudo se aproxima mediante el valor 2.
4.3 Métodos Basados en Modelos Muchos intervalos de confianza son del tipo: Intervalo de confianza =valor± k veces el error estándar de dicho valor. Para tales casos, siempre que se pueda determinar fácilmente el multiplicador k (p.ej., a partir de una tabla de distribución t), informar el error estándar e informar el intervalo de confianza serán altamente equivalentes, puesto que se podrá determinar fácilmente el intervalo de confianza a partir del error estándar. No obstante, los logaritmos de las potencias relativas para modelos de líneas paralelas y algunas parametrizaciones de modelos no lineales, así como las potencias relativas de los modelos de cocientes de pendientes, son cocientes. En tales casos, los intervalos de confianza no son simétricos alrededor del logaritmo de la potencia relativa o de la potencia estimadas, por lo que se requiere el Teorema de Fieller. Para estos casos asimétricos, se debe informar el intervalo de confianza, puesto que el error estándar por sí mismo, no captura la asimetría. El Teorema de Fieller es la fórmula para el intervalo de confianza para un cociente. Suponiendo que R = a/b es el cociente para el que se requiere un intervalo de confianza. Para las estimaciones de a y b, se cuenta con sus respectivos errores estándar, SE. y SEb, y con una covarianza entre ellos, denominada Cov. (La covarianza es una medición del grado de relación de las estimaciones de a y b, y es proporcional a la correlación entre las estimaciones de a y b.) La covarianza puede ser O, al igual
USP 39
Información General/ (1035) Indicadores Biológicos para Esterilización 959
que para algunas parametrizaciones de análisis de líneas paralelas estándares, aunque no es un requisito. Posteriormente, el intervalo de confianza para R es según se indica a continuación:
l
• gCov t . • • gCov 2 { R-- -±= (1-g)SE~ +R 2 sE;-2RCov+--2-J SE: b SEb
(R,,Ru)=~---------------~
1-g
en donde t2SE~
9=---py tes el valor desviado apropiado de t que dependerá del tamaño de la muestra y del nivel de confianza seleccionado (por lo general 95%). Si g > 1, esto significa que el denominador, 6, no presenta una diferencia estadísticamente significativa a O y el uso del cociente no es sensible para dichos datos. Para aquellos casos en los que las estimaciones de a y b no guardan una correlación estadística (Cov = O), la fórmula del intervalo de confianza se simplifica a
{F'u ~~(1- g)sE: + R 2 SE~}
(RL,Ru)=~------~
[4.3]
1-g
5. FUENTES ADICIONALES DE INFORMACIÓN Se pueden usar una variedad de métodos estadísticos para analizar los datos de las valoraciones biológicas. Este capítulo presenta diversos métodos, pero también se pueden emplear muchos otros métodos similares. Es posible encontrar información adicional, así como procedimientos alternativos en las referencias citadas a continuación y en otras fuentes. 1. Bliss CI. The Statistics of Bioassay. New York: Academic Press; 1952. 2. Bliss CI. Analysis of the biological assays in U.S.P. XV. Drug Stand. l 956;24:33-67. 3. Bohrer A. One-sided and two-sided critica! values for Dixon's outlier test for sample sizes up to n = 30. Econ Quality Control. 2008;23:5-l 3. 4. Brown F, Mire-Sluis A, eds. The Design and Analysis of Potency Assays for Biotechnology Products. New York: Karger; 2002. 5. Callahan JD, Sajjadi NC. Testing the null hypothesis for a specified difference-the right way to test for parallelism. Bioprocessing f. 2003:2;71-78. 6. Delean A, Munson PJ, Rodbard D. Simultaneous analysis of families of sigmoidal curves: application to bioassay, radioligand assay, and physiological dose-response curves. Am j Physiol. l 978;235:E97-El 02. 7. European Directorate for the Quality of Medicines. European Pharmacopoeia, Chapter 5.3, Statistical Analysis. Strasburg, France: EDQM; 2004:473507. 8. Finney DJ. Probit Analysis. 3rd ed. Cambridge: Cambridge University Press; 1971. 9. Finney DJ. Statistical Method in Biological Assay. 3rd ed. London: Griffin; 1978. 1O. Govindarajulu Z. Statistical Techniques in Bioassay. 2nd ed. New York: Karger; 2001. 11. Hauck WW, Capen RC, Callahan JD, et al. Assessing parallelism prior to determining relative potency. PDA j Pharm Sci Technol. 2005;59:127-137. 12. Hewitt W. Microbiological Assay for Pharmaceutical Analysis: A Rational Approach. New York: lnterpharm/CRC; 2004. 13. Higgins KM, Davidian M, Chew G, Burge H. The effect of serial dilution error on calibration inference in immunoassay. Biometrics. l 998;54:19-32. 14. Hurlbert, SH. Pseudo replication and the design of ecological field experiments. Ecological Monogr. l 984;54:187-211. 15. lglewicz B, Hoaglin DC. How to Detect and Handle Outliers. Milwaukee, WI: Quality Press; 1993. 16. Nelder JA, Wedderburn RWM. Generalized linear models. j Royal Statistical Soc, Series A. l 972;135:370-384. 17. Rorabacher DB. Statistical treatment for rejection of deviant values: critica! values of Dixon's "Q" parameter and related subrange ratios at the 95% confidence level. Anal Chem. 1991 ;63:39-48.
(1035) INDICADORES BIOLÓGICOS PARA ESTERILIZACIÓN En términos generales, un indicador biológico se define como una preparación caracterizada de microorganismos específicos resistentes a un proceso específico de esterilización. Los microorganismos ampliamente reconocidos como indicadores biológicos adecuados son las bacterias formadoras de esporas, debido a que estos microorganismos son mucho más resistentes que la microflora normal frente a la mayoría de los procesos de esterilización, excepto los que emplean radiaciones ionizantes. Un indicador biológico se puede utilizar en la calificación del desempeño de un equipo de esterilización, y en el desarrollo y establecimiento de un proceso de esterilización validado para un artículo específico. Los indicadores biológicos se emplean en procesos que dan como resultado un producto estéril en su empaque o envase final, al igual que en la esterilización de equipos,
960 (1035) Indicadores Biológicos para Esterilización/ Información General
USP 39
materiales y componentes de envases que se utilizan en procesos asépticos. También se pueden utilizar indicadores biológicos para controlar ciclos de esterilización establecidos y en revalidaciones periódicas de procesos de esterilización. Además, se pueden usar indicadores biológicos para evaluar la capacidad de procesos empleados para descontaminar aisladores o ambientes asépticos de cuartos limpios. Los principios y requisitos de estas aplicaciones se describen en Esterilización y Garantía de Esterilidad de Artículos Farmacopeicos (1211 ).
TIPOS DE INDICADORES BIOLÓGICOS Hay al menos tres tipos de indicadores biológicos. Cada tipo de indicador incorpora una especie conocida de un microorganismo con resistencia conocida a una forma específica de esterilización. Algunos indicadores biológicos también pueden contener dos especies diferentes de microorganismos en concentraciones distintas. Una forma de indicador biológico consiste en esporas que se disponen sobre un transportador (un disco o tira de papel de filtro, vidrio, plástico u otro material) y se envasa de manera que se mantenga la integridad y viabilidad del transportador inoculado. Los transportadores y los envases primarios no deben tener ningún tipo de contaminación (física, química ni microbiana) que afecte de manera adversa el desempeño ni las características de estabilidad del indicador biológico. El proceso específico de esterilización no debe degradar al transportador ni al envase primario, pero se debe usar de manera que afecte el desarrollo del indicador biológico. El transportador debe resistir el transporte en el envase primario y secundario y la manipulación en el lugar de uso. El diseño del transportador y del envase primario debe reducir al mínimo la pérdida del inóculo original durante el transporte, la manipulación y la vida útil durante el almacenamiento. Otra forma de indicador biológico es una suspensión de esporas que se inocula a unidades representativas del producto que se va a esterilizar. Esto constituye un producto inoculado; aunque también se puede inocular un producto simulado si no resulta práctico inocular el producto real. Un producto simulado es una preparación que difiere en uno o varios aspectos del producto real, pero que se comporta como el producto real en condiciones de prueba o durante el proceso real de esterilización del producto. Se deben usar suspensiones de esporas con un valor D conocido para inocular el producto real o simulado. Si se usa un producto simulado, se debe demostrar que dicho producto no disminuirá la resistencia a la esterilización del indicador biológico. El diseño físico del producto real o simulado puede tener influencia sobre la resistencia de las suspensiones de esporas inoculadas. En el caso de productos líquidos inoculados, con frecuencia es conveniente determinar el valor D y el valor z del microorganismo indicador específico en el producto líquido específico. Se debe determinar la población, el valor D, el valor z cuando corresponda, y el tiempo de muerte final del producto real o simulado. Una tercera forma de indicador biológico es un indicador autocontenido. Un indicador autocontenido está diseñado para incubar el envase primario luego del proceso de esterilización, y contiene el medio de crecimiento para la recuperación de los microorganismos expuestos al proceso. Esta forma de indicador biológico, junto con el medio de cultivo autocontenido, se pueden considerar un sistema. En el caso de indicadores biológicos autocontenidos, todo el sistema ofrece resistencia al proceso de esterilización. Si el indicador biológico es una tira de papel o un disco en un envase autocontenido que incluye un medio de cultivo, el envase debe estar diseñado para ser fácilmente penetrable por el agente esterilizante. Para considerar la demora del agente esterilizante en llegar a los microorganismos contenidos en el sistema, se debe caracterizar el valor D, el tiempo de muerte final del proceso y el tiempo de supervivencia para todo el sistema y no solamente para la tira de papel en la unidad autocontenida. Después del tratamiento de esterilización, se manipula el sistema para sumergir la tira o disco de papel con las esporas en el medio de cultivo autocontenido y lograr el contacto entre ambos. Los indicadores biológicos autocontenidos además pueden constar de una suspensión de esporas en su propio medio y con frecuencia también contienen un colorante para indicar si hubo crecimiento positivo o negativo después de la incubación. La resistencia del sistema autocontenido depende de la penetración del agente esterilizante en el envase. El fabricante puede regular la penetración variando los diseños y la composición del envase, ampolla o recipiente del indicador biológico autocontenido. Los indicadores biológicos autocontenidos en ampollas se pueden incubar directamente después de haberse expuesto al proceso de esterilización. Después se incuba todo el sistema en las condiciones especificadas. El crecimiento o la ausencia de crecimiento de las esporas tratadas se determina visualmente (ya sea mediante un cambio de color específico de un indicador incorporado al medio o por turbidez) o mediante el examen microscópico del medio inoculado. Las características de resistencia del sistema autocontenido también deben cumplir con lo establecido en la etiqueta del sistema autocontenido y en la monografía referente al indicador biológico pertinente. El sistema de indicador biológico autocontenido debe soportar el transporte en el envase secundario y la manipulación en el lugar de uso sin romperse. El sistema autocontenido se debe diseñar para disminuir al mínimo la pérdida del inóculo original de microorganismos durante el transporte y la manipulación. Durante o después del proceso de esterilización, los materiales utilizados en el sistema autocontenido no deben retener ni liberar ninguna sustancia que pueda inhibir el crecimiento de un bajo número de microorganismos indicadores supervivientes en el cultivo. Se deben tomar las medidas adecuadas para demostrar que el medio de recuperación ha conservado las características que sustentan el crecimiento después de la exposición al proceso de esterilización.
USP 39
Información General/ (1035) Indicadores Biológicos para Esterilización 961
Preparación Todas las operaciones vinculadas a la preparación de indicadores biológicos se controlan mediante un sistema de calidad documentado. Se mantiene la rastreabilidad de todos los materiales y componentes incorporados o que entran en contacto directo con la suspensión de microorganismos, el transportador inoculado o el indicador biológico. La preparación de suspensiones madre de esporas de los microorganismos seleccionados que se emplean como indicadores biológicos requiere el desarrollo de procedimientos adecuados, entre los que se incluyen cultivos en masa, recolección, purificación y conservación de las suspensiones de esporas. La suspensión madre debe contener principalmente esporas latentes (no germinativas) que se mantienen en un líquido no nutritivo. El producto terminado (suspensión microbiana, transportadores inoculados o indicadores biológicos) suministrado por los fabricantes para uso comercial no debe tener otros microorganismos diferentes a los microorganismos de prueba, en un número tal que afecte al producto de manera adversa. Se debe validar, monitorear y registrar el sistema usado para reducir al mínimo la presencia en el producto de microorganismos distintos de los que constituyen el indicador biológico.
Selección de Indicadores para Procesos de Esterilización Específicos La selección de un indicador biológico requiere el conocimiento de la resistencia del sistema indicador biológico con respecto al proceso de esterilización específico. Se debe establecer que el sistema indicador biológico ofrece una mayor resistencia al proceso de esterilización que la correspondiente a la carga microbiana natural presente en el producto. El uso eficaz de indicadores biológicos en el ciclo de desarrollo, proceso y validación del producto y en el control de la producción de rutina de un proceso de esterilización requiere un profundo conocimiento del producto que se va a esterilizar y de sus componentes (materiales y envase). En el desarrollo o la validación de un proceso de esterilización sólo se deben usar los indicadores biológicos ampliamente reconocidos en la monografía del indicador biológico específico. Esto garantizará que el indicador biológico seleccionado represente un desafío mayor para el proceso de esterilización que la biocarga presente en el producto. Es posible que algunos usuarios necesiten indicadores biológicos con características que difieran de las que poseen los que están disponibles comercialmente. En dichos casos, los usuarios pueden desarrollar sus propios cultivos de esporas con el propósito expreso de preparar indicadores biológicos para su uso interno específico. En dicho caso, se aconsejará al usuario que utilice microorganismos ya descritos en publicaciones científicas como microorganismos indicadores y el usuario debe tener la capacidad de determinar los valores D y z de los indicadores biológicos de uso interno. Cuando los indicadores biológicos se preparan internamente, los usuarios deben confirmar la población, la pureza y la vida útil del indicador biológico para asegurar la validez de cualquier prueba que se lleve a cabo con el indicador interno. Cuando se emplea un diseño de un proceso de esterilización basado en la biocarga, son esenciales los datos que comparan la resistencia del indicador biológico con la resistencia de la biocarga. Además, se requiere el recuento del contenido de la biocarga de los artículos que se esterilizan. El proceso puede dar como resultado una letalidad verificada desde el punto de vista biológico suficiente para lograr que la probabilidad de obtener una unidad no estéril sea menos de una en un millón. Como alternativa, se puede usar el método de sobremuerte en el diseño de un proceso de esterilización. En este caso, se hacen presunciones específicas con respecto a la resistencia presupuesta al establecer los requisitos de letalidad del proceso de esterilización. En general, todos los procesos de sobremuerte se elaboran basándose en la suposición de que la biocarga es igual a un millón de microorganismos y que los microorganismos son muy resistentes. En consecuencia, para lograr la probabilidad requerida de una unidad no estéril menor de uno en un millón, se necesita como mínimo un proceso 12 D. Un proceso 12 D se define como un proceso lo suficientemente letal como para provocar una reducción de 12 unidades logarítmicas, lo que equivale a 12 veces un valor D para microorganismos con una resistencia suficientemente más alta que la resistencia media de la biocarga. Puesto que se da por sentado que la biocarga es un millón, en la práctica real, un proceso de sobremuerte dará como resultado una probabilidad de no esterilidad mucho menor de 10-6 • El diseño y la evaluación del proceso de sobremuerte pueden diferir según el proceso de esterilización en análisis. El uso de un diseño de sobremuerte y un enfoque de validación pueden minimizar o evitar la necesidad del recuento e identificación de la biocarga. CALOR HÚMEDO En procesos de esterilización por calor húmedo, con frecuencia se utilizan esporas de cepas adecuadas de Bacillus stearothermophilus que están disponibles comercialmente como indicadores biológicos. También se han utilizado otros microorganismos formadores de esporas, resistentes al calor, como Clostridium sporogenes, Bacil/us subtilis y Bacillus coagulans en el desarrollo y validación de procesos de esterilización por calor húmedo. CALOR SECO En la esterilización por calor seco, algunas veces se emplean esporas de Bacillus subtilis spp. para validar el proceso. Durante la validación de los procesos de esterilización por calor seco, frecuentemente se llevan a cabo estudios de despirogenación de endotoxinas en lugar de estudios de inactivación microbiana durante el establecimiento de ciclos de esterilización, debido a que la inactivación de las endotoxinas es más difícil que la velocidad de inactivación de las esporas de Bacillus subtilis. En la
962 (1035) Indicadores Biológicos para Esterilización / Información General
USP 39
práctica, una reducción del título de endotoxinas en tres o más unidades logarítmicas dará como resultado un proceso que logra una probabilidad de no esterilidad mucho menor de 10-6 • RADIACIÓN IONIZANTE Las esporas de Bacillus pumilus se han usado para controlar los procesos de esterilización que emplean radiación ionizante; sin embargo, esta práctica se está abandonando. Para establecer procesos de radiación se han utilizado ampliamente métodos de ajuste de dosis de radiación que no usan indicadores biológicos. Además, ciertos microorganismos de la biocarga pueden presentar mayor resistencia a la radiación que Bacillus pumilus. ÓXIDO DE ETILENO En la esterilización por óxido de etileno, habitualmente se emplean esporas de una subespecie de Bacillus subtilis (Bacillus subtilis var. niger). Generalmente se emplean los mismos sistemas indicadores biológicos para la esterilización por óxido de etileno al 100% y para sistemas de óxido de etileno con un gas transportador. PERÓXIDO DE HIDRÓGENO EN FASE DE VAPOR (VPHP, POR SUS SIGLAS EN INGLÉS) Este proceso ha demostrado ser eficaz para esterilizar o descontaminar superficies. El VPHP puede lograr la esterilización (probabilidad de no esterilidad menor de uno en un millón) cuando las condiciones del proceso así lo requieran y si el objeto de la esterilización está adecuadamente configurado. Sin embargo, el VPHP también se emplea habitualmente como agente descontaminante de superficies en el tratamiento de pruebas de esterilidad, contención química y biológica, fabricación de aisladores y cuartos limpios. La descontaminación de superficies es un proceso distinto de la esterilización de materiales que entran en contacto con el producto, sistemas de envase-cierre o producto. Es un proceso ideado para dejar un entorno libre de microorganismos detectables o recuperables. Los indicadores biológicos se utilizan frecuentemente para verificar la eficacia del proceso de descontaminación. Sin embargo, en el caso de la descontaminación, un valor de tres a cuatro unidades de reducción logarítmica de esporas es adecuado, porque el objetivo es la descontaminación más que la esterilización. Tabla 1. Características Típicas de Sistemas de Indicadores Biológicos Suministrados Comercialmente
Modo de Esterilización Calor secoª
Ejemplo de valor D Típico (minutos) 1,9
160º
Intervalo de valores D para Seleccionar un Indicador Biológico Adecuado (minutos)
Límites de Resistencia Adecuada (dependlendo del valor D específico [minutos]) Tiempo de Supervivencia
Tiempo de Muerte
Mín.1,0
Mín. 4,0
10,0
Máx. 3,0
Máx. 14,0
32,0
Óxido de etilenob 600 mg por L
3,5
54º
Mín. 2,5
Mín. 10,0
25,0
Máx. 5,8
Máx. 27,0
68,0
60% de humedad relativa Calor húmedoc
1,9
121 o
Mín. 1,5
Mín. 4,5
13,5
Máx. 3,0
Máx. 14,0
32,0
ª
Para 1,0 x 106 a 5,0 x 106 esporas por transportador. b Para 1,0 x 10 6 a 5,0 x 10 7 esporas por transportador. e Para 1,0 x 105 a 5,0 x 106 esporas por transportador.
Bacillus stearothermophilus es el indicador biológico más utilizado para validar el proceso VPHP. Otros microorganismos que pueden resultar útiles como indicadores biológicos en procesos VPHP son las esporas de Bacilfus subtilis y Clostridium sporogenes. Se pueden considerar otros microorganismos si sus reacciones al VPHP son similares a las de los microorganismos citados anteriormente. Estas esporas se pueden inocular en la superficie de varios sistemas transportadores impermeables a los gases cuyas superficies sean de vidrio, metal o plástico. Las superficies muy absorbentes, como por ejemplo los sustratos fibrosos o cualquier otro sustrato que absorba fácilmente VPHP o humedad, pueden influir de manera adversa sobre la concentración de VPHP disponible para inactivar los microorganismos inoculados. No se usan sustratos de papel porque el VPHP degrada los materiales que contienen celulosa. Para conocer las características representativas de indicadores biológicos disponibles comercialmente, ver la Tabla 1. El indicador biológico también puede estar envasado individualmente en un envase primario envuelto adecuadamente para que no afecte de manera adversa el resultado del indicador y sea penetrable por VPHP. Se ha demostrado que los materiales de poliolefina hilados son adecuados para envolver indicadores biológicos destinados a la evaluación de procesos VPHP. El material de envoltura puede facilitar la manipulación de los indicadores biológicos en el laboratorio después de la exposición a VPHP. Además, se debe evaluar cuidadosamente el material de envoltura, para asegurar que no queden residuos de peróxido
USP 39
Información General/ (1035) Indicadores Biológicos para Esterilización 963
de hidrógeno en el material del envase después de la exposición a VPHP, lo que posiblemente induciría una bacteriostasis durante los pasos de recuperación. Los valores D microbiológicos se verán influidos en cuanto a la velocidad de inactivación por la presencia del material de envoltura del indicador biológico y la posible presencia de residuos de VPHP. En los casos en que se empleen indicadores biológicos (transportadores inoculados) sin el envase primario, se requiere el estricto cumplimiento de las técnicas asépticas.
EVALUACIÓN DEL DESEMPEÑO Responsabilidad del Fabricante La responsabilidad inicial de determinar y proporcionar a los usuarios las características de desempeño de un lote de indicadores biológicosi recae sobre el fabricante del indicador. El fabricante debe suministrar un certificado de análisis con cada lote de indicadores biológicos, el cual debe confirmar la validez de las aseveraciones sobre el desempeño del indicador biológico que se indican en la etiqueta del mismo o en la información adjunta al envase. El fabricante debe definir el proceso de esterilización para el cual se destina el indicador biológico. El fabricante del indicador biológico debe realizar la caracterización inicial que establece las bases de las declaraciones de la etiqueta de cada indicador biológico mediante el uso de aparatos especializados y estandarizados en condiciones definidas y precisas. 1 El fabricante además debe proporcionar información sobre el valor D, el método por el cual se determinó el valor D, y el recuento microbiológico y la estabilidad de la resistencia del indicador biológico durante toda la vida útil del indicador declarada en la etiqueta. El fabricante debe proveer condiciones óptimas de almacenamiento, incluidas la temperatura, la humedad relativa y cualquier otro requisito para almacenamiento controlado. Los datos obtenidos de las diversas valoraciones de desempeño requeridas se deben citar en el prospecto adjunto o en la etiqueta del envase del indicador biológico. El fabricante debe proporcionar instrucciones de uso, entre las que se incluyen el medio y las condiciones que se deben emplear para la recuperación de los microorganismos después de la exposición al proceso de esterilización. Además, el fabricante debe suministrar las instrucciones de eliminación del indicador biológico.
Responsabilidad del Usuario PRODUCTO COMERCIAL Cuando se adquieran indicadores biológicos de una fuente comercial, se debe establecer su aptitud para el uso en un proceso de esterilización específico mediante la realización de estudios de esterilización a menos que se disponga de datos que respalden su uso en el proceso. El usuario debe establecer normas internas de aceptación para los lotes de indicadores biológicos y considerar su rechazo cuando el lote no cumpla con los estándares de desempeño establecidos. Se debe obtener un Certificado de Desempeño de cada lote de indicadores y el usuario debe llevar a cabo periódicamente inspecciones de los procesos y las instalaciones del fabricante. Si no se obtienen certificados ni se realizan inspecciones, o si los indicadores biológicos se van a usar sin tener en cuenta las declaraciones establecidas en la etiqueta del fabricante, es necesaria la verificación y documentación del desempeño en las condiciones de uso. Cuando el usuario recibe por primera vez el indicador biológico de un proveedor comercial, debe verificar la pureza y la morfología de los microorganismos del indicador biológico adquirido. Es conveniente que por lo menos se verifique el género. Además se debe realizar un recuento microbiano para determinar el recuento promedio por unidad de indicador biológico. Se deben observar y tomar nota de los comentarios del fabricante respecto del intervalo del valor D, las condiciones de almacenamiento, la fecha de caducidad y la estabilidad del indicador biológico. El usuario tiene la opción de llevar a cabo evaluaciones para verificar el valor D antes de aceptar el lote. Los laboratorios que tengan la capacidad de realizar determinaciones del valor D pueden realizarlas mediante uno de los tres métodos citados en el capítulo de pruebas generales Indicadores BiológicosPruebas de Resistencia (55) y en las monografías pertinentes de la USP sobre indicadores biológicos. Es de particular importancia la verificación del valor D y la estabilidad del recuento del sistema de indicador biológico si se emplea el almacenamiento a largo plazo. En el caso de que el cultivo de esporas se mantenga durante más de 12 meses en condiciones de almacenamiento documentadas, se debe llevar a cabo tanto un recuento de esporas como un análisis de la resistencia, salvo que el desempeño del cultivo madre original se haya validado durante un período de almacenamiento más prolongado. Los resultados de ambas valoraciones deben estar dentro del intervalo de aceptabilidad establecido en la aceptación inicial de la partida del cultivo de esporas. PRODUCTO NO COMERCIAL Un usuario de sistemas de indicadores biológicos puede optar por cultivar microorganismos para desarrollar indicadores biológicos de uso interno con el propósito de establecer o validar procesos de esterilización. En el caso de que un usuario se convierta en "fabricante" de indicadores biológicos, se debe cumplir con ciertos requisitos de desempeño para indicadores biolóVer Aparatos en Indicadores Biológicos-Pruebas de Resistencia (55). Estos aparatos han sido diseñados para proporcionar condiciones físicas uniformes aplicables a la caracterización de indicadores biológicos. También se indican las características de desempeño requeridas.
1
964 (1035) Indicadores Biológicos para Esterilización / Información General
USP 39
gicos. Si el sistema indicador biológico se emplea para desarrollar nuevos procesos de esterilización o para la validación de los ya existentes, se deben seguir los mismos criterios de desempeño descritos para los fabricantes comerciales de indicadores biológicos.
Preparación del Cultivo de Esporas Debido a que la mayoría de los indicadores biológicos emplean esporas microbianas, los productores de indicadores biológicos, comerciales o no comerciales, deben mantener registros precisos de la identificación del cultivo de esporas. Estos registros deben incluir anotaciones referentes a la fuente del cultivo inicial, identificación, rastreabilidad del cultivo madre de esporas, frecuencia de subcultivos, medios utilizados para la esporulación, cambios en la preparación de los medios y cualquier observación sobre contaminación de cultivos y datos previos y posteriores al choque térmico. Se deben mantener registros respecto al uso del cultivo de esporas y su resistencia a la esterilización (concretamente, los valores D y z cuando corresponda).
Instrumentación La instrumentación que se usa para evaluar la resistencia a la esterilización de los cultivos de esporas debe cumplir los estándares2 que se refieren a la evaluación del desempeño de los sistemas de indicadores biológicos. El equipo para la determinación de los valores D de microorganismos expuestos a VPHP debe poder ejercer un control estricto sobre los parámetros de operación del equipo como se describe para otros sistemas de indicadores biológicos en Indicadores Biológicos-Pruebas de Resistencia (55). Es de particular importancia asegurar una concentración de VPHP reproducible, entregada dentro de un período definido y mantenida dentro de un intervalo específico de concentración o de presión de VPHP durante incrementos de tiempo definidos. La introducción de indicadores biológicos en condiciones de una concentración estabilizada de VPHP se debe efectuar mediante un sistema que permita introducir y retirar rápidamente las unidades de prueba de la cámara. Además, el diseño de la cámara de prueba debe ser tal que se pueda alcanzar el estado estacionario de concentraciones y presiones de VPHP, o se pueda usar una cantidad definida de pies cúbicos de VPHP fluyendo libremente a presión y temperatura normalizadas. Actualmente, el uso de dispositivos que determinan la concentración de VPHP no está muy difundido. Por lo tanto, puede ser necesario basar las condiciones de exposición en el mantenimiento de las presiones de VPHP en estado estacionario o en las velocidades de flujo resultantes de un peso inicial de peróxido de hidrógeno conocido que entra en la cámara en una unidad de tiempo definida. Esta información, junto con el volumen fijo conocido del entorno de la cámara, permite calcular la concentración aproximada de VPHP. Si las condiciones se mantienen constantes a lo largo de cada corrida de evaluación del valor D, se pueden determinar fácilmente comparaciones de resistencia relativa entre diferentes lotes de indicadores biológicos.
USO PARA VALIDACIÓN DURANTE EL PROCESO Independientemente del modo de esterilización, el número de microorganismos de la población inicial, su resistencia a la esterilización, y el sitio de inoculación dentro o sobre el producto pueden influir en la velocidad de inactivación del indicador biológico. Durante las exposiciones del producto a los microorganismos, se deben inocular varios lugares del producto con indicadores biológicos. Si, por ejemplo, se esteriliza un envase con su sistema de cierre, se debe exponer tanto la solución del producto como el sistema de cierre para asegurar que se logre la esterilización equivalente a un nivel de garantía de esterilización (SAL, por sus siglas en inglés) de 10-6 (una probabilidad en un millón de que haya una unidad no estéril) en la solución y el cierre. Puede ser necesario determinar mediante estudios de laboratorio si los componentes del producto son más difíciles de esterilizar por separado que, por ejemplo, una solución o un fármaco contenidos dentro del producto. Dependiendo de la localización de los componentes del producto más difíciles de esterilizar, pueden intervenir diferentes parámetros del proceso para garantizar la inactivación microbiana hasta un nivel SAL de 10-6 • Durante la fase de calificación de desempeño del producto se deben identificar los parámetros del proceso con mayor influencia en la inactivación de microorganismos en los sitios más difíciles de esterilizar. En la validación durante el proceso del producto, los parámetros fundamentales previamente determinados se deben ajustar por debajo de las condiciones establecidas en las especificaciones del proceso. La supervivencia del indicador biológico se puede predecir basándose en su resistencia y la población. Por lo tanto, no siempre se requiere una población de 106 de un indicador biológico para demostrar un SAL de 10-6 • Es adecuado usar indicadores biológicos para confirmar que los parámetros del proceso desarrollado den como resultado el SAL deseado. En la esterilización por calor húmedo, el indicador biológico se emplea para verificar biológicamente la letalidad determinada físicamente. Indicadores biológicos con altos valores D y poblaciones significativamente menores de 106 son adecuados para validar muchos procesos de esterilización y descontaminación. Es importante que los usuarios puedan justificar científicamente su selección de un indicador biológico.
2 Vigentes para Recipientes de Vapor/BIER, Estándares Nacionales de los Estados Unidos (American National Standards), ANSl/AAMI ST45:1992.
Información General/ (1041) Productos Biológicos 965
USP 39
(1041) PRODUCTOS BIOLÓGICOS Algunos productos como por ejemplo antitoxinas, antivenenos, sangre, hemoderivados, antisueros, elementos auxiliares para el diagnóstico inmunológico, toxoides, vacunas y artículos relacionados que se producen bajo licencia en conformidad con los términos de la Ley federal de Servicios de Salud Pública (Estat. 58 682) aprobada el 1 de julio de 1944 como enmienda, se han conocido durante mucho tiempo como "productos biológicos". Sin embargo, en la Tabla 111, Parte F de la Ley, el término "productos biológicos" se aplica al grupo de productos autorizados en conjunto. A los efectos de esta Farmacopea, el término "productos biológicos" hace referencia a aquellos productos que deben estar autorizados según la Ley y cumplir con el Reglamento sobre Alimentos y Medicamentos-Código de Reglamentos Federales, Título 21, Partes 600-680, relativas al control federal de estos productos (excepto ciertos elementos de diagnóstico), según la administración del Centro de Investigación y Evaluación de Productos Biológicos (Center for Biologics Evaluation and Research) o, en el caso de los elementos auxiliares de diagnóstico pertinentes, del Centro de Dispositivos y Radiología (Center for Devices and Radiological Health) de la Administración Federal de Alimentos y Medicamentos. Cada lote de un producto biológico autorizado está aprobado para su distribución cuando se ha determinado que el lote cumple con los requisitos de control específicos para dicho producto según establezca la Administración. El otorgamiento de licencias incluye la aprobación de una serie específica de pasos de producción y de pruebas de control durante el proceso, así como especificaciones sobre el producto final que deben cumplirse lote por lote. Estos pasos sólo pueden alterarse después de la aprobación del Centro de Investigación y Evaluación de Productos Biológicos y con el apoyo de la información apropiada que demuestre que el cambio generará un producto final con una seguridad, pureza, potencia y eficacia iguales o superiores. Ningún lote de un producto biológico autorizado será distribuido por el fabricante antes de completar las pruebas especificadas. Las disposiciones generalmente aplicables a los productos biológicos incluyen pruebas de potencia, seguridad general, esterilidad, pureza, agua (humedad residual), pirógenos, identidad y materiales constituyentes (Artículos 610.1 O a 610.15 y ver Pruebas de Seguridad-Productos Biológicos en Pruebas de Reactividad Biológica In Vivo (88), Pruebas de Esterilidad (71 ), Determinación de Agua (921 ), Prueba de Pirógenos (151) y Prueba de Endotoxinas Bacterianas (85)). Los materiales constituyentes incluyen ingredientes, conservantes, diluyentes y adyuvantes (los cuales generalmente deben cumplir con las normas farmacopeicas), vacunas producidas en cultivos celulares de proteína extraña (la cual se excluye si no origina suero) y antibióticos diferentes de la penicilina agregados al sustrato de producción de vacunas virales (para las cuales hay disponibles monografías oficiales sobre antibióticos y sustancias antibióticas). También es necesario realizar pruebas de seguridad adicionales específicas en vacunas vivas y algunos otros elementos. Cuando el Centro de Investigación y Evaluación de Productos Biológicos (Apartado 610.20) pone a disposición las preparaciones estándar, dichas preparaciones se especifican para la comparación de potencia o pruebas de virulencia. El Estándar de Opacidad de los EE.UU. se utiliza para calcular la concentración bacteriana de ciertas vacunas bacterianas y para evaluar cultivos de desafío en las pruebas realizadas a dichas sustancias. 0f er también Unidades de Potencia en las Advertencias Generales.) Las Monografías Farmacopeicas cumplen la Reglamentación sobre Alimentos y Medicamentos al cubrir los aspectos de identidad, calidad, pureza, potencia, envasado y almacenamiento, que resultan de particular interés para los farmacéuticos y médicos responsables de la compra, el almacenamiento y el uso de productos biológicos. Las revisiones de los requisitos federales que afectan a las monografías de la USP serán los temas centrales de los Suplementos de la USP tan pronto como sea factible. Vehículos y Sustancias Agregadas-Los vehículos y las sustancias agregadas adecuados para productos biológicos son los que se enumeran en la Reglamentación sobre Alimentos y Medicamentos.
Cambio en la tedacción: Envases para Inyecciones-Los envases para productos biológicos que deban ser administrados por vía inyectable cumplen con los requisitos de .•Requisitos de tl1'fasadoyAlmatenamientq (~59), Envasado (iétl1y~ctabfese (AF01-may,2016)·
Cambio en la redacción: Volumen en Envase-Los volúmenes de los envases de productos biológicos que deban ser administrados por vía inyectable cumplen con los requisitos de •ContenidoénEnvas~sparalnyec~ables(ó'll}it
Cambio en la redacción: Etiquetado-Los productos biológicos que deban ser administrados por vía inyectable cumplen con los requisitos de •Eti(Afot'm~y-io16 ¡. Además, la etiqueta del envase final para cada producto biológico indica lo siguiente: el título o nombre propio (el nombre con el cual el producto fue autorizado según la Ley de Servicios de Salud Pública), el nombre, la dirección y el número de licencia del fabricante, el número de lote, la fecha de caducidad y la dosis individual recomendada para envases multidosis. La etiqueta del envase incluye todo lo mencionado anteriormente, con la siguiente adición: el conservante utilizado y la cantidad; el número de envases, si hubiera más de uno; la cantidad de producto contenida en el envase; la temperatura de almacenamiento recomendada; una leyenda, si fuera necesario, que indique que debe evitarse la congelación; y cualquier otra información semejante requerida por la Reglamentación sobre Alimentos y Medicamentos.
quetado (7), Etiquetas y Etiquetado para Medicamentos Jnyectables.
966 (1 041) Productos Biológicos / Información General
USP 39
Envasado y Almacenamiento-El etiquetado indica la temperatura de almacenamiento recomendada (ver Advertencias Generales). Cuando los productos cuya etiqueta indica que deben almacenarse a una temperatura entre 2º y 8º están almacenados en un refrigerador, se deben tomar precauciones para asegurarse de que no se congelen. Los diluyentes envasados con productos biológicos no deben congelarse. Algunos productos (como se define en el Apartado 600.15) deben mantenerse a temperaturas especificadas durante el transporte. Fecha de Caducidad-Para los artículos farmacopeicos, la fecha de caducidad identifica el tiempo durante el cual se puede esperar que el artículo cumpla con los requisitos de la monografía Farmacopeica, siempre que se almacene en las condiciones de almacenamiento prescritas. Esta fecha limita el tiempo durante el cual el producto puede ser dispensado o utilizado (ver Advertencias Generales, página 1 ). Sin embargo, para los productos biológicos, la fecha indicada en cada lote determina el período de vigencia, que comienza en la fecha de fabricación (Apartado 610.50) y más allá de la cual existen dudas razonables de que el producto pueda generar los resultados específicos y conserve la seguridad, pureza y potencia requeridas (Apartado 300.3 (1) y (m)). Dicho periodo de vigencia puede comprender un periodo de almacenamiento en fábrica durante el cual se mantiene en las condiciones prescritas en el almacenamiento del fabricante, seguido de un periodo tras ser retirado de allí. Las monografías individuales suelen indicar este último período y también (entre paréntesis) el período de almacenamiento en fábrica permisible. Si el producto se conserva en el almacenamiento del fabricante durante un periodo superior al indicado (entre paréntesis), la fecha de caducidad se determina reduciendo en la proporción correspondiente el periodo de vigencia después de la salida del almacenamiento del fabricante.
(1043) MATERIALES AUXILIARES PARA PRODUCTOS CELULARES, GÉNICOS Y DE INGENIERÍA TISULAR INTRODUCCIÓN La fabricación de productos celulares, génicos y de ingeniería tisular requiere de una amplia variedad de reactivos y materiales, muchos de los cuales son únicos o complejos. Estos materiales incluyen productos provenientes del plasma o del suero, extractos biológicos, antibióticos, citocinas, medios de cultivo, anticuerpos, matrices poliméricas, dispositivos de separación, medios de gradiente de densidad, toxinas, medios condicionados suministrados por "capas de células de alimentación", sustancias químicas puras, enzimas y soluciones amortiguadoras de procesamiento. Muchos de estos artículos se usan para asegurar la supervivencia y favorecer la proliferación de determinadas poblaciones celulares, aunque su mecanismo de acción puede no estar completamente elucidado. Algunos ejemplos son el suero fetal bovino (FBS, por sus siglas en inglés) y diversos suplementos de medios. Otros artículos, como la toxina del cólera altamente purificada, se introducen en el flujo de procesamiento durante la fabricación para ejercer un efecto bioquímico específico y se eliminan por lavado inmediatamente en pasos subsiguientes del procesamiento para evitar la toxicidad posterior no deseada. Los productos biológicos terminados elaborados en estos procesos a menudo son mezclas complejas que, en algunos casos, no se pueden caracterizar totalmente. Es necesario examinar cuidadosamente los materiales utilizados en la elaboración, para evitar la introducción de agentes adventicios o impurezas tóxicas, y para garantizar la máxima seguridad, eficacia y uniformidad del producto final. En la fabricación de productos celulares, génicos y de ingeniería tisular, a estos reactivos y materiales se los conoce colectivamente como materiales auxiliares (AM, por sus siglas en inglés). Los AM también se conocen como productos auxiliares, reactivos auxiliares, coadyuvantes del proceso ("processing aids") y reactivos de procesos. Los AM se trataron por primera vez bajo el sinónimo de productos colaterales en la Notificación de la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos, "Application of Current Statutory Authorities to Human Somatic Cell Therapy Products and Gene Therapy Products" (Reglamentación Vigente para Productos de Terapia Celular Somática Humana y Productos de Terapia Génica) (Diario Oficial 58(197), 14 de octubre de 1993 ((Federal Register 58(197), Oct. 14, 1993) páginas 53248-53251 ). Este documento estableció la autoridad de la FDA para reglamentar productos de terapia celular somática humana y productos de terapia génica. AM también es sinónimo de "materiales de proceso" que fueron definidos en 21 CFR Parte 1271, "Current Good Tissue Practice far Manufacturers of Human Cellular and Tissue-based Products; lnspection and Enforcement; Proposed Rule (Buenas Prácticas Vigentes para Fabricantes de Productos Tisulares y de Células Humanas; Inspección y Ejecución; Norma Propuesta" (Diario Oficial 66(5), 8 de enero de 2001 ((Federal Register 66(5), January 8, 2001) páginas 1508-1559). Los AM pueden ser análogos a "componentes", y en algunos casos, "envases" según se describe en las reglamentaciones sobre las buenas prácticas de fabricación vigentes (cGMP, por sus siglas en inglés) para productos farmacéuticos terminados según se define en 21 CFR 211.80 a 211.94 y 211.lOl(b) y (c). La propiedad que define a los AM es que no están destinados a estar presentes en el producto final. Son materiales que se usan como ayuda en el procesamiento y la purificación o agentes que ejercen su efecto sobre la sustancia terapéutica. Los materiales o componentes destinados a estar en la forma farmacéutica del producto final (por ejemplo, materiales genéticos, soportes biopoliméricos, soluciones amortiguadoras fisiológicas) no son AM. Los bancos de células y los bancos de virus tampoco se consideran AM; hay una serie de guías que describen los requisitos para su certificación. Sin embargo, los virus "auxiliares" y plásmidos "auxiliares" se pueden considerar AM cuando no están destinados a formar parte del producto final.
USP 39
Información General/ (1043) Materiales Auxiliares 967
La calidad de un AM puede afectar la estabilidad, seguridad, potencia y pureza de un producto celular, génico o de ingeniería tisular. Por ejemplo, se puede desconocer el mecanismo mediante el cual un AM ejerce su efecto y puede no comprenderse el impacto que tiene la variación normal de un AM sobre la calidad y seguridad del producto terapéutico. Otra posibilidad es que los AM de origen humano o animal podrían presentar un riesgo de transmisión de una enfermedad infecciosa. Otros AM, si se administran a seres humanos, pueden provocar una reacción inmunitaria. Finalmente, un AM con propiedades tóxicas que se introduzca en un proceso de fabricación y no se elimine de manera satisfactoria en pasos subsiguientes del proceso, expondrá al paciente a una sustancia tóxica y puede alterar la eficacia de la entidad terapéutica. Estos riesgos que afectan la calidad y seguridad del producto terapéutico frecuentemente aumentan en el caso de productos celulares, génicos y de ingeniería tisular, como consecuencia de la capacidad limitada de llevar a cabo pruebas exhaustivas en proceso y de liberación. Por ejemplo, la falta de pasos de retención en proceso o vida útil limitada pueden crear la necesidad de administrar los productos celulares, génicos o de ingeniería tisular antes de obtener los resultados de las pruebas en proceso o de liberación finales. En otros casos, la escasez de tejido donante adecuado o la compleja logística en el transporte de materiales biológicos puede limitar la cantidad de material disponible para efectuar pruebas. Para minimizar estos riesgos, cuando sea posible hay que implementar rigurosos procedimientos de calificación de los materiales y aplicar con prudencia controles del proceso de fabricación. Con frecuencia, estos nuevos productos terapéuticos se crean utilizando procesos biológicos complicados. Los AM empleados en estos procedimientos se pueden seleccionar principalmente por sus contribuciones funcionales o efectos biológicos especiales. Cuando sea posible, es preferible que los AM sean productos terapéuticos aprobados o autorizados porque están bien caracterizados, poseen un perfil toxicológico establecido y están fabricados según procedimientos controlados y documentados. Por otra parte, el AM puede estar destinado al "uso en investigación" y por lo tanto puede carecer del nivel de calificación necesario para su uso en la producción de un producto terapéutico. En cada caso, el fabricante del producto celular, génico o de ingeniería tisular debe elaborar protocolos de calificación amplios y científicamente válidos para garantizar la rastreabilidad, consistencia, aptitud, pureza y seguridad del AM. En los casos en que los AM sean productos aprobados para su uso con fines terapéuticos, el nivel de calificación probablemente sea menos amplio que el de un material destinado a fines de investigación. No obstante, aún es necesario determinar su aptitud en el proceso de fabricación cuando el AM se utiliza de forma distinta al uso previsto o a lo indicado en el etiquetado. El propósito de este capítulo es ofrecer una guía para elaborar programas de calificación apropiados para AM que se empleen en la fabricación de productos celulares, génicos y de ingeniería tisular.
CALIFICACIÓN DE MATERIALES AUXILIARES La calificación es el proceso de obtener y evaluar datos para establecer el origen, la identidad, la pureza, la seguridad biológica y la aptitud general de un AM especifico. La responsabilidad de la calificación del AM recae en quien desarrolla o fabrica el producto celular, génico o de ingeniería tisular. Esta sección resume a grandes rasgos las bases para que un fabricante pueda establecer programas razonables y científicamente válidos para calificar los AM, aunque la amplia naturaleza de los productos celulares, génicos y de ingeniería tisular, al igual que la de los AM empleados para producir estos productos hacen difícil recomendar pruebas o protocolos específicos para un programa de calificación. La documentación completa y rigurosa es la piedra angular de cualquier programa de calificación. Un programa de calificación bien diseñado se torna más amplio a medida que progresa el desarrollo del producto. En las primeras etapas de desarrollo del producto, el enfoque principal es respecto a la seguridad. En las etapas posteriores, se deben desarrollar actividades de producción y calificación del AM en forma amplia para respaldar la consiguiente concesión de la licencia del producto celular, génico o de ingeniería tisular. En algunas ocasiones, es posible que no hayan proveedores de sustancias complejas o únicas que han demostrado ser esenciales para el control del proceso o la producción y que las producen de conformidad con las cGMP. En estas situaciones, el fabricante debe elaborar una estrategia científicamente válida para la calificación. Un programa de calificación para los AM que se utilicen en la fabricación de productos celulares, génicos y de ingeniería tisular debe cubrir los siguientes aspectos: (1) identificación, (2) selección y aptitud para usarlos en la fabricación, (3) caracterización, (4) calificación del proveedor y (5) control y garantía de calidad.
Identificación El primer paso de cualquier programa de calificación es listar todos los AM que se emplean en la fabricación de un producto determinado e indicar en qué parte del proceso de fabricación se van a utilizar. Se debe establecer el origen y el uso previsto de cada material y se debe determinar la cantidad o concentración necesaria de cada material. Además se deben identificar fuentes alternativas de cada material.
Selección y Aptitud para el Uso Quienes desarrollan productos celulares, génicos y de ingeniería tisular deben establecer y documentar los criterios de selección de AM y los criterios de calificación para cada proveedor al principio de la fase de diseño del desarrollo del producto. Los criterios de selección deben incluir evaluaciones de pureza microbiológica y química, identidad y actividad biológica pertinentes al proceso de fabricación específico. Es importante abordar estos temas al principio del desarrollo del producto porque la calificación de ciertos AM, que inicialmente pueden ser considerados necesarios, puede ser imposible o demasiado costosa,
968 (1043) Materiales Auxiliares / Información General
USP 39
justificando de este modo la investigación de productos alternativos o sustitutos. Entre los ejemplos se encuentran algunos materiales de origen animal o humano que en algunos casos tienen fuentes alternativas (como por ejemplo, de origen vegetal o por síntesis química). Los AM de origen animal o humano se deben seleccionar cuidadosamente debido a los posibles riesgos de enfermedades infecciosas o zoonóticas asociadas a estos materiales. Hay que seleccionar proveedores que puedan proporcionar documentación sobre el país de donde provienen los AM de origen animal para responder a las inquietudes respecto a la encefalopatía espongiforme bovina y otras enfermedades de interés agrícola, como tuberculosis y brucelosis. En muchos casos, se debe documentar la cadena de custodia de los AM de origen animal (es decir, matadero-+ centro de procesamiento intermedio-+ centro de procesamiento final). Los proveedores de AM de origen humano deben poder proporcionar documentación respecto a la rastreabilidad del material. Por ejemplo, los AM obtenidos de plasma humano deben provenir de establecimientos autorizados que controlen el conjunto de donantes y examinen a los donantes individuales para verificar que no padezcan enfermedades infecciosas humanas importantes. En algunos casos, los proveedores de AM de origen animal y humano suministran diferentes categorías de materiales, siendo algunas más adecuadas para usar en la fabricación de productos celulares, génicos y de ingeniería tisular que otras categorías. Por ejemplo, se puede obtener FBS que haya sido procesado para reducir el riesgo de contaminación viral bovina sometiéndolo a procesos validados de irradiación y nanofiltración. Además, muchos componentes obtenidos de animales y de plasma humano se someten a tratamientos químicos (tratamiento con detergentes o disolventes) o físicos (exposición al calor durante períodos prolongados) que, mediante exhaustivos estudios de validación, han demostrado reducir significativamente el riesgo de contaminación microbiana o viral adventicia asociada a los AM iniciales. Se prefiere utilizar dichos AM en procesos de fabricación de productos celulares, génicos y de ingeniería tisular porque reducen significativamente los riesgos asociados al material original. Se puede reducir la complejidad de la evaluación del riesgo mediante el empleo de uno de varios métodos cuantitativos o semicuantitativos, como el análisis de los efectos en modo de falla (FMEA, por sus siglas en inglés), el despliegue de la función de calidad (QFD, por sus siglas en inglés), o el análisis de riesgos y punto crítico de control (HACCP, por sus siglas en inglés). Estos programas generalmente asignan un valor puntual a cada parámetro de riesgo de un AM, que da como resultado puntajes acumulativos que facilitan darle prioridad al esfuerzo y los recursos para disminuir los riesgos asociados a los AM. Por ejemplo, un AM que tenga un fuerte perfil de seguridad y se utilice en cantidades mínimas en los pasos iniciales del proceso de fabricación y se lave minuciosamente para eliminarlo del sistema acumula un puntaje bajo. Por el contrario, un AM que se sepa que es tóxico y se emplee en las etapas finales del proceso presenta más posibilidades de aparecer como residuo en el produce to final y se le debe asignar un puntaje más alto. También se pueden asignar puntos según la clasificación del riesgo (ver Clasificación del Riesgo).
Caracterización Es necesario desarrollar o adoptar e implementar pruebas específicas de caracterización de control de calidad para cada AM. El conjunto de pruebas para cada AM debe evaluar diversos atributos de calidad, entre los que se incluyen la identidad, pureza, funcionalidad y ausencia de contaminación microbiana o viral. El nivel de prueba apropiado para cada AM proviene de su perfil de evaluación de riesgos y del conocimiento obtenido durante el desarrollo. Se deben establecer especificaciones de prueba para cada AM, para asegurar la uniformidad y el funcionamiento del proceso de fabricación. Los criterios de aceptación se deben establecer y justificar sobre la base de datos obtenidos a partir de lotes utilizados en estudios preclínicos y estudios clínicos iniciales, de lotes empleados para demostrar la uniformidad de la fabricación y de datos pertinentes del desarrollo, como los que surgen del desarrollo de procedimientos analíticos y estudios de estabilidad. Algunos AM de naturaleza biológica pueden ser difíciles de caracterizar totalmente. Como estos materiales ejercen su influencia a través de acciones biológicas complejas y las pruebas bioquímicas pueden no predecir el desempeño de los AM en el proceso, puede ser necesario realizar pruebas funcionales o de desempeño. La variabilidad en el desempeño de dichos materiales puede tener un efecto perjudicial sobre la potencia y la uniformidad del producto terapéutico final. Algunos ejemplos de pruebas complejas de funcionalidad de los AM son las pruebas de promoción del crecimiento de lotes individuales de FBS en la línea celular utilizada en la fabricación, pruebas de desempeño de preparaciones de enzimas digestivas y valoraciones in vitro de citotoxicidad en cultivo de tejidos (ver aspectos de Pruebas de Desempeño).
Calificación del Proveedor Se debe calificar a los proveedores de AM lo antes posible. Una auditoría temprana de las instalaciones de fabricación del proveedor, incluyendo sus GMP y su programa de prueba de AM, son elementos básicos de un programa de calificación de un proveedor. Para poder considerar confiable a un proveedor es esencial revisar los procedimientos de procesamiento y del programa de documentación del proveedor. Además, los proveedores certificados por medio de un programa de inspección ISO o auditados por otros organismos gubernamentales suelen contar con sistemas de calidad robustos. Los informes de auditorías anteriores de proveedores de EE.UU. obtenidos a través de la Ley de Libertad de Información (FOI, por sus siglas en inglés) pueden mejorar el proceso de calificación. Es importante establecer una buena relación de trabajo con un proveedor. En algunos casos, el proveedor puede ofrecer normas de fabricación más exigentes, servicios de formulación de acuerdo a las especificaciones del cliente o sustitución de componentes de calidad inferior previa solicitud, con o sin costos adicionales. Una buena relación es esencial si se justifica una
USP 39
Información General/ (1043) Materiales Auxiliares 969
investigación más extensa de proveedores de AM. Además es crítico asegurar que el proveedor tome las medidas correspondientes para evitar la contaminación cruzada entre sus productos durante la fabricación. Los proveedores deben estar familiarizados con los principios de validación, especialmente la validación de limpieza, al igual que la validación de inactivación viral y la validación de esterilización. Finalmente, se deben establecer sistemas para que los proveedores suministren a los clientes certificación por escrito de cambios de procesamiento o de origen, mucho antes de la puesta en práctica de los cambios, de modo que los clientes puedan evaluar sus consecuencias posibles.
Control de Calidad y Garantía de Calidad Como los componentes del programa de calificación tienen varios aspectos y deben cumplir con las cGMP, deben ser controlados por una unidad de garantía de calidad y control de calidad (QAU, por sus siglas en inglés). Las acciones típicas de QAU comprenden los siguientes sistemas o programas: (1) recepción de entrada, separación, inspección y liberación de materiales antes de su uso en la fabricación, (2) auditoría y certificación del proveedor, (3) pruebas de verificación del certificado de análisis, (4) políticas y procedimientos formales para materiales que no cumplen con las especificaciones, (5) prueba de estabilidad y (6) almacenamiento de muestras de archivo.
CLASIFICACIÓN DEL RIESGO Se debe crear un programa de calificación racional y científicamente válido para cada AM, que tome en cuenta su origen y los procesos empleados en su fabricación. Cuando estén disponibles, se prefieren los AM que sean productos terapéuticos aprobados o autorizados porque están bien caracterizados con un perfil toxicológico probado y están fabricados según procedimientos controlados y documentados. Los productos biológicos autorizados, fármacos aprobados y dispositivos médicos o materiales implantables aprobados o autorizados que han sido incorporados en procesos de fabricación de productos celulares, génicos o de ingeniería tisular presentan un perfil de seguridad conocido o más favorable para el paciente que las versiones no aprobadas o no autorizadas. Los programas de calificación para estos AM deben reflejar la inspección amplia y minuciosa de estos artículos durante su desarrollo y fabricación. En consecuencia, se debe poner mayor énfasis en la investigación del impacto de la variabilidad inherente de estos AM sobre la función del producto final. Por ejemplo, un fabricante puede utilizar seroalbúmina humana, destinada a ser administrada a seres humanos, como suplemento para un medio de cultivo celular para un producto celular. Debido a que el producto celular se comercializa como un producto biológico autorizado, no es necesario repetir todas las pruebas realizadas por el proveedor como parte de la calificación del material. Por otra parte, el efecto de la variabilidad de un lote a otro sobre la velocidad de crecimiento celular o el mantenimiento de una propiedad celular diferenciada puede ser una área de investigación aconsejable. Como alternativa, la estabilidad de este material a la concentración empleada en el procesamiento o su potencial de interacción con otros componentes del proceso, también pueden ser áreas que vale la pena investigar. En consecuencia, estos criterios respecto a la calificación de AM se concentran en los AM como una fuente potencial de variabilidad que puede influir en la potencia y seguridad del producto final. Los programas de calificación para estos AM deben ser amplios para minimizar el riesgo al consumidor y garantizar la detección de lotes inaceptables o adulterados. El programa de calificación también debe tener en cuenta la cantidad de AM empleado en la fabricación, al igual que su punto de introducción en el proceso de fabricación. Un ejemplo pertinente es el uso de FBS como suplemento de un medio de cultivo de tejidos empleado para aumentar una población de células madre de un tejido específico para su eventual administración a un paciente (ver Perspectiva General de la Fabricación en llR!llilllllllllllllllfl. .iii!~i!fll~il~ilij~ i!~!li~~IlllJi). Un programa de calificación para tal AM debe incluir (a) la garantía de que el suero proviene de un país o región que esté libre de encefalopatía espongiforme bovina (BSE, por sus siglas en inglés); (b) la garantía de que el ganado de origen se controla y que los resultados de las pruebas de detección de enfermedades importantes en el correspondiente entorno agrícola son negativos (por ejemplo, tuberculosis, brucelosis, fiebre aftosa); (c) el análisis del suero para verificar su esterilidad, detectar micoplasma, contenido de endotoxinas y virus adventicios bovinos vinculados a este material; 1 (d) la revisión y archivo del certificado de análisis del fabricante; (e) la evaluación entre lotes de la aptitud del suero para aumentar de manera uniforme una población celular representativa utilizando una valoración de control de calidad estandarizada para el cultivo de células; y (f) la auditoría del proveedor en su establecimiento para asegurar que la proveniencia y el procesamiento del material sean aceptables según una unidad QA responsable. Para ayudar a los fabricantes y a aquellos que desarrollan el producto en el diseño de sus programas de calificación para una variedad de AM, en las Tablas 1-4 se presentan niveles de categorías de riesgo de muestra, que se proporcionan como una guía. El riesgo también depende de la cantidad y la etapa en la que se usa el AM en el proceso de fabricación. Las Tablas 1-4 no consideran el efecto de la cantidad ni la etapa de uso.
1 La mayoría de los proveedores realizan pruebas para detectar agentes adventicios de conformidad con 9 CFR 11 3, establecido por el Centro de Productos Biológicos Veterinarios, Servicio de Inspección Sanitaria Animal y Vegetal (Center for Veterinary Biologics, Animal and Plant Health lnspection Service) del Departamento de Agricultura de Estados Unidos. Estas pruebas pueden diferir de las utilizadas para analizar productos desarrollados para uso humano (por ejemplo, micoplasma).
USP 39
970 (1043) Materiales Auxiliares/ Información General
Nivel 1 Estos AM presentan un riesgo bajo; son materiales altamente calificados muy adecuados para usar en la fabricación. El AM es un producto biológico, un fármaco aprobado, un dispositivo médico aprobado o autorizado o está destinado al uso como material biológico implantable. En general, estos componentes o materiales se obtienen como un sistema de envase estéril o forma farmacéutica para el uso que se indica en su etiqueta, pero en vez de esto se emplean para un uso "no indicado en la etiqueta" en el proceso de fabricación del producto celular, génico o de ingeniería tisular.
Nivel 2 Estos AM presentan un riesgo bajo; son materiales bien caracterizados y muy adecuados para usar en la fabricación. Están destinados para usarse en la fabricación de fármacos, productos biológicos o dispositivos médicos, incluyendo los productos celulares, génicos y de ingeniería tisular como AM, y se producen con las cGMP pertinentes. La mayoría de materiales de origen animal están excluidos de esta categoría.
Nivel 3 Estos AM son materiales que presentan un riesgo moderado y que requieren un nivel más alto de calificación que los anteriores. Frecuentemente, se producen para uso diagnóstico in vitro y no están destinados a la producción de productos celulares, génicos o de ingeniería tisular. En algunos casos, puede ser necesario mejorar los procesos de fabricación del AM para emplearlo en la fabricación de estos productos (por ejemplo, modificación del proceso de producción de un anticuerpo monoclonal de grado diagnóstico para incluir pasos robustos de eliminación de virus en la purificación).
Nivel 4 Este es el mayor nivel de riesgo de AM. Es necesario efectuar una exhaustiva calificación antes de emplearlos en la fabricación. El material no se produce de conformidad con las cGMP. Los AM no están destinados para la producción de productos celulares, génicos o de ingeniería tisular. Este nivel de riesgo comprende sustancias tóxicas con mecanismos biológicos de acción conocida y también incluye materiales líquidos más complejos, de origen animal, que no se someten a procedimientos de eliminación o inactivación de virus adventicios. Estos materiales pueden requerir (a) un mejoramiento de los procesos de fabricación del AM; (b) tratamiento del AM para inactivar o eliminar agentes adventicios, sustancias causantes de enfermedades o contaminantes específicos (por ejemplo, priones, virus animales); (c) análisis de cada lote de material para asegurar la ausencia de agentes adventicios, sustancias causantes de enfermedades o contaminantes específicos; (d) validación del proceso de fabricación del producto celular, génico o de ingeniería tisular para evaluar la uniformidad en la eliminación de una sustancia tóxica conocida o pruebas de liberación de lote capaces de demostrar niveles de reducción seguros; o (e) validación del proceso de fabricación del producto celular, génico o de ingeniería tisular para evaluar la uniformidad en la eliminación o inactivación de agentes adventicios, sustancias causantes de enfermedades o contaminantes específicos asociados al material. Los encargados de desarrollar el producto deben evaluar en las etapas iniciales de desarrollo la necesidad de estos materiales e investigar sustancias o fuentes alternativas. Tabla 1. Riesgo del AM Nivel 1 Materiales de Riesgo Bajo, Altamente Calificados, Destinados a Usarse como Fármaco Terapéutico o Producto Biológico, Dispositivo Médico o Material lmplantable
Ejemplo
Uso Común en la Fabricación de Productos Celulares, Génicos y de Ingeniería Tisular
Insulina recombinante para inyección
Aditivo para medio de cultivo de células
Líquido conservador de órganos
Líquido biológico de proceso empleado en el transporte o procesamiento de tejidos
Seroalbúmina humana para inyección
Medio de cultivo de células
Líquidos estériles para inyección
Líquido biológico de proceso empleado en transporte de tejidos, procesamiento de células, purificación
Acciones de Calificación o Reducción del Riesgo Referencia cruzada del DMF (cuando sea posible o práctico) Certificado de análisis Evaluar el efecto de un lote a otro sobre el funcionamiento del proceso 1 Evaluar la eliminación en el producto final
Ver Pruebas de Desempeño. A menudo los AM se conservan en alícuotas o se almacenan en diferentes concentraciones, en distintas soluciones amortiguadoras o bajo condiciones diferentes a las establecidas en la etiqueta o validadas previamente. Hay que generar datos que demuestren la estabilidad y conservación de la actividad del AM en las condiciones que sean específicas a su uso en la fabricación. 3 No se deben usar antibióticos beta lactámicos como AM, debido al riesgo de hipersensibilidad del paciente. 1
2
USP 39
Información General/ (1043) Materiales Auxiliares 971
Tabla 1. Riesgo del AM Nivel 1 Materiales de Riesgo Bajo, Altamente Calificados, Destinados a Usarse como Fármaco Terapéutico o Producto Biológico, Dispositivo Médico o Material lmplantable (Continuación)
Ejemplo
Uso Común en la Fabricación de Productos Celulares, Génicos y de Ingeniería Tisular
Materiales biológicos implantables (estructuras de colágeno formado, silicona, poliuretano destinadas a implantación quirúrgica)
Armazones, matrices para cultivo de células inmovilizadas
Desoxirribonucleasa recombinante para inhalación o inyección
Enzima de proceso empleada en la fabricación de vectores virales, procesamiento de células madre
Antibióticos para inyección3
Aditivo de líquido de transporte de medio de cultivo celular y biopsia para reducir el riesgo de contaminación bacteriana
Anticuerpos monoclonales inyectables
Acción inmunológica dirigida a poblaciones celulares específicas para su selección o eliminación
Citocinas inyectables
Medio de cultivo de células
Vitaminas para inyección; nutrientes, sustancias químicas o excipientes definidos para inyección
Aditivo de medio de cultivo de células empleado en la expansión de células, la diferenciación celular controlada y pasos de activación o fabricación de un vector viral
Bolsas IV, tuberías y equipos de transferencia, bolsas para crioconservación, jeringas, agujas
Sistemas de cierre de recipientes de almacenamiento, sistemas cerrados de transferencia aséptica
Acciones de Calificación o Reducción del Riesgo Evaluar la estabilidad del AM mientras se almacena antes de usar en la fabricación 2
1 Ver Pruebas de Desempeño. 2 A menudo los AM se conservan en alícuotas o se almacenan en diferentes concentraciones, en distintas soluciones amortiguadoras o bajo condiciones diferentes a las establecidas en la etiqueta o validadas previamente. Hay que generar datos que demuestren la estabilidad y conservación de la actividad del AM en las condiciones que sean específicas a su uso en la fabricación. 3 No se deben usar antibióticos beta lactámicos como AM, debido al riesgo de hipersensibilidad del paciente.
Tabla 2. Riesgo del AM Nivel 2 Materiales de Riesgo Bajo, Bien Caracterizados, Destinados a Usarse como AM, Producidos de Conformidad con las GMP
EJemplo Factores de crecimiento recombinantes, citocinas 1
Uso Típico en la Fabricación de Producto Celular, Génico o de Ingeniería Tisular
Acciones de Calificación o Reducción del Riesgo
Aditivo de medio de cultivo de células
Referencia cruzada del DMF (cuando sea posible o práctico)
Perlas inmunomagnéticas
Separación inmunomagnética de células
Certificado de análisis
Suero humano AB
Aditivo de medio de cultivo de células
Evaluación del efecto de un lote a otro sobre el funcionamiento del proceso2
Progesterona, estrógeno, vitaminas, sustancias químicas purificadas (grado USP)
Aditivos de medio de cultivo de células, agentes de inducción, componentes de soluciones amortiguadoras
Evaluación de la eliminación en el producto final
Soluciones amortiguadoras para procesos estériles
Líquido biológico de proceso empleado en el transporte de tejidos, procesamiento de células, purificación
Evaluación de la estabilidad del AM mientras se almacena antes de usarse en la fabricación3
Polímeros, armazones e hidrogeles biocompatibles
Armazones, matrices para cultivo de células inmovil izadas
Cuando sea pertinente, confirmar los resultados de la prueba del certificado de análisis que sean esenciales para el producto (podría incluir la valoración funcional)
Enzimas proteolíticas
Enzima de proceso
Auditoría al proveedor
Medios de cultivo de tejidos
Aditivo de medio de cultivo de células
Anticuerpos monoclonales
Acción inmunológica dirigida a poblaciones celulares específicas para su selección o eliminación
Medios de gradiente de densidad
Separación de células por centrifugación
Estos AM se deben producir a partir de fuentes recombinantes, que no sean de mamíferos (es decir, desarrollados microbiológicamente en ausencia de componentes de origen animal en los medios de cultivo). 2 Ver Pruebas de Desempeño. 3 A menudo los AM se conservan en alícuotas o se almacenan en diferentes concentraciones, en distintas soluciones amortiguadoras o bajo condiciones diferentes a las establecidas en la etiqueta o validadas previamente. Hay que generar datos que demuestren la estabilidad y conservación o actividad del AM bajo las condiciones que sean específicas a su uso en la fabricación. 1
USP 39
972 (1043) Materiales Auxiliares / Información General
Tabla 3. Riesgo del AM Nivel 3 Materiales de Riesgo Moderado, No Destinados a Usarse como AM (frecuentemente producidos para su uso en diagnóstico In vltro o materiales grado reactivo)
Ejemplo Factores de crecimiento recombinantes, citocinas
Uso Típico en la Fabricación de Productos Celulares, Génicos o de Ingeniería Tisular Aditivo de medio de cultivo de células
Acciones de Callflcación o Reducción del Riesgo Referencia cruzada del DMF (cuando sea posible o práctico) Certificado de análisis Evaluación del efecto de un lote a otro sobre el funcionamiento del proceso 1 Evaluación de la eliminación en el producto final Evaluación de la estabilidad del AM mientras se almacena antes de usarse en la fabricación 2 Cuando sea pertinente, confirmar los resultados del certificado de análisis que sean esenciales para el producto (podría incluir la valoración funcional)
Medios de cultivo de tejidos
Aditivo de medio de cultivo de células
Auditoría al proveedor
Anticuerpos monoclonales (de grado diagnóstico producidos en cultivo de células)
Acción inmunológica dirigida a poblaciones celulares específicas para su selección o eliminación
Mejorar el proceso de fabricación del material según las GMP
Soluciones amortiguadoras de proceso
Líquido biológico de proceso empleado en el transporte de tejidos, procesamiento celular, purificación
Elaborar especificaciones internas estrictas
Nuevos polímeros, armazones, hidrogeles
Armazones, matrices para cultivo de células inmovil izadas
Enzimas proteolíticas
Enzima de proceso
Sustancias químicas purificadas (grado reactivo)
Aditivos de medio de cultivo, agentes de inducción, componentes de soluciones amortiquadoras
Determinar si son necesarias las pruebas de biocompatibilidad, citotoxicidad o detección de agentes adventicios, de un lote a otro
Ver Pruebas de Desempeño. A menudo los AM se conservan en alícuotas o se almacenan en diferentes concentraciones, en distintas soluciones amortiguadoras o bajo condiciones diferentes a las establecidas en la etiqueta o validadas previamente. Hay que generar datos que demuestren la estabilidad y conservación o actividad del AM bajo las condiciones que sean específicas a su uso en la fabricación. 1 2
Tabla 4. Riesgo del AM Nivel 4 M ater11 a es de Alto RI esgo Ejemplo
Uso Típico en un Producto Celular, Génico, o de Ingeniería Tisular
FBS
Aditivo de medio de cultivo de células
Extractos de origen animal (incluyendo humano)
Aditivo de medio de cultivo de células
Polímeros, armazones e hidrogeles de origen animal
Armazones, matrices para cultivo de células inmovil izadas
Enzimas purificadas
Enzima de proceso
Anticuerpos o proteínas derivados de ascitis
Acción inmunológica dirigida a poblaciones celulares específicas para su selección o eliminación
Células humanas o animales utilizadas como capas de alimentación
Sustrato de cultivo de células o fuente de camponentes de medios
Entidades químicas con toxicidad conocida (p.ej. Agentes de selección utilizados en cultivo de célumetotrexato, toxina de cólera, hemolisina formalas para mejorar o mantener la expresión transgénica, aumentar la proliferación celular, mejorar la dora de poros de Staphylococcus aureus;enterotoxi nas A y B de Staphylococcus, toxina del síndrome supervivencia celular durante la crioconservación, de shock tóxico) superantíqenos para la activación de linfocitos T
Acciones de Callflcaclón o Reducción del Riesgo Igual que en
Tabla 3, más
Verificar la rastreabilidad al país de origen
Asegurar que el país de origen esté calificado como seguro con respecto a enfermedades animales pertinentes a la fuente, incluida TSE (por sus siglas en inglés) Pruebas de detección de agentes adventidos para detectar virus pertinentes a la fuente de origen animal
PRUEBA DE DESEMPEÑO En los casos en que los AM se eligen por su capacidad para proporcionar una cierta función biológica en la elaboración del producto terapéutico, la prueba de desempeño se torna un componente fundamental de su calificación general. Esto es particularmente cierto cuando el AM desempeña un papel crítico en la modulación de un efecto bioquímico complejo y ejerce un gran impacto sobre el rendimiento de la fabricación del producto, su pureza o la potencia del producto final. Estos AM tienden
USP 39
Información General/ (1043) Materiales Auxiliares 973
a ser sustancias o mezclas complejas, frecuentemente de origen biológico y pueden presentar gran variabilidad entre lotes. Como resultado, estos AM en general no tienen una prueba de identidad simple, ni pueden ser fácilmente caracterizados por pruebas físicas o químicas. El desarrollo de valoraciones de desempeño bien definidas para AM complejos no sólo asegura la reproducibilidad del proceso y la calidad del producto final, sino que en muchos casos también cumple con Jos criterios de pruebas de identidad conforme a 21 CFR 21 l .84(d). En algunos casos, Ja calificación inicial de un AM para usarse en la fabricación debe ser la investigación del efecto que tiene Ja cantidad del AM sobre Ja respuesta deseada (aumento del rendimiento, pureza o potencia del producto terapéutico). La cantidad de AM empleada en Ja fabricación debe ser seleccionada para que produzca el efecto deseado de manera uniforme, a la vez que minimice Jos problemas mediante la eliminación del AM en los pasos subsiguientes del procesamiento. Dicha prueba a menudo evalúa el atributo funcional importante que se espera del AM en un proceso de fabricación a escala reducida o simulado. A continuación se indican algunos ejemplos: • Si un AM se agrega a los medios de cultivo porque favorece la proliferación celular o la secreción de un agente terapéutico esencial, la valoración podría demostrar que cada lote de AM produce la velocidad o cantidad esperada de proliferación celular o el nivel esperado de agente terapéutico segregado. • Si se usa un anticuerpo monoclonal para purificar un cierto tipo de célula, se podría demostrar que el nuevo lote de anticuerpo monoclonal purifica la población celular con la recuperación y pureza esperada para el tipo de célula deseado. • Si se usa una desoxirribonucleasa para descomponer el ADN celular, se podrían analizar los nuevos lotes para verificar la capacidad de Ja desoxirribonucleasa para descomponer el ADN. • Si se usa un tipo especial de gradiente de densidad para purificar un vector o célula, se podría demostrar que los nuevos lotes del material utilizado para obtener el gradiente pueden purificar el vector o célula hasta un grado satisfactorio. • Si se usa un plásmido o vector viral en la producción de un vector de terapia génica (por ejemplo, función auxiliar), se podría demostrar que los nuevos lotes del vector auxiliar producen las cantidades esperadas del vector de terapia génica. • Si se produce terapia celular en un biorreactor de fibra hueca, se podría demostrar que los nuevos Jotes del biorreactor producen Ja cantidad prevista de producto celular. La valoración usada podría evolucionar a medida que el proceso de fabricación se desarrolla y las relaciones críticas entre el AM y el producto final se comprendan mejor. Debido a que la mayoría de las pruebas de desempeño producen resultados relativos, a menudo resulta útil valorar un lote nuevo de AM conjuntamente con un Jote aprobado de AM o un estándar de referencia oficial, si se dispone de alguno. La comparación simultánea ayuda a reducir la variabilidad debida a diferentes Jotes de células o vectores y ayuda a distinguir la variabilidad asociada a los diferentes lotes de AM. Si Ja prueba de desempeño implica valoraciones para demostrar que el nuevo lote de AM no afecta el perfil de impurezas del producto terapéutico final, ya sea generando nuevas impurezas o aumentando el nivel de impurezas existentes, es útil valorar ambos respecto al nivel de impurezas totales, al igual que buscar Ja presencia de nuevas impurezas. Un análisis de inmunodetección en general puede evaluar solamente el nivel de impurezas totales. Por ejemplo, un Western blot del producto de terapia génica que se investiga tanto con anticuerpos del producto como con anticuerpos de proteínas de células anfitrionas, es útil para detectar nuevas especies de proteínas y aumentos significativos de los niveles de impurezas de las células anfitrionas. Esta calificación inicial se incrementa por medio de una valoración de desempeño que tiene una lectura cuantitativa con un cambio marcado en la señal cuando se introduce en Ja valoración un cambio importante en la cantidad de AM (por ejemplo, respuesta de dosis). Una respuesta tipo umbral (es decir, hay dos niveles de respuesta para el AM y la respuesta no cambia ni con cambios grandes en el AM por debajo de una dosis determinada ni por encima de una dosis determinada) puede hacer más difícil seleccionar una concentración de AM que dé como resultado el efecto deseado de manera uniforme y minimice los niveles residuales del AM en el producto terapéutico final.
EVALUACIÓN Y ELIMINACIÓN DEL NIVEL RESIDUAL DE MATERIALES AUXILIARES Los AM no están destinados a estar presentes en Ja forma farmacéutica final en los productos celulares, génicos y de ingeniería tisular. Su presencia en el producto final podría provocar efectos indeseables en la persona que los reciba o tener un efecto perjudicial en la potencia del producto. Los efectos indeseables en seres humanos consisten en la toxicidad directa del AM o en una respuesta inmunogénica no deseada. Algunos ejemplos incluyen lo siguiente: •Al generar una vacuna contra un tumor utilizando una biopsia de tumor de un paciente como material inicial, se introduce una entidad química para desnaturalizar las proteínas de Ja superficie celular y Jos antígenos del tumor para aumentar su antigenicidad. Se sabe que Ja entidad química es muy tóxica. • Se pueden agregar antibióticos a una solución de transporte para células humanas para contrarrestar la contaminación microbiana asociada con el procedimiento de obtención. Los niveles residuales del antibiótico pueden afectar la capacidad de proliferación del producto celular final producido por bioingeniería. Los antibióticos residuales también pueden provocar una respuesta anafiláctica en algunos individuos. • El FBS, empleado en el cultivo de un injerto de piel humana realizado mediante bioingeniería, puede provocar una respuesta de anticuerpos humorales contra las proteínas bovinas. • Las inmunoglobulinas aglomeradas de ratón, una traza de impureza en una preparación purificada de anticuerpo monoclonal de ratón dirigido contra una población celular para inmunoselección, pueden ser inmunógenas. • Una citocina empleada como inmunomodulador en la creación de una vacuna autóloga contra tumores producida por modificación génica, puede provocar una reacción grave en el receptor.
974 (1043) Materiales Auxiliares/ Información General
USP 39
• La toxina del cólera, empleada como parte de un medio de cultivo celular para un producto de terapia celular destinado a la administración intravenosa, resultará sumamente tóxica para el receptor si no se elimina durante el procesamiento. Estos riesgos se pueden mitigar si se diseñan procesos que incluyen pasos de eliminación satisfactoria del AM, mediante dilución, separación o inactivación, y se desarrollan valoraciones de detección analítica para evaluar los niveles de AM durante el procesamiento y en el producto terapéutico final. Las estrategias de evaluación y eliminación de AM residuales se deben considerar en las fases iniciales del desarrollo del proceso. Hay dos métodos diferentes para evaluar los niveles de AM residual en el producto terapéutico final: (1) Los estudios de validación pueden demostrar que el proceso es capaz de eliminar más del AM de lo que estaría presente en el peor caso hipotético. (2) Los niveles residuales de un AM se pueden medir en cada lote en un paso apropiado durante el proceso de fabricación. La validación de un AM con frecuencia se realiza mejor agregando al producto impuro con el "peor caso" o niveles superiores de AM y demostrando que el proceso de purificación es capaz de eliminar el AM hasta "niveles no detectables". De este modo se pueden generar factores de depuración para cada paso de purificación de manera análoga a la realizada en estudios de depuración viral. Al diseñar los estudios de validación se deben incluir los tres factores siguientes: (1) La valoración debe ser capaz de cuantificar con exactitud el AM en cada matriz de muestra. (2) Si la validación se lleva a cabo a una escala menor que la utilizada en la producción de lotes de rutina, es necesario demostrar la comparabilidad entre este proceso en pequeña escala y el proceso completo. En general esto significa que el proceso en pequeña escala se realiza con los mismos parámetros críticos que el proceso completo y que el producto generado en cada paso tiene una pureza y rendimiento similares. (3) Igual que con cualquier tipo de estudio con muestras adicionadas, se debe demostrar que el nivel adicional más alto de AM no ha afectado el proceso de purificación. Si se emplea el segundo método de medición de niveles residuales de AM en cada lote, la especificación de la cantidad máxima de AM en el producto terapéutico final se basa en la cantidad de AM en los lotes utilizados en estudios toxicológicos o clínicos o en datos toxicológicos conocidos. El desarrollo de valoraciones analíticas sensibles y reproducibles para AM es otro componente importante de un método de reducción del riesgo. Dos tipos de valoraciones son útiles en la evaluación de los niveles de impurezas residuales de AM: una prueba límite y una prueba cuantitativa. Ambas pruebas deben ser exactas, precisas, robustas y tener un límite de detección bajo. Se pueden llevar a cabo valoraciones para detectar AM residuales en el producto antes de formularlo (por ejemplo, en el fármaco) para evitar cualquier tipo de interferencia de los componentes empleados en la formulación con la valoración de AM residuales o en el producto farmacéutico final. En dichas valoraciones a menudo se incluyen controles de recuperación de cantidades agregadas conocidas para demostrar que la matriz de muestra no inhibe la detección del AM. Preferentemente, las valoraciones se deben diseñar para que detecten todas las formas de AM, entre las que se incluyen aglomerados, fragmentos o conjugados. Se ha demostrado que las proteínas aglomeradas son especialmente inmunógenas. Las valoraciones inmunológicas como ELISA son las más comúnmente usadas para evaluar niveles residuales de AM. Se ha empleado un ELISA para seroalbúmina bovina (BSA) para evaluar niveles residuales de FBS. La tecnología de reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés), se ha utilizado para evaluar los niveles residuales de ADN de células anfitrionas. El marcado de células con 3H timidina o la ejecución de PCR para una secuencia génica específica de células de soporte son dos maneras de evaluar los niveles residuales de células de soporte. Si el "lavado" del AM se logra mediante una minuciosa dilución asociada a otras acciones de procesamiento, puede resultar útil calcular el factor de dilución para el AM durante este proceso. En algunos casos, es suficiente asegurar que el AM se redujo a niveles seguros para el desarrollo clínico inicial. Durante el desarrollo clínico posterior se deben obtener datos que permitan confirmar la eliminación por lavado del AM en los pasos esperados. Este método es particularmente útil cuando ya se conocen los niveles terapéuticos y la toxicidad del AM. En otros casos, se debe obtener información sobre la seguridad y tolerancia del AM (en estudios preclínicos de toxicología o posteriormente con estudios clínicos en seres humanos) para determinar los niveles seguros o no tóxicos que se deben lograr. Estos datos pueden ser necesarios incluso para un AM que esté aprobado para usar con fines terapéuticos si se va a utilizar de una forma diferente a la que establece su uso indicado o su etiquetado o si la vía de administración o nivel de dosificación del AM puede presentar riesgos que previamente no se han encontrado o considerado.
CONCLUSIÓN Si bien se emplean muchos tipos de AM durante la fabricación de productos celulares, génicos y de ingeniería tisular, se les ha dado menos importancia que a los productos finales. Sin embargo, no se puede exagerar la importancia de la calidad del AM para la calidad del producto final. Las diferentes partidas de AM de buena calidad deben cumplir uniformemente con las características de desempeño indicadas, si se seleccionan cuidadosamente y se usan como corresponde. Los AM de calidad insuficiente afectan la calidad y la eficacia del producto final y ponen en peligro la salud de los pacientes. En consecuencia, la implementación de un programa de calificación de AM que considere los riesgos asociados al AM, la etapa de fabricación en la que se use y la cantidad de AM utilizado durante la fabricación, asegurará la seguridad y eficacia del producto final.
Cambio en la redacción:
APÉNDICE Los AM utilizados en productos celulares, génicos y de ingeniería tisular se regularán en el contexto del proceso de fabricación de productos celulares, génicos y de ingeniería tisular. Algunos AM pueden ya estar aprobados para usos diferentes a la
USP 39
lnformacíon General/ (1044) Crioconservación de Células 975
fabricación de productos celulares, génicos y de ingeniería tisular. Se prefiere obtener AM que sean productos terapéuticos aprobados cuando estén disponibles porque están bien caracterizados con un perfil toxicológico establecido y fabricados según procedimientos controlados y documentados. La siguiente lista de documentos ofrece una guía normativa pertinente y una descripción de las mejores prácticas en el desarrollo de productos y procesos, fabricación, control de calidad y garantía de calidad: • Pruebas de Reactividad Biológica, In Vitro (87) • Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo (88) • • •
(AF 01-may-2016)
••Productos Derivados de Células y Tejidos (1046)• (Afo1 -may-2016) • Artículos Obtenidos por Biotecnología-Análisis de Aminoácidos (1052) • •Electroforesis Capilar (105 3) • (AF oi -may-2 o16¡ •Artículos Obtenidos por Biotecnología-lsoelectroenfoque (1054) • Artículos Obtenidos por Biotecnología-Mapeo de Péptidos (1055) • Artículos Obtenidos por Biotecnología-Electroforesis en Gel de Poliacrilamida (1056) •Artículos Obtenidos por Biotecnología-Va/oración de Proteínas Totales (1057) • 21 CFR 211 Subparte E, 211.80 a 211.94 y 211.101 • 21CFR312 •21 CFR314 • 21CFR801.109 (b) (1) • 21 CFR 807.81 a 21 CFR 807.97 • 21CFR812 •21 CFR814 • Center for Biologics Evaluation and Research de la FDA (CBER) "Draft Guidance for Monoclonal Antibodies Used as Reagents in Drug Manufacturing" (1999) • Center for Biologics Evaluation and Research de la FDA (CBER) "Points to Consider in the Characterization of Cell Lines Used to Produce Biologicals" (1993) • Center for Devices and Radiological Health de la FDA (CDRH) "Class 11 Special Controls Guidance Document: Tissue Culture Media for Human ex vivo Tissue and Cell Culture Processing Applications; Final Guidance for lndustry and FDA Reviewers" (16 de mayo de 2001) • CDRH Blue Book Memorandum G95-1 • ISO 10993-1: 1997 Evaluación Biológica de Dispositivos Médicos-Parte 1: Evaluación y Análisis "Biological Evaluation of Medical Devices-Part 1: Evaluation and Testing" • Conferencia Internacional de Armonización (ICH, por sus siglas en inglés) Q5A "Guidance for Viral Safety Evaluation of Biotechnology Products Derived from Cell Lines of Human and Animal Origin" • Conferencia Internacional de Armonización (ICH) Q5D "Guidance on Quality of Biotechnological/Biological Products: Derivation and Characterisation of Cell Substrates Used for Production of Biotechnological/Biological Products" • Public Health Service Guideline on lnfectious Diseases lssues in Xenotransplantation (18 de octubre de 2000)
(1044) CRIOCONSERVACIÓN DE CÉLULAS INTRODUCCIÓN La crioconservación es el proceso de enfriar y almacenar células, tejidos u órganos a temperaturas muy bajas para mantener su viabilidad. El propósito de la crioconservación es almacenar células por largos periodos para permitir su uso futuro en aplicaciones in vitro o in vivo, procurando que luego de la descongelación su función sea suficientemente representativa de la función previa a la congelación de las células. La crioconservación también minimiza los riesgos de mutación genética o desarrollo de subpoblaciones debidos a la replicación celular. Dependiendo de la aplicación, luego de la crioconservación se debe realizar una suficiente evaluación de la capacidad de división, proliferación, diferenciación, expresión de genes o producción de proteínas u otra propiedad funcional específica. Este capítulo presenta las mejores prácticas para la crioconservación, el mantenimiento y el uso de un amplio rango de células, productos de terapia celular y bancos de células derivadas de una variedad de fuentes, incluyendo cultivos humanos, animales y microbianos (el capítulo también contiene un Apéndice con documentos de guía adicionales que son útiles para tipos de células y aplicaciones particulares). Las células crioconservadas proveen una fuente disponible de células viables que se pueden usar, directa o indirectamente, para los propósitos de pruebas de diagnóstico, terapia, fabricación de medicamentos y vacunas, y para valoraciones biológicas que se usan para evaluar la potencia de fármacos y vacunas terapéuticos. En algunos casos, las células mismas, después de la crioconservación y la descongelación, constituyen una terapia para pacientes y, en otros casos, las células se propagan o manipulan de otra manera ex vivo para generar el producto (p.ej., una terapia celular de expansión de cultivo, una proteína terapéutica, un anticuerpo monoclonal o una vacuna). En todos los casos, la crioconservación
976 (1044) Crioconservación de Células/ lnformacíon General
USP 39
apropiada es esencial para conservar las propiedades celulares requeridas y, como objetivo final, para su aplicación en pro del avance de las terapias para pacientes.
PRINCIPIOS DE LA CRIOCONSERVACIÓN Consideraciones Generales Es crítico entender el papel del agua y la necesidad de eliminarla adecuadamente de las células o anular su capacidad para formar cristales de hielo, los cuales dañan la membrana celular, para lograr una crioconservación exitosa. Cuando las células se congelan en suspensión acuosa, a menudo son destruidas. No obstante, en la década de 1940, Polge y otros científicos descubrieron las propiedades crioprotectoras del glicerol. Desde entonces, se han identificado diversos químicos que se denominan genéricamente agentes crioprotectores. El mecanismo de acción de los agentes crioprotectores es complejo y no se ha podido entender en su totalidad. Sin embargo, de acuerdo con la teoría comúnmente aceptada de la acción coligativa, los agentes crioprotectores incrementan la concentración de soluto tanto dentro como fuera de la célula, con lo que se suprime la formación de hielo. Para este propósito, los denominados agentes crioprotectores de penetración (o intracelulares) [p.ej., dimetilsulfóxido (DMSO), glicerol, propanodiol y metanol] deben ser capaces de cruzar la membrana celular con facilidad y penetrar la célula sin presentar una toxicidad significativa. Existe también un grupo de agentes crioprotectores no penetrantes (o extracelulares) (p.ej., sacarosa y trehalosa) cuyo mecanismo de acción parece estar relacionado, al menos en parte, con su interacción estabilizante con las membranas celulares. Esta propiedad también puede explicar las actividades crioprotectoras de algunos compuestos de alto peso molecular tales como almidón hidroxietílico y polivinilpropileno. Los modelos teóricos de crioprotección por lo general evocan la teoría coligativa, pero aún no se ha establecido una explicación completa de la acción de los agentes crioprotectores. Una forma alternativa de conservación celular, comúnmente denominada vitrificación, mediante la cual la suspensión de células se carga de altos niveles de agentes crioprotectores de penetración (a menudo varios agentes combinados), induce un estado similar al vítreo en el que el agua celular y extracelular no puede formar cristales de hielo con facilidad. Cuando las suspensiones de células preparadas de esta manera se enfrían posteriormente con mucha rapidez (velocidades de enfriamiento de 100º-1000º/minuto o superiores) la viscosidad extrema evita la ósmosis y las moléculas de agua son incapaces de formar hielo. Este procedimiento se ha usado ampliamente para estructuras complejas, incluyendo una variedad de tejidos humanos, vegetales y animales, y puede ayudar a conservar aquellas preparaciones celulares con grados variables de permeabilidad celular o cuando la crioprotección estándar no es capaz de entregar el rango de condiciones requerido para conservar la viabilidad en todos los tipos de células que componen los tejidos. Los agentes crioprotectores tienen actividades biológicas que van más allá de sus propiedades crioprotectoras. Algunos agentes, como el DMSO, pueden afectar la membrana celular, el citoesqueleto y la expresión genética, y pueden ser tóxicos para las células después de una exposición prolongada. Por lo tanto, durante el desarrollo de nuevos protocolos de crioconservación, los analistas deben realizar un ensayo de toxicidad en el que las células se expongan al agente crioprotector durante un rango de intervalos de tiempo para evaluar la pérdida de viabilidad o la alteración de su funcionalidad.
Elementos Clave de la Práctica de Crioconservación El desarrollo del método para cualquier muestra celular o producto terapéutico que se va a crioconservar debe tratar los siguientes elementos: PROCESAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN PREVIOS A LA CONGELACIÓN Es crítico optimizar la condición de las células inmediatamente antes de la crioconservación para lograr un resultado exitoso. El carácter y el grado del procesamiento previo a la congelación depende del estado de las células originales extraídas para su conservación, de la composición de la suspensión de células y de las etapas de procesamiento específicas que llevan a la crioconservación. El procesamiento previo a la congelación puede incluir la selección de subpoblaciones, la expansión ex vivo o la incubación con factores de activación o cebado. Se deben establecer las características previas a la crioconservación y la identidad de las células durante las etapas tempranas del desarrollo del proceso. Particularmente para los bancos de células, se debe documentar el estado de las células y las condiciones óptimas de crecimiento, las características y la autenticidad, y se debe contar con un historial bien documentado (con rastreabilidad a un banco de células calificado o una fuente aceptable). El estado y el historial de las células por lo general se describen en términos del carácter y el número de manipulaciones y pasajes de cultivo a partir de las células primarias o del aislado original. Las células finitas o primarias a menudo se crioconservan en un pasaje temprano para mantener la integridad del tejido original, aunque se pueden clonar y expandir líneas celulares continuas, con lo que se asegura una población de células homogénea. Se recomienda preparar bancos de células a partir de una preparación individual o población expandida de células, puesto que a menudo resulta necesario combinar las células de múltiples vasos de cultivo para su congelación. No se deben combinar células de cultivos con diferentes historiales de pasaje ni, evidentemente, de diferentes donantes. En ambos casos, los analistas deben mantener registros detallados de los procedimientos.
USP 39
lnformacíon General/ (1044) Crioconservación de Células 977
Con el fin de preparar la crioconservación de células cultivadas, las células deben recolectarse durante la fase exponencial o más rápida de crecimiento y antes de que el cultivo entre en la fase estacionaria. La recolección de células durante esta fase asegura que las células sean más viables y uniformes. La concentración óptima de células dependerá del tipo de célula, del propósito y de la mejor recuperación posible. Por lo regular, esto se encuentra entre 106 y 107/mL para bancos de células de fabricación, pero puede ser diferente para otros propósitos. También puede ser beneficioso completar la renovación del medio de crecimiento un día antes de recolectar las células. Además, la mayoría de las suspensiones de células se benefician del lavado por centrifugación y de la resuspensión en un medio isotónico hasta alcanzar una concentración celular específica. El procesamiento previo a la congelación no debe resultar en células que estén bajo estrés antes del inicio del proceso de congelación o las pérdidas celulares durante la congelación o después de la descongelación serán mayores que las esperadas. Es importante optimizar las condiciones de crecimiento de una línea celular o de células primarias para mantener una alta viabilidad de las células en el cultivo. Por lo regular, las células que crecen de manera activa y en una fase exponencial presentan una relación baja entre citoplasma y volumen nuclear, lo que lleva a la crioconservación exitosa con crioprotectores de penetración. Las condiciones de cultivo inapropiadas o por debajo de las condiciones óptimas pueden generar una viabilidad menor y estados celulares que serán menos robustos para la conservación y la recuperación. Se debe optimizar el medio de cultivo y usar el mismo medio durante todos los experimentos; asimismo, se debe calificar cada partida de materiales derivados de animales (p.ej., suero) y demás reactivos de cultivo (p.ej., ver la guía de la OMS 201 Oy la guía de la FDA 201 O referidas en el Apéndice). Si fuera posible, se recomienda no usar componentes derivados de animales en el medio de cultivo, en particular para células usadas para terapia o como sustratos de fabricación. De conformidad con la guía de la OMS 201 O y basándose en una evaluación de riesgos, se debe analizar el Banco Maestro de Células o el Banco de Células de Trabajo para determinar la presencia de agentes adventicios. Idealmente, se deben analizar muestras de células para determinar la presencia de agentes adventicios antes de la congelación. El régimen específico de análisis para determinar la presencia potencial de contaminación microbiana o viral de las células depende de la fuente donante, del historial del cultivo y del uso previsto. Se deben mantener registros detallados del historial de las células como fundamento para una evaluación de riesgos apropiada a fin de dirigir cualquier análisis suplementario que pueda ser requerido (p.ej., exposición a virus bovinos en albúmina sérica bovina). Los requisitos reglamentarios específicos para el análisis de células, o donantes de las células, para productos destinados para un uso en particular (p.ej., terapias celulares o fabricación de vacunas) se basan en experiencias anteriores relacionadas con agentes clave que deben incluirse o considerarse. El capítulo general de la USP Productos Derivados de Células y Tejidos (1046) contiene guías sobre requisitos de análisis de esterilidad y seguridad para productos de terapia celular. REACTIVOS Y ENVASES Todos los crioprotectores, envases, entre otros, deben ser adecuados para su propósito, conforme a lo indicado en las pautas reglamentarias pertinentes. Por lo regular, se usan bolsas, crioviales y pajuelas de plástico desechables y estériles para un solo uso en crioconservación. Las especificaciones del fabricante deben ser revisadas cuidadosamente para asegurar que el material usado para fabricar el crioenvase es apropiado para su uso a la temperatura de almacenamiento, que es químicamente compatible con el contenido, que minimiza el potencial de lixiviables y extraíbles, y que asegura la integridad del cierre del envase. Cuando se usen pajuelas, entonces la contención primaria o secundaria durante el almacenamiento será importante para prevenir el contacto directo de las células conservadas con el nitrógeno líquido. Los crioviales deben seleccionarse basándose en su capacidad para proveer al banco de células una integridad adecuada. La conservación de células por lo general requiere el uso de soluciones especializadas que contienen una base (por lo general una solución salina isotónica) con los agentes crioprotectores (con mayor regularidad, DMSO, pero en ocasiones glicerol) y en ocasiones proteínas (suero fetal bovino, suero o plasma humano, medio acondicionado o albúmina humana). Puede ser necesario determinar la composición óptima para los diferentes tipos de células. Los tipos de viales, etiquetas, tinta o marcadores usados deben tolerar las temperaturas extremas del nitrógeno líquido. Las marcas en la etiqueta deben ser legibles y, de ser posible, contar con código de barras. La información mínima que se debe incluir en la etiqueta es el nombre o la descripción de la población celular, la fecha de crioconservación, el número de lote y el número de pasajes, si fuera necesario. Puesto que la mayoría de las crioetiquetas son muy pequeñas, se puede incluir información adicional en la documentación relacionada. En algunas aplicaciones, también puede ser necesario numerar los viales de manera secuencial dentro de un solo lote como parte de la información mínima de la etiqueta a fin de permitir un mejor control sobre el movimiento de los viales de un banco individual, y para identificar sectores del banco que pudieran haberse sometido a condiciones diferentes de crioconservación. ADICIÓN DE SOLUCIÓN CRIOPROTECTORA Las soluciones crioprotectoras por lo general son hipertónicas y no son fisiológicas. Por ejemplo, una solución de DMSO al 10% usada comúnmente en la conservación celular tiene una concentración aproximadamente 1,4 osmolar (Osmol/L). Las células introducidas en este tipo de solución se deshidratan rápidamente a medida que el agua abandona la célula para reducir la diferencia de potencial osmótico entre el interior y el exterior de la célula. El DMSO permea lentamente la célula para lograr el reequilibrio, lo cual puede ocasionar variaciones en el volumen que pueden resultar en una pérdida de viabilidad celular. Por ende, las soluciones de crioconservación comúnmente se agregan a una suspensión de células en adiciones por etapas o gra-
978 (1044) Crioconservación de Células/ lnformacíon General
USP 39
dualmente (p.ej., usando una bomba con jeringa) o dispensando lentamente por la pared del envase para evitar pérdidas como resultado del estrés por ósmosis. El método para introducir o eliminar una solución de crioconservación debe desarrollarse y evaluarse tomando en cuenta su impacto sobre la viabilidad y la funcionalidad celular. En el caso del DMSO, una entalpía latente elevada del mezclado resulta en el calentamiento de la muestra al mezclar las dos soluciones. Este calentamiento puede ser lo suficientemente elevado para dañar las células, por lo que las soluciones que contienen DMSO comúnmente se enfrían antes de mezclarlas. El preenfriamiento de la solución reduce el calentamiento asociado con el mezclado de la solución, reduce los cambios en el volumen osmótico que experimentan las células y reduce las pérdidas celulares asociadas con la exposición al DMSO. El tiempo que las células se exponen al crioprotector antes de la congelación debe limitarse, mientras que el tiempo máximo permisible, sin efectos nocivos, debe determinarse durante el trabajo de desarrollo para el uso de rutina. ENFRIAMIENTO Por lo general, se usan dos tipos distintos de congelación para las células: enfriamiento a velocidad controlada (usando congeladores programables) y enfriamiento pasivo (que incluyen el uso de envases con aislamiento). Las fuentes de nitrógeno líquido se equipan con congeladores a velocidad controlada. La temperatura de la cámara debe controlarse incrementando o reduciendo el flujo de gas de nitrógeno frío en la cámara de acuerdo con una etapa preprogramada. Los protocolos de congelación a velocidad controlada generalmente implican diversas etapas, cada una de las cuales debe ser evaluada y calificada para un tipo específico de células. El uso de congelación a velocidad controlada provee un control más preciso del entorno de congelación y, por ende, puede proveer una recuperación posterior a la descongelación más uniforme (y mayor) para células que pueden tener un rango más estrecho de velocidades de enfriamiento asociadas con la supervivencia máxima o células que son sensibles a la temperatura a la que se forma el hielo en la solución extracelular. Las sondas de temperatura colocadas cerca de las células que se están congelando, o en una suspensión simulada de células que se somete simultáneamente a crioconservación, se usan para monitorear el proceso de congelación y para proveer un control del proceso. Si la liberación de calor latente de la fusión se retarda o no se controla adecuadamente, las células que se someten a crioconservación pueden resultar dañadas y pueden presentar una disminución en la viabilidad después de la descongelación. Pueden ocurrir interrupciones en la congelación a velocidad controlada durante el protocolo las cuales, por lo general, son ocasionadas por fallas en una válvula del congelador o aparato de criogenia de velocidad controlada. Se deben preparar protocolos para manejar las interrupciones durante el proceso de congelación así como planes de respaldo. La congelación pasiva implica colocar un producto en un congelador (aproximadamente -80º o -150º) y permitir que la muestra se enfríe descontroladamente. Se usa un aislante o cajas especialmente diseñadas para reducir la velocidad de enfriamiento de la muestra. Se debe evaluar y calificar la velocidad de enfriamiento promedio lograda para la mayoría de los procesos así como la uniformidad de las curvas de congelación para los propósitos deseados. En general, el control del entorno térmico durante la congelación resulta en una mejor recuperación posterior a la descongelación, aunque ciertas células presentan una recuperación posterior a la descongelación comparable cuando se enfrían de manera pasiva. ALMACENAMIENTO, SEGURIDAD Y TRANSPORTE CRIOGÉNICOS Después de completar el proceso de congelación, los productos son transferidos de congeladores a velocidad controlada o mecánicos a unidades de almacenamiento criogénico. Algunos cultivos celulares microbianos pueden mantenerse adecuadamente en congeladores mecánicos, aunque esto debe demostrarse. Se debe minimizar el entibiamiento de la muestra al transferir el producto celular del dispositivo de congelación al lugar de almacenamiento. Se pueden usar mesas frías o dispositivos de transferencia con aislamiento para minimizar el entibiamiento durante la transferencia. Las células que acaban de ser crioconservadas por lo regular se colocan en una unidad de almacenamiento criogénico para cuarentena antes de completar el análisis para detectar la presencia de agentes adventicios. Después del análisis, las células que arrojan resultados negativos en la determinación de agentes adventicios pueden ser liberadas para su transferencia a unidades de almacenamiento criogénico a largo plazo. El sistema de inventario (o depósito) para el mantenimiento de las células crioconservadas debe tener un diseño de fácil acceso que minimice la manipulación de las muestras, además de que se debe limitar el número de accesos por día a un depósito puesto que la exposición a temperaturas más altas puede comprometer la viabilidad celular y, por consiguiente, la estabilidad a largo plazo. Los bancos de células (p.ej., bancos maestros de células) u otros cultivos celulares a los que se accede con poca frecuencia deben almacenarse por separado de los bancos de células de trabajo o de otros cultivos celulares a los que se accede con mayor regularidad. La recuperación frecuente a partir del banco/cultivo celular puede ocasionar cambios en la temperatura. Esta actividad no debe comprometer la estabilidad a largo plazo ni el desempeño del banco/cultivo celular usado con poca frecuencia. Asimismo, resulta valioso dividir un banco y almacenarlo en sitios múltiples para reducir los riesgos debidos a un evento catastrófico en un sitio particular. Al almacenar células crioconservadas, los analistas deben asegurar que la temperatura de almacenamiento no se eleve por encima de una temperatura crítica denominada temperatura de transición vítrea. Para el almacenamiento a largo plazo de muestras que requieren de atención y cuidados especiales tales como líneas celulares y cultivos celulares primarios, esta temperatura crítica no es superior a -130º para muestras no clínicas y no es superior a -150º para material clínico (para proveer un
USP 39
lnformacíon General/ (1044) Crioconservación de Células 979
margen de error adecuado) en la fase de vapor del congelador de nitrógeno líquido. Los congeladores de nitrógeno líquido son propensos a gradientes de temperatura en la fase de vapor basándose en la forma y el diseño del congelador y el nivel de nitrógeno líquido. Aunque el almacenamiento de células crioconservadas en nitrógeno líquido prolonga su longevidad, los riesgos asociados con el uso de envases inadecuados (p.ej., explosión de viales o ruptura de bolsas) han derivado en un mayor uso del almacenamiento en fase de vapor de nitrógeno. La fase de vapor de nitrógeno líquido provee un entorno más conveniente y seguro para la recuperación de viales. Cuando el congelador de nitrógeno líquido se configura adecuadamente, la temperatura de trabajo en la fase de vapor es, por lo regular, -150º o menor. Se debe calificar el congelador de nitrógeno líquido, además de que se debe verificar de manera rutinaria la temperatura de la fase de vapor para asegurar que dicha temperatura no sobrepase los -130º para líneas celulares u otro material congelado, o sobrepase los -150º para material usado en aplicaciones clínicas (p.ej., terapias celulares). Los sistemas de monitoreo de temperatura deben permitir el registro y el almacenamiento del historial de temperaturas para propósitos de control de calidad. Las unidades de almacenamiento deben estar conectadas a alarmas y a los sistemas de monitoreo de la instalación. Las unidades de almacenamiento crítico deben equiparse con un sistema de alarma de niveles múltiples para asegurar el respaldo del monitoreo y de la respuesta. Las unidades de almacenamiento deben monitorearse de manera rutinaria para detectar fallas en la temperatura ocasionadas por interrupciones eléctricas y cualquier otro fallo potencial. En caso de fallas del equipo o eléctricas, se debe contar con refrigeración de respaldo. La operación apropiada de un depósito requiere monitorear la temperatura, los niveles de nitrógeno líquido y el llenado automático. Asimismo, se recomienda contar con un respaldo para enfriamiento de emergencia (p.ej., almacenamiento criogénico de respaldo vacío) en caso de que falle el congelador. Únicamente el personal capacitado para este propósito debe tener acceso a los productos o las muestras crioconservadas. En algunos casos, la verificación por parte de una segunda persona será necesaria para propósitos de rastreabilidad de la fuente. El personal designado para la implementación de los protocolos debe estar capacitado en procedimientos operativos estándar (POE). Los sistemas de rastreo de muestras que incorporan software y en ocasiones códigos de barras para identificación, registro y rastreo de muestras congeladas son particularmente útiles para los depósitos grandes de muestras y pueden facilitar la recuperación rápida de muestras y minimizar el tiempo que el depósito completo se expone al riesgo de desviaciones de temperatura. Además, se recomienda que todos los cambios a los inventarios del crioalmacenamiento se registren en bitácoras cercanas a la unidad de almacenamiento. Los productos y muestras tales como células primarias, líneas celulares y productos de terapia celular por lo regular se transportan entre sitios de recolección, procesamiento, almacenamiento y uso. Las células crioconservadas por lo regular se transportan en transportadores de vapor de nitrógeno líquido con sistemas de monitoreo de temperatura para asegurar que la temperatura de la unidad no sobrepase los -130º para líneas celulares ni los -150º para material clínico durante el proceso de transporte. Los contenedores para transporte están sujetos a vibraciones y tensiones mecánicas importantes durante el transporte y se deben evaluar de manera regular para asegurar su funcionamiento óptimo. Los estudios de validación del transporte deben abarcar las condiciones más exigentes e incluir los datos de monitoreo de temperatura para materiales críticos. Las células crioconservadas, independientemente de si se transportan dentro del país o internacionalmente, deben transportarse cumpliendo con las reglamentaciones para el correo local, del US Department of Transportation (Departamento del Transporte de EE.UU.) y de la lnternational Air Transport Association (Asociación de Tansporte Aéreo Internacional). Los empaques también deben cumplir con los demás requisitos reglamentarios para cuarentenas, prevención y seguridad biológica. Las células crioconservadas deben recuperarse, envasarse y transportarse de una manera que no interfiera con la integridad de las células. Para la mayoría de las células crioconservadas, puede ser adecuado el transporte en hielo seco durante periodos cortos, pero se debe validar el proceso de transporte y demostrar que no tiene un impacto adverso sobre las células, además de que se deben incluir monitores de temperatura. No obstante, algunas células pueden requerir de transporte en fase de vapor de nitrógeno líquido (Dewars). Puede ser necesaria la validación previa de los métodos de transporte para determinar la mejor opción y se debe realizar una evaluación de riesgo previa a la validación incluso si se está considerando una sola opción de transporte. Con el envío, los transportistas deben incluir instrucciones para el almacenamiento apropiado al recibir las células. DESCONGELACIÓN Las células que se congelan usando métodos convencionales (congelación a velocidad controlada o pasiva) o mediante vitrificación, se deben descongelar con la mayor rapidez posible y el proceso de descongelación inicia tan pronto como la muestra congelada se retira del almacenamiento. Las velocidades lentas de entibiamiento generan daños por recristalización o exposición de las células a altas concentraciones extracelulares de agentes crioprotectores, los cuales pueden producir muerte celular. Se debe desarrollar el procedimiento de descongelación más apropiado (temperatura, gradiente y tiempo) para cada producto de terapia celular y línea celular. Estos productos y líneas celulares por lo general se descongelan en un baño de agua tibia, o en el caso de preparaciones celulares terapéuticas, en un baño de perlas o termobloque. El baño de agua debe limpiarse con regularidad y debe contener agua estéril o Agua para Inyección. La temperatura del baño también debe monitorearse. Muchos laboratorios clínicos emplean bolsas de plástico para envolver y contener el envase primario durante la descongelación rápida a fin de reducir el riesgo de contaminación del producto en caso de que se comprometiera la integridad del envase interno. Como alternativa, se pueden usar baños de perlas tibios (por lo general a aproximadamente 37º) para reducir los riesgos de contaminación. Las velocidades de descongelación deben ser lo más rápidas posible(> 1 º/s para la mayoría de las células de mamíferos). El aumento de las temperaturas del baño por encima de 42º para incrementar la velocidad de entibiamiento se
980 (1044) Crioconservación de Células / lnformacíon General
USP 39
debe realizar con extremo cuidado debido a que las temperaturas hipertérmicas pueden dañar las células, induciendo necrosis o apoptosis. PROCESAMIENTO Y EVALUACIÓN POSTERIOR A LA DESCONGELACIÓN Puesto que las soluciones para crioconservación no son fisiológicas, es normal llevar a cabo algunos procesos posteriores a la descongelación. Para células conservadas en DMSO, las células por lo general se lavan o diluyen inmediatamente después de la descongelación debido a que este agente crioprotector es dañino, en particular para las células congeladas y descongeladas. Las células son más sensibles a expandirse que a contraerse, por lo que los protocolos de eliminación o dilución del agente crioprotector deben optimizarse cuidadosamente para prevenir pérdidas celulares derivadas de la dilución o eliminación. La cuantificación de la viabilidad de las células después de la congelación es importante y puede realizarse usando una variedad de métodos, dependiendo de los requisitos de las células posteriores a la congelación. Se deben establecer límites mínimos de viabilidad basándose en la experiencia, además de que se deben desechar los productos descongelados con viabilidades por debajo de los límites establecidos. Los procesos de crioconservación someten a las células a tensiones importantes que pueden alterar la función metabólica, la estructura de la membrana, entre otros. Por lo tanto, resultan críticos el desarrollo y la validación de ensayos adecuados posteriores a la descongelación. La función posterior a la descongelación generalmente se evalúa usando la integridad física (p.ej., integridad de la membrana), la actividad metabólica, la actividad mecánica (acoplamiento o contracción), la actividad mitótica o el potencial de injerto. La selección del ensayo depende en gran medida de la función deseada de la célula después de la descongelación. La integridad de la membrana es la que se usa con mayor frecuencia. Hoy en día, los colorantes como el azul de tripán se usan con menos regularidad para medir la integridad física posterior a la descongelación debido a que el colorante es difícil de validar en células congeladas y descongeladas. El método para analizar la viabilidad debe seleccionarse y calificarse con cuidado para el tipo de célula en particular que se está midiendo con un protocolo que especifique los diluyentes y el tiempo. El uso de colorantes fluorescentes es cada vez más frecuente para determinar la integridad física de las células posterior a la descongelación. Los métodos rigurosos de evaluación posterior a la descongelación generalmente implican múltiples mediciones de la viabilidad celular y, en particular, al menos dos ensayos independientes para medir la viabilidad posterior a la descongelación. Por ejemplo, la adherencia al sustrato y la proliferación posterior a la descongelación se usan comúnmente para evaluar la viabilidad. A medida que aumenta la complejidad de la función celular deseada después de la descongelación, también crece la necesidad de una evaluación posterior a la misma. Por ejemplo, la evaluación posterior a la descongelación de células madre puede requerir la valoración de la integridad de la membrana así como de la proliferación y de la capacidad de las células ·para diferenciarse en linajes diferentes después de la congelación. Los ensayos posteriores a la descongelación deben desarrollarse y validarse cuidadosamente para evitar sesgos en las mediciones. Una cierta fracción de células se lisarán durante la congelación y los métodos para medir la recuperación celular deben incluir una evaluación completa de las pérdidas celulares (células que se han lisado así como céluas que están intactas pero que no son viables). La estabilidad de las células crioconservadas se puede asegurar mediante la descongelación y el análisis periódicos de un vial de las células (ver también la pauta ICH QSD). El análisis de agentes adventicios después de la preparación de los bancos maestros de células y de los bancos de células de trabajo debe ser parte de la rutina, y los capítulos generales de la USP Evaluación de la Seguridad Viral en Productos Biotecnológicos Obtenidos de Líneas Celulares de Origen Humano o Animal (1050) y Métodos de Pruebas Virológicas (1237) proveen guías de análisis adicionales (ver también la guía de la FDA 201 O citada en el Apéndice). El análisis de contaminación micobacteriana, que podría no ser detectada en un análisis de esterilidad estándar, también se puede considerar para algunos sustratos celulares. Se deben recuperar y analizar viales representativos para determinar la presencia de contaminación (bacterias, hongos, Micoplasmas y virus). Se encuentra disponible una gran cantidad de métodos bien establecidos para detectar Micoplasmas en cultivos celulares (ver el capítulo general de la USP Pruebas para Micoplasmas (63)). El registro de las partidas debe ser detallado e incluir el historial de las células y de todas las actividades, desde la recepción hasta la liberación de los bancos celulares o de los productos para su uso. El registro debe incluir información detallada sobre el proceso de crioconservación, incluyendo el procedimiento, el equipo usado (con un identificador único) y un registro impreso del perfil de congelación. La viabilidad de las células crioconservadas deben monitorearse con el paso del tiempo para confirmar la efectividad del proceso de congelación y de las condiciones de almacenamiento. La información registrada en cada archivo de partida de una línea celular debe ser rastreable a la fuente original y todos los documentos deben mantenerse y actualizarse de acuerdo con el sistema de gestión de calidad en uso.
CRIOCONSERVACIÓN DE PRODUCTOS DE TERAPIA CELULAR DERIVADOS DE CÉLULAS HUMANAS Los métodos de conservación de células se utilizan para asegurar la estabilidad del producto durante las etapas de retención, almacenamiento y transporte para un amplio rango de productos basados en células humanas (el capítulo (1046) ofrece información adicional). Las células se pueden conservar en suspensión líquida durante unos cuantos días, pero invariablemente ocurrirán cambios cuantitativos y cualitativos en el producto celular con el paso del tiempo. Aunque la conservación en estado de congelación también afecta al producto celular, ésta permite una conservación de las características específicas del producto más predecible durante intervalos de tiempo mucho más prolongados.
USP 39
lnformacíon General/ (1044) Crioconservación de Células 981
Para cualquier producto celular determinado, la decisión de usar la crioconservación depende principalmente del tiempo de la administración del producto final en relación con la recolección a partir de la fuente de las células y de las etapas de fabricación del producto. Muchos productos autólogos y alogénicos para pacientes específicos se mantienen en suspensión líquida, sin crioconservación, desde la fuente inicial de las células hasta la formulación final, y se liberan como productos frescos después de un tiempo relativamente corto. No obstante, muchas aplicaciones clínicas requieren la crioconservación de la fuente de las células, de los productos intermedios o del producto final. En estos casos, la crioconservación puede permitir la optimización del flujo de trabajo durante la fabricación, la culminación del análisis de liberación de lotes, el mantenimiento y gestión de un inventario de productos, el transporte del producto al sitio clínico y la coordinación de la administración del producto con el régimen médico o quirúrgico del paciente. Por ejemplo, la sangre del cordón umbilical se crioconserva y almacena en bancos públicos para su transporte subsiguiente y almacenamiento temporal en centros de transplante clínicos, en donde se descongela inmediatamente antes de su infusión en un paciente. El desarrollo de un proceso de crioconservación para una terapia celular clínica debe considerar las consecuencias para el producto, para el paciente y para la viabilidad general de la terapia. Para el producto celular, el fabricante debe asegurar que las pérdidas celulares esperadas debidas a la crioconservación y la descongelación ocurran de una manera que sea razonablemente predecible y debe asegurar que el producto final que se administra al paciente cumplirá con las especificaciones de número, viabilidad y características funcionales de las células. Para el paciente, la crioconservación puede afectar la eficacia y la seguridad del producto final. Por ejemplo, el DMSO crioprotector se asocia con el riesgo de toxicidades predecibles gastrointestinales, cardiovasculares y neurológicas que dependen de la dosis que generalmente se adscriben a la liberación de histamina. Se debe estimar o medir el DMSO residual en el producto final. El DMSO está categorizado por la ICH como un disolvente o excipiente Clase 3 (de riesgo relativamente bajo) en productos farmacéuticos, y se consideran aceptables sin justificación cantidades de hasta 50 mg/día o menos (ver la norma ICH Q3C). Los productos celulares crioconservados con frecuencia contienen 10-20 veces esta cantidad, a menos que se laven después de la descongelación. Pueden presentarse incluso cantidades mayores de DMSO con la administración de múltiples productos crioconservados, lo que ocurre comúnmente con el transplante de células madre autólogas de la sangre periférica. Por lo regular se usa un límite de DMSO de 1 g/kg peso del receptor/día en la práctica de la terapia celular clínica. Asimismo se deben tomar en cuenta los procedimientos para prevenir la toxicidad del DMSO. Resulta una práctica clínica común premedicar a pacientes con difenhidramina u otros agentes antihistamínicos para prevenir la toxicidad del DMSO. Asimismo, se pueden considerar métodos de lavado del producto ya sean manuales (centrifugación) o automáticos, aunque deben validarse para asegurar una recuperación y función celular posteriores al lavado adecuadas. El uso de productos de terapia celular crioconservados puede requerir que el sitio clínico reciba, almacene, descongele y lleve a cabo otras etapas de preparación finales en el producto crioconservado. La evaluación de viabilidad requiere tomar en cuenta las capacidades del sitio con respecto al personal especializado, capacitación, equipo e instalaciones para llevar a cabo dichas tareas. Si la crioconservación se planea como parte del proceso de fabricación, los equipos de desarrollo deben considerar el efecto de la crioconservación sobre el número y las características de las células y debe requerir métodos confiables de enumeración celular y de evaluación de la viabilidad y la función de las células. Durante las corridas de desarrollo, a menudo se realizan más ensayos que los que serán eventualmente requeridos para los análisis durante el proceso y del producto final. Esto se hace para evaluar los efectos que tiene cada manipulación sobre el producto. Debido a que algunas células pueden ser más susceptibles que otras a los daños por congelación-descongelación, estos estudios deben incluir la evaluación de pérdidas selectivas de subpoblaciones celulares importantes dentro del producto. Tal como se describe en la Introducción, el resultado de un protocolo de crioconservación se ve afectado por diversos procesos críticos. A continuación se tratan brevemente cuestiones exclusivas de las terapias celulares.
Procesamiento Previo a la Congelación Si las células se recolectan en presencia de plasma, las muestras deben procesarse adecuadamente con un anticoagulante para prevenir la coagulación. Además, algunas células son propensas a aglutinarse o a agregarse al ser centrifugadas, y algunos productos celulares pueden presentar daños o pérdidas excesivas de una o más poblaciones dentro del producto. Las células recolectadas de cultivos adherentes o no adherentes pueden incluir cantidades importantes de células muertas o frágiles. Por ende, las etapas de centrifugación y lavado deben ser optimizadas y también específicas para el contenido del producto celular, el volumen de suspensión, el medio de suspensión y el envase, junto con una evaluación apropiada del producto celular antes y después de estas manipulaciones. El procesamiento previo a la congelación no debe resultar en células que estén estresadas (p.ej., células que presenten marcadores apoptóticos tempranos o respuestas por golpe de temperatura elevados) antes del inicio del proceso de congelación, o las pérdidas celulares serán mayores que las esperadas.
Reactivos y Envases Se deben usar reactivos y envases de grado clínico siempre que sea posible (ver Materiales Auxiliares para Productos Celulares, Génicos y de Ingeniería Tisular (1043)). Resulta una práctica común usar bolsas o crioviales de plástico desechables y estériles de un solo uso que han sido calificados para el proceso de crioconservación y las condiciones de almacenamiento subsiguientes específicos. Los medios de crioconservación para productos de terapia celular por lo regular consisten en soluciones isotónicas
982 (1044) Crioconservación de Células/ lnformacíon General
USP 39
basadas en sales con uno o más crioprotectores, por lo regular el DMSO crioprotector intracelular a una concentración final del
5%-10% con o sin un crioprotector extracelular como almidón hidroxietílico. Resulta común el uso de aditivos de proteínas de origen humano tales como albúmina sérica humana, suero o plasma, aunque pueden requerir de calificación extensa, por lo que se deben evitar cuando sea posible y evaluarse otras alternativas. En ocasiones se utilizan aditivos tales como heparina derivada de animales, anticoagulantes basados en citratos y ADNasa. Muchos centros formulan sus propios medios de crioconservación, pero el uso de medios de crioconservación comerciales, que por lo regular incluyen DMSO al 5%-10% y otros componentes de patente, se ha incrementado entre los fabricantes de terapias celulares para eliminar la variabilidad y la necesidad de actividades de calificación adicionales relacionadas con la formulación local.
Adición de Solución Crioprotectora y Enfriamiento Los procedimientos para la introducción o eliminación de una solución de crioconservación debe evaluarse antes de la congelación para asegurar que las pérdidas celulares resultantes de esta etapa se mantengan al mínimo. El medio de crioconservación por lo general se agrega a la suspensión de células en etapas o gradualmente (p.ej., usando una bomba con jeringa) para evitar pérdidas como resultado del estrés por ósmosis. Resulta común preenfriar el medio de crioconservación y mantener la suspensión de células y la mezcla frías usando compresas frías, una frazada fría o una superficie de trabajo fría para prevenir daño celular relacionado con el calor durante la adición del DMSO. Una vez que se agrega el medio de crioconservación, la suspensión de células por lo general se transfiere a la cámara preenfriada de un congelador de velocidad controlada. Durante el proceso de congelación, se genera un registro, o curva de congelación, de la temperatura de la cámara y del producto con el paso del tiempo para su inclusión en el registro de producción. Las temperaturas del producto se pueden registrar usando una sonda colocada en la superficie externa de la bolsa del producto o desde el interior de un producto comparable en una bolsa o vial de simulación que se somete a congelación de manera paralela.
Almacenamiento y Transporte Los productos de terapia celular crioconservados por lo regular se almacenan y transportan a temperaturas de -150º o menores. La FDA requiere la detección y el análisis de evidencia de enfermedades transmisibles sólo para donantes alogénicos de productos de terapia celular y no para donaciones autólogas. Sin embargo, cuando sus productos deben ser almacenados, muchos centros analizan donantes autólogos y productos segregados derivados de donantes autólogos quienes se sabe que padecen enfermedades transmisibles. Un informe sobre contaminación cruzada con hepatitis B de productos celulares dentro de un tanque de almacenamiento de nitrógeno líquido llevó a las prácticas actualmente vigentes de almacenamiento en la fase de vapor de nitrógeno líquido y al uso de bolsas para envoltorio para reforzar la contención del producto. El almacenamiento en fase de vapor de nitrógeno líquido se puede asociar con gradientes de temperatura verticales: los productos en la parte superior del tanque de almacenamiento pueden estar expuestos a una temperatura más cálida que los almacenados en la parte inferior del mismo. Los gradientes de temperatura deben ser monitoreados y se deben minimizar los gradientes de temperatura verticales, p.ej., mediante el uso de deflectores metálicos de calor. Las bolsas para envoltorio pueden reducir la velocidad de entibiamiento de la muestra si se usan durante el proceso de descongelación subsiguiente y su uso debe calificarse como parte de la validación general del proceso de crioconservación. El transporte de productos de terapia celular crioconservados a menudo se logra usando contenedores criogénicos secos que contienen material absorbente que se puede cargar con nitrógeno líquido para mantener temperaturas de fase de vapor por un plazo de hasta 2 semanas cuando se cargan adecuadamente. Se deben usar registradores de datos para documentar el historial de temperatura durante el transporte. Además, dichos contenedores y procedimientos de transporte deben validarse antes de transportar los productos de terapia celular para uso clínico en los envases.
Entibiamiento (Descongelación) Aunque la descongelación de los productos de terapia celular en el área adyacente a la cama de un paciente antes de la infusión se ha considerado una práctica clínica común, hoy en día el uso de personal capacitado en un ambiente de laboratorio controlado se reconoce como el método preferido para la descongelación debido a que permite un proceso más estandarizado y un grado mayor de control cuando el personal debe responder a una falla en el envase, lo cual puede requerir la recuperación de producto en un entorno más estéril. La descongelación del producto por lo regular se realiza mediante inmersión en baños de agua a 37º usando bolsas para envoltorio a fin de minimizar la pérdida de producto y la contaminación en caso de fallas en el envase primario. Las bolsas pueden amasarse suavemente durante la descongelación para reducir los gradientes de temperatura en toda la bolsa y para acelerar la descongelación. El producto se retira del baño de agua cuando todavía hay algo de hielo presente en el producto pero la mayoría del producto se ha descongelado.
Procesamiento Posterior a la Descongelación El DMSO es tóxico para las células en suspensión líquida. La toxicidad puede reducirse diluyendo o lavando la suspensión de células antes de la infusión o de la manipulación adicional. Debido a que las células crioconservadas descongeladas son más
USP 39
lnformacíon General/ (1044) Crioconservación de Células 983
sensibles a la expansión volumétrica cuando las células pasan de una solución hipertónica a una solución isotónica, las soluciones y métodos de dilución y lavado deben diseñarse y validarse cuidadosamente. El lavado de células usando una centrífuga convencional o un dispositivo automático puede resultar en tensión mecánica adicional para las células, por lo que las pérdidas celulares deben evaluarse con un método apropiado antes de implementar un método específico en la práctica clínica.
Prácticas de Control de Calidad La gestión de calidad de la crioconservación, el almacenamiento y la descongelación de productos de terapia celular clínica deben incorporar elementos del sistema de calidad que se adhieran a las Buenas Prácticas para Tejidos (BPTv) y a las Buenas Prácticas de Fabricación (BPFv) vigentes, incluyendo calificación del personal, controles de la instalación, control de documentos, control de equipo y materiales, control de etiquetas y uso de Procedimientos Operativos Estándar validados (Título 21 del CFR 1271, 21 Oy 211 ). Las prácticas de control de calidad específicas para la crioconservación incluyen por lo regular la evaluación y documentación de curvas de congelación para todos los productos, la retención de segmentos del sistema de tubos y viales para análisis subsiguiente y el monitoreo regular de la calidad del producto después de la descongelación. Las prácticas requeridas por las Buenas Prácticas para Tejidos vigentes y que se aplican a todos los productos basados en células y tejidos humanos incluyen medidas para asegurar registros y etiquetados exactos y completos, a fin de asegurar que el paciente reciba el producto correcto y para permitir el rastreo del producto celular desde la recolección hasta la infusión. Las implicaciones prácticas de estos requisitos son que el etiquetado y los registros, incluyendo los sistemas de inventario, para productos crioconservados deben diseñarse para prevenir errores en la identificación de productos. Las verificaciones de la identidad de los productos que se trasladan dentro y fuera del almacenamiento crioconservado se llevan a cabo de manera rutinaria, p.ej., con dos personas verificando la etiqueta del producto contra los registros. Si fuera necesario para la verificación adicional de la identidad del producto, el contenido de un segmento del sistema de tubos acoplado a la bolsa de producto puede descongelarse y analizarse antes de descongelar todo el producto. La guía ISBT 128, un sistema internacionalmente reconocido de etiquetado de productos sanguíneos y de terapia celular, incorpora el uso de nomenclatura de productos y códigos de barras uniformes para productos desde su obtención de la fuente donante hasta su administración (ver el Apéndice).
CÉLULAS MADRE HEMATOPOVÉTICAS Los estudios sobre las respuestas de las células madre hematopoyéticas a la congelación comenzaron en la década de 1950, y las células madre hematopoyéticas crioconservadas se han usado ampliamente en la práctica clínica durante los últimos 30 años. El método más común de crioconservación de células madre hematopoyéticas para aplicaciones clínicas implica el uso de DMSO al 10% y un congelador de velocidad controlada ajustado a una velocidad de enfriamiento de 1 º/minuto. Otro método, de uso menos común, implica el uso de congelación pasiva del producto de células madre hematopoyéticas en un congelador mecánico a -80º y el uso de una solución de DMSO al 5% +almidón hidroxietílico al 6%. Las células por lo regular se congelan a densidades de 30-50 x 106 células/mL. Se ha demostrado que el exceso de citocritos en un 20% (v/v) reduce la recuperación celular. La evaluación posterior a la descongelación de la muestra consiste en la enumeración de células nucleadas, células CD34+ viables y unidades formadoras de colonias hematopoyéticas, junto con el cálculo subsiguiente de recuperaciones a partir de valores de precongelación correspondientes. Las células madre hematopoyéticas crioconservadas para uso clínico se pueden obtener a partir de la médula ósea, la sangre periférica movilizada o la sangre de cordón umbilical. Cada fuente tiene requisitos únicos para su conservación. Por ejemplo, los productos de células progenitoras de sangre periférica contienen un mayor número de células y se pueden congelar en bolsas múltiples con concentraciones celulares relativamente altas. Los protocolos para la conservación de células de cordón umbilical pueden incluir el uso de bombas con jeringas para introducir soluciones de crioconservación mientras se minimiza el estrés por ósmosis. Para células de cordón umbilical, las soluciones especializadas a menudo se usan después de la descongelación para diluir o eliminar el DMSO al tiempo que se minimiza el estrés por ósmosis para las células.
CÉLULAS MADRE MESENQUIMÁTICAS La investigación sobre el uso clínico de células madre mesenquimáticas ha aumentado rápidamente desde mediados de la década de 1990. Los métodos confiables, seguros y eficientes de crioconservación y almacenamiento tienen una importancia crítica, en especial para los productos de células madre mesenquimáticas alogénicas estandarizados y de propiedades definidas, fabricados en múltiples dosis de producto para el tratamiento de un gran número de pacientes con una variedad de indicaciones clínicas. Debido a que las células madre mesenquimáticas se han generado en cultivos que contienen suero fetal bovino, los medios de crioconservación para dichas células han incorporado con regularidad suero fetal bovino. En la actualidad, se encuentra en exploración diversas alternativas al suero fetal bovino irradiado con rayos gamma para la expansión de cultivos antes de la crioconservación, además de que la crioconservación ha resultado ser exitosa en medios que contienen DMSO al 5%-10% y otros componentes sin fuentes bovinas de proteína. Aunque no existe un método uniforme de procesamiento de las células posterior a la descongelación, algunos protocolos incluyen la dilución o el lavado de las células para mitigar los efectos del DMSO. Las aplicaciones clínicas emergentes para las células madre mesenquimáticas pueden requerir la dosificación repetida del pro-
984 (1044) Crioconservación de Células/ lnformacíon General
USP 39
dueto celular, lo cual es una práctica que requiere atención a la inmunogeicidad potencial de los componentes del medio de crioconservación, p.ej., suero fetal bovino u otras proteínas. La evaluación posterior a la descongelación de las células madre mesenquimáticas por lo regular ha incluido el uso de colorantes para evaluar la integridad de la membrana tales como azul triptano, expresión de antígenos de la superficie y evidencia de que las células son capaces de diferenciarse en múltiples linajes. Debido a que el mecanismo de acción de las células madre mesenquimáticas puede implicar las propiedades inmunomoduladoras o tróficas de las células, la evaluación posterior a la descongelación también debe incluir la función celular pertinente.
CÉLULAS LINFOIDES Los linfocitos se usan para una variedad de aplicaciones clínicas incluyendo inmunoterapia para tratar cáncer, infecciones virales y enfermedades autoinmunes. La terapia basada en linfocitos puede constar de poblaciones mezcladas de linfocitos o subpoblaciones de linfocitos que han sido seleccionadas o activadas ex vivo, p.ej., células T reguladoras, células asesinas naturales y células T activadas. Al igual que con las células hematopoyéticas, los linfocitos por lo general se crioconservan usando una solución de DMSO al 10% y una velocidad de enfriamiento controlado de 1 º/minuto. Los linfocitos pueden experimentar una extensa apoptosis después de la descongelación, la cual puede influir sobre la eficacia clínica de las células. Las poblaciones altamente purificadas de linfocitos pueden presentar niveles más altos de apoptosis posterior a la descongelación que las poblaciones mezcladas de linfocitos. Se han utilizado estrategias tales como la inhibición de caspasa y el rescate con citoquina para disminuir la apoptosis de los linfocitos posterior a la descongelación.
CONSERVACIÓN DE LÍNEAS DE CÉLULAS MADRE PLURIPOTENTES HUMANAS Las células madre pluripotentes son células que parecen tener la capacidad de (1) autorrenovarse y replicarse indefiidamente y (2) generar células que son representativas de los tres tejidos de la capa germinal necesarias para crear todas las células del cuerpo humano como ha quedado demostrado por su capacidad de generar teratomas en ratones inmunodeficientes. Los dos tipos predominantes de líneas de células madre usadas para la investigación in vitro en el laboratorio son las células madre embrionarias humanas y las células madre pluripotentes inducidas humanas. Las células madre embrionarias humanas se derivan de blastocistos excedentes donados mediante aislamiento y cultivo de la masa celular interna del blastocisto (el tejido que habría evolucionado para formar el embrión). Las células madre pluripotentes inducidas humanas se crean mediante reprogramación artificial de células somáticas (mediante la liberación de factores de reprogramación usando una variedad de métodos) para producir células que expresen las propiedades críticas de las células madre pluripotentes citadas anteriormente. Las células madre pluripotentes inducidas humanas se pueden derivar de una variedad de tipos de células somáticas usando una variedad creciente de métodos para asegurar la expresión de ciertos factores de reprogramación. Se sabe que una variedad de cultivos derivados de tejidos albergan poblaciones de células madre in vitro (p.ej., grasa subcutánea, médula ósea, cordón y sangre de ombligo fetal, células germinales primordiales de la cresta neural fetal y cultivos de esferoides de células madre neurales) que han demostrado tener una capacidad limitada para la replicación in vitro y que no se han establecido como líneas de células madre diploides pluripotentes estables. Dichos cultivos no se tratan en este capítulo; las siguientes secciones abarcan específicamente líneas de células madre embrionarias humanas y las células madre pluripotentes inducidas humanas. Las líneas de células madre pluripotentes son cultivos celulares complejos de componentes múltiples y pueden contener una variedad de poblaciones celulares distintas con grados mayores o menores de diferenciación o compromiso de linaje. No obstante, se debe mantener la autorrenovación, que es la propiedad clave de un cultivo de células madre. Asimismo, las células deben conservar su capacidad de experimentar división asimétrica para generar dos células hijas diferentes: una que sea una célula madre idéntica a la célula progenitora y otra con un grado reducido de potencia (es decir, la capacidad de generar linajes celulares diferentes).
Desarrollo de Metodologías Actuales para Células Madre Pluripotentes En la actualidad, cada laboratorio tiene una metodología preferida, por lo que no existe un enfoque dominante para el uso rutinario, y parece posible obtener niveles aceptables de viabilidad posterior a la descongelación y recuperación, ya sea por vitrificación o por crioconservación a velocidad lenta controlada; sin embargo, en esta sección se describe un método común que resulta en una mejor recuperación celular. En resumen, esta técnica implica colocar colonias de células madre embrionarias humanas en una solución de vitrificación compuesta de DMSO al 20% + etilenglicol al 20% (EG) +sacarosa 0,5 mol/L después de equilibrar con soluciones de DMSO + EG de menor concentración. Las colonias se cargan en pajuelas y se sumergen en nitrógeno líquido. Otro método común implica colocar colonias en una solución que consta de DMSO al 10% (v/v) y usando un dispositivo de congelación pasiva o un congelador de velocidad controlada diseñado para lograr una velocidad de enfriamiento promedio de aproximadamente 1 º/minuto. Las muestras de células madre pluripotentes inducidas o de células madre embrionarias humanas tienen requisitos especiales de almacenamiento y transporte. Todas las muestras crioconservadas o vitrificadas deben almacenarse a temperaturas por debajo de la temperatura de transición vítrea de la muestra, y para las muestras vitrificadas esta temperatura es mucho más baja (p.ej., -150º) que para las muestras de células crioconservadas de manera común. Asimismo, las fluctuaciones en las tempera-
USP 39
lnformacíon General/ (1044) Crioconservación de Células 985
turas durante el almacenamiento o transporte pueden llevar a la cristalización y, por ende, a la degradación de la muestra. Debido a que las muestras vitrificadas son sensibles a estas fluctuaciones de la temperatura, se deben transportar a temperaturas de nitrógeno líquido y no transportarse en hielo seco. Los desafíos para la conservación confiable y reproducible de líneas de células madre pluripotentes recaen no sólo en el proceso de conservación mismo, sino también en los procesos de preparación, crioprotección y recuperación. Específicamente, los métodos de recolección y manipulación antes de la crioconservación pueden resultar en pérdidas celulares importantes. Los procedimientos de procesamiento deben ser tan reproducibles como sea posible y además debe usarse un Procedimiento Operativo Estándar para mejorar la reproducibilidad de los resultados de la conservación. Además, la generación efectiva de bancos de líneas de células madre pluripotentes enfrenta los desafíos impuestos por los métodos mediante los cuales las células regularmente se exponen a pasajes y se recolectan para conservación (es decir, colonias individuales disecadas y transferidas como pequeños fragmentos de colonia a matraces para cultivos frescos para su expansión o a un medio de conservación para su congelación). Primero, para evitar la pérdida extensa de viabilidad en las células recolectadas con anterioridad, los cultivos usados para crear un banco pueden, en efecto, requerir conservación en partidas pequeñas durante un día de trabajo. Segundo, la preparación de bancos de células madre pluripotentes que comprenden combinaciones más pequeñas de fragmentos de colonias celulares no solo es larga y laboriosa, sino que también imposibilita la homogeneización de la preparación de las células antes de preparar las alícuotas en los viales, tal como sucedería con métodos más tradicionales de conservación de líneas de células. Por ende, se ve comprometida la uniformidad entre viales de líneas de células madre pluripotentes. Tercero, congelar células madre pluripotentes como fragmentos de colonias conserva las uniones de brechas que se forman entre las células, lo que potencialmente lleva a la propagación intercelular de cristales de hielo y la pérdida extensa de viabilidad. Para evitar algunos de estos problemas, los analistas pueden usar la desagregación enzimática de colonias para simplificar y acelerar la recolección de células y para mejorar la crioconservación de suspensiones de una sola célula más homogéneas antes de la conservación. Como medida precautoria, algunos laboratorios eligen realizar la desagregación enzimática únicamente antes de la crioconservación, pero no para el cultivo de rutina. Siempre que sea posible, los analistas deben usar agentes enzimáticos que no provengan de fuentes animales para la disociación celular. Otra característica importante de las líneas de células madre pluripotentes es la variable pero común incidencia de diferenciación no dirigida que ocurre dentro de las colonias y que puede variar considerablemente a lo largo de muchas colonias en un cultivo. Las colonias con una alta proporción de células diferenciadas deben desecharse debido a que las células diferenciadas son un componente indeseable de un cultivo de células madre pluripotentes y pueden afectar las propiedades de las células no diferenciadas dentro de la colonia.
Puntos a Considerar para la Conservación de Líneas de Células Madre Pluripotentes Los analistas deben considerar una variedad de factores importantes durante la conservación de líneas de células madre pluripotentes que se deben tratar en los niveles de preparación, recolección, generación de bancos y análisis de inventarios crioconservados. EVALUACIÓN Y RECOLECCIÓN Los analistas deben observar los cultivos celulares de manera regular. Se deben desechar los cultivos que presentan altos niveles de células diferenciadas. Un investigador o instalación individual de generación de bancos debe contar con un programa de control de calidad que evalúe la diferenciación de cultivos de manera regular, además de desarrollar niveles de umbral de diferenciación aceptable en un cultivo. El protocolo de recolección, seguido del equilibrio de la muestra con agentes crioprotectores se debe llevar de manera expedita para minimizar las pérdidas celulares debidas a la recolección. PROCESO DE GENERACIÓN DE BANCOS Los procedimientos convencionales de generación de bancos de células requieren el desarrollo de un banco de células maestro y de un banco de células de trabajo. Las células del banco de células maestro deben conservarse a un número de pasajes temprano (Pl O-P20) para que el trabajo experimental y de desarrollo de la línea celular se lleve a cabo en células al menor número de pasajes posible. El primer banco de células de trabajo debe establecerse con el número mínimo de pasajes para lograr el número de células requerido. Posteriormente, a fin de promover la uniformidad, los bancos de células de trabajo se pueden volver a colocar en el mismo nivel de pasaje usando células del banco maestro según se requiera. VIABILIDAD Determinar la viabilidad y la función posterior a la descongelación de las células madre pluripotentes puede ser complicado y a menudo se lleva a cabo de manera incorrecta. El método más común de evaluación posterior a la descongelación es el uso de un colorante para evaluar la integridad de la membrana. Como una medida de la viabilidad, la fracción de células con membranas intactas se compara con aquéllas que presentan membranas afectadas. Otro método relativamente común es cuantificar las formaciones de colonias de células madre pluripotentes, en el cual se cuenta el número total de colonias sembradas en una placa antes y después de un cierto tiempo de incubación. Este método también evalúa otras características fun-
986 (1044) Crioconservación de Células/ lnformacíon General
USP 39
cionales de las células, tales como su capacidad para adherirse y proliferar. Se debe tomar en cuenta que los procedimientos tales como la recolección y la crioconservación pueden inducir la apoptosis. La tinción para marcadores apoptópicos tempranos (fosfatidilserina en la superficie celular) o tardíos (Anexina VI) puede proveer información sobre la salud general de los cultivos congelados o descongelados. HOMOGENEIDAD Tal como se describió con anterioridad, la conservación de fragmentos de colonias por vitrificación puede exacerbar la carencia de homogeneidad entre viales o pajuelas de células. Cuando se establecen bancos más grandes de células madre pluripotentes, los analistas deben analizar viales de prueba desde las posiciones tempranas, medianas y tardías en la secuencia de llenado del banco de células para determinar la viabilidad, la velocidad de crecimiento y los marcadores clave según se indica en Viabilidad. CUALIDAD DE LA CÉLULA MADRE Para verificar que una línea de células madre pluripotentes no ha perdido ninguna de sus características de célula madre durante la conservación, los analistas deben verificar la expresión de un número de marcadores clave relacionados con las células madre. Un estudio extenso analizó 59 líneas de células embrionarias humanas y un panel de 94 genes y resolvió cinco moléculas relacionadas con células madre para las cuales el ARNm se expresó de manera constante en las células embrionarias humanas. Estos genes hoy en día se incluyen en las tarjetas de genes de microfluidos comercialmente disponibles que se diseñan específicamente para la investigación de poblaciones de células madre. Resulta crucial demostrar que las células madre pluripotentes han conservado su pluripotencia, posteriormente se puede realizar una variedad de pruebas de caracterización, incluyendo la formación de teratoma en ratones inmunodeficientes, la formación de cuerpos embrionarios trilaminares y la diferenciación dirigida para demostrar que el cultivo puede producir representantes de cada uno de los tres tejidos de capa germinal que son necesarios para formar todas las células del cuerpo humano. ESTABILIDAD GENÉTICA En ambas líneas de células madre pluripotentes inducidas y de células madre embrionarias humanas, resulta común el surgimiento de clones de cariotipo anormal en el pasaje extendido y el sobrecrecimiento del cultivo. Por ende, los analistas deben monitorear los cultivos para detectar dichas células anormales. Tradicionalmente, esto se ha llevado a cabo mediante estudios cariotípicos de células en metafase usando tinción con Giemsa. La ocurrencia de células no diploides, incluso a una incidencia muy baja, puede ser problemática. Los documentos guía tales como la 2009 lnternational Stem Cell Banking lnitiative {Iniciativa Internacional para la Generación de Bancos de Células Madre) son útiles para determinar si dichos cultivos deben desecharse. No obstante, los procedimientos más recientes tales como la hibridación de arreglo de genoma comparativo y el arreglo de polimorfismo de un solo nucleótido proveen análisis mucho más detallados de estabilidad genética y se pueden usar en paralelo con bandeo con Giemsa para proveer una mayor confianza en términos de estabilidad genética. MEJORES PRÁCTICAS Además de seguir las buenas prácticas para cultivos celulares, los analistas deben tomar en cuenta la disponibilidad de una guía específica que contenga principios y mejores prácticas para la adquisición, generación de bancos, análisis y almacenamiento de células madre embrionarias humanas para propósitos de investigación (ver la referencia a la ISCB 2009 en el Apéndice). Esta guía es útil para las líneas de células madre pluripotentes inducidas y de células madre embrionarias humanas.
SUSTRATOS CELULARES USADOS EN LA PRODUCCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE PRODUCTOS TERAPÉUTICOS OBTENIDOS POR BIOTECNOLOGÍA Y PRODUCTOS TERAPÉUTICOS BIOLÓGICOS Una amplia variedad de células recombinantes y no recombinantes se crioconservan y usan en la producción y caracterización de productos biológicos y obtenidos por biotecnología humanos (se encuentra disponible más información en la guía ICH Q5D Derivation and Characterisation of Ce// Substrates Used for Biotechnological/Biofogical Products [Derivación y Caracterización de Sustratos Celulares Usados Para Productos Biotecnológicos/Biológicos]). Los grupos principales incluyen líneas de células derivadas de mamíferos (incluyendo humanos), insectos (principalmente polillas) y cepas seleccionadas de bacterias y levaduras. Los sustratos microbianos más comunes usados para la producción de productos humanos obtenidos por biotecnología son cepas recombinantes de Escherichia coli, Pichia pastoris o Saccharomyces spp. (levaduras). Independientemente del alto grado de diversidad entre los tipos de células usadas para fabricar productos biológicos y obtenidos por biotecnología, existe un sorprendente grado de uniformidad entre las prácticas de crioconservación, y los mismos principios se aplican a células usadas para la fabricación y a aquéllas usadas en pruebas para determinar la presencia de agentes adventicios y potencia de los productos.
USP 39
lnformacíon General/ (1044) Crioconservación de Células 987
Por lo regular, se usa un sistema de generación de bancos de células de dos o tres niveles para el mantenimiento de líneas de células de fabricación o cepas microbianas. Para aquéllos que usan un sistema de tres niveles, el banco del primer nivel puede denominarse banco de investigación, de siembra, de inventario, de adquisición, banco previo al banco de células maestro o banco de células parentales. La fuente del banco de células previo al banco de células maestro puede ser un laboratorio de investigación o desarrollo, o las células pueden adquirirse en un depósito comercial. Es recomendable caracterizar el banco de células parentales antes de usarlo en la clonación. El banco de células maestro o inventario de células maestro del segundo nivel (o primer nivel en un sistema de dos niveles) se prepara directamente de este banco de células parentales con mínimos pasajes o generaciones celulares. El banco de células maestro o el inventario de células maestro se analiza extensamente para confirmar la pureza, el fenotipo, el genotipo, la expresión de proteínas u otros atributos importantes. El banco de células de trabajo o inventario de células de trabajo se deriva a partir de viales del banco de células maestro después de pasajes sucesivos en cultivo. El banco de células de trabajo es el sustrato de células de fabricación cuyo tamaño se incrementa a través de subcultivos repetidos para sembrar el biorreactor de producción final, el fermentador o el lote de vasos de cultivo (p.ej., frascos rodantes). En cada nivel del sistema de banco de células, la crioconservación adecuada es primordial para el éxito del desarrollo del producto y de la fabricación. En algunos casos, las células del final de producción también se puede acumular en bancos para propósitos de análisis como parte de la calificación del banco de células.
Líneas Celulares de Mamíferos e Insectos Las líneas celulares de mamíferos son los sustratos celulares preferidos para la producción de moléculas de proteínas complejas. Las células de mamíferos poseen la maquinaria biológica intrínseca necesaria para la glicosilación postranslacional de proteínas que a menudo es crítica para la estabilidad y bioactividad en humanos. Ambas líneas celulares diploides y heteroploides (incluyendo hibridomas) se usan para la producción de productos terapéuticos obtenidos por biotecnología. Las líneas celulares diploides son sustratos de vacunas comunes [p.ej., Wl-38 y MRC-5 (líneas celulares de fibroblastos humanos), BHK-21 (línea celular de riñón de hamster bebé) y MDCK (riñón canino Madin-Darby)]. Además, la línea celular Vero de mono verde africano (una línea de células heteroploides) se usa para varias vacunas autorizadas en EE.UU. Hoy en día, las líneas celulares heteroploides de uso común incluyen varias líneas celulares recombinantes de Ovario de Hámster Chino y de riñón embrionario humano. Los métodos de crioconservación están bastante bien estandarizados para estas líneas celulares. No obstante, puede resultar útil para los investigadores investigar la toxicidad de los diversos crioprotectores y concentraciones al usar un nuevo sustrato celular. Las líneas celulares de insectos han probado su capacidad para producir diversos polipéptidos recombinantes. Las líneas celulares más comunes se derivan de las polillas Spodotera frugiperda y Trichoplusia ni, y sus líneas celulares establecidas se denominan Sf9 y Tn5 (o "High Five"), respectivamente. La producción de proteínas recombinantes emplea la infección por baculovirus recombinante para la transferencia de genes heterólogos. Aunque las líneas celulares de insectos requieren diferentes factores nutricionales, temperaturas de incubación más bajas y mayor osmolaridad que sus contrapartes mamíferas, los mismos elementos esenciales de crioconservación se aplican a ambos grupos. Además de las guías provistas en la sección Elementos Clave de la Práctica de Crioconservación, se deben tomar en cuenta estos puntos adicionales para sustratos de líneas celulares animales: PROCESAMIENTO PREVIO A LA CONGELACIÓN Los analistas deben asegurar que las células no están contaminadas y que aún son viables. Para células diploides, los analistas deben fomentar el crecimiento hasta un nivel de pasaje que mantenga la diploidía y esté por debajo del nivel previsto para su uso. Los analistas combinan cultivos celulares y realizan un recuento de células para determinar el número de células viables disponibles para la generación de bancos. Las células recolectadas se centrifugan a una velocidad relativamente baja durante un tiempo corto, p.ej., 100-200 x g durante 5-1 O minutos, de preferencia usando una centrífuga refrigerada. AGENTES CRIOPROTECTORES Y CRIOENVASES El agente crioprotector de membrana permeable preferido es el DMSO al 5%-10% (v/v) diluido en medio de cultivo fresco. Para algunas líneas celulares sensibles, el medio acondicionado para cultivo de células se puede agregar para complementar el medio de crioconservación. El DMSO debe ser estéril y de grado para cultivo de tejidos (pureza >99%). El crioenvase más apropiado es un vial con tapa de rosca de polipropileno preesterilizado diseñado para almacenamiento criogénico en fase de vapor de nitrógeno líquido. INTRODUCCIÓN DEL MEDIO DE CRIOCONSERVACIÓN Inmediatamente después de la centrifugación de las células, el medio de crecimiento se elimina de los pellets de células y las células se resuspenden suavemente mediante la adición lenta de medio de crioconservación que a menudo se enfría previamente para muchos tipos de células. La suspensión de células se diluye inmediatamente con un volumen apropiado de medio de crioconservación basándose en el recuento de células viables y la densidad celular deseada (por lo regular, los bancos de
988 (1044) Crioconservación de Células/ lnformacíon General
USP 39
células se producen a una densidad de células viables de aproximadamente 1 x 10 7 células/ml). Tal como se mencionó en la sección anterior, el medio de crioconservación es altamente hipertónico, por lo que se debe limitar el tiempo de exposición. La suspensión de células final se transfiere a un vaso en el que las células se pueden mezclar suavemente durante el llenado del vial para facilitar la uniformidad del banco de células. ENFRIAMIENTO, CONGELACIÓN Y ALMACENAMIENTO CONTROLADOS Los viales pueden llenarse manualmente usando un dispositivo de pipeteo manual o usando una máquina de llenado automático de viales. En cualquier caso, los viales a menudo se refrigeran a medida que el llenado progresa para minimizar los efectos tóxicos potenciales del DMSO a temperaturas más altas. Se deben establecer límites de tiempo para todo el proceso de llenado y registrarse en el registro de partida. Inmediatamente después de llenar los viales, los analistas deben transferirlos a un congelador de velocidad controlada o, como alternativa, en un congelador estático ultrafrío (p.ej., -80º) usando un envase aislado y diseñado para el enfriamiento controlado. Cualquier sistema de congelación controlada debe calificarse adecuadamente para asegurar que las velocidades de enfriamiento esperadas se apliquen para todos los viales dentro de la carga. Al usar un congelador de velocidad controlada, los analistas determinan programas de enfriamiento óptimos de manera empírica, pero una velocidad en el intervalo de 1º-5º /minuto después de la transición a través del calor de la fusión debe ser aceptable para la mayoría de las líneas celulares (en temperaturas más frías que aproximadamente -40º, la velocidad se puede incrementar, p.ej., 10º/minuto). Después de que los viales se hayan congelado hasta una temperatura de aproximadamente -80º o menor en el sistema de congelación, se transfieren lo más pronto posible a unidades de almacenamiento en fase de vapor de nitrógeno líquido. ENTIBIAMENTO Y DESCONGELACIÓN DEL VIAL En general, las células congeladas a una velocidad de congelación lenta deben descongelarse a la mayor velocidad posible para maximizar la viabilidad celular. Para asegurar la uniformidad de la temperatura, los viales deben transferirse directamente desde el almacenamiento en fase de vapor de nitrógeno líquido a un transportador en fase de vapor (seco) portátil para su transporte al laboratorio. En ocasiones, cuando no se cuente con un dispositivo Dewar de nitrógeno líquido, los viales pueden empacarse en hielo seco, pero se debe demostrar que este proceso es adecuado debido a que puede resultar en cambios de pH perjudiciales. Después de transferirlos al laboratorio, los viales se colocan directamente en un baño de agua tibia (p.ej., a 37°, asegurando que las tapas no queden sumergidas), en un baño de perlas o en un termobloque. Se debe tomar en cuenta que las líneas celulares de insectos deben descongelarse a 27°-30º. Los viales deben agitarse para facilitar la descongelación uniforme de las células. Inmediatamente después de la descongelación, los viales deben transferirse a la cabina de seguridad biológica e higienizarse antes de abrirlos. Por lo regular, el medio de crecimiento se agrega lentamente a las células descongeladas mientras se agita a fin de diluir el DMSO y reducir lentamente la osmolaridad del entorno posterior a la descongelación a un nivel fisiológico. PROCESAMIENTO POSTERIOR A LA DESCONGELACIÓN Esta etapa se puede lograr con diversos métodos, pero los analistas deben conseguir una dilución suficiente del DMSO y devolver a las células a su ambiente isotónico de crecimiento normal. Se debe minimizar la manipulación de las células inmediatamente después de la descongelación debido a las tensiones inducidas por el proceso de congelación-descongelación. Por ejemplo, se debe minimizar el pipeteo y la centrifugación.
CEPAS MICROBIANAS: E. COU, LEVADURA V CEPAS DE VACUNAS BACTERIANAS Las cepas de f. coli recombinantes cuentan con un registro de rastreo comprobado para la producción de una variedad de productos obtenidos por biotecnología comercialmente disponibles, incluyendo análogos de insulina recombinantes, hormona de crecimiento humana y hormona paratiroidea. En comparación con sus contrapartes mamíferas y derivadas de insectos, las cepas de f. coli recombinantes son relativamente simples de cultivar e incrementar el tamaño de los cultivos de producción hasta volúmenes grandes de, p.ej., 40 000 L. No obstante, las bacterias carecen de la sofisticada maquinaria celular para construir moléculas de proteínas más complejas que requieren modificaciones postranslacionales tales como la glicosilación. Las levaduras son células eucarióticas unicelulares que se pueden manipular genéticamente para producir un amplio rango de proteínas recombinantes y péptidos con complejidad limitada. A pesar de las distancias evolucionarias entre los sustratos celulares mamíferos y microbianos, se aplica el mismo conjunto de elementos esenciales para la crioconservación descritos con anterioridad, con los siguientes puntos específicos: PROCESAMIENTO PREVIO A LA CONGELACIÓN Los cultivos deben propagarse en matraces para agitación hasta una fase logarítmica tardía o estacionaria temprana usando condiciones de crecimiento específicas para la cepa.
USP 39
lnformacíon General/ <1044) Crioconservación de Células 989
AGENTES CRIOPROTECTORES Y CRIOENVASES El crioprotector de pared celular o de membrana celular permeable preferido es el glicerol (aunque también se usa en ocasiones el DMSO) a concentraciones que por lo general van de 5%-10% (v/v). El glicerol sintético se debe usar para el registro de productos comerciales junto con otras materias primas exentas de componentes de origen animal. INTRODUCCIÓN EN EL MEDIO DE CRIOCONSERVACIÓN Debido a que las células microbianas poseen paredes celulares para la protección y el sustento del contenido citoplásmico, la manipulación física y los cambios osmóticos no tienen el mismo impacto negativo observado en las líneas celulares animales. Inmediatamente después de la centrifugación, los pellets de células se resuspenden vigorosamente en medio de crioconservación (hasta una dilución basada en los requisitos del banco de células para el número de viales y las unidades formadoras de colonias viables/mL). Esta etapa de dilución se puede basar en la medición activa de la densidad óptica del cultivo u otros ensayos de enumeración celular. La suspensión de células final se transfiere a un vaso en el que las células pueden mezclarse durante el llenado de envases finales para facilitar la uniformidad del banco de células. Debido a la potencial toxicidad, los analistas deben limitar el tiempo de exposición al glicerol, independientemente de la robustez relativa de las células microbianas. Los viales pueden llenarse manualmente usando un dispositivo de pipeteo manual o usando una máquina de llenado automático de viales. ENFRIAMIENTO, CONGELACIÓN Y ALMACENAMIENTO CONTROLADOS Una vez más, debido a su robustez inherente, las células microbianas no requieren un control tan estricto de la velocidad de enfriamiento como las líneas celulares animales. Por consiguiente, la elección del sistema o método de congelación tiene un efecto menor sobre la viabilidad del banco de células. Los crioenvases llenos simplemente pueden ser transferidos a un congelador a aproximadamente -80º durante toda la noche seguido de una transferencia a la fase de vapor de nitrógeno líquido. Como alternativa, podría omitirse el almacenamiento de los bancos de células microbianas en nitrógeno líquido y almacenarlos a una temperatura de aproximadamente -80º. Sin embargo, si se dispone de almacenamiento en nitrógeno líquido, éste se prefiere para el almacenamiento a largo plazo (p.ej., años). Si se utiliza un congelador de velocidad controlada, entonces debe someterse a una calificación completa para asegurar que provea una velocidad de enfriamiento uniforme que esté dentro de un intervalo esperado, p.ej., 1 º-5º /minuto. ENTIBIAMIENTO Y DESCONGELACIÓN DEL ENVASE El control de las velocidades de enfriamiento y entibiamiento resulta menos crítico para las células microbianas, aunque también se deben descongelar lo más rápido posible usando un baño de agua tibia (p.ej., 30º-35º). Las temperaturas se pueden ajustar a la temperatura de incubación de la cepa. PROCESAMIENTO POSTERIOR A LA DESCONGELACIÓN Se agrega medio de crecimiento para diluir las células descongeladas hasta un nivel deseado de unidades formadoras de colonias/mL y para inducir la eliminación del glicerol intracelular. Todas las células se crean de manera distinta y son divergentes por naturaleza. Los sustratos celulares usados para la fabricación de productos biológicos y obtenidos por biotecnología humanos están separados por un amplio periodo evolutivo. Afortunadamente para las personas dedicadas a los cultivos celulares industriales, las estrategias de crioconservación se reúnen en un conjunto de principios y métodos compartidos que se traducen a lo largo de las vías evolutivas.
APÉNDICE Guías Útiles • FDA. Guidance for industry: characterization and qualification of cell substrates and other biological materials used in the production of viral vaccines for infectious disease indications. 201 O. http://www.fda.gov/downloads/biologicsbloodvaccines/guidancecomplianceregulatoryinformation/guidances/vaccines/ucm202439.pdf. Consultado el 24 de septiembre de 2012. • ICCBBA. OECD best practices guidelines for BRCs [128 Standard Technical Specifications]. 2007. http://www.iccbba.org/. Consultado el 01 de octubre de 2012. • ICH. Q5D Derivation and characterisation of cell substrates used for biotechnological/biological products. 1997. http:// www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Quality/Q5D/Step4/Q5D_Guideline.pdf. Consultado el 25 de julio de 201 3.
990 (1044) Crioconservación de Células / lnformacíon General
USP 39
• Coecke S, Balls M, Bowe G, et al. (2005). Guidance on good cell culture practice. A report of the second ECVAM Task Force on Good Cell Culture Practice, Altern LabAnim. 2005; 33(3):261-287. • Andrews PW, Arias-Diaz J, Auerbach J, et al. Consensus guidance for banking and supply of human embryonic stem cell lines for research purposes: lnternational Stem Cell Banking lnitiative. Stem Ce// Rev. 2009; 5(4):301-314. • WHO. Recommendations for the evaluation of animal cell cultures as substrates for the manufacture of biological medicinal products and for characterization of cell banks. 201 O. http://www.who.int/biologicals/Cell_Substrates_clean_version_ 18_April.pdf. Consultado el 26 de julio de 2013.
USP 39
Información General/ (1045) Artículos Obtenidos por Biotecnología 991
Las pruebas de identidad, pureza y actividad normalmente requieren el uso de Estándares de Referencia USP. Es necesario tener en cuenta qué Estándares de Referencia USP podrían requerirse y cuál podría ser su pertinencia con respecto al método de producción y su relación con las características de un producto final. Estas decisiones deben tomarse en forma individual según cada producto. Se considera deseable el uso de Estándares de Referencia USP representativos de los productos específicos que se han evaluado mediante pruebas clínicas y que están plenamente caracterizados. Aunque la temprana incorporación de métodos generales de análisis de fármacos macromoleculares en la USP podría conducir a una rápida estandarización de los métodos, la tecnología y los procedimientos analíticos están evolucionando muy rápidamente. Los procedimientos analíticos-químicos, físicos, microbiológicos e inmunológicos-se incluyen en las monografías específicas de cada producto.
EL ALCANCE DE LA BIOTECNOLOGÍA EN EL DESARROLLO DE ARTÍCULOS FARMACOPEJCOS Definición de Biotecnología-Perspectiva Histórica En su definición más amplia, la biotecnología se refiere al uso de organismos vivos, incluyendo células aisladas de mamíferos, para la elaboración de productos beneficiosos. Esta definición colocaría al alcohol, la producción de antibióticos y el procesamiento de lácteos, por ejemplo, dentro del espectro de la biotecnología. Sin embargo, el interés generado en la actualidad por la biotecnología es fundamentalmente el resultado de dos importantes avances. El primero fue el desarrollo de la tecnología de ADNr, que permite trasplantar genes de una especie a otra. De esta manera, el gen que codifica la expresión de una proteína deseada (generalmente humana) podría insertarse en una célula anfitriona procariótica o eucariótica de manera que la célula anfitriona exprese posteriormente cantidades utilizables de la proteína deseada. El segundo gran avance fue el desarrollo de técnicas para producir grandes cantidades de anticuerpos monoclonales (es decir, anticuerpos provenientes de un solo linfocito). La biotecnología dentro de la industria farmacéutica se refiere, en general, a la elaboración de productos proteicos empleando técnicas de ADNr o a la producción de anticuerpos monoclonales. Otras tecnologías, como por ejemplo las animales y las plantas transgénicos, la terapia génica y el ADN con una secuencia en dirección antiparalela (de antisentido), podrían tener consecuencias para la industria farmacéutica en el futuro pero no están dentro del alcance de este capítulo.
Tecnología ADNr En esta sección se describen los pasos principales para la aplicación de la tecnología ADNr a la producción de una proteína deseada. El primer paso crítico es la identificación de la proteína que se desea producir y, luego, el aislamiento del gen correspondiente (es decir, la secuencia de ADN que codifica la proteína deseada). Una vez aislado y caracterizado totalmente, este gen se inserta en un vector apropiado, coma por ejempla un plásmido, que es un segmento extracromosómico de ADN que suele encontrarse en determinadas bacterias. A continuación, se inserta el plásmido en la célula anfitriona. Se aíslan los dones de la línea celular anfitriona transformada y aquellos que producen la proteína de interés en las cantidades deseadas se conservan como un banco de células bajo condiciones apropiadas. A medida que las necesidades de fabricación aumentan, se puede aumentar la cantidad de células clonadas mediante un proceso de fermentación o de cultivo celular para obtener el producto proteico. Aunque el proceso de ADNr se describe más detalladamente en otra parte de este capítulo, se debe prestar atención a los siguientes puntos clave. El vector (plásmido) contiene1 en general, un marcador que se puede emplear para identificar las células que contienen este gen. Este se incluye además del gen codificador de la proteína de interés y las secuencias de nucleótidos regulatorias necesarias para la replicación del plásmido y la transcripción del ARN mensajero (ARNm) (el primer paso en la sín· tesis de proteínas). La selección de las células deseadas se simplifica dado que sólo las células correctamente transformadas que contienen el gen marcador seleccionable sobrevivirán bajo las condiciones de cultivo usadas para identificar y reproducir las células transformadas. Por lo general, los marcadores bacterianos y eucarióticos seleccionables pueden incluir la resistencia a antibióticos y genes que complementan una mutación auxotrófica de la célula anfitriona. Hay numerosos ejemplos de ambos tipos de marcadores en cada sistema. Existen diferencias significativas entre las células procarióticas y eucarióticas en el proceso de producción de ADNr. En general, las células bacterianas expresan una mayor concentración de producto proteico y requieren medios relativamente sencillos. Sin embargo, las células procarióticas no realizan muchas modificaciones importantes posteriores a la traducción, como por ejemplo la glicosllación e, históricamente, no ha sido posible expresar proteínas grandes en E. coli. Estas limitaciones requieren, en muchos casos, el uso de células eucarióticas. Las diferencias de producción entre las células anfitrionas eucarióticas y procarióticas tienen repercusiones importantes que se reflejan en los requisitos para la validación de procesos, la purificación y Ja metodología analítica. Estos requisitos se tratan más adelante en este capítulo.
Anticuerpos Monoclonales Los anticuerpos son proteínas producidas por linfocitos B diferenciados. Cada linfocito produce un anticuerpo de especificidad definida (es decir, la molécula de anticuerpo reconoce un sitio específico o epítopo en el antígeno). Los anticuerpos que se
992 (1045) Artículos Obtenidos por Biotecnología / Información General
USP 39
producen en animales inmunizados se forman a partir de muchos clones diferentes de linfocitos B, de donde deriva el término anticuerpos policlonales. Dado que al tomar sangre de estos animales se obtienen, por definición, mezclas de anticuerpos poli. clonales, los antisueros tienen sitios de reconocimiento de epítopos múltiples con una amplia variedad de constantes de unión (avidez) y, en consecuencia, varían de un lote a otro. Los anticuerpos que se producen a partir de líneas de células inmortaliza· das (hibridomas) provenientes de una única célula B se denominan anticuerpos monoclonales. La cosecha de estos cultivos conduce a un anticuerpo de reconocimiento específico de un epítopo con una constante de unión homogénea. Los linfocitos B tienen una vida finita en cultivo y es necesario inmortalizarlos para permitir la producción continua de anti· cuerpos monoclonales. En la actualidad, el procedimiento más común es mediante la fusión químicamente provocada de una célula esplénica de ratón con una célula de mieloma de ratón. La célula hibridoma ratón-ratón resultante hereda de la célula del mieloma la capacidad de replicarse continuamente en cultivo y de la célula esplénica, la capacidad de producir el anticuerpo monoclonal deseado. Los bancos de células de la lfnea de células hibridoma pueden emplearse para producir un suministro continuo del anticuerpo monoclonal, ya sea in vivo (es decir, mediante la inyección en ratones seguida de la recolección del líquido ascítico) o in vitro (es decir, mediantetécnicas de cultivo celular convencionales). Cabe mencionar que los recientes avances en genética molecular han llevado al desarrollo de transfectomas y esquemas de producción basados en E. coli y bacteriófagos que pueden ofrecer ventajas en .la producción futura de anticuerpos monoclonales. La validación de procesos, la purificación y las observaciones analíticas para anticuerpos.monoclonales son conceptualmente similares a las empleadas en los productos de ADNr. Esto se debe a que ambos tipos de productos son proteínas y,eh. conse, cuencia, requieren un manejo y un procedimiento de valoracíón similares. Como los anticuerpos monoclonales son elproduc" to de líneas de células inmortalizadas, es. importante excluir o desactivar eficazmente los posibles contaminantes del ácido nucleico viral durante los procesos de fabricación, como en el caso de los productos recombinantes de líneas celulares continuas. Las. aplicaciones comerciales de anticuerpos monoclonales incluyen el uso terapéutico y de diagnóstico. En algunos casos, el anticuerpo monoclonal se acopla a otra sustancia (por ejemplo, un agente oncolítico, un radionucleido o una toxina), resultan" do un anticuerpo conjugado que es el producto final de interés. En este caso, tanto el anticuerpo intermedio como el producto final requieren un extenso desarrollo de procesos y caracterización analítica. En este capítulo, el alcance de la biotecnología se limitará a los productos farmacéuticos de anticuerpos monoclonales y ADNr.
PROCESOS DE PRODUCCIÓN CARACTERÍSTICOS La principal diferencia entre los productos obtenidos por biotecnología y otros productos farmacéuticos consiste en los medios de producción para generar el producto. La biotecnología emplea organismos vivos genéticamente modificados para producir proteínas o productos peptídicos. Esta afirmación es válida tanto para productos derivados de ADNr como para productos derivados de anticuerpos monoclonales. En consecuencia, los productos obtenidos por biotecnología se diferencian fácilmente de las proteínas o los péptidos que se han obtenido por aislamiento de materiales de origen natural, como por ejemplo plasma, suero o tejido, o por síntesis química; Los productos obtenidos por biotecnología no son significativamente diferentes de otros fármacos proteicos después del proceso de purificación de proteínas. Por lo tanto, los requisitos básicos para la validación de procesos, el control ambiental, la fabricación aséptica y los sistemas de control de calidad y garantía de calidad son fundamentalmente los 111ismos para todos los productos farmacéuticos. Sin embargo, la complejidad de estos sistemas suele ser mayor para los productos obtenidos por biotecnología ya que su producción requiere, por lo general, procesos de propagación de células altamente desarrollados, métodos de purificación complicados y un control analítico para asegurar su homogeneidad, uniformidad entre lotes y seguridad. Esta sección describe con cierto detalle sólo aquellos factores significativos característicos del procesamiento de productos obtenidos por biotecnología. Entre ellos se encuentran las descripciones de los distintos sistemas de producción biológicos utilizados actualmente y un análisis de los problemas relacionados con la purificación.
Producción de ADNr En la actualidad, los productos de ADNr se generan en sistemas procarióticos (bacterias) o eucarióticos (por ejemplo, levaduras o cultivo de células de mamíferos). Por lo general, la elección del organismo de producción depende directamente de la complejidad molecular de la proteína que se va a producir, así como de la economía y eficiencia de la fermentación o el cultivo celular. Los primeros productos obtenidos por biotecnología se produjeron en E. coli debidt;> a la amplia comprensión de su biología molecular. En los últimos años, sin embargo, el uso del cultivo de células eucarióticas a gran escala se ha vuelto relativamente común. PRODUCCIÓN EN CÉLULAS PROCARIÓTICAS (BACTERIAS) La producción bacteriana de productos obtenidos por biotecnología ofrece varias ventajas características, así como ciertas desventajas. Como se ha señalado antes, se ha estudiado y documentado ampliamente la biología bacteriana y el uso seguro y eficaz de E. co/i como organismo anfitrión en la producción. Por lo tanto, la expresión de una proteína nueva en E. co/i, cuando es posible, suele ser más fácil que en otros sistemas de expresión teóricamente más apropiados. Esta ventaja puede verse ate-
USP 39
Información General/ (1045) Artículos Obtenidos por Biotecnología 993
nuada, sin embargo, por el hecho de que E. coli produce proteínas generalmente en un estado químicamente reducido. Para plegarse adecuadamente, tales proteínas requieren la producción de uniones disulfuro intramoleculares por oxidación. Una segunda desventaja es que todas las proteínas de E. coli empiezan su secuencia con un residuo de N-formil-metionina que no siempre puede eliminarse con los sistemas proteolíticos de f. co/í, por lo cual posiblemente se produzca un derivado metionilo de la proteína natural deseada. Una tercera desventaja de la expresión en E. coli es la posibilidad de que el producto se deteriore debido a trazas de impurezas de proteasa. Una cuarta desventaja es el requisito de eliminación de endotoxinas durante la purificación. A pesar de estas limitaciones, la facilidad de uso de E. coli y sus rendimientos de expresión generalmente altos para la mayoría de las proteínas han propiciado el uso preferencial continuado de esta bacteria siempre que sea posible. Como se describió anteriormente, el elemento clave en la tecnología de ADN recornbinante es el plásmido recombinante, que contiene el gen que codifica la proteína de interés. Los plásmidos son segmentos extracromosómicos circulares, sencillos y pequeños de ADN bacteriano que se aíslan de una bacteria y que se autorreplican. La tecnología básica emplea el corte enzimático específico de un plásmido mediante el empleo de endonucleasas, seguido de la inserción de una nueva pieza de ADN que contiene el gen de interés. El plásmido recombinante resultante se considera la materia prima clave de la tecnología de ADNr. El plásmido recombinante se introduce en el organismo anfitrión mediante un proceso llamado transformación, por el cual transmite su nueva información genética y genera el producto proteico. El crecimiento a gran escala de organismos recombinantes puede realizarse en fermentadores comerciales de más de 100 000 L, lo que hace que estos tipos de sistemas de producción sean sumamente económicos. Existen, sin embargo, una serie de problemas que complican el uso de los sistemas de fermentación de E. coli. En algunos casos, el producto proteínico expresado puede causar toxicidad celular y/o ser sumamente difícil de recuperar o purificar ya que puede quedar atrapado en cuerpos de inclusión bacteriana como grandes aglomerados semisolubles. Los recientes avances en la biología molecular de f. coli han permitido expresar proteínas en el espacio periplásmico, facilitando la eliminación de grupos metionina N-terminales no deseados y la obtención de proteínas más fáciles de purificar. PRODUCCIÓN EN CÉLULAS EUCARIÓTICAS (CÉLULAS DE MAMÍFEROS Y LEVADURAS) El uso del cultivo de células eucarióticas para la producción de vacunas se ha establecido hace tiempo en la industria farmacéutica y se ha desarrollado una extensa base de datos para asegurar la aptitud del uso de tales productos proteicos en seres humanos. La extensión de esta tecnología a los productos de ADNr fue principalmente una respuesta a las limitaciones en el uso de f. coli. En particular, en lo que se refiere a proteínas o glicoproteínas grandes, la expresión de células eucarióticas es una alternativa atractiva a un sistema bacteriano, ya que las células eucarióticas pueden secretar proteínas que se pliegan adecuadamente y cuya estructura primaria, secundaria y terciaria es idéntica a la de la proteína humana natural. La preocupación por los aspectos económicos de este sistema de producción obstaculizó en un principio su desarrollo. Sin embargo, los recientes avances en la obtención de mejores niveles de expresión, en el cultivo celular a gran escala mediante el empleo de células de Ovario de Hámster Chino {CHO, por sus siglas en inglés) y en la formulación de medios de crecimiento más definidos han mejorado mucho la factibilidad económica de los sustratos de células eucarióticas. El número de pasajes celulares requeridos para la clonación, selección, amplificación y la creación de bancos celulares antes de la producción requiere, en general, el uso de líneas de células inmortales, ya que las cepas no inmortalizadas (es decir, los cultivos diploides) no pueden propagarse suficientemente como para proporcionar tiempos económicamente convenientes en la etapa de producción. Las dudas iniciales en lo referente a la seguridad de estas líneas de células inmortales reflejaban una preocupación por la presencia de posibles oncogenes y una posible contaminación viral y retroviral. Estas preocupaciones se han disipado considerablemente gracias al análisis y caracterización exhaustivos de bancos de células maestras para determinar agentes adventicios (introducidos accidentalmente), mediante estudios eficaces de la validación de procesos y datos de seguridad obtenidos hasta la fecha para productos elaborados con este método. El banco de células maestras resultante y completamente caracterizado se emplea para la producción a gran escala. Otras líneas de células eucarióticas, como por ejemplo las provenientes de células de insectos, pueden ser útiles para lograr muchas de las ventajas de conformación y postraduccionales que se han descrito para el cultivo de células de mamíferos. Se ha explorado ampliamente el uso de cepas de levaduras, como por ejemplo Saccharomyces cerevisiae, para la producción. La producción de proteínas en levaduras ofrece muchas más ventajas teóricas con respecto al uso de E. coli, aunque plantea nuevas preocupaciones. Al igual que f. co/i, las levaduras pueden mantener plásmidos estables en forma extracromosómica; sin embargo, a diferencia de f. coli, las levaduras tienen la capacidad de producir glicoproteínas. PRODUCCIÓN DE ANTJCUERPOS MONOCLONALES Los anticuerpos monoclonales pueden producirse de dos maneras principales, dependiendo de si son de origen humano o murino (ratón). En el caso de los anticuerpos de origen murino, los linfocitos apropiados se seleccionan de los bazos de ratones o ratas previamente inoculados. La célula se fusiona luego con una línea celular transformada, como por ejemplo una línea de células de mieloma, lo cual produce una célula hibridoma. A continuación, se seleccionan las células hibridomas por clonación y se emplean para generar productos de anticuerpos monoclonales. En el caso de los anticuerpos de origen humano, los linfocitos B humanos pueden seleccionarse por clonación según la especificidad de unión entre el hapteno y los anticuerpos resultantes; estas células seleccionadas luego pueden inmortalizarse mediante la infección con un virus. La célula resultante fusionada o transformada puede proliferar indefinidamente en un entorno de cultivo celular o en un biorreactor o bien puede inyec-
994 (1045) Artículos Obtenidos por Biotecnología / Información General
USP 39
tarse en ratones de cuyo líquido ascítico puede extraerse la proteína. El anticuerpo se produce según lo indica la información cromosómica que reside en la célula o que se adquirió durante la fusión y se secreta en el medio, a partir del cual puede purificarse fácilmente. Las células híbridoma se deben analizar y caracterizar exhaustivamente de la misma manera que un banco de células ADNr. El banco de células resultantes se emplea para la elaboración del producto por cultivo celular a gran escala o mediante la recolección de líquido ascítico de ratones inoculados con células transformadas.
Control de los Procesos de Fermentación y Cultivo de Células Como el proceso de producción a través de un sistema vivo es la base fundamental de la biotecnología, es necesario considerar los problemas que implica el control de los procesos biotecnológicos. Las principales preocupaciones para la producción de proteínas en bacterias, por ejemplo, involucran el desarrollo de sistemas que permitan asegurar fa estabilidad genética, un rendimiento uniforme del producto y la evidencia de que no existe contaminación por microorganismos adventicios. Estas mismas preocupaciones valen para el cultivo de células eucarióticas a gran escala, donde, como se ha indicado anteriormente, también existen problemas importantes relacionados con el uso de líneas celulares inmortalizadas, como por ejemplo la presencia putativa de ADN y ARN oncogénico e impurezas de proteínas de los medios. FERMENTACIONES (BACTERIAS Y LEVADURAS) Se han acumulado muchos conocimientos sobre la producción de proteínas recombinantes en bacterias y levaduras; en consecuencia, los principales problemas del proceso de fermentación suelen resolverse mediante la demostración de que existe uniformidad en las condiciones de fermentación. Las fermentaciones con bacterias y levaduras se realizan generalmente durante períodos breves y bien definidos para vigilar y controlar la velocidad de crecimiento y las condiciones de expresión del producto. Se puede detectar la presencia de organismos contaminantes extraños por sus efectos sobre la velocidad del crecimiento, la pureza del cultivo, el perfil de ácidos grasos, etc.; esta presencia es razón suficiente para terminar la fermentación. La estabilidad genética del plásmído producido por bacterias puede controlarse mediante el aislamiento y el análisis de la secuencia de nucleótidos o mediante el mapeo del ADN con enzimas de restricción. Estos resultados pueden verificarse por mapeo de péptidos de la proteína expresada en cada lote del producto elaborado. Es muy importante optimizar las condiciones de fermentación para limitar o evitar el procesamiento proteolítico de la proteína objetivo. El procesamiento proteolítico suele ser un problema en las fermentaciones de E. co/í y puede producir dificultades en la recuperación y un bajo rendimiento del producto. Finalmente, el proceso de fermentación debe contemplar la conformación de la proteína y sus posibles efectos sobre la potencia. CULTIVOS DE CÉLULAS EUCARIÓTICAS Las técnicas de cultivo celular a gran escala para la elaboración de productos obtenidos por biotecnología se remontan a la producción de vacunas. Ciertos avances, como el cultivo de células en suspensión a gran escala usando organismos recombinantes que secretan la proteína deseada hacia el medio de cultivo, han tenido una importante repercusión en la biotecnología. En la actualidad, pueden producirse grandes proteínas glicosiladas en cantidades suficientes para el mercado. Sin embargo, el uso de cultivos de células eucarióticas se complica por aspectos tales como la estabilidad genética, el plegado de proteínas y las condiciones del cultivo, incluyendo la viabilidad de las células y su velocidad de crecimiento. La estabilidad genética de los cultivos celulares, por ejemplo, no puede controlarse tan fácilmente como en el caso de las fermentaciones de E. colí con técnicas como el análisis de las secuencias del plásmido, ya que el gen que codifica el producto se incorpora al genoma de las células y no se recupera fácilmente. Una alternativa es el mapeo de péptidos de la proteína expresada, que requiere una suficiente resolución y sensibilidad para detectar mutaciones sutiles. La ausencia de organismos adventicios en cultivos celulares es crítica. Además de demostrar que no hay bacterias, levaduras ni hongos presentes en los cultivos de células, el fabricante debe proporcionar evidencia, para cada cultivo, de que no hay micoplasmas ni virus adventicios. Es importante tener en cuenta que algunos hibridomas usados para la producción de anticuerpos monoclonales pueden contener retrovirus endógenos. Sin embargo, debe demostrarse que cualquier virus presente en el cultivo es eliminado del producto final. Esto exige el desarrollo de técnicas analíticas apropiadas que aseguren la ausencia de contaminación por micoplasmas o virus adventicios humanos y animales. El grado y tipo de glicosilación pueden ser importantes para e! diseño de las condiciones de cultivo celular necesarias para la producción de proteínas glicosiladas. El grado de glicosílación puede afectar ta vida media del producto in vivo así como su potencia y antigenicidad. Aunque el estado de glicosilación de un producto de cultivo celular es difícil de determinar, puede comprobarse su uniformidad si las condiciones de cultivo son altamente reproducibles.
Proceso de Recuperación y Purificación Por lo general, la recuperación de productos proteicos obtenidos a partir de fermentación o cultivo celular se basa en técnicas eficientes de separación proteica, como las listadas en la Tabla 1. El proceso de recuperación comienza con el aislamiento de la proteína deseada del medio de fermentación o de cultivo celular, a menudo en una forma muy impura. La ventaja del
USP 39
Información General/ (1045) Artículos Obtenidos por Biotecnología 995
cultivo celular y de los productos obtenidos a partir de levaduras es que muchas de estas proteínas se secretan directamente hacia el medio y, por lo tanto, sólo requieren la separación de las células para obtener una purificación significativa. En el caso de productos obtenidos a partir de f. coli, suele requerirse la lisis de las bacterias para recuperar la proteína deseada. Es importante en cada caso lograr una rápida purificación de la proteína deseada ya que las proteasas liberadas por los organismos lisados pueden escindir el producto deseado. Estas trazas de proteasas adquieren especial importancia durante la purificación de productos obtenidos mediante biotecnología, ya que pueden ser muy difíciles de eliminar, pueden complicar el proceso de recuperación y pueden afectar considerablemente la estabilidad del producto final. Tabla 1. Métodos de Purificación Cromatográflcos Empleados para Productos Obtenidos por Biotecnología Cromatografía focalizada Cromatografía en fase reversa Cromatografía de interacción hidrofóbica Cromatografía por transferencia de carga Cromatografía de exclusión por tamaño (tamizado molecular) Cromatografía de intercambio iónico Aniónico Catiónico Cromatografía de afinidad Química Anticuerpos monoclonales Receptores celulares Colorante/Ligando Quelatos metálicos
Por lo general, el proceso de recuperación está diseñado para una elevada purificación del producto final. El requisito de pureza para un producto depende de muchos factores, aunque puede exigirse que los productos de uso continuo tengan una pureza mucho mayor que aquellos concebidos para un solo uso. Los productos biotecnológicos contienen ciertas impurezas que los procesos de recuperación están específicamente diseñados para eliminar o reducir al mínimo. Estas impurezas incluyen cantidades detectables de ADN, factores de crecimiento, proteínas residuales del anfitrión, endotoxinas y proteínas celulares residuales provenientes de los medios. Las impurezas más comunes de interés y los métodos de valoración apropiados para detectarlas se presentan en la Tabla 2. Tabla 2. Posibles Impurezas y Contaminantes en Productos Obtenidos por Biotecnología Impurezas o Contaminantes
Método de Detección
Impurezas Endotoxinas
Prueba de Endotoxinas Bacterianas (85), Prueba de Pirógenos (151)
Proteínas de células anfitrionas
SDS-PAGP, Valoraciones inmunológicas
Otras impurezas proteicas (medios)
SDS-PAGE, HPLCb, Valoraciones inmunológicas
ADN
Hibridación de ADN, Espectrofotometría UV, Unión a proteínas
Proteínas mutantes
Mapeo de péptidos, HPLC, IEFC, MSd
Formil-metionina
Mapeo de péptidos, HPLC, MS
Metioninas oxidadas
Mapeo de péptidos, análisis de aminoácidos, HPLC, análisis de degradación de Edman, MS
Escisión proteolítica
IEF, SDS-PAGE (reducido), HPLC, análisis de degradación de Edman
Proteínas aglomeradas
SDS-PAGE, HPSEC•
Desamidación
IEF, HPLC, MS, análisis de degradación de Edman
Anticuerpos monoclonales
SDS-PAGE, valoraciones inmunológicas
Sustituciones de aminoácidos
Análisis de aminoácidos, mapeo de péptidos, MS, análisis de degradación de Edman
Contaminantes Microbianos (bacterias, levaduras, hongos)
ª
Pruebas de Recuento Microbiano {61 ), Pruebas de Microorganismos Específicos (62), Pruebas de Esterilidad (71 ), pruebas microbiológicas
Electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecil sulfato de sodio. Cromatografía líquida de alta resolución. e lsoelectroenfoque. d Espectrometría de masas. • Cromatografía de alta resolución de exclusión por tamaño. 1 Borradores de lineamientos relativos al Código de Reglamentaciones Federales, Título 21. 9 Fluorocromo de unión con ADN. h Efecto citopático. i Hemoadsorción. i Producción de anticuerpos murinos. b
996 (1045) Artículos Obtenidos por Biotecnología / Información General
Tabla 2. Posibles Impurezas y Contaminantes en Productos Obtenidos por Biotecnología Impurezas o Contaminantes
USP 39
(Continuación)
Método de Detección
Micoplasmas
Método del 21 CFR Modificado1, DNAF9
Virus (endógenos y adventicios)
CPEh y HAdi (virus exógenos exclusivamente), actividad de transcriptasa reversa, MAPí
ª Electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecil sulfato de sodio. b Cromatografía líquida de alta resolución. e lsoelectroenfoque. d Espectrometría de masas. e Cromatografía de alta resolución de exclusión por tamaño. f Borradores de lineamientos relativos al Código de Reglamentaciones Federales, Título 21. 9 Fluorocromo de unión con ADN. h Efecto citopático. í Hemoadsorción. i Producción de anticuerpos murinos.
La cromatografía focalizada y la cromatografía en fase reversa son métodos de purificación que emplean productos químicos, ya sea en la fase estacionaría (unida) o en la fase móvil, que pueden convertirse en impurezas en el producto final. Como sucede con cualquier tecnología nueva, la responsabilidad de la validación (es decir, de demostrar la supresión de productos químicos potencialmente nocivos) recae en el fabricante. La validación es necesaria cuando se están aislando los anticuerpos monoclonales del producto final o empleando una técnica que contiene una etapa de purificación de anticuerpos monoclonales. El proceso debe probar que se han eliminado los fragmentos de anticuerpos o anticuerpos lixiviados. Es necesario asegurar la ausencia de agentes adventicios, como por ejemplo virus y micoplasmas, en la línea celular de origen de los anticuerpos monoclonales. La principal preocupación es la posibilidad de contaminación del producto con una sustancia antigénica que podría ser perjudicial para los pacientes. Es necesario un continuo control del proceso para evitar o limitar tal contaminación. El problema de la antigenicidad relacionada con las proteínas activas y con las proteínas anfitrionas es característico de los productos obtenidos por biotecnología, en contraste con los fármacos tradicionales. Los métodos de fabricación que emplean ciertos disolventes deben controlarse si son capaces de provocar reordenamientos químicos que alterarían el perfil antigénico del ingrediente activo. El fabricante también está obligado a comprobar la uniformidad en el funcionamiento de las nuevas columnas cromatográficas. Las consideraciones para los productos de un solo uso, como por ejemplo las vacunas, pueden diferir ya que no se administran continuamente y su antigenicidad es deseable. Por otro lado, es necesario validar la eliminación de la contaminación con proteínas extrañas o ligandos. A diferencia de los fármacos de origen natural, los fabricantes de productos obtenidos mediante biotecnología deben validar la eliminación de los ácidos nucleicos durante la purificación. Como ya se ha señalado, las vacunas pueden diferir en este aspecto debido a los antecedentes clínicos acumulados sobre estos productos.
CONTROL DE CALIDAD En general, los sistemas de control de calidad para productos obtenidos por biotecnología son muy similares a los utilizados rutinariamente en productos farmacéuticos tradicionales en áreas tales como pruebas y liberación de materias primas, documentación de control de proceso y fabricación, y procesamiento aséptico. Los sistemas de control de calidad de productos obtenidos por biotecnología incorporan algunas de las mismas filosofías aplicadas al análisis de productos farmacéuticos de baío peso molecular, como el uso de estándares de referencia químicos y métodos validados, para evaluar un amplio espectro de impurezas del producto conocidas y/o potenciales, así como posibles productos de descomposición. Los sistemas de control de calidad para productos obtenidos mediante biotecnología suelen ser análogos a los establecidos para productos biológicos tradicionales en lo que se refiere a la determinación de la esterilidad del producto, la seguridad del producto para animales de experimentación y la potencia del producto. Consultar por ejemplo, Medicamentos Inyectables y en Implantes <1 ), pH \791), Partículas en Inyectables (788), Prueba de Endotoxínas Bacterianas (85) e Impurezas en Fármacos y Productos Farmacéuticos (1086). La diferencia fundamental entre los sistemas de control de calidad para productos obtenidos por biotecnología y productos farmacéuticos tradicionales reside en el tipo de métodos que se emplean para determinar la identidad del producto, su uniformidad, su pureza y el perfil de las impurezas. Además, en el control de calidad biotecnológico, frecuentemente es necesario combinar pruebas para el producto final y pruebas durante el proceso validadas, y la validación del proceso para asegurar la eliminación de impurezas no deseadas reales o posibles, hasta alcanzar los niveles sugeridos por los organismos reguladores. Por lo general, los productos obtenidos por biotecnología requieren una caracterización detallada del organismo de producción (célula), una evaluación completa de los medios de crecimiento y propagación de las células y un análisis explícito del proceso de recuperación del producto final. La complejidad de los sistemas de control de calidad para productos obtenidos por biotecnología se relaciona con el tamaño y con las características estructurales del producto y el proceso de fabricación. En general, los sistemas de control de calidad requeridos por los productos elaborados en células procarióticas son menos complejos que los sistemas requeridos para los elaborados en células eucarióticas. Entre los sistemas de control de calidad para los organismos de producción procarióticos generalmente se encuentran la documentación del origen de la cepa productora y las pruebas tradicionales para la detección de organismos adventicios, cariología, caracterización del fenotipo y resistencia a los antibióticos. Además, pueden ser útiles otras técnicas nuevas, como el mapeo por restricción de ADN, el análisis de secuencias de ADN y el control de rutina, que
USP 39
Información General/ (1045) Artículos Obtenidos por Biotecnología 997
puede incluir la medición de concentraciones de ADN de plásmido o ARNm. El control de calidad del banco de células maestras y el banco de células de trabajo para organismos eucarióticos de producción incluye, por lo general, pruebas para detección de organismos adventicios, cariología, identidad y el control de la estabilidad. Todas las líneas de células eucarióticas (excepto las levaduras) suelen analizarse para detectar la presencia de retrovirus, marcadores de actividad retroviral y tumorigeni· cidad, aunque muchas de estas pruebas pueden tener un valor limitado.
FORMULACIÓN DE PRODUCTOS Los productos biotecnológicos son proteínas y péptidos que son moléculas relativamente inestables comparadas con la mayoría de las sustancias farmacéuticas orgánicas. En la mayoría de los procesos biotecnológicos hay una transferencia de proteínas desde un amortiguador de pH estabilizante o solubilizante a otro durante la purificación. En último término, la proteína se transfiere a una solución en su forma farmacéutica final, donde se logra su estabilidad a largo plazo. Además, estos. productos requieren a menudo la liofilización para lograr una estabilidad a largo plazo, debido a su tendencia a degradarse mediante. una variedad de mecanismos, entre ellos, la desamidación, aglomeración, oxidación y posible proteólisís causada por trazas de proteasas de las células anfitrionas. Por lo general, la forma farmacéutica final de la proteína contiene compuestos estabilizantes que proporcionan el pH óptimo y las condiciones de solución necesarias para la estabilidad a largo plazo del producto y/o las propiedades deseadas para su administración (tonicidad). Entre estos compuestos se encuentran las proteínas, alcoholes polihídricos, aminoácidos, carbohidratos, agentes de volumen, sales inorgánicas y agentes tensoactivos no iónicos. Además, estos excipientes pueden ser necesarios para la obtención de un liofilizado estable. Existen requisitos especiales para los productos liofilizados, como por ejemplo el control de la humedad, que, en general, se definen en la monografía USP de cada producto y que pueden ser importantes para su estabilidad. Vale notar que la evaluación de la estabilidad proteica suele exigir múltiples métodos analíticos, cada uno de los cuales puede emplearse para evaluar una modalidad específica de degradación proteíca. Muchas de estas valoraciones se describen en la siguiente sección. El uso de estudios de estabilidad acelerada para predecir la vida útil de formulaciones proteicas a veces se complica por los efectos de la temperatura sobre la conformación de las proteínas, produciéndose un comportamiento que no se ajusta a la teoría de Arrhenius. Por lo tanto, suelen requerirse con frecuencia estudios de estabilidad en las condiciones de almacenamiento recomendadas en tiempo real para establecer la fecha de caducidad de los productos obtenidos mediante biotecnología.
METODOLOGÍA ANALÍTICA El análisis de los productos obtenidos mediante biotecnología depende en gran medida de métodos analítícos sofisticados para demostrar la identidad estructural y la homogeneidad de las proteínas y para evaluar su vida útil o estabilidad. Esta sección trata sobre la exactitud, la precisión, el contenido informativo y la aplicabilidad general de los métodos más comúnmente utilizados. Algunos métodos, como por ejemplo la valoración de impurezas de la célula anfitriona y los procedimientos para ADN residual, pueden ser muy específicos para el producto y para el proceso en particular; por lo tanto, deben incluirse en cada monografía.
Consideraciones sobre Estándares de Referencia El uso de estándares y materiales de referencia apropiados es sumamente importante para el análisis de los productos obtenidos por biotecnología. Estos estándares pueden ser materiales naturales o proteínas producidas por ingeniería genética. Muchos productos obtenidos por biotecnología requieren estándares de referencia exactamente caracterizados disponibles de fuentes internacionalmente reconocidas, como por ejemplo la USP (ver Estándares de Referencia USP (11 )), OMS, NIH y FDA. Actualmente, los estándares de referencia de algunos productos biológicos con unidades de actividad definidas se obtienen en dichas organizaciones. Los fabricantes emplean estos estándares para probar o calibrar estándares secundarios aplicando mu· chas de las valoraciones descritas en esta sección. El valor de potencia del estándar de referencia se obtiene pór estudios colaborativos que, cuando se evalúan estadísticamente, permiten determinar el valor de potencia máxima asignádo al estándar de referencia. El estándar secundario puede emplearse para determinar la cantidad declarada del fármaco o la potencia definida en la etiqueta del producto. Por lo tanto, la USP aprueba y proporciona los estándares o materiales de referencia para productos obtenidos mediante biotecnología utilizados con los fines analíticos descritos en las monografías USP correspondientes. En una situación ideal, estos estándares de referencia deberían utilizarse mundialmente y siempre deberían estar calibrados en comparación con el estándar de los EE.UU. que el fabricante entrega a la FDA para productos autorizados por la FDA. Esto asegura la determinación exacta y uniforme de la actividad1 contenido y pureza de estos productos. Debido a diversas características especiales de los productos obtenidos por biotecnología, como por ejemplo la especificidad del proceso y del producto, es posible que otros productos similares necesiten estándares de referencia diferentes. Además, la USP realiza el desarrollo minucioso y la recalibración de los estándares de referencia para reemplazar estándares agotados o caducos a fin de asegurar que no cambien las indicaciones en las etiquetas de los productos farmacéuticos. Un punto que se debe considerar en la asignación de la potencia al estándar primario mediante estudios colaborativos es que las unidades de actividad definidas sólo son significativas cuando se comparan en una sola valoración exacta y bien descrita. Si se intenta comparar actividades obtenidas con valoraciones que son ligeramente diferentes, es probable que se obtengan resultados marcadamente distintos.
998 (1045) Artículos Obtenidos por Biotecnología / Información General
USP 39
Metodología Característica Existen varios métodos analíticos específicos para productos obtenidos mediante biotecnología. Muchas de las valoraciones y pruebas descritas pueden realizarse de diferentes maneras y, como algunas pueden ser también específicas para un determinado producto, se necesitan normas claras sobre la aplicación de métodos específicos en cada situación en particular. Ver los capítulos Diseño y Análisis de Va/oraciones Biológicas <111 ) y Validación de Procedimientos Farmacopeicos (1225) para información general sobre la metodología. CONTENIDO PROTEICO Las valoraciones de contenido proteico se emplean para determinar cuantitativamente la cantidad de proteínas en un producto dado obtenido por biotecnología. La determinación del contenido proteico suele ser una de las mediciones más difíciles y frecuentemente requiere una verificación independiente mediante métodos alternativos. Siempre que sea pertinente, pueden emplearse métodos tales como la espectrofotometría UV con una absortividad válida y el análísis de nitrógeno por Kjeldahl para determinar las cantidades absolutas de proteína independientemente de los estándares de referencia. Sin embargo, otros métodos, como Lowry, Biuret y el análisis cuantitativo de aminoácidos, que requieren el uso de sustancias de referencia, también permiten obtener valores exactos. Las valoraciones de contenido proteico se encuentran entre los métodos más importantes para estos productos ya que los resultados de otros tipos de valoraciones, como por ejemplo la potencia, también dependen de ellos. Existen varios métodos comunes de valoración para determinar el contenido proteico. Estos métodos de valoración pueden emplearse en distintos puntos del proceso de elaboración de un determinado producto obtenido por biotecnología. En el caso de proteínas de alta pureza, el método más sencillo para evaluar el contenido proteico se basa en la determinación espectrofotométrica de la absorbancia en el UV de una solución de proteínas. La absorbancia se determina al máximo de absorción y se calcula la concentración proteica empleando una absortividad determinada empíricamente. Esta técnica se aplica a proteínas que contienen los residuos aromáticos triptofano, tirosina, y/o fenilalanina. A menudo, la longitud de onda de absorción empleada es de 280 nm. El coeficiente de extinción, o absortividad molar, debe determinarse en el mismo disolvente usado para la muestra que se va a medir. Si fuera necesario, el producto puede diluirse antes de analizarlo para obtener soluciones con valores de absorbancia en el intervalo lineal de detección. Los aglomerados y partículas de mayor peso molecular pueden dispersar la luz, que artificialmente aumenta la absorbancia. Los excipientes que tienen absorbancia significativa a 280 nm también interfieren. La espectrofotometría UV es única entre los métodos de valoración de contenido proteico, ya que es una medida absoluta de concentración de una proteína específica que no requiere calibración con estándares. Un método general comúnmente utilizado para medir el contenido proteico es la valoración de Lowry. Este método se basa en la reacción de Biuret de proteínas con cobre (ll) en una solución básica y la reducción del ácido fosfomolíbdico-fosfotúngstico de Folin-Ciocalteu a azul de heteropolimolibdeno mediante la oxidación catalizada por cobre de los aminoácidos aromáticos tirosina, triptofano y fenilalanina en la proteína. Los productos de reacción son azules y se cuantifican en forma espectrofotométrica en la región visible entre 540 y 560 nm. Esta reacción es lineal para microgramos de proteína. La valoración, sin embargo, es susceptible de interferencias de varias sustancias, como por ejemplo alcoholes, azúcares y detergentes. En algunos casos, sustancias de interferencia o el producto pueden extraerse antes del análisis, por ejemplo mediante su precipitación. Además, la preparación de controles que contienen sustancias interferentes presentes en el producto farmacéutico puede permitir la corrección. Aunque históricamente se ha empleado la albúmina sérica bovina para preparar la curva estándar, se sabe que cada proteína puede reaccionar con una intensidad diferente y por lo tanto se debe emplear un material de referencia del mismo producto para la calibración. La valoración del ácido bicinconínico (BCA) es una alternativa útil a la valoración de Lowry, ya que es menos sensible a sustancias interferentes. El reactivo de trabajo es una solución de BCA-cobre (11). El complejo de cobre (11) se reduce a cobre (1) en presencia de proteínas y el color morado puede cuantificarse por espectrofotometría a aproximadamente 560 nm. También pueden emplearse otras valoraciones colorimétricas. El método de Bradford, por ejemplo, emplea la unión delcolorante Azul de Coomassie Brillante a la proteína en un medio ácido. La concentración de la proteína en la solución se determina mediante la comparación de la absorbancia a 595 nm con una curva estándar de un material de referencia. Los métodos de fluorescencia empleados se basan normalmente en fluorescamina o en o-ftaldialdehído (OPA). La principal ventaja de estas valoraciones es su mayor sensibilidad. Otra ventaja es su uso con proteínas hidrófobas. La fluorescamina y el OPA reaccionan con aminas primarias en el extremo N-terminal del polipéptido y en las cadenas laterales de aminoácidos tales como la lisina. El método de Kjeldahl para nitrógeno, Determinación de Nitrógeno <461 >, es una determinación exacta y precisa de la concentración proteica y suele emplearse en la determinación de absortividades UV de proteínas. La valoración se realiza en dos etapas. En primer lugar, la muestra se descompone con ácido sulfúrico produciéndose sulfato de amonio, dióxido de carbono y agua. La descomposición se realiza al punto de ebullición del ácido sulfúrico en matraces de cuello largo con forma de pera. Estos matraces sirven para condensar el vapor de agua e impedir la pérdida de material. Según la eficiencia de la descomposición, se pueden agregar diversas sales, como por ejemplo sulfato de potasio, para aumentar el punto de ebullición de la solución de ácido sulfúrico. También se han empleado agentes oxidantes, como por ejemplo ácido perclórico o permanganato de potasio, para mejorar la descomposición. La segunda etapa de la valoración incluye la determinación directa del amoníaco. En la mayoría de las macrodeterminaciones, el amoníaco se destila por corriente de vapor a partir de la mezcla después de la
USP 39
Información General/ (1045) Artículos Obtenidos por Biotecnología 999
alcalinización con hidróxido de sodio. Por to general, el amoníaco destila cuantitativamente de la mezcla en 5 a 20 minutos y se absorbe cuantitativamente en una solución ácida estandarizada, de volumen y normalidad conocidas. El exceso de ácido se retrovalora volumétricamente con una base estandarizada. Para las determinaciones de proteína bruta, el valor del amoníaco (y, por lo tanto, del contenido de nitrógeno) se multiplica por un factor de 6,25 mg de proteína por mg de nitrógeno, que corresponde a un contenido de nitrógeno de 16%. El valor proteico obtenido de esta forma es generalmente válido para la mayoría de las proteínas. Si se requiere un valor más exacto, como en una medición de absortividad, entonces el factor de conversión debe calcularse para el contenido de nitrógeno de cada proteína pura a partir de su composición aminoaddica. En el caso de las glicoproteínas que contienen aminoazúcares, el valor calculado produce un valor atificialmente alto a menos que se aplique una corrección. El análisis de aminoácidos se emplea en la determinación de la absortividad apropiada de la proteína y también puede emplearse cuantitativamente para la determinación del contenido proteico. Este procedimiento, aunque es más complicado que los de.scritos anteriormente, también produce resultados exactos. ANÁLISIS DE AMINOÁCIDOS El análisis de aminoácidos es un método químico clásico para determinar la composición de aminoácidos en proteínas y péptidos. El método consiste en la hidrólisis completa de una proteína o péptido hasta sus aminoácidos componentes, que luego se separan por cromatografía y se cuantifican. Por consiguiente, el análisis de aminoácidos puede emplearse para det~r· minar la composición de un producto (es decir, la identidad) y la cantidad de proteínas totales presente. El método tiene algunas dificultades inherentes (como por ejemplo la destrucción total o parcial de algunos aminoácidos) que pueden evitarse em· pleando la metodología analítica apropiada. El aminoácido triptofano se destruye por hidrólisis con ácido clorhídrico 6 N y, por lo tanto, requiere otras condiciones de hidrólisis. los aminoácidos serina y treonína pueden destruirse parcialmente, mientras que las uniones peptfdicas entre residuos hidrófobos voluminosos tales corno la valina y la isoleucina pueden ser más resistentes a la hidrólisis, proporcionando en ambos casos valores inferiores a los reales. En consecuencia, se puede emplear el análisis de muestras a lo largo de la hidrólisis para compensar estos factores. La cisteína y la metionina pueden requerir la oxída<;:ión prevía a ácido cisteico y metionina sulfona, respectivamente, para su cuantificadón exacta. Cada proteína específica puede re· q!Jerir un procedimiento de hidrólisis en condiciones optimizadas para el análisis de sus aminóácidos a fin de obtenecbuenos resultados. El análisis de aminoácidos se realiza en dos etapas. La primera etapa es la hidrólisis de la proteína ql.le genera sus arninoáci· dos compórientes. Esta hidrólisis se realiza normalmente con ácido clorhídrico 6 Na aproxirn¡¡damente 11 Oº durante 24 hqr;;Js, Algunas proteínas pueden requerir condiciones de hidrólisis más largas o más enérgicas. la segunda etapa es la sepa radón y cuantificación de los aminoácidos individuales mediante alguna forma de cromatografía que se pueda realizar por derivatización anterior o posterior al paso por la columna. Se dispone de varios procedimientOsde derivatizaciónanteriores al paso por la colµmna, como por ejemplo con OPA, fenilisotiocianato (PITC) y fluorenílmetoxicarbonilo (FMOC); Estos derivados se sepa· ran luego mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPlC) en fase reversa (FR) y se cuantifü;an por detección en (!I UV o pódll.lorescencia. Dentro de los métodos de derivatízación posteriores al paso por la columna se encuentran l
SECUENCIACIÓN DE PROTEÍNAS La secuenciación de proteínas es útil para el control de calidad de productos biológicos proteicos ya que puede proporcionar información sobre su estructura primaria, es decir, la estructura amino--terminal y carboxi-terminal. En el caso de productos biológicos provenientes del ADNr, esta metodología también sirve para confirmar la secuencia amínoacídica predicha por el ADN complementario (ADNc), la homogeneidad de la proteína y el número potencial de cortes proteolíticos. En cuanto a los anticuerpos monoclonales, esta técnica se emplea para determinar su homogeneidad proteica. La secuenciación de proteínas se divide en aplicaciones y procedimientos de secuenciación amino-terminal y carboxi-terminal. Secuendación Amino-TerminaJ-EI análisis de la secuencia amino-terminal es una técnica química clásica que proporciona información importante sobre la estructura primaria (secuencia), ta homogeneidad y la presencia de escisiones conocidas o desconocidas en el polipéptído. El análisis de las secuencias N-terminales se realiza con varios secuenciadores de péptidos automáticos comercialmente disponibles. El método se basa en la reacción de acoplamiento del residuo amino~terrninal de una proteína o de un péptido con PITC. El derivado aminoácido-PTC resultante se separa de la proteína con un ácido orgánico perfluorado (por lo general ácido trifluoroacético o heptafluorobutírico), que expone el aminoácido adyacente. Este aminoácido adyacente sirve como un nuevo N-terminal y se derivatiza en el siguiente ciclo de acoplamiento y escisión. Este proceso se repite hasta extraer un número apropiado, normalmente de 8 a 1 O aminoácidos. Por lo general, el residuo aminoácido modifi·
1000 (1 045) Artículos Obtenidos por Biotecnología / Información General
USP 39
cádo resultante del ciclo de escisión (anilinotiazolinona [ATZ]) se convierte en un feniltiohidantoín-aminoácido (PTH-M) en presencia de ácido y calor. Luego, el PTH"Mpuede determinarsemediante un análisis porRP-HPLC. Cuálquier esdsión dentro de la cadena, asícomo la heterogeneidad de los terminales N (por ejemplo, metionina N-terminal) en el polipéptido, también se secuencián simultáneamente. Esto da lugar a picos más pequeños en el cromatograma y permite la cuantificación relativa de los terminales N y la identificacíón del lugar de escisión en el polipéptido. Este procedimiento para la secuenciación de proteínas también puede realizarse manualmente. Las limitaciones del método de secuenciación col1 PfTC son que es solamente semicuantitativo (es decir, la cantidad de terminales N sólo puede estimarse) y que los derivados PTH de la serina y la treonina se pueden degradar mucho, lo cual dificulta su determinación. Para determinar los residuos de cisteína es necesario modifiC:árlos, por ejemplo mediante alquilación. Además, los aminoácidos glicina y prolina se reordenan lentamente, lo que presenta un pequeño problema para su determinación. Secuenciación Carboxi-Terminal-La secuenciación de proteínas a partir del extremo carboxi~terminaHambién proporciona valiosa información sobre la estructura primaria así como posibles escisiones de Ccterminales. La degradación secuencial de una proteína desde el extremo e-terminal puede realizarse mediante métodos químicos o enzimáticos. Se puede usar la reacción de hidrazina, tiocianato de amonio o bromuro de cianógeno ton una proteína para degradar secuencialmente la proteína en el extremo e-terminal o en sus proximidades' Se ha extendido el uso de la reacción de tiocianato de amonio para proteínas acopladas a soportes sólidos. Los aminóácidos (.terminales· pueden escindirse secuencialmente· en forma .enzimática. usando exopeptidasastalescomolas carboxipeptidasas. Las limitaciones de las carboxJpeptidasasson la posible contaminación con endop.eptidasas, su inherente díficultll;dy la· naturaleza impredecible de· ¡a secuenciación. La.espectrometría de. masas puede emplearse ya sea direetar'nente en digeridos de próteínás o.junto con el mapeo de péptidos por H PLC para identificar .el. extrerno t~terrninal de la pro~eína. Sinembar:go7 estos métodos son solamente semicuantitativos. MAPEODE PÉPTIDOS POR.HPLC El rnapeo de péptidos cumple dos propósitos principales en teladón con las protefnas d.e uso farmacéutico: es Un método. de ider:itidad altamente específico y, en el casó de los< productos obtenidos mediante biotecnologíatpuede servir como una confirmaeión defa estabilidád genétiCa. ESte método se emplea pará compararla.estructura proteica de un lote específico de matetial .ton la dé un material o estándar de referencia ápropiado o con la estructura de lotes anteriores para verificar si la estructura primaria es correcta y comprobar la uniformidad de la estructura primaria en cada lote (dentro de los límites de esta técnica). Por lo general, los grupos amino-terminales y carboxi-terrninales de los péptidos, y de los péptidos que contienen carbohidratos se pueden· separar e identificar. Estos últimos son valiosos en los mapeos de kis péptidos de proteínas glícosiladas tales corno los anticuerpos monodónales; Los mapas de péptidos pueden emplearse para determinar Ja presencia de aminoácidos incorrectos simples o múltiples como resultado de Una mutación puntual o errores en lá traducción de la secuencia de ADNc. El procedimiento implica la fragmentación selectiva de la proteína, formándose péptidos diferenciados que se separan· por alguna técnica cromatográfic:a. La fragmentad6n se logra C:on endopróteasas tales como la tripsina, quimotripsina, termolisina, proteasa V$, o mediante la degradación química selectiva ton bromuro de cianógeno, que divide la molécula en sitios específic cos.La selección de la endoproteasaapropíadadepende de la •secuencia primaria dela proteína. La.tripsina escinde los residuos básicos de lisinayargínina en su extremo C0terf1linal; laAy la selección del soporte de sílitepuede ser un criterio importante para una separación óptima, Para los.péptidos más pequeños generados por estas digestiones, se ha comprobado que las fases estacionarias t8 y C1 8 son en general más eficientes que los· soportes C4, LQs disolventes más comunes empleados para sepéJraciones en fase. reversa son agua y acetoni· trilo con una cantidad constante (-0, 1%) de ácido trifluoroacético. tas fases móviles amortiguadas que contienenfosfato también ofrecenuna excelente selectividad según su pH, Al examinar el efecto del ptí entre 3,0 y 5,0 se produce un desplazamientQ en los péptidos que contienen los residuos ácido glutámico y ácido aspártico. Hay menos información disponible para las separaciones de intercambio iónico, pero son útiles los soportes de· sílice, así corno los poli méricos con soporte estacionario
USP 39
Información General/ <1045) Artículos Obtenidos por Biotecnología 1001
de intercambio iónico débil y fuerte. Como muchos péptidos son ligeramente hidrófobos, puede requerirse la adición de pequeñas cantidades de disolventes orgánicos en la fase móvil, por ejemplo 5% a 10% de metano! o acetonitrilo. Una posible desventaja del análisis HPIEC para mezclas de péptidos es que, a veces existe la posibilidad de no retener en la columna los péptidos neutros o los que tienen la misma carga que el soporte y, por lo tanto, este método quizás no permita separarlos o identificarlos. VALORACIONES INMUNOLÓGICAS Las valoraciones inmunológicas se emplean para identificar y cuantificar la proteína de interés en ingredientes farmacéuticos activos o para detectar y cuantificar las impurezas proteicas conocidas provenientes de la célula anfitriona. Dado que estas impurezas proteicas pueden representar un gran número de trazas de impurezas posibles en lugar de una sola impureza, las valoraciones inmunológicas deben ser sensibles y selectivas para detectar la mayor cantidad posible de estas impurezas. Se han desarrollado valoraciones inmunológicas capaces de medir estas impurezas en concentraciones muy bajas en las proteínas de E. cofi (ECP) y CHO. Además, las valoraciones inmunológicas pueden servir corno valoraciones de la potencia para anticuerpos monoclonales con el empleo de un antígeno apropiado. Las valoraciones inmunológicas incluyen un gran grupo de valoraciones basadas en interacciones específicas anticuerpo: antígeno de alta afinidad del complejo, tales corno los radioinrnunoanálisis (análisis RIA) y las pruebas de inmunoabsorción enzimática (prueba ELISA). Los análisis RIA se realizan en fase líquida o sólida con un anticuerpo no marcado dirigido contra la proteína radiomarcada de interés. Este análisis consiste en comparar la inhibición de la unión de un antígeno marcado a un anticuerpo no marcado con la inhibición mediante estándares conocidos, lo cual permite la cuantificación de la proteína de interés. Las valoraciones inmunorradiométricas (IRMA) o los análisis RIA de fase doble utilizan dos preparaciones de anticuerpos entre las que se coloca la proteína de interés. El primer anticuerpo no está marcado y está dirigido contra la proteína; el segundo anticuerpo está radiomarcado y puede estar dirigido contra la proteína o el primer anticuerpo. El complejo anticuerpo:antígeno. se aísla en su totalidad y se determina la radioactividad y, en consecuencia, la proteína de interés. El desarrollo de un análisis RIA o una valoración IRMA para un producto obtenido por biotecnología requiere una cuidadosa atención a la producción de los antisueros, a la preparación del trazador marcado, a la preparación de un estándar de referencia apropiado y a los métodos para la separación del antígeno libre a partir del antígeno unido. El formato de prueba ELISA para el análisis de trazas de impurezas más utilizado es la prueba ELISA de fase doble, que emplea dos preparaciones de anticuerpos en forma similar a las valoraciones IRMA, pero sin marca radioactiva. El primer anticuerpo no está marcado y al segundo anticuerpo se le ha agregado una enzima, como por ejemplo peroxidasa de rábano (HRP) o fosfatasa alcalina. A grandes rasgos, la prueba ELISA consiste en aplicar una capa de anticuerpos purificados a las proteínas de las células anfitrionas sobre placas de microtitulación, seguida del producto proteico. Se agrega el conjugado anticuerpo:enzima y se deja que se una a las proteínas de las células anfitrionas unidas al anticuerpo. Se agrega un substrato apropiado para que se desarrolle un color, que se analiza con un lector de placas por espectrofotometría. Un ELISA multiantígeno de tales características requiere una preparación de estándares de referencia apropiados representativos de fas impurezas proteicas de las células anfitrionas, para así servir como el ínmunógeno en la preparación de los anticuerpos que se emplean en la valoración. Estos estándares de referencia generalmente se preparan mediante un proceso de fabricación que proporciona todas las proteínas esperadas de las células anfitrionas excepto la proteína producto. Es necesaria la ausencia total de la proteína producto en esta preparación para evitar la producción de anticuerpos contra el propio producto cuando el estándar de referencia se emplea como inmunógeno. Debido a la diversa afinidad de los anticuerpos policlonales con las preparaciones multiantigénicas, no se puede garantizar la exactitud absoluta de los métodos multiantígeno ni la capacidad de detectar todos los antígenos posibles. ELECTROFORESIS Los métodos electroforéticos se encuentran entre las valoraciones más comunes y potentes empleadas para la evaluación de la pureza y homogeneidad proteica. Son valiosas no sólo para la evaluación inicial y la separación de productos obtenidos mediante biotecnología sino también como métodos indicadores de estabilídad para detectar cambios moleculares o químicos en la molécula, debidos a la desnaturalización, aglomeración, oxidación, desarnidación, etc. Se facilita el uso de estos métodos dada su sencillez y el hecho de que sólo requieren microgramos de muestra. Los dos tipos de valoraciones electroforéticas más frecuentemene usadas para productos obtenidos por biotecnología son fa electroforesis en gel de poliacrilamida dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) y el isoelectroenfoque (IEF). El método SDS·PAGE separa proteínas principalmente según su peso molecular ya que, en presencia del detergente aniónico Dodecil Sulfato de Sodio, se forma un complejo proteína-Dodecil Sulfato de Sodio con carga neta negativa. En primer lugar, se desnaturaliza la muestra en el detergente, que rompe las uniones no covalentes intra e intermoleculares que le dan estructura a las proteínas y a continuación se somete a electroforesis en un soporte de gel de poliacrilamida. La migración de las proteínas a través del gel es proporcional a su tamaño; las proteínas más pequeñas migran más rápido que las grandes a través del gel. Con frecuencia, las muestras se separan electroforéticamente bajo condiciones reducidas y no reducidas para determinar la existencia de impurezas con el mismo peso molecular o escisiones proteolíticas intramoleculares de la proteína de interés. Aunque fa SDS-PAGE no reductora se emplea normalmente para estimar el estado de aglomeración o de oligomerización de la
1002 (1045) Artículos Obtenidos por Biotecnología / Información General
USP 39
proteína de interés, este método sólo permite observar aglomerados u oligómeros estables en presencia del Dodecil Sulfato de Sodio y en las condiciones usadas para la preparadón y electroforesis de la muestra. Las proteínas que constan de cadenas múltiples unidas por uniones disulfuro se descomponen y se dividen en cadenas polípeptídicas individuales. La detección de la muestra después de la electroforesis puede ser cuantitativa mediante un análisis densitométric.o de tinción con Azul Brillante Coomassie o cualitativa, pero con mayor sensibilidad cuando la muestra está presente en cantidades de nanogramos si se realiza la tinción con plata. El SOS-PACE con tinción con plata también puedellevarse a cabo cuantitativamente bajo condiciones apropiadas. Con una validación adecuada, se puede usar la tinción con Azul Coomassie Brillante y la densitometría para obtener una determinación cuantitativa de nanogramos de polipéptidos. El SDS-PAGE junto con la tinción con Azul de Coomassie Brillante se emplean para determinar cuantitativamente la pureza de Ja muestra con respecto a dímeros y aglomerados y fragmentos peptídicos covalentes más grandes. Cuando el método se combina con la técnica de tinción con plata, se puede hacer una evaluación de niveles bajos o de trazas de una nueva impureza al compar;'lr directamente la muestra sometida a electroforesis con el material o el estándar de referencia sometido a electroforesis en condiciones reducidas y no reducidas, En general, la ti.nción ·ton plata se emplea cualitativamente porque podría haber una variación importante en la unión con. plata en.tre una proteínayotra debido a una tinciónde fondo heterogénea en ensayos de rutina. Se puede estimar la cantidad de una impureza mediante la electroforesis. de una cantidad conocida de un estándar interno, como por ejemplo la albúminasérica bovina, o mediante diluciones menores de la proteína de interés en otros carriles del mismo gel. La separación SDS-PAGE de una. proteína puede combinarse .con un método inmunológico, como por ejemplo la inmunotransferencia (immunoblotting). La trMsferencia Western (Western .blot) resultante se emplea para identificar las bandas electroforéticas (es decir, la impureza relacionada con el producto o con las proteínas de• las células anfitrionas); Después· de la electroforesis, se transfieren las proteínas sepa. rad;'IS a una meqibrana de nitrocelulosa o de difluoruro de polivinilideno (PVDF) y se hacen reaccionar con el anticuerpo de interés. La visualitación del complejo se realiza con un anticuerpo marcado enzimáticamente o radiomarcado. El métodolEF separa.proteínassegúnsu carga en uilcámpo eléctrico. Las cargas en.unaproteína provienen de distintos sitios en la t(!dena de aminoácidos, tales como grupos amino protonados, grupos carboxilo no protonados, grupos sulfhidrílo no pre1tonados, resiºuo~ de tirosina no protonados, residuos de cisteína oxidados. y residuos desamidados. Sin embargo, existe unpH para cada proteína en et·cual la proteína es .isoeléctrita y estas cargas se ¡mulan mutuamente,. siendo la carga. n.eta ·efec~ tivamente cero; El lEF se realiza con p~oteínlils nativas en un soporte de poliac;:rílamída de poros grandes o de gel de agarosa conanfolitos(iones anfóteros debajo pe.so rriolec::ular) que es~ablecenun gradiente depH debido.a su migración dentro de la matriz del soporte cuando se aplica un campo eléctrico.· Simtiltánearriente, en presencia del. campo· eléctrico, las proteínas con carga positiva mígran h;'lcia el cátodQy las proteínas con carga negativa migran hacia el. ánodo. La. migración finaliza cuando cad
Durante mucho tiempo, se han empleado métodos cromatográficos para determinar la pureza de moléculas orgánicas y proteínas pequeñas, tales como la insulina (ver Cromatografía (621)) y para determinar la concentración de ingredientes activos y/o excipientes de productos farmacéuticos. Los métodos cromatográficos también son. muy eficaces para la determinación de la. pureza de productos farmacéuticos obtenidos por la técnica de recombinación . .Sin embargo, la cromatografía de proteínas es mucho más difícil debido a las múltiples modalidades de interacción con el soporte cromatográfico producidas por el tamaño y la forma, la carga y la hidrofobiddad de las proteínas. Los métodos cromatográficos comúnmente empleados para aislar y caracterizar proteínas recombinantes son el RP-HPLC, HPIEC, cromatografía de exclusión por tamaño (HPSEC) y cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC). Estos métodos incluyen la separación de proteínas y se emplean para determi· nar la pureza de los ingredientes farmacéuticos activos, asf como los niveles de impurezas o productos de degradación conocí· dos. Una complic;:ación en todos los métodos cromatográficos por columna es la determinai;;ión del equilibrio de masas entre la carga de la columna y el eluato. Sin embargo, las técnicas de HPLC son valiosas cuando es necesario determini'lr la pureia y la potencia de los procjuctos farmacéutieos proteicos. Los análisis RP-HPLC más comunes se llevan a cabo en columnas que contienen una fase estacionaria C4 o C8 sobre un so• pone de sílice o un soporte polimérico, También se utilizan fases estacionarías Cl 8, pero más frecuentemente con péptidos más pequeños en aplicaciones como el mapeo de péptidos. Se prefieren soportes con poros de un tamaño de al menos 300 A para proteínas con un peso motecularmayor de 1O000. En.la mayoría de los análisis RP-HPLC, las proteínas se eluyen con
USP 39
Información General/ (1045) Artículos Obtenidos por Biotecnología 1003
g~d~'nt~s'*''ª(;e;~nitrtltottcuo~ '/.se·mantienef.'.ofistante ·ef. ácido tr;ifl~{;)r~até:tiGoefi:(f¡;~llf¡;,::T~~i~~:~~;~~-,~~Jj'~Mlk'!.~ ~~d~rti~d~l·PH:í ~mí>porejempl9:f~at()·ó Tris [ttlS(fiiclr.oximeti~)am.idonu:itari<>'l~·®nde.Ei!J ~~··P:íf~:~¡~~~mj~Mfitil~~ ~ tt,~k'l~tiv¡qadyJtjgtats.e~racíoMsóp:timas.
BI HP1ECes í:m f'.tléto9,o frnp<;irtante. para la determináción dE! la pureza. Estas separaciq~ ~e:~~~li\':\(.~~~i~~~~- ete'Ja:m~~il.llüi~·senúJJJe5·para i~ntificar.y ~antifk.ar impur~as ~ur::les11n. p~~íntsi;l!l'.~i~if,,~~~~tii~:.•'fjllílllili:~ Mas:~~i~adas•(priftc;;i~a~m~n~•metiofi!ní!.:•()'xid¡1da) Y• desamiqada.s.(gl.¡;;itam~fia',y,.1a:a~a~9ioa:~,*~ifi~M-il!t~@h'•1~Jtl!:ii da~~·~~e:n·emi;l~ar,~ fáses.~t~Gí~n9'.tlas.de ihte;rcámbib·jónico fuert~: :!il·.dé~Oe~ en~Q~-~'il~~,¡~J~~ífji~¡l.'i~liMí+
to'gt¡,¡fía de tnteréamP:io catiónico:p.uede realiiarse en resinas ae. tipo sulfoprl')lpjlo,Y;S~ ~' p~t.¡;p.ff;Jd(l~i·tt~d~llii~lí.li~-~ mi(¡i'á'.~i:ón~,~r~cg~meral,JaS: protefnás·~e.'tat:ganso~re ona ct:ll:IÍ'}a gradié~e.sa1ina;fiit~o:m:Q ~torurb:ée.,J~~~1~af!iíde:;iif.~i:~:ftjf~em~ti•¡(¡ll*'8 ~~t~lll~;q~~s0:f~f:m:,~@oii~oi se~i~··tª'inf0í'máci6n·.t1ue .se· neeesite,;lafa~m~lt·P,~t!;¡l¡~~~~t~~¡;~fiií~t':i•RllBB.I
º·ª
~1:~:.ami~~~a~w.<;Je~.iiQ;.1.os~'tál.~omo.fosfato 1oo•mMipfl'.1;.()~en:.p~~de:~d~~-i;~~;~~[-~~~ n•s,~!lfas~j.~''1":n •at~o~etaC>J:rópi~Q'.:~·detet!iJéfl'.te•tat '.éame ~e<;ll.$i.Jlfato
te1 e~l:;.oml(ín el flso de soportes basados ea sílice y agárosa, ent:i-ecruzadbs disponibles;~ ei,m~~4dDt.:~~~¡~:s~~li!:ti~~ll
¡;¡p$f~;:para, la~termi(l.ací~;d~ftia~ent'<>s .cleproteínas•. J.as·c;:adef;las. fr!ltme:P:ta{,Úls:~~J~;-~~i.rit•ü~l:tíll• ~tii~ti;Tij.sdis~Jf~~ dé~.sií:iyQs .i:le:ci~tf'l¡¡,.a't~~f'flief'lto dela.muestta.(;on 11·~ 'a~tj;~•;:~~;,~tW•Mlll•lll
t()et~fl:~f:l;bí'i:Jtire'lª··'~tt~'6tl,(&~ulft1ró''!J,,sf:!p.arE1;.,las•gidena6.•P'or r19ristgujeate:.;,l~$,~~~~$Rlim~i:\l~~~¡~'J1•~'tillllf1R r:r:i~!Íi19 fttiif'fl~r:¡.tadt\srotí~i~l!1té et ;k!Bs¡f;, El:fffC ~epara proteíhasen .base: a diferencias eh ·su hidfofol,tltlfd.a!il bajo.<;9o(;J¡~¡
d~~fo~.~::tm~ea·ton'ul'la, fíi!sé'm~Y:iJ;a~úosa·<:le.amo!tiguiit'.dor.~e .pH:y ona,GO~ce:~trá~{~,~:~l:!i~,~i~~'·~ll;~~-~41RllAI!~ íit~~-ti~•)ij.;
mediaate una. c.uidadosa selec(fion :de. Ja,:fa~ e:stífi(lqi'iáf!.~!1
l• jalót~do.r:}es· biomitlnétitas:(vak>(ác'iones que imi~n.el efecto·.biológico del ~u~t~l~di·~Íl.!11~~l~~~lf;~;;¡ (jon~det'1'rilón• ae ias v.1110ráé,lonespara•produtt:d~,yaJ~iM,:;~.!JM•W~i empléadi;í, es deseable y a veces necesario emplear una valoración blomimétka; Vllforátiones en M.Qdefos Animales-las valoradones biomimétlcas en modelos anima~ ;se, b;a'ri.;.
USP 39
1004 (1045) Artículos Obtenidos por Biotecnología / Información General
ploides de prepucio humano o en una línea de células de carcinoma de pulmón humano (A549). Esta valoración se realiza en placas de mícrotitulación por incubación de células con a.-interferón seguida de la exposición: al virus de la encefalomiocarditis. Las células que sobreviven se detectan por unión a un colorante y se calcula la dilución de a-interferón en la cual se produce la protección en un 50% de la monocapa. Valoradones in Vitro {Fisicoquímicas}--Este grupo de valoraciones no depende de un modelo vívo, sino que se basa ge• neralmente en la acción química de un producto biológico. Estos métodos son bastante sencillos, rápidos, precisos y exactos. La actividad del activador plasmínógeno tipo tisular (alteplasa), por ejemplo, puede determinarse con una valoración in vitro de lisis del coágulo que puede automatizarse y prqporcionar los resultados requeridos en cuestión de horas. Se forma un coágulo de fibrina sintética en presencia del plasminógeno como resultado de· 1a acción de la enzima trombina sobre el fibrinógeno. Cuando se agrega alteplasa, el plasminógeno se convierte en la enzima activa plasmina, que luego lisa el coágulo sintético. El punto final de la valoración se sigue en forma espectrofotométrita o visualmente mediante la observación de la liberación de burbujas de aire atrapadas. Otra ventaja de este tipo de valoración, debido a su precisión y exactitud, es que puede emplearse para pr:oporcionar estimaciones confiables de la estabilidad del producto. También se han desarrollado ejemplos de valoraciones biológicas invitro. basadas en• las interacdonesanticuerpo:antígeno y proteína:ligando (receptor) para aplicaciones específicas. Laaplitación·de estos tipos devalorat:iones. ofrece llluchasventajas para determinar la potencia delos anticuerpos mo· nocionales o otras proteínas muy específicas para on ligando cuya •reac:tividad induye paso de en lace.
un
;¡ ADN residual de·· la,S·.celolasarifürjóri9s es Üt)a pósibleilllpt.íreza éspécffidfdel.pfoceso en.•.u11 pfodut:t6 obtenido mediante biótetn61ogfa ..EIADN····residü alesdiféteílt'F eri>~áda pr<)élü!:ifüy~· •qúe depende del organi,SrtioanfüriónY (fe1··procedilllíerito de reó.Jpefa·dón ·otilizado•·•para.··elaborar elpt<)ciütfü; ···,l\úl1qüef!6•·•se· hán.·oetéctada•·efeC:tos··.perjuditiales pará·•·la··•salüden productos biológicos debido a su . contenidode ADN, las agencias reglarnentarias han pedido.a .losfábr)dO\n.tés qüese asegúren·••ún nivel de reol.Jcido .a.bajo aeAQN.•·.en••tsrodUttosóbtehid.os pót·bl()tetnoldgía: l.;atecriita··aetllbfidadorrae.AON•(ah~lísisdetr~tisfe~en!:ila!;ié.pünte>;oddfblot)'es l¡fvaloracióndeADNmás.sensibley rutlhadá.cii$pohiblé·••páfadeterlllipár .él tohtenido dé ADN eh los producfüs,·•.·Sí rífe·. para :Vatciraf él procesó de .l'.lürffitacióh para demostrar· qtle•·se halógrad() un•··nivelbaiti de••ADNeri láetapalnldaf'de 11'1 fabrifaeion> El métodci. se>basa •.·erila.· hibridación· del ADNcelülardélámúestrádoh•soridas deADNes¡;>eCífkam.entemárcadascóri"P••oqufníicarnente·modifítada¡;obtenidasdel AQN de la Célula· anfitfiona .•. Prirnero.se a¡s1á el.A,DN residual en la muestra medianteúri procedimiento· que· puede incluir la hidfótisisdeJaprofoína1 cfümafograña,.extraéc:fünesorgánieasypredpitaC:ion enaleohe>l,·l..1.1ego,sedesnaturaHzaetADNaisladoy se aplíca a úhá melllbrariade riitroC:elulosa c>nallon jünto con Un grupo de están dates diluídosprogresivamenfo dé ADN anfitrión. A continüacion, se a.plitan.coritroles deADNposifivosy· negátivosy la membráná se introduce en un horno aproximadamente a 80º.o se la coloca. bajO luz OVparaasí completar láunióndel ADN a la rr'lembrána. tuego,se prepara una sonda de ADN. mediante desplazamiento de mella (nick tralls!ation), síntesis de iniciador aleatoria o por modificación química de un extracto de ADN de la célula anfitriona. Se purifica]á.sOhdadeADN.Ysedesnaturaliza térmicamente a 95º. Luego se agrega a la membrana tratada en el horno o con UV y se deja que se hibride con el ADN de la$ muestras aproximadamente a 42º en presencia de formamida o a ternperaturaimayóres sin formamldádurante 24 a. 48 horas; ·A continuación ·se coloca la membrana entre dós placasradiográfü:ásy se expone.para pr:odtidr una· aútorradiografía o se desarrolla por medios lnmunoquímitos empleando un. sistema• ton jugado ·enzimátitó/sustrato similar ála prueba . EUSAy/o almetodo deWestern .blot. Se estima el ADN de la muestra por comparación visual de la intensidad del punto de. la. muestra con tos estándares dé ADN diluidos. Tambiéh s:e puede explorar.el• autorradiograma por.densítometría óptica. Se determina la sensibilidad de la valoración, es decir de lO a 250 pg, por el límite de detección visual por encima del fondo producido por estándares deADN diluidos énserle. Se han desarrollado otros métodos para determinar AON por tecnología de sensores biológicos, o biosensores. En la actualidad; esta metodología determina laslmpllrezas totales de· ADN y ácido nucleicotiiás que el ADN específico de las células anfitrionas. Esta tecnología podría ser muy valiosa en el tuturo, especialmente cuando se desarrollen métodos de unión a ADN más específicos. Finalmente, latecnología de la reatciónen cadena de polimerasa (PCR) recientemente des•molladaí que consiste en .la amplificación del ADN, puede resultar útil para detectar e identificar el ADN contaminante.· Sin embargo, el uso cuantitativo de esta tecnología aún debe perfeccionarse. DETERMINACIÓN DE CARBOHIDAATOS
Una de las posibles modificaciones posterióres a la traduc:ciól1 que aparecen en las proteínas es la unión coválente de cadenas de oligosacáridps. La glidósiladón es llr-¡a ·característica de proteínas recombinal1tes expresadas en líneas cellJlares eücarióticas. Aunque Ja· cadena polipeptídica de una glifoproteína sé sintetiza bajo el control direc~o del código genético, los oligosacá· ricios no son prodücfos primarios de lqs genes, sino que sónsilltetízados póreniimas conóddas tomo glicOsiltralisferasas. Esta síntesis da lugar a la mkroheterogeneidad de las cadenas de carbohidrato$. A.demás; la glicosiladón depende de las líneas celulares, por lo que las glkoproteínas eón cadenas polipeptíditas idénticas sintetizadas en distintas líneas celulares puedenten:er estructuras de carbohidrátos considerablemehte diferentes. fos azúcares mas comunes él1 las glicoproteínas incluyen los azúca" res neutros (D-galactosa1 D•rnanosa y L·fucosa), los amínoazúcares (N~acetilglucosamina y N~acetilgalactosamina) y el azúcar acídico conocido como ácido siálico.
USP 39
Información General/ (1045) Artículos Obtenidos por Biotecnología 1 005
Se pueden aplicar dos enfoques principales para determinar los azúcares covalentemente unidos a la glicoproteína. Ambos aceptan que la microheterogeneidad es un fenómeno común entre las glicoproteínas y que la información obtenida representa la composición promedio o la estructura representativa. El primer enfoque es la determinación de la composición de azúcares en una glicoproteína, que puede realizarse mediante varios métodos. Se pueden determinar los azúcares neutros y el ácido siálico por pruebas colorimétricas sencillas. El total de azúcares neutros puede determinarse mediante la reacción con fénol y ácido sulfúrico y midiendo la absorbancia de la solución a 490 nm, comparada con una curva estándar. Luego de una hidrólisis ligeramente ácida y la oxidación con peryodato, se puede determinar el contenido de ácido siálko libre, utilizando ácido tibbarbitúrico y la absorbancia de la solución aproximadamente a 550 nm comparada con una curva estándar. Los azúcares neutros individuales pueden determinarse después de la hidrólisis ácida, por varios métodos. Si no están derivatizados, se pueden separar mediante HPIEC a un pH alto y se pueden cuantificar por detección amperométrica de pulsos. También se pueden convertir en peracetatos de alditol usando anhídrido acético o en acetatos de aldononitrilo utilizando clorhidrato de hidtoxilamina y piridina antes de la peracetilación, y los com· puestos derivatizados se pueden separar por cromatografía de gases. El segundo enfoque para determinar la c;:omposidón de carbohidratos consiste en liberar y separar las.estructuras de oligosacáridos individualesunidas covaleritemente ·a la glicoproteína. Esto requiere el conocimiento de los tipos de estructuras unidas. l..a
Las valoraciones específicas de la biotec:nología. se centra nen la detección de bacterias, hongos, micoplasmas y virus.· Éstos son ejemplos de los posíbles contaminantes que pueden aparecer en la fermentación bacteriana y en el cultivo de células de mamíferos. Se ejer<;;e control de varias maneras, incluyendo la caracterización del banco de siembra maestro y los bancos de células de trabajo para asegurar la ausenda de estos contaminantes, la evaluación de materias primas, el diseño y funcionamiento de sistemas de fabricación cerrados, el análisis de lotes de producción y la validación de procesos de fabricación específicos para asegurar la inactivación o la eliminación de posibles contaminantes. La ausencia de bacterias y hongos en !as formas farmacéutkas estériles finales se evalúa por lo general mediante pruebas de esterilidad según se describe en Pruebas de Esterilidad (71 ). L¡;is valoraciones de micoplasmas se realizan mediante métodos de cultivo estándar, empleando la incubación aeróbica y anaeróbica en medios sólidos en placas y caldos semisólidos en tubos de ensayo y deben cumplir con el Código de Reglamentaciones Federales (21 CFR 610.12). Además, los micoplasmas no cultivablesse detectan microscópicamente porehnétodo de tinción con bisbenzimida de Hoechst. Entre los diversos métodos empleados para detectar la contaminación por virus adventicios en líneas celulares se encuentran la inoculación de líneas celulares indicadoras seleccionadas porque permiten la reproducción de una amplia gama de virus y su control para detectar indiG:adores de infección viral tales como la citopatología, hemoadsorción, hemoaglutinación e inmunofluorescencia; la inoculación de animales no infec:tadosy el segúimiento de la patología y muerte; la inoculación de animales y, despuéS de cuatro semanas, la recolección y evaluación del suero para detectar anticuerpos contra virus específicos de importancia; y valoraciones inmunológicas específicas o sondas genéticas para detectar algunos virus importantes que no se pueden detectar mediante los otros métodos indicados. La expresión de genes de retrovirus endógenos es muy variable en diferentes células y líneas celulares de mamíferos. La n¡;ituraleza impredecible de su manifestación y la diversidad de sus propiedades bioquímicas y biológicas hacen imposible el uso de una sola prueba y exigen una estrategia de pruebas combinadas. Los métodos de prueba generalmente empleados incluyen la microscopía electrónica de transmisión de las células del banco de siembra maestro y de sedimentos obtenidos por ultracentrifugación de medios de cultivos post-cosecha y exentos de células, diversas valoraciones de retrovirus infecciosos que emplean líneas de células indicadoras susceptibles a retrovirus; lá actividad de transcriptasa reversa; y la inducción de retrovirus en las células del banco de células maestras usando sustancias químicas que inducen los retrovirus. Además de los métodos vírológiC:os clásicos, también se están comenzando a emplear otras técnicas más novedosas tales como la hibridación de sondas moleculares. J.USP39
1006 (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos/ Información General
USP 39
(1046) PRODUCTOS DERIVADOS DE CÉLULAS Y TEJIDOS INTRODUCCIÓN Este capítulo general proporciona una visión cabal sobre los aspectos a considerar para el desarrollo de productos derivados de células y tejidos. El Glosario de Términos y Definiciones proporciona una lista de términos comúnmente usados en este campo. Las terapias celulares y tisulares emplean productos médicos que contienen células humanas o animales que se administrarán en humanos para reparar, reemplazar, regenerar o aumentar una célula, tejido u órganos enfermos, lesionados o disfuncionales de un receptor. Las células o tejidos pueden ser recolectados para su uso sin manipulación o se pueden propagar, expandir, tratar farmacológicamente o alterar de otra manera sus características biológicas ex vivo antes de la administración. La diversidad de indicaciones clínicas y tipos de productos derivados de células y tejidos se presentan en la Tabla 7. Tabla 1. Ejemplos de Productos de Terapia Celular Indicación
Producto
Transplante de células madre hematopoyéticas después de la terapia de ablación
Células madre y progenitoras hematopoyéticas que se han recolectado, propagado, seleccionado y/o tratado para eliminar células contaminantes mediante dispositivos y/o reactivos
Cáncer
Células T, células asesinas naturales (o Células NK, por sus siglas en inglés), células dendríticas o macrófagos expuestos a péptidos específicos del cáncer para producir una respuesta anticancerígena; células cancerosas autólogas o alagénicas modificadas genética o bioquímicamente e irradiadas para producir una respuesta anticancerígena
Diabetes
Células f3 de los islotes pancreáticos encapsuladas
Infarto de miocardio
Células madre/progenitoras autólogas o alogénicas; miocitos del músculo esquelético; células madre cardiacas
Enfermedad del injerto contra el anfitrión
Células madre mesenquimales alogénicas
Cicatrización de heridas
Queratinocitos autólogos o fibroblastos dérmicos alogénicos en un andamiaje biocompatible
Defectos focales en el cartílago de la rodilla
Condrocitos autólogos o alogénicos con o sin andamiaje biocompatible
Reparación ósea
Células madre mesenquimales en un andamiaje biocompatible
Enfermedades neurodegenerativas
Células progenitoras neuronales derivadas de tejidos embrionarios, fetales o adultos; células modificadas genéticamente para secretar factores neurotróficos, con o sin encapsulación
Enfermedad infecciosa
Células T activadas
Enfermedad autoinmune
Células T reguladoras (Treo)
Lesión de la médula espinal
Células progenitoras neuronales
Reparación o regeneración de órganos
Células autólogas o alogénicas en biomateriales biocompatibles (geles) o estructura de andamiaje en 3 dimensiones
Los productos de terapia celular se pueden modificar mediante tratamiento con materiales genéticos de integración o no integrados (ADN, ARN, ARN pequeño de interferencia, etc.) con el objetivo de cambiar el patrón de expresión genética. Por lo general, se extraen células de un paciente, se modifican fuera de su cuerpo y luego se retornan al paciente. Las agencias reglamentarias consideran al producto celular modificado genéticamente ex vivo como un producto de terapia génica. Una gran parte de la información de este capítulo general es pertinente al procesamiento, caracterización, fabricación y administración de células modificadas genéticamente. Sin embargo, la información detallada acerca del uso de varios sistemas de transferencia de genes, consideraciones para el monitoreo del paciente, análisis genético y demás consideraciones pertinentes a productos de terapia génica, se tratan en el capítulo general Productos de Terapia Génica (1047). Este capítulo general describe aspectos relacionados con la fabricación, la obtención de componentes y la caracterización de productos derivados de células y tejidos para asegurar su seguridad y eficacia. El Apéndice presenta una lista de guías y documentos reglamentarios relevantes. Los fabricantes de productos derivados de células y tejidos deben considerar y aplicar los controles y procedimientos descritos en este capítulo para asegurar el uso seguro de los productos en humanos. Se están desarrollando y validando continuamente nuevas metodologías, las cuales serán incluidas en la Farmacopea de los Estados Unidos (USP) a medida que se encuentren disponibles. Las monografías de USP para productos tisulares específicos y derivados de tejidos describen las especificaciones de prueba con las que debe cumplir el producto durante toda su vida en el mercado. El término producto celular se refiere a células o tejidos de humanos o animales vivos que han sido manipulados o que se usan de modo tal que se reglamentan como terapias celulares somáticas, conforme a lo definido por la US Food and Drug Administration (Administración de Alimentos y Medicamentos de EE.UU. o FDA). El término producto derivado de tejidos se refiere a tejidos humanos que se reglamentan de conformidad con las buenas prácticas para tejidos (GTP, por sus siglas en inglés). El término productos de combinación se refiere a células combinadas con dispositivos médicos, tales como un andamiaje natural o sintético.
USP 39
Información General/ (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos 1007
Consideraciones para la Incorporación de Conceptos del Sistema de Calidad en las Etapas Tempranas del Desarrollo de Productos Derivados de Células y Tejidos Los requisitos reglamentarios vigentes y futuros continuarán presentando desafíos a los que desarrollan productos derivados de células y tejidos en lo que respecta a incorporar atributos robustos de calidad en etapas tempranas de la fase de diseño para asegurar el énfasis en la seguridad del paciente mediante un alto grado de entendimiento del proceso. Los sistemas de calidad modernos que armonizan las Buenas Prácticas de Fabricación vigentes (BPFv) con otros sistemas reglamentarios farmacéuticos generados fuera de EE.UU. [tales como la lnternational Conference on Harmonization (Conferencia Internacional sobre Armonización o ICH) y la lnternational Organization far Standardization (Organización Internacional para la Estandarización o ISO)] y el sistema de calidad para dispositivos médicos de la FDA se reconocen como las nuevas normas mundiales. Estas nuevas normas incluyen conceptos para desarrollo de producto tales como Calidad por Diseño (QbD, por sus siglas en inglés) y Tecnología Analítica de Procesos (PAT, por sus siglas en inglés). Asimismo, estos sistemas de calidad integran métodos para el mejoramiento continuo y la gestión de riesgos que promueven la adopción de los avances científicos más recientes y de tecnologías innovadoras de fabricación. El uso de los principios de Gestión de Riesgo de Calidad (QRM, por sus siglas en inglés) en etapas tempranas del desarrollo del producto puede ser útil para la identificación de áreas de riesgo que pueden mitigarse antes de que sean incorporadas al proceso de fabricación y afecten la seguridad y eficacia del producto. Los que desarrollan productos derivados de células y tejidos deben emplear técnicas de gestión y evaluación de riesgos como componentes claves de sus sistemas de calidad. La gestión de riesgos se define como un proceso sistemático para la identificación, evaluación y control de riesgos a favor de la calidad del producto derivado de células o tejidos durante todo el ciclo de vida del producto. El uso de técnicas de QRM puede ayudar a conseguir productos seguros y eficaces mediante la evaluación de riesgos para el paciente, la determinación de límites en el espacio de diseño o el ranking de atributos de calidad. La QRM también ayuda a establecer y mantener un estado de control mediante el uso de gestión de riesgos para conducir el control del proceso. Por último, la QRM se puede usar para facilitar el mejoramiento continuo dando prioridad a las oportunidades de mejoramiento. El nivel de esfuerzo, formalidad y documentación del proceso de gestión de riesgos debe ser acorde al nivel de riesgo, debe basarse en conocimientos científicos y, finalmente, debe estar vinculado con la protección del paciente. Los elementos de gestión de riesgo se han convertido en un paradigma aceptado y se pueden encontrar fácilmente en documentos guía reglamentarios de la FDA e internacionales, especialmente el documento ICH Q9. Para facilitar esta evaluación, se han desarrollado diversas herramientas, las cuales proporcionan medios cuantificables para priorizar riesgos de manera que se puedan identificar y corregir los elementos de más alto riesgo de un proceso. Dependiendo del objetivo del programa de gestión de riesgo, los análisis de riesgo pueden presentar un grado mayor o menor de formalidad. De manera preliminar, los análisis de riesgo menos formales entran en acción cuando es necesario acelerar una evaluación de riesgos, por ejemplo para la resolución de un incumplimiento de fabricación. Resulta necesario un sistema de evaluación de riesgos más formal para el desarrollo de procesos o productos, lo cual es especialmente importante cuando se deben priorizar recursos limitados. Los sistemas formalizados se integran en herramientas bien establecidas que pueden cuantificar riesgos en cada fase o etapa de la fabricación. Estos sistemas también se pueden usar para la evaluación de opciones de materias primas, establecimiento de prioridades de validación, alteraciones en las instalaciones, cambios de equipo y deliberaciones sobre servicios. Las herramientas formales de análisis de riesgos incluyen el mapeo del proceso, el análisis preliminar de riesgos, el Análisis de Riesgo y Puntos Críticos de Control (HACCP, por sus siglas en inglés), el Análisis de Riesgo y Operabilidad (HAZOP, por sus siglas en inglés), el Análisis por Árbol de Fallas (FTA, por sus siglas en inglés), el Análisis de Modo y Efecto de Fallas (FMEA, por sus siglas en inglés) y el Análisis de Modo, Efecto y Criticidad de Fallas (FMECA, por sus siglas en inglés). En lo que respecta a productos derivados de células y tejidos, el FMEA se ha usado comúnmente para identificar, cuantificar y priorizar riesgos. El FMEA puede asignar una clasificación numérica en una de tres categorías: • Severidad, que es la consecuencia de una falla; • Ocurrencia, que es la probabilidad de que ocurra la falla basándose en experiencias o incumplimientos anteriores; y • Detección, que se basa la capacidad para detectar la falla. Se asigna una clasificación numérica a cada categoría (por lo regular del 1 al 5 o del 1 al 1 O) que corresponde a la severidad de la variación con respecto al intervalo del parámetro operativo, la probabilidad de una variación y la posibilidad de detectar una variación antes de que afecte el producto. Los números menores denotan una probabilidad remota de detección, mientras que los números más altos denotan la posibilidad de una falla o efecto de riesgo. El producto de los valores de severidad, ocurrencia y detección representa un Número de Prioridad de Riesgo (RPN, por sus siglas en inglés). Durante el proceso de evaluación de riesgos se priorizan los RPN y se puede dirigir la solución más inmediata a las áreas de riesgo más elevado.
COMPONENTES USADOS EN LA FABRICACIÓN DE PRODUCTOS DERIVADOS DE CÉLULAS V TEJIDOS Introducción Los fabricantes de productos derivados de células y tejidos deben asegurarse de que todos los componentes usados en la fabricación sean adecuadamente calificados. Los ejemplos de componentes usados en la fabricación de productos de terapia
1008 (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos/ Información General
USP 39
celular o tisular incluyen células y tejidos de origen; biomateriales naturales o sintéticos; materiales auxiliares requeridos durante la fabricación pero que no están destinados a aparecer en el producto terapéutico final; y excipientes usados en la formulación de productos de terapia celular o tisular. La calificación es el proceso de adquisición y evaluación de datos para establecer el origen, identidad, pureza, seguridad biológica y aptitud general de un componente específico para garantizar la calidad. La diversidad de productos de terapia celular y tisular y de los materiales usados para producirlos dificulta recomendar pruebas o protocolos específicos para un programa de calificación. Por lo tanto, se deben desarrollar programas racionales y científicamente sólidos para cada componente. Las actividades de calificación de materiales cambiarán a medida que los productos pasen de la etapa de estudios clínicos a la de obtención de autorizaciones y comercialización. Un programa de calificación bien diseñado se hace más exhaustivo a medida que progresa el desarrollo del producto. Durante las etapas tempranas del desarrollo del producto, las cuestiones de seguridad deben ser el foco principal de un plan de calificación de materiales. En las etapas posteriores, las actividades de calificación de materiales deben desarrollarse completamente y cumplir con las BPFv.
Calificación de las Fuentes de Células y Tejidos Diversas células y tejidos derivados de humanos y animales sirven como material de origen para productos derivados de células y tejidos. Las células de donantes que se pueden utilizar en los productos de terapia celular provienen de diferentes fuentes: 1 . Las células propias del paciente (productos celulares autólogos) 2. Las células de otro ser humano (productos celulares alogénicos) 3. Las células derivadas de animales (productos celulares xenogénicos) El origen de las células usadas para una terapia celular o tisular determinada depende en gran medida de la compatibilidad, pureza y disponibilidad. El uso de células autólogas presenta la ventaja de un mínimo nivel de inquietudes con respecto al rechazo inmunológico. No obstante, no siempre se cuenta con una fuente autóloga o o ésta no siempre es apropiada cuando el tipo de célula es disfuncional, maligna, difícil de obtener o si está contaminada. La alternativa es una fuente de células alogénicas compatibles que esté fácilmente disponible. La incompatibilidad inmunológica representa la principal preocupación con respecto al uso de fuentes de células alogénicas pues puede llevar al rechazo de la terapia celular o tisular administrada. En receptores inmunocomprometidos, las células de donante pueden reaccionar con las células del paciente, lo que puede resultar en la enfermedad del injerto contra el anfitrión, poniendo en riesgo la vida del paciente. A pesar de las potenciales complicaciones del uso de células o tejidos de donantes alogénicos y ante la ausencia de otras alternativas, la relación riesgo-beneficio es a menudo favorable. Existen diversas metodologías que sortean con éxito las barreras inmunológicas para el uso de fuentes alogénicas. Los fármacos inmunosupresores desarrollados para el transplante de órganos sólidos, así como los avances en la inducción de tolerancia inmune se aplican cada vez más al transplante de células. Algunas células alogénicas desencadenan reacciones inmunológicas mínimas, incluso en receptores HLA incompatibles. Los ejemplos incluyen células madre mesenquimales, algunas células dérmicas y epidérmicas y fibroblastos. Pese a los avances en la derivación de nuevos tipos de células terapéuticas, particularmente células madre (células de adulto, fetales, embrionarias y de pluripotencia inducida), la capacidad de generar ciertos tipos de células o tejidos aún está muy lejos de ser alcanzada. Por consiguiente, los procesos actuales usan células y tejidos xenogénicos para tratar diversas enfermedades o condiciones en los seres humanos. El uso de células xenogénicas debe atender inquietudes relacionadas con el rechazo inmunológico y la transmisión de virus animales a los seres humanos (ver Fuentes Animales de Células y Tejidos, más adelante). Algunos principios generales para la obtención de tejidos incluyen lo siguiente: (1) los sistemas deben permitir la rastreabilidad retrospectiva del material hasta el donante, mientras se cumple la legislación sobre privacidad; (2) deben tomarse medidas para prevenir la transmisión de enfermedades infecciosas del donante al receptor; y (3) la obtención y el procesamiento asépticos deben garantizar la seguridad del producto final, debido a que no es posible la esterilización terminal de productos que contienen células y tejidos vivos. La FDA ha promulgado un conjunto de reglamentos específicos, referidos como Buenas Prácticas para Tejidos (GTP), que tratan específicamente la necesidad de obtener y procesar tejidos de una manera tal que evite la transmisión de una enfermedad transmisible. Se deben seguir las GTP y/o BPF para productos de terapia celular o tisular, dependiendo del origen de la célula y de su lugar en el ciclo de vida del producto. ELEGIBILIDAD DEL DONANTE La FDA ha promulgado un conjunto integral de reglamentos que rigen el uso de tejidos y células humanos destinados para implantes, transplantes, infusión o transferencia a un receptor humano. Se hace referencia a estos materiales como células y tejidos o productos derivados de células y tejidos humanos (HCT/P, por sus siglas en inglés). El cumplimiento con los requisitos de elegibilidad de donantes es de suma importancia para la obtención de HCT/P para uso médico, debido a que estos instruyen que es obligatorio revisar los registros médicos pertinentes de un donante para evaluar los factores de riesgo y la evidencia clínica de agentes infecciosos transmisibles. Esto incluye la obtención de un historial médico y la realización de un examen físico al donante para detectar enfermedades transmisibles. Asimismo, los donantes deben someterse a análisis de laboratorio adecuados usando kits de prueba autorizados o aprobados por la FDA para enfermedades y agentes de enfermedades específicos relevantes (RCDAD, por sus siglas en inglés). El examen de detección de enfermedades requerido será cada vez más amplio a medida que se identifiquen nuevos RCDAD y se encuentren disponibles kits de prueba aprobados o autorizados por la FDA.
USP 39
Información General/ (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos 1009
Dos fuentes de información sobre el examen de detección de enfermedades transmisibles son: la Guidance on Eligibility Determination for Donors of Human Ce/Is, Tíssues, and Ce/lular and Tíssue-Based Products (Guía sobre la Determinación de Elegibilidad de Donantes de Células y Tejidos y Productos Derivados de Células y Tejidos Humanos) de la FDA y la Circular of lnformation (Circular Informativa) de la AABB (http://www.aabb.org/Content/About_Blood/Circulars_of_lnformation/aabb_coi.htm). No se requiere determinar la elegibilidad de donante para HCT/P autólogos. CÉLULAS Y TEJIDOS O PRODUCTOS DERIVADOS DE CÉLULAS O TEJIDOS HUMANOS Los HCT/P se pueden obtener de donantes comunes sanos, donantes cadavéricos o pacientes enfermos, por ejemplo, de cáncer. Se debe evaluar la aptitud del tejido obtenido de pacientes con cáncer y otras enfermedades antes de la recolección para asegurar la seguridad y el funcionamiento adecuados del producto de terapia celular final. Asimismo, la reglamentación del Título 45 del CFR Parte 46 se aplica a todas las investigaciones en humanos financiadas por el gobierno federal. Esta reglamentación requiere que el uso de cualquier tejido extraído de donantes humanos sea examinado y aprobado por una Junta de Revisión Institucional. Asimismo, esta reglamentación incluye consideraciones especiales para la investigación en presos, niños, mujeres embarazadas o tejidos gestacionales. En todos los casos, se debe obtener el consentimiento adecuado, por escrito, del donante o del pariente más cercano, que incluya una descripción del tejido a extraer y del uso previsto. Se debe minimizar el riesgo de transmisión de enfermedades al operador de la fabricación mediante capacitación adecuada sobre la manipulación de materiales potencialmente infecciosos y mediante el uso de equipo y vestimenta de protección. Los tejidos deben obtenerse usando controles y condiciones ambientales que permitan la recuperación aséptica con un alto grado de seguridad. Las células progenitoras hematopoyéticas (HPC, por sus siglas en inglés) son uno de los tipos de célula más utilizados para el transplante humano. Estas células se pueden obtener de la médula ósea, de la sangre periférica o de la sangre del cordón umbilical. El origen de las células depende del paciente, la enfermedad y el protocolo clínico. Los métodos de procesamiento de las células son similares, independientemente de su origen. Las HPC se pueden obtener de donantes saludables o pacientes con trastornos hematológicos. Además de las reglamentaciones sobre HCT/P de la FDA, la American Association of Blood Banks (Asociación Estadounidense de Bancos de Sangre o AABB) , la Foundation for the Accreditation of Hematopoietic Cell Therapy (Fundación Para la Acreditación de la Terapia de Células Hematopoyéticas) y el National Marrow Donar Program (Programa Nacional de Donantes de Médula o NMDP) han publicado guías y normas aplicables a la recolección y el procesamiento de estos materiales. Para fuentes de células o tejidos obtenidos de muestras quirúrgicas o de donantes cadavéricos, se aplican las prácticas corrientes de salas de operación de hospitales. La calidad del aire en una sala de operación con acceso limitado típica es adecuada para dichos procedimientos. El personal de recolección debe tener la capacitación adecuada en todos los aspectos relativos a la recuperación de tejidos: lavado quirúrgico, vestimenta, comportamiento dentro de la sala de operación, anatomía, preparación del sitio de intervención y técnica aséptica. Se requiere especial cuidado cuando la obtención de tejidos u órganos requiera la manipulación prolongada del intestino, lo cual conlleva el riesgo de que se produzca una punción involuntaria del intestino. Si el tejido contiene flora microbiana (p.ej., la piel), puede ser desinfectado adecuadamente en el momento de la extracción con agentes antimicrobianos o bactericidas y un lavado minucioso. FUENTES ANIMALES DE CÉLULAS Y TEJIDOS Resultaría ideal que los productos de terapia celular constaran de células humanas fabricadas con una mínima exposición a materiales derivados de animales. Sin embargo, en la actualidad, importantes necesidades médicas no satisfechas pueden ser potencialmente tratadas mediante productos de terapia celular de células o tejidos animales, tales como los islotes pancreáticos destinados al tratamiento de la diabetes. Las fuentes humanas de islotes pancreáticos están disponibles únicamente de páncreas donados al momento de la muerte. La calidad de los islotes del donante de órganos es variable y el suministro disponible es inadecuado para satisfacer la potencial demanda. Un método consiste en obtener islotes pancreáticos de fuentes animales apropiadamente calificadas para su uso subsiguiente en humanos (xenotransplante). Los desarrolladores que pretenden usar células o tejidos animales en un producto de terapia celular deben tratar adecuadamente las cuestiones de salud pública y deben desarrollar metodologías para reducir el riesgo potencial de introducción y propagación de agentes infecciosos zoonóticos en la población general humana. La PHS Guideline on lnfectious Disease /ssues in Xenotransplantation (Guía sobre Cuestiones Relacionadas con Enfermedades Infecciosas en Xenotransplantes del Servicio de Salud Pública de EE.UU.) (enero de 2001) describe riesgos potenciales. La guía de la FDA Source Animal, Product, Preclinical, and Clínica/ /ssues Concerning the Use of Xenotransplantation Products in Humans (Aspectos sobre Fuentes Animales, Productos, Preclínicos y Clínicos Relacionados con el Uso de Productos de Xenotransplante en Humanos) (abril 2003) presenta métodos y expectativas actuales para minimizar los riesgos de los productos celulares xenogénicos. El uso de tejido animal en la fabricación de productos de terapia celular requiere que el tejido se obtenga de una manera controlada y documentada y que provenga de animales libres de patógenos designados, que hayan sido criados en cautiverio en países o regiones geográficas con sistemas adecuados de prevención y control de enfermedades. Asimismo, el cuidado y uso de animales debe ser aprobado por una comisión institucional acreditada para el cuidado y uso de animales. Los animales donantes deben tener un linaje documentado, provenir de manadas o colonias cerradas y estar en programas de mantenimiento y control de salud. Las instalaciones para albergar a estos animales deben estar certificadas por el USDA (Departamento
101 O (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos / Información General
USP 39
de Agricultura de los Estados Unidos) (para animales vertebrados grandes) o por la Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care lnternational (Asociación para la Evaluación y la Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio; AAALAC, por sus siglas en inglés) (para animales vertebrados pequeños) y deben cumplir con las recomendaciones establecidas por la Cuide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Research Council, 1996) (Guía para el Cuidado y la Utilización de Animales de Laboratorio del Consejo de Investigación Nacional, 1996), que se puede obtener a través de la AAALAC (www.aaalac.org). Estas instalaciones deben contar con veterinarios y demás personal capacitado que garantice la salud de los animales y la prevención de enfermedades. Los procedimientos empleados en las instalaciones deben estar documentados y se deben guardar registros. Los programas de mantenimiento y control de salud deben basarse en la atención veterinaria estándar para cada especie, incluyendo exámenes físicos, monitoreo, pruebas de diagnóstico de laboratorio y vacunaciones. Un método de partidas sucesivas o de ingresos y egresos totales (all-in-a/1-out) para trasladar a los animales en las instalaciones puede minimizar el potencial de transmisión de agentes infecciosos. Los componentes alimenticios deben estar documentados y excluir material reciclado o procesado a fin de reducir el riesgo de enfermedades priónicas. Para garantizar al máximo la seguridad del producto, tanto los donantes animales como sus tejidos deben ser examinados en varias etapas del proceso para descartar la presencia de agentes microbianos. Estas pruebas de control deben emplear ensayos que sean lo suficientemente sensibles y específicos para detectar bacterias, micoplasma, hongos o virus de interés. Los animales donantes deben someterse a estudios de detección de enfermedades pertinentes antes de la extracción del tejido. Las necropsias posteriores a la recuperación de tejidos, los programas de animales centinela y el archivo de órganos, tejidos, sangre y otras muestras de donantes también garantizan la seguridad del tejido animal para aplicaciones de terapia celular. En general, se aplican condiciones de extracción aséptica similares en la obtención de tejido animal y humano. El tejido debe obtenerse usando controles y condiciones ambientales que permitan la recuperación aséptica con un alto grado de seguridad. Se deben utilizar instalaciones especialmente diseñadas para la extracción de tejidos, por lo general, en estrecha relación con la instalación que alberga a los animales. Las características y atributos recomendados para las instalaciones de extracción de tejido animal deben incluir lo siguiente: (1) organización de etapas tales como afeitado, sedación y preparación para la sala de operaciones en salas diferentes con controles ambientales apropiados; (2) filtración de partículas del aire de alta eficiencia (HEPA, por sus siglas en inglés); (3) instalaciones contiguas pero separadas para continuar con el procesamiento de tejidos; y (4) áreas destinadas al retiro de cadáveres. Todo lo relacionado a la capacitación del personal, la manipulación y la punción del intestino, y la desinfección se aplican a la extracción quirúrgica tanto de tejidos humanos como animales (ver la sección Células y Tejidos o Productos Derivados de Células y Tejidos Humanos anterior). Cuando los investigadores establecen líneas celulares animales para su uso como capa de células alimentadoras, es necesario crear, analizar y caracterizar bancos de células, según se indica en la siguiente sección. SISTEMA DE BANCOS DE CÉLULAS Un banco de células es un conjunto de células obtenidas de células combinadas o derivadas de un único don celular o tejido de donante que se almacena en bolsas o viales en condiciones definidas que mantienen la estabilidad genotípica y fenotípica. El sistema de bancos de células por lo general se compone de un banco maestro de células (MCB, por sus siglas en inglés) y un banco de células de trabajo (WCB, por sus siglas en inglés), aunque es posible emplear otras metodologías. El MCB se produce de acuerdo con las BPFv y, preferentemente, se obtiene de una fuente calificada (exenta de agentes adventicios) con antecedentes conocidos y documentados. Las células y tejidos humanos se deben obtener mediante un contratista autorizado para adquisición de tejidos con un programa de calificación de donante que cumpla con el Título 21 del CFR 1271. El WCB se obtiene o produce mediante la expansión de uno o más viales del MCB. El WCB, o el MCB en los ensayos iniciales, se convierte en la fuente de células para cada partida producida para uso humano. Los sistemas de bancos de células contribuyen en gran medida a la uniformidad en la producción de partidas debido a que el material celular inicial es siempre el mismo. No obstante, no siempre es posible o factible crear un banco de células, de modo que se pueden usar células primarias apropiadamente analizadas y calificadas en lugar de crear bancos de células. Como mínimo, el MCB y el WCB deben analizarse para determinar su identidad, esterilidad, pureza, viabilidad y la presencia de virus y micoplasma. CALIFICACIÓN DE BANCOS DE CÉLULAS El análisis de seguridad y la caracterización de bancos de células son etapas importantes para obtener un producto final uniforme que mantenga una uniformidad de lote a lote y que se mantenga exento de agentes adventicios. La norma ICH Q5A, Viral Safety Evaluation of Biotechnology Products Derived from Cell Unes of Human or Animal Origin (Evaluación de Seguridad Viral de Productos Biotecnológicos Obtenidos de Líneas Celulares de Origen Humano o Animal) proporciona recomendaciones específicas para el análisis de bancos de células para agentes virales. Aunque esta guía no está específicamente destinada para los productos derivados de células o tejidos, por lo general se pueden aplicar las mismas pruebas. Pueden ser necesarios análisis de virus adicionales dependiendo del predominio de enfermedades virales endémicas en la población donante. Los análisis para calificar los MCB se realizan una sola vez y se pueden hacer con una alícuota del material del banco o con cultivos de células derivados del banco de células. Se deben establecer especificaciones de manera prospectiva para la calificación del MCB. Es importante documentar los antecedentes del MCB, los métodos y reactivos empleados para crear el banco y las condiciones de almacenamiento. Todos los materiales auxiliares requeridos para la producción de los bancos, tales como medios,
USP 39
Información General/ (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos 1011
sueros, citoquinas, factores de crecimiento y enzimas también deben ser calificados, documentados y analizados de manera apropiada. ANÁLISIS DE SEGURIDAD DE LOS MCB Y WCB Banco Maestro de Células (MCB)-EI análisis de seguridad para calificar el MCB incluye análisis para demostrar la ausencia de agentes adventicios y virus endógenos. Los análisis de agentes adventicios deben incluir pruebas de detección de bacterias, hongos, micoplasma y virus. La ausencia de virus adventicios debe comprobarse utilizando sistemas de prueba tanto in vitro como in vivo y pruebas adecuadas específicas para la especie. Banco de Células de Trabajo (WCB)-EI análisis de seguridad para el WCB es menos extenso y por lo general se enfoca en el potencial de introducción de virus adventicios o en la activación de virus latentes durante el cultivo adicional requerido para crear el WCB. Asimismo, se debe llevar a cabo el análisis de seguridad del final de la producción (EOP, por sus siglas en inglés) para asegurar que las células se puedan expandir en un número máximo conocido de generaciones, a la vez que continúen generando un producto aceptable. Para información acerca de los tipos de análisis de virus adventicios que deben realizarse a las células del MCB, del WCB y EOP, consulte el capítulo Evaluación de Ja Seguridad Viral en Productos Biotecnológicos Obtenidos de Líneas Celulares de Origen Humano o Animal (1050). CARACTERIZACIÓN DE LOS MCB Y WCB La caracterización de los MCB y WCB incluye el análisis de identidad para establecer el origen de las especies, p. ej., análisis de isoenzimas para confirmar el origen humano de las células. No obstante, la caracterización de los bancos de células debe incluir evaluaciones adicionales como las que se mencionan a continuación: • Cinética de crecimiento y tiempo de duplicación de la población • Evaluación morfológica • Porcentaje de confluencia en el pasaje • Conteos de células • Viabilidad (pre y poscrioconservación) • Expresión fenotípica de tipos celulares deseados e indeseados (pre y poscrioconservación) • Monitoreo de marcadores bioquímicos únicos (pre y poscrioconservación) • Evaluaciones de actividad funcional (pre y poscrioconservación) • Análisis de expresión génica y proteica (pre y poscrioconservación) • Expresión de antígenos de histocompatibilidad inmunologica (HLA/MHC) • Identificación genética molecular • Estabilidad cromosómica
Materiales para Andamiajes Biocompatibles La mayoría de los materiales para andamiajes naturales o sintéticos se reglamentan como dispositivos médicos, aunque los andamiajes derivados de tejidos humanos, tales como la dermis se reglamentan como HCT/Ps. Siempre que sea posible, se deben usar andamiajes que hayan sido previamente aprobados para otros usos clínicos, pues dichos materiales deberían haber sido sometidos previamente a análisis exhaustivos de seguridad y calidad. Para aplicaciones en productos derivados de células o tejidos, el material de andamiaje debe permitir la unión, proliferación y migración de células, y por lo regular resulta deseable una alta porosidad para facilitar la siembra de células dentro del material. El andamiaje debe proveer una difusión adecuada de nutrientes para la salud de las células y la liberación de productos excretados por las células. El material debe contar con una resistencia mecánica adecuada y debe ser susceptible a la manipulación, modificación química y fabricación. El material del andamiaje debe ser biocompatible, relativamente inerte e inmunológicamente benigno. Por lo general, los andamiajes se pueden clasificar como duros o blandos. Los andamiajes duros se usan en aplicaciones que requieren una forma específica, tales como la formación de un vaso sanguíneo o una vejiga. Los andamiajes blandos se usan en aplicaciones en las que es necesario que el producto se amolde flexiblemente con una forma existente del cuerpo. Los materiales del andamiaje pueden ser polímeros sintéticos o naturales, biodegradables o permanentes. La biodegradación permite la reabsorción o eliminación del andamiaje por parte del cuerpo sin manipulación. La velocidad de degradación del andamiaje debe coincidir con la velocidad de formación o regeneración del tejido. La estructura del andamiaje natural debe reemplazar al andamiaje que se degrada de tal manera que mantenga la integridad estructural del tejido u órgano que se está regenerando. Por ejemplo, un vaso sanguíneo recientemente formado debe tolerar tanto la presión sanguínea interna como las fuerzas mecánicas externas. El polímero biodegradable sintético que se usa de manera más común es el ácido poliglicólico (PGA, por sus siglas en inglés). El ácido Poliláctico (PLA, por sus siglas en inglés) también se usa ampliamente, en ocasiones en combinación con el PGA. Estos polímeros se degradan dentro del cuerpo, se eliminan fácilmente antes de la degradación y tienen un extenso historial de uso en materiales de sutura. La policaprolactama (PCL), que presenta una velocidad de degradación menor a la del PLA o el PGA, se usa en aplicaciones que requieren de una larga presencia en el cuerpo.
1012 (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos/ Información General
USP 39
La matriz extracelular (ECM, por sus siglas en inglés) y sus derivados son materiales naturales que se usan para andamiajes en la fabricación de productos de combinación de células y biomateriales. Las proteínas tales como el colágeno o la fibrina y los polisacáridos como el quitosano o los glicosaminoglicanos (GAG) también han sido usados en el crecimiento de células para fabricar productos de combinación. El colágeno es por mucho el sustrato más popular para células y ha sido moldeado en andamiajes para una variedad de productos, principalmente en aplicaciones para la piel de ingeniería tisular. Los agentes de entrecruzamiento tales como el glutaraldehído y las carbodiimidas solubles en agua se han usado para mejorar la fuerza de los andamiajes naturales. Dependiendo del origen del material, los andamiajes naturales pueden ser inmunogénicos. Cuando las células deben proliferar después de la siembra, el andamiaje y el sistema de cultivo de apoyo debe permitir el intercambio de nutrientes y productos de desecho. Una matriz gruesa e impermeable conducirá a zonas de tejido necrótico. Muchos dispositivos de tejido están diseñados de tal manera que puedan ser eventualmente retirados del paciente. Se debe establecer la seguridad y biocompatibilidad del andamiaje y de los materiales que entran en contacto con el producto. Se debe llevar a cabo una batería completa de las pruebas recomendadas por los capítulos Pruebas de Reactividad Biológica, In Vitro (87), Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo (88), y los documentos ISO 10993 o el FDA Blue Book (Libro Azul de la FDA) G95-1. Los residuos del proceso y los productos de degradación derivados de la preparación del andamiaje deben cuantificarse y se deben establecer límites. Es necesario establecer condiciones de estabilidad y almacenamiento de los materiales del andamiaje.
Calificación de Materiales Auxiliares Los productos auxiliares incluyen una amplia variedad de materias primas y componentes usados en la fabricación. Pueden incluir materiales relativamente simples o sustancias complejas como medios de cultivo, amortiguadores, factores de crecimiento, citoquinas, componentes de cultivo y procesamiento, anticuerpos monoclonales y dispositivos de separación de células. Los materiales auxiliares no están destinados a estar presentes en el producto terapéutico final. Por lo general, las formulaciones de medios definidos incluyen componentes como la albúmina y la transferrina, purificadas a partir de fuentes humanas o animales. La purificación, el procesamiento y el análisis exhaustivo de estos componentes minimizan aún más el riesgo de contaminación viral o microbiana, si bien no lo eliminan. Las cantidades residuales de materiales auxiliares usados en el proceso de fabricación, incluyendo proteínas recombinantes u otros componentes de medios definidos, pueden ser potencialmente antigénicos por lo que se debe evaluar su eliminación del producto final y se deben establecer límites apropiados cuando sea necesario. Los riesgos conocidos se asocian con el uso de materiales auxiliares en la producción de productos de terapia celular. La calidad de los materiales auxiliares utilizados en la elaboración de un producto de terapia celular puede influir en la seguridad, potencia y pureza del producto. Idealmente, cada uno de los materiales auxiliares empleados en la fabricación de un producto de terapia celular o tisular debe elaborarse en condiciones que cumplan con las BPFv. No obstante, las sustancias complejas o únicas que resultan esenciales para el control de procesos o la producción pueden no estar disponibles a través de proveedores que las producen de acuerdo con las BPFv. En este caso, el fabricante de productos de terapia celular o tisular debe desarrollar una estrategia científicamente sólida para calificar la materia prima. Un programa de calificación de materiales auxiliares utilizados en la fabricación de productos de terapia celular y tisular debe incluir los siguientes puntos: (1) identificación y selección, (2) aptitud para uso en la fabricación, (3) caracterización y criterios de aceptación, (4) calificación del proveedor y (5) garantía de calidad. Se deben generar archivos históricos de los lotes para cada material auxiliar. El cumplimiento con las especificaciones establecidas se debe comparar con los datos provistos en el Certificado de Análisis. La rastreabilidad es esencial y se deben anotar los números de lote para cada material auxiliar en los registros de producción del producto derivado de células. Se debe consultar el capítulo de información general de USP Materiales Auxiliares para Productos Celulares, Génicos y de Ingeniería Tisular (1043) para información específica sobre la implementación de un programa de calificación apropiado para estos materiales. Otros capítulos de USP tratan aspectos que se deben considerar con respecto a la calificación de materiales auxiliares específicos (p.ej., Suero Bovino (1024), Suero Fetal Bovino-Atributos de Calidad y Pruebas de Funcionalidad (90) y Factores de Crecimiento y Citoquinas Usados en la Fabricación de Productos de Terapia Celular (92)).
Calificación de Excipientes Durante las etapas finales del proceso de fabricación, es posible incluir excipientes o sustancias que incrementan la estabilidad de las células terapéuticas. Los ejemplos de excipientes incluyen medios de cultivo, solución salina USP u otras soluciones de electrolitos aprobadas para inyección, proteínas exógenas tales como albúmina sérica humana o crioprotectores tales como dimetil sulfóxido (DMSO). Los excipientes no están destinados a ejercer un efecto terapéutico directo sobre el paciente, sino que están destinados a contribuir con el mantenimiento de los atributos de calidad del producto celular final. Debido a que los excipientes se administrarán al paciente junto con las células, se debe poner especial atención a su calificación. En general, siempre que sea posible, deben usarse excipientes que ya hayan sido aprobados por la FDA para uso humano. Si se usan excipientes no aprobados, debe realizarse una evaluación de la seguridad completa. Para los excipientes novedosos, tales como soluciones para crioconservación, pueden ser necesarios estudios de seguridad preclínicos apropiadamente diseñados.
USP 39
Información General/ (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos 1013
FABRICACIÓN DE PRODUCTOS DERIVADOS DE CÉLULAS O TEJIDOS Introducción La fabricación de productos derivados de células o tejidos requiere de diversas de operaciones y manipulaciones por parte de individuos bien capacitados en técnicas de procesamiento aséptico. La competencia técnica del personal es fundamental para la seguridad y eficacia del producto. Los productos autólogos presentan más retos para el procesamiento celular y tisular puesto que deben desarrollarse procedimientos para segregación de lotes, autorización de línea y procesos operativos a fin de reducir las posibilidades de confundir lotes para pacientes específicos (ver Consideraciones sobre el Diseño y la Operación de Instalaciones a continuación).
Aislamiento y Selección de Células Los principios generales para el procesamiento de tejidos humanos o animales después de su extracción aséptica son independientes del origen de la célula o tejido. La fabricación de productos celulares puede llevarse a cabo en una instalación de fabricación ubicada en las inmediaciones del sitio clínico o en una instalación de fabricación de productos celulares central distante. El material celular o tisular de origen debe ser envasado en envases estériles a prueba de fugas y transportado desde el área de extracción al lugar de procesamiento en condiciones controladas que mantengan la viabilidad de las células. El medio líquido en el cual se sumergen las muestras durante el transporte debe ser óptimo para mantener la viabilidad de células y tejidos. Este medio de transporte puede complementarse con antibióticos. Los niveles de antibiótico en los amortiguadores del proceso deben disminuirse y, finalmente, eliminarse durante las etapas subsiguientes del procesamiento, de modo que los antibióticos no estén presentes en el producto celular final. En el caso de productos sanguíneos o de tejidos con gran cantidad de sangre, el medio de transporte o solución amortiguada de electrolitos debe contener un anticoagulante. AISLAMIENTO Por lo general, se realiza una disección de órganos o tejidos sólidos para dejar expuesta la región deseada. Este material se puede usar tal como está para transplante o se puede someter a procesamiento adicional. Si se desean organoides multicelulares (por ejemplo, los islotes de Langerhans) o suspensiones de célula única, el tejido se puede someter a disgregación mecánica o enzimática. La disgregación física se puede lograr con instrumentos que homogeneizan el material impartiendo grandes fuerzas de corte o dividiendo el tejido en partes más pequeñas. Alternativamente, el material se puede comprimir o pasar a través de tamices con tamaños de malla determinados. La digestión enzimática de tejido conectivo extracelular es otro método común para disociar el tejido sólido, en la cual se usan diversas enzimas, incluyendo colagenasa, dispasa, tripsina, elastasa, hialuronidasa, papaína y quimotripsina. Se pueden agregar enzimas con actividad nucleasa, como la desoxirribonucleasa, para contribuir en la digestión de los ácidos nucleicos liberados de las células dañadas y evitar la aglomeración excesiva de las células. Al final de la incubación, la suspensión de células puede ser sometida a una acción de bombeo leve para dividir aún más los cúmulos multicelulares hasta lograr el tamaño o la composición deseados. Habitualmente, los métodos de disgregación enzimática y física se combinan para lograr el resultado deseado. Debido a que las células sanguíneas o de médula ósea son intrínsecamente suspensiones, la manipulación mecánica por lo general se limita a la extracción de plasma y agregados, lo cual se consigue mediante centrifugación y filtración. Las actividades de aislamiento de células y tejidos que implican etapas abiertas de manipulación deben llevarse a cabo en una cabina de seguridad biológica ISO 5 (clase 100). El entorno de la cabina de seguridad biológica debe ser adecuado para mantener operaciones de procesamiento aséptico. Para HCT/P que sufren una manipulación mínima en sistemas cerrados, estos entornos pueden estar controlados pero sin clasificación. No obstante, para productos de terapia celular y tisular que se manipulan y fabrican de conformidad con las BPFv, el entorno de la cabina de seguridad biológica debe estar controlado y clasificado, por lo general como un cuarto limpio ISO 7 (clase 1 O 000). Se deben tomar precauciones para segregar los aislados tisulares y celulares específicos del paciente. SELECCIÓN Por lo general, las suspensiones de células son una mezcla de tipos celulares que pueden requerir procesamiento adicional, a fin de aislar una población celular de interés y para reducir el nivel de tipos celulares no deseados, tales como células tumorales potencialmente contaminantes. Diversas técnicas de aislamiento y separación de células proporcionan un alto rendimiento de poblaciones celulares puras. Las poblaciones celulares se pueden enriquecer selectivamente variando la fuerza y la duración del centrifugado. La separación también se puede lograr mediante centrifugación isopícnica, donde la suspensión de células se centrifuga en un medio de gradiente que abarca todas las densidades de las células de la muestra. Las centrífugas de elutriación de flujo continuo especialmente diseñadas separan poblaciones celulares sometiendo una suspensión de células a fuerzas centrífugas y de corriente líquida opuestas en una cámara especial dentro del mecanismo del rotor. Las poblaciones celulares se separan dentro del rotor
1014 (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos/ Información General
USP 39
según sus tamaños y densidades y se eluyen selectivamente fuera de la cámara del rotor al aumentar la fuerza de corriente líquida. Finalmente, otros métodos implican la adición de agentes de alta densidad como el almidón hidroxietílico a la suspensión celular. Los procedimientos de concentración y separación como estos con frecuencia ocasionan la pérdida de células debido a la aglomeración y agregación. La separación celular también se puede lograr aplicando técnicas que toman ventaja de las características citológicas o bioquímicas únicas de distintas poblaciones celulares. La aglutinina de soja agrega células que contienen un grupo particular de carbohidratos que se expresa en células maduras de la sangre pero no en células madre, permitiendo el enriquecimiento de las células madre. Los linfocitos poseen el antígeno CD2 que actúa como receptor de eritrocitos ovinos. Al agregar eritrocitos ovinos a la mezcla de células, los linfocitos forman rosetas alrededor de los eritrocitos ovinos y posteriormente se separan mediante centrifugación diferencial. Algunas aplicaciones aprovechan la capacidad de ciertas poblaciones de células de adherirse a la superficie de sustratos sólidos específicos, como el plástico para cultivo de tejidos, materiales revestidos de colágeno y los andamiajes de polímeros naturales y sintéticos. El tipo celular unido específicamente se recupera selectivamente en la superficie y se retira de la suspensión de células inicial. Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra proteínas específicas de superficie de células se pueden usar tanto para la selección positiva como para la selección negativa de células. Por ejemplo, una población celular unida con anticuerpos monoclonales puede ser retirada de la suspensión celular después de su exposición a partículas magnéticas recubiertas con anticuerpos anti monoclonales. Las partículas magnéticas y sus células unidas se retiran de la suspensión celular magnéticamente. Las suspensiones de células no marcadas se pueden verter o incubar sobre superficies, como matraces de plástico o microesferas recubiertas de anticuerpos monoclonales para aislar poblaciones celulares particulares. Además, se pueden separar diferentes tipos de células, utilizando un clasificador de células activado por fluorescencia (FACS, por sus siglas en inglés), mediante la unión de anticuerpos con marcadores fluorescentes a un tipo de célula particular. Otras técnicas enriquecen poblaciones de células destruyendo células no deseadas. Por ejemplo, algunos anticuerpos monoclonales unidos a células son capaces de fijar y activar el complemento que se agrega exogénicamente, provocando lisis celular. Algunos procedimientos utilizan agentes citotóxicos o inhibidores mitóticos para destruir selectivamente células no deseadas. Estos métodos por lo regular se dirigen a subpoblaciones celulares con altas tasas de crecimiento, tales como las células tumorales. Finalmente, un anticuerpo se puede conjugar con un grupo tóxico, como la ricina, y permitir que el agente citotóxico alcance la población celular deseada. La mayoría de estos procedimientos requieren varias etapas de lavado para garantizar la eliminación de las células muertas, fragmentos de células y agentes citotóxicos del producto celular final.
Expansión y Diferenciación de Células Ex Vivo EXPANSIÓN EX VIVO Un aspecto fundamental para los fabricantes de productos celulares y tisulares es la capacidad de producir y administrar al paciente una dosis terapéuticamente relevante de la población celular requerida. Según la aplicación de que se trate, el producto puede ser de un tipo celular puro y homogéneo, o una mezcla de diferentes tipos celulares funcionales. Hay muchas poblaciones de células blanco presentes en bajos niveles o baja pureza en los tejidos complejos de fuentes primarias. En estos casos, la producción de una dosis terapéutica se puede lograr sólo mediante el enriquecimiento y la expansión ex vivo específicos de las células requeridas. La expansión ex vivo de células se puede presentar en cultivos en suspensión (p.ej., células To células madre hematopoyéticas y progenitoras), cultivos adherentes (p.ej., células madre mesenquimales, células madre embrionarias, células madre pluripotentes inducidas, células madre neuronales o fibroblastos dérmicos) o una mezcla de ambos (p.ej., expansión del estroma medular). Existen numerosas tecnologías para el cultivo de células. Las células se pueden propagar en matraces de cultivo de tejidos (matraces T), frascos tipo rodantes, andamiajes poliméricos o bolsas flexibles, permeables a gases, por lo general, dentro de incubadoras con control de temperatura, humedad y composición gaseosa. Los sistemas para cultivo de células multicapa de alta capacidad compuestos por sistemas de bolsas múltiples de plástico para cultivo de tejidos y biorreactores que emplean microportadores permiten llevar a cabo la expansión, recolección y formulación en un sistema cerrado. Las unidades de fermentación de pequeña escala tradicionales se pueden usar para la expansión de células en cultivos en suspensión. Asimismo, es posible expandir células adherentes en esas unidades ya sea proporcionado una superficie de adherencia (microportadores, perlas recubiertas o discos) o adaptando las células para propagarlas en un cultivo en suspensión. Algunos sistemas de cultivo se diseñan específicamente para la propagación de células para aplicaciones terapéuticas. Estos por lo general, son sistemas cerrados que usan cartuchos desechables para el biorreactor en unidades de procesamiento automático con control directo de temperatura, composición gaseosa y velocidad de perfusión de medios. En algunas ocasiones el software automatizado permite el rastreo de paciente-donante, así como documentar las condiciones de cultivo y las manipulaciones. Estas características son útiles en el diseño e implementación de los programas de Control de Calidad (QC) de liberación de producto y para la documentación de Garantía de Calidad (QA) de corridas de procesamiento. En cultivos adherentes, las células por lo general se recolectan de la superficie en la que se han expandido. Los métodos de liberación incluyen la agitación física, la ruptura enzimática, la quelación de iones metálicos y la inhibición competitiva de moléculas de adhesión o de matriz. Como se describió anteriormente, debe tenerse en cuenta la fuente, la seguridad, la toxicología y el análisis de residuos para cualquier reactivo utilizado para liberar células adherentes durante la fabricación. Algunos sistemas específicos para ciertos productos no requieren la liberación de células adherentes. Las células se expanden en un anda-
USP 39
Información General/ (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos 1015
miaje sintético o natural biocompatible que luego se aplica en forma tópica (por ejemplo, sustitutos de piel modificados por ingeniería) o las células se cultivan dentro o fuera de fibras para perfusión ex vivo (por ejemplo, hepatocitos en dispositivos de fibra hueca para tratar hepatopatías). En todos los casos, se deben optimizar los parámetros estándar de cultivo de células para maximizar la eficiencia del proceso. Tales parámetros incluyen la composición del material celular de origen, la densidad de siembra inicial, la composición de los medios, la velocidad de recambio de los medios, la temperatura, la composición gaseosa, el pH y la velocidad de entrega. Según la naturaleza del producto, es necesario definir el efecto potencial de los parámetros del proceso sobre la potencia y la función de las células blanco. Biorreactores-Se requieren biorreactores y dispositivos especializados para la fabricación de productos de combinación tridimensionales. Estos biorreactores sostienen los andamiajes/matrices biocompatibles para la fabricación de la construcción. Aunque el biorreactor puede proporcionar un sistema cerrado para la fabricación de construcciones, éste genera el reto de acceder al andamiaje para la siembra de células y durante la obtención de muestras para el análisis de liberación de producto mientras se mantiene la esterilidad. Los biorreactores son, por lo general, dispositivos de un solo uso, con lo cual se evita la contaminación cruzada entre productos. De preferencia, el producto no será reenvasado para su transporte y entrega. Por ejemplo, los biorreactores también pueden servir como envase final para el transporte del producto. La prueba de envase-cierre se debe llevar a cabo en todos los sistemas de envase-cierre finales. Se debe verificar la compatibilidad para la esterilización del biorreactor y del andamiaje y el proceso de esterilización debe ser validado para cada configuración de producto. Los productos lixiviables y extraíbles de los materiales en contacto con el producto tales como biorreactores y componentes de envasado deben cuantificarse y se deben establecer límites. En los sistemas cerrados de biorreactores puede ser difícil observar o muestrear células. La medición de parámetros metabólicos puede servir de método sustituto susceptible de validación con el que se puede evaluar la tasa de proliferación y predecir el momento de la recolección del producto celular. Debe definirse bien la relación entre tales parámetros y la viabilidad, la potencia y la función del producto celular. Puede ser necesaria la purificación y el enriquecimiento de las células blanco después de la expansión mediante métodos como los descritos anteriormente. DIFERENCIACIÓN Algunos productos de terapia celular requieren diferenciación de linaje o funcional de las células de origen. Por ejemplo, a través de los procesos de expansión de células madre hematopoyéticas, normalmente se generan productos que contienen una mezcla de células madre multipotentes, células progenitoras comprometidas hacia un linaje y células diferenciadas hacia un linaje. La composición de estos productos se puede manipular mediante diversas combinaciones de factores de crecimiento y citoquinas durante el proceso de expansión. Lo opuesto se aplica a los procesos en los que las células maduras son desdiferenciadas para permitir que luego vuelvan a comprometerse hacia un linaje determinado (por ejemplo, los condrocitos en la reparación de cartílago). Algunos ejemplos específicos de la manipulación ex vivo son la producción de células T específicas para antígenos destinados a tratar determinadas enfermedades o la obtención de tipos de células terapéuticas a partir de células madre embrionarias. Antes de su liberación para uso clínico, las células blanco diferenciadas resultantes deben ser completamente caracterizadas. Puede ser necesario evaluar el potencial de desdiferenciación de células multipotentes que hayan sido sometidas a diferenciación para garantizar la seguridad del producto. Cuando las células hayan sido expandidas y subsiguientemente diferenciadas, se puede llevar a cabo el análisis de cariotipo o ensayos de transformación in vitro para demostrar que las células son aceptables para uso clínico. MANIPULACIÓN GENÉTICA EX VIVO La modificación genética de células ex vivo es un procedimiento común de procesamiento que se usa para alterar el patrón de expresión génica en una población definida. La introducción de materiales genéticos integrantes o no integrantes (ADN, ARN, ARN pequeño de interferencia) se lleva a cabo a fin de inducir la expresión de nuevos genes y productos o para inhibir la expresión génica endógena. La modificación genética ex vivo en entornos de transplante autólogo implica la manipulación de una población de células recolectada o expandida de un paciente y la readministración subsiguiente de las.células al donante. En un entorno de transplante alogénico común, una población de células estable y modificada genéticamente que ha sido caracterizada y de la cual se ha generado un banco, se administra a una amplia población de pacientes. Con el propósito de controlar la enfermedad del injerto contra el anfitrión en transplantes alogénicos de médula ósea, las células T de donantes seleccionadas han sido tratadas con genes letales, como el de la timidina quinasa, que hacen que las células sean susceptibles al tratamiento con ganciclovir después del transplante. Entre los ejemplos de productos de terapia celular autólogos genéticamente modificados se incluye la transducción de células tumorales con citoquina u otros genes inmunomoduladores, linfocitos transducidos con receptores para antígenos tumorales y la introducción en linfocitos recolectados de un vector de ribozima antiviral como una estrategia para tratar la infección por virus de inmunodeficiencia humana. Entre los ejemplos de productos alogénicos de terapia celular se incluyen líneas de células tumorales genéticamente modificadas e irradiadas que se usan como vacunas contra tumores y células encapsuladas transfectadas con un gen para expresar un factor neurotrófico para una administración localizada de proteína terapéutica en el sistema nervioso central. Las células genéticamente modificadas ex vivo se consideran productos de terapia génica. Las cuestiones relacionadas con los productos de terapia génica se tratan en detalle en el capítulo general Productos de Terapia Génica (1047), en especial lo
1016 (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos/ Información General
USP 39
referente a la producción del vector o material genético usado para conseguir la transferencia génica, las estrategias de pruebas analíticas, la seguridad del paciente y el monitoreo. La fabricación, procesamiento de células y las metodologías de control de procesos tratadas con anterioridad se pueden aplicar a los procedimientos usados para manipulación genética. Con frecuencia, las poblaciones celulares genéticamente modificadas se aíslan y expanden o seleccionan antes de la introducción del material genético. Se cuenta con equipo y procesos especializados para la introducción de material genético el cual debe ser validado y monitoreado. Las cuestiones relacionadas con la generación de bancos de células y estabilidad aplican a líneas de células usadas en productos alogénicos de terapia celular que se establecen y crioconservan en MCB y WCB. Por último, las cuestiones relacionadas con el análisis y la administración de la población de células genéticamente modificadas se analizan más adelante en este capítulo.
Formulación de Productos Derivados de Células y Tejidos Las metodologías para formular productos derivados de células y tejidos dependen en gran medida del tiempo de almacenamiento planeado para las células antes de la administración al paciente. Para algunos productos derivados de células, el tiempo entre el fin de la fabricación y la administración al receptor previsto puede medirse en el orden de horas a días. Otros productos derivados de células pueden crioconservarse para extender su vida útil. Una metodología distinta para formular productos derivados de células y tejidos puede implicar la adición de un andamiaje natural o sintético que pueda facilitar el manejo, la protección de las células de la respuesta inmune y la creación de una forma específica que contribuya con el efecto terapéutico. Las consideraciones para formular cada uno de estos tipos de productos derivados de células y tejidos se analizan a continuación. PRODUCTOS DERIVADOS DE CÉLULAS Y TEJIDOS NO CRIOCONSERVADOS Los productos que constan de suspensiones de células para administración en pacientes dentro de las horas posteriores a su fabricación con frecuencia se formulan en soluciones amortiguadas estériles, adecuadas para administración directa. Para otros productos derivados de células y tejidos no crioconservados, es posible extender la vida útil de horas a días, usando soluciones que contengan nutrientes y antioxidantes apropiados. En la mayoría de los casos, estos excipientes no están destinados para su administración directa a pacientes. Por consiguiente, puede ser necesario eliminar los excipientes antes de la administración al paciente (ver Preparación y Administración del Sitio Clínico). Cuando se va a administrar un amortiguador para formulación no aprobado a pacientes, se debe llevar a cabo un análisis toxicológico preclínico. PRODUCTOS DERIVADOS DE CÉLULAS Y TEJIDOS CRIOCONSERVADOS La mayoría de las formulaciones de medios de crioconservación de células se suplementan con DMSO del 5% al 10% con o sin almidón hidroxietílico (por lo general al 6%) y una proteína plasmática como albúmina sérica humana del 4% al 10% en una solución salina balanceada. El DMSO previene la deshidratación al alterar la concentración aumentada de soluciones extracelulares no penetrantes durante la formación de hielo. La solución polimérica de hidroxietilo de alto peso molecular protege a las células de la deshidratación puesto que el agua se incorpora en cristales de hielo extracelulares. El uso de proteínas, a menudo, determina una recuperación y viabilidad máximas de células después de descongelar. En ocasiones se usa suero (de 5% a 90%) en lugar de proteínas específicas. Algunas formulaciones para crioconservación están completemente exentas de proteína. La concentración óptima de células para crioconservación depende del tipo de célula y debe determinarse empíricamente, pero por lo general oscila entre 106 y 10 7 células por mL. La homogeneidad y viabilidad de la población de células que se crioconservan también puede diferir después de la descongelación y se debe evaluar cuidadosamente. En los casos en los que el producto final derivado de células o tejidos está destinado para descongelación y administración inmediata, la presencia de DMSO en el amortiguador de la formulación somete al paciente a un nivel incrementado de toxicidad relacionada con la infusión, aunque esto se relaciona con el volumen administrado y con la concentración final del crioconservante. Referirse a la sección Preparación y Administración del Sitio Clínico para consideraciones adicionales. CÉLULAS COMBINADAS CON ANDAMIAJES BIOCOMPATIBLES Muchos productos de terapia celular y tisular se administran en conjunto con un andamiaje biocompatible. Por ejemplo, los productos para cicatrización de heridas o sustitutos de piel contienen células sembradas en un andamiaje. La estructura bioquímica y física del andamiaje y el método para combinar células con el andamiaje son específicos para cada producto. Las células se pueden cargar en un dispositivo de membrana semipermeable para administración. Por lo regular, el tamaño de poro de la membrana es lo suficientemente grande para permitir que los factores terapéuticos secretados por las células pasen, pero es lo suficientemente pequeño para evitar que las inmunoglobulinas y las células anfitrionas entren en contacto, destruyan o monten una respuesta inmune con las células terapéuticas. El dispositivo puede ser una fibra hueca o una cápsula semipermeable con células en el interior que secretan compuestos terapéuticos o bien puede formar parte de un sistema más grande de bombas y filtros, como módulos de fibra hueca con hepatocitos para tratar hepatopatías.
USP 39
Información General/ (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos 1017
Las células se pueden sembrar en un andamiaje tridimiensional y se les permite propagarse y formar una estructura parecida al tejido. En el producto resultante, las células se orientan de una manera única, que es importante para el uso previsto del producto (p.ej., substitutos de piel). Las células se pueden encapsular en un gel o solución de polímero entrecruzable y la estructura implantable resultante puede funcionar como vaso de cultivo, como un medio para proteger a las células del sistema inmune del anfitrión, o como una manera de moldear las células en una forma definida. Algunos de los polímeros utilizados son alginato, ácido hialurónico, colágeno, quitina o polímeros sintéticos. Se han implantado células fJ de los islotes pancreáticos encapsuladas en pacientes para tratar la diabetes. Para tratar la incontinencia urinaria, se han mezclado condrocitos con alginato a fin de formar una estructura al inyectarlos. Las células se pueden adherir a andamiajes con formas definidas que posteriormente se implantan. Algunos ejemplos incluyen células precursoras osteogénicas en andamiajes de hueso humano cadavérico desmineralizado, cerámica de hidroxiapatita, cerámica de hidroxiapatita-fosfato tricálcico o vidrio biodegradable, que se pueden usar en la reparación de defectos óseos.
MÉTODOS ANALÍTICOS Consideraciones Generales La complejidad y el alcance de las terapias celulares se reflejan en la amplia variedad de métodos analíticos que se usan para establecer controles durante el proceso y criterios de liberación del producto final. Se deben seleccionar especificaciones de calidad para productos celulares y tisulares para confirmar la calidad, seguridad y potencia del producto. Las pruebas seleccionadas deben ser específicas para cada producto y deben contar con criterios de aceptación adecuados a fin de garantizar parámetros de calidad uniformes y dentro de los límites aceptables de variación biológica, pérdida de actividad, cambios fisicoquímicos o degradación durante la vida útil del producto. El desarrollo y el establecimiento de especificaciones para productos celulares y tisulares deben respetar los principios descritos en el documento de la ICH Q6B Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products (Especificaciones: Procedimientos de Prueba y Criterios de Aceptación para Productos Biotecnológicos/Biológicos). Las especificaciones se establecen a partir de una caracterización minuciosa del producto durante la fase de desarrollo y un entendimiento del proceso y su capacidad. La caracterización debe incluir mediciones de las propiedades fisicoquímicas, la seguridad, la pureza, las impurezas derivadas del proceso y del producto, la potencia, la viabilidad, la esterilidad y la cantidad. Los fabricantes deben desarrollar especificaciones para cada producto desarrollado a partir de esta información mediante la aplicación de métodos estadísticos apropiados. Los datos deben incluir lotes usados en los estudios preclínicos y clínicos, y deben incluir además datos de validación de ensayo y proceso que pueden estar correlacionados con la evaluación de estabilidad, seguridad y eficacia. Los controles durante el proceso y las especificaciones para el producto deben estar sustentadas usando un estándar de referencia apropiado. Un producto autólogo puede basarse en un estándar de referencia generado a partir de células o tejidos de procesamiento de un donante saludable o de una fuente que proporciona células y tejidos a instituciones de investigación. El estándar de referencia garantiza que el proceso, según se mide en los ensayos de liberación, no cambie de manera importante con el tiempo y que verifique que una prueba produzca resultados aceptables, es decir, que se cumplen los requisitos de aptitud del sistema. El estándar de referencia se fabrica a partir de un lote producido en condiciones controladas y cumple con todas las pruebas de proceso y de liberación final. Además, este estándar de referencia está sujeto a un nivel adicional de caracterización, que incluye pruebas que no se suelen realizar para la liberación de productos. No es necesario que el estándar de referencia esté almacenado en la misma dosis, formulación o temperatura que el producto final. Sin embargo, se debe determinar la estabilidad del estándar de referencia. Alternativamente, se puede usar un estándar de trabajo. En ese caso, debe comportarse en la prueba de forma similar al estándar de referencia. El cambio a un nuevo estándar de referencia debe incluir muchas pruebas y todas ellas se deben realizar paralelamente al estándar de referencia existente. Se debe evaluar, con sumo cuidado, el impacto de cualquier cambio en las propiedades del nuevo estándar de referencia antes de adoptarlo. Una opción de estándar de referencia para un producto celular con una vida útil corta, o para una aplicación autóloga o específica para un paciente, puede ser un banco de células donantes normales del tipo celular apropiado. Este banco de células se puede utilizar para asegurar que el proceso de fabricación es capaz de generar un producto uniforme.
Controles durante el Proceso Los procesos de fabricación deben contar con criterios bien definidos para decidir si se avanza o no se avanza, en etapas clave durante el proceso. Los controles durante el proceso son valoraciones o pruebas realizadas para garantizar que la calidad y la cantidad del producto en proceso sean suficientes para fabricar un producto final aceptable. Entre los ejemplos de controles durante el proceso se incluyen: • Enumeración y viabilidad • Microbiológicos (esterilidad, endotoxinas, micoplasma) • Expresión de marcadores fenotípicos o genotípicos • Verificación de morfología contra estándares de referencia visuales
1018 (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos/ Información General
USP 39
• Producción de una sustancia bioactiva deseada • Determinación de duplicaciones de población, número de pasaje, edad del cultivo • Valoraciones de impurezas potenciales del proceso • Monitoreo de parámetros del sistema de cultivo (% C0 2, humedad relativa %, pH, glucosa, lactato, etc.) • Pruebas funcionales tales como unidades formadoras de colonias (UFC) y expresión de proteínas específicas de las células. La razón principal para establecer pruebas de control durante el proceso es garantizar que se obtenga el producto correcto con calidad y desempeño específicos. La razón secundaria para la realización de pruebas durante el proceso consiste en recolectar datos de caracterización del proceso y del producto útiles en la evaluación del impacto de los cambios o desviaciones en el proceso. El material intermedio en proceso que no cumple con los criterios de control durante el proceso no debe usarse para la fabricación adicional. Este material se puede reprocesar cuando se cuenta con procedimientos para tales actividades. El material reprocesado debe cumplir con las especificaciones originales durante el proceso y se debe definir el efecto del reprocesamiento sobre otros atributos de calidad, tales como la estabilidad, antes de que el material pueda someterse a fabricación adicional. Cuando se van a combinar varios sublotes (p.ej., células recolectadas de diversos vasos de cultivo) para procesamiento adicional, los sublotes que no cumplen con los criterios especificados no deben incluirse en la combinación, incluso si la combinación que contenga estos sublotes no aprobados cumpliese con los criterios de valoración en proceso. Durante el desarrollo del proceso clínico, los ensayos para calidad y desempeño del producto deben realizarse después de la mayoría de las etapas de procesamiento para determinar los pasos críticos así como los ensayos más sensibles a las desviaciones en el proceso. Se deben usar controles de proceso estadísticos y parámetros críticos para establecer límites para validaciones de proceso e investigaciones de fabricación. Se deben usar herramientas de muestreo estadístico para asegurar un tamaño de muestra válido. Los controles durante el proceso deben llevarse a cabo para procesos totalmente validados para asegurar que estos continúen bajo control. Los resultados de estos ensayos deben someterse a un análisis de tendencia y se deben tomar medidas para corregir los problemas cuando éstos surjan.
Especificaciones de Liberación de Producto Final Las terapias celulares reglamentadas como productos biológicos deben cumplir con las secciones aplicables del Título 21 del CFR 211 y del Título 21 del CFR 61 O para garantizar que cumplan con su identidad, pureza, potencia, seguridad microbiológica y demás atributos esenciales, tales como la viabilidad. Debido a que no es posible emplear la esterilización terminal de un producto celular vivo, esencialmente se requiere que todos los productos derivados de células cumplan con los criterios de aceptación para pruebas de producto tales como esterilidad, micoplasma y endotoxina-por lo general, un resultado negativo o la falta de crecimiento demuestran la esterilidad y la ausencia de micoplasma; asimismo, los productos deben demostrar <5 unidades de endotoxina (UE) por kilogramo de peso corporal del paciente. En el caso de las inyecciones intratecales, el límite de endotoxina especificado es más estricto ::;0,2 UE por kilogramo de peso corporal del paciente. El análisis de virus adventicios se realiza en contadas ocasiones en el producto de terapia celular final debido a que las células o bancos de células de origen y los materiales auxiliares de origen biológico ya han sido sometidos a análisis para detectar agentes virales de interés antes de la fabricación. Para casi todos los demás criterios de liberación de producto final, tales como aquellos para identidad, pureza y potencia, los procedimientos analíticos con métodos y criterios de aceptación son específicos para el producto derivado de células individual. La Tabla 2 ofrece una visión general de las pruebas de liberación de producto final previstas para productos de terapia celular y lista ejemplos de metodologías que se usan para cumplir con los requisitos de las pruebas. Tabla 2. Visión General de Anállsls de Liberación de Producto Final Prueba de Liberación
Criterios
Ejemplos
Esterilidad
USP {71)
Negativo
Micoplasma
Método de cultivo directo e indirecto (FDA Points to Consider[Puntos a Considerar])
Negativo; no detectado
Endotoxina
USP {85)
<5 UE/kg (:s;0,2 UE/kg intratecal)
Identidad
• Determinación de marcador de superficie • Análisis de isoenzimas • Identificación genética • Morfología • Bioensayo • Marcador bioquímico
Específico del producto
Pureza
• Porcentaje de células viables • Porcentaje de marcadores específicos de expresión de células • Límites para tipos no deseados de células • Límites para contaminantes del proceso (p.ej., suero)
Específico del producto
Información General/ (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos 1019
USP 39
Tabla 2. Visión General de Análisis de Liberación de Producto Final (Continuación) Prueba de Liberación
Ejemplos
Criterios
Potencia
• Número de células viables • Ensayo de formación de colonias • Cambio en la expresión de genes específicos • Secreción de macromoléculas deseadas • Inducción de efecto secundario (p.ej., antígenos leucocitarios humanos (HLA)) • Evidencia de actividad metabólica • Evidencia de función celular
Específico el producto
Dosis
• Número de células viables • Enumeración de población de células específicas • ADN total • Proteína total
Específico del producto
Otros
• Apariencia • Morfología •Tamaño
Específico del Producto
ESTERILIDAD Los productos derivados de células deben cumplir con los requisitos de las pruebas de liberación del producto final, incluyendo la esterilidad. Asimismo, las pruebas de esterilidad con frecuencia se llevan a cabo durante el proceso para establecer la pureza microbiana de las células que requieren de mayor tiempo de cultivo. Las pruebas de esterilidad adecuadas incluyen la prueba descrita en el Título 21 del CFR 610.12 y en el Capítulo de pruebas generales de USP Pruebas de Esterilidad (71 ). Estos métodos de prueba basados en cultivos requieren de 14 días y, por consiguiente, únicamente son adecuados para productos de terapia celular con vidas útiles prolongadas (p.ej., después de la crioconservación). Muchos productos de terapia celular tienen vidas útiles cortas y deben administrarse a los pacientes antes de que los resultados de la prueba de 14 días estén disponibles. En tales casos, la FDA ha identificado una metodología que permitirá la administración de productos derivados de células a pacientes en dicha situación [ver Guidance far FDA Reviewers and Sponsors: Content and Review of Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) lnfarmation far Human Somatic Ce// Therapy lnvestigational New Drug Applications (INDs)] (Guía para Revisores y Auspiciadores de la FDA: Contenido y Revisión de Información Química, de Fabricación y Control (CMC) para Nuevas Aplicaciones Farmacológicas lnvestigativas (IND) de Terapia Celular Somática en Humanos): • Prueba de esterilidad durante el proceso de una muestra tomada de 48 a 72 horas antes de la recolección final o después de la última adición de medio a los cultivos. • Una prueba rápida de detección microbiana, como por ejemplo, tinción de Gram u otro procedimiento en el producto final formulado. • Prueba de esterilidad que cumpla con el Título 21 del CFR 610.12 en el producto final formulado. Cuando se usa esta metodología alternativa, Jos criterios de liberación para esterilidad se basan en un resultado negativo de la tinción de Gram y en resultados que demuestren Ja ausencia de crecimiento en la prueba de esterilidad durante el proceso de 48 a 72 horas. En caso de que la prueba de esterilidad de 14 días arroje resultados positivos después de que el producto haya sido administrado al sujeto, el fabricante deberá informar sobre la falla en la esterilidad, los resultados de la investigación de la causa, así como cualquier acción correctiva a manera de enmienda a la IND dentro de Jos 30 días hábiles posteriores a la recepción inicial del resultado de prueba de cultivo positivo. Debido a las inquietudes relacionadas con la sensibilidad de una tinción de Gram y a Ja incapacidad para obtener resultados completos de esterilidad durante 14 días después de Ja administración al paciente, existe un extenso interés en el uso de métodos microbiológicos rápidos como alternativa al método de cultivo de 14 días. Esto se analiza en Métodologías de Prueba Alternativas. MICOPLASMA El Micoplasma y el ureaplasma son los microorganismos libres vivientes más pequeños. El micoplasma carece de pared celular rígida y su tamaño oscila entre 0,2 y 0,3 µm. Se puede observar el micoplasma con una forma redonda o filamentosa en un cultivo de células usando un microscopio de campo oscuro o de contraste de fases. En agar sólido, el diámetro de las colonias de micoplasma puede variar de aproximadamente 15 a 300 µm, mientras que las colonias más grandes se distinguen por una típica apariencia de "huevo frito". El micoplasma es ubicuo y se puede aislar de prácticamente cualquier mamífero. El micoplasma ha representado históricamente uno de los principales problemas de contaminación de cultivos de tejidos, debido a que tiende a ser difícil de controlar y requiere de ácidos nucleicos preformados provistos por componentes de los medios. Estos componentes pueden encontrarse fácilmente en los materiales de cultivo de células que se usan durante la fabricación. El micoplasma puede surgir de componentes de cultivo bovinos o de otros animales, de materiales de células o tejidos de pacientes asintomáticos, o posiblemente de operadores que lo liberan durante la fabricación.
1020 (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos/ Información General
USP 39
Se recomienda llevar a cabo el análisis de micoplasma para todas las materias primas de origen humano o animal y es indispensable como ensayo de liberación de lote para productos derivados de células. La FDA ha publicado un documento (Points to Consider in the Characterization of Ce// Lines Used to Produce Biologicals [Puntos a Considerar durante la Caracterización de Líneas Celulares Usadas para Producir Productos Biológicos) que describe en detalle los métodos aceptados para el cultivo y aislamiento de micoplasma. Los métodos para la detección de micoplasma también se describen en el capítulo de pruebas generales de USP Pruebas para Micoplasma (63). Debido a que los ensayos clásicos requieren un mes de análisis para su culminación, se están desarrollando y validando métodos alternativos para la detección rápida de micoplasma. Esto se analiza en Métodologías de Prueba Alternativas.
EN DOTO XI NAS Las endotoxinas ejercen diversos efectos biológicos en la membrana celular de los mamíferos y pueden afectar la secreción y producción de citoquinas, pueden provocar fiebre en los receptores o pueden servir como mitógenos poderosos. Debido a la posibilidad de los ampliamente variados efectos biológicos de las endotoxinas sobre los cultivos de células y tejidos, se deben evaluar las materias primas y los componentes usados para la fabricación de productos derivados de células para determinar la presencia de endotoxinas como parte del proceso de calificación de materias primas. El control de endotoxinas en la fabricación de productos de terapia celular es un elemento esencial de cualquier programa de control de calidad. La presencia de endotoxinas en productos administrados a pacientes representa una preocupación de seguridad importante. El capítulo de pruebas generales de USP Prueba de Endotoxinas Bacterianas (85) describe una variedad de métodos para la medición de endotoxinas que se basan en el ensayo de lisado de amebocitos de Limulus. Este ensayo se puede validar para una amplia gama de productos biofarmacéuticos. Una característica importante de la valoración con respecto a los productos de terapia celular es la capacidad de realizar el ensayo antes de la liberación de productos con vidas útiles cortas. IDENTIDAD El análisis de liberación de lote para productos celulares debe incluir una prueba de identidad. Esta prueba se emplea claramente para identificar al producto. Su complejidad depende de la naturaleza del producto específico y de la gama de productos que se fabriquen. Por ejemplo, se pueden llevar a cabo análisis más extensos y rigurosos para un producto de terapia celular autólogo en una instalación de fabricación en la que se preparan múltiples productos para pacientes, comparando con un producto de terapia celular alogénico que es el único producto fabricado en una instalación. Las pruebas de identidad para productos derivados de células deben ser pertinentes al tipo de célula y a las manipulaciones realizadas durante el procesamiento. Con frecuencia, se usan marcadores de superficie diferenciales para determinar la identidad del producto. Los inmunoensayos por citometría de flujo son los métodos más comunes para detectar y cuantificar estos marcadores. La identificación y cuantificación de subgrupos individuales de células se realiza mediante análisis multiparamétrico, por lo general, según el tamaño y la granularidad, y de uno o más marcadores de identidad. Otros ejemplos de pruebas de identidad incluyen análisis isoenzimáticos para confirmar las especies de origen, los cuales serían preferibles si el producto constara de células xenogénicas. Se puede emplear la morfología celular para distinguir tipos de células específicas. Existe una creciente tendencia al uso de tecnologías de identificación genética tales como repeticiones cortas en tándem para establecer la identidad de líneas celulares (p.ej., células madre embrionarias humanas usadas para derivar tipos de células terapéuticas). PUREZA Los métodos de pureza cuantifican específicamente los componentes activos deseados del producto. Las impurezas son contaminantes residuales relacionados con el producto o el proceso que se pueden detectar en el producto final. El requisito de analizar una impureza particular para la liberación de un lote dependerá de: (1) la capacidad demostrada del proceso de fabricación y purificación para eliminar o inactivar la impureza mediante la validación del proceso y (2) el potencial de toxicidad o el impacto funcional sobre el producto asociado con la impureza. Entre los ejemplos de impurezas relacionadas con el proceso asociadas con productos de terapia celular se incluyen los componentes residuales del medio de producción (p.ej., suero, antibióticos o citoquinas exógenas), materiales auxiliares usados en el procesamiento subsiguiente (downstream processing) (p.ej., nucleasas o proteasas) y lixiviables (p.ej., plastificantes de tuberías o plásticos para cultivo). Las impurezas pueden ser bioactivas (p.ej., citoquinas u hormonas) o inmunogénicas (p.ej., agregados, productos de degradación o proteínas derivadas de animales). Las impurezas pueden tener otros efectos perjudiciales, dependiendo de la dosis del producto. Las impurezas relacionadas con el producto son específicas a cada tipo de producto. Los ejemplos incluyen restos celulares, presencia de células no diferenciadas en un producto derivado de células que debe contener tipos específicos de células terapéuticas diferenciadas; niveles inaceptables de células no viables; células competentes para la replicación en un producto celular que debe contener células mitóticamente inactivadas; o cambios en la composición de células funcionales posteriores a la crioconservación y descongelación. Las metodologías analíticas para evaluar la pureza requieren la cuantificación de las impurezas o su separación física del producto. Se debe hacer hincapié en demostrar la uniformidad del perfil de impurezas del pro-
USP 39
Información General/ (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos 1021
dueto. Puede ser posible valorar el proceso de fabricación al grado que se pueda limitar el análisis de liberación de lote específico para impurezas. El análisis de impurezas es a menudo extenso durante la caracterización del producto y la validación del proceso cuando se está demostrando la uniformidad de la fabricación y del proceso de purificación. El análisis de impurezas como parte del análisis de liberación del lote debe reflejar los riesgos de seguridad asociados con la impureza y la capacidad del proceso para eliminar sistemáticamente tal impureza. POTENCIA La potencia se define, de conformidad con el Título 21 del CFR 600.3(s), como "la capacidad específica del producto, conforme a lo indicado por pruebas de laboratorio apropiadas o por datos clínicos adecuadamente controlados obtenidos mediante la administración del producto en la forma prevista, para generar un resultado determinado." junto con la dosis, la potencia define la actividad biológica de cada lote (ver Ensayos para Determinación de Dosis, a continuación). La relación entre las mediciones de potencia del producto durante el desarrollo y la fabricación con la seguridad y eficacia clínicas es clave para su uso en la liberación de partidas. La potencia se puede evaluar mediante valoraciones biológicas in vitro o in vivo o una combinación de éstas. Es común que estas valoraciones tengan coeficientes de variación entre 30% y 50%. Estas valoraciones requieren un material de referencia representativo, bien definido, que se pueda utilizar como control positivo para la valoración. El control positivo sirve para calificar el rendimiento de una valoración individual. El desarrollo de las valoraciones de potencia debe centrarse en la caracterización y control de la variabilidad. Las valoraciones de alta precisión son herramientas eficaces para controlar la calidad del producto. La información relacionada con la variabilidad de la valoración de potencia se debe incorporar en el diseño de estudios de estabilidad y la metodología estadística propuesta para asignar la fecha de caducidad (ver Estabilidad más adelante). Los tipos de valoraciones que se pueden emplear para establecer la potencia de un producto derivado de células son muy variados y dependen de las características únicas y la vida útil del producto. Para algunos productos derivados de células tales como células progenitoras hematopoyéticas, las valoraciones de potencia del producto han sido correlacionadas con la eficacia clínica. En este caso, el ensayo tradicional por formación de colonias que cuantifica células progenitoras tales como las unidades formadoras de colonias-granulocito-macrófago (UFC-GM) ha sido relacionado con los resultados clínicos de injerto en algunos estudios. Para otros productos derivados de células, se han usado los modelos de enfermedades de animales in vivo para establecer la potencia del producto. Si el producto derivado de células libera una macromolécula bioactiva, la valoración de potencia se puede basar en unidades de actividad liberada. Por ejemplo, la producción de insulina como respuesta a los cambios en los niveles de glucosa puede ser la base de un ensayo de potencia para células destinadas para el tratamiento de diabetes. Los productos específicos para pacientes tales como las inmunoterapias autólogas presentan retos relacionados con la demostración de la actividad terapéutica en un sistema de ensayo in vitro o in vivo. Las metodologías novedosas para medir la potencia, como la correlación de la evolución clínica con otras pruebas de caracterización, como las pruebas de identidad, pueden ser apropiadas y deben ser analizadas con las autoridades reglamentadoras en las primeras etapas del desarrollo. Por ejemplo, la capacidad de determinar marcadores específicos de identidad de superficie celular empleando técnicas de citometría de flujo o tinciones vitales puede ser una medición aceptable de la potencia, si está validada adecuadamente y se correlaciona con el resultado clínico. La FDA ha emitido pautas que analizan la posibilidad de uso de una matriz de ensayos biológicos y no biológicos, incluyendo tanto ensayos cualitativos como cuantitativos, para establecer la potencia del producto. La información contenida en estas pautas es particularmente importante para productos derivados de células con una vida útil corta o mecanismos de acción complejos o actividades biológicas múltiples (ver Guidance for lndustry: Potency Tests for Ce/Ju/ar and Gene Therapy Products [Guía para la Industria: Pruebas de Potencia para Productos de Terapia Celular y Génica). Por lo general, se requiere de una valoración de potencia validada antes de la aprobación reglamentaria. Durante los estudios clínicos investigativos, las autoridades reglamentarias por lo general requieren que, antes de iniciar los ensayos clínicos claves, se cuente con una valoración o valoraciones bien definidas destinadas a establecer la potencia del producto. Se recomienda ampliamente la implementación temprana de una o más valoraciones candidatas destinadas a establecer la potencia del producto. Los datos de estas valoraciones candidatas de potencia o funcionales pueden ser particularmente importantes al evaluar cambios propuestos en la fabricación, durante la transferencia de tecnología y para determinar la estabilidad del producto. ENSAYOS DE DETERMINACIÓN DE DOSIS El ensayo que mide, con precisión, la cantidad de producto se denomina ensayo de determinación de dosis y se selecciona basándose en su exactitud y precisión. Un ensayo que mide la actividad terapéutica de un producto recibe el nombre de valoración de potencia y se diseña para medir la función del producto. Este tipo de valoración es diferente al ensayo de determinación de dosis. El diseño del ensayo depende del tipo de producto. En el caso de medicamentos, las valoraciones que miden la cantidad de fármaco (dosis) se llaman valoraciones de contenido. Para estos medicamentos, las dosis de producto se pueden definir como la concentración o cantidad del producto final administrado al paciente y por lo general se mide como masa de producto. Para productos derivados de células, los atributos tales como el número viable de células terapéuticas a menudo se usan para definir la dosis del producto.
1022 (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos / Información General
USP 39
Los productos de terapia celular se pueden dosificar con base en la enumeración de una o más poblaciones de células. Cuando el producto se encuentra en una suspensión homogénea de célula única, el ensayo más utilizado es el número de células viables. Estos ensayos pueden incluir la enumeración de todas las células, células nucleadas totales u otro subgrupo celular. Los ensayos de viabilidad por lo general se basan en la capacidad de las células de excluir un colorante supravital, como el azul de tripán. Los resultados se expresan como el número de células que excluyen el colorante y, por lo tanto, se consideran viables. Los compuestos fluorescentes que se unen a las proteínas nucleares y que son excluidos por las células viables pueden incorporarse a métodos de citometría de flujo para la determinación simultánea de viabilidad y marcadores de identidad de las células. El conteo de células se puede llevar a cabo rápidamente por métodos manuales o automatizados. El recuento manual por enumeración visual de células en una cámara hematocitométrica es una técnica de fácil acceso, de exactitud aceptable, pero de menor precisión que la mayoría de los métodos automatizados. Los instrumentos habituales para el recuento celular automático proporcionan una enumeración reproducible de células no nucleadas (eritrocitos y plaquetas) y de células nucleadas y un recuento diferencial de células anteriormente nucleadas en poblaciones de leucocitos mononucleares y polimorfonucleares. Una discriminación mayor de poblaciones celulares específicas, por lo general, requiere el análisis de fenotipos de superficie celular por citometría de flujo u otros métodos (ver la sección Identidad anterior). La proporción de una subpoblación celular específica puede determinarse por FACS o por citometría de flujo. Un ejemplo de ensayo de enumeración de células es la enumeración de células progenitoras hematopoyéticas CD34 positivas (CD34+). Para productos que contienen células en una suspensión no homogénea, tales como células que se combinan con un biomaterial (p.ej., un andamiaje), se han usado medidas alternativas para la enumeración de células, incluyendo el área total de una capa de células, el peso húmedo, las proteínas totales y el ADN total. Si se emplean estas medidas para determinar la dosis del producto, se deben llevar a cabo pruebas complementarias para establecer la importancia.
Consideraciones para el Análisis de Liberación de Construcciones de Células y Biomateriales Para algunos productos derivados de células tales como células combinadas con biomateriales para formar productos de combinación, puede no ser factible analizar directamente la construcción de células y biomateriales. Con frecuencia se da este caso cuando están implicadas células autólogas y la construcción de células y biomateriales consta de una sola unidad y no es factible el muestreo de la construcción. En tales casos, los componentes individuales se analizan antes de ser combinados y la construcción final no se somete a análisis directo. Las medidas indirectas tales como el muestreo del medio de cultivo se pueden emplear para tratar los requisitos reglamentarios. Se debe establecer la calidad y estabilidad de la construcción de células y biomateriales formulada, así como la importancia de las medidas indirectas mediante estudios de validación durante el desarrollo del producto.
Consideraciones sobre el Muestreo Conforme a lo requerido por las BPF, se deben conservar muestras de producto después de haber completado el análisis de liberación. Cuando se emplean estrategias de liberación rápida, es posible que los fabricantes deban conservar muestras adicionales de manera que pueda reevaluarse la calidad del producto mediante metodologías de prueba alternativas o tradicionales, si fuera necesario. El muestreo para el análisis de liberación de lote debe basarse en la distribución potencial del parámetro analizado. Ver Desarrollo del Protocolo de Estabilidad (más adelante) para consideraciones adicionales. Se deben conservar muestras de cada lote ante la posibilidad de que surjan problemas de seguridad o calidad con un lote. Aunque la vida útil del producto sea muy breve, se pueden utilizar estas muestras retenidas para detectar impurezas y otras sustancias. La necesidad de un diseño adecuado del plan de muestreo requiere de consideración especial. En estos casos, la validación del proceso ayudará a determinar el diseño apropiado de muestreo estadísticamente fundamentado.
Métodos de Prueba Alternativos Conforme a lo indicado en Especificaciones para la Liberación de Producto Final (anteriormente), los productos de terapia celular deben someterse a pruebas de esterilidad, micoplasma y endotoxina. Antes del uso clínico, se deben cumplir criterios de aceptación adicionales para el análisis relacionado con la identidad, pureza, potencia, dosis y demás características pertinentes. Excepto por la esterilidad, micoplasma y endotoxinas, la mayoría de los procedimientos de prueba y sus métodos centrales usados para garantizar que el producto final cumple con los criterios de aceptación para liberación son únicos para el producto y se pueden adaptar para cumplir con las características y aplicaciones específicas del producto derivado de células. En general, se deben desarrollar métodos de prueba basándose en los mejores criterios científicos disponibles y deben ser adecuados para su uso en un ambiente de fabricación que cumpla con las BPM. Las valoraciones deben ser robustas, confiables y susceptibles de validación y deben proporcionar resultados antes de la liberación para uso clínico. El capítulo Validación de Procedimientos Farmacopeicos (1225) proporciona consideraciones básicas para la validación de métodos. Para algunos productos de terapia celular, el tamaño de la muestra y el volumen de material requerido para el análisis, o el tiempo necesario para obtener resultados de prueba puede consumir cantidades significativas del producto final o el tiempo
USP 39
Información General/ (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos 1023
requerido para obtener resultados puede exceder la vida útil del producto o ambos. Esto crea problemas con el suministro disponible de producto para tratar pacientes y en otras situaciones, descarta la posibilidad de obtener resultados antes de su administración en pacientes, lo cual es un problema particular para la prueba de esterilidad farmacopeica así como para el método de cultivo en caldo-agar para micoplasma, recomendado por la FDA. Por consiguiente, tanto la industria como las autoridades reglamentarias han mostrado un interés considerable en facilitar el desarrollo de métodos de prueba alternativos para estabilidad y micoplasma. Las reglamentaciones de la FDA para productos biológicos tratan específicamente el uso de métodos equivalentes siempre que garanticen que la seguridad, pureza, potencia y eficacia del producto biológico sean iguales o mayores a las garantías provistas por el método específico (Título 21 del CFR 610.9). A continuación se describen algunos de los métodos de prueba alternativos disponibles para esterilidad y micoplasma. Existe una amplia variedad de tecnologías disponibles que continúa en desarrollo por parte de diseñadores de ensayos para su uso en la industria de las terapias celulares. Los atributos que deben incluirse en cualquier revisión de tecnología propuesta incluyen la exactitud para el propósito destinado, la velocidad de productividad, los costos, la aceptabilidad por parte de la comunidad científica y las agencias reglamentarias, la simplicidad de la operación, los requisitos de capacitación y reactivos, la reputación del proveedor, los servicios técnicos provistos por el vendedor y, finalmente, los requisitos de servicios y espacio. La validación de estos métodos de prueba y la demostración de equivalencia, según se describen en el Título 21 del CFR 610.9, son obligatorias al momento de solicitar la autorización para productos biológicos (BLA, por sus siglas en inglés) o una aprobación previa a la comercialización (PMA, por sus siglas en inglés). ESTERILIDAD Las plataformas de detección para métodos microbiológicos alternativos por lo general se han basado en el crecimiento, viabilidad, artefactos o ácidos nucleicos. Las tecnologías basadas en el crecimiento emplean medidas bioquímicas o fisiológicas que reflejan el crecimiento de microorganismos. Las muestras de prueba se transfieren a formulaciones de medio tradicionales o mejoradas que estimulan la proliferación microbiana, y el crecimiento microbiano se detecta química o espectrométricamente. La ventaja primaria de estos sistemas es la naturaleza automatizada de los resultados de prueba y la recuperación de microorganismos para investigaciones de fallas y otras metodologías de caracterización microbiana. La FDA ha publicado pautas para validación de métodos microbiológicos rápidos basados en crecimiento (Guidance for lndustry: Validation of Growth-Based Rapid Microbiological Methods for Sterility Testing of Cellular and Gene Therapy Products, CBER, 2008 [Guía para la Industria: Validación de Métodos Microbiológicos Rápidos Basados en Crecimiento para Pruebas de Esterilidad de Productos de Terapia Celular y Génica). Los principios de validación de métodos microbiológicos alternativos también se describen en el capítulo de USP Validación de Métodos Microbiológicos Alternativos (1223). Las tecnologías basadas en la viabilidad no requieren de crecimiento celular. Estas tecnologías se basan en detectar la presencia de contaminantes vivos individuales mediante colorantes vitales, tintes o marcadores de superficie celular. Las células marcadas con un sustrato metabólico de fluorocromo específico se recolectan en una membrana de detección. Las tecnologías basadas en artefactos analizan componentes celulares o sondas moleculares que se designan específicamente para una especie microbiana particular. Por ejemplo, las especies individuales se pueden caracterizar mediante patrones únicos de composición de ácidos grasos después de que se han saponificado muestras de células enteras para inducir la formación de ésteres metílicos. Otras tecnologías emplean espectrometría de masas por tiempo de vuelo. Las tecnologías de ácidos nucleicos (NAT, por sus siglas en inglés) se basan en la amplificación de ADN mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR), tipificación de ARNr 16s ó 23s y secuenciación génica. Algunas tecnologías identifican microorganismos mediante la secuenciación de una porción del cromosoma de un organismo desconocido y comparando la secuencia de ARNr 16s con una base de datos. Esta tecnología es capaz de identificar hongos, micoplasma y bacterias, incluyendo elementos de lento crecimiento y no fermentadores. Para más detalles sobre los métodos basados en PCR, ver el capítulo de USP Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Amplificación (1127). MICOPLASMAS Las metodologías de análisis farmacopeico para micoplasma se desarrollan basándose en cultivos en agar y caldo y requieren por lo menos 28 días para controlar adecuadamente la presencia de contaminación por micoplasma. Debido a esta limitante, se han desarrollado una variedad de tecnologías de análisis rápido de micoplasma basadas en técnicas de amplificación de ácidos nucleicos tales como PCR, así como ensayos de hibridación de ácidos nucleicos no amplificados, ELISA y ensayos basados en enzimas.
SISTEMAS DE CALIDAD Los sistemas de calidad entrelazan los diversos aspectos de la fabricación. Los programas de control de calidad (QC) y de garantía de calidad (QA) deben ejercer control sobre las instalaciones y los procesos de fabricación, los procesos de validación y las pruebas de las materias primas, los materiales en proceso, los productos a granel y el producto formulado final. Los programas de capacitación y certificación representan el núcleo para contar con personal de fabricación técnicamente competen-
1024 (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos/ Información General
USP 39
te. Se debe implementar un programa de documentación para sustentar todas las operaciones de fabricación, capacitación, validación y calidad. Los cambios en los procesos y procedimientos deben seguir un programa formal basado en principios bien establecidos de control de cambios. Cuando se usan células o tejidos humanos alogénicos como material de origen para la fabricación de productos derivados de células o tejidos, los donantes de células o tejidos deben ser sometidos a análisis de detección y pruebas adecuadas (ver la sección Eligibilidad de Donantes anterior). En todos los casos, las células y tejidos humanos de origen deben manipularse de conformidad con las Buenas Prácticas para Tejidos (GTP) según se describe en el Título 21 del CFR 1271. Además de las GTP, se aplican las BPFv conforme a lo descrito por la FDA en el Título 21 del CFR 21 O, 211, 600s (en especial en el Título 21 del CFR 61 O) y 820 a la fabricación de productos derivados de células y tejidos que están sujetos a la aprobación previa a su comercialización. Las instalaciones, equipos y procesos de fabricación, al igual que las materias primas, sistemas de calidad y personal capacitado son algunos de los elementos fundamentales de las BPFv. Las BPFv se aplican al proceso y a la planta de fabricación a lo largo de todo el desarrollo clínico. El grado de control se incrementa a medida que progresa el desarrollo clínico y se espera el cumplimiento cabal con las BPFv al momento de iniciar los ensayos clínicos Fase 111. Es indispensable monitorear los datos obtenidos del análisis durante el proceso y de liberación del producto final. Los resultados fuera de especificación (OOS, por sus siglas en inglés), o incluso aquellos que están fuera de la tendencia, se deben investigar antes de desechar el material. La Guidance for lndustry: lnvestigating Out of Specification (OOS) Test Results for Pharmaceutical Production (octubre de 2006) [Guía para la Industria: Investigación de Resultados de Pruebas Fuera de Especificación en la Producción Farmacéutica] de la FDA ofrece un enfoque sistemático para llevar a cabo una investigación. El resultado de un ensayo puede rechazarse cuando se confirma que se ha presentado un error, tal como un error del analista, de cálculo o fallo del equipo. Si la investigación determina que los resultados de las pruebas del producto no cumplen con los criterios de aceptación especificados, el lote debe ser rechazado. En algunas situaciones, especialmente con productos autólogos o alogénicos específicos del paciente, puede ser necesario administrar un producto que no cumpla con todas las especificaciones o que presenta únicamente resultados de prueba incompletos como medida para salvar la vida de un paciente. Sin embargo, se debe contar con procedimientos que rijan la comunicación de resultados OOS al médico o a la persona responsable de tomar la decisión del uso del producto y para proporcionar instrucciones para todas las pruebas de seguimiento, monitoreo del paciente y comunicación de dichos resultados a todas las partes, incluyendo autoridades reglamentarias. Conforme a lo descrito con anterioridad, un enfoque de gestión de riesgos efectivo en las etapas tempranas de desarrollo del producto puede asegurar la más alta calidad de un producto derivado de células al proveer una medida proactiva para identificar y mitigar problemas potenciales de calidad. La probabilidad de falla en los productos de terapia celular puede surgir de una variedad de fuentes, incluyendo errores del personal, fallas en el procesamiento aséptico, fallas de los equipos, fallas de las instalaciones y servicios, limpieza, desinfección y fallas en los componentes y materias primas. Un entendimiento proactivo del riesgo puede ayudar a tomar mejores decisiones al momento de presentarse un problema de calidad. La gestión efectiva de riesgos puede facilitar la toma de decisiones más informadas y adecuadas y puede ofrecer a las autoridades reglamentarias una mayor garantía de la capacidad de un desarrollador para tratar riesgos potenciales. Dicha garantía puede afectar el grado y nivel de supervisión reglamentaria directa. La gestión de riesgos de calidad se puede integrar en partes claves del sistema de calidad tales como la gestión de cambios, la Acción Correctiva y Preventiva (CAPA, por sus siglas en inglés), las BPFv, la validación, entre otras, y se puede usar para establecer especificaciones coherentes y Parámetros Críticos del Proceso (CPP, por sus siglas en inglés) para asegurar el cumplimiento de los atributos de calidad. El análisis de riesgos es de naturaleza cualitativa. Se puede lograr usando experiencia y conocimientos sobre el proceso para definir las categorías para la evaluación de riesgo que pueden formar la base de un sistema de evaluación y mitigación de riesgos después de identificar errores de fabricación. Por ejemplo, resulta una práctica común desarrollar categorías de riesgo de incumplimento o desviaciones que puedan incorporarse a un procedimiento de investigación de incumplimiento o fallas. Las categorías son particularmente útiles cuando es necesario acelerar la evaluación de riesgos para facilitar una CAPA. A continuación se definen, a manera de ejemplo, los Niveles de Riesgo 1 a 4 los cuales se pueden adoptar como un medio para llevar a cabo una evaluación preliminar de riesgos: Nivel de riesgo 1: Aspectos Técnicos-No presenta ningún riesgo para el paciente y no impacta la seguridad y efectividad del producto. Ejemplo: Falta de una firma en el registro de partida. Nivel de riesgo 2: Alerta-Puede presentar un riesgo para la seguridad del paciente o puede tener un impacto potencial en la seguridad y eficacia del producto. Se debe volver a establecer el cumplimiento mediante justificación apropiada para proceder después de su entrega a QA para su revisión y aprobación. Ejemplo: El tiempo de digestión de procesamiento de biopsia está fuera del intervalo definido. Nivel de riesgo 3: No enviar/rechazar el lote-Puede presentar un riesgo para la seguridad del paciente o afectar la eficacia del producto incluso después de tomar acciones correctivas. No se permite su envío. Ejemplo: Los cultivos no demuestran un crecimiento celular adecuado. Nivel de riesgo 4: Evento posterior a la distribución-Puede presentar un riesgo para la seguridad del paciente o un impacto potencial en la seguridad, potencia o pureza del producto. La señal de seguridad se identifica después de la distribución del producto. Ejemplo: La prueba de esterilidad fallida se conoce después de la distribución del producto.
USP 39
Información General/ (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos 1025
DISEÑO DE LAS INSTALACIONES Y CONSIDERACIONES OPERATIVAS Las instalaciones de fabricación para productos de terapia celular y tisular deben ser cuidadosamente diseñadas para mantener las operaciones de procesamiento aséptico de acuerdo con las BPF, al tiempo que abarca aspectos únicos del producto. Las células o tejidos recibidos pueden tener biocarga u otros contaminantes por lo que puede ser necesario recibirlas y procesarlas en un área segregada en cuarentena para evitar comprometer a la instalación principal. Asimismo, el procesamiento de tejido para obtener células de interés puede requerir de equipo y procesos especializados que deben considerarse durante el diseño y las operaciones subsiguientes de la instalación. Para fabricar productos de combinación que implican andamiajes biocompatibles, puede ser necesario que la instalación sea capaz de manejar operaciones que impliquen procesamientos, manipulaciones y eliminaciones químicas. Esto puede presentar restricciones en el diseño de la instalación, especialmente para los sistemas de manejo de aire en ambientes de cuartos limpios. Aunque el principal hincapié en la fabricación de un producto derivado de células o tejidos se relaciona con la protección del producto de contaminación involuntaria, es necesario evaluar y reducir los riesgos para el operador de fabricación mediante capacitación adecuada en el manejo de patógenos transmitidos por la sangre y en el uso de equipo/vestimenta de protección. La protección del operador y el procesamiento aséptico son complementarios e incluyen el uso de cabinas de seguridad biológica certificadas y de vestimenta de protección aséptica que consta de batas, guantes, mangas, máscaras quirúrgicas, protección para los ojos y cubiertas para la cabeza. El tejido humano debe obtenerse en condiciones y controles ambientales que proporcionen un alto grado de garantía de recuperación aséptica. El grado de control requerido para operaciones de procesamiento de células y tejidos depende de una variedad de factores, incluyendo la complejidad de los procesos de fabricación aséptica, el sitio primario de fabricación y la vida útil del producto final. Los procesos de fabricación que implican la manipulación abierta de células, incluso en una cabina de seguridad biológica, tienen mayor riesgo de contaminación que los procesos que se llevan a cabo en biorreactores cerrados o sistemas de bolsas, que utilizan dispositivos estériles de conexión y de sellado de tubos. Por lo regular, los cuartos limpios ISO 7 (clase 1 O 000) y las cabinas de seguridad biológica ISO 5 (clase 100) son componentes esenciales para procesos de fabricación de productos de terapia celular, especialmente aquellos que implican manipulaciones abiertas. El ambiente controlado de un cuarto limpio, cuidadosamente diseñado, construido, validado y mantenido puede minimizar los riesgos de contaminación ambiental durante el procesamiento aséptico y reducirá la posibilidad de contaminación cruzada de productos específicos para un solo paciente. Las presiones diferenciales entre la fabricación clasificada deben cumplir con el documento guía de septiembre de 2004, Sterile Drug Products Produced by Aseptic Processing-Current Good Manufacturing Practice (Medicamentos Estériles Producidos Mediante Procesamiento Aséptico-Buenas Prácticas de Fabricación Vigentes). Se debe monitorear la calidad del aire en las instalaciones y las áreas de procesamiento de manera tal que se provea un alto nivel de condiciones asépticas durante el procesamiento. Para pautas relacionadas con este tema, ver el capítulo Control Microbiológico y Monitoreo de Ambientes para Procesamiento Aséptico (1116). La limpieza de las instalaciones, la segregación de componentes y productos, así como los procedimientos de desinfección, deben llevarse a cabo para evitar contaminación microbiana y contaminación cruzada entre lotes producidos en las instalaciones. Los productos celulares o tisulares basados en células autólogas representan un nivel de complejidad adicional para el diseño y la operación de las instalaciones de fabricación. Para productos autólogos, se fabrica un lote de producto para cada persona y se requiere de segregación completa durante la fabricación. A diferencia de los diseños de instalaciones para productos alogénicos, los cuales se basan en volumen en gran escala para lograr la máxima eficiencia de fabricación, las instalaciones para productos autólogos requieren de una unidad de ampliación (a escala), lo cual debe considerarse durante el diseño y la operación de las instalaciones. La automatización puede emplearse de manera efectiva para gestionar la manipulación manual repetitiva de células. Es posible que la escala inicial de operación no justifique una inversión de capital inicial para automatización, pero se debería considerar a medida que aumenta el tamaño de las operaciones de fabricación. La segregación del producto en las instalaciones es otro punto clave a tomar en cuenta durante el diseño y la operación. La supervisión del etiquetado y de QA se usan generalmente para el rastreo y la segregación. Técnicas tales como los códigos de barra y las etiquetas de frecuencia radial (FR) pueden usarse para el rastreo y la segregación del producto. Para obtener pautas sobre este tema, ver el Título 21 del CFR 211.42, 211.113, 1271 y la Guidance for lndustry: Sterile Drug Products Produced by Aseptic Processing-Current Good Manufacturing Practice (Guía para la Industria: Medicamentos Estériles Producidos Mediante Procesamiento Aséptico-Buenas Prácticas de Fabricación Vigentes) de la FDA, septiembre 2004. El equipo de fabricación debe ser robusto, proveer productos uniformes y permitir la calibración periódica y el mantenimiento preventivo. La calificación es necesaria para el equipo del cual se derivan parámetros o mediciones críticas del proceso. En la mayoría de los casos, esto incluye el software que controla las operaciones del equipo o sistemas. Los equipos críticos, como las incubadoras o los congeladores, deben contar con sistemas de alarma capaces de emitir señales de falla de manera remota. Asimismo, el equipo crítico debe estar conectado a un generador de respaldo para emergencias, el cual debe probarse periódicamente para verificar su estado operativo.
CONSIDERACIONES SOBRE LA VALIDACIÓN Y CALIFICACIÓN Los principios de validación recomendados por los documentos guía de la FDA y de la ICH, así como los capítulos de USP (1225) y Validación de Recuperación Microbiana de Artículos Farmacopeicos (1227) aplican a los productos derivados de células y
1026 (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos / Información General
USP 39
tejidos. La variación biológica en las células y tejidos de origen usados para fabricar la mayoría de los productos de terapia celular o tisular pueden afectar los esfuerzos de la validación. Las actividades de validación deben incluir la evaluación de riesgos, la capacitación y calificación del personal, la calificación del equipo e instalaciones, la validación de métodos analíticos, el procesamiento aséptico, el proceso de fabricación y la limpieza. La validación del proceso debe tomar en cuenta la seguridad, la uniformidad (rendimiento del proceso y por etapas, eliminación de impurezas), la robustez {operador a operador, día a día) y la calidad del producto final (identidad, pureza, potencia). Es necesario evaluar o calificar de manera apropiada los métodos analíticos usados para evaluar el proceso. La validación de procesos para productos específicos del paciente como los productos autólogos celulares y tisulares presenta problemas excepcionales. Primero, los materiales de partida para productos específicos del paciente por lo general se obtienen de materiales del paciente o de un donante que corresponda, tales como material de biopsia, productos obtenidos por aféresis, tejidos de desecho de procedimientos quirúrgicos y órganos de cadáveres que no califican para transplan'te. El proceso puede requerir que los fabricantes acepten cierto intervalo en lo que respecta a la calidad y la cantidad del material de partida, al tiempo que deben seguir produciendo un producto final que satisfaga los análisis de liberación. En segundo lugar, el procesamiento manual de células y tejidos presenta un grado de variabilidad inherente. Se deben desarrollar etapas de procesamiento que resulten de manera exitosa y uniforme en componentes de proceso y productos finales apropiados, incluso si el proceso se basa en materiales tisulares no estándares o variables. La validación del proceso debe tomar en cuenta dicha variabilidad y debe garantizar que los puntos finales y críticos de la fabricación y del análisis cumplan en todo momento con las especificaciones. Las validaciones de procesos asépticos se deben llevar a cabo usando medios microbiológicos que demuestren que el personal de fabricación puede realizar los procedimientos y producir un producto libre de contaminación microbiana. Los procedimientos destinados a mantener la segregación durante la fabricación se deben someter a desafío para verificar que la probabilidad de contaminación cruzada o confusión entre lotes de producto para diferentes pacientes sea mínima. Dependiendo de la variabilidad de las células o tejidos de origen y de la complejidad del proceso de fabricación, puede ser necesario fabricar más de tres lotes de calificación para verificar la uniformidad y la robustez del proceso de fabricación. No todos los esfuerzos de fabricación serán exitosos para productos de terapia autólogos y específicos del paciente. Sin embargo, se debe establecer la tasa de éxito y realizar un seguimiento que permita a los fabricantes detectar cualquier reducción en dicha tasa y, en tal caso, tomar las medidas necesarias para corregir el problema. Las células primarias bien caracterizadas de un banco de células se pueden utilizar en la validación del proceso si el perfil de los donantes se encuentra dentro del intervalo deseado para la población de pacientes. También puede ser apropiado un análisis de tendencia de un número de administraciones de producto estadísticamente aceptable. Deben realizarse validaciones sobre la limpieza del equipo y las instalaciones a fin de demostrar la eficacia de los agentes de limpieza sobre contaminantes estándar microbianos y fúngicos, así como contaminantes aislados de la planta de fabricación. La medición de los residuos de los agentes de limpieza debe tratarse en las validaciones de limpieza del equipo. Deberá evaluarse el equipo, las instalaciones y los sistemas electrónicos de monitoreo y control, tales como los sistemas de monitoreo de edificios y de control de inventarios. El equipo y los métodos analíticos y de fabricación deben ser validados siguiendo los procedimientos descritos en el capítulo (1225), además de los documentos guía emitidos por la ICH (ver Q2 R1 ). Se deben establecer planes de capacitación y se deben llevar a cabo calificaciones del personal. Se deben realizar validaciones para el transporte de tejidos y el envío de productos.
PREPARACIÓN Y ADMINISTRACIÓN DEL SITIO CLÍNICO Consideraciones Generales Antes de llevar a cabo la administración de algunos productos derivados de células o tejidos, puede ser necesario realizar modificaciones al producto o etapas de preparación. Estas modificaciones o etapas a menudo se realizan cerca del momento de la administración y, por lo tanto, quedan fuera del control de fabricante original. La naturaleza de estas modificaciones depende, en gran medida, de las características del producto. Las etapas de preparación incluyen la descongelación, el lavado o filtrado para eliminar células o sustancias acumuladas durante el almacenamiento, la transferencia a una solución infusible o la formulación con un vehículo o material estructural tal como un andamiaje. Asimismo, las consideraciones sobre el paciente, tales como la necesidad de preparar dosis o modificar el producto de acuerdo con la estructura anatómica, peso o volumen sanguíneo del paciente, pueden afectar dichas etapas. Se deben establecer en el sitio clínico procedimientos adicionales y controles de proceso para todos los intervalos de almacenamiento de producto, etapas de transporte y modificaciones, comenzando con una definición clara de puntos de control críticos. Los requisitos operativos incluyen la designación de un espacio físico adecuado para la manipulación aséptica, como por ejemplo una cabina de seguridad biológica ISO 5 (clase 100), personal capacitado, procedimientos operativos estándar detallados y supervisión de la calidad. La naturaleza única e irremplazable de muchos productos derivados de células o tejidos incrementa la necesidad de contar con procedimientos bien establecidos para preparación y administración en el sitio clínico.
USP 39
Información General/ (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos 1027
Manipulación del Producto Antes de administrar productos médicos que contienen células, la preparación en el sitio puede implicar una o más manipulaciones. Las manipulaciones típicas incluyen lo siguiente: Cambio en el Envase Final-El producto fabricado puede haber sido almacenado o transportado en un envase y es posible que necesite ser transferido a un envase diferente para su administración. Cambio del Estado Físico o Temperatura-Puede ser necesario descongelar o entibiar el producto. Cambio en Solución o Suspensión-Puede ser necesario disolver, diluir o suspender un producto en un líquido. Combinación con un Material Biológico-Puede ser necesario combinar las células terapéuticas con un material de andamiaje tal como hojas de matriz extracelular descelularizadas, geles, tapones, cápsulas, esponjas, partículas o gránulos. En otros casos, puede ser necesario agregar las células a un dispositivo médico existente tal como una unidad de filtración de fibras huecas antes de su uso. Mezclado o Preparación Magistral-Para algunos productos celulares, puede ser necesario el mezclado o la preparación magistral en el sitio clínico. Filtración o Lavado-La presencia de materiales no deseados en el producto fabricado, tales como partículas, desechos celulares, metabolitos o compuestos remanentes de manipulaciones previas, puede requerir de etapas de lavado o filtración. Muestreo-Puede ser necesario llevar a cabo un muestreo del producto final antes de su administración para probar la formulación final.
Consideraciones sobre las Instalaciones del Sitio Clínico Los requisitos de las instalaciones para llevar a cabo las etapas de preparación en el sitio o la administración de productos de terapia celular dependen de los productos y de las manipulaciones requeridas. El principal determinante de las características de las instalaciones es el grado de riesgo de contaminación microbiana relacionado con cada paso. Ver Preparación MagistralPreparaciones Estériles (797) para obtener pautas relacionadas con el tipo de manipulación y los niveles de control ambiental requeridos para garantizar el manejo aséptico.
Descongelación de Productos Derivados de Células La descongelación se lleva a cabo rápidamente. Si se va a reinfundir o trasplantar una pequeña cantidad de células, no es necesario extraer el DMSO de la suspensión, porque la mayoría de las preparaciones celulares pueden ser concentradas adecuadamente para mantener la concentración de DMSO dentro de límites tolerables. El uso de DMSO ejerce dos efectos sobre las células después de la descongelación: Se pueden agrupar si están dañadas y el DMSO reduce la viabilidad celular en minutos. Si se debe extraer el DMSO o concentrar las células para la administración, por lo general, se diluye la suspensión de células descongelada de forma seriada (para evitar el choque osmótico) y se la vuelve a suspender en un medio con proteínas. La viabilidad y potencia de las células se puede monitorear después de la descongelación, pero a menudo, la información es sólo para propósitos de recolección de datos y no una especificación que se debe cumplir para el uso clínico del producto celular. Algunos productos de terapia celular necesitan ser transportados frescos (es decir, sin congelar). En algunas situaciones, los componentes celulares se almacenan congelados pero se descongelan y aplican a los andamiajes en el sitio de fabricación a temperatura ambiente o de refrigeración, justo antes de ser transportados. Es posible que los productos de combinación compuestos por células en un andamiaje requieran ser transportados a temperaturas superiores a las temperaturas de refrigeración (es decir, temperatura ambiente) para evitar que las células se desprendan del andamiaje. Debido a que el producto preparado recientemente (fresco) es metabólicamente activo, el envase para transporte debe estar diseñado y validado para mantener la actividad metabólica del producto, además de cumplir con las pruebas de validación estándar de transporte. El metabolismo puede lentificarse disminuyendo la temperatura de transporte, pero esto requiere de un control de temperatura confiable durante el transporte. Debido a que los envases para transporte dependen en cierta medida de la temperatura exterior, estos deben ser validados para mantener un estricto control de la temperatura en cualquier condición climática.
Pruebas Adicionales de Liberación de Productos Celulares Manipulados en el Sitio Clínico Los productos de terapia celular que se someten a etapas de preparación o a manipulaciones en los sitios clínicos deben someterse a controles o pruebas apropiadas que garanticen el cumplimiento de todas las especificaciones de calidad antes de la liberación para su administración en pacientes. La naturaleza y el grado de las manipulaciones determina la necesidad de aplicar requisitos de liberación o especificaciones críticas adicionales a las requeridas inmediatamente después de la fabricación inicial. Por lo general, las pruebas previas a la liberación incluyen lo siguiente: • Inspección física del producto, incluyendo apariencia del producto (color, turbidez, partículas o materia extraña), integridad del envase, temperatura y exactitud y conveniencia del etiquetado • Revisión de los registros de proceso y/o certificado de análisis
1028 (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos/ Información General
USP 39
• Para productos específicos del paciente, verificación del etiquetado del producto y de los registros relacionados con la identidad del receptor Los productos de alto riesgo (definidos en el capítulo (797)) deben someterse a pruebas adicionales. Para todos los productos de alto riesgo, se debe evaluar la necesidad de valoraciones de calidad adicionales de identidad, potencia y pureza de los ingredientes activos y llevarlas a cabo cuando sea apropiado. Para productos de alto riesgo en la Categoría 11, llevar a cabo pruebas de esterilidad y de endotoxinas.
Administración a Pacientes Es posible que, dependiendo de la aplicación específica de la terapia celular o tisular, el personal para el cuidado del paciente requiera llevar a cabo algunas etapas para preparar al paciente. Estas etapas ayudan a asegurar que el producto emitirá los resultados terapéuticos esperados y ayudan a minimizar el riesgo de efectos adversos. La determinación de la aptitud del paciente para la terapia, incluyendo la evaluación de histocompatibilidad, por lo general ocurre antes de la preparación del producto. El estado clínico de un paciente puede cambiar después de la recolección de tejidos (debido a fiebre, infección, recurrencia o diseminación de tumores, o mal funcionamiento de órganos), por lo que se deben revisar la condición general del paciente y su aptitud para la terapia antes de la administración del producto. Esta evaluación puede incluir la historia clínica del paciente, una exploración física y estudios de laboratorio tales como hemogramas y análisis químicos. Asimismo, se pueden llevar a cabo mediciones funcionales y físicas basales, análisis de laboratorio o estudios de diagnóstico por imágenes pertinentes. Puede ser necesario preparar al paciente antes del tratamiento, dependiendo de la ruta de administración. Para terapias celulares que requieren de administración intravenosa, puede ser necesario colocar un catéter venoso central a pacientes con circulación periférica deficiente. Cuando se implantan en el paciente células o tejidos combinados con materiales estructurales, es necesaria la preparación del sitio, para lo cual puede ser necesario establecer un acceso quirúrgico al sitio, eliminando tejido degenerado o dañado, cortando el tejido adyacente para acomodar el implante y eliminando el tejido de un sitio secundario para sujetar o sostener el implante. Por ejemplo, si se implantan productos celulares para la cicatrización de heridas, el sitio para el injerto debe estar libre de infecciones y el lecho de la herida debe estar bien preparado. Para células de reparación de defectos en cartílagos, es necesario preparar el sitio dañado. Antes de realizar la administración terapéutica en un sistema de órganos (p.ej., el sistema broncoalveolar) o en una red vascular (p.ej., las arterias coronarias), puede ser necesario generar un acceso en el paciente para el catéter mediante cirugía, endoscopía o dirigido por radiografías. Para todos los casos, se debe evaluar cuidadosamente la necesidad la anestesia y medicación previa adecuadas. Por ejemplo, cuando el DMSO se va a conservar en un producto celular crioconservado descongelado, puede ser necesario administrar un antihistamínico al paciente antes de la administración. El examen previo a la administración también debe evaluar los tratamientos concomitantes que puedan interactuar con el producto de terapia celular o tisular y modificar sus efectos. Algunos tratamientos pueden ser auxiliares de la terapia celular o tisular, tales como las citoquinas que promueven la proliferación o la diferenciación del tejido infundido o implantado. Se deben evaluar los posibles efectos de otros fármacos usados comúnmente, tales como antibióticos, antineoplásicos, anticoagulantes y agentes antiinflamatorios. ADMINISTRACIÓN DE TERAPIAS CELULARES A PACIENTES Algunos productos de terapia celular o tisular son específicos del paciente debido a que se fabrican a partir de células, tejidos o fuentes de tejido autólogos o alogénicos. Ciertos productos específicos del paciente tienen un potencial definido para el beneficio o daño por inmunorreactividad. Se deben establecer sistemas para impedir la administración de un producto de este tipo al paciente equivocado. Los sistemas recomendados incluyen procedimientos similares a aquellos usados en la administración de hemoderivados humanos por lo que al menos dos personas deben verificar la identidad del paciente y del producto específico del paciente inmediatemente antes de la administración. Los productos de terapia celular y tisular se pueden administrar a través de una variedad de rutas que incluyen las rutas parenterales comunes (intravenosa, subcutánea, intramuscular e intraarterial) y el tracto respiratorio o gastrointestinal. Otras posibilidades son su aplicación directa en la vasculatura regional, órganos, tejidos o cavidades corporales mediante agujas o catéteres o bien después de la exposición quirúrgica del tejido. Aunque la administración parenteral se puede llevar a cabo en instalaciones habituales para pacientes ambulatorios o internados, las otras vías pueden exigir lugares especializados, como una sala de operaciones o sala de endoscopia asépticas. Con frecuencia se emplea una variedad de sistemas de administración tales como catéteres, jeringas y líneas IV para administrar las células a los pacientes. Antes del uso clínico, los fabricantes deben asegurarse que los componentes de estos dispositivos médicos sean compatibles con las células y con las soluciones de la formulación. En todos los casos, deben existir procedimientos operativos estándar y un programa de calidad para garantizar que el producto se administre de la manera prevista. MONITOREO POSTERIOR A LA ADMINISTRACIÓN Se debe contar con políticas y procedimientos escritos para monitorear los resultados del paciente, así como para informar y gestionar los eventos adversos. Los exámenes de evolución del paciente deben incluir indicadores capaces de detectar errores
USP 39
Información General/ (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos 1029
o problemas relacionados con todo el proceso de fabricación, y se debe poner especial atención a las manipulaciones, al almacenamiento o al transporte después de la fabricación. La gestión de las reacciones adversas debe incorporar procedimientos para asegurar el examen médico rápido y el tratamiento de pacientes, además de un sistema para informar y evaluar los efectos adversos que puedan identificar posibles defectos en el producto. Los informes incluirán información requerida por los programas de monitoreo de eventos adversos federales o estatales.
ESTABILIDAD Consideraciones Generales La estabilidad de los productos celulares o tisulares y de los componentes usados para su fabricación variará dependiendo de la naturaleza del producto, de su uso clínico previsto, de sus atributos específicos y de las condiciones de almacenamiento, envasado y transporte. Por esta razón, generalmente no es posible generar pautas integrales que abarquen una amplia gama de productos. De cualquier modo, el estudio de estabilidad siempre debe diseñarse basándose en principios científicamente sólidos, así como en un conocimiento cabal del producto terapéutico final y su uso previsto. Los fabricantes también deben evaluar la estabilidad de las etapas de retención durante el proceso, bancos de células, materias primas críticas y estándares de referencia. Un programa de estabilidad bien diseñado y ejecutado ofrece un alto grado de garantía de que el producto será estable durante su vida útil especificada. Cuando sea factible, se deben llevar a cabo análisis de estabilidad, de conformidad con los principios descritos en las pautas ICH Q5C, presentadas en el capítulo Calidad de Productos Biotecnológicos: Pruebas de Estabilidad de Productos Biotecnológicos o Biológicos (1049). Asimismo, se deben recolectar datos de estabilidad para materiales a granel y en proceso que se almacenan antes del procesamiento y llenado final. Dependiendo de la formulación usada y de las condiciones de almacenamiento, la vida útil puede variar de horas a años. Para los casos en los que el producto tiene una vida útil corta o cuando se debe eliminar el estabilizador del producto, puede ser necesario preparar la formulación final en el sitio clínico, justo antes de su administración. A menudo, la inestabilidad se observa en forma de agregación en productos celulares y como falta de uniformidad estructural en productos tisulares. Se debe establecer la estabilidad del producto celular o tisular final mediante estudios de validación durante el desarrollo. Para algunos productos celulares o tisulares, tales como productos celulares autólogos o específicos del paciente, los lotes finales tienden a constar de volúmenes pequeños con una vida útil de apenas unas pocas horas o días. En dichos casos, los protocolos de estabilidad deben basarse en materiales de donantes múltiples. En los estudios de estabilidad para validar el almacenamiento, transporte y fecha de caducidad, y debido a que a menudo resulta difícil obtener suficientes células o tejidos de productos autólogos o específicos del paciente, se pueden usar células o tejidos de diversas fuentes tales como donantes normales, repositorios tisulares para investigación, fuentes cadavéricas o células primarias de bancos bien caracterizados. No obstante, los resultados obtenidos con tales células o tejidos "sustitutos" deben interpretarse con cuidado y de manera conservadora hasta que los datos confirmen que las células autólogas o específicas del paciente en cuestión presentan perfiles de estabilidad similares a los de las células o tejidos sustitutos. Para productos de combinación que incluyen células y biomateriales, se debe considerar la estabilidad de ambos componentes. Cuando se encuentran presentes materiales de andamiaje biodegradables, se debe tomar en cuenta la degradación del andamiaje para determinar la estabilidad y la vida útil del producto de combinación.
Desarrollo del Protocolo de Estabilidad Los estudios formales de estabilidad para respaldar la obtención de la autorización y la recopilación de información de estabilidad del producto en etapas tempranas deben detallarse en un plan por escrito que describa la forma en que se deben recolectar y analizar los datos sobre la estabilidad para sustentar la fecha de caducidad. Los protocolos deben seguir el formato recomendado en las pautas reglamentarias existentes y deben incluir el alcance, las condiciones de almacenamiento y el número de lotes a analizar, el programa de análisis, los ensayos, el análisis de datos y las especificaciones del producto. Todo ensayo empleado en un estudio de estabilidad formal para obtener la autorización debe ser validado antes de comenzar el estudio. El diseño específico del estudio debe tomar en cuenta los desafíos razonablemente previstos que pueden surgir para el producto. Por ejemplo, si la formulación del producto final se realiza en el sitio clínico, se deben realizar estudios de estabilidad en esta formulación final para determinar el intervalo de tiempo y las condiciones de su conservación. Para células o tejidos crioconservados, la estabilidad debe establecerse después de la crioconservación del producto final, de productos intermedios del proceso o de cualquier etapa de retención. Los estudios de estabilidad deben verificar que las condiciones de almacenamiento mantengan los atributos de calidad del producto de manera que éste último cumpla con las especificaciones de estabilidad. Estas especificaciones pueden diferir de las especificaciones de liberación, pero deben tratar la potencia del producto. Medir y calcular el deterioro de la actividad del producto empleando metodologías estadísticas puede requerir de muestreos frecuentes durante un periodo prolongado, además del análisis de múltiples lotes de producción para compensar la variabilidad de las valoraciones o productos. Se deben llevar a cabo estudios iniciales para establecer una fecha de caducidad provisional antes de la administración al primer paciente. Estos estudios también son útiles para determinar qué valoraciones son indicadoras de estabilidad, es decir, los indicadores óptimos de degradación del producto. Debido a que los métodos farmacopeicos existentes no tratan las carac-
1030 (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos/ Información General
USP 39
terísticas únicas de todos los productos celulares y tisulares, los fabricantes deben desarrollar valoraciones que abarquen estas características únicas. Las validaciones de transporte representan un tipo especial de estudio de estabilidad con protocolos predeterminados, requisitos de prueba y criterios de aceptación. Por lo regular, el producto se envasa y transporta en condiciones normales y extremas, y el material se analiza antes y después del transporte para garantizar que aún cumple con los requisitos de liberación de producto. Conforme a lo descrito en Almacenamiento y Transporte (a continuación), se debe poner especial atención a las condiciones específicas de estrés térmico, mecánico y radiológico que podrían afectar a los productos.
Condiciones de Desafío de la Estabilidad El perfil indicador de la estabilidad de un producto celular o tisular puede variar con el tiempo por la influencia de una amplia variedad de condiciones ambientales, incluyendo temperatura, estrés mecánico y luz. En el desarrollo de un programa que investigue los efectos de estos parámetros sobre la estabilidad de los productos, se deben considerar vías de degradación multifactoriales. Los estudios, basándose en la evaluación de riesgos, deben incluir condiciones que superen los intervalos de almacenamiento especificados, es decir, condiciones de desafío como las encontradas durante períodos de almacenamiento, transporte o manipulación anormales. Algunos ejemplos son el mal funcionamiento de incubadoras durante un breve periodo, fallas de la incubadora o del almacenamiento en frío, períodos de fluctuaciones térmicas extremas ocasionadas por el transporte hacia climas calurosos o fríos, condiciones hipobáricas en el sector de carga de una aerolínea comercial o temperaturas previsibles en la sala de cirugía. Una exposición breve a una condición ambiental muy alejada de un límite establecido y una exposición prolongada a un ambiente que apenas exceda el límite establecido pueden ser igualmente dañinas. Si se aplican condiciones de almacenamiento diferentes, la velocidad lenta y constante de degradación del producto a una temperatura específica puede aumentar. Si existe una justificación científica, se debe investigar el efecto de la luz sobre el perfil indicador de estabilidad. Se debe prestar especial atención a los productos almacenados en fluidos que contienen componentes sensibles o que reaccionan con la luz los cuales pueden dar origen a subproductos citotóxicos. Los estudios análogos a los de envejecimiento acelerado habitualmente usados en programas de monitoreo de estabilidad farmacéutica también son útiles para caracterizar la manera en que el producto se degrada y los ensayos que son indicadores de la estabilidad. Por ejemplo, si un producto derivado de células se va a conservar en refrigeración (4º-6º) hasta su uso, entonces los estudios realizados durante la etapa de retención del producto durante periodos prolongados a temperatura ambiente (25º) pueden ofrecer información útil sobre la integridad del producto así como de los métodos analíticos usados. Estos tipos de estudios deben llevarse a cabo antes de los estudios formales de estabilidad, de manera que los estudios formales incorporen en el protocolo los ensayos indicadores de estabilidad validados.
ALMACENAMIENTO Y TRANSPORTE Consideraciones Generales Las condiciones de almacenamiento se seleccionan para preservar la pureza y la potencia a fin de que se mantengan las especificaciones del producto durante el almacenamiento, transporte y manipulaciones en el sitio clínico. Antes del uso en ensayos clínicos, deben realizarse estudios iniciales para determinar si las condiciones de almacenamiento, transporte y manipulación son aceptables. Se deben especificar las condiciones de almacenamiento y la fecha de caducidad del producto. No es necesario que las condiciones de almacenamiento y transporte sean las mismas que aquellas previstas para el producto comercial, pero deben garantizar que se mantengan las especificaciones del producto más allá de la fecha de caducidad inicialmente propuesta. Una vez que se hayan desarrollado los métodos indicadores de estabilidad y que se hayan seleccionado las condiciones del cierre del envase final, almacenamiento y transporte, dichas condiciones deben ser valoradas, conforme a lo tratado en la sección Estabilidad (anterior). Para productos con vidas útiles cortas, se deben tomar en cuenta las condiciones de almacenamiento y transporte en conjunto-incluso dentro de un solo sitio clínico- debido a que el transporte constituye la mayor parte del tiempo de almacenamiento después de la fabricación. El producto debe ser colocado en un envase a prueba de fugas y resistente a la luz, con un soporte físico adecuado, que garantice la estabilidad y la prevención de fugas durante las condiciones normales de transporte. Se debe poner especial atención a la capacidad de los gases para penetrar .el envase de transporte, especialmente si el producto de terapia celular se almacena o transporta usando hielo seco o nitrógeno líquido.
Almacenamiento Para cada tipo de producto de terapia celular, el fabricante debe establecer especificaciones de almacenamiento del producto y condiciones de almacenamiento aceptables que incluyan el intervalo de temperatura o el nivel de nitrógeno líquido. Las unidades de almacenamiento requieren de un sistema que monitoree y registre continuamente la temperatura y/o los niveles de nitrógeno líquido. Esto incluye un sistema de alarma para notificar inmediatamente al personal del laboratorio sobre condi-
USP 39
Información General/ (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos 1031
ciones de almacenamiento inaceptables. La estabilidad del producto durante el almacenamiento de rutina debe monitorearse mediante un programa de estabilidad (ver la sección Estabilidad anterior). La crioconservación es el principal modo de almacenamiento a largo plazo para células. Los productos celulares se crioconservan usando procedimientos de congelación a velocidad controlada o equivalentes que mantengan la viabilidad. Se debe monitorear y documentar la temperatura de los productos durante la congelación y el almacenamiento de conformidad con las políticas de la instalación. Asimismo, se debe valorar la estabilidad del producto en condiciones de retención tanto en la instalación de fabricación como en el sitio clínico. La velocidad de enfriamiento para soluciones celulares durante la crioconservación es importante debido a las lesiones mecánicas y por deshidratación que resultan de la formación y crecimiento de cristales de hielo. Las temperaturas ideales dependen del tipo de células y de la concentración del crioconservante. La velocidad de enfriamiento óptima para la mayoría de las células está entre 1ºy 3º por minuto. Los congeladores con velocidad controlada que pueden duplicar de manera reproducible esta velocidad de enfriamiento óptima son fundamentales cuando se congela un gran número de viales o grandes volúmenes de células en bolsas. Una vez enfriadas por debajo del punto de congelación, las células deben almacenarse a temperaturas por debajo de -130º. Esto se puede conseguir mediante congeladores eléctricos o con nitrógeno líquido. El almacenamiento de células en la fase de vapor de un congelador de nitrógeno líquido reduce el riesgo de contaminación cruzada con otros materiales en el congelador. Se debe validar el equipo congelador y se debe mapear la temperatura de modo que las células no estén sujetas a temperaturas por encima de -130º a medida que el nitrógeno líquido se evapora o durante la apertura del congelador. Algunas células se pueden almacenar a -80º si se pretende usarlas dentro de unas pocas semanas. Asimismo, es posible prevenir la contaminación cruzada usando envoltorios sellados para cubrir las criobolsas. Una gran cantidad de productos derivados de células no pueden ser crioconservados. Debido a que las células mantienen su metabolismo durante el almacenamiento, su período de caducidad es corto-en el orden de horas o días. La fecha de caducidad se puede extender si se aumenta el volumen del medio de almacenamiento, si se ajusta la temperatura de almacenamiento o si se conecta una serie de bolsas o compartimientos que permitan cambiar el medio sin violar la esterilidad del sistema. Además, se deben definir y monitorear las condiciones de almacenamiento en el sitio clínico. Aunque los centros de procesamiento de células o los centros médicos implicados en el transplante de médula ósea por lo general cuentan con congeladores de nitrógeno líquido, la mayoría de las farmacias clínicas no cuentan con estos equipos. Las temperaturas y características de almacenamiento deben definirse para cada producto. Es posible que el sitio clínico deba retener el producto en el envase para transporte hasta que éste pueda administrarse al paciente. Cuando el descongelamiento y la administración del producto derivado de células se llevan a cabo en el centro médico, el laboratorio que almacena o transporta las células debe colaborar estrechamente con el sitio clínico debido a que las células en una suspensión concentrada sólo pueden sobrevivir durante unas pocas horas.
Transporte Los envases para transporte y los procedimientos de transporte deben asegurar que las temperaturas se mantengan dentro de los intervalos aceptables de duración del transporte y en condiciones de uso real. Estas condiciones incluyen temperaturas dentro del envase para transporte, extremos de temperaturas en el exterior del envase para transporte (como las temperaturas en la pista caliente de un aeropuerto o en el frío sector de carga de un avión) y demás desafíos de transporte (tales como rayos x o vibración mecánica). Durante el desarrollo del producto, se deben realizar estudios de transporte para identificar las condiciones adversas que podrían afectar a los productos. De manera subsiguiente, se deben seleccionar y validar los materiales de refuerzo y aislamiento para armar un sistema de embalaje que proteja contra temperaturas extremas y condiciones mecánicas adversas. La mayoría de los productos se transportan mediante transportadores o sistemas de correo comerciales. En ocasiones, los productos críticos son transportados a mano en aviones comerciales. Los transportistas comerciales deben obtener permisos especiales para evitar las revisiones con equipo de rayos x en los aeropuertos. Se debe poner especial atención a las etiquetas del envase para transporte ya que puede ser necesario mostrar información sobre riesgo biológico y específica del paciente en áreas específicas del embalaje. Las validaciones de transporte deben llevarse a cabo usando protocolos definidos con criterios de aceptación predeterminados para asegurar que el producto cumpla con las especificaciones de calidad (incluyendo la potencia) una vez que alcance su destino final. Los productos derivados de células crioconservados por lo regular se envían a sitios clínicos usando hielo seco o en transportadores secos de nitrógeno líquido. Se prefieren estos últimos, porque resulta más fácil mantener y monitorear la temperatura, y permiten el monitoreo continuo de la temperatura del transportador, la cual puede ser recabada y registrada hasta 14 días. El hielo seco y el nitrógeno líquido son materiales considerados peligrosos durante el transporte por lo que se deben etiquetar adecuadamente.
ETIQUETADO El etiquetado de productos de terapia celular está regulado por la FDA de conformidad con el Título 21 del CFR 201, 601, 61 O y 1271. En lo que respecta a productos biológicos, el Título 21 del CFR 61 O Subparte G describe los requisitos de etiquetado de envase y embalaje. Siempre que sea posible, se debe adjuntar una etiqueta completa al envase del producto. Ésta incluye el nombre propio del producto obtenido del US Adopted Names (USAN) Council (Consejo de Nombres Adoptados en los
1032 (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos / Información General
USP 39
EE.UU.); el nombre, dirección y número de autorización del fabricante; el número de lote; la fecha de caducidad; para envases multidosis, la dosis individual recomendada; la leyenda "Solamente Rx" para productos de venta bajo receta; instrucciones para el dispensador para que proporcione, cuando se requiera, una Guía de Medicación a cada paciente; y si el envase no está contenido en un empaque, todos los puntos requeridos para una etiqueta del empaque. Si la etiqueta es demasiado pequeña para incluir toda esta información, se puede usar una etiqueta parcial, pero la siguiente información debe aparecer en dicha etiqueta: el nombre expresado como nombre propio o nombre USAN; el número de lote y el nombre del fabricante; y para envases multidosis, la dosis individual recomendada. Cuando se usan etiquetas parciales, el envase debe colocarse en un empaque que tenga una etiqueta que incluya todos los puntos requeridos para la etiqueta del empaque. Para los envases que no pueden incluir ninguna etiqueta, el envase debe colocarse en un empaque que incluya toda la información requerida para una etiqueta del empaque. Además, cuando la etiqueta se coloca en el envase, ésta no debe impedir la inspección del contenido. Para productos con vidas útiles muy cortas, la fecha de caducidad debe ajustarse y corregirse a los husos horarios para proporcionar al usuario una evaluación exacta de la vida útil. La etiqueta del empaque debe contener el nombre propio o USAN del producto, el nombre, dirección y número de autorización del fabricante, el número de lote, la fecha de caducidad, el conservante usado y su concentración, o las palabras "Sin conservante" si fuera apropiado, el número de envases, si contiene más de uno, la cantidad de producto en el envase, la temperatura de almacenamiento recomendada, las palabras "Agitar Bien", "No Congelar" u otras instrucciones según se indique, la dosis individual recomendada para envases multidosis, la vía de administración, las sustancias sensibilizantes conocidas, el tipo y la cantidad de antibióticos agregados durante la fabricación, los ingredientes inactivos si representan un factor para la seguridad, el coadyuvante, el origen del producto cuando represente un factor para la administración segura, la potencia mínima expresada en términos del estándar oficial de potencia o la declaración "No Existe un Estándar de Potencia de EE.UU." y, finalmente, la declaración "Solamente Rx" para productos de venta bajo receta. Los reglamentos del Título 21 del CFR 610.62 tratan la posición y prominencia del nombre propio o USAN con respecto a un nombre comercial. Los requisitos adicionales de etiquetado son aplicables puesto que el Título 21 del CFR 1271.90 considera a los productos de terapia celular como HCT/P. Para productos de terapia celular autólogos, el fabricante está exento de los requisitos para determinar la elegibilidad del donante. No obstante, si no se realiza el análisis recomendado para contaminantes patógenos o microbianos antes de la liberación, la etiqueta debe contener la leyenda "SÓLO PARA USO AUTÓLOGO" o "NO EVALUADO PARA SUSTANCIAS INFECCIOSAS". La etiqueta debe contener la leyenda para Peligro Biológico (Biohazard) mostrada en el Título 21 del CFR 1271.3(h) con la leyenda "ADVERTENCIA: Explicar a los pacientes los riesgos de enfermedades transmisibles." Para productos específicos del paciente, el nombre completo del paciente, sus iniciales o una combinación de los mismos debe aparecer en el etiquetado para garantizar que el producto se administre al paciente apropiado. Asimismo, los reglamentos rigen el contenido y formato del etiquetado para productos farmacéuticos para prescripción en humanos (incluyendo productos biológicos), también conocido como prospecto del empaque. Estos reglamentos, que aplican a productos terapéuticos aprobados, entraron en vigor el 30 de junio de 2006. Los detalles sobre el contenido y el formato se pueden encontrar en el Título 21 del CFR 201.56 y 201.57. Estos cambios fueron diseñados para mejorar la capacidad de los profesionales de la salud para acceder, leer y usar el etiquetado de medicamentos bajo receta. El principal cambio es la adición de una sección de media página de información más relevante. La mayoría de los demás cambios implican la reorganización de las secciones para trasladar al frente la información más crítica para la prescripción. Además de los requisitos reglamentarios específicos de la FDA, diversos grupos han diseñado la ISBT 128, una norma para uniformar el etiquetado de productos de terapia celular, en la que ISBT son las siglas de la lnternational Society of Blood Transfusion (Sociedad Internacional de Transfusión Sanguínea) y el 128 refleja la selección de la simbología de código de barras conocida como Código 128. La ISBT 128 define las estructuras de los datos y la colocación de códigos de barras y su texto correspondiente, legible a la vista, que aparece debajo del código de barras. Asimismo, la norma proporciona clasificaciones para diferentes tipos de productos celulares, texto modificador para procesamiento de células, texto de manipulación para la forma en que se fabrican las células, texto crioprotector para productos celulares congelados, así como otros textos diversos que deben incluirse en las etiquetas. Aunque esta norma voluntaria cumple con los requisitos de diferentes organizaciones para el etiquetado de productos celulares, actualmente no cumple con los requisitos reglamentarios de la FDA. Por consiguiente, las etiquetas que cumplen con la ISBT 128 deben complementarse con información adicional requerida por la FDA.
CONSIDERACIONES PARA LA TRANSFERENCIA DE TECNOLOGÍA La transferencia de habilidades, conocimiento, tecnologías y métodos de fabricación necesarios para crear un producto derivado de células o tejidos son esenciales para garantizar que los desarrollos científicos y tecnológicos sean accesibles a usuarios que puedan desarrollarlos aún más y convertir la tecnología en nuevos productos, procesos, aplicaciones, materiales o servicios. A continuación se resumen algunas consideraciones generales para las actividades de transferencia de tecnología. El proceso para desarrollar un producto de terapia celular o tisular es complejo y a menudo implica varias rondas de transferencia de tecnología durante el ciclo de vida del producto. Algunos ejemplos de actividades de transferencia de tecnología incluyen: desde la investigación de campo hasta la investigación traslacional; transferencia desde la investigación y el desarrollo hasta la fabricación que cumpla con las BPF; y cambio en la instalación de fabricación (por ejemplo, de la fabricación interna al fabricante contratista). Los fabricantes deben anticipar la necesidad de transferir tecnología durante la etapa de investigación y desarrollo de un proceso de terapia celular o tisular. Lo anterior debe resultar en buenas prácticas de documentación para investigación y desa-
USP 39
Información General/ (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos 1033
rrollo del producto, incluyendo procedimientos de análisis. Los datos y resultados deben conservarse en forma de informes de desarrollo o informes técnicos para proporcionar información histórica que pueda usarse como referencia y para solicitudes reglamentarias. Asimismo, las materias, procedimientos y equipos críticos deben identificarse durante la transferencia de tecnología. El progreso de desarrollo del producto y del proceso debe monitorearse en función de hitos establecidos como parte de la evaluación de riesgos y la identificación de brechas en el plan de transferencia de tecnología. La Tabla 3 proporciona una visión general de las etapas relacionadas con la transferencia de tecnología. Tabla 3: Transferencia de Tecnología-Etapas Fundamentales
Preparación
• Definir el alcance, la estrategia y los riesgos asociados con el proyecto que será transferido • Identificar brechas generales y la capacidad de transferencia del proceso • Evaluar la disponibilidad de documentación tal como los procedimientos de fabricación y análisis, planes de muestreo, datos y especificaciones del producto en proceso y final, especificaciones de material (incluyendo el origen, requisitos de análisis y cantidades requeridas para un procedimiento de fabricación o de prueba), especificaciones de equipo, requisitos de capacitación especializados, requisitos de la instalación y requisitos de infraestructura •Establecer un órgano de administración formado por líderes, expertos y mentores por parte del que transfiere y del que recibe la tecnología; determinar responsabilidades para cada grupo e individuo • Definir canales de comunicación e información • Identificar mediciones de desempeño, hitos y secuencias
Desarrollo e Implementación
• Establecer un plan de gestión de riesgos • Establecer un plan maestro de transferencia de tecnología • Desarrollar un plan de capacitación • Establecer documentos en el centro receptor (especificaciones, SOP, registros de partidas y métodos de prueba estándar) • Operaciones de capacitación, calidad y apoyo del personal para la sostenibilidad • Calificar materiales y proveedores • Establecer y ejecutar protocolos de comparabilidad/aptitud del equipo • Calibrar el equipo en el centro receptor • Calificar al personal, al equipo y las instalaciones en el centro receptor (incluye la ejecución de validadones de procesamiento aséptico, llenado de medios estériles y validaciones de limpieza) • Establecer y ejecutar calificaciones de métodos/valoraciones • Establecer un programa de estabilidad de producto • Realizar pruebas de ingeniería y uniformidad/calificación • Evaluar la necesidad de establecer la comparabilidad y preparar solicitudes reglamentarias • Establecer y ejecutar calificaciones de transporte
Mantenimiento
• Recolectar y establecer tendencias de datos de procesos/producto • Monitorear la estabilidad del producto • Gestionar el control de cambios • Capacitar y volver a calificar al personal • Recalibrar y volver a calificar el equipo • Actualizar las solicitudes reglamentarias
El objetivo final de la transferencia de tecnología se centra en que el receptor reproduzca un proceso de manera uniforme para producir productos comparables que cumplan con los reglamentos. Es común que los fabricantes desarrollen e implementen mejoras en el proceso durante las etapas tempranas de transferencia de tecnología para respaldar la ampliación y la fabricación para los ensayos clínicos de las Fases 1/11. Sin embargo, durante la transferencia de tecnología para estudios de la Fase 111, ensayos claves o fabricación comercial, se deben evitar cambios en el proceso o productos debido a que pueden requerir de estudios clínicos adicionales y afectar negativamente el tiempo hasta su comercialización.
REGLAMENTACIONES V ESTÁNDARES La Federal Food, Drug, and Cosmetic Act (Ley Federal de Alimentos, Medicamentos y Cosméticos o Ley FD&C) y la Public Health Service Act (Ley de Servicios de Salud Pública o Ley PHS) ofrecen el marco legal para la reglamentación de la FDA para productos biológicos, incluyendo productos de terapia celular. La Tabla 4 presenta una lista de términos de uso frecuente en la reglamentación de productos de terapia celular. En 1993, la FDA notificó que tenía la intención de reglamentar los productos de terapia celular y génica como productos biológicos (Registro Federal 1993;58:5324853251 ). La FDA definió productos de terapia celular somáticos como células autólogas (es decir, obtenidas del mismo sujeto), alogénicas (es decir, intraespecies) o xenogénicas (es decir, interespecies) que han sido propagadas, expandidas, seleccionadas, tratadas farmacológicamente o alteradas de otro modo ex vivo para su administración en humanos para la prevención, tratamiento, cura, diagnóstico o mitigación de enfermedades o lesiones. Para otros productos y medicamentos biológicos, se deben realizar ensayos clínicos que impliquen productos de terapia celular somáticos con base en una solicitud para nuevo medicamento en investigación (IND). Después de que el patrocinador presente evidencia suficiente sobre la seguridad del producto y de la eficacia clínica, se puede obtener la aprobación de la FDA para la comercialización a través de una solicitud de autorización para Productos biológicos (BLA) o PMA. Conforme a lo definido por la FDA, los productos de terapia celular se consideran medicamentos y productos biológicos, pero también HCT/P reglamentados con base en la Sección 351 y/o Sección 361 de la Ley PHS. Esto significa que los productos de terapia celular están sujetos a las BPFv (Título 21 del CFR 21 O y 211 ), a los reglamentos para Productos Biológicos (Títu-
1034 (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos/ Información General
USP 39
lo 21 del CFR 61 O) y a los reglamentos para productos elaborados con células o tejidos humanos (Título 21 del CFR 1271) incluyendo las Buenas Prácticas para Tejidos vigentes. En años recientes, la FDA ha emitido diversas reglamentaciones y documentos guía para productos celulares y tisulares humanos (HCT/P) (ver el Apéndice y www.fda.gov/cber/). Las reglamentaciones del Título .21 del CFR 1271 son de particular importancia pues establecen un enfoque gradual basado en el riesgo de productos elaborados con células o tejidos humanos (HCT/P). Dentro de este marco reglamentario, una gran cantidad de células o tejidos humanos convencionales no están sujetos a la aprobación previa a la comercialización y únicamente tienen que cumplir con las Buenas Prácticas para Tejidos vigentes, incluyendo los requisitos de elegibilidad del donante. Este nivel más bajo de supervisión reglamentaria tiene como propósito prevenir la introducción, transmisión o diseminación de enfermedades transmisibles. Cuando las células o tejidos humanos son el material de partida para la creación de un producto derivado de células novedoso, se aplican requisitos reglamentarios adicionales. Este nivel más alto de supervisión reglamentaria incluye el cumplimiento con las BPFv, las normas para productos biológicos y la aprobación previa a la comercialización (ver el Título 21 del CFR 1271.1 O). Para casi todas las instancias, los productos derivados de células descritos en este capítulo general deben cumplir con el nivel más alto de supervisión reglamentaria. Además de las reglamentaciones y pautas específicas de terapia celular, resultan importantes y aplicables una gran cantidad de pautas tales como aquellas relacionadas con el procesamiento aséptico, las expectativas de las BPF durante el desarrollo y la validación del proceso, entre otras (ver www.fda.gov). Asimismo, la ICH ha emitido documentos guía para la calificación de productos derivados de células y tejidos (ver el Apéndice y www.ich.org). Algunas de las pautas y conceptos en estos documentos se reproducen en los compendios USP-NF. La vía reglamentaria para productos de terapia celular es paralela a la de los productos farmacéuticos y, a medida que el producto se traslada de la investigación temprana a los ensayos clínicos claves y finalmente hasta su aprobación para comercialización, el grado de control de fabricación aumenta en rigurosidad. Lo anterior tiene implicaciones para la unidad de fabricación y puede requerir que el sitio sea trasladado. Las organizaciones para el establecimiento de normas fomentan el uso de una unidad de calidad plenamente funcional para supervisar el progreso de la fabricación. La información se encuentra disponible en el sitio Web de la FDA, junto con referencias a los grupos a cargo de guiar a la comunidad médica y a la unidad de fabricación durante el desarrollo. Además de los capítulos generales y monografías de USP para productos de terapia celular y tisular, diversas organizaciones profesionales para el establecimiento de normas (ver la Tabla 5 y el Apéndice) han trabajado estrechamente con las autoridades reglamentarias para desarrollar normas y prácticas. Estas organizaciones garantizan que las normas se mantengan actualizadas y que cumplan con las reglamentaciones gubernamentales. Estas normas representan una fuente complementaria de conocimiento en relación con la identificación de donantes, la selección y el análisis de donantes, las recolecciones de productos, el procesamiento de productos celulares, la administración, el informe de eventos adversos y el seguimiento posterior al tratamiento. El MTB ha elaborado pautas para obtener tejido alogénico. Con el paso de los años, diversas organizaciones han intentado armonizar normas, así como el desarrollo de circulares comunes que puedan compararse con los prospectos del empaque. Sin embargo, en la actualidad, cumplir con las normas de una organización no garantiza el cumplimiento con las normas de otras organizaciones. Los programas de normas voluntarias generan una gran cantidad de beneficios para las instalaciones de fabricación que participan de estos programas. Las organizaciones profesionales para el establecimiento de normas participan en talleres educativos y diseminan información sobre asuntos operativos. Asimismo, mantienen una vigilancia estrecha sobre las actividades de la FDA y la capacitación de inspectores. Además, la FDA confía en la acreditación mediante el programa de normas voluntarias; asimismo, las inspecciones no anunciadas de la FDA han llevado al aumento en el nivel de cumplimiento por parte de las instalaciones de laboratorio y clínicas, lo que sin lugar a dudas ha incrementado la seguridad del paciente. Los terceros responsables de los pagos y los servicios de clasificación de hospitales han comenzado a usar informes de acreditación en su evaluación de programas de calidad. Tabla 4. Términos de Uso Frecuente en la Reglamentación de Productos de Terapia Celular DEFINICIÓN TÉRMINO 351 productos
Regulados con base en la Sección 351 de la Ley PHS
361 productos
Regulados con base en el Título 21 del CFR 1271, Células, Tejidos y Productos Derivados de Células y Tejidos Humanos
BLA
Solicitud de Autorización para Productos Biológicos
CBER
Centro para la Evaluación e Investigación de Productos Biológicos
CDRH
Centro para Dispositivos y Salud Radiológica
BPF
Buenas Prácticas de Fabricación
GTP
Buenas Prácticas para Tejidos, Título 221 del CFR 1271, Células, Tejidos y Productos Derivados de Células y Tejidos Humanos
IDE
Exención de Investigación de Dispositivos. Una exención de investigación de dispositivos (IDE, por sus siglas en inglés) permite el uso del dispositivo bajo investigación en un estudio clínico a fin de recolectar datos de seguridad y eficacia requeridos para respaldar la solicitud de Aprobación Previa a la Comercialización (PA) o la entrega de una Notificación Previa a la Comercialización [51 O(k)] a la FDA.
Información General/ (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos 1035
USP 39
Tabla 4. Términos de Uso Frecuente en la Reglamentacion de Productos de Terapia Celular (Continuacion) DEFINICIÓN
TÉRMINO
IND
Nuevo Fármaco en Investigación (IND, por sus siglas en inglés). Un IND es una solicitud de autorización presentada ante la FDA para administrar un medicamento en investigación a humanos. Las reglamentaciones para IND se pueden encontrar en el Título 21 del CFR 312.
PMA
Aprobación Previa a la Comercialización
Tabla 5. Organizaciones para el Establecimiento de Normas para Productos de Terapia Celular
AABB
La AABB, anteriormente conocida como la American Association of Blood Banks (Asociación Estadounidense de Bancos de Sangre), es una asociación internacional que representa a individuos e instituciones implicadas en actividades relacionadas con la transfusión y las terapias celulares, incluyendo medicamentos de transplante.
http://www.aabb.org/
AATB
La American Association of Tissue Banks (Asociación Estadounidense de Bancos de Tejidos) es una organización educativa y científica, exenta de impuestos, que facilita el abastecimiento de tejidos transplantables de alta calidad para satisfacer las necesidades de la nación. La AATB publica normas para asegurar que las actividades de los bancos de tejidos cumplan con las normas aceptables de desempeño técnico y ético. La AATB lleva a cabo un programa de acreditación para establecimientos que recolectan, procesan, almacenan o distribuyen tejido humano para transplante. El personal del banco de tejidos se somete a un programa de certificación para asegurar que las actividades de bancos de tejidos se lleven a cabo de manera profesional, cumpliendo constantemente con las normas de la asociación.
http://www.aatb.org/
ASTM
La ASTM lnternational (ASTM), conocida originalmente como la American Society for Testing and Materials (Asociación Estadounidense para Análsis y Materiales), es una de las organizaciones voluntarias para el desarrollo de estándares más grandes del mundo y proporciona normas técnicas para materiales, productos, sistemas y servícios. Las normas de la ASTM lnternational se usan en la infraestructura de información que guía el diseño, la fabricación y la comercialización en la economía global.
http://www.astm.org/
FACT
La Foundation for the Accreditation of Cellular Therapy (Fundación para la Acreditación de Terapias Celulares) es una organización sin fines de lucro fundada conjuntamente por la lnternational Society for Cellular Therapy (Sociedad Internacional para Terapias Celulares o ISCT) y la American Society of Blood and Marrow Transplantation (Sociedad Estadounidense de Transplante De Médula y Sanguíneo o ASBMT) para la inspección y acreditación voluntaria en el campo de la terapia celular.
http://www.factwebsite.orq/
NMDP
El National Marrow Donor Program (Programa Nacional de Donantes de Médula) es una organización sin fines de lucro que opera el registro de donantes de células hematopoyéticas y de unidades sanguíneas de cordón umbilical, auspiciado por el gobierno federal, en los Estados Unidos.
http://www.nmdp.org/
ICCBBA
El lnternational Council for Commonality in Blood Banking Automation (Consejo lnternacional sobre Aspectos Comunes de Automatización de Bancos de Sangre) se estableció con el objetivo de implementar y gestionar la norma ISBT 128, un sistema de identificación, etiquetado y procesamiento de sangre, tejido y productos de terapia celular humanos que emplean un sistema internacionalmente normalizado.
http://www.iccbba.org/
GLOSARIO Aféresis: Procedimiento de extracción de sangre de un donante, retirando componentes seleccionados (p.ej., plaquetas o leucocitos) y retransfusión del remanente al donante. Agente Adventicio: Agente extraño que se introduce inadvertidamente; no es natural ni hereditario (como en la contaminación microbiana, química o bioquímica de una sustancia purificada). Alogénico: De un integrante no emparentado de la misma especie pero con un genotipo diferente. Anticuerpos Monoclonales: Anticuerpos derivados de un único don celular. Antígenos Leucocitarios Humanos (HLA, por sus siglas en inglés): Proteínas controladas por el complejo principal de histocompatibilidad. Estas proteínas tienen un papel preponderante en la determinación de la compatibilidad para trasplantes. Autólogo: Que se obtiene del organismo propio. Bioensayo: Medición de la efectividad de un compuesto por su efecto en animales o células en comparación con una preparación estándar. (Ver también Potencia.) Biotecnología: Toda técnica que utilice organismos vivos (o partes de estos) para producir o modificar productos, mejorar plantas o animales o desarrollar microorganismos para usos específicos. La definición más nueva se refiere al uso industrial y farmacéutico del ADN recombinante, fusión celular, nuevas técnicas de bioprocesamiento y terapia génica. BPFv: Abreviatura para Buenas Prácticas de Fabricación vigentes. CD34: Cúmulo del marcador 34 de la superficie celular. El CD34 es una proteína que distingue a las células madre y progenitoras de células sanguíneas más maduras. Célula Dendrítica: Célula que sensibiliza las células T a los antígenos.
1036 (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos/ Información General
USP 39
Célula Madre: Célula inmortal capaz de proliferar y diferenciarse en distintos tipos de células especializadas. Se supone que cada sistema de tejidos importante tiene su propia célula madre. Célula Progenitora: Célula madre o ancestral generalmente ya comprometida a diferenciarse en un tipo o linaje celular específico. Células Alimentadoras: Células usadas en cocultivo para mantener células madre pluripotentes. Para hESC, las capas alimentadoras típicas incluyen fibroblastos embrionarios de ratón o humanos tratados para evitar su división. Células Asesinas Naturales (Células NK): Linfocitos citotóxicos que constituyen un componente principal del sistema inmune innato. Células de la Médula Ósea: Una variedad de células indiferenciadas (células madre) y diferenciadas (linfocitos, granulocitos, eritrocitos y plaquetas) que se encuentran en las cavidades internas de los huesos o la médula ósea. Células de los Islotes: Células de los islotes fJ del páncreas que secretan insulina. Células Endoteliales: Células epiteliales de origen mesodérmico que recubren las cavidades internas del cuerpo como el corazón y los vasos sanguíneos y linfáticos. Células Epiteliales: Células del revestimiento de distintos órganos. Ejemplos: células epiteliales respiratorias, intestinales o vasculares. Células Madre de Sangre del Cordón Umbilical: Células madre obtenidas de la sangre que se conserva en la placenta y en el cordón umbilical que se mantienen unidos después del alumbramiento. Célula Madre Embrionaria Humana (hESC, por sus siglas en inglés): Célula madre derivada de la masa celular interna del blastocisto. Células Madre Hematopoyéticas: Células madre que dan origen a todos los leucocitos, eritrocitos y plaquetas. Células Madre Mesenquimales: Células madre multipotentes que pueden diferenciarse en una variedad de tipos de células. Células Madre Neuronales: Células madre encontradas en el tejido neuronal que pueden dar origen a neuronas y células gliales. Células No Diferenciadas: Células que no se han desarrollado en un tipo de célula o tejido especializado. Células Osteogénicas: Provenientes del hueso o que participan en el crecimiento o reparación ósea. Células Somáticas: Células que no son células germinales. Células T: Linfocitos que adquieren su repertorio de funciones y su capacidad de discriminación autóloga en el timo, y son responsables de la inmunidad mediada por células. Hay varios subgrupos de células T (células T colaboradoras, células T supresoras y células T citotóxicas). Citoquina: Todo factor que actúa sobre las células; por lo general, una proteína que favorece el crecimiento. Citoplasma: Material celular contenido entre la membrana celular y el núcleo. Citotóxico: Capaz de causar la muerte celular. Clasificador de Células Activado por Fluorescencia (FACS, por sus siglas en inglés): Equipo que clasifica células basándose en marcadores fluorescentes unidos a las células. Clonal: Genes, células u organismos enteros derivados de y genéticamente idénticos a un único gen, célula u organismo ancestral común. Colorante Supravital: Colorante que tiñe células vivas solamente. Condrocitos: Células que producen los componentes del cartílago. Cultivo en Suspensión: Células capaces de crecer en suspensión sin la necesidad de adherirse a un sustrato (soporte) para generar la división celular. Diferenciación: Proceso de cambios bioquímicos y estructurales mediante el cual las células adquieren forma y función especializadas. ELISA: Enzimoinmunoensayo. lnmunoensayo que utiliza un antígeno o anticuerpo marcado con una enzima para detectar la unión de una molécula a una matriz sólida. Enfermedad del Injerto Contra el Anfitrión: Rechazo del tejido transplantado por parte del anfitrión. Es la causa principal de muerte del paciente cuando se utiliza un tejido alogénico mal compatibilizado con el receptor. Ensayo Clonogénico: Procedimiento basado en la capacidad de producir un clon de células. Epidérmico: Perteneciente a la capa más externa y avascular de la piel, derivada del ectoderma embrionario. Ex Vivo: Procedimiento que se lleva a cabo fuera de un organismo vivo. Se refiere al procedimiento médico en el que un órgano, células o tejido se toman de un cuerpo vivo para un tratamiento o procedimiento y posteriormente se devuelven al cuerpo vivo. Exento de suero: Se refiere al medio de crecimiento celular que carece de componentes séricos. Factor Estimulante de Colonias de Granulocitos y Macrófagos (GM CSF, por sus siglas en inglés): Hormona natural que estimula la producción de leucocitos, especialmente granulocitos y monocitos. Factores de Crecimiento: Factores responsables de regular la proliferación, función y diferenciación celular. Fibroblastos: Células de tejido conectivo capaces de producir colágeno. Formulado: Preparado de acuerdo con condiciones o métodos prescritos. Granulocito: Uno de los tres tipos de leucocitos. Estas células digieren bacterias y otros parásitos. Hemacitómetro: Dispositivo usado para el recuento manual de células. Hematopoyético: Perteneciente o con influencia sobre la formación de células sanguíneas.
USP 39
Información General/ (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos 1037
Hepatocitos: Células predominantes del hígado, que cumplen una función importante en el metabolismo y son productoras de proteínas séricas. Por lo general, estas células no están en división pero si se dañan, se pueden dividir y regenerar hasta reponer las células dañadas. In Vivo: Procedimiento que se lleva a cabo dentro de un organismo vivo. In Vitro: En el laboratorio (fuera del organismo). Lo contrario de in vivo (en el organismo). Injerto: Proceso mediante el cual se implantan o trasplantan células, tejidos u órganos en otro organismo. Se refiere tanto a los procesos mecánicos como biológicos necesarios para obtener un injerto plenamente funcional. lnmunoensayo: Técnica para identificar sustancias basándose en el uso de anticuerpos. lnmunofluorescencia: Técnica que combina una estrategia de detección de anticuerpos con un marcador fluorescente para visualización que por lo general se usa en combinación con la clasificación de células por microscopía o activación por fluorescencia. lnmunogénico: Sustancia capaz de inducir una respuesta inmunitaria; una forma de antígeno que induce una respuesta inmunitaria, contrario a un tolerógeno, que induce tolerancia. Linaje (Células Progenitoras Comprometidas, Células Diferenciadas): Vía específica de diferenciación celular que se puede rastrear hasta una célula única de origen. Líneas Celulares: Células que derivan de cultivos primarios de embriones, tejido u órganos. Estas líneas celulares pueden tener una vida finita o pueden inmortalizarse (modificadas para replicarlas indefinidamente). Linfocitos B (Células B): Una clase de linfocitos provenientes de la médula ósea que producen anticuerpos. Macrófago: Cualquiera de las diversas formas de fagocitos mononucleares que se encuentran en los tejidos y que surgen de las células madre hematopoyéticas en la médula ósea. Materiales auxiliares: Componentes usados durante la fabricación que no deben estar presentes en el producto final. Ejemplos: factores de crecimiento, citoquinas, anticuerpos monoclonales, dispositivos de separación de células y componentes de medios. Medicina Regenerativa: Campo interdisciplinario de investigación y aplicaciones clínicas emergente que se centra en la reparación, reemplazo o regeneración de células, tejidos u órganos para restaurar funciones deficientes usando una combinación de métodologías que incluyen, de manera enunciativa mas no limitativa, el uso de moléculas solubles, terapia génica, transplante de células madre, ingeniería tisular y reprogramación de tipos de células y tejidos. Medio de Cultivo: Líquido que cubre las células en un vaso de cultivo y que contiene ingredientes para nutrir y sustentar las células. El medio de cultivo también puede incluir factores de crecimiento que se agregan para producir cambios deseados en las células. Miocitos: Células fundamentales del tejido muscular. Células blanco para la inserción de genes que codifican proteínas secretoras. Pasaje: Proceso en el que las células son desasociadas, lavadas y sembradas en nuevos cultivos después de una ronda de crecimiento y proliferación celular. El número de pasajes es una buena indicación de la edad de los cultivos y de la estabilidad esperada. Potencia: Medición cuantitativa de la actividad biológica basada en el atributo del producto vinculado a las propiedades biológicas relevantes. Producto Biológico: Cualquier virus, suero terapéutico, toxina, antitoxina o producto análogo aplicable a la prevención, tratamiento o cura de enfermedades o lesiones en humanos. (El término producto análogo indica que incluye esencialmente productos obtenidos por biotecnología y procedimientos que incluyen terapia génica, productos transgénicos y terapia celular somática.) Productos de Combinación: Productos terapéuticos que combinan fármacos, dispositivos y/o productos biológicos. Queratinocitos: Células epidérmicas diferenciadas que constituyen la capa superior de las células de la piel. Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés)-Técnica para amplificar una secuencia específica de nucleótidos de ADN o ARN mediante ciclos de copiado que utilizan polimerasa, dando como resultado incrementos geométricos en el número de copias. Terapia Celular: Terapia que utiliza células completas para tratar una enfermedad, afección o lesión. Transplante de Médula Ósea: Transplante de células de la médula ósea capaces de mantener las funciones hematológicas indefinidamente. Técnica empleada en el tratamiento de trastornos inmunitarios (deficiencias inmunitarias combinadas graves, tales como la deficiencia de ADA), trastornos hematológicos (anemia), metabólicos (enfermedad de Gaucher) y enfermedades malignas (leucemia, linfoma o tumor sólido). Validación del Proceso: Método para suministrar documentación probatoria de que el proceso de fabricación está controlado, es reproducible y capaz de generar uniformemente un producto que cumple con especificaciones predeterminadas. Xenogénico: De una especie diferente. Xenotransplante: Transplante de órganos de una especie a otra (por ejemplo, de cerdos a seres humanos).
1038 (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos/ Información General
USP 39
APÉNDICE Lista de Referencias Reglamentarias Pertinentes Las terapias celulares y los componentes de las terapias celulares están reglamentados por la FDA como productos biológicos. Los requisitos generales se listan en la legislación nacional y en las guías internacionales. En los Estados Unidos, los requisitos nacionales se codifican en diferentes secciones del Título 21 del CFR, mientras que los documentos guía de la FDA proporcionan recomendaciones adicionales. Los documentos guía internacionales se encuentran disponibles en la ICH, en la European Agency of Medicines (Agencia Europea de Medicamentos o EMA) y en la Organización Mundial de la Salud (OMS). Aunque el presente capítulo general hace una buena referencia a los documentos guía de la ICH, no ocurre lo mismo con los documentos de la OMS y de la EMEA, por lo que se recomienda a los fabricantes de productos derivados de células y tejidos destinados a mercados fuera de los Estados Unidos referirse a las pautas pertinentes de las naciones correspondientes. De manera complementaria a los capítulos de USP referidos en este capítulo, la siguiente lista incluye documentos reglamentarios y las mejores prácticas de desarrollo de productos y procesos, fabricación, control de calidad y garantía de calidad: Código de Reglamentos Federales (CFR) •Título 21 del CFR 201.56-57 •Título 21 del 21 O •Título 21 del CFR 211 •Título 21 del CFR 600.3 •Título 21 del CFR 601 •Título 21 del CFR 61 O • Título 21 del CFR 820 •Título 21 del CFR 1271 • Título 21 del CFR 46 Documentos Guía de la FDA • Draft Guidance far FDA Reviewers and Sponsors: Content and Review of Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) lnformation far Human Somatic Cel/ Therapy lnvestigational New Drug Applications (INDs) • Draft Guidance far lndustry: Potency Tests far Cellular and Gene Therapy Products •Draft Guidance far lndustry: Current Good Tissue Practice (cGTP) and Additional Requirements far Manufacturers of Human Ce/Is, Tissues, and Cellular and Tissue-Based Products (HCT/Ps) • Guidance far lndustry: Eligibility Determination far Donors of Human Ce/Is, Tissues, and Cellular and Tissue-Based Products (HCT/Ps), February 2007. http://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatorylnformation/
Guidances/Tissue/ucm073964.htm • Guidance far lndustry: Source Animal, Product, Preclinical, and Clínica/ /ssues Concerning the Use of Xenotransplantation Products in Humans, April 2003. http://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatorylnformation/
Guidances/Xenotransplantation/ucm074354.htm • PHS Guideline on lnfectious Disease /ssues in Xenotransplantation, january 2001. http://www.fda.gov/BiologicsBloodVacci-
nes/GuidanceComplianceRegulatorylnformation/Guidances/Xenotransplantation/ucm074727.htm • Guidance far lndustry: /nvestigating Out-of-Specification (005) Test Resu/ts far Pharmaceutical Production, October 2006.
www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatorylnformation/Guidances/UCM070287.pdf • Guidance far lndustry: Validation of Growth-Based Rapid Microbiological Methods far Sterility Testing of Cellular and Gene-Therapy Products, CBER, 2008. http://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatorylnformation/
Guidances/CellularandGeneTherapy/ucm072612.htm • FDA Blue Book G95-l, http://www.fda.gov/MedicalDevices/DeviceRegulationandGuidance/GuidanceDocuments/ ucm080735.htm Documentos Reglamentarios Nacionales e Internacionales • The United States Consensus Standard for the Uniform Labeling of Cellular Therapy Products using ISBT 128, disponible en: http://www.iccbba.org/usconsensusstandard_cellulartherapy. pdf • ISO 10993-1 :2003, Biological evaluation of medical devices-Part 1: Evaluation and testing, disponible en: http:// www.iso.org • ICH Q2(Rl ): Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology, disponible en: http://www.ich.org • ICH Q5C: Quality of Biotechnological Products: Stability Testing of Biotechnological/Biological Products, disponible en: http://www.ich.org • ICH Q6B: Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products, disponible en: http://www.ich.org • ICH Q9: Quality Risk Management, disponible en: http://www.ich.org • Naming Scheme for Cell Therapies by the United States Adopted Names (USAN) Council, available at: http://www.amaassn.org/ • Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Research Council, 1996), disponible en: http:// www.nap.edu/
Información General/ (1047) Productos de Terapia Génica 1039
USP 39
(1047) PRODUCTOS DE TERAPIA GÉNICA INTRODUCCIÓN Los productos de terapia génica permiten la administración de ácidos nucleicos para modificar el material genético de las células. Los productos de terapia génica son ampliamente clasificables con base en la metodología de administración e incluyen lo siguiente: (1) vectores virales [virus que transportan los genes de interés pero, generalmente, sin el mecanismo de autorreplicación in vivo]; (2) ácidos nucleicos en una formulación simple (ADN desnudo); y (3) ácidos nucleicos formulados con agentes tales como los liposomas, que mejoran su capacidad para penetrar en la célula. Cuando la introducción del ácido nucleico se lleva a cabo ex vivo, la población de células que se administra se convierte en el producto de terapia génica. Las pautas específicas para la fabricación, el procesamiento, la caracterización y la administración de productos derivados de células se proporcionan en el capítulo Productos Derivados de Células y Tejidos (l 046). La toma de decisiones con respecto a un vector génico puede ser compleja (ver Consideraciones de Diseño para Vectores Génicos en Fabricación de Productos de Terapia Génica). Los virus más comúnmente utilizados incluyen retrovirus murinos, adenovirus humanos y virus humanos asociados a adenovirus (VAA). La definición de terapia génica de este capítulo considera inherentemente que la administración de ácidos nucleicos mediante transducción se expresa como ARN y posteriormente como proteína. En la Tabla 7 se incluyen ejemplos de productos de terapia génica. Tabla 1. Ejemplos de Productos de Terapia Génica Categorías o Estrategias
Indicación: Producto Administrado
Reemplazo de genes Corto plazo Largo plazo
Enfermedad cardiovascular: vector de factor de crecimiento en un andamiaje biocompatibleª Fibrosis quística: vector para la regulación de la conductancia transmembrana Hemofilia: vector para el factor VIII ó IX
Destrucción directa de células
Cáncer: virus oncolíticos recombinantes
Inmunoterapia
Cáncer: células tumorales autólogas, transducidas con genes para citoquinas u otros genes inmunomoduladores; linfocitos transducidos con receptores para antígenos tumorales Artritis: linfocitos autólogos modificados genéticamente
Genes condicionalmente letalesb
Cáncer (tumor sólido): vector que inserta el gen de timidina quinasa (TK) o citosina desaminasa (CD) en las células tumorales Enfermedad del injerto contra el anfitrión (GVHD, por sus siglas en inglés): Vector que transduce el gen de TK o CD en las células T de donantes
Alteración del gen mediante ARN antisentidos, ribozimas y ARN inhibitorios expresados mediante un vector
Cáncer: vector con antioncogen Retinitis por citomegalovirus: vector antiviral Virus de inmunodeficiencia humana (VIH): linfocitos autólogos transducidos con vector con ribozima antiviral
lntracuerpos
Cáncer o VIH: vector que codifica anticuerpo monocatenario contra una proteína tumoral o viral, respectivamente
ª Este producto favorece la formación de nuevos vasos sanguíneos. b Las células con genes condicionalmente letales, así como sus células vecinas, se destruyen después de la administración de un segundo fármaco in vivo. Para la timidina quinasa (TK, por sus siglas en inglés), el fármaco es ganciclovir. Para la citosina desaminasa (CD, por sus siglas en inglés), el fármaco es 5-fluorocitosina.
PROPÓSITO V ORGANIZACIÓN DEL CAPÍTULO Los usos clínicos de los productos de terapia génica, sus procesos de fabricación y los esquemas analíticos para determinar la identidad, dosis, potencia, pureza y seguridad están evolucionando a gran velocidad y son tan diversos como los productos mismos. Este capítulo sintetiza las mejores prácticas vigentes y cuestiones inherentes a la fabricación, pruebas y administración de productos de terapia génica. Por lo general, los capítulos de USP se concentran en los materiales disponibles comercialmente. Sin embargo, este capítulo no solamente analiza productos con aplicaciones comerciales, sino que también está dirigido a la producción de materiales para ensayos clínicos. Cuando usan diferentes enfoques para el material utilizado en ensayos clínicos, en comparación con aquellos utilizados en productos comerciales, así se indica. Cuando resulte apropiado, se hace referencia a las pautas aplicables incluyendo las pautas de calidad de la lnternational Conference on Harmonization (Conferencia Internacional de Armonización, ICH) debido a que los principios aplican incluso si los productos de terapia génica estuvieran fuera del alcance oficial. El Apéndice presenta una lista de documentos reglamentarios y guías aplicables a la terapia génica, a la par de una lista de términos de uso común en el campo de la terapia génica. La perspectiva farmacopeica tradicional es desarrollar normas públicas que puedan aplicarse a un producto final en particular sin proporcionar detalles de la producción. Este capítulo tiene como propósito identificar las situaciones en las que se pueden adaptar las metodologías o normas tradicionales. La amplitud de este capítulo se deriva de la diversidad de los productos y de las consideraciones especiales que requieren. La fabricación se ha dividido en dos secciones: la primera analiza los aspectos generales de la fabricación y del desarrollo del proceso, mientras que la segunda analiza el diseño de vectores y temas sobre clases específicas. La Preparación y Administración In Situ aparece después de las secciones sobre fabricación, ya que el manejo de estos productos en la clínica requiere una infraes-
USP 39
1040 (1047) Productos de Terapia Génica / Información General
tructura y experiencia profesional que no se encuentran comúnmente en un hospital convencional. Las otras secciones relacionadas con la fabricación incluyen: Métodos Analíticos; Estabilidad; Almacenamiento y Transporte; y Etiquetado. La sección Reglamentaciones y Normas resume las pautas existentes y resalta la necesidad de desarrollar y validar nuevas metodologías para evaluar la calidad del producto. El Glosario de Términos presenta y define los términos y abreviaturas usados en este capítulo y aquellos usados comúnmente en este campo.
ASPECTOS GENERALES DE LA FABRICACIÓN
Introducción La fabricación de productos de terapia génica se ha dividido en dos secciones. Esta sección, Aspectos Generales de la Fabricación, analiza cinco temas que se aplican a la fabricación de todos los productos de terapia génica: (1) materias primas, (2) caracterización de materiales de bancos, (3) controles durante el proceso, (4) especificaciones y (5) validación. La segunda sección, Fabricación de Productos de Terapia Génica, trata la fabricación de vectores de terapia génica, tanto virales como no virales, y analiza en detalle el diseño de vectores génicos. Todos los principios generales de las buenas prácticas de fabricación vigentes (BPFv) establecidas por la FDA en el Título 21 del CFR 21 O, 211, 600s (en especial el Título 21 del CFR 61 O) y 820, y en otros capítulos de USP aplican a la fabricación de productos de terapia génica. Las instalaciones, equipos y procesos de fabricación, al igual que las materias primas, sistemas de calidad y personal capacitado son algunos de los elementos fundamentales de las BPFv. Las BPFv aplican durante todo el desarrollo clínico. Por lo regular, el nivel de control aumenta a medida que avanza el desarrollo clínico y, para el momento de iniciar la fabricación como respaldo de la Fase 111 de los ensayos clínicos, se espera un cumplimiento total de las BPFv. Las instalaciones y el equipo deben diseñarse, edificarse y validarse cuidadosamente para sustentar el proceso de fabricación y para mantener la segregación requerida del producto/instalación. El mantenimiento preventivo y la calibración se deben llevar a cabo de manera rutinaria en el equipo crítico. Las incubadoras, biorreactores y congeladores deben contar con sistemas de alarma capaces de emitir señales de falla de manera remota. Se deben establecer sistemas de calidad para garantizar que la fabricación sea uniforme y controlada. Los sistemas incluyen, de manera enunciativa mas no limitativa, lo siguiente: control de cambios, control de documentos, monitoreo del medio ambiente, capacitación, planes maestros de validación, análisis y liberación de materias primas, aprobación de proveedores, análisis y liberación de productos, pruebas de estabilidad y acción correctiva/ preventiva (CAPA, por sus siglas en inglés).
Materiales Auxiliares Se puede utilizar una amplia variedad de materias primas, incluyendo materiales auxiliares, en la fabricación de los productos. Las materias primas pueden incluir sustancias complejas tales como células, tejidos, fluidos biológicos, factores de crecimiento y anticuerpos monoclonales. Algunos de estos materiales pueden mantenerse en el producto terapéutico final como sustancias activas, crioconservantes o excipientes. Un material auxiliar tiene un efecto sobre el material terapéutico (por ejemplo, una citoquina puede activar una población de células) pero no está destinado a estar presente en el producto terapéutico final. La calidad de las materias primas usadas en la elaboración de un producto de terapia génica puede influir en la seguridad, potencia y pureza del producto. Por lo tanto, es necesario calificar este tipo de materiales para garantizar la uniformidad y la calidad de todos los productos de terapia génica. Las actividades relacionadas con la calificación de materias primas cambiarán a medida que los productos avancen por las diferentes etapas de desarrollo clínico hacia la obtención de la autorización y su comercialización. La amplitud de un programa de calificación bien diseñado se extiende a medida que progresa el desarrollo del producto. Un programa de calificación de materias primas utilizadas en la fabricación de productos de terapia génica debe tratar cada una de las siguientes áreas: (1) identificación y selección, (2) aptitud para uso, (3) caracterización, (4) componentes derivados de animales y (5) garantía de calidad. Se debe considerar para todas las materias primas el momento y la etapa en la que se usa cada una dentro del proceso de fabricación debido a que puede ser útil para definir criterios de selección. Se debe consultar el capítulo de USP, Materiales Auxiliares para Productos Celulares, Génicos y de Ingeniería Tisular (1043), para información específica sobre la implementación de un programa de calificación apropiado para estos materiales. Otros capítulos de USP proveen información que se debe tomar en cuenta con respecto a la calificación y normas de materiales auxiliares específicos (p.ej., Suero Bovino (1024), Suero Fetal Bovino-Atributos de Calidad y Pruebas de Funcionalidad (90) y Factores de Crecimiento
y Citoquinas
Usados en la Fabricación de Productos de Terapia Celular(92)).
Caracterización de Bancos de Células
y de Virus
BANCOS DE CÉLULAS Un banco de células es un conjunto de viales que contienen células almacenadas en condiciones definidas, con una composición uniforme y obtenidas a partir de células combinadas derivadas de un único clon celular. El sistema de bancos de células, por lo general, se compone de un banco maestro de células (MCB, por sus siglas en inglés) y un banco de células de trabajo (WCB, por sus siglas en inglés), aunque existen otras categorizaciones posibles. El MCB se produce de acuerdo con las BPFv y,
USP 39
Información General/ (1047) Productos de Terapia Génica 1041
preferentemente, se obtiene de una fuente repositoria calificada (exenta de agentes adventicios) con antecedentes conocidos y documentados. El WCB se obtiene o produce mediante la expansión de uno o más viales del MCB. El WCB, o el MCB en los ensayos iniciales, se transforma en la fuente de células para cada partida producida para uso humano. Los sistemas de bancos de células contribuyen en gran medida a la uniformidad en la elaboración de partidas de productos clínicos o autorizados, debido a que el material celular inicial es siempre el mismo. Los bancos de células usados para la preparación de bancos de virus o del producto clínico se deben caracterizar adecuadamente antes de su uso. Los aspectos relacionados con la elaboración de bancos de células y su validación se analizan en los capítulos Productos Derivados de Células y Tejidos (1046), Calidad de Productos Biotecnológicos: Análisis de la Construcción Expresable en Células Usadas para la Producción de Productos Proteínicos Obtenidos con ADN Recombinante (1 048) y Evaluación de la Seguridad Viral en Productos Biotecnológicos Obtenidos de Líneas Celulares de Origen Humano o Animal (1050). BANCOS DE VIRUS El banco de virus maestro (MVB, por sus siglas en inglés) es similar al concepto del MCB puesto que se deriva de un ciclo de producción único y su composición es uniforme. El banco de virus de trabajo (WVB, por sus siglas en inglés) deriva directamente del MVB. Tal como sucede con los bancos de células, el propósito de un banco de virus es contar con una fuente de virus uniforme, libre de agentes adventicios, para su uso en la producción de partidas clínicas o de productos. De acuerdo con las reglamentaciones de las BPFv, las pruebas para los bancos de células que se utilizarán en la producción de bancos de virus, incluidas las pruebas de garantía de calidad, deben completarse antes de usar este banco de células para la producción de bancos de virus. CALIFICACIÓN La caracterización de los bancos de células y de virus es un paso importante para la obtención de un producto final uniforme, manteniendo la coherencia entre lotes y la ausencia de agentes adventicios. Las pruebas para calificar los MCB o MVB se realizan una vez y se pueden hacer con una alícuota del material del banco o con cultivos de células derivados del banco de células. Se deben establecer especificaciones para la calificación del MCB o MVB. Es importante documentar el historial del MCB o MVB, los métodos y reactivos empleados para crear el banco y las condiciones de almacenamiento. Todas las materias primas requeridas para la producción de los bancos-los medios, los sueros, la tripsina y similares-también deben someterse a pruebas para descartar la presencia de agentes adventicios. CALIFICACIÓN DEL BANCO MAESTRO DE CÉLULAS La Guidance for lndustry: Human Somatic Ce// Therapy and Gene Therapy (Guía para la Industria: Terapia Celular Somática Humana y Terapia Génica) de la FDA (marzo 1998) proporciona recomendaciones específicas para la calificación de los MCB. El documento ICH QSD ofrece pautas adicionales. Se requiere de una descripción e historial de la línea celular, junto con una descripción del proceso de congelamiento, condiciones de almacenamiento y número de viales preparados. La identidad de las células debe analizarse usando marcadores genotípicos y/o fenotípicos. Para MCB que contienen secuencias de vectores, se debe demostrar la presencia y la integridad del vector usando ensayos moleculares (mapeo de endonucleasa de restricción y/o secuenciación de ácidos nucleicos) y/o medición de expresión génica del vector. La pureza se debe analizar para determinar la ausencia de contaminación bacteriana, micoplásmica, fúngica y viral (diferentes a las secuencias de vectores). La ausencia de virus adventicios debe comprobarse utilizando pruebas de virus tanto in vitro como in vivo y pruebas adecuadas específicas para la especie, como la prueba de producción de anticuerpos murinos (MAP, por sus siglas en inglés). Se debe poner especial atención a la detección del virus competente para la replicación (VCR) que surge de la recombinación del vector y las secuencias virales. El MCB se califica adicionalmente llevando a cabo pruebas en células (obtenidas del MCB o del WCB) expandidas hasta el límite de la edad celular para producción in vitro. CALIFICACIÓN DEL BANCO DE VIRUS MAESTRO Las pruebas para el MVB son similares a las del MCB y deben incluir pruebas para determinar la ausencia de agentes adventicios en general (tales como bacterias, hongos, micoplasmas o virus) y para organismos específicos de la línea celular de producción, incluyendo VCR. Las pruebas de identidad del MVB deben establecer las propiedades del virus y la estabilidad de estas propiedades durante la fabricación. CALIFICACIÓN DE BANCO DE CÉLULAS O DE VIRUS DE TRABAJO La caracterización del WCB o del WVB generalmente es menos exhaustiva y requiere lo siguiente: (1) pruebas para determinar la ausencia de agentes adventicios que puedan haber sido introducidos durante la elaboración del WCB, (2) pruebas para determinar la presencia de VCR, si corresponde, (3) pruebas de identidad de rutina para verificar la contaminación cruzada de la línea celular y (4) demostración de que las alícuotas pueden ser utilizadas sistemáticamente para la elaboración del producto
1042 (1047) Productos de Terapia Génica / Información General
USP 39
final. Con esto se asume que el WCB y el WVB se prepararon en un ambiente controlado usando medios y equipos analizados adecuadamente para determinar la ausencia de agentes adventicios. En caso contrario, es necesario realizar pruebas de liberación adicionales.
Controles Durante el Proceso Los procesos de fabricación deben incluir criterios bien definidos para decidir si se avanza o no se avanza, que se aplican a los productos intermedios clave del proceso y se utilizan para combinar el material que ha atravesado una etapa del proceso en varios sublotes. La calidad debe incorporarse al producto además de probarse durante la liberación de la partida. Los controles en proceso son valoraciones o pruebas realizadas para garantizar que la calidad y la cantidad del producto intermedio en proceso sean suficientes para fabricar un producto final de buena calidad. En la Tabla 2 se incluyen ejemplos de controles durante el proceso. Los controles durante el proceso se realizan principalmente para asegurar la obtención del producto correcto con la calidad y el rendimiento previstos. El material intermedio del proceso que no cumple con los criterios de control durante el proceso no debe usarse para la fabricación adicional. Este material se puede reprocesar cuando se cuenta con procedimientos para tales actividades. El material reprocesado debe cumplir con las especificaciones de proceso originales antes de que pueda usarse para fabricación adicional. Si se van a combinar varios sublotes para procesamiento adicional, los sublotes que no cumplan con los criterios no se podrán incluir, aún si la combinación que contiene esos sublotes cumpliera con los criterios de los ensayos de proceso. Durante el desarrollo clínico, los ensayos de calidad y rendimiento del producto se deben efectuar después de la mayoría de los pasos del procesamiento a efectos de determinar cuáles son los pasos críticos y cuáles los ensayos más sensibles a desviaciones del proceso. La información así obtenida también se utiliza para establecer los criterios para los ensayos seleccionados. Los controles de proceso se realizan para la validación completa de los procesos y para asegurar que continúen bajo control. Los resultados de estos ensayos deben someterse a un análisis de tendencia y se deben tomar medidas para corregir los problemas cuando éstos surjan. Tabla 2. Ejemplos de Aplicaciones de Controles Durante el Proceso Tipo de Producto
Atributo a Controlar
Terapia génica viral
Cantidad de virus después del cultivo del virus Actividad específica de virus en fracciones obtenidas después de una cromatografía en columna Cantidad de ADN de células anfitrionas en fracciones obtenidas después de una cromatografía en columna
Terapia génica no viral
Densidad óptica o cambio en el consumo de oxígeno durante el cultivo Cantidad y forma de plásmido antes de la recolección del cultivo Cantidad y forma de plásmido después de las etapas de extracción Cantidad de pirógenos o endotoxinas después de las etapas de extracción en la combinación de plásmidos
Especificaciones La selección de especificaciones para un producto de terapia génica debe centrarse en garantizar la seguridad y eficacia del producto antes de su uso. Las pruebas seleccionadas deben ser específicas para cada producto y deben contar con criterios de aceptación adecuados a fin de garantizar parámetros de calidad uniformes y dentro de los niveles aceptables de variación biológica, pérdida de actividad, cambios fisicoquímicos o degradación durante la vida útil del producto. El desarrollo y el establecimiento de especificaciones para productos celulares y génicos deben respetar los principios descritos en el documento ICH Q6B y deben cumplir con lo establecido en la Guidance far FDA Reviewers and Sponsors: Content and Review of Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) lnfarmation far Human Gene Therapy lnvestigational New Drug Applications (/NDs) (Guía para Revisores y Auspiciadores de la FDA: Contenido y Revisión de Información Química, de Fabricación y Control (CMC, por sus siglas en inglés) para Nuevas Aplicaciones Farmacológicas lnvestigativas (IND, por sus siglas en inglés) de Terapia Génica en Humanos) de la FDA. El establecimiento de especificaciones para un fármaco y medicamento forma parte de una estrategia general de control de fabricación que incluye el control de materias primas, excipientes y bancos de células y virus; análisis durante el proceso; evaluación y validación del proceso; pruebas de estabilidad; y análisis de uniformidad de lotes. Al combinarse estos elementos se tiene la garantía de que el proceso está controlado y que se mantienen los atributos clave de calidad del producto. Las especificaciones adecuadas se establecen a partir de una caracterización minuciosa del producto durante la fase de desarrollo y de la comprensión del proceso y su capacidad. La caracterización incluye mediciones de las propiedades fisicoquímicas, la seguridad, la pureza, las impurezas derivadas del proceso y del producto, la potencia, la viabilidad, la esterilidad y la cantidad. Las especificaciones para cada producto y sus ingredientes se deben desarrollar a partir de esta información mediante la aplicación de métodos estadísticos apropiados. La información debe incluir lotes utilizados en estudios preclínicos y clínicos, además de datos de validación de procesos y valoraciones, que pueden guardar correlación con las evaluaciones de seguridad y eficacia. Las especificaciones deben incluir las variabilidades inherentes mostradas por el proceso de producción y las valoraciones. Para estos tipos de productos, puede ser necesario volver a examinar algunas de las especificaciones de liberación de lotes que por lo general se aplican a productos biológicos.
USP 39
Información General/ (1047) Productos de Terapia Génica 1043
Los procedimientos en una especificación para el producto se sustentan mediante estándares de referencia apropiados. El estándar de referencia para el producto garantiza que éste último, según lo determinado por los ensayos de liberación, no cambie significativamente con el tiempo. El estándar de referencia se fabrica usando el mismo proceso que para la producción clínica y se somete a todas las pruebas durante el proceso y de liberación final. Asimismo, el estándar de referencia se somete a caracterización adicional que no se lleva a cabo comúnmente como parte de la liberación del lote. El estándar de referencia no requiere ser almacenado en la misma dosis, formulación o temperatura que el producto, aunque es necesario determinar su estabilidad. El estándar de referencia verifica que una prueba produzca resultados aceptables (que cumpla con las pruebas de aptitud del sistema). Es posible usar un estándar de valoración específico (estándar de trabajo) en la prueba; sin embargo, debe calibrarse en función del estándar de referencia y su comportamiento debe ser similar. El cambio a un nuevo estándar (lote) de referencia debe incluir muchas pruebas y todas ellas se deben realizar paralelamente al estándar de referencia existente. Se debe evaluar cuidadosamente el impacto de cualquier cambio en las propiedades del nuevo estándar de referencia antes de ser adoptado. Pueden ser necesarias especificaciones adicionales para producir un producto de terapia génica seguro y efectivo. Dichas especificaciones pueden relacionarse con algunos de los controles y límites de acción usados para mantener los estándares y la uniformidad de materias primas, excipientes y del proceso de fabricación (ver Materiales Auxiliares y Controles Durante el Proceso). Se deben establecer especificaciones para permitir la aceptación de las materias primas y excipientes utilizados en la formulación final del producto. Asimismo, deben realizarse pruebas en las etapas de fabricación que requieren tomar decisiones críticas o en etapas en las que la información obtenida sirve para confirmar la uniformidad del proceso. Deben establecerse especificaciones de liberación para cada control del proceso. La heterogeneidad puede resultar del proceso de fabricación o almacenamiento del producto. Por lo tanto, el fabricante debe definir el patrón de heterogeneidad dentro del producto y debe establecer límites que mantengan la eficacia terapéutica y la seguridad del producto. En algunos casos, se pueden establecer especificaciones para liberación del lote así como para la vida útil. Conforme a lo analizado en el documento ICH Q5C y en el capítulo Calidad de Productos Biotecnológicos: Pruebas de Estabilidad de Productos Biqtecnológicos o Biológicos (1049), el uso de diferentes especificaciones se debe respaldar con información suficiente para demostrar que el rendimiento clínico no resulta afectado. Los criterios de aceptación se deben establecer y justificar a partir de los datos obtenidos de lotes usados en estudios preclínícos y clínicos, y de lotes utilizados para demostrar la uniformidad en la fabricación, y a partir de datos de desarrollo pertinentes, como los surgidos de procedimientos analíticos validados y estudios de estabilidad. Los criterios de aceptación se deben correlacionar con evaluaciones de seguridad y eficacia. Una vez que se han establecido las especificaciones, los resultados de prueba deben someterse a un análisis de tendencias. Los resultados fuera de especificación (OOS, por sus siglas en inglés)-o incluso aquéllos que están fuera de la tendenciadeben ser investigados antes de considerar el material para procesamiento adicional. El objeto de esta investigación es determinar la causa del resultado discordante. El documento Guidance far lndustry: lnvestigating Out of Specification (OOS) Test Results far Pharmaceutical Production [Guía para la Industria: Investigación de Resultados de Pruebas Fuera de Especificación en la Producción Farmacéutica] de la FDA ofrece un enfoque sistemático para llevar a cabo una investigación. Un resultado de ensayo puede rechazarse cuando se confirma que se ha presentado un error, tal como un error del analista, de cálculo o fallo del equipo. Si la investigación determina que el producto está fuera de la especificación, el lote debe ser rechazado. En situaciones excepcionales, es posible que se deba administrar a un paciente un producto que no cumpla con todas las especificaciones. No obstante, deben existir procedimientos establecidos para la comunicación de los resultados OOS al médico o a la persona responsable de decidir sí se utiliza o no el producto, y para dar indicaciones sobre pruebas de seguimiento, monitoreo del paciente y comunicación de dichos resultados.
Consideraciones de Validación El potencial para producir una amplía variación biológica en productos de terapia génica, particularmente en tratamientos para pacientes específicos, afecta el proceso de validación. No obstante, los principios básicos de validación del proceso para cualquier producto biológico, incluidas las recomendaciones de la ICH, de los documentos guía de la FDA, de los capítulos Validación de Procedimientos Farmacopeicos (1225) y Validación de Recuperación Microbiana de Artículos Farmacopeicos (1227), aplican a la validación de la mayoría de los productos de terapia génica. Las pautas para la validación de vacunas virales pueden ser pertinentes para los procesos de terapia génica que producen vectores virales. Las etapas de retención en un proceso de fabricación deben ser validadas para garantizar que los productos intermedios del proceso estén dentro de la especificación y que sea posible mantener los atributos de calidad del producto final. Es necesario validar los ensayos de liberación del producto antes de producir los materiales para los ensayos clínicos clave de la Fase 111. La validación del proceso demuestra que las operaciones unitarias del proceso de fabricación se llevan a cabo de manera uniforme y pueden generar un producto de calidad que cumpla con las especificaciones. Debido a que los procesos biológicos son propensos a variaciones, la uniformidad y robustez del proceso de fabricación deben determinarse validando el proceso en al menos tres lotes. Los aspectos relacionados con la validación del proceso relevantes para los productos derivados de células se tratan en el capítulo (1046). Siempre que sea posible, se debe validar el proceso con respecto a la depuración del virus de acuerdo con los principios discutidos en el documento ICH QSA. Si lo anterior se complica debido a la naturaleza del vector para terapia génica (p.ej. virus con envoltura), se debe considerar la caracterización adicional de células y componentes derivados de anímales usados en el proceso de producción. Cuando el producto de terapia génica se elabora en una instalación en la que se fabrican productos
1044 (1047) Productos de Terapia Génica / Información General
USP 39
múltiples, se debe validar la limpieza del equipo y de los cuartos para productos múltiples, a fin de demostrar la efectividad de los agentes de limpieza para inactivar o eliminar virus.
FABRICACIÓN DE PRODUCTOS DE TERAPIA GÉNICA Introducción Los principios de fabricación de productos farmacéuticos o biológicos también son pertinentes al desarrollo de vectores de terapia génica para uso en seres humanos. Se aplican los mismos requisitos de la BPFv para garantizar la administración al paciente de un producto de alta calidad. Debido a la naturaleza de los sistemas de fabricación de productos de terapia génica, la mayoría de los fabricantes se enfrentan con problemas de desarrollo tales como la capacidad de producción en escala, el rendimiento, la rentabilidad y la estabilidad del producto. La mayoría de los vectores para terapia génica se producen únicamente en partidas relativamente pequeñas, necesarias para satisfacer las necesidades de los ensayos clínicos iniciales que se llevan a cabo en un pequeño número de pacientes. No obstante, la promisoria aplicación de terapia génica en poblaciones más grandes de pacientes ha generado el progreso de la producción a escala y de la tecnología de purificación. Esta sección se enfoca en el diseño de vectores para terapia génica, así como en la selección de tecnologías de producción adecuadas.
Consideraciones de Diseño para Vectores Génicos TIPOS DE VECTORES Un vector de terapia génica por lo general consta de: (1) el esqueleto del vector; (2) un promotor; (3) el gen terapéutico, ya sea como ADNc o secuencia genómica; y (4) una señal de poliadenilación. Se ha desarrollado una amplia variedad de virusincluidos los retrovirus murinos y humano, adenovirus, parvovirus tales como el VAA, virus del herpes, poxvirus, virus toga y sistemas de terapia con plasmidos no virales- para aplicaciones de terapia génica. Estos vectores (ver la Tabla 3) tienen capacidades muy diferentes en lo que respecta al transporte de material genético y la duración de la expresión. Algunos vectores virales se dirigen, por preferencia, a células en división, mientras que otros son capaces de transducir células en división o células que no están en división. Existen algunas variaciones importantes en la capacidad transgénica (es decir, se presentan limitaciones en cuanto al tamaño del fragmento extraño de ADN que se puede incorporar al genoma del vector). La magnitud, el momento y la duración de la expresión génica requeridos para un producto de terapia génica dependen de la indicación clínica. Para algunas enfermedades como la deficiencia de adenosina desaminasa (ADA) o la hemofilia tipo A o tipo B, puede ser necesaria una expresión génica prolongada de bajo nivel. La expresión breve de alto nivel puede ser más apropiada para el cáncer, cuando se emplean genes que inducen la apoptosis o para enfermedades cardiovasculares cuando la prevención de la hiperproliferación de células musculares lisas puede impedir la reestenosis de injertos de vena safena. Tabla 3. Tipos de Vectores Génicos Viral Familia
Retroviridae
Ejemplos de especies
Virus de la Leucemia Murina
No viral Adenovlridae
Parvovlrldae
Herpesviridae
Togaviridae
Poxviridae
Sindbis
Poxvirus (Vaccinia)
5 kb
VIH
Adenovirus
VAA
Virus del Herpes Simple
8 kb
4,3-34 kb
4-5 kb
40-150 kb
25-50 kb
12 kb
Sí
No, episomal
Puede ser integrado o episomal
Puede ser i ntegrado o episomal No
No
Sí, pero a muy baja frecuencia
Estable
Estable
Estable o transitorio
Estable
Estable o transitorio
Transitorio
Transitorio
Estable o transitorio
Localización del vector
Núcleo
Núcleo
Núcleo
Núcleo
Núcleo
Citoplasma
Citoplasma
Núcleo
Tipos de células transducidas
Únicamente en división
En división y quiescentes
En división y quiescentes
En división y quiescentes
En división y quiescentes
En división y quiescentes
En división y quiescentes
En división y quiescentes
Eficiencia de la transferencia génica
Alta
Alta
Alta
Alta
Alta
Alta
Alta
Baja
Plásmido derivado
Características del Vector Límite de tamaño de inserción Integración al cromosoma Expresión terapéutica
8 kb
Sí
USP 39
Información General/ (1047) Productos de Terapia Génica 1045
Tabla 3. Tipos de Vectores Génicos (Continuación) Viral Familia
Retroviridae
Ejemplos de especies
Virus de la Leucemia Murina
No viral Adenoviridae
Parvoviridae
Herpesviridae
Togaviridae
Poxvirldae
Sindbis
Poxvirus (Vaccinia)
Plásmido derivado
Sí
Sí
No
VIH
Adenovirus
VAA
Virus del Herpes Simple
No
Sí, a menos que se supriman los genes virales
No
Sí
Características del Vector Expresión de proteínas virales
Otros
No
Se puede usar como un sistema de terapia con plásmi dos
El tropismo se puede alterar mediante seudotipificación
CRITERIOS PARA EL DISEÑO DE VECTORES Se están desarrollando muchos tipos de vectores para terapia génica y el vector seleccionado para una aplicación clínica en particular depende del estado de la enfermedad, de la célula blanco y de la vía de administración prevista. Conforme a lo mostrado en la Tabla 3, la capacidad depende del tipo de vector, por lo que las aplicaciones clínicas que requieren de una gran cantidad de material genético limitarán la selección del sistema de vectores. La carga útil de un sistema de vectores adquiere mayor importancia cuando se diseñan vectores con ADN genómico o un vector que contiene secuencias reguladoras extensivas. Los vectores también se seleccionan basándose en la duración pretendida de la expresión y de la célula blanco. Por ejemplo, los vectores retrovirales se integran de manera estable en las células blanco y, por lo tanto, se adaptan bien a las células madre o linfocitos que se espera experimentarán una división celular extensiva. Por el contrario, los vectores adenovirales y plasmídicos son episomales y se pueden perder durante la división celular. No obstante, los vectores adenovirales son atractivos para el desarrollo de vacunas y en aplicaciones contra el cáncer cuyo objetivo es eliminar las células tumorales. Otros vectores tales como el VM, no presentan una integración de alta eficacia, pero se pueden expresar a largo plazo en células que no están en división, como por ejemplo neuronas o hepatocitos. El tipo de célula blanco también tiene un papel importante en la selección de un sistema de vectores apropiado (ver Transducción Dirigida). Por ejemplo, el adenovirus Coxsackie B y receptor de adenovirus (CAR, por sus siglas en inglés) se expresa pobremente en tejidos hematopoyéticos, lo cual limita la utilidad del sistema de vectores para células hemoderivadas. Los vectores basados en retrovirus murinos requieren del ciclo celular y no se ajustan bien a la transducción de células que no están en división tales como las neuronas. El sistema inmune puede dirigir tanto a los componentes virales del vector como al transgén expresado. La presencia de anticuerpos preexistentes o inmunidad celular para ciertos sistemas de vectores pueden limitar su utilidad. Los vectores pueden desencadenar una respuesta inmune innata que podría reducir la eficacia de la transferencia génica e inducir un evento adverso severo. Existe un gran número de metodologías de terapia génica actuales que buscan limitar la toxicidad y la respuesta inmune mediante la administración del vector a células ex vivo. Sin embargo, la mayoría de las enfermedades aptas para terapia génica requerirán la aplicación in vivo, mientras que la investigación en curso busca vectores con reconocimiento inmune limitado. La vía de administración y la manipulación de la dosis total del vector son estrategias que se pueden usar para compensar algunas limitaciones de sistemas de vectores específicos. Además, existen ventajas y desventajas para la fabricación de cada uno de los diferentes sistemas de vectores que se deben considerar al momento de planear una aplicación clínica. La uniformidad de la producción favorece a los sistemas de fermentación o cultivo bien definidos, tales como vectores plasmídicos, retrovirales o adenovirales. Para los sistemas de vectores virales que requieren funciones colaboradoras (ver más adelante), una línea celular racionalmente diseñada puede superar las limitaciones de la capacidad de producción en escala y de la uniformidad impuestas por las cotransfecciones. El empleo de una línea celular que se adapte al cultivo en suspensión puede influir sobre la capacidad de producción en escala y la rentabilidad. TRANSDUCCIÓN DIRIGIDA Para que un vector sea eficaz, en primer lugar, tiene que hallar y transducir su célula blanco. Los virus poseen una gama de anfitriones naturales que está muy influenciada por los niveles de expresión de receptores específicos en la superficie celular, la fase actual del ciclo celular y la vía de administración. Las integrinas son una clase de receptores de adhesión celular que interactúan con la base del pentón o la proteína de la fibra de los adenovirus. Las proteínas de la fibra y de la base del pentón de
1046 (1047) Productos de Terapia Génica / Información General
USP 39
adenovirus median la unión al CAR, al CD46 y a las integrinas. Los virus asociados a adenovirus interactúan primeramente con receptores de heparán sulfato proteoglicano y ácido siálico en la superficie de las células. Sin embargo, es necesaria la interacción con los receptores secundarios tales como integrinas, laminina y factores de crecimiento para el ingreso eficiente de las células y el tráfico de partículas de virus hacia el núcleo. Una variante anfotrópica del virus de la leucemia murina (VLM) comúnmente usada para aplicaciones de terapia génica, emplea la molécula transportadora de fosfato dependiente de sodio RAM-1 para ingresar a blancos celulares. Los niveles de expresión de cada uno de estos receptores varían de acuerdo con el tipo de tejido, el cual dictamina la eficiencia de transducción del vector. La gama de anfitriones y tejidos se puede modificar o dirigir mediante manipulación bioquímica y genética del vector. A lo largo de la seudotipificación genética, se llevan a cabo muchas alteraciones en la especificidad celular y tisular de retrovirus-y particularmente lentivirus. Durante este proceso, las proteínas de envoltura que dictaminan la unión e ingreso de virus mediante un receptor celular específico de un virus se reemplazan con la proteína de envoltura de otro retrovirus o con una proteína de un virus totalmente distinto tal como la glucoproteína del virus de la estomatitis vesicular. La complejidad relativa de las cápsides de adenovirus y de virus asociados con adenovirus permite modificarlas genéticamente de diferentes maneras. La sustitución de una proteína de un solo virus (p.ej., fibra de adenovirus o AW VPl, por sus siglas en inglés) por una de otro serotipo dentro de la misma familia es muy parecida al proceso de seudotipifiación para retrovirus. No obstante, las partículas de virus en mosaico que se crean intercalando proteínas de cápsides individuales de varios serotipos virales distintos en un virión, y las partículas quiméricas creadas por proteínas de cápsides de dos serotipos distintivamente diferentes en una partícula de algún otro serotipo (p.ej., pentón de adenovirus 35 en fibra de adenovirus 41 en una partícula de adenovirus 5) pueden cambiar efectivamente los tipos de células y tejidos que puede transducir un vector. Aunque esta metodología puede parecer sencilla, algunas modificaciones de proteínas de la cápside viral a nivel genético no facilitan la formación de partículas virales. A pesar de que la mayoría de las modificaciones mejoran la captación de virus en un blanco celular específico, también pueden incrementar la captación en algunos otros tejidos en los que no es deseable la transferencia génica. Por consiguiente, se debe considerar y analizar cuidadosamente la selección de proteínas y ligandos en modelos preclínicos de enfermedades antes de que estos vectores puedan usarse ampliamente. Las proteínas del revestimiento viral y los vectores no virales se pueden modificar químicamente para dirigirlos hacia receptores mediados por ligandos. Se pueden conjugar con ligandos dirigidos a las células mediante interacciones anticuerpo-virus con anticuerpos biespecíficos. Los puentes moleculares como los complejos de biotina-avidina y los entrecruzadores químicos tales como polietilenglicol (PEG) bifuncional ligados a proteínas unidas al receptor específicas de la célula se conjugan fácilmente con partículas virales y a menudo se incorporan en estrategias de dirección. Estas metodologías se pueden combinar y/o intercambiar fácilmente con modificaciones genéticas y con los demás para crear vectores dirigidos efectivamente a varios receptores. Aunque la metodología bioquímica evita complicaciones funcionales en la introducción de dominios extraños en las proteínas virales, cada lote de vector se debe modificar puesto que la progenie del virus se restaurará a su tropismo original codificado genéticamente. Los procesos bioquímicos también requieren el uso de múltiples reactivos, lo que puede complicar la transferencia al sitio clínico. Otra estrategia común y efectiva para dirigir vectores virales a células tumorales toma ventaja del ciclo de replicación del virus. La supresión de genes críticos para la toma de los puntos de control de células funcionales para respaldar la replicación normal de virus permite que el virus se replique únicamente en células cancerosas cuando aquellos puntos de control son defectuosos o inactivos. Este efecto se puede mejorar aún más creando pequeñas mutaciones en genes para replicación de virus dirigidos por promotores específicos para ciertos tumores y tejidos. Con respecto al ciclo celular, los adenovirus y los virus asociados con adenovirus infectan fácilmente células quiescentes y en división, mientras que los vectores retrovirales basados en el virus de la leucemia murina son eficaces sólo cuando transducen células en división rápida. Los vectores lentivirales pueden infectar células quiescentes, como las de origen neuronal. En general, los vectores no virales pueden entrar a células en división y que no están en división pero tienen una eficacia de transducción menor que los vectores virales. La eficacia de transducción de vectores no virales se puede mejorar mediante la formulación e inyección directa en el tejido de interés. INFLUENCIA DEL COMPLEMENTO Y DEL SISTEMA INMUNE HUMORAL Una de las barreras más importantes para la transferencia génica eficaz es la respuesta inmune humoral hacia el vector. Independientemente de la vía de administración, de la célula blanco prevista y de la dosis, es probable que el vector encuentre algún componente del sistema inmunitario. En el caso de los vectores virales, el sistema inmunitario humoral no puede distinguir con facilidad entre infecciones por virus salvajes y vectores virales recombinantes, porque la respuesta humoral está dirigida contra proteínas en la envoltura o cápside viral. Las formulaciones de vectores no virales que contienen proteínas también pueden desencadenar una respuesta inmunitaria humoral. Se pueden presentar respuestas humorales específicas o de reacción cruzada preexistentes debido a la exposición natural a versiones salvajes de vectores virales o bien pueden desencadenarse durante la administración, y la respuesta de los anticuerpos puede variar en cuanto a la capacidad para disminuir la transducción génica en ciertos pacientes. Como la capacidad neutralizadora suele aumentar con las dosis múltiples, la administración repetida también puede ser problemática. Algunos de estos problemas se pueden remediar mediante el uso de sistemas no virales. Sin embargo, el nivel de eficacia de transducción de estos vectores actualmente no es suficiente para muchas de las aplicaciones de transferencia génica. La eficiencia de transducción de todos los vectores también se ve comprometida de manera importante por el sistema de complementos. Muchas proteínas de complemento tienen una afinidad natural por las proteínas de la cápside viral. Esta interacción inicia la liberación de citoquinas y quimiocinas que facilitan la rápida eliminación del vector de
USP 39
Información General/ (1047) Productos de Terapia Génica 1047
la circulación sistemática. La afinidad por lo general se eleva (especialmente en el caso de retrovirus) cuando las proteínas celulares no humanas y los componentes de cultivo (p.ej., suero fetal bovino) se incorporan y/o recubren la partículas del virus durante la producción a gran escala. El uso de líneas de células productoras de origen humano y de condiciones de cultivo exentas de suero ha disminuido la inactivación de vectores mediante complemento. Se han desarrollado diversas estrategias para mitigar y evitar la respuesta inmune humoral y la inactivación del complemento. Incrementar la dosis de vector para compensar la actividad neutralizante de los anticuerpos y alterar los regímenes de dosificación para que coincidan con periodos de bajos títulos de anticuerpos son las opciones lógicas, pero la posible toxicidad asociada con altas dosis de virus y la variabilidad individual de la respuesta inmune son consecuencias negativas potenciales de esta metodología. Como alternativa, los vectores virales se pueden diseñar de modo que eludan el sistema inmunitario. Una metodología consiste en aumentar la expresión de genes virales específicos que permiten al virus evadir la respuesta humoral del anfitrión. Los virus recombinantes construidos de serotipos con velocidades de exposición limitadas tales como el adenovirus simiano 7 pueden evitar la neutralización en aquellos expuestos previamente a serotipos más comunes. Los virus del mosaico y quiméricos también pueden evitar la neutralización. Ambas metodologías tratan efectivamente los aspectos de la transferencia génica eficaz en aquellos con inmunidad preexistente, aunque ambas requieren de investigación adicional en respuesta a las inquietudes relacionadas con la seguridad y la producción a gran escala así como la inducción de respuestas inmunes en poblaciones de pacientes que no han sido previamente sometidos a infección. La unión covalente de polietilenglicol (PEGilación) a la cápside viral puede proteger a los virus de la neutralización y cortar la respuesta inmune. Los métodos farmacéuticos tales como fijación de vectores virales en matrices de polímero y la administración de vectores a la mucosa (oral y nasal) también pueden proteger a los vectores virales de la respuesta inmune humoral. INFLUENCIA DE LA RESPUESTA INMUNE CELULAR Una vez iniciada la expresión transgénica, la respuesta inmune celular elimina rápidamente células transducidas por vectores virales y no virales. Esto reduce la efectividad terapéutica general de la transferencia génica de dosis de vector bajas a moderadas y puede ser altamente tóxico cuando se administran dosis mayores. No se requiere de síntesis de proteína activa para la respuesta inmune celular a proteínas de la cápside viral. Por ejemplo, las proteínas de la cápside de vectores de VAA recombinante han mostrado longevidad, lo cual genera una respuesta inmune retardada y la eliminación de células transducidas por vectores. La síntesis de novo de productos génicos virales también puede exacerbar las respuestas celulares del anfitrión. Se han diseñado vectores virales con supresiones específicas del esqueleto para eliminar la expresión de genes de estructura viral y reducir este efecto. Entre los ejemplos de dichos vectores se incluyen adenovirus sin genes virales (gutless), virus del herpes y los virus asociados con adenovirus en los que todos los genes virales han sido suprimidos, lo que los vuelve dependientes de otro virus colaborador para su replicación posterior. Algunas secuencias de plásmidos, en especial aquellas con dinucleótidos CpG no metilados, pueden desencadenar una fuerte respuesta inmune celular y se han usado como adyuvantes en algunas vacunas basadas en ADN. La amplificación de plásmidos en bacterias que expresan la metilasa CpG (M.Sssl), la eliminación de secuencias CpG mediante mutagénesis dirigida y la eliminación de secuencias procarióticas innecesarias para crear plásmidos mínimos han reducido la incidencia de respuestas celulares indeseadas. Una metodología no molecular para minimizar la respuesta celular contra el vector implica el uso de inmunosupresores (ciclosporina, sirolimus, dacluzumab) al momento de la administración inicial del vector, además de los métodos para reducir la respuesta humoral (uso de vectors quiméricos, PEGilación) descritos anteriormente. ANTIGENICIDAD DEL PRODUCTO DE TERAPIA GÉNICA En muchos casos, el producto de terapia génica, los promotores asociados y los elementos mejoradores son antigénicos en algunos blancos celulares. Cuando se utilizan proteínas que son retenidas en la célula blanco, las respuestas celulares pueden eliminar la célula blanco. Si se necesita una expresión proteica sostenida, la respuesta inmune celular puede disminuir la eficacia de la terapia o abolirla por completo. En lo que respecta al tratamiento de enfermedades genéticas, los pacientes con mutación nula que nunca han visto el producto transgénico, pueden presentar un mayor riesgo de respuesta inmune que los pacientes que producen una proteína defectuosa Asimismo, truncar un gen, como el regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR, por sus siglas en inglés) para alojarlo en un vector elegido puede resultar en la creación de un antígeno distinto. En otras aplicaciones, el producto transgénico es una proteína extraña, p.ej., timidina kinasa derivada del virus del herpes simple (VHS) y que, por lo tanto, puede desencadenar una respuesta inmune. En algunos casos, éste es el efecto terapéutico deseado, particularmente en la inmunoterapia antigénica contra el cáncer o una enfermedad viral. Los esfuerzos para minimizar la respuesta inmune contra los elementos asociados con el casete transgénico incluyen el diseño de vectores con la capacidad de realizar secuencias humanizadas de longitud completa para el transgén en cuestión, así como la administración de inmunosupresores en la dosis inicial y en otros intervalos a lo largo del protocolo de tratamiento.
1048 (1047) Productos de Terapia Génica/ Información General
USP 39
LOCALIZACIÓN DEL VECTOR DENTRO DE LA CÉLULA BLANCO Una vez que el vector llega a la célula blanco, varios factores pueden alterar la magnitud y la duración de la expresión génica terapéutica; estos factores rigen la elección de un sistema apropiado de vectores para una indicación clínica específica. La localización del genoma del vector dentro de la célula, la fuerza de los elementos de control de la expresión génica, la estabilidad del mensaje y la estabilidad de la proteína traducida influyen en el efecto terapéutico. Los vectores basados en Alfavirus, como los que provienen del virus Sindbis o el virus del bosque Semliki, residen en el citoplasma y normalmente presentan un nivel muy alto de expresión génica. Los vectores retrovirales, adenovirales o de otros virus otorgan ventajas en la administración génica, con sus mecanismos naturales para la distribución nuclear del gen terapéutico y niveles razonables de expresión génica a partir de promotores virales o de otro tipo. Los vectores plasmídicos no virales son episomales y, con frecuencia, susceptibles a la degradación del ADN cuando se introducen en los endosomas celulares. Sin embargo, algunos sistemas no virales incorporan señales que los dirigen hacia el núcleo con el propósito de incrementar la eficiencia de la transcripción génica terapéutica. EXPRESIÓN ESPECÍFICA DE TEJIDOS Otra manera de controlar la expresión génica es la incorporación de promotores específicos de tejidos para estimular o limitar la expresión del gen terapéutico. Lamentablemente, muchos promotores específicos para tejidos no proveen altos niveles de expresión génica y la incorporación de estas secuencias en vectores virales puede resultar en la pérdida de especificidad o en una expresión de bajo nivel en células que el promotor normalmente no expresa. Marcar el vector con secuencias reconocidas por el sistema de microARN también ha permitido la expresión específica de tejidos y puede ofrecer un control más estrecho que el comúnmente obtenido con sistemas de promotores específicos de tejidos. En la actualidad, se usan promotores que responden a fármacos para controlar la expresión génica. Se han utilizado sistemas de selección (tet-on) con rapamicina, mifepristona y tetraciclina para reprimir la expresión génica. Este tipo de regulación es particularmente útil cuando la expresión constitutiva del transgén vector es tóxica. IMPACTO DEL ESTADO DE REPLICACIÓN DEL VECTOR El estado de replicación es otra consideración importante para el diseño y la selección del vector. Los vectores virales suelen construirse de modo que presenten una replicación incompetente o defectuosa para limitar su propagación descontrolada y su patogenicidad. No obstante, la capacidad para replicarse y propagarse dentro de una población de células específica, p.ej., dentro de un tumor o en sitios metastáticos, puede significar una ventaja terapéutica importante sobre las células de tipo específico blanco de vectores con replicación incompetente o defectuosa. La replicación se puede modificar mediante ingeniería para condicionarla cuando, por ejemplo, interacciones específicas de genes virales se corresponden con los objetivos de la vía intracelular por medio de supresiones dirigidas y/o cambios en el control de transcripción o translación. Cuando estas vías intracelulares son defectuosas o están ausentes, como en las células cancerosas, el virus se puede replicar en ellas, pero cuando la célula funciona normalmente, la replicación viral está reprimida. Entre los virus que han sido modificados por ingeniería genética para replicación oncolítica selectiva se incluyen: adenovirus, VHS, vaccinia, virus de sarampión, picornavirus, virus de la influenza, virus Coxsackie y virus Sendai. Algunos virus que no se modifican genéticamente son inherentemente oncolíticos en células humanas, p.ej., reovirus y el virus de la enfermedad de Newcastle. Uno de los riesgos inherentes en el uso de vectores virales que se replican condicionalmente es que dichos sistemas pueden presentar fugas, es decir, que el crecimiento del virus no se encuentra absolutamente restringido a un sólo tipo de células. Además, las rondas subsiguientes de viremia se vuelven aspectos a considerar durante la evaluación de la distribución/exposición y desprendimiento del tejido. La promisoridad terapéutica de estas metodologías depende de la confiabilidad con la que se pueda seleccionar o modificar por ingeniería la condicionalidad de la replicación. Este potencial terapéutico podrá lograrse únicamente si se equilibra con etapas para controlar los riesgos potenciales para pacientes (asociados con la competencia de la replicación de los virus/vectores virales) y para tratar los problemas relacionados con el desprendimiento por exposición a terceros y las consideraciones ambientales. Una contribución proactiva con el perfil de seguridad, y que al mismo tiempo toma ventaja de la información científica y clínica actualmente disponible, consiste a menudo en usar como esqueleto del vector las cepas de virus que han sido usadas para vacunas humanas. No obstante, debido a que el producto es competente para la replicación, presenta desafíos técnicos específicos para análisis de agentes adventicios y caracterización del producto. Los vectores no virales normalmente se diseñan como sistemas no replicantes, pero algunos grupos están realizando experimentos con plásmidos no virales replicantes para incrementar los niveles de expresión génica (debido a la baja eficacia de transducción de la mayoría de los sistemas no virales) y para incrementar la duración de la expresión génica. Se necesitan más estudios preclínicos para establecer la seguridad de estos sistemas. Asimismo, se han diseñado cromosomas artificiales para aprovechar los mecanismos normales a fin de conservar la expresión génica en células blanco que se dividen rápidamente.
USP 39
Información General/ (1047) Productos de Terapia Génica 1049
INTEGRACION DEL VECTOR La duración de la expresión génica también es una función de la persistencia del genoma del vector en células blanco. Los vectores retrovirales pueden integrarse de manera estable al genoma de las células anfitrionas, lo que provee una expresión prolongada. Los adenovirus y los vectores plasmídicos no virales, p.ej., aquellos que no se administran usando electroporación, no se integran y la expresión por lo general decae con el tiempo. Los vectores de VAA recombinante por lo regular no se integran, y cuando llegan a hacerlo, esto no ocurre en sitios específicos. Sin embargo, se han observado episomas estables en algunos tipos de células, tales como células musculares. La integración específica de sitio puede ser una característica deseable para vectores destinados a corregir trastornos genéticos. El control del sitio de integración es conveniente para prevenir la mutagénesis por inserción, aunque en la actualidad, esto no tiene la eficacia suficiente para ser considerado útil. La mutagénesis por inserción posee el potencial de matar una célula si un gen de funcionamiento crítico se inactiva, o de predisponer la célula a una transformación maligna si un gen supresor de tumores está inactivado. Los elementos promotores o mejoradores con vectores pueden conllevar la activación de oncogenes celulares y se han asociado con la transformación maligna en niños que están siendo sometidos a transferencia génica retroviral para inmunodeficiencia combinada severa entrecruzada. El éxito de cualquier producto de terapia génica depende de la relación entre el sistema de administración de vectores y los requisitos de la enfermedad con respecto al sitio, nivel y duración de expresión génica terapéutica. En la actualidad resulta improblable un vector universal, por lo que el desafío se centra en ajustar uno de varios vectores posibles a la enfermedad y al gen que se va a administrar.
Estrategias de Fabricación y Purificación CONSTRUCCIÓN DEL VECTOR Los vectores de transferencia de genes virales y no virales se construyen mediante protocolos estándar de biología molecular. Para los vectores virales, el esqueleto del vector consiste en secuencias de ARN o ADN viral de las que se han suprimido las regiones que codifican genes con estructura viral o las regiones para replicación. La región suprimida del vector por lo regular se modifica con sitios específicos de endonucleasa de restricción que permiten la inserción del gen de interés. Para los vectores no virales, el esqueleto del ADN plasmídico contiene múltiples sitios de restricción para clonación, así como los elementos bacteriales necesarios para producción de plásmidos. Los esqueletos de los vectores pueden albergar inserciones de genes únicas o múltiples, según la cantidad máxima de secuencia que puedan llevar. El promotor que facilita la transcripción del gen insertado puede ser un promotor viral relacionado, tal como una repetición terminal larga del virus de la leucemia murina (MuLV LTR) o un promotor heterólogo que es específico del tejido, como el promotor alfa del cristalino (del ojo), o constitutivo, como el promotor génico tardío de citomegalovirus (CMV). Por ejemplo, en una construcción de vectores retrovirales que contiene dos insertos de genes, la transcripción de un inserto se regula a partir de la secuencia del promotor LTR 5' y un segundo inserto de gen se puede ligar a un promotor heterólogo interno del virus simiano 40 (SV40). EL ADN complementario (ADNc) que contiene el gen terapéutico de interés, incluyendo sus intrones, se escinde de su fuente usando enzimas de restricción y se inserta en el sitio de clonación múltiple del vector de transferencia de genes. La señal de poliadenilación se puede extraer de múltiples fuentes, como el virus SV40 o el gen de la hormona de crecimiento humana. La caracterización y las pruebas de vectores para terapia génica se describen en Métodos Analíticos. SISTEMAS QUE COLABORAN CON LA FUNCIÓN A menudo, los vectores virales recombinantes se modifican para que tengan una replicación defectuosa, una condición creada por supresión o modificación de los genes virales requeridos para la replicación y producción de virus infecciosos. Debido a que a los vectores se les retiran algunos o todos los genes virales, se debe desarrollar un sistema para proveer proteínas virales y para encapsular el vector en una partícula viral. Por lo general, esto se logra mediante dos métodos: transfección transitoria o líneas celulares empaquetadoras estables. En el método de transfección transitorio, se genera una serie de plásmidos diferentes, incluyendo un plásmido que contiene el vector y otro vector que contiene los genes virales. Por ejemplo, los vectores retrovirales se pueden generar usando un sistema de tres plásmidos: (1) el vector plasmídico que contenga el transgén; (2) un plásmido que contenga la región génica viral gag/poi; y (3) un plásmido que contenga el virus con envoltura. Los trés plásmidos se transfectan a células, p.ej., HEK293 o HTl 080, y los viriones que contienen vectores se recolectan después de dos o tres días. La separación del vector y de los genes virales en plásmidos diferentes, junto con los diseños del vector que minimizan la homología entre el vector y las secuencias virales, reducen la probabilidad de recombinación y regeneración de virus competente para la replicación. Se pueden emplear metodologías similares para la mayoría de los sistemas de vectores virales. El método de transfección transitoria tiene como ventaja un tiempo de producción rápida y la flexibilidad para cambiar los componentes del vector o de las construcciones virales. No obstante, este método puede ser complejo al momento de ampliarlo para fabricación y se debe tener especial cuidado para obtener resultados de producción constantes. El uso de líneas celulares empaquetadoras de vectores es un método alternativo. En este caso, los genes virales se introducen de manera esta-
1050 (1047) Productos de Terapia Génica/ Información General
USP 39
ble en una línea celular inmortalizada que produce una expresión persistente de genes virales. Al igual que con la transfección transitoria, los genes virales por lo general se expresan a partir de diferentes plásmidos para reducir el riesgo de recombinación. Debido a que la integración de los plásmidos es poco frecuente, se requiere de tiempo y esfuerzo considerables para aislar una línea celular empaquetadora con alto título y para generar un MCB. Las construcciones de vectores se pueden introducir a las células del MCB; asimismo, los investigadores pueden permitir el aislamiento de una línea celular estable que genere el vector de interés analizando por la presencia de un clon de alto título. Estas líneas celulares por lo general se expanden a grandes números y a menudo producen vectores durante un periodo de hasta una semana a la vez, lo que facilita la ampliación a escala del vector y la uniformidad del producto. Los sistemas típicos que colaboran con la función son los siguientes: Sistemas de Vectores Retrovirales-Las células empaquetadoras iniciales se basaban en la línea celular de fibroblasto murino NIH 3T3. La línea celular PGl 3 (que expresa la envoltura del Virus de la Leucemia del Mono Gibbon) se ha usado ampliamente con una baja incidencia de eventos de recombinación que conllevan al VCR. En tiempos recientes, se han modificado las líneas celulares humanas HEK293 y HTl 080 para servir como líneas celulares empaquetadoras para retrovirus. El uso de una línea celular humana reduce la eliminación de partículas de vector por parte del sistema de complementos humanos (aunque por lo general esto no representa una preocupación para vectores usados en protocolos ex vivo). Sistemas de Vectores Adenovirales-Las células HEK293 se usan ampliamente para proveer la función El, necesaria para replicación adenoviral eficaz que se suprime de los vectores adenovirales de primera generación. Asimismo, se han creado otras lineas celulares complementarias, tales como las células A549 modificadas con El (carcinoma pulmonar humano) y la línea celular PER.C6 (retinoblasto embrionario humano), para proveer El u otras funciones ausentes. La PER. C6 contiene la región El bajo el control de un promotor de fosfoglicerato quinasa (PGK, por sus siglas en inglés) y no posee secuencias adenovirales flanqueadas, a fin de eliminar la producción de adenovirus competentes para la replicación (ACR). Sistemas de Vectores de VAA-Clásicamente, utilizan líneas celulares HEK293 infectadas por adenovirus, transitoriamente transfectadas con plásmido colaborador de VAA que contiene los genes rep y cap necesarios para la replicación del VAA y la formación de la cápside, respectivamente, y que son suprimidos del vector de VAA. En algunos sistemas de producción de VAA, el adenovirus salvaje ha sido eliminado del proceso usando transfección triple de plásmidos que expresan genes tempranos Ad, rep y cap, y el transgén del vector. La línea celular HeLa (del carcinoma cérvico uterino humano) también se ha empleado como sistema de producción transitorio. En tiempos recientes, ambas líneas celulares han sido utilizadas para establecer líneas celulares empaquetadoras transfectadas de manera estable que expresan los genes rep y cap y, en algunos casos, expresan las funciones adenovirales necesarias para la replicación del VAA cuando hay genes rep y cap (ARN de VA, El a, El b, E2a y E4). También se han desarrollado sistemas de producción de VAA que usan VHS recombinante y Baculovirus. Adenovirus Sin Genes Virales (Gutless)-Los sistemas de fabricación iniciales para el vector de adenovirus, también llamados adenovirus sin genes virales (gutless) eran similares a los sistemas de fabricación de vector de VAA clásicos debido a que las células HEK293 se transfectaban transitoriamente con plásmido colaborador que contenía las funciones adenovirales requeridas. El desarrollo de virus colaboradores que hospedan una señal de empaquetamiento flanqueada por sitios loxP y que complementa a las líneas celulares HEK293 que expresan la recombinasa Cre del bacteriófago Pl de sitio específico ha mejorado de sobremanera el rendimiento del virus sin genes virales. Esta tecnología reduce notoriamente la cantidad de contaminación de virus colaborador previniendo el empaquetado del genoma del virus colaborador al tiempo que le permite replicarse y respaldar la replicación y encapsidación del vector sin genes virales. VECTORES DE TERAPIA GÉNICA VIRAL Los vectores retrovirales y adenovirales por lo regular han sido producidos a escala de laboratorio que no se ajusta a las BPF a través de métodos de cultivo tradicionales para líneas celulares dependientes de suero y anclaje empleando matraces, bandejas y frascos tipo roller. Inicialmente, los vectores de terapia génica se producían con estos métodos porque no se necesitaban grandes volúmenes del producto para los primeros estudios clínicos. Los sistemas de bancos de células se emplean como fuente de células y los bancos de virus, como fuente de virus para la producción clínica. En la mayoría de los casos, el sobrenadante se recolecta, clarifica y se almacena congelado en bolsas a -70º. En muchos ensayos clínicos tempranos, el sobrenadante no purificado ha sido usado para la transferencia génica ex vivo. Se ha informado sobre métodos de producción en etapas iniciales a gran escala los cuales se usan comúnmente. Estos incluyen métodos de cultivo en suspensión, en biorreactor y en lecho fijo o microtransportador. Algunos grupos han informado que adaptan sus células de proceso a condiciones de cultivo sin suero. Las células se cosechan y lisan o se recolecta el sobrenadante. La recolección se clarifica y purifica para eliminar los restos de células anfitrionas, el ADN de la célula anfitriona y demás contaminantes derivados del proceso. Tradicionalmente, los virus se purifican usando ultracentrifugación en gradiente, aunque esto demanda mucho tiempo y no es adecuado para propósitos de producción a gran escala. La selección de pasos en procesos subsiguientes y su secuencia está determinada por la naturaleza del virus en sí mismo y las etapas iniciales del proceso utilizado para fabricar el virus. Con el desarrollo de procesos para la fabricación de vectores de terapia génica, se ha informado sobre una gran cantidad de etapas diferentes de purificación, las cuales incluyen cromatografía de intercambio iónico y en celulosa sulfonada, cromatografía de afinidad de iones cinc y cromatografía de exclusión por tamaño. Por lo regular, los tratamientos con ADNasa y otras nucleasas se usan en el proceso a fin de reducir el ADN de la célula anfitriona o del plásmido. La producción de VAA y lentivirus se complica por la necesidad de transfección o cotransfección transitoria del plásmido o del virus colaborador. En general, estos pro-
USP 39
Información General/ (1047) Productos de Terapia Génica 1051
cesos han requerido líneas de células que necesitan anclaje, que son difíciles de producir a gran escala. El desarrollo de líneas celulares transfectadas establemente permitiría la producción a gran escala. MÉTODOS DE PURIFICACIÓN: VECTORES VIRALES Retrovirus-A la fecha, la purificación de preparaciones de retrovirus para ensayos clínicos de la fase 1ha sido mínima, es decir, la concentración simple de sobrenadantes de cultivo es insuficiente para cumplir con las estrictas normas de calidad requeridas para terapia in vivo. Las técnicas de centrifugación y microfiltración son muy útiles para clarificar sobrenadantes de cultivo y para eliminar desechos celulares. Asimismo, las técnicas de cromatografía de intercambio iónico, de exclusión por tamaño y de afinidad han sido empleadas para eliminar el exceso de sal, suero y contaminantes de bajo peso molecular también concentrados con el virus. Adenovirus-Los vectores adenovirales recombinantes a menudo se purificaban mediante ultracentrifugación de equilibrio en un gradiente de densidad con cloruro de sodio. Este proceso aún se emplea para preparaciones de escala investigativa, aunque no es posible aumentar su escala ni es eficiente para cantidades más grandes de virus de grado clínico. Los métodos de purificación más recientes que permiten aumentar la escala usan cromatografía de intercambio aniónico debido a la fuerte afinidad de partículas de virus intactas para la resina con respecto a la de las proteínas de la cápside celular e individual. Las estimaciones de carga publicados para resinas de intercambio aniónico pueden variar entre 0,5 x 10 12 y 5 x 10 12 partículas de virus/mL de resina o entre O, 14 mg de virus y 1,4 mg de virus/mL de resina. La filtración en gel y la cromatografía de afinidad de metales inmovilizados a menudo se usan en las etapas de refinamiento siguiendo la purificación de intercambio aniónico de productos derivados de adenovirus recombinantes. Virus Asociados con Adenovirus-La toxicidad de cloruro de cesio, el agregado de partículas de VAA y el hecho de que el adenovirus no se elimina por completo después de una extensa centrifugación complican la purificación de VAA mediante ultracentrifugación de equilibrio en un gradiente de densidad con cloruro de cesio. Otro medio de separación de densidad, el yodixanol, que es menos tóxico que el cloruro de cesio y que previene la agregación de VAA, se ha empleado en una sola etapa de centrifugación. El pasaje de la fracción de VAA por una columna de afinidad que consiste en una matriz de soporte heparinizada o en anticuerpos monoclonales producidos contra VAA2 aumentó en gran medida la pureza e infectividad de las preparaciones finales. Estos métodos son apropiados únicamente para serotipos de VAA específicos. La cromatografía de intercambio iónico es el método más potente y versátil de purificación de VAA, aunque la solución amortiguadora de pH, la concentración de detergente y el medio de la columna se deben ajustar para cada serotipo de VAA. La infectividad y pureza de las preparaciones obtenidas de estas estrategias de purificación son comparables a las obtenidas por métodos cromatográficos de afinidad y se completan en un periodo de tres horas. PLÁSMIDOS O VECTORES NO VIRALES Los plásmidos son moléculas de ADN de doble cadena circular que existen en bacterias, como moléculas extracromosómicas autorreplicantes. Se han modificado para servir de sistemas de clonación, para contar con múltiples sitios de reconocimiento por endonucleasas de restricción para la inserción del transgén clonado y para tener marcadores genéticos seleccionables para identificar las células que portan el vector recombinante. Los vectores no virales basados en plásmidos se suelen utilizar como sistemas de suministro de genes, tanto en terapias génicas in vivo como ex vivo. Estos vectores se encuentran en forma de ADN desnudo o se complejan con lípidos u otros agentes que facilitan la transferencia a través de la membrana celular y el transporte al núcleo de la célula sin degradación. Una ventaja del sistema de vector plasmídico es la producción eficiente de grandes cantidades del vector que se caracteriza fácilmente y evita el riesgo de VCR asociado con muchos sistemas virales. Los vectores no virales por lo regular se producen usando un sistema bacteriano de Escherichia coli. Los plásmidos son transfectados en f. coli y se selecciona y expande una colonia bacteriana única apropiada para crear un MCB. Después de volver a seleccionar una colonia a partir de una placa bacteriana inoculada del MCB, se aísla el ADN del plásmido a partir de cultivos cuyo tamaño varía entre 1 litro, a escala de laboratorio, y cientos de litros, en fermentadores bacterianos. El ADN plasmídico puede ser purificado por varios métodos, como la cromatografía de afinidad o de intercambio iónico y los gradientes de densidad de cloruro de cesio-bromuro de etidio. Estos últimos no se recomiendan para producir material de grado clínico. PRODUCCIÓN Y PROCESAMIENTO DE VECTORES NO VIRALES Un beneficio de los vectores no virales para la transferencia génica es que el proceso de producción es en realidad genérico y se puede aplicar a cualquier preparación plasmídica independientemente de la composición o aplicación. Puesto que la dosis humana promedio vigente de ADN plasmídico para transferencia génica y para vacunación es aproximadamente 1 mg, el desafío primario asociado con la producción de plásmidos a gran escala consiste en desarrollar un proceso económico y que se pueda aumentar en escala. Por consiguiente, el desarrollo del proceso para vectores derivados de plásmidos permanece como un área activa de investigación y desarrollo. Un proceso estándar de producción a gran escala de plásmidos de ADN recombinante consta de las cinco operaciones unitarias siguientes. Fermentación-Los procesos de fermentación deben respaldar el crecimiento de bacterias transformadas y maximizar la cantidad de plásmido producido por cada célula. La f. coli es la cepa más común empleada para la producción de plásmidos.
1052 (1047) Productos de Terapia Génica/ Información General
USP 39
Los aminoácidos, nucleósidos y la relación entre el nitrógeno y carbono de los compuestos presentes en una formulación de medio rico mejoran de gran manera el rendimiento de los plásmidos. Recolección-Las células bacterianas se recolectan mediante centrifugación o microfiltración. La centrifugación en condiciones que cumplan con las BPF puede ser costosa, lo que hace de la microfiltración el método aceptado de recolección celular. Asimismo, la microfiltración permite eliminar los medios usados, los subproductos metabólicos, los desechos extracelulares y las impurezas antes de la purificación. Lisis-Las células bacterianas se deben lisar para liberar los plásmidos recombinantes. Éste es uno de los pasos más críticos en el proceso de producción debido a que puede afectar significativamente la cantidad de formas de ADN usables [circular cerrado en forma covalente (ccc, por sus siglas en inglés)] y no usable [cortado, parcialmente desnaturalizado y circular abierto (oc, por sus siglas en inglés)] en una preparación. El método de lisis más usado para fabricación a escala clínica es el tratamiento con detergente alcalino y la precipitación de desechos celulares con acetato. Este método elimina una gran fracción de impurezas celulares generadas del lisado, al tiempo que incrementa la sensibilidad de los plásmidos para el mezclado y las concentraciones localizadas de detergente, las cuales son difíciles de manipular a gran escala. La lisis de células mediante exposición al calor tratan este problema y desnaturaliza de manera efectiva las proteínas celulares y el ADN bacteriano. Asilamiento y Purificación-Algunos procesos incluyen etapas adicionales para eliminar desechos celulares y demás contaminantes derivados de los lisados bacterianos crudos mediante precipitación con detergentes, polietilenglicol o sal. Estos reactivos afectan la estabilidad plasmídica y se eliminan mediante cromatografía en columna. La cromatografía de exclusión por tamaño puede separar de manera eficaz el ADN plasmídico del ARN, proteínas y demás moléculas pequeñas presentes en el lisado liberado. El grado de separación de ADN plasmídico de los contaminantes depende en gran medida del tipo y la concentración de sal en la solución amortiguadora de corrida. Las resinas usadas en la cromatografía de intercambio aniónico tienen una alta afinidad para ADN plasmídico y proporcionan una concentración de muestra máxima. La cromatografía de interacción hidrófoba y tiofílica aromática son los métodos preferidos para la separación selectiva de isoformas de ADN plasmídico diferente y la reducción de endotoxina. Preparación a Granel-Después de la purificación, el plásmido a granel se coloca en una solución amortiguadora adecuada y se formula mediante ultrafiltración usando una membrana con un tamaño de poro de 50-100 kDa. Los plásmidos para uso clínico se deben someter a una caracterización de alto nivel. Se tiene amplio conocimiento de las impurezas derivadas de las etapas de producción y procesamiento. Las pruebas necesarias para confirmar la identidad, pureza y potencia de un producto derivado de plásmido están bien establecidas y se consideran de rutina. La Tabla 4 resume estas pruebas y la especificaciones vigentes establecidas por la FDA y la Organización Mundial de la Salud. Tabla4 Nivel Aceptable del Producto Final
Tipo de Ensayo
Problemática
Determinado mediante
Identidad
Contaminación cruzada con otros productos
Digestión por restricción/electroforesisen gel
No disponible
ADN cromosómico bacteriano residual
PCR en tiempo real
<2 µg/mg ADN
ARN residual
HPLC analítica
<0,2 µg/mg ADN
Proteína bacteriana residual
Ensayo BCA [(Valoración de proteínas por el método de BCA (ácido bicinconínico)]
<3 µq/mqADN
Endotoxina
Ensayo de LAL
<1 O EU/mg ADN
Esterilidad (bacteriana y fúnqica)
Método descrito en el Título 21 del CFR 610.12
Sin crecimiento
Apariencia
Inspección visual
Solución transparente exenta de partículas
pH
Medidor de pH
Fisiológico (7,0-7,4), pero puede ser específico del producto
Confirmación de plásmidos (ccc vs oc)
HPLC o CGE
>97% ccc
Dosis declarada
In vitro ELISA FACS RT-PCR Absorbancia de luz (A1,n)
Transgén/específico del plásmido
Pureza
Potencia
Introducción de Material Genético en Células-Células Modificadas Genéticamente Una extensión común de la terapia celular implica la introducción de material genético, por lo general ADN, en células para alterar su patrón de expresión génica. Aunque la discusión se centra en el ADN, el ARN o un derivado del ADN pueden ser sometidos a procesos similares, excepto que la estabilidad y la solubilidad de cada ácido nucleico puede exigir la modificación de ciertos pasos. El proceso general se suele denominar terapia génica ex vivo, ya que las células se extraen del paciente o del
USP 39
Información General/ (1047) Productos de Terapia Génica 1053
donante y la introducción del material genético se lleva a cabo con las células fuera del cuerpo. A continuación, las células modificadas genéticamente son administradas al paciente. El material genético introducido puede causar la expresión de nuevos genes y productos o inhibir la expresión de genes y productos ya expresados. Esta última posibilidad representa un tipo de terapia antisentido. Este material genético se puede introducir con la misma variedad de reactivos implicados en la terapia génica: vectores virales, ácido nucleicos en una formulación simple (ADN desnudo) o ácidos nucleicos formulados con agentes tales como liposomas que mejoran su capacidad de penetrar la célula. La mayoría de los pasos y consideraciones analizados se aplican también a la introducción ex vivo de material genético en las células. El objetivo principal de la terapia ex vivo es desarrollar procesos robustos que funcionen con la mayoría de las células de los pacientes o de los donantes, lo cual requiere de un esfuerzo considerablemente mayor para las líneas celulares. El método para introducir nuevo material genético en las células depende de la biología del sistema y la estabilidad deseada de expresión génica. Si un vector retroviral simple, como por ejemplo el virus de la leucemia murina de Molony, se usa para la transducción, las células deben estar en división activa, ya que el ADN del vector sólo se integra al ADN celular durante la replicación. Esto, habitualmente, conduce a una expresión prolongada del producto génico deseado. Los vectores adenovirales, el ADN desnudo o el ADN formulado se pueden introducir en las células que no están en división. No obstante, la expresión génica será transitoria debido a que el ADN introducido por lo general será extracromosómico. El desafío principal en la terapia génica ex vivo consiste en lograr una transducción o transfección eficiente, introduciendo suficiente ADN en la célula antes de que se degrade el ADN. En el caso de la transducción por vectores retrovirales simples, las células son estimuladas por reactivos que las colocan en la fase S (replicación) en el momento de aplicación del vector. En un cultivo de células, la mayoría de los vectores retrovirales permanecen estables durante algunas horas. Dado que la difusión es mínima, sólo una pequeña fracción de partículas virales entra en contacto con las células durante este período. Las siguientes técnicas se pueden usar para incrementar el número de partículas virales que entran en contacto con la célula en un periodo determinado: 1. Maximización de la concentración de partículas virales y minimización del volumen de los medios durante la etapa de transducción 2. Aplicaciones múltiples del virus 3. Centrifugación de partículas de virus en las células 4. Colocación de las células en un filtro y arrastre lento de los medios virales a través del filtro 5. Adición de polímeros que mejoran la unión a los medios. [NOTA-No se recomienda cocultivar las células blanco con el productor viral. Esta técnica aumenta las posibilidades de recombinación y de producción de VCR. Asimismo, cualquier producto para el que se utilice el cocultivo para transducir células humanas sería considerado un xenotrasplante si las células productoras no son de origen humano. El segundo tipo celular, ya sea humano o no, puede ocasionar inflamación.] Cada una de estas técnicas tiene su propio conjunto de consideraciones que se deben tratar a fin de desarrollar un proceso robusto. En la técnica 1, la reducción del volumen durante la transducción provoca un rápido agotamiento del medio, por lo que debe agregarse medio suplementario pocas horas más tarde. En la técnica 2, las células pueden no estar ya en la fase correcta del ciclo celular durante aplicaciones posteriores o pueden haberse tornado refractarias por transformación improductiva durante la aplicación anterior. Las técnicas 3 y 4 pueden funcionar bien en una escala muy pequeña, pero es posible que el número de células que se puede transducir sea insuficiente para obtener una dosis eficaz. En la técnica 5, es posible que los polímeros no provean ningún beneficio debido a que la unión del virus puede requerir de receptores específicos cuya densidad superficial puede ser un factor limitante. Consideraciones y técnicas similares pueden aplicarse a otras preparaciones de virus o de ADN. El problema de la difusión lenta es aún más marcado en el caso de preparaciones de ADN. Factores como el tipo de célula donde se ha producido el vector viral, los medios utilizados para la producción del vector y la pureza del vector pueden tener un efecto significativo sobre la eficacia de la transducción. Aunque algunos métodos pueden no requerir que las células se encuentren en ciclo activo, en la práctica, la mayoría de los procesos requieren que las células sean capaces de replicación debido a las siguientes consideraciones: 1. Las consideraciones de seguridad pueden instruir que sólo las células que expresan el ADN nuevo sean devueltas al paciente, lo cual requiere la selección de estas células. Conforme a lo descrito anteriormente, el método de selección más común emplea un gen resistente a los antibióticos que se cointroduce con el nuevo material genético. 2. Puede ser necesaria la propagación adicional para lograr la dosis terapéutica de células. 3. Las cuestiones económicas, biológicas o técnicas pueden dictar que la etapa de introducción del ADN se lleve a cabo a un número celular bajo y que la población celular deseada se expanda a la dosis requerida. Por lo tanto, para casi todos los casos, se deben desarrollar condiciones que permitan a la célula mantener su capacidad de proliferación. La biología de las células, la tecnología disponible y la economía de procesos determinarán si las células se propagarán antes, después o durante la introducción del nuevo material genético. De hecho, la mayoría de los procesos expanden la población después de la introducción del nuevo gen. La posible administración a pacientes de células que no expresan productivamente el gen depende de la biología de la aplicación, de la dosis requerida en comparación con la capacidad de manejo del sistema de fabricación y, principalmente, de la toxicidad de la población de células no productivas. La selección de la población de células modificadas genéticamente, por lo general, se lleva a cabo utilizando un gen marcador de resistencia a antibióticos, como la neomicina, que se introduce en la célula junto con el material genético nuevo. Para la selección por neomicina, las células en cultivo se tratan con el antibiótico G418, a una concentración y durante un período que han demostrado ser capaces de matar las células de expresión no pro-
1054 (1047) Productos de Terapia Génica/ Información General
USP 39
ductiva, mientras permiten la proliferación de células de expresión productiva. De esta manera, se asume que las células que son resistentes al antibiótico también expresan el ADN de interés. Esta expresión se debe analizar como un requisito de liberación de lote o se debe verificar en una serie de simulacro de pruebas. Debido a que la mayoría de los antibióticos reducen la proliferación celular, puede ser necesario optimizar la composición de los medios de cultivo para la selección y propagación eficientes de las células modificadas genéticamente. Después de la etapa de selección de antibióticos, puede ser necesaria una segunda fase de propagación celular exenta de antibióticos a fin de lograr la dosis deseada y para enjuagar el G418 residual fuera del sistema. El medio seleccionado y el tiempo total que las células están en cultivo pueden ser críticos para mantener la expresión deseada de las funciones diferenciadas originales. Otro problema relacionado con la selección de marcadores es que, generalmente, son genes no humanos. La expresión de estos genes suele inducir una respuesta inmunitaria. El desarrollo del proceso suele realizarse con células de donantes sanos. Es preciso tener en cuenta que en pacientes muy enfermos, puede ser difícil obtener células sanas que puedan ser estimuladas de modo que se repliquen en forma eficiente y sostenida. La fabricación, el procesamiento celular y las cuestiones relacionadas con las pruebas analíticas relevantes para productos derivados de células se analizan en el capítulo (1046).
Formulación de Productos de Terapia Génica Las formulaciones finales para productos de terapia génica aún se encuentran en etapas tempranas de desarrollo y, en la actualidad, la mayoría de los vectores de transferencia génica se almacenan en solución a temperaturas ultra bajas. La formulación exitosa de candidatos para transferencia génica se basa en un entendimiento cabal de las características fisicoquímicas y biológicas únicas de cada sistema de vectores. Los factores tales como el pH de la solución, el contenido iónico y la osmolaridad influyen en la estabilidad térmica de los vectores virales y no virales. Los carbohidratos orgánicos tales como manito!, sorbitol, sacarosa y trehalosa han sido incorporados en las preparaciones para evitar la disrupción de la conformación nativa del vector en solución, durante el proceso de congelación-descongelación y durante la liofilización. Los aminoácidos tales como arginina y leucina han sido incorporados en formulaciones por sus efectos amortiguadores y para evitar la agregación. Los surfactantes tales como Tweens, Spans y Pluronics han demostrado ser efectivos para evitar la agregación, pero este efecto es hasta cierto punto específico del vector debido a que algunos de los productos del vector se rompen fácilmente con estos agentes. Asmismo, las proteínas de lípidos, de polímeros y extrañas (albúmina humana y gelatina) se han incorporado en muchas preparaciones de vectores dada su capacidad para evitar la pérdida del vector derivada de la interacción directa con superficies farmacéuticas y durante los ciclos de congelación-descongelación. Antes de iniciar un programa formal de selección de formulaciones para un vector, se deben considerar los siguientes factores. Se debe establecer la dosis requerida y/o la concentración de almacenamiento del producto final, así como los aspectos específicos del sistema de envase y cierre y/o de administración. Además, se debe contar con métodos analíticos para evaluar la potencia e identificar degradantes. Finalmente, deben definirse las expectativas de la formulación. Algunos criterios pragmáticos para el diseño y la selección de formulaciones de vacunas para su uso a nivel mundial son: (a) el producto final debe presentarse en una formulación que alcance una vida útil de 18 a 36 meses cuando se almacena a una temperatura de 2º-8º o mayor, (b) la formulación debe tener un perfil de estabilidad aceptable a temperatura ambiente que cubra el almacenamiento a corto plazo y el transporte en el campo, (c) debe proteger adecuadamente al vector de daños durante el ciclo de congelación-descongelación y (d) debe constar de reactivos que sean farmacéuticamente aceptables y dentro de las concentraciones fisiológicamente aceptables. Los cambios en la formulación durante el desarrollo clínico se deben respaldar con estudios preclínicos y con datos de estabilidad. Para esto, se debe invertir tiempo suficiente para generar planes para cumplir con este requisito. A la fecha, es poco el trabajo descrito en el área de desarrollo de formulaciones de vectores retrovirales con aditivos aprobados para uso humano. El esfuerzo más significativo para desarrollar formulaciones estables para transferencia génica se ha dado con adenovirus recombinantes. En los últimos tiempos, la identificación de mecanismos mediante los cuales los adenovirus recombinantes se degradan en solución ha llevado al desarrollo de diversas formulaciones líquidas que estabilizan el virus por un periodo de hasta 18 meses a 4º. Los virus asociados con adenovirus se consideran como uno de los vectores virales más estables. Se ha documentado que este virus permanece estable durante aproximadamente 4 meses en solución salina amortiguada con fosfatos a 4º. La adición de crioprotectores y surfactantes previene la agregación de partículas de virus y extiende la vida útil a un año. Asimismo, se han descrito formulaciones liofilizadas de ambos adenovirus y del VM con vidas útiles de siete años a temperatura ambiente. Aunque se ha demostrado que los vectores no virales son generalmente robustos en soluciones amortiguadoras estándar a 4º, su estabilidad se puede ver ampliamente influenciada por componentes extraños incluidos para promover la dirección hacia el gen. Se debe considerar la naturaleza de dichos componentes al momento de desarrollar protocolos y estrategias de estabilidad (ver más adelante).
PREPARACIÓN V ADMINISTRACIÓN IN SITU Pueden ser necesarias una o más modificaciones del producto o etapas preparativas antes de la administración del producto de terapia génica al paciente. Estas modificaciones o etapas a menudo se realizan cerca del momento de la administración y, por lo tanto, se llevan a cabo en condiciones que quedan fuera del control del fabricante original. La naturaleza de estas modificaciones depende en gran medida de las características del producto en relación con una aplicación particular. Estas incluyen
USP 39
Información General/ (1047) Productos de Terapia Génica 1055
la descongelación, el lavado o la filtración para eliminar materiales indeseados relacionados con la fabricación del producto e incluyen además el espacio físico definido con controles ambientales apropiados, personal capacitado, procedimientos operativos estándar detallados y un programa de calidad integral. La naturaleza única e irreemplazable de muchos productos de terapia génica, p.ej., células modificadas genéticamente, muchos de los cuales se han originado de una fuente tisular autóloga o alogénica seleccionada, genera consideraciones especiales para fabricación, liberación y administración del producto. Las cuestiones relacionadas con la administración de productos derivados de células se tratan a detalle en el capítulo (1046).
Preparación In Situ MANIPULACIÓN DEL PRODUCTO Antes de la administración, la preparación in situ del producto de terapia génica puede requerir de una o más manipulaciones, incluidas las siguientes: • Cambio en el envase final-El producto fabricado puede haber sido almacenado o transportado en un envase pero puede ser necesario transferirlo a un envase distinto para su administración. • Cambio en el estado físico o la temperatura-Puede ser necesario descongelar un producto o entibiarlo del estado refrigerado. • Cambio en la solución o suspensión-Puede ser necesario disolver, diluir o suspender un producto en un líquido. • Adición a un material estructural biocompatible-Puede ser necesario combinar un producto de terapia génica con una matriz o tejido estructural vivo, natural o sintético. Entre los ejemplos de material para matriz se incluyen fibras huecas, láminas fibrosas, geles, tapones, cápsulas, esponjas o gránulos. • Mezcla o preparación magistral con otros materiales no estructurales-Puede ser necesario mezclar o preparar magistralmente un producto con fármacos, citoquinas, productos biológicos u otros materiales no estructurales. • Filtración o lavado-Los materiales no deseados en el producto fabricado tales como partículas, desechos celulares, metabolitos o compuestos remanentes de manipulaciones previas pueden requerir de etapas de lavado o filtración. • Muestreo-Puede ser necesario el muestreo del producto final inmediatamente antes de la administración para algunos protocolos clínicos. REQUISITOS DE LAS INSTALACIONES Los requisitos de las instalaciones donde se llevan a cabo los procedimientos de preparación in situ o la administración de productos de terapia génica dependen de la naturaleza de los productos, sus aplicaciones y las manipulaciones necesarias. El principal determinante de las características de las instalaciones es el grado de riesgo de contaminación microbiana relacionado con cada paso. La definición de condiciones de alto y bajo riesgo se puede establecer tomando en cuenta un marco similar al definido para Preparaciones Magistrales Estériles de Nivel de Riesgo Bajo (PMEs) y PMEs de Nivel de Riesgo Alto en la sección Niveles de Riesgo de Contaminación Microbiana en las PME del capítulo Preparación Magistral-Preparaciones Estériles (797). LIBERACIÓN DEL PRODUCTO FINAL Los productos de terapia génica que se someten a etapas de preparación o manipulaciones in situ deben estar sujetas a verificaciones o pruebas adecuadas para asegurarse de que cumplan con las especificaciones de calidad antes de ser liberados para su administración a pacientes. La naturaleza y el grado de las manipulaciones determinarán si deben agregarse requisitos de liberación o especificaciones fundamentales a los ya exigidos inmediatamente después de la fabricación inicial. Los requisitos previos a la liberación incluyen: 1. La inspección física del producto, que, por lo general, incluye medidas para garantizar que el producto tenga el aspecto adecuado en cuanto a color, turbidez, partículas o materia extraña, integridad del envase, temperatura del producto y etiquetado apropiado y exacto; 2. Revisión de los registros de los procesos 3. Para productos específicos para un solo paciente, inspección administrativa del etiquetado del producto o de los registros relativos a la identidad del receptor previsto Además, los productos considerados como productos de alto riesgo de acuerdo con la descripción del capítulo (797) deben someterse a análisis de producto adicionales. Para todos los productos de alto riesgo, se deben definir y efectuar ensayos de calidad que contemplen la identidad, la potencia y la pureza de los principios activos. Los productos de alto riesgo en la categoría 11 se deben someter a pruebas de esterilidad y de endotoxinas.
1056 (1047) Productos de Terapia Génica/ Información General
USP 39
Administración a Pacientes REQUISITOS PREVIOS A LA ADMINISTRACIÓN Dependiendo de la aplicación de terapia génica específica, el personal capacitado para el cuidado del paciente debe completar etapas para preparar al paciente para la administración del producto. El objetivo de estos pasos es asegurar que el producto origine el resultado terapéutico previsto y minimizar el riesgo de efectos adversos. Los aspectos pertinentes a la administración de productos derivados de células se tratan en el capítulo (1046). Por lo general, se debe llevar a cabo una reevaluación extensa de la condición general del paciente y de su aptitud para la terapia cerca del momento de la administración del producto. Por lo general, esta evaluación incluye el historial clínico del paciente, una exploración física y estudios de laboratorio tales como hemogramas y analítica. Además, el personal puede obtener mediciones funcionales y físicas basales, análisis de laboratorio o estudios de diagnóstico por imágenes correspondientes a la aplicación específica. Algunos ejemplos de estos estudios son las evaluaciones de la función pulmonar para un tratamiento destinado a mejorarla, la medición de los niveles en sangre de una enzima que es el producto génico en una aplicación de terapia génica y el diagnóstico por imágenes de resonancia magnética previo a las terapias contra el cáncer. Pueden ser necesarias diversas intervenciones al paciente relacionadas con la vía de administración antes de la administración del producto. Para terapias que requieren de administración intravenosa, puede ser necesario colocar un catéter venoso central a pacientes con acceso venoso deficiente. Para aplicaciones en las que se implantan en el paciente células modificadas genéticamente o matrices combinadas con células, puede ser necesario preparar el sitio del implante en la sala de operaciones, lo cual puede requerir de un acceso quirúrgico al sitio, eliminando tejido degenerado o dañado, cortando el tejido adyacente para acomodar el implante y eliminando el tejido de un sitio secundario que se usará para sujetar o sostener el implante. Por ejemplo, si se implantan productos para la cicatrización de heridas, es fundamental que el sitio para el injerto no esté infectado y que el lecho de la herida esté bien preparado. Cuando las células modificadas genéticamente están destinadas a corregir defectos del cartílago, se debe preparar el sitio dañado de manera que las células se puedan aplicar en un compartimiento impermeable al agua. Para aplicaciones que implican la administración directa del producto a un sistema orgánico (por ejemplo, el sistema broncoalveolar) o red vascular (por ejemplo, las arterias coronarias), puede ser necesario acceder al sitio mediante endoscopia o cirugía. Además de estos pasos, siempre se debe evaluar cuidadosamente la necesidad de anestesia y medicación previa adecuadas antes de administrar el producto. El examen del paciente antes de la administración también debe evaluar los tratamientos concomitantes que puedan interactuar con el producto de terapia génica y modificar sus efectos. Algunos tratamientos pueden considerarse auxiliares de la terapia génica, como las citoquinas que promueven la proliferación o la diferenciación del tejido infundido o implantado. Se deben analizar otros fármacos frecuentes, como antibióticos, agentes antineoplásicos, anticoagulantes y antiinflamatorios, y determinar sus posibles efectos sobre la eficacia del producto de terapia génica. TRATAMIENTO DEL PACIENTE Algunos productos de terapia génica son específicos para el paciente debido a que se fabrican a partir de una fuente tisular seleccionada, como tejido autólogo, alógeno seleccionado o xenógeno. Ciertos productos específicos del paciente tienen un potencial definido para el beneficio o daño por inmunorreactividad. Se deben establecer sistemas para impedir la administración de un producto de este tipo al paciente equivocado. Los sistemas recomendados incluyen procesos similares a los empleados para administrar productos sanguíneos humanos, y dos personas, por lo menos, deben dedicar especial atención a la identificación correcta del paciente y al producto específico para el paciente inmediatamente antes de la administración. Estas cuestiones se tratan a detalle en el capítulo (1046). Los productos de terapia génica se pueden administrar mediante diversas rutas, las cuales incluyen inyección parenteral, inhalación y vías gastrointestinales. Otras posibilidades son su aplicación directa en la vasculatura regional, órganos, tejidos o cavidades corporales mediante agujas o catéteres o bien después de la exposición quirúrgica del tejido. Aunque la administración parenteral se puede llevar a cabo en instalaciones habituales para pacientes ambulatorios o internos, las otras vías pueden exigir lugares especializados, como una sala de operaciones o sala de endoscopia asépticas. En todos los casos, deben existir procedimientos operativos estándar y un programa de calidad para garantizar que el producto se administre de la manera prevista. MONITOREO DEL PACIENTE POSTERIOR A LA ADMINISTRACIÓN Se debe contar con políticas y procedimientos escritos para monitorear la evolución de los pacientes y manejar los informes de efectos adversos. El examen de evolución del paciente debe incluir indicadores capaces de detectar errores o problemas relacionados con todo el proceso de fabricación, con especial atención a la manipulación, almacenamiento o transporte después de la fabricación inicial del producto. La gestión de las reacciones adversas debe incorporar procedimientos para asegurar el examen médico rápido y el tratamiento de pacientes con posibles efectos adversos, así como un sistema para informar y evaluar los efectos adversos que puedan señalar un posible defecto en el producto administrado. Los procedimientos de informe incluyen suministrar detalles requeridos para los programas de informe de eventos adversos federales, estatales o de USP.
Información General/ (1047) Productos de Terapia Génica 1057
USP 39
Se deben implementar procedimientos de seguimiento y monitoreo para pacientes que han recibido vectores de terapia génica o terapias génicas ex vivo. Siempre que sea relevante y posible de evaluar, se deben controlar la distribución biológica y persistencia in vivo de vectores o células modificadas genéticamente. Cuando los vectores se administran directamente, la localización en la línea germinal puede ser un problema. Si bien es posible recurrir a estudios preclínicos para abordar este problema, se puede obtener información útil mediante el seguimiento del paciente. Cuando se administra un vector retroviral, se debe controlar a los pacientes para detectar si los retrovirus son competentes para la replicación (RCR, por sus siglas en inglés), de acuerdo con el documento Guidance for lndustry: Supplemental Guidance on Testing for Replication Competent Retrovirus in Retroviral Vector-Based Gene Therapy Products and During Follow-up of Patients in Clinical Trials Using Retroviral Vectors (Guía para la Industria: Guía Complementaria de Pruebas para Retrovirus Competentes para la Replicación en Productos de Terapia Génica Basada en Vectores Retrovirales y Durante el Seguimiento de Pacientes en Estudios Clínicos con Vectores Retrovirales) de la FDA (octubre de 2000). Lo anterior implica el monitoreo activo durante el primer año y posteriormente archivar las muestras del paciente si no se detectan RCR. Los sistemas de bases de datos para cotejar y rastrear los resultados de monitoreo del paciente son esenciales para gestionar esta información. Los registros nacionales o los datos publicados deben tomarse en cuenta para establecer la seguridad colectiva de la terapia génica.
MÉTODOS ANALÍTICOS La complejidad y el alcance de los productos de terapia génica se reflejan en la amplia variedad de procedimientos analíticos y sus métodos, los cuales se emplean para evaluar la calidad del producto. Los productos de terapia génica aprobados deben cumplir con las secciones correspondientes del Título 21 del CFR 211 y 61 O para garantizar su identidad, dosis, potencia, pureza y seguridad. La guía específica para la identificación, el desarrollo y la validación de metodologías analíticas para respaldar la caracterización de bancos de células y virus, la liberación del producto final y los estudios de estabilidad actualmente se provee en las pautas de la FDA para fabricación y análisis de productos de terapia génica (ver el Apéndice); en Validación de Procedimientos Farmacopeicos (1225); y las pautas Q2(R1) y Q6B de la ICH. La mayoría de los métodos analíticos específicos para productos de terapia génica no han sido estandarizados. Incluso pruebas bien definidas, como las descritas en Pruebas de Esterilidad (71 ), pueden no ser aplicables directamente a ciertos productos de terapia génica. Es posible que no se disponga de grandes cantidades de material clínico durante el desarrollo clínico inicial de algunos de estos productos. Algunas de las pruebas requeridas (p.ej. esterilidad) pueden requerir de modificaciones. Se recomienda consultar con las autoridades reglamentarias. La Tabla 5 ofrece una visión general de los parámetros de prueba para productos específicos para los componentes biológicos y métodos o enfoques generales usados para cumplir con los requisitos de las pruebas para productos de terapia génica celular modificados genéticamente, virales y no virales. El análisis de productos de terapia génica se basa, en gran medida, en valoraciones biológicas, pero también se recurre a metodologías desarrolladas para productos obtenidos por biotecnología. El objetivo de esta sección es reseñar los tipos de métodos y sus aplicaciones específicas respecto de las pruebas de caracterización, estabilidad y liberación de productos. La validación del proceso puede reducir la necesidad de ciertas pruebas específicas de liberación de lotes. El desarrollo del producto debe incluir la creación de materiales de referencia adecuados y estándares para productos de terapia génica celular modificados genéticamente, virales y no virales. Los materiales de referencia deben estar bien caracterizados con el fin de proporcionar continuidad entre los estándares a lo largo del tiempo. En los productos de terapia celular y génica modificados genéticamente, el material de referencia puede ser un tejido sustituto o producto simulado. Los materiales de referencia se tratan brevemente en la Guidance for lndustry: Potency Tests for Ce/Ju/ar and Gene Therapy Products (Guía para la Industria: Pruebas de Potencia Para Productos de Terapia Celular y Génica) de la FDA. Los productos de terapia génica celular modificados genéticamente, virales y no virales pueden requerir de un método de liberación rápida cuando presentan una vida útil limitada (ver Productos Derivados de Células y Tejidos (l 046)). Este método no suele aplicarse a productos de terapia génica viral y no viral, porque son suficientemente estables para completar las pruebas antes de su liberación. Algunos productos de terapia génica no virales también tienen vidas útiles limitadas. En estos casos, se analizan los componentes individuales antes de la liberación y no se analiza el complejo formulado. La formación y estabilidad del complejo de terapia génica no viral formulado se establece mediante estudios de validación durante el desarrollo del producto. Según se especifica en el CFR, se deben conservar muestras de productos después de completar las pruebas de liberación de producto. Si se emplean estrategias de liberación rápida, se deben conservar muestras adicionales para poder reevaluar la calidad del producto con metodologías de prueba alternativas o tradicionales, si fuera necesario. Tabla 5. Pruebas Analíticas para Productos Biológicos de Terapia Génica y Celular Prueba
Producto de Terapia Génica o Celular Genéticamente Modificado
Identidad de la Sustancia Biológica
• Determinación del marcador de superficie •Especies • Morfología •Valoración Biológica • Marcador Bioquímico
Productos de Terapia Génica Viral
No viral
-Mapeo por enzimas de restricción
-PCR -lnmunoensayo para gen expresado -Secuenciación
-Mapeo por enzimas de restricción
-PCR -lnmunoensayo para gen expresado -Secuenciación
USP 39
1058 (1047) Productos de Terapia Génica/ Información General
Tabla 5. Pruebas Analíticas para Productos Biológicos de Terapia Génica y Celular (Continuación) Productos de Terapia Génica
Producto de Terapia Génica o Celular Genéticamente Modificado
Viral
Dosis
• Número de células viables • Enumeración de la población celular específica •ADN total • Proteína total
-Número de partículas -Unidades de transducción (ensa- -Peso del ADN plasmídico yo de hibridación de ADN) -Valoración por HPLC o electroforesis ca-Proteína total pilar para determinar el peso del complejo -Ensayo por HPLC usando estánformulado usando estándares de referencia dares de referencia autentificados autentificados
Potencia
•Número de células viables (células destinadas a reparación estructural) •Valoraciones biológicas - Ensayo de formación de colonias - Función del gen expresado - Inducción de efecto secundario (p.ej., inducción del antígeno leucocitario humano (HLA, por sus siglas en inglés), secreción de citoquinas y regulación del marcador de superficie)
-Función del gen expresado (inducción de efecto secundario y otras valoraciones biológicas)
-Función del gen expresado (inducción de efecto secundario y otras valoraciones biológicas)
Pureza
• Porcentaje de células viables • Porcentaje de células transducidas • Porcentaje de células con marcadores de superficie específicos •Contaminantes del proceso (p.ej., suero)
-ADN residual de células anfitrionas -Contaminantes del proceso (p.ej., suero y cloruro de cesio) -Virus colaborador residual -Cociente de densidad óptica -Proteínas residuales de células anfitrionas -Perfil de proteínas virales (valoración por HPLC para partículas defectuosas o inmaduras) -ARN residual
-Porcentaje de forma física específica (p.ej., porcentaje de superenrollado) -ADN residual de células anfitrionas -ARN residual -Proteínas residuales de células anfitrionas -Disolventes residuales -Cociente de densidad óptica -Contaminantes del proceso (p.ej., cloruro de cesio)
Seguridad
• Micoplasma • Esterilidad • Pirógenos y endotoxinas •Virus adventicios •Virus residuales •Vector competente para la replicación
-Seguridad general -Esterilidad -Pirógenos y endotoxinas -Virus adventicios -VCR
-Micoplasma -Esterilidad -Pirógenos y endotoxinas
Prueba
Novlral
Aspectos sobre el Muestreo El muestreo para las pruebas de liberación de lote se debe basar en la potencial distribución para el parámetro analizado. Ver Desarrollo del Protocolo de Estabilidad en Estabilidad (más adelante) para consideraciones adicionales. Se deben conservar muestras de cada lote ante la posibilidad de que surjan problemas de seguridad o calidad con un lote. Aunque la vida útil del producto sea muy breve, se pueden utilizar estas muestras conservadas para detectar impurezas y otras sustancias. Se resalta la necesidad de un buen diseño del esquema de obtención de muestras en la prueba de seguridad de agentes adventicios o en la evaluación de VCR para productos de terapia génica celular o viral modificados genéticamente. En estos casos, la validación del proceso ayuda a determinar el diseño apropiado de muestreo estadísticamente fundamentado.
Seguridad Las pruebas de seguridad para productos de terapia génica tienen tres objetivos: (1) detectar contaminación por agentes adventicios durante el procesamiento del producto, (2) prevenir el uso de líneas celulares empaquetadoras y plásmidos que podrían permitir la recombinación genética entre vectores y las líneas celulares empaquetadoras o plásmidos-o entre los mismos vectores y (3) analizar.el producto final para asegurar un nivel seguro de variantes genéticas y/o estructurales indeseadas u otros virus usados en el procesamiento. Las medidas primarias para evaluar la seguridad son la realización de ensayos biológicos para medir agentes adventicios directamente. También se utilizan valoraciones con técnicas de biología molecular para medir ADN o ARN de agentes adventicios o para detectar variantes genéticas no deseadas. Aunque los vectores vivos modificados genéticamente por ingeniería están oficialmente fuera de su alcance, se debe consultar la información detallada disponible en la pauta QSA de la ICH, presentada en el capítulo (1050), puesto que los principios son aplicables. PRODUCTOS DE TERAPIA GÉNICA VIRAL Una de las cuestiones primarias de seguridad relacionada con vectores virales usados para terapia génica es la aparición de variantes genéticas no deseadas, de las cuales, el tipo más crítico y probablemente mejor estudiado, es el VCR. El VCR está
USP 39
Información General/ (1047) Productos de Terapia Génica 1059
definido de manera más clara para vectores virales incompetentes para la replicación, pero para virus condicionalmente competentes para la replicación se refiere a variantes genéticas no deseadas que han perdido selectividad hacia las células blanco, generando así inquietudes sobre la seguridad. Independientemente del virus, estos problemas se fundan en que no siempre es posible prever la patogenicidad de un virus contaminante para una vía específica de administración, en especial si no es la vía habitual de infección o si los seres humanos no son el anfitrión natural para el virus. Se conoce la patogenia de la infección por adenovirus salvaje, pero no siempre es útil para predecir la patogenia por las vías de administración de vectores adenovirales recombinantes. En la actualidad, para vectores adenovirales incompetentes para la replicación, se considera aceptable un límite de un ACR por 3 x 10 10 partículas virales (ver el documento Guidance for FDA Reviewers and Sponsors: Content and Review of Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) lnformation for Human Gene Therapy lnvestigational New Drug Applicatíons (INDs)
(Guía para Revisores y Auspiciadores de la FDA: Contenido y Revisión de Información Química, de Fabricación y Control (CMC) para Nuevas Aplicaciones Farmacológicas lnvestigativas (IND) de Terapia Génica en Humanos]. Por lo regular, los niveles de ACR se determinan mediante un ensayo basado en células que permite amplificar el ACR al tiempo que evita la replicación del producto. La línea celular que se usa más a menudo para amplificar y detectar ACR es la A549. Sin embargo, algunos vectores adenovirales recombinantes expresan genes terapéuticos que interfieren en el análisis con células A549. En tales casos, se usan líneas bicelulares basadas en valoraciones biológicas. La primera línea de células se selecciona basándose en la resitencia a los efectos de expresión del transgén y con pasaje subsiguiente de lisado celular o sobrenadante sobre células A549 para amplificación y detección del ACR. El ACR a menudo se detecta mediante observación visual del efectos citopático, pero también se puede detectar en el cultivo de células A549 por métodos inmunológicos o basados en PCR. La cuantificación del nivel de ACR se basa en la cantidad de muestra analizada y el límite de detección de la valoración. Por lo general, las valoraciones biológicas de ACR se validan como capaces de detectar 1 unidad formadora de placa o unidad infecciosa de ACR en la muestra de prueba en una amplia gama de tamaños de muestras de prueba. Los tamaños de muestras de prueba pueden variar, pero por lo regular se basan en el límite de aceptación para ACR de la FDA. Para verificar los límites de detección, se deben incluir como parte de la prueba controles con cantidades agregadas conocidas, incluso con valoraciones validadas. Para adenovirus recombinantes producidos con células HEK293, la detección de ACR por PCR en los productos finales o la progenie de un virus amplificada en las células HEK293 puede alterarse por la detección de ADN residual de células anfitrionas HEK293 (detección de la región El). Sin embargo, las valoraciones por PCR se pueden diseñar para cuantificar específicamente la contaminación del ADN de células anfitrionas y hacerlas específicas para formas particulares de ACR de crecimiento lento. Las ensayos cuantitativos por PCR se pueden utilizar junto con un método basado en células para cuantificar los ACR de manera precisa. Cuando se detecta una muestra de prueba positiva, la identidad del ACR suele confirmarse mediante un análisis por PCR. Lo anterior descarta la posibilidad de que la contaminación del ensayo con adenovirus salvajes exógenos u otros agentes adventicios sea responsable del resultado positivo. Para adenovirus condicionalmente competentes para la replicación u otros vectores virales competentes para la replicación, el análisis de VCR o variantes genéticas indeseadas a menudo es más complicado y específico del vector. Por lo general, una o dos líneas celulares no permisivas que no son células blanco se infectan con el virus competente para la replicación con la intención de producir la progenie del virus. Para poder generar una cantidad suficiente de población de progenie para su análisis, los analistas someten a la infección a múltiples pasajes y a un tiempo de cultivo prolongado. Se han usado dos líneas celulares de fibroblastos normales fáciles de cultivar, la Wl-38 y la MRC-5, como el modelo de líneas celulares no permisivas para detectar ACR en productos de adenovirus competentes para la replicación. Incluso después de múltiples pasajes en las líneas celulares no permisivas, puede ser necesario amplificar la progenie (la cual tiende a presentarse en cantidades diminutas) en líneas celulares permisivas o empaquetadoras hasta una cantidad suficiente para análisis subsiguiente. La progenie resultante debe analizarse para determinar cambios en la selectividad biológica y en la composición genética. Por lo regular, la caracterización genética de la población de progenie incluye el mapeo por enzimas de restricción seguido de transferencia Southern (blotting), PCR o secuenciación de nucleótidos. Después de identificar los elementos genéticos exclusivos del VCR o las variaciones genéticas indeseadas, se pueden diseñar ensayos cuantitativos por PCR para monitorear el nivel de VCR después de la amplificación en líneas de células no permisivas o, en ocasiones, si la sensibilidad es adecuada, directamente en el producto final sin amplificación biológica. Se recomienda el uso de un control de cantidades agregadas conocidas en la valoración biológica para detectar VCR, aunque puede no ser aplicable a todos los casos. En la actualidad no existe un límite aceptable especificado de ARC para adenovirus condicionalmente competentes para la replicación, aunque se ha informado sobre la seguridad clínica para una aplicación oncológica con varios miles de ACR por dosis. Para vectores retrovirales, es necesario el análisis de RCR para bancos de células, lotes de producción de vectores virales y cualquier lote de producto resultante ex vivo (ver Guídance for Jndustry: Supplemental Guídance on Testíng for Replícatíon-Competent Retrovírus in Retrovíral Vector-Based Gene Therapy Products and Duríng Follow-up of Patíents in Clínica/ Tríals Usíng Retrovíra/ Vectors [Guía para la Industria: Guía Complementaria de Pruebas para Retrovirus Competentes para la Replicación en Produc-
tos de Terapia Génica Basada en Vectores Retrovirales y Durante el Seguimiento de Pacientes en Estudios Clínicos con Vectores Retrovirales] de la FDA). Se han diseñado valoraciones estándar para detectar VLM competente para la replicación. Se desconoce la patogenia y la potencial toxicidad a largo plazo del VLM anfotrópico de bajo nivel en seres humanos. Los métodos habituales para detectar RCR incluyen una amplificación del título viral aplicando el producto a una línea celular que puede replicarse, como Mus dunní. Debido a que la infección se ve limitada por la capacidad de un virus de llegar a las células mediante movimiento browniano, se pueden usar procedimientos (p.ej., centrifugación y filtración) que físicamente ponen en contacto al virus con las células a fin de mejorar la detección. Sin embargo, el vector recombinante de título alto puede interferir con la
1060 (1047) Productos de Terapia Génica/ Información General
USP 39
detección de RCR de bajo nivel, y dichos métodos pueden aumentar esta interferencia. Las células infectadas se someten a varios pasajes para permitir la replicación viral. El medio de cultivo se cosecha al final del período de cultivo y se detecta RCR mediante una línea celular indicadora. Si el producto es un VLM anfotrópico, se puede hallar RCR con un ensayo de PG4 S+Lbasado en células felinas, un ensayo MiCI S+L- basado en células de visón o un ensayo de rescate con marcadores. En los ensayos S+L-, el RCR expresa proteínas que conducen a la transformación y la posterior formación de placas en la monocapa. En un ensayo de rescate con marcadores, el RCR infecta una línea celular que expresa un vector retroviral que codifica un gen marcador, como la f3 -galactosidasa, resistencia a fármacos o una proteína fluorescente. El vector es empaquetado por las proteínas que le son suministradas en trans por el RCR. El sobrenadante potencialmente cargado con vectores se transfiere a células blanco vírgenes que se analizan para determinar la expresión del vector marcador. El análisis de RCR se lleva a cabo mediante cocultivo de la línea de células o la amplificación del sobrenadante cargado de vectores con una línea de células que permite la replicación de RCR, generalmente M. dunni, durante varios pasajes. El medio de cultivo se cosecha al final de este proceso de cocultivo y se aplica a una línea de células indicadoras apropiada, como se ha descrito anteriormente. Es importante señalar que se pueden generar artefactos durante el ensayo de cocultivo por la expresión de un virus endógeno en la línea de células permisivas o mediante fusión, si la línea de células productoras del vector se cultiva directamente con una línea de células de rescate con marcadores. Asimismo, el cocultivo puede no ser posible para productos celulares ex vivo con requisitos de cultivo específicos o vidas de cultivo limitadas. No se especifican las metodologías para analizar la presencia de RCR en crudo, productos de vectores finales o a granel. La FDA ha presentado a la American Type Culture Collection (Centro Estadounidense de Colecciones de Cultivos o ATCC) un estándar de referencia de un VLM híbrido anfotrópico. A este depósito viral se le ha asignado un título de marcación, que debe emplearse en la validación del ensayo. La validación del método debe demostrar la capacidad de detectar, de manera reproducible, una única partícula de RCR en tipos individuales de productos, porque el producto y sus impurezas pueden interferir en la detección del RCR. En la actualidad, no hay límites aceptables para la contaminación de productos con RCR. No se pueden usar en humanos lotes de productos que contengan RCR. No se han desarrollado estándares de referencia para evaluar VCR en otros vectores virales, como el VLM ecotrópico, xenotrópico o seudotipado, adenovirus y lentivirus. El material de referencia de adenovirus, que consiste en adenovirus humano salvaje tipo 5, se ha usado como control de cantidades agregadas conocidas y durante la validación de ensayos de ACR, pero ésta podría no aplicar para todos los ensayo de ACR. La amplificación y detección de VIH competente para la replicación, especialmente sus variaciones seudotipificadas, pueden requerir procedimientos de contención y manipulación especiales. Los análisis de seguridad adicionales por lo general se centran en métodos similares a los descritos en los capítulos Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo (88), Pruebas de Esterilidad-Productos Biológicos (71 ). Para vectores para terapias génicas virales producidas con una línea celular humana, se recomiendan las valoraciones biológicas con agentes adventicios in vitro utilizando tres líneas celulares. Para vectores adenovirales, también se recomiendan las pruebas específicas para virus asociados con adenovirus. Para virus asociados con adenovirus, se recomiendan pruebas específicas para adenovirus y virus del herpes. El material para análisis se debe derivar de la etapa de fabricación que ofrece la mayor posibilidad de detección, que puede ser en el producto previo al granel (p.ej., fermentación en etapa tardía), a granel o final. PRODUCTOS DE TERAPIA GÉNICA NO VIRAL El análisis de seguridad por lo general se centra en métodos similares a los descritos en los capítulos (88) y (71 ). Las pruebas de seguridad deberían realizarse en material formulado no viral. Si la vida útil del producto no viral formulado es muy corta, los componentes deben analizarse de manera individual. Las pruebas de seguridad para variaciones genéticas no deseadas que pueden surgir durante el proceso de fabricación en productos de terapia génica no viral son similares a las del análisis de VCR para vectores virales pero con más consideraciones específicas para los vectores. Por lo general, los métodos basados en biología molecular se aplican al producto final para probar las variaciones. Cuando la estabilidad genética se establece mediante validación del proceso, los ensayos para monitorear los niveles de variaciones genéticas no deseadas se pueden limitar al mapeo por enzimas de restricción seguido por la confirmación adicional de elementos genéticos críticos (tal como transgenes o elementos reglamentarios) mediante PCR o transferencia Southern.
Ensayos de Determinación de Dosis Al ensayo que mide, con precisión, la cantidad de producto se le denomina ensayo de determinación de dosis y se selecciona basándose en su exactitud y precisión. Un ensayo que mide la actividad terapéutica de un producto recibe el nombre de valoración de potencia y se diseña para medir la función del producto. El diseño del ensayo depende del tipo de producto. En el caso de medicamentos químicos y proteicos, los ensayos que determinan la cantidad de fármaco (dosis) se llaman valoraciones de contenido. La dosis de producto se puede definir como la concentración o cantidad del medicamento administrado al paciente y por lo general se mide como la masa de producto. La concentración de partículas es una medición comúnmente usada para dosis de producto de vectores virales. Se puede medir con ensayos físicos, biofísicos o celulares in vitro. Por ejemplo, es posible cuantificar las partículas adenovirales purificadas empleando la densidad óptica de una solución viral en solución de dodecil sulfato de sodio (SOS, por sus siglas en inglés) al O, 1% (p/v), a 260 nm, porque se ha publicado una relación entre la absorción y la concentración de partículas de adenovi-
USP 39
Información General/ (1047) Productos de Terapia Génica 1061
rus. La concentración de número de partículas es equivalente al producto de la absorbancia a 260 nm en una celda de 1 cm, el factor de dilución y l, 1 x 1012 partículas. Un método que se ha estandarizado para determinar la concentración de partículas es la integración del área del pico viral de absorbancia a 260 nm y/o 280 nm contra un estándar de referencia autenticado en un ensayo por cromatografía líquida de alta resolución basada en resina de intercambio aniónico (HPLC). En comparación con el método de densidad óptica, el método por HPLC presenta como ventaja la eliminación de la interferencia de ADN libre y/o proteínas de la cápside en la cuantificación de partículas virales. El material de referencia de adenovirus (ARM, por sus siglas en inglés) de la ATCC tiene una concentración de partículas determinada por HPLC derivada de una colaboración a gran escala que implicó a muchos laboratorios. Siempre que sea posible, se debe usar el ARM para calibrar el método de HPLC interno y el material de referencia. La concentración de virus también se puede evaluar midiendo proteínas estructurales seleccionadas con masas moleculares conocidas y números de copias conocidos dentro del virión. Para este método, el virus debe lisarse y las proteínas estructurales deben separarse usando un procedimiento cromatográfico apropiado de alta recuperación (p.ej., HPLC de fase reversa). La separación cromatográfica y la identidad y la pureza de la proteína estructural seleccionada deben verificarse durante la validación de la valoración con métodos, como electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE), secuenciación de péptidos y espectroscopía de masas. Las proteínas estructurales seleccionadas pueden ser cuantificadas, por ejemplo, integrando los picos cromatográficos a 214 nm y comparando el área con la de un estándar de referencia autenticado. Luego se puede calcular la concentración viral sobre la base de la masa molecular, el número de copias y la masa medida de proteína. Cabe señalar que es posible estimar simultáneamente la concentración viral a partir de múltiples proteínas estructurales, lo que permite utilizar esta valoración en preparados de virus relativamente impuros. Este método ha sido aplicado a adenovirus y debería ser aplicable a otros tipos de vectores virales. Los métodos biofísicos para determinar el número de partículas incluyen la cuantificación directa del ácido nucleico del vector mediante hibridación con sonda radiomarcada y la cuantificación indirecta mediante amplificación de un molde de ácido nucleico (p.ej., PCR y RT-PCR) o mediante amplificación de señal (p.ej., ADN de cadena ramificada usando hibridación con sonda múltiple). Cuando no se dispuso de métodos biofísicos, se han usado valoraciones biológicas que miden el título de vector génico. Estas incluyen infección, transfección o transducción de una línea celular susceptible in vitro, seguida de alguna medición de la respuesta del producto. Los métodos para cuantificar o estimar el número de episodios de infección, transfección o transducción incluyen valoraciones de unidades formadoras de placa, valoraciones de dosis infecciosa en cultivo de tejidos basadas en efectos citopáticos de 50% (TCID 50) o detección inmunofluorescente de una proteína expresada del vector o un ensayo cuantitativo de hibridación de ADN. Los ejemplos incluyen: Para productos de terapia génica adenoviral competente para la replicación, el ARM disponible en ATCC tiene un intervalo definido de título TCID 50 determinado mediante un esfuerzo colaborativo. Siempre que sea aplicable, se debe usar en la validación de un estándar de referencia interno o un control de ensayo para ensayos de título infeccioso. Sin embargo, debido a la posibilidad de diferencias genéticas entre el ARM, que es adenovirus humano salvaje tipo 5, y el producto de terapia génica adenoviral competente para la replicación, puede no ser aconsejable normalizar el título del vector de interés con el del ARM. Para productos de terapia génica retroviral o lentiviral o VM que portan un marcador seleccionable (p.ej., para resistencia a la neomicina) o un gen indicador (p.e., p -galactosidasa) además del gen terapéutico, el título infeccioso a menudo se determina midiendo el número de células transducidas infectadas que expresan estas proteínas no terapéuticas. Por lo general, el título del vector se expresa como el número de unidades formadoras de colonias (ufc) por mL para células transducidas con vectores virales que contengan marcadores de resistencia a fármacos y se seleccionan para crecer en un medio que contenga el fármaco. El título basado en p -galactosidasa se puede expresar en ufc azules por mL, después de teñir y contar las células que convierten el sustrato X-Gal de la p -galactosidasa en un cromóforo azul. Para vectores sin un gen marcador, la cuantificación de transducción se ha medido con presición usando PCR cuantitativa o se ha estimado usando métodos de hibridación. La mayoría de los productos de terapia génica no virales contiene ADN plasmídico y su medida de dosis habitual es la masa de ADN. Ésta se puede determinar en el estado formulado y, si se incluye proteína recombinante en la formulación, se puede emplear la masa combinada total de todos los componentes, basada en un cociente específico. La medición por densidad óptica a 260 nm es la manera más simple de calcular concentraciones de ADN superiores a 500 ng/ml. Este método, por lo general, no se puede aplicar al ADN en formulación lipídica. Debido a que el ARN y las proteínas también presentan absorbancia significativa a 260 nm, se deben efectuar otros análisis para demostrar una contaminación mínima con ARN, proteínas o ADN cromosómico residual de células anfitrionas. Los colorantes que se unen específicamente al ADN de doble cadena permiten medir con exactitud concentraciones de ADN inferiores a 500 ng/mL, cuando se calculan con respecto a una curva estándar de ADN autenticada. PicoGreen es uno de los colorantes fluorescentes y se ve mínimamente afectado por ADN de cadena simple, ARN, proteínas, sales y detergentes. El colorante fluorescente Hoechst 33258 también une tanto el ADN de cadena simple como el de doble cadena y se puede usar para determinar concentraciones de ADN tan bajas como 0,3 ng/ml. El Hoechst 33258 no se une a la proteína ni al ARN y puede determinar con exactitud las concentraciones de ADN en muestras crudas. Asimismo, se pueden emplear métodos tales como la electroforesis capilar y la HPLC que usan un material de referencia autentificado para determinar el contenido de productos no virales.
1062 (1047) Productos de Terapia Génica/ Información General
USP 39
Potencia La potencia se define como la actividad terapéutica del producto farmacéutico. Junto con la dosis, la potencia define la actividad biológica de cada lote (ver Ensayos de Determinación de Dosis). La potencia se puede evaluar con valoraciones biológicas in vitro o in vivo. No es extraño que estas valoraciones tengan coeficientes de variación entre 30% y 50%, aunque un diseño de valoración estricto con buena consideración estadística puede ayudar a reducir variaciones en la valoración. Estas valoraciones requieren un material de referencia representativo bien definido que se pueda usar como control positivo para la valoración y/o para calcular la potencia relativa del artículo de prueba. Las consideraciones generales para valoraciones biológicas en los capítulos vigentes de USP sobre diseño y desarrollo de valoraciones biológicas se deben aplicar al diseño de valoración de potencia para productos de terapia génica. El control positivo califica el rendimiento de una valoración individual. El desarrollo de las valoraciones de potencia debe centrarse en la caracterización y control de la variabilidad. Las valoraciones de alta precisión son herramientas más eficaces para controlar la calidad del producto. La información sobre la variabilidad en las valoraciones de potencia se debe incluir en el diseño del estudio de estabilidad y en la metodología estadística propuesta para asignar la fecha de caducidad (ver Estabilidad). Las valoraciones biológicas empleadas para medir la potencia de productos de terapia génica viral y no viral por lo general implican la infección, transfección o transducción de una línea celular susceptible in vitro, seguida por alguna medida funcional del gen de interés expresado. Por lo general, se deben usar valoraciones funcionales para el gen terapéutico (p.ej., aquellos que miden la actividad enzimática y la estimulación o inhibición de crecimiento celular) en lugar de métodos analíticos tales como enzimoinmunoensayo (ELISA). Cuando la función biológica del transgén expresado presenta una amplia variedad de actividades o únicamente genera resultados semicuantitativos, el ELISA u otras lecturas inmunológicas o bioquímicas se pueden usar como valoraciones de potencia sustitutas con un estrecho intervalo de especificación si se cuenta con datos extensos de caracterización para demostrar que toda proteína expresada es biológicamente activa. Por ejemplo, para los productos de terapia génica que expresan una citoquina, la expresión de la citoquina por lo regular se cuantifica primero mediante ELISA y el resultado se usa para ajustar la dilución de muestra para la valoración funcional. La potencia de tales vectores se puede controlar mejor mediante los resultados de cuantificación del ELISA, pero la actividad biológica de la citoquina expresada se puede usar para verificar que la masa medida es biológicamente activa sin tener que cumplir con un intervalo de especificación estrecho para la actividad biológica misma. La HPLC o la citometría de flujo, que proveen información sobre el nivel de expresión pero que sólo infieren la función, también se han usado en un contexto parecido al descrito para inmunoensayos. Asimismo, para vectores virales, las mediciones de título infeccioso por sí solas, por lo general, no se consideran como una medida adecuada de potencia del producto. Por ejemplo, el título de TCID50 o las valoraciones de unidades formadoras de placas para vectores adenovirales en células HEK293 pueden indicar que se conserva la infectividad del adenovirus pero no confirma que el producto adenoviral haya mantenido sus funciones biológicas completas, especialmente la actividad biológica del transgén. El diseño y la aptitud final de un sistema de valoraciones para determinar la potencia depende de la relación entre la célula humana blanco in vivo y: (1) la eficiencia de transducción o transfección de la línea celular utilizada in vitro, (2) los niveles de expresión de proteínas y (3) el tiempo de expresión necesario para lograr el efecto terapéutico. Las pruebas in vivo también se pueden usar para medir la potencia del vector en el producto. Las lecturas se pueden basar en una respuesta por animal (p.ej., los niveles sanguíneos de la proteína terapéutica a las 24 horas del tratamiento) o una tasa de respuesta grupal (p.ej., el porcentaje de animales que obtuvo una respuesta inmunitaria o sobrevivió al desafío del virus). La disponibilidad de un sistema de pruebas in vivo apropiado depende del intervalo vector-anfitrión (para vectores virales), la farmacocinética y la distribución biológica del vector y su producto génico resultante comparado con su equivalente humano y del tiempo necesario para observar el efecto terapéutico o el efecto indirecto. Factores como el costo, las instalaciones, la validación y la ética determinan si una prueba de potencia in vivo resulta práctica.
Pureza Los métodos analíticos que separan, aíslan y específicamente cuantifican los componentes del producto activo, determinan la pureza del producto. Las impurezas son componentes relacionados con el producto o el proceso que se pueden trasladar al producto final. Se debe optimizar el proceso de fabricación y purificación a fin de eliminar impurezas constantemente y, al mismo tiempo, conservar la actividad del producto. El requisito de detectar una impureza particular para la liberación de un lote depende de: (1) la capacidad demostrada del proceso de fabricación y purificación para eliminar o inactivar la impureza durante la validación de proceso y (2) la toxicidad potencial asociada con la impureza. Entre los ejemplos de impurezas relacionadas con el proceso asociadas con los productos de terapia génica se incluyen componentes del medio de producción (p.ej., SFB, suero fetal bovino), antibióticos, citoquinas y ADN cromosómico de E. coli en un producto plasmídico), productos auxiliares usados en el procesamiento subsiguiente (p.ej., las nucleasas tales como ADNasa 1) y humedad residual para productos de vectores liofilizados. Las impurezas pueden ser bioactivas (p.ej., citoquinas y hormonas) o inmunogénicas (p.ej., agregados de productos, productos de degradación, marcadores de selección de plásmidos y proteínas no humanas) o bien pueden ejercer otros efectos perjudiciales (p.ej., pueden competir con el producto) si se administran a una dosis igual a la del producto. Las impurezas relacionadas con el producto son específicas para cada tipo de producto. Los ejemplos incluyen formas de plásmidos mellados (nicked) en productos no virales y partículas defectuosas o inmaduras en productos de vectores retrovirales o adenovirales. Las metodologías analíticas para evaluar la pureza requieren la
USP 39
Información General/ (1047) Productos de Terapia Génica 1063
cuantificación de las impurezas o su separación física del producto. El sentido común debería determinar si es necesario cuantificar las impurezas específicas. La validación adecuada del proceso de fabricación puede limitar la necesidad de pruebas de liberación para lotes específicas para impurezas. Los fabricantes pueden poner énfasis en demostrar la uniformidad del perfil de impureza del producto. La prueba para impurezas es a menudo extensa durante la caracterización del producto y la validación del proceso cuando se está demostrando la uniformidad del proceso de fabricación y purificación. El análisis de impurezas como parte del análisis de liberación del lote debe reflejar los riesgos de seguridad asociados con la impureza y la capacidad del proceso para eliminar consistentemente tal impureza. PRODUCTOS DE TERAPIA GÉNICA VIRAL En vectores virales, las impurezas relacionadas con el producto incluyen agregados y partículas defectuosas e inmaduras que se pueden generar durante la fabricación o purificación del vector recombinante. Se pueden formar agregados de vector si el producto es altamente concentrado, se almacena en ciertas condiciones (p.ej., a un pH o temperatura dados) o reconstituido después de la liofilización. Las valoraciones para detectar agregados incluyen análisis de tamaño de partícula mediante dispersión de luz con láser y el uso de PAGE no desnaturalizante y no reductora, seguido por tinción de gel o transferencia y detección de proteínas virales mediante análisis de transferencia Western. El análisis de velocidad de sedimentación también puede permitir la separación de agregados de monómeros basados en tamaño. Los análisis de densidad óptica de dispersión de luz también se usan para evaluar la agregación de vectores. Las partículas defectuosas son partículas virales sin el genoma recombinante apropiado-es decir, contienen algún otro ácido nucleico o no contienen ningún genoma o el vector contiene algún componente estructural defectuoso o alterado de alguna otra manera que disminuye su capacidad de transducir una célula. En sistemas de vectores virales con simetría capsomérica, que requiere la incorporación apropiada de ácido nucleico para la configuración, es posible distinguir con facilidad las partículas vacías de las que portan genomas. Es probable que no se puedan separar tan fácilmente las partículas vacías de aquéllas con ácido nucleico encapsidado en virus con envoltura. La HPLC analítica es útil para separar partículas virales activas de las defectuosas en algunos productos de vectores virales. Se han empleado resinas de intercambio aniónico para separar el adenovirus activo de partículas virales defectuosas. No obstante, este método puede no ser útil para un vector adenoviral purificado mediante cromatografía de intercambio aniónico, a menos que la resina para la valoración sea diferente de la usada en la fabricación. Dependiendo de la naturaleza del vector viral y sus formas no activas o defectuosas, puede ser necesario que otros métodos de separación, tales como centrifugación de equilibrio en un gradiente de densidad con cloruro de cesio, precedan la cuantificación de la partícula activa. El método de separación idealmente permitirá la cuantificación. Las partículas defectuosas que portan un oncogén no derivado de la célula u otros genes no deseables pueden representar una preocupación especial. Por ejemplo, en líneas de células murinas que aportan la envoltura al retrovirus, se pueden empaquetar pequeños elementos virales, llamados secuencias VL30, en aproximadamente un tercio de las partículas. Se puede requerir de valoraciones para cuantificar partículas defectuosas específicas cuando se sepa que están presentes en cantidades suficientes para representar una preocupación de seguridad. La calidad del virus y la comparabilidad de preparaciones también se puede evaluar midiendo proteínas estructurales seleccionadas con masas moleculares conocidas y números de copia conocidos dentro del virión. Para este método, el virus se lisa y las proteínas estructurales se separan usando HPLC en fase reversa o algún otro procedimiento cromatográfico de alta recuperación. La separación cromatográfica debe validarse y se debe verificar la identidad de las proteínas estructurales seleccionadas por métodos tales como SDS-PAGE, secuenciación de péptidos o espectroscopía de masas. La identificación genética de la partida se puede llevar a cabo basándose en la cuantificación de las proteínas estructurales seleccionadas y su comparación con un estándar de referencia. Cuando el método incluye la espectroscopía de masas, también se pueden identificar impurezas, como las variantes estructurales. Para las preparaciones de adenovirus, algunos precursores y la mayoría de las proteínas viriónicas maduras se pueden detectar y distinguir, permitiendo el monitoreo del producto y de las formas viriónicas inmaduras. Las proteínas derivadas de las células anfitrionas se pueden considerar impurezas para algunos productos de vectores virales y se pueden separar y cuantificar mediante PAGE o HPLC o detectarse mediante análisis de aminoácidos, transferencia Western (Western blot) o métodos basados en inmunoensayos. Sin embargo, para virus con envoltura, como los retrovirus, las proteínas de membrana derivadas de células anfitrionas son una parte integral del producto. En esos sistemas de vectores, puede ser complicado determinar la presencia de proteínas contaminantes exógenas derivadas del anfitrión. La presencia de impurezas específicas relacionadas con el proceso depende de los procesos de fabricación y purificación de cada tipo de vector o producto. No obstante, la mayoría de los productos deben ser analizados para detectar endotoxinas residuales (ver Prueba de Endotoxinas Bacterianas (85)). Se han establecido límites aceptables de endotoxinas, que se pueden aplicar directamente a productos de vectores virales. Históricamente, se ha considerado que el ADN genómico proveniente de sustratos celulares continuos empleados para fabricar productos biológicos era potencialmente tumorígeno, pero estudios recientes sugieren que los riesgos son muy bajos. Sin embargo, durante el desarrollo del proceso, debería intentarse reducir los niveles de ADN contaminantes. La necesidad de analizar el ADN residual como parte de la liberación de lote de producto se debe evaluar caso por caso y puede depender de la distribución del tamaño del ADN, su asociación con el producto o sus componentes de formulación y la vía de administración del producto. Los ensayos cuantitativos por PCR pueden analizar la
1064 (1047) Productos de Terapia Génica/ Información General
USP 39
cantidad de ADN residual de células anfitrionas usando cebadores diseñados para amplificar secuencias blanco conservadas evolutivamente y abundantes tales como 18S para células HEK293. La cuantificación de componentes séricos residuales tales como albúmina sérica bovina (ASB) se puede lograr usando ELISA y un estándar de referencia de ASB. Puede ser necesario que los investigadores desarrollen métodos funcionales o inmunológicos específicos para otros productos auxiliares, incluyendo otros medios de cultivo o componentes del proceso de purificación tales como citoquinas o enzimas (p.ej., desoxirribonucleasa 1 o nucleasa benzon). PRODUCTOS DE TERAPIA GÉNICA NO VIRAL Un plásmido usado como fármaco se considera como un producto biológico bien caracterizado, mientras que las impurezas clave del proceso de fabricación son bien conocidas. El análisis por lo general se lleva a cabo en cada componente individual: el ADN plasmídico, reactivos lipídicos o lipopléxicos y componentes proteicos si se encuentran presentes en la formulación. EL ADN plasmídico se caracteriza para una variedad de impurezas, incluyendo ADN residual de células anfitrionas, ARN residual y proteína residual. Las pruebas de proteínas residuales se suelen incluir en las pruebas de liberación de lotes. Con frecuencia, los cocientes de densidad óptica (usualmente la medición entre 260 nm y 280 nm) se usan en las especificaciones de pureza para ADN plasmídico. Asimismo, el ADN plasmídico se debe caracterizar con respecto a su conformación en solución. El ADN plasmídico se presenta en forma monomérica superenrollada, monomérica relajada y lineal. Puesto que todas las formas se pueden generar durante la fermentación a gran escala y los datos sobre su potencia relativa in vivo son escasos, la cantidad relativa de cada forma se monitorea para verificar la uniformidad entre partidas en las cantidades relativas de cada conformación. La electroforesis en gel de agarosa puede resolver cada una de estas formas pero no es altamente cuantitativa para cada especie individual. La HPLC analítica de intercambio aniónico funciona como análisis cuantitativo para la conformación monomérica superenrollada y de otras conformaciones, como los concatémeros. Otros métodos analíticos que han sido valiosos para la caracterización de construcciones plasmídicas durante el desarrollo del proceso y validación tales como electroforesis capilar en gel, dicroísmo de flujo lineal y microscopía de fuerza atómica, también son viables para evaluar la pureza de una preparación plasmídica determinada. El método más apropiado para la liberación de lote depende de cómo afecta cada plásmido a la potencia del producto. Los detalles específicos para cada uno de estos métodos se resaltan en el capítulo Técnicas Basadas en Ácidos NucleicosGeneralidades (1125). Las pruebas deben realizarse para impurezas relacionadas del proceso tales como disolventes orgánicos residuales (fenol, alcohol), sales y ciertos antibióticos tales como kanamicina usados durante el proceso de fermentación. Se deben analizar también los componentes de formulaciones lipídicas y lipoplex para determinar su pureza química. Las pruebas para impurezas químicas específicas comúnmente se realizan con cromatografía de gases-espectroscopía de masas (GC-MS), HPLC o cromatografía en capa delgada (TLC). Si la proteína forma parte del complejo formulado, también se debe comprobar su pureza. La HPLC es capaz de detectar cantidades de trazas de antibióticos residuales y pueden, por lo tanto, usarse durante la validación del proceso o el análisis de liberación de lote para confirmar que hayan sido eficazmente eliminadas. Los aspectos específicos de estos métodos se detallan en Artículos Obtenidos por Biotecnología-Mapeo de Péptidos (1055) o en Artículos Obtenidos por Biotecnología-Valoración de Proteínas Totales (1057). Las proteínas, el ADN, el ARN y las endotoxinas bacterianas son los principales tipos de contaminantes del proceso derivados del anfitrión. Se pueden emplear valoraciones estándar de proteínas (p.ej., Lowry, Bradford o Coomassie), PAGE seguida de tinción argéntica o Western blot, o ELISA a fin de detectar proteínas residuales del anfitrión con sensibilidad de nanogramos. El ADN cromosómico del anfitrión se puede detectar por hibridación slot blot (detección en picogramos) o por PCR en tiempo real (sensibilidad de detección< 1 pg) utilizando secuencias altamente conservadas (p.ej., 18S para E. col1). Los ensayos por PCR para este propósito deben usar polimerasas recombinantes altamente purificadas para minimizar el ADN bacteriano residual cuya presencia puede crear señales de fondo. Se puede emplear PAGE o electroforesis en gel de agarosa, seguidas de tinción fluorescente, para detectar ARN residual. Es posible que la cuantificación no sea necesaria, debido a la naturaleza lábil del ARN y su escasa toxicidad. La prueba de lisado de amebocitos de Limulus (LAL, por sus siglas en inglés) es el método más sensible y ampliamente usado para la determinación de endotoxinas. Los ensayos colorimétricos ofrecen sensibilidades de 0,005 UE/ml. Los detalles de los métodos descritos en este capítulo se resaltan en los capítulos (1057), Artículos Obtenidos por BiotecnologíaElectroforesis en Gel de Poliacri/amida (1056), Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Enfoques para Detectar Trazas de Ácidos Nucleicos (1130), (1125) y (85). PRODUCTOS DE VECTORES VIRALES Y NO VIRALES LIOFILIZADOS La humedad residual puede afectar la estabilidad de un producto de vectores liofilizado. La Guía de Determinación de Humedad Residual en Productos Biológicos Secos de la FDA recomienda una humedad residual del 1%, aunque se consideran aceptables los datos que indiquen que no hay efectos adversos sobre la estabilidad del producto a niveles más altos. Los niveles de humedad residual se pueden determinar con un método estándar (ver Determinación de Agua (921 )) compatible con el producto formulado.
USP 39
Información General/ (1047) Productos de Terapia Génica 1065
Identidad El análisis de liberación de lote para productos de terapia génica debe incluir una prueba de identidad. Esta prueba identifica claramente el producto y confirma que no haya ocurrido la sustitución inadvertida por otro producto. Su complejidad depende de la naturaleza del producto específico y de la gama de productos que se fabriquen. Por ejemplo, se pueden llevar a cabo pruebas más exhaustivas y rigurosas para un producto de terapia celular modificado con gen autólogo en una planta donde se fabrican múltiples productos para pacientes que para un producto de vector viral elaborado en un sitio que fabrica un único producto. PRODUCTOS DE TERAPIA GÉNICA VIRAL Para propósitos de caracterización, el mapeo por enzimas de restricción y la secuenciación del ADN de la unidad de transcripción son las metodologías usadas con mayor regularidad. Los métodos basados en PCR, el mapeo por enzimas de restricción y los inmunoensayos basados en la expresión del transgén se usan comúnmente para confirmar la identidad durante el análisis de liberación de lote. PRODUCTOS DE TERAPIA GÉNICA NO VIRAL El mapeo por enzimas de restricción es el método de identidad más común para productos derivados de plásmidos. El número de enzimas utilizadas para crear el patrón genético del vector varía según la complejidad del ADN y la similitud entre múltiples productos. Si se emplean lípidos, agentes lipoplex o proteínas para formular el ADN, también se debe analizar y confirmar su identidad. Los procedimientos usados para productos farmacéuticos tradicionales, como GC-MS, TLC y similares, permiten identificar lípidos y componentes lipoplex. Los componentes proteicos de la formulación se pueden identificar mediante mapeo de péptidos u otros medios descritos en (105 7).
ESTABILIDAD La vida útil de los productos de terapia génica varía mucho en función de su naturaleza, el uso clínico previsto, sus atributos específicos y las condiciones recomendadas de almacenamiento, envasado y transporte. Por lo tanto, es difícil redactar pautas uniformes sobre la duración de estudios de estabilidad y la frecuencia de las pruebas, para todos los productos. El estudio siempre debe diseñarse basándose en principios y metodologías científicamente sólidos, y un conocimiento cabal del producto terapéutico final y su uso previsto. Se debe determinar la estabilidad del producto durante los pasos de espera en el proceso, de los bancos de células y virus, de materias primas fundamentales y de los estándares de referencia. Un programa de estabilidad bien diseñado y ejecutado asegurará, en gran medida, que el producto permanezca estable dentro de la vida útil especificada. Para productos de terapia génica con vectores virales y no virales y productos de terapia génica celular modificados genéticamente no específicos para un solo paciente, la selección de partidas para respaldar la solicitud de licencia y el etiquetado del producto final deberían llevarse a cabo de acuerdo con los principios de las pruebas de estabilidad, como los descritos en la guía Q5C de la ICH y en el capítulo (1049). Además, se deben reunir datos sobre estabilidad para el material a granel y en otros puntos dentro del proceso, si el material es almacenado antes del procesamiento y el llenado finales. Los aspectos relacionados con la estabiidad de los productos derivados de células se tratan en el capítulo (1046). Los vectores plasmídicos de ADN no viral a menudo se formulan con mezclas específicas de lípidos, proteínas o lipoconjugados para formar liposomas o complejos encapsulados. Según la formulación empleada, se puede lograr una vida útil de horas a años. Cuando el producto tiene una vida útil corta, puede ser necesario preparar la formulación final en el sitio clínico justo antes de su administración. La inestabilidad con frecuencia se observa como agregación y precipitación. La formación y la estabilidad del complejo formulado se caracterizan y establecen mediante estudios de validación durante el desarrollo del producto. Asimismo, se deben recolectar datos de estabilidad para los componentes principales del complejo formulado, como lípidos, liposomas y el ADN.
Desarrollo del Protocolo de Estabilidad Los estudios de estabilidad verifican que las condiciones de almacenamiento conserven la pureza y la potencia durante un periodo definido, de manera que cuando el producto se administre al paciente, siga cumpliendo con las especificaciones de estabilidad. Estas especificaciones pueden diferir de las estipuladas para la liberación de la fabricación; no obstante, se deben verificar con datos clínicos. Los estudios formales de estabilidad para respaldar la autorización, así como los planes para reunir información sobre estabilidad del producto en la fase inicial deben estar detallados en un plan escrito que determine cómo se obtendrán y analizarán los datos de estabilidad a fin de avalar el período de caducidad del producto. Los protocolos deben seguir el formato recomendado en las guías vigentes e incluir el alcance, las condiciones de almacenamiento, el número de lotes que se analizarán, el cronograma de prueba, las valoraciones que se utilizarán, el análisis de los datos y las especificaciones del producto. Todo ensayo empleado en un estudio de estabilidad formal para obtener la autorización debe ser validado
1066 (1047) Productos de Terapia Génica/ Información General
USP 39
antes de comenzar el estudio. El diseño del estudio específico debe tomar en cuenta los problemas que el producto puede enfrentar durante la fabricación, el transporte y el procesamiento en el sitio clínico (ver Condiciones de Desafío Aceleradas y Más Apropiadas, a continuación). El diseño del estudio también debe incluir los conocimientos más recientes en ciencias biológicas y debe tratar los requisitos reglamentarios existentes. Por ejemplo, si la formulación final del producto se lleva a cabo en el sitio clínico, los estudios de estabilidad sobre esta formulación final se deben llevar a cabo para establecer el tiempo y las condiciones en las que se puede conservar el producto. La evaluación de la estabilidad debe incluir una evaluación de funcionalidad de producto (potencia). La valoración de potencia suele tener un alto grado de variabilidad intrínseca. Medir y calcular el deterioro de la actividad del producto empleando las metodologías estadísticas estándar puede requerir múltiples y frecuentes intervalos de muestreo en un período prolongado y el análisis de más de tres lotes de producción para compensar la variabilidad de la valoración. Se deben efectuar estudios iniciales para establecer una fecha de caducidad provisional antes de la administración al primer paciente. Estos estudios también son útiles para determinar qué valoraciones son indicadoras de estabilidad, es decir, los indicadores óptimos de degradación del producto. Como los métodos farmacopeicos vigentes no contemplan las características singulares de los productos de terapia génica, se recomienda desarrollar ensayos que consideren estas características singulares.
Condiciones de Desafío Aceleradas y Más Apropiadas El perfil indicador de estabilidad de un producto de terapia génica varía con el tiempo por la influencia de una amplia variedad de condiciones ambientales, incluida la temperatura, los extremos en condiciones fisiológicas de almacenamiento y la luz. Cuando los investigadores investiguen los efectos de estos parámetros sobre la estabilidad del producto, se deben considerar las vías de degradación multifactoriales. Los estudios deben incluir condiciones que superen los intervalos de almacenamiento especificados, es decir, condiciones de desafío como las halladas durante períodos de almacenamiento, transporte o manejo anormales. Algunos ejemplos son el mal funcionamiento de incubadoras durante un breve periodo, fallas de la incubadora o del almacenamiento en frío, períodos de fluctuaciones térmicas extremas ocasionadas por el transporte hacia climas calurosos o fríos, condiciones hipobáricas en el sector de carga de una aerolínea comercial o temperaturas probables en la sala de operaciones. Una corta exposición a una condición ambiental fuera de un límite establecido y una exposición prolongada a una condición ambiental que está justo fuera de un intervalo aceptable establecido puede ser igualmente perjudicial para el perfil general de estabilidad. Si se aplican condiciones de almacenamiento diferentes, la velocidad lenta y constante de degradación del producto a una temperatura específica puede aumentar. Si existe una justificación científica, se debe investigar el efecto de la luz sobre el perfil indicador de estabilidad. Se debe prestar especial atención a los productos almacenados en líquidos que contienen componentes sensibles o que reaccionan con la luz, los cuales pueden dar origen a subproductos citotóxicos. Los estudios análogos a los de envejecimiento acelerado habitualmente usados en programas de monitoreo de estabilidad farmacéutica también son útiles para determinar la manera en que el producto se degrada y los ensayos que son indicadores de la estabilidad. Pueden ser los mismos estudios que algunos de los mencionados en el párrafo precedente. Otros estudios consisten en exponer un producto a 37º ó 18º cuando su temperatura normal de almacenamiento es de 25± 2º o colocar un producto liofilizado en un ambiente muy húmedo. Este tipo de estudios deben llevarse a cabo antes de los estudios formales de estabilidad, de manera que estos últimos puedan incorporar ensayos indicadores de estabilidad validados.
ALMACENAMIENTO V TRANSPORTE Las condiciones de almacenamiento adecuadas se seleccionan para preservar la pureza y la potencia a fin de que se mantengan las especificaciones del producto y de sus ingredientes durante el almacenamiento, transporte y manejo en el sitio clínico. Antes de la administración, deben realizarse estudios para determinar si las condiciones de almacenamiento, transporte y manejo son aceptables. No es necesario que las condiciones de almacenamiento y transporte sean las mismas que aquellas previstas para el producto comercial, pero deben garantizar que se mantengan las especificaciones del producto más allá de la fecha de caducidad inicial. Para productos con vidas útiles cortas, se deben considerar las condiciones de almacenamiento y transporte, incluso dentro de un centro médico, puesto que el transporte constituye la mayor parte del tiempo de almacenamiento después de la fabricación. Se debe poner especial atención a la capacidad de los gases para penetrar el envase de transporte, especialmente si el producto de terapia génica se almacena o transporta usando hielo seco. Una vez que se hayan desarrollado los métodos indicadores de la estabilidad y que se hayan seleccionado la condiciones de almacenamiento y transporte finales, éstas deben validarse de acuerdo con la sección Estabilidad. La mayoría de los productos con vidas útiles limitadas se transportan mediante sistemas confiables de correo con entrega al día siguiente. Algunos productos muy frágiles son transportados a mano en aviones comerciales. Los transportistas comerciales deben obtener permisos especiales para evitar el control con equipos de rayos X en los aeropuertos. Durante el desarrollo de sistemas de embalaje, se deben diseñar estudios de transporte de carga para identificar las condiciones adversas que podrían afectar al producto. Luego se deben seleccionar y validar los materiales de refuerzo y aislamiento para armar un sistema de embalaje que tolere y proteja al producto de las condiciones extremas de transporte. La mayoría de los productos de terapia génica se pueden liofilizar o formular mediante técnicas similares a las empleadas para muchos productos proteicos recombinantes o de terapia celular. Estas formulaciones de almacenamiento típicamente tienen períodos de caducidad superiores a un año y carecen de requisitos de transporte especiales. Los productos de terapia génica no viral, que pueden ser inestables en su formulación final, pueden tener fechas de caducidad similares si se almacenan en
USP 39
Información General/ (1047) Productos de Terapia Génica 1067
un equipo de viales múltiples con el ácido nucleico en un vial y un vehículo como los lípidos, en el otro. La formulación final se elabora en el centro médico justo antes de la administración.
ETIQUETADO El etiquetado de un producto está reglamentado por la FDA y se requiere que cumpla con la reglamentación vigente. Debido a que los productos de terapia génica son productos biológicos reglamentados, su etiquetado está sujeto a las reglas mencionadas. Los productos biológicos y dispositivos deben cumplir con los requisitos de etiquetado específicos para el envase y el empaque (Título 21 del CFR 61Oy801, respectivamente). Tanto la etiqueta del envase como la del empaque deben incluir la fecha de caducidad. Si el envase está empacado, se deben incluir las condiciones de almacenamiento recomendadas en la etiqueta del embalaje. Si no está empacado, las condiciones de almacenamiento y todos los demás requisitos de una etiqueta de embalaje deben aparecer en el envase. El etiquetado debe cumplir además con los requisitos nacionales e internacionales pertinentes. Cuando un producto se va a aplicar a un paciente en una orientación física en particular o en un área específicamente definida, el etiquetado que indique la orientación y/o el área correctas debe ser visible incluso después de abrir el empaque. A menos que el producto haya sido analizado para detectar contaminantes patógenos o microbianos antes de la liberación, se exige un etiquetado de riesgo biológico apropiado. Para productos con vida útil muy corta, es necesario ajustar y corregir la fecha de caducidad según los husos horarios para brindar al usuario una estimación exacta de la vida útil. Los procedimientos clínicos se deben programar próximos a estos marcos temporales cruciales. Las etiquetas de productos específicos para un solo paciente deben tener el nombre completo del paciente, sus iniciales o una combinación de ambos, además de la designación del lote, a fin de garantizar que el producto se administre al paciente correcto.
REGLAMENTOS Y NORMAS Las tecnologías implicadas en la fabricación de productos de terapia génica han sido ampliamente documentadas en la literatura y continúan evolucionando. Estos productos se pueden reglamentar como medicamentos o productos biológicos, y en contadas ocasiones como dispositivos, dependiendo de la manera en que se fabrican y emplean. Los nuevos enfoques que estas tecnologías permitan pueden dificultar la determinación de qué centros de la FDA estarán a cargo de su reglamentación; la FDA ha recomendado a los fabricantes solicitar aclaraciones en las primeras etapas del desarrollo. En la actualidad, el Center for Biologics Evaluation and Research (Centro para la Evaluación e Investigación de Productos Biológicos o CBER) rige la mayoría de los productos de terapia génica humana. El CBER se basa tanto en la Public Health Service Act (Ley del Servicio de Salud Pública) y la Federal Food Drug and Cosmetic Act (Ley Federal de Alimentos, Medicamentos y Cosméticos). La reglamentación es la misma que para los productos obtenidos por biotecnología. Los requisitos generales se describen principalmente en el Título 21 del CFR. El gobierno federal ha emitido una gran cantidad de documentos guía como Points to Consider (Puntos a Considerar) o Guidelines (Pautas) (ver www.fda.gov1111illl!lliJ). Los documentos guía de la ICH para muchas de las áreas relacionadas con la calidad son importantes en diversas magnitudes para productos de terapia génica que califican (aunque algunos productos por lo general quedan nominalmente fuera del alcance de los documentos guía, los principios siguen aplicando; ver www.ifpma.org o www.ich.org). Algunos de estos documentos se reproducen en los compendios USP-NF como capítulos generales. Asimismo, la ICH ha celebrado diversas reuniones sobre productos de terapia génica y cuenta con un Grupo de Discusión sobre Terapia Génica (Gene Therapy Discussion Group o GTDG) que trata los aspectos actuales sobre el desarrollo e investigación de productos de terapia génica y que ha emitido diversas Consideraciones de la ICH que reflejan los principios armonizados. Los National lnstitutes of Health (Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos o NIH) han publicado las Guidelines for Research lnvolving Recombinant DNA Molecules (Guías para la Investigación de Moléculas de ADN Recombinante) que requieren la revisión de la investigación por parte de NIH, incluyendo investigaciones o ensayos clínicos realizados o patrocinados por instituciones que reciben fondos de NIH. Estas guías se aplican a muchos productos de terapia génica. Se recomiendan ampliamente los estándares biológicos y bioquímicos para GC de la producción y el análisis de productos de terapia génica. La diversidad de productos de terapia génica, en particular los vectores virales, ha limitado el desarrollo de estándares con amplia capacidad de aplicación. Una preparación de RCR de VLM (VR-1450) con un título de infectividad asignado está disponible en ATCC para el análisis de vectores retrovirales murinos para determinar la presencia de RCR. Un estándar de referencia de adenovirus salvaje tipo 5 con un número de partículas y un título de infectividad asignados para caracterización de vectores adenovirales también está disponible en ATCC. Se ha etablecido un grupo de trabajo para supervisar el desarrollo de un estándar de referencia de VAA. No obstante, se han presentado diversos obstáculos para seleccionar, desarrollar, establecer y poner en circulación estándares adecuados, los cuales incluyen tomar decisiones sobre qué serotipo de virus se usará de manera más común y exitosa para terapia génica, la disponibilidad de materiales preparados conforme a las BPF, la seguridad, la estabilidad a largo plazo, el transporte y el inicio y culminación de estudios colaborativos para evaluar los estándares candidatos. Asimismo, el desarrollo de estándares para otros vectores virales, incluyendo vectores lentivirales, del virus del herpes y poxvirales, sigue siendo un desafío. En la actualidad se encuentran disponibles nuevas metodologías, incluyendo proteómicos, tecnologías basadas en ácidos nucleicos (NAT, por sus siglas en inglés) novedosas, métodos de modificación de proteínas y aislamiento y cultivo de células ma-
1068 (1047) Productos de Terapia Génica/ Información General
USP 39
dre, y, en muchos casos, se aplican al desarrollo, caracterización y análisis de productos de terapia génica. Además, el uso de polímeros sintéticos tanto para modificar vectores virales existentes como para el desarrollo de vectores sintéticos químicamente dinámicos ofrece ventajas tales como circulación sistémica mejorada, mejor dirección y liberación y menores niveles de inmunoestimulación e inflamación. La disponibilidad de poblaciones de células madre definidas y los métodos mejorados de injerto deben llevar a una mayor efectividad de células transducidas ex vivo usadas en protocolos de terapia génica. La introducción de nuevas metodologías requerirá de revisión continua y supervisión reglamentaria para asegurar la calidad y seguridad de los productos de terapia génica del futuro.
GLOSARIO Adenovirus: Virus perteneciente a la familia Adenoviridae de virus de ADN con un virión sin envoltura con 252 capsómeros y un diámetro entre 70 y 90 nm; una sola molécula lineal de ADN de doble cadena (36 a 38 kb); al menos 1O proteínas estructurales resitentes al éter y estables en ácido; los viriones son liberados mediante destrucción celular. ADN Complementario (ADNc): El ADN sintetizado a partir de un ARNm y no de un molde de ADN. Se usa para clonación o como sonda de ADN para localizar genes específicos. ADN Desnudo: ADN aislado y purificado que carece de proteínas o lípidos. ADN Recombinante: ADN que se produce mediante la unión de fragmentos de ADN de diversas fuentes a través de manipulaciones in vitro. Agente Adventicio: Agente extraño que se introduce accidental o inadvertidamente; no es natural ni hereditario (como en la contaminación microbiana, química o bioquímica de una sustancia purificada). Anticuerpos Monoclonales: Anticuerpos derivados de un único don celular. Antígenos Leucocitarios Humanos (HLA, por sus siglas en inglés): Proteínas controladas por el complejo principal de histocompatibilidad. Estas proteínas tienen un papel preponderante en la determinación de la compatibilidad para trasplantes. Autólogo: Que se obtiene del organismo propio. Bioensayo: Medición de la efectividad de un compuesto por su efecto en animales o células en comparación con una preparación estándar. (Ver también Potencia.) Biotecnología: Toda técnica que utilice organismos vivos (o partes de estos) para producir o modificar productos, mejorar plantas o animales o desarrollar microorganismos para usos específicos. La definición más nueva se refiere al uso industrial y farmacéutico del ADN recombinante, fusión celular, nuevas técnicas de bioprocesamiento y terapia génica. BPFv: Abreviatura para Buenas Prácticas de Fabricación vigentes. La FDA resalta las BPFv en el Título 21 del CFR y en Federal Register (Registro Federal), así como en sus Points to Consider (Puntos a Considerar). Célula Germinal: Célula reproductiva (esperma u óvulo), gameto o célula sexual. Célula Madre: Célula inmortal capaz de proliferar y diferenciarse en distintos tipos de células especializadas. Se supone que cada sistema de tejidos importante tiene su propia célula madre. CFTR: Regulador de la conductancia transmembrana de fibrosis quística. Citoquina: Todo factor que actúa sobre las células; por lo general, una proteína que favorece el crecimiento. Citoplasma: Material celular contenido entre la membrana celular y el núcleo. Citotóxico: Capaz de causar la muerte celular. Clasificador de Células Activado por Fluorescencia (FACS, por sus siglas en inglés): Equipo que clasifica células basándose en marcadores fluorescentes unidos a las células. Construcción Génica: Vector de expresión que contiene la secuencia de codificación de una proteína y los elementos necesarios para su expresión. Cultivo en Suspensión: Células capaces de crecer en suspensión sin necesidad de adherirse a un sustrato (soporte) para generar la división celular. Diferenciación: Proceso de cambios bioquímicos y estructurales mediante el cual las células adquieren forma y función especializadas. Electroporación: Método para permitr la transferencia de material a las células que implica el uso breve de un campo eléctrico para crear poros temporales en la membrana celular. ELISA: Enzimoinmunoensayo. lnmunoensayo que utiliza un antígeno o anticuerpo marcado con una enzima para detectar la unión de una molécula a una matriz sólida. Endonucleasa de Restricción: Endonucleasa que reconoce una secuencia específica de bases dentro de un ADN de doble cadena. Enfermedad del Injerto Contra el Anfitrión (GVDH, por sus siglas en inglés): Rechazo del tejido transplantado por parte del anfitrión. Es la causa principal de muerte del paciente cuando se utiliza un tejido alogénico mal compatibilizado con el receptor. Episomal: Perteneciente a cualquier material genético extracromosómico accesorio. Ex Vivo: Procedimiento que se lleva a cabo fuera de un organismo vivo. Exento de suero: Se refiere al medio de crecimiento celular que carece de componentes séricos. Factores de Crecimiento: Factores responsables de regular la proliferación, función y diferenciación celular. Fase S: Parte del ciclo celular en la que ocurre la replicación del ADN (Fase de Síntesis). Formulado: Preparado de acuerdo con condicones o métodos prescritos.
USP 39
Información General/ (1047) Productos de Terapia Génica 1069
Fusión: Unión de la membrana de dos células, para generar una célula hija que contiene algunas de las propiedades de cada célula paterna. Se usa en la generación de hibridomas en los que las células que producen anticuerpos se fusionan con células de mieloma de ratón. Genoma: Material hereditario total de una célula. Hematopoyético: Perteneciente o con influencia sobre la formación de células sanguíneas. Hepatocito: Células predominantes del hígado, que cumplen una función importante en el metabolismo y son productoras de proteínas séricas. Por lo general, estas células no están en división pero si se dañan, se pueden dividir y regenerar hasta reponer las células dañadas. Hibridación Dot Blot (ADN o ARN): Técnica para detectar, analizar e identificar proteínas; similar a la transferencia Western (Western blot) pero sin separación electroforética de proteínas. Humoral: Perteneciente a los elementos encontrados en los fluidos corporales (por ejemplo, inmunidad humoral y anticuerpos neutralizantes). lnmunoensayo: Técnica para identificar sustancias basada en el uso de anticuerpos. In Vivo: Procedimiento que se lleva a cabo dentro de un organismo vivo. In Vitro: Procedimiento que se lleva a cabo fuera de un organismo vivo. Puede involucrar células o tejidos derivados de los organismos. Integración: Asimilación (inserción mediante unión covalente) de material genético (ADN) en el cromosoma de una célula receptora. lntracuerpos: Anticuerpos intracelulares que no se secretan y que están diseñados para unir e inactivar moléculas blanco dentro de las células. Leucemia: Neoplasia maligna de los tejidos formadores de la sangre. Línea Celular Empaquetadora: Línea celular que produce proteínas requeridas para empaquetar y producir vectores virales de manera activa pero que no produce virus competentes para la replicación. Complementa a nivel proteico las carencias genéticas del vector. Línea Celular Productora: Línea celular establecida que se usa para producir vectores de virus, a menudo a gran escala. Líneas Celulares: Células que derivan de cultivos primarios de embriones, tejido u órganos. Estas líneas celulares pueden tener una vida finita o pueden inmortalizarse (modificadas para replicarlas indefinidamente). Lipoplex: Formulación de lípidos y polímeros y/o proteínas. Liposoma: Bicapa de lípidos esférica que encierra un compartimento acuoso. Materiales Auxiliares: Componentes usados durante la fabricación que no deben estar presentes en el producto final. Ejemplos: factores de crecimiento, citoquinas, anticuerpos monoclonales, dispositivos de separación de células y componentes de los medios. Mutagénesis lnsercional: Tipo de mutación ocasionada por la inserción de ácido nucleico en un cromosoma de la célula anfitriona. Existen múltiples consecuencias negativas posibles por este evento, incluida la muerte de la célula cuando se inactiva un gen esencial o predisposición al cáncer si se inactiva un gen supresor de tumores. Oligonucleótido: Polímero que consiste en un pequeño número de nucleótidos, por lo general de 5 a 30. Oncogenes: Genes asociados con la proliferación neoplásica (cáncer) después de una mutación o perturbación de su expresión. Oncogénico: Que ocasiona cáncer. Par de Base: Dos bases de nucleótido en cadenas diferentes de la molécula de ácido nucleico que se unen. Parvovirus: Virus de ADN de la familia Parvoviridae. La variedad de anfitriones incluye muchas especies de vertebrados. ADN pequeño de cadena simple lineal con bucles terminales en forma de horquilla. Plásmido: Forma pequeña y circular de ADN que porta determinados genes y que es capaz de replicarse de manera independiente en una célula anfitriona. Potencia: Medición cuantitativa de la actividad biológica basada en el atributo del producto vinculado a las propiedades biológicas relevantes. Producto Biológico: Cualquier virus, suero terapéutico, toxina, antitoxina o producto análogo aplicable a la prevención, tratamiento o cura de enfermedades o lesiones en humanos. (En esta definición derivada de la FDA, el término producto análogo indica que incluye esencialmente productos obtenidos por biotecnología y procedimientos que incluyen terapia génica, productos transgénicos y terapia celular somática.) Promotor: Secuencia de ADN que se localiza en la parte frontal de un gen y que controla la expresión génica. Es necesario para unir la ARN polimerasa e iniciar la transcripción. Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés): Técnica para amplificar una secuencia específica de nucleótidos de ADN o ARN mediante ciclos de copiado que utilizan polimerasa, dando como resultado incrementos geométricos en el número de copias. Retrovirus: Virus que contiene transcriptasa reversa, la cual convierte el ARN viral en ADN que posteriormente se integra a la célula anfitriona en una forma denominada provirus. Simulacro de Prueba: Corrida de una prueba en la que deliberadamente se omiten algunos reactivos críticos. Terapia Celular: Terapia que utiliza células completas para tratar una enfermedad, afección o lesión. Es diferente del transplante de tejidos y órganos.
1070 (1047) Productos de Terapia Génica / Información General
USP 39
Terapia Génica: Terapia que emplea ácidos nucleicos que se expresan de manera subsiguiente como ARN o proteínas para tratar una enfermedad o condición. La FDA de los EE.UU. define los productos de terapia génica como productos que contienen material genético que se administran para modificar o manipular la expresión de material genético a fin de alterar las propiedades biológicas de células vivas. Transducción: Transferencia y expresión de material genético en una célula mediante un vector viral o bacteriófago. Transfección: Transferencia de ADN a las células por medios físicos tales como coprecipitación con fosfato de calcio. Transferencia Western (Western Blot): Método de electrotransferencia de proteínas en el que éstas se transfieren de un gel a un soporte rígido y delgado (p.ej., membrana de nitrocelulosa), sobre el que posteriormente se detectan mediante la unión de anticuerpos unidos a enzimas, que permiten el uso de un sustrato cromogénico o quimioluminiscente precipitante, o de anticuerpos marcados radioactivamente. Transgén: Se refiere al material genético extraño administrado como parte de una construcción de vectores. Validación del Proceso: Método para suministrar documentación probatoria de que el proceso de fabricación está controlado, es reproducible y capaz de generar uniformemente un producto que cumple con especificaciones predeterminadas. Vector: Agente (plásmido, virus o complejo liposoma-proteína o complejo ADN-proteína) usado para introducir ADN €n una célula. Viabilidad: Propiedad de estar vivo y ser funcional. Virión: Partícula viral elemental que consta de material genético (nucleocápside) y un recubrimiento proteico. Virus: Agente infeccioso submicroscópico que contiene información genética necesaria para la reproducción. Es un parásito intracelular obligado. Virus Anfotrópico: Virus que infecta y se replica en células de múltiples especies. Virus Asociado con Adenovirus (VAA): El parvovirus humano contiene un genoma de ADN de cadena simple y depende de virus colaboradores (adenovirus, virus del herpes o virus vaccinia) para su replicación. Sin la coinfección, los viriones salvajes se integran en un sitio específico en el cromosoma 19 y permanecen latentes. Virus Colaborador: Ayuda al desarrollo de un virus defectuoso suministrando o restaurando la actividad de un gen viral o permitiendo que el virus defectuoso forme una envoltura funcional. Virus Competente para la Replicación (VCR): Virus que puede completar un ciclo de replicación completo sin requerir un virus colaborador; virus que se replica de manera autónoma. Virus con Envoltura: Virus que contienen una bicapa lipoproteica que rodea la cápside y que se adquiere mediante gemación a través de la membrana celular de las células anfitrionas. Virus del Herpes Simple (VHS): Virus de ADN miembro de la familia Herpesviridae. Puede infectar tanto a vertebrados de sangre caliente como de sangre fría por contacto con superficies mucosas húmedas. Virus Ecotrópico: Virus que infecta y se replica en células derivadas únicamente de la especie anfitriona original. Xenogénico: De una especie diferente.
Cambio en la redacción:
APÉNDICE
Lista de Referencias Regulamentarias Pertinentes Los productos de terapia génica son reglamentados por la FDA como productos biológicos y, por lo tanto, su fabricación, análisis, etiquetado y demás factores están sujetos a los requisitos codificados en el CFR y en los documentos guía de la FDA (www.fda.gov). Las pautas de la ICH ofrecen guías adicionales (www.ich.org). Los fabricantes de productos de terapia génica que buscan mercados fuera de los Estados Unidos deben referirse a los documentos reglamentarios de los países pertinentes. De manera complementaria a los capítulos de USP, la siguiente lista incluye documentos reglamentarios, además de las mejores prácticas para el desarrollo, la fabricación, el control de calidad y la garantía de calidad de los productos de terapia génica: CFR 21 21 21 21 21 21
CFR CFR CFR CFR CFR CFR
21 O 211 600s 610 Subparte G 801 820 DOCUMENTOS GUÍA DE LA FDA
Guideline for the Determination of Residual Moisture in Dried Biological Products (enero 1990) Guidance for lndustry: Human Somatic Cell Therapy and Gene Therapy (marzo 1998)
USP 39
Información General/ (1048) Calidad de Productos Biotecnológicos: Análisis 1071
Guidance for lndustry: Supplemental Guidance on Testing for Replication-Competent Retrovirus in Retroviral Vector-Based Gene Therapy Products and During Follow-up of Patients in Clinical Trials Using Retroviral Vectors (octubre 2000) FDA Guidance for lndustry: lnvestigating Out-of-Specification (OOS) Test Results for Pharmaceutical Production (octubre 2006) Guidance for FDA Reviewers and Sponsors: Content and Review of Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) lnformation for Human Gene Therapy lnvestigational New Drug Applications (INDs) (abril 2008) Draft Guidance for lndustry: Potency Tests for Cellular and Gene Therapy Products (octubre 2008) DOCUMENTOS REGLAMENTARIOS NACIONALES E INTERNACIONALES Q5A(Rl): Viral Safety Evaluation of Biotechnology Products Derived from Cell Unes of Human or Animal Origin ICH Q5C: Quality of Biotechnological Products: Stability Testing of Biotechnological/Biological Products ICH Q5D: Quality of Biotechnological Products: Derivation and Characterization of Cell Substrates Used for Production of Biotechnological/Biological Products ICH Q6B Specification: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products ICH Q2 (Rl ): Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology NIH Guidelines for Research lnvolving Recombinant DNA Molecules
llilllll!iiii!:iai¡
(1048) CALIDAD DE PRODUCTOS BIOTECNOLÓGICOS: ANÁLISIS DE LA CONSTRUCCIÓN EXPRESABLE EN CÉLULAS USADAS PARA LA PRODUCCIÓN DE PRODUCTOS PROTEÍNICOS OBTENIDOS CON ADN RECOMBINANTE1 l. INTRODUCCIÓN Este documento proporciona una guía para caracterizar construcciones expresables para la producción de productos proteínicos a partir de ADN recombinante (ADN-r) en células eucarióticas y procarióticas. El propósito de este documento es describir las clases de información importantes para evaluar la estructura de la construcción expresable para producir proteínas obtenidas con ADN-r. Este documento no pretende cubrir todos los aspectos relativos a la calidad de los productos medicinales obtenidos con ADN-r. La construcción expresable se define como el vector de expresión que contiene la secuencia codificadora de la proteína recombinante. Para asegurar la calidad y la uniformidad del producto final, se deben analizar los segmentos de la construcción expresable utilizando técnicas para ácidos nucleicos junto con otras pruebas realizadas sobre la proteína recombinante purificada. Se debe considerar al análisis de la construcción expresable a nivel del ácido nucleico como una parte de la evaluación general de calidad, teniendo en cuenta que esta prueba sólo evalúa la secuencia codificadora de un gen recombinante y no la fidelidad de la traducción ni otras características de la proteína recombinante, tal como su estructura secundaria, su estructura terciaria y las modificaciones posteriores a la traducción.
11. FUNDAMENTOS PARA EL ANÁLISIS DE LA CONSTRUCCIÓN EXPRESABLE El propósito de realizar el análisis de la construcción expresable es establecer que se ha incorporado la secuencia codificadora correcta del producto en la célula anfitriona y que esta secuencia se mantiene sin cambios desde el comienzo del cultivo hasta el final de la producción. La secuencia genética de las proteínas recombinantes que se producen en células vivas puede sufrir mutaciones que podrían alterar las propiedades de la proteína con probables consecuencias adversas para los pacientes.
1 La presente guía ha sido desarrollada por el Grupo de Trabajo de Expertos (en Calidad) de la Conferencia Internacional para la Armonización de Requisitos Técnicos para el Registro de Medicamentos destinados para Uso de Seres Humanos (ICH por sus siglas en inglés) y para su redacción se han consultado a diversos organismos regulatorios, de conformidad con los procedimientos de la ICH. Este documento ha sido ratificado por el Comité Directivo de la ICH en la Etapa 4 del procedimiento de la ICH, el 29 de noviembre de 1995. Al llegar a la Etapa 4 del procedimiento, se recomienda la adopción del borrador final a los organismos regulatorios de la Unión Europea, Japón y los Estados Unidos. Esta guía ha sido publicada en el Diario Oficial (Federal Register) el 23 de febrero de 1996 (61 FR 7006) y es aplicable a fármacos y productos biológicos. A pesar de que esta guía no crea ni confiere derecho alguno a persona alguna y que no obliga a la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA, por sus siglas en inglés) ni al sector industrial, este documento representa la posición actual de la FDA respecto de la producción de productos proteínicos obtenidos con ADN recombinante. Para obtener copias adicionales de esta guía, comunicarse con: Drug lnformation Branch, HFD-21 O, CDER, FDA, 5600 Fishers Lane, Rockville, MD 20857 (Teléfono: 301-827-4573) o con Manufacturers Assistance and Communication Staff (HFM-42), CBER, FDA, 1401 Rockville Pike, Rockville, MD 20852-1448. Enviar una etiqueta autoadhesiva con nombre y dirección impresos para facilitar el trámite de la solicitud. También se encuentra disponible una versión en formato electrónico de esta guía en Internet usando la Red Mundial (WWW) (conectarse a la Página Inicial de CDER (CDER Home Page) en http://www.fda.gov/cder e ir a la sección "Regulatory Guidance").
1072 (1048) Calidad de Productos Biotecnológicos: Análisis / Información General
USP 39
No se puede esperar que un único enfoque experimental detecte todas las modificaciones posibles de una proteína. Se pueden emplear técnicas de análisis de proteínas para evaluar la secuencia de aminoácidos de una proteína y las características estructurales de la proteína expresada debidas a modificaciones posteriores a la traducción, tal como el procesamiento proteolítico, la glicosilación, la fosforilación y la acetilación. Los datos del análisis del ácido nucleico podrían ser útiles ya que los métodos de análisis de proteínas pueden no detectar todos los cambios estructurales de la proteína que resultan de mutaciones en la secuencia codificadora de la proteína recombinante. La importancia relativa del análisis del ácido nucleico y del análisis de la proteína varían de un producto a otro. El análisis del ácido nucleico se puede emplear para verificar la secuencia codificadora y el estado físico de la construcción expresable. El análisis de ácido nucleico se realiza para asegurar que la proteína expresada tendrá la secuencia de aminoácidos correcta, pero no está concebido para detectar niveles bajos de secuencias variantes. Cuando las células de producción tienen múltiples copias integradas de la construcción expresable y no todas ellas son activas para la transcripción, un examen del producto de transcripción en sí mediante un análisis de ARN mensajero (ARN-m) o ADN codificador (ADN-c) puede ser más adecuado que un análisis del ADN genómico. Los enfoques analíticos que examinan el grueso de una población de ácidos nucleicos, como por ejemplo los que se realizan sobre combinaciones de clones o sobre material amplificado por reacción en cadena con polimerasa, pueden ser considerados como una alternativa a los enfoques que dependen de la selección de clones de ADN individuales. Se podrán tener en cuenta otras técnicas que permitan la confirmación rápida y sensible de la secuencia codificadora de la proteína recombinante en la construcción expresable. En las siguientes secciones se describe la información que se debe suministrar con respecto a la caracterización de la construcción expresable durante el desarrollo y la validación del sistema de producción. Deben validarse las metodologías analíticas previstas para la confirmación de la secuencia. La documentación de validación debe incluir, como mínimo, estimaciones de los límites de detección para las secuencias variantes. Esto debe llevarse a cabo para los métodos de secuenciación de ácidos nucleicos y de proteínas. Se deben revisar periódicamente la filosofía y las recomendaciones referidas a los análisis que se expresan en este documento, con el fin de aprovechar los adelantos tecnológicos y los avances en la información científica.
111. CARACTERIZACIÓN DEL SISTEMA DE EXPRESIÓN A. Construcción Expresable y Clon Celular Utilizado para Desarrollar el Banco de Células Maestras El fabricante debe describir el origen de la secuencia de nucleótidos codificadora de la proteína. Debe incluirse la identificación y la fuente de la célula originaria de la secuencia nucleotídica. También se deben describir los métodos empleados para preparar el ADN que codifica la proteína. Se deben describir detalladamente los pasos empleados para ensamblar la construcción expresable. Esta descripción debe incluir la fuente y la función de las partes que componen la construcción expresable, por ejemplo los orígenes de replicación, los genes de resistencia a antibióticos, promotores, potenciadores y si la proteína se sintetiza como una proteína de fusión. Se debe proporcionar un mapa detallado de los componentes y una secuencia completa del plásmido con anotaciones, indicando las regiones secuenciadas durante la construcción y las secuencias extraídas de la bibliografía. Se deben indicar otras proteínas expresables codificadas por el plásmido. Se deben determinar la secuencia nucleotídica de la región codificadora del gen de interés y de las regiones adyacentes asociadas que se insertan en el vector, hasta el empalme de inserción, inclusive, mediante el secuenciamiento del ADN de la construcción. Se debe describir del método de transferencia de la construcción expresable a la célula anfitriona. Asimismo, se deben describir detalladamente los métodos empleados para amplificar la construcción expresable y el criterio utilizado para la selección de clones celulares para su producción.
B. Sistema de Banco de Células La producción de proteínas recombinantes debe basarse en un Banco de Células Maestras y en Bancos de Células de Trabajo bien definidos. Un banco de células es un conjunto de ampollas con una composición uniforme almacenadas en condiciones definidas; cada ampolla contiene una alícuota de una sola combinación de células. El Banco de Células Maestras por lo general proviene del clan celular seleccionado que contiene la construcción expresable. El Banco de Células de Trabajo se obtiene por propagación de una o varias ampollas del Banco de Células Maestras. Se deben detallar la historia de la línea celular y la producción de los bancos celulares, incluyendo los métodos y los reactivos utilizados durante el cultivo, la edad de las células in vitro y las condiciones de almacenamiento. Todos los bancos de células deben caracterizarse mediante los marcadores fenotípicos y genotípicos pertinentes, que podrían incluir la expresión de la proteína recombinante o la presencia de la construcción expresa ble. Se debe analizar la construcción expresable en el Banco de Células Maestras según se describe a continuación. Si la prueba no se puede llevar a cabo en el Banco de Células Maestras, se debe realizar en cada Banco de Células de Trabajo. Se debe emplear el mapeo con endonucleasas de restricción u otras técnicas adecuadas para analizar la construcción expresable para determinar el número de copias, las inserciones o eliminaciones y el número de sitios de integración. Para los sistemas de expresión extracromosómica, se debe determinar el porcentaje de células anfitrionas que retienen la construcción expresable.
USP 39
Información General/ (1048) Calidad de Productos Biotecnológicos: Análisis 1073
Se debe verificar la secuencia codificadora de proteína para el producto de proteína recombinante de la construcción expresable. Para los sistemas de expresión extracromosómica, se debe aislar la construcción expresable y verificar la secuencia nucleotídica codificadora del producto sin clonación adicional. Para las células con copias macrosómicas de la construcción expresable, la secuencia nucleotídica codificadora del producto puede verificarse a través de una nueva clonación y secuenciamiento de las copias cromosómicas. Alternativamente, se puede verificar la secuencia nucleotídica codificadora del producto empleando diversas técnicas, tales como el secuenciamiento de clones de ADN-c combinados, o amplificando el material por la reacción en cadena con polimerasa. La secuencia nucleotídica debe ser idéntica a la determinada para la construcción expresable dentro de los límites de detección de la metodología, según se describe en la sección 111.A., y debe corresponder a lo esperado para la secuencia de la proteína.
C. Límite de Edad para las Células de Producción In Vitro El límite de edad para las células de producción in vitro se debe basar en datos obtenidos de células productoras propagadas a escala de planta piloto o a escala normal de producción hasta la edad propuesta para las células in vitro o más. Por lo general, las células productoras se obtienen mediante la propagación del Banco de Células de Trabajo; el Banco de Células Maestras podría emplearse para preparar células de producción si se justifica debidamente. La construcción expresable de las células de producción debe analizarse una vez para el Banco de Células Maestras, según se indica en la sección 111.B., pero se podría verificar la secuencia codificadora de la proteína de la construcción expresable mediante pruebas de ácido nucleico o bien mediante análisis del producto proteínico final. Todo incremento en el límite de edad definido para las células productoras in vitro debe basarse en datos obtenidos de células propagadas in vitro hasta una edad igual o mayor que el nuevo límite de edad para las células in vitro.
IV. CONCLUSIÓN La caracterización de la construcción expresable y de la proteína purificada final son importantes para asegurar la producción uniforme de un producto obtenido con ADN-r. Según se ha descrito anteriormente, para asegurar la calidad de un producto de proteína recombinante se deben evaluar los datos del análisis de ácidos nucleicos y de la evaluación de la proteína purificada final.
GLOSARIO Banco de Células de Trabajo (BCT): El Banco de Células de Trabajo se prepara a partir de alícuotas de una suspensión homogénea de células obtenidas del cultivo de material del Banco de Células Maestras en condiciones de cultivo definidas. Banco de Células Maestras (BCM): An aliquot of a single pool of cells that generally has been prepared from the selected cell clone under defined conditions, dispensed into multiple containers, and stored under defined conditions. The MCB is used to derive all working cell banks. The testing performed on a new MCB (from a previous initial cell clone, MCB, or WCB) should be the same as for the MCB unless justified. Construcción Expresable: Es el vector de expresión que contiene la secuencia codificadora de la proteína recombinante y los elementos necesarios para su expresión. Edad de Células In Vitro: Es una alícuota de una combinación única de células que se ha preparado por lo general a partir de un don celular seleccionado en condiciones definidas, dispensada en múltiples recipientes y almacenada en condiciones definidas. El Banco de Células Maestras se emplea para proporcionar todos los bancos de células de trabajo. Las pruebas que se realizan en un Banco de Células Maestras nuevo (a partir de un previo don celular inicial, Banco de Células Maestras o Banco de Células de Trabajo) deben ser las mismas que las realizadas en el Banco de Células Maestras a menos que se justifique otra cosa. Escala de Planta Piloto: La producción de una proteína recombinante mediante un procedimiento que simula y es totalmente representativo de una escala de fabricación comercial. Los métodos de propagación celular, la cosecha y la purificación del producto deben ser idénticos, excepto por la escala de producción. Marcadores Genotípicos y Fenotípicos Relevantes: Son los marcadores que permiten identificar la cepa de la línea celular y que deben incluir la expresión de la proteína recombinante o la presencia de la construcción expresable. Regiones de Control Adyacentes: Son secuencias nucleotídicas no codificadoras que están adyacentes a los extremos 5' y 3' de la secuencia codificadora del producto y que contienen elementos importantes que afectan la transcripción, traducción o estabilidad de la secuencia codificadora. Estas regiones incluyen, por ejemplo, las secuencias promotoras, potenciadoras y de empalme y no incluyen los orígenes de la replicación ni los genes de resistencia a los antibióticos. Sitio de Integración: Es el sitio donde una o varias copias de la construcción expresable se integran al genoma de la célula anfitriona.
1074 (1049) Calidad de Productos Biotecnológicos: Estabilidad / Información General
USP 39
(1049) CALIDAD DE PRODUCTOS BIOTECNOLÓGICOS: PRUEBAS DE ESTABILIDAD DE PRODUCTOS BIOTECNOLÓGICOS O BIOLÓGICOS 1
INTRODUCCIÓN (1) Las pautas establecidas en la guía armonizada tripartita de la ICH, titulada "Pruebas de Estabilidad de Nuevos Fármacos y Productos Farmacéuticos" (publicada por la ICH el 27 de octubre de 1993) son aplicables en general a productos biotecnológicos o biológicos. Sin embargo, los productos biotecnológicos o biológicos tienen características distintivas que deben tenerse en cuenta en cualquier programa de prueba bien definido, diseñado para confirmar su estabilidad durante el período de almacenamiento deseado. Para tales productos, en los cuales los componentes activos son típicamente proteínas y/o polipéptidos, el mantenimiento de la conformación molecular y, por lo tanto, de la actividad biológica, depende tanto de fuerzas no covalentes como de fuerzas covalentes. Los productos son particularmente sensibles a factores ambientales tales como cambios de temperatura, oxidación, luz, contenido iónico y cizalladura. Para asegurar el mantenimiento de la actividad biológica y evitar la degradación, por lo general son necesarias condiciones rigurosas para su almacenamiento. Es posible que la evaluación de la estabilidad necesite metodologías analíticas complejas. Las valoraciones de actividad biológica, cuando correspondan, deben ser parte de los estudios esenciales de estabilidad. Los métodos fisicoquímicos, bioquímicos e inmunoquímicos adecuados para el análisis de la entidad molecular y para la detección cuantitativa de productos de degradación también deben formar parte del programa de estabilidad toda vez que la pureza y las características moleculares del producto permitan el uso de estas metodologías. Con estas inquietudes en mente, el solicitante debe desarrollar los datos adecuados que justifiquen la estabilidad de un producto biotecnológico o biológico y tener en cuenta numerosas condiciones externas que puedan afectar la potencia, la pureza y la calidad del producto. Los datos primarios para avalar un período de almacenamiento solicitado, ya sea para un fármaco o un producto farmacéutico, deben basarse en estudios de estabilidad a largo plazo, en tiempo real y en condiciones reales. De este modo, el desarrollo de un programa de estabilidad a largo plazo adecuado resulta fundamental para el desarrollo exitoso de un producto comercial. El propósito de este documento es dar pautas a los solicitantes respecto del tipo de estudios de estabilidad que deben proporcionarse para avalar las solicitudes de comercialización. Se entiende que durante el proceso de revisión y evaluación, pueden ocurrir actualizaciones continuas de los datos de estabilidad iniciales.
ALCANCE DEL ANEXO (2) Las pautas que se establecen en este anexo para las "Pruebas de Estabilidad de Nuevos Fármacos y Productos Farmacéuticos" son aplicables a proteínas y polipéptidos bien caracterizados, sus derivados y los productos de los cuales son componentes, y que se aíslan de tejidos, fluidos corporales, cultivos celulares, o se producen usando tecnología de ácido desoxirribonucleico recombinante (ADN-r). Por lo tanto, el documento abarca la generación y presentación de datos de estabilidad para productos tales como citocinas (interferones, interleuquinas, factores estimulantes de colonias, factores de necrosis tumoral), eritropoyetinas, activadores de plasminógeno, factores de plasma sanguíneo, hormonas y factores del crecimiento, insulinas, anticuerpos monoclonales y vacunas constituidas por proteínas o polipéptidos bien caracterizados. Además, las pautas detalladas en las siguientes secciones pueden aplicarse a otros tipos de productos, tales como vacunas convencionales, después de consultar con las autoridades reguladoras correspondientes. El documento no abarca a los antibióticos, extractos alergénicos, heparinas, vitaminas, sangre entera ni componentes celulares sanguíneos.
TERMINOLOGÍA (3) El lector debe consultar el "Glosario" en "Pruebas de Estabilidad de Nuevos Fármacos y Productos Farmacéuticos", para encontrar las definiciones de los términos básicos usados en este anexo. No obstante, dado que los fabricantes de productos biotecnológicos o biológicos en ocasiones emplean terminología tradicional, los términos tradicionales figuran especificados entre
1 La presente guía ha sido desarrollada por el Grupo de Trabajo de Expertos (en Calidad) de la Conferencia Internacional sobre Armonización de Requisitos Técnicos para el Registro de Productos Farmacéuticos destinados para Uso en Seres Humanos (ICH por sus siglas en inglés), y para su redacción ha sido sometida a consulta por los diversos organismos reguladores, en conformidad con el proceso de la ICH. Este documento ha sido ratificado por el Comité Directivo de la ICH en la Etapa 4 del proceso de la ICH, el 20 de noviembre de 1995. En la Etapa 4 del proceso, se recomienda la adopción del borrador final a los organismos reguladores de la Unión Europea, Japón y los Estados Unidos. Esta guía ha sido publicada en el Diario Oficial (Federal Register) el 1O de julio de 1996 (61 FR 36466) y es aplicable a productos farmacéuticos y biológicos. Pese a que esta guía no crea o confiere derechos a favor de o para persona alguna y que no es vinculante para la FDA ni para el sector industrial relevante, este documento representa la posición actual de la agencia respecto a las pruebas de estabilidad de productos biotecnológicos o biológicos. Para obtener copias adicionales de esta guía, comuníquese con: Drug lnformation Branch, HFD-21 O, CDER, FDA, 5600 Fishers Lane, Rockville, MD 20857 (Teléfono: 301-827-4573) o con Manufacturers Assistance and Communication Staff (HFM-42), CBER, FDA, 1401 Rockville Pike, Rockville, MD 20852-1448. Envíe una etiqueta autoadhesiva con su nombre y dirección impresos en ella para facilitar el procesamiento de su solicitud. También se encuentra disponible una versión de esta guía en formato electrónico en Internet usando la World Wide Web (WWW) (conectarse a la Página de Inicio de CDER (CDER Home Page) en http://www.fda.gov/cder e ir a la sección "Regulatory Guidance").
USP 39
Información General/ (1049) Calidad de Productos Biotecnológicos: Estabilidad 1075
paréntesis para ayudar al lector. También se incluye un glosario complementario que explica ciertos términos usados en la elaboración de productos biotecnológicos o biológicos.
SELECCIÓN DE PARTIDAS (4) Fármaco (Material a Granel) (4.1) En los casos en los que el material a granel deba almacenarse después de su fabricación, pero antes de la formulación y fabricación final, se deben proporcionar datos de estabilidad de al menos tres partidas cuya fabricación y almacenamiento sean representativos de la escala de fabricación. Para los casos en los que se solicitan más de 6 meses de almacenamiento, debe suministrarse, al momento de la presentación, un mínimo de datos de 6 meses de estabilidad. Para fármacos con períodos de almacenamiento menores de 6 meses, la cantidad mínima de datos de estabilidad para la presentación inicial se determinará basándose en cada caso en particular. Los datos de partidas realizadas a escala de planta piloto correspondientes a un fármaco producido a una escala reducida de fermentación y purificación podrán proporcionarse en el momento en que se presente el expediente ante las agencias reguladoras, con el compromiso de colocar las primeras tres partidas de escala de fabricación en el programa de estabilidad a largo plazo después de su aprobación. La calidad de las partidas de fármaco colocadas en el programa de estabilidad debe ser representativa de la calidad del material utilizado en estudios preclínicos y clínicos y de la calidad del material que se producirá a escala de fabricación. Además, el fármaco (material a granel) producido a escala de planta piloto, debe ser elaborado mediante un proceso y almacenado bajo condiciones representativas de aquellas usadas para la escala de fabricación. El fármaco ingresado en el programa de estabilidad debe ser almacenado en envases que sean representativos de aquellos usados para contener la sustancia durante la fabricación. Los envases de tamaño reducido serán aceptables para pruebas de estabilidad de fármacos, siempre y cuando estén fabricados con el mismo material y usen el mismo tipo de sistema de envase/cierre que se pretende utilizar durante la fabricación.
Productos Intermedios (4.2) Durante la fabricación de productos biotecnológicos o biológicos, la calidad y el control de ciertos productos intermedios puede ser fundamental para la producción del producto final. En general, el fabricante debe identificar los productos intermedios y generar datos internos y límites de procesos que aseguren su estabilidad, dentro de los parámetros del proceso desarrollado. Pese a que se permite el uso de datos a escala de planta piloto, el fabricante debe establecer la conformidad de tales datos utilizando el proceso a escala de fabricación.
Producto Farmacéutico (Producto del Envase Final) (4.3) Deberá proporcionarse información sobre la estabilidad de al menos tres partidas del producto del envase final, representativas de aquellas que se usarán a escala de fabricación. Cuando sea posible, las partidas del producto del envase final incluidas en la prueba de estabilidad deben provenir de distintas partidas del material a granel. Para los casos en los que se solicitan más de 6 meses de almacenamiento, debe suministrarse, al momento de la presentación, un mínimo de datos de 6 meses de estabilidad. Para productos farmacéuticos con períodos de almacenamiento menores de 6 meses, la cantidad mínima de datos de estabilidad en la presentación inicial se determinará en cada caso en particular. La fecha de caducidad del producto debe basarse en los datos reales presentados como aval de la solicitud. Dado que la fecha se basa en los datos de tiempo real/temperatura real presentados para revisión, deben efectuarse actualizaciones continuas de los datos de estabilidad inicial durante los procesos de revisión y evaluación. La calidad del producto del envase final sometido a los estudios de estabilidad debe ser representativa de la calidad del material utilizado en los estudios preclínicos y clínicos. Los datos de partidas a escala de planta piloto del producto farmacéutico podrán proporcionarse en el momento en que se presente el expediente ante las agencias reguladoras, con el compromiso de incluir las primeras tres partidas a escala de fabricación en el programa de estabilidad a largo plazo después de su aprobación. Cuando las partidas a escala de planta piloto hayan sido presentadas para establecer el período de vida útil de un producto y, en caso de que el producto elaborado a escala de fabricación no cumpla con esas especificaciones de estabilidad a largo plazo durante todo el período de vigencia o que no sea representativo del material usado en estudios preclínicos y clínicos, el solicitante debe notificar a las autoridades reguladoras correspondientes para determinar un curso de acción adecuado.
Selección de muestras (4.4) Cuando un producto es distribuido en partidas que difieran en volumen de llenado (por ejemplo, 1 mililitro (mL), 2 mL o 1 O mL), cantidad de unidades (por ejemplo, 1 O unidades, 20 unidades o 50 unidades), o masa (por ejemplo, 1 miligramo (mg), 2 mg o 5 mg), las muestras que se ingresen al programa de estabilidad podrán ser seleccionadas basándose en un sistema de matriz y/o por "bracketing" (estudio de inferencia por extremos).
1076 (1049) Calidad de Productos Biotecnológicos: Estabilidad / Información General
USP 39
El matrizado, es decir, el diseño estadístico de un estudio de estabilidad en el cual se prueban diferentes fracciones de muestras en distintos puntos de muestreo, sólo debe aplicarse cuando se proporciona documentación adecuada que confirma que la estabilidad de las muestras probadas representa la estabilidad de todas las muestras. Las diferencias en las muestras para el mismo producto farmacéutico deben ser identificadas indicando, por ejemplo, que cubren distintas partidas, distintas concentraciones, distintos tamaños del mismo cierre y, posiblemente, en algunos casos, distintos sistemas de envase y cierre. El matrizado no debe aplicarse a muestras con diferencias que puedan afectar la estabilidad, tales como distintas concentraciones y distintos envases y cierres, donde no pueda confirmarse que los productos responden de manera similar a las condiciones de almacenamiento. Cuando se utilicen la misma concentración y exactamente el mismo sistema de envase y cierre para tres o más volúmenes de llenado, el fabricante puede optar por incluir sólo los tamaños de envase más pequeño y más grande en el programa de estabilidad, es decir, puede optar por el "bracketing". El diseño de un protocolo que incorpore "bracketing" supone que la estabilidad de las muestras de condición intermedia están representadas por aquellas de los extremos. En ciertos casos, se pueden necesitar datos para demostrar que todas las muestras están adecuadamente representadas por los datos reunidos para los extremos.
PERFIL INDICADOR DE ESTABILIDAD (5) En general, no hay una valoración ni un parámetro único indicador de estabilidad que ofrezca un perfil de las características de estabilidad de un producto biotecnológico o biológico. Por consiguiente, el fabricante debe proponer un perfil indicador de estabilidad que garantice que los cambios en la identidad, pureza y potencia del producto serán detectados. En el momento de la presentación, los solicitantes deben haber validado los métodos que comprenden el perfil indicador de estabilidad y los datos deben estar disponibles para su revisión. La determinación de las pruebas que deben incluirse será específica para cada producto. Los elementos enfatizados en las siguientes subsecciones no pretenden incluir todas las características de un producto, sino representar aquellas que típicamente deben documentarse para demostrar en forma adecuada la estabilidad del mismo.
Protocolo (5.1) El expediente que acompaña la solicitud para autorización de comercialización debe incluir un protocolo detallado de la evaluación de la estabilidad tanto del fármaco como del producto farmacéutico, que justifiquen las condiciones de almacenamiento y los períodos de vida útil propuestos. El protocolo debe incluir toda la información necesaria que demuestre la estabilidad del producto biotecnológico o biológico durante el período de vida útil propuesto incluyendo, por ejemplo, especificaciones bien definidas e intervalos de prueba. Los métodos estadísticos que deben utilizarse se describen en la guía tripartita sobre estabilidad.
Potencia (5.2) Cuando el uso previsto de un producto está vinculado a una actividad biológica definible y mensurable, las pruebas de potencia deben formar parte de los estudios de estabilidad. A efectos de las pruebas de estabilidad de los productos descritos en esta guía, la potencia es la aptitud o capacidad específica de un producto para lograr su efecto previsto. Se basa en la medida de algún atributo del producto y se determina por medio de un método cuantitativo in vivo o in vitro adecuado. En general, las potencias de los productos biotecnológicos o biológicos probados por diferentes laboratorios pueden compararse en forma significativa sólo si se expresan en relación con la de un material de referencia adecuado. Para tal propósito, debe incluirse en la valoración un material de referencia calibrado directa o indirectamente con respecto al material de referencia nacional o internacional correspondiente. Los estudios de potencia deben realizarse a intervalos adecuados, según se define en el protocolo de estabilidad y los resultados deben expresarse en unidades de actividad biológica calibradas, siempre que sea posible, en relación a estándares reconocidos nacional o internacionalmente. Cuando no existan estándares de referencia nacionales ni internacionales, los resultados de las valoraciones podrán ser informados en unidades obtenidas internamente, utilizando un material de referencia caracterizado. En algunos productos biotecnológicos o biológicos, la potencia depende de la conjugación del ingrediente o ingredientes activos a una segunda subunidad o de la unión con un adyuvante. La disociación del ingrediente o los ingredientes activos del transportador utilizado en conjugados o adyuvantes debe ser examinada en estudios en tiempo real/temperatura real (incluyendo condiciones que se encuentran durante el transporte). Es posible que la evaluación de la estabilidad de tales productos sea dificultosa, ya que, en ciertos casos, las pruebas in vitro de actividad biológica y de caracterización fisicoquímica son poco prácticas o proporcionan resultados inexactos. Para superar las deficiencias de las pruebas in vitro, habrá que considerar estrategias adecuadas (por ejemplo, probar el producto antes de la conjugación o unión, evaluar la liberación del compuesto activo de la segunda subunidad, valoraciones in vivo) o el uso de una prueba alternativa adecuada.
USP 39
Información General/ (1049) Calidad de Productos Biotecnológicos: Estabilidad 1077
Pureza y Caracterización Molecular (5.3) A efectos de las pruebas de estabilidad de los productos descritos en esta guía, la pureza es un término relativo. Debido a los efectos de la glicosilación, desamidación u otras heterogeneidades, la pureza absoluta de un producto biotecnológico o biológico es sumamente difícil de determinar. Por consiguiente, la pureza de un producto biotecnológico o biológico debe ser evaluada típicamente por más de un método y el valor de pureza que se obtenga dependerá del método. A efectos de las pruebas de estabilidad, las pruebas de pureza deben concentrarse en los métodos para la determinación de los productos de degradación. El grado de pureza, al igual que las cantidades individuales y totales de productos de degradación del producto biotecnológico o biológico ingresado en los estudios de estabilidad, deben ser informados y documentados siempre que sea posible. Los límites de degradación aceptables deben derivar de los perfiles analíticos de las partidas del fármaco y del producto farmacéutico utilizados en los estudios preclínicos y clínicos. El uso de metodologías analíticas fisicoquímicas, bioquímicas e inmunoquímicas pertinentes debería permitir una caracterización exhaustiva del fármaco y/o del producto farmacéutico (por ejemplo, tamaño molecular, carga, hidrofobicidad) y la detección exacta de cambios de degradación que puedan ser consecuencia de desamidación, oxidación, sulfoxidación, agregación o fragmentación durante el almacenamiento. Como ejemplos, entre los métodos que pueden contribuir a este objetivo se incluyen la electroforesis (SDS-PAGE, inmunoelectroforesis, Western blot, isoelectroenfoque), la cromatografía de alta resolución (por ejemplo, cromatografía en fase reversa, filtración a través de gel, intercambio iónico, cromatografía de afinidad) y el mapeo de péptidos. Siempre que se detecten cambios cualitativos o cuantitativos significativos, que indiquen la formación de un producto de degradación durante los estudios de estabilidad a largo plazo, acelerados y/o de estrés, habrá que tener en cuenta los riesgos potenciales y la necesidad de caracterización y cuantificación de los productos de degradación dentro del programa de estabilidad a largo plazo. Deberán proponerse y justificarse límites aceptables, teniendo en cuenta los niveles observados en el material utilizado en estudios preclínicos y clínicos. Para sustancias que no puedan caracterizarse adecuadamente, o productos para los cuales no se pueda determinar un análisis exacto de la pureza por métodos analíticos de rutina, el solicitante debe proponer y justificar procedimientos de prueba alternativos.
Otras Características del Producto (5.4) Las siguientes características del producto, pese a no estar específicamente relacionadas con productos biotecnológicos o biológicos, deben ser monitoreadas e informadas para el producto farmacéutico en su envase final: El aspecto visual del producto (color y opacidad para soluciones o suspensiones; color, textura y tiempo de disolución para polvos), las partículas visibles en soluciones o después de la reconstitución de polvos o liofilizados, el pH y el nivel de humedad de polvos y productos liofilizados. Las pruebas de esterilidad o pruebas alternativas (por ejemplo, prueba de integridad del envase/cierre) deben realizarse, como mínimo, al inicio y al final de la vida útil propuesta. Los aditivos (por ejemplo, estabilizadores, conservantes) o los excipientes se pueden degradar durante el período de vida útil del producto farmacéutico. Si hay alguna indicación, durante los estudios de estabilidad preliminares, de que la reacción o la degradación de tales materiales afectan adversamente la calidad del producto farmacéutico, puede que se precise controlar estos componentes durante el programa de estabilidad. El envase/cierre tiene el potencial de afectar adversamente al producto y debe ser evaluado cuidadosamente (ver a continuación).
CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO (6) Temperatura (6.1) Como la mayoría de los productos biotecnológicos o biológicos terminados necesitan temperaturas de almacenamiento definidas con precisión, las condiciones de almacenamiento para los estudios de estabilidad en tiempo real/temperatura real pueden limitarse a la temperatura de almacenamiento propuesta.
Humedad (6.2) Los productos biotecnológicos o biológicos generalmente se distribuyen en envases que los protegen contra la humedad. Por lo tanto, donde pueda demostrarse que los envases propuestos (y las condiciones de almacenamiento) logran una protección suficiente contra la alta y baja humedad, por lo general, se podrán omitir las pruebas de estabilidad a distintas humedades relativas. Cuando no se utilicen envases que protejan contra la humedad, deben proporcionarse datos de estabilidad adecuados.
1078 (1049) Calidad de Productos Biotecnológicos: Estabilidad / Información General
USP 39
Condiciones Aceleradas y de Estrés (6.3) Según se observó anteriormente, la fecha de caducidad debe basarse en datos de tiempo real/temperatura real. No obstante, se sugiere enfáticamente que se realicen estudios sobre el fármaco y el producto farmacéutico bajo condiciones aceleradas y de estrés. Los estudios bajo condiciones aceleradas pueden proporcionar datos útiles para establecer la fecha de caducidad, proporcionar información sobre la estabilidad del producto o sobre el futuro desarrollo del producto (por ejemplo, la evaluación preliminar de los cambios de fabricación propuestos tales como cambios en la formulación, aumento de escala), ayudar a la validación de métodos analíticos para el programa de estabilidad, o generar información que pueda ayudar a dilucidar el perfil de degradación del fármaco o del producto farmacéutico. Los estudios bajo condiciones de estrés pueden ser útiles para determinar si las exposiciones accidentales a condiciones que no sean las propuestas (por ejemplo, durante el transporte) son perjudiciales para el producto y también para evaluar qué parámetros específicos de prueba pueden ser los mejores indicadores de la estabilidad del producto. Los estudios de la exposición del fármaco o del producto farmacéutico a condiciones extremas pueden ayudar a revelar patrones de degradación; si es así, dichos cambios deben ser monitoreados bajo las condiciones de almacenamiento propuestas. Pese a que la guía tripartita sobre estabilidad describe las condiciones de los estudios acelerados y de estrés, el solicitante debe tener en cuenta que esas condiciones pueden no ser adecuadas para productos biotecnológicos o biológicos. Las condiciones deben seleccionarse cuidadosamente, de acuerdo a cada caso en particular.
Luz (6.4) Los solicitantes deben consultar a las autoridades reguladoras correspondientes, en cada caso, a fin de determinar las pautas para las pruebas.
Envase/Cierre (6.5) Pueden ocurrir cambios en la calidad del producto, a causa de las interacciones entre el producto biotecnológico o biológico formulado y el envase/cierre. Cuando no pueda excluirse la ausencia de interacciones en productos líquidos (que no sean ampollas selladas), los estudios de estabilidad deben incluir muestras mantenidas en posición invertida u horizontal (es decir, en contacto con el cierre), como también en posición vertical, para determinar los efectos del cierre sobre la calidad del producto. Deben suministrarse datos para todas las combinaciones diferentes de envase/cierre que se vayan a comercializar. Además de los datos estándar necesarios para un vial monodosis convencional, el solicitante debe demostrar que el cierre utilizado en un vial multidosis es capaz de tolerar las condiciones de inserciones y extracciones reiteradas, de modo tal que el producto conserve completamente su potencia, pureza y calidad durante el período máximo especificado en las instrucciones de uso en los envases, empaques y/o folletos del empaque. Dicho etiquetado debe cumplir con los requisitos nacionales y regionales pertinentes.
Estabilidad después de la Reconstitución de Productos Liofilizados (6.6) Deberá demostrarse la estabilidad de los productos liofilizados, después de su reconstitución, para las condiciones y el período de almacenamiento máximo especificados en los envases, empaques y/o folletos del empaque. Este etiquetado debe cumplir con los requisitos nacionales y regionales pertinentes.
FRECUENCIA DE LAS PRUEBAS (7) La vida útil de los productos biotecnológicos o biológicos puede variar entre días y varios años. Por lo tanto, es difícil elaborar guías uniformes respecto de la duración de los estudios de estabilidad y de la frecuencia de prueba que corresponderían a todos los tipos de productos biotecnológicos o biológicos. No obstante, sólo con unas pocas excepciones, la vida útil para los productos existentes y los futuros productos potenciales oscila entre 0,5 y 5 años. Por lo tanto, las pautas se basan en la vida útil esperada dentro de ese intervalo. Esto toma en cuenta el hecho de que la degradación de los productos biotecnológicos o biológicos puede no estar regida por los mismos factores durante intervalos diferentes de un período de almacenamiento prolongado. Cuando se propone una vida útil de 1 año o menos, los estudios de estabilidad en tiempo real deben realizarse mensualmente durante los primeros 3 meses y a intervalos de 3 meses de allí en adelante. Para productos con una vida útil propuesta de más de 1 año, los estudios deben realizarse cada 3 meses durante el primer año de almacenamiento, cada 6 meses durante el segundo año y anualmente desde ese momento en adelante. Mientras que los intervalos de prueba mencionados anteriormente pueden ser adecuados en la etapa previa a la aprobación o licencia, pruebas de estabilidad reducidas pueden ser adecuadas después de la aprobación o licencia, cuando se dispone de datos que demuestran una estabilidad adecuada. Cuando existan datos que indiquen que la estabilidad de un producto no se ve comprometida, se recomienda al solicitante presentar un protocolo que avale la eliminación de intervalos de prueba específicos (por ejemplo, prueba a los 9 meses) para estudios a largo plazo posteriores a la aprobación o licencia.
USP 39
Información General/ (1050) Evaluación de la Seguridad Viral 1079
ESPECIFICACIONES (8) Pese a que los productos biotecnológicos o biológicos pueden estar sujetos a pérdidas significativas de actividad, a cambios fisicoquímicos o a degradación durante el almacenamiento, las regulaciones internacionales y nacionales han proporcionado pocas pautas en relación a especificaciones claras sobre liberación y fin de la vida útil. No se han desarrollado recomendaciones sobre pérdidas de actividad máximas aceptables, límites para cambios fisicoquímicos o degradación durante la vida útil propuesta, que se refieran a tipos individuales o grupos de productos biotecnológicos o biológicos, sino que aquellas se consideran en cada caso en particular. Cada producto debe conservar sus especificaciones dentro de los límites establecidos para seguridad, pureza y potencia durante su vida útil propuesta. Estas especificaciones y límites deben derivar de toda la información disponible, usando los métodos estadísticos adecuados. El uso de especificaciones diferentes para liberación y caducidad debe estar respaldado por datos suficientes que demuestren que la eficacia clínica no se ve afectada, según se establece en la guía tripartita sobre estabilidad.
ETIQUETADO (9) Se recomienda la definición precisa de temperaturas de almacenamiento para la mayoría de los fármacos y productos farmacéuticos biotecnológicos o biológicos. Deben establecerse recomendaciones específicas, en particular, para fármacos y productos farmacéuticos que no toleren la congelación. Estas condiciones, y en los casos pertinentes, las recomendaciones sobre protección contra la luz o la humedad, deben figurar en los envases, empaques y/o folletos de los empaques. Dicho etiquetado debe cumplir con los requisitos nacionales y regionales pertinentes.
GLOSARIO (10) Escala de Planta Piloto: La producción del fármaco o del producto farmacéutico por medio de un procedimiento totalmente representativo y que simula el que se aplicará a escala de fabricación. Los métodos de expansión celular, la cosecha y la purificación del producto deben ser idénticos, excepto por la escala de producción. Impureza: Cualquier componente del fármaco (material a granel) o producto farmacéutico (producto del envase final) que no sea la entidad química definida como el fármaco, un excipiente u otros aditivos del producto farmacéutico. Producción a Escala de Fabricación: Fabricación a la escala que se encuentra típicamente en una instalación destinada a la elaboración de productos para su comercialización. Producto Conjugado: Un producto conjugado está constituido por un ingrediente activo (por ejemplo, un péptido, un carbohidrato) unido en forma covalente o no covalente a un transportador (por ejemplo, una proteína, un péptido, un mineral inorgánico), con el objetivo de mejorar la eficacia o la estabilidad del producto. Producto de Degradación: Una molécula que resulta de un cambio en el fármaco (material a granel) ocurrido con el tiempo. A efectos de las pruebas de estabilidad de los productos descritos en esta guía, dichos cambios podrían ocurrir como resultado de un proceso o del almacenamiento (por ejemplo, por desamidación, oxidación, agregación, proteólisis). En el caso de productos biotecnológicos o biológicos, algunos productos de degradación pueden ser activos. Producto Intermedio: Para los productos biotecnológicos o biológicos, un material producido durante un proceso de fabricación que no sea el fármaco o el producto farmacéutico pero cuya fabricación es fundamental para la producción exitosa del fármaco o del producto farmacéutico. Generalmente, un producto intermedio será cuantificable y se establecerán especificaciones para determinar la finalización exitosa de la etapa de fabricación antes de la continuación del correspondiente proceso de fabricación. Incluye material que podrá ser sometido a modificaciones moleculares adicionales o conservado durante un período extenso antes de someterse a procesos adicionales.
(1050) EVALUACIÓN DE LA SEGURIDAD VIRAL EN PRODUCTOS BIOTECNOLÓGICOS OBTENIDOS DE LÍNEAS CELULARES DE ORIGEN HUMANO O ANIMAL l. INTRODUCCIÓN Este documento trata sobre el análisis y la evaluación de la seguridad viral de productos biotecnológicos derivados de líneas caracterizadas de células de origen humano o animal (es decir, de mamíferos, aves, insectos) y describe brevemente los datos que deberán presentarse en el dossier para la solicitud y/o registro de comercialización del producto. A los efectos de este documento, el término "virus" excluye los agentes transmisibles no convencionales como los asociados con la Encefalopatía Espongiforme Bovina (BSE, por sus siglas en inglés) y el scrapie ovino (o tembladera ovina). Se recomienda a los solicitantes tratar los temas asociados con la BSE con las autoridades reguladoras.
1080 (1050) Evaluación de la Seguridad Viral / Información General
USP 39
El documento abarca los productos obtenidos a partir de cultivos celulares iniciados en bancos de células caracterizadas. Cubre los productos derivados del cultivo celular in vitro, como por ejemplo interferones, anticuerpos monoclonales y productos derivados del ácido desoxirribonucleico recombinante (ADN-r), incluyendo las vacunas de subunidades recombinantes y también los productos derivados de hibridomas cultivados in vivo, como la ascitis. En este último caso se aplican consideraciones especiales y el Apéndice 7 contiene información adicional sobre pruebas de células multiplicadas in vivo. Se excluyen de este documento las vacunas inactivadas, todas las vacunas a virus vivo que contienen agentes autorreplicables y vectores vivos diseñados genéticamente. El riesgo de contaminación viral es una característica común a todos los productos biotecnológicos obtenidos a partir de líneas celulares. Tal contaminación podría tener consecuencias clínicas graves y puede surgir de la contaminación de la fuente misma de las líneas celulares (células sustrato) o de la introducción accidental de un virus durante la producción. Hasta la fecha, sin embargo, los productos biotecnológicos derivados de líneas celulares no han estado involucrados en la transmisión de virus. De todos modos, se estima que la seguridad de estos productos con respecto a la contaminación viral sólo puede garantizarse razonablemente mediante la aplicación de un programa de pruebas de detección viral y la evaluación de los procesos de eliminación e inactivación viral efectuados durante la fabricación, como se describe a continuación. Se han desarrollado tres enfoques principales y complementarios para controlar la potencial contaminación viral de los productos biotecnológicos: (1) Selección y prueba de líneas celulares y otras materias primas, incluso de los componentes de los medios, para determinar la ausencia de virus indeseables que pueden ser infecciosos y/o patógenos para los seres humanos; (2) Evaluación de la capacidad de los procesos de producción para eliminar los virus infecciosos; (3) Realización de pruebas al producto en fases apropiadas de la producción para verificar la ausencia de virus infecciosos contaminantes. Todas las pruebas sufren la limitación inherente a las valoraciones virales cuantitativas, es decir, que la capacidad para detectar concentraciones virales bajas depende, por razones estadísticas, del tamaño de la muestra. Por lo tanto, un solo enfoque no alcanza para establecer la seguridad de un producto. En muchos casos, la certeza de que el producto final no contiene virus infecciosos no surge exclusivamente de pruebas directas para determinar su presencia sino también de una demostración de que el régimen de purificación es capaz de eliminar y/o inactivar los virus. El tipo y el alcance de las pruebas virales y de los estudios de depuración viral necesarios en diferentes fases de producción dependerán de diversos factores y deberán considerarse para cada caso en particular y paso por paso. Los factores que se deberán tener en cuenta incluyen el alcance de la caracterización y calificación del banco de células, la naturaleza de los virus detectados, los componentes del medio de cultivo, los métodos de cultivo, el diseño de las instalaciones y los equipos, los resultados de las pruebas virales después del cultivo de las células, la capacidad del proceso para eliminar los virus, el tipo de producto y el uso clínico para el cual está destinado. El propósito de este documento es describir un marco de referencia general para las pruebas de detección viral, los experimentos para la evaluación de la depuración viral y el enfoque recomendado para el diseño de pruebas para la detección de virus y estudios de depuración viral. En los apéndices se incluye información relacionada mientras que en el glosario pueden encontrarse definiciones de algunos términos seleccionados. Los fabricantes deberán adaptar las recomendaciones presentadas en este documento a su producto y proceso de producción específicos. Se deberá explicar y justificar el enfoque empleado por los fabricantes en su estrategia general para garantizar la seguridad viral. Además del detalle de los datos que se proporcionan, podría ser útil contar con un resumen general de la evaluación de la seguridad viral a fin de facilitar la revisión por parte de las autoridades regulatorias. Este resumen deberá contener una breve descripción de todos los aspectos de los estudios de seguridad viral y de las estrategias empleadas para impedir la contaminación viral en relación con este documento.
11. FUENTES POTENCIALES DE CONTAMINACIÓN VIRAL La contaminación viral de los productos biotecnológicos puede surgir de la fuente original de las líneas celulares o de la introducción accidental de virus durante los procesos de producción.
A. Virus que Pueden Encontrarse en el Banco de Células Maestras (BCM) Las células pueden sufrir una infección viral latente o persistente (por ejemplo, virus del herpes) o tener retrovirus endógenos que pueden transmitirse verticalmente desde una generación de células a la siguiente, ya que el genoma viral persiste dentro de la célula. Tales virus pueden expresarse constitutivamente o inesperadamente como un virus infeccioso. Los virus pueden introducirse en el BCM por diferentes vías, como por ejemplo: (1) derivación de líneas celulares de animales infectados; (2) empleo de virus para establecer la línea celular; (3) empleo de reactivos biológicos contaminados, como por ejemplo, componentes séricos animales; (4) contaminación durante la manipulación de las células.
Información General/ (1050) Evaluación de la Seguridad Viral 1081
USP 39
B. Virus Adventicios Que Pueden Introducirse Durante la Producción Los virus adventicios pueden introducirse en el producto final por diferentes vías que incluyen, entre otras, las siguientes: (1) empleo de reactivos biológicos contaminados, como por ejemplo, componentes de suero animal; (2) empleo de un virus para inducir la expresión de genes específicos que codifican una proteína deseada; (3) empleo de un reactivo contaminado, como por ejemplo, una columna para cromatografía de afinidad con anticuerpos monoclonales; (4) empleo de un excipiente contaminado durante la formulación; y (5) contaminación durante la manipulación de las células y del medio. El control de los parámetros de cultivo de células puede ser útil para la detección temprana de la contaminación potencial por virus adventicios.
111. CALIFICACIÓN DE LÍNEAS CELULARES: PRUEBA PARA LA DETECCIÓN DE VIRUS Una parte importante de la calificación de una línea celular para su uso en la producción de un producto biotecnológico es la realización de pruebas apropiadas para detectar la presencia de virus.
A. Pruebas Virales Sugeridas para BCM, Banco de Células de Trabajo (BCT) y Células en el Límite de Edad Celular in Vitro Empleadas para Producción La Tabla 7 muestra ejemplos de pruebas virales que se realizan una sola vez a diversos niveles de células, incluyendo el BCM, el BCT y las células en el límite de edad celular in vitro usadas para producción. Tabla 1. Ejemplos de Pruebas de Virus a ser Realizadas Una Única Vez a Distintos Niveles Celulares BCM
BCT 1
Células en el Límlte 2
Pruebas para Retrovirus y Otros Virus Endógenos 1nfectividad
+
-
+
Microscopía electrónica 3
+3
-
+3
Transcriptasa inversa 4
+4
-
+4
según correspon das
-
según correspondas
Valoraciones in vitro
+
-6
+
Valoraciones in vivo
+
Pruebas de producción de anticuerpos 7
+7
-
-
Otras pruebas específicas para virus 8
+ª
-
-
Otras pruebas específicas para viruss
Pruebas para Virus No Endógenos o Adventicios _6
+
Ver texto-sección 111.A.2. 2 Células en el Límite: Células en el límite de edad celular in vitro utilizadas para la producción (l/er texto-sección 111.A. 3.). 3 También puede detectar otros agentes. 4 No es necesario si es positivo en la prueba de infectividad de retrovirus. 5 Según sea adecuado para las líneas celulares que se sabe están infectadas por tales agentes. 6 Para el primer BCT, esta prueba deberá hacerse sobre células en el límite de la edad celular in vitro generadas a partir de ese BCT; para los BCT subsiguientes al primer BCT, se puede llevar a cabo una única prueba in vitro e in vivo ya sea directamente sobre el BCT o sobre células en el límite de la edad celular in vitre. 7 Por ejemplo, MAP, RAP, HAP-normalmente aplicables para las líneas celulares de roedores. B Por ejemplo, las pruebas para líneas celulares derivadas de líneas celulares humanas, de primates no humanos, u otras, según sea adecuado. 1
1 . BANCO DE CÉLULAS MAESTRAS En el BCM se deberá realizar un examen exhaustivo para detectar la contaminación viral, tanto endógena como no endógena. En el caso de las líneas celulares heterohíbridas en las cuales una o varias células asociadas son de origen humano o provienen de primates no humanos, se deberán realizar pruebas para detectar los virus de origen humano o provenientes de primates no humanos porque la contaminación viral que surge de estas células puede representar un peligro importante. Las pruebas para detectar virus no endógenos deberán incluir pruebas de inoculación in vitro e in vivo y otras pruebas específicas, incluyendo pruebas específicas para la especie que sean apropiadas, como por ejemplo la prueba de producción de anticuerpos en ratones (MAP, por sus siglas en inglés), según el historial de resiembra de la línea celular, para detectar posibles virus contaminantes. 2. BANCO DE CÉLULAS DE TRABAJO Cada BCT empleado como sustrato inicial de células para la producción de medicamentos deberá ser examinado para detectar virus adventicios, ya sea realizando pruebas directas o mediante el análisis de células que estén en el límite de edad celular in vitro, obtenidas inicialmente del BCT. Cuando se hayan realizado pruebas adecuadas para detectar virus no endógenos en el BCM y se hayan obtenido del BCT células cultivadas hasta el límite de edad celular in vitro, o más allá de ese límite y se las haya utilizado para detectar la presencia de virus adventicios, no será necesario realizar pruebas similares en el BCT inicial. Por
USP 39
1082 (1050) Evaluación de la Seguridad Viral / Información General
lo general, no son necesarias las pruebas de producción de anticuerpos para el BCT. También se consideraría aceptable un enfoque alternativo en el cual se lleven a cabo pruebas completas sobre el BCT en lugar de hacerlo en el BCM. 3. CÉLULAS EN EL LÍMITE DE EDAD CELULAR IN VITRO EMPLEADAS PARA PRODUCCIÓN El límite de edad celular in vitro usado para la producción deberá estar sustentado en los datos de células de producción expandidas a escala de planta piloto o condiciones de escala comercial hasta la edad celular in vitro propuesta, o más allá de ésta. Por lo general, las células de producción se obtienen por expansión del BCT; el BCM también puede utilizarse para preparar las células de producción. Las células que se encuentran en el límite de la edad celular in vitro deberán evaluarse una vez para detectar los virus endógenos que pueden no haber sido detectados en el BCM y BCT. La realización de pruebas adecuadas (por ejemplo, in vitro e in vivo) por lo menos una vez en las células utilizadas para la producción que están en el límite de edad celular in vitro proporcionaría una seguridad adicional de que el proceso de producción no es propenso a la contaminación por virus adventicios. Si se detecta algún virus adventicio a estos niveles, el proceso se deberá controlar cuidadosamente para determinar la causa de la contaminación y, si fuera necesario, su diseño deberá modificarse por completo.
B. Pruebas Recomendadas para la Detección e Identificación de Virus Se pueden emplear numerosas pruebas para la detección de virus endógenos y adventicios. En la Tabla 2 se enumeran ejemplos de estas pruebas. Estos ejemplos deberán ser considerados como protocolos de valoración recomendados actualmente, pero la lista no es exhaustiva ni definitiva. Puesto que las técnicas más apropiadas pueden cambiar con los avances científicos, las propuestas de técnicas alternativas pueden considerarse aceptables, siempre y cuando se acompañen de datos que las avalen. Se recomienda a los fabricantes tratar estas alternativas con las autoridades reguladoras. Puede ser necesario realizar otras pruebas conforme a cada caso particular. Las pruebas deberán incluir controles apropiados para asegurar una adecuada sensibilidad y especificidad. Pueden requerirse pruebas y/o enfoques específicos en aquellos casos en los que se puede predecir con una probabilidad relativamente alta la presencia de un virus específico proveniente de la especie de origen del sustrato celular. Si la línea celular usada para la producción es de origen humano o de primate no humano, deberán realizarse pruebas adicionales para detectar virus de humanos, como por ejemplo los que causan enfermedades de inmunodeficiencia y hepatitis, a menos que se justifiquen otra cosa. La reacción en cadena de polimerasa (RCP) puede ser apropiada para detectar las secuencias de otros virus humanos, así como otros virus específicos. A continuación, se incluye una breve descripción del marco de referencia general y de los antecedentes filosóficos conforme a los cuales el fabricante deberá justificar lo realizado. Tabla 2. Ejemplos de Uso y Límites de Valoraciones Que Pueden Utilizarse para Detectar Virus Prueba
Artículo de Prueba
Capacidad de Detección
Limitaciones de la Detección
Producción de anticuerpos
Usado de células y su medio de cultivo
Antígenos virales específicos
Antígenos no infecciosos para sistema de prueba en animales
Examen de virus in vivo
Usado de células y su medio de cultivo
Amplia gama de virus patogénicos para humanos
Agentes que no se replican ni producen enfermedades en el sistema de prueba
Amplia gama de virus patogénicos para humanos
Agentes que no se replican ni producen enfermedades en el sistema de prueba
Virus y partículas similares a virus
Valoración cualitativa con evaluación de identidad
Retrovirus y TI retroviral expresada
Sólo detecta enzimas con actividad óptima bajo condiciones preferidas. La interpretación puede ser difícil debido a la presencia de enzimas celulares; fondo con algunas muestras concentradas
Examen de virus in vitro para:
1. Caracterización del banco de células
1. Usado de células y su medio de cultivo (para cultivos conjuntos, las células intactas deberán estar en el artículo de prueba)
2. Examen de producción
2. Recolección a granel no procesada o lisado de células y su medio de cultivo celular del reactor de producción
TEM sobre: 1. Célula sustrato
1. Células viables
2. Sobrenadante de cultivo celular
2. Sobrenadante de cultivo libre de células
Transcriptasa inversa (TI)
Sobrenadante de cultivo libre de células
1
Además, es difícil distinguir el artículo de prueba de las células indicadoras.
USP 39
Información General/ (1050) Evaluación de la Seguridad Viral 1083
Tabla 2. Ejemplos de Uso y Límites de Valoraciones Que Pueden Utilizarse para Detectar Virus (Continuación) Prueba
Artículo de Prueba
Capacidad de Detección
Limitaciones de la Detección
lnfectividad con retrovirus (RV)
Sobrenadante de cultivo libre de células
Retrovirus infecciosos
RV que no se replican ni forman focos o placas discretos en el sistema de prueba elegido
Cultivo conjunto
Células viables
Retrovirus infecciosos
RV que no se replican
1. Punto final de infectividad
1. Ver más arriba en
2. Punto final de TEM
2. Ver más arriba en TEM 1
infectividad de RV
3. Punto final de TI
3. Ver más arriba en TI
RCP (Reacción de cadena de polime rasa)
Células, líquido de cultivo materiales
y otros
Secuencias de virus específicas
Las secuencias de los iniciadores deben estar presentes. No indica si el virus es infeccioso.
1 Además, es difícil distinguir el artículo de prueba de las células indicadoras.
1. PRUEBAS PARA DETECTAR RETROVIRUS Para el BCM y para células cultivadas hasta el límite de edad celular in vitro o más allá de éste usadas para la producción, se deberán realizar pruebas para retrovirus, incluidas las valoraciones de infectividad en cultivos celulares sensibles y estudios de microscopía electrónica (ME). Si no se detecta infectividad y no se han observado ningún retrovirus o partículas similares a retrovirus por ME, deberá realizarse la valoración de transcriptasa inversa (TI) u otras valoraciones apropiadas para la detección de retrovirus que pueden no ser infecciosos. Se ha descubierto que los estudios de inducción no son útiles. 2. VALORACIONES IN VITRO Las pruebas in vitro se llevan a cabo mediante la inoculación de un artículo de prueba (ver Tabla 2) en diversos cultivos celulares indicadores, sensibles y capaces de detectar una amplia gama de virus humanos y animales pertinentes. La selección de células usadas en la prueba se rige por la especie de origen del banco de células a evaluar, pero deberá incluir una línea celular humana y/o de primates no humanos que sea sensible a los virus humanos. La naturaleza de la valoración y de la muestra a analizar están regidas por el tipo de virus que posiblemente pueda estar presente considerando el origen o manipulación de las células. Se deberán buscar los virus tanto citopáticos como hemadsorbentes. 3. PRUEBAS DE PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS Se deberá inocular un artículo de prueba (ver Tabla 2) en animales, incluyendo ratones adultos y lactantes, y en huevos embrionados para descubrir virus que no pueden crecer en cultivos celulares. Se pueden emplear otras especies de animales, según la naturaleza y el origen de las líneas celulares que se van a analizar. Se deberá vigilar la salud de los animales y deberá investigarse toda anormalidad para establecer la causa de la enfermedad. 4. PRUEBAS DE PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS Los virus específicos para la especie, presentes en líneas celulares de roedores, pueden detectarse mediante inoculación del artículo de prueba (ver Tabla 2) en animales libres de virus, y mediante el examen, después de un período específico, del nivel del anticuerpo sérico o la actividad enzimática. Ejemplos de tales pruebas son la prueba de producción de anticuerpos en ratones (MAP), la prueba de producción de anticuerpos en ratas (RAP) y la prueba de producción de anticuerpos en hámsteres (HAP). Los virus que actualmente se examinan en las valoraciones de producción de anticuerpos se presentan en la Tabla 3. Tabla 3. Virus Detectados en las Pruebas de Producción de Anticuerpos MAP
HAP
RAP
Virus de Ectromelia 2·3
Virus de Coriomeningitis Linfocítica (LCM)l,3
Virus Hantaan 1,3
Virus Hantaan 1,3
Virus de la Pneumonía de Ratón (PVM) 2·3
Virus de Rata Kilham (KRV) 2·3
Virus K2
Reovirus Tipo 3 (Reo3)1,3
Virus de la Encefalomielitis de Ratón (Theilers, GDVll)2
Virus de Deshidrogenasa Láctica (LDM) 1·3
Virus Sendai 1·3
Virus de la Pneumonía de Ratón (PVM)2,3
Virus de Coriomeningitis Linfocítica (LCM) 1·3
SV5
Coronavirus de Rata (RCV) 2
1 Virus de los que se tiene evidencia de su capacidad de infectar a seres humanos o primates. 2 Virus de los que no se tiene evidencia de su capacidad para infectar a seres humanos. 3 Virus capaces de replicarse in vitro en células de origen humano o de primates.
1084 (1050) Evaluación de la Seguridad Viral / Información General
USP 39
Tabla 3. Virus Detectados en las Pruebas de Producción de Anticuerpos (Continuación) MAP
RAP
HAP
Reovirus Tipo 3 (Reo3)1,3
Virus Diminuto de Ratón2,3 Adenovirus de Ratón (MAV)2,3
Virus Sendajl,3
Citomegalovirus de Ratón (MCMV) 2,3
Virus de Sialoacrioadenitis (SDAV)2
Virus de la Encefalomielitis de Ratón (Theilers, GDVll) 2
Virus Toolan (Hl)2,3
Virus de la Hepatitis de Ratón (MHV) 2 Rotavirus de Ratón (EDIM)2,3 Virus de la Pneumonía de Ratón (PVM) 2,3 Virus de Polioma 2 Reovirus Tipo 3 (Reo3) 1,3 Virus Sendail ,3 Virus Tímico2 1 Virus de los que se tiene evidencia de su capacidad de infectar a seres humanos o primates. 2 Virus de los que no se tiene evidencia de su capacidad para infectar a seres humanos. 3 Virus capaces de replicarse in vitro en células de origen humano o de primates.
C. Aceptabilidad de las Líneas Celulares Se reconoce que algunas líneas celulares usadas para la fabricación de productos contienen retrovirus endógenos, otros virus o secuencias virales. En tales circunstancias, el plan de acción recomendado para la fabricación es el descrito en la Sección V de este documento. La aceptabilidad de las líneas celulares que contienen virus distintos de los retrovirus endógenos será considerada en forma individual por las autoridades regulatorias, teniendo en cuenta un análisis de riesgo/beneficio basado en el beneficio del producto y el uso clínico al que está destinado, la naturaleza de los virus contaminantes, su potencial para infectar o causar enfermedades en los seres humanos, el proceso de purificación del producto (por ejemplo, datos de evaluación de depuración viral) y el nivel de pruebas virales realizadas en el material a granel purificado.
IV. COMPROBACIÓN DE VIRUS EN EL MATERIAL A GRANEL SIN PROCESAR El material a granel sin procesar está constituido por uno o varios grupos de células y medios de cultivo recolectados mezclados. Cuando las células no son accesibles fácilmente (por ejemplo, fibra hueca o sistemas similares), el granel sin procesar estaría constituido por líquidos extraídos del fermentador. Una muestra representativa del material a granel sin procesar, tomada del reactor de producción antes del procesamiento adicional, representa uno de los niveles más apropiados en el cual se puede determinar la posibilidad de contaminación viral adventicia con una alta probabilidad de detección. Se deberán realizar pruebas apropiadas para detectar virus al nivel de granel sin procesar, a menos que la prueba para detectar virus se haga más sensible mediante un procesamiento inicial parcial (por ejemplo, un granel sin procesar podría ser tóxico en cultivos de células de prueba, mientras que un granel parcialmente procesado podría no serlo). En ciertos casos, puede ser más apropiado probar una mezcla de células intactas y deshechas y el sobrenadante del cultivo celular extraído del reactor de producción antes del procesamiento adicional. Como parte de la solicitud y/o registro para la comercialización de un producto, se deberán presentar datos de, por lo menos, tres lotes de granel sin procesar a escala de planta piloto o comercial. Se recomienda a los fabricantes elaborar programas para la evaluación de virus adventicios en lotes de producción. El alcance, el grado y la frecuencia de pruebas virales en el granel sin procesar deberán determinarse tomando en consideración varios puntos, incluyendo la naturaleza de las líneas celulares usadas para elaborar los productos deseados, los resultados y el grado de las pruebas para virus realizadas durante la calificación de las líneas celulares, el método de cultivo, las fuentes de materia prima y los resultados de los estudios de depuración viral. Las pruebas de examen in vitro, utilizando una o varias líneas celulares, generalmente se emplean para probar el material a granel no procesado. Si fuera apropiado, puede utilizarse una prueba de RCP u otros métodos apropiados. En general, el material recolectado en el cual se han detectado virus adventicios no deberá utilizarse para elaborar el producto. Si se detectan algunos virus adventicios a este nivel, se deberá controlar el proceso con cuidado para determinar la causa de la contaminación y tomar las acciones apropiadas al caso.
V. JUSTIFICACIÓN V PLAN DE ACCIÓN PARA LOS ESTUDIOS DE DEPURACIÓN VIRAL V PRUEBAS VIRALES EN MATERIAL A GRANEL PURIFICADO Es importante diseñar el protocolo más adecuado y racional para las pruebas virales a partir del nivel de BCM, a lo largo de los diversos pasos de la producción del fármaco hasta la obtención del producto final, incluyendo la evaluación y la caracterización de la depuración viral del material a granel sin procesar. La evaluación y caracterización de la depuración viral cumple una
USP 39
Información General/ (1050) Evaluación de la Seguridad Viral 1085
función fundamental en este esquema. El objetivo deberá ser obtener la mayor seguridad razonable de que un producto está libre de contaminación viral. Al seleccionar los virus que se utilizarán en un estudio de depuración, resulta útil distinguir entre la necesidad de evaluar los procesos con respecto a su capacidad de eliminar los virus que se sabe están presentes y el deseo de calcular la solidez del proceso mediante la caracterización de la depuración de los virus de "modelo" no específico (descritos a continuación). En el glosario se incluyen las definiciones de virus "relevantes" y virus "modelo" específicos y no específicos. La evaluación de procesos requiere un conocimiento de la cantidad de virus que pueden estar presentes en el proceso, como en el material a granel no procesado, y cuánto puede depurarse a fin de evaluar la seguridad del producto. El conocimiento de la dependencia del tiempo en los procedimientos de inactivación es útil para asegurar la eficacia del proceso. Cuando se evalúa la depuración de contaminantes conocidos se deberán proporcionar estudios profundos de inactivación dependientes del tiempo, una demostración de la reproducibilidad de la inactivación/eliminación y una evaluación de los parámetros del proceso. Cuando un proceso de fabricación está caracterizado por la robustez de depuración utilizando virus "modelo" no específicos, en el diseño del estudio se deberá prestar atención especial a los virus no encapsulados. El alcance de los estudios de caracterización de depuración viral puede estar influenciado por los resultados de las pruebas en las líneas celulares y el material a granel sin procesar. Estos estudios deberán realizarse conforme a la descripción de la sección VI que sigue a continuación. La Tabla 4 muestra un ejemplo de un plan de acción en relación con la evaluación del proceso y la caracterización de depuración viral, así como las pruebas virales en material a granel purificado en respuesta a los resultados de las pruebas virales en células y/o el material a granel sin procesar. Se consideran diversos casos. En todos los casos, se deberá realizar la caracterización de la depuración que utiliza virus "modelo" no específicos. Las situaciones más comunes son los Casos A y B. Normalmente no se usan sistemas de producción contaminados con un virus que no sea un retrovirus de roedores. Cuando existen razones convincentes y bien justificadas para la producción de fármacos usando una línea celular de los Casos C, D o E, éstos deberán ser tratados con las autoridades reguladoras. Con los Casos C, D y E, es importante haber validado los pasos eficaces para inactivar/eliminar el virus en cuestión del proceso de fabricación. Tabla 4. Plan de Acción para la Evaluación del Proceso de Depuración Viral y Pruebas para Virus en Materiales a Granel Purificados Caso A
Caso B
Presencia de virus 1
-
-
Partículas similares a virus 1
-
-
Partículas similares a retrovirus 1
-
+
Caso C2
Caso D2
Caso E2
+
+
(+)3
-
-
(+ )3
-
-
(+)3
Estado
Virus identificado
no corresponde
+
+
+
-
Virus patógeno para humanos
no corresponde
-4
-4
+
desconocido
Caracterización del proceso de depuración viral utilizando virus "modelo" no específicos
sí5
sí5
sí5
sí5
sí7
Evaluación de proceso de depuración viral utilizando "virus relevantes" o "modelo" específicos
no
sí6
sí6
sí6
sí7
no corresponde
sí8
sí8
sí8
sí8
Acción
Prueba para virus en material a granel purificado 1
Resultados de las pruebas de detección de virus para el substrato celular y/o al nivel de granel no procesado. Los cultivos celulares utilizados para la producción que estén contaminados con virus generalmente no serán aceptables. Los virus endógenos (tales como retrovirus) o los virus que forman parte integral del BCM pueden ser aceptables si se utilizan procedimientos de evaluación de depuración viral apropiados. 2 El uso de material fuente que está contaminado con virus, ya sea que se sepa o no que son infecciosos y/o patógenos para el ser humano, solamente serán aceptables en circunstancias muy excepcionales. 3 Se ha observado un virus por métodos directos o indirectos. 4 Se piensa que es no patógeno. 5 Se deberá llevar a cabo la caracterización de la depuración utilizando virus "modelo" no específicos. 6 Se deberá llevar a cabo la evaluación del proceso con virus "relevantes" o virus "modelo" específicos. 7 Ver texto para el Caso E. 8 Deberá confirmarse la ausencia de virus detectables para el material a granel purificado utilizando métodos apropiados de alta especificidad y sensibilidad para la detección del virus en cuestión. Para la autorización de su comercialización, se deberán proporcionar los datos de por lo menos 3 lotes de material a granel purificado y fabricado a escala de planta piloto o comercial. Sin embargo, para líneas celulares tales como células CHO, para las cuales las partículas endógenas han sido caracterizadas extensivamente y se ha demostrado una depuración adecuada, normalmente no es necesario determinar la presencia de partículas no infecciosas en el material a granel purificado.
Caso A Cuando se ha demostrado que no hay ningún virus, partículas similares a virus o partículas similares a retrovirus en las células o en el granel sin procesar, se deberán realizar estudios de inactivación o eliminación viral con virus "modelo" no específicos como se indicó anteriormente.
1086 (1050) Evaluación de la Seguridad Viral / Información General
USP 39
Caso B Cuando hay presente solamente un retrovirus de roedor (o una partícula similar a un retrovirus que se piensa que es no patógena, como las partículas de roedor de tipo A y R), se deberá realizar la evaluación del proceso utilizando un virus "modelo" específico, como un virus de leucemia murina. El material a granel purificado deberá analizarse utilizando métodos apropiados que tengan una alta especificidad y sensibilidad para detectar el virus en cuestión. Para la autorización de la comercialización, se deberán proveer datos de al menos tres lotes de material a granel purificado a escala comercial o escala de planta piloto. Se han usado con frecuencia líneas celulares tales como las de ovario de hámsteres chinos (CHO), de Cl 27, de riñón de hámsteres recién nacidos (BHK) y líneas celulares de hibridoma murino como sustratos para la producción de medicamentos sobre los cuales no se han informado problemas de seguridad relacionados con la contaminación viral de los productos. Para estas líneas celulares en las cuales las partículas endógenas se han caracterizado ampliamente y se ha demostrado la depuración, generalmente no es necesario hacer pruebas para detectar la presencia de partículas no infecciosas en el material a granel purificado. Son apropiados los estudios con virus "modelo" no específicos, como en el Caso A.
Caso C Cuando se sabe que las células o el material a granel no procesado contienen virus, distintos de un retrovirus de roedores, del que no hay ninguna evidencia de la capacidad de infección en seres humanos [como aquellos identificados en la nota 2 al pie de la Tabla 3, excepto los retrovirus de roedores (Caso B)], los estudios de evaluación de eliminación e inactivación de los virus deberán usar el virus identificado. Si no es posible usar el virus identificado, se deberán utilizar virus "relevantes" o "modelo" específicos para demostrar una depuración aceptable. Se deberá obtener una inactivación dependiente del tiempo para los virus identificados (o virus "relevantes" o "modelo" específicos) en los pasos de inactivación fundamentales como parte de la evaluación del proceso para estos virus. El material a granel purificado deberá analizarse utilizando métodos apropiados que tengan una alta especificidad y sensibilidad para detectar el virus en cuestión. Para la autorización de la comercialización, se deberán proveer los datos de al menos tres lotes de granel purificado elaborado a escala de planta piloto o escala comercial.
Caso D En aquellos casos en que se identifica un agente patógeno humano conocido, como los indicados en la nota 1 al pie de la Tabla 3, el producto puede ser aceptable sólo en circunstancias excepcionales. En este caso, se recomienda usar el virus identificado para los estudios de evaluación de eliminación e inactivación viral y emplear métodos específicos con alta especificidad y sensibilidad para detectar el virus en cuestión. Si no es posible usar el virus identificado, se deberán utilizar virus "relevantes" y/o "modelo" específicos (descritos a continuación). Se deberá demostrar que el proceso logra la eliminación e inactivación de los virus seleccionados durante los procesos de purificación e inactivación. Se deberán obtener datos de inactivación dependientes del tiempo para los pasos de inactivación fundamentales como parte de la evaluación del proceso. Deberán hacerse pruebas en el granel purificado utilizando métodos apropiados que tengan una alta especificidad y sensibilidad para detectar el virus en cuestión. Para la autorización de la comercialización, se deberán proveer los datos de al menos tres lotes de granel purificado elaborado a escala de planta piloto o escala comercial.
Caso E En aquellos casos en que se detecta un virus que no puede clasificarse según los métodos actualmente disponibles en células o material a granel no procesado, el producto se considera por lo general inadmisible ya que el virus puede resultar patógeno. En el caso muy poco frecuente de que haya razones convincentes y bien justificadas para producir el fármaco usando dicha línea celular, deberá tratarse con las autoridades reguladoras antes de continuar avanzando.
VI. EVALUACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LOS PROCEDIMIENTOS DE DEPURACIÓN VIRAL La evaluación y caracterización de los procedimientos de eliminación y/o inactivación viral desempeñan un papel importante a la hora de establecer la seguridad de un producto biotecnológico. Anteriormente, han ocurrido muchos casos de contaminación con agentes cuya presencia no se detectó ni se sospechó y aunque esto sucedió con productos biológicos obtenidos de diversas materias primas diferentes de las líneas celulares plenamente caracterizadas, la evaluación de la depuración viral proporcionará una medida de seguridad que indica que puede eliminarse cualquier virus desconocido, no sospechado y nocivo. Se deberán realizar estudios de una manera bien documentada y controlada. El objetivo de los estudios de depuración viral es evaluar el paso o los pasos del proceso que pueden considerarse eficaces para la inactivación o eliminación de los virus y hacer el cálculo cuantitativo del nivel general de reducción viral obtenido por el proceso. Esto deberá realizarse mediante la introducción deliberada ("adicionado") de cantidades significativas de un virus al material crudo y/o a diferentes fracciones obtenidas durante los diversos pasos del proceso y la demostración de su eliminación o inactivación durante los pasos posteriores. No se considera necesario evaluar o caracterizar todos los pasos de un proceso de fabricación si se demuestra una depuración adecuada mediante el uso de menos pasos. Deberá tenerse presente que otros
USP 39
Información General/ (1050) Evaluación de la Seguridad Viral 1087
pasos del proceso pueden tener un efecto indirecto sobre la inactivación o eliminación viral lograda. Los fabricantes deberán explicar y justificar el enfoque utilizado en los estudios de evaluación de la depuración viral. La reducción de la infectividad viral puede lograrse mediante la eliminación de las partículas virales o por inactivación de la infectividad viral. Para cada etapa de producción evaluada, se deberá describir el posible mecanismo de pérdida de infectividad viral estableciendo si se debe a inactivación o eliminación. Para los pasos de inactivación, el estudio deberá planificarse de tal manera que las muestras se tomen en diferentes tiempos y se deberá elaborar una curva de inactivación (ver Sección Vl.B.5.). Los estudios de evaluación de depuración viral se realizan para demostrar la depuración de un virus que se sabe está presente en el BCM y/o para proporcionar cierta seguridad de que se eliminarían los virus adventicios que no pudieron detectarse o que pudieran llegar a tener acceso al proceso de producción. Los factores de reducción se expresan normalmente en escala logarítmica, lo cual implica que, aunque la infectividad viral residual nunca se reducirá a cero, puede reducirse considerablemente en forma matemática. Además de los estudios de depuración para los virus que se sabe están presentes, deberán realizarse estudios para caracterizar la capacidad para eliminar y/o inactivar otros virus. El objetivo de los estudios con virus que presentan una variedad de propiedades bioquímicas y biofísicas que no se sabe si están presentes o que no se estima que lo estén es caracterizar la robustez del procedimiento en lugar de lograr una inactivación o eliminación específica. Es aconsejable que se haga una demostración de la capacidad del proceso de producción para inactivar o eliminar los virus (ver Sección Vl.C.). Tales estudios no se realizan para evaluar un riesgo específico de seguridad. Por consiguiente, no se necesita llegar a un valor específico de depuración.
A. Selección de Virus para la Evaluación y Caracterización de la Depuración Viral Los virus para la evaluación de la depuración y los estudios de caracterización de los procesos, deberán elegirse de manera tal que se asemejen a los virus que puedan contaminar el producto y que representen una amplia gama de propiedades físico-químicas para probar la capacidad del sistema para eliminar los virus en general. El fabricante deberá justificar la elección de los virus en conformidad con los objetivos de la evaluación y el estudio de caracterización y las pautas proporcionadas en este documento. 1. VIRUS "RELEVANTES" Y VIRUS "MODELO" Un aspecto importante en la realización de un estudio de depuración viral es determinar qué virus deberán utilizarse. Estos virus se clasifican en tres categorías: virus "relevantes", virus "modelo" específicos y virus "modelo" no específicos. Los virus "relevantes" son virus utilizados en la evaluación de los procesos de estudios de depuración viral, que son los virus identificados o virus de la misma especie que los virus que se sabe que contaminan las células sustrato u otros reactivos o materiales utilizados en el proceso de producción, o que tienen probabilidades de hacerlo. La purificación y/o proceso de inactivación deberá demostrar la capacidad para eliminar y/o inactivar tales virus. Cuando un virus "relevante" no está disponible o no se adapta bien a la evaluación del proceso de estudios de depuración viral (por ejemplo, no puede multiplicarse in vitro a niveles suficientemente altos), se deberá utilizar un virus "modelo" específico como sustituto. Un virus "modelo" específico apropiado puede ser un virus que esté relacionado estrechamente con el virus conocido o presunto (del mismo género o familia), con propiedades físicas y químicas similares a las del virus observado o presunto. Generalmente, las líneas celulares derivadas de roedores contienen partículas de retrovirus endógenos o partículas similares a retrovirus que pueden ser infecciosas (partículas tipo C) o no infecciosas (partículas citoplasmáticas tipo A y R). Deberá determinarse la capacidad del proceso de fabricación para eliminar y/o inactivar los retrovirus de roedores de los productos obtenidos de tales células. Esto puede realizarse utilizando un virus de leucemia murina, un virus "modelo" específico en el caso de células de origen murino. Cuando se han obtenido líneas celulares humanas que secretan anticuerpos monoclonales mediante la inmortalización de linfocitos B por el Virus Epstein-Barr (EBV por sus siglas en inglés), se deberá determinar la capacidad del proceso de fabricación para eliminar y/o inactivar un virus de herpes. El virus de la pseudo-rabia también puede utilizarse como un virus "modelo" específico. Cuando la finalidad es caracterizar la capacidad del proceso de fabricación para eliminar y/o inactivar los virus en general, es decir, caracterizar la robustez del proceso de depuración, los estudios de caracterización de depuración viral deberán realizarse con virus "modelo" no específicos con propiedades diferentes. Los datos obtenidos de los estudios con virus "relevantes" y/o "modelo" específicos también pueden contribuir a esta evaluación. No es necesario probar todos los tipos de virus. Se deberá dar preferencia a los virus que muestran una resistencia significativa a los tratamientos físicos y/o químicos. Los resultados obtenidos para tales virus proporcionan información útil acerca de la capacidad del proceso de producción para eliminar y/o inactivar todo tipo de virus. La selección y el número de virus utilizados dependerán de la calidad y caracterización de las líneas celulares y del proceso de producción. En el Apéndice 2 y en la Tabla A- 7 se incluyen ejemplos de virus "modelo" útiles con diferentes estructuras físico-químicas y ejemplos de virus que se han utilizado en los estudios de depuración viral. 2. OTRAS CONSIDERACIONES Deberán considerarse los siguientes puntos adicionales:
1088 (1050) Evaluación de la Seguridad Viral / Información General
USP 39
(a) Se aconseja usar virus que puedan multiplicarse hasta un título alto, aunque esto no siempre es posible. (b) Deberá existir una prueba eficaz y confiable para la detección de cada virus utilizado, para cada etapa de fabricación sometida a prueba. (c) Se deberán considerar los riesgos planteados por determinados virus para la salud del personal que realiza los estudios de depuración viral.
B. Diseño e Implicaciones de la Evaluación de la Depuración Viral y de los Estudios de Caracterización 1. INSTALACIONES Y PERSONAL Es inapropiado introducir cualquier tipo de virus en las instalaciones de producción debido a las restricciones impuestas por las buenas prácticas de fabricación (BPF). Por consiguiente, los estudios de depuración viral deberán ser realizados en un laboratorio separado, equipado para el trabajo virológico y por personal con experiencia en virología conjuntamente con el personal de producción que participa en el diseño y preparación de una versión a menor escala del proceso de purificación. 2. SISTEMA DE PRODUCCIÓN A MENOR ESCALA Se deberá demostrar la validez de la producción a menor escala. El nivel de la purificación de la versión a menor escala deberá ser tan representativo del procedimiento de producción como sea posible. Para el equipo cromatográfico, se deberá demostrar que la altura del lecho de la columna, la velocidad lineal de flujo, el cociente entre la velocidad de flujo y el volumen del lecho de la columna (es decir, el tiempo de contacto), los tipos de gel y soluciones amortiguadoras, el pH, la temperatura y la concentración de proteínas, sales y el producto son representativos de la fabricación a escala comercial. Deberá obtenerse un perfil similar de elución. Para otros procedimientos, se aplicarán consideraciones similares. Las desviaciones que no pueden evitarse deberán considerarse con respecto a su influencia en los resultados. 3. ANÁLISIS DE LA ELIMINACIÓN VIRAL ESCALONADA Cuando se están realizando estudios de depuración viral, es aconsejable evaluar la contribución a la eliminación viral de más de una etapa de producción. Los pasos que tienen probabilidad de eliminar virus deberán evaluarse individualmente con respecto a su capacidad para eliminar e inactivar el virus y la definición exacta de paso individual deberá considerarse meticulosamente. Se deberá tener suficiente virus en el material utilizado en cada paso que se desea probar para obtener una evaluación adecuada de la eficacia en cada paso. Por lo general, se deberán agregar virus al material en proceso de cada paso que se desea probar. En algunos casos, simplemente será suficiente agregar un virus de título alto a un material a granel no purificado y evaluar su concentración entre cada uno de los pasos. Cuando la eliminación viral es el resultado de procedimientos de separación, se recomienda investigar, si es apropiado y posible, la distribución de la carga viral en las diferentes fracciones. Cuando se usan agentes reguladores virucidas en varios pasos dentro del proceso de fabricación, se pueden utilizar estrategias alternativas como por ejemplo la adición en paralelo de cantidades conocidas en soluciones amortiguadoras menos virucidas como parte de la evaluación general de los procesos. Se deberá determinar el título viral antes y después de cada paso de la prueba. Las valoraciones cuantitativas de infectividad deberán poseer una sensibilidad y reproducibilidad adecuadas y realizarse con suficientes repeticiones para asegurar una validez estadística adecuada del resultado. Se podrán utilizar valoraciones cuantitativas no asociadas con infectividad si se justifica. Se deberán incluir controles virales apropiados en todas las valoraciones de infectividad para asegurar la sensibilidad del método. Además, se deberán considerar los datos del muestreo estadístico cuando el virus tiene baja concentración (Appendix 4). 4. DETERMINACIÓN DE LA ELIMINACIÓN FÍSICA EN FUNCIÓN DE LA INACTIVACIÓN Se puede reducir la infectividad viral mediante la eliminación o inactivación del virus. Para cada etapa de producción evaluada, se deberá describir el posible mecanismo de pérdida de infectividad viral estableciendo si se debe a inactivación o eliminación. Si mediante el proceso de producción se logra una escasa depuración de la infectividad y se considera que la depuración del virus es el factor más importante para la seguridad del producto, se deberán introducir pasos adicionales o específicos de inactivación o eliminación. Puede ser necesario distinguir entre la eliminación y la inactivación para un paso en particular, por ejemplo, cuando existe la posibilidad de que una solución amortiguadora utilizada en más de un paso de depuración pueda contribuir a la inactivación en todos ellos; es decir, se deberá distinguir entre la contribución de la inactivación por una solución amortiguadora utilizada en varios pasos cromatográficos y la eliminación lograda en cada uno de estos pasos cromatográficos.
USP 39
Información General/ (1050) Evaluación de la Seguridad Viral 1089
5. EVALUACIÓN DE LA INACTIVACIÓN Para la evaluación de la inactivación viral, se deberá agregar (spike) un virus infeccioso al material en crudo, no procesado o al material intermedio y deberá calcularse el factor de reducción. Se debe reconocer que esa inactivación viral no es una reacción sencilla de primer orden, sino que generalmente es más compleja, con una "fase l" rápida y una "fase 2" lenta. Por lo tanto, se deberá planificar el estudio de tal manera que las muestras se tomen a diferentes tiempos y se deberá elaborar una curva de inactivación. Se recomienda que los estudios para determinar la inactivación incluyan al menos un punto de tiempo menor al tiempo de exposición mínima y que sea mayor que cero, además del tiempo de exposición mínimo. Los datos adicionales son particularmente importantes cuando el virus es un virus "relevante" que se sabe que es un agente patógeno humano y se está diseñando un proceso de inactivación eficaz. Sin embargo, para los estudios de inactivación en los cuales se usan virus "modelo" no específicos o cuando se usan virus "modelo" específicos como sustitutos de partículas virales, tales como las partículas intracitoplasmáticas de CHO similares a retrovirus, se deberá demostrar una depuración reproducible en al menos dos estudios independientes. Siempre que sea posible, se deberá determinar la carga viral inicial a partir del virus que puede detectarse en el material inicial con virus agregado. Si esto no fuera posible, la carga viral inicial puede calcularse a partir del título de la preparación viral que se siembra. Cuando la inactivación es demasiado rápida para graficar una curva de inactivación con las condiciones del proceso, se deberán realizar controles apropiados para demostrar que la infectividad realmente se pierde mediante la inactivación. 6. FUNCIÓN Y REGENERACIÓN DE COLUMNAS Con el transcurso del tiempo y después de un uso repetido, la capacidad de las columnas cromatográficas y otros dispositi-
vos utilizados en el sistema de purificación para eliminar los virus puede variar. Algunas estimaciones de la estabilidad de la depuración viral después de varios usos pueden servir de respaldo para el uso repetido de tales columnas. Se deberá asegurar que cualquier virus potencialmente retenido por el sistema de producción puede ser adecuadamente destruido o eliminado antes de la reutilización del sistema, por ejemplo demostrando que los procedimientos de limpieza y de regeneración en realidad inactivan o eliminan el virus. 7. PRECAUCIONES ESPECÍFICAS (a) Se deberán tomar las precauciones necesarias al preparar el virus de título alto para evitar la agregación que puede aumentar la eliminación física y disminuir la inactivación y, de esta manera, distorsionar la correlación con la producción real. (b) Se deberá considerar la cantidad mínima de virus que puede analizarse de manera confiable. (c) El estudio deberá incluir valoraciones de control paralelas para evaluar la pérdida de la infectividad del virus debido a causas tales como dilución, concentración, filtración o almacenamiento de las muestras antes de la titulación. (d) El virus "agregado" (spike) se deberá adicionar al producto en un volumen pequeño para no diluir ni cambiar las características del mismo. La muestra de prueba de proteína cuando se diluye ya no es idéntica al producto obtenido a escala comercial. (e) Las diferencias pequeñas, como por ejemplo en las soluciones amortiguadoras, el medio, o los reactivos, pueden afectar sustancialmente la depuración viral. (f) La inactivación viral es una función dependiente del tiempo y, por consiguiente, el tiempo durante el cual el producto con virus agregado permanezca en una solución amortiguadora específica o en una columna cromatográfica específica deberá reflejar las condiciones del proceso a escala comercial. (g) Las soluciones amortiguadoras y el producto deberán evaluarse independientemente con respecto a la toxicidad o la interferencia en las valoraciones usadas para determinar la valoración viral, ya que estos componentes pueden afectar negativamente a las células indicadoras. Si las soluciones son tóxicas para las células indicadoras, quizá sea necesaria la dilución, el ajuste del pH o la diálisis de la solución amortiguadora que contiene el virus agregado. Si el producto en sí mismo tiene actividad antiviral, es posible que se deba realizar el estudio de depuración sin el producto en una corrida "simulada", aunque la omisión del producto o el uso de una proteína similar que no tiene actividad antiviral en su lugar podría afectar el comportamiento del virus en algunas de las etapas de la producción. Se deberán incluir suficientes controles para demostrar el efecto de los procedimientos utilizados únicamente para preparar la muestra para la valoración (por ejemplo: diálisis, almacenamiento) en la eliminación o inactivación del virus agregado en cantidades conocidas. (h) Muchos esquemas de purificación usan repetitivamente las mismas soluciones amortiguadoras o columnas similares. Se deberán considerar los efectos de este enfoque cuando se analicen los datos. La eficacia de la eliminación viral mediante un proceso específico puede variar en las distintas etapas de fabricación en las cuales se usa. (i) Los factores generales de reducción pueden subestimarse cuando las condiciones de producción o las soluciones amortiguadoras son demasiado citotóxicas o virucidas y cada caso deberá tratarse individualmente. También se pueden sobreestimar los factores generales de reducción debido a las limitaciones inherentes o al diseño inadecuado de los estudios de depuración viral.
1 090 (1 050) Evaluación de la Seguridad Viral / Información General
USP 39
C. Interpretación de los Estudios de Depuración Viral; Aceptabilidad El objetivo de la evaluación de la inactivación o eliminación viral es evaluar y caracterizar los pasos del proceso que pueden considerarse eficaces para inactivar o eliminar los virus, y estimar cuantitativamente el nivel general de la reducción viral obtenida mediante el proceso de fabricación. En el caso de los contaminantes víricos, como por ejemplo en los Casos B a E, es importante demostrar que el virus no solamente ha sido eliminado o inactivado, sino que además existe una capacidad en exceso de depuración viral en el proceso de purificación para garantizar un nivel apropiado de seguridad para el producto final. La cantidad de virus eliminado o inactivado por el proceso de producción deberá compararse con la cantidad de virus que puede estar presente en el material a granel no procesado. Para realizar esta comparación, es importante calcular la cantidad de virus en el material a granel no procesado. Este cálculo estimado deberá obtenerse utilizando valoraciones de infectividad u otros métodos como por ejemplo la microscopía electrónica de transmisión {TEM, por sus siglas en inglés). Todo el proceso de purificación deberá ser capaz de eliminar sustancialmente una cantidad de virus mayor de la que se estima que hay presente en el equivalente de una dosis única de material a granel no procesado. Ver el Appendix 5 para el cálculo de los factores de reducción viral y el Appendix 6 para el cálculo de partículas estimadas por dosis. Los fabricantes deben reconocer que los mecanismos de depuración pueden diferir entre las distintas clases de virus. Se deberá tomar en consideración una serie de factores cuando se evalúen los datos que avalan la eficacia de los procedimientos de inactivación o eliminación de virus. Estos incluyen: (i) La conveniencia de los virus de prueba utilizados; (ii) El diseño de los estudios de depuración; (iii) La reducción logarítmica lograda; (iv) La dependencia del tiempo de inactivación; (v) Los efectos potenciales de la variación en los parámetros del proceso sobre la inactivación o eliminación viral; (vi) Los límites de las sensibilidades de la valoración; (vii) La posible selectividad de los procedimientos de inactivación o eliminación para ciertas clases de virus. Se puede lograr la depuración eficaz mediante cualquiera de los siguientes procedimientos: varios pasos de inactivación, varios pasos de separación complementarios o combinaciones de pasos de inactivación y separación. Ya que los métodos de separación pueden depender de las propiedades físico-químicas sumamente específicas de un virus, lo cual influye en su interacción con las matrices de gel y las propiedades de precipitación, los virus "modelo" pueden separarse de una manera diferente a la de un virus objetivo. Los parámetros de fabricación que influyen en la separación deberán definirse y controlarse adecuadamente. Las diferencias pueden originarse en cambios de la superficie, como por ejemplo en la glicosilación. Sin embargo, a pesar de estas variables potenciales, se puede obtener la eliminación eficaz mediante la combinación de pasos de separación complementarios o combinaciones de pasos de inactivación y de separación. Por lo tanto, los pasos de separación bien diseñados, tales como los procedimientos cromatográficos, los pasos de filtración y las extracciones, pueden ser pasos eficaces de eliminación viral siempre que se realicen bajo condiciones debidamente controladas. Un paso eficaz de eliminación viral deberá producir una reducción reproducible de la carga viral en por lo menos dos estudios independientes. Un factor de reducción general se expresa normalmente como la suma de los factores individuales. Sin embargo, una reducción de título viral del orden de 1 log, 0 o menos se consideraría inapreciable, y podría descartarse a menos que se justifique. Si se logra una escasa reducción de la infectividad mediante el proceso de producción, y la eliminación del virus es el factor más importante para la seguridad del producto, se deberá introducir uno o más pasos específicos adicionales de inactivación o eliminación. Los fabricantes deberán justificar la aceptabilidad de los factores de reducción obtenidos para todos los virus. Los resultados deberán evaluarse sobre la base de los factores ya enumerados.
D. Límites de los Estudios de Depuración Viral Los estudios de depuración viral son útiles para ayudar a garantizar el logro de un nivel de seguridad aceptable en el producto final, pero por sí solos no determinan que el producto es seguro. Sin embargo, existen varios factores en el diseño y la ejecución de los estudios de depuración viral que pueden conducir a una estimación incorrecta de la capacidad del proceso para eliminar la infectividad viral. Estos factores incluyen los siguientes: 1. Las preparaciones virales utilizadas en los estudios de depuración para un proceso de producción probablemente se producen en un cultivo tisular. El comportamiento de un virus de cultivo tisular en una etapa de producción puede ser diferente al del virus natural, por ejemplo, si los virus naturales y cultivados difieren en la pureza o en el grado de agregación. 2. A menudo la inactivación de la infectividad viral sigue una curva bifásica en la cual una fase inicial rápida está seguida de una fase más lenta. Es posible que el virus que escapa al primer paso de inactivación sea más resistente a los pasos posteriores. Por ejemplo, si la fracción resistente toma la forma de agregados virales, la infectividad puede ser resistente a una variedad de diferentes tratamientos químicos y al calentamiento. 3. La capacidad del proceso general de eliminar la infectividad se expresa como la suma del logaritmo de las reducciones en cada paso. La sumatoria de los factores de reducción de varios pasos, en particular de los pasos con poca reducción (por ejemplo, por debajo de 1 log 10), puede sobreestimar el potencial real de la eliminación viral. Aún más, los valores de reducción logrados mediante la repetición de procedimientos idénticos o casi idénticos no se deberán incluir a menos que se justifique.
USP 39
Información General/ (1050) Evaluación de la Seguridad Viral 1091
4. La expresión de los factores de reducción como reducciones logarítmicas de la valoración implica que, aunque la infectividad viral residual puede reducirse considerablemente, nunca se reducirá a cero. Por ejemplo, una reducción de la infectividad de una preparación que contenga 8 log 10 unidades infecciosas por mililitro (mL) por un factor de 8 log 10 da cero log, 0 por mL o una unidad infecciosa por mL, considerando el límite de la detección de la valoración. 5. El procesamiento a escala de planta piloto puede ser diferente del procesamiento a escala comercial a pesar del cuidado tomado en el diseño del proceso a menor escala. 6. La suma de factores individuales de reducción viral que son resultado de mecanismos similares de inactivación a lo largo del proceso de fabricación puede sobreestimar la depuración viral general.
E. Estadística Los estudios de depuración viral deberán incluir el uso del análisis estadístico de los datos para evaluar los resultados. Los resultados del estudio deberán ser estadísticamente válidos para avalar las conclusiones (ver Appendix 3).
F. Reevaluación de la Depuración Viral Cuando se hacen cambios significativos en la producción o en el proceso de purificación, se deberá considerar el efecto de ese cambio en la depuración viral, tanto directo como indirecto y deberá volver a evaluarse el sistema según cada caso. Por ejemplo, los cambios en los procesos de producción pueden causar cambios significativos en la cantidad de virus producida por la línea celular; los cambios en los pasos del proceso pueden cambiar el grado de depuración de los virus.
VII. RESUMEN Este documento sugiere enfoques para la evaluación del riesgo de contaminación viral y para la eliminación del virus del producto, y de este modo contribuye a la producción de productos biotecnológicos seguros derivados de líneas celulares de origen animal o humano, y enfatiza el valor de muchas estrategias, que incluyen: A. La caracterización o examen minucioso del sustrato celular usado como material inicial para identificar los contaminantes virales presentes, si los hubiera; B. La evaluación del riesgo mediante la determinación del tropismo en seres humanos de los contaminantes; C. La creación de un programa apropiado de pruebas para detectar virus adventicios en material a granel no procesado; D. El diseño cuidadoso de los estudios de depuración viral que utilizan diferentes métodos de inactivación o eliminación viral en el mismo proceso de producción para lograr la máxima depuración viral; y E. Estudios de rendimiento que evalúan la inactivación y la eliminación viral.
GLOSARIO Adventitious Virus: Unintentionally introduced contaminant virus. Banco de Células de Trabajo (BCT): El BCT está preparado a partir de alícuotas de una suspensión homogénea de células obtenidas cultivando el BCM bajo condiciones definidas de cultivo. Banco de Células Maestras (BCM): Es una alícuota de una fuente única de células, generalmente preparada a partir de un clan de células seleccionado bajo condiciones definidas, dispensada en envases múltiples y almacenada bajo condiciones definidas. El Banco de Células Maestras se emplea para proporcionar por derivación todos los bancos de células de trabajo. Las pruebas que se realicen sobre un nuevo BCM (a partir de un clan de células inicial previo, BCM o BCT) deberán ser las mismas que las realizadas sobre el BCM, a menos que se justifique otra cosa. Caracterización del Proceso de Depuración Viral: Estudios de depuración viral en los cuales se utilizan virus "modelo" no específicos para evaluar la robustez del proceso de fabricación para eliminar y/o inactivar virus. Células de Producción: Las células sustrato utilizadas para fabricar el producto. Depuración Viral: La eliminación del virus designado mediante la eliminación de partículas virales o la inactivación de la infectividad viral. Edad Celular in Vitro: Es la medida del transcurso del tiempo entre el descongelamiento del vial o viales del BCM y la cosecha del recipiente de producción, calculado ya sea mediante el tiempo cronológico transcurrido en cultivo, por el nivel de duplicación de la población de células o por el nivel de pasaje de las células cuando están subcultivadas por un procedimiento definido para la dilución del cultivo. Eliminación de Virus: La separación física de partículas de virus del producto previsto. Endogenous Virus: Viral entity whose genome is part of the germ line of the species of origin of the cell line and is covalently integrated into the genome of animal from which the parental cell line was derived. Far the purposes of this document, intentionally introduced, nonintegrated viruses such as EBV used to immortalize cell substrates ar Bovine Papilloma Virus fit in this category. Estudios de Evaluación del Proceso de Depuración Viral: Estudios de depuración viral en los cuales se utilizan virus "relevantes" y/o "modelo" específicos para determinar la capacidad del proceso de fabricación para eliminar y/o inactivar virus.
1092 (1050) Evaluación de la Seguridad Viral / Información General
USP 39
lnactivación: Reducción de la infectividad del virus causada por una modificación química o física. Material a Granel sin Procesar: Una o varias extracciones combinadas de células y medios de cultivo. Cuando las células no son fácilmente accesibles, el material a granel sin procesar sería el líquido extraído del fermentador. Nonendogenous Virus: See Virus. Partículas Similares a Virus: Las estructuras visibles por microscopía electrónica que aparentan ser, desde un punto de vista morfológico, parecidas a virus conocidos. Período Mínimo de Exposición: El período más corto durante el cual se mantendrá una fase de tratamiento. Sustrato Celular: Células utilizadas para la fabricación del producto. Virus: Agentes infecciosos que se replican intracelularmente y que son potencialmente patógenos, poseen un único tipo de ácido nucléico [ya sea ácido ribonucléico (ARN) o ADN], no pueden crecer ni dividirse por fisión binaria y se multiplican en la forma de su material genético. Virus Adventicio: Un virus contaminante introducido accidentalmente. (Ver también Virus.) Virus Endógeno: Una entidad viral cuyo genoma es parte de la línea germinal de la especie de origen de la línea celular y que está integrada de manera covalente dentro del genoma del animal del cual se derivó la línea celular madre. A los efectos de este documento, están incluidos en esta categoría los virus no integrados introducidos intencionalmente tales como el virus de la encefalitis bovina (EBV), utilizado para inmortalizar células sustrato o el Virus de Papiloma Bovino. (Ver también Virus.) Virus Modelo Específico: Un virus estrechamente relacionado con el virus conocido o sospechado (del mismo género o familia) y que tiene propiedades físicas y químicas similares a aquellas del virus observado o sospechado. Virus Modelo No Específico: Un virus utilizado para la caracterización del proceso de depuración viral cuando el objetivo es caracterizar la capacidad del proceso de fabricación para eliminar y/o inactivar los virus en general, por ejemplo, para caracterizar la robutez del proceso de purificación. Virus No Endógen: Virus de fuentes externas presentes en el BCM. (Ver también Virus.) Virus Relevante: Los virus utilizados en estudios de evaluación de procesos, que son o bien el virus identificado o un virus de la misma especie que el virus conocido, o un contaminante probable del sustrato celular o de cualquier otro reactivo o material utilizado en el proceso de producción.
APÉNDICES
Apéndice 1: Productos Derivados de Bancos de Células Caracterizadas que Posteriormente Se Multiplicaron In Vivo Para productos elaborados a partir de fluidos extraídos de animales inoculados con células de bancos caracterizados, se deberá proporcionar información adicional referente a los animales. Siempre que sea posible, los animales que se utilicen en la fabricación de productos biotecnológicos y/o biológicos se deberán obtener a partir de colonias bien definidas y libres de agentes patógenos específicos. Se deberán realizar pruebas adecuadas para detectar los virus correspondientes, como por ejemplo los que se enumeran en la Tabla 3. Se deberán describir procedimientos de cuarentena para animales recién llegados y enfermos y se deberán proporcionar medidas que aseguren que todos los métodos de confinamiento, limpieza y descontaminación utilizados dentro de las instalaciones son adecuados para contener la propagación de agentes adventicios; esto puede lograrse mediante la aplicación de un programa de vigilancia. También se deberá incluir una lista de agentes para los cuales se realizan pruebas. Los servicios de soporte veterinario deberán estar disponibles en el sitio o estar en un lugar de fácil acceso. Se deberá describir hasta qué grado el bioterio está aislado de otras áreas de la planta de fabricación. Las prácticas del personal deberán ser las adecuadas para garantizar la seguridad. Se deberán describir detalladamente los procedimientos para el mantenimiento de los animales, incluyendo la dieta, los horarios de limpieza y alimentación, la provisión de un servicio de atención veterinaria periódica, si correspondiera, y detalles de manipulación especial que los animales puedan requerir una vez inoculados. Se deberá incluir una descripción del régimen de preparación de los animales, la preparación del inóculo, el sitio y la vía de inoculación. El primer material recolectado de los animales puede considerarse como una etapa equivalente a la de recolección de material a granel sin procesar de un bioreactor. Por lo tanto, se deberán aplicar todas las consideraciones de prueba detalladas previamente en la sección IV de este documento. Además, el fabricante deberá evaluar la biocarga del material a granel sin procesar, determinar si el material está libre de micoplasma y realizar un análisis específico de la especie, además de una prueba in vivo en ratones adultos y en ratones lactantes.
Apéndice 2: Selección de Virus para Estudios de Depuración Viral A. EJEMPLOS DE VIRUS "MODELO" ÚTILES 1. Virus "modelo" no específicos que representan una amplia gama de estructuras físico-químicas: • SV40 (Polyomavirus maccacae 1), poliovirus humano 1 (Sabín), parvovirus animal o algún otro virus pequeño no encapsulado;
USP 39
Información General/ (1050) Evaluación de la Seguridad Viral 1093
•virus de parainfluenza o virus de influenza, virus Sindbis o algún otro virus ARN de tamaño mediano a grande encapsulado; • herpesvirus (por ejemplo, HSV-1 o virus de la pseudo-rabia) u otros virus ADN de tamaño mediano a grande. Estos virus se ofrecen sólo a modo de ejemplo y su uso no es obligatorio. 2. Para células sustrato de roedores es común que se empleen retrovirus murinos como virus "modelo" específicos.
B. EJEMPLOS DE VIRUS UTILIZADOS EN ESTUDIOS DE DEPURACIÓN VIRAL En la Tabla A- 7 se enumeran varios virus que se han empleado en estudios de depuración viral. Sin embargo, ya que éstos son solamente ejemplos, el uso de cualquiera de los virus de la tabla no se considera obligatorio y se invita a los fabricantes a que consideren otros virus, especialmente los que puedan ser más apropiados para sus procesos de producción individual. En general, deberá evaluarse el proceso con respecto a la capacidad de eliminar al menos tres virus diferentes con distintas características. Tabla A-1. Ejemplos de Virus que se Han Utilizado en Estudios de Depuración Viral Familia
Género
Huésped Natural
Genoma
Virus de la Estomatitis Vesicular
Rhabdoviridae
Virus vesicular
Equinos, Bovinos
ARN
sí
70
Parainfluenzavirus
Paramixoviridae
Virus paramixo
Varios
ARN
sí
100-200
Mul V
Retroviridae
Oncovirus Tipo
Ratones
ARN
sí
Virus
Med. Amb.
e
Tamaño (nm)
150
Forma
Resistencia 1
Cónica
Baja
Pleo/Esférico
Baja
80-110
Esférico
Baja
X
Virus de Sindbis
Togaviridae
Alfavirus
Humanos
ARN
sí
60-70
Esférico
Baja
BVDV
Flaviviridae
Pestivirus
Bovinos
ARN
sí
50-70
Pleo/Esférico
Baja
Virus de la Pseudorabia
Herpesviridae
Porcinos
ADN
sí
120-200
Poliovirus Sabín Tipo 1
Picornaviridae
Enterovirus
Seres humanos
ARN
no
Virus de la Encefalomiocarditis (EMC)
Picornaviridae
Cardiovirus
Ratones
ARN
3
Esférico
Media
25-30
lcosahédrico
Media
no
25-30
lcosahédrico
Media Media
Reoviridae
Ortoreovirus
Varios
ARN
no
60-80
Esférico
sv 40
Papova
Poliomavirus
Monos
ADN
no
40-50
lcosahédrico
Muy alta
Parvovirus (canino, porcino)
Parvoviridae
Parvovirus
Caninos Porcinos
ADN
no
18-24
lcosahédrico
Muy alta
Reovirus
1 Resistencia a tratamientos físico-químicos basados en estudios de procesos de producción. La resistencia se refiere al tratamiento específico y se utiliza en el contexto del entendimiento de la biología del virus y la naturaleza del proceso de fabricación. Los resultados obtenidos varían según el tratamiento. Estos virus se ofrecen a modo de ejemplo y su uso no se considera obligatorio.
Apéndice 3: Consideraciones Estadísticas para la Evaluación de Valoraciones Virales Las valoraciones virales sufren los problemas de variación comunes a todos los sistemas de valoración biológica. Deberá realizarse una evaluación de la exactitud de las valoraciones virales y los factores de reducción derivados de éstas y de la validez de las valoraciones para determinar la confiabilidad de un estudio. El objetivo de la evaluación estadística es establecer que el estudio se ha llevado a cabo a un nivel aceptable de competencia virológica. 1. Los métodos de valoración pueden ser cuantales o cuantitativos. Los métodos cuantales incluyen valoraciones de infección en animales o en dosis infectiva en cultivo tisular (TCID), en las cuales el animal o el cultivo de células se califica como infectado o como no infectado. Los títulos de infectividad son medidos por la proporción de animales o cultivos infectados. En los métodos cuantitativos, la infectividad medida varía continuamente con la entrada de virus. Los métodos cuantitativos incluyen valoraciones de placa donde cada placa contada corresponde a una sola unidad infecciosa. Tanto las valoraciones cuantales como las cuantitativas son susceptibles de evaluación estadística. 2. Puede haber variación en una valoración como resultado de errores de dilución, efectos estadísticos y diferencias en el sistema de valoración que son desconocidas o difíciles de controlar. Probablemente estos efectos sean mayores cuando se comparan diferentes ciclos de valoración (variación entre valoraciones) que cuando se comparan los resultados dentro de un solo ciclo de valoración (variación intra-valoración). 3. Los límites de confianza del 95 por ciento para los resultados de variación intra-valoración deberán estar normalmente en el orden de ±0,5 log 10 de la media. La variación intra-valoración puede evaluarse con métodos estadísticos estándar. La variación entre valoraciones puede controlarse mediante la inclusión de una preparación de referencia, cuya estimación de potencia deberá estar dentro de aproximadamente 0,5 log 10 de la estimación de la media establecida en el laboratorio para el valor aceptado de la valoración. Las valoraciones con menor precisión pueden considerarse aceptables con una justificación apropiada.
1094 (1050) Evaluación de la Seguridad Viral / Información General
USP 39
4. Los límites de confianza del 95 por ciento para el factor de reducción observado deberán calcularse, siempre que sea posible, con estudios de depuración de virus "relevantes" y "modelo" específicos. Si los límites de confianza del 95 por ciento para las valoraciones virales del material inicial son +s y para las valoraciones virales del material después del paso son +a, los límites de confianza del 95 por ciento para el factor de reducción son:
±Js2 +a2 Apéndice 4: Probabilidad de Detección de Virus en Concentraciones Bajas A concentraciones virales bajas (por ejemplo, dentro del intervalo de 1O a 1000 partículas infecciosas por L) es evidente que una muestra de unos pocos mililitros puede o no contener partículas infecciosas. La probabilidad, p, de que esta muestra no contenga virus infecciosos es:
p = ((V-v)/V)" en donde V (L) es el volumen total del material a analizar, v (L) es el volumen de la muestra y n es el número absoluto de partículas infecciosas estadísticamente distribuidas en V. Si V>> v, se puede realizar una aproximación a esta ecuación mediante la distribución de Poisson:
p=
e-cv
en la cual c es la concentración de partículas infecciosas por L.
o, c =In p/-v Como ejemplo, si se analiza una prueba con un volumen de 1 mL, las probabilidades p a concentraciones virales que varían desde 1O hasta 1000 partículas infecciosas por L son:
1:
1
~~99
1
~~90
11000 0,37
Esto indica que para una concentración de 1000 virus por L, en un 37 por ciento de las muestras, 1 mL no contendrá una partícula viral. Si solamente se prueba el virus en una porción de una muestra y la prueba es negativa, se deberá calcular la cantidad de virus que tendría que haber presente en la muestra total para lograr un resultado positivo y este valor debería considerarse al calcular un factor de reducción. Es aconsejable que los límites de confianza alcancen el 95 por ciento. Sin embargo, en algunos casos, esto quizás no sea factible debido a las limitaciones de los materiales.
Apéndice 5: Cálculo de Factores de Reducción en Estudios para Determinar la Depuración Viral El factor de reducción viral de un paso de purificación o inactivación individual se define como el log 10 del cociente de la carga viral en el material antes de la purificación y la carga viral en el material una vez purificado cuando está listo para ser empleado en el próximo paso del proceso. Si se utilizan las siguientes abreviaturas: Material inicial: volumen v'; concentración 1 ºª'; carga viral: (v')(l Oª), Material final: volumen v"; título 1O•"; carga viral: (v")(l O•"), los factores de reducción individual Ri se calculan según: 1ORi = (v')(l O•') / (v")(l Oª") Esta fórmula considera las concentraciones y los volúmenes de los materiales antes y después del paso de purificación. Debido a la imprecisión inherente de algunas valoraciones virales, un factor de reducción individual empleado para el cálculo de un factor de reducción general deberá ser mayor de 1. El factor de reducción total para un proceso de producción completo es el logaritmo de la suma de los factores de reducción de los pasos individuales. Esto representa el logaritmo del cociente entre la carga viral al comienzo del primer paso del proceso de depuración y al final del último paso del proceso de depuración. Los factores de reducción se expresan normalmente en una escala logarítmica lo cual implica que, mientras que la contaminación viral residual nunca se reducirá a cero, puede reducirse considerablemente en forma matemática.
Apéndice 6: Cálculo de Partículas Estimadas por Dosis Esto se aplica a aquellos virus para los cuales puede hacerse una estimación de una cifra inicial, como por ejemplo los retrovirus endógenos. Ejemplo:
USP 39
Información General/ (1051) Limpieza de Material de Vidrio 1095
l. Suposiciones Concentración estimada o medida de virus en el cultivo celular recolectado: = 106 /ml Factor de depuración viral calculado=> 101s Volumen de cultivo recolectado necesario para hacer una dosis del producto = 1 L (10 3 ml) 11. Cálculo de Partículas/Dosis Estimadas de /ml)x(10 3 ml/dosis) (106 unid~des virus
Factor de depuración> 1015
_ 109 partículas /dosis Factor de depuración> 1015
=<1
o-6 partículas/dosis
Por lo tanto, se esperaría menos de una partícula por millón de dosis.
(1051) LIMPIEZA DE MATERIAL DE VIDRIO El éxito de muchas valoraciones y pruebas Farmacopeicas depende de la limpieza del material de vidrio utilizado. Siempre que resulte necesario, se deben usar reactivos inorgánicos o detergentes disponibles comercialmente. En cualquier caso, es importante verificar que el procedimiento de limpieza sea apropiado para la prueba o valoración particular que se esté llevando a cabo. Esto se puede lograr de diversas maneras, incluyendo el uso de controles experimentales o verificación de la limpieza usando análisis de residuos/residuales para asegurar la eliminación de cualquier contaminante potencial. El protocolo de limpieza debe incluir una cláusula en la que se describa la forma en que se evaluará el éxito del procedimiento de limpieza. Para las mediciones ópticas, se debe prestar especial cuidado a la limpieza de los recipientes, pero no debe usarse ácido crómico ni soluciones altamente alcalinas. Las siguientes son algunas de las pruebas en las que el uso de material de vidrio limpio es particularmente crítico para el éxito de las mismas: pruebas para pirógenos y carbono orgánico total, así como valoraciones de heparina sódica y actividad de vitamina B12 • El Apéndice incluye referencias seleccionadas que pueden ser útiles para obtener información adicional sobre la limpieza de material de vidrio. Dichas referencias no están avaladas por la USP y no representan una lista exhaustiva. Se puede encontrar información adicional sobre los procedimientos de limpieza de material de vidrio mencionados en este capítulo en la mayoría de los textos sobre química analítica cuantitativa.
APÉNDICE Es posible encontrar información adicional y pautas en las referencias citadas a continuación y en una gran cantidad de textos sobre química analítica cuantitativa. 1. Parenteral Drug Association. Draft-Poínts to Consider far Cleaníng Valídatíon (Technical Report Number 29). Bethesda, MD: Parenteral Drug Association; 1998. 2. Anderson NR. Container cleaning and sterilization. En: Olson WP, Groves MJ, eds. Aseptíc Pharmaceutícal Manufacturing. 1st ed. Buffalo Grove, IL: lnterpharm Press; 1987:15-22. 3. Green C. Cleaning validation-application in the laboratory; Montalvo M. The cleaning validation policy and the cleaning validation plan; Verghese G, Kaiser N. Cleaning agents and cleaning chemistry; Verghese G, Lopolito P. Cleaning engineering and equipment design. En: Pluta PL, ed. Cleaníng and Cleaníng Valídatíon, Volume 1. Bethesda, MD: Parenteral Drug Association; 2009. 4. Gordon AJ, Ford RA. Standard glassware cleaning solutions. En: Gordon AJ, Ford RA, eds. The Chemíst's Companíon. Hoboken, NJ: Wiley and Sons; 1973.
1096 (1052) Artículos Obtenidos por Biotecnología / Información General
USP 39
(1052) ARTÍCULOS OBTENIDOS POR BIOTECNOLOGÍA-ANÁLISIS DE AMINOÁCIDOS
Este capítulo proporciona guías y procedimientos utilizados para la caracterización de artículos obtenidos por biotecnología mediante análisis de aminoácidos. Se lo ha armonizado con los capítulos correspondientes en la Farmacopea japonesa (JP) y la Farmacopea Europea (EP). Algunas partes de este capítulo que no están armonizadas con las otras dos farmacopeas están marcadas con el símbolo +. La nota al pié de página se encuentra en la USP, pero no así en la FE o FJ. También se muestran otras 1w~lf~i!!!i!i'J!iilli~!ll~~~t!r~iJfü!im~irn4m"¡",¡i¡?n8ii'i'i Artículos Obtenidos por BiotecnologíaPruebas de caracterización armonizadas en 1:rzz ,,,~+:1:11L!ilo~~~~i!,%~1111111H1 , ~!lmi!MWll~fl:1,11 lsoelectroenfoque (1054), Artículos Obtenidos por Biotecnología-Mapeo de Péptidos (1055), Artículos Obtenidos por Biotecnología-Electroforesis en Gel de Poliacrilamida (1056) y Artículos Obtenidos por Biotecnología-Valoración de Proteínas Totales (1057).
INTRODUCCIÓN El análisis de aminoácidos se refiere a la metodología usada para determinar la composición o el contenido de aminoácidos de proteínas, péptidos y otras preparaciones farmacéuticas. Las proteínas y los péptidos son macromoléculas formadas por aminoácidos unidos covalentemente organizados como polímeros lineales. La secuencia de los aminoácidos en una proteína o un péptido determina las propiedades de la molécula. Las proteínas se consideran moléculas grandes que existen comúnmente como estructuras plegadas con una conformación específica, mientras que los péptidos son más pequeños y pueden estar formados por pocos aminoácidos. El análisis de aminoácidos se puede usar para cuantificar proteínas y péptidos, para determinar la identidad de proteínas o péptidos basándose en su composición de aminoácidos, para respaldar el análisis estructural de proteínas y péptidos, para evaluar estrategias de fragmentación para el mapeo de péptidos y para detectar aminoácidos atípicos presentes en una proteína o un péptido. Antes del análisis de aminoácidos, es necesario hidrolizar una proteína o péptido descomponiéndolo en sus aminoácidos constituyentes. Después de la hidrólisis de la proteína o el péptido, el procedimiento de análisis de aminoácidos puede ser igual al utilizado para aminoácidos libres en otras preparaciones farmacéuticas. Los aminoácidos constituyentes de la muestra de prueba normalmente se derivatizan para su análisis.
APARATOS Los métodos usados para el análisis de aminoácidos por lo general se basan en una separación cromatográfica de los aminoácidos presentes en la muestra de prueba. Las técnicas actuales aprovechan la instrumentación cromatográfica automatizada diseñada para las metodologías analíticas. Un instrumento de análisis de aminoácidos típico es un cromatógrafo de líquidos de baja presión o de alta presión, capaz de generar gradientes de fase móvil que separan los aminoácidos en una columna cromatográfica. El instrumento debe tener la capacidad de derivatizar los aminoácidos después de pasar por la columna, a menos que la muestra se analice con derivatización anterior a la columna. El detector generalmente es de luz UV-visible o de fluorescencia, según el método de derivatización usado. Se usa un dispositivo de registro (p.ej., un integrador) para transformar la señal analógica del detector y para la cuantificación. Es preferible que los instrumentos utilizados para el análisis de aminoácidos se destinen específicamente a esos fines.
PRECAUCIONES GENERALES La contaminación de fondo es siempre una preocupación en el análisis de aminoácidos. Se requieren reactivos de alta pureza (p.ej., el ácido clorhídrico de baja pureza puede contribuir a la contaminación con glicina). Los reactivos analíticos se cambian rutinariamente cada pocas semanas y se usan solamente disolventes para cromatografía de líquidos de alta presión (grado HPLC). La posible contaminación microbiana y los materiales extraños presentes en los disolventes se reducen por filtración antes de usarlos, cubriendo los recipientes y colocando el instrumental para análisis de aminoácidos alejado de la luz solar directa. Las prácticas de laboratorio pueden determinar la calidad del análisis de aminoácidos. Colocar los instrumentos en una zona de poco tránsito del laboratorio. Mantener limpio el laboratorio. Hay que limpiar y calibrar las pipetas según un plan de mantenimiento. Mantener las puntas de las pipetas en una caja cubierta; los analistas no deben manipular las puntas de las pipetas con las manos. Los analistas pueden usar guantes de látex sin polvo o similares. Limitar la cantidad de veces que se abre y se cierra un vial de muestra ya que el polvo puede hacer que aparezcan niveles elevados de glicina, serina y alanina. Se necesitan instrumentos bien mantenidos para que los resultados de los análisis de aminoácidos sean aceptables. Si el instrumento se usa de modo rutinario, se debe revisar diariamente para detectar pérdidas, verificar la estabilidad del detector y la lámpara y la capacidad de la columna para mantener la resolución de los aminoácidos individuales. Limpiar o reemplazar, de acuerdo a un plan de rutina, todos los filtros de los instrumentos y demás artículos de mantenimiento.
USP 39
Información General/ (1052) Artículos Obtenidos por Biotecnología 1097
MATERIAL ESTÁNDAR DE REFERENCIA Los estándares de aminoácidos aptos para este tipo de análisis están disponibles comercialmente* y consisten generalmente en una mezcla acuosa de aminoácidos. Cuando se determina la composición de aminoácidos, los estándares de proteínas o péptidos se analizan junto con el material de prueba como un control para demostrar la integridad de todo el procedimiento. Para este propósito, se ha usado seroalbúmina bovina altamente purificada como estándar de proteína.
CALIBRACIÓN DE LOS INSTRUMENTOS La calibración del instrumental para análisis de aminoácidos por lo general involucra el análisis de estándares de aminoácidos, que son una mezcla de aminoácidos de varias concentraciones, para determinar el factor de respuesta y el intervalo de análisis de cada aminoácido. Se conoce la concentración de cada aminoácido en el estándar. En el procedimiento de calibración, el analista diluye el estándar de aminoácidos para obtener distintos niveles de concentración de analito dentro del intervalo lineal esperado de la técnica de análisis de aminoácidos. Luego, se analizan repetidamente las diversas concentraciones de analito. Las áreas de los picos obtenidos para cada aminoácido se grafican en función de la concentración conocida para cada uno de los aminoácidos en la dilución estándar. Estos resultados permiten al analista determinar el intervalo de concentraciones de aminoácidos donde el área del pico de cada aminoácido es una función aproximadamente lineal de su concentración. Es importante que el analista prepare las muestras para el análisis de aminoácidos de manera que estén dentro de los límites analíticos (p.ej., intervalo de trabajo lineal) de la técnica empleada a fin de obtener resultados exactos y repetibles. Se analizan de cuatro a seis concentraciones del estándar de aminoácidos para determinar un factor de respuesta para cada aminoácido. El factor de respuesta se calcula como el área del pico o la altura del pico promedio por nmol de aminoácido presente en el estándar. Para calcular la concentración de cada aminoácido presente en la muestra de prueba se prepara y se usa un registro de calibración con el factor de respuesta de cada aminoácido. En este cálculo se divide el área del pico de un aminoácido dado por su correspondiente factor de respuesta, y se obtienen así los nmol del aminoácido. Para los análisis de rutina, basta una calibración de un solo punto; sin embargo, el archivo de calibración se actualiza frecuentemente y se prueba por análisis de controles analíticos para asegurar su integridad.
REPETIBILIDAD Los resultados uniformes y de alta calidad de los análisis de aminoácidos de un laboratorio analítico exigen prestar atención a la repetibilidad de la valoración. Durante el análisis de la separación cromatográfica de los aminoácidos o sus derivados, se pueden observar numerosos picos en el cromatograma que corresponden a los aminoácidos. El gran número de picos exige un sistema de análisis de aminoácidos que los pueda identificar repetidamente basándose en el tiempo de retención e integrar las áreas de los picos para la cuantificación. Una evaluación de repetibilidad típica involucra la preparación de una solución de aminoácidos estándar y el análisis de varias determinaciones repetidas (es decir, seis análisis o más) de la misma solución estándar. Se determina la desviación estándar relativa (RSD, por sus siglas en inglés) para el tiempo de retención y el área del pico integrada de cada aminoácido. La evaluación de la repetibilidad se amplía incluyendo múltiples valoraciones realizadas durante varios días por distintos analistas. Las múltiples valoraciones incluyen la preparación de diluciones estándar a partir de materiales iniciales para determinar la variación debida a la manipulación de la muestra. A menudo, la composición de aminoácidos de una proteína estándar (p.ej., seroalbúmina bovina) se analiza como parte de la evaluación de repetibilidad. La evaluación de la variación de determinaciones repetidas (es decir, la RSD) permite al laboratorio establecer límites analíticos para asegurar que sus análisis se encuentran bajo control. Es conveniente establecer los límites de variación mínimos practicables para asegurar los mejores resultados. Para disminuir la variabilidad del análisis de aminoácidos, conviene enfocarse en la preparación de la muestra, la elevada interferencia espectral de fondo debido a la calidad de los reactivos y/o a las prácticas del laboratorio, el funcionamiento y mantenimiento de los instrumentos, el análisis y la interpretación de los datos y el desempeño y los hábitos del analista. Todos los parámetros se investigan a fondo como parte del trabajo de validación.
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA La obtención de resultados exactos del análisis de aminoácidos exige muestras purificadas de proteínas y péptidos. Los componentes de las soluciones amortiguadoras (p.ej., sales, urea, detergentes) pueden interferir con el análisis de aminoácidos y se eliminan de la muestra antes del análisis. Los métodos que utilizan derivatización de aminoácidos postcolumna generalmente no se ven tan afectados por los componentes de la solución amortiguadora como se observa en los métodos de derivatización precolumna. Es conveniente limitar el número de las manipulaciones de las muestras con el fin de reducir la posible contaminación de fondo, para mejorar la recuperación de analitos y para reducir el trabajo. Las técnicas comunes empleadas para eliminar los componentes de las soluciones amortiguadoras del pH de las muestras de proteínas incluyen: (1) inyectar la muestra de proteína en un sistema HPLC en fase reversa, extrayendo la proteína con un disolvente volátil que contenga suficiente componente orgánico y secando la muestra en una centrífuga de vacío; (2) diálisis contra una solución amortiguadora del pH volá*•se pueden obtener estándares adecuados de NIST (Gaithersburg, MD), Beckman lnstruments (Fullerton, CA), Sigma Chemical (St. Louis, MO), Pierce (Rockford, IL) o Agilent (Palo Alto, CA) .•
1098 (1 052) Artículos Obtenidos por Biotecnología / Información General
USP 39
til o agua; (3) ultrafiltración centrífuga para el reemplazo de la solución amortiguadora del pH por una solución amortiguadora del pH volátil o agua; (4) precipitar la proteína de la solución amortiguadora del pH usando un disolvente orgánico (p. ej.: acetona); y (5) filtración en gel.
ESTÁNDARES INTERNOS Se recomienda usar un estándar interno para controlar las pérdidas y variaciones físicas y químicas durante el análisis de aminoácidos. Antes de la hidrólisis, se puede agregar a la solución de proteína una cantidad de estándar interno conocida con exactitud. La recuperación del estándar interno indica la recuperación general de los aminoácidos de la solución de proteína. Sin embargo, los aminoácidos libres no se comportan igual que los aminoácidos unidos a proteínas durante la hidrólisis ya que sus velocidades de liberación o destrucción son variables. Por lo tanto, el uso de un estándar interno para corregir las pérdidas durante la hidrólisis puede proporcionar resultados no confiables. Hay que tener en cuenta este punto cuando se interpretan los resultados. También se pueden agregar estándares internos a la mezcla de aminoácidos después de la hidrólisis para corregir por las diferencias en la aplicación de las muestras y los cambios en la estabilidad del reactivo y las velocidades de flujo. Idealmente, un estándar interno es un aminoácido primario que no se encuentra naturalmente y que está disponible comercialmente a bajo precio. También debe ser estable durante la hidrólisis, su factor de respuesta debe ser función lineal de su concentración y debe eluir con un tiempo de retención único, sin superponerse con otros aminoácidos. Los estándares de aminoácidos comúnmente empleados incluyen la norleucina, la nitrotirosina y el ácido a-aminobutírico.
HIDRÓLISIS DE PROTEÍNAS La hidrólisis de muestras de proteínas y péptidos es necesaria para el análisis de aminoácidos de estas moléculas. El material de vidrio usado para la hidrólisis debe estar muy limpio para evitar resultados erróneos. Los polvos para guantes y las huellas dactilares en los tubos de hidrólisis pueden causar contaminación. Para limpiar los tubos de vidrio para hidrólisis, hay que hervir los tubos durante 1 hora en ácido clorhídrico 1 N o sumergirlos en ácido nítrico concentrado o en una mezcla de ácido clorhídrico concentrado y ácido nítrico concentrado (1 :1 ). Los tubos de hidrólisis limpios se enjuagan con agua de alta pureza, seguido por un enjuague con metano! de grado HPLC, se secan de un día para el otro en una estufa y se almacenan cubiertos hasta su uso. Alternativamente, el material de vidrio limpio se puede someter a pirólisis a 500º durante 4 horas para eliminar la contaminación de los tubos para hidrólisis. También se puede usar material de laboratorio desechable adecuado. La hidrólisis ácida es el método más común para hidrolizar una muestra de proteína antes del análisis de aminoácidos. La técnica de hidrólisis ácida puede aumentar la variabilidad del análisis debido a la destrucción completa o parcial de varios aminoácidos. El triptófano se destruye; la serina y la treonina se destruyen parcialmente; la metionina puede oxidarse; y la cisteína típicamente se recupera como cistina (pero la recuperación de la cistina suele ser mala debido a la destrucción o reducción parcial a cisteína). La aplicación de vacío adecuado (menos de 200 µm de mercurio o 26,7 Pa) o la introducción de un gas inerte (argón) en la cámara gaseosa superior del recipiente de reacción puede reducir la destrucción oxidativa. En las uniones peptídicas que involucran isoleucina y valina, las uniones amida de lle-lle, Val-Val, lle-Val y Val-lle se escinden parcialmente; y la asparagina y la glutamina se desamidan, dando como resultado ácido aspártico y ácido glutámico, respectivamente. La pérdida de triptófano, asparagina y glutamina durante una hidrólisis ácida limita la cuantificación a 17 aminoácidos. Algunas de las técnicas de hidrólisis descritas se usan para tratar estos problemas. Algunas de las técnicas de hidrólisis descritas (es decir, los Métodos 4- 7 7) pueden modificar otros aminoácidos. Por lo tanto, hay que considerar las ventajas de usar una técnica de hidrólisis en comparación con sus problemas; estas ventajas se analizan adecuadamente antes de emplear un método que no sea la hidrólisis ácida. A menudo se emplea un estudio en función del tiempo (es decir, un análisis de aminoácidos con tiempos de hidrólisis ácida de 24, 48 y 72 horas) para analizar la concentración inicial de aminoácidos que se destruyen parcialmente o que se escinden lentamente. Al graficar la concentración observada de aminoácidos lábiles (es decir, serina y treonina) en función del tiempo de hidrólisis, se puede extrapolar la línea hasta su origen para determinar la concentración inicial de estos aminoácidos. Los estudios de hidrólisis en función del tiempo también se usan con aminoácidos que se escinden lentamente (p.ej., isoleucina y valina). Durante el transcurso del tiempo de hidrólisis, el analista observa una meseta en estos residuos. El nivel de esta meseta se considera la concentración de residuo. Si el tiempo de hidrólisis es demasiado largo, la concentración del residuo en la muestra comienza a disminuir, indicando una destrucción por las condiciones de hidrólisis. Una alternativa aceptable al estudio en función del tiempo es someter un estándar de calibración de un aminoácido a las mismas condiciones de hidrólisis que la muestra de prueba. El aminoácido libre puede no ser totalmente representativo de la velocidad de destrucción de los aminoácidos lábiles dentro de un péptido o una proteína durante la hidrólisis. Esto es especialmente válido para las uniones peptídicas que se escinden lentamente (p.ej., uniones lle-Val). Sin embargo, esta técnica permite al analista dar cuenta de cierta destrucción de residuos. Se ha empleado la hidrólisis ácida por microondas y ésta es rápida, pero exige equipo y precauciones especiales. Las condiciones óptimas para la hidrólisis por microondas se deben investigar para cada muestra de proteína o péptido. La técnica de hidrólisis por microondas típicamente toma sólo unos minutos, pero una desviación de 1 minuto puede proporcionar resultados inadecuados (p.ej., hidrólisis incompleta o destrucción de aminoácidos lábiles). Se ha empleado la proteólisis completa usando una mezcla de proteasas pero puede ser complicada, exige controles adecuados y, por lo general, se puede aplicar más a péptidos que a proteínas. [NOTA-Durante los análisis iniciales de
USP 39
Información General/ (1052) Artículos Obtenidos por Biotecnología 1099
una proteína desconocida, se realizan experimentos con diferentes tiempos de hidrólisis y condiciones de temperatura para determinar las condiciones óptimas.]
Método 1 La hidrólisis ácida usando ácido clorhídrico que contenga fenol es el procedimiento más comúnmente usado para la hidrólisis de proteínas o péptidos antes del análisis de aminoácidos. La adición de fenol a la reacción evita la halogenación de la tirosina. Solución de Hidrólisis: ácido clorhídrico 6 N que contenga entre O, 1% y 1,0% de fenol. ProcedimientoHidrólisis en Fase Líquida-Colocar la muestra de proteína o péptido en un tubo para hidrólisis y secar. [NOTA-La muestra se seca para que el agua de la muestra no diluya el ácido empleado para la hidrólisis.] Agregar 200 µL de la Solución de Hidrólisis por cada 500 µg de proteína liofilizada. Congelar el tubo de la muestra en un baño de hielo seco y acetona y sellar a la llama en vacío. Las muestras típicamente se hidrolizan a 11 Oº durante 24 horas al vacío o en una atmósfera inerte para evitar la oxidación. Se investigan tiempos mayores de hidrólisis (p.ej., 48 y 72 horas) si existe la preocupación de que la proteína no esté totalmente hidrolizada. Hidrólisis en Fase de Vapor-Éste es uno de los procedimientos de hidrólisis ácida más comunes y se prefiere para el microanálisis cuando sólo se dispone de pequeñas cantidades de muestra. La contaminación de la muestra por el reactivo ácido también se minimiza usando la hidrólisis en fase de vapor. Colocar los viales que contengan las muestras secas en un recipiente con una cantidad adecuada de la Solución de Hidrólisis. La Solución de Hidrólisis no entra en contacto con la muestra de prueba. Aplicar una atmósfera inerte o vacío (menos de 200 µm de mercurio o 26,7 Pa) a la cámara gaseosa del recipiente y calentar aproximadamente a 11 Oº durante un tiempo de hidrólisis de 24 horas. El vapor ácido hidroliza la muestra seca. Minimizar toda condensación del ácido en los viales de la muestra. Después de la hidrólisis, secar la muestra al vacío para eliminar el ácido residual.
Método 2 La oxidación del triptófano durante la hidrólisis disminuye si se usa ácido mercaptoetanosulfónico (MESA) como ácido reductor. Solución de Hidrólisis: solución de MESA 2,5 M. Hidrólisis en Fase de Vapor-Secar aproximadamente de 1 a 100 µg de la proteína o péptido en análisis en un tubo de hidrólisis. Colocar el tubo de hidrólisis en un tubo más grande con aproximadamente 200 µL de la Solución de Hidrólisis. Sellar al vacío el tubo más grande (aproximadamente a 50 µm de mercurio o 6,7 Pa) para vaporizar la Solución de Hidrólisis. Calentar el tubo de hidrólisis entre 170º y 185º durante aproximadamente 12,5 minutos. Después de la hidrólisis, secar el tubo de hidrólisis al vacío durante 15 minutos para eliminar el ácido residual.
Método 3 La oxidación del triptófano durante la hidrólisis se evita usando ácido tioglicólico (TGA) como ácido reductor. Solución de Hidrólisis: una solución que contenga ácido clorhídrico 7 M, 10% de ácido trifluoroacético, 20% de ácido tioglicólico y 1% de fenol. Hidrólisis en Fase de Vapor-Secar aproximadamente de 1O µg a 50 µg de la proteína o péptido en análisis en un tubo de muestra. Colocar el tubo de muestra en un tubo más grande con aproximadamente 200 µL de la Solución de Hidrólisis. Sellar el tubo más grande al vacío (aproximadamente a 50 µm de mercurio o 6,7 Pa) para vaporizar el TGA. Calentar el tubo de muestra a 166º durante aproximadamente 15 a 30 minutos. Después de la hidrólisis, secar el tubo de muestra al vacío durante 5 minutos para eliminar el ácido residual. La recuperación de triptófano por medio de este método puede depender de la cantidad de muestra presente.
Método 4 La oxidación de la cisteína-cistina y de la metionina se realiza con ácido perfórmico antes de la hidrólisis de la proteína. Solución de Oxidación-Preparar ácido perfórmico en el momento de análisis mezclando ácido fórmico y peróxido de hidrógeno al 30% (9:1) e incubar a temperatura ambiente durante 1 hora. Procedimiento-Disolver la muestra de proteína o péptido en 20 µL de ácido fórmico y calentar a 50º durante 5 minutos; agregar luego 100 µL de la Solución de Oxidación. En esta reacción, la cisteína se convierte en ácido cisteico y la metionina se convierte en metionina sulfona. Dejar que la oxidación continúe durante de 1O a 30 minutos. Eliminar el reactivo en exceso de la muestra en una centrífuga de vacío. Esta técnica puede modificar los residuos de tirosina en presencia de haluros. Luego se puede realizar una hidrólisis ácida de la proteína oxidada usando el Método 7 o el Método 2.
1100 (1052) Artículos Obtenidos por Biotecnología / Información General
USP 39
Método 5 La oxidación de cisteína-cistina se logra durante la hidrólisis en fase líquida con azida de sodio. Solución de Hidrólisis: agregar azida de sodio a ácido clorhídrico 6 N que contenga 0,2% de fenal, para obtener una concentración final de 0,2% (p/v). El fenal agregado evita la halogenación de la tirosina. Hidrólisis en Fase Líquida-Realizar la hidrólisis de la proteína o péptido aproximadamente a 11 Oº durante 24 horas. Durante la hidrólisis, la cisteína-cistina presente en la muestra se convierte en ácido cisteico mediante la azida de sodio presente en la Solución de Hidrólisis. Esta técnica permite una mejor recuperación de tirosina que el Método 4, pero no es cuantitativa para la metionina. La metionina se convierte en una mezcla de la metionina original y sus dos productos de oxidación, metionina sulfóxido y metionina sulfona.
Método 6 La oxidación de cisteína-cistina se logra con dimetil sulfóxido (DMSO). Solución de Hidrólisis: agregar DMSO a ácido clorhídrico 6 N que contenga de O, 1% a 1,0% de fenal, para obtener una concentración final de 2% (v/v). Hidrólisis en Fase de Vapor-Realizar la hidrólisis de la proteína o péptido aproximadamente a 11 Oº durante 24 horas. Durante la hidrólisis, la cisteína-cistina presente en la muestra se convierte en ácido cisteico por el DMSO presente en la Solución de Hidrólisis. Para reducir la variabilidad y compensar la destrucción parcial, se recomienda evaluar la recuperación de ácido cisteico de las hidrólisis oxidativas de proteínas estándar que contengan de 1 a 8 moles de cisteína. Los factores de respuesta del hidrolizado de proteínas o péptidos por lo general son aproximadamente 30% menores que los de los estándares de ácido cisteico no hidrolizado. Como la histidina, la metionina, la tirosina y el triptófano también se modifican, con esta técnica no se obtiene un análisis completo de la composición.
Método 7 La reducción y la alquilación de cisteína-cistina se logra a través de una reacción de piridiletilación en fase de vapor. Solución Reductora-Transferir 83,3 µL de piridina, 16,7 µL de 4-vinilpiridina, 16,7 µL de tributilfosfina y 83,3 µL de agua a un recipiente adecuado y mezclar. Procedimiento-Agregar la proteína o péptido (entre 1 y 100 µg) a un tubo de hidrólisis y colocar en un tubo más grande. Transferir la Solución Reductora al tubo más grande, sellar al vacío (aproximadamente a 50 µm de mercurio o 6,7 Pa), e incubar aproximadamente a 100º durante 5 minutos. Luego, retirar el tubo de hidrólisis interior y secarlo en un desecador de vacío durante 15 minutos para eliminar los reactivos residuales. Después, se puede realizar una hidrólisis ácida de la proteína o péptido piridiletilados usando los procedimientos descritos previamente. La reacción de piridiletilación se realiza simultáneamente con una muestra de un estándar de proteína que contenga de 1 a 8 moles de cisteína, para mejorar la exactitud de la recuperación de piridiletil-cisteína. Mayores tiempos de incubación en la reacción de piridiletilación pueden modificar el grupo a-amino terminal y el grupo E-amino de la lisina en la proteína.
Método 8 La reducción de cisteína-cistina y la alquilación se logran a través de una reacción de piridiletilación en fase líquida. Soluciones Madre-Preparar y filtrar tres soluciones: clorhidrato de Tris 1 M (pH 8,5) que contenga edetato disódico 4 mM (Solución Madre 7), clorhidrato de guanidina 8 M (Solución Madre 2) y 2-mercaptoetanol al 10% en agua (Solución Madre 3). Solución Reductora-Preparar una mezcla de la Solución Madre 2 y la Solución Madre 7 (3:1) para obtener una solución amortiguada de clorhidrato de guanidina 6 M en clorhidrato de Tris 0,25 M. Procedimiento-Disolver aproximadamente 1O µg de la muestra de prueba en 50 µL de la Solución Reductora y agregar aproximadamente 2,5 µL de la Solución Madre 3. Almacenar bajo nitrógeno o argón durante 2 horas a temperatura ambiente en un lugar oscuro. Para lograr la reacción de piridiletilación, agregar aproximadamente 2 µL de 4-vinilpiridina a la solución de proteína, e incubar durante 2 horas adicionales a temperatura ambiente en un lugar oscuro. La proteína o péptido se desaliniza por recolección de la fracción de proteína o péptido luego de una separación por HPLC en fase reversa. La muestra recolectada se pu~de secar en una centrífuga de vacío antes de la hidrólisis ácida.
Método 9 La reducción de cisteína-cistina y la alquilación se logran a través de una reacción de carboximetilación en fase líquida. Soluciones Madre-Preparar según se indica en el Método 8. Solución de Carboximetilación-Preparar una solución que contenga 100 mg de yodoacetamida por mL de alcohol. Solución Amortiguadora-Usar la Solución Reductora, preparada según se indica en el Método 8. Procedimiento-Disolver la muestra de prueba en 50 µL de la Solución Amortiguadora y agregar aproximadamente 2,5 µL de la Solución Madre 3. Almacenar bajo nitrógeno o argón durante 2 horas a temperatura ambiente en un lugar oscuro. Agre-
USP
39
Información General/ (1 052) Artículos Obtenidos por Biotecnología 11 01
gar la Solución de Carboximetifación en una relación de 1,5 veces el contenido teórico total de tioles, e incubar durante 30 minutos adicionales a temperatura ambiente en un lugar oscuro. [NOTA-Si el contenido de tioles de la proteína se desconoce, agregar 5 µL de yodoacetamida 100 mM por cada 20 nmol de proteína presente.] La reacción se detiene agregando un exceso de 2-mercaptoetanol. La proteína o péptido se desaliniza por recolección de la fracción de proteína o péptido luego de una separación por HPLC en fase reversa. La muestra recolectada se puede secar en una centrífuga de vacío antes de la hidrólisis ácida. La S-carboxiamidometilcisteína formada se convierte en S-carboximetilcisteína durante la hidrólisis ácida.
Método 10 La cisteína-cistina se hace reaccionar con el ácido ditiodiglicólico o el ácido ditiodipropiónico para producir un disulfuro mixto. [NOTA-La elección del ácido ditiodiglicólico o del ácido ditiodipropiónico depende de la resolución requerida por el método de análisis de aminoácidos.] Solución Reductora: una solución que contenga 1O mg de ácido ditiodiglicólico (o ácido ditiodipropiónico) por mL de hidróxido de sodio 0,2 M. Procedimiento-Transferir aproximadamente 20 µg de la muestra de prueba a un tubo de hidrólisis y agregar 5 µL de la Solución Reductora. Agregar 1O µL de alcohol isopropílico y luego eliminar todo el líquido de la muestra mediante centrifugación al vacío. Luego, hidrolizar la muestra usando el Método 7. La ventaja de este método es que no se derivatizan otros residuos aminoacídicos por reacciones secundarias y no es necesario desalinizar la muestra antes de la hidrólisis.
Método 11 La asparagina y la glutamina se convierten en ácido aspártico y ácido glutámico, respectivamente, durante la hidrólisis ácida. Los residuos de asparagina y ácido aspártico se suman y se representan con Asx, y los residuos de glutamina y ácido glutámico se suman y se representan con Glx. Las proteínas o péptidos pueden hacerse reaccionar con bis(l, 1-trifluoroacetoxi)yodobenceno (BTI) para convertir los residuos de asparagina y glutamina en residuos de ácido diaminopropiónico y ácido diaminobutírico, respectivamente, en la hidrólisis ácida. Estas conversiones permiten al analista determinar el contenido de asparagina y glutamina de una proteína o péptido en presencia de residuos de ácido aspártico y ácido glutámico. Soluciones Reductoras-Preparar y filtrar tres soluciones: una solución de ácido trifluoroacético 1O mM (Solución 7), una solución de clorhidrato de guanidina 5 M y ácido trifluoroacético 1O mM (Solución 2) y una solución recién preparada de dimetilformamida que contenga 36 mg de BTI por mL (Solución 3). Procedimiento-A un tubo de hidrólisis limpio, transferir aproximadamente 200 µg de la muestra de prueba y agregar 2 mL de la Solución 7 o la Solución 2 y 2 mL de la Solución 3. Sellar el tubo de hidrólisis al vacío. Calentar la muestra a 60º durante 4 horas en un lugar oscuro. Luego, dializar la muestra con agua para eliminar el exceso de reactivos. Extraer la muestra dializada tres veces con volúmenes iguales de acetato de n-butilo y luego liofilizar. Después, se puede realizar la hidrólisis ácida de la proteína usando los procedimientos descritos previamente. Los residuos de ácido a-,p -diaminopropiónico y ácido a-, ydiaminobutírico típicamente no se resuelven de los residuos de lisina en la cromatografía de intercambio iónico basada en el análisis de aminoácidos. Por lo tanto, cuando se usa el intercambio iónico para separar los aminoácidos, el contenido de asparagina y glutamina es la diferencia cuantitativa entre el ácido aspártico y ácido glutámico determinados por hidrólisis ácida sin derivatizar y el contenido que se obtiene por derivatización con BTI. [NOTA-El contenido determinado para treonina, metionina, cisteína, tirosina e histidina puede cambiar por la derivatización con BTI; se debe realizar una hidrólisis sin BTI si el analista está interesado en la composición de estos otros residuos de aminoácidos.]
PRINCIPIOS GENERALES DE LAS METODOLOGÍAS DE ANÁLISIS DE AMINOÁCIDOS Existen muchas técnicas de análisis de aminoácidos y la elección de una de estas técnicas a menudo depende de la sensibilidad que requiera la valoración. En general, aproximadamente la mitad de las técnicas de análisis de aminoácidos empleadas se basan en la separación de los aminoácidos libres mediante cromatografía de intercambio iónico seguida por derivatización postcolumna (p.ej., con ninhidrina u o-ftalaldehído). Las técnicas de detección postcolumna se pueden utilizar con muestras que contienen pequeñas cantidades de los componentes de las soluciones amortiguadoras, tales como sales y urea, y por lo general necesitan entre 5 y 1O µg de muestra de proteína por análisis. Las demás técnicas de aminoácidos generalmente involucran la derivatización precolumna de los aminoácidos libres (p.ej., isotiocianato de fenilo; carbamato de 6-aminoquinolil-Nhidroxisuccinimidilo u o-ftalaldehído; cloruro de (dimetilamino)azobencensulfonilo; 9-fluorenil-metilcloroformiato; y 7-fluoro-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol) seguida de HPLC en fase reversa. Las técnicas de derivatización precolumna son muy sensibles y por lo general necesitan entre 0,5 y 1,0 µg de la muestra de proteína por análisis, aunque pueden ser influenciadas por sales amortiguadoras presentes en las muestras. Las técnicas de derivatización precolumna también pueden producir múltiples derivados de un aminoácido dado, lo cual complica la interpretación de los resultados. Las técnicas de derivatización postcolumna generalmente están menos influenciadas por variaciones en el desempeño de la valoración que las técnicas de derivatización precolumna. Se pueden usar los siguientes Métodos para el análisis cuantitativo de aminoácidos. Los instrumentos y reactivos para estos procedimientos están disponibles comercialmente. Además, existen muchas modificaciones de estas metodologías con diferen-
1102 (1 052) Artículos Obtenidos por Biotecnología / Información General
USP 39
tes preparaciones de reactivos, procedimientos de reacción y sistemas cromatográficos. Los parámetros específicos pueden variar según los equipos y procedimientos usados. Muchos laboratorios usan más de una técnica de análisis de aminoácidos para aprovechar las ventajas de cada una. En cada uno de estos Métodos, la señal analógica se visualiza mediante un sistema de captación de datos y las áreas de los picos se integran con fines de cuantificación.
Método 1-Principio General de Detección Postcolumna con Ninhidrina La cromatografía de intercambio iónico con detección postcolumna con ninhidrina es uno de los métodos más comúnmente usados para el análisis cuantitativo de aminoácidos. Por lo general, se emplea un sistema de intercambio catiónico a base de Li para el análisis de muestras fisiológicas más complejas y un sistema de intercambio catiónico a base de Na, que es más rápido, para mezclas de aminoácidos más simples obtenidas de hidrolizados proteicos (que típicamente contienen 17 aminoácidos). La separación de los aminoácidos en una columna de intercambio iónico se logra a través de una combinación de cambios en el pH y en la fuerza catiónica. A menudo se emplea un gradiente de temperatura para mejorar la separación. Cuando el aminoácido reacciona con la ninhidrina, el reactante adquiere un color púrpura o amarillo característico. Los aminoácidos, a excepción de los iminoácidos, dan un color púrpura y muestran máxima absorción a 570 nm. Los iminoácidos, como por ejemplo la prolina, dan un color amarillo y muestran una absorción máxima a 440 nm. La reacción postcolumna entre la ninhidrina y cada aminoácido eluido de la columna se controla a 440 nm y 570 nm, y el cromatograma obtenido se usa para determinar la composición de aminoácidos. Se considera que el límite de detección es 1O pmol para la mayoría de los derivados de aminoácidos, pero es 50 pmol para la prolina. Se obtiene una respuesta lineal entre 20 y 500 pmol con coeficientes de correlación superiores a 0,999. Para obtener buenos datos de composición, es mejor contar con muestras de más de 1 µg antes de la hidrólisis para este análisis de aminoácidos de proteínas o péptidos.
Método 2-Principio General de Detección Fluorométrica Postcolumna con OPA El o-ftalaldehído (OPA) reacciona con las aminas primarias en presencia de un tiol para formar productos de isoindol altamente fluorescentes. Esta reacción se utiliza para la derivatización postcolumna en el análisis de aminoácidos por cromatografía de intercambio iónico. La regla de separación es la misma que la del Método l. Los instrumentos y reactivos para esta forma de análisis de aminoácidos están disponibles comercialmente. Existen muchas modificaciones de este método. Si bien el OPA no reacciona con aminas secundarias (iminoácidos, como por ejemplo la prolina) para formar sustancias fluorescentes, la oxidación con hipoclorito de sodio permite que las aminas secundarias reaccionen con OPA. El procedimiento emplea una columna de intercambio catiónico fuertemente ácida para la separación de aminoácidos libres seguida de una oxidación postcolumna con hipoclorito de sodio y derivatización postcolumna usando OPA y un compuesto tiol, como por ejemplo N-acetil-L-cisteína y 2-mercaptoetanol. La derivatización de aminoácidos primarios no se altera perceptiblemente con el aporte continuo de hipoclorito de sodio. La separación de los aminoácidos en una columna de intercambio iónico se logra a través de una combinación de cambios en el pH y en la fuerza catiónica. Después de la derivatización postcolumna con OPA de los aminoácidos eluidos, el reactante pasa a través de un detector fluorométrico. La intensidad de la fluorescencia de los aminoácidos derivatizados con OPA se controla con una longitud de onda de excitación de 348 nm y una longitud de onda de emisión de 450 nm. Se considera que el límite de detección es de unas pocas decenas de pmol para la mayoría de los derivados de aminoácidos. La respuesta es lineal entre unos pocos pmol y unas pocas decenas de nmol. Para obtener buenos datos de composición en este análisis de aminoácidos de proteínas o péptidos, es mejor contar con muestras de más de 500 ng antes de la hidrólisis.
Método 3-Principio General de Derivatización Precolumna con PITC El fenilisotiocianato (PITC) reacciona con los aminoácidos para formar derivados de feniltiocarbamilo (PTC) que se pueden detectar con alta sensibilidad a 254 nm. Por lo tanto, se usa la derivatización precolumna de aminoácidos con PITC seguida por separación por HPLC en fase reversa con detección UV para analizar la composición de aminoácidos. Después de eliminar el reactivo al vacío, los aminoácidos derivatizados se pueden almacenar secos y congelados durante varias semanas sin degradación significativa. Si la solución para inyección se mantiene fría, no hay pérdida perceptible en la respuesta cromatográfica después de tres días. La separación de los aminoácidos-PTC por HPLC en fase reversa con una columna ODS se logra a través de una combinación de cambios en las concentraciones de acetonitrilo y en la fuerza iónica de la solución amortiguadora. Los aminoácidos-PTC eluidos de la columna se controlan a 254 nm. Se considera que el límite de detección es 1 pmol para la mayoría de los derivados aminoacídicos. Se obtiene una respuesta lineal entre 20 y 500 pmol con coeficientes de correlación superiores a 0,999. Para obtener buenos datos de la composición, en este análisis de aminoácidos de proteínas o péptidos es mejor contar con una muestra de más de 500 ng de proteína o péptido antes de la hidrólisis.
USP 39
Información General/ (1052) Artículos Obtenidos por Biotecnología 1103
Método 4--Principio General de Derivatización Precolumna con AQC Se usa la derivatización precolumna de aminoácidos con 6-aminoquinolil-N-hidroxisuccinimidil carbamato (AQC) y después se separan por HPLC en fase reversa con detección fluorométrica. El AQC reacciona con los aminoácidos para formar derivados de urea estables, fluorescentes y no simétricos (aminoácidos AQC) que se pueden someter fácilmente al análisis por HPLC en fase reversa. Por lo tanto, se usa la derivatización precolumna de aminoácidos con AQC seguida de la separación por HPLC en fase reversa para analizar la composición de aminoácidos. La separación de los aminoácidos-AQC en una columna ODS se logra a través de una combinación de cambios en las concentraciones de acetonitrilo y sal. La detección de fluorescencia selectiva de los derivados con una longitud de onda de excitación de 250 nm y una longitud de onda de emisión de 395 nm permite la inyección directa de la mezcla de reacción sin ninguna interferencia significativa del único subproducto fluorescente importante del reactivo, la 6-aminoquinolina. El exceso de reactivo se hidroliza rápidamente (t112< 15 segundos) para producir 6-aminoquinolina-N-hidroxisuccinimida y dióxido de carbono y después de 1 minuto no se puede producir ninguna otra derivatización. Las áreas de los picos para los aminoácidos-AQC esencialmente no cambian durante al menos 1 semana a temperatura ambiente y los derivados tienen más que suficiente estabilidad para permitir el análisis cromatográfico automatizado durante la noche. Se considera que el límite de detección está entre aproximadamente 40 fmol y 320 fmol para cada aminoácido, a excepción de la Cys. El límite de detección para la Cys es aproximadamente 800 fmol. Se obtiene una respuesta lineal entre 2,5 µM y 200 µM con coeficientes de correlación superiores a 0,999. Se pueden obtener buenos datos de composición a partir del análisis de hidrolizados proteicos derivatizados que contengan tan solo 30 ng de proteína o péptido.
Método 5-Principio General de Derivatización Precolumna con OPA Se usa la derivatización precolumna de aminoácidos con OPA y luego se separan por HPLC en fase reversa con detección fluorométrica. Esta técnica no detecta los aminoácidos que existen como aminas secundarias (p.ej., prolina). El OPA junto con un reactivo tiol reacciona con grupos amino primarios para formar productos isoindólicos altamente fluorescentes. Se puede usar 2-mercaptoetanol y ácido 3-mercaptopropiónico como tiol. El OPA por sí mismo no muestra fluorescencia y por lo tanto no produce picos que interfieren. Además, su solubilidad y estabilidad en soluciones acuosas, junto con la rápida cinética de reacción permiten la derivatización y análisis automatizados usando un muestreador automático para mezclar la muestra con el reactivo. Sin embargo, la falta de reactividad con aminoácidos secundarios ha sido una desventaja importante. Este método no detecta los aminoácidos que son aminas secundarias (p.ej., prolina). Para compensar esta desventaja, esta técnica se puede combinar con la técnica descrita en el Método 7 o en el Método 8. A la derivatización precolumna de aminoácidos con OPA le sigue la separación por HPLC en fase reversa. Debido a la inestabilidad de los derivados aminoácidos-OPA, la separación y el análisis por HPLC se realizan inmediatamente después de la derivatización. El cromatógrafo de líquidos está equipado con un detector fluorométrico para la detección de aminoácidos derivatizados. La intensidad de fluorescencia de los aminoácidos derivatizados con OPA se controla con una longitud de onda de excitación de 348 nm y una longitud de onda de emisión de 450 nm. Se ha informado de límites de detección de sólo 50 fmol a través de fluorescencia, aunque el límite práctico de análisis se mantiene en 1 pmol.
Método 6-Principio General de Derivatización Precolumna con DABS-CI Se usa derivatización precolumna de aminoácidos con cloruro de (dimetilamino)azobencenosulfonilo (DABS-CI) y luego se separan por HPLC en fase reversa con detección en la región de luz visible. El DABS-CI es un reactivo cromofórico empleado para marcar aminoácidos. Los aminoácidos marcados con DABS-CI (aminoácidos-DABS) son muy estables y muestran la máxima absorción a 436 nm. Los aminoácidos-DABS, los 19 derivados de aminoácidos naturales, se pueden separar en una columna ODS de HPLC en fase reversa empleando sistemas de gradientes constituidos por una mezcla de acetonitrilo y una solución amortiguadora acuosa. Los aminoácidos-DABS separados que eluyen de la columna se detectan a 436 nm en la región visible. Este método puede analizar los iminoácidos, como por ejemplo la prolina, junto con los aminoácidos, con igual sensibilidad. El método de derivatización con DABS-CI permite la cuantificación simultánea de residuos de triptófano mediante hidrólisis previa de la proteína o péptido con ácidos sulfónicos, como por ejemplo ácido mercaptoetanosulfónico, ácido p-toluensulfónico o ácido metanosulfónico, descritos en el Método 2 en Hidrólisis de Proteínas. Los otros residuos sensibles a los ácidos, asparagina y glutamina, también se pueden analizar mediante la conversión previa en ácido diaminopropiónico y ácido diaminobutírico, respectivamente, tratando la proteína o péptido con BTI, descrito en el Método 7 7 en Hidrólisis de Proteínas. El aminoácido no proteinogénico, norleucina, no se puede usar como un estándar interno en este método ya que eluye en una región cromatográfica abundante en picos de aminoácidos primarios. La nitrotirosina se puede usar como estándar interno ya que eluye en una región despejada. El límite de detección de aminoácidos-DABS es aproximadamente 1 pmol. Se pueden analizar cuantitativamente de 2 a 5 pmol de cada aminoácido-DABS con confiabilidad y sólo se necesitan entre 1O ng y 30 ng del hidrolizado proteico tratado con DABS para cada análisis.
11 04 (1 052) Artículos Obtenidos por Biotecnología / Información General
USP 39
Método 7-Principio General de Derivatización Precolumna con FMOC-CI Se usa derivatización precolumna de aminoácidos con cloroformiato de 9-fluorenilmetilo (FMOC-CI) y luego se separan por HPLC en fase reversa con detección fluorométrica. El FMOC-CI reacciona con aminoácidos primarios y secundarios para formar productos altamente fluorescentes. La reacción del FMOC-CI con aminoácidos se realiza bajo condiciones suaves, en solución acuosa y se completa en 30 segundos. Los derivados son estables y sólo se degrada el derivado de histidina. Si bien el FMOC-CI es fluorescente por sí mismo, el exceso de reactivo y los subproductos fluorescentes se pueden eliminar sin pérdida de aminoácidos-FMOC. Los aminoácidos FMOC se separan por HPLC en fase reversa usando una columna ODS. La separación se lleva a cabo mediante elución por gradiente que varía linealmente de una mezcla de solución amortiguadora de ácido acético, metanol y acetonitrilo (50:40:1 O) a una mezcla de acetonitrilo y solución amortiguadora de ácido acético (50:50). En estas condiciones, se separan 20 derivados de aminoácidos en 20 minutos. Cada derivado que eluye de la columna se controla a través de un detector fluorométrico ajustado a una longitud de onda de excitación de 260 nm y una longitud de onda de emisión de 313 nm. El límite de detección se encuentra en el intervalo inferior de fmol. Para la mayoría de los aminoácidos la respuesta es lineal entre O, 1 µM y 50 µM.
Método 8-Principio General de Derivatización Precolumna con NBD-F Se usa la derivatización precolumna de aminoácidos con 7-fluoro-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (NBD-F) y después se separan por HPLC en fase reversa con detección fluorométrica. El 7-fluoro-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (NBD-F) reacciona con aminoácidos primarios y secundarios para formar productos altamente fluorescentes. Los aminoácidos se derivatizan con NBD-F calentándolos a 60º durante 5 minutos. Los derivados aminoácidos-NBD se separan en una columna ODS de HPLC en fase reversa empleando un sistema de elución por gradiente constituido por una mezcla de acetonitrilo y una solución amortiguadora acuosa. En estas condiciones se separan 1 7 derivados de aminoácidos en 35 minutos. Se puede usar el ácido f-aminocaproico como estándar int~rno ya que eluye en una región cromatográfica despejada. Cada derivado que eluye de la columna se controla mediante un detector fluorométrico ajustado a una longitud de onda de excitación .de 480 nm y una longitud de onda de emisión de 530 nm. La sensibilidad de este método es casi igual que la del método de derivatización precolumna con OPA (Método 5), excluyendo la prolina, que no reacciona con el OPA. Esto puede ser una ventaja del NBD-F con respecto al OPA. El límite de detección para cada aminoácido es aproximadamente 1O fmol. El perfil analítico se logra con aproximadamente 1,5 mg de hidrolizado proteico en la mezcla final de reacción de marcación precolumna para HPLC.
CÁLCULO Y ANÁLISIS DE DATOS Cuando se determina el contenido de aminoácidos de un hidrolizado de proteína o péptido, se debe tener en cuenta que el paso de hidrólisis ácida destruye el triptófano y la cisteína. La serina y la treonina se destruyen parcialmente con la hidrólisis ácida, mientras que la isoleucina y la valina podrían escindirse sólo parcialmente. La metionina puede oxidarse durante la hidrólisis ácida y algunos aminoácidos (p.ej., glicina y serina) son contaminantes comunes. La aplicación de un vacío adecuado (menos de 200 µm de mercurio o 26,7 Pa) o la introducción de un gas inerte (argón) en la cámara gaseosa del recipiente de reacción durante la hidrólisis en fase de vapor puede reducir la destrucción oxidativa. Por lo tanto, los resultados cuantitativos obtenidos para cisteína, triptófano, treonina, isoleucina, valina, metionina, glicina y serina de un hidrolizado de proteínas o péptidos pueden variar y pueden requerir posterior investigación y consideración.
Cálculos Porcentaje Molar de los Aminoácidos-Es el número de residuos de cada aminoácido por cada 100 residuos en una proteína. Este resultado puede ser útil para evaluar los datos de análisis de aminoácidos cuando se desconoce el peso molecular de la proteína o péptido a investigar. Esta información se puede usar para corroborar la identidad de una proteína y tiene otras aplicaciones. Identificar e integrar cuidadosamente los picos obtenidos según se indica para cada Procedimiento. Calcular el porcentaje molar de cada aminoácido presente en la muestra de prueba, por la fórmula: 1OOru/r en donde ru es la respuesta correspondiente al pico, en nmol, del aminoácido en análisis y res la suma de respuestas correspondientes a los picos, en nmol, de todos los aminoácidos presentes en la muestra de prueba. La comparación entre el porcentaje molar de aminoácidos en análisis y los datos de proteínas conocidas puede ayudar a establecer o corroborar la identidad de la proteína de muestra. Muestras de Proteínas Desconocidas-Esta técnica de análisis de datos se puede usar para estimar la concentración proteica de una muestra de proteína desconocida usando los datos de análisis de aminoácidos. Calcular la masa, en µg, de cada aminoácido recuperado, por la fórmula: mMw/1000
USP 39
Información General/ (1 052> Artículos Obtenidos por Biotecnología 1105
en donde m es la cantidad recuperada, en nmoles, del aminoácido en análisis; y Mw es el peso molecular para ese aminoácido, corregido por el peso de la molécula de agua que se eliminó durante la formación de la unión peptídica. La suma de las masas de los aminoácidos recuperados permite estimar la masa total de la proteína analizada después de corregir adecuadamente por los aminoácidos destruidos parcial o completamente. Si se dispone del peso molecular de la proteína desconocida (es decir, por análisis SDS-PAGE o espectrometría de masas), se puede predecir la composición de aminoácidos de la proteína desconocida. Calcular el número de residuos de cada aminoácido, por la fórmula: m/(l OOOM/MWT) en donde m es la cantidad recuperada, en nmol, del aminoácido en análisis; M es la masa total, en µg, de la proteína; y MWT es el peso molecular de la proteína desconocida. Muestras de Proteínas Conocidas-Esta técnica de análisis de datos se puede usar para investigar la composición de aminoácidos y la concentración proteica de una muestra de proteína de peso molecular y composición aminoacídica conocidos usando los datos de análisis de aminoácidos. Cuando se conoce la composición de la proteína que se está analizando, se puede aprovechar el hecho de que algunos aminoácidos se recuperan bien, mientras que la recuperación de otros aminoácidos puede verse comprometida debido a la destrucción total o parcial (p.ej., triptófano, cisteína, treonina, serina, metionina), la escisión incompleta de uniones (es decir, para isoleucina y valina) y la contaminación por aminoácidos libres (es decir, por glicina y serina). Los aminoácidos que se recuperan mejor representan a la proteína y se eligen para cuantificarla. Los aminoácidos que se recuperan bien son, típicamente, aspartato-asparagina, glutamato-glutamina, alanina, leucina, fenilananina, lisina y arginina. Esta lista se puede modificar según la experiencia propia con el sistema de análisis utilizado. Dividir la cantidad, en nmol, de cada uno de los aminoácidos bien recuperados por el número esperado de residuos de ese aminoácido con el fin de obtener el contenido proteico basado en cada aminoácido bien recuperado. Promediar los resultados de contenido proteico calculados. El contenido proteico determinado para cada uno de los aminoácidos bien recuperados se debe distribuir uniformemente en torno a la media. Descartar los valores de contenido proteico para esos aminoácidos que se alejan demasiado de la media. Típicamente, una variación mayor de 5% con respecto a la media se considera inaceptable. Recalcular la media del contenido proteico de los valores restantes para obtener el contenido proteico de la muestra. Dividir el contenido de cada aminoácido por el contenido proteico medio calculado para determinar la composición de aminoácidos de la muestra. Calcular el error relativo de composición, en porcentaje, por la fórmula: 100m/m 5 en donde m es la cantidad determinada experimentalmente, en nmol por residuo aminoacídico, del aminoácido en análisis; y m 5 es el valor conocido para los residuos de ese aminoácido. El error relativo composicional promedio es el promedio de los valores absolutos de los errores relativos composicionales de los aminoácidos individuales, excluyendo típicamente el triptófano y la cisteína de este cálculo. El error relativo composicional promedio puede proporcionar información importante acerca de la estabilidad de los análisis en función del tiempo. La coincidencia en la composición aminoacídica entre la muestra de proteína y la composición conocida se puede usar para corroborar la identidad y pureza de la proteína en la muestra.
•APÉNDICE PROCEDIMIENTOS DE ANÁLISIS DE AMINOÁCIDOS Se presentan los ejemplos de procedimientos específicos para cada Método descrito en Metodologías de Análisis de Aminoácidos.
Método 1-Detección Postcolumna con Ninhidrina A continuación se presenta un método para detección postcolumna con ninhidrina. Existen muchos otros métodos, con instrumental y reactivos disponibles comercialmente. Preparación de la Fase MóvilSolución A-Transferir aproximadamente 1,7 g de citrato de sodio anhidro y 1,5 mL de ácido clorhídrico a un matraz volumétrico de 100 mL, disolver y diluir a volumen con agua y mezclar. Ajustar, si fuera necesario, con ácido clorhídrico hasta un pH de 3,0. Solución B-Transferir aproximadamente 1,7 g de citrato de sodio anhidro y 0,7 mL de ácido clorhídrico a un matraz volumétrico de 100 mL, disolver y diluir a volumen con agua y mezclar. Ajustar con ácido clorhídrico, si fuera necesario, hasta un pH de 4,3. Solución (-Preparar una solución que contenga 5% de cloruro de sodio, 1,9% de citrato de sodio anhidro y O, l % de fenal en agua y ajustar hasta un pH de 6. Solución Regeneradora de la Columna-Preparar una solución que contenga 0,8% de hidróxido de sodio en agua y ajustar hasta un pH de 13. Fase Móvil-Usar mezclas variables de Solución A, Solución By Solución C según se indica en el Sistema Cromatográfico.
1106 (1052) Artículos Obtenidos por Biotecnología / Información General
USP 39
Reactivo Postcolumna-Transferir aproximadamente 18 g de ninhidrina y 0,7 g de hidrindantina a 900 mL de una solución que contenga 76,7% de dimetil sulfóxido, 0,7% de acetato de litio dihidrato y O, 1% de ácido acético y mezclar durante un mínimo de 3 horas bajo un gas inerte, como por ejemplo nitrógeno. [NOTA-Este reactivo es estable durante 30 días si se mantiene a una temperatura entre 2º y 8º bajo un gas inerte.] Solución Amortiguadora-Preparar una solución que contenga 2% de citrato de sodio anhidro, 1% de ácido clorhídrico, 0,5% de tiodiglicol y O, 1% de ácido benzoico en agua y ajustar hasta un pH de 2. Sistema Cromatográfico-Equipar un cromatógrafo de líquidos con un detector con filtros de interferencia apropiados a 440; 570 ó 690 nm y una columna de 4,0 mm x 120 mm rellena con copolímero sulfonado de estireno-divinilbenceno de 7,5 µm. La velocidad de flujo es de aproximadamente 14 mL por hora. Programar el sistema del siguiente modo. Inicialmente, equilibrar la columna con Solución A; a los 25 minutos, cambiar la composición de la Fase Móvil a 100% de Solución 8; y a los 37 minutos, cambiar la composición al 100% de Solución C. A los 75 minutos de la corrida, eluye el último aminoácido de la columna y se regenera la columna con la Solución Regeneradora de la Columna durante 1 minuto. Equilibrar luego la columna con Solución A durante 11 minutos antes de la siguiente inyección. Programar la temperatura de la columna del siguiente modo. La temperatura inicial es 48º; después de 11,5 minutos, aumentar la temperatura a 65º a una velocidad de 3º por minuto; aproximadamente a los 35 minutos, aumentar la temperatura a 77º a una velocidad de 3º por minuto; y finalmente aproximadamente a los 52 minutos, disminuir la temperatura a 48º a una velocidad de 3º por minuto. Procedimiento y Reacción Postcolumna-Reconstituir el hidrolizado proteico o peptídico liofilizado en la Solución Amortiguadora, inyectar una cantidad adecuada en el cromatógrafo y proceder según se indica en Sistema Cromatográfico. Cuando los aminoácidos eluyen de la columna, se mezclan con el Reactivo Postcolumna, que se suministra a una velocidad de flujo de 7 mL por hora, a través de una llave T. Después de mezclar, el efluente de la columna y el Reactivo Postcolumna pasan a través de un reactor tubular a una temperatura de 135º, donde se forma un color púrpura o amarillo característico. Desde el reactor, el líquido pasa a través de un colorímetro con una cubeta de flujo de 12 mm. La luz que emerge de la cubeta se divide en tres haces que son analizados por el detector con filtros de interferencia a 440; 570 ó 690 nm. La señal de 690 nm se puede restar electrónicamente de las otras señales para obtener mejores relaciones señal-ruido. Las señales de 440 nm (iminoácidos) y de 570 nm (aminoácidos) se pueden sumar para simplificar el manejo de datos.
Método 2-Detección Fluorométrica Postcolumna con OPA A continuación se presenta un método de detección fluorométrica postcolumna con OPA. Preparación de la Fase MóvilSolución A-Preparar una solución de hidróxido de sodio, ácido cítrico y alcohol en agua de grado HPLC con una concentración de sodio 0,2 N y que contenga 7% de alcohol (p/v), ajustada hasta un pH de 3,2. Solución 8-Preparar una solución de hidróxido de sodio y ácido cítrico en agua de grado HPLC con una concentración de sodio 0,6 N, ajustada a un pH de 10,0. Solución C: hidróxido de sodio 0,2 N. Fase Móvil-Usar mezclas variables de Solución A, Solución 8 y Solución C según se indica en Sistema Cromatográfico. Preparación de Reactivo PostcolumnaSo/ución Amortiguadora Alcalina-Preparar una solución que contenga carbonato de sodio 384 mM, ácido bórico 216 mM y sulfato de potasio 108 mM y ajustar hasta un pH de 10,0. Reactivo de Hipoclorito-Agregar 0,4 mL de una solución de hipoclorito de sodio (10% de cloro) a 1 L de la Solución Amortiguadora Alcalina. [NOTA-La solución de hipoclorito es estable durante 2 semanas.] Reactivo OPA-Transferir 2 g de N-acetil-L-cisteína y 1,6 g de OPA a un matraz volumétrico de 15 mL, disolver con alcohol, diluir a volumen con alcohol y mezclar. Transferir esta solución y 4 mL de una solución acuosa al 10% de éter laurílico de polioxietileno (23) a un matraz volumétrico de 1 L, diluir con 980 mL de Solución Amortiguadora Alcalina y mezclar. Sistema Cromatográfico-Equipar el cromatógrafo de líquidos con un detector fluorométrico ajustado a una longitud de onda de excitación de 348 nm y una longitud de onda de emisión de 450 nm y con una columna de 4,0 mm x 150 mm rellena con material L17 de 7,5 µm. La velocidad de flujo es de aproximadamente 0,3 mL por minuto y la temperatura de la columna se ajusta a 50º. Programar el sistema del siguiente modo. Equilibrar la columna con Solución A; durante los siguientes 20 minutos, cambiar linealmente la composición de la Fase Móvil a 85% de Solución A y 15% de Solución 8; luego cambiar abruptamente a 40% de Solución A y 60% de Solución 8; durante los siguientes 18 minutos, cambiar linealmente la composición a 100% de Solución 8 y mantenerla durante 7 minutos; luego cambiar abruptamente a 100% de Solución C y mantenerla durante 6 minutos; luego cambiar abruptamente a la Solución A, mantener esta composición durante los siguientes 8 minutos. Procedimiento y Reacción Postcolumna-lnyectar en el cromatógrafo aproximadamente 1,0 nmol de cada aminoácido en análisis y proceder según se indica en el Sistema Cromatográfico. Cuando el efluente deja la columna, se mezcla con el Reactivo de Hipoclorito. La mezcla pasa a través del primer reactor postcolumna que es un tubo de acero inoxidable de 0,5 mm x 2 m. Inmediatamente a continuación del primer reactor postcolumna se coloca un segundo reactor postcolumna de diseño similar que se usa para la reacción postcolumna con OPA. La velocidad de flujo tanto para el Reactivo de Hipoclorito como para el Reactivo OPA es 0,2 mL por minuto, dando como resultado una velocidad de flujo total (es decir, Reactivo de Hipoclorito, Reactivo OPA y el efluente de la columna) de 0,7 mL por minuto que sale de los reactores posteriores al paso por la columna. Las reacciones postcolumna se realizan a 55º. Esto produce un tiempo de permanencia de aproximadamente 33 segundos en
USP 39
Información General/ (1052) Artículos Obtenidos por Biotecnología 1107
el reactor postcolumna con OPA. Después de la derivatización postcolumna, el efluente pasa a través del detector fluorométrico.
Método 3-Derivatización Precolumna con PITC A continuación se presenta un método de derivatización precolumna con PITC. Preparación de la Fase MóvilSolución A: acetato de amonio 0,05 M, ajustado con ácido fosfórico a un pH de 6,8. Solución 8---Preparar acetato de amonio O, 1 M, ajustar con ácido fosfórico a un pH de 6,8 y luego preparar una mezcla de esta solución y acetonitrilo {l :1 ). Solución C: una mezcla de acetonitrilo y agua (70:30). Fase Móvil-Usar mezclas variables de la Solución A, Solución By Solución C según se indica en el Sistema Cromatográfico. Preparación del Reactivo de DerivatizaciónSolución Amortiguadora de Acoplamiento: una mezcla de acetonitrilo, piridina, trietilamina y agua (10:5:2:3). Disolvente de la Muestra: una mezcla de agua y acetonitrilo (7:2). Procedimiento de Derivatización de la Muestra-Disolver la muestra de prueba liofilizada en 100 µL de Solución Amortiguadora de Acoplamiento y luego secar en una centrífuga de vacío para eliminar todo el clorhidrato si se realizó un paso de hidrólisis de proteína. Disolver la muestra de prueba en 100 µL de Solución Amortiguadora de Acoplamiento, agregar 5 µL de PITC e incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos. La muestra de prueba se seca nuevamente en una centrífuga de vacío y se disuelve en 250 µL de Disolvente de la Muestra. Sistema Cromatográfico-Equipar un cromatógrafo de líquidos con un detector a 254 nm y una columna de 4,6 mm x 250 mm rellena con material L1 de 5 µm. La velocidad de flujo es de aproximadamente 1 mL por minuto y la temperatura de la columna se mantiene a 52º. Programar el sistema del siguiente modo. Equilibrar la columna con la Solución A; durante los siguientes 15 minutos, cambiar linealmente la composición de la Fase Móvil a 85% de Solución A y 15% de Solución B; durante los siguientes 15 minutos, cambiar linealmente la composición a 50% de Solución A y 50% de Solución B; luego cambiar abruptamente a 100% de Solución C y mantenerla durante 1O minutos; luego cambiar abruptamente a 100% de Solución A y dejar que la columna se equilibre antes de la siguiente inyección. Procedimiento-Inyectar en el cromatógrafo aproximadamente 1,0 nmol de cada aminoácido-PITC en análisis (1 O µL de la muestra en el Disolvente de la Muestra) y proceder según se indica en Sistema Cromatográfico.
Método 4--Derivatización de Precolumna con AQC A continuación se presenta un método de derivatización precolumna con AQC. Preparación de la Fase MóvilSolución A-Preparar una solución de acetato de sodio 140 mM y trietilamina 17 mM y ajustar con ácido fosfórico hasta un pH de 5,02. Solución B: una mezcla de acetonitrilo y agua (60:40). Fase Móvil-Usar mezclas variables de Solución A y Solución B según se indica en Sistema Cromatográfico. Procedimiento de Derivatización de la Muestra-Disolver aproximadamente 2 µg de la muestra de prueba en 20 µL de ácido clorhídrico 15 mM y diluir con una solución amortiguadora de borato 0,2 M (pH 8,8) a 80 µL. Iniciar la derivatización agregando 20 µL de AQC 1O mM en acetonitrilo y dejar que prosiga durante 1O minutos a temperatura ambiente. Sistema Cromatográfico-Equipar el cromatógrafo de líquidos con un detector fluorométrico ajustado a una longitud de onda de excitación de 250 nm, una longitud de onda de emisión de 395 nm y con una columna de 3,9 mm x 150 mm rellena con material L1 de 4 µm. La velocidad de flujo es de aproximadamente 1 mL por minuto y la temperatura de la columna se mantiene a 37°. Programar el sistema del siguiente modo. Equilibrar la columna con la Solución A; durante los siguientes 0,5 minutos, cambiar linealmente la composición de la Fase Móvil a 98% de Solución A y 2% de Solución B; luego durante los siguientes 14,5 minutos a 93% de Solución A y 7% de Solución B; durante los siguientes 4 minutos a 87% de Solución A y 13% de Solución B; durante los siguientes 14 minutos a 68% de Solución A y 32% de Solución B; luego cambiar abruptamente a 100% de Solución B para un lavado de 5 minutos; durante los siguientes 1 O minutos, cambiar abruptamente a 100% de Solución A y dejar que la columna se equilibre antes de la siguiente inyección. Procedimiento-Inyectar en el cromatógrafo aproximadamente 0,05 nmol de cada aminoácido-AQC en análisis y proceder según se indica en el Sistema Cromatográfico.
Método 5-Derivatización Precolumna con OPA A continuación se presenta un método de derivatización precolumna con OPA. Preparación de la Fase MóvilSolución A: una mezcla de acetato de sodio 100 mM (pH 7,2), metanol y tetrahidrofurano (900:95:5). Solución B: metanol. Fase Móvil-Usar mezclas variables de Solución A y de Solución B según se indica en Sistema Cromatográfico.
1108 (1052) Artículos Obtenidos por Biotecnología / Información General
USP 39
Reactivo de Derivatización-Disolver 50 mg de OPA en 1,25 mL de metanol (apto para secuenciación de proteína). Agregar 50 µL de 2-mercaptoetanol y 11,2 mL de borato de sodio 0,4 M (pH 9,5) y mezclar. [NOTA-El reactivo es estable durante 1 semana.] Procedimiento de Derivatización de la Muestra-Transferir aproximadamente 5 µL de la muestra de prueba a un recipiente adecuado, agregar 5 µL del Reactivo de Derivatización y mezclar. Después de 1 minuto, agregar no menos de 20 µL de acetato de sodio O, 1 M (pH 7,0). Usar 20 µL de esta solución para el análisis. [NOTA-Se recomienda usar un estándar interno (p.ej., norleucina) para el análisis cuantitativo debido a variaciones potenciales en el volumen del reactivo en la derivatización de la muestra. La derivatización de la muestra se realiza de manera automatizada en línea. Debido a la inestabilidad de los derivados aminoácido-OPA, la separación y análisis por HPLC se realizan inmediatamente después de la derivatización.] Sistema Cromatográfico-Equipar el cromatógrafo de líquidos con un detector fluorométrico ajustado a una longitud de onda de excitación de 348 nm y una longitud de onda de emisión de 450 nm y con una columna de 4,6 mm x 75 mm rellena con material L3 de 3 µm. La velocidad de flujo es de aproximadamente 1,7 mL por minuto y la temperatura de la columna se mantiene a 37°. Programar el sistema del siguiente modo. Equilibrar la columna con 92% de Solución A y 8% de Solución B; durante los siguientes 2 minutos, cambiar la composición de la Fase Móvil a 83% de Solución A y 17% de Solución By mantener durante 3 minutos más; después durante los siguientes 5 minutos cambiar a 54% de Solución A y 46% de Solución By mantener durante 2 minutos más; después durante los siguientes 2 minutos cambiar a 34% de Solución A y 66% de Solución By mantener durante 1 minuto; después durante los siguientes 0,3 minutos cambiar a 20% de Solución A y 80% de Solución By mantener durante 2,6 minutos más; y finalmente durante 0,6 minutos cambiar a 92% de Solución A y 8% de Solución By mantener durante 0,6 minutos más. Procedimiento-Inyectar aproximadamente 0,02 nmol de cada derivado aminoácido-OPA en análisis en el cromatógrafo y proceder según se indica en el Sistema Cromatográfico.
Método 6-Derivatización Precolumna con DABS-CI A continuación se presenta un método de derivatización precolumna con DABS-CI. Preparación de la Fase MóvilSo/ución A: acetato de sodio 25 mM (pH 6,5) que contenga 4% de dimetilformamida. Solución B: acetonitrilo. Fase Móvil-Usar mezclas variables de Solución A y de Solución B según se indica en Sistema Cromatográfico. Preparación del Reactivo de DerivatizaciónSo/ución Amortiguadora de Muestra: bicarbonato de sodio 50 mM ajustado hasta un pH de 8, 1. Reactivo de Derivatización-Disolver 1,3 mg de DABS-CI en 1 mL de acetonitrilo. [NOTA-Este reactivo se prepara poco antes del paso de derivatización.] Solución Amortiguadora de Dilución de la Muestra-Preparar una mezcla de fosfato de sodio 50 mM (pH 7,0) y alcohol (1 :1 ). Procedimiento de Derivatización de la Muestra-Disolver la muestra de prueba en 20 µL de Solución Amortiguadora de Muestra, agregar 40 µL de Reactivo de Derivatización y mezclar. Sellar el recipiente de la muestra con un tapón de goma de silicona y calentar a 70º durante 1O minutos. Mientras se calienta la muestra, la mezcla se disuelve completamente. Después de la derivatización, diluir la muestra de prueba con una cantidad adecuada de Solución Amortiguadora de Dilución de la Muestra.
Sistema Cromatográfico-Equipar un cromatógrafo de líquidos con un detector a 436 nm y una columna de 4,6 mm x 250 mm rellena con material L1. La velocidad de flujo es de aproximadamente 1 mL por minuto y la temperatura de la columna se mantiene a 40º. Programar el sistema del siguiente modo. Equilibrar la columna con 85% de Solución A y 15% de Solución B; durante los siguientes 20 minutos, cambiar la composición de la Fase Móvil a 60% de Solución A y 40% de Solución B; durante los siguientes 12 minutos, cambiar la composición a 30% de Solución A y 70% de Solución By mantener durante 2 minutos más. Procedimiento-Inyectar en el cromatógrafo aproximadamente 0,05 nmol de los aminoácidos-DABS y proceder según se indica en Sistema Cromatográfico.
Método 7-Derivatización Precolumna con FMOC-CI A continuación se presenta un método de derivatización precolumna con FMOC-CI. Preparación de Fase MóvilSo/ución Amortiguadora de Ácido Acético-Transferir 3 mL de ácido acético glacial y 1 mL de trietilamina a un matraz volumétrico de 1 L y diluir a volumen con agua de grado HPLC. Ajustar con hidróxido de sodio hasta un pH de 4,20. Solución A: una mezcla de Solución Amortiguadora de Ácido Acético, metanol y acetonitrilo (50:40:1 O). Solución B: una mezcla de acetonitrilo y Solución Amortiguadora de Ácido Acético (50:50). Fase Móvil-Usar mezclas variables de Solución A y de Solución B según se indica en el Sistema Cromatográfico. Preparación del Reactivo de DerivatizaciónSo/ución Amortiguadora de Borato-Preparar una solución de ácido bórico 1 M y ajustar con hidróxido de sodio hasta un pH de 6,2. Reactivo FMOC-C/-Disolver 155 mg de cloroformiato de 9-fluorenilmetilo en 40 mL de acetona y mezclar.
USP 39
Información General/ (1053) Electroforesis Capilar 1109
Procedimiento de Derivatización de la Muestra-Agregar O, 1 mL de Solución Amortiguadora de Borato y 0,5 mL de Reactivo FMOC-CI a 0,4 mL de la muestra de prueba. Después de aproximadamente 40 segundos, extraer la mezcla con 2 mL de pentano y luego extraer una vez más con una nueva porción de pentano. La solución acuosa con los derivados de aminoácidos queda lista para la inyección. Sistema Cromatográfico-Equipar el cromatógrafo de líquidos con un detector fluorométrico ajustado a una longitud de onda de excitación de 260 nm y una longitud de onda de emisión de 313 nm y con una columna de 4,6 mm x 125 mm rellena con material L1 de 3 µm. La velocidad de flujo es de aproximadamente 1,3 mL por minuto. Programar el sistema del siguiente modo. Equilibrar la columna con Solución A y mantener esta composición durante 3 minutos; durante los siguientes 9 minutos, cambiar a 100% de Solución B; durante los siguientes 0,5 minutos, aumentar la velocidad de flujo a 2 mL por minuto y mantenerla hasta que el último aminoácido-FMOC eluya de la columna. El tiempo total de la corrida es de aproximadamente 20 minutos. Procedimiento-Inyectar en el cromatógrafo no menos de 0,01 nmol de cada aminoácido-FMOC en análisis y proceder según se indica en el Sistema Cromatográfico. El derivado histidina-FMOC por lo general dará una respuesta menor que los demás derivados.
Método 8-Derivatización Precolumna con NBD-F A continuación se presenta un método de derivatización precolumna con NBD-F. Preparación de la Fase MóvilSo/ución A: una solución de citrato de sodio 1O mM y perclorato de sodio 75 mM, ajustada con ácido clorhídrico hasta un pH de 6,2. Solución B: una mezcla de acetonitrilo y agua (50:50). Preparación del Reactivo de DerivatizaciónSolución Amortiguadora de Muestra: una solución de ácido bórico O, 1 M ajustada con hidróxido de sodio a un pH de 9,2. Reactivo de Derivatización-Disolver 5 mg de NBD-F en 1,0 mL de alcohol y mezclar. Procedimiento de Derivatización de la Muestra-Disolver la muestra de prueba en 20 µL de Solución Amortiguadora de Muestra, agregar 1O µL de Reactivo de Derivatización y mezclar. Calentar el recipiente de la muestra a 60º durante 5 minutos. Después de la derivatización, diluir la muestra de prueba con 300 µL de la Solución A. Sistema Cromatográfico-Equipar el cromatógrafo de líquidos con un detector fluorométrico ajustado a una longitud de onda de excitación de 480 nm y una longitud de onda de emisión de 530 nm y una columna de 4,6 mm x 150 mm rellena con sílice ODS con un tamaño de partícula de 5 µm. La velocidad de flujo es de aproximadamente 1,0 mL por minuto y la temperatura de la columna se mantiene a 40º. Programar el sistema del siguiente modo. Equilibrar la columna con 94% de Solución A y 6% de Solución B; durante los siguientes 16 minutos, cambiar linealmente la composición a 63% de Solución A y 37% de Solución B; durante los siguientes 5 minutos, cambiar linealmente la composición a 62% de Solución A y 38% de Solución B; durante los siguientes 9 minutos, cambiar linealmente la composición a 100% de Solución By mantener durante otros 5 minutos; finalmente durante 2 minutos, cambiar linealmente la composición a 94% de Solución A y 6% de Solución By luego dejar equilibrar la columna antes de la siguiente inyección. Procedimiento-Inyectar en el cromatógrafo aproximadamente 15 pmol de cada aminoácido-NBD en análisis y proceder según se indica en el Sistema Cromatográfico..
(1053) ELECTROFORESIS CAPILAR Este capítulo proporciona guías y procedimientos utilizados para la caracterización de artículos obtenidos por biotecnología mediante electroforesis capilar. Se lo ha armonizado con los capítulos correspondientes en la Farmacopea japonesa (JP) y la Farmacopea Europea (EP). También se muestran otras pruebas de caracterización armonizadas en Artículos Obtenidos por Biotecnología-Análisis de Aminoácidos (1052), Artículos Obtenidos por Biotecnología-lsoelectroenfoque (1054), Artículos Obtenidos por Biotecnología-Mapeo de Péptidos (1055), Artículos Obtenidos por Biotecnología-Electroforesis en Gel de Poliacrílamida (1056) y Artículos Obtenidos por Biotecnología-Va/oración de Proteínas Totales (1057).
INTRODUCCIÓN La electroforesis capilar es un método físico de análisis basado en la migración, dentro de un capilar, de analitos cargados disueltos en una solución de electrolitos, bajo la influencia de un campo eléctrico de corriente continua. En esta sección se describen cuatro métodos de electroforesis capilar: Electroforesis Capilar de Zona, Electroforesis Capilar en Gel, lsoelectroenfoque Capilar y Cromatografía Electrocinética Micelar.
USP 39
111 O (1053) Electroforesis Capilar/ Información General PRINCIPIOS GENERALES
La velocidad de migración del analito en un campo eléctrico de intensidad E está determinada por la movilidad electroforética del analito y la movilidad electroosmótica de la solución amortiguadora dentro del capilar. La movilidad electroforética de un soluto (µ.p) depende de las características del soluto (carga eléctrica, tamaño molecular y forma) y de las características de la solución amortiguadora en donde ocurre la migración (tipo y fuerza iónica del electrolito, pH, viscosidad y aditivos). La velocidad electroforética (v.p) de un soluto, suponiendo una forma esférica, es la siguiente:
en donde q es la carga efectiva del soluto; TJ es la viscosidad de la solución electrolítica; r es el radio de Stoke del soluto; V es el voltaje aplicado; y L es la longitud total del capilar. Cuando se aplica un campo eléctrico a través del capilar lleno con solución amortiguadora, se genera un flujo de disolvente dentro del capilar que se denomina flujo electroosmótico. Su velocidad depende de la movilidad electroosmótica (µ 00) que a su vez depende de la densidad de la carga en la pared interna del capilar y de las características de la solución amortiguadora. La velocidad electroosmótica (v00 ) está dada por la ecuación:
en donde a es la constante dieléctrica de la solución amortiguadora; i; es el potencial zeta de la superficie del capilar; y los otros términos son los definidos anteriormente. La velocidad del soluto (v) está dada por la ecuación:
La movilidad electroforética del analito y la movilidad electroosmótica pueden actuar en la misma dirección o en direcciones opuestas, dependiendo de la carga del soluto. En electroforesis capilar normal, los aniones migrarán en la dirección opuesta al flujo electroosmótico y sus velocidades serán menores que la velocidad electroosmótica. Los cationes migrarán en la misma dirección del flujo electroosmótico y sus velocidades serán mayores que la velocidad electroosmótica. Bajo condiciones en las cuales hay una velocidad electroosmótica rápida con respecto a la velocidad electroforética de los solutos, tanto los cationes como los aniones se pueden separar en la misma corrida. El tiempo (t) que tarda el soluto en migrar la distancia (1) desde el extremo de inyección del capilar al punto de detección (longitud efectiva del capilar) es el siguiente: l(L)
t=
en donde los otros términos son los definidos anteriormente. En general, los capilares de sílice fundida sin recubrimiento con un pH por encima de 3 tienen carga negativa debido a los grupos silanol ionizados en la pared interna. Por consiguiente, el flujo electroosmótico va del ánodo al cátodo. El flujo electroosmótico debe mantenerse constante de corrida a corrida para obtener una buena reproducibilidad en la velocidad de migración de los solutos. Para algunas aplicaciones, puede ser necesario reducir o suprimir el flujo electroosmótico modificando la pared interna del capilar o cambiando la concentración, la composición y/o el pH de la solución amortiguadora. Después de la introducción de la muestra dentro del capilar, cada ión del analito de la muestra migra dentro del electrolito de fondo como una zona independiente de acuerdo con su movilidad electroforética. La dispersión de la zona, o sea el extendido de cada banda de soluto es el resultado de fenómenos diferentes. En condiciones ideales, el ensanchamiento de la zona del soluto se debe solamente a la difusión molecular del soluto a lo largo del capilar (difusión longitudinal). En este caso ideal, la eficiencia de la zona, expresada como el número de platos teóricos (N), está dada por:
(µep +µeo ){VI)
N=~--~-
2DL
en donde D es el coeficiente de difusión molecular del soluto en la solución amortiguadora. En la práctica, otros fenómenos, como por ejemplo la disipación de calor, la adsorción de la muestra en la pared del capilar, las diferencias de conductividad entre la muestra y la solución amortiguadora, la longitud de la zona de inyección, el tamaño de celda del detector y los recipientes de solución amortiguadora no nivelados, pueden contribuir significativamente a la dispersión de banda. La separación entre dos bandas (expresada por la resolución, R5) se puede obtener modificando la movilidad electroforética de los analitos, la movilidad electroosmótica inducida por el capilar y aumentando la eficiencia para la banda de cada analito del siguiente modo:
USP 39
Información General/ (1053) Electroforesis Capilar 1111
R _ .JN (µepb - µepa) S4(µep + µea) en donde µepa y µepb son las movilidades electroforéticas de los dos analitos a separar; dio de los dos analitos calculada como:
ilep
es la movilidad electroforética prome-
APARATO Un aparato de electroforesis capilar se compone de una fuente de alimentación de corriente continua (directa) regulable, de alto voltaje; dos recipientes para las soluciones amortiguadoras que se mantienen en el mismo nivel y que contienen las soluciones anódica y catódica especificadas; dos conjuntos de electrodos (cátodo y ánodo) sumergidos en los recipientes de las soluciones amortiguadoras y conectados a la fuente de alimentación; un capilar de separación, generalmente de sílice fundida, a veces con una ventana de visualización óptica alineada con el detector, dependiendo del tipo de detector, con los extremos del capilar ubicados en los recipientes de las soluciones amortiguadoras y el capilar lleno con una solución que se especifica en la monografía correspondiente; un sistema de inyección adecuado; un detector capaz de monitorear la cantidad de sustancia de interés que pasa a través de un segmento del capilar de separación en un tiempo dado, generalmente basado en la espectrofotometría de absorción (UV y visible), fluorometría, o detección conductimétrica, amperométrica o espectrométrica de masas, dependiendo de las aplicaciones específicas, o incluso en la detección indirecta para detectar compuestos no fluorescentes y que no absorben luz UV; un sistema termostático capaz de mantener una temperatura constante dentro del capilar, recomendada para obtener una buena reproducibilidad de separación; un registrador y un integrador apropiado o una computadora. La definición del proceso de inyección y su automatización son críticos para realizar análisis cuantitativos precisos. Los modos de inyección incluyen la inyección por gravedad, presión o vacío o la inyección electrocinética. La cantidad de cada componente de muestra introducida electrocinéticamente depende de su movilidad electroforética, lo cual lleva a una posible discriminación al usar este modo de inyección. Se espera que el capilar, las soluciones amortiguadoras, el método de preacondicionamiento, la solución muestra y las condiciones de migración estén especificadas en la monografía correspondiente. La solución electrolítica empleada se filtra para eliminar partículas y desgasificar para evitar la formación de burbujas que pueden interferir con el sistema de detección o interrumpir el contacto eléctrico en el capilar durante la corrida de separación. Para lograr un tiempo de migración reproducible de los solutos, es necesario desarrollar, para cada método analítico, una rutina de enjuague riguroso después de cada inyección.
ELECTROFORESIS CAPILAR DE ZONA Principio En la electroforesis capilar de zona, los analitos se separan en un capilar que contiene únicamente una solución amortiguadora sin ningún medio anticonvectivo. En esta técnica, la separación ocurre debido a que los distintos componentes de la muestra migran como bandas discretas con velocidades diferentes. La velocidad de cada banda depende de la movilidad electroforética del soluto y del flujo electroosmótico en el capilar (ver Principios Generales). Se pueden usar capilares recubiertos para aumentar la capacidad de separación de las sustancias que se adsorben en las superficies de sílice fundida. Este método de electroforesis capilar es apropiado para el análisis de moléculas pequeñas (PM < 2000) y grandes (2000 < PM < 100 000). Debido a la alta eficiencia lograda en la electroforesis capilar de zona se puede efectuar la separación de moléculas que presenten diferencias mínimas en su relación carga-masa. Este modo de separación también permite la separación de compuestos quirales por adición de selectores quirales a la solución amortiguadora de separación.
Optimización La optimización de la separación es un proceso complejo en el que diversos parámetros de separación pueden desempeñar un papel importante. Los principales parámetros que se deben considerar en el desarrollo de las separaciones son los parámetros instrumentales y de la solución electrolítica.
Parámetros Instrumentales VOLTAJE Un gráfico de calentamiento de joule es útil para optimizar el voltaje aplicado y la temperatura de la columna. El tiempo de separación es inversamente proporcional al voltaje aplicado. Sin embargo, un aumento en el voltaje empleado puede producir
1112 (1053) Electroforesis Capilar/ Información General
USP 39
calor excesivo, dando lugar a un aumento de temperatura y, como resultado, a gradientes de viscosidad en la solución amortiguadora dentro del capilar, lo cual ensancha las bandas y disminuye la resolución. POLARIDAD La polaridad del electrodo puede ser normal (el ánodo en la entrada y el cátodo en la salida) y el flujo electroosmótico se moverá hacia el cátodo. Si la polaridad del electrodo se invierte, el flujo electroosmótico queda lejos de la salida y solo los analitos cargados con movilidades electroosmóticas mayores que el flujo electroosmótico pasarán hacia la salida. TEMPERATURA El principal efecto de la temperatura se observa en la viscosidad y conductividad eléctrica de la solución amortiguadora afectándose, por lo tanto, la velocidad de migración. En algunos casos, un aumento en la temperatura del capilar puede alterar la conformación de algunas proteínas, modificando su tiempo de migración y eficiencia de separación. CAPILAR La longitud y diámetro interno del capilar afectan el tiempo de análisis, la eficiencia de las separaciones y la capacidad de carga. El aumento de la longitud efectiva y de la longitud total permiten disminuir los campos eléctricos, a un voltaje constante, lo cual aumenta el tiempo de migración. Para una solución amortiguadora y un campo eléctrico dados, la disipación de calor (por lo tanto, el ensanchamiento de banda de la muestra) depende del diámetro interno del capilar. Este último también afecta el límite de detección, dependiendo del volumen de muestra inyectado en el capilar y del sistema de detección usado. La adsorción de los componentes de la muestra en la pared del capilar limita la eficiencia; por lo tanto, hay que considerar métodos para evitar estas interacciones cuando se desarrolla un método de separación. En el caso específico de las proteínas, se han diseñado varias estrategias para evitar la adsorción en la pared capilar. Algunas de estas estrategias (uso de pH extremo y adsorción de aditivos amortiguadores cargados positivamente) sólo necesitan la modificación de la composición del amortiguador del pH para evitar la adsorción de las proteínas. Otras estrategias incluyen el recubrimiento de la pared interna del capilar con un polímero unido covalentemente a la sílice lo cual evita la interacción entre las proteínas y la superficie de la sílice negativamente cargada. Para este propósito, se consiguen en el mercado capilares listos para el uso con recubrimiento de polímeros hidrófilos neutros, catiónicos y aniónicos.
Parámetros de la Solución Electrolítica TIPO DE SOLUCIÓN AMORTIGUADORA Y CONCENTRACIONES Las soluciones amortiguadoras apropiadas para la electroforesis capilar tienen una capacidad amortiguadora adecuada en el intervalo de pH de elección y baja movilidad para minimizar la generación de corriente. Para minimizar la distorsión de la banda es importante hacer coincidir la movilidad de los iones en la solución amortiguadora con la movilidad del soluto siempre que sea posible. Es importante el tipo de disolvente de la muestra empleado para lograr el enfoque de la muestra en la columna, lo que aumenta la eficiencia de separación y mejora la detección. Además, el aumento en la concentración de las soluciones amortiguadoras a un pH dado disminuye el flujo electroosmótico y la velocidad del soluto. PH DE LA SOLUCIÓN AMORTIGUADORA El pH de la solución amortiguadora puede afectar la separación al modificar la carga del analito o aditivos y al cambiar el flujo electroosmótico. Para la separación de proteínas y péptidos, un cambio en el pH de la solución amortiguadora desde un valor superior al punto isoeléctrico a un valor inferior al punto isoeléctrico cambia la carga neta del soluto de negativa a positiva. Un aumento en el pH de la solución amortiguadora generalmente aumenta el flujo electroosmótico. DISOLVENTES ORGÁNICOS Los modificadores orgánicos, como por ejemplo el metanol, el acetonitrilo y otros, se pueden agregar a la solución amortiguadora acuosa para aumentar la solubilidad del soluto o de otros aditivos o para afectar el grado de ionización de los componentes de la muestra. Estos modificadores orgánicos agregados a la solución amortiguadora suelen disminuir el flujo electroosmótico.
USP 39
Información General/ (1053) Electroforesis Capilar 111 3
ADITIVOS PARA SEPARACIONES QUIRALES Para separar isómeros ópticos, se agrega un selector quiral a la solución amortiguadora de separación. Los selectores quirales más comúnmente usados son las ciclodextrinas, aunque en algunos casos se pueden usar éteres corona, algunos polisacáridos o incluso proteínas. Como el reconocimiento quiral depende de las distintas interacciones entre el selector quiral y cada uno de los enantiómeros, la resolución lograda para los compuestos quirales depende en gran medida del tipo de selector quiral usado. Mientras se desarrolla una separación dada, puede ser útil analizar las ciclodextrinas que tengan distintos tamaños de cavidad (a, fJ o y-ciclodextrina) o ciclodextrinas modificadas con grupos neutros (metilo, etilo, hidroxialquilo, etc.) o grupos ionizables (aminometilo, carboximetilo, sulfobutiléter, etc.). Al usar ciclodextrinas modificadas se deben tener en cuenta las variaciones de una partida a otra en el grado de sustitución de las ciclodextrinas, puesto que eso influirá en la selectividad. La resolución en la separación de compuestos quirales también está controlada por la concentración del selector quiral, la composición y el pH de la solución amortiguadora y la temperatura de separación. Los aditivos orgánicos, como por ejemplo el metano! o la urea, también pueden afectar la resolución de la separación.
ELECTROFORESIS CAPILAR EN GEL En la electroforesis capilar en gel, la separación ocurre dentro de un capilar lleno con un gel que actúa como un tamiz molecular. Las moléculas con relaciones carga a masa similares se separan de acuerdo con el tamaño molecular dado que las moléculas más pequeñas se mueven más libremente a través de la red del gel y, por lo tanto, migran más rápido que las moléculas más grandes. De esa forma, las diferentes macromoléculas biológicas (por ejemplo, las proteínas y los fragmentos de ADN), que a menudo tienen relaciones carga a masa similares se pueden separar por electroforesis capilar en gel de acuerdo con su masa molecular.
Características de los Geles En electroforesis capilar se usan dos tipos de geles: los geles recubiertos permanentemente y los geles recubiertos dinámicamente. Los geles recubiertos permanentemente se preparan dentro del capilar por polimerización de monómeros. Un ejemplo de dicho gel es una poliacrilamida entrecruzada. Este tipo de gel generalmente está unido a la pared de sílice fundida y no se puede eliminar sin destruir el capilar. Para el análisis de proteínas bajo condiciones reductoras, la solución amortiguadora de separación, por lo general, contiene dodecilsulfato de sodio, y la muestra se desnaturaliza por calor en una mezcla de dodecilsulfato de sodio y 2-mercaptoetanol o ditiotreitol antes de la inyección. Cuando se emplean condiciones no reductoras (por ejemplo, durante el análisis de un anticuerpo intacto), no se utilizan 2-mercaptoetanol y ditiotreitol. La optimización de la separación en un gel entrecruzado se obtiene modificando la solución amortiguadora de separación (ver Electroforesis Capilar de Zona) y controlando la porosidad del gel durante la preparación del mismo. Para geles de poliacrilamida entrecruzados, la porosidad se puede modificar cambiando la concentración de acrilamida y/o la relación del agente de entrecruzamiento. Como regla general, al disminuir la porosidad del gel se reduce la movilidad de los solutos. Debido a la rigidez de este tipo de gel, sólo se puede usar la inyección electrocinética. Los geles recubiertos dinámicamente son polímeros hidrófilos (es decir, poliacrilamida lineal, derivados de celulosa, dextrano, etc.) que se pueden disolver en soluciones amortiguadoras acuosas de separación, dando lugar a un medio de separación que también actúa como tamiz molecular. Estos medios de separación poliméricos son más fáciles de preparar que los polímeros entrecruzados. Se pueden preparar en un vial y llenar por presión en un capilar de pared recubierta sin flujo electroosmótico. Si se reemplaza el gel antes de cada inyección generalmente mejora la reproducibilidad de la separación. La porosidad de los geles recubiertos dinámicamente se puede aumentar usando polímeros de una masa molecular mayor (a una concentración de polímero dada) o disminuyendo la concentración de polímero (para una masa molecular de polímero dada.) Al disminuir la porosidad del gel se reduce la movilidad del soluto para la misma solución amortiguadora. Se pueden usar técnicas de inyección hidrodinámica y electrocinética ya que la disolución de estos polímeros en la solución amortiguadora produce soluciones de baja viscosidad.
ISOELECTROENFOQUE CAPILAR Principio En isoelectroenfoque las moléculas migran bajo la influencia del campo eléctrico, siempre y cuando estén cargadas, en un gradiente de pH generado por anfolitos que tienen un intervalo amplio de valores de pi (ácidos poliaminocarboxílicos) disueltos en la solución amortiguadora de separación. Los tres pasos básicos en el isoelectroenfoque capilar son la carga de la muestra, el enfoque y la movilización. CARGA Se pueden emplear dos métodos.
1114 (1053) Electroforesis Capilar/ Información General
USP 39
Carga en un Solo Paso-La muestra se mezcla con anfolitos y se introduce en el capilar por presión o vacío. Carga Secuencial-Se introducen en el capilar una solución amortiguadora inicial, luego los anfolitos, luego la muestra mezclada con anfolitos, otra vez los anfolitos solos y finalmente la solución amortiguadora final. El volumen de la muestra debe ser suficientemente pequeño como para no modificar el gradiente de pH. ENFOQUE Cuando se aplica voltaje, los anfolitos migran hacia el cátodo o el ánodo según su carga neta, creando un gradiente de pH desde el ánodo (menor pH) al cátodo (mayor pH). Durante este paso los componentes a separar migran hasta que alcanzan el pH correspondiente a su punto isoeléctrico y la corriente cae a valores muy bajos. MOVILIZACIÓN Si se requiere movilización para la detección, usar uno de los siguientes métodos. Se cuenta con tres métodos. Método 1-La movilización se consigue durante el Enfoque, bajo la influencia del flujo electroosmótico cuando este flujo es suficientemente pequeño para permitir el enfoque de los componentes. Método 2-La movilización se consigue por aplicación de presión positiva después del Enfoque. Método 3-La movilización se consigue después del Enfoque, agregando sales al recipiente del cátodo o del ánodo, dependiendo del sentido elegido para la movilización, a fin de alterar el pH en el capilar cuando se aplica voltaje. Al cambiar el pH, las proteínas y anfolitos se movilizan hacia el recipiente que contiene las sales agregadas y pasan por el detector. La separación lograda se expresa como ~pi y depende del gradiente de pH (dpH/dx), el número de anfolitos que tienen valores de pi diferentes, el coeficiente de difusión molecular (D), la intensidad del campo eléctrico (E) y la variación de la movilidad electroforética del analito en función del pH (-dµ/dpH):
~pl= 3 D( dpH/dx)
E(-dµ!dpH)
Optimización Los principales parámetros que se deben considerar en el desarrollo de las separaciones son los siguientes: VOLTAJE Emplear campos altos desde 300 V/cm a 1000 V/cm durante el Enfoque.. CAPILAR Según la estrategia de Movilización seleccionada (ver más arriba), el flujo electroosmótico se debe reducir o eliminar. Los capilares recubiertos tienden a reducir el flujo electroosmótico. SOLUCIONES El recipiente con el amortiguador correspondiente al ánodo se llena con una solución de pH más bajo que el pi del anfolito más ácido y el recipiente del cátodo se llena con una solución que tiene un pH más alto que el pi del anfolito más básico. Frecuentemente se usa ácido fosfórico para el ánodo e hidróxido de sodio para el cátodo. La adición de un polímero, como la metilcelulosa, a la solución del anfolito tiende a suprimir las fuerzas convectivas (si las hubiese) y el flujo electroosmótico por aumento de la viscosidad. Se dispone comercialmente de anfolitos que abarcan muchos intervalos de pH, que se pueden mezclar para obtener un intervalo de pH ampliado. Los intervalos de pH más amplios se usan para estimar el punto isoeléctrico (pi) mientras que los más estrechos se emplean para mejorar la exactitud. La calibración se puede llevar a cabo relacionando el tiempo de migración con el punto isoeléctrico de una serie de marcadores estándar de proteínas. Durante el Enfoque, se puede evitar la precipitación de proteínas en su punto isoeléctrico, si fuera necesario, usando aditivos de amortiguadores como por ejemplo glicerol, agentes tensoactivos, urea o amortiguadores zwiteriónicos. Sin embargo, según las concentraciones, la urea puede desnaturalizar las proteínas.
USP 39
Información General/ (1053) Electroforesis Capilar 1115
CROMATOGRAFÍA ELECTROCINÉTICA MICELAR (CECM) Principio La separación se efectúa en una solución electrolítica que contiene un agente tensoactivo en una concentración por encima de la concentración micelar crítica (eme). Las moléculas de soluto se distribuyen entre la solución amortiguadora acuosa y la fase pseudo-estacionaria compuesta por las micelas según el coeficiente de partición del soluto. Esta técnica se puede considerar un híbrido de electroforesis y cromatografía. Es una técnica que se puede usar para la separación de solutos neutros o cargados manteniendo la eficiencia, la velocidad y la aptitud del instrumento de electroforesis capilar. Uno de los agentes tensoactivos más ampliamente usados en CECM es el tensoactivo aniónico dodecilsulfato de sodio, aunque se han usado otros agentes tensoactivos, como por ejemplo las sales de cetiltrimetilamonio tensoactivos catiónicos. El mecanismo de separación es el siguiente. A pH neutro y alcalino, se genera un flujo electroosmótico fuerte que mueve los iones de la solución amortiguadora de separación hacia el cátodo. Si se usa dodecilsulfato de sodio como agente tensoactivo, la migración electroforética de la micela aniónica se produce en el sentido opuesto, hacia el ánodo. Como resultado, la velocidad general de migración de las micelas disminuye en comparación con el flujo en masa de la solución electrolítica. En el caso de solutos neutros, como el analito se puede repartir entre la micela y la solución amortiguadora acuosa y no tiene movilidad electroforética, la velocidad de migración del analito dependerá únicamente del coeficiente de partición entre la micela y la solución amortiguadora acuosa. En el electroferograma, los picos correspondientes a cada soluto sin carga están siempre entre el del marcador del flujo electroosmótico y el de la micela; y el tiempo transcurrido entre estos dos picos se denomina ventana de separación. Para los solutos con carga eléctrica, la velocidad de migración depende del coeficiente de partición del soluto entre la micela y la solución amortiguadora acuosa y de la movilidad electroforética del soluto en ausencia de micelas. Dado que el mecanismo de solutos neutros o débilmente ionizados en CECM es esencialmente cromatográfico y la migración del soluto y la resolución se pueden racionalizar en términos del factor de retención del soluto (k'), también conocido como cociente de distribución másica (Dm), que es el cociente entre el número de moles de soluto en la micela y los moles en la fase móvil. Para un compuesto neutro, k' es del siguiente modo:
k'= t
t, -to 1-t/tmc)
0{
K( VMv. J
en donde t, es el tiempo de migración del soluto; t 0 es el tiempo de análisis del soluto no retenido obtenido al inyectar un marcador de flujo electroosmótico que no entra a la micela (p.ej., metanol); tmc es el tiempo de migración de la micela medido al inyectar un marcador de micela, como por ejemplo Sudán 111, que migra continuamente asociado con la micela; K es el coeficiente de partición del soluto; V5 es el volumen de la fase micelar; y VM es el volumen de la fase móvil. La resolución entre dos solutos que migran cerca (R 5) es la siguiente: 1
(to)
R8 = .JNxa- 1 x~x - !:, 4 a k;+1 1+k;x(1-l
tmc)
en donde N es el número de platos teóricos para uno de los solutos; a es la selectividad; ka' y kb' son los factores de retención para ambos solutos, respectivamente (kb' > ka'). Ecuaciones similares, aunque no idénticas, dan valores de k' y R5 para solutos con carga eléctrica.
Optimización Los principales parámetros a considerar en el desarrollo de separaciones por CECM son los parámetros instrumentales y de la solución electrolítica. PARÁMETROS INSTRUMENTALES Voltaje-El tiempo de separación es inversamente proporcional al voltaje aplicado. Sin embargo, un aumento en el voltaje podría generar calor excesivo, aumentando los gradientes de temperatura y de viscosidad de la solución amortiguadora en la sección transversal del capilar. Este efecto puede ser significativo con amortiguadores de alta conductividad, como por ejemplo aquellos que contienen micelas. La disipación insuficiente del calor ensancha las bandas y disminuye la resolución. Temperatura-Las variaciones en la temperatura del capilar afectan el coeficiente de partición del soluto entre la solución amortiguadora y las micelas, la concentración micelar crítica y la viscosidad de la solución amortiguadora. Estos parámetros contribuyen al tiempo de migración de los solutos. El uso de un buen sistema de enfriamiento mejora la reproducibilidad del tiempo de migración para los solutos. Capilar-Al igual que en la Electroforesis Capilar de Zona, la longitud y el diámetro interno de los capilares influyen sobre el tiempo de análisis y la eficiencia de las separaciones. El aumento de la longitud efectiva y de la longitud total puede disminuir
1116 (1053) Electroforesis Capilar/ Información General
USP 39
los campos eléctricos, trabajando a un voltaje constante, aumenta el tiempo de migración y mejora la eficiencia de la separación. El diámetro interno controla la disipación de calor, para un amortiguador y campo eléctrico dados, y por consiguiente ensancha las bandas de la muestra. PARÁMETROS DE LA SOLUCIÓN ELECTROLÍTICA Tipo de Agente Tensoactivo y Concentración-El tipo de agente tensoactivo, al igual que la fase estacionaria en cromatografía, afecta la resolución ya que modifica la selectividad de la separación. El log k' de un compuesto neutro aumenta linealmente con la concentración de agente tensoactivo en la fase móvil. Cuando k' se acerca al valor de
~tmJto la resolución de la CECM alcanza su máximo. La modificación de la concentración del agente tensoactivo en la fase móvil cambia la resolución. pH de la Solución Amortiguadora-El pH no modifica el coeficiente de partición de los solutos no ionizados, pero puede modificar el flujo electroosmótico en capilares sin recubrimiento. Una disminución en el pH de la solución amortiguadora disminuye el flujo electroosmótico y por lo tanto aumenta la resolución de los solutos neutros en CECM, llevando a un aumento del tiempo de análisis. Disolventes Orgánicos-Se pueden agregar modificadores orgánicos (metanol, propano!, acetonitrilo, etc.) a la solución electrolítica para mejorar la separación por CECM de compuestos hidrófobos. La adición de estos modificadores generalmente disminuye el tiempo de migración y la selectividad de la separación. Dado que la adición de modificadores orgánicos afecta la concentración micelar crítica, sólo se puede usar una concentración dada de un agente tensoactivo con un cierto porcentaje de un modificador orgánico para evitar inhibir o alterar adversamente la micelación, que daría como resultado la ausencia de micelas y, por lo tanto, la ausencia de partición. La disociación de micelas en presencia de un alto contenido de disolvente orgánico no siempre significa que la separación ya no será posible, dado que en ciertos casos, la interacción hidrófoba entre el monómero tensoactivo iónico y los solutos neutros forman complejos solvófobos que se pueden separar electroforéticamente. Aditivos para Separaciones Quirales-Para la separación de enantiómeros usando CECM, se incluye un selector quiral en el sistema micelar, unido covalentemente al agente tensoactivo o agregado al electrolito de separación micelar. Las micelas que tienen un grupo con propiedades de discriminación quiral incluyen sales, N-dodecanoil-L-aminoácidos, sales biliares, etc. La resolución quiral también se puede lograr usando discriminadores quirales, como por ejemplo ciclodextrinas, agregados a las soluciones electrolíticas que contienen agentes tensoactivos aquirales micelizados. Otros Aditivos-La selectividad se puede modificar agregando productos químicos a la solución amortiguadora. También se emplea la adición de varios tipos de ciclodextrinas al amortiguador para reducir la interacción de solutos hidrófobos con la micela, aumentando la selectividad para este tipo de compuesto. La adición de sustancias modificadoras de las interacciones soluto-micela por adsorción en las micelas se ha usado para mejorar la selectividad de las separaciones en CECM. Estos aditivos pueden ser un segundo agente tensoactivo (iónico o no iónico) que da lugar a la formación de micelas mixtas, o cationes metálicos que se disuelven en la micela y forman complejos de coordinación con los solutos.
Cuantificación Las áreas de los picos se dividen por el tiempo de migración correspondiente para obtener el área corregida a fin de compensar el cambio en el tiempo de migración de corrida a corrida, reduciendo la variación de la respuesta. Al dividir las áreas de los picos por el tiempo de migración también se compensan las distintas respuestas de los constituyentes de la muestra que tienen diferentes tiempos de migración. Cuando se usa un estándar interno, hay que verificar que no enmascare ninguno de los picos de la sustancia a examinar. CÁLCULOS A partir de los valores obtenidos, calcular el contenido del componente o componentes que se están determinando. Cuando se indique, se calcula el porcentaje de uno o más componentes de la muestra a examinar determinando las áreas corregidas del pico o picos como porcentaje de las áreas totales corregidas de todos los picos, excluyendo aquellos debidos a disolventes o reactivos agregados (procedimiento de normalización). Se recomienda usar un sistema de integración automático (sistema integrador o de adquisición y procesamiento de datos).
APTITUD DEL SISTEMA Con el fin de verificar el comportamiento del sistema de electroforesis capilar, se usan parámetros de aptitud del sistema. La elección de estos parámetros depende del tipo de electroforesis capilar utilizado. Los parámetros incluyen los siguientes: factor de retención k' usado únicamente para la Cromatografía Electrocinética Micelar, el número aparente de platos teóricos (N), el factor de simetría (A5) y la resolución (R 5). Es de destacar que las expresiones teóricas para N y R5 se han descrito en las seccio-
USP 39
Información General/ (1053) Electroforesis Capilar 1117
nes anteriores, pero las ecuaciones más prácticas que permiten la determinación de estos parámetros de aptitud usando los electroferogramas se describen a continuación.
Número Aparente de Platos Teóricos El número aparente de platos teóricos (N) se puede calcular a partir de la fórmula:
N = 5,54 (tR/wh)2 en donde tR es el tiempo de migración o distancia a lo largo de la línea base entre el punto de inyección y la perpendicular trazada desde el máximo del pico correspondiente al componente; y wh es el ancho del pico a la mitad de su altura.
Resolución La resolución (R5) entre los picos de alturas similares de dos componentes se puede calcular a partir de la fórmula:
R5 = 1, 18(tR2 - tR1)/(wh, + Wh 2)
en donde tR, y tR2 son los tiempos de migración o distancias a lo largo de la línea base, entre el punto de inyección y las perpendiculares trazadas desde el máximo de los dos picos adyacentes; y wh, y wh 2 son los anchos de los picos a la mitad de su altura. Cuando sea apropiado, la resolución (R 5) también se puede calcular midiendo la altura del valle (Hv) entre dos picos parcialmente resueltos en una preparación estándar, la altura del pico más pequeño (Hp), y calculando la relación pico a valle: p/v = Hp/Hv
Factor de Simetría El factor de simetría de un pico (A5) se puede calcular usando la fórmula:
A,
=w0,05 /2d
en donde w 0,05 es el ancho del pico a una vigésima parte de su altura; y d es la distancia entre la perpendicular trazada desde el máximo del pico y el borde frontal del pico a una vigésima parte de su altura. Otros parámetros de aptitud incluyen pruebas para la repetibilidad del área (desviación estándar de las áreas o del área/ tiempo de migración) y pruebas para la repetibilidad del tiempo de migración (desviación estándar del tiempo de migración). La repetibilidad del tiempo de migración proporciona una prueba de la aptitud de los procedimientos del lavado del capilar. Para evitar la falta de repetibilidad del tiempo de migración, una práctica alternativa consiste en usar un tiempo de migración relativo al estándar interno.
Relación Señal-Ruido Una prueba para verificar la relación señal-ruido de una preparación estándar o para determinar el límite de cuantificación puede ser útil para la determinación de sustancias relacionadas. El límite de detección y el límite de cuantificación corresponden a una relación señal-ruido de 3 y 1O, respectivamente. La relación señal-ruido (S/N) se calcula del siguiente modo: S/N
= 2H/h
en donde H es la altura del pico correspondiente al componente pertinente en el electroferograma obtenido con la solución de referencia especificada, medido desde el máximo del pico hasta la línea base extrapolada de la señal observada sobre una distancia igual a veinte veces el ancho del pico a la mitad de su altura; y h es el intervalo de ruido de fondo en un electroferograma obtenido después de la inyección de un blanco, observado sobre una distancia igual a veinte veces el ancho del pico a la mitad de su altura en el electroferograma obtenido con la solución de referencia prescrita y, de ser posible, situado igualmente alrededor del lugar donde se encontraría este pico.
1118 (l 054) Artículos Obtenidos por Biotecnología / Información General
USP 39
(1054) ARTÍCULOS OBTENIDOS POR BIOTECNOLOGÍAISOELECTROENFOQUE Este capítulo proporciona guías y procedimientos utilizados para la caracterización de artículos obtenidos por biotecnología mediante isoelectroenfoque. Se lo ha armonizado con los capítulos correspondientes en la Farmacopea Japonesa (JP) y la Farmacopea Europea (EP). También se muestran otras pruebas de caracterización armonizadas en Artículos Obtenidos por Biotecnología-Análisis de Aminoácidos (1052), Electroforesis Capilar (1053), Artículos Obtenidos por Biotecnología-Mapeo de Péptidos (1055), Artículos Obtenidos por Biotecnología-Electroforesis en Gel de Poliacrilamida (1056) y Artículos Obtenidos por Biotecnología-Valoración de Proteínas Totales (1057).
PRINCIPIOS GENERALES El isoelectroenfoque (IEF, por su sigla en inglés) es un método de electroforesis que separa proteínas según sus puntos isoeléctricos. La separación se lleva a cabo en una placa de gel (slab) de poliacrilamida o agarosa que contiene una mezcla de electrólitos anfotéricos (anfolitos). Cuando se aplica un campo eléctrico, los anfolitos migran en el gel, creando un gradiente de pH. En algunos casos, se usan geles que contienen un gradiente de pH inmovilizado, preparado por incorporación de ácidos y bases débiles en regiones específicas de la red de gel durante su preparación. Cuando las proteínas aplicadas alcanzan la zona del gel que tiene un pH igual a su punto isoeléctrico (pi), su carga se neutraliza y la migración cesa. Los gradientes se pueden formar en diversos intervalos de pH, según la mezcla de anfolitos elegida.
ASPECTOS TEÓRICOS Cuando una proteína está en la posición de su punto isoeléctrico, no tiene carga neta y el campo eléctrico no la puede mover en una matriz de gel. Sin embargo, se puede mover de dicha posición por difusión. El gradiente de pH obliga a la proteína a mantenerse en la posición de su punto isoeléctrico, concentrándola; este efecto de concentración se denomina "enfoque". Al aumentar el voltaje aplicado o reducir la carga de la muestra, hay una mejor separación de las bandas. El voltaje aplicado está limitado por el calor generado, que necesita ser disipado. El uso de geles delgados y una placa de enfriamiento eficiente que esté controlada por un circulador termostático evita que el gel se queme y permite un enfoque nítido. La separación se estima determinando la diferencia de pi mínima (i'lpl), que es necesaria para separar dos bandas vecinas, del siguiente modo:
~pl= 3 D(dpH/dx)
E(-dµ!dpH)
en donde O es el coeficiente de difusión de la proteína; dpH/dx es el gradiente de pH; E es la intensidad del campo eléctrico, en voltios por centímetro y -dµ/dpH es la variación de la movilidad del soluto en función del pH en la región cercana al pi. Como no se pueden alterar O y -dµ/dpH para una proteína dada, la separación se puede mejorar usando un intervalo de pH más estrecho y aumentando la intensidad del campo eléctrico. La resolución entre las bandas de proteínas en un gel de IEF preparado con anfolitos transportadores puede ser muy buena. Se puede lograr una mejor resolución usando gradientes de pH inmovilizados donde las sustancias amortiguadoras, que son análogas a los anfolitos transportadores, se copolimerizan dentro de la matriz de gel. Las proteínas que muestran valores pi que difieren tan sólo en 0,02 unidades de pH se pueden resolver usando un gel preparado con anfolitos transportadores, mientras que los gradientes de pH inmovilizados pueden resolver proteínas que difieran en aproximadamente 0,001 unidades de pH.
ASPECTOS PRÁCTICOS Desde un punto de vista operativo, se debe prestar especial atención a las características de la muestra o a su preparación. La sal en una muestra puede ser un problema, y en lo posible es mejor preparar la muestra en agua desionizada o anfolitos al 2% usando diálisis o filtración con gel si fuera necesario. El tiempo necesario para completar el enfoque en capas delgadas de gel de poliacrilamida se determina colocando una proteína coloreada (p.ej., hemoglobina) en distintas posiciones en la superficie del gel y aplicando el campo eléctrico: el estado estacionario se alcanza cuando todas las aplicaciones dan un patrón de banda idéntico. En algunos procedimientos, se determina que el enfoque está completo según el tiempo transcurrido después de la aplicación de la muestra. El gel de IEF se puede usar como prueba de identidad cuando el patrón de migración en el gel se compara con una preparación estándar adecuada y proteínas de calibración de IEF; el gel de IEF se puede usar como prueba de límite cuando la densidad de una banda en IEF se compara subjetivamente con la densidad de las bandas que aparecen en una preparación estándar, o se puede usar como prueba cuantitativa cuando la densidad se mide usando un densitómetro o instrumento similar para determinar la concentración relativa de proteína en las bandas, siempre que se valide.
USP 39
Información General/ (1054) Artículos Obtenidos por Biotecnología 1119
APARATO Un aparato para isoelectroenfoque consiste en un generador regulable capaz de proporcionar una corriente constante en tensión, intensidad y potencia. Se utilizan en general potenciales de 2500 V, los cuales se consideran óptimos en ciertas condiciones operativas. Se recomienda un suministro de hasta 30 W de potencia constante. El aparato incluye además una cámara plástica rígida de isoelectroenfoque que contiene una placa enfriada de un material adecuado para sostener el gel; y una cubierta plástica con electrodos de platino que se conectan al gel por medio de papel absorbente de largo, ancho y grosor adecuados, impregnado con soluciones de electrólitos anódicos y catódicos.
ISOELECTROENFOQUE EN GELES DE POLIACRILAMIDA: PROCEDIMIENTO DETALLADO El siguiente método es una descripción detallada de un procedimiento de IEF en placas gruesas de gel de poliacrilamida, que se utiliza a menos que la monografía indique algo diferente.
Preparación de los Geles MOLDE El molde está compuesto por una placa de vidrio (A) sobre la cual se coloca la película de poliéster (B) para facilitar la manipulación del gel, uno o más espaciadores (C), una segunda placa de vidrio (D) y pinzas para mantener unida la estructura (ver Figura 1).
D
Figura 1. Molde GEL DE POLIACRILAMIDA AL 7,5% Disolver 29, 1 g de acrilamida y 0,9 g de metilenbisacrilamida en 100 mL de agua. Agregar la mezcla de anfolitos especificada en la monografía individual a 2,5 volúmenes de esta solución y diluir hasta 1O volúmenes con agua. Mezclar cuidadosamente y desgasificar la solución. PREPARACIÓN DEL MOLDE Colocar la película de poliéster sobre la placa de vidrio inferior, aplicar el espaciador, colocar la segunda placa de vidrio y las pinzas. Antes de usar, colocar la mezcla en un agitador magnético y agregar 0,25 volúmenes de una solución de persulfato de amonio de 100 g/L y 0,25 volúmenes de tetrametilendiamina. Llenar inmediatamente el espacio entre las placas de vidrio del molde con la solución. SOLUCIÓN FIJADORA PARA GEL DE POLIACRILAMIDA DE ISOELECTROENFOQUE Mezclar 35 g de ácido sulfosalicílico y 100 g de ácido tricloroacético en 1000 mL de agua.
1120 (1054) Artículos Obtenidos por Biotecnología/ Información General
USP 39
SOLUCIÓN DE TINCIÓN COOMASSIE Y SOLUCIÓN DE DECOLORACIÓN Usar las mismas soluciones indicadas en el capítulo de información general Artículos Obtenidos por Biotecnología-Electroforesis en Gel de Poliacrilamida (1056).
Procedimiento Desarmar el Molde, y usando la película de poliéster, transferir el gel al soporte enfriado humedecido con unos pocos mL de un líquido adecuado, procurando evitar que se formen burbujas de aire. Preparar las soluciones de prueba y las soluciones de referencia según se especifica en la monografía individual. Colocar sobre el gel las tiras de papel para la aplicación de las muestras, de aproximadamente 1O mm x 5 mm, e impregnar cada una con las cantidades prescritas de las soluciones de prueba y de referencia. Aplicar también la cantidad descrita de una solución de proteínas con puntos isoeléctricos conocidos como marcadores de pH para calibrar el gel. En algunos procedimientos, el gel tiene ranuras moldeadas previamente donde se aplica la solución de la muestra, en lugar de usar tiras de papel impregnadas. Cortar dos tiras de papel de la longitud del gel e impregnarlas con las soluciones de los electrólitos: ácida para el ánodo y alcalina para el cátodo. Las composiciones de las soluciones del ánodo y el cátodo se proporcionan en cada monografía. Aplicar estos papeles absorbentes a cada lado del gel a varios mm del borde. Colocar la cubierta de modo que los electrodos estén en contacto con los papeles absorbentes (con respecto a los polos anódico y catódico). Proceder con el isoelectroenfoque aplicando los parámetros descritos en la monografía individual. Desconectar la corriente cuando la migración de la mezcla de las proteínas estándar se haya estabilizado. Usando pinzas, retirar las tiras de aplicación de las muestras y los dos papeles absorbentes de los electrodos. Sumergir el gel en la Solución Fijadora para Gel de Poliacrilamida de lsoelectroenfoque. Incubar con agitación suave a temperatura ambiente durante 30 minutos. Escurrir la solución y agregar 200 mL de la Solución de Decoloración. Incubar con agitación durante 1 hora. Escurrir el gel y agregar la Solución de Tinción Coomassie. Incubar durante 30 minutos. Decolorar el gel por difusión pasiva con la Solución de Decoloración hasta que las bandas se visualicen bien contra un fondo transparente. Ubicar la posición e intensidad de las bandas en el electroferograma, como se prescribe en cada monografía.
Variaciones en el Procedimiento Detallado (Sujetas a Validación) Cuando se hace referencia al método general de isoelectroenfoque, se pueden hacer variaciones en la metodología o en el procedimiento siempre que se validen. Estas variaciones incluyen el uso de geles previamente moldeados disponibles comercialmente y de kits comerciales de tinción y decoloración; el uso de gradientes de pH inmovilizados; el uso de tubos de gel (rod gels); y el uso de geles en placas de distintas dimensiones, incluyendo geles ultra delgados (0,2 mm); las variaciones en el procedimiento de aplicación de la muestra, incluyendo distintos volúmenes de muestra o el uso de máscaras de aplicación de la muestra o mechas absorbentes que no sean de papel; el uso de distintas condiciones de corrida, incluyendo variaciones en el campo eléctrico dependiendo de las dimensiones del gel y el equipo y el uso de tiempos de migración fijos en lugar de la interpretación subjetiva de la estabilidad de la banda; la inclusión de una etapa de pre-enfoque; el uso de instrumentación automatizada; y el uso de geles de agarosa.
VALIDACIÓN DE LOS PROCEDIMIENTOS DE ISOELECTROENFOQUE Cuando se emplean métodos alternativos al procedimiento detallado es necesario validarlos. Se pueden usar los siguientes criterios para validar la separación: la formación de un gradiente de pH estable de las características deseadas, evaluado, por ejemplo, usando marcadores de pH coloreados con puntos isoeléctricos conocidos; la comparación con el electroferograma suministrado con la sustancia química de referencia para la preparación a examinar; y cualquier otro criterio de validación prescrito en la monografía individual.
VARIACIONES ESPECIFICADAS DEL MÉTODO GENERAL Las variaciones del método general necesarias para el análisis de sustancias específicas pueden estar especificadas en detalle en cada monografía. Las variaciones pueden incluir el agregado de urea en el gel (una concentración 3 M a menudo es satisfactoria para mantener la proteína en solución pero se puede usar hasta 8 M). Algunas proteínas precipitan en su punto isoeléctrico. En este caso, se incluye la urea en la formulación del gel para mantener la proteína en solución. Si se usa urea, pueden usarse solamente soluciones recién preparadas para evitar la carbamilación de la proteína. Otras variaciones incluyen el uso de otros métodos de tinción y el uso de aditivos de geles tales como detergentes no iónicos (por ejemplo: octilglucósido) o detergentes zwitteriónicos (por ejemplo: CHAPS o CHAPSO) y la adición de anfolitos a la muestra para evitar la aglomeración o precipitación de las proteínas.
USP 39
Información General/ (1055) Artículos Obtenidos por Biotecnología 1121
PUNTOS A CONSIDERAR 1. Las muestras se pueden aplicar a cualquier zona del gel, pero para proteger las proteínas de medios de pH extremo, las muestras no se deben aplicar cerca de ninguno de los electrodos. Durante el desarrollo del método, el analista puede intentar aplicar la proteína en tres posiciones del gel (p.ej., en el medio y en ambos extremos); el patrón de una proteína aplicada en los extremos opuestos del gel puede no ser idéntico. 2. Si un gel se enfoca por mucho tiempo, puede ocurrir un fenómeno conocido como deriva catódica, donde el gradiente de pH disminuye con el tiempo. Aunque no se entiende bien, la electroendosmosis y la absorción de dióxido de carbono son factores que pueden favorecer la deriva catódica. La deriva catódica se observa cuando la proteína enfocada migra hacia el extremo catódico del gel. Se pueden usar gradientes de pH inmovilizados para resolver este problema. 3. Es importante un enfriamiento eficiente (aproximadamente 4º) del lecho donde se encuentra el gel durante el enfoque. Las intensidades de campo elevadas usadas durante el isoelectroenfoque pueden producir recalentamiento y afectar la calidad del gel enfocado.
(1055) ARTÍCULOS OBTENIDOS POR BIOTECNOLOGÍA-MAPEO DE PÉPTIDOS
Este capítulo proporciona guías y procedimientos utilizados para la caracterización de artículos obtenidos por biotecnología mediante mapeo de péptidos. Se lo ha armonizado con los capítulos correspondientes en la Farmacopea japonesa (f P) y la Farmacopea Europea (EP). Las partes del capítulo que no están armonizadas con las otras dos farmacopeas se indican con el símbolo+. También se muestran otras pruebas de caracterización armonizadas en Artículos Obtenidos por Biotecnología-Análisis de Aminoácidos (1052) I l!f~J:/¡tlllr•Ji!.~;•.l!l'\l~i!!i~ili1mi\Y.illiil!il!ll..! .. Artículos Obtenidos por Biotecnología-/soelectroenfoque i:::,m"'~~M!~~~l'RiA•W~OO"!~:~Ml~&'!!:!!!~~;~r (1054), Artículos Obtenidos por Biotecnología-Electroforesis en Gel de Poliacrilamida (1056) y Artículos Obtenidos por Biotecnología-Valoración de Proteínas Totales (1057).
INTRODUCCIÓN El mapeo de péptidos es una prueba de identidad para proteínas, especialmente para aquellas obtenidas por tecnología de ADN-r. Implica el tratamiento químico o enzimático de una proteína, con la formación de fragmentos peptídicos y seguido de la separación e identificación de los fragmentos en una manera reproducible. Es una prueba de gran alcance capaz de identificar cambios en aminoácidos individuales como resultado de acontecimientos tales como errores en la lectura de las secuencias de ADN complementario (ADNc) o mutaciones puntuales. El mapeo de péptidos es un procedimiento comparativo ya que la información obtenida, comparada con un Estándar de Referencia o Material de Referencia tratado de manera similar, confirma la estructura primaria de la proteína, es capaz de detectar si ha habido alguna alteración en la estructura y demuestra la uniformidad del proceso y la estabilidad genética. Cada proteína presenta características exclusivas que se deben entender bien para que el enfoque científico y analítico permita el desarrollo validado de un mapa peptídico que suministre suficiente especificidad. Este capítulo proporciona una ayuda detallada para la aplicación del mapeo de péptidos y su validación para caracterizar el producto proteico deseado, con el fin de evaluar la estabilidad de la construcción de expresión de las células usadas para productos de ADN recombinante; para evaluar la uniformidad del proceso global; y para evaluar la estabilidad del producto, además de asegurar la identidad del producto proteico o de detectar la presencia de una variante de la proteína. • El esquema de la validación presentado establece diferencias entre la calificación del método en una etapa temprana del proceso reglamentario, al nivel de Nuevo Fármaco en Investigación (IND, por sus siglas en inglés) y la validación completa para apoyar una Solicitud de Nuevo Fármaco (NDA, por sus siglas en inglés), Solicitud de Licencia de Producto (PLA, por sus siglas en inglés), o Solicitud de Autorización para Comercialización (MAA, por sus siglas en inglés). Los conceptos de validación descritos concuerdan con el capítulo de información general Validación de Procedimientos Farmacopeicos (1225) y con el documento de la Conferencia Internacional sobre Armonización (ICH) sobre Validación de Métodos Analíticos .•
EL MAPA PEPTÍDICO El mapeo de péptidos no es un método general, pero implica el desarrollo de mapas específicos para cada proteína única. Si bien la tecnología evoluciona rápidamente, existen ciertos métodos que están generalmente aceptados. Las variaciones de estos métodos se indican, cuando corresponda, en las monografías específicas. Un mapa peptídico se puede considerar como la huella digital de una proteína y es el producto final de varios procesos químicos que permiten una amplia comprensión de la proteína analizada. Se necesitan cuatro pasos principales para el desarrollo
1122 (1055) Artículos Obtenidos por Biotecnología / Información General
USP 39
del procedimiento: aislamiento y purificación de la proteína, si la proteína es parte de una formulación; escisión selectiva de los enlaces peptídicos; separación cromatográfica de los péptidos; y análisis e identificación de los péptidos. Una muestra de prueba se digiere y valora en paralelo con un Estándar de Referencia o Material de Referencia. La escisión completa de uniones peptídicas es más factible con enzimas tales como endoproteasas (por ejemplo: tripsina) en lugar de reactivos de escisión química. Un mapa debe contener suficientes péptidos para ser significativo. Por otro lado, si hay demasiados fragmentos, el mapa puede perder su especificidad ya que de este modo es posible que muchas proteínas tengan los mismos perfiles.
Aislamiento y Purificación El aislamiento y la purificación son necesarios para el análisis de fármacos a granel o en formas farmacéuticas que contienen excipientes y proteínas transportadoras que interfieren y, cuando es necesario, se especifica en la monografía. Se debe validar la recuperación cuantitativa de proteínas de la forma farmacéutica.
Escisión Selectiva de Uniones Peptídicas La selección del enfoque usado para la escisión de uniones peptídicas depende de la proteína que se está analizando. Este proceso de selección involucra la determinación del tipo de escisión a emplear-enzimática o química-y el tipo de agente de escisión dentro de la categoría elegida. En la Tabla 7 se muestran varios agentes de escisión y su especificidad. Esta no es una lista completa y se ampliará a medida que se identifiquen otros agentes de escisión. Tabla 1. Ejemplos de Agentes de Escisión Tipo Enzimático
Agente
Especificidad
Tripsina, EC 3.4.21.4
Extremo (-terminal de Arg y Lys
Quimotripsina, EC 3.4.21.1
Extremo (-terminal de residuos hidrófobos (por ej., Leu, Met, Ala, aromáticos)
Pepsina, EC 3.4.23.1 y EC 3.4.23.2
Digestión no específica
Lisil endopeptidasa (endopeptidasa Lys-C), EC 3.4.21.50
Extremo (-terminal de Lys
Glutamil endopeptidasa; (de la cepa S. V8), EC 3.4.21.19
aureus
Extremo (-terminal de Glu y Asp
Peptidil-Asp metaloendopeptidasa (endoprotei- Extremo N-terminal de Asp nasa Asp-N), EC 3.4.24.33 Clostripain, EC 3.4.22.8 Químico
Extremo (-terminal de Arg
Bromuro de cianógeno
Extremo (-terminal de Met
Ácido 2-nitro-5-tiocianobenzoico
Extremo N-terminal de Cys
Ácido 0-yodosobenzoico
Extremo (-terminal de Trp y Tyr
Ácido diluido
Asp y Pro
BNPS-Escatol
Trp
TRATAMIENTO PREVIO DE LA MUESTRA Según el tamaño o la configuración de la proteína, se pueden usar distintos enfoques en el tratamiento previo de las muestras. Para los anticuerpos monoclonales, es necesario separar las cadenas pesadas y livianas antes del mapeo. Si se usa tripsina como agente de escisión para las proteínas que tengan una masa molecular mayor que 100 000 Da, se deben proteger los residuos lisina por citraconilación o maleilación; de lo contrario, se generan demasiados péptidos. TRATAMIENTO PREVIO DEL AGENTE DE ESCISIÓN Podría ser necesario el tratamiento previo de purificación de los agentes de escisión, especialmente los agentes enzimáticos, con el fin de asegurar la reproducibilidad del mapa. Por ejemplo, la tripsina usada como agente de escisión debe tratarse con tosil-L-fenilalanina clorometilcetona para inactivar la quimotripsina. Otros métodos, tales como la purificación de la tripsina por HPLC o la inmovilización de enzimas en un soporte de gel, han resultado eficaces cuando se dispone sólo de una pequeña cantidad de proteína. TRATAMIENTO PREVIO DE LA PROTEÍNA Bajo ciertas condiciones, puede ser necesario concentrar la muestra o separar la proteína de sustancias y estabilizadores usados en la formulación del producto, si éstos interfieren con el procedimiento de mapeo. Los procedimientos físicos usados para el tratamiento previo pueden incluir la ultrafiltración, la cromatografía en columna y la liofilización.
Información General/ (1055) Artículos Obtenidos por Biotecnología 1123
USP 39
Otros tratamientos previos tales como el agregado de agentes caotrópicos (por ejemplo, urea) se pueden usar para desplegar la proteína antes del mapeo. Para permitir que la enzima tenga acceso total a los sitios de escisión y que la proteína sufra algún grado de desplegamiento, a menudo es necesario reducir y alquilar las uniones disulfuro antes de la digestión. La digestión con tripsina puede introducir ambigüedades en el mapa tríptico debido a reacciones secundarias durante la digestión, tales como escisión no específica, desamidación, isomerización de disulfuros, oxidación de residuos de metionina, o formación de grupos piroglutámicos creados por desamidación de glutamina en el extremo N-terminal de un péptido. Además, se pueden producir picos por autohidrólisis de la tripsina. Sus intensidades dependen de la relación de la tripsina con respecto a la proteína. Para evitar la autohidrólisis, se pueden preparar soluciones de proteasas a un pH que no sea óptimo (por ejemplo, pH 5 para la tripsina), lo cual significa que la enzima sólo se activa cuando se diluye con la solución amortiguadora de digestión. ESTABLECIMIENTO DE LAS CONDICIONES ÓPTIMAS DE DIGESTIÓN Los factores que afectan la integridad y eficacia de la digestión de las proteínas son aquellos que podrían afectar a cualquier reacción química o enzimática. pH-EI pH de la mezcla de digestión se determina empíricamente para asegurar el desempeño óptimo de un agente de escisión dado. Por ejemplo, cuando se usa bromuro de cianógeno como agente de escisión, es necesario un ambiente altamente ácido (por ejemplo: pH 2, ácido fórmico); sin embargo, al usar tripsina como agente de escisión, un ambiente levemente alcalino (pH 8) es óptimo. Como regla general, el pH del entorno de la reacción no debe alterar la integridad química de la proteína durante la digestión y no debe cambiar durante el transcurso de la reacción de fragmentación. Temperatura-Una temperatura entre 25º y 37º es adecuada para la mayoría de las digestiones. La temperatura empleada está prevista para minimizar las reacciones químicas secundarias. El tipo de proteína en análisis determinará la temperatura del medio de reacción ya que algunas proteínas son más susceptibles a la desnaturalización a medida que aumenta la temperatura de la reacción. Por ejemplo, la digestión de somatropina bovina recombinante se realiza a 4º ya que a temperaturas más altas ésta precipita durante la digestión. Tiempo-Si se dispone de suficiente muestra, se puede realizar un estudio en función del tiempo a fin de determinar el tiempo óptimo para obtener un mapa reproducible y evitar una digestión incompleta. El tiempo de digestión varía de 2 a 30 horas. La reacción se detiene al agregar un ácido que no interfiera en el mapa tríptico, o por congelación. Cantidad de Agente de Escisión-Si bien se usan cantidades de agente de escisión en exceso para lograr tiempos de digestión razonablemente rápidos (es decir, 6 a 20 horas), la cantidad se minimiza para evitar su contribución al perfil del mapa cromatográfico. Generalmente se usa una relación proteína-proteasa entre 20:1 y 200:1. Se recomienda agregar el agente de escisión en dos o más etapas para optimizar la escisión. Sin embargo, el volumen final de la reacción se mantiene lo suficientemente pequeño para facilitar el siguiente paso en el mapeo de péptidos-el paso de separación. Para determinar los artefactos de digestión que podrían interferir con los análisis siguientes, se realiza una determinación con un blanco usando un control de digestión con todos los reactivos excepto la proteína en análisis.
Separación Cromatográfica Se usan muchas técnicas para separar péptidos para mapeos. La elección de la técnica depende de la proteína estudiada. Las técnicas eficaces para la separación de péptidos se muestran en la Tabla 2. Tabla 2. Técnicas Usadas para la Separación de Péptidos Cromatografía Líquida de Alta Resolución en Fase Reversa (RP-HPLC) Cromatografía de Intercambio lónico (IEC) Cromatografía de Interacción Hidrófoba (HIC) Electroforesis en Gel de Poliacrilamida (PAGE), sin desnaturalización Electroforesis en Gel de Poliacrilamida con Dodecilsulfato de Sodio (SDS-PAGE) Electroforesis Capilar (CE) Cromatografía de Alto Voltaje en Papel (PCHV, por sus siglas en inglés) Electroforesis de Alto Voltaje en Papel (HVPE)
En esta sección, se describe un método de HPLC en fase reversa (RP-HPLC) ampliamente usado en la separación cromatográfica. La pureza de los disolventes y de las fases móviles es un factor crítico en la separación por HPLC. Se recomienda usar agua y disolventes de grado HPLC, disponibles comercialmente, para la RP-HPLC. Los gases disueltos presentan un problema en los sistemas de gradientes donde la solubilidad del gas en un disolvente puede ser menor en una mezcla que en un disolvente solo. La desgasificación al vacío y la agitación por ultrasonido suelen ser útiles para la desgasificación. Cuando las partículas sólidas presentes en los disolventes se introducen en el sistema HPLC, pueden dañar los sellos de las válvulas de las bombas u obstruir la parte superior de la columna cromatográfica. Se recomienda filtrar antes y después del bombeo. Columna Cromatográfica-La selección de una columna cromatográfica se determina empíricamente para cada proteína. Las columnas con tamaño de poro de 100 Ao 300 Ay soporte de sílice pueden proporcionar una separación óptima. Para
1124 (1055) Artículos Obtenidos por Biotecnología / Información General
USP 39
péptidos más pequeños, los rellenos de columna de octilsilano unido químicamente a partículas de sílice totalmente porosas, de 3 a 1O µm de diámetro (L7), y de octadecilsilano unido químicamente a micropartículas porosas de sílice o cerámica, de 3 a 1 O µm de diámetro (L 1), son más eficientes que el relleno de silano de butilo unido químicamente a partículas de sílice totalmente porosas, de 5 a 1O µm de diámetro (L26) Disolvente-El disolvente más comúnmente usado es agua con acetonitrilo como modificador orgánico al cual se le agrega menos de O, 1% de ácido trifluoroacético. Si fuera necesario, agregar alcohol isopropílico o alcohol n-propílico para solubilizar los componentes de digestión, siempre que el agregado no aumente excesivamente la viscosidad de los componentes. Fase Móvil-Se usan fases amortiguadas que contienen fosfato para flexibilizar la selección de las condiciones de pH ya que los cambios en el pH en el intervalo de 3,0 a 5,0 mejoran la separación de los péptidos que contienen residuos ácidos (por ejemplo, ácido glutámico y ácido aspártico). También se han usado fosfatos de sodio o potasio, acetato de amonio, ácido fosfórico y un pH entre 2 y 7 (o superior para soportes a base de polímeros), con gradientes de acetonitrilo. También se usa a menudo ácido trifluoroacético que contiene acetonitrilo. Selección del Gradiente-Los gradientes pueden ser lineales, no lineales o incluir funciones escalonadas. Se recomienda un gradiente gradual a fin de separar mezclas complejas. Los gradientes se optimizan para resolver claramente uno o dos picos que serán los picos "marcadores" de la prueba. Selección !socrática-Los sistemas isocráticos de HPLC que usan una única fase móvil se emplean por su conveniencia de uso y las respuestas mejoradas del detector. A menudo es difícil de establecer la composición óptima de una fase móvil para obtener una resolución clara de cada pico. En sistemas isocráticos de HPLC no deben usarse fases móviles donde un cambio leve en la relación de sus componentes o en el pH tenga un efecto importante en los tiempos de retención de los picos del mapa peptídico. Otros Parámetros-Generalmente es necesario controlar la temperatura de la columna para lograr una buena reproducibilidad. Las velocidades de flujo para las fases móviles varían de O, 1 a 2,0 mL por minuto y la detección de péptidos se realiza con un detector UV entre 200 nm y 230 nm. Se han usado otros métodos de detección (por ejemplo: derivatización postcolumna), pero no son tan robustos ni tan versátiles como la detección UV. Aptitud del Sistema-El apartado Aptitud del Sistema en Cromatografía (621) suministra un medio experimental para medir el desempeño global del método de prueba. El criterio de aceptación para la aptitud del sistema depende de la identificación de los parámetros críticos de prueba que afectan la interpretación y aceptación de los datos. Estos parámetros críticos también son criterios que controlan la digestión y el análisis de péptidos. Un indicador de que se alcanzó el punto final de digestión deseado es la comparación con un Estándar de Referencia o un Material de Referencia, el cual se trata exactamente como el artículo en análisis. El uso de un Estándar de Referencia USP paralelamente con la proteína en análisis es crítico en el desarrollo y establecimiento de los límites de aptitud del sistema. Además, se debe incluir el cromatograma de una muestra con el Estándar de Referencia USP o Material de Referencia a los efectos de comparación adicionales. Otros indicadores pueden incluir la inspección visual de la solubilidad de la proteína o el péptido, la ausencia de proteína intacta, o la medición de respuestas de un péptido dependiente de la digestión. Los parámetros críticos de aptitud del sistema para el análisis de péptidos dependerá de cada modo de separación y detección de péptidos y de los requisitos de análisis de datos. Cuando se usa el mapeo de péptidos como prueba de identificación, los requisitos de aptitud del sistema para los péptidos identificados incluyen la selectividad y la precisión. En este caso, al igual que cuando se realiza la identificación de variantes de proteínas, la identificación de la estructura primaria de los fragmentos peptídicos en el mapa peptídico suministra una verificación de la estructura primaria conocida y la identificación de las variantes de las proteínas por comparación con el mapa peptídico del Estándar de Referencia USP o Material de Referencia para la proteína especificada. El método de elección para la determinación de la resolución de péptidos es el uso de un Estándar de Referencia USP o Material de Referencia digerido para una proteína dada. Para el análisis de una variante de una proteína, se puede usar una mezcla caracterizada de una variante y un estándar de referencia, especialmente si la variante del péptido se encuentra en una región menos resuelta del mapa. El índice de uniformidad del patrón puede ser simplemente el número de péptidos principales detectados. La uniformidad del patrón de péptidos se puede definir mejor por la resolución de los picos de los péptidos. Los parámetros cromatográficos-tales como la resolución pico a pico, el ancho máximo de los picos, el área de los picos, los factores de asimetría de los picos y la eficiencia de la columna-se pueden usar para definir la resolución peptídica. Dependiendo de la proteína en análisis y el método de separación que se use, pueden ser necesarios requisitos de resolución de un solo péptido o de múltiples péptidos. El análisis repetido del digerido del Estándar de Referencia USP o Material de Referencia para la proteína en análisis produce medidas de precisión y recuperación cuantitativa. La recuperación de los péptidos identificados generalmente se puede determinar por el uso de estándares peptídicos internos o externos. La precisión se expresa como la desviación estándar relativa (RSD). Es de esperar diferencias en la recuperación y precisión de los péptidos identificados; por lo tanto, hay que establecer los límites de aptitud del sistema tanto para la recuperación como para la precisión de los péptidos identificados. Estos límites son exclusivos para cada proteína y se especificarán en las monografías individuales. La comparación visual de los tiempos de retención relativos, las respuestas de los picos (el área del pico o la altura del pico), el número de picos y el patrón de elución global se completa inicialmente. Luego se complementa y respalda con el análisis matemático de los cocientes de respuesta de los picos y el perfil cromatográfico de una mezcla 1 :1 (v/v) de la muestra y el digerido del Estándar de Referencia USP o Material de Referencia. Si todos los picos en el digerido de la muestra y en el digerido del Estándar de Referencia USP o Material de Referencia tienen los mismos tiempos de retención relativos y cocientes de respuesta de los picos, se confirma la identidad de la muestra en análisis.
USP 39
Información General/ (1055) Artículos Obtenidos por Biotecnología 1125
Si los picos que inicialmente eluyeron con tiempos de retención relativos significativamente diferentes luego se observan como picos únicos en la mezcla 1 :1, la diferencia inicial sería una indicación de la variabilidad del sistema. Sin embargo, si se observan picos separados en la mezcla 1 :1, esto indicaría la no equivalencia de los péptidos en cada pico. Si un pico en la mezcla 1 :1 es significativamente más ancho que el pico correspondiente en la muestra y el digerido del Estándar de Referencia USP o Material de Referencia, podría indicar la presencia de péptidos diferentes. Se ha propuesto y aplicado un software de reconocimiento de patrones para el análisis de los datos del mapeo de péptidos, pero los problemas relacionados con la validación del software impiden que pueda usarse en una prueba farmacopeica en el futuro cercano. Se han usado otros enfoques automatizados que emplean fórmulas matemáticas, modelos y reconocimiento de patrones. Se han propuesto enfoques tales como, por ejemplo, la identificación automatizada de compuestos por espectroscopia IR y la aplicación de análisis espectral UV con arreglo de diodos para la identificación de péptidos. Estos métodos tienen limitaciones debido a resoluciones inadecuadas, elución conjunta de fragmentos o diferencias absolutas en las respuestas de los picos entre el Estándar de Referencia USP o Material de Referencia y los fragmentos de la muestra. La comparación numérica de los tiempos de retención y áreas o alturas de los picos se puede realizar para un grupo seleccionado de picos relevantes correctamente identificados en los mapas peptídicos. Las áreas de los picos se pueden calcular usando un pico como referencia interna con relativamente poca variación, teniendo en cuenta que la integración del área del pico es sensible a la variación de la línea base y posiblemente introduzca un error en el análisis. De modo alternativo, se puede calcular la altura porcentual del pico de cada péptido con respecto a la suma de todas las alturas de los picos para la muestra de prueba. El porcentaje se compara luego con el del pico correspondiente del Estándar de Referencia USP o Material de Referencia. La posibilidad de autohidrólisis de la tripsina se controla mediante la producción de un mapa peptídico blanco que es el mapa obtenido cuando la solución blanco se trata con tripsina. El requisito mínimo para la calificación de un mapeo de péptidos es un procedimiento de prueba aprobado que incluya la aptitud del sistema como control de prueba. En general, en una etapa temprana del proceso reglamentario, basta con la calificación del mapeo de péptidos para una proteína. A medida que avanza el proceso de aprobación reglamentario de la proteína, calificaciones adicionales de la prueba pueden incluir una validación parcial del procedimiento analítico con el fin de asegurar que el método funciona en la forma planeada en el desarrollo del mapa peptídico para la proteína especificada.
Análisis e Identificación de Péptidos Esta sección es una guía para el uso del mapeo de péptidos durante la investigación que respalda las solicitudes reglamentarias. El uso de un mapa peptídico como herramienta cualitativa no exige la caracterización completa de los picos de péptidos individuales. Sin embargo, la validación del mapeo de péptidos en respaldo de las solicitudes reglamentarias exige la caracterización rigurosa de cada pico en el mapa peptídico. Los métodos para caracterizar picos varían desde la secuenciación N-terminal de cada pico seguida por un análisis de aminoácidos hasta el uso de espectrometría de masas (MS, por sus siglas en inglés). A los efectos de la caracterización, cuando se usan la secuenciación N-terminal y el análisis de aminoácidos, la separación analítica se realiza a mayor escala. Ya que el aumento en escala puede afectar la resolución de los picos de péptidos, es necesario asegurar con datos empíricos que no haya pérdida de resolución debida al aumento en escala. Se recogen los eluatos correspondientes a picos de péptidos específicos, se concentran al vacío y se cromatografían nuevamente, según sea necesario. El análisis de aminoácidos de los fragmentos puede estar limitado por el tamaño del péptido. Si el N-terminal está bloqueado, puede ser necesario desbloquearlo antes de la secuenciación. También se puede usar la secuenciación e-terminal de las proteínas de manera conjunta con la digestión por carboxipeptidasa y espectrometría de masas por tiempo de vuelo con ionización por desorción láser asistida por matrices (MALDl-TOF MS, por sus siglas en inglés) para su caracterización. El uso de MS para la caracterización de fragmentos peptídicos se hace por infusión directa de péptidos aislados o por el uso en línea de cromatografía líquida y espectrometría de masas (LC-MS, por sus siglas en inglés) para el análisis estructural. En general, incluye el electrospray y analizadores MALDl-TOF así como también el bombardeo atómico rápido (FAB, por sus siglas en inglés). También se ha usado la MS en serie para secuenciar una proteína modificada y para determinar la modificación aminoacídica producida. La comparación de los espectros de masas de los digeridos antes y después de la reducción proporciona un método para asignar las uniones disulfuro a los diferentes péptidos que contienen sulfhidrilos. Si hay regiones de la estructura primaria que no se demuestran claramente en el mapa peptídico, podría ser necesario realizar un mapa peptídico secundario. El objetivo de un método validado de caracterización de una proteína a través del mapeo de péptidos es conciliar y explicar al menos el 95% de la composición teórica de la estructura de la proteína.
•EL USO DEL MAPEO DE PÉPTIDOS PARA LA EVALUACIÓN DE ESTABILIDAD GENÉTICA Se puede usar un mapa peptídico validado para evaluar la integridad de la secuencia primaria prevista de un producto proteíco (es decir, su estabilidad genética). También se puede usar para determinar la uniformidad lote a lote del proceso de productos biotecnológicos. Además, el desempeño de la expresión de la proteína en el sistema de producción se evalúa mejor a través del mapeo de péptidos de la proteína expresada. Los mapas peptídicos de proteínas producidos en diversas etapas de la expresión de la proteína, incluyendo un punto más allá del tiempo normal de expresión de la proteína, comparados con los de un Estándar de Referencia USP o Material de Referencia, sirven para evaluar la estabilidad genética del sistema de expresión en función del tiempo.
1126 (1 055) Artículos Obtenidos por Biotecnología / Información General
USP 39
Pueden surgir variantes de las secuencias de las proteínas a partir de una variación genética en el ADN (mutación puntual) o como un error en la traducción. El mejor enfoque es un mapa peptídico validado para la detección de variantes de proteínas. Sin embargo, se deben considerar las limitaciones inherentes del mapeo de péptidos. La detección de una variante estructurada es posible únicamente si la variante peptídica correspondiente es fácil de aislar y caracterizar. Para establecer estabilidad genética es necesario usar una batería de métodos bioquímicos, siempre que las variantes tengan propiedades distintas de las de la proteína "normal" .•
•VALIDACIÓN
Factores Críticos La validación del mapeo de péptidos exige el diseño de un protocolo que describa detalladamente el experimento a realizar y los criterios para la aceptación del mapa. Los criterios para la aceptación del mapeo incluyen límites de detección, especificidad, linealidad, intervalo, exactitud, precisión y estabilidad de los reactivos. La reproducibilidad del mapa peptídico es un elemento crítico en su utilización como prueba de identidad y para confirmar la estabilidad genética. Se analizarán aquellos aspectos técnicos del mapeo de péptidos que influencian la reproducibilidad del mapa. El ajuste de los límites, con respecto a la cuantificación (área o altura del pico) e identificación (tiempos de retención) para el grupo seleccionado de picos relevantes se basa en observaciones empíricas. Estos límites detectan diferencias significativas entre la muestra y el Estándar de Referencia USP o Material de Referencia dentro de una serie de análisis. Otro problema crítico es la recuperación de péptidos y su efecto sobre la determinación y reproducibilidad de las áreas de los picos y en el establecimiento de criterios de aceptación. Los criterios de recuperación tratan todos los aspectos de metodología de la prueba, desde la digestión hasta las condiciones cromatográficas. La determinación de la recuperación de péptidos incluye el análisis cuantitativo de aminoácidos, el agregado de cantidades conocidas (spike addition), el marcado radioactivo y la sumatoria UV. Una recuperación general de aproximadamente el 80% se considera satisfactoria. La recuperación de péptidos individuales es más problemática y se maneja caso por caso. Los factores críticos de la validación de un mapa peptídico son los siguientes. Procedimientos de Prueba Documentados por Escrito-Estos procedimientos incluyen una descripción detallada del método analítico en donde se definen los reactivos, equipos, preparación de la muestra, método de análisis y análisis de los datos. Protocolo de Validación-Se prepara un protocolo que incluye un procedimiento para la validación de la prueba. Criterio de Aceptación-El criterio puede ser mínimo en las primeras etapas, pero debe definirse mejor a medida que progresan los estudios de validación. Informe de los Resultados-En los resultados del estudio de validación se documentan los parámetros analíticos indicados en el protocolo de validación. Revalidación del Procedimiento de la Prueba-Si el método empleado requiere alteraciones que podrían afectar los parámetros analíticos previamente evaluados en la validación, es necesario volver a validar el procedimiento de la prueba. Si hay cambios significativos en el procesamiento del artículo, en los laboratorios que realizan el análisis, en la formulación de los productos a granel o terminados y en cualquier otro parámetro importante, se requerirá la revalidación de los métodos.
Requisitos PRECISIÓN Precisión lntra Prueba-Es una medida de la reproducibilidad del mapeo de péptidos. Los dos pasos críticos en el mapeo de péptidos son la fragmentación (es decir, digestión) y la separación de péptidos. La precisión es aceptable cuando los tiempos de retención absolutos y las áreas de los picos relativos son constantes de corrida a corrida y la variación promedio en el tiempo de retención es pequeña en relación con la del pico de referencia interno seleccionado. La reproducibilidad del mapa se puede mejorar si se usa un horno con columna con control de temperatura, si se equilibra exhaustivamente el sistema antes de comenzar la prueba, si primero se realiza una determinación con un blanco (mezcla de digerido control sin proteína) para minimizar los "efectos de la primera corrida" y si se intercala periódicamente un digerido del Material de Referencia o del Estándar de Referencia USP con las muestras de prueba para evaluar la variación sistemática de la cromatografía. Los criterios para validar el paso de fragmentación son similares a los descritos a continuación para la separación de péptidos, pero se cumplen para pruebas consecutivas de una serie de digeridos preparados por separado de la proteína en análisis. Los criterios para la validación del paso de separación de péptidos incluyen lo siguiente: 1. La desviación estándar promedio de los tiempos de retención absolutos de todos los picos principales para un conjunto de pruebas consecutivas del mismo digerido no excede un criterio de aceptación especificado. 2. La desviación estándar promedio del área de pico absoluta para todos los picos principales totalmente resueltos no excede un porcentaje especificado. Precisión lnter Pruebas-Esta es una medida de la reproducibilidad del mapeo de péptidos cuando la prueba se realiza en distintos días, por distintos analistas, en distintos laboratorios, con reactivos o enzimas de distintos proveedores o con distintos lotes del mismo proveedor, con instrumental diferente, en columnas de fabricación distinta o columnas de igual fabricación
USP 39
Información General/ (1055) Artículos Obtenidos por Biotecnología 1127
pero de lotes distintos y en columnas individuales de la misma fabricación y el mismo lote. Si bien sería preferible, desde una perspectiva científica, validar el efecto de todas estas variables sobre la precisión, un enfoque práctico es validar la prueba usando aquellas variables que sean más probables de encontrar en condiciones operativas. Se pueden incluir variables adicionales cuando sea necesario. El diseño experimental permite al analista realizar comparaciones usando tiempos de retención de picos y áreas de picos que se expresan con relación a un pico de referencia interno altamente reproducible dentro del mismo cromatograma. El área de pico relativa se expresa como el cociente entre el área del pico y el área del pico de referencia interna. El tiempo de retención relativo se puede expresar como la diferencia entre el tiempo de retención absoluto y el tiempo de retención del pico de referencia. El uso de valores relativos elimina la necesidad de realizar correcciones separadas por diferencias de volumen de un inyector a otro, por unidades de medición de las áreas de los picos, por dimensiones de la columna y por volúmenes de espacio muerto de los instrumentos. Se espera que la variabilidad en los tiempos de retención y en las áreas de los picos para los experimentos de Precisión lnter Pruebas sea ligeramente mayor que la variabilidad observada para la Precisión lntra Prueba. ROBUSTEZ La composición de la Fase Móvil, la calidad de la proteasa o la pureza de los reactivos químicos, la variación y edad de la columna y la estabilidad del digerido son todos factores que podrían afectar el desempeño general de la prueba y su reproducibilidad. Se evalúan las tolerancias para cada parámetro clave y se establecen los límites de la línea de base en caso de que la prueba se use para la liberación rutinaria de lotes. Fase Móvil-La composición de la Fase Móvil se optimizará para obtener la máxima resolución de péptidos en todo el perfil de elución. Se prefiere un equilibrio entre la resolución óptima y la reproducibilidad general. Un pH más bajo podría mejorar la separación entre los picos pero podría acortar la vida de la columna, dando como resultado una falta de reproducibilidad. Los mapas peptídicos a un pH por encima o por debajo del pH del procedimiento se comparan con el mapa peptídico obtenido al pH del procedimiento y se observa si hay diferencias significativas; también se revisan con respecto a los criterios de aceptación establecidos en el protocolo de validación. Calidad de la Proteasa o Pureza de los Reactivos Químicos-Se prepara y digiere una muestra del Estándar de Referencia USP o Material de Referencia para la proteína en análisis con distintos lotes del agente de escisión. En los cromatogramas para cada digerido se comparan las áreas de los picos, su forma y el número de picos. Se puede aplicar el mismo procedimiento a otras sustancias químicas o tratamientos previos usados durante la preparación de la muestra, como por ejemplo los reactivos reductores y de carboximetilación. Consideraciones de la Columna-La variabilidad entre una columna y otra, incluso dentro de un mismo lote, puede afectar el desempeño de la columna en el desarrollo de mapas peptídicos. El tamaño de la columna también puede producir diferencias significativas. Se digiere un Estándar de Referencia USP o Material de Referencia de la proteína de prueba y el digerido se cromatografía en distintos lotes de columna de un mismo fabricante. Luego se evalúa el perfil de elución general, los tiempos de retención, la resolución de selectividad y la recuperación de los mapas. Para evaluar la robustez de la columna durante toda su vida útil, se debe realizar una prueba de mapeo de péptidos en distintas columnas y variar significativamente el número de inyecciones (por ejemplo,· de 1O inyecciones a 250 inyecciones). Los mapas resultantes se comparan buscando diferencias significativas en el ensanchamiento de los picos, área de los picos y resolución general. A medida que la columna envejece, podría observarse un aumento en la contrapresión que podría afectar los mapas peptídicos. Una precaución razonable en el uso de columnas de mapeo de péptidos es seleccionar columnas alternativas, en caso de que las columnas originales no estén disponibles o dejen de fabricarse. Realizar una prueba de mapeo de péptidos usando columnas equivalentes de distintos fabricantes y examinar los mapas. Las diferencias en la forma y el tamaño de las partículas, el tamaño y volumen de los poros, la carga de carbono y el recubrimiento exhaustivo (end-capping) pueden dar lugar a diferencias significativas en los tiempos de retención, la selectividad del perfil de elución, la resolución y la recuperación. Podría ser necesario hacer ligeras modificaciones en el perfil del gradiente para lograr mapas equivalentes cuando se usen columnas de distintos fabricantes. [NOTA-Debe considerarse la equivalencia entre la instrumentación usada para la validación de la prueba y para la prueba de control de calidad de rutina. Podría ser preferible usar el mismo sistema HPLC para todas las aplicaciones. De lo contrario, se determina la equivalencia de los sistemas, lo cual puede exigir algunos cambios en las condiciones de la prueba cromatográfica.] Estabilidad del Digerido-Se evalúa el tiempo de almacenamiento de un digerido y las condiciones de almacenamiento antes de la cromatografía. Se almacenan varias alícuotas de un mismo digerido en distintas condiciones de almacenamiento y se cromatografían. Estos mapas luego se evalúan para buscar diferencias significativas. REPRODUCIBILIDAD Se repite la determinación de varios de los parámetros indicados anteriormente usando el mismo Estándar de Referencia USP o Material de Referencia y la misma muestra de prueba en al menos dos laboratorios distintos y por dos analistas, equipados con sistemas HPLC similares. Luego se evalúan los mapas peptídicos generados para ver si existen diferencias significativas .•
1128 (1056) Artículos Obtenidos por Biotecnología / Información General
USP 39
(1056) ARTÍCULOS OBTENIDOS POR BIOTECNOLOGÍAELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA Este capítulo proporciona guías y procedimientos utilizados para la caracterización de artículos obtenidos por biotecnología mediante electroforesis en gel de poliacrilamida. Este capítulo ha sido armonizado con los capítulos correspondientes en la Farmacopea japonesa (/P) y la Farmacopea Europea (EP). Las partes de este capítulo que no están armonizadas con las dos farmacopeas mencionadas están marcadas con el símbolo +. También se muestran otras pruebas de caracterización armonizadas en Artículos Obtenidos por Biotecnología-Análisis de Aminoácidos (1052), Electroforesis Capilar (1053), Artículos Obtenidos por Biotecnología-/soelectroenfoque (1054), Artículos Obtenidos por Biotecnología-Mapeo de Péptidos (1055) y Artículos Obtenidos por Biotecnología-Valoración de Proteínas Totales (1057).
INTRODUCCIÓN
Alcance La electroforesis en gel de poliacrilamida se utiliza para la caracterización cualitativa de proteínas en preparaciones biológicas, para controles de pureza y para determinaciones cuantitativas.
Propósito La electroforesis analítica en gel es un método apropiado con el que se identifica y evalúa la homogeneidad de las proteínas en las preparaciones farmacéuticas. El método generalmente se utiliza para la estimación de masas moleculares de subunidades de proteínas y para la determinación de composiciones de subunidades de proteínas purificadas. Los geles y reactivos listos para usar se encuentran disponibles comercialmente y se pueden usar en lugar de los descritos en este capítulo, siempre y cuando ofrezcan resultados equivalentes y cumplan con los requisitos de validez que se citan en Validación de la Prueba.
CARACTERÍSTICAS DE LOS GELES DE POLIACRILAMIDA Las propiedades de tamizado de los geles de poliacrilamida se establecen mediante la red tridimensional de fibras y poros que se forma cuando la bisacrilamida bifuncional se entrecruza en forma adyacente a las cadenas de poliacrilamida. La polimerización por lo regular se cataliza con un sistema generador de radicales-libres compuesto de persulfato de amonio y N,N,N~N ~tetrametiletilendiamina (TEMED). A medida que aumenta la concentración de acrilamida de un gel, disminuye el tamaño efectivo de sus poros. El tamaño efectivo del poro de un gel se define operacionalmente por sus propiedades de tamizado, es decir, por la resistencia que imparte a la migración de macromoléculas. Existen límites con respecto a las concentraciones de acrilamida que se pueden usar. En concentraciones altas de acrilamida, los geles se rompen con mucha más facilidad y son difíciles de manipular. A medida que disminuye el tamaño del poro de un gel, disminuye la velocidad de migración de una proteína a través del gel. Al ajustar el tamaño de poro de un gel, mediante la modificación de la concentración de acrilamida, se puede optimizar la resolución del método para un producto proteico dado. Por lo tanto, un gel se caracteriza físicamente por su composición de acrilamida y bisacrilamida. Además de la composición del gel, el estado de la proteína es un factor importante de la movilidad electroforética. En el caso de las proteínas, la movilidad electroforética depende del valor pK de los grupos cargados y del tamaño de la molécula. Está influenciada por el tipo, la concentración y el pH de la solución amortiguadora; por la temperatura y la intensidad del campo; y por la naturaleza del material de soporte.
ELECTROFORESIS DESNATURALIZANTE EN GEL DE POLIACRILAMIDA El método citado a manera de ejemplo se limita al análisis de polipéptidos monoméricos con un intervalo de masa de 14 000 a -100 000 Da. Es posible ampliar este intervalo de masa mediante diversas técnicas (por ejemplo, sistemas de geles de gradiente o de soluciones amortiguadoras particulares). Por ejemplo, los geles de tricina-dodecilsulfato de sodio (SDS, por sus siglas en inglés) emplean tricina en lugar de glicina (en el método descrito en este capítulo) como el ión trasero en la solución amortiguadora de corrida para electroforesis, pueden separar proteínas muy pequeñas y péptidos por debajo de 1O00015 000 Da. La electroforesis desnaturalizante en gel de poliacrilamida usando glicina SDS (SDS-PAGE) es el modo más común de electroforesis para evaluar la calidad farmacéutica de productos proteicos y es el objeto de estudio del método de ejemplo. Típicamente, la electroforesis analítica de proteínas se realiza en geles de poliacrilamida bajo condiciones que aseguran la disociación de las proteínas en sus subunidades polipeptídicas individuales y que minimizan la aglomeración de estas subunidades. El detergente SDS fuertemente aniónico se usa más comúnmente en combinación con calor para disociar las proteínas antes de
USP 39
Información General/ (1 056) Artículos Obtenidos por Biotecnología 1129
que se coloquen en el gel. Los polipéptidos desnaturalizados se unen al SDS, adquieren carga negativa y exhiben una relación carga-masa estable, sin importar el tipo de proteína. Como la cantidad de SDS unido casi siempre es proporcional a la masa molecular del polipéptido y es independiente de su secuencia, los complejos SDS-polipéptido migran a través de los geles de poliacrilamida cuyas movilidades dependen del tamaño del polipéptido. Las movilidades electroforéticas de todos los complejos de detergente-polipéptido resultantes adoptan la misma relación funcional con sus masas moleculares. Los complejos SDS migran de modo previsible hacia el ánodo, observándose que los complejos de baja masa molecular migran más rápido que los complejos más grandes. La masa molecular de una proteína se puede estimar por su movilidad relativa en SDS-PAGE calibrada y la intensidad de una banda única con respecto a otras bandas no deseadas en un gel de este tipo puede ser una medición de la pureza. Sin embargo, las modificaciones de la cadena polipeptídica, tales como la N-glicosilación o la 0-glicosilación, pueden cambiar la masa molecular aparente de una proteína, debido a que el SDS no se une a una parte de carbohidrato de la misma manera que a un polipéptido; por lo tanto, no se mantiene una relación entre masa y carga uniforme. Dependiendo del grado de glicosilación y de otras modificaciones postraduccionales, la masa molecular aparente de proteínas puede no reflejar con exactitud la masa de la cadena polipeptídica.
Condiciones Reductoras Las subunidades de polipéptidos y la estructura tridimensional por lo general se mantienen en las proteínas mediante uniones disulfuro. Uno de los objetivos del análisis SDS-PAGE en condiciones reductoras es romper esta estructura por reducción de las uniones disulfuro. La desnaturalización y disociación completa de proteínas por tratamiento con 2-mercaptoetanol (2-ME) o ditiotreitol (DTI) despliega el esqueleto polipeptídico, formándose luego un complejo con SDS. Con estas condiciones, la masa molecular de las subunidades de polipéptidos puede ser calculada de manera razonable por regresión lineal (o, de manera más cercana mediante regresión no lineal) en presencia de estándares adecuados de masa molecular.
Condiciones No Reductoras Para algunos análisis, no es conveniente la disociación completa de la proteína en subunidades peptídicas. En ausencia de tratamiento con agentes reductores tales como 2-ME o DTI, los enlaces disulfuro covalentes permanecen intactos, preservando la forma oligomérica de la proteína. Los complejos de SOS-proteína oligomérica migran más lentamente que sus subunidades SDS-polipéptido. Además, las proteínas no reducidas no se pueden saturar por completo con SDS y, por lo tanto, no pueden unirse al detergente en una relación de masa constante. Asimismo, las uniones disulfuro dentro de la cadena limitan la forma molecular generalmente de una manera que reduce el radio de Stokes de la molécula, reduciendo así la masa molecular aparente, M,. Esto hace que las determinaciones de masa molecular de estas moléculas mediante SDS-PAGE sean menos sencillas que los análisis de po!ipéptidos completamente desnaturalizados, porque es necesario que las proteínas estándar y las proteínas desconocidas estén presentes en configuraciones similares para que las comparaciones sean válidas.
CARACTERÍSTICAS DE UNA ELECTROFORESIS EN GEL CON SISTEMA AMORTIGUADOR DISCONTINUO El método electroforético más popular para la caracterización de mezclas complejas de proteínas usa un sistema amortiguador de pH discontinuo que incluye dos geles contiguos pero diferenciados: un gel de resolución o separador (inferior) y un gel concentrador (superior). Los dos geles están conformados con diferentes porosidades, pH y fuerzas iónicas. Además, se usan distintos iones móviles en el gel y en los amortiguadores de pH de los electrodos. La discontinuidad del amortiguador actúa para concentrar muestras de gran volumen en el gel concentrador, mejorando así la resolución. Cuando se aplica electricidad, se produce una caída de voltaje a través de la solución de muestra que conduce a las proteínas hacia el gel concentrador. Los iones de glicinato del amortiguador de pH de los electrodos siguen a las proteínas hacia el gel concentrador. Se forma rápidamente un frente móvil con los iones de cloruro de alta movilidad adelante y los iones relativamente lentos de glicinato atrás. Se forma un gradiente de alto voltaje localizado entre los frentes de iones delanteros y traseros, haciendo que los complejos SDSproteína se acumulen en una zona delgada (concentrado) y migren entre las fases de cloruro y glicinato. Dentro de un amplio límite, sin importar la altura de la muestra aplicada, todos los complejos SDS--proteína se condensan en una región muy estrecha e ingresan al gel separador como una zona delgada, bien definida, de alta densidad proteica. El gel concentrador, de grandes poros, no retrasa la migración de la mayoría de las proteínas y sirve principalmente como un medio anticonvectivo. En la interfase de los geles concentrador y separador, las proteínas experimentan un marcado incremento en el retardo debido al tamaño restrictivo del poro del gel separador y a la discontinuidad de la solución amortiguadora, lo cual también contribuye al enfoque de las proteínas. Una vez en el gel separador, las proteínas continúan siendo ralentizadas por el tamizado de la matriz. Los iones de glicinato sobrepasan a las proteínas, que se mueven entonces en un espacio de pH uniforme formado por tris(hidroximetil)aminometano (Tris) y glicina. El tamizado molecular hace que los complejos SDS-polipéptido se separen según sus masas moleculares.
11 30 (1 056) Artículos Obtenidos por Biotecnología / Información General
USP 39
PREPARACIÓN DE GELES VERTICALES DE SDS-POLIACRILAMIDA CON SISTEMA AMORTIGUADOR DISCONTINUO Esta sección describe la preparación de geles usando instrumentos particulares. Esto no se aplica a los geles preformados. En el caso de los geles preformados u otros equipos disponibles comercialmente, se deben usar las instrucciones del fabricante como guía. Se recomienda el uso de reactivos comerciales que se hayan purificado en solución. Cuando este no sea el caso, y cuando la pureza de los reactivos no sea suficiente, se aplica un pretratamiento. Por ejemplo, cualquier solución suficientemente impura como para requerir filtración debería también desionizarse con una resina de lecho mixto (intercambio aniónico-catiónico) para eliminar el ácido acrílico y otros productos de degradación cargados. Cuando se almacenan de acuerdo con las recomendaciones, las soluciones de acrilamida/bisacrilamida y persulfato sólido se mantienen estables durante periodos prolongados.
Soluciones Madre de Gel SOLUCIÓN DE ACRILAMIDA-BISACRILAMIDA AL 30% Preparar una solución que contenga 290 g de acrilamida y 1O g de metilen-bisacrilamida por litro de agua. Filtrar. SOLUCIÓN DE PERSULFATO DE AMONIO Preparar una pequeña cantidad de solución, con una concentración de 100 g/L de persulfato de amonio. [NOTA-El persulfato de amonio proporciona los radicales libres que impulsan la polimerización de la acrilamida y la bisacrilamida. Debido a que el persulfato de amonio se descompone rápidamente, se deben preparar nuevas soluciones a diario.] TEMED Usar un reactivo de grado electroforético. SOLUCIÓN DE SDS Se trata de una solución de 100 g/L de sds de grado electroforético. SOLUCIÓN AMORTIGUADORA 1,5 M Disolver 90,8 g de Tris en 400 mL de agua. Ajustar el pH a 8,8 con ácido clorhídrico y diluir hasta 500,0 mL con agua. SOLUCIÓN AMORTIGUADORA 1 M Disolver 60,6 g de Tris en 400 mL de agua. Ajustar el pH a 6,8 con ácido clorhídrico y diluir hasta 500,0 mL con agua.
Ensamblado del Casete de Moldeo del Gel Limpiar las dos placas de vidrio (con un tamaño de, p.ej., 1O cm x 8 cm), el peine de politetrafluoroetileno, los dos espaciadores y la tubería de caucho de silicona (p.ej., 0,6 mm de diámetro x 35 cm largo) con detergente suave; enjuagar minuciosamente con agua, seguida de alcohol deshidratado y dejar que las placas se sequen a temperatura ambiente. Lubricar los espaciadores y la tubería con grasa no siliconada. Colocar los espaciadores a lo largo de los dos lados cortos de la placa de vidrio, a 2 mm de los bordes y a 2 mm del lado largo correspondiente a la parte inferior del gel. Comenzar a colocar las tuberías sobre la placa de vidrio, utilizando un espaciador como guía. Cuidadosamente doblar la tubería por debajo del espaciador y seguir el lado largo de la placa de vidrio. Mientras se sostiene la tubería con un dedo por el lado largo, doblar nuevamente la tubería y colocarla sobre el segundo lado corto de la placa de vidrio, usando el espaciador como guía. Colocar la segunda placa de vidrio perfectamente alineada y mantener unido el molde haciendo presión con la mano. Colocar dos pinzas en cada uno de los dos lados cortos del molde. Colocar cuidadosamente cuatro pinzas sobre el lado largo del molde para el gel, formando así su parte inferior. Verificar que la tubería corra a lo largo del borde de las placas de vidrio y que no se haya salido al momento de colocar las pinzas. El molde del gel está ahora listo para el vertido del gel.
USP 39
Información General/ (1056) Artículos Obtenidos por Biotecnología 1131
Preparación del Gel En un sistema de gel de SDS-poliacrilamida con sistema amortiguador discontinuo, se recomienda verter el gel separador, dejar que solidifique, y luego verter el gel concentrador, debido a que los geles tienen diferente composición de acrilamidabisacrilamida, solución amortiguadora y pH. PREPARACIÓN DEL GEL SEPARADOR En un matraz Erlenmeyer, preparar el volumen adecuado de solución que contenga la concentración deseada de acrilamida para el gel separador usando los valores proporcionados según se indica en la Tabla 7. Mezclar los componentes en el orden que se muestra. Cuando corresponda, antes de agregar la Solución de Persulfato de Amonio y el TEMED, filtrar la solución si fuera necesario al vacío a través de un filtro de membrana de acetato de celulosa (con un diámetro de poro de 0,45 µm). Mantener la solución al vacío mientras se agita la unidad de filtración por rotación suave hasta que no se formen más burbujas en la solución. Agregar cantidades adecuadas de Solución de Persulfato de Amonio y de TEMED, según se indica en la Tabla 7; agitar por rotación suave y verter inmediatamente en el espacio entre las dos placas de vidrio del molde. Dejar espacio suficiente para el gel concentrador (el largo de los dientes del peine más 1 cm). Con una pipeta de vidrio cónico, cubrir cuidadosamente la solución con isobutanol saturado con agua. Dejar el gel en posición vertical, a temperatura ambiente, para permitir la polimerización. · Tabla 1. Preparaclon del Gel Separador Volumen (mL) de Componentes por Volumen del Molde del Gel Indicado Debajo Componentes de la solución
5mL
10mL
15mL
20mL
25mL
30mL
40mL
50mL
Agua
2,6
5,3
7,9
10,6
13,2
15,9
21,2
26,5
Solución de Acrilamida-Bisacrilamida al30%
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
8,0
10,0
Solución Amortiguadora 7,5 M
1,3
2,5
3,8
5,0
6,3
7,5
10,0
12,5
Solución de SOS
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,4
0,5
Solución de Persulfato de Amonio
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,4
0,5
TEMED
0,004
0,008
0,012
0,016
0,02
0,024
0,032
0,04
Agua
2,3
4,6
6,9
9,3
11,5
13,9
18,5
23,2
Solución de Acrilamida-Bisacrilamida al 30%
1,3
2,7
4,0
5,3
6,7
8,0
10,7
13,3
Solución Amortiguadora 7,5 M
1,3
2,5
3,8
5,0
6,3
7,5
10,0
12,5
Solución de SOS
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,4
0,5
Solución de Persulfato de Amonio
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,4
0,5
TEMED
0,003
0,006
0,009
0,012
0,015
0,018
0,024
0,03
Agua
1,9
4,0
5,9
7,9
9,9
11,9
15,9
19,8
Solución de Acrilamida-Bisacrilamida al30%
1,7
3,3
5,0
6,7
8,3
10,0
13,3
16,7
Solución Amortiguadora 7,5 M
1,3
2,5
3,8
5,0
6,3
7,5
10,0
12,5
Solución de SOS
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,4
0,5
Solución de Persulfato de Amonio
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,4
0,5
TEMED
0,002
0,004
0,006
0,008
0,01
0,012
0,016
0,02
Agua
1,6
3,3
4,9
6,6
8,2
9,9
13,2
16,5
Solución de Acrilamida-Bisacrilamida al30%
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
16,0
20,0
Solución Amortiguadora 7,5 M
1,3
2,5
3,8
5,0
6,3
7,5
10,0
12,5
Solución de SOS
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,4
0,5
Solución de Persulfato de Amonio
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,4
0,5
TEMED
0,002
0,004
0,006
0,008
0,01
0,012
0,016
0,02
Acrilamida al 6%
Acrilamida al 8%
Acrilamida al 10%
Acrilamida al 12%
11 32 (1056) Artículos Obtenidos por Biotecnología / Información General
USP 39
Tabla 1. Preparación del Gel Separador (Continuación) Volumen (ml) de Componentes por Volumen del Molde del Gel Indicado Debajo Componentes de la solución
5ml
10ml
15ml
20ml
25ml
30ml
40ml
50ml
Agua
1,4
2,7
3,9
5,3
6,6
8,0
10,6
13,8
Solución de Acrilamida-Bisacrilamida al 30%
2,3
4,6
7,0
9,3
11,6
13,9
18,6
23,2
Solución Amortiguadora 1,5 M
1,2
2,5
3,6
5,0
6,3
7,5
10,0
12,5
Solución de SOS
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,4
0,5
Solución de Persulfato de Amonio
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,4
0,5
TEMED
0,002
0,004
0,006
0,008
0,01
0,012
0,016
0,02
Agua
1, 1
2,3
3,4
4,6
5,7
6,9
9,2
11,5
Solución de Acrilamida-Bisacrilamida al30%
2,5
5,0
7,5
10,0
12,5
15,0
20,0
25,0
Solución Amortiguadora 1,5 M
1,3
2,5
3,8
5,0
6,3
7,5
10,0
12,5
Solución de SOS
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,4
0,5
Solución de Persulfato de Amonio
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,4
0,5
TEMED
0,002
0,004
0,006
0,008
0,01
0,012
0,016
0,02
Acrilamida al 14%
Acrilamida al 15%
PREPARACIÓN DEL GEL CONCENTRADOR Una vez finalizada la polimerización (aproximadamente 30 minutos), retirar el isobutanol y lavar la superficie del gel varias veces con agua para quitar la capa de isobutanol y toda la acrilamida no polimerizada. Drenar tanto líquido como sea posible de la parte superior del gel y luego quitar el agua remanente usando el borde de una toalla de papel. En un matraz Erlenmeyer, preparar el volumen adecuado de solución con la concentración deseada de acrilamida, usando los valores proporcionados en la Tabla 2. Mezclar los componentes en el orden que se muestra. Cuando corresponda, antes de agregar la Solución de Persulfato de Amonio y el TEMED, filtrar la solución si fuera necesario al vacío a través de un filtro de membrana de acetato de celulosa (con un diámetro de poro de 0,45 µm). Mantener la solución al vacío mientras se agita la unidad de filtración por rotación suave hasta que no se formen más burbujas en la solución. Agregar cantidades adecuadas de Solución de Persulfato de Amonio y de TEMED, según se indica en la Tabla 2. Agitar por rotación suave y verter inmediatamente en el espacio entre las dos placas de vidrio del molde, directamente sobre la superficie del gel separador polimerizado. Introducir inmediatamente un peine de politetrafluoroetileno limpio en la solución de gel concentrador, con cuidado para no atrapar burbujas de aire. Agregar más solución de gel concentrador para llenar completamente los espacios del peine. Colocar el gel en posición vertical y dejar polimerizar a temperatura ambiente. Tabla 2. Preparación del Gel Concentrador Volumen (ml) de Componentes por Volumen del Molde del Gel Indicado Debalo 1 ml
2ml
3 ml
4ml
5ml
6ml
8ml
10ml
Agua
Componentes de la solución
0,68
1,4
2,1
2,7
3,4
4,1
5,5
6,8
Solución de Acrilamida-Bisacrilamida al30%
0,17
0,33
0,5
0,67
0,83
1,0
1,3
1,7 1,25
Solución Amortiguadora 1, OM
0,13
0,25
0,38
0,5
0,63
0,75
1,0
Solución de SOS
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,08
0,1
Solución de Persulfato de Amonio
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,08
0,1
TEMED
0,001
0,002
0,003
0,004
0,005
0,006
0,008
0,01
Preparación de la Muestra A menos que se especifique de otro modo en la monografía específica, las muestras pueden prepararse de la siguiente manera:
USP 39
Información General/ (1056) Artículos Obtenidos por Biotecnología 11 33
SOLUCIÓN AMORTIGUADORA DE MUESTRA PARA SDS-PAGE (CONCENTRADA) Disolver 1,89 g de Tris, 5,0 g de lauril sulfato de sodio y 50 mg de azul de bromofenol en agua. Agregar 25,0 mL de glicerol y diluir hasta 100 mL con agua. Ajustar el pH a 6,8 con ácido clorhídrico y diluir hasta 125 mL con agua. SOLUCIÓN AMORTIGUADORA DE MUESTRA PARA SDS-PAGE EN GELES EN CONDICIONES REDUCTORAS (CONCENTRADA) Disolver 3,78 g de Tris, 10,0 g de SDS y 100 mg de azul de bromofenol en agua. Agregar 50,0 mL de glicerol y diluir hasta 200 mL con agua. Agregar 25,0 mL de 2-ME. Ajustar a un pH de 6,8 con ácido clorhídrico y diluir hasta 250,0 mL con agua. Alternativamente, se puede usar DTI como agente reductor en lugar de 2-ME. En este caso, preparar la solución amortiguadora de muestra según se indica a continuación: Disolver 3,78 g de Tris, 10,0 g de SDS y 100 mg de azul de bromofenol en agua. Agregar 50,0 mL de glicerol y diluir hasta 200 mL con agua. Ajustar a un pH de 6,8 con ácido clorhídrico y diluir hasta 250,0 mL con agua. Inmediatamente antes de usar, agregar DTI hasta una concentración final 100 mM. SOLUCIÓN AMORTIGUADORA DE CORRIDA PARA SDS-PAGE Disolver 151,4 g de Tris, 721,0 g de glicina y 50,0 g de lauril sulfato de sodio en agua, y diluir hasta 5000 mL con el mismo disolvente. Inmediatamente antes de usar, diluir 1O veces su volumen con agua y mezclar. Medir el pH de la solución diluida. El pH es entre 8, 1 y 8,8. SOLUCIÓN MUESTRA (CONDICIONES NO REDUCTORAS) Mezclar volúmenes iguales de: una mezcla de agua más la preparación o las soluciones de referencia y la Solución Amortiguadora de Muestra para SDS-PAGE (Concentrada). SOLUCIÓN MUESTRA (CONDICIONES REDUCTORAS) Mezclar volúmenes iguales de: una mezcla de agua más la preparación o las soluciones de referencia y la Solución Amortiguadora de Muestra para SDS-PAGE para Condiciones Reductoras (Concentrada) que contenga 2-ME (o DTI) como agente reductor. La concentración prescrita en la monografía puede variar dependiendo de la proteína y del método de tinción. Tratamiento de la muestra: Mantener durante 5 minutos en un baño de agua en ebullición o en un bloque de calentamiento ajustado a 100º y luego enfriar. (Tener en cuenta que la temperatura y el tiempo pueden variar en la monografía debido a que se puede presentar la escisión de proteína durante el tratamiento con calor.)
Montaje del Gel en el Aparato de Electroforesis y Separación Electroforética Una vez completada la polimerización (aproximadamente 30 minutos), retirar cuidadosamente el peine de politetrafluoroetileno. Enjuagar inmediatamente los pocillos con agua o con la Solución Amortiguadora de Corrida para SDS-PAGE para eliminar toda la acrilamida no polimerizada. Si fuera necesario, enderezar los dientes del gel concentrador con una aguja hipodérmica roma conectada a una jeringa. Quitar las pinzas de uno de los lados cortos, retirar cuidadosamente la tubería y volver a colocar las pinzas. Proceder de manera similar con el otro lado corto. Quitar la tubería de la parte inferior del gel. Montar el gel en el aparato de electroforesis. Agregar las soluciones amortiguadoras de electroforesis a los recipientes superior e inferior. Quitar cualquier burbuja que haya quedado atrapada en el fondo del gel, entre las placas de vidrio. Esta eliminación se realiza mejor con una aguja hipodérmica roma conectada a una jeringa. Nunca se debe correr previamente el gel antes de cargar las muestras porque esto destruiría la discontinuidad de los sistemas amortiguadores de pH. Antes de cargar la muestra, enjuagar cuidadosamente cada pocillo con Solución Amortiguadora de Corrida para SDS-PAGE. Preparar las soluciones de prueba y de referencia en la solución amortiguadora de muestra recomendada y tratar según se indica en la monografía individual. Aplicar el volumen adecuado de cada solución a los pocillos de gel concentrador. Comenzar la electroforesis usando las condiciones recomendadas por el fabricante del equipo. Los fabricantes de equipos para SDS-PAGE pueden proveer geles de diferentes áreas y espesores, y el tiempo de corrida y la corriente o el voltaje de la electroforesis puede variar para lograr la separación óptima. Verificar que el frente de tinción se mueva hacia el gel separador. Detener la electroforesis cuando la tinción esté cerca del fondo del gel. Retirar el montaje de gel del aparato y separar cuidadosamente las placas de vidrio. Quitar los espaciadores, cortar y desechar el gel concentrador y proceder de inmediato con la tinción.
11 34 (1 056) Artículos Obtenidos por Biotecnología / Información General
USP 39
ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA-DODECIL SULFATO DE SODIO-GELES EN GRADIENTE DE CONCENTRACIÓN Los geles de gradiente (geles separadores) se preparan con una concentración creciente de acrilamida desde la parte superior hacia la parte inferior. La preparación de los geles en gradiente requiere de un aparato de formación de gradiente. Se encuentran disponibles comercialmente geles en gradiente listos para usar con protocolos recomendados específicos. Los geles en gradiente ofrecen algunas ventajas sobre los geles de concentración fija. Algunas proteínas que ca-migran en los geles de concentración fija pueden resolverse dentro de los geles en gradiente. Durante la electroforesis las proteínas migran hasta que el tamaño de poro detiene su avance y, por ende, se presenta un efecto concentrador, lo que resulta en bandas más pronunciadas. De acuerdo con la Tabla 3, los geles en gradiente también permiten la separación de un rango más amplio de masas moleculares de proteína que los geles de concentración fija. La Tabla 3 provee composiciones sugeridas del gradiente lineal, relacionando el rango de concentraciones de acrilamida con los rangos moleculares de proteína apropiados. Se debe tener en cuenta que se pueden preparar otras formas de gradiente (p.ej., cóncava) para aplicaciones específicas. Tabla 3. Porcentajes de Gradiente de Acrllamlda Recomendados para los Pesos MI o ecu 1ares dP e rote 'mas Espera dos Acrllamlda
(%)
Rango de Proteínas (kDa)
5-15 5-20 10-20 8-20
20-250 10-200 10-150 8-150
Los geles en gradiente también se usan para la determinación de masas moleculares y la determinación de pureza de las proteínas.
DETECCIÓN DE PROTEÍNAS EN GELES La tinción con Coomassie y plata son los métodos de tinción más comunes y se describen en mayor detalle a continuación. Se encuentran disponibles otros colorantes, métodos de detección y kits comerciales. Por ejemplo, las tinciones fluorescentes se visualizan usando un generador de imágenes fluorescente y a menudo proveen una respuesta lineal a lo largo de un amplio rango de concentraciones de proteína-por lo regular con diversos órdenes de magnitud, dependiendo de la proteína. La tinción de Coomassie tiene un nivel de detección de proteína de aproximadamente 1-1 O µg de proteína por banda. La tinción con plata es el método más sensible para teñir proteínas en geles y es posible detectar una banda que contenga 10100 ng. Dichas cifras se consideran robustas en el contexto de estos geles. La sensibilidad mejorada en uno o dos órdenes de magnitud ha sido referida en la bibliografía relacionada. La tinción de Coomassie responde de manera más lineal que la tinción con plata, aunque la respuesta y el intervalo dependen de la proteína y del tiempo de desarrollo. Tanto la tinción con Coomassie como con plata pueden ser menos reproducibles si la tinción se detiene de manera subjetiva, es decir, cuando el analista considera que la tinción es satisfactoria. Es importante usar rangos dinámicos amplios de proteínas de referencia debido a que ayudan a evaluar la sensibilidad y la linealidad intra-experimental. Todas las etapas de la tinción del gel se llevan a cabo usando guantes, a temperatura ambiente, con agitación suave (p.ej., en la plataforma de un agitador orbital) y usando cualquier recipiente apropiado.
Reactivos de Tinción SOLUCIÓN DE DECOLORACIÓN Preparar una mezcla de 1 volumen de ácido acético glacial, 4 volúmenes de metanol y 5 volúmenes de agua. SOLUCIÓN DE TINCIÓN DE COOMASSIE Preparar una solución de 1,25 g/L de azul ácido 83 en Solución de decoloración. Filtrar. SOLUCIÓN FIJADORA Agregar 0,27 mL de formaldehído a 250 mL de metanol y diluir con agua hasta 500,0 ml.
USP 39
Información General/ (1 056) Artículos Obtenidos por Biotecnología 11 35
REACTIVO DE NITRATO DE PLATA Agregar, gota a gota y mezclando, 8 mL de una solución de 200 g/L de nitrato de plata a una mezcla de 3 mL de amoníaco concentrado y 40 mL de hidróxido de sodio 1 M. Diluir hasta 200 mL con agua. SOLUCIÓN DE DESARROLLO Diluir 2,5 mL de una solución de 20 g/L de ácido cítrico y 0,27 mL de formaldehído hasta 500,0 mL con agua. SOLUCIÓN DE DETENCIÓN Una solución de ácido acético al 10% (v/v).
Tinción de Coomassie Sumergir el gel en un gran exceso de Solución de Tinción de Coomassie y dejar en reposo durante al menos 1 hora. Retirar la solución de tinción. Decolorar el gel con un gran exceso de Solución de Decoloración. Cambiar la Solución de Decoloración varias veces, hasta que las bandas de proteína teñidas se distingan claramente sobre un fondo transparente. Cuanto más completamente se decolore el gel, menor será la cantidad de proteína detectable por el método. Se puede lograr una decoloración más rápida incluyendo unos pocos gramos de resina de intercambio aniónico o una esponja pequeña en la Solución de Decoloración. [NOTA-Las soluciones de alcohol-ácido usadas en este procedimiento no fijan completamente las proteínas en el gel. Esto puede conducir a pérdidas de algunas proteínas de baja masa molecular durante la tinción y decoloración de geles delgados. La fijación permanente se puede lograr dejando el gel en reposo en una mezcla de 1 volumen de ácido tricloroacético, 4 volúmenes de metano! y 5 volúmenes de agua durante 1 hora antes de sumergirla en la Solución de Tinción de Coomassie.]
Tinción con Plata Sumergir el gel en un gran exceso de Solución Fijadora y dejar en reposo durante 1 hora. Desechar la Solución Fijadora, agregar Solución Fijadora recién preparada, e incubar durante al menos 1 hora, o durante toda la noche si fuera conveniente. Desechar la Solución Fijadora y lavar el gel en un gran exceso de agua durante 1 hora. Embeber el gel durante 15 minutos en una solución de glutaraldehído al 1o/o (v/v). Lavar el gel dos veces durante 15 minutos en un gran exceso de agua. Embeber el gel en Reactivo de Nitrato de Plata recién preparado durante 15 minutos en la oscuridad. Lavar el gel tres veces durante 5 minutos en un gran exceso de agua. Sumergir el gel durante aproximadamente 1 minuto en Solución de Desarrollo hasta obtener una tinción satisfactoria. Detener el desarrollo mediante incubación en la Solución de detención durante 15 minutos. Enjuagar el gel con agua.
REGISTRO DE RESULTADOS Los geles deben fotografiarse o barrerse mientras aún estén húmedos o después de un proceso de secado apropiado. En la actualidad, se encuentran disponibles comercialmente sistemas de barrido de geles con un software de análisis de datos para fotografiar y analizar el gel húmedo inmediatamente. Dependiendo del método de tinción empleado, los geles se tratan de manera ligeramente distinta. Para la tinción de Coomassie, después del paso de decoloración, dejar el gel en reposo en una solución de glicerol de 100 g/L durante al menos 2 horas (es posible incubar durante toda la noche). Para la tinción con plata, agregar al enjuague final un paso de 5 minutos de inmersión en una solución de glicerol de 20 g/L. Uno de los métodos para obtener una documentación permanente consiste en secar los geles de poliacrilamida teñidos con SDS. Este método con frecuencia resulta en la ruptura del gel durante el secado entre películas de celulosa. Sumergir dos láminas de película de celulosa porosa en agua, e incubar durante 5-1 O minutos. Colocar una de las láminas en un marco de secado. Levantar el gel cuidadosamente y colocarlo sobre la lámina de película de celulosa. Eliminar todas las burbujas de aire atrapadas y verter algunos mL de agua alrededor de los bordes del gel. Colocar la segunda lámina por encima y eliminar todas las burbujas de aire atrapadas. Completar el montaje del marco de secado. Colocar en una estufa o dejar a temperatura ambiente hasta que esté seco.
DETERMINACIÓN DE LA MASA MOLECULAR Las masas moleculares de las proteínas se determinan por comparación de sus movilidades con las de varias proteínas marcadoras de peso molecular conocido. Para la calibración de geles, se encuentran disponibles mezclas de proteínas previamente teñidas y sin teñir con masas moleculares conocidas con precisión, combinadas para una tinción uniforme. Están disponibles
1136 (1056) Artículos Obtenidos por Biotecnología / Información General
USP 39
en diversos rangos de masas moleculares. Las soluciones madre concentradas de proteínas de masa molecular conocida se diluyen en el amortiguador del pH de muestra apropiado y se cargan en el mismo gel que la muestra de proteína a estudiar. Inmediatamente después de correr el gel, marcar la posición del colorante de rastreo de azul de bromofenol para identificar el borde frontal de iones electroforéticos. Esto se puede realizar cortando muescas en los bordes del gel, o insertando en el gel, en el frente de tinción una aguja empapada en tinta China. Después de la tinción, medir las distancias de migración de cada banda de proteína (marcadoras y desconocidas) desde la parte superior del gel separador. Dividir la distancia de migración de cada proteína por la distancia recorrida por el colorante de rastreo. Las distancias de migración normalizadas se denominan movilidades relativas de las proteínas (con respecto al frente de tinción) o RF" Construir una gráfica del logaritmo de las masas moleculares relativas (M,) de los estándares de proteínas en función de los valores RF. Las masas moleculares desconocidas se pueden estimar mediante análisis de regresión lineal (con mayor exactitud, mediante análisis de regresión no lineal) o por interpolación a partir de las curvas de logaritmo M, en función de RF siempre que los valores obtenidos para las muestras desconocidas se coloquen a lo largo de la parte lineal de la gráfica.
VALIDACIÓN DE LA PRUEBA La prueba no es válida a menos que el rango de resolución esperado del gel haya sido demostrado mediante la distribución de los marcadores de masa molecular apropiados, p.ej., a lo largo del 80% de la longitud del gel. La separación obtenida para las bandas de proteína esperadas debe presentar una relación lineal entre el logaritmo de la masa molecular y el valor RF. Si la gráfica tiene una forma sigmoidea, entonces, en los cálculos, solamente se pueden usar los datos de la región lineal de la curva. Se pueden especificar requisitos de validación adicionales con respecto a la muestra de prueba en las monografías individuales. Asimismo, se debe validar la sensibilidad. Un control de proteína de referencia correspondiente al límite de concentración deseado que se corre en paralelo con las muestras de prueba puede servir como verificación de la aptitud del sistema del experimento.
CUANTIFICACIÓN DE IMPUREZAS La SDS-PAGE a menudo se usa como una prueba de límite para impurezas. Cuando las impurezas se cuantifican por normalización con respecto a la banda principal usando un densitómetro de integración o análisis de imágenes, se debe validar la linealidad de las respuestas. Se debe tener en cuenta que, dependiendo del método de detección y de la proteína, según se describió en la introducción de la sección Detección de Proteínas en Geles, el rango lineal puede variar pero puede ser evaluado dentro de cada corrida usando una o más muestras de control que contengan un rango apropiado de concentraciones de proteínas. Cuando se especifica el límite de impurezas en la monografía individual, los analistas deben preparar una solución de referencia correspondiente a ese nivel de impureza, mediante la dilución de la solución de prueba. Por ejemplo, cuando el límite es 5%, la solución de referencia sería una dilución 1 :20 de la solución de prueba. Ninguna impureza (cualquier banda que no sea la banda principal) en el electroferograma obtenido con la solución de prueba puede ser más intensa que la banda principal obtenida con la solución de referencia. En condiciones validadas, las impurezas se pueden cuantificar por normalización con respecto a la banda principal, usando un densitómetro de integración, o mediante análisis de imagen.
(1057) ARTÍCULOS OBTENIDOS POR BIOTECNOLOGÍAVALORACIÓN DE PROTEÍNAS TOTALES Combio en la redacción: Este capítulo proporciona guías y procedimientos utilizados para la caracterización de artículos obtenidos por biotecnología. Se lo ha armonizado con los capítulos correspondientes en la Farmacopea japonesa (f P) y la Farmacopea Europea (EP). También se muestran otras pruebas de caracterización armonizadas en Artículos Obtenidos por Biotecnología-Análisis de Aminoácidos (1 052), •Electroforesis Capilar (105 3) • (AF Ol-may- 2016), Artículos Obtenidos por Biotecnología-lsoelectroenfoque (l 054 ), Artículos obtenidos por Biotecnología-Mapeo de Péptidos (1055) y Artículos Obtenidos por Biotecnología-Electroforesis en Gel de Poliacrilamida (1056).
USP 39
Información General/ (1057) Artículos Obtenidos por Biotecnología 1137
INTRODUCCIÓN Los siguientes procedimientos se proporcionan para ilustrar la determinación del contenido de proteínas totales en las preparaciones farmacopeicas. Otras técnicas, tales como HPLC, también son aceptables si se demuestra la recuperación total de proteínas. Muchos de los métodos de valoración de proteínas totales descritos a continuación se pueden realizar satisfactoriamente con equipos comerciales. [NOTA-Siempre que se necesite agua, usar agua destilada.]
Método 1 La proteína en solución absorbe la luz UV a una longitud de onda de 280 nm debido a la presencia de aminoácidos aromáticos, principalmente tirosina y triptófano. Esta propiedad es el fundamento del Método 7. La determinación de proteínas a 280 nm es principalmente una función del contenido de tirosina y triptófano de la proteína. Si la solución amortiguadora usada para disolver la proteína tiene una absorbancia elevada en relación a la del agua, hay una sustancia interferente que se puede compensar cuando el espectrofotómetro se ajusta a cero con la solución amortiguadora. Si la interferencia da como resultado una absorbancia muy alta, los resultados podrían afectarse. Además, en concentraciones bajas, la proteína puede ser absorbida en la cubeta, reduciendo así el contenido en solución. Esto puede evitarse preparando muestras más concentradas, o usando un detergente no iónico en la preparación. [NOTA-Mantener la Solución de Prueba, la Solución Estándar y la solución amortiguadora a la misma temperatura durante la prueba.] SOLUCIÓN DE PRUEBA Disolver una cantidad adecuada de la proteína en análisis en la solución amortiguadora apropiada para obtener una solución con una concentración de 0,2 a 2 mg por ml. SOLUCIÓN ESTÁNDAR A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, preparar una solución del Estándar de Referencia USP o material de referencia para la proteína en análisis en la misma solución amortiguadora y a la misma concentración que la Solución de Prueba. PROCEDIMIENTO Determinar concomitantemente las absorbancias de la Solución Estándar y de la Solución de Prueba en celdas de cuarzo a una longitud de onda de 280 nm con un espectrofotómetro adecuado (ver lllflllBllli~~~), usando la solución amortiguadora como blanco. Para obtener resultados exactos, la respuesta debe ser lineal para el intervalo de concentraciones de proteína a ser valoradas. DISPERSIÓN DE LUZ La exactitud de la determinación espectroscópica UV de la proteína puede disminuir si la muestra dispersa la luz. Si las proteínas en la solución existen como partículas de tamaño comparable con la longitud de onda de la luz de medición (250 a 300 nm), la dispersión del haz de luz produce un aumento aparente en la absorbancia de la muestra. Para calcular la absorbancia a 280 nm causada por la dispersión de luz, hay que determinar las absorbancias de la Solución de Prueba a longitudes de onda de 320; 325; 330; 335; 340; 345 y 350 nm. Usando el método de regresión lineal, trazar la gráfica del logaritmo de la absorbancia observada en función del logaritmo de la longitud de onda y determinar la curva estándar que mejor se ajuste a los puntos graficados. A partir de la gráfica así obtenida, extrapolar el valor de absorbancia causada por la dispersión de luz a 280 nm. Restar la absorbancia por dispersión de luz debido a la absorbancia total a 280 nm para obtener el valor de absorbancia de la proteína en la solución. Para reducir el efecto de la dispersión de luz, en especial si la solución está muy turbia, se puede pasar la solución por un filtro con un tamaño de poro de 0,2 µm o se puede clarificar por centrifugación. CÁLCULOS Calcular la concentración, Cu, de la proteína en la muestra de la prueba, por la fórmula: Cs(AufAs) en donde C5 es la concentración de la Solución Estándar; Au y A5 son las absorbancias corregidas de la Solución de Prueba y la Solución Estándar, respectivamente (ver \Rlli~~;-~¡~~J~i!i~lilll~I).
1138 (1057) Artículos Obtenidos por Biotecnología / Información General
USP 39
Método 2 Este método, comúnmente conocido como la valoración de Lowry, se basa en la propiedad que tienen las proteínas de reducir la mezcla cromogénica de los ácidos fosfomolíbdico y túngstico en el reactivo Folin-Ciocalteu para fenoles, que produce una absorbancia máxima a 750 nm. El reactivo Folin-Ciocalteu para fenoles reacciona principalmente con residuos tirosina en la proteína, lo cual puede conducir a una variación en la respuesta cuando se valoran diferentes proteínas. Como el método es sensible a sustancias de interferencia, se puede usar un procedimiento para precipitar la proteína de la muestra. Cuando sea necesaria la separación de las sustancias de interferencia de la proteína en la muestra de la prueba, proceder según se indica a continuación para Sustancias de Interferencia antes de la preparación de la Solución de Prueba. El efecto de las sustancias de interferencia se puede minimizar por dilución, siempre que la concentración de la proteína en análisis continúe siendo suficiente para una medición exacta. SOLUCIONES ESTÁNDAR A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, disolver el Estándar de Referencia USP o el material de referencia para la proteína en análisis, en la solución amortiguadora usada para preparar la Solución de Prueba. Diluir porciones de esta solución con la misma solución amortiguadora para obtener no menos de cinco Soluciones Estándar con concentraciones uniformemente espaciadas entre 5 y 100 µg de proteína por mL. SOLUCIÓN DE PRUEBA Disolver una cantidad adecuada de la proteína en análisis, en la solución amortiguadora apropiada para obtener una solución con una concentración "omprendida dentro del intervalo de concentraciones de las Soluciones Estándar. Una solución amortiguadora apropiada producirá un pH entre 10,0 y 10,5. BLANCO Usar la solución amortiguadora utilizada para la Solución de Prueba y las Soluciones Estándar. REACTIVOS Y SOLUCIONES Reactivo de Sulfato de Cobre-Disolver 100 mg de sulfato cúprico y 200 mg de tartrato de sodio en agua, diluir con agua a 50 mL y mezclar. Disolver 1O g de carbonato de sodio en agua a un volumen final de 50 mL y mezclar. Verter lentamente la solución de carbonato de sodio en la solución de sulfato de cobre, mezclando. Preparar esta solución a diario. Solución de SOS-Disolver 5 g de dodecilsulfato de sodio en agua y diluir con agua a 100 ml. Solución de Hidróxido de Sodio-Disolver 3,2 g de hidróxido de sodio en agua, diluir con agua a 100 mL y mezclar. Reactivo de Cobre Alcalino-Preparar una mezcla de Reactivo de Sulfato de Cobre, Solución de SOS y Solución de Hidróxido de Sodio (1:2:1 ). Este reactivo se puede almacenar a temperatura ambiente hasta 2 semanas. Reactivo Folin-Ciocalteu para Fenoles Diluido-Mezclar 1O mL de Folin-Ciocalteu para Fenoles SR con 50 mL de agua. Almacenar en un frasco ámbar, a temperatura ambiente. PROCEDIMIENTO Agregar 1 mL de Reactivo de Cobre Alcalino a 1 mL de cada Solución Estándar, a 1 mL de la Solución de Prueba y a 1 mL del Blanco y mezclar. Dejar en reposo a temperatura ambiente durante 1 O minutos. Agregar 0,5 mL del Reactivo Folin-Ciocalteu para Fenoles Diluido a cada solución, mezclar inmediatamente cada tubo y dejar reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Determinar las absorbancias de las soluciones obtenidas de las Soluciones Estándar y la Solución de Prueba a la longitud de onda de absorbancia máxima a 750 nm con un espectrofotómetro adecuado (ver •(857)• (AF oi-may-2016¡), usando la solución del Blanco para ajustar el instrumento a cero. CÁLCULOS [NOTA-La absorbancia no es función lineal de concentración proteica; sin embargo, si el intervalo de concentración de la curva estándar es lo suficientemente pequeño, se aproxima a la linealidad.] Usando el método de regresión lineal, graficar las absorbancias de las soluciones obtenidas de las Soluciones Estándar en función de las concentraciones de proteína y determinar la curva estándar que mejor se ajuste a los puntos graficados. A partir de la curva estándar así obtenida y de la absorbancia de la Solución de Prueba, determinar la concentración proteica de la Solución de Prueba.
USP 39
Información General/ (1057) Artículos Obtenidos por Biotecnología 1139
SUSTANCIAS DE INTERFERENCIA En el siguiente procedimiento, se agrega desoxicolato-ácido tricloroacético a una muestra de prueba, para eliminar las sustancias de interferencia por precipitación de las proteínas antes de hacer la prueba. Esta técnica también puede usarse para concentrar proteínas de una solución diluida. Reactivo de Desoxicolato de Sodio-Preparar una solución de desoxicolato de sodio en agua, con una concentración de 150 mg en 100 ml. Reactivo de Ácido Tricloroacético-Preparar una solución de ácido tricloroacético en agua, con una concentración de 72g en 100 ml. Procedimiento-Agregar O, 1 ml de Reactivo de Desoxicolato de Sodio a 1 ml de una solución de la proteína en análisis. Mezclar en un mezclador por vórtice y dejar reposar a temperatura ambiente durante 1O minutos. Agregar O, 1 ml de Reactivo de Ácido Tricloroacético y mezclar en un mezclador por vórtice. Centrifugar a 3000 x g durante 30 minutos, decantar el líquido y eliminar todo líquido residual con una pipeta. Volver a disolver el pellet de proteína en 1 ml de Reactivo de Cobre Alcalino. Proceder según se indica para la Solución de Prueba. NOTA-El desarrollo del color alcanza un máximo entre los 20 y 30 minutos del comienzo de la incubación a temperatura ambiente, y después hay una pérdida gradual de color. La mayoría de las sustancias de interferencia reducen la intensidad del color; sin embargo, algunos detergentes causan un leve aumento del color. Una concentración alta de sal puede provocar la formación de un precipitado. Como las distintas especies de proteína pueden dar respuestas de color de distinta intensidad, la proteína estándar y la proteína de prueba deben ser la misma.
Método 3 Este método, comúnmente denominado ensayo de Bradford, se basa en el cambio de absorción de 470 nm a 595 nm que se observa cuando el colorante azul brillante G se une a la proteína. El colorante azul brillante G presenta más afinidad por los residuos arginilo y lisilo en la proteína lo que conduce a la variación en la respuesta de la valoración para diferentes proteínas. SOLUCIONES ESTÁNDAR A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, disolver el Estándar de Referencia USP o el material de referencia para la proteína en análisis en la solución amortiguadora usada para preparar la Solución de Prueba. Diluir porciones de esta solución con la misma solución amortiguadora para obtener no menos de cinco Soluciones Estándar que tengan concentraciones uniformemente espaciadas entre 100 µg y 1 mg de proteína por ml. SOLUCIÓN DE PRUEBA Disolver una cantidad adecuada de la proteína en análisis en la solución amortiguadora apropiada para obtener una solución con una concentración comprendida dentro del intervalo de concentraciones de las Soluciones Estándar. BLANCO Usar la solución amortiguadora utilizada para preparar la Solución de Prueba y las Soluciones Estándar. REACTIVO DE COOMASSIE Disolver 100 mg de azul brillante G* en 50 ml de alcohol. [NOTA-No todos los colorantes tienen el mismo contenido de azul brillante G y distintos productos pueden dar resultados diferentes.] Agregar 100 ml de ácido fosfórico, diluir con agua a 1 L y mezclar. Pasar la solución a través de papel de filtro (Whatman Nº 1 o equivalente) y almacenar el reactivo filtrado en un frasco ámbar a temperatura ambiente. [NOTA-El colorante precipita lentamente durante el almacenamiento del reactivo. Filtrar el reactivo antes de usarlo.] PROCEDIMIENTO Agregar 5 ml del Reactivo Coomassie a 100 µL de cada Solución Estándar, a 100 µL de la Solución de Prueba y a 100 µL del Blanco y mezclar por inversión. Evitar la formación de espuma ya que altera la reproducibilidad. Determinar las absorbancias de las soluciones de las Soluciones Estándar y la Solución de Prueba a 595 nm con un espectrofotómetro adecuado (ver ll:!~¡¡;i,:r::i~'!i 1 Tu::~:5,;¡¡;¡il¡\ usando el Blanco para ajustar el instrumento a cero. [NOTA-No emplear celdas de cuarzo (sílice) en el espectro,,,J!il!L JiiiWJJ!!!l!lV fotómetro dado que el colorante se une a este material. Como las distintas especies de proteína pueden dar respuestas de color de diferente intensidad, la proteína estándar y la proteína de prueba deben ser la misma.] • La pureza del colorante es importante en la preparación del reactivo. Serva Blue G (Crescent Chemical Company, Hauppage, NY) es un grado aceptable.
1140 (1057) Artículos Obtenidos por Biotecnología/ Información General
USP 39
Hay relativamente pocas sustancias de interferencia, pero se deben evitar los detergentes y los anfolitos en la muestra de prueba. Las muestras muy alcalinas pueden interferir con el reactivo ácido. CÁLCULOS [NOTA-La absorbancia no es función lineal de la concentración proteica; sin embargo, si el intervalo de concentración de la curva estándar es lo suficientemente pequeño, se aproxima a la linealidad.] Usando el método de regresión lineal, graficar las absorbancias de las soluciones obtenidas de las Soluciones Estándar en función de las concentraciones de proteína y determinar la curva estándar que mejor se ajuste a los puntos graficados. A partir de la curva estándar así obtenida y de la absorbancia de la Solución de Prueba, determinar la concentración proteica de la Solución de Prueba.
Método 4 Este método, comúnmente denominado valoración con ácido bicinconínico o BCA, se basa en la propiedad que tienen las proteínas de reducir el ión cúprico (Cu 2 +) a ión cuproso (Cu 1+). El reactivo de ácido bicinconínico se usa para detectar el ión cuproso. El método tiene pocas sustancias de interferencia. Cuando hay sustancias de interferencia presentes, se puede minimizar su efecto mediante dilución, siempre que la concentración de la proteína en análisis sea suficiente para una medición exacta. SOLUCIONES ESTÁNDAR A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, disolver el Estándar de Referencia USP o el material de referencia para la proteína en análisis, en la solución amortiguadora usada para preparar la Solución de Prueba. Diluir porciones de esta solución con la misma solución amortiguadora para obtener no menos de cinco Soluciones Estándar con concentraciones uniformemente espaciadas entre 1O µg y 1200 µg de proteína por mL. SOLUCIÓN DE PRUEBA Disolver una cantidad adecuada de la proteína en análisis en la solución amortiguadora apropiada para obtener una solución con una concentración comprendida dentro del intervalo de concentraciones de las Soluciones Estándar. BLANCO Usar la solución amortiguadora utilizada para preparar la Solución de Prueba y las Soluciones Estándar. REACTIVOS Reactivo BCA-Disolver aproximadamente 1O g de ácido bicinconínico, 20 g de carbonato de sodio monohidrato, 1,6 g de tartrato de sodio, 4 g de hidróxido de sodio y 9,5 g de bicarbonato de sodio en agua. Ajustar, si es necesario, hasta un pH de 11,25 con hidróxido de sodio o con bicarbonato de sodio. Diluir con agua a 1 L y mezclar. Reactivo de Sulfato de Cobre-Disolver aproximadamente 2 g de sulfato cúprico en agua a un volumen final de 50 ml. Reactivo Cobre-BCA-Mezclar 1 mL de Reactivo de Sulfato de Cobre y 50 mL de Reactivo BCA. PROCEDIMIENTO Agregar 2 mL de Reactivo de Cobre-BCA a O, 1 mL de cada Solución Estándar, 0, 1 mL de la Solución de Prueba y 0, 1 mL del Blanco, y mezclar. Incubar las soluciones a 37° durante 30 minutos, anotar el tiempo y dejar que lleguen a temperatura ambiente. Dentro de los 60 minutos siguientes a la incubación, determinar las absorbancias de las soluciones de las Soluciones Estándar y la Solución de Prueba en celdas de cuarzo a 562 nm, con un espectrofotómetro adecuado (ver •(857)9 (AFOl-may.2016)), usando la solución Blanco para ajustar el instrumento a cero. Después de enfriar las soluciones a temperatura ambiente, la intensidad del color continúa aumentando gradualmente. Si hay sustancias presentes que causen interferencias en la prueba, proceder según se indica en Sustancias de Interferencia en el Método 2. Como las distintas especies de proteína pueden dar respuestas de color de distinta intensidad, la proteína estándar y la proteína de prueba deben ser la misma. CÁLCULOS [NOTA-La absorbancia no es función lineal de la concentración proteica; sin embargo, si el intervalo de concentración de la curva estándar es lo suficientemente pequeño, se aproxima a la linealidad.] Usando el método de regresión lineal, graficar las absorbancias de las soluciones obtenidas de las Soluciones Estándar en función de las concentraciones de proteína y determinar
USP 39
Información General/ (105 7) Artículos Obtenidos por Biotecnología 1141
la curva estándar que mejor se ajuste a los puntos graficados. A partir de la curva estándar así obtenida y de la absorbancia de la Solución de Prueba, determinar la concentración proteica de la Solución de Prueba.
Método 5 Este método, comúnmente denominado valoración de Biuret, se basa en la interacción del ión cúprico (Cu 2+) con la proteína en una solución alcalina y el desarrollo de absorbancia a 545 nm. SOLUCIONES ESTÁNDAR A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, preparar una solución de Albúmina Humana, para la cual se haya determinado previamente el contenido proteico por análisis de nitrógeno (usando el factor de conversión nitrógeno-proteína de 6,25) o del Estándar de Referencia USP o material de referencia para la proteína en análisis en solución de cloruro de sodio (9 en 1000). Diluir porciones de esta solución con solución de cloruro de sodio (9 en 1000) para obtener no menos de tres Soluciones Estándar con concentraciones uniformemente espaciadas entre 0,5 y 1O mg por ml. [NOTA-Pueden observarse respuestas bajas si la muestra en análisis tiene un nivel de prolina significativamente diferente al de la Albúmina Humana. En dichos casos se puede emplear una proteína estándar diferente.] SOLUCIÓN DE PRUEBA Preparar una solución de la proteína de prueba en solución de cloruro de sodio (9 en 1000), con una concentración comprendida dentro del intervalo de las concentraciones de las Soluciones Estándar. BLANCO Usar solución de cloruro de sodio (9 en 1000). REACTIVO DE BIURET Disolver aproximadamente 3,46 g de sulfato cúprico en 1O mL de agua caliente y dejar enfriar (Solución 1). Disolver aproximadamente 34,6 g de citrato de sodio dihidrato y 20,0 g de carbonato de sodio en 80 mL de agua caliente y dejar enfriar (Solución 2). Mezclar la Solución 7 y la Solución 2 y diluir con agua a 200 ml. Este Reactivo de Biuret es estable a temperatura ambiente durante 6 meses. No usar el reactivo si aparece turbidez o contiene algún precipitado.
\
PROCEDIMIENTO
A un volumen de una solución de la Solución de prueba, agregar un volumen igual de solución de hidróxido de sodio (6 en 100) y mezclar. Agregar inmediatamente un volumen de Reactivo de Biuret equivalente a 0,4 volúmenes de la Solución de Prueba y mezclar. Dejar en reposo a una temperatura ambiente entre 15º y 25º, durante no menos de 15 minutos. Dentro de los 90 minutos siguientes a la adición del Reactivo de Biuret, determinar las absorbancias de las Soluciones Estándar y de la solución obtenida de la Solución de Prueba a la longitud de onda de absorbancia máxima a 545 nm con un espectrofotómetro adecuado (ver usando el Blanco para ajustar el instrumento a cero. [NOTA-Toda solución que desarrolle turbidez, o un precipitado, no es aceptable para el cálculo de la concentración proteica.]
--•fll),
CÁLCULOS Usando el método de regresión lineal de cuadrados mínimos, graficar las absorbancias de las Soluciones Estándar en función de las concentraciones de proteína, determinando la curva estándar que mejor se ajuste a los puntos graficados y calcular el coeficiente de correlación para la misma. [NOTA-Dentro del intervalo dado de los estándares, la relación entre la absorbancia y la concentración proteica es aproximadamente lineal.] Un sistema adecuado es aquel que produce una línea con un coeficiente de correlación de no menos de 0,99. A partir de la curva estándar y de la absorbancia de la Solución de Prueba, determinar la concentración proteica de la muestra de prueba, haciendo las correcciones necesarias. SUSTANCIAS DE INTERFERENCIA A fin de minimizar el efecto de las sustancias de interferencia, se puede precipitar la proteína en la muestra de prueba inicial, como se indica a continuación. Agregar O, 1 volúmenes de ácido tricloroacético al 50% a 1 volumen de una solución de la muestra de prueba, retirar la capa sobrenadarite y disolver el precipitado en un volumen pequeño de hidróxido de sodio 0,5 N. Usar la solución así obtenida para preparar la Solución de Prueba.
1142 (1057) Artículos Obtenidos por Biotecnología / Información General
USP 39
COMENTARIOS Esta prueba muestra una diferencia mínima entre muestras de lgG y de albúmina equivalentes. La adición de hidróxido de sodio y del Reactivo de Biuret como reactivo combinado, la mezcla insuficiente después de la adición del hidróxido de sodio o un tiempo prolongado entre la adición de la solución de hidróxido de sodio y la adición del Reactivo de Biuret produce para las muestras de lgG una respuesta más alta que para las muestras de albúmina. El método de ácido tricloroacético usado para minimizar los efectos de sustancias de interferencia también se puede usar para determinar el contenido proteico en muestras de prueba con concentraciones por debajo de 500 µg por ml.
Método 6 Este método fluorométrico se basa en la derivatización de la proteína con o-ftalaldehído (OPA), que reacciona con las aminas primarias de la proteína (es decir, el aminoácido NH 2 -terminal y el grupo i:-amino de los residuos lisina). La sensibilidad de la prueba puede aumentarse hidrolizando la proteína antes de realizar la prueba. Mediante hidrólisis los grupos a-amino de los aminoácidos constituyentes de la proteína quedan disponibles para reaccionar con el reactivo o-ftalaldehído. El método requiere cantidades muy pequeñas de la proteína. Las aminas primarias, tales como el tris(hidroximetil)aminometano y las soluciones amortiguadoras de aminoácidos, reaccionan con el o-ftalaldehído y deben evitarse o eliminarse. El amoníaco en concentraciones altas reacciona también con el o-ftalaldehído. La fluorescencia obtenida cuando la amina reacciona con el o-ftalaldehído puede ser inestable. El uso de procedimientos automatizados para estandarizar este procedimiento puede mejorar la exactitud y la precisión de la prueba. SOLUCIONES ESTÁNDAR A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, disolver el Estándar de Referencia USP o el material de referencia para la proteína en análisis, en la solución amortiguadora usada para preparar la Solución de Prueba. Diluir porciones de esta solución con la misma solución amortiguadora para obtener no menos de cinco Soluciones Estándar con concentraciones uniformemente espaciadas entre 1O y 200 µg de proteína por ml. SOLUCIÓN DE PRUEBA Disolver una cantidad adecuada de la proteína en análisis en la solución amortiguadora adecuada para obtener una solución con una concentración comprendida dentro del intervalo de concentraciones de las Soluciones Estándar. BLANCO Usar la solución amortiguadora utilizada para preparar la Solución de Prueba y las Soluciones Estándar. REACTIVOS Solución Amortiguadora de Borato-Disolver aproximadamente 61,83 g de ácido bórico en agua y ajustar con hidróxido de potasio, hasta un pH de 10,4. Diluir con agua a 1 L y mezclar. Reactivo OPA Madre-Disolver aproximadamente 120 mg de o-ftalaldehído en 1,5 mL de metanol, agregar 100 mL de Solución Amortiguadora de Borato y mezclar. Agregar 0,6 mL de éter polioxietilén (23) laurílico y mezclar. Esta solución es estable a temperatura ambiente durante al menos 3 semanas. Reactivo OPA-A 5 mL de Reactivo OPA Madre, agregar 15 µL de 2-mercaptoetanol. Preparar al menos 30 minutos antes de usar. Este reactivo es estable durante un día. PROCEDIMIENTO Ajustar cada una de las Soluciones Estándar y la Solución de Prueba a un pH entre 8 y 10,5. Mezclar 1O µL de la Solución de Prueba y 1O µL de cada una de las Soluciones Estándar con 100 µL de Reactivo OPA y dejar reposar a temperatura ambiente durante 15 minutos. Agregar 3 mL de hidróxido de sodio 0,5 N y mezclar. Usando un fluorómetro adecuado (ver •Espectroscopía de Fluorescencia (853)• (AF 01 .may.2016¡), determinar las intensidades de fluorescencia de las soluciones obtenidas de las Soluciones Estándar y de la Solución de Prueba a una longitud de onda de excitación de 340 nm y a una longitud de onda de emisión entre 440 y 455 nm. [NOTA-La fluorescencia de una muestra individual se lee sólo una vez, porque la irradiación disminuye la intensidad de la fluorescencia.]
USP 39
Información General/ (1058) Calificación de Instrumentos Analíticos 1143
CÁLCULOS La fluorescencia es función lineal de la concentración proteica. Usando el método de regresión lineal, graficar las intensidades de fluorescencia de las soluciones obtenidas de las Soluciones Estándar en función de las concentraciones de proteína y determinar la curva estándar que mejor se ajuste a los puntos graficados. A partir de la curva estándar así obtenida y de la intensidad de fluorescencia de la Solución de Prueba, determinar la concentración proteica de la muestra.
Método 7 Este método se basa en el análisis de nitrógeno como un medio de determinación de proteína. La interferencia causada por la presencia de otras sustancias nitrogenadas en la muestra pueden afectar la determinación de proteína por este método. Las técnicas de análisis de nitrógeno destruyen la proteína en análisis, pero no se limitan a la determinación de proteínas en un medio acuoso. PROCEDIMIENTO 1 Determinar el contenido de nitrógeno de la proteína en análisis según se indica en Determinación de Nitrógeno (461 ). Hay instrumental disponible comercialmente para la valoración de nitrógeno por el método de Kjeldahl. PROCEDIMIENTO 2 Hay instrumental disponible comercialmente para análisis de nitrógeno. La mayoría de los instrumentos para análisis de nitrógeno emplean pirólisis (es decir, la combustión de la muestra en oxígeno a temperaturas cercanas a los 1000º), produciéndose óxido nítrico (NO) y óxidos de nitrógeno similares (NOJ a partir del nitrógeno presente en la proteína de prueba. Algunos instrumentos convierten los óxidos nítricos en gas nitrógeno, que se cuantifica con un detector de conductividad térmica. Otros instrumentos mezclan el óxido nítrico (NO) con ozono (0 3) formándose dióxido de nitrógeno excitado (N0 2), que emite luz cuando se desintegra y se puede cuantificar con un detector de quimioluminiscencia. Se usa un material de referencia de proteína o un estándar de referencia que sea relativamente puro y similar en composición a las proteínas de la prueba para optimizar los parámetros de inyección y pirólisis y para evaluar la uniformidad en el análisis. CÁLCULOS La concentración proteica se calcula dividiendo el contenido de nitrógeno de la muestra por el contenido conocido de nitrógeno de la proteína. El contenido conocido de nitrógeno de la proteína se puede determinar a partir de la composición química de la proteína, o por comparación con el contenido de nitrógeno del Estándar de Referencia USP o del material de referencia.
(1058) CALIFICACIÓN DE INSTRUMENTOS ANALÍTICOS INTRODUCCIÓN En la industria farmacéutica se usa una gran variedad de equipos e instrumentos de laboratorio y sistemas analíticos computadorizados, desde simples evaporadores de nitrógeno hasta tecnologías complejas multifuncionales (ver Categorías de Instrumentos) para adquirir datos que ayuden a garantizar que los productos son aptos para su uso previsto. El objetivo de un analista es obtener en forma constante datos confiables y válidos que sean adecuados para el fin previsto. Dependiendo de las aplicaciones, los usuarios validan sus procedimientos, calibran los instrumentos y realizan controles adicionales de instrumentos, tales como pruebas de aptitud del sistema y análisis de muestras para control de calidad del proceso analítico (quality control check samples o muestras control), con el fin de garantizar que los datos adquiridos son confiables. Con la creciente sofisticación y automatización de los instrumentos analíticos, a los usuarios se les exige cada vez más la calificación de los instrumentos. A diferencia de las actividades de validación de métodos y de aptitud del sistema, la calificación de instrumentos analíticos (AIQ, por sus siglas en inglés) carece en la actualidad de guías o procedimientos específicos. Existen opiniones encontradas en lo que respecta a la calificación de instrumentos y a la validación de procedimientos, así como a los roles y responsabilidades de quienes las realizan. Por consiguiente, en la calificación de instrumentos se han usado diversos enfoques que requieren un número variable de recursos y generan cantidades de documentación que difieren ampliamente. Este capítulo brinda un enfoque científico a la AIQ y la considera como uno de los componentes principales requeridos para generar datos confiables y repetibles. Cabe anotar que el rigor aplicado al proceso de calificación dependerá de la complejidad y el uso previsto de los
1144 (1058) Calificación de Instrumentos Analíticos / Información General
USP 39
instrumentos. Este enfoque enfatiza el papel de la AIQ en el proceso general de obtención de datos confiables de los instrumentos analíticos.
Validación contra Calificación En este capítulo, el término validación se usa para procesos de fabricación, procedimientos analíticos y de software, y el término calificación se emplea para instrumentos. Por lo tanto, la frase "calificación de instrumentos analíticos" (AIQ) se usa para el proceso de garantizar que un instrumento es adecuado para el uso al que está destinado.
COMPONENTES DE LA CALIDAD DE LOS DATOS Existen cuatro componentes críticos involucrados en la generación de datos confiables y repetibles (datos de calidad). La Figura 7 muestra estos componentes como actividades en capas dentro de un triángulo de calidad. Cada capa influye en la
calidad general. La calificación de instrumentos analíticos constituye la base para generar datos de calidad. Los otros componentes esenciales para generar datos de calidad son la validación del método analítico, las pruebas de aptitud del sistema y las muestras control. Estos componentes de la calidad se describen a continuación.
Validación del Método Analítico
Calificación de Instrwnentos Analíticos
Figura 1. Componentes de la calidad de los datos.
Calificación de Instrumentos Analíticos La AIQ es la colección de pruebas documentadas de que un instrumento se desempeña adecuadamente para su uso previsto. El uso de un instrumento calificado en los análisis contribuye a la confianza en la validez de los datos generados.
Validación del Método Analítico La validación del método analítico es la colección de pruebas documentadas de que un procedimiento analítico es apto para su uso previsto. El uso de un procedimiento validado con instrumentos analíticos calificados ofrece la confianza de que el procedimiento generará datos de prueba de calidad aceptable. En el capítulo de información general Validación de Procedimientos Farmacopeicos (1225) se puede encontrar una guía adicional sobre la validación de los procedimientos farmacopeicos.
Pruebas de Aptitud del Sistema Las pruebas de aptitud del sistema verifican que el sistema se desempeñe de acuerdo con los criterios fijados en el procedimiento. Estas pruebas se efectúan junto con los análisis de la muestra para garantizar que el desempeño del sistema es aceptable en el momento de la prueba. En el capítulo general Cromatografía (621) de la USP se presenta una discusión más detallada de las pruebas de aptitud del sistema en lo que se refiere a sistemas cromatográficos.
Información General/ (1058) Calificación de Instrumentos Analíticos 1145
USP 39
Muestras Control Muchos analistas efectúan sus pruebas en instrumentos estandarizados mediante el uso de materiales de referencia y/o estándares de calibración. Algunos análisis requieren también la inclusión de muestras control que brinden un aseguramiento continuo o durante el proceso del desempeño adecuado de la prueba. De esta manera, la AIQ y la validación del método analítico contribuyen a la calidad del análisis antes de que los analistas lleven a cabo las pruebas. Las pruebas de aptitud del sistema y los análisis de muestras control ayudan a garantizar la calidad de los resultados analíticos inmediatamente antes o durante el análisis de la muestra.
PROCESO DE CALIFICACIÓN DE INSTRUMENTOS ANALÍTICOS Las siguientes secciones se refieren en detalle al proceso de AIQ. Los otros tres componentes que incorporan calidad dentro de los datos analíticos-la validación del método analítico, las pruebas de aptitud del sistema y las muestras control-están fuera del alcance de este capítulo.
Fases de Calificación La calificación de instrumentos no es un único proceso continuo sino el resultado de varias actividades diferenciadas. Por conveniencia, estas actividades se pueden agrupar en cuatro fases: calificación del diseño (DQ, por sus siglas en inglés), calificación de la instalación (IQ, por sus siglas en inglés), calificación operativa (OQ, por sus siglas en inglés) y calificación del desempeño (PQ, por sus siglas en inglés). Algunas actividades de AIQ cubren más de una fase de calificación y los analistas podrían efectuarlas durante más de una de estas fases (ver Tabla 7). Sin embargo, en muchos casos se precisa un orden específico para las actividades de AIQ; por ejemplo, la calificación de la instalación debe ocurrir primero con el fin de iniciar otras actividades de calificación. Las actividades de AIQ se deben definir y documentar. Tabla 1. Tiempo de Ejecución, Aplicabilidad y Actividades para Cada Fase de la Calificación de Instrumentos Analíticos* Calificación del Diseño
Calificación Operativa
Calificación de la Instalación
Calificación de Desempeño
Momento y Aplicabilidad Antes de la adquisición de un nuevo modelo de instrumento
Durante la instalación de cada instrumento (nuevo, viejo o existente sin calificar)
Garantía de la DQ del fabricante
Descripción
Garantía de disponibilidad de soporte adecuado por parte del fabricante
Entrega del instrumento
Aptitud del instrumento para su uso en el laboratorio
Servicios/instalaciones
Después de la instalación o reparación importante de cada instrumento
Periódicamente a intervalos especificados para cada instrumento
Parámetros fijos
Mantenimiento preventivo y reparadones
Actividades ~
Establecer prácticas de operación, calibración, mantenimiento y control de cambios ~
Entorno
Red y almacenamiento de datos
~
Almacenamiento de datos, copia de seguridad (backup) y archivo seguros
Verificación de la instalación
~
Pruebas de las funciones del instrumento
Montaje e instalación
~
Controles de desempeño
* Las actividades mencionadas debajo de cada fase se efectúan por lo general como aparecen en la tabla. Sin embargo, en algunos casos puede ser apropiado
llevar a cabo o combinar una actividad dada con otra fase. Dichas actividades que abarcan más de una fase de la calificación se muestran conectadas por flechas dobles. Si una actividad listada bajo una fase dada se efectúa en otra fase, no es necesario repetir la actividad en la fase en que está listada. Llevar a cabo la actividad es mucho más importante que la fase en la que se efectúa la misma.
CALIFICACIÓN DEL DISEÑO La calificación del diseño (DQ) es la colección documentada de actividades que definen las especificaciones funcionales y operativas del instrumento y los criterios para la selección del proveedor, basándose en el uso previsto del instrumento. La calificación del diseño (DQ) puede ser realizada no sólo por el que desarrolla o fabrica el instrumento, sino también por el usuario. Por lo general, el fabricante es responsable del diseño robusto y de mantener la información que describe cómo está fabricado (especificaciones de diseño, requisitos funcionales, etc.) y probado el instrumento analítico antes de despacharse a los usuarios. No obstante, el usuario debe asegurar que los instrumentos disponibles comercialmente (commercial off-the-shelf; COTS, por
1146 (1058) Calificación de Instrumentos Analíticos / Información General
USP 39
sus siglas en inglés) son adecuados para el uso al que están destinados y que el fabricante ha adoptado un sistema de calidad que garantiza un equipo confiable. Los usuarios deben determinar también la capacidad del fabricante para dar soporte a la instalación, servicio y capacitación. Esta determinación podría facilitarse por la interacción previa del usuario con el fabricante. CALIFICACIÓN DE LA INSTALACIÓN La calificación de la instalación (IQ) es la colección documentada de actividades necesarias para establecer que un instrumento se entrega como fue diseñado y especificado y está debidamente instalado en el entorno seleccionado, y que este entorno es adecuado para el instrumento. La IQ se aplica a un instrumento nuevo o de segunda mano, o a cualquier instrumento existente que no ha sido calificado anteriormente. Partes relevantes de la IQ se aplican también a un instrumento calificado que haya sido transportado a otro sitio o esté siendo reinstalado por otras razones, tal como un almacenamiento prolongado. Las actividades y la documentación asociadas típicamente con la IQ son las siguientes. Descripción-Proporcionar una descripción del instrumento o del conjunto de componentes del instrumento, incluyendo el fabricante, el modelo, el número de serie, la versión del software y la ubicación. Usar planos y diagramas de flujo de ser necesario. Entrega del Instrumento-Asegurar que el instrumento, el software, los manuales, los suministros y cualquier otro accesorio del instrumento lleguen según se especifique en la orden de compra y que no hayan sufrido daños. En el caso de un instrumento de segunda mano o ya existente, se deben obtener los manuales y la documentación. Servicios/Instalaciones/Entorno-Verificar que el lugar de instalación cumpla satisfactoriamente con los requisitos ambientales especificados por el fabricante. Montaje e Instalación-Ensamblar e instalar el instrumento y efectuar cualquier diagnóstico o prueba preliminar. El montaje e instalación deben ser hechos por el fabricante, proveedor, ingenieros especializados o personal interno calificado. Las pruebas y guías de instalación establecidas por el fabricante proporcionan una valiosa referencia para determinar la aceptación del instrumento. Cualquier hecho anormal observado durante el montaje e instalación merece documentarse. Es posible que los paquetes de instalación comprados al fabricante o proveedor deban, no obstante, ser suplementados con criterios específicos del usuario. Red y Almacenamiento de Datos-Algunos sistemas analíticos requieren que los usuarios proporcionen las conexiones en red y las capacidades de almacenamiento de datos en el lugar de instalación. Cuando sea necesario, conectar el instrumento a la red y verificar su funcionalidad. Verificación de la Instalación-Efectuar los diagnósticos y pruebas iniciales del instrumento después de la instalación. CALIFICACIÓN OPERATIVA Después de una IQ exitosa, el instrumento está listo para las pruebas OQ. La calificación operativa (OQ) es la colección documentada de las actividades necesarias para demostrar que un instrumento funcionará de acuerdo con su especificación operativa en el entorno seleccionado. Las actividades de prueba en la fase OQ pueden constar de los siguientes parámetros. Parámetros Fijos-Estas pruebas miden los parámetros invariables del instrumento, tales como longitud, altura, peso, entradas de voltaje, presiones aceptables y cargas. Si las especificaciones proporcionadas por el fabricante para estos parámetros satisfacen al usuario, los requisitos de la prueba se pueden obviar. Sin embargo, si el usuario desea confirmar los parámetros, se pueden efectuar las pruebas en el sitio del usuario. Los parámetros fijos no cambian durante la vida del instrumento y por lo tanto no es necesario volver a determinarlos. [NOTA-Estas pruebas podrían efectuarse también durante la fase IQ (ver Tabla 7); de ser así, no es necesario volver a determinar los parámetros fijos como parte de las pruebas OQ.] Almacenamiento de Datos, Copia de Seguridad (backup) y Archivo Seguros-Cuando corresponda, probar el manejo seguro de datos, tal como almacenamiento, copia de seguridad, registros de auditoría y archivo en el sitio del usuario, de acuerdo con los procedimientos escritos. Pruebas de las Funciones del Instrumento-Las funciones del instrumento requeridas por el usuario se deben probar para verificar que el instrumento funcione según lo previsto por el fabricante. La información proporcionada por el fabricante es útil para identificar las especificaciones de estos parámetros y para el diseño de pruebas para evaluar los parámetros identificados. Los usuarios o sus representantes calificados deben efectuar estas pruebas para verificar que el instrumento cumple con las especificaciones del fabricante o del usuario en el entorno de este último. La cantidad de pruebas OQ que tiene que pasar un instrumento depende de sus aplicaciones previstas. Por lo tanto, en este capítulo no se ofrecen pruebas OQ específicas para ningún instrumento o aplicación. Las pruebas analíticas de rutina no constituyen pruebas OQ. Las pruebas OQ están diseñadas específicamente para verificar que el instrumento funciona de acuerdo con las especificaciones en el entorno del usuario y puede no ser necesario repetirlas a intervalos regulares. Sin embargo, cuando el instrumento se somete a reparaciones o modificaciones mayores, las pruebas OQ y/o PQ relevantes se deben repetir para verificar que el instrumento sigue funcionando satisfactoriamente. Si un instrumento se lleva a otro sitio, se debe evaluar si es necesario repetir alguna prueba OQ. Las pruebas OQ pueden ser modulares o integrales. Las pruebas modulares de los componentes individuales de un sistema pueden facilitar el intercambio de dichos componentes sin recalificación. Las pruebas integrales, que involucran a todo el sistema, también son aceptables.
USP 39
Información General/ (1058) Calificación de Instrumentos Analíticos 1147
CALIFICACIÓN DE DESEMPEÑO La calificación de desempeño (PQ) es la colección documentada de las actividades necesarias para demostrar que un instrumento se desempeña uniformemente de acuerdo con las especificaciones definidas por el usuario y es apropiado para el uso previsto. Después de haber efectuado las pruebas IQ y OQ, la calificación de desempeño demuestra la continua aptitud del instrumento para su uso previsto. La fase PQ puede incluir los siguientes parámetros. Controles de Desempeño-Establecer una prueba o serie de pruebas para verificar el desempeño aceptable del instrumento para su uso previsto. Las pruebas PQ se basan por lo general en las aplicaciones típicas del instrumento en el sitio de uso y pueden consistir en el análisis de estándares o componentes conocidos. Las pruebas se deben basar en métodos científicos y reflejar el uso general previsto para el instrumento. Algunas pruebas de aptitud del sistema o análisis con muestras control que se efectúan concomitantemente con las muestras de prueba se pueden usar para demostrar que el instrumento se desempeña de manera adecuada. Las pruebas PQ pueden semejarse a las efectuadas durante la OQ, pero las especificaciones para sus resultados se pueden fijar de manera diferente de ser necesario. Sin embargo, las especificaciones del usuario para las pruebas PQ deben demostrar que el instrumento funciona sin problemas para las aplicaciones previstas. Como en el caso con las pruebas OQ, las pruebas PQ pueden ser modulares o integrales. La frecuencia de prueba depende de la robustez del instrumento y de la criticidad de las pruebas efectuadas. Las pruebas pueden llevarse a cabo sin programación-por ejemplo, cada vez que se usa el instrumento. También se pueden programar a intervalos regulares. La experiencia con el instrumento puede influir en esta decisión. Podría ser útil repetir las mismas pruebas PQ cada vez que se usa el instrumento, para poder compilar la historia del desempeño del instrumento. Como alternativa, el instrumento se puede incluir en un sistema de soporte integrado para garantizar que permanezca calificado continuamente. Algunas pruebas de aptitud del sistema o análisis con muestras control que se efectúan concomitantemente con las muestras de prueba implican también que el instrumento se desempeña de manera adecuada. Mantenimiento Preventivo y Reparaciones-Cuando un instrumento deja de cumplir con las especificaciones de la prueba PQ, puede requerir mantenimiento o reparación. Un mantenimiento preventivo periódico puede también estar recomendado para muchos instrumentos. Las pruebas PQ relevantes se deberían repetir después del mantenimiento o reparación para garantizar que el instrumento sigue estando calificado. Prácticas de Operación, Calibración, Mantenimiento y Control de Cambios-Establecer prácticas para mantener y calibrar el instrumento. Cada actividad de mantenimiento y calibración se debe documentar.
ROLES Y RESPONSABILIDADES
Usuarios En última instancia, los usuarios son los responsables del funcionamiento del instrumento y de la calidad de los datos. El grupo de usuarios abarca los analistas, sus supervisores, los especialistas del instrumento y la gerencia de la organización. Los usuarios deben ser capacitados adecuadamente en el uso del instrumento y su historial de capacitación se debe mantener como lo exijan las reglamentaciones. Los usuarios deben también ser responsables de calificar sus instrumentos porque su capacitación y pericia en el uso de aquellos los convierte en el grupo mejor calificado para diseñar las pruebas y especificaciones del instrumento necesarias para una exitosa AIQ. Los consultores, fabricantes o proveedores de equipos, especialistas en validación y personal de garantía de calidad (QA) pueden asesorar y asistir según sea necesario, pero la responsabilidad final de calificar los instrumentos recae en los usuarios, quienes también deben mantener el instrumento calificado, efectuando rutinariamente la PQ.
Unidad de Calidad El papel de la Unidad de Calidad en la AIQ sigue siendo el mismo que para cualquier otra actividad reglamentada. El personal de calidad es responsable de garantizar que el proceso de AIQ reuna los requisitos de cumplimento, que los procesos se sigan y que el uso previsto del equipo esté respaldado por datos válidos y documentados.
Fabricantes Los fabricantes y desarrolladores son responsables de la DQ al diseñar el instrumento. Son también responsables de la validación de los procesos relevantes usados en la fabricación y montaje del instrumento. Los fabricantes deben probar los instrumentos ensamblados antes de enviarlos a los usuarios. Por último, es deseable que los fabricantes y proveedores notifiquen a todos los usuarios conocidos de los defectos del hardware descubiertos después de la liberación de un producto; ofrezcan al usuario capacitación, servicio, reparación y soporte para la instalación; y lo inviten a hacer auditorías, según sea necesario.
1148 (1058) Calificación de Instrumentos Analíticos / Información General
USP 39
VALIDACIÓN DE SOFTWARE El software usado para trabajo analítico se puede clasificar en tres categorías: firmware, software para control del instrumento, adquisición de datos y procesamiento; y software autónomo. Aunque la validación del software no es el objetivo principal de este capítulo, las siguientes secciones describen en cuáles casos esta actividad está dentro del alcance de la calificación de instrumentos analíticos.
Firmware Los instrumentos analíticos computadorizados contienen chips integrados con software de bajo nivel (firmware). Dichos instrumentos no funcionarán sin un firmware que opere adecuadamente y los usuarios por lo general no pueden alterar el diseño ni la función del firmware. Por lo tanto, el firmware se considera un componente del instrumento mismo. De hecho, la calificación del hardware no es posible sin ponerlo en funcionamiento a través de su firmware. Por lo tanto, cuando se califica el hardware (o sea, el instrumento analítico) en el sitio del usuario, también se está calificando esencialmente el firmware integrado. No es necesario calificar el firmware por separado en el sitio. Siempre que sea posible, se debe registrar la versión de firmware como parte de las actividades de IQ. Cualquier cambio que se haga a las versiones de firmware se debe rastrear a través del control de cambios del instrumento (ver Control de Cambios a continuación).
Software para Control del Instrumento, Adquisición de Datos y Procesamiento En muchos de los instrumentos computarizados actuales, el software para control del instrumento, adquisición de datos y procesamiento se carga en una computadora conectada al instrumento. La operación del instrumento se controla entonces a través del software, lo cual deja pocos controles operativos en el instrumento. Además, el software se necesita para la adquisición de datos y para los cálculos posteriores. Por ello, tanto el hardware como el software, con sus funciones inextricablemente entrelazadas, son críticos para proporcionar los resultados analíticos. El fabricante debe efectuar la DQ, validar este software y proporcionar a los usuarios un resumen de la validación. En el sitio del usuario, la calificación integral, que involucra todo el sistema del instrumento y el software, es más eficaz que la validación modular del software solo. Por lo tanto, el usuario califica el software para el control del instrumento, adquisición de datos y procesamiento cuando califica el instrumento de acuerdo con el proceso de la AIQ.
Software Autónomo Se dispone de una guía autorizada para validación de software autónomo, tal como LIMS. 1 El proceso de validación es administrado por el desarrollador del software, quien especifica también el modelo de desarrollo apropiado para el software. La validación se lleva a cabo en una serie de actividades planeadas y ejecutadas a través de diversas etapas del ciclo de desarrollo.
CONTROL DE CAMBIOS Los cambios a los instrumentos, incluido el software, se vuelven inevitables a medida que los fabricantes agregan nuevas características y corrigen defectos conocidos. Sin embargo, la implementación de todos esos cambios no siempre beneficia a los usuarios. Por lo tanto, los usuarios deben adoptar los cambios que consideren útiles o necesarios y deben también evaluar los efectos de los cambios para determinar si se requiere alguna recalificación. El proceso de control de cambios les permite hacerlo. El control de cambios puede seguir el proceso de clasificación DQ/IQ/OQ/PQ. Para DQ, evaluar los parámetros cambiados y determinar si la necesidad del cambio justifica su implementación. Si la implementación es necesaria, introducir el cambio al sistema durante la IQ. Evaluar cuál de las pruebas OQ y PQ existentes necesita revisión, eliminación o adición como resultado del cambio instalado. Cuando el cambio haga necesarias adiciones, eliminaciones o revisiones de las pruebas OQ o PQ, seguir el procedimiento esbozado a continuación.
Calificación Operativa Revisar las pruebas OQ según lo requiera el cambio. Efectuar las pruebas relevantes afectadas por el cambio. Esto asegura el funcionamiento eficaz del instrumento después de instalar el cambio.
General Principies of Software Va/idation: Final Guidance far lndustry and FDA Staff, U.S. Department of Health and Human Services, Administración de Alimentos y Medicamentos de Estados Unidos, Rockville, MD, Enero 11, 2002. http://www.fda.gov/cdrh/comp/guidance/938.html (consultada en septiembre de 2004).
1
USP 39
Información General/ (1058) Calificación de Instrumentos Analíticos 1149
Calificación de Desempeño Revisar las pruebas PQ según lo requiera el cambio. Efectuar las pruebas PQ después de la instalación del cambio en caso de que durante la OQ no se haya efectuado ya una prueba similar. En el futuro, efectuar las pruebas PQ revisadas. Para cambios al firmware y al software relacionados con el control del instrumento, adquisición de datos y procesamiento, el control de cambios se efectúa a través del DQ/IQ/OQ/PQ del instrumento afectado. El control de cambios para el software autónomo requiere pruebas de la funcionalidad cambiada en el sitio del usuario.
DOCUMENTACIÓN DE LA AIQ Los documentos obtenidos durante la calificación del instrumento se deben conservar de manera accesible. Cuando existan múltiples instrumentos de un tipo, los documentos comunes de todos los instrumentos y los documentos específicos de un instrumento se pueden almacenar por separado. Durante el control de cambios, documentos adicionales pueden complementar aquellos obtenidos durante el proceso de calificación y ambos grupos de documentos se deben conservar y mantener en una forma adecuada que permita la protección y el acceso apropiados.
CATEGORÍAS DE INSTRUMENTOS Los laboratorios modernos por lo general cuentan con instrumentos y equipos variados, desde simples evaporadores de nitrógeno hasta complejos instrumentos automatizados. Por lo tanto, aplicar un único set de principios para calificar instrumentos tan disímiles sería científicamente inapropiado. Los usuarios están en capacidad de establecer el grado de calificación necesaria para un instrumento. Según el grado necesario, conviene clasificar los instrumentos dentro de tres grupos: A, B, y C, según se define a continuación. Se proporcionan ejemplos de los instrumentos en cada grupo. Cabe anotar que la lista de instrumentos se proporciona únicamente como ilustración y no pretende ser exhaustiva. No suministra la categoría exacta de un instrumento en el lugar del usuario. Esa categoría deben determinarla los usuarios para sus instrumentos o aplicaciones específicos. La agrupación exacta de un instrumento deben determinarla los usuarios según sus requisitos específicos. Dependiendo de los requisitos de los usuarios individuales, el mismo instrumento puede caer apropiadamente en un grupo para un usuario y en otro grupo para otro usuario. Por lo tanto, se recomienda a los usuarios hacer una selección cuidadosa de los grupos.
Grupo A El Grupo A incluye equipos estándar sin capacidad de medición o requisito habitual de calibración, donde la especificación de funcionalidad básica provista por el fabricante se acepta como requisitos del usuario. La conformidad de los equipos del Grupo A con los requisitos del usuario se puede verificar y documentar a través de la observación visual de su funcionamiento. Ejemplos de equipos en este grupo son: evaporadores de nitrógeno, mezcladores magnéticos, mezcladores por vórtice y centrífugas.
Grupo B El Grupo B incluye equipos e instrumentos estándar que suministran valores medidos, así como equipos que controlan parámetros físicos (como temperatura, presión o flujo) que necesitan calibración, donde los requisitos del usuario son típicamente los mismos que la especificación de funcionalidad y los límites operativos del fabricante. La conformidad de los instrumentos o equipos del grupo B con los requisitos del usuario se determina de acuerdo con los procedimientos operativos estándares para el instrumento o equipo y se documenta durante la IQ y OQ. Ejemplos de instrumentos en este grupo son: balanzas, aparatos para medir el punto de fusión, microscopios de luz, medidores de pH, pipetas variables, refractómetros, termómetros, tituladores y viscosímetros. Ejemplos de equipos en este grupo son: muflas, hornos, refrigeradores-congeladores, baños de agua, bombas y diluidores.
Grupo C El Grupo C incluye instrumentos y sistemas analíticos computadorizados, donde los requisitos del usuario para la funcionalidad y los límites operativos y de desempeño son específicos para la aplicación analítica. La conformidad de los instrumentos del Grupo C con los requisitos del usuario se determina por pruebas de función y pruebas de desempeño específicas. La instalación de estos instrumentos puede ser una tarea complicada y puede requerir de la asistencia de especialistas. A estos instrumentos se les debe aplicar un proceso de calificación total, según se esboza en este documento. Ejemplos de instrumentos en este grupo incluyen los siguientes: • espectrómetros de absorción atómica • calorímetros diferenciales de barrido • aparatos de disolución
1150 (1058) Calificación de Instrumentos Analíticos / Información General
• • • • • • • • • • • • • • • • •
USP 39
microscopios electrónicos espectrómetros de absorción a la llama cromatógrafo de líquidos de alta presión espectrómetros de masas lectores de microplaca analizadores termo gravimétricos espectrómetros de fluorescencia de rayos X difractómetros de rayos X para polvos densitómetros detectores de arreglo de diodos analizadores de elementos cromatógrafos de gases espectrómetros de IR espectrómetros de IR cercano espectrómetros Raman espectrómetros de UV/Vis espectrómetros de emisión por plasma inductivamente acoplado
(1059) DESEMPEÑO DE EXCIPIENTES
INTRODUCCIÓN Los excipientes se usan prácticamente en todos los medicamentos y son esenciales para la fabricación y el desempeño del producto. Por tanto, la fabricación exitosa de un producto robusto requiere del uso de excipientes y procesos de fabricación bien definidos que entreguen constantemente un producto de calidad. Los excipientes usados en los medicamentos generalmente se fabrican y proveen en cumplimiento con normas farmacopeicas. No obstante, los efectos de las propiedades de los excipientes sobre los atributos de calidad críticos (CQA, por sus siglas en inglés) de un medicamento son particulares para cada formulación y proceso, y pueden depender de propiedades de los excipientes no evaluadas en las monografías USP o NF. Los efectos de las variaciones en las propiedades materiales del excipiente dependen de la función de un excipiente en una formulación y de los atributos de calidad críticos del producto terminado. Este capítulo general provee un marco para la aplicación de principios de Calidad por Diseño (QBD, por sus siglas en inglés) a la calidad y desempeño de los excipientes. Un excipiente puede ser usado de distintas formas o para distintos propósitos en una formulación y puede, por tanto, requerir de diversas propiedades materiales para lograr el desempeño deseado. Las categorías funcionales del excipiente son términos amplios, cualitativos y descriptivos del propósito de un excipiente en una formulación. La sección de Documentos Preliminares, Excipientes, del NF incluye una lista de excipientes agrupados por categoría funcional que resume los propósitos más comunes de estos excipientes en los medicamentos. También es importante que se identifiquen y controlen las propiedades materiales de los ingredientes, para asegurar que el excipiente desempeñe la función deseada en un medicamento. Un atributo material crítico (CMA, por sus siglas en inglés) es una propiedad física, química, biológica o microbiológica de un material que debe estar dentro de un límite, intervalo o distribución apropiados para asegurar que los atributos de calidad críticos de los medicamentos se mantengan durante todo el ciclo de vida del producto. La mayoría de los atributos críticos de los materiales, pero no todos, se convierten en pruebas en una monografía oficial. En algunas aplicaciones, los proveedores y usuarios de excipientes necesitarán identificar y controlar las propiedades materiales además de las especificaciones de la monografía. La identificación de atributos críticos de los materiales requiere de una comprensión profunda de los atributos de calidad críticos del medicamento, de los procesos de fabricación, así como de las propiedades físicas, químicas, biológicas o microbiológicas de cada ingrediente. Los fabricantes deben prever la variabilidad entre lotes y entre proveedores en las propiedades del excipiente y deben contar con medidas de control apropiadas para asegurar que los atributos materiales críticos se mantengan dentro de los límites requeridos. Se pueden utilizar conocimientos previos, diseños experimentales y herramientas de evaluación de riesgos para priorizar e identificar los atributos críticos de los materiales de los excipientes, así como los parámetros críticos del proceso. Un atributo crítico para un excipiente puede no estar relacionado con el componente principal del excipiente ya que, por ejemplo, la presencia de componentes menores (p.ej., peróxidos, \lllllllllaRllllll!- o contenido microbiológico) puede afectar la estabilidad o calidad del producto. Las buenas prácticas de desarrollo de productos, que en ocasiones se denominan principios de calidad por diseño, requieren un entendimiento de los atributos materiales críticos del excipiente que contribuyen al desempeño uniforme y que son la base de una estrategia de control que compense la variabilidad del excipiente, logrando que los atributos de calidad del producto final se mantengan constantes.
USP 39
Información General/ (1059) Desempeño de Excipientes 1151
Este capítulo de información general proporciona una visión general de las categorías funcionales claves de los excipientes, además de pruebas o procedimientos que pueden usarse para monitorear y controlar los atributos materiales críticos. 1 En este capítulo, las categorías funcionales han sido organizadas por sus usos más representativos en formas farmacéuticas comunes. Sin embargo, las categorías funcionales pueden aplicarse a múltiples formas farmacéuticas. La asociación de una categoría funcional con una forma farmacéutica en particular no limita el uso de un excipiente a un solo tipo de forma farmacéutica o sistema de liberación. Cada categoría funcional incluye una descripción general; los mecanismos mediante los cuales los excipientes logran su actividad; las propiedades físicas comunes de estos excipientes; las propiedades químicas; y una lista de capítulos generales de la USP que pueden ser útiles en el desarrollo de pruebas específicas, procedimientos y criterios de aceptación para asegurar que los atributos materiales críticos se monitorean y controlan adecuadamente. Debido a la complejidad de la naturaleza e interacción de los ingredientes de las formulaciones, del procesamiento y de los requisitos de desempeño de las formas farmacéuticas, la información provista en este capítulo no debe considerarse restrictiva ni completamente exhaustiva.
Cambio en la redacción:
TABLETAS V CÁPSULAS
Categoría Funcional: Diluyente DESCRIPCIÓN Los diluyentes son componentes que se incorporan en las tabletas o cápsulas para incrementar el volumen o peso de la forma farmacéutica. Los diluyentes a menudo constituyen una gran proporción de la forma farmacéutica, y la cantidad y tipo de diluyente seleccionado por lo regular depende de sus propiedades físicas y químicas. Por ende, la fabricación exitosa y robusta y el desempeño de la forma farmacéutica dependen de la medición y el control de los atributos materiales críticos. MECANISMO FUNCIONAL Entre los papeles funcionales más importantes que desempeñan los diluyentes se encuentra su capacidad de impartir propiedades deseables de fabricación (p.ej., fluidez de polvos, fuerza de compactación de tabletas, formación de granulados húmedos o secos, u homogeneidad) y desempeño (p.ej., uniformidad de contenido, desintegración, disolución, integridad de la tableta, friabilidad, o estabilidad física y química). En ocasiones se hace referencia a algunos diluyentes (p.ej., celulosa microcristalina) como aglutinantes secos debido al alto grado de resistencia mecánica que imparten a la tableta comprimida final. PROPIEDADES FÍSICAS Las propiedades físicas primarias pertinentes a los diluyentes para tabletas/cápsulas son aquellas que pueden tener un efecto directo en el desempeño del diluyente y la formulación. Estas incluyen: (1) tamaño y distribución del tamaño de partícula, (2) forma de la partícula, (3) densidad aparente/por asentamiento/verdadera, (4) área superficial específica, (5) cristalinidad, (6) contenido de humedad, (7) fluidez de polvos, (8) solubilidad, (9) forma cristalina y (1 O) propiedades de compactación para tabletas. PROPIEDADES QUÍMICAS Los diluyentes de tabletas comprenden un amplio y diverso grupo de materiales que incluyen materiales inorgánicos (p.ej., fosfato dibásico de calcio o carbonato de calcio), materiales orgánicos de un solo componente (p.ej., lactosa monohidrato o manito!) y materiales orgánicos de componentes múltiples (p.ej. celulosa microcristalina silicificada o esferas de azúcares) o complejos (p.ej., celulosa microcristalina o almidón). Estos pueden ser solubles o insolubles en agua y pueden ser de naturaleza neutra, ácida o alcalina. Tales propiedades químicas pueden tener un efecto positivo o negativo sobre la estabilidad física o química del fármaco y sobre el desempeño. La selección apropiada de excipientes con propiedades físicas y químicas deseables puede mejorar la estabilidad física y química, así como el desempeño del fármaco y de la forma farmacéutica. La composición detallada de un excipiente puede ser importante debido a que la presencia de componentes concominantes menores, que son esenciales para el desempeño adecuado, puede influir sobre la función del excipiente. Es posible que los científicos farmacéuticos encuentren necesario controlar la presencia de componentes no deseados (p.ej., •impurezas elementales 4 usm o peróxidos) para asegurar la estabilidad y el desempeño adecuados de la forma farmacéutica.
1 Este capítulo de información general provee información no obligatoria que no deriva en requisitos farmacopeicos oficiales. Para información adicional sobre capítulos generales no obligatorios, así como métodos y procedimientos alternativos, ver las Advertencias Generales, 6.30 Métodos y Procedimientos Alternativos y
Armonizados.
1152 (1059) Desempeño de Excipientes / Información General
USP 39
CAPÍTULOS GENERALES Los siguientes capítulos generales pueden ser útiles para asegurar la regularidad en las funciones de los diluyentes: Medición del Tamaño de Partícula por Difracción de Luz (429), Densidad Aparente y Densidad por Asentamiento de los Polvos (616), Cristalinidad (695), Caracterización de Sólidos Cristalinos por Microcalorimetría y Calorimetría de Disolución (696), Densidad de Sólidos (699), Pérdida por Secado (731 ), Microscopía Óptica (776), Estimación de la Distribución del Tamaño de Partícula por Tamizado Analítico (786), Finura de Polvos (811 ), Área Superficial Específica (846), Determinación de Agua (921) y Fluidez de Polvos (1174).
Categoría Funcional: Aglutinante Vía Húmeda DESCRIPCIÓN Los aglutinantes de tabletas y cápsulas se incorporan a las formulaciones para facilitar la aglomeración del polvo en gránulos durante el mezclado con un líquido de granulación, como por ejemplo agua, mezclas hidroalcohólicas u otros disolventes. El aglutinante puede disolverse o dispersarse en el líquido de granulación o mezclarse en estado seco; además de que es posible agregar por separado otros componentes y el líquido de granulación durante la agitación. Después de evaporarse el líquido de granulación, los aglutinantes generalmente producen gránulos secos que adquieren las propiedades deseadas tales como tamaño de gránulo, distribución del tamaño, forma, contenido, masa y contenido activo. La granulación húmeda facilita el procesamiento adicional de los gránulos mejorando una o más de las propiedades del granulado tales como fluidez, manipulación, resistencia mecánica, resistencia a la segregación, pulverulencia, apariencia, solubilidad, compactación o liberación del fármaco.
MECANISMO FUNCIONAL Los aglutinantes son solubles o parcialmente solubles en el disolvente de granulación o, como en el caso de almidones nativos, se pueden hacer solubles. Las soluciones concentradas de aglutinante también tienen propiedades adhesivas. Cuando se agregan líquidos, los aglutinantes generalmente facilitan la producción de granulados húmedos (aglomerados) alterando la adhesión entre partículas. También pueden modificar las propiedades interfaciales, viscosidad, u otras propiedades. Durante el secado pueden producir puentes sólidos que generan una resistencia mecánica residual mejorada del granulado seco.
PROPIEDADES FÍSICAS La dispersión o disolución de un aglutinante en el líquido de granulación depende de sus propiedades físicas: entre las propiedades más importantes, dependiendo de la aplicación, se encuentran la tensión superficial, el tamaño de partícula, la distribución de tamaño, la solubilidad y la viscosidad. La incorporación homogénea de un aglutinante a una mezcla seca depende también de sus propiedades físicas, tales como tamaño de partícula, forma y distribución de tamaño. La viscosidad a menudo es una propiedad importante que se debe considerar para los aglutinantes y, en el caso de los polímeros, se ve influenciada por la naturaleza de la estructura polimérica, por el peso molecular y por la distribución del peso molecular. Los aglutinantes poliméricos pueden formar geles.
PROPIEDADES QUÍMICAS Los aglutinantes para tabletas y cápsulas se pueden categorizar como (1) polímeros naturales, (2) polímeros sintéticos o (3) azúcares. La naturaleza química de los polímeros, incluyendo la estructura polimérica, las propiedades y secuencia monomérica, los grupos funcionales, el grado de sustitución y el entrecruzamiento, influyen en las interacciones complejas que pueden presentarse durante la granulación. Los polímeros naturales, particularmente, pueden presentar una variación mayor en sus propiedades debido a variaciones en sus orígenes y, por tanto, en su composición.
CAPÍTULOS GENERALES Los siguientes capítulos generales pueden ser útiles para asegurar la regularidad en las funciones de los aglutinantes. Densidad Aparente y Densidad por Asentamiento de los Polvos (616), Cromatografía (621 ), Cristalinidad (695), Densidad de Sólidos (699), Pérdida por Secado (731 ), Estimación de la Distribución del Tamaño de Partícula por Tamizado Analítico (786), Área Superficial Específica (846), Viscosidad-Métodos Capilares (911) y Fluidez de Polvos (1174).
USP 39
Información General/ (1059) Desempeño de Excipientes 1153
Categoría Funcional: Desintegrante DESCRIPCIÓN Los desintegrantes son componentes funcionales que se agregan a las formulaciones para promover la desintegración rápida en unidades más pequeñas y para permitir que el fármaco se disuelva con mayor rapidez. Los desintegrantes son sustancias poliméricas naturales, sintéticas o naturales químicamente modificadas. Cuando los desintegrantes entran en contacto con agua o fluido intestinal o estomacal, funcionan absorbiendo el líquido y comienzan a hincharse, a disolverse o a formar geles. Esto ocasiona que la estructura de la tableta se rompa y se desintegre, produciendo mayores superficies para una mejor disolución del fármaco. MECANISMO(S) FUNCIONAL(ES) La capacidad de interactuar fuertemente con el agua es esencial para la función del desintegrante. Existen tres mecanismos principales que describen la función de los diversos desintegrantes: aumento de volumen por hinchamiento, deformación y acción capilar (capilaridad). En formulaciones de tabletas, la función de los desintegrantes se describe mejor como una combinación de dos o más de estos efectos. El comienzo y grado de las acciones logradas localmente dependen de diversos parámetros de un desintegrante, tales como su naturaleza química y su distribución de tamaño de partícula y forma de partícula, así como de algunos parámetros importantes de las tabletas tales como dureza y porosidad. PROPIEDADES FÍSICAS Las propiedades físicas primarias pertinentes a un desintegrante son aquellas que describen la estructura de las partículas del producto como un polvo seco o su estructura cuando entra en contacto con el agua. Estas propiedades pueden incluir (1) distribución de tamaño de partícula, (2) velocidad de absorción de agua, (3) velocidad de hinchamiento o índice de hinchamiento y (4) la caracterización del producto resultante independientemente de si se mantiene en partículas o si se forma un gel. PROPIEDADES QUÍMICAS Los polímeros que se utilizan como desintegrantes son no iónicos o aniónicos con contraiones tales como sodio, calcio o potasio. Los polímeros no iónicos son polisacáridos naturales o modificados físicamente tales como almidones, celulosas, pululano o polivinilpirrolidona entrecruzada. Los polímeros aniónicos son en su mayoría almidones modificados, productos de celulosa o poliacrilatos de bajo grado de entrecruzamiento. Estas propiedades químicas deben tomarse en cuenta para el caso de los polímeros iónicos. El desempeño de desintegración se ve afectado por cambios en el pH del tracto gastrointestinal o por la formación de complejos con fármacos iónicos. CAPÍTULOS GENERALES Los siguientes capítulos generales pueden ser útiles para asegurar la regularidad en las funciones de los desintegrantes: Medición del Tamaño de Partícula por Difracción de Luz (429), Microscopía Óptica (776), Estimación de la Distribución del Tamaño de Partícula por Tamizado Analítico (786) y Fluidez de Polvos (1174).
Categoría Funcional: Lubricante DESCRIPCIÓN Los lubricantes por lo general se usan para reducir las fuerzas de fricción entre partículas y entre partículas y superficies de contacto metálicas del equipo de fabricación, tales como punzones y matrices para tabletas usados en la fabricación de formas farmacéuticas sólidas. Los lubricantes líquidos se pueden absorber en la matriz del granulado antes de la compactación. Los lubricantes líquidos también se pueden usar para reducir la fricción metal-metal en el equipo de fabricación. MECANISMO FUNCIONAL Los lubricantes de capa límite funcionan adhiriéndose a superficies sólidas (gránulos y partes metálicas) y reduciendo la fricción partícula-partícula o la fricción partícula-metal. La orientación de las partículas del lubricante adherente se ve influenciada por las propiedades de la superficie del sustrato. Para un desempeño óptimo, las partículas del lubricante de capa límite deben estar compuestas de pequeños cristales en forma de placa o pilas de cristales en forma de placa. Los lubricantes de película fluida se funden bajo presión creando así una película fluida delgada alrededor de las partículas y en la superficie de los punzones y matrices de las tableteadoras, lo que ayuda a reducir la fricción. Los lubricantes de película fluida se resolidifican después
1154 (1 059) Desempeño de Excipientes / Información General
USP 39
de retirar la presión. Los lubricantes líquidos se liberan de los gránulos bajo presión y crean una película fluida. Estos no se resolidifican cuando se retira la presión pero se reabsorben o redistribuyen a través de la matriz de la tableta con el transcurrir del tiempo. PROPIEDADES FÍSICAS las propiedades físicas que son importantes para la función de los lubricantes de capa límite incluyen tamaño de partícula, área superficial, estado de hidratación y forma polimórfica. También pueden ser importantes la pureza (p.ej., relación estearato:palmitato) y el contenido de humedad. las propiedades físicas de posible importancia para los lubricantes de película fluida son el tamaño de partícula y el comportamiento en estado sólido/térmico. La pureza también puede ser importante. PROPIEDADES QUÍMICAS los lubricantes se pueden clasificar en lubricantes de capa límite, lubricantes de película fluida, o lubricantes líquidos. Los lubricantes de capa límite son sales de ácidos grasos de cadena larga (p.ej., estearato de magnesio) o ésteres de ácidos grasos (p.ej., fumarato de estearilo sódico) con una cabeza polar y una cola de ácido graso. los lubricantes de película fluida son grasas sólidas (p.ej., aceite vegetal hidrogenado, tipo 1), glicéridos (behenato y diestearato de glicerilo) o ácidos grasos (p.ej., ácido esteárico) que funden al someterlos a la presión. Los lubricantes líquidos son materiales líquidos que se liberan de los gránulos bajo presión. CAPÍTULOS GENERALES los siguientes capítulos generales pueden ser útiles para asegurar la regularidad en las funciones de los lubricantes: Medición del Tamaño de Partícula por Difracción de Luz (429), Cristalinidad (695), Caracterización de Sólidos Cristalinos por Microcalorimetría y Calorimetría de Disolución (696), Pérdida por Secado (731 ), Microscopía Óptica (776), Estimación de la Distribución del Tamaño de Partícula por Tamizado Analítico (786), Área Superficial Específica (846), Análiis Térmico (891 ), Determinación de Agua (921) y Caracterización de Sólidos Cristalinos y Parcialmente Cristalinos por Difracción de Rayos X Sobre Polvo (DRXP) (941 ). INFORMACIÓN ADICIONAL Algunos lubricantes, particularmente aquellos usados en formas farmacéuticas efervescentes, no caen en las categorías químicas definidas anteriormente. Estos materiales se usan en situaciones especiales y no son adecuados para su aplicación universal. El talco es un material inorgánico que puede tener algunas propiedades lubricantes. Por lo general se usa en combinación con lubricantes de película fluida para reducir la adhesión a los punzones y matrices.
Categoría Funcional: Deslizante y/o Agente Antiaglutinante DESCRIPCIÓN los deslizantes y agentes antiaglutinantes se usan para promover la fluidez de polvos y para reducir el aglutinamiento o la formación de grumos que puede presentarse cuando los polvos se almacenan a granel. Además, los deslizantes y agentes antiaglutinantes reducen la incidencia de puenteado durante el vaciado de tolvas para polvos y durante el procesamiento del polvo. MECANISMO FUNCIONAL Se piensa que los deslizantes trabajan mediante una combinación de adsorción en la superficie de partículas más grandes y la reducción de las fuerzas adhesivas y cohesivas entre partículas, permitiendo así que las partículas se muevan con mayor facilidad en relación con las otras. Además, los deslizantes se pueden dispersar entre partículas más grandes y reducir de esta manera la fricción entre estas partículas. Los agentes antiaglutinantes pueden absorber humedad libre que de otro modo permitiría el desarrollo de puentes entre partículas implicados en los fenómenos de aglutinamiento. PROPIEDADES FÍSICAS las propiedades físicas primarias de potencial importancia para deslizantes y agentes antiaglutinantes son el tamaño de partícula, distribución del tamaño de partícula y área superficial. Estos pueden ser ligeramente higroscópicos.
USP 39
Información General/ (1059) Desempeño de Excipientes 1155
PROPIEDADES QUÍMICAS Los deslizantes y agentes antiaglutinantes por lo general son materiales inorgánicos finamente divididos. Por lo general, son insolubles en agua. Algunos de estos materiales son complejos. CAPÍTULOS GENERALES Los siguientes capítulos generales pueden ser útiles para asegurar la regularidad en las funciones de los deslizantes o agentes antiaglutinantes: Medición del Tamaño de Partícula por Difracción de Luz (429), Pérdida por Secado (731 ), Estimación de la Distribución del Tamaño de Partícula por Tamizado Analítico (786), Área Superficial Específica (846) y Determinación de Agua (921 ).
Categoría Funcional: Agente Colorante DESCRIPCIÓN Los agentes colorantes se incorporan a las formas farmacéuticas a fin de producir una apariencia distintiva que se puede usar para diferenciar un producto en particular de otros con apariencia física similar o, en algunos casos, para proteger componentes fotolábiles de la forma farmacéutica. Estas substancias se subdividen en colorantes (sustancias solubles en agua), lacas (formas insolubles de un colorante que resultan de su adsorción irreversible en un óxido metálico hidratado), pigmentos inorgánicos (sustancias tales como dióxido de titanio u óxidos de hierro) y colorantes naturales (compuestos colorantes que no se consideran colorantes per se, tales como riboflavina). Los agentes colorantes están sujetos a las reglamentaciones federales y, en consecuencia, se debe determinar el estado reglamentario vigente de una sustancia dada antes de usarla. La Ley Federal de Alimentos, Medicamentos y Cosméticos (Federal Food, Drug, and Cosmetic Act) define tres categorías de agentes colorantes: • Colorantes FD&C: colorantes certificables para su uso en la coloración de alimentos, medicamentos y cosméticos. • Colorantes D&C: colorantes y pigmentos considerados seguros en medicamentos y cosméticos cuando entran en contacto con membranas mucosas o cuando se ingieren. • Colorantes D&C de uso externo: colorantes que, debido a su toxicidad oral, no son certificables para su uso en productos ingeribles pero que se consideran seguros para productos que se aplican externamente. Cada organismo reglamentario puede tener diferentes requisitos para agentes colorantes y cantidades aceptables. Asimismo, se debe considerar el consumo diario y acumulativo de los colorantes. MECANISMO FUNCIONAL Los colorantes -solubles en agua por lo general se disuelven para su uso en un líquido de granulación, aunque también se pueden adsorber en portadores tales como almidón, lactosa o azúcar a partir de soluciones acuosas o alcohólicas. Estos últimos productos a menudo se secan y utilizan como ingredientes de formulación. Debido a su carácter insoluble, las lacas casi siempre se mezclan con otros excipientes secos durante la formulación. Por esta razón, las tabletas de compresión directa a menudo se colorean con lacas. PROPIEDADES FÍSICAS El tamaño y la distribución del tamaño de partícula de colorantes y lacas puede tener influencia sobre los tiempos de procesamiento del producto (mezclado y disolución), intensidad de color y uniformidad de apariencia. Un agente colorante no debe reaccionar físicamente con otros excipientes ni con los fármacos. PROPIEDADES QUÍMICAS Las propiedades más importantes de un agente colorante son su intensidad de color y resistencia a desteñirse con el tiempo. Las sustancias se pueden clasificar por su eficiencia para reflejar los colores deseados del espectro de luz visible, así como por sus absortividades molares a longitudes de onda características. Un agente colorante no debe reaccionar químicamente con otros excipientes ni con los fármacos. La calidad de un agente colorante comúnmente se mide mediante una determinación de su concentración, desempeño o valoración. El perfil de impurezas se establece mediante mediciones de materia insoluble, contenido de sales inorgánicas, contenido metálico e impurezas orgánicas. CAPÍTULOS GENERALES Los siguientes capítulos generales pueden ser útiles para asegurar la regularidad en las funciones seleccionadas de los agentes colorantes: Medición del Tamaño de Partícula por Difracción de Luz (429) y Color-Medición Instrumental (1061 ). Se deben usar métodos instrumentales para determinar el color absoluto de un agente colorante.
1156 (1059) Desempeño de Excipientes / Información General
USP 39
INFORMACIÓN ADICIONAL Los agentes colorantes están sujetos a las reglamentaciones federales y, en consecuencia, se debe determinar el estado reglamentario vigente de una sustancia dada antes de usarla.
Categoría Funcional: Cubierta de Cápsula DESCRIPCIÓN La palabra cápsula se deriva del latín 'capsula' que significa envase pequeño. Las cápsulas, entre otros beneficios, permiten formular polvos y líquidos farmacéuticos con exactitud de dosificación y facilidad de transportación. El material de las cápsulas debe ser compatible con todos los demás ingredientes en el medicamento. Las cápsulas duras por lo regular consisten en dos partes: ambas son cilíndricas y una parte, denominada cuerpo, es ligeramente más larga que la otra. La tapa se ajusta estrechamente al cuerpo para cerrar la cápsula. Por el contrario, la cápsula blanda es una unidad de una sola pieza que puede estar sellada a lo largo de un eje o puede presentarse sin costura. El material de la cápsula se puede obtener por hidrólisis de colágeno de fuentes porcinas, bovinas o de peces, o puede ser de origen no animal, p.ej., entidades químicas celulósicas o de polisacáridos. La cubierta de la cápsula también contiene otros aditivos tales como plastificadores, colorantes y conservantes. En algunos casos, las cubiertas de las cápsulas se esterilizan para prevenir el crecimiento microbiano. La cubierta de la cápsula es una parte integral de la formulación y por ende la fabricación robusta y el desempeño de la formulación dependen de la medición y del control de atributos críticos de los materiales. Las Cápsulas se pueden usar para administrar medicamentos por vía oral, rectal, vaginal o inhalación. MECANISMO FUNCIONAL Las cápsulas pueden encerrar formulaciones sólidas, semisólidas y líquidas. Entre la variedad de beneficios que ofrecen las cápsulas se incluye lo siguiente: enmascaran sabores desagradables, facilitan el cegado en estudios clínicos, facilitan el tragado y presentan una apariencia única. Las cubiertas de cápsulas convencionales se deben disolver rápidamente a 37º; en fluidos biológicos tales como medios gástricos e intestinales. No obstante, las propiedades de solubilidad de la cubierta se pueden modificar (p.ej., con polímeros entéricos o de liberación controlada) para controlar la liberación del contenido de las cápsulas. PROPIEDADES FÍSICAS Las propiedades físicas primarias pertinentes a las cubiertas de las cápsulas son aquellas que pueden tener un efecto directo en el desempeño del producto (1) contenido de humedad, (2) permeabilidad a los gases, (3) estabilidad durante el almacenamiento, (4) desintegración, (5) consistencia y (6) fragilidad. El contenido de humedad varía con el tipo de cápsula. Las cápsulas de gelatina dura por lo general contienen 13%-16% de agua en comparación con las cápsulas de hipromelosa (hidroxipropil metilcelulosa o HPMC) que por lo regular presentan un 4%-7% de contenido de agua. El contenido de humedad tiene un impacto importante en la tendencia a la fractura de las cápsulas. Las cápsulas de gelatina blanda contienen 5%-15% de agua. El contenido de agua en equilibrio también puede ser crucial para la estabilidad de la forma farmacéutica debido a que se puede producir migración de agua entre la cubierta y el contenido de las cápsulas. La permeabilidad a los gases puede ser importante y por lo general es mayor en cápsulas de HPMC que en las cápsulas de gelatina debido a la presencia de estructuras abiertas en las primeras. A diferencia de las cápsulas de HPMC, que no se entrecruzan, las cápsulas de gelatina pueden sufrir entrecruzamiento, debido a la exposición ambiental y química. Las cápsulas de gelatina pueden experimentar entrecruzamiento durante el almacenamiento a una temperatura y humedad elevadas (p.ej. 40º/75% HR). Asimismo, se sabe también que el material de las cubiertas de gelatina se entrecruza debido a la exposición a aldehídos, cetonas y algunos colorantes en las formulaciones de las cubiertas. Por ende, se debe tomar en cuenta la presencia de estos materiales en los excipientes para productos encapsulados en gelatina. El entrecruzamiento reduce la velocidad de disolución in vitro y a menudo requiere la introducción de enzimas en el medio de prueba. Las cápsulas de gelatina deben desintegrarse dentro de los 15 minutos al exponerlas a ácido clorhídrico al 0,5% a 36º-38º pero a una temperatura no menor de 30º. Las cápsulas de HPMC se pueden desintegrar a una temperatura por debajo de 30º. PROPIEDADES QUÍMICAS La gelatina es una proteína comercial derivada de colágeno nativo. El producto se obtiene mediante hidrólisis parcial de colágeno derivado de piel, tejido conectivo blanco y huesos de animales. La gelatina tipo A se obtiene mediante tratamiento ácido, mientras que la gelatina tipo B se obtiene por tratamiento con bases. Las fuentes comunes de gelatina comercial son la piel de cerdo, el cuero de ganado bovino, los huesos de ganado bovino, la piel de bacalao y la piel de tilapia. La cápsula de gelatina también contiene, por lo general, agentes colorantes, plastificantes tales como alcoholes polihídricos, gomas y azúcares naturales y conservantes tales como metabisulfito de sodio y ésteres de ácido p-hidroxibenzoico. Hoy en día, las cápsulas sin gelatina mayormente usadas se fabrican con HPMC. Los diversos tipos de cápsulas contienen distintos niveles de humedad
USP 39
Información General/ (1059) Desempeño de Excipientes 1157
y pueden, por tanto, influir sobre la estabilidad del medicamento. La composición detallada de un excipiente puede ser importante debido a que la función de la cubierta se puede ver influenciada por pequeñas cantidades de impurezas en los excipientes (p.ej., peróxidos en aceites o aldehídos en lactosa y almidones) que pueden provocar entrecruzamiento en la cápsula Se debe evaluar la presencia de materiales indeseables en las cubiertas de las cápsulas, tales como metales, sustancias odorantes, sustancias insolubles en agua y dióxido de azufre, a fin de asegurar la estabilidad y el desempeño. CAPÍTULOS GENERALES Los siguientes capítulos generales pueden ser útiles para asegurar la regularidad en las funciones seleccionadas de las cubiertas de las cápsulas: Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano (61 ), Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Microorganismos Específicos (62), Arsénico (211 ), ,~··.'.. "' ..: :·w·' ;:: ; .:~· ·:· " .... ·.~':. • •..'.~ ~ * ·.:· · .:· . Residuo de Incineración (281 ), Desintegración (701 ), Disolución (711 ), Determinación de Agua (921) y Color-Método Instrumental (1061 ).
llJll9J ··. ':. '. ::. · ·:.. ·. ,'
'11111111111
·7:,••.I
Categoría Funcional: Agente de Recubrimiento DESCRIPCIÓN Las tabletas orales pueden recubrirse usando recubrimiento por compresión, grageado o recubrimiento con película. El recubrimiento por compresión (en efecto comprimir una tableta dentro de una tableta) por lo general emplea los mismos ingredientes que una tableta convencional y, por tanto, está fuera del alcance de esta sección. El término grageado se refiere a un proceso y no requiere el uso de sacarosa como parte de la formulación. Las cápsulas orales pueden recubrirse usando procedimientos de recubrimiento con película. Las razones para recubrir las formas farmacéuticas incluyen: enmascarar olores y sabores desagradables, mejorar la ingestión y apariencia, proteger del ambiente a los ingredientes activos y modificar la liberación del ingrediente activo (p.ej., velocidades de liberación controladas o liberación gastrointestinal). Los materiales usados como agentes de recubrimiento difieren dependiendo del proceso de recubrimiento usado. El grageado es el proceso original de recubrimiento. Sin embargo, debido a razones técnicas y económicas, hoy en día el grageado ha sido ampliamente reemplazado por el recubrimiento con película. El grageado es un proceso complejo que generalmente implica la aplicación de diversas capas que incluyen una capa de sellado, una capa de pre-recubrimiento, una capa de engrosamiento, una capa de alisado, una capa de color y una capa de pulido. Las soluciones o suspensiones de recubrimiento se vierten lentamente o se aplican de otro modo en alícuotas sobre un lecho de tabletas en una paila (o bombo) que gira lentamente. El proceso de recubrimiento generalmente toma un largo periodo (que puede llevar varios días) y genera un incremento significativo en el peso de las tabletas. Por el contrario, el recubrimiento con película es un proceso más simple en el que la solución o suspensión de recubrimiento se rocía sobre las tabletas en una paila rotatoria o en un aparato de lecho fluido y genera únicamente un aumento modesto en el peso de la cápsula o tableta. Los materiales usados en el grageado y el recubrimiento con película incluyen materiales naturales, semisintéticos y sintéticos. Éstos pueden ser soluciones, suspensiones o dispersiones coloidales (látex o pseudolátex) que se pueden aplicar como sistemas acuosos o no acuosos. Además, se pueden aplicar ceras y lípidos en estado fundido como recubrimiento sin utilizar disolventes. Las ceras y los lípidos también se pueden aplicar en estado sólido como una capa de pulido sobre el grageado o el recubrimiento con película. MECANISMO FUNCIONAL-GRAGEADO El recubrimiento de sellado se usa para sellar la superficie de los núcleos de tabletas para prevenir que el agua de las soluciones o suspensiones de recubrimiento provoque la desintegración de los núcleos de las tabletas durante la etapa de recubrimiento. El recubrimiento de sellado por lo general es un polímero (p.ej., goma laca) que es insoluble en agua y que se aplica como una capa delgada a partir de una solución en un disolvente no acuoso. El componente clave de la mayoría de las soluciones o suspensiones de grageado es un soluto, generalmente sacarosa, que es muy soluble en agua y que a muy alta concentración genera una solución pegajosa y viscosa (un jarabe). Se pueden disolver o suspender otros materiales en la solución dependiendo de la etapa del proceso de recubrimiento. A medida que el recubrimiento se seca, el material de recubrimiento disuelto se adhiere a la superficie de las tabletas. La solución o suspensión de recubrimiento por lo general se aplica en etapas sucesivas, seguidas de secado, hasta que se haya obtenido el recubrimiento requerido. El recubrimiento de engrosamiento se compone de otra capa delgada diseñada para adherirse a los núcleos que han sido sellados para proveer una base de pre-recubrimiento de manera que la capa de engrosamiento se pueda adherir a la superficie de la tableta. El pre-recubrimiento por lo general contiene una alta concentración de sólidos suspendidos y está diseñado para incrementar el peso de las tabletas
1158 (1 059) Desempeño de Excipientes / Información General
USP 39
de manera comparativamente rápida. El recubrimiento de alisado (o glaseado) está diseñado para proveer una superficie lisa, mientras que el recubrimiento de color provee el color final requerido. Finalmente, las tabletas pueden transferirse a una paila de pulido y pulirse usando una mezcla de ceras para proveer un acabado de alto brillo. MECANISMO FUNCIONAL-RECUBRIMIENTO CON PELÍCULA Los agentes de recubrimiento con película están compuestos de materiales formadores de película (ver Categoría Funcional: Agente Formador de Película) que proporcionan propiedades farmacéuticas deseables, tales como apariencia, aceptación por parte del paciente (p.ej. enmascaramiento de sabores y facilidad al tragar). Los agentes de recubrimiento con película también pueden usarse para otros propósitos funcionales tales como proveer una barrera contra reacciones químicas indeseables o la liberación inoportuna del fármaco. Después de su ingestión, el recubrimiento con película se puede disolver mediante procesos como hidratación, solubilización o desintegración, dependiendo de la naturaleza del material usado. Los recubrimientos entéricos son insolubles en medios ácidos (pH bajo) pero se disuelven con facilidad en condiciones de pH neutro. No obstante, los polímeros de recubrimiento con película más comunes no tienen una solubilidad específica de pH. El espesor de la película puede variar por la aplicación y la naturaleza de los agentes de recubrimiento. En el proceso de recubrimiento, las cadenas de polímero se dispersan sobre la superficie del núcleo y coalecen en una película continua a medida que se evapora el disolvente. Las soluciones o dispersiones de polímero con baja viscosidad y alta capacidad de unión de pigmentos reducen el tiempo de aplicación del recubrimiento y permiten lograr una fabricación relativamente simple y económica. Los polímeros plásticos, ceras y recubrimientos basados en lípidos se pueden aplicar sin disolventes mediante fundición y atomización. Cuando las gotitas de fluido fundido impactan contra la superficie de las partículas de fármaco fluidizado, se dispersan y resolidifican para formar capas de película. Por tanto, los materiales de recubrimiento con película generalmente tienen la capacidad de formar una película completa y estable alrededor del sustrato. El recubrimiento con película por lo regular se aplica de manera uniforme y se seca cuidadosamente para asegurar la producción de un producto de calidad constante. Puede ser necesario el uso de plastificantes adecuados para disminuir la temperatura mínima de formación de la película del polímero, y los formuladores deben considerar su efecto potencial sobre la liberación del fármaco. PROPIEDADES FÍSICAS El grageado es un proceso largo y complejo. Las propiedades físicas del polímero de recubrimiento de sellado y de la solución son importantes, al igual que las propiedades físicas del componente del jarabe en las capas subsiguientes y de cualquier sólido disuelto o suspendido, y los agentes de recubrimiento deben ser lo suficientemente estables durante su uso. El recubrimiento con película es un proceso complejo y las características de un polímero formador de película son importantes. El tamaño de partícula de las dispersiones coloidales varía según su composición y fabricación (látex, pseudolátex o polvo redispersado) y puede tener un efecto sobre la formación de la película. La tensión superficial de las preparaciones de recubrimiento puede influir sobre el patrón de rociado en el proceso de fabricación. La película debe tener una elasticidad y fuerza mecánica suficientes para soportar las tensiones durante las operaciones de recubrimiento y envasado. Para los recubrimientos que se aplican en estado fundido sin disolventes (polímeros plásticos, ceras y recubrimientos basados en lípidos), el intervalo de fusión y la viscosidad de fusión son las propiedades que requieren de mayor consideración por parte de los formuladores. PROPIEDADES QUÍMICAS Los componentes del recubrimiento pueden ser de origen natural, semisintético o sintético y también pueden estar disponibles en diferentes grados químicos. Comprenden una variedad de materiales químicos distintos. Los formuladores deben considerar la naturaleza del material y su uso previsto al identificar y cuantificar los atributos críticos de los materiales para garantizar el desempeño constante. CAPÍTULOS GENERALES Los siguientes capítulos generales pueden ser útiles para asegurar la regularidad en las funciones seleccionadas de los agentes de recubrimiento: Grasas y Aceites Fijos (401 ), Medición del Tamaño de Partícula por Difracción de Luz (429), Disolución (711 ), Resistencia a la Tensión (881 ), Análisis Térmico (891 ), Viscosidad-Métodos Capilares (911 ), Viscosidad-Métodos Rotatorios (912) y Viscosidad-Método de Bola Rodante (913). Asimismo, los capítulos generales citados en Categoría Funcional: Agente Formador de Película (a continuación) también pueden ser adecuados para la evaluación de polímeros para recubrimiento con película.
INFORMACIÓN ADICIONAL La formulación del recubrimiento incluye a menudo el uso de aditivos. Los diluyentes sólidos (p.ej., alcoholes de azúcares, celulosa microcristalina, carbonato de calcio y caolín) se pueden agregar para incrementar el contenido de sólidos del agente
USP 39
Información General/ (1059) Desempeño de Excipientes 1159
de recubrimiento sin incrementar la viscosidad. Se puede usar ácido esteárico para mejorar la función protectora/barrera contra la humedad de un recubrimiento. Es posible agregar agentes colorantes (p.ej., dióxido de titanio y óxido de hierro) para modificar la apariencia.
Categoría Funcional: Plastificante DESCRIPCIÓN Un plastificante es una sustancia de bajo peso molecular que, cuando se la agrega a otro material-por lo regular un polímero-lo vuelve flexible, elástico y más fácil de manejar. Los plastificantes son componentes clave que determinan las propiedades físicas de los sistemas farmacéuticos poliméricos tales como los recubrimientos de las tabletas y las cubiertas de las cápsulas. MECANISMO FUNCIONAL Los plastificantes funcionan incrementando la movilidad intramolecular e intermolecular de las macromoléculas que componen los materiales poliméricos. Lo anterior se logra interfiriendo con los mecanismos normales de unión intermoleculares e intramoleculares en dichos sistemas. Los plastificantes más efectivos ejercen su efecto a bajas concentraciones, por lo regular menos de 5% p/p. Los plastificantes comúnmente se agregan a los recubrimientos de película (sistemas acuosos y no acuosos) y a las cubiertas de las cápsulas (duras y blandas) para mejorar la capacidad de trabajo y resistencia mecánica. Sin la adición de plastificantes, dichos materiales pueden agrietarse o fracturarse prematuramente. Los plastificantes también se agregan a preparaciones farmacéuticas semisólidas tales como cremas y ungüentos para mejorar sus propiedades reológicas. PROPIEDADES FÍSICAS Los plastificantes más comunes son sólidos o líquidos de bajo peso molecular(< 500 Da). Generalmente tienen puntos bajos de fusión ( < 100º) y pueden ser volátiles (es decir, ejercer una presión de vapor importante) a temperatura ambiente. Los plastificantes pueden reducir la temperatura de transición vítrea (T9 ) del sistema al que se agregan. PROPIEDADES QUÍMICAS Muchos plastificantes modernos son ésteres sintéticos tales como citratos y ftalatos. Los plastificantes farmacéuticos tradicionales incluyen aceites, azúcares y sus derivados. CAPÍTULOS GENERALES Los siguientes capítulos generales pueden ser útiles para asegurar la regularidad en las funciones seleccionadas de los excipientes: Disolventes Residuales (467), Intervalo o Temperatura de Fusión (7 41 ), Índice de Refracción (831 ), Peso Específico (841 ), Análisis Térmico (891) y Determinación de Agua (921 ). INFORMACIÓN ADICIONAL La selección de un plastificante apropiado a menudo está determinada por su parámetro de solubilidad, que se relaciona con su densidad de energía cohesiva. Los valores de los parámetros de solubilidad para una gran cantidad de materiales comunes se tabulan en textos de referencia. Para asegurar la máxima eficacia, el parámetro de solubilidad del plastificante y del sistema polimérico que se está plastificando deben coincidir en la mayor medida posible.
Categoría Funcional: Agente Formador de Película DESCRIPCIÓN Los agentes formadores de película por lo general son polímeros que se pueden usar para preparar películas de polímero para recubrir tabletas o cápsulas para administración oral, para modificar la apariencia, para modificar la liberación de fármacos o para otros propósitos tales como formulaciones que se funden en la boca. Los materiales poliméricos usados como agentes formadores de película se pueden derivar de fuentes naturales, semisintéticas o sintéticas, y se pueden proveer como polvos, gránulos, soluciones previamente preparadas o dispersiones coloidales. Las dispersiones coloidales pueden contener otros componentes tales como plastificantes, agentes tensioactivos, conservantes o estabilizantes. Los agentes formadores de película pueden aplicarse como dispersiones coloidales (látex o pseudolátex) o como soluciones poliméricas acuosas, hidroalcohólicas o no acuosas.
1160 (1059) Desempeño de Excipientes / Información General
USP 39
MECANISMO FUNCIONAL Los agentes formadores de película por lo general están compuestos por materiales poliméricos que poseen la capacidad de formar películas después de la evaporación del disolvente de una solución del polímero o de la fase continua de una dispersión coloidal. Por ende, el polímero mismo debe ser un sólido a temperatura y humedad ambientes. Algunos polímeros pueden formar películas sin incluir componentes agregados, pero otros polímeros pueden requerir el uso de componentes adicionales tales como plastificantes. PROPIEDADES FÍSICAS Muchos agentes formadores de película poliméricos están disponibles en una variedad de grados físicos que por lo general se basan en la viscosidad nominal del grado pertinente. Las propiedades físicas del polímero son las correspondientes a los sólidos y muchos polímeros están disponibles como polvos o gránulos. Además de las propiedades normales de los polvos y gránulos a granel, otras propiedades físicas importantes de un agente formador de película polimérico son la distribución de peso molecular, que se vincula con la viscosidad nominal del grado y la temperatura de transición vítrea (T9 ). Si el agente formador de película se provee en forma de solución o dispersión previamente preparada, la viscosidad de la solución o dispersión puede afectar el desempeño, por lo que deberá monitorearse. PROPIEDADES QUÍMICAS Los agentes formadores de película comprenden un grupo diverso de materiales que incluyen materiales naturales, semisintéticos y sinteticos, tal como se discutió anteriormente. Pueden tener grupos funcionales ionizables que imparten propiedades que dependen del pH y también pueden estar disponibles en diversos grados químicos (p.ej., con diversos grados de sustitución química). Las monografías oficiales a menudo describen clases de materiales poliméricos que permiten un intervalo considerable de composición. Los formuladores deben considerar estos factores al momento de identificar atributos críticos de los materiales y de establecer especificaciones para asegurar un desempeño uniforme. CAPÍTULOS GENERALES Los siguientes capítulos generales pueden ser útiles para asegurar la regularidad en las funciones seleccionadas del agente formador de película: Grasas y Aceites Fijos (401 ), Medición del Tamaño de Partícula por Difracción de Luz (429), Densidad Aparente y Densidad por Asentamiento de Polvos (616), Cromatografía (621 ), Densidad de Sólidos (699), Disolución (711 ), Microscopía Óptica (776), pH (791 ), Resistencia a la Tensión (881 ), Análisis Térmico (891 ), Viscosidad-Métodos Capilares (911 ), ViscosidadMétodos Rotatorios (912), Viscosidad-Método de Bola Rodante (913), Procedimientos para el Muestreo de Polvos a Granel (1097), Espectroscopía en el Infrarrojo Cercano (1119), Espectroscopía Raman (1120), Formas Farmacéuticas (1151 ), Fluidez de Polvos (1174) y Microscopía Electrónica de Barrido (1181 ).
Categoría Funcional: Saborizantes y Fragancia DESCRIPCIÓN Un saborizante es una entidad química individual o una mezcla de productos químicos de origen sintético o natural que tiene la capacidad de producir una respuesta de sabor o aroma (es decir, fragancia) cuando se consume por vía oral o se huele. El propósito principal del saborizante que se agrega a una preparación farmacéutica es proveer todo o parte del sabor y aroma del producto que se lleva a la boca. Los saborizantes a menudo se usan en tabletas farmacéuticas de desintegración oral, soluciones orales y suspensiones orales para enmascarar el sabor desagradable del fármaco y para hacer que la formulación sea más agradable al paladar, con lo que se promueve el cumplimiento por parte del paciente con la ingesta requerida. MECANISMO FUNCIONAL Los químicos disueltos en la saliva excitan a los quimioreceptores en las papilas gustativas que residen principalmente en la lengua y que generan la percepción de sabor. La disolución también libera productos químicos volátiles que alcanzan a los receptores olfativos generando así la percepción de aromas. La combinación de las respuestas de gusto y olor constituyen el sabor. Los humanos pueden distinguir entre cinco componentes de sabor: ácido, salado, dulce, amargo, no dulce, así como un amplio rango de olores específicos. Los mejoradores y modificadores de sabor se pueden usar para modificar el perfil de dulzura de un agente endulzante o para enmascarar sabores. Por ejemplo, se sabe que los ácidos orgánicos tales como el ácido aspártico y glutámico reducen el amargor.
USP 39
Información General/ (1059) Desempeño de Excipientes 1161
PROPIEDADES FÍSICAS La percepción de sabor depende de factores fisicoquímicos, fisiológicos y psicológicos. Todas las propiedades físicas tales como tamaño de partícula, solubilidad, humectación, textura y color influyen sobre los sentidos. Además del sabor, los atributos sensoriales de la vista (p.ej., color llamativo), sonido (p.ej., el crujido de una tableta masticable) y la sensación en la boca (p.ej., viscoso, pegajoso, calcáreo, empalagoso o acuoso) también contribuyen con la experiencia sensorial general. PROPIEDADES QUÍMICAS Los productos químicos que proveen uno de los cinco sabores básicos poseen una amplia variedad de estructuras, grupos funcionales y pesos moleculares. Los productos químicos usados para impartir sabor a las preparaciones farmacéuticas mediante olor y sabor tienden a presentar pesos moleculares bajos (< 250 Da) y grupos funcionales polares tales como ésteres, cetonas, aldehídos, aminas o alcoholes. Para incrementar la estabilidad de los sabores en una forma farmacéutica sólida y para minimizar las interacciones entre sabor y fármaco, los formuladores pueden agregar saborizantes encapsulados o secados por aspersión. CAPÍTULOS GENERALES Los siguientes capítulos generales pueden ser útiles para asegurar la regularidad en las funciones de los saborizantes: Medición del Tamaño de Partícula por Difracción de Luz (429), Cromatografía (621 ), Temperatura de Solidificación (651 ), Pérdida por Secado (731 ), Intervalo o Temperatura de Fusión (741 ), Rotación Óptica (781 ), Estimación de la Distribución del Tamaño de Partícula por Tamizado Analítico (786), Índice de Refracción (831) y Peso Específico (841 ).
Categoría Funcional: Agente Modificador de Liberación Los agentes de modificación de la liberación se usan para controlar la liberación de fármacos en las formulaciones de liberación prolongada (también referidas como formulaciones de liberación controlada). Los agentes de liberación sostenida y recubrimiento entérico se incluyen en Categoría Funcional: Agente de Recubrimiento. DESCRIPCIÓN Los agentes modificadores de liberación cambian el patrón de liberación de fármacos de un medicamento para lograr el perfil plasmático deseado en un tiempo determinado. La mayoría de los agentes modificadores de liberación son polímeros que difieren en términos de solubilidad, facilidad de erosión, velocidad de dilatación o sensibilidad al ambiente biológico en el que se colocan. Estos polímeros se han empleado para fabricar sistemas de administración de fármacos basados en matrices o membranas para las vías de administración oral, parenteral, transdérmica, entre otras. Los sistemas de liberación de fármacos controlados por matrices se pueden clasificar como matrices hidrófilas erosionables, matrices hidrófilas no erosionables o matrices hidrofóbicas. En los sistemas de liberación de fármacos controlados por membrana el reservorio del fármaco se recubre con una membrana polimérica que controla la velocidad, la cual puede consistir en una mezcla de polímeros para controlar la liberación. Dichos dispositivos pueden tomar la forma de tabletas, cápsulas, microesferas, vesículas, fibras, parches, entre otros. Además de los polímeros, algunos excipientes basados en lípidos también pueden usarse como agentes modificadores de liberación en dispositivos de matriz hidrofóbica y en otros tipos de sistemas de liberación modificada. Por lo regular, estos materiales basados en lípidos son grasas y ceras o materiales relacionados con intervalos de fusión por encima de 45º. MECANISMO FUNCIONAL Al entrar en contacto con un fluido biológico, los polímeros que controlan la liberación pueden experimentar una variedad de cambios físicos tales como hinchamiento, gelificación, disolución o erosión, cada uno de los cuales se puede disparar por una simple exposición acuosa, o se puede modular por el pH, la tensión osmótica o las interacciones con la bilis u otros contenidos intestinales. Además de los cambios físicos, los polímeros pueden experimentar degradación química por ácidos, bases, enzimas, agua, calor, por mencionar algunos. Cualquiera de estos mecanismos o todos ellos pueden actuar de manera coordinada para controlar la velocidad a la que se libera el fármaco del sistema de liberación. Para matrices hidrófilas en las que la difusión del fármaco domina la velocidad de liberación, la velocidad de liberación de fármacos depende de las propiedades del gel polimérico, y la naturaleza de la fase continua en los intersticios del gel influencia las velocidades de disolución y difusión del fármaco. En el caso de las matrices erosionables, el gel se erosiona debido a la acción mecánica del tracto gastrointestinal a medida que la captación de agua se incrementa, y el gel se vuelve más diluido, reduciendo así la distancia de difusión o liberando partículas de fármaco que se disuelven posteriormente. Los materiales hidrofóbicos que forman matrices son insolubles. La liberación de fármacos de dichos sistemas está regulada por la difusión del fármaco a través de los poros tortuosos que se van produciendo a medida que los componentes solubles se disuelven.
1162 (1059) Desempeño de Excipientes / Información General
USP 39
Los sistemas de liberación de fármacos basados en membrana incluyen tabletas, cápsulas y microesferas con recubrimientos poliméricos. Los mecanismos de liberación de fármacos de dichos sistemas son complejos y dependen de las características fisicoquímicas del fármaco y de los polímeros o lípidos usados, así como de factores biológicos en el caso de sistemas biocompatibles y biodegradables. Con mayor frecuencia, la liberación de fármacos de dichos sistemas está regulada por la difusión del fármaco a través de la membrana hidratada que controla la velocidad. Otros sistemas de liberación modificada para uso parenteral incluyen nanopartículas de lípidos sólidos y liposomas. Los mecanismos de liberación para estos sistemas a menudo implican una interacción complicada con los procesos biológicos tales como una depuración potencial a través del sistema reticuloendotelial, liberación dirigida y captación celular. Los dispositivos de bomba osmótica representan un caso especial de los sistemas de administración por membrana. El polímero que controla la velocidad es insoluble y semipermeable-es decir, permitirá la difusión de agua-no así de moléculas de fármaco-a través de la membrana. La liberación se controla mediante la presión osmótica de los componentes en el centro y de la viscosidad de la solución o suspensión resultante. La salida de la solución o suspensión del fármaco, se fuerza a través de un orificio en la membrana, que típicamente se perfora con un láser durante la fabricación del producto. PROPIEDADES FÍSICAS Las propiedades físicas del excipiente que controla la liberación dependen del tipo químico: polímero hidrófilo, polímero hidrofóbico, mezclas de polímeros semipermeables o lípidos, ceras o polímeros biodegradables (que pueden ser hidrófilos o hidrofóbicos). Los polímeros hidrófilos forman un gel al entrar en contacto con agua o medios acuosos. Típicamente estos polímeros son de grados de peso molecular elevado debido a que deben proveer resistencia a la acción mecánica del tracto gastrointestinal durante el pasaje. A las concentraciones generalmente usadas durante la liberación in vivo, estos polímeros de pesos moleculares altos a menudo no presentan propiedades newtonianas, excepto en solución muy diluida (si son solubles). Los formuladores deben monitorear las propiedades cinéticas y viscoelásticas de los geles formados en el medio de liberación. Los polímeros hidrofóbicos son insolubles en agua y sus propiedades en solución se determinan en soluciones no acuosas. Los polímeros usados en la preparación de membranas semipermeables en dispositivos de bomba osmótica también son insolubles en agua y, de manera similar, sus propiedades en solución se determinan en soluciones no acuosas. De forma parecida, los materiales hidrofóbicos basados en lípidos son insolubles en agua. PROPIEDADES QUÍMICAS Los agentes que controlan la velocidad pueden ser de muchos orígenes y tipos diferentes y se encuentran disponibles en una variedad de grados que reflejan la considerable variación química en sus estructuras y propiedades químicas. Los formuladores deben considerar estas variables durante cualquier investigación química y cuando consideren los efectos de la estructura química sobre el desempeño del excipiente. Las propiedades de interés pueden incluir composición química de copolímeros y derivados celulósicos, grado de ionización, peso molecular, grado de entrecruzamiento o, para lípidos, composición de ácidos grasos. Las impurezas residuales del proceso de fabricación tales como monómeros, iniciadores, agentes de extinción, peróxidos y aldehídos pueden afectar la estabilidad del fármaco y se deben monitorear. CAPÍTULOS GENERALES Los siguientes capítulos generales pueden ser útiles para asegurar la regularidad en las funciones seleccionadas de los agentes modificadores de liberación: Grasas y Aceites Fijos (401 ), Medición del Tamaño de Partícula por Difracción de Luz (429), CristaDisolución 1), Pérlinidad (695), Caracterización de Sólidos Cristalinos por Microcalorimetría Calorimetría de Disolución dida por Secado (731), Intervalo o Temperatura de Fusión (741), lillilA!l;Ulf~~lillmflllllBllllltillllif[lrl,l[IJ llillltlll~I Microscopía Estimación de la del Tamaño de Superficial Específica (846), ~lfl?l~~~~i~~[~~~~-~~~4~l~!lial~~fil~~~~~IR~~~ifi~~l~i~l~,':·~~lllliilllijl'' Resistencia a la Tensión (881 ), Análisis Térmico (891 ), Viscosidad-Métodos Capilares (911 ), Viscosidad-Métodos wntntnrm< Viscosidad-Método de Bola Rodante (91 3), Determinación de Agua (921 ), Caracterización de Sólidos Cristalinos y Parcialmente Cristalinos por Difracción de Rayos X Sobre Polvo (DRXP) (941 ), Fluidez de Polvos (1174) y Microscopía Electrónica de Barrido (1181 ).
INFORMACIÓN ADICIONAL Algunos agentes modificadores de liberación pueden incluir aditivos tales como agentes antioxidantes o antiaglutinantes.
USP 39
Información General/ (1059) Desempeño de Excipientes 1163
LÍQUIDOS ORALES Categoría Funcional: Modificador de pH {Agente Acidificante/Agente Alcalinizante/Agente Amortiguador) DESCRIPCIÓN La concentración de ión de hidrógeno, [H+], en una solución acuosa se expresa como pH = - log(H+). El pH del agua pura es 7 a 25º. Una solución acuosa es ácida a un pH < 7 y alcalina a un pH > 7. Se puede agregar un ácido para acidificar una solución. De manera similar, se puede usar una base para alcalinizar una solución. Un amortiguador es un ácido (o base) débil y su sal. Cuando un amortiguador está presente en una solución, la adición de pequeñas cantidades de ácido o base fuerte produce sólo un pequeño cambio en el pH de la solución. La capacidad amortiguadora se ve influenciada por la relación sal/ácido (o base/sal) y la concentración total de ácido (o base) y sal. El pH de las soluciones farmacéuticas por lo regular se controla usando agentes acidificantes/alcalinizantes y amortiguadores para (1) mantener un pH cercano al del fluido corporal pertinente para evitar la irritación; (2) mejorar la estabilidad de un fármaco cuando se determine que ésta depende del pH; (3) controlar la solubilidad en equilibrio de ácidos o bases débiles; y (4) mantener un estado de ionización uniforme de las moléculas durante el análisis químico, p.ej., cromatografía líquida de alta resolución. MECANISMO FUNCIONAL Los equilibrios de ionización de bases débiles, ácidos débiles y agua son la clave de las funciones de los agentes acidificantes, alcalinizantes y amortiguadores. La reacción autoprotolítica del agua se puede expresar como H2 0 + H2 0
<-->
Hp+ + OH-
La constante de autoprotólisis (o producto iónico) del agua es Kw = 1 x 10-14 a 25º y varía significativamente con la temperatura. Debido a que las concentraciones de iones de hidrógeno e hidroxilos en el agua pura son iguales, cada una tiene el valor de aproximadamente 1 x 10-7 moles/L, lo que conlleva a un pH neutro de 7 a 25º. Cuando se agrega un ácido, base o sal de un ácido (o base) débil, el equilibrio de ionización del agua se modifica de manera que [H+][OH-] se mantiene constante, lo que resulta en un pH de la solución que es diferente de 7. PROPIEDADES FÍSICAS Los modificadores del pH generalmente se disuelven en formas farmacéuticas líquidas. Las propiedades físicas pueden ser importantes y deben considerarse debido a que pueden influenciar los requisitos de procesamiento (p.ej., el tamaño de partícula puede influenciar el tiempo de mezclado requerido para disolver un modificador del pH). PROPIEDADES QUÍMICAS Los amortiguadores y modificadores del pH influyen sobre el pH, la capacidad amortiguadora, la osmolalidad, la osmolaridad y la conductividad del agua de la solución. Cuando se usan en un análisis químico, los amortiguadores deben ser químicamente compatibles con los reactivos y la sustancia de prueba. Los amortiguadores usados en sistemas fisiológicos no deben interferir con la actividad farmacológica del medicamento ni con la función normal del organismo. CAPÍTULOS GENERALES Los siguientes capítulos generales pueden ser útiles para asegurar la regularidad en las funciones seleccionadas del modificador del pH o agente amortiguador: Conductividad del Agua (645), Osmolalidad y Osmolaridad (785) y pH (791 ).
Categoría Funcional: Agente Humectante
y/o Solubilizante
DESCRIPCIÓN Los solubilizantes se pueden usar para disolver moléculas que de otro modo serían insolubles. Funcionan facilitando la transferencia espontánea de fase para producir una solución termodinámicamente estable. Una variedad de solubilizantes se encuentra disponible comercialmente. Los solubilizantes aceptables para aplicaciones farmacéuticas han sido totalmente evaluados en animales para comprobar su seguridad y toxicología. Los agentes humectantes incrementan las propiedades de dispersión y penetración de un líquido mediante la reducción de su tensión superficial.
1164 (1059) Desempeño de Excipientes / Información General
USP 39
MECANISMO FUNCIONAL Los agentes humectantes y solubilizantes comprenden una variedad de estructuras o clases químicas distintas. Algunos solubilizantes tienen estructuras químicas únicas. Por ejemplo, una entidad hidrófila se puede amarrar a una entidad hidrofóbica para producir formas y morfologías definidas de micelas en agua, lo que facilita la solubilización. El mecanismo de solubilización a menudo se asocia con una interacción favorable del agente insoluble y el núcleo interior del ensamble solubilizante (p.ej. micelas). En otros casos, se presentan sitios hidrofóbicos únicos capaces de formar complejos de inclusión. Otros tipos de solubilizantes emplean una gama de cadenas poliméricas que interactúan con moléculas hidrofóbicas para incrementar la solubilidad disolviendo el agente insoluble en las cadenas poliméricas. PROPIEDADES FÍSICAS Los agentes humectantes y solubilizantes son generalmente materiales sólidos, líquidos o cerosos. Sus propiedades físicas dependen de sus estructuras químicas. Sin embargo, las propiedades físicas y el desempeño de los agentes humectantes y solubilizantes dependen de las propiedades tensoactivas de los solubilizantes y del balance hidrófilo-lipofílico (HLB, por sus siglas en inglés). Los materiales con con valores HLB más bajos se comportan como emulsificantes, mientras que aquéllos con valores HLB más altos se comportan generalmente como solubilizantes. Por ejemplo, el lauril sulfato de sodio (HLB 40), un agente humectante y solubilizante comúnmente usado, es hidrófilo y altamente soluble en agua y, cuando se dispersa en agua, reduce espontáneamente la tensión superficial y forma micelas que sirven para solubilizar materiales lipofílicos. Las propiedades únicas de hidrofilia e hidrofobia de los solubilizantes se pueden caracterizar por sus estructuras químicas, números de agregación o concentraciones micelares críticas (CMC). El valor de CMC es único para cada solubilizante individual con cadenas hidrófilas, lipofílicas y/o hidrofóbicas. La CMC es una medida de la concentración a la que las moléculas tensoactivas forman agregados, los cuales pueden solubilizar el soluto incorporando una parte en el interior hidrofóbico. Tales interacciones con la molécula insoluble estabilizan adicionalmente las moléculas en los ensambles completos, sin precipitación. PROPIEDADES QUÍMICAS Las propiedades químicas y tensoactivas dependen de las estructuras de los solubilizantes. Debido a la naturaleza compleja de las interacciones soluto-disolvente-solubilizante, los científicos farmacéuticos deben considerar, identificar y controlar cuidadosamente los atributos críticos de los solubilizantes.
CAPÍTULOS GENERALES Los siguientes capítulos generales pueden ser útiles para asegurar la regularidad en las funciones seleccionadas del agente solubilizante: Grasas y Aceites Fijos (401 ), Medición del Tamaño de Partícula por Difracción de Luz (429), pH (791 ), Peso Específico ~i!~iillíiiili~JW!r~~w .• . . • i1 (841 ), Área Superficial Específica (846 ),g _ _ _ i!~~ :··. •• . ,, '. . rn·· •••-~· ' ~.·. •...
1111111111 Análisis Térmico (891 ), Viscosidad-Métodos Capilares (911 ), Viscosidad-Métodos Rotatorios (912), ViscosidadMétodo de Bola Rodante (913) y Microscopía Electrónica de Barrido (1181 ).
Categoría Funcional: Conservante Antimicrobiano DESCRIPCIÓN Los conservantes antimicrobianos se usan para matar o prevenir el crecimiento de bacterias, hongos filamentosos y levaduras en la forma farmacéutica. MECANISMO FUNCIONAL Los conservantes actúan mediante una variedad de mecanismos para controlar microbios. La mayoría actúan en la membrana celular, ocasionando daños en la membrana y alteración de la permeabilidad celular. Otros modos de acción incluyen inhibición del transporte, precipitación de proteínas y desacoplamiento del gradiente de protones. Algunos conservantes son bactericidas (matan bacterias u hongos filamentosos y levaduras); algunos son bacteriostáticos (inhiben el crecimiento de microorganismos); mientras que otros son esporicidas (matan esporas). Algunos de los conservantes pueden actuar sinergísticamente (p.ej., combinaciones de parabenos). PROPIEDADES FÍSICAS Los antimicrobianos por lo general son solubles en agua en los intervalos de concentración en los que resultan efectivos. La presión de vapor de estos agentes es importante, en especial si la forma farmacéutica está destinada para liofilización o secado
USP 39
Información General/ (1059) Desempeño de Excipientes 1165
por aspersión. Algunos de estos agentes son inflamables. Comprender el coeficiente de partición de un excipiente es importante debido a que la partición de un conservante en una fase oleosa puede disminuir la concentración del mismo en la fase acuosa, lo que a su vez reducirá su valor como conservante. PROPIEDADES QUÍMICAS Los conservantes fenólicos pueden experimentar oxidación y formación de color. Se deben tomar en cuenta las incompatibilidades de los conservantes (mezclas catiónicas y aniónicas, adsorción en tubos o filtros, o unión con surfactantes y proteínas) durante el desarrollo del producto. CAPÍTULOS GENERALES Los siguientes capítulos generales pueden ser útiles para asegurar la regularidad en las funciones seleccionadas de los agentes anti microbianos: l,\l(~~--~!!~•fll!!!Ml~iljiílfa;l¡UIM•~~¡~i')j¡IJ,!1~¡~~1~~!~ Pruebas de Eficacia Antimicrobiana (51 ), Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano (61 ), Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Microorganismos Específicos (62) y Agentes Antimicrobianos-Contenido (341 ). INFORMACIÓN ADICIONAL Se deben considerar los requisitos de seguridad y etiquetado con respecto al uso de conservantes antimicrobianos.
Categoría Funcional: Agente Quelante
y/o Complejante
DESCRIPCIÓN Los agentes quelantes forman moléculas complejas solubles con ciertos iones metálicos (p.ej., cobre, hierro, manganeso, plomo y calcio) y, en esencia, eliminan los iones de la solución para minimizar o eliminar su capacidad de reaccionar con otros elementos y/o para precipitar. Estos agentes se usan en preparaciones farmacéuticas (formulaciones orales, parenterales y tópicas), cosméticos y alimentos para secuestrar iones de la solución y formar complejos estables. Los agentes quelantes también son conocidos como quelantes, queladores o agentes secuestrantes. Los agentes complejantes forman moléculas complejas solubles (p.ej., complejos de inclusión) con otros solutos (p.ej., fármacos) y pueden influenciar propiedades físicas y químicas tales como solubilidad y estabilidad. MECANISMO FUNCIONAL Los agentes quelantes se usan para secuestrar iones metálicos indeseables de la solución. Su estructura química les permite actuar como una "garra" para asociarse con el átomo metálico formando una estructura de anillo heterocíclico. Los agentes complejantes funcionan de manera similar pero mecanísticamente y no requieren (por definición) de una estructura de garra de dos dedos ya que se pueden asociar mediante uno o más sitios de unión. Todos los agentes quelantes son agentes complejantes, pero no todos los agentes complejantes son agentes quelantes. los agentes quelantes se usan como sinergistas antioxidantes, sinergistas antimicrobianos y ablandadores de agua. los agentes quelantes reducen la propensión a reacciones oxidantes secuestrando los iones metálicos de la solución. Los agentes quelantes tienen además la capacidad de mejorar la eficacia antimicrobiana generando un ambiente deficiente en iones metálicos que de otro modo alentaría el crecimiento microbiano. Los agentes complejantes por lo general forman moléculas complejas solubles con solutos (p.ej., moléculas de fármacos) que pueden influenciar las propiedades físicas, químicas y de liberación del fármaco. Los agentes complejantes que forman complejos de inclusión por lo general contienen una cavidad hidrofóbica en la que se puede introducir un fármaco, además de una región externa más hidrófila. PROPIEDADES FÍSICAS Los agentes quelantes y complejantes por lo general son solubles en agua y generalmente se disuelven en formas farmacéuticas líquidas. Las propiedades físicas pueden ser importantes y deben considerarse debido a que pueden influenciar los requisitos de procesamiento (p.ej., el tamaño de partícula puede influenciar el tiempo de mezclado requerido para disolver). Los agentes quelantes y complejantes presentan diferentes grados de higroscopicidad. Debido a que los agentes quelantes se usan en niveles muy bajos, su distribución del tamaño de partícula puede ser importante para permitir una uniformidad de contenido aceptable en las formas farmacéuticas.
1166 (1 059) Desempeño de Excipientes / Información General
USP 39
PROPIEDADES QUÍMICAS Los agentes quelantes forman complejos con iones metálicos mediante cualquier combinación de enlaces iónicos y covalentes. Las soluciones acuosas diluidas pueden ser neutras, ácidas o alcalinas. El ácido edético y sus sales son incompatibles con oxidantes fuertes, bases fuertes y iones metálicos polivalentes (p.ej., cobre y níquel). Los agentes específicos para una formulación se seleccionan basándose en su solubilidad, su afinidad por el ión metálico diana y su estabilidad. Las sales de edetato son más solubles que el ácido libre. A diferencia de otras sales de edetato y del ácido libre, el edetato cálcico disódico no secuestra calcio y por lo tanto se prefiere para prevenir la hipocalcemia. También se prefiere para quelar :liUii metales con la liberación de iones de calcio. De manera alternativa, se puede usar edetato disódico para tratar la hipercalcemfa. El ácido edético producirá descarboxilato si se calienta a una temperatura por encima de 150º. Los agentes complejantes por lo general forman complejos moleculares con fármacos que son dependientes de las propiedades físicas y químicas del agente complejante. La capacidad de un soluto para formar un complejo de inclusión depende del peso molecular del agente complejante, de su estructura química y de las dimensiones de la cavidad hidrofóbica. CAPÍTULOS GENERALES Los siguientes capítulos generales pueden ser útiles para asegurar la regularidad en las funciones seleccionadas de los agentes quelantes y complejantes: Pruebas de Eficacia Antimicrobiana Examen de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano (61 ), ldlllllll!iilHi=l~lflRU!l'J~lllli~ll!~li!llllf~llllllllll!lll!llll~lllllllli811~ ll!~lllil;liill Hierro (241 ), Plomo (251 ), Agentes Antimicrobianos-Contenido (341 ), ""º'"'r1r1n del Tamaño de por Diy Productos Derivados de Pérdida por Secado (731 ), pH (791 ), Determinación de Agua (921 ), Células y Tejidos (1046).
Categoría Funcional: Antioxidante DESCRIPCIÓN Esta categoría aplica a los antioxidantes usados como estabilizadores in vitro de preparaciones farmacéuticas para mitigar los procesos de oxidación. Los antioxidantes usados para su actividad biológica in vivo se pueden considerar como ingredientes activos con efectos terapéuticos por lo que no se analizan en este capítulo. Los antioxidantes retrasan la aparición y/o reducen significativamente la velocidad de las reacciones oxidativas complejas que de otro modo podrían tener un efecto perjudicial en el fármaco. Los antioxidantes también se pueden considerar para proteger componentes inactivos tales como aceites insaturados, lípidos pegilados, saborizantes y aceites esenciales. De esta forma, los antioxidantes conservan la integridad general de la forma farmacéutica contra el estrés oxidativo. Los antioxidantes son más efectivos cuando se incorporan en la fórmula para prevenir o retardar las reacciones en cadena y para inhibir a los radicales libres e hidroperóxidos de tomar parte en los procesos en cascada descritos anteriormente. La aplicación efectiva de antioxidantes y la evaluación de su eficacia requieren comprender los mecanismos oxidativos y la naturaleza de los subproductos que generan. La autooxidación se inicia cuando el oxígeno reacciona con un sustrato para formar especies altamente reactivas conocidas como radicales libres (RH ~ R · ). Después de la "iniciación", los radicales libres en presencia de oxígeno pueden desatar reacciones en cadena (R · + 0 2 ~ROO· y ROO· + RH ~ R · + ROOH) para formar radicales peroxi, hidroperóxidos y nuevos radicales alquílicos que pueden iniciar y luego propagar sus propias reacciones en cadena. Las reacciones en cascada durante la fase de propagación se pueden acelerar mediante calor, luz y catalizadores metálicos. Ante la presencia de trazas de catalizadores metálicos (Cu+, Cu 2 +, Fe2+ y Fe3+), los hidroperóxidos (ROOH) se descomponen fácilmente en RO· y ROO · y, de manera subsiguiente, pueden desencadenar reacciones con el API y/o los excipientes (p.ej., hidrocarburos) para formar ácidos hidroxílicos, ceto ácidos y aldehídos que pudieran tener efectos indeseables adicionales. Se debe tener en cuenta que los hidroperóxidos no son sólo productos de reacción de los mecanismos oxidativos dentro de una formulación. También se pueden encontrar cantidades residuales de hidroperóxidos en excipientes usados comúnmente como polietilenglicoles, polivinilpirrolidona y polisorbatos. La fase de iniciación por lo general es lenta y tiene un efecto limitado sobre la calidad del producto terminado. Por el contrario, la fase de propagación implica la degradación rápida e irreversible de especies químicas. MECANISMO FUNCIONAL Los antioxidantes se pueden agrupar por su modo de acción. A los antioxidantes fenólicos que bloquean las reacciones en cadena de los radicales libres también se les conoce como antioxidantes verdaderos o primarios. Este grupo consiste en compuestos monohidroxi o polihidroxi fenólicos con sustituciones en el anillo. Presentan una energía de activación muy baja para donar átomos de hidrógeno a cambio de los electrones de radicales que son rápidamente deslocalizados por radicales libres. Al aceptar los electrones de radicales estabilizan a los radicales libres. La reacción produce radicales libres de antioxidantes que también pueden reaccionar con radicales libres de lípidos para formar otros compuestos estables. De esta forma pueden bloquear las reacciones oxidativas en cadena tanto en la etapa de iniciación como de propagación. Debido a su solubilidad, los antioxidantes fenólicos son más efectivos para proteger aceites y sustancias activas solubles en aceite contra el estrés oxidativo.
USP 39
Información General/ (1059) Desempeño de Excipientes 1167
Los agentes reductores son por lo general antioxidantes solubles en agua (p.ej., ácido L-ascórbico) con un potencial redox menor que el del fármaco o excipiente que protegen. Estos retrasan el inicio y la velocidad de las reacciones oxidantes reaccionando con el oxígeno y otras especies reactivas. El potencial de remoción de oxígeno de los agentes reductores puede ser sensible al pH y puede además verse negativamente afectado por la presencia de trazas ~ Los agentes quelantes se unen con los metales libres (Cu+, Cu 2+, Fe 2+ y Fe 3+) que pudieran estar presentes en trazas en la formulación. Los complejos iónicos formados nuevos no son reactivos. Por consiguiente, los agentes quelantes eliminan la capacidad de los catalizadores metálicos de participar en reacciones oxidativas que ocurren durante la etapa de propagación. La utilidad de los antioxidantes se puede maximizar mediante el uso sinergístico de uno o dos antioxidantes primarios en conjunto con agentes reductores y quelantes. El efecto combinado a menudo es mayor que la suma de los efectos individuales de cada antioxidante (efecto sinergístico). PROPIEDADES FÍSICAS La solubilidad del antioxidante debe ser máxima en la fase de la formulación (oleosa, acuosa o interfase de la emulsión) en la que el fármaco es más soluble. La temperatura a la que el antioxidante se descompone es crítica para preparaciones esterilizadas en un autoclave en las que puede ocurrir una pérdida de actividad antioxidante. También debe considerarse la estabilidad del antioxidante, pudiendo ser una función del pH y las condiciones de procesamiento. Los iones metálicos pueden reaccionar con galato de propilo para formar complejos de colores. A un pH alcalino, algunas proteínas y sales de sodio pueden ocasionar la decoloración de la terc-butilhidroquinona. PROPIEDADES QUÍMICAS La energía de activación, el potencial de oxidoreducción, así como la estabilidad en formulaciones diferentes (p.ej., pH) y las condiciones de procesamiento (p.ej., calor) constituyen propiedades químicas importantes. Si la vida útil esperada de la forma farmacéutica depende de la función del antioxidante, la concentración debe ser tomada en cuenta y evaluarse periódicamente a fin de asegurar que se conserva una cantidad suficiente de antioxidante durante toda la vida útil del producto. CAPÍTULOS GENERALES Los siguientes capítulos generales pueden ser útiles para evaluar las funciones de los excipientes antioxidantes seleccionados: Hierro (241 ), Cromatografía (621 ), Cristalinidad (695), Intervalo o Temperatura de Fusión (741 ), Área Superficial Específica (846) y Determinación de Agua (921 ).
Categoría Funcional: Agente Edulcorante DESCRIPCIÓN Los agentes edulcorantes se usan para edulcorar formas farmacéuticas orales y para enmascarar sabores desagradables. Ver Categoría Funcional: Saborizantes y Fragancia para más detalles. MECANISMO FUNCIONAL Los agentes edulcorantes se unen a los receptores de la lengua responsables de la sensación de dulzura. Entre más tiempo permanezca la molécula edulcorante unida al receptor, más dulce se percibirá la sustancia. La sacarosa es el estándar para dulzura. PROPIEDADES FÍSICAS Las propiedades físicas primarias pertinentes a los edulcorantes se relacionan con su compatibilidad con los demás ingredientes de la formulación (p.ej., ingredientes ácidos), las condiciones de procesamiento (p.ej., calentamiento), la distribución y el tamaño de partícula, el contenido de humedad, el isomerismo, la dulzura y la capacidad para enmascarar el sabor. Estas propiedades pueden depender de la formulación. PROPIEDADES QUÍMICAS Los edulcorantes se pueden dividir en tres grupos principales: azúcares (que presentan una estructura de anillo), alcoholes de azúcares (azúcares sin estructura de anillo) y edulcorantes artificiales. Todos los edulcorantes son hidrosolubles. La estabilidad de muchos edulcorantes se ve afectada por el pH y por los demás ingredientes en la formulación. Algunos edulcorantes pueden catalizar la degradación de algunos ingredientes activos, especialmente en líquidos y en los casos en que los procesos de fabricación incluyen calentamiento.
1168 (1059) Desempeño de Excipientes / Información General
USP 39
CAPÍTULOS GENERALES Los siguientes capítulos generales pueden ser útiles para asegurar la regularidad en las funciones seleccionadas de los agentes edulcorantes: Medición del Tamaño de Partícula por Difracción de Luz (429), Pérdida por Secado (731 ), Intervalo o Temperatura de Fusión (741 ), Rotación Óptica (781) y Determinación de Agua (921 ). INFORMACIÓN ADICIONAL Los productos que contienen aspartamo deben incluir una advertencia en la etiqueta que indique que el producto contiene fenilananina. Los alcoholes de azúcares tienen un índice glicémico muy por debajo del presentado por la glucosa. No obstante, el sorbitol se metaboliza lentamente a fructosa y a glucosa, lo cual eleva los niveles de azúcar en la sangre. Los alcoholes de azúcares en cantidades generalmente mayores a 20 g/día actúan como laxante osmótico, especialmente cuando están contenidos en una formulación líquida. Los sistemas de conservantes deben ser cuidadosamente seleccionados para evitar su incompatibilidad con el edulcorante, mientras que algunos edulcorantes son incompatibles con ciertos conservantes.
SEMISÓLIDOS, PRODUCTOS TÓPICOS V SUPOSITORIOS Categoría Funcional: Base para Supositorios DESCRIPCIÓN Las bases para supositorios se usan en la fabricación de supositorios (para administración rectal) y supositorios vaginales (para administración vaginal). Las bases pueden ser hidrofóbicas o hidrófilas. MECANISMO FUNCIONAL Los supositorios deben fundirse justo por debajo de la temperatura corporal (37º), permitiendo así la liberación del fármaco por erosión y partición en caso de que el fármaco esté disuelto en la base o por erosión y disolución si el fármaco se suspende en la base. Las bases para supositorios de grasa sólida funden aproximadamente a la temperatura corporal. Las bases para supositorios hidrófilas también f6nden a la temperatura corporal y por lo regular también se disuelven o dispersan en medios acuosos. De esta manera, la liberación ocurre mediante una combinación de erosión y disolución. PROPIEDADES FÍSICAS El intervalo de fusión constituye la característica física importante de las bases para supositorios. Por lo general, las bases para supositorios funden a una temperatura entre 27º y 45º. No obstante, las bases individuales por lo regular tienen un intervalo de fusión mucho más estrecho dentro de estos límites de temperatura, generalmente 2º-3º. La selección de un intervalo de temperatura en particular está determinada por la influencia que tienen los otros componentes de la formulación sobre el intervalo de fusión del producto final. PROPIEDADES QUÍMICAS Las bases para supositorios de grasa sólida son mezclas de ésteres de triglicéridos semisintéticos de ácidos grasos de cadena más larga. Pueden contener proporciones variadas de mono y diglicéridos y también pueden contener ácidos grasos etoxilados. Se encuentran disponibles en una gran cantidad de grados distintos que se diferencian en intervalo de fusión, índice de hidroxilo, índice de acidez, índice de yodo, intervalo de solidificación e índice de saponificación. Las bases para supositorios hidrófilos son mezclas de materiales semisólidos hidrófilos que combinadas son sólidas a temperatura ambiente y que además liberan el fármaco mediante fusión, erosión y disolución cuando se administran al paciente. Las bases para supositorios hidrófilas tienen niveles mucho más altos de grupos hidroxilo u otros grupos hidrófilos que las bases para supositorios de grasa sólida. Los polietilenglicoles que presentan un comportamiento de fusión apropiado son ejemplos de bases para supositorios hidrófilas. CAPÍTULOS GENERALES Los siguientes capítulos generales pueden ser útiles para asegurar la regularidad en las funciones seleccionadas de las bases para supositorios: Grasas y Aceites Fijos (401 ), Temperatura de Solidificación (651 ), Intervalo o Temperatura de Fusión (741) y Formas Farmacéuticas (1151 ).
USP 39
Información General/ (1059) Desempeño de Excipientes 1169
INFORMACIÓN ADICIONAL Algunos materiales incluidos en los supositorios de grasas sólidas tienen intervalos de fusión mucho más altos. Estos materiales por lo general son ceras microcristalinas que ayudan a estabilizar las formulaciones de suspensiones fundidas. Los supositorios también se pueden fabricar a partir de gelatina glicerinada.
Categoría Funcional: Agente de Suspensión y/o Viscosante DESCRIPCIÓN Los agentes de suspensión y viscosantes se usan en las formulaciones farmacéuticas para estabilizar sistemas dispersos (p.ej., suspensiones o emulsiones), para reducir la velocidad de transporte de solutos o partículas, o para disminuir la fluidez de formulaciones líquidas. MECANISMO(S) FUNCIONAL(ES) Existe una variedad de mecanismos que contribuyen a la estabilización de la dispersión o al efecto viscosante de estos agentes. El más común es el incremento en la viscosidad-debido a que el disolvente queda atrapado por cadenas macromoleculares o plaquitas de arcilla-y la interrupción del flujo laminar. Otros mecanismos incluyen la formación de gel mediante una red tridimensional de moléculas o partículas de excipiente a través de un continuo con el disolvente, y la estabilización estérica, donde el componente macromolecular o mineral en el medio de dispersión se adsorbe a las superficies de las partículas o gotitas de la fase dispersa. Estos últimos dos mecanismos incrementan la estabilidad de la formulación al inmovilizar la fase dispersa. PROPIEDADES FÍSICAS Cada uno de los mecanismos-viscosidad aumentada, formación de gel o estabilización estérica-es una manifestación del carácter reológico del excipiente. Debido a los pesos y tamaños moleculares de estos excipientes, los perfiles reológicos de sus dispersiones no son Newtonianos. Las dispersiones de estos excipientes presentan propiedades viscoelásticas. La distribución del peso molecular y la polidispersión de los excipientes macromoleculares en esta categoría son criterios importantes para su caracterización. PROPIEDADES QUÍMICAS La mayoría de los agentes de suspensión y viscosantes son (1) macromoléculas hidrófilas de carbohidratos (goma arábiga, agar, ácido algínico, carboximetilcelulosa, carragenanos, dextrina, goma gellan, goma guar, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hipromelosa, maltodextrina, metilcelulosa, pectina, alginato de propilenglicol, alginato de sodio, almidón, tragacanto y goma de xantana) y (2) macromoéculas hidrófilas sin carbohidratos, incluyendo gelatina, carbómeros de povidona, óxido de polietileno y alcohol polivinílico. Los minerales (p.ej., atapulgita, bentonita, silicato de magnesio y aluminio, y dióxido de silicio) comprenden el segundo grupo más grande de agentes de suspensión y viscosantes. El monoestearato de aluminio es el único excipiente no mineral y no macromolecular en esta categoría funcional. Consiste principalmente en proporciones variables de monoestearato de aluminio y monopalmitato de aluminio. CAPÍTULOS GENERALESLos siguientes capítulos generales pueden ser útiles para asegurar la regularidad en las funciones seleccionadas de los agentes viscosantes: Viscosidad-Métodos Capilares (911 ), Viscosidad-Métodos Rotatorios (912) y ViscosidadMétodo de Bola Rodante (913).
Categoría Funcional: Base para Ungüentos DESCRIPCIÓN Un ungüento es una preparación semisólida viscosa que se usa por vía tópica sobre una variedad de superficies corporales. La base de ungüento es el componente principal de un ungüento y controla sus propiedades físicas. MECANISMO FUNCIONAL Las bases para ungüentos funcionan como vehículos para la aplicación tópica de sustancias medicinales y como emolientes y agentes protectores para la piel.
11 70 (1 059) Desempeño de Excipientes / Información General
USP 39
PROPIEDADES FÍSICAS
Las bases para ungüentos son líquidos con una viscosidad relativamente alta de modo que los sólidos se puedan suspender como una mezcla estable. Las bases para ungüentos se clasifican como (1) bases para ungüentos oleosas que son anhidras, no absorben agua fácilmente, son insolubles en agua y no se pueden eliminar con agua (p.ej., petrolato); (2) bases para ungüentos de absorción que son anhidras y absorben algo de agua pero son insolubles en agua y no se pueden eliminar con agua (p.ej., lanolina); (3) bases para ungüentos para emulsión que son emulsiones de agua en aceite o de aceite en agua y que están hidratadas, absorben agua y son insolubles en agua (p.ej., cremas acuosas, aceites, ceras o parafinas); y (4) bases para ungüentos solubles en agua que son anhidras, que absorben agua, que son solubles en agua y que se pueden eliminar con agua (p.ej., polietilenglicol). PROPIEDADES QUÍMICAS
Las bases para ungüentos se seleccionan para que sean inertes y químicamente estables. CAPÍTULOS GENERALES
Los siguientes capítulos generales pueden ser útiles para asegurar la regularidad en las funciones seleccionadas de las bases para ungüentos: Temperatura de Solidificación (651 ), Viscosidad-Métodos Capilares (911 ), Viscosidad-Métodos Rotatorios (912) y Viscosidad-Método de Bola Rodante (913).
Categoría Funcional: Agente Espesante DESCRIPCIÓN
Un agente espesante es un agente o una mezcla de agentes que incrementa la viscosidad o firmeza de una preparación, especialmente en ungüentos y cremas. MECANISMO FUNCIONAL
En general, los agentes espesantes son sólidos con alto punto de fusión que incrementan el punto de fusión de ungüentos o incrementan la consistencia o cuerpo de las cremas. Los agentes espesantes pueden ser hidrofóbicos (p.ej., grasa sólida o parafina) o hidrófilos (p.ej., polietilenglicol de alto peso molecular). PROPIEDADES FÍSICAS
La propiedad física primaria pertinente a los agentes espesantes es su alto punto de fusión o intervalo de fusión. Los intervalos de fusión típicos para los agentes espesantes oscilan de 43º a 47° (cera de ésteres cetílicos), 53º a 57° (diestearato de glicerilo), 69º a 74º (behenato de glicerilo) y 85º a 88º (aceite de ricino hidrogenado). PROPIEDADES QUÍMICAS
Los agentes espesantes comprenden un grupo diverso de materiales que incluyen glicéridos de ácidos grasos saturados, alcoholes alifáticos sólidos, ésteres de alcoholes grasos saturados y ácidos grasos saturados, hidrocarburos saturados, mezclas de alcoholes grasos y un derivado polioxietilenado de un éster de ácido graso de sorbitán, y polímeros de etilenglicol de pesos moleculares más altos. CAPÍTULOS GENERALES
Los siguientes capítulos generales pueden ser útiles para asegurar la regularidad en las funciones seleccionadas del agente espesante: Temperatura de Solidificación (651 ), Intervalo o Temperatura de Fusión (741 ), Viscosidad-Métodos Capilares (911 ), Viscosidad-Métodos Rotatorios (912) y Viscosidad-Método de Bola Rodante (913). INFORMACIÓN ADICIONAL
Algunos de los materiales incluidos como agentes espesantes incrementan la capacidad de los ungüentos para retener agua (p.ej., petrolato) o funcionan como coemulsificantes en cremas. Los ejemplos incluyen alcohol estearílico y alcohol cetílico.
USP 39
Información General/ (1059) Desempeño de Excipientes 11 71
Categoría Funcional: Emoliente DESCRIPCIÓN Los emolientes son excipientes usados en preparaciones tópicas para impartir lubricación, facilidad para untar, textura y suavización de la piel, así como para contrarrestar el potencial efecto resecante/irritante de los surfactantes en la piel. MECANISMO FUNCIONAL Los emolientes ayudan a formar una capa protectora y a mantener la función de barrera de la epidermis. Su eficacia se puede describir mediante tres mecanismos de acción: protección contra los efectos deslipidizantes y resecantes de los surfactantes, humectación debida a la oclusión (al proveer una capa de aceite sobre la superficie de la piel, los emolientes reducen la velocidad de pérdida de agua e incrementan de esta manera la capacidad de retención de humedad del estrato córneo) y lubricidad, agregando capacidad de deslizamiento a la preparación. PROPIEDADES FÍSICAS Los emolientes imparten uno o más de los siguientes atributos a una preparación farmacéutica: capacidad para untar, sensación agradable al tacto, suavidad de la piel y humectación indirecta de la piel previniendo la pérdida de agua. PROPIEDADES QUÍMICAS Los emolientes son aceites o derivados de componentes de aceites como ésteres de ácidos grasos. Dependiendo de la naturaleza de su éster de ácido graso, un emoliente puede ser líquido, semisólido o sólido a temperatura ambiente. Por lo general, cuanto más grande sea el peso molecular del ácido graso (longitud de la cadena de carbono) más intenso será la sensación y la suavidad al tacto. La fluidez por lo regular se imparte mediante una longitud de cadena menor y un mayor grado de insaturación en el ácido graso. El grado de ramificación de los enlaces del éster también influye en las propiedades del emoliente. CAPÍTULO GENERAL El siguiente capítulo general puede ser útil para asegurar la regularidad en las funciones seleccionadas de los emolientes: Grasas y Aceites Fijos (401 ).
Cambio en la redacción: PARENTERALES
Categoría Funcional: Agua Farmacéutica DESCRIPCIÓN El agua se usa como disolvente, vehículo o diluyente para muchos medicamentos, especialmente para aquellos que se proveen en forma líquida, los cuales incluyen medicamentos inyectables, medicamentos oftálmicos, soluciones para inhalación, entre otros. El agua es además un vehículo para amortiguadores y agentes antimicrobianos y es un elemento que permite expandir el volumen de soluciones de infusión. La USP incluye monografías para ocho grados de aguas para uso farmacéutico. El Agua para Inyección está destinada para su uso en la preparación de soluciones parenterales. Cuando se usa en la preparación de soluciones parenterales que se someten a esterilización final, usar medios adecuados para minimizar el crecimiento microbiano, o producir primero Agua Estéril para Inyección y, en lo sucesivo, protegerla de la contaminación microbiana. Para soluciones parenterales que se preparan en condiciones asépticas y que no se esterilizan mediante filtración adecuada o en el envase final, producir primero Agua Estéril para Inyección y, en lo sucesivo, protegerla de la contaminación microbiana. No usar Agua Purificada en las preparaciones destinadas para administración parenteral. Cuando se usa para formas farmacéuticas estériles con un uso distinto a la administración parenteral, procesar el artículo para que cumpla con los requisitos en Pruebas de Esterilidad (71 ), o producir primero Agua Estéril Purificada y, en lo sucesivo, protegerla de la contaminación microbiana. La USP también contiene referencias a otros tipos de agua, tales como agua destilada, agua desionizada y demás, de acuerdo con el uso específico según se resume en el capítulo de información general Agua para Uso Farmacéutico (1231 ).
11 72 (1059) Desempeño de Excipientes / Información General
USP 39
MECANISMO FUNCIONAL Un disolvente es capaz de disolver materiales debido a su capacidad de interferir con las fuerzas de atracción intermoleculares y para permitir que las moléculas individuales se dispersen en todo el disolvente a granel. El agua es un disolvente y vehículo aceptado en la mayoría de las aplicaciones debido a su facilidad de manejo, seguridad y bajo costo. PROPIEDADES FÍSICAS El agua es un líquido a temperatura y presión normales. Se convierte en hielo a temperaturas de congelación de Oº o menores y se evapora a una temperatura normal de ebullición de 100º, dependiendo de la presión atmosférica. El agua en forma de vapor se usa para propósitos de esterilización debido a que el calor latente de vaporización es significativamente mayor que el del agua hirviendo. PROPIEDADES QUÍMICAS El agua en su forma pura tiene pH neutro y una conductividad y carbono orgánico total (TOC, por sus siglas en inglés) muy bajos. Sin embargo, el pH, la conductividad y el TOC se ven afectados por las condiciones de almacenamiento y la exposición a los gases en el aire. La exposición del agua al dióxido de carbono atmosférico reduce su pH. El almacenamiento en envases de plástico puede incrementar el contenido de TOC del agua con el paso del tiempo. El agua almacenada en envases de vidrio puede experimentar un incremento en el pH y la conductividad con el paso del tiempo. CAPÍTULOS GENERALES Los siguientes capítulos generales pueden ser útiles para asegurar la regularidad en las funciones seleccionadas del agua farmacéutica: •Medicamen.tos Inyectables yen lmplantes{l),• (AFOl-may.2016) Prueba de Endotoxinas Bacterianas (85), Carbón Orgánico Total (643), Conductividad del Agua (645), Agua para Uso en Hemodiálisis (1230) y Agua para Uso Farmacéutico (1231 ).
Categoría Funcional: Agente de Volumen DESCRIPCIÓN Los agentes de volumen usados en liofilizados farmacéuticos, también referidos como productos liofilizados, incluyen diversos sacáridos, alcoholes de azúcares, aminoácidos y polímeros. La función primaria de los agentes de volumen es proporcionar una torta (cake) liofilizada farmacéuticamente elegante con una integridad estructural que no se colapse y que se reconstituya rápidamente antes de la administración. Además, los agentes de volumen se seleccionan para prevenir la pérdida de producto ocasionada por arrastre de vapor (blow-out), para facilitar el secado eficaz y para proporcionar una matriz de formulación física y químicamente estable. Con frecuencia, se usan combinaciones complementarias de agentes de volumen, p.ej., manitol y un polímero, para mejorar el desempeño. MECANISMOS FUNCIONALES Un agente de volumen que se cristaliza fácilmente durante la liofilización ayuda a mantener la estructura integral de la torta formada durante el secado primario, evitando así el colapso macroscópico y manteniendo la elegancia farmacéutica. Aunque aún queda la posibilidad de que ocurra un colapso microscópico de los componentes amorfos en la formulación (con algunos resultados potencialmente indeseables), no resulta en colapso macroscópico o sublimación incompleta (meltback) si las propiedades y la concentración del agente de volumen son adecuadas. Además, el agente de volumen debe tener una temperatura de fusión eutéctica con el hielo elevada para permitir temperaturas primarias de secado relativamente elevadas con un secado proporcional rápido y eficiente y con una reconstitución rápida subsiguiente al momento de su uso. Los excipientes que forman tortas tales como manitol se usan con frecuencia debido a que tienden a cristalizarse durante el congelamiento, lo que permite un secado eficaz y la formación de una torta estructuralmente robusta y estable. Los aminoácidos y codisolventes también han sido utilizados para lograr dicho efecto. La mayoría de los ingredientes activos biopoliméricos se mantienen amorfos al liofilizarse y los agentes de volumen tales como los disacáridos pueden funcionar como lioprotectores ayudando a mantener una fase amorfa estable durante el congelamiento y el secado para evitar la desnaturalización. En ocasiones se logra mejorar la solubilidad de un ingrediente activo cristalino insoluble mediante el uso de un biopolímero que mejora la solubilidad o previene la cristalización durante la liofilización o la reconstitución subsiguiente. Los agentes de volumen también se seleccionan basándose en la biocompatibilidad, capacidad de amortiguación y propiedades de modificación de tonicidad. Las propiedades lioprotectoras de los agentes de volumen (es decir, aquéllas que protegen al fármaco durante la liofilización) por lo general se logran mediante la formación de una fase vítrea altamente viscosa que incluye el fármaco biopolimérico en combinación con sacáridos amorfos de bajo peso molecular tales como sacarosa, trehalosa o algunos aminoácidos. Un mé-
USP 39
Información General/ (1059) Desempeño de Excipientes 11 73
todo típico para la formulación farmacéutica de proteínas es combinar un alcohol de azúcar que se cristaliza fácilmente y un diluyente amorfo; esta mezcla actúa como lioprotector. PROPIEDADES FÍSICAS Los agentes de volumen se disuelven en solución acuosa antes de la liofilización. Por lo tanto, la pureza química y la ausencia de biocarga y materiales pirógenos son propiedades esenciales del excipiente. Sin embargo, la forma física y las propiedades de partícula del excipiente por lo general no son relevantes para las propiedades finales de la formulación liofilizada. Resulta posible facilitar los procesos de solubilización y secado usando codisolventes volátiles tales como etanol o alcohol butílico terciario. Las propiedades físicas que son esenciales para el desempeño del producto durante y después de la liofilización incluyen la temperatura de transición vítrea (T9) del concentrado congelado amorfo antes del secado, la temperatura de transición vítrea de la torta seca de la formulación final y la temperatura de fusión eutéctica del agente de volumen cristalino con hielo. La temperatura de transición vítrea (T9 ) de la formulación depende de las temperaturas de transición vítrea de los componentes individuales, sus concentraciones e interacciones. Aunque se pueden realizar aproximaciones basándose en las temperaturas de transición informadas para componentes individuales, las prácticas actuales incluyen la medición de las temperaturas de transición vítrea de la formulación mediante análisis térmico o microscopia de liofilización. Los estados físicos del agente de volumen durante y después de la liofilización representan propiedades físicas importantes. Tanto la composición de la formulación como los parámetros de procesamiento desempeñan un papel al determinar si el agente de volumen es amorfo o si adquiere una forma cristalina específica. La velocidad de congelación, las temperaturas de secado y el calentamiento y enfriado controlado de la solución para promover la cristalización (annealing) se encuentran entre los parámetros importantes de proceso usados para controlar el estado físico de la formulación y sus componentes. La retención y adsorción de humedad después de la liofilización también pueden contribuir a la falta de estabilidad y la reconstitución deficiente de la formulación. PROPIEDADES QUÍMICAS La reactividad del agente de volumen con los demás componentes de la formulación, especialmente el ingrediente activo, puede ser crítica. Es bien sabido que los azúcares reductores reaccionan con aminas aromáticas y alifáticas. Los glicoles pueden contener trazas de peróxidos que pueden iniciar una degradación oxidativa. La capacidad de los sacáridos y alcoholes polihídricos para formar enlaces de hidrógeno con los biopolímeros pueden influir sobre sus efectos lioprotectores. CAPÍTULOS GENERALES Los siguientes capítulos generales pueden ser útiles para asegurar la regularidad en las funciones seleccionadas de los agentes de volumen: •Medícamentos Inyectables y en Implantes (1},• íAFPJ-may-2016.) Cristalinidad (695), Caracterización de Sólidos Cristalinos por Microcalorimetría y Calorimetría de Disolución (696), Análisis Térmico (891 ), •• (AFm-may-2016¡ Formas Farmacéuticas (1151) e Interacciones Agua-Sólido en Sistemas Farmacéuticos (1241 ).
Categoría Funcional: Agente de Tonicidad DESCRIPCIÓN Para reducir la crenación o la hemólisis de eritrocitos cuando las soluciones se inyectan y para mitigar el dolor y la incomodidad cuando se aplican en los ojos o en la nariz, resulta necesario isotonizar las soluciones. Para esto, la presión osmótica efectiva de las soluciones para inyección debe ser aproximadamente igual que la de la sangre. Cuando los medicamentos se preparan para su administración en membranas tales como las oculares o los tejidos nasales o vaginales, las soluciones se deben isotonizar con respecto a estos tejidos. MECANISMO FUNCIONAL La tonicidad es igual a la suma de las concentraciones de los solutos que tienen la capacidad de ejercer una fuerza osmótica a través de una membrana, con lo cual se refleja la osmolalidad general. La tonicidad aplica a los solutos impermeantes dentro de un disolvente-en contraste con la osmolaridad, la cual toma en cuenta los solutos permeantes e impermeantes. Por ejemplo, la urea es un soluto permeante, lo que significa que puede pasar a través de la membrana celular libremente y no se toma en cuenta al determinar la tonicidad de una solución. Por el contrario, el cloruro de sodio es impermeante y no puede pasar a través de una membrana sin la ayuda de un gradiente de concentración y, por lo tanto, contribuye con la tonicidad de la solución.
1174 (1059) Desempeño de Excipientes/ Información General
USP 39
PROPIEDADES FÍSICAS Las soluciones de cloruro de sodio, dextrosa y de Ringer Lactato son ejemplos comunes de preparaciones farmacéuticas que contienen agentes de tonicidad. No todos los solutos contribuyen con la tonicidad, la cual en general depende únicamente del número de partículas de soluto presentes en una solución, y no de los tipos de partículas del soluto. Por ejemplo, mol por mol, las soluciones de cloruro de sodio presentan una presión osmótica mayor que las soluciones de glucosa de la misma concentración molar. Esto se debe a que cuando la glucosa se disuelve se mantiene como una sola partícula, pero cuando el cloruro de sodio se disuelve, se convierte en dos partículas: Na+ y CI-. Se encuentran disponibles varios métodos para calcular la tonicidad. PROPIEDADES QUÍMICAS Los agentes de tonicidad pueden presentarse como tipos iónicos o no iónicos. Entre los ejemplos de los agentes de tonicidad iónicos se incluyen los haluros de metales alcalinos o alcalinotérreos tales como CaCl 2 , KBr, KCI, LiCI, Nal, NaBr o NaCI, Na 2 S0 4 o ácido bórico Los agentes de tonicidad no iónicos incluyen glicerol, sorbitol, manitol, propilenglicol o dextrosa. El cloruro de sodio o potasio y la dextrosa comúnmente se agregan para ajustar la tonicidad. CAPÍTULOS GENERALES Los siguientes capítulos generales pueden ser útiles para asegurar la regularidad en las funciones seleccionadas del agente tonicidad: •Medicamentos Inyectables y en Implantes {1}, • (AF oi-may.2016J Osmolalidad y Osmolaridad (785) • • (AF 01 .may.2016, y Cálculos en la Práctica Farmacéutica (1160).
AEROSOLES
Categoría Funcional: Propelente DESCRIPCIÓN Los propelentes son compuestos que se encuentran en estado gaseoso en condiciones ambientales. Se usan en medicamentos (atomizadores nasales y formulaciones respiratorias y tópicas), cosméticos y alimentos para proporcionar fuerza para expulsar el contenido de un envase. MECANISMO FUNCIONAL Las sustancias propelentes son líquidos con bajo punto de ebullición o gases comprimidos que son relativamente inertes para los ingredientes activos y excipientes. Se pueden caracterizar mediante tres propiedades: si forman una fase líquida a temperatura ambiente y presiones útiles, su solubilidad y/o miscibilidad en el resto de la formulación y su inflamabilidad. Su desempeño se juzga por su capacidad para proveer una presión adecuada y predecible a lo largo de la vida útil del producto. Los propelentes que tienen tanto una fase líquida como una gaseosa en el producto proporcionan presiones uniformes siempre que haya fase líquida presente-la presión en la cámara gaseosa se mantiene mediante el equilibrio de las dos fases. Por el contrario, la presión provista por los propelentes que no tienen fase líquida puede cambiar relativamente rápido a medida que se expulsa el contenido del envase. A medida que aumenta el tamaño de la cámara gaseosa, la presión dentro del envase cae proporcionalmente. Los propelentes que no tienen fase líquida pero que tienen una solubilidad significativa dependiente de la presión en el resto de la formulación tienen características de desempeño compartidas de los otros dos sistemas. En dichos casos, a medida que la cámara gaseosa se incrementa, el propelente sale de la solución para ayudar a mantener la presión del sistema. En inhaladores de dosis fija, el propelente tiene una fase líquida que es parte integral del medicamento dispensado. Al activar la válvula dosificadora se dispensa un volumen definido del contenido líquido. El propelente hierve espontáneamente y proporciona fuerza de atomización y de propulsión. Se presenta un cambio predecible en la concentración activa desde el inicio hasta el final del ciclo de vida del envase a medida que la fase líquida del propelente vaporiza para restablecer la presión de equilibrio del sistema conforme aumenta la cámara gaseosa. PROPIEDADES FÍSICAS Los propelentes tienen puntos de ebullición muy por debajo de las temperaturas ambientales. Al seleccionar el propelente, es importante tomar en cuenta su densidad para sistemas dispersos y sus propiedades de solubilidad. El apaflurano y el norflurano tienen densidades de fase líquida mayores a las del agua. Los propelentes hidrocarburos (butano, isobutano y propano) y el éter dimetílico tienen densidades de fase líquida menores a las del agua.
USP 39
Información General/ (1059) Desempeño de Excipientes 11 75
PROPIEDADES QUÍMICAS Por lo general, los propelentes son materiales estables. Los propelentes hidrocarburos (butano, isobutano y propano) y el éter dimetílico son todos r;nateriales inflamables. El apaflurano, dióxido de carbono, nitrógeno y norflurano no son inflamables. El óxido nitroso no es inflamable pero sustenta la combustión. Los propelentes clorofluorocarbonados son considerados sustancias que consumen el ozono. Su uso en alimentos, medicamentos, dispositivos o cosméticos está reglamentado por el Título 21 del CFR 2.125. Los inhaladores de dosis fija de albuterol formulados con propelentes clorofluorocarbonados no han estado disponibles en los Estados Unidos de América desde el 1ro de enero de 2009. CAPÍTULOS GENERALES Los siguientes capítulos generales pueden ser útiles para asegurar la regularidad en las funciones seleccionadas de los propelentes: Medicamentos Nasales y para Inhalación: Pruebas de Calidad de Desempeño de Aerosoles, Atomizadores y Polvos (601 ), Cromatografía (621) y Determinación de Agua (921 ).
INHALADORES DE POLVO SECO Los inhaladores de polvo seco por lo regular contienen pocos excipientes funcionales. Por ejemplo, los inhaladores de polvo seco pueden contener un transportador y pueden usar una cubierta de cápsula. Otros excipientes útiles incluyen deslizantes para mejorar el flujo durante la fabricación de la mezcla transportadora activa. Las secciones sobre tabletas o cápsulas anteriores incluyen mayor información sobre el uso de un lubricante además de las propiedades del transportador analizadas más adelante.
Categoría Funcional: Transportador DESCRIPCIÓN Los transportadores se usan para ayudar a depositar el ingrediente activo en el pulmón y pueden desempeñar un papel secundario en la dilución del activo para asegurar que las dosis puedan medirse adecuadamente. MECANISMO FUNCIONAL Los transportadores se usan para promover la descarga del fármaco en los pulmones para una mejor penetración o absorción en la región adecuada de los pulmones. Asimismo, el transportador se usa para reducir la concentración del activo de modo que este último se dosifique adecuadamente y de manera uniforme. PROPIEDADES FÍSICAS Las propiedades físicas de los transportadores incluyen morfología adecuada, estado de hidratación, fluidez, energía superficial y distribución del tamaño de partícula. PROPIEDADES QUÍMICAS Los transportadores deben tener una pureza adecuada, incluyendo un contenido microbiano bajo y sin proteínas o impurezas extrañas para evitar interacciones con el sistema inmune del paciente. CAPÍTULOS GENERALES Los siguientes capítulos generales pueden ser útiles para asegurar la regularidad en las funciones seleccionadas de los transportadores: Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano ), Examen de Productos No Estériles: Pruebas de Microorgnismos Específicos (62), .!~1it!!1~míl~11i1-~Ciis~l~tl~ieil~.~l~i~~¡~~~.¡IJ~iMi~lliRllilirM~ lifilfliBl'.i~li~~ll~~~~·l:!l~~~i~li~¡j¡~~ Medición del Tamaño de Partícula por Difracción de Luz (429), Determinación de Nitrógeno (461 ), Medicamentos y para Pruebas de Calidad de Desempeño de Aerosoles, Atomizadores y Polvos (601 ), Densidad Aparente y Densidad por Asentamiento de los Polvos (616), Cristalinidad (695), Caracterización de Sólidos Cristalinos por Microcalorimetría y Calorimetría de Disolución (696), Densidad de Sólidos (699), Pérdida por Secado (731 ), Microscopía Óptica (776), Estimación de la Distribución del Tamaño de Partícula por Tamizado Analítico (786), Finura de Polvos (811 ), ri1*1~tg~[~ ~~::il·~:r".ej¡f~o~I~~~ 1.E:si,~tos•t1l~.fl:ltr~f~~'f!liMJ~lb,l~~8~1'Mr.<>.€in~'ih•~1-o~) Determinación de Agua (921 ), Caracterización de Sólidos Cristalinos y Parcialmente Cristalinos por Difracción de Rayos X sobre Polvos (DRXP) (941) y Fluidez de Polvos (1174).
1176 (1059) Desempeño de Excipientes/ Información General
USP 39
Categoría Funcional: Cubiertas de Cápsulas para Inhaladores de Polvo Seco DESCRIPCIÓN Las cubiertas de cápsulas en ocasiones se usan en los inhaladores de polvo seco. La cubierta de cápsula se usa para contener la cantidad de dosificación y para resguardar el polvo inhalable en un inhalador de polvo seco. MECANISMO FUNCIONAL El uso de cubiertas de cápsulas puede acelerar el desarrollo farmacéutico puesto que no requiere de un dispositivo complejo y puede usar un fármaco o formulación previamente medidos. Una cubierta de cápsula no debe fragmentarse en porciones inhalables y debe permanecer intacta después de que se abre para exponer el polvo para inhalación. PROPIEDADES FÍSICAS La composición de las cubiertas de cápsulas por lo general está regulada por el contenido de humedad, la fragilidad y las interacciones electrostáticas del fármaco con el polvo inhalable. CAPÍTULOS GENERALES Los siguientes capítulos generales pueden ser útiles para asegurar la regularidad en las funciones seleccionadas de las cubiertas de las cápsulas para inhaladores de dosis fija: Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano (61 ), Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Microorgnismos Específicos (62), Arsénico (211),11111111 llUl1&111111illl•llllilil~llilJlilll:al!f~lllrlll\'1111Jll'llillli Residuo de Incineración (281 ), Medicamentos Nasales y para Inhalación: Pruebas de Calidad de Desempeño de Aerosoles, Atomizadores y Polvos (601 ), Desintegración
(701 ), Disolución (711 ), Pérdida por Secado (731 ), Microscopía Óptica (776), Estimación de la Distribución del Tamaño de Partícula por Tamizado Analítico (786), Uniformidad de Unidades de Dosificación (905), Determinación de Agua (921 ), Color-Medición Instrumental (1061) e Interacciones Agua-Sólido en Sistemas Farmacéuticos (1241 ).
PREPARACIONES OFTÁLMICAS Categoría Funcional: Conservante Antimicrobiano DESCRIPCIÓN El sistema conservante actúa como resguardo para matar o inhibir el crecimiento de microorganismos que pudieran introducirse inadvertidamente en el producto después del proceso de fabricación durante el almacenamiento o el uso. MECANISMO FUNCIONAL Los conservantes antimicrobianos actúan mediante una variedad de mecanismos. Los compuestos de amonio cuaternario afectan a las membranas celulares microbianas mediante interacciones de carga con fosfólípidos, lo que genera la alteración de la membrana celular. Los parabenos también alteran la integridad de la membrana celular. Los alcoholes tales como clorobutanol y alcohol bencílico actúan mediante la solvatación de lípidos (membrana) y la desnaturalización de proteínas. La N-[3-(dimetilamino)propil]tetradecanamida tiene mayor efectividad antimicrobiana contra hongos y protozoarios que los compuestos de amonio cuaternario. Al igual que los compuestos de amonio cuaternario, ésta altera la integridad del plasma de la membrana. El ácido sórbico actúa mediante la reducción de grupos sulfihidrilo de las proteínas. El hipoclorito es un agente de oxidante fuerte. Las reacciones de cloraminas con los grupos amino de las proteínas puede ocasionar cambios en la conformación y, por consiguiente, pérdida de la actividad protéica. El cloro liberado por estas reacciones puede reaccionar con los componentes de las células tales como proteínas y lípidos. La poliaminopropil biguanida se acumula en la membrana celular bloqueando el ingreso de nutrientes.
USP 39
Información General/ (1 059) Desempeño de Excipientes 11 77
PROPIEDADES FÍSICAS Para funcionar como conservante antimicrobiano oftálmico, un compuesto debe ser al menos moderadamente soluble en agua, con lo que se provee un intervalo apreciable de concentraciones utilizables. PROPIEDADES QUÍMICAS Un conservante debe ser compatible con los ingredientes activos e inactivos del producto terminado. Por ejemplo, los compuestos de amonio cuaternario son incompatibles con algunos surfactantes aniónicos. El alcohol bencílico es incompatible con agentes oxidantes. El clorobutanol es incompatible con algunos surfactantes no iónicos. La compatibilidad entre compuestos varía con el pH de la fórmula. El conservante debe ser estable en solución al pH de la formulación, que por lo general es de 5 a 8. El pH de la formulación puede afectar la actividad del conservante al influir sobre la forma en que el conservante se reparte entre la formulación y los microbios, y en la forma en que el conservante interactúa con los sitios diana de la célula microbiana. Por ejemplo, los conservantes que deben pasar a través de las membranas celulares antes de ejercer su actividad, deben formularse a un pH en el que el conservante se encuentre principalmente en su estado no ionizado. CAPÍTULOS GENERALES Los siguientes capítulos generales pueden ser útiles para asegurar la regularidad en las funciones de los conservantes antimicrobianos: Pruebas de Eficacia Antimicrobiana (51 ), Pruebas de Esterilidad (71 ), Densidad Aparente y Densidad por Asentamiento de los Polvos (616), Cromatografía (621 ), Densidad de Sólidos (699), Pérdida por Secado (731 ), Formas Farmacéuticas (1151 ), Fluidez de Polvos (1174), Esterilización y Garantía de Esterilidad de Artículos Farmacopéicos (1211) y Validación de la Recuperación Microbiana de Artículos Farmacopéicos (1227).
Categoría Funcional: Polímero para Uso Oftálmico DESCRIPCIÓN Los polímeros se usan en preparaciones oftálmicas para mejorar la retención de ingredientes activos mediante la reducción de la cantidad de producto que se pierde en el ojo cuando el paciente pestañea. Asimismo, los polímeros pueden ser componentes de las lágrimas artificiales. La mayoría de los polímeros solubles en agua comúnmente usados como agentes formadores de película en preparaciones oftálmicas se pueden categorizar según se indica a continuación: (1) sustancias basadas en celulosa, (2) gomas producidas por medios biológicos y (3) sustancias producidas por medios sintéticos. MECANISMO FUNCIONAL Los agentes formadores de película para preparaciones oftálmicas pueden mejorar la retención de los ingredientes activos en el ojo mediante diversos mecanismos. Se pueden usar como simples agentes modificadores de la viscosidad para reducir el flujo del producto, con lo que se reduce la velocidad de pérdida del producto después de la administración. Asimismo, se pueden usar para formar películas en la superficie del ojo de modo que el fármaco permanezca depositado en el ojo después de que la porción líquida del producto haya sido expulsada o se haya evaporado. Estos agentes pueden formularse para producir una película o gel cuando el producto se entibia a la temperatura corporal (después de entrar en contacto con la superficie del ojo), mezclándose con la película de lágrimas y/o evaporándose. Algunos polímeros presentan propiedades bioadherentes en la córnea y pueden incrementar la retención del fármaco. PROPIEDADES FÍSICAS Para funcionar como un agente formador de película oftálmica, un polímero generalmente debe, por lo menos, ser ligeramente soluble en agua, con lo que se provee un intervalo apreciable de concentraciones de uso. Dichos polímeros a menudo incrementan la viscosidad o presentan propiedades de formación de película o gel cuando se entibian a la temperatura corporal, cuando se los expone al pH o a la composición de soluto y fuerza iónica de la película de lágrimas, o cuando el producto se evapora. PROPIEDADES QUÍMICAS
El intervalo de viscosidad del producto terminado que se puede obtener con un agente formador de película se relaciona con su estructura química y peso molecular. Los grupos funcionales tales como los grupos piruvato y acetato de goma de xantana pueden afectar la relación entre la viscosidad y el pH y la fuerza iónica de la solución, además de que pueden determinar las propiedades formadoras de película y de gel. La carga del polímero puede influenciar las interacciones con la capa mucosa
11 78 (1059) Desempeño de Excipientes / Información General
USP 39
del ojo. La conformación molecular, la movilidad de la cadena y el grado de entrecruzamiento también pueden afectar el grado de hinchamiento y, por ende, el desempeño. CAPÍTULOS GENERALES Los siguientes capítulos generales pueden ser útiles para asegurar la regularidad en las funciones de los polímeros para uso oftálmico: Densidad Aparente y Densidad por Asentamiento de los Polvos (616), Cromatografía (621) (ver en particular Cromatografía de Exclusión por Tamaño), Densidad de Sólidos (699), Pérdida por Secado (731 ), Partículas en Soluciones Oftálmicas (789), Viscosidad-Métodos Capilares (911 ), Viscosidad-Métodos Rotatorios (912), Viscosidad-Método de Bola Rodante (913), Formas Farmacéuticas (1151) y Fluidez de Polvos (1174). Asimismo, los capítulos generales citados en Categoría Funcional: Agentes Formadores de Película también pueden ser adecuados para la evaluación de polímeros para uso oftálmico.
PRODUCTOS TRANSDÉRMICOS Y PARCHES Categoría Funcional: Adhesivo DESCRIPCIÓN Los sistemas de liberación tópica de fármacos (p.ej., productos transdérmicos o parches para la piel) requieren el uso de adhesivos para mantener el contacto entre el sistema de liberación de fármacos aplicado y la piel. Los adhesivos pueden intercalarse como una capa separada entre la matriz de la formulación y la superficie de la piel, incorporarse como parte de la matriz misma de la formulación o aplicarse a la periferia del sistema de administración tópica. MECANISMO FUNCIONAL La adhesión es la tendencia que presentan superficies diferentes a adherirse entre sí como resultado de uno o más tipos de interacciones. Para sistemas de liberación tópica de fármacos, estas interacciones adhesivas por lo general son de caracter químico (principalmente electrostáticas) o dispersivo (unión van der Waals y/o puentes de hidrógeno), aunque existe la posibilidad de interacción mecánica mediante el interbloqueo de asperezas microscópicas. PROPIEDADES FÍSICAS En general, los adhesivos usados en productos transdérmicos o parches para la piel son materiales sensibles a la presión cuyo desempeño se caracteriza mejor a través de métodos de pruebas físicas para adherencia y viscoelasticidad del adhesivo mismo y la viscosidad de una solución del adhesivo. PROPIEDADES QUÍMICAS En los productos transdérmicos, los adhesivos sensibles a la presión de mayor uso son los polímeros acrílicos, de caucho y de silicona. Los adhesivos de polímeros acrílicos incluyen diversos ésteres de ácido acrílico o metacrílico, acrilamida, metacrilamida, N-alcoxialquil o N-alquil-acrilamidas. Los poliisobutilenos y polisiloxanos se encuentran entre los adhesivos basados en caucho y silicona más comunes, respectivamente. El peso molecular y la distribución de componentes de los polímeros son críticos para la replicación de la eficacia del adhesivo entre partidas. CAPÍTULOS GENERALES Los siguientes capítulos generales pueden ser útiles para evaluar la aptitud de los adhesivos usados en los productos transdérmicos: Resistencia a la Tensión (881) y Viscosidad-Métodos Capilares (911 ).
Categoría Funcional: Agente Formador de Película DESCRIPCIÓN Los agentes formadores de película usados como matriz de la formulación de los sistemas tópicos de liberación de fármacos (p.ej., productos transdérmicos o parches para la piel) o en conjunto con dichos sistemas comprenden una película no pegajosa pero adherente, que se aplica a la superficie de la piel, completa o parcialmente.
USP 39
Información General/ (1 059) Desempeño de Excipientes 11 79
MECANISMO FUNCIONAL La formación de la película resulta de la pérdida progresiva de disolvente (o medio de dispersión) a partir de una solución (o dispersión) de un agente formador de película, ya sea en forma de partículas o moléculas dispersas. La pérdida de disolvente (o medio de dispersión) lleva a una aglomeración molecular o de partículas más cercana y a una mayor interacción entre las moléculas o partículas del agente formador de película. Por último, se forma una película continua como resultado de un aumento en el entrelazamiento molecular o de la sinterización de las partículas. PROPIEDADES FÍSICAS Las propiedades críticas para la formación exitosa de película incluyen la temperatura de transición vítrea del agente formador de película (T9), la viscosidad de la solución o dispersión y las características de la superficie del sustrato. Las propiedades viscoelásticas tales como módulo elástico, módulo viscoso y la viscosidad intrínseca o compleja describen las características funcionales tales como la adhesión para un componente adhesivo sensible a la presión. Las pruebas de adhesión a un sustrato, de adherencia y de cizallamiento se pueden usar para la liberación de partidas. PROPIEDADES QUÍMICAS Los agentes formadores de película comunes son polímeros o copolímeros termoplásticos o termoestables de alto peso molecular, a menudo en forma de dispersiones acuosas o composiciones de látex. Los polímeros de celulosa, los polímeros vinílicos y los copolímeros, así como los polímeros y copolímeros de ácido acrílico y metacrílico con frecuencia se usan en los sistemas de administración tópica como agentes formadores de película. CAPÍTULOS GENERALES Los siguientes capítulos generales pueden ser útiles para evaluar la aptitud de los agentes formadores de película usados en productos transdérmicos y parches: Análisis Térmico (891 ), Viscosidad-Métodos Capilares (911 ), Viscosidad-Métodos Rotatorios (912) y Viscosidad-Método de Bola Rodante (913).
PREPARADOS RADIOFARMACÉUTICOS Los preparados radiofarmacéuticos regularmente contienen categorías de excipientes que también se usan en los medicamentos convencionales. Por ejemplo, las cápsulas de preparados radiofarmacéuticos pueden contener diluyentes y necesariamente emplean una cubierta de cápsula, mientras que los preparados radiofarmacéuticos parenterales pueden contener agua farmacéutica, diluyentes, agentes de tonicidad, modificadores de pH, conservantes antimicrobianos, agentes quelantes y/o complejantes y antioxidantes. No obstante, muchos preparados radiofarmacéuticos difieren de los medicamentos convencionales, debido a que su preparación (reconstitución) implica una o más reacciones químicas que requieren de excipientes poco comunes. Ademas, la autoabsorción de la radiación emitida puede resultar en la descomposición radiolítica de muchos preparados radiofarmacéuticos. Por consiguiente, son varios los excipientes que se usan predominantemete en las formulaciones radiofarmacéuticas, aunque se pueden usar de vez en cuando en otros medicamentos.
Categoría Funcional: Agente Reductor DESCRIPCIÓN Los agentes reductores por lo general son necesarios para los preparados radiofarmacéuticos de tecnecio Te 99m. El tecnecio Te 99m, en la forma química de pertecnetato de sodio (estado de oxidación+ 7), se debe reducir a un estado de oxidación menor de modo que pueda ser quelado o complejado de alguna otra manera con el ligando deseado para formar el preparado radiofarmacéutico final Te 99m. El agente reductor, por lo general una sal estannosa, a menudo se formula en un kit de preparación del preparado radiofarmacéutico de tecnecio Te 99m. MECANISMO FUNCIONAL El agente reductor (p.ej., ión estannoso) debe estar presente en una cantidad suficiente para reducir todos los átomos de tecnecio al estado de oxidación deseado, pero no debe generar productos de reducción indeseables ni otras impurezas (p.ej., precipitados de hidróxido de estaño). PROPIEDADES FÍSICAS Los agentes reductores (p.ej., sales estannosas) deben ser fácilmente solubles en agua.
1180 (1059) Desempeño de Excipientes / Información General
USP 39
PROPIEDADES QUÍMICAS Los agentes reductores (p.ej., sales estannosas) son sensibles a la oxidación por el oxígeno atmosférico y a las especies oxidantes en solución. Por consiguiente, el contenido liofilizado de los viales del kit se debe llenar con un gas no oxidante tal como nitrógeno o argón. El agente reductor también debe ser estable al pH esperado para el producto formulado.
CAPÍTULOS GENERALES Los siguientes capítulos generales pueden ser útiles para asegurar la regularidad en las funciones seleccionadas del agente reductor: Cromatografía (621) y Radioactividad (821 ).
Categoría Funcional: Ligando de Transferencia DESCRIPCIÓN En la preparación de algunos preparados radiofarmacéuticos, el radiometal (p.ej. tecnecio Te 99m reducido con estaño) primero se quela mediante un ligando quelante relativamente débil y luego se transfiere al ligando quelante principal o subunidad complejante. Ejemplos de dichos ligandos de transferencia incluyen citrato, gluconato y tartrato.
MECANISMO FUNCIONAL Los ligandos de transferencia por lo general experimentan reacciones rápidas con tecnecio reducido para formar quelatos débiles, con lo que se mantiene el tecnecio reducido en una forma soluble hasta que se transfiere al ligando principal. Este procedimiento es especialmente útil cuando la cinética de formación de complejo con el ligando principal es lenta o cuando se requiere un paso de calentamiento para exponer los grupos quelantes del ligando principal.
PROPIEDADES FÍSICAS Los ligandos de transferencia deben ser fácilmente solubles en agua.
PROPIEDADES QUÍMICAS Los ligandos de transferencia deben tener cinéticas rápidas de formación de complejos y deben formar quelatos relativamente débiles en comparación con la formación del complejo con el ligando principal.
CAPÍTULOS GENERALES Los siguientes capítulos generales pueden ser útiles para asegurar la regularidad en las funciones seleccionadas de los ligandos de transferencia: Cromatografía (621) y Radioactividad (821 ).
Categoría Funcional: Agente Estabilizante de Coloides DESCRIPCIÓN Los coloides liofóbicos tienden a aglomerarse y formar grandes agregados para minimizar su relación área superficial-volumen. Los agentes estabilizantes de coloides son moléculas liofílicas relativamente grandes que recubren la superficie de cada partícula coloidal individual y previenen o inhiben la aglomeración. Entre los ejemplos de agentes estabilizantes de coloides se incluyen la gelatina y el dextrano.
MECANISMO FUNCIONAL El agente estabilizante de coloides recubre las partículas coloidales liofóbicas y les da propiedades liofílicas. Además, se puede agregar una carga al agente estabilizante de coloides, lo cual provoca que las partículas coloidales recubiertas se repelan entre sí.
PROPIEDADES FÍSICAS Los agentes estabilizantes de coloides deben ser fácilmente solubles en agua.
USP 39
Información General/ (1061) Color-Medición Instrumental 1181
PROPIEDADES QUÍMICAS Los agentes estabilizantes de coloides deben ser capaces de recubrir las partículas coloidales liofóbicas, p.ej., mediante la atracción electrostática de una carga opuesta. CAPÍTULOS GENERALES Los siguientes capítulos generales pueden ser útiles para asegurar la regularidad en las funciones seleccionadas del agente estabilizante de coloides: Cromatografía (621) y Radioactividad (821 ).
Categoría Funcional: Secuestrador de Radicales Libres DESCRIPCIÓN Las interacciones de la radiación con el agua y otras moléculas con frecuencia producen radicales libres. Los secuestradores de radicales libres interactúan preferencialmente con radicales libres oxidantes o reductores que de otro modo provocarían la desintegración de los componentes de la formulación. En el caso de los preparados radiofarmacéuticos, los secuestradores de radicales libres se pueden usar para mejorar la pureza radioquímica. Entre los ejemplos de secuestradores de radicales libres se incluyen el azul de metileno y el ácido aminobenzoico. MECANISMO FUNCIONAL Los secuestradores de radicales libres interactúan preferencialmente con los radicales libres producidos por la vía radiolítica antes de que dichos radicales puedan interactuar con el preparado radiofarmacéutico y produzcan impurezas radioquímicas. PROPIEDADES FÍSICAS Los secuestradores de radicales libres deben ser fácilmente solubles en agua. PROPIEDADES QUÍMICAS Los secuestradores de radicales libres deben ser capaces de interactuar preferencialmente con radicales libres sin ocasionar otros efectos.
(1061) COLOR-MEDICIÓN INSTRUMENTAL El color observado (ver (631) Color y Acromatismo) de un objeto depende de la energía espectral de la iluminación, las características de absorción del objeto y la sensibilidad visual del observador en el intervalo de luz visible. De manera similar, es esencial que todo método instrumental de amplia aplicación tenga en cuenta estos mismos factores. Los métodos instrumentales para medir el color proporcionan datos más objetivos que la determinación visual de color subjetiva realizada por un pequeño número de personas. Con un buen mantenimiento y calibración, los métodos instrumentales pueden proporcionar mediciones exactas y precisas de color y de diferencias de color que no varían con el tiempo. Toda medición instrumental de color se basa en el hecho de que el ojo humano detecta el color a través de tres "receptores". Por lo tanto, todos los colores se pueden descomponer en una mezcla de tres estímulos de radiación seleccionados adecuadamente para excitar los tres receptores del ojo. Aunque no exista un solo conjunto de fuentes de luz reales que se pueda emplear para comparar todos los colores (es decir, para tres luces cualesquiera que se elijan existen algunos colores que requieren una cantidad negativa de una o más luces), se han definido tres estímulos arbitrarios con los que se pueden definir todos los colores reales. Mediante extensos experimentos de comparación de color realizados con personas con una visión de colores normal, se han medido los coeficientes de distribución para cada longitud de onda visible (400 nm a 700 nm) que proporcionan la cantidad relativa de estimulación de cada receptor causada por la luz a esa longitud de onda. Estos coeficientes de distribución se muestran a continuación. De manera similar, para cualquier color la cantidad de estimulación de cada receptor en el ojo se define mediante un conjunto de Valores tricromáticos (X, Y y Z) para ese color. En las siguientes ecuaciones se proporcionan las relaciones entre el coeficiente de distribución (ver la figura adjunta) y los valores tricromáticos
z,
x, y,
1182 (1061) Color-Medición Instrumental / Información General
USP 39
X= fo\x,¡P,¡dA./Y', Y=
S: f,Y;_P,dA./Y'
Z=
y
S: f,z,¡P;_dA./Y'
en donde
es la potencia espectral de la fuente luminosa y f, es la reflectancia espectral (p;) o la transmitancia espectral (e;) del material. 200---------------~
150 e
'º ·¡:; :::;
'°Cií
x
·¡:
'5 100 Q) "O
"' .2:! e Q)
·¡:;
~ o
ü
50
Longitud de onda,nm
Coeficientes de Distribución de 400 a 700 nm Una vez que se han calculado los valores tricromáticos de un color, se pueden emplear para determinar la coordenadas del color en un espacio de color tridimensional idealizado al que se denomina espacio de color visualmente uniforme. En un intento por definir dicho espacio se han desarrollado muchos conjuntos de ecuaciones de color. Las ecuaciones proporcionadas en este capítulo representan una solución intermedia entre la sencillez del cálculo y la adecuación a lo ideal. Las coordenadas de un color en un espacio de color visualmente uniforme pueden emplearse para calcular la desviación de un color con respecto a un punto de referencia seleccionado. Cuando se utiliza el método instrumental para determinar el resultado de una prueba que requiere comparar el color de una preparación de prueba con el color de un estándar o un líquido de comparación, el parámetro a comparar es la diferencia, en espacio de color visualmente uniforme, entre el color del blanco y el color de la muestra de prueba o estándar.
Cambio en la redacción:
Procedimiento Las consideraciones que se tratan en •Espectrosc<:;p[a Ultravíoleta-Visible{857)• (AF-Ol-may-2016¡ también se aplican a la medición instrumental del color. En el método espectrofotométrico, los valores de reflectancia o de transmitancia se obtienen a longitudes de onda discretas en todo el espectro visible, a un ancho de banda de 1O nm o menor. Luego, estos valores se emplean para calcular los valores tricromáticos mediante el uso de factores de ponderación. 1 En el método colorimétrico, la ponderación se realiza mediante el uso de filtros. La norma ASTM Z58.7.l-1951 proporciona valores típicos de ponderación, tal como se informa en el )ournal of the Optical Society of America, Vol. 41, 1951, páginas 431-439.
1
USP 39
Información General/ (1061) Color-Medición Instrumental 1183
En la medición de la reflectancia espectral de sólidos opacos, el ángulo de visión está separado del ángulo de iluminación de manera tal que sólo entran en el receptor los rayos que se reflejan difusamente de la muestra de prueba. Se excluyen el reflejo especular y la luz dispersada. Para la medición de la transmitancia espectral de líquidos transparentes, la muestra se irradia desde un ángulo que no se diferencia en más de 5 grados con respecto a la normal a su superficie, y la energía transmitida medida está dentro de los 5 grados de la normal. El color de las soluciones cambia con el espesor de la capa medida. A menos que existan consideraciones especiales que indiquen algo diferente, se debe emplear una capa de 1 cm de espesor. Los métodos descritos en este documento no son aplicables a líquidos turbios o sólidos translúcidos. CALIBRACIÓN A los fines de la calibración, se puede utilizar alguno de los siguientes materiales de referencia, según lo requiera la geometría del instrumento. Para mediciones de transmitancia, se puede utilizar agua purificada como un estándar del color blanco y asignarle una transmitancia de 1,000 a todas las longitudes de onda. Luego, los valores tricromáticos X, Y y Z para la fuente C de la Comisión Internacional del Color (CIE, por sus siglas en francés) son 98,0; 100,0 y 118, 1, respectivamente. Para mediciones de reflectancia, se pueden usar placas de porcelana opaca, cuya base de calibración es el reflector difuso perfecto y cuyas características de reflectancia han sido determinadas para la geometría instrumental apropiada. 2 Si la geometría de la muestra presentada excluye el uso de tales placas, se puede emplear sulfato de bario comprimido, de grado estándar de reflectancia del color blanco. 3 Después de llevar a cabo la calibración con los materiales mencionados, es deseable, siempre que sea posible, medir un material de referencia que tenga un color lo más semejante posible al de la muestra. Si no es adecuado emplear una muestra del material sometido a prueba como estándar a largo plazo, hay disponibles tablas de color4 que abarcan todo el espacio de color uniforme visualmente, en pequeños incrementos de color. Se recomienda el uso de un estándar de referencia de este tipo como un método para supervisar el desempeño de un instrumento incluso para determinaciones de color absoluto. MÉTODO ESPECTROFOTOMÉTRICO Determinar la reflectancia o transmitancia entre 380 y 770 nm a intervalos de 1 O nm. Expresar el resultado como un porcentaje, siendo 100,0 el máximo. Calcular los valores tricromáticos X, Y y Z de la siguiente manera. Materiales Reflectantes-Para los materiales reflectantes, los valores X, Y y Z son
X= I::~pAXiPAL'lA/Y',
770 Z= "L.,,350 p)z\P).flA/Y', ' •
en donde
x
es la reflectancia espectral del material, 1.P1J y,P 1 y z;.P¡. son valores conocidos asociados con cada Fuente Estándar, 1•2 y 1'1/c se expresa en nm. Materiales de Transmisión-Para materiales de transmisión, las cantidades X, Y y Z se calculan según se indicó anteriormente, sustituyendo Pi. por "L"¡, (transmitancia espectral). MÉTODO COLORIMÉTRICO Operar un colorímetro 5 adecuado para obtener valores equivalentes a los valores tricromáticos, X, Y y Z. La exactitud con la que los resultados, obtenidos a partir del colorímetro de filtro, coinciden con los valores tricromáticos puede indicarse determinando los valores tricromáticos de placas de colores fuertemente saturados y comparando tales valores con los calculados a partir de mediciones espectrales en un espectrofotómetro.
2 Los elementos adecuados se pueden conseguir en BYK-Gardner USA, 2431 Linden Lane, Silver Spring, MD 2091 O o en Hunter Associates Laboratory, lnc., 11491
Sunset Hills Road, Restan, VA 22090. El material adecuado se puede conseguir en Eastman Kodak Company, Rochester, NY 14650, como "White Reflectance Standard" (Estándar de Reflectancia del Color Blanco). 4 Se pueden obtener Cartas de Colores Centroides de proveedores de instrumentos para la medición del color. 5 Un colorímetro tricromático adecuado se puede obtener en BYK-Gardner USA, 2431 Linden Lane, Silver Spring, MD 2091 O, o en Hunter Associates Laboratory, lnc., 11491 Sunset Hills Road, Restan, VA 22090. 3
1184 (1061) Color-Medición Instrumental/ Información General
USP 39
1nterpretación COORDENADAS DE COLOR Las Coordenadas de Color, L*, a* y b* se definen mediante L* = l16(Y/Y0)'/, -16 a*= 500[(X/X0)'h - (Y/Y0)'h) y b* = 200[(Y/Y0)'¡, - (Z/Z 0)'h) en donde X0, Y0 y Z0 son los valores tricromáticos del estándar blanco nominal o incoloro e Y/Y0 > 0,01. Normalmente son iguales a los valores tricromáticos de la fuente de iluminación estándar, donde el conjunto de Y0 es igual a 100,0. En este caso X0 = 98,0 y Z0 = 118, 1. DIFERENCIA DE COLOR La Diferencia de Color total
~E*
es ~E*
= [(~L*)2 + (~a*)2 + (~b*)2)'!,
en donde ~L *, ~a* y ~b* son las diferencias en las coordenadas de color de las muestras comparadas. Las variables instrumentales pueden influir en los resultados. Aunque pueden hacerse comparaciones confiables entre colores similares medidos al mismo tiempo, los resultados obtenidos por distintos instrumentos o en diferentes condiciones de funcionamiento deben compararse con cuidado. Si fuera necesario comparar datos obtenidos con distintos instrumentos o tomados en diferentes momentos etc., es muy útil tener datos concomitantes obtenidos con un material de referencia estándar, como por ejemplo tablas de color para materiales opacos. La comparación de las lecturas del material de referencia ayuda a identificar variaciones debidas al funcionamiento del instrumento.
(1064) IDENTIFICACIÓN DE ARTÍCULOS DE ORIGEN BOTÁNICO POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA DE ALTA RESOLUCIÓN INTRODUCCIÓN La identificación de artículos botánicos puede lograrse mediante la aplicación de múltiples técnicas, incluyendo descripciones macroscópicas y microscópicas, análisis de ADN y medios químicos. El capítulo Identificación de Artículos de Origen Botánico (563) provee un análisis detallado de estos enfoques. La identificación química por lo regular emplea procedimientos cromatográficos o espectroscópicos para lograr la identificación mediante comparación de la huella dactilar contra la de un Estándar de Referencia, descripción de monografía o un cromatograma de referencia. La cromatografía en capa delgada (TLC) es una de las técnicas cromatográficas usadas de esta manera en las monografías USP para artículos botánicos. La cromatografía en capa delgada de alta resolución (HPTLC) es la versión más avanzada de la TLC (ver Cromatografía (621 )), y un procedimiento analítico general para la aplicación de HPTLC a la identificación de productos botánicos se describe en el capítulo Procedimiento de Cromatografía en Capa Delgada de Alta Resolución para Identificación de Artículos de Origen Botánico (203). En la HPTLC, la fase estacionaria consta de una capa uniforme, generalmente de 200 µm de espesor, de partículas irregulares porosas (tamaño de poro de 60 Á) de gel de sílice con un tamaño entre 2 y 1O µm y un tamaño promedio de partícula de 5 µm, además de un aglutinante polimérico y un indicador fluorescente (F 254 ) recubriendo un soporte que por lo general es una placa de vidrio o lámina de aluminio. Otras fases estacionarias tales como fases unidas químicamente (C8, Cl 8, CN, NH2; DIOL) o celulosa microcristalina, también están disponibles con y sin indicador fluorescente. Debido a la mayor eficiencia de separación de las partículas finas en la HPTLC, el sistema cromatográfico se miniaturiza, usando cámaras de desarrollo más pequeñas y distancias de desarrollo más cortas de 6-8 cm, en comparación con la TLC clásica, en el que se requieren 12-15 cm para una mejor separación. En consecuencia, se requiere menos fase móvil y menos tiempo para el desarrollo del cromatograma. Otro efecto de la miniaturización es el uso de volúmenes de muestra más pequeños, lo que resulta en la posibilidad de analizar más muestras por placa que con la TLC clásica. Asimismo, la mejor calidad de la capa debida a un tamaño de partícula más pequeño mejora la relación señal-ruido y, por ende, tiene efectos sobre la capacidad de detección de los componentes de la muestra separados. Se usa una prueba de aptitud del sistema para calificar los resultados. Esta característica es de gran importancia para la identificación de ingredientes botánicos, los cuales tienen una variabilidad natural intrínseca en su composición química. Las imágenes electrónicas de cromatogramas de HPTLC permiten una comparación visual conveniente de los resultados obtenidos para múltiples muestras
USP 39
Información General/ (1064) Artículos Botánicos 1185
contra imágenes de cromatogramas generados con materiales de referencia. Para propósitos de identificación, la complejidad de los ingredientes botánicos se representa mejor mediante huellas dactilares obtenidas con múltiples modos de detección a partir del mismo cromatograma, p.ej., luz UV 254 nm y UV 366 nm sin derivatización, y luz blanca y UV 366 nm después de la derivatización. Debido a que los métodos farmacopeicos se usan para determinar el cumplimiento, se debe evitar la variabilidad de los resultados ocasionada por el método analítico seleccionado. Dado que la HPTLC puede controlar las variables dentro de intervalos estrechos usando una metodología rigurosamente estandarizada y equipo apropiado, la HPTLC es capaz de incrementar de manera significativa la reproducibilidad de los resultados cromatográficos entre placas, en comparación con la TLC tradicional. A continuación se presenta un análisis de las variables que se deben controlar para obtener resultados reproducibles en la identificación de artículos de origen botánico usando HPTLC.
VARIABLES DE LA HPTLC La placa es un sistema abierto afectado por factores ambientales, los cuales deben controlarse cuidadosamente. A diferencia de la cromatografía en columna que es un sistema cerrado en el que las muestras se analizan de manera secuencial, en la HPTLC se pueden analizar múltiples muestras en paralelo en la misma placa. Todas las etapas del proceso cromatográfico planar son independientes en cuanto a tiempo y espacio (proceso fuera de línea). Para cada una de las etapas-aplicación de la muestra, desarrollo del cromatograma, visualización, detección, documentación y evaluación-se pueden seleccionar libremente numerosos parámetros. Esta característica única agrega una inmensa flexibilidad al método y hace del enfoque cromatográfico planar un complemento de las técnicas basadas en columna. Durante el desarrollo del método, la gran cantidad de opciones disponibles para los diversos parámetros puede resultar abrumadora, y, dependiendo de la combinación seleccionada, pueden resultar múltiples opciones que cumplan con el objetivo analítico respectivo, aunque sean bastante distintas. Por este motivo, a menudo se dice que un determinado ajuste de parámetros es "mejor" o "peor" que otro de acuerdo con las preferencias personales. En un ambiente de cumplimiento con las Buenas Prácticas de Fabricación vigentes, la reproducibilidad y la integridad de los resultados son de gran importancia. Esta es la razón por la que los parámetros individuales de la técnica de HPTLC deben ser seleccionados y combinados concienzudamente en una metodología estandarizada de modo que se optimice el resultado final y se pueda comparar con los resultados obtenidos por distintos analistas. Puede ser importante evitar etapas engorrosas y que consuman mucho tiempo, así como evitar el uso de sustancias químicas peligrosas o tóxicas. La simplicidad y la claridad son aspectos deseables de los métodos prácticos.
Manipulación de las Placas Las placas para HPTLC son delicadas y deben manipularse con cuidado para evitar que se dañe la capa. Cuando se deba trasladar la placa, sólo debe tocarse la parte superior por encima de la región donde se realiza la cromatografía. Las notaciones sobre las placas se deben realizar con un lápiz suave en la esquina superior derecha (o izquierda). La distancia de desarrollo prefijada puede marcarse en el borde derecho (o izquierdo) con un lápiz haciendo una pequeña muesca hasta el soporte de vidrio. Se debe evitar marcar la distancia de desarrollo a lo largo de toda la placa debido a que es difícil juzgar el momento cuando el frente difuso de la fase móvil alcanza dicha línea. Es más fácil alinear el frente con una muesca en el borde lateral. Las placas deben almacenarse en un lugar que esté libre de vapores y polvo con las capas orientadas hacia abajo en una pila de placas. El envoltorio plástico del empaque no debe estar en contacto con la placa a fin de evitar la contaminación con materiales volátiles de la lámina. Por lo general, las placas para HPTLC están listas para usar sin necesidad de pretratamiento. Las placas más viejas o almacenadas inadecuadamente pueden haber acumulado impurezas y, por ende, requerir de limpieza previa. Tal es el caso cuando, después del desarrollo, se observa el frente de la fase móvil (o frentes secundarios adicionales) bajo UV 254 nm como una banda oscura amplia e intensa a lo largo de la placa. La limpieza previa puede realizarse desarrollando la placa en metanol hasta el borde superior. Posteriormente, la placa se seca en una estufa limpia a 120º durante 20 minutos. Para enfriar a temperatura ambiente y para su almacenamiento previo a uso adicional, las placas se pueden mantener en un desecador vacío o envueltas en papel aluminio. La limpieza previa puede cambiar ligeramente la selectividad de una placa. Por lo tanto, es importante definir en un método si se va a permitir o no el uso de placas previamente limpiadas. La limpieza previa con la fase móvil por lo general no es una opción adecuada debido a que puede ser difícil eliminar completamente todos los componentes durante la etapa de secado.
Organización de la Placa y Aplicación de la Muestra El formato estándar de la placa para HPTLC es 20 cm de ancho xx 1 O cm de altura. Se podrían usar también otros tamaños (p.ej., 1O x 1 O cm), pero se debe tener en cuenta que para obtener resultados reproducibles, cada tamaño de placa requiere una cámara diferente para mantener los mismos aspectos geométricos como los tendría, por ejemplo, una cámara de cubetas gemelas para la placa estándar (ver Desarrollo del Cromatograma). La distancia óptima de desarrollo en la HPTLC es 6 cm. Cortar las placas a una altura menor de 1 O cm no provee ventajas adicionales. El posicionamiento exacto es esencial para la identificación apropiada de zonas separadas. Se deben considerar los siguientes parámetros para la aplicación de muestras con respecto a la organización de la placa (Figura 7).
1186 (1064) Artículos Botánicos/ Información General
... . X1
X2
USP 39
1· >1 >1• 1 d2 ty -· d1
1
1
Figura 1. Organización de la placa. Para la identificación apropiada (distancia de migración/valores RF), todas las muestras deben aplicarse en una línea (virtual) paralela al borde inferior de la placa. La distancia entre la línea de aplicación y el borde inferior (y) debe ser lo suficientemente grande para evitar que la muestra se sumerja en la fase móvil. Durante el desarrollo, la velocidad de la fase móvil se reduce a medida que aumenta la distancia de desarrollo. Por consiguiente, el resultado final depende de la posición de aplicación con respecto al nivel de fase móvil (Figura 2).
Figura 2. Parte superior: Efecto de la posición de aplicación con respecto al nivel de fase móvil (5 mm). La distancia desde el borde inferior va de 8-50 mm en incrementos de 3 mm. Parte inferior: Valores RF calculados para las diferentes distancias de desarrollo efectivas. Muestra: partes aéreas de Houttuynia; fase móvil: una mezcla de acetato de etilo, ácido fórmico y agua (15:1 :1, v/v/v); derivatización: reactivo para productos naturales; detección: UV 366 nm. Para obtener resultados reproducibles, se debe mantener constante la distancia desde el borde inferior (y) y también se debe fijar la cantidad de fase móvil que se coloca en la cámara. Para minimizar el consumo de fase móvil, se usan cámaras de cubetas gemelas. Por lo general, el nivel de fase móvil en dichas cámaras es de 5 mm. Se forma un menisco sobre la placa en la línea de inmersión. Una muestra aplicada a y= 8 mm estará adecuadamente por encima de este menisco. La distancia de la posición de aplicación con respecto a los bordes izquierdo y derecho de la placa (x) debe ser suficiente para evitar el denominado "efecto de borde" (Figura 3). Durante la producción, la mayoría de las placas pre-recubiertas desarrollan una pequeña elevación en los bordes donde la capa es ligeramente más gruesa. Esto ocasiona que la fase móvil avance más rápido, y las muestras que se aplican directamente en o muy cerca del borde elevado migrarán de manera irregular.
USP 39
Información General/ (1064) Artículos Botánicos 1187
Figura 3. El "efecto de borde". La posición x 1 a menudo se denomina "posición de aplicación". Para evitar el efecto de borde, se debe tomar en cuenta la longitud de la banda aplicada (1) al definir x2 como la distancia a partir del borde de la placa. Se requiere un mínimo de 15 mm para x2 • La distancia entre dos muestras (d 7) también considera la longitud de la banda ({). Para d2, se recomienda un mínimo de 3 mm de modo que las muestras no interfieran entre sí cuando se apliquen volúmenes mayores. Se debe fijar la longitud de la banda (1) para cada método, debido a que ésta afecta la concentración de muestras por banda si se aplica un volumen definido de solución muestra. La cantidad aplicada (a lo largo de una longitud de banda definida) tiene un efecto sobre la intensidad de las zonas separadas y puede afectar la capacidad de visualizar una zona particular de una huella dactilar. Un motivo para seleccionar bandas más cortas sería la capacidad para aplicar más muestras sobre la placa. Sin embargo, debido a que la evaluación del cromatograma se realiza principalmente de manera visual, se debe tener en cuenta que una banda se ve más "definida" (más como una banda y menos oblonga) cuando tiene una longitud >5 mm (Figura 4). Una longitud de banda de 8 mm es un buen compromiso teniendo en cuenta también que el capítulo (621) especifica bandas de 5-1 O mm para placas para HPTLC.
1188 (1064) Artículos Botánicos/ Información General
USP 39
0,9 0,8 0,7
0,6 0,5
0.4 0,3 0,2 0,1
Figura 4. Efecto de la longitud de banda sobre la impresión visual de separación. De izquierda a derecha, 3 µL/3 mm, 5 µL/5 mm, 8 µL/8 mm, 11 µL/11 mm y 15 µL/15 mm. Muestra: Flores de Tilo; fase móvil: mezcla de acetato de etilo, ácido fórmico, agua y metil etil cetona (50:10:10:30, v/v/v/v); derivatización: reactivo para productos naturales /polietilenglicol; detección: UV 366 nm. Con los parámetros descritos, la organización estándar de la placa presentará 15 bandas de 8 mm de longitud. Si se va a analizar un número menor de muestras, se recomienda aplicar determinaciones repetidas o dejar algunos carriles en blanco sobre la placa. Durante la aplicación, las muestras se depositan con precisión sobre las placas para HPTLC en las posiciones y cantidades definidas. Las soluciones muestra se pueden aplicar mediante contacto usando un capilar o una jeringa, o rociando la solución muestra sin tocar la placa (técnica de rociado superficial). Durante la aplicación por contacto, el disolvente de la muestra puede producir una cromatografía circular (Figura 5). Por lo tanto, sólo se deben aplicar volúmenes pequeños en un solo desplazamiento y, de ser posible, sólo se deben usar disolventes no polares. Durante la aplicación por rociado superficial, el disolvente de la muestra se nebuliza y evapora, creando zonas bien definidas independientemente de la polaridad del disolvente. Si se realiza una aplicación manual, se puede usar una guía de aplicación para posicionar adecuadamente las muestras. No se recomienda marcar la posición de aplicación con un lápiz debido a que la capa puede dañarse fácilmente.
USP 39
Información General/ (1064) Artículos Botánicos 1189
1,0
0,9 0,8 0,7
0,6 0,5 0,4
0,3 0,2 O, 1 0,0
1
2
3
4
5
6
7
8
Figura 5. Parte inferior: Aplicación de la muestra como punto (carriles 1-4) y en banda (carriles 5-8) mediante aplicación por contacto (carriles 1; 2; 5; 6) o técnica de rociado superficial (carriles 3; 4; 7; 8); volúmenes de aplicación: 2 µL (carriles 1; 3; 5;7) ó 5 µL (carriles 2; 4; 6; 8); mezcla de prueba de colorantes en metanol. Parte superior: Cromatografía con tolueno como fase móvil.
Desarrollo del Cromatograma Los procesos en una cámara cromatográfica son altamente complejos y difíciles de describir. A diferencia de la cromatografía en columna, en la cual se asume que tiene lugar en sistemas cromatográficos equilibrados, la cromatografía planar siempre comienza en un estado sin equilibrar, y nunca se alcanza el equilibrio. La muestra ha sido aplicada sobre la placa, la cual se convierte en la fase estacionaria sólo cuando entra en contacto con un líquido en la cámara cromatográfica. La fase móvil que avanza debe ser capaz de disolver la muestra para que comience la cromatografía. Impulsada por la acción capilar, la velocidad de la fase móvil disminuye a medida que se incrementa la distancia de migración debido a que también se incrementa la resistencia de la fase estacionaria contra el flujo. Se puede demostrar experimentalmente que la distancia de migración óptima para fases móviles en placas de HPTLC es aproximadamente 6 cm. Dependiendo de la viscosidad de la fase móvil, el desarrollo toma entre 1O y 20 minutos. Extender el desplazamiento del frente de la fase móvil por tan solo 1 O mm aumentará el tiempo de desarrollo entre 5-15 minutos, mientras que un desplazamiento adicional de 20 mm aumentará el tiempo de desarrollo entre 15-40 minutos. A menudo, resulta injustificable la contribución de dicha distancia extra de desarrollo para lograr una mejor separación, debido a que generalmente, toda ganancia en separación debida a la mayor distancia recorrida se compensa por la difusión que se produce a causa de la reducción en la velocidad de la fase móvil. En una cámara cromatográfica ocurren cuatro procesos distintos, los cuales siempre suceden simultáneamente e interaccionan entre sí (Figura 6).
1190 (1064) Artículos Botánicos/ Información General
USP 39
2
Figura 6. Procesos que ocurren en la cámara cromatográfica (cámara de cubetas gemelas): (1) saturación de la cámara; (2) preacondicionamiento de la placa; (3) evaporación; (4) formación de frentes secundarios. La saturación de la cámara (Figura 6, proceso 1) por lo regular se realiza antes de colocar la placa en el interior de la cámara. La fase móvil, que tiene una composición conocida, se coloca en el interior de ambas cubetas de la cámara y la hoja de papel de filtro en la cubeta posterior se humedece por completo. La saturación de la cámara ocurre una vez que el líquido en la cámara está en equilibrio con su propio vapor, lo cual es una función de tiempo. Después de 20 minutos, la cámara por lo general logrará un grado reproducible de saturación. La placa debe colocarse dentro de la cámara de tal manera que el soporte descanse en posición vertical apoyado sobre la pared delantera mientras que la capa debe estar orientada hacia la pared trasera. La parte seca de la capa absorbe el vapor de la fase móvil desde la fase gaseosa (proceso 2) para lograr la saturación adsortiva, la cual ocurre cuando la superficie queda recubierta por una capa de moléculas de la fase móvil. Por lo general, este proceso puede disminuir los valores RF y afectar también la selectividad de la separación. En la porción inferior de la placa, el líquido que asciende desde la cubeta forma la fase móvil. Dependiendo del grado de saturación, podría evaporarse parte de la fase móvil de la placa (proceso 3). La fase estacionaria podría ocasionar la separación de los múltiples componentes de las fases móviles debido a las diferentes interacciones de dichos componentes con la fase estacionaria. Este proceso se ve afectado por el grado de preacondicionamiento. En una cámara no saturada, la situación es bastante diferente. La cubeta posterior no contiene líquido ni papel de filtro. La placa se introduce inmediatamente después de la fase móvil, lo cual no permite suficiente tiempo para lograr el equilibrio de saturación gas-líquido. El preacondicionamiento tiene menos preponderancia, mientras que la evaporación y la posible formación de frentes secundarios (proceso 4) dominan el proceso cromatográfico. Ambos procesos por lo regular ocasionan alteraciones en los cromatogramas, por lo que la separación se ve afectada. En conclusión, cada cámara provee un resultado algo distinto, dependiendo de la geometría de la cámara, la presencia o ausencia de líquido y papel de filtro en una de las cubetas, y el tiempo de espera antes de la introducción de la placa. Los cromatogramas presentados en la Figura 7 se obtuvieron con una cámara de desarrollo automático con control de humedad. En este ejemplo, una cámara saturada (A) provee una mejor separación que una cámara no saturada (C). Los cromatogramas son reproducibles siempre que todas las condiciones sean iguales (A) y (B). Si el papel de filtro para saturación no se cambia, sino que se reúsa sin secarlo, se obtiene un resultado completamente distinto (D).
USP 39
Información General/ (1064) Artículos Botánicos 1191
A
B
e
D
Figura 7. Efectos de las distintas configuraciones de cámara a una humedad relativa de 33%: (A) y (B) saturadas, (C) no saturada, y (D) saturada con papel de filtro reutilizado. Muestra: Lapsana communis, estándares de referencia: ácido clorogénico (RF 0,38, carril 1, Panel A), quercitrina (RF 0,58, carril 2, Panel A), fase móvil: agua, metanol, ácido acético glacial y cloruro de metileno (2:3:8:15, v/v/v/v); derivatización: Reactivo de productos naturales/polietilenglicol; detección: UV 366 nm. Para obtener resultados reproducibles, es necesario estandarizar cuidadosamente el desarrollo. La saturación de la cámara es fácil de conseguir, al igual que la apropiada reproducibilidad de los tiempos. Las cámaras no saturadas son extremadamente sensibles a los pequeños cambios y, por ende, desde un punto de vista práctico, deben evitarse, aunque fuesen capaces de lograr una "mejor" separación. Una buena práctica es seguir mantener las distancias de desarrollo constantes (en las condiciones óptimas) para todos los métodos, puesto que otros parámetros tales como la selectividad y el acondicionamiento de la fase gaseosa afectan la separación en un grado mucho mayor.
Secado Después de que la fase móvil haya recorrido la distancia deseada, la placa debe retirarse de la cámara y secarse de manera reproducible. La mejor manera de conseguir esto es exponiendo la placa en posición vertical a una corriente de aire frío. Las temperaturas elevadas durante el secado pueden ocasionar difusión de los componentes volátiles de la muestra o que se evaporen de la placa. Durante la evaporación de la fase móvil, los componentes de la muestra migran desde áreas más profundas de la capa hacia la superficie. El secado no uniforme a lo largo de la placa puede generar intensidades diferentes para zonas con las mismas cantidades de sustancias.
Efectos de la Humedad El gel de sílice tiene una afinidad extremadamente alta para el agua y es un agente desecante efectivo. Una placa para HPTLC siempre está en equilibrio con el vapor de agua en la atmósfera del laboratorio (humedad relativa o HR). Los resultados cromatográficos se ven afectados por la variación en la cantidad de agua adsorbida en la superficie del gel de sílice. A mayor humedad relativa, se absorberá mayor cantidad de agua. En primera instancia, esto reduce la "actividad" de la fase estacionaria y ocasiona valores RF más altos. Además, debido a que el agua adsorbida puede convertirse en parte de la fase estacionaria, la selectividad del sistema cromatográfico a menudo cambia como respuesta a una variación en la humedad relativa. Desafortunadamente, es casi imposible predecir el efecto que tendrá un cambio en la humedad relativa sobre una separación dada (Figura 8). Algunas separaciones se ven más afectadas que otras y, en ocasiones, únicamente cambiarán algunas partes del cromatograma. Además, no existe una actividad ideal de la placa que pueda resolver todos los problemas de separación, y es difícil usar cambios de actividad definidos de la fase estacionaria para influir sobre la separación de la manera deseada. La mejor opción es mantener la humedad relativa constante a un nivel moderado (p.ej., 33%) y, posteriormente, intentar ajustar la selectividad de la fase móvil. Una excepción práctica es el "secado exhaustivo" de la placa efectuado con tamiz molecular. Es posible activar la placa con calor (120º durante 20 minutos), debido a que en estas condiciones, el agua adsorbida en el gel de sílice se elimina de manera efectiva, pero la placa se reequilibra a la humedad relativa ambiental al enfriarla y almacenarla, o durante la aplicación de la muestra.
1192 (1064) Artículos Botánicos/ Información General
USP 39
1,0
1,0
0,9
0,9
0,8
0,8
0,7
0,7
0,6
0,6
0,5
0,5
0,4
0,4
0,3
0,3
0,2
0,2 0,1
0,1
o.o
0,0 2%
33%
54%*
47%
75%
A
16%*
33%
58%*
75%
B 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0
e
2%
33%
47%
50%*HR
Figura 8. Efectos de la humedad relativa sobre la separación de diferentes muestras. (A) Hoodia gordonii, fase móvil: cloroformo, metanol y agua (70:30:3, v/v/v); derivatización: reactivo de anisaldehído, detección: luz blanca. (B) Raíz de regaliz, fase móvil: acetato de etilo, ácido fórmico, ácido acético y agua (15:1 :1 :2, v/v/v/v); derivatización: reactivo de ácido sulfúrico; detección: luz blanca. (C) Acteína/rizoma de cimicífuga racemosa, fase móvil: tolueno, formiato de etilo y ácido fórmico (5:3:2, v/v/v); derivatización: reactivo de ácido sulfúrico; detección: luz UV 366 nm. Humedad: *ambiental; 2%: tamiz molecular; 33%: solución saturada de cloruro de magnesio (MgCl 2); 47%: solución saturada de tiocianato de potasio (KSCN); 75%: solución saturada de cloruro de sodio (NaCI). Para obtener resultados reproducibles independientemente de los cambios estacionarios o regionales en la humedad relativa de los distintos laboratorios, es importante exponer la placa, con las muestras ya aplicadas, a una humedad relativa definida antes del desarrollo. Esto mantendrá constante la actividad y la selectividad de la fase estacionaria. Se puede crear una humedad relativa definida en contenedores cerrados tales como un desecador sobre soluciones salinas saturadas. Entre 20º y 25º, las soluciones saturadas de cloruro de magnesio generan una humedad relativa del 33%; las de tiocianato de potasio (KSCN), una humedad relativa del 47%; y las de cloruro de sodio (NaCI), una humedad relativa del 75%.
Información General/ (1064) Artículos Botánicos 1193
USP 39
Derivatización, Detección y Evaluación Una ventaja sobresaliente de la cromatografía planar es la posibilidad de lograr una derivatización química conveniente de sustancias ya separadas en una placa. Se pueden aplicar soluciones de reactivos de derivatización sobre la placa, ya sea mediante rociado o inmersión. Para obtener resultados reproducibles, la cantidad aplicada de un reactivo de una concentración dada, debe definirse por volumen (rociado) o por volumen y tiempo de inmersión. La mayoría de las reacciones de derivatización requieren llevar a cabo una etapa de calentamiento en un calentador de placas o en un horno de secado. La placa debería ser secada al aire antes del calentamiento para evitar cualquier alteración en la capa generada por la evaporación del disolvente residual. Antes de calentar la placa, el dispositivo de calentamiento debe alcanzar la temperatura requerida. Para obtener resultados reproducibles, es importante que todo el proceso de derivatización se cronometre de manera estricta. Esto incluye todos los tiempos de espera (p.ej., de enfriamiento) antes de la etapa de detección. La detección se lleva a cabo bajo luz blanca, por lo regular usando una fuente de luz sobre la placa (reflectancia) en combinación con luz proveniente de debajo de la placa (transmisión). Se puede obtener información adicional (por lo regular antes de cualquier derivatización química) bajo luz UV 254 nm. El indicador F254 de la placa para HPTLC emitirá una luz verde (azul para F254 ,). Cualquier sustancia que absorba luz UV 254 nm será visible como una zona "de extinción" oscura donde el grado de extinción corresponde a la cantidad de dicha sustancia (y a su coeficiente de extinción). Algunas sustancias fluorescentes se pueden excitar usando luz UV 366 nm, particularmente después de la derivatización química. Dichas sustancias se observan como zonas de colores específicos sobre un fondo oscuro. La HPTLC se beneficia de las imágenes digitales tomadas de la placa en distintos modos de detección/iluminación. En ocasiones, dichas imágenes pueden parecer diferentes de lo que percibe el analista mediante inspección visual. Esto se debe a algunas limitaciones físicas, pero es posible estandarizar el proceso de generación de imágenes de modo que se generen datos "fidedignos". Estos parámetros siempre deberían ser los mismos para una placa dada independientemente del lugar o la persona que tome la imagen. No es permisible el uso de software de edición de imágenes para cambiar ciertos aspectos de las imágenes. En la etapa de evaluación, los datos analíticos obtenidos para una muestra se comparan contra las especificaciones del método. La HPTLC para identificación de ingredientes botánicos por lo regular produce huellas dactilares, es decir, secuencias de zonas que tienen posiciones, colores e intensidades específicos. Dichas huellas dactilares se comparan contra los datos obtenidos con materiales de referencia. Idealmente, dicha comparación se basa en imágenes más que en descripciones. Debido a la variabilidad natural de los materiales botánicos, el criterio de aceptación siempre tendrá un intervalo asociado para que una huella dactilar pase la prueba de identidad. Las huellas dactilares de diversas especies (adulterantes) deberían tener características distintivas que no estén presentes en muestras que pasen la evaluación (Figura 9). Al definir los criterios de aceptación para la identificación, es necesario incluir una variedad de materiales botánicos de referencia que abarque diversas entradas. El uso de múltiples modos de detección es útil a la hora de tomar decisiones. 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3
0,2 0,1
1
2
3
4
5
Figura 9. Similitudes y diferencias entre múltiples muestras de especies relacionadas: (1) Cimicifuga racemosa; (2) Cimicifuga foetida; (3) Cimicifuga heracleifolia/dahurica; (4) Cimicifuga pachypoda; (5) Cimicifuga americana.
Aptitud del Sistema Antes de evaluar y/o comparar los datos que se originan de diferentes placas para HPTLC, se debe calificar cada una de las placas desarrolladas. Esto es posible mediante una prueba de aptitud del sistema, la cual es parte del método analítico. En cada placa, se seleccionan dos o más sustancias de referencia que tengan valores RF similares pero apenas separables en las condiciones cromatográficas que se van a usar; [por ejemplo, ácido clorogénico (azul) e hiperósido (anaranjado amarillento) en sistemas cromatográficos usados para flavonoides]. Las sustancias designadas para verificar la aptitud del sistema en lo que respecta a resolución, posición y colores de las bandas pueden estar incluidas en extractos estándares de referencia o en otra matriz. La descripción de la resolución, posición y colores para las bandas clave de la identificación del material de referencia deben corresponderse con la descripción de la referencia dentro del intervalo de tolerancia especificado. Los resultados obtenidos con las muestras en la misma placa se podrán evaluar adicionalmente para determinar el cumplimiento, únicamente cuando se
1194 (1064) Artículos Botánicos/ Información General
USP 39
hayan satisfecho los requisitos de aptitud del sistema. Para referencias sobre un procedimiento estandarizado de identificación de artículos de origen botánico que controle las variables descritas en este capítulo, ver el capítulo (203).
CONCLUSIONES Debido al amplio y creciente uso a nivel global de la HPTLC en la identificación botánica para monitorear la calidad de los artículos de origen botánico, parece importante estandarizar concienzudamente los procedimientos analíticos implicados. Todos los parámetros discutidos anteriormente deben especificarse siempre para cada uno de los análisis por HPTLC. En la actualidad, los laboratorios en diversos países pueden generalizar esta selección dentro del marco de los capítulos generales USP; no obstante, no se cuenta con pautas acerca de cómo obtener resultados específicos de HPTLC de manera reproducible. Un procedimiento estandarizado tal como el propuesto en el capítulo (203) puede llenar dicha brecha y servir como fundamento para la armonización de los resultados obtenidos en diferentes laboratorios.
(1065) CROMATOGRAFÍA IÓNICA INTRODUCCIÓN La cromatografía iónica (CI) es una técnica de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) instrumental que se utiliza en los procedimientos de prueba USP, tales como pruebas de identificación y valoraciones para medir aniones y cationes inorgánicos, ácidos orgánicos, carbohidratos, alcoholes de azúcar, aminoglicósidos, aminoácidos, proteínas, glicoproteínas y, potencialmente, otros analitos. Según las características del analito, la CI se ha aplicado a todos los aspectos de la fabricación y disposición de productos farmacéuticos, entre los que se incluye la caracterización de los ingredientes activos, excipientes, productos de degradación, impurezas y flujos de procesos. Se han analizado los siguientes tipos de muestras, entre otras: materias primas, intermedios (incluidos medios y caldos de cultivo), ingredientes activos a granel, diluyentes, productos formulados, soluciones de limpieza de equipos de producción y flujos de desechos. Esta técnica es particularmente valiosa para analitos iónicos o ionizables (en la fase móvil) que tienen una absorbancia UV reducida o nula. La capacidad de combinar la separación por intercambio iónico con numerosas estrategias de detección, p.ej., la detección amperométrica por pulsos (DAP), amplía las aplicaciones de la CI a aquellos casos en los que las estrategias de detección específicas para cada analito pueden proporcionar el grado de sensibilidad o especificidad requerido. El uso de este tipo de estrategias permite implementar las aplicaciones de CI en sistemas HPLC con una configuración apropiada. Asimismo, las separaciones por exclusión iónica y la detección amperométrica por pulsos amplían el campo de aplicación de la CI a ácidos orgánicos alifáticos, así como a analitos no iónicos de gran interés farmacéutico, entre los que se incluyen alcoholes, alditoles, carbohidratos y aminoácidos. El amplio intervalo dinámico de esta metodología hace posible su aplicación a la cuantificación de trazas contaminantes así como a los componentes principales de un producto. Dado que la CI suele utilizar soluciones salinas, álcalis o ácidos diluidos como fase móvil y no utiliza un disolvente orgánico, no se requiere la compra de disolventes orgánicos costosos ni la eliminación peligrosa de los efluentes de desecho. El efluente puede ser eliminado después de neutralizarlo debidamente (a -pH 7) y, en caso de ser necesario, después de diluirlo con agua. La CI permite la separación utilizando técnicas de intercambio iónico, exclusión iónica o pares iónicos. Las separaciones por CI se basan en las diferencias entre las densidades de carga de las especies de analito, las cuales, a su vez, dependen de la valencia y del tamaño de las especies iónicas individuales que se desea medir. Las separaciones también se pueden realizar a partir de las diferencias en las características hidrofóbicas de las especies iónicas. Por lo general, la CI se realiza a temperatura ambiente. Al igual que con otras formas de HPLC, las separaciones por CI se basan en factores de capacidad variables y, por lo general, siguen la ecuación de Knox. La cromatografía iónica es una técnica que complementa las utilizadas más comúnmente en el análisis farmacéutico: la HPLC en fase reversa y en fase normal y las técnicas de absorción atómica y con plasma de acoplamiento iónico (espectroquímica de plasma).
APARATOS Los instrumentos utilizados en la CI se asemejan en gran medida a los utilizados en la HPLC convencional. Los componentes típicos incluyen un muestreador automático, una bomba de alta presión, una válvula de inyección con un bucle de muestra de tamaño adecuado (normalmente de 1O a 250 µL), una guarda columna, una columna analítica, un supresor opcional u otras formas de sistema de reacción posterior al paso por columna, un detector de flujo continuo y un sistema de datos cuya complejidad puede variar desde un integrador a un sistema de datos computarizado (Figura 1).
USP 39
Información General/ (1065) Cromatografía lónica 1195
Guarda columna
Eluyente
Columna
··········9 Bomba de alta presión
inyección
Dispositivo de supresión o Derivación post columna (opcional)
Unidad de datos
Figura 1. Ilustración esquemática de los componentes de un sistema de CI típico; DC =detector de conductividad y DAP = detector amperométrico por pulsos Dado que, por lo general, las fases móviles consisten en soluciones diluidas de ácidos, álcalis o sales, los componentes que están en contacto con la fase móvil y la muestra suelen realizarse a partir de materiales inertes, como por ejemplo polieteretercetona (PEEK, por sus siglas en inglés). También pueden utilizarse los sistemas HPLC convencionales siempre que sus componentes sean compatibles con la fase móvil y las soluciones de muestras inyectadas. Se debe usar un sistema exento de metales para el análisis de trazas de metales. Después de una preparación adecuada, la muestra se introduce a través de la válvula de inyección. Seguido de la supresión química opcional u otra reacción posterior al paso por columna en el efluente de la columna, se detectan las especies de analitos empleando conductividad, amperometría, UV/VIS u otras técnicas de detección. Dado que la CI utiliza una fase móvil predominantemente iónica, suele requerirse un supresor antes de la detección conductimétrica, aunque la detección conductimétrica no suprimida se ha utilizado con éxito en el análisis farmacéutico.
Fases Estacionarias y Fases Móviles Con el desarrollo y perfeccionamiento de la CI como técnica instrumental, ha aumentado el número de materiales de intercambio iónico desarrollados para esta técnica gracias a la comprensión de los procesos que tienen lugar en la superficie de la fase estacionaria. A diferencia del relleno de la columna de sílice predominante en la HPLC clásica, en la CI se utilizan principalmente polímeros orgánicos como materiales de soporte. Este tipo de materiales presenta una mayor estabilidad ante valores de pH extremos y, en muchos casos, son compatibles con los disolventes orgánicos. Normalmente, la separación de los aniones requiere el uso de intercambiadores de aniones a base de polímeros y bases diluidas como fases móviles. Sin embargo, para la separación de los cationes, la estabilidad en toda la gama de pH que es típica de los polímeros orgánicos no es necesaria, ya que los ácidos diluidos sirven como fases móviles. En consecuencia, para la separación de cationes suelen utilizarse intercambiadores de cationes a base de sílice que presentan una eficiencia cromatográfica considerablemente superior. Según la técnica de separación empleada (intercambio iónico, exclusión iónica o pares iónicos), se utilizan diferentes tipos de fases estacionarias. En el caso del intercambio iónico, se utiliza como fase estacionaria un intercambiador de aniones o de cationes. Por lo general, se utiliza un intercambiador de cationes fuerte para la separación de ácidos orgánicos mediante exclusión iónica y una fase estacionaria en reversa cuando se utiliza la técnica de separación por pares iónicos. La capacidad de intercambio iónico de una resina se define como el número de sitios de intercambio iónico por peso equivalente al relleno de la columna y suele expresarse en mEq por g de resina. En el caso del intercambio iónico, los tiempos de retención de los iones de analito aumentan cuando aumenta la capacidad de intercambio iónico de la resina. Este efecto puede compensarse en parte utilizando fases móviles de mayor concentración iónica. En el proceso de fabricación de los intercambiadores iónicos a base de polímeros se utilizan copolímeros de estireno/divinilbenceno, polimetacrilato y resinas polivinílicas como materiales de sustrato. Los polímeros orgánicos actúan directamente en su superficie, a excepción de los intercambiadores iónicos a base de látex, en los que la partícula de látex totalmente porosa actúa como material de intercambio iónico. Los sustratos "peliculares" que actúan en la superficie presentan una eficiencia cromatográfica mucho mayor en comparación con las resinas de actuación integral. En el intercambio iónico, para lograr la separación se utiliza una fase móvil compuesta por especies iónicas monovalentes o divalentes, solas o mezcladas en una proporción óptima. En los métodos de exclusión iónica, particularmente para los ácidos orgánicos, la fase móvil consta de ácidos minerales para mantener los ácidos orgánicos en sus formas no disociadas. Con frecuencia, la naturaleza del analito determina la fase móvil y el método de detección utilizados. A continuación, en la sección sobre detectores, se describen las fases móviles típicamente utilizadas en la CI.
Detectores La detección por conductividad es, sin duda, el método de detección más utilizado en CI. A pesar de que las tareas de desarrollo original de la CI incluían el uso de resinas de intercambio iónico de baja capacidad con el fin de lograr una separación cromatográfica y una detección conductimétrica de iones que fueran eficientes, en una fase móvil químicamente suprimida, los avances en tecnologías de columna y el desarrollo del instrumental permiten, en la actualidad, el uso de intercambio iónico de alta capacidad.
1196 (1065) Cromatografía lónica / Información General
USP 39
En la CI suprimida, la conductancia de fondo de la fase móvil iónica se reduce considerablemente a medida que fluye a través del dispositivo de supresión. Por ejemplo, el NaOH diluido, aproximadamente de 1 O a 50 mM, usado como fase móvil en CI de aniones se convierte a H2 O (escasa conductividad) cuando el efluente de la columna que contiene NaOH fluye a través de un dispositivo supresor presente en forma ácida. Las especies iónicas del analito en el efluente de la columna se convierten de su forma salina a base de sodio o de otro metal a formas ácidas altamente conductoras (debido a la mayor conductancia equivalente de los iones de hidrógeno en comparación con otros cationes). Se producen reacciones análogas en el supresor de forma de hidróxido en la CI de cationes, en la que la fase móvil ácida se convierte en agua y los cationes del analito se convierten en formas de hidróxido altamente conductoras (debido a la mayor conductancia equivalente de los iones de hidróxido en comparación con otros aniones). La reducción en la conductancia de fondo y el aumento en la señal debido a las especies iónicas dan como resultado una relación señal-ruido mejorada para la detección conductimétrica de iones en CI suprimida. Esto produce una reducción en el ruido de fondo y un aumento en la sensibilidad y en la capacidad de reproducción del análisis. Los dispositivos de supresión química comúnmente utilizados se encuentran en una de tres categorías generales. En la primera, las reacciones se producen a través de una membrana de intercambio iónico y los iones regeneradores son proporcionados por un producto químico o bien como productos de la electrólisis del agua. En la segunda, las reacciones de supresión se producen en un lecho de material de resina de alta capacidad de intercambio, relleno, y la regeneración se obtiene mediante un producto químico o por la electrólisis del agua. En la tercera, aunque no son muy utilizados, las reacciones de supresión tienen lugar cuando el flujo de eluyente se mezcla con el flujo de material de resina de alta capacidad. En el caso de análisis farmacéuticos, la detección conductimétrica suprimida puede utilizarse para detectar trazas de iones en aguas de alta pureza. Las fases móviles más utilizadas para la separación de aniones mediante CI suprimida incluyen iones de hidróxido o una mezcla de iones de bicarbonato y carbonato. Las fases móviles normalmente utilizadas para la separación de cationes constan, por lo general, de ácidos minerales o de ácido metanosulfónico. Los análisis por cromatografía iónica también pueden realizarse sin supresión química, en cuyo caso el efluente de la columna analítica fluye directamente a un detector de conductividad. Los eluyentes normalmente utilizados en CI no suprimida son ácido ftálico y ácido p -hidroxibenzoico para la determinación de aniones y ácido metanosulfónico para la determinación de cationes. Los valores de conductancia equivalentes del cloruro, del sulfato y de otros aniones comunes son considerablemente mayores que los del anión del eluyente y, en consecuencia, se detecta un pico positivo cuando los aniones pasan por el detector. Los valores de conductancia equivalentes del sodio, del potasio, del calcio, del magnesio y de otros cationes comunes son considerablemente menores que los del catión (H+ ) del eluyente. En este caso, se detecta un pico negativo cuando los cationes pasan por el detector. La CI no suprimida es más fácil de realizar y es una técnica útil para determinar los iones de ácidos débiles como cianuro y sulfuro, que son no conductores después de la supresión química pero presentan un ruido de la línea base más elevado. Los análisis farmacéuticos pueden realizarse en el modo no suprimido debido a que los límites de cuantificación en mg por L suelen encontrarse en los niveles porcentuales superiores a bajos. Si bien por lo general deben implementarse metodologías con supresión química en los sistemas de instrumentos diseñados específicamente para este propósito, la CI puede realizarse sin el supresor en una HPLC ya existente. Esto es posible debido a que los eluyentes normalmente utilizados en la CI incluyen bases o ácidos diluidos que sean compatibles con los instrumentos de HPLC ya existentes. Al considerar este método, se recomienda a los analistas que consulten al fabricante del instrumento para verificar su aplicabilidad en el análisis por CI. OTROS DETECTORES Otras técnicas de detección comúnmente utilizadas en CI incluyen amperometría por pulsos, detección UV directa o derivación posterior al paso por columna seguida por detección UV/VIS. Técnica de Detección Amperométrica Por Pulsos (DAP)-Esta técnica es una variante especializada de la técnica amperométrica convencional. Este tipo de detector suele utilizarse para la detección de especies electroactivas, p.ej., compuestos orgánicos como carbohidratos, alcoholes de azúcar, aminoácidos y especies de azufre orgánico. En esta técnica, los analitos se detectan mediante un proceso de desorción oxidativa en la superficie de un electrodo ubicado en el flujo de efluente de la columna. Después del proceso de detección, se aplica una serie de potenciales durante períodos fijos para limpiar la superficie del electrodo. A diferencia de la amperometría convencional en la que la superficie del electrodo se ensucia, en esta variante se aplica una secuencia de potenciales de trabajo diferentes de rápida reiteración, denominada forma de onda, que ayuda a eliminar los productos de las reacciones redox de la superficie del electrodo. Detección UV Directa e Indirecta-La Detección UV Directa se utiliza para iones inorgánicos y orgánicos que poseen un cromóforo UV. Éstos incluyen ácidos orgánicos, bromuro, yoduro, nitrato, nitrito, tiosulfato y complejos cianometálicos. En forma análoga a la detección conductimétrica inversa de cationes, la detección UV también puede realizarse en forma indirecta. Este método se conoce como cromatografía fotométrica indirecta (CFI). Detección Fotométrica-La detección fotométrica consiste en la quelación de iones metálicos en el efluente de la columna con un reactivo colorante antes de su detección a una longitud de onda visible. Un ejemplo clásico es la separación de iones metálicos en la que el efluente de la columna se quela con 4-(2-piridilazo)-resorcinol seguido por su detección en un margen de 510 nm a 530 nm.
USP 39
Información General/ (1066) Ambientes Físicos 1197
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA La preparación típica de una muestra para CI incluye dilución o filtración a través de un filtro de 0,45 µm, o ambos procesos. En ciertos casos, puede ser necesario eliminar las especies indeseables de las muestras mediante técnicas de extracción en fase sólida (EFS). Por ejemplo, una muestra altamente alcalina puede neutralizarse pasándola a través de un cartucho EFS relleno con material de intercambio catiónico en forma ácida.
PROCEDIMIENTO La detección conductimétrica requiere agua de alta pureza (por lo general, con una resistividad de más de 18 megohmio-cm) y productos químicos de alta pureza para la preparación de la fase móvil. Para la separación de pares iónicos con detección UV, se debe utilizar agua y componentes de fase móvil de baja absorbancia UV. Para intercambio iónico, el tiempo de retención de los iones aumenta a medida que baja la concentración iónica y la valencia (carga) de los componentes de la fase móvil. Por ejemplo, a concentraciones equimolares de fase móvil de hidróxido de sodio o carbonato de sodio, los factores de capacidad (k ') para aniones son menores con hidróxido de sodio como fase móvil que con carbonato de sodio como fase móvil. Algunas fases móviles, como el hidróxido de sodio, absorben el dióxido de carbono ambiente, lo cual genera un cambio en su composición y, a menudo, artefactos en la línea de base. En este caso, se deben tomar las precauciones necesarias para evitar que la fase móvil de hidróxido de sodio absorba dióxido de carbono. Para la exclusión iónica, los factores de capacidad de los ácidos orgánicos se incrementan con el aumento de la concentración iónica o de los ácidos minerales pero se reducen cuando aumenta la temperatura de la columna. Debido a que el volumen de permeabilidad se mantiene constante, estos efectos suelen ser menores. La adición de un disolvente como acetonitrilo reduce la retención de los ácidos orgánicos. Al igual que otras técnicas de HPLC, los sistemas CI se calibran graficando las respuestas de los picos en comparación con concentraciones conocidas de un estándar de referencia, usando un procedimiento de normalización externo o interno.
(1066) AMBIENTES FÍSICOS QUE FAVORECEN EL USO SEGURO DE LOS MEDICAMENTOS INTRODUCCIÓN El ambiente físico de trabajo en los entornos de cuidados de la salud es uno de los mayores contribuyentes potenciales a los errores de medicación. Los datos sobre errores de medicación informados al Programa de Informe de Errores de Medicación de la Farmacopea de los Estados Unidos (2008) demuestran que diversos atributos físicos del lugar de trabajo afectan el desempeño humano al realizar este trabajo. Estos atributos pueden ayudar o entorpecer a los profesionales de la salud en sus esfuerzos de proveer cuidados seguros y de alta calidad a todos los pacientes. Conforme a lo indicado por el Instituto de Medicina (IOM) en su emblemático informe de 2001, Quality Chasm (El Abismo de la Calidad), "Hoy en día, el cuidado de la salud ocasiona daños con demasiada frecuencia y, en muchas ocasiones, es incapaz de proveer su potencial benéfico." Este capítulo general describe normas basadas en evidencia para crear y mantener un ambiente físico que sustente y favorezca el uso exacto y seguro de los medicamentos. El proceso para el uso seguro de los medicamentos implica múltiples aspectos o etapas: adquisición, prescripción, transcripción, ingreso de órdenes, preparación, dispensación y administración, así como el seguimiento de los efectos del medicamento sobre el paciente. Una mejor comprensión de estos procesos puede formar una base sólida para el mejoramiento, lo que permitiría a los profesionales de la salud alcanzar un desempeño óptimo dentro del sistema de uso de los medicamentos en diversos entornos de práctica. Este capítulo general se concentra en las características del ambiente físico que pueden favorecer el uso apropiado de los medicamentos. Las normas se proveen cuando están justificadas por evidencias y opiniones de expertos; asimismo, se provee un glosario de términos usados en este capítulo.
RESPALDO DE LA ORGANIZACIÓN Los líderes de una organización de cuidados de la salud son quienes por lo general determinan las operaciones, las políticas y los procedimientos que influyen sobre la seguridad. También establecen el diseño del ambiente de trabajo y la cultura, y tienen una fuerte influencia sobre la adopción de una cultura de seguridad en lugar de una imposición cultural. Por ejemplo, el personal jerárquico de la organización puede ayudar a mejorar la seguridad favoreciendo el libre flujo de información y reforzando los comportamientos de seguridad, o puede desalentar y restar importancia a las iniciativas de seguridad. Se encuentran disponibles dos informes que documentan aspectos relacionados con las acciones organizacionales y la cultura y la forma en que afectan la seguridad y el cuidado de los pacientes: El informe de la IOM de 1999, To Err is Human (Errar es Humano), y el informe de la IOM de 2006, Preventing Medication Errors (Prevención de Errores de Medicación).
1198 (1 066) Ambientes Físicos / Información General
USP 39
Los organismos de acreditación tales como The Joint Commission (La Comisión Conjunta o TJC), la National lntegrated Accreditation for Healthcare Organizations (Acreditación Integrada Nacional para Organizaciones de Cuidados de la Salud o NIAHO) y la lnternational Organization for Standardization (Organización Internacional para la Estandarización o ISO) enfatizan los roles de la organización y de sus directivos en la determinación de las normas de seguridad. La TJC define la función crítica de los directivos y responsabiliza a los líderes por los sistemas y procesos, mientras que la NIAHO y la ISO requieren la revisión gerencial de la calidad y la seguridad por parte del organismo rector, con el propósito de favorecer cuidados de la salud seguros y de alta calidad. De acuerdo con James Reason (Human Error [Error Humano], 1990) se puede decir que la influencia de la organización cae en algún punto intermedio entre los controles normativos, representados por reglas y procedimientos, y los controles discrecionales, que pueden basarse únicamente en la experiencia del individuo. Los controles de la organización que favorecen ambientes seguros deben incluir, como mínimo, los planes de informe, análisis e intervención necesarios para fundamentar las defensas contra eventos adversos de medicación. Los sistemas para el análisis de errores deben incluir las influencias organizacionales que finalmente afectan a los trabajadores a nivel de unidad. Una cultura directiva que apoya y empodera a todos los niveles de la organización, debería resultar en ambientes físicos de trabajo óptimos que ayudan a prevenir errores de medicación y que favorecen el uso exacto de los medicamentos. Este enfoque puede mejorar el desempeño de todos los individuos implicados en el proceso de uso de los medicamentos. Una organización que alinea los objetivos y recursos de los directivos centrándose en la seguridad estratégica basada en evidencia genera sistemas más seguros para la administración de medicamentos. Aunque los hospitales han sido "diseñados" para el cuidado de pacientes, existe un organismo de investigación rector que apunta al diseño basado en evidencia para una provisión segura de los cuidados. Otras industrias de alto riesgo con énfasis en la seguridad estratégica comparten características comunes que incluyen el uso de procesos robustos para el mejoramiento de organizaciones; esto puede llevar a intervenciones basadas en datos y evidencia científica.
ZONAS DE SEGURIDAD PARA MEDICACIÓN En el sistema de uso de medicamentos, el grado de exactitud y seguridad lograda es el resultado final de muchas interacciones entre humanos, sus ambientes físicos de trabajo y los equipos y la tecnología utilizados. Es importante concentrarse en áreas de ambiente laboral en las que (1) se prescriben los medicamentos; (2) se ingresan las órdenes en una computadora o se transcriben en papel; y (3) se realizan preparaciones magistrales de medicamentos que se dispensan y se administran. Estas áreas de trabajo comúnmente se conocen como zonas de seguridad para medicación. Entre los ejemplos se incluyen las áreas de trabajo alrededor de un carro de medicamentos en una unidad de enfermería; cualquier lugar donde se toman las decisiones con respecto a las prescripciones; el espacio de trabajo de un dispositivo automatizado de dispensación de medicamentos; una farmacia donde se preparan, inspeccionan y dispensan las prescripciones; y áreas en los hogares de los pacientes donde se preparan, administran o consumen los medicamentos. La zona aledaña a la cama del paciente en una instalación de cuidados de la salud o su hogar es otra zona de seguridad para medicación importante que presenta retos únicos. El ambiente físico de cualquier sala de operaciones requiere atención especial debido a los altos niveles de ruido, a la iluminación variable y otras distracciones. En este entorno desafiante, los profesionales de la salud toman decisiones críticas de medicación que pueden influir en la vida o muerte de un paciente. Asimismo, las zonas de seguridad para medicación deben incluir áreas con un espacio destinado a un equipo seguro para el desecho de material punzante (agujas y jeringas). En general, en todas las zonas de seguridad para medicación, es importante asegurar que se mantengan cantidades apropiadas de suministros, verificar de manera rutinaria las fechas de caducidad de los productos, y las condiciones de almacenamiento correctas para el mantenimiento de los productos sensibles a la temperatura.
Principios derivados de la Investigación de Factores Humanos La literatura investigativa describe diversos principios que pueden ser útiles para el planeamiento del ambiente físico de una zona de seguridad para medicación. PRINCIPIO DE IMPORTANCIA Dentro de la zona de seguridad para medicación, los componentes importantes se deben colocar en lugares convenientes. Por ejemplo, los sistemas de información deben ser accesibles dentro o cerca de la zona de seguridad para medicación de modo que la información del medicamento y los datos del paciente (p.ej., resultados de laboratorio y signos vitales) estén disponibles de inmediato. Las instrucciones de funcionamiento y resolución de problemas de los equipos se deben colocar cerca o sobre los equipos para ofrecer respuestas rápidas a cualquier pregunta que surja.
USP 39
Información General/ (1 066) Ambientes Físicos 1199
PRINCIPIO DE FRECUENCIA DE USO Los suministros y equipos que se usen de manera frecuente deben ser fáciles de encontrar y accesibles. Esto reduce la probabilidad de que el personal deba improvisar soluciones, en las que se utilicen equipos/suministros menos adecuados en lugar de los artículos recomendados. PRINCIPIO DE FUNCIÓN Los exhibidores, controles o suministros relacionados con una función específica deben mantenerse juntos. Por ejemplo, las jeringas, las agujas y los hisopos con alcohol pueden almacenarse juntos en un cajón; y los tubos y conectores IV que se usan en la preparación de infusiones pueden colocarse en el mismo estante. PRINCIPIO DE SECUENCIA DE USO Los artículos deben colocarse en un orden que refleje la secuencia de los pasos necesarios para realizar correctamente la tarea. Por ejemplo, los guantes estériles se deben encontrar dentro o con los kits de vendas estériles, y los artículos se deben acomodar de manera secuencial. Esto permite al personal completar las tareas de manera rápida y correcta.
Estaciones de Trabajo Aledañas a la Cama Existen métodos disponibles para realizar el análisis del espacio de trabajo. Un aspecto importante son las áreas de administración de medicamentos aledañas a la cama del paciente (en instalaciones de cuidados de la salud o en el hogar del paciente), que deben seguir el mismo diseño que la zona de seguridad para medicación centralizada. Las distracciones representan un reto mayor cuando se trabaja en las zonas aledañas a la cama del paciente, por lo que se deben tomar medidas para minimizarlas siempre que sea posible. La información y los suministros deben mantenerse accesibles (de acuerdo con los principios de factor humano tratados con anterioridad) y colocarse en un área ordenada con iluminación adecuada. Los recipientes para desechar objetos punzantes se deben colocar en áreas donde se puedan alcanzar fácilmente, pero fuera de las áreas de tránsito constante. Cada área aledaña a la cama debe presentar un diseño estandarizado, de manera que no se necesite reubicar la información y los suministros al trasladar un paciente de una cama a otra.
Producción Optimizada El mantenimiento de un lugar de trabajo eficiente y efectivo reduce la probabilidad de errores. Una manera eficiente para diseñar el lugar de trabajo emplea técnicas de producción optimizada para mejorar las actividades deseables y con valor agregado, al tiempo que se eliminan actividades indeseables que producen pérdidas durante los procesos de trabajo. A continuación se presentan tres técnicas de producción optimizada: (1) Controles Visuales, es decir, mantener los procesos de trabajo e indicadores a la vista de modo que el personal pueda ver el estado de la tarea a simple vista; (2) Diseño racionalizado, es decir, optimizar la secuencia de los procesos de trabajo a través del diseño de las instalaciones; y (3) Almacenamiento en el Lugar de Uso, es decir, almacenar suministros en el lugar donde se usarán siempre que sea posible, de modo que el personal pueda realizar las tareas de manera más eficiente. 1
Simplificación y Estandarización La aplicación de cambios que simplifiquen y estandaricen el ambiente de cuidados del paciente disminuye la carga cognitiva, reduciendo la probabilidad de olvidos y errores durante tareas de rutina al minimizar el tiempo de decisión y manipulación. La estandarización se puede usar en el diseño de instalaciones y habitaciones, equipo médico y funciones relacionadas con la medicación (p.ej., entrega de medicamentos y almacenamiento de medicamentos específicos del paciente). Asegurar el acceso inmediato a la información clínica que es específica para el paciente (o de los medicamentos), es esencial para todas las áreas en las que el personal desarrolla las etapas del proceso de uso de medicamentos.
Soluciones Innovadoras Otra manera de optimizar el diseño de la zona de seguridad para medicación consiste en involucrar al personal que realiza las tareas de manera rutinaria. Los trabajadores pueden sugerir soluciones innovadoras para los problemas en la estación de trabajo. Para favorecer la innovación, es recomendable incorporar flexibilidad en el diseño de la zona de seguridad para medicación.
1
Sanders MS, McCormick EJ. Human Factors in Engineering and Design. New York: McGraw-Hill; 1993.
1200 (1066) Ambientes Físicos / Información General
USP 39
Funciones de Restricción Las restricciones y las funciones de restricción son medios efectivos para prevenir errores, en particular para medicamentos y situaciones de alto riesgo. Las funciones de restricción no siempre se refieren al diseño del dispositivo. De éstas, las más simples no requieren de tecnología. Una de las primeras funciones de restricción identificada en los cuidados de la salud fue la eliminación de potasio concentrado de las unidades hospitalarias para eliminar el riesgo de preparación involuntaria de soluciones intravenosas con potasio concentrado, un error que, con el paso de los años, ha ocasionado un número de muertes bajo pero constante. Otros ejemplos incluirían la incorporación de bloqueadores neuromusculares en un kit de entubado sellado lo cual reduce la posibilidad de que se administre un agente paralizante a un paciente sin tener acceso a ventilación asistida. Además, el envasado de un producto enteral de modo que no se pueda conectar físicamente a un conector con cierre Luer para tubuladuras intravenosas evitaría un error de ruta de administración, incluso si el personal de enfermería se encontrase trabajando bajo condiciones de poca luz y, en un principio, hubiera cometido un error al identificar la ruta destinada para el tubo. La disponibilidad de tecnología de seguridad para medicación nunca debe reemplazar a las prácticas seguras de medicación dentro de una zona de seguridad para medicación. Diversos informes han advertido acerca de errores derivados de ignorar o pasar por alto (override) controles de seguridad, tales como bibliotecas de fármacos en bombas de infusión inteligentes y alarmas.
Elementos del Sistema de Trabajo CARACTERÍSTICAS DEL PERSONAL Las características del individuo que realiza el trabajo incluyen su nivel de experiencia, edad, agudeza visual y auditiva, tendencia a las distracciones y nivel de atención. Los seres humanos difieren en sus respuestas al ambiente físico. En un escenario ideal, el ambiente físico podría modificarse para cada individuo. De esta forma, el ambiente se podría adaptar para ajustarlo a las necesidades del usuario de turno a fin de optimizar la exactitud de su desempeño. Alternativamente, el ambiente debe ser lo más favorable posible para la más amplia gama de capacidades posible.
SONIDO V RUIDO La Agencia de Protección Ambiental de EE.UU. (Environmental Protection Agency o EPA) recomienda niveles pico de sonido de 45 dB durante el día y 35 dB durante la noche en hospitales. Las guías de la Organización Mundial de la Salud (OMS) establecen que los niveles de sonido de fondo en las habitaciones de los pacientes no deben exceder de 35 dB. El lnternational Noise Council recomienda máximos de 45 dB durante el día y de 20 dB en la noche para áreas de cuidados agudos. Es necesario usar protección para los oídos cuando los trabajadores estén expuestos a niveles de sonido que promedien 90 dB. La norma para niveles de sonido en zonas de seguridad para medicación se establece en 45 dBA. Con esto se pretende asegurar que la información verbal crítica se pueda escuchar con exactitud. Los profesionales de la salud deben ser conscientes de sus propias necesidades de silencio, dependiendo de la tarea realizada, y deben contar con un área silenciosa para favorecer el desempeño apropiado. La eliminación total de ruido en instalaciones de cuidados del paciente no es factible ni deseable. Las áreas de asesoramiento de pacientes en las farmacias deben incluir métodos de reducción de sonido para mejorar la audición y el aprendizaje, por ejemplo, el uso de una sala cerrada. El ruido se considera como un riesgo serio para la salud de los pacientes hospitalarios, además de ser una fuente de interferencia para el desempeño efectivo en el trabajo. La mayoría de los estudios sobre los efectos del ruido en el ambiente de trabajo han sido realizados en entornos no relacionados con el cuidado de la salud. No obstante, se documenta cada vez con mayor frecuencia que los niveles de ruido son un factor que contribuye al estrés del personal de enfermería. En los centros de cuidados de la salud, las fuentes de ruido pueden incluir desde sistemas de radiolocalización de personas, alarmas de equipos, sistemas de calefacción, ventilación y aire acondicionado (HVAC), cañerías, televisores y radios hasta máquinas de hielo. Se ha citado al ruido como un obstáculo para el desempeño adecuado del personal de enfermería. Un estudio exhaustivo desarrolló un mapa de ruido de un hospital en el que se encontraron niveles de sonido de 55 dB, lo que representa 10-20 dB por encima de las recomendaciones de la EPA dependiendo de la hora del día. Los niveles de sonido promedio en otros hospitales han presentado mediciones entre 45 y 68 dB, con picos entre 85 y 90 dB. Un estudio de niveles de sonido durante cambios de turno presentó mediciones de 11 3 dB. A continuación, se presentan condiciones relacionadas con el sonido que pueden afectar la exactitud al dispensar los medicamentos: previsibilidad del sonido; capacidad de control del sonido; tipo de tarea (simple vs compleja); realización simultánea de tareas múltiples; distracciones debidas al ruido (que puede confundir las señales ambientales y la voz interna del trabajador, usadas para practicar y recordar tareas importantes). De 58 estudios, 7 mostraron que el ruido mejoraba el desempeño, al contrario de 29 que mostraron que el ruido lo perjudicaba. Un estudio mostró que los sonidos y ruidos impredecibles pero controlables mejoran la exactitud de la preparación de prescripciones, contrario a lo mostrado por investigaciones anteriores. Lo anterior puede ser indicativo de que es necesario cierto estímulo ambiental para mantener a los trabajadores en un estado de alerta y atención adecuados. Los investigadores intentan identificar niveles óptimos de reacción debida al sonido y al ruido para las personas que realizan diferentes tipos de tareas (p.ej. la ley de Yerkes-Dodson).
USP 39
Información General/ (1066) Ambientes Físicos 1201
Es posible reducir el ruido y demás interferencias sensoriales mediante actividades, herramientas y principios desarrollados por expertos en factores humanos e ingeniería, muchos de los cuales ya se usan en algunas organizaciones dedicadas al cuidado de la salud. Como parte de un proyecto de investigación (http://www.healthdesign.org/pebble) auspiciado por The Center far Health Design (Centro de Diseño para la Salud), una organización de investigación y promoción sin fines de lucro, se están estudiando los efectos que tienen estos y otras mejoras en el diseño de los espacios de trabajo de enfermería, sobre el estado final de los pacientes y el desempeño del centro de atención. El proyecto ha encontrado disminuciones en errores médicos, así como en transferencias de pacientes, infecciones intrahospitalarias, caídas de pacientes y uso de medicamentos. Cuando lo permitan las guías de control de infecciones, se puede lograr la reducción del ruido a un costo moderado mediante la instalación de materiales que puedan absorber el sonido (p.ej. materiales de cielos rasos y paredes, y alfombras). Los ingenieros acústicos pueden proveer métodos adicionales para la reducción de ruido. Los trabajadores que no necesitan responder a señales audibles tales como llamadas telefónicas o alarmas pueden usar auriculares con cancelación de ruido y escuchar música, siempre que su desempeño no se vea afectado de manera adversa.
ACTIVIDADES V TAREAS REALIZADAS Al diseñar un ambiente físico óptimo que favorezca el uso exacto de los medicamentos, se deben considerar las actividades y tareas que se requieren llevar a cabo. Un ambiente con un diseño deficiente u otras condiciones adversas en el área de trabajo puede llevar a una adaptación insegura de los procedimientos. Por ejemplo, los profesionales que tienen que escuchar constantemente alarmas de los equipos fuera de los parámetros adecuados (y que por lo tanto producen demasiadas falsas alarmas) pueden silenciar las alarmas para disminuir el ruido. No obstante, esto limita la capacidad del profesional para monitorear la seguridad del sistema. Una situación similar es la de las alarmas visuales y los mensajes de computadora que a menudo se ignoran o pasan por alto. En general, las actividades y las tareas deben estructurarse de modo que puedan llevarse a cabo con la menor dificultad posible. Si se detectan soluciones improvisadas, estas deben investigarse como una indicación de que el procedimiento o flujo de trabajo no es adecuado para la tarea.
Atención Dividida en Tareas Múltiples El término "Atención Dividida en Tareas Múltiples" se originó en la industria de la ingeniería informática y se refiere a la capacidad de una persona para llevar a cabo más de una tarea en simultáneo. El cerebro humano funciona de manera distinta en cada persona; por lo tanto, no todos son capaces de realizar múltiples tareas en simultáneo de manera exitosa. La necesidad de realizar múltiples tareas en simultáneo es común en todas las áreas del ambiente de los cuidados de la salud, ya sea en una unidad de enfermería, en una farmacia, en una sala de operaciones o en un área de procedimientos especiales. Algunas personas pueden concentrarse sin problemas al realizar más de una tarea a la vez, mientras que a otras no les resulta posible. En el cerebro humano, la atención dividida en tareas múltiples implica ir y volver de forma lineal de una actividad a otra mientras en realidad se completa una tarea a la vez. Esto puede generar problemas en los establecimientos de cuidados de la salud, en particular si sucede algo inesperado con respecto a una tarea mientras el individuo está enfocado en otra. Estas interrupciones y distracciones pueden llevar a errores de medicación y otras formas de daños a los pacientes. Otro tipo de error por atención dividida en tareas múltiples se relaciona con la "sobrecarga mental", es decir, cuando diversos asuntos se están considerando al mismo tiempo. Un exceso en la carga de trabajo cognitiva puede tener consecuencias indeseables, por lo que es importante tener en cuenta que no todos los profesionales son capaces de manejar sistemas y procesos establecidos en un ambiente físico particular. Los farmacéuticos y enfermeras son profesionales que con regularidad realizan múltiples tareas en simultáneo. Aunque la mayoría de las prescripciones se preparan o administran de a una por vez, esto no significa que no pueda ocurrir la atención dividida en tareas múltiples. El área de trabajo debe estar diseñada para mantener las prescripciones individuales separadas y para permitir la atención dividida en tareas múltiples. Los individuos tienen capacidades diferentes para llevar a cabo tareas secuenciales en lugar de dividir su atención en tareas múltiples. En la actualidad, no hay evidencia suficiente para evaluar la aptitud de un individuo para dividir su atención en tareas múltiples en ambientes de cuidados de la salud, pero la investigación de factores humanos en los entornos de laboratorio controlados sugiere que, en el futuro, pueda ser posible evaluar y aumentar esta capacidad en los profesionales de la salud.
HERRAMIENTAS V TECNOLOGÍAS EN EL AMBIENTE FÍSICO En el entorno de cuidados de la salud, las herramientas y tecnologías que se usan para realizar las tareas también pueden interactuar con el ambiente físico para afectar la probabilidad de errores de medicación. Por tanto, el diseño del ambiente debe tener en cuenta las herramientas y tecnologías específicas que serán usadas por los individuos para completar su trabajo. Por ejemplo, el diseño físico de una sala de operaciones debe tener el tamaño, la maniobrabilidad y los espacios requeridos entre los muchos dispositivos que se usan durante una cirugía. Las herramientas y tecnologías también deben cumplir con las normas de diseño ergonómico. Otro ejemplo consiste en que las etiquetas de los medicamentos en ocasiones son demasiado pequeñas para mostrar instrucciones de preparación, dispensación o administración; cuando esto ocurre, se deben considerar alternativas. Una alternati-
1202 (1 066) Ambientes Físicos / Información General
USP 39
va es incluir códigos QR de Respuesta Rápida en las etiquetas, los cuales permiten al personal de cuidados de la salud acceder a la información de prescripción y manipular el producto correctamente con un dispositivo conectado a la Internet (tales como iPad, iPhone o Android). Los códigos QR de Respuesta Rápida son códigos de barras bidimensionales que, al ser leídos por el dispositivo de lectura de imagen, llevan al usuario directamente al sitio Web que contiene la información requerida. Los factores adicionales que deben tenerse en cuenta incluyen las fallas, el tiempo de inactividad y la vibración de los equipos. Falla de los Equipos: El supervisor debe ser inmediatamente informado acerca de cualquier equipo que presente fallas, daños, o que se haya extraviado. En el caso de las fallas, se debe tomar la decisión de reparar el artículo o reemplazarlo a la brevedad posible. En muchos casos, el artículo puede reemplazarse rápidamente, pero algunas partes del equipo pueden tomar más tiempo para desarmarlas y reinstalarlas. El personal debe confirmar que el equipo se encuentra en buen estado de operación antes y después de cada uso. Se debe contar con un programa de rutina de confirmación del funcionamiento del equipo. Inactividad de los Equipos: El término "inactividad" se refiere a los periodos en los que no se encuentra disponible un sistema o parte de un equipo. Los cortes, o duración de la inactividad, se refieren al tiempo durante el cual el equipo no puede cumplir con su función primaria. El concepto de inactividad por lo regular se aplica a redes y servidores informáticos, aunque también puede usarse al tratar las fallas de los equipos. Dichas fallas pueden deberse a varias razones, incluidos daños; defectos de diseño; error en el procedimiento, es decir, uso inadecuado por parte del personal; problemas de ingeniería, es decir, la forma en que se usa e implementa el equipo; sobrecarga por someter los recursos del sistema a un estrés mayor a su capacidad; problemas ambientales con sistemas de soporte tales como calefacción, ventilación y aire acondicionado (HVAC) y electricidad; e inactividad programada por mantenimiento, actualizaciones o expansión. Los contratos de servicios son una práctica habitual para minimizar la inactividad y los cortes. Se debe contar con procedimientos para tratar la inactividad. Vibración de los equipos: La vibración es un fenómeno mecánico en el cual ocurren oscilaciones alrededor de un punto de equilibrio. Aunque en ocasiones la vibración puede ser conveniente, por lo general no lo es, desperdicia energía y crea ruido indeseado. Por ejemplo, los movimientos vibratorios de los motores, motores eléctricos o de cualquier dispositivo mecánico son generalmente indeseados y pueden deberse a falta de equilibrio en las partes giratorias, fricción poco uniforme, encastre imperfecto de los dientes del engranaje, entre otros factores. A menudo, el diseño cuidadoso y la instalación apropiada pueden minimizar las vibraciones indeseadas.
DISTRACCIONES E ÍNDICE DE CAPACIDAD DE DISTRACCIÓN El ambiente de trabajo de los cuidados de la salud está repleto de distracciones e interrupciones que pueden afectar de manera negativa el desempeño y llevar a errores de medicación. Los arquitectos, ingenieros y demás profesionales que desempeñan un papel en el diseño del lugar de trabajo tienen la responsabilidad de estar al tanto y conocer profundamente este problema de modo que puedan diseñar espacios de trabajo seguros y ergonómicamente idóneos. Este enfoque debe tener un importante impacto benéfico al contrarrestar los efectos negativos de las interrupciones y distracciones durante el cuidado de pacientes. En general, las zonas de seguridad para medicación se deben ubicar en áreas donde se minimice el potencial de distracciones e interrupciones. Con frecuencia, el personal de enfermería cita las distracciones e interrupciones como factores que contribuyen a la incidencia de los errores de medicación. La distracción derivada de tareas paralelas puede afectar el desempeño de muchas maneras, como por ejemplo, la interferencia sensorial/perceptiva (p.ej., el personal de enfermería no escucha la alarma debido a que un compañero de trabajo interrumpe con una pregunta), el costo cognitivo de cambiar de una tarea a otra (el personal de enfermería responde a una alarma con mayor lentitud debido a que toma tiempo recobrar la orientación hacia la tarea de la alarma después de la pregunta del compañero de trabajo) o la posible pérdida de memoria (el personal de enfermería omite llevar a cabo una etapa pues olvidó en qué parte se quedó al retomar la tarea después de la interrupción). Además, las interrupciones y distracciones han sido asociadas con tasas más altas de errores de dispensación de prescripciones en una farmacia ambulatoria. De acuerdo con el 2008 USP MEDMARX Data Report, las distracciones continúan teniendo un papel principal en los errores de medicación al identificarlas como un factor que contribuye con el 45% de todos los errores de medicación en hospitales y sistemas de salud. Sin embargo, la prevención o reducción de interrupciones y distracciones se puede lograr otorgando al personal la capacidad de controlar y manejar su exposición a dichos factores. Se puede permitir que el personal ajuste las características de la zona de seguridad para medicación con el objeto de maximizar su concentración, los niveles de atención y optimizar su desempeño. Las características ajustables incluyen proporcionar una estación de trabajo protegida de interrupciones y distracciones, tales como una sala de medicación separada o un carro con espacio de trabajo para aquellos que no se ven afectados de manera adversa por las distracciones. Cada individuo tiene un nivel distinto de capacidad de distracción y deben ser conscientes de sus propias necesidades de mantener un área de trabajo libre de distracciones. Elevar la consciencia del trabajador sobre el impacto adverso de las interrupciones y distracciones puede ayudar a minimizar problemas. Además, se puede capacitar a los trabajadores sobre cómo evitar interrumpir a sus compañeros de trabajo por razones no urgentes, en particular cuando estos últimos se encuentran realizando tareas relacionadas con la medicación. De acuerdo con un estudio en farmacia, las solicitudes de ayuda por parte de compañeros de trabajo representan la fuente más frecuente de interrupciones. Las técnicas que pueden ser efectivas para disminuir interrupciones y distracciones incluyen estímulos visuales (tales como vestir chalecos de seguridad de color anaranjado) y barreras físicas tales como preparar dosis en una sala de medicación. Asi-
USP 39
Información General/ (1066) Ambientes Físicos 1203
mismo, el personal puede usar listas de verificación para enfocar o reenfocar su atención en las tareas. La investigación científica sobre distracciones e interrupciones en el ambiente físico es limitada; por lo tanto, se requieren estudios adicionales para identificar acciones correctivas basadas en evidencia que promuevan el uso seguro de los medicamentos.
ELEMENTOS DEL AMBIENTE FÍSICO Diversos factores del ambiente físico tales como la iluminación, el ruido, la temperatura, la distribución y el diseño de la estación de trabajo, interactúan con los factores humanos y relacionados con las tareas para influir sobre la exactitud del uso de los medicamentos. Las partes siguientes de este capítulo general se enfocan en proveer guías sobre el ambiente óptimo para mejorar el desempeño de los individuos implicados en el proceso de uso de los medicamentos.
DISEÑO DEL SISTEMA DE TRABAJO De acuerdo con el modelo de la Systems Engineering lnitiative for Patient Safety (Iniciativa de ingeniería de Sistemas para la Seguridad del Paciente o SEIPS), existe una interacción entre cinco elementos del sistema de trabajo-humanos, tareas, tecnología y herramientas, organización y ambiente-que afectan los resultados del empleado, de la organización y del paciente. Debido a que estos cinco sistemas de trabajo están estrechamente interrelacionados, los diseñadores deben tenerlos en cuenta en todo momento. Siempre que uno de estos elementos cambie, habrá implicaciones para los otros elementos. El sistema de trabajo completo requiere de un diseño adecuado para optimizar el desempeño y asegurar resultados positivos. Aunque este capítulo general describe todos los sistemas de trabajo, su enfoque se centra en recomendaciones para el ambiente físico.
Diseño Basado en Evidencias El diseño basado en evidencias (EBD, por sus siglas en inglés) es un campo de estudio que hace uso de los datos de investigación más confiables para la planificación del diseño del ambiente y equipo del lugar de trabajo. El diseño basado en evidencias está estrechamente relacionado con la jerarquía sistemática de la práctica basada en evidencias y emplea un proceso sistemático de evaluación de investigaciones científicas como fundamento para tomar decisiones de diseño que mejoren el desempeño humano y que reduzcan la tensión en el ambiente complejo de los cuidados de la salud. El diseño basado en evidencias cruza y combina los dominios de la ergonomía, los factores humanos, la capacidad de uso y la psicología cognitiva para conseguir el mejor ambiente de trabajo posible. Los principios del diseño basado en evidencias están disponibles para proveer información sobre las opciones de diseño ambiental. En 2008, Ulrich y sus asociados publicaron una revisión de la literatura de investigación sobre el diseño de cuidados de la salud basado en evidencias, en la que concluyeron que "La evidencia indica que los entornos físicos bien diseñados desempeñan un papel importante para que los hospitales sean más seguros y proporcionen una mejor atención a los pacientes, así como mejores lugares para que el personal realice su trabajo." Por ejemplo, los principales avances tales como una reducción en las tasas de infección se han asociado con el diseño y la ubicación de los lavamanos, ventilación apropiada y materiales adecuados para superficies. La aplicación de los principios de diseño basado en evidencias al diseño del equipo es igual de esencial que su aplicación al ambiente de trabajo. En años recientes, se ha descrito el uso del diseño basado en evidencias para bombas intravenosas, tubos de alimentación y dispositivos de liberación de analgésicos controlados por el paciente. La investigación continúa apoyando el uso de tipos de letra y etiquetas estandarizados para la identificación de fármacos, así como el diseño basado en evidencias para áreas de almacenamiento de medicamentos. Las partes interesadas deben recurrir a la evidencia de la investigación más relevante disponible al momento de tomar decisiones sobre el complejo ambiente de trabajo de los cuidados de la salud, y usarla como uno de los principales factores guía. La selección de objetos tales como muebles, estantes y dispositivos debe realizarse después de tener en cuenta de manera cuidadosa los objetivos del diseño basado en evidencia y la investigación realizada. Por ejemplo, sería ideal configurar los muebles para crear una sensación de privacidad y minimizar las distracciones visuales y auditivas durante la transcripción, preparación, dispensación y administración de medicamentos. Los muebles deben ajustarse para satisfacer las necesidades ergonómicas de un trabajador. Además, la contaminación de superficies puede reducirse seleccionando materiales no porosos y sin juntas ni uniones, permitiendo una fácil limpieza.
DESAFÍOS EN EL AMBIENTE FÍSICO Preparación de Órdenes y Transcripciones Los errores al ordenar medicamentos o al transcribir órdenes de medicamentos están bien documentados en la literatura de investigación. Debido a que los errores cometidos al realizar estas tareas pueden poner directamente en peligro la seguridad del paciente, la preparación de órdenes y transcripciones deben tratarse como actividades de alto riesgo en el ambiente de los cuidados de la salud. Los métodos manuales para preparar órdenes y transcribirlas dependen del desempeño humano. Los errores pueden cometerse cuando el lector malinterpreta imperfecciones en la escritura manuscrita, abreviaturas o decimales,
1204 (1066) Ambientes Físicos / Información General
USP 39
o cuando simplemente se lee erróneamente la escritura manuscrita. Las órdenes enviadas por fax implican fuentes de error adicionales debido a que la legibilidad puede ser deficiente después de la transmisión e impresión. Los sistemas computarizados para preparación de órdenes, conocidos como ingreso de orden médica computarizado (CPOE, por sus siglas en inglés), y la transcripción de órdenes por medios electrónicos no está totalmente protegida de la posibilidad de errores. Por ejemplo, se han citado fallas en el uso y en la visualización de los registros electrónicos de cuidados de la salud, además de que pueden carecer de la personalización necesaria para preparar órdenes para poblaciones específicas tales como pacientes pediátricos. Aunque la transmisión electrónica de datos se considera más segura con respecto a los errores de interpretación, aún no se ha establecido con base en evidencia que la adición de decisiones asistidas en el ingreso de orden médica computarizado constituya una intervención que garantice la seguridad. En todo momento, la aplicación de tecnología deberá someterse a cierto grado de escrutinio al igual que los otros métodos para prevenir errores de medicación.
Preparación de Prescripciones y Preparación Magistral de Medicamentos El área de trabajo para la preparación de prescripciones/preparación magistral de medicamentos debe diseñarse, ordenarse y mantenerse a fin de facilitar la preparación magistral de alta calidad que cumpla con las normas de los capítulos Preparación Magistral-Preparaciones No Estériles (795) y Preparación Magistral-Preparaciones Estériles (797). El área de preparación de medicamentos estériles debe estar separada del área de preparación de medicamentos no estériles (ver los capítulos (795) y (797)). El tránsito en el área de preparación de prescripciones/preparación magistral de medicamentos debe mantenerse al mínimo permitiendo el acceso únicamente a personal autorizado. La iluminación, la temperatura y la ventilación deben ser óptimas para prevenir la descomposición de ingredientes activos farmacéuticos (API, por sus siglas en inglés), excipientes y medicamentos. Estas medidas también pueden asegurar un lugar de trabajo en el que la incomodidad física no sea un motivo de distracción. La humedad debe monitorearse y controlarse, debido a que los medicamentos tienden a degradarse en presencia de humedad. Debido a su efecto sobre la estabilidad y la integridad del medicamento, la humedad en las áreas de preparación magistral y de almacenamiento es el segundo aspecto más importante tras la temperatura (ver los capítulo (795) y (797)). Se debe colocar un higrómetro en una pared interna, pero alejado del retorno de aire del acondicionador, placa de calentamiento o puerta de entrada/salida, de modo que provea una lectura representativa de la humedad relativa en el área de preparación magistral o instalación de almacenamiento. Los materiales usados para el piso, paredes, estantería, gabinetes y cielos rasos no deben retener polvo, olores ni residuos de las actividades de preparación magistral. Además, el área debe estar libre de relieves que acumulen polvo (p.ej., tubos en el cielo raso, sistemas de luces colgantes y cornisas). El área de trabajo real debe estar nivelada, lisa, impermeable (libre de grietas y fisuras) y no deben liberar partículas, mientras que los estantes y gabinetes deben ser fáciles de limpiar. Los medicamentos peligrosos deben ser preparados, almacenados y manipulados por personal adecuadamente capacitado en condiciones que protejan a los trabajadores de cuidados de la salud y a los demás individuos que puedan entrar en contacto con estos medicamentos. La eliminación de desechos de medicamentos peligrosos debe cumplir con los reglamentos federales y estatales aplicables. Los trabajadores que lleven a cabo el mantenimiento de rutina de las actividades de eliminación de desechos y de limpieza en las áreas de almacenamiento y preparación de medicamentos peligrosos deben estar capacitados para realizar los procedimientos adecuados para protegerse a sí mismos y para prevenir la contaminación del ambiente físico. Esta capacitación debe incluir los procedimientos que deben seguirse en caso de derrames. Para la preparación magistral estéril, la unidad de control de ingeniería primario {CIP) debe colocarse en un lugar donde minimizará el ruido y evitará condiciones que podrían afectar de manera adversa su operación. Por ejemplo, las corrientes de aire fuertes de las puertas abiertas, el tránsito de personal o las corrientes de aire de los sistemas de HVAC pueden afectar el flujo de aire unidireccional de las mesas de trabajo abiertas. El control de ingeniería primario debe colocarse fuera del flujo del tránsito en una posición que evitará interrupciones en el sistema de HVAC y corrientes de aire cruzadas en la habitación. En general, la selección e instalación de todo el equipo debe realizarse con el objetivo de crear condiciones óptimas de trabajo, con ruido mínimo y suficiente iluminación, de modo que el personal pueda realizar un trabajo exacto y de alta calidad (ver el capítulo (797)).
Dispensación Existen muchas distracciones potenciales en las áreas de dispensación de farmacias y otras áreas en las que se dispensan los medicamentos. Estas distracciones pueden incluir el sonido de los teléfonos e interrupciones de pacientes, personal, visitantes, entre otros. Las distracciones deben ser minimizadas o eliminadas en la mayor medida posible. Aunque las funciones de dispensación a menudo requieren la atención dividida en tareas múltiples, lo óptimo es preparar, procesar y verificar una sola prescripción u orden de medicación a la vez. La verificación final debe ser realizada por un farmacéutico o profesional autorizado y con licencia en un área libre de distracciones. Algunos puntos adicionales incluyen: • Se debe contar con iluminación necesaria debido a que las etiquetas de algunos envases tienen impresiones muy pequeñas o con colores muy tenues. • Los niveles de ruido deben mantenerse al mínimo (ver la Tabla 2), lo cual puede requerir el traslado de un equipo ruidoso a una habitación diferente, o por lo menos el uso de un tabique para separarlo.
USP 39
Información General/ (1066) Ambientes Físicos 1205
• Los olores en el entorno de farmacia deben controlarse usando sistemas de ventilación apropiados, los cuales deben mantenerse apropiadamente y monitorearse de manera periódica. Las farmacias contienen una combinación de olores que resultan del almacenamiento, de la preparación y la dispensación de los medicamentos mismos; los olores también emanan de otros artículos tales como agentes desinfectantes. • La temperatura debe mantenerse a niveles apropiados para la comodidad del personal de farmacia y para la estabilidad de los productos farmacéuticos. • El espacio de trabajo de la farmacia debe estar diseñado para mejorar la eficiencia del flujo de trabajo y para mantener la seguridad a lo largo de todo el proceso de dispensación.
Administración Algunas zonas de seguridad para medicación de importancia crítica para el personal de enfermería incluyen las áreas de preparación y administración de medicamentos. La información debe estar disponible al momento en un formato fácil de usar que ayude al profesional en el proceso de sintetizar los hechos y datos. El acceso a la información relacionada con los medicamentos debe ser eficiente, con materiales y registros disponibles en los sitios adecuados. Por ejemplo, el personal de enfermería puede requerir información de los medicamentos y datos específicos del paciente para tomar decisiones sobre la administración del medicamento; por lo tanto estos dos tipos de información deben estar cerca uno del otro para facilitar el descubrimiento de los hechos y/o la toma de decisiones. Las diversas fuentes de información dentro de un espacio se deben ordenar de acuerdo con principios específicos para disminuir las distracciones al momento de buscar información y de tomar decisiones. El personal de enfermería también debe ser consciente de factores adicionales al administrar medicamentos, p.ej., iluminación, desorden, olor, niveles de ruido y temperatura.
El Ambiente Hogareño El ambiente de cuidados de la salud en el hogar del paciente difiere al ambiente hospitalario u otros ambientes institucionales en varios aspectos. Por ejemplo, los médicos reconocen que el entorno de cuidado de la salud en el hogar es el dominio privado del paciente. Por ende, el cuidado que proveen a cada paciente debe ser único e individualizado, basado en gran medida en dicho entorno hogareño. Existen variables relacionadas con situaciones en el hogar del paciente que presentan riesgos para el paciente y que son difíciles o imposibles de eliminar para los médicos. Por ejemplo, los hospitales cuentan con departamentos de seguridad ambiental para monitorear la calidad del aire, así como diseñadores/ingenieros para asegurar que la altura de los escalones de las escaleras sean seguras; sin embargo, los profesionales de la salud a domicilio pueden no tener la capacitación o recursos necesarios para evaluar y mejorar dichos riesgos en el hogar del paciente. No obstante, el paciente y las personas que cuidan de él pueden promover un ambiente seguro en la vivienda estableciendo un almacenamiento, una organización y accesibilidad apropiados para los medicamentos, así como una iluminación adecuada en las áreas en las que se administran medicamentos. También se deben evaluar otros diversos elementos físicos para facilitar la manipulación y la administración seguras de medicamentos. La vivienda debe contar con un servicio telefónico confiable, con un área adecuada para preparar y administrar medicamentos (p.ej., infusiones parenterales) y tomacorrientes en buen estado y seguros para cualquier equipo requerido. Todos los medicamentos deben almacenarse de modo tal que se facilite el cumplimiento y la seguridad de estos. Los sitios de almacenamiento deben estar secos y frescos. Los medicamentos que requieren refrigeración deben almacenarse en áreas en las que no se congelen. Todos los medicamentos, ya sea de venta bajo receta o de venta libre, deben mantenerse fuera del alcance de los niños, mascotas, o adultos con trastornos o discapacidades mentales.
FACTORES DEL AMBIENTE FÍSICO La interferencia sensorial que resulta de temperaturas extremas, ruido, poca iluminación, superficies encandilantes, interrupciones y desorden pueden interferir con la memoria de trabajo y con el desempeño de los profesionales del cuidado de la salud. Las guías descritas en este capítulo para el ambiente físico deben aplicarse a zonas de seguridad para la medicación.
Iluminación Los niveles adecuados de iluminación pueden mejorar tanto la exactitud como la eficiencia del desempeño. Un incremento en los niveles de iluminación de 450 a 1460 lux (45-146 fe) en una farmacia para pacientes ambulatorios con elevada carga de trabajo mejoró significativamente la exactitud en la preparación de prescripciones, de 96,2% a 97,4%. A través de un estudio se demostró que los farmacéuticos que calificaban los niveles de iluminación como "mínimo suficiente" detectaron 38% más errores durante la preparación de prescripciones. Además, a medida que aumenta la fatiga visual durante un turno de trabajo, se requiere una mejor iluminación. Los farmacéuticos que usaron luces para tareas específicas para aumentar la iluminación registraron una reducción del 10,7% de error en la verificación de productos. Un estudio de iluminación en viviendas, oficinas y espacios públicos encontró niveles menores a los recomendados para la lectura, y también relacionó el desempeño con la edad. Se debe poner énfasis en la prevención de errores de medicación ocasionados directa o indirectamente por la baja
1206 (1 066) Ambientes Físicos / Información General
USP 39
iluminación. Por ejemplo, el informe de un incidente indicó que la poca iluminación había contribuido a la inadecuada conexión de un dispositivo de administración de analgésico controlado por el paciente (PCA, por sus siglas en inglés), lo que ocasionó que el medicamento se derramara sobre el piso e impidió que el paciente pudiera controlar el dolor. La baja iluminación hacía difícil observar que el tubo no estaba conectado adecuadamente. Un estudio de iluminación en una farmacia minorista reveló un error relacionado con el contenido y la forma farmacéutica: se usaron cápsulas de diciclomina de 1O mg para preparar una prescripción de tabletas de 20 mg. El nivel de iluminación del estante en el que se encontraban los medicamentos era de 220 lux (22 pe). Las recomendaciones descritas en este capítulo tienen en cuenta la necesidad de trabajar rápidamente y con exactitud durante la manipulación de medicamentos, el nivel de visibilidad requerido por la tarea y la comodidad del trabajador. Tanto arquitectos como ingenieros de iluminación pueden consultar la referencia "Lighting for Hospitals and Healthcare Facilities" (Iluminación para Hospitales e Instalaciones de Cuidado de la Salud) de la llluminating Engineering Society of North America {IESNA) para detalles sobre la iluminación de las áreas de medicación. Es importante tomar en cuenta que los niveles de iluminancia recomendados en la referencia de la IESNA están por debajo de los citados en esta guía, que son mayores debido a las evidencias sobre la relación inversa entre los niveles de iluminación y los errores de medicación. Se recomiendan lámparas fluorescentes de luz blanca fría de lujo o lámparas fluorescentes compactas por su índice de reproducción cromática de 80 o más y porque tienen una alta eficiencia en comparación con las lámparas incandescentes. Proveer el índice de reproducción cromática recomendado puede ayudar a evitar la identificación errónea de medicamentos. Cuando los niveles de iluminancia del ambiente están por debajo de los recomendados es necesario usar luces localizadas para tareas específicas (iluminación funcional) en las áreas donde se realizan tareas visuales críticas. Si no se cuenta con iluminación funcional, los trabajadores pueden proyectar sombras sobre el espacio de trabajo, lo cual reducirá aún más los niveles de iluminación. Las tareas críticas incluyen la lectura de prescripciones escritas a mano y de letra pequeña en etiquetas, así como la inspección de formas farmacéuticas de medicamentos. Debido a que las personas perciben de manera distinta los niveles de iluminación, se recomiendan luces funcionales ajustables de 50 watts de alta intensidad para situaciones en las que el personal se enfrente con prescripciones y etiquetas de productos difíciles de leer, tales como etiquetas de envases de dosis única. Los niveles de iluminación son importantes para los profesionales de la salud implicados en el ingreso de órdenes al computador (p.ej., médicos o farmacéuticos), preparación de prescripciones, inspección y asesoría al paciente. Los niveles de iluminación para las áreas de ingreso de órdenes al computador deben ser de al menos 750 lux (75 pe). Se recomiendan niveles más altos [1000 lux (100 fe)] para leer órdenes escritas a mano. La iluminación se debe colocar de manera que no se produzca reflejo en el monitor del computador que dificulte leer la pantalla con exactitud. Las áreas de preparación de prescripciones, las estaciones de inspección de medicamentos (para doble verificación) y de asesoría deben presentar niveles de iluminación entre 900 y 1500 lux (90-150 fe). Todas estas normas están por encima del mínimo de 200 lux (20 pe) para una lectura exacta de las etiquetas de los medicamentos, establecidas por la American Society for Testing and Materials lnternational (ASTM lnternational). Una norma de ASTM lnternational incluye una prueba de legibilidad en la que se requiere que el nombre y la cantidad del fármaco en la etiqueta sea legible a 20 pe de luz a una distancia de aproximadamente 20 pulgadas (500 mm) por una persona con una visión no asistida o corregida de 20/20. Los niveles de iluminación se deben incrementar cuando téngalos trabajadores tengan una edad promedio superior a 45 años para optimizar la legibilidad (recomendación general para el tratamiento de presbicia). Se recomienda que los profesionales de la salud cuenten con una lupa que les ayude a leer con cuidado etiquetas con inscripciones de letras muy pequeñas y en situaciones en las que no sea posible evitar bajos niveles de iluminación. El uso de una lupa en conjunto con iluminación funcional redujo en 22% los errores de verificación de productos por parte de los farmacéuticos, en comparación con un grupo de control. Para el personal de enfermería, las tareas clave relacionadas con la medicación que requieren de buena iluminación incluyen la revisión de órdenes de medicamentos y la selección, preparación y administración de los medicamentos. Es posible que estas tareas se lleven a cabo en uno o más lugares en la unidad de enfermería, como por ejemplo en la estación de enfermería donde se almacenan los historiales de los pacientes, la sala de medicación o la habitación del paciente. Se recomienda la iluminación transicional para las áreas de medicación en las estaciones de enfermería y otras unidades de cuidado del paciente para evitar sitios oscuros y sitios de luz intensa próximos a áreas de baja iluminación. La iluminación debe permitir una buena reproducción cromática (un índice de reproducción cromática de 80 o más) para ayudar a la revisión apropiada de medicamentos. La iluminación funcional puede ayudar a conseguir niveles apropiados de iluminación y se debe incluir en los carros de medicamentos (incluyendo aquellos que usan sistemas de verificación de código de barras de medicamentos). Se debe controlar el reflejo asegurando que no haya reflejos de luz que pudieran incidir en la pantalla dificultando la lectura de los monitores de los computadores. Los niveles de iluminación para las salas de medicación en las unidades de enfermería deben ser de al menos 1000 lux (100 pe) basándose en la complejidad de la tarea (p.ej., en la lectura de letra pequeña en los envases de medicamentos) y la necesidad de exactitud y velocidad. Se debe usar un intervalo mayor de nivel de iluminación cuando la tarea requiere la lectura de letra pequeña. Las recomendaciones para niveles de iluminación se resumen en la Tabla 7. Con el paso del tiempo, los niveles de iluminación pueden sufrir una reducción (p.ej., del 25% durante un periodo de 2 años) por lo que es importante dar mantenimiento a las lámparas de manera rutinaria para mantener los niveles de iluminación recomendados. Los niveles de iluminación deben medirse cada tres meses. Las bombillas quemadas o parpadeantes deben reemplazarse de inmediato.
USP 39
Información General/ (1066) Ambientes Físicos 1207
Tabla 1. Recomendaciones para Niveles de Iluminación en Entornos de Cuidado de la Salud Nivel de Iluminación Lux
Pie-Candela (pe)
Ingreso de órdenes al computador
1000
100
Procesamiento de órdenes escritas a mano
1000
100
Preparación y verificación de medicamentos (farmacia)
900-1500
90-150
Asesoría al paciente (farmacia)
900-1500
90-150
Preparación magistral estéril y preparación de medicamentos
1000-1500 500
100-150
Área de preparación de medicamentos (p.ej., estación de enfermería)
1000
100
Área de trabajo de administración de medicamentos (p.ej., superficie del carro, habitación del paciente)
1000
100
Área de Trabajo
Área de almacenamiento de medicamentos de la farmacia
50
La iluminación apropiada también es esencial en el sitio donde se proporcionan los cuidados. Intentar que la iluminación sea cómoda para pacientes y familiares puede resultar contrario a las condiciones de iluminación necesarias para la administración segura de medicamentos. La administración de medicamentos por la noche con baja iluminación para evitar molestar al paciente o a los familiares es una práctica insegura. Se debe contar con iluminación funcional o localizada, de manera que los profesionales puedan confirmar visualmente que tratan al paciente correcto (leyendo el brazalete o mediante otra tecnología de identificación), y de modo que no se comprometa el medicamento y el sitio de administración. Las lámparas fluorescentes compactas requieren cierto tiempo para alcanzar el nivel de iluminación correcto. Por lo tanto, no se deben realizar tareas críticas sino hasta que la luz alcance el nivel requerido.
Recomendaciones para Sonido y Ruido En el caso de hospitales, la Environmental Protection Agency (Agencia de Protección Ambiental de EE.UU. o EPA) recomienda niveles pico de sonido de 45 dB durante el día y 35 dB durante la noche en hospitales. Las guías de la Organización Mundial de la Salud (OMS) establecen que los niveles de sonido de fondo en las habitaciones de los pacientes no deben exceder de 35 dB. El lnternational Noise Council (Consejo Internacional sobre Ruido) recomienda límites de 45 dB durante el día y de 20 dB durante la noche para áreas de cuidados agudos. Es necesario usar protección para los oídos cuando los trabajadores estén expuestos a niveles de sonido que promedien 90 dB. Las recomendaciones para niveles de sonido se indican en la Tabla 2. Tabla 2. Recomendaciones de Niveles Pico de Sonido Área de Trabajo
Fuenteª
Niveles de Sonido (dB)
Hospitales (día)
EPA
45
Hospitales (noche)
EPA
35
OMS
35
INC
45
Áreas de cuidados agudos (noche)
INC
Protección auditiva requerida
INC
20 90 (promedio)
Habitación del paciente Áreas de cuidados agudos (día)
Zonas de seguridad para medicación
-
50
ª
EPA, Environmental Protection Agency (Agencia de Protección Ambiental); OMS, Organización Mundial de la Salud; INC, lnternational Noise Council (Consejo Internacional de Ruido).
La norma para niveles de sonido en las zonas de seguridad para medicación se establece en 45 dB, con la intención de asegurar que la información verbal crítica se pueda escuchar con exactitud. Sin embargo, muchas de las áreas de preparación magistral y de dispensación de farmacias rebasarán dicha norma. Los profesionales de la salud deben ser conscientes de sus propias necesidades de silencio, dependiendo de la tarea realizada, y deben contar con un área silenciosa para favorecer el desempeño apropiado. La eliminación total de ruido en instalaciones de cuidados del paciente no es factible ni deseable. Las áreas de asesoramiento de pacientes en las farmacias deben incluir métodos de reducción de sonido (p.ej., el uso de una sala cerrada) para mejorar la audición, el aprendizaje y la privacidad. El ruido en exceso se considera como un riesgo serio para la salud de los pacientes. Se debe tener en cuenta su efecto sobre los pacientes hospitalizados y su potencial interferencia con el desempeño efectivo del trabajo de los médicos. La mayoría de los estudios sobre los efectos del ruido en el ambiente de trabajo han sido realizados en entornos no relacionados con el cuidado de la salud. No obstante, se documenta cada vez con más frecuencia que los niveles de ruido son un factor que contribuye al estrés del personal de enfermería. En los centros de cuidados de la salud, las fuentes de ruido pueden incluir desde sistemas de radiolocalización de personas, alarmas de equipos, sistemas de calefacción, ventilación y aire acondicionado (HVAC), cañerías, televisores y radios hasta máquinas de hielo. Se ha citado al ruido como un obstáculo para el desempeño adecuado del personal de enfermería. Un estudio exhaustivo desarrolló un mapa de ruido de un hospital en el que se encontraron niveles de sonido de 55 dB, lo que representa 10-20 dB por encima de las recomendaciones de la EPA dependiendo de la hora del día.
USP 39
1208 (1 066) Ambientes Físicos / Información General
Los niveles de sonido promedio en otros hospitales han presentado mediciones entre 45 y 68 dB, con picos entre 85 y 90 dB. Un estudio de niveles de sonido durante cambios de turno presentó mediciones de 113 dB. La exactitud al dispensar un medicamento puede verse afectada por características específicas del sonido/ruido, p.ej., si es predecible y si puede ser controlado. Estos factores pueden confundir las señales ambientales y la voz interna del trabajador, usadas para practicar y recordar tareas importantes. De 58 estudios, 7 mostraron que el ruido mejoraba el desempeño, al contrario de 29 que mostraron que el ruido lo perjudicaba. Un estudio mostró que los sonidos y ruidos impredecibles pero controlables mejoran la exactitud de la preparación de prescripciones, contrario a lo mostrado por investigaciones anteriores. Lo anterior puede ser indicativo de que es necesario cierto estímulo ambiental para mantener a los trabajadores en un estado de alerta y atención adecuados. Los investigadores intentan identificar niveles óptimos de reacción debida al sonido y al ruido para las personas que realizan diferentes tipos de tareas (p.ej. la ley de Yerkes-Dodson). Los efectos adversos de ruido y demás interferencias sensoriales pueden reducirse usando actividades, herramientas y principios desarrollados por expertos en factores humanos e ingeniería. Muchos de estos principios y herramientas ya se usan en algunas organizaciones dedicadas al cuidado de la salud. Los investigadores se encuentran estudiando y evaluando los efectos que tienen estos y otras características del diseño de los espacios de trabajo de enfermería sobre el estado final de los pacientes y el desempeño del centro de atención; uno de estos estudios es el auspiciado por The Center far Health Design, una organización de investigación y promoción sin fines de lucro, y una red de 11 proveedores de servicios de la salud (http://www.healthdesign.org/pebble). Los datos han mostrado reducciones en errores médicos, transferencias de pacientes, infecciones intrahospitalarias, caídas de pacientes y uso de medicamentos. Cuando lo permitan las guías de control de infecciones, se puede lograr la reducción del ruido a un costo moderado mediante la instalación de materiales que puedan absorber el sonido (p.ej. materiales de cielos rasos y paredes, y alfombras). Los ingenieros acústicos pueden proveer métodos adicionales para la reducción de ruido. Además, los trabajadores que no necesitan responder a señales audibles tales como llamadas telefónicas o alarmas pueden usar auriculares con cancelación de ruido y escuchar música, siempre que su desempeño no se vea afectado de manera adversa.
Olor Las áreas en los que se almacenan o manipulan los productos farmacéuticos tienden a presentar un olor que es característico de los fármacos correspondientes. Dichos olores a menudo pueden minimizarse usando sistemas de acondicionamiento/ extracción de aire. La calidad del ambiente en interiores (IEQ, por sus siglas en inglés) puede estar asociada a los productos químicos y otras fuentes. Los olores detectados en casi todos los ambientes de trabajo pueden derivarse de materiales de calafateo, selladores, recubrimientos, adhesivos, pinturas, barnices, manchas, papel tapiz, agentes de limpieza, combustibles y productos de combustión, alfombras, pisos de vinilo, materiales de telas, desodorantes ambientales y otros productos perfumados, así como productos personales de los empleados (p.ej., perfumes, champús, entre otros). Si no se controlan estos olores, pueden surgir problemas con la calidad del ambiente en interiores, en particular si el sistema de ventilación del edifico no cuenta con un diseño apropiado o recibe un mantenimiento deficiente. La calidad del ambiente en interiores puede mejorarse instalando sistemas de extracción apropiados para eliminar los olores que emanan de los medicamentos. Esto puede incluir instalaciones de "extracción por tubo de aireación" cercanas al lugar donde se manipulan los medicamentos, así como campanas de extracción tipo gabinete. Otras medidas que pueden ser útiles incluyen establecer zonas libres de perfumes, prohibir fumar y no permitir el almacenamiento o consumo de alimentos en las inmediaciones. La práctica de introducir olores agradables en el lugar de trabajo puede o no ser beneficiosa, pero regular la respuesta a los olores y factores irritantes es crítico para mantener la salud y el bienestar de los trabajadores.
Controles de Temperatura y Humedad El control de temperatura es importante para la estabilidad del medicamento y para la comodidad del personal. En una habitación que contiene algún equipo (p.ej. campanas de flujo de aire laminar), tiende a generarse calor y, por lo tanto, se deben diseñar e implementar medidas de control de temperatura apropiadas. En algunas situaciones tales como en la elaboración de preparaciones magistrales, es importante controlar la humedad y minimizar así la estática en los polvos, envasado y otras formas farmacéuticas (ver (795) y (797)). El control de humedad también es importante para aparatos tecnológicos relacionados, tales como computadoras, tabletas electrónicas y máquinas de dispensación automatizadas. La temperatura del núcleo de la unidad central de procesamiento de las computadoras debe ser entre 1 Oº y 32º C, y el índice de humedad ideal es entre 30% y 50%.
Evaluación del Diseño Físico y de la Organización del Espacio de Trabajo El diseño del ambiente del espacio de trabajo influye sobre la capacidad de los profesionales para utilizar información de manera efectiva y realizar tareas con exactitud. La altura del mostrador, de los estantes para el almacenamiento de suministros y los cambios de iluminación en los cajones y gabinetes inferiores que reducen la visibilidad de productos pueden contribuir a errores si no se ajustan adecuadamente. La integración eficaz de accesorios de iluminación y altura de mostradores ajustables, junto con el uso de carros móviles, puede mejorar la eficiencia y la seguridad. El desorden en los mostradores de trabajo y la
USP 39
Información General/ (1 066) Ambientes Físicos 1209
falta de espacio suficiente para realizar tareas clave es comúnmente un indicador de desorganización y planificación deficiente. Un estudio demostró que ocurrían más errores de dispensación cuando los envases de almacenamiento de medicamentos se colocaban amontonados en los estantes (a menos del pulgada entre medicamentos diferentes). Al seleccionar el mobiliario apropiado, se pueden usar listas de verificación de diseño basado en evidencia para mobiliario a fin de tomar decisiones informadas de inversión y mejorar los resultados de los cuidados de la salud (ver la Tabla 3 para una lista de verificación completa). Tabla 3. Lista de Verificación de Diseño Basado en Evidencias Hallazgos
Objetivos y Características del Diseño Basado en Evidenciasª 1. Reducir contaminación superficial vinculada a infecciones asociadas con los cuidados de la salud a. Las superficies pueden limpiarse fácilmente, la superficie no tiene juntas ni uniones. b. Los materiales de tapicería son impermeables (sin poros). c. Las superficies son lisas y sin poros. 2. Reducir las caídas de pacientes y lesiones asociadas a. La altura de la silla puede ajustarse. b. La silla tiene descansabrazos. c. El espacio debajo de la silla admite cambios de posición de los pies. d. El ángulo de inclinación posterior del asiento y el reclinado del respaldo de la silla facilitan la salida del paciente. e. Las sillas son firmes, estables y no pueden voltearse fácilmente. f. El mobiliario con rueditas incluye rueditas con sistema de bloqueo. g. Las sillas no tienen bordes puntiagudos o rígidos que pudieran lastimar a los pacientes que caen o que tropiezan. 3. Reducción de errores de medicación a. Las lámparas deben proveer una iluminación de 90-150 pies-candela y una lámpara funcional de alta intensidad ajustable de 50 vatios para mobiliario con luz integrada que se usa en una zona de seguridad de medicación. b. El mobiliario se puede configurar para crear una sensación de privacidad a fin de minimizar las distracciones visuales e interrupciones por sonido y ruido durante las actividades de transcripción, preparación, dispensación y administración de medicamentos. 4. Mejorar la comunicación y el apoyo social para pacientes y familiares a. El mobiliario puede configurarse en grupos pequeños y flexibles que se pueden ajustar fácilmente para acomodar un número variable de individuos en diversos entornos de cuidados de la salud. b. Se recomienda que el mobiliario sea variado en ancho y edad. c. Se recomienda que el mobiliario sea compatible con la privacidad acústica y visual del paciente. 5. Reducir el estrés y la fatiga de pacientes, familiares y personal a. Materiales que sugieren un vínculo con la naturaleza. b. Apariencia atractiva y sin carácter institucional. c. Se prueba la seguridad y el uso confortable del mobiliario para todas las personas, incluyendo personas que padezcan de obesidad mórbida. 6. Mejorar la efectividad, la eficiencia y la comunicación del personal a. El mobiliario puede ajustarse fácilmente a las necesidades ergonómicas de cada trabajador. b. El diseño permite la coordinación y el intercambio cuidadosos de información. c. Los materiales absorben el sonido. 7. Mejorar la seguridad ambiental a. Los materiales no contienen compuestos orgánicos volátiles, tales como formaldehído y benceno. 8. Representar la mejor inversión a. Reflejar y reforzar la misión, los objetivos estratégicos y la marca de la organización. b. Integrar el mobiliario y objetos nuevos con los existentes en los proyectos de renovación de las instalaciones. c. Las partes pueden reconfigurarse con flexibilidad y moverse para sustentar misiones de cambio y aquéllas emergentes. d. Colocar rueditas o dispositivos de deslizamiento para reducir daños en el piso. e. Verificar que no haya protuberancias que pudieran dañar las paredes; verificar las alturas de los rieles para sillas. f. El fabricante provee resultados sobre las pruebas de seguridad y durabilidad. g. El fabricante describe la evidencia específica que se ha usado para diseñar el producto. h. El fabricante incluye una garantía apropiada para el uso, por ejemplo, para mobiliario que se usa todo el día, todos los días. i. Se encuentran disponibles partes de reemplazo. j. Las reparaciones pueden realizarse en la instalación de cuidados de la salud. k. El fabricante o distribuidor local puede ayudar con la reparación y renovación de mobiliario. l. El personal de servicios ambientales/limpieza puede realizar fácilmente el mantenimiento del mobiliario. m. Se puede usar una Organización para Compras Grupales al adquirir mobiliario.
Escala de hallazgos: Presente (+), Ausente (-), Se requiere más información (?), No aplica (N/A). ª Malone EB, Dellinger BA. Furniture Design Features and Healthcare Outcomes. The Center for Health Design; 2011 (ver https://www.healthdesign.org/chd/ res ea re h/f urn itu re-desig n-fea tu res-a nd-hea lthca re-o utcomes).
MÉTODOS DE EVALUACIÓN DEL AMBIENTE FÍSICO Iluminación Un medidor de iluminancia, también llamado medidor de nivel de luz o fotómetro, es un instrumento que consiste en un fotodetector (con una pantalla digital o análoga) que mide la iluminancia en lux o pie-candela (pe). Los niveles de iluminación se deben evaluar en las zonas de seguridad para la medicación usando mediciones de iluminancia en puntos específicos. Para esto, el fotodetector se debe colocar en el área donde se realiza la tarea crítica de medicación (p.ej., inspección de medica-
121 O (1066) Ambientes Físicos / Información General
USP 39
mentos en el mostrador de trabajo), con el trabajador en una posición normal de trabajo al momento de tomar la medición. Las mediciones en áreas de almacenamiento de medicamentos deben incluir niveles de luz en los estantes superiores, medios e inferiores, debido a que los niveles de luz dependen de la distancia a la fuente de iluminación. Los fotómetros están disponibles comercialmente o se pueden obtener de los ingenieros de gestión, y deben recalibrarse cada año. Los niveles de iluminación también pueden medirse usando una aplicación de "Medición de Luz" para teléfono celular inteligente. Estas aplicaciones son baratas y fáciles de usar, y se descargan de manera simple a un teléfono celular inteligente, en el cual, al iniciar la aplicación, se debe apuntar la cámara del teléfono a un área/superficie iluminada y se presiona el botón encendido/apagado de la aplicación. El dispositivo realiza mediciones y provee una descripción de las actividades apropiadas para los niveles de luz marcados. Las aplicaciones pueden calibrarse y se puede ajustar su sensibilidad, ofreciendo lecturas en lux o pie-candela.
Niveles de Sonido Para medir los niveles de sonido se deben usar medidores de nivel de sonido capaces de leer de 30 a 130 decibeles (dBA) en la escala A. La escala A se usa comúnmente para medir decibeles debido a que es la representación más cercana del oído humano en términos de intensidad sonora. Los medidores se deben calibrar antes de cada uso. Las mediciones se toman en la posición de trabajo, usando las instrucciones provistas en el manual del medidor de sonido específico. Los medidores Tipo 1 o Tipo 2 presentan niveles aceptables de exactitud. Los niveles de sonido también pueden medirse de manera fácil y barata usando una aplicación para teléfono inteligente, la cual se descarga al teléfono inteligente y se seleccionan las opciones de lectura. Posteriormente, se activa el modo de medición y éste continúa proveyendo una lectura completa de la frecuencia (eje x) y de los niveles de presión de sonido en decibeles (eje y) en tiempo real.
Detección de Olores Los olores pueden ser detectados por personas, pero este método es muy subjetivo. Algunos olores indican la presencia de una entidad o unidad química específica. Sin embargo, pueden no estar disponibles dispositivos de medición apropiados para su uso en el ambiente de trabajo o estos pueden no ser prácticos. Por consiguiente, puede ser necesario seleccionar un panel de individuos para categorizar lo que es y no es aceptable en términos de olores en el ambiente de trabajo. Los sistemas de HVAC apropiados pueden desempeñar un papel en la reducción de olores.
Medición de la Temperatura y la Humedad La temperatura por lo general se mide con termómetros digitales, mientras que la humedad se mide con higrómetros. En ambos casos, un instrumento de registro (p.ej., termómetro de registro) ofrece la ventaja de la documentación.
RESUMEN Desde el siglo XIX, Florence Nightingale identificó la importancia de los ambientes físicos para la sanación del paciente, pero no fue sino hasta tiempos recientes en que se estableció que el ambiente físico puede favorecer el desempeño de las tareas críticas realizadas por el personal de cuidados de la salud para proteger al paciente de daños iatrogénicos. En la actualidad, los errores de medicación se reconocen como complejos, multifactoriales y dependientes de sistemas, y ha sido complicado lograr un entendimiento científico cabal sobre la prevención de errores. Sin embargo, el consejo de Nightingale que dice "pero especialmente, no causa daño", nos compromete a usar la evidencia más actualizada para prácticas seguras en los cuidados de la salud a fin de prevenir errores y proteger al paciente. Los aspectos y consideraciones del ambiente físico de trabajo tratados en este capítulo general no son exhaustivos, pero pueden servir como estímulo para la evaluación de los espacios de trabajo existentes y para tener en cuenta la evidencia más reciente sobre la ciencia de los factores humanos en el diseño de nuevas instalaciones. El componente remanente que no se trata en este capítulo general es el profesional de la salud que trabaja en condiciones arduas quien, con la mejor intención, podría contribuir a daños para el paciente a través de acciones inadvertidas cuando las condiciones de trabajo están por debajo de las normas. El ambiente físico de trabajo debe estructurarse a fin de sustentar y promover la provisión segura de cuidados y para prevenir daños a los pacientes, al tiempo que se apuntala la práctica de los cuidados de la salud por parte de los médicos.
GLOSARIO Administración: Preparación, inmediatamente antes del uso, de un agente farmacológico u otro agente terapéutico para ingestión, inyección, inserción o aplicación. Índice de Reproducción Cromática (IRC): Es una expresión de la forma en que una fuente de luz afecta la apariencia del color de los objetos o de los humanos en comparación a cómo deberían verse bajo una fuente de luz de referencia. Preparación Magistral: Preparación, mezclado, ensamblado, alteración, envasado y etiquetado de un medicamento, dispositivo de liberación de medicamento o dispositivo de acuerdo con la prescripción, orden de medicación o iniciativa de
USP 39
Información General/ (1072) Desinfectantes y Antisépticos 1211
un profesional autorizado basada en la relación médico/paciente/farmacéutico/preparador magistral durante el curso de la práctica profesional. Restricción: Es una regla que indica en qué condiciones se permite o prohíbe realizar una acción. Las restricciones se usan en el diseño de procedimientos o herramientas para prevenir prácticas inseguras. Congestionamiento: Condición que ocurre cuando múltiples trabajadores usan el mismo espacio de trabajo, afectando de manera adversa la cantidad de espacio disponible para cada individuo, y además incrementando los factores negativos de distracciones, interrupciones y ruido. Decibel: Unidad usada para medir la intensidad de un sonido comparándolo con un nivel estándar en una escala logarítmica, indicando así el grado de intensidad sonora. Comúnmente se usa la escala A para medir decibeles debido a que es la representación más cercana de la percepción del oído humano en términos de intensidad sonora. Dispensación: Acción de proveer una medicación o una prescripción; preparar una prescripción. Distracción: Estímulo externo que se presenta cuando una persona está enfocada en una tarea o actividad el cual ocasiona una perturbación cognitiva o emocional, pero que no resulta en la interrupción de la actividad, por ejemplo, el timbre de un teléfono o una pregunta de un compañero de trabajo. Diseño ergonómico: Se refiere a un espacio de trabajo que se acomoda a las capacidades y limitaciones de cada individuo, permitiendo un trabajo de manera segura y eficiente. Esto incluye un ambiente óptimo y mobiliario ajustable. Función de restricción: Es un aspecto del diseño que impide que se realice una acción determinada o que permite que se realice solamente si otra acción se realiza primero. Factores Humanos: Disciplina científica relacionada con las interacciones entre humanos y demás elementos de un sistema, así como la profesión que aplica teorías, principios, datos y métodos para diseñar sistemas que optimicen el bienestar humano y el desempeño general del sistema. Nivel de iluminación: La cantidad de energía luminosa que alcanza un área que se mide (en lux o pie-candela) mediante un fotómetro con un sensor de iluminancia e indica la luminosidad. Un lux es una unidad de iluminancia, medida en lúmenes por metro cuadrado. Un pie-candela (pe) es lúmenes/pie cuadrado, y también se mide comúnmente en metros de luz. El término candela reemplazó a pie-candela como medida del Sistema Internacional para intensidad luminosa y representa 1 lumen/estereorradián (lm/sr). Interrupción: El cese de una actividad productiva antes de completar una tarea, ocasionado por estímulos impuestos de forma externa. Producción optimizada: Los resultados de trabajo de alta calidad, a la vez que se elimina el desperdicio y se reducen recursos, tiempo y errores. Zona de Seguridad para Medicación: Área crítica donde se prescriben los medicamentos, se ingresan las órdenes en el computador o se transcriben a documentos en papel, o donde se preparan las prescripciones/preparan o administran los medicamentos. Las características de un ambiente físico óptimo para el uso apropiado de medicamentos se deben aplicar a las zonas de seguridad para medicación. Atención Dividida en Tareas Múltiples: Capacidad de los seres humanos para realizar múltiples tareas en simultáneo. Ruido y sonido: El ruido se define como un estímulo auditivo que no guarda relación informativa con la tarea realizada. El sonido es un cambio en el volumen que guarda alguna relación informativa con la tarea que se realiza. Un ambiente de trabajo silencioso se define como un área ausente de ruido y donde el trabajador se encuentra libre de perturbaciones. Pasar por alto (override): Neutralizar o contrarrestar la acción de un control automático. Fotómetro: Instrumento para medir cantidades fotométricas tales como iluminancia. Ambiente físico: El entorno que puede afectar a uno o más de los sentidos humanos. Solución improvisada, o solución alternativa (workaround): Plan o método usado para sortear un problema (como en un software informático) sin eliminarlo. Condiciones de Trabajo: Conjunto de factores que incluyen el ambiente físico, personal que constituye la fuerza de trabajo, diseño del flujo de trabajo, factores personales/sociales y características organizacionales.
(1072) DESINFECTANTES Y ANTISÉPTICOS INTRODUCCIÓN Se requiere un programa eficaz de limpieza y sanitización de ambientes controlados en los que se fabrican artículos farmacopeicos para prevenir la contaminación microbiana de los mismos. Los productos farmacéuticos estériles pueden contaminarse a través de sus ingredientes farmacéuticos, el agua usada durante el proceso de fabricación, los componentes del empaque, el entorno de fabricación, los equipos de procesamiento y los operadores que trabajen en la fabricación de estos productos. Las Buenas Prácticas de Fabricación vigentes (cGMPs, por sus siglas en inglés) hacen hincapié en el tamaño, diseño, construcción y ubicación de los edificios y en los materiales empleados en la construcción, así como también en el flujo adecuado de materiales para facilitar la limpieza, el mantenimiento y las operaciones apropiadas para la fabricación de productos farmacéuticos. Cuando se emplean desinfectantes en el entorno de fabricación, se debe tener cuidado para evitar la contaminación del pro-
1212 (1072) Desinfectantes y Antisépticos / Información General
USP 39
dueto farmacéutico con desinfectantes químicos dada la toxicidad inherente de los mismos. Los requisitos para el procesamiento aséptico incluyen: pisos, paredes y techos fáciles de limpiar, con superficies lisas y no porosas; control de temperatura, humedad y partículas; y procedimientos de limpieza y desinfección que provean y mantengan las condiciones asépticas. El programa de limpieza y sanitización debería alcanzar estándares de limpieza específicos, controlar la contaminación microbiana de productos y estar diseñado de tal modo que prevenga la contaminación química de ingredientes farmacéuticos, equipos y superficies que entran en contacto con el producto, materiales de empaque y, esencialmente, los productos farmacéuticos. Estos principios también aplican a las formas farmacéuticas no estériles cuya contaminación microbiana se controla mediante la selección de ingredientes farmacéuticos, servicios y entornos de fabricación adecuados; procedimientos efectivos de limpieza de equipos; productos especialmente formulados para controlar la actividad de agua; la inclusión de conservantes adecuados; y el diseño del empaque del producto. Además de desinfectantes, se usan antisépticos para descontaminar la piel humana y tejidos corporales expuestos, que el personal puede usar antes de entrar al área de fabricación. Se pueden usar esterilizantes químicos para descontaminar superficies en las áreas de fabricación y en las de pruebas de esterilidad. Además, los esterilizantes pueden emplearse en la esterilización de artículos farmacopeicos y la irradiación UV puede usarse como sanitizante de superficies. Este capítulo de información general trata de la selección de antisépticos y desinfectantes químicos adecuados; la demostración de su eficacia bactericida, fungicida y esporicida; la aplicación de desinfectantes en el área de fabricación de productos farmacéuticos estériles; y consideraciones respecto a reglamentaciones y medidas de seguridad. La formación de biopelícula (biofilm) y su relación con los desinfectantes se encuentran fuera del alcance de este capítulo. Cualquier información adicional que no se encuentre en este capítulo, se la puede obtener de textos de referencia sobre desinfectantes y antisépticos. 1
DEFINICIONES Agente de Limpieza-Agente que elimina de la superficie de las instalaciones y equipos residuos de productos que pueden inactivar a los agentes sanitizantes o albergar microorganismos. Agente Esporicida-Agente que destruye esporas fúngicas y bacterianas cuando se usa en una concentración suficiente durante un tiempo de contacto específico. Se espera que mate todo microorganismo vegetativo. Agente Sanitizante-Agente que reduce, en superficies inanimadas, la cantidad de toda forma de vida microbiana, incluyendo hongos, virus y bacterias. Antiséptico-Agente que inhibe o destruye microorganismos sobre un tejido vivo, incluyendo la piel, cavidades orales y heridas abiertas. Descontaminación-Eliminación de microorganismos mediante desinfección o esterilización. Desinfectante-Agente físico o químico que al aplicarse sobre una superficie destruye o elimina formas vegetativas de microorganismos nocivos. Desinfectante Químico-Agente químico que se emplea en superficies y objetos inanimados para destruir virus, bacterias y hongos infecciosos, aunque no necesariamente sus esporas. Los agentes antivirales y esporicidas pueden considerarse como una clase especial de desinfectantes. Grupos relacionados con la medicina con frecuencia caracterizan a los desinfectantes de alto, mediano o bajo nivel según su eficacia frente a varios microorganismos. Esterilizante-Agente que destruye toda forma de vida microbiana, incluyendo hongos, virus y todas las formas de bacterias y sus esporas. Los esterilizantes son agentes líquidos o de fase vapor. Los microorganismos difieren mucho en su resistencia a los agentes desinfectantes. En orden descendente de resistencia a los desinfectantes químicos se listan en la Tabla 7 los microorganismos clínicamente importantes. Tabla 1. Resistencia de Algunos Microorganismos Clínicamente Importantes a los Desinfectantes Químicos (Se Listan en Orden Descendente de Resistencia) Tipo de Mlcroorqanlsmos
Ejemplos Bacillus subtilis y Clostridium sporogenes
Esporas bacterianas Micobacterias
Mycobacterium tuberculosis
Virus con envoltura no lipídica
Poliovirus y rinovirus
Esporas fúngicas y hongos filamentosos y levaduras vegetativas
Trichophyton, Cryptococcus y Candida spp.
Bacterias vegetativas
Pseudomonas aeruginosa,Staphylococcus aureus y Salmonel/a spp.
Virus con envoltura lipídica
Virus herpes simple, virus de hepatitis B y virus de inmunoeficiencia humana
CLASIFICACIÓN DE DESINFECTANTES Los desinfectantes químicos se clasifican según su composición química. Esto incluye aldehídos, alcoholes, halógenos, peróxidos, compuestos de amonio cuaternario y compuestos fenólicos (ver Tabla 2).
Ascenzi, j.M., Ed. Handbook of Disinfectonts and Antiseptics, 5th ed.; Marcel Dekker: New York, 1995; Block, S.S., Ed. Disinfection, Sterilization, and Preservation, 5th ed.; Lippincott Williams & Wilkins Publishers: Philadelphia, 2000. Russell, A.D.; Hugo, W.B.; Ayliffe, G.A.J., Eds. Principies and Practices of Disinfection, Preservation and Sterilization, 3rd ed.; Blackwell Science lnc.: London, 1999.
1
Información General/ (1072) Desinfectantes y Antisépticos 1213
USP 39
Tabla 2. Claslflcaclón General de Antisépticos, Desinfectantes y Agentes Esporlcldas Entidad Química
Ejemplo
Clasificación
Aldehídos
Agente esporicida
Glutaraldehído al 2%
Alcoholes
Desinfectante de uso general, antiséptico y agente antiviral
Alcohol isopropílico al 70%, alcohol al 70%
Cloro e hipoclorito de sodio
Agente esporicida
Hipoclorito de sodio al 0,5%
Fenólicos
Desinfectante de uso general
500 µg por g de Clorocresol, 500 µg por g de cloroxile-
Ozono
Agente esporicida
8% de Gas en peso
Peróxido de hidrógeno
Esterilizante de fase vapor, agente esporicida líquido, antiséptico
4 µg por g de H20 2 vapor, solución del 10% al 25%, solución al 3%
nol
Biguanidas sustituidas
Agente antiséptico
Gluconato de clorhexidina al 0,5%
Ácido peracético
Esterilizante líquido, esterilizante de fase vapor
Ácido peracético al 0,2%, 1 µg por g de ácido peracético
Óxido de etileno
Esterilizante de fase vapor
600 µg por g de Óxido de etileno
Compuestos de amonio cuaternario
Desinfectante de uso general
fJ -Propiolactona
Agente esporicida
y antiséptico
Concentración dependente de la aplicación, Cloruro de benzalconio
100 µq por g de fJ -Propiolactona
La eficacia de un desinfectante depende de su actividad biocida intrínseca, la concentración del desinfectante, el tiempo de contacto, la naturaleza de la superficie desinfectada, la dureza del agua usada para diluir el desinfectante, la cantidad de material orgánico presente en la superficie, y el tipo y la cantidad de microorganismos presentes. Conforme a la Ley Federal de Insecticidas, Fungicidas y Rodenticidas (Federal lnsecticide, Fungicide, and Rodenticide Act o FIFRA, por sus siglas en inglés), la Agencia de Protección Ambiental de los EE.UU. (EPA) registra los desinfectantes químicos que se comercializan en los Estados Unidos y exige que los fabricantes suministren información del producto en cuanto a la dilución de uso, el tipo de microorganismos que eliminan y el tiempo de contacto necesario. Ciertos esterilizantes químicos líquidos que se destinan al uso en dispositivos médicos críticos o semicríticos se encuentran definidos y regulados por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los EE.UU. (FDA).
SELECCIÓN DE UN ANTISÉPTICO PARA DESINFECCIÓN DE MANOS V SITIOS DE INTERVENCIÓN QUIRÚRGICA En el ámbito de los hospitales se desinfectan las manos y los sitios de intervención quirúrgica para reducir la flora residente y eliminar la flora transitoria (p.ej., Streptococcus pyogenes) y los S. aureus y P. aeruginosa resistentes a la meticilina, que se han visto implicados en infecciones hospitalarias. Se ha demostrado que el uso de antisépticos para la desinfección de manos es más efectivo que el uso de agua y jabón para la reducción del recuento de bacterias en la piel; el uso repetido de antisépticos reduce aún más el recuento. En la industria farmacéutica, estos principios pueden aplicarse a los operadores de cuartos limpios. Los antisépticos comunes incluyen clorhexidina al 4%, povidona yodada al 10%, hexaclorofeno al 3%, alcohol isopropílico al 70% y clorhexidina al 0,5% en alcohol al 95%.
SELECCIÓN DE UN DESINFECTANTE PARA USAR EN EL ENTORNO DE FABRICACIÓN DE PRODUCTOS FARMACÉUTICOS Al seleccionar un desinfectante para usar en el entorno de fabricación de productos farmacéuticos, se deben considerar los siguientes aspectos: el número y tipos de microorganismos a controlar; el espectro de actividad de los desinfectantes disponibles en el mercado; la declaración de la etiqueta como esterilizante; registros del desinfectante o sanitizante respaldados por la EPA; la concentración, método de aplicación y tiempo de contacto del desinfectante; la naturaleza del material de la superficie a desinfectar y su compatibilidad con el desinfectante; la cantidad de compuestos orgánicos en la superficie que pudieran inactivar al desinfectante; la posibilidad de mantener la actividad bactericida residual del desinfectante en la superficie; la corrosión de los equipos a causa de la aplicación repetitiva del desinfectante; las consideraciones de seguridad para los operadores que aplican el desinfectante; la compatibilidad del desinfectante con agentes de limpieza y otros desinfectantes; la rotación programada del desinfectante; y los pasos necesarios para evitar la contaminación de productos farmacéuticos por el desinfectante.2
ANÁLISIS TEÓRICO DE LA ACTIVIDAD DE LOS DESINFECTANTES Las gráficas del logaritmo del número de microorganismos por mL que sobreviven en una solución de desinfectante indican que se puede aplicar una cinética de primer orden como una aproximación bruta a la reducción del recuento microbiano en
2
Denny, V.F.; Marsik, F.). Current Practices in the Use of Disinfectants within the Pharmaceutical lndustry. PDA /. of Pharmaceutical Sci. and Tech., 1997, 51, (6),
227-228.
1214 (1072) Desinfectantes y Antisépticos / Información General
USP 39
relación al tiempo. En la práctica, las gráficas muestran una curva más sigmoidea con una reducción inicial de los números más lenta, incrementándose luego la velocidad en relación al tiempo. La constante de velocidad, K, para el proceso de desinfección se puede calcular mediante la fórmula: (1 /t)(log N 0 /N) en donde t es el tiempo, en minutos, necesario para reducir el recuento microbiano de N0 a N; N0 es el número inicial de organismos, en ufc por mL; y N es el número final, en ufc por mL, de organismos. Tal como ocurre con una reacción química de primer orden, la misma concentración de desinfectante reduce el número de organismos en forma más rápida a temperaturas elevadas. El impacto de la temperatura, T, puede expresarse a través del Q10, coeficiente por cada 1Oº de aumento en la temperatura, calculado por la fórmula: Tiempo para descontaminación a Tº/Tiempo para descontaminación a T en donde T es Tº - 1O. Otro indicio de que la reacción de primer orden es una descripción inadecuada de la desinfección es que los valores Q10 para las reacciones enzimáticas y químicas son de 2 a 3, mientras que los desinfectantes comunes fenol y alcohol tienen valores Q10 de 4 y 45, respectivamente. Para emplear los desinfectantes de forma satisfactoria, es crucial entender el efecto de la concentración en la reducción microbiana. Un gráfico del logaritmo del tiempo para reducir a cero la población microbiana de un inóculo estándar en función del logaritmo de la concentración del desinfectante es una línea recta cuya pendiente se denomina exponente de la concentración, n. La relación se puede expresar del siguiente modo: n = (log del tiempo de muerte a la concentración e 2 )
-
(log del tiempo de muerte a la concentración e,)/(log e 1 - log e 2 )
en donde e 1 y e 2 son las concentraciones más alta y más baja del desinfectante, respectivamente. Las amplias diferencias en los exponentes de concentración, n, tienen consecuencias prácticas en la selección de la dilución de uso de los distintos desinfectantes y en el uso de la dilución para neutralizar un desinfectante en la prueba de eficacia de desinfectantes y el control microbiano de rutina del entorno de fabricación. Por ejemplo, el cloruro mercúrico tiene un exponente de concentración de 1, por lo que una dilución al tercio reducirá la actividad del desinfectante por 31 (o un tercio), mientras que el fenol con un exponente de concentración de 6 presentará una reducción de la actividad del desinfectante de 36 (o una reducción de 729 veces). Los desinfectantes con exponentes de concentración o coeficientes de dilución mayores pierden rápidamente actividad al diluirlos. En la Tabla 3 se listan los exponentes de concentración de algunos desinfectantes. Ta bl a 3 Exponentes de concentrac I'on de Ant1septicos, . ' . Desm . f ectantes y Ester111 zantes comunes Desinfectante
Exponentes de Concentración
Peróxido de hidrógeno
0,5
Hipoclorito de sodio
0,5
Cloruro mercúrico
1
Clorhexidina
2
Formaldehído
1
Alcohol
9
Fenal
6
Compuestos de amonio cuaternario
de 0,8 a 2,5
Alcoholes alifáticos
de 6,0 a 12,7
Compuestos fenólicos
de 4 a 9,9
Otro aspecto importante que se debe considerar es el pH del desinfectante. Muchos desinfectantes son más activos en su forma ionizada, mientras que otros lo son en su forma no ionizada. El grado de ionización dependerá del pK. del agente y del pH del entorno de desinfección. Por ejemplo, el fenol, con un pK. de 1O será más eficaz a un pH menor que 7, en el cual no está ionizado.
MECANISMO DE LA ACTIVIDAD DEL DESINFECTANTE La Tabla 4 lista los sitios y modos de acción de algunos desinfectantes representativos. Tabla 4. Mecanismo de la Actividad de los Desinfectantes Contra Células Microbianas Objetivo
Desinfectante
Pared celular
Formaldehído, hipoclorito y glutaraldehído
Membrana citoplasmática, acción sobre el potencial de membrana
Anilidas y hexaclorofeno
Enzimas de membrana, acción sobre la cadena de transporte de electrones
Hexaclorofeno
Acción sobre el ATP
Clorhexidina y óxido de etileno
Información General/ (1072) Desinfectantes y Antisépticos 1215
USP 39
Tabla 4. Mecanismo de la Actividad de los Desinfectantes Contra Células Microbianas (Continuación) Desinfectante Objetivo Acción sobre enzimas con grupos -SH
Óxido de etileno, glutaraldehído, peróxido de hidrógeno, hipoclorito y yodo
Acción sobre la permeabilidad general de membrana
Alcoholes, clorhexidina y compuestos de amonio cuaternario
Contenido de las células, coagulación general
Clorhexidina, aldehídos y compuestos de amonio cuaternario
Ribosomas
Peróxido de hidrógeno
Ácidos nucleicos
Hipocloritos
Grupos tiol
Óxido de etileno, glutaraldehído, peróxido de hidrógeno e hipoclorito
Grupos amino
Óxido de etileno, glutaraldehído e hipoclorito
Oxidación general
Hipoclorito
RESISTENCIA MICROBIANA A LOS DESINFECTANTES El desarrollo de resistencia microbiana a los antibióticos es un fenómeno ampliamente descrito. El desarrollo de resistencia microbiana a los desinfectantes es menos probable que ocurra a niveles significativos, ya que los desinfectantes son agentes biocidas más poderosos que los antibióticos. Además, se aplican normalmente en mayores concentraciones contra poblaciones de microorganismos más bajas que, por lo general, no están en crecimiento activo; es por ello que la presión selectiva para el desarrollo de resistencia es menos profunda. Sin embargo, los microorganismos aislados con mayor frecuencia de un programa de control ambiental pueden someterse periódicamente a pruebas de dilución de uso con agentes empleados en el programa de desinfección para comprobar su susceptibilidad ya que hay diferencias reales entre las especies distintas con respecto a su resistencia a los efectos letales de sanitizantes diferentes.
PRUEBA DE DESAFÍO DE DESINFECTANTES Conforme a la FIFRA, la EPA exige que las empresas que registran productos plaguicidos antimicrobianos para la salud pública, incluyendo desinfectantes, agentes sanitizantes, agentes esporicidas y esterilizantes, garanticen la seguridad y eficacia de los productos antes de su venta o distribución. Las empresas que registran estos productos deben declarar la composición química del producto, incluir datos toxicológicos para documentar que el producto es seguro si se emplea según las instrucciones de la etiqueta, incluir datos de eficacia para documentar la efectividad declarada contra organismos específicos y para respaldar las instrucciones de uso del etiquetado, y deben además presentar un etiquetado que refleje los elementos que se requieren para el uso efectivo y seguro del producto. Si bien estas instrucciones proveen información valiosa, es probable que no sean de utilidad en relación con el uso de estos productos como desinfectantes en un entorno de fabricación. En los Estados Unidos, la AOAC lnternational 3 publica los métodos oficiales de prueba de desinfectantes, que incluyen la Prueba de Coeficiente de Fenol, la Prueba del Método de Dilución de Uso, el Método de Portador en Superficie Dura y la Prueba de Portador de Esporicida. El estudio científico que se someta a revisión de la EPA para obtener el registro del desinfectante debe conducirse en las instalaciones de un laboratorio que cumpla con las normas de Buenas Prácticas de Laboratorio (GLP, por sus siglas en inglés, descritas en 21 CFR 58). Para demostrar la eficacia de un desinfectante en un entorno de fabricación de productos farmacéuticos puede considerarse necesaria la realización de las siguientes pruebas: (1) pruebas de dilución de uso (analizar la eficacia de los desinfectantes a varias concentraciones y tiempos de contacto contra una amplia variedad de organismos estándares de prueba y aislamientos ambientales); (2) pruebas de desafío de superficie (usando microorganismos estándares de prueba y microorganismos que son aislamientos ambientales típicos, aplicando desinfectantes sobre las superficies a la concentración de uso seleccionada y durante un tiempo de contacto especificado y determinando la reducción del logaritmo de los microorganismos de desafío); y (3) una comparación estadística de la frecuencia de aislamiento y números de microorganismos aislados antes y después de la implementación de un nuevo desinfectante. Esto se considera necesario ya que, según lo establecido por las normas de Buenas Prácticas de Fabricación (GMP, por sus siglas en inglés), los pasos críticos de un proceso, como la desinfección de áreas de procesamiento aséptico, requieren validación, y porque los requisitos de registro de la EPA no incluyen instrucciones sobre cómo usar los desinfectantes en las industrias farmacéutica, biotecnológica y de dispositivos médicos. Para las pruebas de desafío de superficie, los organismos de prueba se enumeran por medio de métodos de hisopado, enjuague de superficie o placa de contacto. Los neutralizantes que inactivan desinfectantes deberían incluirse ya sea en el diluyente o los medios microbianos usados en el recuento microbiano o en ambos. La información acerca de neutralización de desinfectantes puede encontrarse en Validación de Recuperación Microbiana en Artículos Farmacopeicos (1227). La prueba de eficacia de desinfectantes debe tener un criterio de aceptación realista. En la práctica, es necesario inocular una cantidad suficiente de organismos en un cuadrado de 2 pulgadas x 2 pulgadas de la superficie que está siendo descontaminada, es decir, un cupón (coupon), para demostrar una reducción de al menos 2 log (para esporas bacterianas) a 3 log (para bacterias vegetativas) durante un tiempo de contacto predeterminado (es decir, 1O minutos por encima de la recuperación observada con la aplicación de un desinfectante de control). La eficacia de los neutralizadores y su capacidad para recuperar del material los microorganismos inoculados debería demostrarse durante los estudios de dilución de uso o de desafío de su3
AOAC lnternational Official Methods of Analysis, ediciones 15, 16 y 17va. Arlington, VA.
1216 (1072) Desinfectantes y Antisépticos / Información General
USP 39
perficie. Es importante recordar que los desinfectantes son menos efectivos contra los números más altos de microorganismos usados en las pruebas de desafío de laboratorio que contra los números encontrados en cuartos limpios (ver Control Microbiológico y Monitoreo de Ambientes para Procesamiento Aséptico (1116)); que los inóculos de la fase de crecimiento logarítmico, comúnmente empleados en los laboratorios, son más resistentes, salvo las esporas que se forman durante la fase estacionaria, que aquellos de un cultivo estacionario o en extinción o que los organismos bajo estrés en el ambiente; y que los microorganismos pueden eliminarse físicamente durante la aplicación del desinfectante en el área de fabricación. Aunque no es extensiva, la Tabla 5 lista los organismos de desafío típicos que pueden emplearse. Tabla 5. Organismos de Desafío Típicos Organismos de Desafío AOAC
Aislamientos Ambientales Típicos
Bactericida: Escherichia coli, ATCC 11229; S. aureus, ATCC 6538; P. aeruginosa, ATCC 15442
Bactericida: Micrococcus luteus, S. epidermdis, Coynebacterium jei-
Fungicida: C. albicans, ATCC 10231 ó 2091; Penicil/ium chrysogenum, ATCC 11 709; A. brasiliensis, ATCC 16404
Fungicida: P. chrysogenum, A. brasiliensis
Esporicida: B. subtilis, ATCC 19659
Esporicida: B. sphaericus, B. thuringiensis
keium, P. vesiclaris
Dada la variedad de materiales usados en la construcción de cuartos limpios y otras áreas controladas, se debe analizar cada material por separado para validar la eficacia de un desinfectante determinado. La Tabla 6 contiene un listado de materiales comúnmente usados en la construcción de cuartos limpios. . T1p1cas a Descontaminar con Desinf ectantes en el Area de Fabrlcacion de Productos Farmaceuticos Ta bl a 6. Supe rfº1C1es Material
Aplicación
Acero inoxidable de grados 304L y 316L
Superficies de trabajo, equipo de llenado y tanques
Vidrio
Ventanas y recipientes
Plástico, vinilo
Cortinas
Plástico, policarbonato
Revestimiento aislante
Lexan® (plexiglas)
Pantallas protectoras
Yeso recubierto con epoxilo
Paredes y techos
Plástico reforzado con fibra de vidrio
Paneles de las paredes
Tyvek®
Envoltorio de equipos
Baldosas de terrazo
Pisos
DESINFECTANTES DE UN PROGRAMA DE LIMPIEZA Y SANITIZACIÓN La selección de desinfectantes adecuados y la verificación de su eficacia en pruebas de desafío de superficie son cruciales en el desarrollo de un programa de limpieza y sanitización. Los aspectos relacionados con la implementación satisfactoria de dichos programas se refieren a lo siguiente: desarrollo de procedimientos escritos, capacitación del personal, decisiones acerca de la rotación de los desinfectantes, establecimiento de los métodos de aplicación y tiempos de contacto, control ambiental para demostrar la eficacia, y seguridad del personal. La sección 21 CFR 211.67 de las Buenas Prácticas de Fabricación vigentes (cGMP, por sus siglas en inglés), Limpieza y Mantenimiento de Equipos, especifica los requisitos de los procedimientos escritos en cuanto a la limpieza, mantenimiento y sanitización de los equipos de fabricación de productos farmacéuticos. Estos procedimientos deben especificar la asignación de responsabilidades, establecimiento de horarios, detalles de las operaciones de limpieza, protección de equipos limpios antes de usar, inspección de limpieza inmediatamente antes del uso y mantenimiento de registros de limpieza y sanitización. El personal involucrado en la desinfección requiere capacitación en microbiología, prácticas industriales de limpieza y sanitización, manejo seguro de desinfectantes concentrados, preparación y eliminación de desinfectantes, y métodos de aplicación adecuados. Se debería recalcar que la preparación de diluciones correctas es un punto crítico ya que las fallas de muchos desinfectantes pueden atribuirses al empleo de soluciones desinfectantes muy diluidas. Los desinfectantes que por lo general se usan en áreas de procesamiento y llenado asépticos se diluyen con Agua Purificada Estéril y se preparan asépticamente. Como alternativa, se puede diluir el desinfectante con Agua Purificada y luego esterilizar por filtración para eliminar microorganismos que probablemente puedan persistir en el desinfectante. Los desinfectantes diluidos deben tener una fecha de expiración asignada basada en estudios de efectividad. Se recomineda la rotación de un desinfectante eficaz con una esporicida. Es prudente reforzar el empleo diario de desinfectantes bactericidas con el uso semanal (o mensual) de un agente esporicida. La aplicación diaria de agentes esporicidas no es generalmente recomendada dada su tendencia a corroer equipos y debido a potenciales problemas de seguridad ante la exposición crónica del operador. Otros esquemas de rotación del desinfectante pueden justificarse en la revisión de los datos históricos de control ambiental. Los desinfectantes que se aplican sobre superficies de contacto potencial con productos generalmente se remueven con paños empapados con alcohol al 70%. Se debería controlar la efectividad de la eliminación de desinfectantes residuales como precaución contra la posibilidad de contaminación del producto. Los mayores problemas de seguridad se encuentran en el manejo de desinfectantes concentrados y en la mezcla de desinfectantes no compatibles. Por ejemplo, las soluciones concentradas de hipoclorito de sodio (a una concentración de más de
USP 39
Información General/ (1074) Seguridad Biológica de Excipientes 1217
5%) son oxidantes fuertes que se descomponen al calentarlas, al entrar en contacto con ácidos y bajo la influencia de la luz, despidiendo gases tóxicos y corrosivos, incluyendo cloro. Por lo contrario, las soluciones diluidas (a una concentración de menos de 0,5%) no se consideran peligrosas. No se deben mezclar, bajo ninguna circunstancia, desinfectantes con concentraciones diferentes. Las Hojas de Datos de Seguridad del Material de todo desinfectante usado en el área de fabricación deberían estar a disposición del personal que maneja estos agentes. Se deben suministrar equipos de seguridad adecuados tales como máscaras, lentes de seguridad, guantes y uniformes al personal que prepara los desinfectantes, el cual también debe entrenarse en el uso adecuado de dichos equipos. Las duchas de seguridad y las estaciones para el lavado de ojos deben ubicarse en el área de trabajo donde se preparan las soluciones desinfectantes.
(1074) GUÍAS PARA LA EVALUACIÓN DE LA SEGURIDAD BIOLÓGICA DE LOS EXCIPIENTES INTRODUCCIÓN Este capítulo es de carácter informativo y presenta un enfoque científico para la evaluación de la seguridad de nuevos excipientes farmacéuticos (es decir, los excipientes que no han sido previamente utilizados o autorizados para su uso en una preparación farmacéutica). Las guías aquí presentadas suministran un protocolo para el desarrollo de una base de datos adecuada que permita establecer las condiciones para el uso seguro de un nuevo excipiente en productos administrados por diferentes vías. [NOTA-La última sección de este capítulo, Definición de Términos, contiene algunos de los términos a los que aquí se hace referencia.] Un excipiente puede cumplir diferentes funciones en un producto farmacéutico pero, a diferencia de las sustancias farmacológicamente activas, el excipiente no muestra ninguna actividad farmacológica o posee una actividad muy limitada y específica. Debido a estas diferencias entre excipientes y fármacos activos en términos de relación riesgo-beneficio y actividades biológicas esperadas, los procedimientos para la evaluación de seguridad de los excipientes y de los fármacos activos varían. Por lo tanto, es importante tener en cuenta que las guías presentadas en este capítulo informativo sólo son válidas para la evaluación de la seguridad de los excipientes, y no para la evaluación de la seguridad de los fármacos activos. Estas guías de evaluación son de carácter informativo y deben ser utilizadas por profesionales con conocimientos de toxicología y otras ciencias afines. En la propuesta para la comercialización de un producto, también deberán cumplirse los requisitos pertinentes del método de prueba de seguridad establecidos por la autoridad reglamentadora receptora. Por ejemplo, si se presenta una propuesta a la Administración de Alimentos y Fármacos (Food and Drug Administration) de los EE.UU., deberán cumplirse con los requisitos de las pruebas de seguridad establecidos por dicho organismo. Estas guías no proporcionan detalles específicos relativos a la metodología de prueba e interpretación de datos. Se deberán utilizar los procedimientos de prueba reconocidos de manera general por expertos y organismos reglamentadores. Se alienta el uso de métodos que no utilicen animales vivos siempre y cuando estos procedimientos hayan sido validados para el propósito en cuestión y pueda confirmarse que dichos procedimientos alternativos proporcionarán suficientes datos para fundamentar un juicio sobre la seguridad de un producto. En la realización de todos los procedimientos de prueba, se recomienda ajustarse a los Principios Orientativos sobre el Uso de Animales en Toxicología de la Sociedad de Toxicología (1996) y, en otros países, respetar los códigos legales y profesionales correspondientes. Todos los estudios deben cumplir los requisitos de las guías sobre buenas prácticas de laboratorio nacionales, vigentes en el país en que se realizan los estudios. En los casos en que se cuente con una amplia experiencia en humanos basada en el consumo de alimentos, podría existir suficiente información para cumplir con los requisitos de las guías para excipientes de administración oral únicamente. Asimismo, podrían utilizarse datos basados en estudios con animales, originalmente desarrollados con otros propósitos, para cumplir con los requisitos de las guías de evaluación. Si se han cumplido con los requisitos de datos a través de la experiencia previa de uso por humanos y se han recopilado datos pertinentes en humanos con un criterio científico, no es necesario proporcionar datos de animales para aquellos resultados evaluados según experiencia clínica previa. Algunas vías de administración presentan desafíos toxicológicos únicos y las guías incluyen disposiciones relativas a dichas vías de administración (por ejemplo, inhalación). Además, se proporciona una explicación detallada sobre la cantidad de especies y otra información básica (por ejemplo, dos especies, una roedora y una no roedora). La cantidad de información requerida para definir un grupo de datos de referencia iniciales, que conformen una base de datos toxicológica y química, depende del uso previsto, de la duración y dosificación del material de excipiente propuesto. Es fundamental realizar un análisis profundo de la información de referencia antes de iniciar un régimen de pruebas. Además de consultar las bases de datos de literatura relacionada, debe obtenerse información sobre las propiedades físicas y químicas del compuesto, su proceso (o procesos) de fabricación y las especificaciones del producto, incluyendo límites de impurezas, potencial de actividad farmacológica, condiciones de exposición (es decir, dosis, duración, frecuencia de uso, formulación y vía de administración) y población potencial de usuarios. Además, es fundamental contar con información sobre la toxicidad básica de los productos. Debería prestarse especial atención a los estudios de absorción/distribución/metabolismo/excreción/
1218 (1074) Seguridad Biológica de Excipientes/ Información General
USP 39
farmacocinética (ADME/PK, por sus siglas en inglés) ya que gran parte del proceso de decisión posterior dependerá de dichos datos. Estas guías proporcionan un mecanismo para obtener conjuntos de datos iniciales para todos los materiales propuestos como excipientes. La información de referencia y de toxicidad inicial por sí mismas pueden avalar el uso del excipiente propuesto, ya sea en un producto de vida media corta que no se administre con una frecuencia tal que produzca una acumulación residual del excipiente en tejido corporal o en un producto utilizado solo una vez o dos en la vida, como ser, un agente de diagnóstico. Se necesitan pruebas adicionales, enumeradas en el Paso 4 de las Guías de Evaluación de Seguridad, para el excipiente propuesto cuyo uso resulte en una exposición repetida a corto o mediano plazo en humanos -es decir, un producto farmacéutico que se administre durante menos de 1O días o de 30 a 90 días consecutivos, respectivamente. En el caso de un excipiente propuesto que ha de utilizarse en un producto farmacéutico de administración intermitente o crónica durante un período prolongado, como por ejemplo para el tratamiento de la psoriasis o una preparación de insulina, se requieren pruebas adicionales. Estas pruebas se enumeran en el Paso 7 de las guías y en la sección correspondiente en Requisitos Adicionales para Vías de Exposición Específicas. Si bien las pruebas requeridas ofrecen orientación sobre la seguridad del producto para el consumidor, algunas de ellas están diseñadas para proporcionar información que permita evaluar su seguridad en el ámbito laboral (por ejemplo, irritación de la piel y de los ojos). Las guías se resumen en la Tabla 7. Las pruebas requeridas (R) en las guías difieren de las pruebas que se recomiendan en forma condicional (C). La realización de pruebas condicionales depende de las condiciones de uso y de los datos biológicos disponibles. También deben tenerse en cuenta los requisitos de las autoridades reglamentadoras al tomar la decisión de realizar una prueba. Ta bl a 1. Resumen d e Guias para Exc1p 1entes Vías de Exposición para los Humanos
Pruebas
Oral
A través de las Mucosas
Dérmica/ Tópica/ Transdérmica
Inyectable*
lnhalatorla/ lntranasal
Ocular
Datos de Toxicidad Iniciales
Toxicidad Oral Aquda
R
R
R
R
R
R
Toxicidad Dérmica Aguda
R
R
R
R
R
R
Toxicidad lnhalatoria Aguda
c
c
c
c
R
c R
Irritación Ocular
R
R
R
R
R
Irritación Cutánea
R
R
R
R
R
R
Sensibilización Cutánea
R
R
R
R
R
R
Toxicidad Inyectable Aguda
-
-
-
R
-
Evaluación del Sitio de Aplicación
-
R
R
-
Sensibilización Pulmonar
-
-
-
c
-
R
R
R
-
Fototoxicidad/Fotoalergia
R
-
Ensayos de Genotoxicidad
R
R
R
R
R
R
ADME/PK-Vía Prevista
R
R
R
R
R
R
Toxicidad de 28 Días (2 Especies)-Vía Prevista
R
R
R
R
R
R
Toxicidad a 90 Días (Especies más Adecuadas)
R
R
R
R
R
R
Toxicología Embrio-Fetal
R
R
R
R
R
R
Ensayos Adicionales
c
c
c
c
c
c
Datos Adicionales: Uso Re12etído a Corto o Mediano Plazo
Ensayos de Genotoxicidad
R
R
R
R
R
R
Ensayos de lnmunosupresión
R
c
c
R
c
c
Toxicidad Crónica (Roedor, No Roedor)
c
c
c
c
c
c
Toxicidad Reproductiva
R
R
R
R
R
R
Fotocarcinogenicidad
c c
c c
c c
c c
-
Datos Adicionales: Uso a Larao Plazo Intermitente o Crónico
Carcinoqenicidad R = Requerida C = Condicional • Intravenosa, intramuscular, subcutánea, intratecal, etc.
-
c
c
USP 39
Información General/ (1074) Seguridad Biológica de Excipientes 1219
GUÍAS PARA LA EVALUACIÓN DE LA SEGURIDAD Información de Referencia Antes de proseguir con los pasos de la sección Requisitos y Puntos de Control de Datos, deben analizarse y definirse los siguientes puntos: • Consultar la literatura pertinente utilizando las bases de datos adecuadas • Definir las propiedades químicas y físicas • Definir el proceso de fabricación • Definir las especificaciones del producto, incluyendo impurezas y disolventes residuales (ver guías ICH aplicables) • Estimar las condiciones de exposición (dosis, duración, frecuencia, vía) • Definir la población de usuarios • Evaluar el potencial de actividad farmacológica. En este punto, evaluar lo que se conoce y desarrollar el método inicial de prueba.
Requisitos y Puntos de Control de Datos PASO 1 Datos de Toxicidad (ver Datos de Toxicidad Iniciales) Los datos de toxicidad deben tener en cuenta la siguiente información: • Efectos de la exposición aguda por vía oral y las vías previstas • Efectos de exposiciones repetidas por las vías previstas • Efectos de los ensayos de genotoxicidad in vitro • ADME/PK por vía oral o por las vías adecuadas; dosis únicas o múltiples. PASO 2 Según los resultados anteriores, evaluar los efectos de una dosis única en humanos. PASO 3 Punto de control: Evaluar los resultados de las condiciones de exposición anteriores y las condiciones propuestas y la población expuesta. Los datos anteriores podrían permitir el uso en un producto único con una vida media corta (por ejemplo, un agente diagnóstico). PASO 4 Reunir los siguientes datos adicionales: • Efectos de exposición subcrónica en especies y vías adecuadas • Estudios de desarrollo embrio-fetal a través de la vía de exposición adecuada • Pruebas de genotoxicidad in vitro e in vivo adicionales. PASO 5 Según los resultados anteriores, deberían considerarse las pruebas en humanos como parte de los ensayos clínicos de un ingrediente activo o como un procedimiento independiente. PASO 6 Punto de control: Evaluar toda la información anterior. Los datos podrían permitir el uso en diferentes productos destinados a una ingesta repetida a corto plazo (por ejemplo, antibióticos). Si los estudios ADME/PK para un excipiente no inyectable no muestran absorción, los datos pueden permitir el uso de un producto por 30 a 90 días consecutivos. PASO 7 Deben obtenerse datos adicionales para productos que se toman en forma crónica, ya sea a diario o intermitentemente, durante un período prolongado, teniendo en cuenta lo siguiente: • Resultados de estudios subcrónicos y toxicidad a largo plazo en mamíferos no roedores adecuados
1220 (1074) Seguridad Biológica de Excipientes/ Información General
USP 39
• Estudios de toxicidad reproductiva • Resultados de otras pruebas y datos de exposición humana y toxicidad a largo plazo o carcinogenicidad en roedores.
Datos de Toxicidad Iniciales Deberían tenerse en cuenta los siguientes datos: TOXICIDAD AGUDA ADECUADA POR LAS VÍAS DE ADMINISTRACIÓN PREVISTAS sensibilización cutánea, método de dosis letal aproximada, prueba de límite, etc. OTROS ESTUDIOS DE TOXICIDAD AGUDA ADECUADOS toxicidad oral por prueba de límite o método de dosis letal aproximada, irritación cutánea, etc. ADME/PK dosis únicas o múltiples. GENOTOXICIDAD por ejemplo, la Prueba Ames, prueba de aberración cromosómica in vitro, ensayo de mutación celular en mamíferos. ESTUDIOS DE 28 DÍAS DE DOSIFICACIÓN REPETIDA EN DOS ESPECIES POR LAS VÍAS ADECUADAS (UN ROEDOR, UN MAMÍFERO NO ROEDOR) podrían requerirse una evaluación del sitio de la inyección o consideraciones similares según la vía de administración. NOTAS-
1. En aquellos casos en que las restricciones de la vía prevista (por ejemplo, volumen, concentración) impiden una evaluación adecuada de la toxicidad del excipiente, podría requerirse el desarrollo de un perfil de toxicidad mediante otras vías pertinentes. 2. La comparación de los datos de toxicidad y ADME/PK entre las vías oral y la prevista es fundamental en este punto ya que podría indicar hacia dónde deberían apuntar las pruebas de toxicidad futuras (por ejemplo, pruebas de toxicidad reproductiva realizadas por vía oral en lugar de la vía prevista). Asimismo, la realización de estudios pertinentes utilizando la vía prevista y la duración de exposición anticipada podrían hacer innecesaria la realización de estudios adicionales.
Requisitos Adicionales para Vías de Exposición Específicas PARA EXPOSICIÓN ORAL No hay requisitos adicionales aparte de los presentados para los Datos de Toxicidad Iniciales. PARA EXPOSICIÓN A TRAVÉS DE LAS MUCOSAS No hay requisitos adicionales aparte de los presentados para los Datos de Toxicidad Iniciales. PARA EXPOSICIÓN DÉRMICA, TÓPICA O TRANSDÉRMICA
Datos de Toxicidad Iniciales• Efectos de Exposición Aguda por Vía de Administración Transdérmica: estudio de sensibilización dérmica para aplicaciones repetidas • Efectos de Exposiciones Repetidas por Vía Transdérmica 1 . Estudio de fotoalergia/fototoxicidad 2. Estudios en dos especies (un roedor, un mamífero no roedor) por vía transdérmica. • Efectos de Exposición Subcrónica, Efectos de Toxicidad Reproductiva-Los estudios de toxicidad iniciales pueden realizarse por vía intravenosa para determinar en forma adecuada el perfil de toxicidad del excipiente. De esta manera, si no se puede suministrar una cantidad adecuada del compuesto a través de una forma farmacéutica transdermal, se puede evaluar qué órganos resultarán afectados. Esto depende de los resultados de los estudios ADME/PK.
USP 39
Información General/ (1074) Seguridad Biológica de Excipientes 1221
Los estudios reproductivos también pueden realizarse por vía oral o vía intravenosa con demostración de absorción (oral) y comparaciones farmacocinéticas de la vía elegida en función de la transdérmica. Pueden requerirse estudios de fotocarcinogenicidad, y deben tenerse en cuenta, si los datos y el uso propuesto indican que los materiales se han de colocar en la piel durante períodos prolongados y que la exposición a la luz UV es un factor importante (por ejemplo, protector solar). Esto también es válido para productos orales, parenterales y de inhalación en los casos en que las concentraciones del fármaco en la piel superan las concentraciones plasmáticas del fármaco durante un período considerable o en los casos en que el material propuesto parecería tener potencial de fotoactividad o ha demostrado tenerlo. PARA FORMAS FARMACÉUTICAS INYECTABLES
Información de Referencia-
l. Definir la compatibilidad de la forma farmacéutica con la sangre, si corresponde, según la vía de exposición. 2. Definir el pH y la tonicidad de la forma farmacéutica inyectable, si corresponde, según la vía de exposición. Datos de Toxicidad Iniciales• Efectos de la Exposición Aguda por las Vías de Administración Inyectables Previstas 1. Incluir la evaluación de irritación en el lugar de inyección en conejos o perros 2. Incluir una evaluación de la velocidad de administración. PARA EXPOSICIÓN POR INHALACIÓN O INTRANASAL1
Datos de Toxicidad Iniciales• Toxicidad por Inhalación Aguda-Una prueba de límite que, por ejemplo, utilice la concentración más alta obtenible en una exposición de 4 horas a vapor, aerosol o partículas sólidas. La sensibilización pulmonar puede realizarse junto con otros estudios adecuados. Si la exposición será a un aerosol o partícula sólida, deben generarse partículas de un diámetro medio en masa adecuado. • ADME/PK de Dosis Única y Repetidas por Inhalación o Vías lntranasal y Oral • Estudio de 28 Días de Inhalación por Dosis Repetidas en Dos Especies de Mamíferos Utilizando Vapor o Partículas de un Diámetro Medio de Masa Adecuado: comparar con datos de toxicidad oral similar. PARA EXPOSICIÓN OFTÁLMICA
Información de Referencia: definir pH y osmolaridad de la forma farmacéutica ocular tópica. Datos de Toxicidad Iniciales• Efectos de Exposición Aguda por Vías Oftálmicas: pruebas de citotoxicidad (p. ej. recubrimiento con agar) • Efectos de Exposiciones Repetidas por Vías Oftálmicas 1. Estudios en dos especies (un roedor, un mamífero no roedor) 2. Examen de segmentos anterior y posterior del ojo 3. Estudios sobre potencial de alergenicidad. Otros datos-La comparación de los parámetros farmacocinéticos de la vía elegida para estudios reproductivos y la exposición oftálmica son esenciales para la extrapolación de la toxicidad potencial a través de la vía oftálmica.
GLOSARIO Aguda: exposición a un agente de prueba dentro de un período único de 24 horas. Las dosis pueden ser únicas, múltiples o continuas durante un período de 24 horas. Crónica: dosis repetidas de un agente de prueba durante más del 10% de la expectativa de vida de la especie de prueba (más de 90 días en roedores). Las dosis diarias pueden ser únicas, múltiples o continuas durante un período de 24 horas. Subaguda: administración repetida de un agente de prueba hasta 29 días. Las dosis diarias pueden ser únicas, múltiples o continuas durante un período de 24 horas. Subcrónica: administración repetida de un agente de prueba por 30 días y hasta el 10% de la expectativa de vida de la especie de prueba (90 días en roedores). Las dosis diarias pueden ser únicas, múltiples o continuas durante un período de 24 horas.
1 Al diseñar estudios para evaluar el uso en productos indicados para inhalación o administración por vía intranasal, debe tenerse en cuenta el régimen de dosificación que será utilizado en humanos. El protocolo de estudio adecuado para un producto destinado a una terapia de inhalación que causará exposiciones prolongadas (por ejemplo, varias horas al día) podrá diferir del utilizado para evaluar un producto que resulte en la exposición a varias dosis medidas por día.
1222 (1078) Buenas Prácticas de Fabricación / Información General
USP 39
(1078) BUENAS PRÁCTICAS DE FABRICACIÓN PARA EXCIPIENTES FARMACÉUTICOS A GRANEL ANTECEDENTES Este capítulo de información general proporciona guías para métodos, instalaciones y controles de fabricación que se deben usar en la producción de excipientes farmacéuticos para asegurar que los excipientes posean la calidad, pureza, seguridad y aptitud para el uso supuestos. Los principios y la información de este capítulo se pueden aplicar a la fabricación de todos los excipientes farmacéuticos (mencionados en este documento como excipientes) destinados a ser utilizados en los medicamentos para uso humano, los medicamentos para uso veterinario y los productos biológicos. El capítulo abarca el sistema de gestión de calidad y el alcance necesario de buenas prácticas de fabricación (GMP, por sus siglas en inglés) a lo largo de toda la producción, tanto para procesos por partidas (lotes) como procesos continuos. El capítulo tiene como propósito ayudar a fabricantes y a auditores a establecer si las instalaciones y controles utilizados en la fabricación de excipientes son adecuados, si los excipientes poseen la calidad y pureza supuestas y si son aptos para el uso propuesto. La fabricación de ciertos excipientes para aplicaciones especiales implica desafíos adicionales que exceden el alcance de este capítulo. Los ejemplos incluyen excipientes para uso parenteral, ocular, inhalatorio y en heridas abiertas, además de excipientes estériles y/o exentos de pirógenos. Éste capítulo no provee información sobre todos los requisitos legales nacionales ni detalla las características particulares de todos los excipientes. La norma del sistema de calidad que se utiliza como marco de este capítulo es la ISO 9001, que corresponde a la fabricación. Dada la diversidad de excipientes, algunos de los principios incluidos en este capítulo informativo pueden no ser aplicables a determinados productos y procesos. Este capítulo combina conceptos sobre principios existentes de GMP extraídos de las siguientes fuentes: • Guías de la Organización Mundial de la Salud (OMS) sobre GMP de Excipientes, • Guía de Buenas Prácticas de Fabricación para Excipientes Farmacéuticos a Granel 2001 del lntemational Pharmaceutical Excipients Council (IPEC / Consejo Internacional de Excipientes Farmacéuticos), • Norma PS 9100:2002 para Excipientes Farmacéuticos del Pharmaceutical Quality Group (PQG / Grupo de Calidad Farmacéutica) del Jnstitute of Quality Assurance (IQA / Instituto de Garantía de Calidad), • Requisitos internacionales para sistemas de gestión de calidad desarrollados por la Jntemational Organization far Standardization (ISO / Organización Internacional de Normalización). Ante la creciente globalización de la industria farmacéutica y la armonización de los requisitos de registro farmacéutico, resulta necesario contemplar todos los esquemas. Por lo tanto, a lo largo de este capítulo se emplean partes relevantes de los conceptos de fabricación detallados en tales esquemas. La sección Guía General ofrece una perspectiva general de los criterios apropiados para las prácticas de fabricación de excipientes, así como los puntos de aplicación de las buenas prácticas de fabricación de excipientes y de los sistemas de calidad. Esta sección también recomienda medidas para limitar la contaminación de excipientes. Finalmente, se analiza la relación entre excipientes y formas farmacéuticas terminadas. No se ha intentado incluir detalles específicos para excipientes particulares. La información contenida en el Apéndice: Consideraciones sobre Auditoría estipula los criterios fundamentales con el objeto de ayudar en la auditoría de una planta de fabricación de excipientes. Para obtener una lista de los términos que se utilizan en este capítulo, así como sus definiciones, ver el Glosario.
INTRODUCCIÓN
Propósito y Alcance Este capítulo define el alcance y punto de aplicación de los principios de GMP apropiados para la fabricación de excipientes y es aplicable a la fabricación de excipientes destinados al uso en productos farmacéuticos. Este capítulo abarca el sistema de control de calidad y el alcance necesario de las GMP a lo largo de la fabricación, tanto para procesos por partidas como procesos continuos. El capítulo tiene como propósito ayudar a los fabricantes y a los auditores a establecer si las instalaciones y controles utilizados en la fabricación de excipientes son adecuados, si los excipientes poseen la calidad, pureza y seguridad supuestas y si son adecuados para el uso al que están destinado. La fabricación de ciertos excipientes para aplicaciones especiales implica desafíos adicionales que exceden el alcance de este capítulo. Los ejemplos incluyen excipientes • para uso parenteral, ocular, inhalatorio y en heridas abiertas; y • excipientes estériles y/o exentos de pirógenos. Para estos casos, la información detallada sobre el uso previsto de un excipiente, según lo indicado por usuario final, puede ser útil para determinar las GMP apropiadas. Este capítulo no aborda GMP específicas de las buenas prácticas de comercialización y distribución (GTDP, por sus siglas en inglés).
USP 39
Información General/ (1078) Buenas Prácticas de Fabricación 1223
Principios Adoptados EL CAPÍTULO Y SU USO Los excipientes farmacéuticos son diversos y en muchas ocasiones tienen usos distintos a las aplicaciones farmacéuticas. Cada fabricante debería considerar la forma en que el capítulo podría aplicarse a sus productos y procesos (por ejemplo, procesos por partidas frente a procesos continuos). Dada la gran diversidad de excipientes, algunos de los principios de este capítulo pueden no ser aplicables a determinados productos y procesos de fabricación. APLICACIÓN Este capítulo proporciona la información necesaria para la fabricación de excipientes, aunque no abarca todos los detalles. No es posible especificar en este capítulo los requisitos legales a nivel nacional ni abarcar las características particulares de todos los excipientes. NORMA DEL SISTEMA DE CALIDAD La norma del sistema de gestión de calidad que se utiliza como marco en este capítulo es la ISO 9001, que corresponde a instalaciones de fabricación. Un fabricante puede aplicar la norma ISO con o sin certificación; no obstante, esta posibilidad, como decisión empresarial, no se discute en este capítulo. Sin embargo, la certificación ISO tiene la ventaja de ofrecer a los clientes la garantía de que el sistema de gestión de calidad del fabricante de excipientes ha sido verificado de manera independiente. Los encabezados de este capítulo han sido alineados con las cláusulas de ISO 9001, en virtud de que muchos fabricantes de excipientes ya utilizan tal norma como base de sus sistemas de gestión de calidad. El capítulo incluye encabezados adicionales para introducir guías de GMP que no estén cubiertas por las cláusulas ISO 9001 vigentes. ESTRUCTURA DEL CAPÍTULO Este capítulo combina conceptos sobre principios existentes de GMP extraídos de las siguientes fuentes: • Guías de la Organización Mundial de la Salud (OMS) sobre GMP de Excipientes, • Guía de Buenas Prácticas de Fabricación para Excipientes Farmacéuticos a Granel 2001 del lnternational Pharmaceutical Excípients Councíl (IPEC / Consejo Internacional de Excipientes Farmacéuticos), • Norma PS 9100:2002 para Excipientes Farmacéuticos del Pharmaceutical Quality Group (PQG / Grupo de Calidad Farmacéutica) del lnstitute of Quality Assurance (IQA / Instituto de Garantía de Calidad), Requisitos internacionales para sistemas de gestión de calidad desarrollados por la lnternational Organization for Standardization (ISO / Organización Internacional de Normalización). Debido a la creciente globalización de la industria farmacéutica y la armonización de los requisitos de registro farmacéutico, se emplean a lo largo de este capítulo las partes relevantes de los conceptos de fabricación detallados en tales esquemas. La sección Guía General ofrece una perspectiva general de los criterios de GMP apropiados para la fabricación de excipientes, así como los puntos de aplicación de las GMP de excipientes. Las demás secciones ofrecen una guía sobre los principios de GMP y la implementación de un sistema de gestión de calidad adecuado para la fabricación de excipientes. Por ejemplo, estas secciones recomiendan medidas para limitar la contaminación del excipiente. No se ha intentado incluir detalles específicos para excipientes particulares, y cada fabricante debería considerar tales detalles según apliquen a sus propios productos y procesos. Los Apéndices ofrecen guías de soporte para las GMP de excipientes. El Apéndice 1. Consideraciones sobre Auditoría estipula los criterios fundamentales que se deben considerar en la auditoría de una instalación de fabricación de excipientes. El Apéndice 2. Glosario ofrece las definiciones de los términos que se utilizan en este capítulo.
GUÍA GENERAL Excipientes Farmacéuticos Los excipientes farmacéuticos son sustancias distintas al ingrediente farmacéutico activo (API, por sus siglas en inglés) que han sido evaluadas de manera apropiada respecto a su seguridad y que se incluyen intencionalmente en un sistema de liberación de fármacos. Por ejemplo, los excipientes pueden desempeñar las siguientes funciones: • facilitar el procesamiento del sistema de liberación de fármacos durante su fabricación, • proteger, mantener o mejorar la estabilidad, biodisponibilidad o aceptación por parte del paciente, • contribuir a la identificación del producto, y • mejorar cualquier otro atributo general relativo a la seguridad, eficacia o liberación del fármaco durante el almacenamiento o el uso.
1224 (1078) Buenas Prácticas de Fabricación / Información General
USP 39
La sección Excipientes USP y NF, Agrupados por Categoría en USP-NF ofrece una clasificación más completa de excipientes de acuerdo con sus funciones.
Implementación de GMP de Excipientes La aplicación de las GMP es importante cuando se determina que un producto químico está destinado a ser usado como componente de un producto farmacéutico. La fabricación de excipientes debería realizarse conforme a los conceptos de GMP en consonancia con este capítulo. El objetivo de las GMP de excipientes es garantizar que la fabricación de un excipiente produzca un material acorde con las características de calidad deseadas. El énfasis de las GMP de excipientes está en asegurar la integridad del producto, evitar su contaminación y asegurar el mantenimiento de registros. A medida que avanza el proceso de fabricación de un excipiente, debería aumentarse el grado de garantía en relación con la calidad del producto. Se deberían controlar y documentar los procesos de fabricación. No obstante, en alguna etapa lógica de proceso, según lo determine el fabricante, deberían aplicarse y mantenerse las GMP según se describen en este capítulo. Se requiere de un criterio basado en el análisis de riesgos, así como de un amplio conocimiento del proceso para determinar la etapa del proceso a partir de la cual deberían implementarse las GMP. Esta es habitualmente una etapa bien previa a la operación final de terminación y que, por ejemplo, puede identificarse usando métodos como el análisis de riesgos y puntos críticos de control (HACCP, por sus siglas en inglés), el análisis de modos y efectos de fallas (AMEF o FEMA, por sus siglas en inglés), o un diagrama de flujo detallado del proceso. Asimismo, se deberían tomar en cuentra otros factores como los procesos por partidas frente a los procesos continuos, el equipo dedicado frente al equipo multipropósito y los procesos abiertos frente a los procesos cerrados.
SISTEMA DE GESTIÓN DE CALIDAD: SISTEMAS DE CALIDAD DE EXCIPIENTES Recomendaciones Generales Los principios descritos en este capítulo ofrecen una base integral para el sistema de gestión de calidad usado en la fabricación de excipientes farmacéuticos. Los fabricantes de excipientes deberían identificar los procesos de gestión de calidad requeridos para asegurar la calidad del excipiente. Cuando se contrate a terceros para fabricar, analizar o llevar a cabo otras operaciones que pudieran afectar la calidad del excipiente, la responsabilidad sobre la calidad seguirá recayendo sobre el fabricante del excipiente, debiéndose definir medidas de control (ver también la subsección Información de Compras en la sección Realización del Producto).
Recomendaciones sobre Documentación RECOMENDACIÓN GENERAL El fabricante de excipientes debería tener a su disposición un sistema para controlar los documentos y datos relacionados con los requisitos del sistema de gestión de calidad. MANUAL DE CALIDAD El fabricante de excipientes debería elaborar un manual de calidad en el que se describa el sistema de gestión de calidad, la política de calidad y el compromiso del fabricante de excipientes para aplicar las GMP y normas de gestión de calidad apropiadas contenidas en este capítulo. Dicho manual debería incluir el alcance del sistema de gestión de calidad, referencias a los procedimientos de respaldo y una descripción de la interacción entre los procesos de gestión de calidad. CONTROL DE DOCUMENTOS El fabricante de excipientes debería establecer y mantener procedimientos para la identificación, recopilación, indexación, archivo, almacenamiento, mantenimiento y eliminación de documentos controlados, incluso documentos que procedan de fuentes externas que formen parte del sistema de gestión de calidad. Se deberían documentar, implementar y mantener los procedimientos usados en la fabricación de excipientes. Asimismo, deberían existir controles formales relacionados con la aprobación, revisión y distribución del procedimiento. Estos controles deberían garantizar que se está utilizando la versión actual de un procedimiento en todas las áreas operativas y que se han retirado las revisiones anteriores del documento. La documentación y los cambios posteriores realizados a la misma deberían ser revisados y aprobados por personal calificado designado antes de su entrega a las áreas correspondientes, según se identifican en la documentación. La documentación que afecte la calidad del producto debería ser revisada y aprobada por el departamento de calidad (ver también Responsabilidad y Autoridad en la sección Responsibilidad, Autoridad y Comunicación en Responsabilidad Gerencial).
USP 39
Información General/ (1078) Buenas Prácticas de Fabricación 1225
La documentación controlada puede incluir un identificador exclusivo, la fecha de emisión y un número de revisión para facilitar la identificación de la documentación más reciente. Es recomendable identificar al departamento responsable de la emisión de documentación. Cuando resulte práctico, deberían documentarse los cambios y las razones de los cambios. La documentación en formato electrónico debería cumplir con los requisitos del sistema de control de documentos especificado anteriormente. Si se utilizan firmas electrónicas en los documentos, se deberían aplicar controles sobre éstas para ofrecer seguridad equivalente a la que ofrece la firma manuscrita. Es posible que la documentación y firmas en formato electrónico tengan que cumplir también con requisitos reglamentarios locales. CONTROL DE REGISTROS El fabricante de excipientes debería establecer y mantener procedimientos para la identificación, recopilación, indexación, archivo, almacenamiento, mantenimiento y eliminación de registros. Deberían conservarse registros para demostrar que se logró la calidad requerida y el funcionamiento eficaz del sistema de gestión de calidad. Los registros deberían ser legibles e identificables con el producto en cuestión. Estos registros deberían incluir los datos de calidad pertinentes de los subcontratistas. Las entradas en los registros deberían ser claras, indelebles y asentadas inmediatamente después de llevar a cabo la actividad (en el orden de realización), además de estar firmadas y fechadas por la persona que las ingresa. Las correcciones a las entradas deberían estar firmadas y fechadas, dejando la entrada original aún legible. Los registros deberían conservarse durante un período definido. Este período debería ser congruente con el excipiente y con su fecha de expiración o intervalo de reevaluación. Los registros deberían almacenarse y conservarse de manera tal que se puedan recuperar fácilmente y en lugares que ofrezcan un ambiente apto para minimizar deterioros o daños. CONTROL DE CAMBIOS El fabricante de excipientes debería establecer y mantener procedimientos para evaluar y aprobar cambios que puedan afectar la calidad del excipiente. Por ejemplo, esto puede incluir cambios en los siguientes puntos: • materias primas o envases y sus orígenes, • especificaciones del material, • métodos de prueba, • equipos de fabricación y analíticos, • procesos de producción, • sitios de fabricación o envasado. Un departamento con una función independiente de la producción (por ejemplo, el departamento de asuntos reglamentarios o de garantía de calidad) debería tener la responsabilidad y autoridad para la aprobación final de los cambios. Se debería notificar a los clientes y, cuando corresponda, se debería enmendar la documentación que integra las presentaciones reglamentarias para excipientes (tales como los Archivos Maestros de Fármacos [DMF, por sus siglas en inglés] o los Certificados de Aptitud de la Farmacopea Europea [CEP, por sus siglas en inglés]) de modo que reflejen los cambios significativos de los procedimientos de control de producción y proceso que puedan afectar la calidad del excipiente (ver también Comunicación con los Clientes en la sección Procesos Relacionados con los Clientes en Realización del Producto).
RESPONSABILIDAD GERENCIAL Compromiso Gerencial La alta gerencia debería demostrar a la organización la importancia que le otorga a la satisfacción de los clientes y al cumplimiento con las reglamentaciones y normas apropiadas. Lo anterior debería lograrse a través del desarrollo de una política de calidad y del establecimiento de objetivos de calidad. El progreso hacia los objetivos documentados de calidad debería revisarse a intervalos planeados.
Necesidades de los Clientes Es responsabilidad de la alta gerencia garantizar que se determinen y cumplan los requisitos de los clientes. El fabricante de excipientes debería permitir que el cliente o su representante lleve a cabo auditorías a su sistema de gestión de calidad, a los procesos de fabricación y a los edificios e instalaciones.
Política de Calidad La alta gerencia debería demostrar su compromiso con la política de calidad de la empresa y garantizar que se implemente dentro del departamento operativo. La política de calidad debería respaldar el mejoramiento continuo del sistema de gestión
1226 (1078) Buenas Prácticas de Fabricación / Información General
USP 39
de calidad. La gerencia debería participar en el desarrollo de la política de calidad de la empresa y proporcionar los recursos necesarios para su desarrollo, mantenimiento y despliegue.
Planeación OBJETIVOS DE CALIDAD La alta gerencia debería establecer objetivos de adhesión a las GMP para asegurar que el fabricante de excipientes matenga y mejore su desempeño. Los objetivos deberían desplegarse en toda la organización y deberían ser medibles y estar de acuerdo con la política de calidad. PLANEACIÓN DEL SISTEMA DE GESTIÓN DE CALIDAD La alta gerencia debería proveer los recursos adecuados para asegurar el cumplimiento con las disposiciones de este capítulo. Debería existir un proceso para identificar los recursos necesarios para apegarse a las GMP. Se puede generar un análisis de carencias (gap analysis) basado en auditorías realizadas por personal interno, clientes, agencias reguladoras o contratistas externos, o basado en el uso de este capítulo, para identificar la necesidad de recursos. La alta gerencia debería asegurar la conservación de la integridad del sistema de gestión de calidad al momento de planear e implementar cambios.
Responsabilidad, Autoridad y Comunicación RESPONSABILIDAD Y AUTORIDAD La alta gerencia debería definir claramente las responsabilidades y autoridades y comunicarlas dentro de la organización. Un departamento independiente de la producción, tal como el departamento de calidad, debería tener la responsabilidad de llevar a cabo lo siguiente: • asegurar que las actividades críticas para la calidad se realicen según se definen, • aprobar proveedores de materiales y servicios críticos para la calidad, • aprobar o rechazar materias primas, componentes del envase, productos intermedios y excipientes terminados, • asegurar que se revisen los registros de producción para confirmar que no ha ocurrido ningún error, o si hubiese ocurrido algún error, que se haya investigado de forma exhaustiva, • participar en la revisión y autorizar cambios a procesos, especificaciones, procedimientos y métodos de prueba que afecten potencialmente la calidad (ver también el apartado anterior Control de Cambios en la sección Recomendaciones sobre Documentación en Sistema de Gestión de Calidad: Sistemas de Calidad de Excipientes), así como participar en la investigación de fallas y quejas, • retener la responsabilidad de aprobar o rechazar excipientes producidos, procesados, envasados o conservados bajo contrato por otra empresa, • desarrollar e implementar un programa de autoinspección del sistema de gestión de calidad. El fabricante de excipientes puede delegar algunas de las actividades del departamento de calidad (por ejemplo, auditorías periódicas, capacitación y documentación) a otra parte del personal si es que se cuenta con los controles apropiados. Los vínculos entre los departamentos, así como las relaciones con la alta gerencia de la empresa, deberían quedar reflejadas a través de un organigrama. Se debería contar con descripciones detalladas de tareas del personal cuyos puestos afecten la calidad del excipiente. REPRESENTANTE DE LA GERENCIA El fabricante de excipientes debería designar a un representante de la gerencia con la autoridad suficiente para garantizar la implementación apropiada de las disposiciones de este capítulo. El representante debería informar periódicamente a la alta gerencia acerca del cumplimiento con el sistema de gestión de calidad, incluyendo cualquier cambio en los requisitos del cliente o reglamentarios. COMUNICACIÓN INTERNA El fabricante de excipientes debería garantizar el establecimiento de sistemas apropiados para comunicar a toda la organización los requisitos de GMP y reglamentarios, políticas de calidad, objetivos de calidad y procedimientos. Asimismo, los comunicados deberían ofrecer información sobre la eficacia del sistema de gestión de calidad. Se debería notificar oportunamente a la alta gerencia acerca de situaciones críticas para la calidad, tales como la recuperación de un producto de su circulación, de conformidad con un procedimiento documentado.
USP 39
Información General/ (1078) Buenas Prácticas de Fabricación 1227
Revisión Gerencial RECOMENDACIONES GENERALES La alta gerencia de la empresa debería llevar a cabo revisiones periódicas del sistema de gestión de calidad para confirmar el cumplimiento continuo de la organización con este capítulo. La revisión debería quedar registrada e incluir la evaluación de oportunidades de mejoramiento y la necesidad de cambios en el sistema de gestión de calidad. COMENTARIOS SOBRE LA REVISIÓN Los comentarios sobre la revisión gerencial deberían incluir, por ejemplo, lo siguiente: • resultados de auditorías internas y externas, • retroalimentación de clientes sobre el desempeño de la empresa, •cumplimiento de los productos y desempeño de los procesos, • puntos de acción extraídos de la revisión gerencial anterior, • quejas de los clientes, • estado de acciones correctivas o preventivas, • cambios que pudieran afectar al sistema de gestión de calidad. RESULTADOS DE LA REVISIÓN La revisión gerencial debería identificar los recursos necesarios y las oportunidades para mejorar el sistema de gestión de calidad y mejorar el cumplimiento del producto con los requisitos del cliente y reglamentarios. Debería crearse un registro de las acciones recomendadas y tomadas.
GESTIÓN DE RECURSOS Provisión de Recursos Se debería contar con suficiente personal calificado y recursos (por ejemplo, equipos, materiales, edificios e instalaciones) para implementar, mantener y mejorar el sistema de gestión de calidad, así como para producir, envasar, analizar, almacenar y liberar cada excipiente de manera acorde a este capítulo.
Recursos Humanos RECOMENDACIONES GENERALES El personal cuyas labores afecten la calidad de los excipientes debería tener la combinación apropiada de formación académica, capacitación y experiencia para sus tareas asignadas. Los consultores que brinden asesoría respecto del diseño, producción, envasado, análisis o almacenamiento de excipientes deberían tener formación académica, capacitación y experiencia suficientes o alguna combinación de las mismas, para asesorar en el tema para el que se los contrata. Se deberían mantener registros que indiquen el nombre, dirección y calificaciones de todos los consultores y el tipo de servicio que proveen. COMPETENCIA, CONOCIMIENTO Y CAPACITACIÓN El fabricante de excipientes debería establecer y mantener procedimientos para identificar necesidades de capacitación y proporcionar la capacitación requerida al personal que realiza actividades que afecten la calidad del excipiente. Se deberían mantener registros apropiados de capacitación. La capacitación debería vincularse a operaciones particulares que el empleado realice, así como a las GMP relacionadas con sus funciones. La capacitación sobre GMP debería ser impartida por personas calificadas, con suficiente frecuencia, para garantizar que los empleados permanezcan familiarizados con los principios de GMP aplicables. La gerencia debería establecer y mantener capacitación continua y adecuada sobre higiene personal para el personal que manipule materiales, de modo que comprendan las precauciones necesarias para evitar la contaminación de los excipientes. El programa de capacitación debería asegurar que el personal entienda que las desviaciones respecto de los procedimientos pueden afectar la calidad de los productos de los clientes. HIGIENE PERSONAL Con el fin de proteger a los exipientes de la contaminación, se debería usar equipo de protección, tal como protectores para la cabeza, cara, manos y brazos cuando sea necesario para las tareas realizadas. Cualquier tipo de joyas u otros artículos suel-
1228 (1078) Buenas Prácticas de Fabricación / Información General
USP 39
tos, incluyendo los que se encuentren en los bolsillos, deberían retirarse o cubrirse. Únicamente el personal autorizado debería entrar a las áreas de los edificios e instalaciones designadas como áreas de acceso restringido. El personal debería mantener buenos hábitos de asepsia e higiene. Cualquier persona que parezca tener una enfermedad o lesiones abiertas, detectadas por examen médico u observación del personal de supervisión, que puedan afectar de manera adversa la seguridad o calidad del excipiente, debería ser excluida del contacto directo con materias primas, componentes del envase, productos intermedios y excipientes terminados hasta que esta condición se resuelva o hasta que el personal competente determine que no es un riesgo para la seguridad o la calidad del excipiente. Se debería instruir al personal para que informe a sus supervisores de cualquier afección de salud que pueda tener un efecto adverso sobre los excipientes. El almacenamiento y consumo de alimentos, bebidas, medicamentos personales, productos de tabaco o artículos similares, deberían restringirse a lugares designados, separados de las áreas de fabricación. INFRAESTRUCTURA La infraestructura debería administrarse, operarse, limpiarse y conservarse de conformidad con los principios de GMP para asegurar la calidad del excipiente y evitar la contaminación (incluyendo la infraestructura crítica para la calidad del excipiente, el control de partículas, el control microbiológico y el control de calidad del agua). EDIFICIOS E INSTALACIONES La prevención de contaminación debería considerarse en el diseño de los procesos e instalaciones de fabricación, en particular cuando el excipiente está expuesto. Los edificios e instalaciones usados en la producción, procesamiento, envasado, análisis o almacenamiento de un excipiente deberían mantenerse en buen estado y deberían contar con un tamaño, construción y ubicación adecuados para facilitar la limpieza, mantenimiento y operación apropiados para el tipo de procesamiento. Los procesos de fabricación asociados con la producción de productos de alta sensibilidad o toxicidad (por ejemplo, herbicidas y pesticidas) deberían ubicarse en instalaciones especiales (dedicadas) o deberían utilizar equipos diferentes de los empleados para la fabricación de excipientes. Si esto no fuera posible, se deberían implementar medidas apropiadas (tales como limpieza o desactivación) para evitar la contaminación cruzada. Se debería demostrar la efectividad de estas medidas. Se debería contar con instalaciones adecuadas para el análisis de materias primas, componentes del envase, productos intermedios y excipientes terminados. EQUIPOS Los equipos usados en la producción, procesamiento, envasado, análisis o almacenamiento de un excipiente deberían mantenerse en buen estado y deberían contar con un tamaño, diseño y ubicación apropiados para facilitar su limpieza, mantenimiento y operación correcta, dependiendo del tipo de procesamiento (por ejemplo, procesamiento por partidas frente a procesamiento continuo). Los equipos deberían ponerse en servicio antes de su uso para garantizar que funcionan como se espera. Cuando un equipo se encuentra fuera de las instalaciones, deberían existir controles aptos para minimizar los riesgos para la calidad del excipiente derivados del entorno (por ejemplo, procesamiento dentro de un sistema cerrado). ESTRUCTURA DE EQUIPOS Los equipos de procesamiento se deberían construir de modo que sus superficies de contacto no sean reactivas, aditivas ni absorbentes como para alterar la calidad del excipiente. Se debería evitar que las sustancias necesarias para las operaciones, por ejemplo lubricantes o refrigerantes, entren en contacto con las materias primas, materiales del envase, productos intermedios o excipientes terminados. Cuando exista posibilidad de contacto, deberían emplearse sustancias adecuadas para el uso en aplicaciones de alimentos. Los equipos se deberían diseñar de modo que se minimice la posibilidad de contaminación ocasionada por contacto directo del operador en actividades tales como descarga de bolsas para centrifugación, uso de mangueras de transferencia (en particular las que se emplean para transferir polvos) y la operación de equipos y bombas de secado. Se debería evaluar el diseño sanitario de los equipos de transferencia y procesamiento. Aquellos equipos que posean partes móviles se deberían evaluar con respecto a la integridad de sellos y materiales de empaque para evitar el riesgo de contaminación. MANTENIMIENTO DE EQUIPOS Se deberían establecer y cumplir procedimientos documentados para el mantenimiento de equipos críticos utilizados en la producción, procesamiento, envasado, análisis o conservación del excipiente. Se deberían mantener registros del uso y mantenimiento de equipo crítico para la calidad. Estos registros pueden estar en forma de libro de registro, base de datos de computadora u otro tipo de documentación apropiada.
USP 39
Información General/ (1078) Buenas Prácticas de Fabricación 1229
SISTEMAS COMPUTARIZADOS Los sistemas computarizados que puedan afectar la calidad del excipiente deberían contar con suficientes controles de operación y mantenimiento y de prevención de acceso no autorizado o cambios en el software, hardware o datos computarizados. Tales controles incluyen lo siguiente: • sistemas y procedimientos que muestren que el equipo y el software trabajan como se espera, • procedimientos para controlar el equipo a intervalos apropiados, • conservación de sistemas de respaldo o archivo adecuados tales como copias del programa y archivos, • garantía de que los cambios sean verificados y documentados y que sólo sean efectuados por personal autorizado. SERVICIOS Los servicios (tales como nitrógeno, aire comprimido y vapor) utilizados en la producción, almacenamiento o transferencia de materiales, que pudieran afectar la calidad del excipiente, deberían evaluarse y someterse a acciones apropiadas para controlar el riesgo de contar.ninación y contaminación cruzada. AGUA Se debería demostrar que el agua utilizada en la fabricación de excipientes tiene la calidad apropiada en lo que respecta a requisitos de pureza y al uso para el que está destinado el excipiente. A menos que se justifique de otro modo, el agua de procesamiento debería, como mínimo, cumplir con los requisitos reglamentarios para agua potable. Si el agua potable no es suficiente para asegurar la calidad, o si se requieren especificaciones más estrictas de calidad química o microbiológica del agua, se deberían establecer controles y especificaciones apropiadas: por ejemplo, atributos físico-químicos, recuentos totales microbianos y límites para microorganismos inaceptables y/o endotoxinas. Cuando el fabricante trate el agua usada en el proceso para lograr una calidad definida, el proceso de tratamiento debería especificarse y monitorearse mediante límites de acción apropiados. El agua que entre en contacto con el excipiente debería suministrarse bajo presión positiva continua (u otros medios que prevengan el flujo inverso) en un sistema libre de defectos para controlar el riesgo de contaminación del excipiente. AMBIENTE DE TRABAJO Cuando la fabricación requiera que el excipiente quede expuesto, la exposición debería realizarse en un ambiente apropiado para minimizar la contaminación. El fabricante debería aplicar controles adecuados para mantener tal ambiente. MANEJO DE AIRE Cuando se instale un sistema de manejo de aire para ofrecer protección al excipiente, el fabricante de excipientes debería demostrar su efectividad. Los sistemas de manejo de aire en unidades de producción de excipientes deberían diseñarse para prevenir la contaminación cruzada. En las áreas especiales (dedicadas) que procesan el mismo excipiente, se permite reciclar una parte del aire extraído retornándolo a la misma área. La aptitud de tal sistema para áreas multiusos, especialmente si se procesan diversos productos al mismo tiempo, debería evaluarse con respecto a la contaminación cruzada. AMBIENTE CONTROLADO Puede ser necesario un ambiente controlado para evitar la contaminación o la degradación provocada por la exposición al calor, al aire o a la luz. El grado de protección necesario puede variar según la etapa del proceso. Las condiciones ambientales especiales que requieren algunos procesos se deberían monitorear en todo momento para garantizar la calidad del producto (por ejemplo, atmósfera inerte o protección de la luz). Cuando se requiere una atmósfera inerte, el gas se debe tratar como una materia prima. Si se producen interrupciones en un ambiente especial, se deben documentar con pruebas suficientes y fundamentos apropiados que demuestren que dichas interrupciones no comprometieron la calidad del excipiente. Estos asuntos ambientales adquieren mayor importancia después de la purificación del excipiente. LIMPIEZA Y CONDICIONES HIGIÉNICAS La limpieza adecuada es un punto importante a considerar en el diseño de las instalaciones de fabricación de excipientes. Todo edificio que se use para producción, procesamiento, envasado o conservación de un excipiente debería mantenerse limpio y en condiciones higiénicas apropiadas de acuerdo con el tipo de proceso que se lleve a cabo (por ejemplo, sistemas abiertos/cerrados). Cuando mantener condiciones de limpieza y sanitarias resulta crítico para la calidad del excipiente, deberían existir procedimientos escritos que asignen responsabilidades para el mantenimiento de la limpieza e higiene y que describan con suficiente detalle la frecuencia de limpieza, métodos, equipos y materiales a utilizar en la limpieza de edificios e instalado-
1230 (1078) Buenas Prácticas de Fabricación / Información General
USP 39
nes. Estos procedimientos deberían cumplirse y la limpieza debería quedar documentada. Los residuos deberían segregarse y desecharse puntualmente y de manera apropiada. Si los residuos no se desechan de inmediato, estos deberían identificarse adecuadamente. CONTROL DE PLAGAS Todos los edificios deberían estar libres de roedores, aves, insectos y otras alimañas. Algunas materias primas, en particular las de origen botánico, pueden presentar contaminación inevitable, como por ejemplo infestaciones o suciedad provocada por roedores u otros animales. El fabricante de excipientes debería tener suficientes métodos de control para evitar el aumento de dicha contaminación o infestación en áreas de conservación, así como su propagación a otras áreas de la planta. ILUMINACIÓN Se debería proveer una iluminación adecuada para facilitar la limpieza, mantenimiento y operaciones apropiadas. DRENAJE En las áreas en las que el excipiente se encuentre expuesto al ambiente, los drenajes deberían tener un tamaño adecuado y, en aquellos casos en que estén directamente conectados a una cloaca, deberían tener un freno de aire u otro dispositivo mecánico que implida el reflujo. LAVATORIOS Y BAÑOS Deberían proporcionarse lavatorios adecuados que incluyan agua fría y caliente, jabón o detergente, secadores de aire o toallas desechables, así como baños limpios de fácil acceso desde las áreas de trabajo. Cuando corresponda, deberían proporcionarse instalaciones adecuadas para duchas y/o vestidores.
REALIZACIÓN DEL PRODUCTO Planeación de la Realización del Producto El fabricante de excipientes debería planear y desarrollar los procesos y controles necesarios para la fabricación de un producto. Tales planes y controles deberían ser apropiados para el proceso de producción, especificaciones del excipiente, equipos e instalaciones usadas en la fabricación del producto. Los aspectos fundamentales para la planeación de un proceso adecuado y sus controles deberían incluir lo siguiente, según corresponda: • programas de pruebas documentados, para materiales críticos para la calidad incluyendo excipientes, que contengan especificaciones, planes de muestreo y procedimientos de prueba y liberación apropiados, • generación y mantenimiento de registros (ver también el apartado anterior Control de Registros en la sección Recomendaciones sobre Documentación en Sistema de Gestión de Calidad: Sistemas de Calidad de Excipientes) que ofrezcan evidencia de que los planes se han llevado a cabo según lo previsto y que permiten demostrar la rastreabilidad (ver también más adelante en esta sección, Rastreabilidad en Identificación y Rastreabilidad), • suministro de recursos para implementar dichos planes, • programas de control ambiental y de higiene para minimizar la contaminación.
Procesos Relacionados con los Clientes DETERMINACIÓN DE REQUISITOS RELACIONADOS CON EL PRODUCTO El fabricante de excipientes debería determinar los requisitos del cliente en relación con la calidad, etiquetado y entrega del excipiente. Ambas partes deberían establecer acuerdos en relación con requisitos adicionales, ya sean específicos del cliente, legales o reglamentarios (por ejemplo, material farmacopeico y monografías generales). Cuando se conozcan, deberían considerarse los requisitos no especificados por el cliente pero que son necesarios para el uso específico o previsto. REVISIÓN DE REQUISITOS RELACIONADOS CON EL PRODUCTO El fabricante de excipientes y el cliente deberían establecer un acuerdo mutuo sobre los requisitos identificados en la sección anterior, Determinación de Requisitos Relaciona.dos con el Producto, antes de iniciar el abastecimiento. El fabricante debería contar con las instalaciones y la capacidad de procesamiento que le permitan cumplir el acuerdo según las especificaciones acordadas. Cuando se modifiquen los requisitos determinados en la sección Determinación de Requisitos Relacionados con el Producto, esta revisión debería repetirse antes de reiniciar el abastecimiento.
USP 39
Información General/ (1078) Buenas Prácticas de Fabricación 1231
COMUNICACIÓN CON EL CLIENTE Se debería estipular la provisión de comunicados precisos y pertinentes al cliente. Las copias maestras de documentos tales como especificaciones e informes técnicos deberían ser documentos controlados. Se debería estipular cómo responder las preguntas del cliente, contratos y requisitos para el manejo de órdenes. La retroalimentación y quejas del cliente deberían quedar documentadas. Se debería notificar a los clientes acerca de cambios significativos (ver también el apartado anterior, Control de Cambios, en la sección Recomendaciones sobre Documentación en Sistema de Gestión de Calidad: Sistemas de Calidad de Excipientes). DISEÑO Y DESARROLLO La norma ISO 9001 incluye requisitos para asegurar el control sobre las actividades de diseño y desarrollo. Es recomendable que las empresas implicadas en tales actividades cumplan con los requisitos de la norma ISO 9001. No siempre es posible aplicar la totalidad de las GMP durante el diseño y desarrollo de nuevos excipientes y/o procesos de fabricación. Sin embargo, las partidas de desarrollo de excipientes destinadas para su uso en productos farmacéuticos deberían fabricarse de conformidad con las disposiciones aplicables de este capítulo.
Compras PROCESO DE COMPRAS El fabricante de excipientes debería contar con un sistema de selección y aprobación de proveedores de materiales y servicios críticos para la calidad (por ejemplo, fabricantes o laboratorios subcontratistas). La aprobación del proveedor por parte del departamento de calidad debería requerir una evaluación del sistema de gestión de calidad del proveedor, que incluya la evidencia adecuada de que puede cumplir sistemáticamente con las especificaciones acordadas y mantener la rastreabilidad. Esto puede requerir auditorías periódicas a las intalaciones de fabricación del proveedor. Se deberían mantener registros sobre estas actividades. Los materiales deberían adquirirse según la especificación acordada de proveedores aprobados. INFORMACIÓN DE COMPRAS Los contratos de compras deberían describir el material o servicio ordenado, incluyendo, cuando sean críticos para la calidad del excipiente, lo siguiente: • el nombre, tipo, clase, estilo, grado, número de código del artículo u otra información de identificación precisa que permita el rastreo a las especificaciones de la materia prima y el envase, • diseños, requisitos de procesamiento, instrucciones de inspección y demás datos técnicos pertinentes, incluyendo los requisitos para la aprobación o calificación del producto, procedimientos, equipos de procesamiento y personal, • adhesión a las secciones correspondientes de este capítulo de fabricantes o laboratorios pertinentes contratados, y • una declaración para notificar al fabricante de excipientes sobre cambios significativos en materias primas críticas para la calidad. VERIFICACIÓN DE PRODUCTOS COMPRADOS Deberían existir procedimientos para la aprobación y liberación de material crítico para la calidad. Cuando se reciben, los materiales críticos para la calidad deberían permanecer en cuarentena y no deberían usarse antes de su aprobación. Se puede establecer un sistema de cuarentena eficaz mediante etiquetas o signos de identificación adecuados y/u otros sistemas manuales de documentación. Cuando el sistema de cuarentena y el control de las existencias se gestionan mediante sistemas computarizados en vez de un control físico de las existencias, los sistemas de control deberían prevenir el uso de material no liberado. El sistema de cuarentena puede no ser factible para materiales suministrados a través de duetos. Para estos casos, el fabricante de excipientes debería establecer un acuerdo con el proveedor de tal manera que se notifique al fabricante sobre el material que no cumpla con la especificación. Las actividades de muestreo deberían realizarse bajo condiciones definidas, de conformidad con un método de muestreo predeterminado y utilizando procedimientos diseñados para prevenir la contaminación y la contaminación cruzada. Los materiales críticos para la calidad usados en la fabricación de un excipiente deberían analizarse o verificarse de otro modo antes de su uso. La verificación debería incluir la disponibilidad y una verificación del certificado de análisis del proveedor y, si fuera factible, al menos una prueba de identificación. El plan de análisis debería organizarse de tal forma que se diferencien las pruebas de rutina de aquellas que se realizan con poca frecuencia o únicamente para nuevos proveedores. La entrega de productos a granel debería someterse a controles adicionales para asegurar la pureza y ausencia de contaminación en el material (por ejemplo, uso de camiones cisterna especiales (dedicados), sellos que evidencian su alteración intencional, certificados de limpieza, pruebas analíticas o auditorías del proveedor). Estos procedimientos, actividades y resultados deberían quedar documentados.
1232 (1078) Buenas Prácticas de Fabricación / Información General
Producción
USP 39
y Prestación de Servicios
CONTROL DE PRODUCCIÓN Y PRESTACIÓN DE SERVICIOS Las actividades de producción deberían realizarse bajo condiciones controladas (ver también el apartado anterior, Planeación de la Realización del Producto en Realización del Producto). Las siguientes secciones presentan ejemplos específicos de controles importantes, algunos de los cuales pueden no aplicar para todos los fabricantes de excipientes. INSTRUCCIONES Y REGISTROS DE PRODUCCIÓN Las instrucciones y registros de producción son necesarios, aunque pueden variar dependiendo del tipo de operación: por ejemplo, procesos por partidas frente a procesos continuos. Debería existir un documento controlado en el que se describa la forma como se produce el excipiente (por ejemplo, instrucciones maestras de producción, registros maestros de producción y control o definiciones de procesos). Para procesos por partidas, debería porporcionarse al área de producción una reproducción exacta de las instrucciones maestras de producción pertinentes. Para procesos continuos, debería contarse con un libro de registro de procesamiento. Deberían existir registros disponibles para cada partida de excipiente producida, que deberían incluir información completa relacionada con la producción y control de cada partida. Para procesos continuos, la partida y sus registros deberían estar definidos (por ejemplo, basados en el tiempo o una cantidad definida). Los registros pueden mantenerse en diferentes lugares pero de un modo que permita recuperarlos rápidamente. Cuando los registros, tanto para procesos por partidas como para continuos, sean críticos para la calidad del excipiente, deberían incluir lo siguiente: • fecha y hora en que se completó cada etapa o registro de fecha y hora de parámetros fundamentales, • identificación de personas que realizan y supervisan o verifican directamente cada etapa, operación o parámetro de control importante, • identificación de los principales equipos y líneas utilizados, • datos sobre materiales para permitir la rastreabilidad: por ejemplo, número de partida y cantidades de materias primas/ productos intermedios y la hora en que se agregaron, • resultados de controles de proceso y de laboratorio, • la cantidad producida para la partida definida y una declaración del porcentaje de rendimiento teórico, a menos que no sea cuantificable (por ejemplo, como sucede en algunos procesos continuos), • inspección del área de envasado y etiquetado antes y después de su uso, • registros de control de etiquetado, • descripción de envases y cierres del excipiente, • descripción del muestreo realizado, • fallas, desviaciones y sus investigaciones, • resultados de la inspección del producto final. LIMPIEZA DE EQUIPOS El fabricante de excipientes debería diseñar y justificar procedimientos de limpieza y sanitización y ofrecer pruebas de su efectividad. En plantas multipropósito, se puede emplear el enfoque de producto modelo (grupos de producto de tipo similar) para justificar un procedimiento adecuado. Los procedimientos de limpieza y sanitización deberían quedar documentados y estar lo suficientemente detallados para permitir a los operadores limpiar cada tipo de equipo de manera reproducible y eficaz. Debería generarse un registro que confirme que se ha cumplido con estos procedimientos. El equipo y los utensilios se deben limpiar y sanitizar cuando sean críticos para la calidad del excipiente, a intervalos adecuados para evitar la contaminación y la contaminación cruzada del excipiente. El estado de limpieza del equipo debería quedar adecuadamente documentado. Cuando se usa un equipo multipropósito, es importante poder determinar todo uso previo al momento de investigar una contaminación cruzada o la posibilidad de que se produzca dicha contaminación (ver también más adelante en esta sección, Registros de Uso del Equipo). El arrastre fortuito de remanentes de material ocurre con frecuencia durante una campaña de producción, y por lo general es aceptable porque normalmente no se requiere la limpieza entre partidas sucesivas del mismo excipiente para mantener los niveles de calidad. Los productos que dejen residuos que no puedan eliminarse de manera efectiva deberían producirse en equipos especiales (dedicados). Para procesamiento continuo, el fabricante debería determinar y justificar la frecuencia en la limpieza del equipo. RECUPERACIÓN DE DISOLVENTES, LICORES MADRE Y CRISTALIZACIONES DE SEGUNDAS COSECHAS Cuando los disolventes se recuperan y reutilizan en el mismo proceso o en procesos diferentes, aquellos deberían cumplir con las normas apropiadas antes de reutilizarlos o mezclarlos con otro material aprobado. Resulta frecuente la reutilización de licores madre o filtrados que contienen cantidades recuperables de excipientes, reactantes o productos intermedios. Tales procesos deberían quedar documentados en los registros o libros de producción para permitir su rastreabilidad.
USP 39
Información General/ (1078) Buenas Prácticas de Fabricación 1233
MEZCLA DURANTE EL PROCESO La mezcla durante el proceso para garantizar la uniformidad de la partida o para facilitar su procesamiento debería controlarse y documentarse. Si el objetivo de la operación es garantizar la uniformidad de la partida, aquella debería realizarse de tal forma que se asegure la mezcla homogénea de los materiales hasta el grado que sea factible y debería poder reproducirse en cada partida. CONTROL DE PROCESO Se deberían realizar inspecciones y pruebas durante el proceso basándose en el monitoreo del proceso o en el análisis de una muestra en lugares y tiempos definidos. Los métodos de muestreo deberían estar documentados para garantizar que la muestra es representativa y está claramente etiquetada. Las muestras del proceso no deberían ser devueltas a producción para su incorporación en la partida final. Los resultados de las pruebas del proceso deberían quedar registrados y deberían cumplir con los parámetros del proceso establecidos o con tolerancias aceptables. Las instrucciones de trabajo deberían definir el procedimiento a seguir e indicar cómo utilizar los datos de inspección y prueba para controlar el proceso. Deberían definirse acciones a realizar cuando los resultados queden fuera de los límites especificados. Cuando la aprobación para continuar con el proceso se emite dentro del departamento de producción, las pruebas especificadas deberían ser realizadas por personal capacitado y los resultados registrados. ENVASADO Y ETIQUETADO Se deberían emplear procedimientos para proteger la calidad y pureza del excipiente en el momento del envasado y para garantizar que se aplique la etiqueta correcta a todos los envases. Las operaciones de envasado y etiquetado deberían estar diseñadas para evitar mezclas. Deberían implementarse procedimientos para garantizar la impresión y emisión de las etiquetas correspondientes y que las etiquetas contengan la información correcta. El procedimiento también debería especificar la inmediata destrucción o devolución al almacenamiento controlado de las etiquetas excedentes. Las etiquetas excedentes que lleven números de partida deberían ser destruidas. Las instalaciones de envasado y etiquetado deberían inspeccionarse inmediatamente antes de su uso para garantizar que se hayan retirado los materiales no requeridos para la próxima operación de envasado. Para los casos en que los excipientes se etiquetan en la línea de envasado, se envasan en bolsas preimpresas, o se envían a granel en camiones cisterna, debería existir documentación del sistema utilizado para cumplir con el propósito de los procedimientos indicados anteriormente. REGISTROS DE USO DEL EQUIPO Se deberían mantener registros de uso del equípo crítico para la calidad, los cuales deberían contribuir a determinar la secuencia de las actividades de limpieza, mantenimiento y producción. VALIDACIÓN DE PROCESOS PARA PRODUCCIÓN Y PRESTACIÓN DE SERVICIOS Un factor importante para garantizar la calidad del producto radica en el diseño y control adecuados de los procesos de fabricación, debido a que el análisis del producto por sí solo no es suficiente para revelar variaciones que pudieran haber ocurrido. Cada etapa de proceso de fabricación debería controlarse en la medida necesaria para garantizar que el excipiente cumple con las especificaciones establecidas. El concepto de validación del proceso es un elemento básico para garantizar el cumplimiento de estas metas de garantía de calidad. Las reacciones del proceso, los parámetros operativos, las etapas de purificación, las impurezas y las pruebas fundamentales necesarias para el control del proceso deberían quedar documentados, con lo que se proporcionaría la base para la validación. El fabricante de excipientes no siempre puede llevar a cabo el programa de validación completo que generalmente se emplea en la industria farmacéutica; sin embargo, el fabricante de excipientes debería demostrar la operación sistemática de cada proceso de fabricación: por ejemplo, a través de informes de estudios de capacidad de proceso, de desarrollo y de cambio de escala.
Identificación y Rastreabilidad RASTREABILIDAD Todos los artículos críticos para la calidad (por ejemplo, materias primas, materiales del envase, productos intermedios y excipientes terminados) deberían estar claramente identificados y deberían ser rastreables por medio de registros. Estos registros deberían permitir la rastreabilidad del excipiente durante las etapas anteriores y posteriores del proceso. La identificación de las materias primas utilizadas en los procesos de producción por partidas debería ser rastreable mediante el uso de un sistema de numeración de partidas u otro sistema apropiado. La identificación de materias primas usadas en excipientes producidos me-
1234 (1078) Buenas Prácticas de Fabricación / Información General
USP 39
diante procesamiento continuo debería indicar el período durante el cual una partida (lote) particular de materia prima fue procesado en la planta. Los fabricantes de excipientes también deberían tener conocimiento adecuado acerca del origen de cualquier materia prima derivada de plantas o animales. En ocasiones, las materias primas, incluidos disolventes, se almacenan en tanques para productos a granel u otros contenedores de gran tamaño, lo que dificulta la separación precisa de partidas. No obstante, el uso de tales materiales y contenedores debería quedar documentado en los registros de producción. ESTADO DE INSPECCIÓN Y PRUEBAS Debería contarse con un sistema para identificar el estado de la inspección de todos los artículos críticos para la calidad, incluidas las materias primas, materiales del envase, productos intermedios y excipientes terminados. Aunque se prefiere almacenar los materiales en lugares debidamente definidos, cualquier medio que identifique claramente el estado de la prueba es satisfactorio. La alimentación continua de materiales puede requerir de consideraciones especiales para cumplir con estos requisitos. ETIQUETADO El etiquetado para envases de excipientes está sujeto a requisitos reglamentarios nacionales e internacionales, que pueden incluir medidas de transporte y seguridad. Las etiquetas deben incluir, como mínimo, lo siguiente: • el nombre del excipiente y el grado, si corresponde, • el nombre del fabricante del excipiente y/o del distribuidor, • el número de partida a partir del cual se puedan determinar los antecedentes completos de la partida, • condiciones especiales de almacenamiento, si corresponde. PROPIEDAD DEL CLIENTE El fabricante de excipientes debería establecer y mantener procedimientos para verificar, almacenar y mantener los materiales provistos por el cliente destinados a incorporarse en el excipiente del cliente. La verificación por parte del fabricante no exime al cliente de la responsabilidad de suministrar material aceptable. Se debería registrar e informar al cliente de cualquier material perdido, dañado o inadecuado para su uso. En este caso, deberían existir procedimientos para el desecho y el reemplazo aceptables del material. El fabricante debería establecer disposiciones para proteger toda otra propiedad real e intelectual suministrada por el cliente (por ejemplo, equipos de prueba, métodos de prueba y especificaciones).
Conservación del Producto MANIPULACIÓN, ALMACENAMIENTO Y CONSERVACIÓN Todos los excipientes, productos intermedios y materias primas deberían manipularse y almacenarse bajo condiciones apropiadas de temperatura, humedad y luz, de modo tal que no se vean afectadas su identidad, calidad y pureza. Se acepta el almacenamiento exterior de materias primas (por ejemplo, ácidos, otras sustancias corrosivas y materiales explosivos) o excipientes, siempre que los recipientes ofrezcan protección adecuada contra el deterioro o la contaminación de sus contenidos, que sus etiquetas de identificación se mantengan legibles y que los recipientes se limpien adecuadamente antes de abrirlos y usarlos. Se deberían mantener registros de las condiciones de almacenamiento si aquellas fueran críticas para el cumplimiento continuo del material con las especificaciones. SISTEMAS DE ENVASE Un sistema de envase de excipientes debería incluir las siguientes características: • especificaciones escritas y métodos de examinación y de prueba, • procedimientos de limpieza, cuando se reusen los envases, • sellos que evidencian su alteración intencional, • envases que ofrezcan protección adecuada contra el deterioro o la contaminación del excipiente durante el transporte y almacenamiento recomendado, • envases que no contaminen o interactúen con el excipiente, • procedimientos de almacenamiento y manipulación que protejan a los envases y cierres, que minimicen el riesgo de contaminación, daños o deterioro y que eviten confusiones (por ejemplo, entre envases con especificaciones diferentes pero que presentan apariencia similar). Si se reutilizan envases retornables de excipientes, el etiquetado anterior debería eliminarse o borrarse. Si los envases se reutilizan únicamente para el mismo excipiente, se deberían eliminar o borrar por completo los números anteriores de partida o la etiqueta en su totalidad.
USP 39
Información General/ (1078) Buenas Prácticas de Fabricación 1235
ENTREGA Y DISTRIBUCIÓN La identificación y rastreabilidad de aspectos criticas para la calidad constituyen requisitos para los fabricantes de excipientes. Se deberían mantener registros de distribución de envíos de excipientes, los cuales deberían identificar, por partida de excipiente, a dónde y a quién se le envió el excipente, la cantidad enviada y la fecha del envío, de tal manera que se facilite la recuperación en caso necesario. Cuando los excipientes son manipulados por una serie de distribuidores diferentes, debería ser posible rastrearlos hasta el fabricante original, y no únicamente hasta el proveedor anterior. El fabricante debería mantener la integridad y la calidad del producto después de la inspección y prueba finales. Cuando se especifique mediante un contrato, esta protección debería ampliarse para incluir la entrega al destino final. Los excipientes deberían suministrarse únicamente dentro de su período de expiración y/o reanálisis. CONTROL DE DISPOSITIVOS DE MEDICIÓN Y MONITOREO El equipo de medición y prueba, incluidos los sistemas computarizados, identificados como críticos para la calidad, deberían ser calibrados y sometidos a mantenimiento. Esto incluye instrumentos usados durante el proceso y equipos de prueba usados en el laboratorio. El programa de control debería incluir la estandarización o calibración de instrumentos y equipos a intervalos adecuados de acuerdo con un programa establecido y por escrito. Este programa debería contener instrucciones específicas, cronogramas, límites de exactitud y precisión y disposiciones para acciones correctivas en caso de que no se cumpla con los límites de exactitud o precisión. Los estándares de calibración deberían ser rastreables a estándares nacionales reconocidos o estándares farmacopeicos, según corresponda. No deberían utilizarse instrumentos y equipos que no cumplan con las especificaciones establecidas, y se debería investigar la validez de los resultados previos desde la última calibración exitosa. Los usuarios deberían poder conocer y verificar el estado actual de calibración de los equipos críticos para la calidad.
MEDICIONES, ANÁLISIS Y MEJORAMIENTO La organización debería planear e implementar actividades de monitoreo, medición y mejoramiento requeridas para demostrar el cumplimiento del excipiente con los requisitos del cliente y para garantizar el cumplimiento del sistema de gestión de calidad con este capítulo. La organización debería evaluar oportunidades de mejoramiento a través de la medición y análisis de tendencias de productos y procesos.
Monitoreo y Medición SATISFACCIÓN DEL CLIENTE El fabricante de excipientes debería establecer actividades de medición para evaluar la satisfacción del cliente. Dichas mediciones pueden incluir quejas del cliente, devolución de excipientes y retroalimentación del cliente. Esta información debería impulsar actividades que fomenten el mejoramiento continuo de la satisfacción del cliente. AUDITORÍA INTERNA El fabricante de excipientes debería llevar a la práctica un sistema integral de auditorías internas de calidad planificadas y documentadas para determinar si las actividades vinculadas a la calidad cumplen las disposiciones planificadas y para determinar la eficacia del sistema de gestión de calidad. Las auditorías se deberían programar basándose en el estado y la importancia de la actividad. Las auditorías y las acciones de seguimiento se deberían llevar a cabo conforme a procedimientos documentados. Los resultados de las auditorías se deberían documentar y discutir con el personal de la gerencia responsable del área auditada. El personal de la gerencia responsable del área auditada debería tomar medidas correctivas respecto a las deficiencias encontradas. El Apéndice 1. Consideraciones sobre Auditoría resultará de ayuda para establecer un programa de auditorías internas. MONITOREO Y MEDICIÓN DE PROCESOS El fabricante de excipientes debería identificar las pruebas y mediciones necesarias para controlar de forma adecuada los procesos de fabricación y del sistema de gestión de calidad. Cuando sea crítico para la calidad del excipiente, se deberían establecer técnicas para verificar que los procesos se encuentran bajo control. Cuando ocurran desviaciones de los resultados planeados, se deberían tomar acciones correctivas para garantizar que el excipiente cumple con los requisitos. Se deberían realizar revisiones periódicas de indicadores fundamentales tales como atributos de calidad del proceso y fallas en el mismo a fin de evaluar la necesidad de mejoras.
1236 (1078) Buenas Prácticas de Fabricación / Información General
USP 39
MONITOREO Y MEDICIÓN DE PRODUCTOS El fabricante de excipientes debería establecer métodos y procedimientos de prueba para garantizar que el producto cumple de manera constante con las especificaciones. Deberían adaptarse métodos analíticos para tales propósitos. Los métodos analíticos pueden ser aquellos incluidos en la edición vigente de la farmacopea correspondiente u otra norma aceptada. Pueden usarse también métodos no farmacopeicos. Si el fabricante de excipientes indica que su producto cumple con una farmacopea o un compendio oficial, en ese caso • se debería demostrar que las pruebas analíticas no farmacopeicas son equivalentes a las de los compendios; • el producto debería cumplir con los capítulos y advertencias generales aplicables de la USP. CONTROLES DE LABORATORIO Los controles de laboratorio deberían incluir datos completos a partir de las pruebas requeridas para garantizar el cumplimiento con las especificaciones y normas, incluyendo lo siguiente: • una descripción de la muestra recibida para el análisis, junto con el nombre del material, un número de lote u otro código distintivo y la fecha en que se tomó, • una declaración con referencia a cada método de prueba empleado, • un registro de los datos crudos obtenidos en cada prueba, incluyendo gráficas, cromatogramas, diagramas y espectros de los instrumentos de laboratorio, identificados para mostrar el material y partida específicos analizados, • un registro de los cálculos realizados relacionados con la prueba, • resultados de las pruebas y la manera en que se comparan con las especificaciones establecidas, • un registro de la persona que realizó cada prueba y la(s) fecha(s) de realización de las pruebas. Debería existir un procedimiento documentado para la preparación de reactivos y soluciones de laboratorio. Los reactivos y soluciones adquiridas de una fuente externa deberían etiquetarse con el nombre, concentración y fecha de expiración adecuados. Deberían conservarse registros de la preparación de soluciones que incluyan el nombre de la solución, la fecha de preparación y las cantidades de material empleado. Las soluciones volumétricas deberían normalizarse de acuerdo con un método interno o utilizando un estándar reconocido. Deberían conservarse registros de la normalización. Siempre que se utilicen, los reactivos y estándares de referencia primarios deberían almacenarse adecuadamente y no sería necesario analizarlos al momento de recibirlos, siempre que se cuente con un certificado de análisis del proveedor. Los estándares de referencia secundarios deberían ser preparados, identificados, analizados, aprobados y almacenados de manera adecuada. Debería existir un procedimiento documentado para la calificación de estándares de referencia secundarios frente a estándares de referencia primarios. Se debería definir un período de reevaluación para los estándares de referencia secundarios y cada partida debería ser recalificada periódicamente de acuerdo con un protocolo o procedimiento documentado. ANÁLISIS Y LIBERACIÓN DE EXCIPIENTES TERMINADOS El análisis de excipientes terminados debería realizarse a cada partida para garantizar que el excipiente cumple con las especificaciones documentadas. Debería existir un procedimiento para garantizar que la documentación de fabricación apropiada, además de los resultados de prueba, sea evaluada antes de liberar el excipiente terminado. La responsabilidad relacionada con la liberación del excipiente terminado debería recaer sobre el departamento de calidad. Para excipientes producidos mediante procesos continuos, es posible garantizar que el excipiente cumple con las especificaciones documentadas a través de los resultados de pruebas de proceso u otros registros de control de proceso. RESULTADOS DE PRUEBA FUERA DE ESPECIFICACIONES Los resultados de pruebas fuera de especificaciones (OOS, por sus siglas en inglés) deberían ser investigados y documentados de acuerdo con un procedimiento documentado. Los resultados de las muestras reanalizadas pueden usarse para reemplazar a los resultados de prueba originales únicamente si se demuestra con fundamentos basados en una investigación documentada que el resultado original es erróneo. Cuando se utilizan análisis estadísticos, deben incluirse tanto los datos originales como los del reanálisis. El procedimiento para OOS debería definir las técnicas estadísticas a utilizar y sus circunstancias de uso. Los mismos principios se aplican cuando se sospecha que la muestra no es representativa del material del que se tomó. MUESTRAS RETENIDAS Cuando resulte posible, se debería retener una muestra representativa de cada partida de excipiente. El período de retención debería ser adecuado a la fecha de expiración o de reevaluación. Las muestras retenidas deberían almacenarse y conservarse de tal forma que se puedan recuperar fácilmente en instalaciones que ofrezcan un ambiente adecuado. El tamaño de la muestra debería ser de al menos dos veces la cantidad requerida para llevar a cabo un análisis completo de las especificaciones.
USP 39
Información General/ (1078) Buenas Prácticas de Fabricación 1237
CERTIFICADOS DE ANÁLISIS La organización debería proveer certificados de análisis de las especificaciones requeridas para cada partida de excipiente. IMPUREZAS Cuando sea posible, los fabricantes de excipientes deberían identificar y establecer límites apropiados para impurezas. Los límites se deberían basar en datos de seguridad adecuados, límites descritos en compendios oficiales o en otros requisitos, así como en consideraciones estrictas de GMP. Los procesos de fabricación se deberían controlar adecuadamente de tal manera que las impurezas no excedan de tales límites establecidos. Muchos excipientes se extraen o se purifican usando disolventes orgánicos. Estos disolventes generalmente se eliminan mediante secado. Es importante que las especificaciones del excipiente incluyan pruebas y límites para disolventes residuales. ESTABILIDAD Aunque muchos excipientes son estables y pueden no requerir de pruebas exhaustivas para garantizar su estabilidad, la estabilidad de los excipientes es un factor importante que contribuye a la calidad general del producto farmacéutico. Para excipientes que hayan estado en el mercado durante mucho tiempo, se pueden usar los datos históricos para indicar la estabilidad. Cuando no existan datos históricos, se debería realizar un análisis y/o un programa de evaluación documentados, diseñados para evaluar las características de estabilidad del excipiente. Los resultados de dicho análisis y/o evaluación de estabilidad se deberían usar para determinar las condiciones de almacenamiento y las fechas de reanálisis o expiración adecuadas. El programa de análisis debería incluir lo siguiente: • el número de partidas, tamaños de las muestras e intervalos de pruebas, • condiciones de almacenamiento de muestras retenidas para análisis, • métodos de prueba adecuados que sean indicativos de estabilidad, • almacenamiento del excipiente en envases que simulen el envase comercial, cuando sea posible. La estabilidad de los excipientes puede verse afectada por cambios no detectados en materias primas o cambos sutiles en los procesos de fabricación o condiciones de almacenamiento. Es posible que el transporte de los excipientes se realice en distintos tipos de envases que puedan afectar su estabilidad (por ejemplo, frascos de plástico o vidrio, tambores de metal o plástico, bolsas, camiones cisterna u otros envases de productos a granel). Algunos excipientes pueden estar disponibles en diferentes grados (por ejemplo, diversos pesos moleculares de un polímero o diferentes proporciones de monómeros, diferentes tamaños de partícula o densidades aparentes) o pueden ser mezclas de otros excipientes. Estos excipientes pueden ser muy similares a otros dentro de un grupo de productos. Pequeñas diferencias cuantitativas de algunos de los componentes pueden ser la única variación significativa entre un producto y otro. Para estos tipos de excipientes, puede ser apropiado un enfoque de producto modelo para evaluar la estabilidad de excipientes similares. Los estudios de estabilidad de este tipo deberían comprender la selección de varios productos modelo que se esperaría simulen la estabilidad del grupo de producto en evaluación. Esta selección se debería fundamentar en criterios científicos sólidos y quedar documentada. Se pueden usar los datos de estudios de estabilidad de estos productos modelo para determinar la estabilidad teórica de productos similares. PERÍODOS DE EXPIRACIÓN/REANÁLISIS Se debería asignar un período de expiración o reanálisis a cada excipiente y comunicárselo al cliente. Una práctica común consiste en emplear un período de reanálisis en vez de un período de expiración. CONTROL DE UN PRODUCTO QUE NO CUMPLE CON LOS REQUISITOS Toda materia prima, producto intermedio o excipiente terminado que no cumpla con las especificaciones debería ser claramente identificado y controlado para evitar su uso inadvertido o su liberación para venta. Se debería mantener un registro de productos que no cumplen con los requisitos. Toda incidencia de falta de cumplimiento con los requisitos se debería investigar para identificar la causa. Esta investigación debería quedar documentada y deberían tomarse acciones para evitar la repetición del problema. Se debería contar con un procedimiento documentado en el que se defina la forma en que debe realizarse y registrarse la recuperación de un excipiente de la cadena de distribución. Se debería contar con procedimientos para la evaluación y eliminación subsiguiente de productos que no cumplen con los requisitos. Los productos que no cumplen con los requisitos deberían ser revisados de acuerdo con los procedimientos documentados para determinar si es posible • reprocesarlo o reelaborarlo para que cumpla con los requisitos especificados, • que sea aceptado por el cliente, con su consentimiento, • cambiarle su grado y emplearlo en otras aplicaciones, • destruirlo.
1238 (1078) Buenas Prácticas de Fabricación / Información General
USP 39
REPROCESAMIENTO La repetición de una actividad que es parte normal del proceso de fabricación (reprocesamiento) debería ocurrir únicamente cuando ya se haya documentado que el excipiente se puede fabricar de tal manera. En cualquier otro caso, se debería cumplir con la guía de reelaboración. REELABORACIÓN Cualquier actividad que no sea parte normal del proceso de fabricación (reelaboración) se debería realizar únicamente siguiendo una revisión documentada de los riesgos para la calidad del excipiente y con la aprobación del departamento de calidad. Al evaluar los riesgos, se debería considerar lo siguiente, según corresponda: • nuevas impurezas que pudieran haberse introducido como resultado de la reelaboración, • análisis adicionales para controlar la reelaboración, • registros y rastreabilidad hasta las partidas originales, • criterios de aceptación adecuados para el excipiente reelaborado, • impacto sobre la estabilidad o la validez del intervalo de reevaluación, • desempeño del excipiente. Cuando se determina que es necesario reelaborar un excipiente, se requiere investigar y evaluar las causas. La equivalencia de la calidad del material reelaborado con el material original también debería ser evaluada y documentada para garantizar que la partida cumplirá con las especificaciones y características establecidas. Las partidas de excipientes que no cumplan con las especificaciones de manera individual no deben mezclarse con otras partidas que cumplan con los requisitos en un intento de ocultar material adulterado o que no cumple totalmente con la norma. EXCIPIENTES DEVUELTOS Los excipientes devueltos se deberían identificar y colocar en cuarentena hasta que el departamento de calidad haya completado una evaluación de su calidad. Se debería contar con procedimientos para la retención, análisis, reprocesamiento y reelaboración del excipiente devuelto. Se deberían mantener registros para productos devueltos, que deberían incluir el nombre y el número de partida del excipiente, el motivo de la devolución, la cantidad devuelta y la disposición final del excipiente devuelto. ANÁLISIS DE DATOS El fabricante de excipientes debería desarrollar métodos para evaluar la efectividad de su sistema de gestión de calidad y emplear tales datos para identificar oportunidades de mejoramiento. Estos datos se pueden derivar de quejas de clientes, revisiones de productos, estudios de capacidad de procesamiento, auditorías internas y auditorías del cliente. El análisis de tales datos se puede utilizar como parte de la revisión gerencial (ver también el apartado anterior, Revisión Gerencial en la sección Responsabilidad Gerencia0. Se puede llevar a cabo una revisión periódica de indicadores fundamentales tales como atributos de calidad de productos, quejas de los clientes y falta de cumplimiento de los productos con las especificaciones para evaluar la necesidad de mejoramiento.
Mejoramiento MEJORAMIENTO CONTINUO El fabricante de excipientes debería tomar medidas en favor del mejoramiento continuo de los procesos de fabricación y del sistema de gestión de calidad. Con el fin de identificar oportunidades de mejoramiento continuo, se puede considerar el análisis de los siguientes indicadores de rendimiento: • causas de la falta de cumplimiento del producto con sus especificaciones, • resultados de auditorías internas y externas, • devoluciones y quejas de los clientes, • fallas operativas y del proceso. Acciones Correctivas-El fabricante de excipientes debería establecer, documentar y mantener procedimientos para: • determinar las causas primarias que ocasionan la falta de cumplimiento con las especificaciones, • garantizar la implementación y efectividad de las acciones correctivas, • implementar y registrar cambios en los procedimientos que resulten de las acciones correctivas. Acciones Preventivas-El fabricante de excipientes debería establecer, documentar y mantener procedimientos para: • emprender acciones preventivas para afrontar problemas al nivel correspondiente a los riesgos, • implementar y registrar cambios en los procedimientos que resulten de las acciones preventivas.
USP 39
Información General/ (1078) Buenas Prácticas de Fabricación 1239
GLOSARIO Los siguientes términos se definen según se utilizan en este capítulo. Siempre que fue posible, se emplearon las definiciones utilizadas por la Conferencia Internacional sobre Armonización como base para este apéndice de definiciones. Alta Gerencia: persona o grupo de personas que dirigen y controlan una organización al nivel más alto. El nivel más alto puede ser tanto a nivel del sitio o a nivel corporativo y dependerá de la manera en que esté organizado el sistema de gestión de calidad. Archivo Maestro de un Fármaco (Drug Master File o DMF): información detallada acerca de la fabricación de un excipiente presentada a la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (U.S. Food and Drug Administration o FDA). Calibración: demostración de que un instrumento o dispositivo de medición particular genera resultados dentro de los límites especificados al compararlos con los resultados producidos por un estándar rastreable o de referencia sobre un intervalo apropiado de mediciones. CEP (Certificado de Aptitud de la Farmacopea Europea): certificación otorgada a fabricantes individuales por la Dirección Europea para la Calidad de los Medicamentos (European Directorate for the Quality of Medicines o EDQM) cuando se determina que un excipiente o ingrediente activo específico cumple con una monografía de la Farmacopea Europea. Certificado de Análisis: documento que cita los métodos de prueba, especificaciones y resultados del análisis de una muestra representativa de la partida a que se va a liberar. Cliente: organización que recibe el excipiente una vez que éste ha quedado fuera del control del fabricante del excipiente; incluye intermediarios, agentes y usuarios. Contaminación: introducción indeseada de impurezas de origen químico o microbiológico o de materia extraña en una materia prima, producto intermedio o excipiente durante la producción, muestreo, envasado o reenvasado, almacenamiento o transportación. Contaminación Cruzada: contaminación de un material o producto con otro material o producto. Control de Calidad: verificaciones o pruebas de que se cumple con las especificaciones. Controles/Pruebas de Proceso: controles efectuados durante la producción para monitorear y, si fuera apropiado, ajustar el proceso y/o asegurar que el producto intermedio o el excipiente cumpla con su especificación. Criterios de Aceptación: límites numéricos, intervalos u otras medidas de aceptación adecuadas para los resultados de pruebas. Crítico: etapa de proceso, condición de proceso, requsito de prueba u otro parámetro o punto relevante que se debe controlar dentro los criterios predeterminados para asegurar que el excipiente cumpla con su especificación. Crítico para la Calidad: describe un material, etapa de proceso o condición de proceso, requisito de prueba u otro parámetro relevante que influye directamente sobre los atributos de calidad del excipiente y que se debe controlar dentro de los criterios predeterminados. Cuarentena: estado de los materiales aislados físicamente o mediante cualquier otro método efectivo mientras se espera una decisión sobre su aprobación o rechazo subsiguiente. Desviación: apartamiento de una instrucción aprobada o norma establecida. Especificaciones: lista de pruebas, referencias a procedimientos analíticos y criterios de aceptación apropiados que representan límites numéricos, intervalos u otros criterios para las pruebas descritas para un material. Estabilidad: cumplimiento constante del excipiente con sus especificaciones. Excipiente: toda sustancia distinta del API que ha sido evaluada de manera apropiada respecto a su seguridad y que se incluye intencionalmente en un sistema de liberación de fármacos. Fecha de Caducidad (Expiración): fecha que designa el tiempo durante el cual se espera que el excipiente permanezca dentro de las especificaciones y después de la cual no debería utilizarse. Fecha de Reevaluación (Fecha de Reanálisis): fecha en la que debería reexaminarse el material para asegurar que aún cumple con la especificación. Garantía de Calidad: suma total de planes organizados con el objetivo de garantizar que todos los excipientes tengan la calidad requerida para el uso al que están destinados y que se mantengan los sistemas de calidad. Impureza: componente de un excipiente cuya presencia es indeseada pero que surge como consecuencia del proceso de fabricación. Ingrediente Farmacéutico Activo (API, por sus siglas en inglés): cualquier sustancia o mezcla de sustancias que esté destinada a ser usada en la fabricación de un producto farmacéutico y que, cuando se utiliza en la producción de un medicamento, se convierte en un ingrediente activo del mismo. Tales sustancias están destinadas a proporcionar actividad farmacológica u otro efecto directo en el diagnóstico, cura, alivio, tratamiento o prevención de una enfermedad, o a afectar la estructura o cualquier función del cuerpo humano o de los animales. Instrucción Maestra de Producción (Registro Maestro de Producción y Control): documentación que describe la fabricación del excipiente desde de la materia prima hasta la terminación. Licor Madre: líquido residual que queda después de los procesos de critalización o aislamiento. Lote: Ver Partida. Materia Prima: término general usado para indicar materiales iniciales, reactivos y disolventes destinados al uso en la producción de productos intermedios o excipientes.
1240 (1078) Buenas Prácticas de Fabricación / Información General
USP 39
Material: término general utilizado para indicar materias primas (materiales iniciales, reactivos y disolventes), adyuvantes del proceso, productos intermedios, excipientes, materiales del envase y etiquetado. Material Adulterado: material contaminado con una sustancia extraña o que no ha sido fabricado aplicando GMP. Esta definición no corresponde a materiales que simplemente no cumplen con las especificaciones físicas o químicas. Material de Envase (de Empaque): material destinado a proteger a un producto intermedio o excipiente durante su almacenamiento y transporte. Mezcla: mixtura de diferentes grados en un lote homogéneo. Número de Partida (Número de Lote): combinación única de números, letras y/o símbolos que identifica a una partida y a partir de la cual se puede determinar toda la historia de producción y distribución. Partida (Lote): cantidad específica de material producido en un proceso o serie de procesos de manera tal que se espera que sea homogénea. En un proceso continuo, una partida puede corresponder a una porción definida de la producción. El tamaño de la partida se puede definir mediante una cantidad fija o mediante la cantidad producida en un intervalo fijo de tiempo. Proceso Continuo: proceso que produce continuamente un material a partir del suministro continuo de materias primas. Proceso del Fabricante/de Fabricación: todas las operaciones de recepción de materiales, producción, envasado, reenvasado, etiquetado, reetiquetado, control de calidad, liberación y almacenamiento de excipentes y controles relacionados. Proceso por Partidas (por Lotes): proceso que produce el excipiente a partir de un suministro discreto de materias primas que están presentes antes de completar la reacción. Producción: operaciones involucradas en la preparación de un excipiente, desde la recepción de materiales hasta el procesamiento y envasado del excipiente. Producto Farmacéutico (Medicinal): forma farmacéutica en su envase inmediato final destinada a la comercialización. Producto Intermedio: material que debe someterse a etapas adicionales de fabricación antes de transformarse en un excipiente. Producto Modelo: producto representativo de un grupo de productos similares con respecto a su composición, funcionalidad o especificación. Puesta en Servicio: introducción de un equipo para su uso de manera controlada. Rastreabilidad: capacidad de determinar la historia, aplicación o ubicación que se esté considerando: por ejemplo, el origen de materiales y partes, historia del proceso o distribución del producto después de su liberación. Recuperación: proceso de retiro de un excipiente de la cadena de distribución. Reelaboración: sometimiento de material procesado previamente que no cumplió con las normas o especificaciones a etapas de proceso que son diferentes del proceso normal. Registro: documentación que indica los resultados logrados y/o que proporciona pruebas de las actividades realizadas. Se puede presentar en papel, disco magnético, formato electrónico u óptico, fotográfico o cualquier otro formato o una combinación de los mismos. Registro de Partida o Lote (Batch Record): documentación que proporciona la historia de la fabricación de una partida de excipiente. Reprocesamiento: repetición de una actividad que es parte normal del proceso de fabricación y ha sido previamente documentada. Validación: programa documentado que proporciona un alto nivel de garantía de que un proceso, método o sistema específico producirá constantemente un resultado que cumplirá con los criterios de aceptación predeterminados.
APÉNDICE
Consideraciones sobre Auditoría INTRODUCCIÓN Muchos excipientes se emplean en productos alimenticios, cosméticos e industriales, al igual que en productos farmacéuticos. De este modo, las condiciones ambientales, los equipos y las técnicas operativas empleadas en la fabricación de excipientes son a menudo las que se emplean en la industria química más que en la industria farmacéutica. Los procesos químicos pueden producir impurezas derivadas de reacciones secundarias. Por consiguiente, un cuidadoso control de proceso resulta esencial para minimizar los niveles de impurezas y contaminación. Los excipientes habitualmente se fabrican a gran escala, empleando procesamiento continuo y controles de proceso automatizados. Los equipos de producción y los procesos varían dependiendo del tipo de excipiente a producir, la escala de producción y el tipo de operación (por ejemplo, procesos por partidas frente a procesos continuos). Este apéndice tiene el propósito de ayudar en la preparación de una auditoría de un fabricante de excipientes. Tanto auditores internos como externos (ver también Auditoría Interna en Monitoreo y Medición en la sección Medición, Análisis y Mejoramiento) encontrarán este apéndice útil para identificar asuntos importantes de GMP y calidad que requieren evaluación. Esta sección ayudará a los fabricantes de excipientes a identificar resultados tangibles fundamentales al adoptar las normas de GMP citadas en las otras secciones de este capítulo; en lo que respecta a la planeación de una auditoría, este apéndice también ayudará a verificar la calidad del proceso de fabricación del excipiente y del sistema de gestión de calidad del fabricante.
USP 39
Información General/ (1078) Buenas Prácticas de Fabricación 1241
PRINCIPIOS DE GMP Control de Impurezas y Contaminación: El cliente que usa un excipiente para su producto farmacéutico por lo general no somete al excipiente a etapas adicionales de reacción química o de purificación; el excipiente se utiliza tal como se compra. Por consiguiente, es probable que las impurezas presentes en el excipiente estén presentes en el producto farmacéutico. Si bien los fabricantes de formas farmacéuticas tienen cierto control sobre la calidad del excipiente a través de especificaciones, los fabricantes de excipientes tienen mayor control sobre las características físicas, la calidad y la presencia de impurezas en los excipientes que producen. La contaminación externa del excipiente puede surgir del ambiente de fabricación; sin embargo, los procesos químicos empleados en la fabricación de excipientes habitualmente se llevan a cabo en sistemas cerrados que protegen de dicha contaminación, incluso cuando los recipientes de reacción no están dentro de los edificios. El ambiente externo puede requerir de controles adecuados para evitar la contaminación potencial cuando el excipiente o el material en proceso quedan expuestos. Propiedades y Funcionalidad del Excipiente: Los excipientes se utilizan con frecuencia en aquellos tipos de productos farmacéuticos para los que las características físicas, tales como el tamaño de partícula, pueden ser importantes. Aunque el fabricante de la forma farmacéutica terminada es directamente responsable de identificar las características físicas particularmente requeridas, también es responsabilidad del fabricante de excipientes controlar los procesos de fabricación de excipientes para garantizar el cumplimiento constante con las especificaciones del excipiente. Siempre que sea posible, se debería tener en cuenta el uso final del excipiente. Esto es particularmente importante si el excipiente es un componente directo de un producto farmacéutico estéril o si declara ser libre de pirógenos. Correspondencia entre Fabricación y Control de Cambios: El cabal entendimiento del proceso de fabricación y el control efectivo de cambios son la mejor forma de asegurar la constancia de la calidad del excipiente de una partida a la otra. La implementación de cambios también puede tener consecuencias en los procesos de registro ante agencias reguladoras. Los cambios en los procesos de fabricación de excipientes pueden resultar en cambios de las propiedades físicas o químicas del excipiente que se vuelven evidentes únicamente durante procesamientos subsiguientes o en la forma farmacéutica terminada. Esto es particularmente importante en el contexto del proceso de aprobación del producto farmacéutico cuando se hacen comparaciones de bioequivalencia entre partidas piloto, para estudios clínicos (bio batch) y las partidas de escala comercial. Los cambios realizados al excipiente suministrado para el producto comercial con respecto al excipiente suministrado para el bio batch no deberían afectar la calidad y desempeño del producto farmacéutico comercial. El aumento en escala (scale-up) de las partidas de excipientes hasta la partida de producción comercial puede implicar diversas etapas, pudiéndose requerir de datos para demostrar la correspondencia entre las partidas a lo largo de dicho proceso de aumento de escala. Rastreabilidad: La rastreabilidad de los registros relacionados con las partidas para facilitar investigaciones y recuperaciones de productos, también es un requisito básico de las GMP. APLICACIÓN DE LOS PRINCIPIOS DE GMP Es responsabilidad del fabricante de excipientes designar y documentar los fundamentos para el punto del proceso de fabricación en que resulta adecuado aplicar las GMP. A partir de este punto, se deberían aplicar las GMP apropiadas. El fabricante debería aplicar un nivel de GMP a cada etapa de fabricación directamente relacionado con la importancia que guarda cada etapa en lo que respecta a garantizar la integridad del producto. Esto se puede demostrar utilizando un procedimiento de evaluación de riesgos (por ejemplo, HACCP, FMEA). La rigurosidad de las GMP en la producción de excipientes se debería incrementar a medida que avanza el proceso, desde las etapas iniciales hasta las etapas finales de fabricación, purificación y envasado. El procesamiento físico (por ejemplo, granulado, recubrimiento o manipulaciones físicas del tamaño de partícula, tales como trituración o micronización), así como el procesamiento químico de excipientes, se deberían realizar por lo menos en cumplimiento con las normas sugeridas en este capítulo. Se debería reconocer que no todos los productos intermedios pueden requerir de análisis. No obstante, un fabricante de excipientes debería ser capaz de identificar puntos críticos o fundamentales en el proceso de fabricación en los que se requiere de muestreos y análisis selectivos de productos intermedios para monitorear el desempeño del proceso. CONSIDERACIONES GENERALES SOBRE AUDITORÍA Las auditorías realizadas a una operación de excipientes se verán influenciadas por el propósito de la auditoría y el uso al que está destinado el excipiente. Las etapas fundamentales de un proceso de producción se deberían examinar para determinar si el fabricante controla estas etapas, de tal forma que el proceso se desarrolle en forma constante. En general, una auditoría debería evaluar la capacidad del fabricante de excipientes para entregar un producto que cumpla constantemente con las especificaciones establecidas. El equipo de auditoría puede estar formado por ingenieros, analistas de laboratorio, agentes de compras, expertos en informática, personal de mantenimiento y demás personal que sea apropiado para el alcance y propósito de la auditoría. Los auditores externos deben respetar la confidencialidad del los procesos y otras divulgaciones del fabricante. Una auditoría debería centrarse en las etapas de proceso críticas para la calidad que son necesarias para producir un excipiente que cumpla con los criterios físicos y químicos establecidos. El fabricante de excipientes debería identificar y controlar
1242 (1078) Buenas Prácticas de Fabricación / Información General
USP 39
estas etapas. Las etapas de proceso críticas para la calidad pueden implicar cierto número de operaciones o procesos unitarios. Las etapas críticas para la calidad pueden incluir, aunque no limitarse, a las siguientes: • cambios de fases que involucran a la molécula deseada, disolvente, transportador inerte o vehículo (por ejemplo, disolución, cristalización, evaporación, secado, sublimación, destilación o absorción), • separación de fases (por ejemplo, filtración o centrifugación), • cambios químicos que involucran a la molécula deseada (por ejemplo, eliminación o adición de agua de hidratación, acetilación o formación de una sal), • ajustes de la solución que contiene la molécula (por ejemplo, ajuste del pH), • mediciones precisas de componentes del excipiente, soluciones del proceso y materiales reciclados agregados (por ejemplo, pesada o determinaciones volumétricas), • mezcla de diversos componentes, • cambios que ocurren en el área superficial, tamaño de partícula o uniformidad de la partida {por ejemplo, molienda, aglomeración o mezclado). PUNTOS DE INSPECCIÓN DE UNA AUDITORÍA Un método adecuado para la auditoría de una planta de excipientes consiste en una revisión de las siguientes áreas: • falta de cumplimiento/conformidad-tales como el rechazo de una partida que no cumplió con las especificaciones, quejas de clientes, devolución de un producto por parte del cliente o recuperación de un producto de la cadena de distribución. El fabricante debería haber determinado la causa de la falta de cumplimiento, preparado un informe de la investigación y haber iniciado y documentado la acción correctiva subsiguiente. Se deberían examinar los registros y la documentación para garantizar que la falta de cumplimiento no haya resultado de un proceso deficientemente desarrollado o inconstante; • archivos de quejas de clientes-como informes de que algún aspecto del producto hace que no resulte totalmente adecuado para su uso; estos problemas pueden deberse a impurezas o incongruencias en el proceso de fabricación del excipiente; • libros de registro de control de cambios-para determinar si la empresa evalúa los cambios significativos con el objeto de decidir si es necesario notificar al cliente y/o a la autoridad reguladora; • documentos de las reuniones sobre productos que no cumplen con los requisitos o de la Junta de Revisión de Materiales (Material Review Board) y/o registros equivalentes que demuestren que la disposición de los productos que no cumplen los requisitos se maneja en forma apropiada por el personal responsable; • registros de fórmulas maestras y de producción, para observar revisiones frecuentes que pudieran manifestar problemas en el proceso de producción de excipientes; • evidencia de la presencia de productos intermedios que no hayan reaccionado y de residuos de disolventes en el excipiente terminado; • sistemas de gestión de materiales, para garantizar el control adecuado sobre materiales que no cumplen con los requisitos de tal forma que no se puedan vender a clientes ni utilizarse en la fabricación sin autorización; • revisión del diagrama de flujo del proceso, para ayudar a entender las diversas etapas de procesamiento. Las etapas críticas y los puntos de muestreo se deberían identificar como parte de la revisión de los registros de procesamiento; • revisión de las medidas de control de contaminación. Al evaluar la aptitud de las medidas tomadas para prevenir la contaminación y la contaminación cruzada de materiales durante el proceso, resulta adecuado considerar los siguientes factores de riesgo: • el tipo de sistema (por ejemplo, abierto o cerrado). A menudo, los sistemas cerrados en plantas químicas no están cerrados cuando se cargan y/o cuando se descarga el producto final. Además, en ocasiones se usan los mismos recipientes de reacción para diferentes reacciones; • la forma del material (por ejemplo, húmedo o seco); • la etapa de proceso y uso de los equipos y/o área (por ejemplo, multipropósito o dedicados); • producción continua frente a producción por partidas. REVISIÓN DE DOCUMENTACIÓN Y REGISTROS La documentación requerida para las etapas tempranas del proceso no requiere ser tan exhaustiva como en las etapas finales del mismo. Es importante que exista una cadena de documentos y que dicha cadena esté completa en los siguientes casos: • el excipiente se puede identificar y cuantificar en los procesos en que la molécula se produce durante el transcurso del proceso. Para la producción por partidas, también se puede establecer un balance teórico de masa con límites apropiados, puesto que las desviaciones de las tolerancias resultan un buen indicio de una pérdida de control; • se identifica una impureza u otra sustancia que pueda afectar de manera adversa el perfil de impurezas o la forma de la molécula y se realizan intentos posteriores para eliminarla. A medida que el procesamiento químico avanza, se debería establecer una cadena de documentos que incluya lo siguiente: • un proceso documentado, • la identificación de etapas críticas de procesamiento,
USP 39
Información General/ (1079) Buenas Prácticas de Almacenamiento 1243
• registros de producción apropiados, • registros de números de partidas iniciales y subsiguientes, • registros de materias primas utilizadas, • comparación de resultados de prueba frente a estándares relevantes. Si se registran desviaciones importantes con respecto al proceso de fabricación normal, debería existir evidencia de investigaciones adecuadas, además de una revisión de la calidad del excipiente. Se debería continuar generando documentación completa durante la parte restante del proceso para etapas de proceso críticas para la calidad hasta que el excipiente haya sido envasado y entregado al usuario final. La partida debería ser homogénea dentro de las especificaciones del fabricante. Esto no requiere de la mezcla final del material proveniente de un proceso continuo si los controles de proceso pueden demostrar el cumplimeinto con las especificaciones en toda la partida. Se deberían establecer los siguientes requisitos básicos a fin de promover la uniformidad en las inspecciones de GMP de excipientes: • asignación al excipiente de un número exclusivo de partida que permita rastrearlo a lo largo de la fabricación hasta su liberación y certificación, •controles adecuados para la preparación de un registro de partida destinado a un procesamiento por partidas y/o de un registro de producción, hoja de registro u otra documentación adecuada para un procesamiento continuo, • comprobación de que la partida se ha preparado empleando las guías de GMP desde el punto del procesamiento en el que se determinó que se debían aplicar las GMP de excipientes, • confirmación de que la partida no se combinó con material de otras partidas con el propósito de ocultar o diluir una partida adulterada, • registros que evidencien que se extrajeron muestras de la partida de conformidad con un plan de muestreo que garantice una muestra representativa de la partida, • registros que muestren que la partida ha sido analizada empleando métodos de prueba establecidos científicamente, diseñados para garantizar que el producto cumple con las normas, especificaciones y características establecidas, • datos de estabilidad adecuados que respalden el período de uso indicado del excipiente; estos datos se pueden obtener de datos históricos, estudios reales sobre el excipiente específico o estudios pertinentes de productos modelo que puedan simular razonablemente el desempeño del excipiente específico.
(1079) BUENAS PRÁCTICAS DE ALMACENAMIENTO Y DISTRIBUCIÓN PARA MEDICAMENTOS INTRODUCCIÓN Este capítulo de información general describe buenas prácticas de almacenamiento y distribución para asegurar que los productos farmacéuticos (medicamentos) lleguen al usuario final (profesionales de la salud, pacientes y consumidores) con la calidad intacta. Las siguientes definiciones se aplican en el contexto de este capítulo.
Definiciones Acciones preventivas: Medidas que se adoptan para eliminar la causa de un incumplimiento potencial u otra situación potencial indeseable. Adulteración: Ley de Alimentos, Medicamentos y Cosméticos (FDA FDC Act), Sección. 501 (351 ), Un medicamento o dispositivo se considerará adulterado si (2)(A) Ha sido preparado, envasado o conservado en malas condiciones higiénicas por las que pudiera haberse contaminado con suciedad, o por las que pudiera haber resultado perjudicial para la salud; o (B) el método usado o las instalaciones o controles usados para su fabricación, procesamiento, envasado o conservación no cumplen o no se operan o administran de conformidad con las buenas prácticas de fabricación vigentes para asegurar que dicho fármaco cumple con los requisitos de esta Ley en lo relativo a su seguridad, posee la identidad y el contenido, y cumple con las características de calidad y pureza que pretende o declara poseer. Cadena de suministro: Se refiere a la secuencia continua de entidades que abarcan el ciclo de vida de almacenamiento y distribución de un producto hasta el usuario final. Calidad: Atributos físicos, químicos, microbiológicos, biológicos, de biodisponibilidad y estabilidad que un producto farmacéutico debe mantener a fin de considerarse adecuado para uso terapéutico o de diagnóstico. En este capítulo, el término también abarca las propiedades de seguridad, identidad, contenido, calidad y pureza. Conferencia Internacional sobre Armonización (ICH) Guía para la Industria, /CH Q1 O, Sistema de Calidad Farmacéutica; /CH Q9, Gestión de Riesgos de Calidad; e /CH Q7A R2, Pruebas de Estabilidad de Nuevos Fármacos y Productos Farmacéuti-
1244 (1079) Buenas Prácticas de Almacenamiento / Información General
USP 39
cos (documentación disponible en inglés únicamente): Documentos internacionales armonizados de ayuda para la industria farmacéutica. Contrato o Convenio Escrito (comúnmente referido como Contrato de Calidad, Contrato Técnico, Contrato de Nivel de Servicio, entre otros): Contrato negociado y documentado entre el propietario del medicamento y el proveedor del servicio que define el acuerdo común sobre materiales o servicio, especificaciones de calidad, responsabilidades, garantías y mecanismos de comunicación. Puede ser un contrato legalmente vinculante o meramente informativo. Además, un Contrato de Nivel de Servicio puede especificar el nivel mínimo esperado de desempeño, operación u otros atributos del servicio. Distribución: Se refiere a elementos tales como actividades de envío y transporte relacionadas con el desplazamiento y suministro de medicamentos. Documentación: Toda información registrada. Estabilizador de temperatura: Material o combinación de materiales que almacena y libera energía térmica usada para mantener un intervalo de temperatura específico dentro de un envase o sistema de envase activo o pasivo (p.ej., material de cambio de estado basado en agua, aceite o sustancias químicas, tales como dióxido de carbono sólido o hielo seco y nitrógeno líquido). Materiales de riesgo biológico y/o mercancías peligrosas: Cualquier artículo o material químico cuyo transporte o desplazamiento representa un riesgo para la seguridad pública o el ambiente y que se reglamenta como tal en cualquiera de los siguientes: Reglamentaciones para Materiales de Riesgo Biológico (Título 49 del CFR 100-180); lnternational Maritime Dangerous Goods Code; Dangerous Goods Regulations of the lnternational Air Transport Association; Technical lnstructions of the lnternational Civil Aviation Organization; or the U.S. Air Force Joint Manual, Preparing Hazardous Materia/s far Military Air Shipments (Código lnternational Marítimo de Mercancías Peligrosas; Reglamentaciones sobre Mercancías Peligrosas de la Asociación de Transporte Aéreo Internacional; Instrucciones Técnicas de la Organización de Aviación Civil Internacional; o el Manual Conjunto de la Fuerza Aérea de los EE.UU., Preparación de Materiales Peligrosos para Envíos Aéreos Militares).
Medicamentos: Medicinas, incluidas las formas farmacéuticas con receta médica comercializadas para uso humano o veterinario, materiales a granel, intermedios o en proceso, muestras de medicamentos, materiales para ensayos clínicos y productos de venta libre. Mejora continua: Actividad recurrente para aumentar la capacidad de cumplir con los requisitos [ver Quality Management Systems-Fundamentals and Vocabulary. ISO Standard 9000:2005 (Sistemas de Gestión de la Calidad-Fundamentos y Vocabulario)]. Sistema de Gestión Ambiental: Sistema de gestión que permite identificar aspectos ambientales críticos para la calidad del medicamento (tales como temperatura, humedad y/o factores ambientales adicionales) y que asegura el uso de procesos adecuados para mantener dicho ambiente. Sistema de Gestión de Almacenamiento: Programa que se emplea para controlar el almacenamiento de medicamentos. Sistema de Gestión de Calidad (SGC): En el contexto de este capítulo, se refiere como mínimo a un conjunto de políticas, procesos y procedimientos que permiten la identificación, medición, control y mejoramiento de la distribución y almacenamiento de medicamentos. Se trata del sistema de gestión usado para dirigir y controlar una compañía con respecto a la calidad (ver el modelo ICH Ql O y Quality Management System-Fundamentals and Vocabulary, ISO Standard 9000:2005).
Sistema de Gestión de la Distribución: Programa que abarca el desplazamiento de medicamentos, incluyendo almacenamiento y transporte. Sistema de Gestión de Riesgo: Proceso sistemático usado para evaluar, controlar, comunicar y revisar los riesgos para la calidad de un medicamento a lo largo del ciclo de vida del producto. Como parte integral de un sistema de calidad farmacéutica efectivo, se trata de un enfoque sistemático y activo para identificar, evaluar científicamente y controlar riesgos potenciales para la calidad según se describe en ICH Ql O. Asimismo, facilita el mejoramiento continuo del desempeño del proceso y de la calidad del producto durante todo su ciclo de vida. El modelo ICH Q9 Quality Risk Management (Gestión de Riesgos para la Calidad) proporciona principios y ejemplos de herramientas que se pueden aplicar a diferentes aspectos de la calidad farmacéutica. Temperatura Cinética Media {TCM): Se define como la temperatura única calculada en la que la cantidad total de degradación durante un periodo particular es igual a la suma de las degradaciones individuales que ocurrirían a diversas temperaturas. Usuario final: Se refiere al paciente, así como al proveedor de cuidados de la salud que administra el producto farmacéutico al paciente. Vehículos de transporte: Vehículos usados en la cadena de suministro que incluyen camiones semirremolque, furgonetas, trenes, aviones, barcos y vehículos de entrega de correos. Otros vehículos, cuando se usan para transportar medicamentos, también se incluyen en esta definición, por ejemplo, vehículos de servicios médicos de emergencia y automóviles de representantes de la industria.
USP 39
Información General/ (1079) Buenas Prácticas de Almacenamiento 1245
ALCANCE Las buenas prácticas de almacenamiento y distribución se aplican a todas las organizaciones e individuos implicados en cualquier aspecto del almacenamiento y la distribución de todos los medicamentos, incluyendo, entre otros, los siguiente: • Fabricantes de medicamentos para uso humano y veterinario cuya fabricación puede implicar operaciones en las instalaciones del titular de la solicitud (es decir, instalaciones que pertenecen al titular de una Solicitud de Medicamento Nuevo aprobada o Solicitud Abreviada de Medicamento Nuevo) o en las de un contratista a nombre del titular de la solicitud • Operaciones de almacenamiento por parte del fabricante o de un contratista designado por el titular de la solicitud • Operaciones de reenvasado en las que el medicamento puede ser propiedad de una organización distinta al fabricante principal • Operaciones de laboratorio realizadas en las instalaciones del fabricante o contratista • Consultorios médicos y veterinarios • Farmacias incluyendo, entre otras, farmacias de venta al por menor, de preparación magistral, de especialidad, de orden por correo, de hospitales y de residencias para ancianos • Importadores y exportadores de Registro • Distribuidores de venta al por mayor; compañías de distribución implicadas en servicios automotrices, ferroviarios, marítimos y aéreos • Proveedores externos de servicios logísticos, fletes tercerizados y consolidadores • Profesionales de la salud que dispensan o administran el medicamento al usuario final • Distribuidores por correo, incluyendo el Servicio Postal de EE.UU. (U.S. Postal Service o USPS) y demás servicios de transporte, incluyendo los servicios de transporte expedito Se pretende que la información aquí provista se aplique a todos los medicamentos independientemente de los requisitos ambientales de almacenamiento o distribución. Se reconoce la posibilidad de que existan casos especiales, así como una gran cantidad de medios alternativos para cumplir con el propósito de este capítulo, por lo que dichos medios se deben justificar con bases científicas. Aunque este capítulo no pretende tratar el almacenamiento y la distribución de ingredientes farmacéuticos activos (API), excipientes, productos radioactivos, reactivos, disolventes, dispositivos médicos, gases medicinales o materiales para ensayos clínicos cuyos requisitos de almacenamiento pudieran no haberse definido todavía (p.ej., medicamentos para ensayos clínicos de Fase 1), los principios generales descritos en este capítulo pueden ser útiles si se aplican de manera selectiva o íntegra. Este capítulo de información general no sustituye o reemplaza ningún requisito nacional, federal y/o estatal sobre almacenamiento y distribución, ni a las monografías USP. El Capítulo General (659) Requisitos de Envasado y Almacenamiento contiene definiciones sobre las condiciones de almacenamiento. Este capítulo no abarca temas tales como falsificaciones, medicinas falsificadas, pedigrí de los medicamentos ni otros aspectos de seguridad de la cadena de suministro tales como temas relativos a la cadena de custodia.
ANTECEDENTES Los procesos de almacenamiento y distribución pueden implicar un complejo desplazamiento de productos alrededor del mundo así como diferencias en los requisitos de documentación y manejo, y en la comunicación entre diversas entidades en la cadena de suministro. La transformación de las buenas prácticas en un buen almacenamiento y distribución ayuda a solventar dichos desafíos y establece un estado de control. Las buenas prácticas de almacenamiento y distribución descritas en este capítulo deben facilitar el desplazamiento de medicamentos a través de una cadena de suministro que se controla, mide y analiza para lograr el mejoramiento continuo, y que debe mantener la integridad del medicamento en su sistema de envase durante el almacenamiento y la distribución.
RESPONSABILIDADES El titular de la solicitud del medicamento, el fabricante del medicamento (en el caso de muchos medicamentos de venta libre, cuando no existe una solicitud) y el reenvasador comparten responsabilidades y deberes primarios que incluyen, entre otros, los siguientes: • Las decisiones de presentar propuestas reglamentarias sobre el contenido de este capítulo para el almacenamiento y la distribución de productos farmacéuticos, cuando corresponda. Si se violara alguno de los Sistemas de Gestión de Calidad y no pudiera justificarse o documentarse mediante evidencia científica, la entidad apropiada deberá considerar intervenciones con respecto al producto para asegurar la seguridad pública. • Determinar las prácticas adecuadas de almacenamiento y manejo • Comunicar las prácticas de almacenamiento y distribución a través de la cadena de suministro • Perfiles de estabilidad del medicamento o información relacionada con la estabilidad procedente del propietario, que incluyan condiciones de distribución y desviaciones permisibles. Dichos perfiles de estabilidad incluyen las condiciones de almacenamiento aprobadas para la vida útil del medicamento y, cuando corresponda, datos que avalen las condiciones de distribución, si éstas difieran de las condiciones de almacenamiento.
1246 (1079) Buenas Prácticas de Almacenamiento/ Información General
USP 39
• Cuando sea necesario sustentar desviaciones generales o desviaciones de temperatura, las partes apropiadas, tales como el solicitante titular, deben transmitir los requisitos ambientales pertinentes (p.ej., cuando corresponda, datos de estabilidad del ciclo de vida específicos del producto). Cuando no sea posible revisar o compartir los datos de estabilidad, puede ser necesario realizar una evaluación a fin de considerar revisiones reglamentarias u otras acciones apropiadas (p.ej., destrucción del producto o análisis adicionales de estabilidad). • Retirar y recuperar el medicamento del mercado si se determina su adulteración en cualquier parte de la cadena de suministro No obstante, todas las organizaciones que forman parte de la cadena de suministro tienen la responsabilidad de asegurarse de que el manejo de los medicamentos se efectúe dentro de los parámetros adecuados de almacenamiento y distribución y que no afecte la identidad, contenido, calidad, pureza o seguridad del medicamento. Cada actor de la cadena de suministro tiene la responsabilidad y obligación de aceptar y transferir el medicamento de una entidad a otra.
CONSIDERACIONES DE ETIQUETADO PARA MEDICAMENTOS Los requisitos ambientales para las condiciones de almacenamiento del medicamento deben indicarse en el sistema de envase-cierre primario del medicamento. Si el espacio en el envase inmediato es demasiado pequeño (p.ej., una ampolla) o si resulta poco práctico para el sistema de envase-cierre (p.ej., un envase de blíster), dicha información se puede colocar en el envase más inmediato de tamaño apropiado (p.ej., en la caja). Las condiciones ambientales de almacenamiento y/o las advertencias ambientales deben ser evidentes, indelebles y estar bien fijadas en el envase más externo (por lo regular, el envase para transporte). Aquellos productos clasificados como materiales de riesgo biológico y/o mercancías peligrosas por el U.S. Department of Transportation (Departamento de Transporte de los EE.UU.) u otras autoridades o entidades pertinentes deben etiquetarse, almacenarse y manejarse de conformidad con los reglamentos federales/estatales/locales aplicables. Los medicamentos clasificados como sustancias controladas por la U.S. Drug Enforcement Administration (Administración de Control de Narcóticos de los EE.UU.) o por los requisitos estatales individuales, deben etiquetarse y manejarse de acuerdo con los reglamentos aplicables. Las buenas prácticas y controles de etiquetado deben proveer al receptor instrucciones para el manejo correcto del producto farmacéutico al momento de la recepción. Cuando las condiciones de almacenamiento de un medicamento no se encuentren fácilmente disponibles, se deben utilizar las condiciones de almacenamiento descritas en las Advertencias y Requisitos Generales de la USP o en la monografía USP correspondiente, o se establece contacto con el fabricante del medicamento para recibir información adicional. Las etiquetas de los productos que presentan información que se extiende más allá de la temperatura individual de almacenamiento a largo plazo facilitan el transporte y el uso a los transportistas, distribuidores, profesionales de la salud y pacientes. Las etiquetas de los productos deben definir con claridad el intervalo de temperatura de almacenamiento, además de intervalos más amplios de temperaturas de distribución o uso cuando así se permitan. Los productos etiquetados con la leyenda "Mantener en un lugar frío" o "No congelar" están sujetos a interpretación, por lo que no se aconseja su uso si no se acompaña de intervalos de temperatura. Las definiciones de almacenamiento y los intervalos de temperatura de la USP se definen en las Advertencias y Requisitos Generales. Durante el transporte internacional, se deben usar los idiomas adecuados para asegurarse de que los encargados del manejo entiendan los requisitos establecidos en el etiquetado del medicamento. Se recomienda el uso de símbolos reconocidos por organizaciones internacionales. Los medicamentos se podrán transportar a temperaturas que estén fuera de las temperaturas de almacenamiento declaradas siempre que se demuestre que se ha mantenido la calidad del producto mediante datos de estabilidad y justificación científica pertinente. La duración de los estudios de estabilidad y de las condiciones de almacenamiento para un medicamento deben ser suficientes para abarcar el transporte, la distribución y el uso subsiguiente del medicamento. Los datos recolectados a partir de las normativas de ICH, QlA R2, de análisis acelerados o de análisis en una condición ICH intermedia se pueden usar para evaluar el efecto de las desviaciones a corto plazo fuera de las condiciones de almacenamiento declaradas que pudieran ocurrir durante el almacenamiento y/o la distribución.
SISTEMAS DE GESTIÓN DE CALIDAD Las buenas prácticas de almacenamiento y distribución requieren que las entidades implicadas en el almacenamiento y/o la distribución de productos farmacéuticos mantengan un Sistema de Gestión de Calidad (SGC) que se base en conceptos normativos de calidad, que incluya buenas prácticas de fabricación de acuerdo con las agencias reglamentarias pertinentes, y que complemente a las guías de la ICH sobre calidad, incluyendo ICH Q7 O Pharmaceutical Quality System (Ql O Sistema de Calidad Farmacéutica) y Q9 Quality Risk Management (Q9 Gestión de Riesgos para la Calidad). En el contexto de este capítulo, el SGC incluye los siguientes programas de sistema de gestión: (1) Sistema de Gestión de Almacenamiento, (2) Sistema de Gestión de Distribución, (3) Sistema de Gestión Ambiental y (4) Sistema de Gestión de Riesgos. El SGC de almacenamiento y distribución debe, como mínimo, abarcar los siguientes elementos: acciones correctivas y preventivas, gestión de cambios, gestión de desviaciones/investigaciones y el proceso de revisión de gestiones.
USP 39
Información General/ (1079) Buenas Prácticas de Almacenamiento 1247
Se debe contar con contratos escritos (p.ej., Contrato de Calidad, Contrato Técnico, Contratos de Nivel de Servicio) suscritos entre las organizaciones involucradas correspondientes en la cadena de suministro del medicamento. Esto significa que el fabricante original podría no estar obligado a mantener un Contrato Escrito con todas las partes de la cadena de suministro. El uso de contratos escritos garantiza claridad y transparencia, además de que define las responsabilidades de cada organización en la cadena de suministro.
Buenas Prácticas de Documentación El SGC debe incluir buenas prácticas de documentación. Dicha documentación incluye procedimientos operativos estándar, así como políticas y normas corporativas, además de protocolos y otros documentos escritos que establecen los elementos del SGC. Los programas de SGC deben describir hechos y acciones que se deben documentar mediante el uso de un lenguaje adecuado, el número de copias requeridas y cualquier otra cuestión que asegure el procesamiento adecuado del medicamento y la prevención de retrasos. El proceso de documentación debe emplear un documento normativo tal como un manual de calidad u otra práctica, y debe incluir evaluaciones de rutina para efectuar revisiones y actualizaciones necesarias. Los procedimientos escritos deben asegurar que los medicamentos se conserven de acuerdo con las instrucciones de sus etiquetados y con los requisitos reglamentarios correspondientes. Los procedimientos deben proveer por escrito las etapas necesarias para completar el proceso y asegurar resultados uniformes y estandarizados. Se deben incluir los siguientes elementos: (1) cómo y cuándo se debe trasladar un producto de un envase/vehículo de transporte a otro, (2) cómo manejar los productos cuando se presentan fallas en el equipo o ante retrasos en la distribución debido a retenciones aduaneras y (3) cómo comunicarse con las partes necesarias. El SGC debe requerir el monitoreo de procesos para demostrar que se mantiene un estado de control, en el que el conjunto de controles provee una garantía constante del desempeño continuo del proceso y de la calidad del producto (ICH Ql O). Si se presentan desviaciones, se debe documentar el incumplimiento y llevar a cabo y documentar la investigación correspondiente. El proceso de investigación debe determinar el origen de la desviación. Por ejemplo, se debe determinar lo siguiente: si el medicamento experimentó estrés, daños, retrasos o lapsos ambientales, o si se produjeron errores en la documentación. El personal de gestión de calidad de suministro asociado tendrá la responsabilidad final de aprobar o rechazar la investigación. El proceso de investigación debe vincularse con el programa de gestión de riesgos para asegurar que se lleva a cabo una mitigación apropiada y que se ponen en práctica medidas preventivas. Por ejemplo, se debe llevar a cabo una investigación por escrito si los procesos de recepción y/o transferencia resultan en la exposición de un medicamento a condiciones inaceptables de temperatura o contaminación (p.ej., plagas, microorganismos o humedad). Cualquier violación de los procedimientos operativos estándar debe documentarse con su respectiva justificación de riesgos, según se requiera. Esta información se debe remitir a la organización apropiada responsable del medicamento. El medicamento debe colocarse en cuarentena y la eliminación final debe tener una buena base científica con evidencias adecuadas para justificar las decisiones. Los fabricantes deben desarrollar procedimientos escritos para registrar los procesos de seguridad que confirmen la integridad del envase-cierre para medicamentos que requieren manejo especial, tales como sellos de seguridad para sustancias controladas. Los registros de mercancías devueltas y recuperadas deben contemplar la forma en que se evaluó el medicamento mediante un procedimiento escrito. Asimismo, la capacitación sobre dichos procedimientos debe formar parte del SGC. Se deben conservar registros de compra y venta de medicamentos que muestren la fecha de la compra o suministro; el nombre y cantidad del medicamento; el nombre y dirección del proveedor o consignatario; y los números de lote asociados. Estos registros permiten rastrear un medicamento en la cadena de abastecimiento. Todos los registros y documentos deben mantenerse de acuerdo con un programa rastreable de retención de registros y se deben poner a disposición de las autoridades reglamentarias, cuando así lo requieran. El departamento responsable del SGC debe aprobar, firmar y fechar dichos documentos.
Sistema de Gestión de Almacenamiento SITIOS Y PROCESOS DE ALMACENAMIENTO Es importante que cada entidad defina sus sitios de almacenamiento apropiados para asegurar la disponibilidad de controles adecuados. Estos sitios incluyen edificios e instalaciones para almacenamiento de medicamentos (p.ej., depósitos, áreas de almacenamiento o retención, depósitos del fabricante original, depósitos de contratistas, depósitos de distribución de venta al por mayor, áreas de almacenamiento de farmacias de ventas al por mayor u órdenes por correo, áreas de almacenamiento de farmacias de hospitales o residencias para ancianos; y áreas de almacenamiento de aduanas fronterizas). En dichos sitios, se pueden presentar dos procesos básicos. Primero, la recepción para almacenamiento consiste en traer un medicamento a una instalación, mientras que transferir se refiere a trasladar un medicamento internamente dentro de una instalación o hacia dentro o fuera de un vehículo. Segundo, almacenar y retener se refieren a mantener la posesión temporal de un medicamento en el proceso de la cadena de suministro durante la cual, el producto no experimentará ningún movimiento.
1248 (1079) Buenas Prácticas de Almacenamiento / Información General
USP 39
ALMACENAMIENTO EN EDIFICIOS E INSTALACIONES Las áreas de almacenamiento del medicamento deben mantener la temperatura del producto entre los límites definidos en la etiqueta del mismo. Los edificios e instalaciones usados para conservar, almacenar y/o retener medicamentos deben ser de tamaño adecuado para su uso previsto. Asimismo, dichas instalaciones deben ser adecuadas para prevenir la sobresaturación. Los edificios e instalaciones deben contar con un diseño que permita controlar las condiciones ambientales cuando sea necesario y deben estar construidos con materiales fáciles o rápidos de limpiar. Se deben redactar procedimientos de higienización y control de plagas que indiquen la frecuencia de la limpieza y los materiales y métodos que se deben usar. El programa de control de plagas debe asegurar la prevención de contaminación, así como el uso seguro de plaguicidas. Además, se deben mantener registros de todas las actividades de limpieza y control de plagas. El almacenamiento debe mantenerse ordenado y debe permitir la segregación de medicamentos aprobados, en cuarentena, rechazados, devueltos, o retirados del mercado. Si se emplean sistemas computarizados para controlar las condiciones de almacenamiento, el software debe estar adecuadamente calificado para sus usos previstos. Las instalaciones deben contar con controles para mitigar riesgos tales como incendios, inundaciones o explosiones. Aquellos medicamentos que pudieran ocasionar dichos riesgos deben almacenarse de manera acorde a las circunstancias. Cuando las áreas de almacenamiento no estén computarizadas, deben estar marcadas de manera visible y apropiada. En sí, salvo que estén termostáticamente controladas, las instalaciones de almacenamiento no pueden ser validadas; no obstante, se pueden calificar mediante un proceso de mapeo. Además, se debe calificar el suministro de energía por generador de energía alternativo. RECEPCIÓN Y TRANSFERENCIA DE MEDICAMENTOS El almacenamiento de un medicamento incluye no sólo el periodo durante el cual el medicamento se retiene en las áreas de almacenamiento del fabricante, sino también el tiempo que pasa en la plataforma de descarga del lugar de recepción. Cuando los medicamentos llegan a los puertos de carga de los depósitos y a otras áreas de llegada, se deben transferir lo más pronto posible a un depósito designado o dentro de un periodo que sea congruente con el riesgo y la exposición del producto en el área receptora a un ambiente de almacenamiento designado para asegurar la menor cantidad de tiempo posible fuera de las condiciones de almacenamiento especificadas según se indica en un procedimiento escrito. Con respecto a la recepción del medicamento, se reconoce que el proceso de reacción del producto a las condiciones ambientales comienza de inmediato y puede ocurrir a gran velocidad (p.ej., alcanzar el equilibrio de temperatura dentro de pocos minutos o en unas cuantas horas, dependiendo de ciertos detalles como la masa del producto, el volumen y la densidad de envasado tomando en cuenta el envase secundario y terciario)1. El tiempo que el producto pasa en el vehículo de transporte se considera parte del proceso de distribución y no es un sitio de almacenamiento. Los puertos de recepción deben proteger las entregas de medicamentos del clima inclemente durante la descarga. Todas las áreas de almacenamiento, incluyendo los puertos de carga y descarga para recepción y distribución de medicamentos, deben estar limpios, ser lavables y exentos de plagas. El área de recepción de materiales entrantes debe limitar el acceso a personas autorizadas. Cuando sea apropiado, se debe examinar el vehículo/contenedor de entrega antes de descargarlo para asegurarse de que se haya mantenido una protección adecuada contra la contaminación durante el tránsito. Las entregas deben examinarse al momento de su recepción para verificar que los envases no estén dañados y que el envío corresponda con lo ordenado. Los resultados de dicho examen deben quedar documentados. Se deben designar áreas que ofrezcan un espacio adecuado en el que los envases de medicamentos puedan ser limpiados y abiertos para muestreo. Si el muestreo se lleva a cabo en el área receptora, se debe realizar de tal manera que prevenga la contaminación y la contaminación cruzada, y que prevenga cualquier violación de los requisitos ambientales del medicamento. Se deben tomar precauciones adecuadas para prevenir robos y desvíos de medicamentos. Los medicamentos que hayan sido identificados como falsificados deberán colocarse en cuarentena para evitar su distribución posterior y se deberá establecer contacto con las agencias reglamentarias correspondientes de acuerdo con los procedimientos establecidos. Los registros de entrega adecuados (p.ej., según corresponda, documentos del desplazamiento de vehículos de transporte, registros de recepción/entrega, registros de ingreso de datos, aparatos de registro de temperaturas y dispositivos similares, conocimiento de embarque terrestre o marítimo, conocimiento de embarque aéreo hijo, conocimiento de embarque aéreo madre, etc.) deben ser revisados por cada entidad receptora de la cadena de abastecimiento para determinar si el producto ha estado sujeto a cualquier retraso en su transporte o a otros eventos que pudieran haberlo expuesto a condiciones indeseadas. Cada entidad debe asegurarse de que sus respectivos Contratos de Nivel de Servicios y documentos de sustento tales como POE abarquen las responsabilidades de entrega y recepción de las partes implicadas en las transacciones. No debe permitirse fumar, comer o beber en las áreas de almacenamiento/retención.
1
JP Emond, Study far Temperature Sensitive Product: Prefiminary Testing, Octubre 2009, University of Florida.
USP 39
Información General/ (1079) Buenas Prácticas de Almacenamiento 1249
REFRIGERADORES Y CONGELADORES Los refrigeradores y congeladores usados para almacenar medicamentos deben mantener la temperatura del producto entre los límites definidos en la etiqueta del mismo. Por lo regular, se establecería una especificación de 5º para una unidad de refrigeración con un intervalo permisible de ±3º para almacenar productos cuya etiqueta indicara una temperatura de 2º-8º. Las temperaturas de congelación pueden variar y a menudo van de -25º a -1 Oº. No obstante, algunos productos farmacéuticos congelados requieren temperaturas menores, p.ej., temperaturas de hielo seco o de nitrógeno líquido. Se debe contar con procedimientos operativos y protocolos de mantenimiento regulares a la par de convenios contractuales escritos para todos los procedimientos de mantenimiento y evaluación, incluyendo los siguientes: 1. Los artículos deben almacenarse en las unidades de manera tal que permita un flujo adecuado de aire para mantener las condiciones especificadas. 2. Las unidades deben colocarse en la instalación de modo que no estén sujetas a circunstancias ambientales extremas que pudieran afectar su desempeño. Cuando esto no pueda prevenirse, el protocolo de mapeo debe incluir una disposición que contemple la realización de análisis durante las circunstancias ambientales extremas anticipadas. 3. Las unidades comerciales grandes, tales como cámaras frigoríficas, se califican mediante un estudio de mapeo de temperaturas u otro tipo de proceso de calificación para determinar la aptitud de la unidad para el almacenamiento de medicamentos. Se debe utilizar un número adecuado de dispositivos de registro de temperatura para registrar las temperaturas y para proveer mapas de las temperaturas del área. Posteriormente, las unidades deben monitorearse de acuerdo con lo establecido por los resultados del estudio de mapeo. Puede referirse a la sección de Monitoreo de Temperatura en Sistema de Gestión Ambienta/.
4. Las unidades deben emplear sistemas de registro para registrar y rastrear las temperaturas. Los sistemas de alarma deben ser una parte integral del sistema de monitoreo de refrigeradores y congeladores. Aunque los sistemas automatizados monitorean las unidades continuamente, se deben llevar a cabo verificaciones manuales acordes al programa de validación. Cuando no se cuente con sistemas automatizados, se podrán emplear sistemas manuales.
Sistema de Gestión de Distribución La distribución de medicamentos ocurre dentro de instalaciones o sitios correspondientes a fabricantes, mayoristas, áreas de dispensación de farmacias, sitios de venta minorista, farmacias de clínicas/hospitales/residencias para ancianos y en la práctica médica. La distribución de medicamentos se presenta como un desplazamiento de punto a punto dentro de lc: cadena de suministro entre las instalaciones de distribución mediante camiones semiremolque, furgonetas, vehículos de servicios de emergencias médicas, automóviles de representantes de la industria, trenes, aviones, barcos y vehículos de entrega de correos. La comunicación dentro de la cadena de suministro debe coordinarse a fin de determinar el tiempo adecuado para transporte y recepción de medicamentos, tomando en cuenta días feriados, fines de semana y demás formas de interrupción. Cuando se requiere de distribución internacional, se deben emitir alertas por anticipado y utilizar el idioma adecuado para asegurar la plena comprensión de los requisitos establecidos en el etiquetado del medicamento. EMBALAJE PARA DISTRIBUCIÓN Y TRANSPORTE Los fabricantes farmacéuticos deben considerar el envase primario, secundario y terciario que mejor proteja el medicamento durante su almacenamiento y distribución. El fabricante debe documentar el análisis de desempeño del envase como parte de su Sistema de Gestión de Calidad. Se encuentran disponibles diversos procedimientos de prueba estándar para evaluar el desempeño del envase ante factores tales como impacto, vibración, presión, compresión y demás eventos del tránsito. Las organizaciones con métodos de prueba estándar incluyen las siguientes: la Standard Practíce for Performance Testíng of Shíppíng Contaíners and Systems (Práctica Estándar para el Análisis de Desempeño de Envases y Sistemas de Transporte) de la American Society for Testing and Materials (Sociedad Estadounidense de Análisis y Materiales o ASTM) y las especificaciones de la lnternational Safe Transit Association (Asociación Internacional de Tránsito Seguro o ISTA) para diversos tipos de modos de tránsito, tales como carga menor a la capacidad de un camión, paquetes pequeños, vagón y flete aéreo. Es importante tener en cuenta que el retiro o modificación del empaque original puede someter al producto a condiciones inaceptables. El embalaje (terciario o subsiguientes) para la distribución del medicamento debe seleccionarse y comprobarse de modo que se asegure el mantenimiento de la calidad del producto y para proteger el contenido de los rigores de la distribución, incluyendo daños ambientales o físicos. Todos los medicamentos tienen requisitos de almacenamiento que pueden incluir controles específicos. El envase usado para transportar el medicamento se debe calificar basándose en las condiciones declaradas, así como en las condiciones ambientales anticipadas. Asimismo, se deben tomar en cuenta las diferencias de temperatura estacionales, el transporte entre hemisferios y las vías y modos de transporte. El tipo, tamaño, ubicación y cantidad de los estabilizadores de temperatura requeridos para proteger el producto deben basarse en estudios documentados de los ambientes de distribución específicos, incluyendo rutas nacionales e internacionales, modos de transporte, duración, temperatura y demás exposiciones o sensibilidades ambientales potenciales que pudieran tener un impacto en la calidad del producto. Los materiales de los envases de transporte, tales como paquetes y materiales cáli-
1250 (1079) Buenas Prácticas de Almacenamiento / Información General
USP 39
dos/fríos usados para controlar las condiciones de temperatura se deben acondicionar adecuadamente antes de su uso. La protección mediante barreras puede ser importante para ayudar a determinar la posición de materiales tales como paquetes de gel, a fin de evitar el contacto directo con el medicamento. Se debe determinar si deben llevarse a cabo estudios para asegurar que el hielo seco y sus vapores no afectan de manera adversa al medicamento, incluyendo su etiquetado. VALIDACIÓN Y CALIFICACIÓN DEL DESEMPEÑO TÉRMICO PARA SISTEMAS DE TRANSPORTE Los sistemas de transporte de medicamentos se deben monitorear continuamente mediante sistemas de monitoreo calibrados, (verificación continua), o se deben calificar los sistemas de transporte y basarlos en datos históricos relativos al proceso. No obstante, puede resultar aceptable el uso de datos de estabilidad de producto, así como una evaluación de riesgos de la cadena de suministro para justificar el transporte sin monitorear o calificar continuamente el sistema de transporte. Los estudios de transporte operativos y de desempeño deben constituir una parte genérica del protocolo formal de calificación que pueda usar análisis en ambientes controlados o de campo de prueba real, dependiendo del canal de transporte proyectado. Estos estudios deben reflejar configuraciones de carga, condiciones y extremos ambientales esperados reales. El análisis se debe llevar a cabo en sistemas de envasado térmico activos y pasivos.
Sistema de Gestión Ambiental Aunque los intervalos de temperatura de almacenamiento y distribución para medicamentos se declaran en el empaque, los efectos de la humedad relativa ocurren en un marco de tiempo mucho más extenso. El envase primario se diseña y analiza para proteger el producto de la humedad; por lo tanto, se debe considerar el monitoreo de la humedad cuando se vaya a almacenar un producto en una instalación no controlada. MONITOREO DE TEMPERATURA Las condiciones ambientales representan parámetros importantes a considerar para el almacenamiento y la distribución de todos los medicamentos y, dependiendo de los requisitos, pueden requerir de monitoreo. Cuando se requieren condiciones específicas de almacenamiento y no se ha llevado a cabo la calificación del transporte, y ante la ausencia de envases activos o pasivos, se deben usar aparatos o dispositivos de registro ambiental para confirmar que se ha mantenido un intervalo aceptable durante cada etapa en la cadena de suministros. La temperatura es una de las condiciones más importantes que se debe controlar y los requisitos para cada medicamento deben basarse en datos de estabilidad. Las temperaturas deben rastrearse usando un sistema de monitoreo, mientras que los dispositivos de monitoreo usados deben incluirse en el programa de calibración y/o mantenimiento preventivo. Los dispositivos de monitoreo ambiental deben calibrarse al intervalo de operación. Los dispositivos de monitoreo usados deben proveer un mecanismo de alerta cuando se presente alguna violación de los intervalos establecidos. Las siguientes prácticas y controles son ejemplos de medidas apropiadas que deben ponerse en práctica para asegurar el control ambiental (ver también el capítulo Dispositivos de Monitoreo-Tiempo, Temperatura y Humedad (1118)): • Se debe utilizar un equipo de monitoreo de temperatura, un dispositivo de monitoreo, un equipo de registro de temperatura u otro dispositivo adecuado para dicho propósito. • Un número adecuado de monitores de temperatura u otra forma de registro o prueba de control de temperatura. Se deben usar monitores de temperatura con cada proceso de distribución, a menos que se haya puesto en marcha otro proceso para asegurar los intervalos de temperatura especificados. • Los monitores de temperatura electrónicos deben calibrarse al National lnstitute of Standards and Technology (Instituto Nacional de Estándares y Tecnología o NIST) u otro estándar adecuado. • Se pueden usar indicadores de temperatura química, según sea apropiado. • Se deben establecer intervalos predeterminados de temperatura para todas las áreas aplicables, así como un plan de acción en el caso de una desviación inaceptable. MAPEO DE TEMPERATURA El fundamento de cualquier programa de temperatura en un espacio con temperatura controlada (p.ej., instalación, vehículo, envase para transporte, refrigerador, congelador) es la identificación y documentación de una justificación sólida usada para un procedimiento de mapeo dado. Se deben definir la variabilidad de temperatura asociada con los sitios mapeados y el nivel de riesgos térmicos para el producto, a menos que se haya puesto en marcha otro proceso para asegurar el control ambiental. Se debe diseñar un estudio de mapeo de temperatura para evaluar la uniformidad de la temperatura y su estabilidad con el paso del tiempo y a través de un espacio tridimensional. Para completar un perfil de temperaturas tridimensional se deben medir puntos en no menos de tres planos dimensionales en cada dirección/eje-de arriba hacia abajo, de derecha a izquierda, de adelante hacia atrás, en el lugar donde estará presente el producto.
USP 39
Información General/ (1079) Buenas Prácticas de Almacenamiento 1251
Cuando resulta necesario realizar un mapeo de la temperatura, se debe comenzar con una inspección de la instalación, del equipo y/o del vehículo, y se deben realizar reevaluaciones correspondientes. El mapeo ambiental también debe realizarse después de cualquier modificación significativa del sistema de distribución que pudiera afectar la temperatura del medicamento. Mapeo de temperatura de la instalación: Los siguientes factores, que pueden contribuir a la variabilidad de la temperatura, deben tomarse en cuenta durante el proceso de mapeo de temperatura de los sitios de almacenamiento: (1) tamaño del espacio; (2) ubicación del equipo de calefacción, ventilación y aire acondicionado (HVAC), calentadores y acondicionadores de aire; (3) paredes que reciben la luz del sol; (4) techos o cielos rasos bajos; (5) ubicación geográfica del área que se está mapeando; (6) flujo de aire dentro del sitio de almacenamiento; (7) variabilidad de la temperatura fuera del sitio de almacenamiento; (8) variación del flujo de trabajo y desplazamiento del equipo (día de la semana vs. fin de semana); (9) patrones de carga o almacenamiento de productos; (1 O) capacidades del equipo (p.ej., modo de descongelación, modo de ciclos); y (11) procedimientos operativos estándar. El registro de temperaturas durante el mapeo térmico de un depósito o cuarto frío debe contar con un marco de tiempo suficiente para capturar la variación del flujo de trabajo que puede impactar el flujo de aire y la fluctuación de la temperatura resultante (es decir, se recomienda un periodo de una semana para la recolección de datos que capturen los ciclos de flujo de trabajo). Mapeo de temperatura del equipo (envases/remolque): Para minimizar el riesgo de exposición del producto a temperaturas perjudiciales para el producto durante el transporte, se deben mapear el espacio dedicado a la carga de envases/vehículos. Cuando el mapeo de la flotilla completa (es decir, vehículos del mayorista o distribuidor) es inadecuado o poco realista, se debe mapear al menos un envase/vehículo de la flotilla. En consecuencia, se deben considerar las siguientes opciones: (1) procedimientos operativos estándar, incluyendo procedimientos de carga y descarga; (2) operación específica de la ruta del equipo de control de temperatura; (3) efectos estacionales hallados en las rutas esperadas; (4) patrones de carga; y (5) duración de los transportes. Cuando se emplean envases/vehículos de transporte y equipo no dedicados (es decir, transportadores de correos), su diseño debe minimizar el riesgo de contaminación del producto que se esté manejando. Si no se lleva a cabo el mapeo ambiental de dichos vehículos, se deben poner en práctica otros medios de control para asegurar que el producto farmacéutico esté protegido adecuadamente. El mapeo por parte del consignador puede no ser necesario si éste último utiliza un envase de transporte adecuadamente aislado y previamente calificado para la duración del proceso de distribución por el fabricante del mismo mediante un estudio de mapeo o si los medicamentos se monitorean continuamente a través de sistemas de monitoreo calibrados (verificación continua). El vehículo en el que se transportan los medicamentos se debe mapear para determinar la colocación apropiada de dispositivos que registren la temperatura y para confirmar que la configuración de carga no restringe el flujo de aire. Las siguientes prácticas y controles se recomiendan para vehículos que reciben y transfieren medicamentos: 1. Los envases/vehículos y equipos de transporte usados para almacenar y transportar medicamentos deben ser adecuados para su función prevista. 2. Se deben establecer procedimientos que describan la forma en que se deben operar, limpiar y mantener los envases/vehículos de transporte y equipos usados en el almacenamiento y distribución de medicamentos. 3. El diseño de los envases/vehículos de transporte debe prevenir daños al medicamento, por lo que los fabricantes farmacéuticos deben actuar en colaboración con el encargado del transporte para establecer planes de respuesta a contingencias sobre la forma en que deben manejarse los medicamentos en caso de fallas del equipo. 4. Cuando el medicamento deba ser trasladado de un envase/vehículo de transporte a otro, habrá de seguirse la configuración de carga apropiada. 5. Es necesario comprender la forma en que se establecerá la comunicación con las entidades necesarias cuando ocurra dicha transferencia. 6. Los vehículos de subcontratistas deben estar considerados en los convenios contractuales y auditorías, y se debe mantener documentación relacionada con su uso. El mapeo de temperatura debe tomar en cuenta las cargas máximas y mínimas para capturar la variabilidad de temperatura que resulta de variaciones en la masa de temperatura de la carga útil. Se debe tomar en cuenta el desempeño del equipo ante escenarios extremos, incluyendo fallas de equipo a puerta abierta, a puerta cerrada y simuladas. El mapeo térmico de vehículos debe ser representativo de la flotilla a fin de capturar la variabilidad en toda la variedad de vehículos (tipo de vehículos, incluyendo equipo no refrigerado, de uso, sistema de calefacción y/o enfriamiento). Se debe documentar un programa de recalificación periódica. El mapeo de las instalaciones y de los envases/vehículos de transporte se debe llevar a cabo de tal manera que se confirme su aptitud para la operación durante periodos de climas extremos esperados (p.ej. verano e invierno). Las instalaciones se deben mapear en condiciones operativas variadas-idealmente durante periodos de mayor variabilidad, tomando en cuenta y capturando el resultado de cualquier fluctuación estacional de desplazamiento del inventario, desplazamiento del equipo o variación del flujo de trabajo. El protocolo de mapeo de temperatura y el número asociado de dispositivos de registro de datos de temperatura usados para mapear un espacio tridimensional deben cumplir con el propósito de demostrar una uniformidad tridimensional, además de cumplir con los requisitos del producto. Para el mapeo de temperatura de instalaciones y de remolques/envases, se deben registrar las condiciones ambientales y se deben identificar las correlaciones entre condiciones ambientales y riesgos térmicos potenciales dentro del espacio controlado. Los medicamentos no deben almacenarse en áreas en las que se haya identificado
1252 (l 079) Buenas Prácticas de Almacenamiento / Información General
USP 39
un riesgo térmico como resultado del mapeo de la temperatura. Las áreas definidas como inadecuadas para almacenamiento deben marcarse claramente como tales para asegurarse de que no sean utilizadas. Se deben usar dispositivos de registro de datos de temperatura para el mapeo de temperatura y para análisis de PQ en instalaciones, equipo y envases de transporte que se usan para almacenar o transportar los productos medicinales sensibles a la temperatura. Asimismo, se deben validar apropiadamente dichos dispositivos, junto con cualquier aplicación de software relacionada. Los dispositivos de monitoreo deben contar con certificados individuales de calibración rastreables al NIST u otro estándar internacional. EXCURSIONES El proceso de mapeo ayudará a determinar cuándo podrían ocurrir las excursiones y son útiles cuando los fabricantes farmacéuticos desarrollan un plan para tratarlas. Se deben usar alarmas para revelar excursiones ambientales durante las operaciones. Las excursiones de temperatura para periodos breves fuera de las condiciones respectivas de almacenamiento declaradas pueden ser aceptables siempre que existan datos de estabilidad y una justificación científica/técnica que demuestren que la calidad del producto no fue afectada (ver la GUI 0069 de Health Canada titulada, Guidelines far Temperature Control of Drug Products During Storage and Transportation, 2011 ). CÁLCULO DE LA TEMPERATURA CINÉTICA MEDIA La temperatura cinética media (TCM) es la temperatura única calculada en la que la cantidad total de degradación durante un periodo particular es igual a la suma de las degradaciones individuales que ocurrirían a diversas temperaturas. La TCM se puede considerar como una temperatura de almacenamiento isotérmica que simula los efectos no isotérmicos de la variación de la temperatura de almacenamiento. La TCM no es una simple media aritmética. Las temperaturas usadas para calcular la TCM se pueden recopilar de manera conveniente usando dispositivos electrónicos que midan temperaturas a intervalos frecuentes (p.ej., cada 15 minutos). La TCM se puede calcular directamente o los datos pueden descargarse a una computadora para su procesamiento. Se encuentra disponible comercialmente software para calcular la TCM. Para sitios de dispensación, tales como farmacias y hospitales, en los que el uso de dichos instrumentos puede no ser factible, se pueden emplear dispositivos tales como termómetros de máxima y termómetros de mínima capaces de indicar la temperatura máxima y mínima semanal. Luego se utiliza el promedio entre la máxima y mínima semenal para calcular la TCM. La TCM se calcula mediante la siguiente ecuación (derivada de la ecuación de Arrhenius):
donde Tk es la temperatura cinética media; tiH es el calor de activación, 83, 144 kJ · mol-1 (a menos que se cuente con información más exacta de estudios experimentales); Res la constante universal de los gases, 8,3144 x 10-3 kJ · mol-1 • grado- 1; T1 es el valor para la temperatura registrada durante el primer periodo, p.ej, la primera semana; T2 es el valor para la temperatura registrada durante el segundo periodo, p.ej., segunda semana; y Tn es el valor para la temperatura registrada durante el periodo n, p.ej., la n semana, siendo n el número total de temperaturas de almacenamiento registradas durante el periodo de observación. [NOTA-Todas las temperaturas, T, son temperaturas absolutas en grados Kelvin (K).] TCM DURANTE EL ALMACENAMIENTO Y LA DISTRIBUCIÓN Como parte de las prácticas de almacenamiento y distribución el medicamento puede permanecer en depósito. Los medicamentos en la cadena de distribución del suministro se pueden mantener a temperaturas fuera de sus requisitos de almacenamiento declarados de conformidad con un estudio de estabilidad apropiado. Los medicamentos almacenados en condiciones de depósitos o en modos de transporte pueden experimentar excursiones de sus intervalos de temperatura aceptables. Cada una de las excursiones de los productos deben evaluarse para determinar el efecto sobre el producto final. El medio de evaluación debe ser científicamente sólido y constituir una justificación técnica documentada de que la integridad del medicamento no fue afectada. Un método de análisis de medicamentos almacenados fuera de sus condiciones correspondientes de almacenamiento declaradas es el uso de un cálculo de la TCM. Debido a que la TCM expresa el estrés térmico acumulativo experimentado por un medicamento, se considera una práctica aceptable para el almacenamiento, por lo que debe considerarse para excursiones durante el tránsito en el proceso de distribución. Se debe justificar el cálculo para su uso con excursiones durante la distribución confirmando que la característica limitante de la estabilidad del producto siga la cinética de primer orden durante el intervalo de temperatura encontrado. Las guías de análisis de la estabilidad de la ICH definen la TCM como una temperatura derivada "única", la cual, si se mantiene durante un periodo definido, podría ofrecer el mismo desafío térmico a un medicamento que el que habría experimentado durante un intervalo de temperaturas altas y bajas durante un periodo definido equivalente.
USP 39
Información General/ (1079) Buenas Prácticas de Almacenamiento 1253
El análisis de la TCM debe tener una base científica adecuada y debe tomar en cuenta la integridad del producto. La TCM calculada no es sensible al impacto de las excursiones que podrían ocurrir si la línea base es un periodo largo, tal como un segmento del almacenamiento o la vida entera del producto farmacéutico. Para periodos de línea base más cortos, tales como segmentos de transporte, una excursión puede tener un impacto significativo en la TCM resultante para dicho segmento; sin embargo, dicha condición no tendría necesariamente un impacto significativo sobre la calidad del producto. El análisis de la TCM se puede usar para condiciones de almacenamiento que hayan excedido los parámetros aceptables para un medicamento, durante un periodo corto y no pretende ser una medición para el almacenamiento a largo plazo. Conocer la TCM para una excursión es útil para evaluar el impacto potencial sobre la calidad del producto. No obstante, resulta esencial conocer los límites de temperatura superior e inferior de cualquier excursión. Si estas temperaturas extremas estuvieran fuera de los datos de estabilidad disponibles, podría ser imposible predecir de manera confiable el impacto que tendría la excursión sobre la calidad independientemente de la TCM. Aunque a las altas temperaturas se les da un peso mayor en el cálculo, el cálculo de la TCM para un producto no congelado que se congela durante un periodo puede resultar en una temperatura no aceptable aunque el producto podría no haberse adulterado. A temperaturas más altas, la cinética de degradación puede cambiar o se pueden presentar nuevas reacciones de degradación; a temperaturas más bajas (cercanas a la congelación) se puede presentar un cambio de fase que se sabe que tiene un impacto negativo sobre la calidad de algunos medicamentos (p.ej., algunas proteínas y vacunas). Para un ejemplo de cálculo, ver el capítulo Cálculos en la Práctica Farmacéutica (1160).
Transporte en Vehículos de Servicios de Emergencias, Automóviles y Furgonetas Los vehículos automotores usados para transportar medicamentos (p.ej., ambulancias y otros vehículos de respuesta a emergencias, furgonetas o automóviles, incluyendo aquéllos usados por los representantes de ventas para transportar muestras para médicos) deben ser adecuados para su propósito. Se deben colocar dispositivos de monitoreo en diversas áreas del maletero o cabina en la que se colocará el medicamento durante extremos estacionales (p.ej., verano e invierno). El monitor se debe asegurar de modo que se mantenga inmóvil y no debe existir ambigüedad sobre su posición exacta dentro de la carga útil, de modo que éste siempre se coloque en la misma posición. Asimismo, se pueden usar dispositivos de monitoreo sobre o dentro de empaques o en envases. Se deben tomar medidas adecuadas para mantener el medicamento dentro de los límites permisibles de los requisitos de almacenamiento declarados. El almacenamiento de muestras de medicamentos para médicos por parte de representantes de ventas está regulado por el Título 21 del CFR Parte 203.34(b)(4).
Distribución Mediante Farmacia por Correo El remitente es responsable del proceso de envío por correo apropiado. Los distribuidores de correo, incluyendo el Servicio Postal de los EE.UU. (USPS) y demás servicios de transporte, incluyendo servicios de transporte expedito, son responsables de proveer el servicio contratado. En caso de que el paquete no pueda ser entregado según lo programado, éste debe devolverse a la farmacia remitente.
Sistema de Gestión de Riesgos Las estrategias del Sistema de Gestión de Riesgos deben asegurar que los mejores intereses de cada organización se cumplan mediante el apego a las prácticas, controles y procedimientos apropiados, incluyendo, entre otros, los siguientes: la naturaleza de los medicamentos; requisitos de distribución indicados en el etiquetado legible del envase; exposición a condiciones ambientales adversas; número de etapas/recepciones en la cadena de suministro; instrucciones escritas del fabricante; contratistas; medicamentos que se afectan con la congelación (vacunas, insulina y productos biológicos) o temperaturas elevadas (supositorios de bases grasas, vacunas, insulina y productos biológicos). Entre los ejemplos de riesgos se incluyen los siguientes: (1) vibración que puede ocasionar agregación de algunos medicamentos tales como proteínas y fármacos basados en péptidos; (2) excursiones de temperatura que pueden llevar a cambios de fase (fusión o congelación); (3) pérdida de la integridad del envase-cierre que puede ocasionar rupturas del vidrio o pérdida de la esterilidad en envases de medicamentos estériles; e (4) ingreso de agua u oxígeno que puede generar un incremento en los productos de degradación. Se recomienda que las partes apropiadas tales como los solicitantes titulares transmitan los requisitos ambientales pertinentes cuando se requieran para justificar excursiones. Pueden existir maneras alternativas de determinar las condiciones ambientales aceptables, las cuales deben documentarse y justificarse. Los fabricantes farmacéuticos deben asegurarse de que los proveedores de transporte de medicamentos estén sujetos a monitoreo. Se deben llevar a cabo auditorías rutinarias a las empresas transportistas para asegurar el manejo adecuado de productos. El sistema de control de cambios del fabricante debe capturar y evaluar los cambios en factores logísticos tales como depósitos o áreas de recepción y cambios en los vehículos.
1254 (1079) Buenas Prácticas de Almacenamiento/ Información General
USP 39
CONCLUSIÓN Las prácticas y procesos establecidos en este capítulo de información general se aplican al almacenamiento y distribución como parte de la gestión del ciclo de vida de los medicamentos. Todas las partes implicadas deben garantizar el producto hasta el momento de su uso, mediante la creación de una red de abastecimiento contigua basada en la colaboración y que enfatice las medidas preventivas para proteger la calidad del medicamento. El incremento en los procesos globales asociados con los productos que requieren controles ambientales especiales enfatiza la necesidad de un programa de Gestión de Calidad sólido. La Gestión de Calidad debe proveer los cimientos para mantener las prácticas de almacenamiento y distribución en un programa de mejora continua y como parte de una revisión general del sistema de gestión por parte de cada entidad, según corresponda, en la cadena de suministro. Resulta igualmente importante mantenerse actualizado y estar preparado para ajustarse a la aparición de nuevas soluciones. Estas nuevas tecnologías deben tomarse en cuenta durante el desarrollo de estrategias para buenas prácticas de distribución, controles y procedimientos.
(1080) EXCIPIENTES FARMACÉUTICOS A GRANEL-CERTIFICADO DE ANÁLISIS ANTECEDENTES Este capítulo de información general deriva de la Certificate of Analysis Guide far Bulk Pharmaceutical Excipients (Guía para el Certificado de Análisis de Excipientes Farmacéuticos a Granel), preparada por el Consejo Internacional sobre Excipientes Farmacéuticos de las Américas (IPEC-Américas, por sus siglas en inglés), documento internacional guía para la preparación y el uso apropiado de un Certificado de Análisis (COA, por sus siglas en inglés) para estos excipientes, en adelante denominados "excipientes". El capítulo define los elementos sugeridos de un Certificado de Análisis, proporciona un modelo para organizar de manera lógica los datos requeridos y opcionales y ayuda a establecer una comprensión uniforme de las funciones y responsabilidades de los fabricantes, distribuidores y usuarios de excipientes. Los principios y la información de este capítulo se pueden aplicar a la fabricación de todos los excipientes farmacéuticos a granel destinados a ser utilizados en medicamentos para uso humano, medicamentos para uso veterinario y productos biológicos. Como documento guía internacional, no es posible especificar todos los requisitos legales nacionales ni abarcar en detalle las características particulares de todos los excipientes. Cuando se considere el uso de este capítulo, cada fabricante, distribuidor o usuario debe tener en cuenta cómo podría aplicarse a los productos y procesos de ese fabricante específico. La diversidad de excipientes implica que algunos de los principios de este capítulo podrían no ser aplicables a determinados productos y procesos. El capítulo está dividido en varias partes. La primera proporciona los antecedentes necesarios para el diseño y los elementos sugeridos de un COA. Se suministra un modelo con el fin de mostrar el formato y la localización de la información en el COA. A continuación se ofrece una discusión detallada para garantizar la comprensión del propósito y significado de la información específica contenida en el COA. Ver en el Apéndice 1, una lista de términos usados en este capítulo de información y sus definiciones.
GUÍA GENERAL Los reglamentos internacionales que rigen los medicamentos exigen que sus componentes se fabriquen, procesen, envasen y conserven de conformidad con las buenas prácticas de fabricación (GMP, por sus siglas en inglés). Para una explicación detallada de las GMP que aplican a la fabricación de excipientes, ver Buenas Prácticas de Fabricación para Excipientes Farmacéuticos a Granel (1078). Un excipiente es con frecuencia una sustancia natural, una mezcla o un polímero, cuyas propiedades químicas y físicas son difíciles de cuantificar y que se usa a menudo con una amplia gama de ingredientes farmacéuticos activos y en una gran variedad de formas farmacéuticas terminadas. Hasta el momento, no se contaba con documentos guía que se enfocaran específicamente en el contenido o formato de los COA para excipientes y que trataran la diversidad tanto de los excipientes como de su uso. Preparación y Uso Apropiado de un Certificado de Análisis-El proveedor del material debe preparar y emitir el Certificado de Análisis para excipientes, de acuerdo con las pautas generales que se discuten a continuación. La responsabilidad primordial de preparar el COA recae en el fabricante del excipiente. Es de suma importancia que el usuario del excipiente reciba un COA completo y exacto para lotes o partidas específicos destinados a ser usados en la industria farmacéutica. El distribuidor de excipientes debe tener en cuenta ciertas consideraciones adicionales para la preparación y emisión de un COA. El usuario de un excipiente farmacéutico a granel debe recibir siempre un COA para el material que se usará en la fabricación de un medicamento. Como mínimo, el usuario deberá efectuar pruebas de identificación adecuadas en cada lote de excipiente recibido antes de liberarlo para su uso en el medicamento. Siempre que sea posible se deben usar pruebas de identidad
USP 39
Información General/ (1080) Excipientes Farmacéuticos a Granel 1255
específicas. Según los requisitos reglamentarios, se debe evaluar la conformidad de los excipientes con todas las especificaciones correspondientes. Sin embargo, es posible que no se requiera el análisis de todos los parámetros de especificación para la liberación de un lote, si en el COA del proveedor se han proporcionado las garantías de cumplimiento adecuadas. Antes de usar un excipiente en un producto farmacéutico basándose en datos del COA, el usuario debe conocer los sistemas de control del proveedor y su cumplimiento con las GMP, a través de auditorías apropiadas o de la calificación del proveedor. No obstante, es responsabilidad del usuario del excipiente la verificación de cualquiera de los datos analíticos contenidos en el COA, si el conocimiento de dicha información se considera esencial para el uso de ese excipiente. Dichas pruebas pueden salirse del alcance de los métodos farmacopeicos descritos en el NF, o de los usados para desarrollar la información en el COA. Para usar los resultados de las pruebas de un COA, el usuario debe también determinar la confiabilidad de los resultados de las pruebas del COA del proveedor, efectuando periódicamente todas las pruebas requeridas y comparando los resultados obtenidos con los suministrados por el proveedor. Ocasionalmente, puede que no sea posible efectuar todas las pruebas requeridas debido a que los equipos especiales necesarios, etc, no se encuentran disponibles para el usuario. Puede ser aceptable efectuar menos pruebas que las indicadas, siempre y cuando la confiabilidad del proveedor se establezca adecuadamente con otras técnicas de calificación apropiadas. Es importante comprender que estos resultados pueden no siempre correlacionarse específicamente, en especial cuando un excipiente se produce como un lote continuo. Sin embargo, los resultados de las pruebas del usuario deben demostrar el cumplimento con los requisitos de las especificaciones. Uso de Instalaciones Contratadas-En la fabricación, prueba y distribución de excipientes se usan con frecuencia instalaciones contratadas. En esos casos, el proveedor del excipiente tiene la obligación de garantizar que las instalaciones funcionen bajo normas de calidad apropiadas (es decir, cGMP, GLP, etc.).
DISEÑO Y ELEMENTOS SUGERIDOS DE UN CERTIFICADO DE ANÁLISIS A continuación se enumeran los elementos sugeridos de un COA y se incluyen en la sección Modelo de Certificado de Análisis de este capítulo. Los proveedores de excipientes pueden organizar a su discreción los elementos sugeridos presentados en el modelo de COA; sin embargo, las partes de este modelo fueron diseñadas para presentar la información sugerida y opcional en una forma lógica. Ver más adelante en este capítulo, una descripción detallada de cada elemento y ejemplos de declaraciones. El origen e identidad del excipiente se establecen por lo general en una sección llamada Encabezado. El fabricante y el lugar de fabricación deben identificarse si son diferentes del proveedor y de la ubicación del proveedor, lo que permite al usuario asegurarse de que el excipiente proviene de una fuente calificada. Aunque el nombre del fabricante debe ser informado al usuario, es aceptable el uso de códigos para fabricantes y lugares de fabricación en el COA, con el fin de proteger la confidencialidad. Se debe establecer inequívocamente la identidad del excipiente, indicando el nombre farmacopeico y comercial, el grado del material y las denominaciones farmacopeicas aplicables. Un número de lote o partida u otro medio para identificar exclusivamente la cantidad de material cubierto por el COA y la información relacionada específicamente al mismo se incluyen, por lo general, en la sección denominada Cuerpo. El número de lote u otra identificación exclusiva del material, su fecha de fabricación y el código o número del producto deben declararse y poder rastrearse a un lote especificado. De ser procedente, en esta sección se incluye por lo general la fecha de caducidad, la fecha recomendada de reevaluación o cualquier otra declaración relevante relacionada con la estabilidad del excipiente. Cualquier información requerida por el cliente también se debería incluir aquí. Los resultados reales de las pruebas que sean pertinentes a la cantidad del material cubierto en el COA se incluyen en la sección Análisis. El nombre de la prueba, el resultado, los criterios de aceptación o especificaciones y una referencia al método de prueba utilizado se deben incluir para cada característica enumerada. Se recomienda informar los datos y observaciones reales en lugar de las declaraciones inespecíficas "pasa" o "cumple". Se debe anotar en el COA si los resultados informados derivan de un programa de análisis periódico de lotes (skip-lot) o de análisis de frecuencia reducida, un promedio o un resultado de pruebas durante el proceso. La sección Declaraciones de Cumplimiento y Certificación se usa para enumerar los diversos tipos de declaraciones que pueden requerirse, dependiendo del excipiente y las necesidades específicas del usuario. Dichas declaraciones por lo general se negocian entre el proveedor y el usuario, basándose en los requisitos de aplicación específicos. En esta sección se incluye, por lo general, cualquier declaración del proveedor que se refiera al cumplimiento de otros requisitos farmacopeicos o reglamentarios adicionales. Muchos excipientes tienen aplicaciones diferentes de las farmacéuticas, como por ejemplo en alimentos, cosméticos o productos industriales. Cualquier producto que declara cumplir con reglamentaciones específicas debe cumplir con las especificaciones y requisitos de esa reglamentación y fabricarse bajo las GMP correspondientes. En el COA debe aparecer la identidad del individuo que aprueba el contenido del COA, así como el número de página y total de páginas del COA. Esta información se incluye por lo general en la sección de Pie de página.
MODELO DE CERTIFICADO DE ANÁLISIS A continuación se presenta un modelo del contenido y formato de un COA.
1256 (1080) Excipientes Farmacéuticos a Granel / Información General
USP 39
Encabezado • Titulado "Certificado de Análisis" • Nombre de la Compañía, Dirección, Teléfono e Identidad del Fabricante y Lugar de Fabricación • Nombre (farmacopeico/comercial) del Excipiente • Grado del Excipiente • Denominación Farmacopeica Cuerpo • Número de Lote/Partida • Fecha de Fabricación • Código o Número del Producto • Fecha de Caducidad (según corresponda) • Fecha Recomendada de Reevaluación (según corresponda) • Declaración de Estabilidad (según corresponda) • Información Requerida por el Cliente Análisis • Nombre de la Prueba • Resultados de la Prueba • Criterios de Aceptación (es decir, especificaciones) • Referencia al Método de Prueba • Referencia al Análisis Periódico de Lotes (según corresponda) • Referencia al Promedio o a los Resultados de Prueba durante el Proceso (según corresponda) • Fecha de Reanálisis (según corresponda) • Resumen de Pruebas no Farmacopeicas (si las hubiera) Declaraciones de Cumplimiento y Certificación •Cumplimiento con las GMP • Referencias Reglamentarias Adicionales • Potencial para Cumplir Normas Farmacopeicas Adicionales • Listado de Contenido y Grado de los Ingredientes (si fuera una mezcla) • Otras Declaraciones Específicas de Cumplimiento [por ej., impurezas orgánicas volátiles, disolventes residuales, encefalopatía espongiforme transmisible (TSE, por sus siglas en inglés), etc.] Pie de Página • Identidad de la Persona Autorizada para la Aprobación • Fecha de Aprobación • Número de Página (es decir, 1 de_)
DENOMINACIÓN FARMACOPEICA Para que un proveedor pueda declarar el grado farmacopeico de un excipiente en el COA, se deben cumplir dos requisitos. El primer requisito es que el excipiente sea fabricado de acuerdo con los principios reconocidos de GMP (ver Advertencias y Requisitos Generales). La adecuada conformidad con las GMP se debe demostrar también para los pasos subsiguientes en la distribución del excipiente. El segundo requisito es que el excipiente cumpla con todas las especificaciones contenidas en la monografía oficial correspondiente, a menos que su diferencia se declare en la etiqueta, según se define en Advertencias y Requisitos Generales. Cuando un excipiente se declara como de grado farmacopeico, se entiende que el material ha cumplido con los requisitos anteriores y el usuario podría confirmarlo a través de una auditoría apropiada del proveedor. Las normas farmacopeicas definen lo que se considera un artículo aceptable y establecen también los procedimientos de prueba para demostrar conformidad con los requisitos. Estas normas son aplicables en cualquier momento de la vida del artículo, desde su producción hasta su consumo. Las especificaciones de liberación del proveedor y el cumplimiento de las GMP se desarrollan y siguen para garantizar que el artículo, cuando se almacena de acuerdo con las condiciones recomendadas, cumple con las normas farmacopeicas hasta su fecha de caducidad o fecha recomendada de reevaluación. Todo artículo farmacopeico debe estar constituido de forma tal que cuando se examine de acuerdo con estos procedimientos de prueba y valoración, cumpla con todos los requisitos en la monografía que lo define, así como con las disposiciones en Advertencias y Requisitos Generales y en los capítulos generales, según corresponda. Sin embargo, no debe inferirse que la aplicación de todos los procedimientos analíticos de la monografía a muestras de cada una de las partidas de producción es un prerrequisito necesario para asegurar el cumplimiento con las normas farmacopeicas antes de liberar las partidas para su distribución. Los datos obtenidos a partir de los estudios de validación de procesos de fabricación y de controles durante el proceso pueden conferir mayores garantías sobre una partida, en lo que se refiere al cumplimiento de los requisitos de una monografía en particular, que la información analítica obtenida del examen de unidades terminadas de esa partida. Basándose en tales garantías, el proveedor puede omitir los procedimientos analíticos de la monografía al juzgar el cumplimiento de la partida con las normas farmacopeicas.
USP 39
Información General/ (1080) Excipientes Farmacéuticos a Granel 1257
FECHAS EN UN CERTIFICADO DE ANÁLISIS Parte del objectivo general de estandarizar los COA para excipientes incluye una provisión para el informe uniforme de fechas apropiadas, significativas y bien definidas. A continuación se indican las fechas específicas que se esperan encontrar en el COA, junto con las definiciones de las mismas, con el fin de proporcionar a los proveedores y usuarios de excipientes una comprensión mutua de su significado. El uso de la terminología recomendada será útil para reducir la cantidad de preguntas recibidas sobre la información relativa a las fechas de los excipientes. No es aconsejable el uso de una terminología diferente de la que se discute a continuación, porque los términos pueden estar mal definidos y tener significados diferentes para el proveedor y el usuario de excipientes. Ejemplos de aquellos términos que no se deben usar incluyen "vida útil", "fecha límite de uso", "fecha de garantía" y "período de caducidad". Al informar fechas en un COA para excipientes, es importante usar un formato claro y sin ambigüedades con el fin de evitar posibles tergiversaciones. Para ello, se recomienda usar una designación alfa para el mes (puede ser abreviado), en vez de una representación numérica. Se recomienda también incluir los 4 dígitos en el año (por ej., Ene. 1, 2005 ó 1 ºene. 2005). Fecha de Fabricación-La fecha de fabricación se debe incluir en el COA para cada lote de excipiente y debe ser asignada por los proveedores basándose en sus políticas y procedimientos establecidos. Se sabe que los excipientes pueden fabricarse usando una gran variedad de procesos (por ej., continuo o por partida) que pueden requerir un período de varios días o más para completarse. Además, algunos excipientes pueden ser mezclas o combinaciones de otros excipientes y la producción puede incluir pasos de reprocesamiento. Debido a esta diversidad, el proveedor debe definir claramente la fecha de fabricación y aplicarla en forma uniforme al excipiente y al proceso específicos. Al informar la fecha de fabricación, el proveedor del excipiente debe indicar la fecha de terminación del proceso final de fabricación (según lo definido por el proveedor). Cabe destacar que el reenvasado por sí solo no se considera un paso del procesamiento utilizado para determinar la fecha de fabricación. Con el fin de permitir la rastreabilidad de un lote específico de un excipiente, pueden requerirse otras fechas además de la de fabricación, que reflejen pasos adicionales como el reenvasado. Fecha de Caducidad y Fecha Recomendada de Reevaluación-La estabilidad de los excipientes puede ser un factor importante en la estabilidad de las formas farmacéuticas terminadas que los contienen. Muchos excipientes son muy estables y pueden no requerir pruebas exhaustivas para demostrar la conformidad continua con las especificaciones pertinentes. Otros excipientes pueden sufrir cambios químicos, físicos y microbiológicos con el tiempo, que hacen que el producto se aleje de las especificaciones establecidas. Las fechas apropiadas de caducidad y/o fechas recomendadas de reevaluación para los excipientes se deben establecer a partir de los resultados de un programa documentado de pruebas de estabilidad o a partir de datos históricos. El programa de pruebas debe incluir las condiciones definidas y controladas de almacenamiento (por ej., temperatura y humedad), la consideración de los diferentes tipos de envases que se pueden usar para la comercialización, y los métodos de prueba específicos y significativos para evaluar las características de estabilidad del excipiente. Las pruebas de estabilidad deben determinar si puede ocurrir degradación, pérdida o ganancia de humedad, cambios de viscosidad u otros cambios posibles que hagan al excipiente inaceptable para el uso (por ej., materiales inestables o higroscópicos). Ver en Buenas Prácticas de Fabricación para Excipientes Farmacéuticos a Granel (1078), información adicional sobre la estabilidad del excipiente. La fecha de caducidad de un excipiente se define como la fecha después de la cual el proveedor recomienda no usar el material. Antes de la fecha de caducidad asignada, se espera que el excipiente se mantenga dentro de las especificaciones establecidas, si se almacena de acuerdo con las condiciones recomendadas por el proveedor. La fecha recomendada de reevaluación para un excipiente es la fecha sugerida por el proveedor después de la cual el material debe ser reevaluado para garantizar el cumplimiento continuo con las especificaciones. La reevaluación del excipiente puede incluir la inspección física y pruebas químicas, físicas y microbiológicas apropiadas. Antes de la fecha de reevaluación, se espera que el excipiente se mantenga dentro de las especificaciones establecidas, siempre y cuando se haya almacenado de acuerdo con las condiciones recomendadas por el proveedor. Sin embargo, pasada la fecha recomendada de reevaluación, el excipiente no debe usarse sin la evaluación adecuada a los intervalos apropiados para determinar si el material sigue siendo aceptable para el uso. La fecha recomendada de reevaluación difiere de la fecha de caducidad en que el excipiente puede reevaluarse para extender el tiempo en que puede usarse, si lo respaldan los resultados de la evaluación y los datos de estabilidad apropiados. Al informar la fecha de caducidad y la fecha recomendada de reevaluación, el proveedor del excipiente proporciona al usuario información importante, relacionada con la estabilidad del material. Como se discutió previamente, la asignación de una fecha de caducidad y de una fecha recomendada de reevaluación debe basarse en la evaluación apropiada de los cambios potenciales que pueden ocurrir en las propiedades del material. Es aceptable informar tanto la fecha de caducidad como la fecha recomendada de reevaluación en el COA de excipientes, si corresponde, pero no siempre se requieren ambas fechas. La fecha de caducidad y la fecha recomendada de reevaluación no deben ser informadas por un proveedor sin suficientes datos de estabilidad o de historia del producto para respaldar las fechas asignadas. En caso de excipientes muy estables (más de 2 años), se debe informar la fecha de caducidad específica y/o la fecha recomendada de reevaluación en el COA del material o se puede incluir una declaración general de estabilidad (por ej., estabilidad mayor de 2 años). Si los datos disponibles indican que un excipiente tiene estabilidad limitada (2 años o menos) bajo las condiciones de almacenamiento anticipadas, se debe informar la fecha de caducidad específica y/o la fecha recomendada de reevaluación en el COA del material.
1258 (1080) Excipientes Farmacéuticos a Granel / Información General
USP 39
Si los datos de estudios formales de estabilidad de un excipiente no están disponibles, se debe incluir en el COA una declaración apropiada para indicar lo que se conoce acerca de la estabilidad del material y si se están llevando a cabo los estudios de estabilidad. Fecha de Reanálisis-Si el proveedor de un excipiente efectúa un reanálisis y los resultados se usan para extender el tiempo de uso del material, la fecha de reanálisis se debe informar también en el COA. Las pruebas específicas que se utilizaron en el reanálisis se deben identificar claramente e informar los resultados obtenidos después del reanálisis. También se debe informar en el COA una nueva fecha recomendada de reevaluación después del reanálisis. Fechas Adicionales-En un COA pueden aparecer otras fechas, si así lo desea el proveedor del excipiente o lo solicita el usuario. Algunos ejemplos incluyen la fecha de liberación, la fecha de envío, la fecha de análisis y la fecha en que se imprimió o aprobó el COA. Cualquier fecha adicional que aparezca en un COA para excipientes debe incluir una indicación clara de lo que representa o significa.
FRECUENCIA DEL ANÁLISIS Para los excipientes listados en los compendios USP-NF, el proveedor fija las especificaciones del producto de manera que incluyan todos los parámetros enumerados en la monografía. No se requiere realizar el análisis de todos los parámetros de especificación en cada lote (ver Advertencias y Requisitos Generales). Sin embargo, se debe contar con suficientes datos de análisis y validación de procesos para garantizar que el lote cumpla con todas las especificaciones antes de su liberación. Ésta es una práctica establecida que se ha usado exitosamente en la industria por muchos años. El análisis periódico de todos los parámetros se debe llevar a cabo para revalidar el sistema de control. Los proveedores deben determinar la frecuencia de estos análisis periódicos basándose en su comprensión del sistema de control de fabricación. Como mínimo, los parámetros se deben verificar una vez al año. En el caso de excipientes que no estén incluidos en los compendios USP-NF, el proveedor debe fijar las especificaciones para garantizar que la calidad del material se mantiene de manera continua y refleja el proceso de fabricación del excipiente y las propiedades inherentes. Los métodos analíticos usados para evaluar las características de excipientes no farmacopeicos pueden ser los mismos de aquellos contenidos en la farmacopea o pueden ser exclusivos del proveedor o del material. Se debe demostrar que los métodos proporcionan resultados exactos, reproducibles y uniformes para la característica en análisis. Puede ser apropiado que en el caso de los excipientes no farmacopeicos algunas de las pruebas se efectúen con menor frecuencia. El usuario del excipiente debe evaluar las especificaciones y métodos del proveedor para asegurarse de que sean apropiados y aceptables para el control de calidad necesario en el proceso de fabricación de su producto farmacéutico. El usuario debe determinar cuáles de las especificaciones y métodos del proveedor se requieren para la liberación del excipiente para el uso en su proceso. En caso de que el usuario necesite pruebas adicionales o métodos alternativos, el proveedor y el usuario del excipiente deben acordar los métodos y especificaciones apropiados así como también la responsabilidad para efectuar el análisis.
Análisis de Frecuencia Reducida Cuando se lleva a cabo el análisis de frecuencia reducida de algunos parámetros (por ejemplo, cada décimo lote), se debe indicar claramente en el COA. Se debe indicar toda prueba específica sometida al análisis de frecuencia reducida. El análisis de frecuencia reducida se debe usar sólo para excipientes fabricados usando un proceso estable. Debe de haber una base técnica firme y documentación suficiente que respalde el análisis de cualquier parámetro con una frecuencia reducida. Esto incluiría normalmente los siguientes puntos: • Validación apropiada del proceso de fabricación • Control del proceso-graficación de atributos (según corresponda) • Controles de GMP Como parte de la justificación para los análisis de frecuencia reducida, es importante que existan garantías establecidas que demuestren que el proceso del fabricante cumple con los requisitos de GMP apropiados para el excipiente. Debido a su importancia, algunas pruebas se deben realizar siempre en cada lote, mientras que otras pueden ser candidatas a un análisis de frecuencia reducida. Los análisis de atributos producen datos cualitativos que proporcionan resultados del tipo cumplen/no cumplen o resultados expresados como menor de o mayor de un valor específico. El resultado simplemente establece el cumplimiento con un parámetro de especificación. No existen datos que indiquen cuán bien cumple el material, como serían los obtenidos de resultados de pruebas de variables o cuantitativas. Los análisis de frecuencia reducida de un atributo precisan que el fabricante demuestre que el parámetro cualitativo está bajo control estadístico. Esto hace necesaria la tabulación de los resultados de la prueba para lotes producidos en forma consecutiva. Análisis Periódico de Lotes (Skip-Lot Testing)-EI análisis periódico de lotes se puede aplicar a un excipiente fabricado por un proceso continuo o por partida. Para demostrar el control apropiado del proceso se pueden usar varios planes de muestreo estadístico aceptados comúnmente. A continuación se presentan ejemplos de cada uno. EJEMPLO 1: Para un nivel promedio de calidad de salida (AOQL, por sus siglas en inglés) de 1 % y una frecuencia de análisis de 1 en 1 O, el proveedor debe encontrar 100 lotes consecutivos en conformidad. Para un AOQL de 2% y una frecuencia de análisis de 1 en 1O, el proveedor analizaría 50 lotes consecutivos. Para un AOQL de 1% y una frecuencia de análisis de 1 en 5, el proveedor analizaría 70 lotes consecutivos. Existen nomografías para determinar los requisitos de la prueba.
USP 39
Información General/ (1080) Excipientes Farmacéuticos a Granel 1259
EJEMPLO 2: Cuando el excipiente se fabrica por un proceso continuo, no se produce un lote diferenciado. De nuevo, el plan de muestreo está basado en el riesgo de la aprobación de un lote que no cumplía con los requisitos. Al analizar 140 lotes consecutivos antes de pasar a una frecuencia de análisis de 1 en 1O, el plan establece un riesgo bajo de aprobar un lote que no cumpla con los requisitos. Una vez que se cumpla con el requisito, el proveedor puede monitorear la conformidad con el parámetro de la especificación analizando 1 en 1 O lotes. Si algún lote no pasara el análisis, el proveedor debe volver a analizar el 100% hasta que los resultados cumplan una vez más con las especificaciones descritas anteriormente. Dado que las propiedades físicas y químicas de los excipientes varían enormemente, el proveedor del excipiente debe determinar qué pruebas se deben efectuar rutinariamente y cuáles pueden ser apropiados para un análisis de frecuencia reducida. Esta determinación debe estar justificada y documentada fundamentándose en la idoneidad del sistema de control del proveedor. Se debe conservar la documentación donde se detallen las suposiciones y los datos que respaldan el plan de análisis periódico de lotes. Pruebas Tipo A y Tipo B-Sólo ciertos tipos de pruebas son apropiadas para el análisis de frecuencia reducida. Las pruebas Tipo A se definen como las pruebas que no pueden ser controladas fácilmente a través de técnicas de control estándar de proceso o que pueden cambiar con el tiempo. Estas pruebas deben realizarse normalmente en cada lote. Las pruebas Tipo B se definen como aquellas pruebas que normalmente se pueden controlar usando técnicas de control estándar de proceso y que no se espera que cambien con el tiempo. Estas pruebas pueden ser adecuadas para un análisis de frecuencia reducida. A continuación se presentan ejemplos de ambos tipos de pruebas. TIPO A: EJEMPLOS DE PRUEBAS QUE TÍPICAMENTE SE DEBEN EFECTUAR EN CADA LOTE • Identificación-Requerida por GMP para los usuarios (candidata para análisis de frecuencia reducida por los proveedores) • Valoración-Parámetro de calidad crítico (si se especifica) • Viscosidad-Por lo general indica el grado • Pérdida por secado (o determinación de humedad)-lndicación de estabilidad y controles del proceso apropiados. • Color-Indicación de estabilidad y controles del proceso apropiados. • pH-lndicación de estabilidad y controles del proceso apropiados. TIPO B: EJEMPLOS DE PRUEBAS QUE PODRÍAN SER ADECUADAS PARA ANÁLISIS DE FRECUENCIA REDUCIDA • Impurezas de fabricación-Basándose en los materiales de partida y procesos (por ej., cloro, sulfato, nitrato, glioxal) • Metales pesados •Plomo •Arsénico • Residuo de incineración • Disolventes residuales
Ésta no pretende ser una lista exhaustiva de pruebas. Simplemente proporciona algunas instrucciones sobre la forma en que un proveedor puede evaluar la importancia de cada prueba con respecto al control general del proceso. Es posible que las pruebas listadas como posibles candidatas para análisis de frecuencia reducida (Tipo 8) requieran efectuarse en forma rutinaria (Tipo A), dependiendo de las materias primas y de los procesos. Se puede determinar también que algunas pruebas Tipo A pueden convertirse en Tipo B. En una instalación dedicada, es posible que no sea necesario que el proveedor realice pruebas de identificación. Documentación-El proveedor de un excipiente debe desarrollar y mantener la documentación que esboce los sistemas de control de procesos y los datos de validación para justificar el uso de análisis de frecuencia reducida. Esta documentación debe incluir también los procedimientos para manejar el impacto de los cambios significativos sobre el programa de análisis de frecuencia reducida. La cantidad mínima de lotes que se deben analizar completamente para todos los parámetros de especificación después de un cambio depende del proceso y de la importancia del cambio y se debe basar en consideraciones estadísticas firmes. Adicionalmente, la documentación debe contener procedimientos para reevaluar el programa de análisis de frecuencia reducida cuando ocurra una falla en los análisis. Las decisiones relacionadas con la continuación de los análisis de frecuencia reducida se deben justificar basándose en las razones de la falla y la capacidad del proveedor para proporcionar garantías de que el programa de análisis de frecuencia reducida u otros parámetros durante el proceso identificarán estos tipos de fallas en el futuro. Justificaciones para el Análisis de Frecuencia Reducida-Los siguientes son ejemplos de situaciones en las que se puede demostrar una base técnica firme y en las que los análisis de frecuencia reducida podrían, por lo tanto, estar justificados. [NOTA-Pueden haber otros ejemplos de este tipo.] • Una impureza, subproducto o materia prima sin reaccionar podría no estar presente en el producto debido a que las materias primas o las reacciones químicas usadas podrían no contener o producir dichas sustancias por encima de los límites especificados. •El índice de capacidad del proceso (Cp) sobre el parámetro relevante es alto y está basado en un proceso estable. Los análisis estadísticos de los datos de frecuencia reducida deben mostrar que la propiedad permanece estable y dentro de las especificaciones. Un proceso se considera estable cuando el producto del mismo, independientemente de la naturaleza del procesamiento (por partida o continuo), puede demostrar por los medios apropiados un nivel de variabilidad que cumple uniformemente con todos los aspectos de la especificación declarada (tanto de la farmacopea como del cliente) y por lo tanto es aceptable para su uso previsto. En el caso de procesos continuos, también es importante demostrar que el
1260 (1080) Excipientes Farmacéuticos a Granel / Información General
USP 39
material se ha producido bajo condiciones en las cuales el proceso ha alcanzado un "estado estacionario", es decir, en el cual hay mínima intervención del operario y en donde los parámetros durante el proceso se han estabilizado (ver en el Apéndice 2 una definición más amplia de este concepto y de la forma de determinar los niveles de control). • Para el caso de un proceso continuo, los análisis durante el proceso muestran que la propiedad determinada a una frecuencia reducida es estable y está dentro de las especificaciones. La repetición de la prueba en cada lote sería redundante. • Un análisis que se lleva a cabo en cada lote ha mostrado estar fuertemente correlacionado con un análisis que se realiza a una frecuencia reducida. La correlación demuestra que si el lote está dentro de especificaciones en el primer análisis, estará también dentro de especificaciones en el segundo análisis.
USO DE FIRMAS ELECTRÓNICAS Debido a la creciente dependencia de las computadoras y a la necesidad de ajustarse a sistemas de registros sin papel, se sugiere la alternativa electrónica para los registros y firmas manuscritos. Los proveedores de excipientes han agregado sistemas de información computarizada para aumentar la productividad. El principal inconveniente en la transferencia de un COA sin una firma manuscrita es la validación de los datos. Existen varias condiciones que se deben cumplir antes de considerar aceptable la adición de una firma o nombre electrónicos en un COA. • El acceso a los sistemas computarizados debe estar limitado a las personas autorizadas: el acceso se obtiene solo después de introducir un nombre de usuario y una contraseña. El sistema debe exigir cambios frecuentes de cada contraseña individual. • Debe completarse una confirmación de la integridad y exactitud de la información almacenada en el sistema. • La operación del sistema debe controlarse rutinariamente para garantizar que se transfiera la información correcta de la base de datos al registro impreso. • Los datos introducidos en una base de datos de la cual se extrae información para un COA deben ir acompañados por registros de auditoría sellados con fecha y hora. Cuando estos criterios se cumplen, se acepta la emisión de los COA con firmas electrónicas o el nombre de la persona responsable en el documento, en lugar de una firma manuscrita. [NOTA-Los sistemas computarizados están reglamentados actualmente por el 21 CFR 11 de la FDA. Los usuarios deben consultar el enfoque de la FDA para el cumplimiento en esta área.]
INFORMACIÓN DEL DISTRIBUIDOR La presentación de un COA emitido por un distribuidor enfrenta algunos retos. Dado que los COA son documentos importantes que califican a los excipientes y el estado de su calidad, la fuente de esa información se vuelve muy importante para los usuarios finales. Dado que los distribuidores desempeñan diferentes papeles al prestar los servicios para los cuales fueron contratados, es necesario garantizar que los procedimientos y métodos sean apropiados para las funciones desempeñadas. Los distribuidores pueden desempeñar un gran número de funciones relacionadas con el movimiento de excipientes y los servicios asociados con su producción. Algunos sirven simplemente como instalaciones de tránsito donde no se le hace nada al excipiente, exceptuando su almacenamiento y manipulación. Otros sirven como extensiones del proceso del fabricante al tomar cantidades a granel y reempacarlas para el fabricante. Sin embargo, otros adquieren excipientes y los reenvasan para la venta y distribución con una etiqueta diferente. Estos escenarios deben comprenderse y documentarse apropiadamente con programas que protejan la integridad y seguridad de los excipientes a medida que pasan por el proceso de distribución. Fabricante Original y Lugar de Fabricación-La identidad del fabricante original y del lugar de fabricación debe incluirse en el COA de los excipientes. Esta información es importante porque permite la rastreabilidad de lotes específicos del excipiente y asegura a los usuarios que están obteniendo de manera uniforme un material del mismo fabricante y lugar de fabricación. La información sobre la identidad y ubicación del fabricante no representa un inconveniente cuando el fabricante original es también el proveedor directo del excipiente para los clientes del ámbito farmacéutico. Sin embargo, cabe reconocer que esta información puede considerarse confidencial por un distribuidor de excipientes. Con el fin de resolver este problema adecuadamente, los distribuidores de excipientes deben listar la información específica, identificando el fabricante original y su ubicación o proporcionar la información bajo un código apropiado que se asigna con el propósito de identificar inequívocamente el fabricante original y el lugar de fabricación. Para proteger la confidencialidad de esta información, no se debe revelar el significado del código a los distribuidores intermediarios. Datos del Certificado de Análisis-Cuando un distribuidor se usa principalmente como un punto de tránsito sin producirse cambios al excipiente o el empaque, el COA del fabricante que acompaña al excipiente puede distribuirse en el formato original. Si los datos se extraen, traducen o reescriben en otro papel con membrete, se debe implantar un sistema de verificación de la información reescrita y se debe demostrar su justificación cuando se lo solicite. Como alternativa, se debe indicar la fuente de los datos en el documento. En el caso de un distribuidor que toma cantidades de un excipiente a granel de un fabricante y las introduce en un proceso (por ej., sistema de transporte y almacenamiento), se debe efectuar el análisis del excipiente empacado para demostrar que tiene la misma calidad del lote (partida) introducido. Los datos analíticos apropiados deben incluirse en el COA para verificar la calidad. El distribuidor debe usar una metodología y equipo equivalente para la evaluación analítica. Se pueden usar algunos datos del COA del fabricante original, con la justificación apropiada. En todos los casos, se espera que el distribuidor tenga el nivel apropiado de GMP establecidas.
USP 39
Información General/ (1080) Excipientes Farmacéuticos a Granel 1261
APÉNDICE 1 DEFINICIONES Cambio Significativo-Cualquier cambio que altera una propiedad física o química de un excipiente, con respecto a la norma, o que es probable que altere el desempeño del excipiente en la forma farmacéutica. Certificado de Análisis (COA)-Un documento que refiere específicamente a los resultados del análisis de una muestra representativa extraída de la partida de material que va a ser entregado. Criterios de Aceptación-Las especificaciones y los límites de aceptación o rechazo-como por ejemplo un nivel de calidad aceptable o un nivel de calidad no aceptable, con un plan de muestreo asociado-necesarios para tomar la decisión de aceptar o rechazar un lote o partida de materia prima, producto intermedio, material de empaque o excipiente. Distribuidor-Una parte, diferente del fabricante, que vende el excipiente. Empaque-El envase y sus componentes que contienen el excipiente para almacenamiento y transporte al cliente. Especificación-Los parámetros de calidad que sirven como base para la evaluación de la calidad y a los que se deben ajustar los excipientes, componentes o productos intermedios. Excipiente-Cualquier sustancia, distinta del ingrediente farmacéutico activo o del producto farmacéutico, que ha sido evaluada de manera apropiada respecto a su seguridad y que se incluye en un sistema de liberación de fármacos para ayudar al procesamiento del mismo durante su fabricación; para proteger, mantener o mejorar la estabilidad, biodisponibilidad o aceptación por parte del paciente; para ayudar a la identificación del producto o mejorar cualquier otro atributo general de seguridad y eficacia del sistema de liberación de fármacos durante el almacenamiento o el uso. Fabricante-La parte que efectúa el paso de procesamiento final. Fecha de Caducidad-La fecha después de la cual el proveedor recomienda no usar el material. Fecha de Fabricación-La fecha que indica la terminación del proceso final de fabricación (según lo definido por el proveedor para un excipiente y proceso en particular). Fecha de Reanálisis-La fecha en la cual el proveedor de un excipiente efectúa el reanálisis para extender el tiempo en que se puede usar el material. Fecha Recomendada de Reevaluación-La fecha sugerida por el proveedor en la que el material se debe reevaluar para garantizar el cumplimiento continuo con las especificaciones. Difiere de la Fecha de Caducidad en que el excipiente puede ser reevaluado para extender el tiempo en el que puede usarse, si lo respaldan los resultados de la evaluación y los datos de estabilidad apropiados. Impureza-Cualquier componente de un excipiente que no es la entidad química deseada pero está presente como consecuencia de las materias primas usadas o del proceso de fabricación. Índice de Capacidad del Proceso (Cp)-Una medida estadística que se puede usar para evaluar si el proceso es adecuado para cumplir con las especificaciones. Puede decirse que existe un estado de control estadístico si la variación aleatoria en los resultados de prueba para un parámetro del proceso es tal que la capacidad calculada del proceso es mayor de 1,33 (ver definición más detallada en el Apéndice 2). Instalación Contratada-Una instalación interna o externa que proporciona servicios al fabricante o distribuidor de un excipiente. Pueden incluir, entre otras, las siguientes: instalaciones de fabricación, laboratorios, instalaciones de reempaque (incluido etiquetado) y almacenes. Lote-Ver Partida. Lugar-El sitio donde se fabrica el excipiente. Este puede estar dentro de las instalaciones pero en un área operativa diferente, o en una instalación remota, incluyendo un fabricante por contrato. Número de Lote-Ver Número de Partida. Número de Partida (o Número de Lote)-Una combinación única y característica de números y/o letras a partir de la cual se puede determinar toda la historia de la fabricación, procesamiento, empaque, codificación y distribución de una partida. Partida (o Lote)-Una cantidad definida de excipiente procesado de forma tal que se pueda esperar que sea homogeneo. En un proceso continuo, una partida corresponde a una porción definida de la producción, basándose en el tiempo o cantidad (por ej., volumen del recipiente, producción de un día, etc.). Paso del Proceso-Una instrucción al personal de fabricación del excipiente en la cual se ordena que se efectúe una operación. Proceso-Conjunto de instrucciones operativas que describen cómo se debe sintetizar el excipiente, aislarlo, purificarlo, etc. Proceso Continuo-Un proceso de fabricación que produce continuamente el excipiente a partir del suministro constante de materias primas. Proceso Estable-Un proceso cuyo producto final, independientemente de la naturaleza del procesamiento (por partida o continuo), puede demostrar por los medios apropiados un nivel de variabilidad que cumple uniformemente con todos los aspectos de la especificación declarada (tanto de la farmacopea como del cliente) y por lo tanto es aceptable para el uso previsto. Proceso por Partida-Un proceso de fabricación que produce el excipiente a partir de un suministro discreto de materias primas que está presente antes de completarse la reacción.
1262 (1 080) Excipientes Farmacéuticos a Granel / Información General
USP 39
Programa de Análisis Periódico de Lotes (Skip-Lot Testing Program)-Análisis periódicos o intermitentes efectuados para un parámetro de prueba en particular, justificados por datos históricos que demuestran un estado de control estadístico del proceso. Programa de Pruebas/Análisis de Frecuencia Reducida-Ver Análisis Periódico de Lotes Programa de Pruebas Periódicas-Ver Programa de Análisis Periódico de Lotes. Propiedad Física-Un parámetro de calidad que se puede medir únicamente con un equipo mecánico. Propiedad Química-Un parámetro de calidad que se mide por métodos de análisis químicos o fisicoquímicos. Proveedor-Un fabricante o distribuidor que suministra directamente el excipiente al usuario. Reenvasado---Transferencia de un excipiente de un envase a otro. Reprocesamiento-Reintroducción en el proceso de material previamente procesado que no se ajustó a las normas o especificaciones y repetición de etapas que ya son parte del proceso normal de fabricación. Usuario-La parte que usa un excipiente en la fabricación de un producto farmacéutico o de otro excipiente.
APÉNDICE 2 ESTADO DE CONTROL ESTADÍSTICO: PARÁMETROS DE CAPACIDAD DEL PROCESO PARA DETERMINAR LOS NIVELES DE CONTROL Un proceso se considera en estado de control estadístico si las variaciones entre los resultados observados de las muestras del proceso se pueden atribuir a un sistema constante de causas aleatorias. El índice de capacidad del proceso (Cp) o el índice de capacidad ajustado para el promedio del proceso (Cpk) o el índice de desempeño (Pp) o el índice de desempeño ajustado para el promedio del proceso (Ppk) se pueden usar para evaluar si el proceso es adecuado para cumplir con las especificaciones. Los valores de estos parámetros que excedan 1,33 muestran que el proceso es adecuado para cumplir con las especificaciones. Los valores entre 1,00 y 1,33 indican que el proceso, aunque es adecuado para cumplir con las especificaciones, requerirá control riguroso. Los valores por debajo de 1,00 indican que el proceso no es adecuado para cumplir con las especificaciones y que el proceso y/o las especificaciones deberán cambiarse. Pp/Ppk será siempre menor o igual a Cp/Cpk, respectivamente. La diferencia esencial entre los índices de capacidad y desempeño radica en los datos usados. Los índices de capacidad requieren el cálculo de o; la desviación estándar de la población, mientras que los índices de desempeño requieren el cálculo de s, la desviación estándar de la muestra. Por lo tanto, puede decirse que existe un estado de control estadístico para los excipientes farmacéuticos si la variación aleatoria en los resultados de prueba para un parámetro del proceso es tal que el índice de capacidad del proceso calculado o el índice de desempeño calculado es mayor de 1,33.
(1084) ANÁLISIS DE GLICOPROTEÍNAS Y GLICANOSCONSIDERACIONES GENERALES
INTRODUCCIÓN GENERAL Se han desarrollado diversos fármacos glicoproteicos como resultado de los avances en la biotecnología; asimismo, muchas proteínas derivadas de manera natural poseen estructuras complejas de glicanos. La glicosilación, una modificación postraduccional de estas proteínas, puede desempeñar un papel importante en la determinación de la función farmacocinética, farmacodinámica, estabilidad e inmunogenicidad de estos agentes. Los dos tipos principales de glicosilación proteica son la N-glicosilación y la 0-glicosilación. A diferencia de la transcripción y la traducción, la glicosilación es un proceso que no se realiza a partir de un molde; por lo tanto, se pueden presentar variaciones en el patrón de glicosilación de una proteína ocasionadas por diversas fuentes o diferentes procesos de fabricación. Se sabe que las diferencias en este patrón afectan la actividad biológica. Por consiguiente, los patrones de glicosilación pueden ser un conjunto importante de atributos que surgen al caracterizar una glicoproteína candidata al uso terapéutico y al asegurar su estabilidad y calidad. La primera parte de este capítulo proporciona una breve introducción a la glicobiología y describe la complejidad de las estructuras de los glicanos. Las partes subsiguientes proporcionan diagramas de flujo y una serie de estrategias analíticas generales que se pueden usar para caracterizar los glicanos de las glicoproteínas mediante los métodos siguientes: 1. Análisis directo de glicoproteínas; y 2. Análisis de glicanos liberados no derivatizados o derivatizados usando diversos métodos de separación cromatográfica y electroforética y espectrometría de masas (MS). Al final del capítulo se describen los diferentes métodos para analizar monosacáridos.
USP 39
Información General/ (1084) Análisis de Glicoproteínas y Glicanos 1263
En lo que respecta a métodos analíticos selectos, este capítulo proporciona referencias cruzadas a otros capítulos de la USP, en particular a aquellos relacionados con artículos derivados por biotecnología (ver los capítulos llllllBlilt~~t& Artículos Obtenidos por Biotecnología-/soelectroenfoque (1054), Artículos Obtenidos por Biotecnología-Mapeo de Péptidos (1055) y Artículos Obtenidos por Biotecnología-Electroforesis en Gel de Poliacrilamida (1056)).
1111-
GLICOSILACIÓN DE PROTEÍNAS La mayoría de las proteínas en las células eucarióticas se glicosilan o se modifican postraduccionalmente antes de ser dirigidas hacia los lisosomas, y de convertirse en parte de la membrana en la superficie celular o de secretarse. La glicosilación presenta variaciones significativas en cada célula, tejido y especie, debido a la expresión variante de cientos de glicosiltransferasas y glicosidasas localizadas por todo el aparato de Golgi y el retículo endoplásmico (ER, por sus siglas en inglés). En las proteínas se encuentran cuatro tipos principales de glicosilación enzimática: 1. La N-glicosilación, que implica la transferencia inicial de oligosacáridos al nitrógeno en el grupo amida terminal de la asparagina y su procesamiento y modificación subsiguientes en una serie de cadenas de glicanos; 2. La 0-glicosilación, que en general implica la transferencia inicial de monosacáridos a los grupos hidroxilo de serina y treonina, así como la elongación y ramificación subsiguientes de la cadena de sacáridos mediante la adición de monosacáridos; 3. El anclaje de glicosilfosfatidilinositol (GPI), que es un glicolípido unido al (-terminal de una proteína; y 4. La C-glicosilación, que implica la formación de un enlace carbono-carbono entre el carbono C2 del anillo indol de triptófano y el carbono Cl de un residuo de a-manopiranosilo. Cualquier proteína dada puede contener múltiples glicosilaciones N, O ó C, pero no más de un anclaje GPI. Una adición no enzimática de sacáridos, llamada glicación, puede presentarse cuando las proteínas se mezclan con azúcares reductores mediante una serie de reacciones complejas. Los dos tipos de glicosilación proteica que por lo general son motivo de preocupación y que se analizan en los fármacos glicoproteicos son la N- y la 0-glicosilación. A continuación se analiza cada una de éstas.
N-Glicosilación La biosíntesis de N-glicanos en glicoproteínas se puede describir como un proceso en cuatro etapas: 1. Iniciación y elongación de la cadena de glicanos unida por lípidos; 2. Transferencia de oligosacáridos a la proteína o cadena de polipéptidos naciente; 3. Procesamiento de la cadena de N-glicanos mediante la eliminación de residuos específicos de glucosa y manosa; y 4. Modificación de la cadena de N-glicanos mediante la adición de residuos a los extremos no reductores de la cadena de glicanos. Hay consenso en que la secuencia de aminoácidos para la N-glicosilación es Asn-Xaa-Thr/Ser (donde Xaa es cualquier aminoácido diferente de prolina). En general, sólo aproximadamente dos tercios de todas las secuencias potenciales, denominadas secuones, se glicosilan y, en la actualidad, no existe un método para predecir qué secuón será glicosilado. La N-glicosilación de proteínas está relacionada, generalmente, con el tráfico y secreción de proteínas. Los N-glicanos pueden categorizarse como ricos en manosa, híbridos o complejos, dependiendo del grado de procesamiento (Figura 7). Las estructuras ricas en manosa (Apéndice 1) carecen de residuos de galactosa o de N-acetilglucosamina (GlcNAc), en las ramificaciones que funcionan como antenas en el extremo más distante de la cadena. En las estructuras híbridas, las antenas presentan residuos de GlcNAc sustituídos y residuos de manosa terminal, mientras que en las estructuras complejas, los residuos de a 1,6- y al ,3-manosa se sustituyen con grupos de GlcNAc. Los glicanos híbridos y complejos se pueden presentar con dos o más ramificaciones, frecuentemente denominadas antenas; por lo tanto, a tales glicanos a menudo se les denomina, por ejemplo, biantenarios, triantenarios o tetraantenarios. Asimismo, se sabe que existen los N-glicanos monoantenarios y pentaantenarios. En los glicanos complejos, las antenas con frecuencia portan residuos de ácido siálico terminal (ácido neuramínico). Se ha demostrado que la sialilación tiene un gran efecto sobre la farmacocinética y la farmacodinámica de muchas glicoproteínas terapéuticas.
1264 (1084) Análisis de Glicoproteínas y Glicanos /Información General
USP 39
Tipos comunes de glicanos (N-glicanos) con enlaces de asparagina (Asn) Fue, fucosa; Gal, galactosa; GlcNAc, N-acetilglucosamina: Man, manosa; NeuSAc, ácido N-acetilneuramínico
Tipo Rico en Manosa
(Man al,2)
·J-4
Manal,6 ,Mana'.1,6, Manal,3 ,Man¡31,4GlcNAc¡31,4GlcNAc¡31-Asn Man a'.l,3
f
Tipo Híbrido
ManaL6, jvlanal,6 - Man aL3 }-.an¡31,4GlcNAc¡31,4 GlcNAc¡31-Asn ± Neu5Aca2,3/6 Gal¡31,4 GlcNAc¡31,2 Man al,3 (Manal,2j
J.'
{
Tipos Complejos
Biantenario ±. GlcNAc¡31,4
1
Gal¡31,4 GlcNAc¡31,2 Man al,6
±Fucal,6
1
~Man¡31,4 G lcNAc¡31,4 G lcNAc¡31-Asn
±. ( Neu5Aca2,3/6) J •2 { Gal¡31,4 GlcNAc¡31,2 Man al,3
Triantenario
.±(Neu5Aca2,3/6) O-
Tetraantenario
3
f
Gal¡31,4GlcNAc¡31,4,
±.Fue al,6
,Manal,6, 1 Gal¡31,4 GlcNAc¡31,2 ,Man¡31,4 GlcNAc¡31,4 GlcNAc¡31-Asn Gal¡31,4GlcNAc¡31,2 Manal,3
Gal¡31,4 G lcNAc¡31,4 ~Man al,6
Gal¡31,4GlcNAc¡31,2
±. Fucal,6 \
1
Man J3L4 GlcNAc¡31,4 GlcNAc¡31-Asn ±.(Neu5Aca2,3/6)J-:
Gal¡31,4GlcNAc¡31,4,
/
1 Manal,3
G al¡31,4 G lcN Ac¡31, 2
Figura 1. Tipos comunes de N-glicanos. Para abreviaturas, ver el Apéndice 7.
0-G licosilación Las cadenas de 0-glicanos se construyen secuencialmente mediante un residuo de GalNAc inicial unido a serina, treonina y tirosina, así como a los aminoácidos menos comunes, hidroxiprolina e hidroxilisina. Se conocen múltiples estructuras centrales de glicanos. La secuencia y el enlace isomérico de monosacáridos presentan una mayor variedad que los de los N-glicanos y se han identificado por lo menos ocho tipos distintos (Figura 2). Aunque no hay consenso en una secuencia de aminoácidos determinada para la 0-glicosilación, por lo general, esta se favorece con la presencia de prolina, un residuo antes o tres residuos después del sitio de glicosilación, así como de la ausencia de residuos de aminoácidos cargados próximos a serina o treonina. La unidad de disacárido N-acetil-lactosamina, Galp 1,4GlcNAc, es la extensión más común de la cadena. También son frecuentes las modificaciones adicionales, incluyendo protección de la galactosa terminal con ácido siálico (terminal capping) y fucosilación a lo largo de la cadena. La 0-glicosilación puede ocurrir en grupos, por ejemplo, el tipo mucina, que por lo general forma parte de la matriz extracelular de la superficie celular o de glicoproteínas secretadas. Otra 0-glicosilación, como por ejemplo 0-GlcNAc, se presenta en muchas proteínas nucleocitoplásmicas; asimismo, la glicosilación con enlaces O-Man se presenta en algunas glicoproteínas musculares y neurales y en la levadura. Los tipos de glicosilación con enlaces O-Fue- y 0-Glc se presentan en un gran número . de proteínas epidérmicas parecidas al factor de crecimiento que se asocian con la vía de señalización Notch.
USP 39
Información General/ (1084) Análisis de Glicoproteínas
Núcleo 1
y Glicanos 1265
Galj31,4 GlcNAcj31,6 \ /Galj31,3 GlcNAcj31,3 GalBl.3 GalNAc al -Ser( Thr) Galj31,3 GlcNAc~l,3 '
Galj31,4 (GlcNAcj31,3 Galj31,4) n GlcNAcBl,6 \ GalNAcal - Ser(Thr)
Núcleo 2
GalBl,3 1
Galj31,4 GlcNAcj31,6\ Núcleo 3
Galj31,4 GlcNAcBl,3 GalNAcal -Ser( Thr) Galj31,4 GlcNAcj31,3 I
Galj31,4 GlcNAcBl,6 \ Núcleo 4
GalNAcal - Ser( Thr) Galj31,4 GlcNAcBl.3 I
Núcleo 5
GlcNAcBl,6 GalNAc al- Ser( Thr)
Núcleo 6
GalNAcBl,3 GalNAc al- Ser( Thr) Gal NA e al,6 GalNAcal- Ser{ Thr)
Núcleo 7
Gal al.3 GalNAc al- Ser( Thr)
Núcleo a
Figura 2. Estructuras nucleares comunes de 0-glicanos (resaltadas y subrayadas). Abreviaturas para azúcares conforme al Apéndice 7.
Heterogeneidad de los Glicanos El tipo de glicosilación (con enlaces N- u 0-), la ocupación del sitio y el sitio de glicosilación no son los únicos aspectos que pueden variar de glicoproteína a glicoproteína, sino que también las estructuras reales de los oligosacáridos (ramificaciones y uniones) pueden variar, incluso en el mismo sitio. La variación estructural sucede debido a que la glicosilación no se realiza a partir de un molde. El patrón de glicosilación en un sitio dado depende de muchos factores, incluyendo la disponibilidad de glicosiltransferasas y exoglicosidasas específicas de la célula y dependientes de su crecimiento encontradas en los aparatos de Golgi y el RE. La heterogeneidad conduce a diversas propiedades físicas y bioquímicas, y por consiguiente, también a la diversidad funcional.
Sistemas de Expresión de Células Huésped y Glicosilación BACTERIAS Aunque se ha demostrado que la O- y la N-glicosilación ocurren en una variedad de procariotes, la Escherichia coli, que es la bacteria elegida para muchos productos terapéuticos, no produce proteínas glicosiladas. LEVADURA Las levaduras producen proteínas N-glicosiladas y 0-glicosiladas. La hipermanosilación en las levaduras puede producir cadenas de N-glicanos con más de 100 residuos de manosa, pero la sialilación no ocurre a menos que el organismo sea genéticamente modificado. El desarrollo de cepas recombinantes de Pichía pastorís que contienen genes heterólogos insertados para varias enzimas de glicosilación ha permitido la N-glicosilación en esta levadura de manera similar a la que se produce en humanos. La 0-glicosilación en las levaduras también varía significativamente de la que se presenta en células de mamíferos. A diferencia de las células de mamíferos, la 0-glicosilación de la serina o treonina se produce mediante la unión de moléculas de manosa y a menudo consiste en cadenas lineales de hasta seis residuos de manosa.
1266 (1084) Análisis de Glicoproteínas y Glicanos / Información General
USP 39
CÉLULAS DE INSECTOS Las cadenas de N-glicanos de células de insectos por lo general son del tipo rico en manosa, trimanosa o paucimanosa y complejo truncado (ver el Apéndice 7 para definiciones). Las células de insectos también producen glicoproteínas con el residuo Fu cal, 3 unido al residuo de GlcNAc proximal en el núcleo de quitobiosa. Este residuo del núcleo de fu cosa es un potente inmunógeno y alérgeno. La 0-glicosilación en células de insectos no ha sido bien estudiada y aunque se han encontrado residuos de GalNAc-Ser(Thr) con enlaces 0-glicosídicos, son muy pocos los que se procesan más allá de la secuencia Gal,B l ,3GalNAc-Ser(Thr). No se han encontrado residuos de ácido siálico en proteínas producidas en células de insectos. VEGETALES Y CÉLULAS VEGETALES Los N-glicanos de vegetales contienen principalmente oligosacáridos del tipo oligomanosa, pero también están presentes los tipos híbridos y complejos truncados de estructuras, con o sin Xil,B 1,2 acopladas al residuo de manosa con enlace ,B del núcleo trimanosílico y Fucal,3 acoplado al residuo de GlcNAc proximal del núcleo de quitobiosa. Los residuos Fue y Xil son inmunogénicos y se ha demostrado que forman parte de los glico-epitopes de varios alérgenos vegetales. La 0-glicosilación en vegetales no ha sido bien estudiada pero se sabe que consiste predominantemente en la adición de cadenas de arabinogalactanos acopladas a residuos de hidroxiprolina, treonina y serina que se localizan en la pared celular del vegetal o en la superficie externa de la membrana plasmática celular. Estos glicanos son inmunogénicos. CÉLULAS ANIMALES La mayoría de las proteínas glicosiladas terapéuticas se producen en líneas continuas de células de animales. Se han empleado las células de ovario de hámster chino (CHO, por sus siglas en inglés), de riñón de cría de hámster (BHK, por sus siglas en inglés), de riñón embrionario humano (HEK, por sus siglas en inglés) y de mieloma de ratón (SP2/0 o NSO). Estas células animales por lo general producen proteínas con glicosilación similar a la que se observa en humanos. Aunque existen varias diferencias entre la glicosilación en células de roedores y humanos, tales como la presencia de ácido N-glicolilneuramínico que no se encuentra en humanos, las células de CHO se han convertido en una herramienta ampliamente utilizada por la industria biotecnológica.
ANÁLISIS DE GLICANOS PARA FÁRMACOS BIOLÓGICOS GLICOSILADOS La glicosilación de proteínas puede afectar la actividad biológica, ya sea directa o indirectamente, y la variabilidad en la glicosilación no sólo surge de la diversidad celular, sino también del proceso de fabricación. Por consiguiente, el patrón de glicosilación puede ser importante como parte de los estudios de caracterización al asegurar la uniformidad del proceso, y puede ser importante también al asegurar la calidad uniforme de un medicamento biológico después de su ingreso al mercado. Se requieren materiales de referencia adecuadamente caracterizados para respaldar el análisis biológico y fisicoquímico de las partidas de producción para asegurar la uniformidad entre partidas. El análisis de la glicosilación puede ser adecuado para los siguientes procesos: 1. Caracterización de la estructura y estabilidad de productos novedosos y su estabilidad en las etapas de procesamiento y almacenamiento; 2. Pruebas de liberación de partida y pruebas de control durante el proceso; y 3. Evaluación de la comparabilidad entre productos (p.ej., cuando se han realizado uno o más cambios en el proceso). La comprensión de la relación entre la estructura de glicanos y la función biológica permite tomar decisiones con respecto a la información requerida en cada etapa de desarrollo. Para fármacos biológicos/biotecnológicos, los criterios de caracterización y las especificaciones para la liberación de partidas por lo general se establecen en las pautas ICH Q6B, Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products (Procedimientos de Prueba y Criterios de Aceptación para Productos Biotecnológicos/Biológicos); 1 y ICH Q5E, Comparability of Biotechnological/Biological Products Subject to Changes in Their Manufacturing Process (Comparabilidad de Productos Biotecnológicos/Biológicos Sujetos a Cambios en Su Proceso de Fabricación). 2 El mapeo de glicanos se lleva a cabo aplicando numerosos enfoques y metodologías. Esta variedad es una consecuencia de la diversidad y complejidad de las estructuras de los glicanos, así como de la tecnología y los sistemas de detección disponibles. Debido a la diversidad y complejidad de las estructuras de los glicanos y al aumento en la disponibilidad y las mejoras en varios sistemas de detección y tecnologías, los métodos analíticos cubren una amplia gama. Los diferentes métodos que respaldan a los procedimientos paso a paso varían con las glicoproteínas, la disponibilidad de equipo, la experiencia de cada científico y los grupos de científicos, y la información requerida. Los dos tipos de glicosilación de proteínas más estudiados que afectan a la bioactividad son la N- y la 0-glicosilación. Los análisis de glicanos pueden emplearse en diversas aplicaciones; las más importantes son: caracterización general del producto, validación del proceso, evaluación de la comparabilidad, pruebas de estabilidad, control de uniformidad del proceso de fabricación y pruebas de liberación. La selección de las técnicas analíticas y sus aplicaciones en el desarrollo del producto y la 1 2
http://www.ich.org/products/guidelines/quality/article/quality-guidelines.html; ingresada el 15/12/2011. http://www.ich.org/products/guidelines/quality/article/quality-guidelines.html; ingresada el 15/12/2011.
Información General/ (1084) Análisis de Glicoproteínas y Glicanos 1267
USP 39
fabricación de rutina dependen de muchos factores, como por ejemplo la complejidad de la glicoproteína, el conocimiento de las relaciones entre glicosilación y seguridad y eficacia, y el diseño general de la estrategia para controlar el proceso de fabricación. Por ejemplo, incluso cuando la importancia biológica de la glicosilación es incierta, el control de la glicosilación se puede considerar como una medida de uniformidad de fabricación. El diagrama de flujo de la Figura JA es de gran ayuda en la selección de las aplicaciones del análisis de glicanos, mientras que la Figura 38 ofrece una perspectiva general de las técnicas analíticas disponibles y del equipo empleado.
Sí
Los análisis de glicanos deben considerarse únicamente para observar la uni-
No
¿La estructura del glicano modula la bioactividad de la molécula?
DETENER
formidad del receso
O incierto ¿La molécula se adapta al análisis sin escición de glicanos?
Seleccionar los métodos de mapeo de glicanos
Proteína pequeña, glicosilación limitada y estructuras simples
No
Decidir métodos de análisis (p.ej., análisis
por espectrofotometría de masas)
Molécula grande, glicanos con ramificaciones complejas y/o múltiples sitios de glicosilación
DETENER ¿Se requiere conocimiento sobre glicosilación sitio-específica'
Surge de la definición o biología del fármaco
No ·Determinación del intervalo de carga negativa · Identificación y cuantificación de ácido siálico y/o monosacáridos
No
Decidir métodos de análisis (p.ej., digestión de proteasa y análisis de glicopéptidos)
¿Se requiere del análisis
detallado de glicanos?
Seguir en B (Información general sobre análisis de glicanos): diseñar
métodos para el análisis de glicanos escindidos (p.ej., perfil antenario de las ramificaciones, identificación de estructuras individuales)
Figura 3A. Diagrama de flujo de ayuda para la selección de opciones del análisis de glicanos.
i
Información General sobre los Métodos de Análisis de Glicanos Análisis al nivel de glicoproteínas intactas
t
Espectrometría de masas MALDI y ESI lsoelectroenfoque para la heterogeneidad de la sialilación Electroforesis capilar para la heterogeneidad de la sialilación Cromatografía de intercambio iónico para la heterogeneidad de la sial ilación Métodos por arreglos (arrays) con Lectina Métodos ELISA con Lectina
g
Borohidruro alcalino ____,. ::;¡: cadenas con enlaces 0-)
Análisis al nive
Glicoproteínas Terapéuticas
de glicanos escindidos
::<
E
Hidrazina (cadenas . _ _ . ~ con enlaces O-y N-) -~ ~
Métodos enzimáticos_ (cadenas con enlaces N-)
~
Cromatografía en poligrafrto ..... Espectrometría de masas-MALDJ
J[ X
~
.fr
Análisis al nivel de glicopéptidos
-E
Análisis al nivel de , "d
monosacan os
Cromatografía HPAEC-PAD Separaciones lectínicas Marcac'.ón con 1Espectrometría de masas (MS) fluoroforo Electroforesis capilar Cromatografía de intercambio aniónico Tratamiento de exo-glicosidasas
..()... HPLC en fase normal==> MALDl-MS HPLC-ESl-MS-MS acopladas CE-ESl-MS-MS acopladas Electroforesis en gel
HPLC ____,.. Espectrometría de masas-MALDJ HPLC-ESl-Espectrometria de masas acopladas Espectrometría de masas-MALDI Electroforesis capilar para la heterogeneidad de la sialilación Electroforesis capilar-ESl-Espectrometría de masas acopladas
-E
Cromat~grafía HPAEC-PAD Marcac1on con fluoroforo __,. HPLC en fase reversa Tinción química
Figura 3B. Perspectiva general de las técnicas de análisis de glicanos y del equipo empleado.
1268 (1084) Análisis de Glicoproteínas y Glicanos / Información General
USP 39
SELECCIÓN DE ANÁLISIS DE GLICANOS PARA CARACTERIZACIÓN Y ESPECIFICACIÓN DE FÁRMACOS BIOLÓGICOS GLICOSILADOS Análisis de Glicoproteínas Intactas La forma más directa de análisis es el estudio de las moléculas intactas. Este método permite obtener información sobre el perfil de glicosilación de las glicoproteínas. Sin embargo, este procedimiento ofrece información limitada cuando se analiza una molécula grande con múltiples sitios de glicosilación. Uno de los factores de glicosilación más importantes que define la actividad biológica y determina la vida media de las glicoproteinas en circulación es el grado de sialilación. Esto hace que la electroforesis basada en carga iónica y la cromatografía de intercambio iónico sean las técnicas de elección. Se han usado casi todos los tipos de electroforesis en gel para estudiar la glicosilación de proteínas, incluyendo la electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE), (ver Artículos Obtenidos por Biotecnología-Electroforesis en Gel de Poliacrilamida (1056)) y el isoelectroenfoque (IEF), (ver Artículos Obtenidos por Biotecnología-lsoelectroenfoque (1054)). De manera similar, se ha demostrado que la electroforesis capilar (CE), (ver 1lll!l~~¡--.~:l!lll~i,~l~l~11llJ1¡¡) también es adecuada. La cromatografía de intercambio aniónico fuerte se ha usado con el mismo propósito, pero la resolución es a menudo inferior a la del IEF y la CE. La espectrometría de masas directa (MS) es otra opción para el análisis de la modificación postraduccional. A medida que se mejora la resolución de la MS, se hace posible, por medio de este método, la caracterización directa de glicoproteínas cada vez más complejas.
Análisis de Glicopéptidos El análisis de glicopéptidos ofrece información sobre los sitios de glicosilación, el grado de ocupación y las estructuras de los oligosacáridos. Los sitios de glicosilación se pueden ver afectados por las condiciones de cultivo celular. Por lo tanto, si un sitio de glicosilación conocido es crítico, los fabricantes deben monitorear las estructuras sitio-específicas de los glicanos. El método típico consiste en generar primero glicopéptidos mediante la digestión con proteasa y luego separarlos, por ejemplo, por HPLC en fase reversa (RP-HPLC) (ver Artículos Obtenidos por Biotecnología-Mapeo de Péptidos (1055)). Posteriormente, los glicopéptidos separados se pueden caracterizar individualmente, p.ej., mediante análisis directo usando MS, o por desglicosilación y posterior identificación de los glicanos, según se describe más adelante en la sección Perfil de Oligosacáridos Escindidos. La identificación directa mediante MS de la mezcla de glicopéptidos y péptidos sin glicosilar, está limitada por el efecto del enmascaramiento (supresión de iones) de los péptidos sobre las señales de los glicopéptidos. Se puede evitar este efecto separando los péptidos de los glicopéptidos antes del análisis por MS, por ejemplo, combinando el análisis MS fuera de línea (ionización por desorción con láser asistida por matrices [MALDI, por sus siglas en inglés]) o por acoplamiento en línea (ionización por electrospray [ESI, por sus siglas en inglés]). El análisis por MS de glicopéptidos es importante en la caracterización de 0glicanos debido a que estos glicanos no siempre se liberan cuantitativamente y además, debido a su menor tamaño, se adaptan mejor a la caracterización por MS como glicopéptidos. También puede ser apropiado usar CE de alta resolución para la separación, en especial para el análisis de sialilación.
Perfil de Oligosacáridos Escindidos La generación de un perfil de glicanos totales escindidos de glicoproteínas es el método más común para caracterizar glicoproteínas. Este método ofrece información sobre las diversas poblaciones de glicanos presentes en las proteínas. El grado de sialilación también se puede analizar en este proceso. Dependiendo del método seleccionado, pueden ser necesario derivatizar o marcar previamente a los glicanos para permitir su detección. Se encuentran disponibles muchos protocolos y la mayoría de los pasos en el análisis están bien establecidos. La posible desventaja con tal flexibilidad es la falta de acuerdo con respecto a la elección del método bajo ciertas circunstancias; debido a la variedad de técnicas analíticas, no siempre es posible comparar los resultados obtenidos usando diferentes plataformas. Hasta ahora, la mayoría del trabajo se ha enfocado en la N-glicosilación, debido a los siguientes factores: 1. Por lo general, los N-glicanos son clínicamente más relevantes que los 0-glicanos en los productos biológicos; o 2. La liberación de N-glicanos, ya sea por medios químicos (hidrazina) o por enzimas (endoglicosidasas y N-glicosidasa peptídica F [PNGasa F]), es más sencilla que la liberación de glicanos con enlace 0-. DESGLICOSILACIÓN El método usado para la liberación de glicanos depende de la glicoproteína en análisis. El agente de escisión se selecciona de acuerdo con el tipo de escisión y el nivel de información requeridos. Se puede usar escisión enzimática o química. La Tabla 7 proporciona una lista de algunos agentes de escisión enzimática y su especificidad. La eficiencia de la digestión por lo general depende de la accesibilidad de los glicanos en la proteína y, por consiguiente, la proteína debe desnaturalizarse para maximizar la exposición del sitio de glicosilación, a menos que los analistas deseen distinguir entre glicanos en la superficie y en el
USP 39
Información General/ (1084) Análisis de Glicoproteínas y Glicanos 1269
interior de la proteína. También pueden usarse agentes de escisión química, por ejemplo, hidrazina o borohidruro alcalino para [3-eliminación de glicanos con enlace 0-. Tabla 1. Ejemplos de Agentes de Escisión Enzimática Agente
Especificidad
Liberación de gllcanos con enlace NPéptido-N4 -(N-acetil-,B -glucosaminil) asparagina amidasa (EC 3.5.1.52)
Hidrólisis del residuo del péptido-N4 -(N-acetil-,B -glucosaminil) asparagina en la que el residuo de glucosamina puede estar aún más glicosilado que resulta en una N-acetil-,B -D-glucosaminilamina (sustituida) y un péptido que contiene un residuo de aspartato.
Péptido-N-Glicosidasa F (PNGasa F)
Liberación de las cadenas de N-glicano que no contienen núcleo de fucosa con enlace (al ,3).
Péptido-N-Glicosidasa A (PNGasa A)
Liberación de las cadenas de N-glicano que contienen un núcleo de fucosa con enlace (al ,3).
Manosil-glicoproteína endo-,B -N-acetilglucosaminidasa (EC 3.2.1.96)
Endohidrólisis de la unidad N,N'-diacetilquitobiosilo en glicopéptidos/ glicoproteínas ricos en manosa que contienen la estructura [Man(GlcNAc)i]Asn
Endo-,B -N-acetilglucosaminidasa F (endo F)
Liberación de oligosacáridos ricos en manosa, híbridos y complejos
Endo-,B -N-acetilglucosaminidasa H ( endo H)
Liberación de oligosacáridos ricos en manosa e híbridos
Liberación de glicanos con enlace OGlicopéptido-a-N-Acetilgalactosaminidasa (EC 3.2.1.97)*
Hidrólisis de residuos D-galactosil-N-acetil-a-D-galactosaminídicos terminales
* Esta enzima tiene un uso limitado debido a su alta especificidad de sustrato.
Liberación Química o Enzimática de N-Glicanos-La PNGasa F (Flavobacterium meningosepticum) es la enzima de preferencia para la liberación de N-glicanos para la mayoría de las glicoproteínas, excepto para algunas glicoproteínas de células vegetales y de insectos que pueden contener un residuo Fucal ,3 unido al núcleo de quitobiosilo. Las cadenas de N-glicanos que tienen esta estructura pueden ser separadas del glicopéptido únicamente por la enzima de almendra, PNGasa A. La liberación química por hidrazina anhidra es mucho menos común, principalmente debido a la disponibilidad limitada del reactivo, el cual se considera como un químico peligroso. Asimismo, la hidrazinólisis produce N-glicanos des-N-acetilados. Liberación Química o Enzimática de 0-Glicanos-En la actualidad, solamente una enzima, la 0-glicanasa de Diplococcus pneumoniae, está disponible para la liberación de 0-glicanos y esta enzima tiene un uso limitado debido a su alta especificidad de sustrato: únicamente separa residuos de Galf3 l ,3GalNAcal-Ser/Thr. Además, no se dispone de un procedimiento químico ideal; no obstante, los 0-glicanos unidos a Ser y Thr se pueden liberar generalmente mediante la reacción por f3 -eliminación reductora catalizada con álcali (reacción con borohidruro alcalino), en la que los glicanos liberados se reducen tan pronto como se escinden a fin de evitar la formación de productos de degradación debido al "peeling". Sin embargo, esta reacción no es específica y se sabe que, por lo general, durante la reacción también se liberan aproximadamente 10%-20% de N-glicanos. Los glicanos liberados carecen de un grupo reductor usado para el acoplamiento de marcadores fluorescentes mediante aminación reductiva. Afortunadamente, gracias a los avances en la sensibilidad de la MS, es posible la identificación directa de glicanos reducidos. Se pueden obtener 0-glicanos reductores de una calidad relativamente buena mediante f3 -eliminación catalizada con álcali usando aminas primarias tales como la etilamina y la hidrazina. No obstante, ambos reactivos tienen el potencial de producir productos de degradación debido al "peeling". Además, la liberación de 0-glicanos con etilamina no es cuantitativa. Aunque la hidrazina puede ser mejor que la etilamina, requiere del estricto control de las condiciones de reacción y manipulación, además de que no cuenta con una fuente comercial en Europa. Separación de Glicanos Escindidos Sin Marcado Fluorescente-Los N-glicanos también se pueden resolver mediante cromatografía de intercambio aniónico HPAEC de pH alto con detección amperométrica por pulsos (PAD, por sus siglas en inglés; ver Cromatografía (621 )), la cual presenta alta sensibilidad, puede separar algunos isómeros y alcanzar una capacidad para detectar directamente glicanos nativos sin marcar. No obstante, la LC/MS para este método de separación es complicada debido a que este sistema HPAEC usa fases móviles con pH elevado y alta concentración de sales que interfieren con la ionización de los glicanos. Además, la cuantificación absoluta del glicano sólo es posible si se conocen los factores de respuesta PAD individuales para las diversas estructuras de los glicanos, p.ej., si se encuentra disponible una biblioteca de referencia de oligosacárido apropiada. La cromatografía en grafito poroso (PGC, por sus siglas en inglés) también puede usarse para separar glicanos y ofrece selectividad ortogonal adicional en comparación con otras columnas. Es posible aplicar un método de PGC-MS por ionización con electrospray y para el análisis directo de glicanos. La MALDl/ESl-MS es un método potente para el análisis de mezclas de glicanos tanto en la forma nativa como en la forma derivatizada. La permetilación de glicanos liberados es un método común para el análisis directo usando MALDl/ESl-MS, especialmente para glicanos sialilados.
USP 39
1270 (1084) Análisis de Glicoproteínas y Glicanos / Información General
MARCADO DE GLICANOS PARA INCREMENTAR LA SENSIBILIDAD DE DETECCIÓN Y/O PARA MODIFICAR SUS PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS La derivatización química es el método más común que se emplea para marcar glicanos en su extremo reductor mediante aminación reductiva. Se puede acoplar un marcador fluorescente a cada mono y oligosacárido, facilitando así la determinación de cantidades molares. La Tabla 2 presenta los ejemplos más comunes de marcadores fluorescentes y sus usos más comunes. Tabla 2. Ejemplos de Marcadores Fluorescentes Nombre Ácido 2-aminobenzoico
Acrónimo en inglés 2-AA
Técnica Analítica
Estructura
o:;
HPLC
o-
~
o
2-Aminobenzamida
2-AB
NH 2
cx;H,
HPLC MS
o 2-Aminopiridina
2-AP
Sal trisódica de 8-aminopireno-1,3,6-trisulfónico
APTS
HPLC
QNH, Na0 3S
~
NH 2
CE
1
~~~ 1
~I ~ I~
Na0 3S
~
S0 3 Na
PERFIL DE N-GLICANOS El análisis o la determinación del perfil de los glicanos liberados se puede realizar mediante procedimientos cromatográficos, electroforéticos o de MS y, en general, mediante una combinación de los mismos. Los métodos se pueden elegir y agrupar de acuerdo con la naturaleza de los glicanos y el nivel de información requerida. El análisis de glicanos ofrece información sobre las diversas poblaciones de glicanos presentes en la proteína (ricos en manosa, híbridos, complejos). Perfil de Glicanos mediante HPLC y/o Electroforesis y MS-La generación de perfiles de glicanos marcados con etiquetas fluorescentes mediante HPLC se ha convertido en el método más común. Se puede acoplar una etiqueta a cada mono y oligosacárido individual mediante aminación reductiva en su extremo reductor, facilitando la determinación de cantidades molares. Con un marcador apropiado, se puede generar un perfil de glicanos con alta sensibilidad usando HPLC en fase reversa, en fase normal y de intercambio aniónico (ver Cromatografía (621 )). Rutiariamente, los analistas usan una combinación de estos métodos a fin de incrementar la resolución de la separación y para diferenciar mejor las estructuras de los glicanos. La exactitud de la identificación de los glicanos se puede validar mediante estándares de glicanos y/o acoplando el sistema HPLC con MS. Por consiguiente, la HPLC de intercambio aniónico, en fase normal y en fase reversa-ESl-MS-MS forman combinaciones poderosas; asimismo y de ser posible, el análisis en línea puede ofrecer perfiles cuantitativos relativos e información sobre la estructura de los glicanos en una sola corrida. La identificación de los picos a través del tiempo de retención es aceptable siempre que sus identidades hayan sido previamente validadas por métodos complementarios y que sea posible garantizar la homogeneidad de los picos. El grado de sialilación de las cadenas de los glicanos puede ser un factor crucial para la eficacia clínica, debido a que la sialilación a menudo define la vida media de la molécula in vivo. La HPLC de intercambio aniónico es el método más simple para su determinación y las estructuras de los glicanos separados basandose en la carga pueden ser identificadas posteriormente mediante MS. Cuando la interfase de ionización está diseñada únicamente para flujos de bajo contenido salino, es necesaria la desalinización de cada fracción antes de la MS.
USP 39
Información General/ (1084) Análisis de Glicoproteínas y Glicanos 1271
Cuando se utilizan sistemas de separación de alta resolución tales como la CE, se pueden identificar las estructuras de los glicanos usando estándares bien caracterizados para comparación, sin necesidad de usar la MS. El desarrollo de un sistema CEMS en línea ha incrementado aún más el poder del análisis de glicanos usando este método. Identificación Estructural por Secuenciación Microenzimática y Espectrometría de Masas-Cuando se requiere información detallada sobre la estructura, el análisis generalmente se lleva a cabo usando secuenciación microenzimática. Este procedimiento depende en gran medida de la especificidad y calidad de las enzimas usadas. En los últimos tiempos, la MS en tándem se ha usado con mayor regularidad para confirmar, determinar y secuenciar estructuras de glicanos conocidas y nuevas; este método es factible especialmente cuando los glicanos se liberan de glicoproteínas bien conocidas y de fuentes de producción también bien conocidas.
Análisis de Monosacáridos Diversos ensayos cuantitativos de monosacáridos se llevan a cabo para una variedad de propósitos. En el campo de las glicoproteínas, estos proporcionan información sobre las cantidades relativas de sacáridos en una glicoproteína y sobre el grado de sialilación de una glicoproteína; asimismo, a través de la medición de la composición de monosacáridos, ofrecen cierta información sobre la estructura de las cadenas de glicanos presentes. Los ensayos usados más simples son las pruebas colorimétricas para demostrar que el producto sea glicosilado y para cuantificar la cantidad total de sacárido presente en el producto. Dichas pruebas tienen una pobre especificidad entre diferentes tipos de residuos de azúcares. Los ensayos de la composición de monosacáridos son por lo general más simples de realizar que el perfil de oligosacáridos, aunque proveen menos información. El ensayo de mayor uso es la cuantificación de contenido de ácido siálico, debido a que la pérdida de sialilación y exposición de residuos Gal terminales pueden llevar a una eliminación más rápida de la glicoproteína de la circulación. Estos ensayos se pueden dividir en dos tipos: (1) aquellos que proporcionan información composicional sobre la muestra intacta sin degradación previa; y (2) otros, principalmente cromatográficos, que requieren la hidrólisis de las cadenas de sacáridos antes del análisis y que generan información cuantitativa sobre diversas especies de monosacáridos de manera simultánea. En general, los primeros son colorimétricos y los últimos son cromatográficos. La etapa de hidrólisis es una fuente importante de variabilidad del ensayo y puede requerir de optimización cuidadosa para muestras específicas. La presencia de ciertos monosacáridos señala la presencia de estructuras de glicanos específicas. Por ejemplo, la GalNAc generalmente indica la presencia de cadenas de 0-glicanos, mientras que la fucosa denota la presencia de tipos específicos de cadenas. Como consecuencia de la diversidad limitada de residuos de monosacáridos presentes en los glicanos de las glicoproteínas, se requiere la cuantificación exacta de los residuos Man, Gal o GlcNAc a fin de distinguir entre grandes cantidades de glicanos estructuralmente diversos. El monosacárido ácido N-glicolilneuramínico (Neu5Gc, por sus siglas en inglés) no se produce en humanos y por lo general se considera un componente indeseable y potencialmente inmunogénico de los productos biofarmacéuticos. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA Las muestras de glicoproteínas para el análisis de monosacáridos deben estar libres de sales, excipientes y demás materiales portadores (a menudo se usan azúcares de bajo peso molecular como excipientes para productos biofarmacéuticos). Lo anterior se puede lograr a través de una variedad de métodos, incluyendo los siguientes: 1. Diálisis contra agua o contra un amortiguador volátil, usando una membrana adecuada y liofilización; 2. HPLC en una columna para permeación en gel apropiada, eluida con agua o con un amortiguador volátil, monitoreada por absorbancia UV o índice de refracción y seguida por la liofilización de la muestra; o 3. Captura de la muestra en un cartucho RP-SPE (de fase reversa para extracción en fase sólida) como por ejemplo un sistema para SPE (extracción en fase sólida) Cl 8 o C8, seguido por lavado para eliminar las sales y excipientes y elución de la muestra requerida. CUANTIFICACIÓN El método común para la cuantificación de azúcares neutros en las glicoproteínas depende del color generado al calentar glicanos o glicoproteínas en presencia de fenol acuoso en ácido sulfúrico concentrado. En muchos casos, el calor requerido para esta reacción se genera agregando ácido sulfúrico concentrado a la mezcla de glicoproteínas-fenol en agua. El mezclado rápido y eficaz de las soluciones es crítico para obtener resultados uniformes. Los resultados cuantitativos se obtienen mediante el análisis simultáneo de estándares para generar una curva estándar de absorbancia en función de la cantidad de sacáridos y/o en función de una muestra de referencia del producto en análisis.
1272 (1084) Análisis de Glicoproteínas y Glicanos / Información General
USP 39
PROCEDIMIENTOS DE HIDRÓLISIS PARA CADENAS DE POLISACÁRIDOS Y GLICANOS DE GLICOPROTEÍNAS Los métodos cromatográficos para la identificación y cuantificación de componentes de monosacáridos requieren la hidrólisis de la muestra antes del análisis. Es necesaria la preparación adecuada de la muestra debido a que los excipientes o las impurezas relacionadas con el proceso pueden ser sacáridos, y las sales residuales pueden interferir con la hidrólisis o con la separación cromatográfica subsiguiente o con la marcación con fluoróforo. Los residuos de ácido siálico pueden ser liberados mediante hidrólisis ácida moderada o por tratamiento enzimático, lo cual deja otros residuos de azúcares unidos a la cadena peptídica. La cuantificación de la cantidad de sacárido presente se basa en la adición de un estándar interno antes o después de la hidrólisis. El estándar más comúnmente usado para el análisis de ácido siálico mediante HPAEC es el ácido 3-desoxi-o-gliceroD-galacto-2-nonulosónico (KDN), mientras que la 2-desoxiglucosa se usa ampliamente para azúcares neutros. Ambos azúcares son acidolábiles y se deben agregar después de la etapa de hidrólisis. La cuantificación exacta depende de la hidrólisis estequiométrica y de que no se degraden los productos monosacáridos durante la hidrólisis. DETERMINACIÓN DE ÁCIDOS SIÁLICOS TOTALES Los ácidos siálicos se presentan en polisacáridos y glicoproteínas bacterianas generalmente como derivados N-acetilo y Nglicolilo del ácido neuramínico (Neu5Ac y Neu5Gc). Los ácidos siálicos pueden determinarse junto con otros monosacáridos a través de un proceso que incluye hidrólisis ácida para liberar monosacáridos constitutivos, seguida de HPLC usando una mezcla estándar apropiada. Otra alternativa para determinar el contenido total de ácido siálico son los procedimientos colorimétricos sin necesidad de hidrólisis. El método comúnmente referido como método Warren se basa en la reacción del ácido tiobarbitúrico con el producto de oxidación con peryodato del ácido neuramínico liberado in situ a partir de la glicoproteína. También el color se puede generar, mediante la reacción de resorcinol con ácido neuramínico. Para alcanzar una cuantificación exacta, se incluye una muestra de estándar de referencia en cada medición. Liberación Selectiva de Ácidos Siálicos-La hidrólisis ácida o la digestión enzimática moderadas se pueden usar para liberar de manera selectiva ácido siálico a partir de las cadenas de glicanos de glicoproteínas para cuantificación por métodos cromatográficos y para cuantificación de formas indeseables tales como el Neu5Gc. Resultan necesarias condiciones ácidas más agresivas a fin de liberar azúcares neutros y amino azúcares antes del análisis cromatográfico. El protocolo debe ser optimizado con respecto al rendimiento y la degradación de sacáridos para cada proteína a analizar. Digestión de Neuraminidasa para la Liberación de Ácido Siálico a partir de Glicoproteínas Intactas-Diversos tipos de neuraminidasas han sido aisladas y estudiadas; la enzima derivada de Clostridium perfringens es la que se usa de manera más común para la liberación enzimática de ácidos siálicos a partir de las glicoproteínas. La enzima recombinante está disponible a través de proveedores comerciales. Se encuentran disponibles otras enzimas con diferentes especificidades que pueden ser utilizadas para distinguir diferentes tipos de enlaces. Las condiciones de hidrólisis deben optimizarse para cada producto, debido a que los parámetros cinéticos para diferentes enlaces, así como para Neu5Ac y Neu5Gc pueden variar. La eliminación selectiva de Neu5Ac con enlaces a2~,3 y Neu5Ac con enlaces a2~,6 a partir de glicanos escindidos es un medio conveniente para definir enlaces. Para análisis cuantitativos, se agrega una cantidad conocida de un estándar interno adecuado, a menudo 2desoxiglucosa, después de la hidrólisis y eliminación del ácido. SEPARACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE MONOSACÁRIDOS NO MARCADOS El único método usado para la identificación y cuantificación simultáneas de monosacáridos no marcados en hidrolizados es esencialmente HPAEC-PAD. Los métodos HPAEC-PAD también son aplicables a separaciones de oligosacáridos, por lo que se puede usar un único método instrumental para ambas aplicaciones. Para mayor información sobre los principios y componentes generales de cromatografía, ver Cromatografía (621 ). El HPAECPAD facilita el análisis de monosacáridos y todas las clases de oligosacáridos sin derivatización. Debido a que son compuestos polihídricos, los carbohidratos son ácidos débiles con valores pKa de 12-14 y, a valores elevados de pH, incluso los carbohidratos neutros se ionizan y pueden ser separados como oxianiones mediante cromatografía de intercambio iónico. Aunque las separaciones pueden llevarse a cabo en intercambiadores aniónicos con poliestireno-divinilbenceno porosos estables en álcali, los carbohidratos tienden a presentar picos amplios como resultado de problemas de transferencia de masas. En las microesferas peliculares de relleno de la columna de intercambio aniónico, las microesferas de látex funcionalizadas (diámetro <0, 1 µm) se acoplan a microesferas no porosas uniformes de mayor tamaño (diámetro <1 Oµm). El analito de carbohidrato interactúa con los grupos funcionales en la superficie de las microesferas de látex, eliminando la difusión hacia dentro y hacia afuera de los poros y el ensanchamiento del pico asociado. La PAD es el método preferido para la detección de carbohidratos en HPAEC debido a que se basa en las soluciones con pH alto provistas por HPAEC de manera predeterminada. La detección amperométrica mide la corriente o la carga que resulta de la oxidación o reducción de moléculas de analito en la superficie de un electrodo de trabajo. Los electrones se transfieren del analito electroactivo al electrodo durante las reacciones de oxidación y en la dirección opuesta durante las reacciones de reducción. Este proceso permite la detección sensible y altamente selectiva de analitos que se pueden oxidar o reducir, pero las especies interferentes que no son electroactivas siguen sin ser detectadas. Los carbohidratos se oxidan fácilmente en electrodos de oro y platino a un pH elevado y la corriente generada es proporcional a la concentración de carbohidratos.
USP 39
Información General/ (1084) Análisis de Glicoproteínas y Glicanos 1273
Un sistema típico de detección amperométrica contiene un electrodo de trabajo y un electrodo de referencia. Los electrodos de oro son los más comunes para el análisis de carbohidratos, pero los productos de oxidación dañan la superficie del electrodo e inhiben la oxidación adicional. Una superficie estable y activa en el electrodo se logra mediante pulsaciones cíclicas entre potenciales positivos y negativos altos. A esta serie de potenciales diferentes a intervalos regulares se la conoce como forma de onda y la aplicación repetida de una forma de onda es la base de una amperometría por pulsos. Se usan diferentes formas de onda para diferentes aplicaciones HPAEC-PAD y para diferentes electrodos de trabajo: los electrodos de oro desechables requieren el uso de formas de onda cuádruples y rápidas, pero otros electrodos de oro permiten el uso de un rango más amplio de formas de onda sin dañar la superficie del electrodo. Los electrodos desechables y las formas de onda rápidas se introdujeron para minimizar la influencia del electrodo de receso sobre la sensibilidad y precisión de aplicaciones cuantitativas de monosacáridos. MARCACIÓN DE MONOSACÁRIDOS CON FLUORÓFORO ANTES DE LA SEPARACIÓN Y LA CUANTIFICACIÓN Un método alternativo a la identificación y cuantificación de monosacáridos presentes en un hidrolizado consiste en modificar los monosacáridos mediante aminación reductiva con un marcador fluoróforo fácilmente detectable que permita la detección de alta sensibilidad y mejore la separación cromatográfica de monosacáridos. Se puede usar un equipo de HPLC esencialmente estándar y, debido a que se pueden aplicar los mismos métodos de marcación a los oligosacáridos separados, es posible aplicar un método analítico congruente. La marcación con fluoróforo se ha usado en mucha menor medida que HPAEC-PAD para la identificación y cuantificación de monosacáridos. La marcación de derivados de ácido siálico por lo general se lleva a cabo con 1,2-fenilendiamina (o DMB, 4,5-metilendioxi-derivados) y los productos resultantes se separan en una columna C-18 usando detección por fluorescencia.
CONCLUSIÓN Por lo general, debido a la complejidad de las estructuras de los glicanos de las glicoproteínas y su variación inherente durante los procesos de producción, se requiere que los fabricantes desarrollen, mediante estudios de caracterización, criterios para controlar el patrón de glicosilación de un fármaco biológico cuando ocurra la glicosilación y que desarrollen el nivel de información requerido en cada etapa de la producción y en la liberación de partidas. Posteriormente, se pueden derivar procedimientos analíticos de tal manera que proporcionen información pertinente para cumplir con los requisitos de calidad. En general, resulta necesaria una combinación de métodos y técnicas, además de que se requiere un análisis estructural de glicanos más detallado en etapas tempranas del desarrollo de fármacos. Las consideraciones sobre la validación son importantes a medida que progresa el desarrollo de métodos y el conocimiento de los productos.
APÉNDICE 1 Abreviaturas Fue
L-Fucosa
Gal
o-Galactosa
GalNAc
N-Acetil-o-galactosamina
Glc
o-Glucosa
GlcNAc
N-Acetil-o-glucosamina
Man
o-Manosa
Neu5Ac
Ácido N-acetilneuramínico
Neu5Gc
Ácido N-glicolilneuramínico
Xil
o-Xi losa
Definiciones Adicionales Ricas en manosa-Cadenas de glicanos que contienen dos residuos de núcleo de GlcNAc y entre cinco y nueve residuos de Man y que carecen de residuos de Gal, GlcNAc o Neu5Ac en las antenas. Dichas cadenas por lo regular se encuentran en glicanos de mamíferos. Hipermanosilación-(i) Adición de residuos de Man a cadenas ricas en manosa que crea cadenas con grandes cantidades de residuos de Man y ii) cadenas de glicanos con enlaces O-Man con múltiples residuos de Man sintetizados por levadura. Paucimanosa-Cadenas de glicanos que contienen dos residuos de núcleo de GlcNAc entre dos y cuatro residuos de Man. Pueden estar presentes residuos unidos al núcleo de Fucal ,3 y/o Fucal ,6. Oligomanosa-Se usa en este capítulo como un término genérico que incluye rico en manosa, paucimanosa y cadenas hiper-manosiladas con enlaces N.
1274 (1086) Impurezas en Fármacos y Productos Farmacéuticos/ Información General
USP 39
(1086) IMPUREZAS EN FÁRMACOS Y PRODUCTOS FARMACÉUTICOS INTRODUCCIÓN Este capítulo de información general tiene como propósito proporcionar la terminología común para impurezas y productos de degradación que pueden estar presentes en fármacos y productos farmacéuticos farmacopeicos. Las impurezas o productos de degradación en fármacos pueden surgir durante el proceso de fabricación o durante el almacenamiento del fármaco. Los productos de degradación en productos farmacéuticos pueden surgir a partir de fármacos o productos de reacción del fármaco con el ambiente, con un excipiente o un sistema de envase-cierre primario. Este capítulo no cubre productos biológicos y biotecnológicos, productos de fermentación y productos semisintéticos derivados de los mismos, y preparaciones radiofarmacéuticas. La inclusión en esta Farmacopea de definiciones de términos y los contextos en que se usan dichos términos, permite mejorar las comunicaciones acerca de impurezas y productos de degradación en artículos farmacopeicos. 0/er Definiciones más adelante.) En los últimos años ha habido mucha actividad y discusión sobre definiciones de términos. Ciertas inquietudes de la industria acerca de la terminología y el contexto merecen una publicación de amplia difusión y fácil acceso, y por ello se incluyen en esta Farmacopea. Ver la sección 5.60, Impurezas y Sustancias Extrañas en la sección 5, Componentes de las Monografías en Advertencias y Requisitos Generales y el capítulo general Impurezas Comunes (466). Con el transcurso de los años se han agregado otros capítulos generales que incluyen tópicos de pureza o impurezas a medida que cobraron relevancia o se dispuso de la metodología analítica. En el capítulo Validación de Procedimientos Farmacopeicos (1225) se amplían los aspectos analíticos. Las mediciones de pureza o impurezas en productos farmacéuticos suponen un desafío para el establecimiento de las normas Farmacopeicas. Cuando se trata de la degradación de un producto farmacéutico con el transcurso del tiempo, los mismos métodos analíticos indicadores de estabilidad son también indicadores de pureza. La separación de los ingredientes activos de los excipientes necesarios para la preparación presenta el mismo problema cualitativo. Por esto, muchas monografías de preparaciones Farmacopeicas se caracterizan por tener valoraciones cromatográficas. Cuando se conocen las impurezas de mayor significancia, algunas monografías establecen pruebas de límite específicas. Sin embargo, en general, en esta Farmacopea no se repiten pruebas de impurezas en las monografías de preparaciones subsiguientes cuando dichas pruebas se especifican para las monografías del fármaco y siempre que se espere que tales impurezas no aumenten. Se asume que se retienen muestras adecuadas de la partida exacta de un fármaco usado en un lote específico de un producto farmacéutico. Siempre que el análisis de un artículo oficial genere dudas sobre los atributos oficiales de cualquiera de los fármacos usados, se debe realizar un análisis de las muestras de retención.
FÁRMACO Clasificación de Impurezas-Las impurezas se pueden clasificar en las siguientes categorías: 1. Impurezas orgánicas (de proceso y del fármaco) 2. Impurezas inorgánicas 3. Disolventes residuales Las impurezas orgánicas pueden surgir durante el proceso de fabricación y/o almacenamiento del fármaco. Pueden ser identificadas o no identificadas, volátiles o no volátiles, e incluyen lo siguiente: 1. Materiales iniciales 2. Subproductos 3. Productos intermedios 4. Productos de degradación 5. Reactivos, ligandos y catalizadores 6. Isómeros geométricos y estereoisómeros Las impurezas inorgánicas pueden resultar del proceso de fabricación. Por lo regular se conocen e idientifican, e incluyen lo siguiente: 1 . Reactivos, ligandos y catalizadores 2. Metales pesados u otros metales residuales 3. Sales inorgánicas 4. Otros materiales {p.ej. adyuvantes de filtración, carbón) Los disolventes residuales son líquidos orgánicos que se usan como vehículos para la preparación de soluciones o suspensiones en la síntesis de un fármaco. Debido a que generalmente presentan una toxicidad conocida, la selección de los controles apropiados se logra fácilmente (ver Disolventes Residuales (467)). Los conceptos para establecer los límites de impurezas o productos de degradación en fármacos se basan en inquietudes de índole química y física. Como tales, los límites para impurezas orgánicas e inorgánicas y disolventes residuales se deben establecer para los fármacos. El principio básico para establecer límites consiste en que los niveles de impurezas o de productos de degradación en un fármaco se deben controlar durante su desarrollo para asegurar su seguridad y calidad de uso en un producto farmacéutico.
USP 39
Información General/ (1086) Impurezas en Fármacos y Productos Farmacéuticos 1275
Se debe establecer evidencia documentada de que el procedimiento analítico usado para evaluar impurezas o productos de degradación está validado y es adecuado para la detección y cuantificación de impurezas o productos de degradación.
PRODUCTO FARMACÉUTICO La especificación para un producto farmacéutico incluye una lista de productos de degradación que se espera estén presentes durante la fabricación del producto comercial y en las condiciones de almacenamiento recomendadas. Se deben usar estudios de estabilidad, conocimiento de rutas de degradación, estudios de desarrollo de producto y estudios de laboratorio para caracterizar el perfíl de degradación. La selección de productos de degradación en la especificación del producto farmacéutico debe basarse en los productos de degradación encontrados en las partidas fabricadas mediante el proceso comercial propuesto. Este fundamento debe incluir una discusión sobre los perfiles de degradación observados en las partidas usadas para los estudios de seguridad y desarrollo clínico y en estudios de estabilidad, en conjunto con una consideración del perfil de degradación de partidas fabricadas mediante el proceso comercial propuesto. Para los productos de degradación que se reconocen como inusualmente potentes o que producen efectos farmacológicos tóxicos o inesperados, el límite de cuantificación/detección de los procedimientos analíticos debe ser proporcional al nivel al que se deben controlar los productos de degradación. Para productos farmacéuticos, el concepto para establecer límites de productos de degradación se basa en aplicar un juicio científico bien establecido a los datos disponibles sobre la seguridad y estabilidad del producto farmacéutico, datos que puedan incluir rutas de degradación del fármaco, el proceso de fabricación, interacciones conocidas del excipiente, cualquier estudio de evaluación de seguridad, estudios de estabilidad realizados en las condiciones de almacenamiento recomendadas y estudios auxiliares que pudieran proporcionar información adicional sobre el perfil de estabilidad del producto farmacéutico. Las impurezas que no son productos de degradación (p.ej., impurezas de proceso derivadas del fármaco) a menudo no se controla en el producto farmacéutico, pues por lo general se controlan en el fármaco y no se espera que estas impurezas aumenten con el paso del tiempo. Se pueden encontrar pautas adicionales para establecer límites en diversos documentos del ICH y la FDA, así como en las pautas de presentación de monografías USP. Se debe establecer evidencia documentada de que el procedimiento analítico usado para evaluar impurezas o productos de degradación está validado y es adecuado para la detección y cuantificación de impurezas o productos de degradación. Los productos farmacéuticos deben contener niveles de disolventes residuales que no sean mayores a los que pueden respaldarse mediante los datos de seguridad (ver Disolventes Residuales (467)).
Cambio en la redacción:
DEFINICIONES Componentes Concomitantes-Los componentes concomitantes son característicos de muchos fármacos y no se consideran impurezas en el sentido Farmacopeico. En esta Farmacopea se establecen límites de contenido o intervalos específicos, o se definen mezclas de los componentes concomitantes. Son ejemplos de componentes concomitantes los isómeros geométricos y ópticos (o racematos) y los antibióticos que son mezclas. Cualquier componente que pueda considerarse una impureza tóxica debido a su efecto biológico indeseable significativo no se considera un componente concomitante. Contaminantes del Proceso-Los contaminantes del proceso son sustancias identificadas o no identificadas (excluidas las sustancias relacionadas y el agua), incluyendo los reactivos, catalizadores, otras impurezas inorgánicas (p.ej., metales pesados, cloruro o sulfato); y también pueden incluir sustancias extrañas (contaminantes extraños). Estos contaminantes pueden introducirse durante los procedimientos de fabricación o de manejo. Disolventes Residuales-Líquido orgánico que se usa como vehículo para la preparación de soluciones o suspensiones en la síntesis de un fármaco (ver Disolventes Residuales (467)). Impureza-Cualquier componente de un fármaco que no es la entidad química definida como el fármaco y además, para un producto farmacéutico, cualquier componente que no sea un ingrediente de formulación Impureza Estereomérica-Compuesto con la misma estructura química bidimensional que el fármaco pero que difiere en la orientación tridimensional de los sustituyentes en los centros quirales dentro de dicha estructura. Para aquellos casos en los que todos los centros quirales se encuentran orientados de manera opuesta, la impureza es un enantiómero (impureza enantiomérica). Las determinaciones de impurezas en esta categoría a menudo requieren métodos cromatogáficos quirales especiales. Las impurezas diastereoméricas o epiméricas se presentan cuando solamente algunos de los centros quirales están orientados de manera opuesta. Impurezas Comunes-Algunas monografías hacen referencia a las impurezas comunes. Para mayor información, ver Impurezas Comunes (466). Impurezas Especificadas y Productos de Degradación Especificados-Anteriormente denominadas Impurezas Indicadoras, las impurezas especificadas o productos de degradación especificados son impurezas o productos de degradación que se listan individualmente y se limitan con criterios de aceptación específicos en las monografías individuales, según corresponda. Las impurezas especificadas o productos de degradación especificados pueden ser identificados o no identificados. Impurezas Identificadas y Productos de Degradación Identificados-Impurezas o productos de degradación para los que se ha logrado su caracterización estructural.
1276 (1086) Impurezas en Fármacos y Productos Farmacéuticos / Información General
USP 39
Impurezas Inorgánicas-Las impurezas inorgánicas pueden resultar del proceso de fabricación (p.ej., metales residuales, sales inorgánicas, coadyuvantes de filtración, etc.). Normalmente, las impurezas inorgánicas se controlan mediante pruebas como lil:~lifl~D:'"[~ Residuo de Incineración (281 ). También puede resultar útil la información suministrada en Espectroquímica de Plasma (730) y Cromatografía Jónica (1065). Impurezas No Identificadas y Productos de Degradación No Identificados-Impurezas o productos de degradación para los que no se han logrado caracterizaciones estructurales y se identifican únicamente mediante propiedades analíticas cualitativas (p.ej., tiempos de retención cromatográficos). Impurezas No Especificadas y Productos de Degradación No Especificados-Impurezas o productos de degradación que se limitan mediante criterios de aceptación generales pero que no se listan individualmente con sus propios criterios de aceptación específicos en las monografías individuales. Impurezas Tóxicas-Las impurezas tóxicas poseen una actividad biológica indeseable significativa, aún como componentes minoritarios, y requieren de su identificación y cuantificación individual mediante pruebas específicas. Estas impurezas pueden surgir de la síntesis, preparación o degradación de artículos farmacopeicos. Se seleccionan pruebas y especificaciones individualizadas basándose en los datos de validación. Estas pruebas se realizan mediante la comparación de impurezas con un Estándar de Referencia, si estuviera disponible. Corresponde al fabricante proporcionar datos que respalden la clasificación de dichas impurezas como impurezas tóxicas. Material Inicial-Material que se usa en la síntesis de un fármaco y que se incorpora corno un elemento en la estructura de un producto intermedio y/o del fármaco. Los materiales iniciales a menudo se encuentran disponibles comercialmente y tienen propiedades físicas y químicas y una estructura bien definidas. Otras impurezas-Ver la sección 5. Componentes de las Monografías en Advertencias y Requisitos Generales. Producto de Degradación-Impureza que resulta de un cambio químico en el fármaco ocurrido durante la fabricación y/o el almacenamiento del producto farmacéutico por el efecto de, por ejemplo, la luz, temperatura, pH, agua, o por reacción con un excipiente y/o sistema de envase-cierre primario. Producto intermedio-Material que se produce durante las etapas de síntesis de un fármaco y que experimenta una transformación química adicional antes de convertirse en un fármaco. El producto intermedio a menudo se aísla durante el proceso. Polimorfos-Diferentes formas cristalinas del mismo fármaco, que pueden incluir productos de solvatación o hidratación (también conocidos como seudopolimorfos) y formas amorfas. Aunque los polimorfos no son impurezas por definición, resulta crítico para la caracterización general del fármaco comprender las formas cristalinas, los estados de hidratación o solvatación o la naturaleza amorfa. Reactivo-Sustancia diferente al material inicial, producto intermedio o disolvente que se usa en la fabricación de un fármaco. Sustancias Extrañas (Contaminantes Extraños)-lmpurezas que surgen de una fuente extraña al proceso de fabricación y que son introducidas por contaminación o adulteración. Estas impurezas no pueden preverse al seleccionar las pruebas y valoraciones de las monografías. La presencia de sustancias extrañas inaceptables no reveladas por las pruebas o valoraciones de las monografías constituye una desviación respecto de la norma oficial. Como ejemplos de sustancias extrañas se pueden citar la efedrina en Ipecacuana o un plaguicida en un analgésico oral líquido. Esta Farmacopea considera la posibilidad de detectar sustancias extrañas mediante métodos no oficiales. (Ver la sección 5.60, Impurezas y Sustancias Extrañas en la sección 5, Componentes de las Monografías en Advertencias y Requisitos Generales.) Sustancias Relacionadas-Las sustancias relacionadas están vinculadas estructuralmente con un fármaco. Estas sustancias pueden ser (a) impurezas identificadas o no identificadas que surgen del proceso de síntesis como los materiales iniciales, productos intermedios o subproductos y no aumentan en el almacenamiento o (b) productos de degradación identificados o no identificados que resultan de los procesos de fabricación del fármaco o del producto farmacéutico, o que surgen durante el almacenamiento del material.
(1087) DISOLUCIÓN INTRÍNSECA APARENTE-PROCEDIMIENTOS DE PRUEBAS DE DISOLUCIÓN PARA DISCO ROTATORIO Y DISCO ESTACIONARIO Este capítulo de información general Disolución Intrínseca Aparente-Procedimientos de Pruebas de Disolución para Disco Rotatorio y Disco Estacionario (1087) trata sobre la determinación de las velocidades de disolución de compactos de material no desintegrable que exponen un área superficial fija a un medio disolvente determinado. El compacto, según se usa en este capítulo, es una masa no desintegrable que resulta de la compresión del material en análisis usando condiciones de presión apropiadas. Una única superficie con dimensiones físicas especificadas se expone a disolución. La determinación de la velocidad de disolución puede ser importante durante el desarrollo de nuevas entidades químicas puesto que en ocasiones permite predecir problemas potenciales de biodisponibilidad y puede ser útil también para caracterizar artículos farmacopeicos tales como excipientes o fármacos. Los estudios de disolución intrínseca son estudios de caracterización y no están referidos en las monogra-
USP 39
Información General/ (1087) Disolución Intrínseca Aparente 1277
fías individuales. La información suministrada en este capítulo de información general está destinada a ser adaptada a través de un protocolo específico apropiado al material determinado. La velocidad de disolución por lo general se expresa como la masa de soluto que aparece en el medio de disolución por unidad de tiempo (p.ej., masa seg-1), pero el flujo de disolución se expresa como la velocidad por unidad de área (p.ej., masa cm-2 seg-1). Se prefiere informar el flujo de disolución dado que está normalizado por el área superficial y por lo general se lo denomina velocidad de disolución intrínseca en el caso de un fármaco puro. La velocidad de disolución está influenciada por las propiedades intrínsecas del estado sólido, tal como el estado cristalino, incluyendo polimorfos y solvatos, así como por el grado de no cristalinidad. Se cuenta con numerosos enfoques investigativos para modificar las propiedades fisicoquímicas de las entidades químicas, de forma que mejoren su solubilidad y sus propiedades de disolución. Entre estos métodos se encuentran el uso de los coprecipitados y el uso de dispersiones sólidas amorfas. El efecto de las impurezas asociadas con un material puede también alterar significativamente sus propiedades de disolución. Las propiedades de disolución también se ven influenciadas por factores extrínsecos como el área superficial, la hidrodinámica y las propiedades del medio de disolución, incluyendo el disolvente (por lo general, agua), la presencia de surfactantes, la temperatura, la viscosidad del líquido, el pH y el tipo y concentración de la solución amortiguadora. Los procedimientos de disolución de disco rotatorio y disco estacionario son suficientemente versátiles como para permitir el estudio de las características de los compuestos de interés farmacéutico bajo una gran variedad de condiciones de prueba. Las características comunes a ambos aparatos incluyen las siguientes: (1) Son adaptables al uso con aparatos de disolución estándar y ambos usan una matriz de tableta para contener el compacto no desintegrable durante la prueba de disolución. (2) Dependen de la compresión del compuesto de prueba en un compacto que no se descame ni desprenda durante la prueba de disolución. (3) Una superficie única de geometría y dimensiones físicas conocidas se expone a disolución. (4) La matriz está localizada en una posición fija en el vaso, lo cual disminuye la variación de las condiciones hidrodinámicas. Una diferencia entre los dos procedimientos es la fuente del flujo del líquido sobre la superficie en disolución. En el caso del procedimiento del disco rotatorio, el flujo del líquido se genera por rotación de la matriz en un líquido quiescente, mientras que en el procedimiento del disco estacionario el flujo del líquido se produce con una paleta u otro dispositivo mezclador.
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL El procedimiento para llevar a cabo estudios de disolución con los dos tipos de aparatos consiste en preparar un compacto de material que no se desintegre usando un dispositivo de compactación adecuado, colocar el compacto y el montaje de la matriz circundante en un medio de disolución adecuado, someter el compacto a las condiciones hidrodinámicas deseadas cerca de su superficie y medir la cantidad de soluto disuelto en función del tiempo. Los compactos se preparan por lo general usando un aparato que consta de una matriz, un punzón superior y una placa de superficie inferior fabricada de acero endurecido u otro material que permita la compresión del material en análisis en un compacto que no se desintegre. Un aparato alternativo de compactación consta de una matriz y dos punzones. También se pueden usar otras configuraciones que produzcan un compacto que no se desintegre y tenga un área superficial constante. El compacto no desintegrable tiene por lo general un diámetro de 0,2-1,5 cm.
Preparación del Compacto Conectar la placa de superficie inferior lisa a la cara inferior de la matriz o, como alternativa, insertar el punzón inferior usando un sistema de sujeción apropiado. Pesar con exactitud la cantidad de material necesario para producir un compacto aceptable y transferirlo a la cavidad de la matriz. Colocar el punzón superior dentro de la cavidad de la matriz y comprimir el polvo en una prensa hidráulica a la presión de compresión requerida para formar un compacto que no se desintegre y que permanezca en el montaje de la matriz a lo largo de la prueba. Para muchos de los compuestos cristalinos orgánicos, por lo general es suficiente aplicar compresión durante 1 minuto a 15 MPa, pero se deberían evaluar otras condiciones alternativas de compresión que eviten la formación de capilares. Para una sustancia dada, una vez optimizada la preparación del compacto, ésta se estandariza para facilitar la comparación de las diferentes muestras de la sustancia. Durante la compresión pueden ocurrir cambios en la forma cristalina; por lo tanto, se debe confirmar la forma del estado sólido por medio de difracción de rayos X para polvo u otras técnicas. Retirar la placa de superficie o el punzón inferior. Eliminar el polvo suelto de la superficie del compacto y la matriz con una corriente de aire o nitrógeno.
Medio de Disolución La elección del medio de disolución es una consideración importante. Siempre que sea posible, se deben efectuar las pruebas bajo condiciones de exceso de solubilidad (sink conditions) para evitar que se retarde artificialmente la velocidad de disolución debido al acercamiento del medio al punto de saturación del soluto. Las mediciones de disolución se hacen típicamente en medios acuosos. Para semejar las condiciones in vivo, las mediciones se pueden realizar en el intervalo fisiológico de pH a 37°. Siempre que sea posible, el procedimiento se lleva a cabo bajo las mismas condiciones que se usan para determinar la
1278 (1087) Disolución Intrínseca Aparente / Información General
USP 39
solubilidad intrínseca de la forma del estado sólido en análisis. Los medios de disolución se deben desgasificar inmediatamente antes del uso para evitar la formación de burbujas de aire sobre la superficie del compacto o de la matriz. 1 Se deben controlar la temperatura del medio y el pH, especialmente cuando se usan sales y compuestos ionizables, donde la velocidad de disolución puede depender en gran medida del pH, del tipo de solución amortiguadora y de la concentración de la misma. Para efectos de simplicidad, al hacer pruebas de disolución en un área de superficie constante se supone que el pH en la superficie del compacto en disolución es igual al pH del medio de disolución a granel. En caso de compuestos no ionizables esto es relativamente simple porque no se espera una dependencia significativa de la velocidad de disolución con el pH. En el caso de ácidos y bases, el soluto puede alterar el pH en la superficie del compacto y en las cercanías de la misma durante la disolución. Bajo estas condiciones, el pH en la superficie del compacto puede ser bastante diferente del pH del medio a granel debido a la capacidad autoamortiguadora del soluto. Con el fin de evaluar la solubilidad intrínseca, se deben escoger condiciones experimentales para eliminar el efecto de la amortiguación del soluto, la alteración del pH de la solución y la precipitación de otras formas del estado sólido en la superficie del compacto. En el caso de ácidos débiles, el pH del medio de disolución debe estar de 1-2 unidades por debajo del pKa de la sustancia que se disuelve. En el caso de bases débiles, el pH del medio de disolución debe estar de 1-2 unidades por encima del pKa de la sustancia que se disuelve.
Aparatos Disco Rotatorio-Un aparato típico (Figura 1) consiste en un punzón y una matriz fabricados de acero endurecido. La base de la matriz tiene tres orificios roscados para conectar una placa de superficie de acero pulido, que proporciona una base pulida a espejo para el pellet compactado. La matriz posee una cavidad en la que se coloca una cantidad medida del material cuya velocidad de disolución intrínseca se va a determinar. Luego se inserta el punzón en la cavidad de la matriz y se comprime el material de prueba mediante una prensa hidráulica. [NOTA-Un orificio en la cabeza del punzón permite la inserción de una varilla metálica que ayuda a sacarlo de la matriz después de la prueba.] En la cavidad se forma un pellet compactado del material con una sola cara de área definida expuesta en el fondo de la matriz. Cara inferior de la matriz
Montaje de soporte &eje
Placa de superficie
'Q\ ,_,
Punzón Nota-Acero endurecido y pulido.
Junta de Neopreno
IT--1: uµ
Matriz Nota-Acero inoxidable tipo #316.
1
Placa de superficie Nota-Acero endurecido y pulido.
Figura 1 El montaje de la matriz se conecta entonces a un eje fabricado de un material apropiado (por lo general, acero). El eje que sostiene el montaje de la matriz se coloca de forma tal que, al descender la matriz dentro del medio de disolución (Figura 2), la 1 Un método de desgasificación es el siguiente: Calentar el medio aproximadamente a 41 º mezclando suavemente, inmediatamente filtrar al vacío utilizando un filtro con un tamaño de poro de 0,45 µm o menor, mezclando vigorosamente, y continuar mezclando al vacío durante aproximadamente 5 minutos. También se pueden emplear otras técnicas de desgasificación para eliminar los gases disueltos.
USP 39
Información General/ (1087) Disolución Intrínseca Aparente 1279
superficie expuesta del compacto esté a no menos de 1,0 cm del fondo del vaso y nominalmente en posición horizontal. El montaje de la matriz debe alinearse para reducir al mínimo las oscilaciones y no se debe permitir la formación de burbujas de aire sobre la superficie del compacto o de la matriz.
_Vaso de disolución
---i·-
Montaje de matriz y eje
Figura 2 Se recomienda una velocidad de 300 rpm para el disco rotatorio. Las velocidades típicas de rotación pueden estar entre 60500 rpm. La velocidad de disolución depende de la velocidad de rotación utilizada. Este parámetro se debe seleccionar con el fin de admitir al menos cinco puntos de muestreo durante la prueba, pero si las velocidades de mezclado son excesivas se pueden crear patrones de cizallamiento en la superficie del material en disolución que podrían ocasionar resultados aberrantes (es decir, no linealidad). Por lo general, la concentración de la muestra de prueba se mide en función del tiempo y después se calcula la cantidad disuelta. El intervalo de muestreo se determinará de acuerdo con la velocidad del proceso de disolución. Si se toman muestras del medio de disolución, la cantidad acumulativa disuelta en cada tiempo de muestreo se debe corregir por las pérdidas debidas al muestreo. Disco Estacionario-El aparato (Figura 3) consta de un punzón de acero, una matriz y una placa de base. La base de la matriz tiene tres agujeros para conexión a la placa de base. Los tres tornillos fijos sobre la placa de base se insertan a través de los agujeros de la matriz y luego se aseguran con tres tuercas y arandelas. El material de prueba se coloca dentro de la cavidad de la matriz. Luego se inserta el punzón en la cavidad y se comprime con la ayuda de una prensa de banco. La placa de base se desconecta entonces de la matriz para exponer una superficie lisa del pellet compacto. Alrededor del hombro roscado de la matriz se coloca una junta y luego se enrosca una tapa de polipropileno en el hombro roscado de la matriz. El montaje de la matriz se coloca entonces en el fondo plano de un vaso de disolución especialmente diseñado (Figura 4). La unidad de mezclado (p.ej., la paleta) se coloca a una distancia apropiada (por lo general 2,54 cm) de la superficie del compacto. El montaje de la matriz y la unidad de mezclado se deben alinear para garantizar una hidrodinámica uniforme y no deben haber burbujas de aire presentes en la superficie del compacto durante la prueba. Se pueden utilizar otras configuraciones si es posible establecer la caracterización y control adecuados de la hidrodinámica.
1280 (1087) Disolución Intrínseca Aparente / Información General
USP 39
Tapa de plástico\
11 Junta
~111 '
~7'/"'//"'/l-----,,¡z,.,./Z7T//,..,,ZI M~;,~rPunzón
Compacto de fármaco
Placa de superficie
Figura 3 Vaso de disolución \
Eje de paleta rotatoria
rPaleta
I
Compacto de fármaco
Figura 4 La velocidad de disolución depende de la velocidad de rotación y de la hidrodinámica precisa que exista. Por lo general, la concentración de la muestra de prueba se mide en función del tiempo y después se calcula la cantidad disuelta. El intervalo de muestreo se determinará de acuerdo con la velocidad del proceso de disolución (ver Disco Rotatorio). Si se toman muestras del medio de disolución, la cantidad acumulativa disuelta en cada tiempo de muestreo se debe corregir por pérdidas debidas al muestreo.
ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE LOS DATOS La velocidad de disolución se determina graficando la cantidad acumulativa de soluto disuelta en función del tiempo. El análisis de regresión lineal se efectúa sobre los datos de la región lineal inicial de la curva de disolución. La pendiente corresponde a la velocidad de disolución (masa seg-1). (Se pueden obtener cálculos más precisos de la pendiente usando un modelo lineal
USP 39
Información
General/ (1088) Evaluación In Vivo e In Vitro 1281
generalizado que tenga en cuenta las correlaciones entre las mediciones de las cantidades acumulativas disueltas en los diversos tiempos de muestreo). Los perfiles de cantidad en función del tiempo pueden mostrar una curvatura. Cuando esto ocurre, sólo se usa la porción lineal inicial del perfil para determinar la velocidad de disolución. La curvatura ascendente (segunda derivada positiva) de concentración contra tiempo por lo general indica un problema experimental sistemático. Los problemas posibles incluyen degradación física del compacto por resquebrajamiento, deslaminación o desintegración. La curvatura descendente (segunda derivada negativa) del perfil de disolución, a menudo indica una transformación de la forma sólida del compacto en la superficie o que se está llegando inadvertidamente al punto de saturación del medio de disolución. Esto ocurre con frecuencia cuando una forma cristalina termodinámicamente menos estable se convierte en una forma más estable. Ejemplos de esto incluyen la conversión de una forma amorfa en una forma cristalina, la conversión de una forma anhidra a una forma hidratada, la formación de una sal o la conversión de una sal en el correspondiente ácido o base libre. Si se observa tal curvatura, se puede evaluar la forma cristalina del compacto retirándola del medio y examinándola por difracción de rayos X para polvos u otra técnica similar, para determinar si el área de superficie expuesta está cambiando. La velocidad de disolución del área de superficie constante se expresa en unidades de masa seg-1 , y el flujo de disolución se informa en unidades de masa cm-2 seg-1 • El flujo de disolución se calcula dividiendo la velocidad de disolución por el área de superficie del compacto. Con los análisis se deben informar también las condiciones de la prueba, por lo general, una descripción del aparato, la velocidad de rotación, la temperatura, el tipo y concentración de la solución amortiguadora, el pH y la fuerza iónica.
(1088) EVALUACIÓN IN VIVO E IN VITRO DE FORMAS FARMACÉUTICAS PROPÓSITO Este capítulo proporciona una visión general de la metodología para caracterizar las propiedades fisicoquímicas de un fármaco y de su producto farmacéutico asociado, y analiza la relación entre estos métodos y propiedades con las propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas del producto farmacéutico. Los resultados de los métodos in vitro se vinculan con información de las evaluaciones in vivo a través de una correlación in vitro-in vivo (CIVIV)
ALCANCE El objetivo principal de estos estudios de caracterización es comprender la relación que guardan las propiedades fisicoquímicas y farmacológicas del fármaco con las propiedades farmacocinéticas y el desempeño in vitro del producto farmacéutico. Este capítulo describe el análisis in vitro e in vivo que se lleva a cabo durante el desarrollo del conjunto de datos que proporciona información para la toma de decisiones relacionadas con la formulación, fabricación y actividades reglamentarias asociadas para el desarrollo, aprobación reglamentaria y comercialización de cualquier producto farmacéutico. Este capítulo complementa la información de los capítulos generales, Evaluación de Desempeño del Producto Farmacéutico-Biodisponibilidad, BioequivaJencia y Disolución (1090) y Procedimiento de Disolución: Desarrollo y Validación (1092) detallando los datos in vitro e in vivo esenciales que son fundamentales para comprender la bioequivalencia y la biodisponibilidad. El texto del capítulo reconoce la disponibilidad de guías reglamentarias y de una cantidad importante de literatura sobre el contenido provisto y no tiene como propósito presentar una discusión exhaustiva sobre los temas tratados, sino ofrecer una guía y un listado de los temas de interés.
ANTECEDENTES Durante mucho tiempo se ha buscado establecer una relación significativa entre el comportamiento en lo que respecta a la disolución y el desempeño del producto farmacéutico in vivo (es decir, una CIVIV) desde la perspectiva de la biodisponibilidad (BD) y bioequivalencia (BE) y del control de calidad. La política de la USP para establecer criterios de aceptación de disolución para una monografía de un producto se ha basado en dar una importancia predominante a los estudios válidos de BD o BE, cuando estos se encuentran disponibles. La primera característica in vitro que se consideró que podría predecir el comportamiento in vivo fue la desintegración de cápsulas y tabletas. La prueba de desintegración se adoptó en la USP XIV (1950). En aquel momento, no se realizaron estudios cuantitativos para intentar demostrar dicha relación, especialmente con respecto al desempeño del producto in vivo. Sin embargo, los avances en los métodos instrumentales y en la precisión analítica finalmente sentaron las bases para esta tarea. El Panel de Expertos en Disponibilidad Fisiológica (Joint Panel on Physiologic Availability) de USP-NF reconoció que la prueba de desintegración no era lo suficientemente sensible y, en 1968, ordenó la identificación de artículos experimentales para las primeras 12 pruebas de disolución oficiales que utilizaron el Aparato 1.
1282 (1088) Evaluación In Vivo e In Vitro / Información General
USP 39
La USP requiere analizar la liberación de fármacos mediante la prueba de desempeño de la USP en la mayoría de las monografías de formas farmacéuticas orales, sublinguales y transdérmicas que no sean soluciones. El estado actual de la ciencia hace necesario llevar a cabo pruebas in vivo durante el desarrollo y la evaluación de formas farmacéuticas de liberación inmediata y de liberación modificada. En algunos casos, dependiendo de la clasificación del fármaco en el Sistema de Clasificación de Biofarmacéuticos (Biopharmaceutics Classification System o BCS) y, dependiendo de la política reglamentaria, el análisis en vivo podría no ser necesario. Además, se reconoce ampliamente la especial sensibilidad de la prueba de disolución a los cambios en la composición o en el método de fabricación que no resultan en cambios significativos en el desempeño in vivo. La comprensión de toda la información provista mediante la evaluación in vitro e in vivo del fármaco y del producto es el punto de partida para el desarrollo de una prueba de desempeño in vitro significativa.
EVALUACIÓN IN VITRO
Propiedades Fisicoquímicas-Fármaco La información fisicoquímica generalmente incluye polimorfismo, estabilidad, distribución del tamaño de partícula, solubilidad, velocidad de disolución, lipofilicidad, permeabilidad y otras variables que controlan la liberación del fármaco en condiciones que puedan imitar las condiciones extremas del ambiente fisiológico a las que se someta la forma farmacéutica.
Propiedades Fisicoquímicas-Producto Farmacéutico Las variables analizadas para caracterizar las propiedades fisicoquímicas del producto farmacéutico deben ser las mismas que se analizaron para caracterizar el fármaco. Los perfiles de disolución en un intervalo de pH pertinente, usualmente de pH 16,8, se deben obtener prestando particular atención a los efectos de la formulación. Para caracterizar formulaciones insolubles en sistemas acuosos puede ser necesario agregar lauril sulfato de sodio u otro agente tensoactivo. Se debe determinar la clasificación en el BCS para el fármaco, en especial para formas farmacéuticas de liberación inmediata.
Prueba de Disolución La prueba de disolución se requiere para todas las formas farmacéuticas orales de la Farmacopea, incluyendo sublinguales, que no sean soluciones, en las que sea necesaria la absorción del medicamento para que el producto ejerza el efecto terapéutico deseado. Las excepciones incluyen tabletas que cumplen con un requisito de totalidad de la disolución, productos que contienen fármacos radiomarcados o productos que contienen un fármaco soluble y que demuestran una desintegración rápida (10-15 minutos). La prueba de disolución se debe llevar a cabo en un equipo que cumpla con los requisitos de Disolución (711) y al cual se le haya realizado una prueba de verificación del desempeño cuando exista una disponible. En su sitio Web, la USP ofrece guías para optimizar el desempeño del instrumento de disolución mediante calibración mecánica y pruebas de verificación del desempeño (http://www.usp.org/pdf/EN/dissolutionProcedureToolkit2010-03.pdf). La prueba de disolución in vitro por lo general intenta reproducir la disolución in vivo, aunque no es posible seleccionar a priori dichas condiciones in vitro de manera confiable. Se deben evaluar una variedad de condiciones de prueba de disolución in vitro (p.ej., medios de disolución a diferentes valores de pH, agentes tensoactivos y velocidades de rotación del aparato). El conocimiento de las propiedades del fármaco, de la formulación del producto, la fisiología gastrointestinal, la disolución in vitro y la farmacocinética in vivo ayudará durante la selección de las condiciones y especificaciones de la prueba de disolución in vitro. Para productos que contienen más de un solo ingrediente activo, la disolución generalmente debe determinarse para cada ingrediente activo. Cuando se agrega una prueba de disolución a una monografía existente, la prueba de desintegración se elimina, pero en el caso de preparaciones sublinguales y de tabletas de desintegración oral, la desintegración, aunada a la disolución, puede ser un atributo crítico de calidad. En tales casos, se puede incluir una o ambas pruebas en la monografía. Cuando no es posible establecer un solo conjunto de especificaciones para productos de orígenes múltiples en las monografías, se permiten múltiples pruebas de disolución, y el etiquetado debe indicar la prueba de disolución apropiada para el producto específico. El capítulo Procedimiento de Disolución: Desarrollo y Validación (1092) proporciona información detallada sobre el desarrollo y validación del método. FORMAS FARMACÉUTICAS DE LIBERACIÓN INMEDIATA Para formas farmacéuticas de liberación inmediata, el proceso de disolución in vitro generalmente no toma más de 60 minutos y, en la mayoría de los casos, una sola especificación de tiempo de muestreo es adecuada para los propósitos Farmacopeicos. Para asegurar los tiempos de desintegración típicos, los tiempos de prueba menores a 30 minutos se deben basar en una necesidad demostrada.
USP 39
Información General/ (1088) Evaluación In Vivo e In Vitro 1283
FORMAS FARMACÉUTICAS DE LIBERACIÓN PROLONGADA Para los productos de liberación prolongada, la velocidad de disolución in vivo por lo general es la limitante que resulta en una absorción prolongada del fármaco y, por ende, facilita la identificación de condiciones in vitro que pudieran predecir la disolución in vivo. Por lo tanto, se requieren múltiples tiempos de muestreo para definir un perfil de disolución para una forma farmacéutica de liberación modificada. La elección del aparato se debe basar en el conocimiento de la formulación y el desempeño real de la forma farmacéutica en el sistema de prueba in vitro. El Aparato 7 (canastilla) o el Aparato 2 (paleta) pueden ser más útiles a velocidades de rotación más altas (p.ej., la paleta a 100 rpm). El Aparato 3 (cilindro oscilante) ha demostrado ser especialmente útil para formas farmacéuticas de liberación modificada tipo perlas. El Aparato 4 (celda de flujo) puede ofrecer ventajas para las formas farmacéuticas de liberación modificada que contienen ingredientes activos con una solubilidad limitada. El Aparato 1 (disco oscilante) se puede aplicar para formas farmacéuticas orales de liberación modificada que no se desintegran, al igual que para formas farmacéuticas transdérmicas. El Aparato 5 (paleta sobre disco) y el Aparato 6 (cilindro) también son útiles para evaluar y analizar formas farmacéuticas transdérmicas. Para los propósitos Farmacopéicos, se seleccionan por lo menos tres tiempos de muestreo para caracterizar el perfil de liberación de fármaco in vitro de una forma farmacéutica de liberación prolongada. Pueden ser necesarios tiempos de muestreo adicionales para la aprobación del fármaco. Se selecciona un tiempo de muestreo inicial, habitualmente 1-2 horas, para demostrar que no se produce una liberación masiva, un tiempo de muestreo intermedio para definir el perfil de liberación in vitro de la forma farmacéutica y un tiempo final para demostrar la liberación completa del fármaco.
EVALUACIÓN IN VIVO DE FORMAS FARMACÉUTICAS Al evaluar el desempeño de un producto farmacéutico, los analistas deben preguntarse fundamentalmente qué tipo de estudio deben llevar a cabo para proveer una garantía razonable de la BE de un producto comercializado con respecto al producto del ensayo clínico de seguridad y eficacia demostradas. Aunque los estudios de disolución in vitro proveen información importante con respecto a las características de liberación del fármaco a partir de la forma farmacéutica, en la actualidad se usan principalmente para establecer o sustentar las especificaciones para productos farmacéuticos (p.ej., vida útil) y controles de proceso de fabricación (p.ej., aumento de escala o cambios posteriores a la aprobación). Normalmente, la mejor manera de demostrar la BE es mediante la evaluación in vivo, aunque en ocasiones se puede reemplazar con estudios in vitro. 1 La mejor forma de evaluar la BE de formas farmacéuticas de liberación modificada es observando los comportamientos farmacocinético y/o farmacodinámico del fármaco in vivo mediante estudios clínicos bien diseñados. Las agencias reglamentarias proporcionan múltiples guías para la realización de dichos estudios. Además, cuando existe una relación predecible y bien definida entre las concentraciones plasmáticas del fármaco o sus metabolitos activos y la respuesta clínica (terapéutica y adversa), se pueden usar únicamente los datos de la concentración plasmática del fármaco como fundamento para la aprobación de una forma farmacéutica de liberación modificada diseñada para sustituir una forma farmacéutica de liberación inmediata. Aunque a menudo se emplean estudios farmacocinéticos en humanos para evaluar la BE de formas farmacéuticas orales sólidas de liberación inmediata, en ocasiones, se pueden usar estudios in vitro para realizar dicha evaluación. La ventaja principal de los estudios in vitro es que reducen los costos de desarrollo. Por ejemplo, se prefiere una prueba in vitro cuando se analizan fármacos Clase 1 del BCS con disolución rápida. Algunas agencias reglamentarias permiten este tipo de análisis en lugar de la prueba in vivo. Las siguientes discusiones sirven de guía para la evaluación de un fármaco y el diseño, ejecución y evaluación de estudios que comprendan formas farmacéuticas. Aunque estas pautas se concentran en sistemas de liberación de fármacos de administración oral, los mismos principios pueden aplicarse a otras vías de administración de fármacos (p.ej., transdérmica, subcutánea, intramuscular, etc.).
CARACTERIZACIÓN DE UN FÁRMACO
Sistema de Clasificación de Biofarmacéuticos La FDA emitió una guía titulada "Waiver of In Vivo Bioavailability and Bioequivalence Studies for lmmediate-release Solid Oral Dosage Forms Based on a Biopharmaceutics Classification System" (www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatorylnformation/Guidances/UCM070246.pdf) (Exención de Estudios de Biodisponibilidad y Bioequivalencia In Vivo para Formas Farmacéuticas Orales Sólidas de Liberación Inmediata Basada en un Sistema de Clasificación de Biofarmacéuticos, disponible sólo en inglés). Una suposición clave en el enfoque es que la liberación y disolución del fármaco son lo suficientemente rápidas, por lo que no es posible ni útil determinar una correlación in vitro-in vivo. Cuando corresponde, el Sistema de Bioclasificación de Biofarmacéuticos permite obtener datos de la velocidad de disolución en lugar de los estudios de BD o BE para la aprobación del producto.
1 Título 21 del CFR 320.22 Criteria for waiver of evidence of in vivo bioavailability or bioequivalence. (Criterios para exención de evidencias de biodisponibilidad o bioequivalencia in vivo).
1284 (1088) Evaluación In Vivo e In Vitro / Información General
USP 39
Propiedades Farmacocinéticas Se recomienda caracterizar cuidadosamente el perfil de absorción del fármaco activo a partir de una formulación que tiene una BD rápida (solución intravenosa, solución oral o producto farmacéutico de liberación inmediata bien caracterizado). A su vez, esta información sirve como referencia para evaluar el perfil de absorción de la forma farmacéutica de liberación modificada. Dicha información, junto con la farmacocinética del fármaco activo, puede caracterizar la absorción del fármaco y predecir cambios en la BD del fármaco cuando se modifica la entrada, como en las formas farmacéuticas de liberación modificada. Por ejemplo, si el fármaco activo presenta metabolización hepática de primer paso saturable, podría producirse una reducción en la disponibilidad sistémica después de la administración oral si disminuye la velocidad de entrada. Al diseñar una forma farmacéutica de liberación modificada, puede resultar útil para los analistas determinar la absorción del fármaco activo en diversos segmentos del tracto gastrointestinal (particularmente en la parte inferior del tracto gastrointestinal (colon) para formas farmacéuticas que pueden liberar el fármaco en esa zona). Los efectos de los alimentos también pueden ser importantes y deben investigarse.
Eliminación del Fármaco La información necesaria para caracterizar la eliminación del fármaco puede incluir lo siguiente. 1. Parámetros de eliminación-depuración, área bajo la curva (ABC) de concentración plasmática-tiempo, concentración plasmática máxima (Cmá,), tiempo hasta la concentración plasmática máxima (Tmáx), volumen de distribución, vida media, tiempo de residencia medio o parámetros dependientes del modelo. 2. Linealidad o caracterización de falta de linealidad en el intervalo de concentración o de dosis que se podrían encontrar. 3. Acumulación de fármaco/metabolito 4. Perfil metabólico y ruta de excresión, prestando especial atención a los metabolitos activos y enantiómeros activos de mezclas racémicas. 5. Circulación enterohepática. 6. Parámetros de unión proteica y efectos de diálisis. 7. Los efectos de la edad, sexo, raza y condiciones patológicas relevantes. 8. Plasma: relaciones sanguíneas. 9. Un índice terapéutico estrecho o una respuesta clínica que varía significativamente en función de la hora del día (cronofarmacocinética).
Propiedades Farmacodinámicas Antes de desarrollar una forma farmacéutica, se debe obtener las relaciones de concentración-respuesta en un intervalo de dosis lo suficientemente amplio que abarque las respuestas terapéuticas y adversas importantes. Además, se deben evaluar las características del tiempo de equilibrio2 entre las concentraciones plasmáticas y el efecto. Para productos de liberación modificada que por lo regular tienen dosis de fármaco mayores, estas relaciones de concentración-respuesta deben estar suficientemente caracterizadas a fin de poder predecir razonablemente el margen de seguridad si se produjera la liberación masiva de la dosis. Si existe una relación bien definida entre la concentración plasmática del fármaco activo o los metabolitos activos y la respuesta clínica (terapéutica y adversa), la eficacia clínica de una nueva forma farmacéutica de liberación modificada se podría caracterizar mediante los datos de concentración plasmática-tiempo. Si no se dispone de dichos datos, se deben llevar a cabo ensayos clínicos de la forma farmacéutica de liberación modificada conjuntamente con determinaciones farmacocinéticas y farmacodinámicas.
CARACTERIZACIÓN DE LA FORMA FARMACÉUTICA Propiedades Farmacocinéticas: Formas Farmacéuticas de Liberación Inmediata Los tipos de estudios farmacocinéticos que se deben llevar a cabo dependen del conocimiento que se tenga del fármaco
activo, sus propiedades farmacocinéticas y su Clase en el BCS. Por ejemplo, una nueva entidad química requiere de una mayor caracterización farmacocinética que la necesaria para una formulación ya aprobada por la FDA para la que se presenta una solicitud de cambios posteriores a la aprobación (SUPAC) por motivo de un aumento de escala. Dicha evaluación se presenta cuando un producto farmacéutico aprobado por la FDA experimenta cambios en su fabricación después de que ha sido aprobado. Dichos cambios son comunes y se pueden deber a la expansión del tamaño de los lotes fabricados, a nuevos sitios de fabricación o a la introducción de nuevas tecnologías. Las pruebas de disolución in vitro y/o 2 El tiempo de equilibrio es una medida de la discontinuidad dependiente del tiempo entre las concentraciones plasmáticas medidas y los efectos medidos. La discontinuidad se caracteriza más frecuentemente por el grado de histéresis observado cuando la gráfica de concentración-efecto para concentraciones crecientes se compara con la de concentraciones decrecientes. Cuando el tiempo de equilibrio es muy corto (es decir, equilibrio rápido sin que se generen metabolitos activos), habrá poca o ninguna histéresis. Esto significa que, se observará el mismo efecto para una concentración determinada independiente del intervalo entre el momento de la dosificación y el momento en el que se realizan las mediciones.
USP
39
Información General/ (1088) Evaluación In Vivo e In Vitro 1285
pruebas de BE in vivo necesarias se encuentran descritas en el documento de la FDA "Guidance far lndustry: lmmediate-release Salid Oral Dosage Forms: Scale-up and Postapproval Changes: Chemistry, Manufacturing, and Controls, In Vitro Dissolution Testing, and In Vivo Bioequivalence Documentation" (Guía para la Industria: Formas Farmacéuticas Sólidas Orales de Liberación Inmediata: Aumento de Escala y Cambios Posteriores a la Aprobación: Documentación de Procesos Químicos, Fabricación y Controles, Pruebas de Disolución In Vitro y Bioequivalencia In Vivo) (www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatorylnformation/Guidances/UCM070636.pdf). Se aplican requisitos similares a un equivalente genérico de una forma farmacéutica de liberación inmediata aprobada que debe ser bioequivalente al fármaco innovador, conocido como el fármaco listado de referencia. Los dos métodos de uso más frecuente para cumplir con los requisitos de bioequivalencia son los estudios farmacocinéticos in vivo y los estudios in vitro basados en el BCS.
Propiedades Farmacocinéticas: Formas Farmacéuticas de Liberación Modificada Al igual que los enfoques para formas farmacéuticas de liberación inmediata, los tipos de estudios farmacocinéticos que se deben llevar a cabo para formas farmacéuticas de liberación modificada dependen del conocimiento que se tenga del fármaco activo, sus propiedades farmacocinéticas y si los estudios farmacocinéticos pretenden ser el único fundamento para la aprobación del producto. Se requieren como mínimo dos estudios para caracterizar el producto cuando no existe un produco farmacéutico de liberación modificada de referencia: (1) un estudio cruzado monodosis para cada concentración de una forma farmacéutica de liberación modificada; y (2) un estudio de estado estacionario, multidosis que utilice la concentración más alta de una forma farmacéutica de liberación modificada. Asimismo, se requiere un estudio de los efectos de los alimentos para evaluar el potencial de liberación masiva de las formas farmacéticas de liberación prolongada como estudio separado o incluido como extensión de un estudio cruzado. Para demostrar la intercambiabilidad, será suficiente un estudio cruzado monodosis en condiciones de ayuno contra el producto de referencia. En algunos casos, se requiere un estudio de los efectos de los alimentos cuando se ha demostrado algún efecto de los alimentos sobre la BD en el producto de referencia. A continuación se describen algunos estudios cruzados monodosis y de estado estacionario multidosis. Resultan posibles productos de referencia para formas farmacéuticas de liberación modificada, soluciones intravenosas, soluciones orales o productos farmacéuticos de liberación inmediata bien caracterizados, a fin de evaluar una formulación de liberación modificada. Por ejemplo, si el fármaco activo presenta metabolización hepática de primer paso saturable del intestino delgado, podría producirse una reducción en la disponibilidad sistémica después de la administración oral si disminuye la velocidad de entrada. Se podría observar un incremento de la disponibilidad sistémica si un fármaco es absorbido desde el colon a partir de una forma farmacéutica de liberación retardada que apunta al colon, evitando así un efecto de primer paso. En algunas formas farmacéuticas de liberación modificada en cápsulas, la diferencia entre las concentraciones depende solamente de la cantidad de material idéntico en forma de gránulos en cada cápsula. En este caso, son suficientes estudios de estado estacionario monodosis y multidosis con la concentración de la dosificación más alta. Se pueden caracterizar otras concentraciones a partir de datos comparativos obtenidos de la disolución in vitro. Los estudios farmacocinéticos descritos a continuación serán necesarios para la mayoría de las formas farmacéuticas de liberación modificada. Estos estudios pueden ser la base de la caracterización de la forma farmacéutica. Si se busca la aprobación reglamentaria sin realizar ensayos clínicos, los fabricantes deben consultar con las autoridades reglamentarias para garantizar que exista una base de datos adecuada para la aprobación. Los tipos de estudios farmacocinéticos que se llevan a cabo, por lo general, se pueden categorizar según se indica a continuación: CASO A El Caso A corresponde a una forma farmacéutica oral de liberación modificada original de un fármaco ya comercializado como forma farmacéutica de liberación inmediata y para el cual existen amplios datos farmacocinéticos y farmacodinámicos. Estudio cruzado monodosis: Un estudio cruzado monodosis debe comprender los siguientes tratamientos: la forma farmacéutica de liberación modificada administrada en ayunas; una forma farmacéutica rápidamente disponible administrada en ayunas; y la forma farmacéutica de liberación modificada administrada inmediatamente después de una comida con alto contenido graso. El estudio de los efectos de los alimentos debe controlar la ingestión de fluidos a temperatura ambiente (p.ej., 68 oz.) al momento de la administración del fármaco. La forma farmacéutica se debe administrar dentro de los 5 minutos posteriores al término de la ingestión de la comida. Idealmente, todos los sujetos deben consumir la comida en aproximadamente 15 minutos. Si no se encuentran diferencias significativas en la velocidad o grado de biodisponibilidad (ABC, Cmáx y Tmáx) en función del alimento ingerido, entonces no serán necesarios estudios adicionales de los efectos de los alimentos. Si se encuentran diferencias significativas en la biodisponibilidad, los investigadores deberán definir cómo los alimentos afectan la forma farmacéutica de liberación modificada, 3 y el efecto de los alimentos sobre el fármaco en función del tiempo. Usar las siguientes guías para evaluar los efectos de los alimentos. 1. Si ningún estudio bien controlado ha definido previamente los efectos de una comida con alto contenido graso sobre una forma farmacéutica de liberación inmediata, se deben llevar a cabo estudios para determinar si el efecto de los alimentos podría ocasionar problemas con la forma farmacéutica. Se debe cuestionar si la liberación de la forma farmacéutica pre3
Wagner-Nelson, Loo-Riegelman y otros métodos de deconvolución están disponibles en la literatura sobre productos biofarmacéuticos.
1286 (1088) Evaluación In Vivo e In Vitro / Información General
USP 39
senta cambios relacionados con los alimentos o si hay influencias de los alimentos no relacionados con la forma farmacéutica, p.ej., cambios en la absorción del fármaco en el tracto gastrointestinal o cambios en la eliminación del fármaco que son independientes de la absorción. La causa del efecto del alimento se debe determinar mediante un estudio cruzado monodosis que compare la solución (o forma farmacéutica de liberación inmediata) en condiciones de ayuno y de alimentación. Si el alimento no produce ningún efecto, se concluye que existen problemas con la forma farmacéutica. Si el alimento produce un efecto, se concluye que dicho efecto no está vinculado a la forma farmacéutica. 2. La influencia que tiene el tiempo sobre el efecto del alimento se deben analizar mediante un estudio cruzado de cuatro vías en el que la forma farmacéutica de liberación modificada se administra según las siguientes condiciones de tratamiento: en ayunas, con una comida con alto contenido graso, 1 hora antes de una comida con alto contenido graso y 2 horas después de una comida con alto contenido graso. 3. Si se determina que el efecto del alimento sobre una forma farmacéutica de liberación inmediata se debe a cambios en la absorción del fármaco disuelto en el tubo digestivo o a cambios en la eliminación del fármaco, los estudios deben definir la relación apropiada entre la dosificación del fármaco y las comidas. 4. Se pueden llevar a cabo estudios alternativos adecuados si el solicitante declara en la etiqueta del fármaco que se debe administrar con una comida sin grasas. En este caso, se debe considerar un cambio en la composición de las comidas. 5. Los analistas deben monitorear todo el perfil de absorción de una monodosis de liberación modificada. Cuando corresponda (p.ej., en un estudio multidosis), en el caso de fármacos y sistemas de liberación de fármacos específicos, el segundo día se deben extraer muestras de sangre, después del desayuno y antes de administrar la segunda dosis. Este progama de muestreo es particularmente importante para productos que se administran una vez al día. 6. En el caso de formas farmacéuticas de liberación retardada (con recubrimiento entérico), los analistas deben realizar estudios de biodisponibilidad para caracterizar los efectos de los alimentos y sustentar la dosificación indicada en el etiquetado. Estos estudios tienen un doble propósito: primero, determinar si es necesario incluir en el etiquetado instrucciones que describan condiciones especiales de administración con respecto a las comidas y, segundo, proporcionar información respecto del patrón de absorción de la forma farmacéutica de liberación modificada comparándolo con el de la forma farmacéutica de liberación inmediata. Se debe definir la función de entrada del fármaco para formas farmacéuticas de liberación modificada. Esto servirá de ayuda para desarrollar una prueba de disolución in vitro apropiada. En el caso de formas farmacéuticas que presenten gran variabilidad, se recomienda un diseño de estudios repetidos. Estudios multidosis de estado estacionario Estudio /-Cuando hay datos que demuestren una farmacocinética lineal para una forma farmacéutica de liberación inmediata, se debe llevar a cabo un estudio de estado estacionario con la forma farmacéutica de liberación modificada a una dosificación determinada (preferentemente en el extremo superior del régimen de dosificación habitual) utilizando como control una dosis total diaria comparable de una forma farmacéutica de liberación inmediata. Se deben realizar al menos tres determinaciones de la concentración plasmática mínima del fármaco (Cm;n) a la misma hora del día para demostrar que se lograron las condiciones de estado estacionario. En cada fase del estudio cruzado se deben efectuar determinaciones de concentración plasmática del fármaco, en al menos un intervalo de dosificación de la forma farmacéutica de liberación modificada. Puede ser preferible (como en el caso de variación rítmica de absorción o eliminación del fármaco) determinar concentraciones durante un día entero en cada fase. Se debe verificar la presencia o ausencia de variación circadiana. La forma farmacéutica de liberación modificada debe producir un ABC que sea equivalente al de la forma farmacéutica de liberación inmediata si el grado de absorción de la forma farmacéutica de liberación modificada es comparable a la dosis de liberación inmediata. El grado de fluctuación del producto de liberación modificada debe ser el mismo, o menor, que el de la forma farmacéutica de liberación inmediata dada por el régimen aprobado. Las mediciones apropiadas de la concentración deben incluir los metabolitos principales y el fármaco intacto. En el caso de fármacos racémicos, los analistas deben considerar la determinación de los enantimeros activos. Estudio //-Cuando no hay comparaciones de las propiedades farmacocinéticas de una forma farmacéutica de liberación inmediata en dosis diferentes, o cuando los datos demuestran una falta de linealidad, se deben llevar a cabo estudios cruzados de estado estacionario que comparen los efectos de la forma farmacéutica de liberación modificada con los de la forma farmacéutica de liberación inmediata a dos dosificaciones diferentes: una en el extremo inferior del intervalo de dosificación recomendado y la segunda en el extremo superior del intervalo de dosificación. En cada caso, la forma farmacéutica de liberación modificada debe cumplir los criterios descritos en el Estudio I con respecto al ABC y a las fluctuaciones en las concentraciones plasmáticas de fármaco. Si existieran diferencias importantes entre la forma farmacéutica de liberación modificada y la forma farmacéutica de liberación inmediata tanto en el intervalo de dosificación bajo como alto, estos datos por sí solos no son adecuados para caracterizar al producto. Los datos pueden ser engañosos, si se obtienen de sujetos con características fisiológicas o de eliminación de fármaco atípicas, con relación a la población diana. Por lo tanto, la selección de sujetos debe efectuarse a partir de una población blanco adecuada con una designación aleatoria de la forma farmacéutica. Si la forma farmacéutica de liberación modificada se va a usar en una subpoblacion específica (p.ej., en niños), se debe analizar en esa población. Independientemente de si un fármaco presenta farmacocinética lineal o no lineal, la base para la caracterización es la equivalencia del ABC y del grado relativo de fluctuación de las concentraciones de las formas farmacéuticas de liberación modificada y de liberación inmediata. Además pueden ser necesarios estudios de estado estacionario en poblaciones de pacientes seleccionados o estudios sobre interacción de fármacos, dependiendo del uso terapéutico del fármaco y de los tipos de individuos a los que se recomendará el uso de la forma farmacéutica de liberación modificada. En el caso de fármacos que presentan índices terapéuticos limitados,
USP 39
Información General/ (1088) Evaluación In Vivo e In Vitro 1287
puede ser necesario llevar a cabo mediciones más amplias de la concentración plasmática para determinar la posibilidad de patrones anómalos de liberación del fármaco en ciertas subpoblaciones. En tales estudios, los investigadores deben realizar más de una medición del ABC por paciente para evaluar la variabilidad tanto de las formas farmacéuticas de liberación modificada como de las de liberación inmediata. CASO B El Caso B corresponde a una forma farmacéutica de liberación modificada, no oral, de un fármaco activo ya comercializado del que existen amplios datos farmacodinámicos y farmacocinéticos. Los estudios del Caso A (omitiendo los estudios del efecto de los alimentos) son adecuados para evaluar una forma farmacéutica de liberación modificada diseñada para administrar por vía no oral si el patrón de biotransformación a metabolitos activos es idéntico para las dos vías. Si los patrones de biotransformación son diferentes, entonces deben llevarse a cabo estudios de eficacia clínica con la forma farmacéutica de liberación modificada. Además, pueden ser necesarios estudios especiales para evaluar factores de riesgo específicos relacionados con la forma farmacéutica (p.ej., irritación o sensibilización de la zona de aplicación de un sistema de administración transdérmica de fármaco). CASO C El Caso C se aplica a un equivalente genérico de una forma farmacéutica de liberación modificada aprobada, que debe ser biológicamente equivalente al fármaco de referencia en lo que respecta a su velocidad y grado de exposición (es decir, ABC, Cmáxi Cmím y grado de fluctuación) en estudios cruzados monodosis. En el caso de una forma farmacéutica oral de liberación modificada, también se deben llevar a cabo los estudios con alimentos descritos en el Caso A. CASO D El Caso D se aplica a un producto aprobado por la FDA que se ha sometido a una evaluación de aumento en escala y de cambios posteriores a la aprobación (SUPAC). La guía de la FDA, SUPAC-MR: Modified Release So/id Oral Dosage Forms; Scale-Up and Postapproval Changes: Chemistry, Manufacturing, and Controls, In Vitro Dissolution Testing, and In Vivo Bioequivalence Documentation (www.fda.gov/ down loads/Drugs/Guida nceCompl ianceReg u latoryl nformation/Guidances/UCMO 70640. pdf) describe las pruebas de disolución in vitro y/o pruebas de bioequivalencia in vivo necesarias.
Análisis Estadístico de Bioequivalencia In Vivo Se debe seleccionar un método estadístico apropiado. (Ver Evaluación de Desempeño del Producto Farmacéutico-Biodisponibilidad, Bioequivalencia y Disolución (1090)).
CORRELACIONES IN VIVO-IN VITRO El término correlación in vivo-in vitro (CIVIV) apareció por primera vez en la literatura farmacéutica al conocerse la importancia de los conceptos de biodisponibilidad y las determinaciones de la velocidad de disolución in vitro. El término CIVIV se refiere al establecimiento de una relación racional entre una propiedad biológica, o un parámetro derivado de concentraciones plasmáticas del fármaco producidas por una forma farmacéutica y una característica o propiedad fisicoquímica de la misma forma farmacéutica. Las propiedades biológicas que se usan más frecuentemente son uno o más parámetros farmacocinéticos, tal como Cmáx o ABC, obtenidos después de administrar la forma farmacéutica. La propiedad fisicoquímica que se usa con mayor frecuencia es el comportamiento de la forma farmacéutica durante la disolución in vitro (p.ej., porcentaje de fármaco liberado bajo un conjunto determinado de condiciones). La relación cuantitativa. entre las dos propiedades, biológica y fisicoquímica, es una CIVIV. El uso más importante de un CIVIV es en relación con la predictibilidad. En muchos casos, la concentración plasmática de fármaco real se puede predecir a partir de datos de disolución in vitro. Históricamente, el análisis de la CIVIV ha tenido mayor éxito para formas farmacéuticas de liberación prolongada que para las de liberación inmediata. Esta diferencia problablemente refleja la aplicación de técnicas e interpretaciones de análisis de datos específicos que requieren una velocidad de disolución-absorción de fármaco limitada. Sin embargo, algunas correlaciones con formas farmacéuticas de liberación inmediata han sido demostradas usando métodos que se basan en la presente y amplísima disponibilidad de computadoras y de software de regresión no lineal, junto con nuevos métodos de correlación.
Consideraciones Generales Con la proliferación de formas farmacéuticas de liberación modificada, se ha vuelto necesario examinar con mayor detalle el CIVIV. A diferencia de las formas farmacéuticas de liberación inmediata, las formas farmacéuticas de liberación modificada, particularmente las formas farmacéuticas de liberación prolongada, no se pueden caracterizar mediante una prueba de disolución con un solo tiempo de muestreo. Estas formas farmacéuticas están diseñadas para liberar fármaco de tal modo que el paciente
1288 (1088) Evaluación In Vivo e In Vitro / Información General
USP 39
presente un perfil de nivel plasmático específico durante un período prolongado, por lo regular 12-24 horas. Los analistas requieren de métodos in vitro para garantizar que cada partida del producto se comportará de manera idéntica in vivo. Un CIVIV satisface este requisito. Inicialmente se pensó que desarrollar una correlación significativa para las formas farmacéuticas de liberación inmediata sería una tarea más fácil que para los productos de liberación prolongada. Sin embargo, debido a la naturaleza de los principios sobre los que se basa cada tipo, los analistas actualmente consideran que se puede conseguir un CIVIV con mayor facilidad para las formas farmacéuticas de liberación modificada. Se espera que todos las formas farmacéuticas de liberación prolongada tengan una velocidad de disolución limitada. Para estos productos, la formulación contribuye de manera significativa a la prolongación de la liberación del fármaco a partir de la forma farmacéutica. Debido al impacto de la formulación sobre la BD de una forma farmacéutica de liberación prolongada, se han hecho numerosos intentos de correlacionar uno o más parámetros farmacocinéticos determinados a partir de estudios in vivo con la cantidad liberada en un tiempo determinado durante una prueba de disolución in vitro. Las correlaciones pueden indicar que aumentar o disminuir la velocidad de disolución in vitro de la forma farmacéutica de liberación modificada generaría un cambio de dirección correspondiente en el comportamiento del producto. Sin embargo, tales correlaciones puntuales revelan muy poco sobre la curva general de nivel plasmático, la cual representa un factor primordial para el comportamiento del fármaco en el paciente. En su lugar, se prefieren los métodos de correlación que utilizan todos los datos de concentración plasmática del fármaco y todos los dados de disolución in vitro. Se encuentran disponibles tres procedimientos de correlación que usan todos los datos de disolución y plasmáticos, junto con análisis de momento estadístico. Cada procedimiento presenta diferencias importantes en la calidad de la correlación. Estos métodos se analizan según las ventajas de cada uno, junto con su posible utilidad como herramienta de predicción para el científico farmacéutico.
Niveles de Correlación Se han definido y categorizado tres niveles de correlación, en orden descendente de calidad. El concepto de nivel de correlación se basa en la capacidad de la correlación de reflejar la totalidad de la curva de concentración plasmática de fármacotiempo que resulta de la administración de una forma farmacéutica dada. La relación entre la curva de disolución in vitro total y el perfil concentración plasmática-tiempo total define la fuerza de la correlación y, por lo tanto, la predictibilidad. NIVEL A Este nivel representa la categoría más alta de correlación. Representa una relación punto a punto entre la disolución in vitro y la velocidad de entrada in vivo (velocidad de absorción del fármaco a partir de la forma farmacéutica). Para una correlación de Nivel A, se compara la curva de disolución in vitro de un producto con la curva de entrada in vivo, es decir, la curva producida por deconvolución del perfil plasmático. La deconvolución se puede lograr mediante técnicas de balance de masas dependientes del modelo, como el procedimiento de Wagner-Nelson o el método de Loo-Riegelman, o por deconvolución matemática independiente del modelo. En una correlación ideal, las curvas de disolución in vitro y de velocidad de absorción in vivo son directamente superponibles o se pueden superponer mediante el uso de un valor constante para ajustar la escala de tiempo. Las ecuaciones que describen cada curva son las mismas. Este procedimiento a menudo se encuentra con sistemas de dosificación de liberación modificada que demuestran una velocidad de liberación in vitro esencialmente independiente de los medios de disolución y de las velocidades de mezclado usados en un aparato de disolución. La superposición no es un requisito absoluto para una correlación de Nivel A. Si las curvas de disolución y absorción son diferentes y se puede desarrollar una relación matemática para relacionarlas a ambas, el perfil de nivel plasmático aún se puede predecir a partir de los datos de disolución in vitro. Esta relación no solo es fidedigna para una sola velocidad de entrada, sino también para todo el intervalo de disolución de control de calidad para el producto. Asimismo, cuando la velocidad de disolución depende de la velocidad de mezclado, las dos curvas se pueden se pueden volver superponibles al aumentar o reducir la velocidad de mezclado in vitro u otra alteración del método de disolucion. Las ventajas de una correlación de Nivel A son las siguientes. 1. Desarrolla una correlación de punto a punto. Esto no se consigue con ningún otro nivel de correlación. Se desarrolla utilizando todos los puntos de nivel plasmático y del perfil de disolución recabados en distintos intervalos, por lo que refleja toda la curva de nivel plasmático. Así, en el caso de una correlación de Nivel A, una curva de disolución in vitro puede servir como sustituto del comportamiento in vivo. Un cambio en el sitio de fabricación, método de elaboración, suministro de materias primas, modificación menor en la formulación e incluso en la concentración del producto con la misma formulación, se pueden justificar sin necesidad de realizar otros estudios de BD-BA. 4 •5 2. Se define para la forma farmacéutica un procedimiento verdaderamente valioso de control de calidad que indica el desempeño en vivo y que permite predecir el desempeño de una forma farmacéutica. 4 FDA Guidance SUPAC-MR: Modified Release So/id Oral Dosage Forms-Scale-Up and Postapproval Changes: Chemistry, Manufacturing, and Controls; In Vitro
Dissolution Testing, and In Vivo Bioequivalence Documentation (1997).
C\VIV con la concentración más alta, se pueden otrogar exenciones por cambios realizados en la concentración más alta y en cualquiera de las concentraciones más bajas siempre que tales concentraciones tengan una composición proporcional o sean cualitativamente iguales, los perfiles de disolución in vitro de todas las concentraciones sean similares, y todos los contenidos tengan el mismo mecanismo de liberación (traducción para fines informativos del texto oficial disponible únicamente en inglés)." 5 FDA Guidance Extended-Release Salid Oral Dosage Form-Development, Evaluation, and Application of In Vitro/ln Vivo Corre\ations, "Si se desarrolla una
USP 39
Información General/ (1088) Evaluación In Vivo e In Vitro 1289
3. Los extremos de los estándares de control de calidad in vitro se pueden justificar mediante convolusión (simulando el perfil de nivel plasmático a partir de la curva de disolución) o mediante desconvolusión (usando los límites superior e inferior del intervalo de confianza). NIVEL B Esta correlación utiliza los principios del análisis de momento estadístico. La media del tiempo de disolución in vitro se compara con la media del tiempo de residencia o con la media del tiempo de disolución in vivo. Al igual que con la correlación de Nivel A, el Nivel B emplea todos los datos in vitro e in vivo, pero no se considera una correlación de punto a punto. No se correlacionan los perfiles plasmáticos reales in vivo sino un parámetro que resulta del análisis del momento estadístico de un componente del perfil plasmático tal como el tiempo de residencia medio. Debido a que un número de perfiles plasmáticos diferentes pueden producir valores de tiempo de residencia medio similares, no es posible basarse únicamente en una correlación de Nivel B para predecir un perfil plasmático a partir de datos de disolución in vitro. Además, no se pueden usar datos in vitro de dicha correlación para justificar los valores en los límites de las normas de control de calidad. NIVEL C Esta categoría relaciona un punto de muestreo de la disolución (t50%, t90 ,;,, etc.) con un parámetro farmacocinético tal como ABC, Cmáv o Tmáx· Representa una correlación de un solo punto y no refleja la forma completa del perfil plasmático, que es el factor que mejor define el desempeño de productos de liberación modificada. Debido a que este tipo de correlación no puede predecir el comportamiento real del producto in vivo, generalmente se usa sólo como una guía para el desarrollo de formulaciones o como procedimiento de control de calidad de la producción. En razón de sus limitaciones evidentes, una correlación de Nivel C tiene una utilidad limitada para predecir el desempeño de fármacos in vivo y se deben tomar las mismas precauciones que en una correlación de Nivel Ben cuanto a su capacidad para respaldar modificaciones en el producto y en el sitio de fabricación, al igual que justificar los valores en los límites de las normas de control de calidad. La Guía de la FDA "ExtendedRelease Solid Oral Dosage Forms-Development, Evaluation, and Application of In Vitro/ln Vivo Correlations" (www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatorylnformation/Guidances/UCM070239.pdf) establece que los fabricantes pueden obtener bioexenciones (biowaivers) basadas en múltiples correlaciones de Nivel C. La guía presenta la forma en que los fabricantes pueden lograr esta correlación. Asimismo, la FDA indica que cuando es posible lograr tal correlación, también es factible el desarrollo de una correlación de Nivel A. DESARROLLO DE UNA CORRELACIÓN Este capítulo no define los únicos procedimientos posibles para desarrollar una CIVIV, y cualquier enfoque bien diseñado y científicamente válido es aceptable. Para ayudar al científico farmacéutico, a continuación se describe un procedimiento posible para desarrollar una correlación de Nivel A: 1. Para llevar a cabo de manera adecuada una deconvolución, los analistas deben estar familiarizados con la farmacocinética del fármaco en sí e incorporado en una forma farmacéutica de liberación modificada. Por ejemplo, si se sabe que un fármaco se absorbe por completo pero demuestra cinéticas de primer paso saturables, es mejor asumir una biodisponibilidad del 100% para propósitos del cálculo de la velocidad de absorción. Esto se basa en el hecho de que el fármaco se absorbe completamente, pero debido al metabolismo hepático, se observa una cantidad menor que si el fármaco se hubiese administrado como bolo de liberación inmediata. Si se utiliza el grado de absorción relativo a una forma farmacéutica de liberación inmediata o en solución, el perfil de entrada no se sobrepondrá con el que se calculó asumiendo una absorción del 100%. No obstante, será muy posible establecer las correlaciones de punto a punto. 2. Los diferentes perfiles de disolución de una formulación se deben obtener tal como se ilustra en la Figura 7. La formulación se debe modificar sólo lo suficiente para producir perfiles distintos de disolución de modo que la formulación tenga los mismos excipientes en todos los lotes que se van a analizar. Las modificaciones a la formulación usadas en estas partidas se deben basar en factores que se esperaría que tuvieran alguna influencia sobre la velocidad de liberación modificada del producto y que podrían ocurrir durante la fabricación normal de este. La liberación del fármaco in vitro se lleva a cabo en partidas que se usarán en el estudio de biodisponibilidad y se investiga el efecto de las condiciones variables de disolución. Algunas de las variables que se deben estudiar son el aparato (es preferible usar un equipo de disolución oficial), la intensidad de mezclado y el medio de disolución (es decir, valor de pH, enzimas, agentes tensoactivos, presión osmótica, fuerza iónica, etc.). No es necesario estudiar el comportamiento de la disolución de la forma farmacéutica en todas las condiciones indicadas. El número de condiciones investigadas depende en gran medida de si se puede desarrollar una correlación con los resultados in vitro obtenidos bajo las condiciones investigadas con mayor frecuencia, como aparato, intensidad de agitación o medio de disolución y valor de pH. Cada formulación y cada fármaco representan un desafío individual. Los perfiles de disolución que resultan del uso de diferentes medios de disolución se ilustran en las Figuras 7 y 2, en las cuales se analizaron las mismas formulaciones en agua y en solución amortiguadora ácida.
USP 39
1290 (1088) Evaluación In Vivo e In Vitro / Información General
/'
Jsüt---~~~~------------~ ~
'~'"''
~
t - - - + - r - - + - - - - - - - - l 40~Med1a
~
f---------
1-i..-Rápida
1a
12
14
1e
11
2J
n
u
Tiempo. h
Figura 1. Perfiles de disolución media de tres modificaciones de una nueva formulación de liberación modificada (Aparato 2 de la USP, 50 rpm, 0,9 L de agua, 37°).
//
/
t~ot-----+-~f---_,,._/_ _ _ _ _ _ _ _ _ _~
º
1
/
¡
~
/
Jüt----1-..--+---------------~
13
12
1S
22
24
T1empo,h
Figura 2. Perfiles de disolución media de una nueva formulación de liberación modificada (Aparato 2 de la USP, 50 rpm, 0,9 L de solución amortiguadora de pH 4,5, 37°). 3. Los datos de nivel plasmático o de excresión urinaria obtenidos en el estudio definitivo de biodisponibilidad de la forma farmacéutica de liberación modificada se tratan mediante un procedimiento de deconvolución. Los datos obtenidos pueden representar la velocidad de entrada del medicamento desde la forma farmacéutica. También representan la disolución in vivo cuando la velocidad de disolución de la forma farmacéutica constituye el paso limitante que controla la velocidad (es decir, se considera que la absorción del fármaco después de la disolución es instantánea). Cualquier procedimiento de deconvolución (p.ej., balance de masas o deconvolución matemática) arrojará resultados aceptables. La Figura 3 ilustra los resultados de deconvolución numérica de los perfiles plasmáticos obtenidos para las partidas de las Figuras 1 y
2.
i
+-Lenta a Media
'··•··Rápida
2~
Tiempo h
Figura 3. Perfiles de absorción media a partir de la deconvolución numérica de gráficas de concentración plasmática-tiempo.
USP 39
Información General/ (1088) Evaluación In Vivo e In Vitro 1291
4. La curva de disolución in vitro se compara entonces con la curva de velocidad de absorción del medicamento. Esto se puede realizar por diversos métodos. Simplemente colocar una curva sobre la otra puede indicar a menudo la existencia de una correlación. Esto se puede cuantificar luego definiendo una ecuación para cada curva y comparando las constantes correspondientes. La manera más simple de demostrar una correlación es graficar la fracción absorbida in vivo en función de la fracción liberada in vitro, según se ilustra en las Figuras 4 y 5. Con una correlación de Nivel A, esta relación a menudo es lineal, con una pendiente cercana a 1. Conforme se ilustra en las Figuras 4 y 5, una correlación puede ser curvilineal. La intersección puede ser cero o un valor distinto, dependiendo de si hay un lapso de tiempo antes de que el sistema comience a liberar el medicamento in vivo, o la absorción no es instantánea dando como resultado la presencia de cierta cantidad limitada de medicamento disuelto pero sin absorber. En cualquiera de los casos, se trata de una correlación de punto a punto o una correlación de Nivel A cuando el ajuste de cuadrados mínimos de la línea se acerca a un coeficiente de determinación, R2 , de 1. Para las correlaciones ilustradas en las Figuras 4 y 5, la CIVIV usando los perfiles de disolución con solución amortiguadora ácida fue superior a la obtenida usando agua.
Rápida • Lenta
A
-Lineade
~
•
~s~t-~~~~~~~~~~~~~~~-,#--~~
llü
9ü
1iJO
Figura 4. Intento de CIVIV: agua (usando formulaciones lentas y rápidas).
t---~~~----;.~a=·pid~,~~~~~~~~f-~~
•Lenta _Línea de Tendenqa
3u
50
%Disuelto
Figura 5. Intento de CIVIVC: solución amortiguadora de pH 4,5. 5. Si a partir de los estudios indicados anteriormente en la evaluación de disolución in vitro, la forma farmacéutica de liberación modificada presenta un comportamiento de disolución que es independiente de las variables estudiadas, y se demuestra una correlación de Nivel A cuando la curva de disolución in vitro se compara con la curva de velocidad de entrada del fármaco, es probable que la correlación sea general y se pueda extrapolar dentro de un intervalo razonable para esa formulación del fármaco activo. Si la forma farmacéutica presenta un comportamiento de disolución que varía con las condiciones in vitro, los analistas deben determinar el conjunto de condiciones de disolución que se correlaciona mejor con el desempeño in vivo. Se puede establecer entonces si la correlación es real o es un artefacto. Esto se logra mediante la preparación de al menos dos formulaciones que tengan un comportamiento in vitro significativamente diferente. Una debe demostrar una liberación más rápida y la otra una liberación más lenta que la del lote de biodisponibilidad clínica (biolote). Se debe llevar a cabo un estudio piloto de BD-BE con estas formulaciones y demostrar para ambas la correlación establecida previamente. Las modificaciones en la formulación de estas partidas se deben basar en factores de formulación que podrían influir sobre el mecanismo de liberación modificada del producto, y se espera que la modificación de estos factores de formulación influya sobre la velocidad de liberación de la forma farmacéutica. 6. Como alternativa, el desempeño in vivo de la formulación de biolote se puede simular basándose en la correlación desarrollada con estas formulaciones que se usaron en el estudio de BD-BE. Posteriormente, los analistas pueden comparar los valores predichos y determinados experimentalmente, es decir, el error de predicción. El ejercicio ilustrado en las Figuras 6
1292 (1088) Evaluación In Vivo e In Vitro / Información General
USP 39
y 1 sirve como validación interna de la correlación de
Nivel A. Una validación externa implicaría la simulación de datos para una partida de formulación que no fue incluida en los cálculos de la correlación de Nivel A. Dicha validación se llevó a cabo usando los datos in vivo del lote de medio de la formulación, y los resultados se ilustran en la Figura B.
Tiempo, h
Figura 6. Perfiles plasmáticos medios observados y predichos: formulación lenta. 10
--·----·---------------
"
"'
"'
Tiempo,h
40
Figura 7. Perfiles plasmáticos medios observados
"
"
"
y predichos: formulación rápida.
30.--------------------
Figura 8. Perfiles plasmáticos medios observados y predichos: formulación media. 7. Una vez establecida una correlación de Nivel A, se puede usar en análisis in vitro para establecer especificaciones de disolución, bioexenciones para facilitar la SUPAC y cambios en el contenido de la forma farmacéutica para la misma formulación. Es cuestionable si se puede realizar tal extrapolación con las correlaciones de Nivel By C.
USP 39
Información General/ (1090) Evaluación de Desempeño 1293
Establecimiento de Intervalos de Especificaciones de Disolución Es relativamente fácil establecer una especificación de disolución de múltiples puntos para una forma farmacéutica de liberación modificada. El comportamiento de disolución de biolote se puede usar para definir la cantidad que se va a liberar en cada tiempo de muestreo. La dificultad surge en la variación que se va a admitir en cada punto de muestreo. En el caso de una correlación de Nivel A, esto se puede hacer de dos maneras, las cuales emplean la CIVIV: convolución y deconvolución. CONVOLUCIÓN Se seleccionan valores superiores e inferiores razonables para cada tiempo establecido usando el biolote. Históricamente, las especificaciones de disolución se han seleccionado empleando la disolución promedio de las partidas de desarrollo, con un intervalo de ±2,5-3 desviaciones estándar. Se espera que los valores de disolución promedio sean aproximadamente iguales a los del biolote. Se realiza la convolución de las curvas de disolución definidas por los extremos superior e inferior para proyectar las curvas de nivel plasmático previstas que resultarían de la administración de esas formulaciones a los mismos pacientes a quienes se le administró la biopartida. Si los datos de niveles plasmáticos se ubican dentro del intervalo de confianza del 95% obtenido en el estudio de BD-BE definitivo, estos intervalos se pueden considerar aceptables. Un enfoque alternativo de aprobación que se puede usar después de haber definido el intervalo terapéutico de un medicamento es establecer si los límites superior e inferior de los resultados de la convolución caen dentro del intervalo terapéutico, incluso si no están comprendidos dentro del intervalo de confianza. Si no están comprendidos dentro del intervalo, se debe establecer un intervalo más limitado. Este procedimiento se debe continuar hasta que los valores pronosticados se ubiquen dentro de los intervalos deseados. DECONVOLUCIÓN Se establece un conjunto aceptable de datos de niveles plasmáticos tanto para una partida de sustancia que demuestra una liberación más rápida como para una que demuestra una liberación más lenta que la de la partida de muestra del producto. Se pueden seleccionar usando los extremos del intervalo de confianza del 95% o una desviación estándar de ±1 con respecto al nivel plasmático medio. Se realiza la deconvolución de estas curvas y la curva de velocidad de entrada resultante se usa para establecer las especificaciones de disolución superior e inferior en cada punto temporal. En el caso de las correlaciones de Nivel By C, las partidas del producto se deben elaborar en los límites superior e inferior propuestos del intervalo de disolución y se debe demostrar que estas partidas son aceptables mediante un estudio de BD-BE.
Formas Farmacéuticas de Liberación Inmediata CONSIDERACIONES GENERALES Debido a que los mecanismos de liberación de fármacos de formas farmacéuticas de liberación modificada son más complejos y variables que aquellos asociados a las formas farmacéuticas de liberación inmediata, se esperaría que la CIVIV fuera más fácil de desarrollar con las últimas formulaciones. Lamentablemente, la mayoría de los intentos de correlación realizados hasta la fecha con formas farmacéuticas de liberación inmediata se han basado en el método de correlación de Nivel C, aunque también se han hecho intentos mediante la teoría de análisis estadístico de momento (Nivel B). Aunque es razonable suponer que el mismo método de correlación de Nivel A se podrá utilizar con formas farmacéuticas de liberación inmediata, hasta que se reúnan datos para corroborarlo, el Nivel By el Nivel C son los mejores métodos que se pueden recomendar para usarlos con estas formas farmacéuticas.
(1090) EVALUACIÓN DE DESEMPEÑO DEL PRODUCTO FARMACÉUTICO-BIODISPONIBILIDAD, BIOEQUIVALENCIA Y DISOLUCIÓN ANTECEDENTES Este capítulo ofrece recomendaciones para la evaluación del desempeño del producto farmacéutico in vivo e in vitro. El capítulo está previsto como una guía para los científicos y médicos que buscan evaluar el desempeño del producto farmacéutico por medio de procedimientos sustitutos correlativos y/o antecedentes a estudios clínicos en seres humanos. Los compendios USP-NF proporcionan normas de calidad para fármacos, excipientes y preparaciones terminadas. Una monografía USP-NF para una sustancia o preparación oficial incluye la definición del artículo, el envasado, almacenamiento y otros requisitos, así como la especificación. La especificación consiste en una serie de pruebas universales (descripción, identificación, impurezas y valora-
1294 (1090) Evaluación de Desempeño / Información General
USP 39
ción) y pruebas específicas, uno o más procedimientos analíticos para cada prueba, y criterios de aceptación. Las normas de calidad son atributos importantes que deben ser parte constitutiva del producto farmacéutico. El cumplimiento con las normas USP-NF se acepta mundialmente como garantía de alta calidad y forma parte de los requisitos necesarios para la aprobación de un medicamento de múltiples fuentes (multisource) bioequivalente e intercambiable. Los medicamentos de múltiples fuentes (o multifuentes) deben cumplir con determinados estándares de desempeño in vivo y/o in vitro para ser considerados terapéuticamente equivalentes e intercambiables. La aprobación reglamentaria de productos intercambiables de múltiples fuentes puede diferir ligeramente en cada país (ver una descripción más amplia en el capítulo de próxima aparición Puntos Esenciales para la Selección de Medicamentos (1096)). El desempeño de un medicamento puede definirse como la liberación del ingrediente farmacéutico activo (IFA o API, por sus siglas en inglés) de la forma farmacéutica del producto, que conduzca a la disponibilidad sistémica del API necesaria para alcanzar la respuesta terapéutica deseada. Este capítulo discute los enfoques in vivo e in vitro para determinar el desempeño del producto farmacéutico. El capítulo se centra principalmente en el desempeño de los medicamentos orales sólidos. El capítulo hace referencia a la guía de la Administración de Alimentos y Medicamentos de Estados Unidos (FDA) conocida como Guidance far lndustry-Bioavailability and Bioequivalence Studies far Oral/y Administered Drug Products-General Considerations (2003) (http://www.fda.gov/; buscar por el título del documento) y a un documento de la Organización Mundial de la Salud (OMS o WHO, por sus siglas en inglés), titulado Annex 7 Multisource (Generic) Pharmaceutical Products: Guidelines on Registration Requirements to Establish lnterchangeability (2006) (http://who.int/en/; buscar por el título del documento). Las guías de la FDA se usan en los Estados Unidos, mientras que otras autoridades reglamentarias nacionales y regionales pueden usar las guías de la OMS, de la FDA, así como también guías nacionales y regionales. Después de la aprobación de un medicamento, se puede lograr su control de la calidad, en parte, por la especificación privada y/o pública, que puede incluir una prueba de desempeño. La USP proporciona los capítulos generales Desintegración (701 ), Disolución (711 ), Liberación de Fármacos (724), Evaluación de Formas Farmacéuticas In Vivo e In Vitro (1088), y Procedimiento de Disolución: Desarrollo y Validación (1092), donde se describen estas pruebas y procedimientos. Este capítulo proporciona información general sobre la realización de estudios de bioequivalencia (BE), como una forma alterna de medir el desempeño de un producto farmacéutico in vivo, y comparaciones del perfil de disolución para medir el desempeño del producto farmacéutico in vitro. El capítulo también analiza las condiciones bajo las cuales ciertos productos farmacéuticos pueden quedar exentos del requisito de BE in vivo (bioexención o biowaiver) y muestra cómo se puede usar el Sistema de Clasificación Biofarmacéutica (BCS, por sus siglas en inglés) para predecir el desempeño de un producto farmacéutico. En el apéndice de este capítulo se define la terminología científica clave y se proporciona una comparación entre las evaluaciones de desempeño del producto farmacéutico de la FDA y la OMS.
BIODISPONIBILIDAD, BIOEQUIVALENCIA Y DISOLUCIÓN Los estudios de biodisponibilidad (BD o BA, por sus siglas en inglés) se enfocan en determinar el proceso y plazo durante el cual se libera el fármaco de una forma farmacéutica oral y se desplaza al sitio de acción [ver la guía de la FDA Guidance far lndustry-Bioavailability and Bioequivalence Studies far Oral/y Administered Drug Products-General Considerations (2003)]. La BD es una medida indirecta o alterna de la velocidad y grado con los que el API o la entidad/parte activa (active moiety) se absorbe desde el producto farmacéutico y se vuelve disponible en sus sitios de acción. Los datos de BD proporcionan un cálculo de la exposición sistémica al fármaco, incluida la fracción del fármaco absorbida. Para medicamentos que no están destinados a ser absorbidos en el torrente sanguíneo, la disponibilidad puede evaluarse con mediciones que reflejen la velocidad y grado en los que el ingrediente activo o la parte activa llega a los sitios de acción. Los productos farmacéuticos se consideran bioequivalentes si el producto farmacéutico de prueba no muestra una diferencia significativa en la velocidad y grado de absorción por comparación con un producto farmacéutico designado como referencia, cuando se administran a la misma dosis molar de la misma entidad activa, en la misma forma farmacéutica, bajo condiciones experimentales similares, bien sea en dosis únicas o en dosis múltiples. La BD y la BE se pueden obtener generalmente por mediciones seriales de las concentraciones del fármaco y/o metabolito en la circulación sistémica durante un período prescrito. Los estudios de BE pueden usar otros enfoques cuando no se pueden medir las concentraciones sistémicas del fármaco o éstas no son apropiadas. En estos casos, los métodos indirectos para determinar la BE incluyen criterios de valoración (endpoints) farmacodinámicos agudos, criterios de valoración clínica y estudios in vitro que típicamente involucran comparaciones de los perfiles de disolución de medicamentos de prueba y de referencia. La información sobre BD y BE es importante para cumplir con las presentaciones reglamentarias. La información de BD abarca la absorción, distribución, metabolismo y excreción del API. En el caso de un producto innovador, los estudios de BE establecen el desempeño del producto destinado a la comercialización por comparación de la BD del producto, tal como fue desarrollado para ser aprobado comercialmente, con el material de los ensayos clínicos, es decir con el producto farmacéutico usado para los ensayos de seguridad y eficacia. Para el desarrollo y aprobación reglamentaria de un medicamento genérico, el producto farmacéutico de prueba debe ser bioequivalente al medicamento de referencia listado (RLD, por sus siglas en inglés; por lo general, es el producto farmacéutico de marca o innovador designado por la autoridad reglamentaria correspondiente). El documento de ICH titulado Guidance on Q6A Specifications: Test Procedures and Acceptance Criterio far New Drug Substances and New Drug Products: Chemical Substances (2000) (http://www.fda.gov/; buscar por el título del documento), proporciona el enfoque para establecer los criterios de aceptación para el desempeño del producto farmacéutico. Este enfoque se basa en la disolución o desintegración de partidas clínicamente aceptables, como lo hace la FDA. Los estudios de BE se centran en el
USP 39
Información General/ (1090) Evaluación de Desempeño 1295
desempeño del producto farmacéutico y por lo general involucran comparaciones de dos medicamentos: el producto de prueba (T) y el de referencia (R) o comparador. Los estudios requeridos y la determinación de BE son competencia de las agencias reglamentarias. En Estados Unidos, R se denomina medicamento de referencia listado (reference listed drug o RLD, por sus siglas en inglés) y así se anota en la lista de Approved Drug Products with Therapeutic Equivalence Ratings [ Orange Book (2008). (http:// www.fda.gov/cder/ob)] preparado por la FDA. Para orientar a los países y regiones en donde no siempre se puede identificar fácilmente el producto R, la OMS ha preparado un documento titulado Annex 7 7 Guidance on the Selection of Comparator Pharmaceutical Products far Equivalence Assessment of lnterchangeable Multisource (Generic) Products (2005) (http://www.who.int/ en/; buscar por el título del documento). En el documento de la OMS, R se denomina como el producto farmacéutico comparador (CPP, por sus siglas en inglés). Cuando un país o región tiene un conjunto de CPPs claramente definido, la tarea consiste en requerir que un fabricante demuestre, a satisfacción de su autoridad reglamentaria, que su producto multifuente es farmacéuticamente equivalente y bioequivalente al CPP correspondiente.
BIOEQUIVALENCIA Un producto multifuente (genérico) intercambiable debe ser farmacéuticamente equivalente (FE). El documento de la OMS permite que las alternativas farmacéuticas se consideren terapéuticamente equivalentes e intercambiables si son bioequivalentes. Además, para que los productos genéricos se consideren terapéuticamente equivalentes (TE) al producto R (CPP) debe demostrarse que son bioequivalentes. Para que el producto sea considerado farmacéuticamente equivalente, debe tener el mismo ingrediente activo, igual contenido de activo, la misma forma farmacéutica y vía de administración, así como el mismo etiquetado del producto comparador. Se cuenta con diversos métodos para evaluar y documentar la BE, que incluyen los siguientes: 1. Estudios farmacocinéticos comparativos en seres humanos. En estos estudios, el fármaco activo y/o sus metabolitos se miden en función del tiempo en fluidos biológicos accesibles como sangre, plasma, suero u orina para obtener mediciones farmacocinéticas como el área bajo la curva de la concentración del fármaco en plasma en función del tiempo (ABC) y la concentración máxima (Cmáx), que son un reflejo de la exposición sistémica. Los estudios de BE se diseñaron para comparar el desempeño in vivo de un producto genérico con un producto R. Por lo general, el estudio se diseña cruzado, aleatorizado, con dos períodos, dos secuencias, una dosis única y se efectúa en 18 a 36 sujetos. La cantidad de sujetos debe justificarse estadísticamente y no ser menor de 12. Durante el estudio, se recolectan muestras de sangre con intervalos suficientes para evaluar Cmáx' ABC y otros parámetros. Las muestras de sangre se analizan por medio de metodología bioanalítica apropiadamente validada con medidas farmacocinéticas estándares y enfoques estadísticos. El método estadístico para evaluar la BE farmacocinética se basa en la determinación del intervalo de confianza del 90% alrededor del cociente de la media geométrica de las medias poblacionales transformadas en logaritmos (genérico/R) para ABC y CmáX' efectuando dos pruebas unilaterales con un nivel de significación de 5%. 2. Otras opciones. Además, se pueden utilizar estudios farmacodinámicos comparativos en seres humanos y ensayos clínicos comparativos para documentar o suplementar la evaluación de BE. Además de estos estudios clínicos, la disolución in vitro basada en el BCS puede asegurar la BE entre los productos T y R. La documentación de equivalencia in vivo es especialmente importante para: fármacos con intervalo terapéutico estrecho; evidencia documentada de problemas de bioequivalencia; medicamentos de liberación modificada diseñados para actuar por absorción sistémica; y productos combinados de dosis fijas con acción sistémica cuando al menos uno de los API requiere un estudio in vivo.
Productos Farmacéuticos de Liberación Inmediata Los estudios cruzados de BE de dosis única se efectúan con la dosis más alta para comparar los productos T y R en condiciones de ayuno. Para fármacos que tienen una vida media de eliminación (t,1,) muy larga se puede utilizar un diseño de estudio paralelo. Las agencias reglamentadoras pueden permitir el truncamiento del muestreo a las 72 horas. Las concentraciones más bajas de la forma farmacéutica pueden recibir una bioexención basándose en la proporcionalidad de la forma farmacéutica y en la similitud del perfil de disolución. Se requieren estudios sobre el efecto de los alimentos si en el etiquetado existe una indicación de que la administración concomitante de alimentos puede disminuir, aumentar o no influir sobre la BD del producto farmacéutico.
Productos Farmacéuticos de Liberación Modificada Los estudios de BE para formas farmacéuticas de liberación prolongada se efectúan en forma cruzada, con una dosis única, bajo condiciones de ayuno y alimentación, con la dosis más alta, para comparar los productos T y R. Un estudio de dosis única es más sensible que los estudios de dosis múltiples en estado estacionario para evaluar el desempeño del producto farmacéutico in vivo, especialmente en lo que respecta al fenómeno de liberación masiva de la dosis, es decir, la liberación prematura rápida e imprevista del ingrediente activo en el torrente sanguíneo a partir de un producto de liberación prolongada. Las concentraciones menores de una forma farmacéutica de liberación prolongada pueden no requerir un estudio in vivo, basándose en el uso del mismo mecanismo de liberación del fármaco, la proporcionalidad de la forma farmacéutica y el perfil de disolución similar.
1296 (1090) Evaluación de Desempeño / Información General
USP 39
Productos Farmacéuticos Administrados por Vía Oral, No Destinados a un Efecto Sistémico Algunos productos farmacéuticos orales están destinados a una actividad local. Por ejemplo, la mesalamina y la colestiramina son fármacos destinados a ejercer una actividad local. Para este tipo de medicamentos, la absorción sistémica desde el tracto gastrointestinal es mínima, requiriéndose por lo tanto de un ensayo clínico comparativo, aunque también se puede requerir un perfil de exposición sistémica al fármaco. En algunos casos, los estudios in vitro pueden ser apropiados; por ejemplo, la inclusión de una comparación de la unión de la colestiramina a las sales biliares.
Estudios de Bioequivalencia Objetivo-El objetivo de un estudio de BE es medir y comparar el desempeño de la formulación entre dos o más productos farmacéuticamente equivalentes. La disponibilidad del fármaco a partir de los productos T y R no debe ser estadísticamente diferente cuando el medicamento se administra a pacientes o sujetos en la misma dosis molar y bajo condiciones experimentales similares. Diseño-El diseño de un estudio de BE depende de los objetivos del mismo, la capacidad de analizar el fármaco (y los metabolitos) en fluidos biológicos, la farmacodinámica del fármaco, la vía de administración del medicamento y la naturaleza del fármaco y del producto farmacéutico. Para determinar la BD del fármaco a partir de un producto farmacéutico pueden utilizarse los parámetros farmacocinéticos, los parámetros farmacodinámicos, las observaciones clínicas y/o los estudios in vitro. Algunos posibles diseños de estudios de BE incluyen: 1. Estudio cruzado de dos vías y dosis única en ayunas. 2. Estudio cruzado de dos vías y dosis única, posprandial. 3. Estudio paralelo de dosis única en ayunas. 4. Diseño replicado, de dosis única 5. Diseño parcialmente replicado, de dosis única 6. Estudio cruzado de dos vías y dosis múltiples en ayunas 7. Estudio farmacodinámico o clínico (endpoint study) 8. Comparaciones del perfil de disolución in vitro El estudio de BE estándar tiene un diseño cruzado (p.ej., diseño cruzado de cuadrado latino) en el cual cada sujeto recibe el producto farmacéutico y el producto de referencia en ocasiones separadas. Los estudios por lo general se evalúan por un diseño cruzado aleatorizado de dosis única, dos períodos, dos tratamientos, dos secuencias, abierto, que compara dosis iguales de los productos de prueba y referencia en sujetos sanos adultos alimentados o en ayunas. Algunos medicamentos de liberación prolongada pueden requerir un estudio de dosis múltiples. Entre los dos períodos se programa un período de eliminación para permitir que los sujetos eliminen completamente el fármaco absorbido en la primera dosis antes de la administración de la segunda dosis. Si la concentración antes de la dosis es :<:;5% del valor Cmáx en ese sujeto, se pueden incluir los datos de ese sujeto sin ningún ajuste en todas las mediciones y cálculos farmacocinéticos. Las muestras de un fluido biológico accesible, como la sangre, caracterizan el perfil de la concentración del fármaco en función del tiempo. Durante el estudio en ayunas los sujetos ayunan al menos 1O horas. Se toma una muestra de sangre antes de la dosis (tiempo O). El producto farmacéutico se administra con 240 mL de agua (8 onzas). No se permite ningún alimento por lo menos 4 horas después de la dosis. La recolección de muestras de sangre se efectúa periódicamente después de la administración de la dosis, de acuerdo con el protocolo. Un estudio con intervención de alimento o de efecto del alimento se efectúa en condiciones estándar de alimentación que proporcionen los mayores efectos sobre la fisiología gastrointestinal, de manera que la disponibilidad sistémica del fármaco se afecte al máximo. Además, el alto contenido lipídico de la alimentación puede afectar la velocidad de liberación del fármaco a partir del producto farmacéutico, in situ. Como alimentación de prueba para los estudios de BD bajo el efecto de los alimentos (food-effect BA) y de BE en estado posprandial (fed BE) se recomienda una comida rica en grasas (aproximadamente 50% del contenido calórico total de la comida) y en calorías (aproximadamente 800 a 1000 calorías). Esta comida de prueba debe aportar aproximadamente 150, 250 y 500 a 600 calorías a partir de proteínas, carbohidratos y grasas, respectivamente. El producto farmacéutico se administra con 240 mL de agua (8 onzas) después de la ingestión de la comida estándar. Los sujetos deben consumir comidas idénticas a la misma hora durante el período de prueba. Análisis de las Muestras-Las muestras, por lo general de plasma, se analizan para medir las concentraciones del fármaco activo y, en ocasiones, las concentraciones del metabolito activo, por medio de métodos bioanalíticos validados. Parámetros Farmacocinéticos-Los parámetros farmacocinéticos se obtienen de las curvas resultantes de concentración en función del tiempo. Para evaluar la velocidad y grado de absorción sistémica del fármaco se usan dos parámetros farmacocinéticos importantes. La ABC refleja el grado de absorción del fármaco, mientras que la concentración máxima del fármaco (Cmáx) refleja la velocidad de absorción. Otros parámetros farmacocinéticos pueden incluir el tiempo para alcanzar la concentración máxima del fármaco (Tmáx), la constante de velocidad de eliminación (k), la vida media de eliminación (t,1,), el tiempo de latencia o demora (T1• 9), y otros.
Análisis Estadístico Los parámetros farmacocinéticos se analizan estadísticamente para determinar si los productos T y R arrojan valores comparables. Dado que los estudios de BE pueden utilizar tamaños pequeños de muestras, la transformación logarítmica de los datos
USP 39
Información General/ (1090) Evaluación de Desempeño 1297
permite que la frecuencia de distribución de los datos sea más normalizada de manera que se puedan efectuar análisis estadísticos paramétricos (FDA, Guidance far lndustry: Statistical Approaches to Establishing Bioequivalence (2001) (http:// www.fda.gov/; buscar por el título del documento). Para el análisis de datos farmacocinéticos derivados de estudios de BE in vivo, se recomiendan procedimientos que siguen el modelo lineal general paramétrico (teoría normal). Se debería realizar un análisis de varianza (ANOVA) con los parámetros farmacocinéticos ABC y Cmáxi empleando modelos y programas estadísticos adecuados. Por ejemplo, para un diseño de estudio cruzado convencional de dos tratamientos, dos períodos, dos secuencias (2 x 2), aleatorizado, el modelo estadístico a menudo incluye factores que toman en cuenta las siguientes fuentes de variación: • Secuencia (a veces dominada Grupo u Orden) • Sujetos, agrupados en secuencias • Periodo (o Fase) •Tratamiento (a veces denominado Medicamento o Formulación) Debería probarse el efecto de la secuencia usando el cuadrado medio [sujeto (secuencia)] obtenido del ANOVA como una evaluación del error. Los demás efectos principales deberían probarse contra el error residual (error cuadrático medio) obtenido del ANOVA. Se debería usar el procedimiento de cuadrados mínimos (LSMEANS) para calcular las medias de los cuadrados mínimos de los tratamientos. Se deberían estimar las diferencias ajustadas entre los promedios de los tratamientos y el error estándar asociado a estas diferencias. Las suposiciones estadísticas derivadas del ANOVA son las siguientes: • Aleatorización de las muestras • Homogeneidad de varianzas • Aditividad (linealidad) del modelo estadístico • Independencia y normalidad de residuos En los estudios de BE estas suposiciones se pueden interpretar de la siguiente manera: • Los sujetos elegidos deberían asignarse aleatoriamente a las secuencias del estudio. • Las varianzas asociadas con los dos tratamientos, así como entre los grupos de secuencias, deberían ser iguales o por lo menos comparables. • Los efectos principales del modelo estadístico, como por ejemplo el sujeto, la secuencia, el período y el efecto del tratamiento para un estudio cruzado estándar 2 x 2, deberían ser aditivos. No debería existir interacción entre estos efectos. • Los residuos del modelo deberían estar distribuidos en forma normal e independiente. Si no se cumplen estos supuestos, deberían tomarse medidas adicionales antes de realizar el ANOVA, incluyendo la transformación de datos para mejorar el ajuste a los supuestos o el uso de una prueba estadística no paramétrica en lugar del ANOVA. Sin embargo, se sabe que las suposiciones de normalidad y varianza constante en el modelo de ANOVA son relativamente robustas (es decir, una desviación pequeña o moderada de una de estas suposiciones, o de ambas, no tendrá un efecto significativo sobre el resultado final). La justificación de la transformación logarítmica se encuentra en la guía Statistical Approaches to Establishing Bioequivalence de la FDA. Se debe proporcionar una justificación en caso de usar datos sin transformar. Procedimiento de Pruebas Doblemente Unilaterales (two one-sided tests)-Para determinar la comparabilidad de los valores de la media geométrica de los parámetros farmacocinéticos medidos después de la administración de los productos de prueba y de referencia se usa lo que se conoce como el procedimiento de pruebas doblemente unilaterales. 1 El procedimiento de las pruebas doblemente unilaterales decide si T no es significativamente menor que R y si R no es significativamente menor que T. A menudo, 20% significa una diferencia significativa. El procedimiento estadístico implica el cálculo de un intervalo de confianza para el cociente (o diferencia) entre los promedios de las variables farmacocinéticas del producto de prueba (T) y del de referencia (R). Los límites del intervalo de confianza observado deben estar comprendidos en un intervalo predeterminado para el cociente (o diferencia) entre los promedios. La estimación puntual de los cocientes de las medias (T/R) derivados de los datos de ABC y Cmáx transformados logarítmicamente debe estar entre 80% y 125%. Dado que los datos se transforman en logaritmos, T/R = 80/100 = 80% y R/T = 100/80 = 125%. Además, los intervalos de confianza del 90% para los cocientes de las medias geométricas (T/R) para ABC y Cmáx deben estar entre 80% y 125%. Los requisitos reglamentarios para los intervalos de confianza del 90% para Cmáx pueden ser diferentes fuera de los Estados Unidos. Bioinequivalencia-Si no se puede demostrar la BE, puede ser debido a una falla en el desempeño del producto To a un diseño inadecuado del estudio. Si no se puede demostrar la BE por un diseño inadecuado del estudio, esto puede deberse a un muestreo inadecuado en el cual (1) el tiempo de muestreo para Cmáx no se obtuvo apropiadamente o (2) el número de muestras tomadas no describe adecuadamente el perfil de concentración plasmática del fármaco en función del tiempo. En el caso de fármacos altamente variables (p.ej., %CV >30%), a menudo se comprueba que se usaron muy pocos sujetos en el estudio y por lo tanto el estudio no tiene suficiente poder estadístico. Presentación de los Datos. Debería proporcionarse la concentración del fármaco en el fluido biológico a cada tiempo de muestreo, sin transformar, para todos los sujetos que hayan participado en el estudio. Los parámetros farmacocinéticos derivados también deberían proporcionarse sin transformar. En el informe final se debería calcular y tabular la media, la desviación estándar y el coeficiente de variación (CV) para cada variable.
1
Schuirmann DJ. A comparison of the two one-sided tests procedure and the power approach for assessing the equivalence of average bioavailability. /. Pharmaco-
kinetics ond Biophormoceutics, 1987:15:657-680.
1298 (1090) Evaluación de Desempeño / Información General
USP 39
Para facilitar las comparaciones de BE, deberían presentarse los parámetros farmacocinéticos para cada individuo en forma . paralela para las formulaciones probadas. Específicamente, para ABC y Cmáx' la diferencia {T - R), el cociente (T/R) y el logaritmo del cociente (log T/R o In T/R) entre los valores de T y R se deberían tabular en forma paralela para todos los sujetos. Las tablas deberían indicar la secuencia de administración del producto para cada sujeto {T, R o R, T). Es útil presentar histogramas que muestren la distribución de frecuencias de la diferencia y el cociente logarítmico (In o log) para los principales parámetros farmacocinéticos (ABC y Cmáx). Además de las medias aritméticas para los productos T y R deberían calcularse las medias geométricas (antilogaritmo de las medias de los logaritmos), las medias de los logaritmos y las desviaciones estándar de los logaritmos para ABC y Cmáx· En el informe deben incluirse todas las medias: la media aritmética, la media geométrica y las medias de los logaritmos, así como las desviaciones estándar y los coeficientes de variación.
DISOLUCIÓN V DESEMPEÑO DEL PRODUCTO IN VITRO Conforme a lo descrito para las preparaciones oficiales, las monografías de la USP proporcionan una especificación pública que incluye una lista de las pruebas, referencias a los procedimientos analíticos y criterios de aceptación. La mayoría de las formas farmacéuticas orales sólidas, incluidas las suspensiones orales, requieren una prueba de disolución o una prueba de liberación de fármacos. Las pruebas de disolución y liberación de fármacos se describen en los capítulos generales de la USP Disolución (711) y Liberación de Fármacos (724). Estas especificaciones públicas se usan para pruebas de control de calidad y para la aprobación comercial. La prueba de disolución en la monografía de la USP está relacionada con la BD y la BE solamente cuando va de la mano de una determinación reglamentaria sólida. Sin esta relación, se debe considerar únicamente como una prueba de control de calidad para la liberación de la partida. Las guías correspondientes de la FDA son (1) Guidance for lndustry-Dissolution Testing of Jmmediate Release So/id Oral Dosage Forms (1977) (http://www.fda.gov/; buscar por el título del documento) y (2) Guidance for Jndustry-Extended Release Oral Dosage Forms: Development, Evaluation, and Application of In Vitro/ln Vivo Correlation (1977) (http://www.fda.gov/; buscar por el título del documento).
Disolución y Biodisponibilidad In Vitro Las pruebas de disolución y liberación de fármacos son muy útiles durante el desarrollo del producto farmacéutico para identificar los atributos críticos de fabricación, como son el impacto de las propiedades del ingrediente y del proceso de fabricación sobre el desempeño del producto farmacéutico. Durante el desarrollo del producto, es necesario conseguir las condiciones óptimas de disolución con el fin de discriminar las formulaciones del producto farmacéutico y los cambios en los procesos de fabricación. Una vez que la forma farmacéutica se aprueba para su comercialización, las pruebas de disolución y liberación de fármacos son útiles para predecir los posibles cambios en el desempeño de producto debidos al aumento de escala y a los cambios posteriores a su aprobación (SUPAC). Ver las siguientes guías de la FDA: Guidance for lndustry-lmmediate Release So/id Oral Dosage Forms, Scale-Up and Postapproval Changes: Chemistry, Manufacturing, and Controls, In Vitro Dissolution Testing, and In Vivo Bioequivalence Documentation (1995) (http:www.fda.gov/; buscar por el título del documento) y Guidance for lndustry-SUPAC-MR: Modified-Release So/id Oral Dosage Forms: Scale-Up and Postapproval Changes: Chemistry, Manufacturing, and Controls; In Vitro Dissolution Testing and In Vivo Bioequivalence Documentation (1977) (http:// www.fda.gov/; buscar por el título del documento). Para algunos productos farmacéuticos orales, la disolución del fármaco in vitro se puede relacionar con el desempeño in vivo, tal como la biodisponibilidad y/o la exposición sistémica al fármaco. El capítulo de información general de la USP Evaluación In Vivo e In Vitro de Formas Farmacéuticas (1088) describe diferentes enfoques para la correlación in vitro-in vivo (IVIVC).
Disolución y Equivalencia In Vitro La prueba de disolución es una poderosa prueba fisicoquímica in vitro que mide la calidad y el desempeño del producto farmacéutico para una gran variedad de formas farmacéuticas, como las formas farmacéuticas sólidas orales, formas farmacéuticas transdérmicas, suspensiones y ciertas formas farmacéuticas semisólidas. Las pruebas de la USP para las formas farmacéuticas terminadas se pueden dividir en dos tipos: (1) pruebas de calidad del producto farmacéutico y (2) pruebas de desempeño del producto farmacéutico. Las pruebas de calidad del producto están previstas para evaluar atributos tales como valoración y uniformidad de contenido; las pruebas de desempeño están diseñadas para evaluar el desempeño del producto y en muchos casos se relacionan con la disolución. Para detalles concernientes a la realización de una prueba de disolución, ver los capítulos generales (711 ), (724), (1088) y (1092) de la USP. La prueba de disolución in vitro se desarrolló inicialmente como una herramienta de control de calidad para garantizar la calidad del producto farmacéutico y la uniformidad entre las partidas. Los procedimientos de las pruebas de disolución se describen en los capítulos generales (711) y (724) de la USP. El desarrollo del sistema de clasificación biofarmacéutica (BCS) ofrece una nueva interpretación y poder a la prueba de disolución. El sistema BCS clasifica un fármaco de acuerdo con su solubilidad y permeabilidad a través de una biomembrana como la de las células mucosas intestinales. La velocidad de disolución del fármaco a partir de la forma farmacéutica es importante para sustentar bioexenciories basadas en el BCS.
USP 39
Información General/ (1 090) Evaluación de Desempeño 1299
Comparaciones del Perfil de Disolución Las pruebas de disolución y liberación de fármacos in vitro pueden relacionarse con el desempeño del fármaco in vivo, tal como la BD. Las comparaciones de los perfiles de disolución tienen cada vez más importancia como un medio de documentar los estudios comparativos de BD, es decir, de BE. Una bioexención es el reemplazo o exención de los estudios de BE in vivo por una prueba in vitro. Un modelo de enfoque matemático independiente se usa para comparar el perfil de disolución de dos productos. (1) para comparar el perfil de disolución entre el producto T (genérico, de múltiples fuentes) y el producto de referencia R (comparador) en las consideraciones de la bioexención; (2) para comparar el perfil de disolución entre dos concentraciones de productos de un fabricante dado; y (3) para SUPAC después de la aprobación del producto. Para comparar el perfil de disolución, se debe calcular el factor de similitud f 2 usando la ecuación
donde R,y T, son el porcentaje acumulativo del fármaco disuelto en cada uno de los n puntos de tiempo seleccionados, del producto de referencia y de prueba, respectivamente. Un valor f 2 de 50 o más (50 a 100) garantiza la similitud del perfil de disolución y la igualdad o equivalencia de las dos curvas y por tanto del desempeño de los dos productos. Como mínimo se deben usar tres puntos para la comparación del perfil de similitud; no más de un punto debe exceder el 85%. Para productos que se disuelven muy rápidamente (2:85% de disolución en 15 minutos) no es necesario el perfil de comparación.
BIOEXENCIÓN El término bioexención se aplica a un proceso de aprobación reglamentaria cuando el expediente (dossier) se aprueba basándose en una evidencia de equivalencia diferente a la prueba de BE in vivo. Para formas farmacéuticas sólidas orales, la evidencia de equivalencia se determina basándose en una comparación del perfil de disolución in vitro entre el producto multifuente y el producto comparador.
Bioexención Basada en la Forma Farmacéutica El requisito de un estudio comparativo in vivo de BD o BE del producto farmacéutico puede eximirse si los productos comparados contienen los mismos ingredientes farmacéuticos activos, en la misma concentración, los mismos excipientes en concentraciones comparables y cumplen con uno de los siguientes criterios: • Soluciones acuosas que se deben administrar parenteralmente • Soluciones para uso oral que no contienen un excipiente del que se sabe o sospecha que afecte el tránsito gastrointestinal o la absorción de la sustaricia activa •Gases • Polvos para reconstitución como solución • Productos áticos u oftálmicos preparados como soluciones acuosas • Productos tópicos preparados como soluciones acuosas • Productos para inhalación o atomizadores nasales que se administran con dispositivos esencialmente similares. Deberían requerirse pruebas especiales de desempeño in vitro para documentar el desempeño comparable de los dispositivos.
Bioexención Basada en la Proporcionalidad de la Forma Farmacéutica Cuando se efectúa un estudio de BE de dosis única en ayunas en la concentración designada del producto farmacéutico (por lo general la más alta), se puede eximir del requisito de efectuar estudios de BE adicionales con las concentraciones más bajas del mismo producto, siempre y cuando la concentración más baja (1) se presente en la misma forma farmacéutica; (2) sea proporcionalmente similar en sus ingredientes activos e inactivos; (3) tenga el mismo mecanismo de liberación del fármaco (para productos de liberación prolongada); (4) cumpla con un criterio apropiado de comparación del perfil de disolución in vitro (f2 2:50); y (5) tanto las concentraciones más bajas como las más altas estén dentro del intervalo farmacocinético lineal.
Bioexención Basada en el Sistema de Clasificación Biofarmacéutica (BCS) El BCS está basado en la solubilidad acuosa y en la permeabilidad intestinal del API. Cuando las propiedades de los API se evalúan en conjunto con la disolución de la forma farmacéutica, el BCS tiene en cuenta tres factores importantes que rigen la velocidad y grado de absorción del fármaco a partir de formas farmacéuticas de liberación inmediata. De acuerdo a la solubilidad y permeabilidad de la forma farmacéutica, el fármaco se ubica en una de las cuatro clases siguientes: Clase 1 : alta solubilidad, alta permeabilidad Clase 2: baja solubilidad, alta permeabilidad
1 300 (1090) Evaluación de Desempeño / Información General
USP 39
Clase 3: alta solubilidad, baja permeabilidad Clase 4: baja solubilidad, baja permeabilidad El uso del BCS se ha convertido en un medio para documentar la BE sin efectuar un estudio in vivo; ver la guía de la FDA titulada Guidance for lndustry: Waiver of In Vivo Bioavailability and Bioequivalence Studies for lmmediate-Release So/id Oral Dosage Forms Based on a Biopharmaceutics Classification System (2000) (http://www.fda.gov/; buscar por el título del documento). Los estudios de disolución in vitro se llevan a cabo por lo general por el método de canastilla a 100 rpm o por el método de paleta a 50 rpm (ver la guía de la FDA citada anteriormente) o 75 rpm [Guía de la OMS, Annex 7 Multisource (Generic) Pharmaceutical Products: Guidelines on Registration Requirements to Establish lnterchangeability(2006)] (http://www.who.int/en/; buscar por el título del documento) en 900 mL de medio a pH 1,2; 4,5 y 6,8. Con respecto a la velocidad de disolución, las formas farmacéuticas se clasifican como (1) de muy rápida disolución, si 85% o más de la forma farmacéutica se disuelve en 15 minutos o menos; (2) de rápida disolución, si 85% o más de la forma farmacéutica se disuelve en 30 minutos; o (3) de lenta disolución, si 85% de la forma farmacéutica tarda más de 30 minutos en disolverse. Para la bioexención, las pruebas de disolución se deben efectuar tanto para el producto genérico como para el de referencia bajo las mismas condiciones. Para que el producto genérico califique para la bioexención, el producto de referencia debe pertenecer a la misma clase de BCS y cumplir con los criterios de comparación del perfil de la disolución. Basándose en la clasificación del BCS y en la comparación del perfil de disolución, las autoridades reglamentarias pueden considerar la bioexención siempre y cuando se cumplan los criterios de similitud del perfil de disolución que se proporcionan en las siguientes secciones. MEDICAMENTOS DE CLASE 1 (PERMITIDOS EN LOS ENFOQUES DE LA OMS Y LA
FDA)
Las formas farmacéuticas de fármacos que son altamente solubles, altamente permeables y de disolución rápida califican para las bioexenciones bajo las siguientes condiciones: 1 . 85% o más de la forma farmacéutica se disuelve en 30 minutos o menos y el perfil de disolución del producto genérico es similar al del producto de referencia en solución amortiguadora de pH 1,2; 4,5 y 6,8 usando el método de la canastilla a 100 rpm o el método de la paleta a 50 rpm (FDA) o 75 rpm (OMS), y cumple con el criterio de similitud del perfil de disolución, f 2 2'.50. 2. Si tanto la forma farmacéutica de referencia como la genérica son de muy rápida disolución (es decir, 85% de disolución en 15 minutos o menos en los tres medios bajo las condiciones de prueba mencionadas anteriormente), entonces no es necesaria la determinación del perfil. MEDICAMENTOS DE CLASE 2 (PERMITIDOS EN EL ENFOQUE DE LA OMS) Las formas farmacéuticas de fármacos con alta solubilidad solo a pH 6,8 y alta permeabilidad (baja solubilidad por definición, BCS Clase 2) califican para bioexenciones, siempre y cuando: 1. La forma farmacéutica se disuelva rápidamente (85% o más en 30 minutos o menos) en solución amortiguadora de pH 6,8. 2. El producto genérico exhiba perfiles de disolución similares a los del producto comparador en soluciones amortiguadoras de pH 1,2; 4,5 y 6,8. MEDICAMENTOS DE CLASE 3 (PERMITIDOS EN EL ENFOQUE DE LA OMS) Las formas farmacéuticas de fármacos que son altamente solubles y tienen baja permeabilidad califican para las bioexenciones bajo las siguientes condiciones: 1. Tanto la forma farmacéutica de referencia como la genérica son de muy rápida disolución (85% de disolución en 15 minutos o menos en los tres medios bajo las condiciones de prueba mencionadas anteriormente) y no contienen ningún excipiente y/o sustancias inactivas de las que se sabe que alteran la motilidad gastrointestinal y/o la permeabilidad o influencian la absorción del fármaco. 2. Los fabricantes deben demostrar que la cantidad de excipientes usados es congruente con el uso previsto. Cuando se incluyan en la forma farmacéutica excipientes nuevos y/o cantidades atípicamente grandes de excipientes usados comúnmente, se requiere información adicional que documente la ausencia de cualquier impacto significativo sobre la biodisponibilidad del fármaco. DISOLUCIÓN COMO PRUEBA DE CONTROL DE CALIDAD Y PRUEBA DE BIOEQUIVALENCIA Existe una clara diferencia entre la disolución como una prueba de control de calidad y la disolución como una prueba de BE in vitro. Para las formas farmacéuticas de liberación inmediata, la prueba de control de calidad involucra una prueba de disolución de un solo punto en un solo medio (por lo general, una prueba farmacopeica). Por otra parte, la prueba de equivalencia in vitro (prueba de BE) involucra la comparación del perfil de disolución a pH 1,2; 4,5 y 6,8 entre el producto T y el producto
R.
USP 39
Información General/ (1091) Etiquetado de Ingredientes Inactivos 1301
APÉNDICE Comparación de las Definiciones de la FDA y la OMS FDA
OMS
Equivalentes Farmacéuticos
Los medicamentos se consideran equivalentes farmacéuticos si contienen los mismos ingredientes activos, se presentan en la misma forma farmacéutica, tienen la misma vía de administración y son idénticos en contenido o concentración. Los medicamentos farmacéuticamente equivalentes están formulados para contener la misma cantidad del ingrediente activo en la misma forma farmacéutica y para cumplir con las mismas normas farmacopeicas u otras normas pertinentes (contenido, calidad, pureza e identidad), pero pueden diferir en características como forma, configuración de las ranuras, mecanismos de liberación, envasado, excipientes, fecha de caducidad y, dentro de ciertos límites, etiquetado.
Los productos son equivalentes farmacéuticos si contienen la misma cantidad molar del mismo o los mismos ingredientes farmacéuticos activos (API) en la misma forma farmacéutica; si cumplen con estándares comparables y si están destinados a ser administrados por la misma vía. La equivalencia farmacéutica no necesariamente implica equivalencia terapéutica, porque las diferencias en los excipientes y/o en el proceso de fabricación y otras variables pueden llevar a diferencias en el desempeño del produeto.
Alternativas Farmacéuticas
Los medicamentos se consideran alternativas farmacéuticas si contienen la misma entidad terapéutica pero presentan sales, ésteres o complejos diferentes de esta entidad o son formas farmacéuticas o concentraciones diferentes.
Los productos son alternativas farmacéuticas si contienen la misma cantidad molar de la misma entidad farmacéutica activa pero difieren en la forma de dosificación (p.ej., tabletas en vez de cápsulas) y/o forma química (p.ej., diferentes sales o ésteres). Las alternativas farmacéuticas liberan la misma entidad o parte activa por la misma vía de administración pero no son farmacéuticamente equivalentes. Pueden ser o no bioequivalentes o equivalentes terapéuticos del producto comparador.
Equivalentes Terapéuticos
Los medicamentos se consideran equivalentes terapéuticos solo si son equivalentes farmacéuticos y si se puede esperar que tengan el mismo efecto clínico y el mismo perfil de seguridad cuando se administran a pacientes bajo las condiciones especificadas en el etiquetado.
Dos productos farmacéuticos se consideran terapéuticamente equivalentes si son farmacéuticamente equivalentes o alternativas farmacéuticas y después de la administración en la misma dosis molar, sus efectos, con respecto a eficacia y seguridad, son esencialmente iguales cuando se administran a los pacientes por la misma vía en las condiciones especificadas en el etiquetado.
Biodisponibilidad (BD)
Este término se refiere a la velocidad y grado al cual el ingrediente o parte activa es absorbido a partir de un medicamento y está disponible en el sitio de acción.
La velocidad y grado al cual el ingrediente farmacéutico activo o la parte activa se absorbe a partir de una forma farmacéutica y se encuentra disponible [en el sitio de acción] en la circulación general.
Medicamentos Bioequivalentes (BE)
Este término describe productos farmacéuticos equivalentes o alternativas farmacéuticas que demuestran una biodisponibilidad comparable cuando se estudian bajo condiciones experimentales similares.
Dos productos farmacéuticos son bioequivalentes si son farmacéuticamente equivalentes o son alternativas farmacéuticas y su biodisponiblidad, en términos de concentración máxima (Cmáx), tiempo para alcanzar la concentración máxima (Tmáx) y exposición total (ABC) después de la administración de la misma dosis molar bajo las mismas condiciones, es similar a tal grado que se puede esperar que sus efectos sean esencialmente iguales.
RLD (Producto de Referencia) o Producto Comparador
Un RLD [21 CFR 314.94(a)(3)] es un medicamento listado, identificado por la FDA como el medicamento en el cual el solicitante confía al buscar la aprobación de su ANDA (Abbreviated New Drug Application).
El producto comparador es un producto farmacéutico destinado a ser intercambiable con el producto de múltiples fuentes en la práctica clínica. El producto comparador normalmente será el producto innovador para el cual se han establecido la eficacia, seguridad y calidad. La autoridad reglamentaria generalmente hace la selección del producto comparador a nivel nacional.
Producto Genérico
Un producto genérico es aquel que es terapéuticamente equivalente al RLD y está destinado a ser intercambiable con el producto innovador.
Término
Productos Farmacéuticos de Múltiples Fuentes o Mu/tifuentes
Productos farmacéuticos equivalentes o productos farmacéuticamente alternativos que pueden ser o no terapéuticamente equivalentes. Los productos farmacéuticos de múltiples fuentes que son terapéuticamente equivalentes son intercambiables.
Producto Farmacéutico lntercambiable
Un producto farmacéutico intercambiable es aquel que es terapéuticamente equivalente a un producto comparador y puede intercambiarse con éste en la práctica clínica.
(1091) ETIQUETADO DE INGREDIENTES INACTIVOS Este capítulo informativo proporciona guías para el etiquetado de ingredientes inactivos presentes en formas farmacéuticas.
USP 39
1 302 (1091) Etiquetado de Ingredientes Inactivos / Información General
En los últimos años, varias asociaciones comerciales que representan a fabricantes de productos farmacéuticos han adoptado guías voluntarias para dar a conocer los ingredientes inactivos y cómo declararlos en la etiqueta. Esta práctica resulta útil para los individuos sensibles a sustancias particulares y que desean confirmar la presencia o la ausencia de esas sustancias en productos farmacéuticos. Debido a la actividad de estas asociaciones, en la actualidad se considera una buena práctica farmacéutica a la declaración de los ingredientes terapéuticamente inactivos en las etiquetas. Aunque los fabricantes representados por estas asociaciones producen la mayoría de los productos vendidos en los Estados Unidos, no todos los fabricantes o compañías que se dedican al reenvasado o al etiquetado, dentro o fuera de los Estados Unidos, son miembros de estas asociaciones. Además, existen algunas diferencias entre las guías de las diferentes asociaciones. Las guías presentadas aquí están diseñadas para ayudar a promover la uniformidad en el etiquetado. En conformidad con las buenas prácticas farmacéuticas [NOTA-para los requisitos referentes a preparaciones parenterales y tópicas, ver Advertencias Generales] todas las formas farmacéuticas deben declarar en la etiqueta la identidad de toda sustancia agregada presente (ingredientes terapéuticamente inactivos), entre las cuales se incluyen los colorantes, pero no saborizantes y fragancias que pueden listarse bajo el término general "saborizantes" o "fragancias". Dicha lista debe estar en orden alfabético y debe ser distinta a la declaración de identificación del ingrediente activo. El nombre de un ingrediente activo debe tomarse de la edición vigente de una de las siguientes obras de referencia (en el siguiente orden de precedencia): (1) la Farmacopea de los Estados Unidos o el Formulario Nacional; (2) USAN y el Diccionario USP de Nombres de Fármacos; (3) el CTFA Diccionario de Ingredientes Cosméticos; (4) Código de Químicos y Alimentos. Si un ingrediente no figura en ninguna de las obras de referencia mencionadas se le debe identificar por su nombre común o usual (el nombre generalmente reconocido por los consumidores o profesionales del área de la salud) o, si ningún nombre común o usual estuviera disponible, por su nombre químico u otro nombre técnico. Un ingrediente que puede estar presente en un producto, aunque no siempre, debe ser calificado por palabras como por ejemplo "o" o "también puede contener". El nombre de un ingrediente cuya identidad sea un secreto comercial puede omitirse de la lista si ésta declara: "y otros ingredientes". A los efectos de esta norma, se considera que un ingrediente es un secreto comercial sólo si la presencia del ingrediente confiere a su fabricante una ventaja competitiva y significativa, y si su identidad no puede ser determinada mediante el empleo de tecnología analítica moderna. No es necesario enumerar un ingrediente presente en trazas en forma incidental, si no ejerce un efecto funcional o técnico sobre el producto, a menos que se haya demostrado que causa reacciones de sensibilidad o respuestas alérgicas. Los ingredientes inactivos deben enumerarse en la etiqueta del envase de un producto destinado para la venta sin receta, excepto si su envase es demasiado pequeño, en cuyo caso tal información puede aparecer en otra etiqueta o dentro del empaque.
(1092) PROCEDIMIENTO DE DISOLUCIÓN: VALIDACIÓN
DESARROLLO Y
INTRODUCCIÓN
Propósito El capítulo Procedimiento de Disolución: Desarrollo y Validación (1092) provee un enfoque integral que abarca puntos a tener en cuenta para el desarrollo y la validación de los procedimientos de disolución y los procedimientos analíticos que lo acompañan. El capítulo trata el uso de la automatización a través de la prueba y provee guías y criterios de validación. Asimismo, el capítulo se enfoca en el tratamiento de los datos generados y en la interpretación de los criterios de aceptación para formas farmacéuticas orales sólidas de liberación inmediata y modificada.
Alcance El capítulo (1092) trata el desarrollo y la validación de los procedimientos de disolución, con un enfoque en las formas farmacéuticas orales sólidas. Sin embargo, muchos de los conceptos presentados pueden aplicarse a otras formas farmacéuticas y vías de administración. Se proveen recomendaciones generales entendiendo que deben justificarse todas las modificaciones aplicadas al aparato y a los procedimientos provistos en los capítulos generales de la USP. La organización del capítulo (1092) sigue la secuencia de las acciones que a menudo se realizan en el desarrollo y la validación de una prueba de disolución. Las secciones se presentan en la secuencia siguiente. 1. EVALUACIÓN PREELIMINAR (PARA LAS ETAPAS TEMPRANAS DEL DESARROLLO DEL PRODUCTO/DESARROLLO DEL MÉTODO DE DISOLUCIÓN) 1.1 Compatibilidad del Filtro 1.2 Determinación de la Solubilidad y la Estabilidad del Fármaco en Diversos Medios
USP 39
Información General/ (1092) Procedimiento de Disolución 1 303
1.3 Selección de Medios y Volúmenes. 1 .4 Selección de Aparatos 2. DESARROLLO DEL MÉTODO 2.1 Desgasificación 2.2 Dispositivos de Sumersión 2.3 Agitación 2.4 Diseño del Estudio 2.4.1 Tiempos de Muestreo 2.4.2 Observaciones 2.4.3 Muestreo 2.4.4 Limpieza 2.5 Procesamiento de Datos 2.6 Evaluación del Procedimiento de Disolución 3. COMPLEMENTACIÓN ANALÍTICA 3.1 Procesamiento de Muestras 3.2 Filtros 3.3 Centrifugación 3.4 Procedimiento Analítico 3.5 Análisis Espectrofotométrico 3.6 HPLC 4. AUTOMATIZACIÓN 4.1 Preparación del Medio 4.2 Introducción de la Muestra y Tiempo 4.3 Muestreo y Filtración 4.4 Limpieza 4.5 Software Operativo y Cómputo de Resultados 4.6 Desviaciones Comunes de los Procedimientos Farmacopeicos que Podrían Requerir Validación 5. VALIDACIÓN 5.1 Especificidad/Interferencia del Placebo 5.2 Linealidad e Intervalo 5.3 Exactitud/Recuperación 5.4 Precisión 5.4.1 Repetibilidad del Análisis 5.4.2 Precisión Intermedia/Tolerancia o Fortaleza 5.4.3 Reproducibilidad 5.5 Robustez 5.6 Estabilidad de la Solución Muestra y la Solución Estándar 5.7 Consideraciones para la Automatización 6. CRITERIOS DE ACEPTACIÓN 6.1 Formas Farmacéuticas de Liberación Inmediata 6.2 Formas Farmacéuticas de Liberación Retardada 6.3 Formas Farmacéuticas de Liberación Prolongada 6.4 Pruebas de Disolución Múltiples 6.5 Interpretación de Jos Resultados de la Disolución 6.5.1 Formas Farmacéuticas de Liberación Inmediata 6.5.2 Formas Farmacéuticas de Liberación Retardada 6.5.3 Formas Farmacéuticas de Liberación Prolongada 7. REFERENCIAS
1. EVALUACIÓN PRELIMINAR (PARA LAS ETAPAS TEMPRANAS DEL DESARROLLO DEL PRODUCTO/DESARROLLO DEL MÉTODO DE DISOLUCIÓN) Antes de poder comenzar con el desarrollo del método, es importante caracterizar la molécula de modo que el filtro, el medio, el volumen del medio y el aparato puedan seleccionarse de manera apropiada para evaluar el desempeño de la forma farmacéutica.
1.1 Compatibilidad del Filtro La filtración es una etapa clave en Ja preparación de muestras para obtener resultados de prueba exactos. El propósito de la filtración es eliminar fármacos y excipientes no disueltos de la solución retirada. Si no se eliminan de la solución muestra, las
1304 (1092) Procedimiento de Disolución / Información General
USP 39
partículas del fármaco continuarán disolviéndose y pueden sesgar los resultados. Por lo tanto, generalmente es necesario filtrar las muestras de disolución y se debe hacer inmediatamente si el filtro no está colocado en la cánula. La filtración también elimina excipientes insolubles que de otro modo podrían interferir con la conclusión analítica. La selección del material apropiado del filtro es importante y se debe realizar, y justificar a través de experimentos, en las etapas tempranas del desarrollo del procedimiento de disolución. Las características importantes a tener en cuenta al seleccionar el material del filtro son el tipo, el tamaño del filtro y el tamaño de poro. Puede ser necesario reconsiderar en tiempo posterior la selección del filtro basada en la evaluación durante las etapas tempranas del desarrollo del procedimiento de disolución. Además, se debe tener en cuenta la recalificación después de aplicar un cambio en la composición del medicamento o cambios en la calidad de los ingredientes (p.ej., tamaño de partícula de la celulosa microcristalina). Los ejemplos de filtros usados en el análisis de disolución pueden incluir filtros de cánula, discos de filtro o material sinterizado, puntas de filtro o filtros para jeringas. El material del filtro tiene que ser compatible con los medios y el fármaco. Los tamaños de poro comunes van de 0,20 a 70 µm; sin embargo, se pueden usar filtros con otros tamaños de poro según se requiera. Si el tamaño de partícula del fármaco es muy pequeño (p.ej., micronizado o nanopartículas), puede ser complicado encontrar un filtro con un tamaño de poro que excluya estas partículas pequeñas. Es posible que ocurra la adsorción de fármacos en el filtro, por lo que ésta debe ser evaluada. Los materiales del filtro interactuarán con los medios de disolución para influir en la recuperación de los solutos individuales y deben tenerse en cuenta para cada caso. Los diferentes materiales de filtro presentan distintas propiedades de unión al fármaco. El porcentaje de pérdida de fármaco a partir del filtrado debido a la unión puede depender de la concentración del fármaco. Por lo tanto, se debe evaluar la interferencia de la adsorción en soluciones muestra a diferentes concentraciones cubriendo los extremos del intervalo de concentración esperado. Cuando la adsorción de fármaco es saturable, desechar un volumen inicial de filtrado puede permitir la recolección de una solución subsiguiente que se acerque a la concentración original de la solución. Por lo regular, se pueden encontrar materiales alternativos de filtros que minimizan la interferencia de la adsorción. Puede ser necesario humedecer previamente el filtro con el medio. Además, es importante que los lixiviables del filtro no interfieran con el procedimiento analítico. Esto puede evaluarse analizando el medio de disolución filtrado y comparándolo con el medio sin filtrar. El tamaño del filtro debe basarse en el volumen que se va a retirar y la cantidad de partículas que se van a separar. El uso de las dimensiones de filtro correctas mejorará el rendimiento y la recuperación, y reducirá las obstrucciones. El uso de un filtro grande para una filtración de pequeño volumen puede generar la pérdida de muestra a través del volumen muerto, mientras que la filtración a través de filtros de tamaños pequeños requiere mayores presiones y tiempos más largos, y los filtros pueden obstruirse rápidamente. Los filtros usados para el Aparato 4 de la USP requieren especial atención debido a que están integrados en el proceso de flujo. Las partículas no disueltas pueden depositarse en los filtros, creando resistencia al flujo. En el caso de los sistemas automatizados, la selección del filtro con respecto al material y al tamaño de poro puede realizarse de manera similar a la filtración manual. La velocidad de flujo a través del filtro y las obstrucciones pueden ser críticas en el caso de filtros usados en sistemas automatizados. La verificación experimental de que un filtro es apropiado puede lograrse comparando las respuestas para soluciones estándar y soluciones muestra filtradas y sin filtrar. Esto se lleva a cabo primero preparando una solución estándar adecuada y una solución muestra. Por ejemplo, preparar una muestra de disolución típica en un vaso de precipitados y mezclar vigorosamente con un mezclador magnético hasta disolver completamente la carga de fármaco. Para soluciones estándar, comparar los resultados de las soluciones filtradas (después de desechar el volumen apropiado) con los resultados de soluciones sin filtrar. Para soluciones muestra, comparar los resultados de las soluciones filtradas (después de desechar el volumen apropiado) con los resultados de soluciones sin filtrar y centrifugadas.
1.2 Determinación de la Solubilidad y la Estabilidad del Fármaco en Diversos Medios Las características físicas y químicas del fármaco deben determinarse como parte del proceso de selección del medio de disolución apropiado. Al decidir la composición del medio para el análisis de disolución, es importante evaluar la influencia de las soluciones amortiguadoras, el pH y, de ser necesario, los diferentes surfactantes respecto a la solubilidad y la estabilidad del fármaco. La solubilidad del fármaco por lo regular se evalúa determinando la concentración de saturación del fármaco en diferentes medios a 37º usando el método de solubilidad por agitación del matraz (solubilidad en equilibrio). Para nivelar los efectos iónicos potenciales entre el fármaco y las soluciones amortiguadoras usadas en los medios, se usan mezclas de ácido clorhídrico e hidróxido de sodio para realizar las investigaciones de solubilidad; esto es adicional a las soluciones amortiguadoras típicas. En algunos casos, puede ser necesario evaluar la solubilidad del fármaco a temperaturas distintas a 37° (es decir, 25º). El pH del sobrenadante transparente debe verificarse para determinar los cambios de pH durante la prueba de solubilidad. También se pueden usar enfoques alternativos para la determinación de la solubilidad. Los medios típicos para disolución pueden incluir los siguientes elementos (no se mencionan en orden de preferencia): ácido clorhídrico diluido, soluciones amortiguadoras (fosfato o acetato) en el rango de pH fisiológico de 1,2-7,5, fluido gástrico o intestinal simulados (con o sin enzimas) y agua. Para algunos fármacos, la incompatibilidad del fármaco con algunas soluciones amortiguadoras o sales puede influir en la selección de la solución amortiguadora. La molaridad de las soluciones amortiguadoras y de los ácidos usados puede influir sobre el efecto de solubilización y este factor puede ser evaluado. Las soluciones acuosas (soluciones ácidas o amortiguadoras) pueden contener un porcentaje de un surfactante [p.ej. dodecilsulfato de sodio, polisorbato u óxido de lauril dimetilamina] para aumentar la solubilidad del fármaco. Los surfactantes seleccionados para las investigaciones de solubilidad deben abarcar todos los tipos de surfactantes comunes, es decir, aniónicos, no
USP 39
Información General/ (1092) Procedimiento de Disolución 1305
aniónicos y catiónicos. Cuando se ha identificado un surfactante adecuado, se deben investigar diferentes concentraciones de dicho surfactante para identificar la concentración más baja requerida para lograr las condiciones de exceso de medio. Por lo regular, la concentración de surfactante está por encima de su concentración micelar crítica (CMC). La Tabla 1 presenta una lista de algunos de los surfactantes usados en los medios de disolución. Los valores de CMC aproximados se proveen con referencias, cuando están disponibles. Las listas no son exhaustivas y no pretenden excluir los surfactantes no listados. Otras sustancias, tales como hidroxipropil fJ -ciclodextrina, se han usado como aditivos de medios de disolución para mejorar la disolución de compuestos con solubilidad baja. La Administración de Alimentos y Medicamentos de los EE.UU. (FDA, por sus siglas en inglés) mantiene una base de datos de métodos de disolución, la cual incluye información sobre los medios de disolución que han sido usados (1 ). Por lo regular, la cantidad de surfactante agregado es suficiente para lograr las condiciones de exceso de medio en el volumen deseado del medio de disolución. Es importante controlar el grado y la pureza de los surfactantes debido a que usar grados diferentes podría afectar la solubilidad del fármaco. Por ejemplo, el dodecilsulfato de sodio está disponible en un grado técnico y en un grado de alta pureza. Obtener polisorbato 80 de distintas fuentes puede afectar su aptitud al realizar el análisis por cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC, por sus siglas en inglés). Pueden presentarse efectos de contra-iones o pH sobre la solubilidad o la estabilidad de la solución de las soluciones con surfactantes. Por ejemplo, se forma un precipitado cuando la sal potásica para la solución amortiguadora de fosfato se usa en una concentración de 0,5 M en combinación con dodecilsulfato de sodio. Esto puede evitarse usando la sal de fosfato de sodio al preparar medios con dodecilsulfato de sodio. Tabla 1. Surfactantes de Uso Común con Concentraciones Mlcelares Críticas CMC Surfactante
Catiónico
Referencia
o, 18o/o-0,23%
(2-4)
Taurocolato de sodio
0,2%
(3)
Colato de sodio
0,16%
(3)
Desoxicolato de sodio
0,12%
(3)
Bromuro de Cetiltrimetilamonio (CTAB, bromuro de hexadeciltrimetilamonio)
0,033o/o-0,036% (0,92-1,0 mM)
(5,6)
Cloruro de bencetonio (Hiamina 1622)
0,18% (4 mM)
(2)
Polisorbato 20 (Monolaurato de sorbitán Polioxietileno (20), Tween 20)
0,07%-0,09%
(3,7)
Polisorbato 80 (Monooleato de sorbitán polioxietileno (20), Tween 80)
Dodecilsulfato de sodio, lauril sulfato de sodio
Aniónico
(% peso/volumen)
0,02%-0,08%
(3,7)
Polioxil-8 glicéridos de caprilocaproilo (Labrasol)
0,01%
(4)
Aceite de ricino polioxilado 35 (Cremophor EL)
0,02%
(8)
Éter laurílico de polioxietileno 23 (Brij 35)
0,013%
(9)
0,01 o/o-0,03%
(3, 10)
0,023%
(11)
No iónico
Octoxinol (Triton X-100)
Zwitteriónicos
N-óxido de laurildimetilamina (LDAO)
Por lo regular, el medio de disolución está amortiguado; sin embargo, el uso de agua purificada como medio de disolución es adecuado para productos con un comportamiento de disolución independiente del pH del medio. Existen diversas razones por las podría no preferirse el agua purificada. La calidad del agua puede variar dependiendo de su fuente y el pH del agua no está tan estrictamente controlado como el pH de las soluciones amortiguadoras. Además, el pH puede variar día a día y también puede cambiar durante una corrida, dependiendo del fármaco y de los excipientes. No se recomienda emplear una mezcla de un disolvente orgánico y uno acuoso como medio de disolución; sin embargo, puede ser aceptable si existe una justificación apropiada para este tipo de medio. Cuando se necesiten, deben llevarse a cabo investigaciones de la estabilidad del fármaco en el medio de disolución seleccionado con los excipientes presentes a 37°. Esta temperatura elevada tiene el potencial de reducir la estabilidad de la solución (degradación). La estabilidad debe permitir un tiempo suficiente para completar o repetir el procedimiento analítico. La estabilidad física puede ser un motivo de preocupación cuando ocurre una precipitación debido a una reducción de la solubilidad a temperatura ambiente o refrigerada.
1.3 Selección de Medios y Volúmenes Cuando se desarrolla un procedimiento de disolución, una meta es tener condiciones de exceso de medio, definido como el volumen de medio igual a por lo menos tres veces el requerido para formar una solución saturada del fármaco. Cuando la condición de exceso de medio está presente, existirán mayores probabilidades de que los resultados de disolución reflejen las propiedades de la forma farmacéutica. Un medio que no cumple con la condición de exceso de medio puede ser aceptable si se justifica adecuadamente. La composición y el volumen del medio de disolución se guían por las investigaciones de solubilidad. Por ejemplo, es necesario justificar la selección y la concentración de un surfactante a partir de los datos de solubilidad y de los perfiles de disolución.
1 306 (1 092) Procedimiento de Disolución / Información General
USP 39
El uso de enzimas en el medio de disolución está permitido según lo establece el capítulo Disolución (711) cuando la disolución no cumpla con los requisitos debido al entrecruzamiento en cápsulas de gelatina o productos con cubiertas de gelatina. El capítulo Cápsulas-Pruebas de Disolución y Atributos de Calidad Relacionados (1094) trata el fenómeno del entrecruzamiento y el desarrollo del método usando enzimas. La validación debe realizarse con el método que emplea enzimas de acuerdo con la sección 5. Validación. Otra opción es usar medios cuya composición es más cercana a la de los fluidos estomacales y del tracto intestinal. Estos medios pueden contener ingredientes surfactantes fisiológicos, tales como taurocolatos. Los medios también pueden contener emulsificantes (lecitina) y componentes tales como solución salina que incrementan la osmolalidad. Además, se puede manipular la concentración iónica o molaridad de las soluciones amortiguadoras. Los medios están diseñados para representar el estado alimentado y de ayuno del estómago y del intestino delgado. Estos medios pueden ser muy útiles al crear un modelo del comportamiento de la disolución in vivo de las formas farmacéuticas de liberación inmediata, en particular aquéllas que contienen fármacos lipofílicos, y pueden ayudar a entender la cinética de disolución del producto relacionada con la compensación fisiológica de los fluidos digestivos. Se han publicado resultados para crear un modelo exitoso de la cinética de disolución, principalmente para productos de liberación inmediata. En el caso de las formas farmacéuticas de liberación prolongada con un efecto reducido del fármaco sobre el comportamiento de la disolución, el uso de dichos medios debe evaluarse de manera diferente. Las pruebas de desempeño in vitro no necesariamente requieren medios que generen modelos de los estados de ayuno y postprandial (12, 73). Una etapa ácida es parte del análisis de productos de liberación retardada mediante el Método A o el Método B del capítulo (711 ). En el caso de fármacos con una solubilidad en ácido menor al 10% de la cantidad declarada en la etiqueta o de fármacos que se degradan en ácido, se compromete la utilidad de la etapa ácida en la detección de fallas en el recubrimiento, lo cual requiere ser tratado para cada caso particular. Las soluciones posibles incluyen agregar surfactante a la etapa ácida o ajustar las especificaciones. Durante la selección del medio de disolución, se debe tener cuidado de asegurar que el fármaco es adecuadamente estable durante todo el análisis. En algunos casos, se pueden usar antioxidantes tales como ácido ascórbico en el medio de disolución para estabilizar al fármaco. Hay ocasiones en las que dichas acciones no son suficientes. Para compuestos que se degradan con rapidez para formar un producto de degradación estable, monitorear el producto de degradación sólo o en combinación con un fármaco puede ser más adecuado que analizar sólo el fármaco. Las técnicas espectroscópicas in situ tienden a verse menos afectadas por la degradación en comparación con los análisis por HPLC (incluyendo UHPLC y otros enfoques de cromatografía de líquidos). Para el Aparato 1 (canastilla) y el Aparato 2 (paleta) farmacopeicos, el volumen del medio de disolución puede variar de 500 a 1000 ml. Por lo regular, se puede determinar el volumen requerido para la prueba de disolución para mantener las condiciones de exceso de medio. En algunos casos, se puede aumentar el volumen entre 2 y 4 L, usando recipientes más grandes y dependiendo de la concentración y de la condición de exceso de medio del fármaco; el uso de este enfoque debe justificarse. En la práctica, el volumen del medio de disolución por lo regular se mantiene dentro del intervalo farmacopeico provisto anteriormente. Como alternativa, puede ser preferible cambiar a otro aparato farmacopeico, tal como un cilindro oscilante (Aparato 3), soporte oscilante (Aparato 7) o celda de flujo (Aparato 4). Algunas aplicaciones pueden requerir volúmenes bajos de medios de disolución (p.ej., 1 00-200 mL) cuando se prefiere el uso de una paleta o canastilla. En estos casos, se puede usar un aparato alternativo no farmacopeico (p.ej., aparato de pequeño volumen).
1.4 Selección de Aparatos La elección del aparato se basa en el conocimiento que se tenga sobre el diseño de la formulación y los aspectos prácticos del desempeño de la forma farmacéutica en el sistema de la prueba in vitro. En general, se debe seleccionar un aparato farmacopeico. El Aparato 1 y el Aparato 2 son los aparatos que se utilizan con mayor frecuencia para las formas farmacéuticas orales sólidas. Si el Aparato 1 o el aparato 2 no fuesen apropiados, se puede utilizar otro aparato oficial. El Aparato 3 (cilindro oscilante) ha demostrado ser especialmente útil para tabletas masticables, cápsulas de gelatina blanda, formas farmacéuticas de liberación retardada y productos que no se desintegran, tales como perlas recubiertas. El Aparato 4 (celda de flujo) puede ofrecer ventajas para las formas farmacéuticas de liberación modificada y las formas farmacéuticas de liberación inmediata que contienen ingredientes activos con solubilidad limitada. Además, el Aparato 4 puede resultar útil para múltiples tipos de formas farmacéuticas tales como cápsulas de gelatina blanda, productos en forma de perlas, supositorios o formas farmacéuticas de depósito, así como formas farmacéuticas de liberación prolongada tipo suspensión. El Aparato 5 (paleta sobre disco) y el Aparato 6 (cilindro rotatorio) son útiles para evaluar y analizar las formas farmacéuticas transdérmicas. El Aparato 7 (soporte oscilante) se puede aplicar a formas farmacéuticas orales de liberación modificada que no se desintegran, stents e implantes, y a formas farmacéuticas transdérmicas. Para formas farmacéuticas semisólidas, el aparato generalmente usado incluye la celda de difusión vertical, la celda de inmersión y el aparato de celda de flujo con el inserto para formas farmacéuticas tópicas (ver el capítulo Medicamentos Semisólidos-Pruebas de Desempeño (1724)). Se pueden realizar cambios en los aparatos farmacopeicos; por ejemplo, se puede usar una canastilla con un tamaño de malla diferente a la típica canastilla de malla 40 (p.ej., de malla 1O; 20 u 80) cuando se documenta eficientemente la necesidad del cambio y se cuenta con datos de apoyo. Se debe tener cuidado de emplear canastillas que sean uniformes y cumplan con los requisitos de tamaño especificados en el capítulo (711 ).
USP 39
Información General/ (1092) Procedimiento de Disolución 1 307
Un aparato no farmacopeico puede tener alguna utilidad si cuenta con la debida justificación, calificación y documentación que demuestra su superioridad sobre el equipo estándar. Por ejemplo, un aparato de pequeño volumen con minipaletas y canastillas puede considerarse para productos de baja dosificación. Un frasco rotatorio o tubos para diálisis pueden ser útiles para microesferas e implantes, vasos con pico y celdas de flujo modificadas para formas farmacéuticas especiales, incluidos los polvos y los stents.
2. DESARROLLO DEL MÉTODO Una prueba diseñada adecuadamente debe arrojar datos que no sean demasiado variables y deben estar exentos de problemas significativos de estabilidad. La gran variabilidad de los resultados puede dificultar la identificación de tendencias o efectos referentes a los cambios de formulación. El tamaño de la muestra puede afectar la variabilidad observada. Los resultados de disolución se definen en una guía como demasiado variable si la desviación estándar relativa (RSD, por sus siglas en inglés) es más de 20% a los tiempos de muestreo de 1 O minutos o menos y más de 10% a los tiempos de muestreo posteriores para un tamaño de muestra de 12 (7 4). Sin embargo, durante el desarrollo del método, se pueden usar muestras más pequeñas, por lo que se deberán hacer juicios apropiados. No obstante, la mayoría de los resultados de disolución presentan una variabilidad menor. En el desarrollo de un procedimiento de disolución, se debe investigar la fuente de variabilidad y se debe intentar reducirla siempre que sea posible. Las dos causas más probables de variabilidad se vinculan con la formulación en sí (p.ej, fármacos, excipientes o proceso de fabricación) o con artefactos asociados al procedimiento de prueba (p.ej., formación de conos, tabletas que se adhieren a la pared del vaso o a la malla de la canastilla). Con frecuencia, la observación visual ayuda a comprender la fuente de variabilidad y si la misma prueba de disolución contribuye a dicha variabilidad. Cuando el contenido de la forma farmacéutica no se dispersa fácilmente por todo el vaso de manera uniforme, pueden originarse resultados aberrantes. Dependiendo de cada caso, los problemas usualmente se resuelven cambiando los siguientes factores: el tipo de aparato, la velocidad de agitación, el nivel de desgasificación; el tipo de dispositivo de sumersión; o la composición del medio. Muchas causas de variabilidad pueden encontrarse en la formulación y en el proceso de fabricación. Existen ejemplos que pueden ser fuentes de variabilidad e interferencias, tales como falta de uniformidad de contenido, inconsistencias en el proceso, interacciones o interferencias con el excipiente, el recubrimiento, el envejecimiento de la cubierta de la cápsula y el endurecimiento o ablandamiento de la forma farmacéutica en función de su estabilidad.
2.1 Desgasificación Se debe determinar la importancia de la desgasificación del medio de disolución debido a que las burbujas de aire pueden actuar como una barrera para el proceso de disolución si están presentes en la unidad de dosificación o en la malla de la canastilla, y pueden afectar de manera adversa la confiabilidad de los resultados de prueba. Además, las burbujas pueden causar que las partículas se adhieran a las paredes del vaso y del aparato. Las burbujas en la unidad de dosificación pueden aumentar la flotabilidad, lo que ocasiona el aumento de la velocidad de disolución o la disminución de la superficie específica disponible produciendo una disminución en la velocidad de la disolución. Los fármacos poco solubles son más sensibles a la interferencia de las burbujas de aire; por lo tanto, puede ser necesaria la desgasificación al analizar estos tipos de productos. La sección Procedimiento del capítulo (711) describe en una nota al pie de página un método de desgasificación. Los pasos típicos incluyen calentamiento del medio, filtración y vacío durante un periodo corto. Otros métodos de desgasificación están disponibles y la industria los utiliza en forma rutinaria. Una vez que se ha identificado el proceso de desgasificación adecuado, éste debe documentarse como parte del proceso de disolución. El grado de desgasificación puede evaluarse midiendo la presión total del gas disuelto o midiendo la concentración de oxígeno disuelto en agua. Por ejemplo, se ha determinado que una concentración de oxígeno por debajo de 6 mg/L es efectiva como marcador para la desgasificación adecuada del agua para la Prueba de Verificación de Desempeño con el ER Tabletas de Prednisona USP. Los medios que contiene surfactantes por lo regular no se desgasifican debido a que el proceso genera espuma en exceso y, por lo regular, el efecto del aire disuelto en el proceso de disolución se mitiga mediante la reducción de la tensión superficial del medio. En ocasiones, puede ser efectivo desgasificar el medio antes de agregar surfactantes. Para determinar si es necesario desgasificar un medio, se deben comparar los resultados de las muestras de disolución corridas con un medio no desgasificado y con otro medio desgasificado usando una técnica farmacopeica, tal como se describió anteriormente. Si no se detecta efecto alguno por la desgasificación, este experimento puede usarse como justificación de que la desgasificación no será necesaria en el futuro. Sin embargo, si se detecta algún efecto, entonces será necesario controlar cuidadosamente este parámetro, por lo que será prudente caracterizar la robustez del proceso de desgasificación. El contenido de gas disuelto de los medios desgasificados bajo presión atmosférica es inestable y presentará una tendencia a la saturación. Las manipulaciones del medio desgasificado tales como mezclado o vertido pueden incrementar la velocidad a la que se redisuelven los gases atmosféricos.
2.2 Dispositivos de Sumersión Los dispositivos de sumersión a menudo se usan para ajustar la flotabilidad de las formas farmacéuticas que, de otro modo, flotarían durante la prueba con el Aparato 2. Cuando se usen dispositivos de sumersión, se debe proveer una descripción deta-
USP 39
1308 (1092) Procedimiento de Disolución / Información General
liada del dispositivo en el procedimiento escrito. Puede ser útil evaluar diferentes dispositivos de sumersión, reconociendo que los dispositivos de sumersión pueden influir significativamente en el perfil de disolución de la unidad de dosificación. Al transferir el procedimiento, se deben usar los mismos dispositivos de sumersión o, si se usa un diseño distinto, se debe demostrar que produce resultados equivalentes. Existen en el mercado varios tipos de dispositivos de sumersión. El capítulo (711) provee una descripción de un dispositivo de sumersión armonizado en la Figura 2a. Tabla 2. Dispositivos de Sumersión de Alambre con Tamaños de Cubierta de Cápsula Comunes Longitud del Alambre (cm)
Diámetro (cm)
Sacabocados Número
#0, oblonga
12
0,8
4
#1 y #2
10
0,7
3
#3 y #4
8
0,55
2
Tamaño de Cubierta de Cápsula
Se puede fabricar un dispositivo de sumersión estándar usando un alambre de longitud apropiada y enrollándolo alrededor de un cilindro. Los materiales deben ser un alambre de acero inoxidable 316, normalmente de 0,032 pulgadas/calibre 20, u otro material inerte; y enrollar el alambre alrededor de cilindros que tengan un diámetro adecuado (p.ej., sacabocados) un número de vueltas apropiado que se ajuste al tipo de cubierta de la cápsula. Los tamaños se presentan en la Tabla 2. Los extremos del alambre pueden curvarse para retener la cápsula dentro del dispositivo de sumersión al sumergirlos. Debido a que los extremos del alambre pueden ser ásperos, puede ser necesario limarlos. Si el dispositivo de sumersión está hecho a mano, debe documentarse el material utilizado y las instrucciones del procedimiento de construcción (p.ej. dimensiones, diseño, número de vueltas); si se usa un dispositivo de sumersión comercial, se debe informar el número de catálogo del proveedor, cuando se conozca. Aunque los dispositivos de sumersión por lo regular se usan para mantener la forma farmacéutica en el fondo del vaso, también se pueden usar para evitar que las formas farmacéuticas se adhieran al vaso (p.ej., tabletas recubiertas). El dispositivo de sumersión debe ser apropiado para la forma farmacéutica; por lo tanto, un tamaño de dispositivo de sumersión podría no ser adecuado para todos los tamaños de formas farmacéuticas. El dispositivo de sumersión no debe apretarse demasiado alrededor de la forma farmacéutica, debido a que esto puede restringir su interacción con el medio. Por el contrario, si se enrolla demasiado suelto, la forma farmacéutica podría soltarse inmediatamente después de iniciar la prueba. El dispositivo de sumersión debe ser lo suficientemente pequeño para que la cápsula no cambie su orientación dentro del dispositivo de sumersión. Se debe tener cuidado al analizar cápsulas que presenten algo de entrecruzamiento, a fin de evitar que la cubierta pegajosa se adhiera al fondo del vaso. En este caso, el diseño del dispositivo de sumersión armonizado provisto en la Figura 2a del capítulo (711) ofrecerá ventajas.
2.3 Agitación Para cápsulas o tabletas de liberación inmediata, los aparatos de uso más común son el Aparato 1 (canastillas) a 50-100 rpm o el Aparato 2 (paletas) a 50 ó 75 rpm. Con una justificación apropiada, se aceptan otras velocidades de agitación. Por lo general, las velocidades fuera del intervalo de 25-150 rpm para la paleta y la canastilla no son apropiadas debido a las faltas de uniformidad del mezclado ocasionadas por un mezclado demasiado rápido o demasiado lento. Las velocidades de agitación entre 25 y 50 rpm son generalmente aceptables para las suspensiones. Para formas farmacéuticas que presentan la formación de conos (montículos) debajo de la paleta a 50 rpm, el cono puede reducirse al aumentar la velocidad de la paleta a 75 rpm, reduciendo el artefacto para, de este modo, mejorar los datos. Si se justificara, se puede emplear una velocidad de 100 rpm con el Aparato 2, especialmente para productos de liberación prolongada. El aumentar o disminuir la velocidad de rotación del aparato puede justificarse si para lograr una mejor correlación in vitro-in vivo (IVIVC, por sus siglas en inglés) los perfiles resultantes reflejan mejor el desempeño in vivo, o si los resultados del método demuestran una mejor discriminación sin afectar adversamente la variabilidad del método. El Aparato 3 (cilindro oscilante) puede usarse a velocidades de inmersión que van de 5 a 30 sumersiones/minuto. La hidrodinámica se ve influenciada por el movimiento oscilante del cilindro y el movimiento resultante de la muestra en el medio. El movimiento oscilante del cilindro y de la malla puede ocasionar la formación de espuma si el medio contiene surfactantes. La adición de un agente antiespumante tal como simeticona o n-octanol puede ser útil para evitar la formación de espuma por surfactantes. El Aparato 4 (celda de flujo) se describe en el capítulo (711) con velocidades de flujo estándar de 4; 8 y 16 mL/min. Se pueden usar otras velocidades de flujo para el Aparato 4 siempre que se justifique y dentro de la capacidad de la bomba para cumplir con los requisitos del capítulo (711 ). La agitación en el Aparato 4 no sólo se relaciona con la velocidad de la bomba, sino también puede verse afectada por el diámetro de la celda. A una velocidad de flujo determinada, según se mide por el volumen, la celda de 12 mm desarrollará una velocidad de fluido lineal mayor que la conseguida en la celda de 22,6 mm. El Aparato 4 puede configurarse con la adición de perlas de vidrio en el cono de entrada de la celda de flujo (columna rellena) o sin perlas de vidrio (columna abierta). Las características del flujo de la celda de flujo se tratan en la literatura científica ( 15). La colocación de la muestra en la celda de flujo influirá los patrones de flujo que se presenten, lo cual debe tenerse en cuenta al intentar reducir la variabilidad de los resultados.
USP 39
Información General/ (1092) Procedimiento de Disolución 1 309
2.4 Diseño del Estudio La selección de la velocidad de agitación y de otros elementos del diseño del estudio para la forma farmacéutica, ya sea de liberación inmediata o modificada, deben cumplir con los requisitos y especificaciones (es decir, aparato, procedimientos e interpretación) del capítulo (711 ).
2.4.1 TIEMPOS DE MUESTREO Para las formas farmacéuticas de liberación inmediata, la duración del procedimiento de disolución es usualmente entre 3060 minutos; en la mayoría de los casos, la especificación de un solo tiempo de muestreo es adecuada para fines farmacopeicos. Sin embargo, para el desarrollo del método, se deben seleccionar suficientes tiempos de muestreo para una adecuada caracterización de la fase ascendente y de la meseta de la curva de disolución. Los conceptos industriales y reglamentarios referentes a la comparabilidad y desempeño del producto pueden exigir tiempos adicionales y esto también puede ser requisito para el registro o aprobación del producto. De acuerdo con el Sistema de Clasificación Biofarmacéutica al cual se refiere en varias instancias las Guías de la FDA, los fármacos muy solubles y de alta permeabilidad formulados como productos que se disuelven rápidamente no requieren estar sujetos a un perfil de comparación si demuestran una liberación de 85% o más del fármaco dentro de los 15 minutos. Para este tipo de productos, será suficiente una prueba de un solo punto o una prueba de desintegración. Sin embargo, la mayoría de los productos no pertenecen a esta categoría. Los perfiles de disolución de productos de liberación inmediata por lo general presentan un incremento gradual que alcanza entre 85%-100% en un período de aproximadamente 30-45 minutos. De este modo, se eligen tiempos de muestreo de disolución suficientes para caracterizar el desempeño en la mayoría de los productos de liberación inmediata. Para algunos productos, incluyendo suspensiones, se puede obtener información útil a partir de puntos anteriores, p.ej., 5-1 O minutos. Para productos de disolución más lenta, pueden ser útiles los tiempos de muestreo superiores a 60 minutos. Los tiempos de la prueba de disolución para las pruebas farmacopeicas generalmente se basan en una evaluación de los datos del perfil de disolución. El factor de similitud f2 puede no ser útil cuando se disuelve más del 85% a los 15 minutos. Si se va a usar el factor de similitud f2, se requieren múltiples tiempos de muestreo para la prueba de disolución, con al menos dos tiempos de muestreo con un porcentaje promedio disuelto (por lo regular para n = 12) inferior al 85% disuelto y sólo un punto por encima del 85% para ambos productos (7 6). Por lo tanto, puede ser útil la adición de tiempos de muestreo tempranos. Para analizar una forma farmacéutica de liberación prolongada, se seleccionan al menos tres tiempos de muestreo para protegerse de una liberación rápida de la dosis, para definir el perfil de liberación in vitro y para demostrar que se logra la liberación prácticamente completa (>80%) del fármaco. Pueden ser útiles tiempos de muestreo adicionales. Algunos criterios para la correlación in vivo-in vitro, tales como la correlación de nivel B (de acuerdo con el capítulo Evaluación In Vitro e In Vivo de Formas Farmacéuticas (1088)), requieren la determinación experimental del tiempo para disolver el 100% de la cantidad declarada en la etiqueta. La selección de los tiempos de muestreo finales refleja los datos obtenidos del perfil de liberación del fármaco que se generan durante el desarrollo. En el caso de productos que contengan más de un ingrediente activo, se debe determinar la liberación del fármaco para cada ingrediente activo. Las formas farmacéuticas de liberación retardada por lo regular requieren especificaciones para al menos dos tiempos de muestreo; por lo tanto, durante el desarrollo del fármaco, es importante evaluar todo el perfil de disolución. En el caso de las formas farmacéuticas con recubrimiento entérico, la funcionalidad del recubrimiento por lo general se demuestra mediante desafío en un medio ácido, seguido por la demostración de la disolución en un medio con un pH mayor. El capítulo (711) provee un medio de solución amortiguadora estándar para dicha etapa del análisis, aunque se pueden usar otros medios si se justifica. El tiempo de la etapa ácida es por lo regular 2 horas y la liberación en la solución amortiguadora es similar a las formas de liberación inmediata. Para formas farmacéuticas de liberación retardada que no son con recubrimiento entérico, el establecimiento de especificaciones es diferente. A diferencia de la liberación retardada, el inicio de la liberación no está determinado por el diseño experimental, que es el cambio de pH; por lo tanto, pueden requerirse especificaciones multivariadas para definir intervalos de tiempo y sus intervalos porcentuales correspondientes. Los puntos llamados infinitos pueden ser útiles durante los estudios de desarrollo. Para obtener un punto infinito, se aumenta la velocidad de la paleta o de la canastilla al final de la corrida (después del último tiempo de muestreo) durante un periodo sostenido (normalmente 15-60 minutos); después de transcurrido ese tiempo, se toma una muestra adicional. Aunque no se tenga en el perfil un requisito para el 100% de disolución, el punto infinito puede compararse con los datos de la uniformidad de contenido y puede proveer información útil acerca de las características de la formulación durante el desarrollo inicial o acerca de las desviaciones del método.
2.4.2 OBSERVACIONES La observación visual y los registros del comportamiento de disolución y desintegración del producto son de utilidad ya que los patrones de disolución y desintegración pueden ser indicativos de variaciones en la formulación o en el proceso de fabricación. Una adecuada iluminación del contenido de los vasos (con debida consideración de la fotodegradación) y una buena visibilidad en el baño son esenciales para la observación visual. La documentación de las observaciones a través de dibujos, fotografías o vídeos puede ser instructiva y útil para quienes no pueden observar la prueba de disolución en tiempo real. Las observaciones son especialmente útiles durante el desarrollo del método y la optimización de la formulación. Es importante
131 O (1092) Procedimiento de Disolución/ Información General
USP 39
registrar las observaciones de los seis vasos para determinar si la observación se presenta en los seis vasos, o sólo en algunos. Si la prueba se lleva a cabo para ayudar con el desarrollo de la formulación, se debe proveer al formulador cualquier observación que se considere única. Ejemplos de observaciones típicas incluyen, pero no se limitan, a lo siguiente: 1. Distribución irregular de partículas por todo el vaso. Esto puede ocurrir cuando las partículas se adhieren a las paredes del vaso, cuando las mismas forman un cono o montículo directamente debajo del aparato (p.ej., por debajo de la canastilla o paleta), cuando las partículas flotan en la superficie del medio, cuando las tabletas recubiertas con película se pegan al vaso y/o cuando se forman montículos fuera del centro. 2. Burbujas de aire dentro del vaso, en el aparato o en la unidad de dosificación. Un brillo en el aparato es también una señal de la presencia de burbujas de aire. Esta observación se haría típicamente al evaluar la necesidad de desgasificar el medio. 3. Movimiento errático o en giros de la unidad de dosificación o bien ésta es golpeada por la paleta. 4. Adherencia de las partículas a la paleta o al interior de la canastilla, lo que se puede observar al remover el dispositivo de agitación al final de la prueba. 5. Películas o formaciones análogas, tales como sacos transparentes o gomosos, masas hinchadas rodeando el contenido de la cápsula. 6. Presencia de partículas flotantes grandes o trozos de la unidad de dosificación, en especial en la superficie de los medios. 7. Observación de la velocidad de desintegración (p.ej., la reducción del porcentaje en tamaño de la unidad de dosificación dentro de un cierto tiempo). 8. Desintegración compleja del recubrimiento de productos con cubierta entérica o modificada [p.ej., una apertura parcial y separación de las partes (como sería separar la concha de una almeja) o una apertura incompleta de la cubierta] acompañada de la liberación de burbujas de aire y excipientes. 9. Si la forma farmacéutica se posa en el centro del vaso o en un costado, y, si está en un costado, si queda adherida en dicha posición. 1 O. El tiempo requerido para la disolución completa de la cubierta de la cápsula o para la desintegración de la tableta. Las observaciones también ayudan a documentar que se ha seguido el procedimiento apropiado o, de mayor importancia, que ha ocurrido una desviación. Los ejemplos incluyen confirmar la presencia de una forma farmacéutica en el vaso durante la prueba o que, inadvertidamente, se encuentre más de una forma farmacéutica en el mismo vaso, o que haya caído un filtro del muestreador automático en el vaso. 2.4.3 MUESTREO Manual: Para el muestreo manual, usar dispositivos químicamente inertes (p.ej., jeringas poliméricas o de vidrio, y cánulas poliméricas o de acero inoxidable), un filtro y/o un soporte para filtro. El sitio de muestreo debe cumplir con las especificaciones del capítulo (711 ). Cuando las condiciones de agitación son muy lentas, p.ej., una canastilla a 50 rpm, se debe tener cuidado de muestrear de manera uniforme en el mismo lugar del vaso debido a que puede existir un gradiente de concentración; se debe evitar realizar un muestreo demasiado cerca del eje o de la pared del vaso. Durante el desarrollo del método, se debe tomar una decisión con respecto a si se debe reemplazar los medios después de cada tiempo de muestreo. No se recomienda reemplazar los medios debido a que la unidad de dosificación puede verse afectada durante la liberación de los medios. Sin embargo, el reemplazo puede ser necesario cuando mantener las condiciones de exceso de medio represente un desafío. Con el reemplazo, el volumen usado en los cálculos se mantiene igual en todos los tiempos de muestreo, aunque se extrae algo de fármaco con cada muestra, lo cual debe tenerse en cuenta para los cálculos. Las superficies de metal pueden interactuar con la muestra. Por ejemplo, puede ocurrir adsorción en las superficies metálicas, o las superficies metálicas pueden liberar iones metálicos en medios acuosos. Posteriormente, los iones podrían catalizar las reacciones de degradación, generando artefactos durante los procedimientos analíticos. Las superficies de los elementos de mezclado y de los seguros metálicos de jeringas pueden ser fuentes de interferencia para el muestreo exacto. Muestreo automático: El muestreo automático se trata en la sección 4. Automatización.
2.4.4 LIMPIEZA La evaluación del proceso de limpieza entre pruebas es importante. Los cambios de medio de disolución y/o de producto generan la necesidad de limpieza. Los residuos de los vasos pueden afectar los resultados (p.ej., los residuos adsorbidos pueden disolverse y alterar las propiedades subsiguientes del medio o interferir con el análisis de muestras), por lo que la limpieza efectiva los devolverá a un estado adecuado. Los sistemas automatizados se tratan en la sección 4.4 Limpieza.
2.5 Procesamiento de Datos Las velocidades de disolución se calculan a partir del cambio en la concentración del fármaco en el medio de disolución. Para procedimientos en los que se trabaja con un volumen de medio fijo, como en el caso del análisis con el Aparato 1 y el Aparato 2 de formas farmacéuticas de liberación inmediata con un solo tiempo de muestreo, la concentración de la muestra se multiplica por el volumen de medio para llegar a la masa de fármaco disuelto que por lo general se expresa como porcentaje de la cantidad declarada en la etiqueta. Cuando se toman múltiples tiempos de muestreo, la cantidad total de fármaco retirada
Información General/ (1092) Procedimiento de Disolución 1311
USP 39
en los tiempos de muestreo tempranos debe evaluarse y puede ser parte del cálculo de la cantidad disuelta, si se considera importante. De manera similar, si el volumen de medio no es fijo, por ejemplo, cuando el volumen de la muestra no se reemplaza en el caso de productos de liberación prolongada, el cambio en el volumen de medio debe ser parte del cálculo para tiempos de muestreo sucesivos. Las pruebas de disolución realizadas con el Aparato 4 en la configuración de circuito cerrado con una detección in situ proveen control conveniente del volumen de medio. Para el análisis con el Aparato 4 en la configuración abierta, el tiempo de prueba y la velocidad de flujo determinarán el volumen de medio usado en los cálculos de la disolución. Los resultados de la disolución pueden evaluarse como velocidades acumulativas o velocidades fraccionales. Las velocidades acumulativas representan la suma de toda la disolución de fármaco ocurrida durante un intervalo (Figura 7). Las velocidades fraccionales se evalúan en un tiempo de muestreo específico o durante una parte del tiempo de prueba total (Figura 2). Por lo regular, la velocidad de liberación se expresará como masa o porcentaje de la cantidad declarada en la etiqueta por unidad de tiempo. Para la mayoría de las pruebas farmacopeicas de disolución, la velocidad de disolución se expresa como porcentaje de la cantidad declarada disuelta en el tiempo de prueba indicado.
Figura 1. Ejemplo de una gráfica de disolución como proceso acumulativo. La concentración, C, es la cantidad de fármaco liberado por volumen de medio y t representa el tiempo. Este tipo de gráfica se observa fácilmente en los sistemas de disolución de volumen constante, tales como el Aparato 1 o el Aparato 2, o el Aparato 4 en la configuración de circuito cerrado.
e
Figura 2. Ejemplo de una gráfica de la concentración observada de la muestra tomada durante un intervalo que es inapreciablemente pequeño con respecto al tiempo del proceso general de disolución. La concentración es proporcional a la velocidad de disolución instantánea o fracciona! (dc/dt). Este tipo de gráfica se observa fácilmente en los sistemas de disolución de flujo constante, tal como el Aparato 4 en la configuración de circuito abierto. Los perfiles de disolución acumulativa representan la cantidad total de fármaco disuelto a partir de la formulación con el paso del tiempo. Cuando la disolución acumulativa se mide en un sistema de volumen constante, no es necesario aplicar ninguna corrección por la cantidad perdida en el muestreo. Si la muestra se retira del sistema, la cantidad consumida en el análisis debe tenerse en cuenta en el cálculo. El muestreo recirculado con el Aparato 1 o el Aparato 2, o con el Aparato 4 en la configuración de circuito cerrado (Figura 3), son ejemplos de sistemas que producirán velocidades de disolución acumulativa. Con el Aparato 4 en la configuración abierta (Figura 4), las velocidades acumulativas tienen en cuenta la cantidad total de fármaco disuelto a lo largo del intervalo de análisis que se obtienen recolectando y analizando todo el flujo saliente de cada celda de flujo individual. Con el Aparato 3 (Figura 5), se muestrea el medio de cada tubo al final del intervalo programado y la concentración analizada representa la velocidad de disolución acumulativa durante dicho intervalo.
Figura 3. Aparato 4 en la configuración de circuito cerrado.
USP 39
1312 (1092) Procedimiento de Disolución/ Información General
Sistema Abierto
Figura 4. Aparato 4 en la configuración de circuito abierto. La muestra puede recolectarse en fracciones, tal como se muestra en la parte superior. El medio puede cambiarse usando reservorios sucesivos.
------i
Formas farmacéuticas
t Tiempo
Figura 5. Progresión posible para un cilindro oscilante del Aparato 3. El cilindro oscilante puede moverse de vaso en vaso. Esta característica facilita el cambio del medio de disolución y el análisis de diferentes intervalos en tubos sucesivos. Las velocidades de disolución fracciona! a menudo se miden para un intervalo discreto. Una serie de dichas velocidades producirá una función escalonada como el perfil de disolución. En cualquier momento, la velocidad de disolución acumulativa de este tipo de perfil es la suma de los intervalos precedentes. Este tipo de perfil está representado por el Aparato 3 usando múltiples tubos o por el Aparato 4 en la configuración de circuito abierto en la que todo el flujo de salida se recolecta y analiza durante intervalos sucesivos. Existen diversos métodos algebraicos y numéricos para transformar resultados de disolución acumulativos y fraccionales. Se puede calcular la diferencia en la cantidad liberada durante tiempos de muestreo sucesivos y la velocidad de liberación promedio se determina mediante la fórmula: Resultado= (M2 - M 1)/(t2
-
t1)
M = masa o porcentaje de la cantidad declarada en la etiqueta t= tiempo A medida que se reduce la diferencia de t2 a partir de t 1, se puede considerar que la velocidad promedio se acerca a la velocidad instantánea. Las consideraciones del muestro y las restricciones físicas para la medición de la transferencia de masa en la interfaz de medio de la forma farmacéutica hacen que la medición de la disolución instantánea verdadera sea poco práctica para la determinación de rutina en el laboratorio. La disolución fracciona! se mide para intervalos en los que la diferencia ente t2 y t1 es pequeña, con respecto al tiempo total de prueba. El diseño del Aparato 4 en la configuración abierta permite una medición directa de la disolución fracciona! durante intervalos de tiempo pequeños. Por ejemplo, si se muestrea una fracción de 4 mL del flujo de salida para el Aparato 4 que corre 16 mL/min, ya sea mediante detección in situ o fuera de línea, la cantidad de fármaco detectado representa la disolución que ocurre en un intervalo de 15 segundos. La disolución combinada se ha usado en diversas monografías. El procedimiento de disolución combinada produce una velocidad de liberación promedio para las unidades analizadas combinando volúmenes iguales de cada vaso o celda y analizando únicamente una solución resultante. Debido a que este enfoque sólo usa la velocidad de liberación promedio para la comparación con la tabla de aceptación, se considera que el procedimiento de disolución combinada reduce la cantidad de datos disponibles de la prueba de disolución y, por consiguiente, su propio valor. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que la combinación de volúmenes de muestra iguales es equivalente, desde el punto de vista de los cálculos, a determinar la media aritmética de los resultados de muestra individuales. El uso del factor de similitud f2 en la comparación de los perfiles de disolución se trata en el capítulo Evaluación del Desempe-
ño del Producto Farmacéutico-Biodisponibilidad, Bioequivalencia y Disolución (1090).
USP 39
Información General/ (1092) Procedimiento de Disolución 1313
Para la correlación con datos in vivo, se obtienen parámetros de modelos matemáticos ajustándolos a los datos de disolución para establecer una relación funcional continua denominada correlación in vivo- in vitro (ver el capítulo (1088)).
2.6 Evaluación del Procedimiento de Disolución El procedimiento de disolución requiere un aparato, un medio de disolución y condiciones de prueba que provean un método sensible a los cambios en los atributos críticos de calidad, pero lo suficientemente resistente y reproducible para las operaciones diarias y que se pueda transferir entre laboratorios. El procedimiento de disolución ideal no contribuirá a un grado inaceptable de variabilidad y proveerá un perfil con puntos adecuados por debajo de una disolución del 85%. Si ocurre una disolución del 85% antes de 15 minutos, entonces podrían no ser apropiadas las comparaciones f2 • Existe una gran cantidad de formas de desafiar la sensibilidad del método. Una opción consiste en comparar los perfiles de disolución de formulaciones que se fabrican intencionalmente con variaciones significativas para la variable de fabricación crítica más relevante, por ejemplo, un cambio de ±10%-20% en los intervalos de estas variables. De manera similar, se pueden usar muestras que hayan presentado estrés para demostrar la sensibilidad a los cambios en la estabilidad. Este concepto puede usarse para establecer los factores que tienen una influencia más significativa sobre la velocidad de disolución. Dichos estudios pueden enfocarse en los parámetros de disolución (p.ej., concentración de medio, velocidad de agitación y desgasificación) o en los atributos del producto (p.ej., relaciones de excipientes, tamaño de partícula, compresión). El objetivo final es entender los mecanismos de liberación y determinar si el procedimiento de disolución puede presentar cambios en los atributos de calidad críticos de un medicamento.
3. COMPLEMENTACIÓN ANALÍTICA La etapa de disolución se ha descrito como una preparación intrincada de la muestra. La manipulación de la muestra y el procedimiento analítico que se usan para determinar la cantidad de fármaco disuelto durante el procedimiento de disolución se denominan "complementación analítica." Aunque las determinaciones espectrofotométricas y la HPLC son las técnicas de uso más común y se tratan en este capítulo, se puede usar cualquier tecnología analítica adecuada. La Sección 5. Validación describe los criterios para los métodos.
3.1 Procesamiento de Muestras Después de que las muestras se retiran del medio de disolución, éstas pueden requerir procesamiento adicional para adecuarlas a la metodología analítica que se utiliza para determinar la cantidad liberada. Por ejemplo, se puede usar filtración para retirar partículas no disueltas o las muestras podrían requerir protección de la exposición a la luz, o requerir almacenamiento refrigerado. Además, es posible que las muestras deban diluirse a un nivel que esté dentro del intervalo lineal del método. En el caso de los análisis mediante HPLC, puede ser necesaria la dilución de la muestra con la fase móvil para reducir el efecto sobre la separación al inyectar el medio de disolución. Pueden ser necesarios otros tipos de tratamientos dependiendo de la formulación del producto, tal como la inactivación o eliminación de la interferencia ocasionada por los componentes de la formulación por la adición de los reactivos apropiados. Sin embargo, la separación puede no ser posible o requerirse para todos los casos. En algunos casos, pueden ser útiles las mediciones in situ obtenidas con métodos tales como fibra óptica o determinación electroquímica.
3.2 Filtros El tema de la filtración se trata en la sección 7. 7 Compatibilidad del Filtro.
3.3 Centrifugación La centrifugación de muestras no es recomendable por diversas razones: la disolución puede continuar ocurriendo hasta que los sólidos son retirados, se puede formar un gradiente de concentración en el sobrenadante, y la energía impartida puede generar un aumento en la disolución de las partículas del fármaco. Algunas excepciones en los que podría recomendarse la centrifugación incluyen su uso con compuestos que se adsorben en todos los filtros comunes, o casos en los que los lixiviables y sustancias extraíbles potenciales del filtro pudieran interferir con la etapa cuantitativa de la prueba de disolución (p.ej., cuando se usan procedimientos de fluorescencia en la cuantificación). La centrifugación puede demostrar su utilidad durante el desarrollo del método para evaluar la aptitud del material del filtro.
3.4 Procedimiento Analítico La valoración común para una muestra de disolución emplea un procedimiento espectrofotométrico o un procedimiento de cromatografía de líquidos. La determinación espectrofotométrica puede ser directa o puede proveer la detección para la HPLC.
1 314 (1092) Procedimiento de Disolución / Información General
USP 39
La determinación espectrofotométrica se usa a menudo debido a que los resultados pueden obtenerse con mayor rapidez, el análisis es más simple, es más fácil de automatizar y se requieren menos disolventes. El uso de la determinación espectrofotométrica directa por lo regular requiere confirmar la especificidad. La HPLC es la técnica preferida por diversas razones, por ejemplo, provee un amplio intervalo dinámico que reduce la necesidad de diluir algunas muestras al mismo tiempo que provee sensibilidad en el análisis de muestras diluidas, además de una mayor selectividad cuando los excipientes o múltiples fármacos en la formulación presentan una interferencia significativa. Los sistemas modernos de HPLC emplean muestreadores automáticos que proveen ventajas de velocidad y simplicidad comparables al análisis espectrofotométrico.
3.5 Análisis Espectrofotométrico Los análisis espectrofotométricos pueden realizarse en muestras que se introducen manualmente en las celdas. Como alternativa, las muestras se pueden introducir en el espectrofotómetro en forma automática utilizando succionadores automáticos y celdas de flujo. Los controles rutinarios de desempeño, la limpieza y el mantenimiento descritos en los correspondientes procedimientos operacionales estándares o en la documentación de metrología ayudan a asegurar la operación confiable de estos dispositivos. Generalmente se utilizan celdas cuya longitud de paso varía entre 0,02 y 1 cm, y se pueden usar cubetas con una longitud de paso mayor para incrementar el intervalo de cuantificación de muestras diluidas. La alineación de las celdas y las burbujas de aire pueden ser fuentes de error. La longitud de paso más pequeña de las celdas se usa para evitar la dilución de la muestra; sin embargo, se requiere demostrar una linealidad aceptable y el error estándar. La selección de la longitud de onda para la determinación debe basarse en el espectro del fármaco en solución. En algunos casos, cuando el fármaco puede degradarse en el medio de disolución (p.ej., formas farmacéuticas que contienen aspirina), es útil llevar a cabo las mediciones del punto isosbéstico. Los excipientes también pueden tener efectos, pero realizar el análisis a diferentes longitudes de onda puede minimizarlos. La contribución de la absorbancia a partir de un excipiente a la longitud de onda analítica se puede determinar en ocasiones mediante el cociente de su absorbancia a una longitud de onda en la que la absorbancia del fármaco es mínima. Mediante una complementación analítica validada, las soluciones estándar por lo general se preparan en medio de disolución y se analizan sólo a una concentración, igual a 100% o al valor Q seleccionado de la concentración de la dosificación debido a que se ha establecido la linealidad del complemento analítico. Antes de la validación, el análisis del perfil de disolución o el análisis de productos de varias concentraciones requiere usar múltiples soluciones estándar que abarquen el intervalo de concentración esperado. Un blanco del medio típico, estándar y muestra pueden analizarse en una secuencia que comprenda la muestra con los estándares y los blancos, especialmente al comienzo y al final del análisis. Las soluciones del estándar y de las muestras se deben preparar en el medio de disolución en el intervalo de concentración lineal y medirse a la misma longitud de onda. Sin embargo, se pueden usar cantidades pequeñas de un disolvente orgánico en la preparación del estándar, siempre que se puedan cumplir los criterios de exactitud durante la validación. La absortividad se calcula dividiendo la absorbancia estándar media entre la concentración, en mg/mL, dividida por la longitud de paso de la celda en cm. Un reacomodo de la expresión Beer-Lambert provee la absortividad, a, como:
a= A/be A = absorbancia b = longitud de paso (cm)
e= concentración (mg/mL) Las unidades típicas para absortividad que se usan en el análisis de disolución están en términos de AU · mL/mg, donde AU es la unidad de absorbancia. Los datos históricos pueden usarse para proveer un intervalo aceptable de absortividad para el analito (empleando la celda con una longitud de paso apropiada). Este valor puede ser útil para corregir datos aberrantes. El uso de fibra óptica como método de muestreo y de determinación, con validación apropiada, es una opción.
3.6 HPLC En el caso del análisis por HPLC, es necesario enumerar el efecto sobre los picos en el cromatograma que resulta de la inyección del medio de disolución. Una perturbación grande del disolvente puede afectar la exactitud y la precisión de la respuesta cuando ésta se resuelva de manera deficiente del pico de interés, lo cual adquiere mayor importancia cuando se requieren inyectores de mayor volumen (> 100 µL). Las pruebas de aptitud del sistema pueden evaluar la forma del pico, la separación del pico principal de la perturbación del disolvente y de los picos que eluyen de manera cercana, y la precisión de la inyección. Como mínimo, la precisión se considera un aspecto crítico. Idealmente, las soluciones estándar deben diluirse con los medios de disolución a una concentración dentro del intervalo lineal del método, p.ej., 100%, o el valor Q seleccionado de la concentración de la dosificación. Sin embargo, se puede usar un disolvente orgánico en la preparación del estándar, siempre que se puedan cumplir los criterios de exactitud durante la validación. En algunos casos, la muestra pude diluirse con fase móvil para mejorar la forma del pico. Las soluciones del estándar y de las muestras se deben preparar en el intervalo de concentración lineal y medirse a la misma longitud de onda.
USP 39
Información General/ (1092) Procedimiento de Disolución 1 315
4. AUTOMATIZACIÓN Los sistemas de disolución automatizados pueden configurarse en diversas maneras y grados. Los elementos de la preparación, inicio, muestreo y tiempo, de la prueba, además de la limpieza, pueden automatizarse. Se encuentran disponibles sistemas completamente automatizados, al igual que sistemas en los que las etapas individuales, tales como la preparación de medios o el muestreo, están automatizadas. Esta sección tratará las etapas operativas que se pueden automatizar. El nivel de complejidad de la automatización depende de si la configuración del instrumento es de circuito abierto o cerrado y también de si el dispositivo analítico se acopla en línea o fuera de línea. El análisis en línea devuelve la alícuota de muestra al sistema de prueba, como en el caso de la espectrofotometría con cubetas de flujo. El análisis fuera de línea elimina la alícuota de la muestra del medio de disolución para el análisis subsiguiente, por lo regular mediante HPLC, en el que el análisis consume la muestra. La decisión con respecto a la configuración por lo regular depende del número de muestras que se van a procesar y del tiempo requerido para su análisis. La automatización puede requerir desviaciones de las especificaciones farmacopeicas de los instrumentos, tales como incorporar una salida integrada en la parte inferior del vaso para limpiar y reemplazar el medio. Las etapas adicionales que no sean parte del procedimiento farmacopeico deben ser validadas. Las desviaciones del procedimiento estándar descritas en el capítulo (711 ), tales como usar sondas de muestreo o sondas de fibra óptica deben validarse contra el procedimiento estándar.
4.1 Preparación del Medio La preparación automatizada de medios por lo general se logra mediante la dilución de concentrados. Los sistemas automatizados de preparación de medios por lo regular dispensan el volumen de medio en el vaso monitoreando el peso o el volumen. La estabilidad física o química de los concentrados, así como la homogeneidad de las diluciones durante el periodo de uso previsto son aspectos importantes que deben ser entendidos. Los concentrados de las soluciones amortiguadoras y los surfactantes pueden tener problemas de estabilidad, tales como degradación química y cambio de pH. Se debe prevenir la inestabilidad física, la cual puede presentarse como precipitación, recristalización o separación de fases. Si se requiere la desgasificación del medio, se debe especificar el nivel de desgasificación. La concentración del oxígeno disuelto puede usarse para evaluar la eficacia de los procedimientos de desgasificación tratados en la sección 2. 7 Desgasificación.
4.2 Introducción de la Muestra y Tiempo Las muestras deben insertarse en el vaso de una manera que sea reproducible. La introducción de muestras y el retiro de alícuotas automatizados proveen una ventaja sobre el muestreo manual debido a que las técnicas automatizadas pueden reducir la variabilidad del tiempo entre vasos de los intervalos de prueba. Sin embargo, la manipulación automatizada de muestras puede imponer limitaciones de tiempo que deben tenerse en consideración. La tolerancia farmacopeica de ±2% del tiempo de prueba de disolución especificado puede ser difícil de cumplir para los tiempos de muestreo tempranos.
4.3 Muestreo y Filtración El muestreo automático es una alternativa útil al muestreo manual, especialmente si la prueba incluye varios tiempos. La transferencia y la filtración de soluciones muestra a partir del instrumento de disolución a la unidad analítica puede realizarse mediante conexiones de tubos o mediante dispositivos robóticos operados en un procedimiento por etapas. Es posible retirar volúmenes de muestra del medio de disolución sin devolverlos (muestreo consuntivo) o se puede devolver el volumen de la muestra al medio de disolución (muestreo por recirculación). Existen muchas marcas comerciales de muestreadores automáticos, entre los que se incluyen sistemas semiautomatizados y totalmente automatizados. Los controles rutinarios de desempeño, la limpieza y el mantenimiento descritos en los procedimientos operativos estándar pertinentes o en la documentación de metrología ayudan a asegurar la operación confiable de estos dispositivos. Las sondas de muestreo pueden o no permanecer en el vaso durante toda la corrida. Las sondas de muestreo o las sondas de fibra óptica pueden perturbar la hidrodinámica del vaso; por lo tanto, se debe realizar una validación adecuada para garantizar que las sondas no causan un cambio significativo en la velocidad de disolución. Si se usan filtros diferentes a los que se usan para el muestreo manual, dichos filtros también deben ser evaluados por separado. La posición de la zona de muestreo farmacopeica para el Aparato 1 y el Aparato 2 es a la mitad entre la parte superior del elemento de mezclado y la superficie del medio, y depende del volumen del medio. Las sondas de muestreo deben sacar la muestra de la zona de muestreo. Los instrumentos en los cuales se lleva a cabo el muestreo a través del eje hueco deben ser diseñados con un medio para ajustar la profundidad de la apertura de ingreso para permitir el cumplimiento de este requisito. El volumen de muestreo programado depende del volumen muerto del sistema de tubos, cubetas y otros dispositivos y debe ser ajustado de manera correspondiente.
1 316 (1092) Procedimiento de Disolución / Información General
USP 39
Se puede operar una alineación de muestreo recirculado descargando el contenido del sistema de tubos en el vaso después de cada muestreo o permitiendo que el sistema de tubos se mantenga lleno de solución en los intervalos entre los puntos de muestreo. En el último caso, el volumen muerto y los efectos de arrastre son aspectos importantes a considerar. Asimismo, se debe tener en cuenta la necesidad de reemplazar el volumen de muestra. En un muestreo por consumo con múltiples tiempos de muestreo, el volumen retirado puede reemplazarse con un volumen igual de medio preparado recientemente. El volumen de muestreo puede ser crítico si excede en total 1% del volumen declarado de medio de disolución requerido por el procedimiento. Si se puede demostrar que el reemplazo del medio no es necesario, el cambio de volumen debe ser parte del cálculo de los resultados. Ver la sección 2.5 Procesamiento de Datos. El arrastre puede ocurrir cuando muestras subsiguientes se ven afectadas por los residuos o condiciones de las muestras previas; el efecto de la primera muestra o condición "arrastra" a la segunda. En la manipulación de líquidos, los residuos de los líquidos previamente presentes en la solución muestra pueden contaminar las soluciones muestra subsiguientes. Los medios de disolución que contienen surfactantes o lípidos pueden presentar problemas. El arrastre puede ocurrir en muestras sucesivas tomadas durante una prueba con múltiples tiempos de muestreo, así como al inicio de una nueva prueba debido a la solución de limpieza. Este tema se trata en la sección 4.4 Limpieza. La interacción del fármaco disuelto con los dispositivos de muestreo y de transferencia es un aspecto importante a considerar. Cuando se presenta la adsorción del fármaco disuelto, a menudo implica las superficies del aparato de disolución o los filtros de muestreo y el sistema de tubos. La adsorción puede depender del pH en el caso de fármacos disueltos cargados. La adsorción del fármaco disuelto en las partes del dispositivo de muestreo debe evaluarse usando una solución muestra típica (muestra de disolución a partir del producto o fármaco con una matriz de formulación) con una concentración conocida. El diseño típico es una validación cruzada con alícuotas de la misma solución muestra que pasan y que rodean el dispositivo de muestreo (incluyendo la sonda de muestreo, el filtro, el sistema de tubos, las válvulas y la bomba). No existe una recomendación general en la que se prefiera algún tipo de material o construcción del equipo (p.ej., vidrio o polímeros específicos). Ver la sección 5.7 Consideraciones para la Automatización para más información. Además de la información provista en la sección 2.4.3 Muestreo, las conexiones de bombas y sistemas de tubos pueden ser fuentes de contaminación en sistemas automatizados. Las interferencias con los procedimientos analíticos espectroscópicos, que por lo regular se usan en el análisis de disolución, generan menos preocupaciones. No obstante, las interferencias deben evaluarse si el producto que se está investigando contiene sales de metales en bajas dosis, como en el caso de algunos suplementos dietéticos. La transferencia de líquidos por lo general se realiza mediante sistemas de tubos poliméricos. En ocasiones, no es posible usar materiales inertes tales como politetrafluoroetileno (PTFE) debido a sus propiedades mecánicas. Cuando se requieren tubos flexibles, como en el caso de bombas peristálticas o para bobinado en un radio pequeño, los materiales preferidos pueden ser el polipropileno (PP) o el polietileno de alta densidad (HOPE, por sus siglas en inglés). Dependiendo del tipo de polímero y su cristalinidad y densidad, puede presentarse la lixiviación de componentes, especialmente de plastificantes. Los lixiviables pueden interferir con el procedimiento analítico. La concentración lixiviada a la solución muestra por lo regular depende de la superficie, la temperatura, el tiempo de exposición, las condiciones hidrodinámicas y la composición de los medios.
4.4 Limpieza Además de la información provista en la sección 2.4.4 Limpieza, los sistemas automatizados presentan cuestiones de limpieza específicas. Por ejemplo, se recomienda evaluar la efectividad del purgado y enjuagado entre tiempos de muestreo, así como la condición del sistema de tubos dentro de la corrida. Asimismo, es importante evaluar el proceso de limpieza entre pruebas.
4.5 Software Operativo y Cómputo de Resultados Los sistemas de software para la evaluación de datos y la operación de instrumentos deben validarse de conformidad con el Título 21 del CFR 11 (7 7).
4.6 Desviaciones Comunes de los Procedimientos Farmacopeicos que Podrían Requerir Validación Algunas áreas comunes en las que se presentan desviaciones de los procedimientos farmacopeicos incluyen lo siguiente: • Introducción de la muestra con respecto al inicio de la rotación del vástago • Tiempo de residencia y colocación de las sondas de muestreo • Muestreo por recirculación contra muestreo consuntivo • Reemplazo del volumen de muestra en el muestreo consuntivo.
5. VALIDACIÓN Los temas típicos referentes a la validación se describen en esta sección, aunque tal descripción no es exhaustiva, y se pueden observar en el contexto del capítulo Validación de Procedimientos Farmacopeicos (1225), así como en el documento de la lnternational Conference on Harmonization (Conferencia Internacional sobre Armonización o ICH), Validación de Procedimien-
USP 39
Información General/ (1092) Procedimiento de Disolución 1 317
tos Analíticos (18) (disponible sólo en inglés). Esta sección trata la validación de ambas partes del procedimiento de disolución, el complemento analítico y la etapa de disolución. La etapa de disolución es la liberación del fármaco en el medio de disolución y el muestreo. El complemento analítico se define en la sección 3. Complemento Analítico. La validación del complemento analítico evaluará los atributos, la linealidad y el intervalo, la precisión, la especificidad, la exactitud/recuperación, la robustez y la estabilidad de las soluciones muestra y estándar. La validación de la etapa de disolución incluirá la evaluación de la precisión y la robustez de la preparación de la muestra de disolución. La validación del complemento analítico se lleva a cabo usando una solución estándar o un placebo con cantidades agregadas conocidas, o a través del método de adición estándar (cantidades agregadas conocidas del medicamento según lo descrito en la sección Exactitud del capítulo (1225)), según se especifica en las secciones siguientes. La validación de la etapa de disolución requiere el uso de una forma farmacéutica bien caracterizada (p.ej., que tenga una estrecha uniformidad de contenido y un desempeño uniforme. Dependiendo del parámetro de interés, la validación de la manipulación de la muestra y del procedimiento analítico puede llevarse a cabo in situ, p.ej., dentro del vaso de disolución. Los parámetros de validación tratados y el grado de la validación pueden variar, dependiendo de la fase de desarrollo o del uso pretendido de los datos. Los criterios de aceptación se presentan sólo como guías y pueden diferir para algunos productos. Los fabricantes deben documentar los criterios de aceptación apropiados para sus productos en los Procedimientos Operativos Estándar pertinentes o en los protocolos de validación. Otras consideraciones pueden ser importantes para formas farmacéuticas especiales. Los estudios de validación deben realizarse en todo el intervalo de los tiempos de muestreo del perfil. En el caso de productos que contengan más de un ingrediente activo, se debe validar el procedimiento de disolución para cada ingrediente activo. Se espera que las investigaciones sobre la aptitud del filtro y el potencial de adsorción del vidrio hayan sido realizadas con anterioridad (ver 1.1 Compatibilidad del Filtro). La validación de dichas evaluaciones puede realizarse durante los experimentos de recuperación de cantidades agregadas conocidas.
5.1 Especificidad/Interferencia del Placebo Es necesario para demostrar que los resultados no están indebidamente afectados por los ingredientes del placebo, otros fármacos activos o productos de degradación. El placebo está constituido por todos los excipientes y recubrimientos, incluyendo tintas y cubiertas de cápsulas cuando corresponda, sin el ingrediente activo. La interferencia del placebo puede evaluarse usando un placebo con cantidades agregadas conocidas que se prepara pesando las muestras de la mezcla del placebo y disolviéndolas o dispersándolas en el medio de disolución a las concentraciones que se pueden encontrar durante la prueba, y agregando una cantidad conocida del fármaco en solución. Puede ser preferible realizar este experimento a 37°, comparando la solución con una solución estándar a la concentración que se espera encontrar durante el análisis, usando la fórmula: Resultado= (Ap/A 5) x C5 x (VIL) x 100 Ap = absorbancia del placebo
A5 = absorbancia del estándar C5 = concentración del estándar (mg/mL) V= volumen de medio (mL) L = cantidad declarada en la etiqueta (mg) La interferencia no debe exceder 2%. Se debe tomar en cuenta que para productos de liberación prolongada, puede ser más apropiado usar una versión del placebo de la forma farmacéutica terminada que las mezclas, ya que la formulación del placebo liberará varios excipientes de cierta manera que representará mejor al producto que una simple mezcla de excipientes. En este caso, puede ser apropiado evaluar la interferencia potencial en puntos múltiples de muestreo en el perfil de liberación, donde la peor interferencia se espera en los puntos de muestreo más avanzados. El blanco es el medio de disolución sin la muestra disuelta y se trata de la misma manera que la muestra. Se debe evaluar el efecto de la absorbancia del blanco a la longitud de onda analítica. En la mayoría de los casos, la absorbancia del medio de disolución usado como blanco puede no exceder de 1% de la solución estándar a la concentración usada para el análisis. Los valores >1% deben evaluarse caso por caso. Si la interferencia del placebo excede de 2%, puede ser necesario modificar el método. Las posibles modificaciones incluyen seleccionar otra longitud de onda, restar la línea base usando una longitud de onda mayor, transformar los valores de absorbancia (p.ej., primera derivada) y usar una técnica analítica alternativa tal como HPLC. Podrían aceptarse otros medios para minimizar la interferencia del placebo si se justifican apropiadamente. Cuando están presentes otros fármacos activos o hay niveles significativos de degradación, es necesario demostrar que estos no afectan demasiado los resultados. Un procedimiento para lograrlo es medir la matriz en presencia y ausencia del otro fármaco activo o producto de degradación: ninguna interferencia debe exceder de 2%. Se pueden usar enfoques similares cuando se usan otras técnicas para el terminado analítico.
5.2 Linealidad e Intervalo La linealidad se establece habitualmente preparando soluciones del fármaco, que abarcan desde una concentración inferior a la más baja concentración esperada hasta una concentración mayor de la concentración más alta durante la liberación. Las soluciones pueden prepararse usando una solución estándar o una solución con cantidades agregadas conocidas, o por el mé-
1318 (1092) Procedimiento de Disolución / Información General
USP 39
todo de adición de estándar. Normalmente se usa un mínimo de cinco concentraciones (ver el capítulo (1225)). En lo posible, las soluciones normalmente se preparan a partir de una solución madre común. El intervalo de concentración no puede exceder los límites de linealidad del método, incluyendo el instrumento. Para mejorar la solubilidad del fármaco se pueden emplear disolventes orgánicos en la preparación de las soluciones estándar de linealidad; sin embargo, a menos que se valide, no se debe usar más de 5% (v/v) del disolvente orgánico en la solución final. La linealidad habitualmente se calcula utilizando un programa de regresión de cuadrados mínimos adecuado. Típicamente, el cuadrado del coeficiente de correlación (r2 ~ 0,98) demuestra linealidad. Además, la ordenada al origen y no debe ser significativamente diferente de cero. El intervalo del procedimiento es el intervalo entre las concentraciones superior e inferior del fármaco (incluyendo estos niveles) que ha demostrado tener un nivel de precisión, exactitud y linealidad adecuado usando el procedimiento tal como se describe.
5.3 Exactitud/Recuperación La exactitud y la recuperación por lo general se establecen al preparar muestras múltiples que contengan el fármaco y cualquier otro ingrediente presente en la forma farmacéutica (p.ej., excipientes, materiales de recubrimiento, cubiertas de cápsulas) con concentraciones que varían de concentraciones menores que el rango más bajo esperado hasta concentraciones mayores que las más altas concentraciones durante la liberación del fármaco. La exactitud y la recuperación se pueden lograr conjuntamente con la determinación de la linealidad. También se puede usar el método de adición de estándar. Antes de esta actividad, se espera que ya se haya llevado a cabo la evaluación del filtro y que también se haya investigado y descartado la adsorción del fármaco en el vidrio. Las soluciones individuales pueden prepararse directamente en el medio de disolución. Alternativamente, para mejorar la solubilidad del medicamento, puede ser apropiado preparar una solución madre disolviendo el fármaco en una pequeña cantidad de disolvente orgánico (generalmente que no exceda de 5%) y diluyendo a la concentración final con el medio de disolución. Se puede usar una cantidad de solución madre equivalente a la cantidad declarada, específicamente elegida, en lugar del fármaco en polvo. De la misma manera, en el caso de concentraciones muy bajas, puede ser más apropiado preparar una solución madre que intentar pesar cantidades muy pequeñas. La medida de recuperación se encuentra normalmente entre 95%-105% de la cantidad agregada. Cuando existen múltiples concentraciones puede ser útil emplear matrices o selección de extremos (bracketing). Un caso especial para la validación es el procedimiento de la Etapa Ácida descrito en el capítulo (711 ), Formas Farmacéuticas de Liberación Retardada. Se debe validar el límite de no más de 10%. Los experimentos de recuperación para los fármacos que tienen baja solubilidad en medios ácidos pueden presentar desafíos o ser imposibles de realizar, y puede ser necesario tratarlos caso por caso. Si el compuesto se degrada en ácido, el experimento de validación debe tener en cuenta este factor.
5.4 Precisión 5.4.1 REPETIBILIDAD DEL ANÁLISIS En el caso del terminado analítico, la repetibilidad se evalúa obteniendo mediciones repetidas de las soluciones estándar y/o de las soluciones placebo con cantidades agregadas conocidas/de adición de estándar. Se puede medir mediante el cálculo de la desviación estándar relativa de múltiples inyecciones o lecturas espectrofotométricas para cada solución estándar o usando la exactitud o los datos de linealidad. La guía de la ICH, Validation of Analytical Procedures: Methodology (Validación de Procedimientos Analíticos: Metodología), recomienda evaluar la repetibilidad usando un mínimo de nueve determinaciones que abarquen el intervalo especificado para el procedimiento (es decir, tres concentraciones y tres determinaciones repetidas de cada concentración) o usando un mínimo de seis determinaciones al 100% de la concentración de prueba. Un criterio de aceptación típico es una desviación estándar relativa de <2%. La demostración de la repetibilidad para la etapa de disolución se lleva a cabo realizando la etapa de disolución en unidades separadas de una forma farmacéutica bien caracterizada o de un compuesto equivalente.
5.4.2 PRECISIÓN INTERMEDIA/TOLERANCIA O FORTALEZA Si se asume que el factor que más contribuye a la varianza proviene de la etapa de disolución, se puede evaluar la precisión intermedia para determinar los efectos de los eventos aleatorios sobre la precisión del procedimiento de disolución. Normalmente, esta evaluación se realiza en una etapa avanzada del desarrollo de la forma farmacéutica y es necesaria para la validación completa del método. Para muchos procedimientos analíticos, la precisión intermedia por lo regular se evalúa determinando las contribuciones a la varianza y, posiblemente, mediante una comparación de medias. Para la evaluación de la precisión intermedia, se recomienda el uso de un diseño experimental de matriz debido a que pueden observarse efectos de la interacción con mayor claridad en comparación con un experimento con una sola variable. En el análisis de disolución, a menudo se adopta un enfoque de tolerancia o fortaleza que compara por sí mismo las medias para investigar los factores que contribuyen a la precisión intermedia. La tolerancia o fortaleza puede evaluarse en el intervalo completo de las concentraciones del producto. Las variaciones típicas a considerar en un estudio incluyen días, analistas y equipos diferentes. De ser posible, se pue-
USP 39
Información General/ (1092) Procedimiento de Disolución 1319
de evaluar la tolerancia o fortaleza usando un lote de producto cuando se haya caracterizado adecuadamente, por ejemplo, cuando se cuenta con una estrecha uniformidad de contenido y un desempeño uniforme; sin embargo, cuando este tipo de lote no esté disponible, se puede usar un placebo previamente medido con ingredientes activos para investigar la precisión intermedia. El uso de dicho placebo con cantidades agregadas conocidas sustentaría adicionalmente la evaluación de la contribución del complemento analítico con la variabilidad observada de los resultados. El procedimiento de disolución en el mismo lote de la forma farmacéutica bien caracterizada puede ser llevado a cabo por al menos dos analistas diferentes del mismo laboratorio, en donde cada analista prepara las soluciones estándar y el medio, y sigue el procedimiento definido de extracción/cuantificación. Por lo general, los analistas utilizan diferentes baños de disolución, equipos de espectrofotometría o HPLC (incluyendo columnas) y muestreadores automáticos así como realizan el análisis en diferentes días. Cuando resulta pertinente para el producto, se deben evaluar los perfiles completos. Es posible que este procedimiento no sea necesario para cada concentración; puede ser aceptable la selección de extremos sólo con las concentraciones alta y baja. Se deben determinar previamente los criterios de aceptación para la precisión intermedia o para la tolerancia o fortaleza. Un criterio de aceptación típico para la tolerancia o fortaleza es que la diferencia en el valor medio entre los resultados de disolución en cualquiera de las dos condiciones que empleen la misma concentración no exceda un 10% absoluto en tiempos de muestreo con <85% disuelto y no excede de 5% para los tiempos de muestreo >85%. Los criterios de aceptación pueden referirse a un producto específico y pueden emplearse otros límites y pruebas estadísticas. 5.4.3 REPRODUCIBILIDAD La reproducibilidad sigue los conceptos generales de la precisión intermedia, pero es llevada a cabo por dos analistas diferentes en distintos laboratorios.
5.5 Robustez La evaluación de la robustez, es decir el estudio del efecto de cambios pequeños y deliberados en las condiciones de disolución, por lo general se hace en las etapas avanzadas del desarrollo del medicamento y es un requisito para la validación completa del método. La evaluación de robustez se lleva a cabo empleando un lote bien caracterizado de un medicamento con estrecha uniformidad de contenido y desempeño uniforme. El número de determinaciones repetidas (por lo regular 3 ó 6) depende de la precisión intermedia. Se deben evaluar todos los puntos del perfil. La selección de los parámetros sujetos a variaciones depende del procedimiento de disolución y del tipo de análisis, y pueden incluir composición del medio (p.ej., concentración del surfactante o solución amortiguadora, pH, desgasificación) volumen, velocidad de agitación, tiempo de muestreo y temperatura. El análisis estadístico de los datos generados ayudará a determinar el grado al que deben controlarse los parámetros en el método. La evaluación de robustez está bien adaptada a las metodologías de Diseño de Experimentos para investigar de manera eficiente el impacto de los parámetros individuales y/o su interacción. El capítulo (1225) hace referencia a la robustez del complemento analítico. Los parámetros de los análisis de HPLC pueden incluir la composición de la fase móvil (porcentaje de componente orgánico, concentración de la solución amortiguadora, pH), velocidad de flujo, longitud de onda, temperatura de la columna y múltiples columnas (del mismo tipo). La longitud de onda puede variar para los análisis espectrofotométricos.
5.6 Estabilidad de la Solución Muestra y la Solución Estándar La solución estándar se almacena en condiciones que aseguren la estabilidad. La estabilidad de la solución estándar se analiza durante un periodo específico (que es al menos la duración de todo el procedimiento de disolución), usando una solución estándar recientemente preparada en cada intervalo para realizar la comparación. El intervalo aceptable para la estabilidad de la solución estándar se ve influenciado por la concentración y por lo general se encuentra entre 98% y 102% a la concentración final esperada. La solución muestra usualmente se almacena a temperatura ambiente. La muestra se analiza durante un periodo específico usando la respuesta de la solución de muestra original para realizar la comparación. El intervalo típico aceptable para la estabilidad de la solución muestra puede encontrarse entre 98% y 102% comparado con el análisis inicial de las soluciones de muestra. Si la solución no es estable, los aspectos a considerar incluyen la temperatura (puede requerirse refrigeración), protección de la luz y material de los envases (plástico o vidrio). El procedimiento puede indicar que los estándares y las muestras requieren ser analizados dentro de un periodo durante el cual se demuestre la estabilidad aceptable de la solución muestra y de la solución estándar.
5.7 Consideraciones para la Automatización Los métodos automatizados ofrecen oportunidades para incrementar la precisión y la reproducibilidad; no obstante, hay posibilidad de introducción de sesgo. La sonda de muestreo y las líneas de la muestra requieren atención particular pues son lu-
1320 (1092) Procedimiento de Disolución / Información General
USP 39
gares en los que pueden presentarse imprecisiones. Las desviaciones del procedimiento descritas en el capítulo (711 ), tales como usar sondas de muestreo que se mantienen en el vaso durante el ensayo, o muestrear a través del elemento de agitación del eje (muestreo en el eje hueco), o sondas de fibra óptica, deben validarse. Otros aspectos de la validación de la automatización pueden incluir el arrastre de residuos del fármaco, los efectos de mantener la sonda en el vaso durante el ensayo, adsorción del fármaco y los ciclos de limpieza y/o enjuague. La validación se realiza usando el sistema de disolución automatizado e incluye los materiales. Por lo tanto, cualquier cambio en los materiales requerirá demostrar la aptitud basándose en los atributos de validación que sufren algún impacto por el cambio. Se deben comparar los procedimientos manuales con los automatizados para evaluar la intercambiabilidad de los procedimientos. Esto se lleva a cabo realizando dos corridas automatizadas en cada concentración de dosificación, usando todos los puntos de muestreo, y comparándolas con corridas muestreadas manualmente de las mismas muestras. No es posible determinar el efecto de la sonda que se mantiene en el vaso durante el análisis mediante el muestreo manual ni automatizado del mismo vaso. Los resultados deben ser coherentes con los requisitos para la precisión intermedia si se considera que los procedimientos son intercambiables. La diferencia en el valor medio entre los resultados de disolución en cualquiera de las dos condiciones que empleen la misma concentración no debe exceder un 10% absoluto en tiempos de muestreo con <85% disuelto, ni exceder de 5% para los tiempos de muestreo >85%. Los criterios de aceptación pueden referirse a un producto específico y pueden emplearse otros límites y pruebas estadísticas. La revalidación puede ser necesaria cuando el sistema automatizado se usa con diferentes formulaciones debido a la interacción con excipientes. Los medios de disolución que contienen surfactantes o lípidos pueden requerir validaciones adicionales.
6. CRITERIOS DE ACEPTACIÓN Los criterios de aceptación deben ser congruentes con los datos históricos de liberación o estabilidad. Existe la expectativa de que las partidas aceptables darán resultados que caerán dentro de los criterios de aceptación y de que todas las partidas fabricadas deberán presentar un comportamiento de disolución similar, enfatizando así la importancia de contar con un método que no presente una alta variabilidad. Por lo tanto, los criterios de aceptación y los puntos de muestreo deben discriminar entre partidas aceptables e inaceptables. Asimismo, los resultados de la prueba de disolución se consideran un vínculo con las partidas clave para ensayos clínicos. Cuando se ha demostrado que los cambios en la velocidad de disolución afectan la biodisponibilidad de manera significativa, la prueba de disolución y el criterio de aceptación deben distinguir entre partidas con una biodisponibilidad inaceptable (19). Asimismo, cuando los cambios en la formulación y en el proceso de fabricación afectan significativamente la disolución y estos no se controlen mediante otro aspecto de la especificación, la prueba y los criterios de disolución deben distinguir dichos cambios.
6.1 Formas Farmacéuticas de Liberación Inmediata Aunque los datos de liberación y de estabilidad se recopilan durante el desarrollo de la forma farmacéutica, es común registrar todo el perfil de disolución o la cantidad de fármaco disuelta en intervalos específicos, tales como 1O; 20; 30; 40; 50 y 60 minutos o 15; 30; 45 y 60 minutos. En el registro, la disolución para una tableta de liberación inmediata por lo regular se convierte en una prueba de un solo punto. El criterio de aceptación y el tiempo de la prueba se establecen evaluando los datos del perfil de disolución. El criterio de aceptación para una prueba de disolución es una función Q, que se expresa como la cantidad disuelta de fármaco, como porcentaje de la cantidad declarada, en un tiempo especificado. Los valores Q típicos están en el intervalo de 75%-80% disuelto. Por lo general, no se usan valores Q que superan el 80% puesto que se tienen que adaptar a las necesidades de los intervalos de valoración y la uniformidad del contenido.
6.2 Formas Farmacéuticas de Liberación Retardada La discusión sobre la disolución de formas farmacéuticas de liberación retardada del capítulo (711) se enfoca en las formas farmacéuticas con recubrimiento entérico, que son la forma farmacéutica de liberación retardada más común. Una prueba de disolución para una tableta o cápsula de liberación retardada es una prueba de dos partes, cada una de las cuales tiene criterios de aceptación. Primero, las formas farmacéuticas se exponen a un medio ácido, seguido de la exposición a un medio amortiguado. Para asegurar que el recubrimiento entérico tiene un desempeño apropiado, se indica un criterio de aceptación de "no más de" en el capítulo (711) para la etapa ácida. El medio usado para una etapa ácida por lo regular es HCI O, 1 N y la duración de esta etapa es por lo general 2 horas. Posteriormente, las formas farmacéuticas se exponen a un medio amortiguado, por lo general solución amortiguadora de fosfato 0,05 M a un pH 6,8, aunque se pueden usar otras soluciones amortiguadoras y pH esperados siempre que se justifique. La duración de la etapa amortiguada es por lo regular 45 minutos para pruebas farmacopeicas, aunque dicha duración puede variar dependiendo del medicamento. Al igual que con las formas farmacéuticas de liberación inmediata, se determina un valor Q y un tiempo de muestreo evaluando todo el perfil de disolución.
USP 39
Información General/ (1092) Procedimiento de Disolución 1 321
6.3 Formas Farmacéuticas de Liberación Prolongada Una prueba de disolución para una forma farmacéutica de liberación prolongada por lo general es similar a la usada para los medicamentos de liberación inmediata o retardada, excepto que la duración de la prueba es mayor y que se especifican al menos tres tiempos de muestreo para propósitos farmacopeicos (20). Pueden necesitarse tiempos de muestreo adicionales para la aprobación del fármaco. Se elige un tiempo de muestreo inicial, habitualmente de 1-2 horas, para demostrar que improbable que se produzca la liberación masiva. Se elige un tiempo de muestreo intermedio para definir el perfil de liberación in vitro de la forma farmacéutica y se elige un tiempo final para mostrar básicamente la liberación completa del fármaco (20). Los tiempos de muestreo para la prueba deben determinarse evaluando el perfil de disolución a lo largo del tiempo de la prueba deseado. A menudo, se obtienen tiempos de muestreo adicionales durante el desarrollo de la forma farmacéutica para ayudar a seleccionar los tiempos de muestreo apropiados para la especificación o monografía. Al igual que con los medicamentos de liberación inmediata o retardada, los criterios de aceptación y los tiempos de muestreo para un medicamento de liber(!ción prolongada deben discriminar entre partidas aceptables e inaceptables. Los criterios de aceptación para la primera etapa de análisis (L1 ) deben establecerse con respecto a los datos de la partida disponibles (7 9,20). Si se cuenta con datos sobre biodisponibilidad en humanos para formulaciones que presentan diferentes velocidades de liberación, entonces se puede usar una relación in vitro/in vivo para establecer los criterios de aceptación (7 9,20). Los criterios de aceptación para la segunda (L2) y tercera (L 3) etapas se derivan de los criterios de L1 usando la Tabla de Aceptación 2 del capítulo (711 ).
6.4 Múltiples Pruebas de Disolución Por lo regular, las monografías para formas farmacéuticas de liberación prolongada contienen múltiples pruebas de disolución que representan productos específicos. De acuerdo con las Advertencias y Requisitos Generales 4.10.1 O, la prueba apropiada, cuando se usa una diferente a la Prueba 7, se indica en el etiquetado del producto. Por ejemplo, la monografía USP de Clorhidrato de Oxicodona, Tabletas de Liberación Prolongada (2 7) cita dos pruebas de disolución, cada una de las cuales tiene tres o cuatro tiempos de muestreo. Si las Tabletas se analizan usando la Prueba 2 y los resultados de la disolución cumplen con los criterios provistos en la monografía, el etiquetado de las Tabletas puede indicar que las Tabletas cumplen con la Prueba de Disolución 2 de la USP. También se pueden encontrar múltiples pruebas de disolución en las monografías para formas farmacéuticas de liberación inmediata y retardada. Por ejemplo, las monografías USP de Levotiroxina Sódica, Tabletas y Pantoprazol Sódico, Tabletas de Liberación Retardada proveen cuatro pruebas de disolución (22,23).
6.5 Interpretación de los Resultados de la Disolución La sección Interpretación del capítulo (711) trata las formas farmacéuticas de liberación inmediata, retardada y prolongada. En este capítulo se amplía la discusión sobre cada uno de estos patrones de liberación con ejemplos para ayudar en la aplicación de los criterios durante varias etapas del análisis. Entender la forma en que se aplican estos criterios ayudará a establecer criterios de aceptación apropiados.
6.5.1 FORMAS FARMACÉUTICAS DE LIBERACIÓN INMEDIATA Una vez que se ha establecido el valor Q, la prueba de disolución es una prueba por etapas de tres niveles. En el primer nivel del análisis denominado S1, se analizan seis formas farmacéuticas. Cada forma farmacéutica debe presentar una cantidad Q + 5% (puntos porcentuales absolutos) disuelta en un tiempo especificado. Por ejemplo, el tiempo y las tolerancias en una monografía serían: Tiempo: 30 min Tolerancias: No menos de 80% (Q) de la cantidad declarada del "fármaco" Si el valor Q para una tableta de liberación inmediata con una cantidad declarada (LC, por sus siglas en inglés) de 200 mg se especifica en 80% y el tiempo de muestreo es 30 minutos, entonces se debe disolver no menos de 85% de la cantidad declarada (170 mg) del fármaco en cada tableta a los 30 minutos. Si no se cumple este criterio, entonces deben analizarse 6 tabletas adicionales en el nivel 2 (S 2). Para pasar el criterio de aceptación S2, el promedio de las 12 tabletas debe ser igual o mayor que el valor Q (80% de la cantidad declarada; 160 mg en el ejemplo anterior), y ninguna tableta debe tener un valor menor que Q- 15% (65% de la cantidad declarada; 130 mg en el ejemplo anterior). Si no se cumplen estos criterios, entonces se debe llevar a cabo un análisis en el nivel 3 o S3 analizando 12 tabletas adicionales. Para pasar S3, el promedio de las 24 tabletas debe ser igual o mayor que el valor Q (80% de la cantidad declarada; 160 mg en el ejemplo anterior). Además, se deben cumplir dos criterios adicionales: 1) no más de 2 tabletas tienen un valor menor que Q - 15% (65% de la cantidad declarada; 130 mg en el ejemplo anterior) y 2) ninguna tableta tiene un valor menor que Q25% disuelto (55% de la cantidad declarada; 11 O mg en el ejemplo anterior.)
1 322 (1092) Procedimiento de Disolución / Información General
USP 39
6.5.2 FORMAS FARMACÉUTICAS DE LIBERACIÓN RETARDADA Al final de la etapa ácida, se analiza una alícuota del medio ácido a partir de cada vaso. Para la etapa ácida, los criterios de aceptación tienen tres niveles. El análisis de nivel 1 (A,) se aprueba cuando ningún valor individual excede del 10% de disolución. Si no se cumplen los criterios A,, entonces la prueba de disolución se lleva a cabo en 6 formas farmacéuticas adicionales para el análisis del nivel 2 (A2 ). Los criterios del nivel A2 se aprueban si el promedio de las 12 formas farmacéuticas en la etapa ácida es no más de 10% disuelto y si ninguna forma farmacéutica individual es más de 25% disuelto. Si no se cumplen los criterios A2 , se lleva a cabo el análisis de nivel 3. Los criterios A 3 se aprueban si el promedio de las 24 formas farmacéuticas en la etapa ácida es no más de 10% disuelto y si ninguna tableta individual es más de 25% disuelto. Para el caso especial en el que la solubilidad del fármaco en un medio ácido debido a la conversión al ácido libre es demasiado baja para sustentar un criterio de aceptación de no más de 10%, se debe exponer el medicamento a la etapa ácida durante el tiempo definido y luego exponerlo al medio amortiguado. Se pueden justificar criterios de aceptación alternativos para la etapa ácida basándose en la solubilidad del fármaco. Para formas farmacéuticas de liberación retardada, el porcentaje total disuelto se determina sumando las cantidades medidas en las fases ácida y amortiguada para cada forma farmacéutica individual. Estos valores calculados se comparan posteriormente con los criterios de aceptación de la etapa correspondiente {B 1, B2 y 83) que se basan en un valor Q. Los criterios B1, B2 y 8 3 son idénticos a aquellos para los criterios de liberación inmediata S2 S3 •
s,, y
6.5.3 FORMAS FARMACÉUTICAS DE LIBERACIÓN PROLONGADA En el siguiente ejemplo hipotético, que se usa para describir los criterios para una forma farmacéutica de liberación prolongada, los tiempos de muestreo son 1; 4 y 8 horas. El intervalo de aceptación para cada tiempo de muestreo es el siguiente: • Entre 24% y 44% disuelto de la cantidad declarada de fármaco en 1 hora • Entre 56% y 76% disuelto de la cantidad declarada de fármaco en 4 horas • No menos de 85% disuelto de la cantidad declarada de fármaco en 8 horas. Los intervalos de aceptación a menudo se expresan en forma de tabla en los compendios USP-NF (ver la Tabla 3): Tabla 3 Criterios L•1 Tiempo (h)
Cantidad Disuelta
1
24%--44%
4
56%-76%
8
No menos de 85%
Se analizan seis tabletas en el Nivel 1 {L1); los criterios de aceptación se cumplen si ningún valor individual está fuera de cada uno de los intervalos declarados, y ningún valor individual es menor que el porcentaje especificado para el tiempo final de muestro. Si no se cumplen los criterios L1, entonces se analizan 6 tabletas adicionales en el nivel 2 (L2 ). Los criterios L2 se cumplen cuando se satisfacen las siguientes tres condiciones: 1. El valor promedio de las 12 tabletas está dentro de cada uno de los intervalos declarados y es no menor que el intervalo establecido del tiempo final de muestreo. 2. Ninguna de las 12 tabletas está fuera por> 10% del contenido declarado en cada uno de los intervalos establecidos. 3. Ninguna de las 12 tabletas está fuera por> 10% por debajo del contenido declarado de la cantidad establecida en el tiempo final de la prueba. Para el ejemplo anterior, los criterios de aceptación L2 para las 12 tabletas (ver la Tabla 4) son los siguientes: Tabla 4. Criterios L2 1h
4h
8h
Promedio
24%--44%
56%-76%
No menos de 85%
Tabletas individuales
14o/o-54%
46%-86%
No menos de 75%
Si no se cumplen los criterios L2, entonces se analizan 12 tabletas adicionales en el nivel 3 (L 3). Los criterios L3 se cumplen cuando se satisfacen las siguientes cinco condiciones: 1. El valor promedio de las 24 tabletas está dentro de cada uno de los intervalos establecidos y es no menor que el intervalo establecido en el tiempo final de muestreo. 2. No más de 2 de las 24 tabletas están fuera por > 10% del contenido declarado en cada uno de los intervalos establecidos. 3. No más de 2 de las 24 tabletas están fuera por> 10% por debajo del contenido declarado de la cantidad establecida en el tiempo final de muestreo. 4. Ninguna de las 24 tabletas está fuera por >20% del contenido declarado en cada uno de los intervalos establecidos. 5. Ninguna de las 24 tabletas está fuera por >20% por debajo del contenido declarado de la cantidad establecida en el tiempo final de la prueba. Los criterios de aceptación L3 para las 24 tabletas en el ejemplo anterior se resumen en la Tabla 5:
Información General/ (1092) Procedimiento de Disolución 1 323
USP 39
Tabla 5 Criterios L., Promedio
Tabletas individuales
1h
4h
24%-44%
56%-76%
No menos de 85%
8h
No más de 2 tabletas están fuera del intervalo de 14%-54%, y ninguna tableta individual está fuera del intervalo de 4%-64%
No más de 2 tabletas están fuera del intervalo de 46%-86%, y ninguna tableta individual está fuera del intervalo de 36%-96%
No más de 2 tabletas libera <75% y ninguna tableta individual libera
<65%
REFERENCIAS 1. FDA. Recommended dissolution methods. http://www.accessdata.fda.gov/scripts/cder/dissolution/index.cfm. Consultado el 1O de septiembre de 2014. 2. Mihali C, Oprea G, Cical E. Determination of critica! micelar concentration of anionic surfactants using surfactants-sensible electrodes. Chem Bu// "Politehnica" Univ (Timi§oara). 2008; 53(67):1-2. 3. Stippler ES. Biorelevant dissolution test methods to assess bioequivalence of drug products [PhD dissertation]. Frankfurt: Johann Wolfgang Goethe University; 2004. 4. Koga K, Kusawake Y, lto Y, Sugioka N, Shibata N, Takeda K. Enhancing mechanism of Labrasol on intestinal membrane permeability of the hydrophilic drug gentamicin sulfate. Eur / Pharm Biopharm. 2006; 64(1 ):82-91. 5. Neugebauer JM. Detergents: an overview. Methods Enzymol. 1990; 182:239-253. 6. Harris ELV, Angal S, editors. Protein Purification Applications: A Practica/ Approach. Oxford, England: IRL Press at Oxford University Press; 1990; 71. 7. Helenius A, McCaslin DR, Fries E, Tanford C. Properties of detergents. Methods Enzymol. 1979; 56:734-749. 8. Kassel D. Properties of cremophore EL micelles probed by fluorescence. Photochem Photobiol. 1992; 56(4):447-451. 9. Rowe RC, Sheskey PJ, Quinn ME, editors. Handbook of Pharmaceutical Excipients. 6th ed. London: APhA; 2003. 1O. Rosenthal KS, Koussale F. Critica! micelle concentration determination of non-ionic detergents with coomassie brilliant blue G-250. Anal Chem. 1983; 55:1115-1117. 11. Herrman KW. Non-ionic-cationic micellar properties of dimethyldodecylamine oxide. / Phys Chem. 1962; 66:295-300. 12. Leeson LJ, Ádair D, Clevenger H, Chiang N. The in vitro development of extended-release salid oral dosage forms. / Pharmacokinet Biopharm. 1985; 13(5):493-514. 13. Dressman JB, Amidon GL, Reppas C, Shah VP. Dissolution testing as a prognostic tool for oral drug absorption: immediate release dosage forms. Pharm Res. 1998; 15(1 ):11-22. 14. FDA. Guidance for industry. Waiver of in vivo bioavailability and bioequivalence studies for immediate-release salid oral dosage forms based on a biopharmaceutics classification system. August 2000. http://www.fda.gov/downloads/Drugs/ .. ./ Guidances/ucm070246.pdf. Consultado el 14 de junio de 2013. 15. Kakhi M. Classification of the flow regimes in the flow-through cell. Eur / Pharm Sci. 2009; 37(5):531-544. 16. FDA. Guidance for industry. Dissolution testing of immediate release salid oral dosage forms. 1997. http://www.fda.gov/ downloads/drugs/guidancecomplianceregulatoryinformation/guidances/UCM070237.pdf. Consultado el 1O de septiembre de 2014. 17. FDA. 21 CFR Part 11. April 2012. http://www.accessdata.fda.gov/scripts/cdrh/cfdocs/cfCFR/CFRSearch.cfm?CFRPart= 11. Consultado el 14 de junio de 2013. 18. ICH. Q2(Rl ). Validation of analytical procedures. 1996. http://www.ich.org/products/guidelines/quality/quality-single/ article/validation-of-analytical-procedures-text-and-methodology.html. Consultado el 17 de junio de 2013. 19. ICH. Q6A. Specifications: test procedures and acceptance criteria for new drug substances and new drug products: chemical substances. October 1999. http://www.ich.org/products/guidelines/quality/quality-single/article/specifications-test-procedures-and-acceptance-criteria-for-new-drug-substances-and-new-drug-produc.html. Consultado el 14 de junio de 2013. 20. FDA. Guidance for industry. Extended release oral dosage forms: development, evaluation, and application of in vitro/in vivo correlations. September 1997. http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatorylnformation/ Guidances/ucm070239 .pdf. Consultado el 14 de junio de 201 3. 21. USP. USP 36-NF 3 7, Oxycodone Hydrochloride Extended-Release Tablets. Rockville, MD: USP; 2013:4642-4644. 22. USP. USP 36-NF 3 7, Levothyroxine Sodium Tablets. Rockville, MD: USP; 2013:4109-411 O. 23. USP. USP 36-NF 37, Pantoprazole Sodium Oelayed-Release Tablets. Rockville, MD: USP; 2013:4682-4686.
1324 (1094) Cápsulas-Pruebas de Disolución/ Información General
USP 39
(1094) CÁPSULAS-PRUEBAS DE DISOLUCIÓN Y ATRIBUTOS DE CALIDAD RELACIONADOS 1. INTRODUCCIÓN Este capítulo de información general provee enfoques para el desarrollo de procedimientos de pruebas de disolución para cápsulas, los cuales no están incluidos en los capítulos Disolución (711 ), Liberación de Fármacos (724), Procedimiento de Disolución: Desarrollo y Validación (1092) y Desintegración y Disolución de Suplementos Dietéticos (2040). Este capítulo también trata de los atributos de calidad relacionados con las cápsulas que pueden afectar el resultado de la prueba de disolución.
1.1 Tipos de Cápsulas Las cápsulas se pueden clasificar en dos tipos principales, basándose en las características físicas de la cubierta: cápsulas blandas y cápsulas duras. Para los propósitos de este capítulo, se hace referencia a las cápsulas de cubierta blanda y a las cápsulas de cubierta dura como "de gelatina blanda" y "de gelatina dura", respectivamente. Las cápsulas de gelatina blanda tienen una cubierta más gruesa y por lo regular presentan un mayor grado de elasticidad debido a la adición de plastificante, además de que tienen un tiempo de ruptura ligeramente más prolongado en comparación con las de gelatina dura. Por comparación, las cápsulas de gelatina dura tienen una cubierta más delgada y más rígida que las de gelatina blanda. Ambos tipos de cápsulas están compuestas por un polímero, p.ej., gelatina, almidón o un derivado de celulosa tal como hipromelosa (HPMC, por sus siglas en inglés) u otros polímeros, un plastificante y agua. En el caso de las cápsulas de gelatina dura, el agua actúa como plastificante, mientras que las de gelatina blanda contienen polioles de alto punto de ebullición tales como glicerol o sorbitol como plastificantes, además de que también contienen agua. A pesar del gran número de parámetros que afectan las propiedades físicas y químicas de la cubierta, es la relación entre polímero y plastificante la que principalmente determina la rigidez, la fragilidad y el desempeño de disolución de la cubierta. Asimismo, las cápsulas se pueden caracterizar por las propiedades químicas del material de relleno (materiales de relleno hidrófobos versus materiales de relleno hidrófilos) o por las propiedades físicas del material de relleno (soluciones versus dispersiones versus sólidos). Las soluciones hidrófobas incluyen aceites sin diluir, combinaciones de aceites miscibles o ingredientes activos disueltos en vehículos oleosos. Las dispersiones hidrófobas incluyen ingredientes activos dispersos o suspendidos en aceite o en mezclas de cera y aceite. Éstas últimas, por lo regular, se denominan semisólidas. Las soluciones hidrófilas pueden ser líquidos sin diluir, combinaciones de líquidos miscibles en agua o ingredientes activos disueltos en vehículos miscibles en agua. Las dispersiones o suspensiones hidrófilas incluyen ingredientes activos dispersos o suspendidos en vehículos hidrófilos tales como polietilenglicol. Los materiales de relleno sólidos contienen mezclas de excipientes e ingredientes activos cuyas propiedades como hidrofilia/hidrofobia, polimorfismo, tamaño de partícula, entre otras, dirigen el comportamiento de la disolución.
1.2 Cuestiones de Fabricación
y Envasado que Pueden Afectar las Pruebas de Disolución
Algunas cuestiones que afectan el desarrollo de un procedimiento de disolución y del comportamiento de disolución de las cápsulas incluyen: • Las propiedades del material de la cubierta de las cápsulas • Las propiedades del material de relleno • La interacción entre el material de la cubierta de las cápsulas y el material de relleno La gelatina es un material higroscópico y su contenido de humedad afecta las propiedades de las cápsulas de gelatina dura y blanda. Debido a que algunos excipientes son agentes higroscópicos conocidos, resulta particularmente importante monitorear las propiedades mecánicas de las cápsulas de gelatina almacenadas en diversas condiciones de temperatura y humedad relativa. Los factores que pueden afectar las propiedades de las cápsulas incluyen: el intercambio de humedad entre la cubierta y el material de relleno, el cual potencialmente podría generar fragilidad en la cubierta de gelatina; y las interacciones químicas entre el material de relleno y la gelatina, las cuales pueden resultar en entrecruzamientos de la gelatina. Durante el desarrollo del producto, se deben investigar el potencial de impurezas aldehídicas y la formación de productos de degradación así como la degradación de ingredientes activos o excipientes en la formulación, usando estudios de estabilidad (los aldehídos contribuyen al entrecruzamiento; ver la sección 2. Entrecruzamiento en Cápsulas de Gelatina). El entendimiento de las posibles rutas de la formación de aldehídos o cetonas, así como las posibles fuentes de aldehídos, ayuda a predecir el comportamiento de las cápsulas. La velocidad de enfriamiento y secado pueden modificar las características de liberación de los ingredientes activos de la matriz. Se debe investigar la posibilidad de que el ingrediente activo migre dentro de la cubierta de la cápsula principalmente cuando la cubierta de la cápsula blanda es de gelatina, debido al impacto sobre la prueba de disolución. Las cubiertas de las cápsulas pueden volverse reactivas dependiendo de las condiciones de almacenamiento. La selección del envasado y de las condiciones de almacenamiento del producto deben prevenir los efectos adversos sobre la calidad de las
USP 39
Información General/ (1094) Cápsulas-Pruebas de Disolución 1325
cápsulas. El ingreso de humedad y/u oxígeno en el empaque y a través de la cubierta de las cápsulas, así como la velocidad de ingreso, pueden afectar la vida útil final del producto. En algunos casos, un incremento en el contenido de agua de la cubierta de las cápsulas puede producir una reducción medible en el tiempo de disolución puesto que un producto humedecido puede facilitar la hidratación del polímero. Debido al contenido de agua de la cubierta de gelatina (por lo general entre 13% y 16%), este tipo de cápsula se comporta como un depósito de humedad que puede afectar la estabilidad de los ingredientes activos sensibles a la humedad. Cuando una cápsula se sumerge en un medio acuoso, el agua permea las paredes, el polímero se hidrata y la cápsula se hincha. Cuando está completamente hidratada, la cubierta comienza a disolverse. El tiempo que tarda el agua en penetrar la cubierta de las cápsulas varía, dependiendo de la naturaleza de las cubiertas de las cápsulas y de otros factores. Se ha informado que dicho tiempo es de aproximadamente 40 segundos para cápsulas de gelatina y aproximadamente 3 minutos para cápsulas de HPMC. Este retraso puede ser significativo sólo para la prueba de disolución de formas farmacéuticas de liberación inmediata, y debería tener poco o ningún impacto sobre la prueba de disolución de formulaciones de liberación modificada.
2. ENTRECRUZAMIENTO EN CÁPSULAS DE GELATINA El entrecruzamiento implica la formación de enlaces químicos más fuertes que la simple unión por medio de puentes de hidrógeno y uniones iónicas entre las cadenas de gelatina, y afecta la reversibilidad térmica de la transición de solución a gel de la gelatina en la cubierta. El entrecruzamiento puede ser ocasionado por agentes presentes en el relleno de las cápsulas que reaccionan con las moléculas de la gelatina, lo cual resulta en la formación de una película en la superficie interna de la cubierta. Con menor frecuencia, se puede formar una película en la superficie externa de la cubierta, la cual surge de los agentes reactivos presentes o que se derivan de los productos intermedios de los componentes del envase final. Una película es una membrana transparente, delgada e insoluble en agua, de proteínas entrecruzadas en la superficie interna o externa de la cápsula que impide la liberación del relleno de la cápsula. El entrecruzamiento se evidencia por la presencia de una membrana delgada o de una masa gelatinosa durante la prueba de disolución, puesto que la película misma puede ser difícil de observar. El entrecruzamiento también puede ser ocasionado por agentes o impurezas presentes en la cubierta, lo que provoca que toda la matriz de la cubierta sea insoluble en condiciones que normalmente disolverían la cubierta de la gelatina. Uno de los tipos más comunes y fuertes de entrecruzamiento implica la unión covalente entre el grupo amino de una cadena lateral de lisina de una molécula de gelatina y un grupo amino similar de otra molécula. Esta reacción, por lo general, es ocasionada por trazas de aldehídos reactivos. El formaldehído, el glutaraldehído, el glioxal y los azúcares reductores son los agentes de entrecruzamiento más comunes. La unión covalente producida por este tipo de entrecruzamiento es, a fines prácticos, irreversible, y la disolución de la cubierta debe incluir la ruptura de otros enlaces tales como la ruptura mediada por enzimas de los enlaces peptídicos en las cadenas de proteínas. La gelatina modificada por medios químicos, p.ej., mediante la adición de grupos de ácido succínico a las cadenas laterales de lisina, puede prevenir o al menos aminorar el entrecruzamiento mediado por aldehídos. Un tipo más débil de entrecruzamiento implica la formación de complejos de grupos de ácidos carboxílicos libres de dos moléculas diferentes de gelatina con iones metálicos trivalentes tales como Fe 3+ y Al3+. Estos cationes se pueden encontrar en algunas tinturas usadas como colorantes o como contaminantes de excipientes en bajo nivel. Para gelatina con una mayor consistencia Bloom (ver la sección 6.1.1 Gelatina), que por lo general se considera de mayor calidad, el entrecruzamiento se presenta con mayor facilidad puesto que se necesita una menor cantidad de enlaces para unir cadenas de gelatina de longitudes mayores. Es extremadamente importante conocer y entender la formulación del producto para identificar las posibles fuentes de agentes de entrecruzamiento y tomar medidas para eliminar o minimizar su papel en la promoción de entrecruzamientos. Dicho conocimiento puede ayudar en lo que respecta a los cambios en la formulación y/o en el material de envase posteriores a la aprobación. Las causas comunes de entrecruzamiento incluyen lo siguiente: •Aldehídos presentes en ingredientes activos, excipientes o materiales de envase (p.ej., en disolventes residuales); o que se pueden formar in situ durante el almacenamiento. •Alta humedad (que lleva a una mayor permeabilidad del oxígeno). • Sustancias que facilitan una reacción de entrecruzamiento. • Sustancias que promueven la descomposición del estabilizador en el almidón de maíz (hexametilentetramina), la cual resulta en la formación de amoníaco y formaldehído, lo que ocasiona la reacción de entrecruzamiento. •Torundas de rayón que contienen un grupo funcional de aldehído (furfural). • Polietilenglicol, el cual puede contener peróxidos y aldehídos. • Luz UV, en especial con alto calor y humedad. • Formación de aldehído promovida por temperaturas elevadas. La prueba de disolución de cápsulas entrecruzadas puede impedir o generar una liberación más lenta del fármaco. En raras ocasiones, si existen defectos en la costura de las cápsulas rellenas de líquido, la cápsula puede romperse por la costura, incluso en presencia de entrecruzamiento en la gelatina, lo que resulta en una liberación temprana del relleno de la cápsula en el medio de disolución. El grado de entrecruzamiento no es uniforme dentro de una cápsula ni entre diversas cápsulas. En consecuencia, existe una mayor variabilidad en los resultados de disolución si las cápsulas de gelatina presentan entrecruzamiento.
1326 (1094) Cápsulas-Pruebas de Disolución / Información General
USP 39
Se pueden agregar enzimas al medio de disolución para superar este problema (ver Disolución (711 )). No se deben usar enzimas si no se presenta dicha evidencia.
3. DESARROLLO DEL PROCEDIMIENTO DE DISOLUCIÓN El diseño de un procedimiento de prueba de disolución de cápsulas depende de la formulación del producto. La composición del relleno, la solubilidad de los ingredientes activos en el relleno y la dispersión del relleno en el medio de disolución influyen sobre el comportamiento de una formulación con un relleno determinado. Por ejemplo, una formulación que contenga un ingrediente activo soluble en lípidos con excipientes hidrófobos y un punto de fusión que exceda de 37º probablemente no liberará el ingrediente activo en forma de solución en medios acuosos en un lapso que responda a las expectativas para las formas farmacéuticas de liberación inmediata. Por el contrario, un ingrediente activo fácilmente miscible en agua disuelto o dispersado en una fórmula de relleno soluble o dispersable en agua a temperatura ambiente se liberará en forma de solución rápidamente después de la ruptura de la cubierta y de que la forma farmacéutica libere el material de relleno en el medio. Al desarrollar un método de disolución para un producto dado, se debe conocer el diseño específico de la formulación y el perfil de liberación esperado. La flotabilidad tiene un gran impacto sobre la liberación del relleno de las cápsulas para las formulaciones basadas en lípidos que a menudo son menos densas que los medios acuosos. Si la formulación ha sido diseñada para que sea autoemulsionable o automicroemulsionable, ésta se dispersará de manera eficiente en la mayoría de los medios acuosos. Las formulaciones como las que están compuestas simplemente por un triglicérido sin codisolvente o emulsificante adicional flotarán rápidamente hacia la superficie del medio de disolución en el vaso. En esta situación, los resultados cuantitativos de una prueba de disolución proveen la velocidad de la partición del fármaco desde esta capa flotante. La selección del aparato es quizás el paso más crítico para estos tipos de cápsulas debido a que la eficiencia con la que el contenido de las cápsulas se mezcla con los medios de disolución se ve altamente influenciada por la hidrodinámica de la agitación. Una vez que el aparato ha sido seleccionado, las otras variables que se deben tomar en cuenta para el desarrollo de una prueba de disolución son la velocidad de rotación, la velocidad de inmersion o la velocidad de flujo, el tipo y la concentración de agente tensoactivo/mejorador de solubilidad, y el volumen y pH del medio (ver los capítulos (711 ), (1092) y (2040)). Con el objetivo de guiar de mejor manera el diseño de la forma farmacéutica, puede ser útil considerar otras características del producto tales como la solubilidad de los ingredientes activos en diversos medios, la disolución intrínseca de los ingredientes activos (ver Disolución Intrínseca Aparente-Procedimientos de Pruebas de Disolución para Disco Rotatorio y Disco Estacionario (1087)), la capacidad de dispersión, el tamaño de los glóbulos para emulsiones, la formación de micelas, la digestión, la precipitación durante la dilución en el medio, los estudios de comportamiento de fase y las pruebas de estallido para detectar el entrecruzamiento de la gelatina. La prueba de ruptura puede ser una herramienta útil en las etapas tempranas del desarrollo y la evaluación de la formulación, en especial si el ingrediente activo pertenece a la Clase 1 del Sistema de Clasificación de Biofarmacéuticos (Biopharmaceutics Classification System Class 1) (ver FDA Guidance for lndustry-Waiver of In vivo Bioavailability and Bioequivalence Studies for lmmediate-Release So/id Oral Dosage Forms Based on a Biopharmaceutics Classification System [Guía para la industria de la FDA-Exención de Estudios de Biodisponibilidad y Bioequivalencia In Vivo para Formas Farmacéuticas Sólidas Orales de Liberación Inmediata Basándose en el Sistema de Clasificación de Biofarmacéuticos]) y está formulado en un relleno miscible en agua. Para dicho propósito, se considera que la ruptura ocurre cuando la cubierta de la cápsula se fisura, exponiendo el contenido del relleno. Si la ruptura de la cubierta de la cápsula se puede correlacionar con los datos de disolución, entonces se puede explorar como una posible alternativa a la prueba de disolución.
3.1 Aparato Al igual que con otras formas farmacéuticas sólidas orales, el Aparato 7 de la USP (canastilla), el Aparato 2 de la USP (paletas), el Aparato 3 de la USP (cilindro oscilante) y el Aparato 4 de la USP (celda de flujo) son los aparatos que se seleccionan con mayor regularidad para la disolución de cápsulas (ver los capítulos (711) y (2040)). No obstante, al seleccionar y usar los aparatos de disolución para las cápsulas se deben considerar los diversos beneficios y desventajas específicos: • Las cápsulas pueden rellenarse con un material que tenga un peso específico menor que el del agua. Por ende, las cápsulas pueden flotar en un medio de disolución acuoso; • En lugar de disolverse por completo durante la prueba de disolución, la cubierta de la cápsula puede ablandarse y desintegrarse formando una masa cerosa o pegajosa que se puede adherir a cualquier punto en el vaso de disolución y en áreas diferentes en vasos diferentes, generando una alta variabilidad en los resultados. • El material de relleno de las cápsulas puede formar una película en la superficie del medio de disolución durante el transcurso de la prueba. El proceso de disolución de las cápsulas incluye tres etapas: (1) ruptura de la cubierta de las cápsulas, (2) liberación y dispersión del material de relleno de las cápsulas y (3) disolución de los ingredientes activos en el medio. Cada aparato de disolución previamente referido puede lograr estas tres etapas, pero pueden ocasionar un efecto hidrodinámico diferente sobre las cápsulas al igual que en cualquier otra forma farmacéutica.
USP 39
Información General/ (1094) Cápsulas-Pruebas de Disolución 1327
3.1.1 APARATO 1 DE LA USP (CANASTILLA) Este aparato tiene la ventaja de encerrar las cápsulas, evitando que floten libremente en el medio. No obstante, las canastillas pueden no ser adecuadas para ciertas cápsulas. A medida que la cápsula se rompe, el material de la cubierta de la cápsula puede obstruir la malla de la canastilla, mientras que para materiales de relleno hidrófobos, la fase oleosa liberada de la cápsula puede no dispersarse en la canastilla en forma de gotitas lo suficientemente finas para pasar de manera eficiente a través de la malla. Puede ser necesaria una malla de mayor tamaño para superar estas limitaciones. 3.1.2 APARATO 2 DE LA USP (PALETAS) Este aparato no tiene una malla que se pueda obstruir, pero no evita que las cápsulas floten. Para estos casos, se pueden enrollar espirales de alambre alrededor de las cápsulas o se pueden usar dispositivos de sumersión disponibles comercialmente para encerrar las cápsulas y mantenerlas en el fondo del vaso, permitiendo una mayor exposición del relleno al medio (ver Aparato/Agitación, Dispositivos de Sumersión en el capítulo (1092)). Los dispositivos de sumersión también se pueden usar para evitar que la cápsula se pegue a las paredes del vaso y para proveer un mejor contacto con el medio de disolución, incluso si la cápsula no flota y se mantiene en el fondo del vaso. La forma y el tamaño del dispositivo de sumersión pueden desempeñar un papel importante en el perfil de disolución y se deben seleccionar cuidadosamente. Resulta necesario tomar en cuenta el hinchamiento que la cápsula experimenta cuando entra en contacto con el medio de disolución al momento de definir el tamaño del dispositivo de sumersión que se va a usar. 3.1.3 APARATO 3 DE LA USP (CILINDRO OSCILANTE) Este aparato, al igual que el Aparato 1, encierra las cápsulas. No obstante, la malla en el fondo del cilindro puede obstruirse con las cubiertas no disueltas. Se puede solucionar este problema cambiando el tamaño de la malla. El mecanismo de agitación diferente del Aparato 3 provee una hidrodinámica muy distinta en comparación con los Aparatos 1 y 2. Esta característica puede ayudar a dispersar las gotitas hidrófobas, evitando la formación de capas y algunos problemas ocasionados por la flotación de la cápsula. En el caso del Aparato 3, resulta posible cambiar diferentes medios durante el transcurso de la prueba de disolución. Esto permite determinar los perfiles de disolución a diversos valores de pH, lo cual resulta útil para formas farmacéuticas de acción localizada o de liberación modificada. Este aparato puede no ser una opción adecuada para casos en los que el ingrediente activo se ha dispersado pero no se ha disuelto, debido a una pérdida significativa de muestra al transferir el cilindro de un tubo al otro. Asimismo, el Aparato 3 de la USP tiene la tendencia de generar espuma cuando se agregan agentes tensoactivos a los medios. Ante esta situación, se puede agregar al medio un agente antiespumante apropiado. Una alternativa al Aparato 3 es el aparato de desintegración descrito en el capítulo Desintegración (701 ). Se debe evitar el uso de discos debido a las obstrucciones. Si no se usan los discos, la cápsula flotará y podría no humedecerse uniformemente. Este aparato ofrece condiciones de mayor turbulencia que pueden ser útiles para la dispersión del relleno hidrófobo, evitando la formación de capas y contrarrestando la flotabilidad de la cápsula. 3.1.4 APARATO 4 DE LA USP (CELDA DE FLUJO) Este aparato también encierra las cápsulas y tiene un filtro. Se encuentran disponibles diversos tipos de celdas, dependiendo de la aplicación. El uso de la celda de flujo diseñada para cápsulas blandas rellenas de lípidos puede ser útil para ciertos tipos de formulaciones (ver la Figura 2 en el capítulo (2040)). El uso del Aparato 4 también posibilita cambiar diferentes medios y alterar el flujo durante el transcurso de la prueba de disolución. Asimismo, este equipo se puede configurar para volúmenes bajos o altos de medio, los cuales se pueden usar para productos de baja concentración y para ingredientes activos con baja solubilidad, respectivamente. Se puede considerar el uso de otros aparatos, siempre que se justifique adecuadamente, evaluando las variaciones en la composición de los medios, el volumen de los medios, la velocidad de agitación o flujo y otros parámetros de prueba de cada aparato candidato para determinar el efecto que tiene cada uno sobre el desempeño de la disolución del producto.
3.2 Medio Se pueden consultar las recomendaciones generales para la selección de medios de disolución apropiados en los capítulos (1092) y (2040), en la FDA Guidance for lndustry-Dissolution Testing of lmmediate-Release So/id Oral Dosage Forms (Guía de la FDA para la Industria-Prueba de Disolución de Formas Farmacéuticas Sólidas Orales de Liberación Inmediata) y en la FDA Guidance for lndustry-Extended Release Oral Dosage Forms: Development, Evaluation, and Application of In vitro/ln vivo Corre/ations (Guía de la FDA para la Industria-Formas Farmacéuticas Orales de Liberación Prolongada: Desarrollo, Evaluación y Aplicación de Correlaciones In vitro/ln vivo). Las características del medio de disolución que pueden afectar la apertura o ruptura de la cubierta de la cápsula, la liberación y la dispersión del material de relleno de la cápsula, así como la disolución de los ingredientes activos se tratan en las secciones siguientes.
1328 (1094) Cápsulas-Pruebas de Disolución / Información General
USP 39
3.2.1 LOGRO DE LAS CONDICIONES DE EXCESO DE MEDIO Al igual que en el desarrollo de cualquier procedimiento de disolución efectivo, el medio, de preferencia, aunque no necesariamente, debe proveer condiciones de exceso de medio para el ingrediente activo en un ambiente que asegure la estabilidad y que, de preferencia, sea pertinente desde el punto de vista fisiológico para el producto (ver el capítulo (1092)). Si el relleno es soluble en agua o, por lo menos, fácilmente dispersable en un medio acuoso, y si el ingrediente activo mismo también es soluble, se pueden lograr condiciones de exceso de medio en una manera comparable a la usada para cualquier otra forma farmacéutica sólida oral. No obstante, las cápsulas rellenas de líquido pueden contener una matriz o ingrediente activo (o ambos) que sean hidrófobos o insolubles en agua. En este caso, puede ser necesario usar un medio con agentes tensoactivos (ver más adelante). No se recomienda el uso de codisolventes orgánicos para mejorar las condiciones de exceso de medio y, en caso necesario, su uso deberá justificarse de forma apropiada y únicamente como último recurso y en cantidades mínimas. En la práctica, la presencia de disolventes orgánicos en el medio puede inhibir la disolución de la cubierta. Además de dispersar/disolver la matriz y los ingredientes activos, el medio no debe interferir con la actividad de las enzimas usadas ni interactuar negativamente con la cubierta de la cápsula o la formulación. Por lo tanto, el desarrollo de un medio adecuado para sistemas hidrófobos puede requerir de una serie considerable de experimentos. Por ejemplo, el uso de la prueba del capítulo (711) requiere la adición de enzimas cuando la cápsula de gelatina no pasa la prueba debido a la formación de película. Cuando se usan ciertos agentes tensoactivos (p.ej., lauril sulfato de sodio), la enzima puede quedar desactivada, dependiendo del tipo y la concentración del agente tensoactivo usado. En este caso, se puede considerar un periodo de pretratamiento con la enzima proteolítica seguido por la adición posterior del agente tensoactivo al medio. El tiempo de este pretratamiento debe ser lo más corto posible. En la mayoría de los casos no excede de 15 minutos. El periodo de pretratamiento se incluye en el tiempo total de la prueba de disolución. Para establecer un medio adecuado, se deben evaluar varios medios diferentes para identificar al que logre las condiciones de exceso de medio apropiadas con la cantidad más baja de agente solubilizante/dispersante. También, se deben evaluar el efecto del pH, de la concentración iónica, del contraión amortiguador y/o del codisolvente sobre la solubilidad del ingrediente activo y la actividad enzimática, en particular para ingredientes activos hidrófobos, además de la partición relativa del ingrediente activo entre la matriz y el medio. 3.2.2 USO DE AGENTES TENSOACTIVOS/AGENTES DE DISPERSIÓN/MEJORADORES DE LA SOLUBILIDAD Se pueden usar en el medio de disolución agentes tensoactivos, agentes de dispersión o mejoradores de la solubilidad cuando el relleno de la cápsula, el ingrediente activo, o ambos, sean hidrófobos o insolubles en agua. Asimismo, se pueden usar cuando los medios descritos en el capítulo (1092) y en las guías de la FDA no sean efectivos para dispersar el relleno de las cápsulas o para lograr condiciones de exceso de medio adecuadas para el ingrediente activo. Los agentes tensoactivos, agentes de dispersión y mejoradores de la solubilidad incluyen: • Aniónicos: - Dodecil sulfato de sodio (SDS, por sus siglas en inglés; o lauril sulfato de sodio, SLS, por sus siglas en inglés) - Sales biliares (desoxicolato de sodio, colato de sodio) • Catiónicos: - Bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB, por sus siglas en inglés) - Bromuro de hexadeciltrimetilamonio (HTAB, por sus siglas en inglés) - Cloruro de metilbencetonio (Hyamine™) • No iónicos: - Polisorbatos (Tween™) - Ésteres de sorbitán de polioxietileno - Octoxinol (Triton X 100™) - N-Óxido de N,N-dimetildodecilamida - Brij 721 - Aceite de ricino polioxilado (Cremophor™) - Nonilfenol etoxilado (Tergitol™) - Ciclodextrinas - Éter polioxil 1O laurílico • Zwitterión - Óxido de lauril dimetil amina (óxido de dodecildimetilamina, DDAO, por sus siglas en inglés) - Lecitina Aunque resultan útiles como agentes solubilizantes, los agentes tensoactivos deben usarse con cuidado debido a que pueden interactuar con la gelatina en la cubierta de la cápsula y pueden dificultar la desintegración o la disolución. Asimismo, pueden inhibir enzimas que se pueden usar para hidrolizar la cubierta de la gelatina y/o el relleno. Uno de los agentes tensoactivos aniónicos más comunes usado para la prueba de disolución de tabletas, el lauril sulfato de sodio, presenta ambos efectos adversos mencionados, particularmente en presencia de pH bajos (p.ej., en fluido gástrico simulado). Asimismo, el lauril sulfato de sodio forma precipitados insolubles en presencia de iones de potasio. El lauril sulfato de sodio es uno de los agentes tensoactivos menos compatibles con enzimas, por lo que únicamente se debe usar lauril sulfato de
USP 39
Información General/ (1094) Cápsulas-Pruebas de Disolución 1329
sodio con un grado de calidad muy alto en los medios de disolución debido a la interferencia potencial de sus impurezas en la etapa de cuantificación de la prueba de disolución. Por consiguiente, el uso de lauril sulfato de sodio se debe considerar únicamente ante la falta de alternativas. Existen otros agentes tensoactivos aniónicos o catiónicos que han mostrado afectar la solubilidad de la gelatina, por lo que el grado de estas interacciones debe tomarse en cuenta al momento de seleccionar el medio de disolución. Se debe evitar el uso de agentes tensoactivos catiónicos en formulaciones que contengan ácidos grasos puesto que dicha combinación puede formar precipitados insolubles. 3.2.3 USO DE ENZIMAS Las enzimas proteolíticas tales como la pepsina (a un pH bajo) o la pancreatina (a un pH de ~6,8) se pueden usar cuando las cubiertas de gelatina de las cápsulas no se disuelvan en medios acuosos ordinarios debido al entrecruzamiento, conforme a lo descrito previamente. La pancreatina tiene la ventaja de poseer también actividad de lipasa, lo que la vuelve útil cuando el material de relleno de las cápsulas es un triglicérido. Se deben llevar a cabo pruebas para asegurar que las enzimas usadas en la prueba de disolución no interaccionan de manera adversa con la formulación. Asimismo, se debe optimizar el medio de disolución (p.ej., ajustando el pH, la fuerza iónica, entre otros) de modo que conserve la actividad enzimática mientras mantiene las condiciones de exceso de medio para el ingrediente activo. Cuando también se usen agentes tensoactivos, se deben evaluar sus efectos adversos potenciales sobre la actividad enzimática. 3.2.4
PH
Además de establecer un perfil de pH-solubilidad durante el desarrollo de la disolución, también se debe evaluar lo siguiente: • El efecto del pH de los medios sobre el hinchamiento o la disolución de la cápsula basándose en el tipo de gelatina usada en el producto: ya sea de Tipo A (para cuyo medio, el pH es generalmente 7-9) o Tipo B (para cuyo medio, el pH es generalmente 4,7-5,4) • La necesidad de enzimas puede influir sobre la selección de un intervalo de pH específico para ajustarse apropiadamente a la solubilidad y estabilidad del ingrediente activo y para minimizar los efectos sobre la actividad enzimática.
3.3 Entrecruzamiento en Cápsulas de Gelatina Conforme a lo tratado previamente, el entrecruzamiento resulta en la formación de películas en la superficie interna o externa de la cubierta. Dependiendo del grado de entrecruzamiento y de la integridad estructural de la cubierta, esta película puede retardar o evitar la liberación del relleno y la disolución de los ingredientes activos durante la prueba. Las películas a menudo son difíciles de disolver y por lo regular requieren el uso de enzimas proteolíticas en el medio para lograr la disolución. La gelatina forma también entrecruzamientos iónicos (puentes salinos), por lo regular entre los residuos con carboxilatos (aniónicos) y los residuos con grupos amonio (catiónicos) de los aminoácidos que componen la cadena polipeptídica. Aunque pueden inhibir la disolución de la gelatina, los entrecruzamientos iónicos son mucho más débiles que los entrecruzamientos covalentes y se pueden alterar cambiando la fuerza iónica o el pH del medio o usando una enzima. 3.3.1 ENTRECRUZAMIENTO FORZADO Durante el desarrollo del producto y del método de disolución, la formación forzada de entrecruzamientos en la cápsula de gelatina puede ser útil para establecer el tipo y la cantidad de enzima que se usará en la prueba, así como para entender de mejor manera el comportamiento de la formulación en el medio de disolución. Esto se puede lograr agregando cantidades conocidas de excipientes con cantidades conocidas de formaldehído u otros agentes de entrecruzamiento, o exponiendo las cápsulas a humedad elevada.
3.4 Muestreo El establecimiento de la técnica y ubicación adecuadas para el muestreo de las cápsulas sigue los procedimientos descritos en los capítulos (711) y (1092). En el caso de cápsulas rellenas de líquidos hidrófobos, el material de relleno por lo regular forma una película en la superficie del medio de disolución durante el transcurso de la prueba, por lo que el muestreo debe realizarse de tal manera que la sonda penetre la capa aceitosa sin obstruirse. Además de los estudios de validación y compatibilidad estándares, se debe tener cuidado al utilizar un filtro para asegurar que éste no se obstruya con aceite o material de la cubierta de la cápsula no disuelto al momento de tomar la muestra. Se aplican consideraciones similares al equipo de muestreo automatizado debido a que los filtros y las líneas de transferencia pueden obstruirse durante el muestreo. Para tratar este problema, puede ser necesario el uso de agentes tensoactivos y/o enzimas en los medios de disolución para solubilizar de me-
1330 (1094) Cápsulas-Pruebas de Disolución/ Información General
USP 39
jor manera la cubierta y el relleno de la cápsula. Otro punto a considerar en el caso del equipo de muestreo automatizado es la sonda. Si se mantiene dentro del medio durante la prueba, puede perturbar la capa aceitosa y posiblemente influir sobre la hidrodinámica y cambiando el perfil de disolución. Un método alternativo es la eliminación de la sonda y su introducción justo al momento del muestreo. Se debe validar el método de muestreo para cada producto.
3.5 Cuantificación Al igual que las muestras de disolución de otras formas farmacéuticas sólidas orales, las muestras de disolución de cápsulas pueden cuantificarse usando técnicas cromatográficas, espectrofotométricas, de cromatografía-espectrometría de masas en tándem y demás, después del desarrollo y validación adecuados del método (ver el capítulo (1092), y cuando se presenten las consideraciones especiales conforme a lo descrito a continuación en la sección 4. Validación del Método).
4. VALIDACIÓN DEL MÉTODO Además de los parámetros generales de validación del método tratados en el capítulo (1092), se pueden evaluar las siguientes características de desempeño: • El efecto del pH y de la fuerza iónica sobre la solubilidad del fármaco y sobre la actividad enzimática, si se usan enzimas • Para ingredientes activos hidrófobos, la partición relativa de los ingredientes activos entre la matriz y el medio, así como los efectos adversos potenciales al liberarlos en el medio acuoso • Para procedimientos cromatográficos, el efecto adverso potencial del agente tensoactivo, si se usa, sobre la separación cromatográfica; como parte del estudio de robustez, la evaluación de las diferentes concentraciones de agente tensoactivo, los diferentes tipos de agentes tensoactivos, la interacción con sales amortiguadoras, entre otros • Para procedimientos espectrofotométricos, se debe evaluar la absorbancia a partir de la contribución potencial de la cubierta de la cápsula • Los efectos adversos potenciales del agente tensoactivo o la enzima, si estuvieran presentes, sobre la vida de la columna cromatográfica • La calificación del procedimiento de muestreo para prevenir la obstrucción de la sonda, del sistema de tubos de transferencia o de los filtros •Validación de la prueba de disolución en dos etapas (con el uso de enzimas) - tiempo de remojo previo - compatibilidad de cualquier agente tensoactivo presente con las enzimas - verificación de que las condiciones de la prueba de la segunda etapa no afectan el perfil de disolución cuando se comparan con la prueba de la primera etapa
5. SUGERENCIAS PARA PUNTOS DE INICIO Basándose en las consideraciones tratadas anteriormente, los posibles puntos de inicio para establecer una prueba de disolución para cápsulas con base en las características de solubilidad del relleno y de los ingredientes activos son los siguientes: Formulaciones posibles: 1. Relleno hidrófilo/ingrediente activo soluble en medios acuosos 2. Relleno hidrófobo/ingrediente activo poco soluble en medios acuosos 3. Relleno hidrófilo/ingrediente activo poco soluble en medios acuosos 4. Relleno hidrófobo/ingrediente activo es soluble en medios acuosos
5.1 Medio Evaluar la solubilidad del ingrediente activo en medios acuosos dentro de un intervalo de pH de 1,0 a 7,2-7,5.
5.2 Aditivos para el Medio Enzimas, tales como la pepsina (a un pH <4,0) o la pancreatina (a un pH 2'.6,8) se pueden usar cuando el producto presente evidencia de entrecruzamiento en la cápsula de gelatina. Si el producto es una formulación tal como las formulaciones 2 ó 3 anteriores, evaluar el uso de agentes tensoactivos y la posible interacción con enzimas.
5.3 Aparato Aparatos 1 ó 2 de la USP. Si la cápsula está rellena de líquido con un peso específico bajo y presenta tendencia a flotar, se deben usar dispositivos de sumersión. Si el producto es una formulación tal como las formulaciones 2 ó 4 anteriores, considerar como opción el Aparato 3.
USP 39
Información General/ (1094) Cápsulas-Pruebas de Disolución 1331
5.4 Velocidad de Agitación La velocidad de agitación por lo regular es de 50-100 rpm para canastillas y de 50-75 rpm para paletas. El uso de velocidades mayores deberá justificarse.
5.5 Tiempos de Muestreo Se debe establecer un perfil de disolución durante la fase de desarrollo para identificar el momento en que la velocidad de liberación del ingrediente activo se haya estabilizado.
6. ATRIBUTOS CRÍTICOS DE CALIDAD 6.1 Composición de la Cubierta El conocimiento de la composición de la cubierta (polímero, plastificante, contenido de agua, etc.), según lo tratado al inicio de este capítulo, es un aspecto importante y ayuda a determinar los atributos críticos de calidad. Otros aspectos importantes con respecto al entendimiento de los atributos críticos de calidad son la composición y las propiedades de la masa de gel y de la cubierta terminada. En su forma más simple, la cubierta de una cápsula se prepara a partir de una masa fundida de gel, el cual, en el caso de las gelatinas duras, consta de gelatina u otros polímeros y agua, y, en el caso de gelatinas blandas, la cubierta consta de gelatina y un plastificante disuelto en un vehículo acuoso. La relación entre polímero y plastificante varía dependiendo de las características de desempeño deseadas de la cubierta, del tamaño de la misma y de la composición del material de relleno. Otros componentes menores agregados a la masa de gel pueden incluir colorantes, saborizantes, estabilizadores, amortiguadores y agentes opacificantes. Las características físicas y la calidad de estos componentes menores son una parte central para el diseño de formulaciones robustas y de alta calidad. La composición de gelatinas duras, por lo regular, no varía con el tamaño de la cápsula.
6.1.1 GELATINA Proceso de fabricación de cápsulas de gelatina: Para gelatinas duras, existen dos etapas distintas de fabricación: (1) la fabricación de cubiertas vacías y (2) el proceso de llenado. Las cubiertas de las cápsulas se producen, envasan y transportan a los fabricantes de la forma farmacéutica. Posteriormente, las cápsulas se llenan y se sellan. La mayor parte de la maquinaria moderna para relleno de cápsulas está diseñada para permitir el relleno exacto con polvos, gránulos, pellets, tabletas y combinaciones de los mismos, y en muchos casos se pueden modificar para poder llenar gelatinas duras con líquidos calientes o fríos. Una parte esencial de una operación de llenado con líquidos es la capacidad de sellar de manera efectiva la cápsula. Este proceso de sellado es un parámetro crítico del proceso, y es importante el conocimiento detalladao de todos los aspectos de este proceso. Para gelatinas blandas, la formación de la cápsula, el proceso de llenado (proceso de encapsulación) y el sellado de las cápsulas se producen de manera simultánea. Durante el proceso de encapsulación, es importante monitorear el espesor de la cubierta, la calidad de la costura, el peso de la cápsula y el peso del relleno usando controles estadísticos para el proceso. Composición química de la gelatina: El conocimiento de la naturaleza química de la gelatina es otro componente importante de los atributos críticos de la formulación. La gelatina se clasifica principalmente por la consistencia del gel. Dependiendo del proceso y de la fuente del tejido, surgen diferencias notorias entre proveedores e incluso entre lotes del mismo proveedor. Por consiguiente, el control de la consistencia de la gelatina entre partidas, medida en grados Bloom, es clave para obtener un producto con un desempeño uniforme. La graduación Bloom es una forma de medir la consistencia del gel preparado a una concentración establecida de gelatina en agua en condiciones controladas y es una función del peso molecular de la gelatina, de la concentración de la gelatina en el gel y del pH del gel. Es una medición de la resistencia resultante del gel a la compresión y se informa en grados Bloom o gramos. La consistencia en grados Bloom aumenta cuando se incrementa la concentración de gelatina en el gel, cuando aumenta el peso molecular promedio de la gelatina y cuando el pH del gel se aproxima a la neutralidad (desde cualquier dirección). Asimismo, a medida que aumenta la consistencia en grados Bloom, también aumenta el costo de la gelatina y se reduce la velocidad de disolución del gel. La consistencia en grados Bloom también tiene un efecto sobre la transparencia y el color de las cápsulas rellenas de líquido. Para gelatina con una mayor consistencia en grados Bloom, se requiere menos gelatina para producir una cubierta adecuada, lo que resulta en una cubierta más transparente y en una menor necesidad de colorantes y tintes para producir el tono deseado. Aunque la gelatina puede comprarse con grados Bloom que van de 50 a 300, la mayoría de las gelatinas usadas en la fabricación de cápsulas rellenas de líquido tienen una consistencia en grados Bloom de aproximadamente 150-200 para gelatinas blandas y 220-280 para gelatinas duras. Los fabricantes de gelatinas, por lo regular, mezclan diversos sublotes de gelatina para cumplir con los requisitos de consistencia en grados Bloom. Estas importantes características de la gelatina deben tomarse en cuenta al caracterizar el producto en desarrollo.
1 332 (1094) Cápsulas-Pruebas de Disolución / Información General
USP 39
6.1 .2 QUÍMICA DE OTROS POLÍMEROS Se debe prestar atención adecuada a los otros polímeros usados para fabricar las cubiertas de las cápsulas. Los carragenanos iota y kappa, los almidones de maíz, papa y guisante modificados, así como las celulosas modificadas, junto con los plastificantes, también se usan para la preparación de las cubiertas de las cápsulas. Los carragenanos son polisacáridos que se extraen de las algas marinas. Poseen las características de gelificación requeridas similares a las de la gelatina. No obstante, el carragenano kappa produce un gel quebradizo, mientras que el carragenano iota produce un gel blando y elástico. Por lo regular, los carragenanos se combinan con almidones modificados y plastificantes para formar la cubierta de la cápsula. Las celulosas modificadas tales como hipromelosa (HPMC, por sus siglas en inglés), también se usan en la fabricación de gelatinas duras. En comparación con la cubierta de gelatina, la cubierta que se prepara usando los polímeros mencionados anteriormente presentará algunas ventajas, tales como ausencia de entrecruzamiento, capacidad de tolerar intervalos más amplios de pH y tolerancia a una temperatura de llenado elevada. 6.1.3 COADYUVANTES DEL PROCESAMIENTO Los coadyuvantes del procesamiento incluyen lubricantes de cinta de gelatina en el proceso de fabricación de la gelatina blanda. Los lubricantes de cinta de uso común incluyen aceite mineral y triglicéridos de cadena media. Puesto que los lubricantes de cinta se aplican a las superficies internas y externas de la cubierta de la cápsula, la evaluación de sus efectos adversos potenciales se enfoca en la cápsula misma y, principalmente, en el entrecruzamiento de la gelatina.
6.2 Estabilidad y Condiciones de Almacenamiento El conocimiento de la estabilidad y la reactividad de la gelatina o de otros polímeros es esencial para anticipar su influencia sobre la calidad del producto final. A temperatura ambiente, las cubiertas de las cápsulas tal como se proveen son relativamente efectivas para proteger el relleno del oxígeno y sus efectos, y cuando se agrega un agente opacificante tal como dióxido de titanio a la cubierta, puede prevenir la fotodegradación del relleno. Asimismo, la baja actividad de agua de la cubierta no promueve el crecimiento microbiano. Para que las bacterias, hongos filamentosos y levaduras crezcan, se requiere de una mayor actividad de agua de al menos 80 unidades de actividad de agua; la actividad del agua en las cubiertas de las cápsulas es por lo regular menor de 0,40 unidades de actividad de agua. Las condiciones de almacenamiento del producto final van desde temperatura de refrigeración hasta temperatura ambiente estándar. Los productos deben almacenarse de acuerdo con las instrucciones de la etiqueta. Se deben evaluar las desviaciones breves fuera de dichas condiciones para determinar su influencia en la calidad del producto final. Asimismo, se deben considerar las condiciones y la duración del almacenamiento para las cubiertas de las cápsulas vacías.
6.3 Desarrollo de la Formulación y Fabricación de las Cápsulas Rellenas de Líquido Resulta importante entender las propiedades de los ingredientes activos durante el desarrollo de la formulación. Se pueden aplicar las formulaciones que se desarrollan usando tecnología para rellenos líquidos cuando los ingredientes activos (1) presentan una baja solubilidad en sistemas acuosos, (2) tienen una vida media corta que requiere dosificación frecuente, (3) tienen un punto de fusión bajo, (4) se caracterizan por una dosis baja/potencia alta cuando es importante mantener la proporción dosis baja/potencia alta, (5) tienen un requisito de enmascaramiento del sabor u olor y (6) requieren una estabilidad química o física crítica como en el caso de ingredientes activos altamente higroscópicos. Otros factores que se deben considerar durante el desarrollo de la formulación incluyen: • La compatibilidad y estabilidad de excipientes e ingredientes activos con el paso del tiempo • La solubilidad dependiente de la temperatura del ingrediente activo en el lípido • Las características de envejecimiento/polimórficas del lípido • La caracterización adecuada del estado de saturación/supersaturación de los ingredientes activos en la formulación del lípido para evitar la precipitación de los ingredientes activos. Idealmente, el estado de saturación debe determinarse cuando la formulación se encuentra en equilibrio con la cubierta. • La estabilidad en solución en condiciones de estrés • La formación de aldehídos y degradación de los ingredientes activos • La influencia, si la hubiere, que tiene la velocidad de enfriamiento sobre la estructura de ciertos excipientes, lo cual puede modificar las características de liberación de los ingredientes activos Entre los factores importantes a considerar durante una operación de relleno con líquidos son la temperatura y la viscosidad del material de relleno y, en el caso de una dispersión o suspensión, el tamaño de partícula de los ingredientes activos dispersados. En principio, se puede usar cualquier excipiente que se determine compatible con la cubierta, aunque en un ambiente de fabricación, la viscosidad del material de relleno es importante. Los excipientes que son sólidos a temperatura ambiente pero que funden a temperaturas de hasta 70º pueden ser adecuados (dependiendo del polímero de la cubierta) para formular ingredientes activos, siempre que dichos excipientes produzcan el desempeño in vivo deseado.
USP 39
Información General/ (1097) Procedimientos para el Muestreo de Polvos a Granel 1 333
Resulta necesario controlar los niveles de entrecruzamiento de los agentes conocidos, tales como formaldehído y azúcares reductores, en los excipientes de la cubierta y del relleno. Las imperfecciones en la cubierta y/o en la costura pueden afectar la disolución, además de que pueden generar fugas del contenido de las cápsulas. Se debe contar con controles durante el proceso apropiados para monitorear y reducir la variabilidad entre lotes.
(1097) PROCEDIMIENTOS PARA EL MUESTREO DE POLVOS A GRANEL INTRODUCCIÓN Este capítulo tiene como objetivos proporcionar pautas relacionadas con los procedimientos de muestreo de polvos a granel, identificar conceptos importantes del muestreo de polvos a granel y recopilar información básica sobre prácticas y consideraciones útiles que puedan llevar al muestreo físico ideal de materiales en polvo a granel. La terminología usada en este capítulo está bien establecida en el campo del muestreo de materiales (por ejemplo, ver la referencia 7 en el Apéndice 3). El muestreo se lleva a cabo como parte de un proceso de estimación. El parámetro de interés primario es el nivel medio de algún analito en la totalidad del polvo a granel. El propósito de un plan de muestreo es obtener una muestra representativa de una población de tal manera que se puedan sacar conclusiones válidas sobre la población muestreada con cierto nivel o grado de confianza. La obtención de una muestra representativa de un lote es una tarea crítica debido a que sin una muestra representativa todos los análisis e interpretaciones de datos adicionales sobre el lote resultan dudosos. Un proceso de muestreo ideal se define como un proceso en el que todas las partículas o al menos todas las porciones de igual tamaño de la población tienen la misma probabilidad de ser seleccionadas en la muestra. Además, los procedimientos de muestreo deben ser reproducibles, es decir que si se repitiese el protocolo de muestreo, debería existir una alta probabilidad de obtener resultados similares. Asimismo, la integridad de la muestra debe conservarse durante y después del muestreo. Los detalles sobre la forma de realizar el muestreo dependen de una variedad de factores. Por ejemplo, los criterios de muestreo para evaluar la segregación de partículas pueden diferir de los criterios para evaluar el contenido de humedad o la identificación. Debido a la tendencia de un polvo a la segregación, los sistemas heterogéneos pueden dificultar la obtención de una muestra ideal. Por consiguiente, para extraer muestras representativas se requiere del desarrollo cuidadoso de un plan de muestreo que tome en cuenta y mitigue la tendencia a la segregación. El desarrollo de pautas generales para el muestreo de polvos a granel supone diversos desafíos debido a que cada situación es diferente y, por lo tanto, se deben usar diversos enfoques para hacer frente a cada situación. En consecuencia, el objetivo de este capítulo de información general es delinear los pasos recomendados para desarrollar un esquema o plan de muestreo que sea consistente con las buenas prácticas. La dificultad primaria para obtener una muestra representativa es que el tamaño de la muestra para la medición, típicamente de unos pocos miligramos a gramos, se debe retirar de una gran población que está en el orden de cientos a miles de kilogramos. Los pocos miligramos analizados en un laboratorio se deben tomar de una gran población de partículas de un depósito de tal manera que la muestra para medición sea representativa de todas las partículas del lote. Cualquier sesgo o error en el proceso de muestreo ocasionará que todas las conclusiones futuras sean erróneas. Con el paso de los años, se han desarrollado y perfeccionado métodos con la intención de asegurar que la muestra para medición sea representativa de toda la población general. La Figura 7 presenta una estrategia típica, la cual consiste en muestrear por etapas, comenzando con la muestra inicial bruta o primaria retirada directamente de los envases recibidos. El tamaño de la muestra bruta debe ser reducida en el laboratorio hasta que tenga un tamaño apropiado para la medición. Esto debe realizarse de tal manera que se minimice la introducción de errores de muestreo. La clave para reducir el error de muestreo radica en asegurar que cada partícula de la población tenga la misma probabilidad de ser incluida en la muestra. Sin embargo, debido a la segregación o a la naturaleza no aleatoria de los polvos, son muchos los obstáculos que pueden generar sesgos y contribuir a la aparición de errores de muestreo. Seguir el diagrama de flujo de la Figura 7 y los pasos delineados en los debates subsiguientes ayudará a minimizar los errores de muestreo.
1 334 (1097) Procedimientos para el Muestreo de Polvos a Granel / Información General
USP 39
••• 2
N
3
Lote inicial: Escala de 100tos de kg
i i i
Muestra bruta: Escala de kg
Muestra de laboratorio: Escala de g
Muestra para medición: Escala de mg
Figura 1. Estrategia de muestreo general para reducir el tamaño de la muestra de la escala de cientos de kg a la escala de mg. Para adquirir una muestra representativa se debe desarrollar e implementar un plan de muestreo adecuado. Un buen plan de muestreo incluye: (1) la determinación de la población y la selección del tamaño de la muestra, (2) un procedimiento de recolección de muestras y un método de reducción del tamaño de la muestra y (3) resumen de precálculos que demuestren que el plan de muestreo generará muestras que caractericen de manera exacta a la población dentro de un nivel declarado de aceptación. Asimismo, se requiere una infraestructura para mantener la integridad de las muestras y de los materiales muestreados. Este capítulo comienza con una breve introducción a la teoría y terminología del muestreo. El contenido técnico del capítulo requiere de una compresión científica básica de las características físicas (p. ej., masa, densidad, forma y tamaño) y estatísticas (p. ej, muestreo de aceptación y distribución binomial) de las partículas.
TEORÍA V TERMINOLOGÍA DEL MUESTREO Tamaño Fundamental de la Muestra (Masa de la Muestra) El tamaño de la muestra se considera desde dos perspectivas: (1) la masa de la muestra con la que se pretende representar a toda la población, en ocasiones denominada muestra compuesta y (2) el número de muestras tomadas con una masa suficiente para evaluar, comparar o proporcionar confianza de manera independiente a fin de asegurar la reproducibilidad de la muestra compuesta o la uniformidad de la población. La clave para obtener una muestra ideal consiste en comprender y tomar en cuenta el grado de heterogeneidad de la característica que se evalúa en el sistema en estudio. Por ejemplo, la heterogeneidad de un sistema de partículas se produce a partir de dos fuentes: la heterogeneidad intrínseca, constitutiva o de composición y la heterogeneidad de la distribución espacial. La heterogeneidad intrínseca del sistema de polvos refleja las diferencias fundamentales en las partículas individuales. Se espera que la heterogeneidad estadística (diferencias entre individuos), o varianza, mantenga las propiedades asumidas. Para una población normal, la expresión general para un tamaño de muestra estadístico sugiere que el número de muestras independientes sea proporcional al cuadrado de la función cuantil normal al nivel de confianza deseado (Z) y a la varianza de la población (cr2 ), y sea inversamente proporcional al cuadrado de la diferencia mínima detectable requerida (o), según se muestra en la ecuación 1 :
Resulta necesario tomar en cuenta las características del material a fin de aplicar la ecuación teórica normal del tamaño de la muestra a la masa de la muestra con un número discreto de partículas. Para un material a granel heterogéneo, tal como un polvo a granel, la masa de la muestra requerida para asegurar la representación adecuada de la heterogeneidad o variación intrínseca o fundamental de la población se determina por el tamaño, la forma y la densidad de las partículas. El error total de muestreo (ETM) mide la diferencia entre la concentración del analito estimada en la muestra (amuestra) y la concentración media del analito en el lote (a 10te) en relación con la concentración media del analito en el lote (a 10te), según se muestra en la ecuación 2: ETM= amuestra - ªiote alote
(2 )
Cuando se emplea un muestreo ideal, el ETM se reduce a un error de muestreo fundamental, limitado únicamente por la heterogeneidad intrínseca del material. La varianza relativa del error de muestreo fundamental (Semi2) ha sido estimada empíri-
USP 39
Información General/ (1097) Procedimientos para el Muestreo de Polvos a Granel 1335
camente en aplicaciones de tamaño de partícula mediante la caracterización de la masa crítica de partículas, la heterogeneidad, el tamaño (diámetro), la forma, la densidad y los pesos del material. Los estimados empíricos requieren de un conocimiento cabal y completo del material y del proceso. Los métodos y la caracterización del material establecidos son aspectos críticos para evitar estimaciones inaceptables. Según se muestra en la ecuación 3: semt ocfforma 9FG CmáxJdmá.3 ( -1- - -1-) (3) mmuestra mlote
l
donde f1orma es una medida del factor de cubicidad o forma de las partículas del analito; gFGi el factor granulométrico, es un factor empírico de corrección de diferencias en el tamaño de partículas; cmáx es la heterogeneidad máxima de composición y se calcula como si el material consistiera en las partículas de analito y en todo lo demás; 1, el factor de liberación, es un factor empírico que representa la proporción de partículas de contenido crítico separadas de las partículas del lote que no contienen analito; dmáx es el diámetro de partícula [por ejemplo, el diámetro máximo o el diámetro (cm) del tamaño de la abertura de un tamiz que retiene 5% en peso del lote que se va a muestrear]; mmuestra es la masa de la muestra; y m101• es la masa del lote que se está muestreando. [NOTA-Cuando el analito no aparece como partículas separadas se requiere un factor de liberación. Un valor de liberación alto (1,0) sugiere la heterogeneidad de las partículas. Un valor de liberación bajo (0,05) sugiere partículas muy homogéneas. El Apéndice 1 proporciona ejemplos de aplicaciones potenciales de la ecuación 3 en la estimación de Ja masa fundamental de la muestra requerida para dar cuenta de la heterogeneidad constitutiva de la mezcla de polvos.] El uso de Ja ecuación 3 requiere la estimación previa de f1orma1 gFG1 cmáXI 1 y dmáx·
Error de Segregación La heterogeneidad de la distribución es la diferencia espacial o temporal entre muestras o grupos de partículas. Por ejemplo, las partículas pequeñas se localizan preferentemente en la porción inferior de un lecho de polvo. Este tipo de situación puede surgir como resultado de la segregación del lecho y es común en algunos sistemas con amplia distribución del tamaño de partícula. En otras palabras, es posible que las partículas más pequeñas no estén distribuidas de manera aleatoria en todo el lote. La heterogeneidad espacial introduce una variación en la muestra y es una fuente de variación que contribuye a la variación total. En conjunto, el error fundamental y de segregación originan un error de muestreo, el cual establece cuan variables serán las muestras, cuan grandes deberían ser el tamaño y el número de muestras (p.ej., 1 O envases de los que se obtienen muestras de la parte superior y del fondo, con tamaños de muestra de 50 g cada una) y qué tan difícil será obtener una muestra representativa. Minimizar los efectos del error de segregación durante la caracterización del material del lote, sin dejar de asegurar una masa de muestra representativa, requiere la recolección de muchas muestras pequeñas que promedien la variación del error de segregación. Con esto se asume que se está interesado en estimar el promedio general y no en caracterizar la heterogeneidad del lote. El error de segregación es difícil de controlar debido a que la segregación puede ser el resultado de cambios en el tamaño, la forma y la densidad de las partículas, así como en la entrada de datos en la determinación de la masa de la muestra. Minimizar los efectos del error de segregación al momento de reducir el tamaño de la muestra primaria requiere del mezclado físico adecuado o de la distribución al azar de las muestras primarias antes del análisis, proporcionando así una probabilidad de selección similar.
Error Total del Método de Muestreo La heterogeneidad intrínseca o de composición es una función del sistema de polvos y representa las verdaderas características del material (p.ej., la ecuación 3). Por consiguiente, la heterogeneidad intrínseca es a menudo la varianza mínima que puede tener un sistema. La diferencia entre el estado verdadero del sistema y lo qué en realidad se mide al emplear un muestreo ideal se denomina error fundamental (ecuación 2). La varianza relativa del ETM (el S2r01• 1) se representa en la ecuación 4 como la suma de las varianzas relativas de todos los componentes del error:
s;otal =S f~ndamental
+ S s~gregación + S ;xtracción + S d~limitación + S p;eparación + S t~ndenciaS, cambÍs S c~clos + S ~étodo analítico
(
4)
El S2rotai se puede reducir empleando un muestreo ideal. El muestreo ideal limitará o se ajustará a los efectos del error aportado por la segregación de partículas, del error de extracción creado por el dispositivo de muestreo, del error de delimitación creado al no considerar la naturaleza del material a granel de tres dimensiones y de los errores de manipulación de la muestra tales como la degradación del producto. La variación total es la suma de estas fuentes de error, ilustradas en la ecuación 4 como componentes sumandos independientes. A fin de reducir estos errores, un objetivo importante en la caracterización del material por muestreo es la determinación de los errores pertinentes dentro de la muestra a granel. Conocer la fuente del error ayuda a determinar la mejor manera de minimizar estos errores. El error fundamental surge de la heterogeneidad intrínseca de las partículas dentro de una muestra de la población del material. El error fundamental se reduce cambiando las características intrínsecas del material tales como reducir el tamaño de partícula mediante molienda o trituración. El error de segregación es la diferencia en la distribución espacial de las partículas en toda la población. Este tipo de error se puede minimizar mezclando o distribuyendo al azar las partículas que se están selec-
1336 (1097) Procedimientos para el Muestreo de Polvos a Granel /Información General
USP 39
donando. El error de segregación se ve afectado por las características del error fundamental. Asimismo, para la determinación tanto del error fundamental como del error de segregación, se asume que el muestreo mecánico se lleva a cabo de manera correcta y que no es invasivo, es decir, que el muestreo mecánico no altera las características que se están midiendo y proporciona una representación verdadera. En los casos en los que el muestreo del material a granel proporciona una representación sesgada o es tan invasivo que altera las características del material, es posible que los operadores, a fin de obtener una representación sin sesgo y no invasiva, puedan cambiar el muestreo de una forma a granel a una forma de muestreo continuo durante el proceso, ya sea antes o despúes (más cerca o más lejos) en el proceso (ver el Apéndice 2). Es posible que el muestreo mecánico requiera mezclar la muestra lo suficiente como para facilitar el muestreo aleatorio con una probabilidad de selección similar a fin de obtener una representatividad adecuada del lote a granel completo. El proceso también puede requerir del mezclado o muestreo desde un punto en el proceso que proporcione una muestra aleatoria del material que sea susceptible a la segregación. Los errores de extracción, delimitación y manipulación resultan del muestreo mecánico y de la manipulación de la muestra antes del análisis, los cuales también se ven afectados por el error fundamental. Las tendencias, los cambios y los ciclos son fuentes temporales de errores que afectan al error total. El error analítico del método de análisis contribuye al error general del resultado obtenido. Además de obtener submuestras representativas a partir del material a granel, el método también debe obtener una submuestra representativa a partir de la muestra particulada del laboratorio antes del análisis.
Estrategia de Muestreo Una estrategia típica de muestreo se compone de dos etapas básicas: (1) la muestra primaria o bruta, seguida de (2) la muestra secundaria, la cual reduce la muestra primaria a un tamaño adecuado para medición en el laboratorio. En resumen, el objetivo es seleccionar del lote una cantidad de material adecuado para la medición, sin cambios significativos del atributo por el que se realiza el muestreo. En paralelo a la reducción del tamaño de la muestra, los cálculos del tamaño de la muestra se deben llevar a cabo de tal manera que la estrategia de muestreo tenga un poder estadístico suficiente para determinar si los atributos relevantes se encuentran dentro de los parámetros especificados con un grado de certeza razonable. Cada etapa debe realizarse de manera correcta o la estrategia de muestreo en su conjunto no proporcionará una muestra que sea representativa de la población original. Para retirar con éxito una muestra de un envase a granel que sea representativa de la población, es necesario tener una idea de la heterogeneidad de la población, es decir, qué tan segregado o estratificado es el sistema. El conocimiento de los factores que puedan acentuar la segregación y los probables modelos de segregación ayudará a determinar la causa de la segregación en un lecho de polvo y a tomar mejores muestras. Son muchos los factores que pueden afectar el grado de segregación del lecho de polvo. Para que ocurra la segregación, es necesario aplicar suficiente energía al lecho de polvo para inducir el movimiento entre las partículas. Cuando se suministra una cantidad suficiente de energía, la segregación puede ocurrir en tres modos: percolación (en el lecho de polvo), rodado (en las superficies libres del lecho de polvo) y flujo libre (cuando el lecho de polvo se fluidifica). Estos modos se ilustran en la Figura 2.
Vibración del Lecho
Percolación
Rodado
Flujo Libre
Figura 2. Ilustración de los tres modos de segregación de partículas: percolación, rodado y flujo libre. Dentro del lecho de polvo, la segregación puede ocurrir por percolación, también denominada segregación por tamizado, así como por el movimiento de partículas gruesas hacia la parte superior mediante vibración. Durante la segregación por tamizado, las partículas más pequeñas que actúan por la influencia de la gravedad puederi migrar más fácilmente hacia abajo ocupando los espacios vacíos entre las partículas de mayor tamaño cuando se perturba el lecho de partículas. El efecto neto de estos movimientos radica en que las partículas más pequeñas se filtran hacia abajo en el lecho del polvo, lo que resulta en una mayor proporción de las partículas de mayor tamaño en la parte superior del lecho. Un ejemplo común de segregación por tamizado son los granos de maíz sin inflar que se encuentran en la parte inferior de una bolsa de maíz inflado. Para las superficies libres, la segregación por rodado puede ocurrir en cualquier momento en que las partículas puedan rodar hacia abajo en una superficie libre. En otras palabras, la segregación puede ocurrir en cualquier superficie desnivelada que permita el movimiento relativo de partículas. Cuando las partículas ruedan en estas superficies libres, las partículas de mayor tamaño tienden a caer aún más abajo en la superficie que las partículas más pequeñas (ver la Figura 3). Por ejemplo, si se forma
USP 39
Información General/ (1097) Procedimientos para el Muestreo de Polvos a Granel 1337
un montón o pila cónica en medio de una tolva durante la carga, las partículas de mayor tamaño son más propensas a rodar más hacia abajo en el montón, hacia el borde exterior de la tolva. Lo anterior genera una situación en la que las partículas más pequeñas tienden a estar en el centro de la tolva y las partículas de mayor tamaño se acumulan hacia la pared externa de la tolva. La formación de estas superficies libres puede representar un factor importante en la segregación.
Mayor concentración de partículas de mayor tamaño
Mayor concentración de partículas más pequeñas
Figura 3. Ejemplo de segregación extensa en el polvo dentro de un tambor. Cuando el lecho de polvo se fluidifica, se incorpora una gran cantidad de aire y cuando este aire está en movimiento, su velocidad puede exceder la velocidad terminal de las partículas más pequeñas. Cuando esto sucede, las partículas finas se suspenden en la corriente de aire, mientras que las partículas gruesas sedimentan. Eventualmente, las partículas finas sedimentan en la parte superior del lecho de polvo, formando una capa superior con una concentración mayor de partículas finas. Este tipo de segregación, en ocasiones denominada segregación por elutriación, puede ocurrir cuando se descarga un polvo de una tolva o cuando se vierte en la parte superior de una tolva y se desplaza un gran volumen de aire. En resumen, para un sistema con un alto nivel de segregación, el lecho de polvo podría tener una distribución de partículas similar a la mostrada en la Figura 3, en la que, como resultado de la segregación por elutriación, una capa de partículas finas en la parte superior reviste a las partículas de mayor tamaño depositadas por la segregación por percolación, y se presenta una distribución radial de las partículas de mayor tamaño hacia la pared exterior como resultado de la segregación por rodado. En general, los factores primarios que afectan a la segregación son el tamaño y la distribución del tamaño, la densidad y la forma y la distribución de la forma de las partículas. De menor importancia resultan la rugosidad de la superficie, el coeficiente de fricción de la superficie, el contenido de humedad y la forma y diseño del envase. El tamaño de partícula es el factor individual más importante y las diferencias sutiles en el tamaño de partícula pueden ocasionar una segregación medible. Si el atributo relevante está asociado con el tamaño de partícula, entonces este atributo segregará junto con los tamaños diferentes de partícula. Por ejemplo, si un fabricante elabora un granulado en el que las partículas de mayor tamaño contienen más fármaco que las partículas más pequeñas, entonces el contenido de fármaco puede ser muy propenso a la segregación-es decir, el contenido de fármaco presentará patrones de segregación similares a los asociados con la segregación por tamaño de partícula. La segregación puede incrementar notablemente el error de muestreo debido a que reduce la probabilidad de que ciertos tipos de partículas se encuentren en la muestra. Además, cabe la posibilidad de que el lecho de polvo ya se hubiera segregado al momento de recibir el material; asimismo, la manipulación deficiente de la muestra puede ocasionar segregación. Para evitar la segregación adicional durante la manipulación de la muestra, el operador debería evitar situaciones que promuevan la segregación, tales como las siguientes: verter donde el polvo forme una superficie inclinada, verter en el núcleo de una tolva, las vibraciones, agitar y revolver (a menos que se haga para promover el mezclado). Asimismo, el uso de tolvas de flujo de masa reduce la segregación. Existen dos estrategias básicas que ayudan a promover el muestreo ideal: (1) usar un muestreador y (2) muestrear a partir de una corriente de polvo en movimiento. Un muestreador es una sonda larga en forma de arpón que se puede insertar en el lecho de polvo y que, una vez insertado, puede recolectar muestras de los puntos adyacentes al arpón. Las partículas de casi cualquier punto del lecho de polvo pueden ser incluidas en la muestra con el uso de un muestreador. El segundo método se basa en principios fundamentales de muestreo, principalmente en que (1) un polvo siempre debe muestrearse cuando esté en movimiento y (2) toda la corriente de polvo debe muestrearse durante muchos periodos cortos en lugar de muestrear una parte de la corriente durante un periodo prolongado. Por ejemplo, si el envase a muestrear se vacía en una cinta transportadora, todo el material pasará por un solo punto en que se pueda muestrear. De esta forma, sin importar qué tan segregado esté el sistema, la recolección del polvo en tiempos de muestreo seleccionados al azar asegura que todas las partículas tengan una misma probabilidad de ser incluidas en la muestra. El segundo principio fundamental toma en cuenta la segregación de material en la cinta transportadora: al recolectar toda la corriente se obtiene una sección transversal de todas las partículas, sin importar cuánta segregación ocurra en la cinta transportadora. Se dispone de una gran cantidad de métodos para la obtención de una muestra de un sistema de polvo. Muchos de estos métodos implican poner el lecho de polvo en movimiento o llevar a cabo el muestreo durante el proceso. Debido a la posibilidad de contaminación cruzada y a la presencia de materiales potencialmente tóxicos, la mayoría de estos métodos son poco prácticos para el muestreo a granel requerido para cumplir con las Buenas Prácticas de Fabricación vigentes (cGMP, por sus siglas en inglés). Por consiguiente, la mayoría de los muestreos realizados en la industria farmacéutica son muestreos estáticos,
1338 (1097) Procedimientos para el Muestreo de Polvos a Granel / Información General
USP 39
que se llevan a cabo ya sea mediante (1) muestreo con cuchara o muestreo por captura, o (2) muestreo estratificado, típicamente empleando un muestreador. La selección del método se establece por la distribución del atributo que se está muestreando en el envase, según se analiza a continuación.
RECOLECCIÓN GENERAL DE MUESTRAS: CONSIDERACIONES Y HERRAMIENTAS Tipos de Sistemas y Consideraciones Generales Sistemas Homogéneos: Para los sistemas de polvo en los que el atributo relevante está distribuido uniformemente en todo el envase-de manera que cualquier muestra sea una representación no sesgada de todo el envase, lote o población en análisis-el muestreo con cuchara resulta adecuado. El muestreo con cuchara es un procedimiento sencillo en el que el operador, después de seleccionar envases representativos para muestreo, abre un envase, retira con cuchara una cantidad suficiente de material de la parte superior del lecho de polvo, y posteriormente, sella el envase. Si se sospecha que una delgada capa de material en la parte superior del lecho de polvo es diferente del material a granel, las muestras deben tomarse de un punto por debajo de esta capa superior. Por ejemplo, en los casos de segregación por elutriación, es posible que una capa delgada de partículas finas se encuentre en la parte superior del lecho de polvo, por lo que el operador debe profundizar en la cama de polvo para evitar la obtención de muestras de esta capa. La cuchara debe ser lo suficientemente grande como para que no se pierda material durante la manipulación, puesto que la pérdida de material puede resultar en un sesgo de la muestra. En otras palabras, se debería evitar el uso de una cuchara muy colmada de la que el material pudiera rodar por los costados. Las ventajas del muestreo con cuchara son la conveniencia y el costo, y para materiales altamente potentes, se pueden usar cucharas desechables de bajo costo para minimizar la contaminación cruzada. Sistemas Heterogéneos: Si el atributo relevante está distribuido espacialmente de manera heterogénea por toda la muestra, entonces el muestreo con cuchara es propenso a errores potencialmente significativos. El muestreo con cuchara es un método no probabilístico debido a que solamente se muestrea la fracción más accesible del envase. Obviamente, con una cuchara sólo es posible alcanzar el material en la capa superior. Por ejemplo, una muestra del borde exterior del tambor mostrado en la Figura 3 puede estar sesgada debido a que en este ejemplo, las partículas de mayor tamaño están distribuidas preferentemente hacia los bordes superior y exterior del tambor. En consecuencia, las partículas más pequeñas tienen una menor probabilidad de aparecer en la muestra. Como resultado, las partículas pequeñas no tendrán una representación aceptable en la muestra y cualquier análisis de tamaño de partícula no reflejará la verdadera distribución del tamaño de partícula de la población original. Para los sistemas heterogéneos, la muestra primaria inicial es la más difícil de obtener, por lo que es necesario el uso de un muestreador, en ocasiones denominado sonda de granos o arpón de muestreo. La ventaja de un muestreador es que se puede acceder a una mayor parte del lecho de polvo debido a que puede obtener muestras de diferentes puntos del lecho, lo cual ayuda a reducir el sesgo del muestreo. Se encuentran disponibles muchos tipos de muestreadores, incluyendo: (1) la sonda de tubo doble con compartimentos, (2) la sonda de tubo con un solo compartimento, (3) el muestreador de apertura terminal y (4) el muestreador de núcleo. Cada uno de estos tipos tiene sus propios procedimientos operativos, según se describe a continuación. La sonda de tubo doble con compartimentos separados es probablemente el tipo de muestreador más popular usado en la industria farmacéutica. Este tipo consiste en dos tubos o cilindros concéntricos, en el cual el tubo interno se divide en compartimentos. Este diseño permite detectar diferencias en el atributo relevante a distintas profundidades del envase. Para recolectar una muestra, el operador cierra los compartimentos e inserta el muestreador en el lecho de polvo con las aberturas de la zona de recolección orientadas hacia arriba. El mango se gira para abrir las zonas de muestreo; después, el mango se mueve hacia arriba y hacia abajo con dos movimientos cortos y rápidos para ayudar a llenar los compartimentos. Posteriormente, se cierra el muestreador y se retira del lecho de polvo. El operador debe inspeccionar visualmente el polvo extraido antes de vaciar el muestreador. El polvo de los compartimentos individuales se puede combinar en una superficie limpia o en un recipiente para recolección. En algunas situaciones el material de cada compartimento se puede analizar por separado, sin mezclarlo. En la sonda de tubo con un solo compartimento, el tubo interno no está dividido en compartimentos. La sonda se inserta primero en el lecho de polvo con el compartimento abierto, luego se rota la manga externa a la posición de cerrado, y posteriormente, el muestreador se retira del lecho de polvo. El contenido de la sonda se vacía del extremo del mango sosteniendo la sonda en posición vertical y permitiendo que la muestra se deslice hacia afuera del mango; éste es un método más conveniente que el utilizado con la sonda de tubo doble con compartimentos separados. Sin embargo, este tipo de muestreador dificulta más llevar a cabo la inspección visual para examinar el material en busca de inconsistencias que dependen de la profundidad. Una sonda muestreadora de apertura terminal, por lo regular usada para muestrear suspensiones espesas, tiene una sola zona de entrada en la parte inferior del muestreador. Con frecuencia, la zona de muestreo terminal es de mayor tamaño que el resto del muestreador. Esta característica resulta una desventaja debido a que cuanto más grande sea la sonda, más perturba el lecho de polvo, lo que posiblemente resultará en la introducción de sesgo al muestreo. Los muestreadores de núcleo tienen un cilindro exterior poco profundo con una pared exterior estrecha en el extremo abierto. Esta sonda se inserta en el lecho de polvo y la cohesión intrínseca de las partículas evita que fluyan hacia afuera al retirar la sonda. Posteriormente, el contenido del cilindro se vacía en un recipiente limpio. Consideraciones Generales: Los resultados más confiables y reproducibles en las mediciones de tamaño de polvo se obtienen cuando el tamaño de partícula es 2-1 O µm; de otro modo, el polvo es demasiado cohesivo y no fluye adecuadamente
USP 39
Información General/ (1097) Procedimientos para el Muestreo de Polvos a Granel 1339
hacia el interior del muestreador. Además, las partículas de tamaños mayores a aproximadamente un tercio del ancho del compartimento proporcionan resultados deficientes. Las muestras se deberían tomar de diversos sitios en todo el envase. La sonda debe ser lo suficientemente larga para penetrar al menos tres cuartas partes de la profundidad del lecho de polvo, asegurando que se pueda capturar en la muestra material procedente de todas las profundidades. La selección de los sitios debe establecerse por conocimiento (a menudo subjetivo) del grado de heterogeneidad del lecho de polvo, la cual puede haberse originado por la manipulación o el movimiento durante el transporte. Los planes de muestreo pueden requerir la inserción de la sonda en posiciones y ángulos aleatorios o en posiciones y ángulos predeterminados. Por ejemplo, el plan puede requerir la inserción de la sonda en el centro y en dos ubicaciones cerca de los bordes. Asimismo, muchos operadores recomiendan siempre insertar las sondas en un ángulo de 1 Oº de la vertical, lo cual incrementa la variedad de posiciones muestreadas. Algunas de las desventajas del muestreador incluyen el arduo trabajo que requiere el procedimiento. La sonda se debe insertar físicamente en el lecho de polvo, por lo regular en múltiples ocasiones; se debe vaciar el contenido de la sonda; y posteriormente, se debe limpiar la sonda a fondo. Para lechos de polvo sedimentados, la sonda de muestreo puede ser difícil de insertar. Además, la sonda de muestreo puede introducir errores como resultado de lo siguiente: las partículas finas se pueden depositar entre los tubos interno y externo; las partículas se pueden fracturar; las partículas finas se pueden compactar y no fluir bien hacia los compartimentos de muestreo; la segregación puede ocurrir durante el flujo hacia la zona de muestreo; y la inserción de la sonda puede perturbar el lecho de polvo al arrastrar polvo de las capas superiores del lecho hacia abajo y a través del lecho.
Muestreo Representativo del Lote Los planes de muestreo estadísticos se basan en principios estadísticos y dependen de la heterogeneidad espacial y de la variabilidad intrínseca de la población. Los planes de muestreo estadísticos son eficientes y permiten la recolección de un número suficiente de muestras para proporcionar el grado de certeza deseado sin recolectar una cantidad muy alta o muy baja de muestras para el método de prueba, escala, variación del producto, requisitos de riesgo y tolerancia para un nivel o especificación de calidad establecido del producto. El plan de muestreo -YN + 1 comúnmente usado que se proporciona en la Tabla 1 no es un plan de muestreo estadístico y puede resultar en la recolección de un número de muestras demasiado bajo para poblaciones pequeñas o demasiado alto para poblaciones grandes. El uso de planes de muestreo estadístico es ventajoso debido a que facilita la gestión de riesgos. No obstante, para los casos en los que el conocimiento previo de la población que se va a muestrear es insuficiente, se puede considerar un plan de muestreo no estadístico, tal como el proporcionado en la Tabla 1. La Figura 4 presenta los pasos del esquema de selección del tamaño de muestra. La primera decisión radica en si debe usarse un plan de muestreo estadístico o no estadístico. Cuando se está determinando un atributo variable como el tamaño de partícula o el contenido de fármaco, se prefieren los planes estadísticos. Los métodos generales de muestreo se describen en el capítulo de información general USP Datos Analíticos-Interpretación y Tratamiento (1010). Los planes de muestreo estadístico para aceptación del lote requieren de una base lógica con niveles de calidad conocidos para la determinación de las características del lote de producto. Conforme a lo indicado, la aplicación de planes de muestreo estadístico, incluyendo los planes de muestreo para aceptación del lote, requiere de conocimiento específico y profundo del material que se está muestreando. Los planes de muestreo estadístico de referencia establecen la base lógica para el muestreo como parte del esquema de muestreo. Los fabricantes que usan un método de muestreo estadístico para aceptación del lote deberían referirse a una norma apropiada tal como la norma ANSl/ASQ Zl .9-2003 para materiales a granel o la norma ANSl/ASQ Zl .4-2003 para poblaciones de unidades múltiples o discretas. Estas normas están disponibles en fuentes como la American Society for Quality (http:// www.asq.org/) o el American National Standards lnstitute (http://www.ansi.org/).
USP 39
1340 (1097) Procedimientos para el Muestreo de Polvos a Granel / Información General
HHH 1
2
•••
Población que se va a muestrear
3
N
No estadístico: Niveles de Calidad No Definidos
Pob.laclón De"nida y Atributos que e;e
Estadístico: Niveles de Calidad Definidos
van, a MiJestreaf
Consecuente Nivel2 Muestra Insuficiente Mue'stray
Valor.ación
Fin del Muestreo
Fin del Muestreo
Figura 4. Esquema de selección del tamaño de la muestra. Si se está desarrollando un plan de muestreo no estadístico cuyo nivel de calidad se desconoce, la Tabla 7 proporciona los tamaños de muestra sugeridos para el número de envases que deben muestrearse en el lote. El plan de muestreo Nivel 7 es pertinente para materiales cuando la heterogeneidad no afecta el análisis y el cliente busca muestrear más de un envase, cuando el plan de muestreo puede ser proporcional a la raíz cuadrada del número de envases recibidos y cuando el material proviene de una fuente conocida y confiable. En tales casos, la muestra se puede retirar de cualquier punto del envase. Para sistemas suficientemente homogéneos, resulta adecuado el muestreo con cuchara de la parte superior del envase. El plan de muestreo Nivel 2 implica un incremento del 50% en el tamaño de la muestra en comparación con el Nivel 7 y se usa cuando es necesaria una mayor proporción del número de envases, por ejemplo, cuando se sospecha que la heterogeneidad de un material es importante y los niveles de calidad de muestreo para aceptación no están definidos o cuando el material proviene de una fuente menos confiable. Dependiendo del grado de heterogeneidad del material, se puede usar un muestreador. Sin embargo, si el grado de heterogeneidad no afecta significativamente los resultados para el atributo que se está muestreando, aún puede ser adecuado un muestreo con cuchara a partir de la parte superior del tambor. La Tabla 7 presenta el número de envases, n, que se va a muestrear para un lote segregado en N envases. Se debe tomar en cuenta que el valor de n de la fórmula se redondea de 0,5 al número entero superior siguiente. Por ejemplo, si N = 6: para el Nivel 7, n = -V6 + 1 = 3,45 se redondea a n = 3; para el Nivel 2, n = 1,5 x -V6 = 3,67, que se redondea a n = 4. Tabla 1 n (Tamaño de la Muestra) N (Número de Envases que Componen el Lote)
N :o: 3 N 2:4
Nivel 1
Todos -ffi+l
Nivel 2
Todos 1,5
X
,fJ\j
Estas decisiones iniciales, según se ilustra en la Figura 4, por lo regular son difíciles y en ocasiones se deben tomar sin la información suficiente. En ocasiones, cuando no se tiene la certeza sobre la aptitud de un método o nivel, una prueba rápida e informal a pequeña escala del sistema puede ayudar a determinar la mejor manera de proceder. Asimismo, para algunos sistemas y atributos, los planes de muestreo de Nivel 7 y Nivel 2 pueden resultar en sobremuestreo. Por ejemplo, cuando se muestrea para fines de identificación a partir del mismo lote, los niveles sugeridos pueden resultar en la recolección de más muestras que las estadísticamente requeridas; en tales casos, se pueden emplear los planes de muestreo estadísticos referidos en la Figura 4.
USP 39
Información General/ (1097) Procedimientos para el Muestreo de Polvos a Granel 1 341
Recolección de la Muestra Obtener una muestra representativa de un lote de polvo a granel es un procedimiento difícil que requiere de consideraciones especiales; a continuación se analizan los procedimientos básicos para adquirir una muestra representativa. Se debe tomar en cuenta que cada situación requiere de técnicas apropiadas para la población determinada que se va a muestrear. Los métodos presentados en este capítulo son aplicables al muestreo de polvos estáticos almacenados en envases a granel de tamaño mediano, tales como súper costales de 1 tonelada, tambores de 50 kg o bolsas de 50 libras. Estos métodos no son necesariamente aplicables al muestreo de líquidos, envases de almacenamiento grandes tales como vagones de tren o silos o sistemas durante el proceso tales como mezcladoras o cintas transportadoras móviles. Además, los procedimientos descritos en este capítulo son más aplicables a partículas con tamaños que van de aproximadamente -1 µm a aproximadamente -1000 µm. Las partículas con tamaños significativamente mayores o menores requieren de procedimientos especiales que no se tratan en este capítulo.
RECOLECCIÓN DE LA MUESTRA PRIMARIA Las muestras para la aceptación del lote por lo general se transfieren o entregan en envases. Para recolectar una muestra representativa primaria o bruta (ver la Figura 1), primero debe seleccionarse el envase o envases apropiados de la población de N envases; después, se debe extraer una muestra representativa de cada uno de los envases seleccionados.
Selección del Envase Para evitar sesgos y otros errores de muestreo, los envases que se van a muestrear deben seleccionarse de manera aleatoria. Para llevar a cabo una selección aleatoria, primero se numeran todos los envases del lote y luego se emplea una tabla numérica aleatoria (o números aleatorios generados por computadora) para seleccionar el o los envases de los cuales se extraerán las muestras. Para los sistemas en los que los envases se agrupan de tal manera que muchos de los envases individuales son prácticamente inaccesibles (p.ej., bolsas de 50 lb apiladas y unidas con envoltorio plástico sobre una paleta), es posible que el plan de muestreo necesite tomar en cuenta el envase de mayor tamaño, además del envase más pequeño, como una unidad de muestreo, a fin de asegurar una muestra representativa.
Retiro de la Muestra de un Envase Tipos de Envases: Los tres tipos de envases más populares son la bolsa, el tambor y el súper costal. Debido a que las bolsas por lo general están cerradas y no son resellables, se han diseñado muestreadores especiales, en ocasiones denominados caladores de bolsas, para perforar las bolsas. Cuando el sistema que se va a muestrear es heterogéneo, las muestras deberían obtenerse del fondo, del centro y de la parte superior de la bolsa; y dependiendo de la forma en que se apilan las bolsas en la paleta, también deberían obtenerse muestras de las partes frontal y posterior de la bolsas. Cuando se toman muestras de bolsas, se debe prestar atención particular a las esquinas, debido a que pueden atrapar partículas finas de manera desproporcionada. Cuando no se cuenta con un calador de bolsas, se puede usar un cuchillo para abrir la bolsa para el muestreo. Cuando se toman muestras de una bolsa, es necesario asegurarse de que la superficie externa esté lo suficientemente limpia para no contaminar la muestra y evitar la introducción de materia extraña en el material a granel. Una vez que se ha tomado la muestra, colocar un material compatible sobre el agujero de la bolsa y luego fijar este parche con una cinta adhesiva adecuada. Dependiendo de la heterogeneidad del tambor, se puede usar una cuchara o un muestreador. Los súper costales son costales de gran tamaño que por lo regular tienen una boca de llenado en la parte superior y una boca de descarga en el fondo. Para material adecuadamente homogéneo, el muestreo con cuchara es adecuado; no obstante, cuando existan dudas acerca de la heterogeneidad del material, se debe usar un muestreador. El gran tamaño de los súper costales le otorga mayor importancia al uso de un muestreador para un muestreo representativo que en el caso de un tambor o bolsa, a fin de disminuir el error de delimitación potencial.
Manipulación de la Muestra Las muestras recolectadas se pueden analizar de manera individual o combinadas; posteriormente, se puede analizar un subconjunto de la muestra bruta, según se ilustra en la Figura 1 y se describe a continuación. Las muestras acumuladas se deben combinar sobre una superficie limpia y seca o en un recipiente o bolsa adecuados. Todos los recipientes con los que entre en contacto la muestra deben ser inertes y no reaccionar química o físicamente con la muestra. Además, las muestras deben etiquetarse adecuadamente y es necesario mantener registros apropiados. Se debe conservar una porción en caso de que se requiera un análisis futuro.
1 342 (1097) Procedimientos para el Muestreo de Polvos a Granel / Información General
USP 39
REDUCCIÓN DEL TAMAÑO DE LA MUESTRA PRIMARIA Conforme a lo mencionado anteriormente, la muestra primaria por lo general consiste en múltiples muestras tomadas de varios envases y mezcladas entre sí. Para obtener una muestra para análisis o medición (Figura 1), la muestra bruta o primaria debe reducirse a un tamaño apropiado para el método analítico. La reducción del tamaño de la muestra bruta o primaria es un aspecto de un plan de muestreo que a menudo no se tiene en cuenta, pero que es un paso importante. Los factores que ocasionan la segregación en un envase también pueden provocar la segregación de la muestra primaria y cualquier sesgo en el método de reducción del tamaño para la muestra primaria conducirá a resultados erróneos. La ventaja de las muestras secundarias es que la masa ha sido reducida a un punto en el que resulta más fácil obtener una muestra representativa debido a que se puede acceder fácilmente a cada elemento en el lecho de polvo, lo cual facilita el cumplimiento con las mejores prácticas de muestreo. En general, la medición de la muestra se lleva a cabo en condiciones húmedas o secas y son los requisitos del método analítico los que establecen las condiciones requeridas. Por ejemplo, el contador Coulter requiere que las muestras estén uniformemente suspendidas en un electrolito, mientras que otros métodos, tales como el tamizado, por lo regular se realizan con polvos secos. Antes de dividir una muestra aglomerada, los aglomerados deberían separarse mediante una técnica adecuada como tamizado.
Métodos de Análisis en Seco Existe una gran cantidad de dispositivos de laboratorio disponibles para la reducción de la muestra primaria a una muestra analítica. Los tres métodos más importantes usados en la industria farmacéutica son: (1) 21 muestreo con cuchara, (2) la formación de cono y cuarteo, y (3) el "spinning riffler" o el separador rotatorio (método manual de fraccionamiento por pala); ver la Figura 5.
Figura 5. Dos procedimientos para dividir muestras. Parte superior: separador rotatorio, en el que un soporte circular gira a una velocidad constante y la muestra se carga a una velocidad constante en los recipientes mediante un vertedor vibratorio que se alimenta con una tolva de flujo de masa. Parte inferior: formación de cono y cuarteo. (El cono a la izquierda se aplana y se divide en cuatro; se pueden formar cuartos y luego subdividirlos.) Muestreo con Cuchara: El muestreo con cuchara se lleva a cabo según se describió anteriormente, pero por lo general con una cuchara o espátula más pequeña. Se debe tener mucho cuidado al retirar material de la muestra primaria debido a que este material podría estar altamente segregado como resultado de la manipulación. El muestreo con cuchara es adecuado para polvos homogéneos o cohesivos. No obstante, si el polvo es propenso a la segregación, el muestreo con cuchara puede introducir errores significativos. Además, el muestreo con cuchara presenta diversas desventajas importantes. En primer lugar, el método depende de la decisión del operador sobre qué parte de la muestra primaria va a recoger con la cuchara y la cantidad de la muestra que retira, que son aspectos que pueden introducir un sesgo debido al operador. Segundo, en el muestreo con cuchara, los operadores tienden a retirar la muestra de la superficie libre, la cual es altamente propensa a la segregación y no es representativa de todo el material a granel. Tercero, es necesario que los operadores eviten formar una pila en la cuchara o espátula que pueda ocasionar segregación, debido a que el material podría caer por los bordes de la espátula o cuchara y sesgar en la muestra. Resultaría ideal que el operador intentase mezclar la muestra primaria antes de usar la cuchara, pero esto también podría agravar los problemas de segregación por lo que se debe llevar a cabo con sumo cuidado. Formación de cono y cuarteo: La formación de cono y cuarteo se lleva a cabo vertiendo la muestra primaria formando un cono simétrico sobre una superficie plana. Posteriormente, el cono se aplana con una superficie plana tal como una espátula y se divide en cuatro cuartos idénticos (Figura 5). Se toma un cuarto como muestra. Este procedimiento se puede repetir hasta obtener el tamaño de muestra deseado (p.ej., se pueden subdividir muestras de cuartos en cuartos). La teoría de este
USP 39
Información General/ (1097) Procedimientos para el Muestreo de Polvos a Granel 1343
método se basa en que al crear un cono simétrico todos los procesos de segregación también ocurren simétricamente alrededor del cono, por lo que se usa la simetría para mitigar el efecto de la segregación. En la práctica resulta muy difícil generar un cono de polvo simétrico y el método se vuelve sumamente dependiente del operador y a menudo poco confiable. La diferencia en la manera en que los operadores forman la pila y la subdividen puede llevar a la falta de precisión y errores significativos. Asimismo, cuando el método se lleva a cabo más de una vez, los errores se pueden propagar cada vez que se realiza la formación de cono y cuarteo. Algunos expertos no recomiendan este método. Separador Rotatorio: Un separador rotatorio (Figura 5) incluye una serie de recipientes montados en un soporte circular. El soporte circular gira a una velocidad constante y la muestra se carga a una velocidad constante en los recipientes mediante un vertedor vibratorio que se alimenta con una tolva de flujo de masa. Una vez que el material se ha dividido entre los diferentes receptáculos, se puede retirar un receptáculo individual para su análisis o para una nueva división de la muestra. La velocidad angular de los soportes circulares y la amplitud del alimentador vibratorio pueden ser controladas para acomodar polvos con diferentes propiedades de flujo. La velocidad del soporte y la velocidad de alimentación deben ajustarse de manera que los recipientes se llenen uniformemente y para evitar que se forme una pila en el alimentador vibratorio. Los separadores rotatorios están disponibles en diversos tamaños, lo que permite generar subdivisiones de polvos desde unos pocos miligramos hasta cientos de gramos. Las únicas desventajas del separador rotatorio son el tiempo requerido para procesar la muestra y la limpieza del equipo, así como el capital requerido. A pesar de estas desventajas menores, el separador rotatorio es por ahora, el mejor método de subdivisión de polvos de flujo libre. El fraccionamiento por pala es la versión manual del separador rotarorio. En este método, se toman las muestras con cuchara a partir de la muestra original y se colocan en un número suficiente de alícuotas; posteriormente, se siguen tomando cucharadas subsiguientes de la muestra original y se colocan en una de las alícuotas en orden secuencial. Este proceso se repite hasta agotar las muestras originales. Después, se toma al azar una de las alícuotas como la muestra reducida. Al igual que con todos los métodos manuales, los errores derivados del operador y la variabilidad pueden representar errores significativos.
Métodos de Análisis Húmedos Los métodos de análisis húmedos requieren dispersar la muestra en un líquido adecuado para su análisis y después retirar una alícuota usando una jeringa o pipeta. El muestreo secundario efectivo requiere preparar una suspensión homogénea estable (es decir, la muestra debe ser estable desde el momento de la formación de una suspensión hasta el momento en que se completa el análisis). Algunos factores importantes del análisis húmedo son la solubilidad de la muestra en el vehículo de dispersión, la agrupación de la muestra, el uso de agentes de suspensión y la separación de partículas primarias en el vehículo de dispersión. Aún cuando la suspensión preparada sea uniforme, la muestra debe homogeneizarse, por lo regular agitando, inmediatamente antes de retirar la muestra con una jeringa o pipeta. El diámetro de la jeringa o pipeta debe ser lo suficientemente grande como para no excluir partículas y evitar obstrucciones. Los diámetros de las partículas de mayor tamaño no deben exceder del 40% del diámetro de la punta de la jeringa o pipeta. Cuando por razones prácticas, la cantidad de material de la muestra primaria es demasiado grande, el tamaño de la muestra se debería reducir antes de preparar una suspensión. Para reducir el tamaño de la muestra se pueden usar los métodos descritos anteriormente en la sección Métodos de Análisis en Seco. A manera de precaución, se debe recolectar y conservar suficiente muestra como para todas las pruebas un mínimo de cinco veces.
APÉNDICE 1: EJEMPLOS DE SUBMUESTREO Los siguientes ejemplos describen la importancia de la caracterización de las partículas del material durante la selección de una masa de muestra adecuada. A continuación se presentan cuatro ejemplos. En el primer ejemplo se asume la similitud en las características fundamentales o intrínsecas del material. En el segundo ejemplo se cambia la densidad del analito que se está midiendo. En el tercer ejemplo se evalúa el efecto de cambiar el tamaño de partícula. En el cuarto ejemplo se evalúa la capacidad de las características fundamentales de las partículas en una formulación necesaria para una unidad de dosificación o masa de las partículas determinada.
Ejemplo 1. Determinación de la Masa de la Muestra Si se asume que el tamaño del lote es 1 kg, el diámetro máximo de partícula es 1000 µm, y se espera que la concentración del analito sea 1 %, ¿qué masa de la muestra de partículas esféricas de 1000 µm de igual tamaño y forma con una densidad de 1 g/cm 3 se necesitaría para estimar la concentración promedio del analito con una desviación estándar relativa porcentual (%RSD, por sus siglas en inglés) de 5%? Si se reordena la ecuación 3, se puede estimar la masa de la muestra según se muestra en la ecuación 5: mmuestra
""---=s-~1 - - -
emf2 1 ------+ftorma9FG CmaxldmaiZ mlote
(5)
1 344 (1097) Procedimientos para el Muestreo de Polvos a Granel / Información General
USP 39
La heterogeneidad máxima de composición (cmáx) se puede estimar tomando en cuenta la densidad del analito y de la matriz O-a y A.m, respectivamente, y su promedio A.) y la concentración del analito (al) (ecuación 6):
(6) Para concentraciones bajas de analito, la heterogeneidad máxima de composición se simplifica a la ecuación 7:
Para concentraciones altas de analito, la heterogeneidad máxima de composición se simplifica a la ecuación 8:
El factor de forma se aproxima mediante la ecuación 9:
t
forma
~Volumen/ 3 j d
(9)
Donde des el diámetro de partícula nominal para una esfera y el factor de forma es [(4/3)rc/8] o aproximadamente 0,5. El factor granulométrico se puede aproximar mediante el diámetro mínimo típico observado en el percentil 5 de tamaño dividido por el diámetro máximo típico observado en el percentil 95 de tamaño, según se observa en la ecuación 1O:
(1 O) Debido a que todas las partículas son del mismo tamaño, el factor granulométrico, gFGi es 1,0. Debido a que el analito se presenta en un estado liberado de las partículas de la matriz, el factor de liberación es también 1,0. La masa de la muestra para una RSD del 5% (usando la ecuación 5) es, por ende: mmuestra
==
O, 05 2 1 -------~+-3 5 X 1 X 100 X 0, 1 1000
19,6 g
º·
Una masa de la muestra de 19,6 g proporcionará un error de muestreo con RSD de aproximadamente 5%. Se debe tomar en cuenta que en este ejemplo las características de las partículas se simplifican para demostrar que un lote con una masa de 1000 g contiene 2 x 10 6 partículas con una masa de 0,5 mg. La masa de la muestra de 19,6 g contiene aproximadamente 39 216 partículas, con una RSD del 5%, usando la distribución binomial donde p es la concentración del analito (al) y n es el número de partículas muestreadas, según se presenta en la ecuación 11. RSDBinomial= ~(1-p)/np =
~(1-0,01)/39216x0,01
=
0,0498,,,,0,05
(11)
(Ver la Tabla 2 para un resumen de los cálculos.) Tabla 2. Resumen de Cálculos para el Ejemplo 1, Partículas de Tamaños y Formas Idénticas mlnte (g) 1000
1
d (cm)
1
o, 1
Masa por Partícula P, d 3fform>Aa
1 1
ffnrm;i
0,5
9FC.
1
1
Cmáx
1
100,0
1 1
al 0,01
Partículas en 19,6 g m /(P /gfr.) 0,005
39 216
1 1
A..(g/cm 3) 1
1
1
1
1
m, (g) 19,6
RSD Binomial p = a(l) = 0,01 n=39216 (Igual a 11) 0,05
Al determinar la masa de la muestra requerida, se asume que la muestra es representativa de la población. Además, al usar una sola muestra representativa, se asume que la uniformidad de la masa de la muestra es constante con respecto a la población remanente. Se debe tomar en cuenta que los factores granulométricos y de liberación permiten el ajuste proporcional del tamaño de la muestra, dependiendo de la naturaleza de las partículas. La inclusión de un factor de liberación en la ecuación permite a las partículas contener una proporción del analito dentro de cada partícula o en una proporción de la misma partícula. El factor granulométrico permite ajustar la masa de la muestra tomando en cuenta la relación de tamaño entre las partículas más pequeñas y más grandes representadas en el lote.
Información General/ (1097) Procedimientos para el Muestreo de Polvos a Granel 1345
USP 39
Esta aproximación también se puede aplicar a suspensiones líquidas en las que cada partícula se considera discreta y la muestra se puede caracterizar con respecto al tamaño, densidad, masa y volumen.
Ejemplo 2. Metal Pesado En este ejemplo se asume que el analito es el metal pesado plomo, con una densidad de 11,34 g/cm 3, con un límite de no más de 5 ppm, donde las formas de las partículas son cúbicas (f1orma = 1,0), las partículas son de aproximadamente 50 µm y se toma una muestra de 5 g del material analizado (gFG = 0,55). Basándose en la ecuación 3, la %RSD es 17,7%. Usando la ecuación 5, se puede encontrar que es necesaria una masa de la muestra de aproximadamente 60 g para lograr una RSD del 5%, asumiendo que aL es igual al límite permitido y que no se puede suponer que el analito se liberará del material (1 = 1,0). (Ver la Tabla 3 para un resumen de los cálculos.) Tabla 3. Resumen de Cálculos para el Ejemplo 2, Metal Pesado m
(g) 1000
m ( )
d (cm)
5
0,005
X
10-6
11,34
1,0
58,71
Si se asumiera que la muestra es homogénea (1 = O, 1) con respecto a la presencia del analito en todas las partículas, entonces sería necesaria una masa de muestra de 6,2 g. Asimismo, si la forma de las partículas fuera entre esférica y cúbica (f1orma = 0,8), entonces sería necesaria una masa de muestra de 5 g para completar el análisis.
Ejemplo 3. Submuestreo El muestreo ideal, según se mencionó con anterioridad, es fundamental para entender el papel importante del submuestreo. En muchas ocasiones, resulta deseable reducir el tamaño de la muestra de manera que resulte en una muestra representativa y disminuya la necesidad de analizar una masa grande de muestra. En algunos casos, el tamaño de partícula y la heterogeneidad de composición puede resultar en una masa de muestra difícil de manejar. Esto puede ocurrir con partículas de gran tamaño o cuando se requiere de una muestra compuesta de muchos envases. Las muestras con partículas de mayor tamaño pueden necesitar ser reducidas físicamente. Por ejemplo, usando el Ejemplo 2 anterior, si el tamaño máximo de partícula fuera 1000 µm o 1 mm, entonces la ecuación 3 sugeriría una muestra de 997 g. Reduciendo el tamaño de partícula mediante molienda o submuestreo para conseguir una %RSD de muestreo predeterminada puede requerir más de un submuestreo para lograr el tamaño de partícula deseado. Por ejemplo, la muestra completa puede reducirse hasta 100 µm para disminuir la %RSD a aproximadamente 3%; luego, con el muestreo ideal, se puede seleccionar una submuestra y reducirla completamente hasta 50 µm para lograr una RSD del 5%. Finalmente, sería posible tomar y analizar correctamente una submuestra de 5 g. Cuando ciertas partículas son de gran tamaño con una alta concentración del analito, entonces se deben seleccionar muestras para asegurar que al menos 1 partícula, pero de preferencia al menos 5 a 6 partículas fueran seleccionadas con una probabilidad u oportunidad de selección del 95%.
Ejemplo 4. Masa Mínima de Unidad de Dosificación Sería deseable para el formulador conocer la masa mínima requerida para una forma farmacéutica a fin de asegurar, con una confianza del 95%, una unidad de dosificación de polvo de fármaco activo al 1%. El fármaco y el excipiente tienen una forma redonda similar (f1orma = 0,5) y una densidad de 0,33 g/cm 3 • El fármaco activo se muele hasta 1 µm, pero el tamaño de los excipientes puede ser tan grande como 200 µm. El valor para gFG se toma de la ecuación 1O, usando el intervalo esperado del excipiente que representa el 95% de la formulación, como 1O µm/200 µm o gFG = 0,05. La cantidad cmáx de la ecuación 7 se toma como 0,33/0,01. Las partículas del fármaco están completamente liberadas del excipiente. El tamaño de la partida es de 100 kg. Tabla 4. Resumen de Cálculos para el Ejemplo 4, Masa Mínima de Unidad de Dosificación m
(g) 105
d (cm)
0,02
f1
gF
0,5
0,05
c 33
a 0,01
/.., (g/cm 3) 0,33
1
m (g)
1,0
0,00264
Se requiere una masa de muestra mínima de aproximadamente 3 mg para asegurar con una confianza del 95% (2 desviaciones estándares relativas) que el contenido de fármaco promedio es O, 9%-1, 1%. La forma farmacéutica propuesta tiene una concentración activa de 100 µm/1 O mg de masa total por unidad. La masa de la forma farmacéutica por unidad es adecuada, pero la formulación requiere que el proceso de mezclado, la producción de la unidad de dosificación, el dispositivo de muestreo a granel y la preparación de la muestra en el laboratorio o submuestreo a partir de muestras a granel resulten en una probabilidad similar de selección de partículas del fármaco. Sólo si se cumplen dichas condiciones de mezclado, producción, muestreo y análisis será posible demostrar con facilidad que se cumplen los criterios de aceptación de 1 % (0,01 µg/mg) para la unidad de dosificación y la determinación de la prueba. Los resultados aceptables de dicho análisis también indican que es necesario controlar el tamaño de partícula, la forma y la densidad. Por ejemplo, un incremento en los tamaños de partículas hasta 500 µm resulta en la necesidad de una masa de muestra y dosis de 42 mg. Si se asume una forma cúbica, contrario a lo establecido para la forma redonda, la partícula incrementa la masa de la muestra hasta 5 mg, lo cual, para una masa fija de la
USP 39
1 346 (1097) Procedimientos para el Muestreo de Polvos a Granel / Información General
forma farmacéutica, puede resultar en menos espacio para la variación debida a otras características o en una confianza menor. Si se cambiaran los criterios de aceptación a 0,95%-1,05%, lo que requeriría una RSD de 1 %, entonces la masa mínima de la muestra se incrementaría hasta aproximadamente 70 mg. (Ver la Tabla 4 para un resumen de los cálculos.)
APÉNDICE 2: CARACTERIZACIÓN Y MUESTREO DEL MATERIAL El conocimiento específico y profundo de la síntesis, composición y uso del material es crítico para desarrollar un plan de muestreo de un material a granel. La caracterización del material es importante debido a que el material a granel puede adquirir una gran cantidad de formas durante todo el flujo del proceso del material. Conforme a lo presentado en la Figura 6, el tipo de muestreo puede variar en cada paso del proceso y en última instancia afecta el uso del material en el medicamento. La caracterización apropiada del material toma en cuenta el paso del proceso del material, el tipo de muestreo, el objetivo del paso del proceso y finalmente, el medicamento.
1 1 1
Síntesis I
1
Muestreo
Fabricación
1
durante el
L
1 caracterizació~n 1
1
del material · [
~----L
__l____
1
Control del
1
--
[
Proceso
.J
1
1
--Tl
· - - -
r-E;,vasado J ¡---M j ¡ r Verificación de \ Et I uestreopara~~ . ___,iq_ue_ta_do---j Aceptación Atributo~ _de Transito ______j Aceptac1on
1
J
- - ¡ - -:peticiÓn_J
~cenamiento de~a PruebJ-1 - -
1
\
1~
Proceso
1
1
_J-Peno~o
de
LJ Materi~1J
Uso del, \ \
.
L-fechad_o_I
Figura 6. Flujo del proceso del material. Por ejemplo, cuando el muestreo puede ser limitado o ideal para la característica relevante, el material puede mezclarse o sintetizarse en un recipiente grande. Cuando la característica es importante pero las condiciones de muestreo no son ideales, tal vez debido a la heterogeneidad de una mezcla de polvo, entonces el muestreo para dicha característica se puede llevar a cabo de manera más apropiada en un área diferente, antes o después (más cerca o más lejos) en el proceso, para evaluar la heterogeneidad del contenido y asegurar el muestreo ideal. Lo anterior se realiza a veces para reducir la dimensión del muestreo. La dimensión del muestreo se reduce cuando el espacio de un envase a granel de tres dimensiones se muestrea en un flujo de 1 ó 2 dimensiones a través del tiempo. Reduciendo la dimensión espacial del muestreo puede proveer condiciones que permitirán una medición más exacta de la heterogeneidad del material al tiempo que se limita el error de muestreo mediante el muestreo ideal. Los atributos de aceptación (ver la Tabla 5) dependen de la caracterización y el proceso del material. Los atributos de aceptación pueden se aplicables durante toda la vida del material a granel. El número y el tamaño de las muestras requieren un conocimiento de la variación del material. Tabla 5. Ejemplos de Atributos de Aceptación Atributos de Aceptación Físicos Tamaño de partícula Viscosidad Densidad
Químicos Pureza pH Identidad Concentración
Envasado
Microbiológicos Esterilidad Pirógenos Carga microbiana
Exactitud de la etiqueta Integridad
APÉNDICE 3: FUENTES ADICIONALES DE INFORMACIÓN 1. Allen, T, Portie/e Size Measurement, 5° ed., Vol. 1, Powder Technology Series, B. Scarlett and G. Jimbo (Eds.), 1997, London: Chapman & Hall, pág. 525. 2. Beebe, KR, RJ Pell, and MB Seasholtz, Chemometrics: A Practica/ Cuide. 1998, New York: John Wiley & Sons, pág. 348. 3. Brereton, RG, Chemometrics Data Analysis for the Laboratory and Chemical Plant. 2003, Chichester, England: John Wiley & Sons, pág. 489. 4. Burns, DA, and EW Ciurczak, Handbook of Near-lnfrared Analysis: Practica/ Spectroscopy, 2° ed. 1992, New York: Marce! Dekker. 5. Chowhan, Z, Segregation of particulate solids, Part 1. Pharm. Technol., 1995, l 9(mayo): págs. 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70. 6. Chowhan, Z, Segregation of particulate solids, Part 2. Pharm. Technol., 1995, l 9(junio): págs. 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94. 7. Gerlach, RW, and JM Nocerino, Guidance for Obtaining Representative Laboratory Analytical Subsamples from Particulate Laboratory Samples. U.S. Environmental Protection Agency EPA/600/R-03/027, Noviembre 2003. 8. Jillavenkatesa, A, SJ Dapkunas, and L-SH Lum, Portie/e Size Characterization, Special Publication 960-1, National lnstitute for Science and Technology, 2001. 9. Kramer, R, ed., Chemometric Techniques for Quantitative Analysis. 1998, New York: Marce! Dekker, pág. 203.
USP 39
Información General/ (1102) Métodos de Pruebas Inmunológicas 1347
1O. Malinowski, ER, Factor Analysis in Chemistry, 3°· ed. 2002, New York: John Wiley and Sons, pág. 414. 11. Martens, H, and T Naes, Multivaritate Calibration. 1989, Chichester, England: John Wiley & Sons, pág. 419. 12. Muzzio, F, et al., Sampling and characterization of pharmaceutical powders and granular blends. lnt. /. Pharm., 2003, 250(1 ): págs. 51-64. 13. Muzzio, FJ, et al., Sampling practices in powder blending. lnt. /. Pharm., 1997, 155(2): págs. 153-178. 14. Petersen, L, CK Dahl, and KH Esbensen, Representative mass reduction in sampling-a critica! survey of techniques and hardware. Chemom. lntel/. Lab. Syst., 2004, 74: págs. 95-114. 15. Petersen, L, P Minkkinen, and KH Esbensen, Representative sampling for reliable data analysis: theory of sampling. Chemom. lnte/I. Lab. Syst., 2005, 77: págs. 261-277. 16. Sastry, KVS, et al., Solid-solid operation and equipment, in Perry's Chemical Engineeer's Handbook, RH Perry, DW Green, and JO Maloney, Eds. 1997, New York: McGraw-Hill, págs. 19-1-19-65. 17. Skoog, DA, and JJ Leary, Principies of Instrumenta/ Analysis, 4°· ed. 1992, Fort Worth, TX: Saunders College Publishing, pág. 700. 18. Smith, PL, A Primer for Sampling Sofids, Liquids, and Gases: Based on the Seven Sampfing Errors of Pierre Gy. In ASA-SIAM Series on Statistics and Applied Probability, RF Gunst, ed. 2001, Philadelphia: Society for Industrial & Applied Mathematics. pág. 96. 19. Tatavarti, AS, et al., Assessment of NIR spectroscopy for nondestructive analysis of physical and chemical attributes of sulfamethazine bolus dosage forms. MPS PharmSciTech, 2005, 6(1 ): págs. E91-E99. 20. Venables, H, and J Wells, Powder sampling. Drug Dev. lnd. Pharm., 2002, 28(2): págs. 107-117.
(1102) MÉTODOS DE PRUEBAS INMUNOLÓGICASCONSIDERACIONES GENERALES INTRODUCCIÓN Este capítulo de información general proporciona descripciones de alto nivel sobre los principios de los métodos de pruebas inmunológicas (MPI) que se pueden usar en las pruebas especificadas en las monografías, así como información y metodologías para el desarrollo analítico y la validación de los MPI. El alcance de este capítulo es proveer información general aplicable a todos los MPI. Este capítulo ofrece una base para capítulos específicos sobre diversos tipos de MPI, tales como los capítulos Métodos de Pruebas Inmunológicas-Ensayo por lnmunoadsorción Ligado a Enzimas (EL/SA) (1103), Métodos de Pruebas Inmunológicas-Análisis por lnmunotransferencia (1104) (propuesto) y Métodos de Pruebas Inmunológicas-Resonancia de Plasmón Superficial (1105). Este conjunto de capítulos de información general se relaciona con los capítulos de información general sobre valoraciones biológicas. El uso de MPI para monitoreo del proceso, diagnóstico y evaluación de respuesta clínica, evaluación de farmacocinética/farmacodinámica/absorción, distribución, metabolismo y excreción (PK/PD/ADME, por sus siglas en inglés, respectivamente), y demás caracterizaciones del producto (pruebas que no se usan para liberar el producto) quedan fuera del alcance de este capítulo. El fundamento de todos los MPI usados para medir un atributo de calidad de un fármaco o medicamento biológico es la interacción de unión no covalente altamente específica entre un antígeno y un anticuerpo. Por lo regular, el antígeno es un analito de interés (p.ej., proteína, carbohidrato, virus o célula), mientras que el enlazante es por lo general un anticuerpo (p.ej., un anticuerpo monoclonal o un antisuero policlonal). Los MPI se pueden aplicar a moléculas que son directamente antigénicas (inmunogénicas) o que pueden transformarse indirectamente en antigénicas (haptenos). El mesurando en los MPI se relaciona directamente con un atributo de calidad del producto en análisis. Los MPI tienen gran valor debido a que presentan una alta sensibilidad y especificidad para un analito en matrices complejas. Asimismo, los MPI se usan generalmente para la evaluación cualitativa y cuantitativa de anticuerpos y antígenos, pero su aplicación también se extiende a la medición de haptenos, complemento, complejos antígeno-anticuerpo y demás interacciones entre proteínas. Estas propiedades de los MPI permiten emplearlos para evaluar la identidad, potencia (contenido), pureza, impurezas, estabilidad y demás atributos de calidad de fármacos y medicamentos biológicos. Los MPI son útiles para una gran cantidad de aplicaciones debido a que pueden medir moléculas en un amplio intervalo de tamaños y tipos de enlace. En general, los anticuerpos se mantienen estables durante varias modificaciones químicas que no tienen una influencia adversa significativa sobre las interacciones con un antígeno. Las moléculas de anticuerpos tienden a tolerar cambios de pH acídicos y alcalinos moderados mejor que otras proteínas. Debido a tal característica, resulta posible una variedad de MPI con altos grados de sensibilidad y especificidad. La capacidad de acelerar el contacto entre un antígeno y un anticuerpo da lugar a formatos de MPI que proporcionan resultados rápidos o en tiempo real. Por lo general, los MPI tienen una mayor precisión y un menor tiempo de respuesta que las valoraciones biológicas tradicionales (es decir, las valoraciones en animales y las basadas en células). Aunque en algunas ocasiones, estas ventajas pueden respaldar el uso de un inmunoensayo en lugar de una valoración biológica, dichos cambios se deben plantear sistemáticamente y con precaución. A menudo, probar la equivalencia o comparabilidad de resultados de valoraciones biológicas e inmunoensa-
1 348 (1102) Métodos de Pruebas Inmunológicas / Información General
USP 39
yos representa un desafío, debido a que la interacción entre antígeno y anticuerpo podría no reflejar los atributos funcionales observados en las valoraciones biológicas. Una limitación importante de los MPI en comparación con los métodos fisicoquímicos (tales como cromatografía líquida o de gases) es que estos últimos, por lo general, son más precisos y pueden identificar un conjunto de impurezas o sustancias inesperadas simultáneamente. Otra limitación importante es que, por lo regular, los MPI operan en diluciones molares altas en las que son sensibles a las alteraciones ocasionadas por factores ambientales en la matriz de la muestra (es decir, efectos de la matriz). Los efectos de la matriz pueden depender del formato de MPI y aún no se comprenden del todo. Su especificidad, una característica distintiva de los MPI, en ocasiones se ve comprometida por las similitudes en la estructura o secuencia entre el analito y una impureza molecular estrechamente relacionada (reactividad cruzada). La mayoría de los MPI reflejan la interacción física (unión) entre un antígeno y un anticuerpo y no las propiedades funcionales del analito. Por lo tanto, los analistas deben prestar atención a la selección y ejecución del formato de los MPI. Los MPI basados en células que pueden proveer información funcional sobre el analito están fuera del alcance de este capítulo.
CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LOS MPI Los MPI se basan en el principio de interacciones específicas, no covalentes y reversibles entre antígeno y anticuerpo. En general, la reacción antígeno-anticuerpo primaria es ocasionada por la complementariedad, lo que genera una especificidad macromolecular. Esta interacción no covalente determina el grado de afinidad intrínseca. La afinidad intrínseca contribuye a la afinidad funcional y/o relativa que depende de factores tales como la fase y valencia de reacción, lo cual, a su vez, determina el grado de reversibilidad de una interacción. Comprender de manera adecuada los factores que afectan las interacciones antígeno-anticuerpo proporciona los fundamentos necesarios para el desarrollo de un formato de MPI adecuado (p.ej., fase líquida o sólida, unión competitiva o no competitiva, etc.). Una característica que define a los MPI es que emplean un antígeno (o hapteno) y un anticuerpo. Asimismo, los MPI pueden contener moléculas acompañantes tales como complementos. Los componentes de los MPI se definen del siguiente modo: • Antígenos-Comprenden un amplio rango de moléculas que son capaces de unirse al anticuerpo en una interacción específica. Por lo general, las partes de un antígeno (los epítopes inmunogénicos) son capaces de provocar la respuesta del anticuerpo. • Haptenos-Pequeñas moléculas que, por sí mismas, no son capaces de provocar una respuesta del anticuerpo, pero que son capaces de provocar una respuesta inmune cuando se adjuntan a un portador más grande tal como una proteína. Los anticuerpos producidos por un aducto hapteno-portador también pueden unirse al hapteno de la molécula pequeña en una interacción específica. • Complementos-Moléculas acompañantes que, en ciertas condiciones, ayudan a la funcionalidad de los complejos antígeno-anticuerpo, pero que no son necesarias para las interacciones antígeno-anticuerpo o hapteno-anticuerpo. • Anticuerpos-Proteínas con regiones que imparten un alto grado de enlace específico a antígenos (y haptenos). Los elementos estructurales de un anticuerpo inmunoglobulina G (lgG) se muestran en la Figura 7. Además de estos componentes, los MPI requieren de algunos medios para detectar o monitorear la reacción de unión entre el antígeno y el anticuerpo.
Información General/ (11 02) Métodos de Pruebas Inmunológicas 1 349
USP 39
Sitios de unión de antígenos
........................
.···
···•················
·.............
········•·...........
·······t······
·····..
·· ...
Región Bisagra
~
...........
- Carbohidratos - Enlaces Disulfuro
Figura 1. Estructura de la lgG. La molécula de la lgG se caracteriza por una estructura de dominio distintiva de cadenas pesadas (H) y livianas (L), las cuales se dividen en regiones variables y constantes (V y C, respectivamente). Las cadenas livianas consisten en dominios VL y CL, mientras que las cadenas pesadas consisten en un dominio variable (VH) y tres dominios constantes (CH 1, CH2 y CH3). Todos los dominios se estabilizan mediante enlaces disulfuro, mientas que los dominios CH2 contienen carbohidratos. La región bisagra flexible entre los dominios CH 1 y CH2 permite el comportamiento independiente de dos sitios de unión de antígeno formados por dominios variables.
TIPOS DE MPI La medición de la unión antígeno-anticuerpo se puede llevar a cabo mediante una variedad de tipos y formatos de valoración: fase sólida o líquida, manual o automática, marcada o sin marcar, competitiva o no competitiva, cualitativa o cuantitativa, homogénea o heterogénea, o combinaciones de algunas de las citadas. La característica distintiva de todas estas valoraciones es la unión de un anticuerpo o antígeno con el analito (que también puede ser un antígeno o un anticuerpo), seguido por la detección de un complejo antígeno-anticuerpo. Aunque se puede usar una gran cantidad de formatos para la reacción de unión, en conjunto con diferentes métodos de detección, la cuantificación del analito en el artículo de prueba siempre se realiza comparando la medición con un estándar de referencia. Por ende, las investigaciones de calidad de producto están respaldadas por una variedad de tecnologías de MPI. Los diseños de valoración comúnmente usados incluyen: ensayo por inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA), transferencia Western, citometría de flujo, ensayo por inmunoadsorción ligado a enzimas competitivo, resonancia de plasmón superficial (RPS), nefelometría cinética, radioinmunoensayo (RIA), inmunodifusión radial, precipitación y aglutinación. Dichos métodos se describen a continuación.
Ensayo por lnmunoadsorción Ligado a Enzimas Un ELISA es un método inmunológico cuantitativo en fase sólida para medir un analito después de la unión con un inmunoadsorbente y su detección subsiguiente usando la hidrólisis enzimática de un sustrato revelador, ya sea de manera directa (el analito tiene propiedades enzimáticas) o indirecta (p.ej., un anticuerpo unido a peroxidasa de rábano o fosfatasa alcalina enlazado posteriormente al analito inmunoadsorbido). Por lo regular, el analito se cuantifica mediante interpolación en una curva estándar de un material de referencia. El capítulo de información general Métodos de Pruebas Inmunológicas-Ensayo por lnmunoadsorción Ligado a Enzimas (ELISA) (1103) analiza el ELISA en mayor detalle, incluido el desarrollo de un ELISA para análisis cuantitativo.
Transferencia Western Una transferencia Western es un método semicuantitativo o cualitativo para la medición de un analito proteico que ha sido resuelto mediante electroforesis en gel de poliacrilamida y transferido posteriormente a una membrana sólida (p.ej., nitrocelu-
1 350 (1102) Métodos de Pruebas Inmunológicas / Información General
USP 39
losa, nailon o difluoruro de polivinilideno). La detección se puede lograr de manera directa mediante reacción con un anticuerpo primario marcado (anticuerpo específico contra el analito de interés), o de manera indirecta mediante reacción del anticuerpo secundario marcado (anticuerpo contra el anticuerpo primario) contra el anticuerpo primario unido al antígeno inmovilizado en la membrana. El marcado se puede realizar con un radioisótopo o una enzima que utilice el sustrato para producir color, fluorescencia o luminiscencia. Este método es semicuantitativo, en especial cuando las proteínas están presentes en una concentración baja y en mezclas muy complejas. Por lo regular se utiliza en las etapas tempranas de desarrollo del proceso (p.ej., selección de anticuerpos, expresión de proteínas, purificación de proteínas, entre otros). La transferencia Western es un método poderoso para analizar e identificar proteínas en mezclas complejas, en particular después de la separación usando electroforesis en gel bidimensional, la cual separa proteínas basándose en el tamaño y la carga (pi).
Citometría de Flujo La citometría de flujo es un método semicuantitativo basado en tecnología láser que permite la medición de sondas conjugadas con fluoróforo a medida que interactúan con sus ligandos respectivos en células o partículas. El capítulo general Citometría de Flujo (1027) ofrece más detalles sobre esta técnica.
Resonancia de Plasmón Superficial La RPS es un método cuantitativo para medir un analito en una muestra en la que se puede medir en tiempo real la formación de un complejo antígeno-anticuerpo en la interfase de un líquido y de un sólido (p.ej., superficies o partículas de oro). La medición que se toma es el cambio en tiempo real en la refracción de una luz polarizada y ocurre durante la formación del complejo antígeno-anticuerpo, lo cual genera cambios en los mínimos de resonancia de plasmón (es decir, el sensorgrama). La cantidad de analito se determina mediante comparación con la medición de una curva estándar de referencia determinada en la misma valoración. El capítulo de información general Métodos de Pruebas Inmunológicas-Resonancia de Plasmón Superficial (1105) ofrece más detalles sobre la RPS.
Nefelometría cinética La nefelometría cinética es un método cuantitativo para medir un analito en una muestra en solución mediante de la medición de la dispersión de la luz introducida por pequeños agregados formados por complejos antígeno-anticuerpo. La cantidad de analito se determina mediante comparación con la medición de una curva estándar de referencia determinada en la misma valoración.
Radioinmunoensayo El RIA, un MPI sensible desarrollado originalmente en 1950, es un método cuantitativo para medir un analito en una muestra. El RIA generalmente emplea una reacción de unión competitiva antígeno-anticuerpo, aunque también se puede usar en un formato de inmunoensayo tipo sándwich, incluyendo inmunoprecipitación. En los RIA competitivos, el analito compite para unirse con un antígeno de referencia radiomarcado (p.ej., usando 1251 ó 3 H) que es idéntico al analito; por lo tanto, el analito y el antígeno compiten para unirse a una dilución fija y limitante de un anticuerpo específico (a menudo policlonal). El antígeno radiomarcado se encuentra en exceso. El mismo antígeno sin marcar en la muestra de prueba compite para unirse al mismo sitio en el anticuerpo, el cual se encuentra en una cantidad fija. La unión del antígeno sin marcar con el anticuerpo conlleva al desplazamiento del antígeno marcado, lo que resulta en una reducción en la radioactividad de la fracción del complejo antígeno-anticuerpo. Para separar el complejo antígeno-anticuerpo del exceso de antígeno sin enlazar, el complejo generalmente se precipita con un anticuerpo secundario (o proteína G) inmovilizado en una matriz sólida (p.ej., perlas de vidrio o resina) o con un anticuerpo primario previamente inmovilizado. La cantidad de analito, por lo regular, se determina mediante interpolación en una curva estándar de un material de referencia, en donde una cantidad fija de anticuerpo y de antígeno radiomarcado se mezcla con una cantidad creciente de antígeno sin marcar. Por ende, incluso una pequeña cantidad de antígeno no marcado resultará en una reducción cuantitativa relativa de la radioactividad total de la unión.
lnmunodifusión Radial Simple La inmunodifusión radial simple (IDRs) es un método cuantitativo para medir un analito en una muestra a través de la medición del diámetro del anillo de precipitina formado por el complejo antígeno-anticuerpo. El antígeno se aplica en un pocillo de un gel infundido con un nivel constante de anticuerpo. Las soluciones con concentraciones más altas de antígeno difunden a una mayor distancia antes de saturarse con el anticuerpo y precipitar. La cantidad de analito se determina mediante la comparación con una curva estándar de referencia medida mediante la misma valoración.
USP 39
Información General/ (1102) Métodos de Pruebas Inmunológicas 1351
Precipitación El principio subyacente para este método es que la interacción de un anticuerpo multivalente y un antígeno conlleva a la formación de un complejo. En algunos casos, se forma un precipitado visible. Otras técnicas de inmunoprecipitación implican el uso de perlas de Proteína A o de Proteína G para capturar el complejo antígeno-anticuerpo y facilitar su separación de otros antígenos en la solución. La precipitación no se usa comúnmente para propósitos de análisis cuantitativo debido al tiempo requerido (días para completarla), la falta de sensibilidad y la necesidad de grandes cantidades de antígeno y anticuerpos.
Aglutinación La aglutinación y la inhibición de la aglutinación, respectivamente, proporcionan mediciones cualitativas y cuantitativas de ciertos antígenos y anticuerpos. La inhibición de la aglutinación es una modificación de la reacción de aglutinación que proporciona una mayor sensibilidad para detectar pequeñas cantidades de proteínas, productos químicos, virus y otros analitos. El principio de aglutinación es similar al de precipitación, con la excepción de que la interacción se lleva a cabo entre un anticuerpo y un antígeno particulado y genera un cúmulo visible o aglutinación. El ejemplo de uso más común de esta aplicación es la tipificación sanguínea C.es decir, antígeno A, B u O).
SELECCIÓN DEL MPI Al seleccionar un MPI, los analistas deben considerar su sensibilidad y especificidad, así como la complejidad de la muestra. La Tabla 1 proporciona al desarrollador de valoraciones una visión comparativa de las ventajas y desventajas de una variedad de formatos de MPI. La selección del formato más adecuado debe estar regida por la aplicación prevista del MPI. Tabla 1. MPI Usados en Laboratorios Biofarmacéuticos Método
Ventajas
Desventajas
Usos Comunes en la Industria
ELISA
• Alta Sensibilidad • A menudo con un amplio intervalo dinámico • Alto rendimiento • Bajo costo
• Proceso de etapas múltiples altamente dependiente de la ejecución adecuada de cada etapa • Las etapas de lavado implican mayor tiempo y a menudo desechos de riesgo biológico • Requiere el etiquetado de reactivos
• Determinación de potencia • Análisis de concentración de proteínas específicas en muestras complejas • Identificación de proteínas • Evaluación de pureza • Evaluación de inmunogenicidad
Transferencia Western
• Provee información sobre el tamaño y/o la carga del antígeno • Permite la separación de diversos antígenos (o productos de degradación/agregación) que presentan el mismo epítope • Puede tolerar mezclas complejas
• Por lo regular trabaja sólo con epítopes lineales • Requiere una labor intensa • Bajo rendimiento • Sujeto a interpretación • La inmovilización puede alterar la unión • Limitado a proteínas
• Evaluación de pureza de proteínas • Evaluación de estabilidad de proteínas • Pruebas de identidad de proteínas
Citometría de flujo
•Alto rendimiento • Altamente automatizada
• Uso limitado a células, partículas y muestras enlazadas a perlas • Sensible a los agregados y a la matriz de muestra
• Determinación de potencia • Identidad celular en productos de terapia celular
RPS
• Detección directa de unión • Puede medir la afinidad con precisión, incluyendo las velocidades de acoplamiento y desacopla miento
• La inmovilización puede alterar la unión • La regeneración puede alterar la unión • Bajo rendimiento
• Evaluación de inmunogenicidad • Determinación de potencia • Análisis de concentración de proteínas específicas en muestras complejas
Nefelometría cinética
• Fácilmente automatizable • Rápida
• Intervalo de detección pequeño • Alto fondo para muestras turbias
• Valoración para componentes individuales de vacunas para verificar la estabilidad y la pureza
RIA
• La unión ocurre en una conformación nativa • Se pueden analizar muestras con bajas concentraciones • Anticuerpo de alta sensibilidad usado en dilución limitante que conserva el reactivo • Puede realizarse en placa para un rendimiento mayor (p.ej., valoraciones de proximidad de centelleo)
• Requiere marcado radioactivo para la detección • La vida media más corta de algunos radioisótopos requiere la preparación periódica del trazador • Desechos de riesgo biológico
• Identificación de proteínas (p.ej., hormonas) • Análisis de concentración de proteínas específicas en muestras complejas
USP 39
1 352 (11 02) Métodos de Pruebas Inmunológicas / Información General
Tabla 1. MPI Usados en Laboratorios Biofarmacéuticos (Continuación) Método
Ventajas
Desventajas
Usos Comunes en la Industria
IDRs
• Precisa • Configuración simple
• Semicuantitativa • Baja precisión • Baja sensibilidad
• Prueba de liberación de vacunas
Precipitación
• Bajo costo de equipos
• Sujeta a interpretación • Lenta • Sensibilidad deficiente (intervalo de µg)
• Identificación de vacunas
Aglutinación
• Rápida • Bajo costo de equipos
• Sujeta a interpretación • Lenta • Baja especificidad debido a sustancias interferentes
• Identificación de vacunas
CONSIDERACIONES CLAVE PARA EL DESARROLLO DE MPI El objetivo durante el desarrollo del método es producir una valoración exacta que sea factible desde el punto de vista práctico y que cuente con un grado aceptable de precisión intra e intervaloración. Para una minimización general de las imprecisiones, es necesario identificar y minimizar las fuentes de variabilidad.
Selección de Reactivos Los inmunoensayos están sujetos a diversas fuentes de interferencia tales como reactividad cruzada, sustancias endógenas interferentes, matrices de los amortiguadores, componentes de la muestra, epítopes enmascarados versus expuestos, cambios en la conformación del antígeno de interés, entre otros factores. Por consiguiente, durante el desarrollo del método, los analistas deben identificar las posibles fuentes de interferencia para desarrollar un método robusto y para facilitar la resolución de futuros inconvenientes. La reactividad cruzada representa un obstáculo importante durante el desarrollo del inmunoensayo. Ésta se presenta cuando la especificidad de una reacción antígeno-anticuerpo se ve comprometida por la reactividad cruzada de moléculas estructuralmente similares que se unen con el enlazante de reacción. Algunos ejemplos comunes son: isoformas de proteínas, entidades de analito degradadas, moléculas de la misma clase, proteínas precursoras, metabolitos, entre otros. La reactividad cruzada se puede minimizar mediante la rigurosa caracterización y selección del reactivo. Los reactivos usados en las aplicaciones de MPI por lo general caen dentro de una de las dos categorías siguientes: reactivos críticos y reactivos no críticos. Los reactivos críticos son específicos y únicos al MPI o a los reactivos particulares que no toleran los más pequeños cambios en la composición o la estabilidad. Entre los ejemplos de reactivos críticos generalmente se incluyen los anticuerpos específicos para la valoración y los estándares de referencia o de calibración del método. La equivalencia en el formato de la valoración se debe establecer antes de reemplazar con un lote nuevo. Los reactivos no críticos son aquéllos cuya composición puede variar en cierto grado sin afectar de manera adversa el desempeño del MPI. A menudo, se asume que los reactivos no son críticos (p.ej., amortiguadores, calidad del agua, amortiguador de bloqueo o sustrato) pero posteriormente se pueden identificar como componentes críticos si la tolerancia de la valoración incumple y es necesario iniciar una etapa de resolución de problemas con los reactivos del MPI. Los reactivos específicos del MPI, incluyendo el proveedor y el número de catálogo, deben definirse en la documentación de los procedimientos de prueba. La selección de los anticuerpos es un paso crítico para el desarrollo de un inmunoensayo exitoso, debido a que con éste se define la especificidad y sensibilidad de la valoración. Asimismo, los analistas deben asegurarse de que, durante la generación de anticuerpos, los protocolos de inmunización respalden el uso final de los anticuerpos. Para algunas aplicaciones, se puede generar un anticuerpo más específico mediante la selección de un inmunógeno pequeño y específico y la purificación de afinidad del anticuerpo, lo cual resulta en una cobertura del epítope altamente definida. En otras aplicaciones, puede resultar crítico asegurar una cobertura amplia de los diferentes epítopes disponibles en las moléculas de interés, mientras que una combinación de anticuerpos policlonales (Acp) puede ser la mejor opción. Hoy en día, se prefieren los anticuerpos monoclonales (Acm) para algunas aplicaciones de detección de analitos individuales debido a su alta especificidad, uniformidad entre lotes y abastecimiento permanente. En comparación con los anticuerpos policlonales, los Acm tienen un costo inicial de producción mayor, pero para estas aplicaciones, las ventajas por lo general tienen un mayor peso que los costos iniciales. Otras aplicaciones pueden requerir de una selección más amplia de epítopes pasa asegurar que los cambios sutiles en las moléculas no eviten el reconocimiento del antígeno completo, por lo que una combinación de anticuerpos monoclonales, o una combinación de AcP, sería la opción preferida. Éstas últimas se usan ampliamente para la detección en una mezcla compleja de analitos (p.ej., proteínas de células hospederas). De manera similar, los inmunoensayos pueden emplear dos epítopes distintos en un antígeno-uno para captura y otro para detección-lo cual reduce en gran medida la reactividad cruzada. Otra metodología para minimizar la reactividad cruzada consiste en purificar el antígeno antes del inmunoanálisis. Las variaciones en la temperatura y tiempo de incubación pueden afectar la cinética de reacción de las interacciones del anticuerpo con antígenos similares aunque diferentes. Por lo tanto, esta propiedad se debe optimizar para incrementar la especificidad de interacciones antígenoanticuerpo.
USP 39
Información General/ (1102) Métodos de Pruebas Inmunológicas 1353
Desarrollo de lnmunoensayos El desarrollo es una etapa importante para el establecimiento de un MPI adecuado. Durante el desarrollo de un MPI, los analistas exploran diversas configuraciones de parámetros de valoración e interacciones entre parámetros para identificar las condiciones en las que la valoración producirá resultados confiables de manera uniforme usando una mínima cantidad de reactivos, esfuerzo y tiempo. En la terminología de Calidad por Diseño, el término "espacio de operación posible" se refiere a la colección de configuraciones de parámetros de valoración exploradas, mientras que "espacio de diseño" se refiere a las condiciones en las que la valoración presenta un desempeño adecuado. Las propiedades de desempeño necesarias del PMI (precisión, exactitud, especificidad, etc.) requerido dependen de los usos previstos. Durante el desarrollo del PMI, los analistas deben considerar lo siguiente: • La relación antígeno-anticuerpo; • En inmunoensayos tipo sándwich, la relación entre anticuerpo de captura y anticuerpo de detección; • La cinética de reacción antígeno-anticuerpo en la matriz de la muestra (por lo general, la unión antígeno-anticuerpo no es lineal); • La selección del estándar (longitud total del antígeno para el estándar o sólo una pequeña porción del antígeno que contiene el epítope de unión al anticuerpo, entre otras consideracones); y • Los efectos de la matriz. Se recomienda ampliamente el uso del diseño de experimentos (DOE, por sus siglas en inglés). Asimismo, diversos métodos de DOE pueden ser adecuados en las distintas etapas del desarrollo. En las etapas tempranas del desarrollo, los diseños de selección resultan particularmente útiles (generalmente, diseños factoriales geométricos fraccionados de dos niveles). Después de la selección (con un modesto número de factores de estudio), por lo regular resultan apropiados los diseños factoriales completos o de superficie de respuesta. A medida que las actividades de desarrollo se trasladan hacia la calificación (idealmente, si no por lo general, a medida que el enfoque se traslada hacia la robustez), los diseños de superficie de respuesta robusta a menudo representan una buena opción. Durante la calificación o validación, puede resultar práctico para los analistas estudiar de manera simultánea la robustez para las condiciones operativas de la valoración (usando un diseño factorial geométrico fraccionado pequeño) y los parámetros de validación tales como la precisión (mediante diseños anidados o cruzados para factores aleatorios asociados con la repetibilidad, la precisión intermedia y la reproductibilidad). Los experimentos que evalúan la linealidad dilucional y los componentes de especificidad, incluyendo los efectos de la matriz, por lo regular implican la construcción de muestras adicionadas. Aunque la adición de cantidades conocidas a menudo se lleva a cabo en una matriz de dilución, agregar cantidades conocidas a una colección de muestras reales o mezclar muestras reales es un componente importante para demostrar la robustez de la linealidad dilucional y los componentes de especificidad con los componentes de la muestra y de la matriz.
Consideraciones de Reactivos El procedimiento para calificar fuentes y proveedores de reactivos (incluyendo auditorías), pedidos, recepción y eliminación de reactivos e insumos comerciales debe detallarse mediante un procedimiento operativo estándar (POE). La preparación de reactivos internos debe documentarse de tal manera que permita su reconstrucción. Los reactivos comerciales y los de preparación interna se deben etiquetar indicando la identidad, la concentración, el número de lote, la fecha de caducidad y las condiciones de almacenamiento. La estabilidad y la designación de fechas de caducidad para reactivos preparados internamente a menudo se basan en la literatura disponible y en la experiencia científica, aunque puede ser necesario que los analistas las confirmen empíricamente. Se recomienda desarrollar un POE para la extensión de fechas de caducidad de reactivos críticos. Asimismo, los analistas deben implementar un mecanismo para rastreo de reactivos y vinculación de números de lotes con números de corridas analíticas. El desempeño inaceptable de reactivos se detecta mediante el rastreo de muestras de control de calidad (CC). Los cambios en las muestras de CC deben dar lugar a una revisión de las corridas analíticas y de los cambios en los números de lote de reactivos o una revisión del posible deterioro de reactivos críticos. Para evitar dichos cambios, los analistas pueden efectuar una validación cruzada de los cambios en los lotes de reactivos críticos. A menudo se pasa por alto el impacto que tienen los envases de recolección y almacenamiento sobre el desempeño analítico. Al definir la estabilidad y la caducidad de reactivos producidos internamente, los analistas deben registrar información relacionada con el proveedor, el número de catálogo y de lote del envase usado para almacenamiento. Es necesario volver a enfatizar la importancia de un estándar de referencia adecuado y de su caracterización en los MPI para productos biológicos. Debido a su complejidad inherente, la caracterización de los estándares de referencia y de calibración de productos biológicos macromoleculares a menudo es menos adecuada que la de los estándares de referencia para fármacos de moléculas pequeñas convencionales. Si el estándar de calibración representa una mezcla de diferentes antígenos (p.ej., proteínas de células hospederas), éste debe ser representativo del perfil del antígeno en las muestras que se analizan. La uniformidad en los resultados del MPI depende de la disponibilidad de un material estándar de referencia representativo adecuado.
VALIDACIÓN La validación analítica implica la ejecución sistemática de un protocolo definido y de un análisis previamente especificado que incluya criterios de aceptación previamente definidos. Una validación demuestra que un método analítico es adecuado
1 354 (1102) Métodos de Pruebas Inmunológicas/ Información General
USP 39
para uno o más de sus usos previstos [ver el capítulo Validación de Procedimientos Farmacopeicos (1225), Validación de Va/oraciones Biológicas (1033) e ICH Q2(Rl )]. La calificación puede implicar experimentos y procedimientos similares o idénticos a los de la validación, aunque la calificación no requiere protocolos, análisis ni criterios de aceptación previamente especificados. En algunas situaciones (p.ej., cuando se usa un kit comercial), el desarrollo de la valoración podría no ser necesario antes de la calificación. El capítulo de información general (1225) analiza las características de desempeño de la valoración que se deben examinar durante la validación para cuatro categorías primarias de usos previstos. Por ejemplo, los procedimientos analíticos que cuantifican fármacos o ingredientes activos a granel importantes pueden no requerir de la validación de los límites de detección y cuantificación, pero sí requerir la validación de exactitud, precisión, especificidad, linealidad e intervalo.
Aptitud del Sistema o Criterios de Aceptación de la Valoración El propósito de la aptitud del sistema o de los criterios de aceptación de la valoración es asegurar que el sistema completoincluyendo instrumental, software, reactivos y analista-esté calificado para llevar a cabo la acción prevista para el propósito previsto. Todos los procesos deben controlarse mediante POE bien definidos para asegurar la uniformidad, para reducir errores y para promover la reproducibilidad de los procesos de laboratorio. Los archivos de capacitación para todo el personal deben ser recientes e incluir alguna prueba de que los analistas están calificados para llevar a cabo el método y el MPI específico. La calificación de instrumentos y software comienza con una definición de las calificaciones del diseño, la cual debe incluir una evaluación de riesgos y un análisis de brechas que identifique cualquier amenaza potencial para la recolección, integridad y captura permanente de datos del MPI. La calificación también incluye calificaciones de la instalación (CI) y calificaciones operativas (CO). Los paquetes comerciales adquiridos para la validación de instrumentos también pueden requerir de modificaciones para cumplir con el uso previsto en cada instalación. El instrumental y el software deben monitorearse de manera continua para asegurar su funcionalidad aceptable mediante la calificación del desempeño (CD) y las revisiones de las transcripciones de prueba de validación de software. El mantenimiento de rutina de instrumentos se lleva a cabo de acuerdo con las recomendaciones del fabricante; asimismo, puede ser necesario un mantenimiento adicional, dependiendo de las necesidades específicas en el ambiente de trabajo. Es necesario archivar un historial completo de mantenimiento de rutina y no rutinario para cada instrumento. Las actualizaciones de software se deben manejar con control de cambios y, por lo general, requieren de validación adicional. Es indispensable mantener el apego a las disposiciones del Título 21 del CFR 11. Para asegurar la robustez, se debe establecer un proceso definido para implementar nuevos MPI en el laboratorio. Se debe disponer de documentos de control, incluyendo planes de validación del método que contengan criterios de aceptación del método e informes de validación a priori para el establecimiento de un nuevo MPI. Asimismo, para asegurar la reconstrucción de resultados analíticos y para minimizar los errores de laboratorio, es necesario contar con documentos bien redactados sobre el método analítico. Los métodos de prueba analíticos deben incluir criterios de aceptación para aspectos críticos de la valoración, incluido el desempeño de la curva de calibración, controles de calidad, concordancia entre determinaciones repetidas de muestras, procedimientos para repetir análisis de muestras e identificación y tratamiento de valores aberrantes, cuando sea necesario. Además, se debe implementar un POE para la investigación y resolución de eventos inesperados.
INFORME DE DATOS Unidades de Medición Los MPI cuantitativos generan datos de la muestra de prueba con una concentración estimada basada en un ajuste de curva de calibración con respecto a muestras de referencia (o estándar) usando un modelo matemático apropiado. Al determinar la cantidad de analito en un proceso de fabricación, los analistas a menudo expresan la unidad de medición en términos de masa de analito por volumen de solución (concentración) o masa de analito por masa de producto (p.ej., partes por millón). Dependiendo de la naturaleza del analito medido, el grado de estandarización de la medición, la región geográfica y el historial del método, los analistas pueden expresar la concentración en términos de peso por volumen, mol por volumen o peso de analito por peso de producto. En algunas circunstancias, la concentración se puede convertir a una unidad de medición de actividad en la que se asume que la masa del analito es 100% activa. En ciertos casos, el análisis cualitativo usando un valor de corte predeterminado puede constituir una alternativa aceptable a los métodos cuantitativos.
Análisis de Datos de lnmunoensayos Los MPI emplean curvas de calibración preparadas con estándares de referencia con concentraciones conocidas (nominales) y se incluyen en todos los métodos bioanalíticos. Esto ayuda a controlar la variación asociada con la repetibilidad, la precisión intermedia y la reproducibilidad, al tiempo que permite estimar resultados para muestras de prueba desconocidas. Los análisis estadísticos simples comunes asumen que los datos (posiblemente transformados) están distribuidos de manera normal, que tienen una varianza constante, que son independientes, y que se ha usado un modelo apropiado. Para muchas valoraciones, una o más de estas suposiciones podría resultar inadecuada. Los analistas deben evaluar dichas suposiciones usando un volu-
USP 39
Información General/ (1102) Métodos de Pruebas Inmunológicas 1 355
men de datos sustancioso (por lo regular, decenas de valoraciones). Cuando tales suposiciones no son razonables, el análisis se vuelve más complejo. Las curvas de calibración por lo general se caracterizan mediante una relación no lineal entre la respuesta media y la concentración de analito, y, generalmente, se grafican de manera logarítmica-lineal con la variable de respuesta (posiblemente transformada y/o ponderada) graficada en el eje de las ordenadas en función de la concentración nominal del calibrador en el eje de abscisas en escala logarítmica. La curva resultante que abarca el intervalo validado de la valoración es inherentemente alinea! y a menudo presenta una forma de sigmoide con asíntotas horizontales a concentraciones de analito muy bajas y muy altas. Los MPI competitivos tienen una pendiente negativa, mientas que los MPI no competitivos se caracterizan por una pendiente positiva. La concentración de analito en una muestra de prueba se estima mediante una regresión inversa contra la curva de calibración. El resultado final a menudo se obtiene después de multuplicar la concentración estimada en la valoración por un factor de dilución necesario para generar una respuesta dentro del intervalo de cuantificación del PMI. Bajo la instrucción de un bioestadístico calificado, los analistas pueden implementar pruebas de valores aberrantes en documentos controlados que permitan la exclusión de resultados de muestra falsos. Se debe contar con un procedimiento bien definido con respecto a la forma de identificar, repetir e informar valores aberrantes. Las pruebas para valores aberrantes y la interpretación de resultados se describen en el capítulo general Datos Analíticos-Interpretación y Tratamiento (101 O). Los resultados de prueba que caigan fuera de sus especificaciones o criterios de aceptación previamente definidos se deben evaluar a través de una investigación para resultados fuera de la especificación, a fin de identificar el origen del problema.
Análisis de Tendencias Un sistema de calidad incluye el monitoreo del desempeño del MPI mediante la recopilación y la revisión de sus características de desempeño. El análisis de tendencias puede detectar desviaciones en el desempeño de la valoración que podrían estar relacionadas con eventos tales como cambios de lote de reactivo de la valoración, adición de nuevos analistas, desviaciones en las condiciones ambientales, entre otros. Se recomienda contar con POE, protocolos de estudio, métodos de prueba analíticos y diagramas de flujo para toma de decisiones a fin de proveer una definición estricta del manejo, uso, edición, rechazo, aceptabilidad e interpretación de datos de calibración y resultados de muestra de prueba para los MPI. Asimismo, resulta común contar con varias revisiones de datos brutos, entre las que se incluyen revisiones realizadas por otros profesionales, de control de calidad y de garantía de calidad. Los analistas deben ser capaces de distinguir dichas cuestiones analíticas de los cambios verdaderos en el analito medido, ocasionados por cambios o errores en el proceso de fabricación que hayan afectado al producto. Dos de los resultados más importantes del monitoreo de tendencias adecuado son detectar problemas potenciales antes de que ocurran e identificar áreas en las que se puedan aplicar medidas correctivas o preventivas. Los capítulos de información general Datos Analíticos-Interpretación y Tratamiento (101 O) y Validación de Valoraciones Biológicas (1033), así como la literatura sobre estadística, ofrecen guías para varios métodos de análisis de tendencias. El monitoreo puede considerar diversas características de desempeño de los MPI. El valor más común en el análisis de tendencias es la evaluación de muestras de control de calidad (CC). Idealmente, se cuenta con una o más muestras de CC para análisis de tendencias a largo plazo en cantidad suficiente y con una estabilidad demostrada de modo que los aspectos de calidad se puedan evaluar en cada corrida y a través de múltiples lotes de fabricación. A medida que la muestra de CC a largo plazo se agota o caduca, se debe completar una comparación cruzada y establecer una nueva muestra de control de calidad de largo plazo. La revisión sistemática de datos de control de calidad a través de valoraciones ayuda a resolver problemas con corridas fallidas del MPI, lo que genera confianza en la evaluación de resultados aberrantes y permite controlar la reposición de reactivos a medida que se agotan, que pudieran no desempeñarse exactamente igual que los anteriores. Otras características de desempeño del MPI que se pueden monitorear incluyen las variables de respuesta de la curva de calibración, los parámetros de ajuste de la curva, ruido de fondo de la valoración y la comparación de datos de control de calidad en estudio con los datos de validación.
Rastreo Las agencias reglamentarias tienen requisitos estrictos con respecto al mantenimiento de la identidad e integridad de muestras y datos. Se debe implementar un proceso de calidad regido mediante POE para asegurar la identidad e integridad correctas de las muestras de prueba y de retención. Idealmente, el sistema de código de barras debe usarse para rastrear la recolección, identidad, ubicación, cadena de custodia, número de ciclos de congelación/descongelación de la muestra, temperatura de almacenamiento y duración del almacenamiento de la muestra. Esta información se debe capturar y debe ser susceptible de auditoría desde el momento de la recolección (de la muestra) hasta su eliminación (o agotamiento). La capacidad para rastrear la historia de la muestra permite la reconstrucción de los eventos que condujeron a la generación de los resultados. Esta información es usada por las agencias reglamentarias para asegurar que se siguieron los procedimientos adecuados, y por los auditores internos para asegurar que la manipulación de la muestra antes del análisis no comprometió los datos del estudio. Además, el rastreo de la muestra permite asegurar que la medición del analito se realizó dentro de los parámetros demostrados para la estabilidad de dicho analito. El resultado final generado a partir de un laboratorio bioanalítico es un número que representa una medición del analito en una muestra de prueba. Los pasos necesarios para generar dichos datos y para preservar el resultado en un informe son numerosos y suceptibles de error. Por lo tanto, se deben implementar sistemas de calidad para minimizar los errores en los datos.
1356 (1102) Métodos de Pruebas Inmunológicas / Información General
USP 39
Los errores pueden originarse a partir de factores tales como una ubicación o identificación incorrecta de la muestra, reducción incorrecta de datos, cálculos mal realizados, errores de transcripción, omisiones, entre otros. Resulta ideal el uso de software y de sistemas de administración de información de laboratorio validados siempre que sea posible para generar, transferir y archivar datos. Generalmente en los procesos automatizados se incluyen pruebas redundantes para revisar visualmente al menos el 10% de los procesos de transferencia de datos. En ausencia de transferencias electrónicas validadas, todos los datos deben ser revisados por al menos un revisor. Al igual que con el rastreo de muestras, la generación, manipulación y almacenamiento de datos deben ser reconstruibles. Asimismo, todos los datos deben tener una copia de seguridad en un formato estable. Se debe contar con planes para actualizar los datos archivados de modo que, con el advenimiento de cambios en la tecnología, los datos archivados aún puedan ser recuperables. Las agencias reglamentarias requieren que los datos brutos estén disponibles durante cierto tiempo después de la culminación de un estudio o solicitud reglamentaria. Por último, los datos deben asegurarse contra cualquier tipo de corrupción, alteración o acceso por parte de personal no autorizado.
(1103) MÉTODOS DE PRUEBAS INMUNOLÓGICAS-ENSAYO POR INMUNOADSORCIÓN LIGADO A ENZIMAS (ELISA) INTRODUCCIÓN Los Métodos de Pruebas Inmunológicas (MPI) utilizan la unión entre un antígeno (Ag) y un anticuerpo (Ac). (Ver el Apéndice 1 para una lista completa de acrónimos usados en este capítulo.) El ensayo por inmunoadsorción ligado a enzimas {ELISA) es uno de los MPI más usados para los análisis de caracterización, liberación y estabilidad de productos biotecnológicos para ayudar a asegurar la calidad de fármacos y medicamentos biológicos. El término ELISA se usa en este capítulo en un sentido más amplio e incluye los enzimoinmunoensayos {EIA), así como métodos de detección alternativos, p.ej. quimioluminiscencia y fluorescencia. Este capítulo provee a los analistas información general sobre los principios, procedimientos, configuraciones experimentales, desarrollo de valoraciones y validación para MPI en fase sólida, tales como el ELISA, y se puede usar para las otras variaciones de enzimoinmunoensayos mencionadas anteriormente. Este capítulo también abarca estándares de referencia y controles usados para inmunoensayos. La información se puede adaptar a los procedimientos específicos de una monografía. Este capítulo no abarca inmunoensayos para la medición de respuesta inmune en animales o humanos (p.ej., valoraciones serológicas o celulares), ensayos no inmunológicos (p.ej., interacciones entre receptor y ligando) ni metodologías relacionadas. Este capítulo es parte de un grupo de capítulos de información general para métodos de pruebas inmunológicas [Métodos de Pruebas Inmunológicas-Consideraciones Generales (11 02), Métodos de Pruebas Inmunológicas-Análisis por lnmunotransferencia (1104) (propuesto) y Métodos de Pruebas Inmunológicas-Resonancia de Plasmón Superficial (1105)]; asimismo, se relaciona con los capítulos de información general para valoraciones biológicas [Diseño y Desarrollo de Va/oraciones Biológicas (1032), Validación de Valoraciones Biológicas (1033) y Análisis de Va/oraciones Biológicas (1034)].
Definición El ELISA se puede definir como un método inmunológico cualitativo o cuantitativo en fase sólida para medir un analito después de su unión con una superficie inmunoadsorbente y su posterior detección mediante el uso de hidrólisis enzimática de un sustrato revelador, ya sea de manera directa (como en el caso de un analito con propiedades enzimáticas o que se marca directamente con una enzima) o indirecta (mediante un anticuerpo ligado a enzima que se enlaza con el analito inmunoadsorbido). Los resultados cualitativos proporcionan un resultado simple, positivo o negativo, para una muestra. Convertir resultados cuantitativos en cualitativos basándose en un valor de corte que separa a los resultados positivos de los negativos es una práctica común. Debido a que las propiedades de desempeño de la valoración dependen en gran medida del valor de corte, el procedimiento que se usa para determinar el corte debe basarse en evidencias y estar bien documentado. Las valoraciones cuantitativas determinan la cantidad del analito basándose en la interpolación en una curva de calibración estándar con concentración de analito conocida, que se lleva a cabo de manera simultánea en la misma valoración. Este estándar debe ser un material de referencia o calibración apropiado, preferentemente homólogo, que sea representativo del analito de interés. La potencia de los inmunoensayos ha quedado demostrada por la variedad de procedimientos que han ido evolucionando y que incluyen superficies sólidas alternativas tales como perlas de diversos tipos, diversos plásticos en placas de diferentes configuraciones y métodos de detección alternativos, p.ej., quimioluminiscencia y fluorescencia. Los ELISA tienen un amplio uso en la industria biofarmacéutica para diversas aplicaciones, tales como identidad, pureza, potencia, detección o cuantificación de anticuerpos o antígenos y otros procedimientos.
Principios Básicos Los pasos esenciales de un ELISA se pueden desglosar según se indica a continuación (ver la Figura 1):
USP 39
Información General/ (1103) Métodos de Pruebas Inmunológicas 1357
Leyenda:
1 Fase Sólida
1
Reactivo de Captura: Proteína de Bloqueo:"':.
1. Unión del Reactivo de Captura
Analito:
O
l 1 ~~;J ~;,,s~"OOrio Analíto Marcado:
/ Detección Directa
1
't
Detección Indirecta
() o J 1&&®
~ '1.¡¡J
3. Unión del Analito
3a. Unión del Analito
4.Cuantificación de Señal y Análisis de Datos
3b. Unión Secundaria
•
• 1&~€1
Figura 1. Pasos esenciales para realizar un ELISA. 1 1. Unir el reactivo de captura (por lo general un anticuerpo o antígeno), que funciona como un inmunoadsorbente para capturar el analito, a una superficie sólida; 2. Eliminar el exceso de reactivo de captura no unido, luego bloquear los sitios de unión sin ocupar, con una proteína de bloqueo tal como albúmina, gelatina, caseína u otro material adecuado; 3a. Incubar el analito (en la muestra de prueba o estándar de referencia) con el reactivo de captura para unir el analito sobre la superficie sólida, seguido del lavado de material no unido en la muestra de prueba y de la detección del analito. La detección directa ocurre cuando el analito presenta actividad enzimática o se ha ligado a una molécula de detección (p.ej., enzima); o 3b. Incubar el analito (en la muestra de prueba o estándar de referencia) con el reactivo de captura para unir el analito sobre la superficie sólida, seguido del lavado de material no unido en la muestra de prueba y de la detección subsiguiente del analito (Figura 7, paso 3a). La detección indirecta ocurre cuando el ana lito se detecta mediante la adición de un reactivo secundario marcado con enzimas (Figura 7, paso 3b); y 4. Cuantificar el analito mediante la adición de un sustrato adecuado para el detector usado (p.ej., 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB)), seguido de la comparación de la muestra de prueba con el material de referencia.
DISEÑO DE LA VALORACIÓN En la Tabla 7 y en las secciones siguientes de este capítulo se describen cinco categorías generales de ELISA. Los diseños de valoración son flexibles y, dependiendo de las necesidades específicas, se pueden modificar a partir de estos procedimientos. La selección de formatos depende principalmente de las cantidades y de la pureza de los reactivos y del equipo disponible. En algunas ocasiones, el analito que se está caracterizando es, en efecto, un anticuerpo, como en el caso de un anticuerpo monoclonal que se está desarrollando como fármaco. En este caso, se usan anticuerpos antiidiotipo u otros anticuerpos específicos para el anticuerpo que se usa para el desarrollo de las valoraciones.
1 El ELISA está conformado por cinco pasos esenciales: unión del reactivo de captura, bloqueo, unión del analito, unión del anticuerpo detector y análisis. Después de cada uno de los pasos de unión del reactivo de captura, bloqueo y unión del analito se debe llevar a cabo un paso de lavado para eliminar reactivos no unidos antes de agregar el siguiente reactivo. Antes del análisis, se debe agregar un sustrato adecuado, seguido de la medición del sustrato mediante un equipo de detección apropiado. La cuantificación de elementos desconocidos se lleva a cabo mediante comparación con una curva estándar.
USP 39
1 358 (1103) Métodos de Pruebas Inmunológicas / Información General
Tabla 1. Tipos Representativos de ELISA Tipo de ELISA
Reactivos Requeridos
Atributos
Desventajas
Detección directa
• Analito de capturaª • Anticuerpo primario marcado específico para antígeno
• Rápido debido a que se usa un solo anticuerpo • Usa menos reactivo • El analito se inmoviliza
• Puede modificar la conformación del analito • Sensible a los componentes de la matriz y de los adyuvantes • No se usa comúnmente • Sensibilidad deficiente
Detección indirecta
• Analito de capturaª • Anticuerpo primario específico para el antígeno • Anticuerpo detector secundario marcado que se une al anticuerpo primario
• Versátil debido que se puede usar una variedad de anticuerpos primarios con el mismo detector secundario • Sensibilidad mejorada debido a la amplificación de la señal • El analito se inmoviliza
• Requiere mayor tiempo debido a pasos adicionales de incubación y lavado
Competitivo
• El analitoª se puede usar como reactivo de captura o se puede marcar con una etiqueta de detección • Anticuerpo específico para el analito que se puede usar para captura o marcado para detección • Anticuerpos secundarios marcados para unirse al anticuerpo primario si se usa un formato indirecto
• Bueno para evaluar la reactividad cruzada antigénica • Adecuado para proteínas más pequeñas con epítopes individuales • Requiere únicamente un solo anticuerpo • El analito en solución compite para unirse con el anticuerpo primario
• Formato difícil para la resolución de problemas • Intervalo dinámico limitado
Tipo sándwich
• Anticuerpo de captura primaria específico para el ana lito • Solución muestra que contiene el analitoª • Un conjugado enzima-anticuerpo primario diferente específico para el analito
• Sensibilidad mejorada • Bueno para valoraciones cuantitativas de moléculas más grandes con múltiples epítopes • Analito medido en solución
• Requiere cantidades relativamente grandes de anticuerpo específico puro o semipuro • No adecuado para proteínas más pequeñas que pudieran tener únicamente un solo epítope o unos pocos epítopes muy próximos entre sí
ª Este reactivo puede ser purificado o parcialmente purificado. Los términos "analito" y "antígeno" se usan de manera intercambiable para describir los ELISA.
ELISA Directo ANTICUERPO MARCADO DIRECTAMENTE
En esta valoración una superficie sólida se recubre con el antígeno y se bloquean los sitios reactivos no unidos remanentes (Figura 2A). Luego, se agrega una solución que contiene un anticuerpo específico marcado con un detector. Después de la
incubación, el anticuerpo no unido se lava y se procede a la adición de un sustrato apropiado para el detector usado.
Información General/ (1103) Métodos de Pruebas Inmunológicas 1359
USP 39
rs:J
~.-.Anticuerpo Primario Antígeno
11
(#1) o de Captura
-
Superficie Sólida
*
Anticuerpo Secun-
.l. ' dario (#2) o Detector "'C.. Marca
Concent. Baja de Antígeno
A.='
Caneen!. Alta de Antígeno
'',jf..
t
ISI
B.
Ag de preincub.
(!I con Ac detector
sin unión
~Ac#1
Marca Directa
'51
Directo
Indirecto
Competitivo
E.
D. ......__ Ac #2 Detector
;,~"'º"'~'
~ Ac #1 Detector
::¡i;._
Ao #1
º"'""'
Puente
Sándwich
Figura 2. Representaciones esquemáticas de ELISA directo, indirecto, competitivo, tipo sándwich y tipo puente.2 (Ac =anticuerpo; Ag =antígeno (o analito); Preincub ~ preincubación) ANTÍGENO MARCADO DIRECTAMENTE Esta valoración es similar a aquélla que usa un anticuerpo marcado directamente, excepto que la superficie sólida se recubre con el anticuerpo y se usa un antígeno marcado como detector.
ELISA Indirecto En esta valoración, una superficie sólida se recubre con un antígeno y, después del bloqueo, se agrega una solución que contiene un anticuerpo específico (Figura 28). Después de la incubación, el anticuerpo no unido se lava y se procede a la adición de un anticuerpo de detección de antiinmunoglobulina (anti-lg). Los detectores de anti-lg están disponibles comercialmente para clases y subclases específicas de lg de una variedad de especies, lo que hace de éste un formato de valoración útil para la isotipificación de anticuerpos. Asimismo, el uso de un detector de anti-lg marcado amplifica la señal en comparación con un ELISA Directo, con lo que se incrementa la sensibilidad de la valoración.
ELISA Competitivos ELISA DIRECTO COMPETITIVO DE ANTICUERPO Esta valoración se usa para detectar o cuantificar antígenos solubles (Figura 2C). Requiere de un anticuerpo específico para el antígeno que se ha conjugado con un detector apropiado, p.ej., peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, rutenio o fluoresceína. Asimismo, requiere de un antígeno purificado o parcialmente purificado para recubrimiento. Se recubre una superficie sólida con el antígeno, seguido de un paso de bloqueo. El anticuerpo conjugado se incuba con la solución de prueba que contiene el antígeno soluble. Posteriormente, la mezcla se agrega al antígeno inmovilizado, se incuba y se lava el complejo antígenoanticuerpo no unido. Después, se agrega al sustrato y se mide la inhibición de la reacción (p.ej., colorimétrica, electroquimioluminiscencia, fluorescencia o quimioluminescencia) con respecto a la reacción cuando no se agrega un antígeno competidor. El tipo de formato de ELISA depende de la disponibilidad de reactivos, del uso previsto de la valoración y de las características fisicoquímicas del analito de interés. Para un ELISA Tipo Puente, los anticuerpos de captura y de detección reconocen el mismo epítope y, por lo tanto, el antígeno diana debe tener al menos dos epítopes disponibles para unión. 2
1360 (1103) Métodos de Pruebas Inmunológicas / Información General
USP 39
La cantidad de inhibición es inversamente proporcional a la cantidad de antígeno en la muestra de prueba. Las valoraciones competitivas también pueden medir moléculas pequeñas mediante el recubrimiento de la placa con un anticuerpo específico para dicha molécula pequeña. La molécula pequeña es a menudo biotinilada con un conector largo que no interfiere con la unión entre el anticuerpo de captura sobre la placa y la molécula pequeña. El antígeno (la molécula pequeña) en la muestra compite posteriormente con la molécula pequeña marcada para unirse al anticuerpo de captura. Después del lavado, se agrega un reactivo de detección (p.ej., estreptavidina marcada con HRP) para detectar el complejo de unión. ELISA DIRECTO COMPETITIVO DE ANTÍGENO Esta valoración es similar al ELISA Directo Competitivo de Anticuerpo, excepto que se usa para detectar anticuerpos solubles. El antígeno se conjuga con el detector y la superficie sólida se recubre con el anticuerpo. ELISA INDIRECTO COMPETITIVO DE ANTICUERPO Esta valoración es similar al ELISA Directo Competitivo de Anticuerpo, excepto que en lugar de marcar directamente el anticuerpo, la prueba usa un reactivo anti-lg marcado para la detección. ELISA INDIRECTO COMPETITIVO DE ANTÍGENO Esta valoración es similar al ELISA Directo Competitivo de Antígeno, excepto que en lugar de marcar directamente el antígeno, la prueba usa un anticuerpo secundario marcado para la detección.
ELISA Tipo Sándwich ELISA TIPO SÁNDWICH DIRECTO En esta valoración, se inmoviliza un anticuerpo sobre una superficie sólida, se bloquea y, posteriormente, se agrega una solución que contiene un antígeno específico (Figura 2D). Después de una etapa de incubación, se lava el material no unido y se agrega el anticuerpo detector marcado. Este formato de valoración requiere de dos anticuerpos, cada uno de los cuales se une a diferentes epítopes sobre la superficie de la molécula grande y compleja. Los dos anticuerpos son específicos para el antígeno y el antígeno debe ser lo suficientemente grande y complejo para alojar la unión de dos anticuerpos. ELISA TIPO SÁNDWICH INDIRECTO Como alternativa al marcado directo del anticuerpo detector, se puede usar un anticuerpo de detección de anti-lg. Los formatos de inmunoensayos tipo sándwich indirectos pueden considerarse únicamente si cada reactivo de unión proviene de una especie diferente (p.ej., una valoración tipo sándwich que utiliza dos anticuerpos monoclonales de ratón para captura y detección no podría detectarse indirectamente debido a que la señal resultante se puede tornar independiente de la concentración de antígeno).
ELISA TIPO
PUENTE:
Esta categoría de ELISA Tipo Sándwich a menudo emplea un solo anticuerpo para captura y detección (Figura 2E). Si se usa un anticuerpo monoclonal, es necesario que el antígeno diana tenga al menos dos epítopes idénticos que estén espaciados adecuadamente para evitar ~I impedimento estérico, de modo que un epítope se una al anticuerpo de captura y el otro se una al anticuerpo detector. Como alternativa, se puede usar un anticuerpo policlonal, aunque esto requiere que el antígeno diana sea lo suficientemente grande para alojar la unión de dos moléculas de anticuerpo. Con respecto a la especificidad y la sensibilidad, las valoraciones tipo puente a menudo son adecuadas para moléculas grandes.
SELECCIÓN DE LA VALORACIÓN La decisión sobre el tipo de formato o procedimiento de ELISA que se va a utilizar a menudo depende de la selección y disponibilidad individual de reactivos, instrumentos y otros equipos. Por ejemplo, en ocasiones, un laboratorio puede modificar por ingeniería repetidamente un epítope particular para generar múltiples proteínas de fusión. En dicho caso, el laboratorio puede emplear ciertos reactivos calificados comunes (p.ej, un anticuerpo para una región de glutatión S-transferasa en múltiples proteínas de fusión), lo cual facilita el desarrollo rápido de un inmunoensayo tipo sándwich. Los antígenos pequeños con un número limitado de epítopes disponibles para unión de anticuerpos limitan las opciones de formato de ELISA. Si se encuentra disponible únicamente un epítope de unión, entonces no es posible utilizar los métodos ELISA que emplean una unión tipo sándwich con dos sitios ni otros formatos tipo puente debido a que estos necesitan al menos dos epítopes disponibles para la unión de anticuerpos. Asimismo, las moléculas pequeñas por lo regular no se usan como reactivo de captura en una placa
USP 39
Información General/ (1103) Métodos de Pruebas Inmunológicas 1361
debido a que el proceso puede interferir en la unión con el reactivo de detección. Entre los ejemplos de tales moléculas pequeñas se incluyen algunos péptidos, oligosacáridos, nucleótidos y antibacterianos. Los analistas generalmente adoptan un formato de valoración competitiva para tales analitos pequeños. Diversas valoraciones y formatos pueden demostrar diferentes propiedades y características, p.ej., especificidad, precisión, exactitud, sensibilidad, intervalo dinámico, relación dosis-respuesta, rendimiento de la muestra, sensibilidad a interferencias y simplicidad o eficiencia para la automatización. Asimismo, la facilidad de la validación puede variar entre los diversos protocolos y formatos de valoración. Los diseños de valoración con determinaciones repetidas en pocillos adyacentes pueden estar sesgados si se presentan efectos por ubicación; por ende, en este caso, las determinaciones repetidas no deben estar en pocillos adyacentes. Los diseños de valoración que son convenientes para su realización en placas de 96 pocillos, los cuales requieren de un menor uso de pipetas de un solo canal y un mayor uso de pipetas multicanal, son a menudo más fáciles de adaptar a la automatización. Las valoraciones con curvas de dosis-respuesta pronunciadas tienen, por lo general, una mejor capacidad de producir estimaciones de alta precisión; no obstante, algunas valoraciones con curvas de dosis-respuesta pronunciadas son imprecisas en la CE50 y requieren de un intervalo de dosis más amplio.
PROCEDIMIENTOS
Fase sólida Las fases sólidas están disponibles en una variedad de formas (p.ej., membrana, placa o perla) y composiciones químicas (p.ej., nailon, nitrocelulosa, fluoruro de polivinilideno (PVDF), polivinilo, poliestireno o una superficie derivatizada químicamente). La selección de la fase sólida determina el mecanismo de unión más probable, es decir, interacciones hidrófobas, hidrófilas o covalentes. En comparación con las placas, las perlas generalmente ofrecen una mayor capacidad y se usan de manera más común en ensayos clínicos, mientras que las placas se usan con mayor regularidad para analizar productos biotecnológicos. Más adelante en este capítulo se proporciona información adicional sobre las placas. RECUBRIMIENTO DE LA FASE SÓLIDA-INMOVILIZACIÓN DEL REACTIVO DE CAPTURA Se recubre una fase sólida con los reactivos de captura agregando a la superficie una solución que contiene el reactivo de captura. Los materiales de la fase sólida de uso más común para la inmovilización del reactivo de captura son las placas plásticas de microtitulación de 96 pocillos. Para lecturas espectrofotométricas, se recomiendan las placas con pocillos de fondo plano, mientras que las placas con pocillos de fondo redondo se recomiendan para la evaluación visual del desarrollo del color de un colorante. El grado de recubrimiento se ve influenciado por la concentración del reactivo de captura, la temperatura durante el recubrimiento, la duración de la adsorción del reactivo de captura, las propiedades de la superficie del material de fase sólida y la naturaleza del amortiguador de la solución del reactivo de captura. Aunque se debe determinar la concentración de recubrimiento óptima para cada reactivo de captura, las concentraciones de uso más común son de 1-1 O µg/pocillo. El volumen de reactivo de captura que se agrega a cada pocillo por lo general se corresponde con el volumen de muestra que se va a analizar, es decir, 50-100 µL. La duración del recubrimiento, la temperatura y los amortiguadores se analizan por separado más adelante en este capítulo. Los analistas deben evitar la introducción de burbujas durante el proceso de recubrimiento. Las proteínas que se unen al plástico pueden desnaturalizarse, lo cual altera la antigenicidad. En tales casos, se puede usar un anticuerpo de captura o una proteína intermediaria tal como Proteína A o Proteína G. Además, se puede usar estreptavidina cuando el reactivo está biotinilado. Es necesario optimizar el pH del amortiguador de recubrimiento basándose en el punto isoeléctrico del reactivo de captura y en las propiedades de la superficie de la placa de valoración seleccionada. PLACAS DE MICROTITULACIÓN La composición y fuente comercial de la placa de microtitulación pueden influenciar la unión del reactivo de captura durante el recubrimiento. Se deben comparar varias placas de microtitulación de diversos proveedores usando un solo procedimiento de recubrimiento para seleccionar aquéllas que proporcionen una alta especificidad para el reactivo de captura de interés y una baja unión inespecífica. Asimismo, puede ser necesario comparar diferentes grados de placas de un solo proveedor. Por lo regular, se usan placas transparentes para ELISA colorimétrico, mientras que las placas opacas se usan generalmente para ELISA quimioluminiscente y fluorométrico. Los reactivos de captura acídicos pueden requerir una solución con un pH menor para neutralizar las fuerzas de repulsión entre la proteína y la fase sólida. A menudo, los péptidos requieren de la optimización del pH del amortiguador, basándose en la carga de estos, para condiciones óptimas de recubrimiento durante el desarrollo de la valoración. El recubrimiento directo de la placa con polisacáridos, lipopolisacáridos o glicoproteínas puede ser complicado y puede requerir de un anticuerpo de captura o de un amortiguador que contenga lisina o glutaraldehído. El recubrimiento con un anticuerpo se puede mejorar recubriendo previamente la placa de microtitulación con Proteína A o Proteína G o una combinación de ambas, lo que permite la unión con la región Fe de modo que la porción Fab se pueda unir al analito de interés. No obstante, se debe tener cuidado de asegurar que los anticuerpos secundarios subsiguientes no reaccionen con los pocillos recubiertos con Proteína A o Proteína G. En este caso, por ejemplo, se puede usar inmunoglobulina Y (lgY) de pollo u otra clase adecuada de anticuerpo. Se pueden usar formatos de placa de microtitulación diferentes a la variedad de 96 pocillos,
1 362 (1103) Métodos de Pruebas Inmunológicas / Información General
USP 39
tales como las placas de volumen reducido a la mitad de 96 pocillos o de 384 pocillos, para aumentar el rendimiento y/o conservación de reactivos. TIEMPO DE RECUBRIMIENTO El tiempo de recubrimiento depende de la cinética de unión, la estabilidad, la concentración del reactivo de captura y la temperatura de incubación. Aunque diferentes combinaciones de tiempos y temperaturas de recubrimiento a menudo ofrecen la misma eficiencia de recubrimiento, la estabilidad del reactivo de captura (que se debe determinar durante el desarrollo del método) influye sobre la selección de condiciones. Los analistas deben evaluar el impacto de realizar variaciones en el tiempo de recubrimiento para determinar la robustez del procedimiento de valoración. TEMPERATURA DE RECUBRIMIENTO La temperatura y el tiempo de recubrimiento son parámetros de valoración estrechamente relacionados. La temperatura de recubrimiento depende de la cinética de unión y de la estabilidad del antígeno. El uso de temperaturas más elevadas puede aumentar la velocidad de adsorción y acortar el tiempo de recubrimiento, aunque también podrían afectar a los sitios de interacción y reducir la afinidad antígeno-anticuerpo. Las combinaciones típicas de tiempo y temperatura son de 1 a 4 horas a temperatura ambiente, de 15 minutos a 2 horas a 37° o durante toda la noche a 4º. Los analistas deben determinar los efectos de las variaciones de temperatura a fin de evaluar la robustez del procedimiento de la valoración. AMORTIGUADORES Los amortiguadores usados para diluyentes, recubrimiento, bloqueo y lavado de placas pueden afectar el desempeño general de la valoración. Los componentes de los amortiguadores pueden interactuar con la muestra de prueba e inhibir la unión. Además, pueden disminuir la sensibilidad del antígeno o aumentar el fondo inespecífico. Diluyente-Los amortiguadores [p.ej., solución salina amortiguada con fosfatos (PBS) o solución salina amortiguada con imidazol] con polisorbato 20 (0,01 o/o-0, l %) se usan comúnmente para distintos pasos del ELISA como diluyente y amortiguador de lavado. Amortiguadores de Recubrimiento-Los amortiguadores de recubrimiento deben maximizar la uniformidad de la valoración y promover la unión del reactivo de captura con la fase sólida. Los amortiguadores de recubrimiento comúnmente usados incluyen soluciones de carbonato 50 mM, pH 9,6; de Tris-HCI 20 mM, pH 8,5; y de PBS 1O mM, pH 7,2. La selección de amortiguadores de recubrimiento depende de la naturaleza de los antígenos individuales y se debe determinar empíricamente. Agentes de Bloqueo y Amortiguadores-Un agente de bloqueo es un compuesto (p.ej., proteína o detergente) que debe saturar los sitios de unión inmunoadsorbentes remanentes después de la unión del reactivo de captura (anticuerpo o antígeno). Esto reduce la unión no específica del analito y otros componentes distintos al analito con la matriz inmunoadsorbente y/o el reactivo adsorbido. La unión no específica ocurre cuando la proteína en la muestra de prueba se une al plástico de la placa de microtitulación o al reactivo adsorbido en lugar de unirse específicamente al reactivo de captura de interés. La unión no específica se puede reducir agregando reactivo de bloqueo a los pocillos y mediante la adición de otra proteína tal como albúmina sérica bovina (BSA) al amortiguador de dilución. La selección del agente de bloqueo debe regirse por la naturaleza del reactivo de captura, de la placa, del amortiguador de recubrimiento, del diluyente de la muestra de prueba y por factores relacionados. Si alguno de estos parámetros cambia, puede ser necesario cambiar el agente de bloqueo. Los agentes de bloqueo comúnmente usados incluyen BSA, leche descremada, gelatina, caseína, suero normal de caballo, suero fetal bovino y polisorbato 20, entre otros. Se encuentran disponibles comercialmente diversos grados de BSA, pero el grado óptimo debe determinarse empíricamente para cada valoración. Asimismo, se encuentra disponible una gran cantidad de reactivos de bloqueo y diluyentes de valoración comerciales para los MPI.
Adición de Muestras y Reactivos Las muestras y reactivos por lo general se pipetean y transfieren a los pocillos de la placa para ELISA. Se debe tener cuidado de evitar la contaminación cruzada, espuma o burbujas. Además, se pueden usar equipos que faciliten los trabajos tales como pipetas electrónicas, manipuladores automáticos de líquidos, lavadoras de placas y pipetas robóticas para mejorar la precisión, reducir la variabilidad entre analistas y aumentar el rendimiento. PIPETAS Se encuentran disponibles pipetas monocanal, multicanal y robóticas con volúmenes regulables o fijos. Es necesario evaluar el tipo y la exactitud de las pipetas para cada aplicación. Resulta indispensable llevar a cabo y documentar el mantenimiento regular y la calibración profesional de las pipetas.
USP 39
Información General/ (1103) Métodos de Pruebas Inmunológicas 1363
PUNTAS PARA PIPETAS Se encuentra disponible una variedad de puntas para pipetas, algunas de las cuales son específicas para ciertos tipos de pipetas. El tipo y la exactitud de la punta para pipeta, particularmente con respecto a la viscosidad y a la unión no específica de los materiales, se deben evaluar para cada aplicación.
Lavado Durante todo el procedimiento de ELISA se incluyen pasos de lavado para eliminar materiales no unidos tales como antígeno de recubrimiento, muestra y reactivos de detección. El lavado es crítico para el desempeño de la valoración, puede ser una fuente de falla de la valoración, y es importante evaluarlo durante el desarrollo del método. Se pueden usar múltiples metodologías para el lavado. Los procedimientos manuales incluyen el uso de frascos exprimibles, sumersión de la placa de microtitulación en amortiguador para lavado, y adición de amortiguador para lavado con una pipeta multicanal o lavadores manuales multicanal (8 o 12 boquillas). Los analistas deben realizar el lavado con cuidado para evitar contaminación cruzada entre pocillos. Las lavadoras de microplacas automáticas por lo general proporcionan una mayor uniformidad de lavado. Asimismo, se encuentran disponible lavadoras de pocillos en tira y multipocillos. La mayoría de las lavadoras automáticas se pueden programar para diferentes volúmenes y velocidades de dispensación, número de lavados, velocidad de aspirado de amortiguador y cantidad de amortiguador residual remanente en el pocillo. Las lavadoras automáticas programadas o mantenidas incorrectamente o cuya limpieza sea incompleta pueden ocasionar variaciones en la valoración y una elevada lectura de fondo.
Incubación Los ELISA se incuban después de la adición de muestras y reactivos. El tiempo, las condiciones y la temperatura óptima de cada paso de incubación se debe determinar durante el desarrollo del método. Los tiempos de incubación van desde minutos hasta toda la noche. Las temperaturas de incubación comúnmente usadas son la temperatura ambiente, 4º y 37º. Las placas para ELISA por lo regular se sellan o colocan en un recipiente secundario para evitar la evaporación o contaminación durante la incubación. Asimismo, durante el desarrollo del método, se deben evaluar las condiciones atmosféricas tales como la incubación en seco o humidificada. Finalmente, puede ser necesario o apropiado agitar, rotar o someter a un movimiento oscilante las placas para microtitulación, dependiendo de la cinética de unión.
Condiciones de Bloqueo y Reacciones No Específicas Después de la inmovilización y eliminación de antígeno o anticuerpo no unido, los sitios de unión no ocupados se bloquean para asegurar que el analito medido en el artículo de prueba o los reactivos subsiguientes (de detección) no se unan de manera inespecífica a la superficie sólida o al antígeno o anticuerpo recubierto. Si se produce unión inespecífica, cualquier señal informada puede sesgar la medición y reducir la sensibilidad y el intervalo dinámico de la valoración. El bloqueo es crítico para asegurar la sensibilidad y/o la especificidad de la valoración. Las fuentes de unión no específicas caen dentro de dos categorías generales: 1. Las interacciones iónicas o hidrófobas ocurren cuando la unión se media a través de interacciones iónicas o hidrófobas no específicas entre reactivos de valoración y la superficie sólida u otro reactivo de valoración. 2. Las interacciones inmunológicas ocurren cuando la unión se media a través de interacciones no previstas entre antígeno y anticuerpo. Esto ocurre cuando las preparaciones de anticuerpos usadas en la valoración interactúan con otros reactivos de valoración. Por ejemplo, si un ELISA se diseñó para analizar un analito derivado de suero usando anticuerpos murinos de captura y de detección, los anticuerpos en el artículo de prueba con reactividad contra la lg murina (también conocidos como anticuerpos heterófilos) se pueden detectar de manera inespecífica en la valoración. La selección del agente de bloqueo (se pueden encontrar ejemplos en la sección anterior Agentes de Bloqueo y Amortiguadores) se determina empíricamente, y el balance entre la reducción en la unión no específica y el impacto sobre la sensibilidad de la valoración se debe evaluar durante el desarrollo del método. Resulta necesario tomar en cuenta la reactividad cruzada con otros reactivos de la valoración; por ejemplo, la biotina endógena de la leche y el suero, y anticuerpos contra proteínas virales o bacterianas que pueden estar presentes en el suero. Por lo tanto, puede ser necesario realizar pruebas específicas para los lotes de suero. El volumen de solución de bloqueo agregado al pocillo debe ser mayor que el volumen de reacción máximo usado para los pasos posteriores, de tal manera que se bloquee el área potencial de la superficie que podría interferir con la unión. Además, la lg en los materiales de prueba se puede eliminar usando amortiguadores que inhiben la conformación de anticuerpos o que agregan los anticuerpos heterófilos, mediante el bloqueo con suero no inmune, o eliminando las regiones Fe en los reactivos de anticuerpos críticos, con lo cual se reducen o eliminan interacciones inmunológicas indeseadas que no se pueden tratar con los reactivos de bloqueo descritos anteriormente. Es posible incluir pocillos de control negativo para monitorear reacciones no específicas. La naturaleza de los pocillos de control negativo depende de la valoración pero puede incluir pocillos bloqueados sin antígeno de recubrimiento, pocillos en los que se elimina el anticuerpo primario o secundario, o pocillos en los
USP 39
1364 (1103) Métodos de Pruebas Inmunológicas / Información General
que se usa amortiguador en lugar de muestra. Los pocillos de control pueden ser útiles como parte de un sistema de pruebas de aptitud del sistema.
Pretratamiento de las Muestras Aunque los métodos de ELISA se diseñan para medir un analito en mezclas complejas, la presencia de otros materiales puede representar un problema si interfieren con la detección del analito. A fin de asegurar la especificidad de la valoración, el procedimiento específico de tratamiento de las muestras para eliminar sustancias interferentes inespecíficas (p.ej., agentes reductores o precipitados) se puede determinar empíricamente durante el desarrollo del método para después incorporarlo en la valoración validada. Cualquier paso de procesamiento de las muestras se debe evaluar teniendo en cuenta la posibilidad de que el tratamiento altere las propiedades del artículo de prueba y/o induzca una mayor variabilidad que genere mediciones sesgadas. Las muestras, estándares y controles se deben preparar y manipular en procesos que sean similares entre sí. Los analistas deben verificar que los pretratamientos no hayan dañado la muestra a tal grado que ya no pueda medirse (p.ej., mediante experimentos en los que la muestra haya recibido algún tipo de adición).
Anticuerpos Detectores Dependiendo del formato del ELISA, se pueden usar como reactivos primarios o secundarios anticuerpos detectores marcados con enzimas u otras marcas, a fin de permitir la detección del analito inmovilizado. En un ELISA directo o competitivo (Figura 2A y Figura 2C), después de que el analito se ha unido a la superficie inmunoadsorbente, se lava el analito en exceso y se detecta el analito inmovilizado usando un anticuerpo detector, el cual se considera el anticuerpo primario. En otros formatos de ELISA (Figura 28, 20, y 2E), se permite que la lg específica del analito (anticuerpo primario no conjugado) se una al analito inmovilizado y se lava cualquier exceso de anticuerpo antes de la adición de un anticuerpo detector, el cual se denomina anticuerpo secundario. Para facilitar la detección, en todos los formatos de ELISA que emplean anticuerpos conjugados con enzimas, se introduce un sustrato específico para la enzima conjugada en el sistema de valoración. Se genera una reacción enzimática que convierte un sustrato en un producto soluble el cual se puede medir usando longitudes de onda apropiadas y un lector adecuado. La sensibilidad del ELISA depende de la calidad de los reactivos y del sistema de detección, incluyendo la marca y el sustrato. Si se dispone de múltiples anticuerpos conjugados, los analistas deben seleccionar uno apropiado para la valoración. Durante esta evaluación, se debe determinar la dilución de cada conjugado que genere una sensibilidad y especificidad adecuadas mediante controles apropiados. Las enzimas de marcado de uso más común para conjugar anticuerpos incluyen fosfatasa alcalina (AP), peroxidasa de rábano (HRP) y galactosidasa. Estas enzimas son altamente específicas, sensibles y estables para la catalización de reacciones cromogénicas, luminiscentes o fluorescentes. El fosfato de para-nitrofenilo (pNPP) es un sustrato comúnmente usado para AP. Los sustratos de uso común para HRP incluyen TMB, OPD (diclorhidrato de o-fenilendiamina) y ABTS [sal diamónica del ácido 2,2'azino-bis(3-etil-benzotiazolin-6-sulfónico)] (ver la Tabla 2). Los sustratos para AP y HRP son cromogénicos y resultan en la formación de un producto coloreado que se puede medir usando un espectrofotómetro. Asimismo, se encuentran disponibles sustratos quimioluminiscentes y fluorescentes para AP y HRP que, en muchas ocasiones, están disponibles como kits comerciales. El fosfato de 3-(4-metoxiespiro{1,2-dioxetano-3,2'-(5'-cloro)triciclo[3.3. l. l 3,7]decan}-4-il)fenilo disódico (CSPD) es un sustrato quimioluminiscente conocido para AP (ver la Tabla 2). Los sustratos fluorescentes bien conocidos para galactosidasa incluyen MG (4-metilumbeliferil galactósido) y NG (nitrofenil galactósido). Si se usa un sustrato quimioluminiscente, entonces es necesario un luminómetro para cuantificar el producto formado. Si en el ELISA se usa un sustrato fluorescente, es necesario contar con un fluorómetro. La Tabla 2 también provee un resumen de las ventajas y desventajas de diferentes tipos de sustratos para ELISA. Los sustratos colorimétricos han prevalecido desde el origen de los ELISA y pueden generar valoraciones robustas que, por lo general, son más asequibles que las valoraciones que usan sustratos quimioluminiscentes y fluorescentes. No obstante, los métodos de ELlSA quimioluminiscentes y fluorescentes pueden generar valoraciones más rápidas y sensibles con un intervalo dinámico más amplio que las valoraciones que emplean una lectura colorimétrica. La selección final del tipo de lectura debe regirse por el propósito de la valoración y los requisitos de la misma. Tabla 2. Conjugados de Enzimas y Sustratos Lectura Colorimétrica
Principio de la Reacción Enzimática Produce un producto coloreado que genera valores de absorbancia directamente proporcionales a la concentración de analito
Enzima AP, HRP
Sustrato pNP p
TMB OPD ABTS
Lector Espectrofotómetro
Ventajas • Robusto •Económico • Disponibilidad del reactivo
Desventajas •Menos sensible
USP 39
Información General/ (1103) Métodos de Pruebas Inmunológicas 1 365
Tabla 2. Conjugados de Enzimas y Sustratos (Continuación) Quimioluminiscente
Produce emisión de luz que es directamente proporcional a la concentración de analito
AP
CSP D
Luminómetro
• Amplio interval o dinámico de valoración • Concentradones de recubrimiento más bajas • Más sensible • Generación rápida de señal
• Requiere placas especiales • Costoso
Fluorescente
Produce emisión de luz inducida por excitación que es directamente proporcional a la concentración de analito
Galactosidasa
MG NG
Fluorómetro
•Rápida •Sensible
• Requiere placas especiales •Costoso • Interferencia de excipientes
PLAN DE DESARROLLO Y VALIDACIÓN DE LA VALORACIÓN Desarrollo de Reactivos Críticos Las consideraciones claves para los reactivos críticos incluyen el origen, la pureza, la especificidad y la estabilidad. Para mediciones de calidad, los MPI emplean estándares de referencia junto con reactivos críticos para captura y detección de analitos. Resulta necesario evaluar cualquier cambio en los reactivos biológicos críticos (ver, por ejemplo, las guías contenidas en el capítulo Diseño y Desarrollo de Valoraciones Biológicas (1032).) FUENTES La disponibilidad y calidad del material inicial se debe controlar de modo que la fabricación del reactivo (purificado) se pueda llevar a cabo de manera reproducible y uniforme, probablemente durante varias décadas. Debido a que los reactivos críticos son moléculas biológicas, las fuentes pueden variar de síntesis químicas (p.ej., péptidos) a matrices biológicas complejas (p.ej., anticuerpos preparados a partir de suero, anticuerpo monoclonal de ascitis/cultivo celular o productos de fermentación/ cultivo celular). Cuando resulte apropiado para el uso previsto de la valoración, se puede fabricar un solo lote de reactivo crítico para establecer un abastecimiento sustancioso y evitar la variabilidad entre lotes. En otros casos, puede resultar apropiado incluir en la validación múltiples lotes o proveedores para demostrar que la valoración es lo suficientemente robusta para el uso previsto. PUREZA En general, la pureza de los reactivos críticos se debe evaluar para asegurar la eliminación de impurezas y residuos del proceso de fabricación que pudieran influir sobre el desempeño y/o la estabilidad del reactivo. ESPECIFICIDAD La especificidad de un reactivo crítico se refiere a su capacidad para capturar o detectar sólo el analito de interés. El reactivo debe ser específico para el analito y debe presentar una baja unión inespecífica o ninguna unión cruzada con las moléculas fuera de interés en materiales de prueba complejos. ESTABILIDAD La estabilidad de reactivos críticos debe determinarse empíricamente para asegurar el desempeño de la valoración con el paso del tiempo (las cuestiones a tratar incluyen exactitud, precisión, reproducibilidad y desvíos de la valoración). Se debe determinar la estabilidad a largo plazo (de meses a años) de los reactivos críticos en las condiciones de almacenamiento requeridas (p.ej., con temperatura y envases definidos) para poder asignarles una fecha de caducidad apropiada. Asimismo, también se requiere la estabilidad a corto plazo (de minutos a días) (y la estabilidad durante el congelamiento/descongelamiento y a temperatura ambiente para los reactivos críticos congelados) para asegurar la exactitud, precisión y reproducibilidad diarias de la valoración.
1 366 (1103) Métodos de Pruebas Inmunológicas / Información General
USP 39
Estudios de Factibilidad/Piloto A continuación, se describen las etapas del proceso mediante el cual se desarrolla, valida y emplea un método de ELISA para análisis rutinarios de muestras: • Generar o adquirir reactivos críticos para medir el analito. Determinar las condiciones de almacenamiento y de estabilidad. • Comprender las metas de desempeño para el sistema de valoración. • Desarrollar la valoración hasta obtener una curva de concentración-respuesta detectable. • Llevar a cabo el desarrollo del método/análisis de robustez. • Preparar el estándar de referencia/calibración y controlar y evaluar la estabilidad. • Establecer procedimientos de valoración, controles y límites apropiados, criterios de aceptación de la valoración y de la muestra, e instrumental. • Determinar el desempeño del método y calificar la exactitud, especificidad, precisión y robustez del método, incluyendo la calificación de todos los tipos de muestra aplicables que se van a analizar. •Validar la valoración. • Implementar el método (transferencia de tecnología) en el laboratorio de análisis, incluyendo la capacitación y calificación de analistas. • Monitorear el desempeño de la valoración. Durante el desarrollo de la valoración, se deben evaluar los parámetros y reactivos críticos requeridos para la valoración, además de establecer niveles que generen un desempeño adecuado de la valoración. En muchos casos, se pueden evaluar diversos parámetros, mientras que los experimentos bien diseñados pueden acelerar el desarrollo de la valoración, en particular para la evaluación de la interacción potencial de diversos factores. Muchos procedimientos de ELISA son específicos para productos, por lo que puede no haber estándares de referencia/calibración externos disponibles. La preparación y estabilidad de estándares de referencia/calibración se deben considerar desde las etapas tempranas del desarrollo de la valoración.
Validación de la Valoración La validación de la valoración se lleva a cabo de conformidad con los lineamientos de las agencias reglamentarias apropiadas (p.ej., ICH Q2) para demostrar que la prueba particular usada para un analito es apropiada para su uso previsto. Los capítulos de información general sobre validación proporcionan información adicional, específicamente el capítulo Validación de Procedimientos Farmacopeicos (1225), o el de Validación de Va/oraciones Biológicas (1033), cuando el ELISA se usa como valoración sustituta de potencia. Ver el Apéndice 2 para información adicional.
ANÁLISIS DE DATOS El análisis de datos del ELISA puede ser simple (p.ej., una calibración lineal con regresión inversa) o complejo (p.ej., una curva de calibración no lineal con regresión inversa). El tipo y rigor del análisis de datos dependen en gran medida del sistema de valoración y de los usos previstos de la misma. Por ejemplo, la reducción de datos puede estimar una concentración (p.ej., ng/mL) de una muestra desconocida usando una curva de calibración. Otras metodologías incluyen la estimación de la mitad de la concentración inhibitoria máxima (Clm 50 ) o la mitad de la concentración efectiva (CE 50 ), que son estimaciones de la cantidad de una muestra que genera la misma respuesta que la CE 50 (o Clm 50 ) en una curva estándar y de la actividad relativa de una muestra de prueba comparada con un estándar de referencia/calibración. Los capítulos de información general Diseño y Desarrollo de Valoraciones Biológicas (1032) y Análisis de Va/oraciones Biológicas (1034) proporcionan guías más detalladas relacionadas con métodos estadísticos para análisis de potencia. En general, las curvas de valoración de ELISA se caracterizan por una relación no lineal entre la concentración del analito de interés y la respuesta media calculada. Por lo regular, esta curva de respuesta se define mediante una relación de sigmoide de la respuesta con la concentración. Las curvas estándar/de calibración se pueden ajustar mediante una amplia variedad de modelos matemáticos, y los analistas deben seleccionar cuidadosamente un algoritmo de ajuste de curva adecuado. En otros casos, las valoraciones mediante ELISA se usan para propósitos cualitativos para determinar si una muestra es positiva o negativa basándose en un umbral de sensibilidad.
Análisis Estadístico Básico Los métodos estadísticos básicos no se detallan en este capítulo. El capítulo de información general Datos Analíticos-Intery Tratamiento (101 O) trata fundamentos importantes, que incluyen manejo de datos; cálculo de medias, desviaciones estándar y errores estándar; detección y métodos para tratar variaciones no constantes o anormales; detección y administración de valores aberrantes; y procedimientos e interpretación de pruebas estadísticas e intervalos de confianza. Los conceptos relacionados con la validación, objetivos, diseños, análisis y métodos prácticos de validación se describen en los capítulos de información general Datos Analíticos-Interpretación y Tratamiento (1010), Validación de Procedimientos Farmacopeicos (1225) y pretación
USP 39
Información General/ (1103) Métodos de Pruebas Inmunológicas 1367
Validación de Valoraciones Biológicas (1033). El capítulo de pruebas generales Diseño y Análisis de Valoraciones Biológicas (111) contiene guías para la combinación de resultados de valoraciones independientes.
Análisis Estadísticos No Lineales La calibración no lineal para inmunoensayos hace uso de una gran cantidad de fuentes para diseño y análisis estadístico. Éstas incluyen métodos para evaluar y tratar la varianza no constante, diseños y métodos de análisis para experimentos con estructuras complejas y validación. Los conceptos en los que se sustentan los diseños de calibración lineal, análisis y regresión inversa se aplican a la calibración no lineal, y los estadísticos profesionales pueden ayudar a aplicar estos conceptos apropiadamente.
Informe de los Resultados Se debe considerar que las estimaciones informadas de concentración tienen un intervalo de confianza asociado que se basa en los resultados de la valoración. El valor o estimación de informe usado para describir una muestra se puede basar en un resultado combinado de múltiples valoraciones.
APÉNDICES Apéndice 1: Abreviaturas Ac-Anticuerpo Ag-Antígeno ABTS-Sal diamónica del ácido 2,2'-azino-bis[3-etil-benzotiazolin-6-sulfónico] Anti-lg-antiinmunoglobulina AP-Fosfatasa alcalina BSA-Albúmina sérica bovina CSPD-Fosfato de 3-(4-metoxiespiro{l ,2-dioxetano-3,2'-(5'-cloro)triciclo[3.3.1. l 3J)decan}-4-il)fenilo disódico EIA-Enzimoinmunoensayo ELISA-Ensayo por inmunoadsorción ligado a enzimas HRP-Peroxidasa de rábano lg-lnmunoglobulina MPl-Métodos de pruebas inmunológicas MG-4-Metilumbeliferil galactósido NG-Nitrofenil galactósido OPD-Diclorhidrato de o-fenilendiamina PBS-Solución salina amortiguada con fosfatos PVDF-Fluoruro de Polivinilideno pNPP-para-Nitrofenil fosfato TMB-3,3',5,5'-Tetrametilbencidina
Apéndice 2: Fuentes Adicionales de Información sobre Temas Específicos en Validación y Análisis de Datos
Datos Analíticos-lnterpretación y Tratamiento
Diseño y Análisis de Valoraciones Biológicas
Validación de Procedimientos Farmacopeicos
Capítulos sobre Valoraciones Biológicas
(1010)
(111)
(1225)
(1032), (1033) y (1034)
Medias
X
Desviaciones estándar
X
Errores estándar
X
Falta de normalidad
X
X
Varianza no constante
X
X
Valores aberrantes
X
X
Pruebas
X
Intervalos de confianza
X
X
USP 39
1 368 (1103) Métodos de Pruebas Inmunológicas / Información General
Datos Analíticos-lnterprelación y Tratamiento
Diseño y Análisis de Valoraciones Biológicas
Validación de Procedimlentos Farmacopeicos
Capítulos sobre Valoraciones Biológicas
(101 O)
(111)
(1225)
(1032), (1033) y (1034)
X
Validación Combinación de resultados de múltiples valoradones
X
X
X
(1104) MÉTODOS DE PRUEBAS INMUNOLÓGICAS-ANÁLISIS POR INMUNOTRANSFERENCIA
INTRODUCCIÓN Definición y Alcance Este capítulo forma parte de un grupo de capítulos de información general para métodos de pruebas inmunológicas (Métodos de Pruebas Inmunológicas-Consideraciones Generales (1102), Métodos de Pruebas Inmunológicas-Ensayo por lnmunoadsorción Ligado a Enzimas (ELISA) (1103) y Métodos de Pruebas Inmunológicas-Resonancia de Plasmón Superficial (1105)), y provee a los analistas información general sobre principios, desarrollo y validación de métodos, y evaluación de datos para análisis por inmunotransferencia. El análisis por inmunotransferencia se define como cualquier método en el que se usa un anticuerpo para la detección de uno o más analitos (p.ej., proteínas, polisacáridos) el cual ha sido transferido a la superficie de una membrana de prueba. Los métodos por inmunotransferencia generalmente se clasifican dependiendo si el procedimiento de inmunotransferencia incluye una separación electroforética. La separación electroforética se basa en la diferencia de los pesos moleculares y en las diferencias de carga de una población de moléculas. Ver los capítulos ~. (AFQl·mfrJ.-ii16¡Electroforesis Capilar (1053), Artículos Obtenidos por Biotecnología-lsoelectroenfoque (1 054) y Artículos Obtenidos por Biotecnología-Electroforesis en Gel de Poliacrilamida (1056) para una descripción detallada de los métodos de separación electroforética. Un ejemplo de análisis por inmunotransferencia que implica la separación electroforética es la transferencia Western (Western Blot), descrita por primera vez en la literatura científica a finales de la década de 1970. Otro enfoque para el análisis por inmunotransferencia consiste en llevar a cabo la detección de moléculas usando un anticuerpo sin separación electroforética previa. La transferencia en ranuras (slot blot) o en puntos (dot blot) son ejemplos de este tipo de método sin separación electroforética. El alcance de este capítulo incluye únicamente aquellos métodos en los que se usa un anticuerpo para la detección de una molécula unida a una membrana. Por lo tanto, este capítulo no analiza procedimientos en los que se emplean medios de detección no inmunológicos.
SELECCIÓN DEL ENSAYO Valoración Sin Separación Eletroforética (Transferencia en Ranuras/en Puntos) El método de transferencia en ranuras/en puntos es un método sin separación electroforética simplificado en el que una mezcla que contiene los analitos para detección primero se aplica directamente en la membrana usando un manifold de vacío cuya construcción incluye ranuras rectangulares separadas de manera uniforme. El método de transferencia en ranuras/en puntos es más rápido y simple debido a que no hay separación electroforética de los múltiples analitos individuales que pudieran estar presentes en la mezcla. Por estas razones, es fácil de adaptar a los análisis automatizados de múltiples muestras, para los cuales se encuentra disponible comercialmente una variedad de sistemas, pero no ofrece información sobre el peso molecular de los analitos y provee únicamente información limitada con respecto a la cantidad de analito presente en la muestra. Aunque se puede configurar en un formato cuantitativo, el método a menudo se usa para producir un resultado cualitativo, p.ej., confirmación de la identidad demostrando la presencia o ausencia de antígenos específicos mediante un sistema de detección que revela la presencia de inmunocomplejos. Después de que los analitos se enlazan a la membrana y se bloquean los sitios no unidos, los analistas emplean un anticuerpo detector para determinar la presencia o ausencia del analito o analitos de interés. La forma uniforme de la transferencia en ranuras y su mayor área superficial para el enlace de analitos la vuelven más adecuada que la transferencia en puntos para aplicaciones cuantitativas y análisis por densitometría.
USP 39
Información General/ (1104) Métodos de Pruebas Inmunológicas 1369
Valoración con Separación Electroforética Los métodos de transferencia electroforética (comúnmente denominados Western blot) se usan ampliamente en el análisis de mezclas de proteínas. El Western blot es una poderosa herramienta para determinar la identidad, la concentración relativa, el peso molecular relativo y las modificaciones postranslacionales de proteínas específicas. En los Western blots, las proteínas de la muestra se separan usando electroforesis en gel. La separación de proteínas puede basarse únicamente en el peso molecular o en el punto isoeléctrico (pi) y el peso molecular. En el primer caso las proteínas migran en una dimensión (1 D) y en el segundo caso en dos dimensiones (2D) a través de un gel. Cuando las proteínas se separan de acuerdo a sus pesos moleculares, las proteínas más pequeñas migran con mayor rapidez. Cuando los analistas emplean electroforesis bidimensional, las proteínas se separan de acuerdo con el punto isoeléctrico en la primera dimensión y luego de acuerdo con sus pesos moleculares en la segunda dimensión. Después de la separación, las proteínas se transfieren a una membrana, la cual se bloquea para evitar el enlace no específico con los reactivos de valoración agregados subsiguientemente, y se detecta la proteína de interés usando anticuerpos específicos. La detección de un anticuerpo unido al analito de interés realizarse por diferentes métodos, los cuales incluyen la detección colorimétrica, la detección fluorescente, la detección quimioluminiscente y la detección radioactiva. Una vez detectadas las proteínas de interés, se puede llevar a cabo indirectamente la cuantificación de la inmunotransferencia mediante densitometría. ELECTROFORESIS UNIDIMENSIONAL En la electroforesis unidimensional, se separan proteínas individuales o grupos de proteínas por su peso molecular para su análisis adicional mediante Western blot. Usando electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDSPAGE, por sus siglas en inglés), las proteínas migran respondiendo a las diferencias en la carga eléctrica a través de una red tridimensional de fibras y poros. La red se forma a medida que la bisacrilamida bifuncional, u otro agente de entrecruzamiento, entrecruza cadenas adyacentes de poliacrilamida para formar un gel (ver también el capítulo general USP (1056)). La combinación del tamaño de poro del gel y las características de las proteínas determinan la migración de proteínas. Las proteínas separadas se detectan posteriormente mediante análisis por Western blot usando anticuerpos específicos para las proteínas diana. Mediante el análisis por Western blot, es posible comparar una muestra de prueba con un estándar, y se puede monitorear la aparición de productos de degradación e impurezas específicamente relacionadas con las proteínas siempre que el anticuerpo de detección mantenga su capacidad de reconocer las formas alteradas de la proteína. Aunque se puede lograr un alto nivel de sensibilidad mediante este método, puede no ser posible conseguir la separación de proteínas con pesos moleculares similares. Cuando los analistas deban analizar proteínas individuales con pesos moleculares similares, podría ser necesario emplear separaciones bidimensionales. ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL En la electroforesis bidimensional, se separan proteínas individuales o grupos de proteínas en la primera dimensión mediante isoelectroenfoque (IEF; carga) y en la segunda dimensión mediante electroforesis con dodecil sulfato de sodio (peso molecular). Separar las proteínas de esta manera permite obtener información no sólo sobre el peso molecular, como en el caso de las electroforesis unidimensionales, sino también sobre la carga de una proteína. Los geles bidimensionales son una opción útil para resolver mezclas complejas y para evaluar la especificidad de anticuerpos de proteínas (p.ej., la evaluación de proteínas de células hospederas).
Membranas, Reactivos y Opciones de Detección MEMBRANAS Por lo general, se usan membranas de nitrocelulosa y fluoruro de polivinilidino (PVDF, por sus siglas en inglés) para los métodos de inmunotransferencia. Por razones de costos, a menudo se prefieren las membranas de nitrocelulosa sobre las membranas de PVDF para transferencias en ranuras/en puntos (o transferencia por vacío), pero, debido a su mayor fuerza mecánica, se deben considerar las membranas de PVDF cuando sea necesario despegar (stripping) los anticuerpos unidos a las bandas de las proteínas y reanalizar (reprobing) la membrana con un nuevo anticuerpo. REACTIVOS DE BLOQUEO Después de la transferencia o unión de la proteína a la membrana, los sitios de unión desocupados en las membranas deben bloquearse para evitar el enlace no específico de los reactivos agregados subsiguientemente. La mayoría de las sondas de detección son proteínas que también se pueden unir con la membrana. La falta de bloqueo adecuado de los sitios de la membrana puede generar uniones no específicas y un fondo elevado. Se encuentra disponible una variedad de reactivos de bloqueo, entre los que se incluye gelatina, leche desgrasada y albúmina sérica bovina (BSA, por sus siglas en inglés). Los reactivos protei-
USP 39
1370 (1104) Métodos de Pruebas Inmunológicas/ Información General
cos no deben estar relacionados con los antígenos analizados en el estudio. Debido a que estos reactivos a menudo presentan variabilidad entre lotes, puede resultar necesario calificarlos. Los reactivos deben evaluarse con el sistema de detección seleccionado y optimizarse usando dicho sistema de detección para lograr un fondo mínimo sin pérdida de señal. Si el reactivo de bloqueo se deriva de una fuente biológica, no debe contener niveles de trazas de la proteína que se está midiendo, ya que esto último puede incrementar el fondo. MÉTODOS DE DETECCIÓN La detección inmunológica de analitos en cualquier tipo de inmunotransferencia puede ser directa o indirecta. La selección del formato depende de una combinación de factores tales como el nivel de sensibilidad requerido y la calidad de los antisueros disponibles. Para la identificación o la detección de un producto, la sensibilidad por lo general no es crítica y comúnmente se usa la detección directa mediante un anticuerpo conjugado, la cual a menudo simplifica y acorta el tiempo requerido para ejecutar el método. Como alternativa, se puede usar la detección indirecta para mejorar la sensibilidad, generalmente mediante el uso de un anticuerpo antiespecies conjugado. En algunas ocasiones, el analito que se está detectando es en realidad un anticuerpo, como en el caso de un anticuerpo monoclonal que se está desarrollando como fármaco. En este caso, se pueden usar anticuerpos específicos para el anticuerpo (p.ej., anticuerpos antiidiotipo). Anticuerpo primario: El anticuerpo primario se selecciona basándose en su especificidad para el analito o proteína. Aunque los antisueros policlonales pueden ofrecer un amplio rango de detección contra un conjunto potencialmente grande de epítopes, puede presentarse una reacción cruzada no deseada que resulte en una disminución de la especificidad. Si lo anterior no puede resolverse mediante la optimización de la valoración, se puede usar un anticuerpo monoclonal o grupos de anticuerpos monoclonales seleccionados. Los anticuerpos monoclonales a menudo presentan ventajas para los estudios a largo plazo, debido a que producen un suministro constante de anticuerpo contra un epítope específico. El uso de anticuerpos monoclonales limita directamente el número de epítopes implicados en la detección de la diana. Esto debe evaluarse para cada aplicación. El anticuerpo primario se puede conjugar directamente o usarse en conjunto con un anticuerpo secundario en un sistema apropiado de detección. Por lo general, se considera que la concentración óptima de anticuerpo es la dilución más grande de anticuerpo que resulte en una señal positiva fuerte con fondo mínimo. Esto debe optimizarse en conjunto con el bloqueo y el sistema de detección seleccionado. El anticuerpo primario debe calificarse antes de usarse en la valoración. Anticuerpo secundario: El anticuerpo secundario por lo general se dirige contra la inmunoglobulina de la especie animal usada para obtener el anticuerpo primario (que es específica para el analito, p.ej., lgG de cabra antiratón). Las enzimas tales como peroxidasa de rábano (HRP, por sus siglas en inglés) o la fosfatasa alcalina (AP, por sus siglas en inglés) generalmente se enlazan con el anticuerpo secundario, pero se pueden usar otros marcadores tales como fluoróforos o partículas de oro para la detección. Si el anticuerpo secundario está biotinilado, se pueden usar complejos de biotina-avidina-peroxidasa de rábano o fosfatasa alcalina para la detección. Enzima y sustrato de detección: Una vez que se ha formado un inmunocomplejo que contenga el anticuerpo conjugado con una enzima, los analistas agregan un sustrato adecuado para la valoración. La degradación del sustrato por la acción de la enzima resulta en una producción de un precipitado de color o un producto fluorescente o quimioluminiscente que se puede registrar, medir y analizar en mayor detalle. Se encuentra disponible un amplio rango de opciones de detección para ajustarse mejor a las aplicaciones individuales y a los usos previstos. Algunos de estos rangos se encuentran disponibles en los capítulos (1103) y (1102), así como en la Tabla 7. Tabla 1. Reactivos y Métodos de Detección Lectura
Colorimétrica
Principio de la Reacción Enzimática
Enzima
Produce un producto de color que genera valores de absorbancia directamente proporcionales a la concentración de analito
Fosfatasa alcalinaª Peroxidasa de rábano'
Sustrato pNPPb TMBci OPDe ABTS1
Detección
Espectrofotómetro
ª Fosfatasa alcalina. b Fosfato para-nitrofenílico. e Peroxidasa de rábano. d 3,3',5,5'-Tetrametilbencidina. e Diclorhidrato de o-fenilendiamina. 1 Sal diamónica del ácido 2,2'-azino-bis[3-etil-benzotiazolina-6-sulfónico]. g 3-(4-Metoxiespiro{1,2-dioxetano-3,2'-(5'-cloro)triciclo[3.3.1.13,7]decan}-4-il)fenil fosfato disódico. h Dispositivo de acoplamiento de carga. i 4-Metilumblliferil galactósido. i Nitrofenil galactósido.
Ventajas - Robusto -Económico - Disponibilidad de reactivos
Desventajas
- Lleva tiempo - Menos sensible que otros métodos
USP 39
Información General/ (1104) Métodos de Pruebas Inmunológicas 1 371
Tabla 1. Reactivos y Metodos de Detecclon (Continuacion) Lectura
Principio de la Reacción Enzimática
Enzima
Quimioluminiscente
Produce una emisión de luz que es directamente proporcional a la concentración de analito
Fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano
Fluorescente
Produce una emisión de luz inducida por excitación que es directamente proporcional a la concentración de analito
Galactosidasa, anticuerpo marcado por fluorescencia
-
Radioactiva
El antígeno se marca con un isótopo radioactivo. La radiación es proporcional a la concentración de analito.
Sustrato
Detección
Ventajas
Desventajas
CSPD9
Luminómetro, película fotográfica (cámara con dispositivo de acoplamiento de cargah)
-Amplio intervalo dinámico de valoración - Muy sensible - Rápida generación de señal
- La reproducibilidad puede resultar un desafío
MGi NGi
Fluorómetro (cámara con CCD con filtros)
-Rápida -Sensible
- Interferencia por excipi entes
Contador de centelleo
- Fácil de cuantificar -Rápida
- Riesgo para la seguridad por exposición - Desechos radioactivos
-
• Fosfatasa alcalina. b Fosfato para-nitrofenílico. e Peroxidasa de rábano. d 3,3',5,5'-Tetrametilbencidina. • Diclorhidrato de o-fenilendiamina. f Sal diamónica del ácido 2,2'-azino-bis[3-etil-benzotiazolina-6-sulfónico]. 9 3-(4-Metoxiespiro{l ,2-dioxetano-3,2'-(5'-cloro)triciclo[3.3.1.1 3.7]decan}-4-il)fenil fosfato disódico. h Dispositivo de acoplamiento de carga. i 4-Metilumblliferil galactósido. i Nitrofenil galactósido.
DESARROLLO DEL MÉTODO El desarrollo del método se puede realizar de acuerdo con la información basal recientemente dada. El alcance del desarrollo del método, y eventualmente la validación del mismo, son determinados de acuerdo al propósito del método, el cual determina el formato para la valoración y demás requisitos para la prueba, por lo que debe determinarse primero. Las siguientes secciones exploran los aspectos a considerar para el propósito del método.
Propósito Previsto del Método ANÁLISIS DE IDENTIDAD En el caso de las pruebas de identidad, los analistas buscan detectar la presencia de una proteína; por ende, resulta esencial y necesario demostrar la especificidad. Para este propósito, los analistas controlan también la cantidad de proteína en la muestra. Por consiguiente, los límites de detección (LOO, por sus siglas en inglés), los límites de cuantificación (LOQ, por sus siglas en inglés) y otras medidas de cantidad no constituyen atributos requeridos del método. Los ejemplos incluyen valoraciones de identidad de materiales que demuestran el isotipo de una lgG y, en ocasiones, demuestran la especificidad de un anticuerpo en una validación del método. Cuando no existe interferencia de la matriz o reacciones cruzadas potenciales con otros materiales presentes en la muestra, entonces puede ser suficiente una transferencia en ranuras/en puntos. Cuando múltiples proteínas en la muestra presentan inmunoreactividad y deben distinguirse entre sí, se debe usar un procedimiento de separación antes de la transferencia y de la inmunotinción. La complejidad de las proteínas en la muestra y la utilidad de la información adicional obtenida usando separación electroforética ayudan a determinar si una transferencia en ranuras/en puntos puede cumplir con las necesidades de la prueba.
ANÁLISIS DE LÍMITE Es posible que en otras aplicaciones los analistas deseen demostrar la eliminación de una impureza hasta un nivel inferior al que genera preocupación toxicológica. En muchos casos, se usa una prueba de límite cuando es posible definir la presencia de una proteína por debajo de un nivel determinado con las expresiones sí o no. Esto simplifica el desarrollo y la validación del método. El uso de equipo de densitometría (barrido o generación de imágenes) permite determinar la intensidad de las manchas o bandas con respecto a una curva estándar, lo que resulta en una estimación de la concentración. Se debe determinar un límite de detección para establecer el umbral de límite apropiado para el método. Una transferencia en puntos puede ser adecuada para cualquier circunstancia siempre que se pueda demostrar la especificidad del anticuerpo en la matriz de muestra.
1372 (1104) Métodos de Pruebas Inmunológicas/ Información General
USP 39
Otro propósito común para una inmunotransferencia es mostrar la presencia o ausencia de una proteína expresada a partir de un cultivo. Ante esta situación, los analistas desean establecer la identidad de la proteína mediante inmunotransferencia, así como verificar que la proteína tenga el peso molecular esperado. Esto provee una mayor garantía sobre la ausencia de interacciones no específicas con otras proteínas en una matriz compleja que genera la señal en la transferencia. ANÁLISIS DE ESPECIFICIDAD Otro propósito habitual de la inmunotransferencia es la caracterización de la especificidad de los reactivos para una prueba de impurezas por ELISA o por columna de inmunoafinidad y constituye otra forma de una prueba de identidad en la que el punto final deseado es la demostración de la especificidad de la unión entre el antígeno y el anticuerpo. El resultado de la medición es una demostración de la unión con un grupo selecto de la población total de proteínas en la muestra o de la unión con la población entera de proteínas en la muestra, conforme a lo requerido por las valoraciones de proteínas de células hospederas. Para demostrar la especificidad de un anticuerpo con respecto a una población de proteínas, los analistas generalmente deben llevar a cabo separaciones electroforéticas o de otro tipo. La demostración mediante inmunotinción de que el anticuerpo puede reconocer una proteína con el peso molecular o punto isoeléctrico correctos es una poderosa comprobación de la especificidad hacia una proteína determinada y de la ausencia de unión con otras proteínas. Asimismo, contar dentro del mismo experimento con las muestras apropiadas de control positivo que se sabe contienen la proteína, así como con las muestras de control negativas que se sabe carecen de la proteína, constituye un argumento convincente para la especificidad del anticuerpo cuando los analistas validan un método ELISA para determinar la presencia de impurezas en las muestras de proteínas. Las separaciones electroforéticas pueden realizarse en una dimensión usando SDS-PAGE (para peso molecular) o isoelectroenfoque (IEF; para punto isoeléctrico) para un número limitado de proteínas con pesos moleculares conocidos. Las separaciones electroforéticas también se pueden realizar en dos dimensiones (p.ej., IEF seguida de SDS-PAGE) para mostrar la selectividad y especificidad hacia una población más heterogénea de proteínas. Resulta común el uso de Western blot bidimensional para demostrar la especificidad de un anticuerpo policlonal candidato dirigido contra una preparación de antígeno proteico de células hospederas (HCP, por sus siglas en inglés) antes del desarrollo de un ELISA cuantitativo para dicho propósito.
Modo de Valoración e Introducción de la Muestra Después de considerar los elementos críticos requeridos para cada propósito del método, el analista puede emplear esta información para seleccionar el modo de valoración más apropiado. Los puntos principales a considerar cuando se desarrolla un método de inmunotransferencia se presentan en la Figura 7. Cuando resulte apropiado, la siembra de las muestras en una membrana o su aplicación mediante vacío es la manera más fácil y conveniente de introducir una muestra en una membrana para inmunotransferencia. No obstante, los niveles bajos de unión no específica de múltiples proteínas pueden crear interferencia no específica adicional en transferencias en ranuras o en puntos, lo que resulta en niveles de fondo que parecen ser el analito deseado. ·
Información General/ (1104) Métodos de Pruebas Inmunológicas 1373
USP 39
Decidir modo de valoración/ Introducción de ............._ia muestra .--
Controles/ Estándares de la valoración
..............
•Transferencia en ranuras/en puntos •Separación unidimensional •Separación bidimensional
•Estándares •Controles negativos •Controles de sensibilidad
~
•Nitrocelulosa •PVDF
Selección de la membrana
..............
•Demostrar la unión del anticuerpo a la membrana con una tinción química
~
·Tiempo de transferencia (electroforesis en gel) •Tiempo de vacío •Volumen de siembra
Optimizar la transferencia
~
~
•Anticuerpo primario
•Anticuerpo secundario o de detección correspondiente con el anticuerpo primario •Anticuerpo secundario o de detección con el sustrato/sistema de
Especificidad del anticuerpo
~
detección seleccionado •Seleccionar las sustancias conocidas que se van a agregar a la matriz y a los controles ~
Selección del reactivo de bloqueo
..............
•Ausencia de analito antígeno •Bloquea uniones no especificas de los reactivos de anticuerpos y del
sistema de detección secundario
.--
Valoración de anticuerpos primarios y
•Anticuerpo primario •Anticuerpo secundario •Valoración simultánea con el diseño de la matriz
~secundarios ~
Incubación del sustrato y adquisición de datos
•Tiempo de incubación del sustrato •Tiempo de adquisición de datos •Análisis de datos
Figura 1. Diagrama de Flujo del Desarrollo del Método. Las separaciones electroforéticas, aunque llevan tiempo, pueden ser útiles para separar y distinguir con mayor detalle la unión específica y no específica. Los analistas deben reemplazar la sensibilidad con la selectividad al trasladarse de un enfoque unidimensional hacia uno bidimensional puesto que la separación adicional de especies inmunoreactivas de una sola banda en múltiples manchas, como sucede con la heterogeneidad observada en las proteínas sialiladas o en las especies desamidadas.
Controles y Estándares de la Valoración Los controles y estándares se seleccionan basándose en el propósito de la valoración y en la información requerida durante el desarrollo. Se pueden usar proteínas marcadoras de peso molecular a fin de obtener una estimación exacta del peso molecular de las especies inmunoreactivas. El uso de controles positivos y negativos es útil para la resolución de problemas durante todo el proceso del diseño experimental. Se pueden usar estándares o controles positivos y negativos para evaluar la aptitud del sistema y para establecer el desempeño del método. Un control positivo puede confirmar la migración apropiada de proteínas y puede confirmar que se ha completado la transferencia de la membrana. Un control negativo es útil para evaluar interacciones no específicas. Se puede usar un control de sensibilidad del método cercano al límite de cuantificación para medir la uniformidad del método cerca de dicho límite a fin de evaluar los cambios en el desempeño de la valoración.
1374 (1104) Métodos de Pruebas Inmunológicas/ Información General
USP 39
Selección de la Membrana La selección de una membrana se realiza basándose en la aplicación y en la proteína que se esté valorando. Se debe contar con membranas con diversos tamaños de poro y deben ser adecuadas para el peso molecular de la proteína de interés a fin de ayudar en la transferencia apropiada de diferentes tamaños de proteínas. Cuando se sabe que un método de tinción química funciona bien en una membrana específica con una proteína específica, entonces resulta ventajoso mostrar que la proteína se une con la membrana y se tiñe antes de que los analistas lleven a cabo las etapas de inmunotinción para la valoración. Las separaciones electroforéticas seguidas de la transferencia a una membrana se deben optimizar mediante tinción química, p.ej., con colorantes fluorescentes o colorantes de plata sensibles y en cantidades de muestra potencialmente elevadas antes de que los analistas trabajen con los niveles de mu.estra más bajos requeridos para la optimización de la transferencia. Los colorantes tales como Coomassie o Coomassie coloidal podrían no ser lo suficientemente sensibles para detectar un nivel bajo de impurezas requerido para ciertas aplicaciones.
Optimización de la Transferencia Los analistas deben optimizar los tiempos de la transferencia de las proteínas desde el gel a la membrana. Las proteínas de mayor tamaño requieren más tiempo para su transferencia que las proteínas más pequeñas. Las proteínas pequeñas podrían perderse si se usan tiempos largos de transferencia, ciertamente, pueden atravesar la membrana y perderse del otro lado de ésta. La densidad del gel afecta la transferencia y cuando se usan geles de gradiente la transferencia puede no ser uniforme desde la parte superior a la parte inferior del gel. Durante la optimización de la transferencia, muchos desarrolladores de métodos emplean múltiples membranas para capturar proteínas que se transfieren a través de la primera membrana. La tinción química del gel y de las membranas puede proveer información útil sobre la ubicación de las proteínas transferidas del gel a la membrana, la optimización de la transferencia se realiza extendiendo o reduciendo el tiempo de transferencia. Después de seleccionar el modo de la valoración, los analistas proceden a investigar la siembra del antígeno o la transferencia desde un gel a la membrana apropiada usando diversos niveles pertinentes de concentración del analito. En un principio, podrían requerirse niveles de analito por encima de la concentración requerida para un Western blot para determinar si es posible realizar la transferencia y el reconocimiento por parte de los anticuerpos. Si el analito está presente en concentraciones bajas, puede ser necesaria la adición de cantidades conocidas para mostrar su ubicación durante la optimización de la transferencia. Debido al potencial de variabilidad de la inmunotinción y la transferencia, se debe incorporar un control de sensibilidad o diversos niveles de controles en el método basándose en la valoración del analito por encima del nivel de fondo. Esto se puede ajustar a medida que progresa el desarrollo del método.
Especificidad del Anticuerpo Los analistas deben demostrar la especificidad del anticuerpo en las etapas tempranas del desarrollo del método de inmunotransferencia. Cuando sea posible, los analistas deben analizar muestras de la matriz sin el analito y deben demostrar la ausencia de respuesta. Por el contrario, las muestras que contienen cantidades conocidas de analito agregadas a la matriz deben mostrar una respuesta positiva, lo cual demuestra la especificidad de los anticuerpos. Los analistas también deben demostrar la especificidad del anticuerpo secundario conjugado o marcado. Las inmunotransferencias de control con calles o siembras de anticuerpo primario y de muestras de la matriz que contengan el analito como un control negativo pueden mostrar que el anticuerpo secundario se está uniendo con el anticuerpo primario y no con las proteínas encontradas en la matriz. Existen anticuerpos contra especies conjugados con enzimas marcados con moléculas fluorescentes fácilmente disponibles en el comercio y, por lo regular, han sido analizados o purificados por afinidad contra las especies del anticuerpo que se está detectando, lo cual elimina parte del trabajo temprano requerido para lograr la especificidad deseada. El anticuerpo secundario o el sistema de detección se deben combinar con el equipo de detección y la sensibilidad deseada de la valoración, p.ej., fluorescencia, sustratos para precipitación calorimétrica o quimioluminiscencia.
Selección de Reactivos de Bloqueo Las membranas se pueden bloquear con agentes de bloqueo previamente descritos a medida que los analistas seleccionan el reactivo de bloqueo más apropiado y la cantidad de tiempo requerido para minimizar el fondo mediante incubaciones subsiguientes del anticuerpo primario y secundario. Los analitos titulados en múltiples concentraciones en la membrana permiten a los analistas evaluar la cantidad de señal con respecto a la cantidad de ruido (fondo) con diversos reactivos de bloqueo seguidos por inmunotinción con el anticuerpo primario, el anticuerpo secundario marcado y el sustrato, en caso necesario, para la visualización. Esta valoración también sirve como el punto inicial para examinar el límite de detección y el límite de cuantificación para las pruebas de límite y las mediciones cuantitativas. El límite de detección para inmunotransferencias se determina mediante el nivel de fondo no específico con respecto a la señal específica del analito. Como en el caso de cualquier otro método analítico, si el fondo y la señal son iguales, no existe diferencia entre la señal y el ruido.
Información General/ (1104) Métodos de Pruebas Inmunológicas 1375
USP 39
Valoración de Anticuerpos Primarios y Secundarios Como en el caso de la selección de un reactivo de bloqueo se puede usar la valoración del nivel de anticuerpos primarios y secundarios a partir de diluciones altas hasta diluciones bajas para seleccionar una concentración de anticuerpo que reduzca la unión de fondo en las regiones blanco que rodean las siembras o bandas de proteínas, y puede optimizar la señal proveniente del analito. Una matriz que varíe el nivel de la señal primaria contra la señal secundaria puede ser útil para optimizar el fondo, mejorar la señal de analito y reducir los requisitos de consumo para reactivos de anticuerpos de alto costo. La cromatografía de inmunoafinidad contra un antígeno altamente purificado se puede usar para reducir el nivel de interferencia no específico para todos los reactivos inmunológicos usados en la inmunotransferencia. El desarrollador del método debe tener cuidado de que no se pierdan la selectividad, la especificidad ni la afinidad del anticuerpo primario durante la purificación por afinidad debido a los anticuerpos de alta afinidad que permanecen en la columna de antígeno o debido a la destrucción de enlaces de anticuerpos ocasionada por las condiciones de elución. Para el anticuerpo secundario, se encuentran disponibles comercialmente anticuerpos contra especies purificados por inmunoafinidad con una variedad de marcadores posibles conjugados con el anticuerpo.
Incubación del Sustrato y Adquisición de Datos Los analistas pueden optimizar el tiempo de desarrollo del sustrato por efecto de la enzima a fin de minimizar el fondo y mejorar el límite de detección y el límite de cuantificación. Los tiempos de desarrollo del sustrato excesivos para sustratos que precipitan pueden resultar en la intensificación del nivel de fondo con respecto a la señal específica proveniente del analito deseado. Si la incubación con el sustrato se realiza con agitación se podrían formar patrones no deseados del producto a partir de los sustratos precipitados. Un tiempo de incubación demasiado corto resulta en una señal menos específica; por el contrario, demasiado tiempo puede resultar en un fondo alto y una resolución deficiente. La mayoría de los anticuerpos conjugados con enzimas se caracterizan por un tiempo de desarrollo óptimo. Los marcadores fluorescentes y quimioluminiscentes tienen la ventaja de la adquisición de los resultados mediante instrumentos de barrido que pueden almacenar datos electrónicamente y, posiblemente, adquirir una imagen generada por la sumatoria de las señales. Los marcadores fluorescentes tienen las ventajas adicionales de que la señal se mantiene estable con el tiempo, de que se pueden realizar numerosos experimentos durante el desarrollo de la valoración con una sola transferencia y de que la optimización de la adquisición de la señal se puede realizar en una sola transferencia.
PROCEDIMIENTOS Transferencias en Ranuras/en Puntos Mediante un aparato de transferencia en ranuras/en puntos apropiado, los analistas pueden hacer que los antígenos de interés se adhieran a una membrana adecuada (p.ej., nitrocelulosa) mediante filtración por gravedad o vacío, seguida de la adición e incubación de anticuerpos para antígenos específicos que se unen con epítopes de los antígenos. Los sitios de unión que permanecen libres en la membrana se bloquean mediante la adición de antígeno no específico (p.ej., BSA), seguida por la adición de anticuerpos para antígenos específicos con un sistema de detección [p.ej., la proteína A/G conjugada con peroxidasa de rábano se une a los anticuerpos y estos complejos posteriormente se visualizan usando un sustrato de peroxidasa de 4-cloro-naftol (4-CN)]. La identificación positiva se interpreta como el desarrollo de puntos o bandas en la membrana. Un resultado negativo se produce cuando la membrana se mantiene de color blanco o presenta bandas apenas perceptibles que son considerablemente más claras que las bandas positivas.
lnmunotransferencia Unidimensional PREPARACIÓN DE GELES SDS-PAGE Los analistas deben seleccionar un gel SDS-PAGE con un contenido de acrilamida-bisacrilamida adecuado para los pesos moleculares de las proteínas de interés; es decir, cuanto menor sea el peso molecular de la proteína, mayor será el porcentaje de mono o bisacrilamida, y por el contrario, cuanto más grande sea el peso molecular de la proteína, menor será el porcentaje de mono o bisacrilamida. Los geles con concentración uniforme tienen intervalos de separación como los presentados en la Tabla 2, mientras que los geles de gradientes tienen intervalos de separación como los presentados en la Tabla 3. Los geles pueden comprarse listos para usar o se pueden producir en el laboratorio de acuerdo con los procedimientos establecidos en el capítulo (1056). Tabla 2. Intervalo Lineal de Separación (kDa) para Geles con Concentración Uniforme Concentración de Acrilamida (%)
Intervalo Lineal de Separación (kDa)
5
57-212
7,5
36-94
1376 (1104) Métodos de Pruebas Inmunológicas/ Información General
USP 39
Tabla 2. Intervalo Lineal de Separación (kDa) para Geles con Concentración Uniforme (Continuación) Concentración de Acrilamlda (%)
Intervalo Lineal de Separación (kDa)
10 12 15
20-80 12-60 10-43
Tabla 3. Intervalo Lineal de Separación (kDa) para Geles de Gradientes Acrilamlda (%)
Intervalo de Proteína (kDa)
5-15 5-20 10---20 8-20
20-250 10-200 10-150 8-150
MUESTRAS Y ESTÁNDAR Para preparar muestras, los analistas por lo general deben lisar células y tejidos para liberar las proteínas de interés. El principal aspecto a considerar durante la selección de una solución amortiguadora de lisis es si el anticuerpo seleccionado para la detección de las proteínas de interés puede reconocer muestras desnaturalizadas. Cuando este no es el caso, los analistas emplean soluciones amortiguadoras sin detergente o con detergente relativamente suave como el detergente no iónico. Las muestras deben tratarse (p.ej., reducirse, no reducirse o desnaturalizarse) de acuerdo con el capítulo general (1056), y cuando se use una muestra con un contenido desconocido de proteína, se debe cargar una serie de diluciones en el gel. Los estándares (marcadores de peso molecular) deben tratarse de acuerdo con las instrucciones del fabricante. ELECTROFORESIS Antes de aplicar las muestras a los pocillos del gel concentrador de acuerdo con el capítulo (1056), los analistas desnaturalizan las muestras (p.ej., calentar a 95º-l 00º durante 5 minutos). Se carga un volumen adecuado de muestra en el gel y se aplica un voltaje de 8 V/cm hasta que el colorante se haya incorporado al gel de resolución. Después, se incrementa el voltaje a 15 V/cm y se corre la separación hasta que el azul de bromofenol alcance el final del gel. Si se usa un gel disponible comercialmente, se siguen las recomendaciones del fabricante. La Tabla 4 presenta volúmenes comunes de carga de la muestra para diversos geles. Tabla 4. Volúmenes Comunes de Carga de la Muestra Espesor del Gel (mm)
Volumen Máximo de Carga de la Muestra
Pocillos
10 10 12 15 15
1,0 1,5 1,0 1,0 1,5
25 37 20 15 25
(µL)
TRANSFERENCIA Después de la electroforesis, las proteínas de interés pueden transferirse a una membrana de nitrocelulosa o PVDF con un tamaño de poro que sea apropiado para el peso molecular de las proteínas de interés. La nitrocelulosa y el PVDF poseen una capacidad de unión proteica de aproximadamente 100-200 µg/cm2. EL PVDF es químicamente más resistente que la nitrocelulosa y es más fácil de manejar. Se pueden encontrar instrucciones detalladas para el proceso de transferencia en los sitios Web de los fabricantes de aparatos de transferencia, las cuales varían dependiendo del sistema. La transferencia se puede llevar a cabo en condiciones húmedas o semisecas. La transferencia semiseca por lo general es más rápida, aunque la transferencia húmeda se recomienda especialmente para proteínas grandes de pesos moleculares de más de 100 kDa. En ambas transferencias, la membrana se coloca junto al gel entre materiales absorbentes; luego, el sándwich se fija con abrazaderas entre soportes sólidos para mantener el contacto ajustado entre el gel y la membrana. Una solución amortiguadora estándar para transferencia es la misma que la solución amortiguadora usada para la migración o corrida sin SOS, pero se le agrega metanol hasta una concentración final de 20%. Para proteínas con un tamaño mayor de 80 kDa, el SOS debe incluirse a una concentración final de O, 1%. La disminución de la cantidad de metanol en la solución amortiguadora de transferencia también promueve la dilatación del gel, lo cual permite que las proteínas grandes se transfieran con mayor facilidad. La Tabla 5 contiene soluciones amortiguadoras comunes usadas para los métodos de Western blot.
Información General/ (1104) Métodos de Pruebas Inmunológicas 1377
USP 39
Tabla 5. Formulaciones Amortiguadoras Comunes para Western Blot Contenido
Solución Amortiguadora
Solución amortiguadora de muestra 2x (no reductora) para electroforesis unidimensional
Solución amortiguadora de muestra 2x (reductora) para electroforesis unidimensional
1,89 g de Tris 5,0 g de SDS 50 mg de azul de bromofenol 25,0 ml de glicerol 100 ml de agua Ajustar con HCI a un pH de 6,8. Agregar agua hasta 125 ml. A una solución amortiguadora de muestra no reductora: Agregar 12,5 ml de 2-mercaptoetanol antes de ajustar el pH. Alternativamente, usar 1,93 g de Tris y agregar una cantidad adecuada de DTIª para obtener una concentración final de DTI 100 mM.
Solución amortiguadora de corrida 1Ox para electroforesis unidimensional
151,4 g de Tris 721,0 g de glicina 50,0 g de SDS Agregar agua hasta 5000 ml. Ajustar a un pH de 8, 1-8,8.
Solución amortiguadora de transferencia 1Ox
151,4 g de Tris 721,0 g de glicina Agregar agua hasta 5000 ml. Ajustar a un pH de 8, 1-8,8.
Solución amortiguadora de transferencia 1 x
100 ml de madre 1Ox 500 ml de agua 200 ml de metanol Agregar agua hasta 1000 ml.
TBS lOx
24,23 g de Tris base 80,06 g de NaCI Mezclar en 800 ml de agua ultrapura. Ajustar con HCI puro a un pH de 7,6. Agregar agua hasta 1000 ml.
TBS-T
100 ml de TBS 1Ox 900 ml de agua 1 ml de polisorbato 20
Solución madre de urea 8,5 M
510 g de urea Agregar agua hasta 1000 ml.
Solución amortiguadora de muestra para electroforesis bidimensional
47 ml de Solución madre de urea 8,5 M 385 mg de tributil fosfina (TBP) 2 g de CHAPSb 25 mg de azul de bromofenol 1% de amfolitos portadores preferidos
ª Ditiotreitol. b 3-[(3-Colamidopropil)dimetilamonio]-1-propanosulfonato.
El metanol es necesario sólo si los analistas emplean nitrocelulosa. Si los analistan usan PVDF, pueden eliminar el metanol de la solución amortiguadora de transferencia y sólo necesitan activar el PVDF antes de armar el sándwich del gel y la membrana. En la transferencia semiseca, un sándwich de papel/gel/membrana/papel humedecido en solución amortiguadora de transferencia se coloca directamente entre el cátodo y el ánodo. Durante la transferencia húmeda, la membrana debe ser el componente más cercano al electrodo positivo, mientras que el gel deberá ser el más cercano al electrodo negativo. La composición de la solución amortiguadora de transferencia no es necesariamente la misma que la de la solución amortiguadora de migración o transferencia. Los analistas deben consultar el protocolo del fabricante del aparato, además se debe notar que es común agregar SDS y metanol. Las cantidades de SDS y metanol en la solución amortiguadora de transferencia, los pesos moleculares de las proteínas y el porcentaje de poliacrelamida del gel pueden afectar la eficiencia de las transferencias semisecas y húmedas. BLOQUEO El bloqueo de la membrana previene la unión no específica de los anticuerpos primarios y secundarios con la membrana. Por lo regular, se usa una de las dos siguientes soluciones de bloqueo: leche desgrasada o BSA (fracción V de Cohn). La leche es más barata pero no se recomienda para el estudio de fosfoproteínas. Para preparar una solución de leche o BSA al 5%, pesar 5 g de leche o BSA, y seguidamente disolver con solución salina amortiguada con Tris que contenga polisorbato 20 (TBS-T; ver la Tabla 5) para obtener un volumen de 100 ml. Mezclar bien y filtrar. Si se omite la filtración puede resultar en la aparición de diminutos puntos oscuros contaminarán la transferencia durante el desarrollo. Incubar a 4º durante 1 hora agitando suavemente. Enjuagar en TBS-T después de la incubación.
1 378 (1104) Métodos de Pruebas Inmunológicas/ Información General
USP 39
ANTICUERPO PRIMARIO Y SOLUCIÓN AMORTIGUADORA DE INCUBACIÓN Diluir el anticuerpo con solución amortiguadora de bloqueo a una dilución apropiada (1:100-1 :3000, dependiendo del título del anticuerpo) y optimizar la dilución de acuerdo con los resultados. Demasiado anticuerpo puede generar bandas no específicas. TIEMPO DE INCUBACIÓN El tiempo de incubación puede variar entre unas pocas horas y toda la noche, y depende de la afinidad de enlace del anticuerpo con la proteína y de la abundancia de la proteína. Un anticuerpo más diluido con un tiempo de incubación prolongado puede mejorar el enlace específico. TEMPERATURA DE INCUBACIÓN La mejor práctica consiste en incubar a temperaturas frías. Cuando los analistas incuban en solución amortiguadora de bloqueo durante toda la noche, deben incubar a 4º para prevenir la contaminación por crecimiento bacteriano y deben agitar suavemente la solución de anticuerpo para permitir una cobertura homogénea y adecuada de la membrana. ANTICUERPO SECUNDARIO Y SOLUCIÓN AMORTIGUADORA DE INCUBACIÓN El anticuerpo secundario y la solución amortiguadora de incubación se tratan según se indica a continuación. Lavar la membrana varias veces en TBS-T mientras se agita para eliminar el anticuerpo primario residual. Diluir el anticuerpo secundario con TBS-T a la dilución sugerida. Demasiado anticuerpo secundario puede resultar en bandas no específicas. Incubar la membrana a temperatura ambiente durante 1-2 horas agitando suavemente. La Tabla 7 presenta múltiples opciones para reactivos y métodos de detección secundarios. La sección Análisis de Datos de lnmunotransferencia siguiente provee más detalles al respecto.
Transferencia en Ranuras/en Puntos El procedimiento es similar al procedimiento para inmunotransferencia unidimensional, pero difiere en que las muestras de proteína no se separan electroforéticamente sino que se siembran directamente en la membrana de forma manual o usando una unidad de transferencia (para formato en puntos o en ranuras). PROCEDIMIENTO USANDO LA SIEMBRA MANUAL Llevar a cabo la siembra manual según se indica a continuación. Colocar un papel de filtro seco sobre una pila de toallas de papel secas. Colocar papel de filtro prehumedecido con solución amortiguadora de transferencia en la parte superior del papel de filtro seco. Colocar una membrana prehumedecida en la parte superior del papel de filtro prehumedecido. Las muestras se siembran en la membrana prehumedecida y se dejan absorber en la membrana. Una vez que la muestra ha sido absorbida, colocar la membrana sobre un papel de filtro seco y limpio para secar. PROCEDIMIENTO USANDO UNA UNIDAD DE TRANSFERENCIA POR VACÍO Por lo general, los analistas emplean una unidad de transferencia por vacío de la siguiente manera. Preparar una membrana y colocarla en la unidad de transferencia de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Aplicar vacío a la unidad de transferencia para eliminar el exceso de solución amortiguadora. Para mejorar la solubilidad, disolver la muestra en una solución amortiguadora y, si no queda transparente, retirar los precipitados mediante centrifugación. Si la muestra es demasiado viscosa para pipetearla, entonces diluirla más con solución amortiguadora. Con el vacío apagado, pipetear las muestras y transferirlas a los pocillos, y aplicar vacío a la unidad de transferencia. Después de que todas las muestras se hayan filtrado a través de la membrana, apagar el vacío, agregar solución amortiguadora a cada pocillo para lavar las paredes y aplicar vacío nuevamente. Retirar la membrana y proceder con la inmunotransferencia.
lnmunotransferencia Bidimensional PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS Los compuestos usados para solubilizar las proteínas no deben incrementar la concentración iónica de la solución. Por ejemplo, una solución de solubilización de muestra común es la siguiente: Urea 8 M, ditiotreitol (DTI) 50 mM ó tributil fosfina (TBP) 2 mM, 4% de 3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-1-propanosulfonato (CHAPS), 0,2% de anfolitos portadores y 0,0002% de azul de bromofenol. La adición de anfolitos portadores mejora la solubilidad de las proteínas conforme se acercan
USP 39
Información General/ (1104) Métodos de Pruebas Inmunológicas 1 379
a sus puntos isoeléctricos. El uso de anfolitos produce una conductividad uniforme aproximada a través del gradiente de pH sin afectar su forma, lo que significa que debe optimizarse la concentración de anfolitos portadores. SEPARACIÓN POR CARGA Diversos proveedores producen y venden tiras de gradientes de pH inmovilizados (IPG, por sus siglas en inglés) o se pueden producir internamente de acuerdo con el capítulo (1054). La selección de las tiras de gradientes de pH inmovilizados depende del punto isoeléctrico de las proteínas de interés. El tamaño de las tiras de gradientes de pH inmovilizados debe corresponder al tamaño del gel de la segunda dimensión. Se debe determinar la cantidad de proteína en cada muestra y las cantidades aplicadas a las tiras de gradientes de pH inmovilizados deben estar dentro del intervalo de 10-300 µg, dependiendo del tamaño de las tiras de gradientes de pH inmovilizados. La muestra y el estándar deben sembrarse de acuerdo con las instrucciones del fabricante o de acuerdo con el capítulo (1054). Después, los analistas proceden con el isoelectroenfoque aplicando los parámetros eléctricos descritos en el capítulo (1054) o por el fabricante. SEPARACIÓN POR PESO MOLECULAR Después de la separación por carga, los analistas deben equilibrar la tira en solución amortiguadora que contenga dodecil sulfato de sodio antes de la separación en la segunda dimensión para determinar el peso molecular (según se indica previamente en la sección lnmunotransferencia Unidimensional). Los analistas deben colocar la tira directamente sobre la parte superior del gel, luego asegurar la tira recubriéndola con agarosa al 0,5%-1,0% preparada en solución amortiguadora de corrida para SDS-PAGE. Para rastrear el frente de la corrida en la segunda dimensión, los analistas pueden agregar azul de bromofenol a la agarosa.
ANÁLISIS DE DATOS DE INMUNOTRANSFERENCIA La presencia o ausencia de bandas a menudo se determina mediante comparación con un control (antígenos altamente caracterizados conocidos o calificados para proveer una respuesta precisa o esperada) de un tipo similar al del antígeno que se está procesando. Aunque los analistas a menudo llevan a cabo una comparación cualitativa, resulta posible cuantificar bandas o puntos usando un sistema de detección (p.ej., después de incubar en una solución que contenga sustrato de peroxidasa 4-CN; ver también la Tabla 1) y se comparan con las bandas de control que se corren en paralelo (p.ej., en el mismo gel).
Opciones de Detección QUIMIOLUMINISCENCIA MEJORADA La quimioluminiscencia mejorada es un método popular para la detección en análisis de inmunotransferencia debido a que es altamente sensible (detección al nivel de pg o menores) y se puede usar para cuantificar la concentración relativa de la proteína de interés. El método depende de la incubación de la membrana con un sustrato que emana luminiscencia cuando se degrada por la acción de la enzima conjugada con el anticuerpo secundario. La luz se detecta usando película fotográfica o una cámara con dispositivo de acoplamiento de carga (CCD, por sus siglas en inglés). Posteriormente, la imagen se analiza mediante densitometría para evaluar la intensidad relativa de la señal de las bandas de proteínas en términos de densidad óptica. Usando un conjunto apropiado de estándares de peso molecular como marcadores, los analistas pueden estimar el peso molecular de los analitos. DETECCIÓN DE FLUORESCENCIA La fluorescencia directa se puede usar para detectar proteínas transferidas a membranas. La fluorescencia directa es simple, rápida, sensible y tiene un intervalo lineal mayor que la detección por quimioluminiscencia mejorada. La ventaja de la fluorescencia directa es la capacidad para detectar una gran cantidad de señales fluorescentes distintas. Este análisis evita la necesidad de reanalizar la transferencia. En comparación con la quimioluminiscencia mejorada, los métodos de fluorescencia son más fáciles de visualizar y cuantificar en sistemas de generación de imágenes con dispositivos de acoplamiento de carga o sistemas de escaneo de imágenes con láser. Algunos sistemas de adquisición de datos permiten extender el tiempo de adquisición de datos para optimizar los niveles de señal-ruido. Las transferencias marcadas por fluorescencia que se pueden reanalizar son útiles para este propósito. La quimiofluorescencia mejorada (ECF, por sus siglas en inglés) es otro método común de fluorescencia. La quimiofluorescencia mejorada usa anticuerpos secundarios conjugados con HRP o AP. Las enzimas conjugadas con los anticuerpos catalizan las reacciones que producen productos fluorescentes a partir de los sustratos no fluorescentes. Los analistas visualizan las señales resultantes usando epiiluminación UV y capturan imágenes digitales. Una señal de quimiofluorescencia mejorada tiene un intervalo lineal mayor que la quimioluminiscencia mejorada tradicional. Por ejemplo, la fluorescencia directa tiene un límite de detección en el intervalo de pg, además de que tiene aproximadamente 2 logaritmos de intervalo dinámico lineal.
1380 (1104) Métodos de Pruebas Inmunológicas/ Información General
USP 39
Los anticuerpos conjugados con puntos cuánticos son una alternativa para detectar proteínas en análisis de inmunotransferencia. Los puntos cuánticos son nanopartículas fluorescentes, las señales fluorescentes que emiten dependen de su tamaño y éstas pueden ser fácilmente diferenciadas. Esto permite el uso simultáneo o secuencial de anticuerpos conjugados con puntos cuánticos de diferente tamaño para determinar la presencia de varias proteínas, sin la necesidad de eliminar anticuerpos unidos a las diferentes bandas de proteínas en las transferencias. De manera similar, el anticuerpo ligado con fluoróforo que emite en el infrarrojo cercano (NIR, por sus siglas en inglés) es una herramienta de detección de analitos, en este caso, la luz producida por la excitación del fluoróforo se mide en un estado estático. La luz medida en un estado estático permite una detección más precisa y exacta que la luz medida en un estado dinámico (p.ej., quimioluminiscencia). DETECCIÓN RADIOACTIVA Las proteínas también pueden detectarse mediante la marcación de un antígeno con un isótopo radioactivo (p.ej., yodo). Por otra parte, este método tiene la ventaja de que la radiactividad en una banda es fácil de cuantificar mediante el tiempo de exposición a la película y densitometría, o escindiendo la banda directamente de la membrana realizando un conteo usando un contador de centelleo. Por otra parte, la radiactividad también introduce la desventaja de la seguridad puesto que los analistas deben manejar materiales radioactivos, mientras que los laboratorios deben contar con un programa para controlar y monitorear el manejo de los desechos y la exposición del personal.
Cuantificación por lnmunotransferencia CUANTIFICACIÓN SIN SEPARACIÓN ELECTROFORÉTICA La cuantificación de una proteína específica se logra cuando el procedimiento de transferencia se optimiza adecuadamente y genera un intervalo de respuesta lineal durante un marco de tiempo particular. La cuantificación por inmunotransferencia incluye diversos elementos: concentraciones y pureza adecuadas de antígeno y anticuerpo, especificidad del anticuerpo, condiciones del bloqueo, suficientes lavados y la duración e intensidad de las señales. Una vez que las exposiciones se capturan en una película o de manera electrónica en condiciones optimizadas, los analistas emplean métodos densitométricos para cuantificar los resultados comparando con una proteína específica sobre la membrana y sobre el estándar. Los analistas pueden corregir los resultados por el fondo mediante la inclusión de un control negativo. La intensidad de las bandas depende de la cantidad de proteína. Se encuentran disponibles diversos paquetes informáticos para el análisis de imágenes de bandas en una película. Alternativamente, los sistemas digitales de generación de imágenes que contienen cámaras con dispositivos de acoplamiento de carga por lo regular incluyen software diseñado para realizar análisis de datos. CUANTIFICACIÓN ELECTROFORÉTICA Las proteínas de diversos pesos moleculares se identifican mediante extrapolación de gráficas de las movilidades relativas de proteínas preteñidas con pesos moleculares conocidos y se pueden comparar con el control positivo. Los controles positivos tienden a determinar el intervalo del límite de los resultados de la densitometría en comparación con los resultados de las concentraciones nominales. Independientemente del método de detección, se deben cumplir los siguientes criterios para obtener resultado válido de Western blot. •Asegurar el desarrollo adecuado minimizando la sobreexposición de la membrana y visualizando los controles de tinción. • Los marcadores de peso molecular previamente teñidos deben ser visibles y deben cubrir el intervalo previsto. • Las bandas deben tener la ubicación e intensidad apropiadas para el estándar, el control y la proteína de interés. • No deben haber artefactos de la transferencia o de la tinción que obstruyan la visualización e interpretación de las bandas.
VALIDACIÓN DEL MÉTODO Conforme a lo establecido en la Pauta Q2(Rl) Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology (en vigencia desde noviembre de 2005) de la ICH y en el capítulo general de la USP Validación de Procedimientos Analíticos (1225), una validación cualitativa tal como la transferencia en ranuras/en puntos requiere la validación de la especificidad. La especificidad es la capacidad de detectar el analito en presencia de otros componentes. Para la validación, se debe demostrar que las etapas particulares del método de transferencia en ranuras/en puntos pueden detectar el antígeno cuando éste está presente y no informar resultados falsos positivos cuando el antígeno está ausente. Además, demostrar la especificidad de los anticuerpos para antígenos específicos es parte de la evaluación de especificidad. El capítulo general de la USP (1225) provee pautas para la validación de procedimientos analíticos y los analistas deben considerar este recurso al evaluar métodos de inmunotransferencia. Todos los métodos requieren una demostración de la especificidad del anticuerpo para el antígeno y la falta de reconocimiento de otras proteínas y reactivos en la matriz. Las pruebas de identidad sólo requieren especificidad. Las pruebas de límite requieren especificidad y limites de detección. La incorporación de un control de sensibilidad en cada prueba puede demostrar el cumplimiento con el límite de cuantificación en cada una de
USP 39
Información General/ (1105) Métodos de Pruebas Inmunológicas 1381
las determinaciones para explicar potenciales cambios en la sensibilidad del método. Una prueba cuantitativa requiere todos los parámetros de validación de la ICH, incluyendo la prueba de robustez. La demostración de especificidad en la inmunotransferencia con separación electroforética debe incluir lo siguiente: geles teñidos para demostrar la separación de las proteínas, transferencias teñidas para demostrar una transferencia adecuada de las proteínas a la membrana, transferencias con muestras de control para demostrar la especificidad del conjugado por el anticuerpo primario, así como transferencias que muestren la unión del anticuerpo al antígeno apropiado. La validación del método también puede identificar la necesidad de membranas de control para cada valoración, así como controles de sensibilidad de las proteínas como mediciones de la aptitud del sistema.
" " (1105) METODOS DE PRUEBAS INMUNOLOGICAS-RESONANCIA DE PLASMÓN SUPERFICIAL Introducción La detección óptica mediante resonancia de plasmón superficial (RPS) es un método que no depende del marcado previo de las moléculas para estudiar interacciones biomoleculares. Los biosensores para RPS disponibles comercialmente pueden recolectar datos en tiempo real y vasta información proveniente de los enlaces entre las moléculas. Dichos datos se pueden usar en una amplia variedad de aplicaciones, desde la investigación básica para el descubrimiento y desarrollo de un fármaco hasta su fabricación y control de calidad (CC). La RPS puede caracterizar eventos de enlace con muestras que varían desde proteínas, ácidos nucleicos y pequeñas moléculas hasta mezclas complejas, vesículas lipídicas, virus, bacterias y células eucariotas. Los atributos de calidad y seguridad típicos tratados con el análisis de RPS incluyen: • Especificidad de la interacción • Afinidad de la interacción • Parámetros cinéticos del enlace • Parámetros termodinámicos • Concentración biológicamente activa de un analito Este capítulo ofrece una visión general sobre los aspectos físicos subyacentes a la RPS y sus configuraciones instrumentales comunes, así como la variedad de moléculas que se pueden estudiar y las consideraciones generales para el diseño experimental, conforme lo determine el objetivo de la valoración.
Consideraciones Generales Historia Los principios físicos de la RPS se explicaron por primera vez en los inicios del siglo XX, comenzando con una descripción de la distribución poco uniforme de la luz en un espectro de red de difracción ocasionado por la excitación de las ondas de plasmones superficiales. Una serie de experimentos fundamentales mostraron la excitación óptica de los plasmones superficiales en condiciones de reflección interna total y promovieron estudios detallados de la aplicación de la RPS para detección química y biológica. Desde entonces, se reconoce el potencial de la RPS para caracterizar películas delgadas y monitorear interacciones en interfases metálicas y además, la investigación y el desarrollo tecnológico significativos han dado lugar a instrumentos que pueden evaluar cuantitativamente las interacciones de enlace de moléculas grandes y pequeñas. Consideraciones físicas La RPS es un fenómeno óptico que se presenta cuando una delgada película conductora se coloca entre dos medios con diferentes índices de refracción. En muchos instrumentos disponibles comercialmente, los dos medios son vidrio y la solución muestra, mientras que la película conductora es, de preferencia, una capa de oro aplicada al vidrio, aunque se han empleado otros metales conductores como la plata. El componente de vidrio-metal comprende un soporte sólido que a menudo se le conoce como sensor. La luz aplicada al vidrio en condiciones de reflexión interna total produce un componente electromagnético denominado onda evanescente. La onda evanescente penetra el medio con menor índice de refracción {por lo general, la solución muestra) sin perder energía neta. La amplitud de la onda evanescente se deteriora exponencialmente con la distancia desde la superficie, apenas la mitad de la longitud de onda de la luz incidente (p.ej., para una fuente de luz de 760 nm, la onda evanescente penetra aproximadamente 300 nm). Para una combinación específica de longitud de onda y ángulo de luz incidente, las ondas de la densidad de carga de electrones, que reciben el nombre de plasmones, se excitan en la película de oro. A medida que la energía se absorbe a través de la onda evanescente, se observa una reducción en la intensidad de la luz reflejada a un ángulo específico (el ángulo de RPS). Los analistas pueden realizar un experimento de RPS fijando la longitud de onda y variando el ángulo de luz incidente. Un incremento en la masa en la superficie del sensor ocasionada por una interacción de enlace entre dos o más moléculas ocasiona un cambio en el índice de refracción local {IR) que da origen a una respuesta de RPS, la cual se observa como una desviación en el ángulo de RPS. Un analista puede generar un sensorgrama (Figura 1) mediante el monitoreo de la desviación en el ángulo de RPS como una función de tiempo. El cambio en el índice de refracción es muy similar para
1 382 (1105) Métodos de Pruebas Inmunológicas / Información General
USP 39
diversas proteínas, por lo que la medición de RPS depende principalmente del cambio de la masa en la superficie del sensor y es relativamente independiente de la naturaleza de las moléculas que se están midiendo. Equilibrio Disociación
~Q) :Ji-----~
~ Línea base
Q)
e:: Regeneración Tiempo
Figura 1. Sensorgrama representativo. Instrumental
Los componentes principales de los instrumentos para RPS disponibles comercialmente son (1) una fuente de luz, generalmente un diodo emisor de luz de alta eficiencia, (2) un detector óptico, como un arreglo de diodos o una cámara con dispositivo de acoplamiento de carga, (3) un soporte sólido que contenga la película conductora y algún medio para inmovilizar moléculas en la película conductora, (4) un sistema de administración de muestra, a menudo con un dispositivo para microfluidos capaz de administrar muestras usando inyecciones en serie o paralelas mediante una o varias agujas y (5) una computadora con software apropiado para control de instrumental, recolección de datos y análisis. Los sistemas de instrumentos basados en prisma y en red qe difracción están disponibles comercialmente. La mayoría de los sistemas basados en prismas siguen la configuración de Kretschmann (Figura 2). La luz se enfoca sobre la superficie del sensor (lejos de las muestras) mediante un prisma con un índice de refracción igual al de la superficie. En esta configuración, la luz incidente no penetra la solución muestra, lo que permite obtener mediciones de RPS para muestras heterogéneas, turbias u opacas. Para sistemas que emplean una red de difracción (Figura 3) la solución del analito se coloca sobre una superficie de plástico en la que se ha depositado un metal. El plástico actúa como un prisma de reflexión interna total atenuada en el que la luz reflejada de la red se refleja de nuevo una gran cantidad de veces hacia la superficie de la red. En esta configuración, la luz pasa a través de la solución muestra de analito y, por consiguiente, las muestras turbias u opacas no son adecuadas para su medición. La red de difracción permite el muestreo de un área superficial mayor y es aplicable para las mediciones de matrices mediante RPS.
Medio de analito
Capa metálica
==~====::::::::~=====;:==~
Figura 2. Configuración Kretschmann para RPS.
Medio de analito
Capa metálica
rne1-~ Luz polarizada
Luz reflejada
Figura 3. Configuración de red de difracción para RPS. Los instrumentos son compatibles con una amplia variedad de muestras y amortiguadores biológicos, así como algunos disolventes orgánicos.
USP 39
Información General/ (1105) Métodos de Pruebas Inmunológicas 1383
Interacciones Biomoleculares que se Pueden Estudiar Mediante Valoraciones con RPS
Es posible estudiar una diversidad de entidades biológicas usando RPS, entre las que se incluyen moléculas pequeñas (<100 Da), proteínas, ácido nucleicos, lípidos, bacterias, virus y células enteras. La mayor parte de las investigaciones de RPS publicadas implican interacciones entre proteínas, de las cuales las interacciones anticuerpo-antígeno representan un subconjunto dominante. Las mejoras en la sensibilidad del instrumental y en los protocolos experimentales han ayudado a los analistas a estudiar pequeñas moléculas, lípidos y ácido nucleicos. Las interacciones de proteínas con entidades más grandes tales como células enteras y algunas bacterias y virus están limitadas por el decaimiento exponencial de la onda evanescente, según se describió con anterioridad. En la práctica, estas moléculas grandes se pueden estudiar de manera efectiva, pero la información que se obtiene puede estar limitada a datos cualitativos o semicuantitativos (p.ej., clasificación relativa). Tipos de Valoraciones
Diversos tipos de valoraciones mediante RPS son de utilidad, incluyendo la especificidad del enlace, el análisis de concentración, el análisis de cinética y afinidad y la termodinámica. Cada tipo de valoración genera información única que es útil para generar perfiles de biomoléculas. La RPS también es adecuada para su uso en estudios cualitativos para confirmar la especificidad de las interacciones. El analista puede monitorear un número de eventos de enlace secuenciales debido a que cada evento individual produce un aumento de masa en la superficie del sensor, y se monitorean todas las etapas del proceso de enlace. Los ejemplos incluyen mapeo de epítopos, isotipificación de anticuerpos y mediciones de inmunogenicidad. La mayoría de los métodos químicos y espectroscópicos usados para cuantificar proteínas (1) miden el contenido total proteico, (2) no distinguen entre moléculas activas e inactivas y (3) no se pueden usar para determinar la concentración de una proteína de interés en muestras no purificadas. Debido a que la RPS es un método no invasivo (la luz no penetra la muestra), puede medir cantidades pequeñas de moléculas de analitos a partir de matrices complejas tales como productos alimenticios, suero o plasma y extractos celulares. Asimismo, son posibles los formatos directos o indirectos (inhibición o competitivos) para medir la concentración. Los biosensores para RPS se ajustan de manera única para la medición de constantes de velocidad de asociación y disociación cinética a partir de la medición en tiempo real de interacciones de enlace. La afinidad se puede derivar de interacciones que hayan alcanzado el equilibrio o del cociente entre las constantes de velocidad de disociación y asociación. El intervalo de trabajo típico para mediciones de afinidad es desde pM hasta concentraciones µM altas. Las constantes de velocidad de asociación que se pueden medir por lo general varían de 103 a 10 7 M-1 s-1, mientras que las constantes de velocidad de disociación van de 10-5 a 0,5 s- 1 • Mediante el estudio de la dependencia de las constantes de velocidad y afinidad con la temperatura, los analistas pueden determinar parámetros termodinámicos para una interacción de enlace. No sólo es posible determinar los valores de equilibrio para cambios en la entalpía (.dH) y la entropía (t15) relacionados con la formación de complejo, sino que se pueden evaluar también las cuestiones energéticas de los estados de transición. Las secciones subsiguientes de este capítulo tratan detalles específicos para estos diferentes tipos de valoraciones. Valoración mediante RPS
La valoración mediante RPS típica implica cinco etapas: 1. Preparación de la muestra y del amortiguador 2. Preparación de la superficie 3. Enlace de analitos 4. Regeneración de la superficie 5. Análisis e interpretación de datos La atención y el cuidado en el diseño experimental conlleva la obtención de datos y resultados de alta calidad. En las valoraciones mediante RPS, el transporte de masas es esencial para que las interacciones de enlace ocurran, cuando los experimentos se lleven a cabo en los instrumentos que utilizan sistemas de celdas de flujo de capa delgada. Las moléculas de analito se transfieren de la solución a granel a la superficie de enlace mediante transporte de masas. Cuando se presenta una limitación en el enlace como resultado de una rápida cinética de enlace combinada con una alta densidad superficial de la molécula que se asocia con el analito, la interacción de enlace se considera limitada por el transporte de masas. En este caso, la cinética de enlace y la formación de complejo se ven influenciadas por la disponibilidad de moléculas de analito. Las ventajas y desventajas del enlace limitado por el transporte de masas se analizan más adelante en los ejemplos de aplicación. Preparación de la Muestra y del Amortiguador Las muestras crudas y purificadas se pueden analizar en una variedad de matrices, incluyendo suero, plasma, sobrenadantes celulares y lisados. Puede ser necesario clarificar las muestras crudas que contienen partículas (p.ej., restos celulares o precipitados) a fin de ayudar a minimizar uniones no deseadas. Se recomienda el uso de centrifugación breve (30-60 s) en una centrífuga de mesa o de filtración usando filtros de bajo enlace proteico (0,22-1,0 µm). El intervalo de concentración para la evaluación depende del objetivo del experimento (enlace sí/no, concentración o análisis de cinética/afinidad), así como de la afinidad de enlace de las moléculas que interactúan. En general, las concentraciones de muestra en un orden de magnitud por debajo de la constante de disociación en equilibrio (K0 ), se pueden detectar mediante RPS, aunque la determinación de una concentración exacta se puede ver influenciada por el tamaño del analito (moléculas grandes vs. pequeñas), por la especificidad del enlace y por la actividad biológica general de las muestras.
1384 (11 05) Métodos de Pruebas Inmunológicas / Información General
USP 39
Se pueden emplear la mayoría de los amortiguadores biológicos, así. como diversos disolventes orgánicos en los experimentos de RPS. Con frecuencia, la adición de sales y detergentes a las soluciones amortiguadoras puede estabilizar las biomoléculas. Se debe usar componentes para amortiguadores con un grado de alta calidad (p.ej., de grado para biología molecular o mayor). Para simplificar los experimentos, los analistas deben agregar únicamente componentes que sean absolutamente necesarios para la actividad o función biológica. Es necesario filtrar y desgasificar los amortiguadores antes de su uso. Preparación de la Superficie La preparación de la superficie implica acoplar uno o más compañeros de enlace a un soporte sólido (superficie). Este proceso recibe con frecuencia el nombre de inmobilización y la superficie resultante con la biomolécula acoplada es el sensor para el experimento. La selección de compañeros de enlace, soporte sólido y método de inmobilización se ven influenciados por (1) la naturaleza y demandas de la aplicación u objetivo experimental; (2) la disponibilidad de superficies con propiedades diferentes (p.ej., densidad de carga, hidrofobicidad o hidrofilicidad); (3) las características y aprovisionamiento de la biomolécula que se usará para la inmovilización; y, lo más importante, que (4) se mantenga la actividad biológica y que existan sitios de enlace disponibles para los compañeros que interactúan. Dependiendo del objetivo experimental, también puede resultar deseable la adición homogénea o de orientación específica de biomoléculas. Las dos categorías principales de los métodos de inmovilización son (1) inmovilización directa, en la que la molécula se acopla de manera covalente a la superficie, y (2) inmovilización indirecta o de captura, que saca ventaja de etiquetas o grupos nativos en la proteína o biomolécula (Tabla 7). Tabla 1. Técnicas de Preparación de la Superficie Química
Método de Inmovilización
Biomoléculas
Comentarios
Amina
Directa
Proteínas y péptidos
Amino terminal, residuos de Lis
Tiol-nativo
Directa
Proteínas
Tiol-ag regado
Directa
Proteínas
y péptidos y péptidos
Grupos carboxilo derivatizados
Aldehído
Directa
Residuo de Cis nativo
Cis-diol requerido
Glicoproteínas
y proteínas
Captura de biotina
Indirecta
Péptidos, ácidos nucléicos biotinilados
Etiquetas de afinidad
Indirecta
Proteínas
Proteína A, Proteína G
Indirecta
Anticuerpos, moléculas marcadas con lgG
lgG dependiente de especies
Proteína A, Proteína G
Indirecta
Biomoléculas específicas al anticuerpo de captura
Los anticuerpos mono o policlonales pueden ser adecuados-se recomienda el análisis
Adsorción hidrófoba, captura de membrana
Indirecta
Lípidos, membranas, proteínas asociadas con membranas
Es posible el acoplamiento monocapa o bicapa
y péptidos
Captura irreversible y estable His, Glutationa 5-transferasa (GSD, etc.
Inmovilización Directa: Para la inmovilización directa, se encuentran disponibles diversos métodos químicos para acoplar proteínas u otras biomoléculas a la superficie. Las propiedades de la superficie determinan la secuencia específica de las etapas y la duración requerida para preparar la superficie. Muchas superficies disponibles comercialmente tienen una capa biológicamente compatible (p.ej., un hidrogel) que contiene grupos funcionales tales como carboxilo, que se pueden usar para la inmovilización. Para asegurar la especificidad del enlace, la pureza de la biomolécula que se acopla a la superficie debe ser del 95% o mayor y la concentración requerida debe ser de 1 a 1000 µg/ml. Los métodos químicos de inmovilización directa con frecuencia resultan en superficies heterogéneas debido a la orientación aleatoria de biomoléculas en la superficie. La inmovilización mediante grupos amino primarios libres tales como residuos de lisina en proteínas o el amino terminal de proteínas o péptidos es, generalmente, uno de los métodos químicos de mayor aplicación para acoplar las proteínas a una superficie mediante un enlace covalente. Los grupos carboxilo en la superficie se convierten en ésteres reactivos usando una mezcla de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) o sulfo-NHS (sNHS) La proteína o biomolécula se aplica en altas concentraciones (mg/mL) para maximizar la eficiencia del acoplamiento de aminas. Por último, los ésteres libres se bloquean con etanolamina. El tiempo de contacto con la superficie, la concentración proteica o la concentración de EDC/NHS se pueden variar para ajustarlos al nivel de inmovilización. Cuando el acoplamiento de aminas interfiere con el sitio de enlace, la biomolécula se puede acoplar usando métodos químicos de acoplamiento alternativos o una metodología de captura de alta afinidad. Por ejemplo, para biomoléculas con grupos tiol libres (a menudo residuos de cisteína), se introduce un grupo de disulfuro tratando la superficie con NHS y EDC para acoplar la 2-(2-piridinilditio)etanoamina (PDEA). Al agregar la biomolécula a la superficie se produce un intercambio tiol-disulfuro y el exceso de grupos PDEA se desactiva con cisteína-HCI. Si la biomolécula carece de un grupo tiol libre, se puede vincular un disulfuro reactivo (PDEA) a los grupos carboxilo. Los grupos piridildisulfuro se pueden acoplar de manera subsiguiente a grupos tiol en la superficie que han sido derivatizados mediante inyección de NHS y EDC, seguidos por cistamina, y luego la reducción con ditioeritritol (DTE) o ditiotreitol (DTT). El acoplamiento de grupos maleimida a la superficie hace posible una forma alternativa de inmovilización mediante grupos tiol en la que se forma un enlace tioéter estable. Las superficies que se preparan usando este método tienen la capacidad de soportar pH básico (> 9,5) y agentes reductores como jJ -mercaptoetanol y ditiotreitol. Se encuentran disponibles comer-
USP 39
Información General/ (1105) Métodos de Pruebas Inmunológicas 1 385
cialmente diversos reactivos heterobifuncionales para la introducción de grupos maleimido reactivos en la superficie, incluyendo sulfo-MBS (éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisulfosuccinimida), sulfo-SMCC (sulfosuccinimidil-4-(Nmaleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato), GMBS [éster de N-(y-maleimidobutiriloxi)sulfosuccinimida], EMCH [ácido N-(&-maleimidocaproico)-hidrazida] o BMPH [ácido N-{/J-maleimidopropionico)-hidrazida]. Para biomoléculas que contienen grupos aldehído nativos o cis-dioles, que se pueden convertir en aldehídos mediante oxidación moderada, el acoplamiento a la superficie mediante un enlace de hidrazona es una opción. Los grupos hidrazida en la superficie del sensor reaccionan con los grupos aldehído en la biomolécula para formar un enlace estable. La inmovilización mediante grupos aldehído es más útil para glicoconjugados, glicoproteínas y polisacáridos. Inmovilización Indirecta (Captura de Alta Afinidad): La metodología de inmovilización por captura indirecta o de alta afinidad utiliza etiquetas comúnmente empleadas para la purificación de proteínas. Esta técnica explota la captura de alta afinidad de la biomolécula mediante una molécula de captura que ha sido inmovilizada covalentemente usando una de las técnicas descritas anteriormente. El requisito de pureza biomolecular es menos estricto para la inmovilización indirecta que para la directa debido a que la etapa de captura para la biomolécula también puede proveer purificación. La inmovilización indirecta a menudo genera una superficie homogénea, debido a que todas las biomoléculas se orientan de manera similar a través de la etiqueta. La afinidad entre la biomolécula y su agente de captura debe ser lo suficientemente alta como para asegurar una mínima o nula disociación de la superficie durante el ciclo de análisis. Los anticuerpos monoclonales se usan con frecuencia como moléculas de captura. Por ejemplo, se pueden acoplar anticuerpos anti-GST a la superficie del chip del sensor mediante métodos químicos con amina para capturar las moléculas marcadas con GST. La Proteína A, la Proteína G y los anticuerpos anti-lgG son útiles para la captura de moléculas en conjunto con los anticuerpos. La interacción de alta afinidad entre estreptavidina o moléculas relacionadas y biotina (K0 "" 10-1 s M) hace de esta un sistema útil para la captura de moléculas biotiniladas (p.ej., proteínas, péptidos, ácidos nucleicos, membranas y liposomas). Con frecuencia, la proteína de enlace de biotina se acopla a la superficie usando grupos amino primarios. En vista de la alta afinidad de la interacción, las moléculas biotiniladas se consideran permanentemente inmovilizadas y, a diferencia de muchas otras metodologías de captura, estas moléculas no se pueden remover sin dañar la superficie. Las proteínas recombinantes marcadas con histidina (His) se pueden capturar mediante procedimientos químicos con níquel-NTA o con anticuerpos anti-His inmovilizados de manera covalente. Los lípidos y las proteínas asociadas con membranas se pueden capturar en la superficie como monocapa o bicapa de lípido. Los lípidos de micelas o liposomas se absorben en una superficie hidrófoba, creando una monocapa de lípido con las colas del lípido hidrófobo orientadas en dirección del soporte sólido y las cabezas hidrófilas en dirección de la muestra acuosa. Esta metodología proporciona un ambiente estable para proteínas asociadas con una superficie de membrana o parcialmente insertadas en la membrana, aunque no es ideal para proteínas transmembranales debido a que la superficie resultante presenta únicamente la mitad de la estructura de la membrana para interacciones de enlace. Las estructuras intactas de la membrana (bicapas lípidas) con proteínas asociadas o incorporadas se pueden capturar preparando liposomas con un componente antígeno específico o con lípidos biotinilados, lo que permite capturar los liposomas con anticuerpos inmovilizados o estreptavidina, respectivamente. Consideraciones adicionales: Una vez que la biomolécula ha sido acoplada al sensor usando una metodología de inmovilización directa o indirecta, el analista debe evaluar la estabilidad de la línea base de la superficie recién creada. La causa más probable de una reducción de la línea base (desplazamiento hacia abajo) es la presencia de biomoléculas no acopladas, lo cual posiblemente se debe a una autoasociación o agregación. Cuando la línea base presenta un aumento (desplazamiento hacia arriba), este cambio podría ser ocasionado por un replegamiento o reorientación. En cualquier caso, la superficie recientemente creada debe acondicionarse antes de su uso mediante uno o más de los siguientes procedimientos: (1) inyecciones múltiples de un amortiguador biológicamente compatible; (2) lavado de la superficie con un amortiguador a una velocidad de flujo rápida; (3) inyecciones múltiples de soluciones con alta concentración iónica (p.ej., NaCI 1 M) o detergentes (p.ej., CHAPS 20 mM o Polysorbato 20 al 0,05% (P20)); o (4) ciclos repetidos para enlace del analito e inyecciones de regeneración. NOTA: las recomendaciones (3) y (4) deben usarse únicamente si se ha evaluado previamente la actividad de la biomolécula ante la presencia de estos reactivos. Los desplazamientos grandes de la línea base ocasionadas por una captura de baja afinidad se pueden superar usando EDC/NHS como una etapa de entrecruzamiento, aunque esto puede comprometer la actividad de la biomolécula si los sitios activos de ésta se ven implicados en los entrecruzamientos. El efecto del entrecruzamiento sobre la actividad de la biomolécula se debe analizar empíricamente para cada sistema de biomolécula-analito. En general, el entrecruzamiento debe ser tan breve como sea posible: a menudo, 15 segundos resultan suficientes para conseguir una estabilidad aceptable de la línea base sin comprometer la actividad de la biomolécula. Cantidad a Inmovilizar: La cantidad de biomolécula que se va a inmovilizar depende del objetivo del experimento. Las ecuaciones 1 y 2 son útiles para calcular la densidad superficial apropiada:
Rmáx = (MWA/MWJ
X
R¡
X
sm [Ecuación 1]
R¡ = Rmáx x (1 /Sm) x (MWJMWA) Rmáx
[Ecuación 2]
= respuesta de enlace teórica máxima (asumiendo que una superficie es 100% activa y 100% enlazada con
analito)
1 386 (1105) Métodos de Pruebas Inmunológicas / Información General
USP 39
= respuesta de la molécula inmovilizada = peso molecular del analito = peso molecular de la molécula inmovilizada = estequiometría del enlace molar Para experimentos cinéticos, se prefiere una baja densidad de la molécula inmovilizada para evitar impedimento estérico, agregación y/o enlace limitado por transporte de masas. La densidad baja se define como RL que limita Rmáx a 5-50 unidades de respuesta. Para otras aplicaciones, p.ej., el análisis de concentración en el que se desea un enlace limitado por transporte de masas, Rmáx puede ser 100-200 veces más grande que para los experimentos cinéticos, siempre y cuando no se induzca el impedimento estérico o la agregación. Las recomendaciones específicas para la densidad de inmovilización se incluyen en los ejemplos de aplicación de este capítulo. Enlace de Analitos No es necesario que las muestras en las que se evaluará el enlace usando RPS tengan la misma pureza que las biomoléculas destinadas para inmovilización directa en la superficie. Debido a que la fuente de luz no penetra la muestra, es posible analizar muestras turbias u opacas mediante RPS. Siempre que resulte práctico, las muestras deben clarificarse de acuerdo con las recomendaciones provistas en la sección Preparación de la Muestra y del Amortiguador, además de que se deben minimizar los aditivos para amortiguadores, al incluir únicamente la cantidad requerida para la actividad biológica. Las diferencias entre el índice de refracción de los amortiguadores a granel y de los amortiguadores de la muestra originan una respuesta. El uso de superficies y muestras de control ayuda a demostrar la especificidad del enlace para las moléculas en la RPS. Para los métodos de inmovilización directa, las superficies de control adecuadas pueden ser (1) la superficie del sensor sin ninguna modificación o biomolécula acoplada, (2) una superficie que haya sido químicamente tratada de la misma manera que la superficie que contiene la biomolécula o (3) superficie que tenga acoplada una biomolécula relacionada no enlazante. Para superficies que se preparan usando inmovilización indirecta (captura), se debe usar la molécula de captura como la superficie de control ante la ausencia del compañero de enlace marcado. La diferencia de la respuesta entre las superficies activas y de control proporciona una indicación inicial de la especificidad del enlace. Las respuestas dependientes de la concentración y la inhibición del enlace mediante la incubación de la muestra con la biomolécula en la superficie pueden establecer aún más la especificidad del enlace. Si se observa un enlace inespecífico o indeseado, los analistas deben determinar la fuente. Mediante cambios frecuentes en el pH o en la concentración iónica de los amortiguadores usados en el experimento se puede reducir o eliminar el enlace indeseado. La Tabla 2 resume sugerencias adicionales para reducir enlaces inespecíficos. RL
MWA MWL
sm
Tabla 2. Acciones Sugeridas para Reducir Enlaces lnespecíflcos Categoría
Acción
Diseño Experimental
1. Optimizar los amortiguadores de corrida: (a) incrementar la sal (de 150 a 500 mM) (b) agregar detergente (0,001 % a 0,05%) (c) equiparar la composición de los amortiguadores de muestra y de corrida 2. Cambiar el método de inmovilización de ligandos 3. Evaluar la calidad de los ligandos 4. Aumentar o reducir la temperatura en la cámara de detección
Selección de Superficie
1. Cambiar la propiedades de la superficie del sensor: (a) reducir las interacciones electrostáticas (b) evaluar el caracter hidrófobo vs. hidrófilo de la superficie (c) considerar un ligando alternativo para su uso como superficie de control 2. Preinmovilizar amino-PEG 3. Cambiar la molécula de bloqueo (p.ej, etilendiamina)
Adiciones a la Muestra
1. Agregar un reductor de enlace no específico a la muestra: (a) incrementar la concentración iónica de los amortiguadores de corrida y de muestra (p.ej. NaCI de 150 a 500 mM) (b) agregar detergente a los amortiguadores de corrida y de muestra (p.ej. surfactante P20 del 0,001 % al 0,05% ) (c) agregar carboximetil dextrano soluble (1-10 mg/ml, únicamente para superficies basadas en dextrano) 2. Simplificar el amortiguador de muestra-incluir únicamente los componentes requeridos para actividad biológica 3. Evaluar la calidad de los analitos
Las ecuaciones 1 y 2 también son útiles para evaluar la actividad de la superficie. Entre más grande sea la respuesta de enlace, más activa será la superficie, a menos que la respuesta de enlace observada exceda el valor calculado Rmáx en cuyo caso, la estequiometría de enlace molar es incorrecta, la molécula de analito presenta agregación o el analito se enlaza de manera no específica a la superficie. Las respuestas de enlace que son bajas (< 10% de Rmá.> sugieren que la concentración de analito seleccionada para el experimento es demasiado baja o que la actividad superficial de la molécula inmovilizada es baja. En el primer caso, incrementar la concentración de analito debe aumentar la respuesta de enlace, mientras que en el segundo caso, puede ser útil emplear un método de inmovilización diferente.
USP 39
Información General/ (1105) Métodos de Pruebas Inmunológicas 1 387
Regeneración de la Superficie La regeneración de la superficie se refiere al proceso de remover el analito enlazado de la superficie a fin de reutilizar la superficie para interacciones de enlace subsiguientes. En algunos casos, la disociación compleja es rápida y el analito enlazado simplemente se lava con solución amortiguadora, por lo que no se requiere de regeneración. Alternativamente, la configuración del instrumento puede permitir la inyección de múltiples muestras de manera secuencial o en paralelo en todas las superficies inmovilizadas simultáneamente, limitando así la necesidad de regeneración. Una regeneración inadecuada de la superficie puede afectar la reproducibilidad de una valoración y afectar de manera negativa la calidad global de los datos resultantes. Para identificar las condiciones correctas, los analistas deben considerar la naturaleza de la interacción específica y el objetivo del experimento. Por ejemplo, un ligero desplazamiento en la línea base no afectará los resultados cuando se busca una simple respuesta polar (sí/no), pero para la determinación de la concentración o en los estudios de cinética, optimizar la etapa de regeneración es un aspecto crítico. La mayoría de las interacciones bioquímicas implican enlaces no covalentes, tales como enlaces de hidrógeno, electrostáticos, de van der Waals e hidrófobos. Debido a que para la mayoría de las interacciones se desconocen la combinación de las fuerzas físicas responsables de los enlaces y las condiciones de regeneración críticas para evitar cambios irreversibles en la conformación, las condiciones finales se deben evaluar empíricamente. La condición ideal para la regeneración es la disociación de todo el material enlazado sin afectar las propiedades biológicas de la biomolécula inmovilizada. Una regeneración incompleta o condiciones demasiado estrictas pueden resultar en una capacidad reducida de enlace del analito en los ciclos subsiguientes debido al bloqueo de los sitios de enlace por el analito no disociado o por la desnaturalización parcial de la biomolécula. Los amortiguadores y soluciones para regeneración se pueden dividir en diferentes clases por el efecto que tienen sobre la interacción. Se puede usar cualquier combinación de amortiguadores. Las clases principales de amortiguadores para regeneración son: ácidos, básicos, iónicos/caotrópicos, detergentes, hidrófobos/no polares y quelantes (ver la Tabla 3 para obtener ejemplos de cada clase). Los analistas deben comenzar con condiciones moderadas y trasladarse progresivamente hacia condiciones más severas. En muchos casos, especialmente cuando se trabaja con anticuerpos, el cambio de pH es el método más efectivo para regenerar la superficie. El tiempo de contacto con la superficie es importante para una regeneración eficiente. Cuando los analistas emplean el cambio de pH, los tiempos de contacto deben ser cortos, de 30 segundos a 2 minutos. Cuando los analistas emplean una alta concentración iónica o caotropos, los tiempos de contactos más extensos, de 2-4 minutos, a menudo resultan efectivos. Tabla 3. Ejemplos de Soluciones para Regeneración Ácidas
Básicas
Ión leas/ Caotrópicas
Detergentes
Hidrófobas/ No polares
HCL 1-100 mM
NaOH 1-100 mM
NaCI 0,5-5 M
SOS al 0,02%-0,5%
etilenglicol al 25%100%
glicina 10-100 mM, pH 1,3-3,0
glicina 10-100 mM, pH 9,0-10,0
MgCl 2 1-4 M
octilenglicol 40 mM + CHAPS 20 mM
OMSO al 5%-50%
ácido fosfórico 10-100 mM
HCI de etanolamina 1 M, pH 9,0 o superior
KSCN 1 M
octilglucósido 40 mM
acetonitrilo al 1%-10%
TFA al 0,1%
carbonato de sodio 100 mM + NaCI 1 M, pH 9- HCI de guanidina 211 6M
ácido fórmico 100 mM
NaOH 20-100 mM que contiene P20 surfactante al 0,5% o SOS al 0,05%
Quelantes EDTA o EGTA 1O20 mM imidazol 10-200 mM
El propósito de optimizar las condiciones de regeneración es encontrar la solución de regeneración más moderada posible para disociar completamente el complejo. Los analistas deben mantener un nivel constante de actividad sobre los ciclos de enlace-regeneración, incluso si la línea base cambia un poco. Ciclos repetidos de enlace del analito seguidos por la regeneración de la superficie proporcionarán información sobre el desempeño general de la superficie. Idealmente, se debe evaluar el desempeño de la superficie para el mismo número de ciclos que se utilizarán durante el experimento de RPS. La superficie debe monitorearse para detectar señales de acumulación y la degradación del ligando inmovilizado (Figura 4). Esto se puede lograr monitoreando la línea base al inicio de cada ciclo de inyección y la señal de enlace (pendiente o respuesta de enlace) de una muestra de control de calidad. Definir apropiadamente los criterios de aceptación para la aptitud del sistema, tales como el desplazamiento de la línea base y el desempeño del control de calidad, ayuda a monitorear la integridad del ligando inmovilizado en la superficie.
1 388 (1105) Métodos de Pruebas Inmunológicas / Información General
A. Nivel de la línea base
USP 39
B. Nivel de la respuesta
5'
e:.
5'
e:.
.l9
~Q)
"'
Q)
::l
c.
::l
o:::"'
c.
Q)
o:::"' Q)
o
2
3
4
Número de ciclo
5
6
o
2
3
4
5
6
Número de ciclo
Figura 4. Evaluación del desempeño de la superficie (A) acumulación en la superficie y (B) degradación del ligando inmovilizado. Existen dos posibles explicaciones cuando la respuesta del enlace disminuye lentamente: 1. Si la línea base del sensograma de los datos brutos se mantiene constante, pero la respuesta del enlace continua disminuyendo, las condiciones de regeneración ocasionan un cambio irreversible en la biomolécula que reduce la capacidad de enlace de la superficie, lo cual a su vez reduce la cantidad de analito que se puede enlazar en la superficie. Los analistas pueden reducir ligeramente la concentración de la solución de regeneración o cambiar a otra solución de regeneración de igual concentración dentro de la misma clase. 2. Si la línea base aumenta, la acumulación de analito ocasiona una reducción de la capacidad de enlace en la superficie, lo que a su vez reduce la cantidad de analito que se puede enlazar en la superficie. Los analistas pueden aumentar ligeramente la concentración de la solución de regeneración o cambiar a una solución de regeneración de igual concentración dentro de la misma clase. Es posible que existan diferencias entre las soluciones de regeneración en lo que respecta a su capacidad para solubilizar el analito. Una vez que se ha determinado una solución de regeneración adecuada, ésta debe analizarse en una serie de ciclos de enlace y regeneración. Debido a que la actividad de enlace de la superficie generalmente disminuye con el tiempo y/o el uso, los analistas deben determinar empíricamente el umbral de respuesta de enlace y el número consecuente de ciclos para uso de la superficie. A continuación se presentan ejemplos para determinar el umbral de enlace y el número de ciclos (ver las Aplicaciones 1-3). En algunos casos, la línea base disminuirá o aumentará y/o la capacidad de enlace disminuirá hasta cierto punto en las primeras pocas inyecciones antes de que se estabilice. Esto se debe a la disociación de biomoléculas enlazadas electrostáticamente de la superficie (dependiendo de las características de la superficie) o al enlace con una fracción de alta afinidad no regenerable de la superficie. Por esta razón, cada superficie recién inmovilizada debe ser acondicionada con ciclos repetidos de enlace y regeneración del analito antes de recolectar datos cuantitativos. Los métodos alternativos de inmovilización, tales como un procedimiento químico diferente o captura indirecta, se deben evaluar cuando la biomolécula inmovilizada es difícil de regenerar. Análisis e Interpretación de Datos El análisis y la interpretación de los datos son específicos para el objetivo del experimento. Existen diversos programas de análisis de datos que ayudan a calcular las constantes de cinética y afinidad a partir de los datos de la RPS. La validez y calidad de los resultados están directamente vinculados con el diseño experimental. El proceso de ajuste es puramente matemático, independientemente de la significancia biológica de los valores obtenidos. Algoritmo para el Análisis de Datos: El análisis global busca un solo conjunto de constantes de velocidad cinética para todas las concentraciones usadas en el experimento. Mediante un algoritmo para el ajuste de los datos tal como el de Marquardt-Levenberg, el software de análisis de datos inicia un proceso iterativo comenzando con una aproximación inicial para encontrar el mejor conjunto de parámetros que produzca un acuerdo entre los datos experimentales (sensorgrama) y el ajuste calculado para los datos. El proceso iterativo continúa hasta que se minimiza la diferencia entre las curvas experimentales y calculadas (teóricas) conforme a la medición obtenida con la suma de los cuadrados residuales. Preparación de los Datos para el Análisis: Antes de llevar a cabo el análisis cinético, los analistas deben inspeccionar visualmente los datos experimentales para detectar anomalías o artefactos, tales como disturbios en la línea base o datos fuera del intervalo (a menudo causados por burbujas de aire) que se presentan durante un periodo previamente definido
USP 39
Información General/ (11 05) Métodos de Pruebas Inmunológicas 1 389
(p.ej., 4-8 segundos). Se deben eliminar los valores aberrantes del conjunto de datos de acuerdo con los criterios prestablecidos. Los datos no esenciales, tales como las inyecciones de captura o regeneración, se deben eliminar del sensorgrama, y los datos de cada concentración de analito se deben ajustar usando el procedimiento de doble referencia descrito más adelante. Antes del análisis, los datos brutos se deben procesar de la siguiente manera: •Alinear el inicio de la inyección a cero segundos para todas las concentraciones y las inyecciones de amortiguador para las superficies de referencia y activas. • Alinear la línea base a cero respuesta para todos los sensorgramas. • Restar el sensorgrama de la superficie de referencia del sensorgrama de la superficie activa para crear un conjunto de datos corregido. • Restar el sensorgrama del amortiguador corregido de los sensorgramas en las diferentes concentraciones para crear un conjunto de datos doblemente referenciados. El procedimiento de doble referencia elimina errores sistemáticos (p.ej., ruido de los instrumentos) y bajos niveles (menos de 5% de la respuesta de enlace total) de enlace no específico. Este procedimiento no debe usarse para corregir los eventos de enlace no específico importantes puesto que puede llevar a mediciones erróneas. Cuando se analizan los datos para obtener información cinética, los analistas emplean las fases de asociación (inyección) y de disociación (flujo de amortiguador) para todas las concentraciones en las series. Para los análisis de afinidad en estado de equilibrio, la respuesta en equilibrio Req (meseta de datos o sin cambio en respuesta vs. tiempo) se mide para cada sensorgrama para crear una isoterma de enlace con Req vs concentración. La isoterma se analiza usando las ecuaciones descritas a continuación. Modelos Cinéticos y de Afinidad en Estado de Equilibrio: El modelo cinético de Langmuir asume una interacción 1 :1 entre compañeros de enlace de modo que
Las constantes de velocidad de asociación y disociación se definen a continuación:
d[AB]=k x [A]x[B] df
8
- d[AB] =k dt d
X
[AB]
Combinando estas dos ecuaciones y definiendo [Blibrel = [8 101 - AB], la expresión de velocidad neta es
d[AB]Jdt =ka
[Alibre] [Btot - AB] - kd
X
X
[AB]
que se puede traducir en términos del experimento RPS de la manera siguiente:
dR/dt = ko
X
e X (Rmáx -
R) - kd
X
R
en donde Res la respuesta de enlace en algún punto a lo largo del sensorgrama y Ces la concentración conocida de analito. Usando los análisis globales descritos anteriormente, kª' kd y Rmáx se calculan a partir de los datos experimentales usando las ecuaciones de velocidad presentadas a continuación: Asociación: dR/dt =ka X e X (Rmáx - R) - kd X R Disociación: dR/dt = -kd x R Dado que la concentración del analito es cero durante la disociación, la ecuación de velocidad para disociación depende únicamente de la respuesta, R, y de la constante de velocidad de disociación, kd. La aplicación de la condición de equilibrio cuando la formación compleja (asociación) es igual al deterioro complejo (disociación)
ka
X
[A]
X
[B] = kd
X
[AB]
genera la siguiente ecuación para la constante de disociación de equilibrio
Ka= [A]x[B] = C(Rmáx -R.ª) [AB]
R.ª
en donde Req es la respuesta de enlace en el equilibrio que se mide en el experimento para una concentración dada de analito y C, Ka y Rmáx se calculan usando un análisis global. Los modelos de enlace cinético se pueden usar para describir interacciones que no son 1 :1, p.ej., interacciones bivalentes que se presentan cuando se usa un anticuerpo como analito, hay heterogeneidad de los compañeros de unión, cambio en la conformación o interacciones más complejas como enlace cooperativo. Los analistas de RPS deben tener cuidado de no usar modelos más complejos para evaluar datos a menos que se haya confirmado el diseño experimental.
1390 (1105) Métodos de Pruebas Inmunológicas/ Información General
USP 39
Evaluación del Ajuste: La calidad y validez del ajuste a los datos cinéticos se puede evaluar mediante (1) inspección visual de la concordancia entre las curvas experimentales y calculadas, (2) el tamaño y la forma de las gráficas de residuos, (3) la importancia biológica de los resultados y (4) parámetros estadísticos tales como x2 (promedio de cuadrados residuales) y error estándar (SE, por sus siglas en inglés), valor To factor U (singularidad). El mejor ajuste de parámetros para los datos experimentales se debe superponer en la curva para cada concentración en el experimento. La gráfica de residuos permite visualizar la diferencia entre los datos calculados y los experimentales. La forma de los residuos debe ser aleatoria sin tendencia (ondulación o encorvamiento hacia arriba o hacia abajo). La altura de la gráfica de residuos debe reflejar el ruido del instrumento. Además, se debe minimizar x2 para un buen ajuste con valores que dependan del ruido del instrumento, número de datos puntuales y respuesta general de enlace. Se deben considerar los valores de los parámetros con respecto a su importancia biológica y experimental. Por ejemplo, ¿El valor calculado de kª es bajo cuando se sabe que la interacción es rápida?, o ¿Es el valor calculado de Rmáx mayor que el valor que se calculó usando las Ecuaciones 1 y 2? La significancia de los parámetros se evalúa basándose en el error estándar, en los valores Ty en el factor U. Los parámetros que son significativos no se pueden cambiar sin afectar la calidad del ajuste. Todos los criterios deben estar dentro de los límites aceptables. Se puede usar un conjunto de criterios similar para evaluar el ajuste de los datos de afinidad en estado de equilibrio, pero debido a que hay menos datos puntuales (6-12 en total, dependiendo del número de concentraciones usadas), es menos factible predecir la calidad de ajuste de los parámetros estadísticos y de las gráficas de residuos. La inspección visual de la concordancia entre las isotermas de enlace experimentales y calculadas y la relevancia de parámetro son buenas herramientas que se usan- para evaluar el ajuste. Asimismo, de acuerdo con la relación entre concentración, K0 , y Rmáxt cuando la concentración es igual a la concentración K0 para la interacción, Res igual al 50% de Rmáx· Confirmar que los datos analizados siguen esta relación representa otra forma de verificar la validez del resultado calculado. Cuando resulte práctico calcular la concentración K0 usando metodologías cinéticas y de análisis en estado de equilibrio, los valores de K0 deben concordar dentro del error experimental. Tratamiento de la Falta de Ajuste: Cuando los datos no se ajustan o los valores de los parámetros no tienen sentido, a menudo el problema se podrá resolver a través de una metodología sistemática que considere las fuentes potenciales para desviaciones y que analice cada hipótesis. Los puntos a considerar incluyen la pureza del reactivo, la química de inmovilización o la densidad superficial, los errores de concentración del analito, los enlaces no específicos, la pérdida de actividad de ligandos o el enlace limitado por transporte de masas. Revisar los datos brutos (sin corregir) ayuda a determinar la fuente de enlace no específico o los errores de concentración. La Tabla 4 cita las fuentes potenciales de desvío del enlace 1 :1 y las acciones recomendadas. Tabla 4. Fuentes Comunes de Desvío de la Cinética de Enlace 1 :1. Fuente de Desvío Línea base con un valor diferente de cero antes de la inyección
Acción Recomendada • Normalizar la respuesta a cero y reanalizar
Tiempos de inicio y fin de inyección incorrectos o definición deficiente del inicio/fin de la inyección
• Ajustar el inicio/fin de la inyección • Retirar los artefactos de sensorgrama (p.ej., inyección o espículas de burbujas de aire)
Errores en la información de la concentración
• Verificar los valores de concentración y reanalizar
Contribución demasiado alta del índice de refracción bruto
• Usar una metodología de doble referencia antes del análisis • Ajustar RI = O
Enlace limitado por transporte de masas
• Variar la velocidad de flujo (lenta a rápida) para una sola concentración y sobreponer los sensorgramas (deben ser idénticos para el mismo tiempo de asociación y disociación) • Incluir el término de transporte de masas, km, en el modelo de ajuste • Reducir la densidad superficial
Enlace no específico
• • • •
Pérdida de actividad del compañero de enlace
• Cambiar el método químico de inmovilización • Cambiar la solución de regeneración • Reanalizar los datos usando un ajuste de parámetros local en vez de un ajuste global para R_,_
Interacción de enlace multivalente
• Inmovilizar el compañero de enlace multivalente
Cambiar el método químico de inmovilización Cambiar las propiedades de la superficie del sensor Aditivos para amortiguadores-agregar o minimizar Pureza del reactivo-purificar muestras de nuevo
Las secciones subsiguientes de este capítulo ofrecerán recomendaciones para el análisis de datos. Aplicación 1-Evaluación de lnmunogenicidad: La RPS ha demostrado ser una técnica efectiva para evaluar la inmunogenicidad de las proteínas con propiedades terapéuticas o proteínas de uso terapéutico. Una ventaja de esta plataforma para detectar anticuerpos en muestras de suero (o plasma) es que permite una detección sin etiquetas basada en la acumulación de masa en tiempo real, lo que permite potencialmente la detección de anticuerpos de poca afinidad de todas las clases y subclases. Esta tecnología es útil para valoraciones de detección (inmunoensayos en primer nivel que se usan para detectar la presencia de anticuerpos capaces de enlazarse a una proteína con propiedades terapéuticas) y para
USP 39
Información General/ (1105) Métodos de Pruebas Inmunológicas 1391
los ensayos de caracterización. Los ensayos de caracterización son útiles para definir anticuerpos generados que se enlazan a la proteína y pueden incluir el análisis de concentración de anticuerpos, isotipos representados, afinidad de enlace relativa y especificidad del enlace. Una limitación es que la RPS no es adecuada para determinar la capacidad neutralizante de los anticuerpos, lo cual se determina mejor usando una valoración biológica basada en células. Al diseñar y validar valoraciones de RPS para la evaluación de inmunogenicidad, los analistas deben considerar parámetros críticos, incluyendo la inmovilización de proteína para asegurar la reactividad biológica, la estabilidad de la proteína inmovilizada y las condiciones de regeneración de la superficie. Inmovilización de Proteínas: El primer paso en el desarrollo de las valoraciones para la evaluación de inmunogenicidad consiste en identificar el mecanismo óptimo para inmovilización de la proteína diana. Al considerar la densidad diana para inmovilización, los analistas a menudo recomiendan usar una superficie de alta densidad. La ventaja de una superficie de alta densidad es que maximiza la oportunidad de que los anticuerpos contra las proteínas terapéuticas entren en contacto con un ligando inmovilizado. Asimismo, una superficie de alta densidad ofrece una sensibilidad de valoración excelente. Un aspecto importante de estas valoraciones radica en que el método químico seleccionado para la inmovilización debe ofrecer una orientación aleatoria en lugar de una orientación dirigida al sitio, de modo que todos los epítopes potenciales en la proteína terapéutica estén disponibles para su enlace con anticuerpos. La efectividad de la inmovilización se determina mediante la evaluación de la capacidad de los anticuerpos de controlpositivos para enlazarse con la proteína inmovilizada. Al evaluar la efectividad de la inmovilización, los analistas deben analizar múltiples anticuerpos con diferentes especificidades para epítopes. Cuando los paneles de anticuerpos que cubren un intervalo de afinidades y enlaces a diferentes epítopes en la proteína diana tienen la capacidad de enlazarse, esto da la confianza de que los anticuerpos contenidos en las muestras clínicas también serán detectados. Si alguno de los anticuerpos de control positivo no demuestra una capacidad de enlace, esto sugiere que la inmovilización no es óptima y debe modificarse. Aunque se ha demostrado que la RPS es eficiente para detectar anticuerpos de alta afinidad, los analistas deben confirmar que el protocolo de inmovilización seleccionado sea efectivo para la detección de anticuerpos de alta y baja afinidad. Estabilización de Proteínas al Momento de la Inmovilización: El anticuerpo de control positivo debe ser capaz de enlazarse a la proteína inmovilizada para que el resultado de una valoración sea aceptable. Esta confirmación de enlace da la confianza de que si en la muestra se presentan anticuerpos contra una proteína, éstos se enlazarán con la proteína inmovilizada en la superficie del sensor. Puesto que la RPS se basa en la reutilización de la superficie de la proteína inmovilizada para múltiples análisis, se requiere de un protocolo de regeneración para eliminar de la proteína inmovilizada cualquier material enlazado de manera efectiva. Este procedimiento de regeneración se basa en la capacidad de eliminar el material enlazado sin dañar o eliminar la proteína inmovilizada. Se pueden usar diversos protocolos de regeneración y, casi siempre, la solución de regeneración es una solución ácida, por lo general un clorhidrato diluido. La proteína inmovilizada debe mantenerse intacta y funcional después de etapas de regeneración repetidas. Dado que la proteína inmovilizada se usará de manera rutinaria para múltiples análisis que implican ciclos repetidos de muestras de suero, los analistas deben verificar la estabilidad de la proteína inmovilizada después de los ciclos de regeneración. La estabilidad de la proteína inmovilizada se puede monitorear de manera efectiva mediante el rastreo de las unidades de respuesta después de la regeneración y también después de la adición de un anticuerpo de control positivo. Si se presenta un cambio en la línea base o una reducción en la magnitud del enlace por parte del anticuerpo de control positivo, entonces la proteína inmovilizada probablemente ya no sea adecuada para análisis adicionales. La estabilidad posterior a la regeneración se debe establecer durante el desarrollo de la valoración y se debe confirmar durante la validación de la valoración. A fin de monitorear el desempeño del sensor durante una valoración, los analistas deben analizar periódicamente una muestra de control positivo durante una corrida de valoración. Si el desempeño de las muestras de control positivo indica que la proteína inmovilizada ha sido comprometida, los analistas deben reanalizar las muestras de prueba obtenidas después de haberse presentado la caída del desempeño de la valoración por debajo de los límites aceptables. Los parámetros de aceptación para inmovilización pueden variar para cada compuesto y se deben establecer para cada valoración. Disponibilidad de Epítopes Después de la Inmovilización: Una vez que se ha inmovilizado la proteína, se debe confirmar la disponibilidad de epítopes múltiples. Idealmente, dicha confirmación se lleva a cabo mediante un análisis para determinar el enlace de anticuerpos de control positivo con diferente especificidad para epítopes. Un método para analizar la disponibilidad de epítopes consiste en usar un panel de anticuerpos monoclonales que puedan reconocer diferentes regiones de la proteína. Si la proteína ha sido inmovilizada aleatoriamente, todos los anticuerpos de control positivo diferentes deben ser capaces de enlazarse. La razón para evaluar la disponibilidad de epítopes es prevenir resultados falsos negativos al evaluar muestras de suero. Si la inmovilización no es aleatoria, sería posible inmovilizar la proteína de manera uniforme mediante un epítope específico, con lo que el epítope no estaría disponible para enlace por parte de un anticuerpo. Otra posibilidad es que la modificación química de la proteína para facilitar la inmovilización haya alterado la conformación de la proteína. Regeneración de la Superficie y Estabilidad Subsiguiente de la Proteína: Usando las pautas anteriores, los analistas deben monitorear la superficie para buscar señales de acumulación y degradación del ligando inmovilizado y descontinuar su uso cuando sea necesario. Por ejemplo, cuando la capacidad de enlace de un anticuerpo de control positivo (diluido en suero de prueba) caiga por debajo del 80% de su capacidad inicial, no se deberá usar la superficie.
1392 (1105) Métodos de Pruebas Inmunológicas / Información General
USP 39
Determinación del Punto de Corte de la Valoración: Al realizar valoraciones para determinar si una muestra de suero contiene anticuerpos contra una proteína, en ocasiones Jos analistas observan cierto nivel de enlace de fondo. Dicho enlace de fondo puede variar dependiendo de la naturaleza de la proteína inmovilizada, así como de la población de pacientes analizada. Para determinar si una muestra de prueba contiene anticuerpos, los analistas comparan el enlace con muestras de control que no contienen anticuerpos contra Ja proteína. Posteriormente, se establece un punto de corte y, cuando una muestra contiene anticuerpos, el enlace es mayor que dicho punto de corte. Los analistas determinan el punto de corte de Ja valoración analizando una serie de muestras de suero que no contienen anticuerpos contra Ja proteína inmovilizada y realizando posteriormente un análisis estadístico para determinar el nivel de enlace que se corresponda con el de una muestra que no contenga anticuerpos. El punto de corte debe establecerse usando las mismas condiciones que se emplearán para el análisis de Ja muestra. Aunque se emplean diferentes metodologías para determinar un punto de corte, una común consiste en establecer la media a partir del enlace de 50-100 muestras de suero obtenidas de voluntarios saludables y establecer el punto de corte al 95% (equivalente a Ja media más 1,645 veces Ja desviación estándar para una distribución normal). Los analistas deben eliminar los valores aberrantes estadísticos de Jos cálculos, debido a que su inclusión puede ocasionar sesgo elevado y elevar el punto de corte. Dicho punto de corte más alto resultará en Ja identificación de un número menor de muestras con anticuerpos contra la proteína inmovilizada. El punto de corte estadísticamente evaluado es el valor de respuesta unitario que las muestras de suero deben exceder para que se considere positiva Ja presencia de anticuerpos contra la proteína terapéutica. Una característica importante de Ja determinación del punto de corte es que éste puede variar para distintas poblaciones de pacientes. Por ejemplo, pacientes con padecimientos inflamatorios pueden presentar un nivel más alto de reactividad no específica en comparación con una población normal. Este nivel mayor de enlace no específico podría resultar en la identificación de muestras como positiva cuando en realidad no contienen ningún anticuerpo específico para la proteína. Cuando se presenta dicha situación, se pueden usar muestras de suero predosificadas para establecer una nueva media específica para la población de pacientes y un punto de corte para Ja valoración. Desarrollo y Validación del Procedimiento Analítico: Una vez que se ha confirmado la estabilidad de Ja proteína inmovilizada, que se ha definido un procedimiento de regeneración y que se ha establecido un punto de corte, se puede proceder al desarrollo y validación del método de análisis de anticuerpos. Las condiciones usadas para analizar las muestras deben ser idénticas a las usadas para establecer el punto de corte de la valoración. Un parámetro importante a considerar es la dilución óptima de la muestra de suero. Al incrementar el factor de dilución, el enlace no específico es reducido por las proteínas del suero, pero también se reduce la sensibilidad general. La mayoría de los procedimientos de evaluación de anticuerpos usan suero al 5%-50%. A medida que se reduce el porcentaje de suero que se analiza, también se reduce el porcentaje de la señal de enlace debida a la interacción no específica y, en consecuencia, se incrementa el porcentaje de la señal mediada por anticuerpos que se enlazan con la proteína inmovilizada. Aparte de la dilución, otros medios para reducir la interacción no específica incluyen la adición de surfactantes, el incremento de la concentración salina, la adición de BSA o HSA o la adición de material de sustento para la superficie del sensor tal como carboximetil dextrano o alginato a la dilución y al amortiguador de corrida. Otras variables importantes para Ja optimización incluyen la velocidad de flujo y el volumen de muestra. La combinación de Ja velocidad de flujo y del volumen de muestra define el tiempo de contacto, que es el tiempo durante el cual la muestra se encuentra en contacto con la proteína inmovilizada. Entré más tiempo una muestra esté en contacto con la proteína inmovilizada, mayor será la probabilidad de enlace del anticuerpo. El siguiente aspecto importante a considerar es la verificación de que el enlace inicial resulte de un anticuerpo y no de algún otro componente del suero. Lo anterior se puede lograr agregando un reactivo de inmunoglobulina antihumana y monitoreando el enlace subsiguiente. Si el enlace inicial observado se debe a un anticuerpo antiproteína, este reactivo se enlazará con dicho anticuerpo (el anticuerpo antiproteína se mantiene enlazado a la proteína inmovilizada). Cuando la proteína inmovilizada es un anticuerpo monoclonal terapéutico, se debe examinar y verificar que el reactivo confirmatorio no se enlace directamente con el anticuerpo monoclonal terapéutico inmovilizado. Una opción para este caso es la inmovilización del fragmento Fab' en lugar del anticuerpo monoclonal terapéutico intacto. Se debe verificar la especificidad del reactivo confirmatorio. Una vez que se han optimizado todos los parámetros, es posible validar Ja valoración. La validación de parámetros incluye aquéllos asociados típicamente con ensayos de inmunogenicidad (precisión, especificidad, sensibilidad y robustez) así como parámetros específicos de las valoraciones de RPS (inmovilización de la proteína, estabilidad de la superficie inmovilizada y número de ciclos de regeneración). Interferencia de los Componentes del Suero: Dependiendo de la proteína inmovilizada, es posible que los componentes del suero distintos a los anticuerpos específicamente dirigidos contra Ja proteína inmovilizada se enlacen con la superficie inmovilizada. Asimismo, es posible que se presenten componentes del suero que bloquean Ja capacidad de los anticuerpos para enlazarse con la proteína inmovilizada. Ambos componentes se pueden evaluar analizando el enlace de las muestras de suero obtenidas de la población diana que se sabe carecen de anticuerpos contra Ja proteína inmovilizada y, posteriormente, monitoreando para determinar si ocurre algún enlace. Si se identifica un enlace no específico, se pueden tomar acciones para reducirlo o eliminarlo. Estas acciones pueden incluir el pretratamiento de muestras para eliminar el reactivo no específico, la adición de surfactante o Ja alteración de la concentración salina en Jos amortiguadores de muestra para reducir el enlace no específico. Los analistas deben verificar que las muestras de suero no contengan agentes que sean capaces de inhibir el enlace del anticuerpo con la proteína inmovilizada (éstos pueden incluir formas solubles de la proteína inmovilizada o receptores
USP 39
Información General/ (1105) Métodos de Pruebas Inmunológicas 1 393
solubles que podrían enlazarse con la proteína inmovilizada y bloquear el enlace de los anticuerpos con la misma). Los analistas pueden agregar el anticuerpo de control positivo a las muestras de suero dianas y evaluar el enlace. Si las muestras de suero dianas presentan una inhibición del enlace en comparación con el enlace con muestras de suero humano normal, se pueden tomar acciones para eliminar el agente inhibidor. Si no se identifica la interferencia del suero diana, podrían generarse resultados falso positivos o falso negativos. Implementación de Ensayos Multiplex: Cuando una proteína terapéutica es un producto de segunda generación que ha sido modificado a partir de una proteína terapéutica original (p.ej., mediante pegilación o glicosilación aumentada), la presencia de anticuerpos contra el producto original y de segunda generación deberá evaluarse simultáneamente. Esto se puede lograr inmovilizando cada proteína en canales separados en el dispositivo para microfluidos y permitiendo que las muestras de suero se enlacen en serie o en paralelo con ambas proteínas inmovilizadas. La justificación para analizar el enlace con la proteína terapéutica original y la modificada es que los anticuerpos generados contra la proteína modificada podrían tener también una especificidad de enlace con la proteína original. Como parte de la caracterización de la respuesta inmune, los analistas deben entender la especificidad de los anticuerpos para los productos de primera y segunda generación. Cuando sea posible, también se puede analizar el enlace con una contraparte endógena mediante la inmovilización de la proteína endógena en una celda o canal de flujo distintos. Caracterización de Anticuerpos contra Proteínas Terapéuticas: Una vez que los anticuerpos contra una proteína terapéutica han sido capturados enlazándolos con la proteína terapéutica inmovilizada, será posible caracterizar dichos anticuerpos. Las características importantes de anticuerpos contra las proteínas terapéuticas que se pueden estudiar incluyen la afinidad de enlace relativa, la cantidad de anticuerpos presentes en la muestra de suero, los isotipos de anticuerpos presentes en la muestra y la especificidad del enlace. Mediante el monitoreo de la velocidad a la que disminuyen las unidades de respuesta después de concluida la adición de la muestra al sensor, los analistas pueden determinar la afinidad relativa de los anticuerpos. Una velocidad elevada de disociación es característica de un anticuerpo de baja afinidad, mientras que una velocidad de disociación baja sugiere la presencia de anticuerpos de alta afinidad. Resulta útil comparar las velocidades de disociación tanto con el anticuerpo de control positivo (generalmente una preparación de anticuerpos de alta afinidad) como con un panel de anticuerpos monoclonales con afinidades de enlace conocidas. La concentración activa relativa de los anticuerpos presentes en una muestra se puede estimar comparando la señal de enlace con la señal producida a partir de una serie de diluciones del control positivo. Los analistas pueden generar una curva estándar a partir del estándar y pueden comparar la concentración activa de anticuerpos en la muestra con dicha curva estándar. Debido a que el control positivo no remeda con exactitud la mezcla de anticuerpos contenida en la muestra-de hecho, el control positivo a menudo se obtiene a partir de animales hiperinmunizados tales como conejos-el valor de concentración obtenido es relativo al del estándar. Este valor únicamente se aproxima a la concentración real de anticuerpos humanos. Debido a que se puede usar el mismo control positivo en todo el desarrollo químico, los analistas pueden comparar la cantidad de anticuerpos obtenidos a partir de sujetos diferentes usando esta estrategia. Puesto que la señal del instrumento es proporcional a la masa que se enlaza al sensor, resulta valioso este tipo de análisis. Los analistas deben considerar que los anticuerpos lgM tienen cinco veces la masa de los anticuerpos lgG. Otra metodología para determinar la concentración de anticuerpos se describe en la sección de análisis de la concentración de este capítulo (ver la Aplicación 2 a continuación). El isotipo de anticuerpos capturados se puede determinar fácilmente monitoreando el enlace asociado con la adición secuencial de reactivos para isotipificación. Por ejemplo, si los anticuerpos lgM están presentes y se han enlazado con la proteína inmovilizada, la adición de un reactivo anti lgM humana producirá una señal adicional. Los reactivos para isotipificación se pueden encontrar con especificidad para lgM, lgG, lgE, lgA, lgGl, lgG2, lgG3 e lgG4. Debido al impedimento estérico, puede ser necesario que los analistas repitan los análisis de isotipificación en diferentes secuencias para tener certeza de que la presencia de reactivos para isotipificación previamente enlazados no haya obstaculizado los análisis subsiguientes. Por ejemplo, supóngase que una muestra contiene anticuerpos lgGl e lgG4 contra una proteína y que ambas muestras se han enlazado con la proteína inmovilizada. Debido a que el reactivo de isotipifiación anti-lgGl se ha enlazado con los anticuerpos lgGl, el reactivo de isotipificación enlazado a éstos puede evitar que el reactivo anti lgG4 agregado subsiguientemente no reaccione con el lgG4, y la presencia del lgG4 permanecería sin ser descubierta. Los analistas concluirán que únicamente están presentes los anticuerpos lgGl, pero si el orden de adición de los reactivos de isotipificación se revirtiera, se descubrirían los anticuerpos lgG4. Este ejemplo subraya la importancia de interpretar con cuidado los resultados de la isotipificación. Esto representa un problema para análisis subsiguientes únicamente si se observa un enlace derivado de un ciclo previo de adición de reactivo de isotipificación. La especificidad de los reactivos de isotipificación se debe confirmar antes de su uso. Por ejemplo los analistas deben verificar que un reactivo anti lgG humana se enlaza únicamente con lgG humana y no presenta una reacción cruzada con la lgM humana. La región de la proteína terapéutica reconocida por los anticuerpos en ocasiones puede determinarse mediante la inmovilización de versiones de la proteína que hayan sido truncadas, que tengan mutaciones puntuales o que contengan únicamente un fragmento de la proteína. Si los anticuerpos no son capaces de enlazarse con la versión modificada de la proteína, esto podría sugerir que el epítope hacia el que se dirigió el anticuerpo se vió influenciado por el cambio. Se debe tener en mente que las mutaciones y truncamientos puntuales no sólo influencian a la secuencia primaria de una proteína, sino que también pueden influir la estructura terciaria (p.ej., multiplicación, conformación)
1 394 (11 05) Métodos de Pruebas Inmunológicas / Información General
USP 39
de una proteína. Asimismo, un sujeto es propenso a generar una población de anticuerpos con diferentes especificidades para una variedad de epítopes. A pesar de esta cuestión, la estrategia descrita puede ser útil para identificar la región en la proteína en la que los anticuerpos se están enlazando. Aplicación 2-Análisis de la Concentración: La RPS se puede usar para determinar la concentración de productos biológicos en sistemas amortiguadores definidos, p.ej., eluatos de columnas de purificación, amortiguadores de la formulación y mezclas complejas tales como suero, caldos de fermentación, extractos celulares crudos y suspensiones celulares. La concentración de un analito se mide por su enlace con el ligando específico u otras moléculas que pueden interactuar con cualquier porción del analito. La concentración del analito se determina en una superficie en la que se inmoviliza el ligando específico del analito o un reactivo de captura específico del analito. Se determina la velocidad de enlace o la masa del analito enlazado y la concentración del analito se calcula usando una curva estándar obtenida a partir de una serie de concentraciones de un material de referencia purificado y bien caracterizado o mediante un análisis exento de calibración que se basa en la relación entre las propiedades de difusión del analito y la concentración absoluta del analito. Inmovilización del Ligando: Para determinar la concentración, el ligando se inmoviliza de manera covalente o de manera no covalente en la superficie. Los analistas seleccionan un mecanismo de acoplamiento apropiado y el método químico para asegurar la integridad funcional del ligando. A fin de proporcionar las condiciones que favorezcan una independencia parcial o total de parámetros cinéticos, resulta deseable una densidad alta de la superficie del ligando. Una superficie con alta densidad permite que el analito se enlace con el ligando en condiciones que limitan el transporte de masa. La interacción entre el analito y el ligando se puede describir mediante el siguiente proceso de dos etapas:
km~~ Asupet1icie + 8
A __
en donde A es la concentración de analito en la muestra, A,uperficie es la concentración del analito en la superficie del sensor, km es el coeficiente de transporte de masa, Bes el ligando inmovilizado, AB es el complejo analito-ligando y kª y kd son las constantes de velocidad para la reacción de asociación entre A y By para la reacción de disociación del complejo respectivamente. El coeficiente de transporte de masa km depende de la velocidad de flujo, de las dimensiones de la celda de flujo y del coeficiente de difusión del analito. El analito primero debe transportarse de la muestra a granel a la superficie del sensor para que reaccione con las moléculas del ligando inmovilizado. Si este transporte de masa del analito es mucho más rápido que la etapa de asociación entre ligando y analito, el enlace general observado será dirigido por la constante de la velocidad de asociación de A con By por la constante de la velocidad de disociación del complejo AB, un prerequisito para determinar con exactitud los parámetros cinéticos. Si el transporte de masa del analito es mucho más lento que la etapa de asociación, el enlace será limitado por el proceso de transporte de masa y los parámetros cinéticos para la interacción específica entre A y B serán difíciles de obtener. No obstante, estas condiciones son deseables para determinar la concentración activa de un analito. Una alta densidad del ligando en la superficie del sensor y velocidades de flujo más lentas favorecen un transporte de masa limitado. Entre estos extremos, el enlace general se determina mediante contribuciones del transporte de masa y de la cinética de interacción. Puede no ser posible lograr condiciones limitadas de transporte de masa para análisis de concentración de interacciones con constantes de velocidad de asociación baja (p.ej., kª = 104 M-1 s-1 ). El ligando y el material de referencia del analito deben tener una pureza suficiente y se debe poner especial atención a la presencia de material agregado. Los agregados del analito pueden interferir con la regeneración de la superficie del ligando debido a que pueden enlazarse con múltiples sitios de enlace. El material de referencia debe ser comparable (p.ej., peso molecular y parámetros cinéticos) con las muestras de prueba. En ciertas condiciones la concentración activa en las muestras desconocidas se puede determinar usando un procedimiento exento de calibración que se basa en la relación entre las propiedades de difusión del analito y la concentración absoluta del mismo. Estas dos metodologías se describen más adelante por separado. Determinación de la Concentración con una Curva Estándar de Referencia: En las valoraciones típicas para determinar la concentración, la concentración del analito se calcula a partir de una curva estándar que se obtiene con un material de referencia que se inyecta usando concentraciones seleccionadas. Se pueden usar tres metodologías distintas para medir la concentración con una curva de calibración estándar de referencia: Valoración de Enlace Directo: Determina la cantidad de analito enlazado después de un tiempo de inyección de muestra fijo y arbitrario. Se puede realizar un método de emparedado como extensión de la metodología de enlace directo de una sola etapa para incrementar la sensibilidad de la valoración. Determinación de la Velocidad de Enlace: Determina la velocidad de enlace inicial para una muestra en lugar de la cantidad enlazada. En las condiciones de enlace limitado por transporte de masas, la velocidad de enlace es directamente proporcional a la concentración de analito e independiente de la cinética de enlace. Esto permite medir la concentración de moléculas relacionadas que pudieran tener características de enlace distintas. Ensayos de Inhibición o Competencia: Se puede usar un ensayo de inhibición cuando el mecanismo de acción para un analito depende de su enlace con un ligando soluble y, por tanto, se afecta la interacción ligando-receptor. En el ensayo de inhibición, se acopla un receptor a la superficie del sensor mediante enlace covalente. La interacción entre el analito y el ligando soluble se mide indirectamente mezclando una concentración fija de ligando con concentraciones variadas del analito, e inyectando la mezcla ligando-analito en toda la superficie del receptor inmovilizado. Asi-
USP 39
Información General/ (1105) Métodos de Pruebas Inmunológicas 1 395
mismo, se pueden usar métodos competitivos en solución para moléculas y partículas grandes, tales como virus, y para analitos pequeños que presentan respuestas directas bajas. En los sistemas paralelos, el ensayo se puede diseñar para que las muestras estándar y la muestra desconocida se inyecten en paralelo. Este método puede ser útil para ligandos que son difíciles de regenerar. Los analistas pueden graficar la señal (cantidad enlazada o velocidad de enlace) de los estándares de referencia en función de las concentraciones y luego generar una curva estándar empleando un modelo matemático apropiado, como por ejemplo, un ajuste de curva lineal o de cuatro parámetros. Las muestras se pueden inyectar en una o más diluciones. Es posible emplear unas pocas diluciones cuando se ha demostrado una relación lineal entre la muestra y el estándar de referencia. Las concentraciones de muestras desconocidas se obtienen mediante retrocálculos a partir de una curva estándar o, si se analizan con las mismas concentraciones diana que las de la curva del estándar referencia, mediante comparación de los parámetros para el ajuste de la curva. Los parámetros que pueden influir sobre el desempeño y los resultados del ensayo incluyen, pero no se limitan a la velocidad de flujo, la densidad del ligando en la superficie, la pureza de la muestra, la matriz de las muestras y la reproducibilidad de la regeneración de la superficie. Estos parámetros deben evaluarse durante la calificación o validación del ensayo. La interferencia con el enlace del analito al ligando inmovilizado se puede minimizar mediante sales, detergentes o material de sustento para la superficie del sensor. Una superficie de sensor comúnmente usada consta de dextrano carboximetilado, por lo que la adición de dextrano al amortiguador de dilución muestra puede minimizar las interacciones no específicas. También pueden usarse inyecciones en una superficie de control negativo para restar matemáticamente los datos de enlace no específico de los datos obtenidos en la superficie positiva. Una valoración RPS calificada o validada para la determinación de la concentración debe incluir muestras de Control de Calidad que sirvan como medida para determinar la exactitud de la curva estándar que se ha preparado para analizar muestras con una concentración de analito desconocida. Dichas muestras pueden prepararse convenientemente en partidas más grandes, calificarlas para su uso con un Certificado de Análisis para la concentración diana y almacenarlas en pequeñas alícuotas en condiciones adecuadas de almacenamiento. Después de cada inyección de analito, se regenera la superficie del ligando y se elimina todo el analito enlazado. Esta regeneración debe ser lo suficientemente fuerte como para eliminar todo el analito enlazado, pero las condiciones también deben dejar intacto el ligando inmovilizado para que las inyecciones puedan ser comparardas entre sí. Determinación de la Concentración Sin Calibración: Las valoraciones de concentración exentas de calibración se basan en la relación entre las propiedades de difusión del analito y la concentración absoluta del mismo. Los analistas pueden derivar la concentración de analito midiendo la velocidad de enlace inicial, siempre que se conozcan propiedades específicas el analito y del ambiente analítico. Esta metodología es útil cuando no se dispone de un estándar de referencia satisfactorio. Para determinar la concentración de analito en una muestra, los analistas emplean la relación entre la velocidad de enlace inicial y la concentración de analito. En una superficie de sensor con un alto nivel de inmovilización, la velocidad de enlace inicial (pendiente) se puede describir como una función del peso molecular, del coeficiente de transporte de masa km y de la concentración de analito. Antes de analizar una muestra, los analistas deben determinar el coeficiente de transporte de masa. Éste depende del coeficiente de difusión (O), de la velocidad de flujo y de las dimensiones de la celda de flujo, y se describe mediante la siguiente fórmula:
k = Ü 98 m
'
X 3
°
2 Xf 0,3xh 2 xwx/
en donde O es el coeficiente de difusión, fes la velocidad de flujo y h, w y I son la altura, ancho y longitud de la celda, respectivamente. La velocidad de flujo y las dimensiones de la celda a menudo se conocen para un instrumento determinado, mientras que el coeficiente de difusión se determina por el tamaño y la forma de la molécula usando herramientas específicas del instrumento, referencias de la literatura o experimentos, p.ej., mediante ultracentrifugación analítica o dispersión de luz. En una configuración experimental típica, la evaluación requiere dos velocidades de flujo. Mediante el uso de mediciones a dos velocidades de flujo distintas, los analistas pueden evaluar la influencia que tiene la velocidad de flujo sobre la velocidad de enlace. La robustez de la valoración también se mejora ajustando los datos obtenidos a dos velocidades de flujo distintas, lo que en consecuencia proporciona dos valores distintos para km (debido a que km depende de la velocidad de flujo), a un modelo con una variable global para concentración de analito (de tal manera que el modelo se limita a encontrar un solo valor de concentración que mejor se ajuste a ambas curvas simultáneamente). El análisis de concentración exento de calibración es adecuado únicamente para proteínas con MW ~ 5000 Da. Éste requiere una rápida asociación ana lito-ligando (kª > 5 x 104 M-1 s-1 ) y no puede manejar mezclas de analitos con propiedades de difusión distintas. El intervalo dinámico del método es aproximadamente 0,05-5 µg/ml. Aplicación 3-Análisis Cinético y de Afinidad: Debido a su capacidad para detectar interacciones de enlace en tiempo real, la RPS provee información valiosa sobre la cinética de la formación y disociación de complejos. Los instrumentos para RPS se pueden usar para determinar las constantes de velocidad de asociación y disociación para una interacción de enlace en particular, y dichos valores se pueden usar posteriormente para calcular la constante de equilibrio de disociación (K0 = kika). Obtener K0 a partir de un cociente de kª y kd es útil cuando la interacción de enlace no alcanza el equili-
1 396 (1105) Métodos de Pruebas Inmunológicas / Información General
USP 39
brío en un marco de tiempo adecuado para un experimento de enlace con RPS. Para interacciones de enlace que alcanzan el equilibrio (la velocidad de formación del complejo es igual a la velocidad de degradación del complejo) en minutos (vs. horas), K0 se puede determinar directamente de una respuesta de enlace en estado de equilibrio. El tiempo requerido para alcanzar el equilibrio se ve influenciado por la velocidad de disociación, por lo que los complejos que que presentan una rápida disociación (p.ej., kd = 10-2 s-1 ) alcanzarán el equilibrio más rápido que los de lenta disociación (p.ej., kd = 10-5 s-1 ). Los programas de software capaces de simular la cinética de enlace 1 :1 son útiles para predecir el tiempo requerido para alcanzar el equilibrio. El intervalo de trabajo típico para mediciones de afinidad con instrumentos de RPS disponibles comercialmente es de 10-12 M (pM) a 10-4 M (µM). Se requiere un diseño experimental adecuado para medir con exactitud k0 , kd y K0 • Son varias las preguntas que se deben considerar al diseñar análisis cinéticos o experimentos de afinidad en estado de equilibrio, las cuales incluyen: •¿Qué compañero de enlace debe inmovilizarse? •¿Cómo inmovilizará el analista uno de los compañeros de enlace? •¿Qué tipo de superficie de referencia se debe usar? • ¿Qué cantidad del compañero de enlace debe inmovilizarse? •¿Mantiene el compañero de enlace su actividad después de la inmovilización? • ¿Es específico el enlace con el compañero de enlace inmovilizado? • Si fuera necesario, ¿Qué condiciones de regeneración deben usarse? Al seleccionar cuál compañero de enlace se va a inmovilizar para la mayoría de las interacciones proteína-proteína, los analistas deben considerar diversos factores: (1) la pureza y disponibilidad de las proteínas, (2) la presencia de una etiqueta o grupo funcional que ayude con la inmovilización, (3) el mantenimiento de la actividad biológica y (4) la valencia del enlace (p.ej., enlace monovalente vs. multivalente). Es necesaria una superficie de referencia para todos los experimentos de análisis cinéticos y de afinidad detallados. Si se usa la inmovilización directa, se debe crear una superficie de referencia usando el mismo protocolo de inmovilización, omitiendo la proteína durante el paso de acoplamiento. Alternativamente, se puede usar una forma mutante de la proteína con un sitio de enlace modificado. La superficie de referencia para la captura de alta afinidad a menudo consiste en la molécula de captura sin compañero de enlace o emplea una molécula no relacionada para una superficie de captura simulada. Para el caso específico de las interacciones anticuerpo-antígeno, un anticuerpo monoclonal no relacionado generalmente funciona como el reactivo de captura en la superficie de referencia. Después de decidir la metodología de inmovilización, los analistas deben decidir qué cantidad del compañero de enlace se va a inmovilizar. Para análisis cinéticos, el aspecto primario a tomar en cuenta se centra en minimizar la densidad de la superficie para evitar el enlace limitado por transporte de masa de la molécula del analito con el compañero de enlace inmovilizado. Asimismo, los analistas deben considerar el nivel de inmovilización al realizar análisis de afinidad en estado de equilibrio puesto que los niveles elevados de inmovilización pueden ocasionar impedimento estérico o inducir efectos secundarios tales como enlace no específico o agregación. Antes de llevar a cabo un experimento cinético o un análisis de afinidad en estado de equilibrio, los analistas deben evaluar la actividad de la superficie inyectando la molécula del analito con una sola concentración. La concentración debe ser lo suficientemente alta como para que la respuesta de enlace en equilibrio provea una aproximación cercana de la respuesta máxima experimental (Rmáx). Esta condición a menudo se cumple cuando la concentración de la molécula diana es al menos 1O veces mayor que la K0 de la interacción del enlace. Para una interacción proteína-proteína con un valor K0 de 100 pM, esto significa que la molécula diana se debe inyectar con una concentración de al menos 1 nM. Usando la ecuación para Rmáx (Ecuaciones 7 y 2), los analistas pueden calcular la Rmáx teórica, basándose en la cantidad de compañero de enlace inmovilizado o capturado. Si la Rmáx experimental excede la Rmáx teórica, entonces la molécula del analito es más grande de lo esperado o la estructura del analito existe en un orden más alto del esperado (p.ej., después de la agregación o como un multímer). Si la Rmáx experimental es significativamente menor (<50%) que la Rmáx teórica, esto sugiere que el procedimiento de inmovilización ha comprometido al sitio de enlace y que debe investigarse un procedimiento de inmovilización alternativo. Una ventaja de usar una captura de alta afinidad en lugar del acoplamiento directo es que la actividad de la superficie por lo general se mantiene cercana al 100%, siempre y cuando la actividad específica del compañero de enlace inmovilizado sea del 100% antes de la captura. Inyectar la molécula en toda la superficie de referencia también proporciona una evaluación rápida de la cantidad de enlace no específico que existe en la superficie del sensor. El enlace no específico de naturaleza electrostática se puede eliminar o reducir mediante la adición de sal (p.ej., NaCI 0,5-1,0 M) al amortiguador de dilución de muestra y al amortiguador de corrida, o usando superficies de sensor con una baja densidad de carga. El enlace no específico que surge por las interacciones hidrófobas se puede minimizar o eliminar agregando detergentes, tales como Polisorbato 20 al 0,05% o CHAPS 1O mM, al amortiguador de dilución de muestra y al amortiguador de corrida. Antes de usar aditivos en los amortiguadores, los analistas deben analizar si la actividad de enlace o la interacción de enlace específicas podrían verse afectadas. El enlace no específico con una molécula de captura se puede resolver cambiando a una molécula de captura distinta. Reducir la densidad de la superficie también puede eliminar el enlace no específico. Muchas interacciones proteína-proteína se disocian lentamente (kd = 10-3 a 10-6 s-1 ), con vidas medias de los complejos (t112) de más de 2 horas. Una etapa de regeneración es importante para estos tipos de interacciones de enlace. En algunas interacciones proteína-proteína, puede no ser posible regenerar la superficie debido a una interacción de enlace de alta afinidad entre las moléculas. Si esta situación se presenta, los analistas pueden considerar un experimento
USP 39
Información General/ (1105) Métodos de Pruebas Inmunológicas 1397
cinético de valoración volumétrica o el uso de instrumentos que sean capaces de realizar las inyecciones de analitos de forma paralela. En una valoración volumétrica cinética, se inyectan concentraciones crecientes de la molécula diana de manera consecutiva en toda la superficie inmovilizada y los datos resultantes se analizan usando un modelo cinético de valoración volumétrica. En instrumentos paralelos, la serie de concentraciones del analito se inyecta en un solo paso, con lo que se elimina la necesidad de regeneración. La regeneración de la superficie a menudo no se lleva a cabo en experimentos de afinidad en estado de equilibrio debido a que las interacciones de enlace en este tipo de experimentos tiene valores kd en el intervalo de 10-2 a 0,5 segundos-1 y, por lo tanto, tienen valores t 112 de <2 minutos. El analito enlazado se disocia de la superficie a medida que el amortiguador fluye sobre la misma, por lo que no se requiere de regeneración. Los analistas deben tener una concentración exacta de analito para los análisis cinéticos puesto que el cálculo de k0 depende de la concentración del analito. Por lo general, se emplea para este propósito una lectura de absorbancia a una longitud de onda de 280 nm (A 280 ), pero los analistas deben recordar que el valor A280 refleja la proteína bruta total y en solución y no refleja la concentración real de proteína que es capaz de enlazarse (es decir, la concentración activa). Se deben incluir por duplicado inyecciones de diluyente de muestra para experimentos cinéticos y de afinidad en estado de equilibrio a fin de eliminar durante el proceso de evaluación de datos las respuestas no específicas debidas al instrumento o al diluyente de muestra. El intervalo de concentración de analito recomendado es 1 O veces por debajo y por encima de Ka para la interacción. Manteniendo la densidad de la superficie baja (Rmáx = 5-50 RU) y extendiendo el tiempo de asociación, los analistas deben ser capaces de recolectar datos con suficiente curvatura para definir con exactitud los valores de k0 y kd. Cuando la afinidad de la interacción es alta (Ka= baja nM a pM), pueden ser necesarias concentraciones más altas del analito para construir un perfil cinético con curvatura suficiente para completar el análisis cinético. Incrementar la concentración del analito no debe usarse como sustituto para cambiar otros parámetros del diseño experimental (p.ej., densidad de la superficie y tiempo de contacto). Aunque resulta deseable emplear concentraciones del analito que se aproximen a RmáXI en pocas ocasiones las altas concentraciones podrán inducir la agregación del analito en solución o el enlace no específico con la superficie. Dentro de una serie de concentraciones del analito, se deben usar muestras repetidas para evaluar la actividad superficial. Asimismo, cada serie de concentraciones se debe analizar de 3-5 veces usando superficies distintas para establecer intervalos de confianza para las constantes de cinética y afinidad resultantes. La cantidad de datos que se recolectan durante un experimento cinético o de afinidad en estado de equilibrio afecta la exactitud de los resultado. Para experimentos cinéticos que implican interacciones con valores kd bajos, los analistas deben recolectar suficientes datos de disociación para poder obtener una respuesta de disociación mensurable (vs. ruido del instrumento). Por ejemplo, una interacción de enlace entre un anticuerpo monoclonal terapéutico y su molécula diana que tiene un valor kd de 10-5 segundos- 1 requerirá una recolección de por lo menos 4 horas de datos de disociación. En vez de recolectar dicha cantidad de datos de disociación para todas las concentraciones de analito, los analistas pueden usar un tiempo largo de disociación para la concentración más alta de analito que se inyectará y pueden emplear u tiempo de disociación corto (2-5 minutos) para todas las demás concentraciones de analito. Usando instrumentos de inyección paralela es posible recolectar los largos datos de disociación para todas las concentraciones. Para evaluar los datos, los analistas deben recolectar datos de tiempos de disociación largos y cortos para las inyecciones de diluyente de muestra. Para experimentos de afinidad en estado contante, el tiempo de inyección del analito debe ser lo suficientemente largo como para permitir que ocurra una respuesta de enlace en estado de equilibrio con todas las concentraciones de analito analizadas. No es necesario recolectar los datos de disociación para un experimento de afinidad en estado de equilibrio, puesto que éstos no se usan en la evaluación de este tipo de experimento, pero se requiere la disociación completa del analito antes de comenzar la siguiente inyección. Uso de la RPS en un Ambiente Reglamentado Cuando las valoraciones de RPS se emplean para análisis de liberación de lote y de estabilidad, la valoración debe existir dentro de un entorno controlado de modo que se puedan tomar decisiones sobre el uso del producto dentro del ambiente clínico o comercial. El instrumental para RPS, incluyendo el software, debe cumplir con los requisitos de la Parte 11 del Título 21 del CFR y debe ser susceptible a la validación. Estos requisitos son importantes debido a que ayudan a asegurar la integridad tanto de la adquisición como de la evaluación de los datos. Además del uso de instrumental para RPS que cumpla con los requisitos reglamentarios, los analistas deben establecer criterios de aptitud del sistema para una valoración por RPS. Incluir dichos criterios en una valoración por RPS asegura que los resultados obtenidos para la muestra de prueba se generen mediante una valoración cuyo desempeño se encuentre dentro de sus parámetros operativos. El alcance de este capítulo no abarca la discusión sobre la evaluación de los parámetros de aptitud del sistema, pero se recomienda al lector referirse a los capítulos generales de la USP, Diseño y Análisis de Va/oraciones Biológicas (111) y Análisis de Va/oraciones Biológicas (1034) para análisis más detallados. Algunos ejemplos de parámetros de aptitud del sistema para una valoración por RPS pueden incluir: • densidad de inmovilización del ligando • parámetros a partir de un modelo de ajuste de curva (p.ej., un ajuste de curva logístico de cuatro parámetros) - valores de EC 50 para la curva estándar de referencia y una curva de Control de Calidad positiva - Asíntotas efectivas (intervalo de respuesta) para una curva estándar de referencia y una curva de Control de Calidad positiva
1 398 (1105) Métodos de Pruebas Inmunológicas / Información General
USP 39
- R2 valores para una curva estándar de referencia y una curva de Control de Calidad positiva - paralelismo entre una curva estándar de referencia y una curva de Control de Calidad positiva • actividad biológica relativa para Control de Calidad positivo (cociente EC 50 entre el estándar de referencia y el control positivo) •concentración calculada para Control de Calidad positivo (medición de Control de Calidad Positivo de un solo punto) • respuesta de enlace para Control de Calidad negativo (analito o diluyente no específico) Se deben usar múltiples lotes de ligando, analito, reactivos de acoplamiento y superficies para establecer criterios de aptitud del sistema de valoración que reflejen condiciones normales de valoración. Se debe dar seguimiento a los resultados de valoración para las muestras de estándar de referencia y de Control de Calidad. Se deben aplicar análisis regulares de tendencias a los datos para comprobar que la valoración por RPS permanece controlada durante su ciclo de vida requerido. Si se observan tendencias en los datos, se pueden tomar acciones correctivas de manera proactiva para prevenir futuras fallas. Para las valoraciones por RPS que se usan en el análisis de liberación de lote, también es importante establecer criterios de aceptación de la muestra. Estos criterios se usan para aceptar o rechazar los datos de muestra y pueden incluir: • bioactividad relativa para la muestra de prueba • coeficiente de variación (CV) para determinaciones repetidas de la muestra • paralelismo entre la curva estándar de referencia y curva de Control de Calidad postiva Otro punto a considerar para valoraciones por RPS en ambientes reglamentados es la identificación de reactivos críticos y no críticos. Los reactivos no críticos por lo general incluyen amortiguadores de acoplamiento, de regeneración y de flujo continuo (corrida). Los reactivos críticos a menudo incluyen el ligando y el analito para ensayos de enlace directo, y el ligando, analito y molécula competidora en ensayos de enlace por inhibición. Los reactivos críticos deben someterse de manera rutinaria a calificación/recalificación para asegurar que son adecuados para su uso en la valoración por RPS. El alcance de este capítulo no comprende las mejores prácticas para la caracterización de reactivos oficiales, por lo que se recomienda al lector referirse a los documentos reglamentarios vigentes correspondientes. Se recomienda a los analistas usar documentos reglamentarios vigentes, tales como las Pautas de la ICH Q2(Rl) Validation of Analytical Procedures y el Capítulo General de los compendios USP-NF Validación de Procedimientos Farmacopeicos (1225) para validar valoraciones por RPS en un laboratorio reglamentado.
(1106) ENSAYOS DE INMUNOGENICIDAD-DISEÑO Y VALIDACIÓN DE INMUNOENSAYOS PARA DETECTAR ANTICUERPOS ANTI FÁRMACOS INTRODUCCIÓN V ALCANCE La inducción de anticuerpos antifármacos (ADA, por sus siglas en inglés) puede ocurrir cuando los sistemas inmunes animales o humanos reconocen un medicamento proteico como extraño. La administración de productos biofarmacéuticos puede inducir la formación de anticuerpos antifármacos específicos del producto, además de que diversos tipos de respuestas de anticuerpos antifármacos se pueden desarrollar tanto en estudios clínicos como no clínicos. [NOTA-El Apéndice contiene una lista de documentos reglamentarios, informes oficiales y otras referencias pertinentes.] Aunque el enfoque principal de este capítulo es el diseño y la validación de inmunoensayos para anticuerpos antifármacos, también se incluye información sobre la estrategia general del análisis del ensayo de inmunogenicidad basado en riesgos que incluye estudios preclínicos y clínicos. Los resultados del ensayo de anticuerpos antifármacos son directamente influenciados por el diseño del ensayo, los reactivos, la forma en que se realiza, las muestras que se corren (tiempo de recolección de muestras, etc.) y la forma en que se analizan los datos. De hecho, resulta esencialmente imposible comparar los resultados de estudios que emplean ensayos diferentes de anticuerpos antifármacos. Las pautas, tales como este capítulo de información general, que recomiendan las mejores prácticas y consideraciones para el desarrollo de ensayos de anticuerpos antifármacos ayudan a asegurar que los ensayos produzcan resultados significativos para la seguridad del paciente y la eficacia del producto. La principal preocupación derivada de la inmunogenicidad no deseada o no prevista de productos biológicos yace en si los anticuerpos producidos por los pacientes que reciben el producto podrían llevar a algún tipo de respuesta clínica (p.ej., efectos sobre la seguridad o la eficacia del tratamiento). La utilidad e interpretación de los estudios toxicológicos preclínicos también se puede ver influenciada por la presencia de anticuerpos antifármacos. La farmacocinética o la actividad farmacológica del fármaco se puede ver alterada por anticuerpos antifármacos que mejoran o reducen la eliminación del producto, alteran la biodisponibilidad o inhiben o exacerban la acción farmacológica del fármaco. Cuando existe una contraparte endógena de un fármaco, los anticuerpos antifármacos que inhiben la actividad del producto también pueden ligarse y provocar reacciones cruzadas con la proteína endógena contraparte del producto, lo que podría conducir a un síndrome de deficiencia. Ante ciertas circunstancias, los anticuerpos antifármacos pueden formar complejos in-
USP 39
Información General/ (1106) Ensayos de lnmunogenicidad 1 399
munes capaces de inducir respuestas clínicas del tipo de la enfermedad del suero. Asimismo, las respuestas de los anticuerpos antifármacos de isotipo lgE pueden generar anafilaxis. El rol de las evaluaciones de inmunogenicidad va en crecimiento en el desarrollo de productos biofarmacéuticos como parte de las Evaluaciones de Riesgos para la Calidad del Producto y en la evaluación de la criticidad de los atributos de calidad (conforme a lo descrito en las pautas Q8 y Q9 de la ICH). Asimismo, son de utilidad para demostrar la comparabilidad de procesos y productos tras la aplicación de cambios en el proceso de fabricación. Frecuentemente, el proceso de fabricación de un producto terapéutico biológico se irá perfeccionando durante el desarrollo clínico, mientras que los cambios generalmente ocurren después de que el patrocinador obtiene la autorización para su comercialización. Aunque dichos cambios son menores, podrían afectar la actividad biológica, la eficacia o la seguridad de un producto terapéutico biológico, en particular la inmunogenicidad es un factor clave a considerar. Los cambios en niveles y tipos de productos de degradación (oxidados, desaminados, agregados, entre otros), isoformas de proteína e impurezas relacionadas con el proceso de producción tales como proteínas de células hospederas y ADN podrían afectar la inmunogenicidad y requerir una evaluación más a fondo.
FACTORES QUE AFECTAN EL POTENCIAL INMUNOGÉNICO DE UNA PROTEÍNA TERAPÉUTICA Son muchos los factores que pueden influenciar que la administración de un producto biológico induzca una respuesta inmune en el paciente, entre los que se incluyen la estructura misma del producto proteico, las variantes del producto, las formulaciones del producto, el estado inmune y la composición genética del paciente, además de la ruta y régimen de dosificación usado en la clínica.
Estructura Proteica La estructura primaria del producto (secuencia de aminoácidos) y sus variantes pueden determinar si existen epitopes inmunogénicos que el sistema inmune del paciente reconozca como extraños, lo que conllevaría una respuesta inmune. No es sorprendente que las secuencias de aminoácidos que no se encuentran en las proteínas humanas y que, por ende, el sistema inmune humano podría reconocer como extrañas (p.ej., aquéllas derivadas de una línea celular no humana o elaboradas con proteínas creadas por ingeniería genética, p.ej., proteínas de fusión), pueden inducir una respuesta inmune en humanos. Además, la modificación química de aminoácidos (p.ej., oxidación o desamidación) puede resultar en una secuencia que puede inducir una respuesta inmune, aunque, al día de hoy, son pocos los datos que han confirmado dichos incidentes después de la administración de proteínas terapéuticas. El corte de la proteína podría exponer secuencias de aminoácidos (neoepitopes) normalmente no expuestos en la proteína nativa, provocando una respuesta inmune. En general, la glicosilación no parece desempeñar un papel importante en la inducción de respuesta inmune a productos biológicos, aunque la glicosilación no humana (p.ej., murina) o no mamífera (p.ej., productos derivados de plantas) puede inducir respuesta inmune. Un ejemplo de lo anterior es un anticuerpo monoclonal humano que contenía un residuo terminal de galactosa-a-1,3-galactosa debido a una modificación postranslacional introducida durante la producción del fármaco en una línea celular murina. Este anticuerpo fue antigénico y ocasionó reacciones severas de hipersensibilidad en individuos previamente sensibilizados que portaban una lgE de reacción cruzada. No se presentó evidencia de que este glicano indujese reacciones inmunes primarias en individuos sin tratar (es decir, que no fueron previamente sensibilizados). Dichos ejemplos son poco comunes. En efecto, en la mayoría de los casos, los carbohidratos complejos pueden prevenir o reducir la antigenicidad de las proteínas inmunogénicas, debido a que enmascaran los epitopes, impidiendo su unión a los anticuerpos. Se ha demostrado que el agregado de proteínas induce inmunogenicidad en modelos animales. Los mecanismos de acción propuestos incluyen la presentación de agregados proteícos de alto peso molecular, la repetición de subunidades (multímeros) directamente en las células B, induciendo así una respuesta independiente de las células To, alternativamente, mediante la inducción de una respuesta dependiente de las células T a través de una presentación de antígeno mejorada. Se ha intentado agregar moléculas de polietilenglicol (PEG) (PEGilación) a productos terapéuticos recombinantes para atenuar la inmunogenicidad y la antigenicidad de proteínas recombinantes limitando la exposición de los epitopes. Aunque no existe evidencia clara que establezca que la inmunogenicidad de las proteínas disminuya con la PEGilación, algunos datos clínicos sugieren que la PEGilación puede limitar la unión de anticuerpos (es decir, antigenicidad) con el esqueleto de la proteína. El PEG mismo puede ser inmunogénico y los anticuerpos anti-PEG deben monitorearse, especialmente en sujetos con hipersensibilidad conocida al PEG. De hecho, se encuentra presente en la población general un nivel de fondo de anticuerpos anti-PEG, lo que lleva a la necesidad de desarrollar un ensayo de anticuerpos anti-PEG al igual que un ensayo de anticuerpos antifármacos durante el desarrollo clínico de los productos PEGilados.
Impurezas Relacionadas con el Proceso Las impurezas relacionadas con el proceso de producción de fármacos tales como endotoxinas, ADN de la célula hospedera, o proteínas, pueden actuar como adyuvantes y pueden provocar una respuesta inmune al producir señales de peligro mediante la activación de receptores celulares inmunes tales como los receptores del tipo Toll. Algunas fuentes postulan que los lixiviables provenientes de los componenes de envasado primario también pueden actuar como estimuladores de respuesta inmu-
1400 (1106) Ensayos de lnmunogenicidad / Información General
USP 39
ne o afectar la estructura de alto orden del producto proteico e inducir una respuesta inmunogénica, aunque no se cuenta todavía con datos que lo demuestren.
Estado Inmune del Paciente La capacidad del sistema inmune del paciente para reconocer y responder a un producto proteico puede dictar el nivel de respuesta inmune. Los pacientes que consumen fármacos inmunosupresores tales como glucocorticoides, ciclosporina o metotrexato, pueden presentar una probabilidad menor de respuesta inmune a un producto proteico, a pesar del potencial inmunogénico de éste. Por el contrario, las enfermedades autoinmunes y la inflamación pueden conllevar la sobreactivación del sistema inmune, por lo que el nivel de inmunogeniciad del producto puede ser mucho mayor de lo previsto. Asimismo, se debe tomar también en cuenta la actividad farmacológica de la proteína terapéutica misma. Algunas proteínas terapéuticas dirigidas contra antígenos de células B pueden agotar las células B periféricas. Por el contrario, otras proteínas terapéuticas pueden presentar actividades inmunomoduladoras, p.ej., alterar los patrones de tráfico de células T. Estas actividades pueden afectar la capacidad de un paciente individual o de una población de pacientes para desarrollar una respuesta inmune a un producto proteico. Además, se debe considerar el estado inmune de un paciente cuando éste presenta anticuerpos antifármacos específicos previamente existentes, anticuerpos antifármacos de reacción cruzada (por ejemplo, en el caso de productos de origen murino o de plantas), o anticuerpos contra impurezas provenientes de las líneas celulares usadas en la producción, las cuales pueden inducir una respuesta clínica no deseada.
Antecedentes Genéticos del Paciente Las moléculas que reconocen y presentan péptidos derivados de proteínas al sistema inmune adaptativo-el antígeno de leucocitos humanos o las moléculas de antígeno mayor de histocompatibilidad (CMH)-presentan una diversidad genética considerable entre individuos y entre poblaciones en diferentes partes del mundo. Dicha diversidad es una de las razones por las que diferentes pacientes pueden presentar diferentes respuestas inmunes al mismo producto. Por consiguiente, si los estudios clínicos incluyen sólo una población con diversidad genética limitada, entonces el perfil de inmunogenicidad de un producto de proteínas terapéuticas en dicha población puede no reflejar su perfil de inmunogenicidad en la población más grande y más diversa a la que quedaría expuesto después de su aprobación.
Dosis y Vía de Administración La forma en que se utiliza un producto de proteínas terapéuticas puede influenciar su potencial de inmunogenicidad. Las diversas vías de administración parecen tener diferentes efectos en la inmunogenicidad, y la inyección subcutánea por lo general se percibe como una vía de exposición más inmunogénica que la administración intravenosa. El régimen de dosificación también puede influenciar la inmunogenicidad. Un producto de proteínas terapéuticas que por lo regular se administra una vez como una sola dosis (p.ej., una proteína trombolítica) es menos propenso a inducir una respuesta inmune que una proteína terapéutica que se usa en un régimen multidosis debido a que el sistema inmune por lo regular requiere de cebado seguido de estimulación (prime-boost) para asegurar una respuesta robusta. Los pacientes pueden tener una sensibilización preexistente incluso sin ninguna exposición conocida a un producto terapéutico proteíco y pueden presentar respuestas clínicas adversas durante la primera exposición. No obstante, se ha demostrado que los productos con vidas medias largas o aquéllos que son particularmente inmunogénicos (p.ej., aquéllos con múltiples epitopes - células T) inducen anticuerpos antifármacos después de una sola inyección. Un régimen de dosificación crónico tiene una mayor probabilidad de inducir una respuesta inmune debido a que el sistema inmune recibe múltiples exposiciones al producto y esto puede llevar a una respuesta más intensa de las células T de memoria. Otro régimen que ha ocasionado anticuerpos antifármacos con secuelas clínicas es uno mediante el cual se provee un producto durante un periodo corto, se detiene la administración, y luego se introduce de nuevo sólo después de transcurrido un largo periodo de reposo. Esto tiene el efecto de cebar el sistema inmune y la reintroducción puede ocasionar eventos relacionados con la respuesta inmune tales como respuestas alérgicas. El uso de dosificación crónica de manera regular, aunque provee el medicamento de manera repetida, parece evitar dicha hipersensibilidad mediante la inducción de algún tipo de tolerancia.
DETERMINACIÓN DE LA INMUNOGENICIDAD PRECLÍNICA Y CLÍNICA lnmunogenicidad Preclínica: Relevancia y Alcance La inmunogenicidad de muchos productos terapéuticos biológicos es mayor en los estudios preclínicos y tiene un bajo valor predictivo para humanos debido a que una respuesta inmune a proteínas humanas o humanizadas tiende a ser mayor en animales que en los humanos dada la condición de desconocimiento de la proteína en los animales y la ausencia de una contraparte biológica endógena. Aunque la detección de anticuerpos antifármacos en animales puede no ser relevante desde el pun-
USP 39
Información General/ (1106) Ensayos de lnmunogenicidad 1401
to de vista clínico, los investigadores deben evaluar los anticuerpos antifármacos para la interpretación de los datos de toxicidad requeridos necesarios para las presentaciones reglamentarias (ver la pauta ICH S6R1 en el Apéndice). Por lo general, las evaluaciones de anticuerpos antifármacos, los datos de farmacocinética y los datos de farmacodinámica ayudan con la interpretación de los resultados y la validez de los estudios de toxicología en animales. En algunos casos, los datos de inmunogenicidad preclínica también se pueden usar para comparar la inmunogenicidad relativa de los productos antes y después de los cambios en la fabricación, aunque esto parece ser significativo sólo con los cambios más importantes en la inmunogenicidad relativa. Los estudios preclínicos, particularmente en especies animales más evoluvionadas, por lo general no incluyen un análisis estadístico adecuado que permita generar conclusiones sobre inmunogenicidad relativa, aunque, cuando se presenta el caso, se debe reconocer que las diferencias en la restricción de CMH y la tolerancia inmune natural de animales frente a la de humanos no pueden permitir la traslación de dicha información sobre efectos en humanos. Asimismo, se debe reconocer que la variedad de las especies usadas en estudios preclínicos es limitada en cuanto a la diversidad genética en comparación con la población humana. Los anticuerpos antifármacos pueden alterar la exposición a un fármaco activo mediante el bloqueo de la unión del agente terapéutico con la diana o acelerando la eliminación del agente terapéutico de la circulación, lo cual resulta en una exposición reducida. Los anticuerpos antifármacos pueden incrementar la vida media de fármacos biológicos y con esto la exposición, si el complejo fármaco-anticuerpo antifármaco sigue siendo biológicamente activo. Por lo general, las muestras deben recolectarse para posibles análisis de anticuerpos antifármacos a partir de todos los estudios preclínicos de seguridad en los que los animales se exponen al fármaco durante más de 7 días (ver las referencias en el Apéndice para más información). Debido a que la consideración clave para incluir análisis de inmunogenicidad en estudios no clínicos es demostrar la exposición al fármaco durante el transcurso del estudio, esto también se puede lograr demostrando la modulación mediada por fármacos de un marcador farmacodinámico. Además, la ausencia de un efecto en la concentración del suero o perfil farmacocinético del medicamento también puede demostrar de manera indirecta la ausencia de efectos detectables de un anticuerpo antifármaco ante la exposición al fármaco. No obstante, en algunas situaciones el desarrollo de un anticuerpo antifármaco podría no afectar de manera significativa la eliminación del fármaco, sino que, en vez de esto, el anticuerpo antifármaco puede afectar la unión del fármaco con la diana y su actividad prevista (p.ej., anticuerpos anti-idiotipo). Por lo tanto, también se debe tomar en cuenta la falta de un efecto sobre un marcador farmacodinámico y/o sobre la farmacocinética para asegurar que la actividad no se vea afectada por el anticuerpo antifármaco. Para la mayoría de los estudios no clínicos, se deben recolectar muestras en las distintas fases del estudio, almacenarlas y analizarlas con respecto a cualquier cambio farmacológico o toxicológico observado. De hecho, la mayoría de los estudios toxicológicos no clínicos no evalúan la cinética del desarrollo de anticuerpos antifámacos, y, por lo general, las muestras para la evaluación de anticuerpos antifármacos se toman al comienzo, al final del tratamiento y al final de los periodos de recuperación. Los análisis de muestras tomadas durante la fase de dosificación también se pueden realizar si se observan datos farmacocinéticos o hallazgos toxicológicos inusuales al final del estudio. En este caso, se debe tomar en cuenta que la interferencia del fármaco puede complicar el análisis de las muestras tomadas durante la fase de dosificación. Por tanto, es importante tomar muestras en tiempos de muestreo apropiados (p.ej., antes de la siguiente dosis) y contar con ensayos adecuados de alta tolerancia al fármaco. En algunos casos, cuando pudiera presentarse una diana soluble en la circulación, el conocimiento del nivel de anticuerpos antifármacos (títulos o unidades de masa relativa) puede facilitar la interpretación de hallazgos toxicológicos. Se debe usar un enfoque basado en riesgos para determinar si es necesaria la caracterización adicional (p.ej., demostrar la actividad neutralizante) en los estudios preclínicos. Dicha decisión se puede ver afectada por factores tales como la presencia de contrapartes endógenas, la utilidad de un marcador farmacodinámico o el ensayo farmacocinético. Si se consideran necesarios datos a partir de un ensayo de anticuerpo neutralizante (AcN), entonces dicho ensayo puede ser un inmunoensayo de inhibición de la unión a la diana o una valoración basada en células, independientemente del nivel de riesgo. La evaluación de inmunogenicidad y la interpretación de los datos del estudio generalmente requieren de muestreos en serie y análisis de muestras de suero para farmacocinética, farmacodinámica y anticuerpos antifármacos. Dichos muestreos repetidos y frecuentes podrían no ser factibles cuando los investigadores lleven a cabo estudios que utilizan roedores, particularmente ratones. En tales casos, el estudio se puede diseñar para permitir análisis discretos de toxicidad, farmacocinética y farmacodinámica de anticuerpos antifármacos a partir de grupos de ratones tratados de manera similar con la recolección de muestras en tiempos de muestreo similares que permitan el análisis ilativo de los efectos observados en todos los grupos de tratamiento.
Estudios Clínicos: Relevancia y Alcance de las Evaluaciones de lnmunogenicidad En los estudios clínicos, la detección y caracterización de anticuerpos antifármacos resulta importante para entender la seguridad, exposición y perfil de eficacia del producto terapéutico. Por lo general, la estrategia de análisis de anticuerpos antifármacos en estudios clínicos incluye un ensayo de detección (screening) para anticuerpos que se unen al fármaco y, posteriormente, un ensayo confirmatorio, seguido de una caracterización adicional de AcN. Los datos de inmunogenicidad de estudios clínicos por lo general se analizan en el contexto de su relevancia para la farmacocinética y la farmacodinámica del producto terapéutico y para los efectos adversos. Para terapias de reemplazo (p.ej., terapias de reemplazo de enzimas, factores de coagulación sanguínea y eritropoyetina), se debe diseñar un extenso programa de monitoreo basado en la detección de anticuerpos antifármacos combinado con múltiples parámetros de seguridad para monitorear el potencial de eventos adversos serios.
1402 (1106) Ensayos de lnmunogenicidad / Información General
USP 39
Los investigadores deben considerar la cinética de la aparición de los anticuerpos antifármacos durante los estudios clínicos debido a que esto puede afectar no sólo la detección de anticuerpos antifármacos, sino también las secuelas clínicas potenciales. Algunos productos inducen anticuerpos rápidamente, pero otros productos bioterapéuticos pueden tomar años antes de que se detecte una respuesta inmune o que ésta pueda relacionarse con alguna secuela clínica. Los investigadores también deben considerar si una respuesta de anticuerpo es transitoria o persistente. Por lo tanto, es importante entender la cinética de la presencia de los anticuerpos antifármacos. Este objetivo se puede lograr seleccionando cuidadosamente los tiempos de recolección de muestras de anticuerpos antifármacos y procediendo con cuidado en el desarrollo del ensayo de anticuerpos antifármacos para estudios clínicos. Las muestras deben recolectarse durante cada fase del estudio (antes del tratamiento, durante el tratamiento y durante cualquier fase de suspensión del tratamiento). La sensibilidad y la tolerancia a fármacos del ensayo de anticuerpos antifármacos también debe ser apropiada para el uso previsto de la valoración. Por ejemplo, cuando los productos tengan vidas medias largas (p.ej., anticuerpos monoclonales) los científicos deberán desarrollar ensayos de anticuerpos antifármacos que sean capaces de detectar anticuerpos antifármacos en presencia de producto en el nivel esperado en las muestras de prueba de pacientes. Asimismo, durante el diseño de los planes de muestreo de anticuerpos antifármacos, los investigadores deben considerar la aptitud de la obtención de muestras después de un periodo de suspensión del medicamento. El número de pacientes evaluados para anticuerpos antifármacos en ensayos clínicos y la duración y tiempo de la recolección de muestras de anticuerpos antifármacos son factores críticos para entender la incidencia y el impacto clínico de los anticuerpos antifármacos. Existen otros factores que pueden frustrar los análisis de anticuerpos antifármacos, los cuales incluyen la naturaleza del producto terapéutico mismo, la presencia de anticuerpos de reacción cruzada preexistentes, factores reumatoideos, anticuerpos heterófilos, dianas solubles o ligandos. Se deben tomar muestras para evaluar los niveles de estos factores interferentes en el suero (y en otros marcadores farmacodinámicos, según corresponda) al mismo tiempo que las muestras de anticuerpos antifármacos. Además de determinar la presencia de anticuerpos de unión, los estudios de inmunogenicidad por lo general incluyen la caracterización adicional de muestras positivas en valoraciones cuantitativas, así como de AcN para determinar el efecto potencial de los niveles de anticuerpos antifármacos para neutralizar el efecto del fármaco o para mediar los eventos de seguridad. Asimismo, comprender la cinética del desarrollo de anticuerpos antifármacos y de AcN mediante la detección de anticuerpos antifármacos en muestras secuenciales tomadas durante todas las fases del estudio y la explicación de las clases y subclases de inmunoglobulinas de los anticuerpos antifármacos puede ayudar a comprender mejor los factores relacionados con el paciente y con el tratamiento así como los mecanismos a través de los cuales el producto terapéutico induce el desarrollo de anticuerpos antifármacos.
ENFOQUE BASADO EN RIESGOS PARA EVALUAR LA INMUNOGENICIDAD Y SUS CONSECUENCIAS Evaluación de Riesgos Potenciales de la lnmunogenicidad Específica del Producto El concepto de riesgo se define en la pauta ICH Q9 como la combinación de la probabilidad de que ocurra un daño y la severidad del mismo. En relación con los productos farmacéuticos, la protección del paciente mediante la gestión de riesgos para la seguridad debe considerarse de primordial importancia y, por ende, las evaluaciones de riesgos de respuestas inmunes inducidas por los productos deben enfocarse más en la severidad potencial de las consecuencias clínicas derivadas de las respuestas de los anticuerpos antifármacos que en la probabilidad de que se presenten dichas respuestas. La mayor preocupación se centra en un pequeño número de pacientes que presentan efectos secundarios severos o que ponen en riesgo sus vidas debido a anticuerpos antifármacos, más que un número mayor de pacientes con anticuerpos antifármacos sin consecuencias clínicas. La mitigación de riegos también debe incluirse en el proceso general de evaluación de riesgos (p.ej., la eliminación del impacto clínico mediante la administración conjunta de otro medicamento). Aunque las estrategias de análisis de anticuerpos antifármacos pueden basarse en la evaluación de riesgos de inmunogenicidad, esto puede no siempre resultar factible durante el desarrollo temprano del fármaco, cuando podría no contarse con ensayos confiables. Los eventos de seguridad inducidos por anticuerpos antifármacos pueden ir desde efectos secundarios moderados hasta condiciones que atenten contra la vida. La potencial severidad de las consecuencias de una respuesta de anticuerpos antifármacos debe considerarse tan pronto como sea posible. La Tabla 1 resume algunos, no todos, los factores de riesgo que pueden influenciar la severidad de las consecuencias clínicas de una respuesta de anticuerpos antifármacos. Tabla 1. Factores Que Pueden Influenciar la Severidad de las Secuelas Clínicas Relacionadas con los Anticuerpos Antifármacos Presencia de una contraparte endógena idéntica (incluye familias de proteínas que comparten dominios)
1
Menor Riesgo 1
Mediano Riesgo
Mayor Riesgo
La contraparte no endógena (p.ej., toxina botulínica)
Contraparte redundante (p.ej., interferón u hormonas de erecimiento)
Contraparte no redundante [p.ej., eritropoyetina o factor de crecimiento y de desarrollo de megacariocitos (MGDF, por sus siglas en inglés)]
El riesgo es una consecuencia de la severidad y la frecuencia.
USP 39
Información General/ (1106) Ensayos de lnmunogenicidad 1403
Tabla 1. Factores Que Pueden Influenciar la Severidad de las Secuelas Clínicas Relacionadas con los Anticuerpos Antifármacos (Continuación)
Presencia de una molécula o dominio endógeno estructuralmente relacionadas
Menor Riesgo 1
Mediano Riesgo
Mayor Riesgo
Sin molécula o dominio endógeno estructuralmente relacionados
Existe una molécula o dominio endógeno medianamente relacionado desde el punto de vista estructural
Existe una molécula o dominio endógeno altamente relacionado desde el punto de vista estructural
Estado de la enfermedad del paciente
Pone en riesgo la vida
Moderado a severo
Moderado
Consecuencias clínicas potenciales de la inmunogenicidad
Sin impacto clínicamente significativo en la seguridad o en la eficacia
Impacto manejable en la seguridad o en la eficacia
Influencia clínica extensa sobre la seguridad o pérdida (o reducción dramática) de eficacia
1
El riesgo es una consecuencia de la severidad y la frecuencia.
Son varios los factores que pueden contribuir con la incidencia de una respuesta de anticuerpos antifármacos. La Tabla 2 presenta sólo algunos de estos factores. Durante una evaluación de riesgo de inmunogenicidad, se deben tomar en cuenta los factores presentados en la Tabla 2 en conjunto con los de la Tabla 1. Las consecuencias clínicas de la inmunogenicidad son impredecibles, incluso con las evaluaciones de riesgos descritas anteriormente. Una evaluación de riesgos de inmunogenicidad adquiere gran valor únicamente cuando se consideran cuidadosamente todos los factores que influyen en la probabilidad y severidad de una respuesta inmune potencial. Las evaluaciones de riesgos deben realizarse de tal modo que su funcionalidad sea cruzada, incluyendo el aporte de personal clínico, de las evaluaciones de seguridad, de la farmacocinética, de los científicos bioanalíticos, además de los científicos que realizan el proceso. Las consultas a las autoridades reglamentarias y los consejos de monitoreo de la seguridad clínica también pueden ser útiles y se deben llevar a cabo repetidamente durante el proceso de desarrollo del producto a medida que se obtienen datos clínicos. Las secuelas clínicas mediadas por anticuerpos antifármacos y la tasa de incidencia de anticuerpos antifármacos son entidades separadas, aunque existe una relación interna entre ambos factores debido a que el número de pacientes con eventos adversos mediados por anticuerpos puede elevarse con una tasa de incidencia de anticuerpos antifármacos más alta. Tabla 2. Factores Que Pueden Influenciar la Incidencia de Anticuerpos Antlfármacos Incidencia Menor Nivel circulante de contraparte endógena
Abundante
Incidencia Media
Incidencia Mayor
Escaso
Ninguno
Estado inmune del paciente
Suprimido
Normal
Activado
Exposición: régimen o frecuencia de dosificación
Dosis única
Crónica (mantenimiento)
Dosificación episódica
Vía de exposición
Intravenosa u oral
Dosis múltiples Subcutánea, intramuscular, mucosa (no por inhalación)
Niveles más bajos (o ausencia) de impurezas del producto o relacionadas con el proceso (p.ej., agregados o desnaturalización, fragmentación)
Características del Producto
Se mantiene la integridad molecular de la sustancia activa
Contenido bajo o nulo de epitopes potenciales de células T
lntradérmica o por inhalación Niveles más altos de impurezas del producto o relacionadas con el proceso (p.ej., agregados o desnaturalización, fragmentación)
Niveles intermedios de impurezas del producto o relacionadas con el proceso, y contenido potencial de epitopes
Nivel más alto de epitopes antigénicos (derivados de líneas celulares murinas, contienen secuencias mutadas nuevas, etc.) Mecanismo de acción: activación inmune
Mecanismo de acción: p.ej., inmunosupresor
Enfoque Basado en Riesgos para la Estrategia de Análisis de Anticuerpos Antifármacos La estrategia de análisis de anticuerpos antifármacos debe basarse en una evaluación de riesgos de inmunogenicidad. Los ensayos de inmunogenicidad y los esquemas de análisis apropiadamente diseñados, validados y ejecutados proveen datos que hacen posible evaluar los riesgos y predecir los eventuales resultados para los pacientes. La frecuencia del muestreo, las evaluaciones de la actividad neutralizante y las mediciones cualitativas o semi cuantitativas pueden depender en su totalidad de los riesgos percibidos. En los estudios clínicos, la seguridad del paciente es una preocupación mayor, y el grado de caracterización de anticuerpos antifármacos necesario depende del riesgo potencial de secuelas relacionadas con los anticuerpos antifármacos. Asimismo, también se debe tomar en cuenta el tipo de fármaco. Por ejemplo, para una proteína de fusión de componentes múltiples que contiene al menos un componente con un riesgo potencialmente elevado de eventos adversos, se recomienda un método de mapeo de dominios (es decir, reactividad de los anticuerpos antifármacos con componentes individuales).
1404 (1106) Ensayos de lnmunogenicidad / Información General
USP 39
Por lo general, se debe aplicar análisis y caracterizaciones de anticuerpos antifármacos más extensas cuando exista un alto riesgo de efectos clínicos adversos. Las muestras deben analizarse y caracterizarse basándose en el tiempo y la incidencia de la respuesta de los anticuerpos antifármacos, así como en la ocurrencia y severidad de los efectos clínicos secundarios. Normalmente, un riesgo mayor de incidencia de anticuerpos antifármacos no demanda una caracterización extensa de anticuerpos antifármacos, y, por lo general, el riesgo de consecuencias clínicas dirige la estrategia bioanalítica. No obstante, algunas investigaciones pueden ser guiadas por la necesidad de entender la causa de una alta incidencia de anticuerpos antifármacos (p.ej., la reactividad de anticuerpos antifármacos con fármacos agregados contra no agregados). La siguiente estrategia de análisis basada en riesgos y dividida en etapas puede perfeccionarse dependiendo del nivel de riesgo del producto durante el diseño de los estudios clínicos para asegurar la obtención de la máxima cantidad de datos, incluidas las correlaciones con farmacocinética, farmadinámica, entre otros. ETAPA 1 Desarrollar métodos para anticuerpos antifármacos que sean adecuados para el propósito y que concuerden con las mejores prácticas de la industria y las pautas reglamentarias. Incorporar el análisis de anticuerpos antifármacos para muestras obtenidas antes (línea de base) y después del inicio del tratamiento con el medicamento en el diseño del estudio clínico, junto con un análisis concurrente de farmacocinética, más cualquier marcador de farmacodinámica, seguridad o eficacia pertinente que facilite la interpretación de los datos de anticuerpos antifármacos. El análisis de los resultados de las pruebas de anticuerpos antifármacos debe transformarse en planes de análisis para el estudio. ETAPA 2 Realizar el análisis de detección de anticuerpos antifármacos a todas las muestras previas y posteriores a la dosificación. Dos pruebas importantes que deben realizarse en todos los casos son el ensayo de detección de anticuerpos antifármacos y el ensayo confirmatorio de inhibición del fármaco o del agotamiento de la inmunoglobulina. Informar como negativo cualquier resultado de anticuerpos antifármacos que esté por debajo del punto de corte del ensayo y con niveles de fármaco por debajo de los niveles de interferencia, así como aquéllos que resulten negativos en el ensayo confirmatorio. Se prefieren métodos de prueba que sean capaces de ofrecer una detección sensible de anticuerpos antifármacos a pesar de niveles bajos de fármaco. Si no se cuenta con dichos métodos, las muestras que contienen fármacos por encima de los niveles de interferencia deben informarse como no concluyentes con una declaración de posible interferencia del fármaco. En dichos casos, los análisis de anticuerpos antifármacos se pueden realizar más adelante, después de un periodo de eliminación del fármaco para obtener un resultado concluyente (para más información, consultar la sección Sensibilidad Relativa de este capítulo). Para las muestras positivas confirmadas, se deben estimar los niveles de anticuerpos antifármacos, de preferencia mediante titulación, aunque pueden informarse en términos de unidades de masa relativa. Algunas plataformas tecnológicas basadas en masa pueden requerir el uso de unidades de masa relativa. ETAPA 3 Se debe analizar la capacidad neutralizante y, potencialmente, otras características de las muestras consideradas positivas en la Etapa 2, dependiendo de la evaluación de riesgos. En situaciones de alto riesgo, se debe medir la actividad de AcN, por lo general usando un ensayo basado en células. Dependiendo del mecanismo de acción del fármaco, en ocasiones es posible usar un formato de ensayo de unión de ligandos de AcN siempre y cuando se demuestre adecuadamente la detección específica de AcN. Los datos de farmacocinética/farmacodinámica/seguridad o de marcador biológico generados de manera simultánea deben usarse para ayudar a interpretar la relevancia clínica de la actividad neutralizante de los anticuerpos. Además, la determinación de los isotipos y la afinidad de los anticuerpos antifármacos puede ser útil para la evaluación general de la respuesta inmune. Las reacciones alérgicas relacionadas con la administración de fármacos pueden requerir la medición de lgE específica del fármaco, aunque la detección puede depender del esquema de muestreo y del diseño del método.
DISEÑO DE MÉTODOS DE PRUEBA BASADOS EN INMUNOENSAYOS Los métodos de inmunoensayo para la detección de anticuerpos antifármacos por lo general son complejos y requieren un amplio entendimiento de múltiples desafíos técnicos. Los ensayos de detección que sirven como primera etapa clave en el esquema de análisis de inmunogenicidad se diseñan para contar con cierta tasa de falsos positivos (más que falsos negativos) a fin de maximizar la sensibilidad para la detección de anticuerpos antifármacos. Además, usando un enfoque basado en riesgos, resulta más apropiado contar con 5% de falsos positivos en lugar de falsos negativos durante esta fase inicial de detección. Por lo regular, la confirmación de que las muestras de detección positivas contienen anticuerpos antifármacos específicos del fármaco se realiza mediante ensayos confirmatorios antes de determinar el nivel de anticuerpos antifármacos (títulos) o cualquier caracterización adicional.
USP 39
Información General/ (1106) Ensayos de lnmunogenicidad 1405
Ensayos de Detección En su forma más simple, en los ensayos de detección de anticuerpos antifármacos se inmoviliza la proteína terapéutica en una placa de microtitulación o en perlas para capturar anticuerpos antifármacos (fase sólida) o se incuba una proteína terapéutica marcada a una concentración predeterminada con la muestra que contiene los anticuerpos antifármacos (ensayo en solución). El anticuerpo antifármaco policlonal unido se detecta posteriormente usando un reactivo secundario marcado o un fármaco marcado. Se puede incrementar la detección de anticuerpos con constantes de disociación rápidas en plataformas de ensayos que usan etapas de lavado limitando el número de etapas de lavado o reduciendo las velocidades de dispensación de fluido de lavado. Por lo general, los ensayos de detección están diseñados para detectar las clases de anticuerpos que pudieran ser de mayor relevancia para la vía de administración del producto, p.ej., lgA para vías de administración mucosas. Aunque los anticuerpos antifármacos más comunes producidos contra los productos terapéuticos de proteínas son los isotipos lgM e lgG, otros isotipos de anticuerpos antifármacos que incluyen lgE y lgA pueden requerir de detección, basándose en la respuesta clínica y en la vía de administración del producto. Asimismo, dependiendo de la rapidez con que se desarrollen las respuestas de los anticuerpos antifármacos y de la vida media del producto terapéutico, puede resultar factible detectar el desarrollo de anticuerpos antifármacos inicialmente del isotipo lgM que posteriormente maduran en un isotipo lgG luego de la administración repetida del producto. Debido a que los ensayos de detección sirven como la primera etapa en el programa de análisis de inmunogenicidad, estos ensayos están generalmente diseñados para ofrecer una velocidad de procesamiento moderada y a menudo están automatizados. Las diversas plataformas tecnológicas usadas para desarrollar los ensayos de detección de inmunogenicidad tienen fortalezas y debilidades inherentes, según se describe en la Tabla 3. El desarrollo de una estrategia bioanalítica para usar cierta plataforma de tecnología para el desarrollo del ensayo debe tomar en cuenta la naturaleza del producto (p.ej., una proteína terapéutica o un anticuerpo monoclonal), las fuentes potenciales de interferencia en el ensayo (p.ej., la concentración terapéutica prevista en las muestras de pacientes, la diana soluble basándose en medicaciones conjuntas y aspectos biológicos) y los factores de interferencia específicos de la enfermedad o de reacción cruzada (p.ej., factor reumatoideo). Asimismo, los analistas deben evaluar si el método no resulta en una subestimación de muestras de anticuerpos antifármacos positivos debido a que los epitopes de unión de los anticuerpos antifármacos en el reactivo de captura estén bloqueados por una etiqueta o recubriendo las placas o las perlas. Otro punto a considerar en el diseño y desarrollo de un ensayo de anticuerpos antifármacos es la adaptabilidad de la prueba tanto para matrices clínicas como no clínicas. Aunque la mayoría de los formatos de ensayo pueden transferirse fácilmente de uso no clínico a uso clínico, existen excepciones. Asimismo, el uso de ensayos clínicos de anticuerpos antifármacos debe calificarse o validarse con muestras recolectadas de una población similar de pacientes. Nuevamente, aunque la mayoría de los ensayos de detección de anticuerpos antifármacos pueden no presentar interferencias únicas de matriz entre una enfermedad y otra, puede haber excepciones. Los inmunoensayos usados para la detección de anticuerpos antifármacos por lo general son métodos semicuantitativos puesto que, generalmente, no se encuentran disponibles calibradores policlonales de anticuerpos antifármacos estandarizados y específicos para especies (especialmente humanos). Los controles positivos, generalmente desarrollados de manera interna como suero hiperinmune en animales o mediante fagos sirven como sustitutos para los anticuerpos antifármacos inducidos por fármacos en pacientes tratados. Tal como se muestra en la Tabla 3, algunos de los formatos de ensayo más comunes actualmente en uso para el desarrollo de ensayos de detección incluyen ensayos por inmunoadsorción ligados a enzimas basados en placa o en perlas (ELISA; ver también el capítulo general de la USP Métodos de Pruebas Inmunológicas-Ensayo por lnmunoadsorción Ligado a Enzimas (ELISA) (1103)) con lecturas colorimétricas, fluorométricas o luminiscentes, ensayos electroquimioluminiscentes en placa o en fase líquida o ensayos ELISA, ensayos de resonancia de plasmón superficial (RPS; ver también el capítulo general de la USP Métodos de Pruebas Inmunológicas-Resonancia de Plasmón Superficial (1105)), o ensayos de interferometría en biocapa y ensayos de radioinmunoprecipitación (RIPA). Para diferenciar entre respuestas positivas y negativas, los puntos de corte de los ensayos se determinan estadísticamente usando muestras recolectadas de la población diana. El punto de corte del ensayo también ayuda a determinar la sensibilidad del ensayo. Un punto de corte incorrectamente establecido puede resultar en falsos negativos o en demasiados falsos positivos que deben ser descartados como respuestas específicas del fármaco en el ensayo confirmatorio. El desempeño del ensayo por lo general se optimiza durante el desarrollo mediante la evaluación de los siguientes parámetros: sensibilidad (cantidad más baja de anticuerpos detectables en una muestra que se demuestra usando controles sustitutos); especificidad (posibilidad de detección de un positivo verdadero en lugar de una interacción no específica); precisión (reproducibilidad de los resultados de múltiples análisis); interferencia (sustancias interferentes en la matriz de la muestra, incluido el fármaco administrado, lo que afecta la sensibilidad del ensayo); y estabilidad y robustez (probabilidad de desempeño óptimo del ensayo con el tiempo). Después de optimizar estos parámetros, los analistas por lo general validan el método para el uso previsto. Si el ensayo inicial no puede cumplir con los objetivos de desempeño (p.ej., debido a una sensibilidad deficiente o fondos altos), entonces los analistas deben mejorar y validar el primer formato de ensayo nuevamente o desarrollar y validar más de un formato de ensayo.
1406 (11 06) Ensayos de tnmunogenicidad / Información General
USP 39
Tabla 3. Ventajas y Desventajas de Varios Tipos de Ensayos Usados para Evaluar Anticuerpos Antlfármacos Tipo de ensayo
ELISA Directo/Indirecto
Ventajas
Potencial de ruido de fondo alto
Fácilmente disponible
Podría no ser específico
Fácil de automatizar
Su utilidad depende de la capacidad de detectar subtipos diferentes de lg
Económico
Menor tolerancia al fármaco para ELISAs en fase sólida
Los modos de lectura pueden incrementar la sensibilidad (p.ej:, electroquimioluminiscencia) Mayor tolerancia al fármaco para ELISAs en fase líquida
Los lavados en exceso pueden disminuir la detección de anticuerpos antifármacos de baja afinidad
Bajo fondo
Difícil de confirmar la presencia de lgM
Alta especificidad
Requiere marcado del producto
Fácilmente disponible
Capacidad reducida para detectar anticuerpos de baja afinidad e lgG 4 debido a la unión de un solo brazo entre el ligando de unión y el detector
Fácil de automatizar Formato tipo puente
Desventajas
Alto rendimiento
Económico El formato se puede usar entre especies y detecta todos los isotipos Se pueden usar diferentes plataformas de detección (calorimétrica, electroquimioluminescencia, etc.)
Ensayos de Resonancia de Plasmón Superficial/ lnterferometría de Biocapa
Flexibilidad para caracterizar la respuesta inmune (concentración y afinidad relativa)
Tecnología costosa
Mayor tolerancia al fármaco y puede detectar anticuerpos de baja afinidad
Proveedores limitados
Económico
Desecho radioactivo
Altamente sensible
Requiere la recalificación frecuente de reactivos radiomarcados debido a la vida media corta
Ensayos de Radioinmunoprecipitación Mejor para anticuerpos de alta afinidad
Rendimiento moderado
Su utilidad depende de la capacidad de precipitar todos los anticuerpos pertinentes presentes Puede ser menos útil para anticuerpos de baja afinidad
Ensayos Confirmatorios Las muestras que resultan positivas en el ensayo de detección a menudo se confirman en un segundo ensayo que incluye agregar cierta cantidad en exceso del producto terapéutico. Esto tiene el propósito de demostrar que una señal positiva observada en el ensayo de detección de anticuerpos antifármacos es ocasionada por la presencia de anticuerpos específicos contra el fármaco. Debido a que el punto de corte para el ensayo de detección se establece para obtener una detección de aproximadamente 5% de falsos positivos, el ensayo confirmatorio se usa para descartar las muestras falsas positivas de análisis adicionales. Se encuentran disponibles múltiples opciones para llevar a cabo los ensayos confirmatorios. Por lo regular, se agrega un fármaco soluble a la muestra, el cual debe competir con el fármaco inmovilizado unido en placa para poder unirse a los anticuerpos antifármacos de la muestra. Una interacción específica con un fármaco soluble resulta en una reducción en la señal del ensayo. Al igual que con el ensayo de detección, el punto de corte para el ensayo confirmatorio se establece estadísticamente. La verificación de la presencia de un anticuerpo específico contra el fármaco también se puede llevar a cabo usando un método ortogonal en una plataforma de ensayo distinta que puede tener diferentes perfiles de unión no específica. Los analistas deben tener cuidado al momento de adoptar este método para asegurar un ensayo con sensibilidad adecuada a fin de evitar una reacción de falsos negativos. Finalmente, la especificidad de los anticuerpos antifármacos también se puede confirmar mediante el agotamiento de toda la inmunoglobulina de una muestra (p.ej., usando una columna de Proteína A o G) seguida de la repetición del análisis de la muestra agotada. En el último método, la muestra agotada dará un resultado negativo en el ensayo si un anticuerpo ocasionó la señal original. La validación de los ensayos confirmatorios ayuda a asegurar que los resultados del ensayo confirmatorio se interpreten adecuadamente.
Ensayos de Caracterización Después de la detección y la confirmación, el nivel relativo de anticuerpos antifármacos en una muestra positiva se evalúa mediante titulación. El método más común es diluir en serie la muestra e informar la inversa del factor de dilución más alto en el que la muestra arroja un resultado positivo, o título de la muestra. Cuanto más alta sea la dilución de la muestra (y, por tanto, el valor de título de anticuerpos antifármacos), más alta será la concentración de anticuerpos antifármacos circulantes en
USP 39
Información General/ (1106) Ensayos de lnmunogenicidad 1407
dicha muestra. Este método se ha usado históricamente para informar datos serológicos obtenidos de estudios de vacunas. Otro método de uso menos frecuente consiste en expresar la cantidad de anticuerpos antifármacos en la muestra en unidades de masa con respecto a un estándar sustituto. Aunque este enfoque tiene la ventaja de relacionar la cantidad de anticuerpo en la muestra con la sensibilidad del ensayo, los analistas deben reconocer que el calibrador podría no ser representativo de la respuesta policlonal de anticuerpos antifármacos que se está midiendo. Los métodos tradicionales para el análisis de linealidad dilucional no se aplican a los ensayos de anticuerpos antifármacos. Sin embargo, cuando los analistas expresen datos de anticuerpos antifármacos en términos de valores de título, también deberán demostrar que los controles positivos presentan una linealidad de dilución razonable (relativa). Además de llevar a cabo la titulación, los analistas caracterizan de manera rutinaria muestras positivas de anticuerpos antifármacos en ensayos de neutralización para determinar el efecto in vitro de los anticuerpos antifármacos que podría reflejar la actividad biológica o farmacológica in vivo del producto terapéutico. Asimismo, también se pueden analizar los isotipos de los anticuerpos antifármacos. La identificación de isotipos en ocasiones se lleva a cabo de manera multiplexada. Mediante una plataforma multiplex fluorescente, los analistas mezclan cada muestra con múltiples reactivos secundarios que son específicos para los diferentes isotipos de inmunoglobulina y se marcan con etiquetas de fluorocromo únicas. También se puede usar una plataforma de resonancia de plasmón superficial para este propósito (ver el capítulo Métodos de Pruebas Inmunológicas-Resonancia de Plasmón Superficial (1105)). El isotipo de un anticuerpo antifármaco se puede determinar observando la unión de reactivos específicos del isotipo (tales como un Ac lgG, antihumano) para el anticuerpo antifármaco que ha sido capturado por el fármaco inmovilizado. Los analistas deben tener cuidado al identificar y validar los reactivos específicos de un isotipo, debido a la inesperada reactividad cruzada que a menudo se observa. La isotipificación puede ayudar a entender la maduración de la respuesta inmune. Por ejemplo, una respuesta de anticuerpos antifármacos que consta únicamente de anticuerpos lgM es una respuesta inmune inmadura sin la participación de células T, y su progreso adicional no es seguro. Por el contrario, una respuesta inmune que consta de anticuerpos lgG, e lgG 4 representa una respuesta más madura, la cual ya ha involucrado más componentes del sistema inmune. La titulación de anticuerpos antifármacos y los ensayos de caracterización se validan de manera rutinaria usando muchos de los mismos parámetros de los ensayos de detección y confirmatorios para asegurar un desempeño constante del ensayo.
VALIDACIÓN DE INMUNOENSAVOS La validación del método es un proceso para demostrar, mediante el uso de investigaciones específicas en el laboratorio, que las características de desempeño de un método analítico son adecuadas para el uso previsto (ver también el capítulo general de la USP Validación de Procedimientos Farmacopeicos (1225)). El nivel de validación del método depende de la etapa de desarrollo del producto y de los riesgos asociados con el producto. Una validación parcial que incluya evaluaciones de la sensibilidad del método, de la especificidad y de los requisitos de precisión con menos énfasis en la robustez, la reproducibilidad y la estabilidad, puede ser adecuada para las etapas tempranas de desarrollo clínico (estudios de Fase 1-Fase 2), mientras que los estudios cruciales y posteriores a la comercialización requieren de métodos validados en su totalidad. La validación de un ensayo antes de usar el método para el análisis biológico de la muestra recibe el nombre de validación previa al estudio, y se pueden realizar enmiendas a este proceso entre cada estudio. Este proceso mapea las características de desempeño del ensayo y debe demostrar que el método es adecuado para su uso previsto cuando se aplique de manera subsiguiente a las muestras del estudio. Por el contrario, la validación durante el estudio se refiere al monitoreo del desempeño de la valoración durante las aplicaciones de la fase de estudio del ensayo a fin de asegurar que el ensayo sigue siendo válido y que los datos bioanalíticos resultantes son confiables. El desempeño confiable del ensayo también depende de todos los elementos que abarca el análisis bioanalítico y la manipulación de datos, tales como reactivos, analistas, equipo y programas informáticos para el ensayo. En esencia, el ensayo es un sistema que comprende otros elementos distintos a las etapas del ensayo y a los reactivos por sí solos. Por lo tanto, la validación previa al estudio establece la aptitud del sistema (establecimiento de los criterios para muestras de control que se usan para aceptar o rechazar corridas y límites de imprecisión para muestras individuales) y, posteriormente, la validación durante el estudio continúa con la verificación. Los cambios críticos a los métodos a menudo requieren de validación adicional (parcial o total), lo que en ocasiones conduce a la revisión de los criterios de aptitud del sistema.
Dilución Mínima Requerida Durante el desarrollo del ensayo, la dilución mínima requerida se puede definir como el nivel de dilución de la muestra negativa de anticuerpos antifármacos que genera el cociente más alto entre señal y variabilidad (o factor Z'). La capacidad de diluir dichas muestras también se debe evaluar para asegurar que la dilución mínima requerida seleccionada está adecuadamente alejada de cualquier efecto de prozona (efecto gancho) que pudiera haberse observado. Aunque son poco comunes, algunos efectos de prozona pueden requerir que el método de prueba incluya más de una dilución de una muestra de prueba para minimizar los datos falsos negativos. La dilución mínima requerida se debe evaluar durante la fase de desarrollo/diseño del ensayo, es decir, antes de que los analistas inicien los experimentos de validación, de modo que los analistas no necesiten repetir la evaluación durante la validación. La dilución mínima requerida se puede establecer usando 1 O muestras negativas de anticuerpos antifármacos obtenidas de individuos sin tratar, cada una analizada en diluciones seriales dobles (p.ej., un intervalo de 1 :5 a 1 :80). La dilución mínima re-
1408 (11 06) Ensayos de lnmunogenicidad / Información General
USP 39
querida en ocasiones se define como el nivel de dilución que genera el cociente más alto entre señal y fondo cuando, generalmente, el fondo es la matriz de dilución. Sin embargo, esta definición ignora la variabilidad en la señal. Por consiguiente, es preferible definir el valor entre señal y fondo e incluir la variabilidad. Una forma de hacerlo es usando un factor Z' que incluya tanto la intensidad de la lectura del ensayo como su variabilidad en diluciones diferentes (ver el Apéndice para más información). El factor Z' para cada nivel de dilución se obtiene a partir de la fórmula [(media (5) - 3 SO (S)] - [media (B) + 3 SO (B)]/[media (5) - media (B)], donde 5 es la señal del ensayo de la muestra diluida y B es la señal de fondo. Por ende, la dilución mínima requerida es la dilución que genera un valor deseado para el factor Z' y el cociente entre señal y fondo. Esta métrica se usa ampliamente para ensayos de detección de alto rendimiento para asegurar una confianza adecuada en la capacidad para diferenciar entre muestras verdaderamente positivas y muestras negativas. Una dilución mínima requerida inapropiadamente grande puede comprometer la sensibilidad de un ensayo.
Validación Previa al Estudio La validación previa al estudio establece lo siguiente: 1. Puntos de corte del ensayo 2. Criterios de aptitud del sistema 3. Sensibilidad relativa 4. Especificidad 5. Selectividad/interferencia 6. Precisión 7. Robustez 8. Reproducibilidad 9. Estabilidad
Puntos de Corte del Ensayo Dada la naturaleza semicuantitativa de los métodos de detección de anticuerpos antifármacos, se vuelve necesario el uso de un umbral de decisión o punto de corte para discriminar entre muestras positivas y negativas de anticuerpos antifármacos. Puesto que el ensayo de detección y el ensayo confirmatorio de especificidad producen diferentes tipos de resultados, se requieren puntos de corte separados. En algunos casos, también puede requerirse un punto de corte diferente para evaluar los títulos de muestras positivas confirmadas del ensayo de titulación. A continuación se resumen algunos puntos clave del proceso de evaluación (más información se encuentra disponible en el Apéndice). MUESTRAS PARA LA EVALUACIÓN DEL PUNTO DE CORTE Se deben usar muestras de una población apropiada para el desarrollo de puntos de corte del ensayo. En algunos casos, podría resultar poco práctico o factible obtener matrices de muestras de una población que tiene una enfermedad diana antes de iniciar los experimentos de validación previos al estudio. Por consiguiente, comúnmente se usan muestras de sujetos saludables sin tratar para establecer los puntos de corte iniciales. Se prefiere este enfoque para un estudio de Fase 1 convencional con voluntarios normales. Cuando el programa clínico progresa más allá de la Fase 1 y las muestras obtenidas de la población con la enfermedad diana se encuentran disponibles, resulta más apropiado reevaluar los datos de los puntos de corte para la población diana. Si la distribución de las respuestas del ensayo con respecto a la media y a la variabilidad son comparables entre la población diana y los voluntarios normales, entonces se puede usar el mismo punto de corte. De lo contrario, resultan más apropiados los puntos de corte específicos para la enfermedad diana, además de que se pueden considerar puntos de corte fijos o flotantes calculados a partir de datos obtenidos de muestras de la línea de base de un ensayo clínico. PUNTOS DE CORTE DE DETECCIÓN El punto de corte del ensayo de detección es una señal en el ensayo de detección que identifica una muestra que posiblemente contiene anticuerpos antifármacos (denominada muestra positiva de detección o potencialmente positiva) contra una muestra negativa de anticuerpos antifármacos. Se establece un punto de corte del ensayo de detección durante la validación previa al estudio basándose en un riguroso análisis sistemático y estadístico de las respuestas del ensayo a partir de un panel de muestras individuales que se consideran representativas de una población diana de pacientes sin tratar. Para determinar los puntos de corte del método de detección para ensayos clínicos, los analistas deben usar muestras de al menos 50 individuos que no hayan sido tratados con el fármaco para una evaluación robusta. Si se apunta a indicaciones adicionales, los analistas deben analizar al menos 20 individuos que no hayan sido tratados con el fármaco por cada indicación. Si la variabilidad es significativamente distinta de la indicación original, entonces puede ser necesario analizar a un número adicional de individuos que no hayan sido tratados con el fármaco. De lo contrario, se puede aplicar el punto de corte original a la indicación adicional. Para valoraciones no clínicas, debería ser suficiente un total de al menos 25 individuos que no hayan sido tratados con el fármaco. Para asegurar que este punto de corte es robusto, al menos dos analistas deben realizar este ex-
USP 39
Información General/ (1106) Ensayos de lnmunogenicidad 1409
perimento durante tres días usando al menos dos diseños diferentes de placa. Un diseño experimental equilibrado con los diseños de placa ayudará a evitar confusiones potenciales entre analistas, muestras de sujetos, fechas de corridas, entre otros. Para los ensayos clínicos de anticuerpos antifármacos, cuando se están analizando múltiples poblaciones en estado de enfermedad, éstas deberán distribuirse de manera uniforme a través de las placas para asegurar que se encuentren apropiadamente equilibradas entre placas y corridas. Los valores aberrantes estadísticos de los resultados de las muestras deben examinarse y eliminarse, p.ej., usando gráficas de caja para valores aberrantes definidas en términos de rango de cuartiles e intercuartiles. Asimismo, se pueden excluir también las muestras reactivas confirmadas (p.ej., mediante inmunoagotamiento). Se pueden calcular tres tipos de puntos de corte de detección para su aplicación durante la fase de estudio-fijos, flotantes y dinámicos-y se debe seleccionar apropiadamente uno de éstos para el bioanálisis de la fase de estudio. Punto de corte fijo-Un punto de corte fijo es aquél que se determina en una validación previa al estudio y se usa de manera subsiguiente en la fase durante el estudio. El punto de corte fijo se usa para análisis de muestras de prueba hasta que surja la necesidad de revalidar o cambiar el punto de corte (p.ej., debido a un cambio crítico en el ensayo, transferencia del ensayo a otro laboratorio, mejora en la versión de los instrumentos, etc.). El valor de punto de corte se puede fijar dentro de un estudio dado, para una población diana o entre estudios y múltiples poblaciones diana. Para usar este enfoque, se deben demostrar estadísticamente medias y varianzas similares en todas las corridas durante la validación previa al estudio. Se puede determinar un punto de corte fijo basándose en la media+ 1,645 SD (desviación estándar), que representa el 95° percentilo de la población en una distribución normal (y, por lo tanto, se espera identific,ar aproximadamente 5% de las muestras como falsos positivos). La desviación estándar debe incluir diferentes fuentes de variación tales como la variabilidad intracorridas, entre corridas, entre analistas y entre sujetos. Si los datos no están distribuidos de manera normal, se pueden usar transformaciones apropiadas (por lo regular, transformaciones logarítmicas). Si la transformación no ayuda, generalmente se acepta determinar el 95° percentilo no paramétrico. Sin embargo, se puede considerar adecuado en ensayos preclínicos usar un punto de corte en el 99° o 99,9° percentilo, puesto que la inmunogenicidad de una proteína normalmente resulta en títulos altos de anticuerpos. Alternativamente, incluso si los datos de la validación sugieren medias y varianzas similares entre corridas, para tomar en cuenta posibles desviaciones en todas las corridas del ensayo durante la fase de bioanálisis durante el estudio, resultaría más seguro aplicar un punto de corte flotante. Punto de corte flotante-Un punto de corte flotante es aquél que se calcula aplicando un factor de normalización aditivo o multiplicativo, determinado a partir de los datos de la validación previa al estudio, al fondo biológico obtenido durante la fase de estudio (ver el Apéndice G de Shanker et al., 2008, en el Apéndice para información detallada). El fondo biológico se puede representar mediante el control negativo (combinación de la matriz de sujetos que son negativos para anticuerpos antifármacos), el diluyente del ensayo o la muestra del sujeto previa a la dosis (punto de corte específico del sujeto). El método para determinar el punto de corte flotante usa la estimación de variación de la validación previa al estudio que incluye diferentes fuentes de variación tales como la variabilidad intracorridas, entre corridas, entre analistas y entre sujetos. Dicho punto de corte se recomienda cuando las medias de las muestras no tratadas con el fármaco no son similares, pero sí lo son las varianzas en todas las corridas. Cuando se usa un control negativo para la normalización, los analistas también deben asegurar que los resultados del control negativo representan los resultados de la matriz de muestra que no ha sido tratada con el fármaco de la población diana. Esto se logra demostrando que la señal del control negativo presenta una tendencia direccional con la señal de las muestras individuales. Como alternativa, puede resultar más apropiado el uso del diluyente del ensayo para normalización o el pretratamiento de los resultados de la muestra del sujeto ("línea de base"). Sin embargo, un cociente previo a la dosis y posterior a la dosis puede ser una mejor solución. Punto de corte dinámico-Un punto de corte dinámico es aquél que cambia entre las placas en una corrida, entre corridas en un estudio o entre estudios, y no aplica las estimaciones de variación de la validación previa al estudio. Esta última característica lo diferencia de un punto de corte flotante. Este enfoque es necesario únicamente cuando las medias y las varianzas difieren significativamente entre corridas. Debido a que este enfoque implica analizar diversas muestras individuales que no han sido tratadas con el fármaco para la evaluación de un punto de corte específico de la corrida, consume una gran parte de las placas de cada corrida durante el estudio y, por tanto, no es factible desde el punto de vista práctico, en especial cuando los analistas usan placas de 96 pocillos en lugar de placas de 384 pocillos. Las diferencias de variabilidad entre corridas del ensayo en ocasiones pueden resolverse mediante la optimización adicional de algunos pasos clave en el protocolo del ensayo o resolviendo algunas cuestiones analíticas. En algunos casos, las diferencias de variabilidad se pueden atribuir a analistas o instrumentos diferentes, y el uso de un punto de corte flotante para un analista o instrumento específicos puede resolver dicha cuestión. Si la optimización adicional no resuelve la situación o si las causas no son claras, otra alternativa práctica puede ser combinar la variabilidad entre todas las corridas y usar esta varianza combinada para la evaluación del punto de corte flotante durante la fase de estudio. PUNTO DE CORTE DEL MÉTODO DE CONFIRMACIÓN DE LA ESPECIFICIDAD Debido al enfoque conservador de incorporar una tasa de 5% de falsos positivos en el cálculo del punto de corte de detección, la eliminación de las muestras falsas positivas mediante la confirmación de la unión específica del fármaco es un componente importante de los análisis biológicos de anticuerpos antifármacos. También resulta importante comprender el nivel, si lo hubiera, del fármaco mismo dentro de la muestra. La cantidad de cambio en la señal del ensayo que diferencia la unión específica del fármaco de la unión no específica se denomina punto de corte de especificidad. El punto de corte de especificidad debe determinarse mediante un enfoque objetivo
141 O (1106) Ensayos de lnmunogenicidad / Información General
USP 39
en el contexto de variabilidad del ensayo cerca del intervalo positivo bajo del ensayo. Para determinar el punto de corte de especificidad, se deben evaluar muestras de al menos 25 individuos que no hayan sido tratadas con el fármaco (sin embargo, comúnmente se usa un número mayor cuando se encuentran disponibles), con y sin preincubación del fármaco. Idealmente, estas muestras deben ser las mismas que las analizadas durante la evaluación del punto de corte de detección, además de que se deben analizar las contrapartes con y sin cantidades agregadas conocidas de las muestras individuales del sujeto en conjunto con las mismas placas. Se debe calcular el cambio medio porcentual de la muestra sin cantidades agregadas conocidas (inhibición) y la desviación estándar. La inhibición media más 3,09 SO (si se desea una tasa de falsos positivos de O, 1%) representa el punto de corte de especificidad. Al igual que en la determinación del punto de corte de detección, las muestras específicamente reactivas después de la preincubación con el fármaco (es decir, aquéllas que contienen anticuerpos preexistentes) y los valores estadísticos aberrantes deben eliminarse para que el punto de corte de especificidad sea más conservador. El proceso analítico descrito anteriormente para el punto de corte de detección se aplica también a la evaluación del punto de corte de especificidad. En ocasiones, para esta evaluación de punto de corte se consideran enfoques alternativos, tales como el uso de muestras positivas bajas simuladas en las que se agrega a las muestras individuales que no han sido tratadas con el fármaco una cantidad conocida baja de un control positivo. Sin embargo, este método es subjetivo y no se recomienda debido a que depende de la concentración del control positivo y a la afinidad/avidez única del control positivo que pudiera o no ser representativo de muestras verdaderas de pacientes positivos verdaderos. Las fuentes adicionales de información relacionada con los méritos estadísticos relativos de estos enfoques y métodos para verificar las suposiciones se encuentran listadas en el Apéndice. PUNTO DE CORTE DEL MÉTODO DE TITULACIÓN El punto de corte del método de titulación es un valor del resultado de prueba por debajo del cual la dilución adicional en serie de una muestra positiva de anticuerpos antifármacos produce resultados de ensayo negativos. Por lo regular, el punto de corte del ensayo de detección se usa como el punto de corte de la titulación, pero puede ser necesaria la validación de un punto de corte del método de titulación distinto cuando la señal del diluyente del ensayo o de la matriz ocasiona resultados más altos que el punto de corte del ensayo de detección (debido a un efecto de bloqueo del suero) o si las muestras a una dilución mayor que la dilución mínima requerida no generan constantemente resultados negativos, es decir, cuando el punto de corte de detección cae en la meseta inferior de la curva de dilución del control positivo. En dichos casos, los mismos datos generados durante un experimento de punto de corte de detección se pueden usar para definir el punto de corte de la titulación usando un criterio de umbral con una tasa de O, 1% de falsos positivos (es decir, Media+ 3,09 SO). Durante el bioanálisis, se puede asignar a las muestras de pacientes positivas confirmadas que caen entre el punto de corte de detección y el punto de corte de titulación un valor de título igual al de la dilución mínima requerida. PUNTO DE CORTE DEL MÉTODO DE REACTIVIDAD CRUZADA Cuando resulte aplicable, las muestras de anticuerpos antifármacos positivas que se confirmen como específicas del fármaco se pueden caracterizar adicionalmente para determinar la reactividad cruzada con otros antígenos relacionados. Al igual que el ensayo de confirmación de especificidad, un método de prueba de reactividad cruzada puede requerir una etapa de preincubación con y sin el antígeno relacionado. La reactividad cruzada con el antígeno se confirma cuando la inhibición porcentual de la señal en presencia del antígeno es mayor o igual al punto de corte del método de reactividad cruzada. Los métodos para determinar el punto de corte del método de reactividad cruzada son similares a los del punto de corte del método de especificidad, aunque también puede resultar aceptable aplicar el punto de corte de confirmación de especificidad del fármaco.
Definición de la Aptitud del Sistema CONTROLES DEL ENSAYO Los controles para anticuerpos antifármacos positivos pueden incluir anticuerpos antiidiotipo policlonales o monoclonales. Es necesario purificar y cuantificar la afinidad de los controles para permitir la validación del ensayo. Cada corrida (o placa) debe incluir al menos un nivel bajo de control positivo (control positivo bajo) y un control negativo, pero la inclusión de un control de nivel más alto (control positivo alto) también puede ser útil en el monitoreo del desempeño del método. El seguimiento de todos estos controles con el paso del tiempo puede asegurar que el método se esté desarrollando adecuadamente. Un control positivo bajo ayuda a asegurar que el ensayo siga siendo igual de sensible durante el bioanálisis de la fase de estudio que durante la validación previa al estudio. Por una parte, el control positivo bajo debe producir una respuesta que pueda ser observada de manera reproducible por encima del punto de corte, aunque, en ocasiones, puede resultar en una señal que esté por debajo del punto de corte (lo que provocaría que el ensayo fallase o fuese invalidado). Por otra parte, seleccionar una concentración irracionalmente alta para un control positivo bajo puede producir una señal de ensayo que esté significativamente por encima del punto de corte, lo cual es inapropiado. Para darle objetividad a la selección de una concentración para el control positivo bajo, resulta útil pensar en términos de tasas de rechazo del ensayo, es decir, el porcentaje de ensayos (placas) que fallan debido a que el control positivo
USP 39
Información General/ (1106) Ensayos de lnmunogenicidad 1411
bajo produce un resultado por debajo del punto de corte. A manera de ejemplo, y con el fin de entender si el control positivo bajo es lo suficientemente bajo, una tasa de rechazo del 1 % puede ser un objetivo razonable para un control positivo bajo. Esto se calcula como media + t0, 01 ,d1 x SD, donde media y SD se determinan usando los datos del experimento de sensibilidad o los datos de desarrollo del ensayo relacionados, y t0, 01 ,d1 es el valor crítico determinado a partir de la distribución t correspondiente a una tasa de falsos positivos del 1 % y df son los grados de libertad que dependen del número de muestras y corridas usadas en el cálculo. Esto teóricamente implica que aproximadamente 99% de los datos de los controles positivos bajos coincidirán o estarán .por encima del punto de corte. Un control positivo alto opcional puede ser útil para métodos que son propensos a efectos de gancho, seguimiento del desempeño del ensayo, calificaciones de reactivos y resolución de problemas. La concentración del control positivo alto se debe seleccionar a partir del extremo superior del intervalo lineal de la curva de dilución, por lo general apenas por debajo de la meseta superior de la curva. CRITERIOS DE APTITUD DEL SISTEMA Los criterios de aptitud del sistema que usan controles del ensayo ayudan a asegurar que el procedimiento analítico siga siendo válido para su uso. Se deben establecer intervalos de aceptación (criterios de aptitud del sistema) para controles de calidad mediante la evaluación estadística de los datos experimentales adquiridos durante la validación del ensayo. Cuando se considera necesario el enfoque de punto de corte flotante y se emplea para la evaluación del punto de corte de la detección, los criterios o límites de aptitud del sistema se pueden definir para el cociente entre el control positivo bajo y el control negativo y para el cociente entre el control positivo alto y el control positivo bajo, o un control negativo, en lugar de definir límites por separado para cada control positivo. Asimismo, resulta de utilidad aplicar criterios de aceptación para la precisión dentro del ensayo (variabilidad de señales de determinaciones repetidas en un ensayo) para la fase durante el estudio. Aunque deben rechazarse los datos de los ensayos que no cumplan con los criterios de aceptación en la fase de estudio, se debe evitar el establecimiento de criterios para ensayos que pasen o fallen en los experimentos de validación previos al estudio debido a que éstos pueden llevar a la potencial exclusión de algunos datos de validación, lo que puede resultar en una estimación inexacta del error analítico. Se deben incluir todos los ensayos durante la validación previa al estudio y la única excepción deberían ser aquéllos rechazados por una causa asignable (p.ej., error técnico).
Sensibilidad Relativa No se puede esperar que alguno de los controles positivos de anticuerpos antifármacos sea representativo del espectro de respuestas inmunes humorales observadas en individuos tratados con los compuestos en estudio. La sensibilidad de los ensayos de anticuerpos antifármacos depende en gran medida de la naturaleza de los reactivos del control positivo, por lo que los controles positivos de alta afinidad a menudo producen mejores valores de sensibilidad que los controles positivos de menor afinidad en el mismo ensayo. Los analistas deben considerar esto al momento de seleccionar controles, así como al momento de estimar la sensibilidad del ensayo. Además, debido a que el fármaco mismo puede interferir con la detección de anticuerpos antifármacos, la sensibilidad de la detección de anticuerpos antifármacos se vuelve progresivamente más deficiente en presencia de concentraciones crecientes del fármaco dentro de la muestra. A pesar de estas importantes consideraciones, la determinación de la sensibilidad del ensayo tiene valor al momento en que los analistas seleccionan un método o plataforma óptima de detección de anticuerpos antifármacos, un control positivo bajo para la validación, o cuando evalúan la aptitud de un ensayo. La evaluación de la sensibilidad del ensayo en presencia de un fármaco interferente (tolerancia al fármaco) es crítica para comprender la aptitud del método para detectar anticuerpos antifármacos en pacientes tratados con el fármaco. La sensibilidad del ensayo de anticuerpos antifármacos no debe definirse como un solo valor, sino como un conjunto de al menos dos valores: (1) la concentración de anticuerpos antifármacos en el control positivo detectados dentro de una matriz sin diluir en ausencia de cualquier fármaco y (2) la concentración de anticuerpos antifármacos en el control positivo detectados dentro de una matriz sin diluir en presencia de niveles de fármaco esperados en los tiempos de muestreo cuando se toman las muestras para los análisis de anticuerpos antifármacos. En general, los ensayos deben demostrar una sensibilidad de al menos 500 ng/mL para métodos aplicados a estudios clínicos (o 1000 ng/mL para estudios no clínicos) para demostrar su aptitud para el propósito previsto-es decir, para la detección de anticuerpos antifármacos clínicamente significativos, aunque la sensibilidad del ensayo debe justificarse para cada caso. No es de utilidad expresar la sensibilidad en términos de títulos de antisuero y, por lo tanto, la sensibilidad debe evaluarse usando preparaciones de anticuerpos monoclonales o policlonales con afinidad purificada. Los analistas pueden evaluar la sensibilidad mediante dos corridas de ensayo realizadas por dos operadores independientes (cuando resulte factible) para un total de al menos tres corridas. Para evaluar la sensibilidad en ausencia de un fármaco, los analistas deben preparar muestras simuladas con concentraciones conocidas de anticuerpos antifármacos que se diluyen en serie (por lo general, diluciones en serie dobles o triples) en una matriz combinada de individuos que no han sido tratados con el fármaco y evaluados de acuerdo con el método de detección hasta que los resultados del ensayo de las diluciones en la matriz estén por debajo del punto de corte del ensayo de detección. La concentración más baja de anticuerpos antifármacos que se halla constantemente (por ejemplo, usando un límite de confianza superior del 95% basándose en el número de corridas u operadores) por encima del punto de corte del ensayo de detección se considera como la sensibilidad del ensayo. Alternativamente, se puede tratar de la concentración más baja de anti-
1412 (1106) Ensayos de lnmunogenicidad / Información General
USP 39
cuerpos antifármacos que se halla por encima del punto de corte del ensayo de detección en todas las corridas por todos los operadores o en 19 de 20 corridas (ver el Apéndice para más información). Para evaluar la sensibilidad en presencia de un fármaco, se pueden considerar dos enfoques experimentales alternativos: (1) titular el fármaco en una matriz sin diluir con concentraciones establecidas de un control positivo de anticuerpos antifármacos (p.ej., 250, 500 ó 750 ng/mL). Informar la concentración más alta del fármaco en la que los anticuerpos antifármacos sigan siendo detectables. (2) Como alternativa, debido a que las muestras de inmunogenicidad a menudo se toman a los tiempos de muestreo de baja concentración de fármaco, se puede usar el conocimiento previo del intervalo de concentración previsto para determinar la sensibilidad de la valoración en presencia de las concentraciones esperadas del fármaco.
Especificidad La especificidad se refiere a la capacidad del método para detectar anticuerpos antifármacos que se unen específicamente a la molécula del fármaco, sus dominios o componentes. La valoración se desarrolla y optimiza basándose en la capacidad de los anticuerpos antifármacos del control positivo para unirse específicamente al fármaco. Durante la validación, los resultados del ensayo de confirmación de especificidad sustentan la especificidad del ensayo.
Selectividad e Interferencia La selectividad de un ensayo de anticuerpos antifármacos es su capacidad para identificar un control positivo en matrices de muestras biológicas que pueden contener sustancias interferentes potenciales y es una cuestión importante para los ensayos de detección de anticuerpos antifármacos. Dichos efectos de la matriz por lo general surgen de interacciones de unión no específica entre un factor presente en la matriz y los anticuerpos antifármacos o de la unión específica de factores desconocidos. Durante la validación, los analistas evalúan la selectividad del ensayo de anticuerpos antifármacos observando la recuperación de analito (representada por una muestra de control positivo) a partir de matrices de muestras que contienen los interferentes potenciales. Una consideración importante en ese punto es que la selectividad de un ensayo de anticuerpos antifármacos, según se evalúa usando el control positivo, puede no reflejar la selectividad del ensayo cuando se usa con muestras reales clínicas o no clínicas. La interferencia es la propiedad de un factor (regularmente el fármaco mismo y su diana, si es soluble) de afectar los resultados del ensayo de manera positiva o negativa. Se debe evaluar usando una muestra de prueba de anticuerpos antifármacos positiva baja a la que se agrega una cantidad conocida a una matriz de muestra proveniente de pacientes que no han sido tratados con el fármaco. Se debe evaluar cada uno de los factores interferentes potenciales en un intervalo fisiológicamente o farmacológicamente pertinente de concentraciones. La concentración más alta del factor interferente que no altere la clasificación de la muestra de prueba (p.ej., una muestra de anticuerpos antifármacos que permanece positiva con respecto al punto de corte del ensayo de detección) se define como la tolerancia del ensayo a dicho factor interferente. Para productos terapéuticos que tienen una vida media terminal larga, el interferente principal en un ensayo de anticuerpos antifarmacos es el fármaco mismo. Según se describió previamente, la tolerancia al fármaco de un ensayo se debe interpretar como la sensibilidad del método en presencia del fármaco interferente. Otros interferentes endógenos incluyen dianas de fármacos oligoméricas, o el receptor soluble de la diana puede interferir con la detección de anticuerpos antifármacos. Asimismo, algunos pretatamientos de muestras que se llevan a cabo para reducir la interferencia del fármaco pueden liberar la diana del fármaco de los complejos fármaco-diana, lo que conlleva a problemas subsiguientes de interferencia. Por ende, los analistas deben evaluar cuidadosamente las etapas de pretratamiento tales como disociación con ácido durante el desarrollo del ensayo para mitigar el riesgo de datos inexactos.
Precisión La precisión es una medida de la variabilidad en una serie de mediciones para la misma corrida de material en un método. Los criterios de aceptación para la precisión de los ensayos de anticuerpos antifármacos deben estar dentro del intervalo comúnmente esperado para inmunoensayos. Estos criterios también deben ser apropiados para la plataforma del ensayo y deben ser adecuados para su propósito. Durante la validación del ensayo, se debe determinar la precisión en experimentos que se corren al nivel de uso previsto durante la fase de estudio (p.ej., número de placas, muestras por placa, etc.). Los criterios de aceptación para precisión deben estar dentro del intervalo comúnmente esperado para inmunoensayos. Estos criterios también deben ser apropiados para la plataforma usada, tomando como guía los datos de desarrollo del ensayo y la experiencia con la plataforma tecnológica y método del ensayo. El Apéndice contiene información adicional sobre este tema. DETECCIÓN Y PRECISIÓN DEL MÉTODO DE CONFIRMACIÓN Para ensayos de detección de anticuerpos antifármacos con lecturas numéricas (contrarias a las lecturas categóricas sí/no), la precisión del ensayo se puede determinar usando datos de al menos seis corridas de ensayo independientes de los controles positivos de ensayo (controles positivos bajos y altos). Por lo regular, las estimaciones de la precisión intraensayo (variabilidad entre determinaciones repetidas, también denominada repetibilidad intraensayo) y de la precisión entre ensayos (también de-
USP 39
Información General/ (1106) Ensayos de lnmunogenicidad 141 3
nominada repetibilidad entre ensayos o precisión general intermedia, total o general ) se informan como coeficiente de variación porcentual (%CV). La precisión intraensayo (repetibilidad) es la variabilidad de los resultados del ensayo cuando se analiza el mismo material múltiples veces dentro de la misma corrida. La precisión entre ensayos (también denominada precisión intermedia o total) es la variabilidad de los resultados del ensayo cuando la misma muestra se analiza en corridas separadas, durante días separados y por múltiples operadores (o sólo un operador si el bioanálisis de la fase de estudio está diseñado para que lo lleve a cabo un solo operador). Éstos se expresan como %CV de señales de anticuerpos antifármacos. Los datos de determinaciones repetidas de controles negativos y positivos de cada una de todas las corridas analizadas durante la fase de validación previa al estudio se combinan y analizan dentro del marco de ANOVA de efectos aleatorios, lo que resulta en estimaciones de %CV intraensayo y %CV entre ensayos. Los analistas deben considerar los efectos de posición variando la posición de la muestra en las placas de microtitulación puesto que dichos efectos {p.ej., efectos del borde) pueden influenciar la precisión del ensayo. Se debe usar el mismo número de determinaciones repetidas de muestras de prueba y de control durante la validación tal como se usan en el ensayo durante el uso de rutina. De manera similar, las estimaciones de precisión intra y entre ensayos para el ensayo de confirmación se pueden derivar usando los datos de inhibición porcentual de las muestras de control positivo bajo con cantidades agregadas conocidas contra aquéllas sin cantidades agregadas a partir de múltiples corridas del ensayo (al menos seis) en la validación previa al estudio. PRECISIÓN DEL ENSAYO DE TITULACIÓN Para determinar la precisión de un título, dos o más analistas deben valorar diluciones seriales dobles de cinco o más muestras de control positivo alto simuladas en al menos seis corridas. Las muestras de control positivo alto simuladas se pueden obtener mezclando cantidades conocidas de sueros individuales negativos obtenidos de la población diana con una muestra positiva alta. Posteriormente, se determina el título mediante interpolación de cada una de las curvas de dilución y se calcula la media y desviación estándar generales. Se puede determinar la precisión intra y entre valoraciones (%CV). Un enfoque recomendado, aunque más riguroso, es usar estos datos para definir un cociente mínimo significativo (MSR, por sus siglas en inglés): MSR = 1Ot·sqrt(2J-so, donde SO es la desviación estándar general (intracorrida más la variación entre corridas) de los títulos en escala logarítmica en base 1 O, y tes el umbral de la distribución t de Student con n - 1 grados de libertad (n = número de corridas). El cociente mínimo significativo calculado refleja el cambio de veces más pequeño en los valores de título que se puede considerar estadísticamente significativo (P< 0,05)-es decir, si el cociente mínimo significativo= 5, entonces los títulos que difieran en más de cinco veces de dicho valor se pueden considerar significativos. Además de servir como un indicador del nivel de variabilidad en los títulos del control positivo, esta evaluación del cociente mínimo significativo también puede ser un criterio aproximado para comparar muestras con anticuerpos preexistentes confirmados en la línea de base contra las muestras posteriores al tratamiento para evaluar la inmunogenicidad inducida por el tratamiento. El cociente mínimo significativo se aplica únicamente si el título está interpolado y no se aplica a títulos de punto final.
Robustez La robustez es una indicación de la confiabilidad de un ensayo. Se evalúa por la capacidad del ensayo de permanecer inafectado por variaciones pequeñas pero deliberadas en el desempeño del método esperadas en cambios relevantes y reales en situaciones comunes en el laboratorio. La selección de variables de robustez para analizar durante la validación se debe basar en el conocimiento del ensayo y sus riesgos asociados. Algunas variables comunes son los lotes de placa de microtitulación, tiempos de incubación, temperatura y lotes de reactivo y concentraciones. Las muestras del estudio o las muestras de control positivo se pueden usar para analizar la robustez del ensayo. Se recomienda el uso de criterios de aceptación para controles de aptitud del sistema durante la validación de la robustez (calculados a partir de los datos de desarrollo y optimización del ensayo o de criterios de aceptación validados de control de la aptitud del sistema). El monitoreo continuo de un ensayo durante la validación y en etapas posteriores con registros estrictos de parámetros de ensayo claves (p.ej., los tiempos de incubación, volúmenes pipeteados de reactivos críticos, operadores, etc.) puede ayudar a identificar algunas de las interacciones de los factores de robustez cuando se han acumulado datos suficientes.
Reproducibilidad La reproducibilidad de un ensayo de acuerdo con el capítulo general de la USP Validación de Procedimientos Farmacopeicos (1225) y de la pauta ICH Q2(Rl) Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology (Validación de Procedimientos Analíticos: Texto y Metodología) es la confiabilidad de un método cuando se realiza en dos o más laboratorios. En el contexto de la transferencia de métodos y de demostraciones de la validez del método entre laboratorios, la reproducibilidad del ensayo es igual que la validación cruzada. La reproducibilidad se puede aplicar únicamente si un ensayo se lleva a cabo en dos o más laboratorios independientes durante el bioanálisis de la fase de estudio. La reproducibilidad es una evaluación de la transferibilidad de un ensayo, es decir, la validez de las muestras de análisis en dos o más laboratorios y la comparabilidad de los datos producidos por éstos. Las evaluaciones de reproducibilidad no consideran los cambios de rutina en un ensayo tales como la imprecisión entre equipos o entre
1414 (1106) Ensayos de lnmunogenicidad / Información General
USP 39
analistas. Dichos factores que contribuyen con la variabilidad (a menudo referidos como factores de precisión intermedia) son parte de la variabilidad de la reproducibilidad. Los criterios de aceptación de la fase del estudio para los controles de aptitud del sistema son establecidos por el laboratorio generador (ver a continuación) durante el proceso original de validación del ensayo. El desempeño de estos controles se puede comparar entre múltiples laboratorios. No obstante, cuando solamente un laboratorio realiza el ensayo de anticuerpos antifármacos, puede no ser necesario validar la reproducibilidad hasta que el método haya sido transferido a otro laboratorio.
Estabilidad Resulta útil entender las condiciones de almacenamiento óptimas para muestras del ensayo, controles, materiales y reactivos, y éstas deben investigarse como parte de la optimización del ensayo antes de la validación. Posteriormente, durante la validación del ensayo, los estudios de estabilidad deben evaluar el desempeño del ensayo siguiendo las condiciones de almacenamiento previstas. Idealmente, las condiciones de análisis de estabilidad deben reproducir las condiciones de manipulación de la muestra, materiales y reactivos esperadas, las temperaturas de almacenamiento y las diversas duraciones del tiempo de almacenamiento. ESTABILIDAD DE MATERIALES Y REACTIVOS Los ensayos de anticuerpos antifármacos son indicadores de la estabilidad con respecto a los materiales y reactivos aplicables, y, por tanto, generalmente no se requieren pruebas separadas de estabilidad del reactivo para la validación del ensayo. Durante el bioanálisis de la fase de estudio, se presume que los materiales y reactivos del ensayo son estables si los controles de aptitud del sistema cumplen con los criterios de aceptación validados. Sin embargo, los analistas deben validar con anticipación la estabilidad de las placas que han sido preparadas (p.ej., recubiertas con anticuerpo de captura o bloqueadas) y almacenadas. MANIPULACIÓN Y ESTABILIDAD DE LA MUESTRA Las muestras de anticuerpos antifármacos por lo regular se recolectan en una matriz de suero o plasma. Para muestras almacenadas a una temperatura igual o inferior a -20ºC, la estabilidad de los anticuerpos antifármacos se acepta de manera global, por lo que esta condición de almacenamiento puede no requerir de validación. Generalmente se acepta que una muestra de anticuerpos antifármacos en suero o plasma se mantendrá estable después de tres ciclos de congelación-descongelación y hasta dos años cuando se almacena a -70ºC.
Documentación de la Validación Previa al Estudio Por lo regular, se crean tres tipos de documentos específicos del ensayo durante la validación previa al estudio: un plan o protocolo de validación del ensayo, una descripción del método del ensayo y un informe de validación del ensayo. Se recomienda contar con un plan o protocolo de validación del ensayo antes de que los analistas comiencen los experimentos de la validación previa al estudio. Este documento debe etablecer el propósito previsto del método, una descripción detallada del inmunoensayo y de los reactivos o materiales, un resumen de las características de desempeño que se van a validar y criterios de aceptación a priori para precisión, robustez, estabilidad y, cuando corresponda, reproducibilidad. El plan de validación debe presentar algunos detalles experimentales y procedimientos de manejo de datos puesto que dichos detalles proveen una guía clara a los analistas de la validación y aseguran un mejor control sobre los datos resultantes. Frecuentemente, se establece una descripción del método después de la validación previa al estudio, pero antes del estudio. Esto provee una descripción detallada de los reactivos, controles y equipo necesarios para correr el ensayo, junto con un procedimiento operativo con etapas detalladas e información sobre los procesos para la reducción e interpretación de datos. El punto en el que dicha descripción se vuelve un Procedimiento Operativo Estándar es específico para el sistema de calidad de cada fabricante. Una vez completada la validación, los fabricantes generalmente llevan a cabo una revisión técnica realizada por expertos de los datos de validación, seguida por una auditoría de los datos de validación. Cuando el trabajo de validación ha sido completado, se genera un informe de la validación del ensayo, el cual documenta todos los datos de validación del estudio, junto con información sobre los métodos y partidas de reactivos que se usaron. El informe auditado recibe la aprobación gerencial y posteriormente se archiva.
Validación Durante el Estudio La validación durante el estudio (monitoreo del mantenimiento de la aptitud del sistema) y la revalidación son componentes críticos de cualquier método bioanalítico. Por ende, la validación de un método en realidad no termina sino hasta que el método haya sido retirado del uso analítico.
USP 39
Información General/ (1106) Ensayos de lnmunogenicidad 1415
Para analizar el desempeño durante el estudio de los métodos bioanalíticos cuantitativos, por lo general se requieren criterios de aceptación de precisión y exactitud. Puesto que la exactitud no es aplicable para los métodos de anticuerpos antifármacos, el monitoreo del desempeño de las muestras de control de calidad reafirma la certeza para los analistas de que el sistema de ensayo es adecuado para su uso previsto, es decir, que el ensayo sigue siendo válido y que su desempeño es el mismo que durante la validación previa al estudio. El uso de un control positivo bajo asegura que la valoración mantenga su sensibilidad. Por lo regular, durante el análisis de las muestras del estudio, la precisión intraensayo (entre determinaciones repetidas) de los resultados de controles positivos, así como las muestras de prueba (con una señal de ensayo igual o mayor que el punto de corte de detección), se controla usando criterios de aceptación de la aptitud del sistema para asegurar la obtención constante de datos significativos. Sin embargo, los resultados por debajo del punto de corte pueden no ser necesarios para cumplir con el criterio de límite de coeficiente del variación.
GESTIÓN DEL CICLO DE VIDA La gestión del desempeño de los ensayos de inmunogenicidad desde el desarrollo clínico inicial, pasando por el ciclo de vida subsiguiente del producto, requiere comprender las fortalezas, debilidades y capacidades del formato del método, así como de los reactivos críticos para el ensayo y de las características de desempeño del ensayo. Asimismo, un plan bien definido de producción de reactivos críticos, de caracterización y calificación, de calificación de proveedores de reactivos críticos y de parámetros de caracterización y calificación para reactivos producidos internamente (nivel agregado y eficiencia del etiquetado) ayudará a gestionar los riesgos de mantenimiento del ensayo y de la transferencia del método a otros laboratorios. Cuando se presentan cambios en los componentes o equipos críticos del método, o en la población que se está estudiando con un ensayo de anticuerpos antifármacos particular, puede ser necesario llevar a cabo una revalidación del ensayo. La revalidación puede abarcar parte o la totalidad de las características de validación (es decir, puede ser una revalidación parcial o completa del ensayo). El uso de lotes o partidas de reactivos críticos para el ensayo que sean diferentes de los usados en la validación previa al estudio no requieren de revalidación del ensayo, pero se deben sustentar mediante datos de calificación experimental apropiados para el nuevo reactivo a fin de asegurar el mantenimiento de la aptitud del sistema. Otro aspecto crítico de la gestión del ciclo de vida es el desarrollo de una estrategia para relacionar datos clínicos entre un formato de ensayo existente y uno mejorado. Dichos cambios por lo general ocurren durante el ciclo de vida de un producto debido a los compromisos posteriores a la comercialización u otras necesidades. Para facilitar la comparación y la validación cruzada del método existente con las versiones revisadas, los analistas deben conservar alícuotas suficientes de los lotes originales de los reactivos críticos para el ensayo. Además, archivar muestras con cantidades agregadas conocidas de analito, así como muestras de pacientes ciegas, resulta útil para relacionar lotes de reactivos y métodos a fin de minimizar desviaciones en el desempeño del ensayo. Los analistas deben desarrollar un plan por escrito que detalle el tipo de cambios en el ensayo existente o en los reactivos críticos que requerirán una calificación del ensayo contra una validación cruzada o validación completa. Un documento de gestión de calidad debe incluir detalles tales como el número de ensayos que se deben realizar, el número de analistas que se van a usar, la capacitación requerida para los analistas, los criterios de aceptación para demostrar la equivalencia entre métodos existentes y revisados, el análisis de datos y el método de informe. Esta información demuestra la robustez y la uniformidad del ensayo después de los cambios. Los controles de calidad que aseguran la equivalencia del ensayo incluyen o/oCV, límites de tolerancia, valores de pendiente EC 50, nivel de título y relación señal-ruido. Un enfoque comúnmente usado para demostrar la equivalencia de dos métodos de inmunogenicidad es la demostración de una concordancia del ::::90% en resultados de muestras archivadas entre los métodos existentes y revisados. Los analistas deben usar muestras archivadas con un intervalo de valores positivos, así como un número apropiado de negativos para verificar que un nuevo ensayo segrega muestras en categorías positivas y negativas de la misma manera que uno existente. Otra consideración importante para la gestión del ciclo de vida de los reactivos críticos del ensayo es el monitoreo de la estabilidad a largo plazo de los reactivos en diferentes condiciones de almacenamiento. Un plan detallado de análisis de estabilidad incluye temperaturas de almacenamiento (4ºC, -20ºC y -70ºC), volumen de alícuota, ciclos de congelación-descongelación y características de desempeño aceptables para calificación del ensayo, y se deben documentar los resultados. En este contexto, puede ser prudente archivar muestras de pacientes para demostrar la estabilidad a largo plazo de la respuesta de anticuerpos antifármacos policlonales en muestras reales de pacientes.
APÉNDICES Apéndice 1: Análisis de la lnmunogenicidad no Clínica Ponce R, Abad L, Amaravadi L, et al. lmmunogenicity of biologically derived therapeutics: assessment and interpretation of nonclinical safety studies. Reg Toxico/ Pharmacol. 2009; 54:164-182. ICH. S6(Rl) Preclinical safety evaluation of biotechnology-derived pharmaceuticals. Geneva, Switzerland: ICH; 2011.
1416 (1106) Ensayos de lnmunogenicidad / Información General
USP 39
Apéndice 2: Atributos de Calidad y Evaluaciones de Riesgo de lnmunogenicidad CMC Biotech Working Group. A-Mab: a case study in bioprocess development. 2009. http://www.casss.org/associations/ 9165/files/A-Mab_Case_Study_Version_2-1.pdf. Consultado el 01 de diciembre de 2011. Shankar G, Pendley C, Stein KE. A risk-based bioanalytical approach for the assessment of antibody immune responses against biological drugs. Nat Biotechnol. 2007; 25:555-561. ICH. Q8(R2) Pharmaceutical development. 2009. http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Quality/Q8_R1 /Step4/Q8_R2_Guideline.pdf. Consultado el 14 de diciember de 2011. ICH. Q9 Quality risk management. 2005. http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_products/Guidelines/ Quality/Q9/Step4/Q9 _Guideline.pdf. Consultado el 14 de diciembre de 2011.
Apéndice 3: Diseño y Validación de Ensayos de lnmunogenicidad Mire-Sluis AR, Barrett YC, Koren E, et al. Recommendations for the design and optimization of immunoassays used in the detection of host antibodies against biotechnology products. j lmmunol Methods. 2004; 289:1-16. Koren E, Quarmby V, Taniguchi G, et al. Recommendations on risk-based strategies for detection and characterization of antibodies against biotechnology products. j /mmunol Methods. 2008; 333:1-9. Shankar G, Devanarayan V, Amaravadi L, et al., Recommendations for the validation of immunoassays used for detection of host antibodies against biotechnology products. j Pharm Biomed Anal. 2008; 48:1267-1281. Büttel IC, Chamberlain P, Chowers Y, et al. Taking immunogenicity assessment of therapeutic proteins to the next leve!. Biologicals. 2011; 39(2):100-109.
Apéndice 4: Métodos Estadísticos Zhang JH, Chung TDY, Oldenburg KR. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. j Biomolecular Screening. 1999; 4:67-73. Devanarayan V, Tovey MG. Cut-points and performance characteristics for anti-drug antibody assays. In: Detection and Quantification of Antibodies to Biopharmaceuticals: Practica/ and Applied Considerations. Tovey MG, ed. Hoboken, NJ: john Wiley & Sons; 2011.
Apéndice 5: Pautas Reglamentarias para Estudios Clínicos de lnmunogenicidad FDA. Draft guidance for industry: assay development for immunogenicity testing of therapeutic proteins. 2009. http:// www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatorylnformation/Guidances/UCMl 92750.pdf. Consultado el 01 de diciembre de 2011. EMEA. Guideline on immunogenicity assessment of monoclonal antibodies intended for in vivo clinical use. 2012. http:// www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2012/06/WC500128688.pdf. Consultado el 30 de julio de 2012. EMEA. Guideline on immunogenicity assessment of biotechnology-derived therapeutic proteins. 2006. http:// www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2009/09/WC500003947.pdf. Consultado el 01 de diciembre de 2011.
(1106.1) ENSAYOS DE INMUNOGENICIDAD-DISEÑO Y VALIDACIÓN DE ENSAYOS PARA DETECTAR ANTICUERPOS NEUTRALIZANTES ANTI FÁRMACOS INTRODUCCIÓN Y ALCANCE La administración de medicamentos biológicos de origen natural o recombinante puede provocar cierto grado de respuesta inmune que conlleva al desarrollo de anticuerpos antifármacos en sujetos tratados. Los anticuerpos neutralizantes son un subconjunto de anticuerpos antifármacos que afectan la actividad biológica del medicamento biológico. Para los propósitos de este capítulo, los anticuerpos neutralizantes se definen por su capacidad de neutralizar la actividad biológica de un producto terapéutico en un sistema in vitro. Este capítulo no trata anticuerpos que pueden tener un impacto sobre la eliminación del fármaco de la circulación. [NOTA-El Apéndice provee dos referencias útiles sobre este tema.] Se requerirían estudios clínicos adicionales para evaluar los cambios ocasionados por la actividad biológica sobre los resultados terapéuticos.
USP 39
Información General/ (1106.1) Ensayos de lnmunogenicidad 141 7
Los anticuerpos neutralizantes pueden alterar la actividad biológica de la molécula terapéutica uniéndose a uno o más epítopes que están ubicados dentro de su sitio activo. Además, los anticuerpos neutralizantes pueden interferir con los sitios activos por impedimento estérico (es decir, el anticuerpo se une a áreas de la proteína que están cerca del sitio activo) o por inducir cambios alostéricos en la conformación del fármaco (es decir, el anticuerpo se une a un sitio del fármaco e induce un cambio en la conformación que puede interferir con la actividad del fármaco). Por lo tanto, es importante monitorear la inmunogenicidad de los productos terapéuticos biológicos a lo largo del ciclo de desarrollo del medicamento usando métodos sensibles y confiables que no sólo determinen la presencia o ausencia de anticuerpos antifármacos, sino que también caractericen su capacidad neutralizante. El objetivo de este capítulo de información general es proveer recomendaciones útiles sobre las mejores prácticas que se pueden usar para el diseño basado en riesgos y validación de ensayos de anticuerpos neutralizantes antifármacos. Conforme a lo descrito en el capítulo Ensayos de lnmunogenicidad-Diseño y Validación de lnmunoensayos para Detectar Anticuerpos Antifármacos (1106), por lo regular se usan inmunoensayos (o ensayos de unión de ligandos) para detectar la presencia de anticuerpos antifármacos. Se pueden usar diversos formatos de ensayos para determinar si un anticuerpo antifármaco también es un anticuerpo neutralizante. El primer formato de ensayo, definido aquí como ensayo funcional de anticuerpos neutralizantes (que por ende implica una respuesta biológica real), es el de uso más común y puede tomar la forma de un ensayo funcional basado en células o un ensayo funcional no basado en células (p.ej., un ensayo bioquímico para una enzima terapéutica). Otro grupo principal de formatos de ensayos se basa en la inhibición de unión del ligandos mediada por anticuerpos neutralizantes entre los productos terapéuticos y sus dianas. Estos ensayos pueden adoptar la forma de ensayos de unión basados en células (p.ej., cuando existe una diana en la superficie celular) o ensayos de unión que no se basan en células (p.ej., cuando se usa un receptor soluble purificado o un fármaco diana). La decisión de usar un ensayo basado en células o uno no basado en células depende de factores que incluyen el mecanismo de acción del fármaco y la evaluación del riesgo de inmunogenicidad, así como la disponibilidad de ensayos de anticuerpos neutralizantes pertinentes y sensibles (Figura 7). Otra consideración importante al seleccionar el formato del ensayo es el grado de riesgo para la seguridad del paciente presentado por la formación de anticuerpos neutralizantes; por lo tanto, para productos terapéuticos en los que los anticuerpos presentan un riesgo alto para los pacientes, el formato del ensayo debe tener una sensibilidad suficiente para detectar anticuerpos neutralizantes clínicamente relevantes. La urgencia con la que podrían necesitarse los resultados puede influir sobre el tipo de ensayo seleccionado, en particular si el ensayo basado en células requiere un tiempo largo de ejecución. Algunas consideraciones prácticas para tomar esta decisión se presentan en la sección Enfoque Basado en Riesgos para Evaluar los Anticuerpos Neutralizantes y Sus Consecuencias. La detección de actividad neutralizante de fármacos en dichos ensayos in vitro facilita un mejor entendimiento de cualquier efecto clínico observado como resultado de una actividad farmacológica alterada. Por lo tanto, se recomienda en gran medida una investigación minuciosa de la presencia de anticuerpos neutralizantes y su caracterización con respecto a parámetros clínicos del fármaco tales como farmacocinética, farmacodinámica , eficacia y seguridad. Los anticuerpos neutralizantes tienen que ser producidos a una concentración biológicamente significativa de modo que pueda detectarse su efecto en un ensayo in vitro, y dichos anticuerpos tendrán que unirse con afinidad suficiente para permanecer firmemente unidos al producto terapéutico. Por el contrario, un anticuerpo con baja afinidad de unión que reconoce una región activa de una proteína terapéutica podría no permanecer unido al producto terapéutico y, por ende, no mediaría fácilmente un efecto biológico. No obstante, no puede descartarse la posibilidad de que los anticuerpos de baja afinidad tengan un efecto in vivo, por lo que los ensayos de anticuerpos neutralizantes deben diseñarse para detectar anticuerpos con el más amplio rango de afinidades que sea prácticamente posible. (p.ej., limitar el número de pasos de lavado). Aunque los principios descritos en este capítulo en general son aplicables a los ensayos de anticuerpos neutralizantes basados en células y no basados en células de uso más común, puede ser necesario modificar las estrategias del diseño y validación del ensayo para ciertos productos (p.ej, enzimas), usos clínicos (p.ej., diferentes regímenes de dosificación o vías de administración) o poblaciones de pacientes. [NOTA-El Apéndice contiene una lista de guías reglamentarias e informes oficiales útiles.]
FACTORES QUE INFLUYEN SOBRE EL DESARROLLO DE ANTICUERPOS NEUTRALIZANTES Aunque no se tiene plena certeza acerca de la razón por la que los productos terapéuticos biológicos inducen anticuerpos neutralizantes sólo en algunos individuos, ni porqué algunos productos terapéuticos inducen más anticuerpos neutralizantes que otros, la investigación ha mostrado que ciertos factores se encuentran regularmente relacionados con la generación de dichos anticuerpos. La respuesta inicial de baja afinidad a una proteína terapéutica (principalmente compuesta por anticuerpos lgM) raramente puede neutralizar de manera efectiva el efecto biológico de la proteína terapéutica. Sin embargo, la respuesta de los anticuerpos a una proteína terapéutica puede madurar, generalmente por exposición repetida. A medida que madura la respuesta inmune, más epítopes de la proteína terapéutica pueden ser reconocidos por los anticuerpos antifármacos, lo que lleva a un aumento en la posibilidad de formación de anticuerpos neutralizantes, debido a que ahora los epítopes dentro de la región activa de la proteína terapéutica son reconocidos. Por último, aquellos factores que desencadenan el desarrollo de una respuesta inmune robusta requieren el desencadenamiento de respuestas inmunes mediadas por células T. Algunos de estos factores incluyen la presencia de múltiples epítopes en las células T (secuencia lineal de 7-9 aminoácidos reconocida en el entorno del complejo mayor de histocompatibilidad clase 11 o CMH 11); atributos específicos del producto, como la agregación, que fomentarían la captación en las células presentadoras de antígenos; las diferencias en la secuencia genética entre la proteína terapéutica y sus equivalentes endógenos; el grado de
1418 (1106.1) Ensayos de lnmunogenicidad / Información General
USP 39
tolerancia inmunológica; y la cantidad, vía y plan de administración de la proteína terapéutica. Existe también la probabilidad de que proteínas residuales de Ja célula hospedera actúen como adyuvantes. Las proteínas terapéuticas que tienen una secuencia de aminoácidos muy cercana a Ja de las proteínas endógenas son menos propensas a desencadenar una respuesta inmune robusta. Cuando la secuencia es idéntica y el equivalente endógeno está totalmente expuesto al sistema inmune, se puede anticipar un alto nivel de tolerancia a la proteína terapéutica. Este podría no ser el caso en sujetos con trastornos autoinmunes, debido a que la tolerancia a las proteínas propias ya está comprometida. Los anticuerpos neutralizantes siempre se definen dentro del contexto del ensayo que los identifica. Por ende, es posible que no todos los sujetos con anticuerpos neutralizantes puedan ser identificados en todos Jos programas. Asimismo, es importante reconocer que si mejora la sensibilidad de un ensayo de anticuerpos neutralizantes, entonces puede incrementarse el número detectado de sujetos con anticuerpos neutralizantes. Si aumenta Ja incidencia de sujetos con anticuerpos neutralizantes positivos, es importante determinar si el cambio está relacionado con el desempeño del ensayo o con una alteración en los atributos de calidad del producto de la proteína terapéutica. La especificidad del anticuerpo neutralizante también es importante. Para ensayos con una especificidad relativamente deficiente, las muestras basales (pretratamiento) pueden presentar respuesta positiva; sin embargo, dicha respuesta puede no deberse a anticuerpos dirigidos específicamente contra el producto terapéutico que se está estudiando.
DETERMINACIÓN DE LA INMUNOGENICIDAD PRECLÍNICA V CLÍNICA Estudios No Clínicos: Relevancia y Alcance de la lnmunogenicidad Preclínica Los estudios toxicológicos preclínicos por lo general se usan para sugerir la dosimetría y definir los márgenes de seguridad mediante la evaluación de la toxicidad idiosincrática y la toxicidad específica en el órgano diana ocasionada por los productos terapéuticos. El requisito primario para estos estudios es demostrar que los animales están expuestos durante todo el estudio al producto terapéutico a los niveles de dosis determinados. Conforme se indica en la Guía S6 de la ICH, esto puede lograrse analizando la concentración de fármaco circulante (datos farmacocinéticos) en combinación con datos sobre marcadores farmacodinámicos, y/o usando evaluaciones de inmunogenicidad para facilitar la interpretación de la correlación entre exposición y toxicidad. Según se trata en el capítulo (1106), los sistemas de prueba en animales tienen limitaciones importantes en su capacidad para fundamentar conclusiones específicas sobre la inmunogenicidad clínica potencial, en particular con respecto a la restricción del CMH, a las respuestas de células B dependientes de células T, y a la posibilidad de neutralizar el efecto farmacológico del producto terapéutico. No obstante, la evaluación de inmunogenicidad en estudios no clínicos puede ser útil cuando se presente una homología significativa entre el producto terapéutico y un equivalente endógeno en animales [p.ej., eritropoyetina (EPO) y trombopoyetina (TPO)]. Se ha descripto severa trombocitopenia en varias especies animales después de dosificar con moléculas de TPO autólogas, debido al desarrollo de anticuerpos neutralizantes anti-TPO circulantes. En estos estudios, los anticuerpos neutralizantes afectaron directamente la actividad farmacológica de la proteína endógena y del producto terapéutico administrado de manera exógena, lo que dificultó la interpretación de los hallazgos del estudio toxicológico. Los anticuerpos neutralizantes por Jo regular se detectan y caracterizan directamente mediante ensayos in vitro. Sin embargo, una disminución en Ja expresión o el nivel de actividad de un marcador farmacodinámico puede indicar Ja presencia de anticuerpos neutralizantes. Si se desea confirmar que el efecto sobre el marcador farmacodinámico se debe a Ja presencia de anticuerpos neutralizantes, esto puede lograrse mediante un ensayo de anticuerpos neutralizantes como sustituto para inferir la presencia de anticuerpos neutralizantes. Es importante confirmar que el cambio en la reducción del marcador farmacodinámico no se debe meramente a la eliminación del fármaco de la circulación, lo cual es un efecto que puede ser ocasionado por anticuerpos antifármacos, más que por una neutralización "verdadera". Como parte de la evaluación de inmunogenicidad, también puede ser útil caracterizar los epítopes inmunodominantes para proteínas de tan alto riesgo. La recolección de muestras no clínicas y los aspectos relacionados a considerar se tratan en el capítulo (1106). Aunque la incidencia medida y el título de anticuerpos neutralizantes pueden variar en las distintas especies animales, la inducción de anticuerpos neutralizantes en múltiples especies puede sugerir una probabilidad mayor de desarrollo de anticuerpo neutralizante en humanos cuando se presenta una homología significativa dentro del sitio biológicamente activo. Los estudios de inmunogenicidad en animales transgénicos que expresan el gen que codifica la proteína de interés pueden ser útiles para ayudar a predecir el potencial relativo de las diversas formas en que el medicamento puede inducir anticuerpos neutralizantes.
Estudios Clínicos: Relevancia y Alcance de las Evaluaciones de lnmunogenicidad La evaluación de inmunogenicidad, incluido el desarrollo de anticuerpos neutralizantes, sigue siendo una parte importante de la evaluación de seguridad en el desarrollo clínico de fármacos. El alcance de la evaluación de inmunogenicidad para productos terapéuticos se basa en el tipo de producto terapéutico, la indicación seleccionada, la farmacología, la vía de administración, la duración del tratamiento y la inmunocompetencia del paciente. La frecuencia de la recolección de muestras y el análisis deben basarse en el tiempo y la incidencia de la respuesta de los anticuerpos, así como en la ocurrencia y severidad de las secuelas clínicas (ver el capítulo (1106) para mayor información). Debido a que los anticuerpos neutralizantes pueden desencadenar una variedad de posibles efectos clínicos, se requieren métodos analíticos específicos y sensibles para (1) investigar las características de los anticuerpos inducidos con el paso del tiempo
USP 39
Información General/ (1106.1) Ensayos de lnmunogenicidad 1419
(no neutralizantes y neutralizantes), (2) revelar la duración de la respuesta de los anticuerpos antifármacos (temporal contra persistente) y (3) aclarar las implicaciones de la inmunogenicidad potencial para los resultados clínicos. Se debe implementar un seguimiento adecuado para el paciente a fin de medir los anticuerpos antifármacos neutralizantes, debido a que los anticuerpos neutralizantes persistentes por lo general se desarrollan tardíamente en el curso del tratamiento, por lo que es importante caracterizar la naturaleza temporal de la respuesta del anticuerpo. Por ejemplo, un seguimiento cuidadoso puede revelar una respuesta temporal en la que aparecen anticuerpos, pero que desaparecen después de un periodo de 2-3 meses. Además del muestreo programado y repetitivo de rutina, los pacientes deben ser evaluados clínicamente basándose en los síntomas siempre que se sospeche el desarrollo de anticuerpos. Los ensayos clínicos previos a la aprobación podrían no detectar eventos inmunogénicos raros debido a un número insuficiente de pacientes para la evaluación estadística adecuada y/o una duración inadecuada de la exposición al fármaco. Por lo tanto, puede ser necesario un programa de control de la inmunogenicidad posterior a la aprobación para cualquier proteína terapéutica que presente riesgos de generar anticuerpos neutralizantes de importancia clínica.
ESTRATEGIA BASADA EN RIESGOS PARA EVALUAR LOS ANTICUERPOS NEUTRALIZANTES Y SUS CONSECUENCIAS El capítulo (1106) describe en detalle los principios de las estrategias basadas en riesgos para la detección y caracterización de anticuerpos dirigidos contra medicamentos biológicos. Las dos preocupaciones principales relacionadas con los anticuerpos neutralizantes son: (1) el producto terapéutico puede perder actividad farmacológica, lo que a su vez afectaría su eficacia; y (2) los anticuerpos neutralizantes pueden presentar reacciones cruzadas con una proteína endógena no redundante. Asimismo, al igual que con los anticuerpos antifármacos, los anticuerpos neutralizantes pueden contribuir a otros efectos adversos tales como la formación de complejos inmunes y la potencialidad del depósito de estos complejos en los tejidos y en el sistema vascular. La Tabla 7 del capítulo (1106) resume algunos factores de riesgo importantes que pueden influir en la severidad de las consecuencias clínicas de una respuesta de anticuerpos antifármacos o anticuerpos neutralizantes. Los criterios básicos de evaluación de riesgos descritos en la Tabla 7 del capítulo (1106) proveen una orientación útil para este tipo de evaluación de riesgo. Las diversas combinaciones de factores derivadas de las tres categorías de riesgo (riesgo bajo, medio, alto), así como las propiedades reales del anticuerpo, pueden generar toda una gama de riesgos intermedios. Por ejemplo, los anticuerpos neutralizantes dirigidos contra la hormona de crecimiento humano recombinante pueden neutralizar la hormona de crecimiento humano endógena, que es un factor vital no redundante. No obstante, luego de décadas de terapia con diversas preparaciones de hormonas de crecimiento humano recombinantes han demostrado que no se observa una atenuación del crecimiento, incluso en presencia de anticuerpos neutralizantes con reactividad cruzada detectados con un ensayo in vitro. Por lo tanto, el riesgo real asociado con la hormona de crecimiento humano recombinante puede considerarse intermedio entre las categorías de riesgo alto y mediano, a pesar de la existencia del equivalente endógeno. Los formatos potenciales de ensayo se seleccionan basándose en el mecanismo de acción del fármaco, caso por caso, con el asesoramiento de las agencias reglamentarias, cuando así se requiera, mientras que la estrategia analítica (o evaluación de inmunogenicidad) es conducida por el riesgo de inmunogenicidad para el producto terapéutico específico. La Figura 7 presenta un diagrama de flujo con algunas opciones útiles para la selección del diseño de ensayo de anticuerpos neutralizantes.
1420 (1106.1) Ensayos de lnmunogenicidad / Información General
USP 39
Productos Biológicos Terapéuticos Caracterizados por Mecanismo de Acción
Agonista
Conjugado de Anticuerpo-Fármaco (ADC)
Anticuerpo Terapéutico con Función de ADCC
Antagonista
Recomendado
Ensayo basado en células
Se prefiere ensayo basado en células; se acepta CLBA
ADCC basado en células
Ensayo funcional basado en células'
Ensayos de unión basados en células y/o CLBA no basados en células'
Ensayos basados en células o CLBA no basados en células'
Ensayos basados en células o CLBA no basados en células•
[Nota: ADCC es "citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos"; CLBA es "ensayo competitivo de unión de ligandos"; MAb es "anticuerpo monoclonal".] 1 Para productos terapéuticos agonistas dirigidos a receptores celulares, se recomienda un ensayo funcional de anticuerpos neutralizantes basado en células. Esto incluye productos terapéuticos con un equival1mte endógeno redundante o no redundante. 2 Para productos terapéuticos con función ADCC, un ensayo de ADCC basado en células puede presentar potencialmente dificultades técnicas. Además, los anticuerpos antifármacos específicos para la región Fe de anticuerpos terapéuticos humanizados a menudo se unen a otras IgG no específicas en la matriz del suero y son difíciles de detectar en ensayos de unión de anticuerpos antifármacos. En esta situación, una plataforma viable para el ensayo de anticuerpos neutralizantes puede ser un ensayo de unión de ligando que emplee un diseño de conexión o un método de ensayo basado en la interacción antígeno-fármaco. ' Se deben considerar los ensayos no basados en células, con el asesoramiento de las agencias reglamentarias, si la inhibición, inducida por los anticuerpos neutralizantes, del producto terapéutico enzimático lisosomal que funciona a un pH bajo no es posible en la condiciones del ensayo basado en células. • Para productos terapéuticos que se unen a más de un receptor se recomienda un ensayo basado en células.
Figura 1. Ejemplos de selección de diseño de ensayo de anticuerpos neutralizantes. Para agonistas terapéuticos que interactúan directamente con los receptores celulares, tales como factores y hormonas de crecimiento, el desarrollo de ensayos de anticuerpos neutralizantes basados en células es apropiado para reflejar el mecanismo de acción del fármaco. Esta categoría incluye productos terapéuticos con un equivalente endógeno no redundante que puede generar secuelas clínicas con un alto nivel de riesgo para los pacientes. Para estos productos terapéuticos, se requieren ensayos con la capacidad de determinar los niveles de anticuerpos neutralizantes con alta especificidad y sensibilidad; por lo general, los resultados se expresan en títulos o equivalentes del fármaco neutralizado. Estas recomendaciones surgen de la preocupación de que los anticuerpos neutralizantes inducidos por las proteínas terapéuticas pueden presentar reacciones cruzadas con homólogos endógenos vitales y neutralizarlos, y ocasionar síndromes de deficiencia de tipo autoinmune [p.ej., tal como el observado con el factor de crecimiento y desarrollo de megacariocitos (MGDF, por sus siglas en inglés) y la EPO]. También se recomienda la detección temprana y el análisis continuo de anticuerpos neutralizantes dirigido contra las moléculas de alto riesgo debido a que los datos de anticuerpos neutralizantes pueden influir sobre las decisiones terapéuticas. Para antagonistas terapéuticos (p.ej., anti-lgE o anti-factores de la coagulación), algunas agencias reglamentarias han aceptado ensayos competitivos de unión de ligandos no basados en células para la detección de anticuerpos neutralizantes que se dirigen contra los productos terapéuticos con dianas humorales. Sin embargo, para antagonistas terapéuticos que interactúan con un receptor y co-receptor para ejercer un efecto farmacéutico sobre las células diana, por lo regular se recomiendan los ensayos basados en células debido a que este tipo de mecanismo de acción puede no reflejarse con exactitud en un ensayo de
USP 39
Información General/ (1106.1) Ensayos de lnmunogenicidad 1421
unión de ligando no basado en células, puesto que un anticuerpo antifármaco que no bloquea las interacciones fármaco-diana puede interferir con las interacciones del co-receptor diana, ocasionando una neutralización funcional. En lo que respecta a otros productos terapéuticos, tales como conjugados de anticuerpo-fármaco, anticuerpos terapéuticos con funciones efectoras para la eficacia clínica y enzimas terapéuticas que funcionan en células diana, por lo general se recomiendan ensayos basados en células para reflejar el mecanismo de acción del fármaco. Sin embargo, para enzimas lisosomales terapéuticas que funcionan óptimamente a un pH de 4-5, puede ser complicado generar cualquier control de anticuerpos neutralizantes que puedan inhibir la enzima a un pH bajo con sensibilidad suficiente. Ante esta situación, el desarrollo de un ensayo no basado en células (p.ej., inhibición de unión entre un fármaco enzimático y su receptor específico) requiere el asesoramiento de una agencia reglamentaria. Además, un ensayo de actividad enzimática no basado en células puede ser apropiado para enzimas terapéuticas, incluso para aquellos que ejercen sus actividades dentro de las células. No obstante, los resultados de dicho ensayo sólo serán concluyentes si las condiciones requeridas para la actividad intracelular de un fármaco enzimático también permiten la unión efectiva de un anticuerpo neutralizante putativo con el fármaco. Por lo general, se recomienda analizar los anticuerpos neutralizantes de manera más frecuente (p.ej., mensual o bimestral) para situaciones de alto riesgo. Para los casos de pacientes que resulten positivos el muestreo se debe extender después de terminado el estudio hasta que den negativo en dos pruebas consecutivas con al menos dos meses de diferencia, o un periodo calculado en base de la vida media del anticuerpo antifármaco (p.ej., 3-5 vidas medias). Esto puede incluir el análisis posterior a la comercialización. Para situaciones de riesgo medio y bajo, el análisis debe realizarse caso por caso, asesorándose con las agencias reglamentarias. Para evaluar por completo el riesgo potencial asociado con los anticuerpos neutralizantes, también es importante entender la relación exposición-respuesta de un producto bioterapéutico dado, debido a que esta relación podría sugerir el grado en el que los anticuerpos neutralizantes pueden afectar la actividad in vivo del fármaco. Por ejemplo, una alta dosis de fármaco sería más difícil de neutralizar debido a que se requerirían más anticuerpos neutralizantes; por ende, existe un riesgo menor de pérdida de eficacia. Por el contrario, cuando una baja concentración de fármaco es suficiente para lograr el efecto terapéutico, los niveles bajos de anticuerpos neutralizantes podrían neutralizar la actividad del fármaco, incrementando así el nivel de riesgo. Pueden presentarse situaciones similares cuando la concentración de un equivalente endógeno del fármaco es baja; incluso los niveles bajos de anticuerpo neutralizante podrían neutralizar su función fisiológica e incrementar así el riesgo relacionado con el anticuerpo.
DISEÑO DE MÉTODOS DE PRUEBA PARA ANTICUERPOS NEUTRALIZANTES Aspectos Generales La selección de un tipo de ensayo para anticuerpos neutralizantes se realiza según el mecanismo de acción del producto terapéutico y la naturaleza de su diana. Un ejemplo es un anticuerpo monoclonal terapéutico que se une a un receptor en la superficie de la célula, lo que a su vez afecta las interacciones con otros receptores de la superficie celular. Ante esta situación, se debe usar un ensayo de anticuerpos neutralizantes basado en células debido a que es poco probable que dichas interacciones puedan replicarse en la superficie de una placa de microtitulación. La Figura 7 presenta diversas selecciones de ensayos de anticuerpos neutralizantes, categorizadas por su dependencia del mecanismo de acción del producto terapéutico. Los resultados del ensayo de anticuerpos neutralizantes por lo general son valores semi-cuantitativos por medio de un título, o cualitativos, informando un resultado negativo o positivo. Algunas plataformas tecnológicas informan valores cuantitativos, tales como el ensayo de resonancia de plasmón superficial (SPR, por sus siglas en inglés) (ver el capítulo (1106) y el capítulo Métodos de Pruebas Inmunológicas-Resonancia de Plasmón Superficial (1105)) o, en casos especiales, informan la neutralización de cantidades específicas de fármaco. Se puede argumentar que cualquier valor numérico de capacidad neutralizante de la muestra es semi-cuantitativo cuando se usa una preparación de anticuerpos como estándar de referencia, debido a que las afinidades y la naturaleza de los anticuerpos dentro del estándar tienen una baja probabilidad de replicar exactamente lo que está contenido en una muestra de prueba. Además, la comparación de valores de muestra entre diferentes laboratorios que usan diferentes preparaciones estándar posiblemente producirá resultados diferentes para la misma muestra. Por lo tanto, aunque para una muestra de anticuerpos neutralizantes un valor en unidades de masa es útil para realizar comparaciones relativas, se deben tener en cuenta todas las advertencias relacionadas con dicho valor. Para los ensayos de anticuerpos neutralizantes se recomienda obtener un título como respuesta primaria para los ensayos de anticuerpos neutralizantes, el cual se genera analizando diluciones seriales de una muestra. La inversa de la dilución de la muestra de prueba que produce un resultado positivo, según se define en el punto de corte del ensayo, representa el título del ensayo. Este título del ensayo debe multiplicarse por la dilución mínima requerida (MRD, por sus siglas en inglés; ver también (1106)) inicial, si no se ha considerado, para informar el título de anticuerpos neutralizantes presente en la matriz de la muestra sin diluir.
Métodos Basados en Células para la Evaluación de Anticuerpos Neutralizantes Según se indicó anteriormente, los ensayos de anticuerpos neutralizantes basados en células pueden tener dos tipos generales de lecturas: una basada en los eventos de unión, y la otra que requiere una serie de eventos intracelulares que llevan a una respuesta funcional. La unión del fármaco a un receptor o ligando en la superficie de la célula puede resultar en la internalización del receptor, fosforilación, o cambios en la concentración intracelular de monofosfato cíclico de adenosina (cAMP, por sus
1422 (1106.1) Ensayos de lnmunogenicidad / Información General
USP 39
siglas en inglés). Los ensayos funcionales determinan respuestas celulares más complejas, tales como la proliferación celular, expresión del gen indicador o síntesis y secreción de proteínas. Tal como se muestra en la Figura 7, cuando es apropiado un ensayo de anticuerpos neutralizantes basado en células, es importante estudiar los parámetros de desempeño de los componentes críticos en el sistema del ensayo, en particular la línea celular, el medicamento, el anticuerpo neutralizante usado como control positivo (CP) y la matriz de la especie de prueba. Los ensayos de anticuerpos neutralizantes basados en células pueden ser desafiantes desde el punto de vista técnico debido a la necesidad de optimizar la línea celular, las condiciones de cultivo y los componentes de la matriz de la muestra. La falta de optimización puede comprometer la precisión, robustez y sensibilidad del ensayo. Inicialmente, se pueden evaluar las células usadas para el ensayo de potencia biológica del fármaco para su uso en el ensayo de anticuerpos neutralizantes. La utilización de la misma línea celular provee diversas ventajas, teniendo en cuenta que se ha optimizado su mantenimiento y las condiciones de cultivo. A menudo, este sistema puede adaptarse para una matriz biológica. Como alternativa, se encuentran disponibles fuentes comerciales de líneas celulares o se puede obtener por ingeniería genética una línea celular que responda al fármaco. Las líneas celulares transfectadas con receptores diana pueden ofrecer la ventaja de una densidad del receptor más controlada, especificidad y generación de una señal mejorada. Las líneas celulares que expresan genes indicadores pueden proveer puntos finales sensibles del ensayo. La capacidad de respuesta de las células al fármaco debe ser caracterizada, en particular antes y después de la congelación, al igual que durante el cultivo continuo (ver también el capítulo de información general Crioconservación de Células (1044)). Los experimentos de dosis-respuesta del fármaco en la matriz biológica apropiada (p.ej., suero) pueden identificar problemas tempranos de interferencia. Idealmente, se deben evaluar muestras de varias matrices. La especificidad debe estudiarse para permitir el uso con suero obtenido de la especie de interés que desarrolló un anticuerpo neutralizante después de la exposición al fármaco. Los anticuerpos del control positivo a menudo se aíslan a partir de antisueros de esta especie, pero debido a que esto no siempre es posible durante el desarrollo del ensayo, se produce un reactivo con un anticuerpo de control sustituto para usarlo durante el desarrollo y la validación del ensayo (ver la sección Desarrollo de Controles Positivos y Negativos en Ensayos de Anticuerpos Neutralizantes). Los diseños de ensayo basados en células que se han usado con éxito en el desarrollo de medicamentos se presentan en la Tabla 7. El tipo de formato de ensayo seleccionado se ve influido por el mecanismo por el cual el fármaco interactúa con las células. Estas interacciones pueden ser directas o indirectas. Una interacción directa es aquella en la que el medicamento ejerce su efecto actuando directamente sobre las células, tales como citoquinas, péptidos o anticuerpos monoclonales que actúan sobre factores determinantes de la superficie celular. Las interacciones indirectas son aquellas en las que el medicamento bloquea la interacción de un ligando con su receptor de la superficie celular y que en consecuencia interfiere con la actividad biológica del ligando. Los ejemplos de dichos fármacos incluyen anticuerpos monoclonales terapéuticos sobre factores solubles y receptores solubles. Ta bl a 1 Formatos d e Ensayo d e Ant1cuerpos • Neutra I"1zantes Basa d os en C'I e u 1as d e Uso Frecuente Acción del Ejemplos de Anticuerpo NeutraliPunto Final del Ensayo Plataforma de Ensayo zante Ventajas Desventajas
Interacciones en la superficie celular
Citometría de fluorescencia, unión a la superficie celular en placa
Interfiere con la unión del fármaco al sitio diana en la célula o afecta la internalización del medicamento en la célula.
Fosforilación de substratos intracelulares
Activación del receptor de quinasas, ensayos por inmunoadsorción ligados a enzimas (ELISA), tinción intracelular
Afecta la fosforilación del receptor/sustrato diana inducida por el fármaco o afeeta la fosforilación inducida por el ligando bloqueando el fármaco.
Proliferación celular
Expresión del gen indicador
Incorporación de 3H, Azul Alamar
Luciferasa, f3 -galactosidasa, cloranfenicol acetiltransferasa
Afecta la proliferación celular que es inducida o inhibida por el fármaco o afeeta la proliferación celular inducida por el ligando bloqueando el fármaco.
Afecta la expresión del gen indicador por parte del medicamento o afecta la expresión del gen indicador inducida por el ligando bloqueando el fármaco.
La interacción entre fármaco, diana y anticuerpo neutralizante ocurre únicamente sobre la superficie de las células, lo que puede resultar en ensayos robustos y simples.
No se aplica a fármacos con un mecanismo de acción que implique vías de señalización intracelulares; la expresión inadecuada del receptor sobre la célula puede ser una limitación.
Utiliza eventos tempranos de la señalización celular, lo que puede resultar en un ensayo más corto.
Requiere de anticuerpos específicos del sitio de fosforilación; se requieren múltiples etapas en el ensayo si se usa ELISA para detectar la fosforilación.
El punto final del ensayo bien establecido para fármacos de tipo factor de crecimiento refleja lo que sucede en las células.
El punto final del ensayo es el resultado de múltiples vías y etapas intracelulares, lo que puede resultar en un ensayo largo; propenso a interferencia por factores séricos; el ensayo requiere demostrar especificidad.
El ensayo puede ser rápido, sensible y robusto.
Requiere invertir tiempo para construir la línea celular del gen informante que puede responder de manera robusta en presencia del suero de las especies de prueba; requiere demostrar especificidad.
USP 39
Información General/ (1106.1) Ensayos de lnmunogenicidad 1423 ., ) Ta bla 1 Formatos de Ensayo de A nticuerpos Neutrar1zantes Basados en C'I e u1as de Uso Frecuente (Contmuac1on
Punto Final del Ensayo
Ejemplos de Plataforma de Ensayo
Acción del Anticuerpo Neutrallzante
Ventajas
Desventajas
Influye la expresión de proteínas por parte del fármaco o influye la expresión de La proteína puede medirse proteínas inducida por el li- en el sobrenadante celular o en el lisado celular usangando bloqueando el fárdo un ELISA. maco.
El punto final del ensayo es el resultado de múltiples vías y etapas intracelulares, lo que puede resultar en un ensayo largo; el ensayo implica el cultivo celular seguido de un ensayo de unión de ligando para detectar la proteína sintetizada, por lo que se requieren dos ensayos.
Funciones Efectoras
Citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC, por sus siglas en inglés), unión del receptor Fcy
Influye sobre el destino de la célula diana mediado por las funciones efectoras de los anticuerpos terapéuticos.
Requerido para anticuerpos terapéuticos en los que los dominios Fab y Fe están implicados en la función.
Pueden estar implicadas múltiples funciones efectoras (citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos, citotoxicidad dependiente del complemento, fagocitosis, etc.), lo que puede dificultar la selección y el desarrollo del ensayo, así como la interpretación de los resultados.
Citotoxicidad/apoptosis
Ensayos luminiscentes de viabilidad celular, ensayo de marcación de extremos fragmentados de ADN por desoxinucleotidil transferasa terminal y dUTP
Afecta la citotoxicidad/ apoptosis celular inducida por fármaco o afecta la citotoxicidad/apoptosis celular inducida por ligandos bloqueando el fármaco.
Refleja directamente el mecanismo de acción de la muerte celular mediada por productos terapéuticos.
Requiere demostrar especificidad.
Expresión o secreción de proteínas
ELISA, enzimoinmunoensayo, radioinmunoensayo, ensayo electroquimioluminiscente, ensayos de proximidad de centelleo
Se tiene en cuenta el punto final del ensayo, el cual puede reflejar respuestas celulares tempranas o tardías. Las respuestas tempranas incluyen la unión inicial a la superficie celular, internalización, un evento temprano en la señalización celular o expresión génica. Las respuestas tardías reflejan la participación de múltiples vías intracelulares que generan un resultado biológico tal como proliferación, inducción de productos medibles, apoptosis o funciones efectoras tales como citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos o citotoxicidad dependiente del complemento. Se debe tener cuidado de optimizar las concentraciones de los componentes críticos del ensayo que influyen sobre su sensibilidad para detectar anticuerpos neutralizantes. En el caso de un ensayo directo de anticuerpos neutralizantes, se debe evaluar la respuesta de la dosis a diversas concentraciones del medicamento. La cantidad de medicamento usada en el ensayo debe estar dentro de la porción lineal de la curva de dosis-respuesta que produce una respuesta reproducible (p.ej., a menudo una respuesta máxima del ensayo de 30%-80%). La sensibilidad de un ensayo de anticuerpos neutralizantes indirecto depende de la concentración de ligando y de la concentración de medicamento. En todos los casos, se deben incorporar los controles apropiados. Por ejemplo, en un diseño de ensayo directo en el que el fármaco actúa directamente sobre las células para inducir una respuesta biológica, los controles del ensayo deben incluir células solas, células con medicamento y células con medicamento y un control positivo de anticuerpos neutralizantes. Un formato de ensayo indirecto debe incluir células solas, células con ligando, células con ligando y medicamento y células con ligando, medicamento y un control positivo de anticuerpos neutralizantes. El ensayo puede configurarse como una dilución única para proveer información cualitativa (positivo o negativo), como es generalmente el caso de estudios preclínicos, o puede usar diluciones múltiples para proveer un resultado semi cuantitativo, tal como el título. El diseño ensayos bien controlados facilita el monitoreo del desempeño del ensayo con el paso del tiempo y la identificación de factores a considerar tales como las causas del fracaso de un ensayo.
, Métodos No Basados en Células para la Evaluación de Anticuerpos Neutralizantes Las agencias reglamentarias han recomendado tradicionalmente los formatos de ensayos funcionales basados en células para la evaluación de anticuerpos neutralizantes. Sin embargo, en comparación con los desafíos técnicos de los ensayos basados en células descritos anteriormente, los inmunoensayos no basados en células son capaces de superar algunas de las limitaciones técnicas inherentes a los ensayos biológicos basados en células y, por lo tanto, se han convertido en otra plataforma tecnológica útil para la evaluación de anticuerpos neutralizantes. Las plataformas de inmunoensayos no basados en células, en especial los ensayos competitivos de unión de ligandos (CLBA, por sus siglas en inglés) cuando son pertinentes para el mecanismo de acción del fármaco, pueden usarse para la evaluación de anticuerpos neutralizantes si se demuestra que detectan específicamente anticuerpos neutralizantes (Figura 2A y Figura 28). En el caso de diversos productos terapéuticos biológicos (p.ej., anticuerpos monoclonales antagonistas contra un ligando soluble), el fármaco ejerce su efecto farmacéutico uniéndose a su diana y bloqueando la interacción del ligando con su recep-
1424 (11 06.1) Ensayos de lnmunogenicidad / Información General
USP 39
tor de la superficie celular; en consecuencia, el fármaco interfiere con la actividad biológica del ligando. En este caso, es apropiado un método de ensayo no basado en células para la evaluación de anticuerpos neutralizantes debido a que el método de ensayo refleja el mecanismo de acción del fármaco mediante la medición de la unión del fármaco a su diana y la inhibición de dicha actividad de unión por parte de los anticuerpos neutralizantes. El diseño de ensayo para anticuerpos neutralizantes basado en ensayos competitivos de unión de ligandos se basa en la competencia entre el ligando y los anticuerpos neutralizantes por un número limitado de sitios de unión a ligando presentes en el producto terapéutico. A medida que se incrementa el nivel de anticuerpos neutralizantes, menos ligando se une al fármaco y la respuesta que se mide en el ensayo disminuye en comparación con una muestra de control que no tiene actividad neutralizante. Por lo tanto, dentro del intervalo lineal del ensayo, la concentración de anticuerpos neutralizantes es proporcional al cambio porcentual en la respuesta del ensayo. En teoría, cualquier ensayo de unión de ligandos, tal como inmunoensayos en fase sólida o líquida (p.ej., ensayos de radioligando, ELISA, quimioluminiscencia y electroquimioluminiscentes), ensayos de radioinmunoprecipitación (RIPA, por sus siglas en inglés) y de resonancia de plasmón superficial, pueden adaptarse al diseño de ensayos competitivos de unión de ligandos para la detección de anticuerpos neutralizantes en las muestras de prueba (ver el Apéndice y el capítulo Métodos de Pruebas Inmunológicas-Consideraciones Generales (1102) y Métodos de Pruebas Inmunológicas-Ensayo por lnmunoabsorción Ligado a Enzimas (ELISA) (1103), así como el capítulo(1105) para mayor información). Se encuentran disponibles dos formatos para ensayos competitivos de unión de ligandos no basados en células (ver la Figura 2A para formato directo y la Figura 28 para formato indirecto).
A
Ensayo Directo Señal
Ausencia de Señal
Au·enc;a de
un;óc
El Anticuerpo Neutralizante de la muestra compite con ligando marcado
Ligando _ marcado
--
Placa recubierta con producto terapéutico
Figura 2A. Diseño Directo de Ensayo Competitivo de Unión de Ligandos: En este ejemplo de diseño de ensayo, se recubre en una placa con el producto terapéutico que sirve como molécula de captura para unir el ligando marcado con una molécula de detección (p.ej., una enzima, una marca fluorescente o una electroquimioluminiscente). La unión entre el producto terapéutico y el ligando se inhibe ante la presencia de anticuerpo neutralizante en las muestras de prueba, lo que resulta en una señal más baja. "T" representa el "producto terapéutico" y "L" representa el "ligando".
B
Ensayo Indirecto Ausencia de Señal
Anticuerpo Neutralizante
-
Receptor marcado
El producto - + terapéutico une y bloquea al receptor
Figura 2B. Formato indirecto de Ensayo Competitivo de Unión de Ligandos: En este ejemplo de diseño de ensayo, el ligando recubre la placa y el producto terapéutico compite con el receptor marcado para unirse al ligando. Cuando está presente un anticuerpo neutralizante en las muestras de prueba, éste se une al producto terapéutico y el producto terapéutico neutralizado no es capaz de unirse al ligando; por lo tanto, la señal aumentará debido a que el receptor marcado ahora puede acceder y unirse al ligando.
USP 39
Información General/ (1106.1) Ensayos de lnmunogenicidad 1425
En el ensayo directo para anticuerpos neutralizantes basado en un ensayo competitivo de unión de ligandos es un enfoque simple, donde se mide la unión de un fármaco a su diana, (Figura 2A y Tabla 2), mientras que en el ensayo indirecto para anticuerpos neutralizantes basado en un ensayo competitivo de unión de ligandos se monitorea la inhibición mediada por el fármaco de la unión ligando-receptor (Figura 28 y Tabla 2). Ambos formatos de ensayo utilizan el mecanismo de acción del fármaco (inhibición de la unión fármaco-ligando o ligando-receptor) pero miden la actividad neutralizante usando diferentes puntos finales del ensayo. Tabla 2. Diseño de Ensayo para Anticuerpos Neutrallzantes Basado en Ensayo Competitivo de Unión de Llgandos y Componentes Críticos del Ensayo
Diseño del Ensayo
Ensayo Competitivo de Unión de Ligandos Directo
Ensayo Competitivo de Unión de Ligandos Indirecto
Medición del Ensayo
Diseño del Ensayo para lnmunoensayosen Fase Sólida
Componentes del Ensayo
Unión de un fármaco a su ligando (diana)
El fármaco como molécula de captura y el ligando marcado camo molécula de detección (el formato reverso es más propenso a la interferencia del fármaco)
Inhibición mediada por el fármaco de la unión ligando-receptor
El ligando como molécula de captura y el receptor marcado como molécula de detección (el formato reverso es viable)
Ventaja
Desventaja
Fármaco marcado o sin marcar, diana conjugada, muestras de especies de prueba, controles positivos y negativos
Diseño de ensayo simple
Si la unión previene la señalización o el acoplamiento de otro ligando a su receptor, en este ensayo sólo se refleja el paso de unión muy temprana.
Ligando sin marcar o conjugado, receptor conjugado, fármaco sin conjugar, muestras de especies de prueba, controles positivos y negativos
Refleja una consecuenda de la actividad de anticuerpos neutralizantes que se produce en pasos subsiguientes.
La complejidad de Ja purificación del receptor dificulta mantener un plegado apropiado de las proteínas y un desempeño uniforme del ensayo.
Para el diseño de ensayo de anticuerpo neutralizante basado en un ensayo competitivo de unión de ligandos directo aplicado a un inmunoensayo en fase sólida, el fármaco inmovilizado por lo regular sirve como molécula de captura, mientras que la diana marcada sirve como molécula de detección, generando una señal después de que se une al fármaco. La actividad neutralizante puede evaluarse como el nivel de inhibición de una unión fármaco-diana cuando se encuentran presentes anticuerpos neutralizantes en las muestras de prueba. La sensibilidad de estos ensayos directos se ve ampliamente determinada por la concentración seleccionada del fármaco. Una concentración de fármaco baja por lo general lleva a un ensayo de anticuerpos neutralizantes más sensible, pero un rango dinámico bajo de concentraciones puede limitar la detección de un rango amplio de anticuerpos neutralizantes. Por lo tanto, es importante optimizar la concentración de fármaco durante el desarrollo del ensayo. Para optimizar aún más el ensayo, se puede tener en cuenta la implementación de un diseño de experimento para evaluar sistemáticamente las interacciones entre los parámetros clave de operación del ensayo e identificar las condiciones de ensayo más óptimas. En ciertos casos, como cuando el ligando o el receptor es una molécula altamente cargada y tiende a unirse a las superficies de manera no específica, el diseño del ensayo también puede invertirse usando el ligando o receptor proteico como molécula de captura y el fármaco como molécula de detección. Sin embargo, debido al uso del ligando como agente de recubrimiento, este diseño reverso puede ser mucho más propenso a interferencia del fármaco incluso si se logra una sensibilidad comparable del ensayo. Por lo tanto, por lo regular se prefiere un ensayo para anticuerpos neutralizantes basado en un ensayo competitivo de unión de ligandos directo que usa el fármaco como molécula de captura y el ligando conjugado como molécula de detección. Un ensayo para anticuerpos neutralizantes basado en un ensayo competitivo de unión de ligandos indirecto, el cual se basa en la inhibición mediada por fármaco de la unión ligando-receptor, también se puede usar para la detección de anticuerpos neutralizantes para antagonistas terapéuticos que neutralizan los ligandos solubles. Un formato de ensayo para anticuerpos neutralizantes basado en un ensayo competitivo de unión de ligandos indirecto aplicable usa el ligando como la molécula de captura y la proteína receptora conjugada como molécula de detección en un inmunoensayo en fase sólida. El formato reverso también puede ser viable. El ligando inmovilizado se une al receptor conjugado, generando una señal. La unión ligando-receptor se inhibe ante la presencia del fármaco, pero ocurre cuando el fármaco es neutralizado por el anticuerpo neutralizante. Por consiguiente, la actividad neutralizante en la muestra de prueba se estima mediante el nivel de restauración de la unión ligando-receptor cuando la función del fármaco es bloqueada por el anticuerpo neutralizante. La sensibilidad del ensayo para anticuerpos neutralizantes basado en un ensayo competitivo de unión de ligandos indirecto depende en gran medida de las concentraciones de ligando y de fármaco. Una concentración menor de ligando resultará en una concentración menor de fármaco seleccionada para el ensayo, lo que conlleva a una sensibilidad mayor del ensayo para anticuerpos neutralizantes. Otros parámetros operativos también pueden evaluarse de manera efectiva a través del método de diseño de experimento para determinar las condiciones óptimas del ensayo. Cuando se incluye una proteína receptora oligomérica en el ensayo para anticuerpos neutralizantes no basado en células, se deben tener en cuenta específicamente los desafíos presentados por este tipo de receptor, el cual puede ser menos propenso a retener la conformación original necesaria para unirse al ligando cuando no se asocia con la membrana celular. Además, los receptores celulares por lo regular tienen uno o más dominios transmembrana que necesitan ser truncados para facilitar la pu-
1426 (1106.1) Ensayos de lnmunogenicidad / Información General
USP 39
rificación del receptor. Por ende, surgen preocupaciones con respecto al plegado apropiado de la proteína truncada, que contiene solamente los ectodominios , y a la retención de la estructura necesaria para la unión ligando-receptor. La complejidad de la purificación del receptor requiere además que la variación entre lotes y la estabilidad de los productos proteicos se controlen de manera efectiva para mantener el desempeño uniforme del ensayo. Los controles positivos y negativos son críticos para el monitoreo del desempeño del ensayo para anticuerpos neutralizantes. A diferencia de los ensayos para anticuerpos neutralizantes basados en células, el diseño de los controles de los ensayos competitivos de unión de ligandos no basados en células es, por lo regular, más simple, sin necesidad de incluir controles de fondo. La selección de controles positivos y negativos se describe en detalle en la sección Desarrollo de Controles Positivos y Negativos en Ensayos de Anticuerpos Neutralizantes.
VALIDACION DE ENSAYOS DE ANTICUERPOS NEUTRALIZANTES Según se describió anteriormente, existen dos diseños principales de ensayos de anticuerpos neutralizantes: los ensayos funcionales basados en células y los ensayos basados en unión. Las siguientes secciones describen los diversos componentes de la validación que deben llevarse a cabo antes de iniciar el estudio. Los principios de cada aspecto de la validación se aplican a ambos formatos de ensayo, a menos que se indique algo distinto.
Dilución Mínima Requerida La determinación de la dilución apropiada de la matriz del ensayo es una parte importante de la optimización del ensayo de anticuerpos neutralizantes debido a que esto afectará la dilución mínima de la muestra de prueba y, por lo tanto, la sensibilidad del ensayo. Los aspectos a considerar para definir la dilución mínima requerida usada para el inmunoensayo de detección de anticuerpos antifármacos descritos en el capítulo (1106) también pueden ser aplicables a los ensayos de anticuerpos neutralizantes. El efecto que tiene la matriz de la muestra sobre la capacidad del ensayo debe evaluarse en múltiples diluciones, de preferencia usando mezclas diferentes de matrices de prueba. Se debe seleccionar la dilución de la matriz de muestra que tenga un efecto mínimo sobre la respuesta del ensayo y evaluarla adicionalmente usando el control positivo de anticuerpos adicionado a la matriz de la muestra. Un ensayo de anticuerpos neutralizantes debe ser capaz de detectar anticuerpos en presencia de componentes de la matriz del ensayo cuya presencia puede esperarse. Estos pueden incluir complemento, factores de coagulación, dianas solubles, lípidos, medicaciones concomitantes y el equivalente homólogo endógeno, así como el medicamento administrado. Tal como se describe en el capítulo (1106), la dilución mínima requerida puede determinarse y definirse de manera objetiva como el nivel de dilución que alcanza una relación señal-fondo óptima con una variabilidad aceptable. Los factores tales como dianas solubles que se unen al medicamento o que actúan directamente sobre las células pueden interferir en el ensayo, lo que conllevaría a resultados falsos positivos. Alternativamente, algunos factores pueden alterar la respuesta del ensayo de manera que se enmascare la presencia de anticuerpos neutralizantes en la muestra (p.ej., según se indicó para la presencia de niveles interferentes de productos bioterapéuticos o factores de crecimiento). La confirmación de la especificidad del ensayo puede ayudar a determinar la presencia de dichas sustancias interferentes (ver la sección Especificidad del Ensayo). La evaluación de los efectos de la matriz durante el desarrollo del ensayo se puede lograr usando matrices combinadas. Idealmente, la matriz del ensayo debe definirse usando múltiples muestras individuales de matrices debido a la heterogeneidad de las diversas sustancias interferentes posibles. La matriz obtenida de pacientes afectados con la enfermedad (pero que no han sido tratados) puede contener factores adicionales que interfieren en el ensayo y debe evaluarse siempre que sea posible. Si se encuentran disponibles sueros lipémicos, hemolizados, con coagulación incompleta y, de preferencia, sueros de pacientes enfermos que no han sido tratados, estos deberían analizarse en el ensayo con y sin la adición del control positivo de anticuerpos neutralizantes. Si los sueros a los que no se han agregado anticuerpos neutralizantes dan una respuesta en el ensayo y/o los sueros interfieren en la detección del control, el procedimiento analítico debe establecer que las muestras comprometidas de esa manera podrían no proveer resultados confiables y podría ser necesario excluirlas del análisis.
Desarrollo de Controles Positivos y Negativos en Ensayos de Anticuerpos Neutralizantes Los ensayos de anticuerpos neutralizantes, incluyendo los ensayos funcionales basados en células y los inmunoensayos no basados en células, están diseñados para detectar inmunoglobulinas antifármacos heterogéneas y a menudo policlonales. Debido a la naturaleza diversa de las respuestas inmunes al fármaco, no es posible generar un estándar de referencia de anticuerpos neutralizantes verdadero. Por lo tanto, el desempeño del ensayo se monitorea usando controles positivos y negativos sustitutos. Por lo regular, un control negativo se genera mezclando matrices pertinentes negativas para anticuerpos antifármacos, tal como una matriz recolectada a partir de sujetos sin exposición previa al fármaco. Se debe determinar si la mezcla usada para producir un control negativo representa adecuadamente la población de estudio diana, por ejemplo, mediante comparación de la respuesta del ensayo producida por el control negativo con la respuesta promedio producida por las muestras individuales de la matriz de la población diana (al menos 20 individuos). En algunos casos, puede ser complicado obtener un número suficiente de muestras de matrices pertinentes de la población en estudio o asegurar que las muestras usadas en la validación del ensayo representan con exactitud las características de la matriz de las muestras de la población de estudio. Las mues-
USP 39
Información General/ (1106.1) Ensayos de lnmunogenicidad 1427
tras usadas como base de referencia del estudio deben evaluarse para detectar cualquier evidencia de reactividad con el compuesto previa a la dosis. Los controles positivos del ensayo de anticuerpos neutralizantes por lo regular consisten en un suero animal hiperinmunizado, un anticuerpo monoclonal o material que tenga una reactividad de anticuerpos antifármacos específica y generalmente alta que neutralice la afinidad. La preparación de anticuerpos usada para generar el control positivo del ensayo de anticuerpos neutralizantes debe ser capaz de neutralizar la actividad biológica del compuesto farmacéutico in vitro. Idealmente, el control positivo puede prepararse agregando anticuerpos antifármacos (policlonales o monoclonales) purificados por inmunoafinidad o una preparación purificada por proteína-A/G, a una matriz sin diluir apropiada. Como alternativa, únicamente para estudios preclínicos, se puede usar suero animal hiperinmunizado agregado a una matriz sin diluir apropiada. Para anticuerpos monoclonales bioterapéuticos, el control positivo por lo general presenta reactividad de anticuerpo antiidiotípico. El control positivo de anticuerpos se considera un reactivo crítico y deben documentarse y caracterizarse para su uso en el ensayo. La documentación y evaluaciones pertinentes que deben tenerse en cuenta incluyen el esquema de inmunización, el procedimiento y el rendimiento de la purificación, la concentración de proteína, la afinidad relativa, la reactividad cruzada, el isotipo y el título de anticuerpo neutralizante. Una caracterización minuciosa facilitará la uniformidad del reactivo con el paso del tiempo y minimizará la variación entre lotes. Ver el (1106) para monitoreo de la estabilidad de los controles del ensayo. Aunque los controles positivos se usan para desarrollar, validar y monitorear el desempeño de los ensayos de anticuerpos neutralizantes, no se debe considerar que dichos controles representen las muestras de estudio. Se debe esperar una gran diversidad de respuestas inmunes a la molécula del fármaco, incluyendo la producción de anticuerpos que presentan con un rango amplio de afinidad de unión y de características de especificidad. Por lo tanto, el desempeño de los controles positivos y los controles negativos se usa principalmente para asegurar que el ensayo tenga el desempeño esperado (es decir, para confirmar la aptitud del sistema).
Puntos de Corte del Ensayo El punto de corte de un ensayo de anticuerpos neutralizantes es la respuesta del ensayo usada para determinar si una muestra es positiva para actividad neutralizante. A todas las muestras de sujetos que no han sido tratados con el fármaco y a las muestras de control negativo usadas para la evaluación del punto de corte se les debe agregar una cantidad fija de fármaco determinada antes de la validación; sin embargo, esto no se aplicaría al formato directo para ensayos de anticuerpos neutralizantes no basados en células. La respuesta del ensayo puede expresarse como una señal del ensayo o como cociente entre la señal del ensayo de una muestra de prueba y la derivada del control negativo. Las muestras positivas para anticuerpos neutralizantes tendrían una respuesta por encima del punto de corte si el anticuerpo neutralizante incrementa la respuesta del ensayo y por debajo del punto de corte si el anticuerpo neutralizante reduce la respuesta del ensayo. Como alternativa, la respuesta del ensayo puede normalizarse y computarse como cambio porcentual a partir del control negativo. Debido a que el capítulo (1106) incluye una descripción del proceso de evaluación de punto de corte, este capítulo únicamente provee un resumen del proceso de evaluación, con énfasis y aclaraciones sobre algunos pasos clave para los ensayos de anticuerpos neutralizantes (el Apéndice provee recursos adicionales de utilidad). Se pueden aplicar métodos estadísticos alternativos en algunos pasos del proceso de evaluación de punto de corte (p.ej., evaluación de valores aberrantes) con la justificación apropiada. Basándose en aspectos estadísticos y prácticos, se deben usar al menos 30 sueros de sujetos individuales a partir de la población con la enfermedad diana (si estuvieran disponibles) o de donantes sanos para la evaluación del punto de corte. Las muestras a partir de estos sujetos deben ser analizadas en al menos tres corridas independientes (p.ej., días, analistas) por al menos dos analistas usando una estructura de trabajo con un diseño equilibrado. Deben estar disponibles los informes de al menos tres resultados para el control negativo por cada placa, donde el informe de un resultado d puede ser el promedio de los resultados de muestras duplicadas si las muestras del estudio también se analizan por duplicado. Asimismo, estos tres resultados deben provenir de diversos lugares de la placa, tales como la primera columna, la columna del medio y la última columna de la placa. Si el punto de corte se estima únicamente a partir de sueros de donantes sanos durante esta fase de validación, se deben evaluar los datos obtenidos de la población con la enfermedad diana durante la fase de estudio para determinar estadísticamente si las distribuciones de las respuestas del ensayo son similares a las de la población sana. Si las varianzas son significativamente distintas, el punto de corte debe volver a evaluarse usando la población con la enfermedad diana. Si sólo las medias son significantemente distintas, se puede usar el mismo punto de corte después de volver a definir el control negativo basándose en la población diana. Durante el proceso de selección de muestras también deben considerarse otras diferencias entre las poblaciones relevantes para el estudio clínico con respecto al género, a la edad y a otros factores. Las distribuciones de datos originales y de datos transformados por logaritmo (u otras transformaciones), promediados entre corridas del ensayo, se pueden evaluar en términos del coeficiente de asimetría y la gráfica de probabilidad normal. Los datos de la escala (p.ej., original, logarítmica) que provee la distribución más simétrica o cercana a la normal deben usarse en todos los análisis subsiguientes, tales como la evaluación de valores aberrantes, los cálculos del punto de corte y las comparaciones de medias y varianzas entre corridas del ensayo. Los resultados aberrantes analíticos y biológicos deben identificarse usando métodos estadísticos apropiados tales como residuales condicionales y estimaciones de la media de los sujetos a partir de un modelo de efectos mixtos que incluya fuentes relevantes de variación en el experimento de punto de corte (p.ej, este modelo puede incluir Sujetos incluidos dentro de Grupos de Sujetos, Número de Corrida incluida dentro de Analista e Identificación de
1428 (11 06.1) Ensayos de lnmunogenicidad / Información General
USP 39
la Placa como efectos aleatorios, así como Grupos de Sujetos, Analista, Orden de Análisis de las Placas y la interacción de Analistas y Orden de Análisis de las Placas como efectos fijos). Se deben identificar y eliminar los valores aberrantes analíticos antes de identificar los valores aberrantes biológicos, y se debe evaluar la distribución de la respuesta del ensayo después de eliminar los valores aberrantes analíticos y biológicos. Si la distribución es adecuadamente normal (es decir, la prueba Shapiro-Wilk no es significativa), el método paramétrico [media +2,33 xdesviación estándar (DE), si los anticuerpos neutralizantes incrementan la respuesta del ensayo, y la media -2,33 x DE, si los anticuerpos neutralizantes reducen la respuesta del ensayo] se pueden usar para determinar el punto de corte a partir de estos datos de validación. Este cálculo generará una tasa de falsos positivos sin tratar de 1 % a partir de una distribución normal. El punto de corte puede definirse en términos de otras tasas de falsos positivos, tales como O, 1%-5% para cada caso específico, siempre que se justifique y se trate con las agencias reglamentarias. Si la distribución no es adecuadamente normal (es decir, la prueba Shapiro-Wilk es significativa) pero es suficientemente simétrica (coeficiente de sesgo <1 ), y la divergencia de la normalidad se debe principalmente a las colas sesgadas o a algunos valores extremos que podrían no haberse identificado como valores aberrantes estadísticos, se pueden usar en la fórmula de cálculo de punto de corte alternativas robustas a la media y a la desviación estándar, tales como la mediana y 1,4826 x desviación absoluta de la mediana, respectivamente. Si la distribución es sumamente carente de simetría (coeficiente de sesgo> 1 ), se recomienda el 99no percentil no paramétrico, aunque esto debe ser el último recurso debido a que requiere un número mucho más grande de sujetos (> 100) para obtener un estimado confiable. Otro aspecto importante a considerar es que la estimación de desviación estándar usada en la estimación de punto de corte debe incluir todas las fuentes distintas de variación que son relevantes para el contexto en el que se analizarán las muestras del estudio durante la fase de estudio. Debido a que las muestras de estudio por lo regular son analizadas por múltiples analistas en diversas placas y corridas del ensayo, la desviación estándar usada en la evaluación del punto de corte en dichos casos debe incluir, como mínimo, la variabilidad entre analistas, entre placas/corrida, dentro de la placa/corrida y entre sujetos. Para entender la naturaleza de la variabilidad en el ensayo y para determinar si se puede usar el mismo punto de corte evaluado durante la fase de validación para identificar muestras con actividad neutralizante durante la fase de estudio, se deben comparar las medias y las varianzas de la distribución de la señal del ensayo a partir de aproximadamente seis corridas usando un modelo de efectos mixtos y la prueba de Levene, respectivamente (ver el capítulo (1106)). Si éstas no son significativamente diferentes, entonces se puede usar el mismo punto de corte (punto de corte fijo) durante la fase de estudio. Por otra parte, el punto de corte evaluado según se indicó anteriormente usando estos datos de validación debe dividirse por (o restarse de) el control negativo. A esto se le denomina un factor de normalización multiplicativo (o sumatorio). Este factor puede multiplicarse (o sumarse) al control negativo usado durante cada corrida de la fase de análisis biológico para definir el punto de corte específico para la corrida o para la placa. Dicho punto de corte recibe el nombre de punto de corte flotante. Si se encuentra que dichos datos originales son aproximadamente simétricos o normales, entonces se puede usar el factor de corrección sumatorio. Cuando es necesaria una transformación logarítmica para asegurar una simetría o normalidad aproximada de la distribución, o si se ha demostrado que la distribución de la relación entre los resultados de muestra originales (señal del ensayo) y el control negativo tiene una simetría adecuada o es normal, entonces se puede usar un factor de corrección multiplicativo. En dichos casos, todos los análisis para la evaluación de punto de corte también pueden realizarse en términos del cociente entre la señal del ensayo obtenida de la muestra del sujeto individual y el control negativo de la placa correspondiente. En la práctica, independientemente de si las medias y las varianzas son significativamente diferentes entre placas o corridas del ensayo, se recomienda el uso de un punto de corte flotante debido a que puede acomodar desviaciones menores entre corridas del ensayo durante la fase de análisis de las muestras durante el estudio. Cuando se justifique un punto de corte fijo a partir de las evaluaciones anteriores y que por ende se implemente durante la fase de estudio, se requerirá un mayor nivel de atención para monitorear y validar cambios en los reactivos y otras condiciones del ensayo. Debido a que el punto de corte se ha fijado con respecto a dicho ensayo como existía al momento de realizar los experimentos con los que se determinó el punto de corte, es esencial asegurar que los resultados de la señal del ensayo a partir de los controles y las muestras de prueba sean uniformes y estables en caso de que se realice cualquier cambio al ensayo (p.ej., nuevos reactivos, analistas o maquinaria).
Criterios de Aptitud del Sistema Los ensayos de anticuerpos neutralizantes por lo regular tienen un diseño complejo con operaciones de etapas múltiples. Estos ensayos usan reactivos complejos y equipos y también requieren una recolección extensa de datos. Por lo tanto, es importante realizar evaluaciones de la aptitud del sistema para evaluar y verificar la validez y utilidad general del método. Específicamente, se deben incluir los controles positivos y negativos del ensayo y los controles de fondo adicionales (p.ej., células individuales y/o células con medicamento) como parte de cada corrida analítica durante la validación del ensayo y durante la fase de análisis de las muestras. La naturaleza exacta de los controles de fondo dependerá del tipo de ensayo de anticuerpos neutralizantes desarrollado (ver la sección Diseño de Métodos de Prueba de Anticuerpos Neutralizantes). Los datos obtenidos durante la validación del ensayo se usan para desarrollar los criterios de aceptación del ensayo. Por lo general, el monitoreo del desempeño del control positivo bajo y alto se considera lo más crítico. La inclusión del control positivo bajo ayuda a monitorear la sensibilidad establecida del ensayo. Se debe evitar el uso exclusivo de un control positivo medio debido a que el intervalo medio de la respuesta del ensayo en función de la concentración del control positivo puede no verse afectado de manera significativa por los cambios en las condiciones del ensayo (p.ej., reactivos, cambios) de la
USP 39
Información General/ (11 06.1) Ensayos de lnmunogenicidad 1429
misma manera que el control positivo bajo y alto. Alternativamente, analizar un control positivo en una serie de diluciones provee cobertura para múltiples niveles de control positivo, incluyendo el control positivo bajo. En algunas circunstancias, el uso de un control negativo que incluya un anticuerpo no neutralizante puede ser útil para identificar fallas en la corrida y prevenir el informe de resultados falsos positivos. Los criterios de aceptación típicos para las muestras de control del ensayo incluyen (a) precisión de la señal bruta del ensayo para control positivo y control negativo, (b) desempeño del control positivo bajo o informe del título del control positivo, y (c) límite superior y/o inferior para la respuesta del ensayo generada mediante el control negativo del ensayo. Se pueden aplicar otros criterios. Cuando el diseño de punto de corte flotante se emplea para la evaluación del punto de corte del ensayo de anticuerpos neutralizantes, los criterios o límites de aptitud del sistema se pueden definir para el cociente entre el control positivo bajo y el control negativo y para el cociente entre el control positivo alto y el control positivo bajo, en lugar de definir límites por separado para cada control positivo. Para la fase de estudio, también resulta útil aplicar criterios de aceptación para precisión intraensayo (variabilidad de respuesta que se replica en un ensayo). Conforme a lo tratado en el capítulo (1106), se debe evitar el establecimiento de criterios de aprobación o fallo en los experimentos de validación previos al estudio y se deben incluir todos los ensayos realizados durante la validación previa al estudio excepto aquellos rechazados por una causa atribuible. La selección apropiada de la concentración de control positivo bajo y el intervalo aceptable de desempeño son importantes para asegurar la capacidad de monitorear la sensibilidad sostenida del ensayo. Se espera que la tasa de falla para el control positivo bajo sea 1% basándose en el desempeño del control positivo. De manera similar, se puede establecer una tasa de falla del ensayo de 1% basándose en el desempeño del control negativo. Cuando sea aplicable, se podrán usar tasas de falla más altas (p.ej., 5%). Para establecer una tasa de falla específica basándose en el desempeño del control negativo y del control positivo bajo, se deben calcular límites de respuesta del ensayo apropiados basándose en el desempeño del control durante la validación del ensayo previa al estudio. Alternativamente, se pueden establecer límites para el valor del título de control positivo. Estos deben definirse basándose en el desempeño del control positivo observado durante la fase de validación del ensayo previa al estudio. Es importante que, dependiendo de los aspectos específicos del diseño del ensayo de anticuerpos neutralizantes, se espera que la señal del ensayo aumente (Figura 3A) o disminuya (Figura 38) en respuesta al aumento de la concentración del control positivo. Por ende, se debe establecer un límite de control negativo apropiado. Por ejemplo, en el primer caso, cuando aumenta la señal del ensayo, se debe establecer un límite superior para el control negativo. En el segundo caso, tendrá más importancia un límite inferior para el control negativo. 100
o 75
>ra
"'e:
UJ
ra
>
~ so
~ ra
!C: Q)
VI
Punto de Corte del Ensayo
1
25
......~~~~~~~~~~~~~~~
1~~
o
2000
4000
6000
8000
10000
12000
Concentración de Control Positivo de Anticuerpos Neutralizantes
Figura 3A. Respuesta del ensayo de anticuerpos neutralizantes en función de la concentración del control positivo. La señal del ensayo aumenta con concentraciones crecientes del control positivo.
1430 (1106.1) Ensayos de lnmunogenicidad / Información General
USP 39
100
~ o >ro
Punto de Corte del Ensayo
75
t/)
e w
a:; "O
ro > so ro
:¡:¡
a:; o:'.
ro
lC
QJ
(/)
25
o
2000
4000
6000
8000
10000
12000
Concentración de Control Positivo de Anticuerpos Neutralizantes
Figura 3B. Respuesta del ensayo de anticuerpos neutralizantes en función de la concentración del control positivo. La señal del ensayo disminuye con concentraciones crecientes del control positivo. Los criterios iniciales de aceptación de control del ensayo pueden basarse en la información existente relacionada con el desempeño del ensayo obtenida durante el desarrollo del ensayo y la fase de calificación. Como alternativa, se pueden aplicar criterios estándar basados en un procedimiento operativo estándar específico existente para la validación del ensayo de anticuerpos neutralizantes. Se deben tener en cuenta detalles técnicos importantes tales como la capacidad de lectura de señal dé los instrumentos al establecer las expectativas del desempeño del control del ensayo. Los criterios de aceptación reales para los controles del ensayo sólo pueden determinarse después de haber llevado a cabo una evaluación holística de toda la información de la validación del ensayo. Debido a la complejidad de los ensayos de anticuerpos neutralizantes, específicamente los protocolos de anticuerpos neutralizantes basados en células, se debe hacer un esfuerzo por identificar los pasos y condiciones particulares que tengan el potencial más alto de afectar el desempeño del ensayo. Por lo general, se debe monitorear el desempeño del control del ensayo durante la fase de sustentación del estudio para asegurar la uniformidad de los datos informados. Se deben monitorear los datos de desempeño del control del ensayo para detectar cualquier tendencia y variaciones a corto o largo plazo relacionadas con el intervalo predefinido. Cuando se identifique una tendencia sospechosa en el desempeño del control o cuando la señal falle cerca de un límite del intervalo aceptable, se deberá considerar realizar una investigación.
Sensibilidad Relativa La sensibilidad del ensayo de anticuerpos neutralizantes se define como la concentración más baja de un control positivo de anticuerpos que el método puede detectar de manera confiable. El resultado obtenido por este parámetro de validación depende en gran medida de las características del control positivo usado para realizar los experimentos, incluyendo su capacidad neutralizante y su afinidad para unirse al fármaco. La sensibilidad relativa de los ensayos de anticuerpos neutralizantes también es inversamente dependiente de la concentración de fármaco usada en el ensayo. Para llevar a cabo el experimento, se agrega control positivo en la matrices combinadas pertinente para el ensayo. Estas muestras adicionadas son analizadas en múltiples corridas, por lo regular, en al menos tres corridas independientes por parte de dos operadores para un total de seis corridas. Se recomienda realizar más de una curva de anticuerpo por corrida y por operador. Por lo general, se realiza la interpolación lineal entre valores justo por encima y por debajo del punto de corte del ensayo para calcular el parámetro de sensibilidad del ensayo. En algunos casos, se usa un método de ajuste mediante una función con cuatro parámetros para el cual deben estar disponibles al menos seis valores generados por varias concentraciones de control positivo para analizar de manera apropiada el conjunto de datos resultante. Uno de los valores debe caer por debajo del punto de corte del ensayo. Cuando se usa interpolación lineal o un método de ajuste de cuatro parámetros, se calcula la concentración del control positivo que generaría una respuesta del ensayo igual al valor de punto de corte. Se promedian los valores generados en múltiples pruebas durante múltiples días y el resultado se informa como la sensibilidad relativa del ensayo. Una vez establecido, el valor de sensibilidad del ensayo puede usarse para guiar la selección de una concentración del control positivo bajo para usarla al monitorear el desempeño del ensayo durante la validación del mismo y al analizar las muestras de estu-
USP 39
Información General/ (1106.1) Ensayos de lnmunogenicidad 1431
dio. Por lo general, la concentración del control positivo bajo se selecciona para que la tasa de fallo del ensayo debido al desempeño del control positivo no sea mayor a 5%. Debido a que la sensibilidad del ensayo depende en gran medida de las características del control positivo del ensayo, ésta variará entre distintos anticuerpos neutralizantes. El valor de sensibilidad del ensayo determinado durante la validación del ensayo no puede usarse para predecir la concentración real de anticuerpos neutralizantes que podría detectarse en las muestras de estudio. El parámetro de sensibilidad del ensayo de anticuerpos neutralizantes es útil para evaluar diversas plataformas analíticas, durante el desarrollo y la optimización del ensayo, y para seleccionar las concentraciones de control positivo apropiadas para la validación del ensayo y el análisis de aptitud del sistema. Las dianas típicas para la sensibilidad del ensayo de anticuerpos neutralizantes son a menudo 0,5-2 µg/mL; sin embargo, debido a que los ensayos de anticuerpos neutralizantes son complejos, se usa un enfoque adecuado para el propósito de cada caso al momento de seleccionar la sensibilidad apropiada del ensayo con el objetivo de detectar anticuerpos neutralizantes pertinentes desde el punto de vista clínico.
Especificidad del Ensayo La especificidad del ensayo se define como la capacidad de detectar sin ambigüedad el analito de interés. Por ejemplo, en el caso de los ensayos basados en células, se debe realizar una evaluación inicial para investigar la capacidad de la línea celular seleccionada para responder a los componentes biológicos que se espera estén presentes en la matriz del ensayo que pudieran parecerse estructural o funcionalmente a la molécula del fármaco o a su diana molecular; el objetivo es asegurar la especificidad del formato de anticuerpos neutralizantes. Dicha evaluación puede ayudar a determinar el diseño del ensayo, la plataforma analítica, el tipo de línea celular que se va a usar en el ensayo, cualquier tratamiento previo de la muestra y demás condiciones del ensayo. Se debe poner especial atención a las diferencias potenciales entre las muestras normales y muestras de pacientes afectados por la enfermedad. La evaluación de la especificidad del ensayo puede incluir el análisis de anticuerpos antifármacos irrelevantes (p.ej., anticuerpos contra otras moléculas similares) y debe incluir, cuando sea posible, anticuerpos antifármacos de unión específica r que carezcan de actividad neutralizante. La comparación puede realizarse evaluando un perfil de dilución del anticuerpo o agregando el anticuerpo en exceso a una muestra de matrices negativas combinadas. En un ensayo de anticuerpos neutralizantes específicos bien diseñado, se espera que los anticuerpos irrelevantes no arrojen un resultado positivo. Otros componentes de la matriz (p.ej., formas solubles de receptores u otras moléculas capaces de unirse con el fármaco) pueden presentar efectos inhibitorios en la actividad del fármaco. Es importante saber si se debe incluir un análisis confirmatorio verdadero como parte del análisis rutinario de muestras. Dicho análisis confirmatorio debe demostrar que la inhibición de la actividad del fármaco se debe específicamente a la acción de los anticuerpos neutralizantes y no a otros factores hallados en la matriz del ensayo. El análisis confirmatorio de anticuerpos neutralizantes, también referido como ensayos de interferencia de la matriz, por lo regular emplean un estrategia basada en el punto de corte. Si se va a tomar una decisión para incluir un ensayo confirmatorio de anticuerpos neutralizantes de interferencia de la matriz durante el análisis de rutina de las muestras, la validación debe seguir los principios generales descritos anteriormente para la determinación del punto de corte del ensayo.
Selectividad e Interferencia La selectividad evalúa la capacidad de un ensayo de anticuerpos neutralizantes para detectar un control positivo de anticuerpos neutralizantes en una muestra de matriz que contiene factores de interferencia potenciales. Estos factores de la matriz pueden unirse a los anticuerpos neutralizantes mediante interacciones específicas o no específicas, interfiriendo con la detección de anticuerpos neutralizantes. La interferencia general de la matriz puede investigarse evaluando la recuperación de la respuesta del ensayo de anticuerpos neutralizantes generada por el control positivo alto y el control positivo bajo preparados en 1020 muestras de matrices individuales pertinentes. Uno de los principales agentes interferentes en un ensayo de anticuerpos neutralizantes es el fármaco mismo, cuando está presente en las muestras de prueba de sujetos medicados. El fármaco interfiere con la capacidad del ensayo para detectar anticuerpos neutralizantes, lo que ocasiona resultados falsos negativos o falsos positivos, dependiendo del diseño del ensayo. La magnitud de la interferencia del fármaco depende de múltiples factores, tales como la concentración del fármaco circulante, la concentración y otras características (afinidad, avidez) del anticuerpo del control positivo, la vida media del fármaco y el diseño del ensayo. Por lo tanto, no es posible establecer un "nivel de tolerancia al fármaco" universal para todos los ensayos de anticuerpos neutralizantes. Sin embargo, la interferencia del fármaco en el ensayo de anticuerpos neutralizantes debe tratarse en el diseño del ensayo y en las estrategias de análisis. Durante el desarrollo o la optimización del ensayo, la interferencia del fármaco puede evaluarse agregando concentraciones valoradas de fármaco en la matriz sin diluir que contiene concentraciones fijas de un control positivo de anticuerpos neutralizantes, basándose en la sensibilidad del ensayo. El límite de tolerancia al fármaco se informa como la concentración más alta de un fármaco a la que el anticuerpo neutralizante del control positivo sigue siendo detectable, en cuyo caso debe definirse la detectabilidad (p.ej., una cierta relación señal-ruido, un nivel seleccionado por encima del basal). Para asegurar que el método de ensayo sea lo suficientemente sensible para detectar anticuerpos neutralizantes ante la presencia de fármaco en circulación, el control positivo de anticuerpos neutralizantes debe titularse en una muestra de matrices combinadas sin diluir (p.ej., a 250 ng/mL o 500 ng/mL para estudios clínicos o a 1000 ng/mL para estudios no clínicos) a fin de evaluar el nivel de tolerancia al fármaco para el método del ensayo. Por ende, basándose en la sensibilidad del ensayo de anticuerpos neutralizantes, el control positivo debe diluirse a dicho nivel cuando se intenta detectar el anticuerpo
1432 (11 06.1) Ensayos de lnmunogenicidad / Información General
USP 39
neutralizante en presencia del fármaco en circulación. El nivel de tolerancia al fármaco puede variar considerablemente cuando se agregan diferentes concentraciones del control positivo de anticuerpo neutralizante a la matriz del ensayo. Los anticuerpos neutralizantes también pueden diferir en lo que respecta a la afinidad y/o avidez. Por lo tanto, el nivel de tolerancia al fármaco evaluado usando un control positivo puede no predecir los niveles reales de interferencia del fármaco en las muestras de estudio. Debido a que los ensayos de anticuerpos neutralizantes tienden a ser sumamente susceptibles a la interferencia de fármacos, por lo general no se recomienda analizar anticuerpos neutralizantes en muestras obtenidas de tiempos de muestreo en los que se esperan niveles elevados de fármaco. Sin embargo, puede ser necesario analizar la actividad de anticuerpos neutralizantes en muestras de estudio que contengan fármaco en circulación para investigar cuándo ocurre el inicio de la respuesta de los anticuerpos neutralizantes y su impacto sobre la exposición del fármaco. En estas circunstancias, es necesario aplicar métodos para superar la interferencia del fármaco y permitir la detección de anticuerpos neutralizantes en presencia de altos niveles de fármaco en circulación. Las estrategias comúnmente usadas para mejorar el nivel de tolerancia al fármaco incluyen la disociación ácida y la eliminación del fármaco en exceso por medio de separación física o absorción en fase sólida. Un método alternativo es un análisis basado en la cuantificación del fármaco en el que las muestras se analizan para determinar la actividad biológica de fármaco en circulación o agregado de manera exógena. Cada método tiene sus propias advertencias. Por ejemplo, el pretratamiento ácido puede afectar la actividad de los anticuerpos neutralizantes. En los ensayos de anticuerpos neutralizantes basados en células, el exceso de ácido contenido en las muestras puede afectar de manera negativa la respuesta celular y disminuir la señal del ensayo, comprometiendo de esa manera la ventaja ofrecida por el uso del procedimiento de disociación ácida. Además de la interferencia del fármaco, los ligandos solubles del fármaco también pueden interferir con los ensayos de anticuerpos neutralizantes, generando potencialmente resultados falsos positivos. Asimismo, se puede introducir la interferencia de la diana cuando la misma se libera de los complejos diana -fármaco durante la disociación ácida. Estos factores interferentes pueden tratarse optimizando los métodos del pretratamiento de la muestra. Un método viable es el pretratamiento de las muestras con esferas conjugadas con un anticuerpo antidiana. Después de eliminar las esferas, las muestras sin dianas se pueden usar en el ensayo de anticuerpos neutralizantes.
Precisión La precisión-intraensayo y entre ensayos-es la expresión cuantitativa de variabilidad y provee una medida de la cantidad de error aleatorio que ocurre durante la ejecución de un procedimiento analítico. Las estimaciones de precisión son indicadores útiles del desempeño del ensayo en la matriz especificada del ensayo. ENSAYOS DE ANTICUERPOS NEUTRALIZANTES CUALITATIVOS De conformidad con el capítulo de información general Validación de Procedimientos Farmacopeicos (1225) y la norma ICH Q2(Rl ), la precisión intraensayo (repetibilidad) es el grado de acuerdo entre resultados generados por análisis consecutivos (análisis repetidos) de los mismos controles o muestras del ensayo en las mismas condiciones operativas, por el mismo operador usando el mismo equipo en un laboratorio, dentro de un periodo corto. Se evalúan de cuatro a seis preparaciones independientes de muestras de control positivo bajo, control positivo alto y/o control negativo en un lote individual de una mezcla de sueros de donantes (normales o en estado de enfermedad) por duplicado o triplicado, en múltiples posiciones de la misma placa de manera aleatoria, para determinar las fuentes relevantes que contribuyen a la variabilidad de la respuesta. La imprecisión de la respuesta del ensayo (densidad óptica, unidad de fluorescencia, unidad de luminiscencia o cambio porcentual en la señal del ensayo después de la normalización o interpolación), se calcula e informa como coeficiente de variación porcentual (%CV), que es igual a (desviación estándar/media) x 1 OO. Los valores del coeficiente de variación porcentual del ensayo de la respuesta media obtenida con los diversos controles del ensayo deben ser suficientes para la evaluación de la precisión intra-ensayo. El coeficiente de variación porcentual puede variar dependiendo de la tecnología usada para la detección, la metodología del ensayo y la complejidad del procedimiento. Por lo tanto, el coeficiente de variación diana esperado o el coeficiente de variación porcentual combinado para la precisión intra-ensayo debe definirse basándose en la capacidad del ensayo, así como en el uso que se le pretende dar. No es posible generalizar la precisión aceptable debido a que depende del uso del ensayo y tipo de fármaco, del riesgo para el paciente y otros factores, pero la necesidad de basarse en el resultado del ensayo debe conducirse con límites aceptables. La precisión entre ensayos (también denominada precisión total o intermedia) abarca la variación dentro del laboratorio entre corridas de ensayo y, por lo tanto, representa la precisión general del ensayo. El experimento descrito anteriormente debe llevarse a cabo durante múltiples días con al menos dos operadores, en especial si el análisis de muestras va a ser ejecutado por más de un operador en la fase de estudio. La desviación estándar intra-placa combinada y la desviación estándar de la media para cada muestra analizada en múltiples placas durante múltiples días puede usarse para calcular la precisión intermedia, suponiendo que la mayor parte de la variabilidad se puede atribuir a la variabilidad de la placa y a que el tamaño de la muestra es el mismo en todas las placas. La precisión intermedia depende en gran medida de la metodología del ensayo y de la complejidad del procedimiento. Por lo tanto la precisión intermedia diana debe definirse basándose en la capacidad del ensayo, así como en el uso que se le pretende dar (aptitud para el propósito).
USP 39
Información General/ (1106.1) Ensayos de lnmunogenicidad 1433
Mediante una estrategia alternativa, se puede evaluar la precisión entre-ensayos derivando la media, la desviación estándar y el coeficiente de variación porcentual de los controles negativos y los controles positivos a partir de todos los experimentos realizados durante el desarrollo del ensayo (siempre que los efectos de la ubicación de la placa sean inapreciables), con algunas excepciones. Las corridas que se van a excluir son aquellas con errores atribuibles a un operador o un equipo o con variaciones del método introducidas intencionalmente para el análisis de robustez. ENSAYOS DE ANTICUERPOS NEUTRALIZANTES SEMI CUANTITATIVOS Para evaluar la precisión de los títulos informados, los operadores por lo general usan el control positivo bajo y una o dos concentraciones del control positivo alto. Los controles positivos altos (un mínimo de tres preparaciones independientes) deben diluirse en serie, al medio o al tercio, usando una mezcla de matrices del ensayo sin diluir como diluyente y, posteriormente, se deben analizar. El control positivo alto también puede diluirse en una dilución mínima requerida de una mezcla de matrices, siempre que las muestra futuras se diluyan de la misma manera. Para medir la precisión intra-ensayos, por lo general se recomienda que un operador en el mismo día analice tres curvas de titulación del control positivo bajo y alto. Para medir la precisión entre ensayos, dos operadores en un mínimo de 2-3 días diferentes deben analizar cada uno tres curvas de titulación del control positivo alto y bajo. Los títulos se determinan como un valor inverso de la dilución más alta del control positivo que arroje un resultado positivo. Los títulos diana pueden determinarse y designarse para cada control positivo alto y bajo o se pueden calcular como valores medios promediando los valores de los títulos obtenidos para los controles positivos bajos y altos en la evaluación de la precisión. Posteriormente, las precisiones íntra-ensayo y entre ensayos de los títulos se evalúan comparando los títulos obtenidos para curvas preparadas de manera independiente con el título diana designado para el control positivo bajo y el control positivo alto, respectivamente. Según se describe en el capítulo (1106), un análisis recomendado, aunque más riguroso, es usar estos datos para definir un cociente mínimo significativo. El cociente mínimo significativo calculado refleja el número más pequeño diluciones que cambian el valor de un título que se puede considerar estadísticamente significativo (P < 0,05); por ejemplo, sí el cociente mínimo significativo == 5, entonces los títulos que difieran en más de cinco veces de dicho valor se pueden considerar significativos. En general, el criterio de aceptación para la precisión del título es que el valor del título designado debe estar dentro de una dilución del título diana en series de titulaciones independientes. Sin embargo, lo anterior dependerá de la capacidad del método, del nivel de dilución (p.ej., este criterio puede ser adecuado para un diseño de ensayo de diluciones en serie al medio o al tercio pero no para un diseño de dilución en serie al décimo) y el uso pretendido de los datos del título informado en el ambiente clínico. Si se usa el análisis de título medio calculado, el título medio puede caer ocasionalmente entre las diluciones debido a que se deriva de los valores observados a partir de múltiples análisis. En este escenario, se debe modificar la regla de dilución ±1, y los títulos observados para un control positivo definido se redondean a la dilución más próxima para obtener el título diana.
Robustez y Reproducibilidad La robustez y la reproducibilidad de los ensayos de inmunogenícidad se tratan en el capítulo (1106), que está armonizado con el capítulo (1225) y la norma ICH Q2(Rl ). El análisis de robustez debe realizarse como parte de la optimización del ensayo durante el desarrollo del mismo, cuando resulte posible. Esto se debe a que es poco probable que durante la validación un analista específicamente intente hacer cambios que podrían ocurrir de manera rutinaria (p.ej., cambiar lotes de materiales o modificar los tiempos de incubación dentro de ciertos límites). Por lo tanto, es necesario conocer los parámetros del método que requieren un cumplimiento estricto (p.ej., la concentración del anticuerpo de recubrimiento), con límites precisos para el parámetro delineado en el método, versus los parámetros que requieran menos control y que puedan tener descripciones "aproximadas" en el método. Los experimentos de robustez pueden realizarse de manera simple modificando una o dos variables a la vez o mediante análisis de diseño de experimentos, dependiendo de cuántos factores se van a analizar a la vez y el grado en el cual se examinarán las interacciones entre parámetros. La amplitud del análisis de robustez depende del uso pretendido del ensayo (p.ej., un estudio pequeño que busque cambios generales en un experimento toxicológico puede requerir menos análisis de robustez que algunos otros estudios). Sin embargo, cualquier ensayo usado para estudios clínicos que implica el registro de un fármaco debe examinarse minuciosamente de forma rutinaria y durante un período prolongado para asegurar que su desempeño sea el esperado. El efecto de borde de la placa (o uniformidad) debe examinarse durante el desarrollo del ensayo. Otros factores comunes cuyo impacto debe ser evaluado incluyen tiempos y temperaturas de incubación, concentraciones de reactivos y densidades celulares. Cuando sea necesario transferir un ensayo a un laboratorio distinto, los analistas deben evaluar la reproducibilidad del método en el nuevo laboratorio. Esto puede realizarse como parte de la calificación de transferencia del ensayo y/o la validación del método en la nueva instalación. Es importante tener en cuenta que un ensayo diseñado y optimizado apropiadamente, en el que se han conocido y controlado los parámetros críticos, debe ser lo suficientemente robusto para transferirlo sin ningún problema. Sin embargo, se pueden evaluar diversos indicadores útiles para asegurar que el ensayo tendrá un desempeño idéntico en cada laboratorio. Las muestras compartidas pueden analizarse en ambos sitios, y se pueden evaluar las estimaciones de la variabilidad del ensayo y del desempeño del control de calidad (ver también la sección Transferencias a Otros Laboratorios en Gestión del Ciclo de Vida).
1434 (1106.1) Ensayos de lnmunogenicidad / Información General
USP 39
Estabilidad Resulta útil conocer las condiciones de almacenamiento y manipulación óptimas para muestras, controles, materiales y reactivos del ensayo(ver el capítulo (1106) para información adicional). Por ejemplo, puede ser importante asesorar al personal clínico sobre los procedimientos de preparación de alícuotas, el tiempo de congelación de las muestras, la temperatura de almacenamiento y las condiciones de transporte. Un aspecto clave a considerar de los ensayos de anticuerpos neutralizantes basados en células es la estabilidad de la línea celular misma. Las líneas celulares, siendo entidades vivas, presentan una variabilidad inherente y el potencial para cambiar con el paso del tiempo o reaccionar al ambiente de una manera que puede influir sobre su respuesta durante el ensayo. Por ejemplo, las variaciones en los niveles de receptores en la superficie celular pueden verse afectados por el número de duplicaciones celulares, el tiempo de cultivo, la presencia de ciertos componentes de los medios (p.ej., suero) y/o la densidad celular. Por lo tanto, durante el desarrollo de un ensayo de anticuerpos neutralizantes, el desempeño de la línea celular debe caracterizarse minuciosamente. Se deben establecer controles apropiados para parámetros tales como el número de pasajes, reactivos y cambios de medios. Un ejemplo es que el uso de alícuotas de células congeladas del mismo número de pasajes para cada ensayo puede, en ocasiones, reducir la variación debido a cambios en el cultivo continuo.
Documentación de la Validación Previa al Estudio y Durante el Estudio El capítulo (1106) describe la documentación recomendada para la validación previa al estudio y durante el estudio. MONITOREO DE LA VALIDACIÓN DEL ENSAYO DURANTE EL ESTUDIO La capacidad del ensayo de anticuerpos neutralizantes para tener un desempeño confiable con el paso del tiempo es importante para realizar comparaciones históricas de la incidencia de los anticuerpos neutralizantes para un producto bioterapéutico individual a medida que éste avanza en el ciclo de vida del desarrollo clínico. Asimismo, verificar que el ensayo validado continúe teniendo el desempeño esperado es un proceso continuo y, una vez que se ha implementado el ensayo de anticuerpos neutralizantes, se considera una buena práctica científica monitorear su desempeño mediante el análisis de tendencias de los resultados obtenidos con controles del ensayo con el paso del tiempo. Se recomienda usar un enfoque estadístico (p.ej., las reglas Westgard) para designar el umbral de falla del ensayo, así como una investigación basada en el comportamiento del control del ensayo (positivo o negativo). Esto puede ser más fácil de lograr en ensayos de alta precisión que en ensayos con tendencia a una mayor variabilidad. Independientemente, se recomienda tabular los valores de control del ensayo obtenidos a partir de un mínimo de 1O corridas durante un periodo apropiado para establecer un umbral y una estrategia para identificar ensayos que parezcan tener una tendencia hacia los límites del ensayo. Si el ensayo tiene un desempeño que esté fuera de las expectativas preestablecidas, se debe realizar una investigación para identificar la causa de la observación; asimismo, puede ser necesario implementar pasos correctivos apropiados. Si se requieren pasos correctivos, puede ser necesario verificar el desempeño del ensayo para demostrar que el desempeño ha vuelto a su nivel original. Asimismo, es importante identificar variables que podrían contribuir a desviaciones en el ensayo, tales como el uso de un nuevo banco de células de trabajo, cambios en los lotes de reactivos críticos y diversos operadores del ensayo.
MANEJO DEL CICLO DE VIDA Cambio del Diseño de Ensayo de Anticuerpos Neutralizantes Durante la fase de desarrollo del fármaco, puede ser necesario cambiar el diseño del ensayo de anticuerpos neutralizantes. Por ejemplo, el diseño del ensayo puede cambiarse de un formato basado en células a uno no basado en células, o viceversa, para obtener un ensayo con sensibilidad o especificidad mejorada, u otras características deseables. Cuando los eventos adversos relacionados con anticuerpos neutralizantes tiendan a ser serios o a amenazar la vida (p.ej., en el caso de medicamentos de factor de crecimiento o citoquinas que tienen una función no redundante), se recomienda buscar el asesoramiento de las agencias reglamentarias al considerar un diseño de ensayo distinto para asegurar su aptitud para detectar anticuerpos neutralizantes con relevancia clínica. Para todos los cambios de diseño de ensayo de anticuerpos neutralizantes, es importante evaluar la sensibilidad y la especificidad del ensayo. Si el cambio se realiza para proveer un desempeño más sencillo sin mejoras significativas en las características del ensayo, se debe comparar la capacidad para detectar anticuerpos neutralizantes del formato previo y del nuevo. Esta comparación debe realizarse usando muestras de suero de donante adicionadas con anticuerpos del control positivo, así como muestras del estudio que hayan arrojado previamente resultados positivos para anticuerpos neutralizantes. Para éstas últimas, se debe determinar previamente y cumplirse un grado de concordancia para los resultados de la muestra.
USP 39
Información General/ (1106.1) Ensayos de lnmunogenicidad 1435
Transferencias a Otros Laboratorios LABORATORIOS NO CERTIFICADOS POR EL PROGRAMA DE ENMIENDAS PARA EL MEJORAMIENTO DE LABORATORIOS CLÍNICOS Si el laboratorio receptor no está certificado por el programa de Enmiendas para el Mejoramiento de Laboratorios Clínicos (CLIA, por sus siglas en inglés), se debe evaluar la capacidad de dicho laboratorio para seguir las buenas prácticas de laboratorio antes de iniciar cualquier actividad de transferencia del ensayo. Los laboratorios certificados por el programa de enmiendas para el mejoramiento de laboratorios clínicos son reglamentados por los Centers for Medicare and Medicaid Services (Centros de Servicios de Medicare y Medicaid) del U.S. Department of Health and Human Services (Departamento de Salud y Servicios Humanos de los EE.UU.). Estos reglamentos se definen en el Título 24 del CFR Parte 493 y se aplican a los laboratorios que analizan muestras humanas con el propósito de diagnosticar, prevenir, monitorear o tratar enfermedades. La evaluación de capacidades para los laboratorios que no forman parte del programa de enmiendas para el mejoramiento de laboratorios clínicos puede incluir la evaluación de la infraestructura existente para llevar a cabo ensayos de anticuerpos neutralizantes basados en células y no basados en células, la revisión de los registros de capacitación del personal, entre otras actividades. Un estudio informal de viabilidad puede ser útil para evaluar el desempeño del ensayo en el laboratorio receptor. El laboratorio que transfiere puede simplemente proveer el ensayo y los reactivos al laboratorio receptor, el cual puede realizar algunas corridas de prueba y evaluar los controles del ensayo. Este ejercicio ayuda a evaluar tanto la claridad del método escrito y la capacidad del laboratorio receptor para realizar el ensayo. Los resultados del estudio de viabilidad deben ser útiles al determinar el nivel de capacitación formal que el laboratorio que transfiere deberá proveer al laboratorio receptor. De ser necesaria, la capacitación formal deberá seguir un plan documentado de capacitación. Los controles del ensayo y las muestras de capacitación preparadas agregando anticuerpos neutralizantes del control positivo a las muestras de matrices pueden ser analizadas por ambos laboratorios, el que transfiere el ensayo y por el que recibe el ensayo siguiendo el mismo método detallado. El plan de capacitación debe describir claramente los criterios de aceptación para determinar el éxito de una capacitación. Las actividades formales de transferencia del ensayo pueden comenzar después de que el personal del laboratorio receptor ha sido capacitado exitosamente y de que se ha calificado el equipo del laboratorio. Se debe escribir un protocolo de transferencia del ensayo el cual describa los experimentos que se realizarán durante la fase de transferencia del ensayo. Se deben definir claramente los criterios de aceptación para los experimentos. Algunos experimentos típicos que deben ser realizados por el laboratorio receptor durante la transferencia del ensayo pueden incluir (a) corrida de curvas con los anticuerpos del control positivo, (b) analizar las muestras de matrices a las que no se les han agregado o a las que sí se les han agregado anticuerpos neutralizantes del control positivo; y (c) análisis a diferentes lotes de reactivos críticos realizados por más de un analista. Para los experimentos designados (b) y (c), puede ser útil para el laboratorio que transfiere y para el laboratorio que recibe el ensayo realizar dichos experimentos usando las mismas muestras de capacitación. Posteriormente, se deben realizar análisis estadísticos con los datos generados para evaluar el grado de concordancia entre ambos laboratorios. El protocolo debe detallar el grado de concordancia requerido para una transferencia de ensayo exitosa. En ciertas situaciones, puede ser necesario derivar un nuevo punto de corte del ensayo o un cambio en la sensibilidad del ensayo debido a un cambio en los reactivos o los anticuerpos neutralizantes del control positivo. Todos los cambios en el método deben incorporarse en un método revisado, suplementado mediante un informe de transferencia del ensayo que explique detalladamente todos los experimentos que sustentan los cambios. Después de una transferencia del ensayo exitosa, el laboratorio receptor puede implementar el método para analizar las muestras del estudio. Se deben implementar estrategias apropiadas de tendencia del ensayo para monitorear el desempeño del mismo y de esa forma asegurar que se mantiene dentro de las especificaciones recomendadas. LABORATORIOS CERTIFICADOS POR EL PROGRAMA DE ENMIENDAS PARA EL MEJORAMIENTO DE LABORATORIOS CLÍNICOS En el caso de las transferencias de ensayos de anticuerpos neutralizantes a un laboratorio certificado por el programa de enmiendas para el mejoramiento de laboratorios clínicos, es necesario seguir las guías pertinentes para calificación del personal de laboratorio y para la revisión y aprobación de los documentos de capacitación del ensayo y de transferencia por parte de personal que puede supervisar las pruebas requeridas por el programa de enmiendas. La estrategia para la transferencia de ensayos de anticuerpos neutralizantes a laboratorios que cumplen con las buenas prácticas de laboratorio (no certificados por el programa de enmiendas para el mejoramiento de laboratorios clínicos), descritos anteriormente, también se puede usar para las transferencias a laboratorios certificados por el programa. Las evaluaciones anuales de competencia, el monitoreo de la garantía de calidad y la revisión de los controles del ensayo, el informe de ensayos de pacientes individuales a los médicos tratantes acerca de los resultados de prueba, y el análisis de competencia son necesarios en los laboratorios que cumplen con los requisitos de certificación del programa. El análisis de competencia debe realizarse dos veces al año y puede incluir la preparación de muestras de matrices combinadas que se analizan para establecer una línea base. Posteriormente, se proveen alícuotas para el grupo de análisis usando un método ciego (al menos 5 muestras de análisis de competencia/evento de análisis de competencia) y los resultados se comparan con la línea base. En general, 4 de 5 muestras deben pasar el análisis de competencia y cualquier resultado discrepante debe ser investigado.
1436 (1106.1) Ensayos de lnmunogenicidad / Información General
USP 39
Validación Cruzada y Ensayos Puente La validación cruzada puede ser necesaria si el mismo ensayo debe correrse o mantenerse de manera simultánea en múltiples laboratorios. El primer paso es proveer capacitación al personal que corre el ensayo en el nuevo lugar, la cual a menudo es provista por el laboratorio que transfiere el ensayo. Durante la validación cruzada, podrían aplicarse diversos componentes de las actividades de transferencia del ensayo mencionados anteriormente. El desempeño del ensayo puede monitorearse usando controles del ensayo y muestras de la matrices, adicionadas o no adicionadas en ambos lugares. Si el ensayo de anticuerpos neutralizantes sufre alteraciones dentro de un estudio, se deben realizar experimentos de conexión. Esto se puede lograr corriendo en el nuevo método muestras previamente analizadas con el método antiguo y evaluando la concordancia. Durante cierto periodo, las muestras del estudio pueden correrse al mismo tiempo con el método antiguo y con el nuevo para asegurarse de que el nuevo método sea aceptable.
Mejoras o Cambios en el Método El laboratorio debe implementar un proceso para introducir cualquier cambio conocido en el ensayo que pudiera tener un impacto sobre el desempeño del mismo. Se deben realizar experimentos apropiados de calificación antes de introducir el cambio para asegurar que éste no interferirá con el desempeño histórico del ensayo. Si el cambio requiere un ajuste en los criterios de aceptación del ensayo, podría requerirse documentación apropiada que demuestre el impacto del ajuste sobre el uso pretendido del ensayo. Se debe consultar a un estadístico en caso necesario. En el caso de los ensayos de anticuerpos neutralizantes basados en células, un cambio en el método puede implicar el uso de una línea celular distinta o seleccionar un punto final del ensayo diferente con la misma línea celular para obtener características mejoradas del ensayo. En ocasiones, se realiza un cambio en la plataforma de lectura del ensayo de anticuerpos neutralizantes (p.ej., valores de absorbancia generada por ELISA contra valores de electroquimioluminiscencia). En los casos de mejoras del método, se requerirá el desarrollo del ensayo y la validación del ensayo. VALIDACIÓN CRUZADA CON OTRAS ESPECIES Durante el ciclo de desarrollo del fármaco, puede ser necesario cambiar la matriz del ensayo de una especie a otra (p.ej., de monos cynomolgus o chimpancés a humanos) o entre poblaciones de pacientes. El cambio de matriz del ensayo puede requerir una inversión de esfuerzos en el desarrollo del ensayo y en la validación del ensayo para asegurar que el ensayo tenga la sensibilidad, la especificidad y demás características aceptables. REEMPLAZO DE REACTIVOS La calificación de reactivos es necesaria cuando se debe reemplazar un reactivo crítico usando criterios de calificación previamente establecidos. Idealmente, el lote de referencia y el nuevo lote deben compararse preparando controles del ensayo. Sin embargo, en muchos casos puede no estar disponible un lote de referencia para llevar a cabo una comparación. Ante esta situación, el nuevo reactivo deberá analizarse y sólo se considerará aceptable si el ensayo presenta el comportamiento esperado.
Estandarización de Ensayos Existe una creciente necesidad clínica y un valor aparente en la estandarización de ensayos (es decir, uso de estándares de referencia, plataformas y método de referencia) para facilitar la armonización de la estrategia usada en la detección de anticuerpos neutralizantes dirigidos contra fármacos en la misma clase de productos terapéuticos [p.ej., terapias con interferones, anti-factor de necrosis tumoral (TNF, por sus siglas en inglés) anticuerpos monoclonales o agentes estimuladores de eritropoyesis]. Cuando participen varias compañías, se debe asumir una estrategia consensuada para estandarizar el método, lo cual requiere acordar sobre un método y protocolo universales con reactivos comunes en todos los laboratorios relacionados. En el caso de los ensayos de anticuerpos neutralizantes basados en células, es crítico establecer e implementar un banco de células maestro común. Asimismo, se deben uniformar las unidades de informe para muestras positivas de anticuerpos neutralizantes, por ejemplo, expresar los resultados como positivo o negativo en función de valores específicos con unidades y/o un protocolo estándar y reactivos comunes para calcular la actividad de los anticuerpos neutralizantes. Para confirmar de manera exitosa la implementación de dicha estandarización, todos los laboratorios participantes deben usar el método universal durante la estandarización para analizar un conjunto de muestras de matrices con o sin agregado de anticuerpos neutralizantes del control positivo en un experimento ciego. Además, se deben llevar a cabo análisis de muestras de estudio positivas y negativas.
Información General/ (1106.1) Ensayos de lnmunogenicidad 1437
USP 39
APÉNDICE: FUENTES ADICIONALES DE INFORMACIÓN Información General Hu J, Gupta S, Swanson SJ, Zhuang Y. A bioactive drug quantitation based approach for the detection of anti-drug neutralizing antibodies in human serum. j lmmunol Methods. 2009;345(1-2):70-79. Lofgren JA, Wala 1, Koren E, et al. Detection of neutralizing anti-therapeutic protein antibodies in serum or plasma samples containing high leve Is of the therapeutic protein. j lmmunol Methods. 2006; 308(1-2):101-108. Mire-Sluis AR, Barrett YC, Devanarayan V, et al. Recommendations for the design and optimization of immunoassays used in the detection of host antibodies against biotechnology products. j lmmunol Methods. 2004;289(1-2): 1-16. Shankar G, Devanarayan V, Amaravadi L, et al. Recommendations for the validation of immunoassays used for detection of host antibodies against biotechnology products. j Pharm Biomed Anal. 2008;48:1267-1281.
Anticuerpos que Afectan la Eliminación del Fármaco Subramanyam, M. Case study: lmmunogenicity of Natalizumab. In: van de Weert M, Moller EH, editors. lmmunogenicity of biopharmaceuticals. New York: Springer; 2009. pp. 173-187. Zhou, L, Hoofring, SA, Wu, Y, et al. Stratification of antibody-positive subjects by antibody level reveals an impact of immunogenicity on pharmacokinetics. AAPS }. 2013;15(1 ):30-40.
Diseño y Validación de Ensayos de Anticuerpos Neutralizantes Gupta S, lndelicato SR, jethwa V, et al. Recommendations for the design, optimization, and qualification of cell-based assays used for the detection of neutralizing antibody responses elicited to biological therapeutics. j /mmunol Methods.
2007;321 (1-2):1-18. Gupta S, Devanarayan V, Finco D, et al. Recommendations for the validation of cell-based assays used for the detection of neutralizing antibody immune responses elicited against biological therapeutics. j Pharm Biomed Anal. 2011 ;55(5):878-
888.
Métodos Basados en Células Jolicoeur P, Tacey R. Development and validation of cell-based assays for the detection of neutralizing antibodies to drug products: a practica! approach. Bioanalysis. 2012;4(24):2959-2970. Tovey MG, Lallemand C. lmproved analytical methods for the detection and quantification of neutralizing antibodies to biopharmaceuticals. Bioanalysis. 2012;4(17):2179-2190. Wang J, Lozier J, Johnson G, et. al. Neutralizing antibodies to therapeutic enzymes: considerations for testing, prevention and treatment. Nat Biotechnol. 2008;26(8):901-908.
Métodos No Basados en Células Finco D, Baltrukonis D, Clements-Egan A, et al. Comparison of competitive ligand-binding assay and bioassay formats for the measurement of neutralizing antibodies to protein therapeutics. j Pharm Biomed Anal. 2011;54(2):351-358. Thorpe R, Swanson SJ. Current methods for detecting antibodies against erythropoietin and other recombinant proteins. Clin Diagn Lab lmmunol. 2005;12(1 ):28-39. Wadhwa M, Bird C, Dilger P, et al. Strategies for detection, measurement and characterization of unwanted antibodies induced by therapeutic biologicals. j lmmunol Methods. 2003;278(1-2):1-17. Wadhwa M, Thorpe R. Assessment of unwanted immunogenicity. In: van de Weert M, Moller EH, editors. lmmunogenicity of biopharmaceuticals. New York: Springer; 2009. pp. 57-73. Wu BW, Gunn GR, Shankar G. Competitive ligand-binding assays for the detection of neutralizing antibodies. In: Tovey MG, editor. Detection and quantification of antibodies to biopharmaceuticals: practica/ and applied considerations. Hoboken, NJ: John Wiley & Sons, lnc.; 2011.
Métodos Estadísticos Devanarayan V, Tovey MG. Cut points and performance characteristics for anti-drug antibody assays. In: Tovey MG, editor. Detection and quantification of antibodies to biopharmaceuticals: practica/ and applied considerations. Hoboken, NJ: john Wiley & Sons, lnc.; 2011.
1438 (1106.1) Ensayos de lnmunogenicidad / Información General
USP 39
Guías Reglamentarias EMEA. Guideline on immunogenicity assessment of monoclonal antibodies intended for in vivo clinical use. 2012. http:// www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2012/06/WC500128688.pdf. Consultado el 16 de septiembre de 2013. EMEA. Guideline on immunogenicity assessment of biotechnology-derived therapeutic proteins. 2007. http:// www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2009/09/WC500003947.pdf. Consultado el 16 de septiembre de 201 3. FDA. Guidance for industry. Assay development for immunogenicity testing of therapeutic proteins. Draft guidance. 2009. http://www.fda.gov/ downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatorylnformation/Guidances/UCM 19 27 50.pdf. Consultado el 16 de septiembre de 2013. FDA. Guidance for industry. lmmunogenicity assessment for therapeutic protein products. 2014. http://www.fda.gov/ downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatorylnformation/Guidances/UCM338856.pdf. Consultado el 3 de septiembre de 2014. ICH. ICH harmonised tripartite guideline. Validation of analytical procedures: text and methodology Q2(Rl ). 2005. http:// www.ich.org/fileadmin/Pu blic_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Quality/Q2_R 1/Step4/Q2_R l _ Guideline. pdf. Consultado el 16 de septiembre de 2013. ICH. ICH harmonized tripartite guideline. Preclinical safety evaluation of biotechnology-derived pharmaceuticals S6(Rl ). 2011. http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Safety/S6_Rl /Step4/S6_Rl _Guideline.pdf. Consultado el 16 de septiembre de 201 3. ICH. ICH harmonized tripartite guideline. Quality risk management Q9. 2005. http://www.ich.org/fileadmin/ Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Quality/Q9 /Step4/Q9 _Guideline.pdf. Consultado el 16 de septiembre de 2013.
<1111) EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE PRODUCTOS NO ESTÉRILES: CRITERIOS DE ACEPTACIÓN PARA PREPARACIONES FARMACÉUTICAS Y SUSTANCIAS DE USO FARMACÉUTICO La presencia de ciertos microorganismos en preparaciones no estériles puede tener el potencial de reducir y hasta inactivar la actividad terapéutica del producto y de afectar adversamente la salud del paciente. Los fabricantes deben asegurar por tanto una baja biocarga de formas farmacéuticas terminadas mediante la implementación de las guías de Buenas Prácticas de Fabricación vigentes durante la fabricación, el almacenamiento y la distribución de preparaciones farmacéuticas. El examen microbiológico de productos no estériles se realiza de acuerdo a los métodos proporcionados en Pruebas de Recuento Microbiano (61) y Pruebas de Microorganismos Específicos (62). Los criterios de aceptación para productos farmacéuticos no estériles basados en el recuento total de microorganismos aerobios (RTMA) y el recuento total combinado de hongos filamentosos y levaduras (RTCHL) se presentan en las Tablas 7 y 2. Los criterios de aceptación se basan en los resultados individuales o en el promedio de recuentos repetidos, si éstos se realizan (por ej. métodos de siembra directa en placa) Cuando se indica un criterio de aceptación para la calidad microbiológica, interpretar de la siguiente manera: - 101 ufc: recuento máximo aceptable = 20; - 102 ufc: recuento máximo aceptable = 200; - 103 ufc: recuento máximo aceptable = 2000; etc. Tabla 1. Criterios de Aceptación para la Calidad Microbiológica de Formas Farmacéuticas No Estériles
Recuento Total de Microorganismos Aerobios (ufc/g o ufc/ml)
Recuento Total Combinado de Hongos Filamentosos y Levaduras (ufc/g o ufc/ml)
Preparaciones no acuosas para uso oral
103
102
Ausencia de Escherichia coli (1 g o 1 ml)
Preparaciones acuosas para uso oral
10 2
10 1
Ausencia de Escherichia coli (1 g o 1 ml)
Uso rectal
10 3
102
Uso oromucosal
10 2
10 1
Vía de Administración
Microorganismo(s) Específico(s)
Ausencia de Staphylococcus aureus (1 g o 1 ml) Ausencia de Pseudomonas aeruginosa (1 g o 1 mL)
USP 39
Información General/ (1111) Examen Microbiológico de Productos 1439
Tabla 1. Criterios de Aceptación para la Calidad Microbiológica de Formas Farmacéuticas No Estériles (Continuación)
Recuento Total de Microorganismos Aerobios (ufc/g o ufc/mL)
Recuento Total Combinado de Hongos Filamentosos y Levaduras (ufc/g o ufc/mL)
Uso gingival
102
10 1
Uso cutáneo
102
10 1
Vía de Administración
Microorganismo(s) Específico(s) Ausencia de Staphylococcus aureus (1 g o 1 ml) Ausencia de Pseudomonas aeruginosa (1 g o 1 ml) Ausencia de Staphylococcus aureus (1 g o 1 ml) Ausencia de Pseudomonas aeruginosa (1 g o 1 ml)
Uso nasal
10 2
10 1
Ausencia de Staphylococcus aureus (1 g o 1 ml)
Uso auricular
102
10 1
Ausencia de Staphylococcus aureus (1 g o 1 ml)
Uso vaginal
102
10 1
Ausencia de Pseudomonas aeruginosa (1 g o 1 ml) Ausencia de Pseudomonas aeruginosa (1 g o 1 ml) Ausencia de Pseudomonas aeruginosa (1 g o 1 ml) Ausencia de Staphylococcus aureus (1 g o 1 ml) Ausencia de Candida albicans (1 g o 1 ml) Parches transdérmicos (límites para un parche incluyendo la capa adhesiva y el soporte)
10 2
Uso por inhalación (los requisitos especiales aplican a las preparaciones líquidas para nebulización)
102
10 1
Ausencia de Staphylococcus aureus (1 parche) Ausencia de Pseudomonas aeruginosa (1 parche)
10 1
Ausencia de Staphylococcus aureus (1 g o 1 ml) Ausencia de Pseudomonas aeruginosa (1 g o 1 ml) Ausencia de bacterias Gramnegativas tolerantes a la bilis (1 g o 1 ml)
La Tabla 7 incluye una lista de microorganismos específicos para los que se establecen criterios de aceptación. Esta lista no es necesariamente exhaustiva y, para algunas preparaciones, puede ser necesario realizar pruebas para detectar otros microorganismos dependiendo de la naturaleza de los materiales iniciales y del proceso de fabricación. Si se hubiera demostrado que ninguna de las pruebas descritas permitiría un recuento de microorganismos válido al nivel prescrito, emplear un método validado con un límite de detección lo más cercano posible al criterio de aceptación indicado. Ta bl a 2
c riºt erios . d e Aceptaci'on para 1a ca lid a d Mº1crobº10 I'og1ca . d e sustanc1as No
Sustancias para uso farmacéutico
Esteri ' ·1 es para uso Farmaceut co
Recuento Total de Microorganismos Aerobios (ufc/g o ufc/mL)
Recuento Total Combinado de Hongos Filamentosos y Levaduras (ufc/g o ufc/mL)
103
102
Además de los microorganismos que se enumeran en la Tabla 7, se debe evaluar la relevancia de otros microorganismos recuperados, en función de lo siguiente: • El uso del producto: el riesgo varía de acuerdo con la vía de administración (ocular, nasal, respiratoria). • La naturaleza del producto: ¿el producto sustenta el crecimiento? ¿posee la preservación antimicrobiana adecuada? • El método de aplicación. • A quiénes está destinado: los riesgos pueden variar si se destina a neonatos, infantes y pacientes debilitados. • Uso de agentes inmunosupresores y corticosteroides. • La presencia de enfermedades, heridas y órganos dañados. De ser requerido, llevar a cabo una evaluación basada en el riesgo de los factores pertinentes con personal que posea el entrenamiento especializado en microbiología e interpretación de datos microbiológicos. Para materias primas, la evaluación considera el proceso al que se somete el producto, la tecnología actual para la realización de pruebas así como la disponibilidad de materiales de la calidad deseada.
1440 (1112) Determinación de Actividad de Agua / Información General
USP 39
(1112) DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD DE AGUA EN PRODUCTOS FARMACÉUTICOS NO ESTÉRILES La determinación de actividad de agua en formas farmacéuticas no estériles auxilia en la toma de decisiones referentes a lo siguiente: (a) optimización de las formulaciones de productos para mejorar la eficacia antimicrobiana de los sistemas de conservación, (b) reducción de la degradación de los ingredientes farmacéuticos activos susceptibles a la hidrólisis química dentro de las formulaciones farmacéuticas, (c) reducción de la susceptibilidad de las formulaciones (especialmente de líquidos, lociones, ungüentos y cremas) a la contaminación microbiana y (d) provisión de una herramienta para fundamentar la reducción de la frecuencia de prueba en la determinación de límites microbianos y análisis de los microorganismos objetables para la liberación del producto y de las pruebas de estabilidad donde se emplean los métodos tratados en los capítulos generales Pruebas de Recuento Microbiano (61) y Pruebas de Microorganismos Específicos (62). Una reducida actividad de agua (aw) ayudará en gran medida a prevenir la proliferación de microorganismos en los productos farmacéuticos; y la formulación, etapas de producción y análisis de formas farmacéuticas no estériles deberían considerar este parámetro. La reducción de actividad de agua ha sido usada tradicionalmente para controlar el deterioro microbiano de los alimentos. Las frutas secas, los jarabes, y las carnes y vegetales encurtidos son ejemplos de alimentos donde se reduce el agua disponible. La baja actividad de agua en estos materiales favorece su autoconservación. La baja actividad de agua también sirve para prevenir el crecimiento microbiano en productos farmacéuticos. Además de la actividad de agua reducida, otros atributos del producto, tales como pH alto o bajo, ausencia de nutrientes, presencia de tensoactivos y el agregado de agentes antimicrobianos también ayudan a prevenir el crecimiento microbiano. Se debe notar, sin embargo, que los microorganismos más resistentes, entre otros las bacterias formadoras de esporas como Clostridium spp., Bacillus spp., Salmonel/a spp. y los hongos filamentosos pueden persistir dentro del producto aunque no proliferen en un medicamento con baja actividad de agua. Cuando se formula una forma farmacéutica acuosa, ya sea para la via oral o tópica, se deben evaluar las preformulaciones con relación a la actividad de agua para que en lo posible el medicamento se autoconserve. Por ejemplo, pequeños cambios en la concentración de cloruro de sodio, sacarosa, alcohol, propilenglicol o glicerina en una formulación pueden resultar en la creación de un fármaco con una actividad de agua menor, lo que puede desfavorecer la proliferación de microorganismos en el producto. Esto es particularmente valioso con un producto que se usa varias veces y que el mismo usuario puede contaminar. Se deben realizar estudios sobre el envasado para probar la estabilidad del producto y para determinar que el sistema de envase-cierre protege el producto contra la incorporación de humedad, lo que aumentaría la actividad de agua durante el almacenamiento. La reducción de las pruebas de límites microbianos puede justificarse a través de la evaluación de riesgo. Esta reducción, si fuera justificable, puede implicar la completa eliminación de las pruebas de límites microbianos, la implementación de un programa de pruebas sobre lotes salteados o la eliminación de pruebas de rutina. Los líquidos no acuosos o las formas farmacéuticas sólidas secas no favorecen la germinación de esporas o el crecimiento microbiano debido a su baja actividad de agua. La frecuencia del control microbiano puede determinarse mediante una revisión de los datos históricos de las pruebas del producto y de la demostración de la eficacia en el control de contaminación microbiana de las materias primas, el agua empleada como ingrediente, los procesos de fabricación, su formulación y el sistema de envasado del producto. Los datos históricos de las pruebas incluirían el control microbiano durante el desarrollo del producto, su posterior fabricación, la validación del proceso y las pruebas de rutina de una suficiente cantidad del producto ya colocado en el mercado (p.ej., hasta 20 lotes) para asegurar que el producto tiene poca o ninguna posibilidad de contaminación microbiana. Debido a que los requisitos de la actividad de agua para las bacterias Gram positivas, Gram negativas, esporas bacterianas, levaduras y hongos filamentosos están bien descritos en la respectiva literatura, 1 se puede establecer un programa de pruebas de límites microbianos adecuado para productos con diferentes actividades de agua. Por ejemplo, las bacterias Gram negativas, que comprenden microorganismos objeta bles específicos como Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli y Salmonella spp., no proliferarán o sobrevivirán en productos conservados que tienen una actividad de agua por debajo de 0,91, mientras que las bacterias Gram positivas, tales como Staphylococcus aureus, no proliferarán por debajo de 0,86 y Aspergillus niger no proliferará por debajo de 0,77. Además, ni siquiera las levaduras más osmofílicas o los hongos más xerofílicos proliferarían por debajo de 0,60 y no se los podría aislar en medios microbiológicos farmacopeicos. 1 Los requisitos de actividad de agua medidos a 25º para el crecimiento de un rango de microorganismos representativos se exhiben en la Tabla 7.
J. A. Troller, D. T. Bernard y V. W. Scott. Measurement of Water Activity. En: Compendium of Methods far the Microbiological Examination of Foods. American Public Health Association, Washington, DC, 1984 pp.124-1 34.
1
Información General/ (1112) Determinación de Actividad de Agua 1441
USP 39
Tabla 1. Actividades de Agua (aw) Requeridas para Sustentar el Crecimiento de Microorganismos Representativos Hongos Fiiamentosos y Levaduras Actividad de Agua (aw) Bacteria Actividad de Agua (aw) Pseudomonas aeruginosa
0,97
Rhyzopus nigricans
Bacillus cereus
0,95
Mucor plumbeus
0,92
C/ostridium botulinum, Tipo A
0,95
Rhodotorula mucilaginosa
0,92
Escherichia coli
0,95
Saccharomyces cerevisiae
0,90
Clostridium perfrinqens
0,95
Paecilomyces variotti
0,84
Lactobacillus viridescens
0,95
Penicillium chrysogenum
0,83
Salmonella spp.
0,95
Aspergillus fumigatus
0,82
Enterobacter aerogenes
0,94
Penicillium glabrum
0,81
Bacillus subtilis
0,90
Aspergillus f/avus
0,78
Micrococcus lysodekticus
0,93
Aspergillus niger
0,77
Staphylococcus aureus
0,86
Zygosachharomyces rouxii (levadura os-
0,62
0,93
mofílica)
Halobacterium halobium (bacteria ha-
Xeromyces bisporus (hongo xerofílico)
0,75
0,61
lofílica)
Los fármacos con actividades de agua muy por debajo de 0,75 (p.ej., tabletas de compresión directa, cápsulas rellenas de líquido y de polvo, productos líquidos no acuosos, ungüentos y supositorios rectales) serían excelentes candidatos para la reducción de las pruebas de límites microbianos para la liberación y para evaluar la estabilidad del producto. Esto es especialmente cierto cuando los productos farmacéuticos se hacen a partir de ingredientes de buena calidad microbiológica, el ambiente de fabricación no favorece la contaminación microbiana, existen procesos que de por sí reducen el contenido microbiano, la formulación del fármaco tiene actividad antimicrobiana y los sitios de fabricación tienen un historial bien establecido de pruebas con resultados de baja biocarga asociada con sus productos. La Tabla 2 sugiere estrategias para pruebas de límites microbianos para medicamentos de venta libre y productos farmacéuticos comunes basados en la actividad de agua. Otras consideraciones, como las mencionadas previamente, serían pertinentes al establecer el programa de pruebas de límites microbianos de medicamentos particulares debido a que las mediciones de la actividad de agua no pueden usarse como único criterio para justificar la eliminación de las pruebas microbianas para la liberación de productos. Se pueden esgrimir argumentos similares para las pruebas de límites microbianos de los ingredientes farmacéuticos. Se requeriría, sin embargo, que los fabricantes de medicamentos tengan un conocimiento integral acerca de los procesos de fabricación, programas de calidad y registros de pruebas de los fabricantes de ingredientes farmacéuticos. Esto podría obtenerse mediante un programa de auditoría de proveedores. Tabla 2. Estrategia de Pruebas de Límite Microbiano para Medicamentos de Venta Libre y Productos Farmacéuticos Representativos • Idadd e Agua Basada en la Act1v Actividad de Agua Productos
(aw)
Contaminantes de Mayor Potencial
Pruebas Recomendadas
lnhalante nasal
0,99
Bacteria Gram negativa
RTMA, * RTCHL, ausencia de S. aureus y P. aerugino-
Champú para el cabello
0,99
Bacteria Gram negativa
RTMA, RTCHL, ausencia de S. aureus y P.
Antiácido
0,99
Bacteria Gram negativa
RTMA, RTCHL ausencia de E. coli y Salmonella spp.
Crema tópica
0,97
Bacteria Gram positiva
RTMA, RTCHL, ausencia de S. aureus y P. aerugino-
0,90
Bacteria Gram positiva y hongos filamentosos
RTMAy RTCHL RTMAy RTCHL
sa aeruginosa
sa Líquido oral Suspensión oral
0,87
Hongos filamentosos
Ungüento tópico
0,55
Ninguno
Pruebas reducidas
Bálsamo labial
0,36
Ninguno
Pruebas reducidas
Supositorios vaginales y rectales
0,30
Ninguno
Pruebas reducidas
Tabletas comprimidas
0,36
Ninguno
Pruebas reducidas
Cápsula rellena de líquido
0,30
Ninguno
Pruebas reducidas
• RTMA =Recuento Total de Microorganismos Aerobios; RTCHL =Recuento Total Combinado de Hongos Filamentosos y Levaduras. NOTA-Las actividades del agua citadas en la Tabla 2 son representativas para diferentes formas farmacéuticas y se recomienda a las empresas que realicen pruebas de los productos individuales antes de desarrollar una estrategia de prueba.
La actividad de agua, aw, es la razón entre la presión de vapor de HP en el producto (P) y la presión de vapor de HP pura (Po) a la misma temperatura. Es numéricamente igual a 1/100 de la humedad relativa (HR) generada por el producto en un
USP 39
1442 (1112) Determinación de Actividad de Agua / Información General
sistema cerrado. La HR puede calcularse por medición directa de la presión parcial de vapor o por el punto de rocío o medirse indirectamente usando sensores cuyas características físicas o eléctricas se alteran por la HR a la que están expuestos. La relación entre aw y la humedad relativa en equilibrio (EHR) se representa por las ecuaciones siguientes: aw= P/Po y EHR(%)=aw x 100 Se puede medir aw mediante el método del espejo enfriado/punto de rocío. 2 Se emplea un espejo pulido y enfriado como superficie de condensación. El sistema de enfriamiento se conecta electrónicamente a una celda fotoeléctrica en la cual se refleja luz desde el espejo de condensación. Se dirige una corriente de aire, en equilibrio con la muestra de la prueba, hacia el espejo, el cual se enfría hasta que ocurra la condensación en el espejo. La temperatura en la que comienza esta condensación es el punto de rocío a partir del cual se determina la EHR. Se debe tener en cuenta la preparación de la muestra ya que puede afectar el nivel de actividad de agua del material en análisis. Instrumentos, disponibles comercialmente, que usan el método del espejo enfriado/punto de rocío u otras tecnologías, deben ser evaluados en cuanto a su aptitud, validación y calibración cuando se empleen para hacer determinaciones de actividad de agua. Estos instrumentos se calibran típicamente empleando soluciones salinas saturadas a 25º, como figuran en la Tabla 3. Tabla 3. Soluciones Salinas Saturadas Estándar para Calibrar Instrumentos que Determinan Actividad de Agua EHR (%)
ªw
Sulfato de potasio (K 2 S0 4 )
97,3
0,973
Cloruro de bario (BaCl 2 )
90,2
0,902
Cloruro sodio (NaCI)
75,3
0,753
Nitrato de magnesio [Mg(N0 3) 2]
52,9
0,529
Cloruro de magnesio (MgCl 2)
32,8
0,328
Soluciones Salinas Saturadas
(1113) CARACTERIZACIÓN, IDENTIFICACIÓN Y TIPIFICACIÓN DE CEPAS MICROBIANAS INTRODUCCIÓN Por lo general, la caracterización de microorganismos se lleva a cabo cuando éstos se detectan en fármacos, excipientes, agua para uso farmacéutico, productos intermedios, productos farmacéuticos terminados y en el ambiente de fabricación, y puede incluir la identificación y tipificació:i de cepas, según corresponda. [NOTA-Se proporciona un Glosario de Términos al final de este capítulo.] La caracterización de rutina de microorganismos puede incluir la determinación de la morfología de la colonia, morfología celular (bacilos, cocos, agrupaciones celulares, modos de esporulación, entre otros), reacción de Gram u otras técnicas de tinción diferencial, así como diversas reacciones bioquímicas clave (p.ej., actividad de oxidasa, catalasa y coagulasa) que pueden ser de diagnóstico. La caracterización microbiana a este nivel es suficiente para muchos de los propósitos de evaluación de riesgos en operaciones de fabricación farmacéutica no estéril y en algunos ambientes de fabricación de productos estériles. En algunos casos, una identificación de los microorganismos más concluyente requiere una identificación a nivel de género y especie. Más allá de lo antes mencionado, las metodologías disponibles pueden llevar a cabo una identificación a nivel de cepa, que puede ser útil en una investigación para determinar la fuente del microorganismo. La identificación es especialmente habitual cuando se recuperan organismos en tasas inusualmente altas o en cantidades que exceden los niveles recomendados para las categorías específicas de los productos. La identificación microbiana además es útil en el procesamiento aséptico. Es necesario realizarla cuando las pruebas de esterilidad arrojan resultados positivos y cuando se debe evaluar la contaminación recuperada de simulaciones de procesamiento aséptico fallidas, es decir, del llenado de medios. Los sistemas de identificación microbiológica se basan en diversas metodologías analíticas, por lo que las limitaciones pueden ser inherentes al método y/o derivarse de las limitaciones de las bases de datos. La identificación se logra cotejando las características (genotípicas y/o fenotípicas) con un organismo estándar (de referencia) establecido, por ejemplo una cepa tipo. Los microorganismos sólo serán identificables cuando estén incluidos en la base de datos, por lo que los fabricantes deben revisar la extensión de la base de datos del sistema de identificación que planean utilizar, así como la utilidad del mismo con respecto a sus necesidades. Los usuarios deben considerar los sistemas de identificación microbiológica que mejor se ajusten a sus necesidades. Teniendo en cuenta dichas limitaciones y el nivel de identificación requerido (género, especie, cepa), los usuarios deben seleccionar la tecnología apropiada para usar en las pruebas de identificación microbiológica de rutina. El capítulo de pruebas generales de la USP Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Microorganismos Específicos (62) cita específicamente la necesidad de la identificación microbiana. Asimismo, dicho capítulo requiere pruebas de identificación confirmatorias para organismos que proliferan en medios selectivos o de diagnóstico y presentan características 2
Método Oficial 978.18 de la AOAC lnternational. En: Official Methods of Analysis of AOAC lnternational, i 7th edition, AOAC lnternational, Gaithersburg, Maryland.
Información General/ (1113) Caracterización, Identificación y Tipificación 1443
USP 39
morfológicas definidas. Por otra parte, el capítulo de pruebas generales de la U5P Pruebas de Esterilidad (71) permite invalidar la prueba cuando, después de la identificación de los microorganismos aislados de la prueba, el crecimiento de dichas especies se puede atribuir inequívocamente a fallas relacionadas con el material y/o la técnica usada para llevar a cabo el procedimiento de prueba de esterilidad. El capítulo de información general de la U5P Control Microbiológico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento Aséptico (1116) recomienda la identificación de los microorganismos aislados a una tasa que sea suficiente para respaldar el programa de monitoreo ambiental.
AISLAMIENTO DE CULTIVOS PUROS La primera etapa de la identificación consiste en aislar un cultivo puro para su análisis. Esto por lo general se logra mediante la siembra sucesiva en estrías de la colonia de interés, empleando un patrón de cuadrante en medios sólidos microbiológicos generales adecuados, con el propósito de obtener colonias discretas que, por lo general, producen cultivos puros. Esta técnica también permite la expresión fenotípica y la proliferación de inóculo suficiente para los procedimientos de identificación subsiguientes. Los analistas deben reconocer que la fuente del aislamiento, la selección de los medios y las condiciones de crecimiento (ver la Tabla 1) pueden afectar la expresión del fenotipo microbiano (es decir, tamaño y forma de la célula, esporulación, composición celular, antigenicidad, actividad bioquímica y sensibilidad a los agentes antimicrobianos). Por lo tanto, los medios preparatorios para identificación y el número de subcultivos pueden afectar los resultados de los métodos de identificación del fenotipo. Tabla 1. Características Fenotípicas Usadas en la Taxonomía Microbiana Características
Categorías Cultivo
Morfología de la colonia, color de la colonia, forma y tamaño, producción de pigmentos
Morfológicas
Morfología celular, tamaño de la célula, forma de la célula, tipo de flagelos, material de reserva, reacción de Gram, esporas y tinción de ácido alcohol resistencia, modo de esporulación
Fisiológicas
Tolerancia al oxígeno, intervalo de pH, temperatura óptima e intervalo de temperatura, tolerancia a la salinidad
Bioquímicas
Utilización de carbono, oxidación o fermentación de carbohidratos, patrones enzimáticos
Inhibición
Tolerancia a las sales biliares, susceptibilidad a antibióticos, tolerancia a los colorantes
5erológicas
Aglutinación, anticuerpo fluorescente
Quimiotaxonómicas
Perfil de ácidos grasos, toxinas microbianas, composición de la célula entera
Ecológicas
Origen del organismo
Por el contrario, el genotipo microbiano generalmente se conserva de buena manera y no se ve afectado por las condiciones del cultivo. Por lo tanto, una vez que se ha asegurado el aislamiento de una colonia monoclonal pura, el microorganismo puede ser analizado sin preocupación alguna sobre los medios de crecimiento más recientes o aislamientos viables. La Tabla 2 lista las características genotípicas que se pueden determinar. Tabla 2. Características Genotíplcas/Fllogenétlcas Que Se Pueden Usar en la Taxonomía Microbiana Características
Categorías Genotípicas
Relación de bases de ADN (contenido G + C), patrones de fragmentos de restricción y sondas de ADN
Filogenéticas
Hibridación ADN-ADN y secuencias de los ARNr 165 y 235
La taxonomía bacteriana, según se describe en el Bergey's Manual of Systematic Bacteriology [Manual de Bacterología Sistemática de Bergey] (el Manual de Bergey) 1 actualmente se logra mediante el análisis comparativo de material genético. Cuando el ADN de un organismo desconocido se compara con el ADN de un organismo conocido, se puede determinar el grado de correlación. La identificación genotípica (Tabla 2) se logra mediante el uso de hibridación de ADN, comparaciones de los patrones de fragmentos de restricción y/o sondas de ADN. Por ejemplo, una correlación superior al 70% con hibridación ADN-ADN indica que los organismos son de la misma especie. El análisis filogenético (Tabla 2) por lo general se lleva a cabo mediante la comparación de la secuencia de bases de una porción del gen del ARN ribosomal 165 para bacterias o el gen del ARN ribosomal 235 para hongos. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se utiliza para amplificar estos genes y, posteriormente, se aísla la región amplificada y se obtiene su secuencia de bases usando un método electroforético o de terminación de cadena didesoxi. Las comparaciones se pueden llevar a cabo empleando bases de datos validadas de patente o con aquéllas de acceso público. [Precaución: Es posible que las bases de datos de acceso público no estén validadas.]
DETECCIÓN V CARACTERIZACIÓN PRIMARIA Los microorganismos aislados en medios farmacopeicos a partir de muestras de ingredientes farmacéuticos, de agua para uso farmacéutico, del ambiente de fabricación, de productos intermedios y de los productos terminados pueden estar bajo estrés fisiológico. Los microorganismos pasarán de un estado metabólico adecuado para su supervivencia en condiciones ambientales adversas a condiciones de cultivo más favorables desde el punto de vista nutricional y que se encuentran a una tem-
1
Bergey's Manual of Systematic Bacteriofogy, 2da Edición, 2003
1444 (1113) Caracterización, Identificación y Tipificación / Información General
USP 39
peratura de incubación óptima. Esta transición se puede controlar mediante el manejo cuidadoso de los aislamientos. Como preparación para la identificación, se siembran colonias representativas individuales en estrías, a partir de los medios de aislamiento primario, en medios sólidos para colonias monoclonales, según se describió anteriormente. El primer paso consiste en determinar la reacción de Gram, la morfología celular y, en algunos casos, las reacciones bioquímicas de diagnóstico de los aislamientos de bacterias. Éste es un paso crítico para muchos esquemas de identificación fenotípica, puesto que si se asignan características erróneas a un aislamiento, es posible que los análisis subsiguientes se lleven a cabo usando un kit de identificación microbiana erróneo, lo cual conduciría a resultados incorrectos. A continuación se describen diversas pruebas de detección preliminar de uso común.
Tinción de Gram Los métodos de tinción de Gram se pueden realizar en cuatro pasos: cristal violeta (colorante primario), yodo (mordiente), alcohol o solución de alcohol-acetona (decolorante) y safranina (colorante de contraste). En el método de tres pasos, se combinan los pasos de decoloración y contraste. En condiciones óptimas, los organismos Gram positivos retienen el colorante cristal violeta y presentan un color violeta azulado. Los organismos Gram negativos pierden el colorante cristal violeta, por lo que contienen únicamente el colorante de contraste, safranina, y se presentan de color rojo. Algunas bacterias pueden presentar reacciones de Gram variables. Las dificultades más comunes de este método recaen en que la fijación con calor puede ocasionar que las células Gram positivas se tiñan como Gram negativas, y que los cultivos más antiguos puedan presentar reacciones de Gram variables. Un exceso de decolorante puede generar un resultado Gram negativo falso, mientras que una cantidad insuficiente de decolorante puede generar un resultado Gram positivo falso. Una variación que presenta ventajas para algunos casos consiste en fijar el frotis bacteriano con metanol en lugar de calor. En algunos casos, la fijación con alcohol puede arrojar resultados de tinción de Gram más uniformes. Independientemente del método, se debe incluir un control Gram positivo y Gram negativo que permita identificar errores de tinción. Debido a que la reacción de tinción de Gram se debe observar al microscopio, es posible determinar simultáneamente la morfología celular.
Tinción de Esporas La tinción de esporas se puede lograr usando colorante verde malquita para esporas bacterianas. Se debe incluir un control positivo que permita la identificación de errores en la tinción de las esporas.
Detección Bioquímica Las pruebas de detección bioquímica clave incluyen (1) la prueba de oxidasa para separar bacterias Gram negativas con forma de bacilo en bacterias no fermentadoras (oxidasa positiva) y entéricas (oxidasa negativa), (2) la prueba de catalasa para separar Staphylococci (catalasa positiva) de Streptococci (catalasa negativa) y (3) la prueba de coagulasa para separar Staphylococci en coagulasa negativa (presuntamente no patogénica) y Staphylococci coagulasa positiva (más probablemente patogénica). Este pequeño número de pruebas puede proveer información suficiente para la evaluación en curso en muchos tipos de investigaciones e inspecciones de rutina de la biocarga en el ambiente de fabricación. No obstante, cuando las circunstancias exigen una evaluación más a fondo, la identificación hasta el nivel de género, especie o cepa puede generar información valiosa sobre la naturaleza y fuente de la biocarga ambiental. Asimismo, la identificación microbiana hasta el nivel de especie, e incluso de cepa, puede ser crítica para la evaluación y mitigación de riesgos de contaminación microbiana.
IDENTIFICACIÓN MICROBIANA POR MÉTODOS FENOTÍPICOS Los métodos fenotípicos emplean la expresión de productos génicos para distinguir entre microorganismos distintos. Por lo general, éstos requieren un número relativamente grande de células en cultivo puro monoclonal. Los métodos de recuperación y crecimiento para recuento e identificación microbianos se ven limitados por la duración de la incubación y por el hecho de que muchos de los organismos presentes en el ambiente no son recuperados por los medios de crecimiento microbiológico generales. Asimismo, es probable que los microorganismos estresados, recién aislados por subcultivo a partir de la recuperación primaria no produzcan una expresión completa de las propiedades fenotípicas. Sin embargo, los métodos basados en la utilización de carbono y reacciones bioquímicas, así como los perfiles de ácidos grasos mediante cromatografía de gas-líquido y la composición de la célula entera por espectrometría de masas MALDl-TOF, siempre se basan en el desarrollo de inóculos para un sistema de identificación específico. Estos sistemas dependen de los medios de cultivo y de las condiciones de incubación especificados para lograr una identificación uniforme. Los métodos fenotípicos de identificación microbiana se usan con éxito en laboratorios de análisis microbiológico de alimentos, agua, clínicos y farmacéuticos.2 Los métodos fenotípicos de identificación microbiana proveen información que permite a los microbiólogos tomar decisiones bien fundamentadas con respecto a los riesgos del producto y reconocer cambios en la microflora ambiental. La identificación fenotípica por sí misma es sufi2
O'Hara, C.M., M.P. Weinstein, and J.M. Miller. Manual and automated systems for detection and identification of microorganisms. ASM Manual of Clinical Micro-
biology, Bva Edición, 2003.
USP 39
Información General/ (111 3) Caracterización, Identificación y Tipificación 1445
ciente para muchas investigaciones de control de calidad y permitirá a los científicos llevar a cabo una investigación meticulosa y recomendar acciones correctivas apropiadas, según se requiera.
IDENTIFICACIÓN MICROBIANA CON MÉTODOS GENOTÍPICOS Los métodos genotípicos de identificación microbiana son, en teoría, más fidedignos, debido a que las secuencias de ácidos nucleicos se conservan de muy buena manera en la mayoría de las especies microbianas. Los métodos genotípicos aplicables incluyen hibridación ADN-ADN, PCR, secuenciación de ARNr 165 y ARNr 235, tipificación por secuenciación multilocus (MLST, por sus siglas en inglés), pirosecuenciación, sondas de ADN y ribotipificación analítica. Estos métodos pueden presentar desafíos técnicos para los microbiólogos, además de requerir equipo e insumos analíticos más costosos. A menudo, estos análisis se llevan a cabo en laboratorios contratados, laboratorios gubernamentales, universidades, institutos de investigación o laboratorios especializados pertenecientes a firmas industriales. Por lo tanto, el uso de métodos genotípicos de identificación se limita generalmente a investigaciones microbiológicas críticas tales como investigaciones en falla de producto. Asimismo, si se lleva a cabo una identificación a nivel de cepa en el transcurso de una investigación, los analistas deben asegurarse de que el método sea apropiado. La secuenciación de ADN de los primeros 500 pares de bases de la secuencia del gen de ARNr 165 es útil para la identificación a nivel de especies, pero puede no ser lo suficientemente potente para distinguir entre especies estrechamente relacionadas o cepas de la misma especie. Por el contrario, la hibridación Southern de digeridos de endonucleasas de restricción es una técnica potente y puede resultar efectiva para demostrar diferencias entre dos cepas. Si los patrones de bandas parecen idénticos, esto demuestra únicamente que la endonucleasa de restricción tiene sitios de ruptura similares en una determinada región de los dos organismos. La demostración de que dos organismos son iguales debe incluir dos o más digeridos diferentes de endonucleasas de restricción, cada uno de los cuales genera bandas en el área de interés. Todas las bandas de los dos organismos deben ser idénticas. A diferencia de la identificación microbiana, los métodos basados en ácidos nucleicos se pueden usar para detectar microorganismos específicos. Los pasos relacionados con esta actividad son: recolección de las muestras, extracción de los ácidos nucleicos, amplificación de los blancos, hibridación y detección. El problema de amplificar ADN a partir de células bacterianas no viables se puede resolver utilizando transcripción reversa para convertir el ARNr que es transicional, y que por consiguiente se relaciona con la viabilidad, en ADN para amplificación por PCR. Otras cuestiones incluyen: detección de variantes microbianas, límites de detección, efectos de la matriz, verificación de cortes positivos, transferencia de instrumental y sistemas, exactitud del diagnóstico y reproducibilidad.
VERIFICACIÓN DE MÉTODOS DE IDENTIFICACIÓN MICROBIANA Las pruebas de identificación microbiana incluyen pruebas serológicas, de reactivos químicos, de organismos de referencia y de instrumental. La verificación de un sistema de pruebas de identificación puede incluir cualquiera de los siguientes: (1) usar un sistema existente para el análisis paralelo de aislamientos microbianos obtenidos del análisis de rutina (el número de aislamientos analizados puede llegar a 50 y cualquier discrepancia en la identificación puede ser subsanada usando un método de arbitraje); (2) analizar 12-15 cultivos madre representativos conocidos procedentes de diferentes especies comúnmente aisladas para un total de 50 pruebas; o (3) confirmar que 20-50 identificaciones de organismos, incluyendo 15-20 especies diferentes, concuerdan con los resultados de un análisis realizado en un laboratorio de referencia de una muestra dividida. 3 En cada caso, se deben incluir organismos de control de calidad apropiados para el proceso de verificación, según lo recomendado por el proveedor y por la farmacopea. La verificación de la identidad de las especies debe ser evaluada empleando sistemas de identificación, y además tomando en cuenta el nivel de concordancia. Por lo general, se puede lograr una concordancia superior al 90% con muestras de microorganismos que sean apropiadas para el sistema de identificación. Los grupos de organismos que son difíciles de identificar (p.ej., bacterias no fermentadoras, corinobacterias y Staphy/ococci coagulasa negativo) se pueden incluir, cuando corresponda, en el proceso de verificación, pero pueden generar niveles de concordancia menores. La jerarquía de los errores de identificación microbiana en orden descendente de impacto es (1) identificación errónea de géneros, (2) identificación errónea de especies y (3) falta de identificación. La identificación errónea puede provocar la aplicación de acciones correctivas y preventivas inadecuadas y el descarte del producto. Cabe la posibilidad de que un sistema de identificación microbiana no pueda identificar algunos aislamientos por las siguientes razones: el organismo no está incluido en la base de datos, los parámetros del sistema no son lo suficientemente amplios como para identificar el organismo, el aislamiento no reacciona en el sistema o no existe una descripción taxonómica de las especies. En tales casos, los aislamientos pueden enviarse al proveedor del sistema de identificación microbiana para estudio adicional y, cuando corresponda, agregarlos a la base de datos. Alternativamente, se pueden llevar a cabo pruebas genotípicas de identificación y agregar las especies a una base de datos interna. La identificación errónea es más difícil de determinar, pero se debe corroborar que cualquier identificación microbiana sea razonable en lo que respecta a la morfología del microorganismo, sus requisitos fisiológicos y la fuente de aislamiento. Los organismos identificados únicamente al nivel de género pueden 3 Cumitech 31. Verification and Validation of Procedures in the Clinica/ Microbiology Laboratory.Elder, B.l., S.A. Hansen, ).A. Kellogg, F.J. Marsik, y R.). Zabransky, ASM, Febrero 1997.
1446 (1113) Caracterización, Identificación y Tipificación / Información General
USP 39
ser comunes para las numerosas especies no patógenas de Staphylococcus, Corynebacterium (y demás bacilos Gram positivos pleomórficos pequeños) y Micrococcus. Las pruebas de verificación más importantes son exactitud y reproducibilidad. Estas mediciones se pueden definir del siguiente modo: % de Exactitud = (Número de resultados correctos/Número total de resultados) x 100 % de Reproducibilidad =(Número de resultados correctos que concuerdan entre sí/Número total de resultados) x 100 El usuario debe establecer criterios de aceptación adecuados de exactitud y reproducibilidad, tomando en cuenta las capacidades del método. Otras mediciones incluyen: sensibilidad, especificidad y valor predictivo positivo y negativo. Estas mediciones se ilustran mejor con el siguiente ejemplo. Un laboratorio clínico de microbiología comparó la frecuencia de aislamiento de una sonda de hibridación de ADN contra un método de cultivo para la bacteria de transmisión sexual Neisseria gonorrhaeae.3 La frecuencia de aislamiento a partir de muestras clínicas era históricamente de 10%. El laboratorio analizó 100 muestras divididas; los resultados se presentan en la Tabla 3. Tabla 3. Comparación de la Distribución de los Resultados Negativos y Positivos para los Métodos de Sonda de ADN y de Cultivo Resultados del Cultivo Resultados de la Sonda de ADN
Positivo
Negativo
Positivo
9
2
Negativo
1
88
Sensibilidad= [9/(9 + 1)] x 100 = 90% Especificidad= [88/(88 + 2)] x 100 = 97,7% Valor Predictivo Positivo= [9/(9 + 2)] x 100 = 81 ,8% Valor Predictivo Negativo= [88/(88+1)] x 100 = 98,9% Tener en cuenta que el valor predictivo positivo (VPP) no es intrínseco a la prueba; éste depende también de la preponderancia del microorganismo en muestras clínicas. El VPP es directamente proporcional a la preponderancia de la enfermedad o condición. En este ejemplo, si el grupo de individuos analizados hubiese incluido una proporción mayor de personas con la infección, entonces el VPP probablemente habría sido mayor, mientras que el valor predictivo negativo (VPN) habría sido menor. Si todas las personas del grupo hubieran presentado la infección, el VPP habría sido del 100% y el VPN del 0%. La derivación matemática de estas funciones se detalla en la Tabla 4. Tabla 4. Tabla de Contingencia de Dos Filas y Dos Columnas con Respecto al Método de Cultivo de Referencia y al Método de PCR Alternativo (De acuerdo a ISO 5725-1 y 5725-2 2004)* PCR Cultivo Positivo Negativo
Positivo
Suma
a Verdadero Positivo
b Falso Negativo
a+b
e
d Verdadero Negativo
c+d
Falso Positivo Suma
Negativo
a+c
b+d
* ISO 5725-1 :1994 Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results [Exactitud (veracidad y precisión) de los métodos y resultados de la
medición]-Part 1: General principies and definitions (Parte 1: Principios y Definiciones Generales) e ISO 5725-2:1994 Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results [Exactitud (veracidad y precisión) de los métodos y resultados de la medición]-Part 2: Basic methods for the determination of repeatability and reproducibility of standard measurement methods (Parte 2: Métodos básicos para la determinación de repetibilidad y reproducibilidad de métodos de medición estándar).
lnclusividad (%) = [a/(a + b)] x 100 Exclusividad(%)= [d/(c + d)] x 100 Predictividad Positiva (%) = [a/(a + c)] x 100 Predictividad Negativa(%)= [d/(b + d)] x 100 Exactitud Analítica (%) = [(a + d)/(a + b + c + d)] x 100 Índice Kappa= 2(ad - bc)/[(a + c) x (c + d) +(a+ b) x (b + d)]
Consideraciones Filogenéticas La segunda edición del Manual de Bergey representó un cambio mayor en términos de innovación con respecto a la primera edición, e incluso con respecto a la octava y novena ediciones del Manual of Oeterminative Bacteriology (Manual de Bacteriología Determinativa). La organización del contenido en el Manual de Bergey sigue un marco filogenético, basado en el análisis de la secuencia de nucleótidos de la subunidad pequeña del ARN ribosómico 16S, en lugar de una estructura fenotípica. Los árboles filogenéticos o dendrogramas presentan a los organismos con las relaciones genéticas más cercanas. La aplicación de esta tecnología ha generado revisiones en la taxonomía, así como la redenominación de algunos microorganismos bien conocidos; p.ej., al hongo A. niger ATCC 16404 se le renombró A. brasiliensis. En general, los organismos con una correla-
Información General/ (1115) Control de Biocarga 1447
USP 39
ción menor o igual al 97% se consideran de géneros distintos, mientras que aquéllos con una correlación menor o igual al 99% se consideran especies diferentes,4 aunque existen muchas excepciones a dicha generalización. Las diferencias de genotipo y fenotipo son relativamente poco comunes; p.ej., el mismo genotipo o uno muy similar compartido por microorganismos con fenotipos diferentes, fenotípos similares pero genotipos diferentes y microorganismos cuyos genotipos son muy distantes para ser de la misma especie o género. El concepto de taxonomía polifásicas que hace referencia al ensamble y uso de muchos niveles de información, p.ej., caracterización microbiana, datos fenotípicos y genotípicos, y origen de los microorganismos, se puede aplicar exitosamente a la identificación microbiana, lo cual evita tomar decisiones empleando únicamente datos genotípicos que carecen de sentido cuando se consideran las caracterísitcas microbianas, el historial de análisis y la fuente de aislamiento.
GLOSARIO Caracterización microbiana: Uso de la proliferación de colonias, morfología celular, tinción diferencial y características de diagnóstico claves para caracterizar un aislamiento de laboratorio, a fin de determinar tendencias y para propósitos investigativos sin identificación, p.ej., Staphylococci no patógenos. Cepa: Aislamiento específico de una especie que se mantiene en un cultivo puro y está caracterizado. La cepa tipo es representativa de la especie que proporciona una referencia para las especies basada en su historial de aislamiento, caracterización y deposición en colecciones de cultivos reconocidos. Clasificación microbiana: Agrupación de microorganismos en grupos taxonómicos basándose en sus similitudes y relaciones. Correlación: Se refiere al grado de relación o similitud de dos (o más) organismos en un Árbol Filogenético o Dendrograma. Especie filogenética: Especie que consta de una gran cantidad de cepas, que incluyen el tipo de cepa que comparte por lo menos 70% de la hibridación ADN-ADN del genoma total y menos de 5º ~Tm (diferencia en el punto de fusión del híbrido). Identificación microbiana: Determinación del grupo amplio (p.ej., bacterias, levaduras u hongos filamentosos) o grupo reducido (p.ej., géneros y/o especies) al que pertenece un aislamiento de laboratorio. Mol %GC: Porcentaje molecular del contenido de guanina-citosina en el ADN cromosómico. [NOTA-%GC + %AT = 100%.] Secuencia de ARNr: Las secuencias del ADN que codifican para el ARNr usado en la síntesis de proteínas se conservan de muy buena manera entre microorganismos con un linaje común. Se usan para determinar la distancia filogenética entre organismos y son útiles para la taxonomía e identificación microbiana. Taxonomía polifásica: Taxonomía que ensambla y asimila una gran cantidad de niveles de información de fuentes moleculares, fisiológicas, morfológicas, serológicas o ecológicas para clasificar un microorganismo. Tipificación de la cepa: La tipificación de la cepa es una parte integral de las investigaciones epidemiológicas para la microbiología clínica y de salud pública. Los métodos que se pueden usar para demostrar que las especies microbianas pertenecen a la misma cepa y posiblemente se derivan de una misma fuente incluyen electroforesis en gel de campo pulsado, identificación por riboimpresión (riboprinting), reacción en cadena de la polimerasa con cebado aleatorio y mapeo de restricción ordenada del genoma completo o mapeo óptico.
(1115) CONTROL DE BIOCARGA DE FÁRMACOS Y MEDICAMENTOS NO ESTÉRILES INTRODUCCIÓN En términos de control de riesgos por contaminación microbiológica, existen dos grandes categorías de medicamentos: (a) productos estériles, en los que la biocarga se elimina esencialmente usando metodologías validadas, y (b) productos no estériles, en los que la biocarga del producto final se controla a niveles apropiados basándose en los atributos del producto, en la vía de administración y en la población de pacientes esperada. El contenido microbiano en productos no estériles se controla a un nivel que sea congruente con respecto a la seguridad del paciente. El uso de controles excesivos que agreguen complejidad o costos adicionales sin un beneficio de seguridad proporcional no otorga ninguna ventaja en términos de valor agregado para el paciente o el fabricante. Por lo tanto, un enfoque científico pragmático para gestionar la biocarga microbiana en productos no estériles necesita tomar en cuenta el riesgo para el paciente y los objetivos del control de la contaminación a fin de lograr un nivel práctico y apropiado de gestión de riesgos. Una consideración crítica para asegurar la calidad del producto es prevenir aquellas condiciones que puedan favorecer la proliferación o el ingreso de microorganismos en las instalaciones o procesos de fabricación. El crecimiento microbiano en ex-
4 ].E. Clarridge 111. The lmpact of
165 rRNA Gene Sequencing Analysis for ldentification of Bacteria on Clinical Microbiology and lnfectious Diseases, Clin. Microbio/.
Rev. 17 (2) 840-862, 2004. 5 Gillis, M., P. Vandamme, P. De Vos,
J.
Swings and K. Kersters. Polyphasic Taxonomy. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 2da Edición, 2003.
1448 (1115) Control de Biocarga / Información General
USP 39
cipientes, componentes y fármacos es un asunto de cuidado debido a que crea la posibilidad de que el contenido microbiano viable alcance niveles inaceptables. Los niveles de biocarga dentro de los intervalos recomendados en Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Criterios de Aceptación para Preparaciones Farmacéuticas y Sustancias de Uso Farmacéutico (1111) se consideran seguros y no representan un riesgo de infección ni de toxinas microbianas. Los fabricantes deben tener una clara comprensión de las situaciones que pueden favorecer el crecimiento microbiano dentro de sus instalaciones y en sus materiales y deben implementar medidas prácticas para contrarrestarlo. Este capítulo describe un enfoque basado en riesgos para controlar la contaminación en la fabricación de productos no estériles. La fabricación de productos no estériles y la gestión del contenido microbiológico son muy diferentes de las requeridas para los productos estériles. Los productos estériles se administran por vía parenteral mediante inyección o se aplican por vía tópica a tejidos sensibles cuando el riesgo de infección es comparativamente alto. Por el contrario, los productos no estériles se administran en regiones del cuerpo humano que son ricas en flora microbiana y que tienen barreras físicas o inmunológicas contra las infecciones. Entre los ejemplos se incluyen la cavidad oral, la piel, el tracto naso-faríngeo, la vagina y el recto, los cuales albergan una alta y diversa población de microorganismos viables. Los hallazgos recientes del proyecto de microbioma humano ( 7) enfatizan el enorme tamaño y diversidad de las poblaciones de bacterias relacionadas con los humanos. Un adulto sano presenta una población bacteriana que promedia aproximadamente 10 14 bacterias, una cantidad que excede el número de células individuales propias por un factor de 1 O. Todos los seres humanos portan en sus cuerpos microorganismos que, en ciertas condiciones, pueden ocasionar infecciones en otros humanos. El hecho de que estos microorganismos estén presentes en humanos significa que pueden estar presentes temporalmente en el ambiente no estéril de fabricación. Su carácter ubicuo y su infrecuente asociación con las infecciones confirman que los riesgos asociados con ellos son muy bajos. No obstante, los buenos controles higiénicos y la selección de sistemas de vestimenta adecuados son aspectos importantes para productos destinados para pacientes que pudieran estar inmunocomprometidos. La siguiente lista provee una jerarquía para las grandes categorías de productos farmacéuticos no estériles con respecto al riesgo potencial de contaminación microbiológica (de elevada a baja) (2): • inhaladores de dosis fija e inhaladores de polvo seco • atomizadores nasales •áticos • supositorios vaginales •tópicos • supositorios rectales • líquidos orales (acuosos) • cápsulas rellenas con líquido • tabletas orales y cápsulas rellenas con polvo Cuando los formuladores evalúan la susceptibilidad de los productos farmacéuticos no estériles a los riesgos microbianos, los aspectos a considerar incluyen saber si el ingrediente activo tiene una actividad antimicrobiana inherente, el contenido microbiológico de los excipientes, la inclusión de conservantes antimicrobianos en la formulación y la actividad del agua. Asimismo, los fabricantes deben considerar si las etapas de procesamiento y los periodos de retención pueden generar cambios en la biocarga. Se espera que los productos no estériles tengan algo de biocarga, la cual debe controlarse dentro de un intervalo apropiado (ver el capítulo (1111 )). El riesgo de infección resultante de un medicamento no estéril es por lo general bajo, independientemente de la vía de administración, siempre que se sigan las precauciones y los procedimientos apropiados. En este sentido, los capítulos generales Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano (61) y Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Microorganismos Específicos (62) proveen métodos, mientras que el capítulo (1111) provee información para la evaluación de microorganismos aislados durante la fabricación de medicamentos no estériles. Resulta imposible proveer una lista completa de microorganismos inaceptables para cada uno de los productos. El grado en que un organismo puede ser inaceptable depende de los atributos del producto, la vía de administración y la población de pacientes. Los fabricantes son responsables de determinar si los microorganismos recuperados de los medicamentos son inaceptables. En general, los microorganismos inaceptables son aquéllos que se conocen como verdaderamente patógenos, tomando en cuenta la vía de administración del producto. El capítulo (1111) provee en forma de lista por puntos las pautas sobre factores de riesgo que se deben tomar en cuenta. Además, el riesgo puede surgir en situaciones en las que los microorganismos pueden proliferar en números suficientes para generar un nivel inaceptable de riesgo para el paciente hasta un nivel por encima de los intervalos recomendados en el capítulo (1111 ). Se debe evaluar el riesgo microbiológico para cada caso durante el desarrollo de un producto nuevo y durante la validación del proceso de fabricación. La proliferación de contaminación microbiana en una instalación de producción, en productos o en ingredientes de estos es una condición inaceptable. La proliferación microbiana dentro de una instalación genera condiciones que favorecen la diseminación de contaminantes, en números potencialmente peligrosos, en ingredientes, materiales de envasado primarios, e incluso en el producto mismo. La proliferación de microorganismos en ingredientes o en la producción de productos intermedios debe prevenirse puesto que genera un riesgo debido a toxinas microbianas y puede resultar en daños a las propiedades químicas y farmacológicas del medicamento.
USP 39
Información General/ (1115) Control de Biocarga 1449
DOCUMENTOS GUÍA REGLAMENTARIOS DE LOS EE.UU. El Código de Reglamentos Federales de los EE.UU. (U.S. Code of Federal Regulations o CFR) incluye los requisitos de las Buenas Prácticas de Fabricación de la Administración de Alimentos y Medicamentos (Food and Drug Administration), los cuales se citan en la Parte 211 (3). Estos reglamentos contienen requisitos generales para la fabricación de productos farmacéuticos. Las secciones pertinentes del Título 21 del CFR 211 incluyen: 27 7.42 Diseño y construcción (Design and construction)-Esta sección requiere que los edificios usados para la fabricación farmacéutica y sus actividades relacionadas tengan un tamaño, construcción y ubicación adecuadas; 27 7.46 Ventilación, filtración, calefacción y enfriamiento del aire (Ventilation, air filtration, air heating and cooling)-Esta sección requiere el uso de equipo adecuado para controlar microorganismos, polvo, humedad y temperatura y que se provean presiones diferenciales del aire cuando resulte apropiado para la fabricación de medicamentos; 2 7 7.56 Sanitización-Esta sección requiere procedimientos escritos para el uso de rodenticidas, insecticidas, fungicidas, agentes de fumigación, de limpieza y de sanitización adecuados; los procedimientos escritos deben estar diseñados para prevenir la contaminación de equipos, componentes, envases de medicamentos, cierres, empaques y materiales de etiquetado; 2 7 7.82 Recepción y almacenamiento de envases y cierres para medicamentos sin analizar (Receipt and storage of untested components, drug product containers, and closures)-Esta sección requiere un procedimiento de aceptación, cuarentena, análisis y liberación para componentes y envases; 2 7 7. 7 7O Muestreo y análisis de materiales y medicamentos durante el proceso (Sampling and testing of in-process materials and drug products)-Esta sección requiere controles de fabricación durante el proceso que incluyan la determinación de biocarga. Consideraciones sobre organismos inaceptables: El Título 27 del CFR 27 7.84(d)(6)-requiere el análisis microbiológico de envases y componentes entrantes que tengan un potencial de contaminación microbiológica que sea inaceptable para su uso pretendido; el Título 2 7 del CFR 2 7 7. 7 73(a)-requiere procedimientos escritos dirigidos al control de microorganismos inaceptables en medicamentos que no requieren ser estériles; asimismo, el Título 2 7 del CFR 27 7. 765(b)- requiere análisis de laboratorio apropiados, según sea necesario, de cada partida de medicamentos para los que la ausencia de microorganismos inaceptables sea un requisito.
CONSIDERACIONES SOBRE EL CONTROL MICROBIANO DURANTE EL DESARROLLO DEL PRODUCTO Resulta útil un programa formal de evaluación de riesgos que identifique las modalidades de riesgos y que asigne puntos de control críticos para la fabricación de productos no estériles. Los programas de Análisis de Riesgos y de Puntos de Control Críticos ( 4) se usan ampliamente para evaluar y mitigar los riesgos microbianos en la fabricación de alimentos y también pueden ser útiles para los fabricantes de medicamentos no estériles. A continuación se citan los puntos a tomar en cuenta por parte de los microbiólogos farmacéuticos al momento de evaluar los riesgos potenciales relacionados con la fabricación de medicamentos no estériles: • síntesis, aislamiento y purificación final del fármaco • atributos microbiológicos del fármaco • atributos microbiológicos de excipientes y productos intermedios • formulación y atributos fiisicoquímicos del medicamento • propiedades antimicrobianas del material, p.ej., actividad del agua u otras • proceso de fabricación • sistema de administración •envasado • condiciones de almacenamiento para productos intermedios y la forma farmacéutica terminada • vía de administración • procedimiento para el tratamiento y régimen de dosificación esperados • población a la que se administra el producto (p.ej., neonatos, pacientes inmunocomprometidos, etc.) La consideración minuciosa de estos factores es de gran valor al definir los requisitos para las instalaciones de fabricación y las mediciones de punto de control del proceso que limitan las condiciones que favorecen la proliferación y el ingreso de microorganismos.
CONSIDERACIONES SOBRE EL CONTROL MICROBIANO DURANTE LA FABRICACIÓN Aunque muchos factores (Figura 7) pueden resultar en la introducción de microorganismos, algunos presentan una mayor probabilidad de contaminación microbiana. Estos factores de fabricación son, en orden descendente (5): (1) agua empleada como ingrediente, (2) ingredientes farmacéuticos, (3) equipo de procesamiento, (4) personal de fabricación y (5) entorno de fabricación.
1450 (1115) Control de Biocarga / Información General
USP 39
Influencias Microbianas sobre Productos No Estériles
Condiciones de _ _ __,.. Almacenamiento Prácticas y Capacitación - - - - - i i . del Personal
Manteni~iento yllmp1eza del Equipo
~/
~
Procesos de Fabricación y Llenado
- - - - - Validación
Productos
Flujo de ..,_ _ _ _ Productos y Materiales
t
Ingredientes Farmacéuticos Activos
Figura 1. Factores que contribuyen a la biocarga en productos no estériles.
Sistemas de Agua y su Uso El agua usada en la fabricación de ingredientes activos, en la formulación, en la limpieza y en el mantenimiento de las instalaciones es el elemento de riesgo singular más importante que contribuye a la contaminación de productos no estériles. La calidad o el tipo de agua usada para la formulación de productos no estériles y para el enjuague final del equipo limpio deben seleccionarse basándose en los riesgos para el producto. Las aguas purificadas usadas en la fabricación farmacéutica son desionizadas y, por ende, no contienen cloro para controlar el crecimiento microbiano. Las poblaciones importantes de bacterias Gram negativas con forma de varilla y algunos hongos filamentosos pueden crecer en dicha agua purificada sin cloro, especialmente en tanques de almacenamiento a temperaturas ambiente o cercanas a ambiente. El agua estancada debe drenarse o eliminarse físicamente a la mayor brevedad posible y de manera eficiente de los contenedores y equipos de producción, así como de las superficies y pisos de trabajo. El agua potable dorada (agua que se usa en las ciudades) puede ser apropiada para cierto tipo de actividades de limpieza, mantenimiento de las instalaciones y sanitización. La calidad del agua para aplicaciones de procesamiento debe determinarse para cada caso. El capítulo Agua para Usos Farmacéuticos (1231) provee pautas adicionales para el diseño y la operación de sistemas de aguas. Las aguas para procesamiento usadas en la fabricación de excipientes y, en algunos casos, ingredientes activos para productos no estériles representan un riesgo importante para la colonización y proliferación microbiana, particularmente en ingredientes de origen natural que se han sometido a un procesamiento mínimo para reducir la biocarga o para controlar la proliferación microbiana. El equipo de formulación y de fabricación puede ser una fuente de contaminación, y los riesgos se incrementan cuando se utiliza agua e ingredientes que son susceptibles a la supervivencia o crecimiento de microorganismos. Por lo tanto, la limpieza, el secado y, cuando resulte apropiado, la sanitización del equipo de fabricación pueden ser beneficiosos, pero los residuos de desinfectantes deben limitarse en el ambiente operativo y se deben eliminar de las superficies que están en contacto con el producto. El aislamiento de organismos transmitidos a través del agua, en particular de los bacilos Gram negativos, es un indicador probable de la eliminación inadecuada de agua estancada en equipos y superficies ambientales.
Ingredientes Farmacéuticos Activos, Materiales durante el Proceso y Excipientes Los ingredientes y excipientes usados en los procesos de fabricación de productos no estériles son fuentes importantes de contaminación microbiana. La evaluación de proveedores, las especificaciones, el análisis, la selección de empaques y envases, el transporte, las condiciones de almacenamiento, las fechas de caducidad y la evaluación de la probable contaminación o riesgo de la proliferación son todos críticos para la reducción de riesgos microbianos relacionados con estos materiales. Se consideran especialmente críticos los materiales sin procesar de origen natural, aquéllos con alta actividad de agua (ver Determinación de Actividad de Agua en Productos Farmacéuticos No Estériles (1112) para información adicional), los procesos sintéticos con etapas de aislamiento acuoso o procesamiento abierto y los procesos biológicos con limitada purificación posterior o que carecen de etapas de eliminación microbiana definidas. Se deben establecer puntos de monitoreo de la biocarga durante el proceso en momentos inmediatamente anteriores o inmediatamente posteriores a un proceso de reducción potencial de la biocarga (tal como una extracción con disolvente orgánico, calentamiento, un gran cambio en el pH) y/o inmediatamente antes del
USP 39
Información General/ (1115) Control de Biocarga 1451
llenado final según lo determinado en el análisis de riesgos realizado conforme a lo sugerido en la sección Consideraciones sobre el Control Microbiano durante el Desarrollo del Producto. Los fabricantes deben muestrear los materiales entrantes y deben asegurar condiciones adecuadas de control de la contaminación para las etapas de pesaje y adición de materiales al equipo de procesamiento. Todos los equipos de muestreo y pesaje deben limpiarse, sanitizarse, almacenarse e identificarse apropiadamente. Las actividades y los controles relacionados que se implementen para prevenir la colonización y la proliferación microbianas deben basarse en una estrategia documentada y prospectiva de evaluación de riesgos y control de contaminación. Los ingredientes farmacéuticos que presentan una calidad microbiana consistentemente adecuada constituyen un elemento importante del programa de control microbiológico para productos no estériles. El aprovisionamiento de ingredientes con una calidad microbiológica apropiada requiere la identificación de proveedores con capacidad demostrada para producir fármacos o excipientes de calidad adecuada. Se pueden realizar periódicamente evaluaciones en forma de encuesta a los proveedores para establecer que éstos cuentan con un programa de control microbiológico bien diseñado y mantenido para sus instalaciones de fabricación y de envasado primario. Los materiales con baja actividad de agua, que tienen un pH alto o bajo, que no son de origen natural, que son antimicrobianos por naturaleza o que contienen un conservante antimicrobiano, por lo general se encuentran fuera de riesgo de proliferación microbiana. Las evaluaciones de riesgo deben considerar las características de los ingredientes con respecto a la supervivencia microbiana, al soporte del crecimiento microbiano o al evidente antagonismo a la supervivencia microbiana. La introducción de humedad en los materiales almacenados incrementa de manera notoria el riesgo de contaminación microbiana. La condensación en la cámara gaseosa del tanque de almacenamiento o en los envases impermeables de almacenamiento puede resultar en contaminación de los materiales con organismos u hongos que crecen debido al agua incluso cuando se espera que el producto que se está almacenando elimine la posibilidad de colonización o proliferación microbiana. El examen microbiano de ingredientes farmacéuticos (ver los capítulos (61 ), (62) y (1111 )) pueden proveer información importante sobre la calidad microbiológica de los fármacos y excipientes. Los envases primarios e intermedios (p.ej., recubrimiento interno de tambores, bolsas de plástico, entre otros) pueden ser una fuente de contaminación microbiana, por lo que los fabricantes deben considerar su calidad inicial, condiciones de almacenamiento, preparación y procedimientos de manejo.
CONTROL MICROBIANO EN LA FABRICACIÓN DE FÁRMACOS Los enfoques para el control microbiano descritos en este capítulo se pueden aplicar con mínimas modificaciones a los fármacos fabricados mediante procesos biológicos o síntesis orgánica. Los procesos en síntesis orgánica a menudo usan extremos de temperatura, presión, pH y otras condiciones que inhiben o destruyen microorganismos de manera activa. Cuando el proceso químico de fabricación de un fármaco es complejo, las etapas finales a menudo tienen el mayor efecto potencial sobre la biocarga. Tal como en el caso de la fabricación de un medicamento, el agua usada en el proceso presenta el desafío más grande para el control microbiano. Los tipos de agua usados en estos procesos varían. Por lo general, se usa agua potable en el procesamiento y limpieza en etapas tempranas, mientras que el Agua Purificada y el Agua para Inyección se usan a menudo en las etapas posteriores de procesamiento y limpieza. El uso de Agua para Inyección a menudo se restringe a las etapas finales de fabricación de fármacos químicos o biológicos a granel que en última instancia se usarán en la formulación de productos estériles. Estos procesos frecuentemente se realizan casi en su totalidad dentro de recipientes cerrados, lo cual minimiza las consideraciones externas para las instalaciones. Ciertos equipos de proceso son adecuados para las operaciones de limpieza in situ que emplean agentes que no solo son limpiadores efectivos sino que también, en algunos casos, inhiben el crecimiento y la proliferación microbiana. Los materiales usados en la fabricación de fármacos incluyen sustancias naturales, compuestos orgánicos de diversos tipos, sales inorgánicas, ácidos, bases y disolventes orgánicos, y el potencial de contaminación microbiana derivada de estos materiales varía claramente. Las intervenciones del personal en estos procesos se ven limitadas por el carácter del equipo y las consideraciones sobre seguridad del trabajador; por otra parte, en el procesamiento de productos biológicos y en algunas etapas tardías de la síntesis orgánica, los entornos de fabricación pueden estar clasificados (p.ej., ISO 7 e ISO 8). Limitar la participación de personal y el uso de ambientes controlados reducen las oportunidades de contaminación microbiológica.
Diseño y Uso del Equipo Cuando sea posible, las especificaciones para la selección del equipo que se usará en la fabricación de productos no estériles deberá incluir un diseño sanitario. El equipo y los accesorios deben poder limpiarse de modo que los contaminantes y los productos residuales se puedan eliminar de manera confiable. El equipo debe usar accesorios sanitarios y su diseño debe permitir el fácil uso de agentes de limpieza y sanitización, y el drenado completo del agua que se usa para enjuagar. El agua residual en tanques, sistemas de tuberías o en las superficies de equipos introduce el riesgo de colonización por organismos que se transmiten a través del agua. El equipo de fabricación que no se pueda limpiar in situ debe ser de fácil acceso para la limpieza manual, y las partes que deban limpiarse fuera del sitio no solo deberán ser de fácil acceso sino también fáciles de retirar. Otro aspecto adicional a tomar en cuenta es la compatibilidad del equipo con la variedad común de desinfectantes, incluyendo esporicidas, que se usan en los procedimientos de limpieza para sanitizar el equipo.
USP 39
1452 (1115) Control de Biocarga / Información General
El material preferido para la construcción de equipos y utensilios que estarán en contacto con el producto es acero inoxidable austenítico. Los fabricantes deben considerar el acabado de las superficies de los materiales que entran en contacto con el producto, para los cuales una rugosidad promedio (RA, por sus siglas en inglés) de 15-20 µm es razonablemente aceptable. Las superficies del equipo general y las superficies de la maquinaria no deben pulirse más allá de los valores de rugosidad promedio antes mencionados. Los demás materiales de construcción deben ser no porosos, lisos y compatibles con los productos y materiales de limpieza. Los sistemas de tuberías también deben seguir los principios de diseño higiénico y deben estar inclinados para facilitar el drenado, y el equipo debe contar con juntas de ajuste para evitar la acumulación de materiales y facilitar la limpieza. Las Normas Sanitarias 3A (3A Sanitary Standards, ver www.3-A.org) proveen pautas que por lo general son útiles para la disposición y diseño del proceso y para la selección de maquinaria. Se deben detallar los procedimientos de limpieza del equipo y se debe asegurar que el equipo esté completamente seco después de la limpieza y que se almacene de manera tal que se prevenga la proliferación de microorganismos. Los fabricantes deben implementar procedimientos para proteger el equipo y los accesorios limpios antes de su siguiente uso. La validación del proceso de limpieza y sanitización debe incluir la evaluación de contenido microbiano después de la sanitización y antes de su uso. El diseño adecuado de la protección del almacenamiento debe mitigar la posibilidad de crecimiento microbiano antes de usar el equipo, de modo que no debería ser necesario el monitoreo continuo del equipo y de los accesorios después de validar las condiciones adecuadas de almacenamiento. El muestreo microbiano en superficies, inmediatamente después de la limpieza o inmediatamente antes de su uso, debe realizarse con precaución; los residuos de medios y la humedad residual deben eliminarse cuidadosamente cuando se realice el muestreo. Los fabricantes deben evaluar si los productos que se fabrican usando una pieza del equipo de procesamiento puede, en algunas circunstancias del procesamiento, promover el crecimiento de microorganismos. Esta evaluación es necesaria para establecer de manera apropiada los tiempos de espera y para definir las condiciones de uso del equipo después de la limpieza. No es necesario el uso de agentes de sanitización en las superficies de contacto con el producto cuando los procedimientos de limpieza que eliminan residuos químicos también eliminan microorganismos. Asimismo, existe un riesgo de contaminación del producto con agentes de sanitización. Con un procedimiento de limpieza validado, la ausencia de residuos químicos y de agua estancada visible puede garantizar la limpieza del equipo sin desinfección química de rutina y también puede obviar la necesidad de monitoreo microbiológico del equipo.
Personal Además de cuidar su higiene personal, los operadores deben estar capacitados y usar vestimentas adecuadas para la función que desempeñan (Tabla 7). Tabla 1. Vestimenta en Áreas de Fabricación Ropa Protectora
Operadores en Áreas de Formulación y Envasado Primario
Uniforme de planta o uniforme de planta con overol para productos y ambientes de alto riesgo
Sí
Cubrecabello/cubrebarba
Sí
Gafas de seguridad
Sí
Zapatos especiales o cubiertas para zapatos
Sí
Guantes
Sí (si se está en contacto directo con el producto)
Mascarillas
Sí (si se está en contacto directo con el producto)
Ambiente de la Fabricación Tal como se mencionó, los riesgos y controles ambientales para productos no estériles son diferentes de los de aquellos productos estériles fabricados asépticamente. A diferencia del procesamiento aséptico, cuyos requisitos para las instalaciones son generalmente uniformes en términos de especificación y desempeño, los ambientes de la fabricación de productos no estériles a menudo involucran diversos productos y requisitos de control de la contaminación microbiana. En general, los productos líquidos, en cremas o ungüentos requieren un mayor nivel de mitigación de riesgos de contaminación que las formas farmacéuticas sólidas. Los elementos comunes de diseño de control microbiano pueden incluir lo siguiente: • Las paredes, los cielos rasos y los pisos se construyen con materiales no porosos que se pueden limpiar con facilidad y que son resistentes a los agentes de limpieza y desinfectantes. • Los drenajes en el suelo se permiten en áreas de fabricación de productos no estériles siempre que se puedan cerrar durante el procesamiento o que cuenten con un interruptor de aire adecuado si se abren durante la limpieza del área y del equipo. • El acceso debe limitarse al personal necesario. • Los flujos de materiales, equipos y personal deben evitar la contaminación.
USP 39
Información General/ (1115) Control de Biocarga 1453
• La ventilación y la filtración del aire deben ser adecuadas para mantener la limpieza, la presurización del espacio (cuando sea necesario), la temperatura y la humedad relativa especificadas. • Se deben aplicar buenas prácticas de limpieza y de higiene general en todo momento. • Asimismo, se debe conocer en todo momento el estado de la limpieza y del uso de todas las herramientas y accesorios usados para la producción y de todo el equipo de procesamiento. • Los sistemas de tuberías que están en contacto con el producto o de abastecimiento de agua, las válvulas y las juntas deben limpiarse y sanitizarse de acuerdo con un programa definido, almacenarse secos y etiquetarse indicando su estado. • Los fabricantes deben implementar un programa formal de limpieza y sanitización para las áreas operativas, corredores, almacenamiento de equipo, almacenamiento temporal de materiales y otras áreas comunes. No se requieren entornos clasificados para la fabricación de productos no estériles, p.ej., aquéllos especificados en la norma ISO 14644-1 ( 6). La Guía Marco Nº 2 de la ISPE, Formas Farmacéuticas Orales Sólidas (7) provee las características mínimas de diseño aceptables para instalaciones para la fabricación de productos no estériles.
EVALUACIÓN MICROBIANA DE AMBIENTES DE FABRICACIÓN DE PRODUCTOS NO ESTÉRILES Tal como se describió con anterioridad, el monitoreo microbiológico del ambiente de fabricación puede servir como un auxiliar de control y por lo general es una herramienta de evaluación cualitativa de un programa formal de control microbiológico basado en riesgos adecuadamente implementado. Un programa de monitoreo apropiado para el riesgo de biocarga del producto puede ayudar a confirmar la efectividad de controles microbiológicos y puede facilitar la detección temprana de problemas potenciales. Se pueden usar métodos y prácticas microbiológicas para instalaciones asépticas, pero las tasas de recuperación de contaminación definidas en el capítulo Control y Monitoreo Microbiológico de Entornos de Procesamiento Aséptico (1116) no están destinadas para ambientes no estériles. Los ambientes clasificados de la misma clase no necesariamente cuentan con capacidades de control microbiológico similares. Debido a que la mayoría de los organismos recuperados en el monitoreo del ambiente son de origen humano, los niveles de contaminación temporal recuperada dependen en gran parte del nivel de actividad humana y de los requisitos de vestimenta. Los requisitos de vestimenta no son tan extensos para la fabricación de productos no estériles como para el procesamiento aséptico y, por ende, en los entornos no estériles, los fabricantes pueden monitorear la biocarga con menor frecuencia y con expectativas de mayor recuperación de biocarga. Las evaluaciones periódicas de la higiene de la planta de producción pueden ofrecer información útil sobre la efectividad de los controles de limpieza y ambientales de las instalaciones. Durante la fabricación de productos no estériles, el monitoreo microbiológico no necesita ser tan riguroso como el requerido durante el procesamiento aséptico. De manera similar, durante la fabricación de productos no estériles, la mitigación de riesgos microbianos es diferente a la de los productos estériles. En productos no estériles, los fabricantes pueden esperar biocarga microbiana intrínseca que, cuando se controla adecuadamente, no resulta en un riesgo para el usuario final. Los fabricantes deben establecer niveles aceptables de microorganismos dentro de cada producto (3) y deben contar con una identificación · suficiente de microorganismos para lograr una comprensión adecuada de los patrones de biocarga y de la variabilidad estacional.
Muestreo Microbiano Durante la fabricación de productos no estériles, los métodos de muestreo del aire usados para el monitoreo del ambiente son activos o pasivos. Los dispositivos activos muestrean volúmenes de aire apropiados y depositan organismos viables en placas o tiras de medios sólidos. Los resultados por lo regular se expresan como unidades formadoras de colonias por unidad de volumen, aunque se pueden usar métodos alternativos en lugar de la recuperación y del crecimiento en medios. El muestreo pasivo en forma de acomodo de placas se puede usar en lugar de los muestreadores de aire activos. Por lo regular no se requiere monitorear al personal en la fabricación de productos no estériles excepto cuando se emplean materiales para vestimenta casi aséptica. Los sitios de muestreo deben seleccionarse basándose en una evaluación de riesgos seguida por una medición de la higiene general del ambiente. Las áreas muy transitadas donde los materiales son transferidos dentro y fuera de las mismas pueden ser especialmente susceptibles a la contaminación microbiana pasajera. El monitoreo microbiológico no es necesario en áreas que estén más allá del punto en el que el producto se coloca en los envases primarios. Los métodos microbiológicos alternativos basados en cero crecimiento se pueden sustituir por los métodos basados en crecimiento a discreción del usuario. Debido a que no existen métodos de muestreo del entorno estandarizados y debido a que el monitoreo tiene como propósito la evaluación cualitativa de la higiene general de las instalaciones, no existe necesidad de estudios comparativos entre métodos basados en crecimiento y basados en cero crecimiento. Un pequeño número de muestras paralelas es suficiente para establecer un línea base comparativa para un ambiente. La frecuencia del monitoreo debe reflejar el riesgo potencial relacionado con la forma farmacéutica (ver Introducción). Asimismo, algunos productos pueden tener una actividad antimicrobiana innata debido a sus atributos tales como baja actividad de agua o inclusión de un conservante antimicrobiano o un ingrediente activo que por sí mismo es un agente antimicrobiano, p.ej., un antibiótico o agente antitumoral. Los productos que son resistentes a la colonización microbiana o que tienen características microbiocidas o microbioestáticas requieren de monitoreo limitado o no lo requieren.
1454 (1115) Control de Biocarga / Información General
USP 39
En general, los ambientes para la fabricación de tabletas y cápsulas rellenas con polvos y líquidos no deberían requerir de monitoreo o tan solo un monitoreo poco frecuente. Los programas de monitoreo deben basarse en riesgos y la frecuencia y el número de los sitios de muestreo debe reflejar el nivel de riesgo. Las áreas de fabricación para formas farmacéuticas con un riesgo más alto, tales como productos para inhalación, requieren un monitoreo más frecuente y, por lo general, se fabrican en cuartos clasificados con una calidad de aire particular, por ejemplo, ISO 8. Para la mayoría de los ambientes de fabricación de productos no estériles, debido a sus controles ambientales limitados y al riesgo comparativamente bajo de los productos, podría no ser necesario establecer niveles de alerta y acción. El monitoreo del entorno se considera una forma de evaluación informativa sobre las condiciones generales de higiene del entorno y no debe usarse para tomar decisiones sobre la liberación de productos. No es necesario el monitoreo de ambientes no clasificados. El capítulo de información general Caracterización Microbiana, Identificación y Tipificación de Cepas (111 3) contiene información general sobre la caracterización microbiana. En la mayoría de las evaluaciones de higiene no estériles, resultan suficientes la caracterización de los microorganismos, la morfología celular, la reacción Gram y los análisis de diagnóstico simples.
Medidas Activas para el Control Microbiano Además de las consideraciones del diseño de instalaciones y procesos, y de la limpieza del equipo y los controles de almacenamiento, existen casos en los que se requieren medios activos para abordar los riesgos de contaminación. El control microbiológico de productos no estériles se puede mejorar mediante la adopción de procesos de control directo de contaminación tales como los siguientes: • descontaminación de superficies de contacto de productos, materiales y envases, por lo general mediante tratamiento con calor (para las aplicaciones más críticas, se puede usar esterilización) •tratamientos químicos o físicos de reducción de biocarga (p.ej., calor seco o húmedo) para materias primas e ingredientes activos • uso de sistemas cerrados, limpios o descontaminados para el manejo y transferencia de materiales • uso de componentes y accesorios desechables • materiales de vestimenta mejorados para el personal operativo • uso de entornos clasificados en operaciones de alto riesgo Estas medidas se pueden aplicar conforme se requieran para mejorar el control de la contaminación microbiana durante la fabricación de productos no estériles.
GESTIÓN GENERAL DE UN PROGRAMA DE CONTROL MICROBIOLÓGICO La gestión de un programa exitoso de control microbiológico incluye lo siguiente: identificación de proveedores adecuados de ingredientes y excipientes farmacéuticos con buena calidad microbiológica; realizar una evaluación de riesgo microbiológico del proceso de fabricación y sistema de envasado; y el establecimiento de un sistema de monitoreo y control apropiado. Aunque la contaminación del entorno no es de ninguna manera la causa más significativa del retiro de productos no estériles del mercado o de eventos de contaminación, el monitoreo del entorno puede ser un programa auxiliar al programa de control microbiológico. El monitoreo microbiológico es una evaluación y no constituye por sí misma una actividad de control de la contaminación. No existen estudios controlados con bases científicas que demuestren el vínculo, si lo hubiere, entre los resultados del monitoreo de aire y superficies, y la seguridad microbiológica del producto final. El programa de control de contaminación microbiológica debe desarrollarse para identificar y controlar los riesgos para el producto, basándose en una evaluación formal de modalidades de riesgo. El análisis de riesgos debe resultar en la identificación de puntos de control críticos y debe facilitar la selección adecuada del equipo, la estructuración y diseño del proceso y los requisitos de diseño de las instalaciones. Los factores críticos para la prevención de contaminación microbiana durante la fabricación de productos no estériles son el control de la calidad microbiológica de los ingredientes y del agua, junto con el desarrollo de procedimientos adecuados de limpieza y sanitización. El monitoreo microbiológico no mitiga los riesgos, pero puede servir como herramienta de vigilancia. Ningún programa de monitoreo puede proveer garantías sobre el control de la contaminación de manera tan efectiva como las medidas preventivas estrictas y proactivas. El control uniforme de contaminación se puede lograr principalmente mediante una evaluación general del proceso que abarque cada uno de los elementos de control descritos anteriormente mediante la evaluación de riesgos. La evaluación de riesgos se puede unir a estudios de evaluación activos para asegurar que se cuente con las medidas apropiadas para prevenir condiciones que conduzcan a la contaminación.
REFERENCIAS 1. Faust K, Sathirapongsasuti JF, lzard J, et al. (2012) Microbial co-occurrence relationships in the human microbiome. PLoS Comput Biol. 2012;8(7):el 002606. 2. Cundell AM. Risk based approach to pharmaceutical microbiology. En: Miller MJ, ed. Encyclopedia of Rapid Microbiology Methods. River Grave, IL: Davis Healthcare lnternational Publishing: 2005. 3. Título 21 del CFR 211. Good Manufacturing Practice far Finished Pharmaceuticals.
USP 39
Información General/ (1116) Ambientes de Procesamiento Aséptico 1455
4. FDA. Hazard analysis and control point principies and application guidelines. 1997. http://www.fda.gov/Food/GuidanceRegulation/HACCP/ucm2006801.htm. Consultado el 07 de febrero de 2013. 5. Anderson AS, Bassett G, Burke MT, et al. Microbiological monitoring of environmental conditions for nonsterile pharmaceutical manufacturing. Pharm Technol. 1997;21 (3):58-74. http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/ Guidelines/Quality/Q9/Step4/Q9_Guideline.pdf. Consultado el 07 de febrero de 2013. 6. ISO. 14644-1 :1999. Cleanrooms and associated controlled environments-part 1: classification of air cleanliness. 1999. http://www.iso.org/iso/catalogue_detail.htm?csnumber=25052. Consultado el 07 de febrero de 2013. 7. ISPE. Baseline guide volume 2: oral solid dosage forms. 2009. http://www.ispe.org/baseline-guides/oral-solid-dosage. Consultado el 07 de febrero de 2013.
(1116) CONTROL MICROBIOLÓGICO Y MONITOREO DE AMBIENTES DE PROCESAMIENTO ASÉPTICO Los ambientes microbiológicamente controlados se usan para diversos propósitos dentro de la industria de los cuidados de la salud. Este capítulo de información general proporciona información y recomendaciones para ambientes en los que el riesgo de contaminación microbiana se controla mediante procesamiento aséptico. Los productos fabricados en tales ambientes incluyen productos farmacéuticos estériles, fármacos estériles a granel, productos intermedios estériles, excipientes y, en ciertos casos, dispositivos médicos. Los ambientes de procesamiento aséptico son mucho más críticos en lo que respecta a riesgos para el paciente que los ambientes controlados que se usan para otras operaciones de fabricación-por ejemplo, preparación de equipos y componentes, control de biocarga limitada en productos no estériles y procesamiento de productos con esterilización terminal. En este capítulo, el tipo de procesamiento aséptico se diferencia por la presencia o ausencia de operadores humanos. Un proceso aséptico avanzado es aquel en el que no se requiere ni se permite en todo momento la intervención directa con envases de producto abiertos o superficies de contacto expuestas del producto por parte de operadores que utilizan vestimentas convencionales para cuartos limpios. [NOTA-En la parte final de este capítulo, se proporciona un Glosario que incluye una descripción de los términos usados.] Los lineamientos provistos en este capítulo, así como los parámetros de monitoreo citados para evaluación microbiológica deben aplicarse únicamente a cuartos limpios, sistemas de barrera con acceso restringido (RABS, por sus siglas en inglés) y aisladores usados para procesamiento aséptico. Los ambientes clase ISO que se usan para otros propósitos no están sujetos a cumplir con los niveles de control de contaminación requeridos para productos estériles producidos asépticamente. Los ambientes usados para aplicaciones no estériles requieren estrategias de control microbiano diferentes. Una gran parte de los productos que se declaran estériles son fabricados mediante procesamiento aséptico, más que por esterilización terminal. Debido a que el procesamiento aséptico se basa en excluir microorganismos del flujo de proceso y en evitar que los microorganismos ingresen en los envases abiertos durante el procesamiento, la biocarga del producto, así como la biocarga del ambiente de fabricación son factores importantes que rigen el riesgo de contaminación microbiana inaceptable. Los términos aséptico y estéril no son sinónimos. Estéril se refiere a una ausencia total de microorganismos viables u organismos con potencial de reproducción. En el sentido microbiológico puro, un proceso aséptico es aquel que previene la contaminación mediante la exclusión de microorganismos. En la fabricación aséptica actual de productos para el cuidado de la salud, aséptico describe el proceso de manipulación de materiales estériles en un ambiente controlado, diseñado para mantener la contaminación microbiana a niveles que se ha demostrado representan un riesgo mínimo. La contaminación microbiana a cierto nivel es inevitable en cualquier ambiente en que participen operadores humanos. Ni siquiera los diseños y operaciones más cuidadosos de cuartos limpios son capaces de eliminar el desprendimiento de microorganismos ante la presencia de operadores humanos. Por consiguiente, resulta técnicamente imposible y poco realista esperar una contaminación nula (cero) en todas las instalaciones durante las operaciones de procesamiento aséptico. No existen medios para demostrar la esterilidad de un ambiente de procesamiento aséptico ni de las superficies de contacto con el producto dentro de dicho ambiente. El monitoreo de instalaciones deberá basarse en una evaluación de riesgos. Aunque los fabricantes deben revisar con frecuencia los resultados del monitoreo ambiental para asegurar que la instalación opera en un estado de control validado, dichos resultados de monitoreo no pueden probar ni refutar la esterilidad. Debido a las limitaciones del monitoreo, los fabricantes no pueden basarse únicamente en monitoreo, estadísticas, ni en simulaciones periódicas de procesamiento aséptico para asegurar un nivel de garantía de esterilidad. Por lo general, el monitoreo ambiental es realizado por el personal, por lo que requiere la intervención de un operador. En consecuencia, el monitoreo ambiental puede incrementar el riesgo de contaminación y también proporcionar resultados falsos positivos. Por consiguiente, el monitoreo intensivo no ofrece garantías, particularmente en los ambientes ISO 5 que se usan en las zonas más críticas del procesamiento aséptico. Existen diversos métodos de muestreo para evaluar y controlar la situación microbiológica de los ambientes controlados para procesamiento aséptico. En la actualidad, casi todos estos métodos se basan en el crecimiento y la recuperación de microorganismos, muchos de los cuales pueden estar dañados debido al estrés ambiental, por lo que pueden ser difíciles de recuperar. Los valores numéricos para monitoreo del aire, superficies y personal incluidos en este capítulo no pretenden representar lími-
1456 (1116) Ambientes de Procesamiento Aséptico / Información General
USP 39
tes o especificaciones, sino que se proporcionan estrictamente con fines informativos. Debido a la diversidad de equipos y métodos de muestreo microbiológico, no es razonable, desde el punto de vista científico, sugerir que la consecución de dichos valores garantiza un control microbiano o que las variaciones que superen los valores presentados en este capítulo indican una pérdida de control. La evaluación de riesgos asociada con los ambientes de fabricación se debe llevar a cabo durante un periodo significativo y, en cada caso, la métrica de la tasa de recuperación de contaminación deberá establecerse basándose en una revisión de los hallazgos reales dentro de la instalación. El objetivo de cada usuario debe basarse en el uso de las tasas de recuperación de contaminación para rastrear el desempeño actual y perfeccionar el programa de control microbiológico para promover mejoras. Una vez que se logran condiciones operativas óptimas dentro de una instalación, los niveles de las tasas de recuperación de contaminación a menudo se vuelven relativamente estables dentro de un intervalo normal de variabilidad. No existen métodos estándares para el muestreo del aire y la literatura disponible indica que los métodos de muestreo del aire son muy variables. Resulta incorrecto asumir que volúmenes de muestra similares, tomados por métodos diferentes, producirán tasas de recuperación similares. Son muchos los factores que pueden afectar la recuperación y la supervivencia de microorganismos; asimismo, es posible que los diferentes proveedores de muestreadores de aire hayan diseñado sus sistemas para cumplir con requisitos distintos. Además, la variación entre muestras durante el muestreo microbiológico puede ser de consideración. Los datos relacionados con la exactitud, precisión, sensibilidad y límites de detección de los métodos de monitoreo usados en el procesamiento aséptico de productos para el cuidado de la salud son limitados. Los métodos de muestreo de superficies tampoco han sido estandarizados. Los medios empleados varían y, para el caso de los hisopos, cabe la posibilidad de que los métodos de hisopado húmedo y seco y de las placas de contacto produzcan resultados distintos. Se podría esperar que las placas de contacto de muestras repetidas produzcan resultados similares en condiciones idénticas, pero se ha informado que las tasas de recuperación son menores de lo esperado y muy variables. En general, se ha determinado que el monitoreo de superficies recupera <50%, incluso cuando se usa con niveles de inóculo relativamente altos en cupones estandarizados. En los ambientes de producción reales donde los organismos son sometidos a varios grados de estrés, las tasas de recuperación pueden ser menores.
TECNOLOGÍAS ASÉPTICAS AVANZADAS Las tecnologías asépticas avanzadas se pueden definir como aquellas que no dependen de la intervención directa de operadores humanos durante el procesamiento. En la actualidad, las tecnologías tales como aisladores, unidades de soplado/llenado/sellado y RABS cerrados (diseños que nunca se abren durante la instalación u operación) se pueden considerar tecnologías asépticas avanzadas, siempre que se inhabilite la intervención directa de personal durante el procesamiento. En años recientes, la tecnología de los aisladores ha sido ampliamente aceptada en la fabricación de productos para el cuidado de la salud. Los aisladores y RABS cerrados separan de manera efectiva al operador del ambiente de procesamiento aséptico crítico. Debido a que estos sistemas reducen significativamente los riesgos de contaminación, sus niveles de control microbiológicos son mayores que los de los cuartos limpios convencionales que cuentan con un nivel comparable de clasificación de partículas del aire, por ejemplo, ISO 5.
CLASIFICACIÓN DE CUARTOS LIMPIOS PARA AMBIENTES DE PROCESAMIENTO ASÉPTICO La serie ISO 14644 abarca el diseño y la construcción de cuartos limpios y ambientes controlados. Esta norma define el desempeño de un ambiente limpio con respecto a la concentración de partículas totales por unidad de volumen. La norma ISO 14644-1 estipula los recuentos totales de partículas permitidos para que el ambiente limpio cumpla con las clasificaciones definidas de calidad del aire. El lector debe referirse a dicha norma en relación con las características de diseño y la certificación de ambientes limpios. La contaminación por partículas no viables en inyectables concierne a los fabricantes farmacéuticos (ver Partículas en Inyectables (788)). A diferencia de la contaminación microbiana, en la que los datos experimentales sugieren que los humanos representan la única fuente significativa, las partículas no viables pueden surgir tanto de humanos como del equipo de procesamiento. Los estudios indican que los humanos con vestimentas liberan partículas y contaminación microbiana a una tasa bastante constante. No obstante, la relación entre contaminación microbiana (viable) y no viable no considera las partículas desprendidas por el equipo de procesamiento. Cuando el equipo es la fuente primaria de partículas, todas las partículas resultantes son, en esencia, no viables. La premisa que establece que al presentarse menos partículas totales en un cuarto limpio será menos probable la presencia de microorganismos transportados por el aire sólo se cumple si los operadores humanos son la única fuente de partículas. Es imposible distinguir con claridad entre la contaminación de fondo total por partículas generadas en mayor medida por operaciones mecánicas y las partículas totales generadas por el personal. En consecuencia, resulta común y adecuado para los programas de monitoreo ambiental de cuartos limpios contar con un componente para partículas totales y con un componente microbiológico. La Tabla 7 describe las clasificaciones de cuartos limpios comúnmente usadas en la industria farmacéutica. Por lo regular, se emplean ambientes limpios ISO 14644-1 Clases 5-8 para el procesamiento aséptico.
USP 39
Información General/ (1116) Ambientes de Procesamiento Aséptico 1457
Tabla 1. Clases de Limpieza del Aire con respecto a Partículas Totalesª Partículas ~0,5 µm/m3 Clase ISOb ISO 5
3520
1506
35 200
ISO 7
352 000
ISO 8
3520000
ª
Tomada de la Norma Internacional ISO 14644 Parte 1, publicada por la lnternational Organization for Standardization (Organización Internacional para la Normalización), mayo de 1999. b las cuatro clases ISO 14644-1 corresponden estrechamente a las antiguas clasificaciones de la Norma Federal de los EE.UU. 209E. las relaciones son: ISO 5/ Clase 100, ISO 6/Clase 1000, ISO 7/Clase 1 O000 e ISO 8/Clase 100 000.
Los aisladores y RABS cerrados presentan un panorama distinto, debido a que el personal queda excluido del ambiente de procesamiento aséptico y las manipulaciones se llevan a cabo usando ensambles de guantes y mangas, así como medios trajes fabricados con plástico grueso y flexible (como por ejemplo, cloruro de polivinilo o caucho sintético). El personal tiene menos efectos sobre la calidad microbiana del ambiente dentro de un aislador que en ambientes de cuartos limpios. Algunos usuarios han optado por operar los RABS de tal manera que permita la intervención humana abierta y directa. En un estado operativo abierto, estos sistemas son más similares en operación a los cuartos limpios convencionales y, por consiguiente, no se pueden considerar sistemas avanzados de procesamiento aséptico. En un RABS abierto, la capacidad de los operadores para afectar de forma negativa el riesgo de contaminación microbiana es mayor que en los aisladores o RABS cerrados. Las especificaciones para cambios de aire por hora y las velocidades del aire no están comprendidas en la norma ISO 14644, ni tampoco se incluían en la Norma Federal 209E. Por lo general, los cuartos ISO Clase 8/Clase 100 000 están diseñados para proporcionar un mínimo de 20 cambios de aire por hora; los cuartos ISO Clase 7/Clase 1O000 están diseñados para proporcionar más de 50 cambios de aire por hora; y los cuartos limpios ISO Clase 5/Clase 100 proporcionan más de 100 cambios de aire por hora. Los criterios para el diseño de algunas instalaciones puede diferir. Es posible que, mediante la dilución y eliminación de contaminantes, grandes volúmenes de aire puedan reducir la contaminación transmitida por el aire en la producción aséptica. Las condiciones óptimas varían considerablemente, dependiendo de las características del proceso, particularmente de la cantidad de contaminación derivada del personal. Estas especificaciones deben usarse únicamente como guía en el diseño y operación de cuartos limpios, debido a que no se han establecido satisfactoriamente, desde el punto de vista experimental, correlaciones precisas entre cambios de aire por hora, velocidad del aire y control microbiano. Los fabricantes deben mantener un flujo de aire predominantemente unidireccional (vertical u horizontal) en un ambiente de cuarto limpio Clase 5 con personal, especialmente cuando los productos y envases de productos y cierres se encuentran expuestos. En lo que respecta a la evaluación del movimiento del aire dentro de un cuarto limpio, estudiar el flujo del aire visualmente usando estudios con humo y otros medios adecuados es, probablemente, más útil que emplear medidas absolutas de velocidad de flujo de aire y tasas de cambio. Los modelos de evaluación de riesgos son otra forma útil de reducir el riesgo de contaminación y, por tanto, deberían considerarse. La velocidad y las tasas de cambio del aire son mucho menos importantes en aisladores o RABS cerrados que en los cuartos limpios, debido a que el personal está separado de manera más cuidadosa del producto, de los envases del producto y de los cierres. Se ha demostrado que las velocidades de aire significativamente menores que las usadas en los cuartos limpios de escala humana son adecuadas para los sistemas aisladores y pueden ser apropiadas también para los RABS. En las zonas dentro de los aisladores donde las partículas representan un riesgo para la calidad del producto, se puede mantener un flujo de aire unidireccional predominantemente vertical u horizontal. Se ha demostrado a través de la experiencia que un flujo de aire mezclado o turbulento bien controlado resulta satisfactorio para una gran cantidad de procesos asépticos y para las pruebas de esterilidad dentro de los aisladores (Ver Pruebas de Esterilidad-Validación de Sistemas Aisladores (1208)).
IMPORTANCIA DE UN PROGRAMA DE EVALUACIÓN MICROBIOLÓGICA PARA AMBIENTES CONTROLADOS El monitoreo del recuento total de partículas en ambientes controlados, incluso mediante el uso continuo de instrumentos electrónicos, no provee información acerca del contenido microbiológico del ambiente. La limitación básica de los contadores de partículas es que miden partículas de 0,5 µm o mayores. Si bien los microorganismos transportados por el aire no son células individuales o que flotan libremente, con frecuencia se asocian a partículas de 1O a 20 µm. Los recuentos de partículas así como los recuentos microbianos dentro de ambientes controlados varían según la localización del muestreo y las actividades que se desarrollan durante el muestreo. El monitoreo de microorganismos no viables y partículas en el ambiente es una función de control importante puesto que ambos son necesarios para satisfacer los requisitos farmacopeicos de los productos en relación con Materia extraña y Partículas y Esterilidad en l:M:~lll~~Mldl~~lil!lldUl:f~~ll'itil¡ií:Ril· El monitoreo de partículas totales puede proveer medios más adecuados para evaluar la calidad general del ambiente en aisladores y RABS cerrados que en la mayoría de los cuartos limpios convencionales. La exclusión de alto nivel de contaminación transmitida por humanos provista por un aislador da como resultado un aumento en la proporción de partículas no viables. El recuento total de partículas en un aislador puede generar una indicación inmediata de cambios en el nivel de contami-
1458 (1116) Ambientes de Procesamiento Aséptico/ Información General
USP 39
nación. Los programas de monitoreo microbiológico deben evaluar la efectividad de las prácticas de limpieza y sanitización llevadas a cabo por y aplicadas al personal que pudiera tener algún impacto en la biocarga. Debido a que los aisladores por lo regular se descontaminan usando un sistema automático de generación de vapor o gas, el monitoreo microbiológico es mucho menos importante al momento de establecer la eficiencia de los mismos para eliminar la biocarga. Estos sistemas automáticos de descontaminación se validan de manera directa, usando un desafío con un indicador biológico apropiado, y se controlan mediante parámetros de exposición definidos durante su uso rutinario para asegurar una descontaminación uniforme. El monitoreo microbiológico no puede ni necesita identificar ni cuantificar todos los contaminantes microbianos en estos ambientes controlados. El monitoreo microbiológico de un cuarto limpio es técnicamente un ejercicio semicuantitativo, debido a que es imposible realizar una evaluación verdaderamente cuantitativa del ambiente, dadas las limitaciones del equipo de muestreo. La falta de precisión en los métodos de enumeración y los volúmenes de muestra restringidos que se pueden analizar de manera efectiva sugieren que el monitoreo ambiental es incapaz de proporcionar información cuantitativa directa sobre la garantía de la esterilidad. El analista debe recordar que ningún plan de muestreo microbiológico puede probar la ausencia de contaminación microbiana, incluso si no se recupera contaminación viable. La ausencia de crecimiento en una muestra microbiológica significa únicamente que no se descubrió crecimiento, lo cual no implica que el ambiente esté exento de contaminación. El monitoreo microbiano de rutina debe proveer información suficiente para demostrar que el ambiente de procesamiento aséptico opera en un estado de control adecuado. El valor real de un programa de monitoreo microbiológico se basa en su capacidad para confirmar en todo momento condiciones ambientales uniformes de alta calidad. Los programas de monitoreo pueden detectar cambios en la tasa de recuperación de contaminación que pueden indicar cambios en el estado de control dentro del ambiente. El monitoreo microbiano ambiental y el análisis de datos por parte de personal calificado puede ayudar a asegurar la conservación de un estado de control adecuado. El muestreo ambiental debe llevarse a cabo durante las operaciones normales para recopilar datos significativos relacionados con el proceso. El muestreo microbiano debe realizarse cuando los materiales estén en el área, se estén desarrollando las actividades de procesamiento y una dotación completa de personal esté trabajando dentro del ambiente de procesamiento aséptico. El monitoreo microbiano de cuartos limpios de fabricación, RABS y aisladores debe incluir gases comprimidos, superficies, aire del cuarto o recinto y cualquier otro material y equipo que pudiera representar un riesgo de contaminación. El análisis de tendencias de contaminación en un ambiente aséptico ha sido durante mucho tiempo un componente del programa de control ambiental. En los ambientes de procesamiento aséptico y en particular en los ambientes ISO Clase 5, es poco frecuente observar contaminación. En los recintos de aisladores, la contaminación es todavía menos común debido a la exclusión superior de contaminación transmitida por humanos. Debido a la criticidad de estos ambientes, incluso los cambios menores en las tasas de incidentes de contaminación pueden resultar importantes, por lo que los fabricantes deben revisar de manera frecuente y cuidadosa los datos de monitoreo. En los ambientes menos críticos, la contaminación microbiana puede ser más alta, pero se deben tomar en cuenta, investigar y corregir los cambios en las tasas de recuperación. Las recuperaciones aisladas de microorganismos deben considerarse como un fenómeno normal en cuartos limpios convencionales, y estos incidentes por lo general no requieren acciones correctivas específicas, debido a que se sabe con casi toda certeza que tales investigaciones no podrán ofrecer una causa científicamente verificable. Debido a que el muestreo por sí mismo requiere una intervención aséptica en cuartos limpios convencionales, cualquier evento de contaminación no correlacionado puede ser un falso positivo. Cuando las tasas de recuperación de contaminación superan una norma establecida, se debe llevar a cabo una investigación de procesos y operaciones. Las investigaciones diferirán dependiendo del tipo y procesamiento del producto fabricado en el cuarto limpio, RABS o aislador. La investigación debe incluir una revisión de la documentación de mantenimiento de la zona, de la documentación de sanitización/descontaminación, de la incidencia de eventos no rutinarios, de los parámetros físicos u operativos inherentes, tales como los cambios en la temperatura ambiental y humedad relativa, y la capacitación del personal involucrado. En RABS cerrados y sistemas aisladores, la pérdida de integridad de los guantes o la introducción accidental de material que no ha sido descontaminado se encuentran entre las causas más probables de contaminación microbiana detectable. Después de la investigación, se deben tomar acciones para corregir o eliminar las causas más probables de contaminación. Debido a la relativa poca frecuencia de eventos de contaminación en instalaciones modernas, la investigación a menudo presenta resultados no concluyentes. Las acciones correctivas pueden incluir el reforzamiento de la capacitación del personal para enfatizar el uso adecuado de vestimentas, así como técnicas asépticas y control microbiano del ambiente aceptables. Es posible implementar algunos procesos de muestreo microbiológicos adicionales con mayor frecuencia, aunque esto podría no ser apropiado durante el procesamiento aséptico debido a que el muestreo intrusivo o demasiado intensivo puede representar un mayor riesgo de contaminación. Cuando el control adicional resulta conveniente, éste puede ser más apropiado durante los estudios de simulación de proceso. Las medidas adicionales que se pueden considerar para controlar de mejor manera la contaminación microbiana incluyen sanitización adicional, uso de distintos agentes de sanitización e identificación de contaminantes microbianos y sus posibles fuentes. En todos los ambientes asépticos, convencionales o avanzados, la investigación y la justificación para las acciones seleccionadas como resultado de la investigación deben documentarse de manera cuidadosa e integral.
USP 39
Información General/ (1116) Ambientes de Procesamiento Aséptico 1459
EVALUACIÓN FÍSICA DE LA EFECTIVIDAD DEL CONTROL DE CONTAMINACIÓN Los ambientes limpios deben certificarse de acuerdo con lo descrito en la serie ISO 14644 para que cumplan con sus requisitos de clasificación de diseño. El diseño, construcción y operación de cuartos limpios varían enormemente, por lo que es difícil generalizar los requisitos para parámetros tales como la integridad del filtro, velocidad del aire, patrones del aire, cambios de aire y presión diferencial. En las aplicaciones particularmente críticas, tales como el procesamiento aséptico, puede ser apropiada una metodología estructurada para la evaluación física de riesgos. Un método de este tipo ha sido desarrollado por Ljundqvist y Reinmüller. Este método, conocido como el método L-R, desafía al sistema de ventilación de aire mediante la evaluación del flujo de aire y la capacidad de un ambiente para diluir y eliminar partículas del aire. En el método L-R, un generador de humo permite a los analistas visualizar los movimientos de aire a través de un cuarto limpio o un ambiente controlado, incluyendo vórtices o zonas turbulentas, mientras que el patrón de flujo de aire puede ser ajustado detalladamente para minimizar estos efectos indeseables. Después de la optimización visual del flujo de aire, se generan partículas cerca de la zona crítica y del campo estéril. Esta evaluación se realiza en condiciones simuladas de producción, pero con los equipos y el personal en su lugar de trabajo. Este tipo de prueba también se puede usar para evaluar la habilidad de los RABS y sistemas de aisladores para resistir los efectos de la contaminación, en particular alrededor de los puertos de salida del producto en estos sistemas. La evaluación visual del movimiento de aire dentro de los cuartos limpios es un proceso subjetivo. No es posible la eliminación completa de turbulencias o vórtices en cuartos limpios en operación que contienen personal y equipo. La visualización del aire representa simplemente un paso de todo el esfuerzo para optimizar las operaciones de cuartos limpios y no es una prueba definitiva que indique el cumplimiento/incumplimiento, debido a que no es fácil definir condiciones aceptables o inaceptables. Resulta esencial llevar a cabo pruebas adecuadas y optimizar las características físicas del cuarto limpio, RABS o aislador antes de implementar el programa de monitoreo microbiológico. Asegurar que el cuarto limpio, RABS o aislador cumple con sus especificaciones de ingeniería predeterminadas ofrece la certeza de que la capacidad de los sistemas de la instalación y de las prácticas operativas para controlar la biocarga y las partículas no viables es apropiada para el uso previsto. Dichas pruebas deben repetirse durante la certificación de rutina del cuarto limpio o de los sistemas de procesamiento aséptico avanzado y toda vez que se cambie significativamente una operación, como el flujo de personal, operación del equipo, flujo de materiales, sistemas de manejo de aire o distribución de equipos.
CAPACITACIÓN DE PERSONAL El buen desempeño del personal ejerce un papel esencial sobre el control de contaminación, mientras que la capacitación y supervisión adecuadas son aspectos centrales del control de contaminación. El procesamiento aséptico es la actividad más crítica que se lleva a cabo en ambientes microbiológicamente controlados y los fabricantes deben poner especial atención a los detalles en todos los aspectos de este esfuerzo. Una rigurosa disciplina y la estricta supervisión del personal son esenciales para asegurar un nivel de calidad ambiental apropiado para el procesamiento aséptico. La capacitación de todo el personal que trabaja en ambientes controlados es crítica. Esta capacitación es igualmente importante para el personal responsable del programa de monitoreo microbiano, debido a que la contaminación de la zona de trabajo limpia podría ocurrir inadvertidamente durante el muestreo microbiano. En operaciones altamente automatizadas, el personal encargado del monitoreo pueden ser los empleados que tienen contacto más directo con zonas y superficies críticas dentro del área de procesamiento. El muestreo microbiológico tiene el potencial de contribuir con contaminación microbiana ocasionada por técnicas de muestreo inadecuadas o por la ubicación del personal dentro o cerca de la zona crítica. Se requiere un programa formal de capacitación para minimizar este riesgo. Dicha capacitación debe ser documentada para todo el personal que ingresa a los ambientes controlados. Deben minimizarse las intervenciones en todo momento, incluyendo aquellas requeridas para actividades de monitoreo; sin embargo, cuando no es posible evitar las intervenciones, se pueden llevar a cabo empleando técnicas asépticas que busquen acercarse lo más posible a la la perfección. La gerencia de la instalación debe asegurarse de que todo el personal que participa en operaciones en cuartos limpios y ambientes de procesamiento aséptico avanzado tengan buena instrucción sobre los principios microbiológicos relevantes. La capacitación debe incluir instrucción sobre los principios básicos de las técnicas asépticas y debe enfatizar la relación que guardan los procesos de fabricación y manipulación con las posibles fuentes de contaminación de los productos. Las personas que supervisan, auditan o inspeccionan el control microbiológico y las actividades de monitoreo deben tener un profundo conocimiento sobre principios básicos de microbiología, fisiología microbiana, desinfección y sanitización, selección y preparación de medios, taxonomía y esterilización. El personal responsable de la supervisión y del análisis debe contar con capacitación académica en microbiología médica o ambiental. Tanto el personal de muestreo como los individuos que trabajan en cuartos limpios deben estar al tanto de sus responsabilidades para minimizar la liberación de contaminación microbiana. El personal implicado en la identificación microbiana necesita una capacitación especializada sobre los métodos de laboratorio requeridos. Se debe ofrecer capacitación adicional sobre la gestión de los datos recolectados. Resulta crítico conocer y comprender los procedimientos operativos estándares, especialmente aquellos relacionados con las medidas correctivas que se toman cuando las condiciones ambientales así lo requieren. Comprender los principios del control de contaminación y las responsabilidades de cada persona con respecto a las buenas prácticas de fabricación (BPF) debe ser parte integral del programa de capacitación, junto con la capacitación para efectuar investigaciones y análisis de datos.
1460 (1116) Ambientes de Procesamiento Aséptico / Información General
USP 39
El personal representa la única fuente significativa de contaminación microbiana en los ambientes asépticos. Debido a que los operadores dispersan contaminación y puesto que que el objetivo primordial del procesamiento aséptico es reducir los riesgos para el usuario final, únicamente se debe permitir la entrada a individuos saludables a los ambientes controlados. No se debe permitir el acceso a ambientes de procesamiento aséptico a individuos enfermos, incluyendo ambientes que utilicen tecnologías asépticas avanzadas tales como aisladores, unidades de soplado/llenado/sellado o RABS cerrados. Se debe enfatizar en todo momento la importancia de una buena higiene personal y la atención cuidadosa al detalle en el uso de vestimenta aséptica. Los requisitos de uso de vestimenta difieren dependiendo del uso del ambiente controlado y de los aspectos específicos del sistema de vestimenta. Los ambientes de procesamiento aséptico requieren el uso de vestimenta esterilizada con las mejores propiedades de filtración disponibles. Es aconsejable cubrir la piel en la mayor medida posible, por lo que se deben considerar cubre mangas o cinta para minimizar las fugas en las uniones críticas de guantes y mangas. La piel expuesta nunca deber ser visible en cuartos limpios bajo ninguna circunstancia. Las consideraciones sobre personal y vestimentas para RABS son esencialmente idénticas a los de los cuartos limpios convencionales. Una vez que los empleados porten adecuadamente la vestimenta, deben tener cuidado de mantener la integridad de sus guantes, máscaras y de otros materiales de la vestimenta en todo momento. Los operadores que trabajan con sistemas de aisladores no están obligados a usar vestimentas esterilizadas para cuartos limpios; sin embargo, las técnicas asépticas inadecuadas y la contaminación transmitida por los empleados representan los principales riesgos para las operaciones asépticas seguras en aisladores, así como en RABS y en cuartos limpios convencionales. Los ensambles de guantes y mangas pueden generar fugas que conllevan a la transferencia mecánica de microorganismos al producto. Un segundo guante, usado por debajo o por encima del guante primario de aisladores/RABS, puede proporcionar un nivel adicional de seguridad contra fugas en el guante o puede actuar como una medida higiénica. Asimismo, los operadores deben entender que la técnica aséptica es un requisito absoluto para todas las manipulaciones realizadas con guantes dentro de RABS y aisladores. El programa de monitoreo ambiental por sí mismo no es capaz de detectar todos los eventos que ocurren durante el procesamiento aséptico que pudieran comprometer la calidad microbiológica del ambiente. Por lo tanto, los estudios periódicos de llenado de medios o de simulación de procesos, al igual que la supervisión integral continua, son necesarios para garantizar que se mantengan eficazmente controles operativos y capacitación apropiados.
FACTORES CRÍTICOS EN EL DISEÑO E IMPLEMENTACIÓN DE UN PROGRAMA DE MONITOREO MICROBIOLÓGICO DEL AMBIENTE Desde el surgimiento de los programas integrales de monitoreo ambiental, se han enfatizado sus aplicaciones para captar tendencias o desviaciones adversas. En un ambiente de procesamiento aséptico moderno-ya sea un aislador, RABS o cuarto limpio convencional-los casos de contaminación son cada vez más raros. No obstante, un programa de monitoreo debe ser capaz de detectar un cambio del estado validado de control en una instalación, así como de ofrecer información para implementar medidas de corrección apropiadas. Los programas de monitoreo ambiental deben adaptarse a las instalaciones y condiciones específicas. Asimismo, resulta útil mantener una perspectiva amplia durante la interpretación de datos. Un solo resultado no correlacionado de un día determinado puede no ser de importancia en el contexto de las limitaciones técnicas asociadas con métodos de muestreo aséptico.
Selección de Medios de Crecimiento En la mayoría de los casos, resulta adecuado un medio de crecimiento microbiológico general, por ejemplo el medio de digerido de caseína y soja (SCDM, por sus siglas en inglés), para el monitoreo ambiental, debido a que promueve el crecimiento de una amplia variedad de bacterias, levaduras y hongos filamentosos. Este medio se puede suplementar con aditivos para reducir o minimizar los efectos de agentes sanitizantes o de antibióticos. Los fabricantes deben considerar la detección específica de hongos filamentosos y levaduras. Si fuera necesario, se pueden usar medios micológicos generales tales como agar de Sabouraud, agar de Sabouraud modificado o agar inhibidor de hongos filamentosos. En general, no se lleva a cabo un monitoreo estricto de anaerobios, debido a la poca posibilidad de supervivencia de estos organismos en el aire ambiental. No obstante, se pueden observar organismos microaerófilos en el procesamiento aséptico. Cuando se presentan condiciones anóxicas o si las investigaciones lo requieren (p.ej., la identificación de estos organismos en instalaciones de prueba de esterilidad o los resultados de Pruebas de Esterilidad (71 )), puede ser necesario el monitoreo de organismos microaerófilos y de organismos que crecen en condiciones de poco oxígeno. Se debe evaluar la capacidad de promoción de crecimiento de cualquier medio usado en el monitoreo ambiental, incluyendo aquellos seleccionados para recuperar tipos específicos de organismos, según se indica en (71 ).
Selección de Condiciones de Cultivo El tiempo y las temperaturas de incubación se establecen después de seleccionar los medios adecuados. Por lo regular, para los medios generales de crecimiento microbiológico tales como SCDM, se han usado temperaturas de incubación en el intervalo de aproximadamente 20-35º con un tiempo de incubación de no menos de 72 horas. Se pueden considerar tiempos de incubación mayores cuando se sabe que los contaminantes crecen con lentitud. Los intervalos de temperatura provistos ante-
USP 39
Información General/ (1116) Ambientes de Procesamiento Aséptico 1461
riormente no son absolutos. Las bacterias mesófilas y los hongos filamentosos comunes en el ambiente de instalación típico por lo general son capaces de crecer en un amplio intervalo de temperaturas. Para muchos organismos mesófilos, la recuperación es posible en un intervalo de aproximadamente 20º. Ante la ausencia de pruebas confirmatorias, los microbiólogos pueden incubar una sola placa a una temperatura baja y a una más alta. El incubar primero a la temperatura más baja puede comprometer la recuperación de cocos Gram positivos que son importantes debido a que a menudo se les relaciona con humanos. Se deben validar los procesos de esterilización para preparar los medios de crecimiento. Cuando se usan medios selectivos para el monitoreo, las condiciones de incubación deben reflejar los requisitos técnicos publicados. No se debe introducir contaminación a un cuarto limpio de fabricación como resultado del uso de medios o equipo de muestreo contaminados. El uso de medios de muestreo preparados asépticamente representa una preocupación especial. Siempre que sea posible, se deben esterilizar terminalmente los medios de muestreo y sus envolturas mediante calor húmedo, radiación u otros medios adecuados. Cuando se deban usar medios preparados asépticamente, los analistas deberán llevar a cabo una preincubación e inspección visual de todos los medios de muestreo antes de introducirlos en el cuarto limpio. Se refiere al lector al capítulo general Óptimas Prácticas de Laboratorio Microbiológico (111 7) para mayor información sobre operaciones y controles en laboratorios microbiológicos.
ESTABLECIMIENTO DE PLANES Y SITIOS DE MUESTREO Resulta necesario determinar ubicaciones específicas para el muestreo de aire y de superficies durante el inicio o la puesta en servicio de un cuarto limpio u otro ambiente controlado. Entre las ubicaciones consideradas se deben incluir aquéllas en la proximidad del producto, envases, cierres y superficies de contacto expuestos. Durante el procesamiento aséptico, al área en la que los envases, cierres y producto están expuestos al ambiente a menudo se le denomina zona crítica-la zona crítica siempre es un ambiente ISO 5. Para operaciones asépticas, toda la zona crítica debe tratarse como un campo estéril. Ningún objeto no estéril, incluyendo manos enguantadas del personal del cuarto limpio o un guante para RABS/aislador, debe entrar en contacto con un producto estéril, cierre de envase, estación de llenado o equipo de transporte antes o durante las operaciones de procesamiento aséptico. Los operadores y el personal de monitoreo ambiental nunca deben tocar partes estériles de transportadores, agujas de llenado, tolvas o cualquier otro equipo que esté dentro de la ruta de descarga del producto. Esto significa que es mejor realizar el monitoreo de estas superficies al final de las operaciones de producción. La frecuencia del muestreo depende del proceso de fabricación que se lleve a cabo dentro de un ambiente. Los ambientes clasificados que se usan sólo para proporcionar un nivel general de biocarga menor en las áreas de fabricación de productos no estériles requieren monitoreo ambiental de menor frecuencia. Los ambientes clasificados en los que se llevan a cabo operaciones cerradas de fabricación, entre las que se incluyen fermentación, procesamiento estéril de un ingrediente farmacéutico activo y procesos químicos, requieren un número menor de sitios de monitoreo, así como monitoreo menos frecuente debido a que el riesgo de contaminación microbiana del entorno es comparativamente bajo. El monitoreo microbiológico de ambientes en donde los productos se llenan antes de la esterilización terminal a menudo es menos crítico que el monitoreo en las áreas de procesamiento aséptico. La cantidad de monitoreo requerido en las operaciones de llenado para esterilización terminal depende de la susceptibilidad de la supervivencia en el producto y del potencial de proliferación de contaminación microbiana. La identificación y el número estimado de microorganismos resistentes a la esterilización posterior pueden ser más críticas que el monitoreo ambiental microbiológico de los ambientes de fabricación circundantes. No es posible recomendar niveles de control microbianos para cada tipo de ambiente de fabricación. Por ejemplo, los niveles establecidos para un ambiente ISO Clase 7 pueden ser inapropiados para otro ambiente de la misma clase, dependiendo de las actividades de producción que se lleven a cabo en cada ambiente. El usuario debe llevar a cabo un análisis de riesgos eventuales y desarrollar una justificación para las ubicaciones y frecuencias de muestreo para cada ambiente controlado. La clasificación de un cuarto limpio ayuda a establecer niveles de control, pero no implica que todos los cuartos con la misma clasificación deban tener los mismos niveles de control ni la misma frecuencia de monitoreo. El monitoreo debe reflejar los requisitos de control microbiológico de las actividades de fabricación o procesamiento. Las técnicas formales de evaluación de riesgos pueden conllevar a la formación de un programa de control de contaminación científicamente válido. La Tabla 2 sugiere frecuencias de muestreo en orden decreciente de frecuencia y según la criticidad o el riesgo para el producto del área muestreada. Esta tabla distingue entre el procesamiento aséptico en el que el personal está sujeto al uso aséptico de vestimentas y aquel en el que resulta apropiado un menor uso de vestimentas. Los planes de muestreo para monitoreo ambiental deben ser flexibles con respecto a las frecuencias del monitoreo; asimismo, las ubicaciones del plan de muestreo se deben ajustar basándose en la tasa observada de contaminación y en los análisis de riesgos continuos. Los fabricantes, basándose en observaciones a largo plazo, pueden incrementar o disminuir el muestreo en una ubicación dada o eliminar una ubicación de muestreo. El muestreo en exceso puede ser perjudicial para el control de contaminación al igual que la falta de muestreo, por lo que considerar cuidadosamente los riesgos y las fuentes de contaminación puede ayudar a determinar la intensidad del muestreo.
1462 (1116) Ambientes de Procesamiento Aséptico / Información General
USP 39
Tabla 2. Frecuencia de Muestreo Sugerida para Áreas de Procesamiento Asépticoª Área/Ubicación del Muestreo
Frecuencia de Muestreo
1
Cuarto Limpio/RABS Zona crítica (ISO 5 o mejor)
Cada turno operativo
Muestreo activo del aire
1
Monitoreo de superficies
/ Al final de la operación
Área aséptica adyacente a la zona crítica
Todo el muestreo
/ Cada turno operativo
Otras áreas asépticas no adyacentes
Todo el muestreo
/ Una vez al día Aisladores
Zona crítica (ISO 5 o mejor)
Muestreo activo del aire
/ Una vez al día
Monitoreo de superficies
/ Al final de la campaña
Áreas no asépticas entorno al aislador
Todo el muestreo
/ Una vez al mes
ª Todos los operadores están vestidos asépticamente en estos ambientes (con excepción de los ambientes de fondo en el caso de aisladores). Estas recomendaciones no se aplican a las áreas de producción para productos no estériles o a otros ambientes clasificados en los que no se utilizan vestimentas completamente asépticas.
SELECCIÓN DE SITIOS DE MUESTREO DENTRO DE CUARTOS LIMPIOS Y ÁREAS DE PROCESAMIENTO ASÉPTICO La norma ISO 14644 sugiere una metodología de cuadrícula (grid approach) para la clasificación de partículas del aire totales en cuartos limpios. Esta metodología es adecuada para certificar el desempeño de la calidad del aire en relación a partículas totales en función del objetivo de su diseño. Asimismo, las cuadrículas pueden tener gran valor para el análisis de riesgos por contaminación microbiana, aunque, en general, las cuadrículas que no presentan actividad por parte del personal propenden a bajos niveles de contaminación. La contaminación microbiana está profundamente relacionada con el personal, por lo que el monitoreo microbiológico de ambientes sin personal tiene un valor limitado. Para seleccionar de la mejor manera los sitios de muestreo microbiológico se debe tomar en cuenta la actividad humana durante operaciones de fabricación. La observación y el mapeo cuidadosos del cuarto limpio durante la fase de calificación pueden proporcionar información útil relacionada con el movimiento y la ubicación del personal. Semejante observación puede generar también información importante sobre las manipulaciones e intervenciones más frecuentes. La ubicación y el movimiento del personal dentro del cuarto limpio se correlacionan con el riesgo de contaminación para el ambiente y para los procesos que se llevan a cabo dentro de dicho ambiente. Los sitios de muestreo deben seleccionarse de tal manera que evalúen el impacto del movimiento y el trabajo del personal dentro del área, en particular las intervenciones y manipulaciones dentro de la zona crítica. La vía más probable de contaminación es a través del aire, por lo que las muestras más críticas para evaluación de riesgos son aquellas relacionadas con la contaminación transmitida por el aire cerca de materiales estériles expuestos. Otras áreas de preocupación son los puntos de ingreso donde los equipos y materiales se mueven desde áreas con clasificaciones más bajas hacia áreas con clasificaciones más altas. El esquema de monitoreo debe incluir las áreas dentro y alrededor de las puertas y esclusas de aire. Se acostumbra también muestrear paredes y pisos; de hecho, el muestreo en estas ubicaciones puede proveer información sobre la efectividad del programa de sanitización. El muestreo en estas ubicaciones puede llevarse a cabo relativamente con poca frecuencia, debido a que es poco probable que la contaminación afecte al producto. Los operadores nunca deben tocar los suelos ni paredes y, por consiguiente, no debería presentarse la transmisión mecánica de contaminación de estas superficies a las áreas críticas donde se encuentra expuesto el producto. Los fabricantes generalmente deben monitorear las superficies dentro de las zonas críticas, aunque dicho control debe realizarse únicamente al final de las operaciones. Se deben evitar los residuos de medios o diluyentes de hisopos húmedos sobre las superficies, debido a que pueden ocasionar la proliferación de microorganismos. Además, la limpieza de superficies para eliminar diluyentes o medios requiere la intervención y movimientos del personal, lo que puede resultar en la liberación de contaminación microbiana dentro de la zona crítica y puede perturbar el flujo de aire.
PARÁMETROS DE CONTROL MICROBIOLÓGICO EN CUARTOS LIMPIOS, AISLADORES Y RABS Desde principios de la década de 1980, los fabricantes han establecido niveles de alerta y acción para monitoreo ambiental. En años recientes, se ha reducido en buena medida la diferencia numérica entre los niveles de alerta y acción, especialmente en ambientes ISO 5. El crecimiento y la recuperación en valoraciones microbiológicas presentan una variabilidad normal en el intervalo de ±0,5 log 10 • Los estudios sobre muestreadores de aire microbiológicos activos indican que es posible una variabilidad tan alta como diez veces entre los dispositivos de muestreo comúnmente usados. Como resultado de esta variabilidad in-
USP 39
Información General/ (1116) Ambientes de Procesamiento Aséptico 1463
herente y del error de muestreo indeterminado, las supuestas diferencias entre, por ejemplo, un nivel de alerta de 1 ufc y un nivel de acción de 3 ufc no son analíticamente significativos. Desde el punto de vista científico, no es válido tratar las diferencias que se encuentran dentro de los intervalos esperados, y por lo tanto normales, como numéricamente diferentes, pudiendo resultar en actividades injustificadas. En términos prácticos, resulta posible que los valores numéricos que presentan variaciones tan altas como cinco a diez veces no sean significativamente diferentes. Debido a la exactitud y precisión limitadas de los ensayos de crecimiento y recuperación microbiana, los analistas pueden considerar la frecuencia con la que se detecta contaminación en lugar de números absolutos de ufc detectadas en una sola muestra. Asimismo, una ufc no es una enumeración directa de microorganismos presentes, sino una medición de la contaminación que pudiera haberse originado de un grupo de organismos. Se deben determinar las tasas de recuperación de contaminación promedio para cada ambiente de cuarto limpio, mientras que los cambios en las tasas de recuperación de contaminación en un sitio determinado o dentro de un cuarto determinado pueden indicar la necesidad de acciones correctivas. Dentro de la zona crítica ISO 5, los métodos actuales deben permitir la consecución de tasas de recuperación del aire y de superficies de 1 % o menores. Las tasas de recuperación de contaminación para RABS cerrados y sistemas de aisladores deben ser significativamente menores y se puede esperar que sean <0, 1 %, basándose en los resultados de monitoreo publicados. La contaminación observada en múltiples sitios en un ambiente dentro de un solo periodo de muestreo puede indicar un aumento en los riesgos para el producto y se debe evaluar cuidadosamente. Asimismo, la aparición de contaminación casi de manera simultánea en múltiples sitios puede ser generada por una técnica de muestreo deficiente, por lo que se requiere una cuidadosa revisión antes de formular conclusiones sobre la potencial pérdida de control. Volver a muestrear un ambiente varios días después de la contaminación ofrece poco valor, debido que las condiciones durante un muestreo pueden ser difíciles de duplicar con exactitud durante otro muestreo. Las muestras de superficies también se pueden tomar de vestimentas para cuartos limpios. Se debe enfatizar el muestreo de personal durante la validación, el cual se lleva mejor a cabo una vez terminado el trabajo de producción a fin de evitar la contaminación adventicia de las vestimentas. En este caso, el promedio también debe ser <1 % para estos sitios de muestreo. Los guantes en RABS y aisladores cerrados deben cumplir con la expectativa más rigurosa para tasas de recuperación de contaminación de <0, 1 %. Debido a la variabilidad inherente de los métodos de muestreo microbiano, las tasas de recuperación de contaminación representan una medición más útil de los resultados de tendencias que enfocarse en el número de colonias recuperadas de una muestra determinada. La Tabla 3 proporciona las tasas de recuperación recomendadas para ambientes de procesamiento aséptico. La tasa de incidencia corresponde a la tasa con que se encuentra contaminación microbiana en muestras del ambiente. Por ejemplo, una tasa de incidencia de 1 % significa que únicamente el 1 % de las muestras tomadas presentan contaminación, independientemente del número de colonias. En otras palabras, 99% de las muestras tomadas están completamente exentas de contaminación. Las tasas de recuperación de contaminación que son más altas que las recomendadas en la Tabla 3 pueden ser aceptables en cuartos con clasificaciones similares que se usan para actividades de bajo riesgo. Las acciones se vuelven necesarias cuando la tasa de recuperación de contaminación presenta tendencias superiores a estas recomendaciones durante un periodo significativo. Tabla 3. Tasas de Recuperación de Contaminación Iniciales Sugeridas en Ambientes Asépticosª Muestra de Aire Activo(%)
Clasificación del Cuarto
Placa de Sedimentación (9 cm) 4 h de Exposición (%)
Placa de Contacto o Hisopo(%)
Guante o Vestimenta (%)
Aislador/ RABS Cerrado (ISO 5 o mejor)
<0,1
<0,1
<0,1
<0,1
ISO 5
<1
<1
<1
<1
ISO 6
<3
<3
<3
<3
ISO 7
<5
<5
<5
<5
ISO 8
<10
<10
<10
<10
ª Todos los operadores están vestidos asépticamente en estos ambientes (con excepción de los ambientes de fondo en el caso de aisladores). Estas recomendaciones no se aplican a las áreas de producción para productos no estériles o a otros ambientes clasificados en los que no se utilizan vestimentas completamente asépticas.
La frecuencia de detección se debe basar en datos de monitoreo reales y se debe retabular mensualmente. Los niveles de acción deben basarse en la capacidad empírica del proceso. Si las frecuencias de detección exceden las recomendaciones de la Tabla 3 o son mayores que la capacidad establecida del proceso, entonces deben tomarse acciones correctivas. Las acciones correctivas pueden incluir, entre otras, las siguientes: • Revisión del programa de sanitización, incluyendo la selección de agentes antimicrobianos, métodos de aplicación y frecuencias • Mayor vigilancia en las prácticas del personal, lo cual podría incluir evaluaciones por escrito de métodos y técnicas asépticas • Revisión de métodos y técnicas de muestreo microbiológicos. Cuando se observan niveles de recuperación más altos de lo común en lo referente a contaminación en guantes y vestimentas, se puede instruir capacitación adicional sobre prácticas de uso de vestimentas.
1464 (1116) Ambientes de Procesamiento Aséptico / Información General
USP 39
VARIACIONES IMPORTANTES Las variaciones superiores a aproximadamente 15 ufc recuperadas de una sola muestra ISO 5, derivadas del aire, de superficies o del personal, deben ocurrir con la menor frecuencia posible. La ocurrencia de semejantes variaciones en ISO 5 puede ser indicativa de una pérdida importante de control cuando éstas se presentan dentro de la zona crítica ISO 5 con estrecha proximidad al producto y a los componentes. Por consiguiente, cualquier variación en muestras ISO 5 > 15 ufc requiere una investigación cuidadosa y minuciosa. Una consideración clave para un número anormalmente alto de colonias recuperadas radica en si el incidente es aislado o si se correlaciona con otras recuperaciones. Los microbiólogos deben revisar las tasas de recuperación para al menos dos semanas previas al incidente de recuperación anormalmente alta, de modo que puedan estar al tanto de otras recuperaciones que pudieran indicar un patrón inusual. Asimismo, los microbiólogos deben considerar cuidadosamente todas las recuperaciones, incluyendo aquellas que se encuentran en el intervalo más común de 1-5 ufc. La identidad de los organismos recuperados es un factor importante para llevar a cabo esta investigación. En el caso de una sola variación aislada, existe la probailidad de que no se pueda establecer una causa definitiva, por lo que sólo podrán considerarse medidas correctivas generales. Resulta inapropiado sugerir una causa de raíz para la que no se cuenta con evidencia científica sólida. Ademas, se debe ser consciente de la variabilidad del análisis microbiológico. Desde una perspectiva realista, no existen razones científicas para tratar una recuperación de 25 ufc como estadísticamente diferente de una recuperación de 15 ufc. Un valor de 15 ufc no debe considerarse significativo en términos de control de procesos, debido a que, en realidad, no existe diferencia entre una recuperación de 14 ufc y una de 15 ufc. Los microbiólogos deben usar un razonamiento científico práctico en sus metodologías para evaluar desviaciones.
CONSIDERACIONES ADICIONALES SOBRE LA INTERPRETACIÓN DE DATOS En los ambientes de alta calidad requeridos para el procesamiento aséptico, la frecuencia de detección es a menudo baja. Como se puede apreciar en las tasas recomendadas de la Tabla 3, la mayoría de las muestras tomadas en un área de procesamiento aséptico producirán una recuperación de cero contaminación. En las áreas más críticas dentro de las operaciones de procesamiento aséptico, se espera que menos del 1% de las muestras produzcan algún tipo de contaminación recuperable. En las operaciones asépticas modernas más avanzadas que emplean tecnologías de separación, como por ejemplo aisladores o RABS cerrados, la tasa de recuperación se aproximará a cero en todo momento. El microbiólogo responsable del control ambiental o de la garantía de esterilidad no debe interpretar lo anterior como un acercamiento a la esterilidad por parte de la calidad ambiental. Se desconoce la sensibilidad de todo sistema de muestreo microbiano en términos absolutos. En el monitoreo ambiental, un resultado cero significa únicamente que el resultado está por debajo del límite de detección del sistema analítico. Se debe evitar un falso sentido de seguridad derivado de la poca frecuencia de recuperación de contaminación en el procesamiento aséptico. La garantía de esterilidad se logra de mejor manera al enfocarse en la contaminación transmitida por humanos, así como en las características de diseño de la instalación que mitiguen de mejor manera los riesgos de esta contaminación. La mejor manera de mitigar riesgos se puede lograr reduciendo o eliminando las intervenciones humanas mediante el diseño de equipo adecuado y proporcionando suficientes cambios de aire por hora para la población de personal pretendida de la instalación. Otros factores para la mitigación de riesgos incluyen el movimiento efectivo del personal y de los materiales, así como el control adecuado de la temperatura y la humedad. Entre los factores secundarios para la mitigación de riesgos se incluyen la limpieza y la sanitización. Los modelos de análisis de riesgos que analizan los procesos de manera prospectiva para reducir el riesgo de contaminación microbiana transmitida por humanos mediante la minimización de las intervenciones del operador son herramientas más poderosas para el aseguramiento de la esterilidad que el monitoreo. El monitoreo ambiental no puede probar ni refutar en términos absolutos la esterilidad de un lote de producto. El monitoreo ambiental sólo puede garantizar a los responsables de un proceso que un sistema de producción se encuentra en un estado de control validado y uniforme. Se debe tener cuidado de no formular conclusiones inapropiadas a partir de los resultados del control.
MUESTREO DE MICROORGANISMOS DEL AIRE Entre las herramientas más comúnmente usadas para el monitoreo de ambientes asépticos se encuentran los muestreadores por impacto y centrífugos. A modo informativo, se detallan algunos muestreadores disponibles en el mercado. El usuario tiene la responsabilidad de determinar la selección, conveniencia e idoneidad de cada muestreador.
Muestreador de Aire de Ranura-Agar (STA, por sus siglas en inglés) La unidad está impulsada por una fuente acoplada de vacío controlable. La toma de aire se hace a través de una ranura estandarizada debajo de la cual se coloca una placa de Petri que gira lentamente y que contiene agar nutritivo. Las partículas en el aire que tienen una masa suficiente impactan la superficie del agar y permite el crecimiento de los organismos viables. A menudo se usa una toma de aire remota para no alterar el flujo de aire unidireccional.
USP 39
Información General/ (1116) Ambientes de Procesamiento Aséptico 1465
lmpactador de Tamiz Este aparato consiste en un recipiente diseñado para alojar una placa de Petri con agar nutritivo. La cubierta de la unidad está perforada con aberturas de un tamaño predeterminado. Una bomba de vacío toma un volumen conocido de aire a través de la cubierta y las partículas del aire que contienen microorganismos impactan el medio de agar de la placa de Petri. Algunos muestreadores disponen de una serie de tamices en cascada, con perforaciones de tamaño decreciente. Estas unidades permiten determinar la distribución del intervalo de tamaños de partículas que contienen microorganismos viables, basándose en el tamaño de las perforaciones que atraviesan las partículas para aterrizar en las placas de agar.
Muestreador Centrífugo La unidad consiste en una hélice o turbina que aspira un volumen conocido de aire hacia el interior de la unidad y luego impulsa el aire al exterior hacia una tira de agar nutritivo dispuesta tangencialmente sobre una base plástica flexible.
Atrio Microbiológico Esterilizable La unidad es una variante del impactador de tamiz de una sola etapa. La cubierta de la unidad contiene orificios uniformemente espaciados de un tamaño de aproximadamente 6,35 mm (0,25 pulgadas). La base de la unidad aloja una placa de Petri que contiene agar nutritivo. Una bomba de vacío controla el movimiento de aire a través de la unidad y se encuentran disponibles un centro de control de unidades múltiples y una sonda de muestreo remoto.
Muestreador por Sistema de Aire en Superficie (Muestreador SAS, por sus siglas en inglés) Esta unidad integrada está formada por una sección de ingreso que aloja una placa de contacto de agar. Inmediatamente detrás de la placa de contacto hay un motor y una turbina que aspira aire a través de la cubierta perforada de la unidad hacia la placa de contacto de agar y más allá del motor, donde se expulsa. También se encuentran disponibles unidades de montajes múltiples.
Muestreador con Filtro de Gelatina La unidad está formada por una bomba de vacío con una manguera de extensión que termina en un portafiltro que puede ubicarse lejos, en el espacio crítico. El filtro está constituido por fibras de gelatina dispuestas al azar, capaces de retener los microorganismos transportados por el aire. Después de un tiempo de exposición especificado, se retira asépticamente el filtro y se lo disuelve en un diluyente adecuado; luego se realiza la siembra sobre un medio de agar adecuado para estimar su contenido microbiano.
Placas de Sedimentación Este método aún se utiliza ampliamente como una manera simple y económica de evaluar cualitativamente los ambientes durante tiempos de exposición prolongados. Los datos publicados indican que las placas de sedimentación, al exponerlas durante periodos de 4 a 5 horas, pueden proveer un límite de detección para una evaluación adecuada del ambiente aséptico. Las placas de sedimentación pueden ser particularmente útiles en áreas críticas en las que el muestreo puede ser intrusivo y representar un riesgo para la operación aséptica. Uno de los principales inconvenientes de los muestreadores mecánicos de aire es el limitado tamaño de muestra de aire analizada. Cuando se espera que el nivel microbiano en el aire de un ambiente controlado contenga niveles extremadamente bajos de contaminación por unidad de volumen, se debe analizar por lo menos 1 metro cúbico de aire a fin de maximizar la sensibilidad. Típicamente, los dispositivos de ranura-agar tienen una capacidad de muestreo de 80 L/minuto (la capacidad de los muestreadores SAS es un poco mayor). El análisis de 1 metro cúbico requeriría un tiempo de exposición de 15 minutos. Puede ser necesario usar tiempos de muestreo por encima de 15 minutos para obtener una muestra del ambiente representativa. Aunque se ha informado de muestreadores con altos volúmenes de muestreo, se debe considerar el potencial trastorno de los patrones del flujo de aire en las zonas críticas o la generación de una turbulencia. Es posible que los técnicos deseen utilizar sistemas de muestreo remotos para minimizar los riesgos potenciales que resultan de la intervención por parte de muestreadores ambientales en las zonas críticas. Independientemente del tipo de muestreador usado, los analistas deben determinar que la tubería extra requerida para una sonda remota no reduzca la sensibilidad del método a tal grado que se vuelva poco probable o imposible la detección de niveles bajos de contaminación.
MUESTREO DE SUPERFICIES Otro componente del programa de control microbiano en ambientes controlados es el muestreo de las superficies de equipo, instalaciones y personal. La estandarización de los métodos y procedimientos para muestreo de superficies no ha sido tra-
1466 (1116) Ambientes de Procesamiento Aséptico / Información General
USP 39
tada de manera tan amplia en la industria farmacéutica como la estandarización de los procedimientos para muestreo del aire. El muestreo de superficies puede llevarse a cabo mediante placas de contacto o por el método de hisopado. Las placas de contacto llenas con agar nutritivo se usan al muestrear superficies regulares o planas y se incuban directamente durante el tiempo y la temperatura apropiados para la recuperación de microoorganismos viables. Se puede usar agar especializado para la recuperación de organismos con requisitos de crecimiento específicos. Las estimaciones microbianas se informan por placa de contacto. El método de hisopado se puede usar como complemento de las placas de contacto para muestrear superficies irregulares, en especial las superficies irregulares de los equipos. El área por donde se pasará el hisopo se define con una plantilla estéril de tamaño adecuado. En general, se trata de un área de entre 24 y 30 cmz. Después de recolectar la muestra, el hisopo se coloca en un diluyente adecuado o medio de transporte y se plaquea sobre el agar nutritivo adecuado. Las estimaciones microbianas se informan por hisopado de un área de muestreo definida. El monitoreo de superficies se usa como herramienta de evaluación ambiental en todos los tipos de ambientes clasificados. En los ambientes ISO 5 para procesamiento aséptico, el monitoreo de superficies por lo general se lleva a cabo cerca de áreas y superficies críticas. Las tolvas y rampas de alimentación que entran en contacto con superficies estériles en cierres y agujas de llenado pueden ser analizadas para detectar contaminación microbiana. A menudo, en los cuartos limpios convencionales con personal, estas superficies de contacto con productos se esterilizan con vapor y se ensamblan asépticamente. La capacidad de los operadores para realizar manipulaciones asépticas se evalúa durante simulaciones del proceso o llenados de medios, aunque no es posible realizar de esta manera una validación verdadera de la técnica del operador. El monitoreo de superficies que se realiza en superficies que entran en contacto directo con partes o productos estériles se debe llevar a cabo únicamente después de haber completado las operaciones de producción. El muestreo de superficies no es una prueba de esterilidad y no debe considerarse un criterio para la liberación o rechazo de productos. Debido a que el personal debe tomar estas muestras asépticamente, resulta difícil establecer con certeza si la contaminación recuperada está relacionada con el producto.
MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES El tipo de medio, líquido o sólido, usado para el muestreo o plaqueo de microorganismos depende del procedimiento y equipos usados. Se debe evaluar la aptitud de todos los medios utilizados según el propósito previsto. El medio de crecimiento microbiológico sólido multipropósito más común es el agar con digerido de caseína y soja. Tal como se mencionó con anterioridad, este medio se puede complementar con químicos que contrarresten el efecto de varios antimicrobianos.
IDENTIFICACIÓN DE AISLAMIENTOS MICROBIANOS Un programa de control ambiental exitoso incluye un nivel apropiado de identificación de la flora obtenida mediante el muestreo. Conocer la flora normal de los ambientes controlados ayuda a determinar la flora microbiana habitual prevista para la instalación que se está controlando, además de que permite evaluar la eficacia de los procedimientos, métodos y agentes de limpieza y sanitización, así como los métodos de recuperación. La información reunida mediante un programa de identificación también puede resultar útil para investigar la fuente de contaminación, especialmente cuando se exceden las frecuencias de detección recomendadas. La identificación de aislamientos de las zonas críticas y las áreas inmediatamente adyacentes a ellas deben tener prioridad sobre la identificación de microorganismos de zonas no críticas. Resulta necesario verificar los métodos de identificación y evaluar los kits listos para usar según su propósito previsto.
CONCLUSIÓN El monitoreo ambiental es uno de los varios elementos clave requeridos para asegurar que un área de procesamiento aséptico se mantiene en un nivel de control adecuado. El monitoreo es un ejercicio cualitativo e, incluso en las aplicaciones más críticas como el procesamiento aséptico, las conclusiones relacionadas con la aceptabilidad del lote no deben ser formuladas basándose únicamente en los resultados del muestreo ambiental. Los ambientes esencialmente libres de operadores humanos por lo general presentan tasas iniciales de contaminación bajas y mantienen bajos niveles de contaminación microbiana. Los cuartos limpios de escala humana presentan un panorama muy distinto. Los estudios muestran de manera concluyente que los operadores, incluso con el empleo cuidadoso y correcto de vestimentas, desprenden continuamente microorganismos en el ambiente. Por consiguiente, no resulta razonable asumir que en todo momento se observarán muestras que no produzcan colonias, incluso en la zona crítica o en superficies críticas. Las desviaciones periódicas son inevitables en los cuartos limpios de escala humana, pero la tasa de recuperación de contaminación, particularmente en ambientes ISO 5 usados para el procesamiento aséptico, debe ser uniformemente baja. Los operadores de los cuartos limpios, en especial aquellos dedicados al procesamiento aséptico, deben esforzarse por mantener una calidad ambiental adecuada y deben trabajar en función del mejoramiento continuo de las operaciones del personal y del control ambiental. En general, un número bajo de personal implicado en el procesamiento y monitoreo asépticos, aunado a una reducción en las intervenciones, reduce el riesgo de contaminación microbiana.
USP 39
Información General/ (1116) Ambientes de Procesamiento Aséptico 1467
GLOSARIO Recuento de Partículas del Aire (también denominado Recuento Total de Partículas): El número total de partículas de un tamaño determinado por unidad de volumen de aire. Recuento de Partículas Viables del Aire: (también denominado Recuento Total de Microorganismos Aerobios del Aire): El número recuperado de unidades formadoras de colonias (ufc) por unidad de volumen de aire. Cambios de Aire: La frecuencia por unidad de tiempo (minutos, horas, etc.) con la que se reemplaza el aire dentro de un ambiente controlado. El aire puede ser parcialmente recirculado o reemplazarse por completo. Muestreador de Aire: Dispositivos o equipos usados para muestrear una cantidad medida de aire en un tiempo especificado para cuantificar el estado microbiológico o de partículas del aire en el ambiente controlado. Aséptico: Técnicamente, se refiere a la ausencia de microorganismos; no obstante, en el procesamiento aséptico, se refiere a métodos y operaciones que minimizan la contaminación microbiana en ambientes donde se llenan y/o ensamblan productos y componentes esterilizados. Procesamiento Aséptico: Operación en la que el producto se ensambla o transfiere a su envase primario en un ambiente ISO 5 o mejor y en condiciones que minimicen el riesgo de contaminación microbiana. El objetivo final es producir productos exentos tanto como sea posible de contaminación microbiana. Sistema de Barreras: Barreras físicas instaladas dentro de un cuarto de procesamiento aséptico que proporcionan una separación parcial entre el personal asépticamente ataviado y las áreas críticas sujetas a riesgos considerables de contaminación. El acceso de personal a la zona crítica está altamente restringido. Se somete a una desinfección de alto nivel. Biocarga: Número total e identidad de microorganismos predominantes detectados en o sobre un artículo. Cuarto Limpio: Un cuarto donde se controla la concentración de partículas del aire para que cumpla con una Clase específica de limpieza del aire con respecto a partículas. Además, se monitorea la concentración de microorganismos en el ambiente; cada Clase de limpieza definida tiene asignada además un nivel microbiano del aire, de superficies y de indumentaria del personal Puesta en Servicio de un Ambiente Controlado: Certificación brindada por ingenieros y control de calidad que confirma que el ambiente se ha construido según las especificaciones de la Clase de limpieza deseada y que, en las condiciones probables de funcionamiento normal (o peores condiciones), es capaz de lograr un proceso aséptico. La puesta en servicio incluye ensayos de llenado de medios y resultados del programa de control ambiental. Tasa de Recuperación de Contaminación: La tasa de recuperación de contaminación es la tasa con la que se mide cualquier nivel de contaminación encontrado en las muestras del ambiente. Por ejemplo, una tasa de incidente de 1o/o significa que únicamente el 1% de las muestras tomadas presentan contaminación, independientemente del número de colonias. Ambiente Controlado: Toda zona de un sistema de procesamiento aséptico en la que se controlan niveles específicos de partículas y microorganismos en el aire, adecuados para las actividades desarrolladas dentro de ese ambiente. Acción Correctiva: Acciones descritas en los procedimientos operativos estándares y que hay que tomar cuando se superan ciertas condiciones. Zona Crítica: Por lo general, el área completa donde el producto, así como los envases y cierres están expuestos en el procesamiento aséptico. Frecuencia de Detección: La frecuencia con la que se observa contaminación en un ambiente. Por lo general, se expresa como porcentaje de muestras en las que se observó contaminación, por unidad de tiempo. Aislamientos Ambientales: Microorganismos que se han aislado en el programa de control ambiental. Programa de Monitoreo Ambiental: Programa documentado, implementado a través de procedimientos operativos estándares, que describe en detalle los métodos y criterios de aceptación usados para monitorear partículas y microorganismos en ambientes controlados (aire, superficies, indumentaria del personal). El programa incluye sitios de muestreo, frecuencia de muestreo e investigación y acciones correctivas. Diagrama de la Distribución de Equipos: Representación gráfica de un sistema de procesamiento aséptico que muestra la interrelación entre los equipos y el personal. Esta distribución se usa en el Análisis de Evaluación de Riesgos para determinar los sitios y frecuencia de muestreo basándose en la posible contaminación microbiológica del sistema de producto/envase/cierre. Los cambios deben ser evaluados por los gerentes responsables, dado que los cambios no autorizados en la distribución de los equipos y de los puestos del personal podrían aumentar la probabilidad de contaminación del sistema de producto/envase/ cierre. Aislador para Procesamiento Aséptico: Un aislador aséptico es un recinto sobrepresurizado con aire filtrado HEPA y que se descontamina usando un sistema automático. Cuando se opera como sistema cerrado, utiliza únicamente interfases descontaminadas o puertos de transferencia rápida (RTP, por sus siglas en inglés) para la transferencia de materiales. Después de la descontaminación, se pueden operar de manera abierta con el ingreso y/o egreso de materiales a través de aberturas definidas que han sido diseñadas y validadas para evitar la transferencia de contaminación. Se pueden usar para actividades de procesamiento aséptico o para asépsis y contención simultáneas. Flujo de Materiales: El flujo de material y personal que ingresa a los ambientes controlados debe seguir un camino especificado y documentado elegido para reducir o minimizar la probabilidad de contaminación microbiana de los sistemas de producto/envase/cierre. Si no se cumple con el flujo indicado, podría aumentar la probabilidad de contaminación microbiana. Se puede modificar el flujo de material y personal, pero los gerentes responsables tienen que evaluar las consecuencias de los cambios desde un punto de vista microbiológico; dichos cambios se deben autorizar y documentar.
1468 (1116) Ambientes de Procesamiento Aséptico / Información General
USP 39
Llenado de Medios: Simulación microbiológica de un proceso aséptico mediante el uso de medios de crecimiento procesados de manera similar al procesamiento del producto y usando el mismo sistema de envase y cierre. Promoción del Crecimiento en Medios: Procedimiento que hace referencia a la Prueba de Promoción de Crecimiento de Organismos Aerobios, Anaerobios y Hongos en Pruebas de Esterilidad (71) para demostrar que los medios usados en el programa de monitoreo ambiental microbiológico, o en ensayos de llenado de medios son capaces de promover el crecimiento de microorganismos indicadores y de aislamientos ambientales de muestras obtenidas en el programa de monitoreo o de sus cepas ATCC correspondientes. Áreas de Contacto con el Producto: Áreas y superficies en un ambiente controlado que están en contacto directo con productos, envases o cierres y cuyo estado microbiológico puede resultar en una posible contaminación microbiana del sistema de producto/envase/cierre. Sistema de Barreras con Acceso Restringido (RABS, por sus siglas en inglés): Un recinto que se basa en una sobredescarga de aire filtrado por HEPA para mantener la separación entre el personal asépticamente ataviado y el ambiente operativo. Se somete a un alto nivel de desinfección antes de su uso en procesos asépticos. Emplea (cuando resulta necesario) interfases descontaminadas o puertos RTP para transferencia de materiales. Permite el ingreso y/o egreso de materiales a través de aberturas definidas que han sido diseñadas y validadas para evitar la transferencia de contaminación. Si se abre después de la descontaminación, su capacidad de desempeño resulta negativamente afectada. Análisis de Evaluación de Riesgos: Análisis de la identificación de posibles contaminaciones en ambientes controlados que establecen prioridades según su gravedad y frecuencia y que lleva al desarrollo de métodos y procedimientos para eliminar, reducir, minimizar o atenuar la probabilidad de contaminación microbiana del sistema de producto/envase/cierre. Plan de Muestreo: Plan documentado que describe los procedimientos y métodos para muestrear un ambiente controlado; identifica los sitios de muestreo, la frecuencia de muestreo y el número de muestras, y describe el método de análisis y cómo interpretar los resultados. Sitios de Muestreo: Ubicación geográfica documentada, dentro de un ambiente controlado, donde se hace el muestreo para evaluación microbiológica. En general, los sitios de muestreo se seleccionan según su potencial de entrar en contacto con el producto/envase/cierre. Procedimientos Operativos Estándares: Procedimientos escritos que describen operaciones, pruebas, muestreos, interpretación de resultados y acciones correctivas relacionadas con las operaciones que tienen lugar en un ambiente controlado y en ambientes auxiliares. Las desviaciones de los procedimientos operativos estándares deben registrarse y estar aprobadas por los gerentes responsables. Campo Estéril o Aséptico: En el procesamiento aséptico o en otros ambientes controlados, es el espacio que está en el mismo plano o encima de los envases abiertos, cierres o el producto en sí, donde es máxima la probabilidad de contaminación microbiana. Esterilidad: Según la definición más estricta de esterilidad, un artículo se considera estéril en ausencia absoluta de microorganismos viables. Viable, para organismos, se define como la capacidad para reproducirse. La esterilidad absoluta no puede demostrarse de manera práctica debido a que es técnicamente imposible demostrar una ausencia absoluta. Asimismo, la esterilidad absoluta no puede demostrarse de manera práctica sin analizar todos los artículos en una partida. La esterilidad se define estadísticamente como una probabilidad de que la contaminación de un artículo sea aceptablemente remota. Hisopos para Muestreo Microbiológico: Dispositivos usados para retirar microorganismos de superficies irregulares o regulares para su posterior cultivo e identificación de población microbiana en la superficie. El hisopo, generalmente formado por una varilla con un extremo absorbente, se humedece antes del muestreo y se frota a través de un área especificada de la superficie de muestreo. Posteriormente, el hisopo se enjuaga en solución salina estéril para suspender los microorganismos y la solución se transfiere a un medio de crecimiento para el cultivo de la población microbiana. Análisis de Tendencias: Datos provenientes de un programa rutinario de monitoreo ambiental microbiano que pueden relacionarse con la hora, turno de trabajo, instalación, etc. Esta información se evalúa periódicamente para establecer el estado o patrón de dicho programa, con el fin de determinar si se encuentra bajo control adecuado. Un análisis de tendencias se usa para facilitar la toma de decisiones con respecto a la recalificación de un ambiente controlado o para programas de mantenimiento y sanitización.
APÉNDICE Referencias Adicionales Agalloco J, Akers J. Risk analysis for aseptic processing: The Akers-Agalloco method. Pharm Technol. 2005; 29(11 ):74-88. Agalloco J, Akers J. The simplified Akers-Agalloco method for aseptic processing risk analysis. Pharm Technol. 2006; 31 (7)6072. Akers, J. The proper role of environmental monitoring in aseptic processing. Am Pharm Rev. 2006; 9(4):24-28. CDC, Healthcare lnfection Control Advisory Committee. Guidelines for environmental control in healthcare facilities. MMWR 2003; 52(No. RR-10):1-42. Favero MS, Puleo JR, Marshall JH, Oxborrow GS. Microbiological sampling of surfaces. j Appl Bacteria/. 1968; 31 :336-346. Hussong D, Madsen R. Analysis of environmental microbiology data from clean room samples. Pharm Techno/. 2004; Aseptic Processing Suppl:l 0-15.
USP 39
Información General/ (111 7) Óptimas Prácticas de Laboratorio 1469
lnternational Organization for Standardization (ISO). 14644-1, Clean rooms and associated environments, part 1: classification of air cleanliness. Geneva: ISO; 1999. lnternational Organization for Standardization (ISO). 14644-2, Clean rooms and associated environments, part 2: specifications for testing and monitoring to prove continued compliance with 14644 part 1. Geneva: ISO; 2000. Jensen PA, Todd WF, Davis GN, Scarpino PV. Evaluation of eight bioaerosol samplers challenged with aerosol of free bacteria. Am lnd Hyg Assoc j. 1992; 53:660-667. Ljungqvist B. Active sampling of airborne viable particulate in controlled environments: a comparative study of common instruments. Eur j Parenter Sci. 1998; 3:59-62. Ljungqvist B, Reinmüller B. lnteraction between air movements and the dispersion of contaminants: clean zones with unidirectional air flow. j Parenter Sci Technol. 1993; 47(2):60-69. Ljungqvist B, Reinmüller B. Airborne viable particles and total number of airborne particles: comparative studies of active air sampling. PDA j Sci Technol. 2000; 54:112-116. Maruyama M, Matsuoka T, Deguchi M, Akers J. The application of robotics to aseptic surface monitoring. Pharm Technol. 2007; 32(7):40-44. Process simulation testing for sterile bulk pharmaceutical chemicals. PDA Technical Report No. 28. j Parenter Sci Technol. 1998; 52 S3. Reinmüller B. Dispersion and risk assessment of airborne contaminants in pharmaceutical cleanrooms. Building Serv Eng Bu// (Sweden). 2001; Bulletin No. 56. Stewart SL, Grinshpun SA, Willeke K, Terzieva S, Ulevicius V, Donnelly J. Effect of impact stress on microbial recovery on an agar surface. Appl Enviran Micro. 1995; 61 :1232-1239. Whyte W. Reduction of microbial dispersion by clothing. j Parenter Sci Technol. 1985; 39(1 ):51-60.
(1117) ÓPTIMAS PRÁCTICAS DE LABORATORIO MICROBIOLÓGICO INTRODUCCIÓN Las buenas prácticas en un laboratorio microbiológico consisten en actividades que dependen de varios principios: técnicas asépticas, control de medios, control de cepas de prueba, operación y control de equipos, registro detallado y evaluación de datos así como capacitación del personal de laboratorio. Debido al riesgo inherente de variabilidad de los datos microbiológicos, la confiabilidad y la reproducibilidad dependen de la utilización de los métodos aceptados y del cumplimiento de las buenas prácticas de laboratorio.
PREPARACIÓN DE MEDIOS V CONTROL DE CALIDAD Preparación de Medios Los medios de cultivo constituyen la base de la mayoría de las pruebas microbiológicas. Por lo tanto, es de suma importancia que se proteja la calidad de estos medios a fin de lograr resultados exitosos en el laboratorio microbiológico. La preparación de los medios, el almacenamiento apropiado y las pruebas de control de calidad pueden asegurar un suministro uniforme de medios de alta calidad. Es importante que se elijan correctamente los medios o componentes para generar medios en base al empleo de fuentes o referencias aceptadas para su formulación. Los medios deshidratados y los medios previamente fabricados generalmente se acompañan con la fórmula y las instrucciones de preparación provistas por el fabricante. Dado que los distintos tipos de medios pueden tener diferentes requisitos de preparación (p.ej., calentamiento, aditivos y ajustes de pH) es importante seguir estas instrucciones para asegurar la preparación de medios de calidad aceptable. Un certificado de análisis, donde figuran la fecha de caducidad y las condiciones recomendadas para almacenamiento, acompaña a los medios prefabricados, como también se incluyen organismos de control de calidad empleados para la promoción de crecimiento y pruebas de selectividad para esos medios. El agua es el diluyente universal que se emplea en medios microbiológicos. Lo que más se emplea en la preparación de medios es Agua Purificada, aunque en ciertos casos pueda ser apropiado usar agua destilada o desionizada. No se debe usar agua de menor calidad para la preparación de medios microbiológicos. Se debería registrar el volumen de agua usado. La preparación uniforme de medios requiere que los medios deshidratados o los constituyentes se pesen con exactitud. Se debería emplear una balanza calibrada de rango apropiado para pesar los ingredientes. (Ver Pesada en una Balanza Analítica (1251 )). Se deberían emplear recipientes de pesado y utensilios (tales como espátulas) limpios para evitar que sustancias extrañas se incorporen a la formulación. Se debe llevar un registro del peso de los componentes. Los medios deshidratados deberían disolverse bien en agua antes de su dispensación y esterilización. Si se necesita calentamiento para disolver los medios, se debe tener cuidado de no sobrecalentar puesto que todos los medios de cultivo, en mayor
1470 (1117) Óptimas Prácticas de Laboratorio/ Información General
USP 39
o menor medida, son sensibles al calor. El equipo a emplearse en la preparación de los medios debería ser el adecuado para poder controlar el calentamiento, la agitación constante y la mezcla de los medios. Una indicación general de sobrecalentamiento es el oscurecimiento de los medios (reacción tipo Maillard, una reacción no enzimática que produce la aparición de un color amarronado). Al agregar los suplementos requeridos a los medios, se debe realizar una mezcla adecuada del medio después del agregado de los suplementos. La preparación de medios en recipientes de vidrio que no estén completamente limpios puede ocasionar la introducción de sustancias inhibitorias en los medios. Las sustancias inhibitorias pueden originarse si quedan residuos del detergente después del lavado de los recipientes de vidrio o a partir de materiales usados previamente en los recipientes. Se recomienda que durante el proceso de limpieza se remuevan todos los materiales de rezago y las sustancias extrañas y que se enjuague bien el detergente con Agua Purificada. Ver Limpieza de Material de Vidrio (1051) para obtener guías adicionales. La esterilización de los medios debería realizarse dentro de los parámetros provistos por el fabricante o validados por el usuario. Los medios preparados comercialmente deberían proveer documentación acerca del método de esterilización empleado. La técnica de esterilización preferida es el autoclavado por calor húmedo, excepto para casos en los que se requiere ebullición para evitar el deterioro de los componentes termolábiles de los medios. La esterilización por filtración puede ser también apropiada para algunas formulaciones. Los efectos del método de esterilización y las condiciones en los medios deberían validarse mediante pruebas de esterilidad y de promoción de crecimiento de los medios. Adicionalmente, si se esterilizan por calor húmedo, el ciclo de autoclave debería validarse para asegurar la distribución adecuada de calor para cargas y volúmenes seleccionados. Usualmente los fabricantes recomiendan que se use un ciclo de autoclave de 121 º durante 15 minutos empleando un autoclave validado. Estas condiciones refieren al tiempo en el que el medio permanece a la temperatura indicada. Como el tamaño de recipiente y la configuración de la carga del autoclave influirán en la velocidad del calentamiento, puede que se requieran ciclos más largos para cargas de mayor tamaño. Sin embargo, el tiempo de esterilización dependerá del volumen de los medios y de la carga del autoclave. Los ciclos de esterilización en los que el autoclave se calienta despacio puede ocasionar el sobrecalentamiento de los medios. En consecuencia, se debe tener cuidado al validar un ciclo de esterilización, balanceando la necesidad de obtener un medio estéril contra la tendencia de los medios a degradarse debido al excesivo calentamiento. Después de que se hayan enfriado, no se recomienda almacenar medios en el autoclave tras completarse el ciclo líquido, ya que se pueden dañar los medios. El calentamiento o condiciones de esterilización inadecuados-para medios preparados en el laboratorio o comercialmente-pueden originar cambio de color, pérdida de transparencia, alteraciones en la consistencia del gel, variación de pH del intervalo recomendado por el fabricante, así como una reducción en la actividad y/o selectividad de promoción de crecimiento. Se debería confirmar el pH de cada lote del medio mediante la extracción aséptica de una muestra para la prueba después de que se haya enfriado a temperatura ambiente (20º-25º). Si se trata de un medio refrigerado adquirido comercialmente, se debe confirmar el pH una vez que haya alcanzado la temperatura ambiente. Para superficies de agar, se recomienda usar una sonda plana para medir el pH y un dispositivo de inmersión para medir los líquidos. Ver pH (791) para obtener pautas sobre la medición del pH y la calibración del instrumento. El pH de los medios debería estar en un intervalo de ±0,2 del valor indicado por el fabricante, a menos que el método validado acepte un intervalo mayor. Los medios preparados deberían comprobarse mediante una inspección adecuada de las placas y los tubos en los siguientes casos: • Recipientes y tapas rotos • Llenado desigual de recipientes • Deshidratación que genere grietas o hundimientos (hoyuelos) en la superficie de un medio sólido • Hemólisis • Oscurecimiento excesivo o cambio de color • Formación de cristales debido a posible congelamiento • Cantidad excesiva de burbujas • Contaminación microbiana • Estado de indicadores redox (si corresponde) • Verificación y registro del número y fecha de caducidad del lote • Esterilidad de los medios • Limpieza de las placas (las tapas no deben adherirse a la placa)
Almacenamiento de Medios Es prudente considerar cómo el fabricante o el proveedor transporta y almacena los medios antes de su distribución al usuario final. Los fabricantes de medios deberían manejar los medios bajo condiciones de transporte y almacenamiento que minimicen la pérdida de humedad, controlen la temperatura, prevengan la contaminación microbiana y provean de protección mecánica a los medios preparados. Se deberían etiquetar adecuadamente los medios con los números de lote, fechas de preparación y de caducidad e identificación de los mismos. Los medios se deberían almacenar conforme a las instrucciones del fabricante. Los medios preparados en el laboratorio deberían almacenarse bajo condiciones validadas. No almacenar un agar a temperaturas iguales o bajo Oº ya que el congelamiento podría perjudicar la estructura del gel. Proteger los medios almacenados de su exposición a la luz y tem-
USP 39
Información General/ (1117) Óptimas Prácticas de Laboratorio 1471
peraturas excesivas. Antes de un almacenamiento prolongado, se deberían colocar las placas de agar en envases sellados para retardar la pérdida de humedad. La fusión de los medios sólidos en su envase original debería realizarse una sola vez para evitar que la calidad de los medios se deteriore por sobrecalentamiento o posible contaminación. Para volver a fundir se recomienda el uso de un baño de agua caliente o vapor fluente. Es común que se empleen hornos de microondas y placas de calentamiento, pero se debe tener cuidado de no dañar los medios por sobrecalentamiento y de la posibilidad que el personal de laboratorio se lesione por quemaduras o rotura de cristales. El medio de agar líquido debería colocarse en un baño de agua controlado a una temperatura entre 45º y 50º durante no más de 8 horas. Se debe tener cuidado al verter medios contenidos en un envase sumergido en un baño de agua para evitar que el agua del baño se mezcle con los medios estériles. Se recomendaría que antes de verter los medios se seque el exterior del envase. Para eliminar los medios de cultivo usados (como también los medios vencidos) se deberían seguir los procedimientos de seguridad de riesgo biológico locales.
Pruebas de Control de Calidad Mientras que los medios para crecimiento pueden prepararse en un laboratorio a partir de componentes individuales, muchos laboratorios facilitan su tarea usando medios deshidratados o adquiriendo medios comercialmente preparados en placas de plástico o envases de vidrio. Los fabricantes de medios tratan de estandarizar las materias primas de fuentes biológicas, aunque constantemente deben lidiar con las inevitables diferencias provenientes de fuentes naturales y, por ello, se debe tener en cuenta la variabilidad lote a lote. Además, el desempeño de los medios preparados en un laboratorio o por un fabricante dependen, en gran medida, de las condiciones de preparación y almacenamiento. La preparación inadecuada de los medios puede resultar en condiciones no satisfactorias para crecimiento o recuperación microbiana y dar resultados no confiables. Por lo tanto, las pruebas de control de calidad deberían realizarse a todos los medios preparados, incluidos los medios asociados con hisopos o medio en tiras y demás formatos no tradicionales. Las pruebas que rutinariamente se realizan en medios preparados internamente deberían incluir pH, promoción de crecimiento, inhibición y propiedades indicativas (según sea apropiado), y controles periódicos de estabilidad para confirmar la fecha de caducidad. Cuando los medios microbiológicos preparados internamente se preparan y esterilizan de forma adecuada empleando un método validado, las pruebas de promoción de crecimiento pueden limitarse a cada lote de medios deshidratados, a menos que se especifique algo diferente en el método farmacopeico pertinente. Si el procedimiento de la preparación de medios no fue validado, cada lote de los medios debería someterse a pruebas de promoción de crecimiento. Se pueden seleccionar organismos de prueba a partir del capítulo de pruebas farmacopeicas apropiado. Asimismo, los microorganismos usados en la prueba de promoción de crecimiento pueden basarse en la recomendación del fabricante de un medio en particular o puede incluirse una muestra ambiental representativa (aunque estos últimos no deben considerarse como requisitos farmacopéicos). Las fechas de caducidad de los medios deberían fundamentarse en pruebas de promoción de crecimiento para indicar que el desempeño de los medios todavía cumple con los criterios de aceptación hasta su fecha de caducidad. La vida útil de un lote de medios dependerá de la estabilidad de sus ingredientes y de la formulación bajo condiciones específicas, así como del tipo de cierre y del envase. Cuando un lote de medios no cumple con los requisitos de las pruebas de promoción de crecimiento, se debería iniciar una investigación para identificar la causa. La investigación debería incluir un plan de acción correctivo para evitar que el problema se repita. Cualquier partida de medio que no pase la prueba de promoción de crecimiento se considerará inadecuada para su uso. [NOTA-Resultados fallidos de la prueba de promoción de crecimiento no pueden usarse para invalidar los resultados de prueba positivos.] Algunos reactivos se utilizan con fines de diagnóstico para coadyuvar en la identificación de organismos microbianos, p.ej., reactivos de tinción de Gram y pruebas de oxidasa. Estos podrían poseer atributos que pueden ser sometidos a controles de calidad similares a los de los medios microbiológicos. Seleccionar los microorganismos estándares adecuados para realizar pruebas de control de calidad, siguiendo las instrucciones del fabricante, y realizar las pruebas de control de calidad antes de realizar una prueba de diagnóstico de una muestra desconocida. Todos los reactivos de diagnóstico pertinentes deberían someterse a una confirmación de calidad de ingreso antes de su uso. Se debe tener especial cuidado con los medios que se usan en pruebas de esterilidad (ver los requisitos en Pruebas de Esterilidad (71 )), así como en estudios de control ambiental. Los medios empleados en el control ambiental de áreas críticas deberían preferentemente estar protegidos con una doble envoltura y sometidos a esterilización terminal. Si no se realiza la esterilización terminal, los medios deberían someterse a una preincubación al 100% e inspección antes de emplearlos dentro de un área crítica. [NOTA-La prueba de promoción de crecimiento para este medio se debe realizar después de la etapa de preincubación.] Esto evitará que la contaminación con materias extrañas llegue a los ambientes controlados y de ese modo prevendrá la ocurrencia de resultados positivos falsos. Debería verificarse un nivel elevado del agar en las placas de contacto para superficies.
MANTENIMIENTO DE CULTIVOS MICROBIOLÓGICOS Los especímenes biológicos pueden ser los estándares más delicados para manipular ya que sus características y viabilidad dependen del almacenamiento y manipulación adecuados. La estandarización de la manipulación y almacenamiento de los
1472 (1117) Óptimas Prácticas de Laboratorio/ Información General
USP 39
cultivos por parte del laboratorio del usuario debería hacerse de tal modo que se minimice la posibilidad de contaminación o alteración de las características de crecimiento. El tratamiento uniforme y cuidadoso de los cultivos madre es vital para lograr la uniformidad de los resultados de las pruebas microbiológicas. Los cultivos que se empleen en pruebas farmacopeicas deberían adquirirse de una colección nacional de cultivos o de un proveedor secundario calificado. Se los puede adquirir congelados, liofilizados, en tubos con medio inclinado o en formas listas para ser usadas. La confirmación de la pureza del cultivo y la identidad del mismo debería realizarse antes de su uso en pruebas de control de calidad. Los cultivos listos para usar deberían someterse a pruebas de pureza e identidad de ingreso antes de su uso. La confirmación de identidad de cepas que se usan con mucha frecuencia en los laboratorios debería idealmente realizarse al nivel de análisis de género y especie. La preparación y resucitación de los cultivos deberían hacerse siguiendo las instrucciones del proveedor o mediante el empleo de un método establecido y validado. Se recomienda la técnica de "Lote de Siembra" ("Seed-Lot") para el almacenamiento de los cultivos madre. La muestra original de la colección nacional de cultivos o de un proveedor secundario calificado se resucita y se hace crecer en un medio adecuado. Las alícuotas de este cultivo madre (la primera transferencia o pasaje) se suspenden en un medio crioprotector, se transfieren a viales y se congelan a -30º o una temperatura más baja hasta su uso. Si se almacenan a -70º, o en formas liofilizadas, las cepas pueden guardarse indefinidamente. Estos cultivos madre congelados luego se emplean para inocular los cultivos de trabajo mensual o semanalmente. Una vez abiertos, no volver a congelar las suspensiones de células que no se usaron después de hacer un cultivo en una suspensión de trabajo. Se debería descartar la porción no usada para minimizar el riesgo de pérdida de viabilidad y la contaminación del cultivo madre. Se debería hacer seguimiento del número de transferencias de los cultivos de control de trabajo para evitar el exceso de subcultivos que incrementa el riesgo de la alteración fenotípica o mutación. El número de transferencias permisibles para pruebas farmacopéicas específicas se puede especificar en dicha prueba. Un pasaje se define como la transferencia de los organismos desde un cultivo viable a un medio fresco con crecimiento de microorganismos. Toda forma de subcultivo se considera una transferencia o pasaje.
EQUIPOS DE LABORATORIO La mayor parte de los equipos (incubadoras, baños de agua y autoclaves) está sujeta a las prácticas estándares de calificación de instalación, operación y desempeño. Además es común requerir una calibración periódica (generalmente cada año). Los equipos nuevos, vitales para la operación del laboratorio, deberían calificarse para cumplir con lo estipulado por un protocolo aprobado por la unidad de garantía de calidad (QAU, por sus siglas en inglés). Asimismo, se debería llevar a cabo la limpieza y sanitización regular del equipo, por ejemplo incubadoras, refrigeradores y baños de agua, a fin de minimizar la posibilidad de contaminación en el laboratorio. Los sellos de las puertas de las incubadoras y refrigeradores deben limpiarse y revisarse para determinar si necesitan de reparaciones. Los instrumentos (medidores de pH y espectrofotómetros) empleados en un laboratorio microbiológico deberían calibrarse con regularidad y probarse para verificar en forma rutinaria su funcionamiento. La frecuencia de la calibración y la verificación del desempeño variarán según el tipo de instrumento y la importancia de ese equipo en la generación de datos en el laboratorio. Los equipos que son difíciles de sanitizar (p.ej., refrigeradores e incubadoras) se deberían destinar exclusivamente a operaciones asépticas (tales como almacenamiento de los medios para análisis o incubación de muestras para pruebas de esterilidad) u operaciones de cultivos vivos para minimizar la posibilidad de contaminación involuntaria de las pruebas. Los autoclaves son elementos centrales para la operación del laboratorio y deben contar con validación apropiada para demostrar la esterilización adecuada de una variedad de operaciones. Los autoclaves deben estar disponibles (y validados) para esterilizar los medios usados (si dicha esterilización se realizara en el laboratorio), así como los medios preparados en ese laboratorio. La selección de uno o varios autoclaves no debe regirse por la necesidad de separar las operaciones en asépticas y no asépticas (todo lo que se mantiene adecuadamente en el autoclave es estéril después del ciclo) sino considerando la disponibilidad de recursos (ver a continuación).
DIAGRAMA DEL LABORATORIO Y OPERACIONES En el diagrama y diseño del laboratorio se deberían tener en cuenta los requisitos de buenas prácticas de microbiología y de seguridad del laboratorio. Es esencial que se trate de minimizar en lo posible la contaminación cruzada de los cultivos microbiológicos y es también importante que las muestras microbiológicas se manipulen en un medio ambiente donde se evite la contaminación. En general, un laboratorio debería estar dividido en áreas limpias o asépticas y áreas de cultivos vivos. En lo posible, las áreas donde se manejan e incuban muestras de productos estériles o ambientales deberían mantenerse completamente libres de cultivos vivos. Si no se puede tener una separación completa entre las zonas de cultivos vivos y las zonas limpias, se deberían emplear otras barreras o prácticas asépticas para reducir la posibilidad de contaminación accidental. Estas barreras incluyen vestimentas de protección, procedimientos para sanitizar y desinfectar así como cabinas de seguridad biológica designadas sólo para operaciones limpias o asépticas. Se debería disponer de procedimientos para manejar derrames o percances con cultivos vivos y todo el personal técnico pertinente debería entrenarse en cuanto a la aplicación de estos métodos.
USP 39
Información General/ (1117) Óptimas Prácticas de Laboratorio 1473
Algunas muestras demostrarán crecimiento microbiano y requerirán de análisis de laboratorio adicionales para identificar los contaminantes. Cuando se detecta crecimiento, sin demora se debería trasladar la muestra de la sección limpia del laboratorio a la sección de cultivos vivos. Los subcultivos, las tinciones, la identificación microbiana u otras operaciones investigativas deberían llevarse a cabo en la sección de cultivos vivos del laboratorio. En lo posible, no se deberían abrir muestras que contengan colonias de crecimiento en las zonas limpias del laboratorio. La separación cuidadosa de materiales y muestras contaminadas reducirá la posibilidad de obtener resultados positivos falsos. El personal que trabaja con muestras no debería entrar o trabajar en la sección de manejo de cultivos vivos del laboratorio, a menos que se observen precauciones específicas, tales como el uso de vestimentas y guantes de protección y desinfección minuciosa de manos al salir del área de trabajo. Lo ideal es que el personal asignado para llevar a cabo muestreos, especialmente quienes están dedicados al procesamiento aséptico, no trabajen en áreas adyacentes donde se realizan las operaciones de laboratorio para cultivos vivos. Es importante considerar que la contaminación microbiana de muestras es siempre posible, en particular aquella que origina falsos positivos, a menos que se tomen las debidas precauciones de asepsia. Las instalaciones deberían estar diseñadas de tal manera que las muestras de excipientes y materias primas puedan hacerse bajo condiciones controladas, incluyéndose el uso de vestimentas adecuadas y equipos esterilizados para muestreo. Puede ocurrir que no siempre se puedan llevar a cabo muestreos de sistemas, tales como los sistemas de agua, bajo condiciones de total asepsia. Sin embargo, se debería tener en cuenta que cuando las muestras no se toman asépticamente inevitablemente su confiabilidad es dudosa. Los métodos de muestreo ambiental deberían requerir una manipulación aséptica mínima durante la carga y descarga de los instrumentos de muestreo. Cuando sea posible, el equipo de muestreo debería cargarse con el medio microbiológico de recuperación en el ambiente donde se realizará el muestreo. Todas las pruebas de laboratorio que se usan para los procedimientos de prueba de mayor importancia, tales como las pruebas de esterilidad de las formas farmacéuticas finales, las de productos a granel, las de siembras de cultivo para producción biológica o para cultivos de células que se emplean en producción biológica, deberían realizarse bajo condiciones controladas. La tecnología de los aisladores también es adecuada para las pruebas microbiológicas estériles de mayor importancia. Los aisladores han demostrado tener menores niveles de contaminación ambiental que los cuartos limpios con personal en ellos y, en consecuencia, existe por lo general menor posibilidad de generar falsos positivos. Es crucial hacer la validación adecuada de aisladores tanto para asegurar la integridad ambiental como para prevenir la posibilidad de generar falsos negativos como resultado de la desinfección química de materiales que se ingresan o usan dentro de los aisladores (ver Pruebas de EsterilidadValidación de Sistemas Aisladores (1208)).
MANIPULACIÓN DE MUESTRAS Los microorganismos viables en la mayoría de las muestras microbiológicas, particularmente muestras de agua, monitoreo ambiental y biocarga, son sensibles a las condiciones de manipulación y almacenamiento. Los parámetros críticos en estas condicoines incluyen la composición del producto (o muestra), composición del recipiente, tiempo de almacenamiento y temperatura de almacenamiento. Por lo tanto, es importante minimizar el tiempo entre el muestreo y el inicio de la prueba y controlar, en la medida de lo posible, las condiciones de almacenamiento. Si la muestra va a ser transportada a un lugar distante para su análisis, entonces se deberían calificar las condiciones de transporte (tiempo, temperatura, etc.) adecuadas para dicha prueba y muestra. Se pueden encontrar pautas para el análisis de agua con relación a este tema en Agua para Usos Farmacéuticos (1231 ).- Puede ser necesario evaluar el mezclado del producto y realizarlo antes del muestreo a fin de asegurar la dispersión de los microorganismos y la representatividad de la alícuota de muestra. Todas las muestras microbiológicas se deberían tomar usando técnicas asépticas, incluyendo aquellas tomadas de productos no estériles. De ser posible, todas las muestras microbiológicas se deben tomar en condiciones absolutamente asépticas en áreas de muestreo especializadas. Estas áreas deberían estar tan cerca como sea posible del lugar donde se van a usar para minimizar la contaminación durante el traslado. Las muestras entregadas al laboratorio microbiológico deberían estar acompañadas por documentación que detalle el origen de la muestra, la fecha en que se tomó la muestra, la fecha de entrega de la muestra, la persona o departamento responsable de la entrega y cualquier material potencialmente peligroso asociado con la muestra. El departamento de análisis debería acusar recibo de la muestra y corroborar la identidad y número de muestras como parte de esta documentación.
TIEMPOS DE INCUBACIÓN DE MEDIOS MICROBIOLÓGICOS Los tiempos de incubación para pruebas microbiológicas de menos de 3 días de duración se deberían expresar en horas: p.ej., "Incubar a una temperatura de 30º a 35º durante 18 a 72 horas". Las pruebas con una duración mayor de 72 horas se deberían expresar en días: p.ej., "Incubar a una temperatura de 30º a 35º durante 3 a 5 días". Para tiempos de incubación expresados en horas, incubar durante el tiempo mínimo especificado y ejercer buen criterio microbiológico cuando sea necesario exceder el tiempo de incubación. Para tiempos de incubación expresados en días, las incubaciones iniciadas en la mañana o después del medio día deberían concluirse generalmente a la misma hora del día.
1474 (1117) Óptimas Prácticas de Laboratorio/ Información General
USP 39
CAPACITACIÓN DEL PERSONAL Cada persona involucrada en cualquiera de las fases de fabricación farmacéutica debería poseer la educación, la capacitación y la experiencia necesarias para cumplir con su trabajo. Las exigencias de las pruebas microbiológicas requieren que los operarios, supervisores y gerentes tengan una previa y sólida educación en microbiología o en otro campo científico vinculado a la biología. Se les debería asignar responsabilidades acordes a su nivel de capacitación y experiencia. Es necesario mantener un sistema coherente de procedimientos operativos estándares (POE) para el funcionamiento del laboratorio microbiológico. Estos procedimientos sirven para lograr dos finalidades en un programa de capacitación. En primer lugar, estos POE describen la metodología que los microbiólogos seguirán para obtener resultados reproducibles y precisos y que, a la vez, sirvan de base para la capacitación. En segundo lugar, registrando los procedimientos que domina un microbiólogo en particular, el número o título del procedimiento sirve también para identificar el tipo de capacitación específica de su trabajo, que haya recibido el microbiólogo. Se deberían establecer programas de capacitación para cada miembro del laboratorio teniendo en consideración sus funciones laborales. El personal del laboratorio no debería realizar pruebas microbiológicas en forma independiente hasta estar capacitado para llevarlas a cabo. El historial de capacitación debe estar al día, documentando el entrenamiento del microbiólogo en la revisión vigente de cada POE en particular. Una evaluación periódica del desempeño del personal es una sabia inversión en la calidad de datos. Esta evaluación de desempeño debería generar evidencia sobre la competencia en las actividades principales de los laboratorios microbiológicos, tales como higiene, siembra en placas, técnicas asépticas, documentación y otras áreas vinculadas a la función del microbiólogo. Los microbiólogos con responsabilidades gerenciales o de supervisión deberían tener una educación apropiada para tal cargo y la capacitación, provista por su empleador, en habilidades de supervisión, medidas de seguridad laboral en el laboratorio, planificación, presupuesto, investigación, redacción de informes técnicos, en los POE pertinentes y demás aspectos de importancia referentes a los procesos de la empresa cuando los mismos estuviesen vinculados a funciones directivas de un laboratorio. La competencia se puede demostrar mediante trabajos específicos, experiencia pertinente y capacitación profesional continua. Conseguir una certificación a través de un organismo acreditado constituye también una acreditación deseable. Además, se espera que los supervisores y gerentes de laboratorio cuenten con un nivel demostrado de competencia en microbiología que sea al menos tan alto como el de las personas a quienes supervisan. La pericia en microbiología se puede lograr a través de diversas rutas adicionales a los estudios académicos y a la acreditación. Se espera que cada compañia evalúe las acreditaciones de aquellos responsables del diseño, implementación y operación del programa microbiológico. Las compañias pueden, por lo tanto, asegurar que aquellos responsables del programa comprendan los principios básicos de microbiología, que puedan interpretar las pautas y reglamentaciones con el soporte científico adecuado, y que tengan acceso a individuos con conocimiento teórico y práctico en microbiología que les provea de asistencia en áreas en las que no contaran con el conocimiento y comprensión adecuados. Se debe tener en cuenta que la microbiología es una disciplina científica que trata con principios biológicos que son muy diferentes de aquellos relacionados con la química analítica e ingeniería. En muchas ocasiones es difícil para los individuos sin capacitación microbiológica específica llevar a cabo la transición.
RECURSOS DEL LABORATORIO La gerencia del laboratorio es responsable de asegurar que el laboratorio cuente con los recursos suficientes para cumplir con los requisitos de análisis existentes. Esto requiere habilidad en la administración presupuestaria y en determinar las medidas apropiadas de desempeño del laboratorio. Una medida del desempeño del laboratorio es el número de investigaciones realizadas en las pruebas que se llevan a cabo en el laboratorio, pero esta medición por sí sola no es suficiente. Además del registro de investigaciones, se debería conocer el periodo entre la entrega de la muestra y el inicio de la prueba, así como el periodo entre la finalización de la prueba y la emisión del informe (o cierre de la prueba). Los retrasos importantes que demuestran estas mediciones también son indicativos de un personal de laboratorio con escasez de recursos. La gerencia del laboratorio debería tener un presupuesto suficiente para cumplir con los requisitos de análisis. Las mediciones particulares de los requisitos presupuestarios serán específicos para un laboratorio dado, pero las consideraciones presupuestarias que se relacionan directamente con la necesidad del laboratorio de contar con recursos suficientes se deben tratar para asegurar resultados de prueba confiables.
DOCUMENTACIÓN Se debería contar con suficiente documentación para demostrar que la prueba fue hecha en un laboratorio y que se emplearon métodos adecuados. Esto incluye, pero no se limita, a la siguiente documentación: • Capacitación de microbiólogos y verificación de competencia • Validación, calibración y mantenimiento de equipos • Desempeño de equipos durante la prueba (p.ej., registradores gráficos de 24 horas/7 días a la semana) • Preparación de medios, controles de esterilidad, promoción de crecimiento y capacidad de selectividad • Inventarios de los medios y pruebas de control • Aspectos críticos de las pruebas realizadas según lo especifica un procedimiento
USP 39
Información General/ (1117) Óptimas Prácticas de Laboratorio 1475
• Verificación de datos y cálculos • Informes revisados por la unidad de garantía de calidad (QAU) o por un gerente responsable calificado • Investigación de desviaciones de datos (cuando sea necesario)
MANTENIMIENTO DE LOS REGISTROS DEL LABORATORIO Es crucial que se mantengan registros adecuados de datos y estudios para el óptimo funcionamiento del laboratorio microbiológico. El principio fundamental es que la prueba se lleve a cabo siguiendo la descripción del POE, que éste esté escrito de manera que refleje cómo realmente se realiza la prueba y que el cuaderno del laboratorio suministre todos los detalles de mayor importancia para reconstruir los detalles del análisis y para confirmar la integridad de los datos. Como mínimo, un informe de laboratorio debería incluir lo siguiente: •Fecha • Material analizado • Nombre del microbiólogo • Número de procedimiento • Registro de los resultados de la prueba • Desviaciones (si se presentaran) • Parámetros documentados (equipos usados, cultivos microbiológicos madre usados, lotes de los medios usados) • Firma de la segunda revisión/Gerencia Cada pieza crítica de equipo debería figurar en el informe y además todo debería estar bajo un plan de calibración, documentado en un POE y un libro de registro de mantenimiento. Según los casos, se debería contar con registros o formularios que respalden los registros del cuaderno del laboratorio. Las temperaturas de los equipos (baños, incubadoras, autoclaves) deberían registrarse y ser rastreables. En el informe se debería incluir en forma explícita el POE vigente y todas sus revisiones. Los cambios en los datos deberían tacharse con una línea e incluir las iniciales. No se debería borrar ni usar correctores para cubrir los datos originales. Los resultados de las pruebas deberían incluir el recuento original en placas para permitir que el revisor pueda reproducir los cálculos usados para obtener los resultados finales. Los métodos para el análisis de datos deberían detallarse en los POE que se citan. Si se incorporan tablas o gráficas en los cuadernos de laboratorio, estos deben asegurarse con cinta transparente y no deben obstruir ningún dato de la página. La tabla o gráfica debe estar firmada por la persona que agrega el documento, con la firma sobrepuesta en la página de la tabla y en el cuaderno. Los cuadernos del laboratorio deberían incluir número de página, un índice para referencia y un cronograma de uso intacto. Se deberían archivar todos los registros de laboratorio y protegerlos contra pérdidas catastróficas. Se debe establecer un programa formal de retención y recuperación de registros.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS DE LAS VALORACIONES Los resultados de las valoraciones microbiológicas analíticas pueden ser de difícil interpretación debido a varias razones importantes: (1) Los microorganismos se encuentran en todas partes y los contaminantes ambientales comunes, particularmente los organismos asociados al ser humano, predominan en muchos tipos de análisis microbiológicos; (2) el analista corre el riesgo de introducir organismos contaminantes durante la manipulación de la muestra o durante el procesamiento de la misma en el laboratorio; (3) los microorganismos pueden no estar distribuidos en forma homogénea dentro de una muestra o ambiente; y (4) las valoraciones microbiológicas están sujetas a una considerable variación respecto a sus resultados. Por lo tanto, diferencias aparentes de un resultado esperado puede que no sean importantes. Debido a estas características de los análisis microbiológicos, los estudios de laboratorio deberían llevarse a cabo con la mayor precaución posible para evitar la contaminación exógena, como se discutió previamente en este capítulo. Igualmente importante es que los resultados se interpreten a partir de una perspectiva microbiológica amplia que tenga en cuenta no sólo la naturaleza del contaminante putativo sino también la posibilidad de que ese organismo u organismos sobrevivan en el ingrediente farmacéutico, el excipiente o el ambiente en análisis. Además, las características de crecimiento del microorganismo deberían tenerse en cuenta (especialmente en lo que se relaciona al crecimiento de hongos filamentosos en medios líquidos). Cuando se observan resultados que no se ajustan a una monografía farmacopeica o a otros criterios de aceptación conocidos, es necesario llevar a cabo una investigación en la desviación de los datos microbianos (MDD, por sus siglas en inglés). Existen generalmente dos razones diferentes para la observación de contaminación microbiana que no cumple con un requisito u objetivo: existe un error de laboratorio o condiciones ambientales de laboratorio que generaron un resultado inválido o el producto contiene un nivel de contaminación o tipos específicos de contaminantes fuera de los niveles o de los límites establecidos. En cualquiera de los casos, la gerencia del laboratorio y, en la mayoría de los casos, la Unidad de Calidad deberían ser notificadas de inmediato. Se debería realizar una evaluación integral y completa de la situación del laboratorio en que se origina el resultado. Todas las condiciones microbiológicas o los factores que pudieran generar la condición observada deberían tenerse en cuenta, incluyéndose la magnitud de la detección comparada con los límites o niveles establecidos. Asimismo, se puede requerir de un estimado de la variabilidad del ensayo para determinar si el hallazgo es significativo.
1476 (1117) Óptimas Prácticas de Laboratorio/ Información General
USP 39
El ambiente de laboratorio, las condiciones de protección establecidas para el muestreo, los hallazgos históricos del material en análisis y la naturaleza del material, especialmente en lo relacionado con la supervivencia de los microbios o la proliferación de los mismos al producirse contacto con el material, se deberían considerar en la investigación. Adicionalmente, entrevistas a los analistas de laboratorio pueden suministrar información respecto a cómo realmente se realizó la valoración, pudiendo ser de gran valor para determinar la confiabilidad del resultado y proseguir con la acción adecuada. Si se identifica que las operaciones de laboratorio fueron la causa del resultado anómalo de la prueba, se debería establecer un plan de acción correctiva para solucionar el problema o los problemas. Luego de aprobado e implementado el plan de acción correctivo, se debería hacer un seguimiento cuidadoso de la situación y determinar si la acción correctiva es la adecuada. Si se invalidan los resultados de la valoración con base al hallazgo de un error atribuible, esta acción se debe documentar. Los laboratorios también deberían tener procedimientos aprobados para pruebas confirmatorias (repetición de la prueba) y, si fuera necesario, para nuevos muestreos cuando las guías farmacopeicas o regulatorias específicas no reglamentan la forma de realizar la investigación de una valoración.
(1118) DISPOSITIVOS DE MONITOREO-TIEMPO, TEMPERATURA Y HUMEDAD INTRODUCCIÓN Este capítulo contiene información general sobre la ciencia y tecnología del monitoreo de la temperatura y humedad con el transcurso del tiempo. En él se describen las tecnologías existentes y sus características de funcionamiento y se proporcionan recomendaciones para la calificación del funcionamiento. La vida útil de un medicamento depende de las condiciones de temperatura y humedad durante el almacenamiento y transporte, así como de las propiedades químicas y físicas del medicamento. Por esta razón, es importante poder monitorear dichas condiciones durante el transporte y almacenamiento de medicamentos sensibles a la temperatura y a la humedad. Este capítulo se enfoca estrictamente en los dispositivos de monitoreo de temperatura y humedad tanto electrónicos como químicos de la cadena de distribución. Las temperaturas de almacenamiento y distribución pueden ser diferentes cuando se justifique mediante estudios apropiados de estabilidad y conforme se indica en el etiquetado. Los efectos de la humedad a menudo se observan durante los periodos más largos de exposición, a diferencia de los efectos de la temperatura, debido a las barreras contra el ingreso de humedad presentes en el envasado primario y secundario del medicamento. Los dispositivos descritos en este capítulo son los de uso más común para monitorear el almacenamiento controlado y la distribución establecida de medicamentos siguiendo las Buenas Prácticas de Distribución (BPD). 1 Este capítulo no trata la medición de temperaturas extremas, las cuales se definen como temperaturas que están por encima de los niveles a los que se expondrían los medicamentos en la cadena de distribución. Los tipos de dispositivos descritos en este capítulo se usan actualmente a nivel mundial en la distribución de productos farmacéuticos, así como en otras industrias similares que requieren de controles de temperatura durante la distribución (por ejemplo, las industrias de alimentos perecederos, componentes sanguíneos y dispositivos médicos). Algunos de estos dispositivos se pueden colocar en artículos individuales para el usuario final (por ejemplo, en los viales de vacunas del programa de inmunización mundial de la Organización Mundial de la Salud (OMS)/ UNICEF). 2 Se deben seguir prácticas adecuadas de reciclaje para todos los dispositivos conforme a lo requerido por las normas locales.
Cambio en la redacción:
DISPOSITIVOS DE MEDICIÓN DE TEMPERATURA Termómetros de Alcohol o Mercurio Estos dispositivos se basan en la variación del volumen de un líquido en función de la temperatura. Ambos tipos de termómetros pueden estar diseñados para indicar temperaturas máximas y mínimas (ver el capítulo •Advertencias y Requisitos Generales, 6.80.30. Dispositivos de Medición de Temperatura. (AF01-may-Z016) para más información). Históricamente, estos tipos de termómetros se usan más en ambientes de laboratorio o farmacia que durante el monitoreo de la cadena de distribución. Los termómetros de alcohol pueden tener una precisión de hasta 0,01 º, pero deben ser bastante grandes para poder medir temperaturas comprendidas en intervalos de más de unos pocos grados.
PDA Technical Report 52 (TR 52) Guidance for Good Distribution Practices (GDPs) For the Pharmaceutical Supply Chain. World Health Organization (WHO)-UNICEF Policy Statement on the lmplementation of Vaccine Vial Monitors: The Role of Vaccine Vial Monitors in lmproving Access to lmmunization, http://whqlibdoc.who.int/hq/2007 /WHO_IVB_07 .04_eng.pdf. 1
2
USP 39
Información General/ (1118) Dispositivos de Monitoreo 1477
Normalmente, los termómetros de mercurio se utilizan en un intervalo de temperaturas de Oº a 50º, con una precisión de aproximadamente O, 1º. Los termómetros de mercurio están sujetos a ciertas reglamentaciones locales, y muchos estados y dependencias locales han legislado o desarrollado programas de recolección o intercambio de dispositivos que contienen mercurio. La Agencia de Protección Ambiental de los EE.UU. (U.S. Environmental Protection Agency) también emite reglamentaciones que requieren a la industria reducir la liberación de mercurio en el aire y en el agua, así como tratar y eliminar adecuadamente los desechos de mercurio para evitar riesgos potenciales para la salud.3 La organización Salud Sin Daño y la OMS colideran una Iniciativa Mundial Conjunta de Reemplazo de Productos para el Cuidado de la Salud (Health Care lnitiative Products Partnership) para reducir la demanda de dispositivos que contienen mercurio en al menos 70% para el 2017 y para trasladar la producción hacia alternativas sin mercurio exactas, económicas y más seguras. 4 Los termómetros de alcohol y mercurio son más frágiles que los otros dispositivos de medición de temperatura descritos en este capítulo.
Dispositivos Infrarrojos Estos dispositivos se usan para medir el calor radiante infrarrojo (IR) del artículo cuya temperatura se desea medir. La lectura IR varía en función de la temperatura del objeto. La ventaja de este tipo de dispositivos es que el artículo puede estar a cierta distancia del sensor IR. Los dispositivos IR pueden proveer lecturas de temperaturas inexactas que son más altas o más bajas a las reales debido a las características superficiales de los empaques (p.ej., superficies negras en comparación con superficies blancas), además del error potencial por parte del operador debido al uso incorrecto del lector IR (ángulo impropio).
Termómetros de Resistencia El termómetro de resistencia (RTD, por sus siglas en inglés) se basa en el cambio en la resistencia eléctrica de un material en función de la temperatura. Su precisión y exactitud dependen de la calidad de los componentes electrónicos utilizados para medir la resistencia. Aunque los termómetros de resistencia se encuentran entre los sensores de temperatura más estables y exactos, su exactitud puede variar con el tiempo y la temperatura del dispositivo debido a que sus componentes electrónicos se ven afectados por el tiempo y el uso. Aunque todos los dispositivos de medición de la temperatura deben situarse en un programa de calibración apropiado, según lo recomendado por el fabricante o lo determinado por el usuario del dispositivo, esta calibración es de particular importancia para los termómetros de resistencia.
Dispositivos de Estado Sólido Los dispositivos de estado sólido se basan en el efecto de la temperatura sobre un circuito integrado (ver Termistor) o sobre un sistema micromecánico o microeléctrico. Estos dispositivos comúnmente se denominan registradores de datos y pueden alcanzar una alta precisión y además, tienen la ventaja de producir un registro digital.
Termistores Un termistor es un dispositivo basado en semiconductores, cuya resistencia varía en función de la temperatura. Los termistores pueden detectar variaciones muy pequeñas de temperatura y son exactos en intervalos de temperatura muy amplios.
Termopares Los termopares se basan en la variación de potencial en la unión de dos metales diferentes en función de la temperatura. Pueden utilizarse una gran variedad de pares de metales diferentes, y cada par permite obtener un intervalo, exactitud y precisión propios. La precisión y exactitud dependen de la calidad de los componentes electrónicos utilizados para medir el voltaje entre ambos metales y del tipo de referencia térmica utilizada.
Dispositivos Termomecánicos Los dispositivos termomecánicos se basan en la variación de longitud de un material sólido en función de la temperatura. Un ejemplo de estos dispositivos es un resorte mecánico, el cual se dilata o se contrae en función de la temperatura y, de esta forma, abre y cierra un circuito eléctrico o mueve la pluma de un graficador. Los ejemplos típicos son los registradores gráficos usados en cuartos fríos.
l 4
http://www.epa.gov/espanol/mercurio/. http://www.noharm.org/salud_sin_danio/.
1478 (1118) Dispositivos de Monitoreo / Información General
USP 39
REGISTRADORES ELECTRÓNICOS DE HISTORIAL DE TIEMPO-TEMPERATURA Estos registradores usan una de las tecnologías electrónicas de medición de temperatura antes descritas y crean un historial de la temperatura experimentada.
Indicadores Electrónicos de Tiempo
y Temperatura
Los indicadores electrónicos de tiempo y temperatura (ITI) pueden diseñarse para emitir una alarma por exceso de frío, por exceso de calor o por desviaciones múltiples de temperatura, y pueden proveer una alarma visual mediante una luz de color o una pantalla de cristal líquido. Por lo general, las alarmas son programables y pueden mostrar condiciones tales como fecha, tiempo, temperatura y duración de la alarma. Los certificados de calibración se emiten para unidades individuales o lotes. Los dispositivos de usos múltiples deben contar con un programa de calibración, aunque se puede confiar en los certificados de calibración de los fabricantes para los dispositivos de un solo uso.
Registradores Electrónicos para Datos de Temperatura Los registradores electrónicos para datos de temperatura son registradores que monitorean la temperatura a intervalos programables y transfieren el historial de temperatura a un sistema periférico, como por ejemplo una computadora personal. Asimismo, los registradores de datos pueden registrar la humedad usando los sensores que se describen a continuación. Los registradores electrónicos monitorean y guardan los valores de temperatura representativos del historial de temperatura acumulado durante un cierto periodo y, por consiguiente, tienen la ventaja de poder calcular la temperatura cinética media (MKT, por sus siglas en inglés) 5 basándose en las mediciones. Los registradores de datos equipados con dispositivos de transmisión (transmisión por radio o cableado) pueden utilizarse para monitorear la temperatura y la humedad de un producto en tránsito, y pueden descargar los datos registrados cuando el registrador de datos ha llegado a su destino. Existe una creciente demanda por parte de los ministerios de salud a nivel mundial para el uso de registradores de datos como parte de un sistema de calidad estándar para buenas prácticas de distribución. Basándose en sus capacidades de comunicación, los registradores de datos pueden clasificarse en distintas categorías.
Registradores de Datos con Radiotransmisores Además de los registradores de datos que requieren una conexión con cableado a una unidad de base o computadora, recientemente las compañías han adaptado registradores inalámbricos (radiofrecuencia o con capacidad de radiofrecuencia) de temperatura y humedad. Se ha demostrado a través de estudios variados sobre sangre, componentes sanguíneos, anticuerpos monoclonales y vacunas, que el uso de identificación por radiofrecuencia (RFID) no tiene ningún efecto sobre los productos biológicos. 6 Estos registradores contienen chips con capacidad de comunicación inalámbrica que constituyen las etiquetas (tags) del sensor de identificación por radiofrecuencia. El chip de identificación por radiofrecuencia que está dentro de la etiqueta puede ser activo, lo cual requiere energía de una batería para su operación, o pasivo, lo cual requiere un campo de radiofrecuencia diferente de cero creado por la unidad interrogadora RFID (que comúnmente recibe el nombre de lector) en las inmediaciones de la etiqueta. Las etiquetas del sensor con capacidad de identificación por radiofrecuencia (temperatura y/o humedad) tienen la capacidad adicional de transmitir el historial de temperatura registrado de forma inalámbrica a una computadora central o a una base de datos para el procesamiento remoto continuo. Existen múltiples estándares activos y pasivos para controlar la comunicación entre la etiqueta y la unidad central, entre las que se incluyen: IS0-18000-6C/ IS0-18000-7, 8 ZigBee, 9 IEEE 802.11, 1o y muchos estándares particulares. Al seleccionar entre tecnologías activas y pasivas, es necesario tener presente que las tecnologías activas por lo general proveen un rango extenso de comunicación y capacidad de memoria a cambio de un costo más elevado. En la actualidad, los rangos de lectura se extienden hasta 100 metros y el uso de repetidores permite abarcar mayores distancias. Sin importar si el sistema de circuitos para comunicaciones es pasivo o activo, estos registradores de radiofrecuencia siguen siendo registradores electrónicos de temperatura, lo que significa que el sistema de circuitos emplea energía externa provista por baterías u otras fuentes. Se ha desarrollado una etiqueta de identificación por radiofrecuencia inalámbrica completamente pasiva con una antena capaz de funcionar como sensor. La etiqueta emplea estructuras de antena resonantes de etiquetas RFID recubiertas con películas 5 The Use of Mean Kinetic Temperature (MKT) in the Handling, 5torage, and Distribution of Temperature 5ensitive Molecules. R. H. Seevers, J. Hofer, P. Haber, D. A. Ulrich, R. Bishara. Pharmaceutical Outsourcing, May/)une, 30-37, 2009. 6 Effects of Radio Frequency ldentification-Related Radiation on In Vitro Biologics. l. Uysal, C. Hohberger, R. 5. Rasmussen, D. A. Ulrich, J. P. Emond, A. Gutierrez. PDA )ournal of Pharmaceutical 5cience and Technology, Vol. 66(4), )uly/Aug, 333-345, 2012. 7 150/IEC 18000-6:2010-150/IEC 18000-6:2010-lnformation technologyRadio frequency identification for ítem management-Part 6: Parameters for air interface communications at 860 MHz to 960 MHz. 8 150/IEC 18000-7:2009-lnformation technology-Radio frequency identification for ítem management-Part 7: Parameters for active air interface communications at 433 MHz. 9 IEEE 802.15.4-Wireless Medium Access Control (MAC) and Physical Layer (PHY) 5pecifications for Low-Rate Wireless Personal Area Networks (LR-WPANs), 2003. 10 IEEE 802.11-Wireless Local Area Networks (LANs), 2007.
USP 39
Información General/ (1118) Dispositivos de Monitoreo 1479
específicas para sensores. Las etiquetas pasivas inalámbricas de RFID actúan como sensores análogos que, cuando son interrogados por un lector inalámbrico, muestran la temperatura instantánea. La película cambia las características de reflexión de la antena basándose en la variable ambiental monitoreada (tal como temperatura y/o humedad), que es posteriormente decodificada por el lector. La película del sensor se puede diseñar para que trabaje con diferentes variables tales como temperatura, humedad y diversos vapores de gas y químicos. Aunque no tienen la misma funcionalidad de memoria de los registradores electrónicos, los sensores inalámbricos pasivos son económicos en comparación con los registradores de datos y se pueden considerar para aplicaciones al nivel de los artículos.
INDICADORES QUÍMICOS DE TEMPERATURA Los indicadores químicos de temperatura son relativamente económicos en comparación con los registradores electrónicos de datos y se pueden considerar para aplicaciones al nivel de los artículos. Existen dos tipos básicos de indicadores químicos de temperatura: 1) un indicador de umbral que responde a una temperatura específica y 2) un ITI que responde a una exposición de calor acumulativa.
Indicadores Químicos de Umbral de Temperatura Estos indicadores, en ocasiones denominados indicadores de temperaturas críticas, se basan en un cambio físico o reacción química que tiene lugar en función de la temperatura. Ejemplos de estos dispositivos son los cristales líquidos, las ceras, los polímeros y las lacas que cambian de estado físico, y por lo tanto de aspecto, en función de la temperatura. Los indicadores químicos de umbral de temperatura son reversibles o irreversibles y son aptos para altas o bajas temperaturas. Los indicadores de umbral de temperatura no incluyen retrasos de tiempo especificados para presentar una respuesta y, generalmente, son dispositivos de un solo uso. Estos indicadores proveen una señal sólo cuando se les expone a temperaturas mayores (indicador ascendente) o menores (indicador descendente) que un umbral predeterminado de temperatura. Indicadores de Umbral de Temperatura Ascendente-Los indicadores de umbral de temperatura ascendente se proveen como etiquetas o tarjetas autoadhesivas y generalmente están constituidas por un componente que se funde a la temperatura crítica. La fusión del compuesto origina un cambio de color o la aparición de un color. Otros tipos de indicadores se proveen en forma de tintas, lacas, pellets o crayones. Los indicadores de umbral de temperatura ascendente están disponibles para temperaturas desde Oº hasta más de 200º y hasta 1O temperaturas en una sola unidad. Algunos indicadores de umbral de temperatura ascendente usados para monitorear temperaturas de congelación o refrigeración requieren una etapa de activación (tales como retirar una pestaña o romper un sello de un depósito aplicando presión). Indicadores de Umbral de Temperatura Descendente-Los indicadores de umbral de temperatura descendente generan una respuesta cuando se les expone a temperaturas inferiores a un umbral determinado. Estos indicadores no incluyen un retraso de tiempo específico para generar una respuesta, y dicha respuesta generalmente es provocada por el tiempo requerido para la solidificación del líquido a la temperatura del umbral. La solidificación de un líquido ocasiona un cambio visual en el indicador. Los ejemplos incluyen: 1) la expansión del líquido hasta romper una ampolla y liberar un colorante, 2) la contracción del líquido hasta mezclar los componentes para generar un color o 3) la agregación de partículas coloidales para cambiar el color.
Indicadores Químicos de Tiempo-Temperatura Estos indicadores, en ocasiones referidos como integradores de tiempo-temperatura (ITI), incluyen sistemas que utilizan la velocidad de reacción o un proceso de difusión para estimar una temperatura equivalente integrada a lo largo del tiempo. En consecuencia, estos ITI proveen una medición del calor acumulado en lugar de una temperatura instantánea como un salto o umbrales críticos (descritos anteriormente). Las reacciones por lo por lo general son irreversibles-una vez que ocurre un cambio de color, desarrollo de color, o un proceso de difusión, la exposición a bajas temperaturas no llevará a que el indicador recupere su estado original, pero las bajas temperaturas (refrigeración) enlentecen el cambio de color. La exactitud y precisión de estos indicadores depende, en cierta medida, de la interpretación humana. Se han preparado algunas versiones de indicadores químicos usando un formato de código de barras y se pueden leer con lectores para códigos de barras. Otros desarrollos incluyen leer un indicador químico con dispositivos de imagen tales como la cámara de un teléfono inteligente. Los ITI no reflejan directamente el estado de los medicamentos a los que están adosados. En la práctica real, las características de degradación de un fármaco particular que guían la selección de un ITI adecuado, 11 se conocen gracias a estudios de estabilidad acelerados y en tiempo real que siguen pautas internacionalmente aceptadas tales como la PDA TR 53. 12 No es necesario que la energía de activación del ITI se corresponda exactamente con la energía de activación de la degradación del medicamento que se está monitoreando, y es posible que la energía de activación del medicamento no se conozca con precisión. Por lo tanto, la selección del ITI debe realizarse buscando que éste provea una advertencia temprana que indique si el fármaco se ha expuesto a calor excesivo antes de la fecha de caducidad.
11
12
ASTM Fl 416-96 (2008) Standard Guide for Selection of Time Temperature lndicators. PDA Technical Report 53 (TR 53) Guidance for lndustry: Stability Testing to Support Distribution of New Drug Products, https://store.pda.org.
1480 (1118) Dispositivos de Monitoreo / Información General
USP 39
Una característica importante de los ITI químicos es la precisión con la que puede determinarse el punto final. Para los ITI que cambian de color, se incluye una referencia de color que muestra la porción activa del ITI y el color del punto final, lo que simplifica la interpretación del ITI. La exactitud puede variar ampliamente con el control y la calidad de los procesos de fabricación. Algunos ITI se fabrican usando procedimientos que cumplen con las Reglamentaciones sobre Sistemas de Calidad para Dispositivos Médicos. Según se analiza más adelante en Calibración de Dispositivos de Monitoreo de Temperatura y Humedad, no es posible calibrar ningún dispositivo de un solo uso debido a que la prueba es, dada la naturaleza del ITI, necesariamente destructiva. Esto es análogo a cualquier producto farmacéutico debido a que no es posible calibrar o validar cada dosis, pero se deben usar procesos validados en el proceso de fabricación. Los ITI se dividen en dos tipos: aquéllos que indican el historial parcial y aquéllos que indican historial completo. Los ITI que indican el historial parcial proveen una respuesta que depende del tiempo y de la temperatura cuando ésta última excede un valor predeterminado. Un ITI que indica el historial parcial por lo regular consta de un compuesto teñido que se funde y luego se difunde a lo largo de una tira o mecha porosa una vez que la temperatura excede el punto de fusión del compuesto. El proceso de difusión del compuesto hacia la mecha depende de la temperatura y, por lo tanto, el ITI que indica el historial parcial provee una respuesta de tiempo y temperatura por encima del punto de fusión del compuesto. La migración del compuesto hacia la mecha se detiene cuando el indicador se expone a una temperatura más baja, punto en el cual se solidifica el compuesto. Estos ITI por lo regular tienen una o más ventanas de observación para monitorear la longitud recorrida por el compuesto teñido a lo largo de la mecha. Algunos indicadores se activan al retirar una película protectora que separa el compuesto teñido de la mecha, o rompiendo el depósito que contiene el compuesto teñido. Otros indicadores no requieren de activación y se deben almacenar por debajo del punto de fusión del compuesto antes de usarlos. Estos ITI que indican el historial parcial pueden durar (vida de servicio) desde algunas horas hasta varios años. Los ITI que indican el historial completo proveen una respuesta o temperatura continua; estos indicadores cambian de color o de apariencia física como resultado de la exposición al paso del tiempo, y la velocidad del cambio se incrementa con la temperatura, por lo que son sensibles a la exposición acumulativa al calor. Los ITI que indican el historial completo responden a la temperatura cinética media (ver el capítulo (1079)) y generalmente son de un solo uso, irreversibles y desechables, debido a que una vez que el color ha cambiado, no volverá a su color original.
Indicadores Químico-Físicos de Tiempo-Temperatura Este tipo de ITI se basa en un proceso de difusión o una reacción química dependiente de la temperatura. Consta de un dispositivo sensible a la presión en forma de cinta, compuesto por una cinta indicadora y una cinta activadora. En un ejemplo, la cinta indicadora contiene un precursor colorante disperso en un portador polimérico. El activador se incorpora a un adhesivo sobre la cinta activadora. La laminación de la cinta activadora sobre la cinta indicadora produce la activación. Cuando el activador migra al indicador en función de la temperatura y el tiempo aparece un cambio de color o un mensaje legible. Otros enfoques para desarrollar los cambios de color incluyen el uso de un indicador de pH o el grabado de aluminio por parte de la cinta activadora.
Indicadores Químicos de Tiempo-Temperatura Basados en Polimerización Este tipo de ITI utiliza un proceso de polimerización en estado sólido en el que tiene lugar un cambio en la intensidad del color en función del tiempo y la temperatura. La evolución del color es ocasionada por la polimerización de un monómero incoloro a un polímero altamente coloreado. Estos ITI pueden aplicarse mediante un proceso de impresión que permite su integración directa en la etiqueta de un producto o etiqueta separada. Como este tipo de ITI no requiere activación, debe ser despachado de fábrica en hielo seco o en condiciones de congelación y debe almacenarse a las temperaturas indicadas por las instrucciones del fabricante, normalmente por debajo de -24º, antes de su uso. Los ITI químicos basados en polimerización se pueden diseñar para alcanzar el punto final en tan sólo algunas semanas a la temperatura de refrigeración o con el paso de muchos años a temperatura ambiente controlada.
Indicadores Químicos de Tiempo-Temperatura Basados en Enzimas Este tipo de ITI utiliza una reacción generadora de color catalizada por enzimas que tiene lugar en función del tiempo y la temperatura. El cambio de color es causado por una enzima que reacciona con un sustrato, acompañado por un cambio en el pH. La enzima y el sustrato se encuentran en soluciones separadas en compartimentos adyacentes. Al romper la barrera entre los dos compartimentos y mezclar las dos soluciones, el ITI se activa.
Indicadores Químicos de Tiempo-Temperatura Basados en Pigmentos Orgánicos Este tipo de ITI usa un pigmento orgánico que se activa mediante la exposición a la luz ultravioleta para desarrollar un color inicial azul oscuro. Posteriormente, se coloca un filtro sobre la etiqueta para protegerlo de la reactivación deliberada o accidental. El pigmento teñido se decolora con el paso del tiempo en función de la temperatura.
USP 39
Información General/ (1118) Dispositivos de Monitoreo 1481
TECNOLOGÍAS DE MEDICIÓN DE LA HUMEDAD RELATIVA La humedad relativa puede definirse como la relación entre la presión parcial de vapor de agua en el aire y la presión de vapor de aire saturado a una temperatura dada. En otras palabras, la humedad relativa es la cantidad de vapor de agua presente dividida por la cantidad teórica de vapor de agua que podría contener ese volumen de aire a una temperatura determinada. Existen extensas tablas de datos sobre humedad relativa. Los dispositivos para medir la humedad relativa reciben el nombre de higrómetros. Existen diversas tecnologías para medir la humedad relativa.
Psicrómetro El tipo de higrómetro más simple se basa en la diferencia de temperatura observada entre dos termómetros idénticos, uno común y el otro con una malla de tela húmeda sobre el bulbo. Los dos termómetros se hacen girar en el extremo de una cadena y la evaporación de agua de la malla enfría el termómetro del bulbo húmedo debido al enfriamiento por evaporación. Luego, se compara la diferencia de temperaturas entre el termómetro húmedo y el seco con una tabla, específica para ese psicrómetro y basada en la temperatura del bulbo seco, y se determina así la humedad relativa.
Higrómetro de Cabello Este tipo de dispositivo se basa en el hecho de que la longitud de un cabello sintético o humano aumenta en función de la humedad relativa. Este cambio se utiliza para mover un indicador o afectar un medidor de tensión. Los higrómetros de cabello pueden tener una exactitud de ±3%, pero no responden a cambios rápidos en la humedad y pierden exactitud a niveles muy altos o muy bajos de humedad relativa.
Higrómetro Infrarrojo Este tipo de higrometro determina la humedad relativa comparando la absorción de dos longitudes de onda diferentes de radiación IR a través del aire. Una de las longitudes de onda es absorbida por el vapor de agua y la otra no. Este tipo de higrómetro puede medir en forma exacta la humedad relativa en volúmenes de aire grandes o pequeños. Es sensible a las variaciones rápidas de humedad y puede integrarse a un sistema de manejo de datos electrónico.
Higrómetro de Punto de Rocío Este tipo de dispositivo utiliza un espejo enfriado para determinar el punto de rocío de una muestra de aire. El punto de rocío es la temperatura a la que el vapor de agua presente en el aire comienza a condensarse, es decir, la temperatura en la que la humedad relativa es 100%. La humedad relativa puede calcularse a partir de esta medición y de una medición exacta de la temperatura ambiente. El higrómetro de punto de rocío es el estándar contra el cual se calibran la mayoría de los instrumentos disponibles comercialmente.
Higrómetro Capacitivo de Película Delgada El principio de este tipo de higrómetro es que el dieléctrico de un polímero no conductor cambia en proporción directa a la humedad relativa. Este cambio se mide como una variación en la capacitancia. Este tipo de higrómetro tiene una exactitud de ±3%.
Higrómetro Resistivo de Película Delgada Este tipo de higrómetro es similar al higrómetro capacitivo de película delgada puesto que utiliza el efecto producido por el cambio de humedad relativa en un circuito eléctrico. En el higrómetro resistivo de película delgada, el sensor es un polímero orgánico cuya resistencia eléctrica cambia en proporción logarítmica a la humedad relativa. Este tipo de higrómetro tiene una exactitud de ±5%.
CALIBRACIÓN DE DISPOSITIVOS DE MONITOREO DE TEMPERATURA V HUMEDAD Los termómetros e higrómetros que se usan para proporcionar datos sobre la exposición de un producto a la temperatura y humedad, deben ser adecuados para los usos previstos. Específicamente, deben estar correctamente calibrados. Un programa de calibración asegura al usuario del dispositivo de monitoreo que el dispositivo ha sido probado con anterioridad por el fabricante o por el usuario para evaluar la aptitud para el uso que se le pretende dar. Las calibraciones deben llevarse a cabo con la frecuencia apropiada para sustentar un uso continuado. Los dispositivos de monitoreo utilizados en la fabricación, almacenamiento y transporte de medicamentos deben ser calificados debidamente por sus usuarios para asegurar que fueron recibidos
1482 (1118) Dispositivos de Monitoreo / Información General
USP 39
y mantenidos en condiciones de buen funcionamiento. Resulta aceptable la calibración realizada por el fabricante del dispositivo que se detalla en el certificado de calibración y la fecha de caducidad. En el caso de dispositivos para el monitoreo de la temperatura y la humedad, la exactitud de las mediciones se refiere a la proximidad del valor obtenido con un determinado dispositivo y al valor real del objeto o ambiente que se está midiendo. En la práctica, esto se determina por comparación con un dispositivo calibrado contra un estándar que se obtiene del Instituto Nacional de Normas y Tecnología (NIST, por sus siglas en inglés), o de una organización nacional de metrología comparable. Todo dispositivo de monitoreo tarda un cierto tiempo en responder a una variación en la temperatura o humedad. La capacidad de respuesta de la medición por lo general se define en las especificaciones de un dispositivo para su intervalo de operación. Los diferentes intervalos de registro de datos son apropiados para monitorear aplicaciones y se deben basar en la longitud de la cadena de distribución (por ejemplo, el transporte por vía marítima puede requerir intervalos de 30 minutos, mientras que los intervalos de 15 minutos pueden ser adecuados para el transporte aéreo). Normalmente, la exactitud del tiempo se expresa como un ± porcentaje de la duración total del período de registro. En el caso de aplicaciones farmacéuticas, una exactitud de tiempo de ±0,5% es adecuada. Los indicadores electrónicos y químicos de un solo uso deben seguir las Buenas Prácticas de Fabricación con controles de prueba apropiados. Los indicadores electrónicos requieren calibración apropiada. El desempeño de indicadores de un solo uso puede ser calificado por el usuario de la cadena de distribución mediante el muestreo y análisis de múltiples lotes de producción. Para los ITI que calculan la temperatura cinética media, puede evaluarse el funcionamiento de una partida en forma estadística, sometiendo una muestra del tamaño adecuado a condiciones de temperatura elevada durante un período establecido de tiempo y observando los resultados. Los fabricantes deben adoptar criterios de aceptación apropiados. Resulta aceptable el uso de la prueba de liberación realizada por el fabricante del indicador (basándose en el certificado de calibración o en el certificado de análisis y en la fecha de caducidad) en lugar de la calibración o de la calificación.
USO DE DATOS HISTÓRICOS DE TEMPERATURA Aunque pueden utilizarse las tendencias geográficas y estacionales históricas como herramienta de planificación para seleccionar los tipos de dispositivos de monitoreo de la temperatura y humedad, las temperaturas ambiente externas no necesariamente constituyen indicadores confiables de las temperaturas experimentadas por diferentes artículos en la cadena de distribución. Por ejemplo, estudios indicaron desviaciones importantes con respecto a la temperatura ambiente durante los días de verano en el caso de buzones, camiones y depósitos. B Por lo tanto, resulta beneficioso usar el monitoreo de temperatura en canales de distribución específicos cuando los fabricantes y transportistas desarrollan un perfil ambiental y puede ser un punto valioso a tomar en cuenta en un enfoque basado en riesgos para mantener la calidad del producto. 14 La calidad de un medicamento (identidad, contenido y pureza) se puede ver notoriamente influenciada por variaciones en la temperatura y la humedad durante el transcurso de su vida útil, por lo que los fabricantes deben monitorear apropiadamente dichas condiciones ambientales. Los fabricantes farmacéuticos llevan a cabo análisis de estabilidad para evaluar cuidadosamente los efectos de la temperatura y la humedad en sus productos. El envasado, la vida útil, las condiciones de almacenamiento y transporte recomendadas para un producto se seleccionan basándose en los resultados de estos estudios de estabilidad. Los efectos de la temperatura pueden presentarse con rapidez; por lo tanto, el monitoreo de la temperatura debe implementarse en un enfoque basado en riesgos tomando en cuenta la estabilidad del producto, la vía de distribución, el modo de transporte y los riesgos potenciales que pudieran comprometer la calidad del producto. Los efectos de la humedad relativa ocurren en un lapso de tiempo mucho mayor; el monitoreo de la humedad puede omitirse cuando el medicamento cuenta con una protección suficiente provista por el envase primario, conforme se demuestre mediante estudios rigurosos de estabilidad. El monitoreo de la humedad es recomendable cuando se definen restricciones ambientales especiales para el medicamento relacionadas con la humedad.
(1119) ESPECTROSCOPÍA EN EL INFRARROJO CERCANO INTRODUCCIÓN La espectroscopía en el infrarrojo cercano (NIR, por sus siglas en inglés) es una rama de la espectroscopía vibracional que tiene muchos principios en común con otras mediciones espectroscópicas. La región espectral del infrarrojo cercano incluye dos subintervalos asociados a detectores usados en el desarrollo inicial del instrumental NIR. La longitud de onda corta (región de Herschel o región de silicio) se extiende aproximadamente de 780 a 1100 nm (12 821-9000 cm-1); y las longitudes de onda más largas entre 1100 y 2500 nm comprenden la región tradicional del NIR (sulfuro de plomo). Los espectros de las aplicaciones de la espectroscopía NIR se presentan tanto en unidades de longitud de onda como en número de onda. Como es el 13
Okeke, C.C. Medwick, T., Bailey, L.C., and Grady L.T. Temperature and Humidity Conditions During Shipment in lnternational Commerce, PF 25(2) Mar.-Apr.
1999. 14
ISTA 7E Standard, http://www.ista.org.
USP 39
Información General/ (1119) Espectroscopía en el IR Cercano 1483
caso de otras mediciones espectroscópicas, las interacciones entre la radiación NIR y la materia, suministran información que puede servir para evaluar la composición química de las muestras en forma cualitativa y cuantitativa. Además se pueden caracterizar cualitativa y cuantitativamente las propiedades físicas de una muestra debido a su influencia sobre los espectros NIR. Pueden realizarse mediciones directas sobre las muestras in situ además de las aplicaciones propias de los procedimientos estándares de muestreo y análisis. Las aplicaciones del análisis cualitativo incluyen la identificación de materias primas, muestras en proceso o productos terminados. Estas aplicaciones a menudo implican la comparación de un espectro NIR de una muestra con el espectro de referencia y la evaluación de las similitudes según los criterios de aceptación desarrollados y validados para una aplicación específica. Por el contrario, las aplicaciones del análisis cuantitativo implican el desarrollo de una relación predictiva entre los atributos espectrales del NIR y las propiedades de la muestra. Estas aplicaciones, por lo general, usan modelos numéricos para predecir cuantitativamente las propiedades químicas y/o físicas de la muestra en función de los atributos espectrales del NIR. En la espectroscopía vibracional en la región del NIR predominan sobretonos y bandas combinadas que son mucho más débiles que las vibraciones fundamentales del infrarrojo medio de las cuales se originan. Dado que las absortividades molares en el intervalo del NIR son bajas, la radiación puede penetrar varios milímetros en el material, incluso en los sólidos. Muchos materiales, como el vidrio, son relativamente transparentes en esta región. La tecnología de fibra óptica se implementa con facilidad en el intervalo del infrarrojo cercano, lo que permite supervisar los procesos en entornos que de otra manera podrían ser inaccesibles. Las pruebas de calificación de los instrumentos y los criterios de aceptación suministrados en este capítulo podrían no ser apropiados para todas las configuraciones instrumentales. En tales casos, se deben documentar y justificar científicamente las verificaciones de aptitud y desempeño alternativos de los instrumentos. Además, los parámetros de validación discutidos en este capítulo pueden no ser aptos para todas las aplicaciones de la espectroscopía NIR. Los parámetros de validación propios de una aplicación NIR específica deben demostrar la aptitud de la aplicación NIR para su uso previsto.
Transmisión y Reflexión Las mediciones más comunes realizadas en el intervalo espectral del NIR son las de espectroscopía de transmisión y reflexión. La radiación NIR incidente se absorbe o dispersa por la muestra y se mide como transmitancia o reflectancia, respectivamente. La espectrometría de transflexión es un híbrido de transmisión y reflexión en donde se coloca un reflector detrás de la muestra de forma que el paso óptico a través de la muestra y de regreso al detector se duplica en comparación con una medición de transmisión de una muestra del mismo espesor. La transflexión se usa para describir cualquier técnica de transmisión de doble paso. La luz se puede reflejar desde un reflector difuso o especular (espejo) colocado detrás de la muestra. Se puede adaptar esta configuración para que comparta la geometría del instrumento con ciertos sistemas de reflexión o de sondas de fibra óptica en los que la fuente y el detector están del mismo lado de la muestra. TRANSMITANCIA, T, es una medida de la disminución de la intensidad de radiación en función de la longitud de onda cuando dicha radiación se pasa a través de una muestra. Se coloca la muestra en el haz óptico situado entre la fuente y el detector. Los resultados de las mediciones de transmisión y transflexión, por lo general, se presentan directamente en términos de absorbancia, es decir, log 10 (1 /T). REFLECTANCIA, R, es una medida del cociente entre la intensidad de la luz reflejada desde la muestra, /, y la reflejada desde un fondo o superficie reflectiva de referencia, IR. La mayoría de las mediciones de reflexión en el NIR se realizan en muestras con capacidad dispersiva como polvos y suspensiones espesas. En dichos materiales, la radiación NIR puede penetrar una distancia considerable dentro de la muestra, donde puede ser absorbida cuando la longitud de onda de la radiación corresponde a una transición entre el estado vibracional fundamental del analito, y un armónico de un modo vibracional determinado (un sobretono) o la suma de dos o más modos diferentes (una banda de combinación). La radiación no absorbida se dispersa desde la muestra de regreso al detector. Los espectros de reflexión en el infrarrojo cercano se obtienen calculando y graficando la curva de log(l/R) en función de la longitud de onda. La forma logarítmica es la seudoabsorbancia del material y por lo general se denomina absorbancia.
Factores que Afectan los Espectros NIR La siguiente lista no es exhaustiva, pero incluye muchos de los factores principales que afectan los espectros NIR. Temperatura de la Muestra-La temperatura de la muestra influye en los espectros obtenidos de soluciones acuosas y otros líquidos con puentes de hidrógeno, y una diferencia de pocos grados puede ocasionar cambios espectrales significativos. La temperatura puede afectar también los espectros obtenidos de líquidos menos polares, así como de sólidos que contienen disolventes y/o agua. Humedad y Disolvente-La humedad y el disolvente presentes en el material de muestra y en el sistema analítico pueden cambiar el espectro de la muestra. Tanto la absorción por humedad como el disolvente y su influencia sobre los puentes de hidrógeno de los ingredientes farmacéuticos activos y excipientes pueden cambiar el espectro NIR. Espesor de la Muestra-El espesor de la muestra es una fuente conocida de variabilidad espectral y debe ser comprendida y/o controlada. El espesor de la muestra en el modo de transmisión se controla, por lo general, usando un paso óptico de longitud fija para la muestra. En modo de reflexión difusa, el espesor de la muestra se controla por lo general con el uso de
1484 (1119) Espectroscopía en el IR Cercano/ Información General
USP 39
muestras con "espesor infinito" con respecto a la profundidad de penetración detectable de la luz NIR dentro de un material sólido. Aquí "espesor infinito" implica que el espectro de reflexión no cambia si el espesor de la muestra aumenta. Propiedades Ópticas de la Muestra-En los sólidos, deben tenerse en cuenta las propiedades dispersivas de la superficie y del volumen de los estándares de calibración y de las muestras analíticas. La morfología de la superficie y el índice de refracción afectan las propiedades dispersivas de los materiales sólidos. En el caso de los materiales en polvo, el tamaño de las partículas y la densidad aparente influyen sobre las propiedades dispersivas y el espectro NIR. Polimorfismo-La variación en la estructura cristalina (polimorfismo) de los materiales con la misma composición química puede influir sobre la respuesta espectral NIR. Los diferentes polimorfos y la forma amorfa del material sólido se pueden distinguir entre sí según sus propiedades espectrales NIR. De manera similar, los diferentes estados cristalinos de hidratación o solvatación de un mismo material pueden exhibir diferentes propiedades espectrales NIR. Antigüedad de las Muestras-Las muestras pueden manifestar cambios en sus propiedades químicas, físicas u ópticas con el paso del tiempo. Se debe tener cuidado de garantizar que tanto las muestras como los estándares usados en el análisis NIR sean aptos para la aplicación prevista.
INSTRUMENTAL Aparato Todas las mediciones del NIR se basan en la exposición del material a radiación luminosa incidente NIR y en medir la atenuación de la luz emergente (transmitida, dispersada o reflejada). Se cuenta con varios espectrofotómetros, basados en los diferentes principios de funcionamiento, por ejemplo: filtros, redes de dispersión, filtro acústico-óptico sintonizable (AOTF, por sus siglas en inglés), NIR por transformada de Fourier (FT-NIR, por sus siglas en inglés) y filtros de cristal líquido sintonizables (LCTF, por sus siglas en inglés). Los materiales de detección comunes usados son silicio, sulfuro de plomo, arseniuro de indio y galio y sulfato de triglicina deuterada. Ejemplos de interfases de muestra comunes para introducir la muestra en el tren óptico del espectrómetro son las cubetas portamuestras convencionales, las sondas de fibra óptica, las celdas de inmersión para transmisión y los portamuestras giratorios o deslizantes. La selección del instrumental específico y de los accesorios de muestreo se debe basar en la aplicación prevista y se debe poner especial atención a la aptitud de la interfase de muestreo para el tipo de muestra que se va a analizar.
Espectros de Referencia en el Infrarrojo Cercano Las referencias NIR que proporcionan mediciones conocidas y estables contra las que se pueden comparar otras mediciones se utilizan para minimizar las variaciones instrumentales que podrían afectar la medición. Transmitancia-La medición de la transmitancia requiere un espectro de referencia de fondo para determinar la absorción de la muestra con respecto al fondo. Los materiales de referencia aptos para transmitancia dependen de la aplicación NIR específica e incluyen aire, una celda vacía, un blanco de disolvente o una muestra de referencia. Reflectancia-La medición de reflectancia requiere medir un espectro de reflexión como referencia para determinar la atenuación de la luz reflejada con respecto al haz incidente no atenuado. El espectro de reflectancia se calcula como el cociente entre los espectros de simple haz de la muestra con respecto al material de referencia. Los materiales de referencia aptos para reflectancia dependen de la aplicación NIR específica e incluyen cerámica, polímeros perfluorados, oro y otros materiales apropiados.
Calificación de los Instrumentos NIR Calificación-La calificación de un instrumento NIR se puede dividir en tres elementos: calificación de la instalación (IQ, por sus siglas en inglés), calificación operativa (OQ, por sus siglas en inglés) y calificación del desempeño (PQ, por sus siglas en inglés). Ver información adicional en el capítulo de información general Calificación de Instrumentos Analíticos (1058). Calificación de la Instalación-Los requisitos de calificación de la instalación ayudan a garantizar que el hardware y el software se instalen para brindar un uso seguro y eficaz del instrumento en el sitio deseado. Calificación Operativa-En la calificación operativa se caracteriza el desempeño del instrumento usando estándares para verificar que el sistema opere dentro de las especificaciones deseadas. El propósito de la calificación operativa es demostrar que el desempeño del instrumento es adecuado. Dado que existen tantos enfoques diferentes para medir los espectros NIR, se recomienda la calificación operativa usando estándares con propiedades espectrales conocidas. El uso de materiales estándares de referencia externos rastreables no justifica la omisión de los procedimientos de control de calidad internos del instrumento. Como en el caso de cualquier dispositivo espectroscópico, se deben calificar la incertidumbre de la longitud de onda, la linealidad fotométrica y las características de ruido de los instrumentos NIR contra las especificaciones deseadas para la aplicación prevista. Calificación del Desempeño-La calificación del desempeño demuestra que la medición NIR funciona siempre dentro de las especificaciones deseadas definidas por el usuario para una aplicación específica y se denomina con frecuencia aptitud del sistema. La calificación del desempeño para las mediciones NIR puede incluir la comparación de un espectro de una muestra o de
USP 39
Información General/ (1119) Espectroscopía en el IR Cercano 1485
un estándar con espectros previamente registrados. Las comparaciones de espectros tomados a lo largo del tiempo de muestras idénticas y estables o de materiales estándares de referencia pueden formar la base para evaluar la estabilidad a largo plazo de un sistema de mediciones NIR. El objetivo es demostrar que no se produzca un desplazamiento anormal de la longitud de onda o un cambio en la sensibilidad del detector durante el análisis en curso. Caracterización de Desempeño del Instrumento-Los procedimientos específicos, los criterios de aceptación y los intervalos de tiempo para caracterizar el desempeño de un instrumento NIR dependen del instrumento y de la aplicación prevista. Muchas aplicaciones NIR usan modelos previamente validados que relacionan la respuesta espectral NIR con una propiedad física o química de interés. La demostración del desempeño estable del instrumento durante periodos extensos proporciona cierta garantía de que se pueden tomar medidas confiables de los espectros de muestra usando modelos NIR previamente validados. Incertidumbre de la Longitud de Onda-Los espectros NIR de la muestra y/o del estándar de referencia se pueden usar para demostrar el desempeño adecuado de la dispersión de la longitud de onda del instrumento con respecto a las especificaciones deseadas. El Estándar de Referencia USP para la Aptitud del Sistema en el Infrarrojo Cercano o el Material de Referencia Estándar (SRM) 2036 del National lnstitute of Standards and Technology (NIST) para la medición de reflectancia y el NIST SRM 2035 para la medición de transmitancia se pueden usar para la verificación de la longitud de onda. Los materiales aptos para demostrar el desempeño de la dispersión de la longitud de onda incluyen poliestireno, mezclas de óxidos de tierras raras y absorción por vapor de agua para instrumentos que usen un interferómetro para dispersión de la longitud de onda. Con la debida justificación se pueden usar estándares alternativos. La incertidumbre de la longitud de onda se caracteriza por lo general, a partir de un espectro único (obtenido con la misma resolución espectral que la utilizada para obtener el valor estándar), usando un mínimo de tres picos que cubran un intervalo espectral apropiado del instrumento. Las tolerancias típicas para cumplir con los valores estándares son ± 1,0 nm por debajo de 2000 nm y± 1,5 nm desde 2000 nm hasta 2500 nm. Se pueden usar tolerancias alternativas para aplicaciones específicas cuando se justifique. Linealidad Fotométrica y Estabilidad de Respuesta-Los espectros NIR de muestras y/o materiales estándares de referencia con transmitancia o reflectancia relativas conocidas se pueden usar para demostrar una relación apta entre la atenuación de la luz NIR (debido a la absorción) y la respuesta del instrumento. Para mediciones de reflectancia, a menudo se usan estándares de reflectancia disponibles comercialmente, con propiedades de reflectancia conocidas. Los espectros obtenidos de los estándares de reflexión están sujetos a variabilidad como resultado de la diferencia entre las condiciones experimentales bajo las cuales fueron calibrados en fábrica y aquéllas en las que se les utiliza posteriormente. Por lo tanto, los valores de reflectancia provistos con un set de estándares de calibración pueden no ser útiles al intentar establecer una calibración "absoluta" para un instrumento determinado. Siempre que (1) los estándares no cambien química ni físicamente, (2) se use también el mismo fondo de referencia que el utilizado para obtener los valores estándares y (3) el instrumento mida cada estándar bajo idénticas condiciones (incluso la colocación precisa de la muestra), la reproducibilidad de la escala fotométrica se establecerá sobre el intervalo de estándares. Las mediciones subsiguientes en los sets de estándares idénticos brindan información sobre la estabilidad a largo plazo. La linealidad fotométrica se caracteriza por lo general, usando un mínimo de cuatro estándares de referencia en el intervalo de 10% a 90% de reflexión (o transmisión). Las aplicaciones NIR basadas en mediciones de absorbancia mayores que 1,0 pueden requerir estándares con propiedades de reflectividad entre 2% y 5% de reflexión (o transmisión) para caracterizar el desempeño del instrumento a baja reflectancia. El propósito es demostrar una relación lineal entre la reflectancia de NIR y/o la transmitancia y la respuesta del instrumento en el intervalo de barrido. Las tolerancias típicas para una relación lineal son 1,00 ± 0,05 para la pendiente y 0,00 ± 0,05 para la ordenada al origen de una gráfica de la respuesta fotométrica medida en función de la respuesta fotométrica estándar. Pueden darse tolerancias alternativas para aplicaciones específicas cuando se justifique. Ruido Espectroscópico-El software de instrumentos NIR puede incluir procedimientos incorporados para determinar el ruido del sistema de forma automática y para suministrar un informe estadístico del ruido o la relación señal/ruido (S/N) en el intervalo operativo del instrumento. Además, es conveniente complementar tales controles con mediciones que no dependan de forma directa de los procedimientos suministrados por los fabricantes. Los procedimientos típicos incluyen la medición de los espectros de los materiales de referencia rastreables con reflectancia alta y baja. Las tolerancias para estos procedimientos deben demostrar la relación señal/ruido apta para la aplicación prevista. RUIDO DE ALTO FLUJO-El ruido del instrumento a alto flujo luminoso se evalúa midiendo la reflectancia o transmitancia del estándar de referencia con respecto al mismo estándar de referencia (p.ej., estándar de reflexión al 99%) que funciona como muestra y como referencia de fondo a la vez. RUIDO DE BAJO FLUJO-Se puede emplear el mismo procedimiento con un material de referencia de menor reflectividad (p.ej., estándar de reflectancia al 10%) para determinar el ruido del sistema a un flujo luminoso reducido. La fuente, los elementos ópticos, el detector y los equipos electrónicos contribuyen sustancialmente al ruido en estas condiciones.
VALIDACIÓN DEL MÉTODO Introducción El objetivo de la validación de un método NIR, como en la validación de cualquier procedimiento analítico, es demostrar que la medición es adecuada para el propósito previsto. Aunque la espectroscopía NIR difiere levemente de las técnicas analíticas convencionales porque la validación se obtiene generalmente mediante la evaluación de parámetros quimiométricos, estos pa-
1486 (1119) Espectroscopía en el IR Cercano/ Información General
USP 39
rámetros aún se pueden relacionar con las características fundamentales de validación requeridas para cualquier método analítico. El tratamiento previo de los datos es con frecuencia un paso vital en el análisis quimiométrico de los datos espectrales del infrarrojo cercano. El tratamiento previo de los datos se puede definir como la transformación matemática de los datos espectrales del infrarrojo cercano para mejorar las características espectrales y/o eliminar o reducir las fuentes de variación indeseables antes de usar el espectro. La Calibración es el proceso mediante el cual se desarrolla una relación matemática entre la respuesta espectral NIR y las propiedades de las muestras. Existen muchos algoritmos quimiométricos adecuados para el tratamiento previo de los datos y la calibración; la selección debe basarse en un criterio científico sólido y en la aptitud para la aplicación prevista.
Parámetros de Validación Las características de desempeño que demuestran la aptitud de los métodos NIR son similares a las requeridas para cualquier procedimiento analítico. Un análisis de los principios generales aplicables se halla en Validación de Procedimientos Farmacopeicos (1225). Estos principios deben considerarse como típicos para los procedimientos NIR, pero las excepciones deberán tratarse en forma individual, caso por caso. Para los métodos NIR cualitativos, ver el capítulo (1225), Datos Requeridos para la Validación, Categoría IV. Para los métodos NIR cuantitativos, ver el capítulo (1225), Datos Requeridos para la Validación, Categoría I y Categoría 11. Los criterios de aceptación específicos para cada parámetro de validación deben ser coherentes con el uso previsto del método. Las muestras para la validación deberán ser independientes del set de calibración. Especificidad-El alcance de las pruebas de especificidad depende de la aplicación prevista. La demostración de la especificidad en los métodos NIR por lo general se logra mediante los siguientes enfoques: Cualitativo-Las pruebas de identificación son aplicaciones comunes de la espectroscopía NIR cualitativa. La identificación se consigue comparando un espectro de muestra con un espectro de referencia o una biblioteca de referencia espectral. La especificidad del método de identificación por NIR se demuestra obteniendo una identificación positiva de las muestras junto con resultados negativos de materiales que no deberían cumplir con los criterios para identificación positiva. Los materiales para demostrar la especificidad deben basarse en un criterio científico sólido y pueden incluir materiales similares en apariencia visual, estructura química o nombre. Cuantitativo-Las aplicaciones cuantitativas de la espectroscopía NIR por lo general incluyen el establecimiento de una relación matemática entre la respuesta espectral NIR y una propiedad física o química de interés. La demostración de especificidad con respecto a una propiedad física o química de interés se basa en interpretar tanto los atributos espectrales del NIR como los parámetros quimiométricos en términos de la aplicación prevista y puede incluir lo siguiente: • La correlación entre regiones espectrales en el modelo de calibración y una respuesta espectral NIR conocida, asociada con la propiedad de interés. • La verificación de la información espectroscópica relevante que se usa en el modelo matemático, mediante el examen de las longitudes de onda utilizadas por análisis de regresión para la calibración (p.ej., en modelos de regresión lineal múltiple [MLR, por sus siglas en inglés]) o los vectores de carga para cada factor (p.ej., en modelos de cuadrados mínimos parciales [PLS, por sus siglas en inglés] o la regresión de componentes principales [PCR, por sus siglas en inglés]) • La variación en los espectros de las muestras de calibración, los cuales se pueden examinar e interpretar como observaciones espectrales esperadas. • La demostración de que las variaciones en la composición del material y la matriz de la muestra no tienen un efecto importante sobre la cuantificación de la propiedad de interés en el intervalo especificado para el método. Linealidad-Los métodos NIR cuantitativos generalmente intentan demostrar una relación lineal entre la respuesta espectral NIR y la propiedad de interés. Aunque no se requiere demostrar una respuesta lineal para todas las aplicaciones NIR, el modelo escogido, sea lineal o no, debe representar apropiadamente la relación. La validación de la linealidad en los métodos NIR se puede conseguir examinando una gráfica de la respuesta espectral NIR en función de valores reales o aceptados para la propiedad de interés. Se cuenta con muchos métodos estadísticos para la evaluación de la bondad del ajuste de la relación lineal. Otros métodos estadísticos y gráficos aplicables pueden ser apropiados. El coeficiente de correlación, r, puede no ser una medida informativa de la linealidad. El cuadrado del coeficiente de correlación (Pearson) es una medida de la fracción de la variación de los datos que está adecuadamente modelada por la ecuación. La linealidad depende del error estándar de la ecuación de calibración (y por lo tanto, del método de referencia) y del intervalo de los datos de calibración. Por tanto, aunque los valores muy cercanos a 1,00, tales como 0,99 o mayores, indican por lo general una relación lineal, los valores más bajos no distinguen entre no linealidad y variabilidad alrededor de la línea. Intervalo-El intervalo especificado de un método NIR depende de la aplicación específica. El intervalo por lo general se establece confirmando que el método NIR proporciona una capacidad de medición apta (exactitud y precisión) cuando se aplica a muestras dentro de los límites extremos de la medición NIR. Se deben usar controles para garantizar que no se acepten los resultados fuera del intervalo validado. En ciertas circunstancias, puede no ser posible o deseable extender el intervalo validado para incluir la variabilidad de la muestra por fuera del intervalo validado. La extensión del intervalo de un método NIR requiere la demostración de la capacidad de medición apta dentro de los límites del intervalo expandido. Como ejemplos de situaciones en las que solamente se puede disponer de un intervalo de muestras limitado, se encuentran las muestras de un
USP 39
Información General/ (1119) Espectroscopía en el IR Cercano 1487
proceso controlado de fabricación y las muestras en proceso. El intervalo limitado de un método no excluye el uso del método NIR. Exactitud-La exactitud en los métodos NIR se demuestra por la proximidad con el valor que se ha aceptado como valor verdadero convencional o un valor de referencia. La exactitud se puede determinar por comparación directa entre los resultados de la validación y los valores de referencia reales o aceptados. La proximidad apropiada entre los valores NIR y de referencia se determina basándose en la capacidad de medición requerida para una aplicación específica. El propósito es demostrar una relación lineal entre los resultados NIR y los valores reales. La exactitud se puede determinar por la proximidad entre el error de predicción estándar (SEP, por sus siglas en inglés) y el error estándar del método de referencia para la validación. El error del método de referencia puede conocerse basándose en los datos históricos, por medio de resultados de validación específicos del método de referencia o por el cálculo del error estándar del laboratorio (SEL, por sus siglas en inglés). La proximidad apropiada entre los valores SEP y SEL se basa en la capacidad de medición requerida para una aplicación específica. Precisión-La precisión de un método NIR expresa el grado de concordancia entre una serie de mediciones en las condiciones prescritas. Se deben considerar dos niveles de precisión: repetibilidad y precisión intermedia. La precisión de un método NIR se expresa por lo general, como la desviación estándar relativa de una serie de resultados del método NIR y debe ser apta para la aplicación prevista. La demostración de la precisión en los métodos NIR se puede lograr mediante los siguientes enfoques: Repetibilidad-La repetibilidad se puede demostrar por: • Evaluación estadística de un número de mediciones repetidas de la muestra sin reposicionarla entre cada adquisición espectral individual, o • Evaluación estadística de resultados múltiples obtenidos por el método NIR, cada uno de los cuales proviene de un análisis repetido de una muestra después de reposicionarla entre adquisiciones espectrales. Precisión Intermedia-La precisión intermedia se puede demostrar por: • Evaluación estadística de un número de mediciones NIR repetidas de las mismas muestras o similares en el estudio de Repetibilidad efectuadas por diferentes analistas en días diferentes. Robustez-Los parámetros de medición NIR seleccionados para demostrar la robustez variarán dependiendo de la aplicación y de la interfase de la muestra con el instrumento NIR. Los parámetros de medición críticos asociados con la robustez a menudo se identifican y caracterizan durante el desarrollo del método. Los parámetros de medición típicos incluyen: • Efecto de las condiciones ambientales (p.ej., temperatura, humedad y vibración) • Efecto de la temperatura de la muestra • Manipulación de la muestra (p.ej., profundidad de la sonda, compresión del material, profundidad o espesor de la muestra, presentación de la muestra) • Influencia de los cambios del instrumento (p.ej., cambio de la lámpara, tiempo de calentamiento)
Evaluación Continua del Método Los métodos NIR validados deben someterse a evaluación de desempeño continua, que puede incluir la supervisión de la exactitud, precisión y otros parámetros apropiados del método. Si el desempeño es inaceptable, la acción correctiva se hace necesaria. Eso implica llevar a cabo una investigación para identificar la causa del cambio en el desempeño del método y puede indicar que el método NIR no es apto para el uso continuo. Mejorar el método NIR para que cumpla con los criterios de aptitud de la medición puede requerir desarrollo adicional del método y documentación de los experimentos de validación que demuestren que el método mejorado es apto para la aplicación prevista. El grado de revalidación requerido depende de la causa del cambio en el desempeño del método y de la naturaleza de la acción correctiva requerida con el fin de establecer el desempeño adecuado del método. Se deben implementar controles de cambio apropiados para documentar las actividades continuas de mejoramiento del método. La revalidación de un modelo cualitativo puede ser necesaria como resultado de: • La adición de un material nuevo a la biblioteca de referencia espectral • Cambios en las propiedades físicas del material • Cambios en la fuente del suministro del material • Identificación de atributos críticos de los materiales desconocidos previamente La revalidación de un modelo cuantitativo puede ser necesaria como resultado de: • Cambios en la composición de la muestra de prueba o del producto terminado • Cambios en el proceso de fabricación • Cambios en las fuentes o grados de las materias primas • Cambios en el método analítico de referencia • Cambios importantes en el hardware del instrumento Resultados aberrantes-Los espectros de las muestras que producen una respuesta NIR que difiere del modelo de calibración cualitativo o cuantitativo pueden producir un resultado aberrante. Esto no necesariamente indica un resultado fuera de especificación. Un resultado aberrante es dependiente del método NIR particular e indica que pueden requerirse más pruebas de la muestra. Si las pruebas subsiguientes de la muestra por un método apropiado indican que la propiedad de interés está dentro de las especificaciones, entonces la muestra cumple sus especificaciones. Los resultados aberrantes se pueden incluir en un modelo de calibración actualizado después de la realización y documentación de estudios de validación apropiados.
1488 (1119) Espectroscopía en el IR Cercano / Información General
USP 39
Transferencia del Método Los controles y mediciones para demostrar la aptitud del desempeño del método NIR después de la transferencia del método son similares a los requeridos para cualquier procedimiento analítico. Las excepciones a los principios generales para efectuar la transferencia del método NIR se debe justificar en forma individual, caso por caso. La transferencia de un método NIR a menudo se efectúa usando un modelo de calibración NIR sobre un segundo instrumento que sea similar al instrumento primario usado para desarrollar y validar el método. Cuando un modelo de calibración se transfiere a otro instrumento, deben aplicarse los procedimientos y criterios necesarios para demostrar que el modelo de calibración cumple con los criterios de medición apropiados en el segundo instrumento. La selección de un procedimiento adecuado de transferencia del modelo de calibración debe basarse en un criterio científico sólido.
GLOSARIO ABSORBANCIA,
A, está representada por la ecuación: A = -log T = log (1 /7)
donde Tes la transmitancia de la muestra. La absorbancia se expresa también con frecuencia como: A= log (l/R) donde R es la reflectancia de la muestra. ANCHO DE BANDA o RESOLUCIÓN DEL INSTRUMENTO es una medida de la capacidad del espectrómetro para separar la radiación de longitudes de onda similares. BIBLIOTECA DE REFERENCIA ESPECTRAL es una colección de espectros de materiales conocidos para comparación con materiales desconocidos. El término se usa comúnmente en relación con los métodos cualitativos de análisis espectral (p.ej., identificación de materiales). CALIFICACIÓN DE LA INSTALACIÓN es el conjunto de actividades documentadas necesarias para establecer que un instrumento se entrega como fue diseñado y especificado y está debidamente instalado en el entorno seleccionado, y que este entorno es apto para el uso previsto del instrumento. CALIFICACIÓN DEL DESEMPEÑO es el proceso por el cual se verifica el desempeño uniforme del instrumento mediante el uso de uno o más materiales de referencia estables y bien caracterizados. La calificación de desempeño puede emplear estándares iguales o diferentes para las diversas características de desempeño. CALIFICACIÓN OPERATIVA es el proceso mediante el cual se demuestra y se documenta que un instrumento funciona de acuerdo con las especificaciones y que puede realizar la tarea para la cual está previsto. Este proceso es necesario luego de cambios sustanciales como la instalación del instrumento, cambio de ubicación o reparaciones importantes. CUADRADOS MÍNIMOS PARCIALES (PLS, POR sus SIGLAS EN INGLÉS) es un algoritmo de calibración para relacionar las respuestas del instrumento con las propiedades de las muestras. La característica distintiva de este algoritmo es que los datos relacionados con las propiedades de las muestras para calibración se usan en el cálculo de los factores para describir las respuestas del instrumento. ERROR DE CALIBRACIÓN ESTÁNDAR (SEC, POR sus SIGLAS EN INGLÉS) es una medida de la capacidad de un modelo para ajustarse a los datos de referencia. El SEC es la desviación estándar de los residuos obtenidos al comparar los valores conocidos para cada una de las muestras de calibración con los valores que se calculan a partir de la calibración. El SEC no se debe usar como una herramienta de evaluación de la exactitud esperada del método (veracidad y precisión de la predicción) del valor previsto de muestras futuras. La exactitud del método debe verificarse por lo general calculando el error estándar de predicción (SEP), usando un set de muestras de validación independientes. Un método aceptado consiste en marcar una parte del set de calibración como conjunto de validación. Este set no es totalmente independiente pero se puede usar como alternativa para la determinación de la exactitud. ERROR ESTÁNDAR DE PREDICCIÓN (SEP, POR sus SIGLAS EN INGLÉS) es una medida de la exactitud del modelo de un método analítico que se basa en la aplicación de un modelo de calibración determinado a la información espectral de un set de muestras diferentes pero similares a las empleadas para calcular el modelo de calibración. El SEP es la desviación estándar de los residuos obtenidos de la comparación de los valores del laboratorio de referencia con los obtenidos por medio del método en análisis, para las muestras especificadas. El SEP ofrece una medida de la exactitud esperada del modelo en la medición de muestras futuras. ERROR ESTÁNDAR DE VALIDACIÓN CRUZADA (SECV, POR sus SIGLAS EN INGLÉS) es la desviación estándar calculada usando el método de omisión de un dato. En este método se omite de la calibración una muestra de calibración y se obtiene la diferencia entre el valor para esta muestra calculado a partir de su valor de referencia y el valor obtenido a partir de la calibración calculada con todas las otras muestras del conjunto. El proceso se repite para todas las muestras en el conjunto y la SECV es la desviación estándar de las diferencias calculadas para todas las muestras de calibración. Este proceso se puede efectuar también con un grupo de muestras. En lugar de omitir una muestra, se omite un grupo de muestras. La SECV es una medida de la exactitud del modelo que se puede esperar en mediciones futuras si no se cuenta con suficientes muestras para calcular la SEP a partir de un conjunto de validación completamente independiente.
USP 39
Información General/ (1119) Espectroscopía en el IR Cercano 1489
ERROR ESTÁNDAR DEL LABORATORIO (SEL, POR sus SIGLAS EN INGLÉS) es un cálculo basado en las lecturas repetidas de una o más muestras para estimar Ja precisión y/o exactitud del método del laboratorio de referencia, según cómo se hayan obtenido los datos. ESPECTRO DE FONDO se usa para generar un espectro de muestra con contribuciones mínimas de Ja respuesta del instrumento. También se conoce como espectro de referencia o referencia de fondo. La relación entre el espectro de muestra y el espectro de fondo produce un espectro de transmitancia o reflectancia dominado por Ja respuesta espectral NIR asociada con la muestra. En mediciones de reflexión, un material de referencia estándar altamente reflectivo y difuso sirve para la medición del espectro de fondo. Para Ja medición de Ja transmisión, el espectro de fondo se puede medir sin que haya muestra presente en el espectrómetro, o usando una celda con un blanco de disolvente o una celda llena del material de referencia apropiado. ESPECTRO DE REFERENCIA-Ver Espectro de Fondo. LINEALIDAD FOTOMÉTRICA, también llamada verificación fotométrica, es el proceso de verificación de Ja respuesta de la escala fotométrica de un instrumento. MODELO DE CALIBRACIÓN es una expresión matemática que relaciona la respuesta de un instrumento analítico con las propiedades de las muestras. RAÍZ MEDIA CUADRÁTICA DEL RUIDO (RMS, POR sus SIGLAS EN INGLÉS) se calcula mediante la ecuación:
en donde A; es la absorbancia para cada punto de análisis; dad de puntos por segmento. REFLECTANCIA se describe mediante la ecuación:
A es la absorbancia media del segmento espectral; y
N es la canti-
R =!/IR en donde I es la intensidad de la radiación reflejada desde la superficie de la muestra; e IR es la intensidad de la radiación reflejada desde un material de referencia de fondo y sus pérdidas incorporadas debido a la absorción, refracción y dispersión del disolvente. REFLECTANCIA DE SUPERFICIE, también llamada reflexión especular, es la porción de la radiación que no interactúa con la muestra sino que simplemente se refleja desde la capa superficial de la muestra (interfase muestra-aire). REFLECTANCIA DIFUSA es la relación entre el espectro de luz irradiada que penetra en la superficie de la muestra, interactúa con la muestra, vuelve a pasar por la superficie de la muestra y alcanza el detector, y el espectro de fondo. Éste es el componente de la reflectancia total que permite obtener el espectro de absorción de Ja muestra. REFLECTANCIA ESPECULAR (SUPERFICIAL) es Ja reflectancia de superficie frontal de la muestra. REFLECTANCIA TOTAL es la suma de reflectancia difusa y especular. REGRESIÓN DE COMPONENTES PRINCIPALES (PCR, POR sus SIGLAS EN INGLÉS) es un algoritmo de calibración para relacionar la respuesta de un instrumento analítico con las propiedades de las muestras. Este algoritmo, que expresa un set de variables independientes como una combinación lineal de factores, es un método para relacionar estos factores con las propiedades de las muestras para las cuales se han obtenido las variables independientes. REGRESIÓN LINEAL MÚLTIPLE es un algoritmo de calibración para relacionar la respuesta de un instrumento analítico con las propiedades de las muestras. La característica distintiva de este algoritmo es el uso de una cantidad limitada de variables independientes. Se realizan cálculos de cuadrados mínimos lineales para establecer la relación entre estas variables independientes y las propiedades de las muestras. SEUDOABSORBANCIA, A, está representada por la ecuación:
A =-log R = log (1 / R) donde R es Ja reflectancia difusa de Ja muestra. SONDAS DE FIBRA ÓPTICA contienen dos componentes: fibras ópticas, que pueden variar en longitud y en cantidad de fibras, y un terminal que contiene elementos ópticos especialmente diseñados para examinar Ja matriz de la muestra. TRANSFLEXIÓN es una técnica para medir Ja transmitancia, en Ja cual la radiación atraviesa la muestra dos veces. La segunda vez se produce después de que la radiación se refleja desde una superficie por detrás de Ja muestra. TRANSMITANCIA se representa por la ecuación:
T = 1/10 O T = 1QA en donde I es la intensidad de la radiación transmitida a través de la muestra; 10 es la intensidad de la energía radiante incidente sobre la muestra e incluye las pérdidas debidas a Ja absorción, refracción y dispersión del disolvente; y A es Ja absorbancia.
1490 (1120) Espectroscopía Raman / Información General
USP 39
(1120) ESPECTROSCOPÍA RAMAN Cambio en la redacción:
INTRODUCCIÓN • • (AF ol-may.2016¡ La espectroscopía Raman es una técnica espectroscópica vibracional y, por tanto, está relacionada con la espectroscopía en el infrarrojo (IR) y en el infrarrojo cercano (NIR, por sus siglas en inglés). El efecto Raman en sí mismo surge como resultado de un cambio en la polarizabilidad de enlaces moleculares durante un determinado modo vibracional y se mide como radiación dispersada inelásticamente. Un espectro Raman se genera mediante la excitación de la muestra de interés a un estado virtual con una fuente monocromática, generalmente un láser. La luz dispersada elásticamente (sin cambio en la longitud de onda) se conoce como dispersión de Rayleigh y no presenta interés alguno en la espectrometría Raman, excepto para marcar la longitud de onda láser. Sin embargo, si la muestra se relaja a un nivel de energía vibracional que difiere del estado inicial, la radiación dispersada se desplaza en energía. Este desplazamiento es proporcional a la diferencia de energía entre el estado vibracional inicial y el estado vibracional final. A esta luz "dispersada inelásticamente" se la denomina dispersión Raman. Sólo aproximadamente uno de cada 106-10 8 fotones que inciden sobre la muestra experimenta dispersión Raman. Por ello se emplean láseres en los espectrómetros Raman. Si el fotón Raman dispersado es de energía menor, se denomina dispersión de Stokes. Si es de energía mayor, se denomina dispersión anti-Stokes. En la práctica, casi todas las mediciones Raman útiles desde el punto de vista analítico usan la dispersión Raman de desplazamiento Stokes. El espectro Raman es muy similar al espectro infrarrojo graficado linealmente en absorbancia. Las intensidades, o el número de fotones Raman contados, se grafican en función de las energías de desplazamiento. El eje x generalmente se denomina "Desplazamiento Raman/cm-1" o "Número de onda/cm-1 ". El desplazamiento Raman normalmente se expresa en número de onda y representa la diferencia entre el número de onda absoluto del pico y el número de onda del láser. El espectro se interpreta del mismo modo que el espectro infrarrojo medio correspondiente. Las posiciones de los números de onda (desplazados de Raman) para un modo vibracional dado son idénticos a los números de onda de las bandas correspondientes en un espectro de absorción IR. Sin embargo, los picos más fuertes en un espectro Raman a menudo son débiles en un espectro IR y viceversa. Por este motivo, con frecuencia se dice que las dos técnicas espectroscópicas son complementarias. La espectroscopía Raman es ventajosa porque a menudo se pueden realizar mediciones rápidas y exactas sin destruir la muestra (sólida, semisólida, líquida o, con menor frecuencia, gas) y sin necesidad de preparar la muestra o con una preparación mínima. El espectro Raman contiene información sobre modos vibracionales fundamentales de la muestra que puede proporcionar una comprensión tanto de la muestra como del proceso. La señal generalmente se encuentra dentro del intervalo visible o del IR cercano, lo que permite un acoplamiento eficiente con la fibra óptica. Esto también significa que se puede obtener una señal partiendo de cualquier medio que sea transparente a la luz del láser, como por ejemplo vidrios, plásticos o muestras en medios acuosos. Además, dado que los espectros Raman se excitan por lo general con radiación visible o IR cercano, pueden usarse elementos ópticos estándar de cuarzo o vidrio. Desde un punto de vista instrumental, los sistemas modernos son fáciles de usar, proporcionan rápidos tiempos de análisis (desde segundos a varios minutos) y son confiables. Sin embargo, debe tenerse presente el peligro de usar láseres de alta potencia, en especial cuando sus longitudes de onda están en el IR cercano y, por lo tanto, no son visibles al ojo humano. Las sondas de fibra óptica se deben usar con precaución y respetando las reglamentaciones gubernamentales apropiadas en lo que respecta a láseres y sus clases. Además de la espectroscopía Raman "normal", existen varias técnicas Raman más especializadas. Éstas incluyen resonancia Raman (RR), espectroscopía Raman de superficie amplificada (SERS, por sus siglas en inglés), actividad óptica Raman (ROA, por sus siglas en inglés), espectroscopía Raman anti-Stokes coherente (CARS, por sus siglas en inglés), espectroscopía de ganancia o de pérdida Raman y espectroscopía hiper-Raman. Estas técnicas no se usan ampliamente en los laboratorios farmacéuticos y no se tratan en este capítulo de información general.
MEDICIONES RAMAN CUALITATIVAS Y CUANTITATIVAS Existen dos clases generales de mediciones que se realizan comúnmente con espectrometría Raman: cualitativa y cuantitativa.
Mediciones Raman Cualitativas Las mediciones Raman cualitativas proporcionan información espectral sobre los grupos funcionales presentes en una muestra. Debido a que el espectro Raman es específico para un compuesto dado, las mediciones Raman cualitativas se pueden usar como una prueba de identificación farmacopeica, así como también para elucidación estructural.
USP 39
Información General/ (1120) Espectroscopía Raman 1491
Mediciones Raman Cuantitativas Para instrumentos equipados con un detector que mide la potencia óptica (como un espectrómetro transformador de Fourier [FT, por sus siglas en inglés]-Raman), las mediciones Raman cuantitativas utilizan la siguiente relación entre señal, Sw a un determinado número de onda, v, y la concentración de un analito, C: Sv = Kcrv(vL -
Vp ) 4 P0C
en donde K es una constante que depende del diámetro del rayo láser, los elementos ópticos de recolección, el volumen de la muestra y la temperatura; av es la sección transversal Raman del modo vibracional en particular; vL es el número de onda del láser; vp es el número de onda del modo vibracional; y P0 es la potencia del láser. La sección transversal de Raman, ay, es característica de la naturaleza del modo vibracional en particular. El volumen de muestra está definido por el tamaño del foco del rayo láser en la muestra, el elemento óptico usado para enfocar y las propiedades ópticas de la muestra misma. El tamaño de las zonas de medida sobre la muestra puede variar desde menos de 1 µm para una microsonda, hasta 6 mm para un sistema de muestreo de gran superficie. Para espectrómetros Raman que miden la cantidad de fotones por segundo (tales como los espectrómetros con dispositivos de acoplamiento de carga [CCD, por sus siglas en inglés]-Raman), la ecuación correspondiente es: Sv = KuvvL(vL-
Vp ) 3 P0C
En las ecuaciones anteriores se observa que la señal del pico es directamente proporcional a la concentración. Esta relación es la base para la mayoría de las aplicaciones Raman cuantitativas.
FACTORES QUE AFECTAN LA CUANTIFICACIÓN Factores Basados en la Muestra Los factores más importantes, basados en la muestra, que afectan negativamente la espectrometría Raman cuantitativa son la fluorescencia, el calentamiento de la muestra, la absorción de la matriz o de la misma muestra y el efecto de polarización. Si la matriz de la muestra incluye compuestos fluorescentes, la señal medida por lo general contendrá una contribución de la fluorescencia. La fluorescencia se observará sólo si la longitud de onda de la excitación del láser se superpone a una banda de absorción de un compuesto fluorescente. La fluorescencia se observa generalmente como un amplio fondo en pendiente subyacente al espectro Raman. La fluorescencia puede ocasionar tanto un desplazamiento de la línea base como una reducción de la relación señal-ruido. El intervalo de longitud de onda y la intensidad de la fluorescencia dependen de la composición química del material fluorescente. Debido a que la fluorescencia es generalmente un proceso mucho más eficiente que la dispersión Raman, incluso cantidades muy pequeñas de impurezas fluorescentes pueden dar como resultado una degradación significativa de la señal Raman. La fluorescencia se puede reducir utilizando fuentes de excitación de longitud de onda más larga, tales como 785 nm o 1064 nm. Sin embargo, cabe recordar que la intensidad de la señal Raman es proporcional a (vL - v/3 ) 4 , de manera que la ventaja de usar un láser de excitación de longitud de onda larga para minimizar la fluorescencia es al menos parcialmente compensada por una reducida intensidad de la señal Raman. La mejor relación señal-ruido se obtendrá equilibrando el rechazo de la fluorescencia, la intensidad de la señal y la respuesta del detector. La fluorescencia en los sólidos se puede mitigar en ocasiones exponiendo la muestra a la radiación láser durante un período dado anterior a la medición. Este proceso se denomina fotoblanqueo (photobleaching) y funciona degradando las especies de alta absorción. El fotoblanqueo es menos eficaz en líquidos, cuando la muestra es móvil o si la cantidad de material fluorescente es más que trazas. El calentamiento de las muestras con la fuente de láser puede causar una variedad de efectos, como por ejemplo cambios en la forma física (fusión), conversión polimórfica o el quemado de la muestra. La probabilidad de que la muestra se caliente es mayor cuando el tamaño de las zonas de medida en la muestra es más pequeño, es decir, cuando se usa una microsonda. Esto es generalmente un problema para las especies coloreadas de alta absorción o para partículas muy pequeñas con una baja transferencia de calor. Los efectos del calentamiento de la muestra generalmente se observan como cambios en el espectro Raman con el transcurso del tiempo o mediante una inspección visual de la muestra. Además de disminuir el flujo láser, se puede emplear una variedad de métodos para disminuir el calentamiento inducido por láser, como por ejemplo mover la muestra o el láser durante la medición o mejorar la transferencia de calor a partir de la muestra mediante contacto térmico o inmersión en un líquido. También puede suceder que la matriz o la misma muestra absorba la señal Raman. Este problema prevalece más consistemas FT-Raman de longitud de onda larga donde la señal Raman puede superponerse con la absorción de sobretonos del IR cercano. Este efecto dependerá de los elementos ópticos en el sistema así como también de la presentación de la muestra. La variabilidad de la dispersión en sólidos se asocia con este efecto como resultado de las diferencias en el tamaño de partículas y la compactación. Sin embargo la magnitud de todos estos efectos generalmente es menos grave que en NIR debido a que en la espectroscopía Raman la profundidad de penetración es limitada y a que se utiliza una región de longitudes de onda relativamente más estrecha.
USP 39
1492 (1120) Espectroscopía Raman / Información General
Finalmente, se debe reconocer que la radiación láser está polarizada y los espectros Raman de los materiales cristalinos y de otras muestras orientadas pueden diferir significativamente, dependiendo de la forma en que se coloque la muestra. Si el espectrómetro Raman es capaz de producir una radiación polarizada linealmente en la muestra, entonces se recomienda un despolarizador (polarization scrambler) para los análisis rutinarios de muestras.
Factores de Muestreo La espectroscopía Raman es una técnica sin ruido de fondo, en donde la señal esperada en el detector en ausencia de la muestra es cero. Esta situación puede contrastarse con espectrometría de absorción, donde la señal en el detector es máxima en ausencia de la muestra. Las técnicas sin ruido de fondo son inherentemente sensibles debido a que pequeños cambios en la concentración de la muestra conducen a cambios proporcionales en los niveles de la señal. El instrumento también será sensible a otras fuentes de luz que pueden causar variaciones de una muestra a otra en el nivel medido de la señal. Adicionalmente, una señal fuerte de fondo, causada por fluorescencia conducirá a un incremento del nivel de ruido (photon noise shot). Por tanto, puede ser muy difícil usar la señal Raman absoluta para la determinación directa de un analito. Otras fuentes potenciales de variación son los cambios en la opacidad y la heterogeneidad de la muestra, los cambios de la potencia del láser sobre la muestra y los cambios de la geometría de recolección óptica o la posición de la muestra. Estos efectos se pueden minimizar realizando el muestreo de una forma reproducible y representativa. El diseño cuidadoso de la instrumentación puede reducir estos efectos pero no los puede eliminar por completo. El uso de un estándar interno de referencia es el método más común y robusto para eliminar las variaciones debidas a las fluctuaciones de intensidad absoluta. Existen varias opciones para este enfoque. Se puede agregar deliberadamente un estándar interno y se pueden emplear picos aislados de este estándar; o también puede usarse una banda debida a una subunidad molecular, como un anillo aromático, cuya sección transversal Raman no cambia con la forma en que se prepara la muestra. Para los espectros en solución, se puede emplear una banda de disolvente aislada ya que el disolvente permanecerá relativamente sin cambios entre una muestra y otra. Además, en una formulación, se puede usar un pico de excipiente si está en un exceso considerable en comparación con el analito. También se puede usar todo el espectro como referencia, asumiendo que los cambios de orientación de la muestra y el láser afectarán a todo el espectro por igual. Un segundo factor importante basado en el muestreo a tener en cuenta es la contaminación espectral. El efecto de dispersión Raman es débil y puede ser enmascarado por una cantidad de fuentes externas. Las fuentes de contaminación comunes incluyen artefactos de los portamuestras (recipiente o sustrato) y luz ambiental. Generalmente, estos problemas se pueden identificar y resolver mediante una experimentación cuidadosa.
APARATO Componentes Todas las mediciones Raman modernas implican la irradiación de una muestra con láser, la recolección de la radiación dispersada, rechazando la dispersión Rayleigh de luz, diferenciando los fotones Raman por longitud de onda, y detectando el espectro Raman resultante. En consecuencia, todos los instrumentos Raman comerciales comparten las siguientes características comunes para realizar estas funciones: 1. Fuente de excitación (láser) 2. Dispositivo de muestreo 3. Dispositivo para filtrar/rechazar la luz dispersada a la longitud de onda del láser 4. Unidad de procesamiento de longitud de onda 5. Detector y componentes electrónicos FUENTE DE EXCITACIÓN (LÁSER) La Tabla 7 identifica varios láseres comúnmente usados para aplicaciones farmacéuticas o espectrometría Raman. También se han usado láseres UV para aplicaciones especializadas, pero éstos tienen muchas desventajas que limitan su utilidad para mediciones analíticas generales. A medida que se describan más aplicaciones para los láseres UV, es probable que se vuelvan más comunes para la espectrometría Raman. Tabla 1. Láseres Usados en Aplicaciones Farmacéuticas Potencia Típica 'A del láser, nm (número entero más cercano}
Tipo
en el Láser
Intervalo de Longitud de Onda, nm (Reglón Stokes, 100 cm-1 a 3000 cm-1 desplazamiento}
Comentarios
Láseres NIR 1064
Estado sólido (Nd:YAG)
Hasta 3 W
1075-1563
Usados comúnmente en instrumentos de transformada de Fourier
USP 39
Información General/ (1120) Espectroscopía Raman 1493
Tabla 1. Láseres Usados en Aplicaciones Farmacéuticas (Continuación) Potencia Típica A. del láser, nm (número entero más cercano)
Tipo
en el Láser
Intervalo de Longitud de Onda, nm (Reglón Stokes, 100 cm-1 a 3000 cm-1 desplazamiento)
Comentarlos Limitado por lo general a 2000 cm-1; Desplazamiento Raman debido a respuesta espectral CCD; menos común que otros láseres
830
Diodo
Hasta 300 mW
827-980
785
Diodo
Hasta 500 mW
791-1027
632,8
He-Ne
Hasta 500 mW
637-781
532
Duplicado (Nd:YAG)
Hasta 1 W
535-632,8
Alto riesgo de fluorescencia
Láseres Raman de dispersión más usado
Láseres Visibles Riesgo de fluorescencia relativamente bajo
514,5
Ar+
Hasta 1 W
517-608
Alto riesgo de fluorescencia
488-632,8
Ar+
Hasta 1 W
490-572
Alto riesgo de fluorescencia
DISPOSITIVO DE MUESTREO Existen varios dispositivos de muestreo posibles, incluyendo interfases ópticas directas, microscopios, sondas basadas en fibra óptica (ya sean elementos ópticos de inmersión o sin contacto) y cámaras de muestras (incluyendo portamuestras especiales y cambiadores de muestras automatizados). También se pueden diseñar elementos ópticos de muestreo para obtener un espectro Raman dependiente de la polarización, que a menudo contiene información adicional. La selección del dispositivo de muestreo a menudo depende de la muestra y del analito. Sin embargo, para optimizar el dispositivo de muestreo para una aplicación en particular, se deben evaluar consideraciones tales como el volumen de muestreo, la velocidad de la medición, la seguridad del láser y la reproducibilidad en la presentación de la muestra. DISPOSITIVO DE FILTRACIÓN La intensidad de luz dispersada a la longitud de onda del láser (Rayleigh) es varios órdenes de magnitud mayor que la señal Raman y debe rechazarse antes del detector. Los filtros de banda escalonada se utilizan casi universalmente para este propósito y proporcionan un rechazo y estabilidad excelentes con un tamaño pequeño. El uso tradicional de monocromadores de múltiples etapas para este propósito, si bien aún es viable, ya casi no se usa. Además, se pueden necesitar varios filtros o barreras físicas para proteger la muestra de fuentes de radiación externa (p.ej., luz ambiental, líneas de plasma láser) dependiendo de la geometría de recolección del instrumento. UNIDAD DE PROCESAMIENTO DE LONGITUD DE ONDA La escala de longitud de onda se puede procesar con un monocromador de barrido, un policromador de red de dispersión (en los espectrómetros CCD-Raman) o un interferómetro de doble haz (en espectrómetros-FT Raman). Un análisis de los beneficios y desventajas específicos de cada uno de los diseños de dispersión comparados con el instrumento FT se encuentra fuera del alcance de este capítulo. Cualquier instrumento debidamente calificado debería ser apto para las mediciones cualitativas. Sin embargo, se debe tener cuidado al seleccionar un instrumento para realizar mediciones cuantitativas, ya que la linealidad de respuesta y dispersión podría no ser uniforme en todo el intervalo espectral. DETECTOR El dispositivo de acoplamiento de carga (CCD, por sus siglas en inglés) a base de silicio es el detector más común para los instrumentos de dispersión. El dispositivo detector enfriado permite mediciones a lo largo del intervalo espectral desde 4500 cm- 1 a 100 cm- 1 de desplazamiento Raman con bajo ruido, cuando se usan la mayoría de los láseres visibles, tales como el de frecuencia duplicada de itrio-aluminio-granate dopado con neodimio (Nd:YAG) (532 nm) o el de helio-neón (632,8 nm). Cuando se usa un láser de diodo de 785 nm, el intervalo de longitud de onda se reduce aproximadamente de 3100 cm- 1 a 100 cm- 1 • El CCD más comúnmente usado tiene su máxima respuesta cuando se lo acopla al láser de gas He-Ne de 632,8 nm o el láser de diodo de 785 nm generalmente usado. Los instrumentos de transformación de Fourier normalmente utilizan detectores de un solo canal de germanio o de indio-galio arseniuro (lnGaAs) sensibles en el NIR para igualar la excitación a 1064 nm del láser de Nd:YAG.
1494 (1120) Espectroscopía Raman / Información General
USP 39
Calibración La calibración del instrumento Raman incluye tres componentes: longitud de onda primaria (eje x), longitud de onda del láser e intensidad (eje y). LONGITUD DE ONDA PRIMARIA (EJE
X)
En el caso de instrumentos FT-Raman, la calibración del eje de longitud de onda primaria se mantiene, al menos en la primera aproximación, con un láser interno de He-Ne. La mayoría de los instrumentos dispersivos utilizan lámparas de emisión atómica para la calibración del eje de longitud de onda primaria. En todos los instrumentos adecuados para mediciones analíticas Raman, el proveedor ofrecerá un procedimiento de calibración del eje x que el usuario puede realizar. Para los instrumentos de dispersión Raman, se prefiere una calibración basada en múltiples líneas de emisión atómica. La validez de este enfoque para la calibración se puede verificar después de la calibración de la longitud de onda del láser usando un estándar de desplazamiento Raman adecuado. Para los instrumentos de barrido dispersivo, puede ser que la calibración se deba realizar con mayor frecuencia, y puede ser que se tenga que verificar la precisión tanto en el modo operativo de barrido como en el estático. 1 LONGITUD DE ONDA DEL LÁSER La variación de la longitud de onda del láser puede afectar tanto la precisión de la longitud de onda como la precisión fotométrica (señal) de un instrumento dado. Incluso los láseres actuales más estables pueden variar levemente la longitud de onda. Por tanto, se debe confirmar la longitud de onda para asegurar que las posiciones de desplazamiento Raman sean exactas tanto para instrumentos FT-Raman como para los instrumentos Raman dispersivos. Para este propósito se pueden utilizar materiales estándar de referencia de desplazamiento Raman como los descritos en ASTM El 840-96 (2002) 1 u otros materiales verificados adecuadamente. [NOTA-Los valores estándar de desplazamiento Raman confiables para los reactivos líquidos y sólidos utilizados frecuentemente, necesarios para la calibración del número de onda de los espectrómetros Raman, se proporcionan en la citada guía de normas ASTM. Se pueden utilizar estos valores además de las líneas de emisión de las lámparas de arco de baja presión y alta precisión y exactitud que también están disponibles para usar en la calibración de los instrumentos Raman.] Materiales de grado espectrométrico se pueden comprar a los proveedores apropiados para este uso. Ciertos instrumentos pueden utilizar un estándar Raman interno separado del recorrido óptico principal. Los dispositivos de calibración externa reproducen exactamente el recorrido óptico tomado por la radiación dispersada. [NOTA-Cuando se utilizan estándares químicos, se debe tener cuidado de evitar la contaminación y confirmar la estabilidad del estándar.] A menos que el instrumento sea de un tipo de calibración continua, la calibración del eje de longitud de onda primaria debe realizarse, según los procedimientos del proveedor, justo antes de la medición de la longitud de onda del láser. Para la calibración externa, el estándar de desplazamiento Raman se debe colocar en la misma ubicación y se debe medir utilizando parámetros de captación apropiados. Se deberá evaluar el centro del pico de una banda fuerte, bien resuelta en la región espectral de interés. La posición se puede determinar manualmente o con un algoritmo válido de detección de picos adecuado. El software que proporciona el proveedor podría medir la longitud de onda del láser y ajustarla apropiadamente para que este pico se posicione correctamente. Si el proveedor no proporciona esta funcionalidad, la longitud de onda del láser se debe ajustar manualmente. Dependiendo del tipo de láser, su longitud de onda puede variar con la temperatura, la corriente y el voltaje. Las tolerancias de longitud de onda pueden variar dependiendo de la aplicación específica. INTENSIDAD DE LA SEÑAL (EJE
Y)
La calibración del eje fotométrico puede ser crítica para la cuantificación exitosa usando ciertos métodos analíticos (quimiometría) y para la transferencia de métodos entre instrumentos. Tanto los espectrómetros FT-Raman como los espectrómetros Raman dispersivos deben pasar por procedimientos de calibración similares. La tolerancia de la precisión fotométrica aceptable para una medición dada debe establecerse durante la etapa de desarrollo del método. Para calibrar la respuesta fotométrica de un instrumento Raman, se debe utilizar una fuente de emisión de banda ancha. Existen dos métodos aceptados. El Método A, utiliza una fuente de luz blanca de tungsteno. 2 La potencia de dichas fuentes es rastreable al Instituto Nacional de Metrología (NMI, por sus siglas en inglés). En el Reino Unido, el Laboratorio Nacional de Física suministra también bombillas de luz calibradas. Muchos otros proveedores suministran también estándares de calibración de irradiación rastreable al NIST. Este método se aplica a todas las longitudes de onda de excitación comunes de los láseres enumeradas en la Tabla 1. En el Método B, se utilizan los materiales de referencia estándar (SRM, por sus siglas en inglés) NIST. 3 Varios estándares de fluorescencia de vidrio dopado están actualmente disponibles.
1 ASTM El 840-96(2002) Standard Guide for Raman Shift Standards for Spectrometer Calibration, ASTM lnternational, 100 Barr Harbor Orive, PO Box C700, West Conshohocken, PA, USA 19428-2959. 2 Declaración de fuente de luz blanca de tungsteno rastreable al NIST: Mientras que la calibración del eje de frecuencia Raman (o desplazamiento Raman, cm- 1) utilizando materiales puros y una norma ASTM existente es muy aceptada, las técnicas para la calibración del eje de intensidad Raman no lo son. Las calibraciones de intensidad de los espectros Raman se pueden lograr con fuentes de luz blanca certificadas. 3 NIST SRM 2241: Ray KG, McCreery RL. Raman intensity correction standard far systems operating with 785-nm excitation. Appl. Spectrosc.1997, 51, 108-116.
USP 39
Información General/ (1120) Espectroscopía Raman 1495
Método A-La fuente debe colocarse en la ubicación de la muestra con el láser apagado y medir la respuesta del detector (usando parámetros apropiados para el instrumento). Se debe conocer la potencia de la fuente usada para la calibración. La relación de la respuesta medida con respecto a la respuesta verdadera debe determinarse y se debe generar un archivo de corrección. Esta corrección se debe aplicar a todos los espectros captados con el instrumento. La mayoría de los fabricantes proporcionarán tanto fuentes apropiadas de calibración como software para este enfoque. Si el fabricante no proporciona un procedimiento o un método, el usuario puede realizar la tarea utilizando una fuente obtenida del NIST y un software apropiado. Si se utiliza el método de un fabricante, se debe prestar atención al procedimiento de calibración y a la validez de la fuente. El usuario debe obtener documentación apropiada del fabricante para asegurar un enfoque calificado. Método B-EI estándar de fluorescencia debe colocarse en la ubicación de la muestra. Con el láser encendido, se debe obtener un espectro del SRM (utilizando parámetros apropiados para el instrumento). El valor de la potencia de la fuente usada para la calibración debe ser conocido. La relación de la respuesta medida con respecto a la respuesta verdadera debe determinarse y se debe generar un archivo de corrección. Esta corrección se debe aplicar a todos los espectros captados con el instrumento. La mayoría de los fabricantes proporcionarán tanto fuentes apropiadas de calibración como software para este enfoque. Si el fabricante no proporciona un procedimiento o un método, el usuario puede realizar la tarea utilizando una fuente obtenida del NIST y un software apropiado. Si se utiliza el método de un fabricante, se debe prestar atención al procedimiento de calibración y a la validez de la fuente. El usuario debe obtener documentación apropiada del fabricante para asegurar un enfoque calificado. [NOTA-El Método Bes adecuado actualmente para sistemas con excitación del láser de 785 nm (SRM 2241 ), 532 nm (SRM 2242) y tanto para 514,5 nm como para 488 nm (SRM 2243). El NIST está desarrollando actualmente otros materiales SRM que serán específicos para longitudes de onda de excitación de 1064 nm (SRM 2244) y 632,8 nm (se espera que estén disponibles en 2006).] CALIBRACIÓN EXTERNA Se recomienda la validación funcional detallada empleando estándares de referencia externos para demostrar la aptitud instrumental de instrumentos de laboratorio, incluso para aquellos instrumentos que poseen sistemas internos de calibración. El uso de estándares de referencia externos no evita la necesidad de procedimientos internos de control de calidad; por el contrario, proporciona documentación independiente sobre la aptitud del instrumento para realizar el análisis o aplicación específicos. Para los instrumentos instalados en sitios de procesamiento o en un reactor donde el posicionamiento de un estándar externo de forma rutinaria no es posible, incluidos aquellos instrumentos que poseen sistemas internos de calibración, se debe realizar la verificación periódica del desempeño relativo del sistema de calibración interna y externa. El propósito de esta prueba es comprobar los cambios en los componentes que no puedan incluirse en el método de calibración interna (lentes de proceso, sonda de fibra óptica, etc.), p.ej., la calibración fotométrica del sistema óptico.
CALIFICACIÓN Y VERIFICACIÓN DE ESPECTRÓMETROS RAMAN La aptitud de un instrumento específico para un método dado se asegura mediante una evaluación exhaustiva de aptitud tecnológica para la aplicación; una calificación operativa, rutinaria y periódica del instrumento; y la verificación de desempeño más frecuente (ver Definición de Términos y Símbolos). El propósito de la evaluación de aptitud tecnológica es asegurar que la tecnología propuesta es adecuada para la aplicación prevista. El propósito de la calificación del instrumento es asegurar que el instrumento a usar sea adecuado para su aplicación prevista y, cuando se vuelva a calificar periódicamente, éste continúe funcionando correctamente durante largos períodos de tiempo. Cuando el dispositivo se usa para un análisis cualitativo o cuantitativo específico, se realizan verificaciones regulares del desempeño. Debido a que existen muchos enfoques distintos para medir los espectros Raman, la calificación operativa del instrumento y la verificación del desempeño a menudo emplean estándares externos que se pueden utilizar en cualquier instrumento. Como con cualquier dispositivo espectrométrico, un instrumento Raman debe estar calificado tanto para la precisión del número de onda (eje x y desplazamiento de la fuente de excitación) como para la precisión fotométrica (eje de señal). En la verificación del desempeño, se puede emplear la calidad de ajuste a un barrido inicial o grupo de barridos (a menudo llamada acumulación, en los instrumentos que no son de barrido) incluidos en la calificación instrumental. Se supone que, en tal análisis, los espectros del estándar de referencia recogidos con un instrumento nuevo o recientemente reparado, que funcione correctamente, representan los mejores espectros disponibles. La comparación de los espectros tomados a lo largo del tiempo con estándares de referencia idénticos (ya sea el estándar original o nuevos estándares idénticos si la estabilidad de los estándares de referencia es cuestionable) constituye la base para evaluar la estabilidad a largo plazo de un sistema de medición Raman.
Frecuencia de Prueba La calificación instrumental se realiza a intervalos especificados o después de una reparación o una reconfiguración óptica significativa, tal como el reemplazo del láser, el detector o los filtros de banda escalonada o de borde. La recalificación total del instrumento podría no ser necesaria cuando se cambian accesorios de muestreo como una microsonda, un compartimiento de muestra o una sonda de fibra óptica fija. Las pruebas de verificación de desempeño pueden ser suficientes en estos casos; se
1496 (1120) Espectroscopía Raman / Información General
USP 39
deberán seguir las pautas específicas para el instrumento proporcionadas por el proveedor sobre los requisitos de calificación. Las pruebas incluyen la precisión de la longitud de onda (eje x y desplazamiento de la fuente de excitación) y la precisión fotométrica (eje de señal). Las pruebas de calificación del instrumento exigen que se cumpla con las tolerancias específicas dependientes de la aplicación. La verificación de desempeño se lleva a cabo en el instrumento configurado para las mediciones analíticas y se realiza más frecuentemente que la calificación del instrumento. La verificación de desempeño incluye la medición de la incertidumbre de la longitud de onda y la precisión de la escala de intensidad. Las pruebas de precisión de longitud de onda y de precisión de la escala de intensidad pueden ser necesarias antes de la adquisición de datos en un día dado. El desempeño se verifica comparando los espectros actuales con los recogidos durante la calificación anterior del instrumento.
Calificación Operativa del Instrumento Es importante notar que las especificaciones de aceptación dadas en las secciones Calificación Operativa del Instrumento y en Calificación de Desempeño se aplican al uso general; las especificaciones para los instrumentos y las aplicaciones particulares pueden variar según el método de análisis usado y la exactitud deseada en el resultado final. También se especifican los materiales de referencia estándar de ASTM, entendiendo que bajo ciertas circunstancias (específicamente aplicaciones remotas en línea) la calibración usando uno de estos materiales puede ser poco práctica y se pueden utilizar otros materiales verificados adecuadamente. En este punto es importante destacar que se deben incluir parámetros específicos, como el ruido del espectrómetro, los límites de detección (LOO, por sus siglas en inglés), los límites de cuantificación (LOQ, por sus siglas en inglés) y el ancho de banda espectral aceptable, para cualquier aplicación dada como parte del desarrollo del método analítico. Los valores específicos para las pruebas, como el ruido del espectrómetro y el ancho de banda, dependerán del instrumento elegido y del propósito de la prueba. Como resultado, las pruebas específicas del instrumento para estos parámetros no se incluyen en este capítulo informativo. EXACTITUD DE LA LONGITUD DE ONDA (EJE X) Es importante asegurar la exactitud del eje de la longitud de onda a través de la calibración, para mantener la integridad de las posiciones de los picos Raman. La calibración de la longitud de onda de un espectrómetro Raman consta de dos partes: calibración del eje de longitud de onda primaria y la calibración de la longitud de onda del láser. Después de calibrar tanto el eje de longitud de onda primaria como la longitud de onda del láser, se puede determinar la incertidumbre de la longitud de onda del instrumento. Esto se puede lograr usando un estándar de desplazamiento Raman como los estándares de desplazamiento ASTM u otro material verificado en forma adecuada. Se recomienda la elección de un estándar con bandas presentes a lo largo de todo el intervalo espectral Raman para que la incertidumbre de la longitud de onda del instrumento se pueda evaluar en varias posiciones dentro del espectro. La tolerancia de la precisión de la longitud de onda necesaria para una medición dada debe determinarse durante la etapa de desarrollo del método. [NOTA-Para los instrumentos de dispersión de barrido, es posible que se necesite realizar la calibración con mayor frecuencia y puede ser que se tenga que verificar la precisión tanto en el modo operativo de barrido como en el estático.] PRECISIÓN FOTOMÉTRICA La variación del láser con respecto a la cantidad total de fotones emitidos que ocurre durante dos mediciones puede causar cambios en la precisión fotométrica del instrumento. Desafortunadamente, es muy difícil separar los cambios en la respuesta fotométrica asociada a las variaciones en la cantidad total de fotones emitidos por la muestra y las perturbaciones inducidas por el muestreo. Ésta es una de las razones por las que las mediciones Raman absolutas no se recomiendan y el motivo por el cual se fijan especificaciones de precisión fotométrica relativamente amplias. La tolerancia de la precisión fotométrica necesaria para una medición dada debe evaluarse durante la etapa de desarrollo del método. CALIFICACIÓN DE DESEMPEÑO El objetivo de la calificación de desempeño es asegurar que el instrumento se desempeñe dentro de límites especificados con respecto a la precisión de la longitud de onda, la precisión del eje fotométrico y la sensibilidad. En algunos casos, cuando el instrumento haya sido ajustado para una medición específica (por ejemplo, cuando se lo instala en un reactor de proceso), puede no ser posible ni deseable medir los estándares de referencia de calificación de la longitud de onda y fotométricos (señal) que se identificaron anteriormente. Siempre que la calificación operativa del instrumento haya mostrado que el equipo es apto para ser usado, se puede utilizar un único estándar externo de verificación de desempeño para volver a verificar la función de modo continuo (por ejemplo, una señal de un disolvente de proceso usada de manera rutinaria, para la precisión tanto de la longitud de onda como fotométrica, después de la limpieza del reactor). El estándar de verificación de desempeño debe ser lo más parecido posible en formato a las muestras en análisis y utilizar parámetros similares de adquisición espectral. Las mediciones cuantitativas del espectro de un estándar de verificación de desempeño externo verifican la precisión tanto de la longi-
USP 39
Información General/ (1120) Espectroscopía Raman 1497
tud de onda (eje x y longitud de onda del láser) como fotométrica (señal). La comparación favorable de una serie de espectros de verificación de desempeño demuestra el correcto funcionamiento continuo del instrumento. PRECISIÓN DE lA LONGITUD DE ONDA La precisión de la longitud de onda debe medirse recolectando datos para un único espectro del estándar de desplazamiento Raman seleccionado para un período igual al usado en la prueba de uniformidad fotométrica. Cuando resulte apropiado, las muestras en polvo se deben recompactar entre un conjunto de mediciones. Las posiciones de los picos a lo largo del intervalo espectral de interés se utilizan para calcular la precisión. El desempeño se verifica comparando las posiciones actuales de los picos con las recolectadas durante la calificación anterior del instrumento y no debe variar con una desviación estándar de más de ±0,3 cm-1, si bien esta especificación se puede ajustar según la exactitud necesaria en la medición. PRECISIÓN FOTOMÉTRICA La precisión fotométrica debe medirse recolectando datos para un único espectro de un material estándar de referencia verificado adecuadamente durante un tiempo especificado. Después de una corrección adecuada de la línea base, se deben calcular las áreas de una cierta cantidad de bandas, a lo largo del intervalo espectral de interés, usando un algoritmo apropiado. El área de la banda más fuerte se ajusta a 1 y todas las otras se normalizan según esta banda. El desempeño se verifica haciendo coincidir las áreas de banda actuales con las áreas respectivas recogidas durante la calificación anterior del instrumento. Las áreas no deben variar en más de 10%, si bien esta especificación se puede ajustar según la exactitud requerida en la medición. PRECISIÓN Y EXACTITUD DE lA POTENCIA DE SALIDA DEL LÁSER Esta prueba se aplica únicamente a los instrumentos Raman con medidores automáticos internos de potencia láser. Los instrumentos sin medición de potencia láser deben utilizar un medidor de potencia láser calibrado de un proveedor reconocido. La potencia del láser debe ajustarse a una salida representativa, determinada por los requisitos de la medición analítica y por la potencia del láser medida. La salida debe medirse y verificarse con respecto a la salida medida en la calificación del instrumento. La energía (en milivatios o vatios) no debe variar más del 25% en comparación con el nivel calificado. Si la potencia varía más de esta cantidad, se le debe realizar un servicio al instrumento (ya que esta variación puede indicar, entre otras cosas, una gran desalineación del sistema o el principio de una falla del láser). Para los instrumentos con un medidor automático interno de la potencia láser, la exactitud de los valores generados por el medidor de potencia interno se debe comparar con un medidor de potencia láser externo calibrado a intervalos no mayores de 12 meses. El valor calculado internamente se debe comparar con el generado por el medidor externo de potencia. El desempeño se verifica comparando el valor actual con el generado durante la calificación anterior del instrumento. El fabricante puede proporcionar un software que facilite este análisis. Si el diseño del instrumento impide el uso de un medidor externo de potencia, el proveedor debe proporcionar documentación para asegurar la calidad del instrumento y además un procedimiento recomendado para realizar el análisis mencionado anteriormente durante una visita de servicio programada.
VALIDACIÓN DE MÉTODOS La validación de los métodos Raman seguirá los mismos protocolos descritos en Validación de Procedimientos Farmacopeicos (1225) en términos de exactitud, precisión, etc. Sin embargo, varios de estos criterios se ven afectados por variables específicas para la espectrometría Raman. La fluorescencia es la principal variable que puede afectar la aptitud de un método. La presencia de impurezas fluorescentes en las muestras puede ser bastante variable y tener poco efecto en la aceptabilidad de un material. El método debe ser lo suficientemente flexible para aceptar los diferentes regímenes de muestreo que puedan ser necesarios para minimizar los efectos de estas impurezas. Se debe confirmar la linealidad del detector en todo el intervalo de niveles de señal posible. La fluorescencia podría provocar elevaciones de la línea base y ruidos más allá de los utilizados en la validación, en cuyo caso se debe disminuir la fluorescencia, o el método se debe modificar para aceptar los niveles de fluorescencia superiores. Esto también es cierto para la precisión, los límites de detección (LOD) y los límites de cuantificación (LOQ) del método, debido a que un mayor ruido de la línea base afectará negativamente a todos estos valores. Como la fluorescencia puede influir también en la cuantificación debido a los desplazamientos en la línea base, se debe confirmar también la cuantificación aceptable a distintos niveles de fotoblanqueo, cuando se use. Se debe determinar el impacto del láser sobre la muestra. La inspección visual de la muestra y la inspección cualitativa del espectro Raman para las mediciones con diferentes potencias de láser y tiempos de exposición confirmarán que la muestra no se está alterando (excepto por fotoblanqueo). Las variables específicas a confirmar en el espectro son los desplazamientos en la posición de los picos, los cambios en la altura y en el ancho de banda de los picos y los cambios inesperados en la intensidad de fondo. La precisión del método también debe abarcar la posición de la muestra. La presentación de la muestra es un factor crítico tanto para sólidos como para líquidos y debe controlarse muy de cerca o debe tenerse en cuenta en el modelo de calibración.
1498 (1120) Espectroscopía Raman / Información General
USP 39
La sensibilidad a la posición de la muestra puede a menudo minimizarse mediante la preparación apropiada de la muestra o la geometría del portamuestras, pero variará de un instrumento a otro según la excitación y la configuración óptica de recolección.
DEFINICIÓN DE TÉRMINOS Y SÍMBOLOS ANCHO DE BANDA (o RESOLUCIÓN) DEL INSTRUMENTO: es una medida de la capacidad del espectrómetro para separar radiaciones de longitudes de onda similares. CALIFICACIÓN DE DESEMPEÑO: es el proceso por el cual se verifica el desempeño uniforme del instrumento mediante el uso de uno o más materiales de referencia estables y bien caracterizados. En la calificación se pueden emplear estándares iguales o diferentes para las diversas características de desempeño. CALIFICACIÓN OPERATIVA: es el proceso mediante el cual se demuestra y se documenta que el instrumento funciona de acuerdo con las especificaciones, y que puede realizar la tarea para la cual está previsto. Este proceso es necesario luego de cambios significativos como la instalación del instrumento, cambio de ubicación, reparaciones importantes, etc. DESPLAZAMIENTO DEL NÚMERO DE ONDA RAMAN: 4 ,
es el número de onda de la línea excitante menos el número de onda de la radiación dispersada. Unidad SI: m-1. Unidad común: cm-1 = 100 m-1.
fJAv donde fJ es la sección transversal Raman diferencial, es positivo para la dispersión de Stokes y negativo para la dispersión antiStokes. DISPERSIÓN RAMAN (NORMAL): 4 es la dispersión inelástica de radiación que ocurre debido a cambios en la polarizabilidad, de los enlaces pertinentes durante una vibración molecular. Los espectros Raman normales se excitan por radiación que no está en resonancia con las transiciones electrónicas en la muestra. ESPECTROS RAMAN: 4 son gráficos de la energía radiante o de la cantidad de fotones dispersos por la muestra a través de la interacción indirecta entre las vibraciones moleculares en la muestra y la radiación monocromática de frecuencia mucho mayor que la de las vibraciones. La abcisa por lo general es la diferencia en el número de onda entre la radiación incidente y la dispersada. MODELO DE CALIBRACIÓN: es una expresión matemática que relaciona la respuesta de un instrumento analítico con las propiedades de las muestras.
(1121) NOMENCLATURA INTRODUCCIÓN Las denominaciones USP (o NF) para artículos de monografías están reconocidas en la Ley Federal de Alimentos, Medicamentos y Cosméticos como las denominaciones de uso para etiquetar los artículos a los que se refieren. El valor de denominar a cada fármaco mediante una única denominación común 1 es importante con respecto al logro de simplicidad y uniformidad en la nomenclatura de fármacos. En apoyo al programa de Nombres Adoptados en los Estados Unidos (U.S. Adopted Names) (ver Misión y Prefacio en los compendios USP-NF), copatrocinado por la Convención de la Farmacopea de los Estados Unidos, el Consejo de Expertos de la USP considera la adopción del Nombre Adoptado en los Estados Unidos, si existiera, como nombre oficial para cualquier compuesto que alcance reconocimiento farmacopeico. Se proporciona una recopilación de los Nombres Adoptados en los Estados Unidos (USAN, por sus siglas en ingles) publicada desde el inicio del programa USAN en 1961, al igual que otros nombres de fármacos, tanto vigentes como retrospectivos, en el USP Dictionary of USAN and lnternational Drug Names (Diccionario USP de Nombres de Fármacos USAN e Internacionales, disponible sólo en inglés). Esta publicación sirve como una guía de nombres útil para identificar y distinguir toda clase de nombres de fármacos, ya sean nombres comunes, marcas comerciales, nombres químicos o designados por códigos (alfanuméricos).2 La denominación común de un fármaco sirve para numerosos y diversos propósitos. Su función principal es identificar la sustancia a la que se refiere por medio de una denominación que pueda ser empleada por el público profesional y no profesio4 Chalmers, j., Griffiths, P., Eds. Handbook of Vibrational Spectroscopy;john Wiley & Sons, Ltd: New York, 2002. 1 Con respecto a la nomenclatura de fármacos, el término "genérico" ha sido usado ampliamente en lugar del término "común", que es más más exacto y des-
criptivo. 2 El USP Dictionary of USAN and Jnternational Drug Names (Diccionario USP de Nombres de Fármacos USAN e Internacionales) se puede solicitar a: U.S. Pharmacopeia, Customer Service Department, 12601 Twinbrook Parkway, Rockville, MD 20852.
USP 39
Información General/ (1121) Nomenclatura 1499
nal sin las limitaciones asociadas a las marcas registradas. La enseñanza en ciencias de la salud requiere una denominación común, especialmente en el caso de un fármaco que se puede obtener de distintas fuentes o que está incorporado en un producto farmacéutico combinado; las denominaciones comunes facilitan la comunicación entre los profesionales de la salud; las denominaciones comunes se deben utilizar como los nombres de los artículos reconocidos por los compendios oficiales de medicamentos; una denominación común es esencial para el fabricante de productos farmacéuticos como un medio para proteger la propiedad industrial del nombre de marca comercial del artículo correspondiente; y, finalmente, la ley federal obliga al fabricante a incluir la denominación común establecida en la publicidad y el etiquetado. Según los términos de las Enmiendas sobre Medicamentos (Drug Amendments) de 1962 a la Ley Federal de Alimentos, Medicamentos y Cosméticos, que se transformaron en ley el 1O de octubre de 1962, la Secretaría de Salud y Asuntos Sociales (Secretary of Health and Human Services) está autorizada a darle un nombre oficial a cualquier fármaco cuando se considere "necesario o conveniente por motivos de utilidad y simplicidad" .3 El Comisionado de Alimentos y Medicamentos y la Secretaría de Salud y Asuntos Sociales publicaron en el Diario Oficial reglamentos en vigor a partir del 26 de noviembre de 1984, que establecen, en parte: "Sec. 299.4 Nombres establecidos de fármacos." "(e) La Administración de Alimentos y Medicamentos (Food and Drug Administration) no designará de forma rutinaria nombres oficiales de acuerdo con el artículo 508 de la ley. Como resultado, el nombre establecido de conformidad con el artículo 502(e) de la ley será generalmente el nombre farmacopeico del fármaco, o, si no hay nombre farmacopeico, el nombre común y habitual del fármaco. Las personas interesadas, en ausencia de una denominación oficial por parte de la Administración de Alimentos y Medicamentos, pueden contar con el nombre farmacopeico vigente o el nombre USAN adoptado que figure en el USAN y el USP Dictionary of Drug Names como el nombre establecido para cualquier fármaco." 4 Se debe tener en cuenta que las monografías sobre los productos biológicos, producidos de conformidad con licencias otorgadas por la Secretaría del Departamento de Salud y Asuntos Sociales de Estados Unidos, representan un caso especial. Si bien las gestiones para lograr la uniformidad continúan, puede haber alguna diferencia entre el nombre respectivo estipulado por la ley federal y el nombre USP. Dichas diferencias son menos que las que había en revisiones anteriores de la Farmacopea. El nombre USP, cuando es distinto del nombre otorgado por el Center for Biologics Evaluation and Research de la FDA (Centro de Evaluación e Investigación de Productos Biológicos), no constituye necesariamente un sinónimo a los fines del etiquetado; las condiciones para la concesión de la licencia de los productos biológicos en cuestión exigen que cada uno de esos artículos sea denominado por el nombre que figura en la licencia de producto otorgada al fabricante. Cuando un nombre USP difiere del nombre establecido en los reglamentos federales, el primero ha sido adoptado en vista de su utilidad, simplicidad y cumplimiento con los principios que rigen la selección de títulos de monografías en general.
POLÍTICA PARA LA DENOMINACIÓN DE MONOGRAFÍAS DE MEDICAMENTOS Y PREPARACIONES MAGISTRALES QUE CONTIENEN SALES DE FÁRMACOS Los títulos de las monografías de la USP para productos farmacéuticos y preparaciones magistrales formulados con una sal de un ácido o una base usan el nombre de la parte activa, según se define a continuación. El contenido del producto o preparación también se expresa en términos de la parte activa. La porción activa es la molécula o ión, excluyendo aquellas partes de la molécula adjuntas que causan que el fármaco sea una sal (incluyendo una sal con uniones de coordinación o puentes de hidrógeno), u otros derivados no covalentes de la molécula (como complejos, quelatos o clatratos). La parte activa es responsable de las acciones fisiológicas o farmacológicas del fármaco, sin importar si la molécula in vivo está eléctricamente cargada. Por ejemplo, la parte activa de la sal clorhidrato de una base es la base libre y no la forma protonada de la base. La parte activa de una sal metálica de un ácido es el ácido libre. La USP sigue esta Política para denominar los productos farmacéuticos y las preparaciones magistrales recientemente reconocidos en el compendio USP. No se pretende revisar las monografías existentes para que se ajusten a esta Política, a menos que el Consejo de Expertos de la USP determine que, por razones tales como seguridad, se justifique un cambio de nomenclatura.
Etiquetado El etiquetado indica claramente la forma salina específica de la parte activa que está presente en el producto o preparación, debido a que esta información puede ser útil para profesionales de la salud y pacientes. Se proveen en el etiquetado los nombres y los contenidos tanto de la parte activa como de la forma salina específica (cuando corresponde).
Excepciones Se puede considerar una excepción a esta Política, en aquellos casos raros en los que el uso de la forma salina específica de la parte activa en el nombre suministra información vital desde una perspectiva clínica. En tales casos, cuando el título de la 3 4
F.D.&C. Act (Ley Federal de Alimentos, Medicamentos y Cosméticos), Sec. 508 [358]. 53 Fed. Reg. (Diario Oficial) 5369 (1988) que enmienda el Título 21 del CFR (Código de Reglamentos Federales)§ 299.4.
1500 (1121) Nomenclatura / Información General
USP 39
monografía contiene la forma salina específica de la parte activa, el contenido del producto o preparación también se expresa en términos de la forma salina específica.
Cambio en la redacción:
FORMAS GENERALES DE NOMENCLATURA Se encuentra disponible una lista de los productos farmacéuticos específicos con ejemplos amplios en el documento USP Nomenclature Guidelines (Pautas de Nomenclatura de la USP) (www.usp.org). La USP ha desarrollado también diversas prácticas generales para la nomenclatura de productos farmacéuticos: • La [VÍA DE ADMINISTRACIÓN] se omite en aquellas formas farmacéuticas para las que la vía de administración se sobreentiende. Para esos casos, la forma general es simplemente [FÁRMACO], [FORMA FARMACÉUTICA]. - Por consiguiente, el término oral no se incluirá como la vía de administración para cápsulas, tabletas y tabletas de disolución bucal que se administren por la vía oral. - La vía de administración se omite para productos aplicados por vía tópica-cremas, ungüentos, lociones y pastas. No obstante, si se prevé alguna otra vía de administración (p.ej., oftálmica), se incluirá en el título de la monografía. • En algunos casos, el fármaco se presenta en una forma farmacéutica para la preparación de otra forma farmacéutica. En tales casos, se nombra primero la forma farmacéutica provista en el envase y utiliza la preposición "para", seguida de la forma farmacéutica final que es adecuada para administración. El formato general es [FÁRMACO] [FORMA FARMACÉUTICA] para [FORMA FARMACÉUTICA] [VÍA DE ADMINISTRACIÓN], p.ej. Aspirina, Tabletas Efervescentes para Solución Oral. • El término "para" se incluye en los nombres de preparaciones sólidas que se deben disolver o suspender en un líquido adecuado para obtener una forma farmacéutica adecuada para su administración, y la forma general es [FÁRMACO] para [FORMA FARMACÉUTICA] [VÍA DE ADMINISTRACIÓN], p.ej., Ampicilina para Suspensión Oral, Citarabina para Inyección. • El término "Insertos Vaginales", en lugar de "Tabletas Vaginales", "Cápsulas Vaginales" o "Supositorios Vaginales" se usa en el nombre de este tipo de preparación vaginal para reducir la posibilidad de uso indebido de estos productos. • El término "Supositorios" se usa en los nombres de preparaciones sólidas destinadas a la administración rectal. • Las soluciones que se administran mediante inyección reciben oficialmente el nombre de Inyectables (ver el capítulo • Medicamentos Jnyectables yen Implantes {1)• (AFo1.may.2m 6i). La vía de administración se omite para fármacos que se inyectan, debido a que la vía (p.ej., intravenosa, intramuscular, subcutánea, etc.) debe aparecer en las etiquetas y en el etiquetado. La USP define siete tipos de inyectables: 1. [FÁRMACO] Inyección-Preparaciones líquidas que son fármacos o soluciones de los mismos. 2. [FÁRMACO] para Inyección-Sólidos secos que, al agregarles vehículos adecuados, producen soluciones que cumplen con todos los requisitos para Inyectables. 3. [FÁRMACO] Emulsión Inyectable-Preparaciones líquidas de fármacos disueltos o dispersos en un medio para emulsión adecuado. 4. [FÁRMACO] Suspensión Inyectable-Preparaciones líquidas de sólidos suspendidos en un medio líquido adecuado. 5. [FÁRMACO] para Suspensión Inyectable-Sólidos secos que, al agregarles vehículos adecuados, producen soluciones que cumplen con todos los requisitos para Suspensiones Inyectables. 6. [FÁRMACO] Suspensión Inyectable de Liberación Prolongada-Preparaciones líquidas de sólidos suspendidos en un medio líquido adecuado y formuladas de forma tal que permite la disponibilidad del ingrediente farmacéutico activo durante un periodo prolongado. 7. [FÁRMACO] para Suspensión Inyectable de Liberación Prolongada-Sólidos secos que, al agregarles vehículos adecuados, producen preparaciones que cumplen con todos los requisitos para Suspensiones Inyectables de Liberación Prolongada. Los inyectables destinados para ser administrados a través de un desvío en una línea intravenosa ("piggyback") que se formulan en vehículos que no sean de Agua para Inyección deben denominarse de la siguiente manera: [FÁRMACO] en [VEHÍCULO]. A continuación se presentan ejemplos de formatos de Vehículo que actualmente aparecen en títulos de monografías USP: 1 . [FÁRMACO] en Inyección de Dextrosa 2. [FÁRMACO] en Inyección de Dextrosa y Cloruro de Sodio 3. [FÁRMACO] en Solución de Ringer Lactato y Dextrosa Inyectable 4. [FÁRMACO] en Inyección de Cloruro de Sodio
POLÍTICA PARA LA IMPLEMENTACIÓN DE REVISIONES DE NOMENCLATURA Con el objeto de proveer un tiempo razonable para realizar los cambios en las etiquetas de los productos y para permitir que los profesionales de la salud y los consumidores tengan suficiente tiempo para familiarizarse con la nueva terminología, es la práctica de la USP establecer fechas oficiales para las revisiones en la nomenclatura (cambios en los nombres establecidos o en los aspectos de la nomenclatura que se encuentran en las secciones de etiquetado de las monografías). La determinación del periodo de implementación está a cargo del Comité de Expertos de la USP. Los periodos de implementación de la USP que se describen a continuación, son automáticos, a menos que se trate de una excepción.
t.:ISP 39
Información General/ (1125) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos 1501
18 meses Por lo general se aplica un periodo de implementación de 18 meses cuando sólo uno o un pequeño número de productos se ven afectados.
30 meses Por lo general se aplica un periodo de implementación de 30 meses cuando se cambian los nombres o etiquetados de productos de distintas fuentes o de líneas de varios productos de una compañía de preparaciones.
60 meses Por lo general se aplica un periodo de implementación de 60 meses para cambios en nombres o etiquetados que afecten excipientes, porque dichos cambios implican el reetiquetado de cantidades muy grandes de preparaciones con receta médica y de preparaciones de venta libre. Puede haber excepciones a estos periodos de implementación cuando se necesite un tiempo más corto para especificar los cambios de nomenclatura y etiquetado en casos que la salud pública y la seguridad sean motivo de preocupación. Rara vez se otorgan extensiones a los periodos de implementación y éstas deben contar con justificaciones adecuadas, además de la aprobación del Comité de Expertos de la USP. Cualquier pregunta o inquietud relacionada con los periodos de implementación se debe dirigir al personal de enlace de la USP asignado al Comité de Expertos.
(1125) TÉCNICAS BASADAS EN ÁCIDOS NUCLEICOSGENERALIDADES ALCANCE Los ensayos basados en ácidos nucleicos se usan en una gran variedad de ámbitos, de los cuales los más comunes son la detección de agentes infecciosos (virus, bacterias, etc.) y materiales celulares, así corno en la clasificación de enfermedades. En los últimos tiempos, tales ensayos se han usado también para propósitos forenses y para la detección de oligocontarninantes en materiales biológicos. Este último incluye aplicaciones para el desarrollo farmacéutico, corno la depuración viral y el análisis de agentes adventicios en lotes de siembra de vacunas y bancos de células para cultivo de tejidos. Este capítulo sirve de introducción a una serie de capítulos de información general que proporcionan técnicas de apoyo a procedimientos para la detección y el análisis de ácidos nucleicos (ver la Figura 1). Los ensayos que usan estas técnicas pueden presentarse en un capítulo general de la USP o en una especificación privada.
USP 39
1502 (1125) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos / Información General
<1126> Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos Extracción, Detección y Secuenciación
<1127> Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos Amplificación
<1125> Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos Generalidades
<1128> Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos M icromatrices
<1129> Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos Genotipificación
<1130> Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos Enfoques para Detectar Trazas de Ácidos Nucleicos (Análisis de ADN Residual)
Figura 1 El requisito principal para cualquier procedimiento analítico de ácidos nucleicos es la disponibilidad de ácidos nucleicos puros e intactos para análisis. La información en Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Extracción, Detección y Secuenciación (1126) discute los procedimientos disponibles para la extracción y manipulación de ácidos nucleicos. La hibridación es el mecanismo central detrás de muchas técnicas de biología molecular y, además de la detección de ácidos nucleicos por mediciones de absorbancia y fluorescencia y mediciones de tamaño por electroforesis en gel, este capítulo cubre también la transferencia (blotting) e identificación de especies de ácidos nucleicos por ensayos de hibridación, usando sondas marcadas (labeled probes). Las sondas de hibridación son oligonucleótidos que tienen una secuencia complementaria al blanco de interés. Las sondas contienen etiquetas (tags) radioactivas, fluorescentes, de biotina, de digoxigenina u otras etiquetas, que después de la unión de la sonda al blanco permiten la visualización e identificación de este último. Las sondas son capaces de detectar secuencias blanco que están presentes en concentraciones demasiado bajas para ser detectadas por mediciones de absorbancia o electroforesis en gel. Estos procedimientos analíticos requieren una cantidad mínima de ácido nucleico, por lo general del orden de nanogramos a microgramos. Sin embargo, en la gran mayoría de los casos, p.ej. en la detección de virus o especies de ARN celular poco frecuentes, el ácido nucleico en análisis está presente en cantidades mínimas (del orden de picogramos a femtogramos) y se debe efectuar un paso de amplificación antes de poder detectar e identificar el ácido nucleico. El paso de amplificación puede dirigirse, bien sea a la señal usada para la detección (amplificación de señal), como el ensayo de ADN ramificado (ensayo de ADNb), o al blanco, como en las tecnologías de amplificación de ácidos nucleicos (NAT, por sus siglas en inglés). En 1983, se desarrolló un proceso revolucionario pero simple a la vez, conocido como reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés), para amplificar el número de fragmentos específicos de ácido nucleico presentes en una muestra y apenas unos pocos años después de su descubrimiento, la PCR se convirtió en el procedimiento más frecuentemente usado para amplificar ácidos nucleicos, especialmente ADN. Desde que se comenzó a usar la PCR, el número de aplicaciones se ha expandido rápidamente y la técnica, que incluye ahora ensayos cuantitativos y multiplex, se usa actualmente en casi todos los campos de investigación y desarrollo en biología y medicina. Se han desarrollado numerosas variaciones de los procedimientos del ensayo para analitos específicos. El capítulo de información general, Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Amplificación (1127), describe los procedimientos de amplificación usados para los análisis de ADN y ARN, así como para los ensayos NAT cualitativos y cuantitativos. Los procedimientos de amplificación de señal en los cuales se usan señales, por lo general fluorescentes, para detectar ácidos nucleicos de interés no son muy comunes. El principal procedimiento para amplificación de la
USP 39
Información General/ (1125) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos 1503
señal, el ensayo de ADN ramificado (ensayo de ADNb), se usa predominantemente para la detección de ácidos nucleicos virales. Los aspectos de garantía de calidad de la metodología también están cubiertos, junto con un resumen de los requisitos reglamentarios actuales para los ensayos NAT. La necesidad de resultados mundialmente comparables, exactos y confiables en el campo diagnóstico ha dirigido la búsqueda y el desarrollo de estándares nacionales e internacionales dentro de un ámbito reglamentario internacional altamente desarrollado, cada vez más sofisticado y sólido metrológicamente, dedicado a los más altos estándares de la ciencia reglamentaria. Dado que las NAT se han convertido en las técnicas de ácidos nucleicos más ampliamente usadas, la mayoría de las guías y normas están relacionados con tales tecnologías. El capítulo de información general, Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Micromatrices (1128), se refiere a un campo todavía emergente con relevancia creciente para el análisis de ADN. El tratamiento detallado de diversas micromatrices o microarreglos (microarrays), incluidos el análisis y la validación de los datos, se excluyen del (1128) en este momento. El capítulo de información general, Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Genotipificación (1129), se enfoca en las modificaciones específicas de las técnicas que son necesarias para permitir la detección de diferencias en una sola base y las variaciones genéticas comunes, p.ej., los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP, por sus siglas en inglés). El capítulo de información general final de la serie, Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Enfoques para Detectar Trazas de Ácidos Nucleicos (Análisis de ADN Residual) (1130), describe las pruebas de ADN residual en el contexto de la fabricación farmacéutica. Las aplicaciones relevantes a los agentes virales adventicios se discuten en el capítulo de información general Métodos de Pruebas Virológicas (1237). De esta familia de capítulos sobre NAT se excluyen dos usos principales del análisis de ácidos nucleicos: pruebas virales que garantizan la seguridad de la sangre y hemoderivados y pruebas genéticas. La perspectiva tradicional de la USP consiste en desarrollar normas públicas aplicables a un producto final en particular, sin definir expresamente los detalles de un producto y/o de su producción. El objetivo de este capítulo consiste en especificar cuándo se pueden adaptar las metodologías tradicionales o los estándares existentes. También se mencionan metodologías novedosas para amplificación y detección por NAT. A medida que estas nuevas metodologías se desarrollen y sean correctamente validadas, se irán incluyendo en las revisiones sucesivas. Debido al rápido desarrollo de ese campo, se aconseja a los científicos encargados de asuntos farmacopeicos y reglamentarios que consulten la edición vigente de USP y sus Suplementos con regularidad.
GLOSARIO Absorbancia: [Símbolo: A]-Es el logaritmo, en base 1 O, del recíproco de la transmitancia (T). [NOTA-Los términos descriptivos empleados anteriormente incluyen densidad óptica y extinción.] Ácido desoxirribonucleico (ADN): Material genético que pasa de la célula progenitora a las células hijas y propaga las características de la especie a través de los genes que contiene y de las proteínas para las cuales codifica. El ADN contiene los cuatro desoxirribonucleósidos siguientes: dA, dC, dT y dG. Ácido nucleico: Polímeros lineales de nucleótidos, unidos por enlaces fosfodiéster 3', 5'. En el ADN, ácido desoxirribonucleico, el azúcar es la desoxirribosa y las bases son adenina, guanina, timina y citosina. El ARN o ácido ribonucleico tiene ribosa como azúcar y el uracilo reemplaza la timina. Ácido ribonucleico (ARN): Un tipo de ácido nucleico compuesto por una secuencia específica de ribonucleótidos unidos. El ARN contiene los cuatro ribonucleósidos siguientes: A, C, G y U. Actividad correctora (proofreading): Consiste literalmente en leer con el propósito de detectar errores para su corrección posterior. La ADN polimerasa tiene una actividad de exonucleasa 3'-5' que se usa durante la polimerización para retirar los nucleótidos recién añadidos que están apareados incorrectamente. Actividad exonucleasa 3'-5': Actividad enzimática para retirar un nucleótido mal apareado del extremo 3' de la cadena creciente. La reacción es una hidrólisis de un enlace fosfoéster. La presencia de una actividad exonucleasa 3'-5', o actividad correctora (proofreading), mejora la fidelidad de la polimerización. Actividad exonucleasa 5'-3': Actividad enzimática para retirar un nucleótido mal apareado del extremo 5' de una cadena de polinucleótidos. Esta actividad es en realidad la de una endonucleasa dependiente de cadena simple y es necesaria para retirar los cebadores de ARN de los fragmentos de Okazaki, la cadena de ARN en el heterodúplex de ADN-ARN intermediario durante la transcripción reversa, y durante la reparación del ADN. ADN complementario (ADNc): ADN sintetizado a partir de un molde de ARN en una reacción enzimática catalizada por la enzima transcriptasa reversa. ADN polimerasa: Enzima que puede sintetizar nuevas cadenas de ADN complementario usando un molde de ADN y un cebador. Varias de estas enzimas se consiguen comercialmente, entre ellas ADN Taq polimerasa y ADN rTth polimerasa. ADN rTth polimerasa: ADN polimerasa termoestable recombinante, aislada originalmente de la bacteria Thermus thermophilus. La rTth tiene una actividad óptima entre 70º y 80º y no se degrada durante los pasos de desnaturalización de la PCR. Además de la actividad de ADN polimerasa, tiene una eficiente actividad de transcriptasa reversa en presencia de manganeso. ADN Taq: ADN polimerasa termoestable que se aisló originalmente de la bacteria Thermus aquaticus. La Taq tiene actividad óptima entre 70º y 80º y no se degrada durante los pasos de desnaturalización con calor elevado de la PCR.
1504 (1125) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos/ Información General
USP 39
Alelo: Una o más formas alternativas de un gen en una posición determinada (locus) de un cromosoma, debido a una diferencia en la secuencia del ADN. Amplicón: Segmento corto de ADN generado por el proceso de PCR, cuya secuencia está definida por cebadores directo e inverso. A veces se denomina amplímero. Amplificación: Replicación enzimática in vitro de un ácido nucleico blanco o diana. Apareamiento (annealing): Hibridización o unión de ácidos nucleicos complementarios, por lo general a una temperatura óptima. Apareamiento incorrecto: Apareamiento de bases no convencional (distinto de C con G, A con To U). Un par de bases apareadas incorrectamente tiene menos energía de enlace y disminuye la estabilidad de la molécula de ADN. Cebador (primer): Las polimerasas de ácido nucleico unen un mononucleótido a una cadena de ácidos nucleicos denominada cebador. Las ARN polimerasas son capaces de usar un solo nucleótido como cebador, mientras que las ADN polimerasas siempre requieren un oligonucleótido. Coeficiente de extinción: [Símbolo: e]-Cociente de la absorbancia (A) dividida por el producto de la concentración, expresado en moles/L, de la sustancia y la longitud de paso de la absorción, en cm. [NOTA: Los términos empleados anteriormente incluyen: índice de absorbancia molar, absortividad molar y coeficiente de absorción molar.] Concatenación: Proceso en el cual el segmento de ADN compuesto por secuencias repetidas se une de punta a cabo (end-to end). Desnaturalización: Proceso de separación del ADN de cadena doble en cadenas simples mediante la ruptura de los enlaces de hidrógeno. Esto por lo general se consigue calentando la solución de ADN a temperaturas por encima de 90º o tratándola con un álcali fuerte. Desoxirribonucleótido trifosfato (dNTP): Base que se agrega a un cebador durante la PCR y constituye la cadena recién sintetizada. Ejemplos de dNTP son dATP, dUTP, dCTP, dGTP y dTIP. Endonucleasa: Enzima que escinde los enlaces fosfodiéster en una cadena polinucleotídica. Especificidad: Habilidad para evaluar inequívocamente el analito en presencia de componentes que podrían estar presentes, como impurezas, productos de degradación y componentes de la matriz. Exactitud: La exactitud de un procedimiento analítico es la proximidad entre los resultados de la prueba obtenidos mediante ese procedimiento y el valor verdadero. Extensión: Elongación de la cadena de ADN que se está sintetizando, usando la cadena progenitora de ADN como molde para la síntesis de la cadena hija. Este es un proceso natural que ocurre durante la replicación del ADN. La extensión ocurre durante el proceso de PCR con las ADN polimerasas. Extinción (quenching): Proceso de extinguir, retirar o disminuir una propiedad física como el calor o la luz. La extinción de fluorescencia puede ser colisiona! o estática. Fidelidad: Medida de la exactitud de la replicación del ácido nucleico. La enzima polimerasa usada es sólo uno de los elementos que influyen en la fidelidad. Otros elementos incluyen las condiciones del amortiguador, los parámetros de termociclado, la cantidad de ciclos, la eficiencia de la amplificación y la secuencia del ADN que se está copiando. Fluorescencia: Emisión de uno o más fotones por una molécula o átomo activado por la absorción de un cuanto de radiación electromagnética. Los rayos X, UV, la luz visible las radiaciones IR estimular la fluorescencia. Ver detalles sobre la medición espectroscópica de fluorescencia en _111111~11-llllllBll)~ll~lllll~lfll'I· Fluoróforo: Grupo funcional en una molécula, que la hace fluorescente al una longitud de onda específica y que reemite la energía a otra longitud de onda. Fotoblanqueo (photobleaching): Destrucción irreversible de un fluoróforo en un estado excitado. Los diferentes fluoróforos tienen tasas distintas de fotoblanqueo. Por ejemplo, la fluoresceína se fotoblanquea muy fácilmente. A menudo la tasa de descomposición es proporcional a la intensidad de la iluminación. Una forma simple y práctica de evitar el fotoblanqueo consiste en reducir la radiación incidente. Genoma: Complemento genético completo o conjunto completo de instrucciones para reproducir un organismo y desempeñar su función biológica en la vida. El ADN de nuestras células conforma nuestro genoma. Cuando nuestras células se dividen, el genoma completo en ellas se duplica para su transmisión a cada una de las células hijas resultantes. Genotipificación: Proceso de evaluación de las variaciones genéticas presentes en un individuo. Genotipo: Constitución genética de un organismo según se revela en el análisis genético o molecular, es decir, el conjunto completo de genes, tanto dominantes como recesivos, poseídos por una célula u organismo en particular. Hibridación: Proceso de formación de una molécula de ácido nucleico de doble cadena, por ejemplo entre una secuencia de nucleótidos (sonda) y un blanco (target). Horquilla (hairpin): Estructura dúplex antiparalela que se forma por apareamiento de secuencias repetidas invertidas dentro de un ácido nucleico de cadena simple. La sección helicoidal se llama tallo y el segmento de bases no apareadas al final de la estructura se llama bucle. Ligación: Proceso de unión de dos o más fragmentos de ADN. Límite de cuantificación: Mínima cantidad de analito en una muestra que se puede determinar con precisión y exactitud aceptables bajo las condiciones experimentales declaradas. Límite de detección: Cantidad mínima de analito que puede detectarse en una muestra, aunque no necesariamente cuantificarse, bajo las condiciones experimentales declaradas.
USP 39
Información General/ (1125) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos 1505
Micromatriz o microarreglo (microarray): Sets de zonas de reacción química miniaturizadas que se usan para analizar fragmentos de ADN, anticuerpos o proteínas. Por lo general las sondas se inmovilizan sobre un chip y se hibridizan con un blanco o diana. Molde: Copia maestra usada para comenzar el proceso de replicación de ADN o ARN. Oligonucleótido: Secuencia lineal que comprende hasta 25 nucleótidos unidos por enlaces fosfodiéster, generalmente usados como cebador en la síntesis de ADN. PCR con inicio en caliente (hot-start PCR): Técnica que se usa comúnmente para mejorar la sensibilidad y especificidad de la amplificación por PCR. El inicio en caliente se efectúa reteniendo fuera de la mezcla de reacción uno de los componentes clave, necesario para la amplificación, hasta que la reacción alcanza una temperatura por encima de la temperatura óptima de apareamiento de los cebadores. El componente retenido de la mezcla de reacción puede ser un cebador, la ADN polimerasa, MgCl 2 , o dNTP. PCR en tiempo real: Procedimiento para la cuantificación y amplificación simultáneas del ADN. Es la generación de amplicones monitoreados a medida que se están generando mediante el uso de un sistema indicador fluorescente y capturados por un instrumental sofisticado. Puede denominarse con frecuencia PCR Cuantitativa o PCR Cuantitativa en Tiempo Real, pero no RT-PCR. Polimerasa: Enzima que cataliza la síntesis de ácidos nucleicos en moldes de ácidos nucleicos preexistentes, ensamblando ARN a partir de ribonucleótidos o ADN a partir de desoxirribonucleótidos. Precisión: Grado de concordancia entre los resultados de las pruebas individuales cuando se aplica el procedimiento repetidamente a múltiples muestreos de una muestra homogénea. Procesividad: Habilidad de una enzima para continuar repetitivamente su función catalítica sin disociarse de su sustrato. Reacción en cadena de la polimerasa (pcr): Técnica de laboratorio que amplifica rápidamente una región específica de ADN de doble cadena, predeterminada por el par de cebadores utilizados para la amplificación. Por lo general implica el uso de una ADN polimerasa termoestable. Reacción en cadena de la polimerasa con transcripción reversa (rt-pcr): Variación de la técnica de PCR en la cual se produce ADNc a partir de ARN por transcripción reversa. El ADNc se amplifica después usando protocolos de PCR estándar. Robustez: La robustez de un procedimiento analítico es una medida de su capacidad para no ser afectado por variaciones pequeñas, aunque deliberadas, en los parámetros del procedimiento indicados en la documentación, y provee una indicación de su aptitud durante condiciones normales de uso. RT-PCR en tiempo real: Combinación de PCR en tiempo real y PCR con transcripción reversa. Sonda: Secuencia específica de ADN o ARN que ha sido marcada con etiquetas (tags) radioactivas, fluorescentes o quimioluminiscentes y se usa para detectar secuencias complementarias por técnicas de hibridación como transferencia (blotting) o hibridación de colonias. Además, las sondas se pueden utilizar también para la cuantificación de amplicones según se describe para los ensayos de PCR cuantitativa. Una descripción más detallada de dichas sondas se ofrece en el capítulo de información general, Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Amplificación (1127). Temperatura de fusión (desnaturalización) (Tm): Temperatura a la cual el 50% del ADN se vuelve de cadena simple. Transcripción: Síntesis de ARN usando un molde de ADN. Transcripción reversa (rt, por sus siglas en inglés): Proceso de obtención de ADNc usando un molde de ARN. Transcriptasa reversa: Enzima que requiere un cebador de ADN y cataliza la síntesis de una cadena de ADN a partir de un molde de ARN. Una enzima que puede usar ARN como molde para sintetizar ADN. Transferencia de energía: Proceso en el cual un estado excitado de una entidad molecular (el donador) es desactivado a un estado inferior por transferencia de energía a una segunda entidad molecular (el aceptar), que por lo tanto se eleva a un estado de energía más alto.
APÉNDICE
Apéndice 1: Reglamentaciones y Estándares Las técnicas basadas en ácidos nucleicos han transformado rápidamente casi todos los campos de investigación, desarrollo farmacéutico y diagnóstico. La necesidad de resultados mundialmente comparables, exactos y confiables en el campo diagnóstico ha dirigido el desarrollo de estándares nacionales e internacionales, a la vez que ha promovido un ambiente reglamentario altamente desarrollado. Dado que las NAT se han convertido en las técnicas de ácidos nucleicos más ampliamente usadas, la mayoría de las guías y normas están relacionadas con dichas tecnologías. 1 Las reglamentaciones específicas para virus y los estándares de referencia se tratarán en el Apéndice del Capítulo de Información General Métodos de Pruebas Virológicas (1237). La siguiente es una lista selectiva de documentos de orientación a nivel nacional. Para pautas específicas sobre la aplicación, se remite al usuario de estos compendios a la agencia de reglamentación relevante donde encontrará la orientación más actualizada.
1 Los materiales de referencia para las técnicas basadas en ácidos nucleicos se consiguen en el National lnstitue of Standards and Technology (Instituto Nacional de Normas y Tecnología; NIST, por sus siglas en inglés) http://ts.nist.gov/measurementservices/referencematerials/index.cfm.
1506 (1125) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos/ Información General
USP 39
• "Review Criteria for Nucleic Acid Amplification-Based In Vitro Diagnostic Devices for Direct Detection of lnfectious Microorganisms"(l 993); Centro para la Evaluación e Investigación de Productos Biológicos (CBER, por sus siglas en inglés) de la FDA. • "Guidance for lndustry: Content and Format of Chemistry, Manufacturing and Controls lnformation and Establishment Description lnformation for a Biological In Vitro Diagnostic Product'' (1999); Centro para la Evaluación e Investigación de Productos Biológicos (CBER) de la FDA. • "Guidance for lndustry: In the Manufacture and Clinical Evaluation of In Vitro Tests to Detect Nucleic Acid Sequences of Human lmmunodeficiency Viruses Types 1 and 2" (1999); Centro para la Evaluación e Investigación de Productos Biológicos (CBER) de la FDA. • "Guidance for lndustry: Use of Nucleic Acid Tests on Pooled and Individual Samples from Donations of Whole Blood and Blood Components (including Source Plasma and Source Leukocytes) to Adequately and Appropriately Reduce the Risk of Transmission of HIV-1 and HCV" (2004); Centro para la Evaluación e Investigación de Productos Biológicos (CBER) de la FDA.
Apéndice 2: Abreviaturas 3SR
replicación de secuencia autosostenida
AABB
American Association of Blood Banks
ACD
ácido-citrato-dextrosa
ADN
ácido desoxirribonucleico
AD Nasa
desoxirribonucleasa
ADNb
ensayo de ADN ramificado
ADNc
ADN complementario
ADNcs
ADN de cadena simple
ADNdc
ADN de doble cadena
AMO
aspirado de médula ósea
ARN
ácido ribonucleico
ARNasa
ribonucleasa
ARNm
ARN mensajero
ASO
oligonucléotidos alelo específicos (ASO, por sus siglas en inglés)
CCD
dispositivo de acoplamiento de carga (CCD, por sus siglas en inglés)
CE-UF
electroforesis capilar con detección mediante fluorescencia inducida por láser
CPR
reacción cíclica con sonda (CPR, por sus siglas en inqlés)
CsCI
cloruro de cesio
Ct
ciclo umbral
DEPC
dietilpirocarbonato
DHPLC
cromatoqrafía líquida de alta resolución desnaturalizante
DMSO
dimetilsulfóxido
dNTP
desoxirribonucleótido trifosfato
DOP-PCR
PCR con cebadores degenerados (DOP-PCR, por sus siglas en inqlés)
dTIP
2'-desoxitimidín 5'-trifosfato
dUTP
2'-desoxiuridín 5'-trifosfato
EDTA
ácido etilendiaminotetraacético
'
ESI
ionización por electrospray (ESI, por sus siglas en inglés)
FDA
Food and Drug Administration (Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos; FDA, por sus siglas en inqlés)
FEN
flap endonucleasa (FEN, por sus siglas en inglés)
FFPE
fijado en formalina e incluído en parafina (FFPE, por sus siglas en inglés)
FISH
hibridación fluorescente in situ (FISH, por sus siglas en inqlés)
FRET
fluorescencia por transferencia de energía resonante (FRET, por sus siglas en inglés)
GLP
buenas prácticas de laboratorio
ICH
lnternational Conference on Harmonization (Conferencia Internacional sobre Armonización; ICH, por sus siglas en inglés)
LAPS
sensor potenciométrico fotosensible
LCR
reacción en cadena de la ligasa (LCR, por sus siglas en inglés)
LED
diodo emisor de luz (LED, por sus siglas en inglés)
Información General/ (1126) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos 1507
USP 39
ácido nucleico bloqueado (LNA, por sus siglas en inglés)
LNA MALOI
ionización por desorción láser asistida por matrices (MALOI, por sus siglas en inglés)
MOA
amplificación por desplazamiento múltiple (MOA, por sus siglas en inglés)
MOPS
ácido 3-[ N-[ morfolino ]propanosulfónico
MS
espectroscopía de masas
NASBA
amplificación basada en la secuencia del ácido nucleico (NASBA, por sus siglas en inglés)
NAT
tecnoloqía de amplificación de ácidos nucleicos (NAT, por sus siglas en inglés)
NTP
nucleótido trifosfato
OLA
ensayo de ligación de oligonucleótidos (OLA, por sus siglas en inglés)
PAGE
electroforesis en gel de poliacrilamida
PCR
reacción en cadena de la polimerasa
PEP
preamplificación por extensión de cebadores (PEP, por sus siglas en inglés)
PPi
pirofosfato
QA
garantía de calidad
QC
control de calidad
RCA
amplificación por círculo rodante (RCA, por sus siqlas en inqlés)
RFLP
polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP, por sus siglas en inglés)
RT
transcriptasa reversa (RT, por sus siglas en inglés)
RT-PCR
reacción en cadena de la polimerasa con transcripción reversa
rTth
Thermus thermophilus recombinante
sos
dodecil sulfato de sodio
SNP
polimorfismo de un solo nucleótido (SNP, por sus siqlas en inqlés)
SSCP
polimorfismo conformacional de cadena simple (SSCP, por sus siglas en inqlés)
STR
repetición corta en tándem (STR, por sus siglas en inglés)
Taq
Thermus aquaticus
Tm
temperatura de fusión (desnaturalización)
TMA
amplificación mediada por transcripción (TMA, por sus siglas en inglés)
TOF
tiempo de vuelo (time-of-flight)
UNG
uracil-N-glicosilasa
VHC
virus de la hepatitis
VIH
virus de la inmunodeficiencia humana
WGA
amplificación del genoma completo (WGA, por sus siglas en inglés)
,,
e
,,
,,
(1126) TECNICAS BASADAS EN ACIDOS NUCLEICOS-EXTRACCION, DETECCIÓN Y SECUENCIACIÓN EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS Introducción Los principios básicos de las tecnologías de amplificación de ácidos nucleicos (NAT, por sus siglas en inglés) y las definiciones de las diversas técnicas se tratan en Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Generalidades (1125). El presente capítulo cubre los pasos generales en la extracción y purificación de ácidos nucleicos de una gran variedad de muestras. La disciplina en expansión de la biología molecular en la investigación y desarrollo farmacéutico y biomédico se caracteriza por el rápido descubrimiento de nuevos marcadores para enfermedades y tecnologías para su detección. Los ácidos nucleicos blanco o diana se aíslan de una gran variedad de muestras y la calidad y cantidad del blanco extraído se ven enormemente afectadas por la recolección y manipulación de la muestra y la elección del procedimiento de extracción. El análisis de organismos complejos con técnicas de biología molecular exige el aislamiento de ADN genómico puro de alto peso molecular y de ARN intacto de longitud completa. La aplicación de estas técnicas permite entonces la detección, identificación y caracterización del organismo asociado o del agente adventicio. Las pruebas recientemente desarrolladas que emplean ADN humano purificado permiten hacer análisis genéticos para detectar la presencia, predisposición o estado del porta-
1508 (1126) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos/ Información General
USP 39
dor de enfermedades hereditarias como la fibrosis quística, la hemocromatosis hereditaria o la enfermedad de Tay-Sachs, para nombrar unos pocos ejemplos, o el análisis de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP, por sus siglas en inglés). La ADNasa y la ARNasa son las principales fuentes de inestabilidad de ácidos nucleicos. Aunque ambas enzimas son ubicuas y fácilmente liberadas durante la extracción de ácidos nucleicos, las ARNasas son bastante más estables y más difíciles de desactivar que las ADNasas porque generalmente no requieren cofactores para funcionar. Para destruir el ARN bastan cantidades mínimas de ARNasa, de manera que se debe poner especial atención para evitar introducir inadvertidamente estas enzimas en la muestra durante o después del proceso de aislamiento. Si se recolecta ARN para la aplicación específica del análisis de expresión génica, los investigadores deben tener en cuenta que el proceso mismo de recolección de la muestra puede alterar el perfil de expresión resultante. Debido a la ubicuidad de las ARNasas, la medición de blancos o dianas de ARN intracelulares ha quedado rezagada con respecto a la de blancos de ADN en la contribución al manejo de pacientes y la caracterización de blancos para fines farmacéuticos. Sin embargo, el ARN representa el estado actual del organismo y es una herramienta importante para correlacionar un fenotipo con su actividad genética asociada. La naturaleza inestable del ARN ha hecho difícil la estandarización de las pruebas NAT y es muy factible la producción de resultados falsos negativos en una muestra deficientemente manipulada, debido a la degradación del blanco, más que a la ausencia de enfermedad o a regulación de la actividad de los genes. No obstante, los sistemas de aislamiento y detección que se consiguen comercialmente proporcionan un alto grado de estandarización y robustez que ha traído como consecuencia la implementación de ensayos basados en ARN en los últimos años. Las siguientes secciones discuten los pasos generales en la extracción y purificación de los ácidos nucleicos a partir de una gran variedad de muestras, concentrándose en (1) recolección, manipulación y almacenamiento de muestras; (2) disrupción de muestras; (3) subsiguiente extracción y purificación de ácidos nucleicos; y (4) almacenamiento de ácidos nucleicos purificados.
Fuente de la Muestra La amplia diversidad de muestras posibles requiere diferentes procedimientos para su recolección. Por ejemplo, las muestras de sangre se recolectan en un tubo que contiene el anticoagulante o aditivo apropiado. El ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y el ácido-citrato-dextrosa (ACD) son los anticoagulantes recomendados para las pruebas que requieren plasma o muestras de aspirado de médula ósea (AMO). Cuando la extracción de los tejidos resulta apropiada, la cantidad de tejido óptima es por lo general 1 a 2 g, dependiendo del tipo de tejido, porque la cantidad de ADN y ARN por peso de tejido varía enormemente de un tejido a otro. Por lo general, se requieren más de 1O mg de tejido para obtener> 1 O µg de ADN o ARN. Debido a las cantidades y tipos tan variables de proteínas y otros contaminantes presentes en los diferentes tejidos, los protocolos de aislamiento de ácidos nucleicos son específicos de los tejidos. Varios fabricantes de kits para extracción de ácidos nucleicos ofrecen una amplia gama de sistemas de aislamiento listos para usar. El tipo de tejido también influye en la estabilidad, tanto del ADN como del ARN en las muestras, y los dos tipos de ácido nucleico difieren de manera importante con respecto a la preparación de la muestra y el análisis en etapas posteriores. Estos temas se describen más adelante en este capítulo.
Etapas Preanalíticas y Recolección de la Muestra Aunque la composición genética del organismo permanece prácticamente sin cambio con el tiempo, la población de ARNm representa el estado actual de una célula bajo cualquier conjunto de condiciones dadas y por lo tanto, es sumamente dinámica. Para prevenir la degradación de ARNm y/o preservar el patrón de transcripción original del ARNm celular, se debe colocar inmediatamente el tejido en hielo o congelarlo instantáneamente en nitrógeno líquido. Sin embargo, la congelación altera la estructura celular y libera ARNasas. Por esa razón, para el aislamiento de ARN en general (ARNm, ARN ribosómico, ARN viral, etc.) es esencial descongelarlo en una solución amortiguadora inactivante de la ARNasa. Un procedimiento más conveniente emplea un agente estabilizante a temperatura ambiente. Se consiguen comercialmente varios reactivos para diferentes tipos de material de muestra (p.ej., tejido o bacteria). Las sales de vanadio se usaban para inhibir la actividad de ARNasa, pero han sido reemplazadas por el uso de agentes caotrópicos para la inhibición de ARNasa y la estabilización de ARN. La muestra se puede recolectar fácilmente en dichos reactivos y almacenarse desde varios días a semanas antes del aislamiento del ARN. Para el análisis confiable de la expresión génica, un prerrequisito ineludible es la estabilización inmediata del patrón de expresión del ARN y del ARN mismo. Inmediatamente después que la muestra biológica es obtenida o extraída, ocurren cambios en el patrón de expresión génica debido a la degradación específica y no específica del ARN, así como a la inducción de la transcripción. Dichos cambios en el patrón de expresión génica se deben evitar en todos los análisis cuantitativos confiables de la expresión génica, tales como el biochip y los análisis de matrices o arreglos (array analysis) y la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción reversa (RT-PCR, por sus siglas en inglés) cuantitativa. El uso de guantes mientras se manipulan reactivos y muestras de ARN es obligatorio para evitar la contaminación con ARNasa proveniente del contacto con la superficie de la piel o del equipo de laboratorio. Con el fin de crear y mantener un ambiente sin ARNasa, el personal de laboratorio debe tratar el agua y las soluciones amortiguadoras con dietilpirocarbonato (DEPC), el cual inactiva las ARNasas por modificación química covalente. Se debe tener cuidado porque el DEPC es irritante para los ojos, piel y membranas mucosas y es también un posible carcinógeno. Como alternativa, se pueden usar soluciones y reactivos sin ARNasa que se consiguen comercialmente. También se consiguen comercialmente las proteínas inhibidoras de la ARNasa para uso en reacciones, pero con grados diferentes de eficacia con respecto a los diversos tipos de ARNasa. Sin embargo, cabe tener en cuenta que el DEPC no puede usarse con soluciones amortiguadoras de Tris. Muchos científicos recomiendan el uso de
USP 39
Información General/ (1126) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos 1509
recipientes desechables al trabajar con ARN. El material de vidrio no desechable se debe limpiar con un detergente, enjuagar cuidadosamente y luego secar en horno a 240º durante 4 horas o más antes de usarlo (el autoclave solo no desactiva totalmente muchas de las ARNasas). Como alternativa, el material de vidrio se puede tratar también con DEPC. El material de plástico no desechable se debe enjuagar cuidadosamente con hidróxido de sodio 0, 1 M y EDTA 1 mM, seguido por agua sin ARNasa. Como alternativa, se puede enjuagar con cloroformo el material de plástico que sea resistente al cloroformo para inactivar las ARNasas. El uso de puntas (tips) con filtros resistentes a los aerosoles también es importante para evitar la contaminación con ARNasa. Estos temas no son críticos para el ADN y por lo general basta con seguir las pautas de Buenas Prácticas de Laboratorio (GLP, por sus siglas en inglés) para aislar exitosamente el ADN. Como precaución general, el personal debe seguir todas las precauciones de seguridad aplicables cuando manipule tejidos o líquidos corporales (humanos o de otro tipo). Algunas de estas precauciones (p.ej., el uso de guantes desechables) evitan también la contaminación de la muestra. Las guías y normas aplicables para la recolección y procesamiento de materiales de origen humano han sido publicadas por la American Association of Blood Banks (MBB), la Conferencia Internacional sobre Armonización (ICH) y la FDA.
Disrupción y Homogeneización de la Muestra Antes de la extracción se disrumpe y homogeniza el material inicial. La disrupción es el rompimiento completo de las paredes celulares y membranas plasmáticas de los tejidos sólidos y de las células con el fin de liberar todo el ADN y el ARN contenido en la muestra. Esto se logra por lo general usando una solución amortiguadora de lisis que también inactiva nucleasas endógenas. Además de disrumpir tejidos, la homogeneización corta ADN y componentes celulares de alto peso molecular. Durante el aislamiento del ARN, los científicos a menudo tienen que reducir la viscosidad de los lisados celulares (causada por la presencia de moléculas de ADN de alto peso molecular) antes del aislamiento final, con el fin de hacer más fáciles y eficientes los pasos siguientes de la extracción. La homogeneización incompleta puede interferir con los pasos subsiguientes de purificación de ARN (p.ej., unión ineficiente del ARN a membranas de sílice) y por lo tanto producir un rendimiento bajo. Un procedimiento típico para cortar ADN de alto peso molecular y homogeneizar la muestra consiste en pasar repetidamente el lisado a través de una aguja de pequeño calibre. Sin embargo, este procedimiento requiere mucho tiempo y no es apto para procesar un alto número de muestras. Los mejores procedimientos para conseguir la disrupción y homogeneización completas de las células y tejidos incluyen la agitación rápida en presencia de perlas (beads) y solución amortiguadora de lisis (molienda con perlas) u homogeneización con rotor-estator. Durante el proceso de molienda con perlas, la disrupción y homogeneización simultáneas ocurren por la acción de ruptura y trituración que imparten las perlas a medida que colisionan con las células. La eficiencia de la disrupción está influenciada por el tamaño y composición de las perlas, la velocidad y configuración del agitador, la relación entre solución amortiguadora y perlas, el tiempo de desintegración y la cantidad de material inicial. Estos parámetros se deben determinar empíricamente para cada aplicación. Para disrupción con mortero y mano, las muestras deben congelarse en nitrógeno líquido y molerse hasta un polvo fino bajo nitrógeno líquido. Al trabajar con nitrógeno líquido se deben poner en práctica las precauciones estándar de seguridad y usar vestimenta de seguridad para proteger la piel y los ojos. Los homogeneizadores de rotor-estator son capaces de disrumpir y homogeneizar tejidos animales y vegetales en 5 a 90 segundos, dependiendo de la muestra. El rotor gira a velocidad muy alta, haciendo que la muestra se disrumpa por una combinación de turbulencia y ruptura mecánica. Otras alternativas son las columnas homogeneizadoras para centrifugación (spin-column homogenizers) comerciales en combinación con tecnología de membrana de sílice, que proporcionan una manera rápida y eficiente de homogeneizar lisados de células y tejidos sin contaminación cruzada de las muestras. Con el fin de conseguir la disrupción completa, los diferentes tipos de muestra requieren distintos procedimientos. Las células de cultivos de tejido que crecen como monocapa o en suspensión se disrumpen fácilmente por adición de una solución amortiguadora de lisis que por lo general contiene una mezcla de un detergente aniónico, una proteasa y un agente caotrópico en una solución salina amortiguada. En contraste, la disrupción de tejidos fibrosos, como músculo esquelético, corazón y aorta, para el aislamiento de ácidos nucleicos puede ser dificultosa debido a la abundancia de proteínas contráctiles, tejido conjuntivo y colágeno. Las muestras de tejido frescas o congeladas se deben cortar en pedazos pequeños para ayudar a la lisis. Las muestras de sangre, incluyendo las tratadas para retirar eritrocitos pueden lisarse eficazmente con una solución amortiguadora de lisis y una proteinasa. En general, los mismos procedimientos se pueden aplicar para la extracción de ADN y ARN. Para el aislamiento de ADN se prefieren procedimientos más delicados, mientras que durante el aislamiento de ARN se pueden disrumpir células y tejidos usando un molino mezclador porque no hay riesgo de cortar el ARN. Ciertas aplicaciones posteriores requieren ADN de alto peso molecular; por lo tanto, se debe tener cuidado de no cortar las moléculas de ADN para no volverlo inapropiado para los análisis posteriores.
Extracción y Purificación Aunque hay varios procedimientos disponibles para la extracción de ácidos nucleicos, la aptitud de un procedimiento depende del material inicial, del tipo y pureza del ácido nucleico aislado y posiblemente de la aplicación posterior. A continuación se describen los principales procedimientos; el mercado ofrece varios kits comerciales para diferentes tipos de muestras y aplicaciones.
151 O (1126) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos/ Información General
USP 39
EXTRACCIÓN DE FASE La técnica original para extracción de ADN y ARN a partir de muestras lisadas es la extracción de fase, que incluye la extracción de ácido nucleico usando una mezcla de fenol y cloroformo. Dependiendo del pH y de la concentración salina, el ADN o ARN se separan en la fase acuosa. A pH neutro o básico, el ADN permanece en la fase acuosa y el ARN en la fase orgánica o en la interfase (con las proteínas). Sin embargo, a pH ácido, el ADN de la muestra se protona neutralizando la carga y esto ocasiona que se separe en la fase orgánica. El ARN que permanece cargado se separa en la fase acuosa. Las dos fases se separan por centrifugación y la fase acuosa se vuelve a extraer con una mezcla de fenol y cloroformo, seguida por extracción con cloroformo para retirar el fenol residual. El ácido nucleico se recupera de la fase acuosa por precipitación con alcohol. Para el ARN, este procedimiento a menudo se combina con digestión con proteasas, precipitación con alcohol o cloruro de litio y/o gradientes de densidad de cloruro de cesio (CsCI). Un problema potencial es la contaminación del ADN o ARN recuperado con disolventes orgánicos que pueden interferir con las reacciones enzimáticas posteriores o las lecturas espectroscópicas. CENTRIFUGACIÓN EN GRADIENTE DE DENSIDAD DE CLORURO DE CESIO Para el aislamiento de ADN genómico de alto peso molecular, la centrifugación en gradiente de densidad de CsCI es el procedimiento tradicional. Las células se lisan usando un detergente y el ADN se aísla del lisado por precipitación con alcohol. El ADN se mezcla entonces con CsCI y bromuro de etidio y se centrifuga por varias horas a fuerza g alta (normalmente 100 000 x g). La banda de ADN, que se puede visualizar bajo luz UV como resultado de la intercalación del bromuro de etidio con el ADN se recolecta del tubo de centrífuga, se extrae con isopropanol para retirar el bromuro de etidio y luego se precipita con etanol para recuperar el ADN. Este procedimiento permite el aislamiento de ADN de alta calidad pero requiere mucho tiempo y también representa una preocupación en cuanto a seguridad debido a la gran cantidad de EtBr utilizado. CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO ANIÓNICO Un procedimiento alterno para la purificación de ADN genómico de alto peso molecular es la cromatografía de intercambio aniónico basada en la interacción entre los grupos fosfato del ácido nucleico cargados negativamente, y las moléculas de superficie cargadas positivamente, en la resina de intercambio aniónico. La unión ocurre bajo condiciones de baja salinidad y las impurezas, como el ARN, las proteínas celulares y los metabolitos se lavan usando amortiguadores de salinidad media. El ADN puro se eluye con un amortiguador de alta salinidad y se desaliniza y concentra por precipitación con alcohol. Este procedimiento produce ADN de una pureza y actividad biológica equivalente a dos rondas de purificación en gradientes de CsCI, pero en mucho menos tiempo. El procedimiento evita también el uso de sustancias tóxicas y puede adaptarse para diferentes escalas de purificación. Con este procedimiento se puede aislar ADN de hasta 150 kilobases (kb) de longitud. Se consiguen varios kits para el aislamiento de ADN basado en tecnología de intercambio aniónico y los procedimientos varían en los tiempos de procesamiento y calidad y tamaño del ADN aislado. TECNOLOGÍA DE SÍLICE El procedimiento actual de elección para la mayoría de las aplicaciones se basa en tecnología de sílice y se puede usar para el aislamiento de ARN de longitud completa o ADN con un tamaño promedio de 20 a 50 kb. Sin embargo, el ADN de peso molecular mayor, que exceda de 100 kb, no se extrae eficientemente con esta tecnología. El procedimiento depende de la adsorción selectiva de ácidos nucleicos a la sílice, en presencia de altas concentraciones de sales caotrópicas. Aunque ambos tipos de ácido nucleico se adsorben a la sílice, el uso de soluciones amortiguadoras específicas en el procedimiento de lisis garantiza que sólo se adsorba el ácido nucleico deseado, mientras otros ácidos nucleicos, proteínas celulares y metabolitos permanecen en solución. Los contaminantes se lavan y el ARN o ADN de alta calidad se eluye de la sílice usando una solución amortiguadora de baja salinidad. La matriz de sílice se puede usar como partículas en suspensión, en forma de perlas magnéticas o como una membrana. Esta técnica es de alta capacidad de procesamiento y comercialmente se consiguen varios kits y sistemas automatizados. Sin embargo, estas soluciones amortiguadoras acuosas de lisis (en contraste con soluciones amortiguadoras de lisis preparadas en un disolvente orgánico, como fenol) no son las más aptas para muestras difíciles de lisar (p.ej., tejidos adiposos). Se consiguen kits diseñados para facilitar la lisis de tejidos adiposos y para inhibir las ARNasas. Los kits a base de sílice ofrecen un procedimiento rápido y confiable para la purificación del ADN y del ARN y se usan comúnmente para la extracción de ácidos nucleicos. Aunque estos procedimientos generan ácidos nucleicos puros, en algunas aplicaciones en las cuales los oligocontaminantes pueden interferir con ARN o ADN, puede ser necesario el pretratamiento con ADNasa o ARNasa. Como alternativa, se pueden usar procedimientos que usen sondas de captura específicas. Las aplicaciones pertinentes que requieren tales ácidos nucleicos ultrapuros se discuten en Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Amplificación (1127).
USP 39
Información General/ (1126) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos 1511
Aplicaciones Específicas para Materiales de Difícil Extracción EXTRACCIÓN A PARTIR DE BIOPSIAS FIJADAS CON FORMALINA E INCLUIDAS EN PARAFINA Los ácidos nucleicos en biopsias fijadas en formalina e incluidas en parafina (FFPE, por sus siglas en inglés) están por lo general muy fragmentados y químicamente modificados por el formaldehído. Aunque la modificación por formaldehído no se puede detectar en ensayos estándar de control de calidad, como la electroforesis en gel, tal modificación interfiere con los análisis enzimáticos. Con una digestión prolongada con proteasa se puede conseguir la suficiente extracción y desmodificación de ADN, pero esto llevará a una extensa fragmentación y degradación del ARN. Algunos sistemas de aislamiento han sido optimizados para invertir la modificación de formaldehído hasta donde sea posible sin posterior degradación del ARN. Sin embargo, el ARN purificado de las muestras FFPE no se debe usar en las aplicaciones posteriores que requieren ARN de longitud completa. Algunas aplicaciones pueden requerir modificaciones para permitir el uso de ARN fragmentado (p.ej., diseño de amplicones pequeños para RT-PCR). EXTRACCIÓN A PARTIR DE BACTERIAS Y PATÓGENOS Aunque las bacterias gramnegativas son relativamente fáciles de lisar, las bacterias grampositivas o las levaduras necesitan por lo general un pretratamiento enzimático para retirar la pared celular con el fin de lograr una lisis eficiente. Esta metodología se puede aplicar sólo al aislamiento de ADN porque el tratamiento enzimático influirá en el perfil de expresión del organismo y por lo tanto el aislamiento de ARN requiere un procedimiento de lisis más rápido. Otro factor para tener en cuenta es que los microorganismos normalmente se presentan dentro de una matriz anfitriona o ambiental (p.ej., tierra), lo cual dificulta a menudo la detección por reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés), debido a los componentes inhibidores. Esto significa que el procedimiento de aislamiento tiene que ser cuidadosamente adaptado y optimizado para el organismo y tipo de muestra específicos. Se consiguen kits comerciales y la mayoría están basados en el uso de lisozima para la remoción de las paredes celulares. CONSIDERACIONES ESPECIALES PARA CANTIDADES LIMITADAS DE MUESTRA Múltiples técnicas de pruebas genéticas, incluyendo el análisis de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), análisis de repetición corta en tándem, secuenciación o genotipificación usando matrices, PCR en tiempo real y otros procedimientos, dependen de la disponibilidad de ADN de alta calidad. Dado que el ADN genómico humano o las muestras de genotipos individuales con frecuencia son limitadas, un proceso para inmortalizar muestras de ácidos nucleicos podría superar esta limitación. Los procedimientos aplicables a la genotipificación se discuten en Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Genotipificación (1129). La amplificación del genoma completo (WGA, por sus siglas en inglés) se ha empleado recientemente para amplificar ADN genómico limitado a partir de ADN ya purificado o directamente de muestras clínicas y casuísticas sin ninguna purificación del ADN. Existen dos tecnologías básicas para WGA, basadas en PCR o que dependen de amplificación isotérmica por desplazamiento múltiple. Estas aplicaciones se describen en más detalle en Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Amplificación (1127).
Manipulación de la Muestra y Almacenamiento a Largo Plazo El ADN es una macromolécula relativamente estable y una vez aislado puede mantenerse entre 2º y 8º al menos durante 1 año. Sin embargo, cuando el ADN está presente en cantidades muy pequeñas, como es el caso de una prueba de ADN residual, podría ser aconsejable almacenar el ADN a temperaturas menores o iguales a -20º. Por lo general, el ADN se almacena en solución. Se puede usar agua destilada si el ADN se va a usar para PCR y/o digestión por endonucleasas a los pocos días después de su aislamiento. Sin embargo, para el almacenamiento del ADN la solución amortiguadora preferida es Tris-EDTA a pH entre 7,5 y 8,5, dado que en agua puede ocurrir la degradación del ADN debido a la limitada capacidad amortiguadora de este medio. Los ácidos nucleicos purificados conservan características reconocibles durante el almacenamiento a largo plazo, siempre y cuando las muestras se almacenen como soluciones congeladas. La solución de ADN se debe almacenar como una solución madre primaria congelada a -80º. El ADN también se puede liofilizar y almacenar seco sin necesidad de refrigeración. En algunos casos, el ADN se puede almacenar por años sobre papeles de filtro especiales a los cuales se adhiere y que permiten el almacenamiento en estado seco a temperatura ambiente. La ubicuidad de las ARNasas requiere precauciones extras al manipular el ARN. El ARN aislado se debe mantener en hielo mientras se pipetean las alícuotas. Se recomienda el uso de puntas (tips) con filtro que evitan el arrastre de la ARNasa de la pipeta, y tubos estériles y desechables de polipropileno durante todo el procedimiento porque estos tubos por lo general no contienen ARNasa y no requieren ningún tratamiento para inactivar las ARNasas. El ARN purificado se puede almacenar a -20º o -80º en agua. Bajo estas condiciones normalmente no se detecta degradación alguna. A diferencia del ADN, el ARN no se beneficia de las soluciones amortiguadoras básicas durante el almacenamiento a largo plazo debido a su sensibilidad a las condiciones alcalinas. Por lo general, si se requieren muestras de ácido nucleico para pruebas múltiples, se deben congelar las muestras de ARN y ADN en múltiples alícuotas a -80º para análisis subsiguientes, con el fin de evitar ciclos repetidos de conge-
1512 (1126) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos/ Información General
USP 39
lación-descongelación que pueden producir degradación y también para minimizar la posibilidad de contaminación, que podría ser causa de inexactitud analítica.
Cambio en la redacción:
EVALUACIÓN CUALITATIVA Y CUANTITATIVA DE ÁCIDOS NUCLEICOS Introducción Esta sección describe los procedimientos que evalúan la pureza, integridad y cantidad de los ácidos nucleicos purificados, incluidos los procedimientos espectroscópicos, la electroforesis de fragmentos de ácido nucleico y las técnicas basadas en sondas. La detección y cuantificación por amplificación se discuten en Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Amplificación (1127). ESPECTROSCOPÍA DE ABSORBANCIA Los principios básicos se tratan en •Espectroscopía Ultravío/eta-Vísible (857)•
Protocolos para Cuantificación de ADN y ARN por Fluorescencia Los derivados de colorantes de cianina se usan para la cuantificación de ácidos nucleicos porque actúan específicamente con los ácidos nucleicos (ADN, ARN y oligonucleótidos) y fluorescen sólo después de su unión. El mecanismo exacto de interacción no siempre se comprende por completo pero puede involucrar la intercalación en el ADN de doble cadena y la unión superficial. Las mediciones pueden efectuarse usando un fluorómetro o un lector de placa. La sensibilidad de la fluorescencia con estos colorantes es mucho mayor que la de la absorbancia, por lo cual estos colorantes son de gran utilidad cuando la concentración de ADN es baja (hasta un mínimo de 25 pg por mL). El colorante debe estar protegido de la luz para evitar el fotoblanqueo. La linealidad se mantiene sobre tres a cuatro órdenes de magnitud. Con frecuencia se usan ADN de timo de ternero y fago Lambda como calibradores para construir una curva estándar. Algunos de estos colorantes se han optimizado para unir ADN de doble cadena o ARN de cadena simple y oligonucleótidos. Un colorante de unión a ADN también se unirá al ADN de cadena simple y al ARN pero solo a baja fuerza iónica y la señal es aproximadamente de 10% o menos que la observada con ADN de
USP 39
Información General/ (1126) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos 1513
doble cadena para una masa de material equivalente. Por lo tanto, esta metodología se prefiere para mediciones de ADN cuando no se ha intentado retirar el ARN de la preparación. Otro colorante fluorescente que está optimizado para mediciones de ARN también se encuentra disponible. Usando dos concentraciones diferentes de este colorante, los analistas pueden detectar ARN en cantidades tan bajas como 1 ng por mL y tan altas como 1 µg por mL. El colorante también emite fluorescencia con el ADN pero no muestra una habilidad equivalente para minimizar la unión por el uso de condiciones particulares (p.ej., con ADN y el colorante de unión a la doble cadena). La cuantificación puede verse afectada por el ácido nucleico contaminante (p.ej., ADN en una preparación de ARN y viceversa) El tratamiento con una ADNasa es necesario si hay ADN presente en la preparación de ARN. Es poco probable que las proteínas interfieran con estos colorantes, pero algunos detergentes, así como fenoles ocasionan una pérdida en la fluorescencia. Por lo tanto, se debe verificar el efecto de los reactivos para extracción de ácidos nucleicos en los ensayos de fluorescencia subsiguientes. Los colorantes del fluorocromo bisbenzimida (como 2'-[ 4-hidroxifenil]-5-[ 4-metil-1-piperazinil]-2,5'-bi-1 H-benzimidazol) representan otra opción para medir el ADN. Los investigadores han estudiado la unión de estos colorantes al surco menor del ADN y han encontrado que las secuencias de adenina o timina en la secuencia de ADN proporcionan una dimensión del surco menor que se une mejor a los colorantes. Por lo tanto, la señal fluorescente puede mostrar dependencia por la secuencia de ADN y el calibrante de ADN debería tener una composición de nucleótido que sea similar a la del ADN que se va a medir. Estos colorantes no son tan sensibles como los colorantes de cianina pero son más sensibles que las mediciones de absorbancia. Se requieren concentraciones bajas de colorante y fuerza iónica alta con el fin de que los analistas distingan el ADN de doble cadena del ARN. Se requieren condiciones de fuerza iónica baja con el fin de diferenciar el ADN de doble cadena del ADN de cadena simple.
Detección por Tamaño ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA La electroforesis en gel de agarosa proporciona un procedimiento simple y exacto para separar los ácidos nucleicos por el tamaño del fragmento. La técnica se puede adaptar para separar fragmentos de un gran intervalo de tamaños y se puede usar en una forma preparatoria o analítica. Por ejemplo, la electroforesis en gel se puede usar para verificar que un producto de una reacción de PCR sea del tamaño correcto. Los fragmentos de ADN se pueden recuperar de una porción de gel y proporcionan un producto de PCR suficientemente puro para clonación o secuenciación. La integridad general de una preparación de ARN puede determinarse también por electroforesis en gel. La estequiometría del tamaño del fragmento de ácido nucleico (en pares de bases) y la carga negativa del fosfato proporcionan la base para la separación. Con excepción de los plásmidos, la electroforesis está generalmente libre de efectos inducidos por la conformación del ADN. El plásmido de ADN superen rollado emigrará delante del plásmido lineal o de círculo abierto/mellado, lo cual es útil para determinar la conformación de una preparación de plásmidos. En contraste, los geles desnaturalizantes se usan para el ARN debido a la tendencia que tiene el ARN a formar estructuras inter e intramoleculares secundarias. La electroforesis en gel de agarosa utiliza una configuración horizontal donde el gel se moldea en un soporte adecuado y se coloca sobre un puente entre dos compartimientos para amortiguadores que están llenos de la solución amortiguadora elegida. El gel se cubre también con una delgada capa (-1 mm) de solución amortiguadora. Aunque la principal resistencia eléctrica está en el gel mismo, existe una carga suficiente en los ácidos nucleicos para mover los fragmentos hacia el ánodo a través del gel. Los fragmentos se mueven en proporción con el tamaño, moviéndose más rápido los fragmentos más pequeños. Los parámetros que más afectan la electroforesis son el tamaño de poro del gel, la concentración de la solución amortiguadora y el gradiente de voltaje. La capacidad de separar los fragmentos elegidos es en gran medida una función del tamaño de poro del gel, lo cual depende de la concentración de agarosa. Por lo general, la concentración de agarosa está en el intervalo de 0,5% a 1,0% para fragmentos de ADN de< 100 a 25 000 pares de bases y la concentración más alta se usa cuando es importante distinguir los fragmentos más pequeños. La disminución de la concentración de agarosa en el gel lleva a la resolución de fragmentos más grandes pero también a una pérdida de resolución de los fragmentos pequeños. Para los fragmentos más grandes se utiliza la electroforesis de campo pulsado (reverso). Para conseguir una electroforesis uniforme, toda la agarosa debe estar completamente fundida. La agarosa de grado electroforético se disuelve en la misma solución amortiguadora que se usará para la electroforesis. Las soluciones amortiguadoras más comúnmente usadas para las separaciones de ADN son TBE (tris-borato-EDTA) o TAE (tris-acetato-EDTA). La TBE tiene una mayor capacidad amortiguadora que la TAE; pero esta última se debe usar si el ADN se va a recuperar del gel. Los geles desnaturalizantes de ARN usan solución amortiguadora MOPS (40 mM de MOPS, 1O mM de acetato de sodio y 1 mM de EDTA, pH 7,0). La fusión de la agarosa se logra de manera conveniente con ayuda de un horno de microondas. La agarosa entra fácilmente en ebullición, pero esto no siempre consigue la fusión completa de la agarosa, para lo cual se podría requerir llevar la solución a ebullición varias veces, con períodos intermitentes de mezclado y reposo, hasta que la agarosa se funda completamente. Las partículas de agarosa se transforman de blanco a transparente antes de la fusión. Cualquier agarosa parcialmente fundida puede detectarse agitando el matraz mientras se sostiene contra la luz. La solución requiere más calentamiento si no está uniforme. La agarosa se vierte en la cubeta para geles después de un enfriamiento parcial, pero antes de que gelifique. También se pueden usar geles que se consiguen comercialmente listos para usar y aptos para una aplicación en particular. Para geles desnaturalizantes de ARN, se agrega formaldehído a la agarosa fundida bajo una campana de extracción, hasta una concentración final de 2,2 M o 6,7%. Antes de que la agarosa se haya endurecido, el analista coloca un peine en el gel para crear
1514 (1126) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos/ Información General
USP 39
pocillos para las muestras y los estándares de tamaño. Una vez solidificado, el gel se coloca en la cubeta de electroforesis y la solución amortiguadora se agrega hasta que llene ambos lados y haya una capa de solución amortiguadora sobre toda la superficie del gel. Luego se agrega la solución amortiguadora de rastreo 1 OX (40% de sacarosa con 0,25% de azul de bromofenol o 0,25% de xileno cianol, o ambos) a cada muestra de ADN para aumentar la densidad de la muestra y proporcionar un colorante de rastreo que se usa para evaluar cuándo termina la electroforesis. El aumento de la densidad permite transferir la muestra al pocillo y mantenerla ahí hasta que migre dentro del gel durante la electroforesis. Se deben usar una o más calles (lanes) para un estándar de tamaño de ADN que contenga fragmentos dentro del intervalo pertinente a las muestras y la concentración de agarosa. Los estándares de tamaño en varios intervalos se consiguen fácilmente. Es útil poner las muestras en los pocillos entre los estándares para determinar si el gradiente de electroforesis ha sido uniforme en todo el ancho del gel. Sin embargo, en el caso de preparaciones de ARN de células eucarióticas, los ARN ribosómicos 18S y 28S que se coextraen de las bandas prominentes (correspondientes a 1900 y 4700 nucleótidos) se pueden usar también como estándares de tamaño. Además, el ARNr proporciona información sobre la integridad del ARN porque las bandas de ARNr faltantes o confusas indican problemas con la calidad de la preparación del ARN. Una vez que se han llenado los pocillos, se coloca la tapa sobre la cubeta del gel y se conecta la cubeta al suministro eléctrico. El colorante indicador en la solución amortiguadora de rastreo agregada a las muestras y al estándar de tamaño permite determinar fácilmente qué tan lejos ha avanzado la electroforesis. El azul de bromofenol migrará con fragmentos de ADN de <500 pares de bases y el xileno cianol migrará con fragmentos de 5000 pares de bases. El suministro eléctrico funciona con frecuencia bajo condiciones de voltaje constante (1 a 1O V) por cm de la longitud del gel. El voltaje elevado puede ocasionar corriente alta, lo cual produce calor nocivo y agotamiento de la solución amortiguadora. ELECTROFORESIS DE CAMPO PULSADO Esta variación de electroforesis en gel de agarosa se usa para separar un intervalo de fragmentos grandes de ADN y es muy útil cuando se necesita una resolución de fragmentos de 50 000 a 200 000 pares de bases. La diferencia principal es la adición de un dispositivo de campo alterno que controla el suministro eléctrico de voltaje constante. Los fragmentos grandes de ADN cambian la conformación con el fin de moverse a través de los poros de agarosa; los fragmentos más grandes demoran más en reajustarse cuando el campo se invierte y por lo tanto se mueven más lentamente que los fragmentos más pequeños. Esto permite la resolución de fragmentos durante el período de horas en que funciona el procedimiento de campo pulsado. Una relación comúnmente usada de dirección hacia delante y hacia atrás es 3:1 y, además, el procedimiento típicamente requiere un aumento escalonado en la unidad de tiempo entre inversiones del campo. La electroforesis puede continuar por 1O a 16 horas para evitar la fluctuación en la temperatura del gel, la viscosidad y otras propiedades que podrían causar artefactos. ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA (PAGE, POR SUS SIGLAS EN INGLÉS) El formato para efectuar la PAGE es muy diferente del de la electroforesis en gel de agarosa. El procedimiento general para PAGE se describe en Artículos Obtenidos por Biotecnología-Electroforesis en Gel de Poliacrilamida (1056). Para resolución de pequeños fragmentos de ADN en el intervalo de 1O a 500 pares de bases, la electroforesis en gel de poliacrilamida no desnaturalizante es más apta que la electroforesis en gel de agarosa porque la separación de fragmentos de este tamaño requiere tamaño de poro mucho más pequeño que lo que se consigue en los geles de agarosa. El gel se prepara por polimerización de monómeros de acrilamida. El porcentaje de acrilamida determina el intervalo de tamaños de fragmentos que se pueden resolver mejor. Por ejemplo, 20% de acrilamida es apto para el intervalo de 1O a 100 pares de bases y 5% de acrilamida es útil en el intervalo de 100 a 500 pares de bases. También se pueden usar geles de poliacrilamida que se consiguen comercialmente listos para usar y son aptos para la discriminación de un tamaño particular. Los ácidos nucleicos separados se visualizan por tinción por ejemplo con solución de nitrato de plata en vez de usar colorantes de bromuro de etidio o cianina. Sin embargo, la tinción con nitrato de plata es laboriosa y requiere tiempo y no es apta para preparaciones que contengan una gran cantidad de proteína, porque las proteínas se colorean también con el nitrato de plata. ELECTROFORESIS CAPILAR Y FLUORESCENCIA INDUCIDA POR LÁSER (CE-LIF, POR SUS SIGLAS EN INGLÉS) La CEF se ha usado durante muchos años para separar fragmentos de ADN (para los principios generales de CE, ver •Electroforesis Capilar(1053)• (AFOl-may.2016)). El procedimiento se basa en un principio similar al de la electroforesis con gel de agarosa. La CE puede utilizar los sistemas de amortiguación entrecruzada aplicados en la electroforesis en gel, pero la técnica puede usar también soluciones que contienen polímeros (p.ej., polimetilcelulosas) que están diseñadas para crear poros que atrapen las proteínas. Estas soluciones poliméricas se pueden agregar a los capilares entre las inyecciones, lo cual permite obtener un gel "fresco" antes de cada corrida. Además, se pueden usar capilares para más inyecciones de lo que es posible para capilares polimerizados llenos de gel. El poder de resolución de la separación depende del tamaño de los poros, que se basa en la composición del gel. Se consiguen kits para separar fragmentos en los intervalos de tamaño deseados. Es posible separar tamaños de fragmentos fuera de la ventana de resolución, pero dicha separación puede no ser confiable o reproducible cuando se excede la capacidad del gel.
USP 39
Información General/ (1126) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos 1515
Los fragmentos se pueden detectar por una gran variedad de mecanismos. La detección usando absorbancia UV es posible, pero el procedimiento de detección preferido y más común es la fluorescencia inducida por láser (UF, por sus siglas en inglés). La fluorescencia ofrece ventajas sobre la detección UV en términos de selectividad y sensibilidad. Además, los límites de detección para fluorescencia son de dos a tres órdenes de magnitud superiores a los de UV. Aunque el ADN es intrínsecamente fluorescente, la fluorescencia de fondo y la compleja espectroscopía láser requerida impiden el uso en forma rutinaria. La forma más común de marcar el ADN se describe en la sección anterior sobre protocolos de fluorescencia para cuantificación de ARN y ADN. Este sistema se emplea ampliamente debido a su simplicidad (los colorantes se agregan a la muestra o a la solución amortiguadora de reacción) y eficacia. Las ventajas de la CE incluyen: velocidad de análisis, sensibilidad usando volúmenes mínimos de muestra y posibilidad de automatización. Estas se consiguen principalmente por la miniaturización inherente del gel. Los sistemas automatizados permiten el análisis robusto de la calidad, cantidad y tamaño de fragmentos tanto del ARN como del ADN. Las aplicaciones de CE han sido especialmente importantes para evaluar la integridad del ARN debido a la inestabilidad y progresiva degradación del ARN causadas por las ARNasas ubicuas, mientras que las nuevas tecnologías que comparan las relaciones entre 285 y 185 mejoran las capacidades de estos procedimientos.
HIBRIDACIÓN DE FILTROS Y MARCADO (LABELING) DE SONDAS IN VITRO Introducción Las técnicas de hibridación se usaron desde el comienzo en biología molecular para identificar ácidos nucleicos individuales y para calcular el grado de similitud entre especies. La hibridación se usa ampliamente en los procedimientos descritos en este y otros capítulos para visualizar e identificar secuencias de ácidos nucleicos (ver Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Amplificación (1127), Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Genotipificación (1129) y Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Enfoques para Detectar Trazas de Ácidos Nucleicos (Análisis de ADN Residual) (1130)). Con el advenimiento de la digestión de ADN con endonucleasa de restricción y la separación electroforética por masa molecular, la hibridación usando sondas marcadas (labeled probes) proporcionó una manera de visualizar la organización de genes dentro de un genoma específico. Las técnicas de hibridación descritas son transferencia en puntos (dot blotting) y por ranuras (slot blotting), transferencia Northern, transferencia de Southern, hibridación in situ e hibridación fluorescente in situ (FISH, por sus siglas en inglés). Todas estas técnicas dependen del uso de sondas de ácido nucleico. Las sondas son oligonucleótidos con secuencias específicas de ADN o ARN que han sido marcadas con etiquetas radioactivas, fluorescentes, quimioluminiscentes, químicas o enzimas (moléculas indicadoras). Las sondas hibridizadas se unen a las secuencias complementarias en los ácidos nucleicos diana y se utilizan para visualizar y caracterizar los blancos según se describe a continuación.
Transferencia en Puntos y por Ranuras (Dot and Slot Blotting) La transferencia en puntos es la más simple y rápida de las técnicas de hibridación. Los ácidos nucleicos se aplican directamente a una membrana de soporte, que puede ser de nitrocelulosa o nailon, sin separación previa de las especies de ácido nucleico por electroforesis en gel de agarosa. Los ácidos nucleicos se aplican en el filtro con una micropipeta o un aparato como el de transferencia por ranuras (slot blot) o el de transferencia en puntos (dot blot). Este consiste en un soporte de la membrana con una membrana en sándwich entre las dos piezas del marco. La placa inferior del marco se conecta a un manifold de vacío y la parte superior tiene ranuras a través de las cuales se cargan los ácidos nucleicos. Las muestras se cargan aplicando vacío y se pasan a través de la membrana por vacío, el ácido nucleico se une a la membrana y luego el filtro se seca con aire. Los ácidos nucleicos se fijan al filtro, bien sea por calentamiento a 80º para membranas de nitrocelulosa o por exposición a luz UV durante un tiempo predeterminado para filtros de nailon. La hibridación con una sonda marcada proporciona confirmación de la identidad del ácido nucleico pero no suministra ninguna información sobre el número o tamaños de las especies. Las especies de ácidos nucleicos de interés se pueden cuantificar por aplicación de concentraciones conocidas del ácido nucleico purificado sobre el filtro y comparando la señal generada por las muestras desconocidas con las de las preparaciones estándar.
Transferencia de Southern (Southern Blotting) La transferencia de Southern se refiere a la transferencia de ADN de un gel de agarosa o poliacrilamida a una membrana de nitrocelulosa o nailon. Se pueden usar sondas pequeñas de ADN de cadena simple para visualizar e identificar las especies de ADN de interés. El análisis por transferencia de Southern se basa en una metodología de transferencia e inmovilización desarrollada en 1975, junto con la separación electroforética de ADN fragmentado. Más específicamente, el procedimiento se usa por lo general para identificar secuencias específicas de ácido nucleico en el contexto de una topografía genética definida, como un mapa de endonucleasas de restricción. La posición de los genes dentro del genoma vírico se puede mapear con exactitud, usando una gran variedad de endonucleasas de restricción en combinación con el análisis por transferencia de Southern. El procedimiento requiere obtener suficiente cantidad de ADN para el análisis. El ADN fragmentado se separa de acuerdo con el tamaño usando electroforesis en gel de agarosa. Los fragmentos de ADN de doble cadena se deben desnaturalizar antes de ser transferidos e inmovilizados sobre una membrana por acción capilar. El ADN inmovilizado se entrecruza con el filtro, el cual
1516 (1126) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos/ Información General
USP 39
puede estar compuesto de nitrocelulosa o nailon, según se describe anteriormente. Sin embargo, el uso de membranas de nailon cargadas positivamente elimina la necesidad de fijar el ADN a la membrana de nailon. Las membranas de nitrocelulosa son más frágiles y pueden ser usadas hasta tres veces con sondas diferentes. Las membranas de nailon son más robustas y se pueden sondear 1 O a 12 veces, aunque pueden presentar más ruido de fondo, en particular cuando se usan con sondas cromogénicas.
Transferencia Northern (Northern Blotting) El análisis por transferencia Northern comprende una serie de etapas para la separación, transferencia e inmovilización del ARN en una forma similar al tratamiento del ADN usando análisis por transferencia de Southern. Requiere la desnaturalización del ARN para reducir la estructura secundaria con el fin de garantizar que el ARN se separe en la agarosa uniformemente, de acuerdo con la longitud. La desnaturalización del ARN se consigue, bien sea antes de la electroforesis usando glioxal o dimetil sulfóxido (DMSO) o durante la electroforesis, por medio de geles que contienen formaldehído. La transferencia se logra de manera idéntica a la usada para la transferencia de Southern. Sin embargo, en el caso de transferencia Northern, no es necesario desnaturalizar el ARN antes de la transferencia, ya que la desnaturalización se consigue antes de la separación electroforética de las especies de ARN. El ARN inmovilizado se entrecruza con la membrana de una manera similar al entrecruzamiento del ADN.
Hibridación In Situ e Hibridación Fluorescente In Situ (FISH) La hibridación de un ácido nucleico in situ clásicamente se refiere a la determinación de la ubicación de la secuencia del ácido nucleico en su estado natural, en el tejido, en células individuales o en un cromosoma. Las sondas de hibridación in situ están diseñadas para unirse a las secuencias complementarias de ácido nucleico, sean de ADN o ARN. El propósito de estos procedimientos de hibridación consiste en descubrir dónde se expresa un gen en un tejido, en cuyo caso el blanco es el ARN, o mapear una secuencia específica de ADN en su ubicación en un cromosoma, en cuyo caso el blanco es el ADN. El mapeo cromosómico de secuencias de ADN se consigue pegando químicamente granos de plata a las secuencias de la sonda y luego contando la densidad de los granos en un extendido de cromosomas en metafase. Aunque históricamente estos procedimientos funcionaban bien, la sensibilidad no dejaba de ser una preocupación. La solución fue usar un indicador (reporter) que fuera más sensible y seguro que otros indicadores, a saber, la fluorescencia usada en la técnica de hibridación fluorescente in situ (FISH). La FISH tiene el beneficio adicional de que los diferentes colores disponibles en fluorescencia permiten observar múltiples eventos de hibridación simultáneamente, una característica que no estaba disponible con otros sistemas de detección.
Detección de ADN y ARN en Ensayos de Hibridación Usando Sondas Marcadas La visualización y localización de especies individuales de ácidos nucleicos de interés se consiguen por la hibridación específica de sondas de ADN y ARN que se marcan para facilitar la visualización. El filtro o muestra (células o tejidos fijados en el caso de hibridación in situ y FISH) se incuba con la sonda marcada a una temperatura y concentración salina apropiadas que permita la hibridación con la rigurosidad deseada. Esto va seguido por lavado con soluciones amortiguadoras de concentraciones variadas de detergente y sal y a diferentes temperaturas, con el fin de minimizar la señal de fondo debida a la hibridación no específica. La marcación y los tipos de sondas se discuten a continuación. Las sondas pueden ser de ARN generadas in vitro o sondas de ADN, bien sea de fragmentos de doble cadena, plásmidos u oligonucleótidos de cadena simple conteniendo moléculas que facilitan la detección de fragmentos que contienen porciones del gen de interés. Las sondas se pueden marcar con marcadores radioactivos como el 32 P o el 3ss, por incorporación de un nucleótido marcado en la secuencia de la sonda o con un marcador radioactivo como biotina por incorporación de una base modificada, como monofosfato de adenina unido a biotina. Las sondas radioactivas se visualizan con una película de rayos X colocada sobre la membrana de transferencia. Las sondas marcadas con biotina se detectan con un conjugado de estreptavidina-fosfatasa alcalina. Se produce una reacción enzimática con la fosfatasa alcalina y un sustrato que genera un producto insoluble coloreado en el sitio de la sonda. Las variantes de sondas no radioactivas utilizan otras modificaciones en el ADN y anticuerpos unidos a la fosfatasa alcalina, así como sondas quimioluminiscentes que se detectan sobre una película. Los ácidos nucleicos se pueden sintetizar y manipular por medios enzimáticos o químicos. Estos mismos sistemas se pueden usar para modificar la estructura del ácido nucleico e introducir porciones extrañas para crear moléculas únicas que pueden ofrecer una ventaja en la detección de ácidos nucleicos virales limitantes dentro de un marco de ácidos nucleicos anfitriones. La síntesis química de ácidos nucleicos y su purificación se ha vuelto de rutina y comúnmente se consiguen síntesis y purificaciones de alta calidad. Más aún, se pueden sintetizar segmentos más grandes y cuando se requieran segmentos todavía más grandes, se pueden diseñar las subsecciones para concatenación y ligación. La síntesis de oligonucleótidos especiales de ADN se consigue fácilmente en el laboratorio usando reactivos y equipos disponibles comercialmente. Como alternativa, se puede hacer un pedido de sondas especiales a numerosos proveedores comerciales. Los procedimientos de purificación por exclusión de tamaño generalmente se usan para eliminar oligonucleótidos incompletos. Los oligonucleótidos de ARN también se pueden sintetizar químicamente o generarse in vitro usando fragmentos com-
USP 39
Información General/ (1126) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos 151 7
plementarios de ADN clonado bajo el control de diversas secuencias promotoras de la ARN polimerasa procariótica. El uso de sondas de ADN es mucho más común, pero podrían haber algunas aplicaciones en las cuales la asociación creciente de híbridos de ARN-ARN o ARN-ADN sea ventajosa. Los principales procedimientos para marcar ADN son la marcación directa usando una reacción de kinasa para enganchar un nucleótido marcado al final de cada cadena de ADN mediante la incorporación de nucleótidos marcados dentro de un ADN mellado, utilizando la función de reparación del ADN del fragmento Klenow de la enzima ADN polimerasa 1de Escherichia coli (nick translation o traslación de mellas), y mediante PCR. Este último procedimiento genera una producción relativamente alta de sondas marcadas internamente porque cada ronda de termociclado duplica la cantidad de la sonda marcada, mientras que los procedimientos anteriores arrojaban una relación de menos de una molécula de sonda por molécula molde. El procedimiento de PCR se usa también para generar sondas únicas con una variedad de entidades localizadas en los terminales.
SECUENCIACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS Introducción El primer procedimiento de secuenciación de ADN, descrito en 1977, utilizó la escisión química para introducir específicamente rupturas de cadena en una secuencia de ADN (secuenciación de Maxam y Gilbert). El procedimiento demostró ser de utilidad significativa en los primeros años de la biología molecular pero no se ha usado para efectuar secuenciación de alto volumen y por lo tanto no se discute en detalle aquí. La mayoría de las secuenciaciones efectuadas en la actualidad se basan en el procedimiento de secuenciación con didesoxinucleótidos, descrita también en 1977 (secuenciación de Sanger). Este procedimiento cambió fundamentalmente la secuenciación al explotar la especificidad enzimática de las polimerasas que introducen interrupciones de la cadena en bases específicas. Este es el procedimiento de secuenciación más ampliamente reconocido y se considera un ensayo de rutina en laboratorios de biología molecular. Las innovaciones en instrumental, preparación y recolección de la muestra, gestión de datos, análisis de datos y ensamble de la secuencia han dependido de este procedimiento de secuenciación como su generador de secuencias fundamental. La secuenciación de alta capacidad de procesamiento (high-throughput sequencing) toma todos los elementos de los procedimientos de secuenciación y los aplica a una colección masiva de datos de secuencias, típicamente para genomas más grandes, aunque tal secuenciación se puede usar también para proyectos más pequeños. La obtención de la información de la secuencia final incluye todos los procesos asociados con la preparación de la muestra, la secuenciación, la reunión de los datos y la terminación de los datos. La tecnología para conseguir estos objetivos individuales incluye al instrumental, materiales desechables, protocolos y procedimientos.
Reacción de Secuenciación El procedimiento de secuenciación con didesoxinucleótidos aprovecha la especificidad de la enzima de Klenow para introducir nucleósidos de terminación de cadena, llamados didesoxinucleótidos, de manera intermitente durante el proceso de extensión de la polimerasa. La secuenciación de cada muestra requiere cuatro reacciones separadas (una por cada base). La mezcla resultante de diversas longitudes de cadenas de nucleótidos se separa de acuerdo con las masas moleculares individuales. La incorporación de nucleótidos marcados radioactivamente durante la reacción de secuenciación permite la detección de las cadenas de nucleótidos. Las mejoras en biotecnología han llevado al descubrimiento de enzimas más robustas con alta fidelidad, estabilidad mejorada y otros atributos que han permitido lecturas más largas y fidelidad mejorada de la secuencia. Estos perfeccionamientos han hecho posible la introducción de secuenciación cíclica, la cual se usa ahora comúnmente. El principio del procedimiento de secuenciación cíclica es una combinación de secuenciación de Sanger y aspectos de la amplificación por PCR, en donde se incorporan didesoxinucleótidos dentro del ADN amplificado. La secuenciación cíclica lleva a una concentración más alta de fragmentos marcados, abarcando un intervalo mayor de tamaños que la secuenciación de Sanger, lo cual lleva a su vez a una longitud de lectura mayor.
Procedimientos de Separación de los Fragmentos de Secuenciación de ADN Las secciones anteriores de este capítulo se ocupan del tratamiento de moléculas intactas de ADN y ARN; las secciones siguientes tratan sobre los retos de la separación de fragmentos que resultan de las reacciones de secuenciación, especialmente de la secuenciación en placa de gel y de la electroforesis capilar. Las secciones subsiguientes tratan sobre las tecnologías de detección y la integridad de la secuencia.
Secuenciación en Placa de Gel La electroforesis en gel de poliacrilamida, frecuentemente conocida como electroforesis en placa de gel, fue el primer mecanismo de separación empleado para separar los fragmentos de secuenciación del ADN. Tal como se ha descrito anteriormente, la separación electroforética de fragmentos de ADN depende del tamaño de los fragmentos en la mezcla de la reacción. Sin
1518 (1126) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos / Información General
USP 39
embargo, para la secuenciación en placa de gel se escogen los tamaños de poro de manera que sea posible la resolución de bases individuales para muchos cientos de bases. Además de la poliacrilamida, frecuentemente se agrega al gel un desnaturalizante como la urea para garantizar la desnaturalización de los fragmentos. Hasta la implementación de sistemas de secuenciación multicapilares, la capacidad de separación y de procesamiento de los mecanismos de separación en placa de gel a menudo se consideraban de vanguardia.
Secuenciación en Electroforesis Capilar Como se observó anteriormente, la electroforesis capilar ofrece ventajas significativas sobre las separaciones basadas en gel. Sin embargo, al igual que en la secuenciación en placa de gel, se escogen los tamaños de poro de manera que sea posible la resolución de bases individuales para muchos cientos de bases. Los sistemas multicapilares que utilizan de 8 a 384 capilares se consiguen comercialmente. Estos son los principales sistemas utilizados para la secuenciación de ADN en gran escala y, en teoría, rinden más de 1100 millones de pares de bases de secuencias de ADN al año.
Detección RADIOACTIVIDAD Las primeras estrategias de detección para las reacciones de secuenciación del ADN utilizaban isótopos radioactivos como el 32p o el 3ss, especialmente porque estos eran prácticos para las separaciones en gel. Entre las ventajas se pueden mencionar: la detección es universal, son posibles límites bajos de detección, se eliminan los desplazamientos de movilidad y no se presentan diferencias de fidelidad para las ADN polimerasas. Las desventajas incluyen los altos costos de eliminación y seguridad, la incapacidad para multiplexar (lo cual en última instancia limita la capacidad de procesamiento) y la necesidad de exposición durante 24 a 36 horas (es decir, no hay detección en tiempo real). FLUORESCENCIA Los colorantes para fluorescencia han reemplazado en gran medida a los isótopos radioactivos como medios de detección durante la secuenciación del ADN, en especial porque no tienen las desventajas de las sondas radioactivas. Dado que los colorantes se pueden discriminar por medio de sus máximos de emisión, la multiplexación (multiplexing) es posible, de manera que cuatro reacciones de secuenciación por muestra pueden ser reemplazadas por una sola reacción, usando cuatro marcas diferentes. De esa manera se puede usar una sola calle (lane) en vez de las cuatro calles separadas que se necesitaban con las sondas radioactivas. Entre las ventajas adicionales se cuenta una alta capacidad de procesamiento y la recolección automatizada de datos en tiempo real. ESPECTROSCOPÍA DE MASAS La espectroscopía de masas (MS, por sus siglas en inglés) ha revolucionado el campo de la bioquímica y tiene un potencial significativo en el área de la secuenciación de ácidos nucleicos. Las técnicas de ionización suave como la ionización por electrospray y la ionización por desorción láser asistida por matrices han expandido la aplicación potencial de MS a la secuenciación del ADN. La MS ofrece algunas ventajas sobre otras metodologías de detección, incluso la velocidad de detección de fragmentos (la adquisición de la señal está en el intervalo de microsegundos, comparado con horas para los enfoques convencionales) y exactitud (p.ej., la masa molecular de cada fragmento se puede determinar con un alto grado de exactitud). El procedimiento de Sanger utiliza las diferencias de masa de los fragmentos generados como parte de la reacción de polimerización. La MS es suficientemente precisa para resolver tamaños de fragmentos que difieran sólo por un par de bases. Desafortunadamente, la sensibilidad de la detección de la MS disminuye a medida que aumenta la longitud del fragmento y falta todavía cruzar la barrera de los 100 pares de bases. Más recientemente, han surgido otras tecnologías de secuenciación basadas en técnicas de secuenciación masiva en paralelo que intentan lograr la secuenciación a bajo costo. Estas técnicas se basan, por ejemplo, en secuenciación en fase sólida o hacen uso de pirosecuenciación altamente paralela y miniaturizada, como se describe en Técnicas Basadas en Ácidos NucleicosGenotipificación (1129).
Integridad de la Secuencia Un prerrequisito para la recolección automatizada de datos y la interpretación consiste en que los datos sean de buena calidad, lo cual significa minimizar la intervención humana y permitir que el sistema haga las identificaciones de las bases siguiendo las etapas de detección. Es un paso crítico para garantizar la identificación exacta de las bases secuenciando mínimamente, varias veces, ambas cadenas de ADN. Además, se pueden emplear otras tácticas, como el uso de cebadores en diferentes posiciones de la secuencia, lo cual puede mejorar la exactitud de la secuencia de consenso desarrollada. Los paquetes de software especializado que se consiguen comercialmente pueden facilitar esta tarea. El desarrollo de tecnología más reciente ha produ-
USP 39
Información General/ (1127) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos 1519
cido plataformas de secuenciación alternas que se adaptan mejor a proyectos de secuenciación a gran escala. Estas técnicas incluyen plataformas basadas en matrices o arreglos (arrays) en las cuales tiras cortas del blanco se secuencian en un chip que suministra datos crudos a programas computacionales sofisticados que reconstruyen la secuencia. Se han desarrollado otros enfoques para la secuenciación rápida de secuencias cortas de ácidos nucleicos como los oligonucleótidos de los productos de PCR cortos. Estas tecnologías incluyen plataformas basadas en MS y pirosecuenciación; esta última se describe en Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Genotipificación (1129).
(1127) TÉCNICAS BASADAS EN ÁCIDOS NUCLEICOSAMPLIFICACIÓN INTRODUCCIÓN Los principios básicos de las tecnologías de amplificación de ácidos nucleicos (NAT, por sus siglas en inglés) y las definiciones de las diversas técnicas se tratan en Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Generalidades (1125). Este capítulo cubre las principales técnicas que llevan a la amplificación de secuencias blanco de ácidos nucleicos. El ensayo NAT más común es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés), descrita primero por Kary Mullís. Este procedimiento se refinó posteriormente para amplificar un fragmento de ADN a partir de ARN (PCR con transcripción reversa o RT-PCR). Inicialmente, la PCR se usó en una manera cualitativa para amplificar y detectar moléculas de ADN porque su exquisita sensibilidad, a la par de su alta especificidad, la convertían en una herramienta útil para la detección de blancos (dianas) de ácidos nucleicos. Desde que se comenzó a usar la PCR, el número de aplicaciones se ha expandido rápidamente y la técnica, que incluye ahora ensayos cuantitativos y multiplex, se usa actualmente en casi todos los campos de investigación y desarrollo en biología y medicina. Además de los cambios y mejoras al diseño original del procedimiento de PCR, existen técnicas alternativas a la PCR que son usadas en la amplificación de ácidos nucleicos diana para generar ARN en vez de amplicones de ADN. Las técnicas más comúnmente usadas son la amplificación basada en la secuencia del ácido nucleico (NASBA, por sus siglas en inglés) y la amplificación mediada por transcripción (TMA, por sus siglas en inglés), las cuales se describen aquí en detalle. En contraste con la PCR, que depende de la incubación de la muestra a tres temperaturas diferentes, la NASBA y la TMA se basan en condiciones isotérmicas. Además de la amplificación del ácido nucleico blanco, la etapa de amplificación se puede dirigir también a la señal usada para la detección (amplificación de señal). La técnica empleada más comúnmente es el ensayo de ADN ramificado (ADNb), en el cual se amplifica la señal, que por lo general es una sonda fluorescente que se une a la secuencia blanco. El ensayo de ADNb se usa principalmente para la detección y cuantificación de ácido nucleico viral. Este capítulo describe los principales componentes del ensayo que son necesarios para un procedimiento de PCR e incluye una discusión de la optimización general de los ensayos de PCR. Se tratan los diversos formatos de ensayo, incluidas la PCR, PCR anidada y RT-PCR, y a continuación se presenta una discusión de la detección de los amplicones resultantes. Aunque todos estos ensayos son esencialmente procedimientos cualitativos, pueden modificarse para semicuantificación. Las diversas modificaciones para semicuantificación también se describen en este capítulo. Para una cuantificación exacta y confiable, la PCR en tiempo real ha reemplazado ahora los métodos listados más arriba; la PCR en tiempo real y la RT-PCR en tiempo real se describen en la sección Ensayos NAT. La misma sección incluye una discusión sobre sondas y colorantes, que son uno de los componentes esenciales de la PCR en tiempo real, así como de los métodos de cuantificación por medio de la generación de curvas estándar. La siguiente técnica de PCR que se comenta es la PCR multiplex, que se usa para la detección simultánea de blancos múltiples o para la normalización de los resultados de un ensayo. Además de la PCR, las principales pruebas NAT alternativas que se usan en forma rutinaria, especialmente en los ensayos de detección sistemática (screening) en sangre y en diagnóstico clínico, son la NASBA y la TMA. La última técnica descrita es la amplificación del genoma completo, en la cual las complejidades de la amplificación requieren modificaciones de los procedimientos de la PCR. El capítulo concluye con una discusión sobre la evolución del instrumental usado en los ensayos NAT y las cuestiones de garantía de calidad y control de calidad asociadas con NAT, dado que ésta es probablemente una de las técnicas biológicas más reguladas, especialmente cuando se aplica a pruebas de detección sistemática en sangre.
COMPONENTES DEL ENSAVO
Enzimas Los componentes esenciales de los ensayos NAT-polimerasas, soluciones amortiguadoras de reacción que incluyen desoxinucleótidos, iones, cebadores (primers), sondas y colorantes fluorescentes-se pueden escoger de una vasta selección de kits de reactivos NAT comercialmente disponibles y de distintos proveedores. Las polimerasas aptas para las aplicaciones de NAT se pueden agrupar, en principio, en ADN Taq polimerasas o ADN polimerasas 1 obtenidas a partir de otras especies de Thermus, que son polimerasas con características similares a las de la ADN Taq polimerasa. Además, se consiguen las llamadas polimera-
1520 (1127) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos/ Información General
USP 39
sas correctoras (p.ej., de la especie Pyrococcus) que muestran actividad de exonucleasa 3'-5', capaces de retirar las bases erróneamente incorporadas a la cadena creciente de ADN bajo las condiciones de amplificación. La ADN Taq polimerasa es la enzima estándar para NAT y es la que se usa más a menudo en los ensayos NAT. También se usan modificaciones de la ADN Taq polimerasa, tales como deleciones del dominio de exonucleasa 5'-3' (fragmento Klenow, fragmento Stoffel) o mutaciones puntuales para la incorporación mejorada de didesoxinucleótidos (p.ej., para reacciones de secuenciación basadas en PCR). Las polimerasas correctoras del ADN o las mezclas de ADN Taq polimerasa con una polimerasa correctora se usan si la fidelidad del producto NAT es crítica (p.ej., para experimentos de clonación de ADN) o si se van a amplificar productos NAT más largos. Para RT-PCR se necesita una transcriptasa reversa que convierta primero el ARN blanco en un ADN copia o complementario (ADNc) que pueda amplificarse subsiguientemente. Para llevar a cabo la TMA, se requiere una transcriptasa reversa con actividad de ARNasa H para convertir el ARN blanco en un molde de ADN de doble cadena, mientras que para la NASBA se agrega ARNasa H exógena a la mezcla de la reacción. Dos tipos de enzimas se pueden usar para generar ADNc, dependiendo del ambiente de reacción: una transcriptasa reversa aislada de fuentes retrovíricas o una ADN polimerasa que pueda funcionar a la vez como transcriptasa reversa y como ADN polimerasa. Por último, la modificación química de la polimerasa, que produce una enzima inactiva a temperaturas por debajo de 90º, se emplea ahora por lo general para evitar la unión incorrecta de cebadores (mispriming) a los moldes a temperaturas subóptimas (ver sección Optimización del Ensayo).
Amortiguadores de Reacción Los amortiguadores de reacción varían de acuerdo con la composición iónica, pH y aditivos y en ocasiones se adaptan específicamente para aplicaciones particulares como PCR multiplex, PCR en tiempo real, RT-PCR, TMA y NASBA. Un importante componente de la mezcla de reacción son los iones Mg 2+ o, en el caso de polimerasas con funciones tanto de transcriptasa reversa como de ADN polimerasa, como la de Thermus thermophilus (Tth), iones Mn 2+. Pueden estar presentes otros aditivos que mejoren la sensibilidad y especificidad del ensayo. La concentración de los cuatro desoxinucleótido trifosfatos (dNTPs) se debe optimizar.
Cebadores Los sets de cebadores (primers) son oligonucleótidos con secuencias diseñadas específicamente para cebar la amplificación de una porción del ácido nucleico blanco de interés. Los oligonucleótidos sintéticos que se usan como cebadores tanto para la PCR estándar como para la PCR en tiempo real o cuantitativa están diseñados para el reconocimiento específico y la unión a una secuencia de ADN simple o de ARN. Dicha especificidad se consigue por medio del diseño que involucra tanto la longitud como la secuencia de los cebadores. Las especificaciones de longitud y secuencia tienen criterios diferentes que se deben cumplir en forma simultánea con el fin de que los cebadores se desempeñen apropiadamente. La longitud de un cebador es una cuestión estadística que está relacionada con la longitud mínima de una secuencia específica necesaria para garantizar que la secuencia blanco deseada sea única, sin importar el tamaño o complejidad del genoma. Como ejemplo, en el caso del genoma humano, con sus 3200 millones de bases de ADN, esa longitud es de 17 bases. Por esta razón, la mayoría de los cebadores para PCR tienen entre 20 y 25 bases de longitud. La especificidad de un cebador se debe determinar por comparación con las secuencias en todas las bases de datos conocidas. Las herramientas disponibles en la Web facilitan dichas comparaciones. En términos de la secuencia del cebador, los puntos a considerar son la Tm (la temperatura a la cual el 50% de la molécula de ácido nucleico de doble cadena se vuelve de cadena simple) y la estructura secundaria. Todo ADN tiene su propia Tm característica, determinada por la longitud, la composición de la secuencia y el ambiente de reacción. Los cebadores para PCR están diseñados para unirse a una secuencia de ADN perfectamente complementaria, por medio del apareamiento de las bases guanina con citosina (G-C) y adenina con timina (A-T). La Tm de los dos cebadores para PCR usados en una reacción debe ser lo más cercana posible. En términos de la estructura secundaria, se debe minimizar la formación de estructuras por intra o intercomplementariedad. La interacción entre los diferentes cebadores puede resultar en dímeros de cebadores que comprometan la sensibilidad y especificidad del ensayo. Todas las cuestiones de diseño presentadas se tratan en los paquetes de software para diseño de cebadores que están disponibles en la Internet.
Optimización del Ensayo La optimización del ensayo NAT es necesaria para una amplificación exitosa que sea sensible y específica. Los parámetros que se deben optimizar incluyen las condiciones de termociclado, tanto las temperaturas como los tiempos de ciclado (que dependen en gran medida de las secuencias del blanco, del cebador y de la sonda), las concentraciones del molde, las concentraciones de los reactivos NAT, la matriz de la muestra y la cantidad de ciclos de amplificación. En el caso de la PCR multiplex, por lo general es necesario un compromiso entre los elementos de las condiciones de reacción, debido a las dificultades para optimizar las condiciones de todos los sets de cebadores y sondas. Recientemente se han hecho cambios para mejorar la sensibilidad y especificidad de los ensayos NAT. Uno de estos cambios es la PCR con inicio en caliente (hot-start PCR), en donde se retiene temporalmente fuera de la mezcla de reacción uno de los componentes esenciales del ensayo NAT, por lo general la ADN polimerasa. Cuando en la preparación de la reacción se contempla esta modificación, la etapa inicial de desnaturalización del ácido nucleico evita la amplificación no específica debido a la unión incorrecta de cebadores a temperaturas subóptimas.
USP 39
Información General/ (1127) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos 1521
Los primeros procedimientos de inicio en caliente usaban barreras de cera que separaban eficazmente los componentes esenciales en dos fases líquidas que se mezclaban sólo cuando la cera se derretía. Sin embargo, este procedimiento ha sido reemplazado por dos tecnologías importantes de inicio en caliente que no requieren la separación física de los componentes mediante pasos adicionales de manipulación inconvenientes. En el primero de estos nuevos procedimientos, anticuerpos dirigidos contra la ADN polimerasa forman un complejo con la enzima y pierden su avidez de unión a temperatura elevada al comienzo de la reacción. El segundo procedimiento utiliza la modificación química de la polimerasa, lo cual produce una enzima inactiva. A temperaturas por encima de 90º, por lo general en la primera etapa de desnaturalización, el modificador se disocia de la enzima y se restablece la actividad enzimática. La ventaja de un inicio en caliente mediado por anticuerpos es la liberación inmediata de la actividad enzimática al comienzo de la reacción, por una etapa muy corta de incubación en caliente. Sin embargo, si existe un gran exceso de moléculas de polimerasa activas, el inicio en caliente mediado por anticuerpos tiende a ser menos riguroso cuando se compara con el de las enzimas químicamente activadas.
ENSAYOS NAT Esta sección describe las técnicas básicas de PCR, PCR anidada y RT-PCR, así como las modificaciones del procedimiento que permiten la semicuantificación.
Reacción en Cadena de la Polimerasa La técnica de PCR se basa en un proceso de tres etapas: la desnaturalización del ADN de doble cadena (ADNdc) en dos cadenas simples (ADNcs), el apareamiento (annealing) de cebadores al ADNcs y la extensión enzimática de cebadores que son complementarios a los moldes de ADNcs. Cada etapa se lleva a cabo por lo general a diferente temperatura. Repitiendo cíclicamente las etapas de temperatura (usualmente 30 a 45 veces) se puede conseguir una amplificación de mil millones de veces del ácido nucleico blanco, aunque el número óptimo de ciclos se debe determinar empíricamente. En algunos casos, especialmente cuando la sensibilidad es más importante que los resultados falsos positivos debido al exceso de ciclos, como en pruebas de detección sistemática en sangre, se puede obtener sensibilidad extra al incrementar el número de ciclos a 60 para garantizar la detección de concentraciones extremadamente bajas del blanco. En una reacción típica, el producto de PCR (amplicón) se duplica en cada ciclo de amplificación (amplificación exponencial). El aumento en la amplificación en los primeros ciclos sigue una curva sigmoide. En los últimos ciclos, las concentraciones de las cadenas del molde y los amplicones favorecen el reapareamiento de las cadenas del molde en lugar del apareamiento del cebador de PCR con el molde. En este punto, la concentración del producto de PCR deja de duplicarse después de cada ciclo y la curva empieza a mostrar una meseta. El uso de una enzima termoestable como la Taq-polimerasa es un prerrequisito porque los ciclos de temperatura a 95º (la temperatura típica de la etapa usada para desnaturalizar moldes de doble cadena) inactivaría una polimerasa termolábil. PCR ANIDADA Una variación previa del ensayo de PCR fue la PCR anidada, diseñada para aumentar la sensibilidad y especificidad del ensayo. En este procedimiento, los amplicones de la reacción de PCR inicial se someten a una segunda ronda de amplificación, usando un set de cebadores diferente. Este set de cebadores es específico de la secuencia de los amplicones pero está dentro del primer set de cebadores (cebadores anidados). Las ventajas de la amplificación con dos sets de cebadores específicos del blanco son la especificidad aumentada (se reduce cualquier amplificación no específica de la primera ronda de amplificación) y la sensibilidad aumentada (debido a la amplificación inicial del blanco en la primera ronda de amplificación). Además, la amplificación de un producto del tamaño esperado se toma como una confirmación de la presencia del blanco. Sin embargo, uno de los mayores inconvenientes de este procedimiento es la alta probabilidad de contaminación cruzada debido al incremento de la manipulación de los amplicones generados en la primera ronda de amplificación. El uso de cebadores y sondas altamente específicos y la optimización de las condiciones de reacción han llevado a la disminución de las aplicaciones de este procedimiento para pruebas de rutina, pero el procedimiento en ocasiones se usa para muestras que son difíciles de amplificar por la PCR convencional. RT-PCR Al amplificar blancos de ARN, los analistas preparan ADNc antes de la etapa de amplificación (RT-PCR). Se cuenta con procedimientos de RT-PCR de uno o dos pasos. En RT-PCR de un solo paso, la transcripción reversa del ARN en ADNc y el subsiguiente paso de amplificación se llevan a cabo en una sola reacción sin procedimientos intermedios. Por lo tanto, la mezcla de reacción para RT-PCR de un solo paso incluye cebadores de amplificación específicos del gen, que se usan tanto para la transcripción reversa como para la amplificación. La ventaja de este procedimiento es la reducción general del tiempo de manipulación, el aumento de la capacidad de procesamiento y el riesgo reducido de contaminación debido a que no es necesario volver a abrir el recipiente de la reacción. En contraste, en la RT-PCR de dos pasos, la transcripción reversa y la amplificación se efectúan como dos etapas separadas. En general, para el paso de transcripción reversa se usan cebadores aleatorios o cebadores oligo-d(T) en vez de cebadores específicos del gen. Una alícuota de la reacción de síntesis del ADNc se transfiere entonces a
1522 (1127) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos / Información General
USP 39
la reacción NAT para la subsiguiente amplificación. La ventaja de este procedimiento es la estandarización de la reacción de transcripción reversa, que se puede usar como fuente única para el análisis de múltiples transcritos en el análisis de la expresión del gen. DETECCIÓN DE AMPLICONES Después de la amplificación, los analistas pueden emplear una gran variedad de procedimientos para la detección del amplicón, según se describe en detalle en el capítulo de información general, Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Extracción, Detección y Secuenciación (1126). Estos incluyen electroforesis en gel de agarosa con bromuro de etidio u otros colorantes, electroforesis capilar y fluorescencia inducida por láser e hibridación, seguida por detección cromogénica, como la detección con el complejo estreptavidina-peroxidasa de rábano, quimioluminiscencia o detección fluorescente usando sondas marcadas. Cuantificación-Los ensayos originales de PCR y RT-PCR eran cualitativos y detectaban amplicones al final de la reacción. Dicha detección no es fácil de cuantificar porque en esta etapa la amplificación está en la fase de meseta al final del ensayo y la cantidad de amplicones no necesariamente está relacionada en forma directa con la cantidad del molde inicial. Se han desarrollado varios enfoques para intentar resolver la deficiencia de la PCR para producir resultados cuantitativos confiables. Los intentos iniciales de cuantificación se basaban en evaluar la cantidad del ADN amplificado durante el comienzo o la parte exponencial del ensayo, pero este procedimiento estaba plagado de problemas porque las alícuotas se debían tomar de las mezclas de reacción a intervalos regulares, lo cual aumentaba muchísimo el riesgo de contaminación cruzada. Uno de los primeros y más directos enfoques para cuantificar los productos de PCR consistió en medir la cantidad de amplicones que se generaban durante la fase exponencial de la reacción, comparándolos con un control externo diluido serialmente. Sin embargo, diversos aspectos, incluyendo la variabilidad en la preparación de la muestra y las variaciones en las condiciones de la reacción, entorpecían este procedimiento. Debido a la amplificación exponencial de los procedimientos NAT, incluso pequeños errores o discrepancias pueden llevar a diferencias marcadas. Comparado con los procedimientos de dilución, la PCR competitiva demostró ser un enfoque mucho más preciso para conseguir cálculos confiables de las moléculas blanco presentes originalmente. Este procedimiento se basa en la coamplificación simultánea de una secuencia blanco específica, en presencia de concentraciones crecientes de una molécula blanco exógena (control) que comparte los sitios de unión del cebador con la secuencia blanco, pero cuya secuencia está ligeramente modificada o acortada con el fin de facilitar la discriminación de los amplicones salvajes (wild-type). Además, se conoce la concentración del control. La estrecha homología de la secuencia y el tamaño similar del control y de los amplicones blanco están diseñados para garantizar que el molde y el control interno se amplifiquen con eficiencia comparable. La concentración relativa de las bandas de amplicones del molde y del control se deben analizar, por ejemplo, sobre geles de agarosa teñidos con bromuro de etidio, lo cual da una cuantificación relativamente precisa del blanco salvaje. Un defecto de este enfoque es que el control interno y el molde deben estar presentes en la reacción aproximadamente en la misma cantidad con el fin de producir resultados correctos. El desarrollo de la PCR cuantitativa en tiempo real ha eliminado la variabilidad asociada con la PCR cuantitativa, permitiendo así la cuantificación rutinaria y confiable de los productos de PCR. PCR EN TIEMPO REAL Y RT-PCR EN TIEMPO REAL Aunque la cuantificación de genes por PCR cuantitativa fue un procedimiento ampliamente usado, sus aplicaciones se expandieron con el advenimiento de la PCR en tiempo real y la RT-PCR en tiempo real. La PCR en tiempo real aporta las mismas ventajas de la PCR cuantitativa estándar-sensibilidad, especificidad y amplio intervalo dinámico-pero el procedimiento en tiempo real ofrece la ventaja adicional de no requerir de un procesamiento postamplificación porque combina amplificación y detección en un solo paso. La PCR en tiempo real recolecta datos a lo largo del proceso de amplificación, midiendo una señal de fluorescencia creada a medida que la amplificación progresa. Un gran número de estrategias de fluorescencia permiten la correlación del producto generado por PCR con la intensidad de la fluorescencia. En principio, la intensidad de la fluorescencia aumentará con cada ciclo efectuado. Una vez que la intensidad es mayor que la fluorescencia de fondo, se consigue el valor de ciclo umbral (CJ. Este valor, que representa el primer ciclo en el cual hay un aumento detectable en la fluorescencia por encima del nivel de fondo, se usa para medir cantidades de blanco relativas o absolutas. El valor C1 es inversamente proporcional al número de moléculas blanco en la muestra y por lo tanto proporciona un medio para cuantificar la cantidad de blanco en el material inicial (es decir, cuanto mayor sea el número de moléculas blanco presentes, menor será el valor C1). Las condiciones de reacción para las aplicaciones de PCR en tiempo real deben contemplar la presencia de sondas y requieren optimización. Las sondas más comúnmente usadas en la actualidad son sondas de hidrólisis, aunque las sondas de hibridación representan una alternativa. En la mayoría de los casos, las etapas de amplificación y detección se pueden combinar en una reacción cíclica en dos pasos, pero estas condiciones tienen que optimizarse. En contraste, los colorantes de unión al ADN, que también se pueden usar para la detección de amplicones, requieren la separación de los pasos de apareamiento y extensión puesto que la unión con el colorante ocurre durante el paso de extensión que por lo general se hace a 72º. Para la detección del producto de PCR en tiempo real se usa un colorante fluorescente que se intercala con el ADN. Este colorante emite luz cuando se une al ADN de doble cadena y el subsiguiente aumento en fluorescencia puede ser detectado por instrumentos de PCR en tiempo real. Los colorantes que se unen al ADNdc no solo se unen al producto específico de PCR sino a los artefactos, como los productos no específicos de PCR y los dímeros de cebadores. Los analistas han observado diferencias sustanciales en la especificidad de los colorantes de unión al ADNdc que se usan con los kits de PCR en tiempo real. Por
USP 39
Información General/ (1127) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos 1523
esa razón, algunos analistas recomiendan verificar la presencia de un solo producto de PCR por electroforesis en gel para determinar el tamaño correcto del mismo. También es aconsejable realizar un análisis de la curva de fusión (desnaturalización) para garantizar la ausencia de artefactos que podrían contribuir a la señal fluorescente y por lo tanto llevar a interpretaciones erróneas de los datos cuantitativos. Como alternativa, se pueden emplear sondas marcadas, específicas de secuencia. Se cuenta con una amplia variedad de cebadores y sondas marcadas con fluorescencia para su uso en PCR en tiempo real, las cuales se describen en la próxima sección. Sondas para PCR en Tiempo Real-La diferencia entre la PCR convencional y la PCR en tiempo real es la presencia de un tercer oligonucleótido sintetizado químicamente, la sonda, que en el caso de las sondas más básicas de hibridación contiene algún tipo de molécula indicadora, por lo general una molécula fluorescente o fluoróforo. A los ADN sintetizados químicamente se les pueden agregar materiales distintos a ácidos nucleicos, que se incorporan luego en las sondas de oligonucleótidos para PCR en tiempo real. Otras aplicaciones incluyen sondas de hibridación como las usadas para hibridación fluorescente in situ (FISH, por sus siglas en inglés) y micromatrices y sondas diseñadas para capturar otros ácidos nucleicos. Al usar sondas fluorescentes para PCR en tiempo real, se presenta el desafío impuesto por la sonda no unida o libre dado que ésta no se retira antes de la detección, requiriéndose entonces un medio para distinguir entre la señal de la sonda unida y de la libre. Por el contrario, los ensayos de FISH incluyen el lavado, después de la hibridación, para eliminar la sonda libre. Todos los problemas asociados con el diseño del cebador para PCR convencional aplican a los cebadores para PCR en tiempo real, así como a la secuencia de la sonda. Como regla general, sólo dos consideraciones adicionales aplican a la secuencia de la sonda. Una de estas es la termodinámica y la otra concierne específicamente a las porciones indicadoras de la sonda. Termodinámicamente, una buena molécula para sonda que se haya diseñado para unirse a la secuencia ubicada en algún punto entre los dos cebadores de PCR tendrá una Tm que es aproximadamente 5º mayor que la de los dos cebadores. En la gran mayoría de los casos, la longitud del amplicón estará entre 100 y 500 bases de ADN, aunque para la PCR en tiempo real un amplicón más pequeño, entre 100 y 150 bases de longitud, producirá una reacción más eficiente. Por lo tanto, rara vez será un problema encontrar una secuencia dentro del amplicón de PCR que cumpla con los criterios necesarios. Los diseños actuales de las sondas permiten superar los problemas de la señal de fondo proveniente de la sonda no unida, usando sondas de hibridación simples. En el diseño original, se marcan dos sondas que hibridizan secuencias adyacentes sobre el ácido nucleico blanco. La porción indicadora es una molécula fluorescente unida al extremo 3' de la secuencia río arriba de la sonda, en tanto una segunda molécula fluorescente se une al extremo 5' de la segunda sonda. La excitación del fluoróforo en 5' con energía luminosa de la longitud de onda adecuada lleva a la absorción de dicha energía, seguida por emisión de energía luminosa a una longitud de onda ligeramente más larga o menos energética (Ley de Stoke). Esta energía emitida excita luego el fluoróforo en 3', si éste está suficientemente cerca al emisor y es compatible con él, en el sentido de que la energía emitida del fluoróforo en 5' pueda excitar el fluoróforo en 3'. Cuando esto ocurre, la longitud de onda de la luz fluorescente observada será la de la molécula aceptora y no la de la dadora. Los espectros de absorción y emisión de fluorescencia se consiguen fácilmente para todos los fluoróforos comúnmente usados, y las únicas reglas que deben aplicarse consisten en que las dos moléculas fluorescentes estén separadas por menos de 40 bases de ADN y que el espectro de emisión del dador se solape con el espectro de absorción del aceptor. Por lo tanto, la hibridación de las dos sondas, también conocidas como sondas de hibridación o sondas FRET (siglas en inglés para Fluorescencia por Transferencia de Energía Resonante), ocasiona la emisión de una señal fluorescente por parte del aceptor, la cual se puede detectar. En ausencia de hibridación, las sondas están suficientemente separadas en la solución, de manera que no puede ocurrir la transferencia de energía y el dador sólo emite fluorescencia de fondo. Los problemas de compatibilidad de fluoróforos han sido resueltos por el uso creciente de una clase especial de molécula llamada extintor (quencher). Los extintores son moléculas fluorescentes que absorben energía fluorescente en una amplia gama de longitudes de onda. En vez de reemitir esa energía como luz, simplemente la disipan como calor. Por lo tanto, si una molécula extintora se coloca en el extremo 3' de una sonda y un fluoróforo en el extremo 5', la sonda permanecerá oscura, aunque esté presente la energía de excitación, siempre que la molécula permanezca intacta (sondas de hidrólisis). Estas sondas utilizan la actividad de nucleasa 5' de la ADN polimerasa para hidrolizar una sonda unida a su amplicón blanco. La escisión ocasiona la separación del indicador y el extintor y permite la fluorescencia del indicador. Esto reduce gran parte del trabajo de optimización de las condiciones del ensayo (puesto que sólo se usa una sonda) y el ruido de fondo generado con dos sondas. Una variación de las sondas de hidrólisis incluye la colocación de las moléculas indicadora y extintora sobre un solo oligonucleótido que está construido de tal forma que cuando no está unido, el extintor y el indicador estén cercanos, lo cual lleva a una eficiente extinción del indicador. Cuando la sonda hibridiza a su secuencia complementaria en el amplicón, la sonda pasa por un cambio en la conformación que obliga al extintor y al indicador a separarse, permitiendo la fluorescencia del indicador. Una variación de estos tipos de sonda consiste en un cebador y una sonda combinados, en los cuales, de nuevo, el extintor y el indicador están cerca en la sonda nativa, por lo cual no hay señal. El cebado y subsiguiente elongación del cebador-sonda producen la hibridación a la cadena de ADN recién sintetizada, ocasionando la separación espacial del extintor y el indicador y la generación de una señal. Marcación de la Sonda-Las estrategias modernas de modificación de oligonucleótidos sintéticos permiten la fabricación de oligonucleótidos con materiales distintos de ácidos nucleicos. La incorporación de las modificaciones se efectúa de dos maneras posibles: durante la síntesis o después de la síntesis. En el primer caso, las modificaciones se construyen de tal manera que se comportan como las cuatro bases del ADN o ARN que se colocan rutinariamente en la secuencia. La modificación se presenta entonces en el sitio deseado durante la síntesis como si fuera otra base en la serie. En el segundo caso, usualmente
1524 (1127) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos / Información General
USP 39
empleado cuando se realiza más de una modificación, la síntesis incluye un ligador (linker), tal como un grupo amino, al cual se conecta la modificación deseada. Este proceso con frecuencia se denomina etiquetado manual ("hand-tagging"). Quizás el ejemplo mejor conocido de etiquetado manual es la sonda convencional doblemente marcada que se usa en la PCR en tiempo real. El extintor se coloca en el extremo 3' de la secuencia durante la síntesis y la molécula indicadora fluorescente se etiqueta manualmente a una modificación de grupo amino en el extremo 5' de la secuencia después de que la síntesis ha terminado y ha pasado por el proceso de purificación. Se han diseñado algunas modificaciones, como las que utilizan biotinas, para poder llevar a cabo múltiples modificaciones en una sola síntesis. De esa forma, es posible modificar una secuencia de ADN o ARN sintéticos para que contengan una variedad de moléculas distintas de los ácidos nucleicos. Dichas modificaciones tienen un costo asociado por cuanto las alteraciones a menudo se consiguen con una pérdida de masa debido a una menor eficiencia inherente de las modificaciones para unirse a los oligonucleótidos, en comparación con las bases estándar de ADN o ARN, o al requisito de que el producto de la síntesis sea purificado antes de la modificación, después de la modificación o en ambos casos. Los beneficios de la modificación de ADN o ARN sintéticos por lo general superan los costos. La sonda estándar para PCR en tiempo real, doblemente marcada y con extintor, ha permitido la cuantificación precisa de la expresión génica. Los oligonucleótidos de ADN marcados con fluorescencia son también componentes esenciales de las hibridaciones in situ y de las micromatrices (microarrays). Algunas modificaciones confieren un incremento en la estabilidad térmica cuando se hibridizan sondas de ADN o ARN sintéticos a ADN o ARN complementarios, por comparación con los dúplex de ADN-ADN o ADN-ARN no modificados. Estos análogos incluyen ácidos nucleicos peptídicos, 2'-fluoro N3-P5'-fosforamidatos y ácidos 1',5'-anhidrohexitolnucleicos. Aunque dichos análogos mejoran en diferentes grados las estabilidades térmicas, fallan en proporcionar un mejor reconocimiento del blanco. Otro enfoque consiste en usar análogos de bases como el ácido nucleico bloqueado, el cual es un análogo que contiene un puente 2'-0, 4'-C metileno. Este puente restringe la flexibilidad del anillo de la ribofuranosa y bloquea la estructura en una formación bicíclica rígida, lo cual le confiere mejor desempeño y estabilidad a la hibridación. La modificación de una sonda está determinada generalmente por el uso previsto de la misma. Por lo general, se usan indicadores fluorescentes en PCR en tiempo real e hibridación in situ. La gama de indicadores fluorescentes disponibles cubre el espectro de 51 7 nm a 778 nm. En el caso de las sondas de hibridación, se prefieren las modificaciones de las bases porque éstas alteran principalmente las interacciones termodinámicas entre las bases, lo cual mejora la especificidad. Los grupos amino de conexión, tanto los que tienen espaciadores C como los que no, se usan para conectar otras modificaciones a secuencias de ADN y para conectar secuencias de ADN a superficies sólidas como los portaobjetos (slides) de vidrio. Un ejemplo es la unión de moléculas de biotina a secuencias de ADN. La biotina forma un enlace fuerte con materiales recubiertos de estreptavidina, tales como perlas magnéticas, permitiendo la captura de ácidos nucleicos específicos que podrían ser hibridizados a su vez a otras moléculas. Cuantificación-Los productos de PCR se pueden cuantificar usando una curva estándar graficada a partir de diluciones seriadas repetidas de un reactivo o estándar de referencia para la secuencia de ácido nucleico de interés. Se conoce la concentración del ácido nucleico en el reactivo de referencia. La cuantificación de PCR en tiempo real basada en una curva estándar puede utilizar ADN de plásmidos u otras formas de ADN. Sin embargo, la eficiencia de la PCR debe ser la misma para los estándares y para las muestras blanco. La PCR de blancos purificados puede ser en algunos casos más eficiente que la PCR con mezclas complejas de ácidos nucleicos. Los valores de ciclo umbral (Ct) y las concentraciones de las diluciones del reactivo de referencia se pueden usar para trazar una curva estándar a partir de la cual se pueda calcular la concentración de la muestra desconocida. Cuando las condiciones de corrida del ensayo se han estandarizado bien y la curva estándar para un blanco particular está bien calibrada, en las subsiguientes corridas del ensayo será suficiente coamplificar solo dos diluciones de un reactivo de referencia (habitualmente diluciones que contengan cantidades conocidas de ácido nucleico a alta y baja concentración). Estas diluciones, o calibradores, se pueden usar entonces para cuantificar cualquier muestra desconocida por comparación de los valores de et. PCR Multiplex-La PCR multiplex describe la amplificación simultánea de varias secuencias blanco de ácidos nucleicos en una sola reacción del ensayo. Esta es una variación especialmente exigente de la PCR porque requiere el uso de un solo set de condiciones de reacción para la amplificación de blancos múltiples con diferentes características de secuencia. Pueden surgir complicaciones adicionales debido a la mayor probabilidad de productos de amplificación no específicos que resultan de múltiples interacciones de los cebadores. Además, las diferentes eficiencias de amplificación de los blancos individuales pueden llevar a que las reacciones más débiles sean superadas por reacciones más fuertes y más eficientes. Las aplicaciones, tanto cualitativa como cuantitativa, de la PCR multiplex, han sido descritas en la literatura, al igual que los ensayos de RT-PCR multiplex. La PCR multiplex cuantitativa depende, bien sea de la generación de múltiples curvas estándar para permitir la cuantificación de cada blanco en el ensayo o de la inclusión de secuencias del competidor interno que se puedan usar como calibrantes. La cinética de hibridación de los cebadores y de las sondas puede ser significativamente diferente, incluso cuando se diseñan usando el mismo algoritmo. Esto deja al analista un campo muy limitado para optimizar las condiciones de reacción. Sin embargo, la optimización puede incluir ajustes de la cantidad de la ADN polimerasa, del Mg 2+ para aumentar la eficiencia de la hibridación o de la concentración del cebador. En la PCR en tiempo real, especialmente, la optimización de la concentración del cebador es crítica para la coamplificación cuantitativa de los genes blanco, que están contenidos en la muestra en cantidades significativamente diferentes. El aumento de la eficiencia de la hibridación del sistema cebador-sonda se puede conseguir suministrándole reactivos suficientes, como Mg2 +, así como agregando un reactivo de amontonamiento molecular ("molecular crowding") que aumente la concentración efectiva de todos los componentes de la reacción en la mezcla. La PCR multiplex no
USP 39
Información General/ (1127) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos 1525
se usa sólo para aplicaciones de genotipificación, sino también para PCR en tiempo real cuantitativa porque ofrece diversas ventajas sobre las reacciones estándar de la PCR simple en tiempo real. Algunas de estas ventajas son: utilización de una cantidad minimizada de muestra, aumento de la precisión por medio del uso de un control interno (p.ej., un gen constitutivo o "housekeeping gene") coamplificado con el gen blanco en la misma reacción, ausencia de pasos de pipeteo separados y mejor relación costo-rendimiento. La mayoría de los ensayos de PCR tienen un problema común, que es el de minimizar las diferencias en extracciones o amplificaciones entre las diferentes muestras. La PCR multiplex es útil en casos donde resulta crítico garantizar que la variabilidad en la cuantificación de diferentes muestras no se debe a las diferencias en la extracción de ácidos nucleicos o en las mediciones de amplificación (por lo general cuando se mide la producción de una especie de ARNm). Para minimizar estos retos se pueden emplear ciertas precauciones y técnicas que se discuten en la siguiente sección sobre normalización de los resultados del ensayo. Normalización de los Resultados del Ensayo-Para minimizar los efectos de las variables del ensayo, los analistas usan en ocasiones un procedimiento de cuantificación relativa que normaliza la concentración del transcrito blanco frente a un control que se puede emplear y comparar para todas las muestras incluidas en el estudio de expresión génica. Probablemente el procedimiento de cuantificación relativa más confiable y más frecuentemente usado se basa en la medición de genes constitutivos (housekeeping genes) o de control para normalizar la expresión del gen blanco en un formato de PCR multiplex. Se prefiere este procedimiento porque la cuantificación tanto del gen constitutivo como del gen blanco está influenciada por eficiencias variables de la síntesis del ADNc o por la presencia de inhibidores enzimáticos contenidos en la muestra. Sin embargo, cabe observar que la eficiencia de la conversión del ARN blanco a ADNc no es necesariamente coherente, ni siquiera dentro de una reacción en un solo tubo, sino que depende del diseño del cebador, de la secuencia blanco, etc., los cuales pueden diferir entre los genes blanco y constitutivo. La selección de genes apropiados de control puede causar problemas porque no necesariamente se expresan de manera equivalente en todas las muestras desconocidas y pueden variar bajo condiciones experimentales. La normalización de mediciones de un grupo de genes constitutivos con el fin de evitar el problema de variabilidad podría resolver este inconveniente. Como alternativa, los analistas pueden establecer una evaluación cuidadosa de los genes constitutivos que no alteren los grados de expresión génica bajo las condiciones experimentales. Todas las técnicas NAT descritas hasta el momento son variaciones del ensayo de PCR, que es la técnica NAT más ampliamente usada. Sin embargo, los ensayos isotérmicos basados principalmente en la amplificación del ARN se usan para propósitos rutinarios. Esto se conoce como ensayo de amplificación mediada por transcripción (TMA), el cual está muy relacionado con el ensayo de amplificación basada en la secuencia del ácido nucleico (NASBA). Ambos ensayos se describen en más detalle en la siguiente sección. AMPLIFICACIÓN BASADA EN LA SECUENCIA DEL ÁCIDO NUCLEICO Y AMPLIFICACIÓN MEDIADA POR TRANSCRIPCIÓN Tanto la NASBA como la TMA dependen de la amplificación isotérmica in vitro para la detección y amplificación de ácidos nucleicos, también conocida como replicación de secuenciación autosostenida o 3SR. La principal diferencia entre los ensayos radica en que la NASBA utiliza tres enzimas: transcriptasa reversa (RT), ARN polimerasa y ARNasa H, mientras que la TMA usa sólo dos enzimas: RT y ARN polimerasa. El procedimiento completo generalmente se efectúa de 41 º a 42º, usando dos cebadores. Tanto la NASBA como la TMA son especialmente adecuadas para amplificar analitos de ARN, incluyendo ARNr, ARNm, patógenos que tienen ARN como su material genético, así como ADN blancos. Uno de los cebadores que tiene una secuencia promotora para la ARN polimerasa en el extremo 5' se une al ARN blanco y se extiende por medio de la actividad de ADN polimerasa de la RT. El producto de esta reacción es un híbrido ARN-ADN. La actividad de ARNasa H digiere entonces específicamente la cadena ARN del híbrido, dejando sólo el ADNc al cual se puede unir el segundo cebador. La RT sintetiza luego una cadena complementaria de ADN, dando lugar a una molécula ADNdc con un promotor T7 en el extremo 5'. La ARN polimerasa T7 transcribe entonces múltiples copias del amplicón de ARN. Las copias de ARN pueden pasar por el mismo ciclo para crear nuevas moléculas de ADN dúplex con un promotor T7 de las cuales se transcriben muchas moléculas de ARN. Así, a diferencia de la PCR, el amplicón amplificado en este caso es de una especie de ARN. Algunas de las características de esta tecnología son: se pueden amplificar eficientemente solo secuencias blanco relativamente cortas (cerca de 100 a 250 nucleótidos); emplea una sola temperatura, lo cual elimina la necesidad de un equipo especial de termociclado; la fidelidad de la técnica es comparable a la de otros procesos de amplificación; y los amplicones de ARN se amplifican exponencialmente. La contaminación por arrastre se minimiza debido a la naturaleza lábil del amplicón de ARN en el ambiente del laboratorio. Los procedimientos de contención incorporados al procedimiento del ensayo ayudan a minimizar la contaminación aún más. La detección de amplicones se consigue por lo general mediante el uso de sondas marcadas y, en la tecnología de TMA, un método común consiste en la detección de señales quimioluminiscentes de las sondas hibridizadas que permanecen intactas durante el subsiguiente paso de hidrólisis alcalina usado para destruir la sonda libre. Las técnicas NAT descritas, tanto PCR como TMA, se optimizan para amplificar fragmentos pequeños y específicos de un genoma. En casos donde es deseable la amplificación del genoma completo, como en los análisis de mutación o en las pruebas de identidad, las modificaciones de los procedimientos de la PCR son necesarias con el fin de garantizar la representación de la secuencia adecuada de los loci genéticos, según se describe en la siguiente sección.
1526 (1127) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos/ Información General
USP 39
AMPLIFICACIÓN DEL GENOMA COMPLETO Históricamente, la amplificación del genoma completo (WGA, por sus siglas en inglés) se ha efectuado usando procedimientos de PCR modificada. Estos procedimientos han dependido de la amplificación no específica del genoma, usando cebadores que se unen bajo condiciones de baja rigurosidad al molde del ADN. Los enfoques basados en PCR difieren principalmente en términos del tipo de cebador empleado en la reacción: en la preamplificación por extensión de cebadores (PEP, por sus siglas en inglés) se usan cebadores aleatorios cortos de 15 bases en una reacción de ciclado inicial con baja rigurosidad para hacer múltiples copias aleatorias de segmentos del genoma. Este producto se usa entonces como blanco para la reacción de PCR específica. El mayor inconveniente de esta técnica son los sesgos de amplificación de los contextos favorables de secuencia que llevan a la representación irregular del genoma. Otro inconveniente es la generación de fragmentos cada vez más cortos durante cada ronda de amplificación. Otro procedimiento denominado PCR con cebadores de oligonucleotidos degenerados (DOP-PCR, por sus siglas en inglés) usa cebadores etiquetados (tagged primers) y amplificación de baja rigurosidad para los primeros ciclos de la amplificación, seguido por un aumento de la rigurosidad de apareamiento en los ciclos posteriores. Los cebadores etiquetados se caracterizan por tener etiquetas (tags) de secuencia definidas en los extremos 3' y 5' y una secuencia aleatoria en el centro del cebador. Bajo las últimas condiciones, más rigurosas, los fragmentos de ADN blanco generados durante los primeros ciclos, que contienen las secuencias de la etiqueta de amplificación, se amplifican preferencialmente sin ningún acortamiento posterior de la longitud del fragmento. La WGA basada en PCR emplea por lo general polimerasas tipo Taq que presentan la desventaja de introducir variaciones dentro del ADN amplificado debido a la procesividad y fidelidad relativamente bajas de las mismas, que se incrementan por el altísimo número de ciclos de amplificación usados en estos métodos. Esto puede causar problemas en las aplicaciones posteriores, como el análisis de genotipificación. Estas limitaciones, así como la relativamente mala representación de la secuencia de los loci genómicos, inherentes a la WGA basada en PCR pueden resolverse por una reacción isotérmica llamada amplificación por desplazamiento múltiple (MDA, por sus siglas en inglés). La enzima que se usa para MDA comprende una polimerasa de alta procesividad con actividad correctora (proofreading) y actividad de desplazamiento de cadena. La reacción isotérmica se efectúa a 30º, sin cambios en la temperatura de la reacción. La reacción comienza con el apareamiento de múltiples cebadores aleatorios al ADN blanco y la elongación de los cebadores, usando una ADN polimerasa del fago Phi29 del Bacillus subtilis. Dado que la polimerasa es capaz de desplazar las cadenas del ADN en una dirección 5'-3', la reacción de la polimerasa no se detiene cuando las cadenas elongadas se encuentran con las cadenas del ADN río abajo. La cadena de ADN desplazada sirve de nuevo como blanco para múltiples reacciones de elongación con cebadores de manera que el molde de ADN se amplifica exponencialmente de manera ramificada, produciendo ADN de alto peso molecular con una buena representación de los loci genómicos. Comparado con la WGA basada en PCR, la tasa de error es muy baja. En particular, la velocidad de mutación de las estructuras repetitivas de la secuencia es baja debido a la actividad limitada de desplazamiento de la cadena de la polimerasa Phi29. Esto permite la genotipificación confiable del ADN genómico (p.ej., análisis de SNP, análisis de mutación, pruebas de identidad o análisis de muestras casuísticas) en diferentes plataformas, como la PCR en tiempo real o el análisis de matrices (arrays).
INSTRUMENTAL El desarrollo de las numerosas y variadas técnicas NAT descritas en este capítulo se ha visto facilitado por la evolución del instrumental que ha servido para automatizar estos procedimientos complejos. En esta sección se presenta una descripción general de los principales cambios en el instrumental. El control continuo de las etapas de temperatura necesarias para conseguir la amplificación exponencial para los ensayos de PCR se lleva a cabo con termocicladores totalmente automatizados que constan de un bloque de calentamiento en el cual se puede completar el ciclo de temperatura rápidamente. Los cambios de temperatura son inducidos por agua, o más recientemente, con el efecto Peltier. Estos instrumentos pueden estar acoplados a un fluorómetro si se usan para análisis de PCR en tiempo real. En ese caso, ciertos instrumentos se equipan con un dispositivo rotor que se calienta y enfría por aire en vez de tener un bloque de metal que típicamente se usa como módulo de calentamiento. En el caso de la PCR de punto final (endpoint PCR), los productos de PCR se analizan por lo general de acuerdo con el tamaño en geles de agarosa o poliacrilamida o por electroforesis capilar, usando cebadores marcados con fluoróforo. También se pueden analizar usando matrices o por otros procedimientos de hibridación. Dado que no se requieren etapas de separación de marcas o un procesamiento posterior a la PCR, los ensayos de PCR en tiempo real son simples de realizar, lo cual los hace útiles para aplicaciones de alta capacidad de procesamiento. Los instrumentos de PCR en tiempo real combinan las propiedades de un termociclador y un fluorómetro que permiten la determinación de los productos de PCR por medición de la fluorescencia. En cada ciclo de PCR, se toman una o varias lecturas de fluorescencia para monitorear la reacción de PCR en la generación de amplicones, por lo general en la etapa de extensión de la reacción de PCR. Los instrumentos para PCR en tiempo real varían con respecto a la capacidad de procesamiento de muestras simultáneas (32 a 384 recipientes de reacción), volumen de la muestra (5 µLa 100 µL), fuente de excitación y detector utilizado. Estas composiciones definen el intervalo apropiado de los colorantes fluorescentes para PCR multiplexen tiempo real, así como el tamaño y el principio de calentamiento/enfriamiento (ver arriba). La fuente de excitación de los termocicladores en tiempo real puede ser un sistema basado en láser, lámparas halógenas o diodos emisores de luz (LED, por sus siglas en inglés). Para seleccionar la longitud de onda de interés se usan filtros ópticos. En la mayoría de los instrumentos, la luz emitida es detectada por un dispo-
USP 39
Información General/ (1127) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos 1527
sitivo de acoplamiento de carga (CCD, por sus siglas en inglés) que consta de una matriz de celdas sensibles a la luz. La luz proyectada hacia el CCD es convertida a una carga eléctrica, produciéndose una señal que es proporcional a la intensidad de la luz. La versatilidad del ensayo de PCR ha traído como consecuencia el uso extendido y diverso de esta técnica. Con el advenimiento de la PCR en tiempo real, ha sido posible diseñar instrumental de alta capacidad de procesamiento para pruebas automatizadas. De manera similar, el ensayo de TMA también se ha automatizado. Dicha tecnología se usa en los laboratorios que hacen pruebas sumamente reguladas y que requieren alta capacidad de procesamiento, como las pruebas de detección sistemática en sangre para el virus de la hepatitis C (VHC) o para el virus de la inmunodeficiencia humana 1 (VIH-1 ), dado que las pruebas automatizadas son ideales en un ambiente regulado en donde se requiere mínima intervención humana. El uso de NAT en un ambiente sumamente regulado ha traído como consecuencia el desarrollo de pautas para el manejo de los aspectos de garantía de calidad (QA) y control de calidad (QC) en las pruebas, así como la validación de sistemas y ensayos según se describe en la siguiente sección.
GARANTÍA DE CALIDAD Y CONTROL DE CALIDAD PARA NAT Esta sección sirve como una guía general para el desarrollo de procedimientos específicos de QC y QA para el laboratorio y el proceso NAT. No cubre aspectos como la eliminación de desechos, la manipulación de material radioactivo o el trabajo con material peligroso. La NAT es una tecnología que ofrece extrema sensibilidad en su capacidad para generar millones de amplicones a partir de algo tan pequeño como un solo molde de ácido nucleico y producir una señal detectable. Las ventajas de esta tecnología pueden ser opacadas por la necesidad de establecer protocolos complejos para el ensayo y el requisito de seguir cuidadosamente protocolos muy rigurosos de QC/QA. La desviación de estos protocolos puede acarrear problemas importantes, como los resultados falsos positivos debido a la contaminación de los moldes con los amplicones generados en corridas previas del ensayo. De forma similar, el hecho de no controlar los inhibidores puede llevar a una amplificación subóptima y posibles resultados falsos negativos. Considerando la multitud de factores que pueden influenciar enormemente el resultado de un ensayo NAT, es preciso cubrir todos los aspectos relacionados con NAT por medio de procedimientos de QC/QA que sean adecuados y rigurosos. Esto exige diseñar con cuidado la instalación, el flujo de trabajo y la selección de los equipos apropiados para el propósito previsto. El registro de los datos, la conservación de los registros y la interpretación de los datos son otros de los aspectos que deben estar cubiertos por QC/QA. Por ello, la QA para los ensayos NAT incluye validación del ensayo, establecimiento de especificaciones y criterios de aceptación y adherencia a las buenas prácticas de fabricación y de laboratorio. Estos aspectos se describen también en esta sección. Además, se debe hacer referencia a otras guías publicadas tales como Validation of Analytical Methods: Methodology (Q2B) de ICH y las NCCLS Guidelines.
QC/QA en el Laboratorio Un laboratorio para NAT debe funcionar y estar diseñado de manera que se evite la contaminación de las reacciones con productos de amplificaciones previas (arrastre) así como la contaminación cruzada entre muestras. Históricamente, la aplicación de PCR requería la separación estricta de los diversos pasos del ensayo, con el fin de evitar la contaminación cruzada de la PCR por amplicones. Esto era necesario porque los procedimientos previos para análisis de productos de PCR involucraban la transferencia del producto, lo cual podía llevar a contaminación. Por lo tanto, en un sistema abierto, la mejor medida para prevenir la contaminación consiste en la separación estricta de las zonas de trabajo para los pasos individuales del proceso. Esto incluye áreas individuales para la preparación del molde, preparación de la mezcla maestra, distribución de la mezcla maestra en los pocillos de reacción individual y la adición del molde, espacio para el termociclado de los ensayos de PCR y, opcionalmente, un espacio de trabajo separado para análisis del producto de PCR. Estos requisitos no son necesarios en los sistemas cerrados. Tanto para los sistemas abiertos como para los cerrados sigue siendo necesario tomar precauciones adicionales. Estas medidas de seguridad incluyen iluminación UV de los espacios de trabajo durante la noche para inactivar el ADN residual por entrecruzamiento (crosslinking). En caso de contaminación, las mesas y pipetas del laboratorio se deben descontaminar con una solución de blanqueador comercial al 10%, que por lo general contiene aproximadamente 5% de hipoclorito de sodio, aplicado con las medidas de seguridad apropiadas, como el uso de guantes y gafas protectoras. Posteriormente, las mesas y pipetas se deben enjuagar con agua destilada. Un flujo de trabajo unidireccional reducirá la oportunidad de que ocurra contaminación. Además, no se deben intercambiar materiales, suministros ni equipos entre las áreas o cuartos de trabajo designados.
QC/QA de los Equipos Otras buenas prácticas de laboratorio relacionadas con la prevención de contaminación por arrastre incluyen el uso de equipos apropiados y limpios. Por lo general, se prefieren artículos consumibles desechables (tubos, puntas de pipeta (tips), etc.) al equipo reutilizable. El uso de puntas de pipetas desechables que contengan filtros hidrófobos es otra medida muy eficaz para minimizar la contaminación cruzada. Todas las muestras, cebadores, sondas, etc., deben rotularse con la información pertinente, como identidad del contenido, fecha de uso o preparación, fecha de caducidad, concentración e información de almacenamiento. Las batas destinadas al laboratorio o las batas desechables deben estar disponibles en cada cuarto (o sección) del labo-
1528 (1127) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos/ Información General
USP 39
ratorio de NAT. Durante todas las etapas del procesamiento se deben usar guantes apropiados para prevenir la contaminación de la muestra. Los guantes se deben cambiar con frecuencia. Dado que la esterilización por calor no destruye completamente el ADN, los productos de PCR pueden ocasionar contaminación detectable de las superficies de vidrio, por ejemplo. Es aconsejable seguir procedimientos de esterilización exclusivos para los diferentes materiales, como desechos y equipos de vidrio del laboratorio.
Prevención de Contaminación de Arrastre con Uracil-N-Glicosilasa La contaminación por arrastre del producto de PCR puede atenuarse con el uso del procedimiento de uracil-N-glicosilasa (UNG) comercialmente disponible. El procedimiento implica la sustitución de 2'-desoxitimidina 5'-trifosfato (dTIP) por 2'-desoxiuridina 5'-trifosfato (dUTP) en la preparación de la PCR y el tratamiento de todas las mezclas de PCR con UNG antes de la amplificación por PCR; esto puede incorporarse fácilmente como el primer paso de los programas de ciclado de la PCR. La incorporación de dUTP dentro del amplicón hace que los productos de PCR sean bioquímicamente diferentes del molde de ADN nativo. La enzima UNG corta los productos de PCR que contienen desoxiuridina por apertura del anillo desoxirribosa en la posición Cl. Cuando el ADN que contiene desoxiuridina se calienta durante el primer ciclo térmico, la cadena de ADN del amplicón se rompe en la posición de la desoxiuridina al pH alcalino de la mezcla de reacción de la PCR y por lo tanto hace que el producto de PCR arrastrado no sea amplificable. De esa manera, cualquier amplicón generado previamente que contenga U y que podría haber contaminado otra muestra, se volverá no amplificable. Como consecuencia, se pueden evitar los resultados falsos positivos. Sin embargo, cabe anotar que la UNG tiene límites de concentración por encima de los cuales no elimina completamente los productos de contaminación por arrastre de la PCR. VALIDACIÓN DE LOS SISTEMAS NAT La validación del ensayo se consigue (1) garantizando la calidad y la uniformidad de los componentes del ensayo, entre ellos los cebadores, las sondas y las enzimas; (incluye control de la vida útil y de la contaminación) y (2) estableciendo las características de desempeño del ensayo NAT en términos de reproducibilidad, exactitud, tolerancia, robustez, especificidad, precisión y sensibilidad analítica y clínica. La sensibilidad analítica de un ensayo se define como la concentración mínima de un reactivo de referencia o de un estándar detectada por la prueba, mientras que la sensibilidad clínica de una prueba se determina por el análisis de las muestras clínicas y la determinación del 95% de LOD. La sensibilidad clínica de una prueba no es necesariamente igual a la sensibilidad analítica. Cuanto más se asemeje el material de referencia o estándar a las muestras analizadas, más estrecha será la correlación. Los principales pasos de la validación del ensayo son (1) la preparación de la muestra; (2) la producción uniforme de reactivos críticos; (3) el uso de controles, calibradores y estándares de cuantificación; (4) la estabilidad de la muestra y de los reactivos; (5) la funcionalidad de los instrumentos y del software; (6) la capacitación del operador; y (7) la vigilancia de la aptitud del laboratorio. Después de la validación del ensayo, es necesario realizar QA para monitorear especificaciones y características funcionales que hayan sido establecidas mediante el uso de reactivos bien caracterizados de potencia conocida.
Control de Calidad de los Reactivos MOLDES DE ADN Las muestras de prueba generalmente usadas son entre otras, sangre completa, plasma y suero. La preparación de la muestra es el paso clave en el ensayo NAT y tiene una gran influencia sobre el desempeño y variabilidad del ensayo. La recolección de las muestras es el primer paso en la preparación de la muestra. El personal de QC/QA debe evaluar cuidadosamente los efectos de los tubos de recolección y las temperaturas sobre la integridad del ADN durante el transporte de las muestras. Para prevenir la contaminación cruzada durante la recolección de las muestras se deben usar técnicas asépticas, junto con sistemas de muestreo cerrados, con el fin de evitar la contaminación de la muestra. El uso de técnicas, condiciones de temperatura y anticoagulantes o preservantes apropiados para la manipulación de la muestra debe ayudar a reducir el riesgo de contaminación. Ciertos anticoagulantes como heparina o EDTA pueden interferir con el ensayo NAT. EXTRACCIÓN DE LA MUESTRA Se deben evaluar los efectos inhibidores de los amortiguadores, reactivos y agentes detergentes o caotrópicos usados para la extracción de ácido nucleico sobre el ensayo NAT. Se deben incluir controles de extracción, entre ellos el uso de materiales con
USP 39
Información General/ (1127) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos 1529
cantidades conocidas agregadas (spiked materials), para monitorear la eficiencia y reproducibilidad del método de extracción. La reproducibilidad del método de preparación de la muestra se debe determinar bajo las condiciones de procesamiento, incluidas la manipulación, almacenamiento y condiciones de transporte de la muestra. El ADN por lo general es estable, pero el personal debe tener cuidado de evitar el almacenamiento a temperaturas de refrigeración por períodos prolongados para evitar la degradación de la muestra. Los ciclos de congelación-descongelación repetidos pueden ocasionar la fragmentación del ADN. En caso de que el blanco sea ARN, debe notarse que el ARN es muy inestable y las muestras se deben congelar. CEBADORES Los cebadores y las sondas deben estar calificados en términos de pureza, identidad y potencia funcional. La pureza se puede evaluar por medio de HPLC o espectroscopía de masas; la identidad se puede establecer por secuenciación; y la funcionalidad se puede determinar por medio del uso de reactivos de referencia. Sin embargo, en muchos casos es posible que no se cuente con estos métodos para realizar las pruebas internamente. En esos casos, podría ser suficiente con comparar la variación en pureza y potencia funcional, de un lote a otro, usando métodos pertinentes disponibles en el laboratorio, junto con el uso de reactivos de referencia. ADN POLIMERASAS La funcionalidad de las enzimas se debe determinar mediante el uso de materiales de referencia. Las preparaciones de enzimas se deben examinar para detectar otras actividades enzimáticas; por ejemplo, se deben establecer las actividades y las especificaciones de exonucleasas y de polimerasa dependiente de ADN y ARN. Se debe hacer la comparación de un lote a otro, así como la comparación con los certificados de análisis del fabricante. Las condiciones de almacenamiento recomendadas por el fabricante se deben seguir estrictamente y usar los controles apropiados para monitorear la estabilidad de las enzimas.
Controles de Corrida El uso de controles permite al operador garantizar que el ensayo se efectúa dentro de las especificaciones aceptadas. En las pruebas de PCR se deben monitorear y verificar varios pasos en el proceso de la prueba, como se mencionara anteriormente. Los controles múltiples o los controles que sirven para múltiples propósitos pueden ser necesarios para un ensayo de PCR. Los controles deben reflejar la tecnología específica en desarrollo pero deben permitir el monitoreo de la ultracentrifugación, extracción, amplificación, hibridación, cuantificación, contaminación, etc. Los controles deben ser similares al tipo de muestra, siempre que sea posible, aunque son aceptables los controles con cantidades conocidas agregadas (spiked controls). Un control negativo es aquel que no contiene la secuencia blanco o el patógeno que se está examinando. Debe parecerse tan estrechamente como sea posible a la matriz de muestra en análisis. Se deben examinar múltiples controles negativos, incluyendo secuencias diferentes a las del blanco y controles sin ácidos nucleicos para supervisar falsos positivos que resulten de la contaminación. Debido a la alta sensibilidad de los ensayos de amplificación, el personal de QC/QA recomienda ampliamente que los patrocinadores incluyan medidas de control para la prevención de casos de contaminación. Un control positivo es aquel que contiene la secuencia blanco de interés. Debe parecerse tan estrechamente como sea posible a la matriz de la muestra en análisis y debe contener una cantidad apropiada y definida de secuencias blanco (p.ej., kit de control). Se deben proporcionar las especificaciones, tanto para los controles positivos como para los negativos, así como los datos de validación que respaldan el valor umbral de corte/informe del ensayo o el límite de detección del ensayo. El laboratorio debe definir la fuente de los controles y calibradores y contar con un plan para su renovación continua. Los controles pueden ser infecciosos y no infecciosos. En este último caso, se debe proporcionar una validación de la inactivación viral. Los controles de reactivos se conocen a menudo como blancos y pueden incluir muestras que no tienen la secuencia blanco, enzimas, cebadores, etc. Estos controles proporcionan información adicional sobre los problemas encontrados en los ensayos de PCR. A cada muestra se le agrega un control interno para garantizar la validez general de los resultados de la prueba individual. Los controles internos se usan para verificar la extracción, amplificación y detección de la muestra.
Evaluación Externa de la Calidad y Pruebas de Aptitud La evaluación de calidad del laboratorio se consigue por la participación en evaluaciones periódicas de competencia y programas de aptitud del laboratorio. Estos últimos incluyen el análisis de reactivos de referencia y de paneles bien caracterizados para medir la aptitud técnica de los operadores. Por lo tanto, se debe tener cuidado de evitar la contaminación cruzada, monitorear el flujo de trabajo y garantizar la cuidadosa manipulación de la muestra y de las preparaciones de la muestra. La evaluación de la aptitud del operador debe incluir la participación en programas de competencia y medición de calidad. Todo operador en un laboratorio particular debe participar en dichos programas y demostrar resultados comparables.
1530 (1127) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos / Información General
USP 39
Gestión de Datos Se requiere la documentación acorde y completa de todas las actividades efectuadas y todos los datos generados. Dicha documentación no sólo requiere el mantenimiento de registros de los datos generados durante el análisis de la muestra, sino también información acerca de los reactivos y la calibración y mantenimiento de los equipos. Más aún, cualquier alteración en el procedimiento del ensayo se debe introducir por medio de un proceso de control de cambios planeado y documentado de tal manera que un tercero independiente lo pueda evaluar.
(1128) TÉCNICAS BASADAS EN ÁCIDOS NUCLEICOSMICROMATRICES INTRODUCCIÓN Las micromatrices son conjuntos de puntos microscópicos de ADN (medidos en micrones) dispuestos de manera ordenada (en columnas y filas) sobre una superficie plana de tal manera que cada punto de ADN se puede identificar de manera única para facilitar el análisis exacto de los datos. Los puntos de ADN, denominados también elementos de la micromatriz, son moléculas específicas de ADN con secuencias conocidas o desconocidas de nucleótidos que pueden tener longitudes similares o diferentes. Las muestras de estas moléculas de ADN se colocan en sitios fijos de la micromatriz. A diferencia de las sondas convencionales, que son secuencias específicas de ADN o ARN marcadas con etiquetas (tags) radioactivas, fluorescentes o quimioluminiscentes (ver Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Generalidades (1125), Glosario), los elementos de la micromatriz se denominan sondas cuando se conoce su secuencia, aunque no estén marcados. En este contexto, la diana se refiere a los ácidos nucleicos marcados que se encuentran en solución y se hibridizan con los elementos o sondas de la micromatriz. El propósito de un experimento con micromatrices consiste en identificar la secuencia de estos ácidos nucleicos marcados y/o determinar sus contenidos. En la actualidad, las aplicaciones farmacopeicas son limitadas pero podrían incrementarse con un uso más difundido de las micromatrices en procesos de diagnóstico y aplicaciones para el descubrimiento, desarrollo, registro y control de fármacos. Cuando se utilizan para propósitos farmacopeicos, se podrían aplicar al desarrollo de valoraciones estandarizadas y metodologías de validación con disponibilidad de materiales de referencia adecuados. Las micromatrices pueden ser de baja densidad cuando contienen desde cientos hasta miles de elementos, de alta densidad cuando contienen desde decenas hasta cientos de miles de elementos y de muy alta densidad cuando contienen hasta millones de elementos. Se usan superficies planas para las micromatrices, pero además los elementos de la micromatriz se pueden inmovilizar sobre partículas de soporte individuales, tales como perlas. En estos casos, los elementos de la micromatriz se identifican a través de las partículas mismas y no por ubicaciones específicas en una micromatriz. Algunas de las ventajas de usar puntos microscópicos en la micromatriz incluyen alta densidad, cinética de hibridación rápida y bajos volúmenes de muestra. En comparación con los ensayos convencionales basados en ácidos nucleicos, las micromatrices aceleran de gran manera la adquisición de datos y, en ocasiones, incrementan el poder predictivo de los resultados. Lo anterior se logra mediante miniaturización, combinación múltiple (multiplexing) y ejecución paralela de pruebas basadas en ácidos nucleicos que, tradicionalmente se han realizado en tubos, placas o capilares conforme a lo descrito en el capítulo general (1125) (ver además Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Extracción, Detección y Secuenciación (1126), Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Amplificación (1127), Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Genotipificación (1129) y Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Enfoques para Detectar Trazas de Ácidos Nucleicos (Análisis de ADN Residual) (1130)). El principio del análisis con micromatrices se centra en la unión específica de las moléculas diana de ADN con las sondas o elementos de la micromatriz. La disposición ordenada de las filas y columnas de los puntos permite una detección y análisis altamente automatizados. Las micromatrices de ADN se fabrican, procesan, detectan y analizan de distintas formas y tienen un gran número de aplicaciones. Con ayuda de computadoras, automatización del laboratorio y dispositivos de detección de alta resolución, las micromatrices producen grandes cantidades de datos y representan la herramienta analítica preferida para desentrañar la complejidad molecular del ADN o de sus expresiones como ARN mensajero. Los principios básicos de las tecnologías de amplificación de ácidos nucleicos (NAT) y las definiciones de las diversas técnicas se tratan en el capítulo (1127). El presente capítulo abarca el campo general de las micromatrices; sin embargo, el análisis detallado de las micromatrices para diversas aplicaciones específicas, incluyendo el análisis de datos y validación se excluyen por el momento. Las siguientes secciones tratan las aplicaciones principales de las micromatrices, así como el procesamiento de las muestras, marcación, secuencia de trabajo, detección y análisis de datos. Algunas de estas secciones, por ejemplo, preparación de muestras y marcación, coinciden con los capítulos (1126) y (1127), por lo que se proporcionan las referencias cruzadas correspondientes. Por último, se analizan los aspectos reglamentarios de las micromatrices.
Información General/ (1128) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos 1531
USP 39
PRINCIPIOS GENERALES DE LOS EXPERIMENTOS CON MICROMATRICES Tipos y Aplicaciones Las micromatrices se usan ampliamente en tres tipos de análisis: expresión génica, hibridación genómica comparativa basada en micromatrices (o hibridación genómica comparativa de matrices, aCGH, por sus siglas en inglés) y polimorfismo de un solo nucleótido (SNP, por sus siglas en inglés). En resumen, las micromatrices de expresión génica por lo general miden el ARN mensajero de una célula; la aCGH analiza las variaciones en el número de copias (CNV, por sus siglas en inglés) del ADN, adiciones cromosómicas y eliminaciones en el ADN genómico; y las micromatrices para SNP se emplean en la genotipificación para analizar polimorfismos de un solo nucleótido (ver (1129)). Dentro de cada tipo de micromatriz, se encuentran disponibles diversas plataformas, tanto manuales como con varios niveles de automatización. La Tabla 7 resume los tres tipos principales y las aplicaciones más comunes, así como la diana de cada una de ellas, la sonda y las técnicas de ácidos nucleicos complementarias (ver (1126), (1127) y (1129)). Tabla 1. Tipos y Aplicaciones Principales de las Micromatrices Tipos
Aplicación
Diana
Sonda
Tecnología Complementaria
Expresión Génica
Expresión Génica
ARNm
Oligonucleótido/ ADNc
qRT/PCR, Transferencia de Northern (Northern Blotting)
aCGH
aCGH CNV
ADN
Oligonucleótido/ ADNc/Pac, Yac, Bac
Análisis citogenético de cromosomas
SNP
Genotipificación de SNP
ADN
Oligonucleótidos
Secuenciación
SNP
Amplicones
Oligonucleótido
Secuenciación
SNP
Oligonucleótido
Amplicón
Secuenciación
MICROMATRICES DE EXPRESIÓN GÉNICA Las micromatrices de expresión génica se usan para medir el nivel relativo en el que se expresa un gen determinado. Asimismo, son una herramienta potente para el descubrimiento de genes diana, caracterización molecular de tumores, diagnóstico, clasificación, tratamiento y monitoreo de enfermedades. Ha sido posible identificar los subgrupos moleculares subyacentes que están activos en algunas enfermedades mediante la observación de ciertos genes de expresión recurrentes presentes en los tejidos enfermos. Las micromatrices de expresión génica también se usan para medir cambios en la expresión génica durante un lapso de tiempo dado, p.ej., dentro de varias etapas de un ciclo celular o mediante la identificación de mutaciones génicas que conllevan al crecimiento canceroso. Otra de las aplicaciones de las micromatrices de expresión génica es el desarrollo de nuevos fármacos, p.ej., mediante la medición de la disminución de la expresión de un gen asociado con una enfermedad particular para seguimiento de la efectividad de un nuevo fármaco. Cuando se miden los niveles de expresión de un conjunto de genes, se emplea el término expresión génica característica (biomarcador o clasificador). Otros ejemplos de biomarcadores o clasificadores incluyen los clasificadores de actividad del fármaco, que se usan para determinar el mecanismo de acción de un fármaco, o los clasificadores de toxicidad, que se usan con fines diagnósticos y para desarrollar parámetros de dosificación para un paciente. MICROMATRICES PARA ACGH A diferencia de las micromatrices de expresión génica, las micromatrices para aCGH se centran en segmentos de ADN y no en genes individuales (similar al bandeo cromosómico y a la hibridación genómica comparativa tradicional). En una micromatriz para aCGH, los elementos de la micromatriz, que son segmentos grandes de ADN genómico u oligonucleótidos especialmente diseñados, se usan para identificar cambios o un sitio cromosómico conocido. La principal ventaja de una aCGH es su capacidad para detectar cambios en las copias del ADN en loci múltiples en un solo ensayo a una resolución mucho mayor que la de la CGH convencional. Dependiendo de su diseño, las micromatrices para aCGH ofrecen distintas ventajas sobre los análisis citogenéticos convencionales tales como cariotipificación e hibridación fluorescente in situ (FISH), debido a que tienen el potencial de detectar la mayoría de las anormalidades cromosómicas microscópicas y submicroscópicas. En comparación con la aCGH, las técnicas citogenéticas convencionales presentan un bajo rendimiento, requieren mucho trabajo y, a menudo, personal especialmente capacitado para llevar a cabo las pruebas de forma uniforme. Las micromatrices para aCGH también son útiles para la detección de cáncer, a través del seguimiento de los loci de oncogenes y de genes supresores de tumores. MICROMATRICES PARA SNP Las micromatrices para SNP identifican la presencia de polimorfismos de una secuencia conocida mediante el análisis del patrón de hibridación con una serie de sondas que son específicamente complementarias para las secuencias mutantes o salva-
1532 (1128) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos/ Información General
USP 39
jes. Las micromatrices para SNP se pueden usar para identificar una enfermedad en un individuo cuando se conoce el SNP o el conjunto de SNP asociados con la enfermedad en particular. Las micromatrices para SNP son una herramienta eficiente y económica para el estudio simultáneo de múltiples variaciones genéticas en múltiples muestras.
Diseño de Micromatrices Las siguientes secciones analizan el diseño de los tres tipos de micromatrices descritas anteriormente, así como la aptitud de los materiales usados para las sondas de las micromatrices para cada uno de los tres tipos. MICROMATRICES DE EXPRESIÓN GÉNICA Estas micromatrices representan el tipo de micromatriz más común usado en la actualidad. Los elementos de la micromatriz constan de ADNc derivado de ARNm de genes conocidos pero con secuencia desconocida, o de oligonucleótidos para los que se cuenta con información detallada sobre sus secuencias. Los oligonucleótidos son los elementos de la micromatriz preferidos debido al bajo costo de síntesis y a la gran cantidad de información secuencial disponible hoy en día para genes y fragmentos de genes específicos. Además, se pueden disponer en patrones específicos para permitir el análisis exacto de secuencias de genes y de familias de genes relacionados en un solo ensayo de hibridación. Los siguientes principios generales se aplican al diseño de oligonucleótidos para micromatrices de expresión génica: (1) Los oligonucleótidos deben ser de 25-70 mers. (2) Asimismo, se deben incluir oligonucleótidos control apropiados (es decir, oligonucleótidos que correspondan a secuencias procedentes de un organismo diferente). (3) Debe ser posible mapear todos los oligonucleótidos dentro de los 1000 nucleótidos del extremo 3' de los ADNc y deben corresponder a la cadena codificante. (4) Se deben evitar secuencias repetidas, alargamiento de poliA, G, C y T y extremos de Tms. (5) Resulta necesario comparar los oligonucleótidos con secuencias existentes en bases de datos para evitar reactividad cruzada (se prefiere menos del 70% de identidad de la secuencia con secuencias no diana). Además de los oligonucleótidos, también se usan como sondas los amplicones de la PCR y el ADN de doble cadena (ADNdc). No obstante, los amplicones de la PCR requieren purificación para eliminar enzimas, sales, nucleótidos y demás contaminantes del proceso de amplificación que pudieran interferir con la unión de las sondas y que pudieran además inhibir la hibridación. Asimismo, la preparación de sondas de ADNdc para ser colocadas sobre un soporte (spotting) es una labor intensa y costosa, además de que las sondas de ADNdc pueden tener secuencias repetitivas que comprometen la especificidad de la hibridación. Cuando no se cuenta con información sobre las secuencias, el ADNdc es la opción preferida, debido a que las sondas de ADNdc desconocidas aún pueden usarse para el estudio de la expresión génica. MICROMATRICES PARA ACGH Estas micromatrices generalmente emplean cromosomas artificiales bacterianos (BAC, por sus siglas en inglés), de 1 00-200 mil pares de bases por segmento de ADN, como elementos de la micromatriz. Sin embargo, los aislamientos de ADN a gran escala o las amplificaciones por PCR de tales clones de gran tamaño son laboriosos y requieren mucho tiempo. Es el caso de las aplicaciones para determinar perfiles de expresión, donde las micromatrices para aCGH usan dianas de oligonucleótidos en lugar de dianas de ADNdc. En la actualidad, se pueden comprar colecciones de oligonucleótidos o micromatrices prefabricadas, con lo que se ahorra considerable tiempo y esfuerzo. MICROMATRICES PARA SNP Las micromatrices para SNP pueden, dependiendo de su aplicación, utilizar como sondas tanto amplicones como oligonucleótidos. En uno de los formatos más comunes para detectar mutaciones en una secuencia génica, la sonda contiene una secuencia que difiere en un sólo nucleótido de las demás en la matriz. Para la discriminación por un solo apareamiento incorrecto, las sondas cortas de oligonucleótido (15-30 pares de bases) maximizan la desestabilización ocasionada por el apareamiento incorrecto y, por lo tanto, se usan para la detección de SNP.
Fabricación de Micromatrices Los elementos de la micromatriz se depositan sobre un soporte sólido; el vidrio es el soporte más usado. La fabricación de micromatrices se puede dividir en dos categorías principales, síntesis directa de las sondas sobre la micromatriz (in situ) o síntesis de las sondas antes de colocarlas sobre la micromatriz (ex situ). La síntesis in situ se usa por lo general para micromatrices de mayor densidad, pero se limita a nucleótidos de aproximadamente 25-100 bases. A medida que se incrementa la longitud del nucleótido, aumenta la probabilidad de productos truncados debido a la estabilidad limitada de la construcción de oligonucleótidos in situ. Por el contrario, la fabricación de micromatrices ex situ puede transformar cualquier material prefabricado
USP 39
Información General/ (1128) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos 1533
en un formato de micromatriz, incluidos los oligonucleótidos, productos de la PCR (amplicones), ADN complementario (ADNc) y BAC. Las principales técnicas para la síntesis in situ son la fotolitografía, litografía sin máscara y la tecnología de "impresión a chorro" (inkjet). Aunque las micromatrices por lo general se fabrican a escala comercial, para el caso de un pequeño número de micromatrices de baja densidad, el usuario final puede fabricar las micromatrices usando un instrumento robótico de bajo rendimiento (personal microarrayer). Sin embargo, únicamente la litografía sin máscara y la tecnología de "impresión a chorro" están disponibles para ser usadas por los usuarios finales en la fabricación. Para sintetizar los oligonucleótidos sobre el sustrato, se emplea la fotolitografía, que requiere un sustrato de vidrio que contiene una fotomáscara preparada químicamente, de modo que determinados nucleótidos se unan a posiciones específicas. Las máscaras determinan previamente los nucleótidos que se activarán cuando estén cubiertos con uno de los cuatro tipos de nucleótidos. El proceso se repite hasta sintetizar el número de bases requerido. La fabricación de estas micromatrices emplea algoritmos generados por computadora y múltiples aplicaciones puntuales (spots) para abarcar el gen de interés. La litografía sin máscara emplea un dispositivo digital de microespejos que utiliza un arreglo en estado sólido de espejos de aluminio en miniatura para crear máscaras virtuales que reemplazan a las fotomáscaras físicas. Una computadora controla el patrón deseado de luz UV a través de espejos individuales. Los microespejos controlados digitalmente, a su vez, controlan el patrón de luz UV proyectada sobre el vidrio en la cámara de reacción, la cual está acoplada a un sintetizador de ADN. La luz UV rompe selectivamente un grupo protector lábil a la luz UV ubicado precisamente donde se acoplará el próximo nucleótido. Los patrones se coordinan con la síntesis química del ADN de manera paralela y combinatoria, de modo que puedan sintetizarse cientos de miles de oligonucleótidos únicos en una sola micromatriz. En la tecnología de "impresión a chorro" los nucleótidos se construyen, base por base, en capas de impresión repetitivas usando la típica reacción química de la fosforamidita. Las cabezas de "impresión a chorro", similares a las usadas en las impresoras de chorro de tinta, se conectan con frascos que contienen los cuatro distintos nucleótidos de fosforamidita que se ensamblan como bloques de construcción en la síntesis de ácidos nucleicos in situ. Las ventajas de la "impresión a chorro" y la litografía sin máscara son la flexibilidad de diseño y la capacidad para fabricar pequeñas partidas de micromatrices rápidamente. Los dos tipos principales de técnicas de fabricación ex situ son la micropuntuación (impresión por contacto) y la impresión piezoeléctrica (impresión sin contacto). La tecnología se destaca por imprimir múltiples sondas una gran cantidad de veces sobre numerosas superficies con la carga de un pequeño volumen de sonda. El tamaño de la puntuación y el volumen de entrega se controlan por medio del tamaño de las terminaciones de las puntas, de las que se disponen muchos tamaños. Un mecanismo de impresión piezoeléctrica emplea un pequeño cristal dieléctrico que está en contacto con un capilar de vidrio que contiene la muestra líquida. La aplicación de voltaje produce la expulsión del líquido desde la punta, generándose gotas con volúmenes que varían desde cientos de picolitros hasta varios microlitros.
Consideraciones Experimentales Generales Todos los experimentos con micromatrices, independientemente del tipo y de la aplicación, se realizan en una secuencia de etapas similares: amplificación, marcación, hibridación y lavado, seguidas por barrido, cuantificación e informe. El diseño experimental determina el tipo de micromatriz usada, el número de puntos requeridos y los conjuntos específicos de ácidos nucleicos sobre la micromatriz. El diseño experimental también influye sobre la plataforma usada, por ejemplo, el número de puntos, tipo de superficie, tipo de ácido nucleico, rendimiento, resolución y número de colores que se pueden detectar en un solo ensayo. Las plataformas pueden ser abiertas (el soporte está disponible a través de varios proveedores) o cerradas (el soporte está disponible a través de un solo proveedor). En general, los diseños experimentales que requieren micropuntuaciones de alta densidad y los utilizados para ensayos cuantitativos son más difíciles de implementar y más caros que los ensayos cualitativos.
Consideraciones de la Muestra para Micromatrices Es necesario seleccionar cuidadosamente la extracción, aislamiento y preparación de la muestra para no alterar su capacidad de hibridizarse sobre la micromatriz. En general, las dificultades para la preparación de la muestra para las micromatrices son las mismas que para otras técnicas de laboratorio tales como PCR cuantitativa y secuenciación (descritas en los capítulos (1126) y (1127)). Algunos de los tipos de muestras analizados con micromatrices están constituidos por ARN, ADNc, ADN genómico y productos de PCR. Para algunas aplicaciones de genotipificación, se emplean alelos específicos como elementos de la micromatriz y como dianas. Al igual que con cualquier técnica de ácidos nucleicos, la calidad del ácido nucleico es crítica para el experimento con micromatrices. El ácido nucleico debe ser puro, además de estar intacto y cuantificado con exactitud antes de su uso (1126). En particular, la presencia de ADN contaminante en muestras de ARN total puede ocasionar problemas durante el análisis por micromatrices, debido a que algunos métodos de marcación marcan el ARN y el ADN con la misma eficiencia. El tratamiento previo con ADNasa o ARNasa puede ser necesario para aquellas aplicaciones que pudieran resultar afectadas por trazas de ARN o ADN contaminantes. Por ejemplo, el ADN contaminante marcado se podría hibridizar con sondas de la micromatriz, generando señales de hibridación elevadas no provenientes de transcriptos de ARN, provocando así una estimación inexacta de la concentración de ARN diana por cuantificar ambas especies de ácidos nucleicos a la misma longitud de onda. Un aspecto de gran importancia a tener en cuenta para cualquier experimento con micromatrices es la disponibilidad de cantidades suficientes de ácido nucleico en las muestras. Por ejemplo, una muestra obtenida mediante captura por microdisec-
1534 (1128) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos/ Información General
USP 39
ción láser, biopsias de tejidos con aguja u otras muestras clínicas pequeñas no producen suficiente ARN (para micromatrices de expresión) ni ADN (para micromatrices para aCGH), por lo que se deben amplificar antes del análisis. Resulta crítico diseñar los procedimientos de amplificación de ARNm de tal manera que la mezcla final de amplicones refleje con exactitud la distribución de las especies de ARNm en la muestra. La amplificación uniforme de ADN genómico para las micromatrices para aCGH se puede lograr mediante el uso de amplificación por desplazamiento múltiple (MOA, por sus siglas en inglés), procedimiento que permite evitar la amplificación no uniforme de ADN genómico que se presenta en los métodos de amplificación basados en PCR, que emplean PCR con cebador oligonucleótido degenerado (DOP-PCR). En el caso de las micromatrices para SNP en las que las dianas de interés son alelos específicos, la amplificación no uniforme no representa un problema y las muestras se pueden amplificar (y marcar) usando PCR, PCR multiplex y amplificación del genoma completo (ver (1127)).
Marcación de Micromatrices Las dianas para micromatrices, son una población de ácidos nucleicos que se extraen de una muestra y que se marcan de manera apropiada. Se pueden usar muchos métodos para la marcación de las dianas (ver (1127)), pero la marcación con fluorescencia es el más usado debido a que ofrece una alta sensibilidad y un intervalo más amplio. Una ventaja adicional es la capacidad de detectar dos o más señales en un solo experimento. El método de marcación depende del tipo de micromatriz. En el capítulo (1127/ se describe la marcación directa e indirecta como los dos métodos usados para la marcación fluorescente de las dianas para micromatrices de expresión génica. En general la marcación indirecta, donde la etiqueta se agrega mediante un conector (linker), requiere menos material de partida y es menos costosa. En la literatura se describe que este método produce resultados similares a los obtenidos a partir de muestras marcadas directamente. En las micromatrices para aCGH , el ADN del paciente y el ADN de referencia (300-1000 ng) por lo general se marcan con colorantes fluorescentes rojos y verdes, respectivamente, usando a menudo un protocolo de cebado aleatorio. La marcación con cebador aleatorio emplea una alta concentración de enzima de Klenow, mediante lo cual el ADN genómico se digiere con enzimas de restricción y se hibridiza con cebadores aleatorios. Los cebadores se extienden mediante la actividad de la 5'-3' polimerasa de Klenow, lo que resulta en una actividad de desplazamiento de cadena con la incorporación directa de los nucleótidos marcados. Las micromatrices para SNP que emplean oligonucleótidos como elementos de la micromatriz se marcan usando nucleótidos marcados con fluorescencia tanto en reacciones de PCR individuales como en las PCR multiplex, seguidas de una etapa de purificación para eliminar los colorantes no incorporados. Cuando se usan amplicones como elementos de la micromatriz, las sondas de oligonucleótidos marcados se sintetizan usando la reacción química de fosforamidita.
Hibridación y Lavado La hibridación se debe llevar a cabo en condiciones que minimicen el apareamiento (annealing) de fragmentos no complementarios. Los pasos de lavado posteriores a la reacción de hibridación se optimizan para ofrecer la mejor especificidad, la relación señal-ruido más alta y la máxima reproducibilidad posibles (ver (1126)). Antes de la hibridación, es necesario desnaturalizar las sondas y dianas de doble cadena y bloquear los sitios no específicos. La composición química de la superficie de las micromatrices está diseñada para capturar todos los ácidos nucleicos con una alta eficiencia, por lo que se deben bloquear o inactivar los grupos de unión libres en la superficie para evitar la unión no específica de material marcado que pudiera comprometer la relación señal-ruido. Las superficies se bloquean y lavan con varias soluciones amortiguadoras acuosas que por lo general incluyen sales, detergentes y agentes de bloqueo tales como proteínas hidrolizadas de bajo peso molecular. El propósito de los lavados posteriores a la hibridación es eliminar de la superficie y de las sondas todas las etiquetas no acopladas y las unidas en forma inespecífica. En general, los lavados manuales y automatizados se llevan a cabo en soluciones amortiguadoras de solución salina de citrato de sodio/dodecil sulfato de sodio (SSC/SDS) de diversas concentraciones y a distintas temperaturas elevadas, dependiendo de la intensidad requerida. Después de la etapa final de lavado, las micromatrices que usan dianas fluorescentes se secan inmediatamente mediante centrifugación o en una corriente de nitrógeno. Es indispensable almacenar las micromatrices hibridizadas en la oscuridad y barrerlas lo antes posible. Algunos colorantes fluorescentes usados en los análisis por micromatrices se pueden degradar por el ozono ambiental; en estos casos, los niveles de ozono en el ambiente experimental deben ser inferiores a 5 ppb (0,005 ppm). Se fabrican campanas especializadas exentas de ozono para proteger a los colorantes de la micromatriz.
Detección en Micromatrices Independientemente del tipo de micromatriz cada punto en una micromatriz representa una secuencia de sonda única a la que se une una sola diana marcada, y esta unión específica permite la detección y cuantificación de la diana. Esto se realiza mediante la detección de la luz emitida a una longitud de onda particular por los dúplex marcados fluorescentemente cuando la micromatriz se expone a una luz de longitud de onda específica para excitación. La luz fluorescente emitida es convertida en energía eléctrica por un detector. El detector puede ser un tubo fotomultiplicador o un dispositivo de carga acoplada con pasos ópticos especialmente diseñados para recolectar datos crudos de la micromatriz (barrido). Los filtros del detector y los pasos ópticos se diseñan para detectar colorantes fluorescentes específicos a una resolución suficiente, al mismo tiempo que eliminan la superposición entre los espectros (crosstalk) cuando se usan dos o más colorantes en una sola micromatriz. La señal
USP 39
Información General/ (1128) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos 1535
resultante es proporcional al número de fotones emitidos por la micromatriz. Estas señales se usan para crear una imagen digitalizada que muestra la presencia y cuantificación de dianas específicas. Las muestras se pueden barrer desde un único canal de longitud de onda o secuencialmente desde dos canales. Por ejemplo, para micromatrices con plataformas de un solo canal, la muestra se marca generalmente con un fluoróforo que emite una señal en el canal rojo. Para un formato de micromatrices de doble canal, se puede marcar una segunda muestra con un colorante que emita en el canal verde. La marcación doble se usa en algunos diseños experimentales, tales como micromatrices de expresión, a fin de medir la sobre expresión de un gen asociado con una enfermedad. En dichos experimentos, los ADNc derivados del ARNm de tejidos normales o enfermos se marcan de forma distinta, se mezclan y se analizan en la misma laminilla en una reacción de hibridación competitiva. Las relaciones resultantes de los dos colores reflejan la relativa abundancia del material marcado dentro de cada muestra. De manera similar, el cálculo de las relaciones de fluorescencia de cada diana en una micromatriz para aCGH permite el mapeo de ganancias y pérdidas para un cromosoma de interés.
Procesamiento de Imágenes de Micromatrices La mayoría de los escáners detectan y adquieren uno, dos o más colores (mediante uno, dos o más canales). El paso óptico del sistema minimiza la superposición entre los espectros (crosstalk) y permite la adquisición de dos imágenes espectralmente separadas. En muchas ocasiones, las imágenes se representan como una imagen roja y una verde. Cuando se emplean dos colores, la relación entre las dos imágenes fluorescentes elimina artefactos ocasionados por irregularidades regionales y el tamaño desparejo de los puntos. Si se emplea sólo un color, las señales fluorescentes de dos o más micromatrices se deben normalizar para poder compararlas entre sí. Los diámetros de los puntos impresos sobre las micromatrices varían desde 1 O µm hasta casi 1000 µm, y la resolución de los escáners varía desde 1 µm hasta 50 µm. En consecuencia, al barrer completamente una micromatriz se pueden obtener cantidades variables de datos-píxeles dependiendo de la resolución del escáner.
ANÁLISIS DE IMÁGENES DE MICROMATRICES El análisis de las imágenes barridas generalmente implica tres pasos: localización de los puntos o grillado, segmentación de la imagen y cuantificación de puntos. Inicialmente se asignan coordenadas específicas a los puntos. El proceso de localización de puntos o grillado puede ser manual o totalmente automático, dependiendo del software de procesamiento de imágenes usado. Se tiene en cuenta el tamaño individual y la forma de cada punto y se realizan ajustes para aquellas filas y columnas no uniformes producidas durante el proceso de impresión. El proceso de segmentación particiona la imagen completa dividiendo los píxeles entre píxeles resaltados y píxeles de fondo basándose en la intensidad y las propiedades espaciales de cada píxel. Existen cuatro tipos principales de segmentación de señales que se han empleado para las matrices de puntuación. El método más simple es la segmentación espacial que coloca dos círculos (uno interno y otro externo), de tamaños fijos pero diferentes, sobre cada punto para distinguir la señal de la sonda de la señal de fondo aledaña. Por una parte, debido a la irregularidad de los tamaños de los puntos en algunas micromatrices el área real del círculo interno puede ser mayor que el diámetro del punto y, por lo tanto, contener píxeles correspondientes al fondo. Por la otra parte, se pueden detectar artefactos y señales en el área entre el círculo interno y externo contribuyendo a la señal de fondo. El segundo método, la segmentación basada en la intensidad, distingue los píxeles-señales de los píxeles de fondo, de acuerdo con las intensidades de los puntos dentro de una región predeterminada. En este caso, se puede clasificar un determinado porcentaje de píxeles dentro de las intensidades más altas, como píxeles-señales. Las ventajas de este método son la simplicidad y la velocidad, pero el inconveniente es la incapacidad para distinguir entre artefactos y señales y su tendencia a detectar señales bajas pertenecientes al fondo. El tercer método es un enfoque estadístico conocido como segmentación Mann-Whitney que combina información de los análisis espaciales y los basados en la intensidad. En este método, los píxeles de fondo localizados fuera del círculo interno se usan para determinar un nivel de umbral de intensidad para una señal dentro del círculo interno. La limitación de este método recae en que su exactitud puede verse disminuida por una gran cantidad de artefactos e irregularidades de los puntos. El cuarto método, el método de segmentación de medida limitada, también combina información espacial con información de intensidad, y mide las distribuciones de las señales dentro y fuera del círculo interno. El método elimina los extremos superior e inferior de cada distribución para excluir los artefactos y los píxeles-señales incorrectamente localizados en el fondo. La hipótesis principal de la cuantificación de puntos consiste en que la intensidad total de fluorescencia de un punto es proporcional al nivel de expresión del transcripto marcado. Esto depende en gran medida de una variedad de factores, que incluyen la preparación de la diana, las condiciones de hibridación y la detección de la señal dentro del intervalo dinámico lineal. Si la cantidad de sonda depositada durante el procedimiento de fabricación de la micromatriz varía de punto a punto y de matriz a matriz, lo cual generaría puntos de diferentes tamaños, entonces la suma o la intensidad total de las señales puede ser variable e inexacta. Para corregir tal variación, la aplicación puntual de las sondas en las micromatrices se debe realizarr usando una química de superficie homogénea que tenga capacidad de unión fija, lo que asegura que cada puntuacón contenga la misma cantidad de sonda. Alternativamente, los puntos se pueden cuantificar tomando la media, la mediana, o la moda de las intensidades de todos los píxeles-señales que se encuentran en la señal de medida. Los métodos más robustos que protegen contra señales aberrantes son la media limitada (trimmed mean) (en el que un porcentaje determinado de señales más altas y más bajas se descartan antes de calcular la media) y la mediana de las intensidades de las señales. Cuando se emplean dos fluorófo-
1536 (1128) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos/ Información General
USP 39
ros diferentes, se puede usar la relación de intensidad para realizar la corrección por cantidades de sonda variables y se puede calcular a partir de la media, de la mediana y de la moda de las intensidades de cada canal.
ANÁLISIS DE DATOS DE MICROMATRICES Los formatos de micromatrices particularmente densos que contienen desde decenas de miles hasta millones de sondas por chip o laminilla generan un gran volumen de datos brutos por micromatriz, lo cual requiere el uso de un software de análisis de datos especializado. Los programas para micromatrices están diseñados para extraer datos primarios, normalizar los datos para eliminar la influencia de variaciones experimentales y vincular las sondas a los genes y dianas derivados de secuencias pertinentes. Los programas también están disponibles para aplicar métodos estadísticos, analizar, desplegar visualmente y manipular datos para extraer información biológica significativa. Las partes principales del análisis de datos son la normalización, la corrección del fondo y el cálculo de la relación. La normalización se emplea para ajustar sistemáticamente los datos sin procesar de la micromatriz en un esfuerzo por reducir la variabilidad generada por las diferencias en la fabricación y procesamiento de las micromatrices y por las variables técnicas, de modo que se puedan detectar las verdaderas diferencias biológicas entre las muestras. La gran variedad de métodos de normalización impide un análisis detallado del tema en este capítulo y, en la actualidad, no existen estándares para normalización. Los algoritmos usados comúnmente se seleccionan basándose en el tipo de micromatriz, en el número de fluoróforos usados y en las muestras que se están analizando. Algunos métodos están incorporados en el software del fabricante, pero otros están disponibles a través de fuentes comerciales o proveedores de software de código abierto. La corrección del ruido de fondo elimina los bajos niveles de ruido inherentes a los instrumentos de detección y a la química de superficie usada en la fabricación. Algunos contaminantes introducidos durante el procesamiento de la micromatriz pueden ocasionar altos niveles de ruido de fondo que deben corregirse antes de analizar los datos. En las micromatrices de dos colores, la relación entre las intensidades de la señal de los elementos de la micromatriz de dos muestras cohibridizadas se usa como medida relativa de la expresión génica. En sistemas de un solo canal, la relación se puede calcular entre señales tomadas de dos muestras diferentes hibridizadas en micromatrices individuales, una de las cuales se toma como muestra de referencia. Por consiguiente, los datos resultantes de las micromatrices no representan una cuantificación absoluta, sino un nivel relativo de ARN o de ADN contra una muestra de referencia o un control .
Control de Calidad y Garantía de Calidad Al igual que con cualquier ensayo de diagnóstico, el control de calidad y la garantía de calidad tienen una importancia crítica. Las micromatrices deben demostrar robustez y reproducibilidad. Los pasos generales para el control y garantía de calidad descritos en el capítulo (1127) para ácidos nucleicos y NAT también se aplican a las micromatrices. A diferencia de otras pruebas de diagnóstico, en la actualidad no se cuenta con reactivos de referencia para el control de calidad de las micromatrices, y las pautas reglamentarias se encuentran en desarrollo. La FDA ha emitido una serie de guías preeliminares tituladas "In Vitro Diagnostic Multivariate lndex Assays" (Análisis de Índice Multivariado de Diagnóstico In Vitro), las cuales tratan la definición y el estado reglamentario de una clase de dispositivos de diagnóstico in vitro a los que se refiere como análisis de índice multivariado de diagnóstico in vitro (IVDMIA, por sus siglas en inglés), y las micromatrices caen dentro de esta categoría. La guía trata sobre la secuencia de etapas previas a la comercialización y los requisitos posteriores a la comercialización relacionados con los IVDMIA. Diversas fuentes no intencionales de variabilidad que son específicas de las micromatrices pueden afectar de gran manera las intensidades de las señales y la derivación exacta de una señal verdadera que refleje con exactitud el transcripto marcado. Una de las principales fuentes de variabilidad es la calidad de los puntos. Las mediciones de la calidad de los puntos en la etapa de procesamiento permite la eliminación de puntos con calidad deficiente o cuestionable. Otras fuentes de variabilidad son los artefactos, por ejemplo, desplazamientos regionales (elevaciones o caídas) en la señal general de la micromatriz que se pueden observar dentro de un chip individual o en datos compuestos derivados de múltiples chips. Estos cambios se pueden diferenciar de la variabilidad real debido a que no son aleatorios, y los patrones se pueden detectar visualizando las señales sobre el área completa del chip. Cuando se usan colorantes con propiedades espectrales distintas para marcar dos muestras diferentes en una reacción de hibridación competitiva usando una sola matriz, se pueden presentar diferencias debido a desviaciones inherentes a la marcación y no tanto por el nivel de expresión génica. Por ejemplo, el canal verde puede parecer uniformemente más brillante que el canal rojo, a pesar de que no existan diferencias reales en la expresión. La hibridación con colorantes reversos puede asegurar la detección y eliminación de los efectos de las desviaciones debidas a los colorantes. De igual manera que con cualquier ensayo cuantitativo para ARN, la integridad de la muestra afecta su medición y la calidad de la muestra es un determinante importante para la exactitud. Por ejemplo, debido a que la marcación se dirige desde el extremo 3' al 5' pero el ARN se degrada a partir del extremo 5', el ARN degradado conduce a altas relaciones 3'/5', lo que resulta en una marcación no uniforme de todo el transcripto. Por último, se puede introducir variabilidad durante el procesamiento de las micromatrices, un procedimiento relativamente complejo que implica múltiples pasos tales como marcación, hibridación, lavado y tinción (variables técnicas). Dicha variabilidad puede enmascarar las verdaderas diferencias en las muestras analizadas. Cuando se usan como prueba de diagnóstico, las micromatrices deben demostrar robustez, reproducibilidad, un alto grado de correlación con el formato orginal y confiabilidad de la predicción pronóstica. En circunstancias ideales, las micromatrices deben contener al menos 2-3 puntos repetidos por cada gen informante para asegurar la reproducibilidad intraensayo. Con
USP 39
Información General/ (1129) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos 1537
micromatrices de dos canales, se puede hibridizar una combinacón de muestras de referencia en el canal de fluorescencia complementario para que los datos puedan expresarse como logaritmos de cocientes, con lo cual se reduce la necesidad de una normalización extensiva. La reproducibilidad interensayo de los resultados de las pruebas y la estabilidad con el paso del tiempo se pueden rastrear usando una variedad de muestras de referencia que, cuando se marcan e hibridizan, representan un espectro de puntos finales predictivos (por ejemplo, riesgo alto, no conclusivo o bajo) y que deben caer dentro de un intervalo predeterminado de resultados. Cualquier falla en estos controles debería resultar en el rechazo de los resultados de las muestras en la misma corrida. Si el ensayo se realiza en un gran número de sitios, la reproducibilidad entre sitios es obligatoria y se debe evaluar. Asimismo, se debe determinar la reproducibilidad del ensayo con respecto a la extracción del tejido, y se debe especificar de manera clara la calidad de las muestras de tejido o ARN (por ejemplo, porcentaje de células tumorales dentro de la muestra). En conclusión, los experimentos con micromatrices deben diseñarse y llevarse a cabo cuidadosamente para minimizar la variabilidad y producir datos que se relacionen de manera exacta con las muestras analizadas. Además, se deberían analizar y verificar los marcadores biológicos de interés, usando una plataforma alternativa tal como qRT-PCR, la cual debería demostrar que estos biomarcadores se pueden detectar de manera reproducible tanto en la misma muestra como en otras diferentes. El desarrollo de estándares de referencia, en especial cuando se usan micromatrices como pruebas de diagnóstico, es el siguiente paso para asegurar la calidad y la validación de los resultados obtenidos con micromatrices. Con el advenimiento de las micromatrices comerciales en reemplazo de las micromatrices personalizadas, se han solucionado ampliamente las cuestiones relacionadas con la reproducibilidad, la estandarización y el control de calidad a través de los rigurosos controles de calidad usados en la fabricación comercial.
(1129) TÉCNICAS BASADAS EN ÁCIDOS NUCLEICOSGENOTIPIFICACIÓN INTRODUCCIÓN Este capítulo trata sobre las técnicas para detectar diferencias de una sola base en el ADN y otros tipos de secuencias polimórficas del ADN que ocurren en los tres mil millones de bases que constituyen el genoma humano. La variación genética más común es el polimorfismo de un solo nucleótido (SNP, por sus siglas en inglés), que es un simple cambio en una base de la secuencia génica. Los SNP ocurren en promedio cada 1000 bases y constituyen una gran proporción de la variabilidad interindividual. Los SNP pueden predisponer a los individuos a enfermedades o influir en su respuesta a un medicamento. Se han identificado aproximadamente 1,8 millones de loci para SNP en humanos y probablemente se descubran más en los próximos años. 1 Los enfoques comunes para detectar SNP y otros tipos de secuencias polimórficas del ADN se describen en las siguientes secciones. Estos enfoques abarcan una gran variedad de técnicas, como las de tecnología de amplificación de ácidos nucleicos (NAT, por sus siglas en inglés), NAT en tiempo real y micromatrices (microarrays), cuyos principios se tratan en más detalle en los capítulos relacionados. Este capítulo se concentra en las modificaciones específicas de las técnicas que son necesarias para permitir la detección de diferencias de una sola base.
TECNOLOGÍAS DE GENOTIPIFICACIÓN DE SNP Aunque la utilidad del estudio de SNP para mapeo de genes y estudios de asociación de enfermedades es evidente, no se ha adoptado un único procedimiento estandarizado para la genotipificación de SNP. Se han desarrollado diversos métodos para efectuar la genotipificación de SNP, que satisfacen una amplia gama de necesidades, incluyendo la capacidad de procesamiento, facilidad de diseño del ensayo, exactitud y confiabilidad. Los procedimientos disponibles también se pueden clasificar en dos grupos: aquellos que se basan en la identificación de SNP conocidos y los que se pueden usar para detectar SNP desconocidos. Con el fin de identificar el procedimiento más apropiado para la genotipificación de SNP para una aplicación específica, se deben determinar los requisitos de capacidad de procesamiento en términos del número de SNP a analizar por muestra (nivel de multiplexación), y la capacidad de procesamiento en función de la cantidad de muestras a procesar, porque diversos enfoques podrían funcionar mejor dependiendo de estos requisitos. La mayoría de los procedimientos para la genotipificación de SNP dependen de la amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) de las regiones genómicas que abarcan los SNP, seguida por la reacción de genotipificación. La PCR proporciona la sensibilidad y especificidad requeridas para distinguir entre genotipos heterocigóticos y homocigóticos en genomas grandes y complejos. La dificultad de diseñar y efectuar las reacciones de PCR multiplex limita la capacidad de procesamiento de muchos de los ensayos actuales para genotipificación de SNP. Las siguientes secciones destacan 1 La Database of Single Nucleotide Polymorphism (db SNP) Versión 128 se consigue en el National Center for Biotechnology lnformation (NCBI), http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/index.html.
1538 (1129) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos/ Información General
USP 39
varios de los enfoques principales que se usan actualmente para la genotipificación de SNP. En muchos casos, la tecnología subyacente puede modificarse para que cumpla con los requisitos de la aplicación específica, en términos de la capacidad de procesamiento de muestras y número de SNP detectados. En general, los procedimientos basados en PCR en tiempo real son más adecuados para procesar un gran número de muestras y los procedimientos basados en matrices son más apropiados para la detección simultánea de muchos SNP. También están surgiendo tecnologías más novedosas, basadas en formatos de matrices multiplex (multiplexed arrays), que serán apropiadas para aplicaciones en las que se requiera procesar un gran número de muestras y muchos SNP.
Secuenciación La secuenciación es el procedimiento definitivo para analizar el ADN y su uso para la detección de SNP permite la identificación inequívoca de los cambios de bases (ver la secuenciación de ácido nucleico en Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Extracción, Detección y Secuenciación (1126)). La tecnología estándar es costosa y el procedimiento toma tiempo, requiere mucha mano de obra y tiene baja capacidad de procesamiento de muestras. La secuenciación es una herramienta confirmatoria útil y tiene aplicación en situaciones donde otras tecnologías no son apropiadas, pero no es la solución más económica para la mayoría de aplicaciones de genotipificación de SNP que requieren la identificación de sólo una o unas pocas bases.
Análisis del Polimorfismo de la Longitud del Fragmento de Restricción El primer procedimiento más ampliamente usado para la detección de polimorfismos aprovechaba las alteraciones en los sitios de restricción enzimática ocasionados por los SNP, que llevan a la ganancia o pérdida de eventos de corte. El análisis del polimorfismo de la longitud de fragmentos de restricción (RFLP, por sus siglas en inglés) por PCR comprende la amplificación con PCR de un fragmento de interés y la subsiguiente digestión con una enzima de restricción. Los fragmentos producidos se analizan, generalmente con un procedimiento de fraccionamiento por tamaño, usualmente electroforesis en gel. Debido a su simplicidad, el procedimiento se ha usado extensamente y aún se sigue usando, aunque conlleva ciertas limitaciones: sólo el subconjunto de polimorfismos que residen en un sitio de restricción de una endonucleasa se puede estudiar con el procedimiento convencional; la digestión incompleta debido a un procesamiento subóptimo puede producir patrones de digestión engañosos; y el procedimiento es más complicado de automatizar que otros procedimientos usados para la genotipificación de SNP.
Hibridación con Sonda Muchos procedimientos de genotipificación de SNP se basan en hibridaciones del ADN, aprovechando el hecho de que una sonda de ADN forma una unión más fuerte con una diana o blanco complementario con el que puede aparearse perfectamente, que la unión con un blanco que contiene una base con la que no se aparea correctamente. La habilidad de la hibridación con oligonucleótidos alelo-específicos (ASO, por sus siglas en inglés) para detectar un apareamiento incorrecto (mismatch) de una sola base se demostró por primera vez a fines de los años 70 y se ha usado desde entonces para detectar la mutación de drepanocitos en el gen de la beta-globina mediante una hibridación por transferencia de Southern. La invención de la PCR facilitó el desarrollo posterior de ensayos basados en sondas para la genotipificación de SNP en genomas complejos. La estabilidad térmica de un híbrido entre una sonda ASO y su secuencia blanco que contiene SNP no solo se determina por la rigurosidad de las condiciones de la reacción sino también por la estructura secundaria de la secuencia blanco y de la secuencia de nucleótidos que flanquean el SNP. Por lo tanto, resulta difícil predecir a priori las condiciones de la reacción o de la secuencia de la sonda ASO que permitirá la discriminación óptima entre dos alelos, usando hibridación ASO. Estos parámetros se deben establecer empíricamente y por separado para cada SNP. Por consiguiente, no existe un solo conjunto de condiciones de reacción que sean óptimas para la genotipificación de todos los SNP, lo cual dificulta extremadamente el diseño de ensayos multiplex basados en hibridación con sondas ASO. Un enfoque para contrarrestar el problema del diseño del ensayo consiste en efectuar reacciones multiplex de hibridación ASO sobre matrices que contengan sondas múltiples para cada SNP que se va a analizar. Esto implica el uso de conjuntos de sondas en las cuales el SNP ocurra en posiciones diferentes a lo largo de las sondas. Cuando se usan matrices de alta densidad que pueden llevar hasta 1Q6 sondas por cm2 se hace posible incluir grandes cantidades de sondas ASO por SNP. Otro enfoque consiste en usar análogos de bases como ácido nucleico bloqueado (LNA, por sus siglas en inglés), según se describe en detalle en Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Amplificación (1127). Para aplicaciones que involucran pocos SNP pero muchas muestras, se han desarrollado métodos homogéneos de PCR en tiempo real. Estos incluyen el uso de sondas fluorescentes, tales como sondas de hidrólisis, sondas tallo-bucle y sondas de hibridación que usan fluorescencia por transferencia de energía resonante (FRET, por sus siglas en inglés). El principio de estos ensayos se discute en más detalle en Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Amplificación (1127). La base de muchos ensayos para la detección de SNP consiste en la unión selectiva de la sonda ASO y de su secuencia blanco perfectamente apareada, lo que lleva a la transferencia de energía y a la generación de una señal fluorescente. Las sondas diseñadas con estructuras secundarias específicas tienden a formar una estructura tallo-bucle que desestabiliza los híbridos apareados incorrectamente, lo cual incrementa su poder para distinguir alelos, comparado con las sondas lineales ASO. Las sondas de hidrólisis modificadas con moléculas de unión al surco menor del ADN que
USP 39
Información General/ (1129) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos 1539
aumentan la afinidad del blanco muestran mayor poder de discriminación de alelos. El uso de dos sondas, cada una marcada con un fluoróforo indicador diferente permite detectar ambos alelos SNP en un solo tubo. Al usar sondas marcadas con fluoróforos diferentes se puede conseguir multiplexación limitada. En los ensayos basados en sondas fluorescentes, el aumento de la fluorescencia debido al producto acumulado de PCR por lo general se monitorea en tiempo real en placas de microtitulación de 96 ó 384 pocillos. Como alternativa, se puede medir la fluorescencia generada por los dos alelos después de completada la PCR. En este caso, los resultados se expresan como un cociente de señales que refleja la hibridación de los dos oligonucleótidos a la secuencia blanco y de esa forma las diferencias en la eficiencia de la amplificación entre las muestras no afectan la interpretación de los resultados de la genotipificación. Un tercer método implica el calentamiento de los productos de amplificación después de haberse completado la PCR, con el fin de separar la sonda del blanco. Cada dúplex tiene su propia Tm específica, definida como la temperatura a la cual el 50% del ADN se vuelve de cadena simple. La Tm depende de la estabilidad del dúplex de sonda-blanco. Los dúplex de sonda-blanco perfectamente apareados tienen mayor estabilidad y por lo tanto una Tm mayor que el mismo dúplex conteniendo una sola base apareada incorrectamente. Al monitorear continuamente la fluorescencia durante la fase de calentamiento, los analistas generan una "curva de fusión (desnaturalización)" que mide los cambios en fluorescencia cuando la sonda se desnaturaliza o "funde" y se separa del amplicón. Este método se puede usar sólo para sistemas que no dependen de la hidrólisis de la sonda para generar una señal y por lo tanto no es apto para ensayos de hidrólisis de la sonda. Dado que después de la PCR no se requieren pasos de procesamiento o separación de marcadores, los ensayos homogéneos de PCR en tiempo real son simples de realizar, lo cual los hace útiles para aplicaciones en las que debe genotipificarse un alto número de muestras. Las sondas óptimas se deben diseñar individualmente para cada SNP y por lo tanto los ensayos serán más eficientes cuando se analice un número limitado de SNP. El costo de las sondas modificadas con moléculas fluorescentes y de extinción también puede ser un factor limitante para la aplicación de los ensayos a alta capacidad de procesamiento.
Extensión del Cebador En esta técnica se usa un oligonucleótido para cebar la síntesis de ADN con una enzima polimerasa, según se efectúa en una PCR o en una reacción de secuenciación estándar. La técnica tiene variaciones. La PCR alelo-específica usa dos cebadores, cada uno totalmente complementario a uno de los alelos del SNP, con la posición de SNP en el extremo 3' del cebador y un cebador inverso común de PCR para amplificar selectivamente los alelos SNP. Dado que sólo los oligonucleótidos perfectamente apareados cebarán la extensión de la polimerasa del ADN, el producto será detectado sólo en la reacción que contiene el cebador perfectamente apareado. La electroforesis en gel de agarosa se usa para detectar los productos amplificados, aunque también se han desarrollado métodos homogéneos de PCR alelo-específica en tiempo real usando cebadores marcados con diferentes fluoróforos o un colorante fluorescente, que se intercala con los productos de doble cadena de PCR, o efectuando la detección del amplicón con sondas de hidrólisis y sondas horquilla (tallo-bucle). Cuando se usan colorantes intercalados o cebadores marcados para PCR alelo-específica sin un paso de detección consecutiva específica del blanco o de separación por tamaño, se puede encontrar que la especificidad del procedimiento está comprometida debido a la formación de dímeros de cebadores y a otros productos espurios de la amplificación que no se distinguen del producto real de PCR. Una limitación de todas las variantes de la PCR alelo-específica consiste en que las condiciones de la reacción o el diseño del cebador para la amplificación selectiva de los alelos debe optimizarse empíricamente para cada SNP. Al igual que los ensayos de hidrólisis y sonda horquilla, los procedimientos homogéneos de PCR alelo-específica son más apropiados para el análisis de un número limitado de SNP en un gran número de muestras. También se han desarrollado métodos basados en matrices de mayor multiplexación de SNP. En procedimientos basados en la extensión del cebador de un nucleótido único (a veces denominada minisecuenciación), la discriminación de alelos se basa en la alta exactitud de la polimerasa del ADN para incorporar nucleótidos. Se usa un cebador y su extremo 3' se coloca en la base que precede al SNP que se va a examinar. La polimerasa del ADN se utiliza entonces para incorporar ddNTP marcados, cada uno con un colorante fluorescente diferente. Después de que los oligonucleótidos marcados se separan de los ddNTP no incorporados, los resultados se pueden valorar sobre un lector de placas de fluorescencia. Además de las etiquetas (tags) fluorescentes, los ddNTP se pueden marcar con biotina o haptenos y luego detectar indirectamente por medio de anticuerpos conjugados con fosfatasa alcalina o peroxidasa, usando marcadores colorimétricos o quimioluminiscentes en formatos ELISA. También se ha descrito que la multiplexación de este procedimiento resulta en una reducción de costos y un aumento de la capacidad de procesamiento. En estos procedimientos multiplexados, se separan los diferentes loci genotipificados simultáneamente, bien sea por electroforesis en gel o por hibridación a matrices o arreglos de etiquetas (arrayed tags). También es posible la extensión del cebador directamente sobre un soporte sólido, como una micromatriz. La inmovilización de los cebadores de cadena simple sobre el soporte sólido se puede hacer por medio de una reacción biotina-avidina-estreptavidina o en forma covalente a través de grupos disulfuro en el extremo 5'. La espectroscopía de masas con técnicas como la espectrometría de masas por tiempo de vuelo con ionización por desorción láser asistida por matrices (MALDl-TOF MS, por sus siglas en inglés) se puede utilizar también para determinar la identidad del ddNTP incorporado basándose en la masa del nucleótido. Una dificultad con la MALDl-TOF MS es que los productos de extensión del cebador deben ser rigurosamente purificados antes de la medición para evitar el ruido del material biológico presente en la muestra. Estos procedimientos asistidos por enzima han demostrado ser más robustos y proporcionar una discriminación más específica de los alelos que la hibridación ASO en condiciones de reacción similares. Estas características son
1540 (1129) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos/ Información General
USP 39
ventajosas para las aplicaciones en las que se requiere alto volumen de procesamiento, porque se minimiza el esfuerzo requerido para el diseño y la optimización del ensayo.
Ligación En el ensayo de ligación de oligonucleótidos (OLA, por sus siglas en inglés), los oligonucleótidos se diseñan de forma tal que se encuentren en la posición del SNP que se va a examinar. La unión enzimática, con una ADN ligasa, ocurre solamente cuando el apareamiento es perfecto. La prueba por lo general se efectúa diseñando dos oligonucleótidos específicos para cada alelo, marcados en forma diferente en uno de los lados del SNP, con un oligonucleótido común en el otro. La detección de los alelos se puede efectuar directamente en los pocillos de la microplaca por métodos colorimétricos. El uso de multiplex y de separación en gel también se han descrito. La OLA se ha usado en formatos de micromatriz con una de las sondas de ligación inmovilizada o con sondas tallo-bucle únicas inmovilizadas. Como alternativa, la ligación se puede llevar a cabo en solución, seguida por la captura de los productos de ligación sobre micromatrices o en micropartículas que llevan un conjunto genérico de oligonucleótidos que son complementarios a una secuencia de "etiquetas (tags)" sobre una de las sondas de ligación. En la práctica, se usan frecuentemente ligasas termoestables para la genotipificación de SNP en combinación con PCR antes de las reacciones de detección de la ligasa alelo-específica. Dado que los mecanismos de reacción para PCR y ligación son diferentes, los reactivos de ambas reacciones se pueden combinar. Esta característica se usa en un ensayo homogéneo de PCR en tiempo real con genotipificación mediada por ligasa y detección por FRET. Comparado con los procedimientos de extensión del cebador asistidos por ADN polimerasa, un inconveniente de la OLA es que la detección de cada SNP requiere tres oligonucleótidos, lo cual incrementa los costos de estos ensayos. Las sondas padlock son oligonucleótidos lineales cuyos extremos son complementarios al blanco y tienen una secuencia aleatoria en el centro. Cuando se hibridizan perfectamente a su secuencia blanco, las sondas padlock pueden circularizarse por ligación, mientras que un apareamiento incorrecto con la secuencia blanco evita la ligación. Los oligonucleótidos circularizados pueden actuar como moldes para la amplificación por círculo rodante (RCA, por sus siglas en inglés) asistida por ADN polimerasa. La RCA puede usarse para amplificar las sondas padlock circularizadas ligadas hasta un nivel requerido para detectar secuencias de copia única. Se ha diseñado un ensayo homogéneo, isotérmico para genotipificación de SNP individuales en una placa de microtitulación, el cual combina amplificación exponencial de las sondas padlock ligadas, usando una reacción de amplificación por círculo rodante ramificada con detección por cebadores en forma de horquilla marcados por transferencia de energía.
Desplazamiento El ensayo invasor utiliza la propiedad de las flap endonucleasas (FEN, por sus siglas en inglés) para cortar las porciones redundantes (flap) del extremo 5' de un fragmento de ADN río abajo (downstream) que se solapa sobre un fragmento de ADN río arriba (upstream) (invasor). Se diseña un oligonucleótido invasor con su extremo 3' sobre el SNP que se va a examinar. También se diseñan dos sondas de oligonucleótidos de señal que se solapan sobre el sitio polimórfico y cada una corresponde a uno de los alelos. Después del desplazamiento de las sondas de señal por la sonda invasora, ocurre la escisión mediada por la FEN sólo para la sonda de señal alelo-específica perfectamente apareada. La generación del fragmento escindido se monitorea usándolo en una segunda reacción como una sonda invasora para escindir una sonda FRET. Este ensayo no requiere amplificación por PCR del locus que se va a examinar y la cuantificación (scoring) se puede hacer con un simple lector de placa fluorescente.
Pirosecuenciación En el procedimiento de pirosecuenciación, la extensión del cebador se monitorea por la detección luminométrica de pirofosfato (PPi) mediada por enzima, que se libera durante la incorporación del desoxinucleótido trifosfatos. El genotipo de un SNP se deduce por la adición secuencial y degradación de los cuatro nucleótidos usando apirasa en un instrumento, dedicado a este ensayo, que funciona en un formato de placas de microtitulación de 96 ó 384 pocillos. Por medio de pirosecuenciación, el aparato puede determinar secuencias de ADN de 30 a 50 bp que flanquean un SNP. Una limitación del procedimiento es que la identificación secuencial de las bases no permite la genotipificación de varios SNP por reacción en genomas diploides. Una ventaja del procedimiento es que permite detectar cualquier polimorfismo nuevo. Sin embargo, se necesitan equipos específicos para la inyección de los nucleótidos.
Análisis de Polimorfismo Conformacional de Cadena Simple y de Heterodúplex El análisis de polimorfismo conformacional de cadena simple (SSCP, por sus siglas en inglés) y el análisis de heterodúplex estuvieron entre los primeros procedimientos establecidos para la detección de SNP. El análisis SSCP convencional involucra la desnaturalización de fragmentos amplificados por PCR y la subsiguiente formación de estructuras secundarias y terciarias específicas de la secuencia de las cadenas individuales durante la electroforesis en gel no desnaturalizante. La movilidad electroforé-
USP 39
Información General/ (1129) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos 1541
tica depende entonces de la forma tridimensional de las moléculas de cadena simple. Una sola base de diferencia en los fragmentos de ADN de hasta 300 bps usualmente cambiará la conformación de manera que podrá ser detectada por PAGE no desnaturalizante. Los geles de poliacrilamida tradicionales y los fragmentos marcados con 32 P están siendo frecuentemente reemplazados por fragmentos marcados con fluorescencia y electroforesis capilar automatizada. La simplicidad del procedimiento, combinada con automatización y corto tiempo de análisis, contribuye a una alta capacidad de procesamiento de muestras a un costo relativamente bajo. Si los productos de PCR desnaturalizados se dejan renaturalizar lentamente, forman los dúplex de ADN. Los dúplex con la misma secuencia en ambas cadenas (homodúplex) o con un solo par de bases apareado incorrectamente en una cadena (heterodúplex) tienen diferente movilidad electroforética en un gel nativo. En el caso de una sustitución de un único par de bases, el heterodúplex se puede separar fácilmente de un homodúplex. En otras versiones de la técnica, se usa la cromatografía líquida de alta resolución desnaturalizante (DHPLC, por sus siglas en inglés) para la separación de las cadenas heterodúplex y homodúplex. El análisis de mutación con DHPLC puede automatizarse casi totalmente con un muestreador automático en un extremo y un recolector de fracciones en el otro. El análisis es rápido (cerca de 5 minutos por muestra) y la evaluación sencilla de los datos distingue entre picos simples y múltiples en los perfiles de elución, permitiendo analizar ADN con una longitud de hasta 1,5 kb. Una desventaja puede ser el uso recomendado de ADN polimerasa Pfu, que por ser una enzima de alta fidelidad permite picos más definidos pero puede ser menos exitosa para amplificar algunas regiones.
Perfil de Repetición Corta en Tándem Una repetición corta en tándem (STR, por sus siglas en inglés) es un tipo de polimorfismo de ADN que ocurre cuando un patrón de dos o más nucleótidos se repite y las secuencias repetidas están adyacentes una de la otra. El patrón puede variar en longitud de 2 a 1O bp (p.ej., CATGn en una región genómica) y por lo general está en la región intrónica no codificante o regiones río arriba/río abajo. Al examinar varios loci de STR y contar cuántas repeticiones de una secuencia STR específica hay en un locus determinado, se puede crear un perfil genético exclusivo de un individuo. Hasta el momento se han publicado más de 1O000 secuencias STR en el genoma humano. Los análisis de STR se han convertido en el procedimiento de análisis preferido para determinar los perfiles genéticos en casos forenses. El análisis de STR en el campo forense se volvió muy popular desde mediados de los años 90. Los STR que se usan en análisis forenses son repeticiones de tetra o pentanucleótidos (4 ó 5 unidades de repetición) porque estas generan una alta proporción de datos sin error a la vez que son suficientemente robustas para sobrevivir a la degradación en condiciones no idóneas. Las secuencias de repetición más cortas tienden a generar artefactos como tartamudeo y amplificación preferencial; diversas enfermedades genéticas están asociadas con repeticiones de trinucleótidos, incluyendo la enfermedad de Huntington. Las secuencias de repetición más largas son más susceptibles a la degradación ambiental y no se amplifican por PCR tan bien como las secuencias más cortas. El análisis se lleva a cabo por extracción de ADN nuclear de las células de una muestra forense de interés y la posterior amplificación por PCR de las regiones polimórficas específicas de la muestra extraída. Una vez que las secuencias han sido amplificadas, se resuelven por electroforesis en gel o por electroforesis capilar, lo cual permite a los analistas determinar el número de las repeticiones de la secuencia STR en cuestión. Si el ADN se resuelve por electroforesis en gel, el ADN se puede visualizar por tinción con plata o intercalando un colorante como bromuro de etidio o, como se hace en la mayoría de laboratorios forenses modernos, por colorantes fluorescentes. Los instrumentos indicados para resolver fragmentos de STR por electroforesis capilar usan también colorantes fluorescentes. En Estados Unidos, se han seleccionado 13 loci centrales para STR como la base a partir de la cual se puede generar un perfil genético individual. Estos perfiles se almacenan en bancos de datos de ADN locales, estatales y nacionales como el Sistema de Índice Combinado de ADN (CODIS, por sus siglas en inglés). Se cuenta con materiales de referencia forense. El Estándar del Perfil del ADN está compuesto por ADN humano bien caracterizado en dos formas: ADN genómico y ADN para ser extraído de células aplicadas en un papel de filtro.
CONSIDERACIONES DE VALIDACIÓN DEL ENSAYO La dificultad para reproducir y validar los ensayos existentes y emergentes de genotipificación por SNP, debido a factores como la variación en el desempeño de los termocicladores de PCR, la eficiencia de diferentes enzimas, el personal y la presencia de inhibidores de la PCR en la matriz de la muestra (discutidos en más detalle en Técnicas Basadas en Ácidos NucleicosAmplificación (1127) para ensayos generales de NAT) pueden obstaculizar la implementación apropiada de las tecnologías. Además, el uso de formatos de ensayo internos de cada laboratorio clínico a menudo dificulta las comparaciones entre laboratorios. El diagnóstico incorrecto de una mutación genética puede tener consecuencias significativas, de manera que para dichos ensayos es esencial alcanzar una exactitud de 99,99% o más. Para poder determinar la exactitud de una tecnología, el nuevo procedimiento se debe validar en múltiples muestras en las cuales se ha determinado previamente el genotipo con un procedimiento estándar de referencia, como la secuenciación. Incluso con el procedimiento de análisis más exacto, la preparación y amplificación de la muestra y los procedimientos de detección se deben optimizar para eliminar cualquier posible inexactitud. Algunos errores de genotipificación se pueden minimizar por planeación cuidadosa de los procedimientos de laboratorio, la inclusión de controles bien definidos y el aumento de automatización. Sin embargo, los errores debidos a los procesos usados para genotipificación en ocasiones son difíciles de superar y es necesario tenerlos en cuenta. Los tipos de errores y la frecuencia
1542 (1130) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos/ Información General
USP 39
con la que ocurren difieren entre las diferentes estrategias. Todas las situaciones en las cuales ocurre la amplificación preferencial de un alelo o sonda de hibridación no específica pueden llevar a identificaciones incorrectas en SNP. Los polimorfismos adicionales no anticipados que están presentes en las secuencias del cebador y sonda pueden ocasionar sesgos en la amplificación, lo cual resalta la necesidad de un cuidadoso diseño y validación del ensayo usando técnicas alternativas. Las muestras limitadas y degradadas también pueden ocasionar amplificación alélica preferencial debido a eventos de cebado casuales a bajo número de copias. Resulta preferible un resultado indeterminado, lo cual requeriría la repetición de la prueba, y no una identificación incorrecta que proporcione resultados erróneos que se informen subsiguientemente. La realización de ensayos replicados puede también ayudar a garantizar la exactitud. La interpretación de los datos también puede afectar la exactitud. Los resultados correspondientes a las muestras salvaje, heterocigota y homocigota deben distinguirse claramente unos de otros y se les debe atribuir una medida bien definida de incertidumbre. Los esquemas de pruebas de aptitud y los ensayos inter-laboratorio (ring-trials) van más allá para garantizar que los ensayos individuales sean aptos para el propósito para el cual fueron previstos en las aplicaciones específicas y que el personal que los efectúa sea competente. También es útil compartir la información técnica del diseño del ensayo y la preparación de la muestra. La disponibilidad de paneles de referencia de muestras bien caracterizadas ayuda al diseño y evaluación del ensayo y permite hacer comparaciones inter-laboratorio.
(1130) TÉCNICAS BASADAS EN ÁCIDOS NUCLEICOS-ENFOQUES PARA DETECTAR TRAZAS DE ÁCIDOS NUCLEICOS (ANÁLISIS DE ADN RESIDUAL) INTRODUCCIÓN Los principios básicos de las tecnologías de amplificación de ácidos nucleicos (NAT, por sus siglas en inglés) y las definiciones de las diversas técnicas se tratan en Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Generalidades (1125). Este capítulo cubre el procedimiento analítico usado para cuantificar el ADN residual en productos biofarmacéuticos. La cuantificación de las impurezas de ADN residual en productos biofarmacéuticos se basa en razones de seguridad. Las células usadas para elaborar productos biofarmacéuticos pueden ser fuentes de una variedad de impurezas complejas, heterogéneas y potencialmente inseguras, y entre éstas se cuenta el ADN de la célula huésped (host cell). Gran parte de la preocupación de seguridad asociada con el ADN residual en productos biofarmacéuticos radica en la posibilidad de que el ADN de la célula huésped, particularmente el ADN de una línea celular continua, pueda producir tumores o reacciones adversas. Las células usadas para elaborar productos biofarmacéuticos pueden transportar virus o albergar ácido nucleico peligroso y el ADN residual en un producto biofarmacéutico determinado puede ser infeccioso. Aunque las pruebas en animales han demostrado que el ADN extraño puede causar tumores o infecciones, hasta la fecha ningún informe ha demostrado ese riesgo en seres humanos. Por lo tanto, algunas agencias reglamentarias han fijado un límite de 100 pg o menos de ADN residual por dosis en productos biofarmacéuticos y se pueden considerar concentraciones de ADN residual de hasta 1O ng por dosis, dependiendo de la fuente de ADN residual y de la vía de administración del producto. El ADN residual en los procesos biofarmacéuticos se puede evaluar de dos maneras: validando la depuración (clearance) durante la validación del proceso o monitoreando las concentraciones de ADN residual en el fármaco mediante pruebas de rutina. El grado de preocupación sobre el ADN residual puede ligarse a la fuente potencial del ADN residual (p.ej., ADN viral infeccioso) y la vía de administración, de manera que la especificación del ADN residual y el procedimiento para monitorear la depuración de ADN para un producto determinado deben desarrollarse consultando a las agencias reglamentarias. Sin importar si las pruebas de rutina de un producto farmacéutico se usan para determinar el contenido de ADN residual o si la depuración de ADN se demuestra por la validación del proceso, se requieren procedimientos analíticos para cuantificar el ADN residual. Los procedimientos analíticos usados para determinar el contenido de ADN residual en los productos biofarmacéuticos pueden incluir hibridación, instrumental basado en proteína de unión a ADN, PCR cuantitativa (q-PCR) u otros métodos de amplificación de ADN. Se espera que el procedimiento analítico utilizado para cuantificar el ADN residual en productos biofarmacéuticos tenga un límite de detección cercano a 1O pg por dosis. Los ensayos basados en hibridación, proteína de unión a ADN y qPCR son típicamente las técnicas de elección porque pueden alcanzar la sensibilidad requerida.
PRETRATAMIENTO DE LA MUESTRA El análisis de ADN residual requiere la cuantificación exacta de concentraciones de pg de ADN en mg (o cantidades más grandes) de producto. La misma muestra, bien sea una proteína u otra entidad química, puede crear efectos de la matriz de la muestra que deben ser resueltos con el fin de generar un ensayo útil. Las muestras de proteínas pueden requerir sólo digestión con proteinasa (p.ej., Proteinasa K, Pronasa) para permitir que el método analítico recupere cuantitativamente el ADN residual. Puede ser necesario tratar la muestra con un detergente para disociar el ADN residual de la matriz de la muestra. Tradicional-
USP 39
Información General/ (1130) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos 1543
mente se han aplicado métodos de extracción basados en fenol y cloroformo, seguidos por precipitación con etanol, para la purificación de ADN en el área de investigación en biología molecular. La técnica de extracción con fenol y cloroformo puede ser un pretratamiento útil para muestras de ADN residual antes del análisis. Dado que por lo general la concentración de ADN residual en las muestras es baja, puede ser difícil la recuperación cuantitativa de ADN por precipitación con etanol. Por esta razón, puede ser necesaria la utilización de una molécula transportadora (p.ej., glucógeno) para asistir en la recuperación de ADN si se usa esta técnica. Existe un kit comerciaP que se ha usado de forma exitosa para el pretratamiento de muestras de ADN residual. El kit comercial usa un caotropo (yoduro de sodio) y un detergente (N-lauroilsarcosinato de sodio) para romper la asociación del ADN con la muestra. El ADN se coprecipita entonces usando glucógeno como molécula transportadora, en presencia de isopropanol. Cada una de estas técnicas de pretratamiento puede producir resultados aceptables, o los analistas pueden combinar las técnicas para obtener una recuperación aceptable del ADN residual de la muestra. La extracción de la muestra es un paso extra de manipulación que puede ocasionar la recuperación incompleta del ADN residual o puede introducir ADN ambiental en la muestra, por lo que se debe tener mucho cuidado durante cualquier manipulación de la muestra. Una práctica común consiste en incorporar muestras al ensayo de ADN residual a las que se ha agregado una cantidad conocida de ADN (spiked samples). Una recuperación de 80% a 120% de la cantidad del ADN agregado es un criterio de aceptación que se aplica a menudo a los ensayos de ADN residual para garantizar que el ensayo produzca resultados aceptables. Cuando las características de la muestra (p.ej., efectos de la matriz, método de preparación de la muestra) hagan que resulte impracticable conseguir un criterio de aceptación para la recuperación de 80% a 120%, una práctica también aceptable consiste en corregir la concentración de ADN observado por el porcentaje de recuperación del ADN agregado. Durante la calificación de un ensayo de ADN residual, algunos científicos tratan las muestras con ADNasa 1 para degradar el ADN en la muestra con el fin de demostrar que la respuesta del ensayo se debió al ADN y no a algún otro componente de la muestra.
ENSAYOS DE ADN RESIDUAL BASADOS EN HIBRIDACIÓN Los primeros ensayos de ADN residual se basaron en técnicas de hibridación del ADN, en las que una sonda de ADN creada a partir del ADN de la célula huésped detecta y cuantifica la cantidad de ADN complementario presente en el producto en análisis. El ADN de doble cadena de la célula huésped consta de dos cadenas complementarias de ADN que se mantienen unidas por enlaces de hidrógeno. El ADN de doble cadena en la muestra de prueba se desnaturaliza a cadenas individuales y se inmoviliza sobre una membrana, por lo general de nitrocelulosa o nailon. La muestra se sondea usando ADN de la célula huésped que ha sido desnaturalizado y marcado. La sonda de ADN de la célula huésped no consiste de una secuencia específica sino que se prepara por un procedimiento de marcado aleatorio durante el cual se introduce una marca radioactiva o fluorescente dentro del ADN de la célula huésped para producir la sonda. Cuando la sonda de ADN marcado y desnaturalizado se pone en contacto con el ADN inmovilizado en la membrana, la sonda se une con las secuencias complementarias del ADN de la célula huésped. Si la sonda es radioactiva, la membrana se coloca contra una película de autorradiografía durante un tiempo suficiente, después se revela y se observa una mancha negra donde el ADN en análisis se encontraba inmovilizado. Si la sonda tiene una marca fluorescente, la intensidad de las manchas se determina usando un sistema de imágenes de fosforescencia o fluorescencia. La intensidad de la mancha es proporcional a la cantidad de sonda que se hibridizó al ADN en análisis y por lo tanto es proporcional a la cantidad de ADN residual en la muestra. La intensidad de la mancha se puede comparar visualmente con la intensidad de las manchas que corresponden a una curva estándar que produce resultados semicuantitativos (es decir, cuantificación visual) o la intensidad se puede determinar usando un instrumento (p.ej., densitómetro) para crear un valor cuantitativo que se compara con los valores obtenidos a partir de una curva estándar.
ENSAYOS DE ADN RESIDUAL BASADOS EN PROTEÍNA DE UNIÓN A ADN Se consigue comercialmente instrumental para la cuantificación de ADN residual en productos biofarmacéuticos. El instrumental requiere reactivos que usen proteína de unión a ADN y anticuerpos dirigidos contra ADN en un procedimiento analítico de cuatro etapas. En la primera etapa el ADN se desnaturaliza a ADN de cadena simple por calentamiento de la muestra. El ADN desnaturalizado se mezcla con un reactivo único que contiene proteína de unión a ADN conjugada con estreptavidina y un anticuerpo monoclonal antiADN conjugado con ureasa. La proteína de unión a ADN y el anticuerpo monoclonal son específicos para el ADN de cadena simple pero no tienen especificidad de secuencia. Esta primera etapa, al realizarse en fase líquida, facilita la formación de complejos de reacción que contienen ADN, estreptavidina y ureasa. Durante la segunda etapa, la muestra se filtra a través de una membrana biotinilada que se une a la estreptavidina y captura los complejos sobre la membrana, la cual se lava para retirar cualquier reactivo que no esté unido a la misma. Durante la tercera etapa, la membrana se inserta en un sensor del instrumento, donde la ureasa del complejo de ADN reacciona con una solución de urea en el sensor, produciendo amoníaco y un cambio en el pH que se detecta usando un sensor potenciométrico fotosensible (LAPS, por sus siglas en inglés). El cambio en el pH se correlaciona directamente con la cantidad de ADN en la muestra. En la cuarta etapa, los datos crudos del instrumento se analizan usando el software apropiado para determinar el contenido de ADN residual en la muestra.
1
DNA Extractor Kit, Wako Chemicals,
1544 (11 30) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos/ Información General
USP 39
ENSAYO DE ADN RESIDUAL BASADO EN PCR CUANTITATIVA La q-PCR en tiempo real es un procedimiento que está bien adaptado para procesar rápidamente gran número de muestras y tiene aplicaciones en muchas áreas de la fabricación de productos biofarmacéuticos (p.ej., detección de número de copias, detección de virus). La técnica puede cuantificar la cantidad de una secuencia blanco de ácido nucleico en el ADN de una gran variedad de muestras. La sonda de ADN usada en el análisis es la clave del procedimiento. La sonda tiene un colorante indicador fluorescente en un extremo y un colorante extintor en el otro extremo. A la reacción se le agrega también un par de cebadores de ADN. Durante la reacción de amplificación, la ADN polimerasa 1 se conecta donde el cebador de ADN se une a la muestra de ADN de cadena simple (molde) y se mueve a lo largo de la muestra de ADN, sintetizando nuevo ADN complementario. Mientras se mueve a lo largo del molde de ADN, la ADN polimerasa 1 corta cualquier ADN complementario en el camino. Si la ADN polimerasa 1 encuentra la sonda de ADN marcada, cortará el colorante indicador de la sonda. El colorante indicador se libera dentro de la solución y, en ausencia del extintor, se puede cuantificar como una señal fluorescente. La repetición del ciclo de reacción resulta en una amplificación de la señal fluorescente. El número de ciclos requeridos para que la medición fluorescente exceda un valor umbral está correlacionada con la cantidad de ADN residual inicial en la muestra. Al comparar la fluorescencia obtenida a partir de una muestra con una curva estándar, los analistas pueden cuantificar el ADN residual en la muestra.
APLICACIONES PRÁCTICAS DEL ANÁLISIS DE ADN RESIDUAL Los analistas que escogen técnicas de hibridación, proteína de unión a ADN o q-PCR para el análisis de ADN residual deben considerar cómo se usará el ensayo, la estructura del ADN disponible (p.ej., longitud del fragmento) y los asuntos reglamentarios. El costo del análisis puede ser significativo y debe tenerse en cuenta al evaluar un formato para el ensayo. Tradicionalmente, los ensayos de hibridación se efectuaban usando ADN marcado con 32p y autorradiografía. Dado que el 32 P se descompone rápidamente, las sondas preparadas con 32 P tienen una vida útil limitada y las precauciones necesarias para manipular material radioactivo pueden ser engorrosas. Estos problemas con el marcado con 32 P pueden hacer que la marcación de la sonda de hibridación con fluorescencia sea una opción preferible. Si el ensayo de hibridación se evalúa visualmente, este representará un ensayo semicuantitativo, pero si la intensidad de las manchas se determina usando un densitómetro u otro sistema de imágenes los resultados pueden ser cuantitativos. Los ensayos con proteína de unión a ADN y q-PCR arrojan resultados cuantitativos. Los ensayos cuantitativos se prefieren por lo general sobre los ensayos semicuantitativos porque los resultados se consideran más exactos y precisos, lo cual permite monitorear y controlar mejor el proceso. Debido a la interferencia de la muestra, a menudo se requiere un paso de pretratamiento de la muestra para obtener resultados exactos y reproducibles. Los pasos de pretratamiento pueden influenciar la recuperación de ADN, por lo que con frecuencia es necesario diseñar el ensayo con un control de recuperación de la cantidad conocida de ADN agregado (spike-recovery control) y un criterio de aceptación para garantizar el desempeño del ensayo. Por lo general no se consiguen fuentes comerciales de ADN de célula huésped y de vector para preparar controles internos. Los controles internos se preparan usualmente en el laboratorio y se cuantifican por espectroscopía UV, usando técnicas estándar empleadas en biología molecular para determinar el contenido y pureza del ADN. Adicionalmente, una buena práctica consiste en evaluar los controles internos de ADN residual por electroforesis en gel de agarosa para demostrar que el ADN tiene un tamaño apropiado para el ensayo empleado y que no está degradado. El ensayo de hibridación usa ADN genómico y/o de vector, marcado aleatoriamente a lo largo del ADN, como sonda de hibridación. Por esta razón el ensayo de hibridación es específico para la fuente de ADN, pero no es específico para una secuencia en particular. Se puede sintetizar una sonda, específica para una secuencia determinada, para usarla en el ensayo de hibridación si se requiere este grado de especificidad. El ensayo de ADN residual con proteína de unión a ADN no es específico de secuencia y por lo tanto no es específico para el ADN anfitrión. Por esa razón, el personal de laboratorio debe evitar la contaminación de las muestras para este ensayo con ADN ambiental antes de la desnaturalización del ADN; de lo contrario, los resultados de ADN residual podrían presentar valores falsamente elevados. La sonda usada en los ensayos de q-PCR es específica de secuencia, lo cual crea algunos desafíos especiales para el desarrollo de un ensayo de ADN residual por q-PCR. La secuencia específica de q-PCR debe ser estable dentro de una región altamente conservada de ADN. La recuperación de la secuencia blanco de la sonda debe representar congruentemente la recuperación de todo el ADN residual. Como pauta, para que un fragmento de ADN sea detectado por hibridación, q-PCR y ensayos de proteína de unión a ADN, debe tener no menos de 50, 150 y 600 pares de bases, respectivamente. Un bioproceso puede involucrar típicamente operaciones que corten el ADN en fragmentos más pequeños y esto se debe tener en cuenta al seleccionar un ensayo. Existen procedimientos para determinar si los fragmentos de ADN en una muestra son demasiado pequeños para permitir la recuperación del ADN residual con un ensayo determinado. Como se ha destacado, los ensayos de ADN residual son sumamente sensibles. Se han informado límites de detección tan bajos como <1, 3 y 6 pg de ADN por muestra para ensayos por q-PCR, proteína de unión a ADN e hibridación, respectivamente. Aunque las preocupaciones de seguridad relacionadas con las impurezas de ADN residual no son tan prominentes como antes, las concentraciones de ADN residual en cualquier bioproceso siguen siendo un atributo clave de calidad y ayudan a definir el proceso.
USP 39
Información General/ (11 32) Proteína Residual Células Huésped 1545
(1132) MEDICIÓN DE PROTEÍNA RESIDUAL DE CÉLULAS HUÉSPED EN PRODUCTOS BIOFARMACÉUTICOS 1. INTRODUCCIÓN V ALCANCE Muchos productos medicinales se producen a través de tecnología recombinante mediante una célula huésped (p.ej., bacterias, levaduras o líneas celulares de mamíferos, insectos o plantas). Durante la fabricación de dichos productos, cierta cantidad de material de las células huésped que no forman parte del producto será inevitablemente introducida en la corriente del proceso. Este proceso resulta en una mezcla del producto deseado y de impurezas derivadas de la célula huésped, incluyendo proteínas de células huésped (HCP, por sus siglas en inglés) y otras impurezas relacionadas con el proceso que serán el objetivo de la depuración mediante el bioprocesamiento. Las proteínas residuales de células huésped tienen el potencial de afectar la calidad, seguridad y eficacia del producto; por lo tanto, la cantidad de proteínas de células huésped debe ser baja. Los procesos de purificación del producto deben optimizarse para eliminar de manera uniforme la mayor cantidad posible de proteínas de células huésped, con el propósito de producir un producto tan puro como sea posible. La preocupación principal con las proteínas de células huésped en productos biofarmacéuticos es su potencial de inducir anticuerpos anti-HCP que podrían inducir un efecto clínico en los pacientes. Además, las proteínas de células huésped pueden actuar como adyuvantes, lo que puede inducir anticuerpos antifármacos que pueden afectar la seguridad o la eficacia del medicamento. El capítulo general USP Ensayos de lnmunogenicidad-Diseño y Validación de lnmunoensayos para Detectar Anticuerpos Antifármacos (1106), presenta una discusión más extensa de la inmunogenicidad y su efecto sobre los estudios preclínicos y clínicos. Las proteínas de células huésped también pueden tener un efecto directo sobre la calidad del producto mismo. Por ejemplo, las proteínas proteolíticas de células huésped, incluso en cantidades diminutas, pueden escindir el producto proteico deseado con el paso del tiempo, reduciendo o eliminando la potencia biológica o alterando la estabilidad. Este capítulo se enfoca en los inmunoensayos de proteínas de células huésped para productos terapéuticos recombinantes. Este capítulo no trata productos tales como vacunas o terapias genéticas, celulares o tisulares, aunque los principios generales presentados podrían ser aplicables a la medición de proteínas de células huésped en dichos productos. El diseño y la validación de inmunoensayos de proteínas de células huésped implica retos únicos y significativos debido a: 1) la amplia variedad de proteínas de células huésped posibles en productos medicinales; 2) el uso general de reactivos de anticuerpos policlonales para detectarlos; 3) la falta de estándares con una correspondencia exacta para cuantificación; 4) en algunos casos, un efecto considerable de los efectos de dilución de la muestra; y 5) las limitaciones inherentes para medir especies individuales de proteínas de células huésped. El capítulo incluye estrategias de desarrollo de ensayos a través del ciclo de vida del desarrollo del producto y del proceso, y describe enfoques para demostrar que el ensayo es apto para su uso (p.ej., ilustrar la depuración por operación unitaria de las proteínas de células huésped, liberación de lote). Debido a la complejidad de los inmunoensayos de proteínas de células huésped, se requiere el desarrollo y la caracterización cuidadosos de reactivos críticos, en particular del inmunógeno usado para inducir los anticuerpos anti-HCP, los reactivos de anticuerpos y el estándar de proteínas de células huésped del ensayo. Debido a que el análisis de proteínas de células huésped es una parte esencial del desarrollo del proceso y del control de calidad del producto, el análisis de proteínas de células huésped también se trata en conjunto con los requisitos reglamentarios y otras consideraciones para proveer pautas sobre la estrategia general de control para proteínas de células huésped. A continuación se presenta una breve descripción del capítulo general: 1. Introducción y Alcance 1.1 Consideraciones sobre Fabricación1 Caracterización y Uniformidad 2. Terminología 3. Métodos de lnmunoensayo de Proteínas de Células Huésped 3.1 Ciclo de Desarrollo del Ensayo 3.2 Desarrollo y Caracterización de Reactivos de Proteínas de Células Huésped 3.3 Desarrollo de Métodos de lnmunoensayo y Calificación de Aptitud para su Uso 4. Validación de Métodos de lnmunoensayo de Proteínas de Células Huésped 4. 7 Exactitud 4.2 Sensibilidad e Intervalo del Ensayo 4.3 Linealidad de la Muestra 4 .4 Especificidad 5. Tecnologías de Apoyo para la Detección1 Identificación y Medición de Proteínas Residuales de Células Huésped 5.1 Consideraciones para Métodos Electroforéticos 5.2 Consideraciones para Métodos de Transferencia Western (Western Blot) 5.3 Consideraciones para Métodos Cromatográficos y Proteómicos 5.4 Comentarios Finales sobre Tecnologías de Apoyo para Proteínas de Células Huésped 6. Uso de lnmunoensayos de Proteínas de Células Huésped para Desarro/101 Caracterización y Validación del Proceso 6. 1 Ensayos para Proteínas de Células Huésped Individua/es
1546 (11 32) Proteína Residual Células Huésped / Información General
USP 39
6.2. Estrategia de Control 7. Resumen y Conclusiones 8. Bibliografía
1.1 Consideraciones sobre Fabricación, Caracterización y Uniformidad Se usan diferentes sistemas de expresión basados en células para fabricar productos medicinales, tales como bacterias (Escherichia coli, Pseudomonas fluorescens), levaduras (Saccharomyces cerevisae, Pichia pastoris), células de mamíferos (p.ej., ovario de hámster chino (CHO, por sus siglas en inglés), línea celular NSO de mieloma de ratón, entre otros), células de insectos (células de Spodoptera frugiperda infectadas con baculovirus) y células vegetales (tabaco, Arabidopsis, arroz). El perfil particular de las proteínas de células huésped es único y específico de cada tipo de células huésped, en condiciones de cultivo y procesos de fabricación específicos. Las proteínas de células huésped puede variar en pi (-3-11) e hidrofobicidad, y presentan una amplio intervalo de pesos moleculares (de -5 kDa a al menos -250 kDa), dependiendo de la célula huésped y del proceso de fabricación usado. El número de proteínas de células huésped en muestras del proceso previo a la purificación (upstream) puede ir desde varios cientos hasta más de mil proteínas, dependiendo de la célula huésped y de las condiciones de cultivo. Aunque históricamente se ha usado una gran cantidad de huéspedes celulares en la fabricación biofarmacéutica, la mayor experiencia se ha obtenido usando E. coli y las células de mamíferos CHO, NSO, SP2/0, y la línea celular HEK293 de riñón embriónico humano. La guía provista en este capítulo se basa principalmente en la experiencia con estos sistemas de expresión; sin embargo, los principios generales se aplican ampliamente a cualquier sistema de célula huésped. En células de mamíferos, la proteína recombinante por lo general se secreta de las células al fluido del cultivo celular (CCF, por sus siglas en inglés), junto con muchas de las proteínas de las células huésped. Sin embargo, se ha observado que el tráfico de proteína intracelular puede no proceder de manera normal en los cultivos de producción. Por ejemplo, las proteínas que por lo regular se asocian con organelas intracelulares, tales como lisosomas, pueden encontrarse en el fluido del cultivo celular de cultivos celulares altamente viables, debido a que los clones han sido seleccionados para la máxima exportación de proteína. Además, a medida que mueren algunas de las células, sus proteínas intracelulares solubles son liberadas en el fluido del cultivo celular. Algunas de las operaciones de cosecha también lisan las células; por lo tanto, el fluido del cultivo celular cosechado resultante por lo regular contiene proteínas de células huésped secretadas e intracelulares. Mientras esta mezcla de proteínas se incuba en el fermentador, pueden ocurrir cambios adicionales en la población de proteínas de células huésped, por ejemplo, como resultado de la actividad enzimática (p.ej., proteinasas o sialidasas). Los ensayos de proteínas de células huésped proveen información importante sobre la composición del material que ingresa en el proceso de recuperación a partir de la purificación (downstream) y la forma en que cada paso de purificación afecta la depuración de proteínas de células huésped. En algunos casos, las proteínas de células huésped pueden incluso unirse, y co-purificarse, con algunos productos. La caracterización del proceso y los estudios de validación son necesarios para mostrar qué pasos del proceso eliminan las proteínas de células huésped y también para demostrar la robustez de estos pasos para eliminar de manera uniforme las proteínas de células huésped. Como tal, los ensayos de proteínas de células huésped son una parte esencial del desarrollo del proceso de purificación y ayudan a asegurar la uniformidad en la fabricación. Por último, pueden requerirse ensayos de proteínas de células huésped reproducibles y confiables para medir las proteínas de células huésped residuales remanentes en el fármaco usado para fabricar el medicamento que se administra al paciente. Los niveles de proteínas de células huésped deben medirse en: 1) lotes preclínicos usados en la evaluación toxicológica, 2) todos los lotes durante el desarrollo clínico y 3) muestras de validación del proceso a partir del proceso de fabricación final. Después de la aprobación, puede requerirse el monitoreo de proteínas de células huésped como un elemento del sistema de control. Las secciones subsiguientes de este capítulo tratan en mayor detalle el uso de ensayos de proteínas de células huésped en la validación del proceso y en un sistema de control que cumpla con las buenas prácticas de fabricación (BPF).
2. TERMINOLOGÍA Para ayudar a establecer la nomenclatura común en la literatura y con las autoridades reglamentarias, la Tabla 7 lista términos comunes con sus definiciones (indicando la forma en que se usan en este capítulo) además de los sinónimos usados históricamente. Se debe tener en cuenta que el término "plataforma" indica que dentro de una empresa se usa el mismo conjunto de estándares y reactivos para analizar una variedad de productos fabricados a partir del mismo sistema de expresión (p.ej., células de CHO) cultivadas en condiciones similares en el proceso previo a la purificación (upstream). En el caso de las valoraciones en plataforma de proteínas de células huésped (plataforma HCP), los anticuerpos contra las proteínas de células huésped se obtienen a partir de animales inmunizados con antígenos de proteínas de células huésped generados mediante un proceso común previo a la purificación (upstream) que es aplicable a una gran cantidad de productos, incluso si las purificaciones realizadas a partir del proceso de purificación (downstream) son diferentes. Este enfoque permite aprovechar el conocimiento de productos anteriores. Por consiguiente, la justificación de que un ensayo es adecuado para un nuevo producto, usando el mismo sistema de expresión y condiciones de proceso previo a la purificación (upstream) comunes, es a menudo relativamente simple. El inmunógeno de las proteínas de células huésped usado para generar la plataforma de anticuerpos anti-HCP y a menudo usado como estándar de calibración del ensayo está compuesto, por diseño, por un conjunto amplio de proteínas de las células huésped. Por el contrario, el calificativo "específicos del proceso" indica que el inmunógeno/estándar ha sido preparado a
USP 39
Información General/ (1132) Proteína Residual Células Huésped 1547
partir de un conjunto de proteínas de células huésped único para un proceso determinado (un proceso de cultivo celular pre-
vio a la purificación (upstream) único o un proceso de purificación único a partir de la etapa de purificación (downstream)). Los ensayos específicos del proceso tienen, por lo tanto, una utilidad limitada, y cada una debe calificarse cabalmente para cada proceso. Los inmunógenos y estándares de calibración específicos del proceso son, intencionalmente, más estrechos y específicos para un proceso determinado. Los ensayos "disponibles comercialmente" producidos por proveedores a menudo se derivan de una combinación de cepas y procedimientos de recolección/purificación, y dichos ensayos están destinados para una aplicación más amplia; sin embargo, estos ensayos disponibles comercialmente no están específicamente diseñados para la línea celular patentada por un fabricante dado, y los usuarios no tienen control sobre la disponibilidad del reactivo ni la uniformidad entre lotes. Tabla 1. Terminología asociada con las proteínas de células huésped Término
Definición
Disponible comercialmente
Disponible al público para venta comercial; por lo regular, se trata de una combinación de aislados de proceso previo a la purificación (upstream) y anticuerpos correspondientes fabricados por el proveedor y que se vende como reactivos o kits.
Genérico
Plataforma
El mismo conjunto de un estándar de proteínas de célula huésped y anticuerpos es desarrollado con una cepa de células huésped patentada por la compañía y se usa ampliamente dentro de un tipo (p.ej, CHO) en diversos productos cuando las condiciones del proceso previo a la purificación (upstream) son similares.
Personalizado, desarrollado internamente, de patente
Específico del proceso previo a la purificación (upstream)
Ensayo diseñado a partir de material en donde el proceso de cultivo previo a la purificación (upstream) se desvía de manera significativa de la plataforma. Esto por lo general se presenta antes de cualquier purificación y puede aplicarse a más de un producto si estos parámetros son similares.
Personalizado, desarrollado internamente, específico del producto, de patente
Específico del proceso a partir de la purificación (downstream)
Ensayo diseñado a partir de materiales obtenidos de operaciones unitarias del proceso a partir de la purificación (downstream) que se usan para enriquecer la población de proteínas de célula huésped. Esto puede aplicarse a más de un producto si estos parámetros son similares. Esto se usa raramente en la actualidad y no se recomienda excepto para algunos productos con procesamiento a partir de la purificación (downstream) excepcional.
Personalizado, desarrollado internamente, específico del producto, de patente
Ensayo para una proteína individual de célula huésped
Ensayo que usa un estándar compuesto de una proteína de célula huésped conocida, individua! e identificada y sus anticuerpos específicos.
Ensayo de un analito individual o Personalizado, específico para proteínas de células huésped
Cobertura
Describe la evaluación del nivel de reconocimiento que una población de anticuerpos policlonales hace sobre la población de proteínas de células huésped. La evaluación de cobertura puede realizarse sobre la población de proteínas de células huésped usada como el antígeno de proteínas de células huésped o a partir del cultivo de producción del producto.
Calificación
Demostración de la aptitud de los métodos analíticos (incluyendo los reactivos usados en estos métodos) para su aplicación prevista a un proceso y muestras del proceso determinadas.
Purificación por afinidad con proteínas A o G
Purificación por afinidad de anticuerpos con Proteínas A o G inmovilizadasª
Cromatografía de afinidad
Purificación por afinidad de proteínas de células huésped
Purificación por afinidad de anticuerpos usando proteínas de célula huésped inmovilizadas (antígeno)ª
Cromatografía de afinidad, cromatografía de inmunoafinidad
Célula nula
Se refiere a la cepa celular usada para la producción que no contiene los elementos gené- Célula parental, blanco o con transfección simulada ticos específicos del producto; incluye células parentales sin transfectar y células transfectadas con el vector de expresión pero sin el gen del producto.
ng/mg
Cantidad numérica (relación) de proteínas de célula huésped por producto, en la que ng representa la masa de las proteínas de célula huésped y mg representa la masa del produeto. Se calcula dividiendo la concentración de proteína de célula huésped (ng/ml) por la concentración de proteína del producto (mq/ml).
ª
Sinónimos históricos
ppmb
En algunos casos, se realizan ambas purificaciones, por lo regular primero con proteína A o G y luego por afinidad con las proteínas de células huésped. Aunque las ppm se han usado históricamente, dicho término no se recomienda debido a que se usa para reflejar la masa por volumen unitario para otros tipos de pruebas. Se reconoce que la unidad ng se usa convencionalmente como un valor derivado de la interpolación de una curva estándar de proteínas de célula huésped (en unidades de ng/ml), en donde la señal refleja la unión de anticuerpos, a diferencia de la medición de concentración de proteínas terapéuticas, que no estrictamente refleja la masa de proteínas de células huésped que pueden estar presentes.
b
1548 (1132) Proteína Residual Células Huésped / Información General
USP 39
3. MÉTODOS DE INMUNOENSAYO DE PROTEÍNAS DE CÉLULAS HUÉSPED Los métodos de inmunoensayo se basan en anticuerpos que reconocen, con la mayor amplitud posible, la población de proteínas de células huésped que ingresan en el proceso de purificación (downstream); por lo tanto, el inmunoensayo tipo sándwich, diseñado con anticuerpos policlonales, es eficaz para el monitoreo y cuantificación de proteínas de células huésped. Este formato de ensayo ofrece una combinación de alta sensibilidad, especificidad, rendimiento, potencial de automatización, respuesta rápida, resultados cuantitativos y bajo costo por ensayo imposible de igualar por otra tecnología de ensayo actualmente disponible. Otros formatos de inmunoensayo (p.ej., inmunoensayos competitivos) pueden o no ser adecuados debido a que no cuentan con la especificidad o la sensibilidad lograda por el formato tipo sándwich. Aunque estos métodos resultan en un valor individual de proteínas de célula huésped para un lote dado, el número puede proveer un mayor peso a las proteínas de células huésped cuyos anticuerpos de alta afinidad están presentes en los reactivos-y un peso bajo o nulo a las proteínas de células huésped que no son reconocidas, o que son reconocidas por anticuerpos de baja afinidad en el ensayo. Por estas razones, a menudo se requieren mediciones ortogonales de pureza del producto. La sección 5. Tecnologías de Apoyo para la Detección, Identificación y Medición de Proteínas Residuales de Células Huésped provee más detalles sobre estos métodos. Los principios y el diseño básicos de los inmunoensayos se tratan en el capítulo Métodos de Pruebas Inmunológicas-Ensayo por lnmunoadsorción Ligado a Enzimas (ELISA) (1103) de la USP. El formato más comúnmente usado para el análisis de proteínas de célula huésped es el inmunoensayo tipo sándwich con sistemas de detección tales como calorimétrico, electroquimioluminiscente, quimioluminiscente, radioactivo, entre otros. Los inmunoensayos homogéneos, incluidos ensayos competitivos, en los que todos los reactivos se combinan de una sola vez y la unión ocurre en un solo paso sin lavado, pueden ser problemáticos debido al exceso de antígenos que puede generar problemas de insuficiencia de anticuerpos (tratado más adelante en este capítulo); por lo tanto, estos formatos deben usarse con cuidado. Por lo general se prefiere el formato de inmunoensayo tipo sándwich heterogéneo descrito en el capítulo (1103), debido a que el intervalo dinámico y la sensibilidad pueden verse reducidos en el formato homogéneo. Los formatos, con sus ventajas y desventajas, se tratan con mayor profundidad en el capítulo Métodos de Pruebas Inmunológicas-Consideraciones Generales (1102). El análisis de datos por lo general se realiza con un ajuste no lineal de la curva sigmoidea generada por un amplio intervalo de concentraciones estándar, aunque algunos análisis pueden enfocarse en el extremo inferior de la curva para una mayor sensibilidad.
3.1 Ciclo de Desarrollo del Ensayo La Figura 7 ilustra los planes comunes de desarrollo de ensayos, dependiendo de los reactivos disponibles en diversas etapas. Se requieren menos estudios puente cuando: 1) se encuentran disponibles reactivos de plataforma y 2) los procesos previos a la purificación (upstream) son históricamente uniformes. La Figura 7A ilustra un escenario en el que no se encuentran disponibles métodos de plataforma, y se usa un ensayo disponible comercialmente hasta la etapa de validación del proceso con calificación apropiada del ensayo. Para la fase 111 y posteriores, se prefiere un método de plataforma o previo a la purificación (upstream) específico del proceso. Se debe realizar un estudio puente para justificar el reemplazo de ensayos. Si el ensayo comercial está destinado para la fase 111 y para la aprobación posterior, se debe tener cuidado de demostrar cabalmente que los reactivos del ensayo son aplicables a las proteínas de células huésped del proceso. Una consideración adicional es que los reactivos provienen de un proveedor externo sobre el cual el fabricante biofarmacéutico tiene menos control.
Figura 1A. Cuando no existe un ensayo de plataforma antes de iniciar el desarrollo del producto. Figura 1 B. Cuando existe un ensayo de plataforma antes de iniciar el desarrollo del producto. La Figura 7B sugiere que puede usarse un ensayo de plataforma a través de todas las etapas del desarrollo del producto cuando ya se encuentre disponible al momento de iniciar el desarrollo del producto. El ensayo de plataforma debe calificarse para cada nuevo producto. Puede ser necesario cambiar a un ensayo (upstream) específico del proceso previo a la purificación para la fase 111 o para la validación del proceso y etapas posteriores, si el proceso del cultivo celular sufre cambios importantes con respecto al proceso de plataforma, y puede introducir poblaciones de proteínas de células huésped significativamente distintas. Se debe realizar un estudio puente para justificar el reemplazo de ensayos. Se deben considerar las limitaciones de un ensayo de proteínas de células huésped específico para el proceso a partir de la purificación (downstream), debido a que puede ser tentador pensar que los ensayos de proteínas de células huésped se mejoran tomando las proteínas de células huésped de una expresión nula a lo largo de las primeras columnas e inmunizando ani-
USP 39
Información General/ (11 32) Proteína Residual Células Huésped 1549
males con una combinación de columna del proceso a partir de la purificación (downstream). Históricamente, la lógica era que el inmunógeno y el estándar se enriquecerían con aquellas proteínas de células huésped con la probabilidad más alta de ingresar al proceso de recuperación y estar presentes en el producto final. Esta estrategia se basaba en la suposición de que, en vez de contar con miles de proteínas irrelevantes en el inmunógeno, sólo aquellas con la mayor probabilidad de estar presentes en el proceso estarán presentes en el inmunógeno; por ende, el ensayo resultante se enfocará en aquellas proteínas de células huésped de mayor interés. Las preocupaciones potenciales que pueden surgir como resultado de este enfoque son: 1. Si se usan únicamente proteínas de células huésped derivadas de una combinación de células nulas a partir de la primera columna, entonces los cambios posteriores durante el desarrollo del proceso (p.ej., cambios en las condiciones de corrida de la columna) podrían invalidar el ensayo de proteínas de células huésped. Por ende, el desarrollo del proceso se vuelve muy restringido e implica el riesgo de requerir el desarrollo de múltiples ensayos de proteínas de células huésped por cambios pequeños en el proceso (o la necesidad de manejar la incertidumbre). 2. Las ca-purificación de algunas proteínas de células huésped con un producto puede deberse a que éstas se unen directa o indirectamente con la proteína del producto. Una corrida de célula nula de una columna sin la proteína del producto dejaría escapar dichas proteínas de células huésped. 3. La adsorción no específica a resinas cromatográficas es común y, a menudo, no es un fenómeno reproducible. En comparación con el primer pasaje, los pasajes subsiguientes del material de corrida de célula nula por una columna probablemente producirán un conjunto distinto de proteínas de células huésped después del pasaje por una nueva resina de columna.
3.2 Desarrollo y Caracterización de Reactivos de Proteínas de Células Huésped 3.2.1 PREPARACIÓN DE ANTÍGENO/ ESTÁNDAR DE PROTEÍNAS DE CÉLULAS HUÉSPED Según se describió en la sección 1.1 Consideraciones sobre Fabricación, Caracterización y Uniformidad, el "antígeno" de proteínas de células huésped total es una población compleja de proteínas; por lo tanto, al generar el reactivo de estándar/antígeno de proteínas de células huésped, es importante asegurar que: 1) el estándar de calibración sea representativo de la línea celular y del proceso de fabricación, 2) su concentración de proteínas se ha cuantificado con exactitud y 3) el inmunógeno se administra de forma tal que genera anticuerpos policlonales que son reactivos a la mayor cantidad posible de proteínas de células huésped. La composición del antígeno de proteínas de células huésped debe ser lo suficientemente integral para tolerar los cambios normales en el proceso de fabricación durante el ciclo de vida de los productos. Además de los usos citados anteriormente, el antígeno de proteínas de células huésped también puede ser necesario para preparar la columna de afinidad para la purificación de antisueros. Si se usa la purificación por afinidad, la cantidad de antígeno de proteínas de células huésped requerida debe planearse con cuidado. La cantidad producida deber ser lo suficientemente grande para proveer un inventario suficiente para muchos años (a menudo 10-20 años); idealmente, para el ciclo de vida completo del producto. Sin embargo, el proceso de preparación del antígeno debe llevarse a cabo y documentarse de una forma que facilite un potencial reabastecimiento. Debido a que el ensayo de proteínas de células huésped se usa para analizar muestras de fármacos que contienen trazas de impurezas de proteínas de células huésped, cualquier reactividad cruzada de los anticuerpos anti-HCP con el producto puede comprometer el método de prueba y generar resultados sesgados. Por lo tanto, se debe evitar cualquier contaminación del antígeno de proteínas de células huésped con el producto para evitar la generación de anticuerpos anti-producto. 3.2.1.1 Preparación de antígenos de proteínas de células huésped a partir de células de mamíferos: La mayoría de los productos biofarmacéuticos producidos en la actualidad se expresan en células de mamíferos, p.ej., células de CHO. La Figura 2 describe un proceso típico para la preparación del antígeno de proteínas de células huésped de CHO. Células nulas cultivadas en biorreactores
El líquido de cultivo celular en fase líquida se separa de las
células y los desechos celulares mediante centrifugación
Figura 2. Ejemplo de preparación de antígeno de proteínas de células huésped de mamífero. El primer paso es establecer una célula nula que no exprese el gen del producto, ya sea usando células no transfectadas (es decir, células parentales) con un origen común con aquellas usadas para fabricar el producto solo, o transfectarlas con el vector usado para crear la línea celular de producción sin el gen codificante del producto (proceso históricamente descrito como una transfección "simulada"). La ventaja principal para el segundo procedimiento es que se expresan marcadores selectivos (p.ej., dihidrofolato reductasa o glutamina sintetasa). Alternativamente, se pueden producir anticuerpos específicos de marcadores selectivos de manera independiente. Otra ventaja es que las células nulas con transfección simulada expresan marcado-
1550 (11 32) Proteína Residual Células Huésped / Información General
USP 39
res de selección y pueden cultivarse en condiciones de cultivo celular que simulen de manera más cercana el proceso de fabricación. El uso de combinaciones (pools) de líneas de células nulas transfectadas simuladas que no hayan sido clonadas permite la máxima diversidad genética potencial y, por lo tanto, provee el mayor potencial de generar una población amplia de proteínas de células huésped. Sin embargo, estos cultivos, que se siembran con combinaciones de células (no clonadas), pueden mostrar una mayor variabilidad entre corridas. Ambos enfoques [no transfectados (parental) y transfectados simulados] se usan comúnmente y también están expuestos a los siguientes problemas: el proceso de cultivo celular optimizado para el clon de producción puede no conllevar a una viabilidad y densidad celular similares de las células nulas. Además, en ausencia de las tensiones experimentadas por las células que producen grandes cantidades de proteínas del producto, las líneas celulares nulas pueden presentar un perfil de proteínas de células huésped distinto. Estos cambios en la viabilidad, el metabolismo celular y la densidad celular pueden alterar el perfil de proteínas de células huésped del antígeno, volviéndolo menos representativo del proceso de fabricación. Más adelante se trata la selección de condiciones apropiadas para la preparación del antígeno de proteínas de células huésped. Una vez que se han establecido las células nulas, el antígeno de proteínas de células huésped se prepara en un biorreactor, en un matraz de cultivo celular o en una bolsa de cultivo celular que refleje las condiciones del producto o del cultivo celular del proceso. Se puede aplicar un proceso de cultivo celular de plataforma, lo cual representa un proceso de fabricación común para diversos productos (p.ej., anticuerpos monoclonales derivados de CHO). Por lo regular, el antígeno de proteínas de células huésped resultante se procesa al mínimo para asegurar un espectro amplio de proteínas de células huésped, lo que vuelve al antígeno adecuado para el monitoreo de las proteínas de células huésped de múltiples productos generados a partir del proceso de plataforma. Un antígeno de plataforma HCP también puede producirse combinando diversas corridas de células nulas en condiciones de cultivo celular ligeramente distintas (p.ej., permitiendo que el cultivo permanezca en el biorreactor por periodos más largos para variar la viabilidad celular). Este enfoque se usa para obtener un espectro de proteínas de células huésped más amplio, y los antisueros generados contra este inmunógeno pueden ser adecuados para la detección de proteínas de células huésped en productos generados a partir de una variedad de procesos ligeramente distintos. Estos reactivos también pueden incrementar la robustez del inmunoensayo de proteínas de células huésped con respecto a cambios en el proceso. Alternativamente, el antígeno de proteínas de células huésped puede prepararse usando un enfoque (upstream) específico del proceso previo a la purificación en el que el proceso de cultivo celular se diseña para replicar el proceso de producción para un producto único o proceso específico. La ventaja de este enfoque puede ser la alta relevancia del antígeno de proteínas de células huésped resultante para un proceso previo a la purificación (upstream) particular. Al igual que con los reactivos de plataforma, debido a que no se incluyen pasos adicionales de purificación de procesamiento, el antígeno contiene una amplia variedad de proteínas de células huésped, y el antígeno a menudo seguirá siendo adecuado para el monitoreo de proteínas de células huésped después de los cambios en el proceso de producción a partir de la purificación (downstream). La desventaja de este enfoque es que el uso de reactivos por lo regular se verá limitado a un solo (o unos pocos) producto(s) o proceso(s). El antígeno de proteínas de células huésped puede producirse a partir de una corrida representativa a escala pequeña, a escala piloto o a escala de producción. Existen ventajas y desventajas para cada enfoque. La escala piloto o de producción puede replicar mejor el proceso real; no obstante, puede no reflejarse la variación normal entre corridas de cultivo celular si se aplica únicamente una corrida a gran escala. Por el contrario, se pueden combinar diversas preparaciones a pequeña escala y se puede reflejar de mejor manera la variabilidad entre corridas del proceso de cultivo celular. Independientemente de la escala, se debe evitar de forma enfática la presencia del producto, debido a que su presencia en el inmunógeno de proteínas de células huésped comprometerá la calidad de los antisueros del inmunoensayo resultantes. Después de realizar la corrida de célula nula, el antígeno de proteínas de células huésped puede prepararse a partir del lisado celular, del fluido del cultivo celular concentrado o como una mezcla de ambos, según se muestra en la Figura 2. Si el antígeno se prepara a partir del fluido del cultivo celular, las células pueden recolectarse en el momento cuando se lleve a cabo la recolección de la línea de producción o algunos días después, a fin de permitir el lisado de algunas de las células y que liberen proteínas de células huésped en el fluido del cultivo celular, con lo que se amplía el espectro de proteínas de células huésped. Para preparar inmunógeno a partir de lisado celular, las células se recolectan mediante centrifugación y los pellets de células se lavan y se lisan (p.ej., usando ciclos repetidos de congelación/descongelación, u homogenización a alta presión). Las condiciones que por lo regular se seleccionan para replicar el proceso de producción (es decir, para preparar el inmunógeno a partir del fluido del cultivo celular, las células y los desechos se eliminan mediante centrifugación y, posteriormente, el fluido de cultivo celular se trata mediante ultrafiltración/diafiltración). La solución amortiguadora se intercambia (p.ej. a PBS o HEPES) y el fluido del cultivo celular se concentra. El corte para la filtración debe seleccionarse para minimizar la pérdida de proteínas de células huésped, p.ej., 1 O kDa o menor. 3.2.1.2 Preparación de antígenos de proteínas de células huésped a partir de células bacterianas: Muchos de los principios descritos anteriormente usados en la preparación de antígenos de proteínas de células huésped de mamíferos también aplican a cultivos celulares de células procarióticas. Sin embargo, se deben considerar algunos desafíos únicos. En particular, los procesos de fabricación para sistemas de expresión bacteriana son más variados, como aquéllos que generan depósitos de proteínas concentradas conocidos como cuerpos de inclusión, los cuales pueden representar hasta 95% del total de proteínas de células. Las impurezas de proteínas de células huésped también están presentes en los cuerpos de inclusión, incluidas proteínas de membrana bacteriana, proteínas de subunidad ribosomal y proteínas citoplásmicas, tales como proteínas pequeñas de choque térmico o chaperonas. La formación de cuerpos de inclusión en la cepa de producción hace más difícil generar una preparación de proteínas de células huésped representativa a partir de un proceso de fermentación de células nulas. La célula
USP 39
Información General/ (1132) Proteína Residual Células Huésped 1551
nula puede no tener el mismo perfil de proteínas de células huésped y no generará cuerpos de inclusión cuyas proteínas de células huésped específicas puedan ca-purificarse, tal como se describió con anterioridad. En otros casos, las proteínas de células huésped han sido creadas a partir de sistemas de secreción periplásmicos, si el proceso de producción puede replicarse en la célula nula. Debido a que no existe un enfoque obvio para superar estas limitaciones, en la práctica, el antígeno de proteínas de células huésped bacterianas por lo general se genera a partir de lisados de células lavadas, usando fermentaciones de células nulas, que se cultivan e inducen en condiciones que representan en la mayor medida posible el proceso de fabricación previo a la purificación (upstream). Como en el caso de cualquier antígeno de proteínas de células huésped, es necesario demostrar que el perfil de proteínas de células huésped es representativo del proceso de fabricación antes de usarlo en el desarrollo de la valoración. Este enfoque genera el conjunto completo de proteínas de células huésped expresadas y, por lo tanto, es muy amplio. Debido a que la mayoría de los animales han sido expuestos a antígenos bacterianos y pueden tener anticuerpos preexistentes a muchas proteínas de células bacterianas, es importante caracterizar las respuestas del anticuerpo preexistente y, de ser apropiado, considerar el uso específico de animales exentos de patógenos La presencia de niveles significativos de anticuerpos anti-HCP preexistentes puede confundir el análisis de las respuestas de anticuerpos; por lo tanto, es importante analizar los sueros preinmunes de los animales para detectar la presencia de anticuerpos preexistentes antes de la inmunización. Las células bacterianas nulas transfectadas con el vector de expresión contienen genes chaperones que pueden expresarse a niveles altos (p.ej., 5% del total de proteínas de células huésped). Dicha sobreexpresión de impurezas de proteínas de células huésped particulares pueden requerir el desarrollo de ensayos de analito individual para estas impurezas particulares (ver 6. 1 Ensayos para Proteínas de Células Huésped Individuales).
3.2.1.3 Caracterización del antígeno de proteínas de células huésped: Se recomiendan diversos análisis antes de la inmunización: 1) contenido de proteína (ensayo de proteínas totales); 2) ausencia de producto (según se demuestra mediante transferencia Western (Western blot), inmunoensayo y/o análisis por Espectrometría de Masas); y 3) caracterización mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE, por sus siglas en inglés) unidimensional o bidimensional. La concentración de proteínas se mide para establecer la concentración estándar para uso futuro y para determinar la cantidad general del antígeno preparado. Los métodos más comúnmente usados son el ensayo con ácido bicinconínico, el ensayo Bradford y el análisis de aminoácidos, aunque los métodos calorimétricos requieren un estándar (p.ej., albúmina sérica bovina) que no está bien apareado con el analito (proteína de célula huésped). La absorbancia a 280 nm (A280) también puede usarse, aunque es menos específica para proteína (p.ej., también se medirán los ácidos nucleicos). Estas metodologías a menudo proveen resultados similares, pero algunos métodos pueden verse afectados de manera más significativa que otros por la presencia de sustancias interferentes. Se debe considerar el uso de dos métodos ortogonales para excluir una sobre o subestimación grosera de la concentración de proteína por un método particular. Para mayor información, ver el capítulo general Artículos Obtenidos por Biotecnología-Valoración de Proteínas Totales (1057), el cual trata las ventajas y desventajas de diversos métodos de análisis de proteínas. La concentración de proteínas de células huésped debe asignarse mediante un enfoque científicamente sólido que se use de manera uniforme durante todo el ciclo de vida. La falta de producto puede evaluarse con geles, transferencias Western de anticuerpos anti-producto u otros métodos adecuados. Por último, los geles unidimensionales o bidimensionales ayudan a caracterizar el patrón de proteínas de células huésped, demuestran la presencia de un espectro amplio de proteínas, y demuestran la presencia de una correspondencia razonable con la producción. Sin embargo, esto puede ser desafiante debido a la presencia de grandes cantidades del producto, lo que puede complicar la detección de proteínas de células huésped. Se pueden realizar comparaciones entre las poblaciones específicas de proteínas huésped producidas en cultivos nulos y en cultivos de producción usando los métodos ortogonales tratados en 5. Tecnologías de Apoyo para la Detección, Identificación y Medición de Proteínas Residuales de Células Huésped.
3.2.1.4 reactivos estándar de referencia para proteínas de células huésped: El material de proteínas de células huésped congeladas es por lo regular estable durante un periodo muy largo, pero se debe monitorear la estabilidad de los reactivos estándar de proteínas de células huésped con el paso del tiempo debido a que la vida del ensayo puede ser muy larga. La estabilidad del estándar de proteínas de células huésped puede confirmarse monitoreando el desempeño del estándar de proteínas de células huésped en el inmunoensayo de proteínas de células huésped, así como en métodos ortogonales. Se pueden establecer controles apropiados dentro del intervalo del ensayo para monitorear el desempeño de este último. Se pueden preparar controles a partir de diluciones independientes del estándar de proteínas de células huésped, muestras de producto o combinaciones intermedias, o muestras de producto adicionadas. Sin embargo, existe el ligero riesgo de que las muestras de control preparadas como dilución a partir del mismo material estándar de proteínas de células huésped puedan degradarse a la misma velocidad que el estándar de proteínas de células huésped sin diluir, y que la degradación del estándar no sea detectada. Para mitigar el riesgo, a menudo se evalúan los datos de diversos parámetros de curva estándar (p.ej., señal, fondo, pendiente, coeficiente de determinación) para cada valoración y se usan para determinar la estabilidad del estándar de proteínas de células huésped. El uso de material diferente al de referencia para preparar controles ayudará a asegurar que la velocidad de degradación sea independiente, con lo que la degradación del estándar de proteínas de células huésped podrá detectarse con facilidad. Se pueden establecer y usar diagramas de control del ensayo para registrar parámetros de curvas de referencia, valores de muestras de control e información específica del lote para los reactivos críticos, tales como anticuerpos contra proteínas de células huésped marcados. Se deben establecer intervalos aceptables para los controles fundamentados en múltiples corridas (por lo regular 20-30) y se pueden usar como parte de los criterios de aceptación de los ensayos de rutina. Además, los valores para el coeficiente de variación % del estándar y de las determinaciones repetidas del control son a menudo una parte de los
1552 (11 32) Proteína Residual Células Huésped / Información General
USP 39
criterios de aceptación del ensayo. Las diferencias con el paso del tiempo en el desempeño de la curva estándar de proteínas de células huésped o de los niveles de control de proteínas de células huésped, o un incremento en la variabilidad del ensayo, pueden indicar una falta de estabilidad del estándar de proteínas de células huésped.
3.2.2 PREPARACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE ANTICUERPOS
3.2.2.1 Preparación de anticuerpos contra proteínas de células huésped: Los anticuerpos anti-HCP preparados a menudo se usan para muchas aplicaciones (transferencias Western, inmunoensayo) durante un periodo largo (p.ej., la vida anticipada de un producto o plataforma). Por lo tanto, las necesidades de materiales no deben subestimarse. La cantidad de antisueros recomendada dependerá de muchos factores incluyendo el uso previsto, la cantidad predicha que se purifica a partir de un volumen dado de antisuero, la cantidad para recubrir placas de microtitulación y muchas otras consideraciones. La selección de especies animales usadas para generar anticuerpos anti-HCP es guiada por el inmunógeno, por los requisitos del método particular y las preferencias de cada investigador. A menudo se seleccionan conejos, ovejas y cabras para los programas de inmunización. En algunos casos, se han usado múltiples especies animales, en los cuales, el uso de especies más filogenéticamente distantes de los mamíferos (p.ej., pollos) ha ayudado a generar anticuerpos anti-HCP para proteínas de células huésped de mamíferos conservadas. La selección de especies animales también puede ser guiada por el deseo de incrementar la cantidad de antisueros disponibles a partir de uno o varios animales (cabras u ovejas), o de usar una estrategia para obtener una mayor diversidad de respuestas provista por el uso de una cantidad mayor de animales individuales de una única especie(p.ej., conejos). El número de animales seleccionado para generar las combinaciones de antisuero depende de las especies usadas y de la duración del protocolo de inmunización. Si se usan animales más pequeños para generar el antisuero, por lo general se requerirán más animales individuales (p.ej., 10-20 conejos). Por el contrario, si se usan animales más grandes (cabras u ovejas), los investigadores por lo regular inmunizarán 3-1 O animales por protocolo. Los protocolos de inmunización típicos proveen aproximadamente 100-150 mL de antisuero por conejo o aproximadamente 500 mL de antisuero por cabra, y el total generado de anticuerpo purificado de Proteína A o Proteína G es aproximadamente 1 gramo por conejo o 5 gramos por cabra. Los animales deben analizarse para detectar anticuerpos contra fármacos preexistentes antes de la inmunización. Si se arrojan resultados positivos, entonces estos animales deben excluirse de la inmunización. Se mezcla una porción del antígeno de proteínas de células huésped preparado con un coadyuvante apropiado (más comúnmente, adyuvante de Freund o en combinación con adyuvante incompleto) y usado para la inmunización de animales. Cada animal recibe una estimulación inicial de la inmunización, seguida de múltiples inmunizaciones de refuerzo (a menudo de 4 a 8), para madurar la respuesta inmune y generar respuestas de anticuerpos de títulos altos de alta afinidad. El antisuero se recolecta a partir de cada animal antes de la estimulación inicial de la inmunización (tiempo O) y en intervalos apropiados (por lo general 10-14 días) después de las dosis de refuerzo. Por lo regular se recolectan de cuatro a seis sangrías de cada animal. Sin embargo, la duración del protocolo de inmunización puede extenderse incrementando el número de inmunizaciones de refuerzo, posibilitando la recolección de antisueros adicionales con títulos altos. Otras estrategias de inmunización también pueden ser útiles (p.ej., inmunización en cascada o fraccionamiento por tamaño del inmunógeno de proteínas de células huésped). Los investigadores deben realizar análisis de títulos o de transferencia Western de las sangrías de prueba individuales antes de combinar el antisuero para detectar y eliminar suero que 1) tenga título bajo, 2) muestre una respuesta inmune inmunodominante a un grupo pequeño de proteínas de células huésped, o 3) tenga características de unión o reactividad antiproducto no específicas. Esta evaluación debe realizarse también sobre las combinaciones de anticuerpos finales para demostrar la cobertura amplia de las proteínas de células huésped y la ausencia de unión al producto terapéutico. Además, algunos laboratorios han encontrado la utilidad de evaluar agregados en anticuerpos usando cromatografía de exclusión por tamaño según se describe más adelante. Las condiciones de elución con ácido pueden ocasionar la agregación de algunos anticuerpos y los multímeros de este tipo, en particular cuando se marcan con biotina o peroxidasa de rábano, pueden generar un aumento de fondo del ensayo. Además, algunos laboratorios incluyen un paso final de cromatografía de exclusión por tamaño a escala de proceso para reducir los niveles de agregados a niveles bajos (p.ej., <5%). A través de múltiples enfoques en el proceso de purificación de anticuerpos a partir de combinaciones de antisuero, se han generado exitosamente anticuerpos adecuados para su uso en inmunoensayos de proteínas de células huésped. La purificación de anticuerpos se realiza a menudo mediante cromatografía en columna por afinidad con Proteína A, Proteína G o proteínas de células huésped. La aplicación de perlas magnéticas recubiertas puede también proveer beneficios en algunos casos. La selección de Proteína A o Proteína G es guiada por el tipo de especie animal usado para generar el anticuerpo. Los fabricantes proveen protocolos estándar para estas purificaciones de anticuerpos de rutina. Al purificar anticuerpos anti-HCP por afinidad, se deben evitar materiales tales como resinas cromatográficas, que pudieran haber sido usadas previamente para otros productos, y se debe contar con ciclos de limpieza adicionales para minimizar el arrastre. Idealmente, los fabricantes deben usar una resina que nunca haya sido expuesta a un medicamento. Antes del paso de purificación por afinidad, algunos laboratorios también incluyen una precipitación inicial con sulfato de amonio al 50% del antisuero crudo para enriquecer y concentrar la fracción de anticuerpo y extender de esa forma el desempeño y la duración de uso de las columnas de afinidad. El uso de estrategias de purificación con Proteína A o Proteína G genera reactivos en los que los anticuerpos específicos anti-HCP constituyen una proporción pequeña del anticuerpo total. Por el contrario, las estrategias de purificación por afinidad para proteínas de células huésped purifican selectivamente anticuerpos específicos anti-HCP a partir de antisuero o de preparaciones enriquecidas con anticuerpos. En este caso, los antígenos de proteínas de células huésped se acoplan a una resina activada y el anti-
USP 39
Información General/ (1132) Proteína Residual Células Huésped 1553
suero se purifica mediante la columna siguiendo los protocolos establecidos o las instrucciones del fabricante de la resina. Los anticuerpos purificados pueden ser purificados aún más usando cromatografía de exclusión por tamaño para eliminar agregados, para posteriormente dializarlos, concentrarlos, dividirlos en alícuotas y almacenarlos congelados (por lo regular a -70º o menos). Asimismo, el antisuero sin diluir debe almacenarse congelado (ver el capítulo (1106) para información adicional sobre el almacenamiento de muestras de suero). La purificación por afinidad de anticuerpos específicos usando proteínas de células huésped inmovilizadas en una columna requiere una manipulación cuidadosa de la preparación de la columna y su uso para que sea reproducible confiablemente en purificaciones futuras. Además, si se vuelve a usar, se deben evaluar y controlar procedimientos apropiados para almacenamiento y regeneración de resina para evitar la degradación durante el almacenamiento. Cuando se realiza de forma adecuada, se considera un proceso confiable y reproducible que ha generado anticuerpos anti-HCP e inmunoensayos de proteínas de células huésped uniformes. Después de cargar la columna con antisueros, es crítico un procedimiento de lavado optimizado. Debido a que la preparación es una mezcla de anticuerpos con afinidades distintas, el lavado exhaustivo puede eliminar anticuerpos de baja afinidad. De manera similar, cargar grandes cantidades de antisuero anti-HCP en la columna puede resultar en anticuerpos de alta afinidad, desplazando anticuerpos de baja afinidad si reconocen los epítopes cercanos. En cualquier caso, los anticuerpos de baja afinidad pueden ser eliminados. En teoría, los anticuerpos de alta afinidad también pueden ser difíciles de eluir. Independientemente de las condiciones de carga y lavado seleccionadas al inicio para la purificación por afinidad específica para antígenos, estas condiciones deben mantenerse en los lotes de producción futuros de los anticuerpos. La Tabla 2 presenta una comparación entre estas dos estrategias de purificación. Ambos enfoques se usan comúnmente. Tabla 2. Estrategias de Purificación de Anticuerpos Tipo de Purificación
Ventajas
Cromatografía en Columna por Afinidad con Proteína A o G
Robusta y reproducible para separar rápidamente la fracción de lgG de otras proteínas del suero
Menor proporción de anticuerpos específicos contra proteínas de células huésped y puede tener una cantidad mayor de anticuerpos de baja afinidad
Cromatografía en Columna por Afinidad con Proteínas de Células Huésped
Enriquece anticuerpos específicos anti-HCP de alta afinidad; excluye anticuerpos no específicos y proteínas del suero
Se requieren mayores habilidades y documentación para fabricar y mantener resinas de manera uniforme. Algunos anticuerpos anti-HCP de alta afinidad pueden no ser eluidos de forma utilizable y podrían no ser recuperados
Desventajas
3.2.2.2 Caracterización de anticuerpos para proteínas de células huésped: Los anticuerpos preparados para captura y detección se evalúan independientemente y como parte del par de inmunoensayos tipo sándwich. La concentración del anticuerpo sin modificar se determina más comúnmente mediante absorbancia a 280 nm, análisis de aminoácidos o ensayo bicinconínico. Todos los enfoques son aceptables siempre que se apliquen de manera uniforme y (si es colorimétrico) que se estandarice de manera similar. Es importante determinar la concentración de los anticuerpos de captura y detección en cada partida debido a que se diluirán hasta una concentración dada en el método de inmunoensayo optimizado. Los anticuerpos de detección y captura se caracterizan por su desempeño en los métodos de inmunoensayo. La mejor relación de conjugación de marca y anticuerpos se debe evaluar empíricamente, basándose principalmente en su mejor desempeño en el ensayo. Esta relación óptima debe buscarse en el futuro cuando se fabriquen nuevos anticuerpos marcados. Finalmente, aunque los anticuerpos son por lo general muy estables cuando se almacenan congelados (p.ej., -70º), los investigadores deben asegurar la integridad del almacenamiento y determinar un periodo definido de uso. Esto se puede lograr monitoreando continuamente mediante diagramas de tendencias o mediante experimentos de recalificación en intervalos de tiempo específicos. La calidad del par de anticuerpos (captura y detector) a menudo se evalúa de dos maneras: 1. Demostrar que los pares de anticuerpos son específicos y sensibles en un formato de inmunoensayo para las proteínas de células huésped presentes en una serie de muestras tomadas de las operaciones unitarias de un esquema de purificación dado, incluido el fármaco. Este tema también se trata en más detalle en la sección 4. Validación de Métodos de lnmunoensayo de Proteínas de Células Huésped. Conceptualmente, la capacidad de detectar y medir proteínas de células huésped (inmunoreactividad) en una serie de muestras del proceso real obtenidas de un proceso determinado para un producto en desarrollo se demuestra mediante datos que indiquen: 1) la depuración secuencial a medida que el producto se purifica, 2) la linealidad de la muestra a lo largo de una serie de diluciones y 3) la ausencia de reactividad cruzada con el producto o la matriz. La reducción de proteínas de células huésped durante el proceso de purificación se determina mediante los factores de depuración en donde el contenido de proteínas de células huésped (en ng/mg) en cada paso del proceso se divide por la cantidad en el paso anterior. Por lo regular, las muestras de partida obtenidas del cultivo celular pueden tener niveles de proteínas de células huésped que van desde algunos cientos de miles hasta algunos millones ng/mg y los productos finales pueden tener niveles de proteínas de células huésped que van de <1 a 1 00 ng/mg (demostrando muchos logaritmos de depuración). Dichas tendencias, al ser observadas, sugieren que el proceso y el ensayo funcionan de manera efectiva, y que los anticuerpos usados en el inmunoensayo tienen atributos de calidad adecuados. El no observar estas tendencias, no necesariamente refleja un problema con los anticuerpos, debido a que también es posible que el proceso de purificación no sea efectivo. 2. Demostrar el reconocimiento de una amplia variedad de proteínas de células huésped en el estándar de calibración (es decir, que la cobertura de la población de proteínas de células huésped sea adecuada). La cobertura se evalúa al menos para los anticuerpos de captura usando transferencias Western en gel bidimensionales o fraccionamiento por inmunoafini-
USP 39
1554 (11 32) Proteína Residual Células Huésped / Información General
dad de la población total de proteínas de células huésped inmovilizando los anticuerpos anti-HCP en una columna. Además, se recomienda analizar la cobertura del anticuerpo de detección si se usan diferentes anticuerpos de recubrimiento y de detección. Los beneficios y limitaciones de usar geles bidimensionales o fraccionamiento por inmunoafinidad para demostrar la cobertura se trata en mayor detalle más adelante. Independientemente del método usado, el grado de cobertura debe indicarse al calificar los reactivos inmunoquímicos. Las evaluaciones de cobertura de las proteínas de células huésped ayudan a evaluar la capacidad de los anticuerpos para reconocer una amplia variedad de proteínas de células huésped en el estándar de calibración y aquellas presentes en las muestras del proceso y del fármaco. Existen dos métodos (los geles bidimensionales seguidos por análisis de transferencia Western y purificación por inmunoafinidad seguida por análisis en gel bidimensional) muy comúnmente usados y los cuales tienen la limitación de que tienden a subestimar la unión real del antígeno en los métodos de inmunoensayo, aunque pueden tener cierto valor al comparar dos preparaciones entre sí (o una plataforma con un reactivo comercial). Ambos procedimientos usan electroforesis reductora en gel bidimensional para separar las proteínas de células huésped en el estándar de proteínas de células huésped o en las muestras tempranas del proceso (p.ej., recolección). Las comparaciones de cobertura numérica deben usarse con precaución debido a la gran cantidad de variables del método y a la técnica requerida para reproducir resultados, incluso con los mismos reactivos en el mismo laboratorio. Debido a esta variabilidad, la mejor forma de evaluar los resultados es cualitativamente. Las comparaciones de partidas (o fuentes) de anticuerpos deben realizarse en paralelo en la mayor medida posible para determinar si los lotes de anticuerpos son comparables o si uno es superior al otro. El enfoque SDS-PAGE/Western es básicamente una comparación del número de manchas presentes en la membrana inmunológicamente teñida en función del número presente en un gel duplicado (o transferencia) teñido para proteína total (p.ej., mediante plata o colorante fluorescente; ver también el capítulo Métodos de Prueba Inmunológicos-Análisis por lnmunotransferencia (1104) de la USP). La tinción diferencial de cada preparación de anticuerpos puede potenciar el análisis, debido a que puede usarse para analizar el mismo gel bidimensional. El segundo enfoque de unión por inmunoafinidad/SDS-PAGE implica comparar el flujo y el eluato con la carga del estándar de calibración de proteínas de células huésped (o de la muestra de proceso temprana) pasada por una resina en la que los anticuerpos de captura se han inmovilizado de manera covalente. La resina se lava después de la carga y antes de la elución para eliminar las proteínas de células huésped unidas de manera no específica. Para el propósito de la comparación de muestra, puede ser útil la tecnología de electroforesis en gel por diferencia (DIGE, por sus siglas en inglés). La Tabla 3 lista las ventajas y desventajas de estos dos métodos de cobertura. Tabla 3. Comparación de Métodos de Cobertura Ventajas
Desventajas
La buena separación de proteínas de células huésped individuales permite el recuento de manchas individuales.
Los antígenos de proteínas de células huésped son desnaturalizados, pueden no ser representativos de los que se observa en ensayos inmunológicos (p.ej., ELISA). Alta variabilidad -Los valores de "cobertura porcentual" numérica varían ampliamente con el mismo material analizado dentro de un solo laboratorio y entre diferentes laboratorios.
SDS-PAGE Bidimensional/ Transferencia Western
La eficiencia de la transferencia de un intervalo amplio de proteínas de células huésped es difícil de optimizar, lo que lleva a subestimaciones debidas a la sobre transferencia a través de la membrana o falla en la transferencia desde el gel, dependiendo del peso molecular. Aparear las manchas correspondientes entre transferencias y geles es difícil y no es estandarizable.
Unión por inmunoafinidad/ SDS-PAGE uni o bidimensional
Las proteínas de células huésped se unen en solución a una resina de anticuerpo en condiciones nativas similares a las del inmunoensayo tipo sándwich.
Puede representar de manera ineficiente a algunas proteínas de células huésped si están unidas de manera muy fuerte y no eluyen, lo que resulta en una subestimación de la cobertura.
El análisis de manchas en geles no requiere de inmunotransferencia y es más simple debido a que se evitan los problemas de transferencia.
La preparación de la resina anti-HCP debe realizarse cuidadosamente y puede ser difícil de reproducir. Los resultados pueden depender de las condiciones de la carga y de elución de la resina. No se detectarán las proteínas a baja concentración que sólo se observan en las transferencias Western.
Se puede encontrar más información sobre el uso apropiado de los métodos SDS-PAGE/transferencia Western y las formas de minimizar las desventajas anteriores en la sección posterior 5.2 Consideraciones para los Métodos de Transferencia Western. La Figura 3 presenta un ejemplo de uso adecuado de este enfoque.
USP 39
Información General/ (11 32) Proteína Residual Células Huésped 1555
120 100 90 80 70 60 50 40 30 25 20 15 10 pH 3
pH 10
pH 3
pH 10
Figura 3. Panel izquierdo: Análisis IEF bidimensional/SDS-PAGE de estándar de calibración de proteínas de células huésped de ovario de hámster chino teñido con un colorante fluorescente sensible. Panel izquierdo: Análisis de transferencia Western del mismo gel mostrado en el panel izquierdo. 3.2.3 GENERACIÓN Y CALIFICACIÓN DE REACTIVOS DE REEMPLAZO Cuando se agota el abastecimiento de reactivos de proteínas de células huésped o si se presenta una disminución en su desempeño, pueden ser necesarios nuevos reactivos. A menudo, los nuevos antígenos de proteínas de células huésped y los nuevos anticuerpos de proteínas de células huésped se generan al mismo tiempo. En teoría, el nuevo conjunto de reactivos debe ser creado siguiendo el mismo protocolo usado para el conjunto previo de reactivos para hacer coincidir en la mayor medida posible el desempeño de los ensayos nuevos y anteriores y producir datos uniformes para un programa dado. Sin embargo, en la práctica no siempre es posible (ni recomendable) generar los reactivos del ensayo de forma exactamente igual a la forma en que originalmente se prepararon. Por ejemplo, si el proceso de fabricación ha sido optimizado con el paso del tiempo y los reactivos del ensayo de plataforma originales ya no son relevantes, se debe llevar a cabo una evaluación cuidadosa. Cuando se requieren dichos cambios, la forma ideal de confirmar la calidad de los reactivos reemplazados es mediante caracterización de anticuerpos (ver más adelante) y demostrando que pueden detectar una reducción logarítmica de proteínas de células huésped mayor o similar, desde la recolección hasta el fármaco, usando las mismas muestras analizadas de manera directa con los reactivos del ensayo originales. Al reemplazar un antígeno de proteínas de células huésped en el que el proceso de producción vigente es esencialmente el mismo que el proceso anterior, el nuevo antígeno de proteínas de células huésped debe prepararse de la manera más similar posible al anterior. Es importante comparar en paralelo las concentraciones de proteína del antígeno de proteínas de células huésped nuevo y anterior, usando el mismo método para asignar de manera correcta la concentración de proteína para el nuevo antígeno y para asegurar que las concentraciones de proteína son comparables en el estándar de calibración de proteínas de células huésped nuevo y anterior. La caracterización mediante SDS-PAGE unidimensional o bidimensional debe realizarse como una comparación en paralelo de los antígenos de proteínas de células huésped nuevo y anterior (ver arriba) para asegurar que no hayan ocurrido cambios burdos en la composición de las proteínas. Para el reemplazo de anticuerpos, de ser posible, se debe usar la misma especie animal. En los casos en los que se desee una mejor respuesta de anticuerpos, se pueden evaluar los anticuerpos producidos mediante diferentes especies. La selección de especies debe tomar en cuenta todos los puntos discutidos en este capítulo. Se debe incluir una comparación en paralelo de los resultados de las muestras del proceso usando los anticuerpos nuevos y anteriores en un formato de inmunoensayo tipo sándwich para demostrar la aptitud de los anticuerpos de reemplazo. Se recomienda la caracterización adicional por métodos ortogonales (p.ej., cobertura usando SDS-PAGE unidimensional y bidimensional), según se describió anteriormente. La calificación o validación del ensayo también debe considerarse después de cambiar los reactivos. Entender por completo el efecto de reemplazar los reactivos críticos de proteínas de células huésped sobre los resultados del ensayo requiere el análisis de las muestras del proceso en estudios puente usando múltiples muestras a partir de la recolección, productos intermedios del proceso de todas las etapas de purificación apropiadas, y el fármaco final. Estos estudios pueden requerir una intensa inversión de recursos, lo que enfatiza la importancia de fabricar cantidades suficientes de reactivos críticos para proteínas de células huésped al inicio (y minimizar el reemplazo).
USP 39
1556 (11 32) Proteína Residual Células Huésped / Información General
3.3 Desarrollo de Métodos de lnmunoensayo y Calificación de Aptitud para su Uso Según lo indicado en 7. Introducción y Alcance, los inmunoensayos de proteínas de células huésped tienen dos funciones importantes en el desarrollo y control de procesos de fabricación de productos biofarmacéuticos. Los inmunoensayos de proteínas de células huésped funcionan como una medición de la pureza del producto y, por lo tanto, se relacionan potencialmente con la seguridad del paciente. También sirven como una medición de la uniformidad en la fabricación y, por ende, reflejan el control del proceso. Para cumplir con estos requisitos, los ensayos de proteínas de células huésped a menudo se validan e incorporan en el sistema de control de Buenas Prácticas de Fabricación vigentes, el cual incluye límites de rechazo específicos (en el fármaco como un método de Certificado de Análisis (C de A) o como un control durante el proceso). Si el fármaco final es una proteína conjugada, el análisis debe realizarse en el producto intermedio de la proteína (antes de la conjugación). Además, los ensayos de proteínas de células huésped se usan para guiar el desarrollo del proceso y a menudo se usan para demostrar el desempeño robusto del proceso en el contexto de las actividades formalizadas de validación del proceso. Los inmunoensayos de proteínas de células huésped a menudo se presentan en formato de ELISA tipo sándwich, y se encuentran disponibles múltiples opciones de marcado de anticuerpos (ver el capítulo (1103)). Dependiendo del marcado escogido, se seleccionan conjugados y sustratos apropiados; en el capítulo (1103) se describen algunos ejemplos. La mayoría de las proteínas pueden ser biotiniladas debido a su contenido de lisina y, debido a que la biotina es pequeña, es menos probable que afecte la actividad de unión de las proteínas. Debido a que los anticuerpos son grandes y tienen muchos residuos de lisina, la relación de conjugación entre biotina y anticuerpo puede ser mayor que la de las proteínas más pequeñas. Sin embargo, es importante no sobremarcar ni submarcar el anticuerpo (p.ej., con biotina o peroxidasa de rábano), debido a que esto puede llevar a una menor unión de antígenos o a una menor señal/sensibilidad, respectivamente. Controlar y definir la estequiometría de marcado (p.ej., mol de biotina a mol de lgG) es útil para la fabricación uniforme de partidas futuras. Se debe analizar y optimizar el desempeño de múltiples relaciones de marca y de anticuerpo en el inmunoensayo. Se debe eliminar el exceso de reactivos no conjugados, ya sea por diálisis, purificación por afinidad o usando una columna de desalinización adecuada. A menudo, el estándar primero se analiza para determinar si se puede generar una curva de dosis-respuesta y, de ser así, en qué intervalo de concentración de analito. Los resultados también pueden revelar un punto de partida para las concentraciones iniciales de reactivos que pueden ser optimizadas de manera adicional. Si se ha preparado más de un par de anticuerpos, entonces cada uno se analiza para encontrar el mejor desempeño (ver el capítulo (1103) de la USP para más información). La relaciones señal (estándar de calibración bajo) a ruido (fondo) generadas con cada candidato de anticuerpo se pueden usar para seleccionar el mejor par. Por lo regular, los inmunoensayos de proteínas de células huésped no siempre poseen una curva de dosis-respuesta completa con ambas asíntotas; por lo tanto, para el propósito de la detección de proteínas de células huésped residuales, la valoración para liberación de fármaco debe enfocarse en el extremo inferior de la curva. 3.3.1 CALIFICACIÓN DE UN PROCESO DE FABRICACIÓN NUEVO MEDIANTE VALORACIÓN EN PLATAFORMA
HCP
Tal como se indicó anteriormente, si se equipara el procedimiento de aislamiento/proceso previo a la purificación (upstream), entonces un nuevo producto producido en dicho sistema puede beneficiarse del uso de un ensayo de plataforma que puede disminuir el tiempo y el esfuerzo de calificación. Sin embargo, en casos en los que existen variaciones que ocurren al optimizar los cultivos de producción y el espacio del diseño del cultivo celular no está completamente definido, es importante entender si dichas variaciones son lo suficientemente significativas para considerar que el ensayo de plataforma es inadecuado. En estos casos, el ensayo de plataforma debe calificarse por medios experimentales para demostrar que es adecuado para medir proteínas de células huésped a partir del nuevo proceso. Se debe evaluar la exactitud, la precisión, la sensibilidad, la linealidad, el intervalo y la especificidad del ensayo (ver 4. Validación de Métodos de lnmunoensayo de Proteínas de Células Huésped). Además, el intervalo de proteínas de células huésped en el estándar de la plataforma HCP debe ser comparado con los presentes en el nuevo proceso. Los anticuerpos también deben caracterizarse usando muestras a partir del nuevo proceso o producto usando los enfoques tratados anteriormente. Los siguientes enfoques y conceptos pueden ser útiles al determinar si un ensayo de plataforma es adecuado para un producto fabricado con un nuevo proceso: 1. Realizar una corrida de célula nula representativa a pequeña escala en condiciones usadas en el nuevo proceso de cultivo y determinar la concentración de proteína del fluido del cultivo celular de la corrida de célula nula. Valorar el fluido del cultivo celular de la corrida de célula nula a la misma concentración nominal que el estándar de proteínas de células huésped del ensayo usando el inmunoensayo de proteínas de células huésped tipo sándwich y comparar la curva de dilución del fluido del cultivo celular de la corrida de célula nula con el estándar usado en el ensayo. Si la curva estándar y la nueva curva del fluido del cultivo celular de la corrida de célula nula son similares (p.ej., en su forma y amplitud, y las concentraciones de proteínas de células huésped calculadas están dentro de un factor de dos), entonces se considera que el nuevo proceso no es diferente al de plataforma, y por lo regular no se requiere un ensayo de proteínas de células huésped específico del proceso. 2. Con el fluido del cultivo celular obtenido de la corrida de célula nula anterior del nuevo proceso, realizar comparaciones con el estándar de calibración de proteínas de células huésped usando electroforesis en gel bidimensional. Esto comparará la diversidad de proteínas producidas mediante los dos procesos. Sin embargo, se debe ser consciente de que pueden aparecer nuevas "manchas" en los geles bidimensionales que pueden no reflejar las diferencias inmunoquímicas en el ensayo, por ejemplo, las modificaciones post-traduccionales o la proteólisis limitada. Como tal, la aparición de unas pocas
USP 39
Información General/ (1132) Proteína Residual Células Huésped 1557
manchas nuevas o del aumento o disminución de intensidad de manchas en la corrida de célula nula específica del proceso no es una base para invalidar la aplicación del ensayo de plataforma. Se recomienda una evaluación cualitativa (p.ej., contra una transferencia Western). 3. También es valiosa la comparación de niveles de proteínas de células huésped al momento de la recolección en las corridas reales de producción (muestras de fluido del cultivo celular) con el mismo producto producido en el proceso original y en el "nuevo" proceso. En general, los resultados del inmunoensayo dentro de un factor de dos a menudo se consideran similares, con lo que se confirman los reactivos de la plataforma HCP. 4. Las proteínas de células huésped en el fluido del cultivo celular de los cultivos de producción también pueden estimarse basándose en las mediciones de proteínas totales. La proteína total en el fluido del cultivo celular es la suma del producto (que se mide usando un ensayo de titulación específico del producto) y de las proteínas de células huésped. Las muestras de cosechas del cultivo celular de corrida de fabricación pueden dializarse, siempre y cuando presenten una concentración suficiente para que las pérdidas de membrana sean inapreciables, para remover los péptidos pequeños y los aminoácidos, y posteriormente, se determinan las proteínas totales (p.ej., mediante análisis de aminoácidos). Restar la concentración del producto de las proteínas totales provee una estimación de la proteína que no corresponde al producto, es decir, la proteína de células huésped, en mg/ml. Este valor puede compararse con la concentración de proteínas de células huésped a partir del inmunoensayo. Los valores comparables (p.ej., dentro de 2x) indican la confirmación de la plataforma de proteínas de células huésped para el nuevo proceso. 3.3.2 NECESIDAD DE NUEVOS REACTIVOS DESPUÉS DE CAMBIOS EN EL PROCESO Los cambios grandes, tales como cambios sustanciales y no ambiguos en las condiciones del cultivo celular (p.ej., trasladarse de un proceso que contenga suero a un proceso de producción exento de suero), por lo regular requiere la producción de nuevos reactivos y el desarrollo y la validación de un nuevo ensayo de proteínas de células huésped. En este ejemplo, los reactivos de proteínas de células huésped generados usando el anterior proceso reconocen un número de proteínas de suero pero podrían no reconocer muchas nuevas proteínas de células huésped en el proceso exento de suero. Debido al cambio en el proceso y al cambio en la valoración, se observarán diferentes niveles de proteínas de células huésped cuando se midan las proteínas de células huésped en las mismas muestras en el ensayo nuevo y en el anterior (es decir, las muestras del proceso que contiene suero puede tener un alto nivel de proteínas de células huésped medido en el ensayo anterior y un bajo nivel de proteínas de células huésped medido por el nuevo ensayo, mientras que las muestras del proceso exento de suero puede presentar resultados de proteínas de células huésped mucho más bajas en el ensayo anterior, pero mayores con el nuevo ensayo). Si el ensayo fue desarrollado como un ensayo específico del proceso a partir de la purificación (downstream), los cambios en las etapas de purificación también pueden requerir reemplazar el ensayo con uno que sea relevante para el nuevo proceso a partir de la purificación (downstream). Este es el principal problema con estos ensayos tan especializados y la razón por la que regularmente se prefieren los ensayos basados en plataforma, debido a que a menudo no requieren un nuevo ensayo cuando se presentan cambios en los pasos del proceso a partir de la purificación (downstream). 3.3.3. ESTABILIDAD DE LA MUESTRA Es importante demostrar que los procedimientos de manipulación de muestras no afecten los resultados del ensayo. Esto es particularmente cierto al comparar los resultados de diversas combinaciones de procesos intermedios. En ocasiones, las proteínas de células huésped pueden precipitarse durante la congelación o cuando el pH de la muestra se ajusta de ácido a neutro. Además, el almacenamiento a 2º-8º o múltiples ciclos de congelación-descongelación pueden resultar en una pérdida de reactividad. Puede ser necesario agregar componentes estabilizadores específicos (p.ej., cationes divalentes) a las muestras para asegurar la estabilidad.
4. VALIDACIÓN DE MÉTODOS DE INMUNOENSAYO DE PROTEÍNAS DE CÉLULAS HUÉSPED Los inmunoensayos de proteínas de células huésped para evaluación de la pureza del producto por lo regular forman parte del sistema de control de Buenas Prácticas de Fabricación vigentes, ya sea como una prueba durante el proceso o en el Certificado de Análisis, y debe validarse apropiadamente. El enfoque de validación depende en parte de los tipos de muestras que se analizarán con el método. Al usar una prueba de impurezas cuantitativa para el fármaco final, se requieren todos los parámetros de validación para dicha prueba, mientras que la validación para las muestras durante el proceso por lo regular se enfoca en la linealidad, la interferencia y la precisión de la dilución. Independientemente de si el ensayo es un ensayo realizado durante el proceso o un ensayo de liberación (fármaco), los límites de acción son valiosos como parte de una estrategia de control general. Se recomienda a los lectores referirse a las guías ICH Q2(Rl) y al capítulo Validación de Procedimientos Farmacopeicos (1225) con respecto a las expectativas generales para la validación del ensayo, en particular para los requisitos de validación del ensayo de Buenas Prácticas de Fabricación vigentes, y al capítulo (1103) para inmunoensayos tipo sándwich. Aunque el enfoque principal de esta sección es la validación del ensayo de Buenas Prácticas de Fabricación vigentes, muchos de los mismos principios se aplican a los ensayos usados para demostrar que los pasos de purificación del proceso son adecuados para el uso previsto.
1558 (11 32) Proteína Residual Células Huésped / Información General
USP 39
Esta sección se enfocará en aquellos aspectos de los inmunoensayos de proteínas de células huésped que son únicos o que requieren atención y documentación especial. Los inmunoensayos de proteínas de células huésped difieren de los inmunoensayos más convencionales en que son ensayos multianalitos. Existen potencialmente miles de proteínas en el inmunógeno y en el estándar, y se produce un conjunto de anticuerpos correspondientemente diverso, aunque sólo el fluido del cultivo celular del proceso previo a la purificación (upstream) contendrá una diversidad de proteínas que se aproximan al estándar de calibración de proteínas de células huésped. Las combinaciones intermedias y los productos finales por lo regular contienen un número progresivamente menor de proteínas de las células huésped que están presentes en el estándar. Según se trató anteriormente, este es el aspecto relacionado con la exactitud que se ve comprometido por los inmunoensayos de proteínas de células huésped, y la razón por la que las relaciones de unidades de masa (ng de proteínas de células huésped por mg de fármaco) no son una relación de "masa" literal. Sin embargo, a continuación se presentan enfoques comunes de la industria que tratan estas limitaciones en la mayor medida posible. El siguiente resumen de validación es para el fármaco final o para un penúltimo paso del proceso, cualquiera que se seleccione para el Certificado de Análisis del método. Se debe tomar en cuenta que para el análisis durante el proceso, el enfoque se centra en la exactitud del método (recuperación de cantidades agregadas conocidas), la linealidad de la dilución y la precisión. En el caso de la exactitud, algunas muestras tendrán un número mayor de sustancias interferentes potenciales (otras impurezas o aditivos del proceso) que pueden requerir de ser confirmadas como no interferentes (p.ej., ADN residual, proteína A lixiviada, inactivadores de virus, agentes caotrópicos y amortiguadores de pH bajo).
4.1 Exactitud Para evaluar la exactitud del ensayo de proteínas de células huésped en el fármaco, como mínimo se debe agregar el estándar del ensayo analítico a muestras apropiadas y se debe demostrar la recuperación de cantidades agregadas conocidas en el intervalo del ensayo. La interferencia de la matriz puede provenir de los componentes de la solución amortiguadora y del producto, y la dilución mínima requerida para la recuperación aceptable de cantidades agregadas conocidas (por lo regular entre 70% y 130%) debe determinarse para cada tipo de muestra. Por lo regular, los experimentos de recuperación de cantidades agregadas conocidas se realizan con cantidades agregadas conocidas usando al menos tres y potencialmente hasta cinco niveles diferentes. Debido a que las muestras se valoran en múltiples diluciones, el investigador puede agregar cantidades conocidas y luego diluir la muestra, o diluir la muestra y luego agregar cantidades conocidas a las muestras diluidas. Las cantidades agregadas conocidas cerca del límite de cuantificación ayudan a evaluar la exactitud y repetibilidad del ensayo cerca del límite de cuantificación, que es el punto en el que a menudo la medición es más variable. Una recuperación de cantidades agregadas conocidas del 50%-200% puede ser aceptable para una cantidad agregada conocida en o cerca del límite de cuantificación. Aunque estos representan los requisitos mínimos para la validación del ensayo, no se debe interpretar que demuestran la exactitud de ninguna proteína de célula huésped específica que puede ca-purificarse con el producto. Para lograr lo anterior, se requiere la comparación con un estándar de dicha especie de proteína de célula huésped particular; sin embargo, esto puede no ser posible debido a que dicha proteína de célula huésped raramente se conoce. Se proveen consejos para distinguir estas situaciones en la sección de linealidad siguiente, así como en 5. Tecnologías de Apoyo para la Detección, Identificación y Medición de Proteínas Residuales de Células Huésped.
4.2 Sensibilidad e Intervalo del Ensayo Los inmunoensayos tipo sándwich para proteínas de células huésped a menudo logran una sensibilidad de curva estándar de un sólo dígito bajo en ng/ml. En el caso de las concentraciones de proteína en las muestras donde la dilución de prueba es de 1 O mg/mL, esto implica que es posible una sensibilidad de aproximadamente 1 ng de proteínas de célula huésped por mg de producto. Sin embargo, esta sensibilidad puede ser difícil de lograr con concentraciones bajas de proteína. Es importante resaltar que la relación de proteínas de células huésped informada (ng de proteínas de células huésped residuales con respecto a mg de producto) no es en realidad la relación de masas implicada por la unidad ng/mg, sino los "equivalentes inmunológicos" por mg de producto. El primer aspecto para determinar el límite de cuantificación por lo regular se determina de manera experimental para cada producto en una matriz de amortiguador de muestra dada en estudios de recuperación de cantidades agregadas conocidas. La dilución mínima recomendada (MRD, por sus siglas en inglés) para el fármaco debe establecerse agregando cantidades conocidas del estándar de proteínas de células huésped a una serie de diluciones muestra. Por ejemplo, una cantidad conocida de proteína de célula huésped de 1O ng/mL agregada a cada serie de diluciones que contengan proteína sin diluir (p.ej., 1O mg/mL) y fármaco diluido en series. Aquellas diluciones en las que la recuperación de cantidades agregadas conocidas es 70%-130% (50%-150% también se usa comúnmente para niveles cercanos al límite de cuantificación) se consideran aceptables. Por lo regular, se analiza adicionalmente una dilución mínima recomendada de fármaco para asegurar que la recuperación de cantidades agregadas conocidas se logre constantemente. Para la segunda parte de la determinación del límite de cuantificación, el fármaco se analiza a la dilución mínima recomendada (si las muestras de fármaco tienen altos niveles de proteína de célula huésped detectable, se puede usar una solución amortiguadora de formulación). El límite de cuantificación por lo general se determina mediante el análisis de concentraciones de cantidades agregadas conocidas de proteína de célula huésped y estableciendo el nivel mínimo al que se puede determinar la proteína de célula huésped con exactitud y precisión aceptable. Este estudio por lo regular se realiza al menos tres veces, de
USP 39
Información General/ (11 32) Proteína Residual Células Huésped 1559
preferencia por varios analistas o en días diferentes. Por ejemplo, una cantidad agregada conocida de 3 ng/mL de proteína de célula huésped en una concentración de proteína del producto de 5 mg/mL tiene un límite de cuantificación de 0,6 ng/mg o 3 ng/mL si se logra una recuperación de cantidades agregadas conocidas en, p.ej., al menos cuatro de seis pruebas o si se cumple el criterio de recuperación media de cantidades agregadas conocidas. Por lo regular, los ensayos se configuran para medir el intervalo de unos pocos ng/mL hasta >100 000 ng/ml. Este intervalo permite al analista analizar una variedad de muestras a diferentes diluciones (ver la sección 4.3 Linealidad de la Muestra) y permite un ensayo práctico que puede acomodar las combinaciones durante el proceso con niveles de proteínas de células huésped que difieren en gran medida. Por ejemplo, las muestras del proceso previo a la purificación (upstream) pueden contener >100 000 ng/mL de proteínas de células huésped y requiere grandes diluciones para obtener resultados en el intervalo de la curva estándar. Para la fabricación comercial de fármaco de rutina donde se conoce la concentración de proteína del producto y se entienden bien las impurezas del proceso, se puede usar un análisis a una sola dilución para la liberación. Los resultados se informan como la relación entre proteína de célula huésped medida (ng/mL) y la concentración de producto (mg/mL) resultante en unidades de ng/mg. Cuando el fármaco tiene niveles indetectables, los resultados se informan como "menor que" el límite de cuantificación del ensayo (ng/mL) dividido por la concentración del producto (mg/mL; p.ej., <0,6 ng/mg en el ejemplo anterior). Sin embargo, antes de establecer esta concentración esperada para el análisis, la linealidad de la dilución de las muestras debe entenderse cabalmente y se debe establecer un proceso robusto de fabricación. En caso de que el nivel o las especies de proteínas de células huésped varíen entre corridas, puede ser necesario analizar cada muestra a múltiples diluciones (ver más adelante).
4.3 Linealidad de la Muestra La falta de linealidad del ensayo de proteínas de células huésped para algunas muestras no es extraña y se debe evaluar en el caso de múltiples partidas de un tipo de muestra dado (p.ej., a partir de diversos lotes clínicos del fármaco o partidas de validación del proceso) para asegurar la uniformidad y el informe apropiado de los resultados. Debido a que una proteína de célula huésped individual (o unas pocas proteínas de células huésped individuales) pueden ca-purificarse con el producto, es posible que se presente un exceso de proteínas de células huésped particulares respecto de los anticuerpos disponibles en el inmunoensayo de proteínas de células huésped. Esto es posible en ensayos de analitos múltiples en los que sólo se encuentra disponible un área de superficie limitada en las placas de microtitulación o perlas del ensayo, y debido a que se requieren miles de anticuerpos anti-HCP diferentes, los anticuerpos para cualquier proteína individual de célula huésped serán necesariamente limitados. Además, tampoco se controla la cantidad relativa de anticuerpo para cada proteína de célula huésped independiente, por lo que la capacidad de unión para cada proteína de célula huésped independiente difiere. Para muestras que presentan este comportamiento, los analistas deben diluir la muestra en el intervalo del ensayo, es decir, a un punto en el que ya no se observe el comportamiento no lineal debido a que la proteína de célula huésped se ha diluido a una concentración en la que ya no excede la cantidad de anticuerpo disponible. En algunos casos, la sensibilidad del ensayo se convierte en una limitante y no es posible alcanzar una dilución en la que el resultado del ensayo sea independiente de la dilución de muestra. En algunos casos, el valor de la relación de proteínas de células huésped más alta (corregida para la dilución muestra) dentro del intervalo validado del ensayo debe informarse. A continuación se presenta un ejemplo detallado de cómo manejar las diluciones no lineales que surgen como resultado de la insuficiencia de anticuerpo. La Tabla 4 y la Figura 4 presentan datos para tres muestras diferentes analizadas en un ELISA que tiene un intervalo de 1-100 ng/ml. En este ejemplo, todas las muestras se diluyeron inicialmente hasta 1O mg/mL (la dilución mínima recomendada, en la que la recuperación de cantidades agregadas conocidas ha sido previamente confirmada) y luego se diluyeron en serie usando una serie de diluciones al medio hasta por debajo del límite de cuantificación del ensayo de 1 ng/ml. Mientras que la Muestra 1 (diamantes) se diluye linealmente en el intervalo completo analizado, los resultados de proteínas de células huésped de la Muestra 2 (cuadrados) y de la Muestra 3 (triángulos) se estabilizan a concentraciones más altas de la muestra. La saturación de los anticuerpos refleja el exceso de antígeno y la determinación del valor de proteínas de células huésped se lleva a cabo diluyendo la muestra en el intervalo de dilución lineal; se estima visualmente como <2 mg/mL para los cuadrados y <1 mg/mL para los triángulos. [NOTA-Si se requieren diluciones de muestra grandes para alcanzar el intervalo del ensayo de proteínas de células huésped, se puede considerar realizar diluciones intermedias para limitar los errores relacionados con la dilución.]
USP 39
1560 (1132) Proteína Residual Células Huésped / Información General
Tabla 4.ª Datos Brutos para el Gráfico de la Figura 4ª Producto
Concentración (mg/ml)
Concentración de proteínas de células huésped (ng/ml)
Muestra 3
Muestra 2
Muestra 1 Cociente de proteínas de células huésped (nq/mg)
Valor de relación máximo O/o
Concentraclón de proteínas de células huésped (ng/ml)
Cociente de proteínas de células huésped (ng/mg)
O/o
Concentraclón de proteínas de células huésped (ng/ml)
Cociente de proteínas de células huésped (ng/mg) 0,3
Valor de relación máximo
Valor de relación máximo O/o
10,00 (sin diluir)
49 (sin diluir)
4,9
83%
20 (sin diluir)
2,0
<20
3,2 (sin diluir)
5,00
28,5
5,7
96%
16,5
3,3
54%
2,5
0,5
35%
2,50
12
4,8
81%
10
4,0
66%
1,5
0,6
42%
1,25
7,4
5,9
100%
7,4
5,9
97%
1,1
0,9
83%
87%
0,9
1,4
100% NO DISPONIBLE
0,63
3, 1
5,0
84%
3,3
5,3
0,31
1,6
5,1
86%
1,9
6,1
100%
<1
<6
<1
<6
NO DISPONIBLE
<1
<6
NO DISPONIBLE
<1
<6
0,16 Valor de relación de proteínas de células huésped informado con la guía yn
Guía 1 = 5,2 (n = 6); Guía 2 = 5,2 (n = 6)
22%
NO DISPONIBLE
Guía 1 = 1,2 (n = 2); Guía 2 = 1,4 (n = 1)
Guía 1 = 5,8 (n = 3); Guía 2 = 5,3 (n = 4)
ª Datos numéricos para tres muestras (también graficadas en la Figura 4) que presentan grados diversos de saturación de la respuesta a concentraciones más altas de producto (e impureza de proteínas de células huésped) analizado. Dos guías sobre cómo interpretar estos datos (las guías 1 y 2) ilustran la forma en que el "intervalo lineal" del ensayo se limita para la mayoría de los puntos de datos de dilución mostrados en la Tabla 4 y la Figura 4. Nota-Las muestras siempre se diluyen hasta que la concentración de proteínas de células huésped esté por debajo del límite de cuantificación del ensayo (en este ejemplo, el límite de cuantificación es 1 ng/mL). Guía 1: Se promedian todos los valores que se encuentran dentro del 20% del valor máximo. Guía 2: Los valores se promedian siempre que el coeficiente de variación del valor sea <20%, eliminando primero las muestras menos diluidas. También se puede usar una tercera guía que informa el valor más alto medido por encima del límite de cuantificación pero la aptitud de este enfoque debe demostrarse de manera adecuada por la validación del método.
150
¡¡ 40 ,___ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ ___,
f 30 l - - - _ . . . - - - - - - - - - - - - - - - - - - 1
~
'íl
~ 20""'";;::---~---------------¡
1101------=--~,...,..------------t
.¡¡
j
0,1
Concentración del Producto(mg/ml)
Figura 4. Dilución en serie al medio de las tres muestras listadas en la Tabla 4. Los resultados de la concentración de proteínas de células huésped se grafican en función de la concentración de producto en las muestras, lo que sirve como una medición de la dilución muestra. Debido a que las mediciones cerca del límite de cuantificación pueden tener una mayor variabilidad y una menor reproducibilidad que las mediciones más alejadas del límite del ensayo, por lo regular (si fuera posible) se promedian los valores dentro del intervalo de respuesta de concentración lineal de proteínas de células huésped de la muestra. Se debe especificar el procedimiento para el cual se pueden promediar los puntos de datos antes de realizar el ensayo y por lo regular se documenta como parte del procedimiento de prueba. En el ejemplo mostrado en la Tabla 4, se ilustran dos guías diferentes. La Guía 7 promedia todos los valores dentro de 20%-25% del valor máximo de relación de proteínas de células huésped. La Guía 2 promedia valores sólo si el coeficiente de variación para los valores promedio resultantes es <20%-25%. Aunque sus conjuntos de datos no son idénticos, ambas reglas se justifican, basándose en el argumento de que las variaciones del 20%-25% están dentro de la variación observada en las determinaciones repetidas del ensayo y reflejan la reproducibilidad subyacente de los métodos del inmunoensayo. En este ejemplo, ambos métodos proveen resultados muy similares. Por el contrario, la tercera guía potencial, que informa el valor más alto medido por encima del límite de cuantificación, generaría resultados que son al menos 10% más altos. Además, la validez de la tercera guía dependería en gran medida de la calidad del desarrollo del método. Los inmunoensayos tipo sándwich homogéneos (incubaciones en un solo paso sin lavados entre adiciones de reactivos) son más propensos al exceso de antígeno y a problemas resultantes de falta de linealidad de la dilución y pueden exhibir "efectos
USP 39
Información General/ (1132) Proteína Residual Células Huésped 1561
de gancho de alta dosis" en los que las muestras con grandes cantidades de antígeno proveen lecturas inexactamente bajas, debido a que el exceso de antígeno previene la formación del sándwich completo. El uso adecuado de este formato debe confirmarse experimentalmente para cada tipo de muestra y puede ser aceptable si las muestras están diluidas para ensayar el límite de cuantificación del ensayo y se confirma la ausencia de efectos de gancho. Históricamente, algunas compañías han usado datos de recuperación de cantidades agregadas conocidas producidos en la validación de exactitud para demostrar la linealidad. Aunque esto demuestra la dilución lineal del estándar, no demuestra la dilución lineal de las proteínas de células huésped en las muestras. Por las razones de exceso de antígeno tratadas anteriormente, la dilución lineal del estándar es una condición necesaria aunque insuficiente para demostrar la linealidad del ensayo para diversos tipos de muestras. Finalmente, aunque por lo general se cree que la insuficiencia del anticuerpo es la causa principal de una falta de linealidad de dilución, otras causas potenciales son: 1) reactividad de los anticuerpos con proteína del producto, 2) la presencia de anticuerpos no específicos (anticuerpos "problemáticos"), 3) reactividad de los anticuerpos a las proteínas que no son de células huésped presentes en las muestras (tales como peptonas o albúmina sérica bovina), 4) agregación de proteínas de célula huésped, 5) perfil de dilución del estándar de proteínas de célula huésped que no es representativo de las proteínas de célula huésped del proceso o del producto final y 6) interferencia de la matriz de muestra. La reactividad cruzada y la interferencia de la matriz se tratan más adelante.
4.4 Especificidad La evaluación de la interferencia potencial de la matriz en las muestras se trata en la sección 4.1 Exactitud y se usa principalmente para establecer la ausencia de interferencia de la formulación (en el fármaco) y otras impurezas que por lo regular están presentes (para muestras del proceso previo a la purificación (upstream). Otro problema de especificidad que se debe evaluar es la reactividad cruzada potencial de los anticuerpos anti-HCP dentro del producto mismo. Aunque esto es posible, rara vez se observan anticuerpos para proteínas de células huésped que presentan reactividad cruzada con los epítopes del producto. En aquellos casos en los que se observa reactividad cruzada, un mayor número de señales positivas falsas del ensayo constituyen riesgos que se deben manejar. Si se sospecha reactividad cruzada, se debe establecer científicamente y de manera cuidadosa. En la vasta mayoría de los casos, las señales en los inmunoensayos de proteínas de células huésped son reales, lo que indica la presencia de impurezas de proteínas de células huésped. En particular, aquellos casos en los que las proteínas de células huésped están asociadas con el producto de manera no covalente y se co-purifican, puede parecer reactividad cruzada. Sin embargo, debido a la tremenda variedad de anticuerpos en una combinación (pool) de anticuerpos policlonales anti-HCP, al medir las proteínas residuales de célula huésped en presencia de niveles excesivos de producto, algunos anticuerpos pueden aún unirse al producto, generando una señal positiva falsa. En este caso, puede ser necesario modificar el ensayo o el reactivo anti-HCP. Si se usa una valoración en plataforma HCP para analizar múltiples partidas (para el mismo programa) y se observan distintos niveles de proteínas de célula huésped entre partidas, esto es una fuerte evidencia de que la señal de proteínas de célula huésped positiva es real y que no se debe a reactividad cruzada. A menudo se observa evidencia de reactividad cruzada en un producto que se ha purificado en una secuencia de pasos y cuando los niveles de proteínas de células huésped no son reducidos por los procesos de purificación típicos. La relación proteínas de célula huésped/producto (ng/mg) debe usarse de modo que se puedan comparar los cambios en la relación de proteínas de célula huésped/producto durante la purificación. Primeramente, las transferencias Western del fármaco por lo regular se sondean con anticuerpos anti-HCP para determinar si las proteínas de células huésped están asociadas de manera no covalente con el producto. Si se detectan bandas que no están relacionadas con el producto, esto sugiere que no está ocurriendo reactividad cruzada y puede requerirse un desarrollo mayor del proceso si se buscan niveles más bajos de proteínas de células huésped. Alternativamente, si el anticuerpo anti-HCP está reconociendo una banda asociada con el producto, esto sugiere reactividad cruzada. Sin embargo, se debe proceder con precaución debido a que el producto está desnaturalizado (por la SDS-PAGE) y la unión puede darse con epítopes que no son accesibles en la fase soluble nativa (es decir, en el inmunoensayo). En este caso, una transferencia Western positiva puede tratarse de un artefacto (por el contrario, una transferencia Western negativa también puede no detectar la reactividad cruzada, aunque esto es menos probable). Independientemente de esto, si se sospecha reactividad cruzada, se puede confirmar y corregir mediante: 1) la adición de un producto de alta pureza (o estructuras relacionadas, tales como lgG humana derivada de una fuente distinta, para un anticuerpo monoclonal) para bloquear los anticuerpos que presentan reactividad cruzada en el ensayo, o 2) el agotamiento del anticuerpo anti-HCP en los reactivos usando una columna de afinidad del producto fabricada a partir de producto altamente purificado. En cualquier caso, es importante asegurarse de que el antígeno usado para bloquear o agotar el suero está libre de proteínas de células huésped residuales. Esta información está disponible a partir de las transferencias Western sondeadas con anticuerpos anti-HCP. Si se presentan bandas de proteínas de células huésped, esto indica que puede ser necesario un producto de mayor pureza y se puede preparar con purificaciones ortogonales a escala de laboratorio. En ocasiones, la HPLC en fase reversa puede ser efectiva al preparar este material, aunque esto no es útil durante la producción del producto debido a sus propiedades desnaturalizantes.
1562 (1132) Proteína Residual Células Huésped / Información General
USP 39
5. TECNOLOGÍAS DE APOfO PARA LA DETECCIÓ~, IDENTIFl~ACIÓN Y MEDICIÓN DE PROTEINAS RESIDUALES DE CELULAS HUESPED Los fabricantes biofarmacéuticos requieren un sistema de control integrado que ofrezca garantía de la pureza general del producto y de la uniformidad en la fabricación. Por lo regular, la pureza de un producto se demuestra usando una combinación de métodos, y este es en gran medida el caso de las proteínas de células huésped. Además del formato de inmunoensayo tipo sándwich más común, otros tipos de ensayos proveen información complementaria valiosa. Las Tablas 5, 6 y 7 proveen información general sobre los métodos comúnmente usados para la detección, cuantificación y caracterización de proteínas de células huésped. La Tabla 5 trata métodos electroforéticos; la Tabla 6 trata métodos de transferencia Western; y la Tabla 7 trata métodos cromatográficos y proteómicos. La electroforesis en gel y las inmunotransferencias se tratan también en la sección 3.2.2.2 Caracterización de anticuerpos para proteínas de células huésped. Los métodos de ensayo ortogonales usados para proveer garantías adicionales sobre la pureza y la ausencia de proteínas de células huésped pueden usarse en cualquiera de las tres maneras siguientes "detección", "identificación" o "cuantificación". En el caso de la detección, los ensayos ortogonales responden al interrogante de "si existe alguna proteína distinta a una forma del producto que podría haber sido pasada por alto por el inmunoensayo." Si este es el caso, a medida que se acumula conocimiento con respecto a la identidad de las proteínas de células huésped, se vuelve posible realizar una evaluación de riesgo específica para proteínas y, en caso necesario, generar un estándar y una prueba independiente para dicha impureza particular de proteínas de célula huésped. El método ortogonal puede entonces usarse en un modo "cuantitativo" comparando la muestra de producto con el estándar de proteínas de célula huésped apropiado para la proteína de célula huésped conocida. Por ejemplo, se puede desarrollar un método de HPLC-MS/MS cuantitativo basándose en los péptidos de monitoreo que ionizan bien a partir de digeridos de la proteína estándar analítica y de la muestra.
5.1 Consideraciones para Métodos Electroforéticos Tres métodos electroforéticos que son útiles en los análisis de impurezas son SDS-PAGE unidimensional y bidimensional y la SOS-electroforesis capilar que emplea tamizado sin gel (CE-SDS). En todos estos métodos, se carga muestra en exceso para asegurar la detección de trazas de impurezas de proteínas. La desventaja es que el exceso de producto oculta impurezas que podrían migrar a una zona cerca del producto y ocasionar interferencia. Sin embargo, los geles unidimensionales o CE-SDS pueden ya formar parte del sistema de control de Buenas Prácticas de Fabricación para el monitoreo de fragmentos relacionados con el producto; por lo tanto, extender estos métodos para el monitoreo de proteínas de células huésped no implica análisis adicional. Los geles bidimensionales se han usado para investigar la pureza del producto final y para identificar manchas menores en los geles asociadas con las variantes de producto o impurezas de proteínas de células huésped. La presencia de una nueva banda en el gel, o un nuevo pico en el electroferograma CE-SDS, puede representar una nueva sustancia/impureza relacionada con el producto o puede reflejar la presencia de una impureza de proteínas de células huésped ("relacionada con el proceso"). En cualquier caso, se justifica una investigación. Si no forma parte del sistema de control de rutina, un gel unidimensional continúa siendo un excelente método para la caracterización extendida de lotes importantes, tales como lotes de registro y para investigaciones de fabricación. Los geles y el CE-SDS son útiles para confirmar la ausencia de niveles altos de proteínas de células huésped (si estuvieran presentes y si hubiesen sido pasados por alto en el inmunoensayo). Los geles por lo regular se tiñen con un colorante de alta sensibilidad, tal como un fluoróforo o plata. Idealmente, la tinción debe ser compatible con la digestión proteolítica en el gel y el análisis subsiguiente mediante espectrometría de masas para identificar la proteína. Las proteínas difieren en su intensidad de tinción con plata o colorantes fluorescentes; por lo tanto, sólo son posibles estimaciones semicuantitativas de la cantidad de proteína en una banda o mancha (p.ej., las formas glicosiladas pueden no teñirse con tanta intensidad). Sin embargo, debido a que estos métodos no se basan en anticuerpos anti-HCP, proveen una importante medición ortogonal de la pureza. Algunas proteínas pueden aparecer en geles como bandas o manchas múltiples que resultan de modificaciones post-traduccionales o corte proteolítico. En la medida en que se distribuye un producto génico individual a múltiples ubicaciones en el gel, esto reduce más la sensibilidad de los geles para detectar impurezas. Como se analiza en la Tabla 7 siguiente respecto a los métodos proteómicos, a menudo es posible extirpar/recortar bandas o manchas de los geles. Estos fragmentos de gel extirpados pueden posteriormente incubarse con proteasas para promover la digestión in situ de la proteína en péptidos. Estos péptidos pueden fraccionarse y secuenciarse posteriormente usando LCMS/MS y compararse con bases de datos para identificar el origen de los péptidos como relacionados con el producto o con proteínas de células huésped.
USP 39
Información General/ (11 32) Proteína Residual Células Huésped 1563
Tabla 5. Métodos Electroforéticos Analíticos y de Caracterización para el Análisis de Proteínas de Células Huésped Sensibilidad Aproximada para Proteínas de Células Huésped y Capacidad para Cuantificar
Método
Uso
Ventajas
Gel unidimensional reducido o no reducido, teñido con plata o colorante fluorescente de alta sensibilidad.
Detección de un gran número de muestras para propósitos de uniformidad y presencia de bandas de proteínas que no correspanden al producto. Se puede usar como parte del sistema de control de Buenas Prácticas de Fabricación.
Separación de alta resolución; provee información aproximada sobre el peso molecular (MW); relativamente simple de correr. Los análisis paralelos de muestras proveen comparaciones poderosas para la uniformidad en la fabricación.
Un exceso grande de proteí- 100 ng/mg. na de producto puede Semicuantitativa a menos ocultar bandas de proteíque se use con un estándar nas de células huésped. Di- analítico para una proteína ferentes proteínas presende célula huésped conocitan diferencias en las inten- da. sidades de tinción por lo que sólo es semicuantitativa. Capacidad limitada de las calles del gel para carga de proteína total.
Gel bidimensional de formato grande (por e.j., 20 x 25 cm), teñido con plata o colorante fluorescente de alta sensibilidad.
Detección de un número pequeño de muestras para propósitos de uniformidad y presencia de manchas de proteínas desconocidas. No adecuado para uso rutinario en la liberación de lote, pero se puede usar para la caracterización de lotes específicos o estándares de proteínas de células huésped.
Separación de alta resolución de trazas de impurezas de proteínas de células huésped a partir del produeto. Provee el peso molecular aproximado y la información de pi de las manchas de proteínas.
Un exceso grande de proteí- 100 ng/mg de carga de na de producto puede proteína total). ocultar manchas de proteíSemicuantitativa a menos nas de células huésped. Dique se use con un estándar ferentes proteínas presenanalítico para una proteína tan diferencias en las inten- de célula huésped conocisidades de tinción por lo da. que sólo es semicuantitativa. Resultados altamente dependientes de la técnica que requieren personal capacitado y equipo sofisticado.
CE-SDS con detector de fluorescencia inducida por láser (UF, por sus siglas en inglés). Las muestras marcadas con fluorescencia se separan como muestras reducidas o no reducidas.
Detección de un número grande de muestras para propósitos de uniformidad y presencia de picos de proteínas desconocidas. Se puede usar como parte del sistema de control de Buenas Prácticas de Fabricación.
Método rápido de alta resolución para separar proteínas marcadas con fluorescencia.
La sensibilidad puede no ser tan grande como con un gel unidimensional con una tinción altamente sensible. Las etiquetas fluorescentes no son específicas para proteínas de células huésped, por lo que no existe distinción entre las proteínas de células huésped y los péptidos relacionados con el producto. Difícil de extender a otras mediciones, tales como transferencias Western, o para identificar picos de proteínas.
Desventajas
1000 ng/mg (0,1% de carga de proteína total). Semicuantitativa a menos que se use con un estándar analítico para una proteína de célula huésped conocida.
5.2 Consideraciones para Métodos de Transferencia Western (Western Blot) La técnica de transferencia Western (Western Blot) es complementaria al inmunoensayo tipo sándwich para demostrar la pureza del producto y para caracterizar los reactivos inmunoquímicos usados en el inmunoensayo (ver 3.2.2.2 Caracterización de Anticuerpos para Proteínas de Células Huésped). Cuando se usan anticuerpos anti-HCP como sonda, puede ser útil para: 1) detectar las proteínas de células huésped que están asociadas de manera no covalente con el producto y (potencialmente) pasados por alto en el inmunoensayo, o 2) monitorear una proteína de célula huésped individual. En otros casos, una proteína que reacciona bien en el inmunoensayo puede no ser detectada en la transferencia Western debido a la pérdida de un epítope conformacional después de la desnaturalización. Las inmunotransferencias requieren sólo un anticuerpo para una proteína dada, mientras que los inmunoensayos tipo sándwich requieren dos. El trabajo previo ha mostrado que los anticuerpos de alta afinidad que reaccionan con una proteína de célula huésped dada pueden ser más sensibles que la tinción de geles con plata o fluorescente. Las transferencias Western unidimensionales de producto final proveen un método ortogonal simple y confiable para demostrar la pureza del producto. Aunque se puede usar la misma preparación del anticuerpo en el inmunoensayo y en la transferencia Western, por las razones citadas anteriormente, la transferencia puede proveer información adicional sobre las trazas de proteínas (y no detectar otras), lo que le da su naturaleza ortogonal. La Tabla 6 presenta las ventajas y desventajas de los métodos de transferencia western unidimensionales y bidimensionales para estos propósitos. A continuación se presenta una lista de las principales consideraciones para la optimización de los métodos SDS-PAGE/ Western:
USP 39
1564 (11 32) Proteína Residual Células Huésped / Información General
• Formato y tamaño del gel bidimensional: Los formatos de mayor tamaño (18 cm de longitud o mayores) resuelven proteínas mejor y se presentan en una variedad de modos de aplicación de isoelectroenfoque (IEF) y dimensiones de peso molecular (p.ej., gradientes). La tinción de proteína total de varios formatos puede ser estudiada para optimizar la separación en ambas dimensiones y encontrar así el equilibrio que separa la mayoría (o el número máximo) de proteínas de células huésped. •Se debe optimizar la carga en los geles bidimensionales para equilibrar la sensibilidad requerida (carga mayor) en función de la resolución deseada (carga menor). Es necesario equilibrar la carga de proteína, el contenido iónico de la muestra y la velocidad de separación para evitar el sobrecalentamiento y para optimizar la resolución. Las tinciones o sustratos que se van a usar influirán en esta decisión. Por lo regular, se carga más para la inmunotransferencia (p.ej., 200 µg) que para el gel o transferencia teñidos con proteína total (p.ej., 50 µg para tinciones en plata). La diferencia en la carga puede afectar en cierto grado la separación; por lo tanto, encontrar el balance adecuado requerirá de experimentación. • El desarrollo de la señal para la proteína total (gel o transferencia) y la transferencia Western requiere de experimentación importante (p.ej., tipos de colorantes, tiempos de exposición, condiciones del amortiguador) para su optimización. Por ejemplo, debido a que es importante detectar tantas bandas como sea posible, en ocasiones la señal se amplifica tanto que las especies más abundantes obstruyen a las otras, o el fondo aumenta y se pierde el contraste. Un asunto relacionado es la estandarización y calibración del densitómetro o del generador de imágenes, el cual se debe ajustar de manera precisa para lograr la uniformidad en condiciones determinadas experimentalmente. La optimización de reactivos y del instrumento pueden requerir de tiempo significativo para establecer de manera reproducible las condiciones optimizadas en las que la señal se maximiza y el fondo se minimiza (ver también (1104)). • Los reactivos de transferencia y de bloqueo requieren de experimentación para identificar las mejores condiciones (tales como amortiguadores, potencia/tiempo del instrumento, temperatura y bloqueantes). Tabla 6 Métodos de Transferencia Western Analíticos y de Caracter1zac1on para el Análisis de Protemas de Células Huésped Sensibilidad Aproximada y Capacidad para Cuantificar Proteínas de Células Huésped
Método
Uso
Ventajas
Desventajas
Gel unidimensional, transferencia Western
Detección de un número grande de muestras para propósitos de uniformidad y presencia de bandas de proteínas desconocidas que reaccionan con anticuerpos anti-HCP. Se puede usar como parte del sistema de control de Buenas Prácticas de Fabricación.
Separación de alta resolución; provee información aproximada sobre el peso molecular (MW); relativamente simple de correr. Los análisis paralelos de muestras proveen comparaciones poderosas de lotes.
Requiere una fuente de anticuerpos anti-HCP de alta calidad. Un gran exceso de producto en el gel puede llevar a la tinción no específica de las bandas de productos. La desnaturalización inducida por SDS de las proteínas conlleva a la pérdida de epítopes conformacionales.
No cuantitativo para proteínas de células huésped a menos que se use un estándar de proteína específico. La sensibilidad depende completamente de la calidad del anticuerpo.
Transferencia Western en gel bidimensional de formato grande (p.ej., 20 x 25 cm) con quimioluminiscencia o detección de alta sensibilidad similar.
Detección de un número pequeño de muestras para propósitos de uniformidad y presencia de manchas de proteínas desconocidas que reaccionan con anticuerpos de proteínas de células huésped. No adecuado para uso rutinario, pero se puede usar para la caracterización de lotes específicos de producto o la caracterización de reactivos de anticuerpos.
Separación de alta resolución de trazas de impurezas de proteínas de células huésped a partir del producto. Provee el peso molecular aproximado y la información de pi de las manchas de proteínas.
Requiere una fuente de anticuerpos anti-HCP de alta calidad. Un exceso grande de proteína de producto puede ocultar manchas de proteínas de células huésped. La desnaturalización en SDS de proteínas conlleva a la pérdida de epítopes conformacionales. Produce resultados altamente dependientes de la técnica que requieren personal capacitado y equipo sofisticado.
No cuantitativo para proteínas de células huésped a menos que se use un estándar de proteína específico. La sensibilidad depende totalmente de la calidad del anticuerpo, pero es posible un valor de 100 ng/mg.
5.3 Consideraciones para Métodos Cromatográficos y Proteómicos Las técnicas de espectrometría de masas para la detección, identificación y cuantificación de proteínas de células huésped individuales están evolucionando rápidamente y aprovecha una gran parte de la tecnología desarrollada para proteómicos. Además, a medida que ponen a disposición nuevas bases de datos genómicos (p.ej., el genoma CHO), los enfoques espectrométricos de masa se vuelven más útiles. Estos métodos (ver también Aplicaciones de Espectrometría de Masas (1736) para información adicional) a menudo combinan la preparación de la muestra tal como reducción, alquilación y digestión proteolítica, seguida por separación (p.ej., cromatografía de fase reversa RP-HPLC de) antes de la introducción en un espectrómetro de masas que fragmenta todas las proteínas, proveyendo así una secuencia de aminoácidos para cada péptido. La información de la secuencia resultante se compara con la secuencia del producto para identificar fragmentos relacionados con el producto y con una base de datos relacionada con el hospedero (p.ej., E. coli, CHO) para identificar proteínas de células huésped.
Información General/ (11 32) Proteína Residual Células Huésped 1565
USP 39
Un desafío para el análisis por Espectrometría de Masas proviene del abrumador número de péptidos relacionados con el producto relativos a los péptidos de impurezas. Un enfoque para tratar este problema de ionización competitiva de los péptidos (también denominada supresión iónica de los péptidos de la proteína de célula huésped por parte de los péptidos del producto), consiste en aplicar el análisis LC-MS/MS sobre preparaciones de proteínas de células huésped parcialmente resueltas (p.ej., fracciones de HPLC). Esta purificación reduce la contribución del producto a los iones totales en el espectrómetro de masas. Se encuentran en desarrollo otros enfoques. Las mejoras tecnológicas recientes tales como 1) resinas para cromatografía capaces de resolver de manera efectiva usando fases móviles aptas para MS, 2) interfaces mejoradas para sistemas de separación por LC de extremo frontal y/o IEF, y 3) espectrómetros de masas con mayor resolución de masas, exactitud y velocidades más altas de barrido, ahora posibilitan la identificación y cuantificación de proteínas de células huésped específicas en fármacos con un alto grado de confianza. Los principales cambios en términos de sensibilidad y cuantificación de conjuntos suficientemente grandes de proteínas de células huésped heterogéneas, el costo y los problemas relacionados con el control de calidad aún deben resolverse antes de que esta tecnología pueda reemplazar a los inmunoensayos para el control de proteínas de células huésped en fármacos. Como un método de caracterización ortogonal al inmunoensayo de proteínas de células huésped, los datos de LC-MS/MS pueden usarse de dos maneras. Primero, si el método basado en Espectrometría de Masas no encuentra proteínas de células huésped en muestras que también estuvieron por debajo del límite de cuantificación en el inmunoensayo, entonces estas técnicas ortogonales pueden aumentar la confianza de que el ELISA de proteínas de células huésped no fallará en detectar una proteína de célula huésped que se ha co-purificado. El límite de detección para muchos métodos de LC-MS/MS se encuentra actualmente en el intervalo de aproximadamente 1 O a 100 ng de proteína de célula huésped por mg de producto. Por lo tanto, es lo suficientemente sensible para descartar una proteína de célula huésped individual que esté presente a un nivel alto y es más sensible que los geles. Segundo, si se identifica una impureza a un nivel alto o a otro que represente una preocupación para la seguridad, entonces se puede evaluar si es necesario mejorar el proceso de purificación para eliminarla, o si el sistema de control vigente es adecuado, y si se requiere desarrollar una valoración específica. La ausencia de señal no es evidencia de la ausencia de proteínas de células huésped, pero una vez que se ha identificado una proteína de célula huésped, se puede mejorar la sensibilidad de la LC-MS/MS. La LC-MS/MS es complementaria a otras tecnologías de proteínas de células huésped y su valor como método ortogonal sigue aumentando. La discusión detallada de todos los enfoques proteómicos al análisis de proteínas de células huésped está fuera del alcance de este capítulo, debido en parte a que el campo está evolucionando de manera tan rápida que cualquier revisión perdería su vigencia rápidamente. Las proteínas de células huésped intactas también pueden ser separadas usando HPLC con detección UV. Por ejemplo, el perfil ha sido usado para comparar distintos lotes de corridas celulares nulas. Los lectores deben referirse al capítulo Cromatografía (621) para los fundamentos científicos de los métodos cromatográficos de HPLC. Debido a que las proteínas de células huésped difieren en abundancia y a que la cromatografía puede no proveer una resolución única de todas las proteínas, una proteína de célula huésped individual debe constituir aproximadamente 1% (o menos con buena resolución) de la población total de proteínas para una posible detección (incluso así, una proteína de célula huésped determinada puede verse obstruida por el producto, dependiendo de su tiempo de retención). Sin embargo, la investigación de picos desconocidos como una práctica general y las comparaciones de los perfiles cromatográficos de proteínas de células huésped de corridas de células nulas pueden ser útiles para determinar la similitud de las proteínas de células huésped producidas en distintas condiciones de cultivo. Al igual que con los métodos electroforéticos tratados en este capítulo, la separación en fase reversa de muestras de productos separados proteolíticamente con detección UV puede ya estar incluida en un sistema de control de Buenas Prácticas de Fabricación como parte del análisis del producto. La presencia de picos nuevos o inesperados en el cromatograma UV puede indicar la presencia de una impureza de proteína de célula huésped, aunque este método no es excesivamente sensible (-1 % de impureza si no se ve obstruido por otros picos). Sin embargo, debido a que no se requiere un nuevo análisis o preparación de muestra, se debe considerar esta oportunidad de usar un método ortogonal para determinar la pureza. Tabla 7. Métodos Cromatográficos y Proteómicos Analíticos y de Caracterización para el Análisis de Proteínas de Células Huésped
Método Espectrometría de Masas -
HPLC/ionización por electrospray (ESl)-MS/MS o c!EF/ES/-MS/MS o MALDI-TOF de digeridos de proteína
Uso
Ventajas
Desventajas
Identificación de proteínas individuales de células huésped. Se puede aplicar a la caracterización de un lote de producto purificado o a estándares de proteínas de células huésped de corrida de células nulas.
Permite la identificación y el monitoreo de proteínas individua/es de células huésped. Se puede combinar con geles para identificar las proteínas individuales observadas en geles.
Método de bajo rendimiento que requiere de significativa preparación de la muestra, personal capacitado e instrumentos sofistica dos.
Sensibilidad Aproximada y Capaddad para Cuantificar 100 ng/mg y semicuantitativo si se usa en el modo de descrubrimiento para proteínas de células huésped desconocidas. 1 O ng/mg (o posiblemente mejor) y cuantitativa si se usa con un estándar analítico para una proteína de células huésped conocida.
1566 (11 32) Proteína Residual Células Huésped / Información General
USP 39
Tabla 7. Métodos Cromatográficos y Proteómlcos Analíticos y de Caracterización para el Análisis de Proteínas de Células Huésped (Continuación)
Método
Uso
RP-HPLC/UV o RPAdecuado para comparar -UHPLC/UV. Puede aplicar- estándares de corrida de se a proteínas intactas o di- células nulas si las proteígeridos proteolíticos nas están bien separadas. Las proteínas más grandes pueden requerir proteólisis limitada o reducción para mejorar la resolución.
Ventajas Alta resolución, separa proteínas de células huésped basándose en la hidrofobicidad y el tamaño; es posible la comparación directa de cepa nula y cepa del producto mediante superposiciones.
Desventajas
Sensibilidad Aproximada y Capaddad para Cuantificar
Difícil de encontrar una 1O 000 ng/mg (1 %). combinación de fase estaSemicuantitativa a menos cionaria y fase móvil para que se use con un estándar resolver y eluir todas las analítico para una proteína proteínas de células huésde célula huésped conociped. La coelución puede da. dificultar la cuantificación de proteínas específicas. La alta concentración de picos de productos puede interferir con la detección de trazas de proteínas de células huésped.
5.4 Comentarios Finales sobre Tecnologías de Apoyo para Proteínas de Células Huésped Con el paso del tiempo, se han intentado diversas técnicas analíticas híbridas. Un ejemplo es el fraccionamiento de estándares de proteínas de células huésped mediante intercambio iónico, seguido de cromatografía en fase reversa y luego un inmunoensayo o análisis por Espectrometría de Masas (MS bidimensional) en las proteínas de las fracciones finales. Alternativamente, se ha evaluado la "sustracción de producto" para eliminar el grueso de la proteína total a partir de las muestras de producto antes de la electroforesis en gel del análisis LC-MS/MS. Estos métodos híbridos para la determinación de cobertura requieren mucho trabajo y pueden introducir artefactos o sesgo de sí mismos (p.ej., los anticuerpos para productos por lo regular no eliminan la multitud de formas heterogéneas). Por ende, no se han aplicado de manera tan amplia, aunque en algunos casos puntuales pueden proveer información sobre la naturaleza de las impurezas del producto. La electroforesis, la transferencia Western y el inmunoensayo se mantienen como los métodos de uso más amplio para la caracterización de reactivos de proteínas de células huésped y para demostrar la depuración de proteínas de células huésped por parte de los procesos de purificación, debido a que son robustos, sensibles y pueden abarcar un amplio rango de impurezas de proteínas. El inmunoensayo y (cada vez más) la espectrometría de masas son altamente complementarias y son los métodos más poderosos para monitorear niveles de proteínas de células huésped residuales en muestras y para confirmar su ausencia en el fármaco final.
6. USO DE INMUNOENSAYOS DE PROTEÍNAS DE CÉLULAS HUÉSPED PARA DESARROLLO, CARACTERIZACIÓN Y VALIDACIÓN DEL PROCESO Según se describió anteriormente, aunque el análisis de proteínas de células huésped tiene limitaciones como ensayo cuantitativo, si el inmunoensayo puede detectar de manera rápida y robusta la mayoría de las proteínas de células huésped, entonces es extremadamente valioso durante el desarrollo, la caracterización y la validación del proceso. La depuración de proteínas de células huésped en cada etapa intermedia del proceso en una variedad de condiciones representa datos valiosos. Su aplicación al proceso de validación requiere la demostración de que el ensayo es científicamente sólido y adecuado para el propósito previsto y que está apropiadamente documentado. Según se indicó anteriormente, las combinaciones del proceso pueden diferir ampliamente en lo que respecta a los componentes del amortiguador, a la concentración del producto y a la composición de las proteínas de células huésped. Como mínimo, es necesaria la recuperación aceptable de cantidades agregadas conocidas del estándar de las proteínas de células huésped en las muestras de combinaciones del proceso para calificar las diluciones de prueba de las diversas combinaciones en el ensayo. Además, analizar cada tipo de muestra en diluciones múltiples es útil durante el desarrollo para verificar que: 1) los resultados están dentro del intervalo del ensayo y 2) se considera la falta de linealidad en la dilución de la muestra. En los casos en los que se demuestra que el proceso depura proteínas de células huésped de manera robusta, la validación del proceso también puede usarse para justificar el no contar con una prueba de proteínas de células huésped de rutina como parte del sistema de control de Buenas Prácticas de Fabricación vigentes. La Figura 5 ilustra los datos recolectados durante el desarrollo y la validación del proceso y muestra la dependencia en la dilución de una variedad de combinaciones del proceso (la Combinación 7 es posterior al primer paso de purificación de fluido del cultivo celular, la Combinación 2 es la siguiente, y así sucesivamente) a través del mismo. La Figura 5 muestra la relación de proteínas de células huésped (en ng/mg) en el eje ygraficado contra la dilución del producto en el pocillo de prueba en el eje x. Cada muestra se diluye en serie a través de tres o cuatro diluciones al medio. La dilución inicial se determina por la necesidad de diluir muestras con altos niveles de proteína de célula huésped en el intervalo de la valoración y la necesidad de analizar sólo diluciones en las que ya se haya demostrado una recuperación de cantidad conocida agregada aceptable. En la Figura 5, el fluido del cultivo celular tiene un poco más de 1 millón de ng de proteína de célula huésped por mg de producto, lo que significa que un poco menos de la mitad de la proteína total en el fluido del cultivo celular es producto. La primera combinación de columna reduce el nivel de proteína de célula huésped a apenas por encima de 1O 000 ng/mg. La segunda columna
USP 39
Información General/ <11 32) Proteína Residual Células Huésped 1567
tiene una depuración de proteína de célula huésped mínima; la tercera columna reduce el intervalo de proteína de célula huésped a 1000 ng/mg. La columna final en el proceso reduce el nivel de proteína de célula huésped en 2 logaritmos adicionales, lo que resulta en una proporción final de proteínas de células huésped de 1 O ng/mg. Todas las combinaciones intermedias presentan valores de proporción de proteínas de células huésped que son independientes de la dilución de la muestra. 10 000000
.-------------------~
e; 1000000
i------·-~··-·----------------1
Liquido de Cultivo Celular
~
.s
ººº f - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - j
100
l ,.. .,,. . 1
...
Combinacíón 1
10 000 f----------º~•~•~·~C=om=b=ina="º='º~'_ _ ______,
~
:e
1000f-----------~·L--..--.-.----~
"5 u
Combinación 3
100>-----------------------l 10 ,___ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _c_º-~-inraci~ón~Fi.--.oal
Dilución
Figura 5. Ejemplo de depuración de proteínas de células huésped mediante cada etapa de purificación. Dentro de un conjunto de muestra, el primer valor es la mayor dilución en su serie de diluciones. La Figura 6 presenta un conjunto de datos para un proceso de recuperación diferente. Al igual que en la Figura 5, se grafican los datos de la relación de proteínas de células huésped para una serie de diluciones al medio de cada muestra de combinación del proceso. Para el líquido de cultivo celular y las combinaciones de las columnas 1 y 2, la proporción de proteínas de células huésped (ng/mg) es independiente de la dilución de la muestra (la linealidad de la dilución se logra al igual que en la Figura 5). Sin embargo, después de procesar la tercera columna, se vuelve aparente en el ensayo una dependencia distintiva de la dilución. Esta dilución no lineal está probablemente asociada con el exceso de antígeno con respecto al anticuerpo disponible para el conjunto particular de proteínas de células huésped en la muestra (es decir, un número individual o limitado de especies de proteínas de células huésped co-purifican con el producto). Con la purificación del producto, se debe colocar más producto en el pocillo del ensayo para que las proteínas de células huésped sean detectables en el inmunoensayo. La concentración de producto en el ensayo puede aumentarse con cada etapa de purificación y, por ende, existe un aumento similar en la concentración de la impureza de proteínas de células huésped que co-purifica. Al llegar a la columna 3, la cantidad de impurezas probablemente excede la capacidad de los anticuerpos disponibles. Este fenómeno se repite en la combinación final, lo que no implica una depuración de proteínas de células huésped sino únicamente el intercambio de amortiguadores mediante UF/DF. El valor de informe para estas combinaciones es el que se obtiene diluyendo la muestra hasta cerca del límite de cuantificación del ensayo (la muestra más diluida de la serie) usando un método descrito en la Tabla 4, que en este caso es aproximadamente 300 ng/mg. La subsección 4.3 Linealidad de la Muestra de la sección 4. Validación de Métodos de lnmunoensayo de Proteínas de Células Huésped provee información adicional sobre la falta de linealidad del ensayo. 10000000.--------------------. Líquido de Cultivo Celular
1
ººº 000 • • • • •
~
E
g, 100 000
..,
.!O ~
~
. .., . ·~ ~
:>:
:; :¡;
10
ººº
1 000
Combinación 1
• •................. •••• f - - - - - - - - - - Combinación 2 - - - - - l
u
~
~
.5
100 10
x Combinación 3
l>
l>
X
L.> ~ X Combinación Final 11
~
...e
x
~
Dilución
Figura 6. Ejemplo de depuración de proteínas de células huésped con un proceso de purificación. Dentro de un conjunto de muestra, el primer valor es la mayor dilución en su serie de diluciones.
6.1 Ensayos para Proteínas de Células Huésped Individuales En algunos casos, un proceso de fabricación puede resultar en la producción de niveles relativamente elevados de una proteína de célula huésped individual que pueden generar sesgo en los resultados informados. Tal como se discutió anteriormente, en este caso la concentración de los anticuerpos presentes en el ensayo de proteínas totales de células huésped puede no ser suficiente para capturar en su totalidad dicha proteína de célula huésped particular presente. En tales casos, cuando se presente una proteína de célula huésped individual conocida, puede ser necesario otro ensayo para dicha proteína de célula huésped individual. Por ejemplo, en el caso de los cultivos de producción de E. coli, pueden producirse a niveles muy altos de cha-
1568 (11 32) Proteína Residual Células Huésped / Información General
USP 39
peronas de coexpresión u otras enzimas de procesamiento que ayudan a plegar o con la formación de disulfuro. Además, estas chaperonas pueden estar presentes en el inmunógeno usado para desarrollar los reactivos del ensayo de proteínas de células huésped, en una conformación que sea distinta a la que la proteína presenta en las muestras. Por ende, los anticuerpos producidos para chaperonas no unidas pueden no reconocer, o reconocer de manera deficiente, las proteínas de células huésped unidas al producto. En este caso, puede ser necesario desarrollar ensayos independientes usando anticuerpos apropiados. La existencia de altos niveles de una proteína de célula huésped individual no es exclusiva a los cultivos celulares bacterianos y puede presentarse con cualquier sistema de expresión celular. Otro ejemplo es cuando una proteína se agrega intencionalmente como parte del procesamiento, entonces se trata como una proteína de célula huésped individual, y un ensayo específico proveerá mejores datos (que el inmunoensayo de proteínas de células huésped total).
6.2 Estrategia de Control 6.2.1 OBJETIVOS, LÍMITES DE ALERTA Y LÍMITES DE RECHAZO En las reglamentaciones de los Estados Unidos y de la Unión Europea, así como en otros mercados en general, las proteínas de células huésped se describen como impurezas relacionadas con el proceso, y las guías indican que su presencia debe ser minimizada mediante el uso de procesos de fabricación apropiados bien controlados. El Título 21 del CFR 610.13 de los EE.UU. requiere que los productos biológicos estén " ... exentos de material extraño, excepto cuando sea inevitable ... ". La guía ICH Q6B indica que los fabricantes de productos biológicos deben evaluar las impurezas que pudieran estar presentes y desarrollar criterios de aceptación para las impurezas basándose en su experiencia preclínica y clínica. Sin embargo, la guía reglamentaria también reconoce los desafíos inherentes relacionados con el uso de datos específicos del ensayo y de reactivos específicos para el producto y el proceso. Las Guía indica que "La pureza absoluta de productos biotecnológicos y biológicos es difícil de determinar y los resultados son dependientes del método" (ICH Q6B), y que "De la misma manera, la estandarización de los métodos analíticos sería problemática debido a que los reactivos usados están relacionados con el producto y con el sistema de producción" [Agencia Europea para la Evaluación de Productos Medicinales (EMEA, por sus siglas en inglés) 1997]. Aunque la guía de la FDA describe la necesidad de analizar la presencia de proteínas de células huésped, también permite, mediante validación, la eliminación del requisito de la prueba de liberación, una vez que se haya demostrado la uniformidad de la depuración. Existe la expectativa de que, siempre que sea posible, las impurezas introducidas por los procesos de fabricación y que permanecen en los productos deben estar por debajo de los niveles detectables basados en un método analítico altamente sensible. Sin embargo, un estudio de depuración apropiadamente realizado como parte del proceso de validación puede ser un sustituto aceptable del análisis de lotes (Certificado de Análisis) (FDA 1997), incluso cuando se encuentren presentes niveles bajos de proteínas de células huésped en el fármaco. Además, "Si las impurezas son cualitativa y cuantitativamente las mismas (es decir, las cantidades y/o concentraciones relativas) en el fármaco, no es necesario el análisis del medicamento" (ICH Q6B). Este es el caso para las proteínas de células huésped, cuya concentración en el medicamento puede inferirse a partir del fármaco, debido a que el proceso de fabricación no introduce, o depura, proteínas de células huésped al momento de convertir el fármaco en el medicamento. Por ende, en estos casos, por lo general no se requiere el análisis de proteínas de células huésped del medicamento. El objetivo global es desarrollar procesos que minimicen las cantidades de proteínas de células huésped residuales en fármacos. Al usar inmunoensayos de proteínas de células huésped como parte de un sistema de control de fabricación, es necesario establecer límites para resultados aceptables. La "diana" para proteínas de célula huésped en un producto final provee al grupo de desarrollo de la purificación un objetivo para el proceso, el cual se puede alcanzar o no. Los procesos de anticuerpos con pasos de cromatografía de afinidad altamente selectiva (p.ej., que usan Proteína A) en ocasiones son capaces de conseguir una sensibilidad de 1 ng de proteína de célula huésped por mg de proteína. Los niveles de proteínas de células huésped esperados determinan el criterio del diseño que se usará posteriormente para desarrollar el proceso. Los lotes para toxicología preclínica son los primeros lotes para los que se deben determinar valores oficiales de proteínas de células huésped, debido a que en este punto en el desarrollo del producto, el investigador se encuentra construyendo el conjunto de datos que se usará para sustentar la seguridad de los estudios clínicos subsiguientes. A medida que la molécula avanza en el desarrollo clínico, los estudios precedentes se usan para sustentar la seguridad (y los riesgos) proyectada asociada con los estudios subsiguientes. Idealmente, los cambios en el nivel de proteínas de células huésped y, por ende, la exposición clínica, debe reducirse a medida que el producto se mueve a través del desarrollo clínico. Como parte de una estrategia de control general, los "límites de rechazo" son aquellos niveles que, de ser excedidos, resultarán en un producto no apto para uso. Durante el desarrollo del producto, aumenta el conocimiento sobre el proceso y el producto; por lo tanto, se espera que los límites de rechazo se ajusten a medida que se avanza del material para toxicología al material de fase 1/11, al de la fase 111 y finalmente al material comercial. El perfil de cada medicamento candidato y su programa clínico es único; por consiguiente, ningún límite numérico individual es aplicable a todos los casos. Los límites de rechazo están principalmente relacionados con la seguridad del paciente. Por lo regular, no se cuenta con datos específicos que documenten niveles "inseguros" de proteínas de células huésped. En su lugar, se deben determinar niveles aceptables para los productos de etapas tempranas mediante una evaluación de riesgos (incluyendo datos no clínicos, bibliografía disponible, experiencia previa con productos fabricados usando la misma línea celular o una similar, entre otros). Para productos comerciales, los niveles aceptables también se basan en la experiencia recabada durante los ensayos clínicos. Debido a que los perfiles de impurezas de proteínas de células huésped pueden verse influenciados por el proceso de purifica-
USP 39
Información General/ (11 32) Proteína Residual Células Huésped 1569
ción, las partidas de registro usadas en los ensayos clínicos de pivote deben ser representativos del proceso que se va a comercializar. Los límites de rechazo para el producto comercial deben establecerse para excluir valores de proteínas de células huésped que estén fuera del rango de experiencia clínica que sirvió como base para tomar la decisión de riesgo/beneficio para el biofármaco . Los límites de alerta, límites de tendencias o límites de acción (compañías distintas emplean distintos términos) reflejan las consideraciones de la uniformidad en la fabricación. En un proceso comercial, debe existir un historial de fabricación suficiente para poder definir los resultados que estén fuera de la tendencia. Sin embargo, en las etapas tempranas del desarrollo del producto, cuando se cuenta con un historial corto o nulo de fabricación, se pueden usar los límites de acción para establecer límites superiores sobre las proteínas de células huésped esperadas, basándose en la experiencia con productos similares para los que existe un historial, o comparando con el valor esperado. Exceder dichos límites debe desencadenar una investigación para determinar si el lote es liberable. Las mediciones ortogonales de pureza del producto son valiosas en dichas investigaciones. Con el surgimiento de mediciones ortogonales de pureza, se debe evaluar cualquier señal atípica no relacionada con el producto. Se deben realizar esfuerzos para revisar el proceso de purificación para eliminar cualquier proteína de célula huésped no deseada a niveles más altos que los niveles deseados (basándose en, por ejemplo, datos clínicos y no clínicos, bibliografía disponible, etc.), o se debe proveer una justificación específica de su aceptabilidad. Esto se logra como parte de un análisis de riesgo que tome en cuenta la exposición clínica similar a la descrita anteriormente para inmunoensayos. En los casos en los que los ensayos de proteínas de células presentan mejorías o cambios debidos a eventos inesperados, puede ser necesario modificar los límites de rechazo y, en algunos casos, incluso aumentarlos (si el nuevo ensayo tiene una cobertura más amplia). Sin embargo, es esencial que las muestras se analicen en estudios puente para asegurar que no se pasará por alto ningún cambio en la calidad durante la nueva valoración mejorada. En algunos casos, los ensayos mejorados proveen valores más altos, por lo que se requerirán estudios puente (contrastando el ensayo original con el ensayo mejorado) para justificar el nuevo límite de especificación. 6.2.2 CONSIDERACIONES DE SEGURIDAD DURANTE EL ESTABLECIMIENTO DE LÍMITES Los límites de especificación de proteínas de células huésped en unidades de ng/mg por lo regular se establecen usando las capacidades del proceso y también basándose en la experiencia clínica (es decir, los niveles usados en ensayos en los que se conocen los resultados clínicos). Aunque existen diversas preocupaciones teóricas de seguridad con respecto a las impurezas de proteínas de células huésped, la inmunogenicidad de la impureza es un aspecto primario a considerar. Una respuesta inmune puede incluir la formación de anticuerpos dirigidos contra la proteína de célula huésped o dirigida contra la proteína terapéutica, donde se cree que la proteína de célula huésped ha actuado como un adyuvante. Se refiere a los lectores al capítulo (1106) para una discusión más profunda de factores que influyen sobre la inmunogenicidad. Cuando los pacientes reciben más de una proteína bioterapéutica con sus impurezas asociadas, la inmunogenicidad se vuelve una preocupación aún mayor Aunque los productos de alta dosis pueden tener una masa mayor de proteínas de células huésped residuales por dosis y esto debe considerarse durante las evaluaciones de riesgos, el efecto potencial no es necesariamente predecible a partir de un resultado clínico. En algunos casos, niveles muy bajos de algunas proteínas de células huésped han demostrado tener efectos clínicos, mientras que niveles mayores de otras proteínas de células huésped no han presentado efecto alguno. Se pueden establecer diversos límites, dependiendo de si el producto tiene una o un número muy limitado de proteínas de células huésped que co-purifican o si presenta multiplicidad de proteínas de células huésped, cada una presente como una pequeña fracción del nivel de proteínas de células huésped total en el producto. Esto puede llevar a un ensayo y especificación independientes para proteínas de células huésped individuales que no pueden depurarse del proceso y que se espera estén presentes en el fármaco y que pudieran presentar bioactividad. El origen de la célula huésped también puede ser un aspecto a tener en cuenta. Es posible que las proteínas de células huésped de líneas celulares humanas (p.ej., células HEK293) puedan presentar un riesgo menor de inmunogenicidad que las proteínas de células huésped de especies relacionadas más distantes debido a la homología de las secuencias. Sin embargo, si estas proteínas son por lo regular intracelulares, entonces aún podrían ser inmunógenas y podrían ser observadas como "extrañas" por el sistema inmune del paciente. Si se desarrollan dichos anticuerpos, estos podrían presentar una reacción cruzada con proteínas humanas endógenas y neutralizar o volver inefectivos uno o más sistemas biológicos necesarios. En consecuencia, se pueden presentar argumentos sobre ambos lados; por ende, por lo general se cree que los riesgos basados en la línea celular de producción (microbiana contra mamífera) son los mismos y que prácticamente no pueden ser informativos a priori. Además de considerar la inmunogenicidad, la proteína de célula huésped puede ser bioactiva y presentar un riesgo. Por ejemplo, un homólogo de hámster de una proteína terapéutica expresada en células CHO puede ser lo suficientemente similar al producto para presentar co-purificación. Alternativamente, un producto de anticuerpo de citoquina antihumana expresado en células CHO puede unirse a la citoquina de hámster homóloga, y el complejo podría co-purificar con el producto del anticuerpo. En ambos casos, las proteínas de hámster homólogo pueden estar biológicamente activas al administrarlas a los pacientes.
7. RESUMEN Y CONCLUSIONES Los productos biofarmacéuticos deben estar libres de proteínas de células huésped residuales en la medida de lo posible. La norma de la industria para medir proteínas de células huésped es un inmunoensayo tipo sándwich que usa anticuerpos policlo-
1570 (1132) Proteína Residual Células Huésped/ Información General
USP 39
nales dirigidos contra el espectro más amplio posible de potenciales impurezas de proteínas. Debido a la diversidad y a que la proporción de proteínas de células huésped en el estándar de calibración nunca se equipara exactamente con las proteínas de células huésped de ninguna muestra, y debido al amplio intervalo de anticuerpos en los reactivos inmunoquímicos, diferentes ensayos de proteínas de células huésped cuantificarán proteínas individuales de células huésped a un grado distinto. Por ende, la lectura del valor numérico individual del inmunoensayo de proteínas de células huésped "se pondera inmunológicamente". Las proteínas altamente inmunogénicas sobrecuantificarán con respecto a la población promedio, mientras que las proteínas con inmunogenicidad débil presentarán una subcuantiificación. Algunas proteínas pueden no inducir una respuesta inmune en las especies animales usadas para generar anticuerpos, y el inmunoensayo de proteínas de células huésped no detectara a dichas proteínas. Debido a esta posibilidad, también deben incluirse en el sistema de control métodos ortogonales para juzgar la pureza del producto. La mejor estrategia es usar el inmunoensayo de proteínas de células huésped en conjunto con otras herramientas analíticas. Finalmente, se debe tener cuidado al extrapolar valores de proteínas de células huésped seguros entre productos. Ningún límite de especificación individual será suficiente para abarcar todo. Las diferencias en las propiedades biológicas de proteínas particulares de células huésped que co-purifican con el producto, la vía de administración, la población de pacientes y la dosis de producto/proteína de célula huésped contribuyen en conjunto como posibles factores que influyen en los riesgos para el paciente. Durante la historia de los productos bioterapéuticos recombinantes, se han presentado ejemplos en los que las proteínas individuales que co-purifican han sido inmunógenas, han actuado como adyuvantes e incrementan la respuesta inmune del paciente a la proteína terapéutica, o han presentado actividad biológica propia. A pesar de su existencia, dichos ejemplos son raros y, en general, existe un registro de seguridad excelente para los productos biológicos. No obstante, las limitaciones y complejidades de los ensayos de proteínas de células huésped, el cuidadoso y laborioso desarrollo y aplicación de dichos ensayos han ayudado a asegurar la seguridad del paciente para millones de dosis. El análisis de proteínas de células huésped continúa siendo un problema complejo que requiere de tiempo, recursos y consideración cuidadosa por parte de los fabricantes de biofarmacéuticos con el propósito de asegurar que los productos cumplan constantemente con la norma de alcanzar un nivel de impurezas de proteínas de células huésped tan bajo como sea razonablemente posible.
8. BIBLIOGRAFÍA EMEA. 1997. CPMP position statement on DNA and host cell proteins (HCP) impurities, routine testing versus validation studies. London: European Medicines Agency. CPMP/BWP/382/97. FDA. 1997. Points to consider in the manufacture and testing of monoclonal antibody products for human use. www.fda.gov/CBER/ gdlns/ ptc_mab. pdf. http://www. fda .gov/ downloads/BiologicsBloodVacci nes/GuidanceComplianceRegulatoryl nformation/OtherRecom mendationsforMan ufacturers/UCM 153182.pdf. Consultado el 01-11-2013. ICH. 1999. Guidance for lndustry Q6B Specifications: Test procedures and acceptance criteria for biotechnological/biological products. http://www.ich.org/products/guidelines/quality/article/quality-guidelines.html. Consultado el 01-11-2013. ICH. 2005. Validation of analytical procedures: Text and methodologies. Q2(Rl ). http://www.ich.org/fileadmin/ Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Quality/Q2_Rl /Step4/Q2_Rl _Guideline.pdf. Consultado el 26-02-2014.
(1136) ENVASADO Y REENVASADO-ENVASES UNITARIOS ALCANCE Este capítulo proporciona pautas para el envasado y reenvasado en envases unitarios, así como para el uso y aplicación del envasado en unidades de uso. Aunque este capítulo está destinado principalmente para su uso por parte de fabricantes de medicamentos, reenvasadores y farmacéuticos, la información en el capítulo puede ser útil también para proveedores de embalajes y componentes de los envases. Para definiciones sobre los tipos específicos de los envases, ver el capítulo Requisitos de Envasado y Almacenamiento (659).
ENVASE UNITARIO Los envases unitarios en los que se envasa un medicamento de venta bajo receta médica para su dispensación directa al paciente deben cumplir con el requisito de ser seguros para niños. Por otra parte, los envases unitarios destinados para su uso en instituciones u hospitales no están obligados a cumplir con dicho requisito. Los envases unitarios que son seguros para niños incluyen blísteres reforzados, tales como blísteres con ranuras rasgables, coberturas desprendibles o presionables y blísteres sobre tarjetas o sellados, como los de pestaña desprendible y envases deslizables.
USP 39
Información General/ (1136) Envasado y Reenvasado 1571
MATERIALES DE ENVASES Los materiales usados para la fabricación de envases unitarios incluyen vidrio y plástico. El vidrio usado como un componente de los envases primarios debe cumplir con los requisitos del capítulo Envases-Vidrio (660). Por su los materiales de usados como de los envases deben con los del La prueba de permeabilidad a la humedad se puede llevar a cabo conforme a lo descride Desempeño (671 ).
TIPOS DE CIERRES PARA ENVASES Las formas farmacéuticas sólidas, semisólidas y líquidas se pueden envasar en envases recerrables o en envases no recerrables. Ambos tipos de envases deben cumplir con las normas del Título 16 del CFR 1700.15. La Poison Prevention Packaging Act (Ley de Envases para Prevenir Envenenamiento o PPPA) de 1970 requiere para ciertos casos el uso de envases especialesseguros para niños y adecuados para la tercera edad. Los envases seguros para niños protegen a los niños de lesiones o padecimientos serios derivados de la ingestión o manipulación de productos peligrosos incluidos los medicamentos. Debido a que los medicamentos envasados en envases de unidad de uso están destinados para su dispensación al consumidor sin que tengan que ser reenvasados por el farmacéutico, el fabricante o el reenvasador es responsable del envasado especial de sustancias reglamentadas por la PPPA en envases de unidad de uso (Título 16 del CFR 1 701.1 ).
Envases Recerrables Los envases recerrables son envases con cierres adecuados que pueden evidenciar su alteración intencional y ser seguros para niños. Los envases recerrables pueden emplearse para envases de vidrio o plástico.
Envases No Recerrables Los envases no recerrables son envases con cierres que no pueden volver a cerrarse, tales como blísteres, sachets, tiras y otros envases unitarios. Los envases no recerrables pueden incluir envases tales como tiras laminadas y blísteres laminados multicapa combinando materiales de PVC y Aclar® que se pueden moldear en frío o en caliente. Los envases no recerrables pueden ser seguros para niños según el uso previsto y el lugar de uso. Los destinados para uso en el hogar están sujetos a las disposiciones de la PPPA, según se define en el Título 16 del CFR 1700.14. No obstante, debido al diseño de algunos envases de dosis única, no todos cumplen con la PPPA.
ENVASES DE UNIDAD DE USO Los envases de unidad de uso provistos por el fabricante ofrecen algunas ventajas interesantes, que se enumeran a continuación. (1) La forma farmacéutica se puede dispensar al paciente en el envase original del fabricante, práctica que implica que el fabricante ha comprobado la aptitud del envase mediante sus estudios de estabilidad. (2) Se elimina la necesidad de contar y reenvasar las unidades de dosificación en la farmacia, reduciendo de este modo la posibilidad de errores humanos. (3) El farmacéutico puede fijar la etiqueta al envase de unidad de uso para el paciente y puede emplear la fecha de caducidad del fabricante como fecha límite de uso. (4) Se puede determinar en cada caso cuántas unidades de dosificación contiene un envase de unidad de uso. (5) Mejora el cumplimiento del tratamiento por parte del paciente. (6) El envase de unidad de uso protege contra la falsificación puesto que mejora la rastreabilidad del producto mediante códigos de barras y números del National Drug Code (Código Nacional de Fármacos o NDC). Los envases de unidad de uso provistos por los reenvasadores ofrecen las mismas ventajas interesantes que los del fabricante. Sin embargo, los reenvasadores de envases de unidad de uso deben cumplir con todos los requisitos especificados en el capítulo Buenas Prácticas de Reenvasado (1178). Existen varios motivos por los que los reenvasadores realizan el envasado en unidades de uso, por ejemplo, (1) a pedido de las instituciones, (2) para un mejor control del inventario, (3) para reducir los tiempos de dispensación y (4) debido a variaciones de algunos tratamientos. El envase de un sistema de unidad de uso puede ser un envase de unidades múltiples o un envase unitario. Los sistemas de unidad de uso pueden contener productos farmacéuticos en formas farmacéuticas líquidas, semisólidas o sólidas (ver también FDA Guidance far lndustry, Container Closure Systems far Packaging Human Drugs and Biologics[Guía para la Industria, Sistemas de Cierres de Envases para Medicamentos y Productos Biológicos de Uso Humano).
1572 (1136) Envasado y Reenvasado / Información General
USP 39
Etiquetado de Envases de Unidad de Uso El etiquetado de los envases de unidad de uso incluye fechas de caducidad, números de lote del fabricante, designación del NDC y códigos de barras conforme a lo estipulado en la sección Etiquetado de las Advertencias y Requisitos Generales, Conservación, Envasado, Almacenamiento y Etiquetado y en el capítulo Buenas Prácticas de Reenvasado (11 78). Algunas ventajas de los códigos de barras en las etiquetas incluyen una reducción en los errores de medicación, mejoran el control de inventario y facilitan la identificación del medicamento. El etiquetado comprende la información que el fabricante coloca en el envase (ver las Advertencias y Requisitos Generales). Se considera aceptable tanto un etiquetado completo como el de los envases de unidades múltiples, como un etiquetado abreviado que se usa cuando el envase es demasiado pequeño para incluir todo el texto. También se puede incluir el texto de etiquetado completo sobre el envase protector secundario si no estuviera presente en el envase primario.
Envases de Unidad de Uso-Reenvasado y Reprocesamiento Los envases de unidad de uso se reprocesan y reenvasan de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Un envase de unidad de uso en forma de blíster no puede ser reprocesado por el farmacéutico una vez que el medicamento ha sido extraído del envase de dosis única (ver las Advertencias y Requisitos Generales para la aplicación de fecha límite de uso apropiada para un envase de unidades múltiples o de dosis única). El retiro del blíster se refiere al proceso de extraer el medicamento del envase tipo blíster. Sin embargo, tanto el fabricante como el reenvasador contratado pueden reenvasar y reprocesar los envases de unidad de uso siguiendo las Buenas Prácticas de Fabricación vigentes y estrictos controles de calidad.
Información de los Fabricantes Los fabricantes deben ofrecer información apropiada acerca de la estabilidad, de modo que pueda ser empleada para definir las declaraciones adecuadas de etiquetado, almacenamiento y transporte útiles para los pacientes y médicos. Los fabricantes pueden ofrecer otras garantías basándose en la información del producto en el envasado y distribución. Cuando el producto no deba ser reenvasado, los fabricantes pueden especificar esa condición en el etiquetado. Los fabricantes también incluyen etiquetados e información necesarios para el manejo óptimo del medicamento por parte de médicos y pacientes. El etiquetado y la información deben incluir un código de barras a fin de prevenir errores de medicación y facilitar el rastreo del producto.
Responsabilidad del Dispensador-Etiquetado El etiquetado que aparece en los envases de unidad de uso también incluye una etiqueta que agrega el farmacéutico al dispensarlos. Antes de dispensar el envase de unidad de uso, el dispensador debe agregar una o varias etiquetas que suministren la información siguiente: 1 . el nombre del paciente; 2. el nombre del producto y el contenido, las instrucciones de uso conforme a la prescripción del médico o el profesional de la salud, y el nombre de la persona que prescribe; y 3. toda instrucción de almacenamiento, la fecha límite de uso y toda información que las leyes federales y estatales consideren necesaria. En la farmacia, es aconsejable que el farmacéutico emplee códigos de barra, junto con recetas computarizadas, para confirmar que se está dispensando el medicamento correcto al paciente correcto. Los códigos de barra ayudan a minimizar los errores y permiten rastrear los medicamentos y registrar al responsable de su dispensación
Control de Calidad del Sistema de Envase El sistema de envase deberá cumplir las consideraciones generales respecto a la aptitud del sistema, protección, seguridad y características de desempeño descritas en la FDA Guidance far Industry, Container Closure Systems far Packaging Human Drugs and Biologics (Guía de la FDA para la Industria sobre Sistemas de Cierre de Envases para el Envasado de Medicamentos y Productos Biológicos de Uso Humano) y en los capítulos de pruebas generales •Sistemas de Envases Plásticos y sus Materiales de Construcción (661 ), Materiales Plásticos de Construcción (661.1 ), Sistemas de Envases Plásticos para Uso Farmacéutico (661.2) • (Af oi-may- 2106) y Envases-Pruebas de Desempeño (671 ).
REENVASADO DE MEDICAMENTOS SÓLIDOS ORALES SIMPLES EN ENVASES DE DOSIS ÚNICA El reenvasado de productos farmacéuticos sólidos orales, tales como tabletas y cápsulas, en configuraciones de dosis única es una práctica habitual tanto para la farmacia que distribuye medicamentos conforme a una receta médica como para el laboratorio farmacéutico que los reenvasa. La siguiente sección contiene las normas mínimas que servirán de guía para la práctica del reenvasado.
USP 39
Información General/ (1136) Envasado y Reenvasado 1573
El reenvasado de preparaciones en configuraciones de dosis única es un aspecto importante del cuidado farmacéutico y de la optimización del cumplimiento por parte del paciente. A efectos de este capítulo, existen dos tipos de reenvasado: el primero se refiere a las farmacias que dispensan medicamentos recetados y el segundo se aplica a las empresas farmacéuticas comerciales que se dedican a reenvasarlos.
Nomenclatura y Definiciones Un dispensador es un profesional autorizado o registrado quien es legalmente responsable de suministrar un medicamento al paciente, con una etiqueta específica para el paciente, conforme a una orden o receta médica. Además, los dispensadores podrán preparar cantidades limitadas anticipando una prescripción u orden médica. Los dispensadores dependen de la comisión de farmacias de cada estado en particular. Empaque: El término "empaque" es sinónimo del término "empaque". Ver Requisitos de Envasado y Almacenamiento (659). Farmacia: Una farmacia es un establecimiento legalmente responsable de suministrar un medicamento a un paciente, con una etiqueta específica para el paciente, conforme a una prescripción u orden médica. Los términos "dispensador" y "farmacia" se usan de manera intercambiable. Reenvasado: El reenvasado es el acto de retirar un medicamento de su envase primario original y colocarlo en otro envase primario, generalmente más pequeño. Reenvasador: Un reenvasador es un establecimiento que reenvasa medicamentos y los envía a otro lugar en donde se prevé que serán necesarios. Los laboratorios que reenvasan medicamentos lo hacen para su distribución (por ejemplo, para revenderlas a distribuidores, hospitales u otras farmacias), función que no contempla la práctica habitual de una farmacia. La distribución no es específica para un paciente ya que no hay recetas médicas. A diferencia de los dispensadores, los laboratorios que se ocupan de reenvasar medicamentos deben estar registrados ante la FDA y cumplir con la normativa sobre Buenas Prácticas de Fabricación Vigentes establecidas en el Título del 21 CFR 21 O y 211. Dispensador:
Materiales Los blísteres ofrecen una amplia gama de diseños tanto en lo que respecta a la funcionalidad como al aspecto. Se emplean diversos materiales para fabricar blísteres que tengan un desempeño óptimo. El envase tipo blíster está formado por dos componentes: el blíster, formado por la cavidad en donde se ubica el producto, y la lámina de sellado, que es el material que se sella al blíster, como se muestra a continuación. ...----- Lámina de
-------
Sellado
~Blíster Representación Esquemática de un Envase Tipo Blíster Debido a la diversidad de películas para blíster disponibles, la elección de la película se hará en función del grado de protección necesario. La elección de la lámina de sellado depende de cómo se vaya a usar el blíster, pero en general dicha lámina está hecha de papel aluminio. El material usado para formar la cavidad habitualmente es plástico, que puede ser diseñado para proteger la forma farmacéutica contra la humedad. Actualmente se dispone de una gran variedad de grados de protección contra la humedad. A efectos de este capítulo general, se las denomina propiedades de barrera contra la humedad nominal, media, alta y extrema. Cloruro de Polivinilo: El material más utilizado para la fabricación de blísteres es el cloruro de polivinilo (PVC). Este material, que brinda una barrera nominal o cero contra la humedad, se utiliza cuando el producto no requiere una protección eficaz contra la humedad. El PVC se encuentra disponible en varios calibres y puede ser opaco o pigmentado para impedir la entrada de luz de longitudes de onda específicas. La profundidad y el tamaño de la cavidad que se va a formar determinan el espesor del PVC utilizado. Debido a que el plástico se adelgaza durante el proceso de formación del blíster, se debe tener cuidado para garantizar que el blíster terminado brinde suficiente protección contra la luz (si se requiere) y que sea suficientemente fuerte para proteger de manera adecuada la forma farmacéutica. Los calibres habituales del PVC usados en la industria farmacéutica van de 7,5 a 15 mil (0,0075 a 0,015 pulgadas). Películas de Barrera: Muchas preparaciones farmacológicas son extremadamente sensibles a la humedad y por ende requieren películas de barrera que brinden una protección alta. Se pueden emplear varios materiales para proporcionar protección contra la humedad. Las películas de barrera más usadas en la industria farmacéutica se describen a continuación. Laminaciones de PVC/PCTFE-La película de policlorotrifluoroetileno (PCTFE) 1 es una película termoplástica de fluoropolímero de policlorotrifluoroetileno. La película de PCTFE se lamina al PVC mediante una capa adhesiva colocada entre el PVC y la película de PCTFE (estructura doble),
1 Se pueden obtener películas de PCTFE en Allied Signa! (como Aclar®)
y en otras fuentes.
1574 (1136) Envasado y Reenvasado / Información General
USP 39
1iiiiiii=
. Ad hes1vo
PCTFE PVC
Estructura Doble o con una capa de polietileno (PE) colocada entre la capa de adhesivo del PVC y la del PCTFE (estructura triple). PCTFE PE
Adhesivo Adhesivo
PVC
Estructura Triple Con el uso de diversos calibres de película de PCTFE, se pueden obtener barreras contra la humedad de media a extrema. Laminaciones de PVC/PVdC-EI PVC/PVdC es una película en la que el PVC está recubierto por una emulsión de cloruro de poli-
vinilideno (PVdC), según se muestra en la estructura doble ilustrada a continuación.
Adhesivo~
PVdC _.__PVC
Estructura Doble La capa de PVdC se especifica en g/m 2 y se puede fabricar para brindar barreras de protección de media a alta. Los pesos de recubrimiento más usados en la industria farmacéutica son 40, 60 y 90 g/m 2, y la película se ofrece con una capa intermedia de polietileno (PE) o sin ella, según se muestra en la estructura triple siguiente. El polietileno se trabaja con pesos de recubrimiento superiores, tales como 60 y 90 g/m2, para mejorar las características de termoformado de la cavidad del blíster. PVdC PE
Adhesivo Adhesivo
PVC
Estructura Triple Polipropileno-Debido a su morfología, el polipropileno (PP) constituye una buena barrera contra la humedad, porque su estructura esferulítica crea un camino arduo para que las moléculas de agua lo atraviesen. Aunque no se use habitualmente en los Estados Unidos como película para blíster, el PP constituye una alternativa económica para los materiales de barrera media y se emplea en Europa como alternativa al PVC. Lámina Moldeada en Frío-Este material se usa para productos extremadamente higroscópicos o sensibles a la luz. Es una barrera contra la humedad extrema que consta de tres capas: PVC, papel aluminio y nailon. Nailon Aluminio
PVC
Lámina Moldeada en Frío Lámina de sellado: La lámina de sellado se sella al blíster moldeado tal como se describió anteriormente. Se pueden obtener distintos diseños de láminas de sellado y la elección de uno en particular dependerá del modo en que se vaya a utilizar el empaque. Los diseños estándar---desprendible, desprendible seguro para niños y a presión-se describen a continuación. El componente principal de la lámina de sellado es habitualmente aluminio y su calibre varía de 18-25 µm (0,0078-0,001 pulgadas). El lado del laminado de papel aluminio que está en contacto con el producto proporciona la capa termosellada que forma el sellado del material del blíster. El recubrimiento de termosellado debe ser capaz de lograr un sellado adecuado con la película del blíster que se va a sellar. Los materiales empleados para formar la capa de termosellado cumplen con lo establecido en el Título 21 del CFR 175 y 177. Desprendible-La lámina desprendible, que se usa por lo general en un ámbito institucional, consta de varias capas, como se muestra a continuación y puede desprenderse del blíster. [NOTA-Para obtener una lámina desprendible segura para niños, se agregará una capa de poliéster con los adhesivos pertinentes.] La lámina de sellado desprendible, usada junto con el montaje del blíster, hace necesario un proceso de tres pasos para abrir el blíster. Adhesivo laminado
Papel Aluminio Sello por calor
Construcción de una Lámina Desprendible
Información General/ (1136) Envasado y Reenvasado 1575
USP 39
Primero, se debe separar la cavidad del blíster del resto de la tira del blíster. A continuación, las capas de papel y de poliéster se retiran de un área que no está sellada. Por último, el producto se empuja a través del papel aluminio remanente. Es importante destacar que el uso de este tipo de estructura laminada ayuda a que el envase sea más seguro para los niños. No obstante, si es necesario un envase seguro para niños, el diseño debe probarse de acuerdo con lo establecido por el protocolo descrito en el Título 16 del CFR 1 700, la Ley de Envasado para la Prevención de Envenenamiento.
~:~:~~ ~~ ::1~:~ter p
er1cu Ia d e
sAluminio 11
- - - e 01 por ca or
adhesivo laminado
Lámina Segura para Niños
A presión-Existen dos tipos habituales de láminas que se abren a presión: una con una capa externa de papel separada del aluminio por una capa de adhesivo y otra sin papel. La capa externa de papel tiene un fin estético y permite la impresión en el reverso del blíster.
~P,~I
Adhesivo-=
- - - Aluminio Sello por Lámina perforable por presión (con papel)
calor
~~"
(inductor apropiado) Aluminio Sello por calor
Lámina perforable por presión (sin papel)
Otros Tipos de Envases: y envases tipo sachet.
Otros tipos de envases usados para dosis únicas de formas farmacéuticas sólidas son tiras, bolsas Poliéster (48 ga)
Adhesivo
Aluminio (0,0035) Adhesivo Estructura de material para sobres laminados
Polietileno lineal de baja densidad (150 g)
PROCESO Los envases para dosis únicas se pueden fabricar y sellar de diversas maneras. Quienes reenvasan grandes cantidades de medicamentos pueden usar termoformadoras que cumplen estas funciones en la línea de producción, mientras que quienes reenvasan menores cantidades podrían comprar el material preformado para los blísteres. Este apartado comienza con una perspectiva general del proceso de termoformado de un blíster, el proceso fundamental que también se aplica a otros envases de dosis única como las bolsas. Esta perspectiva general no pretende ser exhaustiva sino destacar las operaciones principales junto con sus parámetros críticos. Termoformado de un blíster de dosis única: El proceso completo de termoformado consta de cuatro estaciones básicas donde se efectúan las siguientes operaciones: moldeado, llenado, sellado y terminado. Moldear el blíster mediante termoformado requiere el uso de calor y de aire. El material de la lámina de sellado se sella al material de la cavidad del blíster por un tiempo definido (el recorrido de la máquina), punto en el que la placa de calentamiento se cierra sobre los dos materiales. Estación de moldeado-Antes de ingresar en la estación de moldeado, el material del blíster pasa a través de una unidad de calentamiento donde se calienta de manera uniforme por etapas para garantizar el moldeado correspondiente. Debido a que los diferentes plásticos tienen distintos puntos de ablandamiento, se debe prestar especial atención para determinar la temperatura correcta de la estación de calentamiento, que suele tener múltiples zonas de temperatura. La temperatura, determinada por el material del blíster y la velocidad a la que atraviesa la estación de calentamiento, es un parámetro crítico en lo que respecta al desempeño óptimo. En la estación de moldeado, el material del blíster se calienta hasta el punto en el que el plástico se ablanda lo suficiente para permitir que se forme la cavidad El material del blíster procede de un rollo montado sobre un rodillo (al que se denomina bobina) y la máquina tira de él. Hay una mesa de empalme junto al rodillo de bobinado que deja espacio para un segundo rollo de material de blíster para empalmar y reanudar el proceso de envasado. Se puede instalar un dispositivo de bobinado para ayudar a mover el material del blíster desde el rodillo ajustado a un índice específico. Una vez que el material está debidamente calentado, por lo general se emplea aire comprimido para formar la cavidad del blíster. Una matriz superior y una inferior se cierran sobre el material mientras se introduce aire y se moldea un blíster que
1576 (1136) Envasado y Reenvasado / Información General
USP 39
corresponde al tamaño de la cavidad. Es posible que se necesite un molde macho auxiliar según el material y el tamaño de la cavidad. El molde macho auxiliar asegura una reducción uniforme del grosor del material del blíster que permite optimizar las características de protección del material formado. Una vez moldeado el material según la configuración de blíster deseada, se lleva a la estación de llenado. Estación de llenado-En esta estación, se introduce el producto en la cavidad del blíster. Las cavidades se pueden llenar mediante un dispositivo de llenado automatizado o a mano. El parámetro crítico en esta estación es el llenado correcto de los blísteres moldeados. Estación de sellado-En esta estación, se sella la lámina de sellado a la cavidad llena del blíster, usando calor y presión durante un tiempo de permanencia definido. Los parámetros críticos que se deben considerar en esta estación son la temperatura, la presión y el tiempo de permanencia. El material de la lámina de sellado se monta sobre un rodillo por encima de la cavidad del blíster y puede estar preimpreso o se puede imprimir en la línea de producción. En este punto se pueden imprimir el número de lote y la fecha de caducidad. Las láminas de sellado preimpresas deben tener un sistema de registro de la impresión para controlar la posición de lo que se imprime respecto de la cavidad del blíster. Los parámetros críticos en esta parte de la estación están relacionados con que el etiquetado sea legible y correcto. Estación de terminado-La estación de terminado comprende todos los otros pasos del proceso de envasado, incluido el grabado, la perforación y el corte. El grabado implica la colocación del número de lote y la fecha de caducidad en el envase. Se usan tipos de acero para grabar esta información en los bordes del blíster. Uno de los parámetros críticos en esta estación es la integridad del envase. Es importante que los procesos de grabado, perforación y corte no afecten el blíster, la tapa o el sellado. Otro parámetro crítico en el proceso tiene que ver con la calidad del grabado, el cual tiene que ser legible, correcto, e incluir toda la información necesaria. Bolsas (Pouches) para Dosis Única: El proceso de elaboración de bolsas también consiste en una operación de moldeado, llenado y sellado, pero no proporciona una cavidad moldeada y definida como el proceso de termoformado. Si bien la maquinaria usada para formar bolsas de dosis única puede funcionar de forma distinta a la que se describió para termoformar un blíster, las operaciones principales (moldeado, llenado y sellado) y los parámetros críticos observados en esas estaciones son bastante similares. [NOTA-Ver los parámetros críticos antes mencionados y definidos en la sección sobre termoformado.] El proceso de elaboración de tiras consiste en dosificar un medicamento en una bolsa moldeada de tres caras. Una vez llenada con el medicamento, la máquina sella la bolsa y forma una tira de bolsas de dosis única selladas. El flujo básico del proceso comienza cuando el medicamento se sitúa encima del material de la bolsa. Se usa un rollo de material de la tira para formar la bolsa. Esto se logra moviendo el material sobre un dispositivo que hace que el material se doble en dos lados iguales. Los lados y el fondo se sellan antes de la dosificación. La tira se puede cortar más tarde, durante el procesamiento en la máquina, o puede rodar de forma continua y se corta manualmente. La temperatura y el tiempo de permanencia son los factores críticos de esta máquina. Envases de Dosis Única Preformados: Los envases preformados se sellan ya sea por calor o por adhesión. Los selladores por calor pueden ser unidades manuales que requieren que se aplique presión manual o unidades automatizadas que proporcionan una presión de sellado más controlada. El sellado por calor se puede lograr con el uso de aparatos manuales pequeños. Este equipo generalmente opera a una presión establecida. Los parámetros críticos de estos dispositivos son el control de la presión y la temperatura porque una variación no deseada en estos parámetros puede producir sellados deficientes. Parámetros Críticos: A fin de asegurar que el envase terminado se comporte como se espera, se debe determinar la calificación de los parámetros críticos. Normalmente, la validación de una línea de envasado consiste en la calificación de la instalación, operación y desempeño del sistema de envase. Calificación de la Instalación-Antes de su uso, las máquinas deben estar instaladas y se debe comprobar que estén en condiciones de funcionamiento adecuadas. Calificación Operativa-La calificación operacional se debe realizar para establecer que las máquinas funcionan dentro de los límites especificados por el fabricante. Se deben vigilar y verificar periódicamente los servicios externos necesarios para el funcionamiento del equipo, tales como electricidad, aire, etc. Calificación del Desempeño-La calificación del desempeño debe hacerse para garantizar que las máquinas funcionan correctamente con los materiales requeridos para producir un envase que responda como se espera. Los parámetros críticos incluyen temperatura y presión de moldeado, temperatura y presión de sellado y tiempo de permanencia en la estación de sellado. Para la puesta en marcha de las máquinas, los intervalos calificados deben estar fácilmente disponibles en una fuente de referencia. Será necesaria una nueva evaluación si se efectúan cambios en las máquinas, los materiales o el proceso. Inspecciones Durante el Proceso: Deben realizarse controles estrictos en lo que respecta al envasado y etiquetado. Se debe evaluar el desempeño del envase final en cada una de las estaciones descritas anteriormente. Específicamente, se debe inspeccionar visualmente el envase formado para garantizar que esté debidamente moldeado. La evaluación de la estación de llenado debe incluir una verificación para asegurar que la dosis única se llene debidamente (es decir, que el producto correcto esté presente). Se debe evaluar la estación de llenado para garantizar que se ha logrado el sellado correcto y que el envase sellado cumple las especificaciones sobre impermeabilidad a la humedad. Se debe realizar un examen visual del envase para garantizar que los pasos finales del proceso de envasado son aceptables. Los reenvasadores y dispensadores deben aplicar un plan de inspección estándar para verificar que el envase es adecuado. Se debe realizar una inspección visual para verificar que se ha colocado el producto correcto en el envase adecuado con el
USP 39
Información General/ (1136) Envasado y Reenvasado 1577
etiquetado correspondiente. Se debe evaluar la integridad del sellado, usando una prueba de vacío,2 prueba de helio, prueba de rasgado y otros métodos de prueba adecuados para establecer si se mantiene la integridad del sellado.
DESEMPEÑO El objetivo principal de los envases de dosis única usados para envasar medicamentos es garantizar que, hasta la fecha de caducidad, haya una protección adecuada frente al entorno mientras la forma farmacéutica se distribuye y almacena. Asimismo, es fundamental que los materiales usados no interactúen con la forma farmacéutica. Cuando se determina qué tipo de envase se debe usar en el reenvasado, se deben considerar las sensibilidades de las formas farmacéuticas (si las hubiera) en relación con los entornos de almacenamiento y distribución (por ejemplo, temperatura, luz y humedad). Los materiales usados para fabricar el envase de dosis única así como el proceso de moldeado y sellado en conjunto definen las propiedades del envase terminado. Según se analizó en Materiales, hay una gran variedad de estructuras de películas disponibles comercialmente que proporcionan envases de dosis única con diversos grados de protección contra la humedad y la luz. Los proveedores de estos materiales suelen proporcionar datos cuantitativos, obtenidos a partir de métodos de prueba bien establecidos, para destacar las propiedades de protección del material con que están hechos. Estos datos se basan en las hojas planas de la película, no en el envase moldeado. Resulta crítico comprender que, una vez moldeada la película, las propiedades de protección cambian debido a que el espesor general de la película disminuye cuando se forma la cavidad del blíster. Habitualmente, el cambio implica una disminución, en especial en el caso de las propiedades de barrera. No obstante, el grado de cambio variará según el tipo de estructura de la película usada y también, en gran medida, según el proceso de moldeado del envase utilizado (ver Proceso). Además, un sellado que sea menos que óptimo en el envase moldeado disminuirá las propiedades de protección del envase. La temperatura, el tiempo o la presión insuficientes durante la operación de termosellado pueden permitir el paso de humedad o de oxígeno a través de la zona sellada con el transcurso del tiempo, lo que puede afectar a la forma farmacéutica. Además, puede presentarse el mismo problema si la zona sellada no tiene suficiente superficie. Para garantizar un buen sellado, se recomienda dejar una distancia mínima de 3 mm desde el borde de la cavidad del blíster hasta el borde o la perforación más cercanos. Por lo tanto, es más importante evaluar el desempeño del envase moldeado y sellado que el desempeño de la hoja plana. La humedad constituye un factor crítico en la integridad de la preparación. El capítulo Envases-Pruebas de Desempeño (671) describe el modo de determinar y clasificar la velocidad de permeación de la humedad. Si la etiqueta del fabricante incluye "Proteger de la Humedad", el reenvasador utilizará una película que brinde una mayor barrera. Si un medicamento requiere protección contra la luz, el reenvasador debe cumplir los requisitos para la transmisión de la luz establecidos en Envases-Pruebas de Desempeño (671 ). Nuevamente, esta prueba debe efectuarse al envase moldeado porque las propiedades de protección de la película contra la luz se ven alteradas una vez que la película pierde grosor durante el proceso de moldeado. Se recomienda que estas pruebas, junto con cualquier guía proporcionada por el fabricante, se consideren apropiadas para cualquier sistema de envase-cierre usado en el reenvasado de un medicamento.
FECHA LÍMITE DE USO Si no se cuenta con datos de estabilidad del producto farmacéutico en el envase reenvasado, la fecha límite de uso será un año o el tiempo que reste hasta la fecha de caducidad, sea cual sea el primero. Si se dispone de datos de estabilidad actuales del medicamento en el envase reenvasado, el tiempo establecido por el estudio de estabilidad se puede usar para fijar la fecha límite de uso pero no puede exceder la fecha de caducidad determinada por el fabricante. Tal como se establece en las Advertencias y Requisitos Generales, el dispensador debe mantener el lugar donde se envasan y almacenan las formas farmacéuticas a una temperatura tal que la temperatura cinética media no sea mayor de 25º. El material plástico usado en el envasado de las formas farmacéuticas debe brindar mayor protección que el cloruro de polivinilo, el cual no proporciona una protección adecuada contra la permeación de humedad. Se deben guardar registros de la temperatura del lugar donde se almacenan las formas farmacéuticas y de los materiales plásticos usados en el envasado.
REQUISITOS MÍNIMOS Los apartados anteriores sirven de introducción general al reenvasado al proporcionar conocimientos básicos sobre la selección de materiales, el proceso de moldeado-llenado-sellado y la importancia del desempeño de un envase sellado. En este apartado, se describen con mayor detalle ciertos requisitos mínimos del reenvasado que deben cumplirse.
2 Una prueba de vacío consiste en colocar muestras de la operación de envasado en un frasco lleno de agua. Se coloca una tapa sobre las muestras para sumergirlas por completo en el agua. Se coloca una tapa al envase para crear un sello eficaz y producir aproximadamente 25 cm de vacío. Se coloca la bomba de vacío y las muestras se someten a la prueba durante aproximadamente 1 minuto, se retiran del agua, se secan y se abren para determinar si se ha mojado el interior de la cavidad del blíster o de la bolsa de dosis única. Este proceso debe ajustarse hasta que esté bajo control y se pueden efectuar pruebas adicionales para asegurar que la integridad del sellado se mantiene en niveles aceptables. La presencia de humedad indica que el sellado es defectuoso y por lo tanto existe el riesgo potencial de que el medicamento se degrade al ser expuesto a las condiciones ambientales. Los envases defectuosos deben retirarse de la circulación.
1578 (1136) Envasado y Reenvasado / Información General
USP 39
Personal: Toda persona con responsabilidad en el reenvasado de un medicamento debe tener la formación, capacitación y experiencia, o una combinación de las mismas, para efectuar las tareas asignadas de manera que se mantengan la seguridad, la identidad, el contenido, la calidad, la pureza, la potencia y la presentación de la forma farmacéutica. La capacitación debe estar documentada. El personal involucrado en el reenvasado de un medicamento usará ropa limpia y adecuada para las tareas o procesos que efectúe Instalaciones: Las instalaciones para el reenvasado pueden requerir áreas de baja humedad relativa y las condiciones de temperatura deben cumplir con los requisitos de temperatura ambiente controlada especificados en Requisitos de Envasado y Almacenamiento (659). Equipo: Los equipos utilizados en el reenvasado de un medicamento tendrán un diseño apropiado y estarán ubicados en un lugar adecuado para facilitar las operaciones para las que están destinados. Su diseño debe permitir la limpieza para evitar la contaminación cruzada y facilitar el mantenimiento. Los equipos deben estar fabricados de tal manera que las superficies que estén en contacto con los componentes o medicamentos no sean reactivas, aditivas o absorbentes. Deberá evitarse el contacto de cualquier sustancia necesaria para el funcionamiento del equipo, tales como lubricantes o refrigerantes, con los componentes o los medicamentos. Los equipos y los utensilios deben limpiarse, mantenerse y desinfectarse a intervalos adecuados para evitar el funcionamiento defectuoso o la contaminación. Se debe efectuar un mantenimiento preventivo a intervalos apropiados de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Se deben calibrar los instrumentos usados para controlar los parámetros críticos siguiendo un esquema definido. Proceso: Se deben tomar medidas para determinar los parámetros críticos del proceso (por ejemplo, temperatura de sellado, tiempo de permanencia) al operar las máquinas. Se deben documentar los puntos determinados para estos parámetros y establecer procedimientos para garantizar que éstos se cumplan cada vez que se operen las máquinas. Etiquetado: Los requisitos para el etiquetado difieren dependiendo de si se trata de un reenvasador comercial o de un farmacéutico. Por ejemplo, el reenvasador comercial debe cumplir con lo establecido en el Títilo 21 del CFR 201.1, pero esto no se aplica al farmacéutico o dispensador. Si no se dispone de datos de estabilidad, el dispensador reenvasará sólo una cantidad suficiente para un tiempo limitado e incluirá en la etiqueta el nombre del producto y su contenido, el número de lote, el fabricante y la fecha límite de uso correspondiente. Cuando se reenvasan cantidades con anticipación a las necesidades inmediatas, cada medicamento debe llevar una etiqueta identificadora y el dispensador debe guardar registros de reenvasado adecuados en los que conste el nombre del fabricante, el número de lote, la fecha de caducidad, la fecha de reenvasado y el nombre de las personas responsables del reenvasado y del control. El reenvasador o dispensador llevará controles documentados para evitar errores en el etiquetado. Materiales: El reenvasador o dispensador colocará la fecha límite de uso correspondiente en la etiqueta y en el envase sobre los materiales adecuados. Los materiales que utilice el reenvasador no podrán ser reactivos, aditivos o absorbentes y deben cumplir con los requisitos descritos en el Título 21 del CFR 175 y 177. Almacenamiento: El dispensador rotará y controlará las existencias de cerca para asegurarse de que los medicamentos se expendan en el mismo orden en que se envasan. El reenvasador o dispensador almacenará los medicamentos en las condiciones ambientales requeridas (por ejemplo, temperatura ambiente controlada con una temperatura cinética media que no supere los 25º). Medicamento: El reenvasador o dispensador examinará los medicamentos en busca de signos de inestabilidad tales como cambio en el color o en el olor y aplicará su criterio profesional para determinar si un envase es aceptable. Reclamos: El reenvasador o dispensador guardará registros escritos que describan los reclamos orales y escritos respecto de un medicamento y se asegurará de que dichos reclamos se investiguen y resuelvan como corresponde. Artículos devueltos: Deben establecerse políticas y procedimientos relativos a los artículos devueltos para asegurar su manejo adecuado. Reprocesamiento: No se deben volver a procesar envases de dosis única reenvasados (es decir, retirar el medicamento de un envase de dosis única y colocarlo en otro envase de dosis única). No obstante, el reprocesamiento de un empaque secundario (por ejemplo, retirar el blíster de un paquete de cartón y colocarlo en otro paquete de cartón) está permitido siempre que se mantenga la fecha límite de uso original y se garantice la integridad del blíster. Consideraciones especiales: Si un medicamento presenta sensibilidad al oxígeno o sensibilidad extrema a la humedad o a la luz (por ejemplo, si está envasado con lámina moldeada en frío) no debe reenvasarse. Si un medicamento debe estar refrigerado, no se reenvasará a menos que se disponga de las condiciones ambientales apropiadas y de los materiales adecuados. Ciertos medicamentos (tales como agentes oncológicos, hormonas o derivados de la penicilina) requieren una manipulación especial porque se consideran muy potentes o tóxicos y porque la transferencia de una porción de estos productos a otros productos podría tener un efecto pernicioso.
REENVASADO DE FORMAS FARMACÉUTICAS SÓLIDAS Y LÍQl!IDAS NO ESTÉRILES EN ENVASES UNITARIOS Y ENVASES DE DOSIS UNICA Las siguientes guías están dirigidas a aquéllos relacionados con la dispensación farmacéutica y no se aplica a la dispensación comercial. Las formas farmacéuticas oficiales deben presentar en su etiqueta una fecha de caducidad designada para la formulación particular y el envase del artículo. Dicha fecha limita el tiempo durante el cual el producto puede ser dispensado o usa-
USP 39
Información General/ (1136) Envasado y Reenvasado 1579
do. Debido a que la fecha de caducidad indicada en el sistema de envase-cierre original del fabricante se determina específicamente para el medicamento en dicho sistema particular y no debe aplicarse a un producto que ha sido reenvasado en un envase distinto, los medicamentos reenvasados que se dispensen de conformidad con una receta médica quedarán exentos del uso de la fecha de caducidad indicada en el envase original del fabricante. No obstante, bajo ninguna circunstancia, la fecha de caducidad del medicamento reenvasado puede exceder la fecha de caducidad del fabricante original. Por lo tanto, el dispensador debe tomar otras precauciones para conservar el contenido, la calidad y la pureza de aquellos medicamentos que sean reenvasados para su distribución o venta final a pacientes. Las siguientes guías y requisitos se aplican a los casos en que se reenvasen formas farmacéuticas oficiales en envases unitarios o de dosis única o en envases mnemotécnicos para su dispensación conforme a una receta médica. Etiquetado: El dispensador tiene la responsabilidad de colocar una fecha de caducidad adecuada en la etiqueta, tomando en cuenta la naturaleza del medicamento reenvasado, la información relativa al envasado o fechas de caducidad que aparezca en el etiquetado del producto del fabricante, las características de los envases y las condiciones de almacenamiento a las que debe someterse el artículo. Las formas farmacéuticas reenvasadas deben mostrar en sus etiquetas las fechas de caducidad determinadas conforme a la información del etiquetado del producto (ver las Advertencias y Requisitos Generales, Conservación, Envasado, Almacenamiento y Etiquetado). Todo envase unitario o de dosis única incluirá una etiqueta individual, a menos que el dispositivo que contiene la dosis única de la forma farmacéutica no permita el retiro o la separación del envase intacto unitario o de dosis única del mismo. Almacenamiento: Almacenar el artículo reenvasado en un ambiente con humedad controlada y a la temperatura especificada en la monografía individual o en el etiquetado del producto. Para instrucciones adicionales, consultar el capítulo Requisitos de Envasado y Almacenamiento (659). Los refrigeradores y congeladores no se deben considerar ambientes con humedad controlada. Los medicamentos que se van a almacenar en refrigeradores o congeladores deberán protegerse durante su almacenamiento en dichos ambientes, para lo cual podría ser necesario un envase exterior; se recomienda consultar la monografía del medicamento con respecto al almacenamiento. Reprocesamiento: No se deben volver a procesar envases de dosis única reenvasados (es decir, retirar la unidad de dosificación de un envase de dosis única y colocarlo en otro envase de dosis única). No obstante, el reprocesamiento de un empaque secundario (por ejemplo, retirar el blíster de un paquete de cartón y colocarlo en otro paquete de cartón) está permitido siempre que se mantenga la fecha de caducidad original.
PAQUETES DE MEDICACIÓN PERSONALIZADOS PARA PACIENTES En vez de dispensar dos o más medicamentos prescritos en envases separados, los farmacéuticos pueden proveer a los pacientes un paquete de medicación personalizado, previa autorización del paciente, del médico del paciente o de quien extiende la prescripción (paquete de medicación personalizado para el paciente).3 Un paquete de medicación personalizado para el paciente, es decir, un paquete preparado por un farmacéutico para un paciente específico, consta de una serie de envases y contiene dos o más formas farmacéuticas sólidas orales prescritas. El diseño del paquete de medicación personalizado para el paciente, o el etiquetado de cada uno de los envases, debe indicar el día y la hora o periodo en el que debe administrarse su contenido. El dispensador tiene la responsabilidad de instruir al paciente o a la persona encargada de su cuidado sobre el uso del paquete de medicación personalizado para el paciente. Etiqueta: El paquete de medicación personalizado para el paciente debe incluir una etiqueta en la que se declare lo siguiente: 1. El nombre del paciente. 2. Un número de serie exclusivo para el paquete de medicación personalizado para el paciente y un número de serie de identificación distinto para cada una de las órdenes de prescripción de cada uno de los medicamentos contenidos en dicho paquete. 3. El nombre, contenido, descripción física o identificación y la cantidad total de cada medicamento en el paquete. 4. Las instrucciones de uso y las declaraciones precautorias, si las hubiera, contenidas en la orden de prescripción para cada medicamento ahí contenido. 5. Todas las instrucciones o declaraciones precautorias requeridas por los compendios oficiales. 6. El nombre del profesional que recetó cada medicamento. 7. La fecha de preparación del paquete de medicación personalizado para el paciente y la fecha límite de uso o periodo designado a dicho paquete (dicha fecha límite de uso o periodo no debe ser más extenso que la fecha límite de uso más corta recomendada para cualquier forma farmacéutica incluida en el paquete ni superior a 60 días a partir de la fecha de preparación del paquete, y no deberá exceder la fecha de caducidad más corta indicada en los envases a granel del fabricante original para las formas farmacéuticas ahí incluidas); como alternativa, la etiqueta del empaque deberá indicar la
3
Se debe tomar en cuenta que no existen excepciones especiales para los paquetes de medicación personalizados para pacientes con respecto a los requisitos de la Ley de Envasado para la Prevención de Envenenamiento. Por tanto, cuando los paquetes de medicación personalizados para pacientes no cumplan con las normas de seguridad para niños, deberán colocarse en un envase externo que cumpla con dichas normas, o deberá obtenerse la autorización del comprador o del médico para dispensar en un envase que no cumpla con las normas de seguridad para niños.
1580 (11 36) Envasado y Reenvasado / Información General
USP 39
fecha de las prescripciones o la fecha de preparación del paquete, siempre que éste se acompañe de un registro que indique la fecha de inicio y la fecha límite de uso. 8. El nombre, dirección y número telefónico del dispensador (así como el número de registro del dispensador cuando sea necesario). 9. Cualquier otra información, declaraciones o advertencias requeridas para cualquiera de los medicamentos contenidos en el paquete. Si el paquete de medicación personalizado para el paciente permite el retiro o separación de los envases intactos de éste, cada envase individual deberá incluir una etiqueta que identifique cada uno de los medicamentos en el paquete. Etiquetado: El paquete de medicación personalizado para el paciente deberá acompañarse de un inserto o prospecto del empaque para el paciente para los casos en que alguno de los medicamentos ahí contenidos deba dispensarse junto con dicho inserto como etiquetado adjunto. Alternativamente, dicha información requerida se puede incorporar en un solo inserto de información educativa general provisto por el farmacéutico para todo el paquete de medicación personalizado para el paciente. Envasado: Cuando no existan requisitos de envasado más estrictos para alguno de los medicamentos contenidos en el paquete de medicación personalizado para el paciente, cada envase del paquete deberá cumplir con los requisitos de permeabilidad a la humedad para envases de dosis única o unitarios de la Clase B (ver Envases-Pruebas de Desempeño (671 )). Todos los envases deberán ser no reutilizables o designarse de tal modo que evidencien su apertura. Guías: Al preparar un paquete de medicación personalizado para el paciente, el dispensador tiene la responsabilidad de tomar en cuenta todos los requisitos o guías farmacopeicas aplicables así como la compatibilidad física y química de las formas farmacéuticas colocadas dentro de cada envase, además de cualquier incompatibilidad terapéutica que pudiera ocurrir con la administración simultánea de los medicamentos. Con respecto a lo anterior, se recomienda a los farmacéuticos informar a las oficinas centrales de la USP sobre cualquier incompatibilidad observada o informada. Una vez que el medicamento ha sido colocado en el paquete de medicación personalizado para el paciente con otra forma farmacéutica sólida oral, no podrá ser devuelta al inventario, redistribuirse o revenderse si no se hubiera utilizado. Registros: Además de los requisitos de llenado de prescripciones individuales, se debe mantener y archivar un registro de cada paquete de medicación personalizado para el paciente, el cual debe contener, como mínimo: 1 . El nombre y la dirección del paciente. 2. El número de serie de la orden de la receta correspondiente para cada uno de los medicamentos contenidos en dicho paquete. 3. El nombre del fabricante o encargado de asignar la etiqueta y el número de partida para cada uno de los medicamentos contenidos en dicho paquete. 4. Información suficiente que identifique o describa el diseño, características o especificaciones del paquete de medicación personalizado para el paciente para permitir la preparación posterior de un paquete de medicación personalizado idéntico para el paciente. 5. La fecha de preparación del paquete de medicación personalizado para el paciente y la fecha límite de uso designada. 6. Todas las instrucciones especiales de etiquetado. 7. El nombre o las iniciales del farmacéutico que preparó el paquete de medicación personalizado para el paciente.
(1151) FORMAS FARMACÉUTICAS
CONSIDERACIONES GENERALES Este capítulo proporciona descripciones generales y definiciones para productos farmacéuticos o formas farmacéuticas comúnmente usados para administrar el fármaco (ingrediente farmacéutico activo, API, por sus siglas en inglés). Asimismo, se analizan los principios generales relacionados con la fabricación o preparación magistral de estas formas farmacéuticas. Se proporciona un glosario como recurso para nomenclatura. Una forma farmacéutica es una combinación de uno o más fármacos y/o excipientes para facilitar la dosificación, administración y liberación del medicamento en el paciente. El diseño, materiales, fabricación y análisis de todas las formas farmacéuticas
Información General/ (1151) Formas Farmacéuticas 1581
USP 39
se centra en la calidad del producto farmacéutico. 1 Un protocolo de análisis no sólo debe considerar las propiedades físicas, químicas y biológicas de la forma farmacéutica, según corresponda, sino también la vía de administración y el régimen de dosificación deseado. Las interrelaciones entre las formas farmacéuticas y las vías de administración se han resumido en la taxonomía farmacopeica para formas farmacéuticas (ver la Figura 1). 2 La organización de este capítulo de información general se centra principalmente en los atributos físicos de cada forma farmacéutica particular (Nivel Dos), por lo general, sin referencia específica a la vía de administración. Los términos de formas farmacéuticas acompañados por asteriscos (*) son términos no preferidos y no deben usarse en los títulos de medicamentos nuevos. La información específica sobre la vía de administración se proporciona para los casos que así lo requieren.
NIVEL UNO VÍA DE ADMINISTRACIÓN INYECCIÓN/POR IMPLANTE GASTROINTESTINAL
TÓPICND~RMICA
MUCOSA INHALACIÓN
NIVEL DOS FORMA FARMACl!:UTICA AEROSOLES CÁPSULAS CREMAS EMULSIONES PEL[CULAS ESPUMAS GASES GELES GRÁNULOS GOMAS IMPLANTES INYECCIONES INSERTOS IRRIGACIONES lÍQUIDOS LOCIONES TABLETAS DE DISOLUCIÓN BUCAL UNGÜENTOS PASTAS PELLETS PÍLDORAS EMPLASTOS POLVOS JABONES/CHAMPÚS SOLUCIONES ESPRÁIS TIRAS SUPOSITORIOS SUSPENSIONES SISTEMAS TABLETAS CINTAS ADHESIVAS
NIVEL TRES PATRÓN DE LIBERACIÓN INMEDIATA
PROLONGADA
RETARDADA
Figura 1. Taxonomía farmacopeica para formas farmacéuticas. Las pruebas para garantizar el cumplimiento con las normas de la USP para el desempeño de las formas farmacéuticas caen dentro de una de las siguientes áreas. Uniformidad de Dosis(ver también Uniformidad de Unidades de Dosificación (905)): La uniformidad de la dosificación para un paciente o consumidor requiere el control exacto de las variaciones en el contenido de fármaco de cada unidad de dosificación en toda la partida fabricada o el lote de producto farmacéutico preparado magistralmente. La uniformidad de unidades de dosificación a menudo se demuestra empleando uno de los dos procedimientos siguientes: uniformidad de contenido o variación de peso. El procedimiento para uniformidad de contenido requiere la valoración apropiada del contenido de fármaco en unidades individuales, mientras que el de variación de peso emplea el peso de las unidades individuales para estimar su contenido. La variación de peso puede ser utilizada cuando se presume que la distribución subyacente del fármaco en la mezcla es uniforme y está bien controlada, como en el caso de las soluciones. En tales casos, el contenido de fármaco puede estimarse adecuadamente mediante el peso neto. La uniformidad de contenido no se basa en la suposición de la uniformidad de la mezcla y se puede aplicar en todos los casos. El éxito en el desarrollo y la fabricación de formas farmacéuticas requiere de una evaluación cuidadosa del tamaño de partícula o de las gotitas del fármaco, de las técnicas de incorporación y de las propiedades del excipiente. Estabilidad: La estabilidad del producto farmacéutico implica la evaluación de la estabilidad química, de la estabilidad física y del desempeño con el paso del tiempo. La estabilidad química del fármaco en la matriz de la forma farmacéutica debe respaldar la asignación de la fecha de caducidad para las formas farmacéuticas preparadas comercialmente y de una fecha límite de uso para una forma farmacéutica preparada magistralmente. Los procedimientos de prueba para potencia deben ser indicado1 En los Estados Unidos de América, un fármaco con un nombre reconocido en la USP-NF debe cumplir con las normas de identidad farmacopeicas o se considera adulterado, rotulado incorrectamente (misbranded), o ambos. Para evitar que se consideren adulterados, los fármacos deben cumplir con las normas farmacopeicas de contenido, calidad y pureza, a menos que se declaren en el etiquetado todos los aspectos en los que el medicamento difiere. Ver la Federal Food, Drug, and Cosmetic Act (Ley Federal de Alimentos, Medicamentos y Cosméticos o FDCA), Secciones 501 (b) y 502(e)(3)(b), y las reglamentaciones de la Food and Drug Administration (Administración de Alimentos y Medicamentos de los EE.UU. o FDA) en el Título 21 del CFR 299.5. Asimismo, para evitar que se consideren rotulados incorrectamente, los fármacos reconocidos en USP-NFtambién deben envasarse y etiquetarse de conformidad con las normas farmacopeicas, ver la FDCA, Sección 502(g). En este capítulo, el término "Calidad" abarca todos los requisitos farmacopeicos descritos anteriormente. Esta metodología también es consecuente con la participación de los EE.UU. y de la FDA en la lnternational Conference on Harmonization (Conferencia Internacional para la Armonización o ICH). La pauta Q6A de la ICH sobre especificaciones, indica que "las especificaciones se seleccionan para confirmar la calidad del fármaco y del producto farmacéutico ... " y define "calidad" como "La aptitud de un fármaco o producto farmacéutico para su uso previsto. Este término incluye atributos tales como identidad, contenido y pureza". 2 Marshall K, Foster TS, Carlin HS, Williams RL. Development of a compendia! taxonomy and glossary for pharmaceutical dosage forms. Pharm Forum. 2003;29(5): 1742-1752.
1582 (1151) Formas Farmacéuticas /Información General
USP 39
res de la estabilidad (ver Validación de Procedimientos Farmacopeicos (1225)). Se deben cuantificar los productos de degradación. Para el caso de sistemas dispersos o emulsificados, se debe tomar en cuenta el potencial de sedimentación o separación de los componentes de la formulación. Cualquier cambio físico en la forma farmacéutica debe ser fácil de revertir (p.ej., agitando) antes de dosificar o administrar. Para tabletas, cápsulas, suspensiones orales e implantes, los procedimientos de prueba de liberación in vitro, tales como disolución y desintegración, ofrecen una medición de la uniformidad continua del desempeño con el paso del tiempo (ver Disolución (711 ), Desintegración (701) y Liberación de Fármacos (724)). Biodisponibilidad(ver también Evaluación In Vivo e In Vitro de Formas Farmacéuticas (1088) y Evaluación de Desempeño del Producto Farmacéutico-Biodisponibilidad, Bioequivalencia y Disolución (1090)): La biodisponibilidad se ve afectada por diversos factores tales como el método de fabricación o de preparación magistral, el tamaño de partícula, la forma cristalina (polimorfismo) del fármaco, las propiedades de los excipientes usados para formular la forma farmacéutica y los cambios físicos conforme el producto farmacéutico envejece. Garantizar la uniformidad de la biodisponibilidad con el paso del tiempo (bioequivalencia) requiere una atención estrecha en todos los aspectos de producción (o preparación magistral) y del análisis de la forma farmacéutica. Con la justificación adecuada, se pueden usar pruebas de liberación in vitro (p.ej., desintegración y disolución) como sucedáneas para demostrar la disponibilidad uniforme del fármaco a partir de la dosis formulada. Fabricación: Aunque las instrucciones detalladas sobre fabricación de cualquiera de estas formas farmacéuticas están más allá del alcance de este capítulo de información general, se han incluido principios generales de fabricación. 3 Se puede encontrar información pertinente a las preparaciones magistrales extemporáneas de formas farmacéuticas en Preparación Magistral-Preparaciones No Estériles (795) y en Preparación Magistral-Preparaciones Estériles (797). Vía de Administración: Las vías de administración primarias de formas farmacéuticas se pueden definir como parenteral (ver •Medicamentos Inyectables y en Implantes (1)• {AFOl-may-2016)), gastrointestinal (ver Medicamentos Orales-Pruebas de Calidad del Producto (2)), tópica/dérmica (ver Medicamentos Tópicos y Transdérmicos-Pruebas de Calidad del Producto (3)), por mucosa y por inhalación (ver Medicamentos Nasales y para Inhalación-Información General y Pruebas de Calidad del Producto (5)), y cada una de ellas cuenta con sus propias subcategorías necesarias. Por lo general, muchas de las pruebas usadas para asegurar la calidad se aplican a todas las vías de administración; sin embargo, algunas pruebas son específicas para ciertas vías. Por ejemplo, los productos destinados para inyección se deben evaluar usando Pruebas de Esterilidad (71 ), Prueba de Endotoxinas Bacterianas (85) o Prueba de Pirógenos (151 ), y el proceso de fabricación (y la técnica de esterilización) empleado para parenterales (por inyección) debe asegurar el cumplimiento de dichas pruebas. Algunas formas farmacéuticas pueden requerir pruebas para la determinación de partículas, dependiendo de la vía de administración (p.ej., por inyección, ver Partículas en Inyectables (788) o mucosa, ver Partículas en Soluciones Oftálmicas (789)). Asimismo, para las formas farmacéuticas destinadas para administración por inhalación, se debe monitorear el tamaño de partícula y el patrón de rocío (para inhaladores de dosis fija o inhaladores de polvo seco) y el tamaño de gotitas (para atomizadores nasales). Se puede encontrar información adicional relacionada con las vías de administración y las pruebas sugeridas en la Guía de los Capítulos Generales, Diagramas 4-8, 7O y 73. Un proceso de fabricación y régimen de pruebas adecuados ayudan a asegurar que una forma farmacéutica pueda cumplir con los atributos de calidad apropiados para la vía de administración prevista. Envasado y almacenamiento: Se determina un envasado adecuado para cada producto. Para obtener más información sobre el cumplimiento de los requisitos de envasado listados en el etiquetado individual, consultar Requisitos de Envasado y Almacenamiento (659), Envases-Pruebas de Desempeño (671 ), Buenas Prácticas de Envasado (1177) y Buenas Prácticas de Reenvasado (11 78). El etiquetado del producto debe especificar requisitos de almacenamiento que describan las condiciones ambientales, limitaciones y restricciones. Por ejemplo, la exposición a temperaturas excesivas, humedad y luz puede afectar la capacidad del envasado para proteger el producto. Declaraciones en el etiquetado-Algunas formas farmacéuticas o artículos presentan declaraciones obligatorias en el etiquetado, las cuales se listan en el Code of Federal Regulations (Código de Reglamentos Federales o CFR) (p.ej., Título 21 del CFR 201.320 y Título 21 del CFR 369.21 ). Se debe consultar el texto del Título 21 del CFR para determinar las recomendaciones vigentes.
Cambio en la redacdón:
PRUEBAS GENERALES DE CALIDAD DE PRODUCTOS La guía Q6A de la ICH (disponible en www.ich.org) recomienda especificaciones (lista de pruebas, referencias a procedimientos analíticos y criterios de aceptación) para asegurar que los productos farmacéuticos sean seguros y efectivos al momento de la liberación y durante su vida útil. Las pruebas que se aplican universalmente para asegurar la seguridad, eficacia, contenido, calidad y pureza incluyen: descripción, identificación, valoración e impurezas. Descripción: La sección Definición (ver Advertencias y Requisitos Generales 4.1 O) en las monografías USP describe el medicamento y especifica el intervalo de contenido valorado aceptable de los fármacos presentes en la forma farmacéutica. Para ciertos productos, la Definición incluye información adicional relevante, tal como la presencia o ausencia de otros componentes, excipientes, o adyuvantes, declaraciones de advertencia sobre toxicidad y estabilidad, etc. Aunque las propuestas reglamentarias incluyen información sobre apariencia para facilitar la identificación (p.ej., descripción cualitativa del tamaño, la forma, el
3
Los términos "fabricación" y "preparación" se usan intercambiablemente en este capítulo general.
USP 39
Información General/ (1151) Formas Farmacéuticas 1583
color, etc.) normalmente, no es una parte requerida de las monografías de la USP. Esta información es específica del medicamento. Identificación: Las pruebas de identificación se discuten en las Advertencias y Requisitos Generales 5.40. Las pruebas de identificación deben establecer la identidad de los fármacos presentes en el producto farmacéutico y deben distinguir entre compuestos con estructuras estrechamente relacionadas que pudieran estar presentes. Las pruebas de identificación deben ser específicas para los fármacos. Por ejemplo, el espectro de absorción en el infrarrojo se usa a menudo (ver llllllllfJll[dlidlll ~~llilil!il:i!lfMi<6~tliJ~{':~~~§~ y Pruebas de Identificación Espectrofotométrica (197)). Si no es posible obtener un espectro infrarrojo adecuado, se pueden usar otros métodos analíticos. Los métodos de espectrofotometría en el Infrarrojo Cercano (NIR, por sus siglas en inglés) o Raman también podrían ser aceptables como método único de identificación de la formulación del producto farmacéutico (ver Espectroscopía en el Infrarrojo Cercano (1119) y Espectroscopía Raman (1120)). La identificación mediante un tiempo de retención cromatográfico a partir de un solo procedimiento no se considera específica. Puede resultar aceptable el uso de tiempos de retención procedentes de dos procedimientos cromatográficos para los que la separación se basa en diferentes principios o una combinación de pruebas en un solo procedimiento (ver Cromatografía (621) y Prueba de Identificación por Cromatografía en Capa Delgada (201 )). Valoración: Se debe usar una prueba específica e indicadora de la estabilidad para determinar la concentración (contenido de fármaco) en el producto farmacéutico. Algunos ejemplos de estos procedimientos son los capítulos Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas (81 ), (621) o Valoración de Esteroides (351 ). Para los casos en los que se justifica el uso de una valoración no específica (p.ej., Volumetría (541 )), se deben usar otros procedimientos analíticos de respaldo para lograr la especificidad. Cuando exista evidencia de interferencia de los excipientes en una valoración no específica, se debe usar un procedimiento con especificidad comprobada. Impurezas: El fármaco y los excipientes usados en la fabricación del producto farmacéutico pueden presentar impurezas del proceso, subproductos sintéticos y demás impurezas orgánicas e inorgánicas. Dichas impurezas se evalúan mediante las pruebas contenidas en las monografías del fármaco y de los excipientes. Resulta necesario monitorear las impurezas resultantes de la degradación del fármaco o del proceso de fabricación del producto farmacéutico. El capítulo Disolventes Residuales (467) se aplica a todos los productos, siempre que sea pertinente. En ocasiones resulta adecuado analizar las impurezas de metales pesados.:t:iJ~:llJl!~Jiil;,J Además de l~s pruebas universales citadas anteriormente, se pueden consid~r~~ la;~siguientes pruebas para cada caso específico. Propiedades fisicoquímicas: Los ejemplos incluyen pH (791 ), Viscosidad-Métodos Capilares (911) o Viscosidad-Métodos Rotatorios (912) y Peso Específico (841 ). Tamaño de partícula: En el caso de algunas formas farmacéuticas, el tamaño de partícula puede tener un efecto significativo sobre las velocidades de disolución, la biodisponibilidad, el resultado terapéutico y la estabilidad. Se pueden usar procedimientos tales como los descritos en Medicamentos Nasales y para Inhalación: Pruebas de Calidad de Desempeño de Aerosoles, Atomizadores y Polvos (601) y en Estimación de la Distribución del Tamaño de Partícula por Tamizado Analítico (786). Uniformidad de unidades de dosificación: Ver la discusión sobre Uniformidad de Dosis en la sección de Consideraciones Generales anterior. Contenido de agua: Cuando resulta apropiado, se incluye una prueba de determinación de agua (ver Determinación de Agua (921 )). Límites microbiológicos: El tipo de prueba(s) microbiológica(s) y los criterios de aceptación se basan en la naturaleza del medicamento no estéril, el método de fabricación y la vía de administración (ver Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano (61 ), Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Microorganismos Específicos (62)) y Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Criterios de Aceptación para Preparaciones Farmacéuticas y Sustancias de Uso Farmacéutico (1111 )). Contenido de conservante antimicrobiano: Se deben establecer criterios de aceptación para contenido de conservantes en productos multidosis, los cuales se basan en los niveles de conservante antimicrobiano necesarios para mantener la calidad microbiológica del producto en todas las etapas durante su uso y vida útil propuestos (ver Pruebas de Eficacia Antimicrobiana (51 )). Contenido de antioxidantes: Si el producto farmacéutico contiene antioxidantes, se deben realizar pruebas para determinar su contenido a fin de mantener la calidad del producto en todas las etapas durante su uso y vida útil propuestos. Esterilidad: Dependiendo de la vía de administración, (p.ej., preparaciones oftálmicas, implantes, preparaciones acuosas para inhalación oral e inyecciones) la esterilidad del producto se demuestra cuando resulte apropiado (ver el capítulo (71 )). Disolución: Las formas farmacéuticas tales como tabletas, cápsulas, suspensiones, gránulos para suspensiones, implantes, sistemas de administración transdérmica y gomas de mascar medicadas normalmente incluyen una prueba para medir la liberación de los fármacos a partir del producto farmacéutico. Las mediciones de un solo punto a menudo se usan para formas farmacéuticas de liberación inmediata. Para formas farmacéuticas de liberación modificada, se establecen condiciones de prueba y procedimientos de muestreo apropiados, según sea necesario, (ver los capítulos (711) y (724)). En algunos casos, las pruebas de disolución se pueden reemplazar con un análisis de desintegración (ver el capítulo (701 )). Fuerza de ruptura y friabilidad: Estos parámetros se evalúan como controles durante el proceso. Los criterios de aceptación dependen del envasado, cadena de aprovisionamiento y uso previsto (ver Friabilidad de las Tabletas (1216) y Fuerza de Ruptura de las Tabletas (1217)).
1584 (1151) Formas Farmacéuticas / Información General
USP 39
Sustancias lixiviables: Cuando existe evidencia de que las sustancias lixiviables de los sistemas de envase-cierre (p.ej., los tapones de goma, el recubrimiento interno de la tapa o los frascos de plástico) tienen un impacto sobre la seguridad o eficacia del producto farmacéutico, se incluye una prueba para evaluar la presencia de dichas sustancias. Otras pruebas: Dependiendo del tipo y composición de la forma farmacéutica, pueden ser necesarias otras pruebas, por ejemplo, contenido de alcohol, redispersabilidad, distribución del tamaño de partícula, propiedades reológicas, tiempo de reconstitución, endotoxinas/pirógenos, partículas, pruebas de funcionalidad de sistemas de administración, uniformidad de dosis liberada, viscosidad y osmolaridad.
FORMAS FARMACÉUTICAS Aerosoles Los aerosoles son formas farmacéuticas envasadas a presión que contienen agentes terapéuticos y un propelente que se liberan al activar un sistema de válvula apropiado. Al momento de activar el sistema de válvula, el fármaco es liberado como una nube de partículas finas o gotitas. Al activar la válvula de dosis fija se libera únicamente una dosis de la preparación. En el caso de productos tópicos, y dependiendo de la naturaleza del fármaco y de las condiciones que se estén tratando, la activación de la válvula puede resultar en una liberación fija de una cantidad controlada de formulación o la liberación continua mientras la válvula esté siendo presionada. La forma farmacéutica aerosol se refiere únicamente a aquellos productos envasados a presión que liberan un fino rocío de partículas o gotitas al activarlos (ver el Glosario). Los demás productos que producen dispersiones de gotitas o partículas finas se tratan en las secciones subsiguientes (p.ej., Polvos y Espráis). COMPONENTES TÍPICOS Los componentes típicos de los aerosoles son: la formulación que contiene uno o más fármacos y el propelente, el envase, la válvula y el disparador. Cada componente desempeña un papel para la determinación de las diversas características de la nube emitida, por ejemplo, la distribución del tamaño de partícula o de las gotitas, uniformidad de administración del agente terapéutico, la velocidad de liberación y la velocidad y geometría de la nube. La válvula dosificadora y el disparador actúan en tándem para generar la nube de gotitas o partículas. La válvula dosificadora administra un volumen exacto de la formulación líquida presurizada desde el envase. El disparador dirige el volumen medido a un pequeño orificio que se abre a la atmósfera. Al momento de la activación, la formulación es empujada a través del orificio, formando un rocío fino de partículas que se dirige hacia el sitio de administración. Las preparaciones en aerosol pueden consistir en una formulación de dos fases (gas y líquido) o de tres fases (gas, líquido y sólido o líquido). La formulación de dos fases consta de fármacos disueltos en propelente licuado. Se pueden agregar codisolventes, tales como alcohol, para mejorar la solubilidad de los fármacos. Los sistemas de tres fases de aerosoles para inhalación y nasales constan de fármacos suspendidos en propelentes, codisolventes y, posiblemente, otros excipientes adecuados. La suspensión o emulsión del fármaco finamente dividido a menudo se dispersa en el líquido propelente con ayuda de agentes tensoactivos biocompatibles adecuados u otros excipientes. Los propelentes para formulaciones en aerosol a menudo tienen hidrofluorocarburos o hidrocarburos de bajo peso molecular que están en forma líquida cuando se introducen en el envase, presentan una presión de vapor adecuada a temperatura ambiente y son biocompatibles y no irritantes. Los gases comprimidos no ofrecen una presión constante con el uso y, a menudo, no se utilizan como propelentes. Los envases metálicos pueden tolerar la presión de vapor producida por el propelente. Se puede agregar un exceso de formulación al envase para asegurar la administración exacta del número total de dosis declaradas. El envase y el cierre deben ser capaces de tolerar las presiones anticipadas en condiciones de uso normales y cuando el sistema se exponga a temperaturas elevadas. TIPOS DE FORMAS FARMACÉUTICAS EN AEROSOL Los aerosoles se pueden administrar mediante diversas vías. El envase, el disparador y la válvula dosificadora, así como la formulación, están diseñadas para el sitio de administración específico. Los aerosoles para inhalación, comúnmente conocidos como inhaladores de dosis fija (MDI, por sus siglas en inglés), están destinados para producir partículas o gotitas finas para inhalación a través de la boca y para depositarse en el árbol pulmonar. El diseño del sistema de administración tiene como propósito liberar una masa medida y de calidad apropiada de la sustancia activa con cada disparo. Los aerosoles nasales, comúnmente conocidos como MDI nasales, producen partículas o gotitas finas para administración a través del vestíbulo nasal y para depositarse en la cavidad nasal. Cada disparo de la válvula libera una masa medida de fármaco con las características de calidad apropiadas.
USP 39
Información General/ (11 51) Formas Farmacéuticas 1585
Los aerosoles linguales están destinados a producir partículas o gotitas finas para depositarse en la superficie de la lengua. El diseño del sistema de administración libera una dosis con cada disparo. Los aerosoles tópicos producen partículas o gotitas finas para su aplicación sobre la piel. ETIQUETADO PARA USO APROPIADO Referirse al Título 21 del CFR 201.320 y al Título 21 del CFR 369.21.
Cápsulas Las cápsulas son formas farmacéuticas sólidas en las que el fármaco y/o los excipientes están contenidos dentro de un receptáculo o cubierta soluble o recubren la cubierta de la cápsula. Las cubiertas pueden estar compuestas por dos piezas (un cuerpo y una tapa) o por una sola pieza. A menudo, se hace referencia a las cápsulas de dos piezas con el nombre de cápsulas de cubierta dura, mientras que las cápsulas de una sola pieza reciben el nombre de cápsulas de cubierta blanda. Aunque imprecisa, esta distinción entre cápsulas de dos y de una pieza refleja los diferentes niveles de plastificantes en las dos composiciones, así como el hecho de que las cápsulas de una pieza generalmente son más flexibles que las cápsulas de dos piezas. Las cubiertas de las cápsulas por lo general se fabrican con gelatina. Sin embargo, también se pueden fabricar con polímeros de celulosa u otro material adecuado. La mayoría de las cápsulas están diseñadas para administración oral. Cuando no se ha modificado intencionalmente la velocidad de liberación del fármaco, las cápsulas reciben el nombre de cápsulas de liberación inmediata. Cápsulas de dos piezas o de cubierta dura: Las cápsulas de dos piezas consisten en dos piezas telescópicas -un cuerpo y una tapa- en un intervalo de tamaños estandarizados. Cápsulas de una pieza o de cubierta blanda: Las cápsulas de una pieza generalmente se usan para administrar un fármaco en forma de solución o suspensión. Las formulaciones líquidas colocadas en las cápsulas de una pieza pueden ofrecer ventajas en comparación con las cápsulas con contenido seco y las tabletas en lo que respecta a lograr la uniformidad de contenido de fármacos potentes o la disolución aceptable de fármacos con poca solubilidad en agua. Debido a que el contacto entre la pared de la cubierta y su contenido líquido es más íntimo que en las cápsulas con contenido seco, la probabilidad de que ocurran interacciones no deseadas es más alta (incluyendo el entrecruzamiento con la gelatina y la formación de película). Cápsulas de liberación modificada: La liberación de fármacos a partir de las cápsulas se puede modificar de varias maneras. Existen dos categorías para formulaciones de cápsulas de liberación modificada reconocidas por la USP: Cápsulas de liberación retardada-En ocasiones, las cápsulas se formulan para incluir gránulos con recubrimiento entérico que protege los fármacos ácido-lábiles del entorno gástrico o para evitar eventos adversos, tales como irritación. Las cápsulas con multipartículas con recubrimiento entérico pueden reducir la variabilidad en la biodisponibilidad asociada con los tiempos de vaciado gástrico para partículas más grandes (p.ej., tabletas) y para minimizar la probabilidad de falla terapéutica cuando se presentan defectos en el recubrimiento durante la fabricación. Como alternativa, se puede aplicar un recubrimiento a la cubierta de la cápsula para conseguir la liberación retardada del contenido. Cápsulas de liberación prolongada-Las cápsulas de liberación prolongada se formulan de tal manera que el fármaco contenido esté disponible durante un periodo prolongado después de la ingestión. Las expresiones "acción prolongada", "acción repetida", "liberación controlada" y "liberación sostenida" también se han empleado para describir esta forma farmacéutica. Sin embargo, para propósitos farmacopeicos, se emplea el término "liberación prolongada". Los requisitos de disolución (ver el capítulo (711 )) por lo general se especifican en la monografía individual. Los métodos para modificar la liberación del fármaco a partir de las cápsulas incluyen recubrir las cubiertas de las cápsulas llenas o el contenido de las cápsulas en el caso de las cápsulas con contenido seco. PREPARACIÓN Cápsulas de dos piezas: Las cápsulas de gelatina de dos piezas, por lo general, se fabrican a partir de mezclas de gelatinas con una fuerza de gel relativamente alta, a fin de optimizar la claridad y dureza de la cubierta, o a partir de hipromelosa. Asimismo, pueden contener colorantes tales como colorantes D&C y FD&C 4 o diversos pigmentos, agentes opacificantes como dióxido de titanio, agentes dispersantes, plastificantes y conservantes. Las cubiertas de las cápsulas de gelatina normalmente contienen entre 12% y 16% de agua. En 1960 el Congreso de los EE.UU. promulgó Enmiendas para Aditivos Colorantes (Color Additive Amendments), en las que requiere a la FDA la regulación de colorantes, pigmentos y demás agentes colorantes en alimentos, medicamentos y cosméticos de manera independiente a los aditivos alimenticios. Por ley, los aditivos colorantes se consideran inseguros a menos que se usen de conformidad con las reglamentaciones de la FDA. La ley ofrece un marco de trabajo para la inclusión y certificación de aditivos colorantes. Ver la FDCA, sección 721; ver las reglamentaciones de la FDA en el Título 21 del CFR Parte 70. Los colorantes también deben incluirse en las reglamentaciones de la FDA pertinentes para usos específicos; la lista de aditivos colorantes para medicamentos que están exentos del requisito de certificación está publicada en el Título 21 del CFR Parte 73, Subparte B. Asimismo, la FDA lleva a cabo un programa de certificación para partidas de aditivos colorantes que requieren certificación antes de su venta; ver el Título 21 del CFR Parte 74 (Subparte B referente a medicamentos). Las reglamentaciones relacionadas con los procedimientos de certificación, las especificaciones generales y el listado de colorantes con certificación provisional se encuentran en el Título 21 del CFR Parte 80. La FDA mantiene un sitio web para aditivos colorantes con enlaces a diversos recursos legales y reglamentarios en: http://www.fda.gov; buscar por título de documento. 4
1586 (1151) Formas Farmacéuticas / Información General
USP 39
Las cubiertas se fabrican en un conjunto de operaciones y posteriormente se llenan en un proceso de fabricación distinto. Las cubiertas de las cápsulas de dos piezas se fabrican mediante un proceso que consiste en la inmersión de punzones moldeados en soluciones de gelatina o hipromelosa y posteriores etapas de secado, cortado y ensamblado. Las formulaciones en polvo para cápsulas de gelatina de dos piezas por lo general están compuestas por el fármaco y al menos un excipiente. Tanto la formulación como el método de llenado pueden afectar la liberación del fármaco. En la operación de llenado, el cuerpo y la tapa de la cubierta son separadas antes del llenado. Después de la operación de llenado, la maquinaria reensambla el cuerpo con la tapa y asegura el cierre satisfactorio de la cápsula aplicando fuerza adecuada sobre las dos piezas. Las cápsulas ensambladas se pueden sellar después del llenado usando una banda sobre la unión del cuerpo y la tapa o empleando una junta de sujeción diseñada entre la tapa y el cuerpo. En la práctica de la preparación magistral de prescripciones, las cápsulas de dos piezas se pueden llenar a mano. Esto permite al prescriptor seleccionar un solo fármaco o una combinación de fármacos al nivel de dosis exacto que se considera mejor para cada paciente. Cápsulas de una pieza: Las cápsulas de una sola pieza se fabrican, llenan y sellan en un solo proceso usando la misma máquina, y se encuentran disponibles en una amplia variedad de tamaños, formas y colores. El tipo de cápsula de una pieza más común es el que se produce usando un proceso de matrices rotativas, el cual produce una cápsula con costura. Las cubiertas de gelatina blanda son un poco más gruesas que las de las cápsulas de dos piezas y pueden plastificarse mediante el agregado de polioles, tales como glicerina, sorbitol u otro material adecuado. La relación entre plastificante y gelatina se puede modificar para cambiar la flexibilidad de la cubierta, dependiendo de la naturaleza del material de llenado, su uso pretendido o las condiciones ambientales. En la mayoría de los casos, las cápsulas de una pieza se llenan con líquidos. Por lo general, los fármacos se disuelven o suspenden en un vehículo líquido. Tradicionalmente, se empleaban vehículos oleosos, por ejemplo, aceite vegetal. Sin embargo, en la actualidad resultan más comunes los vehículos líquidos no acuosos miscibles en agua, como los polietilenglicoles de bajo peso molecular. Es posible seleccionar las propiedades fisicoquímicas del vehículo a fin de asegurar la estabilidad del fármaco y para influenciar el perfil de liberación a partir de la cubiei:ta de la cápsula.
Cremas (Ver Emulsiones.)
Emulsiones Una emulsión es un sistema coloidal disperso que consiste en dos fases líquidas inmiscibles, generalmente estabilizadas con uno o más agentes adecuados. Normalmente, las emulsiones farmacéuticas se preparan a partir de líquidos acuosos y orgánicos (aceites) inmiscibles. En una emulsión pueden existir sistemas multifases complejos. Que la fase acuosa o la orgánica sea la fase dispersa depende de los volúmenes de las dos fases, el emulsionante elegido y el método de preparación. Cuando una fase oleosa está dispersa en una fase acuosa, la emulsión se denomina emulsión de aceite en agua (O/W, por sus siglas en inglés) y la fase acuosa se denomina fase continua. Cuando la fase acuosa está dispersa en la fase oleosa, la emulsión se denomina emulsión de agua en aceite (W /O, por sus siglas en inglés). Normalmente, el tamaño de las gotas de las fases dispersas de las emulsiones varían de O, 1 a 100 µm. Las emulsiones son opacas, mientras que las microemulsiones son normalmente transparentes o translúcidas. Las microemulsiones tienen fases dispersas con gotas de menos de O, 1 µm. Las emulsiones pueden presentar tres tipos de inestabilidad: floculación, cremado y coalescencia. La floculación describe el proceso mediante el cual la fase dispersa sale de la suspensión en forma de escamas. La coalescencia es otra forma de inestabilidad-pequeñas gotitas contenidas en los medios se combinan continuamente para formar gotitas de mayor tamaño progresivamente. Las emulsiones también pueden experimentar un cremado, cuando una de las fases emigra a la parte superior (o inferior, dependiendo de las densidades relativas de las dos fases) de la emulsión. Para evitar la floculación, el cremado y la coalescencia de las emulsiones, los fabricantes suelen agregar agentes tensoactivos, agentes modificadores del pH o agentes emulsionantes para aumentar la estabilidad de las emulsiones de modo que la emulsión no cambie significativamente con el paso del tiempo. Las emulsiones se usan ampliamente como formas farmacéuticas. Las emulsiones orales se preparan para mejorar el sabor, la solubilidad, la estabilidad o la biodisponibilidad. Las emulsiones para administración tópica se denominan cremas, lociones y a veces ungüentos. Las emulsiones parenterales se usan para anestésicos, nutrición parenteral y para administración de medicamentos con poca solubilidad en agua. Cremas: Las cremas son formas farmacéuticas en emulsión semisólida. A menudo, contienen más de 20% de agua y sustancias volátiles y/o por lo general contienen menos de 50% de hidrocarburos, ceras o polioles como vehículos para el fármaco. Las cremas, por lo general, están destinadas para aplicación externa sobre la piel o las membranas mucosas. Las cremas tienen una consistencia relativamente suave y untable, y se pueden formular como una emulsión de agua en aceite (p.ej., Crema Fría o Crema Grasa tal como se cita en la Farmacopea Europea) o como una emulsión de aceite en agua (p.ej., la Crema de Valerato de Betametasona). Las cremas, por lo general, se describen como no lavables o lavables, lo que refleja el hecho de que una emulsión con una fase externa acuosa continua es más fácil de eliminar que una con fase externa no acuosa (emulsión de agua en aceite).
USP 39
Información General/ (1151) Formas Farmacéuticas 1587
Lociones: Las lociones son formas farmacéuticas líquidas emulsificadas destinadas para aplicación externa sobre la piel. Algunas suspensiones tópicas, tales como la loción de calamina, han sido denominadas históricamente como lociones; sin embargo, dicha nomenclatura no es la preferida en la actualidad. Las lociones comparten una gran cantidad de características con las cremas. El factor de distinción se basa en que las lociones son más fluidas que semisólidas y, por lo tanto, se pueden verter. Debido a su carácter fluido, las lociones son más fáciles de aplicar en superficies extensas de la piel que las preparaciones semisólidas. Las lociones pueden contener agentes antimicrobianos como conservantes. Emulsiones inyectables: Las emulsiones inyectables son formas farmacéuticas líquidas estériles de fármacos disueltos o dispersos en un medio de emulsión adecuado. Las emulsiones inyectables se usan para la administración parenteral de medicamentos con poca solubilidad en agua. Ungüentos: Los ungüentos a veces son formas farmacéuticas en emulsiones semisólidas (ver Ungüentos). PREPARACIÓN El capítulo (795) proporciona información general sobre la preparación de emulsiones. Cremas: Las cremas se pueden formular a partir de una variedad de aceites minerales y vegetales, y de alcoholes grasos, ácidos grasos y ésteres grasos. Los agentes emulsificantes incluyen agentes tensoactivos no iónicos, detergentes y jabones. Los jabones, por lo general, se forman in situ durante la preparación de las cremas, a partir de un ácido graso en fase oleosa que se hidroliza con una base disuelta en la fase acuosa. La preparación a menudo implica la separación de los componentes de la fórmula en dos porciones: lípida y acuosa. La porción lípida contiene todos los componentes insolubles en agua, mientras que la porción acuosa contiene los componentes solubles en agua. Ambas fases se calientan a una temperatura por encima del punto de fusión del componente con el punto de fusión más alto. Posteriormente, las fases se mezclan y se sigue mezclando hasta que la mezcla alcance la temperatura ambiente o hasta que solidifique. Por lo general, el mezclado continúa durante el proceso de enfriamiento para promover la uniformidad. Tradicionalmente, la fase acuosa se agrega a la fase lípida, aunque se han obtenido resultados comparables usando el procedimiento inverso. Se puede emplear homogeneización de alta velocidad para reducir el tamaño de partícula o de las gotitas y para mejorar la estabilidad física de la forma farmacéutica resultante. Los fármacos se pueden agregar a la fase en la que son solubles al inicio del proceso de fabricación o se pueden agregar después de preparar la crema mediante un proceso de dispersión adecuado tal como levigación o molienda con un molino de rodillo. Las cremas, por lo general, requieren la adición de conservantes, a menos que se preparen magistralmente inmediatamente antes de su uso y estén destinadas para su consumo en un periodo relativamente corto. Lociones: Las lociones, por lo general, se preparan disolviendo o dispersando el fármaco en la fase más apropiada (aceite o agua), agregando el emulsionante o agente de suspensión apropiado y mezclando las fases oleosa y acuosa para formar una emulsión fluida uniforme. Emulsiones inyectables: r:ii)iJ!illlliilll proporciona una guía sobre preparaciones estériles. Las emulsiones destinadas para su administración parenteral pueden formularse usando los mismos principios que las cremas y las lociones. La formulación debe diseñarse para que su administración sea fácil. El tamaño de partícula de la fase dispersa puede variar dependiendo de la vía de administración. Por ejemplo, las emulsiones destinadas para su administración intravenosa deben cumplir con Distribución del Tamaño de Glóbulos en Emulsiones Inyectables de Lípidos (729). El procedimiento que asegure la esterilidad se debe validar por llenado de medios. Por lo general, no se usan conservantes en emulsiones inyectables. Ungüentos: (Ver Ungüentos.)
Películas Las películas son láminas finas que se colocan en la cavidad oral. Contienen una o más capas. Las capas pueden o no contener el fármaco. Normalmente, estas láminas finas se forman mediante fundición o extrusión que resulta en la dispersión de los componentes por toda la película. Las películas se clasifican según su lugar de aplicación. Las "películas orales" se pueden formular para que liberen la medicación en la boca, como los productos de higiene oral, o en el tracto gastrointestinal donde se absorbe. Las "películas bucales" y las "películas sublinguales" están formuladas para facilitar la absorción a través de la membrana proximal de las mucosas evitando el primer paso del metabolismo o su degradación en el tracto gastrointestinal y proporcionando un rápido comienzo de la acción. Las películas se pueden formular con polímeros comestibles, tales como pululano o con polímeros solubles en agua, tales como celulosa modificada, gomas comestibles y copolímeros. La velocidad de disolución de la película se controla para facilitar la incorporación de la medicación a la saliva o su absorción por la mucosa proximal. Estas películas deben ser capaces de mantener su integridad durante la fabricación y el envasado, y durante la manipulación por parte del paciente. Debido a su rápida disolución, el gusto y la sensación en la boca son consideraciones importantes.
Espumas Las espumas son preparaciones que contienen burbujas de gases distribuidas en un líquido. El líquido contiene el fármaco y excipientes adecuados. Las espumas medicadas pueden envasarse en envases presurizados o en otros dispositivos dispensado-
1588 (1151) Formas Farmacéuticas / Información General
USP 39
res especiales. Las espumas medicadas que se administran desde envases no presurizados requieren el uso de fuerza mecánica para generar la espuma. Las espumas están destinadas para su aplicación sobre la piel o sobre las membranas mucosas. La espuma medicada se forma en el momento de su aplicación. Se usan agentes tensoactivos para asegurar la distribución del gas en el líquido y para estabilizar la espuma. Las espumas medicadas tienen una consistencia semisólida y pueden formularse para que se colapsen rápidamente formando un líquido o para que se mantengan como espuma y así asegurar el contacto prolongado. Las espumas medicadas destinadas para el tratamiento de la piel severamente lesionada o de heridas abiertas deben ser estériles. PREPARACIÓN Una espuma puede contener uno o varios fármacos, agentes tensoactivos y líquidos acuosos o no acuosos, y se produce con o sin la ayuda de propelentes. Cuando no se usa ningún propelente, se requiere trabajo mecánico para generar la espuma. Si el propelente se encuentra en la fase interna (discontinua), se descarga una espuma estable. Si el propelente se encuentra en la fase externa (continua), se descarga una espuma que se colapsa rápidamente. Las espumas que se colapsan rápidamente formuladas con alcohol generan una sensación refrescante después de aplicarlas sobre la piel y pueden tener propiedades antimicrobianas.
Gases Los gases medicinales son productos que se administran directamente en forma de gas. Un gas medicinal tiene una acción farmacológica directa o actúa como diluyente para otro gas medicinal. Los gases usados como excipientes para la administración de productos en aerosol, como un adyuvante en el envase, o los producidos por otras formas farmacéuticas, no se incluyen en esta definición. Componentes: Los gases medicinales pueden ser componentes individuales o mezclas definidas de componentes. Las mezclas también se pueden preparar extemporáneamente en el momento de su uso. Administración: Los gases medicinales se pueden administrar al paciente usando diversos métodos: cánulas nasales, mascarillas faciales, carpas atmosféricas para gases y tubos endotraqueales para la vía pulmonar; cámaras hiperbáricas para las vías de administración pulmonar y dérmica; tubos de chorro que se dirigen al tejido dental para promover el secado en la preparación de obturaciones y coronas; tubos para dilatar los intestinos para facilitar la generación de imágenes médicas durante la colonoscopia; tubos para dilatar la pelvis mediante insuflación transuterina durante la preparación para ligadura de trompas de falopio; y tubos para dilatar los dispositivos de angioplastia. La dosis de gas medicinal, por lo general, se mide mediante una velocidad de flujo de volumen en condiciones de presión y temperatura ambientales. La administración de un gas sumamente comprimido, por lo general, requiere un regulador para disminuir la presión, un controlador de flujo de volumen variable y un sistema de tubos adecuado para dirigir el gas hacia el paciente. Para administración pulmonar, el flujo de gas se dirigirá hacia la nariz o la boca mediante un dispositivo adecuado o hacia el interior de la tráquea a través de un respirador mecánico. Cuando los gases medicinales se administran de forma crónica, resulta común humidificarlos. Se debe tener cuidado de evitar la contaminación microbiana. CONSIDERACIONES ESPECIALES Las conexiones del envase y del sistema deben ser adecuadas para el gas medicinal. No se deben usar adaptadores para conectar los envases a los tubos o equipo del sistema de administración para uso del paciente. Se pueden almacenar grandes cantidades de gases, tales como oxígeno o nitrógeno, en estado líquido en un envase criogénico y convertirlos en gas, según se requiera, mediante evaporación. Las agencias gubernamentales (p.ej., el U.S. Department of Commerce [Departamento de Comercio de los EE.UU.]) promulgan reglas adicionales con respecto a la fabricación y uso de envases criogénicos. Los envases, tubos y mascarillas de administración usados para gases que contienen oxígeno deben estar libres de todo compuesto susceptible a la oxidación o que pudiera irritar el tracto respiratorio. Una fracción significativa de la dosis de un gas medicinal podría ser liberada en las inmediaciones del paciente debido a una absorción incompleta. Puede ser necesaria ventilación adecuada para proteger a los trabajadores sanitarios y demás individuos de la exposición al gas (p.ej., óxido nitroso).
Geles Los geles son semisólidos que consisten en suspensiones de partículas inorgánicas pequeñas o de moléculas orgánicas interpenetradas por un líquido. Las jaleas son un tipo de gel que, por lo general, presenta un contenido mayor de agua. Los geles pueden clasificarse como sistemas de una sola fase o de dos fases. Un gel de dos fases consta de una red de pequeñas partículas discretas (p.ej., Gel de Hidróxido de Aluminio o Hemicelulosa de Psyllium). Estos geles suelen ser tixotrópicos, los cuales forman semisólidos durante el reposo y se vuelven menos viscosos al agitarlos. Para garantizar la homogeneidad, deben agitarse antes de su uso y así debe indicarse en la etiqueta.
USP 39
Información General/ (1151) Formas Farmacéuticas 1589
Los geles de una sola fase constan de macromoléculas orgánicas distribuidas uniformemente en todo el líquido, de tal manera que no existe ningún límite evidente entre las macromoléculas dispersas y el líquido. Los geles de una sola fase se pueden fabricar a partir de macromoléculas naturales o sintéticas (p.ej., Carbómero, Hiprome/osa o Almidón) o con gomas naturales (p.ej., Tragacanto). A éstos últimos también se los conoce como mucílagos. Aunque estos geles comúnmente son acuosos, se pueden emplear alcoholes y aceites como fase continua. Los geles se pueden administrar por vía tópica o mucosa. En medicina veterinaria, los geles se pueden administrar mediante infusión por vía intramamaria. PREPARACIÓN Ver el capítulo (795) para procedimientos generales. Asimismo, se puede consultar la información contenida en Suspensiones para la formulación y fabricación de geles que contienen componentes inorgánicos o fármacos en la fase sólida. Ver el capítulo (797) para procedimientos generales para la preparación de geles estériles, tales como jalea de Clorhidrato de Lidocaína. Los geles formados por moléculas orgánicas grandes se pueden preparar dispersando la molécula en la fase continua (p.ej., calentando almidón), entrecruzando las moléculas dispersas mediante cambio del pH (como el caso del Copolímero de Carbómero) o reduciendo la fase continua (como en el caso de las jaleas formadas con sacarosa). Se debe tener cuidado de asegurar la uniformidad de los fármacos dispersándolos mediante mezcla o molienda vigorosa o agitando si la preparación es menos viscosa.
Gránulos Los gránulos son formas farmacéuticas sólidas compuestas por aglomeraciones de partículas más pequeñas. Estas composiciones de componentes múltiples se preparan para administración oral y se usan para facilitar regímenes de dosificación flexibles como gránulos o como suspensiones, para tratar desafíos de estabilidad, para permitir el enmascaramiento de sabores o para facilitar la flexibilidad de la administración (por ejemplo, en pacientes pediátricos, pacientes geriátricos o animales). Las formas farmacéuticas granulares se pueden formular para administración oral directa y pueden facilitar la preparación magistral de múltiples fármacos permitiendo al farmacéutico encargado de la preparación magistral mezclar varias composiciones granulares en la farmacia comercial u hospitalaria. Con mayor frecuencia, los gránulos se reconstituyen en forma de suspensión mediante la adición de agua o un diluyente líquido suministrado, inmediatamente antes de su administración al paciente. Los gránulos efervescentes están formulados para liberar gas (dióxido de carbono) con la adición de agua. Entre los ejemplos comunes de gránulos efervescentes se encuentran las preparaciones antiácidas y de suplementos de potasio. Las clases comunes de medicamentos terapéuticos formulados como gránulos incluyen antibióticos, algunos laxantes (por ejemplo, productos de extracto de senna), electrolitos y diversos remedios para la tos y el resfriado que contienen múltiples fármacos. PREPARACIÓN Los gránulos son a menudo los precursores usados en la compresión de tabletas o en el llenado de cápsulas. Aunque esta aplicación representa un producto farmacéutico intermedio y no una forma farmacéutica final, son muchos los productos comerciales que se basan en gránulos. En la fabricación típica de gránulos, el fármaco se mezcla con excipientes (coadyuvantes de procesamiento) y se humecta con una solución de unión, disolvente o mezcla de disolventes farmacéuticos adecuados para promover la aglomeración. Esta composición se seca y, posteriormente, se ajusta su tamaño para proporcionar las propiedades deseadas del material. Con frecuencia, los gránulos se usan debido a que el fármaco es inestable en ambientes acuosos y no se puede exponer al agua durante periodos suficientes para cubrir la fabricación, el almacenamiento y la distribución en una suspensión. La preparación de una forma farmacéutica líquida a partir de gránulos inmediatamente antes de su dispensación permite una estabilidad aceptable durante el periodo de uso. Los gránulos fabricados para este propósito se envasan en cantidades suficientes durante un periodo limitado-por lo general el transcurso de una terapia que a menudo no excede de 2 semanas. Además del fármaco, se pueden agregar otros ingredientes para asegurar una estabilidad aceptable (p.ej., amortiguadores, antioxidantes o agentes quelantes) o para colorear, edulcorar y saborizar; y, en el caso de las suspensiones, para proporcionar una viscosidad aceptable a fin de asegurar una suspensión adecuada de las partículas que permita la dosificación uniforme. Los gránulos efervescentes por lo general se formulan a partir de bicarbonato de sodio o potasio y un ácido, por ejemplo ácido cítrico o tartárico. Para prevenir la generación inoportuna de dióxido de carbono, los fabricantes deben tomar precauciones especiales para limitar el agua residual en el producto derivada de la fabricación, así como en la selección de envases que protejan los productos de la humedad. La fabricación de gránulos efervescentes puede requerir instalaciones especializadas, diseñadas para mantener una humedad muy baja (aproximadamente 10% de humedad relativa). Las mezclas de polvo efervescente se producen intencionadamente en forma de gránulos relativamente gruesos para reducir la velocidad de disolución y para proveer una efervescencia más controlada. La reconstitución de los gránulos debe asegurar la humectación completa de todos los ingredientes, además del tiempo y la agitación suficientes para permitir que se disuelvan los componentes solubles. Se deben seguir cuidadosamente las instrucciones específicas de reconstitución provistas por el fabricante.
1590 (1151) Formas Farmacéuticas / Información General
USP 39
Las suspensiones reconstituidas deben mezclarse o agitarse minuciosamente antes de su uso, para resuspender las partículas dispersas, lo cual es especialmente importante para las suspensiones cuyas dosis se obtienen de envases multidosis. Para suspensiones particularmente viscosas propensas a atrapar aire, las instrucciones pueden recomendar al usuario la manera en que se debe agitar la preparación para resuspender las partículas sedimentadas y minimizar la posibilidad de atrapar aire. Para gránulos reconstituidos para formar suspensiones para administración oral, la suspensión aceptable de la fase particulada depende del tamaño de partícula de la fase dispersa y de la viscosidad del vehículo. La temperatura puede influenciar la viscosidad, lo cual a su vez afecta las propiedades de la suspensión y la facilidad para extraer la dosis del frasco. Asimismo, los ciclos de temperatura pueden ocasionar cambios en el tamaño de partícula de la fase dispersa a través de la maduración de Ostwald. Por consiguiente, se deben proveer instrucciones claras en relación con la temperatura de almacenamiento adecuada para el producto.
Gomas La goma medicada es una forma farmacéutica flexible diseñada para masticarse en lugar de tragarse. Las gomas medicadas liberan los fármacos en la saliva. Las gomas medicadas pueden liberar agentes terapéuticos para acción local en la boca o para absorción sistémica por las vías bucal o gastrointestinal (p.ej., nicotina o aspirina). La mayoría de las gomas se fabrican usando el proceso de fusión convencional de la industria confitera o, alternativamente, se pueden compactar directamente a partir de polvo para goma. Las gomas medicadas se formulan a partir de bases sintéticas insolubles para goma, tales como poliisopreno, poliisobutileno, copolímero de isobutilenisopreno, caucho de estireno-butadieno, acetato de polivinilo, polietileno, gomas de éster o politerpenos. Se agregan plastificantes y ablandadores, tales como propilenglicol, glicerina, ácido oleico o aceites vegetales procesados, para mantener la flexibilidad de la base de la goma y para facilitar la incorporación de los fármacos, edulcorantes y agentes saborizantes. Los azúcares y los edulcorantes artificiales se incorporan para mejorar el sabor; asimismo, se pueden usar colorantes para mejorar la apariencia. Algunas gomas medicadas se recubren con estearato de magnesio para reducir la adhesividad y mejorar el manejo durante el envasado. Se pueden agregar conservantes. PREPARACIÓN Goma fundida: La goma base se funde a una temperatura de aproximadamente 115º hasta que adquiere la viscosidad de jarabe espeso y, en ese momento, se filtra a través de un tamiz de malla fina. La goma base fundida se transfiere a tanques de mezclado donde se le agregan y mezclan los edulcorantes, plastificantes y normalmente el fármaco. La adición de colorantes, saborizantes y conservantes se lleva a cabo mientras la goma fundida se enfría. Posteriormente, se le da forma a la mezcla fría mediante extrusión o pasándola por un mecanismo de rodillos y corte. Las unidades de dosificación con la forma y potencia deseadas se envasan individualmente. Se pueden agregar recubrimientos adicionales, tales como recubrimientos en polvo para reducir la adhesividad o recubrimientos de película o azúcar, para mejorar el sabor o facilitar el envasado a granel. Goma compactada directamente: La goma base se provee en forma de polvo granular que fluye libremente. Posteriormente, la goma base en polvo se mezcla en seco con edulcorantes, saborizantes, el fármaco y lubricantes. Después, la mezcla se procesa a través de una prensa para tabletas convencional y se producen las tabletas con la forma deseada. Las tabletas de goma medicada resultantes se pueden recubrir con azúcar o excipientes libres de azúcar. Estas tabletas se pueden envasar en blísteres o frascos, según se requiera. CONSIDERACIONES ESPECIALES Las gomas medicadas por lo general se dispensan en envases de dosis única. Las instrucciones para el paciente también pueden incluir una advertencia de que debe evitarse el calor excesivo.
Implantes Los implantes son formas farmacéuticas de larga acción que proveen una liberación continua del fármaco, a menudo durante periodos que van de meses a años. Los implantes se administran por vía parenteral. Asimismo, para la administración sistémica se pueden colocar por vía subcutánea o, para administración local, se pueden colocar en una región específica del cuerpo (p.ej., en los senos nasales, en una arteria, en el ojo, en el cerebro, etc.). Se encuentran disponibles diversos tipos de implantes. Los implantes en pellet son pequeñas masas sólidas y estériles compuestas por un fármaco con o sin excipientes, que por lo general se administran con un inyector especial adecuado (p.ej., un trocar) o a través de una incisión quirúrgica. La liberación del fármaco de los pellets regularmente se controla mediante cinéticas de difusión y disolución. El tamaño de los pellets y la velocidad de erosión afectarán la velocidad de liberación, que por lo general sigue una cinética de primer orden. Resulta posible la liberación del fármaco a partir de los pellets durante periodos de 6 meses o más. Las micropartículas reabsorbibles son un tipo de implante que provee una liberación prolongada del fármaco durante periodos que van de unas cuantas semanas hasta meses. Para su liberación sistémica, se pueden administrar por vía subcutánea o intramuscular, o se pueden depositar en una ubicación deseada del cuerpo para su liberación en un sitio específico. El diáme-
Información General/ (1151) Formas Farmacéuticas 1591
USP 39
tro de las micropartículas readsorbibles inyectables (o microesferas) por lo general va desde 20 hasta 100 µm. Están compuestas por un fármaco disperso dentro de un excipiente polimérico biocompatible y bioreadsorbible (matriz). Los polímeros de poli(lactido-co-glicólido) se han utilizado con frecuencia. Estos excipientes por lo general se reabsorben mediante la hidrólisis de enlaces éster. Las micropartículas se administran suspendiéndolas en un vehículo acuoso, y posteriormente se inyectan usando una jeringa y aguja convencionales. La liberación del fármaco de las micropartículas comienza después de que el fluido fisiológico ingresa en la matriz de polímero, disolviendo una parte del fármaco que, posteriormente, se libera mediante un proceso de difusión controlada. La liberación del fármaco también puede ocurrir a medida que la matriz se desgasta. Los implantes de polímero pueden formarse como una masa de una sola forma, por ejemplo, un cilindro. La matriz de polímero debe ser biocompatible (verBiocompatibilidad de los Materiales Usados en Envases de Medicamentos, Dispositivos Médicos e Implantes (1031 )), aunque puede ser biodegradable o no biodegradable. Los implantes de polímero con forma definida se administran usando un inyector especial adecuado. Por lo general, la cinética de liberación no será de orden cero, aunque dicha cinética puede ser posible. La liberación del fármaco se puede controlar mediante la difusión del fármaco a partir de la matriz de polímero a granel o mediante las propiedades de un recubrimiento de membrana polimérico que limite la velocidad. Los implantes poliméricos se usan para liberar pequeñas moléculas potentes como esteroides (p.ej., estradiol para ganado) y moléculas grandes como péptidos [p.ej., hormona liberadora de la hormona luteinizante (LHRH, por sus siglas en inglés)]. Algunos ejemplos de los periodos de liberación de fármacos pueden ser 2 ó 3 meses para implantes biodegradables y hasta 3 años para implantes no biodegradables. Una ventaja de los implantes biodegradables es que no es necesaria su extracción después de que han liberado todo el contenido de fármacos. Los implantes de polímero no biodegradables pueden extraerse antes o después de completar la liberación del fármaco, o se pueden dejar in situ. Un implante puede tener una pestaña con un orificio para facilitar su sutura en el lugar requerido, (p.ej., para un implante intravítreo para administración ocular local). Estos implantes pueden proveer una liberación terapéutica durante periodos de hasta 2,5 años. Los estents con elución de fármaco combinan el efecto mecánico de la endoprótesis para mantener la arteria desbloqueada con el efecto farmacológico prolongado del fármaco incorporado (a fin de reducir la reestenosis, inhibir la formación de coágulos o combatir infecciones). Por ejemplo, una endoprótesis metálica puede recubrirse con un fármaco que contiene un polímero no biodegradable o biodegradable. El recubrimiento resultante es una matriz polimérica que controla la liberación prolongada del fármaco. En medicina veterinaria, los fármacos en pellet pueden implantarse subcutáneamente en la oreja del animal (ganado). PREPARACIÓN Los implantes en pellet se fabrican mediante compresión o moldeado del fármaco. Los implantes poliméricos cilíndricos por lo general se fabrican mediante extrusión fundida de una mezcla de fármaco y polímero, con lo que se obtiene una varilla que se corta en trozos menores. Los implantes poliméricos también se pueden fabricar mediante moldeado por inyección. En la actualidad, algunos implantes aún se ensamblan a partir de tubos metálicos y componentes plásticos moldeados por inyección. La esterilidad se puede lograr mediante esterilización terminal o a través de procedimientos de fabricación aséptica.
Inyecciones (Ver Emulsiones, Polvos, Soluciones y Suspensiones.) Las inyecciones no se tratan como una forma farmacéutica en este capítulo. proporciona información sobre la calidad y otros aspectos de los productos inyectables. Se puede encontrar terminología de formas farmacéuticas específicas en el Glosario. Para la nomenclatura apropiada sobre inyecciones, ver Nomenclatura (1121 ). Exceso de volumen en inyectables: Los envases de los inyectables se deben llenar con un volumen ligeramente mayor que el "volumen" declarado en la etiqueta o el volumen a extraer. Los excesos de volumen recomendados en la Tabla 1 son, por lo general, suficientes para permitir la extracción y administración del volumen declarado en la etiqueta. Tabla 1 Exceso de Volumen Recomendado Volumen Declarado (mL)
Para Líquidos Móviles (mL)
Para Líquidos Viscosos (mL)
0,5
0,10
0,12
1,0
0,10
0,15
2,0
0,15
0,25
5,0
0,30
0,50
10,0
0,50
0,70
20,0
0,60
0,90
30,0
0,80
1,20
50,0 o más
2%
3%
159 2 (1151) Formas Farmacéuticas / Información General
USP 39
Insertos Los insertos son formas farmacéuticas sólidas que se insertan en una cavidad natural del cuerpo (no quirúrgica) distinta a la boca o al recto (ver Supositorios). Los insertos liberan el fármaco para su acción sistémica o local. Los insertos vaginales, por lo general, tienen forma globular u oval y cada uno pesa aproximadamente 5 g. Los insertos destinados para disolución en secreciones vaginales a menudo se fabrican con vehículos solubles o miscibles en agua tales como polietilenglicol o gelatina glicerinizada. PREPARACIÓN Para consideraciones generales, ver el capítulo (795). La preparación de los insertos puede variar de manera considerable. Los insertos se pueden moldear (usando tecnología similar a la empleada para preparar las tabletas de disolución bucal, supositorios o plásticos), compactar a partir de polvos (como al preparar tabletas) o formular como aplicaciones especiales de cápsulas (se han utilizado cápsulas de gelatina blanda y cápsulas de gelatina dura para preparaciones magistrales extemporáneas). Los insertos pueden estar formulados para que fundan a la temperatura corporal o para que se desintegren al momento de la inserción. Se debe tomar en cuenta para el diseño de la forma farmacéutica el volumen de fluido disponible en el sitio de inserción y minimizar la posibilidad de irritación local. La mayoría de los insertos están formulados para asegurar su retención en el sitio de administración.
Irrigaciones 0Jer Soluciones.)
Líquidos Como forma farmacéutica, un líquido consiste en un químico puro en su estado líquido. Entre los ejemplos se incluyen el aceite mineral, isoflurano y éter. Este término de forma farmacéutica no se aplica a las soluciones.
Lociones (Ver Emulsiones.)
Tabletas de Disolución Bucal Las tabletas de disolución bucal son formas farmacéuticas orales sólidas diseñadas para disolverse o desintegrarse lentamente en la boca. Contienen uno o más fármacos que se liberan lentamente de la base, normalmente saborizada y edulcorada. Con frecuencia, están destinadas para proporcionar una acción local en la cavidad bucal o en la garganta, aunque también se incluyen aquéllas destinadas para su absorción sistémica después de la disolución. Las categorías terapéuticas comunes de fármacos administrados como tabletas de disolución bucal son antisépticos, analgésicos, descongestionantes, antitusivos y antibióticos. Las tabletas de disolución bucal moldeadas se denominan pastillas para la tos, pero este término no se usa para denominar los artículos farmacopeicos. Las tabletas de disolución bucal preparadas por compresión o mediante estampado o cortado a partir de un lecho uniforme de pasta en ocasiones reciben el nombre de trociscos (término que no se usa para denominar los artículos farmacopeicos). Las tabletas de disolución bucal comprimidas o estampadas a menudo se producen con forma circular. Las tabletas de disolución bucal se pueden fabricar usando azúcares tales como sacarosa y dextrosa o pueden ofrecer los beneficios de una formulación exenta de azúcar, la cual generalmente se basa en sorbitol o manito!. En ocasiones se incluyen polietilenglicoles e hipromelosa para disminuir la velocidad de disolución. PREPARACIÓN Los excipientes usados en la fabricación de tabletas de disolución bucal moldeadas incluyen gelatina, sacarosa fundida, sorbitol u otra base de carbohidratos. Las tabletas de disolución bucal moldeadas que emplean una base de sacarosa o sorbitol que contienen fármacos tales como fenol, dextrometorfano, fentanilo y clorhidrato de diclonina y mentol se preparan cocinando el azúcar (sacarosa, jarabe de maíz y sorbitol) y el agua a aproximadamente 150º hasta reducir el contenido de agua a menos de 2%. La solución de azúcar fundida se transfiere a una banda o mesa de enfriamiento y, posteriormente, se agregan y mezclan minuciosamente los medicamentos, saborizantes y colorantes mientras se enfría. Después, las unidades de dosificación individuales con la forma deseada se forman transfiriendo la masa fundida a moldes. Estas tabletas de disolución bucal se enfrían rápidamente en los moldes para atrapar la base en su estado vítreo. Una vez formadas, las tabletas de disolución bucal son retiradas de los moldes y envasadas. Se debe tener cuidado de evitar la humedad excesiva durante el almacenamiento para prevenir la cristalización de la base de azúcar.
USP 39
Información General/ (1151 > Formas Farmacéuticas 1593
Las tabletas de disolución bucal comprimidas se fabrican usando excipientes que pueden incluir diluyentes sólidos, aglutinantes, agentes edulcorantes, agentes saborizantes y lubricantes. A menudo se incluyen azúcares tales como sacarosa, sorbitol y manitol debido a que pueden actuar como diluyentes sólidos o aglutinantes, además de que funcionan como agentes edulcorantes. Asimismo, pueden estar presentes colorantes y lacas (colorantes adsorbidos en hidróxido de aluminio insoluble) FD&C y D&C aprobados. La fabricación de tabletas de disolución bucal comprimidas es, en esencia, igual a la empleada para la fabricación convencional de tabletas, excepto que puede ser necesaria una prensa para tabletas capaz de fabricar tabletas más grandes y ejercer una fuerza mayor para producir tabletas más duras (ver Tabletas). La pasta usada para producir tabletas de disolución bucal que se fabrican mediante estampado o cortado contiene un agente humectante, sacarosa y agentes edulcorantes y saborizantes. La pasta homogénea se esparce en forma de lecho con un espesor uniforme del cual se cortan o estampan las tabletas de disolución bucal para posteriormente dejarlas secar. Algunas tabletas de disolución bucal se preparan forzando polvos humedecidos a baja presión en cavidades de moldes y expulsándolos en bandejas adecuadas para secado a temperaturas moderadas.
Ungüentos Los ungüentos son preparaciones semisólidas generalmente destinadas para la aplicación externa sobre la piel o las membranas mucosas. Los fármacos administrados en ungüentos están destinados para su acción local o absorción sistémica. A menudo contienen menos de 20% de agua y sustancia volátiles, y más de 50% de hidrocarburos, ceras o polioles como vehículos. Las bases para ungüentos reconocidas para su uso como vehículos caen dentro de cuatro clases generales: bases hidrocarbonadas, bases de absorción, bases lavables con agua y bases hidrosolubles. Bases hidrocarbonadas: También conocidas como bases oleosas para ungüentos, las bases hidrocarbonadas sólo permiten la incorporación de cantidades mínimas de un componente acuoso. Los ungüentos preparados a partir de bases hidrocarbonadas actúan como apósitos oclusivos y mantienen al fármaco en contacto prolongado con la piel. Son difíciles de eliminar y sus características físicas no cambian con el paso del tiempo. Bases de absorción: Permiten la incorporación de soluciones acuosas e incluyen únicamente componentes anhidros (p.ej., Vaselina Hidrofílica) o emulsiones de tipo agua en aceite (p.ej., Lanolina). Las bases de absorción también sirven como emolientes. Bases lavables con agua: Las emulsiones del tipo aceite en agua (p.ej., Ungüento Hidrofílico) en ocasiones se denominan cremas (ver Emulsiones). Pueden lavarse fácilmente de la piel o de la ropa con agua, lo que las vuelve viables para fines cosméticos. Otra ventaja de las bases lavables con agua es que se pueden diluir con agua, además de que favorecen la absorción de secreciones serosas en las afecciones dermatológicas. Bases hidrosolubles: También conocidas como bases desgrasadas para ungüentos, están totalmente formuladas a partir de componentes solubles en agua. El Ungüento de Polietilenglicol es la única preparación oficial de este grupo. Estas bases ofrecen muchas de las ventajas de las bases lavables con agua. Además, no contienen sustancias insolubles en agua tales como vaselina, lanolina anhidra o ceras. Más correctamente, estas bases se categorizan como geles (ver Geles). La selección de una base de ungüento depende de la acción deseada, de las características del fármaco incorporado y de la biodisponibilidad de éste último para casos en los que se desea una acción sistémica. Para lograr la estabilidad del producto, puede ser necesario usar una base poco idónea en lo que respecta al cumplimiento con otros atributos de calidad. Por ejemplo, los fármacos que se hidrolizan rápidamente son más estables en bases hidrocarbonadas que en las bases que contienen agua. PREPARACIÓN Los ungüentos por lo general se fabrican mediante la incorporación directa en una base para ungüentos previamente preparada o mediante fusión (calentando durante la preparación del ungüento). A menudo se agrega un agente levigante para facilitar la incorporación del medicamento en la base para ungüento mediante el procedimiento de incorporación directa. En el método de fusión, los ingredientes se calientan. Por lo general, se requiere de homogeneización. La velocidad de enfriamiento es un detalle importante de la fabricación, debido a que el enfriamiento rápido puede generar una estructura más rígida en el producto preparado por el método de fusión.
Pastas Las pastas son preparaciones semisólidas de consistencia firme que contienen un alto porcentaje (20%-50%) de sólidos finamente dispersos. Las pastas están destinadas para aplicación sobre la piel, la cavidad oral o las membranas mucosas. Por lo general, las pastas no fluyen a la temperatura corporal y, por consiguiente, pueden servir como recubrimientos oclusivos y protectores. En consecuencia, las pastas se usan para ofrecer una acción protectora más a menudo que los ungüentos. Las pastas grasas que tienen una alta proporción de sólidos hidrófilos son menos oleosas y más absorbentes que los ungüentos. Éstas se usan para absorber secreciones serosas y a menudo se prefieren para lesiones con tendencia a la formación de costras, vesículas o exudados.
1594 (1151) Formas Farmacéuticas / Información General
USP 39
Las pastas dentales se aplican a los dientes. Otras pastas administradas oralmente pueden estar destinadas para adhesión a la membrana mucosa para conseguir un efecto local. En medicina veterinaria, generalmente, las pastas se administran oralmente y están destinadas para la administración sistémica de los fármacos. La pasta se estruja dentro de la boca del animal, generalmente en la parte posterior de la lengua, o se unta dentro de la boca.
Pellets Los pellets son formas farmacéuticas compuestas por pequeñas partículas sólidas de forma uniforme, que en ocasiones reciben el nombre de perlas, aunque "perlas" no es el término preferido como forma farmacéutica. Por lo general, los pellets tienen forma casi esférica, aunque no es obligatorio. Los pellets pueden administrarse por la vía oral (gastrointestinal) o mediante inyección (ver también Implantes). Las formulaciones de pellets pueden ofrecer varias ventajas, incluyendo la separación física de materiales con incompatibilidad física o química, liberación prolongada del fármaco o liberación retardada para proteger un fármaco ácido-lábil de la degradación en el estómago, o para proteger los tejidos estomacales de la irritación. Las formulaciones de pellets de liberación prolongada pueden estar diseñadas con el fármaco disperso en una matriz o se puede recubrir el pellet con un recubrimiento de polímero adecuado que modifique las características de liberación del fármaco. Como alternativa, el diseño del pellet puede combinar los dos enfoques anteriores. En el caso de las formulaciones de liberación retardada, se prefiere el polímero de recubrimiento para resistir la disolución en las condiciones del bajo pH del entorno gástrico, pero para disolverse en el pH mayor del entorno intestinal. Las preparaciones de pellets que se administran por inyección o por la vía quirúrgica (ver Implantes) a menudo se usan para proveer una terapia continua durante periodos de meses o años. Los pellets se pueden diseñar como entidades individuales o múltiples. Por lo general, los pellets implantados incluirán el contenido deseado de fármaco en una o varias unidades. Los pellets orales generalmente se encuentran dentro de cápsulas de gelatina dura para su administración. Aunque no existen requisitos absolutos relacionados con el tamaño, el intervalo de tamaño útil de los pellets depende de las limitaciones prácticas del volumen de las cápsulas comúnmente usadas y de la necesidad de incluir una cantidad suficiente de pellets en cada dosis para asegurar una dosificación uniforme del fármaco. Por consiguiente, muchos pellets usados para administración oral caen dentro de un intervalo de tamaño de 71 O µm a 2,5 mm. En ocasiones, las formulaciones de pellets se usan para minimizar la variabilidad relacionada con la retención gástrica de formas farmacéuticas de mayor tamaño. Las formulaciones de pellets de liberación retardada y algunas formulaciones de liberación prolongada se preparan mediante la aplicación de un recubrimiento a las partículas formuladas. El recubrimiento se debe aplicar como una película continua sobre toda la superficie de cada partícula. Puesto que es difícil evitar que una pequeña población de las partículas no queden perfectamente recubiertas, el diseño de los pellets orales requiere la administración de un gran número en una sola dosis, a fin de minimizar los efectos adversos de los pellets con recubrimiento imperfecto durante la administración del fármaco. PREPARACIÓN Las características de desempeño deseadas determinan la selección del método de fabricación. En general, los pellets se fabrican mediante procesos de extrusión húmeda seguida de procesos de esferonización, de recubrimiento húmedo o seco, o de compresión. La fabricación de pellets mediante recubrimiento húmedo por lo general implica la aplicación de recubrimientos sucesivos en esférulas (nonpareil seeds). Con frecuencia, este proceso de fabricación se lleva a cabo en equipos de procesamiento de lecho fluido. Los procesos de recubrimiento de polvo seco o de aplicación de capas a menudo se realizan en equipos especializados de granulación por rotor. El grado de crecimiento de las partículas que se puede conseguir en los procesos de recubrimiento húmedo, por lo general es más limitado que el crecimiento obtenible mediante técnicas de aplicación de capas de polvo seco, aunque cualquiera de los métodos permite al formulador desarrollar y aplicar múltiples capas de recubrimiento para lograr el perfil de liberación deseado. La fabricación de pellets mediante compresión está limitada en gran medida a la producción de material para implantación subcutánea. Este método de fabricación provee el control necesario para asegurar la uniformidad de la dosis y, en general, se adapta mejor a los requisitos de procesamiento aséptico. Las técnicas de microencapsulamiento se pueden usar de manera alternativa para la fabricación de pellets. Las técnicas de recubrimiento por coacervación por lo general producen partículas recubiertas de tamaños mucho menores que aquéllas fabricadas usando otras técnicas.
Píldoras Las píldoras son pequeños cuerpos sólidos y esféricos, que contienen fármacos, oral. La píldora ha sido ampliamente reemplazada por las tabletas comprimidas y las píldoras, generalmente se preparan mediante una técnica de amasado por vía deo. Este término se usa infrecuente e incorrectamente como un término general sólidas, como tabletas y cápsulas.
y que están destinados para administración por las cápsulas. A diferencia de las tabletas, húmeda, producción de magdaleones y molpara describir formas farmacéuticas orales
USP 39
Información General/ (1151) Formas Farmacéuticas 1595
PREPARACIÓN La selección de excipientes se lleva a cabo basándose en su capacidad para producir una masa firme y con textura plástica. El fármaco se tritura con excipientes en polvo mediante diluciones en serie hasta obtener una mezcla uniforme. Posteriormente, se agregan excipientes líquidos a los materiales secos para unir y proveer elasticidad a la masa. La masa se forma mediante amasado. Las propiedades de firmeza y plasticidad son indispensables para que la masa pueda ser trabajada y que ésta conserve la forma producida. Se forman magdaleones a partir de porciones de la masa. El magdaleón se corta en pedacitos que corresponden al tamaño deseado de las píldoras y se ruedan para adoptar la forma final. Las máquinas para fabricar píldoras pueden automatizar la preparación de la masa, la producción de los magdaleones, el corte y el rodado.
Emplastos Un emplasto es una sustancia semisólida para aplicación externa que generalmente se proporciona en un material de soporte. Los emplastos se aplican durante periodos prolongados para proveer protección, soporte u oclusión (maceración). Éste es un término no preferido y no debe usarse para títulos de medicamentos nuevos. Los emplastos consisten en una capa adhesiva que puede contener sustancias activas y que se esparce uniformemente sobre un soporte apropiado el cual, por lo general, está fabricado de una base de caucho o resina sintética. Los emplastos no medicados están diseñados para proveer protección o soporte mecánico en el sitio de aplicación. Los emplastos están disponibles en una variedad de tamaños o se cortan en tamaños determinados para ofrecer un contacto prolongado efectivo en el sitio de aplicación. Asimismo, se adhieren firmemente a la piel, pero pueden ser retirados sin ocasionar lesiones.
Polvos Los polvos se definen como un único sólido o una mezcla de sólidos en estado finamente dividido. Los polvos usados como formas farmacéuticas pueden contener uno o más fármacos y se pueden usar tal cual o mezclarse con un vehículo adecuado para administración. Los polvos se clasifican de acuerdo a los siguientes términos: muy grueso, grueso, moderadamente grueso, fino y muy fino (ver Finura de Polvos (811 )). Los polvos pueden estar destinados para uso interno o externo. Por lo general, los polvos para uso externo se espolvorean sobre la piel, o se aplican a vendajes o a la ropa. Los polvos para uso interno se pueden aplicar a membranas mucosas accesibles con aplicadores adecuados o pueden arrastrarse en corrientes de aire para aplicación en la nariz o los pulmones. El desempeño de los polvos como forma farmacéutica se puede ver afectado por las características físicas del polvo. Por ejemplo, el tamaño de partícula puede influir sobre la velocidad de disolución de las partículas, afectando así la biodisponibilidad y/o la efectividad en el lugar de acción. Los polvos para aplicación externa deben tener un tamaño de partícula de 150 µm o menor (por lo general en el intervalo de 50 a 100 µm para prevenir una sensación arenosa en la piel que pudiera irritar aún más la piel lesionada). El tamaño de partícula de los polvos que se administran en el pulmón o la nariz condiciona dónde se deposita el polvo. El tamaño de partícula puede influir en el mezclado, la segregación y agregación de las partículas, que a su vez puede afectar la administración y uniformidad de la forma farmacéutica. En medicina veterinaria, un polvo que necesita ser reconstituido antes de su administración se denomina concentrado (p.ej., medicamentos que se administran agregándolos al agua potable). El uso del término "concentrado" ya no es el preferido. Polvos para inhalación y polvos nasales: Los polvos para inhalación y polvos nasales consisten en un sólido dividido fina y apropiadamente y de un sistema de administración de envase-cierre adecuado. Para más información, ver los capítulos (5) y (601 ). PREPARACIÓN Los polvos se pueden producir mediante la combinación de múltiples componentes para formar una mezcla uniforme. Esta preparación puede implicar además la reducción del tamaño de partícula, un proceso referido como pulverización. Se puede reducir el tamaño de partícula de los polvos usando molienda, secado por rocío, fluido supercrítico, homogeneización a alta presión, tecnologías de precipitación y técnicas de fabricación de micropartículas. A medida que se reduce el tamaño de partícula, se incrementa el número de partículas y el área superficial, lo que puede aumentar la velocidad de disolución y la biodisponibilidad y/o la velocidad y la intensidad de la acción local del fármaco. El mezclado de polvos puede conseguirse mediante diferentes técnicas. Los procesos industriales pueden emplear el tamizado o la rotación de polvos en un recipiente giratorio. Uno de los mezcladores por rotación más comunes es el mezclador en V, que está disponible en una variedad de tamaños adecuados para la preparación magistral a pequeña y gran escala y para la producción industrial. Dependiendo del tamaño de partícula del fármaco, se puede usar una mezcla aleatoria de polvos. Las técnicas de mezclado para polvos incluyen aquéllas usadas en la farmacia magistral, tales como la técnica con espátula o de trituración (ver el capítulo (795)). El flujo del polvo se puede ver afectado por el tamaño y la forma de la partícula. Las partículas de mayor tamaño por lo general fluyen de manera más libre que las partículas finas. El flujo del polvo es un atributo importante que puede afectar el envasado o la dispensación de un polvo.
1596 (1151) Formas Farmacéuticas / Información General
USP 39
Jabones y Champús Los jabones y champús son preparaciones sólidas o líquidas destinadas para aplicación tópica sobre la piel o el cuero cabelludo, seguida de enjuagado con agua. Los jabones y champús son emulsiones, suspensiones, o composiciones tensoactivas que forman fácilmente emulsiones, micelas o espumas con la adición de agua seguida de frotamiento. La incorporación de fármacos en jabones y champús combina las capacidades limpiadoras y desengrasantes del vehículo y facilita la aplicación tópica del fármaco sobre las áreas afectadas, e incluso áreas grandes del cuerpo. Las propiedades tensoactivas del vehículo facilitan el contacto del fármaco con la piel o el cuero cabelludo. Las formulaciones de jabón y champú medicado con frecuencia contienen agentes anti microbianos adecuados para proteger de la contaminación por bacterias, hongos filamentosos y levaduras. PREPARACIÓN La preparación de jabones y champús medicados sigue técnicas frecuentemente usadas para la preparación de sistemas emulsificantes. Para asegurar la uniformidad, los fármacos deben agregarse al vehículo antes de la solidificación (en el caso de los jabones) seguido por el mezclado minucioso. Si la medicación está presente como suspensión, se debe controlar el tamaño de partícula para promover la distribución uniforme del fármaco y para, posiblemente, optimizar el desempeño. Debido a que la fabricación de jabones con frecuencia implica el procesamiento de ingredientes a una temperatura elevada, se debe tener cuidado de evitar la degradación excesiva del fármaco durante el procesamiento.
Soluciones Una solución es una preparación que contiene una o más sustancias químicas disueltas en un disolvente adecuado o mezcla de disolventes mutuamente miscibles. Dado que las moléculas de un fármaco en solución se dispersan uniformemente, el uso de soluciones como formas farmacéuticas, por lo general, garantiza la administración de dosis uniformes y la exactitud cuando la solución se diluye o mezcla por otros medios. Las sustancias en solución son más susceptibles a la inestabilidad química que cuando se encuentran en estado sólido y, por lo general, son más pesadas y más voluminosas por dosis que las formas farmacéuticas sólidas. Estos factores incrementan el costo de envasado y envío con respecto al de las formas farmacéuticas sólidas. Las soluciones se pueden administrar mediante inyección, inhalación y por la vía mucosa, tópica/dérmica y gastrointestinal. Las soluciones que se administran mediante inyección reciben oficialmente el nombre de inyectables (ver •(1 ). (AFOl-may-2016¡). Algunas soluciones están diseñadas para adoptar una forma de masa in situ. Estas soluciones incluyen polímeros, fármacos y disolventes del polímero. El disolvente del polímero puede ser agua o un disolvente orgánico. Después de administrar la solución a un paciente mediante administración subcutánea o intramuscular, forma un gel o una matriz polimérica sólida que atrapa el fármaco y extiende la liberación del fármaco durante días o meses. Las soluciones destinadas para administración oral por lo general contienen saborizantes y colorantes que dan un mayor atractivo al medicamento y lo vuelven más apetecible para el paciente o usuario. Asimismo, cuando sea necesario, pueden contener estabilizantes para mantener la estabilidad química y física, además de conservantes para evitar el crecimiento microbiano. A veces, para facilitar la aplicación, las soluciones se colocan en hisopos, paños o esponjas. En medicina veterinaria, una solución que necesita ser diluida antes de su administración se ha denominado concentrado (p.ej., medicamentos que se administran agregándolos al agua potable). El uso del término "concentrado" ya no es el preferido.
Espráis Las preparaciones en atomizador pueden administrar la formulación en cantidades exactamente medidas o en cantidades no medidas. Un espray es una forma farmacéutica que contiene un fármaco en estado líquido como una solución o suspensión que está destinada para administración en forma de nube de gotitas. Los espráis se diferencian de los aerosoles en que los atomizadores no están presurizados. La mayoría de las atomizaciones se generan apretando manualmente un envase flexible o activando una bomba que genera la nube de gotitas al descargar el contenido a través de la boquilla. Dependiendo del diseño de la formulación y del sistema de válvula, las gotitas generadas pueden estar destinadas para inhalación inmediata por la boca y depositarse en el árbol pulmonar, o para inhalación por la nariz y depositarse en la cavidad nasal. El mecanismo para generación de las gotitas y el uso previsto de la preparación distingue entre varios tipos de espráis. Un atomizador puede estar compuesto de una bomba, envase, disparador, válvula, boquilla, además de la formulación que contiene los fármacos, disolventes y excipientes. El diseño de cada componente tiene una función en el desempeño apropiado del producto farmacéutico y para determinar las características críticas de la distribución del tamaño de las gotitas. Las distribuciones de tamaño de las gotitas y de las partículas, uniformidad de dosis liberada, geometría de la nube y velocidad de las gotitas son parámetros críticos que afectan a la eficiencia de la administración del fármaco. Cuando la preparación se suministra como
USP 39
Información General/ (1151) Formas Farmacéuticas 1597
un envase multidosis, puede ser necesario agregar un conservante antimicrobiano adecuado. Las formulaciones de los espráis destinadas para conseguir un efecto local o sistémico, por lo general, tienen una base acuosa y pueden contener excipientes para controlar el pH y la viscosidad. Además, dependiendo de la vía de administración, la formulación puede ser isotónica. Para más información, ver los capítulos (5) y (601 ). ETIQUETADO Y USO Referirse a la Guía para la Industria del Centro de Evaluación e Investigación de Medicamentos (CDER, por sus siglas en inglés): Nasal Spray and lnhalation Solution, Suspension, and Spray Drug Products-Chemistry, Manufacturing, and Controls Documentation (Medicamentos en Atomizador Nasal, Concentrado para Solución lnhalable, Suspensión lnhalable y Atomizador para Inhalación-Documentación Química, de Fabricación y de Control).
Tiras Una tira es una forma farmacéutica o dispositivo en forma de material sólido, alargado, estrecho, delgado y absorbente, como el papel de filtro. Normalmente es estéril y puede estar impregnada con un compuesto o estar indicada para permitir mediciones para propósitos de diagnosis, como la medición de producción de lágrimas. El término "tira" no debe usarse cuando otro término, como "película" sea más apropiado.
Supositorios Los supositorios son formas farmacéuticas adaptadas para su aplicación en el recto. Se funden, ablandan o disuelven a la temperatura corporal. Un supositorio puede tener un efecto protector local o paliativo o puede liberar un fármaco para conseguir una acción sistémica o local. Las bases para supositorios por lo general incluyen manteca de cacao, gelatina glicerinada, aceites vegetales hidrogenados, mezclas de polietilenglicoles de diversos pesos moleculares y ésteres de ácidos grasos del polietilenglicol. Las bases para supositorios pueden tener una influencia notoria sobre la liberación de los fármacos. Aunque la manteca de cacao se funde rápidamente a temperatura corporal, es inmiscible con los líquidos corporales, lo que inhibe la difusión de fármacos liposolubles en las zonas afectadas. El polietilenglicol es una base adecuada para algunos antisépticos. En los casos en que se desea una acción sistémica, incorporar la forma ionizada del fármaco, en lugar de la forma no ionizada, puede ayudar a maximizar la biodisponibilidad. Aunque los fármacos no ionizados se liberan con más facilidad desde bases miscibles en agua, como la gelatina glicerinada y el polietilenglicol, las bases mismas tienden a disolverse muy lentamente, lo que reduce la velocidad de liberación del fármaco. La manteca de cacao y sus sustitutos (p.ej., Grasa Sólida) tienen un mejor desempeño que otras bases para aliviar la irritación en preparaciones destinadas para el tratamiento de hemorroides internas. Los supositorios para adultos se estrechan en uno o ambos extremos y pesan aproximadamente 2 g cada uno. PREPARACIÓN Los supositorios que tienen como base manteca de cacao se pueden preparar incorporando el fármaco finamente dividido a la base oleosa sólida, a temperatura ambiente, y luego moldeando adecuadamente la masa resultante; o bien, fundiendo la base para trabajarla en caliente y permitiendo que la suspensión resultante se enfríe en moldes especiales. Puede agregarse una cantidad apropiada de agentes endurecedores para contrarrestar la tendencia de algunos fármacos (p.ej., el hidrato de cloral y el fenol) a ablandar la base. El supositorio terminado funde a la temperatura corporal. Diversos aceites vegetales, tales como el aceite de coco o el aceite de semilla de palma, modificados por esterificación, hidrogenación o fraccionamiento, se usan como sustitutos de manteca de cacao para obtener productos de composición y temperatura de fusión variables (p.ej., Aceite Vegetal Hidrogenado y Grasa Sólida). Estos productos pueden presentar un diseño que reduzca la rancidez, al mismo tiempo que incorpora las características deseadas, tales como intervalos estrechos entre temperaturas de fusión y solidificación e intervalos de fusión para ajustarse a la formulación y condiciones climáticas. Los fármacos pueden incorporarse a las bases de gelatina glicerinada mediante el agregado de las cantidades indicadas a un vehículo que consiste en 70 partes de glicerina, 20 partes de gelatina y 1 O partes de agua. Diversas combinaciones de polietilenglicoles con temperaturas de fusión superiores a la temperatura corporal se emplean como bases para supositorios. Debido a que la liberación a partir de estas bases depende de la disolución en lugar de la fusión, presentan muchos menos problemas en la preparación y almacenamiento que los vehículos que actúan por fusión. Sin embargo, las altas concentraciones de polietilenglicoles de mayor peso molecular pueden extender el tiempo de disolución, generando problemas de retención. Resulta posible emplear diversos agentes tensoactivos no iónicos, que guardan estrechas relaciones químicas con los polietilenglicoles, como vehículos para supositorios. Algunos ejemplos incluyen ésteres de ácidos grasos de sorbitán de polioxietileno y estearatos de polioxietileno. Estos agentes tensoactivos se emplean solos o en combinación con otros vehículos para supositorios para obtener un amplio rango de temperaturas de fusión y consistencias adecuadas. Una ventaja notoria de tales vehículos es su capacidad de dispersión en agua. Sin embargo, se debe tener cuidado con el empleo de agentes tensoactivos, dado
1598 (1151) Formas Farmacéuticas /Información General
USP 39
que pueden aumentar la velocidad de absorción del fármaco o interactuar con éste, conduciendo a una disminución en la acción terapéutica. La preparación magistral de supositorios usando una base para supositorios, por lo general requiere fundir la base para supositorios y disolver o dispersar el fármaco en la base fundida (ver el capítulo (795)). En la preparación magistral de supositorios, el profesional de la preparación magistral prepara una cantidad en exceso de formulación total, a fin de dispensar con exactitud la cantidad prescrita. Durante la preparación magistral de supositorios, se deben evitar ingredientes cáusticos o irritantes, además de seleccionar una base que permita al fármaco generar el efecto esperado; asimismo, a fin de minimizar la abrasión en las membranas del recto, se deben reducir los ingredientes sólidos al menor tamaño de partícula posible.
Suspensiones Una suspensión es una preparación bifásica que consta de partículas sólidas disperas en una fase líquida. Las suspensiones se pueden formular para vías específicas de administración tales como oral, por inhalación, tópica, oftálmica, ótica e inyección. Algunas suspensiones están preparadas y listas para usar, mientras que otras se presentan como mezclas de sólidos para reconstitución con un vehículo apropiado justo antes de su uso. Las suspensiones inhalables (ver el capítulo (5)), suspensiones oftálmicas, suspensiones inyectables y algunas suspensiones óticas se preparan de manera estéril. Por lo general, las suspensiones no se inyectan por vía intravenosa, epidural o intratecal, a menos que el etiquetado del producto especifique claramente tales vías de administración. Algunos medicamentos liposomales se denominan suspensiones porque pueden sedimentar y requerir una resuspensión antes de su administración (ver •(1)• (AFOJ-may.2016¡). Algunas suspensiones están diseñadas para adoptar una forma de masa in situ. Estas suspensiones incluyen polímeros, fármacos y disolventes del polímero. El disolvente del polímero puede ser agua o un disolvente orgánico. Después de administrar la suspensión a un paciente mediante administración subcutánea o intramuscular, forma un gel o una matriz polimérica sólida que atrapa el fármaco y extiende la liberación del fármaco durante días o meses. Históricamente, el término "leche" se usaba para describir suspensiones en vehículos acuosos destinadas para la admistración oral (p.ej., Leche de Magnesia). El término "magma" a menudo se emplea para describir suspensiones de sólidos inorgánicos, como las arcillas en agua, que presentan una fuerte tendencia a la hidratación y agregación del sólido, originando una consistencia similar a la de los geles y un comportamiento reológico tixotrópico (p.ej., Magma de Bentonita). Antiguamente, el término "loción" se refería tanto a suspensiones tópicas como a emulsiones tópicas. Hoy en día, el término se refiere sólo a emulsiones tópicas (ver Emulsiones). La limitada solubilidad acuosa de los fármacos es la justificación más común para el desarrollo de una suspensión. Otras ventajas potenciales de una suspensión oral incluyen el enmascaramiento de sabores y un mejor cumplimiento del paciente debido a la mayor conveniencia de la forma farmacéutica. En comparación con las soluciones, las suspensiones pueden presentar una mejor estabilidad química. Una suspensión idealmente debe contener partículas pequeñas uniformes que se suspenden de inmediato y se redispersan fácilmente después de la sedimentación. A menos que el sólido dispersado sea coloidal, las partículas en una suspensión sedimentarán hacia el fondo del envase al dejarlo en reposo. Tal sedimentación puede conducir a la aglutinación y la solidificación del sedimento y dificultar la redispersión de la suspensión al agitar. Para evitar estos problemas, los fabricantes por lo general agregan ingredientes para aumentar la viscosidad y el estado de gel de la suspensión o la floculación, incluyendo arcillas, agentes tensoactivos, polioles, polímeros o azúcares. Con frecuencia, se emplean vehículos tixotrópicos para contrarrestar las tendencias de sedimentación de las partículas, aunque dichos vehículos no deben interferir con el vertido o la redispersión. Asimismo, se puede modificar la densidad de la fase dispersa y de la fase continua para tener mayor control sobre la velocidad de sedimentación. En el caso de las suspensiones tópicas, resulta deseable el secado rápido después de la aplicación. La temperatura puede influenciar la viscosidad (y por ende las propiedades de la suspensión y la facilidad para retirar la dosis del frasco), mientras que los ciclos de temperatura pueden ocasionar cambios en el tamaño de partícula de la fase dispersa a través de la maduración de Ostwald. Cuando los fabricantes realizan estudios de estabilidad para establecer la vida útil y las condiciones de almacenamiento, deben someter las condiciones a ciclos (congelación/descongelación) para investigar los efectos de la temperatura. A menos que los estudios confirmen que la formulación no respaldará el crecimiento microbiano, las suspensiones envasadas para proporcionar múltiples dosis deben contener agentes antimicrobianos adecuados que protejan de la contaminación bacteriana, por levaduras y hongos filamentosos (ver el capítulo (51 )) o se deben tomar otras medidas apropiadas para evitar la contaminación microbiana. Las suspensiones para reconstitución son polvo seco o mezclas granulares que requieren la adición de agua, o de un diluyente formulado provisto, antes de la administración. Este enfoque de formulación se usa con frecuencia cuando la estabilidad química o física del fármaco o de la suspensión no permite una vida útil suficiente para una suspensión previamente formulada. A menudo, estas suspensiones se refrigeran después de la reconstitución para aumentar su vida útil. Para este tipo de suspensiones, la mezcla de polvos es uniforme y el polvo se dispersa fácilmente al momento de la reconstitución. Las suspensiones inyectables por lo general están destinadas para rutas de administración subcutánea o intramuscular y deben tener un tamaño de partícula controlado, que por lo general es de 5 µm o menor. La justificación para el desarrollo de suspensiones inyectables puede incluir poca solubilidad del fármaco, estabilidad química mejorada, duración prolongada de la
USP 39
Información General/ (1151) Formas Farmacéuticas 1599
acción y prevención del metabolismo de primer paso. Se debe tener cuidado al seleccionar la técnica de esterilización, puesto que ésta puede afectar la estabilidad del producto o alterar las propiedades físicas del material. En medicina veterinaria, una solución que necesita ser diluida antes de su administración se denominaba un concentrado (p.ej., medicamentos que se administran agregándolos al agua potable). Este uso del término "concentrado" ya no es el término preferido. PREPARACIÓN Las suspensiones se preparan agregando agentes de suspensión u otros excipientes y agua purificada o aceite a los fármacos sólidos, y mezclando hasta lograr la uniformidad. Al preparar una suspensión, se deben considerar las características de la fase dispersa y del medio de dispersión. Durante el desarrollo, los fabricantes deben definir una distribución del tamaño de partícula apropiada para el material suspendido para alcanzar la efectividad deseada y minimizar la probabilidad de cambios en el tamaño de partícula durante el almacenamiento. En algunos casos, la fase dispersa tiene cierta afinidad por el vehículo y se humedece fácilmente con la adición del mismo. Para algunos materiales, resulta difícil desplazar el aire de la superficie del sólido y las partículas sólidas pueden formar grumos o flotar en la parte superior del vehículo. En este último caso, para ciertos tipos de suspensión se puede emplear un agente humectante para facilitar el desplazamiento del aire de la superficie del polvo. Se pueden usar agentes tensoactivos, alcohol, glicerina y demás líquidos hidrófilos como agentes humectantes para los casos en que se utilizará un vehículo acuoso como fase de dispersión. Estos agentes funcionan desplazando el aire en las grietas de las partículas y dispersándolas. En la prepara" ción de suspensiones a gran escala, se puede facilitar la humectación de la fase dispersa mediante el uso de equipo de mezcla de alta energía, como molinos coloidales u otros dispositivos de mezcla de rotor-estator. Después de que se ha humedecido el polvo, se agrega el medio de dispersión (que contiene los componentes solubles de la formulación tales como colorantes, saborizantes y conservantes) en porciones al polvo y la mezcla se mezcla minuciosamente antes de las adiciones subsiguientes de vehículo. Se emplea una porción del vehículo para lavar el equipo de mezcla a fin de eliminar todo el material suspendido; esta porción también se usa para llevar la suspensión a volumen final y para asegurar que la suspensión tenga la concentración deseada de materia sólida. El producto final se puede pasar a través de un molino coloidal u otro mezclador o dispositivo de mezcla para asegurar la uniformidad. Las suspensiones se resuspenden antes de dispensar la dosis. Dada la viscosidad de muchos vehículos de suspensión, se puede presentar el arrastre por aire durante la dosificación. El proceso de formulación permite evaluar esta posibilidad; realizar ajustes a la viscosidad del vehículo o incorporar bajos niveles de agentes antiespumantes son enfoques comunes para minimizar el arrastre por aire. Como alternativa, se pueden proporcionar instrucciones específicas para resuspender la formulación a fin de minimizar la incorporación de aire y para asegurar la dosis exacta.
Sistemas Los sistemas son preparaciones de fármacos en dispositivos que los transportan, a menudo contienen un revestimiento adhesivo y se aplican tópicamente o se insertan en cavidades del cuerpo. El fármaco está diseñado para que se libere de forma controlada durante un periodo especificado o se libere en función de su concentración en la formulación. A menos que el etiquetado indique algo diferente, el dispositivo de transporte se retira antes de usar. El término "sistema" no debe usarse cuando el término de otra forma farmacéutica sea más apropiado (p.ej., insertos e implantes). La notación del contenido se define en términos de la cantidad de fármaco liberada del sistema durante un periodo específico o como la concentración de fármaco dentro de la formulación (p.ej., el porcentaje de fármaco). Son posibles varias vías de administración, por lo que cuando una localización específica sea esencial para el uso apropiado, la vía siempre deberá estar indicada en el nombre farmacopeico (p.ej., "intrauterina","ocular" o "periodontal" como la vía de administración). Por ejemplo, los sistemas que se aplican al ojo se llaman sistemas oculares. Por ejemplo, cuando la absorción sistémica del fármaco se realiza a través de la dermis, sin especificar la región del cuerpo a la que se aplica el sistema, la vía se llama "transdérmica". El término "parche" se ha usado en ocasiones, pero no es el término preferido de uso en la nomenclatura de monografías de medicamentos cuando se refiere a un sistema. Los sistemas intrauterinos están destinados para su colocación en el útero. La liberación del fármaco puede durar hasta 5 años. Los sistemas oculares están destinados para su colocación en el fórnix conjuntivo inferior, desde donde se difunde el fármaco a través de la membrana a una velocidad constante. Los sistemas periodontales están destinados para su colocación en la cavidad entre el diente y la encía. En algunos casos, los sistemas periodontales se pueden formar in situ en la cavidad periodontal y liberar los fármacos durante varias semanas. Los sistemas transdérmicos se colocan sobre piel intacta para administrar el fármaco a la circulación sistémica. Están diseñados para una liberación prolongada (hasta 7 días). Se pueden encontrar pruebas de calidad específicas para sistemas transdérmicos en el capítulo (3).
1600 (1151) Formas Farmacéuticas / Información General
USP 39
Tabletas Las tabletas son formas farmacéuticas sólidas en las que el fármaco se mezcla generalmente con excipientes y se comprime para formar la dosis final. Las tabletas representan la forma farmacéutica de más amplio uso en los EE.UU. Las prensas para tabletas emplean punzones y matrices de acero para preparar tabletas compactadas mediante la aplicación de altas presiones a las mezclas de polvos o granulados. Las tabletas pueden elaborarse en una amplia variedad de tamaños, formas e inscripciones en la superficie. Las tabletas oblongas o con forma de cápsula son comúnmente llamadas "capletas" en Estados Unidos aunque es un término no preferido como nombre de forma farmacéutica. Se pueden usar prensas para tabletas especializadas para producir tabletas con múltiples capas o tabletas con núcleo especialmente formuladas que se colocan en el interior de la forma farmacéutica final. Estas presentaciones de tabletas especializadas pueden retardar o prolongar la liberación de los fármacos o separar físicamente fármacos incompatibles. Las tabletas se pueden recubrir mediante una variedad de técnicas para enmascarar sabores, proteger fármacos sensibles a la luz, prolongar o retardar la liberación, o para brindar una apariencia única (colores). Cuando no se ha modificado intencionalmente la velocidad de liberación del fármaco, las tabletas reciben el nombre de tabletas de liberación inmediata. Tabletas bucales: Están destinadas a insertarse en la cavidad bucal, donde los fármacos se absorben directamente a través de la mucosa oral. Son pocos los fármacos que se absorben fácilmente de esta manera (los ejemplos incluyen nitroglicerina y algunas hormonas esteroideas). Tabletas masticables: Se formulan y fabrican para producir un residuo de sabor agradable en la boca y para facilitar su ingestión. Las tabletas masticables duras se preparan por compresión, por lo general utilizando manitol, sorbitol o sacarosa como aglutinantes y diluyentes sólidos, y contienen colorantes y saborizantes para mejorar su aspecto y sabor. Las tabletas masticables blandas generalmente se fabrican mediante un proceso de moldeado o extrusión, a menudo con más de 10% de agua para ayudar a mantener un producto flexible y blanda. En la medicina veterinaria, las tabletas masticables duras a menudo tienen agentes que mejoran el sabor, tales como levadura de cerveza o saborizantes basados en carne/pescado. Las tabletas para uso humano cuyo título incluye la denominación "Masticable" se deben masticar o triturar antes de tragarlas a fin de asegurar la liberación confiable de los fármacos o para facilitar su ingesta. Si las tabletas están diseñadas para que puedan ser masticadas (pero el mascado no es necesario para liberar el fármaco o facilitar la ingestión), el título no debe incluir la referencia "masticable". En ese caso, el producto aún puede describirse como "masticable" en la declaración auxiliar en el etiquetado. Las tabletas para uso veterinario destinadas para ser masticadas, incluirán la denominación "Masticables" en el título. No obstante, se entiende que, en lo que respecta a productos veterinarios, no es posible asegurar que sean masticadas antes de su ingestión. Las tabletas masticables se pueden partir en pedazos y darlas a los animales que normalmente tragan la tableta entera. Tabletas efervescentes: Se preparan mediante compresión y contienen, además de los fármacos, mezclas de ácidos (p.ej., ácido cítrico o ácido tartárico) y carbonatos y/o bicarbonato de sodio. Al contacto con el agua, estas formulaciones liberan dióxido de carbono, produciendo la característica acción de efervescencia. Tabletas hipodérmicas: Tabletas moldeadas preparadas a partir de ingredientes que se disuelven fácil y completamente en agua; anteriormente se utilizaban en las preparaciones para inyecciones hipodérmicas. Estas tabletas se pueden administrar por vía oral o sublingual cuando se requiere una disponibilidad rápida del fármaco. Tabletas de liberación modificada: Existen dos categorías de formulaciones de tabletas de liberación modificada reconocidas por la USP: Tabletas de liberación retardada-las tabletas en ocasiones se formulan con recubrimientos resistentes a ácidos o entéricos (también llamados gastro-resistentes) para proteger a los fármacos ácido-lábiles del entorno gástrico o para prevenir eventos adversos como la irritación. Tabletas de liberación prolongada-las tabletas de liberación prolongada se formulan de tal manera que el fármaco esté disponible durante un periodo prolongado después de la ingestión. Las expresiones "liberación prolongada", "acción repetida", "liberación controlada" y "liberación sostenida" también se han empleado para describir esta forma farmacéutica. Sin embargo, para propósitos Farmacopeicos, se emplea el término "liberación prolongada". Los requisitos de disolución (ver el capítulo (711 )) por lo general se especifican en la monografía individual. Tabletas de desintegración oral: Las tabletas de desintegración oral están destinadas a desintegrarse rápidamente dentro de la boca para generar una dispersión antes de que el paciente trague la suspensión espesa resultante, donde el fármaco está destinado para administración y/o absorción gastrointestinal. Algunas de estas formas farmacéuticas han sido formuladas para facilitar la desintegración rápida y se fabrican por medios convencionales o mediante procesos de liofilización o moldeado. Se pueden obtener mayores detalles en la Guidance for lndustry: Oral/y Disintegrating Tablets [Guía para la Industria: Tabletas de Desintegración Oral] del CDER. Tabletas sublinguales: Las tabletas sublinguales están destinadas a insertarse debajo de la lengua, donde los fármacos se absorben directamente a través de la mucosa oral. Al igual que con las Tabletas bucales, son pocos los fármacos que se absorben íntegramente de esta manera y una gran parte del fármaco se traga y está disponible para absorción gastrointestinal. Tabletas para solución oral: Las tabletas para solución oral están destinadas a solubilizarse en un diluyente líquido antes de su administración. En algunos casos, las tabletas para solución oral también se pueden masticar o tragar. Tabletas para suspensión oral: Las tabletas para suspensión oral están destinadas a dispersarse en un líquido antes de su administración como una suspensión. La forma farmacéutica es una tableta para suspensión oral cuando el fármaco o los exci-
USP 39
Información General/ (1151) Formas Farmacéuticas 1601
pientes no se disuelven al dispersarse en un líquido. En algunos casos, las tabletas para suspensión oral también se pueden masticar o tragar. Triturado de tabletas: Tabletas pequeñas, normalmente cilíndricas, moldeadas o comprimidas que se empleaban, tradicionalmente, como tabletas de dispensación para administrar una cantidad convenientemente medida de un fármaco potente en preparaciones magistrales, pero que raramente se usan en la actualidad. PREPARACIÓN La mayoría de las tabletas compactadas (comprimidas) están compuestas por el fármaco y una variedad de excipientes. Estos excipientes pueden incluir diluyentes sólidos (diluyentes), aglutinantes, agentes desintegrantes, lubricantes y deslizantes. Asimismo, pueden estar presentes colorantes o lacas FD&C y D&C, saborizantes y agentes edulcorantes aprobados. Los diluyentes sólidos se agregan cuando la cantidad de fármaco es demasiado pequeña o cuando las propiedades del fármaco no permiten una compresión satisfactoria en ausencia de otros ingredientes. Los aglutinantes confieren adhesividad a la mezcla de polvo, además de promover la formación de tabletas y mantener la uniformidad del fármaco en la mezcla para tabletas. Los agentes desíntegrantes facilitan la reducción de la tableta en pequeñas partículas al contacto con el agua o fluidos biológicos. Los lubricantes reducen la fricción durante los ciclos de compactación y eyección. Los deslizantes mejoran la fluidez de los polvos, sus propiedades de manipulación y el control de peso de las tabletas. A menudo, también se agregan colorantes a las formulaciones de tabletas por razones estéticas o a efectos de la identificación del producto. Las tabletas se preparan a partir de formulaciones procesadas mediante uno de los tres métodos generales: granulación húmeda, granulación seca (compactación con rodillos o aglomeración) y compresión directa. Granulación húmeda: Implica la mezcla de polvos con un líquido de granulación para formar una masa granular húmeda que se seca y se ajusta en tamaño antes de la compresión. Resulta particularmente útil para lograr mezclas uniformes de fármacos de dosis baja y para facilitar la humectación y disolución de fármacos hidrófobos con poca solubilidad. Granulaciones en seco: Se pueden producir pasando los polvos entre rodillos a una presión elevada (compactación con rodillos). Como alternativa, la granulación en seco también se puede llevar a cabo mediante el proceso de aglomeración, que consiste en la compactación de los polvos a presiones elevadas en prensas para tabletas. En cualquier caso, el tamaño de los compactados se ajusta antes de la compresión. La granulación en seco mejora el flujo y las propiedades de manipulación de la formulación en polvo sin necesidad de humedad durante el procesamiento. Compresión directa: El procesamiento de tabletas implica la mezcla en seco de los fármacos y excipientes seguida de compresión. Al tratarse de la técnica de fabricación más simple, la compresión directa sólo es aceptable cuando el fármaco y los excipientes presentan propiedades de flujo y compresión aceptables sin necesidad de etapas de procesamiento prevías. Las tabletas pueden recubrirse para proteger los ingredientes de la acción del aíre, la humedad o la luz; para enmascarar sabores y olores desagradables; para mejorar la apariencia de la tableta; y para reducir la erosión generadora de polvo. Asimismo, el recubrimiento se puede usar para proteger el fármaco de valores de pH ácidos relacionados con los fluidos gástricos o para controlar la velocidad de liberación del fármaco en el tracto gastrointestinal. El recubrimiento más común que se usa en la actualidad es un recubrimiento de película fina compuesto por un polímero que se deriva de celulosa. Un método alternativo menos común es el recubrimiento de azúcar. Las tabletas recubiertas con azúcar tienen recubrimientos considerablemente más gruesos que consisten principalmente en sacarosa con una variedad de diluyentes inorgánicos. Se encuentra disponible una variedad de polímeros de recubrimiento en película que permiten el desarrollo de perfiles de liberación especializados. Estas formulaciones se usan para proteger los fármacos acido-lábíles del entorno ácido estomacal y para prolongar la liberación del fármaco a fin de reducir la frecuencia de dosificación (ver el capítulo (711) o el (701 )).
Cintas Adhesivas Una cinta adhesiva es una forma farmacéutica adecuada para administrar fármacos sobre la piel, que consiste en un fármaco impregnado en un material sintético tejido o extrudido, durable y flexible, recubierto con un agente adhesivo. Por lo general, el fármaco impregnado se presenta en estado seco. La capa de adhesivo está diseñada para mantener la cinta de manera segura en su lugar sin ayuda de vendajes adicionales. A diferencia de los sistemas transdérmicos, las cintas adhesivas no están diseñadas para controlar la velocidad de liberación del fármaco. El término "cinta adhesiva" es un término no preferido y no debe usarse para títulos de medicamentos nuevos. El contenido de fármaco en las cintas adhesivas se expresa como cantidad por área superficial con respecto a la superficie de cinta adhesiva expuesta sobre la piel. El uso de un revestimiento oclusivo con la cinta adhesiva mejora la velocidad y el grado de liberación del fármaco en capas más profundas de la piel, lo que puede resultar en una mayor absorción sistémica del fármaco.
1602 (1151) Formas Farmacéuticas / Información General
USP 39
Cambio en la redacción:
GLOSARIO Este glosario ofrece definiciones para los términos usados en medicina y sirve como fuente de nombres oficiales para los artículos oficiales, excepto cuando la definición indique específicamente que el término no debe usarse en el título del medicamento. Los ejemplos de nomenclatura general para las categorías más frecuentes de formas farmacéuticas se presentan en el capítulo (1121 ). Con el propósito de hacer de este glosario una referencia exhaustiva, su compilación se realizó sin tomar en cuenta los límites impuestos por las convenciones preferidas vigentes sobre nomenclatura. Para identificar/distinguir con claridad entre términos preferidos y no preferidos, las entradas indican cuando se trata de un término no preferido y generalmente refieren al usuario al término vigente preferido. Cuando un término se describe como un atributo de una forma farmacéutica, generalmente tiene el propósito de distinguir al término de aquéllos realmente usados en los títulos de la formas farmacéuticas. Aunque los términos sobre atributos, por lo general, no se utilizan como el nombre oficial para la forma farmacéutica, su uso identifica una presentación o característica especializada de la misma. Por ejemplo, el atributo "masticable", se puede usar con el término de la forma farmacéutica "tabletas", para identificar un tipo específico de tableta que se debe masticar antes de tragar. Aerosol: Forma farmacéutica que consta de una preparación líquida o sólida envasada a presión y destinada para administración en forma de fino rocío. El término descriptivo "aerosol" también hace referencia al fino rocío de gotitas o partículas sólidas emitidas por el producto. Agua aromática (término no preferido; ver Solución): Solución acuosa, transparente y saturada de aceites volátiles u otras sustancias aromáticas o volátiles. Alcoholado (término no preferido; ver Solución): Forma farmacéutica líquida compuesta de una solución alcohólica o hidroalcohólica de sustancias volátiles. Aplicación puntual (aplicación en línea): Método de administración de medicamentos líquidos veterinarios basado en la administración sobre la piel del animal, por lo regular entre los omoplatos (aplicación puntual) o de manera descendente sobre la espalda (aplicación en línea). Auditivo (Auricular) (término no preferido; ver Ótico): Para administración en, o por el oído. Baño (término no preferido; ver Baño de inmersión) Baño de inmersión: Vía de administración veterinaria mediante la sumersión parcial o completa en un ambiente específico, como líquido o aire. Bolo (término no preferido; ver Tableta): Tableta grande destinada para administración en animales grandes. En ocasiones, el término "bolo" se usa para describir un método de administración. Bucal: Administración dirigida hacia la mejilla, normalmente desde dentro de la boca. "Capleta" (término no preferido; ver Tableta): Tableta con forma de cápsula. Cápsula: Forma farmacéutica sólida en la que el fármaco, con o sin otros ingredientes, se inserta en una cubierta de cápsula dura o blanda o recubre la cubierta de la cápsula. La mayoría de las cubiertas de las cápsulas están compuestas principalmente de gelatina. Cápsula de cubierta dura (término no preferido; ver Cápsulas): Tipo de cápsula en la que se insertan uno o más fármacos, con o sin otros ingredientes, en una cubierta de dos piezas. La mayoría de las cápsulas de cubierta dura están compuestas principalmente de gelatina y se fabrican antes de la operación de llenado. Cápsula de gelatina blanda (término no preferido; ver Cápsula): Tipo específico de cápsula caracterizado por un aumento en la cantidad de plastificantes para producir un material con paredes más gruesas y flexibles que las cápsulas de gelatina dura. Una distinción adicional de las cápsulas de gelatina blanda es que se presentan como formas farmacéuticas selladas de una sola pieza. Resulta frecuente su uso para administrar composiciones líquidas. Champú: Forma farmacéutica en solución, emulsión o suspensión usada para limpiar el cabello y el cuero cabelludo. Puede contener un fármaco destinado para aplicación tópica sobre el cuero cabelludo. Cinta adhesiva (término no preferido): Forma farmacéutica o dispositivo compuesto de tejido o material sintético sobre el cual se coloca un fármaco, por lo general con un adhesivo en uno o ambos lados para facilitar la aplicación tópica. No se controla la velocidad de liberación del fármaco. Colodión (término no preferido; ver Solución): Preparación en solución compuesta por piroxilina disuelta en una mezcla de disolventes de alcohol y éter, y que se aplica externamente. Concentrado (término no preferido en medicamentos para uso humano o veterinario): En la actualidad se usa para fármacos que no están destinados para administración directa en humanos o animales. Su uso en la nomenclatura de medicamentos se ha descontinuado (ver el capítulo (1121) y Nomenclature Guidelines5 ). Crema: Emulsión semisólida que a menudo contiene más de 20% de agua y sustancias volátiles y/o menos de 50% de hidrocarburos, ceras o polioles como vehículos para el fármaco. Las cremas, por lo general, están destinadas para la aplicación externa sobre la piel o las membranas mucosas. Dental: Término descriptivo de una preparación que se aplica a los dientes para ejercer acción localizada.
5 Nomenclature Guidefines,
http://www.usp.org/sites/default/files/usp_pdf/EN/USPNF/2012-11-07_nom_guidelines.pdf.
USP 39
Información General/ (1151) Formas Farmacéuticas 1603
Dérmico(a): Vía de administración tópica en la que el fármaco está destinado a alcanzar la dermis o a aplicarse sobre la misma. Desintegración oral: Término descriptivo para una forma farmacéutica sólida oral que se desintegra rápidamente en la boca antes de tragarla. El fármaco está destinado para administración y/o absorción gastrointestinal. Ver también CDER Guidance far lndustry, Oral/y Disintegrating Tablets (Guía para la Industria, Tabletas de Desintegración Oral). Dispersión coloidal: Atributo de una preparación o formulación en la que las partículas con dimensiones coloidales (es decir, generalmente entre 1 nm y 1 µm) se distribuyen uniformemente en todo el líquido. De dispersión oral: (término no preferido; ver Desintegración oral) Efervescente: Atributo de una forma farmacéutica oral, con frecuencia tabletas o gránulos, que contienen ingredientes que al entrar en contacto con el agua, liberan rápidamente dióxido de carbono. La forma farmacéutica se disuelve o dispersa en agua para iniciar la efervescencia antes de la ingestión. Elíxir (término no preferido; ver Solución): Preparación que, por lo general, se trata de una solución hidroalcohólica edulcorada, transparente y saborizada destinada para uso oral. Este término no debe usarse para medicamentos nuevos de la USP-NF, pero es de uso común en la farmacia magistral. Emoliente: Atributo de una crema o ungüento que indica un incremento en el contenido de humedad de la piel después de la aplicación de sustancias blandas, grasas u oleosas. Este término no se debe usar en títulos de medicamentos. Emplasto(término no preferido): Forma farmacéutica que contiene una composición semisólida provista sobre un material de soporte para aplicación externa. Los emplastos se aplican durante periodos prolongados para proveer protección, soporte u oclusión (maceración). Emulsión: Forma farmacéutica que consta de un sistema de dos fases compuesto de por lo menos dos líquidos inmiscibles, uno de los cuales se dispersa como gotitas (fase interna o dispersa) dentro del otro líquido (fase externa o continua), generalmente estabilizado con uno o más agentes emulsionantes. La emulsión no se usa como término para forma farmacéutica cuando se puede aplicar un término más específico (p.ej., Crema, Loción o Ungüento). Emulsión inyectable: Preparaciones líquidas de fármacos disueltos o disperos en un medio de emulsión adecuado. Enjuague (ver Solución): Preparación líquida que se usa para limpiar mediante enjuague. El enjuague se usa para hacer buches en la boca y luego escupirlo. El término no preferido "enjuague bucal" se ha usado a veces en lugar de "enjuague". Enjuague bucal (término no preferido; ver Enjuague): Término aplicado a una preparación en solución que se usa para enjuagar la cavidad bucal. Espray: Un espray es una forma farmacéutica que contiene fármacos en estado líquido, como una solución o como una suspensión, y está destinado para su administración como una nube de gotitas. Los espráis se diferencian de los aerosoles en que los atomizadores no están presurizados. La mayoría de las atomizaciones se generan apretando manualmente un envase flexible o activando una bomba que genera la nube de gotitas al descargar el contenido a través de la boquilla. Como atributo, la atomización describe la generación de gotitas de un líquido o solución para facilitar su aplicación en el área prevista. Espuma: Forma farmacéutica que contiene burbujas de gas dispersas en un líquido. Las espumas medicadas tienen una consistencia semisólida y se pueden formular para que se colapsen rápidamente formando un líquido o para que se mantengan como espuma y así asegurar el contacto prolongado. Estent, con elución de fármaco (Stents): Forma especializada de implante usada para administración local prolongada del fármaco en el lugar inmediato del estent. Excipiente: Ingrediente de una forma farmacéutica distinto al fármaco. Este término no se emplea en los títulos de medicamentos. El término "excipiente" es sinónimo de ingrediente inactivo. Forma farmacéutica: Combinación de fármacos y/o excipientes en cantidades y formas físicas diseñadas para permitir una administración exacta y eficiente del fármaco al paciente humano o animal. El término no se usa en títulos de medicamentos. Gas: Uno de los estados de la materia sin forma ni volumen definidos y que ocupa la totalidad del envase en el que se encuentra confinado. Gastrorresistente (término no preferido; ver Liberación retardada): Término descriptivo para una forma farmacéutica sólida sobre la que se ha aplicado un recubrimiento polimérico para prevenir la liberación en el entorno gástrico. Gel: Forma farmacéutica que se presenta como una dispersión semisólida de pequeñas partículas o una solución de grandes moléculas interpenetradas por una solución que contiene un agente gelificante que proporciona dureza. Goma: Forma farmacéutica cuya base consiste en un material flexible que, al mascarlo, libera el fármaco en la cavidad bucal. Gránulos: Forma farmacéutica compuesta por agregados secos de partículas de polvo que puede contener uno o más fármacos, con o sin otros ingredientes. Se pueden tragar en su forma original, dispersarse en alimentos o disolverse en agua. Con frecuencia, los gránulos se compactan para formar tabletas o se insertan en cápsulas, con o sin ingredientes adicionales. Más frecuentemente, los gránulos se reconstituyen en forma de suspensiones. Implante: Forma farmacéutica que consiste en un material sólido o semisólido, el cual contiene el fármaco, que se inserta en el cuerpo. El proceso de inserción es invasivo y el material está destinado a residir en el sitio durante un periodo concordante con la cinética de liberación del diseño o perfil del fármaco.
1604 (1151) Formas Farmacéuticas / Información General
USP 39
Inhalación (por inhalación): Vía de administración para aerosoles caracterizada por la dispersión del fármaco en las vías respiratorias durante la inhalación. Inhalador de polvo seco: Dispositivo usado para administrar un polvo para inhalación en estado finamente dividido y adecuado para inhalación oral por parte del paciente. Este término no se emplea en títulos de medicamentos. Inserto: Forma farmacéutica sólida que se inserta en una cavidad natural del cuerpo (no quirúrgica) distinta a la boca o al recto. Se debe tomar en cuenta que un supositorio está destinado para aplicación en el recto y no se clasifica como un inserto (ver Supositorio). Intraocular: Vía de administración para liberar una preparación estéril dentro del ojo. Inyección: Preparaciones líquidas que pueden contener fármacos y/o excipientes o sus soluciones. El término "para inyección" es indicativo de sólidos secos que cuando se les agrega un vehículo adecuado, producen soluciones que cumplen con los requisitos para inyectables en todos los respectos. Inyección (por inyección): Vía de administración de un líquido o semisólido depositado en una cavidad, fluido o tejido corporal mediante una aguja. Irrigación: Solución o líquido estéril para bañar o lavar heridas abiertas o cavidades del cuerpo. Jabón: Sales alcalinas de un ácido graso o mezcla de ácidos grasos usadas para limpiar la piel. Los jabones que se usan como formas farmacéuticas pueden contener un fármaco destinado para aplicación tópica sobre la piel. Los jabones también se han usado como linimentos y enemas. Jalea (término no preferido; ver Ge/): Dispersión semisólida de pequeñas partículas o una solución de moléculas orgánicas grandes interpenetradas por una solución que contiene un agente gelificante que promueve la dureza. Jarabe (término no preferido; ver Solución): Solución que contiene altas concentraciones de sacarosa u otros azúcares. Este término se emplea comúnmente en la farmacia magistral. Liberación convencional (término no preferido; ver Liberación inmediata): Término descriptivo de una forma farmacéutica para la que no se ha pretendido modificar intencionalmente la velocidad de liberación del fármaco. En el caso de cápsulas y tabletas, la inclusión o exclusión de un agente desintegrante no se interpreta como una modificación. Este término no se emplea en títulos de medicamentos. Liberación extendida (término no preferido: ver Liberación Prolongada:) Liberación inmediata: Término descriptivo para una forma farmacéutica en la que no se ha pretendido modificar intencionalmente la velocidad de liberación del fármaco. En el caso de cápsulas y tabletas, la inclusión o exclusión de un agente desintegrante no se interpreta como una modificación. Este término no se emplea en nombres de medicamentos. Liberación modificada: Término descriptivo para una forma farmacéutica con un patrón de liberación de fármaco que se ha modificado intencionalmente con respecto al observado en la forma farmacéutica de liberación inmediata del mismo fármaco. Los dos tipos de liberación modificada son liberación prolongada y liberación retardada. El término "liberación modificada" no se usa en títulos de medicamentos. Liberación prolongada: Término descriptivo de una forma farmacéutica que se modifica intencionalmente para prolongar la velocidad de liberación del fármaco en comparación con la observada en una forma farmacéutica de liberación inmediata. Este término es sinónimo de liberación extendida o sostenida. Muchas de las formas farmacéuticas de liberación prolongada tienen un patrón de liberación que comienza con un "efecto de estallido" que simula la liberación inmediata seguido por la liberación más lenta del fármaco remanente en la forma farmacéutica. Liberación retardada: Tipo de forma farmacéutica de liberación modificada. Término descriptivo de una forma farmacéutica modificada intencionalmente para retardar la liberación del fármaco durante cierto periodo después de la administración inicial. Por ejemplo, se previene la liberación del fármaco en el entorno gástrico, pero se promueve en el ambiente intestinal; este término es sinónimo de Recubrimiento entérico o Gastrorresistente. Liposomas: Atributo para preparaciones de lípidos anfifílicos de hidrosolubilidad baja (ver ~llllli:ll1/Jilll). Líquido: Forma farmacéutica que consiste en un químico puro en su estado líquido. Este término de forma farmacéutica no debe aplicarse a las soluciones. Este término no se emplea en títulos de medicamentos. Cuando la palabra "líquido" se usa como término descriptivo, ésta hace referencia a un material que es vertible y que se ajusta a su envase a temperatura ambiente. Loción: Forma farmacéutica líquida en emulsión que se aplica a la superficie externa del cuerpo. Históricamente, este término se aplicaba a suspensiones tópicas y emulsiones tópicas. La definición actual de loción se limita a emulsión. Masticable: Atributo de una forma farmacéutica sólida que está destinada para ser masticada o triturada antes de tragar. Nasal: Vía de administración (mucosa) caracterizada por su administración en o por la nariz para lograr un efecto local o sistémico. Ocular (término no preferido; ver Intraocular): Vía de administración que indica la aplicación del fármaco dentro del ojo. Oftálmico(a): Vía de administración caracterizada por la aplicación de una preparación estéril a las partes externas del ojo. Oral: Vía de administración caracterizada por su aplicación en la boca o administración en el tracto gastrointestinal a través de la boca. Orofaríngeo(a): Vía de administración caracterizada por el depósito de una preparación en la cavidad oral y/o en la región faríngea para ejercer un efecto local o sistémico. Ótico: Vía de administración caracterizada por el depósito de una preparación en o por el el oído. En ocasiones también se denomina Auditivo (Auditivo es un término no preferido).
USP 39
Información General/ (1151) Formas Farmacéuticas 1605
Parche (término no preferido; ver Sistema): Con frecuencia de manera incorrecta se usa para describir un Sistema. Parenteral: Vía de administración general caracterizada por una inyección a través de la piel u otro tejido externo aislante o por implantación dentro del cuerpo. Las vías parenterales específicas incluyen la intravenosa, intraventricular, intra-arterial, intra-articular, subcutánea, intramuscular, intratecal, intracisternal e intraocular (ver Pasta: Forma farmacéutica semisólida que contiene un alto porcentaje (20%-50%) de sólidos finamente dispersos con una consistencia firme. Esta forma farmacéutica está destinada para aplicación sobre la piel, la cavidad oral o las membranas mucosas. Pastilla (término no preferido; ver Tabletas de disolución bucal) Pastillas para la tos (término no preferido; ver Tabletas de disolución bucal) Película: Término usado para describir una lámina fina de material, generalmente compuesto por un polímero. Las películas se emplean en diversas vías de administración, incluso como medio de admnistración oral de un material en una forma de disolución rápida. Pellet: Forma farmacéutica sólida y pequeña con forma a menudo esférica y uniforme destinada para administración directa como un pellet. Los pellets esféricos en ocasiones reciben el nombre de Perlas. Los pellets destinados para implante deben ser estériles. El uso del término "pellet" para formas farmacéuticas implantables ya no es el término preferido (ver
1111111111111>·
Implantes).
Periodontal: Término descriptivo de una preparación que se aplica alrededor de un diente para ejercer una acción localizada. Perla (término no preferido; ver Peffets): Forma farmacéutica sólida con forma de esfera pequeña. En la mayoría de los productos, una unidad de dosificación consta de múltiples perlas. Píldora: Forma farmacéutica sólida y esférica que generalmente se prepara mediante una técnica de amasado por vía húmeda, producción de magdaleones y moldeado. Este término se usa frecuentemente de manera incorrecta como término general para describir formas farmacéuticas sólidas orales, como tabletas o cápsulas. Polvo: Forma farmacéutica compuesta por un sólido o mezcla de sólidos, reducidos a un estado finamente dividido, y destinada para uso externo o interno. Polvo para inhalación: Polvo que contiene un fármaco para inhalación oral. El polvo se usa con un dispositivo que lo transforma en aerosol y libera una cantidad medida con exactitud. Premezcla (término no preferido; ver Artículos Medicados Tipo A y Artículos Medicados Tipo Ben Medicamentos Veterinarios para Uso en Alimentos para Animales (1152))
Rectal: Vía de administración caracterizada por depositarse en el recto para lograr un efecto local o sistémico. Recubrimiento: Atributo (recubierto/a) de una forma farmacéutica sólida que implica el cubrimiento externo con un sólido. El depósito externo se denomina recubrimiento o película. El término se usa como un atributo cuando se aplica a una forma farmacéutica sólida oral. Los recubrimientos se aplican por razones de funcionalidad o estética, como el enmascaramiento del sabor, la estabilidad, la modificación de las características de liberación, la identificación del producto y su apariencia. Recubrimiento entérico (término no preferido; ver Liberación retardada): Término decriptivo para una forma farmacéutica sólida sobre la que se ha aplicado un recubrimiento de polímero para prevenir la liberación del fármaco en el entorno gástrico. Semisólido(a): Atributo de un material cuyo flujo presenta un comportamiento plástico. Un material semisólido no se puede verter, no se ajusta fácilmente a su envase a temperatura ambiente y no fluye a una tensión de corte baja. Este término no se emplea en títulos de medicamentos. Sistema: Preparación de fármacos en dispositivos que los transportan que se aplican tópicamente o se insertan en una cavidad del cuerpo. El fármaco está diseñado para que se libere de forma controlada durante un periodo de tiempo especificado o se libere en función de su concentración en la formulación. A menos que el etiquetado indique algo diferente, el dispositivo de transporte se retira después de usar. Solución: Forma farmacéutica líquida, transparente y homogénea que contiene una o más sustancias químicas disueltas en un disolvente o mezcla de disolventes mutuamente miscibles. Sublingual: Vía de administración caracterizada por la colocación debajo de la lengua y por la liberación del fármaco para su absorción en dicha región. Supositorio: Forma farmacéutica sólida en la que se dispersan uno o más fármacos en una base adecuada y se moldean o se les da una forma adecuada por otros medios para su inserción en el recto para proporcionar un efecto local o sistémico. Suspensión: Forma farmacéutica líquida que consta de partículas sólidas dispersadas en una fase líquida. Suspensión inyectable: Preparaciones líquidas de sólidos suspendidos en un medio líquido. El término "para suspensión inyectable" es indicativo de sólidos secos que cuando se les agrega un vehículo adecuado, producen preparaciones que cumplen con los requisitos para suspensiones inyectables en todos los respectos. Suspensión inyectable de liberación prolongada: Preparaciones líquidas de sólidos suspendidos en un vehículo adecuado y formuladas para permitir que el fármaco esté disponible durante un periodo prolongado. El término "para suspensión inyectable de liberación prolongada" es indicativo de sólidos secos que cuando se les agrega un vehículo adecuado, producen una preparación que cumple con los requisitos para suspensiones inyectables de liberación prolongada en todos los respectos.
1606 (1151) Formas Farmacéuticas / Información General
USP 39
Tableta: Forma farmacéutica sólida preparada a partir de polvos o gánulos mediante compactación. Tabletas de disolución bucal: Forma farmacéutica sólida destinada para una lenta desintegración o disolución en la boca. Tabletas desintegrables (término no preferido; ver Tabletas, Tabletas para suspensión oral o Tabletas para solución oral): Ver también Desintegración oral Tabletas dispersables (término no preferido; ver Tabletas, Tabletas para suspensión oral o Tabletas para solución oral) Tabletas moldeadas: Tableta que se forma humedeciendo los ingredientes, presionándolos en un molde y, posteriormente, retirando del molde y secando la masa sólida resultante. Este término no se emplea en títulos de medicamentos. Tabletas solubles (término no preferido; ver Tabletas y Tabletas para solución oral) Tabletas para solución oral: Tabletas que están destinadas a dispersarse en un líquido antes de su administración. Cuando se dispersan en el líquido, resulta una solución. Tabletas para suspensión oral: Tabletas que están destinadas a dispersarse en un líquido antes de su administración. Cuando se dispersan en el líquido, resulta una suspensión. Tintura (término no preferido; ver Solución): Solución alcohólica o hidroalcohólica preparada a partir de materiales vegetales o sustancias químicas. Tira (sólo se usa para productos de diagnóstico, de otra forma es no preferido; ver Película): Forma farmacéutica o dispositivo de material sólido, alargado, estrecho, delgado y absorbente, como el papel de filtro. Tópico(a): Vía de administración caracterizada por la aplicación sobre la superficie externa del cuerpo. Transdérmica(o): Vía de administración a través de la capa dérmica de la piel hasta la circulación sistémica. Trociscos (término no preferido; ver Tabletas de disolución bucal): Forma farmacéutica sólida destinada para una lenta desintegración o disolución en la boca y que, por lo general, se prepara mediante una técnica de compactación similar a la usada para las tabletas. Ungüento: Forma farmacéutica semisólida, que a menudo contiene menos de 20% de agua y sustancias volátiles, y más de 50% de hidrocarburos, ceras o polioles como vehículos. Esta forma farmacéutica por lo general está destinada para la aplicación externa sobre la piel o las membranas mucosas. Uretral: Vía de administración caracterizada por depositarse dentro de la uretra. Vaginal: Vía de administración caracterizada por depositarse dentro de la vagina. Vehículo: Término de uso común en la farmacia magistral que se refiere a un componente para uso interno o externo, el cual se usa como portador o diluyente donde se disuelven o suspenden líquidos, semisólidos o sólidos. Entre los ejemplos se incluye agua, jarabes, elíxires, líquidos oleosos, portadores sólidos y semisólidos, y productos de patente (ver Excipientes). Este término no se emplea en títulos de medicamentos. Veterinario: Término descriptivo para formas farmacéuticas destinadas para uso no humano.
(1152) MEDICAMENTOS VETERINARIOS USADOS EN ALIMENTOS PARA ANIMALES PROPÓSITO Este capítulo provee descripciones generales y definiciones de medicamentos y productos farmacéuticos veterinarios administrados en alimentos para animales. Asimismo, trata los principios generales relacionados con la fabricación, envasado y etiquetado de dichos medicamentos y productos farmacéuticos.
ALCANCE Este capítulo de información general trata sobre los artículos y alimentos medicados que se usan para administrar medicamentos veterinarios a los animales por medio de alimentos. Los medicamentos aprobados para la fabricación posterior de alimentos medicados para animales no son formas farmacéuticas. Las formas farmacéuticas que se administran con alimentos no son alimentos ni artículos medicados. Las formas farmacéuticas se listan en el capítulo general de la USP Formas Farmacéuticas (1151). Los medicamentos veterinarios aprobados para la fabricación posterior de alimentos medicados para animales pueden estar en forma seca o líquida. En ocasiones se hace referencia a estos como premezclas. El término "premezcla" ya no se usa para medicamentos veterinarios usados en alimentos para animales, aunque aún se usa en algunas monografías antiguas de medicamentos. Los medicamentos veterinarios en alimentos se regulan como artículos medicados Tipo A y alimentos medicados Tipo By Tipo C.
USP 39
Información General/ (1152) Medicamentos Veterinarios 1607
Artículos Medicados Tipo A Los artículos medicados Tipo A [Título 21 del CFR 558.3(b)(2)] son formas concentradas de medicamentos veterinarios destinados únicamente a la fabricación posterior de otros artículos medicados Tipo A o alimentos medicados Tipo B y Tipo C aprobados. Esto significa que los artículos medicados Tipo A no pueden suministrarse como alimento directamente a los animales. Estos artículos consisten en uno o más medicamentos veterinarios con o sin un portador (p.ej., carbonato de calcio, cáscara de arroz, maíz, gluten) y con o sin otros ingredientes inactivos. Se pueden preparar en forma seca o líquida. Se venden a las fábricas de alimentos o productores de ganado y están destinados a ser diluidos adicionalmente mezclándolos con los alimentos antes de ser consumidos por los animales.
Alimentos Medicados Tipo B Los alimentos medicados Tipo B [Título 21 del CFR 558.3(b)(3)] son alimentos medicados intermedios para animales. Se fabrican a partir de artículos medicados Tipo A u otros alimentos medicados Tipo B mediante dilución con ingredientes alimentarios no medicados. Los alimentos medicados Tipo B contienen una cantidad importante de nutrientes, no menos del 25% del peso total del alimento, además de los medicamentos veterinarios. Se pueden preparar en forma seca o líquida. De manera similar a los artículos medicados Tipo A, los alimentos medicados Tipo B están destinados únicamente para ser diluidos adicionalmente mezclándolos con los alimentos, y no están aprobados como alimento para animales.
Alimentos Medicados Tipo C Los alimentos medicados Tipo C [Título 21 del CFR 558.3(b)(4)] están destinados a suministrarse como alimento directamente a los animales. Se fabrican a partir de artículos medicados Tipo A, alimentos medicados Tipo B u otros alimentos medicados Tipo C diluidos con ingredientes alimentarios no medicados. Los alimentos medicados Tipo C se pueden preparar en forma seca o líquida. Los alimentos medicados Tipo C se pueden suministrar a los animales como alimento completo, como aderezo en la parte superior de las raciones diarias normales u ofrecerse como de "libre elección" (free-choice) (21 CFR 510.455). Los alimentos medicados Tipo C aprobados para ofrecerse como de libre elección no están destinados a ser consumidos por completo en una sola ración ni a constituir la dieta completa de los animales.
PREPARACIÓN Los artículos medicados Tipo A en forma seca por lo regular se producen mezclando los fármacos con portadores y otros excipientes para promover el mezclado uniforme durante su adición posterior al alimento para animales. Los fármacos pueden mezclarse primero con un excipiente (p.ej.,almidón o aluminosilicato de sodio) que tenga un tamaño de partícula similar y que pueda ayudar a distribuir los fármacos uniformemente en la mezcla final. Esta premezcla se combina posteriormente con excipientes a granel (p.ej., carbonato de calcio o cáscara de soja). El producto puede granularse y/o se le puede agregar aceite (p.ej., aceite mineral, aceite de soja) para facilitar la distribución uniforme, para prevenir la segregación de partículas durante el transporte y/o para minimizar la formación de partículas de fármacos dispersados en el aire durante la producción de otro artículo medicado Tipo A o alimentos medicados Tipo B o Tipo C. Los artículos medicados Tipo A en forma líquida se producen mezclando los fármacos con un disolvente adecuado (p.ej., agua o propilenglicol). Los fármacos por lo regular se disuelven hasta producir una solución, aunque también se pueden formar productos en suspensión. Los alimentos medicados Tipo B o Tipo C por lo general son fabricados en molinos de alimentos o en granjas de productores de ganado. Para fabricar los alimentos medicados Tipo B o Tipo C en forma seca, los artículos medicados Tipo A se agregan a los alimentos durante el proceso de mezclado. Los artículos medicados Tipo A en forma líquida pueden rociarse a velocidades establecidas, mientras que los artículos medicados Tipo A en forma seca se agregan usando métodos que facilitan la distribución uniforme en los alimentos. Los alimentos medicados Tipo B y Tipo C en forma seca se pueden procesar adicionalmente por medio de calor, vapor y extrusión para formar pellets. Los pellets pueden enrollarse o romperse para crear pequeños trozos crujientes. Los alimentos medicados Tipo By C también se pueden preparar en forma líquida. Los alimentos líquidos por lo regular son una base de melazas que contienen un medicamento veterinario disuelto o suspendido en la matriz de líquido. Puede ser necesario recircular o agitar el alimento líquido rutinariamente para mantener una distribución uniforme de los medicamentos. Un alimento medicado Tipo B también puede prepararse diluyendo otro alimento medicado Tipo B. Un alimento medicado Tipo C también puede prepararse diluyendo un alimento medicado Tipo B u otro alimento medicado Tipo C.
ETIQUETADO V ENVASADO El etiquetado para artículos medicados Tipo A y alimentos medicados Tipo B y Tipo C provee toda la información necesaria para su uso seguro y efectivo. La etiqueta para el artículo medicado Tipo A incluye instrucciones de mezclado para la fabricación de alimentos medicados a partir del artículo medicado Tipo A e instrucciones para el suministro como alimento de los
1608 (1152) Medicamentos Veterinarios / Información General
USP 39
alimentos medicados Tipo C. La etiqueta para el alimento medicado Tipo B provee instrucciones de mezclado para la fabricación de alimentos medicados para animales. Las etiquetas para los artículos medicados Tipo A y los alimentos medicados Tipo B indican que no se deben usar para alimentar a los animales directamente. La etiqueta para alimentos medicados Tipo C incluye instrucciones para suministro como alimento. Los artículos medicados Tipo A se envasan en bolsas (p.ej., papel con recubrimiento interno de polietileno) para productos secos o en envases apropiados (p.ej., de plástico) para líquidos. Los tamaños típicos son bolsas de 50 lb o envases de varios galones. Los alimentos medicados Tipo B y Tipo C en forma seca pueden envasarse en bolsas para almacenamiento y administración, o pueden transportarse a granel para su almacenamiento o uso inmediato. Los alimentos medicados Tipo C de libre elección pueden envasarse en bolsas (p.ej., minerales sueltos), envolverse en película (p.ej., bloques comprimidos) o envasarse en tubos (p.ej., bloques moldeados). Los alimentos medicados Tipo B y Tipo C en forma líquida se almacenan y transportan en tanques a granel.
NOMENCLATURA El nombre establecido del medicamento (genérico) consta del fármaco (parte activa) y un tipo apropiado del artículo o alimento medicado. Se dispone de las siguientes opciones de nomenclatura para indicar los tipos de artículos o alimentos medicados como parte del nombre establecido del producto: [Fármaco] artículo medicado Tipo A [Fármaco] artículo medicado Tipo A en forma líquida [Fármaco] alimento medicado Tipo B [Fármaco] alimento medicado Tipo Ben forma líquida [Fármaco] alimento medicado Tipo C [Fármaco] alimento medicado Tipo C en forma líquida [Fármaco] alimento medicado Tipo C de libre elección [Fármaco] alimento medicado Tipo C de libre elección en forma líquida [Fármaco] alimento medicado Tipo C como aderezo superior (top-dress)
,,
,,
,,
(1160) CALCULOS EN LA PRACTICA FARMACEUTICA fndlce 1. INTRODUCCIÓN 2. CÁLCULO DE CANTIDADES DE INGREDIENTES ACTIVOS 3. CÁLCULOS DE DOSIFICACIÓN 4. USO DE UNIDADES DE POTENCIA 5. SUMAS DE VOLÚMENES Y PESOS 6. DENSIDAD Y PESO ESPECÍFICO 7. MIL/EQUIVALENTES Y MIL/MOLES 8. EXPRESIONES PARA CONCENTRACIONES (con la Tabla 1) 9. ALCOHOL 1O. MÉTODOS DE ALIGACIÓN AL TERNA Y ALGEBRAICO 11. CÁLCULOS DE ALÍCUOTAS 12. CÁLCULOS DE VOLUMEN DE POLVO 13. VELOCIDADES DE INFUSIÓN O FLUJO INTRAVENOSO 14. SOLUCIONES ISOOSMÓTICAS 15. CÁLCULOS DE pH Y SOLUCIONES AMORTIGUADORAS 16. TEMPERATURA 17. ENDOTOXINAS 18. CÁLCULOS DE ESTABILIDAD Y FECHA DE CADUCIDAD 19. APÉNDICE 1: LOGARITMOS (con la Tabla 9 y la Tabla 1O)
1. INTRODUCCIÓN El propósito de este capítulo general es proporcionar información general que ayude a los farmacéuticos y al personal de apoyo en la realización de los cálculos necesarios para la preparación magistral y dispensación de medicamentos. Este capítulo general no incluye toda la información necesaria para realizar cálculos farmacéuticos. Para obtener información adicional sobre cálculos farmacéuticos, consulte un libro de texto sobre el tema. Para obtener información adicional sobre preparación magistral farmacéutica y estabilidad de medicamentos, consulte: Preparación Magistral-Preparaciones No Estériles (795), Preparación
USP 39
Información General/ (1160) Cálculos Farmacéuticos 1609
Magistral-Preparaciones Estériles (797) y Requisitos de Envasado y Almacenamiento (659); Garantía de Calidad en la Preparación Magistral (1163) y Consideraciones sobre Estabilidad en la Práctica de Dispensación (1191 ). Se pueden lograr cálculos farmacéuticos correctos usando conversiones apropiadas de un sistema de medición a otro y colocando comas decimales de manera apropiada (o puntos, en los países en los que se acostumbre usar dicho signo en lugar de comas decimales), mediante el entendimiento de conceptos aritméticos, y poniendo especial atención a los detalles de los cálculos. Antes de proceder con cualquier cálculo, los farmacéuticos deben hacer lo siguiente: (a) leer con cuidado toda la fórmula o receta médica; (b) determinar los materiales requeridos; y, posteriormente, (c) seleccionar los métodos de preparación y los cálculos apropiados. Se deben seleccionar métodos lógicos que requieran la menor cantidad de pasos a fin de asegurar que los cálculos se lleven a cabo de manera exacta y correcta. Un farmacéutico debe revisar cada cálculo o solicitar a otra persona que lo haga, p.ej., un técnico, cuando no esté disponible otro farmacéutico, antes de proceder con la preparación magistral. Un método apropiado para la doble verificación es la estimación, la cual consiste en redondear de manera conveniente (p.ej., 0,012 a 0,01; 0,44 a 0,5; 18,3 a 20 y 476 a 500) para aproximar la magnitud de las respuestas.
2. CÁLCULO DE LAS CANTIDADES DE INGREDIENTES ACTIVOS El farmacéutico debe ser capaz de calcular la cantidad o concentración de fármacos en cada unidad o porción de dosis de una preparación magistral al momento de su preparación, y nuevamente al momento de su dispensación. Los farmacéuticos deben realizar cálculos y mediciones para obtener, en teoría, 100% de la cantidad de cada ingrediente en las formulaciones preparadas magistralmente. Los cálculos deben tomar en cuenta el ingrediente activo, o la parte activa, así como el contenido de agua de los fármacos, que incluye el agua en las fórmulas químicas de los hidratos. Los fármacos y las sustancias agregadas oficiales deben cumplir con los requisitos del capítulo general Pérdida por Secado (731 ), lo cual debe incluirse en los cálculos de las cantidades y concentraciones de ingredientes. El farmacéutico debería tener en cuenta el efecto que tiene la humedad ambiental sobre la ganancia o pérdida de agua de fármacos y sustancias agregadas en envases que estén sujetos a la apertura intermitente durante el almacenamiento prolongado. Cada envase debería abrirse durante el tiempo mínimo necesario e, inmediatamente después de su uso, cerrarse herméticamente. Se debe conocer la naturaleza del fármaco que se va a pesar y a usar en la preparación magistral de una receta médica. Si la sustancia es un hidrato, puede ser necesario calcular su peso equivalente anhidro. Por otra parte, cuando la humedad adsorbida está especificada en un Certificado de Análisis o determinada en la farmacia inmediatamente antes de usar el fármaco en la preparación (ver el capítulo (731 )), dicha información deberá usarse al calcular la cantidad de fármaco que se va a pesar para determinar la cantidad exacta de fármaco anhidro requerido. Existen casos en los que la cantidad requerida de una dosis se especifica en términos de un catión (p.ej., Li+), de un anión (p.ej., F-) o de una molécula (p.ej., teofilina en aminofilina). En dichos casos, el fármaco pesado es una sal o un complejo, una porción del cual representa la parte farmacológicamente activa. Por consiguiente, la cantidad exacta de dichos fármacos pesados debe calcularse con respecto a la cantidad requerida de la parte farmacológica. Se puede usar la siguiente fórmula para calcular el peso teórico de un ingrediente en una preparación magistral:
W= AB/CD W = cantidad pesada real A = peso de la parte activa o funcional del fármaco o sustancia agregada prescrito o determinado por el farmacéutico B = peso molecular (MW, por sus siglas en inglés) del ingrediente, incluida el agua de hidratación para los ingredientes hidratados C = peso molecular de la parte activa o funcional de un fármaco o sustancia agregada provisto en el peso molecular del ingrediente pesado O= fracción de peso seco cuando el porcentaje en peso de contenido de humedad adsorbida se conoce a partir del procedimiento de pérdida por secado (ver el capítulo (731)) o del Certificado de Análisis. El Certificado de Análisis debe ser específico para el lote.
2.1 Ingredientes Activos 2.1.1 CÁLCULO DE FÁRMACOS DOSIFICADOS COMO SALES E HIDRATOS Ejemplos-Fármacos dosificados como sales e hidratos 1. Fármacos dosificados en forma de sal e hidrato Triturar cantidades de sulfato de morfina y lactosa para obtener 1Og que contengan 30 mg de sulfato de morfina por cada 200 mg de la mezcla de morfina y lactosa. [NOTA-La morfina se dosifica como sulfato de morfina, que es el pentahidrato.] W = peso de sulfato de morfina (g) A= peso de sulfato de morfina pentahidrato en la receta médica, 1,5 g B = peso molecular de sulfato de morfina pentahidrato, 759 g/mol C = peso molecular de sulfato de morfina pentahidrato, 759 g/mol
USP 39
161 O (1160) Cálculos Farmacéuticos/ Información General
o= 1,0 Para resolver la ecuación: W = (1,5 g x 759 g/mol)/(759 g/mol x 1) = 1,5 g de sulfato de morfina pentahidrato 2. Parte activa del fármaco y corrección por humedad Pesar con exactitud una cantidad de aminofilina para obtener 250 mg de teofilina anhidra. [NOTA-En este ejemplo, la aminofilina dihidrato en polvo pesada contiene 0,4% p/p de humedad adsorbida según se indica en el Certificado de Análisis recibido por la farmacia.] W=AB/CD
W = peso de aminofilina di hidrato (mg) A = peso de teofilina anhidra, 250 mg B = peso molecular de aminofilina dihidrato, 456 g/mol 360 g/mol D= 0,996 [NOTA-Un mol de aminofilina contiene 2 mol de teofilina. La teofilina tiene un peso molecular de 180.] Para resolver la ecuación:
e= peso molecular de teofilina anhidra,
W = (250 mg x 456 g/mol)/(360 g/mol x 0,996) = 318 mg de aminofilina dihidrato
2.2 Hidratos, Sales y Ésteres A menudo, por cuestiones de estabilidad u otras razones como sabor o solubilidad, la forma básica de un fármaco se administra en otra forma, tal como una sal o éster. Esta forma alterada del fármaco por lo regular tiene un peso molecular diferente y, en ocasiones, puede ser útil para determinar la cantidad de la forma básica del fármaco en la forma alterada. 2.2.1 CÁLCULO DE HIDRATOS, SALES Y ÉSTERES
Ejemplos-Hidratos, Sales y Ésteres 1. Hidratos Si se va a preparar una receta médica de 100 g de gel de clorhidrato de lidocaína al 2%, se podrían usar 2 g de clorhidrato de lidocaína anhidra, o se podría calcular la cantidad equivalente de clorhidrato de lidocaína monohidrato según se indica a continuación: W = peso de clorhidrato de lidocaína monohidrato (g) A = peso de clorhidrato de lidocaína anhidra en la receta médica, 2 g B = peso molecular de clorhidrato de lidocaína monohidrato, 288,81 g/mol e= peso molecular de clorhidrato de lidocaína anhidra, 270,80 g/mol o= 1,0 Para resolver la ecuación:
W = (2 g x 288,81 g/mol)/(270,80 g/mol x 1) = 2, 1 33 g de clorhidrato de lidocaína monohidrato 2. Sales Una receta médica requiere 1O mL de un gel tópico de fentanilo a una concentración de 50 µg de fentanilo/O, 1 mL, preparado a partir de citrato de fentanilo. La cantidad de citrato de fentanilo requerida para la preparación se podría calcular según se indica a continuación: Cantidad de fentanilo requerida para la preparación: (50 µg fentanilo/O, 1 mL) x 1O mL
= 5000 µg de fentanilo
W = peso de citrato de fentanilo en la receta médica (µg) A = peso de fentanilo en la receta médica, 5000 µg B = peso molecular de citrato de fentanilo, 528,59 g/mol e= peso molecular de fentanilo, 336,47 g/mol D= 1,0 Para resolver la ecuación: W = (5000 µg x 528,59 g/mol)/(336,47 g/mol x 1) = 7855 µg de citrato de fentanilo 3. Ésteres La cantidad de cefuroxima axetilo contenida en una sola tableta de cefuroxima de 250 mg se puede calcular según se indica a continuación: W = peso de cefuroxima axetilo en la tableta (mg) A = peso de cefuroxima en la receta médica, 250 mg
Información General/ (1160) Cálculos Farmacéuticos 1611
USP 39
B = peso molecular de cefuroxima axetilo, 510,47 mg/mmol e= peso molecular de cefuroxima, 424,39 mg/mmol D= 1,0 Para resolver la ecuación: W= (250 mg x 510,47 g/mol)/(424,39 g/mol x 1) = 300 mg de cefuroxima axetilo
3. CÁLCULOS DE DOSIFICACIÓN
3.1 Dosificación por Peso Las dosis a menudo se expresan como el cociente entre la cantidad de fármaco (en mg) y el peso corporal (en kg) para un intervalo de dosificación. 3.1.1 CÁLCULO DE LA DOSIFICACIÓN POR PESO
Ejemplo-Dosificación por peso Un médico ordena azitromicina para suspensión oral a una dosis de 15 mg/kg/día, dividida cada 12 horas, para un niño que pesa 36 lb. Calcular el volumen de suspensión oral, en mL, que debería administrarse para cada dosis de una suspensión de 200 mg/5 mL según se indica a continuación: (a) Calcular el peso del niño en kg: 36 lb
X
kg/2,2 lb = 16,4 kg
(b) Multiplicar el peso, en kg, por la dosificación: 16,4 kg x 15 mg/kg/día= 246 mg/día (c) Dividir la dosis total diaria por el número de dosis/día: 246 mg/2 dosis= 123 mg/dosis (d) Calcular el volumen de cada dosis usando relación y proporción: (123 mg/dosis)/(200 mg/5 mL) = 3, l mL/dosis Algunos cálculos también pueden completarse usando el análisis dimensional de unidades (DUA, por sus siglas en inglés). El análisis dimensional de unidades debería comenzar en el extremo izquierdo con un factor que contenga las unidades de respuesta del numerador. Se deben cancelar todas las unidades distintas a las de la respuesta. Si se va a usar un análisis dimensional de unidades, la ecuación precedente sería la siguiente:
36/ibras(niño)x~x 15 mg x~x~= 3,1 ml 2,2 libras kg ·día
200 mg
2 dosis
dosis
3.2 Dosificación por Superficie Corporal (Humanos) Algunos medicamentos, incluidos agentes quimioterapéuticos, requieren dosificación por superficie corporal (BSA, por sus siglas en inglés). La dosis se expresa como el cociente entre la cantidad de fármaco y la superficie corporal del paciente en metros cuadrados (m 2). La superficie corporal se puede calcular usando las fórmulas siguientes: BSA
(m 2 )
= )[altura (pulgadas) x peso (libras)]/ 3131
BSA
(m 2 )
=)
[altura (cm) x peso (kg)] / 3600
3.2.1 CÁLCULO POR SUPERFICIE CORPORAL (HUMANOS)
Ejemplo-Dosificación por superficie corporal (humanos) Un médico prescribe rituximab a una dosis de 375 mg/m 2 cada semana durante 6 semanas para un paciente que mide 6 pies 2 pulgadas de altura y pesa 183 lb. Calcular el volumen, en mL, de inyección de rituximab de 1O mg/mL requerido para preparar cada dosis de infusión IV según se indica a continuación: (a) Calcular la superficie corporal del paciente:
m2 = )[74 pulgadas x183 libras]/3131= 2,08 m2 (b) Multiplicar la superficie corporal por la dosificación: 2,08 m 2 x 375 mg/m 2 = 780 mg/dosis (c) Calcular el volumen de cada dosis usando relación y proporción: (780 mg/dosis)/(1 O mg/mL) = 78 ml/dosis
1612 (1160) Cálculos Farmacéuticos/ Información General
USP 39
El cálculo anterior también puede completarse usando un análisis dimensional de unidades según se indica a continuación: 2 08 m'(paciente)x 375 mg x ~ = 78 mL m' ·dosis 10 mg dosis '
3.3 Dosificación por Superficie Corporal (Animales) La superficie corporal para gatos y perros se puede calcular usando las fórmulas siguientes: Para otros animales, consulte referencias apropiadas sobre medicina veterinaria. Superficie corporal para gatos: Superficie corporal (m2) = {l O x [peso corporal (g)]º· 667}/l O 000 Superficie corporal para perros: Superficie corporal (m2)
= {l 0, 1 x [peso corporal (g)]0,667}/l O 000
3.3.1 CÁLCULO DE DOSIFICACIÓN POR SUPERFICIE CORPORAL (ANIMALES) Ejemplo-Dosificación por superficie corporal (animales) Un médico veterinario prescribe una terapia con ciclofosfamida oral a una dosis de 50 mg/m 2 para un gato que pesa 5,8 kg. Calcular la dosis de ciclofosfamida según se indica a continuación: (a) Calcular la superficie corporal del gato: Superficie corporal (m2) (b) Multiplicar la superficie corporal por la dosificación:
= [1 O x (5800 g)0,667]/l O 000 = 0,324 m2
0,324 m 2 x 50 mg/m2 = 16,2 mg
4. USO DE LAS UNIDADES DE POTENCIA Dado que algunas sustancias no se pueden caracterizar por completo por medios químicos y físicos, podría ser necesario expresar las cantidades de actividad en unidades biológicas de potencia [ver las Advertencias y Requisitos Generales 5.50.1 O, Unidades de Potencia (Biológica) de la USP ].
4.1 Cálculo mediante el Uso de las Unidades de Potencia Ejemplos-Uso de las unidades de potencia 1. Conversión de unidades de potencia a miligramos Se administra una dosis de penicilina G benzatínica de 1,2 millones de unidades por vía intramuscular debido a una infección estreptocócica. Si un producto específico contiene 1180 unidades/mg, calcular la cantidad, en mg, de penicilina G benzatínica en la dosis según se indica a continuación: (1 200 000 unidades)/(1180 unidades/mg) = 1017 mg de penicilina G benzatínica 2. Conversión de unidades de potencia a miligramos Una receta médica indica un ungüento de 60 g que contenga 150 000 unidades de nistatina por cada gramo. Calcular la cantidad de nistatina con una potencia de 4400 unidades/mg que debe pesarse para la receta médica según se indica a continuación: 60 g x (150 000 unidades de nistatina/g) = 9 000 000 unidades 9 000 000 unidades/(4400 unidades/mg)
= 2045 mg de nistatina
5. SUMAS DE VOLÚMENES V PESOS Los pesos son aditivos en la mayoría de las mezclas de líquidos, semisólidos y sólidos. Los volúmenes en las mezclas de soluciones miscibles y líquidos puros pueden o no ser aditivos, basándose principalmente en los efectos de las proporciones de volumen y de la unión de hidrógeno intermolecular. Por ejemplo, las mezclas que contienen volúmenes iguales o casi iguales de agua y etanol (y otros alcoholes monohidroxílicos miscibles) serán exotérmicas y generarán una contracción de volumen de <5%, p.ej., 50 mL agua+ 50 mL etanol generan 97-98 mL a 20º-25º. Se presenta una contracción de volumen inapreciable entre el agua y alcoholes polihidroxiílicos o polihídricos, p.ej., glicerina y propilenglicol. Los volúmenes son aditivos con un error generalmente inapreciable en mezclas acuosas que contienen <10% de alcoholes monohidroxiílicos, es decir, se presenta una contracción de volumen de <0,5%.
Información General/ (1160) Cálculos Farmacéuticos 1613
USP 39
6. DENSIDAD V PESO ESPECÍFICO La densidad se define como el cociente entre la masa de una sustancia en aire a una temperatura específica (por lo regular 25º) y la unidad de volumen de dicha sustancia a la misma temperatura. La densidad puede calcularse con la siguiente ecuación: Densidad = (masa de sustancia/volumen de sustancia) a una temperatura y presión particulares El peso específico (SG, por sus siglas en inglés) es la relación sin unidades de la densidad de una sustancia con la densidad del agua a 4º, o [(g de sustancia/mL)/1,00 g/mL]. Como alternativa, el peso específico se puede calcular a una temperatura determinada en algunas unidades comunes a partir de la densidad de la sustancia dividida por la densidad de agua. El peso específico puede calcularse con la siguiente ecuación: Peso específico =(peso de la sustancia)/(peso de un volumen igual de agua)
6.1 Cálculo de Densidad y Peso Específico Ejemplos-Densidad y Peso Específico 1. Cálculo de densidad 2,3 g de polvo de carbón activado ocupan un volumen aparente de 5,2 mL a 20º y 1 atm. La densidad del polvo de carbón activado puede calcularse según se indica a continuación: Densidad= 2,3 g/5,2 mL = 0,44 g/mL 2. Cálculo del peso específico 125 g de glicerina ocupan un volumen de 99 mL a 25º. [NOTA-La densidad del agua a 25º es 0,997 g/ml.] El peso específico de glicerina se puede calcular según se indica a continuación: Peso específico = (125 g/99 mL)/(0,997 g/mL) = 1,266 3. Cálculo de ácido concentrado El Ácido clorhídrico es una solución de aproximadamente 37% (p/p) de ácido clorhídrico en agua. Calcular la cantidad, en g, de ácido clorhídrico contenido en 75 mL de ácido clorhídrico según se indica a continuación. [NOTA-El peso específico del ácido clorhídrico es 1, 18.] 37% p/p
X
1, 18 = 43,7% p/V
(43,7 g/100 mL) x 75 mL = 32,8 g de ácido clorhídrico
7. MILIEQUIVALENTES V MILI MOLES [NOTA-Esta sección trata sobre miliequivalentes (mEq) y milimoles (mmol) aplicables a electrólitos para los cálculos de dosificación. Ver también la sección 8. Expresiones para Concentraciones de este capítulo.] La cantidad de electrólitos administrada a pacientes por lo general se expresa en mEq. Las unidades de peso como los mg o g no se usan con frecuencia para los electrólitos porque las propiedades eléctricas de los iones se expresan mejor en mEq. Un equivalente (Eq) es el peso de una sustancia que aporta 1 unidad de carga. El peso equivalente es el peso, en g, de un átomo o radical dividido por la valencia del átomo o radical. Un mEq es 1/l OOOmo de un Eq. El peso equivalente de un compuesto se puede determinar dividiendo su fórmula o peso molecular en g por la valencia de su valencia iónica más grande. Un mol equivale al peso atómico o molecular de una sustancia expresado en gramos. Un milimol equivale a 1/l OOOmo de un mol.
7.1 Cálculo de Miliequivalentes y Milimoles Ejemplos-Miliequivalentes y milimoles 1. Calcular el peso en mEq de calcio. [NOTA-El calcio tiene un peso molecular de 40,08 y su valencia es de 2+.] Peso Eq = 40,08 g/2 = 20,04 g peso mEq = 20,04 g/1000 = 0,02004 g = 20,04 mg 2. Calcular la cantidad, en mEq, de potasio en una Tableta de Penicilina V Potásica de 250 mg. [NOTA-La penicilina V potásica tiene un peso molecular de 388,48 g, hay un átomo de potasio en la molécula y la valencia de potasio es 1+.] Peso Eq = 388,48 g/l = 388,48 g peso mEq = 388,48 g/1000 = 0,38848 g = 388,48 mg
USP 39
1614 (1160) Cálculos Farmacéuticos / Información General
(250 mg/tableta)/(388,48 mg/niEq) = 0,644 mEq de potasio/tableta 3. Calcular el número de mEq de magnesio y sulfato en una dosis de 2 mL de Inyección de Sulfato de Magnesio al 50%. [NOTA-El sulfato de magnesio (Mg50 4 · 7H 2 0) tiene un peso molecular de 246,47, y la valencia iónica más alta es magnesio 2+ y sulfato 2-.] (50 g/l 00 mL) x (2 mL/dosis) = 1 g/dosis peso Eq = 246,47 g/2 = 123,24 g/Eq (1 g/dosis)/(123,24 g/Eq) = 0,008114 Eq = 8, 114 mEq de magnesio y sulfato por cada dosis Este problema también puede resolverse usando un análisis dimensional de unidades según se indica a continuación: ~x 2 ml x~x 1000 mEq
100 ml
dosis
246,47 g
8,114 mEq
dosis
Eq
4. Un vial de inyección de cloruro de sodio contiene 3 mEq/mL de cloruro de sodio. Calcular la concentración, en % p/v, de la inyección. [NOTA-El cloruro de sodio tiene un peso molecular de 58,44.] 3 mEq x 58,44 g x ml
1 Eq
Eq
0,1753 g
1000 mEq
ml
(O, 1753 g/mL) x 100 mL = 17,53 g en 100 mL = 17,53% (p/v) 5. Calcular el peso de potasio en mmol. [NOTA-El potasio tiene un peso molecular de 39, l.] El peso de 1 mol es 39, 1 g y el peso en mmol es 39, 1 g/l 000 = 0,0391 g ó 39, 1 mg 6. Calcular el contenido, en mmol, de penicilina V potásica en una Tableta de Penicilina V Potásica de 250 mg. [NOTA-La penicilina V potásica tiene un peso molecular de 388,48.] El peso de 1 mol es 388,48 g y el peso de 1 mmol es: 388,48 g/1000 = 0,38848 g ó 388,48 mg 250 mg mmol ---x---tableta 388,48 mg
0,644 mmol de Penicilina V potásica tableta
8. EXPRESIONES PARA CONCENTRACIONES Las expresiones para concentraciones de esta sección hacen referencia a mezclas homogéneas de los siguientes estados de la materia a una temperatura de 20º-30º y a una presión de 1 atm (29,92 en Hg, 760 mm Hg, 101,3 kPa, 1013,3 mb): gas en gas, gas en líquido, líquido en líquido, líquido en semisólido, sólido en líquido, sólido en semisólido y sólido en sólido. Las expresiones para concentraciones usadas en la práctica farmacéutica y en la investigación farmacéutica incluyen, entre otras, aquellas citadas en la Tabla 7. La concentración métrica de fármaco y las concentraciones clínicas comunes incluyen, por ejemplo, µg/mL, mg/dL, g ó mg por cada L, y ng/µL (ver las Advertencias y Requisitos Generales 8.240, Pesos y Medidas). Tabla 1 Abreviatura
Título
Definición
Ninguno es estándar
Cociente entre la masa de un ingrediente dispersado o disuelto y la cantidad en volumen de mezclas que contienen dicho ingrediente
mEqª por volumen
mEq/unidad de volumen
Cociente entre el número de mEq de un electrolito o sal y la unidad de volumen de soluciones que contienen dicho electrolito o sal
Molalidad
m
molb de un soluto/kg de un disolvente que contiene dicho soluto<
Molaridad
M
mol de un soluto/L de un disolvente que contiene dicho solutod
Relaciones de masa en volumen
ª 1 mEq = Eq/1000. b La abreviatura de mol es mol. e 1 mol de soluto en 1 kg de disolvente es una solución 1 molal (1 m). d 1 mol de soluto en 1 L de solución de dicho soluto es una solución 1 molar (1 M). e Normalidad= (Molaridad x valencia iónica más grande de un compuesto), p.ej., (18 M H2S0 4 x 2) = 36 N H2S0 4, donde 2 se deriva de la valencia 2- de 50 4 . f Eq de un compuesto= (1 mol x valencia iónica más grande de un compuesto), p.ej., 1 mol de citrato de litio= 3 Eq de citrato de litio; 1 mol de Ca(gluconato)2 = 2 Eq de Ca(gluconato)i; y 1 mol de KCI = 1 Eq de KCI. g 1 Eq de soluto en 1 L de solución de dicho soluto es una solución 1 normal (1 N). h R, X e Y son números enteros.
USP 39
Información General/ (1160) Cálculos Farmacéuticos 1615
Tabla 1 (Continuación) Título
Abreviatura
Definición
N
Equivalentes (Eq 1) de un soluto/L de un disolvente que contiene dicho soluto9
Partes por millón
ppm
Partes de un gas, líquido o sólido en 1 parte por millón de otro gas, líquido o sólido que contiene el primer gas, líquicio o sólido
o/o Volumen en volumen
o/o v/v
ml de líquido en 100 ml de un disolvente que contiene dicho líquido
o/o Peso en volumen
o/o p/v
g de un soluto en 100 ml de un disolvente que contiene dicho soluto
o/o Peso en peso
o/o p/p
g de un soluto en 100 g de una mezcla que contiene dicho soluto
l:R
1 parte de un ingrediente en Rh partes de una mezcla que contiene dicho ingrediente
1 en R
1 parte de un ingrediente en Rh partes de una mezcla que contiene dicho ingrediente
Normalidade
Xh partes de un ingrediente en l'11 partes de otro ingredienRelación de contenido
X:Y
te en una mezcla
ª
1 mEq = Eq/1000. b La abreviatura de mol es mol. e 1 mol de soluto en 1 kg de disolvente es una solución 1 molal (1 m). d 1 mol de soluto en 1 L de solución de dicho soluto es una solución 1 molar (1 M). e Normalidad= (Molaridad x valencia iónica más grande de un compuesto), p.ej., (18 M H2 S0 4 x 2) = 36 N H2 S04 , donde 2 se deriva de la valencia 2- de 504 . 1 Eq de un compuesto= (1 mol x valencia iónica más grande de un compuesto), p.ej., 1 mol de citrato de litio= 3 Eq de citrato de litio; 1 mol de Ca(gluconato)i = 2 Eq de Ca(gluconato) 2; y 1 mol de KCI = 1 Eq de KCI. 9 1 Eq de soluto en 1 L de solución de dicho soluto es una solución 1 normal (1 N). h R, X e Y son números enteros.
8.1 Cálculo de Normalidad Ejemplo-Normalidad Calcular la cantidad de polvo de bicarbonato de sodio requerida para preparar 50 ml de una solución de bicarbonato de sodio 0,07 N (NaHC0 3). [NOTA-El bicarbonato de sodio tiene un peso molecular de 84,01.] En una reacción ácida o básica, debido a que NaHC0 3 se puede comportar como un ácido cediendo un protón, o como una base aceptando un protón, hay un Eq de NaHC03 contenido en cada mol de NaHC0 3 • 0,050 L x O,O? Eq x
L
~ 1 Eq
·º
x 84 1 g = 0,294 g de bicarbonato de sodio 1 mol
8.2 Cálculo de Concentraciones Porcentuales Las concentraciones porcentuales de las soluciones y otras mezclas homogéneas por lo general se expresan en una de las tres formas comunes en las que las cantidades del numerador y del denominador están en las unidades de medición g y ml. 1. Porcentaje en volumen (% v/v) = (volumen de soluto líquido/volumen de solución o suspensión) x 100 o % v/v = ml de soluto líquido en 100 ml de solución o suspensión 2. Porcentaje en peso (% p/p) = (peso de soluto/peso de la mezcla) x 100 o % p/p = g de ingrediente en 100 g de mezcla 3. Porcentaje de peso en volumen (% p/v) = (peso de soluto/volumen de solución o suspensión) x 100 o % p/v = g de soluto en 100 ml de solución o suspensión Es posible usar las tres ecuaciones anteriores para calcular cualquiera de los tres valores (es decir, pesos, volúmenes o porcentajes) en una ecuación determinada, si se conocen los otros dos valores (ver también las Advertencias y Requisitos Generales 8. 740, Concentraciones Porcentuales).
Ejemplos-Concentraciones porcentuales 1 . Porcentaje en peso Una receta médica indica lo siguiente (ver la Tabla 2): Tabla 2 Óxido de cinc
7,5 g
Calamina
7,5 g
Almidón
15 g
Vaselina blanca
30 g
1616 (1160) Cálculos Farmacéuticos/ Información General
USP 39
Calcular la concentración porcentual de cada uno de los cuatro componentes usando la ecuación de porcentaje en peso anterior según se indica a continuación: (a) El peso total de ungüento = 7,5 g + 7,5 g + 15 g + 30 g = 60,0 g (b) El porcentaje en peso de óxido de cinc= (7,5 g de óxido de cinc/60 g de ungüento) x 100% = 12,5% (c) El porcentaje en peso de calamina= (7,5 g de calamina/60 g de ungüento) x 100% = 12,5% (d) El porcentaje en peso de almidón = (15 g de almidón/60 g de ungüento) x 100% = 25% (e) El porcentaje en peso de vaselina blanca = (30 g de vaselina blanca/60 g de ungüento) x 100% = 50% 2. Porcentaje en volumen Una receta médica indica lo siguiente: Receta médica: Aceite de Eucalipto al 3% v/v en Aceite Mineral. Dispensar 30 ml. Calcular las cantidades de ingredientes en esta receta médica usando la ecuación de porcentaje en volumen según se indica a continuación: (a) La cantidad de aceite de eucalipto: 3% v/v =(volumen de aceite en mL/30,0 mL) x 100% volumen en aceite= 0,9 mL de aceite de eucalipto (b) La cantidad de aceite mineral: 30 mL - 0,9 mL = 29, 1 mL de aceite mineral
8.3 Conversiones de las Expresiones para Concentraciones 8.3.1 CONVERSIONES PARA SOLUCIONES DE SÓLIDO EN LÍQUIDO A continuación, se presentan los cálculos usados para convertir el porcentaje de peso en volumen, o/o p/v, a otras concentraciones y viceversa, usando las mismas densidades y fórmula o pesos moleculares, para soluciones de cloruro de calcio, sulfato de magnesio y cloruro de potasio en agua.
8.3.1.1 Cálculo de conversiones de sólido en líquido Ejemplos-Conversiones de sólido en líquido 1. Convertir cloruro de calcio al 10% p/v (CaCl 2 • 2HP) a molalidad (m). [NOTA-El cloruro de calcio tiene un peso molecular de 147,01 g; una solución al 10% p/v tiene una densidad de 1,087 g/ml.] 10% p/v = 1O g de calcio/100 mL de solución Usando la densidad de la solución: 100 mL de solución x 1,087 g/mL = 108,7 g de solución 108,7 g de solución - 1Og de cloruro de calcio= 98,7 g de agua= 0,0987 kg de agua 1Og de cloruro de calcio/(147,01 g de cloruro de calcio/mol de cloruro de calcio)= 0,068 mol de cloruro de calcio 0,068 mol de cloruro de calcio/0,0987 kg de agua = 0,689 m 2. Convertir sulfato de magnesio al 50% p/v (MgS04 • 7H 20) a molaridad (M). [NOTA-El sulfato de magnesio tiene un peso molecular de 246,47 g.] ~X~ 100 ml
246,47
X
1000ml ~ 2029M 1L '
3. Convertir cloruro de calcio al 10% p/v (CaCl 2 • 2HP) a normalidad (N).
10 9 x 1 mol x 2 Eq x 1000 ml = 1 36 N 100 ml 147,01 g 1 mol 1L ' *2 Eq/mol derivado de la valencia 2+ de calcio 4. Convertir cloruro de calcio al 10% p/v (CaCl 2 • 2H 2 0) a mEq/mL. ~x~x 2Eq x 1000mEq ~1,36mEq/mL 100ml 147,01g 1mol
1Eq
5. Convertir cloruro de calcio al O, 1o/o p/v (CaCl 2 • 2H 2 0) a ppm.
(O, 1 g/100 mL) x (1 x 106 ppm) = 1000 ppm 6. Convertir cloruro de potasio al 33% p/v (KCI) a una relación de concentración 1:R.
Información General/ (1160) Cálculos Farmacéuticos 1617
USP 39
(1 IR)= (33 g/100 mL)
R = 3,03
1 :R = 1 :3 8.3.2 CONVERSIONES PARA SOLUCIONES DE LÍQUIDO EN LÍQUIDO A continuación, se presentan los cálculos usados para convertir el porcentaje de peso en peso, % plp, y volumen en volumen, % vlv, a otras concentraciones y viceversa, usando las mismas densidades y fórmulas o pesos moleculares, para glicerina y alcohol isopropílico en agua. Además de mezclas de líquido en semisólido, sólido en semisólido y sólido en sólido, el % plp se usa para líquidos viscosos, tales como alquitrán de hulla, glicerina y ácidos concentrados.
8.3.2.1 Conversión de soluciones de líquido en líquido Ejemplos-Conversiones de líquido en líquido 1 . Convertir glicerina al 50% plp a % plv. [NOTA-La glicerina al 50% plp tiene una densidad de 1, 1 3 glmL.] (50 gil 00 g) x (1, 13 glmL) = 0,565 glmL 56,5 gil 00 mL = 56,5% plv 2. Convertir alcohol isopropílico al 70% vlv a % plp. [NOTA-El alcohol isopropílico tiene una densidad de 0,79 glmL y el alcohol isopropílico al 70% vlv tiene una densidad de 0,85 glmL.] 70 mL de alcohol isopropílico x (0,79 glmL) = 55,3 g de alcohol isopropílico 100 mL de solución x (0,85 glmL) = 85 g de solución (55,3 g de alcohol isopropílicol85 g de solución) x 100 = 65,06% plp 3. Convertir alcohol isopropílico al 70% vlv a % plv. Los siguientes valores se derivan del ejemplo 2. 55,3 g de alcohol isopropílico/100 mL de solución = 55,3% plv 4. Convertir glicerina al 50% plp a molalidad (m). [NOTA-La glicerina tiene un peso molecular de 92, 1.] 50 g de glicerinal(92, 1 glmol) = 0,543 mol de glicerina 100 g de solución - 50 g de glicerina = 50 g de agua = 0,05 kg de agua (0,543 mol de glicerinal0,05 kg de agua)= 10,86 m 5. Convertir alcohol isopropílico al 70% vlv a molalidad (m). [NOTA-El alcohol isopropílico tiene una densidad de 0,79 glmL y un peso molecular de 60, 1; el alcohol isopropílico al 70% vlv tiene una densidad de 0,85 glmL.] 70 mL de alcohol isopropílico x (0,79 glmL) = 55,3 g de alcohol isopropílico 100 mL de solución x (0,85 glmL) = 85 g de solución (85 g de solución- 55,3 g de alcohol isopropílico) = 29,7 g de agua = 0,0297 kg de agua 55,3 g de alcohol isopropílicol(60, 1 glmol) = 0,92 mol de alcohol isopropílico (0,92 mol de alcohol isopropílicol0,0297 kg de agua)= 30,98 m 6. Convertir glicerina al 50% plp a molaridad (M). [NOTA-La glicerina tiene un peso molecular de 92, 1 g.] A partir del ejemplo 1, glicerina al 50% plp = glicerina al 56,5% plv (56,5 g/100 mL) x (mol/92, 1 g) x (1000 ml/L) = 6, 13 M 7. Convertir glicerina al 50% plp a % vlv. [NOTA-La glicerina al 50% plp tiene una densidad de 1, 13 glmL; la glicerina al 100% tiene una densidad de 1,26 glmL.] 50 g de glicerinal(l ,26 glmL) = 39,7 mL de glicerina 100 g de soluciónl(l, 13 glmL) = 88,5 mL de solución (39,7 mL de glicerinal88,5 mL de solución) x 100% = 44,8% vlv 8. Convertir glicerina al 50% plp a una relación de concentración 1 en R . 1IR= (50 g de glicerina/100 g de solución)
R=2
1618 (1160) Cálculos Farmacéuticos/ Información General
USP 39
1 en R = 1 en 2 8.3.3 CONVERSIONES DE SÓLIDO Y SEMISÓLIDO EN MEZCLAS DE SÓLIDO Y SEMISÓLIDO A continuación, se presentan los cálculos usados para convertir porcentaje de peso en peso(% p/p) a ppm y a relaciones de concentración para fluocinonida y tolnaftato en semisólidos y polvos tópicos. 8.3.3.1 Cálculo de conversiones de sólido y semisólido en mezclas de sólido y semisólido Ejemplos-Conversiones de sólido y semisólido en mezclas de sólido y semisólido 1. Convertir ungüento de fluocinonida al 0,05% p/p a ppm. (0,05 g/100 g) x (1 x 106 ppm) = 500 ppm 2. Convertir polvo de tolnaftato al 1,5% p/p a una relación de concentración 1 :R. 1/ R = (1,5 g de tolnaftato/100 g de polvo)
R = 67 1:R=1 :67 3. Convertir tolnaftato al 1% p/p en polvo de talco a una relación de concentración X: Y. 100 g de polvo - 1 g de tolnaftato = 99 g de talco
X: Y= 1 g de tolnaftato:99 g de talco
8.4 Dilución y Concentración Una solución concentrada puede diluirse a una concentración más baja para obtener el contenido y la precisión apropiados al realizar preparaciones magistrales. Las mezclas de polvos y semisólidos pueden triturarse o mezclarse para conseguir concentraciones más bajas. La cantidad de un ingrediente en la mezcla diluida es la misma que en la porción de la fuente más concentrada usada para realizar la dilución; por lo tanto, la siguiente ecuación puede aplicarse para resolver problemas de dilución (0 7)(C 7) = (02)(C2 ), donde 0 7 y 0 2 son las cantidades de las soluciones 1 y 2, respectivamente, y C7 y C2 son las concentraciones de las soluciones 1 y 2, respectivamente. Se puede usar cualquier término de cantidad y concentración, pero las unidades de dichos términos deben ser las mismas en ambos lados de la ecuación. 8.4.1 CÁLCULO DE DILUCIÓN Y CONCENTRACIÓN Ejemplos-Diluciones y fortificaciones 1. Dilución de semisólidos Calcular la cantidad (02), en g, de diluyente que debe agregarse a 60 g de un ungüento al 10% p/p para preparar un ungüento al 5% p/p.
(0 7) = 60 g, (C 7) = 10% p/p, y (C2) = 5% p/p 60 g X 1Oo/o p/p = (02) X 5o/o p/p (02) = 120 g 120 g - 60 g = se deben agregar 60 g de diluyente 2. Dilución de sólidos Calcular la cantidad de diluyente que debería agregarse a un triturado de 1O g (1 en 100) para preparar una mezcla que contenga 1 mg de fármaco por cada 1O g de la mezcla final. Convertir mg a g: 1 mg de fármaco= 0,001 g de fármaco 1Og de mezcla deberían contener 0,001 g de fármaco
(0 7) = 1Og, (C¡) = (1 en 100) y (C2 ) = (0,001 en 1O) 1ogX(1/100) = (02) X (0,001 /1 O)
(Q2) = 1000 g Debido a que la mezcla final de 1000 g contiene 1Og del triturado, se requieren 990 g (ó 1000 g - 1Og) de diluyente para preparar la mezcla a una concentración de 0,001 g de fármaco por cada 1Og. 3. Dilución de líquidos
USP 39
Información General/ (1160) Cálculos Farmacéuticos 1619
Calcular la concentración porcentual de (C2) de una solución que se obtiene diluyendo 400 mL de una solución al 5,0% p/v hasta 800 ml. (Q 1) = 400 mL, (C¡) = 5,0% p/v y (Q2 ) = 800 mL
400 mL x 5% p/v = 800 mL x (C2)
(C2) = 2,5% p/v 4. Fortificación de líquidos Calcular la cantidad adicional, en g, de fosfato de codeína que necesita agregarse a 180 mL de un elíxir de acetaminofeno con codeína de 12 mg/5 mL para obtener una concentración final de 30 mg/5 mL de fosfato de codeína. Cantidad a agregar= Cantidad total requerida - Cantidad presente Cantidad total requerida: (30 mg/5 mL) x 180 mL = 1080 mg de fosfato de codeína Cantidad presente= (12 mg de codeína/5 mL) x 180 mL = 432 mg de fosfato de codeína Cantidad a agregar: 1080 mg - 432 mg = 648 mg de fosfato de codeína
9. ALCOHOL Para poder cumplir con las disposiciones de las Advertencias y Requisitos Generales sobre Alcohol y de la monografía USP de Alcohol, son necesarias algunas convenciones y cálculos especiales. Ver las Advertencias y Requisitos Generales 5.20.20. 7 En Preparaciones Magistrales, 8.30 Contenido de Alcohol y Etiquetado (7), Alcohol para más información. La monografía USP de Alcohol establece que el Alcohol contiene 92,3%-93,8% en peso correspondiente a 94,9%-96,0% en volumen de alcohol (C 2 H5 0H) a 15,56º. Por lo general, se considera que la concentración porcentual para alcohol es 95% v/v de alcohol (C 2 H5 0H) en agua. En resumen: • Cuando se escriba la palabra alcohol en una receta médica o en una fórmula, por ejemplo "alcohol 1O mL" o "disolver en 5 mL de alcohol", el preparador magistral debería usar Alcohol, USP [que es Alcohol al 95% (C 2 H5 0H)]. •Cuando se escriba la palabra alcohol con un porcentaje, por ejemplo "alcohol 20%", esto quiere decir 20% v/v de alcohol (C 2 H5 0H). Si este porcentaje se encuentra en la etiqueta de un producto comercial, significa que el producto contiene alcohol al 20% v/v (C 2 H5 0H). Si forma parte de la fórmula de una preparación magistral, significa que la persona que realiza la preparación debe agregar el equivalente a 20% v/v de alcohol (C2 H5 0H), lo cual puede requerir cálculos especiales. • Las etiquetas de productos y preparaciones magistrales deben incluir el contenido de alcohol (C 2 Hs0H) en % v/v. En el caso de las preparaciones magistrales, a menudo, este valor se debe calcular basándose en los volúmenes de alcohol que contienen los ingredientes agregados. Al realizar los cálculos para preparar las preparaciones magistrales de fármacos que usan Alcohol, USP, el primer paso es determinar la cantidad, en mL, de alcohol requerida y el segundo paso es determinar el % v/v de alcohol (C 2 H50H) en la preparación final de modo que pueda etiquetarse de manera adecuada.
9.1 Cálculo de Alcohol Ejemplos-Alcohol 1. Determinar la cantidad de alcohol requerida para la receta médica (ver la Tabla 3): Tabla 3 Clindamicina
1%
Alcohol
15%
Propilenglicol
5%
Agua purificada, cantidad suficiente para preparar
60 ml
(a) En esta receta médica, el 15% de alcohol significa que la preparación contiene 15% v/v de alcohol (C 2 H5 0H). (b) Para 60 mL de preparación, calcular la cantidad de alcohol (C 2 H5 0H) requerida: 15% v/v x 60 mL = 9 mL de alcohol (c) Debido a que la fuente de alcohol (C 2 Hs0H) es Alcohol, USP, calcular el volumen, en mL, de Alcohol, USP requerido para obtener 9 mL de alcohol (C 2 H5 0H): 9 mL de alcohol/Alcohol, USP al 95% v/v = 9,5 mL de Alcohol, USP Por lo tanto, agregar 9,5 mL de Alcohol, USP a esta preparación. (d) Determinar el contenido de alcohol en % v/v para el etiquetado.
USP 39
1620 (1160) Cálculos Farmacéuticos / Información General
Debido a que el etiquetado de alcohol está en o/o v/v de alcohol (C 2 H5 0H), el contenido de alcohol de esta preparación se etiquetaría de la forma siguiente: Alcohol 15% . 2. Determinar el contenido de alcohol, en o/o v/v, para la receta médica (ver la Tabla 4): Tabla4 Aceite de ricino
40ml
Acacia
Según se requiera
Alcohol
15 ml
Jarabe de cereza
20 ml
Agua purificada, cantidad suficiente para preparar
100 ml
Debido a que debe usarse la monografía USP de Alcohol cuando la fórmula indique el uso de alcohol, medir 15 mL de Alcohol, USP. Alcohol, USP al 95% x 15 mL = 14,25 mL de alcohol
14,25 mL de alcohol/l 00 mL de preparación= alcohol al 14,25%
1 O. MÉTODOS DE ALIGACIÓN ALTERNA Y ALGEBRAICO 10.1 Aligación Alterna La aligación es un método para determinar las proporciones en que se mezclan sustancias de contenidos diferentes para obtener el contenido o la concentración deseados. Una vez encontrada la proporción, se puede realizar el cálculo para determinar las cantidades exactas de las sustancias requeridas. Plantear el problema del siguiente modo. 1 . Colocar la concentración o el porcentaje deseado en el centro. 2. Colocar el porcentaje de la sustancia con el contenido más bajo en el lado inferior izquierdo. 3. Colocar el porcentaje de la sustancia con el contenido más alto en el lado superior izquierdo. 4. Restar el porcentaje inferior del porcentaje deseado y colocar la diferencia obtenida en el lado superior derecho. 5. Restar el porcentaje deseado del porcentaje más alto y colocar la diferencia obtenida en el lado inferior derecho. Los resultados del lado derecho determinarán el número de partes de los dos contenidos porcentuales diferentes que deben mezclarse para producir el contenido porcentual deseado de una mezcla de fármacos. La suma de las partes será igual al peso o volumen final de la preparación.
10.1.1 CÁLCULO USANDO LA ALIGACIÓN ALTERNA Ejemplos-Aligación alterna 1. Determinar la cantidad de ungüento que contiene una concentración de 12% de fármaco, y la cantidad de ungüento que contiene una concentración de 16% de fármaco para preparar 1 kg de una preparación que contenga una concentración de 12,5% de fármaco. (más alto) 16% ~
/0,5
partes de 16%
12,5%
/(deseado)~ (más bajo) 12%
Mpartes de 12%
j 4,0 partes de 12,5% 1
En un total de 4 partes de una preparación al 12,5%, se requieren 3,5 partes de ungüento al 12% y 0,5 partes de ungüento al 16%.
4 partes corresponden a 1 kg o 1000 g. 1 parte corresponde a 250 g. 3,5 partes corresponden a 3,5 x 250 g u 875 g de ungüento al 12%. 0,5 partes corresponden a 0,5 x 250 g o 125 g de ungüento al 16%. 2. Determinar el volumen, en mL, de dextrosa al 20% en agua y de dextrosa al 50% en agua requerido para preparar 750 mL de dextrosa al 35% en agua.
USP 39
Información General/ (1160) Cálculos Farmacéuticos 1621
(más alto) 50%
/
~35%/ (deseado)
/
(más bajo) 20%
15 partes de 50%
~
15_ partes de 20%
§artes de35% 1
En un total de 30 partes de dextrosa al 35% en agua se necesitan 15 partes de dextrosa al 50% en agua y 15 partes de dextrosa al 20% en agua. 30 partes corresponden a 750 ml. 15 partes corresponden a 375 ml. Por lo tanto, usar 375 mL de la solución al 20% y 375 mL de la solución al 50% para preparar la preparación.
10.2 Método Algebraico La siguiente ecuación algebraica puede usarse en lugar de la aligación para resolver los problemas al mezclar dos concentraciones diferentes del mismo ingrediente: (C, x Q,) + (Cw x Ow) = (C1 x Q1), donde Ces la concentración o el contenido, Q es la cantidad; y el subíndices identifica el contenido mayor, w identifica el contenido menor, f representa la mezcla final con un contenido menor que s y mayor que w, (Q, + Ow) = Qfl Q, = (Q¡- Ow) Y Ow = (Q¡- Q,). 10.2.1 CÁLCULO USANDO EL MÉTODO ALGEBRAICO
Ejemplos-Método algebraico 1. Determinar la cantidad, en g, de fármaco en ungüento al 16% p/p y fármaco en ungüento al 12% p/p requerida para preparar 1 kg de fármaco en ungüento al 12,5% p/p. (16%
X
Q,) + [12%
X
(lOOOg - Q,)]
= 12,5% X lOOOg
16% Q, + 120 g - 12% Q, = 125 g 4% Q,= 5g Q, = 5 g/4%
Ow = 1000 g -
= 125 g de ungüento al 16%
125 g = 875 g de fármaco en ungüento al 12%
2. Determinar el volumen, en mL, de inyección de dextrosa al 10% e inyección de dextrosa al 50% requerida para preparar 750 mL de inyección de dextrosa al 35%. (50% x C,) + [10% x (750 mL - C,)] = 35% x 750 mL 50%
e,+ 75 mL-10% e,= 262,5 mL 40%
e, = 187,5 mL
e,= 187,5 mL/40% = 468,75
mL (prácticamente 470 mL)
Cw = 750 mL - 468,75 mL = 281,25 mL (prácticamente 280 mL)
11. CÁLCULOS DE ALÍCUOTAS Cuando la cantidad de fármaco deseada requiere un grado de precisión en las mediciones que está por encima de la capacidad de los dispositivos de medición disponibles, el farmacéutico puede usar el método de alícuota. Este método se aplica cuando se van a preparar magistralmente fármacos potentes o cuando la cantidad total de fármaco activo en una dosis única o dosis individualizadas es menor que la cantidad mínima que se puede pesar con exactitud (MAWQ, por sus siglas en inglés). Incluso si la cantidad de fármaco requerida es mayor que la cantidad mínima que se puede pesar con exactitud por cada unidad, una alícuota proveerá más material por unidad, lo cual ayudará durante la manipulación y la administración. El término alícuota significa "estar contenido un número exacto de veces en algo más"; la alícuota debe ser una parte proporcional del total. Por lo tanto, 5 es una parte alícuota de 15, puesto que 5 está contenido exactamente 3 veces en 15. Debe ser posible medir de manera fácil y exacta el volumen de solución o el peso del polvo triturado totales, así como el volumen/peso de la alícuota. Si comete un error pequeño al medir la alícuota cuando la solución o polvo triturado tiene una concentración alta, podría cometerse un error grande con respecto a la cantidad de fármaco usada en la formulación final.
1622 (1160) Cálculos Farmacéuticos / Información General
USP 39
Las alícuotas pueden ser: sólido-sólido, cuando el fármaco activo y los diluyentes son sólidos; sólido-líquidos, cuando el fármaco activo es sólido y se debe incorporar en una preparación líquida, tal como una solución, una emulsión, o una suspensión; y líquido-líquido, cuando el fármaco activo es líquido y los diluyentes son líquidos. Puede ser un líquido puro o una solución concentrada de un fármaco. Las alícuotas de líquidos puros son relativamente poco comunes debido a que pocos fármacos son líquidos en estado puro. Las alícuotas que suponen soluciones concentradas son más comunes. Existen dos métodos generales para preparar alícuotas: 1. El método de alícuota 1 se aplica a fármacos o sustancias que deben estar dentro del grado de exactitud provisto por el dispositivo de medición. Se trata del método más simple y se puede aplicar a alícuotas de sólidos y líquidos. 2. El método de alícuota 2, también conocido como método del factor de dilución, es útil cuando existe mayor flexibilidad con respecto a la cantidad de fármaco que se puede medir. Método de Alícuota 1 : (a) Se mide la cantidad mínima de fármaco que se puede pesar con exactitud. (b) El fármaco se diluye con una cantidad arbitraria de diluyente. (c) Se calcula la cantidad de dilución que proveerá la cantidad deseada de fármaco y se mide la cantidad. Método de Alícuota 2: (a) Se determina la cantidad de fármaco que se puede medir multiplicando la cantidad de fármaco requerida por un factor determinado de manera apropiada denominado factor de dilución. El factor de dilución debe ser un número entero mayor o igual a la cantidad mínima que se puede pesar con exactitud dividido por la cantidad de fármaco requerido. (b) Se mide y agrega una cantidad arbitraria de diluyente. Diversos métodos pueden determinar la cantidad de diluyente usada, siempre que la cantidad de diluyente seleccionada provea una alícuota más grande o igual que la cantidad mínima que se puede pesar con exactitud. (c) La cantidad de alícuota requerida se determina multiplicando el peso o volumen de la dilución por la inversa del factor de dilución. Por lo regular, se seleccionan números enteros como factores de dilución. Los cálculos generales pueden representarse de la siguiente manera:
A/B =CID A = cantidad de fármaco deseada B = cantidad de fármaco medida C = cantidad de fármaco en la alícuota
D = cantidad total de alícuota
11.1 Cálculo de Alícuotas Ejemplos-Alícuotas 1. Dilución sólido en líquido (Método de Alícuota 1) Preparar 100 mL de una solución que contenga 0,2 mg/mL de clonidina usando agua como diluyente. Se requieren 20 mg de clonidina para preparar esta solución. (a) Seleccionar el peso de fármaco deseado (A) que sea igual o mayor que la cantidad mínima que se puede pesar con exactitud. En este caso, la cantidad mínima de la balanza que se puede pesar con exactitud es 120 mg. (b) Seleccionar el volumen de alícuota (D) en el que estará contenida la cantidad deseada de fármaco (C). Esto establece la concentración de la solución que se va a preparar. La solubilidad de la clonidina es 1 g/13 mL, de modo que si se seleccionan 5 mL como volumen de la alícuota, la concentración en dicha solución será 20 mg/5 ml. Por lo tanto, la solubilidad no será un problema en esta solución acuosa. (c) Usando la fórmula anterior, calcular el volumen de solución (8) que se va a preparar. 120 mg de clonidina/8 = 20 mg de clonidina/5 mL de alícuota
B= 30 mL (d) Preparar la solución que contenga 120 mg de clonidina en 30 mL de Agua Purificada. Transferir una alícuota de 5 mL a partir de esta solución a un envase final y agregar suficiente Agua Purificada para obtener un volumen final de formulación de 100 ml. 2. Dilución sólido en sólido (Método de Alícuota 2) Preparar una dosis individual que contenga 20 mg de fosfato de codeína. (a) Seleccionar un factor de dilución que provea una cantidad mayor o igual a la cantidad mínima que se puede pesar con exactitud y pesar esta cantidad. En este caso, el factor de dilución puede ser mayor o igual a 6 debido a que 6 x 20 mg = 120 mg. El factor de dilución más pequeño que se puede seleccionar es 6 si la cantidad mínima de la balanza que se puede pesar con exactitud es 120 mg. (b) Pesar una cantidad de diluyente que provea una alícuota mayor o igual a la cantidad mínima que se puede pesar con exactitud. En este ejemplo, se pesan 600 mg de diluyente. (c) Mezclar los dos polvos minuciosamente mediante trituración geométrica en un mortero. (d) Calcular el peso total de la dilución: 120 mg de fosfato de codeína+ 600 mg de diluyente= 720 mg.
USP 39
Información General/ (1160) Cálculos Farmacéuticos 1623
(e) Calcular la parte de alícuota de la dilución que contiene 20 mg de fosfato de codeína multiplicando el peso total de la dilución por la inversa del factor de dilución: 720 mg x (1 /6) = 120 mg. (f) Pesar esta cantidad calculada de la dilución (120 mg) para obtener los 20 mg deseados de fosfato de codeína por cada dosis.
12. CÁLCULOS DE VOLUMEN DE POLVO 12.1 Desplazamiento en Suspensiones 12.1.1 CÁLCULO DEL VOLUMEN DE POLVO Ejemplos-Volumen de Polvo 1. Desplazamiento del polvo en suspensión Las instrucciones para reconstituir un frasco de 150 mL de una suspensión de amoxicilina para suspensión oral de 250 mg/5 mL requiere 111 mL de Agua Purificada. El médico solicitó que el producto se reconstituya a una concentración de 500 mg/5 mL. Calcular la cantidad de Agua Purificada requerida para la concentración más alta. (a) Calcular el volumen de la suspensión ocupada por el polvo de amoxicilina: 150 mL - 111 mL = 39 mL (b) Calcular la cantidad de amoxicilina presente en todo el frasco: 150 mL x (250 mg/5 mL) = 7500 mg (c) Calcular el volumen total de la suspensión a la concentración solicitada (500 mg/5 mL): 7500 mg/(500 mg/5 mL) = 75 mL (d) Calcular el volumen de Agua Purificada requerido para reconstituir el polvo restando el volumen de polvo calculado en el paso a: 75 mL - 39 mL = 36 ml de Agua Purificada NOTA-Dichas formulaciones pueden ser demasiado viscosas para fluir libremente. 2. Volumen de polvo en fármacos para inyección Si el volumen de polvo de 250 mg de ceftriaxona para inyección es O, 1 mL, calcular la cantidad de diluyente que debe agregarse a 500 mg de ceftriaxona para inyección para obtener una suspensión con una concentración de 250 mg/ml. (a) Calcular el volumen total de inyección: 500 mg/(250 mg/mL) = 2 mL (b) Calcular el volumen ocupado por 500 mg de ceftriaxona para inyección: 500 mg/(250 mg/0, 1 mL) = 0,2 mL (c) Calcular el volumen de diluyente requerido: (2 mL de suspensión) - (0,2 mL de ceftriaxona para inyección)= 1,8 mL de diluyente
13. VELOCIDADES DE INFUSIÓN O FLUJO INTRAVENOSO Las soluciones y emulsiones intravenosas (IV) pueden administrarse mediante flujo gravitacional y bombas de infusión o de jeringas. Los equipos para flujo gravitacional IV se regulan mediante una abrazadera ajustable en el sistema de tubos, y la velocidad de flujo aproximada se determina contando el número de gotas por cada 10-15 segundos, y ajustando dicho conteo a una velocidad por minuto. Los equipos IV fabricados por lo regular se calibran para liberar de 15 a 60 gotas/mL, dependiendo del equipo particular.
13.1 Resolución Mediante Pasos Múltiples o Independientes Al igual que en las secciones previas, los siguientes ejemplos pueden resolverse mediante múltiples pasos separados o mediante un procedimiento de análisis dimensional de unidades individual. 1 3.1.1 CÁLCULO DE VELOCIDADES DE INFUSIÓN O FLUJO INTRAVENOSO Ejemplos-Velocidades de infusión IV 1. Se va administrar una infusión IV de dextrosa al 5% en agua con 20 mEq de cloruro de potasio a un niño de 6 años de edad a una velocidad de 12 mL/hora. Se encuentra disponible un equipo de administración IV que libera 60 gotas/ml. Calcular la velocidad de flujo en gotas/minuto:
1624 (1160) Cálculos Farmacéuticos / Información General
12mLx60gotasx~=
hora
mL
60 minutos
USP 39
12gotas minuto
2. Se admite un paciente que pesa 63,6 kg en el Departamento de Emergencias quien requiere una infusión de clorhidrato de dopamina para mantener una presión sanguínea adecuada. Se ordena administrar el medicamento a una velocidad inicial de 2 µg/kg/minuto. Se encuentra disponible una inyección de clorhidrato de dopamina de 400 mg/250 ml. Calcular la velocidad de flujo en mL/hora que se va a administrar usando una bomba de infusión: SJSkg x ~ x 250ml x ~ x 60minutos = 4,8ml '
kg • minuto
400 mg
1000 µg
hora
hora
14. SOLUCIONES ISOOSMÓTICAS La discusión y los cálculos siguientes tienen implicaciones terapéuticas en la preparación de formas farmacéuticas destinadas para administración oftálmica, subcutánea, intravenosa e intratecal, así como para uso neonatal.
14.1 Tonicidad Las células del cuerpo, por ejemplo los glóbulos rojos, no aumentan ni reducen su volumen cuando se colocan en una solución que es isotónica respecto a los fluidos corporales. Sin embargo, la medición de la tonicidad, una propiedad fisiológica, es un poco difícil. Una inyección de cloruro de sodio al 0,9% p/v, con un punto de congelación (FP, por sus siglas en inglés) de 0,52º, es isotónica e isoosmótica con respecto a los fluidos corporales. A diferencia de la isotonicidad, el descenso del punto de congelación es una propiedad física. Algunas soluciones que son isoosmóticas con respecto a los fluidos corporales, no son isotónicas, debido a que contienen solutos con respecto a los cuales las células son libremente permeables más que semipermeables. Los solutos libremente permeables (p.ej., ácido bórico y urea) pueden ocasionar la lisis de los eritrocitos, es decir, comportarse como si fueran hipotónicas en concentraciones que son hiperosmóticas con respecto a los fluidos corporales. No obstante, muchos productos farmacéuticos se preparan utilizando datos sobre el punto de congelación o datos sobre el cloruro de sodio relacionados para preparar soluciones que sean isoosmóticas respecto a los fluidos corporales. Un tema estrechamente relacionado es el de la osmolaridad (ver Osmolalidad y Osmolarídad (785)). Se pueden utilizar datos sobre el punto de congelación o equivalentes de cloruro de sodio de productos farmacéuticos y excipientes (ver Tabla 5 a continuación) para preparar soluciones isoosmóticas, tal como se indica en los ejemplos siguientes: 14.1 .1 CÁLCULO DE TONICIDAD Ejemplo-Tonicidad Determinar la cantidad de cloruro de sodio (NaCI) requerida para preparar 60 mL de una solución isoosmótica de inyección de sulfato de atropina al 0,5% usando los valores E y los valores de descenso del punto de congelación de la Tabla 5. Tabla 5. Equivalentes de Cloruro de Sodio (E) y Descensos del Punto de Congelación para una Solución al 1 O/o del Fármaco o Excipiente Fármaco o Excipiente
E
Descenso del punto de congelación
Sulfato de atropina
0,13
0,075
Cloruro de sodio
1,00
0,576
Uso de los valores E: (a) La cantidad total de sustancias equivalentes a una inyección de cloruro de sodio al 0,9% = (0,9 g/l 00 mL) x 60 mL = 0,54
g. (b) La cantidad de sulfato de atropina requerida= (0,5 g/l 00 mL) x 60 mL = 0,3 g. (c) 1 g de sulfato de atropina equivale a O, 13 g de cloruro de sodio. (d) 0,3 g de sulfato de atropina equivalen a 0,3 x O, 13 g = 0,039 g de cloruro de sodio. (e) Por lo tanto, la cantidad requerida de cloruro de sodio es 0,54 g - 0,039 g = 0,501 g o 0,5 g. Uso de valores de descenso del punto de congelación: (a) El descenso del punto de congelación requerido es 0,52º. (b) Una solución de sulfato de atropina al 1 o/o provoca un descenso del punto de congelación de 0,075º. (c) Una solución de sulfato de atropina al 0,5% provoca un descenso del punto de congelación de 0,5 x 0,075º = 0,0375º. (d) El descenso adicional requerido del punto de congelación es 0,52º - 0,0375º = 0,483º. (e) Una solución de cloruro de sodio al 1o/o provoca un descenso del punto de congelación de 0,576º. (f) Por lo tanto, una solución de cloruro de sodio al 1%/0,576 = 1,736% provoca un descenso del punto de congelación de 1 º. (g) Una solución de cloruro de sodio al 1,736% x 0,483 = 0,838% provoca un descenso del punto de congelación de 0,482º. (h) La cantidad requerida de cloruro de sodio es (0,838%) x 60 mL = 0,502 g o 0,5 g.
USP 39
Información General/ (1160) Cálculos Farmacéuticos 1625
15. CÁLCULOS DE pH Y SOLUCIONES AMORTIGUADORAS 15.1 Cálculos de pH Ver el Apéndice 7 para definiciones y aplicaciones logarítmicas. pH = -log [Hp+] y pKa = -log ([Hp+][A-])/[HA], donde [Hp+] es la concentración de ión hidronio en una solución acuosa, [A-] es la forma iónica del ácido pertinente y Ka es la constante de ionización de un ácido monoprótico o de un protón particular a partir de un ácido poliprótico en solución acuosa. La [H+] =el antilogaritmo de (-pH) ó 10-PH; y Ka= el antilogaritmo de (-pKa) O 10-pKa. Es posible calcular el pH de una solución acuosa que contiene un ácido débil mediante la ecuación de Henderson-Hasselbalch: pH = pKa + log [(forma básica)]/[(forma ácida)] El símbolo (<->) de la ecuación de la solución amortiguadora representa el equilibrio entre las formas básicas y ácidas conjugadas o pares de la misma molécula. Se denomina ecuación amortiguadora, debido a que los cambios pequeños en la relación de concentraciones de las formas conjugadas resultan en un cambio logarítmicamente más pequeño del pH. La forma salina puede ser un ácido o base, dependiendo de la estructura; por lo los tanto, su forma conjugada es una base o un ácido, respectivamente. Ejemplo 1: B y BH+ representan un par de base desionizada o "libre" y ácido catiónico, BH• <--> B+H+ Ejemplo 2: HA y A- representan un par de ácido desionizado o "libre" y base aniónica, HA +-+A- + H+ Ejemplo 3: HnA- y Hn_,A2-, tales como H2 P0 4- y HPO/-, representan un ácido aniónico y una base aniónica correlacionados; el pKa = 7,2 para H2 P0 4 - +-+ HPO/- + H•.
15.1.1 CÁLCULO DE pH
Ejemplo-pH Una solución contiene 0,020 mol/L de acetato de sodio y 0,01 O mol/L de ácido acético, con un valor pKa de 4,76. Calcular el pH y el [H+] de la solución según se indica a continuación: pH = 4,76 + log (0,020/0,01 O)= 5,06 [H+] = antilogaritmo de (-5,06) = 8,69 x 10-6
15.2 Soluciones Amortiguadoras 15.2.1 DEFINICIÓN Una solución amortiguadora es una solución acuosa que se resiste a un cambio de pH cuando se agregan cantidades pequeñas de un ácido o base, cuando se diluye con un disolvente o cuando cambia la temperatura. La mayoría de las soluciones amortiguadoras son mezclas de un ácido débil y una de sus sales o mezclas de una base débil y una de sus sales. El agua y las soluciones de una sal neutra, como el cloruro de sodio, tienen poca capacidad para resistirse a un cambio de pH y no son capaces de ejercer una acción amortiguadora eficaz.
15.2.2 PREPARACIÓN, USO Y ALMACENAMIENTO DE SOLUCIONES AMORTIGUADORAS Las soluciones amortiguadoras para pruebas farmacopeicas se deben preparar utilizando agua calentada a ebullición y enfriada recientemente (ver Reactivos, Indicadores y Soluciones). Deben almacenarse en envases, por ejemplo frascos de vidrio Tipo 1, y usarse dentro de los 3 meses de su preparación. Las soluciones amortiguadoras utilizadas en los sistemas fisiológicos se seleccionan cuidadosamente para que no interfieran con la actividad farmacológica del medicamento ni con el funcionamiento normal del organismo. Las soluciones amortiguadoras que se usan comúnmente en productos parenterales incluyen, por ejemplo: los pares de ácido desionizado y sal básica de ácido acético y acetato de sodio, ácido cítrico y citrato de sodio, ácido glutámico y glutamato de sodio, y fosfato monopotásico o monosódico y fosfato dipotásico o disódico; y el par de sal ácida y base desionizada de clorhidrato de tris(hidroximetil)aminometano y tris(hidroximetil)aminometano. Las soluciones amortiguadoras deben estar recientemente preparadas. La ecuación Henderson-Hasselbalch, citada en la sección 75. 7 Cálculos del pH, permite calcular el pH y las concentraciones de pares conjugados de ácidos débiles y sus sales y bases débiles, así como sus sales en soluciones amortiguadoras cuando se conoce el pKa de la forma ácida del par amortiguador. Esta ecuación, modificada de manera apropiada, se puede aplicar a las soluciones amortiguadoras compuestas por una base débil y su sal.
1626 (1160) Cálculos Farmacéuticos / Información General
USP 39
15.2.3 CAPACIDAD AMORTIGUADORA La capacidad amortiguadora de una solución es la medida de la capacidad de esa solución para resistirse a los cambios de pH después de la adición de cantidades pequeñas de un ácido o base fuertes. Una solución acuosa tiene una capacidad amortiguadora de 1 cuando 1 L de solución amortiguadora requiere 1 equivalente g de un ácido fuerte o una base fuerte para cambiar el pH en 1 unidad. Por lo tanto, cuanto menor sea el cambio de pH después de la adición de una cantidad especificada de ácido o base, mayor será la capacidad amortiguadora de la solución amortiguadora. Por lo general, en los análisis se emplean volúmenes de solución amortiguadora mucho menores para determinar la capacidad amortiguadora. Una fórmula aproximada para calcular la capacidad amortiguadora consiste en equivalentes g de un ácido o base fuertes agregados por cada L de solución amortiguadora por unidad de cambio de pH, es decir, (equivalentes g /L)/(cambio de pH). 15.2.4 CÁLCULO DE LA CAPACIDAD AMORTIGUADORA Ejemplo-Capacidad Amortiguadora La adición de 0,01 equivalentes g de hidróxido de sodio a 0,25 L de una solución amortiguadora produjo un cambio de pH de 0,50. La capacidad amortiguadora de la solución amortiguadora se calcula según se indica a continuación: (0,01 Eq/0,25 L)/cambio de pH de 0,50 = 0,08(Eq/L)/(cambio de pH)
16. TEMPERATURA La relación entre las escalas de temperatura Celsius o Centígrado (ºC) y Fahrenheit (ºF) se expresa mediante las ecuaciones siguientes: ºC
= (ºF -
ºF = (°C
32) X
X
(5/9)
1,8) + 32
16.1 Temperaturas usadas en la USP De acuerdo con las Advertencias y Requisitos Generales 8. 780 Temperaturas, las temperaturas se expresan en grados centígrados (Celsius), y todas las demás mediciones se realizan a 25º a menos que se indique de otro modo. ºF se muestra en los ejemplos como guía instructiva. 16.1.1 CÁLCULO DE TEMPERATURAS Ejemplos-Temperaturas 1. Convertir 77ºF a grados Celsius. ºC
= (77ºF -
32)
X
(5/9)
= 25ºC
2. Convertir 30ºC a grados Fahrenheit. ºF = (30ºC
X
1,8) + 32 = 86ºF
La relación entre las escalas Kelvin o absoluta (K) y Celsius (ºC) se expresa mediante la ecuación: K = ºC + 273, 1
17. ENDOTOXINAS Una endotoxina es un lipopolisacárido que proviene de una fuente particular, en la que por lo general se indican la especie y el número de cepa.
17.1 Concentraciones de Endotoxinas Para mayor información con respecto a endotoxinas, ver Prueba de Endotoxinas Bacterianas (85). 17 .1 .1 CÁLCULO DE ENDOTOXINAS Ejemplo-Endotoxinas
USP 39
Información General/ (1160) Cálculos Farmacéuticos 1627
Un paciente que pesa 71,8 kg va a recibir una infusión intratecal de sulfato de morfina a una velocidad de 0,3 mg/hora. La solución se preparará diluyendo la inyección de sulfato de morfina exenta de conservantes, la cual contiene 1O mg/mL de sulfato de morfina, con inyección de cloruro de sodio al 0,9% para ser administrada a una velocidad de infusión de 2 ml/h. 1. Determinar el volumen, en mL, de inyección de sulfato de morfina (1 O mg/mL) y de inyección de cloruro de sodio al 0,9% requerido para preparar una infusión para 24 horas. 0,3 mg de sulfato de morfina/hora x 24 horas= 7,2 mg de sulfato de morfina 7,2 mg de sulfato de morfina/(1 O mg/mL) = 0,72 mL de inyección de sulfato de morfina 2 mL de infusión/h x 24 h = 48 mL del volumen total 48 mL del volumen total - 0,72 mL de inyección de sulfato de morfina = 47,28 mL de inyección de cloruro de sodio al 0,9% 2. Calcular la carga potencial máxima de endotoxinas/hora para esta preparación. [NOTA-Las monografías USP especifican los límites superiores de 14,29 Unidades USP de Endotoxina (UE)/mg de sulfato de morfina en inyectables para uso intratecal, y 0,5 UE/mL para inyecciones que contienen cloruro de sodio al 0,5%-0,9%.] 7,2 mg de inyección de sulfato de morfina x 14,29 UE/mg de sulfato de morfina = 102,89 UE a partir de sulfato de morfina 47,28 mL de inyección de cloruro de sodio x 0,5 UE/mL = 23,64 UE a partir de inyección de cloruro de sodio al 0,9% Carga de endotoxinas = 102,89 UE + 23,64 UE = 126,53 UE 126,53 UE /24 horas= 5,27 UE/hora 3. Determinar si la carga de endotoxinas en el paso 2 excede del límite USP permisible para este paciente. [NOTA-La carga de endotoxinas máxima por administración intratecal es 0,2 UE/kg/hora (ver el capítulo (85)).] Carga máxima de endotoxinas = (0,2 UE/kg/hora) x paciente de 71,8 kg = 14,36 UE/hora La carga de endotoxina de 5,27 UE/hora no excede el límite permisible de 14,36 UE/hora.
18. CÁLCULOS DE ESTABILIDAD Y FECHA DE CADUCIDAD
18.1 Cálculos de Estabilidad Basados en la Velocidad de Reacción El cálculo de un porcentaje mínimo predeterminado de concentración inicial de fármaco u otro parámetro de calidad, p.ej., disolución in vitro de ingredientes farmacéuticos activos (API, por sus siglas en inglés) o fármacos activos en formas farmacéuticas sólidas orales, se basa en las valoraciones específicas para el componente y en otros análisis científicos validados. La fecha de caducidad o el tiempo transcurrido hasta que se alcanzan dichos límites mínimos aceptables para un medicamento fabricado específico es exclusivo para la formulación, envasado y condiciones ambientales, p.ej., temperatura, humedad e iluminación, específicos a los que se somete el artículo. Ver también los capítulos (659), (795), (797), (1163) y (1191 ). Las velocidades o cinéticas de degradación o pérdida de concentración de la mayoría de los ingredientes farmacéuticos activos pueden representarse o exponerse de manera exacta mediante ecuaciones de velocidad de reacción de orden cero (constante) o de primer orden (monoexponencial). Los cálculos de orden cero por lo general son aplicables a sólidos, semisólidos, suspensiones en los que la mayoría del contenido del fármaco se presenta como partículas sólidas, y a la autoxidación en soluciones. Los cálculos de primer orden por lo general son aplicables para la hidrólisis de fármacos en soluciones.
18.2 Cálculos de Velocidad de Reacción de Orden Cero La ecuación de velocidad isotérmica constante o de orden cero para una formulación particular es C = Ca - kt, donde Ces la concentración del ingrediente farmacéutico activo en cualquier momento, Ca es la concentración en el origen o tiempo cero, k es la constante de velocidad de reacción y tes cualquier tiempo después del origen o cero. Los valores y unidades de la velocidad, dC/ dt y de la constante de velocidad, k, son los mismos para los procesos de orden cero, es decir, las unidades son concentración/tiempo, tales como mg/ml/día. 18.2.1 ECUACIÓN DE LA VELOCIDAD DE ORDEN CERO DERIVADA DE LOS DATOS ORIGINALES Los siguientes ejemplos ilustran cálculos de la ecuación de velocidad de reacción de orden cero a partir de los datos originales de la valoración de concentración y del tiempo, así como una fecha de caducidad que utilice dicha ecuación. 18.2 Cálculo de la velocidad de orden cero Ejemplos-Velocidad de orden cero 1. Calcular la ecuación de la velocidad de orden cero basándose en los resultados de la valoración para una suspensión de medicamento a 25º (ver la Tabla 6):
USP 39
1628 (1160) Cálculos Farmacéuticos / Información General
Tabla6 C(mg/mL)
t (días)
49
3
47,5
8
44,8
17
42,3
26
La regresión lineal de C (ordenada) en función de los valores t (abscisa) produce la ecuación, C = 49,84 - 0,292t con un coeficiente de correlación de 0,9996. 2. Calcular el tiempo cuando C = 0,9 x C0, es decir, la fecha de caducidad donde la concentración será 90% de la concentración original (t90): e= 49,84 - o,292t 0,9
X
49,84 = 49,84 - 0,292(t90)
t90 = (44,86 - 49,84)/-0,292 = 17,05 días 3. Mediante la ecuación de regresión lineal anterior, calcular C de la suspensión de fármaco a 25º donde t = 12 días: C= 49,84 -(0,292 x 12) = 46,34 mg/mL 4. Calcular t cuando C = 45 mg/mL: 45 = 49,84 - 0,292t
t = (45 - 49,84)/-0,292 = 16,6 días 18.2.2 VALORES DE ORDEN CERO CALCULADOS A PARTIR DE UNA ECUACIÓN DE VELOCIDAD A continuación se presentan ejemplos de fechas de caducidad calculadas a partir de una ecuación de velocidad derivada de los datos originales de la valoración de concentración y del tiempo. 18.2.2.1 Cálculo de valores de orden cero a partir de una ecuación de velocidad Ejemplos-Orden cero a partir de una ecuación de velocidad 1. Calcular la fecha de caducidad t80 de un fármaco en crema a 25º usando la ecuación, C = 0,05 - 0,0003t, donde la unidad Ces % p/p y la unidad tes meses. A t80, C = 0,8C0. 0,8 x 0,05 = 0,05 - 0,0003(t80)
t80 = 33,3 meses 2. Calcular la fecha de caducidad
t80 de la formulación del medicamento en crema del ejemplo 1, pero para la cual C0 es O, 1: 0,8 x O, 1 = O, 1 - 0,0003(t80)
t80 = 66,7 meses
18.3 Cálculos de Velocidad de Reacción de Primer Orden La ecuación de velocidad isotérmica de primer orden para una formulación particular en forma exponencial es C = C0e--kt, y en forma lineal es ln(C) = ln(C0)-kt, donde Ces la concentración de un ingrediente farmacéutico activo en cualquier momento, C0 es la concentración en el origen o tiempo cero, k es la constante de velocidad de reacción y tes cualquier tiempo después del origen o cero. En los procesos de primer orden, la velocidad cambia constantemente. La velocidad de reacción, dC/dt y la constante de velocidad, k no son lo mismo que en los procesos de orden cero. Las unidades de velocidad son concentración/ tiempo, p.ej., mg/mL/hora, pero la unidad de la constante de velocidad es el tiempo recíproco, tiempo- 1, p.ej., hora-1 • 18.3.1 ECUACIÓN DE VELOCIDAD LINEAL DE PRIMER ORDEN DERIVADA DE LOS DATOS ORIGINALES Los siguientes ejemplos ilustran el cálculo de la ecuación de velocidad lineal de primer orden a partir de los datos originales de la valoración de concentración y del tiempo, así como el cálculo de una fecha de caducidad que utilice dicha ecuación. 18.3.1.1 Cálculo de ecuaciones de velocidad lineal de primer orden Ejemplo-Velocidad lineal de primer orden 1. Calcular la ecuación de velocidad lineal de primer orden basándose en los resultados de la valoración para un fármaco en solución a 27º (ver la Tabla 7):
USP 39
Información General/ (1160) Cálculos Farmacéuticos 1629
Tabla 7
t (hora)
C(mg/ml) 12,3
2
11,9
6
11,5
14
10,6
24
La regresión lineal de los valores de ln(C) (ordenada) en función de t (abscisa) produce la ecuación, ln(C) = 2,522 - 0,0065t con un coeficiente de correlación de O, 992. 2. A partir de la ecuación de regresión lineal, calcular el tiempo en el que se alcanza el 95% de la concentración original, t95, cuando C = 0,95Ca, que es la fecha de caducidad predeterminada: In( Ca)= 2,522; por consiguiente, Ca= ln(0,95
X
e2,s 22
= 12,45 mg/mL
12,45) = 2,522 - 0,0065(t95)
t95 = (2,470 - 2,522)/-0,0065 = 8 horas 18.3.2 VALORES DE PRIMER ORDEN CALCULADOS A PARTIR DE UNA ECUACIÓN LINEAL A continuación se presentan ejemplos de una fecha de caducidad, concentración y tiempo calculados para el mismo fármaco en solución a 22º a partir de la ecuación de velocidad, ln(C) = 4,382 - 0,076t, donde las unidades C son µg/mL y la unidad tes días, derivadas de los datos originales de la valoración de concentración y del tiempo. 18.3.2.1 Cálculo de los valores de primer orden a partir de una ecuación de velocidad lineal Ejemplos-Primer orden a partir de una velocidad lineal 1. Calcular la fecha de caducidad t9 a: ln(Ca) = 4,382; por consiguiente, Ca= e4· 38 2 = 80 ln(0,9 x 80) = 4,382 - 0,076(t 9 a) t 9a = (4,277 - 4,382)/-0,076 = 1,4 días
2. Calcular el tiempo en el que C = 75 µg/mL: ln(75) = 4,382 - 0,076t
t = (4,317 - 4,382)/-0,076 = 0,86 día 3. Calcular si C = 70 µg/mL ocurre antes o después de t9 a: ln(70) = 4,382 - 0,076t
t = (4,248 - 4,382)/-0,076 = 1,8 días C = 70 µg/mL ocurre a los 1,8 días, después de un t9 a de 1,4 días 18.3.3 FECHA DE CADUCIDAD EN REACCIONES DE PRIMER ORDEN CALCULADA A PARTIR DE DOS VALORES DE CONCENTRACIÓN Y DE TIEMPO Cuando se sabe a partir de la experiencia o de información de referencia que la degradación u otra causa de la pérdida de concentración obedece a la cinética de primer orden, la constante de velocidad puede estimarse exactamente a partir devaloraciones exactas de únicamente dos concentraciones en sus tiempos respectivos. En este caso, la ecuación de velocidad lineal de primer orden, ln(C) =In( Ca) - kt, puede transformarse o integrarse como ln(C2 ) = ln(C 7) - k(t2 - t1), la cual al reordenarse queda como k = ln(C7/C2)/(t2 - t1). Los siguientes ejemplos se aplican a estas ecuaciones para calcular las fechas de caducidad, concentraciones y tiempos. 18.3.3.1 Cálculo de la fecha de caducidad de primer orden a partir de dos valores Ejemplos-Fecha de caducidad de primer orden a partir de dos valores 1. A 25º, la concentración de un antibiótico en solución era 89 mg/mL después de 3 horas y 74 mg/mL después de 8 horas. Calcular la concentración inicial en el tiempo cero:
k = ln(89/74)/(8 - 3) = 0,037 hora- 1 ln(89) = ln(Ca) - (0,037 hora- 1 x 3 horas) In( Ca)= 4,489+0,111 = 4,6
USP 39
1630 (1160) Cálculos Farmacéuticos / Información General
Ca=
e4, 6
= 99,5 mg/mL
2. Calcular la fecha de caducidad t9 a usando los datos del ejemplo 1. A t9 a, C = 0,9Ca. ln(0,9 x 99,5) = ln(99,5) - 0,037(t9a)
t 9 a = (4,495 - 4,600)/-0,037 hora-1 = 2,8 horas 3. Calcular la concentración a la 6ta hora usando los datos del ejemplo 1: ln(C) = ln(99,5) - (0,037 x 6) ln(C) = 4,378
c = e4,378 = 79,7 mg/mL 18.3.4 TIEMPOS EN REACCIONES DE PRIMER ORDEN, t", PARA FRACCIONES DE ORIGINAL REMANENTE
O,n O n% DE LA CONCENTRACIÓN
Los dos valores de primer orden tn más comunes son t5 a, que es un factor parametral primario en la farmacocinética clínica y t9 a, que es el factor de estabilidad más común para calcular la vida útil o fecha de caducidad. Los valores de cualquier t"' donde O< n < 100, se derivan de la ecuación lineal de primer orden, ln(C) =In( Ca) - kt. En los ejemplos siguientes se derivan las ecuaciones para t5 a y t9a en particular. El valor de k por definición es constante para un fármaco específico en una formulación específica a una temperatura específica; por consiguiente, los valores tn derivados de dichos valores de k también son constantes. 18.3.4.1 Cálculo de los tiempos de primer orden para las concentraciones originales remanentes Ejemplos-Tiempos de primer orden para las concentraciones originales remanentes 1. A tm c = O,n X Ca. ln(O,n x Ca)= ln(Ca) - ktn
tn = [ln(O,n x Ca) - ln(Ca)]/-k = ln[(O,n x Ca)!Ca]l-k = ln(O,n)/-k tn
= ln(O,n)/-k
2. A t5 a, C = 0,5(Ca). ln(0,5 x Ca) = ln(Ca) - kt5 a
t5 a = [ln(0,5 x Ca) - ln(Ca)]/-k = ln[(0,5 x Ca)!Ca]l-k = ln(0,5)/-k = -0,693/-k = 0,693/k t5 a = 0,693/k 3. A t9 a, C = 0,9(Ca). ln(0,9 x Ca)= ln(Ca) - kt 9 a
t9a = [ln(0,9 x Ca) - ln(Ca)]!-k = ln[(0,9 x Ca)!Ca]l-k = ln(0,9)/-k = -0, 105/-k =O, 105/k t9a =o, 105/k
18.4 Predicción de la Estabilidad Basada en la Teoría de Arrhenius El fundamento de la teoría de Arrhenius es que las velocidades de reacción y las constantes de velocidad cambian exponencialmente en la dirección del cambio aritmético de temperatura. La aplicación farmacéutica de la teoría de Arrhenius se basa en datos de valoración exactos desde el punto de vista científico y válidos desde el punto de vista estadístico obtenidos a tres o más temperaturas que son ;::: 1Oº más cálidas que la temperatura de almacenamiento prevista del medicamento y entre sí. La ecuación de Arrhenius puede expresarse de manera exponencial, k = Ae-CEa!R1J, en forma lineal, ln(k) = ln(A) - (E0 /R7) y en forma integrada, ln(k)k 1) = EaCT2 - T1)/[R(T2 x T1)], donde k, k 1, and k2 son las constantes de velocidad isotérmica, A es un factor termodinámico, E0 es energía de activación para la reacción de degradación, Res la constante para gases (1,987 x 10-3 kcal mol- 1K - 1 ó 8,314 x 10-3 J K-1 mol- 1) y T, T1 y T2 son temperaturas absolutas o Kelvin. 18.4.1 ECUACIÓN LINEAL DE ARRHENIUS DERIVADA DE DATOS ORIGINALES A continuación, se presentan ejemplos que ilustran la derivación de una ecuación lineal de Arrhenius a partir de datos originales de la valoración y su aplicación en la predicción de una fecha de caducidad en la estabilidad de un medicamento a una temperatura de almacenamiento más fresca o más baja.
Información General/ (1160) Cálculos Farmacéuticos 1631
USP 39
18.4.1.1 Cálculo de ecuaciones de Arrhenius Ejemplos-Ecuaciones de Arrhenius 1. Calcular la ecuación lineal de Arrhenius basándose en las constantes de velocidad y las temperaturas para un antibiótico betafactámico que se descompone en una solución a una velocidad de primer orden (ver fa Tabla 8): Tabla 8 T (ºC)
T(K)
40
313
k (hora - 1)
1/T (K- 1)
3, 195
X
0,0014
lQ- 3
ln(k)
-6,571
50
323
3,096
X
1o- 3
0,005
-5,298
60
333
3,003
X
1o- 3
0,016
-4, 135
La regresión lineal de los valores de ln(k) (ordenada) en función de 1/T (abscisa) produce la ecuación, fn(k) = 33,977 (12 689/7) con un coeficiente de correlación de 0,99997. 2. Calcular la fecha de caducidad de fa vida útil t90, en días, a 25ºC (298 K) usando la ecuación del ejemplo 1: fn(k25 ) = 33,977 - (12 689/298) = 33,977 - 42,581 = -8,604
k25 =
º
e-B, 6 4
= 1,834 x 10-4 hora-1 = 4,402 x 10-3 día-1
t 90 =O,105/k =O, 105/4,402 x 10-3 día- 1 = 23,85 días
t90 a 25ºC = 23,85 días 18.4.2 PREDICCIONES DE ESTABILIDAD USANDO LA ECUACIÓN INTEGRADA DE ARRHENIUS A continuación, se presentan ejemplos que ilustran fas predicciones de estabilidad basándose en una constante de velocidad isotérmica determinada con exactitud y en la adhesión al mismo orden de velocidad de degradación, p.ej., primer orden, a temperaturas a las que se va a calcular el estudio de estabilidad a partir de la ecuación, ln(kzf k 7) = Ea(T2 - T7)/[R(T2 x T7)]. 18.4.2.1 Cálculo de predicción de estabilidad usando la ecuación integrada de Arrhenius Ejemplo-Estabilidad usando las ecuaciones integradas de Arrhenius 1. Calcular fa fecha de caducidad de la estabilidad t85 a 4ºC (277 K) para la hidrólisis de un éster con un Eª= 15 kcal/mol y k = 0,0045 hora - 1 a 23ºC (296 K): fn(k277/0,0045) = 15(277 - 296)/[1,987 fn(k 277)
-
X
10-3 (277
296)]
X
ln(0,0045) = -285/162,92
ln(k277) = -1,749 + ln(0,0045) = -7,153
k277 = e- 7, 153 = 7,825 x 10-4 hora - 1
t85 = ln(0,850)/k277 =-0,163/-7,825 x 10-4 hora- 1 = 208,3 horas t85 a 4ºC = 208,3 horas (t85 a 23ºC es 36,2 horas) 18.4.3 ESTIMACIÓN DE LA ESTABILIDAD
Q10 BASADA EN
ARRHENIUS
El coeficiente de temperatura (010) representa el factor multiplicativo por el cual cambia una constante de velocidad de reacción química en fa misma dirección que la temperatura para cada cambio de 1OºC. Para moléculas de fármacos, 0 10 va de 2 a 5, fo que corresponde a un intervalo Eª de 10-25 kcal/mof ó 42-105 k]/mol. Un 0 10 de 3 produce estimaciones razonables sobre la estabilidad del medicamento en la ecuación, (tn a T2) =
t 90 at 57° = [14 díasx (24 horas/día)]/{3¡c57 -
BJ/lOl}
= 336 horas/3 4,9 = 336 horas/21 7,7 = 1,54 horas
t90 a 5 7° = 1,54 horas
1632 (1160) Cálculos Farmacéuticos/ Información General
USP 39
APÉNDICE 1: LOGARITMOS El logaritmo de un número es el exponente o la potencia a la que hay que elevar un número base dado para obtener ese número. Por consiguiente, el logaritmo de Ycon respecto a la base, b, es igual a X, o logb(Y) =X. El logaritmo de O y de todos los números negativos es indefinido o inexistente. El logaritmo de 1 es O y de los números <1 es negativo en todos los sistemas (ver la Tabla 9). Tabla 9. Logaritmos Comunes (o briggslanos) y Naturales (o neperianos)
Sistema Logarítmico
Abreviatura o Símbolo
Número Base
Formato
Comunes
Loq
10
loq Y=X
Naturales
Ln
e ó 2,7183ª
In Y= X
Antilogarltmo o Logaritmo Inverso 1ox =Y
eX =y
ª e es un número irracional derivado de una serie infinita de factoriales de números enteros recíprocos, e= 1 + 1/1 ! + 1/2!+1 /3! + 1/4! ... + 1/n!, donde n = infinito. e se redondea a 2,7183 cuando n ;o, 8.
2. (a) (b) 3.
Las relaciones entre logaritmos comunes y naturales son las siguientes: log Y= In Y/In 1O = In Y/2,303 In Y= In 10 x log Y= 2,303 x log Y Las reglas para a_lgunos cálculos comunes con logaritmos se presentan en la Tabla 7O. 1 10. Reglas para Ca'I culos con Logaritmos Taba
Fórmula
Ejemplo
Sumas y multiplicaciones
ln(A) + ln(B) = ln(A x 8) log(A) + log(8) = log(A x 8)
ln(0,62) + ln(l ,73) = ln(0,62 x 1,73) = ln(l ,0726) = 0,070 log(5,7) + log(0,43) = log (5,7 x 0,43) = log(2,451) = 0,389
Restas y cocientes
ln(A) - ln(8) = ln(A/ 8) log(A) - log(8) = log(A/ 8)
ln(0,5) - ln(4) = ln(0,5/4) = ln(O, 125) = -2,079 log(l ,57) - log(2,48) = log(l ,57 /2,48) = log(0,6330645) = -0, 199
ln(Y') = l x ln(Y) log( Y') = l x loq( Y)
13,6-Z = 1,25 ln(l ,25) = -Z x ln(l 3,6) Z = -ln(l ,25)/ln(l 3,6) = -0,223/2,61 O= -0,085 0,57Z = 2,3 log(2,3) = Z x log(0,57) l = log(2,3)/log(0,57) = 0,362/-0,244 = -1,484
In (ax e±b) = ln(x) <-> ln(a) ± b = ln(x) log (ax 1O±b) = log(x) <-> log(a) ± b = log(x)
67XlOb=15,1 log(67) + b = log(l 5, 1) 1,826 + b = 1'1 79 b = 1, 1 79 - 1,826 = -0,647
Exponenciales simples sin especificar la base
Exponenciales en base
(1163) GARANTÍA DE CALIDAD EN LA PREPARACIÓN MAGISTRAL INTRODUCCIÓN La necesidad de un sistema de garantía de calidad está bien documentada en los capítulos de la Farmacopea de los Estados Unidos de América (USP) para preparaciones magistrales (ver Control de Calidad en Preparación Magistral-Preparaciones No Estériles (795) y Programa de Garantía de Calidad (QA) en Preparación Magistral-Preparaciones Estériles (797)). Un programa de garantía de calidad se dirige mediante procedimientos escritos que definen responsabilidades y prácticas que garantizan que las preparaciones magistrales se elaboran con atributos de calidad apropiados para satisfacer las necesidades de los pacientes y de los profesionales de la salud. La autoridad y la responsabilidad para el programa de Garantía de Calidad se debe definir e implementar claramente y debe incluir al menos los siguientes nueve componentes individuales pero integrados: (1) capacitación; (2) procedimientos operativos estándares (POE); (3) documentación; (4) verificación; (5) análisis; (6) limpieza, desinfección y seguridad; (7) envases, envasado, reenvasado, etiquetado y almacenamiento; (8) contratación de servicios externos, si se usan; y (9) personal responsable. La definición de preparación magistral, para el propósito de este capítulo, se define en el capítulo de pruebas generales (795). La seguridad, calidad, eficacia y/o beneficio de las preparaciones magistrales depende de ingredientes y cálculos correctos, de mediciones exactas y precisas, de formulaciones, instalaciones, equipo y procedimientos apropiados y de un criterio farma-
USP 39
Información General/ <1163) Garantía de Calidad 1633
céutico prudente. El preparador deberá realizar una última verificación de cada procedimiento utilizado en el proceso de preparación magistral. El preparador, con el fin de asegurar la exactitud y la integridad, deberá observar la preparación terminada para determinar que su apariencia es la esperada y deberá investigar cualquier discrepancia, adoptando las medidas correctivas apropiadas antes de dispensar la prescripción al paciente. El agua usada en todos los aspectos de la preparación magistral debe cumplir con los requisitos de Agua para Uso Farmacéutico (1231 ).
Los materiales radiofarrnacéuticos y radiornarcados tienen características únicas que requieren de garantías de calidad adicionales descritas en Fármacos de Tomografía de Emisión de Positrones para Uso en Preparaciones Magistrales, Investigación Clínica y Estudios Científicos (823) y la sección Preparados Radiofarmacéuticos como PME en el capítulo (797). Las responsabilidades del preparador magistral y del personal de preparación magistral se pueden encontrar en los capítulos (795) y (797).
CAPACITACIÓN El personal implicado en la preparación magistral estéril o no estéril requiere de capacitación adicional y específica, así corno de recapacitación periódica más allá de la capacitación requerida para las tareas rutinarias de dispensación. Un programa de garantía de calidad meticuloso para preparaciones magistrales requiere documentar la competencia en términos de capacitación y habilidades. Además, la autoridad y responsabilidad del programa de Garantía de Calidad se deben definir claramente a medida que se implementa. La capacitación para el personal que elabora preparaciones magistrales no estériles debe cumplir o exceder las normas establecidas en el capítulo (795), mientras que la capacitación para el personal que elabora preparaciones magistrales estériles debe cumplir o exceder las normas establecidas en el capítulo (797).
PROCEDIMIENTOS OPERATIVOS ESTÁNDARES Los POE para la preparación magistral son documentos que describen la manera en que deben realizarse las tareas rutinarias y esperadas en el ámbito de las preparaciones magistrales, las cuales incluyen, entre otros, los procedimientos que implican: • Fechado de Límite de Uso • Estabilidad química y física • Limpieza y desinfección • Evaluación de la calidad de los componentes • Métodos de preparación magistral • Dispensación • Documentación • Calidad y mantenimiento ambiental • Mantenimiento, calibración y operación de equipo • Desarrollo de formulaciones • Etiquetado • Manipulación y almacenamiento de materiales y de la preparación magistral terminada • Medición y pesaje • Envasado y reenvasado • Monitoreo del paciente, quejas e informe de eventos adversos • Educación y capacitación del paciente o proveedor de cuidados • Limpieza y vestimenta del personal •Compras • Garantía de Calidad y Monitoreo Continuo de la Calidad •Seguridad •Transporte •Análisis • Capacitación y recapacitación Los POE son instrucciones detalladas que describen el momento en que debe realizarse una tarea, la forma de realizarla, la persona encargada de realizarla, la razón por la cual es necesario realizarla, los límites de su realización y las acciones que se deben tornar si ocurren desviaciones o discrepancias inaceptables. Se deben revisar y actualizar los POE con regularidad, según sea necesario. Periódicamente se debe realizar la auditoría y verificación del cumplimiento con los POE establecidos. Los POE deben ser escritos específicamente para cada dispositivo y proceso usados en la preparación magistral. La manutención e implementación adecuada de los POE son vitales para la calidad de la preparación.
1634 (1163) Garantía de Calidad / Información General
USP 39
DOCUMENTACIÓN El propósito de la documentación es proporcionar un registro de todos los aspectos y procedimientos de cada operación que se describen en este capítulo, así como en los capítulos (795) y (797). Idealmente se debe ingresar la información en el registro de preparación magistral a medida que se realizan las tareas o conforme se reciben los datos del análisis. El personal de Garantía de Calidad debe revisar la exactitud de los registros de preparación magistral, completarlos (según sea adecuado) y aprobarlos antes de la dispensación. Asimismo, se deben documentar, cuando resulte apropiado, la fecha de límite de uso y los estudios de estabilidad mediante referencia a por lo menos unos de los siguientes puntos: • Estudios de estabilidad publicados en la literatura revisada, • Estudios de estabilidad o esterilidad internos o realizados en un laboratorio, • Farmacopeas nacionales, o • Una extrapolación de lo anterior basándose en el criterio profesional.
VERIFICACIÓN La verificación consiste en garantizar, mediante la firma de la autoridad correspondiente, y documentar que un proceso, procedimiento o equipo está funcionando apropiadamente y produciendo los resultados esperados. La verificación de un procedimiento de preparación magistral implica asegurar que los cálculos, pesos y medidas, el orden de mezclado y las técnicas de preparación magistral y equipos usados fueron adecuados y se realizaron con exactitud. La calidad de los ingredientes se debe verificar al momento de recibirlos (p.ej., mediante el Certificado de Análisis, la etiqueta del fabricante en productos comerciales, etc.). La verificación puede requerir pruebas externas de laboratorio cuando no se cuenta internamente con las capacidades suficientes. Los métodos de verificación de equipos son provistos, algunas veces, por los fabricantes de un equipo específico o pueden desarrollarse internamente. La responsabilidad de garantizar que se verifique el desempeño del equipo, incluido el trabajo completado por los contratistas, recae en el preparador magistral. Ver Selección, Manipulación y Almacenamiento de Componentes en el capítulo (795). Cambio en la redacción:
ANÁLISIS El programa de garantía de calidad para preparaciones magistrales debe incluir el análisis durante el proceso de preparación magistral y, cuando sea adecuado, de la preparación terminada, según se describe en los capítulos (795) and (797). El preparador magistral debe tener una comprensión básica del análisis farmacéutico para garantizar que se obtengan resultados válidos cuando se lleven a cabo las pruebas, sea que se realicen internamente o se contraten a terceros. Se deben determinar los criterios de aceptación antes del análisis. Además de que no se requiere oficialmente, resulta poco práctico analizar cada preparación magistral; sin embargo, los preparadores deben inspeccionar visualmente las preparaciones y tener conocimiento de lo siguiente: (1) la importancia del análisis para el programa de calidad general en la instalación de preparación magistral, (2) cuándo se debe realizar el análisis, (3) qué se debe analizar, (4) los métodos y equipo adecuados que se deben usar, (5) cómo se deben interpretar los resultados, (6) los límites de la prueba y (7) las acciones específicas requeridas cuando una preparación no cumple con las especificaciones. La investigación y la acción correctiva deben extenderse a otras preparaciones que pudieran haber estado relacionadas con la falla o discrepancia específica. El análisis puede implicar uno o más atributos de calidad y cada prueba deberá tener uno o más procedimientos aceptables, generalmente con criterios de aceptación bien definidos. El objetivo del análisis es determinar con exactitud si el proceso de preparación magistral y la calidad de la preparación son adecuados. Cualquier procedimiento de análisis usado debe ser exacto, reproducible y especifico. Ningún procedimiento individual de análisis es adecuado para todos los medicamentos o preparaciones debido a un número de factores que determinan la validez y confiabilidad de los resultados. Los preparadores magistrales cuentan con dos opciones de análisis para preparaciones magistrales o sus ingredientes. Algunos métodos de análisis se pueden efectuar con facilidad en el mismo lugar donde se realiza la preparación magistral, pero otros pueden requerir la contratación de un laboratorio externo. Algunos métodos de análisis pueden ser llevados a cabo internamente por un individuo que cuente con un buen entendimiento del análisis farmacéutico y la capacitación adecuada. Ver la Tabla 7 para una lista de métodos de prueba farmacopeicos y capítulos USP de referencia. Tabla 1. Capítulos de la Farmacopea de los EE.UU. seleccionados como Métodos y Procedimientos de Prueba de Calidad Título del Capítulo
Capítulo
Pruebas Generales Punto de ebullición
Intervalo de Destilación
(721 >
Densidad
Densidad de Sólidos
(699)
Potenciometría de Iones Selectiva
-
Pérdida por Secado
Pérdida por Secado Cálculos en la Práctica Farmacéutica
-
(731) (1160)
Información General J (1163) Garantía de Calidad 1 635
USP 39
., ) ' 1os d e 1a Farmacopea d e 1os EE.UU. se ecc onad os como M'etod os y Procedi m 1entos d e p rue b a d e Ca lld a d (Contmuac1on Ta bl a 1. Cap1tu
Título del Capítulo
Capítulo
(741}
Punto de Fusión
Intervalo o Temperatura de Fusión
Osmolalidad y Osmolaridad
Cálculos en la Práctica Farmacéutica
(1160}
Osmolalidad y Osmolaridad
(785}
Tamaño de Partículas
Finura de Polvos
(811)
Partículas en Inyectables
Partículas en Inyectables
(788)
pH
pH
(791)
Índice de Refracción
Índice de Refracción
(831)
Cambio de Viscosidad
Viscosidad-Métodos Capilares
Pruebas Volumétricas
Balanzas y Aparatos Volumétricos para Prescripciones
(1176)
Peso
Balanzas y Aparatos Volumétricos para Prescripciones
(1176)
Espectroscopía
(911)
-._ lllli ~
"" ""
Cromatografía Cromatografía en columna (CC)
Cromatografía
Cromatografía de qases (GC)
Cromatoqrafía
Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)
Cromatografía
(621) (621) (621)
Cromatografía en papel (PC)
Cromatografía
(621)
Cromatografía en capa delgada (TLC)
Cromatografía
(621)
Microbiología Pruebas de Endotoxinas
Prueba de Endotoxinas Bacterianas
(85)
Pruebas de Límite Microbiano
Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano
(61)
Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Microorganismos Específicos
(62)
Pruebas de eficacia de conservantes
Pruebas de Eficacia Antimicrobiana
(51)
Esterilidad
Pruebas de Esterilidad
(71)
Cuando se lleva a cabo el análisis en el lugar donde se realiza la preparación magistral, se debe contar con el equipo apropiado, el cual deberá ser verificado ya sea por el fabricante al momento de la venta o por el preparador al adquirirlo y se debe mantener, calibrar y usar correctamente. Si se contrata a terceros para que realicen los análisis, el preparador debe determinar qué servicios deben contratarse y cómo seleccionar un laboratorio, y debe establecer una relación continua con los laboratorios escogidos. Los laboratorios contratados deben seguir las normas establecidas en los capítulos generales de USP, según corresponda, y de preferencia deben estar registrados con la U.S. Food and Drug Administration (Administración de Alimentos y Medicamentos o FDA).
Selección de un Método de Prueba Una consideración general en la selección del método de prueba es el tipo de información que se necesita, tal como información cuantitativa (contenido, concentración), semicuantitativa (cuando está involucrado un nivel de tolerancia, como en el caso de los niveles de endotoxinas) o cualitativa (si se analiza presencia o ausencia, incluida la identificación de la sustancia y la esterilidad). Otra consideración abarca las características físicas y químicas del analito, incluida la solubilidad, el coeficiente de partición, la constante de disociación (pKa), la volatilidad, la capacidad de unión y la cantidad presente. El método de prueba seleccionado depende además de factores tales como los requisitos de manipulación/preparación/purificación de la muestra; tipo de datos requeridos; y exactitud, reproductibilidad y especificidad requerida. En el proceso de validación se deben tener en cuenta el grado de medición cuantitativa y la especificidad. Las características analíticas típicas usadas en la verificación del método incluyen exactitud, precisión, especificidad, límite de detección, límite de cuantificación, linealidad, intervalo y tolerancia. Por lo general, cuanto mayor sea el nivel de exactitud, precisión o especificidad requerido, más sofisticados y costosos serán los métodos de prueba necesarios. Los métodos usados dependen también de los tipos de instrumentos y los estándares disponibles para la comparación.
1636 (1163) Garantía de Calidad / Información General
USP 39
Las decisiones sobre el análisis farmacéutico incluyen la selección de procedimientos, la obtención de una muestra representativa (el número de unidades de preparación seleccionada para representar adecuadamente toda la formulación, p.ej., 1 O cápsulas seleccionadas de manera aleatoria de una preparación de 100 cápsulas), el almacenamiento/transporte de la muestra, la preparación de la muestra para análisis, el análisis en sí, la adquisición, tratamiento e interpretación de datos. El preparador tiene la responsabilidad de implementar un programa usando métodos de prueba seleccionados para las preparaciones magistrales fabricadas en las instalaciones. Los capítulos de USP sobre espectroscopía y métodos cromatográficos están referidos en la Tabla 7. Más adelante en este capítulo se analizan ejemplos de métodos de prueba generales y microbiológicos. La Tabla 2 presenta ejemplos de métodos de prueba seleccionados para sustancias a granel y varias formas farmacéuticas (ver el capítulo Formas Farmacéuticas (1151 )).
Requisitos del Muestreo Antes de recolectar las muestra para el análisis, los preparadores magistrales deben considerar los siguientes factores: • Cantidad de preparación magistral que se elabora, para una prescripción específica en comparación con las prescripciones que se reciben rutinariamente con antelación • Números de muestras requeridas • Análisis destructivo o no destructivo • Métodos apropiados para obtener muestras representativas • Estado físico de las muestras (sólido, líquido o gaseoso) •Tipo de envase requerido para recolección y almacenamiento • Cualquier requisito o restricción de manipulación y transporte especiales (p.ej., fármacos controlados, sustancias químicas peligrosas o de riesgo, sustancias inflamables o cáusticas y preparaciones refrigeradas o congeladas)
Requisitos de Almacenamiento Se deben especificar los requisitos de almacenamiento para las muestras, incluyendo el tipo de envase, temperatura, humedad y protección de la luz (ver las Advertencias y Requisitos Generales y la sección Envases, Envasado, Reenvasado, Etiquetado y Almacenamiento de este capítulo). Se debe conocer con antelación el (los) efecto(s) que tienen las sustancias sobre la preparación magistral que pudieran interferir o alterar los resultados. Al enviar una preparación al laboratorio contratista, el preparador debe proporcionar la formulación completa por escrito, de manera que el laboratorio pueda determinar rápidamente si hay alguna sustancia interferente presente.
Requisitos de Interpretación de los Datos La recolección de los datos crudos del proceso de análisis debe completarse con exactitud. Es preciso garantizar que se usan los métodos estadísticos descriptivos válidos y adecuados (p.ej., media, desviación estándar), para analizar los datos y que los parámetros de funcionamiento de los instrumentos analíticos están bien establecidos. Si se cuenta con valores de referencia, estos se deben proporcionar junto con los resultados analíticos. A efectos de la documentación, es importante suministrar una descripción de los controles analíticos usados por el laboratorio, así como la fuente de los estándares de referencia usados para establecer las curvas estándar.
Consideraciones y Requisitos del Personal Si el análisis se realiza internamente, el personal involucrado en esta actividad debe estar adecuadamente capacitado y evaluado con la correspondiente documentación de capacitación y evaluación. Si se contrata a terceros para el análisis, el preparador debe asegurarse de las credenciales, capacitación adecuada y actividades relacionadas con la actualización constante del personal en el laboratorio contratista. Ta bl a 2 . Meto ' d os Farmacope1cos d e Prueba Selecc ona d os para Sustancias a Granel y Varias Formas Farmaceuticas Método de Análisisª Sustancias a Granel y Formas Farmacéuticas Sustancias a granel
p
V ol
p H
Os m
-
-
+
-
HPL
e
Ref
Gr esp.
PF
UV/Vls
e
G
IR
Estérll
Endotoxlna
Part
+
-
+
+
+
+
+
-
+b
-
l.
ª P, peso; Vol, volumen; Osm, osmolalidad/osmolaridad; 1Ref, índice de refracción; Gr esp, peso específico; PF, punto de fusión; UVNis, espectroscopía en el ultravioleta/visible; HPLC, cromatografía líquida de alta resolución; CG, cromatografía de gases; IR, espectroscopía en el infrarrojo; Part, partículas; +, prueba aplicable; -, prueba no aplicable. b Puede ser necesario el análisis de endotoxinas para sustancias a granel usadas en la preparación magistral de algunas preparaciones estériles. e *, límites microbianos (ver Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Criterios de Aceptación para Preparaciones Farmacéuticas y Sustancias de Uso Farmacéutico (1111) y Preparación Magistral-Preparaciones Estériles (797)). d Únicamente para soluciones; no suspensiones ni ungüentos.
Información General/ (1163) Garantía de Calidad 1637
USP 39
, 1cas (Cont1nuac1on ., ) , dos Farmacope cos d e Prue ba se 1ecc onad os para sustanc as a Grane 1 y V ar1as Fonnas Farmaceut Ta bl a 2. Meto
Método de Análisis• HPL e EstéEndotoxlSustancias a Granel y Formas V p Os l. Gr p ol ril na Part H m Ref esp. PF UV/Vls e G IR Farmacéuticas Cápsulas + + + Emulsiones + + + + + + Geles + + + + + + + 1nhalaciones + + + + + + + + + + + Inyectables + + + + + + + + + + + + Insertos + + + + + Irrigaciones + + + + + + + + + + + Tabletas de disolución bucal + + + *e Nasales + + + + + + + + + +d Oftálmicos + + + + + + + + + + Óticos + + + + + + + + + Polvos + + + Semisólidos + + + + + + Soluciones, no estériles + + + + + + + + + Geles estériles para implantes + + + + + + + + + + + Implantes sólidos estériles + + + + + + + + Adhesivos + + + + + Supositorios + + + + + Suspensiones, no estériles + + + + + + Tabletas + + + • P, peso; Vol, volumen; Osm, osmolalidad/osmolaridad; 1Ref, índice de refracción; Gr esp, peso específico; PF, punto de fusión; UV/Vis, espectroscopía en el ultravioleta/visible; HPLC, cromatografía líquida de alta resolución; CG, cromatografía de gases; IR, espectroscopía en el infrarrojo; Part, partículas; +, prueba aplicable; -, prueba no aplicable. b Puede ser necesario el análisis de endotoxinas para sustancias a granel usadas en la preparación magistral de algunas preparaciones estériles. e •, límites microbianos (ver Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Criterios de Aceptación para Preparaciones Farmacéuticas y Sustancias de Uso Farmacéutico (1111) y Preparación Magistral-Preparaciones Estériles (797)). d
Únicamente para soluciones; no suspensiones ni ungüentos.
ANÁLISIS FÍSICOS DE UNIDADES DE DOSIFICACIÓN [NOTA-En esta sección, los términos "unidad" y "unidad de dosificación" son sinónimos. Para asegurar la uniformidad de las unidades de dosificación, cada unidad de un lote deberá tener un peso uniforme dentro de un intervalo estrecho. Las unidades de dosificación se definen como formas farmacéuticas que contienen una sola dosis o parte de una dosis en cada unidad. Si se preparan múltiples unidades de dosificación en una formulación de lote, el número total de unidades no debe desviarse más de ±10% del número teórico de unidades.]
EVALUACIÓN DE PESO Primero ajustar a cero o tarar la balanza. Durante el proceso de preparación magistral, puede ser necesario el pesaje intermedio para asegurar que todas las sustancias hayan sido incluidas y pesadas con exactitud. Al final del proceso de preparación magistral para la forma farmacéutica y la cantidad designadas, se debe tener cuidado de conservar la integridad de cada unidad de dosificación durante los procedimientos de evaluación siguientes. Se asume que la concentración (peso del fármaco por peso de la unidad de dosificación) es uniforme. A continuación se presentan ejemplos de la evaluación de peso.
Cápsulas Duras • Ajustar a cero o tarar la balanza con una cápsula vacía. • Pesar con exactitud cada cápsula llena individual de una muestra representativa del lote terminado (por ejemplo, un mínimo de 5% de las cápsulas totales o 1O cápsulas individuales, lo que resulte menor) y registrar el peso de cada cápsula terminada en el registro de preparación magistral. • Calcular el peso teórico del contenido de una cápsula terminada. • Comparar el peso real del contenido de cada cápsula terminada en la muestra representativa con el peso teórico del contenido de una cápsula terminada.
1638 (1163) Garantía de Calidad / Información General
USP 39
• Determinar si se presenta una desviación superior al ± 10% en el peso del contenido de cualquier cápsula terminada y el peso teórico de una cápsula terminada, y si se presentase, - Revisar el registro de preparación magistral para asegurar que no se omitió ninguna etapa. - Repetir con una muestra representativa más grande del lote terminado (10% de las cápsulas totales o 20 cápsulas individuales, lo que sea menor). No mezclar con la primera partida analizada. • Si se descubre una desviación mayor de ±10% en la segunda muestra representativa, destruir la partida.
Otros Sólidos (Incluidos Tabletas, Supositorios, Insertos y Tabletas de Disolución Bucal) • Pesar con exactitud cada unidad de dosificación individual a partir de una muestra representativa de la partida terminada (por ejemplo, un mínimo de 5% de las tabletas totales o 1 O tabletas individuales, lo que resulte menor) y registrar el peso de cada unidad de dosificación en el registro de preparación magistral. • Calcular el peso teórico de la unidad de dosificación. • Comparar el peso real de cada unidad de dosificación en la muestra representativa con el peso teórico de una unidad de dosificación. • Determinar si se presenta una desviación superior al ± 10% entre cualquier peso de una unidad de dosificación terminada y el peso teórico de una unidad de dosificación terminada, y si se presentase, - Revisar el registro de preparación magistral para asegurar que no se omitió ninguna etapa. - Repetir con una muestra representativa más grande de la partida terminada (10% de las tabletas totales o 20 tabletas individuales, lo que sea menor). No mezclar con la primera partida analizada. • Si se descubre una desviación mayor de± 10% en la segunda muestra representativa, destruir la partida.
Semisólidos (Incluidos Cremas, Geles y Ungüentos) • • • • •
Pesar con exactitud un envase vacío y registrar el peso en el registro de preparación magistral. Llenar un envase vacío con la preparación final. Calcular el peso teórico de la preparación elaborada. Pesar el envase lleno. Determinar si se presenta una desviación superior al ±10%, y si se presentase, revisar el registro de preparación magistral para asegurar que no se omitió ninguna etapa. Si no es posible explicar la desviación, destruir la partida y preparar una nueva. Verificaciones Adicionales de Garantía de Calidad Antes del Envasado de Semisó/idos - Inspeccionar visualmente la preparación para determinar la presencia de materiales extraños y la apariencia esperada. - Medir el pH, cuando corresponda.
ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO Los análisis microbiológicos para preparaciones magistrales de farmacias incluyen pruebas de esterilidad, pruebas de endotoxinas, pruebas de eficacia de conservantes y pruebas de límite microbiano (ver el capítulo (797)).
Pruebas de Esterilidad Las pruebas de esterilidad se pueden llevar a cabo usando kits comerciales o desarrollando y verificando los protocolos de las pruebas de esterilidad de USP. Las normas y procedimientos se explican en el capítulo (71 ).
Pruebas de Endotoxinas Las pruebas de endotoxinas se pueden realizar usando kits comerciales o adquiriendo los componentes por separado. Las pruebas de endotoxinas se pueden realizar internamente con la capacitación y experiencia adecuadas. Ver el capítulo (85).
Pruebas de Eficacia de Conservantes Las pruebas de eficacia de conservantes se pueden llevar a cabo al preparar una formulación que contenga un conservante y que se elabore con frecuencia. Al realizar dicha prueba, los resultados deberán respaldar la fecha límite de uso designada a las preparaciones magistrales elaboradas. Ver el capítulo (51 ).
Pruebas de Límites Microbianos Las pruebas de límites microbianos se pueden realizar para proporcionar una estimación de la cantidad de microorganismos aerobios viables (ver el capítulo (61 )) o para demostrar la ausencia de especies microbianas designadas (ver el capítulo (62)).
Información General/ (1163) Garantía de Calidad 1639
USP 39
LIMPIEZA, DESINFECCIÓN Y SEGURIDAD Esta sección aplica para el equipo y las instalaciones (ver los capítulos (795), (797) y (1072)).
ENVASES, ENVASADO, REENVASADO, ETIQUETADO Y ALMACENAMIENTO Para el almacenamiento, envasado, reenvasado y etiquetado de preparaciones magistrales y el reenvasado de productos fabricados (cuando se definen como preparaciones magistrales en USP), referirse a las Advertencias y Requisitos Generales de USP y a los siguientes capítulos generales:
• Envases-Vidrio (660)
• Tapones E/astoméricos para Inyectables (381) • Buenas Prácticas de Envasado (1177) • Buenas Prácticas de Reenvasado (11 78)
• Envasado y Reenvasado-Envases Unitarios (1136) • Formas Farmacéuticas (1151)
CONTRATACIÓN DE SERVICIOS EXTERNOS [NOTA-Esta sección trata únicamente la adquisición o venta de preparaciones magistrales de farmacia a farmacia, no la contratación externa para pruebas analíticas de preparaciones magistrales.] Para farmacias que se contratan externamente para elaborar preparaciones magistrales o reenvasar productos comerciales, se requiere de documentación de fechado de límite de uso, según se definió con anterioridad en la sección Documentación de este capítulo, la cual deberá entregarse a solicitud. Asimismo, se requiere de documentación del cumplimiento con los capítulos (795) y (797) de USP, la cual deberá entregarse a solicitud. Las instalaciones que reciban preparaciones magistrales o productos comerciales reenvasados por contratistas externos, deberán mantener archivos con la documentación para todas las fechas límites de uso designadas para tales preparaciones o productos.
PERSONAL RESPONSABLE La responsabilidad y autoridad para un programa de garantía de calidad se debe definir e implementar claramente. El personal responsable del programa de garantía de calidad debe tener la educación, capacitación y experiencia necesarias para realizar las funciones designadas. El personal de garantía de calidad debe asegurar que la documentación, la verificación y el análisis se realicen de acuerdo con las políticas y procedimientos escritos. Si se presentasen desviaciones de las políticas y procedimientos aprobados, el personal de garantía de calidad tiene la responsabilidad de investigar e implementar la acción correctiva adecuada. Es responsabilidad del personal de garantía de calidad documentar todas las investigaciones y acciones correctivas. El personal responsable en el programa de garantía de calidad es esencial para garantizar la seguridad, identidad, contenido, calidad y pureza de las preparaciones magistrales de medicamentos.
RESUMEN El programa de garantía de calidad es necesario para garantizar la calidad de las preparaciones magistrales. Un programa de garantía de calidad válido incluye POE detallados, documentación, verificación y pruebas analíticas y microbiológicas apropiados para preparaciones magistrales particulares, además de personal de garantía de calidad responsable. Los profesionales de la preparación magistral deben determinar que tipos y grados de análisis formarán parte del programa de garantía de calidad. También deben decidir si realizarán los análisis internamente o contratarán a un laboratorio externo.
1640 (11 71) Análisis por Solubilidad de Fases / Información General
USP 39
(1171) ANÁLISIS POR SOLUBILIDAD DE FASES El análisis por solubilidad de fases consiste en determinar cuantitativamente la pureza de una sustancia cuantificando la solubilidad con precisión. A una temperatura dada, una cantidad definida de una sustancia pura es soluble en una cantidad definida de disolvente. La solución resultante está saturada de esa sustancia en particular, pero queda insaturada de otras sustancias, aun cuando dichas sustancias puedan estar estrechamente relacionadas, en lo que respecta a su estructura química y a sus propiedades físicas, con la sustancia sometida a prueba. La constancia de la solubilidad, al igual que la de la temperatura de fusión y la de otras propiedades físicas, indica que un determinado material es puro o que carece de sustancias extrañas, a excepción del caso en el cual la composición porcentual de la sustancia sometida a prueba esté en relación directa con la solubilidad de los componentes respectivos. Por el contrario, la variabilidad de solubilidad indica la presencia de una impureza o de varias impurezas. El análisis por solubilidad de fases se puede aplicar a todo tipo de compuestos sólidos cristalinos que formen soluciones estables. No resulta fácil efectuar este tipo de análisis con compuestos que forman soluciones sólidas que contienen impurezas. El método estándar para determinar la solubilidad consta de seis pasos bien diferenciados: (1) mezclar, en una serie de sistemas separados, cantidades crecientes del material con cantidades fijas y medidas de un disolvente; (2) establecer el equilibrio de cada sistema a temperatura y presión constantes e idénticas; (3) separar la fase sólida de las soluciones; (4) determinar la concentración del material disuelto en las distintas soluciones; (5) graficar la concentración del material disuelto por unidad de disolvente (eje y o composición de la solución) en función del peso del material por unidad de disolvente (eje x o composición del sistema) y (6) extrapolar y calcular la solubilidad.
Disolventes Los disolventes adecuados para utilizar en el análisis por solubilidad de fases deben cumplir con los siguientes requisitos: (1) El disolvente debe tener una volatilidad suficiente para evaporarse a presión reducida, pero no demasiada, de modo que no se dificulte transferirlo ni pesarlo ni hacer lo mismo con sus soluciones. En general, son adecuados los disolventes cuyo punto de ebullición se encuentra entre 60º y 150º. (2) El disolvente no debe afectar a la sustancia sometida a prueba. No se deben utilizar disolventes que descompongan la sustancia sometida a prueba ni que reaccionen con ella. Si es posible, se deben evitar los disolventes que se solvatan o que forman sales. (3) Tanto la pureza como la composición del disolvente deben ser conocidas. Se pueden emplear mezclas de disolventes cuidadosamente preparadas. Las trazas de impurezas pueden afectar en gran medida la solubilidad. (4) Se considera óptima una solubilidad de 1 O mg a 20 mg por g, pero puede emplearse un intervalo de trabajo más amplio.
Aparato* Baño de temperatura constante-Emplear un baño a temperatura constante que pueda mantener la temperatura dentro de ±0, 1 ºy equiparlo con un eje horizontal que pueda rotar a aproximadamente 25 rpm. Equipar el eje con pinzas para sujetar las Ampollas. Como alternativa, se puede emplear un baño con un vibrador adecuado que pueda agitar las ampollas entre 100 y 120 vibraciones por segundo y que esté equipado con un eje y pinzas adecuadas para sujetar las ampollas. Ampollas-Emplear ampollas de 15 mL del tipo que se muestra en la ilustración adjunta. También pueden emplearse otros recipientes, siempre que sean a prueba de filtraciones y tengan las demás características adecuadas.
* Fabricado por Hanson Research Corp., 19727 Bahama St., P. O. Box 35, Northridge, CA 91 324.
USP 39
Información General/ (11 71) Análisis por Solubilidad de Fases 1641
78mm
70mm
f-19mm-1
1
f-2smm--j
Ampolla (izquierda) y Matraz de Solubilidad (derecha) Empleados en el Análisis de Solubilidad por Fases Matraces de Solubilidad-Emplear matraces de solubilidad del tipo que se muestra en la ilustración adjunta.
Procedimiento NOTA-Efectuar todas las pesadas con un margen de± 1O µg. Composición del Sistema-Pesar con exactitud, en g, no menos de 7 ampollas de 15 ml que se hayan limpiado minuciosamente. Pesar con exactitud, en g, cantidades cada vez mayores de la sustancia de prueba y colocarlas dentro de las ampollas. La primera ampolla debe contener un peso de sustancia de prueba algo menor del que se disolverá en 5 ml del disolvente elegido; la segunda ampolla contiene un poco más del material y cada una de las siguientes ampollas contienen cantidades cada vez mayores de la sustancia, de modo que excedan la solubilidad indicada. Transferir 5,0 ml del disolvente a cada una de las ampollas, enfriar en una mezcla de hielo seco y acetona, y sellar las ampollas utilizando un mechero de aire-gas de doble boquilla tomando la precaución de no perder ningún trozo de vidrio. Dejar que las ampollas y su contenido tomen la temperatura ambiente y pesar cada una de las ampollas cerradas con los fragmentos de vidrio correspondientes. Calcular la composición del sistema, en mg por g, correspondiente a cada ampolla, por la fórmula: 1OOO(W2 - W1)/(W 3 - W2) en donde W2 es el peso de la ampolla más la sustancia de prueba, W1 es el peso de la ampolla vacía y W3 es el peso de la ampolla más la sustancia de prueba, el disolvente y los trozos de vidrio. Equilibrio-El tiempo necesario para llegar al equilibrio depende de la sustancia, el método de mezclado (rotación o vibración) y la temperatura. Normalmente, se llega al equilibrio con mayor rapidez si se emplea el método de vibración (1 a 7 días) que si se emplea el método de rotación (7 a 14 días). A fin de determinar si se ha llegado al equilibrio, se puede tomar 1 de las ampollas, por ejemplo, la anteúltima de la serie, y calentarla a 40º para sobresaturar la solución. El equilibrio se asegura si la solubilidad obtenida en la solución sobresaturada coincide con las muestras de prueba que llegan al equilibrio a partir de una solución no saturada. Composición de las Soluciones-Después de lograr el equilibrio, colocar las ampollas en posición vertical en una gradilla dentro del baño de temperatura constante cuidando que el cuello de cada ampolla esté por encima del nivel de agua, y permitir que sedimente el contenido. Abrir las ampollas y retirar una porción mayor de 2 ml de cada una mediante una pipeta equipada con un pequeño trozo de membrana de algodón u otro filtro adecuado. Transferir una alícuota de 2,0 ml de la solución transparente de cada ampolla a un matraz para determinar la solubilidad, marcado y tarado, y pesar cada matraz junto con la solución para obtener el peso de la solución. Enfriar los matraces en un baño de hielo seco y acetona, y luego evaporar el disolvente al vacío. Aumentar gradualmente la temperatura hasta que llegue a una temperatura en la que el compuesto sea estable y secar el residuo hasta peso constante. Calcular la composición de la solución, en mg por g, por la fórmula:
1642 (11 71) Análisis por Solubilidad de Fases / Información General
USP 39
en donde F3 es el peso del matraz más el residuo, F1 es el peso del matraz de solubilidad y F2 es el peso del matraz más la solución.
Cálculo Para cada porción de la sustancia de prueba tomada, graficar la composición de la solución como ordenada y la composición del sistema como abscisa. Como se muestra en el diagrama adjunto,
E C>
oc. C>
E
e: 'O ·g oen
.,
.!!!
e
B
"O
e
'O
:~ o
c.
E o
(.)
Composición del Sistema, mg por g (X)
Diagrama Típico de Solubilidad por Fases los puntos correspondientes a aquellos recipientes, con frecuencia uno solo, que representan una solución verdadera quedan graficados sobre una línea recta (AB) que tiene una pendiente igual a 1, que pasa por el origen; los puntos correspondientes a las soluciones saturadas quedan graficados sobre otra línea recta (BC) cuya pendiente, S, representa la fracción en peso de impureza o impurezas presentes en la sustancia sometida a prueba. El hecho de que los puntos graficados no se aproximen a una línea recta es indicio de que no se ha logrado el equilibrio. La presencia de una curva indica que el material sometido a prueba posiblemente sea una solución sólida. Calcular el porcentaje de pureza de la sustancia sometida a prueba por la fórmula: 100 - lOOS. La pendiente, S, se puede calcular gráficamente o mediante cuadrados mínimos para conseguir que los valores experimentales se ajusten mejor a una línea recta. La solubilidad del componente principal se obtiene extendiendo la línea que representa la solubilidad (BC) hasta que cruce el eje y. El punto de intersección sobre el eje y es la solubilidad extrapolada, en mg por g, y es una constante para un compuesto determinado.
Técnica de Purificación Dado que la fase del disolvente de todas las combinaciones de disolvente y soluto que se emplean para construir el segmento BC de un diagrama de solubilidad de fases contiene, en esencia, todas las impurezas que están presentes originalmente en la sustancia sometida a prueba, mientras que la fase sólida en esencia no contiene impurezas, el análisis por solubilidad de fases puede emplearse para preparar muestras de referencia puras de los compuestos deseados al igual que concentrados de impurezas presentes en sustancias que, de otra manera, son consideradas puras. Se puede emplear una modificación simple de esta técnica para conseguir estos objetivos con un esfuerzo bastante menor que el que suele ser necesario para efectuar un análisis riguroso de solubilidad de fases. En la práctica, se suspende una cantidad pesada con exactitud de la muestra de prueba en un disolvente no reactivo que tenga una composición adecuada y en una cantidad tal que aproximadamente el 10% del material se disuelva en el equilibrio. Se cierra el recipiente con la suspensión (suele ser adecuado emplear un vial con tapa a rosca) y se lo agita a temperatura ambiente hasta lograr el equilibrio (por lo general, son suficientes 24 horas). Luego se extrae el licor madre y se lo deja evaporar hasta sequedad aproximadamente a temperatura ambiente. Puesto que el licor madre contiene esencialmente todas las impurezas que estaban presentes en la muestra, el residuo está concentrado en cuanto a las impurezas en una proporción aproximada a la relación que existe entre el peso de la muestra tomada y el peso de los sólidos disueltos en el volumen de disolvente empleado. Los cristales que no se disuelven después de haber extraído el licor madre por lo general tienen una pureza suficiente para utilizarlos como estándar de referencia después de enjuagarlos y secarlos adecuadamente.
USP 39
Información General/ (1174) Fluidez de Polvos 1643
(1174) FLUIDEZ DE POLVOS El amplio uso de polvos en la industria farmacéutica generó una gran variedad de métodos para caracterizar su fluidez. La literatura farmacéutica cuenta con innumerables publicaciones que intentan establecer correlaciones entre las diversas medidas de la fluidez del polvo y sus propiedades durante el proceso de fabricación. El comportamiento de un polvo es multifacético, lo cual dificulta la caracterización de su fluidez y hace inevitable la proliferación de métodos de ensayo. Este capítulo presenta los métodos para caracterizar la fluidez de un polvo que son más comunes en la literatura farmacéutica. Por otra parte, si bien no hay un método de ensayo, único y simple, capaz de caracterizar correctamente las propiedades de fluidez de los polvos farmacéuticos, este capítulo propone estandarizar los métodos de ensayo que puedan resultar útiles en el desarrollo de productos farmacéuticos. Hay cuatro métodos comúnmente utilizados para determinar la fluidez de un polvo: (1) el ángulo de reposo, (2) el índice de compresibilidad o el índice de Hausner, (3) la velocidad de flujo a través de un orificio y (4) la celda de corte. Además, existen numerosas variantes de cada uno de estos métodos básicos. En vista de la amplia variedad de métodos disponibles y de sus variantes, es necesario estandarizar la metodología de ensayo en la medida de lo posible. Con el objetivo de estandarizar la metodología, a continuación se describen los métodos usados con mayor frecuencia. Se definen factores experimentales que es necesario tener en cuenta y recomendaciones para la estandarización de estos métodos. En general, todo método para medir la fluidez de un polvo debería ser práctico, útil, reproducible, sensible y producir resultados significativos. Cabe recalcar que ningún método simple para determinar la fluidez del polvo podrá caracterizar correcta e íntegramente la amplia variedad de propiedades de fluidez que se manejan en la industria farmacéutica. Por este motivo, se recomienda que el investigador utilice una serie de métodos de ensayo estandarizados para caracterizar los distintos aspectos de la fluidez del polvo, según sea necesario.
ÁNGULO DE REPOSO La determinación del ángulo de reposo es un método que se utiliza en diversas ramas de la ciencia para determinar las propiedades de fluidez de los sólidos. Esta propiedad está relacionada con la fricción entre las partículas o con la resistencia al movimiento que ofrecen las partículas entre sí. Según se ha demostrado, los resultados de las pruebas que miden el ángulo de reposo, varían según el método utilizado. Existen dificultades experimentales debido a la separación del material y a la consolidación o aireación del polvo a medida que se forma el cono. A pesar de estas dificultades, la industria farmacéutica continúa utilizando el método y en la literatura se encuentran ejemplos que demuestran su valor para predecir posibles problemas durante la fabricación. El ángulo de reposo se define como el ángulo tridimensional constante (con respecto a la base horizontal) que adopta un montículo de material en forma de cono, el cual se origina mediante alguno de los diversos métodos que se describen someramente a continuación.
Métodos Básicos para Determinar el Ángulo de Reposo La literatura cita varios métodos de ensayo para determinar el ángulo de reposo. Entre ellos, los métodos más comunes para determinar el ángulo de reposo estático se pueden clasificar según las dos variables experimentales que se mencionan a continuación: (1) La altura del "embudo" a través del cual se hace pasar el polvo puede regularse con relación a la base, o incluso se puede variar su altura a medida que se forma el cono. (2) La base sobre la cual se forma el cono puede tener un diámetro fijo o se puede dejar que el diámetro del cono de polvo varíe a medida que éste se forma.
Variantes de los Métodos de Ángulo de Reposo Además de los métodos mencionados, la literatura cita las siguientes variantes: • Ángulo de reposo drenado: se calcula dejando que una cantidad del material en exceso colocada sobre una base de diámetro fijo "drene" desde el recipiente. La formación del cono de polvo en la base de diámetro fijo permite determinar el ángulo de reposo drenado. •Ángulo de reposo dinámico: se calcula llenando un cilindro (que tenga una tapa plana y transparente en uno de sus extremos) y rotándolo a la velocidad especificada. El ángulo de reposo dinámico es el ángulo (calculado con respecto a la horizontal) formado por el polvo que fluye. El ángulo interno de fricción cinética está definido por el plano que separa las partículas que se deslizan sobre la capa superior del polvo y aquellas partículas que rotan con el tambor (de superficie rugosa).
1644 <1174) Fluidez de Polvos/ Información General
USP 39
Escala General de Fluidez para el Ángulo de Reposo Si bien la descripción cualitativa de la fluidez del polvo con el método del ángulo de reposo presenta variaciones, en la mayor parte de la literatura farmacéutica concuerda con la clasificación de Carr*, que figura en la Tabla 7. La literatura cita ejemplos de formulaciones con un ángulo de reposo entre 40º y 50º que se han fabricado con éxito. Si el ángulo de reposo supera los 50º, el flujo es rara vez aceptable para fines de fabricación. Tabla 1. Propiedades de Flujo y sus Correspondientes Ángulos de Reposo* Propiedades del Flujo
Ángulo de Reposo (en grados)
Excelente
25-30
Bueno Adecuado-no se necesita ayuda
31-35 36--40
Aceptable-puede demorarse
41--45
Pobre-es necesario agitar o someter a vibración
46-55
Muy pobre
56-65 >66
Extremadamente pobre
Consideraciones Experimentales sobre el Ángulo de Reposo El ángulo de reposo no es una propiedad intrínseca del polvo, es decir, varía en función del método que se usó para formar el cono de polvo. La literatura publicada cita los siguientes factores que es necesario considerar: • El impacto del polvo que cae puede distorsionar el pico del cono de polvo. Esta distorsión se puede reducir al mínimo formando cuidadosamente el cono de polvo. • El tipo de base sobre la que se forma el cono de polvo altera el ángulo de reposo. Se recomienda formar el cono usando una "base común," que se obtiene formando el cono sobre una capa de polvo. Esta capa se puede formar usando una base de diámetro fijo con un reborde externo que sobresalga y retenga la capa de polvo sobre la cual se formará el cono.
Procedimiento Recomendado para el Ángulo de Reposo Formar el ángulo de reposo en una base fija con un reborde que contenga una capa de polvo en la base. La base no debe estar sometida a ninguna vibración. Regular la altura del embudo para formar cuidadosamente un cono de polvo simétrico. Tomar las precauciones necesarias para evitar vibraciones al mover el embudo. Para reducir al mínimo el impacto del polvo que cae sobre la punta del cono, a medida que se forma el cono, mantener el embudo a una altura entre 2 y 4 cm del extremo superior del cono. El método no es apropiado si el cono de polvo obtenido es asimétrico o si no es posible reproducir el cono obtenido. Medir la altura del cono y calcular el ángulo de reposo, a, con la siguiente ecuación: tg (a)= altura/0,5 base
ÍNDICE DE COMPRESIBILIDAD E ÍNDICE DE HAUSNER En los últimos años, el índice de compresibilidad y el índice de Hausner, que están estrechamente relacionados, se han convertido en métodos rápidos, simples y muy usados para predecir las características de fluidez de los polvos. El índice de compresibilidad se ha propuesto como una medida indirecta de la densidad aparente, el tamaño y la forma, la superficie, el contenido de humedad y la cohesión de los materiales, dado que todos ellos pueden afectar el índice de compresibilidad observado. Los índices de compresibilidad y de Hausner se determinan midiendo el volumen aparente y el volumen por asentamiento de un polvo.
Métodos Básicos para Determinar el Índice de Compresibilidad y el Índice de Hausner Si bien el método para determinar el índice de compresibilidad y el índice de Hausner presenta algunas variantes, el procedimiento básico consiste en medir (1) el volumen aparente sin asentar, V0, y (2) el volumen final asentado, V1, del polvo que se obtiene luego de golpear suavemente el material hasta que no se observen más cambios en el volumen. Los índices de compresibilidad y de Hausner se calculan de la siguiente manera: Índice de Compresibilidad= 100 x [(V0 - V1)/V0] Relación de Hausner = V0/V1
* Carr, R.L. Evaluating Flow Properties of Solids. Chem. Eng. 1965, 72, 163-168.
USP 39
Información General/ (1174) Fluidez de Polvos 1645
Otro procedimiento consiste en calcular los índices de compresibilidad y de Hausner usando valores medidos de densidad aparente (paparente) y densidad por asentamiento (ppor asentamiento) de la siguiente manera: Índice de Compresibilidad = 100
X [(pporasentamiento -
Relación de Hausner =
Paparente)/Pporasentamientol
(ppor asentamiento/Paparente)
Una variante de estos métodos consiste en medir la velocidad de consolidación, en lugar de o además del cambio de volumen que resulta al compactar golpeteando suavemente. La Tabla 2* presenta la escala de fluidez aceptada comúnmente para los índices de compresibilidad y de Hausner. Tabla 2. Escala de Fluidez* Índice de Compresibilidad (%) ~10
Fluidez
Índice de Hausner
Excelente
1,00-1,11
11-15
Buena
1, 12-1, 18
16-20
Adecuada
1, 19-1,25
21-25
Aceptable
1,26-1,34
26-31
Pobre
1,35-1,45
32-37
Muy pobre
1,46-1,59
>38
Extremadamente pobre
>1,60
Consideraciones Experimentales sobre los Índices de Compresibilidad y de Hausner Los índices de compresibilidad y de Hausner no son propiedades intrínsecas de los polvos, es decir, varían en función de la metodología empleada. La literatura cita los siguientes factores experimentales que afectan la determinación de (1) el volumen aparente sin asentar, V0 , (2) el volumen final asentado, V1, (3) la densidad aparente, Paparentei y (4) la densidad por asentamien-
to / Ppor asentamiento: • • • •
El diámetro del cilindro usado El número de veces que se golpea el polvo para obtener la densidad por asentamiento La masa de material empleada en el ensayo La rotación de la muestra durante el asentamiento
Procedimiento Recomendado para Determinar los Índices de Compresibilidad y de Hausner Usar una probeta volumétrica de 250 mL y una muestra de prueba de 100 g. Se pueden utilizar volúmenes y pesos menores pero debería incluirse una descripción de las variaciones del método con los resultados. Se recomienda emplear el promedio de tres determinaciones.
FLUJO A TRAVÉS DE UN ORIFICIO La velocidad de flujo de un material está determinada por distintos factores, algunos relacionados con el tipo de partícula y otros con el proceso. Se ha propuesto medir la velocidad de flujo de un material a través de un orificio como una forma más apropiada para determinar la fluidez de un polvo. El control continuo del flujo es especialmente útil ya que ciertos materiales, e incluso algunos que fluyen con facilidad, presentan patrones de flujo discontinuo. La velocidad de flujo también cambia a medida que el recipiente se vacía. Si bien se han formulado ecuaciones empíricas que calculan la velocidad de flujo según el diámetro del orificio, el tamaño de las partículas y su densidad, la determinación de la velocidad de flujo a través de un orificio sólo es útil si se trata de materiales que fluyen con facilidad. La velocidad de flujo a través de un orificio se mide, en general, como la masa que fluye a través del orificio de salida de un recipiente (probetas, embudos, tolvas) en un tiempo determinado. La velocidad de flujo se puede medir con incrementos discretos o continuos.
Métodos Básicos para Determinar el Flujo a través de un Orificio En la literatura se describen diversos métodos. El método más común para determinar la velocidad de flujo a través de un orificio se puede clasificar en función de tres variables experimentales: (1) El tipo de recipiente en el que se coloca el polvo. Los recipientes usados comúnmente son probetas, embudos y tolvas de los equipos de producción. (2) El tamaño y la forma del orificio. Tanto el diámetro como la forma del orificio son factores clave para determinar la velocidad de flujo de un polvo. (3) El método empleado para medir la velocidad de flujo del polvo. Es posible medir la velocidad de flujo de forma continua con una balanza electrónica acoplada a algún tipo de dispositivo de registro (como por ejemplo una computadora o un
1646 (1174) Fluidez de Polvos/ Información General
USP 39
registrador gráfico continuo). También se puede medir en muestras discretas (por ejemplo, calculando el tiempo necesario para que 100 g del polvo pasen a través del orificio con una aproximación de una décima de segundo, o la cantidad de polvo que pasa a través del orificio en diez segundos con una aproximación de una décima de gramo).
Variantes de los Métodos de Flujo a través de un Orificio Se puede determinar tanto la velocidad de flujo de la masa o la velocidad de flujo del volumen. La velocidad de flujo de la masa es el método más fácil, pero los resultados resultan sesgados, favoreciendo a los materiales de alta densidad. Considerando que el relleno de la matriz es volumétrico, se recomienda determinar la velocidad de flujo del volumen. En algunos casos se acopla un vibrador con el fin de facilitar el flujo de salida del recipiente; sin embargo, esta práctica complica la interpretación de los resultados. Se ha propuesto usar un dispositivo de movimiento en el orificio para simular las condiciones de una prensa rotatoria. Otro método consiste en identificar el diámetro mínimo del orificio a través del cual fluye el polvo.
Escala General de Fluidez para el Flujo a través de un Orificio La velocidad de flujo depende del método usado para medirla por lo que no se dispone de una escala general. La comparación de los resultados publicados en la literatura no es sencilla.
Factores Experimentales del Flujo a través de un Orificio El flujo a través de un orificio no es una propiedad intrínseca de los polvos, sino que varía en función de la metodología empleada. La literatura plantea varias consideraciones importantes que afectan los resultados de los distintos métodos: • El diámetro y la forma del orificio • El tipo de material del recipiente que contiene el polvo (de metal, de vidrio, de plástico) • El diámetro y la altura del lecho de polvo.
Procedimiento Recomendado para Determinar el Flujo a través de un Orificio La velocidad de flujo a través de un orificio solo es adecuada para materiales que cuentan con una cierta capacidad de flujo. No es adecuado para materiales cohesivos. Siempre que la altura del lecho de polvo (la "cabeza" del polvo) sea mucho mayor que el diámetro del orificio, la velocidad de flujo es prácticamente independiente de la altura del lecho del polvo. Emplear una probeta como recipiente para contener el polvo, ya que el material de la probeta apenas afectará el flujo. De esta forma, la velocidad de flujo se determina por el movimiento del polvo sobre el polvo, en lugar del polvo contra la pared del recipiente. A menudo se observa que la velocidad de flujo del polvo aumenta si la altura de la columna de polvo no supera el doble del diámetro de la columna. Emplear un orificio circular y asegurarse de que la probeta no vibre. Guía general para escoger las dimensiones de la probeta: • Diámetro de la abertura> 6 veces el diámetro de las partículas • Diámetro de la probeta> 2 veces el diámetro de la abertura En algunos casos, es apropiado emplear una tolva como recipiente ya que representa bien el flujo en una situación de producción. No se recomienda emplear un embudo, especialmente los que tienen un vástago, ya que el tamaño y la longitud del vástago y la fricción entre ese vástago y el polvo determinarán la velocidad de flujo. En algunos casos un cono truncado es adecuado, pero es necesario prestar especial cuidado en la selección del material del cono ya que el coeficiente de fricción entre las paredes del cono y el polvo afectan el flujo. Para la abertura de la probeta, emplear una placa de superficie plana con un dispositivo que permita variar el diámetro del orificio, de forma de obtener la máxima flexibilidad y para garantizar que haya un patrón de flujo de polvo sobre polvo. La medición de la velocidad puede realizarse de forma discreta o continua. La medición continua con una balanza electrónica permite detectar eficazmente las variaciones puntuales de la velocidad de flujo.
MÉTODOS DE CELDA DE CORTE Los métodos y dispositivos que miden el corte de los polvos permiten evaluar con más precisión y de forma más integral las distintas propiedades de fluidez de los polvos. Estos métodos y dispositivos se desarrollaron con el objetivo de proporcionar fundamentos más sólidos a los estudios sobre fluidez de los polvos y para el diseño de las tolvas. La metodología de celda de corte se ha utilizado ampliamente en el estudio de los materiales farmacéuticos. Estos métodos permiten obtener una amplia variedad de parámetros, incluyendo los puntos de fluencia (yield loci) que representan la relación entre la tensión de corte y la deformación de corte, el ángulo de fricción interna, la resistencia al flujo ilimitada, la resistencia a la tensión y otra serie de parámetros conexos como, por ejemplo, el factor de flujo y otros índices de fluidez. Debido a la capacidad para controlar con mayor precisión los parámetros experimentales, las propiedades de flujo pueden también ser determinadas en función de la carga de consolidación, el tiempo y otras condiciones ambientales. Estos métodos se han utilizado con éxito para determinar parámetros críticos de las tolvas y de los silos de almacenaje.
Información General/ (1176) Balanzas y Aparatos Volumétricos 1647
USP 39
Métodos Básicos para Celda de Corte Un tipo de celda de corte es la celda de corte cilíndrica que está dividida horizontalmente formando un plano de corte entre la base inferior estacionaria y la porción superior móvil del anillo de la celda. Una vez que el lecho de polvo se consolidó dentro de la celda (para lo que se emplea un procedimiento bien definido), se determina la fuerza necesaria para cortar el lecho de polvo moviendo el anillo superior. Las celdas de corte anulares presentan algunas ventajas respecto a las celdas cilíndricas, como por ejemplo que no es necesario emplear tanta cantidad de material. Sin embargo, su diseño impide cortar el lecho de polvo de forma tan uniforme como con las celdas cilíndricas; es decir, el material que se encuentra próximo a la zona externa se corta más que el material que se encuentra en la zona interna. La celda de placas es el tercer tipo de celda de corte y consiste en dos placas de superficie rugosa, la inferior fija y la superior móvil, entre las que se coloca una capa fina de polvo. Todos los métodos de corte presentan ventajas y desventajas, pero la revisión detallada de las mismas excede el alcance de este capítulo. Tal como sucede con los otros métodos que caracterizan la fluidez de los polvos, la literatura describe muchas variantes de este método. En líneas generales, cabe destacar que la gran ventaja de los métodos de corte es que permiten un mayor control de las variables experimentales. La metodología insume muchas horas, requiere cantidades considerables de material y es necesario un operador capacitado.
Recomendaciones para los Métodos de Celda de Corte Las distintas configuraciones de las celdas de corte y de los métodos de ensayo suministran gran cantidad de información y permiten caracterizar eficazmente la fluidez de los polvos. Por otra parte, suministran información útil para diseñar equipos, como por ejemplo tolvas y silos. Debido a la amplia variedad de equipos y de procedimientos experimentales disponibles, en este capítulo no se incluyen recomendaciones específicas en lo que concierne a la metodología. Sin embargo es recomendable que, en los resultados de la caracterización de la fluidez de los polvos por los métodos de celda de corte, se incluya una descripción detallada del equipo y de la metodología empleada.
<1176) BALANZAS Y APARATOS VOLUMÉTRICOS PARA PRESCRIPCIONES Cambio en la redacción:
Balanzas para Prescripciones NOTA-Es posible emplear balanzas distintas de las descritas en este capítulo siempre que sean de una precisión equivalente o mayor. Por ejemplo, se pueden emplear microbalanzas, semimicrobalanzas o balanzas electrónicas de un solo platillo (ver • Balanzas (4 l)e {AFOl-may-2016¡). Algunas balanzas tienen dispositivos de lectura directa o digital. Es preciso calibrar todas las balanzas y someterlas a controles frecuentes utilizando pesas de prueba adecuadas, tanto por separado como en combinación. Descripción-Las balanzas para preparar prescripciones están adaptadas para pesar sustancias medicinales u otras necesarias para la elaboración de recetas médicas u otros preparados farmacéuticos. Están preparadas para pesar hasta su capacidad total sin que eso represente un esfuerzo desmedido y la calibración no se altera con las pesadas repetidas a la capacidad total. Los platillos desmontables o los recipientes para pesar deben tener el mismo peso. Las balanzas deben tener patas o tornillos para nivelarlas. Pueden traer incorporadas pesas y también un resorte de precisión y un cuadrante de lectura en lugar de un astil. Las balanzas que tienen un astil graduado deben tener un tope que detenga el contrapeso en el punto de "cero". El borde de lectura del contrapeso es paralelo a las graduaciones del astil. La distancia que separa la cara de la placa graduada del fiel o de los fieles indicadores no debe ser más de 1,0 mm, las puntas deben ser agudas y, de haber dos, los extremos deben estar separados por no más de 1,0 mm cuando la balanza está en equilibrio. Los elementos indicadores y el sistema de palanca deben estar protegidos de las tracciones y la tapa de la balanza debe permitir que los platillos cargados se muevan con libertad cuando está cerrada. La balanza debe tener un dispositivo mecánico de detención.
DefinicionesCapacidad-Peso máximo, incluido el peso de las taras, que puede soportar cada platillo. El NBS Handbook 44, 4a ed., establece: "En ausencia de información que exprese lo contrario, se supone que la capacidad nominal de una balanza de Clase A es
de 15,5 g C/2 onza de apotecario)." La mayoría de las balanzas de Clase A que están disponibles comercialmente tienen una capacidad de 120 g y traen una leyenda que así lo indica. Astil-Barra graduada equipada con un contrapeso móvil. Las graduaciones métricas aumentan de a 0,01 g y llegan hasta un máximo de 1,0 g. Barra de Taras-Barra astil auxiliar no graduada que tiene un contrapeso móvil. Puede emplearse para compensar las variaciones que surgen cuando se utilizan recipientes de vidrio o papel para pesar.
1648 (1176) Balanzas y Aparatos Volumétricos/ Información General
USP 39
Indicadores del Equilibrio-Combinación de elementos que oscilan uno con respecto al otro para indicar el estado de equilibrio de la balanza durante la pesada. Punto de Equilibrio-Punto que está en la placa graduada en el que se detiene el indicador o el fiel cuando cesan las oscilaciones de la balanza, o la posición en la placa graduada donde se detiene el indicador o el fiel calculada a partir del registro de oscilaciones consecutivas registradas en ambas direcciones pasado el cero de la escala en la placa graduada. Si la balanza tiene un mecanismo indicador de dos fieles, sólo es necesario registrar o utilizar la posición o las oscilaciones de uno para determinar el punto de equilibrio. Requisitos de Sensibilidad (SR)-Cambio máximo de la carga que genera un cambio especificado, una subdivisión de la placa graduada, en la posición de equilibrio del elemento indicador o de los elementos indicadores de la balanza. Balanza para Prescripciones Clase A-Las balanzas que cumplen con las pruebas que certifican a este tipo de balanzas tienen una sensibilidad de 6 mg o menos sin carga o con carga de 1Og en cada platillo. Se deben emplear balanzas de Clase A para efectuar todas las pesadas necesarias para la preparación de prescripciones. A fin de no cometer errores del 5% o más que puedan deberse al límite de sensibilidad de las balanzas de Clase A, no pesar menos de 120 mg de cualquier material. Si fuera preciso pesar material en seco de menor peso, mezclar un peso conocido mayor del ingrediente con un peso conocido de algún diluyente en seco y pesar una porción alícuota de la mezcla que se empleará. Pruebas de las Balanzas para Prescripciones-Las balanzas Clase A para prescripciones cumplen con las cuatro pruebas básicas que se describen a continuación. Emplear un grupo de pesas de prueba y mantener el contrapeso del astil en cero a menos que se indique un cambio de posición. 1. Requisitos de Sensibilidad-Nivelar la balanza, determinar el punto de equilibrio y colocar una pesa de 6 mg en uno de los platillos vacíos. Repetir la operación colocando una pesa de 1 Og en el centro de cada platillo. El punto de equilibrio se desplaza no menos de una división de la placa graduada cada vez que se agrega una pesa de 6 mg. 2. Prueba de la Relación entre los Brazos-Esta prueba tiene como objeto verificar que los dos brazos de la balanza tengan la misma longitud. Determinar el punto de equilibrio de la balanza sin ninguna pesa en los platillos. Colocar en el centro de cada platillo una pesa de prueba de 30 g y determinar el punto de equilibrio. Si el segundo punto de equilibrio no coincide con el primero, colocar una pesa de 20 mg en el platillo más liviano; el punto de equilibrio debería volver al lugar original de la escala o sobrepasarlo. 3. Pruebas de Desplazamiento-El objetivo de estas pruebas consiste en controlar los componentes del brazo y de la palanca de la balanza. A. Determinar el punto de equilibrio del indicador sin ninguna pesa en los platillos. B. Colocar una de las pesas de 1 Og en el centro del platillo izquierdo y colocar la otra pesa de 1 Og sucesivamente hacia la derecha, la izquierda, el frente y la parte de atrás del platillo derecho, prestando atención al punto de equilibrio en cada cambio de posición de la pesa. Si en alguno de los cambios el punto de equilibrio difiere del determinado en el Paso A, agregar una pesa de 1 O mg en el platillo más liviano; esta maniobra debería hacer que el punto de equilibrio vuelva al determinado en el Paso A o lo sobrepase. C. Colocar una pesa de 1 Og en el centro del platillo derecho y colocar otra pesa de 1Og sucesivamente hacia la derecha, la izquierda, el frente y la parte de atrás del platillo izquierdo, prestando atención al punto de equilibrio en cada cambio de posición de la pesa. Si en alguno de los cambios el punto de equilibrio difiere del obtenido sin pesas en los platillos, es preciso compensar esa diferencia agregando la pesa de 1O mg en el platillo que esté más liviano. D. Hacer una serie de observaciones en las cuales las dos pesas se desplacen simultáneamente del centro de los platillos: ambas hacia afuera, ambas hacia adentro, una hacia afuera y la otra hacia adentro, ambas hacia atrás, etc., hasta haber probado todas las combinaciones posibles. Si en alguno de los cambios el punto de equilibrio difiere del obtenido sin pesas en los platillos, la diferencia debería quedar compensada agregando la pesa de 1 O mg en el platillo que esté más liviano. Es necesario ajustar las balanzas que no cumplan con los requisitos de estas pruebas. 4. Pruebas del Astil Graduado y del Contrapeso-Determinar el punto de equilibrio de la balanza sin pesas en los platillos. Colocar en el platillo izquierdo una pesa de prueba de 500 mg, mover el contrapeso hasta el punto que indica 500 mg en el astil y determinar el punto de equilibrio. Si no cae en el punto de equilibrio cero, agregar una pesa de 6 mg en el platillo más liviano. Esta pesa debería hacer que el punto de equilibrio vuelva a la posición original o la sobrepase. Repetir esta prueba empleando una pesa de prueba de 1 g y moviendo el contrapeso a la división 1 g del astil. Si el punto de equilibrio es distinto, es necesario hacer que vuelva al menos al punto de equilibrio en cero agregando una pesa de 6 mg en el platillo más liviano. Si la balanza no pasa esta prueba, es preciso corregir las graduaciones del astil o el contrapeso. Las pesas métricas o de apotecario que se utilizan con las balanzas para prescripcioness deben guardarse en una caja rígida especial que tenga divisiones y deben tomarse con pinzas plásticas o pinzas con puntas de plástico a fin de no rasparlas ni ensuciarlas. Se recomienda emplear pesas analíticas (Clase P o mejor) cuando se preparan recetas. Sin embargo, las pesas de Clase Q tienen una tolerancia que está dentro de los límites de precisión de este tipo de balanzas y conservan la precisión durante mucho tiempo si se las cuida apropiadamente. No se deben emplear pesas con forma de moneda (o de disco). Las pesas de prueba que deben emplearse para someter a prueba las balanzas para prescripciones son dos de 20 g o dos de 30 g, dos de 1 Og, una de 1 g, una de 500 mg, una de 20 mg, una de 1 O mg y una de 6 mg (o una combinación adecuada que sume 6 mg), ajustadas a la tolerancia de N.B.S. para pesas analíticas (Clase P o mejores). Estas pesas deben mantenerse guardadas en una caja herméticamente cerrada y deben tomarse sólo con pinzas plásticas o con pinzas con punta plástica.
USP 39
Información General/ (11 77) Buenas Prácticas de Envasado 1 649
Este conjunto de pesas sólo debe emplearse para someter a prueba la balanza o las pesas que se utilizan en las preparaciones. Si se les da el cuidado adecuado, tienen una duración indefinida.
co~blo en lareilac:doiJ:· Aparatos Volumétricos Los dispositivos farmacéuticos que se emplean para medir el volumen de líquidos, entre ellos buretas, pipetas y probetas graduadas ya sea en unidades métricas o de apotecario, cumplen con las especificaciones estándar para aparatos volumétricos de vidrio descritos en NTIS COM-73-10504 del Servicio Nacional de Información Técnica (National Technical lnformation Service).1 Los matraces Erlenmeyer graduados cumplen con los estándares descritos en el N.B.S. Handbook 44, 4a edición, del Instituto Nacional de Normas y Tecnología (NIST, por sus siglas en inglés). 2 Los goteros graduados para medicamentos cumplen con las especificaciones (ver •f?eqf!i$í~os ae Envásádo y A~macénamlento (§S9}, Compot1entes Relaci()t1Gd()S .. {Af Ql.ffi~y-ZOloj)). Son aceptables los goteros para medicamentos sin graduación que tienen un orificio de salida de 3 mm de diámetro externo y que suministran 20 gotas de agua, que pesan 1 g a una temperatura de 15º. Se considera razonable una tolerancia de ±10% respecto de la especificación de capacidad. Elección y Empleo de Recipientes GraduadosCapacidad-La capacidad de los recipientes o vasos graduados es el volumen especificado, a la máxima graduación, que puede contener o suministrar el recipiente según se indica, a una temperatura especificada. Probetas y Matraces Erlenmeyer Graduados-El error que puede generar, en un volumen medido, una desviación de ±1 mm en la lectura del menisco inferior de una probeta graduada se mantiene constante a lo largo de toda la altura de la columna uniforme. Esa misma desviación de ±1 mm va generando un error cada vez mayor en un matraz Erlenmeyer graduado debido a que el grado del error depende del ángulo de los lados convergentes respecto de la perpendicular del matraz recto graduado. Una desviación de ±1 mm en la lectura del menisco genera un error de aproximadamente 0,5 mL del volumen medido en cualquiera de las marcas de una probeta graduada uniforme de 100 ml. Esa misma desviación de± 1 mm puede generar un error de 1,8 mL en la marca de 100 mL en un matraz Erlenmeyer aceptable de 125 ml. Como regla general, conviene elegir un matraz graduado que tenga la misma capacidad que el volumen que se quiere medir o que apenas lo exceda. Los errores suelen ser mayores si se miden volúmenes pequeños en matraces grandes, ya que el diámetro mayor aumenta el error de volumen en una desviación de ±1 mm de la marca. La relación que existe entre el error de volumen y el diámetro interno de una probeta graduada se basa en la ecuación V= nr2 h. Una probeta graduada aceptable de 1O mL tiene un diámetro interno de 1, 18 cm y contiene 109 µL en 1 mm de columna. En este tipo de probeta con una desviación de ±1 mm de la marca, la lectura de 4,5 mL genera un error de aproximadamente ±2,5% y la misma desviación en un volumen de 2,2 mL en el mismo matraz, genera un error de aproximadamente ±5%. Los volúmenes mínimos que se pueden medir dentro de ciertos límites de error en probetas graduadas de diferente capacidad aparecen descritos en los detalles de diseño de los recipientes graduados que incluye el N.B.S. Handbook 44, 4a edición, del National lnstitute of Standards and Technology. No se deben emplear matraces Erlenmeyer graduados que tengan una capacidad menor de 25 mL para preparar medicamentos recetados.
(1177) BUENAS PRÁCTICAS DE ENVASADO Este capítulo proporciona una guía general acerca de los factores que deben considerarse para el envasado y embalaje de preparaciones farmacopeicas que deban almacenarse, transportarse y distribuirse. Asimismo se describen los procedimientos que garantizan la observancia de las buenas prácticas de envasado, empaque y embalaje. Estas disposiciones no afectan los requisitos exigibles por las buenas prácticas de fabricación, las leyes estatales que rigen los temas farmacéuticos, las Advertencias y Requisitos Generales o las monografías de la USP o las disposiciones de etiquetado aprobado. Las condiciones de almacenamiento y envasado se definen en Requisitos de Envasado y Almacenamiento (659). Se deben calibrar con regularidad todos los equipos empleados para el registro, control y mantenimiento de las condiciones de temperatura y humedad. Esta calibración se realizará conforme a las normas nacionales o internacionales (ver también el capítulo de información general Dispositivos de Monitoreo-Tiempo, Temperatura y Humedad (1118)).
1 NTIS COM-73-10504 está a la venta en National Technical lnformation Service, Springfield, VA 22151. 2
El N.B.S Handbook 44, 4a edición (1971) se puede solicitar a Superintendent of Documents, U. S. Government Printing Office, Washington, DC 20402.
USP 39
1650 (11 77) Buenas Prácticas de Envasado / Información General
ENVASES El subtítulo que se refiere al envasado y almacenamiento en las debe con los establecidos en Envases-Vidrio
el envase (el envase
y en Envases-Pruebas de Desempeño (671 ). En estos capítulos generales se indican, además, las condiciones que el envase es "impermeable" o "bien cerrado." En la mayoría de los casos, las preparaciones farmacopeicas se colocan en envases "impermeables", particularmente si la preparación es sensible a la humedad. Por otra parte, y cuando fuera necesario, los envases deben proteger la preparación de la luz, gases reactivos, pérdidas de disolvente, contaminación microbiana, etc. Los envases "impermeables" y "bien cerrados" están definidos claramente en las Advertencias y Requisitos Generales(ver Envases en Conservación, Envasado, Almacenamiento y Etiquetado). El protocolo de ensayo y los límites de permeabilidad a la humedad, se utilizan determinar si el envase cumple con cualquiera de estas definiciones, se encuentran en (660), y en (671 ), tanto para envases unitarios como para envases de unidades múltiples. Un sistema de envase consta de un envase y de un cierre. El sistema puede incluir varias cubiertas destinadas a proteger la preparación farmacopeica, además de dispositivos de sellado, dispositivos de administración, etiquetado y prospectos. En el capítulo sobre Advertencias Generales se incluyen definiciones de los distintos envases que contienen y protegen las preparaciones farmacopeicas (por ejemplo, envases unitarios, envases de dosis única, etc.). Las pruebas de estabilidad se llevan a cabo con la forma farmacéutica contenida en el mismo envase y con el cierre propuesto para comercializarla. Se describe un tipo de prueba de permeabilidad para envases de unidades múltiples en (671 ). Esta prueba está destinada a productos que se dispensan con receta médica en viales con un sistema de envase y cierre. Los resultados reflejan la permeabilidad al vapor de agua del envase y del cierre. Se han establecido límites de tal manera que definan si un envase para dispensar estos productos tiene las características de impermeable o de bien cerrado en lo que respecta a la permeabilidad al vapor de agua. La FDA recomienda que el fabricante efectúe esta prueba en el sistema de envase y cierre aunque no esté especificada en la USP. Antes de efectuar esta prueba en particular, es necesario quitar el sello interno del sistema de envase y cierre que proporciona el fabricante. Según se indica en (671 ), la permeabilidad al vapor de agua de los envases unitarios de cápsulas y tabletas se mide en función de los criterios que definen las cuatro clases de envases (clases A-D). La USP reconoce varios tipos de materiales oficiales para envases y la selección de los materiales se hace en función de sus propiedades. La mayoría de los envases son de vidrio o de plástico. Los envases de vidrio deben cumplir con los requisitos de resistencia química y de transmisión de la luz (si fuera necesario), según se describe en Envases-Vidrio Además es necelos envases de cumplan con lo dispuesto en la sección llrlflllllillll••llllllllllR ~!l~lllJ1!mlllí~lllllll~ll\!IT111MílltHll~lllflil Se deben evaluar por separado los cierres elastoméricos se indica en cuanto a los envases plásticos se los debe evaluar según los criterios específicos :l~1Jl~l;J1~;Jl~!iil~~~ii~~Í~~ll!il~jil1Ji~~~ii,I~~ Según lo expresado en estas secciones, a los plásticos se los debe someter a las pruebas de transmisión de la corresponde), pruebas de permeabilidad al vapor de agua, (ver también (671 )), pruebas de extracción fisicoquímica y pruebas biológicas (ver también Pruebas de Reactividad Biológica, In Vitro (87) y Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo (88)). Por ejemplo, para efectuar las pruebas de permeabilidad al vapor de agua de los recipientes de polietileno, se sella la boca del envase con una lámina metálica termosellable, y luego se mide la permeabilidad al agua en una atmósfera húmeda. Dado que el vapor de agua no atraviesa el laminado metálico, la prueba verifica sólo las propiedades protectoras del envase. Los resultados de esta prueba sirven para estimar aproximadamente el grado de protección que proporciona un sistema de envase comercializado con un laminado interno metálico termosellable (antes de quitar la lámina). Sin embargo en el caso de frascos de tereftalato de polietileno destinados a preparaciones líquidas, la prueba de permeabilidad al vapor de agua se efectúa llenando los envases con agua y midiendo el promedio de pérdida de agua en una atmósfera seca. En el caso de algunas formas farmacéuticas puede ser necesario realizar más pruebas. Los sistemas de envase y cierre para almacenar o transportar fármacos líquidos a granel son generalmente de plástico, de acero inoxidable, de metal con recubrimiento de vidrio, o de metal con recubrimiento de resina epoxi, y tienen cierres resistentes y a prueba de alteración intencional. Las pruebas que se realizan en estos sistemas de envase y cierre evalúan la permeabilidad a los disolventes y a los gases, la transmitancia de la luz, la integridad del cierre, la resistencia durante el transporte, la protección contra la contaminación microbiana a través del cierre la y seguridad de los componentes de los envases, según corresponda (ver (660), :llH:1:1~!~111V,ii1V/~!ll~llll~''lll:liii~J~l[lf~l!j) Para obtener más información respecto de los sistemas de envase y consultar la publicación de la FDA: Guidance far lndustry: Container Closure System far Packaging Human Drugs and Biologics,www.fda.gov.
USP 39
Información General/ (1177) Buenas Prácticas de Envasado 1651
Cambio en la redacción:
ENVASADO El envasado de los artículos farmacopeicos se clasifica en varias categorías según la terminología aceptada comúnmente por la industria. Como se mencionara previamente, las Advertencias Generales contienen algunas definiciones de los distintos tipos de envases clasificados según sus características y usos. Adicionalmente, el Comité Dl O sobre envasado de la ASTM publica terminología, prácticas, métodos de prueba, especificaciones, guías y clasificaciones para analizar y evaluar los envases, empaques y embalajes (ver ASTM 099695, Terminología Estándar de los Ambientes de Envasado y Distribución,"Standard Terminology of Packaging and Distribution Environments"). Sin embargo, en ciertas normas y pautas (como por ejemplo 49 CFR, Productos Peligrosos, "Dangerous Goods," entre otras), algunos de los componentes que se describen a continuación tienen otras denominaciones. La terminología correspondiente a los procesos de reenvasado se trata en el capítulo Envasado y Reenvasado-Envases Unitarios (11 36). Envase Primario-El envase primario es el envase que se encuentra en contacto directo con la preparación farmacopeica. El propósito del envase primario, también conocido como envase inmediato, es protoger la preparación de los peligros ambientales durante el almacenamiento y la manipulación del producto. En algunos casos, el envase primario también es un dispositivo específico para administrar el fármaco, por ejemplo un aerosol o un dispositivo para administrar una dosis fija (ver Formas Farmacéuticas (11 51) ). El envase primario de la mayoría de las formas farmacéuticas de administración oral es un frasco y una tapa o un envase tipo blíster o bolsa (pouch), fabricados de diferentes materiales, entre los que se incluye vidrio, plástico, metal y materiales flexibles solos o laminados. Todos los componentes del envase primario deben cumplir con los requisitos establecidos en 21 CFR en lo que respecta al contacto directo con los alimentos y, cuando corresponda, con los requisitos de la USP estipulados en (660), •(661 ), (661.1 ), (661.2)• (AF oi-may.2016) y en (671 ). Una descripción detallada de los envases primarios se encuentra en la sección "Sistema de Envase y Cierre" de las Solicitudes de Medicamento Nuevo (New Drug Application o NDA, por sus siglas en inglés) y de las Solicitudes Abreviadas de Medicamento Nuevo (Abbreviated New Drug Application o ANDA, por sus siglas en inglés), así como también en otros documentos de solicitud de la FDA. Envase Secundario Básico-Si bien este envase secundario no está en contacto directo con el artículo, ofrece protección esencial para la estabilidad del producto. En algunos casos, el envase primario se encuentra dentro de un envase secundario crítico, como por ejemplo una bolsa, que lo protege de la humedad, gases, luz o microbios lo que ofrece una mayor seguridad que la que brinda un envase primario. Una descripción detallada de los envases secundarios básicos se encuentra en la sección "Sistema de Envase y Cierre" de las Solicitudes de Medicamento Nuevo y de las Solicitudes Abreviadas de Medicamento Nuevo, así como también en otras solicitudes de la FDA. Envase Secundario-Este envase incluye uno o más envases primarios. No siempre se tiene un envase secundario. En los casos en los que sí se tiene un envase secundario, éste generalmente está diseñado como presentación final para comercializar. A menudo, el envase secundario se usa simplemente para llevar el etiquetado o para contener varios envases primarios individuales con dispositivos para administrar el medicamento u otros accesorios. En otros casos, el envase secundario protege el producto de los daños que pudieran ocurrir durante la manipulación o la distribución. El envase secundario más común es la típica caja de cartón plegado. Algunos productos, como por ejemplo las jeringas, se pueden colocar en bandejas antes de empacarlas en la caja. Los materiales del envase secundario no están incluidos en la descripción de los envases y cierres y no es necesario realizar pruebas de estabilidad ni obtener una autorización previa para cambiar los materiales empleados. Otros Envases-Existe una amplia variedad de otros envases, como por ejemplo bandejas y cajas de presentación, que se pueden utilizar para contener envases primarios. Unidad de Venta-La unidad de venta puede ser un frasco individual, una caja que contiene uno o más frascos o una bandeja con varios envases primarios. En algunos casos, la unidad de venta contiene más de un artículo para venta individual. Una bandeja de presentación, por ejemplo, puede contener varios artículos de una misma clase o varios artículos vinculados entre sí que provienen del mismo fabricante y que están destinados a la venta individual. El artículo individual destinado a la venta se denomina unidad de inventario (SKU, por sus siglas en inglés). Las unidades de inventario tienen un Código Nacional de Medicamentos (National Drug Code o NDC, por sus siglas en inglés). Toda unidad de inventario de los artículos de venta libre tienen un Código de Producto Universal (Universal Product Code o UPC, por sus siglas en inglés). En algunos casos, una unidad de inventario de venta bajo receta está destinada al consumidor final y la farmacia puede no estar autorizada a reenvasarla. Tales envases, a menudo denominados "unidad de uso", deben ser envases seguros para niños tal como se describe en 16 CFR 1700, "Poison Prevention Packaging,", excepto los envases exentos por la Consumer Product Safety Commission (Comisión de Seguridad de los Consumidores). El fabricante generalmente incorpora la característica de seguridad para niños (ver (11 36)). La misma regla se aplica a los artículos de venta libre, sólo si contienen ciertos ingredientes activos en cantidades superiores a los límites fijados. Todo producto reglamentado que se transporte por el Servicio Postal de Estados Unidos (USPS, por sus siglas en inglés) debe cumplir con las normas de 39 CFR 111. Embalaje Exterior Final-Este embalaje consiste generalmente en una caja (o cajón) de cartón de fibra corrugado o una envoltura. La etiqueta de expedición de la caja se encuentra en la última cubierta externa del embalaje y exhibe todos los códigos de barras que exige la National Wholesale Druggists' Association (NWDA). Con este embalaje final habitualmente se envía, en plataformas de carga, a los centros de distribución, a mayoristas y a otros clientes que compran grandes cantidades. El fabricante decide si esta encomienda debe ingresar o no en la cadena de transporte de pequeños paquetes como unidad individual sin que necesite tener otra protección.
1652 (1177) Buenas Prácticas de Envasado/ Información General
USP 39
En algunos casos, particularmente cuando se trata de cajas de cartón de fibra, la humedad relativa afecta la fuerza de compresión de la caja lo que origina que la carga se mueva y cause daños potenciales al artículo o a los envases exteriores o internos. Los artículos que se almacenan en refrigeradores o congeladores, ambientes con humedad relativa alta, son propensos a este tipo de daños cuando se apilan. En algunos casos, debido al diseño de la caja, la colocación de las cajas en pilas o si se emplean cajas de cartón de fibra corrugado con bajo índice de resistencia a la compresión en sus bordes el problema se acrecienta. Ciertos programas de computación permiten determinar la altura y disposición adecuadas de las pilas según el material, el tamaño, el tipo y el peso de la caja. Se debe contactar al fabricante del producto si hubiera problemas. El manual "Fiber Box Handbook", publicado por la Fiber Box Association, contiene información sobre materiales y referencias sobre cajas de cartón de fibra corrugado. Un mayorista u otro revendedor no debe suponer nunca que puede volver a usar el embalaje que haya recibido del fabricante. A menudo el embalaje está diseñado específicamente para ser utilizado por una ruta en particular o para un solo modo de transporte y no es adecuado para otros casos. Al igual que otros embalajes para el transporte, las cajas con aislantes y los empaques protectores internos pueden sufrir daños durante el transporte con la consecuente disminución de su desempeño y la posibilidad de que no protejan adecuadamente el contenido si se los vuelve a usar.
FACTORES AMBIENTALES Los envases, embalajes y empaques están sujetos a diversas disposiciones locales, estatales y federales. En general hay programas locales para reciclar la mayoría de los envases, embalajes y empaques que se usan en la industria farmacéutica. La FDA reglamenta la utilización de materiales reciclados para envases primarios, aunque en general no está permitida. En lo que se refiere a metales pesados y a otros factores ambientales que es necesario tener en cuenta para la fabricación de envases, embalajes y empaques, los fabricantes de productos farmacéuticos habitualmente se rigen por las disposiciones vigentes de la Coalition of Northeastern Governors (por ejemplo, "Model Toxics in Packaging Legislation"). La manipulación de ciertas clases de artículos farmacopeicos requiere precauciones especiales. Entre estos artículos se incluyen los siguientes productos: (1) Artículos Peligrosos según lo dispuesto por el Departamento de Transporte de Estados Unidos, por las reglamentaciones estatales, locales o del transportista; (2) fármacos controlados por la Drug Enforcement Administration (DEA); o (3) sustancias que la legislación estatal ha incluido en la lista de productos peligrosos.
ETIQUETADO Los fabricantes deben cumplir con las disposiciones pertinentes de la FDA y del Departamento de Transporte de Estados Unidos en lo que respecta al etiquetado de los embalajes de transporte. Artículos Peligrosos-El etiquetado de todo Artículo Peligroso, incluso la información del conocimiento de embarque aéreo, marítimo o terrestre, debe cumplir con las disposiciones del Departamento de Transporte de Estados Unidos, de la Asociación de Transporte Aéreo Internacional (IATA, por sus siglas en inglés) y del transportista. El embalaje exterior debe exhibir todos los símbolos estandarizados requeridos para indicar la clase de producto de la que se trata y el embalaje de transporte debe cumplir con los estándares de desempeño que corresponden a los artículos que contiene. El transportista registrado es responsable del cumplimiento con las disposiciones que atañen a los Artículos Peligrosos. Sustancias Controladas-Las preparaciones farmacopeicas que contienen una sustancia controlada de la lista de la DEA que se expiden directamente al paciente por medio del Servicio de Correo de los Estados Unidos (USPS) deben estar marcadas y etiquetadas según lo dispuesto en el USPS Domestic Mail Manual, Artículo C023, Párrafo 7,2.
(1178) BUENAS PRÁCTICAS DE REENVASADO
INTRODUCCIÓN El objetivo del presente capítulo es proporcionar una guía a quienes se ocupan de reenvasar productos farmacéuticos sólidos orales; y el capítulo brinda información a quienes extraen productos farmacéuticos del sistema de envase-cierre original (envase primario nuevo) y los reenvasan con un sistema de envase-cierre distinto para su reventa y/o distribución. Este capítulo no se aplica a farmacéuticos que dispensan medicamentos de venta bajo receta en concordancia con las prácticas de farmacia estatales. El farmacéutico necesita aplicar (1) la información en el de información de USP
USP 39
Información General/ (1178) Buenas Prácticas de Reenvasado 1653
(2) otras referencias de fecha de límite de uso en la subsección Fecha de Caducidad y Fecha de Límite de Uso en la sección Etiquetado en Advertencias y Requisitos Generales.
DEFINICIONES El capítulo Requisitos de Envasado y Almacenamiento (659) proporciona las definiciones relacionadas al reenvasado. A los efectos del presente capítulo, un reenvasador, un envasador contratado y un sistema de envase-cierre equivalente tienen el significado que se describe a continuación: 1. Reenvasador-Un reenvasador es un establecimiento que reenvasa medicamentos y los envía a otro lugar con anticipación a su necesidad. Las empresas de reenvasado se ocupan de reenvasar las preparaciones para su distribución (p.ej., para su reventa a distribuidores, hospitales u otras farmacias), una función más allá de la práctica farmacéutica normal. La distribución no es específica para el paciente dado que no median recetas médicas. A diferencia de los dispensadores, las empresas de reenvasado requieren estar registradas con la FDA y cumplir con las Reglamentaciones de Buenas Prácticas de Fabricación Vigentes estipuladas en 21 CFR 21 O y 211. 2. Envasador Contratado-Un envasador contratado es un establecimiento que es contratado para envasar o reenvasar un producto farmacéutico en envases unitarios o de unidades múltiples. Estos envases deben cumplir con todos los requisitos aplicables descritos en este capítulo. El envasador contratado no adquiere la propiedad del producto por parte del fabricante y por lo general recibe de quien lo contrata la fecha de caducidad asignada. 3. Sistema Equivalente de Envase-Cierre-Esta expresión se refiere al sistema de envase-cierre que ofrece igual o mejor protección que el sistema de envase-cierre original en términos del índice de transmisión de vapor de agua (MVTR, por sus siglas en inglés), transmisión de oxígeno, transmisión de luz y compatibilidad del sistema de envase-cierre con el producto farmacéutico. La equivalencia del sistema se extiende a cualquier material de protección especial, por ejemplo para la transmisión de luz, sellos o desecantes relacionados con el sistema de envase-cierre original. El reenvasador puede obtener estos valores del proveedor del sistema de envase-cierre que se esté considerando o puede determinarlos él mismo.
ESTABLECIMIENTO DE LA FECHA DE CADUCIDAD En la ausencia de datos de estabilidad, los reenvasadores deben considerar los siguientes criterios para asignar la fecha de caducidad.
Envase de Dosis Única 1. El sistema de envase-cierre original del producto farmacéutico a utilizar en el reenvasado debe recibirse cerrado y sin indicios de que haya sido abierto previamente. 2. El sistema de envase-cierre de dosis única debe cumplir con los requisitos de las pruebas para envases Clase A o Clase Ben Envases-Pruebas de Desempeño (671 ). 3. El contenido del producto farmacéutico a granel original a ser reenvasado se reenvasa en una sola operación a menos que el reenvasador tenga datos y/u otra información científica de fuentes bibliográficas que demuestren que el producto farmacéutico no es sensible a la exposición a la humedad, al oxígeno o a la luz. 4. El sistema de envase-cierre de dosis única debe cumplir o superar la especificación del envase original respecto de la resistencia a la luz. 5. Las condiciones de almacenamiento deben cumplir con las especificaciones de almacenamiento definidas en las Advertencias Generales de USP y según se describe en el etiquetado del sistema de envase-cierre original recibido para el reenvasado. Cuando no se indican condiciones de almacenamiento específicas, el producto debe mantenerse a temperatura ambiente controlada y en un lugar seco durante el proceso de reenvasado, incluido el almacenamiento. 6. La fecha de caducidad usada para el producto reenvasado no excede de (1) 6 meses a partir de la fecha de reenvasado; o (2) la fecha de caducidad del fabricante; o (3) 25% del tiempo entre la fecha de reenvasado y la fecha de caducidad que muestra el envase del artículo a granel del fabricante del producto que se está reenvasando, lo que represente un período menor. 7. Las Tabletas Sublinguales de Nitroglicerina o cualquier otro producto farmacéutico con problemas conocidos de estabilidad no deben reenvasarse. Esto incluiría cualquier producto con sensibilidad conocida al oxígeno o que exhiba extrema sensibilidad a la humedad o a la luz. Para decidir si un producto farmacéutico en particular es adecuado para su reenvasado, el reenvasador debe tomar en consideración cualquier información disponible del fabricante, de bibliografía publicada, de la USP y de la FDA. 8. Se debe mantener documentación para demostrar el cumplimiento de los criterios precedentes. 9. Se debe mantener documentación que especifique el material de envase-cierre usado en las operaciones de reenvasado.
1654 (11 78) Buenas Prácticas de Reenvasado / Información General
USP 39
Envase de Unidades Múltiples 1. Un reenvasador puede usar la fecha de caducidad original del fabricante sin la necesidad de realizar pruebas de estabilidad adicionales si el producto farmacéutico es reenvasado en un sistema de envase y cierre equivalente que proporciona por lo menos una protección equivalente o superior a la protección que brinda el sistema original y cumple con los criterios de equivalencia establecidos. 2. El sistema de envase y cierre original del producto farmacéutico a utilizar en el reenvasado debe recibirse cerrado y sin indicios de que haya sido abierto previamente. 3. El contenido del producto farmacéutico a granel original a ser reenvasado se reenvasa en una sola operación a menos que el reenvasador tenga datos y/u otra información científica de fuentes bibliográficas que demuestren que el producto farmacéutico no es sensible a la exposición a la humedad, al oxígeno o a la luz. 4. Las condiciones de almacenamiento cumplen con las especificaciones de almacenamiento definidas en las Advertencias Generales y según se describe en el etiquetado del sistema de envase-cierre original recibido para el reenvasado. Cuando no se indican condiciones de almacenamiento específicas, el producto debe mantenerse a temperatura ambiente controlada y en un lugar seco durante las operaciones de reenvasado. 5. El tipo de sistema de envase-cierre usado para el reenvasado debe ofrecer por lo menos una protección equivalente o superior a la protección que brinda el sistema de envase-cierre original en términos del índice de transmisión de vapor de agua (MVTR, por sus siglas en inglés), transmisión de oxígeno, transmisión de la luz y compatibilidad del sistema de envase-cierre con el producto farmacéutico. La equivalencia del sistema se extiende a cualquier material de protección especial, por ejemplo para la transmisión de luz, sellos o desecantes relacionados con el sistema de envase-cierre original. 6. El sistema de envase-cierre debe cumplir o exceder los resultados para transmisión de luz del sistema de envase-cierre original. 7. Las Tabletas Sublinguales de Nitroglicerina o cualquier otro producto farmacéutico con problemas conocidos de estabilidad no deben reenvasarse. Esto incluiría cualquier producto con sensibilidad conocida al oxígeno o que presenta extrema sensibilidad a la humedad o a la luz. Para decidir si un producto farmacéutico en particular es adecuado para su reenvasado, el reenvasador debe tomar en consideración cualquier información disponible del fabricante, de bibliografía publicada, de la USP y de la FDA. 8. Se debe mantener documentación para demostrar que se cumplen los criterios precedentes. 9. Se debe mantener documentación que especifique el material de envase-cierre usado en las operaciones de reenvasado.
REFERENCIAS DE REGLAMENTACIONES Y GUÍAS DE REENVASADO Las referencias que se listan a continuación no son exhaustivas: las operaciones de reenvasado específicas pueden tener requisitos adicionales. • Food, Drug, and Cosmetic Act (Ley de Alimentos, Medicamentos y Cosméticos) • Food and Drug Administration Regulations and Guidances (Reglamentaciones y Guías de la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos) Enforcement Policy (Política de Ejecución): 21 CFR, Parte 7 General Labeling Provisions (Disposiciones Generales de Etiquetado): 21 CFR, Parte 201, Subparte A Drug Establishment Registration and Listing (Registro y Listado del Establecimiento de Medicamentos): 21 CFR, Parte 207.20 Current Good Manufacturing Regulations (Reglamentaciones de Buenas Prácticas de Fabricación Vigentes): 21 CFR, Partes 210-211 Special Requirements for Specific Human Drugs (Requisitos Especiales para Medicamentos Específicos de Uso Humano): 21 CFR, Parte 250 Controlled Substances (Sustancias Controladas): 21 CFR, Parte 1300 Potable Water (Agua Potable): 40 CFR, Parte 141 Guías de Políticas de Cumplimiento de la FDA, incluyendo las siguientes: Sub Capítulo 430 Labeling and Repackaging (Etiquetado y Reenvasado) Sub Capítulo 460 Pharmacy lssues (Asuntos de Farmacia) Sub Capítulo 480 Stability/Expiration Dating (Fechas de Estabilidad/Caducidad) • Capítulos Aplicables de la USP Envases-Vídrio (660)
Envasado y Reenvasado-Envases Unitarios (1136)
Información General/ (1180) Plasma Humano 1655
USP 39
(1180) PLASMA HUMANO ALCANCE Este capítulo proporciona una fuente consolidada de información relacionada con el plasma humano, haciendo hincapié en el plasma para fraccionamiento. Este capítulo trata específicamente la clasificación y nomenclatura del plasma; los procedimientos de recolección y procesamiento requeridos para garantizar la seguridad del producto; los detalles de plasmas específicos, así como los sistemas de calidad relacionados con la recolección de plasma. Asimismo, al final de las secciones de texto, el capítulo incluye un glosario, una lista de abreviaturas usadas en el capítulo y apéndices con definiciones para plasma, criterios de selección del donante y requisitos de análisis. El plasma proveniente de instalaciones de recolección autorizadas en los EE.UU. representa la mayor fuente de suministro del mercado mundial de derivados de plasma. La Administración de Alimentos y Medicamentos de los EE.UU. (U.S. Food and Drug Administration o FDA) regula la recolección y el procesamiento de plasma usado en fabricación de productos adicionales. El Título 21 del Código de Reglamentos Federales (Code of Federal Regulations o CFR) detalla los requisitos de Buenas Prácticas de Fabricación (BPF) y las normas de productos para proteger la salud del donante de sangre y para garantizar la seguridad y eficacia de los hemoderivados. Aunque los reglamentos del CFR se actualizan de manera periódica, es posible que entre cada revisión, los reglamentos existentes no traten los asuntos y avances científicos de mayor actualidad, por lo que la FDA publica pautas de manera periódica. 1 (Para mayor información, ver Sistemas de Calidad más adelante.) Aunque este capítulo hace hincapié en las prácticas en los EE.UU., debido a que el plasma y sus derivados se distribuyen en todo el mundo, es importante reconocer que existen diferencias regionales en lo que respecta a recomendaciones, requisitos y reglamentos. Por lo tanto, este capítulo proporciona información relacionada con la Unión Europea (EU), el Reino Unido (RU) y Australia.
GENERALIDADES Composición del Plasma El plasma constituye aproximadamente el 55% del volumen sanguíneo total. Se trata de un líquido complejo transparente de color amarillo claro con una composición de 7% de proteínas, 91 % de agua y 0,9% de sales minerales. La albúmina representa la mayor parte de la proteína total del plasma (aproximadamente 70%). Las demás proteínas del plasma pertinentes al fraccionamiento incluyen inmunoglobulinas, factores de coagulación, proteínas fibrinolíticas, proteasas e inhibidores de proteasas. Estas proteínas constitutivas del plasma se pueden aislar basándose en las diversas características de solubilidad de cada proteína cuando se las somete a condiciones específicas de pH, temperatura, concentración iónica y concentración de etanol. Los principales productos derivados del fraccionamiento se listan en la Tabla 7. . 1es d el Proceso Cohn Tabla 1. Fracc1ones y Productos Pr1ncipa
Producto
Fracción Crioprecipitado
Factor antihemofílico (FVlll)
Criosobrenadante
Antitrombina 111, complejo de factor IX
Fracción 1
Fibrinógeno, factor XIII
Fracción 11
lnmunoglobulina G (lgG)
Fracción 111
lgA, lgM, protrombina, plasminógeno
Fracción IV-1
Complejo de factor IX, complejo de factor IX activado
Fracción IV-4
Fracción de proteína plasmática, inhibidor de proteinasa alfa-1
Fracción V
Albúmina
Plasma para la Fabricación de Productos Derivados Los dos métodos de recolección de plasma humano son la aféresis automatizada (para definiciones, ver el Glosario que precede a los apéndices) y la centrifugación de sangre entera de donaciones. El Plasma de Origen que se recolecta por aféresis representa la mayor parte del plasma usado en la fabricación de derivados de plasma en los Estados Unidos. El plasma recolectado para transfusión, pero que no se usa para dicho propósito (es decir, el plasma recuperado), también puede usarse para la fabricación. Las Figuras 7 y 2 presentan diagramas de flujo que explican la forma en que se puede usar el plasma obtenido por aféresis y el derivado de sangre entera en la fabricación de derivados de plasma en los Estados Unidos y Europa, respectivamente.
1 FDA. Pautas para Sangre. www.fda.gov/cber/blood/bldguid.htm. FDA Memoranda to Blood Establishments (Memorandos de la FDA para Centros Hematológicos) disponible en www.fda.gov/cber/memo.htm.
1656 (1180) Plasma Humano / Información General
Flebotomia/Sangre Entera
USP 39
Aféresis Automatizada
Plasma para transfusión (Plasma de 24 horas, FFP, Plasma
Reducido en Crioprecipitado)
Desviación durante el almacenamiento
Figura 1. Fabricación de derivados de plasma en los EE.UU.: Normas de la FDA.
Sangre Entera por Flebotomía o Plasma por Aféresis Automatizada
Plasma de Sangre Entera por Flebotomía
Plasma por Aféresis
Automatizada
Tiempo especificado para congelación y condiciones de congelamiento
Tiempo especificado para
congelación y condiciones de congelamiento
Derivados de Plasma Lábiles y No Lábiles
Derivados de Plasma No Lábiles
Figura 2. Fabricación de derivados de plasma en la UE: Normas de la UE. Sin importar el método de recolección, el plasma para fraccionamiento debe presentarse como un líquido transparente a ligeramente turbio, sin señales visibles de hemólisis; su color puede variar de amarillo claro a verde; debe ser±10% del volumen declarado; y no debe presentar señales de coágulos.
Plasma de Origen El Plasma de Origen autorizado debe ser fabricado únicamente en centros de recolección aprobados por la FDA para la recolección y distribución de Plasma de Origen para comercialización interestatal. En la actualidad, los reglamentos federales que rigen la fabricación de Plasma de Origen, incluyendo los requisitos mínimos para donantes, se encuentran en el Título 21 del CFR 640, Subparte G. Por definición, el Plasma de Origen es plasma destinado para fabricación. Los donantes de Plasma de Origen pueden donar hasta dos veces por semana, y pueden recibir una compensación. Además de los requisitos de la FDA, la mayoría de los recolectores y fraccionadores de plasma también cumplen con normas voluntarias establecidas por la Plasma Protein Therapeutics Association (Asociación para el Tratamiento con Proteínas Plasmáticas o PPTA), una organización de establecimiento de normas que representa a la industria.2 Las normas voluntarias de la PPTA tratan diversas áreas relacionadas con donantes, unidades de plasma, combinación (pool) de plasma y administración del centro, y están diseñadas a manera de complemento para los requisitos reglamentarios existentes.
Plasma para Transfusión El plasma para transfusión no está destinado para fabricación, sino para su transfusión directa a pacientes. Se puede recolectar mediante donación de sangre entera o aféresis. En los Estados Unidos, el plasma para transfusiones proviene de donantes voluntarios que no reciben compensación. Las instalaciones de recolección de sangre que recolectan plasma para transfusión por lo general cumplen con los requisitos del CFR y de la American Association of Blood Banks (Asociación Estadounidense de Bancos de Sangre o AABB), una organización voluntaria que representa al gremio. En la actualidad, las secciones 640.3 y 640.31 del Título 21 del CFR describen los requisitos para donantes de sangre entera y que, por lo tanto, rigen a la mayoría de los donantes de plasma para transfusión, independientemente del método de recolección. Las normas voluntarias de la AABB incluyen información contenida en los reglamentos y pautas de la FDA relacionadas con sangre y plasma, además de normas adicionales. 3 El plasma para transfusión se puede convertir en plasma recuperado, un producto no autorizado que se puede usar en fabricación.
2 3
PPTA. www.pptaglobal.org. AABB. Standards for Blood Banks and Transfusion Services (Normas para Bancos de Sangre y Servicios de Transfusión). 25ta ed. Bethesda, MD: AABB; 2008.
Información General/ (1180) Plasma Humano 1657
USP 39
Plasma para Uso Auxiliar en la Fabricación de Productos Biológicos El plasma humano y sus derivados se usan en la fabricación de otros productos biológicos. En este papel, el plasma o derivado de plasma cae en la categoría de uso como auxiliar. Esto se define como el uso de un reactivo o material como coadyuvante de procesamiento o purificación o un reactivo que tiene algún efecto sobre la sustancia terapéutica pero que no está destinado a formar parte de la formulación del producto final (ver el capítulo de información general USP Materiales Auxiliares para Productos Celulares, Génicos y de Ingeniería Tisular (1043)). El plasma humano se usa comúnmente en los procesos de fabricación que implican células humanas primarias o líneas celulares destinadas para aplicaciones terapéuticas. En estas aplicaciones, el plasma proporciona una fuente de proteínas y posiblemente otros factores que mejoran la expansión y diferenciación de poblaciones celulares. Se ha usado una variedad de métodos para preparar el plasma humano y sus derivados para uso auxiliar; sin embargo, las prácticas no han sido estandarizadas. El plasma alogénico por lo general se obtiene por aféresis o de sangre entera, usando anticoagulación con citrato. El plasma alogénico generalmente se recolecta de donantes remunerados los cuales, al igual que los donantes de Plasma de Origen, han sido sometidos a pruebas específicas para determinar la ausencia de enfermedades transmisibles por transfusión. Los donantes preferidos pueden pertenecer al grupo sanguíneo del tipo AB, debido a que carecen de isohemaglutininas anti-A y anti-B. Otros donantes preferidos incluyen varones que no hayan recibido transfusiones, debido a la improbabilidad de que este grupo tenga anticuerpos contra antígenos de leucocitos humanos (ALH) que pudiesen reaccionar con las células en un sistema de cultivo determinado. El suero se prepara a partir de sangre entera sin anticoagulantes que se ha dejado coagular o mediante la adición de calcio al plasma obtenido a partir de sangre entera con citrato o por aféresis. Calentar el plasma o suero a 56º inactiva el complemento termolábil y otras proteínas. Aunque no existen especificaciones estandarizadas para los productos de plasma usados como materiales auxiliares, los ensayos generalmente incluyen pruebas de seguridad asociadas con productos biológicos generales (p.ej., cultivos bacterianos/ fúngicos, endotoxinas y micoplasmas). Asimismo, la caracterización de los productos puede incluir pruebas para eritrocitos irregulares y anticuerpos contra ALH, osmolalidad, pH, concentraciones totales de proteína e inmunoglobulina, concentración de hemoglobina y elementos químicos tales como Na, K, CI, Ca, además de glucosa. En algunos casos, se ha usado plasma de origen bovino en lugar de plasma humano. Las diferencias entre productos de plasma bovino y humano incluyen factores pertinentes a su eficacia como materiales auxiliares, así como a la seguridad del producto fabricado final cuando se administra a humanos (ver el capítulo de información general USP Suero Bovino (1024)). El suero fetal bovino se prefiere sobre el suero humano para algunas aplicaciones debido a que puede ser superior en la promoción del crecimiento de células humanas in vitro. Las consideraciones de seguridad, especialmente el riesgo de encefalopatía espongiforme transmisible (TSE, por sus siglas en inglés), así como las reacciones alérgicas relacionadas con anticuerpos antibovinos, han llevado a recomendar el uso de fuentes de plasma humano en lugar de bovino siempre que sea posible. No obstante, el uso de plasma humano en lugar de bovino no elimina por completo el riesgo de secuelas infecciosas e inmunológicas, incluso cuando el plasma humano se usa como material auxiliar.
RECOLECCIÓN Y PROCESAMIENTO DE PLASMA Esta sección analiza los principios normativos implicados en la recolección de plasma y los métodos usados para garantizar la seguridad del plasma y de los derivados de plasma fabricados de manera subsiguiente. Los principios de selección del donante y pruebas específicas de donantes se presentan en otras partes de este capítulo.
Recolección El Plasma de Origen se recolecta por aféresis. El plasma recuperado se puede obtener mediante aféresis o como un subproducto de recolección de sangre entera. La recolección debe llevarse a cabo mediante un sistema de recolección exento de pirógenos, estéril, cerrado y aprobado por la FDA que contenga un anticoagulante. No debe agregarse al plasma ningún agente antibacteriano o antifúngico. Las donaciones deben recolectarse asépticamente. La piel del donante se debe preparar asépticamente. El Plasma de Origen se recolecta usando citrato de sodio al 4% como anticoagulante. La Tabla 2 especifica la composición de citrato de sodio. En los Estados Unidos existen tres soluciones anticoagulantes autorizadas para la recolección de sangre entera: citrato fosfato dextrosa (CPD), citrato fosfato doble dextrosa (CP2D) y citrato fosfato dextrosa adenina (CPDA-1 ). La Tabla 3 presenta la composición de las bolsas de recolección de sangre que contienen estos anticoagulantes. El plasma para transfusión o para fabricación se puede preparar a partir de una unidad de sangre entera recolectada en cualquiera de las tres soluciones anticoagulantes. Los reglamentos sobre plasma no hacen distinciones entre las tres soluciones anticoagulantes. Por consiguiente, los requisitos de recolección, almacenamiento y transporte son idénticos independientemente de la solución anticoagulante usada en la recolección primaria.
USP 39
1658 (1180) Plasma Humano / Información General
Tabla 2. Solución Antlcoagulante para Recolección de Plasma de Origen por Aféresis (Citrato de Sodio al 4%)
Volumen
Citrato de Sodio DI hidrato
Ácido Cítrico Anhidro
250 ml o 500 mL
40 g/L
Según se requiera para ajustar el pH
pH (25º) 6,4-7,5
Relación entre Solución y Sanqre Entera 1:16
Tabla 3. Soluciones Antlcoagulantes Usadas durante la Recolección de Sangre Entera para la Recuperación de Plasma (bolsas de recolección de 500 mL) Anticoagulante
CPDª
CP2Db
Volumen (ml)
70
63
63
Dextrosa (mg)
1780
3220
2010
CPDA-1<
Citrato de sodio dihidrato (mg)
1840
1660
1660
Ácido cítrico anhidro (mg)
209
206
206
Fosfato monobásico de sodio (mg)
155
140
Adenina (mg)
-
-
140 17,3
pH (25º)
5,3-5,9
5,3-5,9
5,3-5,9
Relación entre solución y sangre entera
1,4:10
1,4:10
1,4:10
Nota: La recolección de Plasma de Origen por lo general implica el uso de citrato de sodio como anticoagulante. La Tabla 2 proporciona la especificación para citrato de sodio. El plasma para transfusión se almacena a una temperatura de 2º a 8º después de la recolección. El plasma recolectado por aféresis debe congelarse inmediatamente a -18º o menos. ª Citrato fosfato dextrosa. b Citrato fosfato doble dextrosa. e Citrato fosfato dextrosa adenina.
Etiquetado El etiquetado para Plasma de Origen debe cumplir con el Título 21 del CFR 640.70 y el Título 21 del CFR 640.69(b). El etiquetado para sangre entera debe cumplir con el Título 21 del CFR 606.121 y 606.122, y con las licencias internas. Se debe asignar un número de identificación único de manera que la donación pueda asociarse con los registros individuales del donante y los resultados de las pruebas. El origen de cada donación en una combinación de plasma, así como los resultados de la donación y pruebas de laboratorio correspondientes deben ser rastreables, al tiempo que se mantiene el grado requerido de confidencialidad en relación con la identidad del donante. El etiquetado de la sangre entera debe incluir la leyenda "Este producto puede transmitir agentes infecciosos" [Título 21 del CFR 121 (c)(9)]. El etiquetado del Plasma de Origen o plasma recuperado debe incluir la leyenda "Precaución: Sólo para Fabricación" cuando el producto está destinado para su uso en fraccionamiento. El etiquetado del plasma para su uso como reactivo o in vitro debe incluir la leyenda "Precaución: Sólo para Uso en la Fabricación de Productos No Inyectables" [21 CFR 121 (e)(5)(ii)].
Almacenamiento El plasma para fraccionamiento debe almacenarse a una temperatura igual o inferior a -20º. El plasma aún puede usarse para fraccionamiento si su temperatura excede de ~20º (máximo) en una ocasión durante no más de 72 horas y siempre que el plasma se haya mantenido en todo momento a una temperatura de -5º o inferior. Las temperaturas de almacenamiento deben mantenerse durante el transporte.
CONSIDERACIONES SOBRE LA SEGURIDAD DEL PLASMA El plasma está protegido por cinco salvaguardas superpuestas que la FDA ha denominado como "Five-Layer Safety Net" (Red de Seguridad de Cinco Capas): selección del donante, análisis de sangre, suspensión de la elegibilidad de donantes, cuarentena e investigación. Para obtener pautas en este campo, ver la Publicación de la FDA n.º FS 02-1 de febrero de 2002 (FDA Publication No. FS 02-1 February 2002). Las medidas voluntarias que proporcionan un margen adicional de seguridad incluyen reclutamiento y retención de donantes adecuados y del inventario de espera. En la fabricación de productos derivados de plasma, las etapas para la depuración viral son sumamente importantes para garantizar la seguridad. Ninguna de estas medidas es suficiente por sí misma; la red de seguridad es la combinación de dichas actividades que se superponen.
USP 39
Información General/ (1180) Plasma Humano 1659
Selección del Donante La selección de un sitio adecuado para las actividades de donación de sangre y plasma es el paso inicial y sumamente importante para garantizar donaciones seguras. Se prefieren áreas con baja prevalencia de enfermedades para establecer los centros de donación, con lo cual se reduce la probabilidad de recolectar plasma de un donante infectado. Una de las normas voluntarias de la PPTA es la norma de marcador viral, que obliga a los centros de recolección de plasma a informar las tasas de marcador viral para el virus de inmunodeficiencia humana (VIH), virus de la hepatitis B (VHB) y virus de la hepatitis C (VHC) en las poblaciones de donantes. Las tasas de un centro se comparan con el promedio de la industria. Se establecen límites de alerta para tomar en cuenta el número de donaciones anuales en el centro. Si un centro excede el límite para cualquiera de estos virus o para la suma de los tres, el centro debe implementar acciones correctivas que permitan el cumplimiento del centro con la norma. La selección apropiada de donantes ayuda a ofrecer un suministro de plasma seguro. Los cuestionarios detallados sobre los antecedentes del donante en conjunto con exámenes médicos cuidadosos permiten al personal del centro reconocer donantes no aptos cuyos comportamientos los pongan en riesgo de transmitir enfermedades por transfusión o que presenten condiciones médicas subyacentes que los descarten como donantes. El National Donar Deferral Registry (Registro Nacional de Suspensión de Elegibilidad de Donantes o NDDR) de la PPTA es una medida adicional implementada por los centros de recolección de Plasma de Origen. Dicho registro lista a donantes de todo el territorio estadounidense que han sido previamente rechazados del proceso de donación (aunque no proporciona información sobre la razón del rechazo). Otros países cuentan con sistemas distintos que dependen de sus reglamentos nacionales con respecto a la recopilación de datos personales. Cualquier individuo que resulte positivo para VIH, VHB o VHC es agregado a la base de datos nacionales (el National Donar Deferral Registry) usada por todos los centros de plasma de los EE.UU. que están certificados bajo el lnternational Quality Plasma Program (Programa Internacional de Calidad de Plasma o IQPP). Todos los individuos que se presentan por primera vez en un centro de recolección de plasma de los EE.UU. son cotejados contra el NDDR. De esta manera, es posible identificar rápidamente y no aceptar a los donantes que hayan sido rechazados previamente por resultar positivos en cualquier instalación participante. Esta norma asegura que los donantes rechazados por resultar positivos no puedan donar en otras instalaciones. La Qualified Donar Standard (Norma de Donante Calificado), una iniciativa voluntaria de seguridad, implementada por la industria de fraccionamiento de plasma, se cimienta en el hecho de que una gran cantidad de donantes de plasmaféresis donan plasma frecuentemente. Al donante que ingresa a un centro de plasmaféresis por primera vez se le denomina Candidato a Donante y la primera donación se usa únicamente para fabricación si el donante acude al centro por una segunda ocasión. Los donantes potenciales deben pasar dos exámenes médicos diferentes y análisis para VIH, VHB y VHC en dos ocasiones distintas. La persona se convierte en un Donante Calificado únicamente después de una selección satisfactoria y de resultar negativo en las pruebas de detección. Cuando un donante no regresa al centro en un plazo de 6 meses, éste pierde su estado de Donante Calificado y debe someterse de nuevo al proceso de calificación. Esta norma evita que el plasma de una persona que haya donado sólo una vez (incluso cuando todos los resultados sean negativos) sea usado para fabricación. La norma permite contar con donantes comprometidos y elimina el riesgo de que los centros de recolección de plasma acepten a los denominados "buscadores de pruebas o dadores espúreos" (test seekers). El intervalo entre donaciones de sangre entera permitidas es demasiado extenso como para permitir un programa de selección similar, aunque un buen número de donantes en centros de donación de sangre entera son donantes regulares y repetitivos. Existe otra norma voluntaria de la PPTA que trata los criterios para la gestión de donantes. La Community-Based Donar Standard (Norma de Donantes Basada en la Comunidad) permite donar en un centro determinado únicamente a donantes que residan de manera permanente dentro de su área de reclutamiento definida. Asimismo, la Donar Education Standard (Norma de Educación para Donantes) requiere que los nuevos donantes participen en un programa educativo y que tomen una evaluación relacionada con el VIH/síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) y con actividades que los ponen en riesgo de contraer VIH/SIDA. Además de las estrategias y normas para la gestión de donantes, la PPTA ha emitido una norma para la gestión de unidades de plasma denominada Inventario de Espera (lnventory Hold). Esta norma establece que el plasma recolectado será retenido en el inventario durante al menos 60 días, a partir del momento de la recolección, lo cual permite la recuperación de unidades basada en cualquier información posterior a la donación (información desconocida en el momento de la donación) que descalifique al donante. Esta información podría incluir: que el donante admita poseer comportamiento de alto riesgo, que las pruebas para VIH, VHB o VHC arrojen resultados positivos o que proporcione información incorrecta sobre viajes al extranjero.
Análisis de Sangre El análisis de sangre del donante representa una medida de seguridad importante para el plasma destinado para transfusión y para el plasma destinado para fabricación. Los enzimoinmunoensayos (ELISA) y las tecnologías de amplificación de ácidos nucleicos (NAT) se emplean para seleccionar donaciones a fin de determinar la presencia de enfermedades infecciosas. La automatización confiere la eficiencia necesaria para analizar cada donación a fin de determinar la presencia de diversos patógenos potenciales. Las estrategias de prueba del plasma donado son diferentes dependiendo del destino final. El plasma para transfusión requiere de análisis más exaustivos para enfermedades infecciosas, debido a que no existen tecnologías de inactivación/depura-
1660 (1180) Plasma Humano / Información General
USP 39
ción de patógenos autorizados para este producto en los Estados Unidos. Por otra parte, el plasma para fabricación se somete a varias etapas de inactivación/depuración de patógenos durante la fabricación, eliminando así la necesidad de analizar el plasma para algunas enfermedades. La Tabla 4 cita las pruebas vigentes requeridas por la FDA para detectar enfermedades infecciosas en donaciones de plasma recolectadas en los Estados Unidos. El Apéndice 3 compara las pruebas de enfermedades y los requisitos de rechazo de donantes de la UE y los EE.UU. Tabla 4. Requisitos de Pruebas de la FDA para Detección de Enfermedades en Plasma para Transfusión y Plasma para Fabricación Plasma para Fabricación•
Plasma para Transfusión
Enfermedad Hepatitis B
Antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg) Anticuerpo anti-core del virus de la hepatitis B (anti-VHBc)
HBsAg
Hepatitis C
Anti-VHC ARN VHC
Anti-VHC ARN VHC
VIH
Anti-VIH 1/11 ARN VIH
Anti-VIH 1/11 ARN VIH
Virus linfotrópico humanode células T (HTLV) 1/11
Anti-HTLV 1/11
No requerida
Sífilis
Prueba serológica para sífilis, cada donación
Prueba serológica para sífilis, cada 4 meses únicamente para donantes
Virus del Nilo occidental (WNV)b
ARNWNV
No requerida
ªLa FDA también promueve el análisis mediante NAT durante el proceso para parvovirus Bl 9 y hepatitis A. El análisis mediante NAT para VHB también se lleva a cabo en la mayoría de los Plasmas de Origen. b Las pruebas para determinar la presencia del virus del Nilo occidental (WNV, por sus siglas en inglés) están recomendadas en un documento preliminar de pautas de la FDA. La FDA está considerando recomendaciones relacionadas con pruebas para determinar la presencia de Trypanosoma cruzi (enfermedad de Chagas).
Las NAT, de las cuales la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es la más ampliamente utilizada, no se basan en la detección de anticuerpos producidos por el anfitrión infectado después de la exposición, sino que se centran en el ácido nucleico del agente infeccioso. Mediante la selección de moléculas cebadoras adecuadas (cebadores), el ensayo es sumamente específico para el virus infeccioso (ver el capítulo de información general USP Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Amplificación (1127)). A través de varios ciclos de amplificación, la enzima polimerasa puede generar repetidamente copias del fragmento del ácido nucleico viral elegido como blanco, proporcionando una amplificación exponencial de una extensión muy corta del ácido desoxirribonucleico (ADN) [o ácido ribonucleico (ARN)] viral. La amplificación exponencial conduce a la generación de muchas copias de la molécula elegida como blanco y permite la detección subsiguiente del fragmento del virus específico, aunque la carga viral original sea extremadamente baja. Esta metodología ha permitido alcanzar un nuevo nivel de seguridad. Debido a su complejidad y costos, el análisis mediante NAT es difícil de realizar en donaciones individuales. Por lo general, se agrupan alícuotas de varias donaciones en una sola combinación (pool), a menudo denominada minicombinación (minipool). El análisis de combinados (pooled) tiene todavía una sensibilidad mayor que el análisis serológico de detección mediante ELISA de donaciones individuales. Asimismo, el principio de la NAT sortea varias de las limitaciones para la detección de patógenos por métodos serológicos. El análisis de combinados puede influenciar la sensibilidad general, dependiendo del tamaño de la combinación y de la sensibilidad analítica del ensayo NAT utilizado. En muchos países, la carga máxima de patógenos aceptable para una sola donación define la sensibilidad general requerida para NAT. Los ensayos con una sensibilidad analítica mayor se pueden emplear para analizar combinaciones más numerosas, mientras que los ensayos con menor sensibilidad, deben utilizarse para analizar combinaciones más pequeñas para poder cumplir con los reglamentos. La disponibilidad de kits de prueba NAT comerciales con sensibilidad analítica definida ha permitido que las minicombinaciones de hasta 512 sean muy comunes, debido a que estos tamaños de combinaciones, en conjunto con la sensibilidad analítica de los ensayos usados, cumplen con los reglamentos comunes sobre sensibilidad general. El tamizaje por NAT requiere que al inicio de la producción, la carga viral de la combinación de plasma sea menor que la capacidad de inactivación o de depuración del proceso. Las diferencias entre la transfusión de plasma y fraccionamiento industrial del plasma han generado diferentes aplicaciones de las NAT. Para donaciones individuales destinadas para transfusión en las que no se aplica un proceso de inactivación o depuración, y en las cuales las pruebas son el único método para evitar una donación contaminada, se debe garantizar la seguridad de cada donación individual utilizando los métodos más sensibles posibles. En constraste, el plasma destinado para fabricación posterior se combina y funciona como el material inicial para un proceso de múltiples etapas que incorpora metodologías de inactivación de patógenos. Por lo tanto, las pruebas de detección específicas NAT para plasma utilizado para fabricación posterior se centran en garantizar donaciones seguras y en limitar la carga viral del plasma combinado a niveles menores que la capacidad conocida de inactivación/depuración viral del proceso.
USP 39
Información General/ (1180) Plasma Humano 1661
Para evitar la pérdida de grandes cantidades de plasma de una combinación con reacción positiva, la industria del fraccionamiento ha implementado una estrategia de pre-selección, el concepto de selección de minicombinaciones mencionado anteriormente. Se combinan alícuotas de plasma de donaciones para formar minicombinaciones y éstas últimas se analizan mediante NAT. Si una minicombinación tiene reacción positiva para un virus analizado, la donación individual que originó este resultado positivo puede ser identificada e interceptada. Las otras donaciones que demuestran estar exentas de infecciones pueden usarse para fabricación. Posteriormente, las donaciones se mezclan en una combinación para producción de la cual se obtiene una muestra que se somete al análisis mediante NAT según lo requerido por los reglamentos. Conforme a lo indicado, la cartera de pruebas NAT no es uniforme y depende del uso previsto de la donación, así como del marco reglamentario. Aunque la detección sistemática de ARN VHC se lleva a cabo en la mayoría de los países, las pruebas específicas para VIH no son un requisito universal. La detección mediante NAT de VHB se usa principalmente en el plasma para fabricación. Las pruebas específicas para el virus Bl 9 o virus de la hepatitis A (VHA) se realizan únicamente en plasma para fabricación. Las pruebas específicas para VHB usando detección mediante NAT son mucho más extensas en países europeos y asiáticos que en los Estados Unidos.
Suspensión de Elegibilidad del Donante Un donante puede ser rechazado en donaciones posteriores como consecuencia de las respuestas provistas en un cuestionario de antecedentes del donante, luego de aconsejar donantes sobre las razones para la suspensión de elegibilidad, mediante un examen médico realizado en el momento de la donación o por pruebas positivas de enfermedades infecciosas. Estos procesos aseguran tanto la elegibilidad del donante como la aptitud de la donación. En caso de que ninguno de estos sea aceptable, los procesos normativos eliminan permanentemente al donante e interceptan las unidades previamente donadas que no hayan sido usadas. Los registros de donantes mencionados anteriormente son una manera de asegurar que un donante rechazado en un centro no pueda donar en otro lugar.
Cuarentena e Inventario de Espera Cada unidad individual de plasma, ya sea para transfusión o fabricación posterior, se retiene en cuarentena hasta que se hayan completado todas las pruebas requeridas. La unidad podrá ser liberada cuando se hayan llevado a cabo todas las pruebas requeridas y se hayan obtenido resultados aceptables; de lo contrario, la unidad debe ser destruida. La industria del plasma ha implementado voluntariamente el protocolo de inventario de espera (también analizado en la sección previa Selección del Donante) de plasma para fabricación. De acuerdo con los requisitos de inventario de espera, una donación de plasma individual no puede usarse para fabricación durante un periodo de retención de 60 días. La justificación para la retención es que donantes recientemente infectados por un patógeno, podrían no haber desarrollado niveles de anticuerpo al momento de la donación, por lo que su donación resulta en una unidad infecciosa a pesar de los resultados negativos de las pruebas. La retención proporciona suficiente tiempo para que un donante infeccioso desarrolle niveles de anticuerpo que se detectarán durante una donación subsiguiente si el plasma estaba destinado para transfusión. La retención de 60 días también reduce la probabilidad de liberar una unidad infecciosa en el proceso de fabricación. Es posible que la introducción de las NAT haya disminuido la necesidad del inventario de espera, debido a que las NAT se centran en los virus infecciosos directamente y no se basan en la producción de anticuerpos que requiere tiempo. Debido a que las NAT no pueden detectar todos los virus y puesto que incluso las NAT tienen cierto límite (aunque muy bajo) de detección, el inventario de espera continúa siendo valioso y mantiene su lugar dentro de la industria de fraccionamiento de plasma.
Investigación Cada donación de plasma debe ser rastreable desde la donación hasta la eliminación final a fin de minimizar la transmisión potencial de un agente infeccioso. La rastreabilidad abarca todos los datos relacionados con el sitio de donación, información de identificación del donante, resultados de pruebas y datos relacionados con el transporte, almacenamiento y consignatario(s). La estrategia retrospectiva es un proceso para identificar e interceptar (poner en cuarentena) donaciones previas de un donante al que, en una donación subsiguiente, le ha sido detectada (1) una infección con un agente transmisible o (2) se ha determinado que no es adecuado para donar plasma debido a sus antecedentes, examen físico o información posterior a la donación. Aunque las estrategias retrospectivas son similares en la mayoría de los países, los procedimientos específicos pueden variar.
SISTEMAS DE CALIDAD La intención de esta sección es describir los principios y reglamentos generales que representan la base de los sistemas de calidad relacionados con la recolección de plasma. Los centros de recolección en los EE.UU. deben seguir las Buenas Prácticas de Fabricación vigentes, BPFV, derivadas del CFR y que se convierten en reglamentos de la FDA, pautas y normas industriales.
1662 (1180) Plasma Humano / Información General
USP 39
Los reglamentos de las BPF que rigen específicamente el plasma se encuentran en el Título 21 del CFR 600, Biological Products (Productos Biológicos): General (Generalidades); y 606, Current Good Manufacturing Practice (BPFV) for Blood and Blood Components (Buenas Prácticas de Fabricación Vigentes para Sangre y Componentes Sanguíneos). Los reglamentos de las BPFV más generales se encuentran en el Título 21 del CFR 21 O, Current Good Manufacturing Practice in Manufacturing, Processing, Packing, or General Holding of Drugs, General (Buenas Prácticas de Fabricación Vigentes en la Fabricación, Procesamiento, Envasado o Depósito General de Medicamentos, Generalidades); y en el Título 21 del CFR 211, Current Good Manufacturing Practice for Finished Pharmaceuticals (Buenas Prácticas de Fabricación Vigentes para Productos Farmacéuticos Terminados). Aunque los reglamentos para sistemas de calidad son parte del Título 21 del CFR para dispositivos médicos, estos se han extendido a otros aspectos de la fabricación como parte del inciso "c" en las BPFV y las Pautas de la FDA. 4 El sistema de calidad se divide en cuatro partes principales: responsabilidad gerencial, recursos, operaciones de fabricación y actividades de evaluación. Éstas son la base de los cinco sistemas de fabricación: producción, instalaciones y equipo, control del laboratorio, materiales y envasado y etiquetado. Los procedimientos de cada sistema están diseñados para permitir operaciones que faciliten la implementación de los requisitos de las BPFV. En muchos casos, estos requisitos se relacionan con la provisión de instalaciones y experiencia para cumplir con los requisitos de la Red de Seguridad de Cinco Capas (selección del donante, análisis de sangre, suspensión de elegibilidad del donante, cuarentena e investigación) analizados anteriormente. Las responsabilidades gerenciales incluyen proveer liderazgo; construir un sistema de calidad para la organización que cumpla con los requisitos; establecer políticas, objetivos y planes; y revisar los sistemas de calidad con una frecuencia definida. Los recursos incluyen contar con suficientes recursos para actividades operativas, planes de desarrollo del personal, instalaciones adecuadas y equipo adecuado, así como controlar operaciones asignadas a contratistas externos. La fabricación incluye diseñar, desarrollar y documentar productos y procesos, llevar a cabo y monitorear las operaciones y tratar inconformidades. Las actividades de evaluación incluyen analizar datos para detectar tendencias, realizar auditorías internas e iniciar acciones correctivas y preventivas. Un número de actividades de rutina requeridas relacionadas con la recolección y liberación de plasma o plasma normal recuperado 'a partir de sangre entera están vinculadas tanto a las pautas de las BPFV como a los sistemas de calidad. Estos incluyen el requisito de contar con procedimientos operativos estándar (POE) que abarquen todos los aspectos de la recolección, análisis y liberación. Asimismo, es necesario validar el equipo y los sistemas usados por el centro de recolección, incluyendo áreas con temperatura controlada, equipo de laboratorio, sistemas de aguas y sistemas informáticos. Es necesario adecuar el diseño y la operación de las instalaciones para llevar a cabo las tareas pendientes y prevenir la contaminación cruzada. Las instalaciones de recolección de plasma deben contar con un número adecuado de personal competente y capacitado así como con procedimientos de aceptación y liberación de materias primas. En la medida de lo posible, las instalaciones de recolección deben cumplir con los requisitos de las BPF para instalaciones de fabricación farmacéutica.
GLOSARIO Aféresis-Método para obtener uno o más componentes sanguíneos mediante procesamiento de sangre entera en máquinas; los componentes sanguíneos residuales se devuelven al donante durante o al final del proceso. Centro-Sitio o lugar de recolección en el que se recolecta sangre o plasma (y también puede ser procesado y almacenado). Centro también es aplicable al Sitio de recolección de sangre (ver la entrada en el glosario). Centro Hematológico-Cualquier estructura u organización responsable de alguno de los aspectos de la recolección y pruebas de sangre humana o componentes sanguíneos, cualquiera que sea su propósito, y de su procesamiento, almacenamiento y distribución. Los servicios de transfusión en hospitales relacionados únicamente con pruebas de compatibilidad y transfusión sanguínea y de hemoderivados no se incluyen dentro de la definición de centro hematológico. Combinaciones de pequeñas alícuotas de plasma de donantes (minicombinaciones)-Combinación de un pequeño número de unidades o muestras representativas de donaciones usada para las pruebas previas a la combinación de unidades para fabricación. Componente sanguíneos-Componentes de la sangre humana: eritrocitos, leucocitos, plaquetas o plasma. Crioprecipitado-Componente del plasma preparado a partir de plasma fresco congelado mediante precipitación de proteínas por congelación-descongelación y la concentración y resuspensión subsiguientes de las proteínas precipitadas en un volumen pequeño del plasma. Cuarentena-Aislamiento físico de los componentes sanguíneos o materiales/reactivos recibidos durante un periodo variable mientras se espera la aceptación, emisión o rechazo de los componentes sanguíneos o materiales/reactivos recibidos. Distribución-Acción de entregar sangre y componentes sanguíneos a otros centros hematológicos, bancos de sangre de hospitales y fabricantes de hemoderivados. Hemoderivado-Cualquier producto terapéutico derivado de sangre o plasma humanos. Plasma combinado (pool) para uso en producción-Combinación de un número especificado de donaciones de plasma usada como el primer paso en la fabricación de derivados del plasma. Rechazo-Suspensión temporal o permanente de la elegibilidad de un individuo para donar sangre o componentes de la sangre. 4 FDA. Guidance for lndustry: Quality Systems Approach to Pharmaceutical BPFV Regulations. 2006. Disponible en www.fda.gov/cber/gdlns/qualsystem.htm.
Información General/ (1180) Plasma Humano 1663
USP 39
Sitio de recolección de sangre-Cualquier lugar en el que un centro hematológico lleva a cabo la recolección de sangre, sin incluir instalaciones que no sean propiedad o no sean administradas por el centro hematológico en el que se recolecta sangre o cualquier unidad móvil de recolección de sangre. Validación-Establecimiento de pruebas documentadas y objetivas que permitan el cumplimiento constante con los requisitos particulares de un uso previsto específico. ABREVIATURAS MBB
American Association of Blood Banks (Asociación Estadounidense de Bancos de Sangre)
SIDA
Síndrome de inmunodeficiencia adquirida
CFR
Cede of Federal Regulations (Código de Reglamentos Federales)
ECJ
Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob
CMV
Citomegalovirus
SNC
Sistema nervioso central
ADN
Ácido desoxirribonucleico
EBV
Virus Epstein-Barr
EIA
Enzimoinmunoensayo
UE
Unión Europea
FBS
Suero fetal bovino
FDA
Food and Drug Administration (Administración de Alimentos y Medicamentos de los EE.UU.)
FFP
Plasma fresco congelado
FP24
Plasma conqelado dentro de las 24 horas después de la flebotomía
BPFV
Buenas Prácticas de Fabricación Vigentes
VHA
Virus de la hepatitis A
HBsAg
Antígeno de superficie del virus de la hepatitis B
VHB
Virus de la hepatitis B
HCT
Hematocrito
VHC
Virus de la hepatitis C
VIH
Virus de inmunodeficiencia humana
ALH
Antíqenos de leucocitos humanos
HTLV
Virus Linfotrópico humano de Células T
lgA, lgG, lgM
lnmunoglobulinas A, G y M, respectivamente
IQPP
lnternational Quality Plasma Program (Proqrama Internacional de Calidad del Plasma)
UI
Unidad internacional
NAT
Tecnoloqías de amplificación de ácidos nucleicos
NDDR
Registro Nacional de Suspensión de Elegibilidad de Donantes
PCR
Reacción en cadena de la polimerasa
PPTA
Plasma Protein Therapeutics Association (Asociación para el Tratamiento con Proteínas Plasmáticas )
PRP
Plasma rico en plaquetas
ARN
Ácido ribonucleico
SARS
Síndrome agudo respiratorio severo
PRT
Plasma de reemplazo terapéutico
WBDP
Plasma derivado de sangre entera
WNV
Virus del Nilo occidental
APÉNDICES Apéndice 1 NOTA-La recolección, procesamiento y usos del plasma han generado una gran cantidad de términos y definiciones que reflejan la diversidad de las operaciones. Además de las normas y términos de la FDA, la sección Consideraciones sobre la Seguridad del Plasma analiza normas voluntarias que se aplican en la industria. Nota: Estos términos no son definiciones reglamentarias, debido a que las definiciones de términos para plasma pueden variar entre regiones y sectores industriales. Se recomienda al lector consultar con las autoridades reglamentarias responsables de la región y del sector industrial. A menudo, se deben considerar variables específicas del proceso.
Apéndice 1: Ti
--.---------
Tipo de Plasma y Agencia o Tipo de Agencia
--
--.---
de PI --
-
- - - - - - - - .1
E
lfl
Asl
d
--...---------------- ----.,-------
...---
--- --.,-------
---=--------------- --- .-- lsdlccl
d
Especificación
Plasma Recuperado CFR
MBB lnterregión, lntersector
Plasma derivado de unidades individuales de sangre entera como un subproducto en la preparación de componentes sanguíneos a partir de la recolección de sangre entera y destinado para fabricación. Compliance Policy Cuides Manual (Manual de Guías para el Cumplimiento de Políticas o CPG 7134.12), Sección 230.1 OO. Plasma para uso en fabricación y preparado a partir de donaciones alogénicas. Plasma seleccionado para fabricación que se ha recolectado de sangre entera o plasma de aféresis recolectado para transfusión que ya ha caducado. Plasma separado de sangre entera regularmente mediante centrifugación manual o aféresis. La prioridad de la sangre recolectada es generalmente la producción de eritrocitos. No obstante, el plasma puede ser adecuado para la fabricación de productos bioterapéuticos y transfusión. El tiempo desde la recolección hasta la congelación puede variar dependiendo de la distancia entre los sitios de recolección y procesamiento. Resulta común el uso de donantes voluntarios.
Plasma de Origen CFR
Porción fluida de sangre humana recolectada por plasmaféresis y destinada como material de origen para su uso en fabricación (Título 21 del CFR 640.60).
lnterregión, lntersector
Plasma separado de sangre entera mediante plasmaféresis en la que los componentes celulares pueden ser devueltos al donante. La prioridad para el plasma por lo general se centra en la fabricación de productos bioterapéuticos. No obstante, el plasma puede ser adecuado para transfusión. Se congela rápidamente después de la recolección.
~
,,-...
......
00
o ._.,,, -o
.,,Di" 3
Q¡
:r: e
3Q¡ :::::i
o ..._ S"
O'
~
o
a. o, :J
Plasma fresco congelado (FFP) CFR
O\ O\
C)
El plasma fresco congelado deberá prepararse a partir de sangre recolectada mediante una sola punción venosa ininterrumpida con daño y manipulación mínimos del tejido del donante. El plasma deberá separarse de los eritrocitos y colocarse en un congelador dentro de las 8 horas o dentro del tiempo establecido en las instrucciones de uso para el sistema de recolección, procesamiento y almacenamiento de sangre, y almacenarse a una temperatura de -18º o inferior [Título 21 del CFR 640.34(b)].
MBB
Plasma separado de la sangre de un donante individual y colocado a una temperatura de -18º o inferior dentro de las 6 - 8 horas de la recolección del donante o dentro del tiempo especificado en las instrucciones del fabricante.
lnterregión, lntersector
Plasma que se recolecta y congela rápidamente después de la preparación. La transfusión es el uso previsto primario. No obstante, el FFP puede ser adecuado para la fabricación de productos bioterapéuticos.
Consejo de Europa
Componente para transfusión o para fraccionamiento preparado a partir de sangre entera o de plasma recolectado mediante aféresis, y que se congela dentro de un periodo y a una temperatura que mantendrán adecuadamente los factores de coagulación lábiles en un estado funcional (Capítulo 21 ).
RU
Sobrenadante de plasma separado de una donación de sangre entera o plasma recolectado por aféresis, congelado y almacenado.
Australia
El Plasma Fresco Congelado es un componente para transfusión o fraccionamiento preparado a partir de sangre entera o de plasma recolectado por aféresis, y que se congela dentro de un periodo y a una temperatura que mantendrán adecuadamente los factores de coagulación lábiles en un estado funcional. Si se prepara a partir de sangre entera, es preferible recuperarlo dentro de las 6 horas, y no más de 18 horas, después de la recolección si la unidad ha sido refrigerada. El plasma también se puede recolectar hasta dentro de las 24 horas si la sangre recolectada ha sido enfriada inmediatamente y mantenida a una temperatura de 20-24º. El plasma separado debe congelarse a una temperatura inferior a -30º dentro de la primera hora. Conforme a lo anterior, la congelación del plasma recolectado por aféresis debe comenzar dentro de las 6 horas de la recolección o dentro de las 24 horas si la sangre recolectada ha sido enfriada inmediatamente y mantenida a una temperatura de 20-24º.
~ rl)
ª-
Plasma concurrente lnterregión, lntersector
Plasma recolectado de manera concurrente con componentes celulares. El plasma concurrente puede ser adecuado para transfusión o para fabricación de productos bioterapéuticos.
Candidato a Donante lnterregión, lntersector
Plasma Rico en Plaquetas (PRP)
Plasma de Origen obtenido durante la primera recolección de un nuevo donante. El plasma se reserva para las pruebas y no se permite el uso en humanos de ningún producto remanente o de productos derivados del remanente, o se ponen en cuarentena hasta que el donante pase las pruebas adecuadas y acuda para una segunda donación que también pasa las pruebas. En ese momento, ambas recolecciones se reclasifican como "Calificadas".
eV1
-o w
\O
Apéndice 1: TI Tipo de Plasma y Agencia o Tipo de Agencia
de PI
E
ifl
d
R1
lurlsdlccl
Sel
das (C1
., 1)
Especificación
CFR
El PRP deberá prepararse a partir de sangre recolectada mediante una sola punción venosa ininterrumpida con daño y manipulación mínimos del tejido del donante. El plasma deberá separarse de los eritrocitos mediante centrifugación dentro de las 4 horas después de completar la flebotomía o dentro del periodo especificado en las instrucciones de uso del sistema de recolección, procesamiento y almacenamiento de sangre. Deberá demostrarse que el tiempo y la velocidad de centrifugación producen un producto de al menos 250 000 plaquetas por µL. El plasma deberá almacenarse a una temperatura entre 20º y 24º inmediatamente después de llenar el envase final. Deberá mantenerse una agitación suave y continua del producto durante todo el periodo de almacenamiento si se almacena a una temperatura de 20º a 24º [Título 21 del CFR 640.34(d)].
lnterreqión, lntersector
Plasma producto de la primera centrifugación de sangre en la que se separa de los eritrocitos. Las plaquetas se fraccionan en la capa de plasma.
eVI
-o w
\O
Plasma pobre en plaquetas lnterregión, lntersector
Plasma que se purifica adicionalmente de plaquetas mediante una sequnda centrifuqación del PRP.
Plasma pobre en crioprecipitado CFR
El plasma que se conserva después de la eliminación de plaquetas y de factor antihemofílico crioprecipitado (AHF, por sus siglas en inglés) se puede etiquetar como "Plasma Reducido en Crioprecipitado [fítulo 21 del CFR 640.34(e)(2)].
MBB
Plasma Reducido en Crioprecipitado; Plasma Fresco Congelado del que se ha eliminado el crioprecipitado.
lnterregión, lntersector
Plasma que se ha descongelado manteniendo la temperatura justo por encima de la temperatura de congelación (usualmente 4º). Porción grande de ciertas proteínas de plasma (p.ej., FVlll, crioprecipitado, fibrinógeno, fibronectina o FXlll) que ha sido precipitada del plasma.
Consejo de Europa
Plasma, Fresco Congelado, Sin Crioprecipitado (Capítulo 23). Componente preparado a partir de plasma mediante la eliminación de crioprecipitado.
Reino Unido
El término plasma sin crioprecipitado para transfusión se refiere al componente de plasma preparado a partir de una unidad de plasma fresco congelado. Comprende la porción residual después de que se ha eliminado el crioprecipitado.
Australia
El Plasma Fresco Congelado Sin Crioprecipitado es un componente preparado a partir de Plasma Fresco Congelado mediante la eliminación del crioprecipitado. Se mantiene el contenido de albúmina, inmunoglobulina y la mayoría de los factores de coagulación, pero se reducen los niveles de los Factores V y VIII y de fibrinógeno. Se puede almacenar hasta 36 meses a una temperatura inferrior a -25º.
Plasma enriquecido en crioprecipitado lnterreqión, lntersector
Plasma que se ha descongelado mediante la aplicación de calor suave (p.ej., en un baño de agua a 37º) donde el crioprecipitado se mantiene disuelto.
Plasma para productos lábiles lnterregión, lntersector
Plasma que ha sido recolectado y que mejor mantiene la actividad e integridad de las proteínas del plasma lábiles, lo cual se ejemplifica con el Factor de coagulación VIII. Por lo general, el tiempo desde la recolección, pasando por el procesamiento y hasta la congelación es rápido.
Plasma para productos estables lnterregión, lntersector
Plasma que ha sido recolectado para el que no se pudieron lograr las condiciones de conservación de los productos lábiles, pero las condiciones fueron lo suficientemente moderadas para no impactar a los productos relativamente estable tales como lqG y albúmina.
Plasma de menos de 6 horas lnterregión, lntersector
Por lo general, se trata de plasma recuperado que ha sido recolectado, procesado y congelado antes de las 6 horas posteriores a la recolección. Este plasma por lo general se considera aceptable para la producción de productos lábiles.
º' ~
C'\
gi
ª-
....__
_.
/"-...
00
Por lo general, se trata de plasma recuperado que ha sido recolectado, procesado y congelado en un periodo mayor de 6 horas y menor de 12 horas después de la recolección. Este plasma por lo general se considera aceptable para la producción de productos lábiles pero es inferior al plasma de 6 horas para dicho propósito.
o ...._,,
Por lo general, se trata de plasma recuperado que ha sido recolectado, procesado y congelado en un periodo mayor de 12 horas y menor de 24 horas después de la recolección. Este plasma puede ser aceptable para la producción de productos lábiles pero es inferior al plasma de 6 horas y al plasma de 6 a 12 horas para dicho propósito.
:r: e:
Plasma de 12 a 24 horas lnterregión, lntersector
3 8. l"I)
Plasma de 6 a 12 horas lnterregión, lntersector
SO'
-o
¡:¡;-
"' 31:1) 31:1)
::s
Plasma de menos de 12 horas
o_.
°'°' \JI
so1n1~d1?)
- --------- -- - ----Tipo de Plasma y Agencia o Tipo de Agencia
lnterregión, lntersector
Plasma de más de 24 horas lnterregión, lntersector Plasma combinado lnterregión, lntersector Plasma de un solo donante lnterregión, lntersector Plasma hiperinmune lnterregión, lntersector
Plasma tratado con Disolventes/Detergentes lnterregión, lntersector
UE (PharmEuropa)
-- - -------
-----· fi
.d
-
°'°' °'__.
Especificación
,,-....
Por lo general, se trata de plasma recuperado que ha sido recolectado, procesado y congelado en menos de 12 horas después de la recolección. Este plasma puede ser aceptable para la producción de productos lábiles pero es inferior al plasma de menos de 6 horas y al plasma de 6 a 12 horas para dicho propósito.
o ..__,,
00
"iií Por lo general, se trata de plasma recuperado que ha sido recolectado, procesado y congelado en más de 24 horas después de la recolección y por lo regular menos de 72 horas después de la recolección. Este plasma generalmente no es aceptable para la producción de productos lábiles.
"'3 Q¡
I
e:
Plasma recolectado de varios donantes que ha sido combinado para fabricación. Algunas combinaciones de plasma para fabricación de productos bioterapéuticos se pueden derivar de varios cientos a unos pocos miles de donantes.
3Q¡ ~
o
-.... Plasma derivado de un solo donante. Puede tratarse de una sola unidad o de una combinación de varias unidades derivadas de múltiples recolecciones del mismo donante.
5" O'
ª
Q
Plasma derivado de donantes con niveles de titulación elevados para agentes infecciosos específicos. Los niveles de titulación son elevados en estos donantes en su mayoría como resultado de la inmunización con una vacuna (p.ej, hepatitis B, tétanos o rabia) o la exposición a agentes infecciosos (p.ej., VHC o SARS). El plasma hiperinmune por lo general está destinado para la preparación de lgG para proveer inmunidad pasiva contra agentes infecciosos determinados.
Q. o,
::3
C'I
~ ~
ª-
Plasma que ha sido tratado con disolventes/detergentes, un método de inactivación efectiva contra agentes infecciosos virales con envoltura (p.ej., VIH, VHB o VHC). Algunos componentes de proteínas del plasma se desactivan o dañan a través del proceso (p.ej., inhibidor de proteinasa alfa-1, Proteína S, anti-plasmina o FVlll). El Plasma Humano Combinado y Tratado para lnactivación Viral es una preparación liofilizada, estéril y apirogénica que se obtiene a partir de plasma humano derivado de donantes que pertenecen al mismo grupo sanguíneo ABO. La preparación se descongela o reconstituye antes de su uso para proporcionar una solución para infusión. El plasma humano usado cumple con la monografía de Plasma Humano para Fraccionamiento.
Plasma de Reemplazo Terapéutico (PRT) lnterregión, lntersector
Plasma en cuarentena Jnterregión, lntersector
Plasma residual en cuarentena lnterregión, lntersector
Plasma recuperado lnterregión, lntersector Plasma para fraccionamiento (Requisitos de procesamiento)
Es similar al Plasma de Origen en lo que respecta a la recolección. Sin embargo, los donantes son pacientes a los que se les reemplaza su plasma con electrolitos, soluciones proteicas o plasma de otro donante. El objetivo por lo general radica en eliminar los elementos infecciosos del plasma del paciente. En general, el PRT no es recomendable para la fabricación de productos bioterapéuticos. Sin embargo, pueden existir casos en los que un producto de especialidad proponga el uso de PRT específico como material de origen. Plasma que ha sido recolectado y para el que no se han completado las pruebas iniciales y/o que no ha sido almacenado como parte de un programa de donante controlado. El donante se somete una vez más a las pruebas para detectar agentes infecciosos (p.ej., 6 meses después de la recolección). Si el donante resulta nuevamente negativo en la prueba de agentes infecciosos, entonces el plasma se libera para su uso en la fabricación y/o en humanos. Plasma que ha sido recolectado y almacenado como parte de un programa de donante controlado. El donante no fue sometido una vez más a las pruebas para detectar agentes infecciosos (p.ej., 6 meses después de la recolección). Un ejemplo sería que el donante no regresó a la instalación de recolección para someterse a las pruebas posteriores. El Plasma Residual en Cuarentena no se recomienda para la fabricación y/o uso en humanos. Plasma que ha experimentado una desviación de temperatura durante el almacenamiento o transporte pero que aún puede ser útil para la preparación de productos no lábiles tales como albúmina o lqG.
eVl
"w
\()
Apéndice 1: Tipos de Plasma y Especificaciones Asignadas por las Agencias Reglamentarlas en Jurisdicciones Seleccionadas (Continuación) Tipo de Plasma y Agencia o Tipo de Agencia CFR Australia
UE (PharmEuropa)
Plasma congelado dentro de las 24 horas después de la flebotomía CFR
1
Especificación
eVl
-e w
\O
Colocado en un congelador dentro de las 8 horas y almacenado a una temperatura de -18º o inferior. La parte líquida de la sangre humana remanente después de la separación de los elementos celulares de la sangre, que se recolecta en un recipiente que contenga un anticoagulante o que se separa mediante filtración o centrifugación continuas de sangre anticoagulada en un procedimiento de aféresis. Se destina para la fabricación de productos derivados de plasma. Cuando el plasma está destinado para la recuperación de proteínas que son lábiles en plasma, se congela rápidamente a una temperatura de -25º o inferior dentro de las 24 horas de la recolección. Para la recuperación de proteínas no lábiles, el plasma debe congelarse a una temperatura de -20º o menor tan pronto como sea posible y a más tardar dentro de las 72 horas de la recolección. El plasma congelado se almacena y transporta en condiciones designadas para mantener la temperatura a -20º o inferior. Aunque por razones accidentales la temperatura de almacenamiento puede elevarse por encima de -20º en una o varias ocasiones durante el almacenamiento y transporte, el plasma aún se considera adecuado para su uso en fraccionamiento si se cumplen todas las condiciones siguientes: el periodo total durante el cual la temperatura sobrepasa los -20º no excede de 72 horas; la temperatura no excede de -15º en más de una ocasión; la temperatura en ningún momento excede de -5º. El plasma humano para fraccionamiento es la parte líquida de la sangre humana remanente después de la separación de los elementos celulares de la sangre, que se recolecta en un recipiente que contenga un anticoagulante o que se separa mediante filtración o centrifugación continuas de sangre anticoagulada en un procedimiento de aféresis. Está destinado a la fabricación de productos derivados de plasma. Cuando se obtiene mediante plasmaféresis o a partir de sangre entera (después de la separación de los elementos celulares), el plasma destinado para la recuperación de proteínas que son lábiles en plasma se congela dentro de las 24 horas de la recolección enfriando rápidamente en condiciones validadas para asegurar que el núcleo de cada unidad de plasma alcance una temperatura de -25º o inferior dentro de las 12 horas después de haber sido colocado en el aparato de congelación. Cuando se obtiene por plasmaféresis, el plasma destinado únicamente para la recuperación de proteínas que no son lábiles en plasma se congela enfriando rápidamente en una cámara a una temperatura de -20º o inferior tan pronto como sea posible y a más tardar dentro de las 24 horas de la recolección. Cuando se obtiene a partir de sangre entera, el plasma destinado únicamente para la recuperación de proteínas que no son lábiles en plasma se separa de los elementos celulares y se congela en una cámara a una temperatura de -20º o menor tan pronto como sea posible y a más tardar dentro de las 72 horas de la recolección. El plasma congelado se almacena y transporta en condiciones designadas para mantener la temperatura a -20º o menos. Aunque por razones accidentales la temperatura de almacenamiento puede elevarse por encima de -20º en una o varias ocasiones durante el almacenamiento y transporte, el plasma aún se considera adecuado para su uso en fraccionamiento si se cumplen todas las condiciones siguientes: el periodo total durante el cual la temperatura sobrepasa los -20º no excede de 72 horas; la temperatura no excede de-=-l_i"_~más_ de un~c~ó~ la_te111perat~ra E!n 11ingún momento excede de -5º.
SO' El plasma fabricado a partir de sangre entera debe congelarse dentro de las 24 horas posteriores a la flebotomía. El etiquetado del componente de la sangre debe incluir la leyenda "Plasma Congelado Dentro de las 24 Horas posteriores a la Flebotomía."
3o I"\
g:
("¡
~ t1)
ª-
..__
,......_ _.
00
o .___,.
-e ¡¡¡-
"' 3tll :e e:
3tll ::::l
o_.
°'°' 'J
Capítulos _.
Apéndice 2: Criterios de Selección de Donantes Reglón Crlterfo
Estados Unidos
Reino Unido
Australia
Criterios generales para donación de sangre El donante debe presentar una apariencia saludable (MBB)
Condiciones médicas subyacentes
La mayoría de las condiciones médicas serias son motivo de rechazo en las pautas de los Estados Unidos, la UE y el Reino Unido. Las pautas de la FDA requieren el rechazo únicamente si una persona ha usado insulina bovina fabricada a partir de ganado del Reino Unido. Sin embargo, las pautas de la MBB requieren el rechazo por cáncer, enfermedad cardíaca, hepática o de pulmón y por tendencia al sangrado a menos que lo apruebe un director médico. El cáncer y la enfermedad cardíaca, así como la diabetes tratada con insulina, requieren de rechazo permanente con base en las pautas de la UE y el Reino Unido
<': 16 años o de conformidad con la ley estatal aplicable (MBB, sangre entera)
......... _.
_.
00
Apariencia
Edad
°'°'
00
Unión Europea
El donante debe estar saludable
Entre 18 y 65 años; la donación a los 1 7 años se permite siempre que cumpla con la legislación nacional; nuevos donantes de más de 60 años únicamente si lo autoriza un médico.
Únicamente se aceptan donantes saludables
No se proporcionan comentarios específicos La mayoría de las condiciones médicas serias son motivo de rechazo. Cáncer: se acepta después de 5 años de la remisión médica. Enfermedad cardíaca: varía dependiendo de la condición clínica. Diabetes: se acepta cuando esté siendo controlada.
Sangre entera: entre 1 7 y 65 años; no se aceptan nuevos donantes de más de 60 años. Aféresis: nuevos donantes entre 18 y 60 años; se aceptan donantes de hasta 65 años.
Sangre entera: pueden empezar a los 16-1 7 años con la autorización de los padres y continuar hasta los 80 años, aunque se requiere revisación médica para edades mayores de 70 años. Aféresis: acepta nuevos donantes de 18-65 años, pero se requiere evaluación médica para edades mayores de 60 años. Los donantes existentes requieren revisación médica anual si son mayores de 65 años.
Peso
No se proporcionan comentarios específicos: no pueden extraerse más de 10,5 mL/kg (MBB). La FDA requiere que los donantes de Plasma de Origen pesen al menos 50 kq (11 O lb).
Sangre entera: <':50 kg Aféresis: no se presentan requisitos de peso específicos.
Sangre entera: <':50 kg Aféresis: <':50 kg
<45 kg-rechazar. Se requiere una opinión médica en caso de pérdida de peso sin explicación.
Presión sanguínea
Sistólica sl 80 mm Hg Diastólica Sl 00 mm Hg (MBB)
Sistólica Sl 80 mm Hg Diastólica sl 00 mm Hg
No se especifican parámetros de presión sanguínea; los donantes con presión sanguínea alta pueden donar siempre que (1) no hayan sufrido complicaciones ocasionadas por la presión sanguínea alta, (2) están tomando únicamente beta bloqueantes y/o diuréticos y (3) su enfermedad es estable conforme lo determine el personal médico calificado.
Intervalos aceptables: Sistólica 90-180 mm Hg. Diastólica 60-90 mm Hg. Hipertensión 180-100: rechazar. Hipotensión 90-60: rechazar.
Pulso
Entre 50 y 100 latidos por minuto y regular; se aceptan pulsos menores a discreción del médico (MBB).
Entre 50 y 100 latidos por minuto y reguiar
No se especifican parámetros de velocidad de pulso.
Pulso regular entre 50 y 100: aceptar. Pulso entre 40 y 49: aceptar si el donante está en buena condición física y no usa medicamentos.
Temperatura
S37,5º tomada por vía oral al momento de la donación (MBB)
Los donantes que hayan presentado una temperatura de <':38º no pueden donar durante 2 semanas.
Los donantes que hayan presentado una temperatura de <':38º o síntomas parecidos a la influenza no pueden donar durante 2 semanas.
No se especifican requisitos.
o ..._,,,
"'ti
Di'"
V>
3
DJ
I
e:
3
DJ
::J
o ..__ SO'
ª
Cl
("\
o~ ;::¡
()
~
ti)
ª-
e
Vl "'ti
w
\O
Aoéndlce 2: Crl
de Selección de D
eVl
" 1)
(C1
""Q
Reglón Criterio
Estados Unidos
HgB/HCT
~125
Examen de la piel
Embarazo
Reino Unido
Unión Europea
Australia
Hombres: ~135 g/L Mujeres: ~125 g/L
Hombres: ~135 g/L Mujeres: ~125 g/L
Sangre entera: mujeres, 120-165 g/L; hombres, 130-185 g/L Aféresis: mujeres, 115-165 g/L; hombres, 125-185 g/L. Si es alta, rechazar. Si es baja, rechazar durante 6 meses y realizar una prueba de ferritina.
Libre de enfermedades infecciosas de la piel en el sitio de la flebotomía; sin punciones o cicatrices en la piel que indiquen la adicción a narcóticos autoinyectados (CFR). Exento de enfermedades infecciosas {AABB).
La piel en el sitio de la punción venosa debe estar libre de lesiones, incluyendo eczema.
No debe presentar enfermedad de la piel en el sitio de la punción venosa.
Evitar la punción venosa cuando exista evidencia de inflamación o infección.
Rechazar durante 6 semanas después del parto {AABB).
Rechazar durante 6 meses después del parto.
Rechazar durante 1 semana por cada semana de embarazo completada.
Actual: rechazar durante 9 meses a partir de la fecha estimada del parto. Después del parto en el tercer trimestre: rechazar durante 9 meses. Aborto espontáneo o aborto inducido: rechazar durante 3, 6 ó 9 meses, respectivamente para el 1er, 2do y 3er trimestre.
g/L o HCT 38%
w
\O
Condiciones médicas subyacentes que requieran el rechazo y que no representen un riesgo de infección transmisible por transfusión Cáncer
Cardiopatía
Enfermedades cerebrd\/ascu lares
Rechazo permanente a menos que el director médico lo considere adecuado (AABB).
Sin enfermedades en órganos vitales (corazón, hígado y pulmones) a menos que lo considere adecuado el director médico (AABB).
No se proporciona una pauta específica aparte de que el donante debe estar libre de enfermedades en órganos vitales (AABB).
Rechazo permanente, salvo excepciones hechas por un médico. Se permite después de cáncer cervical o carcinoma de células basales cuando se los ha tratado con éxito.
Rechazo permanente para personas con historial de cardiopatía, en especial enfermedad coronaria, angina de pecho, arritmia cardíaca severa, trombosis arterial o trombosis venosa recurrente. Rechazo de 2 años para enfermedad cardíaca reumática sin evidenca de enfermedad crónica.
Rechazo permanente para historiales de enfermedades cerebrovasculares.
Las neoplasias malignas, incluyendo leucemias y trastornos mieloproliferativos son motivo de rechazo permanente; se pueden hacer excepciones para algunas condiciones, siempre que la terapia haya sido exitosa.
Rechazo permanente para neoplasias hematológicas. Cáncer en la piel-carcinoma basal-celular: aceptar. Otros cánceres: rechazar durante 5 años después de completar el tratamiento.
Rechazo permanente para personas con enfermedad cardiovascular severa activa o pasada, excepto por anormalidades congénitas completamente resueltas.
Rechazo permanente para arritmias, endocarditis, cardiopatía isquémica, cirugía de corazón, miocardiopatía. Aceptar: cardiopatía congénita cuando se haya corregido mediante cirugía. Soplos cardíacos: aceptar, basándose en la opinión médica. Aceptar después de la recuperación total: enfermedad del pericardio, cardiopatía reumática.
Rechazo permanente para donantes con historiales de enfermedades del SNC.
Rechazo permanente
5"" O' ~ Q n
g~ ()
~ ~
--ª-
,,,..._ _.
_.
00
o ..___,, ""Q
¡¡;..,,
3
!:11
::I:
e:
3
!:11 :::l
o_.
°'°' \O
so1n1~de)
Capítulos .......
°'o 'J
Reglón Criterio Epilepsia
Enfermedad gastrointestinal
Enfermedad genitourinaria y renal
Diabetes
Estados Unidos Sin rechazo
No se especifica rechazo; libre de enfermedades en órganos vitales a menos que lo considere adecuado el director médico (MBB).
No se especifica rechazo. Libre de enfermedades en órganos vitales a menos que lo considere adecuado el directo médico (MBB).
No se especifica rechazo excepto en el caso en que se utilice insulina bovina fabricada en el Reino Unido, lo cual requiere el rechazo permanente (FDA). Libre de enfermedad en órganos principales a menos que lo considere adecuado el director médico.
Reino Unido
Unión Europea
Australia
Debe estar libre de ataque epiléptico durante 3 años y haber finalizado con todo el medicamento.
Rechazo permanente a menos que hayan pasado 3 años desde la fecha en que el donante tomó por última vez medicamento anticonvulsivo y que los síntomas no se hayan presentado nuevamente.
Rechazar durante 2 años a partir de la última convulsión.
Rechazo (no se especifica si se trata de un rechazo permanente) para enfermedades que produzcan una absorción de hierro deficiente o pérdida de sangre.
Úlceras: rechazar indefinidamente.
Rechazo permanente de donantes con enfermedad genitourinaria o renal seria
Rechazo permanente: pielonefritis crónica, infección renal crónica, diálisis crónica Aceptar si la condición ha sido resuelta: hematuria, infección renal aguda. Catéter urinario presente: plasma únicamente para fraccionamiento si la condición subyacente es aceptable. Diálisis aguda: rechazar durante 12 meses. Glomerulonefritis aguda: rechazar durante 5 años después de la recuperación.
No se especifica rechazo.
Rechazo de cinco años desde la recuperación total de glomerulonefritis aguda
Rechazo permanente si se requiere de terapia con insulina.
Rechazo permanente para dondantes bajo tratamiento con insulina
,,-...
....... 00
.8 -¡;:¡
Dj'" VI
3 ::e e 3 Qj
Qj
:::i
o
5"" O' ~ c:i
'o~"' ::3 ()
~ ~
ª-
Rechazo permanente si se presentan complicaciones asociadas con la diabetes. Aceptar si la enfermedad está controlada, incluso si el paciente está tomando insulina.
e
<.n
iJ
w
\O
Aoéndlce 2: C .
de Sel - --
deD - - - ---
(C
eVI
., 1)
-O
Región Criterio
Estados Unidos
Reino Unido
Enfermedad respiratoria
Libre de enfermedad respiratoria aguda (CFR) Libre de enfermedad en órganos principales (pulmones) a menos que lo considere adecuado el director médico (MBB).
Rechazo permanente para bronquitis crónica; se acepta resfriado común.
Rechazo permanente para enfermedad seria
Rechazo permanente: absceso erónico, bronquiectasia o enfisema con insuficiencia respiratoria Aceptar si el padecimiento es moderado y controlado: asma, bronquiectasia sin insuficiencia respiratoria. Plasma únicamente para fraccionamiento: bronquitis crónica Bronquitis aguda: rechazar durante 2 semanas después de la recuperación y sin haber usado antibióticos durante 5 días. Pleuritis, neumonía: rechazar durante 4 semanas después de la recuperación. Embolia pulmonar aguda: rechazar durante 12 meses después de la recuperación.
Trastornos hematológicos
Libre de tendencia al sangrado anormal a menos que lo considere adecuado el director médico (MBB). Libre de enfermedad en órganos principales (cáncer) a menos que lo considere adecuado el director médico (MBB).
No se especifica rechazo. Los donantes que son heterocigotas para beta talasemia son elegibles si los valores de HgB están dentro de los límites normales.
Rechazo permanente para donantes con enfermedades hematológicas serias
Rechazo permanente: donantes con enfermedades hematológicas serias (anemia falciforme, talasemia mayor) Aceptar: talasemia menor. Rechazar: anemia. Plasma sólo para fraccionamiento: eliptocitosis, deficiencia de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD), esferocitosis Sólo se permite aféresis para pacientes con deficiencia de G6PD.
Trastornos inmunológicos
Enfermedad metabólica
Osteopatía
No se especifica rechazo. Libre de enfermedad en órganos principales a menos que lo considere adecuado el director médico (MBB).
No se especifica rechazo. Libre de enfermedad en órganos principales a menos que lo considere adecuado el director médico (MBB). No se especifica rechazo. Libre de enfermedad en órganos principales a menos que lo considere adecuado el director médico (MBB).
Rechazo permanente para donates con enfermedad autoinmune que afecte a más de un órgano. Rechazar: historial documentado de anafilaxis.
No se especifica rechazo.
Unión Europea
Rechazo permanente de donantes con enfermedades inmunológicas serias
Rechazo permanente para enfermedad metabólica seria
Australia
Rechazo permanente: trastornos autoinmunes Aceptar: si es asintomático, si la condición afecta únicamente el sistema de un órgano y si no está en terapia inmunosupresiva. Aceptar: Síndrome de Sjogren. Sin referencia específica
w
\()
S-
O'
ª
on
o~
:l C) (\:)
:l
(\:)
--ª-
,,...._ __. __.
00
9
-O
~
VI
Rechazo de dos años después de declararse curada la osteomielitis.
No se especifica rechazo.
Sin referencia específica
3tll I
e
3
tll ~
o
__.
°' '...J
Capítulos Apéndice 2: Criterios de Selección de D
1tes (Ci
_.
., 1)
O\ 'J
Reglón Criterio
Cirugía
Estados Unidos
Reino Unido
Unión Europea
Australia
No se especifica rechazo a menos que haya recibido transfusión sanguínea; en dicho caso, se aplica un rechazo de 12 meses (CFR).
Las cirugías mayores requieren de la evaluación de riesgo de enfermedades transmisibles por transfusión.
Rechazo permanente para personas con historial de gastrectomía. Las cirugías mayores requieren un rechazo de 6 meses; las cirugías menores requieren un rechazo de 1 semana.
Cirugía menor (p.ej., lesiones en la piel, artroscopía): rechazar hasta que esté recuperado. Cirugía menor de rutina (p.ej., apendicectomía, laparoscopía): rechazar durante 2 meses. Cirugía mayor (sólo si el donante recibió sangre autóloga): rechazar durante 6 meses. Neurocirugía: evaluación médica requerida.
Medicamentos que requieren rechazo Antibióticos
Según lo defina el director médico (AABB).
Los donantes tratados con cualquier fármaco de venta restringida deben ser rechazados durante un periodo congruente con las propiedades farmacocinéticas del medicamento.
Rechazar durante 2 semanas a partir de la recuperación total o 1 semana a partir del final de la terapia con antibióticos, lo que abarque más tiempo.
Tratamiento agudo: rechazar hasta que esté recuperado y libre de antibióticos durante 5 días. Profiláctico: aceptar plasma únicamente para fraccionamiento. Tópico: aceptar si la piel no presenta fracturas ni infecciones.
Los donantes tratados con fármacos con efecto teratogénico comprobado deben ser rechazados durante un periodo coherente con las propiedades farmacocinéticas del fármaco.
No se deben usar como donantes de sangre aquellos donantes que tomen fármacos con efectos teratógenos comprobados o potenciales o que tomen fármacos que se acumulen en los tejidos durante periodos prolongados
Raloxifeno (Evista): rechazar durante 6 meses después de completar el tratamiento. Acitretina (Neotigason): rechazar durante 3 años después de completar el tratamiento. Etretinato (Tigason): rechazo permanente. Finasterida (Prosear): rechazar 7 días después de completar el tratamiento. lsotretinoína: rechazar durante 8 semanas después de completar el tratamiento.
Medicamentos con potencial teratogénico
Etretinato: rechazo permanente (FDA) Acitretina: Rechazo de 3 años a partir de la última dosis (FDA) Dutasterida: rechazo de 6 meses a partir de la última dosis (FDA) lsotretinoína: rechazo de 1 mes a partir de la última dosis (FDA) Finasterida: rechazo de 1 mes a partir de la última dosis (FDA)
Hormona de crecimiento de hipófisis humana
Rechazo permanente (FDA)
Otros medicamentos
No se especifican otros rechazos por parte de la FDA o la AABB. Cualquier otra rechazo queda a discreción del director médico del centro de recolección de sangre (AABB). Warfarina: Rechazo de 7 días para donación de plasma (AABB).
Se recomienda tener disponible una lista de fármacos usados comúnmente con reglas para la aceptación de donantes aprobada por el personal médico del centro de transfusión.
Se pueden aceptar otros medicamentos siempre que la condición subyacente de quien toma el medicamento sea aceptable.
La mayoría de los medicamentos tomados por los donantes no son dañinos para los receptores; por lo tanto, las personas que tomen medicamentos pueden ser aceptados como donantes de sangre. Su elegibilidad se basa en la evaluación de la condición subyacente y en las pautas específicas del medicamento.
Insulina
Rechazo permanente: insulina bovina fabricada en el RU (FDA).
Rechazo permanente si está siendo tratado con insulina.
Rechazo permanente si está siendo tratado con insulina.
Rechazar si el control de la diabetes es deficiente.
l'-J _.,...,_
_.
_.
00
o ..__,..
"'C
¡:¡j" VI
3Sll :e e:
3Sll ::J
o
--
5"" O'
3
o
a. o,
::J
C\
~
(1)
ª-
Rechazo permanente
etn
"'C UJ
\O
, dice 2:
e.
de Sel
deD
e
. , ')
(C
VI
Región Criterio
Estados Unidos
Reino Unido
Unión Europea
Australia
-o w
\O
Inmunizaciones Sin rechazos
Toxoides
Sin rechazos
Sin rechazos
Vacunas de bacterias muertas auto rizadas
Sin rechazos
Sin rechazos
Vacunas de virus inactivados autorizadas
Sin rechazos
Sin rechazos
Vacunas de virus muertos no autorizadas
Rechazo de 1 año (AABB)
Vacunas de rickettsia inactivadas
Sin rechazos
Sin rechazos
Vacunas de bacterias y virus vivos atenuados
4 semanas para varicela y rubeola, 2 semanas para rubeola, fiebre amarilla, paperas, polio (oral), tifoidea (oral) (AABB)
4 semanas
8 semanas
Plasma únicamente para fraccionamiento durante 4 semanas después de la vacunación
Rechazo permanente para donantes con marcador positivo para VIH confirmado. Se debe informar acerca de los donantes en los que se halla un marcador positivo repetido para VIH que no puede ser confirmado, de acuerdo con el algoritmo acordado a nivel nacional.
Los donantes con VIH 1 o 11 deben ser rechazados permanentemente.
Infección: rechazo permanente Síntomas importantes dentro de los últimos 6 meses: rechazar durante 12 meses. Contacto sexual con pareja con VIH positivo: rechazar durante 12 meses después del último contacto sexual.
Sin rechazos
Sin rechazos, excepto por un rechazo de 1 semana después de recibir la vacuna contra la hepatitis B.
Sin rechazos, excepto por un rechazo de 1 semana después de recibir la vacuna contra la hepatitis B. Rechazar durante 3 meses después de la va cu nación.
Infecciones transmisibles por transfusión que requieran de rechazo Infección con VIH/SIDAy parejas sexuales
Rechazo permanente si presenta evidencia clínica o de laboratorio actual o anterior de infección con VIH/SIDA: EIA positivo con prueba de confirmación positiva o indeterminada; prueba mediante NAT positiva; señales clínicas que incluyan pérdida inexplicable de peso, sudoración nocturna, manchas azules o púrpuras en la boca o la piel, manchas blancas o lesiones inusuales en la boca, ganglios linfáticos inflamados por más de 1 mes, tos persistente o dificultad para respirar, diarrea persistente, fiebre por más de 1 O días; parejas sexuales rechazados durante 1 año a partir de la fecha del último contacto (FDA).
S-
O'
ª
,..,o
o~ ::::; () <"ll
::::;
<"ll
ª-
--.. 00
9
-o
ti)' V\
3s:ll I
e
3
s:ll
::J
o
O\
'-!
w
Apéndice 2: Criterios de Selección de Donantes (Continuación)
O\ 'J
Región
.J>,.
Criterio
Estados Unidos
Reino Unido
Unión Europea
Australia
Hepatitis y parejas sexuales y contactos en el ambiente doméstico
Rechazo permanente para los siguientes casos: historial de hepatitis viral después de los 11 años de edad, HBsAg repetidamente reactivo y confirmado, pruebas positivas para anti-VHBc en más de 1 ocasión (las pruebas no son necesarias para donantes de Plasma de Origen), evidencia de laboratorio o clínica actual o pasada de infección con VHC. Las parejas sexuales de pacientes con hepatitis deben ser rechazadas durante 1 año a partir del último contacto, para contactos en el ambiente doméstico con personas con hepatitis B se rechazan durante 1 año a partir del último contacto (CFR).
Rechazo permanente para donantes cuya sangre presenta una reacción positiva para HBsAg y/o anti-VHC. Los donantes con un historial de ictericia o hepatitis, a discreción de la autoridad médica competente apropiada, pueden ser aceptados como donantes de sangre siempre que resulten negativos en una prueba aprobada para HBsAg y anti-VHC.
Rechazo permanente para hepatitis B y C: los donantes con historial de hepatitis B pueden donar 12 meses después de su recuperación, siempre que todos los marcadores sean negativos o el anticuerpo anti-VHBc sea positivo, el HBsAg sea negativo, y el anti-HBsAg sea ;:> 1 00 Ul/L; los donantes con infección con hepatitis C actual o pasada quedan rechazados permanentemente; los donantes con hepatitis A se rechazan durante 12 meses.
Infección por hepatitis B aguda o anterior: rechazar durante 12 meses después de su recuperación, luego realizar la prueba de detección de hepatitis. Portador crónico de hepatitis B: rechazo permanente Contacto con hepatitis B, sexual, a través de mucosas o en el ambiente doméstico: rechazar durante 12 meses a partir de la última exposición, a menos que se demuestre inmunidad. Otro contacto con hepatitis B: aceptar. Infección con hepatitis C positiva pasada: rechazo permanente. Contacto con hepatitis C, sexual, a través de mucosas, o en el ambiente doméstico: rechazar durante 12 meses a partir de la última exposición; otro tipo de contacto: aceptar.
HTLV
Evidencia clínica o de laboratorio de infección con HTLV 1/11 actual o pasada (EIA positiva en 2 ocasiones) HTLV no se analiza en donantes de Plasma de Origen
Rechazo permanente para portadores de HTLV 1/11
Rechazo permanente para donantes con HTLV 1/11
Infección: rechazo permanente Resultado reactivo repetido: plasma únicamente para fraccionamiento Contacto sexual: rechazar durante 12 meses después del último contacto. Contacto en el ambiente doméstico: aceptar.
Rechazar durante 28 días después de que el donante abandone un área con transmisión en curso en humanos.
Rechazar durante 6 meses si el donante se encontraba en un área endémica de WNV y fue diagnosticado o presentó síntomas coherentes con los del WNV. Rechazar durante 28 días después de que el donante regrese de un área endémica, siempre que no presente síntomas de WNV.
Infección: rechazar durante 3 meses a partir de la recuperación completa. Exposición en el área: plasma únicamente para fraccionamiento durante 8 semanas después de abandonar el área de riesgo.
(FDA).
Virus del Nilo occidental (WNV)
A los donantes con síntomas sospechosos o diagnóstico real de WNV se los rechaza durante 120 días. A los donantes con pruebas postivas para WNV mediante NAT se los rechaza durante 120 días. Los donantes que desarrollan síntomas de WNV dentro de las 2 semanas de la donación deben ser rechazados durante 120 días. Los donantes implicados en una posible infección transmitida por transfusión por WNV deberán ser rechazados durante 120 días
--'
--'
00
o
-----u
~
V>
3t>l I
e
3
t>l
::::¡
o
---S"
O'
ª""
o
o~
::::;
(') r1)
::::; r1)
ª-
(FDA).
eVl
u
w
\()
e
ADéndlce 2: Criterios de Selección de Donantes (Continuación)
Vl ""C
Reglón Criterio
Estados Unidos
Reino Unido
Unión Europea
Australia
Enfermedad de Chagas y babesiosis
Rechazo permanente para historiales de enfermedad de Chagas; las reglamentaciones vigentes de la FDA no requieren el análisis para enfermedad de Chagas. No obstante, aunque no es requisito, la mayoría de las instalaciones que recolectan sangre para transfusión llevan a cabo la prueba EIA para Chagas y rechazan permanentemente a los donantes con resultados positivos. (AABB) Es probable que la FDA no requiera pruebas específicas para anticuerpos para plasma fraccionado o recuperado usado para fabricación. La FDA ha otorgado exenciones y ha permitido la recolección y distribución de Plasma de Origen para fabricación en productos no inyectables procedentes de un donante que se sabe padece la enfermedad de Chagas (CFR). Rechazo permanente para historiales de babesiosis (AABB)
Rechazo permanente para individuos con enfermedad de Chagas o historial de enfermedad de Chagas; la sangre de personas que nacieron o que recibieron transfusiones en áreas donde la enfermedad es endémica debe usarse únicamente para productos de fraccionamiento de plasma a menos que se presente una prueba validada para infección negativa.
Rechazo permanente para individuos con enfermedad de Chagas. Los individuos de las siguientes categorías pueden donar 6 meses después de abandonar un área endémica, siempre que se presente una prueba validada negativa para enfermedad de Chagas (si no se realiza una prueba validada o si ésta resulta positiva, el donante será rechazado permanentemente): nacido en Sur o Centro América, madre nacida en Sur o Centro América, recibió transfusión en Sur o Centro América; vivió o trabajó en una comunidad de subsistencia rural en Sur o Centro América durante 4 semanas o más.
Infección: rechazo permanente Contacto: aceptar. Residente de un área con enfermedad de Chagas: plasma únicamente para fraccionamiento, permanentemente. Visitante a un área con enfermedad de Chagas: plasma únicamente para fraccionamiento durante 12 meses después de abandonar el área endémica.
Enfermedad de Creutzfeld-Jakob (ECJ) y variante de la ECJ (vECJ)
Rechazo permanente si el donante: presenta diagnóstico de ECJ o nvECJ; tiene un pariente sanguíneo que ha sido diagnosticado con ECJ; recibió un injerto de duramadre; recibió hormona de crecimiento de hipófisis humana; recibió insulina bovina fabricada en el RU; pasó un total de 3 meses en el RU entre 1980 y 1996; recibió una transfusión sanguínea en el RU en cualquier momento desde 1980; pasó 6 meses entre 1980 y 1990 en una base militar estadounidense en el Norte de Europa; pasó 6 meses entre 1980 y 1996 en una base militar estadounidense en otra parte de Europa; pasó un total de 5 años en Europa (los donantes de Plasma de Origen no son rechazados por ésta última condición) (FDA).
Rechazo permanente si el donante: fue tratado con extractos derivados de hipófisis humana; ha recibido un injerto de duramadre o de córnea; presenta riesgo familiar de ECJ o cualquier otra ETS. Para vECJ: los estados miembros deben determinar, basándose en la prevalencia de BSE en países individuales, la exposición endógena de la población a productos bovinos importados de países con alta prevalencia de BSE y de la incidencia de casos de vECJ, las medidas precautorias que pueden requerir para minimizar el riesgo de transmisión de vECJ mediante transfusión de sangre.
Rechazo permanente si el donante: fue diagnosticado con ECJ, vECJ o cualquier otra enfermedad prionaria; presenta riesgo familiar de ECJ; un riesgo aumentado por cirugía, transfusión o transplante de tejidos u órganos; recibió un injerto de duramadre; recibió un injerto de córnea, escleral u ocular; recibió un extracto de hipófisis humana; recibió una transfusión sanguínea en el RU a partir de 1980; recibió inmunoglobulina intravenosa (IVlg) fabricada en el RU; donó una unidad de sangre implicada en un posible caso de vECJ por transfusión. Además, ninguna unidad de plasma de donantes británicos puede ser usado para fraccionamiento.
Rechazo permanente si se diagnostica con alguna enfermedad prionaria. Rechazo permanente si los donantes han pasado un total de 6 meses en Inglaterra, Gales, Escocia, Irlanda del Norte, las Islas Anglonormandas o la Isla del Hombre entre el 1 de enero de 1980 y el 31 de diciembre de 1996. Rechazo permanente si los donantes recibieron una transfusión de sangre o hemoderivados en Inglaterra, Gales, Escocia, Irlanda del Norte, las Islas Anglonormandas o la Isla del Hombre desde el 1 de enero de 1980 en adelante, a menos que los hemoderivados hayan sido productos de plasma procesados y hayan sido provistos después del 31 de diciembre de 2001. Rechazo permanente si el donante fue sometido a cirugía de oído entre 1972 y 1989 y se usó duramadre. Rechazo permanente de donantes que recibieron hormonas de crecimiento y gonadotrópicas de fertilidad de hipófisis humana antes de 1986.
w
\O
5"" O'
3 8.
º' ::s
Cl
~ ~
--ª-
.......... __.
00
o ..._,..
"'O
iij'" V>
3Dl :J:
e:
3Dl
::J
o__. O\
'J
\J'1
Aoéndlce 2: C .
de Selección de D
(C
., 1)
O\ 'J
Región Criterio
Estados Unidos
Leishmaniasis visceral (Sangre Entera)
Los donantes que hayan estado en lrak se rechazan durante 1 año. Rechazo permanente para señales y síntomas de leishmaniasis visceral (FDA)
Reino Unido
Sin rechazo específico
O\
Unión Europea
Australia
Rechazo permanente para leishmaniasis visceral
Cutánea: plasma sólo para fraccionamiento, permanentemente Visceral: rechazo permanente Contacto: aceptar.
,.--._ --'
--'
00
o --......-
v ¡:¡¡VI
3
Condiciones médicas y comportamientos que ponen a un individuo en riesgo de infección transmisible por transfusión y requieren de rechazo. Rechazo permanente
Rechazo permanente
Sin rechazo vigente requerido para donación de sangre, pero los reglamentos preliminares para tejido y órganos requieren el rechazo permanente.
Rechazo permanente
Transplante de órganos y tejidos con transfusión de sangre; tratamiento con caneentracios de factor de coagu!ación derivados de plasma
Rechazo de un año (rechazo permanente si se usó injerto de duramadre); rechazo permanente si el paciente recibió concentrados de factor de coagulación y pareja sexual rechazada durante 1 año después del último contacto.
Rechazo de seis meses: si la prueba mediante NAT para hepatitis C es negativa, puede donar después de 4 meses.
Cirugía o uso de endoscopio con biopsia
No se definen criterios de rechazo específicos; se aplican criterios generales de salud y transfusión.
Rechazo de seis meses para cirugía mayor; gastrectomía requiere de rechazo permanente. Rechazo de 1 semana para cirugía menor; Rechazo de 6 meses para endoscopia con biopsia; Si la prueba mediante NAT para hepatitis C es negativa, puede donar después de 4 meses.
Rechazo de seis meses para cirugía mayor o procedimiento que use un endoscopio; rechazo de 1 semana para cirugía menor.
Rechazar durante 6 meses.
Penetración no estéril de la piel o exposición de la membrana mucosa a sangre o fluidos corporales que no sean del propio donante
Rechazo de doce meses
Rechazo de seis meses; si la prueba mediante NAT para hepatitis C es negativa, puede donar después de 4 meses.
Rechazo de doce meses
Rechazo de 12 meses
Xenotransplante
~
I
e
3 Rechazo permanente si el donante recibió alguna vez concentrado de factor de coagulación o si recibió una transfusión después del 1 de enero de 1980; 1 año para transplante de tejidos u órganos.
Transfusión de sangre homóloga: rechazar durante 12 meses Factor de coagulación, derivado de sangre, a corto plazo: rechazar durante 12 meses a partir del último tratamiento. Factor de coagulación, hemoderivado, continuo: rechazo permanente. Receptores de tejido humano: Órgano/hematológico: rechazo permanente. Homólogo, hueso, tendón, piel: aceptar. Colágeno: aceptar. Córnea: rechazo permanente por riesgo de cECj iatrogénica
~
:i
o
--
S" O'
ª
Cl
a. o, :::s
() l"I)
:::s l"I)
ª-
eVl v w
\O
eVl
Apéndice 2: Criterios de Selección de Donantes (Continuación) Reglón Criterio
Estados Unidos
Reino Unido
Unión Europea
Australia
Si se usan artículos de un solo uso: plasma únicamente para fraccionamiento durante 12 meses. Si no son de un solo uso o si no está seguro: rechazar durante 12 meses.
Acupuntura, tatuajes, perforaciones corporales, etc.
Rechazo de doce meses a menos que sea realizado por una entidad regulada por el estado, usando agujas estériles y tinturas desechables.
Rechazo de seis meses; si la prueba mediante NAT para hepatitis Ces negativa, puede donar después de 4 meses; se pueden hacer excepciones de acuerdo con la evaluación nacional de riesgo.
Rechazo de doce meses. Rechazo de 6 meses si la prueba valídada para anti-HBc es negativa; para acupuntura, sin rechazo si se realiza en una entidad regulada por el estado.
Inyección de medicamentos o esteroides no recetados por un médico
Rechazo permanente; pareja sexual, rechazada durante 1 año
Rechazo permanente si el donante se ha inyectado o fue inyectado alguna vez con drogas; pareja sexual, excluído durante 1 año.
Rechazo permanente
Hombres que tienen contacto sexual con otro hombre Aceptó dinero o drogas u otro pago a cambio de sexo desde 1977 Encarcelamiento durante más de 72 horas a lo largo del año anterior Nació o vivió en África
Rechazo permanente por contacto sexual, incluso si fue uno sólo, desde 1977; pareja sexual femenina, rechazada durante 1 año a partir del último contacto
Todos los donantes de sangre deben recibir información exacta y actualizada sobre transmisión de VIH y SIDA de modo que las personas que sostienen prácticas de sexo inseguro u otro comportamiento de riesgo que los exponga a una infección potencial se abstengan de donar. La información provista puede variar entre países de acuerdo con los datos epidemiológicos locales.
Rechazo permanente por contacto sexual oral o anal incluso si se usó protección; pareja sexual femenina, rechazada durante 1 año a partir del último contacto. Rechazo permanente; pareja sexual, rechazada durante 1 año a partir del último contacto
Rechazar durante 12 meses después del último contacto sexual.
Sin rechazo
Rechazar durante 12 meses después de su liberación.
Rechazo permanente; pareja sexual, rechazada durante 1 año a partir del último contacto
Rechazo de un año
"w
\()
Rechazar durante 12 meses después del último contacto sexual.
5"
O'
3 Q
n
Rechazo permanente si nació o vivió en países donde el subtipo O de VIH 1es endémico (Camerún, República Centroafricana, Chad, Congo, Guinea Ecuatorial, Gabón, Níger, Nigeria); pareja sexual, rechazada durante 1 año a partir del último contacto sexual a menos que se aplique una prueba validada para detectar el Grupo O.
Sin rechazo específico para África; se aplican reglas para malaria; no obstante, las parejas sexuales de personas sexualmente activas en áreas donde el VIH es endémico, rechazadas durante 1 año a partir del último contacto.
Sin rechazo específico: los donantes que hayan visitado un área con malaria endémica están sujetos a un periodo de restricción de plasma únicamente durante al menos 12 meses. El periodo de restricción se extiende a 3 años si la residencia ha sido por 6 meses continuos o más dentro de los 3 años anteriores. Cuando la prueba para malaria resulta negativa, el periodo de restricción se puede reducir a 4 meses. Es imperativo interrogar a los donantes que hayan viajado a un área de riesgo por VIH si sostuvieron contacto sexual con un residente de dicha área.
o~ :3 ()
~
l"1)
--ª-
,.-..._
_.
CX>
o -......-
"iiT V\
3Ql :::i:::
e:
3
Ql
:::J
o
O\ "-1 ........
so¡n1Jd~::J
Capítulos Apéndice 3: Pruebas de D, Prueba de Enfermedades
"' - de Enf1
Estados Unidos
dad Unión Europea
Hepatitis HBsAg Anticuerpo anti-core de la hepatitis B (anti-VHBc)
Anticuerpo contra el virus de la hepatitis C (EIA) Análisis mediante NAT para hepatitis C
Rechazo permanente para pruebas repetidamente reactivas (FDA) Rechazo permanente si presenta reactividad en 2 o más ocasiones diferentes; rechazo permanente si los resultados positivos para el anticuerpo anti-core se suman a una prueba repetidamente reactiva para HBsAg (FDA). Las pruebas no son necesarias para donantes de Plasma de Origen.
Farmacopea Europea: Plasma Humano para Fraccionamiento
Las pruebas de laboratorio se llevan a cabo para cada donación a fin de detectar los siguientes marcadores virales: (1) anticuerpos contra VIH-1 (anti-VIH-1) (2) anticuerpos contra VIH-2 (anti-VIH-2) (3) antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) (4) anticuerpos contra el virus de la hepatitis C (anti-VHC) Si se encuentra un resultado repetidamente reactivo en cualquiera de estas pruebas, la donación debe rechazarse.
°'
'-1 00 ,,-.. __.
00
o .........
-o Di"" VI
3Ql I
e:
3Ql
::J
o
Rechazo permanente para pruebas repetidamente reactivas para el anticuerpo contra el virus de la hepatitis C; puede reingresar como donante después de 6 meses si la prueba de confirmación es neqativa (FDA).
Blood Directive (Directriz sobre Sangre) 2002/98/EC (Anexo IV): Requisitos Básicos de Pruebas para Donaciones de Sangre Entera y Plasma
--
Rechazo permanente si resulta positivo en una prueba única (FDA).
Las siguientes pruebas deben realizarse para donaciones de sangre entera y aféresis, incluyendo donaciones autólogas:
3 8.
Grupo ABO (no requerida para plasma destinado únicamente para fraccionamiento) Grupo Rh D (no requerida para plasma destinado únicamente para fraccionamiento) Es necesario realizar pruebas para detectar las siguientes infecciones en donantes: Hepatitis B (HBsAg), Hepatitis C (Anti-VHC), VIH 1 y 2 (Anti-VIH 1 y 2). Pueden ser necesarias pruebas adicionales para componentes, donantes o situaciones epidemiológicas específicas. Blood Directive (Directriz sobre Sangre) 2004/33/EC (Anexo 111): Criterios de Rechazo Permanente (fragmento): Hepatitis B, a excepción de las personas con HBsAg-negativo que demuestren inmunidad. Hepatitis C, VIH 1 ó 2
5"" O'
g' C'\
~
l'1)
ª-
VIH NAT para VIH
Rechazo permanente si resulta positivo en una prueba única (FDA).
eVI
-o w
'°
eVl
Apéndice 3: Pruebas de Detección de Enfermedades (Continuación) Prueba de Enfermedades Anti VIH 1 o 11 (EIA)
Estados Unidos Rechazo permanente para prueba por EIA repetidamente reactiva para VIH; puede reingresar después de 6 meses si la prueba de confirmación resulta negativa (FDA). Las pruebas no son necesarias para donantes de Plasma de Origen.
Unión Europea Farmacopea Europea: Plasma Humano para Fraccionamiento Se llevan a cabo pruebas de laboratorio para cada donación a fin de detectar los siguientes marcadores virales: (1) anticuerpos contra VIH-1 (anti-HIV-1) (2) anticuerpos contra VIH-2 (anti-VIH-2) (3) antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) (4) anticuerpos contra el virus de hepatitis C (anti-VHC) Si se encuentra un resultado repetidamente reactivo en cualquiera de estas pruebas, la donación debe rechazarse. Blood Directive (Directriz sobre Sangre) 2002/98/EC (Anexo IV): Requisitos Básicos de Pruebas para Donaciones de Sangre Entera y Plasma Las siguientes pruebas deben realizarse en donaciones de sangre entera y aféresis, incluyendo donaciones autólogas: Grupo ABO (no requerida para plasma destinado únicamente para fraccionamiento) Grupo Rh D (no requerida para plasma destinado únicamente para fraccionamiento) Es necesario realizar pruebas para detectar las siguientes infecciones en donantes: Hepatitis B (HBsAg),Hepatitis C (Anti-HCV),VIH 1 ó 2 (Anti-VIH 1 y
""iJ
w
\O
2). Pueden ser necesarias pruebas adicionales para componentes, donantes o situaciones epidemiológicas específicas. Blood Directive (Directriz sobre Sangre) 2004/33/EC (Anexo lll):Criterios de Rechazo Permanente (fragmento) Hepatitis B, a excepción de las personas con HBsAg-negativo que demuestren inmunidad. Hepatitis C, VIH 1 ó 2
SO'
3 Ci
a. ::::¡ º' C"I
~ ~
--ª-
_,,..__
_.
00
o ......-
:::s!
ti>
VI
3ti> :::z::
e
3
ti>
::J
o
°' 'I
\O
1680 (1181) Microscopía Electrónica/ Información General
USP 39
(1181) MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE BARRIDO INTRODUCCIÓN Durante las últimas décadas, la microscopía electrónica se ha convertido en una herramienta de investigación confiable para el estudio de materiales sólidos y semisólidos. Desde la invención del microscopio electrónico, atribuida a Max Knoll en 1935, y su comercialización en la década de 1960 por Cambridge lnstrument Co. y JEOL, las mejoras recientes en la resolución, la estabilidad y la colocación de las muestras han resultado en una robusta diversidad de instrumentos comerciales que abarca una amplia variedad de capacidades. Este capítulo provee una revisión de las tecnologías y técnicas comunes de microscopía electrónica.
UTILIDAD DE LA TÉCNICA Descripción General de la Técnica La microscopía electrónica de barrido (SEM, por sus siglas en inglés) es una técnica electrónica de formación de imágenes ópticas que produce tanto imágenes topográficas como información acerca de la composición elemental y se utiliza conjuntamente con una variedad de sistemas de detección y detectores de elementos. Todos los sistemas de microscopía electrónica utilizan un haz de electrones de alta energía enfocado como fuente de iluminación con el consiguiente aumento en la resolución en comparación con la microscopía de fotones (luz). El aumento en la resolución se logra mediante una reducción de longitud de onda ya que el haz de electrones es tres órdenes de magnitud más pequeño que el de la luz visible. El sistema óptico consta de las lentes del condensador y del objetivo, junto con la selección de las aberturas. Un haz de electrones enfocado se rastrilla sobre la superficie de la muestra, generando una variedad de señales a partir de las cuales se puede recolectar una imagen.
Microscopía Electrónica de Barrido de Alto Vacío Tradicional Los sistemas de microscopía electrónica de barrido tradicional operan a alto vacío, por lo que las muestras deben estar limpias, secas y deben ser capaces de soportar el alto vacío de hasta 10-6 torr durante la producción de imágenes. Adicionalmente, las muestras deben ser inherentemente conductoras o estar recubiertas con una sustancia conductora para poder conducir altas cargas superficiales. Estos sistemas comprenden cuatro principios generales que se indican a continuación: • generación del haz electrónico • formación de imagen • preparación de la muestra • composición elemental. Por lo regular, el análisis SEM requiere únicamente una cantidad pequeña (10- 3 a 10-12 g, dependiendo de la aplicación) de una muestra sólida. La muestra se expone al haz de electrones colimado y se barre usando un patrón de barrido controlado. Las imágenes, o micrografías, se generan detectando electrones secundarios (SE, por sus siglas en inglés) y/o de electrones retrodispersados (BSE, por sus siglas en inglés). Los detalles de la muestra se pueden observar con una resolución de hasta 1 O nm, incluso en los sistemas más simples. Además, la colimación del haz de electrones genera una gran profundidad de campo, la cual es evidente en un amplio rango dinámico de aumento, abarcando prácticamente cinco órdenes de magnitud (5x-100 OOOx). El tamaño de la abertura final controla el diámetro del haz y, por consiguiente, la resolución de la imagen y la corriente total dirigida a una muestra. Las aberturas pequeñas se requieren para alta resolución, mientras que las aberturas más grandes proveen alta corriente para una emisión de rayos X de óptima intensidad. En muchos sistemas, la abertura del objetivo se puede ajustar durante el uso deslizando o rotando su suporte. También es importante tener flexibilidad en el compromiso entre la resolución y la corriente puesto que las características de la muestra afectan estos dos criterios de forma diferente. El aumento de las imágenes se controla mediante la modificación del área de barrido del haz de electrones; las áreas más pequeñas producen mayor aumento. Para la detección de electrones se emplea un detector Everhart-Thornly (ET); las imágenes resultantes son muy similares a las de microscopía de luz reflejada. Un detector ET consta de una jaula de Faraday y un disco centelleador acoplado por una guía de luz a un tubo fotomultiplicador. La jaula de Faraday tiene tres funciones: (1) en polarización positiva, atrae los electrones secundarios; (2) en polarización negativa, repele los electrones secundarios para permitir que el detector ET capte solamente señales de electrones retrodispersados; y (3) protege el haz de electrones primarios (PE, por sus siglas en inglés) del potencial del centelleador. Se utilizan diferentes recubrimientos para el centelleador. Por ejemplo, los recubrimientos de fósforo producen imágenes intensas y de alto contraste. Los recubrimientos de aluminio, aunque menos sensibles, pueden resistir el alto flujo de electrones secundarios durante los análisis elementales. Además, los detectores de estado sólido poseen un nivel de sensibilidad hasta 1 O veces mayor para captar electrones retrodispersados. Se pueden colocar en diferentes posiciones y distancias con respecto a una muestra y usarse en conjunto con los detectores ET.
USP 39
Información General/ (1181) Microscopía Electrónica 1681
Microscopía Electrónica de Barrido de Presión Variable o Ambiental (ESEM, por sus siglas en inglés) En los laboratorios de la actualidad, todavía prevalecen comúnmente los sistemas de alto vacío tradicionales en diversas configuraciones robustos. Los denominados sistemas de presión variable, "ambiental" o de bajo vacío (LVSEM, por sus siglas en inglés) aparecieron a mediados de la década de 1980. Se trata de sistemas de microscopio electrónico que operan a una presión mucho más alta, casi ambiental (hasta 50 torr), en el sitio de la muestra, cubriendo la muestra con una atmósfera de gas (se puede usar casi cualquier gas) y también permiten un control de temperatura de hasta 1500ºC. Las ESEM presentan dos ventajas clave: Primero, las muestras no conductoras no requieren recubrimiento con una película delgada de carbono o metal conductor. Los electrones generados de la interacción del haz con la muestra ionizan el gas en la cámara de la muestra. Estos iones se difunden hacia la superficie de la muestra, disipando de esta manera cualquier acumulación de carga negativa. Segundo, si la muestra en cuestión es propensa a liberar gases de sustancias volátiles tales como disolventes y agua, las presiones casi ambientales usadas en la cámara de la muestra pueden disminuir en gran medida la probabilidad de que esto ocurra.
Microscopía Electrónica de Barrido por Transmisión La combinación de un sistema tradicional de microscopio electrónico de transmisión con un control de barrido produce un análisis de la muestra con alta resolución micrográfica, información a escala atómica tal como estructura atómica, información química y de unión interfacial. La adquisición de imágenes se lleva a cabo de la misma manera que en la SEM; pero también permite recolectar imágenes de transmisión mediante el uso de especímenes muy delgados. El gran incremento en la resolución se logra controlando el volumen de la sonda del haz de electrones hasta dimensiones atómicas. La Figura 7 presenta la imagen de red de una cerámica que se obtuvo usando un instrumento de microscopía electrónica de barrido por transmisión (STEM, por sus siglas en inglés). Al igual que con cualquier método de haz de electrones o de iones, la muestra debe ser capaz de tolerar el bombardeo de electrones. Esto no siempre es posible con materiales farmacéuticos, dado que pueden degradarse con el haz de electrones durante el análisis.
Figura 1. Micrografía electrónica de barrido por transmisión para una cerámica de óxido (perovskita), mostrada en los modos de imagen en campo oscuro (izquierda) y en campo brillante (derecha). Imagen cortesía de" ... © Carl Hanser Verlag, Muenchen".
GENERACIÓN DEL HAZ DE ELECTRONES El fundamento para la formación de una imagen electrónica es la generación de un flujo energético de electrones que impactan la superficie de la muestra. Si el haz es demasiado potente, la muestra se quemará a medida que el haz se mueve por la superficie de la muestra. Éste es un aspecto importante a considerar cuando se analizan materiales farmacéuticos. Los cañones de electrones se pueden clasificar en dos tipos: emisores termoiónicos y emisores de campo. Con los primeros, el filamento se calienta a alto vacío y se aplica un gran potencial. El campo que se crea, combinado con la alta temperatura del filamento caliente, "desprende" electrones que posteriormente se enfocan con la óptica del microscopio. Para incrementar el flujo de electrones de los emisores termoiónicos, se debe aumentar el potencial que se aplica en todo el filamento, lo cual también aumenta la energía cinética de los electrones y la probabilidad de que la superficie de la muestra se queme. Otro método usado para producir haces de electrones es aplicar un gran campo electrónico a lo largo del emisor electrónico. El filamento puede o no tener una corriente que lo atraviese. Cuando se considera que los daños en la superficie son un aspecto importante, los emisores en frío son la mejor forma de obtener una imagen clara a un aumento alto sin quemar la superficie ni dañar el material. Por lo regular, se usa tungsteno como emisor de electrones, ya que es lo suficientemente resitente para tolerar las fuerzas mecánicas. Cuando se usan cañones de emisión de campo, el cátodo debe mantenerse a un vacío muy alto y no se debe permitir que contaminantes extraños se depositen sobre el filamento. Por estas razones, la columna debe bombearse diferencialmente. Los instrumentos de emisión de campo son más adecuados para el análisis de compuestos farmacéuticos, dado que producen un haz muy brillante que es menos dañino para la muestra. Asimismo, los SEM de emisión de electrones tienen una mayor resolución espacial que los hace más adecuados para la identificación de partículas extrañas.
1682 (1181) Microscopía Electrónica/ Información General
USP 39
Interacciones de la Muestra con el Haz de Electrones La interacción del haz de electrones primarios (PE) con la muestra produce diversos fenómenos físicos que, cuando se detectan, se usan para formar imágenes y suministran información elemental acerca de la muestra. Estos fenómenos incluyen: • emisión de electrones secundarios (SE) inelásticos dispersos, proporcional a la topografía de la muestra • reflexión de electrones retrodispersos (BSE) elásticamente dispersados, proporcional al número atómico (Z) de la muestra • emisión de componentes de rayos X (XRE, X en la Figura 2) • emisión de electrones Auger (AE, por sus siglas en inglés) • catodoluminiscencia (CL, por sus siglas en inglés) •conducción de corriente (corriente de la muestra) • cargas generadas por inducción de voltaje (IV) o por adsorción de electrones • transmisión de electrones • generación de calor • fuerzas electromotrices (ver la Figura 2).
PE
Figura 2. Diagrama de interacción. Los electrones secundarios se emiten desde la superficie de la muestra como consecuencia de colisiones inelásticas entre electrones primarios (incidentes) y la muestra. Cuando la energía transmitida a un electrón de la muestra excede su función de trabajo en la muestra, ese electrón se emite como un electrón secundario. La mayoría de los electrones secundarios tienen energías de 5-20 eV; los electrones en este intervalo de baja energía se pueden captar eficientemente, produciendo imágenes de alta relación señal-ruido. Dado que tales electrones de baja energía sólo pueden penetrar distancias cortas a través de la muestra, los electrones secundarios se originan a una profundidad de 2-30 nm de la superficie y generan imágenes de alta resolución. La profundidad de penetración que efectivamente puede alcanzar el haz de electrones depende de su voltaje de aceleración, de la composición elemental de la muestra, de su densidad y de su ángulo de montaje. Los volúmenes de excitación con un diámetro de 0,5-5 µm (sombreado gris oscuro en la Fig. 2) son típicos para una amplia variedad de materiales, desde metálicos hasta biológicos. Los electrones retrodispersados son electrones primarios que se han reflejado desde la muestra. Los electrones primarios pueden experimentar colisiones múltiples antes de salir de la muestra; por lo tanto, los electrones retrodispersados tienen una amplia gama de energías y surgen de una zona de penetración de la muestra relativamente profunda (,,,O, 1-5 µm) (ver la Figura 3).
USP 39
Información General/ (1181) Microscopía Electrónica 1683
Haz de electrones incidente
Superficie de la muestra
t 1
Volumen de interacción creciente
El volumen de excitación depende del voltaje de aceleración y la densidad del material
Figura 3. Penetración volumétrica Estos electrones retrodispersados de alta energía (15-25 keV) se captan con menor eficiencia que los electrones secundarios, y producen imágenes de menor resolución. La eficiencia de la reflexión de los electrones retrodispersados es una función del número atómico (Z) de los átomos de la muestra; por lo tanto, el contraste de las imágenes obtenidas a partir de estos electrones depende de la composición elemental. La composición elemental, la densidad e inclinación de la muestra y la energía del haz incidente (voltaje de aceleración) afectan la profundidad de penetración de todos los electrones. Existen diversos algoritmos informáticos que corrigen estas influencias cuando se las conoce, tales como ZAF, Bence-Albee, entre otros. Por ejemplo, las imágenes de electrones secundarios de cristales de fosfato de sodio y fosfato de cinc son bastante similares. Sin embargo, los núcleos más pesados de los compuestos de cinc producen un reflejo de electrones retrodispersados más eficiente y las imágenes de electrones retrodispersados revelarán un mayor contraste. Las imágenes de electrones retrodispersados de fases con elementos pesados en comparación con fases que contienen elementos más livianos, o mezclas de especies, muestran diferencias de contraste muy evidentes, que son representativas de la heterogeneidad de los elementos. El mapeo elemental por espectroscopía de rayos X por dispersión de energías (EDS, por sus siglas en inglés), discutido más adelante, puede proveer información complementaria.
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA A medida que ha avanzado la microscopía electrónica de barrido como técnica analítica, han surgido diversas opciones para la preparación de la muestra. Lo ideal es obtener la imagen requerida o el análisis químico del material que se va a examinar con la menor intervención posible. Asimismo, se debe considerar el propósito del análisis y la cantidad de material disponible. Si el material que se va a examinar es una partícula extraña en un producto parenteral, la preparación de la muestra puede ser muy distinta del procedimiento para obtener una imagen de un fármaco a granel o de un excipiente. El diagrama siguiente (ver la Figura 4) representa una versión simplificada de los métodos de preparación de muestra disponibles y una estrategia posible para determinar el método apropiado de preparación de la muestra. Por ejemplo, además de los portamuestras metálicos (principalmente de aluminio), existen diversas mallas metálicas que se pueden usar para sostener las muestras. Si la partícula en cuestión se aísla de un líquido, el filtro mismo puede servir para sostener el polvo adecuadamente sin tener que transferir la muestra a otro portamuestras. Además, las películas de carbono adhesivo son un medio común para asegurar la muestra al portamuestras. Existe una variedad de otros materiales adhesivos para este propósito tales como las cintas de cobre de doble cara, de plata y aluminio o las pinturas de plata y carbono.
Recubrimiento de la Muestra Históricamente, los materiales farmacéuticos, que por lo regular no son buenos conductores eléctricos, debían recubrirse con una capa muy delgada de material conductor (carbono, oro, platino u otros metales) para asegurar que el haz de electrones usado para la generación de imágenes pudiera disiparse por la superficie de la muestra. El recubrimiento también se usaba para crear una capa de material "rico en electrones" que servía como una fuente para la emisión de electrones secundarios. Con el advenimiento de la microscopía electrónica de barrido ambiental (ESEM) o microscopios electrónicos de barrido a presión variable, el recubrimiento de materiales no conductores ha dejado de ser un prerrequisito. La atmósfera misma en la cámara de la muestra genera iones con carga positiva que disiparán cualquier carga que se acumule en la superficie de la muestra.
USP 39
1684 (1181) Microscopía Electrónica/ Información General
Recepción de la Muestra
¿Es la muestra un material a granel?
'>------No-----
La muestra está presente en muy pequeñas cantidades o es una partícula extraña
Sí
Aislar la muestra mediante filtración o sacarla del líquido
Sí
Considerar la observación de la muestra con ESEM o SEM de presión variable para las que no se requiere recubrimiento
Sí---<
Dispersar el polvo en un portamuestras de aluminio con cintas adhesivas de carbono
No
No
Considerar la observación de la muestra con ESEM o SEM de presión variable para las que no se requiere recubrimiento
Recubrir la muestra con carbono para asegurar la conductividad apropiada sin afectar el análisis elemental
Sí
Dispersar el polvo en un portamuestras de aluminio con cintas adhesivas de carbono
¿Se cuenta con ESEM o SEM de presión ariable?
No
Recubrir la muestra con carbono, oro, platino u otros metales apropiados
Realizar el análisis
Figura 4. Diagrama de decisión para la preparación de la muestra para microscopía electrónica de barrido.
USP 39
Información General/ (1181) Microscopía Electrónica 1685
GENERACIÓN DE RA VOS X Y ANÁLISIS DE COMPOSICIÓN ELEMENTAL Cuando un electrón primario se encuentra con un electrón en un orbital atómico, la colisión resultante puede elevar al electrón orbital a un nivel de mayor energía o producir la ionización del átomo. La estabilización de un átomo por relajación de un electrón de mayor energía para llenar un espacio vacante genera la emisión de un fotón de rayos X. Las energías de estos rayos X son discretas y específicas para cada elemento, son iguales a las diferencias entre las energías de los electrones en las distintas capas de un elemento dado. Por ejemplo, un electrón expulsado de la capa K puede ser estabilizado por un electrón de mayor energía proveniente de la capa L, que llena el orbital vacante, produciendo una energía neta (Et - EK), específica de la energía de un fotón de rayos X de la línea elemental K. Las líneas de emisión de rayos X se clasifican según la capa electrónica donde se produjo el espacio vacante, p.ej., K, L, M. Además, las líneas se categorizan según la capa desde la cual se origina el electrón de relajación. Así, una línea Ka de rayos X surgirá de un espacio vacante en la capa K que se llena desde la capa L; una línea K/3 de rayos X surgirá de un espacio vacante en la capa K que se llena desde la capa M, y así sucesivamente (ver la Figura 5). Haz de e-primarios
Rayo X característico
Figura 5. Modelo Atómico. La detección de los rayos X generados y el análisis elemental subsiguiente se pueden lograr mediante dos tipos de detectores distintos: espectrómetros de rayos X por dispersión de longitud de onda y por dispersión de energía (WDS y EDS, por sus siglas en inglés, respectivamente). Cada uno presenta sus propios beneficios y dificultades. Históricamente los detectores por dispersión de longitud de onda son mucho menos susceptibles a los artefactos espectrales que pueden generar una identificación incorrecta del pico tal como ensanchamiento y distorsión del pico, picos de escape de silicio, absorción, etc. Adicionalmente, la mayoría de los detectores Si(Li) EDS requieren enfriamiento con nitrógeno líquido, lo cual puede ocasionar una acumulación de hielo en la ventana del detector en la cámara de la muestra. El ángulo mucho más grande de recolección del EDS lo hace más robusto y menos susceptible a una alineación deficiente del detector que el WDS. La Figura 6 ilustra la resolución espectral superior que se obtiene con el WDS. Con el WDS, es mucho más sencillo detectar rayos X característicos que son energéticamente similares. El EDS presenta ensanchamiento de picos debido a su estrecha proximidad.
1686 (1181) Microscopía Electrónica / Información General
USP 39
Figura 6. Ejemplo de resolución espectral obtenida con detectores por dispersión de longitud de onda donde S Ka y Mo La se pueden resolver claramente mediante WDS (picos grises) pero no se resuelven mediante EDS (pico claro ancho). "Usado con autorización. Cortesía de Oxford lnstruments." Las ventajas del EDS yacen en la facilidad de uso y la velocidad para recolectar el espectro completo de rayos X, lo que la hace ideal para la identificación de rutina de partículas y aspectos típicos dentro de una muestra. Los dos tipos de tecnologías de detectores con mayor disponibilidad para análisis con espectroscopía de rayos X por dispersión de energía se basan en las tecnologías de deriva de litio en silicio [Si(Li)] y de deriva de silicio. Mientras que los detectores Si(Li) han estado presentes durante los últimos 40 años, los detectores por deriva de silicio (SDD, por sus siglas en inglés) han surgido recientemente como el tipo preferido debido a varias ventajas clave, incluyendo una mejor detección de elementos livianos (Z;?. 4), su capacidad para manejar altas velocidades de conteo, excelente resolución de energía incluso a altas velocidades de conteo y más aún la eliminación de la necesidad de usar nitrógeno líquido para enfriar previamente el detector debido al uso de sistemas de enfriamiento Peltier. Aunque generalmente se recomienda que los detectores Si(Li) operen a 1000-2500 conteos por segundo con una resolución de energía de 129 eV para la línea Mn-Ka, la tecnología SDD actual tiene una mejor resolución de energía de 121 eV incluso a una alta velocidad de conteo de 600 000 cps. Para el usuario promedio, esto significa que el detector SDD puede acortar drásticamente el tiempo de análisis siempre que pueda obtenerse una velocidad de conteo alta y con una resolución significativamente mejor para la detección de elementos livianos. En la práctica, la velocidad de conteo que se puede conseguir se determina mediante el voltaje de aceleración y la corriente de la sonda, el ángulo sólido del detector y la distancia de trabajo a la muestra, así como la capacidad de la muestra para soportar el haz de electrones sin cambios en la carga o en el material. Independientemente de si se usa un detector Si(Li) o SDD, es aconsejable mantener el tiempo muerto en uno de 30% o menos. El contenido elemental de una muestra influye en la selección de las condiciones de análisis. El intervalo más útil de voltaje de aceleración es aproximadamente 3-20 kV; la mayoría de los elementos de interés pueden ser ionizados por electrones con energías en este intervalo. La energía requerida para excitar la emisión de rayos X desde una línea determinada se denomina potencial de excitación crítico. El potencial de excitación crítico de una línea K se puede calcular de forma aproximada por la suma de las energías de la línea primaria (Ka + La + Ma). La selección de un voltaje de aceleración igual a 1,5 veces el resultado de esta suma es, por lo general, suficiente para los análisis semicuantitativos. Po ejemplo, el cobre tiene Ka a 8,05 keV + La a 0,93 keV = 8,98 keV: y 1,5 x 8,98 keV = 13,47 keV. La selección de un voltaje de aceleración de 15 kV produce energía suficiente para ionizar la capa K de los átomos de cobre y generar una señal analítica útil. Por lo general, se sugiere que los usuarios de EDS empleen el voltaje de aceleración mínimo necesario para excitar adecuadamente los elementos de interés (por lo regular 1,5-1 O veces la energía de excitación crítica). El volumen de interacción aumenta con el incremento en el voltaje de aceleración, por lo que se puede obtener una mejor resolución espacial usando un menor voltaje de aceleración. Dependiendo de las dimensiones y de la densidad de las partículas, es posible detectar una señal del soporte. Además, un volumen más grande de interacción ocasiona un incremento en la absorbancia y en la fluorescencia dentro del volumen de la muestra. Se puede experimentar con diversos voltajes de aceleración para determinar el voltaje de aceleración mínimo requerido. El uso de rutina de un estándar de cobre y de un metal más liviano tal como aluminio permite una verificación rápida de las energías elementales de la línea primaria que abarcan el intervalo de O a 1OkeV. Antes o durante el protocolo experimental se analiza el
USP 39
Información General/ (1181) Microscopía Electrónica 1687
metal estándar para verificar que la línea primaria esté dentro de ±0,04 keV de la correspondiente a la referencia (pero esta especificacíon puede depender de lo recomendado por el fabricante del detector). Ésta es una práctica interna estándar adecuada. Se pueden generar interferencias interelementales debido a muchos efectos. Los rayos X de alta energía emitidos desde átomos pesados pueden ionizar elementos más livianos generando la emisión de rayos X secundarios desde los átomos más livianos. En consecuencia, se observa una fluorescencia más baja en elementos de Z alto y una fluorescencia más alta en elementos de Z bajo, a diferencia de lo que se espera de la señal inducida por electrones primarios en un elemento puro. Por el contrario, la emisión de rayos X de un elemento liviano puede ser absorbida por una matriz más pesada, produciendo un sesgo negativo en la señal del elemento liviano. Estos efectos siempre existen en muestras heterogéneas y deben corregirse durante el análisis cuantitativo. Se puede emplear un algoritmo común, ZAF, para corregir las interferencias dependientes de Z debidas a la absorción y emisión de rayos X secundarios. El análisis puntual y el mapeo son modos de análisis comunes disponibles para la identificación de partículas mediante EDS, independientemente del tipo de detector. Las interfases de usuario más modernas permiten al usuario ver una región de interés con creación de imágenes mediante electrones secundarios y compilar un espectro para la región completa o una subrregión definida. Al recolectar un espectro inicial, es importante que el usuario verifique, si éste es aceptable en términos del intervalo de energía para los elementos presentes, si tiene una velocidad óptima de conteo y si está libre de artefactos tales como acumulación de carga. Una vez optimizado para compilación, el usuario puede seleccionar el modo de análisis preferido para identificar su muestra. El análisis puntual es generalmente útil si se pueden observar fácilmente diversas morfologías de partículas mediante SEM. El usuario puede colocar el cursor en el centro de cada partícula para compilar un espectro para comparación posterior. Se debe tener cuidado al analizar partículas de menos de 5 µm dado que el volumen de interacción puede esparcirse a sectores aledaños de la muestra, combinado con la interacción entre la muestra y el haz, y puede excitar electrones de los alrededores. Esto producirá picos espectrales que nos son propios de la estructura de interés. Por esta razón, resulta complicado el análisis químico de objetos pequeños en un SEM. Otras técnicas más sensibles a la superficie tales como la espectroscopía fotoelectrónica de rayos X (XPS, por sus siglas en inglés) y la espectroscopía auger de barrido, entre otras, proveen información espectral más precisa. El análisis ortogonal, tanto interno como externo con otra técnica definida, es de gran valor. Cuando no existe diferencia morfológica obvia en una serie de partículas, el mapeo por EDS puede ser el mejor modo de análisis. En este modo, el detector EDS compila información a medida que el haz de electrones se barre por la muestra en un patrón definido, con lo que la información elemental se registra con la imagen de SE/BSE. El usuario puede definir la región de interés circunscribiéndola a una subregión a partir de la región completa observable en la imagen de SE/BSE. Además, el usuario puede definir la velocidad de escaneo, el tiempo de residencia/pixel y la resolución del mapa para adaptarlos a sus necesidades de velocidad o resolución. Un factor significativo a considerar para el mapeo de EDS es que la señal de rayos X variará dependiendo de la textura de la superficie y de la pendiente de la superficie de la partícula. En el caso más severo, se puede observar una sombra si dicha superficie ya no se encuentra dentro de la línea de visión del detector. Puede ser posible minimizar estos artefactos inclinando más la muestra con respecto al detector. A menudo resulta útil mapear los elementos de interés contra un elemento que no exista en la muestra. Los conteos de rayos X para el elemento no existente proveen un fondo uniforme a través de toda la región si la superficie está nivelada. La Figura 7 presenta ejemplos de mapas elementales superpuestos a la imagen de SE. La primera imagen (Figura 7, izquierda) muestra mapas para bario y potasio, superpuestos sobre la imagen de SE correspondiente, mostrando así que las partículas representan una mezcla con falta de homogeneidad de precipitados de bario/potasio (izquierda). Para el segundo ejemplo, el mapeo de EDS se usó con Cryo-SEM para examinar una emulsión crio-fracturada de silicona/agua en donde el mapa de Si representa a la silicona y el mapa de O representa al agua. Se puede observar la estructura interna de una gotita grande de silicona dentro de una fase acuosa continua se puede observar en la Figura 7 (derecha) donde resulta aparente que la gotita de silicona contiene diversas gotitas internas de agua. Muchas interfases de EDS actuales permiten al usuario extraer un espectro de cualquier lugar dentro del mapa.
1688 (1181) Microscopía Electrónica/ Información General
USP 39
Figura 7. Izquierda: Mapas de potasio y bario superpuestos en la imagen de SE de un precipitado mezcla de potasio/bario. Derecha: Mapas de oxígeno y silicona superpuestos en la imagen de SE de una emulsión vitrificada de silicona/agua.
OPTIMIZACIÓN DE LA IMAGEN Los parámetros instrumentales requeridos para adquirir una imagen de calidad pueden depender en gran medida del tipo de muestra y de la preparación de la muestra. Algunos aspectos importantes con respecto a la muestra incluyen la forma (polvos, monolitos, fibras, líquidos vítreos, etc.), las dimensiones generales, la textura, la composición atómica y la conductividad inherente. Dado que muchos parámetros instrumentales de la SEM moderna requieren sólo una ligera reoptimización, se pueden modificar fácilmente mediante una interfaz de PC, es muy recomendable que el operador experimente con condiciones operativas para seleccionar las mejores condiciones de generación de imagen para las características de interés. Los parámetros que afectan la calidad de imagen se pueden subdividir en ajustes instrumentales y ajustes de observación. Los ajustes instrumentales comunes que pueden afectar la calidad de imagen incluyen voltaje de aceleración, corriente de emisión, distancia de trabajo, modo de detección SE/BSE (cuando se usan múltiples modos), ajuste de corriente del condensador y diámetro de apertura del objetivo. De éstos, el voltaje de aceleración puede ser el parámetro instrumental más importante dado que afecta directamente la profundidad de penetración de electrones incidentes, determinando así las características que se pueden observar. En general, la selección del voltaje de aceleración óptimo es un equilibrio para lograr el mejor contraste para las características de mayor interés para el usuario, al mismo tiempo que se minimizan efectos no deseados tales como acumulación de cargas o pérdida de información topográfica. La mejor manera de seleccionar un voltaje de aceleración ideal para una muestra desconocida es experimentar con hasta 3 voltajes de aceleración (p.ej., 1; 3 y 1 O kV) y posteriormente seleccionar el mejor para continuar con la optimización adicional de la imagen. La selección de la distancia de trabajo y del detector SE/BSE por lo general se realiza en conjunto, dependiendo de la resolución, la profundidad de foco y la inclinación de la muestra deseadas. Por lo general, las distancias de trabajo más cortas resultan en una mayor resolución pero con una menor profundidad de foco. Asimismo, dependiendo de la posición en que se colocan los detectores de SE en la columna, hay un compromiso entre la resolución espacial y la topografía de la superficie, ya que los detectores posicionados más arriba en la columna por lo general detectan la señal de SE con mayor resolución, mientras que los que se posicionan más abajo generan mejores detalles topográficos de la superficie. Por último, los ajustes de la lente del condensador y el diámetro de apertura de la lente del objetivo se pueden optimizar para obtener la resolución, la profundidad de foco y corriente ideales para un tipo de muestra específico. Luego de seleccionar el conjunto inicial de condiciones instrumentales conforme a lo indicado anteriormente, la observación básica de imagen se puede optimizar de la siguiente manera: (1) Seleccionar inicialmente un aumento bajo (1000-3000x) (2) Ajustar aproximadamente el brillo de la imagen (3) Ajustar aproximadamente el foco (4) Seleccionar un área fácil de visualizar de la muestra (5) Verificar/ajustar la alineación electromagnética para optimizar la óptica electrónica (haz, apertura, astigmación) (6) Seleccionar una característica de interés a mayor aumento (7) Ajustar el foco y el astigmatismo (8) Ajustar el brillo y el contraste de la imagen (9) Capturar la imagen La captura de imagen puede lograrse usando diversas resoluciones (1280 x 960 es la más común) y distintas velocidades de captura usando una lenta compilación de barrido o integración de cuadros. En general, la compilación de barrido lenta se usa para adquirir imágenes en alta resolución, mientras que la integración de cuadros se usa para tipos de muestras que tienen problemas de acumulación de cargas o estabilidad. Una adquisición de imagen usando una mayor resolución de captura, una menor velocidad de barrido o cuadros adicionales puede mejorar la resolución; no obstante, el usuario debe tener cuidado
USP 39
Información General/ (1181) Microscopía Electrónica 1689
puesto que aumenta la probabilidad de que la muestra se desplace durante el periodo de acumulación, lo cual anularía cualquier beneficio.
ANÁLISIS FORENSE DE PARTÍCULAS Análisis de Forma Debido a la naturaleza tridimensional de las imágenes obtenidas mediante la microscopía electrónica de barrido, la forma de las partículas provee mucha información sobre la composición y el origen de la partícula sin necesidad de un análisis químico mediante EDS. Las partículas más comúnmente identificadas en compuestos farmacéuticos por lo general se encuentran en categorías bien definidas. Es de destacar que las partículas en productos parenterales surgen generalmente de tres fuentes: (a) extrínsecas o externas, como los sólidos realmente foráneos al producto; (b) intrínsecas o asociadas al producto, o su envase o su proceso de fabricación; (c) partículas inherentes que se espera formen parte de la composición, tales como proteínas en productos bioterapéuticos (ver el capítulo Partículas Subvisibles en Inyectables de Proteínas Terapéuticas (787)), y que se pueden encontrar al examinar dichas fórmulas. Algunos ejemplos de partículas extrínsecas son los siguientes: • Productos de la corrosión de una o más fuentes del equipo que pueden aparecer como resultado de la interacción con la formulación • Materiales del entorno de fabricación tales como celulosa (de bolsas de papel), fibras extrañas (vestimenta, filtros, etc.) • La falta de homogeneidad en el producto, específicamente el mezclado incompleto (para formas farmacéuticas sólidas orales) que pueden crear problemas cosméticos o de presentación con las tabletas • Materiales biológicos cedidos del medio ambiente • Materiales que se hayan expuesto a calor extremo que pudieran carbonizarse. Las causas de esto pueden ir desde papel pirolizado durante la despirogenización hasta la adhesión de materiales a componentes expuestos a la fricción (molienda de polvos, compactación, etc.). Si se acumulan residuos de manera no intencionada en estas zonas expuestas a la fricción se puede descomponer el material, apareciendo quemado. La Figura 8 muestra imágenes representativas de algunas de las partículas mencionadas anteriormente que el usuario puede encontrar en una investigación forense.
A
B
e
D
Figura 8. Micrografías electrónicas de barrido de partículas comúnmente encontradas en áreas de fabricación farmacéutica: A fibras de algodón, B. partículas de vidrio, C. virutas de teflón, D. virutas de aluminio. (Todas las imágenes cortesía de McCrone Atlas (www.mccroneatlas.com.)
1690 (1181) Microscopía Electrónica/ Información General
USP 39
La interpretación del origen de una partícula a partir de los aspectos típicos observados mediante el análisis de SEM depende de las características de las partículas; por ejemplo, cualquier partícula con esquinas punteadas y bordes bien definidos está hecha de un material que no es soluble en el producto líquido. Si es transparente ante el haz, entonces el usuario puede concluir que consiste en elementos con Z muy bajo. Las partículas cristalinas presentan patrones de simetría y crecimiento obvios. El crecimiento lento se caracteriza por grandes cristales, mientras que el crecimiento rápido presenta masas de cristales pequeños generalmente agregados. La morfología de las partículas y las características de la superficie pueden ser útiles para determinar el origen de los componentes desconocidos. La relación de aspecto, es decir, el cociente entre la longitud de una partícula y su ancho, indica materiales fibrosos (NT, cuando es alta). El análisis por microscopía óptica a menudo sirve como una herramienta más efectiva para analizar fibras mediante la determinación de sus propiedades ópticas de diagnóstico (índices de refracción, birrefringencia, elongación, etc.) usando luz polarizada plana y cruzada que puede distinguir entre varias fuentes posibles. No obstante, con un microscopio electrónico de barrido, el análisis elemental puede determinar (a) si la fibra es inorgánica u orgánica y (b) la presencia de aditivos en la superficie. La microscopía electrónica de barrido también ofrece el beneficio de ser capaz de generar imágenes a un aumento mucho mayor para revelar estructuras morfológicas de origen biológico o características indicativas de la fabricación comercial. Como se mencionó anteriormente, se emiten diversos tipos de electrones cuando un haz de electrones interactúa con una superficie sólida. Los dos tipos de electrones más útiles son los secundarios y los retrodispersos. Al seleccionar una configuración adecuada para el detector o instrumento, la imagen se puede manipular privilegiando unos u otros. Los electrones retrodispersos pueden proveer información útil con respecto a la composición química de la característica en cuestión. Si el instrumento se ajusta para su uso con electrones retrodispersos para formar la imagen, los elementos que poseen una masa atómica mayor se verán más brillantes que aquéllos que tienen una masa atómica menor. Al seleccionar este modo de generación de imagen, las partículas orgánicas pueden distinguirse fácilmente de residuos metálicos, por ejemplo. A un kV bajo, el vidrio o el plástico pueden presentarse como objetos sólidos, mientras que a un kV mayor, pueden parecer algo transparentes. Además, la apariencia a un kV bajo en un microscopio electrónico de barrido con filamento de tungsteno puede significar algo completamente distinto de lo que aparece a un kV bajo en un FE SEM o SEM ambiental. Materiales diferentes requieren condiciones operativas distintas para generar imágenes de manera adecuada usando electrones secundarios, a fin de prevenir la acumulación de cargas y mejorar el contraste. Por lo regular, se emplea un kV bajo (3 kV o menor usando un FE SEM en lente o semi en lente) para materiales no conductores tales como vidrio o plástico. Si el material es extremadamente delgado (<100 nm), éste puede visualizarse en modo de transmisión (STEM) así como en modo SE.
REFERENCIAS GENERALES 1. Goldstein, J., et al., Scanning Electron Microscopy and X-ray Microanalysis. Third ed. 2003, New York: Springer. 2. Echlin, P., Handbook of Sample Preparation far Scanning Electron Mícroscopy and X-ray Mícroanalysís. 201 O, New York: Springer. 330. 3. Reimer, L., Scanníng Electron Mícroscopy: Physícs of /mage Formation and Mícroanalysís. Springer Series in Optical Sciences, ed. H.K.V. Lotsch. Vol. 45. 1998, New York: Springer.
(1184) PRUEBAS DE SENSIBILIZACIÓN INTRODUCCIÓN Este capítulo trata de la sensibilización e hipersensibilización en el contexto de los dispositivos médicos e implantes y describe métodos para analizar dichos artículos en lo que respecta a su capacidad de causar sensibilización. Existen cuatro tipos de reacciones de hipersensibilización según el sistema de clasificación de Gell y Coombs. Las reacciones de Tipo 1 incluyen la fijación de lgE a mastocitos que posteriormente liberan sustancias farmacológicamente activas, como por ejemplo la histamina. Las reacciones de Tipo 11 son el resultado de uniones de lgG y/o lgM a las células diana, seguidas de fijación de complemento y lisis celular. Las reacciones de Tipo 111 son causadas por la presencia de complejos antígeno-anticuerpo que ocasionan lesiones físicas, como por ejemplo, daño renal debido al bloqueo glomerular. Las reacciones de Tipo IV son mediadas por células (involucran la acción de las células T y su interacción con los antígenos de linfocitos humanos). Las reacciones de Tipo IV se llaman también reacciones de hipersensibilidad retardada. La Tabla 1, a continuación, resume los tipos de reacciones, los mediadores de las reacciones y ejemplos de enfermedades representativas.
Información General/ (1184) Pruebas de Sensibilización 1691
USP 39
Tabla 1. Los Cuatro Tipos de Reacciones de Hlpersenslbllizaclón*, Mediadores y Ejemplos de Enfermedades Clase de Reacción
Mediadores
Ejemplos de Enfermedades
Tipo 1
Las moléculas de lgE unidas a los mastocitos interactúan con el antígeno para liberar sustancias farmacológicamente activas.
Fiebre del heno, asma bronquial y otras reacciones atópicas
Tipo 11
La lgM y/o las moléculas de lgM interactúan con células diana, fijan el complemento y producen lisis celular
Diversas alergias medicamentosas, eritroblastosis fetal, anemia hemolítica, trombocitopenia
Tipo 111
Complejos antígeno-anticuerpo, complemento
Reacción de Arthus, enfermedad del suero, glomerulonefritis alérgica
Tipo IV
Linfocitos T, antígeno, monocitos, macrófagos
Dermatitis por contacto
* Según el esquema de clasificación de Gell y Coombs
Se sigue un proceso de varios pasos, descrito en el capítulo Biocompatibilidad de los Materiales Usados en Envases de Medicamentos, Dispositivos Médicos e Implantes (1031 ), con el fin de determinar qué pruebas toxicológicas necesitan realizarse, si fuera necesario, sobre un artículo determinado. En algunos casos, los artículos previamente comercializados aportan evidencia suficiente para satisfacer los requisitos toxicológicos (Ver Figura 7 en el capítulo (1031 )). Los factores importantes tratados en la Figura 1 (capítulo (1031)) incluyen el tipo y grado de contacto con el cuerpo, la composición química, el proceso de fabricación, el proceso de esterilización y, como se mencionó anteriormente, la similitud con artículos previamente comercializados. Si fueran necesarias más pruebas toxicológicas, es importante observar la clasificación de los dispositivos médicos proporcionada en la Tabla 2 del capítulo de información general (1031 ), porque el grado y alcance de las pruebas toxicológicas que se requieran dependerán en gran medida de la naturaleza y duración del contacto del artículo con el cuerpo. La clasificación que surge de la Tabla 2 en el capítulo (1031 ), junto con la duración de la exposición al artículo, se usan en las Tablas 3 a 5 del capítulo (1031) para determinar cuáles pruebas toxicológicas se deben efectuar. La Tabla 2, a continuación, presenta información extraída de las Tablas 3 a 5 del capítulo (1031) e indica aquellas circunstancias en las cuales se deben considerar las pruebas de sensibilización. Tabla 2. Artículos para los Cuales se Deben Considerar las Pruebas de Sensl,billzaclón Basándose en la Categoría del Artículo y la Duración de la Exposiclon Categoría del Dispositivo Dispositivos de superficie
Dispositivos de comunicación externa
Dispositivos para implantes
Punto de Contacto con el Cuerpo
Duración del Contacto
Piel
Aª, Bb,
Membrana mucosa
A,B,C
Superficies comprometidas o expuestas
A,B,C
Vía sanguínea, indirecta
A, B, C
Comunicación con tejido, hueso o dentina
A, B, C
Sangre circulante
A,B,C
Tejido o hueso
A,B,C
Sangre
A, B, C
ce
ªA: limitada (menos de 24 horas) b B: prolongada (desde 24 horas hasta 30 días) e C: permanente (más de 30 días)
En este capítulo se revisan nueve métodos de prueba. La Tabla 3 enumera los métodos y las especies con las cuales se efectúan. Tabla 3. Metodologías que se Pueden Usar en las Pruebas de Senslblllzaclon y Especies Requeridas para la Prueba Prueba Maximización de Maqnusson y Kliqman
Especie Usada en la Prueba Cobayo
Prueba Estándar de Buehler
Cobayo
Epicutánea abierta
Cobayo
Adyuvante Completo de Freund
Cobayo
Optimización
Cobayo
Adyuvante Fraccionado
Cobayo
Ensayo del Nódulo Linfático Local
Ratón
Inflamación de la Oreja del Ratón
Ratón
Aumento de Vitamina A
Ratón
Dada la preponderancia de la Prueba de Maximización de Magnusson y Kligman en Cobayo (GPMT, por sus siglas en inglés) o de la Prueba de Buehler (BT, por sus siglas en inglés), dichas pruebas se revisarán en detalle en este capítulo. Como alternativa a los procedimientos usados con más frecuencia, se ofrece un breve resumen de las pruebas restantes.
1692 (1184) Pruebas de Sensibilización / Información General
USP 39
Todas las pruebas se deben validar periódicamente en el laboratorio que las realiza, usando controles positivos, como por ejemplo aldehído hexil cinámico, mercaptobenzotiazol o benzocaína (controles positivos recomendados por la Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económico [OECD, por sus siglas en inglés]).
PRUEBA DE MAXIMIZACIÓN DE MAGNUSSON Y KLIGMAN EN COBAYO (GPMT) Animales Se pueden usar machos y hembras de cobayos albinos. Todos los animales deben estar en perfecto estado de salud y pesar entre 300 g y 500 g al comienzo del experimento. Las hembras no deben estar preñadas, ni haber parido previamente. Antes de las pruebas, es importante aclimatar los animales a las condiciones del laboratorio por lo menos durante 5 días. Todos los animales deben ser manipulados según las pautas estipuladas para el tratamiento humanitario de los animales, contenidas en los requisitos reglamentarios apropiados. Se deben usar al menos 1O animales de prueba y 5 de control. Para conseguir suficiente potencia analítica (es decir, para detectar los sensibilizantes débiles), puede ser necesario usar 20 animales de prueba y 1 O de control. Pueden requerirse animales adicionales para establecer las dosis apropiadas que se deben administrar (ver Determinación de la Concentración del Artículo de Prueba).
Alojamiento y Alimentación El cuarto de los animales debe mantenerse a 20 ± 3º, con una humedad relativa de 30% a 70% y 12 horas de luz y oscuridad. Los animales se pueden alojar individualmente o en grupo. Se pueden usar dietas estándar de laboratorio (las recomendadas para cobayo garantizan una cantidad adecuada de ácido ascórbico). Se debe proporcionar agua potable a voluntad.
Preparación de los Animales Antes de la Prueba Los animales deben ser distribuidos en forma aleatoria mediante un método validado de aleatorización. Por ejemplo, el método puede utilizar tablas de números aleatorios o números aleatorios generados por computadora. Los sitios donde se planea aplicar el artículo de prueba en el animal (región intraescapular), deben ser depilados sin que se produzcan abrasiones en la piel. Esto se puede lograr cortando o afeitando el pelo o con depiladores químicos. El depilador químico no debe producir irritación por sí mismo. Se deben registrar las observaciones generales de los animales antes de la prueba, incluidos cualquier indicio de alteración de la salud (no usar dichos animales en la prueba), y el peso corporal.
Preparación del Artículo de Prueba 1 Este ensayo requiere que el artículo de prueba se pueda inyectar por vía intradérmica. Cuando el artículo de prueba no es apto para la administración directa, se deben preparar extractos de acuerdo con el procedimiento proporcionado en el capítulo general Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo (88).
Determinación de la Concentración del Artículo de Prueba El propósito de este estudio preliminar es determinar las concentraciones de la Preparación del Artículo de Prueba que se van a usar durante la fase inicial de inducción y la segunda fase de desafío de un estudio GPMT. Para la determinación de la concentración se pueden usar dos o tres animales. Se deben inyectar diversas concentraciones del artículo de prueba, o extractos del artículo, por vía intradérmica (O, 1 mL por sitio), con el disolvente que se va a emplear en el Procedimiento de Prueba. La concentración que ocasione sólo irritación leve a moderada (sin generar destrucción cutánea extensa o evidencia de toxicidad sistémica manifiesta para los animales) se debe utilizar en la Fase de Inducción con Inyección lntradérmica del Procedimiento de Prueba. Aplicar a dos o más animales una gama de concentraciones del artículo de prueba o de extractos del artículo de prueba, por medio de vendajes oclusivos y parches. Retirar los vendajes y parches después de 24 horas y examinar los sitios en busca de eritema. Elegir la concentración que ocasione sólo un leve eritema para la Fase de Inducción con Aplicación Tópica del Procedimiento de Prueba. Utilizar la concentración más alta del artículo de prueba o del extracto que no ocasione eritema en la Fase de Desafío del Procedimiento de Prueba. Si no se alcanza el umbral de irritación, seleccionar entonces la concentración más alta posible para la Fase de Inducción con Aplicación Tópica y la Fase de Desafío del Procedimiento de Prueba.
Si desea más información sobre la preparación de la muestra, remítase a la Norma ANSl/AAMl/150/CEN 10993-12-1996: Biological Evaluation of Medica! Devices-Part 12: Sample Preparation and Reference Materials (Evaluación Biológica de Dispositivos Médicos-Parte 12: Preparación de la Muestra y Materiales de Referencia)
1
Información General/ (1184) Pruebas de Sensibilización 1693
USP 39
Procedimiento de Prueba FASE DE INDUCCIÓN CON INYECCIÓN INTRADÉRMICA Esta fase requiere administrar por vía intradérmica tres pares de inyecciones, con la inyección de prueba y la de control de cada par en lados opuestos intraescapularmente. Cada inyección debe contener O, 1 mL; los pares de inyecciones 1 y 2 se deben administrar más cerca de la cabeza y el par 3 ligeramente alejado hacia la cola. Los pares están nominalmente dentro de un área de 8 cm 2 • Los pares de inyecciones constan de: Par de inyección 1:
Una mezcla 1:1 (v/v) de Adyuvante Completo de Freund (FCA, por sus siglas en inglés), una emulsión de aceite en agua que contiene micobacterias y el disolvente o vehículo apropiado (ver Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo (88)). Los animales de control reciben una mezcla de FCA y solución salina fisiológica (1 :1 ).
Par de inyección 2:
La Preparación del Artículo de Prueba en la concentración especificada en Determinación de la Concentración del Artículo de Prueba, con el disolvente o vehículo apropiado. Los animales de control reciben sólo el disolvente o vehículo.
Par de inyección 3:
La Preparación del Artículo de Prueba en la concentración especificada en Determinación de la Concentración del Artículo de Prueba en una mezcla 1 :1 (v/v) con FCA. Los animales de control reciben una inyección de una mezcla 1 :1 (v/v) de FCA y disolvente o vehículo.
FASE DE INDUCCIÓN CON APLICACIÓN TÓPICA Siete días (±1 día) después de la terminación de la Fase de Inducción con Inyección lntradérmica, administrar la muestra de prueba por aplicación tópica en la región intraescapular de cada animal. Tanto para los animales de prueba como para los de control, si la Preparación del Artículo de Prueba no causa irritación cutánea, aplicar lauril sulfato de sodio al 10% en vaselina aproximadamente 24 horas antes de comenzar la Fase de Inducción con Aplicación Tópica, para inducir una irritación local. En cada sitio de inyección, a los animales de prueba se les deben aplicar trozos de 2 x 4 cm de papel de filtro o gasa absorbente, completamente embebidos con la Preparación del Artículo de Prueba (preparada no más de 24 horas antes del uso), con la concentración seleccionada en Determinación de la Concentración del Artículo de Prueba. El papel de filtro o la gasa absorbente deben asegurarse a los animales con vendajes oclusivos. Los animales de control reciben el mismo tratamiento, excepto que se debe usar el disolvente o vehículo correspondiente en lugar del artículo de prueba. Retirar los vendajes y parches aproximadamente 48 horas después de la aplicación. FASE DE DESAFÍO Esta fase debe ocurrir 14 ± 1 días después de la Fase de Inducción con Aplicación Tópica. Se debe retirar el pelo de los sitios de aplicación de la prueba. Los parches de papel de filtro o las cámaras se empapan con Preparación del Artículo de Prueba recién preparada, en la concentración especificada en Determinación de la Concentración del Artículo de Prueba. Esto se hace para todos los animales de prueba y de control. Los parches o cámaras se aseguran con un vendaje oclusivo y se retiran después de 24 ± 2 horas.
Observaciones Aproximadamente 24, 48 y 72 horas después de retirar los parches de desafío se deben examinar los sitios de aplicación en busca de signos de reacciones. Son de particular importancia los casos en donde la reacción en los animales de prueba excede la de los animales de control. Se deben registrar todos los signos de reactividad, poniendo especial atención a los signos de eritema y edema. Una reacción edematosa verdadera palidece cuando se ejerce una presión suave. Cuanto más largo sea el periodo de palidez, mayor la gravedad del edema.
Interpretación Existen varias formas de evaluar y calificar los resultados de la GMPT. Las Tablas 4, 5 y 6 enumeran los detalles de tres de los sistemas de clasificación. Las calificaciones de 1 o más en los animales de prueba, con calificaciones de menos de 1 en los animales de control, indican sensibilización. Si los animales de control presentan reactividad grado 1 y si los animales de prueba presentan reactividad por encima de la reactividad más alta observada en los animales de control, también se sospecha sensibilización debida al artículo de prueba. Los porcentajes de la Tabla 4 se deben revisar si hay sólo 1O animales de prueba (es decir, las categorías serían O, <10%, de 10% a 30%, de 31 % a 60%, de 61 % a 80% y de 81%a100%). Si hay 20 animales de prueba, los múltiplos de 5% son adecuados. Tabla 4. Clasificación Basada en el Porcentaje de Animales de Prueba Sensibles % de Resultados Positivos en el
Calificación Asignada
Grupo de Prueba
o
-
1 No sensibilizante
1694 (1184) Pruebas de Sensibilización/ Información General
USP 39
Tabla 4. Clasificación Basada en el Porcentaje de Animales de Prueba Sensibles (Continuación) O/o de Resultados Positivos en el
Grupo de Prueba
Callflcaclón Asignada
<8 8-28 29-64 6S-80 81-100
1
Débil
2
Leve
3
Moderado
4
Fuerte
5
Extremo
Ta bl a5. CI as ifl caeI'on Basad a en a FormacI'on de Er tema y Edema Eritema y Escara
Grado
o
Ausencia de eritema
<1 2
Eritema leve o equívoco Eritema bien definido Eritema moderado
3
Eritema severo a ligera formación de escara
4 Edema
o
Ausencia de edema
<1 2
Edema leve o equívoco Edema bien definido Edema moderado
3
Edema severo
4 Tabla 6. Clasiflcaclón Basada en la Formación de Eritema Solamente Formación de eritema
Grado
o
Ausencia de eritema Eritema discreto o irreqular
1
Eritema moderado y confluente
2
Eritema intenso y tumefacción
3
Los resultados deben ser presentados para análisis estadístico (p.ej., tabla de contingencia de chi cuadrado) para establecer si las diferencias en los puntajes entre los animales tratados y los de control son significativas. Se debe comparar estadísticamente la respuesta del grupo de prueba en función del grupo de control. (Para esta comparación se puede usar la prueba U de Mann-Whitney).
Reprovocación El grado de cualquier respuesta en el grupo de control negativo, bajo condiciones experimentales, muestra el potencial de irritación de la Preparación del Artículo de Prueba. En este caso, los animales de prueba y de control se deben someter a un nuevo desafío 1 semana más tarde, en el lado no tratado del animal, con una concentración reducida de la Preparación del Artículo de Prueba. Un cobayo sensibilizado reaccionará de alguna manera a ambos desafíos. Una reacción leve que ocurra en un único tiempo de muestreo, en una sola de las provocaciones, debe arrojar serias dudas sobre si el cobayo está realmente sensibilizado. 2
PRUEBAS DE BUEHLER ESTÁNDAR {SBT) Animales Ver Animales en la Prueba de Maximización de Magnusson y Kligman en Cobayos (GPMT).
Alojamiento y Alimentación Ver Alojamiento y Alimentación en la Prueba de Maximización de Magnusson y Kligman en Cobayos (GPMT).
2 Basketter D.A. Guinea pig predictive tests fer contact hypersensitivity. En lmmunotoxicology and lmmunopharmacology, 2nd ed; Dean, j.H, Luster, M.I., Munson, A.E., Kimber, l., Eds; Raven Press, Ltd: Nueva York, 1994; pp. 693-702.
USP 39
Información General/ (1184) Pruebas de Sensibilización 1695
Preparación de los Animales antes de la Prueba Ver Preparación de los Animales antes de la Prueba en la Prueba de Maximización de Magnusson y Kligman en Cobayos (GPMT). Se debe cortar el pelaje de uno de los flancos del cobayo.
Preparación del Artículo de Prueba Ver Preparación del Artículo de Prueba en la Prueba de Maximización de Magnusson y Kligman en Cobayos (GPMT).
Determinación de la Concentración del Artículo de Prueba El propósito de este estudio preliminar es determinar las concentraciones de la Preparación del Artículo de Prueba que se van a usar durante la fase inicial de inducción y la segunda fase de desafío de un estudio SBT. Para la determinación de la concentración se pueden usar dos o tres animales. Se deben aplicar diversas concentraciones del artículo de prueba o extractos del mismo, usando parches (por ejemplo, cuatro almohadillas absorbentes de 4 cm 2) o cámaras. Los parches se deben mantener en su sitio con cinta adhesiva (si fuera necesario) y vendajes oclusivos. Los parches se deben retirar después de aproximadamente 6 horas, limpiando del sitio de prueba cualquier residuo del producto químico de prueba. Las observaciones se hacen en ese momento y a las 24 y 48 horas. La concentración que sólo causa irritación leve a moderada (eritema leve, sin evidencia de toxicidad manifiesta para los animales) y que puede aplicarse repetidamente en el mismo sitio se debe usar en la Fase de Inducción del Procedimiento de Prueba. Utilizar la concentración más alta del artículo de prueba o del extracto que no ocasione eritema en la Fase de Desafío del Procedimiento de Prueba.
Procedimiento de Prueba FASE DE INDUCCIÓN Aplicar 0,4 mL de la Preparación del Artículo de Prueba en un disolvente o vehículo apropiado, en la dosis identificada en Determinación de la Concentración del Artículo de Prueba. Usar parches similares a los usados en Determinación de la Concentración del Artículo de Prueba. Los parches se deben aplicar en un flanco (con el pelo cortado), manteniéndolos en su sitio oclusivamente durante 6 horas. Se puede necesitar restringir el movimiento de los animales para garantizar la oclusión. Los parches y cualquier residuo visible se deben retirar después de 6 horas. A los animales de control también se les aplican parches, pero éstos contienen sólo el disolvente o vehículo apropiado. Este proceso se debe repetir tres veces a la semana tanto para los animales de prueba como para los de control, en el mismo sitio, durante tres semanas consecutivas (en la Prueba de Buehler modificada se usan intervalos semanales). FASE DE DESAFÍO Esta fase debe realizarse 14 días después de la última aplicación de la Fase de Inducción. Cortar el pelo del flanco no analizado previamente de cada animal 24 horas antes de la aplicación de desafío. Al igual que en la Fase de Inducción, aplicar parches que contengan el artículo de prueba (a la concentración especificada en Determinación de la Concentración del Artículo de Prueba) o sólo disolvente o vehículo en las zonas no analizadas de los animales de prueba y de control. Con el fin de obtener bordes bien definidos en los sitios de aplicación, se prefieren las cámaras comerciales con reborde. Asegurar los parches con vendajes oclusivos y mantenerlos en su sitio durante 6 horas. Retirar todos los parches después de 6 horas. OBSERVACIONES A las 22 ± 2 horas después de retirar los parches, se debe cortar o depilar el pelaje de los animales en el sitio de aplicación. Después de aproximadamente 2 horas, clasificar los sitios (se pueden emplear las Tablas 4, 5 ó 6). Se deben registrar todos los signos de reactividad, poniendo especial atención a los signos de eritema y edema. Repetir la clasificación una vez más, después de que hayan transcurrido de 24 a 48 horas. Se puede comparar estadísticamente la respuesta del grupo de prueba en función del grupo de control. (Para esta comparación se puede usar la prueba U de Mann-Whitney). INTERPRETACIÓN Los resultados deben ser presentados para análisis estadístico (p.ej., tabla de contingencia de chi cuadrado) para establecer si las diferencias en los puntajes entre los animales tratados y los de control son significativas. Ver Interpretación en la Prueba de Maximización de Magnusson y Kligman en Cobayos (GPMT).
1696 (1184) Pruebas de Sensibilización /Información General
USP 39
RE PROVOCACIÓN Ver Reprovocación en la Prueba de Maximización de Magnusson y Kligman en Cobayos (GPMT).
OTROS PROCEDIMIENTOS PARA LA PRUEBA DE SENSIBILIZACIÓN La Prueba de Maximizacíón de Magnusson y Kligman en Cobayos y las Pruebas de Buehler Estándar son las pruebas de sensibilización efectuadas con más frecuencia. Sin embargo, existen otros métodos que pueden ser útiles para evaluar la capacidad de sensibilización. Algunos métodos sirven tanto para artículos de prueba sólidos como para extractos, mientras que otros sólo para extractos. Cuando se requiera el uso de cobayos en las siguientes pruebas, los animales y sus alojamientos deben cumplir con los requisitos especificados en Animales, en la Prueba de Maximizacíón de Magnusson y Kligman en Cobayos. Se debe retirar el pelaje del cobayo en los sitios de prueba, como se indica en Preparación de los Animales antes de la Prueba, en la Prueba de Maximizacíón de Magnusson y Kligman en Cobayos.
Prueba de Draize Fue la primera prueba predictiva aceptada por los organismos reglamentarios y todavía se usa. La prueba utiliza cobayos y el artículo de la prueba se administra a través de inyecciones intradérmicas. PREPARACIÓN DEL ARTÍCULO DE PRUEBA Esta prueba requiere que el artículo de prueba esté en forma de una solución que se pueda aplicar directamente a la piel del animal. Por lo tanto, podría ser necesario hacer extractos del material. Ver en Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo (88) la información sobre el procedimiento de preparación. FASE DE INDUCCIÓN Afeitar un flanco de cada uno de los 20 cobayos, luego inyectar 0,05 mL de una solución del artículo de prueba al O, 1% en el flanco anterior. Al día siguiente, y luego día por medio, hasta el día 20, inyectar O, l mL del artículo de prueba en un nuevo sitio del mismo flanco. FASE DE DESAFÍO Esta fase comienza 2 semanas después de la inyección final de la Fase de Inducción. Afeitar el flanco no tratado y luego inyectar 0,05 mL del artículo de prueba a cada uno de los 20 cobayos. Veinte animales no tratados previamente sirven como controles y también reciben inyecciones del artículo de prueba. OBSERVACIONES Los sitios de prueba de todos los animales de control y de prueba se evalúan en busca de eritema 24 y 48 horas después de las inyecciones de desafío. El grado de reacción en los animales de prueba se compara con el de los animales de control. Una respuesta más extensa y/o más intensa de los animales de prueba en función de los animales de control es indicativa de sensibilización.
Prueba Epicutánea Abierta Esta prueba utiliza cobayos. El objetivo es determinar la dosis requerida para inducir sensibilización simulando el uso en humanos a través de la aplicación tópica del artículo de prueba. PREPARACIÓN DEL MATERIAL DE PRUEBA Esta prueba requiere que el artículo de prueba esté en forma de una solución que se pueda aplicar directamente a la piel del animal. Por lo tanto, es necesario hacer extractos del material. Ver en Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo (88) la información sobre el procedimiento de preparación.
USP 39
Información General/ (1184) Pruebas de Sensibilización 1697
PRUEBAS PRELIMINARES Una serie de concentraciones del artículo de prueba se aplica a zonas de piel de 2 cm 2 en el flanco anterior de 6 a 8 cobayos
(0,025 mL por aplicación). Los sitios de prueba se deben examinar en busca de eritema 24 horas después de la administración del artículo de prueba. Se determinan la concentración más alta que no cause irritación (concentración máxima no irritante) y la concentración más baja que cause eritema en aproximadamente 25% de los animales (concentración mínima irritante). FASE DE INDUCCIÓN El artículo de prueba (o vehículo de control) se aplica a zonas de 8 cm 2 de la piel del flanco de 6 a 8 cobayos, diariamente durante 3 semanas o 5 veces a la semana durante 4 semanas. La cantidad por aplicación es de 0,01 ml. De nuevo se emplea una serie de concentraciones crecientes, que abarcan una progresión sucesiva a partir de la concentración mínima irritante. El artículo de prueba se debe aplicar en los mismos sitios en cada ocasión, a menos que se desarrolle irritación, en cuyo caso se debe usar un nuevo sitio en el mismo flanco. Los animales de control reciben el mismo tratamiento, excepto que se usa el vehículo en lugar del artículo de prueba. FASE DE DESAFÍO Cada animal se somete a desafío en el flanco no tratado, 24 a 72 horas después del último tratamiento de la Fase de Inducción, con 0,025 mL aplicados en zonas de 2 cm 2. Se usa una serie de concentraciones crecientes, desde la concentración mínima irritante hasta la concentración máxima no irritante y también se usan 5 concentraciones más bajas. OBSERVACIONES Los sitios de prueba se evalúan 24, 48 y 72 horas después del tratamiento. Se determina la concentración máxima que no causa irritación en el grupo de control. Los animales de los grupos de prueba que desarrollen respuestas inflamatorias a concentraciones más bajas que la concentración máxima no irritante en los controles se consideran sensibilizados.
Prueba del Adyuvante Completo de Freund Esta prueba está basada en el uso de inyecciones intradérmicas del artículo de prueba en una mezcla de adyuvante completo de Freund y agua destilada (50:50). PREPARACIÓN DEL MATERIAL DE PRUEBA Dado que esta prueba usa inyecciones intradérmicas, se necesita preparar extractos del material de prueba para emplear este procedimiento. Ver en Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo (88) la información sobre el procedimiento de extracción. PRUEBAS PRELIMINARES Determinar la concentración mínima irritante y la concentración máxima no irritante de la misma forma que en Pruebas Preliminares en la Prueba Epicutánea Abierta. FASE DE INDUCCIÓN El sitio de prueba consta de seis zonas de 2 cm 2 sobre los hombros de los cobayos. Se deben usar dos grupos, cada uno con 1O a 20 cobayos. A los animales del grupo de prueba se les inyecta por vía intradérmica 0, 1 mL de una solución del extracto del artículo de prueba al 5% en FCA/agua. Los animales de control reciben inyecciones de FCA/agua, sin el artículo de prueba. Estas inyecciones se repiten cada 4 días hasta haber administrado un total de tres inyecciones. FASE DE DESAFÍO Esta fase debe comenzar 2 semanas después de la última inyección de la Fase de Inducción. Las aplicaciones tópicas de 0,025 mL del artículo de prueba a las concentraciones mínima irritante y máxima no irritante, además de dos concentraciones más bajas, se administran en zonas de 2 cm2 del flanco afeitado. Los sitios de prueba deben permanecer descubiertos.
USP 39
1698 (1184) Pruebas de Sensibilización / Información General
OBSERVACIONES Examinar los sitios de prueba en busca de eritema 24, 48 y 72 horas después de las aplicaciones tópicas. Se debe determinar la concentración mínima no irritante en los animales de control. Aquellos animales de prueba que presenten eritema a concentraciones más bajas que la concentración mínima no irritante en los animales de control se deben considerar sensibilizados.
Prueba de Optimización Esta prueba tiene algunas similitudes con la Prueba de Draize. Sin embargo, a diferencia de la Prueba de Draize, ésta usa tratamientos tanto intradérmicos como tópicos e incluye adyuvante para algunas de las inyecciones de inducción. PREPARACIÓN DEL MATERIAL DE PRUEBA Al igual que en otros procedimientos de prueba que incluyen inyecciones intradérmicas, el artículo de prueba debe estar en una forma apta para inyección. Ver en Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo (88) la información sobre el procedimiento de extracción. FASE DE INDUCCIÓN Se usan 20 cobayos de prueba y 20 de control. A cada animal se le deben administrar un total de 1 O inyecciones intradérmicas. Los animales de prueba reciben O, 1 mL de una mezcla del artículo de prueba al O, 1% y solución salina al 0,9% (50:50) el día 1, en una inyección aplicada en el flanco afeitado y otra en una porción de piel dorsal afeitada. Dos y 4 días más tarde, se administra otra inyección intradérmica del artículo de prueba en solución salina en ocho nuevos sitios del dorso. Cada día por medio durante las semanas 2 y 3, inyectar el artículo de prueba por vía intradérmica en 1O sitios sobre los hombros, en una mezcla 50:50 de solución salina y FCA. Administrar la misma secuencia de inyecciones a los 20 animales de control, excepto que no se incluye el artículo de prueba en las inyecciones de solución salina o las de solución salina/FCA. FASE DE DESAFÍO Treinta y cinco días después de la primera inyección, los animales son sometidos a una administración tópica de O, 1 mL de la solución al O, 1% del artículo de prueba en solución salina (animales de prueba). Los animales de control reciben sólo inyecciones de solución salina. Cuarenta y cinco días después de la primera inyección, se administra una segunda aplicación tópica. Aplicar tópicamente una concentración no irritante del artículo de prueba (0,05 mL) a una zona de 1 cm 2 de piel sin tratar. Este sitio se debe cubrir con un trozo de papel de filtro de 2 cm 2, después de lo cual se debe aplicar un vendaje oclusivo. El parche se debe retirar después de 24 horas. OBSERVACIONES Veinticuatro horas después de cada inyección durante la semana 1, se debe medir el espesor de un pliegue cutáneo sobre los sitios de inyección de cada animal, empleando un calibre (mm) y registrar los dos diámetros transversales más grandes de cada reacción eritematosa (mm). Los volúmenes de reacción se calculan multiplicando el espesor del pliegue por el producto de los dos diámetros transversales (expresados como µL). Para cada animal se debe calcular la media del volumen de reacción (+ 1 SD) durante la semana 1. Se calculan los volúmenes de la reacción de desafío de cada animal después de las inyecciones en el día 35. Si un animal desarrolla un volumen de reacción de desafío mayor que la media de su volumen de reacción + 1 SD, se debe considerar sensibilizado. Después de la prueba de desafío con parches, evaluar los sitios de prueba en busca de eritema y edema. Las evaluaciones se deben hacer con la Tabla 5. La cantidad de animales positivos se debe comparar estadísticamente con los animales de control seudopositivos. Esto se hace tanto para los resultados de la inyección intradérmica como para los de la prueba con parches. Se puede utilizar la Prueba Exacta de Fisher. Después de los análisis estadísticos por separado, los resultados de las inyecciones intradérmicas y de las pruebas con parche se pueden combinar y evaluar empleando la Tabla 7, con el fin de clasificar un artículo de prueba como un sensibilizante fuerte, moderado o débil o como no sensibilizante. Tabla 7. Esquema de Clasificación para Artículos de Prueba basado en la Prueba de Optimización lntradérmica % de Animales positivos S*, > 75
* S =significativo; N.S. =no significativo
Prueba con Parche Clasificación
% de Animales positivos y/o S, > 50
Sensibilizante fuerte
Información General/ (1184) Pruebas de Sensibilización 1699
USP 39
Tabla 7. Esquema de Clasificación para Artículos de Prueba basado en la Prueba de Optimización (Continuación) lntradérmica o/o de Animales positivos
Prueba con Parche o/o de Animales positivos
Clasificación
s, 50-75 s, 30-50
y/o S, 30-50
Sensibilizante moderado
N.S.*, 0-30
Sensibilizante débil
N.S., 0-30
N.S., O
No sensibilizante
• S =significativo; N.S.= no significativo
Prueba del Adyuvante Fraccionado Esta prueba utiliza tanto FCA como lesión cutánea. El artículo de prueba se aplica tópicamente. PREPARACIÓN DEL MATERIAL DE PRUEBA Dado que esta prueba emplea aplicaciones tópicas del artículo de prueba, éste puede estar en forma sólida o líquida. Si fuera necesario hacer extractos, ver los procedimientos de extracción en el capítulo Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo (88). FASE DE INDUCCIÓN Tanto para el grupo de prueba como para el de control se usan de 1 O a 20 cobayos. Se debe afeitar una zona de la piel de la espalda, justo detrás de los hombros hasta que la piel quede brillante. Luego, las zonas afeitadas se deben tratar con hielo seco de 5 a 1O segundos. Sobre el área tratada se debe colocar un vendaje hecho con gasa poco densa con adhesivo elástico y con una apertura de 2 cm x 2 cm, el cual se asegura luego con cinta adhesiva. El artículo de prueba (0,2 mL de materiales viscosos, O, 1 mL de líquidos, o material sólido) se coloca dentro de la apertura del vendaje, sobre la piel tratada. Encima del artículo de prueba se deben colocar dos capas de papel de filtro #2 que se recubren con cinta oclusiva. A continuación, el papel de filtro y el material oclusivo que lo recubre se deben asegurar con cinta adhesiva al vendaje circundante. Después de 2 días, levantar el papel de filtro de los sitios de prueba y volver a aplicar el artículo de prueba en el mismo sitio. Asegurar de nuevo el papel de filtro y el recubrimiento. Después de 2 días más, levantar el papel de filtro y administrar dos inyecciones de 0,075 mL de FCA en los bordes del sitio de prueba. Luego se aplica nuevamente el material de prueba y se reasegura el papel de filtro con el recubrimiento. El artículo de prueba se debe volver a aplicar una vez más el día 7, volviéndose a sellar el papel de filtro y el recubrimiento. El día 9, retirar el papel de filtro y todo el material de vendaje asociado. FASE DE DESAFÍO El día 22 después del tratamiento de inducción, se debe aplicar 0,5 mL de material de prueba (o el artículo sólido) a una zona rasurada de 2 cm x 2 cm en el centro de la espalda. Los sitios de prueba se deben cubrir con papel de filtro y recubrir con cinta adhesiva. Ésta se sostiene en su sitio con un vendaje elástico asegurado con cinta adhesiva. Los animales de control reciben el mismo tratamiento en la fase de desafío. La preparación se debe retirar después de 24 horas. OBSERVACIONES Veinticuatro, 48 y 72 horas después de retirar la preparación de la fase de desafío, evaluar los sitios de prueba en busca de eritema y edema. Se puede emplear el esquema de clasificación de la Tabla 5.
Prueba de Inflamación de la Oreja del Ratón Existen una cantidad de ventajas potenciales al usar ratones en lugar de cobayos para los métodos de sensibilización. Las pruebas clásicas en cobayos tienden a ser más costosas y tardan más tiempo. Más aún, al depender de puntajes relativamente subjetivos basados en edema y eritema, la robustez y tolerancia metodológicas podrían ser cuestionables. Esta prueba usa ratones y emplea tanto exposiciones tópicas como inyecciones. ANIMALES Se deben usar ratones hembra CF-1, Balb/c o Swiss, de 6 a 8 semanas de edad. Pueden alojarse en grupo en jaulas con cama de contacto directo (direct bedding cages). La aclimatación debe durar por lo menos de 5 a 7 días. Deben disponer de comida (un alimento apropiado para ratones) y agua a voluntad. En el estudio no se deben usar animales con orejas dañadas. En este momento, se debe medir y registrar el espesor de ambas orejas de cada animal.
1700 (1184) Pruebas de Sensibilización / Información General
USP 39
PREPARACIÓN DEL MATERIAL DE PRUEBA Al igual que en otros procedimientos que incluyen inyecciones intradérmicas, el artículo de prueba debe estar en una forma apta para inyección. Ver en Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo (88) la información sobre el procedimiento de extracción. PRUEBAS PRELIMINARES Para este procedimiento se deben determinar la concentración mínima irritante y la máxima no irritante del artículo de prueba. Esto se hace con cuatro grupos de dos ratones, examinando los efectos de por lo menos cuatro concentraciones del artículo de prueba. FASE DE INDUCCIÓN Afeitar los abdómenes de los animales y luego depilarlos con una cinta adhesiva quirúrgica hasta que el área de prueba quede brillante. Una única inyección de 0,05 mL de FCA se divide y administra por vía intradérmica en dos sitios de inyección dentro del área afeitada y depilada, pero a lo largo de los bordes. Después de las inyecciones de adyuvante, aplicar 100 µL del artículo de prueba (usar la concentración mínima irritante) o vehículo (controles) en el centro de los sitios de prueba afeitados. Después de que los sitios de prueba se sequen, regresar los ratones a las jaulas. La depilación con cinta y la aplicación del artículo de prueba (pero no del FCA) se repiten todos los días durante los siguientes 3 días. FASE DE DESAFÍO Esta fase debe ocurrir 7 días después de la aplicación tópica final de la fase de inducción. El artículo de prueba (a la concentración más alta no irritante) se debe aplicar tópicamente (20 µL) en una oreja, mientras que la oreja opuesta recibe 1 O µL de vehículo solo. Esto se realiza para todos los animales de prueba y de control. OBSERVACIONES Se debe registrar el espesor de ambas orejas de cada animal 24 y 48 horas después del desafío. Las mediciones se deben hacer con un calibre (de preferencia un calibre de resorte). Un animal sensibilizado es aquel cuya oreja tratada con el artículo de prueba presenta un espesor por lo menos 20% mayor que la oreja opuesta. Para que la prueba sea válida, el espesor de las orejas de los animales de control tratadas con el artículo de prueba no debe ser más de 1 0% superior al de las orejas opuestas. Si las orejas de los animales de control no cumplen con los requisitos, la prueba se debe repetir, usando concentraciones más bajas.
Prueba del Nódulo Linfático Local Esta prueba se basa en la observación de que la exposición de los ratones a los sensibilizantes puede ocasionar hiperplasia de células T en los nódulos linfáticos auriculares de los ratones. El método combina fases in vivo e in vitro y requiere el uso de radioisótopos. Un aspecto poco usual de esta prueba es que no se requiere una fase de desafío. ANIMALES Se deben usar cuatro grupos de un mínimo de cuatro ratones, CBA/ca machos o hembras (sólo un sexo en cada prueba), entre 8 y 12 semanas de edad. PREPARACIÓN DEL MATERIAL DE PRUEBA Aunque en teoría se podría aplicar un artículo de prueba sólido a la superficie dorsal de la oreja de un ratón, en la práctica se debe usar un extracto de dicho artículo. Ver en Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo (88) la información sobre el procedimiento de extracción. PRUEBAS PRELIMINARES Se debe usar una concentración no tóxica del artículo de prueba. De no estar establecida, puede ser necesario realizar una prueba preliminar para toxicidad manifiesta, con el fin de determinar una dosis apropiada.
USP 39
Información General/ (1184) Pruebas de Sensibilización 1701
FASE DE INDUCCIÓN Aplicar 25 µL de la concentración apropiada del artículo de prueba, o el vehículo (controles), a la superficie dorsal de cada oreja, durante 3 días consecutivos. Cinco días después del primer tratamiento, inyectar a los animales, a través de la vena de la cola, 2,5 mL de solución salina amortiguada con fosfato que contenga 20 µCi de 3H-metil timidina. Cinco horas después de la inyección isotópica, practicarles eutanasia a los animales. Retirar los nódulos linfáticos auriculares drenantes de todos los animales de los grupos de prueba y de control. Combinar los nódulos linfáticos de todos los animales dentro de un grupo dado, de manera que se obtenga una sola suspensión de células de cada grupo. La suspensión de células se puede obtener pasando los nódulos linfáticos a través de un tamiz de acero inoxidable de malla 200, con ayuda del émbolo de una jeringa. Centrifugar luego las células a 190 x g durante 1 O minutos, resuspender en 3 mL de ácido tricloroacético (ATA) al 5% y mantenerlas durante la noche a 4º. El precipitado resultante se debe recuperar por centrifugado y el pellet se debe resuspender en 1 mL de ATA al 5%. Colocar la suspensión en viales de centelleo con 1O mL de líquido de centelleo y contar las desintegraciones por minuto (dpm) con un contador beta. OBSERVACIONES Comparar las dpm de cada grupo de prueba con respecto al grupo de control. Si el cociente iguala o excede de 3 para cualquier grupo de prueba, puede considerarse que la concentración del artículo de prueba usada en ese grupo es sensibilizante.
Prueba de Aumento de Vitamina A Esta prueba es similar a la Prueba de Inflamación de la Oreja del Ratón en que los artículos de prueba se aplican tópicamente en el abdomen, con una aplicación de desafío en las orejas, seguida por mediciones del espesor de las orejas. Una diferencia importante es el uso de ratones cuyo alimento se suplementa con acetato de vitamina A. El propósito de la suplementación es aumentar la reactividad del sistema inmunitario, incrementando por lo tanto la posible reacción de sensibilización. ANIMALES Se deben mantener ratones Balb/c machos, de 3 a 4 semanas de edad con dieta suplementada con acetato de vitamina A. La dieta se puede preparar mezclando cada kg de alimento con 0,477 g de acetato de vitamina A gelatinizado. La mezcla de comida se debe usar dentro de las 3 semanas de preparada. Los ratones a usar en los estudios de sensibilización deben alimentarse con la dieta suplementada durante por lo menos 4 semanas. Por lo tanto, los ratones deben tener de 7 a 1 O semanas de edad al momento del estudio de sensibilización. En este momento se debe medir y registrar el espesor de ambas orejas de cada animal. PREPARACIÓN DEL MATERIAL DE PRUEBA Aunque, en teoría, se podría aplicar un artículo de prueba sólido a la superficie dorsal de la oreja de un ratón, en la práctica se debe usar un extracto de dicho artículo. Ver en Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo (88) la información sobre el procedimiento de extracción. PRUEBAS PRELIMINARES Determinar la concentración máxima no irritante y la mínima irritante en sendos grupos de animales. Esto puede hacerse según se describe en Pruebas Preliminares en la Prueba de Inflamación de la Oreja del Ratón. FASE DE INDUCCIÓN Afeitar el pelaje del abdomen y del tórax de 1 O ratones de cada grupo. Luego aplicar 100 µL del artículo de prueba (a la concentración mínima irritante) en los sitios de prueba, los días O, 2, 4, 7 y 11. Los animales de control reciben 100 µL de vehículo solo en las mismas fechas. FASE DE DESAFÍO Esta fase debe ocurrir 4 días después de la aplicación final de la Fase de Inducción. Aplicar a cada oreja de todos los animales de los grupos de prueba y control, 25 µL del artículo de prueba (a la concentración máxima no irritante).
1702 (1184) Pruebas de Sensibilización/ Información General
USP 39
OBSERVACIONES Se debe registrar el espesor de ambas orejas de cada animal 24 y 48 horas después del desafío. Las mediciones se deben hacer con un calibre (de preferencia un calibre de resorte). Calcular el porcentaje de aumento en el espesor de cada oreja, restando la medida previa al tratamiento de la medida posterior al tratamiento, dividiendo el resultado por la medida antes del tratamiento y multiplicando por 1OO. Se debe comparar estadísticamente la respuesta del grupo de prueba en función del grupo de control. (Para esta comparación se puede usar la prueba U de Mann-Whitney). También se deben calcular los resultados de cada animal. Si el aumento en el espesor de la oreja de un animal del grupo de prueba es como mínimo 50% mayor que el aumento más elevado de un animal de control, este resultado es indicativo de sensibilización. Como evaluación general, si los resultados del estudio proporcionan un resultado significativo de la prueba estadística con un p<0,01 para las comparaciones del grupo de prueba con el grupo control, o si cuando al menos dos animales de prueba tienen aumentos del espesor de la oreja que excedan el 50% de los cambios máximos en espesor en el grupo de control y la comparación de grupo presentó un p<0,05, esto indica sensibilización al artículo de prueba.
(1191) CONSIDERACIONES SOBRE ESTABILIDAD EN LA PRÁCTICA DE DISPENSACIÓN NOTA-Considerando que el presente capítulo tiene como único objetivo brindar información general, ninguna de las afirmaciones que se hacen en él tiene el propósito de modificar o reemplazar alguno de los requisitos específicos aplicables a los artículos farmacopeicos, que se describen en otras partes de esta Farmacopea. En este capítulo, se tratan aspectos de la estabilidad de los productos farmacéuticos que son de principal interés para el farmacéutico en la dispensación de medicamentos. Los farmacéuticos deben evitar los ingredientes y las condiciones que podrían provocar excesivamente la descomposición química o el deterioro físico de las preparaciones farmacéuticas, en especial cuando se realizan preparaciones magistrales (ver Preparación Magistral-Preparaciones No Estériles (795)). La estabilidad y el efecto clínico de las formas farmacéuticas fabricadas pueden verse muy comprometidos por alteraciones aparentemente mínimas o por preparaciones magistrales inadecuadas. Los farmacéuticos deben establecer y mantener condiciones de preparación magistral que aseguren la estabilidad de los medicamentos a fin de evitar el fracaso terapéutico y las reacciones adversas. Estabilidad-La estabilidad se define como el grado hasta el cual un producto conserva, dentro de límites especificados y durante todo el período de almacenamiento y uso (es decir, su vida útil), las mismas propiedades y características que poseía al momento de su fabricación. La siguiente tabla presenta los cinco tipos de estabilidad que suelen reconocerse. Criterios de Niveles Aceptables de Estabilidad Tipo de Estabilidad Química
Condiciones Mantenidas Durante toda la Vida Útil del Producto Farmacéutico Cada ingrediente activo conserva su integridad química y la potencia declarada en la etiqueta, dentro de los límites especificados.
Física
Se conservan las propiedades físicas originales, entre ellas, aspecto, palatabilidad, uniformidad, disolución y capacidad de suspensión.
Microbiológica
Se conserva la esterilidad o resistencia a la proliferación microbiana según los requisitos especificados. Los agentes antimicrobianos que están presentes conservan la eficacia dentro de los límites especificados.
Terapéutica
No se altera el efecto terapéutico.
Toxicológica
No se produce ningún aumento significativo de la toxicidad.
FACTORES QUE AFECTAN LA ESTABILIDAD DEL PRODUCTO Todos los ingredientes, ya sean los terapéuticamente activos o los necesarios para dar forma farmacéutica a las preparaciones, pueden modificar la estabilidad de los fármacos y las formas farmacéuticas. Entre los principales factores ambientales que pueden disminuir la estabilidad se encuentran la exposición a temperaturas adversas, a la luz, a la humedad, al oxígeno y al dióxido de carbono. Los principales factores asociados a las formas farmacéuticas que influyen en la estabilidad de los fármacos son el tamaño de la partícula (especialmente en emulsiones y suspensiones), el pH, la composición del vehículo (p.ej., el porcentaje de agua "libre" y la polaridad total), la compatibilidad de aniones y cationes, la fuerza iónica de la solución, el envase primario, los aditivos químicos específicos, y la unión molecular y la difusión de fármacos y excipientes. En las formas farmacéuticas, las siguientes reacciones suelen disminuir la cantidad de fármaco activo y, por lo general, no generan indicios visuales ni olfativos que las evidencien. Hidrólisis-Los ésteres y las fJ -lactamas son las uniones químicas con mayor probabilidad de sufrir hidrólisis en presencia de agua. Por ejemplo, el éster acetilo que contiene la aspirina se hidroliza a ácido acético y ácido salicílico en presencia de
USP 39
Información General/ (1191) Estabilidad en la Práctica de Dispensación 1703
humedad; sin embargo, en un ambiente seco, la hidrólisis de la aspirina es inapreciable. La velocidad de hidrólisis de la aspirina aumenta en proporción directa a la presión de vapor de agua en el ambiente. La unión química amida también se hidroliza, aunque generalmente a una velocidad menor que los ésteres equivalentes. Por ejemplo, la procaína (un éster) se hidroliza por autoclavado, mientras que la procainamida no. La amida o unión peptídica que forma parte de péptidos y proteínas tiene una labilidad variable a la hidrólisis. Las uniones lactama y azometina (o imina) presentes en las benzodiazepinas también son lábiles a la hidrólisis. Los principales aceleradores químicos o catalizadores de hidrólisis son las condiciones adversas de pH y sustancias químicas específicas (p.ej., la dextrosa y el cobre en el caso de la hidrólisis de la ampicilina). Epimerización-Las sustancias de la familia de las tetraciclinas son las que más probablemente sufren epimerización. Esta reacción es rápida cuando se expone el fármaco disuelto a un pH de nivel intermedio (superior a 3), y causa un reacomodamiento estérico del grupo dimetilamino. El epímero de la tetraciclina, la epitetraciclina, tiene escasa actividad antibacteriana o carece de ella. Descarboxilación-Algunos ácidos carboxílicos disueltos, como por ejemplo el ácido p-aminosalicílico, pierden dióxido de carbono a partir del grupo carboxilo cuando se los calienta. El producto resultante tiene una menor potencia farmacológica. La f3 -ceto descarboxilación es una reacción que pueden sufrir algunos antibióticos sólidos que tienen un grupo carbonilo en el f3 -carbono de un ácido carboxílico o de un anión carboxilato. Estas descarboxilaciones se producen en los siguientes antibióticos: carbenicilina sódica, ácido libre de carbenicilina, ticarcilina sódica y ácido libre de ticarcilina. Deshidratación-La deshidratación de tetraciclina catalizada por ácidos forma epianhidrotetraciclina, producto que carece de actividad antibacteriana y que además es tóxico. Oxidación-Las estructuras moleculares que tienen mayor probabilidad de sufrir oxidación son las que contienen un grupo hidroxilo unido directamente a un anillo aromático (p.ej., los derivados del fenol, tales como las catecolaminas y la morfina), los dienos conjugados (p.ej., la vitamina A y los ácidos grasos libres insaturados), los anillos aromáticos heterocíclicos, los derivados nitrito y nitroso, y los aldehídos (p.ej., los saborizantes). Los productos de oxidación generalmente carecen de actividad terapéutica. Los signos visuales de la oxidación, por ejemplo, la aparición de productos color ámbar a partir de la epinefrina incolora, probablemente no sean evidentes en algunas diluciones o para algunas personas. La oxidación es catalizada por valores de pH superiores al óptimo, por iones de metales pesados polivalentes (p.ej., cobre y hierro) y por exposición a oxígeno e iluminación UV. Estas dos últimas causas de oxidación justifican el empleo de antioxidantes, atmósferas de nitrógeno durante el llenado de ampollas y viales, empaques externos opacos, y envases de plástico o vidrio ámbar transparente. Descomposición Fotoquímica-La exposición a la luz, en especial a la iluminación UV, puede provocar oxidación (fotoxidación) y escisión (fotólisis) de uniones covalentes. El nifedipino, el nitroprusiato, la riboflavina y las fenotiazinas son muy inestables a la fotoxidación. En los compuestos susceptibles, la energía fotoquímica genera radicales libres intermediarios, que pueden perpetuar las reacciones en cadena. Fuerza lónica-EI efecto que tiene la concentración total de los electrólitos disueltos sobre la velocidad de las reacciones de hidrólisis resulta de la influencia que tiene la fuerza iónica sobre la atracción interiónica. En términos generales, la constante de velocidad de hidrólisis es inversamente proporcional a la fuerza iónica con iones de carga opuesta (p.ej., fármacos catiónicos y excipientes aniónicos) y directamente proporcional a la fuerza iónica con iones de carga similar. Una reacción que genera un ión de carga opuesta a la del ión del fármaco original puede aumentar la velocidad de hidrólisis, a medida que la reacción progresa, como consecuencia del aumento de la fuerza iónica. La alta fuerza iónica de las sales inorgánicas también puede reducir la solubilidad de algunos otros fármacos. Influencia del pH-La degradación de muchos fármacos en solución se acelera o desacelera exponencialmente según disminuya o aumente el pH en un intervalo específico de valores de pH. Debido a las reacciones de oxidación e hidrólisis, un valor inadecuado de pH representa junto a la exposición a temperaturas altas, uno de los factores con mayor probabilidad de causar una disminución del contenido del fármaco clínicamente significativa. Por ejemplo, una solución o suspensión de un fármaco puede permanecer estable durante días, semanas e incluso años en su formulación original, pero cuando se la mezcla con otro líquido que le cambia el pH, se degrada en minutos o días. Es posible que un cambio de pH de 1 sola unidad (p.ej., de 4 a 3 o de 8 a 9) pueda disminuir la estabilidad del fármaco en un factor de 1O o mayor. Los sistemas amortiguadores del pH, que generalmente están constituidos por un ácido o una base débil y su sal, se usan habitualmente como excipientes en preparaciones líquidas para mantener el pH en un intervalo de valores donde la velocidad de degradación del medicamento es mínima. La amortiguación o ajuste de pH también se realiza para lograr la disolución de fármacos. Por ejemplo, la relación entre el pH y el pKa controla las fracciones de las especies ionizadas y no ionizadas de electrólitos orgánicos débiles, siendo las primeras generalmente más solubles que las segundas. También es importante la influencia del pH sobre la estabilidad física de los sistemas de dos fases, sobre todo de las emulsiones. Por ejemplo, las emulsiones grasas para la vía intravenosa se desestabilizan por pH ácido. Compatibilidad lnteriónica (lónN+-lónN--)-La compatibilidad o solubilidad de iones con carga opuesta depende principalmente del número de cargas que tenga cada ión y del tamaño molecular de los iones. En general, los iones polivalentes de carga opuesta son los que tienen más probabilidades de ser incompatibles. Por lo tanto, es probable que surja una incompatibilidad si se agrega un ión grande con una carga opuesta a la del fármaco. Estabilidad en el Estado Sólido-Las reacciones en el estado sólido son relativamente lentas, por lo que la estabilidad de los fármacos en estado sólido rara vez representa un problema en la dispensación. La velocidad de degradación de los sólidos
1 704 (1191) Estabilidad en la Práctica de Dispensación / Información General
USP 39
secos, por lo general, sigue una cinética de primer orden o una curva sigmoidea. Los fármacos sólidos que tienen temperatura de fusión baja no deberían combinarse con otras sustancias químicas con las que podrían formar una mezcla eutéctica. En presencia de humedad, la descomposición del fármaco sólido puede cambiar la cinética química a una de orden cero porque la velocidad está controlada por una fracción relativamente pequeña del fármaco que se encuentra en una solución saturada, que está ubicada (por lo general, de modo imperceptible) sobre la superficie o en la masa del producto farmacéutico sólido. Temperatura-En general, la velocidad de una reacción química se duplica por cada 1 Oº de incremento de la temperatura. Esta relación se ha hallado en casi todos los casos de hidrólisis y en algunos de oxidación de fármacos. El factor real de aumento de velocidad depende de la energía de activación de cada reacción en particular. La energía de activación es una función de la unión reactiva específica y de la formulación del medicamento (p.ej., disolvente, pH, aditivos). Por ejemplo, se toma un medicamento hidrolizable y se lo expone a un aumento de 20º de temperatura, como lo que ocurre cuando se traslada al medicamento desde un ambiente frío a otro ambiente de temperatura ambiente controlada (ver Advertencias y Requisitos Generales); se espera que la vida útil del medicamento en el ambiente de temperatura controlada disminuya desde un cuarto a un veinticincoavo de la vida útil que tiene el mismo medicamento cuando se lo almacena en un refrigerador. El farmacéutico también debe saber que las condiciones de frío inadecuadas pueden ser nocivas para el producto. Por ejemplo, la refrigeración puede generar viscosidad extrema en algunos medicamentos líquidos y provocar sobresaturación en otros. La congelación puede romper las gotitas de las emulsiones o causarles un gran aumento de tamaño; puede desnaturalizar las proteínas; y, en casos infrecuentes, puede generar la formación de los polimorfos menos solubles de algunos fármacos.
ESTUDIOS DE ESTABILIDAD EN LA FABRICACIÓN El alcance y la metodología de un estudio de estabilidad depende del producto y del fabricante. Es frecuente que el formulador de un producto determine en primer lugar los efectos que tienen sobre el o los ingredientes activos factores tales como la temperatura, la luz, el aire, el pH, la humedad, las trazas de metales y los excipientes o disolventes usualmente utilizados en la formulación. Tomando esta información como punto de partida, se preparan una o más formulaciones de cada forma farmacéutica, se las envasa en envases adecuados y se las almacena en distintas condiciones ambientales, tanto extremas como normales. A intervalos adecuados, se toman algunas muestras del producto y se valora la potencia empleando un método indicador de la estabilidad, se las inspecciona en busca de cambios físicos y, si corresponde, se las somete a pruebas para determinar la esterilidad y/o la resistencia al crecimiento microbiano y para evaluar la toxicidad y la biodisponibilidad. Este tipo de estudios, junto con los resultados clínicos y toxicológicos, permiten al fabricante seleccionar tanto la formulación óptima como el envase y establecer las condiciones de almacenamiento recomendadas y una fecha de vencimiento para cada forma farmacéutica en su empaque.
Responsabilidad del Farmacéutico Los farmacéuticos ayudan a asegurar que los productos que están bajo su supervisión cumplan con criterios aceptables de estabilidad mediante las siguientes acciones: (1) dispensando los medicamentos más viejos en primer lugar y respetando las fechas de vencimiento, (2) almacenando los productos en las condiciones ambientales especificadas en las monografías individuales, en el etiquetado, o en ambos, (3) verificando signos de inestabilidad en el producto, (4) tratando y etiquetando del modo adecuado los productos que se vuelven a envasar, se diluyen o se mezclan con otros productos, (5) dispensando los productos en el envase adecuado con el cierre adecuado, y (6) informando y educando a los pacientes en relación al modo adecuado de almacenar y utilizar los productos, incluyendo la disposición de los medicamentos vencidos o demasiado viejos. Rotación de las Existencias y Verificación de la Fecha de Caducidad-Es necesario efectuar una rotación adecuada de las existencias a fin de asegurar que se están dispensando los productos adecuados. Es preciso inspeccionar con detenimiento los productos que son de dispensación infrecuente a fin de tener un control minucioso de los más viejos, sobre todo en relación a la fecha de caducidad. El fabricante puede garantizar la calidad de un producto hasta el momento consignado como fecha de caducidad sólo si el producto se almacena en el envase original bajo las condiciones de almacenamiento recomendadas. Almacenamiento en Condiciones Ambientales Recomendadas-En la mayoría de los casos, las condiciones de almacenamiento recomendadas aparecen en la etiqueta, en cuyo caso es imprescindible respetarlas. Las etiquetas pueden especificar un intervalo de temperatura específico o un lugar determinado de almacenamiento o una condición específica (p.ej., en el "refrigerador," o a "temperatura ambiente controlada"), según se definen en las Advertencias Generales. También es necesario seguir con cuidado las instrucciones complementarias, como por ejemplo una indicación de proteger el producto de la luz. En los casos en que un producto deba ser protegido de la luz y que esté contenido en un envase transparente o traslúcido recubierto con un material opaco, no se debe quitar ese material de protección ni desecharlo hasta haber terminado el contenido en su totalidad. De no haber instrucciones específicas, el producto debe ser almacenado a temperatura ambiente controlada (ver Temperatura de Almacenamiento en las Advertencias Generales). No se debe almacenar el producto en lugares en los que predominan condiciones excesivas o variables de calor, frío o luz, como por ejemplo los sitios próximos a tuberías de calefacción o alumbrado fluorescente. Inspección de Productos en Busca de Evidencias de Inestabilidad-La disminución de la potencia por lo general es producto de cambios químicos, de los cuales los más frecuentes son las reacciones de hidrólisis, oxido-reducción y fotólisis. Los cambios químicos también pueden producirse por interacción entre ingredientes de un mismo producto o, con menor fre-
USP 39
Información General/ (1191) Estabilidad en la Práctica de Dispensación 1 705
cuencia, entre el producto y el envase. Una pérdida aparente de la potencia del ingrediente activo (o de los ingredientes activos, cuando son más de uno) puede ser consecuencia de la difusión del fármaco hacia la superficie del sistema envase-cierre o de su combinación con ellos. Un aumento aparente de la potencia por lo general se debe a evaporación del disolvente o a lixiviación de materiales del sistema envase-cierre. La potencia química de los ingredientes activos debe mantenerse dentro de los límites especificados en la definición de la monografía. La potencia se determina mediante un procedimiento de valoración que permite diferenciar la molécula intacta de los productos de degradación. El fabricante debe proporcionar los datos referentes a la estabilidad química. Si bien el farmacéutico no suele detectar la degradación química, cuando ésta es excesiva, en algunas ocasiones se acompaña de cambios físicos observables. Además, algunos cambios físicos que no están necesariamente vinculados a la potencia química, como por ejemplo cambios de color y olor, formación de un precipitado o turbidez de una solución, pueden alertar al farmacéutico acerca de un posible problema de estabilidad. Se debe asumir que un prod1:1cto que ha sufrido un cambio físico que no aparece explicado en el etiquetado también puede haber sufrido un cambio químico, por lo que nunca se debe dispensar un producto que presente esas características. La excesiva proliferación microbiana, la contaminación microbiana, o ambas también pueden manifestarse mediante un cambio físico. Un cambio considerable de una determinada característica física, como por ejemplo el color o el olor, es un signo de inestabilidad, cualquiera sea el producto. Otros signos físicos frecuentes de deterioro de las formas farmacéuticas son los que se describen a continuación. Formas Farmacéuticas Sólidas-Muchas formas farmacéuticas sólidas deben ser almacenadas en condiciones de baja humedad. Se las debe proteger del agua ambiental y, por lo tanto, deben ser almacenadas en envases impermeables (ver Envases en las Advertencias Generales) o en el envase provisto por el fabricante. La aparición de niebla o gotitas de líquido o la formación de grumos dentro del envase es signo de que las condiciones de almacenamiento no son las adecuadas. La presencia de un desecante dentro del envase del fabricante indica que se debe tener especial cuidado al momento de dispensar el medicamento. Algunos productos de degradación, por ejemplo, el ácido salicílico de la aspirina, pueden sublimar y depositarse como cristales sobre la superficie de la forma farmacéutica o sobre las paredes del envase. CÁPSULAS DE GELATINA DURA Y BLANDA-Puesto que la formulación de la cápsula está contenida dentro de una cubierta de gelatina, todo cambio considerable del aspecto físico o de la consistencia, como el endurecimiento o el ablandamiento de la cubierta, es signo importante de inestabilidad. La evidencia de que se ha producido liberación de gas, como por ejemplo un sello hermético de papel que esté distendido, es otro signo de inestabilidad. TABLETAS SIN CUBIERTA-La inestabilidad física de las tabletas sin cubierta se puede manifestar mediante un exceso de polvo y/o trozos (es decir, el desmenuzamiento diferenciándolo de la rotura) de la tableta en el fondo del envase (debido a erosión, trituración o rotura); grietas o astillas sobre la superficie de las tabletas; aumento de volumen; moteado; coloración; fusión entre tabletas; o aparición de cristales, que obviamente no eran parte de la tableta, sobre las paredes del envase o sobre las tabletas. TABLETAS RECUBIERTAS-La inestabilidad física de las tabletas recubiertas se manifiesta mediante grietas, moteado o adhesividad de la cubierta y la aglutinación de las tabletas. POLVOS Y GRANULADOS SECOS-Los polvos y granulados secos que no están destinados a ser reconstitudos en un líquido dentro del envase original pueden aglutinarse en masas duras o cambiar de color, lo que los puede tornar inaceptables. POLVOS y GRANULADOS PARA RECONSTITUIR EN SUSPENSIONES-Los polvos y los granulados secos que están destinados a ser reconstituidos en soluciones o suspensiones exigen atención especial. Por lo general, estas formas farmacéuticas son antibióticos o vitaminas que son particularmente sensibles a la humedad. Puesto que siempre son dispensados en el envase original, por lo general la humedad no los afecta. Sin embargo, la aparición de un aspecto aglutinado inusual exige una evaluación cuidadosa, y la presencia de niebla o gotitas de líquido dentro del envase generalmente torna a la preparación inadecuada para la utilización. La presencia de un olor desagradable también puede ser un signo de inestabilidad. TABLETAS, GRANULADOS Y POLVOS EFERVESCENTES-Los productos efervescentes son particularmente sensibles a la humedad. El aumento de volumen o la aparición de presión por la presencia de gas son signos específicos de inestabilidad que indican que parte de la efervescencia se ha producido antes de lo esperado. Formas Farmacéuticas Líquidas-En lo que respecta a las formas farmacéuticas líquidas, son de principal preocupación la homogeneidad y la ausencia de proliferación y contaminación microbiana excesivas. Pueden ser signos de inestabilidad, la turbidez o la precipitación en una solución; la separación en una emulsión; un aglomerado no resuspendible en una suspensión; o los cambios organolépticos en cualquiera de las formas farmacéuticas mencionadas. La proliferación microbiana puede estar acompañada de decoloración, turbidez o formación de gases. SOLUCIONES, ELÍXIRES Y JARABES-La presencia de precipitación y la formación de gases por causas microbianas o químicas son los dos signos principales de inestabilidad. EMULSIONES-La separación de una emulsión (p.ej., la separación de la fase oleosa que no se dispersa con facilidad) es un signo característico de inestabilidad, que es importante no confundir con el cremado, que es una separación de la fase oleosa de fácil redispersión y que sucede con frecuencia en emulsiones estables. SUSPENSIONES-La presencia de una fase sólida aglutinada que no puede resuspenderse mediante una agitación razonable es un indicio importante de la inestabilidad de la suspensión. La presencia de partículas relativamente grandes puede indicar que se ha producido un crecimiento excesivo de cristales. TINTURAS Y EXTRACTOS LÍQUIDOS-Las tinturas, los extractos líquidos y las preparaciones similares generalmente son oscuras porque son preparados concentrados, por lo que es importante inspeccionarlas con detenimiento en busca de precipitación.
1 706 (1191) Estabilidad en la Práctica de Dispensación / Información General
USP 39
LÍQUIDOS ESTÉRILES-En lo que respecta a los líquidos estériles, es evidente la importancia que adquiere el mantenimiento de la esterilidad. La presencia de contaminación microbiana en los líquidos estériles por lo general no se puede detectar visualmente, pero la opacidad, el cambio de color, la turbidez, la formación de una película sobre la superficie, la presencia de materia floculenta o de partículas, o la formación de gases son indicios suficientes de una posible contaminación. La transparencia de las soluciones estériles de uso oftálmico o parenteral también es de suma importancia. Todo indicio de que se ha violado la integridad del cierre de estos productos debe fomentar sospechas sobre su esterilidad. Productos Semisólidos (Cremas, Ungüentos y Supositorios)-En el caso de las cremas, los ungüentos y los supositorios, el principal indicio de inestabilidad es a menudo la decoloración o un cambio perceptible de la consistencia o del olor. CREMAS-A diferencia de los ungüentos, por lo general las cremas son emulsiones que contienen agua y aceite. Son indicios de inestabilidad de las cremas la separación de la emulsión, la formación de cristales, la disminución del volumen a causa de evaporación de agua y la contaminación microbiana importante. UNGÜENTOS-Los signos que suelen indicar inestabilidad de los ungüentos son el cambio de la consistencia y el "sangrado" excesivo (es decir, la separación de cantidades excesivas de líquido) y la formación de gránulos o de partículas arenosas. SUPOSITORIOS-El ablandamiento excesivo es el principal indicio de inestabilidad de los supositorios, aunque algunos pueden secarse y endurecerse o arrugarse. La aparición de manchas de aceite en el material del envase debe inducir al farmacéutico a inspeccionar cada supositorio con más detenimiento, para lo que se debe extraer la lámina de envoltura. Como regla general (aunque hay excepciones), los supositorios deben ser almacenados en el refrigerador (ver Temperatura de Almacenamiento en las Advertencias Generales). Tratamiento Adecuado de Productos Sometidos a Manipulaciones Adicionales-Al volver a envasar un producto, diluirlo o mezclarlo con otro, el farmacéutico puede convertirse en el responsable de su estabilidad. Reenvasado-En general, no se aconseja reenvasar los productos. Sin embargo, si de todos modos fuera necesario hacerlo, se debe consultar al fabricante acerca de los problemas que puedan surgir. En cuanto al acondicionamiento de medicamentos recetados, es esencial emplear envases adecuados. La etiqueta del envase debe consignar las condiciones de almacenamiento adecuado y, cuando corresponde, la fecha de caducidad y la fecha límite de uso. Los envases unitarios exigen cuidado y prudencia y un cumplimiento estricto de las pautas que se enumeran a continuación: (1) emplear materiales de envasado adecuados, (2) de no estar disponible la información referente a la estabilidad en el nuevo envase, reenvasar únicamente lo necesario para un lapso limitado, (3) consignar en la etiqueta de la dosis única el número de lote y una fecha adecuada de límite de uso, (4) si se reenvasa un producto estéril tomado de un vial de dosis múltiples en jeringas de dosis única (desechables), descartar la jeringa si no se la usa en un lapso de 24 horas, a menos que se disponga de información que justifique un período más prolongado de almacenamiento, (5) si se reenvasan cantidades determinadas con anticipación en vista de una necesidad inmediata, se debe mantener un registro de los procesos de reenvasado que consigne el nombre del fabricante, el número de lote, la fecha y el nombre de las personas responsables del reenvasado y de la verificación (ver Advertencias Generales) y (6) si es necesario colocar cierres de seguridad, emplear sistemas de cierre que respeten las normas farmacopeicas y reglamentarias de almacenamiento. Dilución o Mezclado-En cuanto a los procesos de mezcla o dilución de productos, el farmacéutico debe seguir procedimientos científicos y profesionales comprobados a fin de evitar la incompatibilidad y la inestabilidad. Por ejemplo, las tinturas tales como la de belladona y digital contienen gran concentración de alcohol para disolver los ingredientes activos, por lo que pueden generar un precipitado si se diluyen o mezclan con sistemas acuosos. Es conveniente que el farmacéutico tenga el hábito de consultar la información que acompaña a los productos y la bibliografía técnica aplicable, que deben ser actuales, ya que a veces los fabricantes cambian las fórmulas de algunos productos. Si una combinación en particular se emplea con frecuencia, es aconsejable consultar con el fabricante. Puesto que se desconoce la estabilidad química de las mezclas preparadas de modo extemporáneo, no es aconsejable efectuar combinaciones de ese tipo; si una mezcla extemporánea presenta una incompatibilidad, la responsabilidad podría recaer sobre el farmacéutico. Los antibióticos orales reconstituidos en suspensión a partir de un polvo nunca se deben mezclar con otros productos. La combinación de productos para la vía parenteral exige especial cuidado, sobre todo en el caso de las soluciones para la vía intravenosa, principalmente debido a la vía de administración. Esta área de la práctica exige sumo cuidado, una técnica aséptica, prudencia y diligencia. Debido a la posibilidad de que surjan problemas inapreciables de esterilidad y estabilidad química, todas las preparaciones extemporáneas para la vía parenteral deben ser empleadas dentro de las 24 horas posteriores a su preparación, a menos que se disponga de información que justifique un almacenamiento más prolongado. Información y Educación al Paciente-Como último paso para cumplir con la responsabilidad en cuanto a la estabilidad de los medicamentos que se dispensan, el farmacéutico tiene la obligación de informarle al paciente acerca de las condiciones adecuadas de almacenamiento (por ejemplo, en un lugar fresco y seco-no en el baño) tanto para los productos recetados como para los de venta libre, y sugerirle un lapso razonable después del cual el medicamento deba ser desechado. Cuando el envase consigne fechas límite de uso, el farmacéutico debe dejar claro al paciente que las fechas son vigentes únicamente si se respetan las condiciones adecuadas de almacenamiento. Además, se debe aconsejar a los pacientes que limpien con frecuencia los gabinetes en los que guardan los medicamentos.
USP 39
Información General / (1195) Guía sobre Cambios Significativos 1707
(1195) GUÍA SOBRE CAMBIOS SIGNIFICATIVOS EN EXCIPIENTES FARMACÉUTICOS A GRANEL ANTECEDENTES Este capítulo de información general tiene su origen en una guía internacional sobre la evaluación de la importancia de los cambios que involucran la fabricación de excipientes farmacéuticos a granel. Tiene como propósito ayudar a los fabricantes de excipientes a determinar la necesidad de informar al usuario del excipiente y a las autoridades reguladoras sobre la naturaleza del cambio. El capítulo proporciona recomendaciones mínimas al considerar el efecto de un cambio en el proceso de fabricación del excipiente. Al decidir cómo usar este capítulo, cada fabricante debe tener en cuenta la forma en que podría aplicarlo a sus productos y procesos. Dada la diversidad de excipientes, algunos de los principios en este capítulo pueden no ser aplicables a determinados productos y procesos. Este capítulo está dividido en varias secciones. La primera proporciona las guías generales necesarias para evaluar un cambio y determinar la necesidad de informar al usuario y/o a las autoridades reguladoras. Otra sección proporciona los criterios para determinar si un cambio involucrará un riesgo significativo. También se incluye un árbol de decisión que es útil al considerar el posible efecto de un cambio sobre el desempeño del excipiente.
INTRODUCCIÓN
Propósito Este documento pretende establecer consideraciones uniformes para evaluar la importancia de los cambios que involucran la fabricación de excipientes farmacéuticos a granel (EFG). El propósito de la evaluación es determinar la necesidad de informar al usuario del excipiente y a las autoridades reguladoras sobre la naturaleza del cambio.
Alcance Los principios y la información de este capítulo se pueden aplicar a la fabricación de todos los excipientes farmacéuticos a granel [mencionados en este documento como "excipientes"] destinados a ser utilizados en medicamentos para uso humano, medicamentos para uso veterinario y productos biológicos. Los principios establecidos aquí se deben aplicar una vez que se haya determinado que un producto químico está destinado a ser usado como componente de un producto farmacéutico. A medida que avanza el proceso de fabricación de un excipiente, debería aumentarse el grado de garantía en relación con la calidad del producto, y se debería controlar y documentar el proceso. No obstante, en alguna etapa lógica del procesamiento, según lo determine el fabricante, deberían aplicarse y mantenerse las buenas prácticas de fabricación (GMP, por sus siglas en inglés), según lo descrito en Buenas Prácticas de Fabricación para Excipientes Farmacéuticos a Granel (1078). Basándose en el análisis de riesgos y en el conocimiento minucioso del proceso, se debe determinar en qué etapa del procesamiento se deberían implementar las GMP.
Principios Adoptados Este capítulo debería ser de aplicación internacional, teniendo en cuenta que los excipientes farmacéuticos son diversos y a menudo tienen usos distintos de las aplicaciones farmacéuticas. Proporciona recomendaciones mínimas cuando se considera el impacto de un cambio sobre el excipiente. Como documento de orientación internacional, no está en condiciones de especificar todos los requisitos legales nacionales ni abarcar en detalle las características particulares de todos los excipientes. Al considerar cómo usar este capítulo, cada fabricante debería tener en cuenta cómo podría aplicarlo a sus productos y procesos. Dada la diversidad de excipientes, algunos de los principios en este capítulo podrían no ser aplicables a determinados productos y procesos. Los términos "debería" y "se recomienda" no necesariamente significan"debe" o "tiene que", según se usa en la aplicación de este capítulo. Los excipientes pueden contener componentes minoritarios que son o podrían ser necesarios para el funcionamiento correcto del excipiente. La presencia de estos "componentes concomitantes esenciales" en el excipiente no debería considerarse indeseable. Estos componentes concomitantes no se consideran parte del perfil de impurezas, y deberían considerarse por separado. El agua puede ser un componente concomitante en algunos excipientes, pero puede estar incluida en el perfil de impurezas de otros. (Ver más información en Perfil de Impurezas en el Apéndice C).
1 708 (1195) Guía sobre Cambios Significativos / Información General
USP 39
Presentación Este capítulo está dividido en varias secciones. La primera proporciona los antecedentes necesarios para evaluar un cambio y determinar la necesidad de informar al usuario y/o a las autoridades reguladoras. Una segunda sección proporciona los criterios para determinar el riesgo de que un cambio sea significativo, incluyendo guías para el desarrollo de un perfil de impurezas. También incluye lo siguiente: El Glosario contiene términos y definiciones usados en todas las secciones de este documento. El Apéndice A incluye algunos ejemplos de cambios que se clasificarían dentro de cada uno de los tres niveles de riesgo. El Apéndice B proporciona un árbol de decisión útil para considerar el impacto potencial de un cambio sobre el desempeño del excipiente. El Apéndice C describe el desarrollo de un perfil de impurezas.
GUÍA GENERAL Diferenciación de la Fabricación del Excipiente La evaluación del impacto de un cambio sobre la fabricación de un excipiente podría ser más difícil que la de un ingrediente farmacéutico activo (API, por sus siglas en inglés). Aunque el API casi nunca se usa más que para unos pocos propósitos terapéuticos, el excipiente farmacéutico a granel (EFG) se usa a menudo con una amplia gama de ingredientes activos y en una gran variedad de formas farmacéuticas terminadas. Mientras que el API tiene por lo general una alta pureza y está bien caracterizado por el laboratorio de control de calidad y el laboratorio analítico, el EFG es a menudo una sustancia natural, una mezcla o un polímero cuyas propiedades químicas y físicas son más difíciles de cuantificar. Para una explicación más detallada de las GMP que aplican a la fabricación de excipientes, ver el capítulo de información general Buenas Prácticas de Fabricación para Excipientes Farmacéuticos a Granel (1078).
Definición de Cambio Significativo Se considera significativo cualquier cambio realizado por el fabricante de un excipiente que altere las propiedades físicas o químicas del excipiente más allá de los límites establecidos o tenga la probabilidad de alterar el desempeño del excipiente en la forma farmacéutica. Dichos cambios pueden requerir la notificación a la autoridad reguladora local. Independientemente de que haya un requisito reglamentario, el fabricante tiene la obligación de notificar los cambios significativos al usuario del excipiente con el fin de que el usuario pueda evaluar el impacto del cambio sobre sus productos. Se sugiere notificar al usuario farmacéutico, a menos que la evaluación del cambio demuestre claramente que éste no es significativo, según lo estipula este capítulo general. Los tipos de cambio que se consideran aquí son cambios de: sitio, escala, equipo, proceso, envasado y etiquetado, y especificación (incluidas las materias primas). El requisito para evaluar el impacto de un cambio sobre el excipiente aplica, como mínimo, desde las materias primas para la primera etapa de procesamiento donde comienza el cumplimiento con las GMP. Los requisitos de GMP aumentan a medida que avanza el proceso de fabricación. Por lo tanto, en alguna etapa lógica del procesamiento, habitualmente una etapa bien previa a la operación final de terminación, deberían imponerse las GMP apropiadas, que deben mantenerse durante el resto del proceso. Se pueden utilizar métodos como el Análisis de Riesgos y Puntos Críticos de Control (HACCP, por sus siglas en inglés); Análisis de Modos y Efectos de Fallas (AMEF o FEMA, por sus siglas en inglés) o un detallado diagrama de flujo del proceso para identificar las operaciones unitarias, los equipos requeridos, las etapas durante las cuales se agregan diversas sustancias, las etapas clave en el proceso, los parámetros críticos (tiempo, temperatura, presión, etc.) y los puntos de monitoreo necesarios. Basándose en el análisis de riesgos y en el conocimiento minucioso del proceso, se debe determinar en qué etapa del procesamiento se deberían implementar las GMP. 1 Es importante considerar cuidadosamente cualquier cambio en el procesamiento que ocurra después de que el excipiente ha sido sintetizado o aislado, pero antes del envasado. Sin embargo, se debe reconocer que un cambio hecho en una etapa previa del proceso puede traer como consecuencia un cambio en la funcionalidad del excipiente, por lo que se recomienda considerar también dichos cambios.
CAMBIO SIGNIFICATIVO Criterios de Evaluación Estos criterios, en forma de preguntas, se presentan para su consideración al evaluar el impacto de un cambio en relación con la fabricación del excipiente: 1. ¿Hubo un cambio en las propiedades químicas o en la composición del excipiente como resultado del cambio? 2. ¿Hubo un cambio en las propiedades físicas del excipiente como resultado del cambio? 3. ¿Hubo un cambio en el perfil de "componentes concomitantes esenciales" del excipiente como resultado del cambio?
1
Ver el capítulo (1078), GMP para Excipientes.
USP 39
Información General / (1195) Guía sobre Cambios Significativos 1709
4. ¿Hubo un cambio en la funcionalidad del excipiente como resultado del cambio? 5. Donde corresponda, ¿ha cambiado el nivel de humedad? 6. Donde corresponda, ¿ha cambiado la biocarga? 7. ¿Hubo un cambio en el origen de cualquier materia prima o envase primario? Una respuesta afirmativa a cualquiera de estas preguntas indica que el impacto del cambio sobre el excipiente puede conducir a cambios en su desempeño en la forma farmacéutica. Es importante proporcionar criterios objetivos para evaluar cuándo ha ocurrido un cambio en una propiedad del excipiente o en su composición, en el perfil de componentes concomitantes esenciales, en el origen biológico o en su funcionalidad. Esto permite al fabricante del EFG evaluar la importancia del cambio sobre el excipiente, con el fin de notificar a las autoridades reguladoras y/o al usuario.
Determinación de la Importancia Criterio 1: La evaluación de las propiedades químicas o de la composición de un excipiente debería incluir, como mínimo, todos los parámetros de especificación de la monografía y del fabricante. Se debería hacer una comparación de estos resultados de la prueba para el excipiente antes y después de un cambio, con el fin de determinar si existe una diferencia estadísticamente significativa. Criterio 2: Se deberían considerar las propiedades físicas, basándose en la forma física del excipiente y en su funcionalidad, según sea de conocimiento o uso por parte de los usuarios finales. Se deberían evaluar también las propiedades físicas que fueran parte de una especificación mutuamente acordada entre el fabricante y el usuario final. Por ejemplo, un fabricante de un excipiente en polvo debería considerar la medición del impacto de los cambios sobre parámetros físicos como densidad aparente, área superficial, forma de la partícula y distribución del tamaño de partícula. Los excipientes líquidos se podrían evaluar por cambios en su pH y viscosidad. Para todos los excipientes poliméricos se debería considerar el efecto de un cambio sobre una propiedad física, como la distribución de los pesos moleculares. Criterio 3: Criterios objetivos son necesarios también al considerar cambios al perfil de los "componentes concomitantes esenciales" de un excipiente como resultado de los cambios. El perfil, según se describe en el Apéndice C, contiene lo siguiente: • impurezas orgánicas identificadas, • impurezas orgánicas no identificadas en una concentración igual o mayor de O, 10%, bien sean especificadas o no,2 • disolventes residuales e • impurezas inorgánicas La factibilidad de desarrollar un perfil de impurezas varía con la composición y el origen del excipiente. Es importante notar que la identificación y cuantificación de impurezas resultan extremadamente difícil en algunos excipientes. Por lo tanto, el fabricante de un excipiente puede no haber desarrollado un perfil de impurezas. En ese caso, es importante que los fabricantes del excipiente documenten sus esfuerzos por identificar y cuantificar las impurezas que pudieran estar presentes, con el fin de justificar sus resultados limitados, o que justifiquen otros medios por los que se podrían evaluar los cambios. La importancia del cambio puede determinarse por comparación del perfil de impurezas del material anterior al cambio con el del producto posterior al cambio. Por lo tanto, una vez desarrollado el perfil, éste se debería reevaluar después de los cambios del proceso. Se debería monitorear una impureza como parte del perfil si está presente en una concentración igual o mayor de O, 10%, si tiene un efecto fisiológico establecido o si se sabe que es insegura en una concentración más baja. El contenido del perfil de impurezas varía según la naturaleza del excipiente, las materias primas usadas en su fabricación y su composición química. Hasta donde sea posible, los cambios se consideran significativos siempre que se introduce una nueva impureza en una concentración de O, 10% o mayor, o cuando desaparece una impureza previamente presente en una concentración igual o mayor de O, 10%. Los cambios en la cantidad de una impureza existente especificada en una monografía e informada en el Certificado de Análisis (COA, por sus siglas en inglés) se debería tratar como una propiedad química para propósitos de esta evaluación. Se deberían considerar los cambios en los niveles de disolventes residuales al determinar la importancia de un cambio. Ver detalles en Disolventes Residuales (467). Criterio 4: Lo ideal es contar con criterios objetivos para evaluar los cambios en la funcionalidad del excipiente. Sin embargo, la naturaleza de este tipo de estudio puede variar ampliamente, dependiendo del excipiente y de su aplicación en la forma farmacéutica. Cabe reconocer que el fabricante del excipiente no siempre conoce todos los usos del excipiente. Por lo tanto, este capítulo no puede proporcionar criterios objetivos para este estudio, pero subraya la importancia de que el fabricante les dé la debida consideración. Si existe la posibilidad de que la funcionalidad del excipiente pueda verse afectada por el cambio, los usuarios deberían ser notificados y se les debería enviar material, previa solicitud, de manera que puedan determinar el impacto del cambio sobre sus productos farmacéuticos terminados. Criterio 5: Con frecuencia el excipiente contiene humedad, cuya presencia puede tener un impacto sobre el desempeño del excipiente en la preparación de la forma farmacéutica. Por lo tanto, un cambio en el nivel de humedad por encima del interva-
Cabe reconocer que aunque sea deseable, esto puede no ser posible de lograr para todos los excipientes, especialmente para los que tienen una naturaleza química más compleja, por ejemplo, los polímeros naturales, para los cuales puede no haber medios adecuados para determinar las sustancias relacionadas. Sin embargo, la documentación del perfil de impurezas debería demostrar por qué esto no se pudo lograr.
2
171 O (1195) Guía sobre Cambios Significativos / Información General
USP 39
lo típico de producción, aunque esté dentro del límite farmacopeico o de la especificación, puede afectar su estabilidad y/o su uso final. Criterio 6: El cambio en las etapas de procesamiento, materias primas o equipos puede afectar adversamente el control de microorganismos en el excipiente. Por lo tanto, se debería evaluar el efecto del cambio sobre la biocarga, especialmente para excipientes susceptibles al crecimiento microbiano. Criterio 7: El cambio en el origen de una materia prima o del envase primario puede ocasionar un cambio en los otros seis criterios. El cambio en el origen puede involucrar el país de origen, el origen geológico o las especies de origen para la materia prima. Un cambio en el país de origen de una materia prima o del envase primario puede afectar el estatus del excipiente, por cuanto se relaciona con la posible presencia de encefalopatía espongiforme bovina (BSE, por sus siglas en inglés), encefalopatía espongiforme transmisible (TSE, por sus siglas en inglés) o de un organismo genéticamente modificado (OGM). El país de origen de una materia prima de origen animal o de los componentes usados en la fabricación de la materia prima, puede ocasionar el incumplimiento con las reglamentaciones pertinentes a la TSE. 3A La información actual sobre BSE y enfermedades relacionadas se puede consultar en el sitio Web del United States Department of Agriculture (USDA; Departamento de Agricultura de EE.UU.), usda.gov. Un cambio en el origen geológico de un excipiente mineral puede alterar la composición del excipiente. Las formaciones geológicas que contienen el mismo mineral pueden diferir en su composición química, estructura cristalina, densidad, etc. Un cambio en el origen geológico de la materia prima puede afectar las propiedades químicas o físicas del excipiente, el perfil de impurezas o la funcionalidad del excipiente. Un cambio en las especies de origen tanto para las materias primas de origen animal como vegetal puede generar ciertas reservas. El cambio de una especie animal por otra puede afectar el estatus del excipiente, puesto que se relaciona con la posible presencia de material de BSE o TSE en el excipiente, según se indica anteriormente. El cambio de materias primas de origen animal a materias primas de origen vegetal, aunque elimina el problema de BSE o TSE, aumenta la posibilidad de que se presente material alergénico de origen vegetal en el excipiente. El cambio de una especie vegetal por otra puede resultar en la posible presencia de un alérgeno en el excipiente. Además del problema con los alérgenos, el uso de materias primas de origen vegetal puede afectar a los fabricantes farmacéuticos que se preocupan por la presencia de OGM en el excipiente.
Niveles de Riesgo En la evaluación del efecto de los cambios sobre el excipiente se reconoce que, aún con criterios objetivos, puede ser necesario aplicar cierto juicio. Para facilitar la decisión respecto a la importancia de un cambio y el probable efecto sobre la forma farmacéutica, los tipos de cambios se clasifican usando tres niveles: • Nivel 1: Cambio Menor • Nivel 2: Podría ser Significativo • Nivel 3: Siempre Significativo NIVEL 1: CAMBIO MENOR Se considera poco probable que estos cambios afecten las propiedades químicas o físicas, el perfil de impurezas o la funcionalidad del excipiente. Dichos cambios se deberían documentar, pero no es necesario enviar notificaciones a los usuarios ni a las autoridades reguladoras. NIVEL 2: PODRÍA SER SIGNIFICATIVO El efecto del cambio se debería evaluar contra los Criterios 1, 2 y 3 (propiedades químicas y físicas y perfil de impurezas) para determinar su posible efecto sobre la funcionalidad del excipiente. Un cambio en el origen biológico de una materia prima se debería considerar con respecto a las reglamentaciones sobre TSE u OGM. Un cambio de nivel 2 se debería comunicar siempre a los usuarios y a las autoridades reguladoras. NIVEL 3: SIEMPRE SIGNIFICATIVO Este tipo de cambio se debería comunicar siempre a los usuarios y a las autoridades reguladoras. El envío al usuario del excipiente que ha sufrido cambios no debería ocurrir sin el consentimiento de la compañía del usuario.
3
Farmacopea Europea, Texto general 5.2.8, Minimizing the Risk of Transmitting Animal Spongiform Encephalopathy Agents Via Medicinal Products. Servicio de Inspección Sanitaria Animal y Vegetal del Departamento de Agricultura de Estados Unidos (APHIS), Registro Federal: Noviembre 4 de 2003, Volumen 68, Número 213 (Reglas propuestas), 9 CFR Partes 93, 94 y 95, Bovine Spongiform Encephalopathy; Minimal Risk Regions and lmportation of Commodities.
4
USP 39
Información General / (1195) Guía sobre Cambios Significativos 1711
Diseño del Protocolo Debería haber un protocolo escrito para la evaluación de un cambio, con el fin de establecer si es significativo o no. El protocolo debería describir la naturaleza del cambio, la razón por la cual puede ser significativo, las pruebas que se deben efectuar para evaluar el cambio y el criterio para determinar la importancia del mismo. Si el cambio es atribuible a una nueva fuente biológica de las materias primas utilizadas en la fabricación del excipiente, se recomienda evaluar primero el estatus reglamentario de la materia prima (es decir, agentes de BSE/TSE y OGM). Luego, cuando sea posible, se deberían comparar los resultados de las pruebas de un mínimo de 1 O partidas del excipiente anteriores al cambio y de 3 partidas posteriores al cambio (ver Datos de Respaldo a continuación). Si se observan cambios significativos, se debería hacer una evaluación de su importancia. El fabricante debería analizar el excipiente fabricado después del cambio, para todas las propiedades de la especificación y comparar los resultados con los datos históricos. Se debería usar una prueba estadística estándar, como la prueba t de las medias, para comparar los nuevos datos con los datos históricos. Si al usar un análisis estadístico apropiado se encuentra suficiente evidencia de que las poblaciones son diferentes en el intervalo de confianza del 95%, el cambio se debería considerar significativo. Como una verificación adicional de la congruencia se recomienda graficar las propiedades de especificación de la nueva partida en gráficos estándares de Control Estadístico de Calidad (CEC o SQC, por sus siglas en inglés), junto con los resultados de partidas estándares.
Datos de Respaldo Es preferible utilizar datos para medir el efecto de un cambio sobre el excipiente. La comparación debería comenzar con las propiedades químicas y físicas, seguidas, cuando corresponda, de la humedad, biocarga, perfil de impurezas y funcionalidad. El fabricante debería hacer uso de su buen juicio al hacer comparaciones de la muestra para otras evaluaciones. Las propiedades químicas y físicas se prestan para la medición cuantitativa. A menudo estas propiedades forman parte de la especificación del excipiente. Como tales, debería existir una gran colección de datos de prueba para todas las propiedades afectadas, para comparar con los datos correspondientes del excipiente fabricado después del cambio. La equivalencia de los perfiles de impurezas se muestra comparando los datos de las partidas anteriores y posteriores al cambio. Si las siguientes condiciones se cumplen, se considera que no ha existido un cambio significativo en el perfil de impurezas. [NOTA-Disolventes Residuales (467) indica que bajo ciertas circunstancias una concentración de impurezas inferior a O, 10% podría ser preocupante y el fabricante del excipiente debería tomarlo en consideración.] 1. No se encuentran nuevas impurezas con una concentración igual o mayor de O, 10%, ni ha desaparecido una impureza de este nivel que se encontraba previamente en el perfil de impurezas. 2. El disolvente residual y las impurezas permanecen dentro del intervalo de confianza del 95% en la media de las partidas producidas antes del cambio.
TIPOS DE CAMBIOS Cambio de Sitio Un cambio de sitio puede involucrar, bien sea la producción o el envasado del excipiente o sus pruebas de control de calidad. Si el sitio propuesto para la fabricación nunca se usó para producir el excipiente, entonces el cambio representa un riesgo mayor de alteración del desempeño del excipiente y se considera un cambio de Nivel 3. Si el sitio propuesto se usó para este propósito durante el año pasado, y el proceso, equipos, servicios y materias primas no presentan cambios, el riesgo se considera menor y por lo tanto es de Nivel 7. Sin embargo, si el excipiente se produjo en el sitio propuesto más de un año atrás, con el mismo proceso, equipos, servicios y materias primas, el riesgo es moderado y por lo tanto es de Nivel 2. Si el cambio involucra al laboratorio de control de calidad, el impacto depende del método de prueba. Si el método sigue siendo igual, el cambio es de Nivel 7, siempre y cuando se lleve a cabo una transferencia formal de método o validación. Si el nuevo laboratorio usa una técnica analítica o equipo analítico diferentes, entonces el cambio debería evaluarse más cuidadosamente, según lo requiere un cambio de Nivel 2.
Escala A menudo los fabricantes encuentran la forma de aumentar la escala de producción. Si el excipiente se está llevando de la escala piloto a la de producción, es probable que el cambio sea significativo y por lo tanto de Nivel 3. Cuando el cambio de escala sea producto del uso de un equipo de producción nuevo y más grande, o de uno más pequeño, que usa el mismo principio operativo, lo cual es a menudo el caso en el procesamiento por partidas, el cambio es de Nivel 2. Si el equipo existente se optimiza para aumentar la capacidad sin alterar el proceso, lo cual se presenta a menudo en un procesamiento continuo, el cambio se considera menor y se trata como de Nivel 7, siempre y cuando la comparación de los datos anteriores y posteriores al cambio no muestre una diferencia estadísticamente significativa. Sin embargo, se debería brindar una consideración minuciosa a los cambios que se hacen y pueden afectar claramente las propiedades del excipiente.
1712 (1195) Guía sobre Cambios Significativos/ Información General
USP 39
Equipos La evaluación de un cambio de equipo se centra en determinar si éste es equivalente al equipo que reemplaza. Por lo general, el equipo que representa un reemplazo del mismo tipo se considera un cambio menor, de Nivel 1. Si el nuevo equipo no es un reemplazo del mismo tipo pero se incluye en la validación del proceso, entonces el cambio sigue siendo de Nivel 1. De lo contrario, el cambio se considera de Nivel 3.
Proceso de Fabricación Un cambio en el proceso involucra a menudo cambios en las instrucciones de procesamiento, tales como los niveles de ciertos parámetros como temperatura, presión y velocidad de flujo; las materias primas utilizadas; la secuencia de las etapas operativas; y la operación que se va a efectuar, incluido el reprocesamiento. Según lo ilustra el árbol de decisión en el Apéndice B, cada tipo de cambio en el proceso se puede presentar en más detalle. Si un cambio en el parámetro del proceso está dentro de la validación del proceso, tal como operar a un nuevo valor objetivo dentro del intervalo calificado, entonces el cambio es de Nivel 1. Sin embargo, si el parámetro del proceso está fuera de la validación, entonces el cambio se debería evaluar como de Nivel 2. Si se hace un cambio menor en las etapas del proceso, como sería un cambio pequeño fuera del intervalo validado en la velocidad de adición de un ingrediente, entonces el cambio es de Nivel 2. Un cambio importante, como sería el cambio en el punto en que se agrega un ingrediente, más temprano o más tarde durante el proceso, puede ser significativo y por lo tanto es de Nivel 3. El reprocesamiento de un excipiente seguido de una etapa de purificación, cuando no es típico del proceso, se debería evaluar como un cambio de Nivel 2. Sin embargo, si no ocurre más purificación del excipiente a granel, este tipo de cambio se considera de Nivel 3.
Envasado y Etiquetado Estos cambios involucran los componentes del empaque destinados a la protección y distribución del excipiente. Cualquier cambio en el envase o en los componentes del empaque, tales como el tambor, la caja, el recubrimiento interno o el sello que evidencia alteración intencional, que sea un reemplazo del mismo tipo, representa un cambio menor (Nivel 1). Un reemplazo del mismo tipo se refiere a envases elaborados con los mismos materiales y sellados de manera similar y a recubrimientos internos hechos con los mismos componentes. Cualquier cambio que no sea un reemplazo del mismo tipo se debería evaluar como de Nivel 3. Cualquier cambio en el etiquetado, relacionado con el sitio de fabricación o de análisis, el origen biológico, los aditivos o las condiciones de almacenamiento y manipulación se debería evaluar como de Nivel 3.
Especificaciones Las diferencias en las materias primas se pueden definir aún más por el proveedor utilizado, sus especificaciones, su origen biológico, el país de origen para aquellas derivadas de animales, o la adición o remoción de la materia prima del proceso del EFG. Si el nuevo proveedor proporciona su materia prima con una especificación que es básicamente igual a la del proveedor anterior y el método de fabricación de la materia prima es similar, el cambio es menor y se trata como de Nivel 1. Sin embargo, si las especificaciones, origen biológico o país de origen cambian o el proceso de fabricación es diferente, entonces el cambio debería evaluarse como potencialmente significativo (Nivel 2). Además, cualquier cambio de fuente (source) para un material de origen animal se debería tratar como un cambio de Nivel 2 si se determina que la fuente no pertenece a un país de riesgo, según lo codificado en 9 CFR 94.18. Por último, si el cambio en la materia prima involucra la adición o remoción de un ingrediente del proceso para producir o preservar el EFG, o se usa de otra forma para producir el excipiente a granel, es probable que el cambio sea significativo (Nivel 3). Cualquier cambio en el origen de las materias primas que conlleve la posibilidad de que contengan materiales peligrosos (es decir, BSE, TSE, alérgenos u OGM) requiere una consideración similar. A veces se hacen cambios a la especificación del excipiente o al método de prueba de control de calidad. Se debería evaluar la importancia de los cambios cuando los mismos no sean el resultado de un cambio en la monografía. Dichos cambios en las pruebas o especificaciones se pueden hacer sobre el excipiente o sobre un componente intermedio. [NOTA-En determinadas circunstancias, el relajamiento de la especificación puede disminuir la calidad si se trata de la especificación para una propiedad significativa; por lo tanto, es preciso evaluar todo cambio y documentar su importancia.] Los cambios en la especificación de un excipiente o el método de prueba son cambios de Nivel 3. Por ejemplo, la adición de un nuevo parámetro de especificación con el propósito de mejorar la calidad del excipiente por medio de la selección de lote puede ser potencialmente un cambio muy significativo, de Nivel 3. Si el cambio de especificación relaja un parámetro de especificación, se debería evaluar el efecto sobre la calidad del excipiente como un cambio de Nivel 2. Un ejemplo de un cambio menor sería el análisis adicional del excipiente iniciado con el solo propósito de caracterizar aún más el material sin alterar su calidad y tiene un riesgo de Nivel 1; no obstante, está indicada su notificación.
USP 39
Información General / (1195) Guía sobre Cambios Significativos 1713
Si una especificación para una materia prima del mismo proveedor se vuelve más estricta, entonces es improbable que el cambio sea significativo (Nivel 7), mientras que si la especificación se vuelve menos estricta, entonces el cambio se debería evaluar cuidadosamente (Nivel 2). Cuando se hace un cambio que aumenta o mantiene el nivel de control sobre el proceso de fabricación, se debería tratar como de Nivel 7. Si el cambio en el proceso de control relaja el control, entonces el efecto se debería evaluar cuidadosamente como de Nivel 2. Un ejemplo ilustrativo es el control de pH. Si un nuevo medidor de pH permite una medición más precisa, el control del proceso se mejora y el cambio se considera de Nivel 7. Sin embargo, si el control del pH se relaja al usar un dispositivo de medición menos preciso, el cambio se trata como de Nivel 2.
Cambios Múltiples Los cambios múltiples implican más de un cambio simultáneo. El nivel de riesgo para la consideración del impacto de los cambios debería ser el más alto de todos los cambios individuales. Sin embargo, se debería evaluar también el efecto de la totalidad de los cambios, porque esto podría sugerir que el riesgo general es más alto.
REQUISITOS PARA EL INFORME
Documentación Se recomienda documentar la evaluación de los cambios en el excipiente, sin importar el nivel del cambio. El informe debería indicar el fundamento para la evaluación del efecto del cambio sobre el excipiente, la importancia de los datos usados para llegar a la conclusión y las medidas implementadas. Cuando fuera apropiado, se debería actualizar la validación del proceso para reflejar los cambios realizados. Esto está claramente indicado en los casos en que la evaluación ha conducido a la conclusión de que el cambio se debería considerar significativo.
Notificación El usuario debería recibir notificación anticipada de un cambio inminente. Para los cambios de Nivel 3 en particular, el usuario puede requerir cierto tiempo para completar la evaluación del impacto del cambio sobre sus formulaciones. Durante este período el usuario puede solicitar el inventario del excipiente producido antes de hacer el cambio. El fabricante debería planear el cambio considerando esta eventualidad. Sin importar el nivel aparente del cambio, todos los cambios que cumplan con la definición de cambio significativo como resultado de la evaluación requieren notificación al usuario. Las autoridades reguladoras a menudo requieren notificación de los cambios significativos que involucran la fabricación de excipientes. Dicha notificación se debería hacer como lo exija la autoridad pertinente.
GLOSARIO Árbol de Decisión: Presentación visual de la secuencia de acontecimientos que pueden ocurrir, incluidos los puntos de decisión. Balance de Masa: Suma del material cuantificable presente en el excipiente. Biocarga: Naturaleza y cantidad de microorganismos presentes en el excipiente. Cambio de Escala (Scale): Aumento o disminución en el tamaño de la partida en un procesamiento por partidas o de la capacidad de productividad en un procesamiento continuo, sea que se use un equipo diferente o no. Cambio Significativo: Cambio que altera las propiedades físicas o químicas de un excipiente, con respecto a la norma, o que es probable que altere el desempeño del excipiente en la forma farmacéutica. Componente Concomitante: Sustancia encontrada en un excipiente que es diferente de la entidad química deseada, pero que puede ser necesaria para garantizar el desempeño apropiado del excipiente en su uso previsto y no es una impureza ni una sustancia extraña (anteriormente conocida como componente menor). Control Estadístico de Calidad (CEC o SQC, por sus siglas en inglés): Graficación de resultados de pruebas secuenciales para mostrar su variación respecto al intervalo de la especificación y su variación normal. Disolvente: Vehículo, distinto del agua, usado en la síntesis del producto, que permanece químicamente inmutable. Disolvente Residual: Sustancia química orgánica volátil que se usa o produce en la fabricación de excipientes. Los disolventes residuales no se eliminan por completo mediante las técnicas prácticas de fabricación. Efecto Fisiológico: Cualquier efecto sobre la salud normal del cuerpo humano. Empaque: Envase y sus componentes que contienen el excipiente para transporte al usuario. Encefalopatía Espongiforme Bovina (BSE, por sus siglas en inglés): Enfermedad que ocasiona el deterioro patológico del cerebro en el ganado bovino; se cree que es causada por un prión que puede transmitirse para causar la enfermedad variante de Creutzfeldt-Jakob (vC]D, por sus siglas en inglés) en seres humanos.
1 714 (1195) Guía sobre Cambios Significativos/ Información General
USP 39
Encefalopatía Espongiforme Transmisible {TSE, por sus siglas en inglés): Cualquier agente que causa una enfermedad sintomática en animales o humanos afín con la BSE y su variante, la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, p.ej., scrapie o tembladera en ovinos. Equipos: Implementos usados en la fabricación de un excipiente. Especificación: Parámetros de calidad que sirven como base para la evaluación de la calidad y a los que se deben ajustar los excipientes, componentes o productos intermedios. Etapa del Proceso: Instrucción al personal de fabricación del EFG en la cual se indica que se debe efectuar una operación. Excipiente: Toda sustancia en un medicamento, distinta del fármaco, que ha sido evaluada de manera apropiada respecto a su seguridad y que se incluye en un sistema de liberación de fármacos para facilitar el procesamiento del medicamento durante su fabricación, para proteger, mantener o mejorar la estabilidad, la biodisponibilidad o la aceptación por parte del paciente, para contribuir a la identificación del producto o mejorar cualquier otro atributo general relativo a la seguridad y eficacia del medicamento durante el almacenamiento o el uso. Excipiente Farmacéutico a Granel (EFG): Ver Excipiente. Fármaco: Ver Ingrediente Farmacéutico Activo. Funcionalidad: Conjunto de criterios de desempeño que el excipiente está previsto cumplir cuando se usa en una formulación. Impureza: Componente de un excipiente que no es la entidad química deseada ni un componente pero que está presente como consecuencia de las materias primas usadas o del proceso de fabricación y no es una sustancia extraña. Ingrediente Farmacéutico Activo (API, por sus siglas en inglés): Cualquier sustancia o mezcla de sustancias que esté destinada a ser usada en la fabricación de un producto farmacéutico (medicinal) y que, al usarse en la producción de un medicamento, se convierte en un ingrediente activo del mismo. Tales sustancias están destinadas a proporcionar actividad farmacológica u otro efecto directo en el diagnóstico, cura, alivio, tratamiento o prevención de una enfermedad, o a afectar la estructura o cualquier función del cuerpo humano o de los animales. Intervalo de Confianza: Intervalo, calculado a partir de datos de la muestra, dentro del cual se espera que esté comprendido un parámetro de población, tal como la media de la población, con un nivel de confianza determinado. Materia Prima: Toda sustancia utilizada en la producción de un excipiente, excluyendo los materiales de empaque. Organismo Genéticamente Modificado (OGM): Organismos vivientes como animales, plantas o microbios con una composición genética alterada, producida por medio de un conjunto especial de tecnologías. Origen Biológico: Definido como origen animal o no animal, según la fuente de la materia prima usada en la fabricación del excipiente; incluye también materiales que podrían entrar en contacto con los equipos usados en la fabricación de otros materiales con componentes derivados de animales o de organismos genéticamente modificados (OGM). Parámetro del Proceso: Condición operativa mensurable. Perfil de Impurezas: Descripción de las impurezas presentes en el excipiente. Proceso: Conjunto de instrucciones operativas que describen cómo se debe sintetizar, aislar, purificar, envasar, etc., el excipiente. Proceso Continuo: Proceso de fabricación que produce continuamente el excipiente a partir del suministro constante de materias primas. Proceso por Partidas: Proceso de fabricación que produce el excipiente a partir de un suministro discreto de materias primas que están presentes antes de completarse la reacción. Propiedad Física: Parámetro de calidad que se puede medir únicamente por medios físicos. Propiedad Química: Parámetro de calidad que se mide por métodos de análisis químicos o fisicoquímicos. Reemplazo del Mismo Tipo: Equipo de fabricación que utiliza los mismos principios de operación y tiene una construcción similar o componentes del empaque hechos con los mismos materiales y sellados en forma similar. Reprocesamiento: Reintroducción en el proceso de un material previamente procesado que no se ajustó a las normas o especificaciones, y repetición de una o más etapas necesarias, que son parte del proceso normal de fabricación. Sitio: Ubicación definida de los equipos con los que se fabrica el excipiente. Puede estar dentro de una instalación más grande. El cambio de sitio puede ser a una parte diferente de la instalación existente pero en un área operativa distinta o puede ser a una instalación remota, incluso la de un fabricante por contrato. Sustancia Extraña: Componente que está presente en el excipiente farmacéutico a granel pero que no se introduce en el excipiente como consecuencia de su síntesis o purificación y no es necesario para conseguir la funcionalidad requerida (conocido anteriormente como contaminante). Validación del Proceso: Programa documentado que ofrece un alto grado de garantía de que un proceso específico producirá constantemente un resultado que cumplirá con los criterios de aceptación predeterminados.
APÉNDICES
Apéndice 1: Niveles de Cambio Se proporcionan ejemplos de cambios que típicamente se clasificarían dentro de los tres niveles de cambio, para que sirvan de guía.
USP 39
Información General / (1195) Guía sobre Cambios Significativos 1 715
NIVEL 1 1. Parámetro de procesamiento cambiado a un nuevo valor que se encuentra dentro de la validación del proceso. 2. Uso de un equipo alternativo que está listado como tal en un documento reglamentario [es decir, en el Archivo Maestro de un Fármaco (Drug Master File)]. 3. Uso de un equipo que representa un reemplazo del mismo tipo. Se trata por lo general de un equipo nuevo que utiliza los mismos principios operativos del equipo reemplazado. 4. Revisión de una especificación de una de las materias primas del excipiente que implica controles de calidad más estrictos o conformidad con farmacopeas adicionales. 5. Adición de un parámetro de prueba o ajuste de un parámetro existente en la especificación de un excipiente, que se usa para propósitos informativos únicamente. No se usa para mejorar la calidad ni para propósitos de control. 6. Control ambiental mejorado para prevenir la contaminación cruzada del excipiente. Un ejemplo de esto es el mejoramiento de un cuarto de envasado o la segregación adicional del equipo de fabricación. NIVEL 2 1. Parámetro de procesamiento cambiado a un nuevo valor que se encuentra fuera de la validación del proceso. 2. Cambio de sitio para retornar la fabricación de un excipiente a un sitio usado para este propósito hace más de un año. 3. Control de proceso que está fuera de los límites normales de variabilidad. Un ejemplo de esto es el nuevo equipo de control de proceso para controlar propiedades del excipiente que no se habían controlado previamente, que ocasiona ajustes del proceso. 4. Cambio en la manipulación, almacenamiento o despacho/entrega del excipiente. Un ejemplo de cambio en la manipulación es el movimiento de un polvo con un nuevo equipo de transporte de polvos. El almacenamiento del excipiente a granel frente al almacenamiento del mismo en el envase de transporte, es un ejemplo de cambio en el almacenamiento. El despacho del excipiente en camiones de temperatura controlada en contraposición con camiones sin control de temperatura es un ejemplo de un cambio en el despacho, aunque no viceversa. 5. Cambio en el tamaño o forma del envase. NIVEL 3 1. Adición o remoción de una entidad química del proceso de fabricación. Un ejemplo sería la adición o remoción de un agente conservante, un agente amortiguador, un estabilizador o un catalizador. 2. Fabricación en un nuevo sitio nunca antes usado con este propósito. 3. Revisión de una especificación de venta hecha con el propósito de mejorar la calidad del excipiente, bien sea a través de un control mejorado del proceso o de selección de lote. 4. Uso de un nuevo envase, tal como un tambor de diferente construcción (es decir, plástico contra acero). 5. Revisión de la etiqueta del producto. 6. Revisión del sello que evidencia alteración intencional. 7. Cambio en la vida útil declarada o en el intervalo de reanálisis.
Apéndice 2: Árbol de Decisión Se ha desarrollado un árbol de decisión con el fin de ayudar en la clasificación del cambio en niveles. El diagrama comienza con el cambio propuesto y guía al fabricante de EFG hasta un indicio de la probabilidad de que el cambio afecte al usuario del excipiente. El árbol de decisión clasifica el tipo de cambio que ocurre en la fabricación del excipiente según involucre al sitio de fabricación, las etapas del procesamiento, el empaque y las pruebas y control de calidad.
1 716 (1195) Guía sobre Cambios Significativos / Información General
USP 39
Apéndice 2: Árbol de Decisión Cambio Propuesto
Lab. Control de Cal.
Fabricación o Envasado
ambi
-
.---"----
(
~~-~~~~-J
· control
~~lente?
No
~D
Proceso de Fabricación
Equipo
Materiales
<Équivalente? Sí ~
~/ No
(_,--N-iv-el_3_)..-·No
--~~opeico
...._J ____
Sí
Sí
Sí
entro de
"vaJ~íó
-·-··-~. Nivel
s· 1
1__)
=r--
T
Nivel 1
J ~ No
!
-··· ~:r··-·,. Si
N
No
USP 39
Información General / (1195) Guía sobre Cambios Significativos 1717
Apéndice 2: Árbol de Decisión (cont.)
Proceso de Fabricación
Materiales
Proveedor
No
Sí
-· ___ ..t_____ ~ Í
Nivel 1
Control de Proceso
Sí
Sí
Etapas del Proceso
eprocesamient
No
~
\._ ------··~·---"',.
Especificación
•
_____l_, l.~~~~---)
No
1
e
Nivel2)
Escala
Nivel 3
~Sí' No
e
Nivel2
}No
Sí
.-- ··"----,, ( \,
1 ____Nivel .......
~ ~-~
)
...
Apéndice 3: Perfil de Impurezas DEFINICIÓN DE PERFIL DE IMPUREZAS El perfil de impurezas de un excipiente puede definirse como una descripción de las impurezas presentes en un lote típico de excipiente producido mediante un proceso de fabricación determinado. El perfil de impurezas incluye la identidad de cada impureza importante o una descripción cualitativa apropiada, tal como el tiempo de retención del pico (si no se ha identificado), la cantidad de impureza observada expresada como un intervalo, y la clasificación, según se discute a continuación, de cada impureza identificada. Los excipientes frecuentemente funcionan debido a que no son "puros". Esto quiere decir que a menudo existen componentes concomitantes que son necesarios para la correcta funcionalidad del excipiente. Estos componentes concomitantes esenciales no deberían ser considerados como parte del perfil de impurezas sino que se deberían evaluar por separado, de ser posible. La composición del perfil de impurezas depende de variables como las materias primas, los disolventes, los reactivos, los catalizadores y el proceso de fabricación usado en la fabricación del excipiente. Las sustancias extrañas, tales como los adyuvantes de fabricación que pueden estar presentes en el excipiente se deberían controlar hasta un nivel que no sea objetable.s Se sabe que la presencia de componentes concomitantes esenciales es importante para el desempeño del excipiente en el medicamento. Por lo tanto, la presencia de estos componentes concomitantes esenciales en el excipiente no debería considerarse indeseable ni confundirse con la presencia de sustancias extrañas o impurezas. s Advertencias Generales vigentes de la USP
1718 (1195) Guía sobre Cambios Significativos/ Información General
USP 39
Cabe anotar que en algunos excipientes el agua puede considerarse como un componente concomitante esencial, necesario para conseguir la funcionalidad deseada. Para otros excipientes, el agua puede estar incluida en el perfil de impurezas, si fuera apropiado, y debería clasificarse como una impureza inorgánica en dichas circunstancias. USO DEL PERFIL DE IMPUREZAS El perfil de impurezas, según se usa en este capítulo, está destinado a ayudar en la determinación de la importancia de un cambio. En lo posible, el fabricante del excipiente debería realizar el perfil de impurezas. Esto puede conseguirse a través del conocimiento de los materiales iniciales y del proceso de fabricación y de la subsiguiente aplicación de pruebas analíticas validadas para lograr un resultado cualitativo y/o cuantitativo del perfil de impurezas. PROCEDIMIENTO PARA EL DESARROLLO DE UN PERFIL DE IMPUREZAS Dada la naturaleza diversa de las sustancias que se pueden incorporar como excipientes farmacéuticos, incluidas las mezclas altamente complejas de fuentes animales, vegetales, minerales y/o sintéticas, pueden requerirse diferentes enfoques para caracterizar sus propiedades. Se sabe que el desarrollo de un perfil de impurezas puede no ser técnicamente factible para determinados excipientes. En tales casos, el fabricante debería documentar qué método se está usando para monitorear el efecto de los cambios sobre el excipiente, según se indica en este capítulo en Criterios de Evaluación y Determinación de la Importancia en Cambio Significativo. CLASIFICACIÓN DE IMPUREZAS Las impurezas del excipiente se clasifican de la siguiente manera: Impurezas Orgánicas: Cualquier material orgánico que surja durante el proceso de fabricación y no esté listado como el excipiente deseado en la monografía o en la especificación y que no sea un componente concomitante o una sustancia extraña. Esto puede incluir materiales iniciales, subproductos, productos intermedios, reactivos, ligandos y catalizadores. Impurezas Inorgánicas: Cualquier material inorgánico que surja durante el proceso de fabricación y no esté listado como el excipiente deseado en la monografía o en la especificación y que no sea un componente concomitante o una sustancia extraña. Esto puede incluir materiales iniciales, subproductos, productos intermedios, reactivos, ligandos y catalizadores. Disolventes Residuales: Disolventes provenientes de la eliminación incompleta de líquidos orgánicos o inorgánicos, sin importar la fuente. Ver detalles en Disolventes Residuales (467). Nótese que los límites especificados se aplican al medicamento según lo considerado en la Opción 2 y al excipiente según la Opción 7. Cabe anotar que un disolvente residual se puede clasificar también como un componente concomitante pero debe considerarse de todas formas. PERFIL DE IMPUREZAS Siempre que sea posible, el fabricante debería intentar la caracterización del perfil de impurezas de un excipiente, tomando en cuenta el proceso de fabricación y las potenciales impurezas anticipadas como consecuencia del mismo. Un enfoque sensato incluye el control de todas las impurezas que tienen características toxicológicas conocidas. Los límites de estas impurezas pueden estar basados en el uso del medicamento, según lo informe el usuario del excipiente, y deberían cumplir con los requisitos de ICH Q3B(R) Impurezas en Productos Farmacéuticos y de Disolventes Residuales (467). Con el fin de desarrollar un perfil de impurezas, los excipientes se pueden clasificar como aquellos en los que la pureza se puede medir directamente y aquellos en los que la pureza no se puede medir directamente. Ejemplos de los primeros son los excipientes cuya monografía o especificación incluye un requisito de pureza. Los polímeros o derivados de productos naturales son a menudo ejemplos de excipientes en los que la pureza no se puede medir directamente. El material usado en el desarrollo del perfil de impurezas debería muestrearse usando la misma técnica de muestreo y el mismo punto de muestreo en el proceso de fabricación que la muestra tomada para el control de calidad que determina la liberación del lote. EXCIPIENTES PARA LOS CUALES SE PUEDE MEDIR LA PUREZA Lo ideal es contar con un balance de masa, pero se sabe que un balance de masa del 100% por lo general no se puede conseguir debido a la limitación inherente en exactitud y precisión de las pruebas disponibles, así como la posible falta de pruebas idóneas para algunos componentes. El balance de masa de la composición del excipiente se debería calcular sumando las impurezas orgánicas, las impurezas inorgánicas, los disolventes residuales y el excipiente. Si existen componentes concomitantes esenciales mensurables, deberían incluirse con el excipiente para propósitos de este cálculo. El propósito de calcular el balance de masa es estimar la cantidad de material no medido en el perfil de impurezas. El fabricante del excipiente debería incluir en el informe de desarrollo del perfil de impurezas el balance de masa conseguido y lo que se piensa son los componentes no cuantificados totalmente.
USP 39
Información General/ (1197) Buenas Prácticas de Distribución 1 719
Impurezas Orgánicas: Identificar cada impureza igual o mayor de O, 10%, usando las técnicas analíticas apropiadas. Si las impurezas orgánicas no se pueden identificar, se debería asignar una descripción cualitativa, tal como el tiempo de retención cromatográfico, a todas las impurezas iguales o mayores de O, 10%. Si la medición directa de las impurezas orgánicas no es posible, se puede informar el total de Impurezas Orgánicas como:
100 - (Impurezas Inorgánicas + Disolventes Residuales+ Excipiente) Impurezas Inorgánicas: Identificar cada impureza igual o mayor de O, 10%, usando las técnicas analíticas apropiadas. Si la medición directa de las impurezas inorgánicas no es posible, se puede estimar el total de Impurezas Inorgánicas como:
100 - (Impurezas Orgánicas+ Disolventes Residuales + Excipiente) Disolventes Residuales:
Informar los disolventes presentes por clasificación (ver Disolventes Residuales (467)) y nivel. EXCIPIENTES PARA LOS CUALES NO SE PUEDE MEDIR LA PUREZA
Aunque lo ideal es contar con un balance de masa del 100% de la composición del excipiente, se sabe que esta meta es a menudo técnicamente difícil de conseguir, si no imposible. Por lo tanto, los fabricantes deberían incluir informes del desarrollo del perfil de impurezas, el balance de masa conseguido y lo que se piensa son los componentes no cuantificados de otra forma. Para excipientes producidos por procesamiento químico continuo, podría no ser posible calcular un balance químico de masa, sino un balance general del proceso. Cuando no sea factible la medición directa de la pureza del excipiente, se deberían usar técnicas para proporcionar un cálculo de la pureza del excipiente. Esta información se aplica luego a las ecuaciones listadas anteriormente en Excipientes Para los Cuales se Puede Medir la Pureza. DOCUMENTACIÓN El proveedor del excipiente debería desarrollar la documentación que respalde el desarrollo de un perfil de impurezas. El proveedor puede compilar esta documentación de varias formas de manera que pueda obtenerse como respaldo del perfil de impurezas. La documentación del perfil de impurezas de un excipiente debería incluir la siguiente información: 1. Plan de muestreo 2. Métodos analíticos de prueba 3. Identidad y cantidad de cada componente del excipiente, incluidos tanto los componentes del excipiente como las purezas identificadas. 4. Discusión de la incertidumbre en la medición de cada componente del excipiente y de la impureza. 5. Discusión del balance de masa
(1197) BUENAS PRÁCTICAS DE DISTRIBUCIÓN PARA EXCIPIENTES FARMACÉUTICOS A GRANEL SECCIÓN 1. INTRODUCCIÓN Y ALCANCE 1.1 Introducción Los excipientes se usan prácticamente en todos los productos farmacéuticos y son esenciales para el desempeño y la calidad de los mismos. Por lo regular, la fabricación y suministro de los excipientes se llevan a cabo de tal manera que cumplan con los estándares farmacopeicos. Los participantes de la cadena de suministro de excipientes farmacéuticos incluyen fabricantes, distribuidores, corredores, proveedores, comercializadores, transportistas, agentes expedidores y reenvasadores. El control inadecuado de actividades tales como distribución, envasado, reenvasado, etiquetado y almacenamiento puede afectar la calidad del excipiente farmacéutico. El control inadecuado o impropio de las prácticas de comercialización y distribución puede representar un riesgo importante para la calidad de los excipientes farmacéuticos y puede incrementar el riesgo de contaminación, contaminación cruzada, adulteración, confusión de productos, degradación o cambios en las propiedades físicas o químicas. Para mantener la calidad original y esperada, todos los participantes de la cadena de suministro de excipientes deben actuar de acuerdo con las normas apropiadas sobre buenas prácticas de comercialización y distribución conforme a lo tratado en este capítulo. NOTA: El Apéndice incluye definiciones y acrónimos.
1 720 (1197) Buenas Prácticas de Distribución / Información General
USP 39
1.2 Alcance Este capítulo de información general ofrece recomendaciones sobre actividades y prácticas que aseguran las buenas prácticas de comercialización y distribución de excipientes farmacéuticos, a fin de garantizar su calidad esperada. Dichas actividades y prácticas incluyen la gestión de calidad, organización, documentación, instalaciones, almacenamiento, equipo, estabilidad, prevención de adulteración, importación, envasado, reenvasado, etiquetado, despacho, transporte, devoluciones y prácticas de preparación magistral. Asimismo, incluyen al personal, autenticidad de datos, fechado de caducidad, reanálisis, quejas y retiros del mercado, manejo de materiales que no cumplen con las normas, auditorías internas/externas/y de terceros, convenios de calidad, vida útil, rastreabilidad, adulteración por motivos económicos y cumplimiento con las monografías oficiales. Los procedimientos aquí descritos son aplicables a todas las personas y fabricantes implicados en el manejo de excipientes farmacéuticos, así como a cada una de las etapas de la cadena de suministro. Este capítulo abarca todos los materiales designados o destinados para su uso como excipientes farmacéuticos, desde el punto del proceso de fabricación a partir del cual se designa el excipiente final para uso farmacéutico.
1.3 Consideraciones Generales Los fabricantes, distribuidores, usuarios, autoridades reglamentarias y consumidores esperan que la fabricación, envasado, almacenamiento y transporte de excipientes farmacéuticos se lleven a cabo de tal manera que no se comprometa la aptitud de su uso en productos medicinales para uso humano o veterinario. Dado que se trata de componentes de productos farmacéuticos, los excipientes están definidos como productos farmacéuticos dentro de la Ley Federal de Alimentos, Medicamentos y Cosméticos de los EE.UU. (Ley FD&C); por lo tanto, cuando un excipiente no sea apto para su uso previsto, se aplicará la definición de adulteración de la Administración de Alimentos y Medicamentos de los EE.UU. (FDA). Los excipientes son un grupo diverso de materiales que pueden ser de origen animal, mineral, sintético o vegetal, y pueden presentarse en estado sólido, líquido o gaseoso. El tamaño y peso de los envases usados para envasar y transportar excipientes puede variar desde unos cuantos gramos hasta un vagón de tren. Debido a su naturaleza diversa y a la variedad de formas en que los excipientes pueden ser transportados desde el sitio de fabricación a través de la cadena de suministro hasta el sitio final de uso, este capítulo de información general no puede ofrecer detalles profundos sobre materiales específicos o modos de transporte. No obstante, este capítulo ofrece información general sobre las responsabilidades de aquellos individuos y organizaciones implicadas en el suministro y distribución de excipientes farmacéuticos destinados para su uso en la fabricación de productos farmacéuticos terminados. Por tanto, en ciertas instancias, los capítulos de los compendios USP-NF Buenas Prácticas de Fabricación para Excipientes Farmacéuticos a Granel (1078), Excipientes Farmacéuticos a Granel-Certificado de Análisis (1080) y Guía sobre Cambios Significativos en Excipientes Farmacéuticos a Granel (1195) ofrecen guías más detalladas sobre las responsabilidades en estas áreas específicas. Los excipientes también se utilizan en una variedad de industrias y, aunque la mayoría de los fármacos por lo general se fabrican para su uso exclusivo en productos farmacéuticos terminados, el uso farmacéutico de un excipiente puede representar solamente una pequeña parte de los usos del material en todas las industrias. Esto complica el control reglamentario tanto para la fabricación como para el suministro de excipientes farmacéuticos. Asimismo, los excipientes se fabrican a menudo fuera de los Estados Unidos, lo cual complica aún más el control reglamentario sobre la fabricación y el suministro de los excipientes farmacéuticos. Por ende, resulta indispensable mantener la transparencia en todas las etapas de la cadena de suministro de excipientes farmacéuticos, así como un flujo apropiado de la información necesaria relacionada con el transporte de los mismos. Además, para asegurar el cumplimiento de este capítulo, los proveedores de excipientes farmacéuticos deben apegarse a todas las leyes y reglamentos nacionales, regionales y locales aplicables.
1.4 Excipientes de Grado Farmacéutico Los excipientes farmacéuticos deben prepararse de conformidad con los principios reconocidos de las buenas prácticas de fabricación (GMP, por sus siglas en inglés), usando ingredientes que cumplan con las especificaciones diseñadas para garantizar que las sustancias resultantes cumplan con los requisitos de la monografía oficial (ver las Advertencias Generales 3.1 Oy el capítulo Buenas Prácticas de Fabricación para Excipientes Farmacéuticos a Granel (1078)). Las normas de los compendios USP o NF se aplican a todos los excipientes comercializados en los Estados Unidos que estén reconocidos en los compendios y que estén destinados para su uso como ingrediente de un producto farmacéutico, o cuando así se declare en su etiquetado. Las normas pertinentes se aplican a dichos artículos independientemente de si se usa la designación "USP" o "NF" (ver las Advertencias Generales 3.10.1 O). Un ingrediente puede incluir la designación "USP" o "NF" junto con su título oficial o en cualquier otra parte de la etiqueta únicamente cuando se proporcione una monografía en el compendio y el artículo cumpla con las normas de dicha monografía y con cualquier otra norma aplicable del compendio incluyendo, entre otros, los principios de buenas prácticas de fabricación (ver las Advertencias Generales 3.20). Cuando no estén disponibles excipientes de grado USP o NF, los fabricantes deberían primero considerar el uso de materiales que declaren cumplir con otras farmacopeas (p.ej., la farmacopea europea o la farmacopea japonesa). Si éstos no estuvieran disponibles, los fabricantes farmacéuticos deberían entonces considerar alternativas apropiadas (p.ej., ingredientes de grado alimenticio), siempre que dichos materiales sean adecuados para el uso previsto. Si no se utiliza un grado farmacopeico, se deberá contar con una justificación por escrito. El fabricante/usuario farmacéutico es responsable de desarrollar y confirmar las
USP 39
Información General/ (1197) Buenas Prácticas de Distribución 1721
pruebas, procedimientos y atributos de calidad adecuados para garantizar que el material sea apropiado para su uso pretendido y que la fabricación se haya llevado a cabo de acuerdo con las buenas prácticas de fabricación o en un sistema de gestión de calidad que demuestre el mismo nivel de garantía de calidad que el ofrecido en la USP (ver (1078)). Elevar un material de grado técnico o industrial a un grado de calidad farmacéutica basándose únicamente en resultados analíticos que demuestren el cumplimiento de los requisitos de una monografía oficial es una práctica inaceptable.
1.5 Autenticidad de los Datos En los Estados Unidos, la responsabilidad con respecto a la calidad de los componentes de un producto farmacéutico terminado recae sobre la organización que garantiza la calidad del producto farmacéutico terminado. Por consiguiente, un aspecto importante a considerar al momento de comprar y suministrar un excipiente farmacéutico es confirmar que el material es lo que pretende ser, que cumple con las especificaciones, que ha sido fabricado bajo las buenas prácticas de fabricación aplicables, que no ha sufrido ningún tipo de alteración intencional antes de su arribo al sitio de uso pretendido, que la apariencia de los envases y otros atributos del envío son comparables a los de aquellos envíos del mismo excipiente y grado previamente recibidos del mismo proveedor, y que es adecuado para su uso pretendido. Todos los envíos de excipientes farmacéuticos deben estar acompañados de documentación específica, la cual debe incluir una declaración de autenticidad y una copia legible de un Certificado de Análisis (COA, por sus siglas en inglés) (ver Excipientes Farmacéuticos a Granel-Certificado de Análisis (1080)). Al recibir un Certificado de Análisis, los fabricantes deben llevar a cabo los pasos adecuados para verificar la autenticidad del mismo y de los datos que contiene. Este punto se ha vuelto particularmente importante en los últimos años debido a los casos de adulteración de excipientes destinados para su uso en la fabricación de productos farmacéuticos. Los pasos para verificar la autenticidad del Certificado de Análisis deben llevarse a cabo en todas las etapas de la cadena de suministro. Los datos en el Certificado de Análisis pueden ser verificados de diversas formas, pero el usuario del excipiente tiene la responsabilidad de confirmar que los datos sean auténticos mediante la verificación periódica del cumplimiento con las especificaciones establecidas conforme a lo indicado en el Título 21 del Código de Reglamentos Federales, Parte 211 (Título 21 del CFR 211; ver Current Good Manufacturíng Practíce Far Fíníshed Pharmaceutícals (Buenas Prácticas de Fabricación Vigentes para Productos Farmacéuticos Terminados), http://www.accessdata.fda.gov/scripts/cdrh/cfdocs/cfcfr/CFRSearch.cfm ?CFRPart=21 l, http://www.fda.gov/downloads/AboutFDA/CentersOffices/CDER/UCM095852.txt). Asimismo, otros documentos tales como las notas de despacho de etapas anteriores en la cadena de suministro pueden ofrecer pruebas adicionales del pedigrí del envío de excipiente. Estos documentos se denominan "documentos de pedigrí". 1 Este capítulo podría representar desafíos adicionales para algunos usuarios de excipientes, p.ej., las farmacias de preparación magistral. No obstante, aquéllos dedicados a la práctica de la preparación magistral siguen estando obligados a realizar todos los pasos razonables para verificar que los excipientes que reciben sean adecuados para su uso previsto. Parte de esta verificación puede incluir la revisión de los documentos de pedigrí, así como un Certificado de Cumplimiento (COC, por sus siglas en inglés) firmado de los proveedores. La información contenida en los requisitos de etiquetado de las monografías de los compendios USP-NF, en la lnactive lngredient Database (Base de Datos de Ingredientes Inactivos) de la FDA, y en el Código de Reglamentos Federales, provee detalles específicos sobre el uso permitido de los excipientes en productos reglamentados por la FDA. Todos los compradores de excipientes farmacéuticos deben establecer procedimientos escritos para verificar los datos y que el excipiente sea adecuado para su uso previsto.
SECCIÓN 2: CALIDAD, ORGANIZACIÓN Y DOCUMENTACIÓN 2.1 Gestión de Calidad Un Sistema de Gestión de Calidad (QMS, por sus siglas en inglés) es una herramienta mediante la cual todas las partes implicadas en la cadena de suministro de excipientes mantienen la calidad del excipiente. Una política de calidad documentada es la piedra angular del Sistema de Gestión de Calidad y describe formalmente la filosofía general de la compañía con respecto a la calidad, de acuerdo con lo autorizado por la cúpula administrativa. Asimismo, un Sistema de Gestión de Calidad apropiado debe incluir: • Una estructura organizativa capaz de sustentar los elementos de la política de calidad • Procedimientos documentados y registros pertinentes que demuestren que el producto cumplirá con los criterios de calidad establecidos. Esto se conoce comúnmente como garantía de calidad • Procedimientos establecidos para la aprobación de proveedores de materiales de partida y para verificar el cumplimiento continuo de los mismos con los requisitos convenidos • Un procedimiento de análisis de liberación de materiales para confirmar la calidad de los excipientes para los propósitos pretendidos. 1 IPEC. The IPEC Excipient Pedigree White Paper. Arlington, VA: IPEC; ND. Disponible en: http://ipecamericas.org/sites/default/files/Excipient_pedigree.pdf (consultado el 6 de julio de 2011 ).
1 722 (1197) Buenas Prácticas de Distribución / Información General
USP 39
Los fabricantes y proveedores de excipientes deben preparar un Manual de Calidad. El Manual de Calidad describe los elementos del Sistema de Gestión de Calidad e incluye la estructura de calidad organizativa, políticas escritas, procedimientos y procesos o referencias a éstos, así como una descripción de las funciones departamentales y su relación con las políticas, procedimientos y procesos (ver la Sección 2.3 Requisitos de Documentación). Al implementar el Sistema de Gestión de Calidad, las compañías deben garantizar la disponibilidad de personal adecuadamente calificado para realizar las acciones requeridas por el Sistema de Gestión de Calidad, evitando cargar a un solo individuo con tal grado de responsabilidades, que ponga en riesgo la calidad. Los Certificados de Cumplimiento para los sistemas de calidad tales como las guías o los análisis de riesgos y puntos de control críticos (HACCP, por sus siglas en inglés) aplicables de la Organización Internacional de Normalización (lnternational Organization far Standardization o ISO) no son obligatorios pero ofrecen la garantía de que los productos se producen y manejan adecuadamente. Sin embargo, la certificación de estos sistemas de calidad no debe considerarse como sustituto de la información contenida en este capítulo. Además, se deben llevar a cabo auditorías internas a intervalos regulares para confirmar el cumplimiento con las buenas prácticas de fabricación (según corresponda) y las buenas prácticas de distribución (GDP, por sus siglas en inglés), y los fabricantes deben buscar oportunidades de mejoramiento (ver la Sección 2.1 Auditorías: Internas, Externas
y de Terceros). Todas las partes implicadas en la cadena de suministro de excipientes comparten responsabilidades con respecto a la calidad y la seguridad del excipiente farmacéutico. Estas responsabilidades deben detallarse en un convenio de calidad entre las partes de la cadena de suministro (ver la Sección 2. 9 Convenios de Calidad). Todas las partes y sus actividades dentro de la cadena de suministro deben quedar documentadas y se deben mantener registros, en apego a los procedimientos escritos, para asegurar la rastreabilidad de todos los productos adquiridos y distribuidos. Todos los integrantes de la cadena de suministro tienen la obligación de proteger los excipientes que estén bajo su custodia contra la adulteración deliberada, motivada por cuestiones económicas, o contra la introducción deliberada de materia extraña que pudiera comprometer la calidad o el desempeño del excipiente o afectar de manera adversa la salud de seres humanos o animales.
2.2 Organización y Personal La estructura organizativa debe ser adecuada y con un número suficiente de personal y los trabajadores deben estar apropiadamente autorizados para las actividades que realizan. Se debe usar un organigrama para detallar las responsabilidades e interrelaciones del personal. Los Directivos son la última parte responsable de la implementación de las buenas prácticas de distribución, así como la verificación de que el Sistema de Gestión de Calidad mantiene la calidad esperada del excipiente. Todos los individuos dentro de la compañía deben tener responsabilidades claramente definidas y documentadas por escrito. Todos los individuos deben entender sus responsabilidades y deben estar adecuadamente calificados para realizar sus funciones asignadas. Asimismo, se debe evaluar y documentar la idoneidad de sus calificaciones para el desempeño de sus responsabilidades. Las calificaciones pueden incluir una combinación de educación, capacitación y experiencia formales. Esto también incluye a cualquier proveedor de servicios contratado. Se debe contar con procedimientos para garantizar que los empleados permanentes, temporales y contratistas minimicen la posibilidad de que el producto sea manejado por personas no autorizadas. En cada sitio de la cadena de suministro, se debe asignar a un empleado la autoridad y responsabilidad necesarias para la implementación y mantenimiento del Sistema de Gestión de Calidad. El empleado designado debe contar con la autoridad, calificaciones y recursos suficientes para desempeñar su función, así como para identificar y corregir cualquier desviación del Sistema de Gestión de Calidad. No deben existir conflictos de interés u otras presiones que pudieran afectar de manera adversa la capacidad de la administración y el personal para realizar sus funciones con respecto a la calidad del producto. El personal debe conocer los principios de las buenas prácticas de distribución incluidos en este capítulo y debe recibir capacitación pertinente de manera continua y regular sobre sus responsabilidades y sobre principios generales de calidad. Toda la capacitación debe conducirse de conformidad con un plan escrito de capacitación y se deben mantener registros de la misma. El personal con funciones especiales tales como el manejo de materiales peligrosos o supervisión de actividades requeridas por la legislación local pueden requerir de capacitación adicional que incluya la gestión de riesgos específicos. La efectividad de la capacitación debe verificarse con regularidad. El personal que trabaja con el producto abierto debe entender y mantener buenas prácticas de higiene, salud y desinfección. El personal debe utilizar vestimentas protectoras adecuadas que no desprendan partículas y que protejan al producto del individuo que recolecta la muestra y a éste último de los riesgos del producto. Se deben establecer procedimientos para eliminar el potencial de contaminación del producto con artículos personales tales como joyería, alimentos, bebidas o tabaco. Además, se debe contar con procedimientos escritos con respecto a la higiene, salud, desinfección y vestimentas protectoras. Cada parte de la cadena de suministro debe contar con procedimientos disciplinarios para tratar situaciones en las que se sospeche o compruebe que el personal implicado en el manejo de productos está involucrado en actividades inapropiadas o ilegales. Se puede contratar a terceras partes, individuos o entidades fuera del empleo directo del proveedor para realizar algunas tareas relacionadas con la calidad. La delegación de estas actividades debe documentarse en un convenio o contrato de calidad celebrado con la tercera parte contratada, además la organización debe confirmar el cumplimiento con los principios de buenas prácticas de distribución mediante auditorías periódicas en las instalaciones de las terceras partes. La delegación de ciertas funciones a terceras partes no libera a la organización de sus responsabilidades generales sobre dichas actividades.
USP 39
Información General/ (1197) Buenas Prácticas de Distribución 1 723
2.3 Requisitos de Documentación 2.3.1 INFORMACIÓN GENERAL Las organizaciones deben contar con un sistema para controlar documentos y datos relacionados con los requisitos del Sistema de Gestión de Calidad. 2.3.2 MANUAL DE CALIDAD Las organizaciones también deben mantener un manual de calidad que describa el Sistema de Gestión de Calidad, la política de calidad y el compromiso de la compañía para aplicar las buenas prácticas de distribución apropiadas y las normas de gestión de calidad contenidas en este capítulo. El manual debe incluir el alcance del Sistema de Gestión de Calidad, referencias a procedimientos de sustento y una descripción de la interacción entre procesos de gestión de calidad. 2.3.3 CONTROL DE DOCUMENTOS Se deben establecer y mantener procedimientos para la identificación, recolección, indexación, registro, almacenamiento, retiro, archivo, mantenimiento y eliminación de documentos controlados, incluyendo documentos de origen externo que sean parte del Sistema de Gestión de Calidad. Se deben documentar, implementar y mantener procedimientos para el manejo y distribución de los excipientes. Asimismo, las organizaciones deben establecer controles formales relacionados con la aprobación, revisión y distribución de los procedimientos. Estos controles deben ofrecer garantías de que se está usando la versión vigente de un procedimiento en todas las áreas operativas y que se han eliminado o retirado las revisiones previas de los mismos. Todos los documentos y sus revisiones subsiguientes deben ser revisados por personal designado calificado antes de remitirlos a las áreas correspondientes. Los documentos que tengan influencia sobre la calidad de un producto deben ser revisados y aprobados por la unidad de calidad. Los documentos controlados pueden incluir un identificador único, fecha de emisión y número de revisión para facilitar la identificación del documento más reciente. Es indispensable identificar al departamento que tendrá la responsabilidad de emitir los documentos. Asimismo, se deben documentar las razones de los cambios y su fecha de implementación. La documentación electrónica debe cumplir con los requisitos establecidos anteriormente para el sistema de control de documentos. Se debe mantener un control sobre el uso de firmas electrónicas para que ofrezcan una seguridad equivalente a la provista por las firmas manuscritas. Además, puede ser necesario que los documentos y firmas en formato electrónico cumplan con requisitos reglamentarios locales. 2.3.4 CONTROL DE REGISTROS Y DATOS Se deben establecer y mantener procedimientos para la identificación, recolección, indexación, registro, archivo, mantenimiento y eliminación de registros y datos. Se deben mantener registros y datos para demostrar la consecución de la calidad requerida, así como registros de la operación efectiva del Sistema de Gestión de Calidad; además, ambos deben ser legibles y estar claramente vinculados con el producto o proceso relacionado. Asimismo, dichos registros deben incluir datos de calidad relevantes de las terceras partes contratadas. Las entradas de los registros y datos deben ser claras e indelebles; además deben ser ingresadas, firmadas y fechadas por la persona que lleva a cabo la actividad inmediatamente después de realizarla. Cualquier corrección efectuada a las entradas deberá estar firmada y fechada, manteniendo la entrada original legible y con una explicación del cambio, en especial cuando éste pudiera no ser evidente para los revisores subsiguientes. Los registros y datos deben mantenerse durante un periodo definido apropiado para el uso, fecha de reanálisis o de reevaluación del excipiente. Los registros y datos deben ser almacenados y conservados de modo tal que se facilite su recuperación y en instalaciones que proporcionen un ambiente adecuado para minimizar daños y deterioro. Los registros electrónicos y los sistemas automáticos de captura de datos deben cumplir con los requisitos de control de registros y datos mencionados con anterioridad. 2.3.5 CONTROL DE CAMBIOS Se deben establecer y mantener procedimientos para evaluar y aprobar todos los cambios, incluyendo por ejemplo, la evaluación del impacto que tendrán los cambios sobre la calidad del excipiente, cambios de: • Fabricantes de excipientes o proveedores de materiales de envase autorizados • Sitios de fabricación o envasado • Especificaciones del excipiente o del material de envase • Métodos de prueba y de laboratorio • Equipo de reenvasado, etiquetado y almacenamiento
1724 (1197) Buenas Prácticas de Distribución / Información General
USP 39
• Equipo analítico • Procesos de reenvasado, etiquetado y almacenamiento • Cambios en procesos y equipos en las instalaciones del fabricante original de excipientes (ver Guía sobre Cambios Significativos en Excipientes Farmacéuticos a Granel (1195)).
La responsabilidad y autoridad para la aprobación final de cualquier cambio debe recaer sobre un grupo de garantía de calidad independiente, el cual puede formar parte de otra unidad operativa tal como la unidad de asuntos reglamentarios o de investigación y desarrollo. Cuando corresponda, se debe notificar a clientes y autoridades reglamentarias (p.ej., aquéllas responsables de los archivos maestros del fármaco o certificados de aptitud de la Farmacopea Europea) sobre cualquier cambio significativo en los procedimientos de producción establecidos y en el control de procesos que pudieran afectar la calidad del excipiente. El fabricante original y los intermediarios posteriores (distribuidores y comerciantes) deben contar con convenios sobre control de cambios en excipientes en los que se defina el grado de responsabilidad de notificación por parte del fabricante original sobre los cambios antes descritos. Cada una de las partes dentro de la cadena de suministro que maneja el excipiente debe contar con convenios sobre control de cambios para asegurar que los cambios realizados por el fabricante original del excipiente sean comunicados al usuario final. Dichos convenios de control de cambios forman parte de los convenios contractuales generales entre las partes.
2.4 Quejas y Desviaciones Se deben documentar e investigar sistemáticamente las quejas de un cliente y la información sobre posibles defectos, basándose en un procedimiento escrito con responsabilidades asignadas, que describa las acciones a tomar y que incluya los criterios en los que se basa la decisión de retirar un producto del mercado. Las investigaciones deben conducirse formalmente y documentarse de manera oportuna para establecer si la queja es justificada, para identificar el origen o la razón de la queja (p.ej., el procedimiento de reenvasado, el proceso del fabricante original, entre otros), para identificar las causas raíz, para definir cualquier acción inicial y de seguimiento, así como el método de comunicación (p.ej., con el cliente, con el fabricante original del excipiente, con las autoridades, etc.). Los registros sobre quejas deben conservarse y someterse a evaluación regular para determinar tendencias, frecuencia y criticidad, a fin de identificar la necesidad de posibles acciones correctivas o preventivas. Las investigaciones deben identificar si el defecto informado se limita a una sola partida de material o si es necesario investigar otras partidas. Si otras partidas estuviesen implicadas, será necesario identificarlas y etiquetarlas de manera correspondiente (p.ej., "en cuarentena"). Después de investigar y evaluar la queja, se deberán tomar acciones de seguimiento apropiadas, según se requieran, las cuales podrían incluir el retiro del mercado (conforme a lo descrito en la Sección 2.5 Retiro del Mercado). Cualquier problema serio confirmado con respecto a la calidad del producto (p.ej., fabricación o envasado deficientes, o deterioro del producto) deberá ser comunicado a todas las partes de la cadena de suministro, desde el fabricante hasta los clientes en caso de que hayan recibido material con el mismo número de partida. Se debe implementar un proceso similar para el manejo de desviaciones y defectos en productos no identificados a través de las quejas de un cliente.
2.5 Retiro del Mercado Las partes implicadas en la cadena de suministro de excipientes deben contar con un sistema para retirar del mercado de manera inmediata cualquier material que sea o que se sospeche defectuoso. Asimismo, deberán implementar procedimientos escritos para gestionar el retiro oportuno del excipiente (recuperación) del mercado. Dichos procedimientos deben: • Describir la manera en que debe gestionarse el retiro del mercado (recuperación) basándose en el riesgo en cuestión • Describir un proceso de toma de decisiones con responsabilidades definidas • Definir las funciones implicadas en el proceso (p.ej., garantía de calidad, ventas, logística, gerencia ejecutiva, autoridades competentes, entre otras.) • Definir los procesos de comunicación y documentación entre las partes dentro de la cadena de suministro y con las autoridades reglamentarias • Definir los pasos necesarios para recuperar el material. Si el fabricante original del excipiente no es quien inicia un retiro del mercado, se le debe informar sobre el mismo. Las partes implicadas en la cadena de suministro deben contar con procedimientos escritos para la organización de cualquier actividad de retiro del mercado, los cuales deberán verificarse y actualizarse con regularidad. Todos los materiales retirados del mercado deberán almacenarse en un área segura y segregada (en cuarentena) hasta que se decida su eliminación. Ante situaciones serias o que pudieran atentar contra la vida, todos los clientes y autoridades competentes de todos los países en los que pudiera haberse distribuido el excipiente deberán ser inmediatamente notificados sobre la intención de retirar el excipiente del mercado. Todos los registros deberán estar a disposición de las personas designadas responsables del retiro del mercado. Estos registros deben contener suficiente información sobre los materiales provistos a los clientes (incluyendo materiales exportados). En intervalos regulares, los grupos de garantía de calidad en las organizaciones de la cadena de suministro deben evaluar la efectividad de los planes para el retiro del mercado.
USP 39
Información General/ (1197) Buenas Prácticas de Distribución 1725
2.6 Manejo de Materiales que No Cumplan con las Normas Los materiales que no cumplan con las normas deberán manejarse de acuerdo con un procedimiento que prevenga su introducción o reintroducción inadvertida en el mercado. Asimismo, se deben almacenar por separado, ya sea en un espacio físico distinto o bajo controles electrónicos, para prevenir su introducción inadvertida en el mercado. Las compañías que lleven a cabo los retiros del mercado deberán mantener registros que abarquen todas las actividades, incluyendo la destrucción, eliminación, devolución y reclasificación, y deben llevar a cabo una investigación para establecer si otras partidas también se vieron afectadas. Adicionalmente, deberán documentar la investigación y las acciones tomadas para prevenir la recurrencia del problema, además de tomar las acciones correctivas requeridas. Se deberá contar con procedimientos para la evaluación y eliminación posterior de productos que no cumplan con las normas, y documentar la eliminación del material, incluyendo su reducción de grado para otros propósitos adecuados. Los materiales que no cumplan con las normas no deberán mezclarse por ningún motivo con materiales que sí cumplan con las especificaciones.
2.7 Auditorías: Internas, Externas y de Terceros Para verificar el cumplimiento de los principios de las buenas prácticas de distribución de excipientes farmacéuticos, las compañías de la cadena de suministro de excipientes deben someterse a un programa regular de auditorías internas, de conformidad con procedimientos aprobados. Los integrantes deberán documentar los hallazgos de la auditoría y las acciones correctivas, además de asegurar que se pongan en conocimiento de los directivos responsables. Las acciones correctivas aceptadas deben ser llevadas a cabo y completadas de manera oportuna y efectiva por personas designadas y calificadas. Las personas calificadas pueden ser empleados de la compañía, pero deben estar suficientemente alejados de la función que se está auditando a fin de no comprometer su independencia. Las compañías deberán llevar a cabo auditorías externas de acuerdo con procedimientos y programas aprobados a fin de evaluar la capacidad de los proveedores para cumplir con los requisitos especificados de un producto o servicio. Responder un cuestionario se puede considerar como parte del proceso de auditoría, aunque generalmente no sustituye a una inspección en el sitio y no se debe considerar como sustituto de una auditoría requerida. Las auditorías de terceras partes pueden ser realizadas por organizaciones auditoras independientes a fin de determinar el nivel de conformidad y cumplimiento con las normas y reglamentos especificados (p.ej., buenas prácticas de fabricación, buenas prácticas de distribución e ISO).
2.8 Actividades Contractuales Cualquier actividad relacionada con las buenas prácticas de distribución que se delegue a un tercero debe convenirse por escrito mediante un contrato aprobado que defina claramente las responsabilidades. El contrato debe establecer con claridad la responsabilidad de cada una de las partes con respecto a cada una de las actividades de calidad aplicables. Antes de iniciar una relación contractual, el contratante debe evaluar el cumplimiento del contratista propuesto con las buenas prácticas de distribución conforme a lo descrito en este capítulo general. La evaluación debe incluir una auditoría incial y presencial de las instalaciones y del sistema de calidad del contratista, con especial énfasis en la prevención de la contaminación cruzada y el mantenimiento de la rastreabilidad. El contrato también debe incluir las responsabilidades del contratante con respecto a los medios para evitar el ingreso de material falsificado o adulterado en la cadena de distribución. No deberán existir brechas o lapsos sin explicación en relación con la aplicación de las buenas prácticas de distribución. El contratista debe auditar periódica y presencialmente las actividades de distribución contratadas con respecto a la aplicación de las buenas prácticas de distribución por parte del contratante. Se puede permitir la subcontratación en ciertas circunstancias, siempre que así lo apruebe el contratante original, en especial para actividades tales como muestreo, análisis, reenvasado y etiquetado. Cuando se opte por la subcontratación, el subcontratista debe cumplir con los mismos estándares de buenas prácticas de distribución que el contratante primario. Asimismo, el subcontratista debe permitir la realización de una auditoría presencial por parte de la unidad de calidad del contratista o su designado. 2 •3
2.9 Convenios de Calidad Los convenios de calidad son documentos legalmente vinculantes que se negocian por mutuo acuerdo entre las partes implicadas en la cadena de suministro de excipientes farmacéuticos. Los convenios de calidad identifican a la parte responsable de ciertas actividades de calidad y la forma en que las partes resolverán los asuntos relacionados con la calidad. Aunque su propósito es tratar los compromisos de calidad entre las partes, los convenios de calidad no están diseñados para sustituir a una auditoría.
OMS. Good Trade and Distribution Practices far Pharmaceutical Starting Materia/s (Buenas Prácticas de Comercialización y Distribución para Materiales de Partida Farmacéuticos). Ginebra; OMS: Technical Report Series (Informes Técnicos), Núm. 917, 2003, Anexo 2. Disponible en: •http://who.int/medicines/areas/ quality_safety/quality_assurance/GoodtradeDistributionPracticesTRS917Annex2.pdf?ua=1 {Consultado el 2 de marzo de 2015).e ERR (OJ.iun-20lS) 3 OMS. Finished Products: Good Distribution Practices far Pharmaceutica/ Products (Productos Terminados: Buenas Prácticas de Distribución para Productos Farmacéuticos). Ginebra; OMS: Technical Report Series (Informes Técnicos) 957, 201 O, Anexo 5. Disponible en: http://whqlibdoc.who.int/trs/WHO_TRS_957_eng.pdf (Consultado el 7 de julio de 2011 ). 2
1 726 (1197) Buenas Prácticas de Distribución / Información General
USP 39
Los proveedores deben establecer convenios de calidad entre ellos mismos y con las partes con las que establecerán relaciones comerciales. Los fabricantes originales de excipientes deben establecer convenios de calidad con sus clientes directos y con los distribuidores autorizados de sus productos. Por su parte, los distribuidores deben establecer convenios de calidad con los usuarios finales y demás partes de la cadena de suministro a las que provean productos. Todas las entidades de la cadena de suministro deberán conocer plenamente sus responsabilidades con respecto a las actividades de las buenas prácticas de distribución (según lo descrito en este capítulo) para cada etapa de la cadena de suministro. Los convenios de calidad deben tratar los requisitos de los sistemas de calidad, aunque no se pretende que mencionen todos los elementos de dichos sistemas. Cuando las partes llegan a un acuerdo general con respecto a la norma de calidad aplicable, no es necesario reiterar el acuerdo para cada punto del sistema de calidad. Los convenios de calidad deberán incluir responsabilidades con respecto a la calidad que requieran la acción de una o ambas partes que celebran el convenio. Un elemento clave que debe definirse en los convenios de calidad son las vías y plazos de comunicación de eventos relacionados con la calidad. Se deben definir claramente las responsabilidades de cada parte con respecto a la notificación de la siguiente parte en la cadena de suministro, así como a la notificación de las autoridades reglamentarias aplicables en el caso de un evento importante relacionado con la calidad. En muchas ocasiones, la decisión sobre quién deberá notificar a la autoridad reglamentaria requerirá un esfuerzo de colaboración entre las partes. Dependiendo del impacto de la situación, se podrá especificar en el convenio de calidad el plazo para dichas notificaciones con respecto al momento del incidente. Ambas partes que celebran el convenio serán responsables de garantizar la exactitud del convenio de calidad durante todo el tiempo que dure la relación comercial. Puede ser necesario efectuar revisiones a dicho documento para reflejar cambios reglamentarios, el suministro de nuevos productos o el surgimiento de un nuevo riesgo para los materiales. Las partes deben mantener un historial de las revisiones efectuadas al convenio de calidad.
Cambio en la redacción:
SECCIÓN 3: INSTALACIONES, ALMACENAMIENTO, REENVASADO V ESTABILIDAD 3.1 Edificios e Instalaciones Las organizaciones deberán establecer procedimientos operativos para el uso de edificios e instalaciones, incluidas las áreas que a continuación se discuten. Asimismo los integrantes deberán considerar medidas de protección para garantizar la seguridad de las instalaciones (p.ej, cercado o bardas perimetrales). El acceso a las áreas usadas para la fabricación, envasado y retención en los edificios e instalaciones usados para el almacenamiento y manejo de excipientes deberá permitirse únicamente al personal autorizado. Las organizaciones integrantes deberán tomar precauciones para prevenir el ingreso de personas no autorizadas a las áreas de acceso limitado. Cuando se requiera evitar el uso de excipientes debido a su estado (p.ej., cuarentena), las organizaciones integrantes deberán contar con controles de acceso limitado claramente marcados o deberán usar sistemas computarizados validados para evitar la distribución del material antes de que se apruebe su liberación. Los edificios deberán tener un tamaño y capacidad adecuados que permitan el flujo ordenado de materiales, el almacenamiento y manejo apropiado de materiales, y el control apropiado de las condiciones ambientales para el despacho final de los excipientes dentro y fuera de las instalaciones. Los edificios deberán mantenerse en buenas condiciones. Los materiales de construcción deberán ser fáciles de limpiar y mantener, mientras que el diseño de los edificios e instalaciones deberá prevenir la contaminación cruzada, el mezclado y confusión de productos o la acumulación de suciedad o materiales contaminantes, en particular cuando los excipientes estén expuestos al medio ambiente. Se deberá contar con espacios adecuados de almacenamiento para excipientes altamente sensibles o tóxicos, por lo que podrían ser necesarias instalaciones especiales para dicho propósito. Además, se deberá contar con procedimientos adecuados para garantizar la limpieza, el mantenimiento y el uso de los edificios e instalaciones. Las plataformas de recepción y despacho deberán estar diseñadas para proteger las instalaciones y excipientes durante la carga y descarga ante condiciones climáticas adversas. Se deberán diseñar y equipar diversas plataformas de ingreso a fin de permitir la limpieza de contenedores antes de su almacenamiento. Asimismo, se deberá contar con un sistema de control de plagas para garantizar que los materiales estén protegidos contra infestaciones de insectos, roedores, animales, aves u otras plagas. Además, se deberá contar con procedimientos escritos que definan la conservación y almacenamiento adecuados de los excipientes, incluyendo los procesos de control de plagas. Será necesario garantizar que los materiales usados para el control de plagas sean seguros y que no representen una causa de contaminación. El uso de pesticidas, insecticidas y rodenticidas deberá limitarse a productos aprobados y deberá ser documentado. Los excipientes que pudieran estar contaminados deberán mantenerse bajo control para evitar la contaminación cruzada en las áreas de contención o la diseminación de contaminación a otras áreas de la instalación.
3.2 Almacenes y Almacenamiento Se deberán describir mediante procedimientos escritos las actividades de recepción, almacenamiento, despacho y otras actividades del manejo de excipientes, así como las medidas de seguridad necesarias para prevenir robos de materiales o la introducción de materiales adulterados o falsificados en la cadena de suministro. Las edificaciones deberán contar con iluminación
USP 39
Información General/ (1197) Buenas Prácticas de Distribución 1 727
adecuada y servicios públicos apropiados para las actividades previstas. Asimismo, deberán mantenerse secas y en condiciones ambientales controladas y apropiadas. Las edificaciones e instalaciones deberán almacenar los excipientes en condiciones ambientales apropiadas. Todas las edificaciones usadas para contener excipientes deberán contar con almacenamiento a temperatura controlada y monitoreada, según se requiera. Las condiciones de almacenamiento y de los almacenes para excipientes deberán cumplir con las especificaciones de las monografías, conforme a lo indicado en la etiqueta del envase del excipiente. Cuando los excipientes requieran condiciones de almacenamiento específicas (p.ej., control de temperatura y humedad), dichas condiciones deberán proveerse de manera controlada y supervisada (p.ej., mediante un sistema de alarma o control manual), y se deberán mantener registros apropiados. Asimismo, se deberán validar todos los sistemas automatizados que se utilicen para el monitoreo de las condiciones ambientales en las áreas donde se manejan o almacenan excipientes. La ubicación de los dispositivos de monitoreo ambiental y las condiciones que monitorean deberán especificarse en un documento aprobado. La ubicación de dichos dispositivos o sondas deberá reflejar las condiciones ambientales extremas del entorno conforme se haya determinado mediante un ejercicio de mapeo ambiental. Los excipientes que presentan riesgos de seguridad tales como de incendio o de explosión deberán almacenarse en áreas seguras y especiales para dicho propósito. Los excipientes que son sensibles o tóxicos deberán mantenerse apropiadamente segregados, mientras que los almacenes y áreas de almacenamiento deberán limpiarse de manera rutinaria, someterse a mantenimiento adecuados y estar libres de plagas. Los excipientes deberán almacenarse de tal manera que se permita la limpieza del área de almacenamiento y la movilización de materiales. Las plataformas usadas para sostener materiales no deberán ser causa de contaminación y se deberán definir por escrito la calidad y materiales de construcción de las mismas. Las plataformas deberán mantenerse limpias y en buenas condiciones, y las organizaciones integrantes deberán mantener un rastreo apropiado de los insumos para asegurar el tratamiento adecuado de los materiales de madera. Cuando se utilicen, las plataformas de madera deberán cumplir con los requisitos de importación. Las organizaciones deberán contar con procedimientos escritos para garantizar que el suministro del excipiente se lleve a cabo dentro su periodo de caducidad o reanálisis y deberán mantener controles adecuados para prevenir la distribución de excipientes caducos. Cuando no sea aplicable una fecha de caducidad, se deberá usar el principio de primeras entradas-primeras salidas. Los excipientes rechazados y demás materiales relacionados con la calidad del excipiente (p.ej., los componentes de envase) deberán marcarse o identificarse como tales y se deberán usar controles como los de separación física o electrónica para prevenir su uso mientras se toma la decisión final sobre su eliminación. Durante la conservación en almacenes o el almacenamiento de excipientes, todos los envases rotos o dañados deberán retirarse del inventario utilizable y manejarse como materiales rechazados. Los materiales en cuarentena pendientes de decisión sobre su liberación deben marcarse o identificarse como tales (p.ej., electrónicamente) para prevenir su uso no autorizado. Estos materiales deben mantenerse fuera de uso y su eliminación final debe guiarse por procedimientos escritos. Se debe contar con procedimientos escritos para la limpieza de derrames a fin de garantizar la eliminación completa de cualquier riesgo de contaminación. 3.2.1 CONTROLES AMBIENTALES Cuando los excipientes requieran de condiciones de almacenamiento específicas para preservar su integridad y calidad durante el intervalo de reanálisis/reevaluación o caducidad, dichas condiciones de almacenamiento requeridas deberán estar indicadas en la etiqueta, en el etiquetado u otra documentación, p.ej., en el Paquete de Información sobre Excipientes (Excipient lnformation Package)4 o Certificado de Análisis. Los distribuidores deberán tomar como guía la información y los requisitos para controles ambientales provistos por el fabricante y mantener controles y monitoreo apropiados para garantizar mediante documentación apropiada el apego a las condiciones de almacenamiento declaradas. Asimismo, los distribuidores deberán mantener registros que indiquen que el excipiente se almacenó de acuerdo con las recomendaciones del fabricante y deberán llevar a cabo evaluaciones regulares para confirmar el cumplimiento de dichas condiciones designadas. Si el fabricante no indica condiciones de almacenamiento específicas, el distribuidor deberá garantizar condiciones de almacenamiento apropiadas para proteger el envase y el etiquetado. Las condiciones en los almacenes que no son posibles de controlar varían de acuerdo con la ubicación geográfica, particularmente con la latitud. Cuando el excipiente va a ser enviado a lugares cuya geografía presenta condiciones muy distintas a las condiciones usadas en el estudio de estabilidad o que tengan alguna justificación del fabricante para no requerir condiciones de almacenamiento especiales, podría ser necesario conducir estudios adicionales para demostrar la estabilidad en las nuevas condiciones. Se debe establecer un programa de monitoreo en los almacenes cuando se desconozcan los efectos de las nuevas condiciones ambientales. El almacenamiento de excipientes al aire libre (por ejemplo, materias a granel, materiales inflamables, ácidos u otras sustancias corrosivas) es aceptable siempre que los contenedores ofrezcan protección adecuada contra el deterioro o la contaminación de sus contenidos, que las etiquetas de identificación se mantengan legibles, que los puertos de descarga tengan cierres protectores adecuados, y que se limpie adecuadamente la parte exterior de los contenedores móviles antes de abrirlos y usarlos.
4
IPEC. The /PEC Excipient /nformation Package (EIP): Template and User Guide. Arlington, VA: IPEC; 2011. http://ipecamericas.org/ipec-store.
1728 (1197) Buenas Prácticas de Distribución/ Información General
USP 39
3.3 Equipo El equipo usado para transporte a granel, reenvasado, etiquetado, análisis o almacenamiento del excipiente deberá mantenerse en buenas condiciones y deberá tener un tamaño, construcción y ubicación adecuados que faciliten su limpieza, mantenimiento y operación correcta. El equipo deberá ser verificado antes de usarlo para asegurar que su construcción, instalación y funcionamiento se ajusten a lo requerido para el excipiente. Cuando el equipo se encuentre al aire libre, se deberá contar con controles adecuados (p.ej., sistemas cerrados o cubiertas protectoras) para minimizar riesgos ambientales que afecten la calidad del excipiente. Siempre que sea posible, el equipo que entra en contacto directo con el excipiente (p.ej., camiones de transporte a granel, equipo de envasado, tanques de almacenamiento, tuberías, mangueras y bombas) deberá usarse exclusivamente para dicho propósito. De lo contrario, se deben aplicar procedimientos validados de limpieza. Cuando se utilice equipo de transporte a granel que no sea exclusivo para dicho propósito, se deberá proveer a las compañías transportistas una lista de restricciones previa del cargamento. El equipo de medición crítico para la calidad y las balanzas para el manejo y análisis del excipiente deberán contar con la precisión y rangos adecuados e identificarse como tales. 3.3.1 CONSTRUCCIÓN DEL EQUIPO El equipo que entre en contacto con un excipiente debe estar construido de tal manera que sus superficies de contacto no sean reactivas, aditivas o absortivas y que, por consiguiente, no alteren la calidad del excipiente. De preferencia, las sustancias requeridas para la operación, tales como lubricantes o enfriadores, no deben entrar en contacto con excipientes y materiales de envase. Cuando exista posibilidad de contacto, los distribuidores deben usar materiales de calidad adecuada que no afecten la calidad del producto y justificar su selección. El equipo debe estar diseñado para minimizar la posibilidad de contaminación proveniente del entorno y del contacto directo con el operador durante actividades tales como descarga de camiones de transporte a granel, uso de mangueras de transferencia (en particular aquéllas usadas para transferir excipientes), muestreo, reenvasado y limpieza. Los distribuidores deben considerar el diseño sanitario del equipo que entra en contacto con excipientes. Asimismo, deben evaluar la aptitud y la integridad de los sellos para minimizar el riesgo de contaminación. Las tuberías deben marcarse adecuadamente indicando el contenido y la dirección del flujo. 3.3.2 MANTENIMIENTO DEL EQUIPO Se deben establecer y seguir procedimientos documentados para el mantenimiento de equipo crítico usado en el reenvasado, etiquetado, análisis o almacenamiento del excipiente. Los distribuidores deberán mantener registros (p.ej., bitácoras, bases de datos electrónicas u otra documentación apropiada) sobre el uso y mantenimiento del equipo crítico para la calidad. El equipo defectuoso debe ser retirado o marcado de manera apropiada para evitar su uso inadecuado. Se debe mantener un control programado sobre el equipo y las balanzas de medición críticos para la calidad, el cual debe incluir: • La calibración de instrumentos u otra verificación apropiada en intervalos adecuados, de acuerdo con un programa establecido y documentado • Establecimiento de los límites de exactitud y precisión del equipo • Disposiciones para acciones correctivas en caso de que no se cumplan los requisitos de exactitud o precisión. Los estándares de calibración deben ser rastreables hasta estándares nacionales o farmacopeicos reconocidos, según corresponda. No deben usarse instrumentos o equipos que no cumplan con las especificaciones establecidas; además, se debe llevar a cabo una investigación para determinar la validez de los resultados previos desde la última calibración exitosa. Se debe dar a conocer la calibración vigente o el estado de verificación del equipo crítico para la calidad a los usuarios, y dicha información debe ser verificable. 3.3.3 LIMPIEZA DEL EQUIPO La selección y uso de equipos de limpieza deberá realizarse de tal modo que no representen una fuente de contaminación. Los materiales de limpieza deberán ser adecuados para la tarea y se deberá justificar su elección. Cuando resulte apropiado, se deberá considerar la rotación entre agentes desinfectantes y de limpieza. Asimismo, se deberán establecer procedimientos escritos de limpieza para equipos que entren en contacto con el excipiente a fin de evitar la contaminación con productos de limpieza o productos previamente procesados en el equipo. Los procedimientos de limpieza deben ser lo suficientemente detallados para permitir que la limpieza se lleve a cabo de manera reproducible y efectiva. Se debe mantener un registro de los procesos de limpieza y desinfección, además de ofrecer evidencia de su efectividad, por ejemplo, mediante lo siguiente: • Análisis del enjuague final después de limpiar los residuos de productos previos • Verificación del equipo después de limpiar los residuos de productos previos • Análisis de cada partida para detectar residuos de productos previos manejados con el mismo equipo
USP 39
Información General/ (1197) Buenas Prácticas de Distribución 1 729
3.4 Muestreo, Reenvasado y Etiquetado A fin de minimizar los riesgos asociados con el reenvasado y el etiquetado, se deberán aplicar las buenas prácticas de fabricación apropiadas (ver Buenas Prácticas de Fabricación para Excipientes Farmacéuticos a Granel (1078)). Para una cobertura completa, a continuación se analizan diversas actividades claves y precauciones necesarias. 3.4.1 MEZCLADO, REENVASADO Y ETIQUETADO Las operaciones tales como la combinación de sublotes en una partida homogénea, el reenvasado o el etiquetado son procesos de fabricación y, por lo tanto, los distribuidores deben apegarse a las buenas prácticas de fabricación apropiadas (ver el capítulo (1078)): • Aquellos procesos en los que se abre el envase del excipiente y éste queda expuesto al entorno (por ejemplo, transferir un excipiente de un envase a otro, incluyendo la transferencia desde equipos para material a granel a tanques/silos de almacenamiento o desde tanques/silos de almacenamiento a envases) son etapas críticas del manejo relacionadas con la integridad del producto terminado. Cuando se modifique únicamente el envase secundario, los operadores deberán tomar las precauciones apropiadas para mantener la integridad del envase primario y del excipiente. • Los excipientes pueden degradarse debido a su exposición a la atmósfera de reenvasado (p.ej., oxígeno, humedad, luz y temperatura). •Además, los excipientes podrían contaminarse con materia extraña tal como lubricantes, materiales de limpieza u otras sustancias. • Mantener la transparencia con el cliente en relación con el reetiquetado, sin importar si se abrió o no el envase original del fabricante del excipiente, es crítico para demostrar la calidad y aptitud del producto para su uso. • Asimismo, mantener la transparencia con el cliente con respecto a las fuentes de datos citadas en la documentación de certificación (etiquetado), es crítico para demostrar la calidad y aptitud del producto para su uso. 3.4.2 REENVASADO Y ETIQUETADO DE PARTIDAS
El personal de la cadena de suministro de excipientes deberá prestar especial atención a los siguientes puntos: • Deberán definirse todos los requisitos de reenvasado y etiquetado mediante procedimientos escritos. • Deberá evitarse la contaminación, la contaminación cruzada y las confusiones de materiales mediante el uso de equipo, procedimientos de limpieza y etiquetado adecuados. • Deberán designarse condiciones ambientales y procedimientos de reenvasado para evitar la contaminación y mantener la integridad del excipiente durante procedimientos de reenvasado y etiquetado. • Los operadores deberán considerar el uso de aire filtrado en el área de reenvasado si fuera necesario para el producto y, en su caso, justificar el estándar de filtración. • La impresión de etiquetas deberá realizarse mediante un proceso controlado (ver la Sección 3.4.9 Reenvasado y Etiquetado). • El personal implicado en los procesos de reenvasado deberá utilizar vestimentas protectoras limpias tales como cubiertas para cabeza, rostro, manos y brazos, según se requieran, y deberá practicar una higiene personal adecuada (p.ej., desinfección de manos de acuerdo con los requisitos de salubridad, monitoreo de la salud y retiro de joyería). El personal deberá recibir capacitación con respecto a los requisitos especiales de higiene, la cual deberá documentarse. • Las áreas de reenvasado deben limpiarse y desinfectarse de manera regular. Los números de partida deberán asignarse de acuerdo a procedimientos documentados. Al momento de asignar nuevos números de partida, el personal deberá asegurarse de que existe documentación adecuada que permita el rastreo hasta los números de partida originales. Asignar un número de partida a envases de partidas diferentes que cumplen con la misma especificación es una práctica inaceptable (ver también las Secciones 3.4.3 Homogeneidad de la Partida del Excipiente y 3.4.4 Excipientes Mezclados). • Se deberá conservar como parte del registro de partida una copia de la información que aparece en las etiquetas originales (p.ej., una fotocopia). Asimismo, se deberá mantener una muestra de la nueva etiqueta. •Todos los procesos de reenvasado y etiquetado deberán llevarse a cabo de modo que se evite el mezclado, la contaminación y la confusión de materiales, para asegurar una rastreabilidad total de los excipientes hasta el fabricante original de los mismos y la rastreabilidad subsiguiente hasta el usuario final. El personal responsable deberá mantener registros suficientes de cada etapa completada, junto con el nombre del operador, así como la fecha y la hora de culminación de cada etapa, p.ej., en el registro maestro de fabricación de partida o mediante sistemas computarizados. 3.4.3 HOMOGENEIDAD DE LA PARTIDA DEL EXCIPIENTE El proceso de mezclado para formar una partida homogénea es una etapa de fabricación y deberá definirse mediante un procedimiento escrito. Una partida podrá considerarse homogénea únicamente cuando los materiales que la conforman hayan sido minuciosamente mezclados. Antes de agregar cada partida, deberá confirmarse que cumple con las especificaciones. El
1730 (1197) Buenas Prácticas de Distribución / Información General
USP 39
mezclado deberá estar controlado en todo momento, y se deberá verificar y documentar la homogeneidad (ver Buenas Prácticas de Fabricación para Excipientes Farmacéuticos a Granel (1078)). El mezclado de partidas o lotes de excipientes, que individualmente no cumplen con las especificaciones, con otros lotes que sí cumplen (en un intento de reusar u ocultar material caduco o adulterado) es una práctica inaceptable. Únicamente se pueden mezclar excipientes provenientes del mismo sitio de fabricación recibidos por un distribuidor y que cumplan con las mismas especificaciones. Se deberá informar al cliente que el material provisto es una mezcla de las partidas del fabricante. 3.4.4 EXCIPIENTES MEZCLADOS Se deberá verificar el proceso de mezclado a fin de asegurar que no tenga influencia alguna sobre la calidad del excipiente. El excipiente mezclado deberá analizarse para garantizar que cumple con la especificación y para proporcionar datos para el Certificado de Análisis (ver Guía sobre Cambios Significativos en Excipientes Farmacéuticos a Granel (1195)). Ante ciertas circunstancias y basándose en controles apropiados, se pueden utilizar Certificados de Cumplimiento siempre que los fundamentos de la declaración de cumplimiento puedan rastrearse dentro del documento. La partida mezclada referida en el nuevo documento de certificación debe ser rastreable hasta los documentos de certificación y número de partida originales (ver el capítulo (1078)). 3.4.5 CERTIFICADOS DE ANÁLISIS Deberá conservarse el Certificado de Análisis del fabricante original del excipiente y ponerlo a disposición del cliente cuando así lo solicite. La partida referida en el Certificado de Análisis entregado al usuario final deberá ser rastreable hasta el Certificado de Análisis del fabricante original del excipiente. Los documentos de calidad adjuntos a las entregas deberán estar sujetos a un convenio entre el distribuidor y el cliente final. En lo que respecta al reanálisis, se deberán aplicar los métodos analíticos del fabricante original del excipiente o métodos farmacopeicos. En caso de que se apliquen otros métodos, éstos deberán ser convenidos por ambas partes. 3.4.6 SISTEMAS DE ENVASE-CIERRE En lo que respecta al material reenvasado, el reenvasador es responsable de justificar la vida útil y las condiciones de reenvasado. El fabricante original y el distribuidor deberán compartir información y convenir las condiciones de reenvasado, así como los materiales de envase primario. Además, deberán establecer el material del sistema de envase-cierre primario y las especificaciones de configuración de envasado, y deberán desarrollar un procedimiento escrito que defina claramente el envasado para cada excipiente individual basándose en su estabilidad. Cuando en el reenvasado se utilicen los mismos tipos de sistema de envase-cierre primario y configuración de envasado, entonces el nuevo sistema de envase-cierre y la configuración de envasado deberán ser equivalentes a los empleados por el fabricante original del excipiente. El reenvasador y el distribuidor deberán tomar en consideración la exposición del excipiente al entorno de reenvasado, y ambos podrán basarse en la evaluación de estabilidad del fabricante y, por consiguiente, asignar la misma vida útil para el excipiente. Cuando la configuración de envasado del sistema de envase-cierre primario del reenvasador presente diferencias importantes con respecto a la del fabricante original [p.ej., en términos de desecantes, permeabilidad de la capa de la barrera protectora (que puede ser tanto el sistema de envase-cierre primario como secundario), o la cámara gaseosa], el reenvasador deberá demostrar que el nuevo sistema es adecuado para proteger el excipiente de la contaminación y el deterioro durante la vida útil (periodo de reanálisis o de caducidad) definida por el fabricante del excipiente. De otro modo, no podrá transferirse la vida útil definida por el fabricante original al material reenvasado. Se deberá confirmar la necesidad de llevar a cabo estudios de estabilidad (ver las Secciones 3.4. 14 Estabilidad y Fechas de Caducidad, y 3.5 Reanálisis y Vida Útil). El sistema de envase-cierre para el excipiente farmacéutico deberá proteger al material desde el momento del envasado hasta su uso final por parte del fabricante del producto farmacéutico. El diseño del sistema de envase-cierre deberá ayudar a prevenir el robo o la adulteración mediante falsificación. Los procedimientos de manejo y almacenamiento deberán proteger envases y cierres, y minimizar el riesgo de contaminación, daño o deterioro y confusiones (p.ej., entre envases que tengan diferentes especificaciones pero apariencias similares). 3.4.7 DEVOLUCIÓN Y REUTILIZACIÓN DE ENVASES Los envases devueltos pueden tener residuos desconocidos derivados de usos distintos al propósito original. Por lo tanto, se recomienda utilizar envases nuevos para los excipientes. Cuando se reutilicen envases, se deberá justificar y documentar el grado de limpieza para excipientes específicos y para diferentes tipos de envases. Los reenvasadores deberán recabar pruebas para demostrar que la calidad del material envasado no haya sido afectada por la reutilización de envases. Los distribuidores y clientes deberán establecer un acuerdo en el que se definan las condiciones específicas de reutilización (p.ej., manejo, sellado y limpieza). Si se van a reutilizar envases retornables de excipientes, todos los etiquetados previos deberán ser retirados o eliminados por completo.
USP 39
Información General/ (1197) Buenas Prácticas de Distribución 1731
3.4.8 CONTROLES AMBIENTALES Los controles ambientales deberán asegurar que la temperatura, humedad y limpieza del aire y del equipo sean adecuados para evitar cualquier contaminación o deterioro del excipiente. Asimismo, se deberán definir las condiciones ambientales necesarias para el reenvasado de cada excipiente. El control ambiental es un tema para especialistas por lo que se deberán consultar expertos en la materia (ver también la Sección 2.6 Manejo de Materiales que No Cumplan con las Normas). 3.4.9 REENVASADO Y ETIQUETADO Los reenvasadores deberán implementar procedimientos para garantizar la impresión y emisión de la cantidad correcta de etiquetas y que éstas contengan la información necesaria. Se deberá contar con suficientes verificaciones cruzadas para garantizar la transferencia apropiada de datos. Además, se deberá contar con procedimientos para evitar el rotulado incorrecto y se deberá restringir la impresión y el uso de las etiquetas. Resulta igualmente necesario registrar todas las operaciones de etiquetado (p.ej., generación, impresión, almacenamiento, uso y destrucción). Los envases etiquetados deberán someterse a inspecciones y se deberá destruir cualquier excedente de etiquetas para evitar usos incorrectos. Cuando las etiquetas no se impriman inmediatamente antes de cada operación específica de etiquetado, se deberá controlar la seguridad del inventario de etiquetas, además de definir límites de acceso. Las instalaciones de reenvasado y etiquetado deberán ser inspeccionadas inmediatamente antes de su uso para garantizar el retiro de cualquier material no requerido para la siguiente operación de reenvasado. 3.4.1 O DOCUMENTACIÓN ADJUNTA PARA LOS EXCIPIENTES REENVASADOS Las entregas de excipientes reenvasados deberán acompañarse de información acerca del sitio de fabricación original (nombre y dirección) y de los sitios de reenvasado y etiquetado. Dicha información debe proveerse en la documentación de certificación del proveedor (p.ej. Certificados de Análisis), o por otros medios (ver la Sección 4.8 Rastreabilidad). El proveedor debe suministrar dicha información al cliente mediante comunicados oficiales. 3.4.11 ANÁLISIS DE EXCIPIENTES REENVASADOS Se deberá realizar el análisis apropiado de los excipientes reenvasados para demostrar la calidad uniforme de los mismos. En ocasiones, podría no ser necesario realizar el análisis completo descrito en una monografía, pero el receptor deberá analizar los parámetros de calidad claves que pudieran verse afectados por el proceso de reenvasado. Los receptores deberán tomar en consideración las recomendaciones del fabricante sobre parámetros de calidad claves, y mantener en cuarentena los materiales reenvasados e identificarlos como tales hasta que se hayan llevado a cabo dichos análisis. Los materiales deberán cumplir con las especificaciones definidas antes de ser liberados para su distribución. El análisis y la liberación de excipientes deberán realizarse bajo la responsabilidad de la unidad de calidad y deberán cumplir con especificaciones y requisitos de prueba analíticos escritos. Los reenvasadores deberán asegurarse de que se mantenga un registro de los datos de análisis y que éstos sean evaluados antes de la liberación del excipiente reenvasado o transferido. No se podrá elevar la categoría del excipiente como resultado de un proceso de reenvasado. Resulta inaceptable elevar la categoría de grados no farmacéuticos a grados farmacéuticos basándose en resultados analíticos satisfactorios, es decir, mediante análisis contra normas farmacopeicas. Los grados farmacéuticos únicamente pueden lograrse cuando la producción original del excipiente y su procesamiento subsiguiente se realicen de conformidad con las buenas prácticas de fabricación (ver Buenas Prácticas de Fabricación para Excipientes Farmacéuticos a Granel (1078)).
3.4.12 MÉTODOS FARMACOPEICOS OFICIALES PARA REANÁLISIS El control de parámetros claves durante el reenvasado o reanálisis completo de excipientes deberá realizarse a través de métodos farmacopeicos oficiales o métodos validados contra métodos farmacopeicos. De otro modo, los reenvasadores deberán usar los métodos analíticos del fabricante original. Los métodos usados deberán citarse en el Certificado de Análisis adjunto al excipiente o se deberán poner a disposición del cliente mediante otra documentación. Asimismo, dichos documentos deberán incluir referencias sobre cualquier laboratorio contratista utilizado para realizar los análisis. El Certificado de Análisis debe identificar claramente las pruebas que no hayan sido aplicadas a la partida reenvasada o transferida, pero que se hayan tomado del Certificado de Análisis del fabricante original. 3.4.13 MUESTREO El muestreo de excipientes deberá llevarse a cabo de tal modo que prevenga la contaminación y se deberán utilizar áreas de muestreo exclusivas para dicho propósito que cuenten con controles ambientales apropiados. Se deberán designar áreas de muestreo en las que se permita la limpieza del exterior del envase antes de abrirlo. Asimismo, se deberá contar con procedimientos de limpieza adecuados para las áreas de muestreo. Las herramientas de muestreo deberán ser específicas para el mate-
1 732 (1197) Buenas Prácticas de Distribución / Información General
USP 39
rial y de uso exclusivo en el área de muestreo; de otro modo, será necesario validar la limpieza de las herramientas de muestreo para garantizar la ausencia de contaminación cruzada proveniente de las herramientas. Todos los envases que sean abiertos para muestreo deberán marcarse con la fecha y el nombre de la persona que realiza dicha operación, además de registrar la cantidad de muestra extraída. Cuando los excipientes sean reenvasados, procesados o envasados a partir de su presentación a granel, deberán conservarse muestras representativas de la partida de excipiente durante al menos un año después de la fecha de caducidad o reevaluación, o durante al menos un año después de haberse completado su distribución, lo que abarque mayor tiempo. El tamaño mínimo de la muestra deberá basarse en la cantidad requerida para llevar a cabo al menos dos análisis completos. Las condiciones de almacenamiento de la muestra deberán prevenir cualquier contaminación o deterioro; además deberán cumplir con las condiciones de almacenamiento indicadas en la etiqueta (ver el capítulo de información general, Procedimientos de Muestreo de Polvos a Granel (1097)). 3.4.14 ESTABILIDAD Y FECHAS DE CADUCIDAD El fabricante original es el responsable primario de la estabilidad y el fechado de caducidad de los excipientes. Al momento de abrir el envase del fabricante original, el reenvasador asume la responsabilidad de probar que la estabilidad y el fechado de caducidad fijados por el fabricante original siguen siendo aplicables. La estabilidad y la vida útil (periodo de reanálisis o de caducidad) deberán tomarse en cuenta cuando un distribuidor reenvase o transfiera un excipiente a otro envase. Asimismo, se deben tomar en cuenta el tipo de envase, los materiales del envase primario, los materiales del envase de protección, la configuración del envasado, la exposición ambiental durante el reenvasado y las condiciones de almacenamiento en el sitio de reenvasado al momento de definir la vida útil (periodo de reanálisis o de caducidad). La fecha de caducidad recomendada por el fabricante original no debe extenderse sin haber demostrado una estabilidad suficiente para justificar la extensión de la vida útil (periodo de reanálisis o de caducidad). Cuando la vida útil se extienda más allá de la recomendada por el fabricante original, se deberán definir claramente el tipo de empaque, las condiciones de almacenamiento y los datos analíticos que indiquen la estabilidad; y el renvasador asumirá la responsabilidad primaria de dicha extensión. Cuando se requieran condiciones especiales de almacenamiento (p.ej., gas inerte superpuesto, protección de la luz, del calor, de la humedad, etc.), deberán indicarse todas las restricciones en el nuevo etiquetado (ver la Sección 3.5 Reanálisis y Vida Útil).
3.5 Reanálisis y Vida Útil Se deberá conservar la vida útil o el intervalo de reanálisis/reevaluación del excipiente indicado por la organización. Las fechas de caducidad o vida útil indican el periodo después del cual un excipiente no debe ser usado o distribuido. Los intervalos de reanálisis/reevaluación indican el periodo posterior al cual se debe evaluar el excipiente para determinar su aptitud continua de uso. La fecha de caducidad/vida útil provista por el fabricante original no debe extenderse sin contar con documentación proveniente del fabricante que demuestre una estabilidad suficiente para justificar dicha extensión. Esta documentación deberá especificar el tipo de envase y las condiciones de almacenamiento necesarias para justificar la extensión, y el distribuidor deberá contar con documentación en la que se indique que el excipiente fue almacenado en el envase indicado y en las condiciones necesarias. Los excipientes sin fechas de caducidad, reanálisis, reevaluación o vida útil se deberán aceptar para su uso únicamente cuando sea posible comprobar la fecha de fabricación y sólo si el excipiente ha sido conservado y transportado en condiciones que cumplan con los estándares apropiados de buenas prácticas de fabricación o buenas prácticas de distribución. La distribución del excipiente después del periodo de reanálisis/reevaluación deberá realizarse únicamente con el asesoramiento del fabricante y con la autorización del comprador o receptor. El distribuidor podrá llevar a cabo dicha evaluación sólo cuando cuente con la capacidad de realizar muestreos y de llevar a cabo la evaluación especificada por el fabricante. Los lotes muestreados deberán colocarse en cuarentena para prevenir su envío durante la evaluación. Los distribuidores que cuenten con la capacidad de realizar muestreos de acuerdo con las instrucciones del fabricante, pero que no tengan la capacidad de llevar a cabo análisis o evaluaciones, deberán enviar las muestras al fabricante o a un laboratorio contratista calificado para su reanálisis/reevaluación. Los lotes de excipientes que cumplan con los criterios del fabricante podrán ser liberados de la cuarentena, y los datos de evaluación de sustento del distribuidor deberán acompañarse de los datos del fabricante original del excipiente para indicar la aptitud de uso del excipiente. Si el distribuidor no tiene la capacidad de realizar muestreos o de evaluar el excipiente, éste no deberá enviarse a los consumidores después de terminado el intervalo de reanálisis/reevaluación. Se puede devolver el excipiente o una muestra representativa del mismo al fabricante o a un tercero para que efectúe el reanálisis/reevaluación. El distribuidor podrá conservar el excipiente en espera de los resultados pendientes adicionales que se obtengan de la muestra representativa. Cuando el distribuidor reenvase o transfiera el excipiente a otro envase, deberá llevar a cabo una evaluación de la estabilidad del excipiente para determinar si la información del fabricante original del excipiente puede continuar siendo usada. Cuando el distribuidor utilice el mismo tipo de material de envasado que ofrezca el mismo ambiente de envasado (cámara gaseosa, área superficial, hermeticidad del cierre, etc.) que el usado por el fabricante original; y si la transferencia o reenvasado se lleva a cabo de modo tal que se proteja al excipiente de eventos ambientales adversos que pudieran afectar su estabilidad, entonces
USP 39
Información General/ (1197) Buenas Prácticas de Distribución 1 733
se podrá seguir usando la fecha de vida útil/caducidad o el intervalo de reanálisis/reevaluación del fabricante original del excipiente. Cuando el material de envase primario o del empaque protector difiera del material de envase primario del fabricante original del excipiente, o cuando el ambiente de envasado varíe significativamente, se deberá llevar a cabo una evaluación del envase y de su sistema de cierre para demostrar que son adecuados para proteger el excipiente del deterioro y la contaminación durante su periodo de vida útil/hasta su fecha de caducidad, o durante su intervalo de reanálisis/reevaluación. De otro modo, se requerirá una evaluación de estabilidad para determinar la vida útil/fecha de caducidad o intervalo de reanálisis/ reevaluación apropiados para el excipiente reenvasado. Dichas evaluaciones deberán llevarse a cabo de conformidad con las especificaciones y métodos de prueba del fabricante.
3.6 Fechas de Caducidad No todos los excipientes cuentan con una fecha de caducidad; sin embargo, cuando se les asigna una, ésta deberá presentarse en el envase e indicar el periodo durante el cual se espera que el excipiente se mantenga dentro de las especificaciones si se almacena correctamente, y posterior al cual ya no debería usarse. La fecha de caducidad se establece para cada partida sumando la vida útil a la fecha de inicio de la fabricación. La fecha de caducidad se basa en el tipo de envase y en las condiciones de almacenamiento, por lo que dichos parámetros deberán definirse con claridad. Cuando se requieran condiciones de almacenamiento especiales (p.ej., protección de la luz, oxígeno, calor, humedad, etc.), éstas deberán indicarse en el etiquetado puesto que pueden influenciar la capacidad de uso hasta la fecha de caducidad.s Las fechas de caducidad para excipientes deberán establecerse mediante pruebas de estabilidad documentadas o datos de estabilidad a largo plazo (ver •Espeétr95c;opfa de Resonancia MagnétfcaNudéar(761)• wm:rnay-2016>). En ciertas ocasiones, la fecha de caducidad podrá establecerse mediante referencia a datos históricos. La estabilidad no sólo implica requisitos farmacopeicos sino también cambios en las propiedades de desempeño. Las pruebas de estabilidad de excipientes deberán determinar la posibilidad de degradación, cambios en el peso y la distribución molecular, captación o pérdida de humedad, cambios en la viscosidad, contaminación microbiológica u otros posibles cambios en los excipientes cuando éstos se almacenan en un tipo específico de envase-cierre en determinadas condiciones de almacenamiento. La discusión sobre estabilidad para excipientes reenvasados se encuentra disponible en la Sección 3.5. Reanálisis y Vida Útil.
3.7 Etiquetas, Iconos y Etiquetado 3.7.1 ETIQUETAS E ICONOS Los sistemas y procesos para generar etiquetas deberán ser seguros, y contar con controles y documentación adecuados. Se deberán mantener registros apropiados de verificación y cada envase habrá de identificarse y etiquetarse adecuadamente. Las etiquetas aplicadas a envases pequeños individuales deberán ser claras, concisas y mantener permanentemente el formato establecido por la compañía. La información de la etiqueta debe ser indeleble. Se pueden usar métodos alternativos para envases/transporte a granel, los cuales deberán estar justificados. La etiqueta puede incluir texto o iconos para resaltar requisitos de almacenamiento y transporte, y riesgos (p.ej., evitar caídas, mantener condiciones ambientales específicas, etc.). Se recomienda el uso de símbolo reconocidos por organizaciones internacionales (ver •8tumqsfrác;tícasd~Alma:cenamientoyOlstribuc{óp.pqraMedfr:amentos(l079)• (AFoi-inay- 2016)). Además, durante la distribución internacional, se deberán emplear los idiomas adecuados para asegurar que el personal que maneje los materiales entienda los requisitos establecidos en la etiqueta. 3.7.2 ETIQUETADO El etiquetado (que incluye la etiqueta y cualquier documento adjunto) debe incluir al menos la siguiente información: • nombre del excipiente, incluyendo el grado y la referencia farmacopeica, según corresponda; • si es aplicable, la Denominación Común Internacional; • cantidad (peso o volumen); • número de partida asignado por el fabricante original del excipiente o número de partida asignado por el reenvasador, si el material ha sido reenvasado y reetiquetado; •fecha de reanálisis o de caducidad (según corresponda); •todas las condiciones de almacenamiento especificadas, según corresponda; • precauciones para el manejo, cuando resulte necesario; •identificación del sitio del fabricante original conforme a lo convenido con el cliente farmacéutico (ver la Sección 4.8 Ras-
treabilidad); • nombre e información de contacto detallada de los proveedores.
5 IPEC.
2011).
The IPEC Excipient Stability Program Cuide 201 O. Arlington, VA: IPEC; 201 O. Disponible en: http://ipecamericas.org/ipec-store (Consultado el 12 de julio de
1734 (1197) Buenas Prácticas de Distribución / Información General
USP 39
Cambio en la redacción:
SECCIÓN 4: BIENES DEVUELTOS, DESPACHO, TRANSPORTE, IMPORTACIÓN, ADULTERACIÓN V RASTREABILIDAD 4.1 Devolución de Bienes 4.1 .1 INFORMACIÓN GENERAL Las devoluciones de bienes a los proveedores por parte de los usuarios deben revisarse caso por paso. El distribuidor debe facilitar un análisis de la causa raíz y una investigación de las quejas. NOTA: Los usuarios deben documentar las razones de la devolución de los bienes al proveedor. Antes de devolver los bienes, si el usuario identifica y confirma que la calidad del producto es inaceptable, deberá proporcionar al proveedor documentación de sustento que puede incluir, entre otros, pruebas y resultados de la investigación. Si así se le solicita, el usuario deberá proveer también muestras del producto usado para pruebas e investigaciones. El proveedor debe recibir la oportunidad de realizar investigaciones minuciosas para confirmar la validez de la queja del usuario sobre la calidad. Mientras la investigación está en curso, el usuario deberá colocar el material en cuarentena de acuerdo con los procedimientos operativos estándar internos, y almacenar el material en un área específicamente designada para devoluciones, con acceso limitado a operaciones y bien separado de las materias primas de ingreso o liberadas. Los bienes devueltos por el usuario por razón de un exceso de inventario u otras causas no relacionadas con la calidad podrán reingresarse al mercado dentro de la vida útil especificada, siempre y cuando el proveedor haya revisado minuciosamente las condiciones de almacenamiento, transporte y la integridad del envase, y que la calidad del excipiente no se haya comprometido de manera alguna. Se deberá realizar una revisión formal documentada de cada envase devuelto y del dispositivo que evidencia la alteración intencional del envase para verificar que estos concuerden con la configuración presentada por el envase al momento de su egreso de la instalación del proveedor. Si el usuario abre un envase comercial para muestreo o investigación (esté o no relacionado con cuestiones de calidad), dicho envase deberá marcarse claramente como Abierto, independientemente de si se extrajo o no material del envase. Se deberá proporcionar documentación escrita al proveedor que confirme la apertura del envase y su posterior sellado de acuerdo con las buenas prácticas de fabricación y que describa las razones de dicha apertura, la cantidad retirada y la forma en que se volvió a sellar el empaque/envase. La documentación sobre bienes devueltos deberá incluir una descripción detallada de todos los eventos, incluyendo el reenvasado. Los envases de excipientes devueltos que hayan sido abiertos por el usuario deberán identificarse claramente como tales y no podrán liberarse como excipientes farmacéuticos. En casos excepcionales, se podrá liberar el material como producto de grado de excipiente, siempre que se demuestre la ausencia de riesgos de contaminación o deterioro mediante una exhaustiva investigación documentada. El departamento de calidad deberá ser el encargado de liberar dicho material. Tanto usuarios como proveedores deberán mantener registros de todos los bienes devueltos que incluyan el nombre del producto (nombre comercial y nombre químico), número de partida o lote, razón de la devolución, cantidad devuelta y documentación sobre la investigación, cuando corresponda. Asimismo, el proveedor deberá mantener un registro sobre la eliminación final del material. Cuando los excipientes devueltos hayan sido conservados, almacenados o enviados en condiciones que pudiesen haber comprometido la calidad del producto (incluidos ingredientes, envases o etiquetado), el fabricante deberá destruirlos. A manera de excepción, los fabricantes podrán liberar los excipientes cuando sus exámenes, análisis e investigaciones demuestren que el material cumple con los estándares adecuados de identidad, calidad y pureza y que no se han puesto en riesgo las buenas prácticas de fabricación ni las buenas prácticas de distribución. 4.1.2 ELIMINACIÓN DE BIENES DEVUELTOS La unidad de calidad del fabricante y/o proveedor del excipiente debe evaluar los productos devueltos. Las opciones disponibles son: • reingreso al mercado • reprocesamiento • reasignación del grado a un estándar menos estricto tal como grado técnico o industrial (no aprobado para su uso por las buenas prácticas de fabricación) • destrucción Sólo podrán considerarse para reingreso al mercado sin necesidad de acciones adicionales aquellos envases que no hayan sido abiertos. Cuando la evaluación de calidad de los bienes devueltos conlleve su destrucción final y cuando exista la posibilidad de que otras partidas relacionadas estén implicadas, se deberá realizar y documentar una investigación adecuada para demostrar que la calidad de las partidas relacionadas no se ha visto afectada.
USP 39
Información General/ (1197) Buenas Prácticas de Distribución 1 735
4.1.3 REPROCESAMIENTO El reprocesamiento es una etapa de fabricación, por lo que se aplican los requisitos del capítulo Buenas Prácticas de Fabricación para Excipientes Farmacéuticos a Granel (l 078). Los requisitos del capítulo (l 078) se aplican únicamente a aquellas entidades intermedias de la cadena de suministro que se dedican al reprocesamiento.
4.2 Envío y Transporte 4.2.1 ENVÍO El proveedor (el fabricante o el distribuidor) de excipientes farmacéuticos deberá asegurar que las condiciones de almacenamiento y transporte apropiadas descritas en el etiquetado del producto mantengan la integridad del excipiente farmacéutico. Después de la capacitación, el personal deberá seguir los procedimientos escritos para el envío de excipientes farmacéuticos. Dichos procedimientos incluyen cumplir con las condiciones recomendadas de almacenamiento y transporte, incluyendo la temperatura, humedad u otras precauciones de manejo especiales. Todas las acciones deben documentarse al momento de su realización. Los registros de envío de excipientes farmacéuticos deberán proveer la siguiente información: • fecha de envío • nombre y dirección de la entidad que acepta los materiales para transporte • modo de transporte • nombre, dirección y estado del consignatario • nombre del material • cantidad enviada • número de partida y fecha de caducidad • condiciones requeridas de almacenamiento y transporte (temperaturas de refrigeración, congelación o ambiente controlada requeridas) • código de envío o número de identificación de la orden de entrega Cuando se presenten acciones reglamentarias tales como Alertas de Campo de la FDA (FDA Field Alerts) o retiro de productos farmacéuticos del mercado, la entidad que maneja el excipiente deberá estar preparada para actuar de inmediato. Se deberá contar con suficiente documentación de envío para permitir el manejo adecuado de cualquier excipiente asociado con la acción reglamentaria. Siempre que resulte razonable, se deberá documentar el programa de envío de excipientes y enumerar las responsabilidades en un convenio de calidad o de cooperación celebrado entre las entidades para indicar la titularidad en la cadena de suministro (Entidad A a Entidad B; Entidad B a Entidad C; etc.-ver la Sección 4.4 Envase: Sellos que Evidencian Alteración Intencional). Los edificios e instalaciones usadas para enviar materiales deberán ser apropiados para su uso pretendido con respecto al almacenamiento y manejo de excipientes (ver la Sección 3.1 Edificios e Instalaciones). Antes de cargar los materiales, los transportistas deberán inspeccionar el contenedor y el vehículo para asegurar la limpieza, además de otras cargas consignadas (cuando el envío se incluya como parte de una carga) para garantizar que no se produzca ningún riesgo de contaminación. Dicha inspección deberá documentarse de acuerdo con un procedimiento escrito. Los materiales no deberán descargarse en otros contenedores o vehículos sin el consentimiento escrito del titular del material o su consignatario. 4.2.2 TRANSPORTE El modo de transporte de los materiales deberá asegurar que se mantengan las condiciones controladas especificadas por el fabricante. El proceso de transporte no deberá afectar de manera negativa a los materiales ni a la integridad del envase. Se deberá suministrar al proveedor de servicios de transporte la información requerida para mantener las condiciones especificadas. El fabricante o proveedor del excipiente farmacéutico deberán convenir con el comprador los detalles del transporte. La necesidad de almacenamiento y transporte en condiciones de temperatura controlada debe determinarse usando un enfoque basado en riesgos, tomando en cuenta las características del excipiente, los resultados de las evaluaciones de estabilidad provistas por el fabricante o reenvasador del excipiente, la cadena de suministro y los riesgos potenciales para el excipiente. Cuando se contrate transporte con temperatura controlada, el transportista deberá contar con un mecanismo para detectar e informar sobre cualquier desviación de la temperatura. En caso necesario el etiquetado de los envases y los documentos de transporte deberán indicar detalladamente las condiciones ambientales de un modo tal que el transportista o el receptor reciba información e identifique inmediatamente dichas condiciones. La responsabilidad de garantizar que se cumplan las condiciones apropiadas de almacenamiento recae en cada entidad que maneja, almacena o transporta los materiales. El modo de almacenamiento y transporte de excipientes farmacéuticos deberá conservar la identidad e integridad del material, además de evitar que el material contamine y se contamine con otros materiales, y garantizar que se tomen las precauciones adecuadas contra derrames, ruptura, malversación y robo. Asimismo, se deberán mantener las condiciones requeridas de almacenamiento para los excipientes farmacéuticos dentro de los límites aceptables durante el transporte.
1 736 (1197) Buenas Prácticas de Distribución / Información General
USP 39
Los excipientes potencialmente peligrosos debido al riesgo de incendio o explosión (p.ej., combustibles líquidos, sólidos y gases presurizados) deberán ser almacenados y transportados en áreas, contenedores y vehículos seguros y exclusivos para dicho propósito. Asimismo, se deberán seguir todos los acuerdos internacionales y reglamentaciones federales aplicables.
4.3 Alteración Intencional y Materiales Dañados Cuando se sospeche el daño o la alteración intencional de los materiales, éstos deberán colocarse inmediatamente en cuarentena y se deberá notificar al fabricante o distribuidor. El fabricante o proveedor del excipiente deberá determinar la eliminación final del material en cuarentena después de consultar con el cliente. El excipiente puede ser devuelto al fabricante o proveedor. Como alternativa, se pueden concertar una destrucción local certificada del material en cuarentena. El proveedor deberá hacer todo lo posible para prevenir el uso de dichos materiales hasta que se haya concluido una investigación y se haya determinado la eliminación final de los mismos. Tanto el trato de excipientes que hayan sufrido alteración intencional como la identificación y manejo del material dañado deberán regirse por procedimientos escritos.
4.4 Envase: Sellos que Evidencian Alteración Intencional Un envase que evidencia alteración intencional tiene uno o más indicadores o barreras para entrar que, cuando han sido violados o están ausentes, ofrecen evidencia visual y razonable de que ha ocurrido alteración intencional. Para reducir la probabilidad de alteración intencional exitosa e incrementar la probabilidad de descubrir cualquier violación, el empaque deberá tener un diseño distintivo o emplear uno o más indicadores o barreras para entrar. El término diseño distintivo significa que el envase no puede ser duplicado usando materiales o procesos comúnmente disponibles. Un envase que evidencia alteración intencional puede incluir un sistema de envase-cierre inmediato que esté en contacto directo con el contenido (envase primario), un sistema de envase-cierre secundario que no esté en contacto directo con el contenido (envase secundario), o cualquier combinación de sistemas cuya función es proveer evidencia visual de la integridad del envase. Para envases primarios que están en contacto directo con el excipiente (p.ej., bolsas de papel), cualquier fuga o ruptura deberá considerarse alteración intencional, incluso si se trata de una simple fuga o ruptura accidental. Para excipientes cuyo envío se hace a granel usando, por ejemplo, cisternas o cuñetes, pueden resultar apropiados otros medios. No obstante, independientemente de los métodos adoptados, estos deben asegurar adecuadamente la integridad del excipiente que se está enviando. El examen visual del empaque en cada etapa de la cadena de suministro deberá proveer evidencia de reeenvasado o alteración intencional del envase comercial. Además, la etiqueta del empaque deberá identificar el nombre y la dirección del fabricante, el peso neto del material, el nombre del material, el número de envasado o partida, la fecha de fabricación y la fecha de reanálisis. La etiqueta deberá colocarse de manera prominente en el empaque y deberá permanecer inalterada si la característica que evidencia la alteración intencional del empaque ha sido violada o no la tiene. La característica que evidencia la alteración intencional del envase del excipiente deberá tener un diseño que la mantenga intacta al someterla a un manejo razonable desde el momento del envasado en el sitio de fabricación y durante toda la cadena de suministro-incluyendo, pero no limitada al almacenamiento en almacenes durante diversas etapas de la cadena de suministro, el transporte, la distribución, la recepción y el almacenamiento en las instalaciones del usuario hasta su uso en la fabricación del producto farmacéutico. El fabricante deberá notificar a las entidades subsiguientes de la cadena de suministro acerca de las características que evidencian alteración intencional. Cuando las entidades subsiguientes observen cualquier evidencia de que se ha comprometido de cualquier manera la característica que evidencia la alteración intencional u otra parte del envase, éstas deberán colocar el material en cuarentena inmediatamente e informar al proveedor. Será necesario concertar apropiadamente con el proveedor para devolver el material inmediatamente junto con una descripción de la violación al envase. Como alternativa, el fabricante o proveedor del excipiente puede concertar la destrucción local certificada del material en cuarentena. El usuario deberá asegurar la protección adecuada del envase violado durante el transporte al proveedor y podrá enviar fotografías del envase violado para ayudar en la investigación del proveedor. El proveedor será responsable de la integridad del envase, incluyendo, entre otros, sus características que evidencian alteración intencional, hasta que la titularidad de los empaques comerciales sea transferida al usuario. Asimismo, el proveedor deberá realizar revisiones e investigaciones minuciosas del material devuelto por motivo de la violación del envase. El material no deberá reingresarse al mercado hasta que el proveedor haya determinado que se mantienen intactas la integridad, identidad, calidad, pureza y seguridad del excipiente. El requisito de documentación deberá cumplir con las expectativas de las buenas prácticas de fabricación, así como con los elementos de documentación e investigación sugeridos en la Sección 4. 7 Devolución
de Bienes.
4.5 Donde Comienza la Titularidad El usuario del excipiente es responsable de los materiales adquiridos durante toda la cadena de suministro. La calificación de la cadena de suministro se documenta mediante auditorías y Certificados de Análisis para todas las partes implicadas en la comercialización y distribución de los materiales. La calificación y documentación de la cadena de suministro sustenta el Pedigrí
USP 39
Información General/ (1197) Buenas Prácticas de Distribución 1737
del Excipiente y la titularidad del mismo. El pedigrí incluye documentación sobre las buenas prácticas de fabricación de excipientes adecuadas aplicadas por el fabricante del excipiente y sobre las buenas prácticas de distribución adecuadas. La titularidad de los materiales comienza con el fabricante original del excipiente y se transfiere a un intermediario o cliente de acuerdo con los términos convenidos sobre costo de seguros, transporte y aceptación de riesgos. Dichos convenios se definen de acuerdo con la terminología de la lnternational Chamber of Commerce (Cámara Internacional de Comercio o lncoterms).6 Los incoterms son una serie de términos internacionales de venta que se usan para dividir los costos de transacción y las responsabilidades entre el comprador y el vendedor y que reflejan las prácticas de transporte más avanzadas.
4.6 Adulteración 4.6.1 ADULTERACIÓN La adulteración está definida en la Ley FD&C y en el Título 21 del CFR en sus Secciones 501 (a)(2)(B) y 501 (b)7 y Título 21 del CFR 211 para productos farmacéuticos terminados y en las Secciones 402(a)(3) y (4) 8 y en el Título 21 del CFR 11 O para alimentos de consumo humano y el Título 21 del CFR 111 para suplementos dietéticos. Dichas leyes y reglamentos establecen las buenas prácticas de fabricación vigentes mínimas e indispensables para prevenir la adulteración de productos farmacéuticos terminados, productos alimenticios y suplementos dietéticos, respectivamente. Los excipientes para uso farmacéutico deberán fabricarse basándose en las buenas prácticas de fabricación vigentes (cGMP, por sus siglas en inglés) apropiadas y deberán cumplir con las especificaciones químicas y físicas requeridas. Además de las especificaciones, los fabricantes y usuarios de excipientes habrán de cumplir con los atributos y límites de calidad convenidos, definidos por las agencias reglamentarias, prácticas comunes de la industria y expectativas farmacopeicas. La adulteración o contaminación de los productos puede ser monitoreada y detectada a través de varios medios que incluyen, entre otros, el cumplimiento con dichas expectativas de calidad predefinidas. Cuando ocurre cualquier tipo de contaminación posible, p.ej., con materias extrañas o microorganismos indeseables, el producto puede resultar adulterado. El problema de la adulteración se puede tratar mediante prácticas normativas que sustenten las buenas prácticas de fabricación vigentes, tales como el Análisis de Riesgos y Puntos de Control Críticos, Procedimientos Operativos Estándar y capacitación del personal para controlar la seguridad y pureza del producto. Esta forma de adulteración se considera imprevisible y no intencionada, por lo que puede controlarse y, en el peor de los casos, detectarse antes de que el producto abandone el sitio de fabricación. La FDA especifica que un producto se puede considerar adulterado cuando las condiciones pudieran llevar a su adulteración partiendo de la base de que es imposible analizar cada producto para todos los tipos de contaminación concebibles. La seguridad y pureza de las sustancias requieren que los fabricantes incorporen controles de calidad en el proceso en lugar de basarse en el análisis de Control de Calidad. 4.6.2 ADULTERACIÓN INTENCIONAL En contraste con la adulteración no intencional, la adulteración intencional es más específica, puesto que requiere una violación voluntaria y con conocimiento de las normativas destinadas a la protección de la seguridad del usuario final. Se trata de una adulteración deliberada. La adulteración de un excipiente de manera deliberada usando un material de bajo costo en lugar de un material de mayor costo, se considera como adulteración intencional por motivos económicos. Cada participante de la cadena de suministro deberá conocer y monitorear su cadena de suministro para detectar cualquier material adulterado además de tomar precauciones razonables para prevenir la adulteración intencional. 9
4.7 Importación Los excipientes fabricados fuera de los Estados Unidos están sujetos a las reglamentaciones de la Administración de Alimentos y Medicamento de los EE.UU. (FDA, por sus siglas en inglés) y a la Oficina de Aduanas y Protección Fronteriza de los EE.UU. (Customs and Border Protection o CBP) para su importación a territorio estadounidense. La Ley sobre Bioterrorismo (Bioterrorism Act o Public Health Security and Bioterrorism Preparedness and Response Act of 2002, Title 111-Protecting Safety and Security of Food and Drug Supply [Ley sobre Seguridad de la Salud Pública y de Preparación y Respuesta contra Terrorismo Bio-
6
lnternational Chamber of Commerce. lncoterms. http://www.iccwbo.org/incoterms (Consultada el 6 de junio de 2011). FD&C Act. Chapter V: Drugs and Devices. Sec. 501. [21 USC §351] Adulterated Drugs and Devices. http://www.fda.gov/Regulatorylnformation/Legislation/ FederalFoodDrugandCosmeticActFDCAct/FDCActChapterVDrugsandDevices/ucm108055.htm. 8 FD&C Act. Chapter IV: Food. Sec. 402. [21 USC §342) Adulterated Food. http://www.fda.gov/Regulatorylnformation/Legislation/FederalFoodDrugandCosmeticActFDCAct/FDCActChapterlVFood/ucm107527.htm (Consultadas el 6 de junio de 2011 ). 9 FDA. Public Meeting on Economically Motivated Adulteration. 2009. http://www.fda.gov/NewsEvents/MeetingsConferencesWorkshops/ucm163619.htm (Consultado el 6 de junio de 2011 ). 7
1 738 (1197) Buenas Prácticas de Distribución / Información General
USP 39
lógico de 2002-Protección de la Seguridad del Suministro de Alimentos y Medicamentos] 1º ha elevado el nivel de formalidad de los requisitos de importación de alimentos y medicamentos en los Estados Unidos. Los fabricantes extranjeros de excipientes usados en medicamentos, alimentos y suplementos dietéticos destinados para uso humano o veterinario que pretendan exportar productos a los Estados Unidos estarán obligados a cumplir con las reglamentaciones de la FDA, la CBP y la Ley sobre Bioterrorismo. Se deberá seguir e implementar un proceso racionalizado para la importación de excipientes usados en productos farmacéuticos, alimentos y suplementos dietéticos antes de permitir su ingreso a los Estados Unidos. Las instalaciones de fabricación y los fabricantes que producen los excipientes deben estar registrados ante la FDA. Además, se requiere un número de registro ante la FDA para la importación. Asimismo, la FDA requiere la presentación de información mediante una Notificación Previa (Prior Notice o PN) para Importaciones. Una vez recibida la información, la FDA otorga un número de confirmación de Notificación Previa. La FDA debe confirmar la Notificación Previa antes de que se realice el envío de los productos, y el número de confirmación de la Notificación Previa debe aparecer en la declaración de aduanas que acompaña al paquete. La información de la Notificación Previa puede presentarse electrónicamente a través de la Interfaz del Sistema de Notificación Previa (Prior Notice Systems Interface o PNSI) de la FDA, una aplicación gratuita en línea que permite a las instalaciones proveer información relacionada con las importaciones esperadas. La información de la Notificación Previa también puede proveerse a través del Sistema Comercial Automatizado (Automated Commercial System o ACS) de la CBP, el cual procesa importaciones y obtiene la información requerida para tomar decisiones con respecto a los artículos que se van a ingresar en los Estados Unidos. La CBP procesa la importación de todos los bienes para su ingreso en los Estados Unidos, incluyendo, entre otros, productos farmacéuticos, alimentos y suplementos dietéticos. La CBP solamente inspecciona los productos reglamentados por la Ley FD&C y delega en la FDA la responsabilidad final sobre la liberación de dichos materiales en el puerto de entrada. Después de revisar la información de la Notificación Previa, la FDA puede determinar que no se debe permitir la entrada de los artículos reglamentados en los Estados Unidos o puede condicionar la importación de los mismos a la aplicación de análisis y su liberación en el puerto de entrada. Además, durante la revisión de la FDA en el puerto de entrada, los artículos reglamentados deben cumplir con todos los requisitos de la Ley FD&C y del Título 21 del CFR antes de que sean liberados por la FDA al importador. Los importadores registrados (personas físicas o compañías) para excipientes pueden contratar a un corredor para que transmita la información de la Notificación Previa y demás documentos en su representación. En este caso, el remitente es el responsable de proveer la información, y el corredor actúa como transmisor. Los corredores son individuos o compañías privadas y autorizadas, reguladas por la CBP que ayudan a importadores y exportadores en el movimiento de mercancías ante dicha autoridad. Los corredores proveen la documentación y los pagos adecuados al CBP en representación de sus clientes y cobran un honorario por sus servicios. Antes de que los corredores puedan solicitar una licencia, deben pasar un examen de correduría aduana l. En la actualidad, la FDA utiliza el Sistema Operativo y Administrativo de Respaldo a las Importaciones (Operational and Administrative System for lmport Support u OASIS)1 1 para determinar la admisibilidad a fin de garantizar la seguridad, eficacia y calidad de los productos de origen extranjero sobre los que tiene responsabilidad reglamentaria de conformidad con la Ley FD&C. El OASIS está integrado a los sistemas ACS de la CBP y PSNI de la FDA para recibir información relacionada con los artículos importados. En ocasiones, las áreas de almacenamiento de la Aduana de los EE.UU. y de la FDA en los Puertos de Llegada podrían no cumplir con las condiciones de almacenamiento requeridas para ciertos excipientes. Los importadores y los corredores registrados que representen a los importadores deberán asegurarse de que los productos sean liberados de la inspección de la Aduana y de la FDA a la mayor brevedad posible. Cuando se presenta un retraso en la liberación, por lo general la FDA permite que tanto la Aduana como ésta misma retire las mercancías y las coloque en cuarentena en el almacén del importador hasta su liberación. El personal de la FDA que revisa las importaciones en el puerto de ingreso está capacitado para entender que los excipientes farmacéuticos deben almacenarse en condiciones definidas. El fabricante, el importador registrado en el país importador y los corredores tienen la responsabilidad de trabajar con el personal de la Aduana y de la FDA para asegurar que las condiciones de almacenamiento no afecten de manera negativa la calidad del producto durante el proceso de cuarentena y revisión.
4.8 Rastreabilidad 4.8.1 RASTREABILIDAD El pedigrí del excipiente debe ser rastreable desde el almacenamiento del fabricante hasta la entrega final a los clientes mediante registros de identificación. Toda la cadena de suministro deberá ofrecer una capacidad total de rastreo (por ejemplo, mediante números de lote y documentos de envío) a fin de permitir investigaciones rápidas y eficientes sobre cualquier asunto
1o
FDA. Guidance far lndustry: Questions and Answers Regarding the lnterim Final Rule on Prior Notice of lmported Food, (Edition 2); Availability (Guía para la Industria: Preguntas y Respuestas sobre la Regla Intermedia Final sobre Ja Notificación Previa de Alimentos Importados (Edición 2); Disponibilidad). 2004. http://www.gpo.gov/
fdsys/pkg/FR-2004-05-03/pdf/04-10023.pdf (Consultada el 6 de junio de 2011 ). 11 FDA. Operational and Administrative System for lmport Support (OASIS). 2009.•e ERR(Ol-jun-20lS)
USP 39
Información General/ (1197) Buenas Prácticas de Distribución 1 739
de calidad o retiro de producto del mercado. Cada una de las entidades de la cadena de suministro también deberá asumir la responsabilidad del proveedor anterior y pasar el producto a los intermediarios subsiguientes hasta el usuario final. Por lo tanto, el fabricante original del excipiente y los intermediarios subsiguientes deberán ser susceptibles de rastreo en todo momento, y la información deberá estar disponible para todas las partes de la cadena de suministro. Todas las partes de la cadena de suministro deberán asegurar que el manejo del excipiente se realice de estricta conformidad con las buenas prácticas de distribución en todas las etapas. Para asegurar la integridad de la cadena de suministro, los intermediarios deberán valerse de la celebración de contratos, convenios, inspecciones y auditorías con todas las partes de la cadena de suministro para monitorear el cumplimiento de los principios de las buenas prácticas de distribución. Cuando la cadena de suministro para cada partida de excipiente esté compuesta por múltiples entidades, cada entidad deberá proveer sus propios documentos de certificación de proveedor (ver Apéndice: Definiciones y Acrónimos) que reflejen su fabricación o recepción de la partida de excipiente hasta la liberación a la entidad subsiguiente. Todos los documentos de certificación de la entidad proveedora deberán representar la totalidad de la cadena de suministro desde el fabricante original del excipiente hasta su uso en el producto farmacéutico final. 4.8.2 DOCUMENTOS RELACIONADOS CON LA RASTREABILIDAD Para asegurar la rastreabilidad, todas las entidades de la cadena de suministro deberán contar con definiciones claras sobre los documentos de envío programados con cada entrega. La documentación de cada entrega deberá proveer, como mínimo, la siguiente información: • nombre y grado del excipiente; • números de lote asignados por el fabricante original del excipiente (ver la Sección 3.4.2 Reenvasado y Etiquetado de Partidas); • datos de calidad y cumplimiento (p.ej., Certificado de Análisis) del excipiente; • origen del excipiente (fabricante y sitio de fabricación); • Certificados de Análisis originales del excipiente (ver la Sección 3.4.5 Certificados de Análisis); • entidad y sitio de reenvasado (cuando se lleve a cabo), incluyendo la apertura o reetiquetado del empaque original del fabricante del excipiente por cualquier motivo; • fecha de envío y transportista; • consignador y consignatario. El envío deberá acompañarse de una copia del Certificado de Análisis (ver los capítulos Guía sobre Cambios Significativos en Excipientes Farmacéuticos a Granel (1195> y Excipientes Farmacéuticos a Granel-Certificado de Análisis (1080>). En caso de que el excipiente se reenvase del empaque del fabricante original en otro envase (incluyendo cualquier violación o etiquetado que no resulte en un nuevo empaque), se deberá incluir en los documentos de envío la identidad y dirección de la entidad que efectúa el reenvasado. Asimismo, se deberán proveer datos adicionales de los análisis realizados por entidades distintas al laboratorio del fabricante original del excipiente junto con una indicación clara de la fuente. Los documentos de calidad deberán facilitar la rastreabilidad hasta el fabricante original con la información de contacto. El Certificado de Análisis emitido por el fabricante deberá distinguir entre los resultados obtenidos mediante el análisis del material original y los resultados obtenidos por otros medios. Ningún distribuidor deberá cambiar el título ni los datos originales del Certificado de Análisis u otros documentos de calidad. Siempre que sea posible, se deberá usar la documentación del fabricante original del excipiente o se deberá verificar la transcripción de los datos. El sitio de fabricación original deberá identificarse en el Certificado de Análisis. Cuando se lleve a cabo cualquier tipo de mezclado de lote(s), los Certificados de Análisis de los fabricantes perderán su validez y el distribuidor deberá llevar a cabo análisis en su propio laboratorio o en un laboratorio contratista aprobado y calificado. El distribuidor deberá proveer un Certificado de Cumplimiento y, cuando el lote mezclado no haya sido sometido a reanálisis, deberá informar al cliente que el material es una mezcla de diferentes lotes del fabricante original del excipiente, siempre y cuando todas las demás actividades de reenvasado y almacenamiento se hayan realizado de conformidad con las buenas prácticas de distribución.
SECCIÓN 5: EXCIPIENTES USADOS EN LA PREPARACIÓN MAGISTRAL EN FARMACIAS Aunque lo ideal sería confirmar mediante pruebas analíticas los atributos de calidad especificados en el Certificado de Análisis de los componentes recibidos para farmacia de preparación magistral, generalmente y debido a las limitaciones en los recursos, los farmacéuticos que realizan preparaciones magistrales confían en las garantías de calidad y pedigrí de los distribuidores de los excipientes. Se encuentran disponibles pautas adicionales sobre los atributos de calidad de los excipientes recibidos por las farmacias de preparación magistral en el capítulo general de la USP Preparación Magistral-Preparaciones No Estériles (795>. En algunas ocasiones, los compendios USP-NF tratan a las preparaciones magistrales de manera distinta a los lotes fabricados comercialmente. Por ejemplo, las fechas de caducidad se asignan a productos fabricados comercialmente, mientras que las fechas límite de uso se asignan a preparaciones magistrales (ver Advertencias Generales 10.40.100.1 Preparaciones Magistrales). Los excipientes farmacéuticos a granel se tratan de manera similar, puesto que no todos los excipientes útiles para la preparación magistral se listan en los compendios oficiales (ver Preparación Magistral-Preparaciones No Estériles (795>).
1740 (1197) Buenas Prácticas de Distribución/ Información General
USP 39
Las juntas estatales de farmacia rigen la preparación magistral. Los estándares USP se proveen en los capítulos Preparación Magistral-Preparaciones No Estériles (795), Preparación Magistral-Preparaciones Estériles (797) y Garantía de Calidad en la Preparación Magistral (1163).
APÉNDICE: DEFINICIONES Y ACRÓNIMOS Criterios de Aceptación: Las especificaciones y límites de aceptación o rechazo-tales como niveles de calidad aceptables o inaceptables con un plan de muestreo asociado-que son necesarios para tomar la decisión de aceptar o rechazar un lote o partida de materia prima, producto intermedio, material de envasado o excipiente. ACS: Sistema Comercial Automatizado Material Adulterado: Es un material que no cumple con los estándares de calidad previstos o que se contamina, diluye o sustituye intencionalmente con otra sustancia o que no fue fabricado, procesado, envasado, distribuido o conservado de conformidad con las buenas prácticas de fabricación vigentes. Auditoría: Evaluación de un sistema o proceso para determinar su conformidad con los requisitos de una norma de operación. Ver también, Auditoría Externa, Interna y de Terceros. Partida (Lote): Cantidad definida de excipiente procesado que se espera sea homogénea. En un proceso continuo, una partida corresponde a una porción definida de la producción basada en tiempo o cantidad (p.ej., volumen del contenedor, producción de un día, etc.). Número de Partida (número de lote): Combinación única y distintiva de números y/o letras, a partir de la que se puede determinar el historial completo de fabricación, procesamiento, envasado, codificación y distribución de una partida. Proceso de una Partida: Proceso de fabricación por el que se produce el excipiente a partir de un suministro separado de materias primas procesadas mediante operaciones unitarias distintas en una masa. Registro de Partida: Documentación que proporciona el historial de fabricación de una partida de excipiente. Mezclado: Entremezclar diversos grados autorizados en un lote homogéneo. Corredor: Entidad que actúa como intermediario entre el comprador y el vendedor de productos o servicios. Los corredores no adquieren la propiedad ni la posesión de los productos o servicios. Calibración: Demostración de que un instrumento o dispositivo de medición particular genera resultados dentro de los límites especificados en comparación con aquéllos generados por un estándar de referencia o rastreable en un intervalo de mediciones apropiado. CBP: Oficina de Aduanas y Protección Fronteriza CEP (Certificado de Aptitud de la Farmacopea Europea): Certificación otorgada a fabricantes individuales por la Dirección Europea para la Calidad de los Medicamentos (European Directorate for the Quality of Medicines) cuando se determina que un excipiente o ingrediente activo específico cumple con una monografía de la Farmacopea Europea CFR: Código de Reglamentos Federales. CFR (Costo y Flete, Puerto de Destino Convenido): (lncoterm) El vendedor debe pagar los costos y el flete para llevar los bienes al puerto de destino. No obstante, una vez que los bienes han cruzado la borda del buque (transporte marítimo únicamente), el riesgo se transfiere al comprador. BPFv: Buenas prácticas de fabricación vigentes. CIF (Costo, Seguro y Flete, Puerto de Destino Convenido): (lncoterm) Igual al CFR, excepto que el vendedor además debe procurar y pagar un seguro para el comprador. CIP (Transporte y Seguro Pagado, Puerto de Destino Convenido): (lncoterm) El transporte de contenedores o equivalente multimodal del CIF. El vendedor paga el transporte y seguro hasta el destino convenido, pero el riesgo se transmite cuando los bienes son entregados al primer transportista. Distribuidor de Envases Cerrados (distribuidor intermedio): Distribuidor que únicamente vende productos que han sido analizados, envasados y sellados en los envases provistos por el fabricante original. Sistema Cerrado: Sistema que se encuentra aislado de su entorno mediante una división que evita la transferencia de material alguno a través de ésta. COA (Certificado de Análisis): Documento que informa sobre los resultados de las pruebas aplicadas a una muestra representativa obtenida de la partida del material que se va a entregar. COC (Certificado de Cumplimiento): Documento que certifica que los bienes o servicios suministrados cumplen con las especificaciones requeridas. También se conoce como Certificado de Conformidad y Certificado de Apego. Instalación (de un equipo): Introducción de equipo para su uso de manera controlada. Preparación Magistral: La preparación, mezclado, reconstitución, alteración, envasado y etiquetado de un medicamento, dispositivo de administración del medicamento o dispositivo, de acuerdo con la receta médica, orden de medicación o iniciativa de un profesional autorizado, basado en la relación entre el profesional, el paciente, el farmacéutico y el preparador en el curso de una práctica profesional (definida en el capítulo general de la USP Preparación Magistral-Preparaciones No Estériles (795)). Consignatario/Consignador: Persona o firma (por lo general el vendedor) que entrega una consigna a un transportista para que la lleve a un consignatario (por lo general el comprador) señalado en los documentos de transporte.
Información General/ (119 7) Buenas Prácticas de Distribución 1 741
USP 39
Contaminación: Introducción indeseada de impurezas de naturaleza química o microbiológica o de materia extraña en una materia prima, producto intermedio o excipiente durante la producción, muestreo, envasado o reenvasado, almacenamiento o transporte. Proceso Continuo: Proceso de fabricación que produce continuamente el excipiente a partir de un suministro continuo de materia prima. Contratante: Persona u organización que otorga un contrato. Contratista: Persona u organización que acepta los términos de un contrato y que por ende acuerda realizar el trabajo o proporcionar los servicios especificados en el contrato. Crítico(a): Etapa del proceso, condición del proceso, requisito de prueba u otro parámetro o asunto relevante que se debe controlar mediante criterios predeterminados para asegurar que el excipiente cumpla con su especificación. Crítico para la Calidad: Ver Calidad, Crítico. Contaminación Cruzada: Contaminación de un material o producto con otro material o producto. Cliente: Organización que recibe el excipiente una vez que éste ha abandonado el control del fabricante del excipiente; incluye corredores, agentes y usuarios. Desviación: Desviación de una instrucción aprobada o estándar establecido. Distribuidor: Entidad que adquiere productos de un fabricante, toma posesión de los mismos y los revende a otra parte o partes. Una característica esencial de un distribuidor es el orden de estas transacciones. Los distribuidores compran productos (es decir, mantienen un inventario) antes de vender. Archivo Maestro del Fármaco (DMF, por sus siglas en inglés): Información detallada sobre la fabricación de un excipiente que ha sido presentado ante la Administración de Alimentos y Medicamentos de los EE.UU. Producto Farmacéutico (medicinal): Forma farmacéutica en el envase inmediato final destinada para comercialización. Fármaco: Cualquier sustancia o mezcla de sustancias destinada para su uso en la fabricación de un producto farmacéutico y que, cuando se usa en la producción de un medicamento, se convierte en un ingrediente activo del producto farmacéutico. Dichas sustancias tienen el propósito de generar actividad farmacológica u otro efecto directo para el diagnóstico, cura, disminución, tratamiento o prevención de enfermedades, o para afectar la estructura o cualquier función del cuerpo en humanos o animales. Adulteración por motivos económicos: Sustitución o adición intencional fraudulenta de una sustancia en un producto con el propósito de incrementar el valor aparente del mismo o de reducir el costo de producción para generar ganancias económicas. Firma electrónica: Compilación de datos generados por computadora de cualquier símbolo o serie de símbolos ejecutada, adoptada o autorizada por un individuo y que tiene el propósito de ser legalmente equivalente a la firma manuscrita del individuo. Excipiente: Cualquier sustancia, distinta del ingrediente farmacéutico activo o producto farmacéutico, cuya seguridad ha sido evaluada de manera apropiada y que se incluye en un sistema de liberación del fármaco para ayudar en el procesamiento de dicho sistema durante la fabricación; para proteger, sustentar o mejorar la estabilidad, biodisponibilidad o capacidad de aceptación del paciente; para ayudar con la identificación del producto; o para mejorar cualquier otro atributo de la seguridad y efectividad general del sistema de liberación de fármaco durante el almacenamiento o uso. Pedigrí del Excipiente: Incluye documentación sobre las buenas prácticas de fabricación de excipientes adecuadas, aplicadas por el fabricante del excipiente y sobre las buenas prácticas de distribución adecuadas. Ver Excipient Pedigree White Paper de la IPEC (Política de la IPEC sobre el Pedigrí de los Excipientes). Auditoría externa: (Ver también Auditoría, Interna y de Terceros.) Una auditoría que se lleva a cabo por lo general en nombre de un cliente del fabricante del excipiente por una persona u organización que no es el fabricante o cliente. Fecha de caducidad: Fecha que designa el tiempo durante el cual se espera que el excipiente se mantenga dentro de las especificaciones y posterior a la cual ya no debería usarse. FCA (Transportista Libre, Destino Convenido): El vendedor entrega los bienes, despachada para exportación, a la custodia del primer transportador (nombrado por el comprador) en el lugar convenido. Este término es adecuado para todos los modos de transporte, incluyendo transporte aéreo, ferroviario, vial y transporte en contenedores/multimodal (también denominado transbordo/carga
y descarga).
FDA: Administración de Alimentos y Medicamentos. Ley FD&C: Ley de Alimentos, Medicamentos y Cosméticos. FOB (Libre a Bordo, Puerto de Carga Convenido): Término de comercio marítimo clásico conforme al cual el vendedor debe cargar los bienes a bordo del navío designado por el comprador y el costo y el riesgo se dividen en la borda. El vendedor debe despachar los bienes para exportación. El comprador es posteriormente responsable de todos los costos adicionales asociados con el transporte, la importación y el almacenamiento hasta que el envío llegue a su destino. El término también se aplica al transporte aéreo cuando el vendedor no es capaz de exportar los bienes de conformidad con el programa detallado en la carta de crédito. En este caso, el vendedor permite una deducción equivalente al transporte marítimo del transporte aéreo. El FOB también se puede calificar de otras maneras. Por ejemplo, FOB Puerta de la Fábrica significa que el título y la responsabilidad cambian tan pronto como el envío abandona las instalaciones del proveedor. Agente Expedidor (Expedidor de Fletes): Agentes que ayudan a otras organizaciones o individuos a transportar cargamentos a un destino y que están familiarizados con las reglas y reglamentos de importación y exportación de países extranjeros y de sus propios países, con los métodos de envío y con la documentación concerniente al comercio internacional.
1742 (1197) Buenas Prácticas de Distribución/ Información General
USP 39
Expedidor de Fletes: Ver Agente expedidor. BPD: Buenas prácticas de distribución. BPF: Buenas prácticas de fabricación. Cámara Gaseosa: Volumen que se deja en la parte superior de un envase llenado casi por completo antes de sellarlo. HACCP (Análisis de Riesgos y Puntos Críticos de Control): El Análisis de Riesgos y Puntos Críticos de Control tiene siete principios establecidos por el National Advisory Committee for Microbiological Criteria for Foods (Comité Asesor Nacional para Criterios Microbiológicos de los Alimentos) para controlar la seguridad del producto. Importador: Se refiere al propietario o consignatario estadounidense al momento del ingreso a los Estados Unidos o al agente o representante estadounidense del propietario o consignatario extranjero al momento del ingreso en los Estados Unidos que es responsable de asegurar que los bienes ofrecidos para su ingreso en los Estados Unidos cumplen con todas las leyes que afectan la importación. Impureza: Componente de un excipiente que no es la entidad química esperada o un componente concomitante, pero que está presente como consecuencia de las materias primas o del proceso de fabricación y que no se considera una sustancia extraña. Independiente: En el contexto de las auditorías internas, se refiere a la calidad de estar libre de cualquier influencia, económica o de otro tipo, del grupo, departamento u organización que se está auditando. Controles durante el Proceso: Verificaciones que se llevan a cabo durante la producción a fin de monitorear y, en caso necesario, ajustar el proceso para asegurar que el material cumpla con sus especificaciones. El control del entorno o del equipo también se puede considerar como parte del control de proceso. Control/Análisis durante el Proceso: Verificaciones que se llevan a cabo durante la producción a fin de monitorear y, en caso apropiado, ajustar el proceso para asegurar que el producto intermedio o excipiente cumpla con sus especificaciones. Producto Intermedio: Material que debe someterse a etapas adicionales de fabricación antes de convertirse en un excipiente. Auditoría Interna: Auditoría realizada por un empleado de la organización o por un individuo de una organización externa pero que actúa en nombre de la organización, para determinar la efectividad de un sistema. (Ver: Auditoría, Auditoría externa y
Auditoría de Terceros). Denominación Común Internacional: La Denominación Común Internacional (DCI) facilita la identificación de sustancias farmacéuticas o ingredientes farmacéuticos activos. Cada DCI es un nombre único mundialmente reconocido y de dominio público. La denominación común se conoce también como nombre genérico. ISO: lnternational Organization for Standardization (Organización Internacional de Normalización). Lote: Ver Partida. Etiquetado: Etiqueta o documento adherido a un envase o contenedor que contiene información sobre el envase y su contenido. Proceso del Fabricante/de Fabricación: Todas las operaciones de recepción de materiales, producción, envasado, reenvasado, etiquetado, reetiquetado, control de calidad, liberación y almacenamiento de excipientes y controles relacionados. Instrucciones Maestras de Producción (Registro Maestro de Producción y Control): Documentación que describe la fabricación del excipiente desde la materia prima hasta su finalización. Material: Término general usado para describir materias primas (materiales de inicio, reactivos y disolventes), coadyuvantes del proceso, productos intermedios, excipientes, materiales de envase y etiquetado. Material que no Cumple con las Normas: Material que presenta deficiencias con respecto a una característica, especificación del producto, parámetro del proceso, registro o procedimiento, las cuales provocan que su calidad sea inadmisible, indeterminada o que no cumpla con los requisitos especificados. OASIS: Operational and Administrative System for lmport Support (Sistema Operativo y Administrativo de Apoyo a las Importaciones). Fabricante Original del Excipiente: Organización responsable de fabricar, basándose en las BPF adecuadas, los excipientes distribuidos y tratados en este capítulo. Distribuidor de Envasado/Reenvasado: Distribuidor que transfiere productos de los envases o contenedores de transporte originales provistos por el fabricante original, a envases alternativos y que vende los productos en dichos envases. Ver Distribui-
dor y Reenvasador. Sistema de Envase-Cierre Primario: Componentes de envase que entran en contacto directo con el excipiente en el envase cerrado y sellado durante el almacenamiento y transporte. Material de Envase: Material destinado a proteger un producto intermedio o excipiente durante el almacenamiento y transporte. Envase: Envase y sus componentes que contienen el excipiente para su almacenamiento y transporte al cliente. Distribuidor Intermedio: Ver Distribuidor de envases cerrados. PN: Notificación previa. PNSI: Interfaz de sistemas de notificación previa. Envase Primario, Secundario: Ver Distribuidor de Envasado/Reenvasado y Sistema de Envase-Cierre primario. Materiales de envase que no entran en contacto con el excipiente durante el transcurso normal de almacenamiento y transporte del excipiente.
USP 39
Información General/ (1197) Buenas Prácticas de Distribución 1743
Producción: Operaciones implicadas en la preparación de un excipiente desde la recepción de las materias primas hasta el procesamiento y envasado del excipiente. QbD (Calidad por Diseño): Enfoque sistemático para el desarrollo farmacéutico que comienza con objetivos predefinidos y enfatiza el entendimiento del producto y de los procesos, así como el control del proceso basado en información científica sustentada y en una gestión de riesgos de la calidad. Se concibe como el diseño y desarrollo de productos y procesos de fabricación para asegurar una calidad predefinida. QMS: Sistema de gestión de calidad. Garantía de Calidad (QA): Se refiere a la suma de las actividades organizadas dedicadas a asegurar que todos los excipientes tengan la calidad requerida para su uso pretendido y al mantenimiento de los sistemas de calidad. Ver Unidad de Calidad. Control de Calidad (QC): Verificación o prueba para comprobar que se cumplen las especificaciones. Ver Unidad de Calidad. Riesgo Crítico para la Calidad: Describe un material, etapa del proceso o condición del proceso, requisito de prueba u otro parámetro pertinente que influencie de manera directa los atributos de calidad del excipiente y que se debe controlar dentro de los criterios predeterminados. Sistema de Gestión de Calidad (QMS): Sistema de gestión que dirige y controla la calidad de una compañía farmacéutica. Manual de Calidad: Describe los elementos del Sistema de Gestión de Calidad e incluye la estructura de calidad de la organización, políticas escritas, procedimientos y procesos o referencias a los mismos, así como una descripción de funciones departamentales en relación con las políticas, procedimientos y procesos. Documento que especifica el sistema de gestión de calidad de una organización. Unidad de Calidad: Ver también: Control de Calidad y Garantía de Calidad. Grupo dentro de una organización más grande responsable de monitorear y asegurar todos los aspectos de la calidad. En la práctica actual de la industria, por lo general, se dividen las responsabilidades de la unidad de control de calidad (QCU), según se define en los reglamentos de las buenas prácticas de fabricación vigentes, entre las funciones de control de calidad (QC) y garantía de calidad (QA). El control de calidad generalmente implica (1) evaluar la aptitud de componentes de ingreso, envases, cierres, etiquetado, materiales en proceso y los productos terminados; (2) evaluar el desempeño del proceso de fabricación para asegurar el apego a las especificaciones y límites apropiados; y (3) determinar la aceptabilidad de cada partida para su liberación. La garantía de calidad implica principalmente (1) revisar y aprobar todos los procedimientos relacionados con la producción y el mantenimiento, (2) revisar los registros asociados y (3) auditar y llevar a cabo/evaluar análisis de tendencias. Cuarentena: Se refiere al estado de aislamiento físico, o por otros medios adecuados, de materiales cuya aprobación o rechazo subsiguiente se encuentra pendiente de decisión. Materia Prima: Término general usado para describir materiales de inicio, reactivos y disolventes destinados para su uso en la producción de productos intermedios o excipientes. Retiro del Mercado: Ver Recuperación. Registro: Documento que indica los resultados logrados o que proporciona evidencia de las actividades realizadas. Dicho documento se puede encontrar en papel, en formato magnético, electrónico, óptico o fotográfico, en un medio distinto o en una combinación de los mismos. Fecha de Reevaluación (Fecha de Reanálisis, Intervalo de Reevaluación): Fecha en que se debe reexaminar el material para asegurar que sigue cumpliendo con las especificaciones. Fecha Recomendada de Reevaluación: Fecha sugerida por el proveedor en la que debe reevaluarse el material para asegurar su cumplimiento continuo con las especificaciones. Es diferente a la Fecha de Caducidad puesto que el excipiente puede someterse a reevalución para extender el tiempo de uso del material, siempre que dicha extensión esté sustentada por los resultados de la evaluación y por datos de estabilidad apropiados. Reenvasador: Individuo u organización que toma un excipiente del envase original del fabricante y lo reenvasa en envases diferentes. Ver también Distribuidor y Distribuidor de Envasado/Reenvasado. Reenvasado: Extracción del excipiente de su envase original (combinación de empaque secundario y/o primario) y su posterior transferencia a otro envase. Reprocesamiento: Reintroducción en el proceso de material previamente procesado que no cumplió con los estándares o especificaciones y repetición de una o más etapas necesarias que forman parte del proceso normal de fabricación. Recuperación (Retiro del Mercado): Proceso de retiro de un excipiente de la cadena de distribución. Refabricación: Proceso en el cual un material previamente procesado que no cumplió con los estándares o especificaciones es sometido a etapas de procesamiento diferentes a las del proceso normal de fabricación. Envase Secundario, Primario: Ver Envase primario, secundario. Alta Gerencia: Ver Cúpula gerencial. Cambio Significativo: Cambio que altera una propiedad física o química del excipiente de la norma aceptada o que podría alterar el desempeño del excipiente en la forma farmacéutica. Especificación: Parámetros de calidad con los que debe cumplir el excipiente, componente o producto intermedio y que sirven como fundamento para evaluar la calidad. Estabilidad: Cumplimiento continuo del excipiente con sus especificaciones. Proceso Estable: Proceso del que puede demostrarse por medios adecuados que sus resultados presentan un nivel de variabilidad que cumple constantemente con todos los aspectos de la especificación declarada (especificaciones de la USP y del cliente) y que por tanto es aceptable para su uso pretendido, independientemente de la naturaleza del procesamiento (por partida o continuo).
1744 (1197) Buenas Prácticas de Distribución/ Información General
USP 39
Subcontratista: Individuo u organización que lleva a cabo un trabajo o servicios en nombre de una persona u organización distinta, la cual a su vez lleva a cabo trabajos o proporciona servicios al contratante original. Documentos de Certificación del Proveedor: Información y datos específicos relacionados con una partida individual de un excipiente, cuya exactitud viene certificada por la entidad comercial que ha tenido control sobre la misma partida individual de excipiente. Los Documentos de Certificación del Proveedor incluyen información y datos de la calidad y de la cadena de suministro. Se deben comprender y controlar los métodos y procesos de los que se derivan los datos e información incluidos; asimismo, todas las fuentes de datos e información deben ser rastreables. Todas las entidades que asuman posesión y responsabilidad por la partida del excipiente deben proveer Documentos de Certificación del Proveedor, incluyendo el fabricante original del excipiente, todos los distribuidores y todos los reenvasadores. Se debe aplicar especial atención y transparencia a los Documentos de Certificación del Proveedor con respecto a cualquier evento que viole el envase o las etiquetas originales del fabricante (incluyendo la adición de nuevas etiquetas). Auditoría de Terceros: Auditoría realizada por un individuo externo a la organización quien no es un proveedor o cliente de la organización, p.ej., un organismo certificador, para determinar la efectividad de un sistema. Cúpula Gerencial: Persona o grupo de personas que dirige y controla una organización al nivel más alto, ya sea en el ámbito de la instalación o el de la corporación, dependiendo de la forma en que el sistema de gestión de calidad esté organizado. Rastreabilidad: Capacidad para determinar un historial, aplicación o ubicación en cuestión, p.ej., el origen de materiales y partes, historial de procesamiento o distribución del producto después de la entrega. Comerciante: Entidad que adquiere productos de un fabricante, que puede o no tomar posesión de los mismos, y que los revende a otra parte o partes. NOTA: En el caso de los comerciantes, la venta por lo general se realiza antes de la adquisición del producto. Usuario: Persona u organización que usa excipientes farmacéuticos para fabricar productos farmacéuticos intermedios o terminados. Validación: Programa documentado que ofrece un alto grado de garantía de que un proceso, método o sistema específico producirá de manera constante un resultado que cumple con un criterio de aceptación predeterminado.
(1207) ENVASADO DE PRODUCTOS ESTÉRILES-EVALUACIÓN DE INTEGRIDAD Este capítulo informativo trata sobre el mantenimiento de la integridad microbiológica del envase de productos estériles hasta el momento de la utilización de su contenido. El ámbito de aplicación de este capítulo incluye los sistemas de envase y cierre de productos farmacéuticos y el envase de barrera estéril de dispositivos médicos, incluidos los productos utilizados para el diagnóstico in vitro. En este capítulo también se tratan los sistemas de envase-cierre y los sistemas de envases de barrera especialmente diseñados o nuevos, que por lo general son más complejos que los sistemas clásicos de envase y administración. Es necesario establecer la integridad del producto estéril para garantizar el mantenimiento de dos condiciones sumamente importantes para el producto: la totalidad de los atributos del producto declarados en la etiqueta y la esterilidad del producto antes de su uso. Las pruebas para determinar la integridad del envase del producto se realizan de forma continua durante toda la vida útil del producto. Generalmente, estas pruebas de integridad deben llevarse a cabo en tres etapas: (1) el desarrollo inicial del sistema de envase del producto, (2) la fabricación de rutina y (3) la evaluación de estabilidad durante la vida útil del producto. Por lo general, durante el desarrollo inicial del envase se realizan estudios físicos y microbiológicos para evaluar la integridad. Ésta es la etapa en la que puede obtenerse información comparativa de los métodos físicos y de desafío microbiológico. Durante la fabricación de rutina, se pueden realizar mediciones físicas de acuerdo con un plan de muestreo establecido para determinar si el envase, el sistema de cierre, o ambos funcionan de manera coherente dentro de los intervalos de aceptación predeterminados para el desempeño. Las pruebas de integridad del envase realizadas durante las evaluaciones de estabilidad a lo largo de la vida útil del producto son pruebas físicas que confirman la integridad del sistema de envase, respaldadas por valores de aceptación establecidos durante el desarrollo del envase. Las pruebas para detectar la entrada de microorganismos pueden ser innecesarias para la evaluación de estabilidad del producto durante su vida útil si en las pruebas físicas y microbiológicas comparativas realizadas durante la etapa de desarrollo del envase se han establecido valores físicos de aceptación que descartarían la entrada de microorganismos. La integridad del envase de los productos debe volver a confirmarse cuando haya cambios importantes en el diseño y los materiales del envase o siempre que cambien las condiciones del proceso de fabricación, incluidas las condiciones de esterilización.
ETAPA DE DESARROLLO DEL ENVASE DEL PRODUCTO Las pruebas realizadas en la etapa de desarrollo suelen ser intensivas, porque establecen las limitaciones para el diseño del producto antes de su fabricación a escala industrial. En esta etapa, se selecciona un diseño adecuado para el envase en relación con el uso final del producto y se definen las variables del proceso de fabricación. Se evalúa el efecto del diseño y las variables
USP 39
Información General/ (1207) Envasado de Productos Estériles-Evaluación de Integridad 1745
del proceso sobre el mantenimiento de la integridad del envase. Se evalúan asimismo las tolerancias aproximadas del diseño para garantizar la esterilidad de la vía de recorrido del líquido o la esterilidad del contenido durante el procesamiento y antes de su uso. Las evaluaciones de la integridad del envase deben tener en cuenta las condiciones de máximo estrés que se verifiquen durante los procesos de fabricación y esterilización. Las pruebas también deben validar la integridad del diseño cuando se exponga a condiciones extremas previstas de almacenamiento, transporte y distribución. Durante esta fase, se desarrollan métodos físicos para evaluar la integridad del envase propuesto y que posteriormente se utilizarán en las pruebas rutinarias durante la fabricación o en las pruebas de estabilidad del producto comercializado.
ETAPA DE FABRICACIÓN DE RUTINA Durante esta etapa, se supervisa el mantenimiento de las condiciones especificadas de producción y de ingeniería, así como las condiciones microbiológicas, mediante procedimientos operativos estándares. Los métodos de prueba físicos, ya sean en línea o no, pueden utilizarse de manera intermitente como complemento de las mediciones de control del proceso para garantizar que los valores de envasado del producto se mantienen dentro de los límites aceptables establecidos durante la etapa de desarrollo del producto. Durante la fabricación de rutina, cuando los procesos críticos de producción están bien controlados, puede que no sea necesaria la supervisión continua de la integridad de cada unidad de producto o de la integridad del envase de liberación del producto terminado. Normalmente no se realizan pruebas microbiológicas de integridad del envase durante la fabricación de rutina que se desarrolla dentro de los límites previamente especificados para producir un envasado aceptable.
ETAPA DE ESTABILIDAD DEL PRODUCTO COMERCIALIZADO Se pueden utilizar métodos de prueba físicos para evaluar los sistemas de envases incluidos en el programa de estabilidad de la vida útil del producto comercializado. Tales sistemas deben evaluarse en condiciones de estabilidad, al comienzo de la vida útil del producto, así como en la fecha de caducidad y en otros momentos e intervalos definidos por las guías o requisitos reglamentarios. La sola realización de la prueba de esterilidad del producto, cuando esta prueba forma parte del programa de estabilidad del envase, no asegurará el mantenimiento de la integridad del envase durante toda la vida útil del producto.
PRUEBAS FÍSICAS Y MICROBIOLÓGICAS Durante la evaluación inicial del envase del producto se emplean con frecuencia pruebas físicas y microbiológicas. 1 Las pruebas físicas para evaluar la integridad del envase del producto presentan varias ventajas sobre las pruebas microbiológicas, dependiendo del método de prueba y del envase que se evalúa. Estas ventajas pueden incluir una mayor sensibilidad, facilidad de uso, rapidez de realización de la prueba o un menor costo. Las pruebas físicas se pueden utilizar para evaluar el envase del producto durante todo su ciclo de vida, para garantizar que todos los atributos del producto estén dentro de los límites óptimos predefinidos. En las etapas iniciales del desarrollo del envase del producto también se debe considerar la realización de pruebas para detectar la entrada de microorganismos, a la par de las pruebas físicas. Sin embargo, para evaluar el envase del producto en un programa de estabilidad durante la vida útil del producto comercializado, se prefiere la utilización de métodos de pruebas físicas con sensibilidad comparable o superior a la de los métodos microbiológicos. Los métodos de prueba físicos permiten una rápida evaluación de la integridad del envase durante las pruebas rutinarias sobre un gran número de muestras de estabilidad de un producto.
Comparación de Métodos Microbiológicos y Físicos Una evaluación comparativa debe determinar si podría tener lugar una intrusión o entrada de microorganismos al interior del envase del producto en los intervalos de valores fijados para la prueba de integridad física que se han considerado aceptables para el producto terminado. Esta determinación debe basarse en una comparación entre los datos microbiológicos y los valores obtenidos a partir del método de prueba de integridad física. La comparación de la prueba de integridad física con la prueba para la detección de la entrada de microorganismos, con objeto de evaluar la integridad del envase del producto, se podrá realizar mediante comparación directa o mediante estudios que demuestren que la prueba física detecta defectos que son demasiado pequeños como para permitir el paso de los microorganismos. Debido a su diseño o a su composición material, es posible que el sistema de envase de un producto no permita o no proporcione respuestas graduadas para las pruebas físicas cuando se crea una gama de defectos en el envase. En algunas situaciones, incluso cuando se crean defectos artificiales en un sistema de envase, el intervalo de valores resultante de la prueba física puede permanecer casi invariable. En otras palabras, el método de prueba puede proporcionar una medida cualitativa más que cuantitativa de las fugas del envase. Asimismo, la entrada de microorganismos puede no suceder hasta que se hayan creado defectos físicos exagerados en el envase. En tales casos, no es posible establecer una correlación directa entre la entrada de microorganismos y una serie de intervalos de valores físicos. Cuando esto ocurre, los resultados de las pruebas se convierten en simples resultados de aprobación o rechazo de un envase con defectos conocidos. 1 En el Informe Técnico Nº 27 de 1998, Pharmaceutical Package lntegrity, de la Parenteral Drug Association se presenta una revisión de los métodos físicos y microbiológicos relacionados con la evaluación de la integridad del envase.
1746 (1207) Envasado de Productos Estériles-Evaluación de Integridad / Información General
USP 39
Selección de Métodos de Evaluación Los métodos físicos y microbiológicos utilizados en las pruebas de integridad del envase del producto deben tener en cuenta el diseño del sistema de cierre, el método de fabricación, incluido el proceso de esterilización, y el uso al que está destinado el producto. Es posible que un método físico o microbiológico en particular no se pueda aplicar a todos los sistemas de envases de productos. Durante las evaluaciones de integridad iniciales de un sistema de envase se podrán utilizar varias pruebas físicas. Estas pruebas físicas pueden incluir, entre otras, pruebas de pérdida de presión y vacío, pruebas de inmersión en colorantes, pruebas de indicadores químicos líquidos, ionización gaseosa de envases vaciados, detección de fugas por alta tensión en envases plásticos o de vidrio, examen visual para detectar grietas en el vidrio y análisis de la cámara gaseosa del envase o de fuga de gases. Otras pruebas que pueden ser valiosas para evaluar la calidad del sellado del envase incluyen la prueba de torsión de la tapa a rosca, la prueba de fuerza de sellado residual del tapón elastomérico o la prueba de resistencia de termosellado. Las pruebas microbiológicas pueden incluir pruebas de inmersión del cierre para los sistemas de envases rígidos, pruebas de transporte inoculado para determinados envases y pruebas de desafío aerobiológico para envases con barreras tortuosas.
Sistemas de Envase-Cierre de Doble Función 2 Los sistemas de envase-cierre de doble función están caracterizados por la adición de una o más funciones a las propias del envase, y la evaluación de su integridad requiere una consideración especial. Por ejemplo, en el caso de envases pequeños, flexibles o rígidos, con un componente agregado en forma de dispositivo que permite la inyección y la administración directa del fármaco al paciente, agrega a la función del envase una función de administración. Así, con frecuencia, uno de los compartimientos del sistema de envase-cierre de doble función está diseñado para contener al fármaco o la solución antes del uso o de la activación del sistema-compartimiento de contención del producto. Otro compartimiento, de función y diseño diferentes, o bien administra directamente el producto desde la porción del envase que lo contiene hacia una vía de líquidos para la inyección directa del producto al paciente o bien se comunica con una vía estéril de otro dispositivo de acceso. Por ejemplo, una jeringa prellenada contiene una solución (compartimiento de contención) y un dispositivo (compartimiento para la administración) separado físicamente del compartimiento de contención y que se utiliza para administrar directamente el fármaco al paciente. Por lo tanto, los sistemas de envase-cierre de doble función suelen tener al menos dos compartimientos que requieren propiedades de barrera microbiológica, y se debe demostrar la integridad del envase, después de la esterilización y/o del llenado aséptico, para ambos compartimientos. En muchos casos, las distintas porciones del sistema de doble función requieren diferentes métodos de prueba de integridad. La selección del método de prueba de integridad se realiza principalmente sobre la base de los objetivos previstos o los requisitos de funcionamiento del compartimiento en cuestión. Por ejemplo, el compartimiento de contención del fármaco o solución del sistema de envase-cierre de doble función tiene que estar cerrado o sellado de manera que impida la fuga del producto o la entrada de microorganismos durante y después del proceso de fabricación (ver Selección de Métodos de Evaluación). Por otra parte, la porción de administración del sistema de envase-cierre de doble función con frecuencia contiene una vía para el líquido que está vacía durante el proceso de esterilización o de llenado aséptico, y que está destinada a permanecer seca hasta que se active la porción de contención del producto antes de su uso. Una cubierta, una funda o quizá una tapa diseñada para proporcionar ventilación durante la esterilización y el almacenamiento protegen el compartimiento para la administración, de la entrada de microorganismos aerotransportados a lo largo de la vida útil del artículo. Sin embargo, esta porción del dispositivo no suele estar diseñada para evitar la entrada de líquidos. La entrada de líquidos se puede evitar mediante un envase secundario o gracias al propio diseño físico del sistema. La prueba de integridad microbiológica de la porción de administración del sistema de envase-cierre de doble función puede incluir un método microbiológico sin inmersión o una prueba de integridad física. La prueba microbiológica incluiría, por ejemplo, un desafío microbiológico con aerosol bajo cambios de presión definidos.
(1208) PRUEBAS DE ESTERILIDAD-VALIDACIÓN DE SISTEMAS AISLADORES Este capítulo suministra guías para la validación de sistemas aisladores utilizados en las pruebas de esterilidad de artículos farmacopeicos. [NOTA-En el contexto de este capítulo, el término "descontaminado" se refiere a un elemento o superficie que se ha sometido a un proceso de eliminación de la biocarga viable.] Los aisladores-dispositivos que crean entornos controlados en los que se realizan las pruebas de esterilidad farmacopeicase han utilizado desde mediados de la década de los años ochenta. A los aisladores se les suministra aire a través de un filtro HEPA o superior, y pueden descontaminarse de manera reproducible. Los aisladores cerrados, los cuales son sistemas que no 2
Para obtener información adicional, ver la Norma ANSl/AAMl/150 11607-2000, 2da edición, Packaging for Terminally Sterilized Medical Devices.
USP 39
Información General/ <1208) Pruebas de Esterilidad-Validación de Sistemas Aisladores 1 747
tienen una abertura directa al ambiente externo, son los que generalmente se usan para las pruebas de esterilidad, aunque pueden usarse aisladores abiertos que permitan la salida de materiales a través de una abertura definida, impidiendo la entrada de contaminación mediante sobrepresión de aire. Los aisladores cerrados usan sólo interfases descontaminadas o un puerto de transferencia rápida para la transferencia de materiales. Los aisladores se construyen con plásticos flexibles (como por ejemplo cloruro de polivinilo), plásticos rígidos, vidrio o acero inoxidable. Los sistemas aisladores protegen el artículo de prueba y los suministros para evitar su contaminación durante la manipulación, eliminando esencialmente el contacto directo entre el analista y los artículos de prueba. Todas las transferencias de material al interior y exterior del aislador se realizan de manera aséptica mientras se mantiene una separación completa del ambiente. Las manipulaciones asépticas en el interior del aislador se realizan mediante semitrajes (half-suits), que son componentes flexibles de la pared del aislador y que permiten a los operadores una amplia gama de movimientos dentro del aislador, o mediante guantes y mangas. No es necesario que los operadores usen ropa especial para cuartos limpios cuando llevan a cabo las pruebas de esterilidad dentro de los aisladores; la ropa normal de laboratorio es adecuada, aunque con frecuencia se usan guantes estériles debajo de los guantes del aislador como medida de precaución adicional contra la contaminación que entra al recinto del aislador y por razones de higiene. El interior del aislador se trata con sustancias químicas esporicidas que eliminan toda la biocarga viable sobre las superficies expuestas.
DISEÑO Y CONSTRUCCIÓN DEL AISLADOR Sistemas de Ventilación Los aisladores utilizados para pruebas de esterilidad están equipados con filtros de retención microbiana (se requieren filtros HEPA o superiores). En reposo, el aislador cumple con los requisitos de calidad del aire para un área de Clase 5 ISO según se define en ISO 14644-1 hasta 14644-3* (ver Control Microbiológico y Monitoreo de Ambientes para Procesamiento Aséptico (1116)). No obstante, el aislador no necesita cumplir con las condiciones de la Clase 5 durante una operación que puede generar partículas, y no existen requisitos relativos a la velocidad del aire o al coeficiente de intercambio de aire. El aislador debe estar lo suficientemente sellado durante la descontaminación de manera que la diseminación de vapores o gases esporicidas en el ambiente que lo rodea se mantenga a niveles adecuadamente bajos. Cuando existen aberturas directas hacia el ambiente exterior, las condiciones de sobrepresión constante del aire mantienen las condiciones de esterilidad dentro del aislador. En general, ambos tipos de aisladores, abiertos y cerrados, se mantienen a presión positiva relativa al ambiente que los rodea, y la sobrepresión más común es de 20 Pa o más. El usuario nunca debe exceder la presión máxima recomendada por el fabricante. El flujo de aire dentro de los aisladores utilizados para las pruebas de esterilidad es unidireccional o turbulento.
Puertas y Puertos de Transferencia Los aisladores pueden conectarse a un descontaminador "de paso" o a un aislador de transferencia para posibilitar la recepción directa de medios estériles, líquidos de dilución estériles y suministros estériles desde el descontaminador al sistema aislador. Los puertos para transferencia rápida (PTR) permiten conectar dos aisladores entre sí, p.ej. la estación de trabajo y el aislador de transferencia, para que los suministros se puedan trasladar de manera aséptica de un aislador a otro. Las conexiones asépticas entre dos aisladores o entre un aislador y un envase equipado con un PTR pueden realizarse en ambientes no clasificados utilizando PTR. Las superficies no estériles de los PTR se conectan mediante bridas o aros de fijación. Un montaje de juntas comprimidas proporciona un sellado hermético, evitando así la entrada de microorganismos. Cuando las dos bridas de un PTR se unen para formar un paso hermético, queda expuesta una banda estrecha de la junta obturadora que podría albergar contaminación microbiana. Esta junta expuesta se debe desinfectar de forma rutinaria inmediatamente después de hacer la conexión y antes de que los materiales se transfieran a través de los PTR. Se debe utilizar una buena técnica aséptica al transferir los materiales y se debe evitar tocar la junta obturadora con los materiales que se están transfiriendo o con los guantes. El mantenimiento preventivo y la lubricación de los montajes de juntas se realiza conforme a las recomendaciones del fabricante de los PTR. Las juntas de los PTR se cambian con la frecuencia recomendada y se monitorean periódicamente para detectar cualquier tipo de daño, ya que las juntas cortadas o gastadas no pueden proporcionar un sellado realmente hermético.
Selección de una Ubicación para el Aislador Los aisladores para las pruebas de esterilidad no tienen que estar instalados necesariamente en un cuarto limpio clasificado, pero es importante situar el aislador en un área de acceso limitado para el personal no esencial. La ubicación apropiada permite que alrededor del aislador haya un espacio adecuado para mover los aisladores de transferencia, para la organización de los materiales y para llevar a cabo el mantenimiento general. No es necesario realizar un monitoreo ambiental del cuarto que rodea al aislador.
* Normas Internacionales de la lnternational Organization for Standardization (ISO, por sus siglas en inglés) 14644-1, 14644-2, 14644-3 y 14644-7
1748 (1208) Pruebas de Esterilidad-Validación de Sistemas Aisladores/ Información General
USP 39
El control de la temperatura y la humedad del cuarto es importante para la seguridad y comodidad del operador y es crucial para el uso eficaz de ciertas tecnologías de descontaminación. Se prefieren condiciones de temperatura uniformes en el cuarto cuando se empleen métodos de descontaminación sensibles a la temperatura. Se debe tener cuidado de situar el aislador de manera que se eviten puntos fríos que podrían resultar en condensación excesiva cuando se usan vapores que condensan para la descontaminación.
VALIDACIÓN DEL SISTEMA AISLADOR El sistema aislador debe ser validado antes de su uso en pruebas de esterilidad que forman parte del procedimiento de liberación de lotes. Para verificar que el sistema aislador y todo el equipo asociado son adecuados para las pruebas de esterilidad, se efectuarán estudios de validación en tres etapas: calificación de la instalación (CI), calificación operativa (CO) y calificación de funcionamiento (CF). Los siguientes apartados contienen puntos que deben considerarse para validar sistemas aisladores para pruebas de esterilidad. La asignación de funciones de prueba a una etapa determinada del programa de validación (es decir, CI, CO y CF) no es crucial, siempre y cuando se demuestre y se documente el funcionamiento correcto del aislador antes de su uso en los Ensayos farmacopeicos.
Calificación de la Instalación (CI) La etapa de CI incluye una descripción detallada de las características físicas del sistema, como por ejemplo las dimensiones, la configuración interna y los materiales de construcción. La disposición de la unidad se diagrama indicando claramente, y con sus dimensiones, las interfases y los sistemas de transferencia. Se verifica que los servicios generales, como por ejemplo el suministro de aire, de vacío, el sistema de extracción externo y el control de temperatura y humedad, se ajusten a las especificaciones del diseño. Asimismo, se describen con detalle los demás equipos utilizados con el sistema aislador; si se hacen revisiones a las especificaciones de diseño, éstas también se incluyen. Los manuales del equipo y sus copias se catalogan y se archivan en un lugar de fácil acceso para su consulta y revisión. Se verifica que los planos se ajusten a las especificaciones de diseño. Todos los planos y los diagramas de proceso e instrumentación se catalogan y se archivan en lugares donde sea fácil consultarlos. Se revisará toda la documentación para verificar que refleja con exactitud los atributos claves del sistema instalado. Esto sirve como referencia general para determinar si el sistema aislador cumple con las especificaciones de diseño y los requisitos de instalación. Los problemas potenciales de los equipos o de control de proceso, que podrían ocasionar fallas en el sistema durante el funcionamiento, se identifican y documentan durante el análisis en la modalidad de fallas y el análisis de riesgos. El sistema se modifica, si fuera necesario, para minimizar el riesgo de fallas, y se establecen métodos para los puntos de control críticos. Los resultados de la CI se resumen en un Informe de Calificación de la Instalación. Se recomienda la siguiente documentación. EQUIPOS Se realiza una lista de equipos con sus respectivas especificaciones de diseño. El informe de CI verifica que el equipo que cumple con las especificaciones de diseño apropiadas se recibió y se instaló de acuerdo con los requisitos del fabricante. MATERIALES DE CONSTRUCCIÓN Se comprueba que los materiales de construcción de los componentes críticos del sistema se ajustan a las especificaciones de diseño. Se verifica la compatibilidad del método de descontaminación previsto con los materiales de construcción. INSTRUMENTOS Se realiza un listado de los instrumentos del sistema, incluido su estado de calibración. ESPECIFICACIONES DE LOS SERVICIOS Se comprueba que todos los servicios necesarios para el funcionamiento del sistema-según se definen en los manuales de uso y en los diagramas de proceso e instrumentación-están disponibles y cumplen con las especificaciones del diseño. Se inspeccionan todas las conexiones entre los sistemas de servicios y el sistema aislador, y se verifica que estas conexiones se ajustan a las especificaciones.
USP 39
Información General/ (1208) Pruebas de Esterilidad-Validación de Sistemas Aisladores 1 749
CERTIFICACIÓN DE FILTROS Se prueban y certifican los filtros HEPA y cualquier otro filtro de retención microbiana; se incluyen copias de los resultados de las pruebas y de los certificados en el informe de CI. Se revisan las solicitudes de compra y se verifica que el sistema de filtrado de aire cumple con las especificaciones. PROGRAMAS INFORMÁTICOS Se realizará un listado de todos los programas informáticos asociados con el sistema aislador; se indicará el nombre, las dimensiones y el número de revisión del archivo. Se verifica el correcto etiquetado de los discos maestros de la computadora y se almacenan de manera segura.
Calificación Operativa (CO) En la etapa de CO se verifica que el sistema aislador funciona de acuerdo con las especificaciones operativas. COMPROBACIÓN DEL DESEMPEÑO OPERATIVO Esta prueba verifica que todas las funciones de alerta y alarma cumplen con sus respectivas especificaciones funcionales. Se verifica la capacidad del sistema para cumplir con todos los puntos establecidos y los parámetros ajustables. COMPROBACIÓN DE LA INTEGRIDAD DEL AISLADOR La integridad del aislador se mantiene durante todas las condiciones normales de funcionamiento. Se realiza una prueba de fugas para verificar que se cumplen las especificaciones funcionales del fabricante y para garantizar la seguridad antes de cargar el aislador con una sustancia química esporicida descontaminante. Para proporcionar protección contra la contaminación accidental, los aisladores funcionan con una presión positiva adecuada durante el funcionamiento normal. Los estudios de validación deben demostrar que el valor establecido de presión de aire puede mantenerse y controlarse durante el funcionamiento del sistema. VERIFICACIÓN DEL CICLO DE DESCONTAMINACIÓN Se verifica el ciclo de descontaminación que es la función del equipo de descontaminación conjuntamente con el (los) aislador(es). Se pueden utilizar distintos métodos de descontaminación para eliminar la biocarga de los sistemas aisladores y los suministros. Entre las sustancias químicas que se han utilizado para tratar los aisladores están el ácido peracético, el dióxido de cloro, el ozono y el peróxido de hidrógeno; cada uno tiene distintos requisitos relativos a las condiciones de exposición y al control del proceso. Es crucial que se cumplan los requisitos operativos del fabricante para el método de descontaminación seleccionado y que éstos se describan en las especificaciones de funcionamiento. La temperatura dentro del aislador también es importante, especialmente para la descontaminación con vapor de peróxido de hidrógeno, en donde es crucial mantener la concentración en relación con el punto de condensación. Con algunas sustancias químicas esterilizantes como el dióxido de cloro y el ozono, se requiere la adición de humedad al aislador antes de la descontaminación. Cuando sea necesaria una humedad relativa elevada, la capacidad para controlarla debe ser verificada durante la CO. También es importante verificar la concentración y distribución de la sustancia química descontaminante. Cuando se aplique en forma de vapor o de gas, la distribución puede evaluarse empleando indicadores químicos, métodos espectroscópicos o detectores electrónicos. Los métodos de descontaminación de gas y de vapor pueden requerir ventiladores en el aislador para distribuir la sustancia química de manera uniforme. La ubicación y la orientación de estos ventiladores se ajustan para asegurar la distribución óptima del aire. Si el aislador utiliza un sistema de recirculación de flujo de aire unidireccional, puede que no se requieran los ventiladores de distribución; sin embargo, esto se debe evaluar caso por caso. Dado que las estanterías, los equipos, los montajes de guantes-mangas y los semi-trajes (half-suits) afectan los patrones de distribución, los controles de distribución se realizan con el aislador completamente cargado con equipos y suministros, y se define y documenta la instalación de estas unidades. Muchas instalaciones utilizan aisladores de transferencia más pequeños como unidades portátiles de descontaminación de superficies. En estos aisladores de transferencia, los artículos de prueba y los suministros se tratan químicamente para eliminar la biocarga antes de su transferencia a través de un PTR al interior del aislador de prueba. Se define su configuración de carga y se revisan y verifican los planos de configuración durante la CO. [NOTA-Las sustancias químicas descontaminantes utilizadas en los aisladores actúan sobre la superficie de los materiales; por lo tanto, toda superficie que quede tapada no será tratada y podría contener biocarga viable. Se deben tomar medidas de precaución especiales para tratar con esporicida las superficies que se sabe están tapadas y pudieran destaparse durante las pruebas de esterilidad.]
1750 (1208) Pruebas de Esterilidad-Validación de Sistemas Aisladores/ Información General
USP 39
Los agentes descontaminantes tienen que retirarse del aislador después del tiempo de exposición, lo que se logra gracias a una corriente de aire nuevo, suministrada ya sea a través del equipo de descontaminación o mediante el uso del sistema de ventilación del aislador. La ventilación se logra en un circuito abierto, en el cual el gas se ventea a través de un orificio de ventilación hacia la atmósfera, o en un circuito cerrado, en donde la sustancia química es retirada y destruida por el equipo de descontaminación. Se comprueba el sistema de ventilación; si se utiliza una configuración de circuito abierto, se comprueba el flujo y la seguridad del sistema de venteo. DESARROLLO DEL CICLO DE DESCONTAMINACIÓN Cuando se termina la CO, tiene lugar el desarrollo del ciclo de descontaminación para establecer los parámetros necesarios para el control del proceso durante los ciclos de descontaminación de rutina. Cualquiera de los métodos generalmente utilizados en la industria para la validación de los procesos de descontaminación-incluidos los métodos basados en la biocarga, ciclos fraccionados y de sobremuerte-son adecuados. El proceso de descontaminación se desafía con indicadores biológicos (IB). Se debe conocer la población de esporas y la resistencia de los IB a las condiciones de descontaminación aplicadas. Siempre que sea posible, se realiza una estimación del valor D para cada sistema de IB, o como alternativa, se obtiene una curva de supervivencia para el sistema de IB (ver Indicadores Biológicos-Pruebas de Resistencia (55)); es aceptable que el proveedor de los IB proporcione el valor D.
Calificaciones de Funcionamiento (CF) En la etapa de CF se verifica que el sistema funcione de acuerdo con las especificaciones requeridas por su operador. Al concluir la etapa de CF, se verifica la eficacia del ciclo de descontaminación y, si correspondiera, la suficiencia del venteo de la sustancia química descontaminante. Todos los datos de CF se resumen, revisan y archivan adecuadamente. VERIFICACIÓN DE LIMPIEZA En general, la limpieza no es crucial para realizar las pruebas de esterilidad. Sin embargo, los residuos de producto son motivo de preocupación cuando se prueban varios productos distintos, particularmente por los agentes antimicrobianos agresivos, ya que estos materiales podrían interferir en la capacidad de las pruebas subsiguientes para detectar niveles bajos de contaminación en el producto. La preocupación acerca de la contaminación con el producto aumenta cuando se trata de un polvo que es inherentemente anti microbiano, ya que los polvos se diseminan más fácilmente. Limpiar hasta un nivel en donde no exista contaminación visible, es suficiente para los sistemas aisladores para pruebas de esterilidad, y es un requisito adecuado de especificación para el operador. Documentar el método, la frecuencia, el equipo y los materiales de limpieza utilizados para limpiar el aislador. VALIDACIÓN DE LA DESCONTAMINACIÓN Se tratan las superficies interiores del aislador, los equipos dentro del aislador y los materiales introducidos en el aislador para eliminar toda la biocarga. Los métodos de descontaminación utilizados para tratar aisladores, artículos de prueba y suministros para pruebas de esterilidad pueden alcanzar de forma reproducible una reducción mayor de tres unidades logarítmicas en la biocarga de un indicador biológico de alta resistencia (IB; ver Indicadores Biológicos para Esterilización (1035)), según se verifica por los métodos de fracción negativa o de análisis de muerte total. Los estudios de análisis de muerte total son adecuados para IB con una población de 1Q3 esporas por unidad, mientras que los estudios de fracción negativa son apropiados para IB con una población de 105 o superior. Se utiliza un número suficiente de IB para probar la reproducibilidad estadística y la distribución adecuada del agente descontaminante. Se presta particular atención a las áreas que pueden causar problemas con relación a la concentración del agente. Se puede requerir un número mayor de IB en los aisladores que se cargan con gran cantidad de equipos y materiales. La capacidad del proceso para lograr de manera reproducible una muerte microbiana mayor de tres unidades logarítmicas se confirma en tres estudios de validación consecutivos. El operador establecerá una periodicidad para la redescontaminación del aislador. La periodicidad puede indicar plazos cortos (pocos días) o largos (varias semanas), dependiendo de la dificultad del mantenimiento de la esterilidad (ver Mantenimiento de la Asepsia en el Entorno del Aislador).
VERIFICACIÓN DE LA INTEGRIDAD DEL ENVASE Algunos materiales son afectados por los agentes descontaminantes, lo que puede dar como resultado la inhibición del crecimiento microbiano. Son motivo de preocupación la penetración de los agentes descontaminantes dentro de los envases de los productos, los accesorios tales como los conjuntos de filtros y tuberías o cualquier material que pudiera entrar en contacto con los productos, los medios o los líquidos de dilución utilizados en la prueba de esterilidad. El operador es responsable de verificar que los envases, medios y suministros no resulten afectados por el proceso de descontaminación. Los tubos con tapa de rosca, los frascos o los viales con tapones de goma y sellados con precintos han demostrado ser muy resistentes a la pene-
USP 39
Información General/ (1208) Pruebas de Esterilidad-Validación de Sistemas Aisladores 1751
tración de los agentes descontaminantes habituales. Envolver los materiales en papel de aluminio o colocarlos en un envase sellado evitará el contacto con el agente descontaminante; sin embargo, estos procedimientos también pueden ocasionar que algunas superficies no se descontaminen. En algunos casos, puede que sea necesario el uso de ciclos de descontaminación de duración más corta y concentraciones reducidas para minimizar la penetración de agentes descontaminantes dentro del envase o recipiente. Pueden ser aceptables ciclos que proveen valores de muerte menores de tres unidades logarítmicas de BI resistentes siempre que el análisis microbiológico del ambiente demuestre que el (los) aislador( es) se encuentra(n) exento(s) de biocarga recuperable. En muchos casos, el operador elegirá tratar las superficies de los envases del producto en análisis con el agente descontaminante para minimizar la probabilidad de que entre biocarga en el aislador. El operador es responsable de demostrar, a través de estudios de validación, que la exposición de los envases de producto al agente descontaminante no influye negativamente en la capacidad de la prueba de esterilidad para detectar niveles bajos de contaminación dentro de estos artículos de prueba. Se recomienda examinar la capacidad del envase para resistir la contaminación utilizando procedimientos de prueba tanto químicos como microbiológicos. Las pruebas de validación de bacteriostasis y fungistasis se deben efectuar utilizando artículos de prueba reales que hayan sido sometidos a todas las etapas del proceso de descontaminación (ver Pruebas de Esterilidad (71 )). Esto se aplica tanto a los envases de dispositivos médicos como a los envases y sistemas de cierre de productos farmacéuticos. En los estudios de validación se debe determinar si los medios de prueba de esterilidad y los medios de control ambiental cumplen con los requisitos de la Prueba de Promoción de Crecimiento de Organismos Aerobios, Anaerobios y Hongos en Pruebas de Esterilidad (71 ).
MANTENIMIENTO DE LA ASEPSIA EN EL ENTORNO DEL AISLADOR Se debe validar la capacidad del sistema aislador para mantener un entorno aséptico durante un período operativo definido. Además, se debe implementar un programa de monitoreo microbiológico para detectar el mal funcionamiento del sistema aislador o la presencia de contaminación accidental dentro del aislador. El monitoreo microbiológico normalmente implica el uso de un programa de muestreo rutinario, que puede incluir, por ejemplo, un muestreo después de la descontaminación el primer día de funcionamiento y un muestreo el último día del período proyectado para el mantenimiento de la asepsia. Se puede realizar un muestreo periódico durante todo el período de uso para demostrar el mantenimiento de la asepsia dentro del aislador. Se puede realizar un monitoreo de las superficies dentro del aislador utilizando placas de contacto para superficies planas o bien hisopos para superficies irregulares. Sin embargo, puesto que los residuos de los medios podrían suponer un riesgo para la asepsia del aislador, es mejor efectuar estas pruebas al final del periodo de prueba. Si se efectúa de manera concurrente con las pruebas, se debe poner mucha atención para asegurar que se eliminan todos los residuos de las superficies del aislador, y que éstas se limpian y desinfectan cuidadosamente. Se podrán utilizar muestras activas de aire y placas de sedimentación, pero puede que no sean lo suficientemente sensibles para detectar los niveles tan bajos de contaminación presentes dentro del recinto del aislador. Una ruta posible para que la contaminación penetre en el aislador es durante la introducción de suministros y muestras en el recinto. Es de vital importancia validar que todos los materiales introducidos en el recinto del aislador estén exentos de contaminación microbiana, así como lo es la inspección periódica de las juntas de obturación para detectar imperfecciones que podrían permitir la entrada de microorganismos. Los conjuntos de guantes y semitrajes (half-suits) son otra fuente posible de contaminación microbiana. Los guantes son motivo especial de preocupación, ya que se utilizan para manejar tanto los materiales para pruebas de esterilidad como los artículos de prueba. En la selección de guantes y mangas debe considerarse la resistencia a la punción y a la abrasión. Los materiales Hypalon son resistentes a los esporicidas químicos empleados en la descontaminación de aisladores y también a las punciones, y se encuentran disponibles en distintos espesores para proveer un grado de sensación tactil adecuado a través de los guantes, a la vez que mantienen su integridad. Las filtraciones muy pequeñas en los guantes son difíciles de detectar hasta que el guante se estira durante el uso. Existen varios detectores de filtraciones de guantes comercialmente disponibles; el operador se asegura de que los detectores analicen el guante bajo condiciones tan similares como sea posible a las condiciones de uso reales. Las pruebas microbiológicas se utilizan para complementar o sustituir a las pruebas físicas. [NOTA-Las "placas de toque dactilar" estándar puede que no sean lo suficientemente sensibles para detectar niveles bajos de contaminación. La inmersión de los guantes en agua de peptona al O, 1% seguida de la filtración del diluyente y la siembra en placa con medio de cultivo puede detectar pérdidas de integridad en los guantes que de otra manera pasarían inadvertidas.] La realización de un monitoreo continuo de partículas no viables dentro del recinto del aislador es ideal, ya que puede detectar rápidamente fallas en el filtro. Una segunda opción es realizar un monitoreo periódico utilizando un equipo de conteo de partículas portátil. El muestreo de partículas se debe realizar de manera que no plantee ningún riesgo para el mantenimiento de la asepsia dentro del aislador.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS DE LAS PRUEBAS DE ESTERILIDAD Es muy improbable que se obtenga un falso positivo en una prueba de esterilidad en un aislador validado y que funciona adecuadamente si se elimina la biocarga del interior del aislador con un alto grado de garantía, si los guantes, mangas y semitrajes (half-suits) están exentos de filtraciones, y si los PTR funcionan correctamente. No obstante, los aisladores son dispositi-
1 752 (1208) Pruebas de Esterilidad-Validación de Sistemas Aisladores / Información General
USP 39
vos mecánicos y sigue siendo necesaria la utilización de buenas técnicas de asepsia. La decisión de invalidar un falso positivo se tomará solamente después de cumplir totalmente con los requisitos que se establecen en Observación e Interpretación de Resultados en Pruebas de Esterilidad (71 ).
CAPACITACIÓN Y SEGURIDAD Al igual que en el caso de las pruebas de esterilidad realizadas en cuartos limpios convencionales, los operadores deben estar capacitados para realizar los procedimientos específicos del aislador. El uso adecuado de técnicas asépticas es crucial para la realización de pruebas de esterilidad en aisladores, así como lo es en cuartos limpios. Por lo tanto, se requiere que todos los técnicos que realizan las pruebas de esterilidad estén capacitados en cuanto a las técnicas asépticas adecuadas. Todas las sesiones de capacitación y la evaluación del desempeño del operador se documentan en el historial de capacitación del individuo. Es necesario que todo el personal esté capacitado en los procedimientos de seguridad necesarios para el funcionamiento y mantenimiento del sistema de aislamiento. Se debe evaluar la seguridad del personal en el uso de un agente descontaminante. Las Hojas de Datos de Seguridad del Material (Material Safety Data Sheets), o documentos equivalentes, deben estar disponibles en el área inmediata al lugar donde se está utilizando el agente descontaminante. Se deben seguir todas las precauciones de almacenamiento y seguridad. Antes de que la unidad entre en servicio, se debe efectuar y documentar una inspección del aislador y todo el equipo asociado para verificar que estén operativamente listos con respecto a su seguridad.
(1209) ESTERILIZACIÓN-INDICADORES E INTEGRADORES QUÍMICOS Y FISICOQUÍMICOS INTRODUCCIÓN El Código Federal de Reglamentaciones, Parte 211, sección 211.165, en Buenas Prácticas de Fabricación para Productos Farmacéuticos Terminados, establece que: "Deben realizarse las pruebas de laboratorio apropiadas, según sea necesario, para cada partida de producto farmacéutico que debe estar exento de microorganismos inaceptables". La interpretación de esta declaración es que se exige una prueba alterna de control de laboratorio para determinar la esterilidad por cada partida de producto liberado paramétricamente. Una prueba de laboratorio apropiada para cada partida puede ser un indicador biológico, incluido en cada partida de producto completamente esterilizado (ver Indicadores Biológicos para Esterilización (1035)), o un indicador o integrador fisicoquímico. Este requisito también puede ser cumplido por un sistema primario de liberación del producto que incluya el registro documentado de sistemas de mediciones termométricas calibradas con un sistema de rastreo NIST y que demuestra un rendimiento de ±0,5º. La presencia de este capítulo en la USP no significa que los indicadores e integradores químicos sean requisitos primarios de liberación para productos de liberación paramétrica. Las mediciones registradas y documentadas de sistemas establecidos de medición termométrica y controladores de proceso asociados (que han sido calibrados y usados tanto durante estudios de validación inicial y periódica y en producción de rutina) pueden ser consideradas sistemas primarios de liberación de producto para la liberación paramétrica.
FUNCIONAMIENTO Los estándares de funcionamiento, dentro de lotes y entre lotes, de indicadores o integradores fisicoquímicos de un fabricante dado deben ser uniformes. No deben interactuar física o químicamente con ningún envase o producto cuando se los coloca junto al producto a esterilizar en la carga de esterilización, y no deben alterar la concentración, calidad, ni pureza del artículo esterilizado. Debe evaluarse la seguridad del personal que maneja los indicadores o integradores fisicoquímicos y, si es necesario, deben tomarse las precauciones adecuadas. Al igual que los indicadores biológicos, los indicadores químicos son considerados dispositivos de Clase 11 y se requiere que el fabricante del indicador obtenga una aprobación 51 OK del dispositivo antes de su uso comercial.
INDICADORES FISICOQUÍMICOS Los datos registrados de la ingeniería del proceso pueden ser suplementados por la presencia de un indicador fisicoquímico en cada partida esterilizada. Un indicador fisicoquímico se define como un dispositivo que responde en forma mensurable a uno o más parámetros críticos de esterilización. Se han desarrollado varias clases diferentes de indicadores, dependientes de medios químicos y fisicoquímicos, para supervisar los ciclos de esterilización. Algunos productos se emplean en un aparato de esterilización para controlar si el contenido se
USP 39
Información General/ (1209) Esterilización-Química y Fisicoquímica 1753
expuso a un factor seleccionado (p.ej., temperatura) del ciclo dado de esterilización, pero es posible que no muestren la duración o intensidad de dicha exposición. Los indicadores químicos y fisicoquímicos se usan para supervisar un parámetro físico de un aparato de esterilización y pueden colocarse en la parte exterior de los envases de los artículos a esterilizar, o pueden ser distribuidos dentro de la carga de esterilización. En este último caso, se puede evaluar hasta cierto punto el efecto del material de empaque y la configuración de la carga en el parámetro seleccionado.
INTEGRADORES FISICOQUÍMICOS Un integrador fisicoquímico se define como un dispositivo que responde a un parámetro crítico del proceso de esterilización, produciéndose un valor mensurable o cuantificable que puede relacionarse a alguna pauta de letalidad microbiana. Los integradores fisicoquímicos han sido diseñados para coincidir generalmente con la inactivación predecible de aquellas preparaciones de esporas en indicadores biológicos que tienen alta y definida resistencia al agente esterilizador. Los fabricantes de integradores fisicoquímicos deben proporcionar datos para demostrar que se cumplen las pruebas de características de funcionamiento de los integradores etiquetadas. Los usuarios de integradores fisicoquímicos deben verificar que los valores de medición específicos están directamente relacionados con la muerte microbiana en un ciclo de esterilización validado. Un integrador fisicoquímico indica si la combinación crítica de parámetros físicos de un ciclo de esterilización validado se ha cumplido o excedido. El integrador generalmente no se emplea como sustituto de un indicador biológico en el desarrollo y la validación de ciclos de esterilización. Si un integrador fisicoquímico muestra que ha logrado la combinación crítica de parámetros físicos de un ciclo de esterilización establecido, esto no debe considerarse equivalente a la inactivación de esporas de una variedad de indicadores biológicos. Sin embargo, el integrador fisicoquímico puede detectar si el proceso de esterilización fue demasiado prolongado, si fueron excesivas la temperatura o la concentración de gas, o si hubo una sobreexposición a la radiación. El lapso entre el tiempo mínimo y el tiempo máximo, o cualquier otro conjunto de parámetros especificado, se asemeja a los límites de tiempo de supervivencia y tiempo de letalidad para un indicador biológico. Este lapso no debe ser más amplio que el deseado para el parámetro especificado, pero puede ser menor si el fabricante puede lograr características de funcionamiento reproducibles con un intervalo menor. Incluso cuando se utiliza un aparato de esterilización con un rendimiento uniforme, pueden ocurrir casos donde las características de funcionamiento del integrador difieren de las declaradas en la etiqueta. Esto podría representar una diferencia entre las características de funcionamiento del aparato del usuario y las del aparato que el fabricante utiliza para verificar las declaraciones de la etiqueta. También se puede mostrar una mayor conformidad con las declaraciones de las etiquetas con cualquier aparato altamente desarrollado, como por ejemplo, el recipiente BIER.1. 2 Por lo tanto, el integrador exige sus propias precauciones de uso y tiene sus propios criterios de interpretación dentro de las características de funcionamiento. Las pruebas para características de funcionamiento de integradores fisicoquímicos incluyen la determinación, en condiciones definidas de (a) un tiempo máximo de exposición en el cual ninguna de las muestras indica que ha ocurrido una exposición adecuada al ciclo, y (b) un tiempo mínimo de exposición en el cual todas las muestras indican que ha ocurrido una exposición adecuada al ciclo. Un tiempo de exposición intermedio, en donde cerca de la mitad de las muestras presentan exposición adecuada, podría indicar una aproximación al punto final de exposición del integrador fisicoquímico. Dado que un indicador sólo refleja la interacción de los parámetros físicos de esterilización, no cambia con ninguno de los factores que puedan influenciar la resistencia de la carga microbiana en los productos a esterilizar (p.ej., resistencia de la progenie, población de esporas, sustrato del inóculo, aceite, sales, proteínas, o residuos o configuraciones), todos los cuales pueden proteger un área contaminada de la penetración del agente esterilizante. De allí que estos dispositivos sean inadecuados para desarrollar un ciclo. Existen, sin embargo, otros factores que pueden afectar un indicador biológico, que podrían también afectar un integrador fisicoquímico (p.ej., configuración que interfiere en el conjunto donde se colocó el integrador, variaciones en el cronometraje o en el control de temperatura, o falla del aparato para alcanzar la temperatura establecida o cumplir otros requisitos). Los defectos de funcionamiento del aparato de esterilización se pueden determinar mediante indicadores y de registros de temperatura, presión, tiempo de exposición, y concentración de gas, según corresponda. El integrador sólo puede indicar exposición inadecuada, adecuada, o excesiva, a una combinación de parámetros críticos de esterilización. Cuando un integrador muestra exposición inadecuada a los parámetros de esterilización, es necesario comprobar si los indicadores y los registros reflejan exactamente las condiciones de esterilización dentro de la cámara de esterilización. Las variaciones entre recipientes de esterilización, que podrían afectar la eficiencia de un ciclo de esterilización seleccionado, se pueden detectar por exposición paralela de varios integradores en distintas ubicaciones en cada carga de esterilización. Los integradores fisicoquímicos para esterilización por vapor están diseñados para reaccionar de manera predecible ante una combinación de parámetros físicos de esterilización: temperatura, presión de vapor y tiempo de exposición. Cierta desviación de uno o más de estos parámetros críticos, no compensada por modificación de otros parámetros, causa que el integrador indique falla para alcanzar los limites prefijados de integración.
1 Estándar para recipientes de vapor/BIER, 27 de Marzo de 1981, Asociación para el Avance de la Instrumentación Médica (AAMI), 3330 Washington Boulevard, Suite 400, Arlington, VA 22201-4598. 2 Estándar para recipientes BIER/EO, 27 de Marzo de 1992, Asociación para el Avance de la Instrumentación Médica (AAMI), 3330 Washington Boulevard, Suite 400, Arlington, VA 22201-4598.
1754 (1209) Esterilización-Química y Fisicoquímica /Información General
USP 39
Los integradores fisicoquímicos para esterilización por óxido de etileno siguen los mismos principios generales de diseño que los integradores para esterilización por vapor, pero con el fin de reaccionar predeciblemente a cada combinación de parámetros físicos de esterilización: humedad, temperatura, concentración del gas esterilizante y tiempo de exposición. La desviación hasta cierto punto de uno o más de estos parámetros críticos, no compensada por modificación de otros parámetros, causa que el integrador indique falla para alcanzar los limites prefijados de integración. Los integradores fisicoquímicos se han diseñados para coincidir en general con la inactivación predecible de preparaciones de esporas que tienen alta y definida resistencia al agente esterilizante. Para la esterilización por vapor, se emplea una cepa de Bacillus stearothermophilus (ver Indicador Biológico para Esterilización por Vapor, Papel Transportador), y para la esterilización por óxido de etileno, se emplea una cepa de Baci/lus subtilis, subespecie niger, (ver Indicador Biológico para Esterilización con Óxido de Etileno, Papel Transportador). Como no hay preparaciones estándar para estas cepas, las características de funcionamiento de estos integradores fisicoquímicos deben interpretarse en relación a un ciclo específico de esterilización validado. Los estándares de funcionamiento, dentro de lotes y entre lotes, de integradores fisicoquímicos de un fabricante dado deben ser uniformes. Los integradores no deben interactuar física o químicamente con envases o productos cuando se los coloca junto al producto a esterilizar en la carga de esterilización, y no deben alterar la concentración, calidad, o pureza del artículo esterilizado al punto de no cumplir los requisitos oficiales. Los usuarios deberían preguntar a los fabricantes del integrador si la esterilización en presencia de integradores fisicoquímicos puede afectar a ciertos artículos a esterilizar. Asimismo, la seguridad en el empleo de estos integradores debe ser verificada.
Esterilización por Calor Húmedo El empleo de integradores fisicoquímicos de esterilización por vapor para complementar la información obtenida por valoración física de los parámetros críticos de operación debería formar parte de la liberación paramétrica de los productos esterilizados por calor húmedo. Estos deben estar diseñados para asegurar que la descarga de letalidad especificada para el proceso se ha cumplido o se ha excedido. La estabilidad del funcionamiento de los integradores fisicoquímicos para la esterilización por calor húmedo debe asegurarse mediante las pruebas de características de funcionamiento que incluyen probar el funcionamiento del sistema indicador o integrador en diversas condiciones prefijadas del proceso de calor húmedo. Los elementos críticos de este tipo de integradores fisicoquímicos incluyen un compuesto orgánico sensible a la combinación de temperatura y vapor, un material polimérico penetrable por vapor saturado y un dispositivo de mecha adsorbente bajo el material polimérico que está en contacto con el compuesto orgánico. A medida que el vapor atraviesa el material polimérico, el compuesto orgánico se funde predeciblemente en pasos que dependen de la temperatura del vapor durante el ciclo. El material licuado se desplaza a lo largo de la mecha y recorre una distancia que se puede medir en una escala. Este compuesto orgánico tiene un intervalo de temperatura de fusión establecido. Algunos integradores, por ejemplo, tienen intervalos de fusión de 132,2º a 134,5º o de 137,0º a 142,0º. Otros intervalos de fusión se pueden especificar para indicar los parámetros de esterilización correspondientes a la exposición real. La combinación de parámetros de esterilización, aplicada para el tiempo de exposición requerido para un ciclo de esterilización por calor húmedo establecido, está indicada en el frente del artículo por el recorrido lineal de la fusión. Estos tipos de integradores fisicoquímicos también pueden emplearse para los llamados ciclos de esterilización por calor húmedo "flash" donde los pasos sucesivos del proceso de esterilización logran la letalidad requerida para el proceso validado. Pueden utilizarse otros tipos de integradores fisicoquímicos para esterilización por calor húmedo si también se los calibra contra un ciclo especificado y validado de esterilización por calor húmedo.
Esterilización por Óxido de Etileno Los integradores fisicoquímicos para esterilización por óxido de etileno deben estar diseñados para coincidir en general con la inactivación predecible de preparaciones de esporas que tienen una alta y definida resistencia a la esterilización por óxido de etileno. La inactivación de esporas de una cepa de Bacillus subtilis, subespecie niger, puede usarse como modelo, aunque también pueden emplearse otras esporas de microorganismos relevantes. Los elementos críticos de los integradores fisicoquímicos para la esterilización por óxido de etileno son una base con un compuesto orgánico a lo largo de una tira lineal de indicador sensible a la combinación de temperatura, humedad y concentración del gas esterilizante. Cuando el compuesto orgánico se expone a una mezcla de gas esterilizante a temperatura y humedad específicas, una reacción química hace aparecer un color a lo largo de la barra indicadora lineal. Esto es función predecible del tiempo de exposición en las condiciones de esterilización por óxido de etileno. Si la barra indicadora no se destiñe ni cambia de color durante un período establecido después de haberse completado el ciclo de esterilización, se confirma la humidificación adecuada en el ciclo. El integrador debe ser capaz de detectar desviaciones de los parámetros prescritos de temperatura, concentración del gas esterilizante, humedad y tiempo de exposición que puedan afectar la esterilización. No muestra las reacciones requeridas si se expone a menor concentración del gas, temperatura y humedad, aún cuando se exponga durante periodos prolongados. Otros tipos de integradores fisicoquímicos para la esterilización por óxido de etileno basados en diferentes principios o mecanismos de integración de parámetros críticos de esterilización podrían emplearse si también se calibran contra un ciclo especificado y validado de esterilización por óxido de etileno.
USP 39
Información General/ (1211) Esterilización y Garantía de Esterilidad 1755
La estabilidad del funcionamiento de los integradores fisicoquímicos para la esterilización por óxido de etileno tiene que asegurarse mediante pruebas de características de funcionamiento a varios tiempos preseleccionados para un ciclo dado de esterilización por óxido de etileno.
(1211) ESTERILIZACIÓN Y GARANTÍA DE ESTERILIDAD DE ARTÍCULOS FARMACOPEICOS Este capítulo informativo proporciona una descripción general de los conceptos y principios que rigen el control de calidad de los artículos que deben ser estériles. Cualquier modificación o variación en los procedimientos para pruebas de esterilidad respecto de los procedimientos contenidos en Pruebas de Esterilidad {71) debe validarse en el contexto del programa total de garantía de esterilidad, y esos procedimientos no están diseñados como métodos alternativos a los descritos en dicho capítulo. Según la definición más estricta de esterilidad, una muestra se considera estéril solamente cuando en ella hay ausencia total de microorganismos viables. Sin embargo, esta definición absoluta no se puede aplicar efectivamente a un lote entero de artículos farmacopeicos terminados debido a las limitaciones para realizar pruebas. La esterilidad de un lote que se presenta como estéril se define por lo tanto en términos probabilísticos, en donde la probabilidad de que una unidad o artículo esté contaminado es aceptablemente remota. Tal estado de garantía de esterilidad se puede establecer solamente mediante procesos de esterilización validados o procesamientos asépticos siguiendo las buenas prácticas de fabricación vigentes y no dependiendo exclusivamente de las pruebas de esterilidad. Los principios básicos para la validación y certificación de los procesos de esterilización se describen del siguiente modo: 1. Establecer que el equipo utilizado en el proceso es capaz de funcionar dentro de los parámetros requeridos. 2. Demostrar que el equipo y la instrumentación de control críticos son capaces de funcionar de acuerdo con los parámetros prescritos para el equipo del proceso. 3. Llevar a cabo ciclos repetidos representativos del intervalo operativo requerido del equipo usando productos reales o simulados. Demostrar que los procesos se han llevado a cabo dentro de los límites prescritos en el protocolo y finalmente que la probabilidad de supervivencia microbiana en los procesos replicados terminados no es mayor que los límites establecidos. 4. Supervisar el proceso validado durante operaciones de rutina. Volver a evaluar y certificar el equipo periódicamente según sea necesario. 5. Concluir los protocolos y documentar los pasos (1) a (4) anteriores. Los principios y la implementación de un programa para validar procedimientos de procesos asépticos son sustancialmente más exhaustivos que la validación de un proceso de esterilización. En un proceso aséptico, los componentes de la forma farmacéutica final se esterilizan por separado y el artículo terminado se ensambla de manera aséptica. Para validar adecuadamente el proceso de esterilización o el proceso aséptico es necesario poseer un amplio conocimiento de la tecnología de esterilización y espacios limpios. Para cumplir con los límites aceptables y alcanzables vigentes de los parámetros de esterilización, es necesario emplear equipos e instrumentos adecuados para controlar los parámetros críticos como temperatura, tiempo, presión, humedad, concentración del gas esterilizante, y/o radiación absorbida. Un aspecto importante en el programa de validación de muchos procedimientos de esterilización es el empleo de indicadores biológicos (ver Indicadores Biológicos {l 035)). Los procesos validados y certificados deben revalidarse periódicamente pero el programa de revalidación no necesita ser tan extenso como el programa original. El programa típico de validación descrito más adelante está diseñado para el autoclave a vapor pero algunos de estos principios pueden aplicarse a otros procedimientos de esterilización descritos en este capítulo informativo. El programa comprende varias etapas. La etapa de calificación de las instalaciones tiene el propósito de determinar que los controles y otros instrumentos estén diseñados y calibrados correctamente. La documentación que demuestra la calidad de los servicios necesarios, tal como vapor, agua y aire debe estar archivada. La etapa de calificación operativa tiene el propósito de confirmar que la cámara vacía funciona dentro de los parámetros de temperatura en los lugares clave de la cámara establecidos en el protocolo. Generalmente es apropiado elaborar perfiles de temperatura, es decir, de registros de temperaturas simultáneas en la cámara mediante el empleo de indicadores múltiples de temperatura. Un intervalo típico y aceptable de temperatura en el interior de la cámara vacía es de ±1 ºcuando la temperatura de la cámara no es menor de 121 º. La etapa confirmatoria del programa de validación es la esterilización propiamente dicha de materiales o equipos. Para esta determinación se necesitan sensores de temperatura insertados en muestras de los artículos, así como en muestras de los artículos a los que se les han agregado concentraciones adecuadas de microorganismos de prueba apropiados (indicadores biológicos) en configuraciones de autoclave a carga completa. La eficacia de la penetración del calor húmedo en los artículos reales y el tiempo de exposición son dos factores importantes que determinan la letalidad del proceso de esterilización. Para la etapa final del programa de validación se exige documentar datos de apoyo durante la ejecución del programa. Generalmente se acepta que los artículos inyectables con esterilización terminal o los dispositivos críticos declarados como estériles, cuando se esterilizan, alcanzan una probabilidad de supervivencia microbiana de 10-6, es decir, se garantiza que la
1 756 (1211) Esterilización y Garantía de Esterilidad / Información General
USP 39
probabilidad de encontrar microorganismos en el artículo esterilizado o en la forma farmacéutica es menor o igual a uno en un millón. Para artículos termoestables, se suele exceder el tiempo crítico necesario para lograr una probabilidad de supervivencia microbiana de 10-6 (sobremuerte) de la biocarga previa a la esterilización que es considerablemente mayor en población (normalmente 106 ) y resistencia (normalmente Dl 21 es igual o mayor a 1,0 minutos) que la biocarga natural previa a la esterilización. Sin embargo, para algunos artículos en donde la exposición excesiva al calor puede dañar el artículo, no será factible emplear un enfoque de sobremuerte (overkill). En este último caso, el desarrollo del ciclo de esterilización depende en gran medida del conocimiento de la población y resistencia de la carga microbiana del producto, basándose en el examen, durante un periodo apropiado, de un número considerable de lotes del producto previamente esterilizado. El valor Des el tiempo (en minutos) necesario para reducir la población microbiana en un 90% o 1 ciclo logarítmico (es decir, a una fracción sobreviviente de 1/l O), a una condición letal específica tal como temperatura. Por lo tanto, cuando el valor D de una preparación de indicador biológico, por ejemplo de esporas de Geo bacillus stearothermophilus, es 1,5 minutos, bajo las condiciones de proceso definidas, p.ej., a 121 º, si se trata durante 12 minutos bajo las mismas condiciones, se puede afirmar que el valor de letalidad de entrada es 8D. El efecto de aplicar este valor de entrada en el producto depende de la carga microbiana inicial. Suponiendo que la resistencia a la esterilización equivale a la del indicador biológico, si la carga microbiana del producto en cuestión es de 102 microorganismos, un valor de letalidad de 2D da como resultado una carga microbiana de 1 (1 Oº teórico), y un valor adicional de 6D da como resultado una probabilidad de supervivencia microbiana calculada de 10-6 • (En las mismas condiciones, un valor de letalidad de entrada de 12D sería un enfoque típico de "sobremuerte".) Por lo general, la probabilidad de supervivencia obtenida para el artículo sometido al ciclo validado de esterilización no se correlaciona completamente con lo que puede ocurrir con el indicador biológico. Por lo tanto, para un uso válido, es esencial que la resistencia del indicador biológico sea mayor que la de la carga microbiana natural del artículo esterilizado. Así resulta apropiado formular una hipótesis del peor caso posible y tratar la carga microbiana como si su resistencia al calor fuera equivalente a la del indicador biológico, aunque no es probable que el microorganismo aislado más resistente de una carga microbiana típica muestre una resistencia al calor de la magnitud mostrada por esta especie, frecuentemente empleada como indicador biológico en la esterilización por vapor. En el ejemplo anterior se considera adecuado un ciclo de 12 minutos para la esterilización si el producto tiene una carga microbiana de 102 microorganismos. Sin embargo, si el indicador tiene originalmente un contenido de 106 microorganismos, se puede esperar realmente una probabilidad de supervivencia de 10-2; es decir, que 1 de cada 100 indicadores biológicos podría generar resultados positivos. Esta situación se puede evitar mediante la selección del indicador biológico adecuado. Alternativamente, se puede utilizar un alto contenido de indicadores sobre la base de una reducción predeterminada y aceptable de recuentos. El valor D para la preparación de Geo bacil/us stearothermophilus determinado o verificado para estas condiciones debe restablecerse cuando se cambia un programa de validación dado. La determinación de curvas de supervivencia (ver Indicadores Biológicos (1035)), o lo que se conoce como enfoque de ciclo fraccionado, puede emplearse para determinar el valor D del indicador biológico preferido para cada procedimiento específico de esterilización. El enfoque de ciclo fraccionado también puede usarse para evaluar la resistencia de la carga microbiana. Los ciclos fraccionados se estudian para la reducción del recuento microbiano o para lograr una fracción de crecimiento microbiano negativo. Estos valores pueden emplearse para determinar la letalidad del proceso en condiciones de producción. La información puede usarse en equipos de producción calificados para establecer los ciclos apropiados de esterilización. Durante la rutina de esterilización se puede utilizar un indicador biológico apropiado como la preparación de Geo bacillus stearothermophilus. Cualquier proceso de esterilización basado en la carga microbiana requiere una vigilancia adecuada de la resistencia microbiana del artículo para detectar cualquier cambio, además de la vigilancia periódica de otros atributos.
MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN En este capítulo informativo se describen cinco métodos de esterilización terminal, incluyendo la eliminación de microorganismos mediante filtración, así como las pautas para procesos asépticos. Sin embargo, el desarrollo tecnológico moderno ha conducido al uso de procedimientos adicionales. Éstos incluyen el moldeo por soplado (a temperaturas elevadas), las formas de calor húmedo diferentes al vapor saturado e irradiación UV, así como el llenado continuo en línea en los procesamientos asépticos. Para elegir un proceso adecuado para una forma farmacéutica o un componente se necesita un amplio conocimiento de las técnicas de esterilización e información relacionada con los efectos del proceso sobre el material que se esteriliza.1
1
Los documentos que tratan el desarrollo y la validación de los ciclos de esterilización y temas relacionados incluyen, por parte de la Parenteral Drug Association, lnc. (PDA), Validation of Moist Heat Sterilization Processes: Cyc/e Design, Development, Qualification and Ongoing Control (Technical Report No. 1); Process Simulation for Aseptically Filled Products (Technical Report No. 22); Sterilizing Filtration of Liquids (Technical Report No. 26); y Validation of Dry Heat Processes Used for Sterilization and Depyrogenation (Technical Monograph No. 3); y por parte de la Pharmaceutical Manufacturers Association (PMA), Validation of Sterilization of Large-Volume Parenterals-Current Concepts (Science and Technology Publication No. 25). Otras publicaciones técnicas incluyen a la Health lndustry Manufacturers Association (HIMA), Validation of Sterilization Systems (Report No. 78-4.1 ); Sterilization Cyc/e Development (Report No. 78-4.2); Industrial Sterility: Medica/ Device Standards and Guidelines (Document #9, Vol. 1); y Operator Training ... far Ethylene Oxide Sterilization, far Steam Sterilization Equipment, for Dry Heat Sterilization Equipment, and for Radiation Sterilization Equipment (Reports No. 78-4.S a 4.8). Las guías de práctica recomendadas publicadas por la Association far the Advancement of Medica! lnstrumentation (AAMI) incluyen Guideline for Industrial Ethylene Oxide Sterilization of Medica/ Devices-Process Design, Validation, Routine Sterilization (No. OPE0-12/81) y Process Control Guidelines far the Radiation Sterilization of Medica/ Devices (No. RS-P 10/82). Se puede encontrar información adicional sobre la esterilización por radiación en ISO 11137-Sterilization of Health Care Products-Requirements for Validation and Routine Control-Radiation Sterilization. Estas publicaciones que ofrecen más detalles se deben consultar para un análisis más extenso de los principios y procedimientos descritos en este capítulo.
USP 39
Información General/ (1211) Esterilización y Garantía de Esterilidad 1757
Esterilización por Vapor El proceso de esterilización térmica que emplea vapor saturado a presión se lleva a cabo en una cámara llamada autoclave. Probablemente éste es el proceso de esterilización más empleado. El principio básico de operación consiste en que el aire en el interior de la cámara de esterilización es desplazado por el vapor saturado mediante el uso de válvulas de escape o trampas. Para desplazar el aire de la cámara y del interior de los artículos con mayor eficacia, el ciclo de esterilización puede incluir etapas de evacuación de aire y de vapor. El diseño o elección de un ciclo para determinados productos o componentes depende de varios factores que incluyen la termolabilidad del material, conocimiento de la penetración del calor en los artículos y otros factores descritos en el programa de validación (ver arriba). Aparte de esa descripción de los parámetros del ciclo de esterilización, usando una temperatura de 121 º, puede ser apropiado el concepto de F0 • El F0, a una temperatura específica diferente a 121 º, es el tiempo (en minutos) necesario para proporcionar la letalidad equivalente a la proporcionada a 121 ºen un tiempo determinado. Los autoclaves modernos trabajan generalmente con un sistema de control significativamente más sensible que la válvula de reducción de vapor de las unidades más antiguas que han estado en servicio durante muchos años. Para que estas unidades antiguas logren la precisión y el nivel de control del ciclo mencionado en este capítulo, podría ser necesario actualizar o modificar el equipo y los instrumentos de control de estas unidades. Esta modificación sólo se justifica si la cámara y la camisa de vapor están intactas para uso seguro continuo y si los depósitos que interfieren con la distribución de calor pueden eliminarse.
Esterilización por Calor Seco/Despirogenación El proceso de esterilización térmica de artículos farmacopeicos mediante calor seco se puede llevar a cabo mediante un proceso en partida en un horno diseñado expresamente para tal propósito o en un tunel de calor seco en el cual los recipientes de vidrio se mueven continuamente a través del sistema. Un sistema de esterilización/despirogenización por calor seco está provisto de aire calentado y filtrado por HEPA, distribuido uniformemente a través de la unidad por convección o radiación y empleando un sistema de soplado con sensores y dispositivos de monitoreo y control de todos los parámetros críticos. Un intervalo de temperatura típico y aceptable en el interior de la cámara vacía es de± 15° cuando la unidad funciona a una temperatura de no menos de 250º. Además del proceso de esterilización por partidas descrito anteriormente, el sistema de túnel continuo por lo general requiere una temperatura mucho mayor que la mencionada anteriormente para el proceso en partidas debido a un tiempo de permanencia mucho menor. El proceso continuo también necesita generalmente una etapa de enfriamiento rápido antes de la etapa de llenado aséptico. En vista del tiempo corto de permanencia, el programa de calificación y validación debe establecer parámetros para la uniformidad de la temperatura y particularmente para el tiempo de permanencia. Debido a que la despirogenización representa un desafío más riguroso para los sistemas de procesamiento por calor seco que la inactivación de un indicador biológico, por lo general no es necesario incluir indicadores biológicos al validar procesos por calor seco si se demuestra la validación de la despirogenización. Una reducción de 3 unidades logarítmicas o mayor es un criterio de aceptación adecuado para la despirogenización y, cuando se demuestra con éxito, asegurará no sólo la despirogenización adecuada de los artículos farmacopéicos, sino también la esterilización. Las pruebas de despirogenización por lo regular se realizan usando artículos inoculados con estándar de referencia de endotoxina. Los artículos se evalúan después de la exposición para determinar los niveles residuales de endotoxina usando valoraciones basadas en lisado de Limulus. Para información adicional sobre la valoración de endotoxinas, ver la Prueba de Endotoxinas Bacterianas (85).
Esterilización por Gases La esterilización por gases es una alternativa a la esterilización por calor que se emplea cuando el material a esterilizar no soporta las altas temperaturas alcanzadas en los procesos de esterilización por vapor o por calor seco. El método más comúnmente usado de esterilización gaseosa es el óxido de etileno. Entre las desventajas del óxido de etileno están su alta naturaleza inflamable, a menos que se mezcle con gases inertes; sus propiedades mutagénicas y la posibilidad de que deje residuos tóxicos en los materiales tratados, particularmente los que contienen iones cloruro. El proceso de esterilización se lleva a cabo generalmente en una cámara preparada para presión y vacío con un diseño similar al del autoclave pero con características adicionales (ver más adelante) sólo presentes en los esterilizadores que emplean este gas. Las unidades que emplean este agente esterilizante deben estar diseñadas para permitir una desgasificación posterior a la esterilización con el fin de determinar la supervivencia microbiana y reducir al mínimo la exposición del personal al gas potencialmente nocivo. 2 La validación del proceso de esterilización que utiliza óxido de etileno se realiza según lo descrito anteriormente. Sin embargo, el programa es más extenso que para los otros procedimientos de esterilización, ya que además del control de temperatura también se requiere un control paramétrico apropiado para la humedad, la presión de vacío, la presión positiva, y la concentración de óxido de etileno. Es importante demostrar que todos los parámetros críticos del proceso en la cámara son adecua2 Ver Ethylene Oxide, Encyclopedia of Industrial Chemical Analysis, 1971, 72, 31 7-340, john Wiley & Sons, lnc., y Use of Ethylene Oxide as a Sterilant in Medica/ Facilities, NIOSH Special Occupational Hazard Review with Control Recommendations, agosto 1977, U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Service, Centers for Disease Control and Prevention, National lnstitute for Occupational Safety and Health, Division of Criteria Documentation and Standards Development, Priorities and Research Analysis Branch, Rockville, MD.
1758 (1211) Esterilización y Garantía de Esterilidad/ Información General
USP 39
dos durante el ciclo completo. Dado que los parámetros de esterilización aplicados a los artículos de esterilización son de importancia crítica, con frecuencia se recomienda acondicionar previamente la carga para obtener la humedad necesaria, con el fin de reducir al mínimo el tiempo de exposición a la temperatura requerida antes de colocar la carga en la cámara de óxido de etileno. La validación por lo general se lleva a cabo empleando un producto inoculado con indicadores biológicos apropiados tales como las preparaciones de esporas de Baci/lus atrophaeus. Para validación, estos indicadores pueden usarse en cargas completas de la cámara con producto real o con producto simulado. Para supervisar la concentración de humedad y de gas se necesitan instrumentos sofisticados que sólo las personas con conocimientos y experiencia pueden calibrar, operar y mantener las condiciones de funcionamiento. También se pueden emplear indicadores biológicos en la supervisión de ciclos de rutina. Según se indica en este capítulo, los indicadores biológicos pueden emplearse en una modalidad de fracción negativa para establecer la probabilidad de supervivencia microbiológica definitiva en el diseño de un ciclo de esterilización con óxido de etileno usando producto inoculado o producto simulado inoculado. Uno de los factores limitantes principales de este proceso de esterilización es la capacidad restringida del gas para difundirse a los lugares más internos del producto que requieren esterilización. Por lo tanto, se debe determinar el diseño del empacado y los patrones de distribución de la carga dentro de la cámara para permitir la penetración necesaria del gas. Referirse a ISO 11135 para una descripción completa del desarrollo del proceso, validación y control rutinario de los procesos de esterilización por óxido de etileno.
Esterilización por Radiación Ionizante La rápida proliferación de dispositivos médicos incapaces de resistir la esterilización por calor y la preocupación por la seguridad del óxido de etileno han aumentado el uso de la esterilización por radiación. Este método también puede aplicarse a ingredientes farmacéuticos activos y a formas farmacéuticas finales. Entre las ventajas de la esterilización por irradiación se encuentran la baja reactividad química, bajos residuos cuantificables y el hecho de que hay menos variables para controlar. De hecho, la esterilización por radiación es única en el sentido de que la base del control es esencialmente la dosis de radiación absorbida, la cual se puede medir con precisión. Generalmente se usan procedimientos de establecimiento de dosis y de sustanciación de dosis para validar la dosis de radiación requerida para lograr un nivel de garantía de esterilidad. La irradiación causa solamente un aumento mínimo de temperatura pero puede afectar ciertos grados y tipos de plásticos y vidrios. Los dos tipos de radiación ionizante que se usan son la desintegración de isótopos (radiación gamma) y la radiación de haz electrónico. En cualquier caso la dosis de radiación establecida para producir el grado requerido de garantía de esterilidad debe ser tal que, dentro del intervalo de dosis mínima y máxima, las propiedades del artículo que se esteriliza sean aceptables. Referirse a ISO 11137-1, - 2 y -3 para una descripción completa de desarrollo del proceso, validación y control rutinario de los procesos de radiación ionizante.
Esterilización por Filtración La esterilización de fluidos mediante filtración es un proceso separativo y difiere de otros métodos de esterilización que se basan en mecanismos destructivos. La filtración a través de materiales que retienen microorganismos se emplea frecuentemente para esterilizar soluciones termolábiles mediante la remoción física de los microorganismos presentes. El ensamblaje del sistema de filtración por lo general consta de una matriz porosa integrada o sujeta dentro de una carcasa. La eficacia de un medio de filtración depende del tamaño de poro del material poroso, de la biocarga previa a la filtración, y puede depender de la adsorción de bacterias sobre o dentro de la matriz del filtro o de un mecanismo de tamizado. Existe evidencia de que el tamizado es el componente más importante de mecanismo. Aunque se debe evitar el uso de filtros que desprendan fibras a menos que no sea posible utilizar otros procedimientos de filtración, se debe tomar en cuenta que de conformidad con el Título 21 del CFR 211.72, está prohibido el uso de filtros que contengan asbestos. Cuando sea necesario usar un filtro que desprenda fibras, es obligatorio que el proceso incluya un filtro que no desprenda fibras colocado después o secuencialmente con respecto al paso de filtración inicial. CLASIFICACIÓN DE FILTROS El tamaño de poro de las membranas de filtración se clasifica mediante una clasificación nominal que refleja la capacidad de la membrana de filtración para retener microorganismos de tamaños representados por cepas específicas, y no mediante determinación de un tamaño promedio de poro ni informe de distribución de tamaños. Los filtros de esterilización no se pueden definir estrechamente debido a que, dependiendo de la biocarga presente en la corriente de fluido, diversos filtros pueden considerarse efectivos para la esterilización. En la actualidad, el filtro de esterilización se puede definir como "un filtro que, cuando se valida apropiadamente, eliminará todos los microorganismos de una corriente de fluido, produciendo un efluente estéril". Las clasificaciones nominales de los filtros de esterilización basadas en las propiedades de retención microbiana difieren cuando la clasificación se realiza por otros medios, p.ej., mediante retención de esferas de látex de diversos diámetros. Es responsabilidad del usuario seleccionar un filtro con la clasificación correcta para el propósito particular, dependiendo de la naturaleza del producto (especialmente considerando su biocarga potencial) que se va a filtrar. No es factible repetir las pruebas de
USP 39
Información General/ (1211) Esterilización y Garantía de Esterilidad 1759
capacidad de filtración en las instalaciones del usuario. Las pruebas de desafío microbiano para cada lote de membranas de filtración fabricadas se llevan a cabo de preferencia en las condiciones del fabricante. El usuario debe determinar si los parámetros de filtración empleados en la fabricación influyen significativamente en la eficiencia de la retención microbiana. Otras cuestiones importantes en la validación del proceso de filtración incluyen la compatibilidad del producto, la sorción del fármaco, presencia de conservantes u otros aditivos, y el contenido de endotoxinas del efluente inicial. Dado que la eficacia del proceso de filtración también está influenciada por la carga microbiana de la solución a filtrar, un aspecto importante de la validación del proceso de filtración es determinar la calidad microbiológica de las soluciones antes de la filtración, así como establecer los demás parámetros del procedimiento de filtración, como las presiones, velocidades de flujo y características de la unidad del filtro. Por lo tanto, otro método para describir la capacidad de retención de los filtros es el empleo del índice de reducción logarítmica (LRV, por las siglas en inglés). Por ejemplo, un filtro de 0,2 µm que puede retener 10 7 microorganismos de una cepa especificada tendrá un LRV de no menos de 7 en las condiciones establecidas. El usuario debe validar primero la compatibilidad e integridad de los ensamblajes de los recipientes y filtros elegidos. Es posible combinar ensamblajes y membranas filtrantes producidos por diferentes fabricantes pero antes se debe validar la compatibilidad de estos ensamblajes híbridos. Además, el fabricante de los filtros de membrana debe realizar otras pruebas que generalmente el usuario no necesita repetir. Estas pruebas incluyen pruebas de desafío microbiológico. Los usuarios deben solicitar al fabricante los resultados de estas pruebas para cada lote de membranas y guardarlos en sus archivos. La filtración con fines de esterilización generalmente se lleva a cabo con unidades que tienen membranas cuya clasificación por tamaño de poro nominal es de 0,2 µm o menos. La integridad inicial de un ensamblaje de filtro de membrana se debe probar antes de su uso, siempre que dicha prueba no afecte negativamente la seguridad, integridad y validez del sistema, y dichas unidades deben probarse después del proceso de filtración para demostrar que la integridad de la unidad se mantuvo durante todo el procedimiento de filtración. Las pruebas de punto de burbuja, flujo de aire difuso, presión sostenida y flujo de salida hacia adelante son pruebas comúnmente efectuadas. Estas pruebas deben correlacionarse con la retención de microorganismos.
Procesamiento Aséptico Unidireccional Si bien hay un consenso general de que la esterilización final de los envases llenos como forma farmacéutica o de los dispositivos empacados es el proceso preferido para garantizar un riesgo mínimo de contaminación microbiana en un lote, hay una clase importante de productos que no se esterilizan terminalmente sino que se preparan mediante una serie de pasos asépticos. Estos pasos están diseñados para impedir el ingreso de microorganismos viables en componentes ya estériles o en productos a granel o sus componentes una vez que se han esterilizados mediante un proceso intermedio. La diferencia fundamental entre productos estériles producidos asépticamente y productos esterilizados terminalmente es la presencia de un paso en el cual el empaque final se somete a condiciones que demuestran la muerte de los contaminantes viables que puede ser validado. Por consiguiente, un producto asépticamente llenado etiquetado como estéril debe usar un sistema de evaluación de riesgos para establecer que se ha conseguido un nivel aceptable de garantía de esterilidad. La tecnología actual no puede proporcionar una evaluación de seguridad adecuada basada en una prueba de unidades individuales. En los métodos de monitoreo individual usados en la actualidad, las simulaciones de proceso no han mostrado una correlación directa con productos terminados contaminados. Las pruebas destructivas para producto terminado (pruebas de esterilidad) se pueden aplicar solamente al examen de un porcentaje muy pequeño de un lote y, por tanto, sólo son capaces de detectar lotes extremadamente contaminados. Esta sección proporciona una revisión de los principios aplicados para la producción de artículos procesados asépticamente con un riesgo mínimo de contaminación microbiana en el lote de formas farmacéuticas terminadas. Es probable que un producto procesado asépticamente contenga componentes que han sido esterilizados mediante uno de los procesos descritos anteriormente en este capítulo. Por ejemplo, el producto a granel, si es un líquido filtrable, puede haber sido esterilizado por filtración. Los componentes de envases vacíos finales probablemente estén esterilizados por calor, los viales de vidrio con calor seco y los tapones de caucho con autoclave. Las áreas de preocupación especial son el entorno microbiano inmediato al que quedan expuestos los componentes previamente esterilizados durante el ensamblaje para producir la forma farmacéutica terminada y la operación de llenado aséptico. Los requisitos de diseño, validación y mantenimiento adecuados para una instalación de llenado aséptico u otro procesamiento aséptico tienen como objetivo principal: (1) un medio ambiente con aire que está adecuadamente controlado con respecto a partículas viables y no viables, diseñado adecuadamente para permitir el mantenimiento eficaz de las unidades de suministro de aire, y (2) la provisión de personal operativo capacitado con el equipo y ropa apropiados. El ambiente deseado se puede lograr gracias al alto nivel de tecnología de filtración de aire, lo que contribuye al aporte de aire con la calidad microbiológica requerida. 3 Las instalaciones incluyen sistemas de barreras primarias (en las cercanías del artículo expuesto) y secundarias (en donde se lleva a cabo el procesamiento aséptico). Para una instalación de procesamiento aséptico o un área de llenado aséptico diseñadas apropiadamente se deben considerar características tales como superficies lisas y no porosas, incluyendo paredes y cielo rasos que puedan soportar la descanta-
3
Los estándares publicados y disponibles para tales áreas de trabajo controladas incluyen lo siguiente: (1) ISO 14464 1-7 Cleanrooms and Associated Controlled Environments. (2) NASA Standard for Clean Room and Work Stations for Microbially Controlled Environment, publicación NHB5340.2, agosto 1967. (3) Contamination Control of Aerospace Facilities, U.S. Air Force, T.O. 00-25-203, 1 diciembre de 1972, enmienda 1-1, octubre de 1974.
1760 (1211) Esterilización y Garantía de Esterilidad / Información General
USP 39
minación rutinaria; salas de vestuario con espacio suficiente para el personal y almacenamiento de vestimenta estéril; separación adecuada entre las áreas donde el personal se prepara y las áreas de procesamiento aséptico final, con disponibilidad, donde sea necesario, de dispositivos tales como esclusas de aire y duchas de aire; diferencia de presión adecuadas entre salas con más presión positiva en los cuartos y zonas de procesamiento aséptico; empleo de flujo de aire unidireccional en las proximidades del producto o componentes expuestos, y su exposición a aire filtrado, con la frecuencia adecuada de cambio de aire; controles apropiados de humedad y temperatura, y programa de higienización documentado. Se debe emprender el adiestramiento adecuado del personal en técnicas higiénicas y sobre vestimenta para que, por ejemplo, las batas, guantes y otras protecciones para el cuerpo cubran sustancialmente todas las superficies de piel expuestas. La certificación y validación del proceso aséptico e instalaciones se logra al establecer la eficacia de los sistemas de filtración, mediante el empleo de procedimientos de monitoreo ambiental microbiológico, así como mediante el procesamiento de un medio de cultivo estéril como producto simulado. El monitoreo de la instalación aséptica debe incluir evaluaciones y pruebas periódicas del filtro HEPA, así como monitoreo ambiental de partículas y microbiológico rutinario. También se deben realizar pruebas periódicas de llenado de medios o de simulación del proceso.
PRUEBAS DE ESTERILIDAD DE LOTES Se debe reconocer que la prueba decisiva de esterilidad podría no detectar la contaminación microbiana si sólo está presente en un pequeño porcentaje de los artículos terminados del lote porque el número especificado de unidades a tomar impone una limitación estadística significativa al valor de los resultados de la prueba. Esta limitación inherente, sin embargo, tiene que aceptarse porque el conocimiento actual no ofrece alternativas no destructivas para evaluar la calidad microbiológica de cada artículo terminado del lote, e incrementar significativamente el número de muestras no es una opción factible. Para información relacionada con la realización de la prueba de esterilidad, referirse al capítulo general Pruebas de Esterilidad (71 ).
(1216) FRIABILIDAD DE LAS TABLETAS Este capítulo de información general ha sido armonizado con los textos correspondientes de la Farmacopea Europea y de la Farmacopea japonesa. Los textos armonizados de estas tres farmacopeas son por lo tanto intercambiables y en lugar de este método del capítulo de información general de la Farmacopea de los Estados Unidos, se pueden usar los métodos de la Farmacopea Europea y/o de la Farmacopea japonesa para demostrar el cumplimiento con los requisitos. Estas farmacopeas se han comprometido a no realizar ningún cambio unilateral a este capítulo armonizado. Este capítulo ofrece pautas para la determinación de la friabilidad de tabletas comprimidas y sin cubierta. El procedimiento de prueba presentado en este capítulo es aplicable en general a la mayoría de tabletas comprimidas. La medición de la friabilidad de tabletas complementa otras mediciones de resistencia física tales como la fuerza de ruptura de las tabletas. Usar un tambor* de polímero sintético transparente, con un diámetro interno entre 283 y 291 mm y una profundidad entre 36 y 40 mm, que tenga superficies internas pulidas y que sufra acumulación de estática mínima (ver figura de un aparato típico). Un lado del tambor es desmontable. Las tabletas dan vuelcos en cada vuelta del tambor por medio de una proyección curvada, que tiene un radio interno entre 75,5 y 85,5 mm y que se extiende desde el medio del tambor hacia la pared exterior. El diámetro externo del anillo central mide entre 24,5 y 25,5 mm. El tambor está sujeto al eje horizontal de un dispositivo que rota a 25 ± 1 rpm. De esta manera, en cada vuelta las tabletas ruedan o se deslizan y chocan contra la pared del tambor o entre ellas.
* Se puede obtener un aparato, que cumpla con estas especificaciones, de proveedores de laboratorios como VanKel Technology Group, 1 3000 Weston Parkway, Cary, NC 27513, o de Erweka lnstruments, lnc., 56 Quirk Road, Milford, CT 06460.
USP 39
Información General/ (1217) Fuerza de Ruptura de las Tabletas 1761
olblra decaída 158,0 ± 2,0 nm
cHmolrO 302,5 ± 4,0 nm
~ 1-38,0±2,0nm
Aparato para Determinar la Friabilidad de las Tabletas Para tabletas con un peso unitario igual o menor a 650 mg, tomar una muestra de tabletas enteras correspondiente lo más cercano posible a 6,5 g. Para tabletas con un peso unitario mayor de 650 mg, tomar una muestra de 1O tabletas enteras. Debe quitarse el polvo de las tabletas cuidadosamente antes de realizar la prueba. Pesar con exactitud la muestra de tabletas y colocarla en el tambor. Hacer girar el tambor 100 veces y retirar las tabletas. Quitar el polvo suelto de las tabletas como se hizo anteriormente y pesar con exactitud. Generalmente, la prueba se realiza una vez. Si se encuentran tabletas claramente agrietadas, segmentadas o rotas en la muestra de tabletas después de la prueba, la muestra no ha pasado la prueba. Si los resultados son difíciles de interpretar o si la pérdida de peso es mayor que el valor esperado, debe repetirse la prueba dos veces y determinar la media de las tres pruebas. Para la mayoría de los productos se considera aceptable una pérdida media máxima de peso de las tres muestras de no más de 1,0%. Si el tamaño o la forma de las tabletas causa una rotación irregular, ajustar la base del tambor de modo que forme un ángulo de aproximadamente 1 Oº con el eje horizontal y las tabletas no se atasquen cuando quedan una junto a otra, lo que evita que caigan libremente. Las tabletas efervescentes y las tabletas masticables pueden tener especificaciones diferentes en cuanto a la friabilidad. En el caso de las tabletas higroscópicas, se requiere un ambiente de humedad controlada apropiado para la prueba. Para realizar la prueba con múltiples muestras a la vez, se permite también el uso de tambores con dos proyecciones o un aparato con más de un tambor.
(1217) FUERZA DE RUPTURA DE LAS TABLETAS INTRODUCCIÓN Como sistemas de administración de agentes farmacéuticos, las tabletas se encuentran en una gran variedad de presentaciones, tales como tabletas de desintegración rápida, de desintegración lenta, erosionables, masticables y de disolución bucal. Cada una de estas presentaciones exige ciertas condiciones para la unión, estructura e integridad de la matriz comprimida. Las tabletas deben ser capaces de resistir los rigores de la manipulación y transporte en la planta de fabricación, en el sistema de distribución del medicamento y, ya en el mercado, en manos de los usuarios finales (pacientes/consumidores). Los procesos de fabricación como el recubrimiento, el envasado y la impresión pueden implicar un estrés considerable que las tabletas deben estar en condiciones de soportar. Por esas razones, la resistencia mecánica de las tabletas reviste una importancia considerable y es un factor que se mide en forma rutinaria. La resistencia de la tableta sirve a la vez como criterio para conducir el desarrollo del producto y como una especificación de control de calidad. Una prueba empleada con frecuencia para medir la capacidad de las tabletas para resistir fuerzas mecánicas consiste en ponerlas a rotar en un cilindro rotatorio con el fin de determinar su resistencia a las desportilladuras y a la abrasión de su superficie. El porcentaje de pérdida de peso después de la rotación se conoce como friabifidad de las tabletas. Los métodos estandarizados y el equipo para probar la friabilidad se describen en el capítulo general Friabifidad de las Tabletas (1216). Otra medida de la integridad mecánica de las tabletas es su fuerza de ruptura, que es la fuerza requerida para que se fracturen (es decir, se rompan) en un plano específico. Por lo general las tabletas se colocan entre dos platinas, una de las cuales se mueve para aplicar suficiente fuerza a la tableta hasta ocasionar su fractura. En caso de tabletas convencionales redondas (de
1762 (1217) Fuerza de Ruptura de las Tabletas/ Información General
USP 39
corte transversal circular), la carga ocurre a través del diámetro (lo que se llama en ocasiones carga diametral) y la fractura ocurre en ese plano. En la literatura farmacéutica, la fuerza de ruptura de las tabletas se conoce comúnmente como dureza; sin embargo, el uso de este término se presta a confusiones. En la ciencia de materiales, el término dureza se refiere a la resistencia de una superficie a la penetración o la hendidura con un indentador pequeño. El término resistencia a la rotura se usa también con frecuencia para describir la resistencia de las tabletas a la aplicación de una carga de compresión. Aunque este término describe la verdadera naturaleza de la prueba con más exactitud que el término dureza, pareciera implicar que las tabletas se trituran durante la prueba, lo cual a menudo no es el caso. Más aún, el término resistencia en esta aplicación podría cuestionarse, porque en física se usa con frecuencia para describir una tensión (p.ej., resistencia a la tracción). Por lo tanto, se prefiere el término fuerza de ruptura, que se usará en la presente discusión.
DETERMINACIONES DE LA FUERZA DE RUPTURA DE LAS TABLETAS Los dispositivos de medición usados anteriormente eran, en general, manuales. Por ejemplo, el medidor de dureza Monsanto (o Stokes) comprimía las tabletas entre dos mordazas por medio de un tornillo y calibre de resorte. En el medidor de dureza Pfizer, la tableta se montaba verticalmente y se apretaba en un dispositivo que se asemejaba a un par de pinzas. En el durómetro Strong Cobb, la carga de ruptura se aplicaba por medio de una pequeña bomba hidráulica, que primero se hacía funcionar manualmente pero luego fue motorizada. Los problemas asociados con estos dispositivos estaban relacionados con la variabilidad de la velocidad de carga entre operarios y las dificultades en el montaje y en la calibración apropiados. Los medidores modernos emplean accionadores mecánicos, celdas de carga extensiométricas para mediciones de fuerza y procesamiento de señales electrónicas, siendo, por consiguiente, preferidos. Sin embargo, al usarlos para la determinación analítica de la fuerza de ruptura se deben tener en cuenta ciertos aspectos importantes que se discuten a continuación.
Platinas Las platinas deben ser paralelas. Sus caras deben estar pulidas y rectificadas con precisión en forma perpendicular a la dirección del movimiento. La perpendicularidad se debe mantener durante el movimiento de la platina y el mecanismo debe estar libre de cualquier desplazamiento por flexión o torsión a medida que se aplica la carga. Las superficies de contacto deben ser más grandes que el área de contacto con la tableta.
Velocidad y Uniformidad de la Carga Tanto la velocidad de movimiento de la platina como la velocidad a la cual se aplica la fuerza de compresión (es decir, la velocidad de carga) deben ser constantes. Cuando se mantiene una velocidad de carga constante se evita la rápida acumulación de cargas de compresión, lo cual podría llevar al cizallamiento o la trituración incontrolada y a una mayor variabilidad en la fuerza de ruptura medida. Sin embargo, las mediciones de velocidad de carga constante pueden ser demasiado lentas para el monitoreo de la producción de tabletas en tiempo real. La velocidad a la cual se aplica la carga de compresión puede afectar significativamente los resultados, dado que en la fractura de la tableta pueden estar involucrados procesos que dependen del tiempo ( 7). La forma en que la matriz de una tableta responde a las diferencias en la velocidad de carga depende del mecanismo de la fractura. A bajas velocidades de deformación, algunos materiales se fracturan en forma dúctil, pero con velocidades de deformación más altas hay mayor probabilidad de que la fractura sea frágil. La transición de fractura dúctil a frágil se acompaña por un aumento en la fuerza de ruptura. Los dispositivos que simplemente trituran las tabletas pueden producir datos reproducibles que son engañosos porque carecen de sensibilidad. Se debe realizar la prueba uniformemente con un equipo que se ha calibrado de forma rutinaria. Cambiar entre equipos de prueba de diseños distintos o entre fabricantes diferentes requerirá una comparación de los datos para asegurarse que las dos unidades someten la forma farmacéutica a una fuerza semejante y de manera similar. Los equipos disponibles actualmente proporcionan una velocidad de carga constante de 20 newtons (N) o menos por ~c::gundo, o un movimiento constante de la platina de 3,5 mm o menos por segundo. La ruptura controlada y uniforme es ur atributo importante del procedimiento de prueba. Con el fin de garantizar la comparabilidad de los resultados, las pruebas se deben realizar bajo condiciones idénticas de velocidad de carga o movimiento de la platina. Dado que cada sistema de aplicación de carga tiene ciertas ventajas, ambos se usan en la práctica. Puesto que la situación particular de la prueba y el tipo de matriz de la tableta que se está evaluando imponen limitaciones diferentes, tampoco se cuenta con bases para declarar la preferencia absoluta por uno de los sistemas. Este capítulo general propone tomar en consideración ambos enfoques. Los distintos métodos pueden llevar a resultados numéricamente diferentes para una muestra de tabletas dada, lo cual requiere que se especifique la velocidad de aplicación de carga o el desplazamiento, junto con la fuerza de ruptura determinada.
USP 39
Información General/ (1217) Fuerza de Ruptura de las Tabletas 1763
Fuerza de Ruptura - Dependencia de la Geometría y Masa de la Tableta Las mediciones de la fuerza de ruptura no tienen en cuenta las dimensiones ni la forma de la tableta. Las tabletas más gruesas del mismo material, comprimidas en condiciones idénticas a las de tabletas más delgadas, con la misma forma de punzonería y la misma fuerza, requerirán fuerzas de ruptura mayores. La orientación y la fractura de la tableta deben guardar relación con las observadas durante el desarrollo de la forma farmacéutica. En comparaciones directas (es decir, sin normalización de datos), las mediciones de la fuerza de ruptura se deben efectuar en tabletas que tengan las mismas dimensiones y geometría, y una orientación uniforme en el equipo de prueba.
Orientación de la Tableta En la compresión diametral de tabletas redondas sin ningún tipo de ranuras, la orientación de la tableta es inequívoca. Esto implica que la tableta se coloca entre las platinas de forma tal que la compresión se produce a través del diámetro. Sin embargo, es posible que las tabletas con una forma singular o compleja no tengan una orientación obvia para la determinación de la fuerza de ruptura. Con el fin de garantizar la comparabilidad de los resultados, lo mejor es convenir una orientación estándar, preferiblemente una que los operarios puedan reproducir fácilmente, dado que la fuerza de ruptura puede depender de la orientación de la tableta en el equipo de medición. En general, las tabletas se someten a prueba en forma diametral o paralela al eje más largo. Las tabletas ranuradas tienen dos posibles orientaciones. Cuando se orientan con las ranuras perpendiculares a las caras de la platina, aumenta la probabilidad de que la fractura por tensión ocurra a lo largo de la ranura. Esto proporciona información sobre la resistencia de la matriz en el punto más débil de la estructura. Se obtiene más información general sobre la resistencia de la matriz cuando las tabletas ranuradas se orientan con las ranuras paralelas a las caras de la platina. Las tabletas en forma de cápsula o las tabletas ranuradas pueden romperse mejor en una prueba de flexión en tres puntos (2). Un accesorio, que se instala sobre las platinas o las sustituye, soporta la tableta por sus extremos y permite aplicar la carga de ruptura sobre la cara opuesta, en el punto medio de la tableta que no está apoyado. Esos accesorios generalmente se consiguen en el mismo sitio que suministra los medidores de dureza.
Unidades, Resolución y Calibración Por lo general, los medidores de fuerza de ruptura modernos se calibran en kilopondios o newtons. La relación entre estas unidades de fuerza (3) es 1 kilopondio (kp) = 1 kilogramo fuerza (kgf) = 9,80 N. Se deben expresar los resultados de prueba en unidades estándares de fuerza para facilitar la comunicación. Algunos medidores de fuerza de ruptura ofrecen también una escala en unidades Strong Cobb (USC), una herencia de los días en que los medidores de dureza Strong Cobb eran de uso común. Se debe tener cuidado con la conversión entre USC y N o kp puesto que la USC proviene de un dispositivo hidráulico y es una medida de presión. Por lo general, los medidores de fuerza de ruptura contemporáneos utilizan diseños electrónicos modernos con lectores digitales. Algunas unidades tienen también una impresora integrada o pueden conectarse a una impresora. Las fuerzas de ruptura se deben poder leer con una aproximación de 1 N. Los medidores de fuerza de ruptura deben calibrarse periódicamente. El sensor de fuerza, así como la mecánica del aparato deben tenerse en cuenta. En el caso del sensor de fuerza, el intervalo completo de medición (o, como mínimo, el intervalo usado para medir la muestra de prueba) debe calibrarse con una precisión de 1 N, utilizando el método estático o el dinámico. Por lo general, la calibración estática emplea contrapesos rastreables; se deben verificar al menos tres puntos diferentes con el fin de determinar la linealidad. La calibración dinámica utiliza una celda rastreable de carga de referencia que se comprime entre las platinas. La calibración funcional de un aparato para determinar la fuerza de ruptura debe confirmar también que la velocidad y la constancia de la velocidad para la aplicación de carga o el desplazamiento estén dentro de las tolerancias prescritas en todo el intervalo de movimiento de la platina.
Tamaño de la Muestra Con el fin de conseguir la suficiente precisión estadística para la determinación de la fuerza de ruptura promedio, se deben analizar como mínimo muestras de 6 tabletas. La fuerza de ruptura promedio por sí sola puede ser adecuada para cumplir el propósito de controlar la calidad del proceso o del producto. En casos en los que la fuerza de ruptura pueda ser particularmente crítica, se debe disponer de los valores individuales y promedio de fuerza de ruptura.
RESISTENCIA A LA TENSIÓN La medición de las resistencias a la tensión proporciona una medida más importante de la resistencia mecánica del material compactado y tiene en cuenta la geometría de la tableta. Si las tabletas se fracturan por tensión, se puede usar la tuerza de ruptura para calcular la resistencia a la tensión. Desafortunadamente, esto resulta práctico solo para las formas simples. Si las tabletas redondas de caras planas (cilindros rectos de bases circulares) se fracturan por tensión, como lo indica una separación
1 764 (121 7) Fuerza de Ruptura de las Tabletas / Información General
USP 39
completa de las mitades bajo compresión diametral, se puede usar la fuerza de ruptura para calcular la resistencia a la tensión por medio de la siguiente ecuación ( 4), que se aplica sólo a tabletas cilíndricas: crx
= 2F/nDH
en donde crx es la resistencia a la tensión, F es la fuerza de ruptura, D es el diámetro de la tableta y H es el espesor de la tableta. Dado que sólo se consideran las tabletas que se fracturan por tensión, los datos se basan en las tabletas que se fracturan en forma congruente. Por lo tanto, la reproducibilidad de los datos debe mejorarse cuando se comparan con las pruebas de resistencia a la ruptura convencionales. Más aún, los datos deben normalizarse con respecto a las dimensiones de la tableta, puesto que tanto el diámetro como el espesor se incluyen en la ecuación. La derivación de esta ecuación se puede encontrar en los textos de referencia (5, 6); se basa en la teoría elástica y en las siguientes suposiciones: 1 . La tableta es un cuerpo isotrópico 2. Obedece a la ley de Hooke 3. El módulo de elasticidad en compresión y en tensión es el mismo 4. Existe un punto de carga ideal La derivación se ha extendido a las tabletas de caras convexas (7, 8): crx
= (10F/nD2) x [(2,84H/D)-(0,126H/W) + (3,15W/D) + 0,01]-1
en donde crx es la resistencia a la tensión, F es la fuerza de ruptura, D es el diámetro de la tableta, H es el espesor de la tableta y W es el espesor central del cilindro (altura de la pared de la tableta). La velocidad de carga lenta y constante de los medidores modernos de fuerza de ruptura motorizados favorece la fractura por tensión. Sin embargo, el punto de carga ideal puede no ocurrir, debido a la trituración y a la inducción de cizallamiento en la interfase con la superficie de las platinas. La adición de una almohadilla a las platinas ayuda a evitar las cizalladuras en los puntos de contacto y promueve una verdadera fractura por tensión. Por esa razón, se recomienda enfáticamente la almohadilla cuando se requieren mediciones muy precisas. Ésta debe ser relativamente delgada para que cualquier desviación con respecto al punto previsto de aplicación de fuerza puntual real no sea grande. La almohadilla debe también colapsar fácilmente de manera que su deformación no se vuelva parte de la fuerza medida por el aparato de prueba. En situaciones de rutina que incluyan mediciones de un gran número de muestras, la adición de almohadilla podría contribuir a inexactitudes en la medición puesto que el polvo de las muestras examinadas anteriormente podría quedarse incrustado en la matriz colapsable y, por lo tanto, alterar sus propiedades. A menos que se contemple el reemplazo frecuente de la almohadilla, puede considerarse aceptable prescindir del uso de la misma para mantener la constancia de las condiciones de la prueba. Otra opción para determinar la resistencia a la tensión de las tabletas consiste en la flexión o torsión de las tabletas. Bajo las condiciones de carga ideales, una carga de ruptura aplicada al punto medio sin apoyo de una de las caras ocasionará la generación de tensión pura en la cara opuesta. Si las tabletas son cilindros rectos circulares y se someten a flexión en tres puntos, la resistencia a la tensión se puede calcular con la siguiente ecuación (9): crx = 3FL/2H 2D
en donde L es la distancia entre los apoyos y los otros términos son iguales a los definidos anteriormente. Las suposiciones son las mismas usadas para calcular la resistencia a la tensión con compresión diametral. Sin embargo, las resistencias a la tensión determinadas por flexión y compresión diametral pueden no concordar debido a la probabilidad de carga no ideal y a la inducción de cizallamiento durante la prueba. REFERENCIAS
1. Davies, P.N.; Newton, J.M. In Pharmaceutical Powder Compaction Technology; Alderbom, G., Nystrom, C., Eds.; Marcel Dekker: Nueva York, 1995; Capítulo 7. 2. Gold, G.; Duvall, R.N.; Palermo, B.T. New instrumentation for determining flexure breaking strength of capsule-shaped tablets. j. Pharm. Sci. 1980, 69( 4), 384-386. 3. Diem, K., Ed. Documenta Geigy, Scientific Tables, 6th ed.; Geigy Pharmaceuticals: Ardsley, Nueva York, 1969; 214. 4. Fell, ].T.; Newton, J.M. Determination of tablet strength by the diametral-compression test. j. Pharm. Sci. 1970, 59(5), 688-691. 5. Tomoshenko, S. Theory of Elasticity; McGraw-Hill: Nueva York, 1934; 82-85, 104-109. 6. Frocht, M.M. Photoelasticity; john Wiley & Sons: Nueva York, 1948; 2, 32-39, 118-129. 7. Stanley, P.; Newton, J.M. The tensile fracture stress of capsule-shaped tablets. J. Pharm. Pharmacol. 1980, 32(12), 852854. 8. Pitt, K.G.; Newton, J.M.; Stanley, P. Tensile fracture of doubly-convex cylindrical discs under diametral loading. j. Mater. Sci. 1988, 23, 2723-2728. 9. Pitt, K.G.; Newton, J.M.; Richardson, R.; Stanley, P. The material tensile strength of convex-faced aspirin tablets. J. Pharm. Pharmaco/. 1989, 4 7, 289-292.
USP 39
Información General/ (1222) Productos Farmacéuticos con Esterilización Terminal 1 765
(1222) PRODUCTOS FARMACÉUTICOS CON ESTERILIZACIÓN TERMINAL-LIBERACIÓN PARAMÉTRICA INTRODUCCIÓN La liberación paramétrica se define como la liberación de partidas o lotes de productos estériles con esterilización terminal, basada en el cumplimiento de los parámetros de esterilización críticos y definidos, y sin tener que realizar las pruebas que figuran en Pruebas de Esterilidad (71 ). La liberación paramétrica es posible cuando la forma de esterilización se comprende bien, los parámetros físicos del procesamiento están bien definidos y son predecibles y mensurables, y cuando la letalidad del ciclo ha sido validada microbiológicamente mediante el uso de indicadores biológicos apropiados o, en el caso de radiación ionizante, mediante el uso de pruebas dosimétricas y microbiológicas adecuadas. El empleo de la liberación paramétrica para procesos de esterilización requiere previa aprobación de la FDA. Al momento de evaluar solicitudes de registro que incluyan el uso de liberación paramétrica del producto, debe esperarse que las agencias reglamentarias insistan en una justificación científica bien fundada para el proceso de esterilización y en datos de validación bien documentados. Las agencias necesitarán asegurarse de que cualquier muestra comercial de un producto sea estéril y, si fuera analizada después de su liberación, cumpliría con los requisitos para esterilidad que se encuentran en el capítulo general Pruebas de Esterilidad (71 ). Es importante considerar las limitaciones de las Pruebas de Esterilidad (71) en la evaluación de productos con esterilización terminal. Las pruebas de esterilidad descritas en el capítulo general (71) tienen una sensibilidad limitada y son estadísticamente poco apropiadas para la evaluación de productos con esterilización terminal dada la probabilidad excesivamente baja de encontrar unidades contaminadas. Por lo tanto, una vez que un proceso de esterilización está completamente validado y funciona con uniformidad, una combinación de datos físicos de esterilización tales como los de dosimetría o letalidad acumulada en combinación con otros métodos, como monitores de carga (p.ej., indicadores biológicos, indicadores termoquímicos o integradores fisicoquímicos), puede proporcionar información más exacta que las pruebas de esterilidad con respecto a la liberación al mercado de productos con esterilización terminal. Hay cuatro formas de esterilización que teórica y prácticamente podrían cumplir con los requisitos para la liberación paramétrica: las esterilizaciones por calor húmedo, por calor seco, por óxido de etileno y por radiación ionizante. En este capítulo de información se discuten primeramente las cuestiones generales relacionadas con la liberación paramétrica, sin importar la forma de esterilización, y luego se analizan algunas formas específicas de esterilización. El capítulo no trata la liberación paramétrica de dispositivos médicos con esterilización terminal. Los productos con esterilización terminal representan la categoría de menor riesgo de productos farmacéuticos estériles. A diferencia de los productos fabricados asépticamente en un ambiente microbiológicamente controlado, los productos con esterilización terminal se someten a un proceso de esterilización que imparte un nivel mínimo y mensurable de garantía de esterilidad (o SAL, por sus siglas en inglés). Dado que el procesamiento aséptico depende de la exclusión de la contaminación microbiológica y no está basado en la letalidad que se le confiere al producto en su envase sellado, no es posible calcular el SAL. Es importante destacar que en el caso del procesamiento aséptico, el SAL sólo puede estimarse a partir de los índices de contaminación en el llenado de medios de cultivo (media fill) u otra forma de evaluación de riesgo. En el caso de la esterilización terminal, es posible calcular un SAL mínimo o Probabilidad de No-esterilidad o Falta de Esterilidad (PNS, por sus siglas en inglés) con bastante exactitud. Por lo tanto, el término SAL tiene diferentes significados contextuales cuando se lo emplea para describir procesos asépticos más que procesos terminales, y es importante que los científicos e ingenieros que trabajan en el campo de fabricación y control de productos estériles comprendan claramente esta diferencia. Las siglas PNS y SAL con frecuencia se usan como sinónimos. Los productos con esterilización terminal deben tener una probabilidad de no-esterilidad (PNS) de no más de una en un millón de unidades producidas. Esto se indica frecuentemente como una PNS o un SAL de 1Q-ó, o una probabilidad de supervivencia de la biocarga del producto al proceso de esterilización en una unidad cualquiera del producto menor de uno en un millón. Se puede probar que un producto con esterilización terminal cumple con la PNS de 1Q-ó mediante diferentes enfoques de desarrollo del ciclo de esterilización. La aplicación apropiada de estos métodos requiere de un conocimiento científico exhaustivo del método de esterilización seleccionado para su uso con un producto determinado. Las estrategias empleadas para validar el desarrollo de procesos de esterilización terminal se encuentran dentro de tres categorías: 1 . Proceso basado en la biocarga. 2. Proceso combinado de indicador biológico/biocarga. 3. Proceso de sobremuerte (overkill). El proceso basado en Ja biocarga requiere de un amplio conocimiento de la biocarga del producto. Debe observarse que muchos de los procedimientos de determinación de la dosis de radiación implican el establecimiento del proceso sobre la base del recuento de la biocarga y de la resistencia a la radiación. Este método exige que el proceso de esterilización produzca al menos una PNS de 10-6 para la biocarga. Esto significa que si el nivel de biocarga activa del producto es de 1 O microorganismos o una unidad logarítmica, deberían inactivarse al menos siete unidades logarítmicas de biocarga para asegurar una PNS de 10-6 • El método basado en la biocarga requiere que el usuario desarrolle puntos críticos de control apropiados dentro del proceso para determinar el título de la biocarga. Los productos que facilitan la supervivencia de la biocarga requieren ambientes de fabrica-
1766 (1222) Productos Farmacéuticos con Esterilización Terminal / Información General
USP 39
ción más controlados y controles más precisos durante el proceso. Este proceso es más apropiado para el desarrollo de ciclos en productos limpios o ultra limpios que contienen constantemente un nivel bajo de unidades formadoras de colonias (ufc) por unidad de producto con una baja frecuencia de microorganismos formadores de esporas. Asimismo, este proceso puede ser necesario para permitir la esterilización terminal de un producto que pudiera perder cualidades o atributos clave como resultado de un proceso de esterilización más riguroso. El microbiólogo puede encontrar que los procedimientos formales de análisis de riesgo, como por ejemplo los de Análisis de Riesgo y Puntos Críticos de Control (HACCP, por sus siglas en inglés), son útiles para establecer las condiciones adecuadas de control de fabricación y los parámetros de control durante el proceso. El proceso combinado de indicador biológico/biocarga se emplea generalmente cuando el fabricante desea un proceso de esterilización que demuestre la inactivación de gran número de microorganismos indicadores biológicos que se saben resistentes al proceso. Aunque el fabricante pueda tener preferencia por el proceso de sobremuerte (overkill), la posible pérdida de algunos atributos del producto en este tipo de proceso puede ocasionar la necesidad de emplear el proceso combinado indicador biológico/biocarga. Este último requiere del conocimiento de la biocarga dentro y sobre el producto, y de una base de datos referente a la resistencia de la biocarga a la esterilización. La resistencia relativa del indicador biológico seleccionado con respecto a la resistencia de la biocarga se debe establecer dentro o sobre el producto. Frecuentemente se emplean indicadores biológicos con aproximadamente 106 esporas con valor 0 121 > 1 minuto en el desarrollo de dicho proceso. Generalmente se realizan ciclos de exposición fraccionada para determinar la resistencia relativa a la esterilización (o valor D) entre el producto inoculado con el o los microorganismos indicadores biológicos y la biocarga encontrada frecuentemente. Este proceso es utilizado con frecuencia para el desarrollo de los ciclos de esterilización por los fabricantes de productos parenterales con esterilización terminal, y para la esterilización por óxido de etileno de dispositivos médicos. El proceso de sobremuerte es frecuentemente utilizado cuando el artículo a esterilizar es completamente inerte al agente esterilizante y a las condiciones del ciclo de esterilización, y no existe riesgo de pérdida de los atributos o de la calidad del producto. Cuando se emplea este proceso, se deben tener conocimientos sobre la biocarga para asegurar que los materiales no están adulterados antes de la esterilización. Estos datos pueden ser los datos de recuento de la biocarga del producto y también sobre la prevalencia de formadores de esporas. No se necesita que la base de datos para este proceso sea tan extensa como las requeridas para el proceso de biocarga o para el proceso de indicador biológico/biocarga. Para establecer la eficacia del proceso de esterilización, se utilizan generalmente indicadores biológicos resistentes al proceso que contienen aproximadamente 106 esporas. Sin embargo, se puede escoger una población de esporas de N 0 para confirmar un proceso de letalidad adecuado. La sobremuerte por lo general se define como un proceso que daría un mínimo de F0 1 de 12 minutos (ver Parámetros Críticos de Operación más adelante) y se demuestra biológicamente basándose en la reducción logarítmica de esporas de indicadores biológicos calibrados.
GENERALIDADES Validación del Proceso de Esterilización La liberación paramétrica exige primeramente que el proceso de esterilización elegido sea diseñado y validado para alcanzar una PNS de 1Q-6. La validación de la mayoría de los procesos de esterilización incluye la validación de los parámetros físicos del proceso y de su eficacia microbiológica mediante el uso de indicadores biológicos. Sin embargo, el uso de indicadores biológicos para establecer o validar periódicamente procesos de esterilización por radiación gamma es poco común. Los organismos ampliamente reconocidos como indicadores biológicos se emplean en la validación de procesos de calor húmedo, porque permiten la comparación de los datos de letalidad medidos físicamente con la letalidad biológica. Debe existir una correlación razonable entre los datos de letalidad medidos físicamente (F 0) y la letalidad biológica del proceso determinada mediante la evaluación del producto con indicadores biológicos. La eficacia predecible de la esterilización terminal basada en la biocarga está fundamentada en el número y la resistencia de los microorganismos dentro o sobre el producto. Por esta razón, uno de los componentes de la liberación paramétrica es un programa activo para el control microbiológico que permita el seguimiento del recuento y la resistencia a la esterilización de la biocarga del producto. El control de la biocarga y su recuento son mucho menos significativos cuando se emplea el diseño de proceso de sobremuerte. En muchos casos, los procesos de sobremuerte no requieren de una evaluación extensiva y continua de la biocarga. También requieren de un menor control del ambiente de fabricación durante el proceso.
Programa de Control Microbiológico de Esterilización El propósito de este programa de control es asegurar que el estado microbiológico del producto, antes de ser esterilizado termina/mente, no se desvíe significativamente del nivel de control microbiológico establecido durante la validación del proceso de esterilización. El programa de control microbiológico incluye el seguimiento de la biocarga dentro y sobre el producto, y el seguimiento del estado microbiológico de los envases, cierres o materiales de empaque que se necesiten. También incluye un programa de evaluación del estado microbiológico del ambiente donde se procesa el producto. El programa de control es par1 F0 se define como el tiempo calculado (en minutos) de la letalidad del proceso equivalente al tiempo a 121, 1º, asumiendo un valor Z de 10,0º en el producto que se va a esterilizar.
USP 39
Información General/ (1222) Productos Farmacéuticos con Esterilización Terminal 1767
ticularmente importante en los casos en donde la esterilización terminal no está basada en la sobremuerte, sino en los enfoques de desarrollo de ciclos basados en la biocarga o en la combinación de indicador biológico/biocarga. En muchos casos, no se requerirá el control de la biocarga y el seguimiento del ambiente de fabricación para diseños del proceso de sobremuerte, en donde la F0 del proceso sea por lo menos de 12 minutos. En otros casos será necesario algún seguimiento limitado, aunque se use el diseño de proceso de sobremuerte. En general, el seguimiento de la biocarga en los procesos de sobremuerte se limita a aquellos productos que sustentan el crecimiento microbiano. Reviste especial preocupación en este caso la posibilidad latente de contaminación del producto con toxinas microbianas o de degradación por microorganismos. La frecuencia del seguimiento dependerá de las variaciones en la biocarga proveniente de fuentes potenciales. Deben considerarse el número de microorganismos, su identificación, así como su resistencia a la forma de esterilización específica cuando se establece la liberación paramétrica del producto con esterilización terminal. La resistencia de diferentes especies a formas de esterilización específicas puede afectar la eficacia de la esterilización y la determinación de las condiciones del proceso de esterilización cuando se usa un método de biocarga o un proceso combinado de biocarga/indicador biológico en el desarrollo del ciclo. En el desarrollo del proceso usando el enfoque de biocarga, pueden usarse organismos indicadores más resistentes que los típicos de la biocarga, aunque no se requieren diferencias extremas en la resistencia. La información sobre el desempeño de indicadores biológicos puede encontrarse en el capítulo general Indicadores Biológicos-Pruebas de Resistencia (55).
Sistema de Control de Cambios Los cambios introducidos en el equipo del proceso de esterilización pueden ocasionar una desviación significativa del proceso de liberación paramétrica inicialmente validado. Por lo tanto, es esencial que se establezca un sistema de control de cambios. Un sistema de control de cambios es un sistema formal con procedimientos operativos estándares apropiados, que incluye la aprobación de cambios en el equipo del proceso de esterilización. Este sistema permitiría la evaluación de todos los cambios relacionados con los parámetros críticos de la liberación paramétrica. El sistema de control de cambios también incluye una revisión técnica y gerencial, y criterios para la aceptación y revisión de cambios. Si un cambio pudiera afectar significativamente cualquier parámetro crítico, cada parámetro tendría que ser revalidado para asegurar la esterilidad del producto farmacéutico con una PNS mínima de 1Q-6. Una notificación apropiada a la agencia reglamentaria también debería formar parte del proceso de revalidación.
Procedimientos de Liberación Debe establecerse un programa de garantía de la calidad que describa en detalle los pasos para la liberación paramétrica de las partidas o lotes de productos esterilizados y la documentación requerida. Aunque la evaluación de la garantía de esterilidad de los productos se basa primariamente en la medición de los parámetros físicos del proceso, se deben revisar, documentar y aprobar varios asuntos para la liberación paramétrica de esos productos. Entre estos asuntos se encuentran los siguientes: revisión de los registros de partida; revisión de los resultados del programa de control ambiental microbiológico en curso y de la biocarga previa a la esterilización; y una revisión de los registros de datos termográficos, de los monitores de carga y de los resultados de los datos críticos y no críticos que puedan haber sido utilizados para demostrar el control del proceso. También es importante asegurar que el esterilizador se encuentra actualizado en cuanto a calibración, mantenimiento y revalidación. El programa de liberación paramétrica no se implementa ni practica en forma intermitente. Una vez implementado dicho programa, la liberación del producto esterilizado se hace de acuerdo con los requisitos del programa aprobado reglamentariamente. La liberación del producto por otros medios no es aceptable si no se alcanzan los parámetros críticos de funcionamiento predefinidos.
FORMAS DE ESTERILIZACIÓN Esterilización por Calor Húmedo La esterilización por calor húmedo de productos farmacéuticos abarca varios tipos de ambientes y medios de esterilización. Los procesos de vapor saturado, de rocío de agua caliente y de inmersión en agua caliente son considerados ambientes de esterilización por calor húmedo. Pueden emplearse diferentes procesos para esterilizar productos por calor húmedo, éstos pueden utilizar esterilizadores de lote o esterilizadores continuos. PARÁMETROS CRÍTICOS DE FUNCIONAMIENTO En las especificaciones del proceso de esterilización se define y establece una lista de parámetros clave del proceso con sus respectivos límites operativos. Los parámetros críticos de funcionamiento son aquellos absolutamente esenciales para asegurar la esterilización del producto a una PNS de 10-6 • Entre los ejemplos de parámetros críticos de funcionamiento se pueden incluir, aunque no exclusivamente, los siguientes: los límites de tiempo de permanencia, los límites mínimo y máximo para la temperatura de permanencia pico del proceso, la temperatura de permanencia pico promedio y los resultados de las pruebas de liberación de la partida o lote que satisfacen los requisitos de CFR, Parte 211 (p.ej., los resultados de laboratorio para un
1768 (1222) Productos Farmacéuticos con Esterilización Terminal / Información General
USP 39
monitor de carga). El valor de F0 puede usarse como un parámetro crítico sólo cuando las relaciones entre temperatura y tiempo están bien definidas. Otros parámetros medidos pueden considerarse parámetros secundarios (o no críticos); y entre ellos se encuentran el tiempo de permanencia máximo y mínimo para el pico de temperatura, la presión de la cámara y, si correspondiera, el nivel de agua de la cámara, el tiempo en que el agua esterilizante permanece por encima de los límites de temperatura definidos, y el diferencial de presión de la bomba recirculante de agua.
Esterilización por Óxido de Etileno La implementación de la liberación paramétrica de productos farmacéuticos esterilizados por óxido de etileno es más dificultosa que la liberación paramétrica de productos esterilizados por procesos de calor húmedo. Los parámetros críticos para la esterilización por óxido de etileno (ETO, por sus siglas en inglés) se interrelacionan y son más complicados que los de los procesos de calor húmedo. PARÁMETROS CRÍTICOS DE FUNCIONAMIENTO Los parámetros críticos pueden incluir los siguientes: temperatura, cantidad de humedad relativa presente, concentración de óxido de etileno, tiempo total de exposición, densidad del producto y de la carga, y factores de permeabilidad del gas. La liberación paramétrica de productos farmacéuticos puede lograrse si se emplea un sistema automatizado de medición de los parámetros críticos, y las cargas de esterilización se definen con límites estrechos y se validan de acuerdo a los tipos de producto, densidades, materiales de empaque y configuración global de la carga. Un ejemplo de la medición de factores críticos que puede ser considerado para la liberación paramétrica sería el uso de registradores de presión de ETO calibrados para proporcionar una estimación de la concentración de ETO durante todo el proceso, o el uso de mediciones directas de la concentración de ETO por IR o cromatografía de gases. Debido a las variaciones que pueden ocurrir en los parámetros clave durante la esterilización, la liberación paramétrica no es ampliamente usada para productos esterilizados por ETO. Sin embargo, para asegurar una liberación paramétrica, además de ceñirse a los parámetros del proceso de esterilización por óxido de etileno, con frecuencia se emplean indicadores biológicos (y sus pruebas de esterilidad posterior al procesamiento de esterilización) o integradores físicoquímicos para la esterilización por óxido de etileno como monitores de carga (parámetros críticos).
Esterilización por Radiación Se han usado dos procesos de esterilización por radiación: la esterilización por rayos gamma y la esterilización por haz de electrones (es decir, radiación ionizante). Algunos productos farmacéuticos, tanto a granel como en sus formas terminadas, han sido esterilizados por radiación. Al tratar los parámetros críticos necesarios para la liberación paramétrica en la esterilización por radiación, la liberación paramétrica se refiere a menudo como liberación dosimétrica. La liberación dosimétrica se establece por el uso de un dosímetro químico que detecta la liberación de una dosis mínima específica de radiación, la cual ha demostrado que esteriliza el producto a una PNS mínima de 1 Q-6. El dosímetro en la esterilización por radiación ionizante que se emplea para medir la recepción de una dosis mínima de radiación, se coloca en una zona preestablecida que absorbe dosis bajas en el transportador del producto irradiado. Esto requerirá el mapeo del perfil de la radiación ionizante absorbida a través de las diversas densidades procesadas en el transportador del producto. La dosis de radiación más baja que se especifica para el proceso se correlaciona con los niveles predecibles de reducción de la biocarga, mediante cualquiera de los tres métodos documentados.2 Es posible considerar un método alternativo disponiendo del recuento extensivo de la biocarga del producto y de los datos de resistencia a la radiación. Los estudios de verificación de la dosis se realizarán con el fin de asegurar que la peor de las biocargas, considerando su resistencia y recuento, pueda ser inactivada en la zona de recepción de la dosis más baja en el sistema transportador, de forma que se logre al menos una PNS de 10-6 . Este método requerirá desde luego un programa continuo de evaluación de la biocarga. El objetivo para el ciclo de radiación es una PNS mínima de 10-6 en cuanto a la biocarga del producto. La liberación dosimétrica de un producto esterilizado por radiación depende de la recepción de una dosis mínima, por lo tanto, los parámetros críticos de funcionamiento que gobiernan la recepción de esa dosis deben estar dentro de límites especificados. Estos parámetros críticos de funcionamiento pueden incluir: configuración de apilado dentro del transportador, densidad del producto a granel, velocidad de la cinta o del sistema transportador, distancia a la fuente de radiación, duración de la exposición del producto, y ajustes adecuados y definidos para compensar la desintegración de la fuente de radiación. La demostración de uniformidad en la dosis de radiación absorbida en las zonas de mínima y máxima absorción de la radiación dentro de los transportadores totalmente cargados, considerada sobre la base de las variaciones entre lotes es una condición necesaria para la liberación dosimétrica de productos farmacéuticos esterilizados por radiación.
2 ANSI/AAMl/150 111 37-1996,
ción, 11 de Julio, 1994.
Esterilización de Productos para el Cuidado de la Salud-Requisitos para la Validación y el Control de Rutina-Esterilización por Radia-
USP 39
Información General/ (1223) Métodos Microbiológicos Alternativos 1769
RESUMEN El uso de la liberación paramétrica como sucedánea de las pruebas de esterilidad de productos descritas en el capítulo general Pruebas de Esterilidad (71) exige la aprobación previa de la FDA. La liberación paramétrica es ventajosa para productos con esterilización terminal. La gran extensión de datos requeridos para establecer la liberación paramétrica, en comparación con los procedimientos del capítulo general (71) los cuales son poco sensibles a niveles muy bajos de contaminación microbiológica, puede dar como resultado una evaluación más exacta y confiable de la probabilidad de falta de esterilidad en lotes de producto.
(1223) VALIDACIÓN DE MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS ALTERNATIVOS INTRODUCCIÓN Este capítulo provee una guía sobre la selección, la evaluación y el uso de métodos microbiológicos como alternativas a los métodos farmacopeicos. A fin de implementar adecuadamente los métodos alternativos, se deben considerar diversos factores importantes antes de seleccionar la tecnología analítica y de calificar dicho método con el producto real. Dichos factores incluyen, entre otros, la identificación de metodología alternativa adecuada, el desarrollo de especificaciones del usuario para la selección de equipos, la demostración de la aplicabilidad del método como reemplazo de un método farmacopeico estándar, y la calificación del método en el laboratorio. Este capítulo abarca: • Requisitos del usuario - Calificación del instrumento - Validación de tecnologías alternativas - Aptitud del método • Las limitaciones en el uso de Unidades Formadoras de Colonias (UFC) como señal estándar para métodos microbiológicos. • Cuatro opciones novedosas para demostrar la equivalencia - Procedimientos aceptables - Equivalencia del desempeño - Equivalencia de los resultados - Equivalencia de las decisiones • Aplicación del concepto de no inferioridad a la validación del método • Guía sobre métodos estadísticos que pueden emplearse en la validación del método Al final de este capítulo se incluye un glosario de los términos utilizados. Los métodos microbiológicos, distintos a los métodos de identificación microbiana y de tipificación de cepas (tratados en el capítulo Caracterización, Identificación y Tipificación de Cepas Microbianas (1113)), descritas en el compendio caen en dos categorías generales: 1. Métodos cualitativos (no enumerativos) que se usan para evaluar la calidad microbiológica general de los artículos farmacopeicos. Esta categoría incluye valoraciones destinadas a demostrar la presencia o ausencia de microorganismos en un artículo farmacopeico. 2. Métodos cuantitativos que producen un resultado numérico (enumerativo) en términos del contenido microbiano de un artículo farmacopeico. Existen factores analíticos inherentes que deben tenerse en cuenta al implementar métodos microbiológicos y en la comparación de un método alternativo candidato con un método farmacopeico existente. Con respecto a ("la ausencia de") análisis cualitativo, es crítico considerar que en microbiología, la determinación de la "no presencia de microorganismos" no significa en términos absolutos que en realidad haya cero células presentes en el artículo farmacopeico. Un resultado de "ausencia de crecimiento" en un método farmacopeico vigente se interpreta adecuadamente como "no se detectó crecimiento en la muestra de prueba del artículo farmacopeico en las condiciones especificadas". Nunca se han establecido cuantitativamente los límites reales de detección de los métodos microbiológicos farmacopeicos, y se entiende que son muchas las variables que pueden afectar la recuperación de microorganismos. Estas variables incluyen la selección del medio de crecimiento, las condiciones de incubación, los requisitos nutricionales de los microorganismos que pudieran estar presentes, la condición física de los microorganismos y las características del artículo farmacopeico en análisis. Los estudios sobre la recuperación de microorganismos de agua potable y ambiental han demostrado que los métodos tradicionales de recuento en placa que informan estimaciones de recuentos celulares como unidades formadoras de colonias (ufc) pueden recuperar O, 1 %-1 % de las células microbianas reales presentes en una muestra (1 ), en comparación con los métodos alternativos que usan citometría de flujo y que, por tanto, producen una señal distinta (recuento celular). La presencia de un
1770 (1223) Métodos Microbiológicos Alternativos/ Información General
USP 39
número mayor de células determinadas por medio de un método alternativo que se basa en una señal distinta a las ufc no se ha correlacionado con un mayor riesgo para el paciente ni con la probabilidad de una mayor presencia de patógenos cuando existe un registro de seguridad establecido. Estos resultados indican que en algunos tipos de muestras, la media estimada para el recuento celular que se registra usando una valoración farmacopeica basada en crecimiento puede dar como resultado un valor de media estimada de recuento celular muy diferente al derivado de un método microbiológico alternativo que se base en una señal distinta a las ufc. Asimismo, se debe considerar que en microbiología analítica, el concepto de resultados falso positivo o falso negativo es difícil desde el punto de vista científico y conceptual. Por ejemplo, no sería apropiado considerar en una comparación entre un método farmacopeico estándar y un método alternativo candidato que un resultado negativo obtenido con el método estándar signifique que los resultados positivos observados en el método alternativo sean falsos positivos. Es una característica normal de un método convencional basado en crecimiento que recupere adecuadamente algunas especies y que no pueda recuperar otras. Aunque no es necesario para un método alternativo y para el método convencional generar una correspondencia en términos del resultado, lo que es importante es que el método candidato sea capaz de permitir al microbiólogo tomar una decisión equivalente con respecto a la calidad del producto de manera consistente. Es extremadamente importante en la aplicación de este capítulo que los usuarios tomen en cuentá que la microbiología es una ciencia logarítmica. Aunque es posible distinguir entre 100 y 1000 ufc (una diferencia de 1 log 10), puede no ser posible distinguir diferencias menores (menos de 0,3-0,5 log 10). La variabilidad inherente de estos métodos es sustancialmente mayor que la de los métodos químicos analíticos. Esta variabilidad analítica inherente siempre debe considerarse durante la selección, el desarrollo y la validación de métodos alternativos. La expectativa de un grado de concordancia entre los métodos microbiológicos alternativos y los métodos tradicionales basados en crecimiento más allá de lo que es técnicamente factible podría complicar la implementación de tecnologías analíticas novedosas independientemente de su modo específico de análisis. En microbiología no es posible lograr el mismo nivel de caracterización (variabilidad del método) de los métodos químicos modernos (p.ej., cromatografía líquida de alta resolución con una precisión de desviación estándar relativa de 1 %-2%) . Es razonable considerar que el nivel típico de precisión por lo general estará en el orden de una desviación estándar relativa de 15%-35%, aunque los resultados fuera de este intervalo en los extremos superior e inferior son ciertamente posibles. Asimismo, la enorme cantidad y diversidad de microorganismos potenciales así como la variabilidad inherente de niveles de actividad metabólica en la naturaleza pueden complicar la recuperación. No se debe pensar que la disponibilidad de nuevos métodos microbiológicos alternativos, que en algunos casos pueden recuperar recuentos celulares mayores que los típicamente observados usando métodos farmacopeicos existentes, significa nuevos riesgos para los pacientes que no habían sido reconocidos con anterioridad.
Perspectiva de la USP sobre la Implementación de Métodos o Procedimientos Alternativos La Farmacopea de Jos EE.UU. (USP) ha provisto desde hace mucho tiempo mecanismos para la implementación de métodos o procedimientos alternativos de valoración para analizar los artículos farmacopeicos. Las Advertencias y Requisitos Generales de la USP indica que, "Se pueden usar métodos y/o procedimientos alternativos que proporcionen alguna ventaja en cuanto a exactitud, sensibilidad, precisión, selectividad o adaptabilidad a la automatización o a la reducción de datos computarizados o en otras circunstancias especiales." Esta declaración permite al usuario libertad con respecto a la decisión de usar un procedimiento alternativo para la liberación habitual del producto, siempre que se preste atención técnica y científica apropiada a la selección, calificación e implementación del método. Cuando se ha demostrado que un producto es seguro para uso amplio al momento de su liberación o cuando se ha controlado usando los métodos vigentes, la implementación de un método alternativo que puede estar bien correlacionado con el método existente debe ser sencilla.
Métodos y Procedimientos USP como Pruebas de Arbitraje Todos los métodos y procedimientos descritos en los capítulos generales USP sobre pruebas microbiológicas, con una numeración menor de (1000), están destinados como pruebas de arbitraje para cualquier producto comercializado legalmente en los Estados Unidos. Esto significa que, en caso de cualquier tipo de disputa, sólo el resultado obtenido usando el método o procedimiento publicado en la USP será concluyente. Por ende, los métodos o procedimientos alternativos implementados y calificados por un usuario no servirán como reemplazo legal del método oficial USP, que continuará sirviendo como prueba de arbitraje en caso de disputa.
Consideraciones Generales Con Respecto a las Valoraciones de Control de Calidad para la Liberación del Producto Aunque los métodos y procedimientos descritos en los capítulos generales USP están destinados como métodos de prueba de arbitraje oficiales, se reconoce que dichos sistemas pueden no funcionar sin modificación de manera óptima como pruebas de control de calidad para artículos farmacopeicos específicos. Los métodos oficiales USP requerirán evaluaciones para determinar su aptitud de uso al aplicarlos a productos específicos y dichas evaluaciones deberán llevarse a cabo teniendo en cuenta los conocimientos específicos que posea el usuario acerca del producto. Los procedimientos para demostrar la aptitud de este método (verificación; inhibición/mejoramiento) se proveen en los capítulos de pruebas farmacopeicas pertinentes. Por ejemplo,
USP 39
Información General/ (1223) Métodos Microbiológicos Alternativos 1 771
algunos artículos farmacopeicos pueden tener propiedades antimicrobianas inherentes que de no ser modificadas (o neutralizadas), podrían afectar de manera adversa la aptitud de un método o procedimiento farmacopeico dado. Cuando dichos métodos o procedimientos se incluyen en las presentaciones reglamentarias y el producto resulta aprobado, estos se usarán como pruebas de liberación del producto y pruebas de vida útil.
Capítulos Armonizados Algunos métodos o procedimientos microbiológicos de la USP contienen una declaración de que han sido armonizados con métodos o procedimientos correspondientes encontrados en la Farmacopea Europea y la Farmacopea japonesa. En los capítulos que contienen esta declaración, el texto que describe el método o el procedimiento se considera intercambiable (para información adicional, ver Armonización Farmacopeica (1196)). Si se lleva a cabo un método o procedimiento farmacopeico usando texto armonizado tal como se encuentre redactado en la USP, la Farmacopea Europea o la Farmacopea Japonesa, se considera legalmente intercambiable. Sin embargo, la implementación de un método alternativo como prueba de control de calidad para reemplazar un método descrito en la USP, no significa que dicho método o procedimiento sería intercambiable desde la perspectiva de todas las jurisdicciones, a menos que cumpla con los criterios para métodos alternativos conforme se especifiquen en la otra farmacopea.
Presentación de Métodos o Procedimientos Alternativos ante la USP Las Advertencias y Requisitos Generales de la USP estipulan que los métodos alternativos deben ser presentados ante la USP para su evaluación en caso de que una organización desee que se tenga en cuenta el método alternativo para su inclusión como método farmacopeico. Esta oportunidad de promover análisis microbiológicos a menudo ignorada por las partes interesadas de la USP. La presentación de métodos o procedimientos alternativos permite a la USP considerar cualquier método como una adición o reemplazo de un método o procedimiento estándar existente. La presentación de un método alternativo debe incluir detalles completos analíticos y del equipo, así como datos analíticos detallados de las pruebas experimentales de calificación pertinentes. Para que cualquier método o procedimiento sea considerado como reemplazo o método de arbitraje adicional, no debe tratarse de un método o procedimiento patentado con reactivos o instrumentación disponible de una sola fuente. Asimismo, cualquier método candidato de reemplazo o adicional debe tener una amplia aplicabilidad, ser adecuado para uso de rutina y debe ser compatible con un espectro amplio de artículos farmacopeicos pertinentes.
Capítulos USP Adicionales Relacionados con la Implementación de Métodos Microbiológicos Alternativos Diversos capítulos de información general USP proveen información habitual relacionada con la implementación de métodos y procedimientos alternativos. El capítulo Validación de Procedimientos Farmacopeicos (1225) provee información detallada sobre presentaciones de métodos alternativos para los compendios, así como una guía general sobre validación y la evaluación de características de desempeño analítico. El capítulo Validación de Recuperación Microbiana de Artículos Farmacopeicos (1227) provee información útil con respecto a la validación de métodos usados para la recuperación de microorganismos viables a partir de artículos farmacopeicos (neutralización de propiedades antimicrobianas de los artículos). El capítulo (1113) provee información sobre la calificación de métodos de identificación microbiana. Finalmente, el capítulo Calificación de Instrumentos Analíticos (1058) provee información sobre la calificación de los equipos analíticos. Aunque el capítulo Análisis de Valoraciones Biológicas (1034) está centrado principalmente en la determinación de la potencia del producto usando valoraciones biológicas, también trata principios fundamentales con respecto a varianza, error y aspectos biométricos que pueden proveer información para aquellos que se encuentran desarrollando y validando métodos o procedimientos microbiológicos alternativos.
Información y Reglamentos Adicionales Relacionados con el Uso de Métodos Alternativos En los reglamentos de las Buenas Prácticas de Fabricación Vigentes de la U.S. Food and Drug Administration o FDA (Administración de Alimentos y Medicamentos de los EE.UU.), que aparecen en el título 21 del CFR, Parte 211.194, se describen los requisitos para métodos de prueba usados para evaluar el cumplimiento de los artículos farmacéuticos con las especificaciones aprobadas. Los reglamentos indican que los métodos de prueba deben tener capacidad adecuada con respecto a exactitud y confiabilidad. Esta subsección de los reglamentos también reconoce el fundamento legal de las normas de la USP y del Formulario Nacional (NF) y aclara que es responsabilidad del usuario validar los métodos o procedimientos que difieran de aquellos estandarizados en dichos compendios. El documento Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology [Q2(R1 )] (Validación de Procedimientos Analíticos: Texto y Metodología [Q2(R1)]) de la lnternational Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use o ICH (Conferencia Internacional sobre Armonización de Requisitos Técnicos para el Registro de Productos Farmacéuticos para Uso Humano) también puede ser una referencia útil para el desarrollo y la validación de mé-
1772 (1223) Métodos Microbiológicos Alternativos/ Información General
USP 39
todos o procedimientos alternativos. Este documento de la ICH provee información útil sobre la presentación de procedimientos analíticos junto con solicitudes de registro de producto presentadas en los Estados Unidos, así como en Japón y Europa.
REQUISITOS PARA EL USUARIO Es esencial determinar los requisitos técnicos precisos necesarios para un método microbiológico alternativo antes de poder seleccionar la tecnología y el equipo apropiados que cumplirán los requisitos pertinentes de la valoración. Por lo tanto, se sugiere que las organizaciones que deseen desarrollar y validar un método alternativo candidato elaboren un documento de especificaciones sobre requisitos para el usuario (URS, por sus siglas en inglés). Este documento debe incluir todas las funciones críticas de la tecnología, los requisitos críticos de interfase del usuario, los requisitos de espacio, ambientales, operativos, y todas las demás características importantes de un método alternativo para el uso previsto. Estos requisitos serán específicos para la compañía u organización, así como para el uso previsto del método alternativo, por lo que los requisitos deben ser generados por el usuario. Al generar un documento de especificaciones sobre requisitos para el usuario, se deben considerar tres componentes independientes del método de validación microbiológica alternativo: 1. Calificación del instrumento. La mayoría de los métodos microbiológicos alternativos dependerán del equipo específico. Este equipo analítico está sujeto a los requisitos estándar de calificación de instrumentos de la industria (ver el capítulo (1058) para más información). 2. Validación de tecnologías alternativas. La justificación básica para usar una metodología alternativa es mejorar en algún aspecto la tecnología existente del método farmacopeico vigente sin sacrificar características esenciales de dicha tecnología (p.ej., recuento en placa y filtración por membrana). La tecnología vigente para los métodos microbiológicos farmacopeicos consiste en la detección del crecimiento de microorganismos viables en (o dentro) de un medio nutritivo. La tecnología alternativa debe ser al menos equivalente a la tecnología vigente en términos de desempeño para el uso previsto. La mayor parte del soporte técnico para equivalencia puede provenir de bibliografía revisada por expertos en el campo o de una presentación reglamentaria previa (p.ej., un proveedor presentó el Archivo de Fármaco Maestro ante la FDA, o una presentación previa de una compañía sobre esta tecnología), pero esto debe confirmarse según sea adecuado para el uso previsto. 3. Aptitud del método. Esta consideración debe tratar tanto la aptitud de la tecnología para la prueba específica y la falta de inhibición del producto como el mejoramiento de los resultados de la prueba. a. Aptitud de la tecnología para la prueba específica. Muchas pruebas microbiológicas farmacopeicas exigen requisitos de prueba. Un ejemplo de esto serían planes de muestra que constan de la cantidad de material que se va a analizar (p.ej., 1 O g o 20 unidades de un volumen específico). Debido a que los resultados de prueba se usan con frecuencia para determinar el cumplimiento con las especificaciones del producto terminado, y las especificaciones dependen del volumen o cantidad de muestra, la tecnología alternativa debe ser capaz de satisfacer los requisitos de volumen de muestra conforme a lo requerido en el método de prueba general. No se recomienda el uso de un volumen o tamaño de muestra menor y esto requeriría ser justificado cabalmente por el usuario o para cada caso. La tecnología alternativa se considera adecuada si puede cumplir con todos los parámetros críticos de la prueba farmacopeica. b. Inhibición y mejoramiento. Algunos productos específicos pueden interferir o mejorar la señal de diversas tecnologías de medición para la señal específica de interés (ver el capítulo (1227)). Este componente del método de validación microbiológica alternativo (es decir, la aptitud) debe demostrarse para cada producto analizado.
Componentes de la Calidad de los Datos El capítulo de información general (1058) describe cuatro componentes diferentes de la calidad de los datos. El componente más fundamental es la calificación del instrumento; es decir, una demostración de que el instrumento funciona para lo que está diseñado. El siguiente punto en importancia es la validación del método, que es una demostración de que la tecnología funciona según lo esperado. Por ejemplo, esta puede ser una demostración de que un método microbiológico alternativo es al menos adecuado para su papel en el método de prueba como lo fue el recuento en placa tradicional o la recuperación en el caldo nutritivo. A continuación en importancia se encuentra la inclusión de controles pertinentes en la prueba para demostrar la aptitud continua del sistema de prueba. El componente final de la calidad de los datos es el uso de muestras de control de calidad, una práctica que no se usa comúnmente en la microbiología debido a que los analistas buscan excluir cultivos vivos de un área de análisis de producto. Estos componentes diferentes de la calidad de los datos son un aspecto importante a considerar al validar una prueba microbiológica alternativa a medida que ayudan a darle forma al documento de especificaciones sobre requisitos para el usuario.
Métodos Microbiológicos Clásicos Las ufc se han usado durante aproximadamente 125 años y continúan siendo especificadas como la unidad de recuento microbiano en todas las monografías USP vigentes. Sin embargo, es importante entender que las ufc siempre han sido una estimación de los microorganismos presentes, más que un conteo real. La conceptualización de ufc como señal requiere una com-
USP 39
Información General/ (1223) Métodos Microbiológicos Alternativos 1 773
prensión fundamental del proceso de plaqueo de bacterias, levaduras u hongos filamentosos en medios sólidos, así como el conocimiento de lo que se requiere para producir una colonia individual. El método de recuento en placa provee una estimación del número de microorganismos presentes basándose en el crecimiento de colonias discretas contables en una placa individual; por lo tanto, el recuento en placa no es un recuento celular real. Aunque es teóricamente posible para una célula viable individual generar una ufc, es poco probable que naturalmente una célula individual desarrolle una colonia sobre una placa. La "viabilidad de una célula" se define como la capacidad de multiplicarse mediante fisión binaria de modo que aparezca una colonia. Para que aparezca una colonia, las células viables deben encontrar condiciones específicas de medio de crecimiento nutritivo, incubación y tiempo. Sin embargo, las células individuales son de naturaleza extraña y es mucho más probable que cualquier colonia que crece sobre medios sólidos surja de un grupo, cadena o masa de células depositadas en conjunto. Entonces, la señal de ufc es propensa a subestimar el número real de células presentes en una muestra. El grado de subestimación variará dependiendo de la naturaleza del microorganismo y de la forma en que se haya preparado la muestra. La señal de ufc también depende completamente de la recuperación de microorganismos de condiciones ambientales, lo cual produce estrés en la capacidad del organismo para sobrevivir. Es importante tomar en cuenta que todos los organismos que están fuera de su nicho ambiental preferido presentarán algún grado de estrés. Además, fuera del laboratorio, los microorganismos en cultivo son menos propensos a encontrarse en la fase de crecimiento exponencial más óptima para su transferencia a medios microbiológicos para recuperación y crecimiento. En un sentido muy real, la mayoría de los microorganismos presentes en los artículos farmacopeicos, en ambientes secos y exentos de nutrientes, a temperaturas elevadas, alta concentración iónica, pHs extremos o en presencia de químicos antimicrobianos, se encuentran severamente estresados y pueden ser difíciles o imposibles de recuperar. Claramente, estos factores de estrés desempeñan un papel en la anomalía del recuento en placa mencionada anteriormente. Si las condiciones de crecimiento, nutricionales o de incubación presentes para los microorganismos no son suficientes para lograr la recuperación y el crecimiento de colonias, la señal puede ser O ufc, o no crecimiento, incluso cuando estén presentes células viables. Estos factores de estrés pueden no ser consideraciones importantes con los métodos alternativos que no se basan en el crecimiento de los microorganismos y dichos métodos pueden producir señales a partir de células que no crecerán en medios. La precisión puede verse comprometida aún más cuando los organismos están presentes en grupos grandes, a menudo asociados con el material orgánico y se rompen en unidades más pequeñas durante la preparación. En este caso, dependiendo del procesamiento o manipulación de la muestra, un grupo puede presentarse como una colonia individual o como múltiples colonias. Además, el número de ufc en una placa debe estar dentro de un intervalo contable, por ejemplo bacterias, 25-250, para un recuento razonablemente confiable. Por ende, los métodos microbiológicos basados en crecimiento representan una ciencia logarítmica con una señal de recuento (ufc) la cual es en verdad una estimación más que un recuento celular preciso. Comprender las fortalezas y las debilidades de las ufc como señal es vital para la validación de un método alternativo que emplee una señal alternativa. Por lo tanto, las ufc no pueden considerarse como la unidad única de recuento microbiológico.
Señales de Métodos Microbiológicos Alternativos Los métodos microbiológicos rápidos o modernos por lo regular producen señales en unidades distintas a las ufc para la estimación y recuento microbiano. Estas señales a menudo se procesan mediante instrumentos más que por la vía visual. Se han realizado estudios extensos sobre las capacidades de los diversos métodos que se pueden aplicar a la evaluación microbiana de artículos farmacopeicos y, en la mayoría de los casos, el usuario prospecto sabrá las características del método y la señal que produce antes de seleccionar dicho método como una alternativa. Se provee una guía sobre la selección del método en la sección Validación de Tecnologías Alternativas y en publicaciones científicas revisadas por expertos. La mayoría de los métodos microbiológicos rápidos son, hasta cierto punto, métodos de recuento celular directo. Por lo tanto, pueden proveer una estimación de recuento celular mayor que el método de ufc para una muestra dada, dependiendo de la forma de uso del método y del artículo farmacopeico que esté siendo evaluado. Algunos métodos alternativos o rápidos detectan y estiman recuentos celulares teniendo como fundamento la actividad metabólica, lo cual da lugar a una señal que puede medirse de manera instrumental. Algunos ejemplos de estos tipos de señales incluyen el contenido de ATP, trifosfato de adenosina, (bioluminiscencia), fluorescencia inducida por láser, actividad enzimática y cambios fisicoquímicos en la composición de un caldo nutritivo o en la fase gaseosa que se encuentra por encima del caldo. Los métodos alternativos también pueden basarse en la tinción vital, en donde las células se tiñen o presentan autofluorescencia (basándose en los componentes de las células) y después se cuentan directamente usando un microscopio u otros instrumentos. Para aumentar la probabilidad de que sólo se cuenten las células vivas, se pueden usar múltiples colorantes, lo cual puede (1) incrementar la sensibilidad basándose en la función de la membrana celular, (2) mejorar la reacción con ácidos nucleicos o (3) mejorar la detección de la actividad metabólica. Existen también métodos basados en ácidos nucleicos que se pueden usar, así como una variedad de otros métodos fisicoquímicos de análisis que se han utilizado en la microbiología farmacéutica, biofarmacéutica, clínica y de los alimentos. Estos métodos pueden enfocar, amplificar, detectar o cuantificar una secuencia de ácidos nucleicos, y es importante entender el tipo de señal que resulta del método analítico. Además, se deben entender las características fisiológicas del microorganismo que dan origen a la señal, lo cual posibilita la enumeración de las células.
1774 (1223) Métodos Microbiológicos Alternativos/ Información General
USP 39
CRITERIOS DE ÉXITO Los métodos alternativos para obtener un recuento celular pueden proveer recuentos celulares mayores o menores que los provistos por los métodos farmacopeicos tradicionales durante el análisis de recuento de los artículos farmacopeicos. Sin embargo, sin importar si los recuentos celulares son mayores o menores con el método alternativo, por lo general es posible detectar tendencias adversas en comparación con las estimaciones obtenidas usando un método farmacopeico. Las observaciones de recuentos celulares que difieren de los resultados de ufc no representan una preocupación cuando los diferentes métodos y sus diferentes señales de presencia celular son equivalentes o no son inferiores a los métodos de arbitraje en lo que respecta a la evaluación de la seguridad microbiológica de un artículo. Los recuentos celulares más altos no necesariamente deben considerarse una indicación de un riesgo mayor debido a la variabilidad inherente de los métodos de crecimiento estándar y a la naturaleza física y química de los artículos farmacopeicos sujetos al análisis. Esto es especialmente cierto en el recuento de microorganismos en artículos que tienen un largo historial de uso seguro y efectivo. En tales casos, determinar que un artículo contiene un recuento celular mayor que lo previamente conocido no significa un deterioro en su seguridad. Con los métodos cualitativos, es decir, que determinan la presencia o ausencia, las comparaciones de resultados falsos negativos y positivos obtenidos en estudios controlados con los métodos microbiológicos farmacopeico y alternativo pueden ser una medición de la equivalencia. Existen mejoras disponibles comercialmente para los métodos basados en crecimiento que permiten la lectura más rápida de colonias en medios sólidos, con un tiempo de incubación sustancialmente menor, en comparación con la lectura a simple vista. Sin embargo, estos métodos aún requieren el crecimiento de organismos sobre o en medios de cultivo. Por lo tanto, muchos de estos métodos no son, en el sentido más estricto, diferentes de los métodos farmacopeicos existentes, sino que son meras mejorías que proveen una detección más rápida de colonias. En la implementación de estos métodos mejorados para la detección de crecimiento de colonias, únicamente la capacidad de detección del método requiere de verificación. TAMAÑO DE LA MUESTRA Cualquier método de prueba microbiológico alternativo (dentro de su propósito previsto) puede usar cualquier tamaño de muestra y número de pruebas que sea suficiente para producir una decisión equivalente (o mejor) con respecto a la calidad microbiológica en comparación con el método de referencia. Puede ser más simple para muchos, si no es para la mayoría de los métodos alternativos, cumplir con las instrucciones de muestreo que se proveen en el método farmacopeico oficial. Para los casos en que se utiliza el enfoque de muestreo definido en el método farmacopeico oficial, no se requiere justificación del tamaño de la muestra.
Estadísticas y Métodos Alternativos Los intentos para usar estadísticas para comparar los resultados de ufc con las señales que surgen de los métodos de análisis bioquímicos, fisiológicos o genéticos pueden tener un valor limitado. Debido a las diferencias entre estos métodos, no se puede esperar que produzcan señales que puedan compararse estadísticamente en términos de los valores medios y la variabilidad. Por ende, los valores numéricos, provistos como resultados en ufc asociados con los métodos de referencia, por lo regular no pueden usarse como criterio de aceptación para la evaluación de artículos mediante métodos alternativos candidatos. En su lugar, es responsabilidad de los usuarios proponer valores, sustentados por bibliografía científica cuando así se requiera, que puedan demostrar como apropiados para el método que han seleccionado y validado. Estos pueden llevarse a cabo independientemente de las normas existentes expresadas en términos de ufc.
CALIFICACIÓN DE INSTRUMENTOS La calificación de instrumentos debe apegarse, al menos de manera general, a lo tratado en el capítulo (1058). La calificación de instrumentos para equipos críticos para el funcionamiento de un método microbiológico alternativo implica cuatro fases distintas: 1. Establecimiento de Especificaciones sobre Requisitos para el Usuario con respecto a los atributos críticos del método, los cuales deben formalizarse en un documento de especificaciones sobre requisitos para el usuario. 2. Calificación de la instalación-Determinar si se instaló correctamente el instrumento 3. Calificación operativa-Determinar si el instrumento cumple con las especificaciones del fabricante para su correcto funcionamiento 4. Calificación del desempeño-Determinar si el instrumento cumple con las especificaciones sobre requisitos para el usuario con respecto al desempeño
USP 39
Información General/ (1223) Métodos Microbiológicos Alternativos 1775
VALIDACIÓN DE TECNOLOGÍAS ALTERNATIVAS Especificación de Requisitos para el Usuario La preparación del documento de especificaciones sobre requisitos para el usuario debe incluir retroalimentación de todas las partes interesadas para el método de prueba microbiológico. Estas partes interesadas pueden incluir representantes de los grupos de Microbiología, Calidad, Asuntos Reglamentarios, Operaciones, entre otros. El tiempo empleado en este paso debe considerarse una inversión para lograr un entendimiento claro de las necesidades de la compañía antes de comprar el equipo, lo cual guiará la calificación de desempeño. Como mínimo, este documento debe incluir lo siguiente: •Propósito y uso previsto (necesidad definida del instrumento) • Descripción de quien usará el equipo • Requisitos operativos (formato de los datos, interfases de usuario y ambiente operativo) •Limitaciones (cronogramas, tiempos muertos, mantenimiento, niveles de capacidad de los usuarios, compatibilidad del producto, límite de detección, exactitud y rapidez) •Ciclo de vida (desarrollo, prueba, transferencia, validación, capacitación y caducidad) •Capacidad (tiempo de inicio, capacidad de la prueba y rendimiento, y requisitos de trabajo) • Sustentabilidad (consumibles, calibración, validación y mantenimiento preventivo) Ver el capítulo (1058) para información sobre la calificación de instrumentos analíticos. los principios descritos en el capítulo (1058) por lo general son aplicables a la calificación de instrumentos usados para realizar análisis microbiológicos alternativos. El usuario puede requerir ajustar las recomendaciones específicas del capítulo (1058) a sus especificaciones para la calificación de instrumentos particulares.
Criterios de Validación los parámetros de validación generalmente recomendados para pruebas microbiológicas cualitativas y cuantitativas se presentan en la Tabla 7. Entre los ejemplos de pruebas cualitativas se encuentran la prueba de esterilidad y la prueba para determinar la ausencia de microorganismos específicos. Una prueba cuantitativa sería el recuento microbiano. Se debe tomar en cuenta que la prueba cualitativa es binaria y que por esta razón generalmente no es necesario definir la equivalencia de unidades de medición, sólo la equivalencia del resultado. Tabla 1. Parámetros de Validación por Tipo de Prueba Microbiológica Parámetro de Validación
Pruebas Cualitativas
Pruebas Cuantitativas
Exactitud
No
Sí
Precisión
No
Sí
Especificidad
Sí
Sí
Límite de detección
Sí
Sí
Límite de cuantificación
No
Sí
Linealidad
No
Sí
Intervalo (dinámico) operativo
No
Sí
Robustez
Sí
Sí
Repetibilidad
Sí
Sí
Tolerancia
Sí
Sí
Equivalencia
Sí
Sí
ESPECIFICIDAD Definición: la especificidad de un método microbiológico cualitativo alternativo se define como su capacidad para detectar una variedad de microorganismos de desafío específicos de dicha tecnología. la "variedad de microorganismos" puede definirse como un número limitado de microorganismos que representan un riesgo para el paciente o el producto, de microorganismos hallados en el ambiente de fabricación y las fallas del producto, microorganismos que son apropiados para medir la efectividad del método alternativo, y microorganismos que son representativos en términos de atributos morfológicos y fisiológicos apropiados para el método y el producto. Demostración: la especificidad se demuestra mediante la recuperación comparable del panel de microorganismos de desafío en los métodos farmacopeicos y alternativos. El desafío microbiano está por encima del límite de detección o de cuantificación pero a un nivel que provee una medición de la eficacia de los métodos. Basado en crecimiento-Agregar cantidades bajas (alrededor de 100 ufc) de cada microorganismo en el panel y llevar a cabo los métodos farmacopeico y alternativo para demostrar la recuperación del microorganismo.
1776 (1223) Métodos Microbiológicos Alternativos / Información General
USP 39
No basado en crecimiento-Usar controles negativos y positivos adecuados para demostrar que la materia extraña que pudiera estar en el sistema (p.ej., trifosfato de adenosina extracelular, ADN o factores de inhibición y mejoramiento) no interfiere con la detección de la variedad definida de microorganismos. Todos los microorganismos de desafío deben ser recuperados e identificados en métodos basados en crecimiento. En el caso de los métodos no basados en crecimiento, los microorganismos deben ser recuperados e identificados en la medida de lo posible. LÍMITE DE DETECCIÓN Definición: El límite de detección de un método microbiológico alternativo se define como el número más bajo de microorganismos en un volumen definido de muestra que puede ser detectado, aunque no necesariamente cuantificado, en las condiciones experimentales declaradas. Esto debe llevarse a cabo con los organismos de control de calidad citados en el capítulo Pruebas de Eficacia Antimicrobiana (51 ), Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano (61 ), Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Microorganismos Específicos (62), Pruebas para Micoplasmas (63) y Pruebas de Esterilidad (71) conforme resulte apropiado para el método alternativo. Demostración Método 1 • Inocular una solución diluyente adecuada con un intervalo de diluciones en serie de cada uno de los microorganismos de desafío, apropiado para el uso previsto del método y la tecnología. En la mayoría de los casos, puede ser suficiente el panel farmacopeico de prueba de promoción de crecimiento en medios. • El nivel de inoculación debe ajustarse para obtener un 50% del resultado esperado en las muestras diluidas que presenten crecimiento en la prueba farmacopeica. • Realizar las pruebas farmacopeica y alternativa. • Las pruebas deben repetirse un número suficiente de veces (riesgo alfa estadísticamente significativo: 0,05; riesgo beta: 0,20) para ambas pruebas farmacopeica y alternativa. - Estadística: Usar.la prueba de chi cuadrado u otro enfoque apropiado para demostrar la recuperación equivalente de los microorganismos de desafío. - Como alternativa, usar el Método 2. Método 2 (Método del Número más Probable, NMP) • Crear una serie de diluciones de los organismos de desafío en una solución diluyente adecuada de modo que incluya al menos el intervalo de 101 ufc a 10-2 ufc (para una serie de diluciones al décimo) o de 5 ufc a 10-1 ufc/volumen de inóculo (para una serie de diluciones al medio). • Realizar las pruebas farmacopeica y alternativa con al menos 5 determinaciones repetidas simultáneas de cada dilución a partir de las series seleccionadas. •Determinar el número más probable a partir de tres diluciones en serie que provean crecimiento positivo o negativo (o señal). • Estadística: Usar la prueba de chi cuadrado u otro enfoque apropiado para demostrar la recuperación equivalente de los microorganismos de desafío.
ROBUSTEZ Definición: La capacidad del método para no ser afectado por variaciones pequeñas, aunque deliberadas, en los parámetros del método, p.ej., volumen de reactivo, tiempo de incubación o temperatura ambiente, representa un indicador de su confiabilidad durante uso normal. La medición de la robustez no es una comparación entre el método farmacopeico y el alternativo, sino un componente necesario de la validación del método alternativo de manera que el usuario entienda los límites de los parámetros operativos del método. El usuario puede confiar en los datos provistos por el fabricante del método de prueba.
TOLERANCIA Definición: El grado de precisión de los resultados de la prueba obtenidos mediante el análisis de las mismas muestras en diversas condiciones normales de prueba, tales como el empleo de diferentes analistas (por ejemplo, tres), instrumentos y lotes de reactivos (el método para la demostración puede seguir las recomendaciones del proveedor de instrumentos o materiales, o podría basarse únicamente en datos provistos por el fabricante del método). Para obtener las definiciones de otros parámetros de validación, ver el Glosario.
APTITUD DEL MÉTODO Para cada producto nuevo que se va a analizar usando el método microbiológico alternativo validado, realizar la prueba de aptitud conforme a lo descrito en los métodos de prueba general (ver los capítulos (51 ), (61 ), (62), (63), y (71 )), usando el
USP 39
Información General/ (1223) Métodos Microbiológicos Alternativos 1 777
número de unidades y cantidades prescritas y la preparación de la muestra apropiada para el producto, así como la sensibilidad de la prueba requerida para determinar la ausencia de un efecto del producto que obstruya la señal del método. La aptitud del método se puede demostrar usando tres pruebas independientes. Para los métodos cuantitativos, sólo se requieren los parámetros de validación de la exactitud y la precisión. Para métodos cualitativos, la recuperación de organismos de desafío según se indica en el capítulo (62), (71) y (1227) es suficiente. Después de que un método alternativo ha demostrado ser equivalente a la prueba farmacopeica con un producto, no es necesario repetir los parámetros de equivalencia para cada producto nuevo; únicamente es necesario verificar la aptitud del método para cada producto adicional. Por ejemplo, al emplear un método basado en ácidos nucleicos, con cada producto nuevo, se debe demostrar que los residuos del producto no interfieren con la concentración, extracción, purificación y recuperación del ácido nucleico diana, o con la amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la sonda química de detección para la secuencia genética de ácido nucleico ribosómico diana (ARNr).
EQUIVALENCIA Todas las pruebas microbiológicas se llevan a cabo para permitir tomar decisiones informadas con respecto a la calidad microbiológica de un producto, materia prima, componente o etapa del proceso. En relación con esto, el propósito de las pruebas microbiológicas puede ser evaluar la presencia o ausencia de microorganismos (como en la prueba de esterilidad) o estimar el número de organismos presentes. Los procedimientos tecnológicos mediante los cuales los métodos de prueba evalúan la calidad microbiológica y permiten tomar una decisión sobre la calidad del producto pueden diferir de los procedimientos basados en crecimiento, típicos de los métodos de referencia. Las unidades de medición (señal) de una evaluación de calidad microbiológica realizada usando métodos de pruebas microbiológicas alternativos por lo general no serán ufc, sino que usarán un enfoque distinto para obtener un recuento celular estimado. Por lo tanto, la validación de los métodos microbiológicos alternativos debe incluir dos componentes: (1) demostración de la equivalencia y (2) calificación del método analítico y del equipo.
Demostración de la Equivalencia Las Advertencias y Requisitos Generales indican que se pueden usar métodos alternativos que proporcionen alguna ventaja en cuanto a exactitud, sensibilidad, precisión, selectividad o adaptabilidad a la automatización o a la reducción de datos computarizados. Asimismo, estipulan que se pueden implementar métodos alternativos en otras circunstancias especiales. Dichos métodos alternativos deben ser validados según se describe en el capítulo (1225) y se debe demostrar que producen resultados equivalentes o mejores que el método de referencia para cualquier atributo de calidad dado. Al comparar dos procedimientos de prueba para demostrar el desempeño equivalente o mejor, se ensambla la evidencia estadística para demostrar la equivalencia o, en términos estadísticos, la no inferioridad. Por ejemplo, con el recuento microbiano, se puede demostrar equivalencia siempre que no exista una diferencia estadísticamente significativa entre las dos medias generadas al efectuar el recuento con los métodos farmacopeico y alternativo. Sin embargo, esto puede no ser posible cuando los dos métodos generan distintas señales. Algunos ejemplos de esta situación son cuando el método de recuento microbiano emplea tinción vital de células microbianas o la medición de material genómico en lugar de ufc. De manera similar, el documento Guidance for lndustry Analytical Procedures and Methods Validation: Chemistry, Manufacturing, and Controls Documentation (Guía para la Industria: Validación de Procedimientos y Métodos Analíticos: Documentación de Aspectos Químicos, de Fabricación y de Control) de la FDA indica que un procedimiento alternativo validado debe presentarse únicamente si demuestra un desempeño igual o mejor que el procedimiento analítico reglamentario. Asimismo, la sección 2.7 del documento Test Procedures and Acceptance Criterio for New Drug Substances and New Drug Products: Chemical Substances (Q6A) (Procedimientos de Prueba y Criterios de Aceptación para Nuevos Fármacos y Nuevos Medicamentos) de la ICH indica que los procedimientos alternativos son aquellos que pueden usarse para medir un atributo en el momento en que dicho procedimiento controla la calidad de un fármaco o medicamento a un grado comparable o por encima del método oficial. Sin embargo, se encuentran disponibles otras opciones para demostrar la equivalencia las cuales se tratan en Demostración de la Equivalencia.
Demostración de la Equivalencia Se encuentran disponibles cuatro opciones para establecer la equivalencia de un método analítico alternativo candidato: (1) procedimientos aceptables (es decir, simplemente cumplir un requisito de desempeño o aceptación mínimo sin necesidad de demostrar equivalencia con el método farmacopeico); (2) equivalencia del desempeño con el método farmacopeico; (3) equivalencia de los resultados con el método farmacopeico y (4) equivalencia de decisiones con el método farmacopeico (7). La Tabla 2 provee una comparación de estas cuatro opciones de equivalencia. Las múltiples opciones de equivalencia reflejan la diversidad de tecnologías y aplicaciones de las metodologías de pruebas alternativas y pueden verse como un cambio paradigmático en la sección Demostración de la Equivalencia.
USP 39
1778 (1223) Métodos Microbiológicos Alternativos / Información General
Tbl2Mrid01 a a at z e peones d e E:qu1va 1enc1a
Opción
Demostración
Comparación con el Método Farmacopeico Oficial
Basada en los Resultados o Concluslón Numéricos
Número de Características
1. Procedimientos aceptables
Aceptable
No
Resultados
Múltiples
2. Equivalencia del desempeño
Equivalente
Sí
Resultados
Múltiple
3. Equivalencia de los resultados
Equivalente
Sí
Resultados
Individuales
4. Equivalencia de las decisiones
Equivalente
Sí
Conclusiones
Individuales
OPCIÓN 1: PROCEDIMIENTO ACEPTABLE Esta no es estrictamente una opción de equivalencia que requiere comparación directa ente el método alternativo candidato y un método farmacopeico oficial. Con esta opción, se puede usar un material de referencia con propiedades conocidas, tales como un inóculo estándar de un microorganismo específico, una cantidad de genoma bacteriano altamente purificado, un nivel de ATP, trifosfato de adenosina, u otra señal apropiada. En algunos casos, puede ser necesario que el método alternativo mida la señal en presencia de la muestra de prueba, con criterios de validación que sean congruentes con la capacidad de la tecnología, conforme a lo descrito en la bibliografía científica. OPCIÓN 2: EQUIVALENCIA DEL DESEMPEÑO La equivalencia del desempeño requiere la demostración de resultados equivalentes o mejores con respecto a los criterios de validación-tales como exactitud, precisión, especificidad, límite de detección, límite de calificación, robustez y toleranciaque pueden ser apropiados para el uso previsto del método cualitativo o cuantitativo alternativo. Es posible que el método alternativo pueda no cumplir con algunos de los parámetros de validación citados en comparación con el método oficial y aún así ser aceptable debido a las ventajas que presenta. Este puede ser el caso si el método alternativo presenta alguna de las ventajas indicadas en las Advertencias y Requisitos Generales ("se pueden usar métodos alternativos que proporcionen alguna ventaja en cuanto a exactitud, sensibilidad, precisión, selectividad o adaptabilidad a la automatización o a la reducción de datos computarizados o en otras circunstancias especiales"). Otras circunstancias especiales incluirían mejoras en el tiempo para obtener un resultado o el costo de correr la prueba. Si un método alternativo candidato es adecuado para evaluar la calidad del material analizado, aún puede ser aceptable incluso si difiere del método oficial en uno o más parámetros de validación. Los criterios finales de calificación analítica deben reflejar sólo los criterios que los microbiólogos consideran necesarios para lograr una equivalencia del desempeño. OPCIÓN 3: EQUIVALENCIA DE LOS RESULTADOS Cuando se requiere la equivalencia de los resultados, la hipótesis que se va a analizar es que los métodos de prueba alternativo y farmacopeico provean resultados numéricos equivalentes. Esto contrasta con la evaluación de los parámetros de validación, como se lleva a cabo en la equivalencia del desempeño. Debido a que en microbiología no se puede analizar la misma muestra, se establece por lo general un intervalo de tolerancia al comparar los dos métodos, en el que se determina que el método alternativo es numéricamente superior o no inferior. Los informes sobre el uso de métodos alternativos no basados en crecimiento han demostrado que estos pueden producir estimaciones de recuentos celulares significativamente mayores que un método de crecimiento que informe resultados en ufc. En este caso, el analista podría usar una curva de calibración que muestre una correlación entre los dos métodos en el intervalo de especificación del producto. OPCIÓN 4: EQUIVALENCIA DE LAS DECISIONES Una equivalencia de las decisiones es similar a la equivalencia de los resultados pero difiere en que no se genera un resultado numérico; en lugar de eso, se obtiene un resultado de aprobado/reprobado. Con este enfoque, la frecuencia de los resultados positivos y negativos generados no debe ser inferior a la del método farmacopeico. Este requisito de no inferioridad se basa en el largo historial de calidad de productos analizados y liberados con la prueba de arbitraje farmacopeica. Para los propósitos de la calificación, se pueden considerar estudios de laboratorio que impliquen la adición de niveles bajos conocidos de microorganismos. Las secciones siguientes proveen enfoques sugeridos para demostrar que el procedimiento alternativo es equivalente o mejor que el procedimiento farmacopeico. Los usuarios pueden usar otros métodos válidos para la demostración de equivalencia con justificación científica de sustento.
Demostración de la Equivalencia para Procedimientos Microbiológicos Cualitativos Alternativos Los resultados obtenidos mediante los procedimientos de los capítulos (62), (63) y (71) son indicadores de la presencia o ausencia de microorganismos en la muestra analizada. Estas pruebas generan una decisión (p.ej., el artículo farmacopeico pasa
USP 39
Información General/ (1223) Métodos Microbiológicos Alternativos 1 779
o falla la prueba). Este tipo de datos caben dentro de la categoría de equivalencia de las decisiones según se describe en el artículo de Estímulo (2). El Enfoque 1 (ver a continuación) se basa en demostrar la equivalencia de las decisiones. El Enfoque 2 (ver a continuación) es una alternativa que convierte los resultados cualitativos en cuantitativos usando el procedimiento de número más probable. Ambos enfoques usan una hipótesis de no inferioridad (3). Para demostrar la aceptabilidad del procedimiento alternativo con respecto al procedimiento microbiológico vigente, el laboratorio debe demostrar que el nuevo procedimiento es tan bueno o mejor que el procedimiento vigente en términos de la capacidad para detectar la presencia de microorganismos. En general, un enfoque recomendado para comparar el procedimiento alternativo con el procedimiento farmacopeico es usar una prueba de no inferioridad (unilateral, como en las pruebas de no inferioridad realizadas en los ensayos clínicos para medicamentos nuevos) (4) en lugar de equivalencia bilateral [como en el caso de la bioequivalencia (5)]. La no inferioridad es un enfoque apropiado por dos razones. Primero, desde la perspectiva del paciente, es beneficioso para promover un procedimiento alternativo que es potencialmente más sensible que el procedimiento de arbitraje. Por el contrario, un enfoque bilateral penaliza mejor la recuperación de microorganismos. Para aquellos que implementen el método alternativo será importante tener en cuenta que deberán evaluar el riesgo relacionado con el cambio en el procedimiento, debido a que un procedimiento más sensible puede generar más resultados positivos. Segundo, el procedimiento alternativo tiene beneficios (principalmente, un tiempo reducido para conseguir un resultado) que lo vuelven preferible sobre el procedimiento farmacopeico, incluso si no es tan sensible, siempre y cuando permita tomar una decisión sobre calidad con respecto al producto que sea no inferior al método farmacopeico. ENFOQUE 1: USO DE RESULTADOS DE PRESENCIA Y AUSENCIA La hipótesis de no inferioridad para este enfoque es que la proporción de muestras que producen una señal para el nuevo procedimiento (PN) es no menor que alguna cantidad (Li >O) menor que la proporción para el procedimiento farmacopeico vigente (Pe) (6): Resultado= PN - Pe :2'. -Li La Li es el margen de no inferioridad. A menos que el laboratorio requiera un margen más estrecho, usar Li = 0,20 en los experimentos descritos anteriormente. Calcular un intervalo de confianza unilateral del 90% para PN - Pe (1). Se determina la no inferioridad si el límite de confianza inferior excede de -0,20. Si el experimento es capaz de concluir a favor de la hipótesis de no inferioridad, entonces se puede determinar, con un 95% de confianza, que PN :2'. Pe - 0,20 al nivel de biocarga estudiado. Esta evaluación debe realizarse usando tipos de microorganismos seleccionados por el laboratorio como representativos de los tipos generales de microorganismos encontrados. Las selecciones pueden guiarse por el capítulo (71) o los organismos de prueba de aptitud apropiados recuperados del análisis del producto y/o microorganismos que representen aquéllos que pueden presentar riesgos para los pacientes debido a la vía de administración del producto. El laboratorio debe realizar una evaluación para determinar si el procedimiento alternativo puede demostrar ser no inferior al procedimiento microbiológico en términos de sensibilidad según lo medido por la proporción de muestras que entregan un resultado positivo para recuperación y crecimiento microbiano. En una prueba cualitativa, realizar tres evaluaciones para cada organismo. La primera usa muestras preparadas mediante dilución en serie para que sean exactamente o alrededor de 10°, es decir, 1 ufc, en la que es probable que no se observe crecimiento (por lo que el procedimiento microbiológico basado en crecimiento no detectará ninguna señal) para caracterizar la sensibilidad del nuevo procedimiento en este nivel. El segundo usa muestras de exactamente o alrededor de 102 (100-200 ufc), donde se esperaría que el procedimiento microbiológico detectase crecimiento a un porcentaje relativamente alto de aproximadamente 75% o mayor, para determinar la aceptabilidad del nuevo procedimiento. El tercero es una comparación de los dos procedimientos a una carga en la que se esperaría que 50%75% de las muestras presentaran crecimiento de colonias [a menudo una dilución en serie hasta alrededor de 10 1 (10-50 ufc)] para analizar la hipótesis de no inferioridad según lo descrito anteriormente. En el experimento de no inferioridad para pruebas microbiológicas cualitativas, se deben analizar un mínimo de 75 muestras en cada procedimiento. El uso de 75 muestras provee una potencia de aproximadamente 80%. Si el laboratorio determina que es necesaria una mayor potencia estadística dados los requerimientos del análisis para un producto dado, incrementar el número de muestras analizadas a 100 resultará en una potencia de aproximadamente 90%. Estos procedimientos son apropiados para los propósitos de concluir la no inferioridad si los dos procedimientos son en realidad sensibles usando Li = 0,20. Si el laboratorio concluye que su nuevo procedimiento es menos sensible que el procedimiento farmacopeico, se requerirá un mayor número de muestras para mantener estos niveles de potencia. Muestras independientes: Suponer que NA muestras han sido analizadas con el procedimiento alternativo candidato, de las cuales XA muestras son positivas, y que Ne muestras (no las mismas que aquéllas analizadas con el candidato) han sido analizadas con el procedimiento farmacopeico y que Xe muestras son positivas. Calcular lo siguiente:
1780 (1223) Métodos Microbiológicos Alternativos/ Información General
PA=XA/NA
USP 39
Pc=XcfNc
B=Nc /NA a=l+B b =-[R(l+ Bflc)+8+ PA] c=R(pA +8pc) pA =[-b-(b2 -4ac) 112 ]/(2a)
Pe= PA / R V= PA(l-pA) +R2 Pc(l-pc) NA Ne zJPA -Rpcf:rv donde R es el cociente de las varianzas en las cuales se determina la potencia. Concluir la no inferioridad si Z > zª donde zª es el punto porcentual superior a de una distribución normal estándar. Muestras apareadas: Suponer que N muestras han sido analizadas mediante los procedimientos candidato alternativo y farmacopeico. Los resultados pueden mostrarse en una tabla de 2 x 2 (ver la Tabla 3). Tabla 3. Resultados para Muestras Apareadas Procedimiento Farmacopeico Positivos
Negativos
Positivos
Procedimiento Alternativo
x,,
Xrn
Totales por Fiia
x,
Negativos
Xn 1
Xnn
N-X,
Totales por columna
X,
N- X,
N
Calcular lo siguiente:
l=[X10 -RX01 +(l-R)X11 ]/N V= XA(X 10 +X01 ) / X~
Z=L/..JV Concluir la no inferioridad si Z >
zª donde zª es el punto porcentual superior a de una distribución normal estándar.
ENFOQUE 2: COMPARAR RESULTADOS DE NÚMERO MÁS PROBABLE Para la referencia farmacopeica y los procedimientos alternativos, realizar un estudio comparativo de número más probable usando procedimientos estándar para número más probable para cada una de las N muestras. Idealmente, se usan las mismas muestras para los dos procedimientos, aunque no es estrictamente necesario. Para el Enfoque 2, la hipótesis de no inferioridad es µA - µe ~ log(R) o antilog(µA - µe) ~ R donde µA y µe son las medias en la escala logarítmica para los procedimientos alternativo y farmacopeico, respectivamente. Muestras independientes: Determinar el número más probable para NA muestras mediante el procedimiento alternativo, convertir todos los valores a logaritmos y determinar la media de la muestra de los valores logarítmicos (xA) y la varianza de la muestra de los valores logarítmicos (S2J. De forma similar, determinar Xc y 52c a partir de los logaritmos de Ne muestras analizadas con el procedimiento farmacopeico. Calcular lo siguiente:
donde ta, dt es el punto porcentual superior a de la distribución t con df grados de libertad y
df=
(S!/NA+s~/Nc)2 (S~ / NA) 2 +(SU Nj NA-1
Nc-1
Si se usa un software que sólo permite números enteros para grados de libertad (p.ej., Excel), usar interpolación lineal para obtener el valor t. Concluir la no inferioridad si antilog(L;ni) ~ R.
USP 39
Información General/ (1223) Métodos Microbiológicos Alternativos 1781
Datos apareados: Determinar el número más probable para N muestras mediante el procedimiento alternativo y para las mismas N muestras mediante el procedimiento farmacopeico, convertir todos los valores 2N a logaritmos y determinar la media de la muestra (x) y la varianza (52) de las diferencias del valor logarítmico alternativo menos el valor logarítmico farmacopeico. Calcular lo siguiente: Linf
=X -
ta,N-lS/-fi\i
donde ta,N-l es el punto porcentual superior a de la distribución t con N - 1 grados de libertad. Concluir la no inferioridad si antilog(L;n1) ~ R.
Demostración de la Equivalencia para Procedimientos Microbiológicos Cuantitativos Alternativos Una característica clave de algunos procedimientos cuantitativos alternativos es que su señal puede diferir significativamente de las ufc del procedimiento microbiológico farmacopeico. En consecuencia, la equivalencia, según se entiende comúnmente, no puede ser demostrada; es decir, se espera que los resultados numéricos difieran en magnitud y unidades. En su lugar, este capítulo sugiere dos criterios para la verificación de los procedimientos cuantitativos alternativos candidatos: 1 . Los resultados obtenidos del procedimiento candidato tienen al menos una precisión aceptable (repetibilidad). 2. Los resultados obtenidos del procedimiento candidato están altamente correlacionados con aquéllos del procedimiento farmacopeico. Una alta correlación se considera una indicación de que los criterios de aceptación cuantitativos expresados en ufc pueden calibrarse a criterios en las unidades del procedimiento alternativo. PRECISIÓN Preparar un mínimo de seis muestras a un mínimo de dos niveles de biocarga cercanos a los límites de especificación relevantes para el laboratorio. Correr el procedimiento alternativo candidato para las muestras preparadas. [NOTA-Esto se usa para corresponderse con las condiciones de repetibilidad; ver el capítulo (1225).] En cada nivel, determinar la varianza de la muestra (52) de los logaritmos (log 10) de los resultados de la muestra. Calcular lo siguiente:
100 *[anti log[ (n; 1)82 J-1]
UL =
X,os,
n-1
Donde n es el número de muestras (n ~ 6) y x2,os,N-l es el valor del 5% inferior de una distribución de chi cuadrado con n -1 grados de libertad. La precisión es aceptable si *UL ~ cr, donde cr es el coeficiente geométrico porcentual predeterminado de repetibilidad máxima aceptable, %GCV. (Para valores pequeños, el %GCV será aproximadamente la %RSD.) Cuanto más grande sea el número de muestras (n) mayor será la probabilidad (potencia, en términos estadísticos) de que un procedimiento, cuya precisión es en realidad aceptable, generará datos que cumplan con este criterio y que, por ende, se pueda declarar aceptable. El laboratorio puede usar datos anteriores para determinar un valor de n que cumpla con sus necesidades. Ejemplo: Para los datos del procedimiento alternativo de la Tabla 4, calcular lo siguiente:
n = 10 52 = 0,000241 y 2
X,as.' = 3,325113, de modo que
UL = 6,06% Por lo tanto, este procedimiento alternativo tiene una precisión de repetibilidad aceptable siempre que el criterio de éxito cr previamente especificado haya sido al menos 6,06%. CORRELACIÓN (LINEALIDAD) Preparar un mínimo de dos muestras en cada uno de cuatro niveles de biocarga diferentes que abarquen el intervalo desde el límite cercano de calificación hasta un logaritmo por encima del límite de especificación definido en la valoración farmacopeica estándar con la que se está comparando el método alternativo. Determinar la actividad para todas las muestras usando los procedimientos alternativo candidato y farmacopeico. Graficar y determinar la correlación entre el logaritmo de los valores del procedimiento alternativo candidato (y) y el logaritmo de valores del procedimiento farmacopeico (x). La correlación es aceptable si al menos 0,95 (o R2 al menos 0,9025). Aunque por lo regular se espera una relación lineal entre dos conjuntos de resultados, puede ser aceptable una relación no lineal. En el caso de una relación no lineal, usar la correlación Spearman (no paramétrica) en lugar de la correlación Pearson.
USP 39
1782 (1223) Métodos Microbiológicos Alternativos/ Información General
Tabla 4 Farmacopelco (ufc)
Alternativo (recuento celular)
70
970
71
965
75
950
92
990
100
1000
105
1051
116
1046
123
1039
127
985
130
1020
La Figura 1 presenta la gráfica de estos datos después de la conversión a logaritmos en base 1O. Debido a que R2 no cumple con el requisito declarado, los resultados de estos dos procedimientos no presentan una correlación suficiente. 3,03
•
o
-~ 3,02
•
e:
2l <( eow
•
3,01
y= O, 1095x + 2,7823
E
R' = 0,5466
]
~
3,00 "
-¡¡
•
"O
·~
• •
Q_
f'C
o
o,
•
2 99
'
s
•
o ]
2,98
•
Oi
& 1,85
1,90
1,95
2,00
2,05
2,10
2,15
Log1 O de Resultados Farmacopeicos
Figura 1. Los procedimientos alternativos candidatos que pueden ser adecuados para tomar decisiones sobre la calidad microbiológica de una muestra (como en la Figura 1) pueden no presentar una correlación suficientemente buena con el procedimiento farmacopeico para cumplir con el requisito de correlación anterior. En tal caso, la otra opción es aplicar el enfoque de equivalencia de la decisión según se describió anteriormente para pruebas cualitativas. Durante el desarrollo del proceso, el laboratorio debe determinar una especificación para el método alternativo para que se corresponda con la especificación farmacopeica para el nivel requerido de calidad microbiológica. Por ejemplo, si el nivel requerido de calidad microbiológica es no más de 102 ufc, cuyo recuento farmacopeico máximo aceptable es 200 ufc, el laboratorio necesitará determinar un criterio de aceptación para el procedimiento alternativo candidato que se corresponderá con el valor partiendo de la perspectiva de tomar una decisión con respecto a la calidad microbiana. Por tanto, el experimento de validación para confirmar esta opción procede según lo descrito anteriormente para las pruebas cualitativas.
GLOSARIO Exactitud: La proximidad de los resultados de la prueba obtenidos mediante el método de prueba alternativo con respecto al valor obtenido por el método farmacopeico que se va a demostrar a lo largo del intervalo dinámico (operativo) del método. Método microbiológico alternativo: Procedimiento de prueba microbiológica moderno o rápido que es diferente del método tradicional basado en crecimiento, tal como el recuento en placa o la recuperación en caldo líquido. El método alternativo o rápido puede usar diferentes tecnologías, instrumentos y software para manejar las pruebas y los análisis de datos y puede proveer resultados de prueba microbiana cuantitativos (recuento) o cualitativos (detección). Unidad formadora de colonias (ufc): Estimación del número de microorganismos obtenidos por medio de métodos tradicionales de recuento en placa. El recuento depende de la capacidad de los microorganismos de la muestra para crecer
USP 39
Información General/ (1223) Métodos Microbiológicos Alternativos 1 783
en los medios de cultivo microbiológicos en las condiciones de incubación. Debido a que no es posible saber con certeza si una colonia se derivó del crecimiento de una o incluso mil células, los resultados se informan en ufc/mL (para un líquido) o ufc/g (para un sólido) y no como células/mL o células/g. Método microbiológico convencional: Método basado en crecimiento clásico o tradicional, tal como recuento en placa de agar o detección en un caldo líquido cuando se incuba durante un tiempo y temperatura específicos. Estos métodos se usan en los capítulos (51 ), (61 ), (62), (63) y (71 ). Equivalencia: Cuando los resultados de las pruebas a partir de dos procedimientos son lo suficientemente cercanos para el uso previsto de los procedimientos. La demostración de la equivalencia requiere una medición previamente especificada del grado de similitud requerido de los resultados. Falso negativo: Resultado de prueba que se determina incorrectamente como negativo (p.ej., un resultado de ausencia de microorganismos viables cuando en realidad se encuentran microorganismos presentes). Un error de tipo 11, también conocido como error del segundo tipo, ocurre cuando la hipótesis nula es falsa pero por error no es rechazada. Es decir, no se es capaz de indicar lo que en realidad está presente-una falla. Un error de tipo 11 puede compararse con un denominado falso negativo en una prueba (y considerarse una "falla") en la que se verifica una condición individual con un resultado definitivo de verdadero o falso. La tasa del error de tipo 11 se denota mediante la letra griega f3 y se relaciona con la potencia de una prueba (que es igual a 1 - f3 ). Falso positivo: Resultado de prueba que se determina incorrectamente como positivo (p.ej., un resultado de detección microbiana viable cuando en realidad no hay microorganismos presentes). En la teoría de pruebas estadísticas, la idea de un error estadístico es una parte integral del análisis de la hipótesis. Estos se describen como errores de tipo 1y tipo 11. Un error de tipo 1, también conocido como error del primer tipo, ocurre cuando la hipótesis nula (HO) es verdadera, pero se rechaza. Significa indicar que algo existe cuando en realidad está ausente (es decir, una indicación falsa). Un error de tipo 1 puede compararse con un denominado falso positivo (un resultado que indica que una condición dada está presente cuando en realidad no lo está) en pruebas en las que se analiza una condición individual. La tasa del error de tipo 1 se denomina "tamaño" de la prueba y se denota mediante la letra griega a. Por lo regular es igual al nivel de importancia de una prueba. En el caso de una hipótesis nula simple, a es la probabilidad de un error de tipo l. Muestras independientes: Muestras seleccionadas de la misma población o de diferentes poblaciones que no tiene un efecto entre sí. Es decir, que no existe correlación entre las muestras. Límite de detección: La concentración más baja de microorganismos en una muestra de prueba que puede ser detectada, aunque no necesariamente cuantificada, en condiciones experimentales definidas. Límite de cuantificación: La concentración más baja de microorganismos en una muestra de prueba que puede ser detectada, con exactitud y precisión, en condiciones experimentales definidas. Linealidad: La capacidad para generar resultados que sean proporcionales a la concentración de microorganismos presentes en la muestra dentro de un intervalo dado. Aptitud del método: Demostración de la falta de mejoría o inhibición por parte del producto de la señal generada por el método. No inferioridad: Demostración de que el método alternativo no es peor que el método farmacopeico en más de una cantidad pequeña previamente especificada. Esta cantidad se conoce como margen de no inferioridad o o. La no inferioridad es diferente de la equivalencia en que en un ensayo de equivalencia, la conclusión deseada es que dos métodos microbiológicos no son inaceptablemente distintos entre sí. En una prueba de no inferioridad, el objetivo es demostrar que un producto nuevo no es inaceptablemente peor que uno anterior. Muestras apareadas: Muestra de pares correspondientes de unidades similares. Intervalo-Dinámico u Operativo: Intervalo entre los niveles superior e inferior de microorganismos que han sido demostrados que se va a determinar con exactitud, precisión y linealidad especificadas. Precisión de la repetibilidad: Grado de concordancia entre los resultados de las pruebas individuales cuando el procedimiento se aplica repetidamente a muestreos múltiples de la misma suspensión de microorganismos y utiliza diferentes suspensiones a lo largo del intervalo de la prueba. También conocida como "repetibilidad". Robustez: La capacidad del método para no ser afectado por variaciones pequeñas, aunque deliberadas, en los parámetros del método, tales como volumen de reactivo, tiempo o temperatura de incubación, representa un indicador de su confiabilidad durante uso normal. Tolerancia: Precisión intermedia (dentro del laboratorio) asociada con los cambios en las condiciones operativas. Los factores que contribuyen a la precisión intermedia implican cualquier cosa que puede cambiar dentro de un laboratorio dado y que pueden afectar la valoración (p.ej., días diferentes, analistas diferentes, equipo diferente). Especificidad: Capacidad para detectar una variedad de microorganismos, la cual demuestra que el método sirve al uso previsto. Estos microorganismos pueden incluir un número limitado de microorganismos que representan un riesgo para el paciente o el producto, de microorganismos hallados en el ambiente de fabricación y las fallas del producto, microorganismos que son apropiados para medir la efectividad del método alternativo, y microorganismos que se especifican en las pruebas farmacopeicas pertinentes que son apropiados para el método y el producto. Responsabilidad del Usuario: La responsabilidad con respecto a la calificación de la instalación, operativa y de desempeño puede ser una responsabilidad conjunta del fabricante del instrumento y del usuario del método microbiológico alternativo. La validación del método puede ser llevada a cabo por el fabricante del instrumento, cuando así se justifique. La prueba de aptitud del método realizada para cada producto específico debe ser responsabilidad exclusiva del usuario.
1 784 (1223) Métodos Microbiológicos Alternativos / Información General
USP 39
Validación: Proceso de demostración y documentación de que las características de desempeño de un procedimiento y su método subyacente cumplen con los requisitos para la aplicación prevista y que el procedimiento es, por tanto, adecuado para su uso previsto. Las validaciones formales se realizan de manera prospectiva con respecto a un plan por escrito que incluye criterios de aceptación justificables sobre procedimientos de validación.
REFERENCIAS 1. Staley, JT and Konopka, A. Measurement of in situ activities of non-photosynthetic microorganisms in aquatic and terrestrial habitats. Ann. Rev. Microbio/. l 985;39:321-346 2. Hauck WW, DeStefano AJ, Cecil TL, Abernethy DR, Koch WF, Williams RL. Acceptable, equivalent, or better: approaches for alternatives to official compendia! procedures. Stimuli to the Revision Process. Pharmaceutical Forum. 2009;35(3). 3. ReChen J], Tsong Y, Kang S-H. Tests for equivalence or noninferiority between two proportions. Drug lnfo J. 2000;34:569578. 4. FDA. lnternational Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use. E9 Statistical principies for clinical trials. Guidance for lndustry. Sep 1998.Washington: U.S. Food and Drug Administration. 5. Schuirmann DJ. A comparison of the two one-sided tests procedure and the power approach for assessing the equivalence of average bioavailability. j Pharmacokinet Biopharm. 1987;15(6):657-680. 6. Farrington CP, Manning G. Test statistics and sample size formulae for comparative binomial trials with null hypothesis of non-zero risk difference or non-unity relative risk. Stat Med. 1990;9(12):1447-1454. 7. Lachenbruch PA, Lynch CJ. Assessing screening tests: extensions of McNemar's test. Stat Med. 1998;17(19):2207-2217.
(1223.1) VALIDACIÓN DE MÉTODOS ALTERNATIVOS PARA VALORACIONES MICROBIOLÓGICAS DE ANTIBIÓTICOS INTRODUCCIÓN Los métodos para valoraciones microbiológicas se han usado tradicionalmente para cuantificar la potencia o la actividad antimicrobiana de los antibióticos. Estos procedimientos microbiológicos se han usado históricamente para certificar cada lote de antibióticos para asegurar la actividad suficiente. Antes de 1998, se publicaron diversas monografías para antibióticos aprobados en el Código de Reglamentos Federales de la FDA, Título 21 CFR. Dichos procedimientos reglamentarios de valoración para antibióticos se publicaron posteriormente en la USP como los métodos de arbitraje oficiales para determinar la potencia de los antibióticos. Los detalles de los procedimientos de valoración microbiana para antibióticos individuales, incluidos los organismos de desafío y los parámetros de prueba, se describen en el capítulo general Antibiótícos-Valoracíones Microbianas (81 ). Las valoraciones microbianas proveen una medición directa de la efectividad del antibiótico contra un microorganismo de referencia. Aunque estos métodos microbiológicos han continuado sirviendo como los métodos de arbitraje oficiales farmacopeicos desde su publicación en la USP, muchos fabricantes los han reemplazado con métodos de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Aunque los métodos microbiológicos proveen evidencia directa de la efectividad antimicrobiana y pueden integrar a todas las partes que contribuyen con los efectos antimicrobianos en una formulación, dichos métodos son menos precisos, más complejos de realizar y más lentos de completar que los métodos alternativos como la HPLC. Las valoraciones microbianas también tienen selectividad limitada y no son apropiados para evaluar impurezas orgánicas. Las habilidades específicas requeridas para realizar las valoraciones microbiológicas de antibióticos, sus requisitos únicos de equipamiento y su complejidad comparativa desincentivan el uso de estos métodos por parte de muchas partes interesadas. Existen muchas razones para reemplazar las valoraciones microbiológicas de antibióticos con valoraciones químicas que usan la pureza o el contenido como sustitutos para la medición de la actividad biológica. Las ventajas de los métodos analíticos químicos han sido descritas previamente para antibióticos simples de un solo componente, así como para antibióticos de componentes múltiples ( 7). Los procedimientos fisicoquímicos, tales como HPLC, permiten una preparación más simple y una adquisición de datos más rápida con precisión, exactitud, selectividad y especificidad mejorada. Los métodos de HPLC pueden usarse de manera efectiva para la designación de potencia y para el análisis de impurezas orgánicas. Además, debido a la amplia disponibilidad de instrumentos modernos y a la pericia en el uso de dichos equipos, la conversión a métodos alternativos puede tener ventajas económicas. Este capítulo general provee puntos a considerar por parte de los fabricantes que deseen usar alternativas fisicoquímicas en lugar de los métodos de valoración microbiana descritos en el capítulo (81 ). Debido al amplio uso de la HPLC como una alternativa a los métodos de valoración microbiana, este capítulo se enfoca en los métodos de HPLC. Sin embargo, los principios establecidos en este capítulo son aplicables a cualquier procedimiento fisicoquímico alternativo.
USP 39
Información General/ (1223.1) Validación de Métodos Alternativos 1 785
CONSIDERACIONES GENERALES PARA EL DESARROLLO DE MÉTODOS ALTERNATIVOS Es necesario considerar múltiples factores importantes al reemplazar los métodos microbianos con HPLC u otras técnicas químicas; esto se debe a las características específicas de los antibióticos. 1. Es esencial conocer si la actividad antimicrobiana manifestada por una preparación resulta de un ingrediente activo individual o si surge de múltiples partes, a menudo relacionadas. Cuando sea posible desde el punto de vista técnico, el analista deberá determinar la contribución de las partes activas principales a la efectividad del antibiótico: Para los propósitos de este capítulo, las partes principales se definen como aquellas que contribuyen en más de 1 % a la potencia del antibiótico. Cuando múltiples partes contribuyen a la actividad antibiótica, la valoración química debe ser capaz de resolver todos los picos de las partes activas principales en la formulación. 2. En la medida de lo posible, se debe evaluar la actividad individual de las impurezas del proceso y de los productos de degradación. Esto podría no ser necesario cuando exista evidencia de que cada una de las impurezas y de los productos de degradación contribuye con menos de 1% de la actividad anti microbiana total de una preparación. 3. El capítulo general (81) es la norma de arbitraje para cualquier comparación de procedimientos. Por lo tanto, el fabricante (o por instrucción de éste) debe llevar a cabo el procedimiento USP oficial vigente para establecer valores de referencia para la valoración dentro del intervalo de prueba. Puede ser necesario evaluar datos usando las pautas del capítulo general Análisis de Va/oraciones Biológicas (1034) cuando el diseño de la prueba sea uno de los descritos en dicho capítulo. Los fabricantes deben establecer los límites apropiados para precisión y exactitud del procedimiento de valoración microbiano basándose en su conocimiento del producto. 4. El método candidato alternativo por HPLC u otro método químico debe validarse completamente de acuerdo con el capítulo general Validación de Procedimientos Farmacopeicos (1225). 5. El valor de cualquier comparación de métodos depende de la precisión y exactitud de los resultados de prueba de la valoración obtenidos de ambos métodos. No se debe llevar a cabo la comparación estadística si los datos de valoración de alguno de los métodos no cumplen con los criterios de aceptación predeterminados para la validación del método. 6. Las guías de este capítulo no aplican a los productos ya comercializados para los que el fabricante ya ha recibido la aprobación reglamentaria para el uso de un método alternativo. En todos los casos, la aplicabilidad de un método alternativo sólo puede determinarse a través de la presentación y de su revisión por parte de la autoridad reglamentaria pertinente. 7. Cualquier alternativa a un procedimiento farmacopeico debe validarse y demostrarse que es equivalente o mejor que el método de arbitraje (2). Un artículo de estímulo publicado en el PF 35(3) [mayo-junio 2009] trata el enfoque de "equivalente o mejor" para evaluar las alternativas a los procedimientos farmacopeicos (3). Se espera que dicha comparación utilice análisis estadísticos apropiados. Este capítulo provee ejemplos de los tipos recomendados de análisis estadísticos.
CONSIDERACIONES TÉCNICAS Los antibióticos simples y complejos se tratan por separado debido a que existen diferencias significativas en el desarrollo y la validación de los métodos para estas dos categorías de antibióticos. • Los antibióticos simples (tales como tetraciclina) son aquellos para los que toda la actividad antimicrobiana proviene de una sola parte activa. • Los antibióticos complejos (tales como gentamicina) son aquellos que tienen más de una parte activa. Se recomiendan procedimientos alternativos que indiquen la estabilidad. Se deben evaluar las impurezas y los productos de degradación cuando éstos contribuyen con más de 1% de la actividad antimicrobiana de una preparación de antibiótico. La valoración microbiana y el método alternativo candidato deben llevarse a cabo conforme a lo descrito en el capítulo general apropiado, p.ej., (81) para valoraciones microbianas, y Cromatografía (621) para procedimientos de HPLC.
ESTUDIOS PUENTE Los estudios puente se usan para comparar los datos obtenidos a partir de los procedimientos alternativos candidatos con los datos de la valoración microbiana para determinar si el procedimiento alternativo es un sustituto adecuado.
Antibióticos Simples 1. Separar la parte activa del antibiótico de las impurezas y los productos de degradación. Comparar para el antibiótico la actividad microbiana de la parte activa principal, las impurezas del proceso y los productos de degradación con respecto al Estándar de Referencia USP. Se pueden descartar las impurezas del proceso y los productos de degradación que presentan niveles por debajo de 1% de actividad anti microbiana. El método alternativo candidato puede resolver impurezas que no tienen actividad antimicrobiana, las cuales posiblemente no contribuirán con el estudio puente. 2. Continuar según lo descrito en esta sección solo si el producto tiene una sola parte activa que genera la actividad antimicrobiana. 3. Validar el procedimiento alternativo usando el capítulo (1225). El procedimiento alternativo debe ser específico, selectivo e indicar la estabilidad.
1 786 (1223.1) Validación de Métodos Alternativos / Información General
USP 39
4. Analizar un mínimo de tres lotes diferentes del fármaco y el Estándar de Referencia USP pertinente usando el procedimiento de valoración microbiana y el método alternativo candidato. 5. Analizar un mínimo de seis muestras repetidas por lote usando la valoración microbiana y el método alternativo candidato. Puede ser necesario incrementar el número de repeticiones basándose en la diferencia porcentual máxima permitida (ver Evaluación de Datos) y la desviación estándar del método ( 4). De ser posible, preparar soluciones madre del estándar y de la muestra y subdividirlas para usarlas con los procedimientos de valoración del método alternativo candidato y de la valoración microbiana. Esto provee datos apareados que pueden ser analizados (ver el Apéndice 2). 6. Aplicar el valor aberrante apropiado (ver los capítulos generales Datos Analíticos-Interpretación y Tratamiento (101 O) y (81 )) y las pruebas de comparación (ver Evaluación de Datos) para determinar si el método alternativo candidato y los procedimientos de valoración microbiana producen resultados equivalentes. 7. Cuando existan valores aberrantes estadísticos en cualquiera de los procedimientos, realizar la comparación excluyendo los valores aberrantes. Si se cumplen los criterios del estudio puente, repetir el estudio puente con controles para evitar valores aberrantes. El informe del estudio puente debe proveer una justificación para el rechazo de valores aberrantes. La aparición constante de valores aberrantes en los resultados de la valoración del método alternativo candidato puede indicar que los controles del procedimiento son inadecuados. Cuando esto ocurra, el estudio puente se considerará nulo y se deberá desarrollar y validar un procedimiento alternativo distinto. 8. Si el estudio puente incumple, puede ser necesario incluir las contribuciones de potencia de las impurezas que están por debajo del 1%.
Antibióticos Complejos 1. Separar y purificar cada parte activa antimicrobiana de una preparación de antibiótico complejo, las impurezas del proceso y los productos de degradación. Comparar para el antibiótico la actividad antimicrobiana de la parte activa principal, las impurezas del proceso y los productos de degradación con respecto al Estándar de Referencia USP. Establecer valores para la actividad microbiana relativa (F) para cada parte activa en comparación con el Estándar de Referencia USP. Se pueden descartar las partes activas, las impurezas del proceso y los productos de degradación con actividad antimicrobiana por debajo de 1%. El método alternativo candidato puede resolver impurezas que no tienen actividad antimicrobiana, las cuales posiblemente no contribuirán con el estudio puente. 2. Evaluar un número adecuado de lotes de producción del antibiótico para determinar si la composición del antibiótico complejo es uniforme entre lotes. 3. Validar el procedimiento alternativo candidato usando el capítulo (1225). El procedimiento debe ser específico, selectivo e indicar la estabilidad. 4. Analizar un mínimo de tres lotes diferentes del fármaco y el Estándar de Referencia USP usando el método de valoración microbiana y el procedimiento alternativo candidato. 5. Analizar un mínimo de seis muestras repetidas por lote usando el método alternativo candidato y los procedimientos de valoración microbiana. Puede ser necesario incrementar el número de repeticiones basándose en la diferencia porcentual máxima permitida (ver Evaluación de Datos) y la desviación estándar del método (4). De ser posible, preparar soluciones madre del estándar y de la muestra y subdividirlas para usarlas con los procedimientos de valoración del método alternativo candidato y de la valoración microbiana. Esto provee datos apareados que pueden ser analizados (ver el Apéndice 2). 6. Usar la actividad microbiana relativa (F) para convertir los valores de pureza porcentuales para cada parte activa, luego sumarlos para determinar un valor de potencia combinado. 7. Aplicar el valor aberrante apropiado (ver los capítulos generales (101 O) y (81 )) y las pruebas de comparación (ver Evaluación de Datos) para determinar si el procedimiento alternativo candidato y el procedimiento de valoración microbiana producen resultados equivalentes. 8. Cuando existan valores aberrantes estadísticos en cualquiera de los procedimientos, realizar una comparación excluyendo los valores aberrantes. Si se cumplen los criterios del estudio puente, repetir el estudio puente con controles para evitar valores aberrantes. El informe del estudio puente debe proveer una justificación para el rechazo de valores aberrantes. La aparición constante de valores aberrantes en los resultados de la valoración del método alternativo candidato puede indicar que los controles del procedimiento son inadecuados. Cuando esto ocurra, el estudio puente se considerará nulo y se deberá desarrollar y validar un procedimiento alternativo distinto o modificado. 9. Si el estudio puente incumple, puede ser necesario incluir las contribuciones de potencia de las impurezas cuya contribución está por debajo de 1%.
EVALUACIÓN DE DATOS A continuación se describen las recomendaciones de la USP para la evaluación de datos. También pueden usarse enfoques alternativos como la regresión Deming (5) y las pruebas de comparación disponibles comercialmente. Para un antibiótico con un intervalo de Valoración comparativamente estrecho (80%-125% o más estrecho), seguir el Paso 1. Para un antibiótico con un intervalo de Valoración amplio (80%-125% o más amplio), seguir los Pasos 1 y 2. 1. Demostrar la equivalencia de los resultados a la potencia diana de 100% usando un método de dos pruebas unilaterales (TOST, por sus siglas en inglés) para evaluar la equivalencia. La prueba unilateral doble ofrece diversas ventajas sobre la
Información General/ (1223.1) Validación de Métodos Alternativos 1 787
USP 39
prueba t, la cual busca diferencias (6,7,8,9). Esto requiere que el laboratorio establezca una diferencia porcentual máxima permitida (tal como 3%, 4% o 5%), denotada por k en los apéndices. Usar las fórmulas del Apéndice 7 para muestras independientes (muestras distintas usadas para los dos procedimientos) o el Apéndice 2 para muestras apareadas (un conjunto de muestras cada una de las cuales ha sido valorada usando los dos procedimientos). 2. Comparar los procedimientos de la valoración microbiana y de la valoración del método alternativo candidato del capítulo usando muestras apareadas que abarquen todo el intervalo de la monografía para los valores de actividad. Preparar una gráfica de Bland-Altman (BA) (Apéndice 3). No debe existir evidencia de una tendencia importante y los límites de correspondencia de 95% en la gráfica BA no deben extenderse fuera de una diferencia máxima predeterminada establecida por el laboratorio.
APÉNDICE 1: FÓRMULAS DE TOST PARA MUESTRAS INDEPENDIENTES Tomando como fundamento el conocimiento del producto, el laboratorio debe la diferencia porcentual máxima permitida entre el resultado promedio de la valoración del método alternativo candidato y el promedio de los resultados del método de valoración microbiana. Una diferencia que cumple con los requisitos indica que el método alternativo provee resultados aceptables en el intervalo farmacopeico especificado al compararlos con la valoración microbiana. En la notación estadística, se debe demostrar que:
1ooiµHPLC -11<100k µMicro
(Ecuación 1)
k = un número positivo pequeño tal como 0,03 (para una diferencia permitida de 3%) µ¡
=valor medio para cada procedimiento
i = método alternativo (HPLC) o valoración microbiana (Micro) Estos son los dos valores que se van a comparar. Al reacomodar, esto se convierte en: (Ecuación 2) La idea de la prueba unilateral doble es considerar las dos desigualdades de la Ecuación 2 por separado. Esto significa que, para demostrar la hipótesis de la Ecuación 2 al nivel de 5%, se deben demostrar ambas desigualdades en la Ecuación 3 al nivel de5%: µHPLC
-(1 + k)µMicro < 0 Y µHPLC -(1 -
k)µMicro
>0
(Ecuación 3)
Para una comparación de medias, la prueba unilateral doble es equivalente a considerar límites de confianza bilaterales de 90%. Si los límites satisfacen las desigualdades de la Ecuación 3, entonces se habrá demostrado la equivalencia. Cuando las muestras para las dos valoraciones que se están comparando son diferentes ("muestras independientes"), determinar los límites de confianza superior (U) e inferior (L) siguientes: u=
XHPLC -(1 + k)XMicro + t0,05,df~s~PLC / NHPLC + (1 + k)2 s~icro / NMicro
(Ecuación 4) (Ecuación 5)
X; = promedio de la muestra S; = desviación estándar de la muestra N = tamaño de la muestra t =valor de 5% unilateral para una distribución t i =método alternativo (HPLC) o método de valoración microbiana (Micro) Para el número de grados de libertad, usar:
(Ecuación 6) Esta es una aproximación que asume que k es pequeña. Si se usa un software que sólo permite números enteros para grados de libertad (p.ej., Excel), usar interpolación lineal para obtener el valor t. Se puede concluir que los dos procedimientos son equivalentes (es decir, cualquier diferencia en el promedio es aceptablemente pequeña) para el lote dado si:
L>OyU
(Ecuación 7)
1788 (1223.1) Validación de Métodos Alternativos/ Información General
USP 39
Datos de Valoración Microbiana
Datos de Valoración con HPLC
72,02
72,68
67,3
72,24
71,79
72,5
71, 16
-
69,06
-
75,56
-
74,7
-
74,16
-
76,48
-
Siguiendo las fórmulas anteriores con k = 0,03: NHPLC
= 3; XHPLC = 72,5;
SHPLC
= 0,221
NMicro
= 9;
SMicro
= 3,045
}(Micro
= 72,5;
Grados de libertad= 8,247; valor t interpolado= 1,853
L = 0,338 y U= -0,219, de modo que se satisfaga el criterio de equivalencia de 3%.
APÉNDICE 2: FÓRMULAS DE TOST PARA MUESTRAS APAREADAS Cuando las muestras para las dos valoraciones sean las mismas, los datos se consideran "pareados". Las hipótesis son las mismas que en el Apéndice 7. Debido al apareamiento de las muestras, los cálculos de la desviación estándar difieren. Determinar los límites de confianza, U y L, según se indica a continuación: U=
XHPLc -(1 + k)X Micro+ t0, 05 ,df~S~ IN
(Ecuación 8)
-(1-k)XMicro-f0,05,dl~Sf f N
(Ecuación 9)
L = XHPLC
N = número de muestras para cada procedimiento
df=N-1 SL y Su se calculan según se indica a continuación:
1 ~ ) 2 Su2 =--LJXHPLC,j-(1+k XMicro)
N-1
j=1
(Ecuación 1 O)
1-I)XHPLc,j -(1-k)XMicro,j]2 Sf = -N-1 j=1
(Ecuación 11)
Se concluye que los dos procedimientos son equivalentes (es decir, cualquier diferencia en el promedio es aceptablemente pequeña) para el lote dado si:
L>OyU
(Ecuación 12)
Ejemplo 2: Datos de Valoración Microbiana
Datos de Valoración con HPLC
1011
980,9
990
981,4
960
978,3
1000
974,3
970
966,7
Siguiendo las fórmulas anteriores con k = 0,03: N = 5;
XHPLC
= 976,3;
XMicro
= 986,2
SL = 18,749; Su= 19,958
df = 4; valor t = 2, 132 L = 1,830 y U= -20,438, de modo que se satisfaga el criterio de equivalencia de 3%.
Información General/ (1223.1) Validación de Métodos Alternativos 1789
USP 39
APÉNDICE 3: GRÁFICAS BLAND-ALTMAN La Figura 1 presenta los datos graficados como HPLC (eje x) vs. Micro (eje y). En la Figura 2, el eje x representa la respuesta promedio obtenida usando los métodos de valoración alternativo y microbiano. El eje y representa la diferencia en respuestas medida con los métodos de valoración alternativo y microbiano. El sesgo para cada conjunto de datos es representado por la diferencia promedio. Los límites de concordancia de 95% son representados por el sesgo± 25. Los puntos de datos fuera de los límites de concordancia se consideran valores aberrantes. La gráfica Bland-Altman (1O,11) debe mostrar los puntos de datos dispersos dentro de los límites de concordancia sin patrón obvio. Si existe un patrón (p.ej., patrón proporcional o canalizado hacia afuera con un promedio creciente), realizar una transformación logarítmica. Si se realiza una transformación logarítmica, tomar el antilogaritmo de los resultados para analizarlo usando la escala original de medición. Ejemplo 3: Nivel
Datos de Valoración Microbiana
Datos de Valoración con HPLC
150 150 150 150 150 120 120 120 120 120 90 90 90 90 90 60 60 60 60 60 30 30 30 30 30
854 862 871 845 836 678 699 688 705 671 530 536 522 510 515 366 363 348 352 357 197 187 192 189 195
867 893 880 906 854 704 722 739 686 669 541 554 528 515 502 343 361 334 370 352 185 172 176 180 167
1 790 (1223.1) Validación de Métodos Alternativos / Información General
USP 39
1000
800
600
o
-r--~~~~~~~~~~~~~~~r-~~~~~~~~~~~~~~--r~~~~~~~----{
o
200
400
600
800
1000
Valores HPLC Figura 1. Ejemplo de datos graficados como Datos de valoración microbiana en función de Datos de valoración con HPLC. La Figura 7 presenta los datos graficados como HPLC (eje x) vs. Micro (eje y). Esto parece tener una concordancia adecuada. La Figura 2 presenta lo que sucede cuando los mismos datos se grafican según lo recomendado por Bland y Altman.
USP 39
Información General/ (1223.1) Validación de Métodos Alternativos 1791
,--------------------------·----------------------------·----------- ---
60
1
40
•
• ~---- --• •• -----------•
20
.
~
o
•
___
------
400
200
CI.
....
-------
~
!:! u
~
-20
•
___
•
• 600
--------
•
•
Datos
•
------
-LCL -UCL
-40
800
•
1000
• -------- ----- • -------••
•
----- Lineal (Datos)
...
...
-60
-80
Promedio Figura 2. Ejemplo de datos en una gráfica Bland-Altman.
Calcular el sesgo, estimado por la diferencia media (d) y la desviación estándar (SD, por sus siglas en inglés) de la diferencia. Diferencia media
= -5,28
Desviación estándar de la diferencia
= 22,36
Se espera que la mayoría de las diferencias se encuentren entre d - 2SD y d + 2SD (si se distribuyen normalmente, el 95% estará dentro de estos límites). Si las diferencias dentro de d ± 2SD (límites de concordancia) no son importantes, se pueden usar los dos métodos de medición de manera intercambiable. LCL (d - 2SD) = -49,95
(Ecuación 1 3)
= 39,39
(Ecuación 14)
UCL (d + 2SD)
La diferencia entre los resultados de los dos procedimientos presenta una bien marcada tendencia. Dicha tendencia se puede observar en la Figura 1, pero la gráfica Bland-Altman de la Figura 2 la presenta de forma más clara.
REFERENCIAS 1. Wright W. Use of liquid chromatography for the assay of antibiotics. Stimuli to the revision process. Pharmacopeial Forum. 1994;20(5):8155-8159. 2. USP. Advertencias generales, 6.30 Métodos y Procedimientos Alternativos y Armonizados. 3. Hauck WW, DeStefano AJ, Cecil TJ, Abernethy DR, Koch WF, Williams RL. Acceptable, equivalent, or better: approaches for alternatives to official compendia! procedures. Stimuli to the revision process. Pharmacopeial Forum. 2009;35(3):772-778. 4. Borman PJ, Chatfield MJ, Damjanov 1, Jackson P. Design and analysis of method equivalence studies. Anal Chem. 2009; 81 (24):9849-9857. 5. Cornbleet PJ, Gochman N. lncorrect least-squares regression coefficients in method-comparison analysis. Clin Chem. 1979;25(3):432-438.
1 792 (1223.1) Validación de Métodos Alternativos / Información General
USP 39
6. Schuirmann DJ. A comparison of the plot s procedure and the power approach for assessing the equivalence of average bioavailability. j Pharmacokinet Biopharm. 1987;15(6):657-680. 7. Limentani GB, Ringo MC, Ye F, Bequist ML, McSorley EO. Beyond the t-test: statistical equivalence testing. Anal Chem. 2005;77(11):221A-226A. 8. Chambers OC, Kelly G, Limentani G, Lister A, Lung, KR, Warner E. Analytical method equivalency: an acceptable analytical practice. Pharm Technol. 2005;9:64-80. 9. Chatfield MJ, Borman PJ. Acceptance criteria for method equivalence assessments. Anal Chem. 2009; 81 (24):9841-9848. 1 O. Bland JM, Altman DG. Measuring agreement in method comparison studies. Stat Methods Med Res. l 999;8(2):135-160. 11. Bland JM, Altman DG. Statistical methods for assessing agreement between two methods of clinical measurement. Lancet. 1986;1 (8476):307-31 o.
(1224) TRANSFERENCIA DE PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS INTRODUCCIÓN Analizar de acuerdo con las especificaciones de un material auxiliar, producto intermedio y/o ingrediente y producto es un paso crítico para el establecimiento de la calidad de una forma farmacéutica terminada. La transferencia de procedimientos analíticos, también referida como transferencia de métodos, es el proceso documentado que califica a un laboratorio (la unidad receptora) para emplear un procedimiento de prueba analítico que se originó en otro laboratorio (la unidad que transfiere), con lo que se asegura que la unidad receptora cuente con el conocimiento adecuado sobre el procedimiento y la capacidad para llevar a cabo el procedimiento analítico transferido según lo previsto. El propósito de este capítulo de información general es resumir los tipos de transferencias que pueden presentarse, incluida la posibilidad de exención de alguna transferencia, y ofrecer una idea general de los componentes potenciales de un protocolo de transferencia. Este capítulo no ofrece métodos estadísticos y no abarca la transferencia de procedimientos microbiológicos ni biológicos.
TIPOS DE TRANSFERENCIAS DE PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS Las transferencias de procedimientos analíticos se pueden realizar y demostrar usando diferentes enfoques. El más común es el análisis comparativo realizado en lotes homogéneos del material original a partir de partidas de producción estándar o muestras preparadas intencionalmente para la prueba (p.ej., agregando cantidades conocidas exactas de impurezas conocidas a las muestras). Otros enfoques incluyen covalidación entre laboratorios, validación completa o parcial de los procedimientos analíticos por parte de la unidad receptora y la exención de la transferencia, que consiste en una omisión adecuadamente justificada del proceso de transferencia. Las pruebas a transferir, el alcance de las actividades de transferencia y la estrategia de implementación deberán basarse en un análisis de riesgo que tome en cuenta las experiencias y conocimientos previos de la unidad receptora, la complejidad y las especificaciones del producto, así como el procedimiento.
Análisis Comparativo Los análisis comparativos requieren el análisis de un número predeterminado de muestras del mismo lote por parte de la unidad que transfiere y de la unidad receptora. Se puede considerar válido el uso de otros enfoques si, p.ej., la unidad receptora cumple con un criterio de aceptación predeterminado para la recuperación de una impureza en un producto con cantidades agregadas conocidas. Este análisis se basa en un protocolo de transferencia preaprobado que estipula los detalles del procedimiento, las muestras que se utilizarán y los criterios de aceptación predeterminados, incluyendo una variabilidad aceptable. Será necesario cumplir con los criterios de aceptación predeterminados para asegurar que la unidad receptora está calificada para llevar a cabo el procedimiento.
Covalidación entre Dos o Más Laboratorios El laboratorio que realiza la validación de un procedimiento analítico está calificado para llevar a cabo el procedimiento. La unidad que transfiere puede involucrar a la unidad receptora en una covalidación entre laboratorios, incluyéndola como parte del equipo de validación en la unidad que transfiere y, por consiguiente, en la obtención de datos para la evaluación de la reproducibilidad. Esta evaluación se lleva a cabo usando un protocolo de transferencia o validación preaprobado que proporciona los detalles del procedimiento, las muestras que se utilizarán y los criterios de aceptación predeterminados. El capítulo general Validación de Procedimientos Farmacopeicos (1225) ofrece guías útiles sobre las características apropiadas para el análisis.
USP 39
Información General/ (1224) Transferencia de Procedimientos Analíticos 1793
Revalidación La revalidación o revalidación parcial es otro enfoque aceptable para la transferencia de un procedimiento validado. Se deben tener en cuenta las características que serán afectadas, las cuales se describen en el capítulo (1225).
Exención de la Transferencia Las transferencias convencionales se pueden omitir en ciertas circunstancias. Para tales casos, se considera que la unidad receptora está calificada para usar los procedimientos de prueba analíticos sin necesidad de comparar ni generar datos comparativos entre los laboratorios. Los ejemplos siguientes ofrecen diversos escenarios que pueden justificar la exención de una transferencia de procedimientos analíticos: • La composición del producto nuevo es comparable con la de un producto existente y/o la concentración de un ingrediente activo es similar a la de un producto existente y se analiza mediante procedimientos para los que la unidad receptora tiene experiencia previa. •El procedimento analítico que se transfiere está descrito en la USP-NFy se mantiene sin cambios. Para este caso, se debe aplicar una verificación (ver (1226)). • El procedimiento analítico transferido es el mismo o muy similar a un procedimiento que ya se encuentra en uso. • El personal a cargo del desarrollo, validación o análisis de rutina del producto en la unidad que transfiere se traslada a la unidad receptora. Si la unidad receptora es elegible para una exención de transferencia, ésta debe documentar dicha exención incluyendo las justificaciones apropiadas.
ELEMENTOS RECOMENDADOS PARA LA TRANSFERENCIA DE PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS Son varios los elementos recomendados para llevar a cabo una transferencia de métodos exitosa, muchos de los cuales pueden estar interrelacionados. Cuando resulte apropiado, y como parte de las actividades previas a la transferencia, la unidad que transfiere debe proporcionar capacitación a la unidad receptora; otra opción es que la unidad receptora lleve a cabo los procedimientos e identifique cualquier circunstancia que necesite ser resuelta antes de firmar el protocolo de transferencia. La capacitación debe ser documentada. La unidad que transfiere, que se trata por lo general de la unidad de desarrollo, es responsable de proveer a la unidad receptora el procedimiento analítico, los estándares de referencia, los informes de validación, así como cualquier documentación necesaria, además de la capacitación y asistencia necesarias durante la transferencia. La unidad receptora puede ser una unidad de control de calidad, otra instalación dentro de la compañía u otra compañía, por ejemplo, una organización de investigación contratada. La unidad receptora proporciona personal calificado o capacita adecuadamente al personal antes de la transferencia, asegura que las instalaciones y el instrumental estén adecuadamente calibrados y calificados según se requiera, y verifica que los sistemas del laboratorio cumplan con los reglamentos aplicables y con los procedimientos generales internos del laboratorio. La unidad que transfiere y la unidad receptora deben comparar y discutir los datos obtenidos, así como cualquier desviación del protocolo. En esta discusión se debe tratar cualquier corrección o actualización realizada al informe final y al procedimiento analítico, necesaria para reproducir el procedimiento. Se puede usar un solo lote del artículo para la transferencia, debido a que el objetivo de la transferencia no se relaciona con el proceso de fabricación, sino con la evaluación del desempeño del procedimiento analítico en la unidad receptora.
PROTOCOLO PREAPROBADO Es necesario discutir, convenir y documentar un protocolo bien diseñado antes de implementar una transferencia de procedimiento analítico. Dicho documento expresa el consenso entre las partes, el cual indica a una estrategia de ejecución y debe incluir los requisitos y responsabilidades de cada una de las partes. Se recomienda incluir en el protocolo los siguientes temas, según corresponda: objetivo, alcance, responsabilidades de la unidad que transfiere y de la unidad receptora, materiales e instrumentos que se utilizarán, procedimiento analítico, diseño experimental y criterios de aceptación para todas las pruebas y/o métodos incluidos en la transferencia. El protocolo de transferencia debe identificar las características de desempeño analíticas específicas a evaluar (ver (1225) y (1226)), así como el análisis que se utilizará para evaluar los resultados aceptables del ejercicio de transferencia, basándose en los datos de validación y en el conocimiento sobre el procedimiento. Los criterios de aceptación para la transferencia, que se basan en el desempeño del método y en datos históricos obtenidos de los resultados de estabilidad y liberación, si estuvieran disponibles, deben incluir los criterios que permitan comparar los resultados de todas las instalaciones. Estos criterios se pueden establecer usando principios estadísticos, basados en la diferencia entre valores promedio e intervalos establecidos, y deben acompañarse con una estimación de la variabilidad (p.ej., desviación estándar relativa porcentual, %RSD, para cada sitio), en particular para la %RSD de precisión intermedia de la unidad receptora y/o un método estadístico para la comparación de los promedios para las pruebas de valoración y uniformidad de contenido. Para los casos de análisis de impurezas, en los que la precisión puede ser deficiente como en el caso de las impurezas en niveles de trazas, se puede usar una metodología descriptiva simple. La disolución se puede evaluar mediante una com-
1794 (1224) Transferencia de Procedimientos Analíticos/ Información General
USP 39
paración de los perfiles de disolución usando el factor de similitud f2 o mediante la comparación de los datos en los tiempos de muestreo especificados. Los laboratorios deben proveer una justificación apropiada para cualquier característica de desempeño analítico no incluida. Se deberán describir los materiales, estándares de referencia, muestras, instrumentos y parámetros instrumentales a utilizar. Se recomienda seleccionar y evaluar cuidadosamente las muestras caducas, vencidas o con cantidades conocidas agregadas para identificar problemas potenciales asociados con las diferencias entre los equipos de preparación de las muestras y para evaluar el impacto de los posibles resultados aberrantes en productos comercializados. La sección de documentación del protocolo de transferencia puede incluir formatos de informes para asegurar el registro uniforme de los resultados y para mejorar la uniformidad entre laboratorios. Esta sección debe contener cualquier información adicional que se vaya a incluir en los resultados, por ejemplo, cromatogramas y espectros de muestra, junto con cualquier información adicional en caso de desviaciones. El protocolo también debe explicar la forma en que habrá de tratarse cualquier desviación de los criterios de aceptación. Todos los cambios realizados al protocolo de transferencia como consecuencia de una falla en los criterios de aceptación deberán ser aprobados antes de recolectar datos adicionales.
PROCEDIMIENTO ANALÍTICO El procedimiento debe presentarse por escrito de manera detallada y con instrucciones explícitas, de modo que un analista capacitado pueda llevarlo a cabo sin dificultad. Las reuniones previas a la transferencia entre la unidad que transfiere y la unidad receptora son útiles para aclarar cualquier cuestión y contestar preguntas relacionadas con el proceso de transferencia. Cuando se cuente con datos de validación completa o parcial, estos deberán estar disponibles para la unidad receptora, junto con todos los detalles técnicos requeridos para llevar a cabo la prueba en cuestión. En algunos casos, la presencia en las instalaciones de las personas implicadas en el desarrollo o validación iniciales durante la transferencia puede ser de utilidad. Para el caso de cromatografía líquida o de gases, se debe expresar claramente el número de muestras repetidas y las secuencias de inyección, mientras que, para la prueba de disolución, se debe estipular el número de unidades de dosificación individuales.
INFORME DE TRANSFERENCIA Una vez que la transferencia se ha completado exitosamente, la unidad receptora debe preparar un informe de transferencia, que describa los resultados obtenidos con respecto a los criterios de aceptación, junto con las conclusiones que confirmen que la unidad receptora está ahora calificada para llevar a cabo el procedimiento. Asimismo, todas las desviaciones deben estar minuciosamente documentadas y justificadas. Se considera que la transferencia ha sido exitosa cuando se cumplen los criterios de aceptación y la unidad receptora está calificada para llevar a cabo el procedimiento. De lo contrario, la transferencia del procedimiento no se considerará completa hasta que se hayan adoptado las acciones correctivas y efectivas para cumplir con los criterios de aceptación. Una investigación puede ofrecer pautas sobre la naturaleza y el grado de las acciones correctivas, las cuales pueden variar desde capacitación adicional y aclaraciones, hasta enfoques más complejos, dependiendo del procedimiento en particular.
(1225) VALIDACIÓN DE PROCEDIMIENTOS FARMACOPEICOS Los procedimientos de prueba para la evaluación de los niveles de calidad de los artículos farmacéuticos están sujetos a diversos requisitos. Según el Artículo 501 de la Ley Federal de Alimentos, Medicamentos y Cosméticos, los ensayos y especificaciones de las monografías de la Farmacopea de los Estados Unidos y el Formulario Nacional constituyen normas legales. Los reglamentos sobre Buenas Prácticas de Fabricación Vigentes [21 CFR 211.194(a)] requieren que los métodos de prueba, que se utilizan para evaluar el cumplimiento de los artículos farmacéuticos con las especificaciones establecidas, deben cumplir normas adecuadas de exactitud y confiabilidad. Sin embargo, según estas reglamentaciones [21 CFR 211.194(a)(2)] no se exige que los usuarios de los métodos analíticos descritos en USP-NF validen la exactitud y confiabilidad de estos métodos, sino que solamente comprueben su aptitud bajo las condiciones concretas de uso. Al reconocer el carácter legal de las normas USP y NF, es esencial, por lo tanto, que las propuestas para adoptar procedimientos analíticos farmacopeicos nuevos o revisados, estén respaldadas por suficientes datos de laboratorio que documenten su validez. El texto de este capítulo informativo ha sido armonizado, en la medida de lo posible, con los documentos Validación de Procedimientos Analíticos y el texto suplementario Metodología, ambos de la Conferencia Internacional Tripartita sobre Armonización (ICH, por sus siglas en inglés), que tratan sobre procedimientos analíticos incluidos como parte de las solicitudes de registro presentadas en la UE, japón y EE.UU.
USP 39
Información General/ (1225) Validación de Procedimientos 1 795
PRESENTACIÓN A LOS COMPENDIOS Las presentaciones de procedimientos analíticos, nuevos o revisados, a los compendios de la USP deben contener información suficiente como para permitir que los miembros del Consejo de Expertos de la USP y sus Comités de Expertos evalúen los méritos relativos de los procedimientos propuestos. En la mayor parte de los casos, se evalúa si la descripción del procedimiento analítico es entendible y completa, se determina la necesidad de los procedimientos, y se evalúa la documentación que sustenta que los métodos han sido validados adecuadamente. La información puede variar dependiendo del tipo de método de que se trate. Sin embargo, en la mayor parte de los casos, la documentación presentada constará de las siguientes secciones.
Justificación Esta sección debe identificar la necesidad del procedimiento y describir la capacidad del procedimiento específico propuesto y por qué se lo prefiere sobre otros tipos de determinaciones. Para procedimientos revisados, debe proporcionarse una comparación de las limitaciones del procedimiento farmacopeico actual y las ventajas ofrecidas por el procedimiento propuesto.
Procedimiento Analítico Propuesto Esta sección debe incluir una descripción completa del procedimiento analítico lo suficientemente detallada como para permitir que expertos en la técnica puedan repetirlo. La reseña debe incluir todos los parámetros operativos importantes e instrucciones específicas, tales como la preparación de reactivos, realización de pruebas de aptitud del sistema, descripción de blancos utilizados, precauciones y fórmulas explícitas para el cálculo de los resultados de las pruebas.
Datos Esta sección debe proporcionar una documentación minuciosa y completa de la validación del procedimiento analítico. Debe incluir resúmenes de los datos y cálculos experimentales que fundamenten cada una de las características de desempeño analítico aplicables. Estas características se describen en la siguiente sección.
VALIDACIÓN La validación de un procedimiento analítico es el proceso que establece, mediante estudios en laboratorio, que las características de desempeño del procedimiento cumplen los requisitos para las aplicaciones analíticas previstas. Las características de desempeño analítico habituales que deben considerarse en la validación de los tipos de procedimientos descritos en este documento se indican en la Tabla 7. Dado que las opiniones pueden diferir respecto a la terminología y al uso, cada una de las características de desempeño se define en la siguiente sección de este capítulo, junto con un esbozo de un método o métodos típicos mediante los cuales puede medirse. Las definiciones hacen referencia a "resultados de las pruebas". La descripción del procedimiento analítico debería definir cuáles son los resultados de las pruebas para el procedimiento. De acuerdo con ISO 5725-1 y 3534-1, un resultado de una prueba es "el valor de una característica que se obtiene al llevar a cabo un método de prueba específico. El método de prueba debería especificar que debe realizarse una o varias mediciones individuales, y que su promedio, u otra función apropiada (tal como la mediana o la desviación estándar), debe informarse como el resultado de la prueba. Asimismo, puede requerir que se apliquen correcciones estándar tales como corrección de los volúmenes de gas a temperatura y presión estándar. Por consiguiente, un resultado de una prueba puede ser un resultado calculado a partir de diversos valores observados. En el caso más simple, el resultado de una prueba es en sí el valor observado". Aunque no necesariamente, un resultado de una prueba también puede ser el valor final informable que se compararía con los criterios de aceptación de una especificación. La validación de métodos de propiedades físicas puede implicar la evaluación de modelos quimiométricos. No obstante, las características analíticas típicas usadas en la validación de métodos se pueden aplicar a los métodos derivados del uso de modelos quimiométricos. Tabla 1. Características Analíticas Típicas Utilizadas para la Validación de Métodos Exactitud Precisión Especificidad Límite de Detección Límite de Cuantificación Linealidad Intervalo Robustez
Los efectos de las condiciones de procesamiento y el potencial de segregación de materiales deben considerarse durante la obtención de una muestra representativa que se usará en la validación de procedimientos.
1 796 (1225) Validación de Procedimientos / Información General
USP 39
En el caso de procedimientos farmacopeicos, puede resultar necesaria una nueva validación en las siguientes circunstancias: una presentación a la USP de un procedimiento analítico revisado o utilización de un procedimiento general establecido con un nuevo producto o materia prima (ver más adelante en Datos Requeridos para la Validación). Los documentos de ICH aconsejan sobre la necesidad de realizar una nueva validación en las siguientes circunstancias: cambios en la síntesis del fármaco, cambios en la composición del producto farmacéutico y cambios en el procedimiento analítico. El Capítulo (1225) tiene como propósito proporcionar información apropiada para validar una amplia variedad de procedimientos analíticos. La validación de procedimientos farmacopeicos puede involucrar algunas o todas las características analíticas típicas sugeridas que se usan en la validación de métodos, según se especifican en la Tabla 1 y se categorizan por tipo de método analítico en la Tabla 2. Para algunos procedimientos farmacopeicos los principios fundamentales de validación se pueden extender más allá de las características sugeridas en el Capítulo (1225). Para estos procedimientos, se remite al usuario al capítulo farmacopeico individual para aquellas características específicas de validación analítica, así como cualquier requisito de validación específico.
Características de Desempeño Analítico EXACTITUD Definición-La exactitud de un procedimiento analítico es la proximidad entre los resultados de la prueba obtenidos mediante ese procedimiento y el valor verdadero. La exactitud de un procedimiento analítico debe establecerse en todo su intervalo. [Nota sobre terminología: La definición de exactitud en (1225) y ICH Q2 corresponde únicamente a insesgadez. Para el Vocabulario Internacional de Metrología (VIM) y en los documentos de la Organización Internacional de Normalización (ISO), "exactitud" tiene un significado distinto. Para ISO, exactitud combina los conceptos de insesgadez (nombrada mediante el término "veracidad") y precisión]. Determinación-En la valoración de un fármaco, la exactitud puede determinarse mediante la aplicación del procedimiento analítico con respecto a un analito de pureza conocida (p.ej., un Estándar de Referencia), o comparando los resultados del procedimiento con los de un segundo procedimiento bien caracterizado, cuya exactitud se haya comprobado o definido. En la valoración de un fármaco en un producto formulado, la exactitud puede determinarse mediante la aplicación del procedimiento analítico a mezclas sintéticas de los componentes del producto farmacéutico al que se hayan añadido cantidades conocidas de analito dentro del intervalo del procedimiento. Si no resulta posible obtener muestras de todos los componentes del producto farmacéutico, se puede aceptar tanto el agregado de cantidades conocidas del analito al producto farmacéutico ("spike") como la comparación de los resultados con los de un segundo procedimiento bien caracterizado, cuya exactitud haya sido comprobada o definida. En el análisis cuantitativo de impurezas, la exactitud debe evaluarse en muestras (del fármaco o del producto farmacéutico) a las que se hayan agregado cantidades conocidas de impurezas. Cuando no sea posible obtener muestras de algunas impurezas o productos de degradación, los resultados deben compararse con los obtenidos mediante un procedimiento independiente. En ausencia de otra información, puede resultar necesario calcular la cantidad de una impureza basándose en la comparación de su respuesta con la del fármaco, pero el cociente entre las respuestas de cantidades iguales de la impureza y del fármaco (factor de respuesta relativa) debe ser utilizado siempre que se lo conozca. La exactitud se calcula como el porcentaje de recuperación de la cantidad valorada con respecto a la cantidad conocida de analito añadida a la muestra, o como la diferencia entre la media de la valoración y el valor verdadero aceptado, considerando los intervalos de confianza. Los documentos de ICH recomiendan que se evalúe la exactitud utilizando un mínimo de nueve determinaciones sobre un mínimo de tres niveles de concentración, cubriendo el intervalo especificado (es decir, tres concentraciones y tres determinaciones repetidas de cada concentración). La evaluación de la exactitud puede efectuarse de varias maneras, incluyendo la evaluación de la recuperación del analito (porcentaje de recuperación) en todo el intervalo de la valoración, o evaluando la linealidad de la relación entre las concentraciones estimadas y las reales. El criterio estadístico de preferencia es que el intervalo de confianza para la pendiente esté comprendido dentro de un intervalo alrededor de 1,0; o alternativamente, que el valor de la pendiente sea cercano a 1,0. En ambos casos, el intervalo o la definición de cercanía deberían especificarse en el protocolo de validación. El criterio de aceptación dependerá de la valoración, de su variabilidad, y del producto. No es aceptable establecer un criterio de aceptación basado en la falta de significancia estadística para la hipótesis nula de que la pendiente es 1,0. La exactitud de los métodos de propiedades físicas se puede evaluar a través del análisis de materiales de referencia estándar o, alternativamente, se puede considerar la aptitud de las metodologías mencionadas anteriormente para cada caso en particular. PRECISIÓN Definición-La precisión de un procedimiento analítico es el grado de concordancia entre los resultados de las pruebas individuales cuando se aplica el procedimiento repetidamente a múltiples muestreos de una muestra homogénea. La precisión de un procedimiento analítico habitualmente se expresa como la desviación estándar o la desviación estándar relativa (coeficiente de variación) de una serie de mediciones. La precisión puede ser una medida del grado de reproducibilidad o de repeti-
USP 39
Información General/ (1225) Validación de Procedimientos 1 797
bilidad del procedimiento analítico en condiciones normales de operación. En este contexto, la reproducibilidad se refiere al uso del procedimiento analítico en diferentes laboratorios, como por ejemplo en un estudio en colaboración. La precisión intermedia (también conocida como tolerancia o fortaleza) expresa la variación dentro de un laboratorio, por ejemplo en diferentes días, con diferentes analistas o con equipos diferentes dentro del mismo laboratorio. La repetibilidad se refiere a la utilización del procedimiento analítico en un laboratorio durante un período corto por el mismo analista con el mismo equipo. Determinación-La precisión de un procedimiento analítico se determina mediante el análisis de un número suficiente de alícuotas de una muestra homogénea que permita calcular estadísticamente estimaciones válidas de la desviación estándar o de la desviación estándar relativa (coeficiente de variación). Los análisis en este contexto son análisis independientes de muestras que se han llevado a cabo mediante el procedimiento analítico completo, desde la preparación de las muestras hasta el resultado final de las pruebas. Los documentos de ICH recomiendan que se evalúe la repetibilidad utilizando un mínimo de nueve determinaciones que cubran el intervalo especificado para el procedimiento (es decir, tres concentraciones y tres determinaciones repetidas de cada concentración) o usando un mínimo de seis determinaciones al 100% de la concentración de prueba. ESPECIFICIDAD Definición-Los documentos de JCH definen especificidad como la capacidad de evaluar de manera inequívoca el analito en presencia de aquellos componentes cuya presencia resulta previsible, tales como impurezas, productos de degradación y componentes de la matriz. La falta de especificidad de un procedimiento analítico individual puede compensarse usando otros procedimientos analíticos complementarios. [NOTA-Otras autoridades internacionales de reconocido prestigio (IUPAC, AOAC-1) han preferido el término "selectividad," reservando "especificidad" para procedimientos que resulten completamente selectivos.] Para las pruebas que se indican a continuación, la definición anterior tiene las siguientes implicancias: Pruebas de Identificación: garantizan la identidad del analito. Pruebas de Pureza: garantizan que todos los procedimientos analíticos efectuados permiten declarar con exactitud el contenido de impurezas de un analito (por ejemplo, prueba de sustancias relacionadas, límite de metales pesados, impurezas orgánicas volátiles). Valoraciones: proporcionan un resultado exacto, que permite una declaración exacta del contenido o potencia del analito en una muestra. Determinación-En análisis cualitativos (pruebas de identificación), debe demostrarse la capacidad de distinguir compuestos de estructura estrechamente relacionada cuya presencia resulta probable. Esta capacidad debería confirmarse mediante la obtención de resultados positivos a partir de muestras que contengan el analito (quizás mediante comparación con un material de referencia conocido), junto con resultados negativos de muestras que no contengan dicho analito, y mediante la confirmación de que no se obtiene una respuesta positiva de materiales con estructura similar o estrechamente relacionada a la del analito. En un procedimiento analítico para impurezas, la especificidad puede establecerse mediante la adición al fármaco o producto farmacéutico de una cantidad conocida de impurezas en concentraciones adecuadas, y la demostración de que estas impurezas se determinan con exactitud y precisión adecuadas. En una valoración, la demostración de especificidad requiere evidencia de que el procedimiento no resulta afectado por la presencia de impurezas o excipientes. En la práctica, esto puede hacerse agregando al fármaco o producto farmacéutico una cantidad conocida de excipientes o de impurezas en concentraciones adecuadas, y demostrando que el resultado del análisis no resulta afectado por la presencia de estos materiales extraños. Si no se dispone de estándares de impureza o de los productos de degradación, puede demostrarse la especificidad comparando los resultados de las pruebas de muestras que contengan impurezas o productos de degradación con los de un segundo procedimiento bien caracterizado (p.ej., un procedimiento farmacopeico u otro procedimento validado). Estas comparaciones deberían incluir muestras sometidas a condiciones forzadas relevantes (p.ej., luz, calor, humedad, hidrólisis ácida/alcalina y oxidación). En una valoración, deben compararse los resultados; en pruebas de impureza cromatográfica, deben compararse los perfiles de impurezas. Los documentos de JCH afirman que cuando se utilizan procedimientos cromatográficos, deberán presentarse cromatogramas representativos para demostrar el grado de selectividad y los picos deberán identificarse adecuadamente. Las pruebas de pureza de picos (p.ej., utilizando arreglo de diodos o espectrometría de masas) pueden resultar útiles para demostrar que el pico cromatográfico del analito no puede atribuirse a más que un solo componente. Para la validación de especificidad de determinaciones cualitativas y cuantitativas mediante métodos espectroscópicos, se deben consultar los capítulos relacionados con temas como espectrofotometría en el infrarrojo cercano, espectroscopía raman y difracción de rayos X sobre polvo. LÍMITE DE DETECCIÓN Definición-El límite de detección es una característica de las pruebas de límite. Es la cantidad mínima de analito que puede detectarse en una muestra, aunque no necesariamente cuantificarse, en las condiciones experimentales indicadas. Las pruebas de límite simplemente comprueban que la cantidad de analito se encuentra por encima o por debajo de un nivel determi-
1 798 (1225) Validación de Procedimientos / Información General
USP 39
nado. El límite de detección se expresa habitualmente como concentración de analito (p.ej., porcentaje, partes por billón) en la muestra. Determinación-Para procedimientos no instrumentales, el límite de detección se determina generalmente mediante el análisis de muestras con concentraciones conocidas de analito, estableciendo el nivel mínimo del analito que puede detectarse confiablemente. Para procedimientos instrumentales, se puede utilizar el mismo enfoque que para procedimientos no instrumentales. En el caso de procedimientos presentados para su consideración como procedimientos farmacopeicos oficiales, casi nunca es necesario determinar el límite de detección real. Más bien, debe demostrarse que el límite de detección es lo suficientemente bajo mediante el análisis de muestras con concentraciones conocidas de analito superiores e inferiores al nivel de detección requerido. Por ejemplo, si se requiere detectar una impureza con una concentración del O, 1%, debería demostrarse que el procedimiento detectará de modo confiable la impureza a esa concentración. En el caso de procedimientos analíticos instrumentales que presentan ruido de fondo, los documentos de ICH describen un enfoque usual, que consiste en comparar las señales medidas a partir de muestras con bajas concentraciones conocidas de analito con las de muestras blanco. Se establece la concentración mínima a la que puede detectarse confiablemente un analito. Las relaciones señal-ruido habitualmente aceptables son de 2:1 ó 3:1. Otros enfoques dependen de la determinación de la pendiente de la curva de calibración y la desviación estándar de las respuestas. Independientemente del método utilizado, el límite de detección debería validarse posteriormente mediante el análisis de un número adecuado de muestras preparadas al límite de detección o que se sabe que están cerca de dicho límite. LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN Definición-El límite de cuantificación es una característica de las valoraciones cuantitativas de compuestos que se encuentran en baja concentración en la matriz de una muestra, tales como: impurezas en fármacos a granel y productos de degradación en productos farmacéuticos terminados. Es la mínima cantidad de analito en una muestra que se puede determinar con precisión y exactitud aceptables en las condiciones experimentales indicadas. El límite de cuantificación se expresa habitualmente como concentración de analito (p.ej., porcentaje, partes por billón) en la muestra. Determinación-Para procedimientos no instrumentales, el límite de cuantificación se determina habitualmente mediante el análisis de muestras con concentraciones conocidas de analito, estableciendo el nivel mínimo del analito que se puede determinar con exactitud y precisión aceptables. Para procedimientos instrumentales, se puede utilizar el mismo enfoque que para procedimientos no instrumentales. En el caso de procedimientos presentados para su consideración como procedimientos farmacopeicos oficiales, casi nunca resulta necesario determinar el límite de cuantificación real. Más bien, debe demostrarse que el límite de cuantificación es lo suficientemente bajo mediante el análisis de muestras con concentraciones conocidas de analito superiores e inferiores al nivel de cuantificación. Por ejemplo, si se requiere analizar un analito a una concentración de O, 1 mg por tableta, debería demostrarse que el procedimiento cuantificará de modo confiable el analito a esa concentración. En el caso de procedimientos analíticos instrumentales que presentan ruido de fondo, los documentos de ICH describen un enfoque común, que consiste en comparar las señales medidas a partir de muestras con bajas concentraciones conocidas de analito con las de muestras blanco. Se establece la concentración mínima a la que puede cuantificarse confiablemente un analito. Una relación señal-ruido habitualmente aceptable es de 10:1. Otros enfoques dependen de la determinación de la pendiente de la curva de calibración y la desviación estándar de las respuestas. Independientemente del enfoque utilizado, el límite de cuantificación debería validarse posteriormente mediante el análisis de un número adecuado de muestras que se sepa que están cerca del límite de cuantificación o fueron preparadas al límite de cuantificación. LINEALIDAD E INTERVALO Definición de Linealidad-La linealidad de un procedimiento analítico es su capacidad para obtener resultados de prueba que sean proporcionales ya sea directamente, o por medio de una transformación matemática bien definida, a la concentración de analito en muestras dentro de un intervalo dado. En esta sección, la "linealidad" se refiere a la linealidad de la relación entre la concentración y la medida de valoración. En algunos casos, para lograr la linealidad, puede ser necesario transformar la concentración y/o la medida. (Notar que los factores de corrección usados en el análisis de regresión pueden cambiar cuando se aplica la transformación.) Las transformaciones posibles pueden incluir el logaritmo, la raíz cuadrada, o el recíproco, aunque otras transformaciones son aceptables. Si no se puede lograr la linealidad, se puede utilizar un modelo no lineal. El objetivo es obtener un modelo que describa con precisión la relación de concentración en función de la respuesta, ya sea lineal o no lineal. Definición de Intervalo-El intervalo de un procedimiento analítico es la amplitud entre las concentraciones inferior y superior del analito (incluyendo estos niveles) en la cual se puede determinar al analito con un nivel adecuado de precisión, exactitud y linealidad utilizando el procedimiento según se describe por escrito. El intervalo se expresa normalmente en las mismas unidades que los resultados de la prueba (p.ej., porcentaje, partes por millón) obtenidos mediante el procedimiento analítico. Determinación de Linealidad e Intervalo-La linealidad debe establecerse en el intervalo completo del procedimiento analítico. Debería establecerse inicialmente mediante examen visual de un gráfico de señales en función de la concentración de analito del contenido. Si parece existir una relación lineal, los resultados de la prueba deberían establecerse mediante méto-
USP 39
Información General/ (1225) Validación de Procedimientos 1 799
dos estadísticos adecuados (p.ej., mediante el cálculo de una línea de regresión por el método de los cuadrados mínimos). Los datos obtenidos a partir de la línea de regresión pueden ser útiles para proporcionar estimaciones matemáticas del grado de linealidad. Se deberían presentar el coeficiente de correlación, la intersección con el eje de ordenadas, la pendiente de la línea de regresión y la suma de los cuadrados residuales. El intervalo del procedimiento se valida verificando que el procedimiento analítico proporciona precisión, exactitud y linealidad aceptables cuando se aplica a muestras que contienen el analito en los extremos del intervalo, al igual que dentro del intervalo. La ICH recomienda que, para establecer la linealidad, se utilicen normalmente un mínimo de cinco concentraciones. También recomienda que se consideren los intervalos especificados mínimos que se indican a continuación: Valoración de un Fármaco (o de un producto terminado): de 80% a 120% de la concentración de prueba. Determinación de una Impureza: de 50% a 120% del criterio de aceptación. Para Uniformidad del Contenido: un mínimo de 70% a 130% de la concentración de prueba, a no ser que se justifique un intervalo más amplio o más apropiado, basándose en la naturaleza de la forma farmacéutica (p.ej., inhaladores de dosis fija). Para Pruebas de Disolución: ±20% por encima del intervalo especificado (p.ej., si los criterios de aceptación de un producto de liberación controlada cubren una región de 30%, después de 1 hora, y hasta 90%, después de 24 horas, el intervalo validado sería de 10% a 11 0% de la cantidad declarada). La definición tradicional de linealidad, es decir, el establecimiento de una relación lineal o matemática entre la concentración de la muestra y la respuesta, no es aplicable al análisis del tamaño de partícula. Para el análisis de tamaño de partícula, se define un intervalo de concentración (que depende del instrumento y el tamaño de partícula) tal que la distribución de tamaño de partícula medida no se vea afectada por cambios en la concentración dentro del intervalo de concentración definido. Las concentraciones por debajo del intervalo de concentración definido pueden introducir un error debido a una pobre relación señal-ruido, mientras que las concentraciones que exceden el intervalo de concentración definido pueden introducir un error debido a dispersiones múltiples. ROBUSTEZ Definición-La robustez de un procedimiento analítico es una medida de su capacidad para no ser afectado por variaciones pequeñas, aunque deliberadas, en los parámetros del procedimiento indicados en la documentación, y provee una indicación de su aptitud durante condiciones normales de uso. La robustez puede determinarse durante la etapa de desarrollo del procedimiento analítico.
APTITUD DEL SISTEMA Si las mediciones son susceptibles a variaciones en las condiciones analíticas, éstas deben controlarse adecuadamente o debe incluirse una advertencia en el procedimiento. Una consecuencia de la evaluación de la tolerancia y la robustez debería ser que se establezca una serie de parámetros de aptitud del sistema para asegurar que la validez del procedimiento analítico se mantiene cada vez que se usa. Variaciones típicas son la estabilidad de soluciones analíticas, diferentes equipos y diferentes analistas. En la cromatografía de líquidos, las variaciones habituales son el pH de la fase móvil, la composición de la fase móvil, diferentes lotes o proveedores de columnas, la temperatura y la velocidad de flujo. En el caso de cromatografía de gases, son variaciones típicas los diferentes lotes o proveedores de columnas, la temperatura y la velocidad de flujo. Las pruebas de aptitud del sistema se basan en el concepto de que el equipo, el sistema electrónico, las operaciones analíticas y las muestras a analizar constituyen un sistema integral que puede evaluarse como tal. Los parámetros de prueba de la aptitud del sistema que deben establecerse para un procedimiento específico dependen del tipo de procedimiento que se está evaluando. Son especialmente importantes en el caso de procedimientos cromatográficos. Las presentaciones a la USP deberían tener en cuenta los requisitos indicados en la sección Aptitud del Sistema en el capítulo de pruebas generales Cromatografía (621 ).
Datos Requeridos para la Validación Los requisitos de las pruebas farmacopeicas varían desde determinaciones analíticas muy rigurosas hasta evaluaciones subjetivas de atributos. Considerando esta amplia variedad, es lógico que diferentes procedimientos de prueba requieran diferentes esquemas de validación. Este capítulo cubre sólo las categorías de prueba más habituales para las que se exigen datos de validación. Estas categorías se indican a continuación. CATEGORÍA
1
Procedimientos analíticos para la cuantificación de los componentes principales de fármacos a granel o ingredientes activos (incluyendo conservantes) en productos farmacéuticos terminados.
1800 (1225) Validación de Procedimientos / Información General
USP 39
CATEGORÍA 11 Procedimientos analíticos para la determinación de impurezas en fármacos a granel o productos de degradación en productos farmacéuticos terminados. Estos procedimientos incluyen análisis cuantitativos y pruebas de límite. CATEGORÍA 111 Procedimientos analíticos para la determinación de las características de desempeño (p.ej. disolución, liberación de fármacos, etc.). CATEGORÍA IV Pruebas de identificación. Para cada categoría, se requiere diferente información analítica. En la Tabla 2 se indican los datos que normalmente se requieren para cada una de estas categorías. Tabla 2. Datos Requeridos para la Validación Categoría 11 Características de Desempeño Analítico
Categoría 1
Análisis Cuantitativos
Pruebas de Límite
Categoría 111
Categoría IV
Exactitud
Sí
Sí
*
*
No
Precisión
Sí
Sí
No
Sí
No
Especificidad
Sí
Sí
Sí
*
Sí
Límite de Detección
No
No
Sí
*
No
Límite de Cuantificación
No
Sí
No
*
No
Linealidad
Sí
Sí
No
*
No
Intervalo
Sí
Sí
*
*
No
* Pueden requerirse, dependiendo de la naturaleza de la prueba específica.
Los procedimientos generales ya establecidos (p.ej., determinación volumétrica de agua, endotoxinas bacterianas) deben verificarse para establecer su aptitud para el uso, tal como su exactitud (y la ausencia de posibles interferencias) cuando se utilizan para un producto nuevo o materia prima nueva. Al validar métodos de propiedades físicas, se deben considerar las mismas características de desempeño requeridas para cualquier procedimiento analítico. Asimismo, se debe evaluar el uso de las características de desempeño para cada caso en particular, a fin de determinar que el procedimiento es adecuado para el uso previsto. Los criterios de aceptación específicos para cada parámetro de validación deben ser congruentes con el uso previsto para el método. Los métodos físicos también se pueden clasificar en las cuatro categorías de validación. Por ejemplo, la validación de un método espectroscópico cuantitativo puede implicar la evaluación de Características de Desempeño Analítico de Categoría I o Categoría 11, dependiendo de los requisitos del método. Las mediciones de propiedades físicas cualitativas, tales como tamaño de partícula, área superficial, densidad aparente y densidad por asentamiento, las cuales pueden tener un impacto sobre las características de desempeño, generalmente se ajustan mejor a la Categoría 111. Las Características de Desempeño Analítico de Categoría IV por lo general se aplican a la validación de métodos espectroscópicos de identificación cualitativa. No obstante, las diversas técnicas se pueden usar para distintos propósitos, y el uso específico del método y las características del material en análisis se deben considerar al aplicar definitivamente una categoría a un tipo de método en particular. La validez de un procedimiento analítico puede verificarse sólo mediante estudios de laboratorio. Por lo tanto, la documentación de la conclusión exitosa de dichos estudios constituye un requisito básico para determinar si un procedimiento es adecuado para sus aplicaciones previstas. Los procedimientos farmacopeicos oficiales también están sujetos a reglamentos que requieren la demostración de aptitud en las condiciones reales de uso (ver Verificación de Procedimientos Farmacopeicos (1226) para los principios relativos a la verificación de procedimientos farmacopeicos). Cualquier propuesta de procedimientos farmacopeicos analíticos nuevos o revisados debe ir acompañada de la documentación adecuada.
(1226) VERIFICACIÓN DE PROCEDIMIENTOS FARMACOPEICOS La intención de este capítulo es proporcionar información general sobre la verificación de procedimientos farmacopeicos que se llevan a cabo por primera vez para lograr resultados aceptables con el personal, equipo y reactivos disponibles. Este capítulo no pretende aplicar retrospectivamente procedimientos de laboratorio ya establecidos con éxito. El capítulo Validación de Procedimientos Farmacopeicos (1225) proporciona información general sobre las características que deben considerarse para
USP 39
Información General/ (1226) Procedimientos Farmacopeicos 1801
las distintas categorías de pruebas y la documentación que debe acompañar a los procedimientos analíticos presentados para su inclusión en USP-NF. La verificación consiste en la evaluación de las características de desempeño analítico seleccionadas, como las que se describen en el capítulo (1225), para generar datos relevantes y adecuados, en vez de repetir el proceso de validación. Los usuarios de los procedimientos analíticos farmacopeicos no necesitan validar estos procedimientos cuando los usan por primera vez en sus laboratorios, aunque deben establecer evidencias documentadas de aptitud en las condiciones de uso reales. En los Estados Unidos, se estableció este requisito en el punto 21 CFR 211.194(a)(2) de las reglamentaciones de Buenas Prácticas de Fabricación vigentes, que declara que "se verificará la aptitud de todos los métodos de prueba usados bajo las condiciones de uso reales." Este capítulo no incluye la verificación de procedimientos microbiológicos porque este tema está cubierto en los capítulos generales Pruebas de Eficacia Antimicrobiana (51 ), Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano (61 ), Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Microorganismos Específicos (62), Pruebas de Esterilidad (71) y Validación de Recuperación Microbiana en Artículos Farmacopeicos (1227) de USP.
PROCESO DE VERIFICACIÓN El proceso de verificación de procedimientos de prueba farmacopeicos es la evaluación que sirve para determinar si el procedimiento puede ser utilizado para su propósito previsto, en las condiciones de uso reales para un fármaco específico y/o matriz de un producto farmacéutico determinado. Los usuarios deben contar con la experiencia, conocimiento y capacitación adecuadas para entender y estar en condiciones de llevar a cabo los procedimientos farmacopeicos, tal y como fueron escritos. El usuario debe realizar la verificación de manera que los resultados proporcionen suficiente confianza de que el procedimiento farmacopeico será llevado a cabo con la aptitud requerida. Si la verificación del procedimiento farmacopeico no es exitosa y la asistencia del personal de la USP no logra solucionar el problema, se puede concluir que posiblemente el procedimiento no sea apto para usar con el artículo que se está evaluando en el laboratorio. Quizás se requiera desarrollar y validar un procedimiento alternativo, según lo permitan las Advertencias Generales. Se puede enviar el procedimiento alternativo a la USP, conjuntamente con los datos adecuados, en apoyo de una propuesta para la inclusión o reemplazo del procedimiento farmacopeico vigente.
REQUISITOS DE VERIFICACIÓN Los requisitos de verificación deben basarse en la evaluación de la complejidad tanto del procedimiento como del material al que se aplica el procedimiento. Si bien para verificar la aptitud de un procedimiento en las condiciones de uso reales no se requiere la revalidación completa del método farmacopeico, para el proceso de verificación se pueden usar algunas de las características de desempeño analítico que se enumeran en el capítulo (1225), Tabla 2. Sólo hay que evaluar las características que se consideran adecuadas para la verificación del procedimiento específico. El proceso mediante el cual se evalúa la aptitud de un procedimiento de prueba analítico farmacopeico puede requerir o no la ejecución, en condiciones reales, del procedimiento para cada una de las características de desempeño analítico. El grado y extensión del proceso de verificación puede depender del nivel de formación y experiencia del usuario, del tipo de procedimiento y los equipos o instrumentos asociados, los pasos específicos del procedimiento y el artículo en análisis. La verificación debe evaluar si el procedimiento farmacopeico es apto para el fármaco y/o la matriz del producto farmacéutico, teniendo en cuenta la ruta de síntesis del fármaco, el método de fabricación del producto farmacéutico o ambos, cuando corresponda. En la verificación se deben evaluar diversos elementos, tales como el efecto de la matriz sobre la recuperación de impurezas y fármacos desde la matriz de producto farmacéutico, la aptitud de las columnas y condiciones cromatográficas, y la adecuada respuesta de la señal del detector, entre otros. Como ejemplo, la evaluación de especificidad es un parámetro clave en la verificación de que un procedimiento farmacopeico es apto para usar en la valoración de fármacos y productos farmacéuticos. Por ejemplo, se puede verificar la especificidad aceptable para un método cromatográfico por conformidad con los requisitos de resolución de aptitud del sistema (si se especifican en el procedimiento). Sin embargo, los fármacos de proveedores distintos pueden tener perfiles de impurezas diferentes que no son considerados por el procedimiento de prueba farmacopeico. De igual manera, los excipientes en un producto farmacéutico pueden variar ampliamente entre los fabricantes y tener el potencial para interferir en forma directa con el procedimiento o causar la formación de impurezas no consideradas en el procedimiento farmacopeico. Además, los productos farmacéuticos que contengan diferentes excipientes, antioxidantes, amortiguadores o material extraíble del envase, pueden afectar la recuperación del fármaco a partir de la matriz. En estos casos, puede requerirse una evaluación más profunda de los efectos de la matriz para demostrar la aptitud del procedimiento para el fármaco o producto farmacéutico específico. Otras características de desempeño analítico como la evaluación del límite de detección o cuantificación y precisión de procedimiento para impurezas pueden ser muy útiles para demostrar la aptitud del procedimiento farmacopeico en las condiciones de uso reales. No se requiere la verificación para los procedimientos de prueba farmacopeicos básicos que se lleven a cabo en forma rutinaria a menos que exista la indicación de que el procedimiento farmacopeico no es adecuado para el artículo en análisis. Los ejemplos de procedimientos farmacopeicos básicos incluyen, entre otros, pérdida por secado, residuo de incineración, distintos procedimientos de química húmeda como el índice de acidez y determinaciones instrumentales simples como las mediciones
1802 (1226) Procedimientos Farmacopeicos / Información General
USP 39
de pH. Sin embargo, para la aplicación de procedimientos de rutina ya establecidos a artículos farmacopeicos que se analizan por primera vez, se recomienda que se consideren los requisitos nuevos o distintos para la manipulación de muestras o la preparación de soluciones.
(1227) VALIDACIÓN DE RECUPERACIÓN MICROBIANA EN ARTÍCULOS FARMACOPEICOS Este capítulo brinda guías para la validación de métodos para el cálculo del número de microorganismos viables, para la detección de microorganismos indicadores o inaceptables, para la validación de métodos microbiológicos utilizados en pruebas de efectividad antimicrobiana y para pruebas de esterilidad de artículos Farmacopeicos. Se entiende por lo general que si un producto tiene propiedades antimicrobianas debido a la presencia de un conservante específico o debido a su formulación, esta propiedad antimicrobiana debe ser neutralizada para recuperar los microorganismos viables. Esta neutralización puede lograrse utilizando un neutralizante específico, diluyendo, combinando dilución con lavado o empleando una combinación de cualquiera de estos métodos. Las pruebas en Pruebas de Efectividad Antimicrobiana (51 ), Pruebas de Esterilidad (71 ), Pruebas de Recuento Microbiano (61) y Pruebas de Microorganismos Específicos (62) requieren la validación de los métodos de recuperación. Para asegurar que los resultados de las pruebas sean confiables, se requiere la neutralización de las propiedades antimicrobianas de la solución de prueba antes de calcular el número de microorganismos viables.
FACTORES INFLUYENTES Varios factores afectan la determinación de la actividad antimicrobiana de una solución de prueba y deben considerarse en el diseño de validación. Éstos incluyen la naturaleza de los microorganismos utilizados como organismos de desafío, la preparación del inóculo de los organismos de desafío, las condiciones específicas de la prueba y las condiciones de recuperación. Estos factores también afectan la validación de los métodos de recuperación para productos acuosos o no acuosos, independientemente de sus propiedades antimicrobianas. De este modo, todos los métodos de prueba deben ser validados con estos factores en mente. La naturaleza del microorganismo de desafío ejerce un gran efecto sobre la respuesta al agente antimicrobiano y, por lo tanto, sobre la neutralización requerida para la recuperación. Entre estos organismos en pruebas farmacopeicas, se encuentran bacterias Gram positivas, bacterias Gram negativas, levaduras y hongos. Cada organismo que se utilice en la prueba debe ser incluido en la validación. La preparación del inóculo de microorganismos de desafío también afecta la prueba de productos que tengan propiedades antimicrobianas. El cultivo y preparación del organismo de desafío determina el estado fisiológico de la célula. Este estado influye directamente sobre los resultados de cualquier prueba de eficacia antimicrobiana. Las pruebas microbianas no utilizan células individuales; se recolectan más bien poblaciones de células para su estudio. Los datos generados en estos estudios son menos variables si las poblaciones de células son homogéneas. Los cultivos líquidos o los cultivos confluentes en medios sólidos son más adecuados para la preparación de cultivos reproducibles. Las condiciones de preparación y almacenamiento del organismo deben ser estandarizadas para la evaluación del neutralizante y deben reflejar las condiciones de la valoración antimicrobiana. Las condiciones específicas de la prueba, incluyendo soluciones amortiguadoras utilizadas, agua, condiciones de luz y temperatura deben ser reproducidas en el estudio de validación. También deben estandarizarse y cumplirse todas las condiciones de prueba en el estudio de validación exactamente como se realizaron en la prueba. Las condiciones de recuperación microbiana están dentro de las más cruciales para calcular con exactitud el número de microorganismos presentes en una solución de prueba. La primera consideración es el medio de recuperación utilizado para permitir el crecimiento de sobrevivientes. Este tema se analiza en detalle más abajo. La segunda consideración se refiere a las condiciones de incubación. Las condiciones óptimas de crecimiento deben estar presentes para asegurar el crecimiento completo y resultados reproducibles.
MÉTODOS PARA NEUTRALIZAR LAS PROPIEDADES ANTIMICROBIANAS Se utilizan tres métodos comunes para neutralizar las propiedades anti microbianas de un producto: (1) inhibición química, (2) dilución y (3) filtración y lavado.
USP 39
Información General/ (1227) Validación de Recuperación Microbiana 1803
Inhibición Química La Tabla 1 muestra los neutralizantes conocidos para diversos agentes antimicrobianos químicos y la toxicidad informada de algunos neutralizantes químicos para microorganismos específicos. Sin embargo, a pesar de su potencial toxicidad, la conveniencia y acción rápida de los inhibidores químicos fomenta su utilización. La inhibición química de bactericidas es el método preferido para la prueba de eficacia antimicrobiana. El potencial de utilidad de los inhibidores químicos se debe considerar en las pruebas de esterilidad por filtración por membrana y por transferencia directa. Los antibióticos pueden no ser susceptibles a la neutralización por medios químicos, siendo en estos casos útil el tratamiento enzimático (p.ej., penicilinasa). Estas enzimas pueden utilizarse cuando se requieran. Tabla 1. Algunos Neutralizantes Comunes para Biocidas Químicos Neutralizante
Tipo de Biocida
Acción Potencial de Biocidas
Bisulfato
Glutaraldehído, Mercuriales
Bacterias No Esporuladas
Dilución
Fenólicos, Alcohol, Aldehídos, Sorbato
-
Glicina
Aldehídos
Células en Crecimiento
Lecitina
Compuestos de Amonio Cuaternario (CAC), Parabenos, Bis-biguanidas
Bacterias
Iones Mg+2 o Ca+2
EDTA
-
Polisorbato
CAC, Yodo, Parabenos
-
Tioglicolato
Mercuriales
Estafilococos
Tiosulfato
Mercuriales, Halógenos, Aldehídos
Estafilococos
y Esporas
Dilución Un segundo enfoque para neutralizar las propiedades antimicrobianas de un producto es a través de la dilución, debido a que la concentración de un bactericida químico ejerce un gran efecto sobre su potencia. La relación entre la concentración y el efecto antimicrobiano difiere entre los agentes bactericidas, pero es constante para cada agente antimicrobiano. Esta relación es de naturaleza exponencial, con la fórmula general: c~t =
k
en donde C es la concentración; tes el tiempo requerido para matar un inóculo estándar; k es una constante; y el exponente de concentración, YJ, es la pendiente de la gráfica del logaritmo de ten función del logaritmo de C. Los agentes antimicrobianos con altos valores de ri se neutralizan rápidamente por dilución, mientras que aquellos con valores de ri bajos no son buenos candidatos para la neutralización por dilución.
Filtración por Membrana Un enfoque que se utiliza comúnmente, especialmente en pruebas de esterilidad, es la neutralización mediante filtración por membrana. Este enfoque se basa en la retención física del microorganismo en la membrana filtrante, mientras que el agente antimicrobiano pasa a través del filtro hacia el filtrado. Luego se incuba la membrana para la recuperación de los microorganismos viables. Sin embargo, la filtración sola puede no quitar cantidades suficientes del agente bactericida como para permitir el crecimiento de los microorganismos sobrevivientes. La adherencia de los agentes antimicrobianos residuales a la membrana puede inhibir el crecimiento. La filtración a través de materiales filtrantes de poca capacidad de unión, tales como el difluoruro de ponivinilideno, ayuda a minimizar esta inhibición de crecimiento. Además, el conservante puede diluirse o eliminarse del filtro por lavado con un líquido propicio, como por ejemplo el Líquido A de dilución (ver Líquidos de Dilución y Enjuague para Filtración por Membrana en Pruebas de Esterilidad (71) para las composiciones de los líquidos de dilución). Los neutralizantes químicos en el líquido de enjuague pueden asegurar que los residuos antimicrobianos en la membrana no interfieran con la recuperación de microorganismos viables.
VALIDACIÓN DE MÉTODOS DE NEUTRALIZACIÓN-COMPARACIONES DE RECUPERACIÓN Un método validado para neutralizar las propiedades anti microbianas de un producto debe cumplir con dos criterios: la eficacia del neutralizante y la toxicidad del neutralizante. El estudio de validación documenta que el método de neutralización empleado es eficaz para inhibir las propiedades antimicrobianas del producto (eficacia del neutralizante) sin afectar la recuperación de microorganismos viables (toxicidad del neutralizante). Los protocolos de validación pueden cumplir con estos dos criterios mediante la comparación de los resultados de la recuperación en grupos de tratamiento. El primero es el grupo de prueba, en el que el producto se somete al método de neutralización y luego se inocula con un nivel bajo de microorganismo de desafío [menos de 100 unidades formadoras de colonias (ufc)] para la recuperación. El segundo es el grupo de control de peptona, en el que el método de neutralización se utiliza con peptona o Líquido A de dilución (ver Pruebas de Esterilidad (71 )), como solución de prueba. El tercero es el grupo de viabilidad, en el que el inóculo real se
1804 (1227) Validación de Recuperación Microbiana / Información General
USP 39
utiliza sin exposición al esquema de neutralización. La recuperación similar entre el grupo de prueba y el grupo de peptona demuestra la eficacia adecuada del neutralizante; la recuperación similar entre el grupo de peptona y el grupo de viabilidad demuestra la toxicidad adecuada del neutralizante. En principio, el protocolo debe mostrar que la recuperación de un inóculo bajo (menos de 100 ufc) no es inhibida por la muestra de prueba ni el método de neutralización. Los protocolos de validación pueden cumplir con estos dos criterios mediante la comparación de la recuperación entre tres grupos de prueba distintos: (1) producto neutralizado con inóculo, (2) control de inóculo de desafío en solución amortiguada y (3) inóculo en ausencia de producto o neutralizante. Esto puede establecerse comparando directamente el resultado en la solución tratada (1) con el inóculo (3) anterior. Si el crecimiento en la solución tratada no es comparable con el crecimiento en el grupo de inóculo, debe determinarse si el método de neutralización en sí es tóxico para los microorganismos.
Recuperación en Medio de Agar En las pruebas de Pruebas de Actividad Antimicrobiana (51) y Pruebas de Recuento Microbiano (61) y Pruebas de Microorganismos Específicos (62), el número de microorganismos de desafío viables en el producto se calcula en diversos intervalos de tiempo calculando la concentración de ufc por mL con el método de conteo en placa. Un diseño para validar la neutralización incorporaría los grupos de tratamiento según se describen en Validación de Métodos de Neutralización-Comparaciones de Recuperación. Deben realizarse al menos tres determinaciones repetidas independientes del experimento y cada una debe demostrar que el número promedio de ufc recuperadas del producto de desafío no es menos del 70% del número recuperado del control de inóculo. En caso de que se requiera un mayor número de determinaciones repetidas en el estudio de validación, las comparaciones pueden evaluarse transformando los números de ufc en sus valores logarítmicos y analizando los datos estadísticamente con la Prueba t de Student (comparaciones pareadas) o con el análisis de varianza (ANOVA) (comparando todos los grupos). Si se usa ANOVA y se determinan diferencias significativas entre las poblaciones, puede utilizarse una prueba como la de Dunnett, usando el grupo de peptona como grupo de control.
Recuperación Mediante Filtración por Membrana Esta validación sigue el procedimiento descrito para la Prueba de Validación en Pruebas de Esterílídad (71 ), con la excepción del sembrado en medio sólido para cuantificar la recuperación. Se asumen tres enjuagues de 100 mL, pero el volumen y el número de enjuagues están sujetos a validación. Cada experimento de validación debe realizarse en forma independiente al menos tres veces. En el grupo de solución de prueba, se filtra el producto a través de la membrana filtrante, seguido de dos porciones de 100 mL de líquido diluyente y neutralizante. Después de filtrar el segundo enjuague, pasar por el filtro una porción final de 100 mL que contenga menos de 100 ufc del microorganismo de desafío específico. Colocar esta membrana en el medio de recuperación de agar apropiado e incubar para recuperación. Sembrar el inóculo directamente sobre el medio sólido. Es posible que la filtración en sí reduzca la recuperación del microorganismo de desafío, ya sea por la toxicidad inherente de la membrana o por adherencia del microorganismo a las paredes del recipiente de filtración. Puede utilizarse un grupo de control para evaluar este componente de validación de filtrado por membrana. Usar el Líquido A de dilución como medio de dilución sin exponer el filtro al producto. Después de agregar el inóculo de bajo nivel al enjuague final, sembrar el filtro según se indica más arriba. La pérdida de microorganismos específica de la técnica puede calcularse comparando la recuperación en el grupo del Líquido A de dilución con el recuento del inóculo. En este análisis se supone que la muestra de prueba puede filtrarse. En caso de que sea necesario solubilizar la muestra de prueba, deben determinarse los efectos del método de solubilización sobre los microorganismos viables. Esta situación puede presentarse al evaluar ungüentos; suspensiones u otros artículos. El método puede considerarse validado si la tasa de recuperación en las tres determinaciones repetidas independientes es similar para la solución de prueba y el control del Líquido A de dilución.
Recuperación en Medio Líquido En Inoculación Directa del Medio de Cultivo en la sección Prueba de Esterilidad del Producto a ser Examinado en Pruebas de Esterilidad (71) se supone que el medio de recuperación permitirá el crecimiento de todos los microorganismos sobrevivientes. El caldo en esa prueba debe servir tanto para neutralizar cualquier propiedad antimicrobiana de la solución de prueba como para ayudar al crecimiento de los microorganismos. Los grupos de tratamiento descritos en Validación de Métodos de Neutralización-Comparaciones de Recuperación más arriba pueden utilizarse para la validación del método de recuperación, variando las proporciones entre el producto y el medio de recuperación para alcanzar la neutralización adecuada. El método puede considerarse validado si todos los grupos muestran crecimiento abundante de todos los microorganismos dentro de los 7 días.
Información General/ (1227) Validación de Recuperación Microbiana 1805
USP 39
RECUPERACIÓN DE MICROORGANISMOS DAÑADOS Los estudios de validación descritos anteriormente utilizan microorganismos de desafío que nunca han sido expuestos a agentes antimicrobianos y que por lo tanto no son idénticos a los organismos observados en las pruebas de efectividad antimicrobiana o cuando se lleva a cabo una prueba de esterilidad en un producto conservado. Si se desea utilizar medios alternativos, debe tratarse la recuperación de microorganismos dañados en el estudio de validación. Esto puede realizarse comparando directamente la recuperación de cada microorganismo de desafío en el medio preferido y en el medio alternativo, luego de la exposición al producto. Esta exposición debe incluir al menos dos períodos de tiempo que muestren la supervivencia de menos de 100 ufc por mL, a menos que la velocidad de muerte del agente antimicrobiano sea tal que no sea posible ninguna recuperación, aunque se sembrara el microorganismo algunos minutos después de haber estado expuesto. Esta comparación debe realizarse al menos tres veces. El medio alternativo queda validado si la recuperación observada en ese medio no es menor que la observada en el medio preferido, dentro de un error de 0,5 unidades logarítmicas.
CÁLCULO DEL NÚMERO DE UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS La exactitud de cualquier cálculo de ufc viables está afectada por el número sembrado. A medida que aumenta el número de células viables sembradas, los efectos de la aglomeración reducen la exactitud del recuento, disminuyendo así el valor estimado. A medida que el número disminuye, el error aleatorio juega un rol cada vez más importante en el cálculo. El intervalo aceptado para el recuento de colonias en una placa de agar estándar está entre 25 y 250 para la mayoría de las bacterias y para Candida albicans. Este intervalo se estableció en la industria alimenticia para contar los bacilos coliformes en la leche. Este intervalo es aceptable para organismos farmacopeicos, excepto para los hongos. No es óptimo para contar todas las cepas aisladas del medio ambiente. El intervalo de recuento recomendado para Aspergillus niger es entre 8 y 80 ufc por placa. La utilización de filtración por membrana para recuperar los microorganismos de desafío o el uso de cepas aisladas del medio ambiente como microorganismos de desafío en pruebas de efectividad antimicrobiana requiere la validación del intervalo de recuento. Esta validación puede realizarse mediante comparación estadística de ufc calculadas a partir de pares sucesivos en una serie de diluciones. Preparar una suspensión de modo que el sembrado provea aproximadamente 1000 ufc por placa y luego diluir dos veces hasta una concentración teórica de aproximadamente 1 ufc por placa. Sembrar todas las diluciones de la serie por duplicado e incubar para la recuperación según las condiciones de la Prueba de Efectividad Antimicrobiana (51 ). Comparar los cálculos de ufc por mL a partir de tubos pareados en la serie de diluciones, por la fórmula:
l2Lule - Hule
1
~2Lule +Hule
<;:;
1.96
en donde Luic es el número de colonias en la placa con el recuento más bajo (mayor dilución) y Hu1e es el número de colonias en la placa con el recuento más alto (menor dilución). Los cálculos de las ufc por mL suministrados por Lu1e y Hu1e deberían estar dentro de los límites de la fórmula con un valor crítico de 1,96. El límite superior de los recuentos de placa se define entonces como el número (Hu1,) que pasa esta prueba en forma reproducible. Este estudio debe repetirse de manera independiente un número suficiente de veces como para establecer un límite superior de ufc en determinadas condiciones de sembrado. Hay un límite inferior en el cual la capacidad de la prueba de efectividad anti microbiana para recuperar los microorganismos se torna insostenible. Si el primer sembrado se realiza con 1 mL de una dilución 10-1 , no se observará ufc en el intervalo de 1 a 1O por mL. En el sembrado de esta dilución, sólo el menor número de ufc puede ser reducido a 3, permitiendo tan pocos sobrevivientes como 30 ufc por mL para informar. Deben justificarse los umbrales de recuento inferior para el mayor sembrado de dilución en serie. El número de colonias en una placa sigue la distribución de Poisson, de modo que la varianza del valor medio es igual al valor medio de los recuentos. Por lo tanto, a medida que disminuye el número promedio de ufc por placa, aumenta el error porcentual del cálculo (ver Tabla 2). Si se encuentran 3 ufc por placa en la dilución 10-1, se calculan 30 ufc por mL, con un error de cálculo de 58%. Tabla 2. Error como Porcentaje de la Media para Recuentos en Placas ufc por Placa
Error Estándar
Error como % de la Media
30
5,48
18,3
29
5,39
18,6
28
5,29
18,9
27
5,20
19,2
26
5,10
19,6
25
5,00
20,0 20,4
24
4,90
23
4,80
20,9
22
4,69
21,3
21
4,58
21,8
20
4,47
22,4
1806 (1227) Validación de Recuperación Microbiana / Información General
USP 39
Tabla 2. Error como Porcentaje de la Media para Recuentos en Placas (Continuación) ufc por Placa
Error Estándar
Error como % de la Media
19
4,36
18
4,24
23,6
17
4,12
24,3
16
4,00
25,0
15
3,87
25,8
22,9
14
3,74
26,7
13
3,61
27,7
12
3,46
28,9
11
3,32
30,2
10
3,16
31,6
9
3,00
33,3
8
2,83
35,4
7
2,65
37,8
6
2,45
40,8
5
2,24
44,7
4
2,00
50,0
3
1,73
57,7
2
1,41
70,7
1
1,00
100,0
(1229) ESTERILIZACIÓN DE ARTÍCULOS FARMACOPEICOS ANTECEDENTES Y ALCANCE Este capítulo de información general proporciona una visión general de los conceptos y principios que conlleva la esterilización (mediante varias modalidades) de artículos farmacopeicos que deben ser estériles. Asimismo, incluye información sobre procesos de esterilización de respaldo que se utilizan en la preparación de dichos artículos. 1 Los capítulos de información general específicos para cada modalidad de esterilización proporcionan recomendaciones más detalladas: • Esterilización con Vapor de Agua por Contacto Directo (1229 .1) • Esterilización con Calor Húmedo de Líquidos Acuosos (1229.2) • Monitoreo de la Biocarga (1229.3) • Esterilización de Líquidos por Filtración (1229 .4) •Indicadores Biológicos para Esterilización (1229.5) • Esterilización en Fase Líquida (1229.6) •Esterilización por Gases (1229.7) • Esterilización por Calor Seco (1229.8) • Integradores Fisicoquímicos e Indicadores para Esterilización (1229.9) • Esterilización por Radiación (1229 .1 O) • Esterilización en Fase de Vapor (1229 .11) Según la definición más estricta de esterilidad, una muestra se considera estéril solamente cuando presenta una ausencia total de microorganismos viables (bacterias, levaduras y hongos filamentosos); sin embargo, la esterilidad no puede ser demostrada con respecto a los artículos farmacopeicos y a otros artículos debido a las limitaciones inherentes de la prueba que se utiliza (ver Pruebas de Esterilidad (71 )). Por lo tanto, la esterilidad se define en términos probabilísticos que establecen un nivel aceptable de riesgo. La esterilidad se puede lograr únicamente mediante el uso de un proceso de esterilización validado de conformidad con las buenas prácticas de fabricación apropiadas y vigentes, y no se puede demostrar basándose únicamente en análisis de esterilidad. Los principios básicos para el control de los procesos de esterilización, entre los que se incluyen el desarrollo, la validación y la garantía continua del método, son los siguientes: 1. El desarrollo del proceso de esterilización que incluye la evaluación de la estabilidad y compatibilidad de materiales, la integridad del envase, la biocarga esperada previa a la esterilización, los parámetros de control del método del equipo, entre otros.
1 Estos procesos también pueden proveer despirogenización, cuyo grado depende de las condiciones reales de esterilización. (La despirogenización por diversos métodos se tratará en un capítulo que se encuentra actualmente en desarrollo.)
USP 39
Información General/ (1229) Esterilización de Artículos Farmacopeicos 1807
2. La identificación de parámetros del proceso de esterilización que conservan las propiedades inherentes de los materiales y que aún así inactivan o eliminan microorganismos. 3. La demostración de que el proceso y el equipo de esterilización son capaces de operar dentro de los parámetros descritos y que se corresponden con mediciones independientes de los parámetros críticos. 4. El desempeño de estudios repetidos que son representativos del intervalo de operación del equipo y que emplean productos reales o simulados. Siempre que sea posible, se recomienda el uso de indicadores biológicos para la correlación entre los parámetros físicos medidos y la letalidad esperada. 5. El mantenimiento y monitoreo del proceso validado durante la operación de rutina. 6. La garantía de que la biocarga (número y tipo) de los materiales es aceptable y que se mantiene dentro de los límites predeterminados durante la operación de rutina.
VALIDACIÓN DE PROCESOS DE ESTERILIZACIÓN La validación de procesos de esterilización requiere de conocimientos sobre tecnologías de esterilización y el uso de instrumentos y equipos apropiados para controlar y verificar parámetros críticos del proceso de esterilización. Un aspecto importante del programa de validación de la esterilización implica el uso de indicadores biológicos siempre que resulte apropiado. Todos los procesos de esterilización deberán mantenerse en un estado de validación que incluya la recalificación periódica. El programa de validación para cada tipo de esterilización comprende diversas etapas formalmente documentadas. Los principios generales de los programas de validación son aplicables a todos los procedimientos de esterilización. Se pueden encontrar detalles individuales en los capítulos de información específicos de la USP para cada modalidad de esterilización. La etapa de desarrollo del proceso sirve para investigar y establecer los parámetros operativos que definen los controles que se utilizarán en el proceso de esterilización. Algunas partes del desarrollo del ciclo se pueden llevar a cabo en un entorno de laboratorio. La etapa de calificación de Ja instalación sirve para determinar que los controles del equipo y demás instrumentos estén instalados y calibrados conforme a las especificaciones. La documentación debe demostrar que los servicios requeridos, tales como vapor, agua y aire son aceptables. La etapa de calificación operativa sirve para confirmar que el equipo funciona dentro de los parámetros definidos de esterilización. La etapa de calificación de desempeño del programa de validación evalúa directamente la esterilización de los materiales o artículos. Esta determinación requiere una medición independiente de parámetros durante el proceso de esterilización, así como desafíos biológicos en configuraciones operativas. La correlación entre las mediciones físicas y la letalidad microbiológica demostrada o la capacidad de eliminación de los métodos de esterilización por filtración respalda la efectividad del proceso de esterilización. La etapa de control rutinario del proceso de esterilización requiere una variedad de prácticas de respaldo y se detalla a continuación.
ESTABLECIMIENTO Y JUSTIFICACIÓN DE fROCESOS DE E~TERILIZACIÓN QUE SE BASAN EN INACTIVACION MICROBIOLOGICA Los artículos destinados a ser estériles deben alcanzar una probabilidad de una unidad no estéril de ::>1 Q-6, es decir, ona probabilidad menor o igual a uno en un millón de que se encuentre presente una biocarga de microorganismos viables. [NOTAEsto también se conoce como Nivel de Garantía de Esterilidad. El término Probabilidad de Una Unidad No Estéril se usa a lo largo de este capítulo debido a que es descriptiva y sustancialmente fácil de entender.] Esta Probabilidad de Una Unidad No Estéril se puede conseguir equilibrando el efecto del método sobre los materiales con la destrucción de la biocarga (ver la Figura 1). En la actualidad se utilizan tres métodos: sobremuerte (overkill), indicador biológico/biocarga y métodos basados en la biocarga. Estos métodos se describen en mayor detalle más adelante. Independientemente del método seleccionado, el objetivo es una Probabilidad de Una Unidad No Estéril máxima para la biocarga de ::>10-6 • El método de sobremuerte es el método más simple de establecer, pero el de mayor impacto sobre los materiales. El método basado en la biocarga es el que requiere un mayor control sobre el método, pero somete a los materiales a las condiciones de menor estrés. La confianza en la letalidad del proceso es la misma, independientemente del método usado. Probabilidad de Una Unidad No Estéril Demostrada
Método de Biocarga
Método de Indicador Biológico I Biocarga
Método de Sobremuerte
Figura 1. Comparación básica de varios métodos de validación.
1808 (1229) Esterilización de Artículos Farmacopeicos / Información General
USP 39
Para artículos que no se ven esencialmente afectados por el proceso de esterilización, se prefiere el método de sobremuerte debido a su simplicidad. La esterilización por sobremuerte se puede definir como un método en el que la destrucción de una alta concentración de un microorganismo resistente sustenta la destrucción de biocarga presente en el procesamiento de rutina razonablemente prevista. Dicho objetivo se puede demostrar consiguiendo una letalidad mínima definida; una serie de condiciones del método definidas; o una confirmación de reducción logarítmica mínima de un indicador biológico resistente. Cuando exista la posibilidad de que los artículos se dañen debido a la exposición prolongada al proceso de esterilización, no sería factible el uso de un método de sobremuerte. En estos casos, la demostración de la efectividad del ciclo de esterilización requiere no sólo de información sobre las condiciones propias del método, sino también conocimiento sobre la resistencia y el control de la población de la biocarga del material. Este método se usa ampliamente para la esterilización terminal de soluciones termolábiles y medios de laboratorio. Esta estrategia de esterilización recibe el nombre alternativo de método de indicador biológico/biocarga o método combinado y se definen como: El método de esterilización basado en el indicador biológico/biocarga es una estrategia en el que se puede usar la destrucción incompleta (o destrucción de una población modesta) de un indicador biológico resistente para demostrar la capacidad del método para destruir la biocarga presente de manera confiable. Esto se logra usando conocimientos detallados de la biocarga y de las poblaciones del indicador biológico y su resistencia relativa. El método basado en la biocarga se usa cuando la estabilidad del material es limitada o cuando no se encuentran microorganismos indicadores biológicos adecuados disponibles para su uso con el proceso de esterilización. Por lo general, la esterilización por radiación se valida usando el método basado en la biocarga. El método basado en la biocarga se puede definir como el método en el que se evalúan muestras de biocarga del material de manera rutinaria para determinar su resistencia al proceso de esterilización y que se puede utilizar para demostrar la efectividad del proceso. El monitoreo de rutina de la población de la biocarga y su resistencia al proceso de esterilización es obligatorio. La esterilización de líquidos y gases por filtración difiere de otras modalidades de esterilización puesto que se basa en la eliminación de microorganismos del fluido más que en la inactivación por medios químicos o físicos.
Valor O y Resistencia Microbiana El valor D es el tiempo (por lo regular en minutos) o dosis de radiación (por lo general en kGy) requeridos para reducir la población microbiana en un 90% o un ciclo de 1 log 10 (es decir, a una fracción de supervivencia de 1/1 O) y se debe asociar con las condiciones letales específicas en las que se determinó (ver la Figura 2). Para vapor de agua y calor seco, el valor D es una función de la temperatura. En esterilización con gas (óxido de etileno, Cl0 2 o 0 3), los valores D son una función de la concentración química, de la humedad relativa y de la temperatura. De manera similar, para la esterilización con químicos líquidos, el valor D es una función de la temperatura y de la concentración del esterilizante. [NOTA-Resulta complejo determinar el valor D para sistemas de vapores químicos (condensación) tales como H2 0 2, plasma de HP2 y ácido peracético, debido a la naturaleza bifásica de los materiales. La esterilización con radiación y por filtración se validan usando métodos únicos. Estos procesos se validan a través de métodos que difieren de los presentados en este capítulo introductorio.] 10'
Valoro
10' 10'
e
'º -~ :o
el:
102 101
10' 10·1
9
12
15
18
21
24
27
30
Tiempo Figura 2. Representación gráfica del valor D. El valor D no es un atributo inherente solamente de los microorganismos, por lo que se debe tomar en cuenta la influencia de otros factores, tales como sustratos, matriz, medios de recuperación y metodología de prueba, al determinar el valor D. La resistencia de un indicador biológico se define para el indicador como un sistema. La evaluación y comparación exacta entre valores D requiere la estandarización de métodos de prueba. Para evaluar adecuadamente la efectividad de un proceso de esterilización, el analista debe evaluar la resistencia de la biocarga por la vía experimental o mediante investigación en la literatura disponible. La curva de muerte para microorganismos sometidos a un proceso de esterilización está compuesta por tres regiones distintas (ver la Figura 3):
USP 39
Información General/ (1229) Esterilización de Artículos Farmacopeicos 1809
1 . Región de curva de supervivencia-En esta región se pueden recuperar y contar microorganismos viables para determinar la pendiente de la curva de muerte. La primera sección de la curva de muerte se puede trazar usando recuentos de microorganismos sobrevivientes en periodos cortos de exposición hasta el punto donde la población sea de aproximadamente 1 O UFC. 2. Región de fracción negativa-En esta región se usan estudios repetidos con múltiples indicadores biológicos para estimar la pendiente. Esto puede extender la porción demostrable de la curva de muerte hasta aproximadamente 10-2 a 10-3 3. Región estimada-En esta región, la curva de velocidad de muerte establecida por el método de curva de supervivencia o de fracción negativa se extrapola a la Probabilidad de Una Unidad No Estéril deseada. Por debajo de 10- 3 se asume que la curva de muerte es lineal y se ilustra en la Figura 3 con la línea discontinua más allá del punto que asume que la muerte de microorganismos continúa a la misma velocidad. 106
Curva de Muerte Típica
103 10°
e:
Muerte estimada por métodos de
10-3
:§ 10-6
:gcu 10-
9
ll..
10-12
Muerte estimada
10-15
en esta región
10-1•
9
12
15
18
21
24
27
30
Tiempo
Figura 3. Curva de muerte que presenta las diversas regiones. Conforme a lo indicado anteriormente, el objetivo del proceso de esterilización es la inactivación de la biocarga sin afectar de manera adversa los atributos de calidad del producto. La demostración de la letalidad de un proceso de esterilización en una operación de rutina se basa en diferencias en la resistencia y la población relativas de la biocarga con respecto al indicador biológico (ver la Figura 4). Cuando se emplea el método de sobremuerte, los controles de biocarga pueden ser menos rigurosos. 10• 10'
to•
Curva de Muerte del
10-3
e: ·¡:;
•O
to•
cu
]j 1Q·lill
o
ll..
10-1:2
1Q-15
10-18
\~Curva l
de Muerte
de la Biocarga
9
12
15
18
21
24
27
30
Tiempo
Figura 4. Resistencia y población relativas de una biocarga de microorganismos y un indicador biológico típicos. La validación de los procesos de esterilización vincula mediciones físicas con el desempeño del indicador biológico para establecer la letalidad del método. [NOTA-En la esterilización con radiación, la respuesta de la biocarga se vincula con mediciones de dosis de irradiación física.] El conocimiento de la efectividad del método junto con los controles de la biocarga en los materiales que se procesan, y la información sobre la resistencia de la biocarga permiten determinar la probabilidad de una unidad no estéril. Los analistas deben conocer la resistencia que presenta el indicador biológico al proceso para asegurar un entendimiento apropiado de la respuesta del organismo al proceso. Resulta igualmente importante contar con conocimientos sobre la biocarga presente durante el uso rutinario del proceso de esterilización y su posible resistencia al proceso seleccionado.
Datos Biológicos y Físicos El indicador biológico, cuando se utiliza, representa un medio conveniente para simplificar el esfuerzo que conlleva validar la esterilización. Los indicadores biológicos por lo general son esporas bacterianas que han desarrollado resistencia al proceso de
181 O (1229) Esterilización de Artículos Farmacopeicos / Información General
USP 39
esterilización que se está evaluando. Cuando se suministran en forma de esporas (sobre un sustrato o como una suspensión) con una población inicial y resistencia conocidas, su respuesta al método se puede correlacionar con las condiciones físicas medidas. Se prefieren las esporas como indicadores biológicos debido a que su resistencia y población son predecibles y estables cuando se manipulan, almacenan y usan conforme a lo recomendado. Las esporas se pueden colocar en la carga de esterilización en lugares en los que no sea posible obtener fácilmente mediciones de parámetros físicos tales como temperatura o concentración de gas (p.ej., dentro de lúmenes de agujas, jeringas y ampollas) o en los que la medición pudiera alterar las condiciones entregadas (p.ej., muestreo del gas letal). El indicador biológico ofrece un medio para evaluar directamente el efecto esterilizante del método de una manera que no sería posible conseguir por mediciones físicas. Debe existir una correlación razonable entre la medición física basada en letalidad y los datos de inactivación biológica de un proceso de esterilización. Cuando no exista correlación, se deberá considerar llevar a cabo una investigación.
INDICADORES E INTEGRADORES DE ESTERILIZACIÓN La realización de los procesos de esterilización se puede respaldar con indicadores e integradores físicos y químicos que indiquen la culminación del procesamiento. Éstos se encuentran disponibles en una gran variedad de formas para su uso en conjunción con muchos procesos comunes de esterilización. Los indicadores de esterilización responden a los parámetros del proceso de esterilización de una manera no cuantitativa; es decir, presentan resultados de aprobación o falla. Asimismo, resultan útiles en un ambiente operativo como medio para identificar si un artículo se ha expuesto a un proceso de esterilización. Su uso es mínimo con respecto al establecimiento directo de la eficacia del proceso. Los integradores de esterilización son dispositivos más sofisticados que reaccionan cuantitativamente en respuesta a uno o más parámetros críticos de esterilización y generan un resultado que se puede relacionar con la letalidad. Los integradores más sofisticados son los dosímetros de radiación, los cuales son tan exactos y robustos que su uso ha desplazado al de los indicadores biológicos para la validación de la esterilización con radiación. El capítulo Esterilización-Indicadores e Integradores Químicos y Fisicoquímicos (1209) ofrece detalles adicionales sobre indicadores e integradores.
DESARROLLO DEL PROCESO DE ESTERILIZACIÓN Un aspecto importante a tomar en cuenta en cualquier actividad de esterilización es la selección de un proceso apropiado a partir de la gran cantidad de alternativas posibles: vapor de agua, calor seco, gas, radiación, vapores químicos, proceso químico o filtración. La selección del método apropiado para un artículo dado requiere conocimiento del proceso de esterilización e información sobre los efectos del proceso sobre el material que se está esterilizando. La selección de un tratamiento de esterilización en particular y los detalles de su realización a menudo representan un compromiso entre las condiciones requeridas para destruir o eliminar la biocarga al nivel deseado y el impacto del proceso de esterilización sobre los materiales que se están procesando. Los procesos de esterilización deben ser lo suficientemente robustos para asegurar la inactivación microbiana y evitar al mismo tiempo consecuencias adversas a los atributos de calidad del material. El método de sobremuerte emplea condiciones que son capaces de destruir una alta concentración de un indicador biológico resistente y, por lo tanto, representan un mayor desafío para la integridad y estabilidad del material. La sobremuerte se emplea solamente cuando los artículos que se están esterilizando pueden soportar la exposición prolongada al proceso de esterilización y se usa con mayor regularidad para metales, vidrio y demás artículos que no se ven afectados por la exposición al proceso. Su uso es siempre preferible cuando los materiales pueden tolerar el uso de condiciones más agresivas. El método de validación del ciclo medio es un caso especial del método de sobremuerte en el cual se duplica arbitrariamente un ciclo letal para el indicador biológico. Su uso expone innecesariamente a los materiales a condiciones adversas por lo que debe evitarse. Los métodos de indicador biológico/biocarga (o una combinación) son apropiados cuando el producto presenta cierta sensibilidad a las condiciones de esterilización. Los analistas los emplean comúnmente para parenterales de pequeño y gran volumen, soluciones usadas en el proceso y medios de laboratorio cuyas propiedades materiales se verían perjudicadas por una exposición prolongada a las condiciones esterilizantes. El uso apropiado del método requiere de control sobre los niveles de la biocarga previa a la esterilización y la certeza de que la resistencia de la biocarga es tal que ésta será destruida durante el procesamiento. La destrucción completa o el uso de una población alta de indicador biológico/biocarga no son necesarios para el uso de este método puesto que se basa en las diferencias en la resistencia y población relativas del indicador biológico y los microorganismos de la biocarga. El método de biocarga basa la duración de la esterilización únicamente en la población y resistencia esperadas de la biocarga en los materiales. Éste es el método preferido para toda esterilización con radiación. Se basa en el monitoreo periódico de la biocarga y en el análisis de la resistencia para establecer la confianza en el método. El método de biocarga no requiere el uso de un indicador biológico. La filtración se usa para líquidos y gases que no pueden soportar los procesos de esterilización química, por calor o radiación, o cuya esterilización en línea resulta más conveniente.
USP 39
Información General/ (1229) Esterilización de Artículos Farmacopeicos 1811
CONTROL RUTINARIO DEL PROCESO Después de haber validado inicialmente un proceso de esterilización, se debe mantener en dicho estado para asegurar su operación continua aceptable. Esto se logra mediante una variedad de actividades relacionadas que son esenciales para el uso continuo del método. Calibración---f.I equipo se debe calibrar periódicamente contra un estándar rastreable. Esto incluye el registro y control de instrumentos que regulan la operación del equipo. Mediciones Físicas-Después de la culminación de cada ciclo de esterilización, se deben verificar los datos informados por los sensores del equipo y los registradores. Los registros obtenidos del equipo de esterilización constituyen una parte esencial de la documentación. Integradores/Indicadores Físicos-Siempre que se utilizan, los integradores, y en menor medida los indicadores, proporcionan una indicación inmediata de la ejecución del método y diferencian entre materiales procesados y sin procesar. Cuando estos integradores proveen una indicación directa de la letalidad del método (p.ej., dosímetros de radiación), se pueden usar para la liberación de materiales. Liberación Paramétrica-La liberación de productos terminados sin análisis de esterilidad se trata en el capítulo Productos Farmacéuticos con Esterilización Terminal-Liberación Paramétrica (1222). Consideraciones Adicionales-Dependiendo de las características propias de cada proceso de esterilización en particular, pueden presentarse requisitos adicionales para confirmar la eficacia del método, los cuales pueden incluir muestreo de la biocarga, determinación de la resistencia de la biocarga, determinación de la resistencia del indicador biológico y auditorías a proveedores. Conforme resulte aplicable, estas actividades deberían llevarse a cabo para mantener el proceso de esterilización en estado validado. Control de Cambios-Para mantener el estado validado, resulta necesario monitorear los materiales, procedimientos y equipo que influencian el proceso de esterilización para asegurar el registro y la evaluación de todos los cambios con respecto a su impacto potencial. Para lograr esto, el analista debe establecer un sistema formalizado de control de cambios. Mantenimiento Preventivo-El usuario debe establecer un programa definido de mantenimiento preventivo para cada parte del equipo de esterilización de acuerdo con la recomendación escrita del fabricante del equipo. El mantenimiento preventivo representa una clase especial de cambios predefinidos que no tienen efectos adversos sobre la operación del sistema y que, por lo tanto, no requieren de evaluación en el control de cambios. Reevaluación Periódica-Ante la ausencia de cambios en los materiales, en el método o en el equipo, se debe reconfirmar la efectividad de los procesos de esterilización de manera periódica. Este sistema debe formalizarse y debe tratar el impacto potencial que ciertos cambios mínimos o cambios no detectados podrían tener sobre el sistema validado. Cuando no se presentan cambios, la cantidad de información requerida para sustentar un proceso de esterilización es menor que la requerida para la aceptación inicial del proceso de esterilización. Capacitación-Los procesos de esterilización se basan fundamentalmente en principios científicos para la destrucción efectiva de microorganismos. Los procesos para asegurar una esterilización efectiva son desarrollados por científicos e ingenieros con buen conocimiento de los principios de muerte y eliminación microbiana. Las personas implicadas en el desarrollo del proceso de esterilización requieren de conocimientos en microbiología, física, química e ingeniería, además de que deben estar familiarizadas con los reglamentos y principios de las buenas prácticas de fabricación. La esterilización es una actividad interdisciplinaria la cual generalmente requiere de los conocimientos combinados de un grupo de individuos para el establecimiento de un proceso confiable. Además del equipo que desarrolla el proceso de esterilización, las personas responsables de mantener y operar los procesos de esterilización deben estar adecuadamente capacitadas para asegurar que sus acciones contribuyan al éxito de los mismos. Estas personas a menudo son las primeras en identificar contratiempos y cambios en el desempeño del proceso debido a su conocimiento profundo del mismo. Se deben establecer y documentar programas efectivos de capacitación, los cuales deben hacer hincapié en principios de esterilización, apego a los procesos y procedimientos establecidos y a la importancia de documentar desviaciones de las operaciones normales. REFERENCIAS
Agalloco, J., & Carelton, F., Validation of Pharmaceutical Processes, lnformaUSA, New York, 2007. Block, S., Disinfection, Sterilization, and Preservation, 5th edition, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, 2001. Morrissey, R., & Phillips, G.B., Sterilization Technology-A Practica! Guide for Manufacturers and Users of Health Care Products, Van Nostrand Reinhold, New York, 1993. Perkins, J., Principies and Methods of Sterilization in Health Sciences, 2nd edition, Charles C. Thomas, Springfield, IL, 1969. Pflug, l., Microbiology and Engineering of Sterilization Processes, 14th edition, Environmental Sterilization Laboratory, Otterbein, IN, 201 O. Russell, A., Hugo, W., & Ayliffe, G., Principies and Practices of Disinfection, Preservation and Sterilisation, Blackwell Scientific, Oxford, U.K., 1982.
1812 (1229.1) Esterilización con Vapor de Agua/ Información General
USP 39
<1229.1) ESTERILIZACIÓN CON VAPOR DE AGUA POR CONTACTO DIRECTO ANTECEDENTES Y ALCANCE La esterilización con vapor de agua es posiblemente el más común de los procesos de esterilización. Se emplea en ambientes que van desde consultorios médicos hasta instalaciones de fabricación a gran escala. La diversidad de las prácticas que emplean esterilización con vapor de agua se refleja en el rango y sofisticación del equipo usado. Este capítulo de información general trata el tipo de esterilización en el que el vapor de agua saturado entra en contacto directo con los artículos de carga (con o sin envoltorio) y ofrece una visión general de los conceptos básicos de este tipo de esterilización, incluyendo su validación. Los artículos de carga en este proceso de esterilización se denominan de diversas maneras tales como piezas, componentes, materiales durables, materiales envueltos o materiales porosos. Estos artículos pueden ser de materiales metálicos, vidrio, cerámica, elastoméricos o poliméricos con poca o nula sensibilidad a la degradación térmica a las temperaturas de esterilización. Para la esterilización con vapor de agua por contacto directo, los artículos generalmente se esterilizan usando un método de sobremuerte. La esterilización de envases llenos con líquido puede diferir sustancialmente. El capítulo general Esterilización con Calor Húmedo de Líquidos Acuosos (1229.2) provee información sobre las aplicaciones en las que el vapor de agua es un medio de calentamiento, pero que no entra en contacto con el artículo que se esteriliza: el líquido contenido en el envase.
VAPOR DE AGUA SATURADO El vapor de agua saturado es una mezcla bifásica de H2 0 en fases gaseosa y líquida en equilibrio térmico. El vapor de agua saturado presenta una relación singular de temperatura-presión en la que ambas fases se encuentran presentes y, a una temperatura dada, sólo es posible una presión para la saturación. La importancia de usar vapor de agua saturado en la esterilización se basa principalmente en dos atributos. Primero, el vapor de agua saturado mata rápidamente microorganismos debido a la presencia de agua líquida. El vapor de agua calentado a una temperatura superior a la de saturación, también denominado vapor de agua sobrecalentado, carece de agua líquida y, aunque su temperatura es mayor que la del vapor de agua saturado, es sustancialmente menos letal para los microbios. Segundo, cuando el vapor de agua cambia de fase gaseosa a líquida, éste libera energía térmica (2202 kj/kg a 121 º) que se transfiere a los artículos de carga, lo que facilita la esterilización de sus superficies expuestas. El objetivo inicial de la esterilización con vapor de agua saturado es que el aire en la cámara de esterilización debe reemplazarse con vapor de agua saturado. El aire residual dentro de la cámara esterilizadora y de los artículos de carga actúa como aislante y al mismo tiempo obstaculiza la penetración del vapor de agua a todas las superficies de los artículos de carga, por lo que su eliminación es esencial para una esterilización efectiva. La presencia de aire residual en la cámara anula la relación singular de temperatura-presión del vapor de agua saturado. Ante la ausencia de saturación, cabe la posibilidad de que las mediciones físicas no garanticen la letalidad.
CICLOS DE DESPLAZAMIENTO POR LA GRAVEDAD En los ciclos más simples de autoclave, la eliminación del aire se logra mediante el desplazamiento por la gravedad. Debido a que el vapor de agua es más caliente y menos denso que el aire, éste se eleva a la parte superior del autoclave, mientras que el aire más frío sale por la parte inferior de la cámara. El vapor de agua saturado que entra en la cámara se convierte en condensado líquido a medida que entra en contacto con las superficies más frías de la cámara del autoclave y de los artículos de carga. La retención de condensado dentro de la carga reduce la efectividad del ciclo puesto que es una barrera para el contacto con el vapor de agua, además de que se requiere más vapor de agua para mantener el vapor de agua saturado a la temperatura esterilizante. Los artículos de carga, los materiales de envoltura y la disposición de la carga deben diseñarse de manera que se facilite la eliminación del aire y el escurrimiento del condensado. En los ciclos de desplazamiento por la gravedad, la carga alcanza lentamente la temperatura esterilizante deseada debido a que la eliminación del aire es relativamente lenta en comparación con los ciclos en los que dicha eliminación se facilita mecánicamente. Durante el segmento de exposición del ciclo, una trampa termostática en la parte inferior de la cámara permite retirar el condensado (y cualquier aire residual) del esterilizador y mantiene las condiciones esterilizantes. Al final del periodo de permanencia, la presión en la cámara se restituye a presión atmosférica.
CICLOS PREVIOS DE VACÍO Para eliminar de manera más efectiva el aire de la cámara y de los artículos de carga, los esterilizadores pueden emplear múltiples pulsos de evacuación/presión en los que el aire es reemplazado por vapor de agua. El número y la profundidad de estos pulsos pueden variar. Debido a que los pulsos que alternan vacío y presión pueden tensar los materiales de envoltura,
USP 39
Información General/ (1229.1) Esterilización con Vapor de Agua 1813
estos últimos deben seleccionarse cuidadosamente. La operación del esterilizador durante el segmento de exposición es similar al del ciclo de desplazamiento por la gravedad anteriormente descrito. El sistema de vacío se puede usar al final del proceso para eliminar vapor de agua y condensado residuales de los artículos de carga. La selección de un ciclo específico y sus parámetros asociados de esterilización para un artículo dado depende de varios factores, los cuales incluyen la termolabilidad del material, la penetración del calor en el artículo, la masa del artículo, las dificultades para la eliminación de aire/condensado, así como otros factores descritos en el programa de validación (ver a continuación).
CONTROL DEL CICLO DE ESTERILIZACIÓN Los esterilizadores se controlan mediante sistemas computarizados/automatizados que manejan la ejecución general del proceso y el informe de datos. Los sistemas de esterilización con vapor de agua pueden estar controlados por sensores de temperatura y/o de presión calibrados en el equipo. Durante las partes de exposición del ciclo, se requiere un tiempo de permanencia mínimo a una temperatura previamente definida para asegurar el cumplimiento del objetivo de letalidad del método (tiempo mínimo-temperatura o F0). La eficacia del ciclo de esterilización con vapor de agua a menudo se mide usando F0, que se define como el tiempo de exposición equivalente a 121 º. F0 es un medio para cuantificar la efectividad de la esterilización con vapor de agua determinando el tiempo de esterilización equivalente en minutos con respecto a una temperatura base de 121 º y a un valor z de 1Oº; el valor z se define como el número de grados de cambio de temperatura necesario para cambiar el valor D por un factor de 1 O. El método F0 se usa para evaluar los procesos de esterilización que operan en condiciones variables de temperatura contra un solo estándar. Se puede calcular la letalidad del proceso a temperaturas distintas a 121 º para determinar la letalidad equivalente a la provista a 121 º.La eficacia de los procesos de esterilización por calor húmedo no está intrínsecamente vinculada con la temperatura específica de 121 º, la cual es simplemente la conversión a grados Celsius de 250ºF, además se pueden usar otras temperaturas. Los sistemas de control del esterilizador para esterilización directa generalmente proveen un tiempo mínimo a una temperatura de referencia definida después de la eliminación inicial de aire/condensado. Los esterilizadores de vapor de agua se controlan usando sensores localizados en la línea de drenaje antes de la trampa termostática, aunque se pueden usar otros esquemas de control. Generalmente, la temperatura en dicha ubicación se registra como parte de la documentación permanente de las condiciones de esterilización. En la esterilización por contacto directo, resulta aceptable exceder los requisitos mínimos de tiempo-temperatura o F0 debido a las consecuencias adversas mínimas para los materiales que se están esterilizando. La letalidad total se puede calcular en el transcurso del proceso. Para la temperatura de referencia específica de 121 ºy un valor z de 1 Oº, el F0 total acumulado se puede determinar mediante la siguiente ecuación:
F. = o
f2 10 (r -121Jdt= "12 10 [r -121JM 10 ~ 10 1
11
donde
t 1 = hora de comienzo t2 = hora de finalización T = temperatura La suma de las contribuciones de letalidad instantáneas durante todo el proceso de esterilización permite calcular la letalidad general del proceso o el F0 generado. El cálculo de F0 debe comenzar a 100º y debe continuar hasta el final del periodo de permanencia siempre y cuando se mantengan condiciones de vapor de agua saturado.
VALIDACIÓN DE LA ESTERILIZACIÓN POR CONTACTO DIRECTO El enfoque predominante para la esterilización con vapor de agua por contacto directo es el método de sobremuerte definido en el capítulo Esterilización de Artículos Farmacopeicos (1229). La esterilización por sobremuerte es un método en el que la destrucción de una alta concentración de un microorganismo resistente se correlaciona con la destrucción de biocarga presente durante el procesamiento de rutina razonablemente prevista. Dicho objetivo se puede demostrar mediante la consecución de cualquiera de los siguientes parámetros: una letalidad mínima definida (F0); un conjunto definido de condiciones físicas; o la confirmación de una reducción logarítmica mínima de un indicador biológico resistente. Los requisitos de validación para el método de sobremuerte son menos onerosos que los de otros métodos, como aquéllos que se basan en biocarga o biocarga/indicadores biológicos. Cuando los artículos de carga pueden soportar un grado de calor importante sin sufrir consecuencias adversas, se prefiere el método de sobremuerte para esterilización con vapor de agua debido a su fácil ejecución, sus consideraciones reducidas para el control de biocarga y su simplicidad en general.
Calificación del Equipo La calificación del equipo es un programa predefinido que examina el equipo para confirmar que su instalación y operación antes del proceso de esterilización sean conforme a lo previsto. La calificación del equipo se puede separar en calificación de la instalación y calificación operativa, o se puede considerar como una calificación conjunta de la instalación y la operación. El
1814 (1229.1) Esterilización con Vapor de Agua/ Información General
USP 39
trabajo de la calificación provee una línea de base para el mantenimiento preventivo del esterilizador, así como para el control de cambios.
Distribución de la Temperatura en la Cámara Vacía Un procedimiento común para evaluar la instalación del esterilizador de vapor de agua es la evaluación del desempeño de la cámara vacía. Cada método de eliminación de aire usado en el esterilizador se evalúa midiendo la temperatura cerca de las esquinas de la cámara del esterilizador, cerca de la sonda de control y de otras partes, según corresponda. La distribución de temperaturas en la cámara vacía se debe determinar únicamente mediante sensores ubicados en la cámara, mientras que las temperaturas en el drenaje de la cámara o fuera de ésta no tienen relevancia directa en esta actividad de validación. Se pueden ignorar las diferencias en el periodo de permanencia del ciclo debido a que sólo se debe evaluar el periodo de permanencia más corto para cada método de eliminación de aire. Los criterios de aceptación para esta prueba varían de acuerdo con las capacidades y uso regular del esterilizador. No se requieren indicadores biológicos para la evaluación de la distribución de la temperatura en la cámara vacía.
Mapeo de Componentes Los artículos que se esterilizan con vapor de agua pueden ser bastante complejos y pueden tener volúmenes muertos internos, superficies ocultas, grietas y superficies de contacto del producto difíciles de alcanzar, las cuales deben ser esterilizadas. La capacidad del vapor de agua saturado para penetrar los envases o materiales de envoltura, así como para alcanzar las superficies, debe establecerse para cada artículo. Aunque es relativamente fácil para artículos individuales tales como espátulas, vasos de precipitados y otras formas geométricas simples, puede resultar sustancialmente más difícil para unidades de llenado, bastidores de filtros, tuberías y mangueras. Los analistas deben realizar estudios para determinar los puntos fríos en los artículos mediante termopares que están en contacto con la superficie del artículo, con el fin de asegurar la penetración de calor en todos los artículos de carga. Estos estudios se pueden llevar a cabo en un laboratorio y no es necesario repetirlos cuando el mismo artículo se esteriliza en múltiples autoclaves. Durante esta evaluación, todos los artículos de carga deben envolverse y acomodarse de manera tal que se facilite el ingreso de vapor de agua y la eliminación de aire y condensado. Asimismo, los artículos deben envolverse y acomodarse de manera esencialmente idéntica para lograr una esterilización reproducible.
Mapeo de la Carga La determinación de los patrones de carga es una práctica esencial para la esterilización terminal de líquidos acuosos por calor húmedo (ver Esterilización con Calor Húmedo de Líquidos Acuosos (1229.2)), aunque esta práctica no representa una preocupación crítica con respecto a la esterilización directa de artículos debido a que las diferencias entre componentes desempeñan un papel mayor que la ubicación dentro de la carga.1 Las cargas para esterilización directa con vapor de agua se pueden validar usando una carga máxima y mínima, según se determine ya sea por el número de cada uno de los artículos o por su masa. Las mejores prácticas incluyen colocar los artículos de mayor tamaño en los anaqueles inferiores, permitiendo que el condensado de estos artículos salga del esterilizador con el mínimo contacto con otros artículos de la carga.
Indicadores Biológicos El indicador biológico comúnmente usado para la esterilización con vapor de agua por contacto directo contiene esporas de Geobacillus stearothermophilus (ATCC 12980 o ATCC 7953), un microorganismo termofílico con una resistencia al calor húme-
do sustancialmente mayor que la de la mayoría de los microorganismos vegetativos. El desafío de esporas puede colocarse en un sustrato dentro o sobre un artículo de carga, o el desafío puede consistir en un artículo de carga inoculado con una suspensión de esporas. Cuando los indicadores biológicos se usen de acuerdo con las instrucciones del fabricante, se podrá usar la información de resistencia proporcionada por el proveedor. Los usuarios finales deben determinar la población y resistencia de los artículos inoculados que preparan.
Penetración del Calor y Desafío Microbiológico El objetivo de la actividad de validación es confirmar la penetración aceptable de calor usando mediciones de temperatura y desafíos de indicadores biológicos. Por lo regular, este estudio se lleva a cabo en condiciones en las que el tiempo y/o la temperatura de exposición son ligeramente menores que las referencias usadas rutinariamente. Los termopares e indicadores biológicos deben colocarse con los artículos de carga en aquéllos lugares más difíciles de calentar determinados durante el mapeo de componentes. Los termopares deben estar en contacto con la superficie del artículo. Los analistas deben tener cuidado al insertar los termopares e indicadores biológicos con el fin de no alterar la capacidad del vapor de agua de ingresar en los obje-
1 A Risk-Based Approach to Variable Load Configuration Validation in Steam Sterilization: Application ol PDA Technical Report 1 Load Equivalence Topic. A. Pavell and K.A. Hughes. PDA J Pharm Sci and Tech 201 O, 201 O Mar-Apr;64(2):124- l 36.
USP 39
Información General/ (1229.2) Esterilización con Calor Húmedo 1815
tos que se someten al desafío. Este inconveniente se puede resolver mediante accesorios especiales para el ingreso de termopares o colocando sondas de temperatura en unidades ubicadas cerca de las unidades que contienen los indicadores biológicos. Para el segundo de los casos, los estudios repetidos proporcionan evidencia de la eficacia del ciclo cuando se da muerte a los indicadores biológicos y las mediciones físicas se corresponden con los valores esperados de tiempo-temperatura o F0• Si las mediciones microbianas y físicas no cumplen con los criterios de aceptación predefinidos, será necesario investigar y aplicar acciones correctivas para rectificar la discrepancia.
Control Rutinario del Proceso Al igual que con todos los procesos de esterilización, después de la validación, la esterilización con vapor de agua debe someterse a controles formales que la mantengan en un estado validado en todo momento. El capítulo Esterilización de Artículos Farmacopeicos (1229) describe los requisitos generales para todos los procesos de esterilización, incluidas la capacitación, calibración, mediciones físicas, integradores o indicadores físicos, control continuo del método, control de cambios, mantenimiento preventivo y reevaluación periódica.
REFERENCIAS Agalloco, J. Steam Sterilization, chapter in Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications: Volume 2, 3rd edition, edited by Nema, S., & Ludwig, ]., lnformaUSA, New York. 201 O. Agalloco, ]., Understanding Overkill Sterilization: Putting an End to the Confusion, Pharmaceutical Technology, Vol. 30, No. 5, supplement, p. Sl 8-25, 2007. Agalloco, J., Akers, ]., & Madsen, R., Revisiting the Moist Heat Sterilization Myths, PDA ]ournal of Pharmaceutical Science and Technology, Vol u me 63, No. 2, pp. 89-102, 2009. DeSantis, P., Steam Sterilization in Autoclaves, chapter in Validation of Pharmaceutical Processes: 3rd edition, edited by J. Agalloco & F. J. Carleton, lnformaUSA, New York, 2007.
(1229.2) ESTERILIZACIÓN CON CALOR HÚMEDO DE LÍQUIDOS ACUOSOS INTRODUCCIÓN La esterilización con vapor de agua de líquidos acuosos (incluidas las suspensiones y emulsiones que se reconstituyen mezclando), también conocida como esterilización de cargas no porosas, es el mejor método para productos parenterales acuosos, líquidos acuosos del proceso, medios de laboratorio y materiales de desecho biológicos. Este tipo de esterilización funciona principalmente con envases cerrados. Durante la esterilización con vapor de agua por contacto directo (también denominada esterilización con vapor de agua de piezas, materiales durables o materiales porosos) el vapor de agua en la cámara entra en contacto directo con la superficie de los artículos de carga para lograr la esterilización (ver Esterilización con Vapor de Agua por Contacto Directo (1229.1 )). En contraste, la esterilización de líquidos en envases se logra aplicando calor al envase, calentando la pared del envase y, en última instancia, calentando el volumen de líquido interno. Esto se puede lograr usando vapor de agua, agua sobrecalentada y aire en diversas combinaciones. Algunos líquidos acuosos son susceptibles al sobreprocesamiento, lo que podría volverlos inadecuados para su uso previsto. Los fabricantes deben tomar en cuenta la influencia de estas diferencias al momento de establecer un proceso adecuado. Durante la esterilización de envases llenos de líquido, las presiones diferenciales entre el interior de los envases y la cámara de esterilización pueden tener un impacto potencial en la integridad del envase. La sobrepresión del aire se usa para minimizar las diferencias de presiones entre el envase y el esterilizador con objeto de proteger la integridad del envase, especialmente las jeringas prellenadas y los envases plásticos. Antes de esterilizar los envases de los productos, los fabricantes deben considerar las potenciales consecuencias adversas del exceso de calor sobre los materiales. Para poder asegurar la esterilidad y la funcionalidad, la definición del proceso y el método de validación usados se deben incorporar en las condiciones del proceso, límites de temperatura superior e inferior y límites de tiempo. Cuando la esterilización de envases sellados llenos de líquidos permite el uso del método de sobremuerte, éste se considera el método preferido y se encuentra descrito en el capítulo Esterilización con Vapor de Agua por Contacto Directo (1229 .1 ). Ante la posibilidad de que los atributos de calidad del producto se vean perjudicados por el calor excesivo, el proceso de esterilización deberá durar menos tiempo o utilizar una temperatura menor para minimizar los efectos adversos sobre los materiales. El tiempo-temperatura de esterilización o condiciones F0 (F0 se define como el tiempo de esterilización equivalente con respecto a una temperatura base de 121 º) incluye límites inferiores (relacionados con la esterilidad) y superiores (relacionados con la
1816 (1229.2) Esterilización con Calor Húmedo/ Información General
USP 39
estabilidad). 1 Los fabricantes comúnmente emplean los métodos de biocarga/indicador biológico (BB/BI, por sus siglas en inglés) o de biocarga cuando las limitaciones con respecto a la capacidad del material para soportar el proceso hacen necesario el uso de condiciones menos agresivas. Este enfoque requiere controles apropiados sobre la biocarga previa a la esterilización y/o los valores D relacionados con el producto en conjunto con indicadores biológicos con un recuento o resistencia menor de las esporas para asegurar la esterilización.
Esterilización Terminal de Productos La conservación de los atributos del producto puede requerir el uso de condiciones de esterilización menos agresivas, así como equipo, ciclos y métodos de validación de esterilización adaptados a tales circunstancias más restringidas. Las variaciones sustanciales en los diseños del equipo y en los métodos de esterilización terminal no permiten proveer una descripción integral de un ciclo típico. Todos los esterilizadores terminales calientan la carga, aunque lo logran de distintas maneras: vapor de agua saturado; mezclas de vapor de agua-aire; mezclas de vapor de agua-aire-agua; y agua sobrecalentada. Se puede usar sobrepresión de aire para mantener la integridad del envase y para enfriar los envases, así como agua para calentar/enfriar la carga, dependiendo del tamaño del autoclave, de las expectativas de rendimiento y del envase en sí.
Fluidos del Proceso Los fluidos del proceso se usan para propósitos de ajuste del pH, dilución a un volumen especificado, lubricación, entre otros. En muchas instancias, estos líquidos se esterilizan en conjunto con artículos que se deben esterilizar mediante contacto directo con vapor de agua, por lo que el proceso de esterilización debe asegurar que todos los artículos se esterilicen adecuadamente.
Medios de Laboratorio Los medios de laboratorio a menudo se esterilizan en autoclaves estándar de vapor de agua con adaptaciones menores. Proporcionar una salida de vapor lenta (para reducir la tensión sobre la integridad del envase y minimizar los derrames) y enfriar la camisa puede ayudar a mejorar el diseño y la operación del esterilizador básico de vapor de agua para ajustarse de mejor manera a los materiales. El proceso de esterilización puede ser específico para envases de medios o para una combinación de envases llenos de líquidos y materiales durables. Este proceso puede ser similar a los métodos usados para productos sometidos a esterilización terminal (ver la sección anterior). La esterilización de medios de laboratorio puede implicar el procesamiento de envases distintos que contengan diferentes materiales. Los fabricantes deben estar al tanto de la posibilidad de subprocesamiento o sobreprocesamiento en toda la carga y deben considerar el tamaño del envase, su contenido y su ubicación. Cuando se combinen envases llenos de líquido con materiales durables en la misma carga, los fabricantes deberán considerar los aspectos únicos de cada uno de éstos para asegurar que todos los artículos se esterilicen de manera apropiada. Puesto que los medios de laboratorio se consideran autoindicadores con respecto a la esterilidad, no se requiere el uso de indicadores biológicos durante la validación.
Esterilización de Desechos Biológicos La esterilización de desechos biológicos en envases sellados derivados del uso en el laboratorio o en la producción es similar a la esterilización de partes. El proceso debe definirse para asegurar un tiempo-temperatura de exposición mínimos o la consecución de un valor F0 especificado en todos los artículos de la carga. Dependiendo de los contaminantes potencialmente presentes, el diseño del autoclave puede incorporar la recolección/esterilización de condensado o filtros de evacuación esterilizables para asegurar la contención adecuada de patógenos. Puesto que el objetivo de la esterilización de desechos biológicos es lograr que dichos materiales sean seguros para su eliminación y contacto, se emplea el método de sobremuerte descrito en el capítulo Esterilización con Vapor de Agua por Contacto Directo (1229.1 ).
MÉTODO DE BIOCARGA/INDICADOR BIOLÓGICO La aplicación del método de biocarga/indicador biológico requiere un entendimiento cabal del tipo, población y resistencia de la biocarga típicamente presente en el envase preesterilizado lleno del producto. El método se basa en las diferencias sustanciales entre la resistencia al calor húmedo y la población de la biocarga presente y del indicador biológico usado durante la validación (Figura 7).
1 La cinética de degradación puede diferir con respecto a la de la muerte microbiana, además de que los valores de F0 pueden no ser suficientes para evaluar completamente los "peores" efectos.
USP 39
Información General/ (1229.2) Esterilización con Calor Húmedo 1817
10' 10'
Curva de Muerte del
10° 10·3
e:
•O
·¡:;
10·"
1'11
:eo
1Q·li'I
D.
10-12
10 15 1Q·18
\~Curva
de Muerte de la Biocarga
~
9
12
15
18
21
24
27
30
Tiempo
Figura 1. Resistencia y población relativas de una biocarga de microorganismos y un indicador biológico típicos. El método de biocarga/indicador biológico es aquel en el que la destrucción incompleta (o destrucción de una población modesta) de un indicador biológico resistente puede usarse para demostrar la capacidad del proceso para destruir cualquier biocarga de manera confiable. Esto se logra mediante conocimientos detallados de las poblaciones de la biocarga y del indicador biológico y su resistencia relativa. Los microorganismos típicos de la biocarga sólo tienen una resistencia mínima en comparación con los indicadores biológicos, lo cual se puede confirmar mediante la selección por calor de aislados de la biocarga. La población de la biocarga se controla mediante etapas de filtración para el fluido, límites de tiempo del proceso, controles ambientales, sistemas de crecimiento, entre otros. Los indicadores biológicos convencionales para esterilización terminal usando el método de biocarga/indicador biológico son Clostridium sporogenes ATCC 7955 y Bacillus subtilis ATCC 5230, aunque se pueden usar otras cepas. El uso de Geobacilfus stearothermophilus para esterilización terminal es poco común con el método de biocarga/indicador biológico, dado que la gran resistencia del organismo al calor húmedo lo vuelve poco adecuado para esta aplicación. La confirmación de una probabilidad de una unidad no estéril (PNSU, por sus siglas en inglés) aceptable se puede lograr usando mediciones físicas y la respuesta del indicador biológico (los cuales definen la letalidad del proceso) en conjunto con los límites de procesamiento para la población y resistencia de la biocarga (que definen el N0 y el valor D). El valor Des el tiempo (por lo general en minutos) requerido para reducir la población microbiana en un 90% o un ciclo de 1 log 10 (es decir, a una fracción sobreviviente de 1/1 O) y debe asociarse con las condiciones letales específicas en las que se determinó. Por ejemplo, D 121 es el valor Da 121 º. Los artículos destinados para ser estériles deben lograr una Probabilidad de Una Unidad No Estéril de ~10-6, es decir, una probabilidad menor o igual a 1 en 1 millón de que se encuentre presente una biocarga de microorganismos viables. La Probabilidad de Una Unidad No Estéril se puede determinar a partir de la Ecuación 1. log Nu = -F/D + log N0
[1]
Nu = PNSU O = valor D de la biocarga natural F0 = valor F0 del proceso (letalidad) N0 = población de biocarga por envase El siguiente ejemplo indica la Probabilidad de Una Unidad No Estéril resultante en condiciones definidas de validación y operación rutinaria (Tabla 7). Tabla 1. Ejemplos de Cálculo de la Probabllldad de Una Unidad No Estéril Uso Rutinario
Validación
= 8,0 min
Fn= 8,0 min
Fn
= 0,5 min Nn del indicador biológico = 106
Nn de biocarqa
D, 11 de indicador biolóqico
= 0,005 min = 100 (ó 102)
D, 11 de biocarga
Probabilidad de Una Unidad No Estéril para el Indicador Biolóqico
= 10-10
Probabilidad de Una Unidad No Estéril para Biocarqa
= 1o-1598
La determinación de la resistencia de la biocarga se logra mediante un proceso de selección por calor durante el cual un cultivo puro (un cultivo de laboratorio que contenga especies individuales de esporas de organismos con una cantidad mínima de células vegetativas) se calienta a ebullición a 100º durante varios periodos. Si el microorganismo de la biocarga es viable después de la exposición, su resistencia a 121 º puede estimarse para su uso en el cálculo de la probabilidad de una unidad no estéril (Tabla 2). Tabla 2. Estimación de 0 121 a partir de los Resultados de la Prueba de Ebullición Tiempo de Exposición 1 min
Valor D
aproximado
0,01 min
USP 39
1818 (1229.2) Esterilización con Calor Húmedo/ Información General
Tabla 2. Estimación de D121 a partir de los Resultados de la Prueba de Ebullición (Continuación) Tiempo de Exposición
Valor 0 121 aproximado
10 min
0,1 min
20 min
0,2 min
100 min
1,0 min
Método de Biocarga En la mayoría de los puntos, el método de biocarga es similar al método de biocarga/indicador biológico. La diferencia yace en el aislamiento y caracterización del microorganismo más resistente de la biocarga. El aislado en las condiciones más exigentes se usa como indicador biológico en la evaluación del proceso, por lo que debe cultivarse para producir una población de desafío adecuada. Cuando se usa este método, la biocarga de cada ciclo del proceso debe controlarse minuciosamente con respecto a la población y su resistencia debe ser monitoreada.
Control del Ciclo de Esterilización El equipo de procesamiento para esterilización terminal a menudo se controla mediante sensores calibrados de presión ubicados dentro o sobre la cámara/equipo. Durante los periodos de exposición del ciclo, para sustentar la letalidad del proceso se usa la consecución de un tiempo de permanencia mínimo a una temperatura predefinida. Por lo regular, la letalidad del ciclo de esterilización terminal se mide usando F0, que se define como un tiempo real de exposición a una temperatura de proceso variable la cual es equivalente a una exposición a 121 º, basándose en un microorganismo ideal con un valor z de 1 Oº. Esto puede incluir la letalidad conseguida durante las fases de calentamiento y enfriamiento del proceso de esterilización. El valor z se define como el número de grados de cambio de temperatura necesario para modificar el valor D por un factor de 1O. El enfoque F0 se usa para evaluar contra un solo estándar los procesos de esterilización que operan en condiciones variables de temperatura. Se puede calcular la letalidad del proceso a temperaturas distintas a 121 º para determinar una letalidad equivalente a la provista a 121 º. Los sistemas de control del esterilizador para esterilización terminal generan condiciones dentro de un intervalo de tiempo-temperatura F0 previamente definido para evitar el sobreprocesamiento. Se pueden usar cálculos matemáticos simples para calcular la letalidad total en el transcurso del proceso. En el caso de la temperatura de referencia específica de 121 ºy un valor z de 10,0º, el cálculo de F0 se puede determinar mediante la Ecuación
2: F = f''rn(T-121Jdt= o J,, 1
o
:t 10 (T-121Jí:J.t o t,
1
[2]
t =tiempo
T =temperatura La suma de las contribuciones de letalidad instantáneas durante todo el proceso de esterilización permite calcular la letalidad general del proceso o el F0 generado en el transcurso de todo el proceso en condiciones variables.
Validación de la Esterilización de Envases Llenos de Líquido Conforme a lo explicado anteriormente, el método preferido para la esterilización con vapor de agua es el método de sobremuerte según se se define en el capítulo Esterilización de Artículos Farmacopeicos (1229) y Esterilización con Vapor de Agua por Contacto Directo (1229 .1 ). No obstante, cuando los materiales procesados sean susceptibles de daños por el calor húmedo en las condiciones de sobremuerte, resulta más adecuado el método de biocarga/indicador biológico puesto que utiliza menos calor y alcanza el mismo grado de eficacia del proceso, aunque con controles distintos. Conforme a lo explicado anteriormente, los procesos de esterilización terminal requieren una mayor consideración sobre los efectos que tendrá el tratamiento sobre las propiedades del material, lo cual tiene implicaciones para muchos de los elementos de los ejercicios de calificación y validación conforme a lo siguiente. Los requisitos de validación para los métodos de biocarga/indicador biológico y de biocarga son más rigurosos que aquéllos relacionados con el método de sobremuerte. Aunque el método de sobremuerte se puede usar de manera confiable sin necesidad de consideraciones detalladas sobre la biocarga previa a la esterilización, la aplicación de los métodos de biocarga/indicador biológico y de biocarga requiere el monitoreo y control continuos de la biocarga, específicamente de su población y resistencia. Lo anterior se puede lograr analizando envases llenos justo antes de la esterilización y contando el número de unidades formadoras de colonias por envase, y confirmando la ausencia de aislados de biocarga resistentes. Cuando se encuentran aislados de biocarga resistentes, se debe determinar su resistencia térmica en el fluido. EFECTO DEL PROCESO DE ESTERILIZACIÓN Durante el desarrollo del producto, se debe llevar a cabo una determinación preliminar de la capacidad del líquido y del sistema de envase-cierre para soportar las condiciones de esterilización esperadas. Esto se puede lograr mediante esterilización
USP 39
Información General/ (1229.2) Esterilización con Calor Húmedo 1819
en condiciones que excedan ligeramente el máximo esperado y evaluando el efecto de éstas en el material. La evaluación debe abarcar los atributos esenciales de calidad centrando su atención en las impurezas conocidas y en aquéllas potencialmente nuevas. Como parte de esta tarea, la apariencia y demás propiedades físicas también deben evaluarse. CALIFICACIÓN DEL EQUIPO La calificación del equipo es un programa predefinido que confirma que el equipo ha sido instalado adecuadamente y que opera conforme a lo previsto. La calificación del equipo de esterilización provee una línea de base para el mantenimiento preventivo y el control de cambios en el esterilizador. El equipo de esterilización puede requerir la calificación del aire, agua, servicios y demás sistemas que tengan un impacto en el desempeño del equipo. DISTRIBUCIÓN DE LA TEMPERATURA EN LA CÁMARA VACÍA Las consideraciones sobre esterilidad y estabilidad comúnmente asociadas con la esterilización de líquidos requieren prestar el mismo nivel de atención al subprocesamiento y sobreprocesamiento de la carga. Por esta razón, puede ser necesario controlar el gradiente de temperatura en todo el esterilizador de manera sustancialmente más estricta que aquél esperado en la esterilización por contacto directo. El objetivo es minimizar las diferencias de tiempo-temperatura o F0 en toda la carga a lo largo del proceso. No se requieren indicadores biológicos para la evaluación de la distribución de la temperatura en la cámara vacía. INDICADORES BIOLÓGICOS La selección de un indicador biológico debe considerarse cuidadosamente debido al equilibrio que se debe mantener entre lograr la esterilización y mantener los atributos de calidad esenciales del material esterilizado. El desafío biológico se inocula directamente en un envase lleno de líquido o se introduce mediante unidades autocontenidas, siempre y cuando exista una correlación adecuada entre su resistencia y la resistencia que se presentaría en el fluido del proceso. El líquido puede ser el producto o un fluido sustituto. Se debe conocer la resistencia del indicador en el producto (y del fluido sustituto, cuando así se use). Las propiedades físicas del sustituto deben ser cercanas a las del producto. Si se presentan- superficies dentro del envase que no hayan sido previamente esterilizadas, puede ser necesario someter dichas superficies al desafío biológico. DETERMINACIÓN DEL VALOR D EN LÍQUIDOS Resulta necesario determinar la resistencia térmica (valor D y valor z) para el indicador biológico. Esto debe llevarse a cabo en un Resistómetro para Evaluación de Indicadores Biologicos (BIER, por sus siglas en inglés) por duplicado. Asimismo, se debe determinar la resistencia térmica de cada lote de indicador biológico en el líquido. Cuando se utilice un líquido sustituto ya sea por conveniencia (p.ej., en un enfoque de solución maestra) o debido a la inhibición microbiana del indicador biológico por parte del líquido, se deberá determinar la resistencia térmica en el líquido sustituto. MAPEO DEL ENVASE Se debe realizar un mapeo de los envases llenos de líquido con volúmenes mayores o iguales a 100 mL para determinar los puntos fríos internos. El mapeo debe realizarse orientando los envases de los productos de la misma manera que dentro de la carga. Las sondas de temperatura deben introducirse en los envases usando métodos que mantengan la integridad de los mismos. Puede ser necesario emplear soportes internos (de materiales con una termoconductividad mínima) para asegurar la colocación correcta de la sonda dentro del envase. Una vez determinadas, estas ubicaciones se usan como ubicaciones de monitoreo o se correlacionan con condiciones externas en el envase durante la validación y el procesamiento de rutina. Los envases de menor tamaño (menos de 100 mL) tienen menos puntos fríos discernibles, cuya importancia es menor conforme se reduce el tamaño del envase. Los envases de menor tamaño (menos de 100 mL) se pueden monitorear con sondas de temperatura colocadas en su exterior. El "punto frío" debe considerarse como una "región" y no como un solo punto en el envase. COLOCACIÓN Y MAPEO DE LA CARGA Puede ser necesario establecer una posición fija de la carga dentro del esterilizador para una esterilización adecuada, con el fin de asegurar un calentamiento y enfriamiento uniformes en el uso rutinario. Una vez que se ha determinado la posición adecuada de la carga, el tamaño de ésta puede variar dentro de un intervalo definido. Se deben llevar a cabo estudios de mapeo de la carga para determinar los sitios más fríos y más calientes dentro de la carga. Estos sitios podrían no ser envases individuales específicos, sino regiones. Esto asegura que los envases no sean subprocesados ni sobreprocesados en la operación de rutina del esterilizador. La validación de patrones de carga de tamaño variable se logra usando un método de selección de extremos cuyo éxito con cargas máximas y mínimas (evitando el sobreprocesamiento y el subprocesamiento) establece la aceptabilidad de las cargas de tamaño intermedio. No obstante, la evaluación de tamaños de carga intermedios puede resultar ventajosa. En la esterilización de productos, únicamente se procesan envases de un solo tamaño junto con un solo lote de producto.
1820 (1229.2) Esterilización con Calor Húmedo/ Información General
USP 39
PENETRACIÓN DEL CALOR Y DESAFÍO MICROBIOLÓGICO El centro de la actividad de validación es confirmar la penetración aceptable de calor a través de mediciones de temperatura e inactivación de desafíos microbianos. Las sondas de temperatura y los indicadores biológicos se colocan dentro de la carga en las peores ubicaciones (p.ej., las partes más frías de la cámara cargada). La introducción de los termopares no debe alterar la integridad del envase. Los desafíos biológicos se colocan en envases adyacentes a los que contienen sondas de penetración de calor (o la misma unidad con la medición externa de temperatura). La evidencia sobre la eficacia del ciclo se obtiene mediante estudios repetidos en los cuales los indicadores biológicos tienen un desempeño conforme a lo esperado y las mediciones físicas corresponden a los valores esperados de tiempo y temperatura o F0 • Si las mediciones microbianas y físicas no cumplen con los criterios de aceptación predefinidos, será necesario investigar y aplicar acciones correctivas para rectificar la discrepancia. Se utilizan muestras de las regiones más calientes de la carga para la evaluación de la estabilidad y calidad del material. CALIDAD DEL PRODUCTO Y EVALUACIÓN DE LA ESTABILIDAD Los fabricantes deben llevar a cabo evaluaciones continuas de la capacidad del producto para soportar las condiciones de esterilización de rutina, las cuales deben abarcar los atributos de calidad esenciales con especial atención en las impurezas conocidas y potencialmente nuevas y en aquellos materiales que reciben mayor calor. Los fabricantes también deben evaluar la apariencia, otras propiedades físicas y la integridad del envase-cierre como parte de esta evaluación. Para los medios microbiológicos, es indispensable que tengan la capacidad de satisfacer la promoción de crecimiento y demás requisitos, tal como se indica en los capítulos de prueba correspondientes (p.ej., Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano (61 ), Examen Microbiológico de Productos no Estériles: Pruebas de Microorganismos Específicos (62) y Pruebas de Esterilidad (71 )).
Control Rutinario del Proceso Todos los procesos de esterilización deben someterse a prácticas formalizadas para mantenerlos en un estado controlado. Las prácticas descritas en el capítulo Esterilización de Artículos Farmacopeicos (1229) incluyen los requisitos generales apropiados para todos los sistemas de esterilización. Esto se logra mediante una variedad de prácticas relacionadas que son esenciales para el uso continuo del proceso durante un periodo prolongado. Las prácticas incluyen: calibración, mediciones físicas, integradores fisicoquímicos, indicadores para esterilización, monitoreo de la biocarga, control continuo del proceso, control de cambios, mantenimiento preventivo, reevaluación periódica y capacitación. Asimismo, resulta común el uso de liberación paramétrica en la esterilización terminal de envases de productos terminados. Este tema se trata en el capítulo Productos Farmacéuticos con Esterilización Terminal-Liberación Paramétrica (1222)
REFERENCIAS Berger, T., & Trupp, K., Validation of Terminal Sterilization, chapter in Validation of Pharmaceutical Processes: 3rd edition, edited by J. Agalloco & F.]. Carleton, lnformaUSA, New York, 2007. Owens, )., Sterilization of LVPs and SVP's, chapter in Morrissey, R., & Phillips, G.B., Sterilization Technology-A Practica! Guide for Manufacturers and Users of Health Care Products, Van Nostrand Reinhold, New York, 1993. Young, )., Sterilization with Steam under Pressure, chapter in Morrissey, R., & Phillips, G.B., Sterilization Technology-A Practica! Guide for Manufacturers and Users of Health Care Products, Van Nostrand Reinhold, New York, 1993.
(1229.3) MONITOREO DE LA BIOCARGA INTRODUCCIÓN El monitoreo de la biocarga de los componentes y productos farmacéuticos durante el proceso es un elemento esencial del programa general de control de contaminación para un apropiado control del proceso de esterilización. El monitoreo de la biocarga debe estar diseñado para recuperar un amplio rango de microorganismos cuya presencia en el material en proceso sea factible. Los procesos de esterilización se implementan con objeto de eliminar la biocarga en los materiales y los productos, asegurando un control de proceso adecuado y la seguridad del usuario final. La biocarga constituye un riesgo potencial para el paciente, no sólo debido a que el proceso de esterilización podría no ser completamente efectivo, sino también después del procesamiento, dada la posible presencia de materiales residuales tales como alérgenos, endotoxinas y exotoxinas. Asimismo, puede tener un impacto adverso en la calidad y estabilidad del producto. Por lo tanto, aunque la biocarga puede abatirse de manera confiable mediante procesos de esterilización destructiva o elimi-
USP 39
Información General/ (1229.3) Monitoreo de la Biocarga 1821
narse mediante procesos retentivos (filtración), según se resume en las secciones siguientes, se debe evitar su proliferación antes de la esterilización. Los programas de control y limpieza, sanitización y desinfección del proceso proveen medios activos para el control de la población de la biocarga y sustentan el muestreo, enumeración y caracterización de la biocarga necesarios para asegurar la eficacia de los procesos de esterilización.
Procesos Destructivos Los procesos de esterilización destructivos, tales como esterilización con calor seco y húmedo, se desarrollan y validan para matar microorganismos. Entender cabalmente la biocarga tiene una importancia crítica para los aspectos de control de calidad del programa de esterilización. Los microorganismos que son más resistentes a los procesos destructivos de uso más amplio son las esporas de ciertas bacterias Gram positivas (cabe destacar que las esporas de hongos filamentosos son menos resistentes a estos procesos destructivos que las esporas bacterianas). Dadas las propiedades de resistencia de estos organismos, algunas especies se usan comúnmente como indicadores biológicos para evaluar el desempeño de los procesos de esterilización. En su estado vegetativo, los microorganismos que forman esporas no presentan una resistencia extraordinaria a los procesos de esterilización. Los procesos que se basan en la radiación ionizante son una excepción a los perfiles típicos de resistencia, puesto que algunos microorganismos que no forman esporas presentan una mayor resistencia que los formadores de esporas. La biocarga dentro de los materiales y productos sujetos a los procesos de radiación se evalúa como parte de las actividades para el establecimiento de dosis y se explica más adelante en la sección Radiación. El proceso de esterilización, el desarrollo de un entendimiento cabal del proceso y su impacto microbiológico, representan elementos principales para poder confirmar el establecimiento de un nivel aceptable de garantía de esterilidad. Comprender la cinética de inactivación de la biocarga típica, así como de otros microorganismos de la biocarga potenciales, es crítico para una implementación exitosa. El nuevo proceso debe contar con una evaluación documentada de riesgos que detalle los aspectos de monitoreo y control. El establecimiento de un nuevo proceso de esterilización requiere la evaluación de la resistencia del indicador biológico sugerido (7,2).
Procesos de Retención Los microorganismos que presentan una menor probabilidad de ser retenidos mediante un proceso de esterilización por filtración son aquéllos con un tamaño potencialmente menor que los poros más pequeños de la matriz del filtro. Aunque la exclusión por tamaño es un factor importante, los filtros no retienen microorganismos únicamente mediante retención por tamizado. La adsorción, que retiene los microorganismos dentro de la matriz del filtro mediante fuerzas de atrapamiento o electrostáticas, también es un mecanismo de retención importante. El control de la biocarga previa a la filtración es un factor importante para la mitigación de riesgo, y resulta particularmente cierto cuando la adsorción puede ser un mecanismo de retención significativo. Por lo tanto, la capacidad de eliminar la biocarga depende del tamaño y del número de los microorganismos de la biocarga, de la distribución de tamaño de poro del filtro, de las propiedades de la solución que se está filtrando y de los parámetros del proceso de filtración.
MONITOREO V MUESTREO Las limitaciones estadísticas y analíticas complican la evaluación de la biocarga a partir de materiales líquidos y sólidos. Muchos productos son inherentemente antimicrobianos, mientras que algunas formulaciones contienen conservantes antimicrobianos; ambos aspectos pueden limitar la recuperación de la biocarga. Los productos que se encuentran fuera del intervalo de pH de aproximadamente 4-9, que son fuertemente hipertónicos o fuertemente hipotónicos, o que tienen una baja actividad de agua, pueden reducir el nivel de microorganismos recuperables. La recolección de múltiples muestras del mismo material a granel a menudo provee resultados variables debido a las diferencias temporales y espaciales en la distribución microbiana. Las muestras a partir de componentes variados y de diferentes formulaciones proveerán diferentes resultados debido a los diferentes requisitos nutricionales y de cultivo, a la tensión ambiental a la que se exponen los microorganismos, a los métodos de muestreo, al tamaño de la muestra, al patrón de muestreo, a la heterogeneidad de las especies y al desplazamiento de las poblaciones microbianas. Debido a los desafíos técnicos relacionados con el análisis de la biocarga, los resultados dependerán de las variables específicas de la muestra y específicas del método al intentar recuperar, cultivar o enumerar organismos. La frecuencia del muestreo y el tiempo de retraso máximo entre el muestreo y el análisis deben establecerse basándose en datos previos. El análisis de la biocarga previa a la esterilización debe llevarse a cabo en muestras que sean representativas de los materiales producidos durante la preparación y el procesamiento de rutina. La frecuencia del muestreo debe establecerse basándose en los datos previos, la variabilidad conocida, el tamaño de partida, el material, el proceso y las influencias ambientales. La biocarga debe recuperarse y enumerarse a partir de muestras que sean representativas del material del proceso. Cuando el material se almacene en envases separados, los analistas deben considerar el análisis de muestras múltiples o compuestas. La evaluación de la biocarga debe enfocarse en microorganismos que representen una mayor preocupación para el proceso de esterilización. Los métodos de recuento total deben considerar las propiedades del producto que se está evaluando y las características del
USP 39
1822 (1229.3) Monitoreo de la Biocarga /Información General
proceso que pudieran afectar la recuperación. Los métodos de cultivo, los diluyentes y la selección de medios deben basarse en experiencias previas con el proceso de fabricación y el material de prueba (3). Los métodos listados en los capítulos Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano (61) y Pruebas para Micoplasmas (63) pueden ser apropiados para la evaluación de la biocarga, aunque pueden requerir la modificación de los métodos y las calificaciones para cumplir con los requisitos de los materiales de prueba específicos.
Evaluación Preliminar de la Biocarga Los materiales y productos que se van a esterilizar deben examinarse para determinar el nivel de la biocarga en el artículo. Determinar el nivel de la población microbiana es un elemento esencial para asegurar la eficacia del proceso. Para procesos letales distintos a la radiación, la presencia de formadores de esporas Gram positivas presentan el mayor potencial de supervivencia. La resistencia potencial de la biocarga al proceso de esterilización específico es un aspecto importante a considerar y se puede evaluar mediante un proceso de selección. Los microorganismos aislados que se identifican como bacilos Gram negativos tienen el potencial de ocasionar altos niveles de endotoxinas. La Figura 1 ilustra un posible programa de evaluación preliminar de la biocarga. Se sabe que el producto es microbicida ¿Biocarga en el Producto?
El producto parece ser microbicida
Ninguna
Ninguno
Seleccionar el tamiz del proceso
No se recuperaron microorganismos
Repetir la prueba en los 2 lotes siguientes
lSe recuperaron microorganismos?
Sí Tamiz del proceso Otros procesos Prueba de ebullición
Tamiz del proceso Radiación
Tamiz del proceso Filtración
VDmáx
0,45 µm
~-------'Riesgo para la salud;.----------.
Sí ¿Se recuperaron i-----~ microorganismos?
Recuento microbiano
>10UFC/ envase
Ninguno
humana/animal Riesgo para la Monitorear el salud humana/ ~------..i proceso de cada lote animal
Ninguno <10 UFC/ envase
Nota: Los resultados deben informarse para cada envase para paciente individual, independientemente del volumen o peso muestreado.
Figura 1 . Programa típico de evaluación preliminar de la biocarga.
Procesos Destructivos (excepto Radiación) Los microorganismos se pueden recuperar después de la exposición a la selección por calor o a un golpe a 100º, con lo que se elimina las células vegetativas y se activa el proceso de germinación en las bacterias formadoras de esporas ( 4). El tratamiento por choque térmico es un medio efectivo para reducir la cantidad de microorganismos de la biocarga que se van a evaluar debido a que los formadores de esporas son los más resistentes a todos los procesos letales distintos a la radiación. La selección por calor elimina células vegetativas que carecen de resistencia a la esterilización y promueve la germinación, facilitando así el aislamiento de formadores de esporas. Los informes publicados comparan la resistencia de los microorganismos recuperados con la de los indicadores biológicos predefinidos para muchos procesos de esterilización comunes (4,5). Los analistas deben evaluar las bacterias formadoras de esporas aisladas para determinar su valor D de resistencia a procesos de esterilización letales específicos y asegurar así la validez del método de esterilización. Los datos disponibles describen que bacterias, hongos filamentosos y especies de levaduras aisla-
USP 39
Información General/ (1229.3) Monitoreo de la Biocarga 1823
dos médica y ambientalmente carecen de resistencia a los métodos de esterilización usados más comunes, por lo que repetir dichos estudios de resistencia podría tener únicamente un valor limitado para los analistas.
Radiación La esterilización mediante procesos de radiación se basa en la biocarga del material preesterilizado. Los analistas comúnmente emplean procesos de esterilización basados en la biocarga conforme a lo descrito en la norma MMl/ISO 11137 (6). Para asegurar una constante garantía de esterilidad, se debe controlar la variabilidad de la biocarga entre lotes. Se deben recolectar y analizar datos para materias primas, productos intermedios y/o productos, a fin de asegurar el control del proceso. La norma MMl/ISO 11137 provee información detallada sobre las prácticas de esterilización con radiación, lo cual incluye el desarrollo del ciclo, los métodos de validación y las metodología5 para auditar la dosis de radiación que incluyen expectativas para la evaluación inicial y periódica de la biocarga. La norma MMl/ISO 11737 provee pautas para establecer métodos para estimar los niveles de la biocarga en dispositivos médicos antes de la irradiación (7).
Esterilización por Filtración La selección de la biocarga para los procesos de esterilización por filtración que aún no han sido sometidos a validación formal se puede llevar a cabo pasando el material a través de un filtro con un tamaño de poro de 0,45 µm y examinando el filtrado para detectar microorganismos viables. El interés se centra únicamente en aquellos microorganismos que pasan por el filtro de 0,45 µm puesto que representan el mayor desafío potencial para el proceso de esterilización por filtración. Se deben evaluar contra la biocarga previa a la filtración. La biocarga que representa la mayor preocupación incluye Pseudomonas, Brevundimonas, Ralstonia y Micoplasmas.
Identificación Los microorganismos recuperados se pueden identificar hasta un nivel apropiado usando los métodos descritos en Caracterización, Identificación y Tipificación de Cepas Microbianas (1113). Sólo aquellos microorganismos que representan un riesgo potencial para el producto o el paciente requieren identificación al nivel de especies o superior. Para una descripción detallada de los métodos usados para cultivar e identificar microorganismos, consultar el capítulo (1113). Aunque puede ser útil en algunas investigaciones, no es necesario identificar todos los microorganismos aislados al nivel de especies para los propósitos de evaluación de la biocarga previa a la esterilización. Los analistas deben realizar todos los trabajos de evaluación con cultivos puros, y deben aplicar los procedimientos normales del laboratorio de microbiología para la selección y mantenimiento de cultivos puros.
Control de la Biocarga Un programa de control de la biocarga típico incluye revisar y analizar las fuentes potenciales de contaminación, además de un diseño del proceso adecuado y medidas preventivas y de monitoreo. El programa de control de contaminación microbiológica debe desarrollarse con objeto de identificar y controlar la biocarga y para evaluar el riesgo para el producto, basándose en una evaluación formal de modalidades de riesgo. La evaluación de riesgo de la biocarga debe resultar en el establecimiento de puntos de control críticos y debe tomar en cuenta los siguientes elementos: • Los atributos microbiológicos de los materiales antes de la esterilización y el proceso de fabricación usado para los materiales (si es aplicable) • Las propiedades antimicrobianas inherentes de los materiales • Los límites de tiempo para la ejecución del proceso • La actividad de agua del material • Las condiciones ambientales dentro de la instalación • El diseño y limpieza del equipo • Los procesos de sanitización, descontaminación y demás procesos activos de control microbiano (tales como prefiltración, temperatura, pH, osmolaridad, etc.) El control de la biocarga de los materiales y productos que se van a esterilizar asegurará el cumplimiento con los niveles requeridos por la validación del proceso de esterilización. Asimismo, el control de los niveles de la biocarga de los artículos que se van a esterilizar asegura que los productos residuales (p.ej., alérgenos, endotoxinas y exotoxinas) derivados de tal población también estén bajo control, lo cual es importante debido a que la detección directa de dichos materiales representa un desafío.
REFERENCIAS 1. 21 CFR 807, Subpart E. Premarket Notification Procedures. 2. FDA. Updated 51 O(k) sterility review guidance K90-1; final guidance for industry and FDA. 2002. http://www.fda.gov/ Medica1Devices/DeviceRegulationandGuidance/GuidanceDocuments/ucm072783.htm.
1824 (1229.3) Monitoreo de la Biocarga /Información General
USP 39
3. Murray Cj. Sampling and data analysis for environmental microbiology. En: Hurst CJ, Knudsen GR, Mclnerney j, eds. Manual of Environmenta/ Microbiology. 2nd ed. Washington, DC: ASM Press; 2002:166-177. 4. Pflug lj. Microbiology and Engineering of Sterilization Processes. 7th ed. Minneapolis, MN: Environmental Sterilization Laboratory; 1990. 5. Block, S. Oisinfection, Sterilization & Preservation. 5th ed. Philadelphia, PA: Lippincott, Williams and Wilkins; 2001. 6. ANSl/AAMl/ISO. 11137. Sterilization of Health Care Products-Radiation-Part 7: Requirements far Development, Validation, and Routine Control of a Sterilization Process far Medica/ Devices. Arlington, VA: AAMI; 2006. 7. AAMl/ISO. 11731. Sterilization of Medica/ Devices-Microbiological Methods-Part 7: Estimation of Population of Microorganisms on Products. Arlington, VA: AAMI; 2006.
(1229.4) ESTERILIZACIÓN DE LÍQUIDOS POR FILTRACIÓN INTRODUCCIÓN En términos generales, los procesos de esterilización se dividen en dos categorías: destrucción de microorganismos y su separación física del material que se va a esterilizar. El autoclavado es un ejemplo de la primera categoría, mientras que la esterilización por filtración es un ejemplo de la segunda. La separación física de microorganismos depende de la biocarga de la solución que se va a filtrar, de las propiedades de la solución, de las condiciones de filtración y del filtro mismo. La esterilización por filtración es un proceso que se puede validar para producir filtrados estériles de una manera consistente, conforme a lo definido en el capítulo Esterilización de Artículos Farmacopeicos (1229). Este capítulo provee una visión general de (1) los diversos factores que afectan al proceso de filtración, (2) la prueba de integridad del filtro y cuándo llevarla a cabo, (3) el control de la biocarga previo a la filtración, (4) las responsabilidades del fabricante y del usuario del filtro, y (5) la resolución de problemas del proceso de filtración. Diversos factores contribuyen a la efectividad de cualquier proceso de esterilización por filtración. Estos incluyen el tipo y número de microorganismos, las propiedades del líquido, el diseño del filtro y el polímero de la membrana, y los parámetros del proceso de filtración. Las propiedades del líquido que influyen sobre la efectividad de la filtración incluyen su química, viscosidad, tensión superficial, pH, osmolaridad, fuerza iónica y temperatura, así como la presencia de materiales insolubles. Los aspectos del filtro que afectan a la filtración incluyen el área efectiva del filtro, el tamaño de poro nominal, la distribución de tamaño de poro, el espesor de la membrana, la porosidad, el polímero de la membrana, la densidad de pliegue del filtro, las capas de soporte que no forman parte del entretejido, la carga electrostática y la hidrofilicidad de la membrana del filtro. Los parámetros del proceso de filtración que influyen sobre la retención microbiana incluyen la temperatura, la velocidad de flujo, el volumen, el tiempo de filtración, la presión diferencial y los pulsos de presión. Además, una esterilización por filtración efectiva depende de (1) los controles de producción y los sistemas de garantía de calidad usados por el fabricante del filtro para asegurar la calidad y uniformidad de las membranas del filtro y de los filtros entretejidos; (2) los estudios de calificación y validación realizados o comisionados por el usuario del filtro para demostrar que el proceso de esterilización por filtración seleccionado logra un filtrado estéril; (3) controles efectivos para asegurar que la biocarga previa a la filtración y los parámetros operativos se mantienen dentro de los intervalos validados; y (4) la integridad del filtro. Los usuarios del filtro deben cerciorarse de que el filtrado se mantenga estéril mediante el uso de procesos de esterilización validados para el ensamblaje de filtración y para todo el equipo de fabricación usado en procesos posteriores, así como en la manipulación aséptica eficaz de los materiales esterilizados. Los usuarios del filtro deben considerar cuidadosamente la colocación del filtro (p.ej., su proximidad a la línea de llenado o al tanque de retención) para minimizar la posibilidad de contaminación posterior a la filtración.
Filtros de Grado de Esterilización Un filtro de grado de esterilización es aquél que es capaz de retener un mínimo de 1 x 10 7 ufc de B. diminuta (ATCC 19146) por centímetro cuadrado de área efectiva de filtro cuando se analiza de conformidad con la ASTM F838-05 (2013), Standard Test Method far Determining Bacteria/ Retention of Membrane Filters Utilized far Liquid Filtration (Método de Prueba Estándar para Determinar la Retención Bacteriana de los Filtros de Membrana Usados para la Filtración de Líquidos) (2). La designación "grado de esterilización" implica una acción esterilizante únicamente cuando se cumplen otras condiciones, incluyendo la especificación de la prueba de integridad establecida por el fabricante del filtro y validada por el usuario (ver Validación, a continuación). Los filtros de grado de esterilización por lo regular son membranas microporosas con valores nominales de tamaño de poro de aproximadamente 0,2 µm. Estas membranas se componen de diversos materiales, tienen distribuciones de tamaño de poro relativamente estrechas y se puede analizar su integridad. Los resultados de la prueba de integridad se pueden correlacionar con la retención microbiana. Los filtros de membrana que tienen un tamaño de poro nominal de 0,45 µm se pueden validar para producir filtrados estériles bajo ciertas condiciones; por ejemplo, algunos líquidos requieren alta presión diferenciales para
USP 39
Información General/ (1229.4) Esterilización de Líquidos por Filtración 1825
lograr velocidades de flujo útiles, y dichas presiones no son aptas para ser utilizadas con filtros de tamaño de poro nominal de 0,2 µm. Cuando los fabricantes usan filtros de 0,45 µm, deben asegurar un control particularmente estricto de la biocarga previa a la esterilización.
Mecanismos de Retención Las membranas microporosas eliminan microorganismos del líquido a través de dos mecanismos primarios: retención por tamizado, la cual se basa en el bloqueo físico de partículas cuyo tamaño es mayor al de los poros de la membrana, y la adsorción, que es un fenómeno relacionado con la carga mediante el cual las partículas se unen a las superficies de la membrana. Ambos mecanismos deben considerarse durante el desarrollo, la calificación y la validación de los procesos de esterilización por filtración. Por lo general, la retención por tamizado, es independiente de las condiciones de filtración y del nivel de desafío microbiano; sin embargo, en ciertas condiciones, la retención por tamizado se puede ver afectada por la composición del líquido, la temperatura y las condiciones de filtración. La adsorción es un fenómeno relacionado con la carga que se ve influenciado por la composición de la membrana, las propiedades del líquido filtrado, las condiciones de filtración y el número y tipo de microorganismos presentes en el líquido. La retención se puede ver afectada por el número y tipo de microorganismos y demás partículas presentes en el material que se va a filtrar. La retención por tamizado implica que todos los microorganismos sean de mayor tamaño que el poro más grande en el filtro. Los microorganismos y los poros del filtro no presentan tamaños uniformes, y algunos microorganismos pueden ser de menor tamaño que los poros más grandes. Aunque un microorganismo sea más pequeño que el poro con el que se encuentra, se lo puede retener por adsorción si se encuentra un sitio disponible y las condiciones de filtración son propicias para la adsorción. La probabilidad de retención se relaciona con el número de microorganismos en la biocarga en las etapas primarias (4,5).
FACTORES QUE AFECTAN LA RETENCIÓN Naturaleza de los Poros Las membranas microporosas están constituidas por una matriz polimérica penetrada por intersticios comúnmente denominados poros. En comparación con los de los filtros de profundidad, los poros en las membranas microporosas presentan una distribución de tamaño relativamente estrecha. El tamaño, el número y la forma de los poros determinan las capacidades de retención del filtro. Con excepción de Jos poros de la membranas de filtro con canales grabados (track-etched), los poros no son cilíndricos; los poros están compuestos por una serie de estructuras seudopoliédricas con diámetros internos diversos (6). El tamaño de poro, la distribución de tamaño de poro y la porosidad de Ja membrana son una función del proceso de fabricación. Es necesario diseñar y controlar cuidadosamente al proceso para asegurar que la membrana resultante tenga la valuación en la prueba de integridad, la capacidad de retención microbiana y la uniformidad deseadas.
Naturaleza de los Microorganismos Los microorganismos se presentan en diversas formas y tamaños. Si el microorganismo se encuentra con un poro de Ja membrana que tiene un tamaño menor que su diámetro más pequeño, el microorganismo probablemente quedará capturado por tamizado. No obstante, si el microorganismo es más pequeño que el poro con el que se encuentra, puede quedar retenido por adsorción si el tiempo de residencia, la carga electrostática, el pH, la química del fluido y el material de la membrana son propicias para la adsorción. Algunos géneros de microorganismos son deformables, por lo que, al aplicar presiones o velocidades de flujo diferenciales altas, un microorganismo puede ser forzado a través de un poro del filtro que es ligeramente más pequeño que el organismo (1). Los molicutes (micoplasmas) carecen de paredes celulares y, por ende, son lo suficientemente pequeños y plegables para pasar a través de filtros de membrana en ciertas condiciones. El pasaje como consecuencia de Ja multiplicación (atravesado del filtro en función del tiempo) puede ser el resultado de una o más de las siguientes situaciones. El microorganismo puede atravesar el filtro a medida que se multiplica: una célula progenitora se divide en dos células hijas más pequeñas las cuales sortean los pasajes del poro. Con el tiempo los microorganismos pueden atravesar el filtro, debido a que el número creciente de los mismos sobrepasa los pocos poros de mayor tamaño con los que se encuentran. No obstante, debido a los periodos limitados que generalmente se conllevan, a los controles de la biocarga, y a la generalmente limitada disponibilidad de nutrientes, el pasaje debido a la multiplicación microbiana se considera un fenómeno raro en los procesos farmacéuticos (ver Monitoreo de la Biocarga (1229.3)) (8).
Composición
y Estructura de la Matriz del Filtro
Diversos factores relacionados con la matriz del filtro que pueden afectar la retención microbiana, los cuales incluyen el material de fabricación del filtro, el tamaño de poro y la distribución de tamaño de poro, si la membrana es isotrópica o anisotró-
1826 (1229.4) Esterilización de Líquidos por Filtración/ Información General
USP 39
pica (es decir, si la estructura de los poros de la membrana es uniforme entre caras o se "estrecha" en una cara con respecto a la otra), el espesor de la membrana y si el filtro consta de una sola o múltiples capas. El material de la membrana es especialmente importante si la adsorción es un mecanismo significativo en un esquema particular de filtración. Por ejemplo, la poliamida exhibe una adsorción microbiana más fuerte que el éster de celulosa (3). Las membranas microporosas con una distribución de tamaño de poro relativamente amplia son menos propensas a retener microorganismos, en particular a niveles de desafío altos, que las membranas con valores de tamaño de poro comparables con distribuciones de tamaño de poro más estrechas. Esto se relaciona con la probabilidad de que un microorganismo se encuentre con un poro cuyo tamaño sea mayor al del propio microorganismo. Las membranas más gruesas por lo general presentan una capacidad de retención mayor que las membranas más delgadas del mismo tipo y valor de tamaño de poro, debido a la mayor probabilidad de atrapamiento o adsorción dentro de la estructura del poro debido al aumento en la distancia que la bacteria debe recorrer en membranas más gruesas. Esta distancia favorece el atrapamiento, al igual que el aumento en el tiempo de residencia dentro del poro, el cual favorece la retención por adsorción (3). Los filtros de membrana de capas múltiples presentan una mayor probabilidad de retención que los filtros de membrana de una sola capa del mismo espesor puesto que el pequeño número de poros más grandes es el factor que afecta la retención y la probabilidad de que un poro grande en una capa se encuentre alineado con otro poro grande en la capa siguiente de un filtro de doble capa no es significativa (3).
Composición de la Solución Filtrada A menos que se detecte antes de seleccionar el filtro que se va a usar, la composición de la solución filtrada puede afectar de manera adversa el material de la membrana si existe una incompatibilidad, ocasionando daños a la membrana y afectando su retención e integridad física. Asimismo, si la adsorción es un mecanismo de retención significativo, entonces se vuelven importantes las propiedades de la solución, tales como el pH y la presencia agentes tensoactivos. La carga superficial y la fuerza iónica son variables importantes. Las superficies bacterianas y de la membrana en medios acuosos presentan cargas negativas, lo que genera repulsión. La fuerza de repulsión se equilibra mediante fuerzas de atracción, las cuales incluyen fuerzas hidrofóbicas de superficie que actúan solo a corta distancia y los puentes de hidrógeno. A fuerzas iónicas elevadas las superficies se pueden cerrar debido a una descarga mediada por el electrolito hasta un punto en que puede ocurrir una adsorción hidrofóbica (3). Por otra parte, la alta fuerza iónica puede deshidratar a la célula, reduciendo su tamaño, lo cual puede disminuir la probabilidad de retención, dependiendo de la composición de la biocarga previa a la filtración. La tensión superficial y la presencia de agentes tensoactivos influyen sobre la retención. La adsorción de agentes tensoactivos por parte del filtro y el microorganismo generan repulsión, lo que conlleva a una reducción en la probabilidad de retención. Los agentes tensoactivos en concentraciones tan bajas como 0,05% han demostrado inhibir la adsorción y reducir la retención de esferas de látex (9).
Condiciones de Filtración La presión diferencial, la velocidad de flujo y la temperatura se encuentran entre los factores que pueden afectar la retención microbiana. Se deben evitar los golpes hidráulicos, no sólo debido a que afectan la presión diferencial y la velocidad de flujo, sino porque también pueden dañar el filtro. La velocidad de flujo es proporcional a la presión diferencial, y velocidades de flujo mayores reducen la adsorción debido a que se reduce el tiempo de contacto (1 O). La retención microbiana puede disminuir a temperaturas más altas cuando éstas resultan en velocidades de flujo mayores debido a la reducción en la viscosidad de la solución. Los efectos de la temperatura no son significativos en filtros en los que la retención por tamizado es el mecanismo primario de remoción.
Eficacia del Filtro: Valor de Reducción Logarítmica La eficacia de la filtración se puede definir en términos de un valor de reducción logarítmica, que es el logaritmo del cociente producido al dividir la población de desafío previa por la población recuperada posterior. El valor de reducción logarítmica se ve influenciado por el número y el tamaño de los microorganismos de desafío, el diseño del filtro y el polímero de la membrana, los parámetros del proceso de filtración, y las propiedades de la solución. Para determinar el valor específico de reducción logarítmica de un filtro, la prueba de desafío debe permitir el paso de algo del microorganismo de prueba a través del filtro para producir un denominador. Los filtros de membrana de grado de esterilización no deben permitir el paso de los microorganismos de desafío especificados para ese valor de filtro. Por ende, el valor de reducción logarítmica de los filtros de grado de esterilización se describe como igual o mayor que el logaritmo de la población de desafío.
USP 39
Información General/ (1229.4) Esterilización de Líquidos por Filtración 1827
Validación Tal como se comentó, la retención microbiana en la esterilización por filtración se basa en una combinación de retención por tamizado y adsorción. Por consiguiente, la validación de la esterilización por filtración requiere determinar el efecto del líquido sobre el filtro y demostrar que el filtro puede producir de manera consistente soluciones estériles en las condiciones de uso estipuladas. El líquido que se va a filtrar puede afectar la estructura del poro de la membrana, puede tener propiedades electrostáticas diferentes a las de la suspensión de desafío estándar usada para establecer la integridad de las especificaciones de prueba, y puede cambiar el tamaño y forma de los microorganismos de desafío. Los factores a considerar durante el desarrollo de un protocolo de validación de la esterilización por filtración incluyen la tensión superficial, el pH, la temperatura y la osmolaridad del líquido que se va a filtrar; la compatibilidad del material o los componentes de la solución con el filtro mismo; las presiones, las velocidades de flujo y los golpes hidráulicos que probablemente se encontrarán; y el tiempo de filtración máximo y el volumen que se va a filtrar. Asimismo, se debe considerar el efecto que tiene la esterilización del filtro (por vapor, radiación o gas) sobre su capacidad de retención. El B. diminuta (ATCC 19146) se usa como organismo de desafío a menos que no sea viable en el líquido que se va a filtrar. Los estudios de viabilidad deben usarse para confirmar que el líquido no tenga efectos adversos sobre el organismo de desafío. Si éste último es viable en el líquido que se va a filtrar, el líquido debe inocularse para lograr un nivel de desafío de 1 x 10 7 ucf/cm 2 , y el filtrado debe evaluarse para determinar la presencia del organismo de desafío. Si el B. diminuta no es viable en el líquido, existen diversas opciones disponibles, y los analistas pueden (1) modificar el líquido para asegurar la viabilidad del organismo de desafío (p.ej., ajustar el pH o eliminar el componente bactericida), (2) reducir el tiempo de exposición para asegurar que el organismo de desafío se mantenga viable, o (3) cambiar el organismo de desafío de B. diminuta a uno que se haya aislado del líquido que se va a filtrar. Estos estudios deben llevarse a cabo utilizando los valores de presiones diferenciales del proceso de producción o valores de flujo de proceso, según corresponda. Cuando sea posible, se debe usar el líquido que se va filtrar, puesto que en algunas instancias el organismo de desafío ha conseguido atravesar el filtro en este líquido pero ha sido retenido por el mismo filtro cuando se inocula en un líquido sustituto
(7 7). Se deben usar tres lotes diferentes de filtros de membrana para los estudios de retención microbiana. Las membranas deben tener valores de prueba de integridad previos a su uso que sean cercanos a la especificación del fabricante para minimizar la posibilidad de que los filtros de producción no cumplan con el valor de la prueba de integridad establecido durante la validación. Los estudios exitosos de desafío microbiano arrojan resultados de ausencia de microorganismos detectables en el filtrado. El proceso de esterilización para el filtro, su armazón y el equipo relacionado deben validarse. El filtro se debe esterilizar dentro de su sistema de ensamblaje en lugar de confiar en el ensamblaje aséptico después de la esterilización de los componentes del sistema de filtración. El aparato de filtración ensamblado se puede esterilizar con vapor en un autoclave, usando un ciclo de vacío, prestando particular atención a la orientación y el envoltorio del armazón, y toda la tubuladura asociada para permitir el drenaje del condensado y la penetración del vapor. También se pueden usar ciclos de esterilización con vapor in situ validados. Los métodos y ciclos de esterilización deben ser cuidadosamente seleccionados y diseñados para evitar daños en el filtro. Las pruebas de integridad previas y posteriores a la esterilización se pueden usar para confirmar que el proceso de esterilización no cambie el valor de la prueba de integridad y para demostrar que el proceso de esterilización no daña el filtro. Finalmente, se debe considerar a qué escala se debe realizar la validación. Existen dos enfoques comunes. Uno emplea una pequeña sección del material de la membrana, generalmente un disco de 47 mm, para representar al filtro. Este enfoque valida la capacidad de retención microbiana de la membrana. Un segundo enfoque emplea la configuración prevista del filtro, generalmente un cartucho de 1O pulgadas en su armazón. Este enfoque valida el desempeño del sistema de filtro además de la capacidad de retención del material de la membrana. Los analistas deben considerar el volumen del líquido de prueba y las condiciones operativas al seleccionar el enfoque que van a usar.
Principios y Métodos de la Prueba de Integridad La prueba de integridad se puede usar para mostrar que un filtro tiene la clasificación correcta de tamaño de poro, que está instalado apropiadamente en su armazón y que no ha sufrido daños derivados del proceso usado para su esterilización. Estos métodos de prueba de integridad por lo general se basan en la detección del flujo de gas ocasionado por una presión diferencial a través de la membrana humedecida. La Figura 7 muestra la relación entre el flujo de gas y la presión diferencial para membranas de área superficial alta y de área superficial baja (un disco de membrana de 47 mm se puede considerar un área superficial baja, mientras que un conjunto de cartuchos múltiples de filtros de cartucho de 1O pulgadas se puede considerar un área superficial alta).
1828 (1229.4) Esterilización de Líquidos por Filtración / Información General
USP 39
I
I Alta superficie de membrana
-
-
-
-
-
/\
-
¡
Baja superficie de membrana
Flujo de masa
,'r
Punto de transición
I I / /
,,.,. ,, /
_.,,,. _,. ,,,_
--r-----
-- -- --- --r
/
Zona de "----- transición
Flujo difusivo
\_Punto de burbuja
Presión diferencial Figura 1. Relación entre el flujo de gas y la presión diferencial para membranas de alta área superficial y baja área superficial (ver las definiciones en la sección Principios y Métodos de la Prueba de Integridad). Un filtro que pasa exitosamente una prueba de integridad basándose en las especificaciones desarrolladas durante un estudio de validación efectivo de la esterilización por filtración es capaz de producir un filtrado estéril. Los métodos de prueba de integridad para filtros de membrana microporosa incluyen punto de burbuja, flujo difusivo y retención de la presión. El tipo y tamaño de la membrana y el proceso de filtración particular influyen sobre la selección de un método de prueba de integridad apropiado. La sensibilidad de la prueba de punto de burbuja se reduce con un área de filtro creciente debido al incremento del flujo difusivo. Las pruebas de integridad de punto de burbuja, de flujo difusivo y de retención de la presión se usan para filtros de membrana microporosos hidrofílicos. Tal como se muestra en la Figura 7, el flujo difusivo se presenta a presiones por debajo del punto de burbuja, y el flujo en masa se presenta por encima del punto de burbuja. El punto de burbuja marca la transición entre el flujo difusivo y el flujo en masa. El punto de burbuja exacto es difícil de detectar en filtros con área superficial alta, debido a que el área superficial alta de la membrana genera una difusión significativa. La prueba de integridad se puede llevar a cabo de forma manual o mediante equipo automatizado, diseñado específicamente para dicho propósito. PUNTO DE BURBUJA
El punto de burbuja ocurre cuando un gas desplaza a un líquido humectante de los poros más grandes de la membrana, lo que resulta en un flujo en masa de gas a través de dichos poros. El flujo se manifiesta como una corriente continua de burbujas a través de una columna de agua en la cara inferior de la membrana. El punto de burbuja se relaciona con el tamaño de poro de la membrana y el ángulo de contacto que el líquido humectante forma con la pared del poro. El punto de burbuja es indirectamente proporcional al tamaño de poro de la membrana y directamente proporcional a la tensión superficial del líquido humectante; es decir, los filtros con tamaños de poro menores tienen puntos de burbuja más altos que aquéllos con poros grandes, y los líquidos que humectan fácilmente la membrana presentan puntos de burbuja más altos que los que no lo hacen. El punto de burbuja se define como:
P= 4 P = presión para evacuar el poro y = tensión superficial 0 = ángulo de humectación D = diámetro del poro
X
yx cose/O
USP 39
Información General/ (1229.4) Esterilización de Líquidos por Filtración 1829
La retención microbiana y el punto de burbuja están correlacionados: numerosos estudios han demostrado que cuando el cociente de reducción microbiana se grafica en función del punto de burbuja, resulta una línea de pendiente constante (7 2). El punto de burbuja verdadero es independiente del área superficial de la membrana, pero el flujo difusivo a través de los filtros de área superficial alta pueden enmascarar el punto de burbuja real. La prueba del punto de burbuja es fácil de realizar en filtros de escala pequeña a media, el tiempo de prueba es corto y los efectos de la temperatura son mínimos. La prueba del punto de burbuja manual requiere manipular la cara inferior del filtro y es subjetiva. FLUJO DIFUSIVO En la prueba de flujo difusivo, un filtro humedecido provee una capa de líquido a través de la cual el gas puede fluir mediante difusión. El flujo difusivo se mide directamente a presión constante. El flujo difusivo es proporcional a la presión diferencial del gas de prueba, la difusividad del gas de prueba en el líquido humectante, el espesor (profundidad) del líquido humectante, la porosidad (es decir, volumen muerto) de la membrana y el área de filtración efectiva. El flujo difusivo se define mediante la Ley de Difusión de Fick, que se expone de la siguiente manera:
N = [O
X
H X (p, - P2)]/(L
X
p)
N =velocidad de permeación (moles de gas por unidad de tiempo) O = difusividad del gas en el líquido H = coeficiente de solubilidad del gas p 1 - p2 = diferencia de presión a través de la membrana (presión diferencial) L = espesor de líquido en la membrana p =volumen muerto (porosidad) de la membrana A diferencia de la prueba del punto de burbuja, la prueba de flujo difusivo mide el flujo de gas a través de todos los poros humedecidos y, por lo tanto, el flujo difusivo no se correlaciona directamente con la retención microbiana. No obstante, las pruebas de desafío bacteriano con una serie de filtros que presentan velocidades de difusión decrecientes muestran que existe una velocidad de difusión de gas por debajo de la cual se obtienen filtrados estériles. La prueba de flujo difusivo es altamente sensible, en especial para membranas con áreas superficiales más altas. Se pueden detectar poros más grandes o imperfecciones mediante un adelgazamiento de la capa de líquido y velocidades de flujo difusivo correspondientemente mayores. Las pruebas de flujo difusivo son útiles para membranas con tamaños de poro pequeños (p.ej., O, 1 µm y menores) debido a que en estos casos se requieren presiones altas para la prueba del punto de burbuja. La prueba de flujo difusivo mide el flujo a través del volumen total de los poros, lo que puede enmascarar una imperfección, especialmente en configuraciones de cartuchos múltiples con áreas superficiales altas (7 3). Esta prueba también es altamente sensible a la temperatura.
RETENCIÓN DE LA PRESIÓN La prueba de integridad por retención de la presión es una variación de la prueba de flujo difusivo. La membrana humedecida provee una capa de líquido a través de la cual el gas puede fluir mediante difusión. El flujo de gas es proporcional a la presión diferencial y se mide mediante la caída de la presión en la cara anterior de la membrana. La velocidad de la caída de la presión se ve influenciada por el volumen anterior para la combinación de armazón-filtro, en particular, la colocación de la válvula y el volumen de la tubuladura. La temperatura debe mantenerse constante debido a la relación entre esta y la presión definida por la ley de los gases ideales. La conversión de los resultados de la prueba de caída de presión a valores de flujo difusivo permite la correlación con la retención microbiana. Los analistas establecen la relación entre la caída de presión y el flujo difusivo calculando el flujo difusivo con respecto a la caída de la presión por unidad de tiempo, usando un volumen anterior conocido y una presión de referencia. El flujo difusivo, se relaciona con la caída de la presión, mediante la siguiente ecuación:
O= [(p 1 x V1)/(p0 x t)] x ln[p 1/(p2
-
Lip)]
O= difusión p1 = presión inicial de la prueba V1 = volumen anterior al sistema de filtro Po = presión atmosférica t = tiempo de la prueba p2 = presión final de la prueba l'lp = p, - P2 Las ventajas y desventajas de la prueba de retención de la presión son similares a las de la prueba de flujo difusivo. La prueba de retención de la presión tiene las capacidades adicionales de revelar imperfecciones en el ensamblaje y sello del armazón y colocación del filtro y de evitar la manipulación posterior. Sus desventajas radican en que se ve fuertemente influenciada por la temperatura y que requiere una medición exacta del volumen anterior (7 4).
USP 39
1830 (1229.4) Esterilización de Líquidos por Filtración/ Información General
Cuándo Se Debe Realizar la Prueba de Integridad La decisión de no realizar una prueba de integridad previa al uso y a la esterilización debe basarse en una evaluación formal de riesgos. La prueba de integridad realizada luego de la esterilización y previo al uso puede crear un riesgo innecesario de contaminación microbiana para el filtro y las tubuladuras asociadas, y equipamiento siguientes. La prueba de integridad previa al uso y posterior a la esterilización es innecesaria cuando se ha demostrado mediante estudios de validación que el proceso para esterilizar el filtro no afecta el valor de la prueba de integridad del filtro. Se debe llevar a cabo la prueba de integridad posterior a la filtración para asegurar que el filtro no se haya dañado durante el proceso de filtración.
CONTROL DE LA BIOCARGA PREVIO A LA FILTRACIÓN La capacidad de remoción de la biocarga depende de la capacidad de retención del filtro disponible, la cual depende de la carga de biocarga inherente, presente en el volumen completo del líquido que se va a filtrar y el área superficial efectiva del filtro. Se ha demostrado mediante estudios que la retención microbiana en la esterilización por filtración es una función de la biocarga previa (3, 15, 16). Asimismo, la capacidad de retención del filtro se puede ver influenciada por las partículas no viables que pudieran estar presentes en la solución (17). Por lo tanto, se debe minimizar y controlar los niveles previos de la biocarga y de partículas antes del paso final de esterilización por filtración. Se pueden usar diversas configuraciones de filtro y diversos procesos para controlar la biocarga y los niveles de partículas no viables que se confrontan finalmente al filtro de grado de esterilización. Una configuración consiste en un arreglo de múltiples filtros que consta de dos filtros de grado de esterilización (o un filtro de reducción de biocarga seguido de un filtro de grado de esterilización) conectados en serie (Figura 2).
Líquido no estéril
·o Filtro de reducción de biocarga
Filtro de grado de esterilización
Líquido filtrado estéril
Figura 2. Configuración multifiltro para controlar la biocarga y las partículas no viables. Otra configuración apropiada para el control de biocarga previo a la filtración utiliza dos etapas de filtración separadas en el tiempo: el líquido se esteriliza por filtración en un tanque esterilizado en el cual se conserva antes de realizar una esterilización por filtración final (Figure 3).
,_ u u
Líquido no estéril
Filtro de reducción de biocarga
Líquido con biocarga controlada
E9 t
Filtro de grado de esterilización
o Líquido filtrado estéril
Figura 3. Control de biocarga usando dos etapas de filtración. En cada uno de estos escenarios, la biocarga y los niveles de partículas que se confrontan finalmente al filtro de grado de esterilización son bajos y se controlan mediante prefiltración. Cuando el proceso resulta en una biocarga previa a la filtración consistentemente baja y controlada, resulta apropiado el uso de un solo filtro de grado de esterilización.
USP 39
Información General/ (1229.4) Esterilización de Líquidos por Filtración 1831
Sin importar la estrategia empleada, los estudios de validación deben demostrar la capacidad para obtener de manera consistente los niveles requeridos de biocarga previa a la filtración, así como la reducción y control del nivel de partículas.
RESPONSABILIDADES Fabricante del Filtro El fabricante del filtro es responsable de asegurar que el proceso de producción del filtro haya sido validado y esté bien controlado, y de que los filtros de grado de esterilización cumplan con los requisitos de la norma ASTM F838-05 (2013). Asimismo, el fabricante del filtro determina la especificación de la prueba de integridad para los filtros, y generalmente agrega un factor de riesgo para asegurarse de que cada filtro cumplirá con dicha especificación. El fabricante del filtro también lleva a cabo estudios de material extraíble y lixiviables para asegurarse de que el filtro no libere niveles cuestionables de estos materiales en los sistemas de disolventes comúnmente empleados en la fabricación de productos farmacéuticos. El fabricante del filtro realiza pruebas de limpieza para asegurarse de que el filtro no afecte de manera adversa los requisitos de partículas de la USP para el producto. Finalmente, el fabricante del filtro provee asistencia técnica y asesoría sobre resolución de problemas a los usuarios del filtro.
Usuario del Filtro El usuario del filtro tiene la responsabilidad de establecer una retención microbiana acorde al valor validado de la prueba de integridad, de establecer una retención microbiana en el líquido que se va a filtrar, y de validar el uso y esterilización del filtro y su ensamble. El usuario del filtro es responsable de determinar que el filtro no afecte adversamente la composición del líquido filtrado mediante adición o extracción.
RESOLUCIÓN DE PROBLEMAS El incumplimiento de un filtro con la prueba de integridad puede significar que el filtro está dañado, que el ensamble no está adecuadamente sellado, que no está humedecido por completo o que no está íntegro. También puede significar que el filtro se ha etiquetado incorrectamente (p.ej., tiene el tamaño de poro incorrecto) o que el aparato de la prueba de integridad no ha sido configurado o calibrado de manera apropiada. La causa de incumplimiento con una prueba de integridad se puede determinar evaluando la configuración de la prueba, los parámetros de prueba, el fluido humectante y el procedimiento de humectación; asegurándose de que el sistema esté exento de pérdidas y que la temperatura sea constante; y asegurándose de que el equipo de prueba se haya calibrado apropiadamente. Cuando no sea posible determinar la causa del incumplimiento, los analistas pueden volver a humedecer el filtro y repetir la prueba de integridad, incrementando así el tiempo de purga, el volumen de purga y la presión diferencial. Puede resultar beneficioso usar un fluido de referencia con una tensión superficial menor (p.ej., alcohol isopropílico al 70%). Cuando el filtro no cumpla con la prueba de integridad usando el líquido de referencia, se deberá considerar como falto de integridad. Además, el filtro puede devolverse al fabricante para un análisis completo para dilucidar con mayor detalle la causa del incumplimiento con la prueba de integridad.
REFERENCIAS
1. USP General Chapters-Microbiology Expert Committee. An outline of planned changes to USP (1211) Sterilization and Sterility Assurance of Compendia/ Articles. Pharmacopeial Forum. 2012; 38(2). 2. ASTM F838-05, Standard Test Method far Oetermining Bacteria/ Retention of Membrane Filters Utilized far Liquid Filtration. West Conshohocken, PA: ASTM; 2013. 3. ]ornitz M.W., Meltzer T.H. Sterile Filtration: A Practica/ Approach. New York: Marcel Dekker; 2001. 4. Pall D.B., Kirnbauer E.A., Allen B.T. Particulate retention by bacteria retentive membrane filters. Colloids Surfaces.
1980;1 (3-4):235-256. 5. Leahy T.J. Validation of Bacteria/ Retention by Membrane Filtration: A Proposed Approach far Oetermining Sterility Assurance [dissertation]. Boston: University of Massachusetts; 1983. 6. Williams R.E., Meltzer T.E. Membrane structure: The bubble point and particle retention: A new theory. Pharm Technol.
1983;7(5):36-42. 7. Reti A.R. An assessment of test criteria in evaluating the performance and integrity of sterilizing filters. Bu// Parent Drug Assoc. 1977;31(4):187-194.
8. Carter ].R., Levy R.V. Microbial retention testing in the validation of sterilizing filtration. In: Meltzer T.H., jornitz M.W., eds. Filtration in the Biopharmaceutical /ndustry. New York: Marcel Dekker; 1998:599. 9. Tolliver D.L., Schroeder H.G. Particle control in semiconductor process streams. Microcontamination. 1983;1 (1 ):34-43.
1832 (1229.4) Esterilización de Líquidos por Filtración/ Información General
USP 39
1O. Leahy T.J., Sullivan M.J. Validation of bacteria! retention capabilities of membrane filters. Pharm Technol. 1978;2(11 ):6575. 11. Sunderam S., Auriemma M., Howard G. Jr., Brandwein H., Leo F. Application of membrane filtration for removal of diminutive bioburden organisms in pharmaceutical products and processes. PDA j Pharm Sci Technol. 1999;53(4):186-201. 12. Johnston P.R., Meltzer T.H. Comments on organism challenge levels in sterilizing-filter efficiency testing. Pharm Technol. 1979;3(11):66-70,11 o. 13. PDA. Sterilizing filtration of liquids, Technical Report no. 26. PDA j Pharm Sci Technol. 2008;62(suppl. 5):2-60. 14. Elford W.J. The principie of ultrafiltration as applied in biological studies. Proc Roy Soc (Lond). 1933;12B:384-406. 15. Zierdt C.H., Kagan R.L., MacLawry J.D. Development of a lysis-filtration blood culture technique. j Clin Microbio/. 1977;5(1 ):46-50. 16. Tanny G.B., Meltzer T.H. The dominance of adsorptive effects in the filtrative sterilization of a flu vaccine. j Parenteral Drug Assoc. 1978;32(6):258-267. 17. Zahka J.C., Grant D.C. Predicting the performance efficiency of membrane filters in process liquids based on their pore-size ratings. Microcontamination. 1992;9(12):23-29.
(1229.6) ESTERILIZACIÓN EN FASE LÍQUIDA INTRODUCCIÓN La destrucción de microorganismos se puede llevar a cabo de diversas maneras. Además de los métodos clásicos de vapor, calor seco y radiación, la esterilización destructiva también puede realizarse mediante inmersión en una solución química, lo cual se denomina esterilización en fase líquida (7 ). En condiciones apropiadas, una variedad de agentes químicos tales como aldehídos, ácidos, bases y oxidantes fuertes en solución son capaces de destruir bacterias y hongos, incluyendo células vegetativas y esporas de manera cuantitativa (2,3). Los objetos que se van a esterilizar se sumergen en la solución del agente químico para posteriormente eliminar el agente de un modo tal que se prevenga la recontaminación del objeto esterilizado. La eliminación del esterilizante químico de las superficies expuestas esterilizadas debe realizarse manteniendo la esterilidad del artículo después del procesamiento. La recontaminación está fuera del alcance de los puntos comunes a considerar para los procesos de esterilización. Sin embargo, en la esterilización química con líquidos, resulta común incluir la eliminación del agente (independientemente de que se logre a través de medios físicos o químicos) en el proceso general, junto con cualquier etapa adicional requerida para evitar la recontaminación. Un número considerable de líquidos en solución acuosa son capaces de esterilizar artículos durante la inmersión. Entre los ejemplos se incluyen los siguientes: • Aldehídos-glutaraldehído, formaldehído •Ácidos-ácido peracético, ácido nítrico, ácido sulfúrico • Bases-hidróxido de sodio, hidróxido de potasio • Compuestos de oxigenación-peróxido de hidrógeno, ozono, dióxido de cloro • Haluros-hipoclorito de sodio, cloro Al igual que con la esterilización con gases, la efectividad de los esterilizantes químicos varía con la concentración y la temperatura. Otros factores que afectan la actividad antimicrobiana incluyen el pH, la duración del mezclado (si estuviera presente) y la presencia de residuos celulares o de otro tipo. Debido al número limitado de variables, el control del proceso de esterilización con líquidos es relativamente simple. Puesto que no existen indicadores biológicos ampliamente aceptados para la esterilización con líquidos, resulta habitual el uso de un formador de esporas mesófilo común tal como Bacillus atrophaeus o B. subtilis debido a que estos son los aislados de biocarga probablemente más desafiantes. Los agentes usados para la esterilización con líquidos varían con respecto a la estabilidad del esterilizante, al intervalo de pH efectivo, a la concentración, a la temperatura, al tiempo de contacto requerido y a la interacción potencial con los materiales. Al seleccionar el esterilizante más apropiado, los fabricantes deben considerar su efecto sobre los materiales, los componentes del envase y el equipo, tal como ocurre con todos los demás procesos de esterilización. La variedad de agentes, diversidad de los procesos, así como las potenciales aplicaciones descartan una revisión de estos agentes para cada material en el presente capítulo. Los fabricantes deben tener en cuenta que estos agentes son altamente tóxicos y que se deben tomar medidas apropiadas de seguridad en todo momento durante el desarrollo del ciclo, la validación y la operación de rutina.
VALIDACIÓN DE LA ESTERILIZACIÓN CON LÍQUIDOS Las pruebas experimentales han demostrado que la cinética de primer orden es apropiada para la destrucción microbiana, lo cual hace de la validación un ejercicio simple. La validación de esterilización con líquidos se puede lograr usando el enfoque de medio ciclo o el método de selección de extremos.
USP 39
Información General/ (1229.6) Esterilización en Fase Líquida 1833
Enfoque de Medio Ciclo El enfoque de medio ciclo descrito a continuación es una modificación del método descrito en el capítulo Esterilización por Gases (1229.7) (ver la Figura 7). Se trata de un método que requiere la destrucción de un microorganismo resistente en condiciones letales definidas. En la operación de rutina, el periodo de residencia se duplica arbitrariamente y sustenta una reducción teórica del indicador biológico (y por ende, de la biocarga) a una probabilidad de una unidad no estéril de al menos 10-6 para un ciclo completo. 10' 10~
Punto final típico del Indicador Biológico (18)
10" e:
·O
ara desafío
10"'
·¡:;
"' :ñ
1()-<
o
a. 10-' 10º"
10-15 10-18
9
12 15 18 21 24 Tiempo (minutos)
27
30
Figura 1. Validación de la esterilización por medio ciclo. El método de medio ciclo se usó originalmente para la esterilización con óxido de etileno cuando se tenía menos certeza sobre la relación entre los microorganismos y los parámetros del proceso generados.
Enfoque de Selección de Extremos En este método (ver la Figura 2), los analistas evalúan las condiciones de concentración y temperatura que abarcan la condición definida del proceso para sustentar el sobretratamiento de los materiales y el subtratamiento de la biocarga. Los usuarios pueden establecer la tasa de muerte de la población microbiana para cada una de las condiciones que abarcan el proceso de rutina.
103
Menor
letalidad, menor
10°
impacto sobre los productos
e 10" •O
-~ 10-ó :ñ
g_
10°" Mayor
leta\idad, mayor impacto
sobre los productos
6
12 15 18 21 24 Tiempo (minutos)
27
30
Figura 2. Método de selección de extremos. Independientemente del método usado, para completar el desarrollo y la validación del ciclo, los fabricantes deben identificar un método de neutralización rápida que desactive el agente químico para permitir la cuantificación microbiana después de la exposición fracciona! de muerte. Puede ser necesario que los periodos de exposición sean breves debido a que muchos de estos agentes tienen velocidades rápidas de muerte.
1834 (1229.6) Esterilización en Fase Líquida/ Información General
USP 39
Calificación del Equipo La calificación del equipo es un programa predefinido que examina el equipo para confirmar que ha sido instalado adecuadamente y que opera conforme a lo previsto antes del proceso de esterilización. Esta actividad para la esterilización con productos químicos líquidos resulta simple debido que el equipo usado rara vez es complejo. El control de la temperatura y las velocidades de agitación/recirculación son los factores esenciales a tomar en cuenta.
Definición de Componentes y Carga La esterilización con líquidos es un fenómeno de superficie en el cual todas las superficies de los materiales deben sumergirse en el esterilizante. La uniformidad del tratamiento se puede asegurar mediante la recirculación o el mezclado del esterilizante durante el proceso. Además, se debe confirmar la penetración en los lúmenes de las agujas, en las partes estrechamente ajustadas y en materiales porosos. El uso de una carga máxima por vaso o envase definido representa las condiciones más exigentes debido a que provee el área superficial máxima que se va a esterilizar.
Indicadores Biológicos Los organismos indicadores comunes para la esterilización química son B. atrophaeus ATCC 9372 or B. subtilis ATCC 6633. El desafío de esporas se inocula directamente sobre los artículos. Los usuarios finales deben determinar la población de los artículos inoculados. Los fabricantes deben colocar indicadores dentro de las cargas en los lugares que se consideran de más difícil acceso para el agente, basándose en un examen visual.
Confirmación del Proceso/Desafío Microbiológico El núcleo de la actividad de validación radica en confirmar parámetros del proceso aceptables y la inactivación del desafío microbiano. El usuario final debe esperar una curva lineal de muerte para el desafío de esporas y requerir la muerte total del desafío. Asimismo, el usuario final puede considerar el ajuste de la concentración del esterilizante químico, el tiempo de proceso, la agitación, entre otros factores. La evidencia de la eficacia del ciclo se obtiene mediante estudios repetidos en los que se mata a los indicadores biológicos y se documentan las mediciones físicas.
Neutralización/Eliminación del Agente Después de la exposición, el agente esterilizante debe ser adecuadamente eliminado de los artículos o neutralizado antes del procesamiento adicional. Este segmento del proceso emplea neutralización química o eliminación física y debe llevarse a cabo de manera tal que se conserve la esterilidad de los artículos. Se debe también proveer un procesamiento aséptico con una capacidad apropiada demostrada. Se espera la simulación del proceso, comenzando con la culminación de la esterilización mediante la colocación en un envase estéril sellado. Ver Esterilización y Garantía de Esterilidad de Artículos Farmacopeícos (1211) para información adicional.
Control Rutinario del Proceso La esterilización en fase líquida debe someterse a controles para mantener el estado validado. Las prácticas descritas en Esterilización de Artículos Farmacopeícos (1229) tratan los requisitos generales para todos los sistemas de esterilización. La esterilización se logra mediante una variedad de prácticas relacionadas que son esenciales para el uso continuo del proceso durante un periodo prolongado, incluyendo calibración, mediciones físicas y químicas, control continuo del proceso, control de cambios, mantenimiento preventivo, reevaluación periódica y capacitación.
REFERENCIAS 1. Agalloco J. Gas, liquid, and vapor sterilization. In: Nema S, Ludwig J, eds. Pharmaceutíca/ Dosage Forms: Parenteral Medícatíons. 3rd ed. New York: Informa USA; 201 O. 2. Favero MS and Bond WW. Chemical disinfection of medical and surgical materials. In: Block SS, ed. Dísínfection, Sterílízatíon, and Preservatíon. 5th ed. Philadelphia: Lippincott Williams and Wilkins; 2001. 3. Block SS. Peroxygen compounds. In: Block SS, ed. Dísínfectíon, Sterílízatíon, and Preservatíon. 5th ed. Philadelphia: Lippincott Williams and Wilkins; 2001.
USP 39
Información General/ (1229.7) Esterilización por Gases 1835
(1229.7) ESTERILIZACIÓN POR GASES INTRODUCCIÓN El uso de gases esterilizantes para la preparación de materiales y equipo es común para artículos que son susceptibles a daños por procesos de calor o radiación. Las superficies de muchos materiales poliméricos, en especial los dispositivo médicos, se esterilizan usando este método, pues se trata de un proceso exento de presión. La esterilización de polvos secos usando gases resulta inapropiada debido a la incapacidad de los gases para penetrar materiales sólidos. La mayoría de los procesos de esterilización con gases emplean óxido de etileno (OE), y los procedimientos para usar con otros gases por lo general se delinean siguiendo las prácticas para OE. El ozono, los óxidos de nitrógeno mezclados y el dióxido de cloro son algunos de los otros gases esterilizantes usados. [Los sistemas que pueden existir en fase líquida y gaseosa a las temperaturas operativas (p.ej., peróxido de hidrógeno, ácido peracético y paraformaldehído) no se consideran en este capítulo.] La capacidad del OE para penetrar a través de polímeros, materiales celulósicos, y otros materiales, permite su uso para la esterilización terminal de dispositivos médicos en su empaque final. Los otros gases esterilizantes pueden ser adecuados para aplicaciones similares. El control de procesos para el equipo de esterilización con gases se logra controlando la concentración del gas esterilizante, la humedad relativa, la temperatura y la presión del sistema. Además, puede resultar beneficioso mezclar el gas en la cámara de esterilización. Se puede usar la liberación paramétrica tal como se describe en Productos Farmacéuticos con Esterilización Terminal-Liberación Paramétrica (1222) para la esterilización con OE. La esterilización con gases difiere significativamente de aquellos procesos en los que el agente usado se puede condensar durante la operación. Los procesos de esterilización con vapor se discuten por separado en el capítulo Esterilización en Fase de Vapor (1229 .11 ). Conforme a lo descrito en el capítulo Esterilización de Artículos Farmacopeicos (1229), los analistas deben tener cuidado de asegurar la esterilidad y demostrar que los atributos de calidad esenciales de los materiales no se ven afectados de manera adversa por el proceso. Con respecto a los procesos con gases, las consideraciones clave incluyen los efectos inmediatos del gas esterilizante sobre los materiales o el equipo que se está esterilizando, el esterilizante residual, los sub-productos del esterilizante y las reacciones químicas potenciales. Los procesos comunes con gas difieren un poco con respecto a la ejecución del proceso y a los asuntos de los materiales, por lo que se describen de manera individual.
ÓXIDO DE ETILENO El OE es un poderoso agente alquilante que destruye microorganismos mediante una reacción química, principalmente con el ADN celular. El mecanismo destructivo sigue en gran medida una cinética de primer orden y depende de la concentración, la humedad y la temperatura. El uso de OE para esterilizar dispositivos médicos en sus envases finales impacta en gran medida el diseño de otras aplicaciones de los procesos de esterilización con OE (y, en menor medida, toda la esterilización con gas) (2,3). El proceso con OE común sigue una secuencia de prehumidificación, eliminación del aire, rehumidificación en la cámara, exposición al gas, eliminación del gas de la cámara y aeración posterior a la exposición. Las etapas previas a la exposición aseguran la presencia de la humedad adecuada sobre y dentro de los artículos que se están esterilizando. Las etapas posteriores a la exposición proveen tiempo para la difusión del OE y sus subproductos fuera de los materiales y del envase. Cuando el OE se usa para equipos no porosos, el proceso se puede simplificar, lo cual elimina muchas de las etapas previas y posteriores a la exposición puesto que sólo se necesita la esterilización superficial. Durante la esterilización con OE, el gas es introducido al inicio, y sólo se necesitan adiciones mínimas posteriores para mantener la presión a medida que el gas se absorbe en la carga de material/esterilización dentro del contenedor. Asimismo, puede ser necesario ajustar la humedad durante el proceso. En algunos casos, el OE reacciona con materiales en la carga para formar etilenclorohidrina y etilenglicol. Estos compuestos, incluyendo el OE, se deben reducir a niveles seguros antes de que los artículos puedan ser usados por pacientes ( 4,5). El procesamiento con OE requiere de una estricta seguridad del trabajador así como estrictos controles ambientales debido a que se relaciona con carcinogenicidad, mutagenicidad y neurotoxicidad. Asimismo, el OE es explosivo en concentraciones de más de 2,6% por volumen en el aire; por lo tanto, a menudo se usan gases inertes para minimizar la inflamabilidad. La cepa de indicador biológico (IB) comúnmente aceptada es Bacillus atrophaeus (anteriormente B. subtilis var. niger).
OZONO El ozono es un potente agente oxidante producido mediante el paso de una corriente de oxígeno o aire a través de un campo eléctrico de alto voltaje. El ozono es un agente biocida efectivo para el tratamiento de suministros de agua y ha demostrado letalidad a concentraciones de 2%-10% en el aire. La destrucción microbiana óptima se logra cuando la humedad relativa está por encima del 80% a temperatura ambiente. El ozono se degrada a oxígeno en presencia de humedad y metales y, por lo tanto, regularmente se genera in situ. El ozono no penetra materiales porosos al mismo grado que el OE. La simplicidad de los sistemas de procesamiento que usan ozono para esterilización con gas representa una ventaja. Su generación y destrucción (usando un convertidor catalítico) se logran sin partes móviles o consumibles además del oxígeno provisto. El proceso de este-
1836 (1229.7) Esterilización por Gases/ Información General
USP 39
rilización usa una secuencia de humidificación, inyección, exposición y ventilación para eliminar el ozono de la cámara al final del ciclo. Los IB comunes identificados para ozono son Geobacillus stearothermophilus y Bacillus atrophaeus.
DIÓXIDO DE CLORO El dióxido de cloro es un gas esterilizante efectivo. El dióxido de cloro puro es metaestable y, por ende, se genera a medida que es requerido. El dióxido de cloro no es carcinogénico ni inflamable y resulta efectivo a temperatura ambiente. Su capacidad para penetrar materiales puede ser menor que la del OE. Un proceso de esterilización típico con dióxido de cloro usa una secuencia de preacondicionamiento, periodo de residencia para acondicionamiento, carga y exposición seguida de aeración. El IB de uso más común es el Bacillus atrophaeus.
DIÓXIDO DE NITRÓGENO El dióxido de nitrógeno es un gas esterilizante efectivo a temperatura ambiente. Asimismo, el dióxido de nitrógeno líquido se convierte en gas al introducirlo en la cámara de esterilización, además de que no es explosivo y sus residuos no son carcinogénicos, citotóxicos ni teratogénicos. Presenta una capacidad limitada para penetrar materiales poliméricos en comparación con el OE, lo que acelera la aeración posterior al ciclo. Es incompatible con materiales celulósicos tales como papel y cartón. Los IB sugeridos para dióxido de nitrógeno son G. stearothermophilus y B. atrophaeus.
VALIDACIÓN DE LA ESTERILIZACIÓN CON GASES La validación de la esterilización con gases por lo general comienza con el establecimiento de un "tiempo de residencia mínimo letal del proceso" a través del uso de estudios de exposición fracciona!. Estos estudios fraccionales establecen dicho tiempo de exposición, en condiciones estándares de procesamiento, cuando el indicador biológico está completamente desactivado. Este tiempo de exposición mínimo se convierte entonces en el fundamento para la aplicación del método del medio ciclo para validar el ciclo de esterilización. Ante la ausencia de información que relacione el efecto de las variaciones en la concentración del gas, humedad y temperatura sobre los microorganismos, se asume en forma conservadora en la que la biocarga tiene una resistencia y población iguales a las del indicador biológico. El método del medio ciclo se puede definir del siguiente modo. La validación por el método del medio ciclo requiere la destrucción de una alta concentración (no menos de 1Q6 esporas) de un microorganismo resistente en condiciones mínimas definidas para lograr la mortalidad total. Esto establece el tiempo de residencia mínimo letal del proceso. En la operación de rutina, el tiempo de residencia del proceso se duplica arbitrariamente y sustenta una reducción teórica del indicador biológico (y por ende, de la biocarga) a una probabilidad de una unidad no estéril (PNSU) de 10-6 (las definiciones de los términos usados en este capítulo se encuentran en el capítulo Esterilización de Artículos Farmacopeicos (1229)). El método del medio ciclo usado para esterilización con gases se ilustra en la Figura 7. 10' 10'
Punto final típico del 1B para desafío
10°
e: 10-0
•O
·¡:¡
:e"'o a_
10.. 10..
...
•
10-12 10-"
··.··..
··...··.
10·18
··•..
g
12 15 18 21 24 Tiempo (minutos)
27
30
Figura 1. Validación de la esterilización del medio ciclo. Se encuentran disponibles enfoques alternativos para la validación del ciclo. Gillis y Mosley desarrollaron un medio para la evaluación paramétrica de las condiciones de esterilización con OE que puede resultar en un mayor uso de otros métodos de validación (6). Se ha usado un método de selección de extremos (ver la Figura 2) que sustenta de mejor manera los intervalos operativos del proceso para los parámetros críticos con respecto al método del medio ciclo. En el método de selección de extremos, se evalúan las condiciones que agrupan la condición definida del proceso para establecer los parámetros para los efec-
USP 39
Información General/ (1229.7) Esterilización por Gases 1837
tos mínimos y máximos sobre los materiales y la biocarga. El tiempo de residencia mínimo letal del proceso (ver la descripción del medio ciclo anterior) establece las condiciones más exigentes para la mortalidad microbiana. Los aumentos graduales del tiempo de residencia del proceso que rebasan el tiempo de residencia mínimo letal del proceso se usan para establecer los periodos de rutina y de máxima exposición, teniendo éste último el mayor efecto sobre los materiales. Asimismo, los ajustes en la concentración de agentes y la humedad relativa se utilizan para mejorar en mayor medida el método de selección de extremos. A través de este método, se pueden establecer las condiciones de proceso de rutina entre las condiciones mínimas y máximas del proceso para asegurar la mortalidad microbiana total, manteniendo al mismo tiempo la integridad de los materiales. 106 Menor letalidad, menor
10°
impacto sobre los productos
e: 10"" •O
-~ 10~
:a
~ 10"" Mayor letalidad,
10-15
mayor
10-••
sobre los productos
impacto
3
6
9
12 15 18 21 24 Tiempo (minutos)
27
30
Figura 2. Método de selección de extremos.
Calificación del equipo La calificación del equipo para esterilización con gases debe incluir sistemas previos y posteriores al ciclo para confirmar que el equipo se ha instalado apropiadamente y opera según lo previsto.
Parámetro de Distribución en la Cámara Vacía Aunque se utilicen gases verdaderos, la evaluación del parámetro de uniformidad a través de la cámara es una actividad común. Esto asegura que los métodos de introducción de gas y de humedad se mantengan uniformes en toda la cámara y que puedan correlacionarse con las ubicaciones de monitoreo de rutina, cuando se encuentren presentes. Los indicadores biológicos no son necesarios en la evaluación de la uniformidad de la cámara vacía.
Mapeo de Componentes y de Carga El mapeo de componentes y carga usando muestreo invasivo no forma parte de la esterilización con gases puesto que los sistemas de muestreo colocados dentro de los artículos de carga alterarían la penetración de gas y humedad. La evaluación de condiciones letales con artículos individuales y a través de patrones de carga se logra de mejor manera mediante indicadores biológicos o dispositivos de desafío del proceso colocados dentro de los artículos de carga y distribuidos dentro de la misma. Los indicadores o dispositivos de control del proceso se colocan dentro de los artículos y la carga en sitios donde se considera más difícil la penetración de gas y humedad.
Indicadores biológicos El indicador biológico de elección para la esterilización con gases varía, tal como se indicó anteriormente. El B. atrophaeus (ATCC 9372) se usa con OE y dióxido de cloro, mientras que la esterilización con ozono se monitorea con G. stearothermophilus (ATCC 12980 ó 7953). Los valores D para el indicador biológico se pueden usar para establecer los periodos de exposición para el proceso de esterilización, con el fin de asegurar la eficacia del proceso adecuado. Al colocar los indicadores biológicos dentro de los artículos, es importante asegurarse de que la colocación del IB no obstruya el paso del gas o interfiera de otra manera con la distribución/penetración del esterilizante dentro del artículo.
Confirmación del Proceso y Desafío Microbiológico La parte más importante de la actividad de validación es la confirmación de parámetros aceptables del proceso con la medición física y química simultánea y el desafío microbiano. Los sensores se colocan en la cámara o se colocan indicadores biológi-
1838 (1229.7) Esterilización por Gases/ Información General
USP 39
cos dentro de los artículos de carga. La prueba de la eficacia del ciclo se obtiene en estudios repetidos en los que se mata a los indicadores biológicos y las mediciones físicas corresponden con los niveles esperados.
CONTROL RUTINARIO DEL PROCESO La esterilización con gases se somete a controles formales que mantienen un estado validado con el paso del tiempo. Las prácticas descritas en el capítulo (1229) incluyen los requisitos generales apropiados para todos los sistemas de esterilización. La esterilización se logra mediante una variedad de prácticas relacionadas que son esenciales para el uso continuo del proceso durante un periodo extenso. Las prácticas esenciales para mantener el estado validado incluyen la calibración, las mediciones físicas, el control continuo del proceso, el control de cambios, el mantenimiento preventivo, la reevaluación y capacitación periódicas. Cuando no se ha establecido la liberación paramétrica, los indicadores biológicos colocados dentro de la carga se usan para la liberación de rutina de cada carga de esterilización, junto con una revisión de la documentación obtenida del sistema de control del esterilizador.
REFERENCIAS 1. USP General Chapters-Microbiology Expert Committee. An outline of planned changes to USP (1211) Sterilization and Sterility Assurance of Compendia/ Artic/es. Pharmacopeial Forum. 2012; 38(2). 2. ISO 111 35-1 :2007 Sterilization of Health Care Products-Ethylene Oxide-Part 1: Requirements for Development, Validation, and Routine Control of a Sterilization Process for Medical Devices. Geneva: lnternational Organization for Standards {ISO); 2007. 3. ISO 11135-2:2008 Sterilization of Health Care Products-Ethylene Oxide-Part 2: Guidance on the Application of ISO 11135-1. Geneva: lnternational Organization for Standards {ISO); 2008. 4. ISO 10993-7 Biological Evaluation of Medical Devices, Part 7: Ethylene Oxide Sterilization Residuals. Geneva: lnternational Organization for Standards {ISO); 2008. 5. Ethylene oxide, ethylene chlorohydrin, and ethylene glycol proposed maximum residue limits and maximum levels of exposure. Fed Regist. 1978; 43(122):27474-27483. 6. Gillis J, Mosley G. Validation of ethylene oxide sterilization processes. In: Agalloco J, Carleton FJ, eds. Validation of Pharmaceutical Processes. 3rd ed. New York: lnformaUSA; 2007.
(1229.8) ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO La esterilización con calor seco es un proceso utilizado para artículos termoestables (vidrio, acero inoxidable, líquidos no acuosos, polvos, etc.) que no son adecuados para la esterilización con vapor debido a la ausencia de agua (líquidos no acuosos y polvos) o a los requisitos de sequedad absoluta posterior al procesamiento (partes de contacto de los productos para productos no acuosos). Debido a que el calor seco depende del aire para la transferencia de calor hacia y desde los artículos de carga, el proceso toma más tiempo que un proceso con vapor para un artículo o carga de tamaño comparable. Los periodos de calentamiento y enfriamiento prolongados requieren que los artículos de carga no se afecten por el calor durante un largo periodo, además de que requieren el uso del método de sobremuerte para el desarrollo y la validación del ciclo. La esterilización con calor seco por lo regular se lleva a cabo en el intervalo de 160º-190º cuando el objetivo se centra en esterilizar y no en despirogenizar. (La despirogenización se tratará por separado en el capítulo Despirogenización con Calor Seco (1228.1 )). En la esterilización con calor seco, el aire caliente entra en contacto directo con los artículos de carga (con o sin envoltorio) y transfiere algo de su energía térmica. A diferencia de la esterilización con vapor, en la esterilización con calor seco el medio de calentamiento no experimenta un un cambio de fase y, por ende, la transferencia de calor es menos eficiente. Los artículos pueden ser de acero inoxidable, vidrio, cerámica u otros materiales termoestables, y pueden estar envueltos o cubiertos con papel aluminio para protegerlos durante la manipulación previa y posterior al proceso. La esterilización con calor seco se usa comúnmente para materiales termoestables (p.ej., vaselina o polvos). Debido a que el aire tiene una capacidad de transferencia de calor limitada, se requiere que los artículos en el horno se coloquen en sitios que se hayan confirmado como aceptables durante la validación. Los fabricantes deben tener precaución con los tamaños variados de carga debido a que, en algunos casos (como resultado del diseño del sistema y la colocación de la sonda de control) los tamaños mínimos de carga pueden representar las condiciones más exigentes.
CONTROL DEL CICLO DE ESTERILIZACIÓN El equipo para la esterilización con calor seco se controla mediante sensores de temperatura calibrados. Durante los periodos de exposición del ciclo, la consecución de un tiempo de residencia mínimo a una temperatura predefinida se usa para documentar la letalidad del proceso. La eficacia del ciclo para esterilización con calor seco por lo general se mide usando FH, que
Información General/ (1229.8) Esterilización por Calor Seco 1839
USP 39
comúnmente se define como la cantidad de tiempo durante el cual la carga recibe el equivalente a una exposición a 170º. Se usa para comparar procesos de esterilización que operan en condiciones de temperatura variables con un solo estándar. Se puede calcular la letalidad del proceso a temperaturas diferentes de 170º para determinar la letalidad equivalente a aquella provista a 170º. Los sistemas de control del esterilizador deben generar las condiciones para la relación FH de tiempo y temperatura dentro de un intervalo definido. Se pueden usar matemáticas simples para calcular la letalidad total durante el transcurso del proceso. Para la temperatura de referencia específica de 170º y un valor z (las definiciones se encuentran en el capítulo Esterilización con Vapor de Agua por Contacto Directo (1229 .1)) de 20º, el cálculo FH se puede determinar usando la siguiente ecuación:
F. = H
FH
T-170) (T-170) f 1O(20 dt = ""t, 1O 20 M t,
~
~~
= letalidad acumulada
t2 =tiempo final t1 =tiempo inicial
T = temperatura La acumulación de letalidad (FH) para el proceso de esterilización a través del ciclo completo (incluyendo los segmentos de calentamiento y enfriamiento) incluye la contribución de tales segmentos y permite definir el ciclo mediante una letalidad predeterminada en lugar de un tiempo a la temperatura mínima definida.
VALIDACIÓN DE LA ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO Debido a que el aire tiene una capacidad de calor limitada y a que las condiciones de calor seco son más variables que las encontradas con otros métodos de esterilización terminal, los analistas validan de manera rutinaria sus procedimientos de esterilización con calor seco usando el método de sobremuerte conforme a lo definido en el capítulo Esterilización de Artículos Farmacopeicos (1229). La esterilización por sobremuerte se puede definir como un método en el que la destrucción de una alta concentración de un microorganismo resistente sustenta la destrucción de una biocarga razonablemente prevista que pudiera estar presente durante el procesamiento de rutina. Dicho objetivo se puede demostrar al conseguir cualquiera de los siguientes puntos: una letalidad mínima definida; una serie de condiciones del método definidas; o la confirmación de una reducción logarítmica mínima de un indicador biológico resistente. Los requisitos de validación para el método de sobremuerte son menos onerosos que los de los otros enfoques de esterilización. Debido a que los artículos de carga pueden resistir cantidades significativas de calor sin sufrir efectos adversos, resulta claramente justificable la mayor letalidad provista por el método de sobremuerte.
Calificación del Equipo La calificación del equipo es un programa predefinido que se enfoca en el equipo de esterilización para confirmar que éste ha sido apropiadamente instalado y que opera conforme a lo planeado antes de la evaluación del proceso de esterilización. En algunas compañías, la calificación del equipo se separa en calificación de la instalación y en calificación operativa, o se agrupa usando una terminología de calificación de la instalación/operativa conjunta. El uso principal de la calificación del equipo de esterilización es proveer una línea base para mantenimiento preventivo y control de cambios, asegurando la reproducibilidad de la operación con el paso del tiempo y garantizando que el proceso de esterilización se realice de manera uniforme y con exactitud.
Distribución de la Temperatura en la Cámara Vacía El equipo se debe evaluar para determinar la distribución de la temperatura en la cámara vacía. El horno o el túnel debe ser evaluado para determinar el intervalo de temperaturas dentro del sistema, y los parámetros del ciclo deben determinarse para asegurar una letalidad adecuada a través de la carga esperada. Los criterios de aceptación para cámaras vacías pueden variar con las capacidades del equipo y el uso común, pero por lo general son menos uniformes que los observados en los esterilizadores con vapor. Los indicadores biológicos no son necesarios durante la evaluación de la distribución de la temperatura en la cámara vacía.
Mapeo de Componentes Los artículos de carga que son complejos y que presentan volúmenes y superficies de contacto del producto inaccesibles deben someterse al mapeo de componentes para determinar los puntos fríos internos. Esto resulta de particular importancia en la esterilización de polvos. Para cada artículo de carga, los fabricantes deben establecer la capacidad del calor para penetrar los artículos o envases y para llevarlos a la temperatura requerida. Estos estudios se pueden llevar a cabo en un ambiente de laboratorio y no necesitan ser repetidos cuando el mismo artículo se esterilice en otro equipo. Los termopares deben colocarse
1840 (1229.8) Esterilización por Calor Seco/ Información General
USP 39
en contacto directo con los artículos que se están evaluando. Durante el mapeo de componentes, los artículos de carga deben prepararse y orientarse de una manera tal que sea congruente con la forma en que van a procesarse.
Mapeo de Carga En hornos para partidas se prefieren los patrones de carga fijos para esterilización con calor seco debido a que la capacidad de calor limitada del aire genera diferencias de temperatura significativas en toda la carga. Puede ser posible validar las cargas máximas y mínimas conforme a lo determinado ya sea por el número de artículos o su masa dentro del horno. La carga en un proceso de túnel continuo se define típicamente por las limitaciones del sistema transportador en línea. El mapeo de la carga y de los componentes asegura que todos los artículos de la carga alcancen la temperatura requerida. La información obtenida del mapeo de carga se usa para ajustar el tiempo del ciclo a fin de asegurar la letalidad apropiada. El control del sistema debe considerar la relación entre la posición de la carga y el tamaño con respecto a los sitios de control de la temperatura.
Indicadores Biológicos El indicador biológico (IB) para esterilización con calor seco es el Bacillus atrophaeus (ATCC 9372), un formador termofílico de esporas con una alta resistencia al calor seco. El desafío de las esporas se coloca en un sustrato colocado dentro de la carga o sobre un artículo de la carga. Si las esporas se usan conforme a lo previsto por el fabricante del IB, se puede usar la información sobre población y resistencia proporcionada por el proveedor. Los usuarios finales deben determinar la población y la resistencia de su indicador biológico usado al inocular sus propios artículos.
Penetración del Calor y Desafío Microbiológico Lo más importante de la validación es confirmar que haya una penetración de calor aceptable usando mediciones de temperatura y desafíos microbianos. Los termopares e IB se colocan dentro de los artículos de carga en los sitios determinados durante el mapeo de los componentes y de la carga para representar las condiciones más exigentes. Los termopares deben colocarse en contacto directo con los artículos que se están monitoreando. La evidencia de la eficacia del ciclo se obtiene mediante estudios repetidos en los que se mata a los IB y las mediciones físicas se corresponden con los valores esperados de tiempo-temperatura o FH. Si las mediciones microbianas y físicas no están correlacionadas, los fabricantes deben llevar a cabo una investigación y deben tomar acciones correctivas para rectificar la discrepancia. Este estudio por lo regular se realiza ligeramente por debajo de las especificaciones mínimas de tiempo, temperatura y/o letalidad acumulativa.
CONTROL DEL PROCESO DE RUTINA Al igual que con todos los procesos de esterilización, después de haber validado el proceso de esterilización, éste debe someterse a controles formalizados que lo mantengan dentro del estado validado con el transcurso del tiempo. El capítulo general Esterilización de Artículos Farmacopeicos (1229) detalla las prácticas generales que son apropiadas para todos los sistemas de esterilización. Esto se logra mediante una variedad de prácticas relacionadas que son esenciales para el uso continuo del proceso durante un periodo prolongado. Las prácticas esenciales para mantener el estado validado incluyen la calibración, las mediciones físicas, los integradores e indicadores físicos, los controles continuos del proceso, el control de cambios, el mantenimiento preventivo y la reevaluación y capacitación periódicas. REFERENCIAS
1. USP General Chapters-Microbiology Expert Committee. An outline of planned changes to USP (1211) Sterilization and Sterility Assurance of Compendia/ Articles. Pharmacopeial Forum. 2012; 38(2).
(1229.1 O) ESTERILIZACIÓN POR RADIACIÓN INTRODUCCIÓN La esterilización con radiación emplea el efecto letal de diversas formas de radiación como medio de destrucción microbiana. La esterilización con radiación ionizante (gamma, rayos X o haces de electrones) se usa extensamente para la esterilización de dispositivos médicos y para una variedad de otros materiales y productos. Los métodos de esterilización no ionizante tales como microondas, infrarrojo y luz ultravioleta pueden ser útiles, pero tienen aplicaciones más restringidas, por lo que quedan fuera del alcance de este capítulo. Este capítulo provee una visión general de la esterilización con radiación ionizante y de su validación, incluyendo la configuración de dosis, la compatibilidad de los materiales y la verificación de la dosis.
USP 39
Información General/ (1229.1 O) Esterilización por Radiación 1841
Los efectos de la radiación sobre los materiales pueden ser significativos y son una consideración mayor para los fabricantes al seleccionar la radiación como método de procesamiento. Las ventajas de la esterilización por irradiación incluyen la simplicidad, la ausencia de complejidad mecánica, la reproducibilidad y la eficiencia en general. En efecto, la esterilización con radiación es única debido a que el fundamento del control es esencialmente la dosis de radiación absorbida, la cual se puede medir con precisión. Los métodos usados para establecer las dosis de radiación apropiadas para lograr el nivel de garantía de esterilidad deseada se definen en las normas ISO 11137-1 Sterilization of Health Care Products (Esterilización de Productos para el Cuidado de la Salud); ISO 11137-2 Sterilization of Health Care Products-Radiation-Part 2: Establishing the Sterilization Dose; (Esterilización de Productos para el Cuidado de la Salud-Radiación-Parte 2: Establecimiento de la Dosis de Esterilización); e ISO TS 13004: 2013 Sterilization of Health Care Products-Radiation-Substantiation of Selected Sterilization Dose: Method VDmaxSD (Esterilización de Productos para el Cuidado de la Salud-Radiación-Verificación de la Dosis de Esterilización Seleccionada: Método VDmáxSD . Estos métodos incluyen el Método 1, el Método 2A, el Método 2B y el Método VDmáxi los cuales difieren en su esquema específico de análisis y en el número de artículos que se necesitan para analizar, además de que se basan en ciertas hipótesis sobre la biocarga. El uso de un indicador biológico resulta inapropiado durante la validación de la esterilización con radiación debido a que (a) existen correlaciones exactas entre la medición de la dosis y la destrucción microbiana para un amplio rango de microorganismos y (b) los métodos establecidos para el establecimiento de la dosis se basan en la biocarga del material en su estado natural. Estas correlaciones han sido desarrolladas por la industria de los dispositivos médicos y proveen una metodología directa para el control de procesos. La dosimetría desempeña un papel central en la esterilización con radiación y funciona como un medio directo para afirmar la letalidad del proceso. La dosis de radiación medida en kGy (anteriormente MRads) se relaciona directamente con los efectos letales de la radiación sobre los microorganismos. La dosis medida tiene la misma utilidad que F0 en la esterilización con vapor. El control del proceso de rutina para la esterilización con radiación se provee mediante uno o más dosímetros de referencia en el exterior de los empaques (después de que los dosímetros han sido correlacionados durante la validación con la medición de la dosis dentro del empaque). La robustez y confiabilidad de la dosis absorbida del artículo que se va a esterilizar puede sustentar la liberación paramétrica, conforme a lo descrito en el capítulo Productos Farmacéuticos con Esterilización Terminal-Liberación Paramétrica (1222), para muchos artículos.
ESTERILIZACIÓN GAMMA La esterilización gamma implica el uso de una instalación específicamente diseñada donde los artículos que se van a esterilizar se exponen a una fuente de radiación de Co 60 en una manera que asegure la dosificación uniforme. Los fotones de alta penetración (rayos gamma) son emitidos a partir de Co 60 a medida que éste decae a Ni 60 . La vida media para este isótopo es de 5,27 años, lo que significa que en el transcurso de cada año la fuente pierde aproximadamente 12% de su radioactividad. Esta reducción continua de radioactividad requiere que los operadores del proceso ajusten sus controles de proceso (por lo general el tiempo de exposición) para mantener la dosis establecida requerida. De manera periódica, se requiere una cantidad adicional de Co 60 para mantener el rendimiento.
ESTERILIZACIÓN CON RAYOS X Los esterilizadores de rayos X generan fotones altamente penetrantes similares a los fotones gamma de los irradiadores de Co 60 . Los fotones de rayos X se generan cuando los electrones acelerados impactan un blanco tal como el tántalo. Estos sistemas se basan en el barrido de materiales con fotones de rayos X para esterilizarlos. Cuando se mantienen adecuadamente, estos sistemas son capaces de proveer una dosis constante con el paso del tiempo. No se requiere ninguna fuente radioactiva localizada para los sistemas de esterilización de rayos X.
ESTERILIZACIÓN CON HAZ DE ELECTRONES Los sistemas de haces de electrones se basan en el barrido de objetos con electrones enfocados para esterilizar los artículos con un campo de radiación definido. Estos sistemas, cuando se mantienen y controlan de manera adecuada, entregan una dosis constante, por lo que no hay cambios en la dosis con respecto al tiempo. Las principales ventajas de la esterilización con haz de electrones son una dosis mucho mayor y la ausencia de una fuente radioactiva localizada. Estos sistemas pueden ser instalados y operados por el usuario final. La penetración del haz de electrones es sustancialmente menor que la obtenida con los fotones y, por lo tanto, el mapeo de dosis resulta crítico para asegurar que los artículos con densidades y complejidad variadas se esterilicen apropiadamente. Debido a las altas dosis usadas en la esterilización con haz de electrones, algunos materiales pueden experimentar temperaturas significativamente mayores que las que podrían experimentar con la irradiación de Co6º.
VALIDACIÓN DE LA ESTERILIZACIÓN CON RADIACIÓN El desarrollo del ciclo para la radiación requiere la identificación de una dosis de radiación apropiada para los objetos, así como la confirmación de que la dosis no afecta de manera adversa los atributos de calidad esenciales de los materiales. En otras palabras, los analistas deberían identificar la dosis de esterilización mínima, así como la dosis máxima que el material pue-
1842 (1229 .1 O) Esterilización por Radiación / Información General
USP 39
de tolerar sin sufrir efectos negativos. Con esta información, los analistas pueden establecer la dosis para una aplicación específica de la esterilización con radiación. El establecimiento de la dosis a menudo se logra siguiendo uno de los métodos ISO: El Método 1, el Método 2A, el Método 2B y el Método VDmáx· La elección del método más apropiado depende principalmente del tamaño del lote de producción, del conocimiento de la biocarga normal y de la sensibilidad del material a la radiación. El mapeo de dosis desempeña un papel importante durante el desarrollo del ciclo y el ejercicio de establecimiento de la dosis.
Establecimiento de la Dosis El Método 1 se basa en la designación y verificación de una dosis de esterilización basada en una población microbiana. No se determina la resistencia de la población microbiana, y el establecimiento de la dosis se basa en una resistencia a la radiación estándar asignada a la población microbiana, derivada de los datos obtenidos de los fabricantes del dispositivo médico y de la literatura. Este análisis asume que la distribución de la resistencia estándar representa un desafío más severo que la población microbiana natural sobre el material que se va a esterilizar. Un estudio de verificación de la dosis debe confirmar la suposición de resistencia relativa. El método VDmáx es similar al Método 1 (requiere el análisis de la biocarga y de la verificación de la dosis) pero se basa en intervalos de biocarga (p.ej., <1000 UFC por artículo para una dosis de esterilización de 25 kGy y, por ejemplo, O, 1-1,5 UFC por artículo para una dosis de esterilización de 15 kGy). El Método 2 es más complejo y no requiere enumerar la población microbiana para el establecimiento de la dosis de esterilización (aunque esto es necesario para el monitoreo y control de rutina) pero utiliza una serie de exposiciones de incremento gradual de dosis para establecer una dosis en la que aproximadamente 1 de cada 100 muestras irradiadas con dicha dosis será no estéril. Esta no es la dosis de esterilización, pero provee el fundamento para determinar la dosis de esterilización mediante la extrapolación a partir de dicha información.
Compatibilidad de los Materiales Una vez que se ha establecido el nivel de dosis requerido, se debe establecer la dosis máxima. Los analistas por lo general establecen la dosis máxima mediante la evaluación de la dosis probable más alta que se podría observar durante el proceso de esterilización, sumando un factor de seguridad y evaluando el artículo para determinar los efectos inmediatos y a largo plazo de la exposición a la radiación. En un inicio, algunos materiales pueden parecer inalterados, y los efectos podrían volverse evidentes sólo con el paso del tiempo. La evaluación debe considerar todos los materiales expuestos al proceso de radiación, en especial el medicamento y su envase primario. Resulta necesario confirmar la estabilidad, la seguridad y la funcionalidad del producto durante su periodo de uso previsto.
Verificación de la Dosis Los métodos para el desarrollo del ciclo y el establecimiento de la dosis se basan en una biocarga controlada. Los analistas emplean controles definidos de biocarga previa a la esterilización y la evaluación periódica de los efectos del proceso sobre la biocarga para mantener la eficacia del ciclo. El establecimiento de la dosis requerida para la destrucción microbiana durante el desarrollo del ciclo emplea la resistencia natural de la biocarga; posteriormente, los analistas extrapolan los algoritmos para establecer la dosis que es capaz de proveer una probabilidad de una unidad no estéril (PNSU, por sus siglas en inglés; una medición estándar) de 1 x 10-6 • Los resultados de los enfoques para el establecimiento de la dosis para una biocarga inicial con diferentes poblaciones y resistencias a la esterilización con radiación se ilustran en la Figura 1.
USP 39
Información General/ (1229.1 O) Esterilización por Radiación 1843
106
e
103
:oo .....
u
~ e
10°
·O
·e;
~
..e o c..
10-3
o
8
4
12
16
20
24
28
Dosis de Radiación
106
e
103
:oo ..... u
~
10º
e
•O
'ü
~
..e o c.. 10-6
o
4
8
12
16
20
24
28
Dosis de Radiación Figura 1. Resultados del establecimiento de la dosis de radiación usando VDmáx· (Parte superior) Una mayor población de la biocarga tiene mayor resistencia a la esterilización con radiación. (Parte inferior) Una menor población de la biocarga tiene menor resistencia a la esterilización con radiación.
Actividades de Validación La confirmación de la aplicación de la dosis apropiada al usar la dosis de esterilización requiere de diversas actividades de apoyo. CALIFICACIÓN DEL EQUIPO El uso de esterilización con rayos gamma requiere la evaluación inicial y periódica de los controles y parámetros del equipo necesarios para establecer la capacidad del sistema. Los sistemas de esterilización que producen haces o rayos dirigidos tienen controles para la velocidad de barrido, la intensidad de la fuente y los cronómetros del sistema. Los otros elementos del equipo de esterilización con radiación se relacionan en mayor medida con el transporte de materiales y se califican con facilidad. Asimismo, se requiere la calificación de controles, dispositivos y software de seguridad.
1844 (1229.1 O) Esterilización por Radiación/ Información General
USP 39
MAPEO DE DOSIS EN LA CÁMARA VACÍA Este ejercicio opcional incluye el mapeo del área que se va a esterilizar para la dosis de radiación en ausencia de una carga y es un posible medio para evaluar un haz enfocado o un sistema de rayos. Provee una línea base de desempeño que puede ser útil con el paso del tiempo. MAPEO DE DOSIS DE CARGA El acomodo de los artículos en los contenedores, portadores o plataformas (pallets) de irradiación es una parte esencial del ejercicio de validación inicial. El objetivo del mapeo es definir la distribución de una dosis a través de los artículos de carga y establecer una configuración que minimice la variación de la dosis entre materiales. Los artículos se mapean usando múltiples dosímetros colocados interna y externamente. La identificación de las ubicaciones de dosis máxima es importante al momento de evaluar los efectos de la radiación en los artículos de carga. La ubicación de la dosis mínima y máxima se puede identificar a partir de los datos del mapeo para el monitoreo en la esterilización de rutina de materiales. INDICADORES BIOLÓGICOS No está indicado el uso de indicadores biológicos para la esterilización con radiación debido a que las mediciones físicas y dosimétricas empleadas son más confiables, reproducibles y robustas que los sistemas biológicos. DOSIMETRÍA El control del proceso para la esterilización con radiación se basa principalmente en la dosimetría para el desarrollo inicial y la verificación continua. Para pautas sobre la selección y uso de un sistema de dosimetría para su aplicación en la esterilización con radiación, consultar la norma ASTM E2628 Practice for Dosimetry in Radiation Processing (Prácticas para Dosimetría en el Procesamiento con Radiación). Los dosímetros y sus instrumentos relacionados deben calibrarse de acuerdo con la norma ISO/ ASTM 51261 Practice for Calibration of Routine Dosimetry Systems for Radiation Processing (Prácticas para la Calibración de Sistemas de Dosimetría de Rutina para el Procesamiento con Radiación). CONFIRMACIÓN DEL PROCESO La parte central de la actividad de validación es la confirmación de la letalidad aceptable usando dosímetros que se colocan en diversos sitios del material a medida que se procesa a través del equipo de esterilización con radiación. La prueba de la eficacia del ciclo de esterilización se obtiene mediante estudios repetidos en los que los resultados de los dosímetros se corresponden con el valor mínimo requerido para la garantía de esterilidad y demuestran que no se ha excedido el valor máximo.
Control Rutinario del Proceso La esterilización con radiación se debe someter a controles formales que mantengan el estado validado. Las prácticas descritas en el capítulo Esterilización de Artículos Farmacopeicos (1229) proveen requisitos generales apropiados para todos los sistemas de esterilización. Esto se logra mediante una variedad de prácticas relacionadas que son esenciales para el uso continuo del proceso durante un periodo extenso. Las prácticas que se consideran esenciales para mantener el estado validado para la radiación incluyen la capacitación, la calibración, las mediciones físicas, el monitoreo de la biocarga, el control de cambios, el mantenimiento preventivo y las auditorias de dosis periódicas.
REFERENCIAS 1. ]acobs, G., Validation of the Radiation Sterilization of Pharmaceuticals, chapter in Agalloco, ]., & Carleton, F. J. (eds.), Vafidation of Pharmaceutical Processes: 3rd Edition, lnformaUSA, New York, 2007. 2. Herring, C., & Saylor, M., Sterilization with Radioisotopes, chapter in Morrissey, R., & Phillips, G. B. (eds.), Steri/ízation Technology-A Practica/ Guide for Manufacturers and Users of Hea/th Care Products, Van Nostrand Reinhold, New York, 1993. 3. Cleland, M., O'Neill, T., & Thompson, C., Sterilization with Accelerated Electrons, chapter in Morrissey, R., & Phillips, G. B., Sterilization Technology-A Practica/ Guide for Manufacturers and Users of Health Care Products, Van Nostrand Reinhold, New York, 1993.
USP 39
Información General/ (1229 .11) Esterilización en Fase de Vapor 1845
(1229.11) ESTERILIZACIÓN EN FASE DE VAPOR INTRODUCCIÓN La esterilización se puede lograr usando agentes esporicidas suspendidos en el aire (p.ej., vapor). Los agentes esterilizantes que operan de esta manera incluyen peróxido de hidrógeno (H 2 0 2 ), ácido peracético (CH 3 C0 3CH), formaldehído (CHP) y glutaraldehído [CHi(CH 2 CH0) 2 ] en solución acuosa. A temperatura ambiente, son líquidos o sólidos que se pueden evaporar para introducirlos en un vaso o cámara. Se diferencian de los gases y líquidos esterilizantes en que presentan múltiples fases dentro del vaso durante la esterilización. Los sistemas de esterilización con vapor son adecuados para materiales sensibles al calor y para la esterilización de superficies. Los artículos expuestos al proceso deben tener sus superficies expuestas en la mayor medida posible. Los procesos de esterilización con vapor requieren una concentración de esterilizante, temperatura y humedad relativa apropiadas, las cuales pueden variar durante el periodo de exposición. Debido a que por lo regular el agente se provee como solución acuosa, éste introduce humedad. Las consecuencias de la variación de estos parámetros pueden ser diferencias localizadas en la humedad relativa, la concentración del agente y las velocidades de condensación en las superficies a tratar, lo que resulta en variaciones en la letalidad del proceso. Los parámetros que deben establecerse incluyen la cantidad de esterilizante (que por lo general se deriva de las cantidades de inyección), la humedad relativa y la temperatura. No existe una correlación demostrada entre las condiciones de la fase gaseosa, las condiciones de la superficie y la muerte microbiana. Por esta razón, el monitoreo en línea de la concentración de la fase de vapor no se utiliza ampliamente como un parámetro de control. Los esfuerzos para desarrollar un indicador biológico estandarizado para sistemas de vapor se han visto limitados por el carácter multifásico de estos esterilizantes. La selección del indicador biológico apropiado y la resistencia deberían basarse en experimentos dentro del sistema del usuario. Únicamente en condiciones específicas bien definidas (p.ej., concentración del agente, nivel de humedad, temperatura, sustrato y fase) es posible establecer un valor D confiable (para la definición del valor D, ver Esterilización de Artículos Farmacopeicos (1229)). Este capítulo revisará brevemente los sistemas de esterilización de peróxido de hidrógeno y de ácido peracético, debido a que su uso es más amplio que el de otros agentes esterilizantes con fase de vapor en las industrias farmacéutica y de dispositivos médicos.
PERÓXIDO DE HIDRÓGENO La eficacia del peróxido de hidrógeno como esterilizante líquido cuenta con amplio respaldo. 1 Existen diversas estrategias efectivas para la inyección de peróxido de hidrógeno (H 20 2), incluyendo la inyección continua, intermitente o total en una sola etapa. Algunos sistemas emplean una etapa de evacuación o secado anterior a la introducción de peróxido de hidrógeno (H 20 2) para permitir una concentración mayor sin exceso de condensación. Como alternativa, el peróxido de hidrógeno (H 2 0 2 ) se puede introducir en forma líquida, seguido por calentamiento dirigido. Después del periodo de exposición, la cámara o el objeto esterilizado se ventila hasta un nivel aceptable para el procesamiento adicional de materiales y/o la exposición al personal (lo que resulte menor) antes de abrir y retirar el artículo esterilizado.
ÁCIDO PERACÉTICO El ácido peracético (CH 3C0 3CH), solo o mezclado con peróxido de hidrógeno, es un agente esporicida de demostrada efectividad.1 El ácido peracético se introduce en forma líquida a través de un atomizador, lo que resulta en la presencia de fases líquida y de vapor dentro de la cámara. Después del periodo de residencia del proceso, se elimina mediante evaporación.
VALIDACIÓN DE LA ESTERILIZACIÓN CON VAPOR No se han definido condiciones estándar de esterilización debido a la naturaleza variable de fase y multifase del esterilizante durante los procesos de esterilización. Por ende, no existen indicadores biológicos estandarizados con valores D que puedan usarse para el análisis predictivo convencional de la velocidad de muerte. Ante la falta de valores D de indicadores biológicos, y debido a la variación en los parámetros de los ciclos de esterilización con vapor, se debe usar una estrategia empírica. Las velocidades de muerte en las fases gaseosa y líquida que constituyen el vapor pueden presentar diferencias significativas (las velocidades de muerte de la fase líquida se consideran mayores que las de la fase gaseosa). La destrucción de indicadores biológicos distribuidos a lo largo del sistema o carga demuestra letalidad independientemente de la fase que genere la muerte. Los parámetros del proceso de esterilización (por lo general, el tiempo) que no consigan matar los indicadores biológicos se podrán ajustar hasta conseguir una muerte completa. De esta forma se establecen las condiciones mínimas necesarias para una muerte completa. La esterilización con vapor se puede validar usando una estrategia de medio ciclo, de selección de extremos o cualquier otra que sea adecuada según se definen en los capítulos (1229) y Esterilización por Gases (1229.7). 1 Block SS, editor. Disinfection, Sterilizotion, and Preservation. 5th ed. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; c2001. Chapter 9, Peroxygen compounds; pp. 185-204.
1846 (1229.11) Esterilización en Fase de Vapor/ Información General
USP 39
La validación del método de medio ciclo requiere la destrucción de una concentración adecuada de un microorganismo resistente en condiciones mínimas definidas para una muerte completa. Posteriormente, en la operación de rutina, el periodo letal mínimo se duplica arbitrariamente, con lo que se sustenta una duplicación de la reducción logarítmica de esporas del indicador biológico y es más que suficiente para inactivar la biocarga. Asimismo, se puede emplear una estrategia de selección de extremos, la cual sustenta los intervalos operativos del proceso para los parámetros críticos de una mejor manera que el método de medio ciclo. En el método de selección de extremos, se evalúan las condiciones que agrupan las condiciones definidas del proceso para establecer parámetros para los efectos máximos y mínimos sobre los materiales y la biocarga. El tiempo de residencia letal mínimo del proceso establece las condiciones más exigentes para la muerte microbiana. El incremento gradual del tiempo de residencia del proceso que sobrepasa el periodo letal mínimo se usa para establecer los periodos máximos de exposición, los cuales tienen el mayor efecto sobre los materiales. Además, se utilizan ajustes en la cantidad de agente introducido, en la temperatura de operación y en la humedad relativa para mejorar aún más la estrategia de selección de extremos. A través de este método, se pueden establecer las condiciones de proceso rutinarias entre las condiciones mínimas y máximas de proceso para asegurar una muerte microbiana completa, al tiempo que se mantiene la integridad de los materiales. Las siguientes actividades se definen para un proceso por partidas y, por lo tanto, es necesario adaptarlas de manera apropiada al aplicarlas en procesos de esterilización intermitentes o continuos. • Calificación del Equipcr-La calificación del equipo para esterilización con vapor reproduce Ja de otros procesos de esterilización para confirmar que el equipo se haya instalado de manera apropiada y opere conforme a lo previsto. • Distribución de parámetros en cámara vacía-Aunque es posible una medición de puntos múltiples, ésta carece de correlación con la muerte microbiana en la superficie. Las mediciones de humedad y temperatura, junto con los indicadores químicos, pueden proveer una indicación limitada de la distribución del esterilizante. Los indicadores biológicos no son necesarios para la evaluación de la cámara vacía. • Mapeo de componentes-Para la esterilización de superficies, no es necesario el mapeo interno de los artículos de carga. Aunque los vapores se usan principalmente como esterilizantes de superficies, cuando se usan para artículos envasados con superficies y volúmenes internos que necesitan ser esterilizados, se debe realizar el mapeo interno, colocando los indicadores biológicos en lugares difíciles de penetrar para confirmar la letalidad del proceso. • Mapeo de carga-Las mediciones de humedad y temperatura, junto con los indicadores químicos, pueden proveer una indicación limitada de la distribución del esterilizante sobre las superficies de los componentes. No se requieren indicadores biológicos. Se deben evaluar los efectos del tamaño y los patrones de la carga. • Indicadores biológicos-Se recomienda el uso de múltiples indicadores biológicos en cada lugar de prueba para sustentar de manera más adecuada la letalidad del proceso. • Confirmación del proceso y desafío microbiológiccr-La parte central de la actividad de validación es la confirmación de los parámetros aceptables del proceso y de la inactivación del desafío microbiológico. La evidencia de la eficacia del ciclo se provee en estudios repetidos en los que se matan indicadores biológicos y se utilizan mediciones químicas o físicas.
CONTROL RUTINARIO DEL PROCESO La esterilización con vapor está sujeta a controles que mantienen un estado validado con el paso del tiempo. Las prácticas descritas en el capítulo (1229) describen los requisitos generales apropiados para todos los sistemas de esterilización. Las prácticas esenciales requeridas para mantener el estado validado incluyen calibración, mediciones físicas, uso de indicadores biológicos, integradores e indicadores físicos o químicos, control continuo del proceso, control de cambios, mantenimiento preventivo, reevaluación periódica y capacitación.
(1230) AGUA PARA USO EN HEMODIÁLISIS CONSIDERACIONES GENERALES DE PURIFICACIÓN Los componentes químicos y microbianos que se pueden encontrar en el agua potable que cumple con las Reglamentaciones Básicas Nacionales Relativas al Agua Potable de la Agencia de Protección Ambiental de los EE.UU. (o equivalente) pueden producir efectos significativamente negativos en pacientes que se someten a hemodiálisis. Por lo tanto, es necesario someter el agua a tratamientos adicionales para reducir estos componentes a niveles aceptables. La monografía Agua para Hemodiálisis proporciona pruebas bacterianas y químicas necesarias para garantizar la seguridad del paciente. A continuación se recomiendan pruebas adicionales: (1) Estacionalmente, se pueden encontrar en el agua potable niveles excesivos de aluminio, fluoruros y cloro como resultado de su tratamiento con ciertos productos químicos. Se deben monitorear estos componentes en el Agua para Hemodiálisis que se produce conforme a los procedimientos operativos estándares establecidos. Los niveles máximos de aceptación de estos y otros elementos y compuestos, propuestos por AAMI (Association for the Advance-
Información General/ (1230) Agua para Uso en Hemodiálisis 1847
USP 39
ment of Medical lnstrumentation) se indican en la Tabla 7. Se deben monitorear periódicamente estos atributos para asegurar que las pruebas realizadas de forma rutinaria los controlan de acuerdo con la monografía Agua para Hemodiálisis. (2) Se debe realizar inicialmente y luego en forma periódica una extensa validación del sistema de producción de Agua para Hemodiálisis, para asegurar que el equipo de tratamiento del agua y los procesos del sistema de desinfección están funcionando adecuadamente. Tabla 1. Niveles Máximos Permitidos de Sustancias Químicas en Agua para Hemodlállsls (agua usada para preparar soluciones de diálisis y concentrados a partir de polvos en una instalación de diálisis y para reprocesar dializadores para usos múltiples)*
Elementos o Compuesto Contaminantes con toxicidad documentada en hemodiálisis
Concentración Máxima (mg/L) 0,01
Aluminio Cloramina
0,1
Cloro libre
0,5
Cobre
0,1 0,2
Fluoruro
0,005
Plomo
2
Nitrato (como N) Sulfato
100
Cinc
0,1
Contaminantes incluidos normalmente en soluciones de diálisis Calcio
2 (O, 1 mEq/L)
Magnesio
4 (0,3 mEq/L)
Potasio
8 (0,2 mEq/L)
Sodio
70 (3,0 mEq/L)
Otros contaminantes Antimonio
0,006
Arsénico
0,005
Bario
0,1
Berilio
0,0004
Cadmio
0,001
Cromo
0,014 0,0002
Mercurio Selenio
0,09
Plata
0,005
Talio
0,002
• Reproducido con autorización de ANSl/AAMI RD62: 2006, "Water treatment equipment for hemodialysis applications", ©Association for the Advancement of Medica! lnstrumentation, Arlington, VA.
Los límites químicos que se incluyen en la Tabla 7 han sido reconocidos por las agencias del gobierno federal como normas para Agua para Hemodiálisis. El médico a cargo o el administrador de las instalaciones designado debe establecer por escrito los procedimientos operativos estándares para el análisis del agua. La decisión sobre la frecuencia de los análisis se debe tomar basándose en el análisis de datos históricos, la calidad de la fuente de agua según informes de la instalación municipal de tratamiento del agua o la agencia de salud pública del área, etc. Se deben mantener registros para documentar los niveles y cualquier acción correctiva tomada de forma inmediata. Los análisis químicos de los componentes del agua enumerados se deben llevar a cabo utilizando los métodos indicados en Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 21 st Edition, 1 de la American Public Health Association, aquellos indicados en Methods for the Determination of Metals in Environmental Samples,2 de la Agencia de Protección Ambiental de los EE.UU. o métodos equivalentes según se indica en ANSl/AAMI RD 62:2006.
CONSIDERACIONES MICROBIOLÓGICAS La monografía Agua para Hemodiálisis incluye los límites de recuento total de microorganismos aerobios de 100 ufc/mL y límites de endotoxinas de 1 Unidad USP de Endotoxina/ml. Además, se debe determinar de forma rutinaria la ausencia de 1 2
American Public Health Association, Washington, DC 20005. Publicación de la Agencia de Protección Ambiental de los EE.UU. EPA-600-R-94-111, Cincinnati, OH.
1848 (1230) Agua para Uso en Hemodiálisis / Información General
USP 39
Pseudomonas aeruginosa dado que es un patógeno oportunista peligroso para los pacientes de hemodiálisis sumamente enfermos. Los recuentos altos de microorganismos y la presencia de Pseudomonas aeruginosa pueden estar asociados con un inadecuado sistema de mantenimiento y desinfección del agua. El muestreo del agua se debe realizar en todos los puntos en el que el agua ingresa al equipo de diálisis. Las muestras deben ser evaluadas dentro de un plazo de 30 minutos de su recolección, o se deben refrigerar inmediatamente para evaluarlas luego dentro de las 24 horas de su recolección. Las pruebas de recuento microbiano y de ausencia se realizan usando procedimientos indicados en los capítulos generales de USP Pruebas de Recuento Microbiano (61) y Pruebas de Microorganismos Específicos (62). La cuantificación de endotoxinas bacterianas se realiza usando los procedimientos del capítulo general Prueba de Endotoxinas Bacterianas (85) de USP. Debido al tiempo de incubación necesario para obtener resultados microbiológicos definitivos, los sistemas de agua se deben monitorear microbiológicamente para confirmar que continúan produciendo agua de calidad aceptable. Por lo tanto es necesario establecer los niveles de "Alerta" e "Intervención" para la supervisión y el control del sistema. Un Nivel de Alerta constituye una advertencia y no requiere una acción correctiva. Un Nivel de Intervención indica una desviación de las condiciones de funcionamiento normales y requiere que se tome una acción correctiva para llevar el proceso nuevamente al intervalo de operación normal. Superar un Nivel de Alerta o de Intervención no implica que la calidad del agua se haya visto comprometida. El Nivel de Intervención máximo recomendado para un recuento total de microorganismos viables en el agua producto no debe exceder de 25 ufc/mL, y el Nivel de Alerta máximo recomendado no debe exceder de 0,25 Unidades USP de Endotoxina/ml. Como con todos los otros valores de control del proceso, se deben establecer los Niveles de Alerta e Intervención a partir del monitoreo de las tendencias y capacidades del proceso en el sistema normal, de manera que permita la implementación de acciones correctivas en respuesta a desviaciones del nivel de control del proceso mucho antes de exceder las especificaciones (ver también Consideraciones Microbiológicas en Agua para Uso Farmacéutico (1231 )).
(1231) AGUA PARA USO FARMACÉUTICO INTRODUCCIÓN El agua se usa ampliamente como materia prima, ingrediente y disolvente en el procesamiento, formulación y fabricación de productos farmacéuticos, ingredientes farmacéuticos activos (API, por sus siglas en inglés) y productos intermedios, artículos farmacopeicos y reactivos analíticos. Este capítulo ofrece información adicional sobre el agua, los atributos de calidad no incluidos en las monografías de agua, las técnicas de procesamiento que se pueden usar para mejorar la calidad del agua y una descripción de las normas de calidad mínimas que se deben tener en cuenta a la hora de seleccionar una fuente de agua. Este capítulo de información no pretende reemplazar la normativa o las guías que existen en la actualidad para tratar temas relativos a las Buenas Prácticas de Fabricación en los Estados Unidos e Internacionales (ICH u OMS), las guías de ingeniería u otras guías para el agua de instituciones reglamentadoras (FDA, EPA u OMS). El contenido de este capítulo ayudará a los usuarios a entender mejor las cuestiones relativas al agua para uso farmacéutico y algunos de los problemas microbiológicos y químicos exclusivos del agua. Este capítulo no es un documento exhaustivo sobre los distintos tipos de agua para uso farmacéutico. Contiene puntos con información básica a considerar, cuando sea apropiado, para el procesamiento, conservación y uso del agua. Es responsabilidad del usuario garantizar que el agua para uso farmacéutico y su producción cumplan con las normas y guías gubernamentales y con las especificaciones farmacopeicas para los tipos de agua usada en los artículos farmacopeicos. El control de la pureza química de estos tipos de agua es importante y constituye el principal propósito de las monografías de este compendio. A diferencia de otros artículos oficiales, las monografías de agua a granel (Agua Purificada y Agua para Inyección) también establecen límites con respecto a la manera en la que se puede producir el artículo debido a que se considera que la naturaleza y la robustez del proceso de purificación están directamente relacionadas con la pureza resultante. Los atributos químicos que se consignan en estas monografías deberían considerarse como un conjunto de especificaciones mínimas. Pueden ser necesarias especificaciones más estrictas para algunas aplicaciones a fin de garantizar la aptitud para usos específicos. La información básica sobre las aplicaciones adecuadas de estos tipos de agua se encuentra en las monografías correspondientes y se explica con mayor detalle en este capítulo. El control de calidad microbiológico del agua es muy importante para muchos de sus usos. La mayoría de las monografías de formas envasadas de agua requieren la condición de esterilidad debido a que los usos previstos hacen de este requisito un atributo importante por motivos de salud y seguridad. La USP ha determinado que no es apropiado establecer una especificación microbiana en las monografías para el agua a granel y tal especificación no se ha incluido en las monografías de estos tipos de agua. Estas aguas se pueden usar en diversas aplicaciones, algunas de las cuales requieren un control microbiológico extremo y otras ningún control de este tipo. Las especificaciones microbiológicas necesarias para un agua a granel determinada dependerán de su uso. Establecer una única especificación para este atributo tan difícil de controlar constituiría para algunos usuarios una carga innecesaria con pruebas y especificaciones irrelevantes. Sin embargo, algunas aplicaciones pueden requerir un control microbiano incluso más cuidadoso para evitar la proliferación de los microorganismos presentes en el agua durante la purificación, el almacenamiento y la distribución de esta sustancia. Una especificación microbiana también sería inapropiada si se refiriera a la naturaleza de "servicio" o suministro continuo de esta materia prima. Las especificaciones microbia-
USP 39
Información General/ (1231) Agua para Uso Farmacéutico 1849
nas se evalúan típicamente mediante métodos de prueba que necesitan como mínimo 48-72 horas para generar resultados. Dado que las aguas para uso farmacéutico generalmente se producen mediante procesos continuos y se usan rápidamente después de su generación en productos y procesos de fabricación, es probable que el agua se haya usado antes de que los resultados definitivos de las pruebas estén disponibles. La falta de cumplimiento con las especificaciones farmacopeicas requeriría investigar el impacto y tomar una decisión respecto de si se deben aceptar o rechazar todos los lotes de productos desde que se obtuvo el resultado aceptable anterior en la prueba de la muestra hasta el siguiente resultado aceptable en la prueba de la muestra. Los problemas técnicos y logísticos ocasionados por un retraso en el resultado de tales análisis no eliminan la necesidad que tiene el usuario de que se establezcan especificaciones microbianas. Por lo tanto, tales sistemas de agua necesitan una operación y un mantenimiento controlados, lo que requiere que el sistema sea validado para garantizar una estabilidad operativa y que se realice un seguimiento cuantitativo de sus atributos microbianos comparándolos con niveles establecidos de alerta y de acción que proporcionarían una indicación temprana del control del sistema. En este capítulo se incluyen los temas relacionados con la validación del sistema de agua y los niveles de alerta y acción.
CONSIDERACIONES RELATIVAS AL AGUA DE ALIMENTACIÓN Para asegurar el cumplimento de determinadas normas de calidad microbiológica y química mínimas, el agua usada en la producción de fármacos o la que se usa como fuente de alimentación para la preparación de distintos tipos de aguas purificadas debe cumplir los requisitos de las Reglamentaciones Básicas Nacionales relativas al Agua Potable (NPDWR, por sus siglas en inglés) (40 CFR 141) de la Dirección de Protección Ambiental de los EE.UU. (EPA, por sus siglas en inglés) o la normativa para el agua potable de la Unión Europea o japón o las guías para el agua potable de la OMS. Los límites respecto a los tipos y cantidades de determinados contaminantes orgánicos e inorgánicos garantizan que el agua contendrá tan solo cantidades pequeñas y seguras de las especies químicas potencialmente objetables. Por lo tanto los sistemas para el tratamiento previo del agua sólo deberán eliminar pequeñas cantidades de estas sustancias químicas difíciles de eliminar. Asimismo, el control de los contaminantes químicos objetables en la etapa de suministro de agua elimina la necesidad de realizar pruebas específicas para detectar algunos de ellos (p.ej., trihalometanos y metales pesados) después de que el agua haya pasado etapas posteriores de purificación. Los requisitos microbiológicos del agua potable aseguran la ausencia de coliformes, que si se determina que son de origen fecal, pueden indicar la presencia potencial de otros microorganismos y virus potencialmente patógenos de origen fecal. El cumplimiento con estos requisitos microbiológicos no descarta la presencia de otros microorganismos, que podrían considerarse indeseables si se encontraran en el fármaco o producto formulado. Para lograr el control microbiano, las autoridades municipales a cargo del agua agregan desinfectantes al agua potable. Se han usado durante muchas décadas sustancias que contienen cloro y otros oxidantes con este fin y generalmente se ha considerado que son relativamente inocuas para los seres humanos. Sin embargo, estos oxidantes pueden interactuar con las materias orgánicas que existen naturalmente para producir productos derivados de la desinfección (DBP, por sus siglas en inglés) tal como los trihalometanos (THM, que incluyen el cloroformo, el bromodiclorometano y el dibromoclorometano) y los ácidos haloacéticos (HAA, por sus siglas en inglés, que incluyen el ácido dicloroacético y el ácido tricloroacético). Los niveles de DBP producidos varían con el nivel y el tipo de desinfectante usado y con los niveles y tipos de materiales orgánicos que se encuentran en el agua, que pueden variar estacionalmente. Debido a que los niveles altos de DBP en el agua potable se consideran un riesgo para la salud, los reglamentos para el agua potable ordenan su control hasta niveles generalmente aceptados como no peligrosos. Sin embargo, dependiendo de las operaciones unitarias empleadas para una purificación posterior del agua, una pequeña fracción de los DBP del agua inicial puede trasladarse al agua terminada. Por lo tanto, es de considerable importancia obtener niveles mínimos de DBP en el agua inicial, mientras se logra una desinfección efectiva. Los niveles de DBP en el agua potable se pueden reducir al mínimo usando desinfectantes tales como el ozono, las cloraminas o el dióxido de cloro. Al igual que el cloro, las propiedades oxidantes de estos reactivos son suficientes para dañar algunas unidades de tratamiento previo y se deben eliminar en las etapas iniciales del proceso de tratamiento previo. La eliminación completa de alguno de estos desinfectantes puede ser problemática. Por ejemplo, las cloraminas se pueden degradar liberando amoníaco durante el proceso de desinfección o durante la eliminación en el tratamiento previo, que a su vez se puede trasladar al agua terminada. Las operaciones unitarias de tratamiento previo se deben diseñar y realizar de modo que eliminen adecuadamente el desinfectante, los DBP del agua potable y los productos de degradación del desinfectante que sean objetables. Se puede ocasionar un problema muy grave si las operaciones unitarias diseñadas para eliminar cloro se enfrentaran, sin previo aviso, con agua potable que contuviese cloramina proveniente de una municipalidad a la que se le haya ordenado que deje de usar la desinfección con cloro para cumplir con las especificaciones relativas a trihalometanos (THM) para el Agua Potable de la EPA, que son cada vez más estrictas. El proceso de descloración puede eliminar de forma incompleta la cloramina, lo que podría perjudicar irreparablemente las operaciones unitarias siguientes en el proceso, y además, el amoníaco que se libera durante este proceso podría traspasar el tratamiento previo y aparecer en el agua terminada, evitando que ésta cumpla con las especificaciones de conductividad farmacopeicas. El proceso de purificación se debe evaluar nuevamente si se cambia el desinfectante del agua, enfatizando la necesidad de una buena relación de trabajo entre el fabricante de agua para uso farmacéutico y el proveedor de agua potable.
1850 (1231) Agua para Uso Farmacéutico/ Información General
USP 39
TIPOS DE AGUA Se usan muchos grados distintos de agua para fines farmacéuticos. Varios se describen en monografías de la USP que especifican usos, métodos de preparación aceptables y atributos de calidad. Estas aguas se pueden dividir en dos tipos generales: las aguas a granel, que se producen típicamente en el lugar en el que se usan y las aguas estériles, que se producen, envasan y esterilizan para conservar la calidad microbiana a lo largo de su vida útil envasada. Hay varios tipos especializados de aguas estériles, que difieren en sus aplicaciones designadas, limitaciones de envasado y otros atributos de calidad. También hay otros tipos de aguas que no cuentan con monografías. Éstas son todas aguas a granel, con nombres que se proporcionan con fines descriptivos exclusivamente. Muchas de estas aguas se usan en métodos analíticos específicos. El texto asociado puede no especificar ni implicar determinados atributos de calidad o modos de preparación. Es posible que estas aguas sin monografías no cumplan necesariamente en forma estricta con los modos de preparación o atributos indicados o implícitos. Las aguas que se producen por otros medios o se controlan mediante otros atributos de prueba también pueden satisfacer los requisitos de los usos previstos para estas aguas. Es responsabilidad del usuario garantizar que tales aguas, incluso si se producen y controlan tal como se indica, sean adecuadas para su uso previsto. Siempre que se utilice el término "agua" en esta farmacopea sin otros adjetivos o cláusulas descriptivas, la intención es que se utilice agua que no tenga una pureza inferior a la del Agua Purificada. A continuación se ofrece una breve descripción de diversos tipos de aguas para uso farmacéutico y sus atributos o usos significativos. La Figura 1 también puede ser de utilidad en la comprensión de algunos de los distintos tipos de aguas. -
Si fuera compatibie sin pu- rificación posterior
AGUA POTABLE (Cumple con los reglamentos de la EPA de EEUU (NPDWR) o oon los reglamentos para agua potable de la Unión Europea o del Japón, o oon las Gulas para el Agua Potable de la OMS)
Etapas de Tratam. Típicas pueden incluir: "
AGUA PARA PROPÓSITOS FARMACÉUTICOS ESPECIALES
Prefiltración Ablandamiento Descloración Elimin. de Amoníaco Secuestramiento Orgánico
(Ej. limpieza inicial, procesamiento de lngred. Farm. Activos y agua como ingrediente)
' 1
AGUA PARA HEMODIÁLISIS
+
1
e
f
Envasada en ) envases no reactivos
t
rl AGUA PURIFICADA
~
AGUA PARA HEMODIÁLISIS (envasada a granel) AGUA REACTIVO ANALÍTICO
'
Destilación o proceso equivalente o superior para la remoción de sust. quimicas y de microorganismos
H
AGUA PARA INYECCIÓN
f-
./
Envasado y Esterilización AGUA PARA LIMPIEZA E INGREDIENTE DE FORMAS FARMACÉUTICAS PARENTERALES
,1
AGUA PARA LIMPIEZA E INGREDIENTE DE r+FORMAS FARMACÉUTICAS NO PARENTERALES (
(Esterilización \
1
AGUA PURIFICADA ESTÉRIL
Oesionización Ósmosis Inversa Destilación Ultrafiltración Luz Ultravioleta
1
Envasado
AGUA PARA INYECCIÓN (envasada a granel) AGUA ESTÉRIL PARA INYECCIÓN AGUA ESTÉRIL PARA IRRIGACIÓN AGUA BACTERIOSTÁTICA PARA INYECCIÓN AGUA ESTÉRIL PARA INHALACIÓN
)
AGUA PURIFICADA (envasada a granel)
1
Figura 1. Agua para usos farmacéuticos.
)
USP 39
Información General/ (1231) Agua para Uso Farmacéutico 1851
Vapor y Aguas a Granel con Monografía Las siguientes aguas se producen típicamente en grandes volúmenes mediante un sistema de agua de operaciones unitarias múltiples y se distribuye mediante un sistema de cañerías para su uso en el mismo lugar. Estas aguas farmacéuticas en particular deben cumplir con los atributos de calidad que se especifican en las monografías relacionadas. Agua Purificada-El Agua Purificada (ver monografía de la USP) se emplea como excipiente en la producción de preparaciones no parenterales y en otras aplicaciones farmacéuticas, como por ejemplo la limpieza de determinados equipos y componentes que entran en contacto con el producto no parenteral. A menos que se especifique algo diferente, el Agua Purificada también se debe usar para todas las pruebas y valoraciones en las que se indique agua (ver Advertencias y Requisitos Generales). También se hace referencia al Agua Purificada en toda la USP-NF. Independientemente de la tipografía y el uso de mayúsculas que se utilice para escribir su nombre, se pretende un agua que cumpla con los requisitos de la monografía de Agua Purificada. El Agua Purificada debe cumplir con los requisitos de pureza química, iónica y orgánica, y debe protegerse de la contaminación microbiana. La calidad mínima del agua fuente, o agua de alimentación para la producción de Agua Purificada es la del Agua Potable. Este suministro de agua puede purificarse usando operaciones unitarias que incluyen la desionización, la destilación, el intercambio iónico, la ósmosis inversa, la filtración u otros procedimientos de purificación adecuados. Los sistemas de agua purificada se deben validar para producir y distribuir agua de calidad microbiológica y química aceptable de manera confiable y regular. Los sistemas de agua purificada que operan en condiciones ambientales son propensos a formar biopelículas de microorganismos, difíciles de erradicar, que pueden ser fuente de niveles indeseables de endotoxinas o microorganismos viables en el agua efluente del sistema. Estos sistemas requieren una frecuente higienización y seguimiento microbiológico para asegurar una apropiada calidad microbiológica del agua en los puntos de uso. La monografía de Agua Purificada también permite el envasado a granel para uso comercial en otros lugares. A diferencia del Agua Purificada Estéril, no se requiere que el Agua Purificada envasada a granel sea estéril. Debido a que el agua no estéril envasada a granel es susceptible de contaminación microbiana y otros cambios de calidad, esta forma de Agua Purificada debe prepararse y almacenarse de manera que se limite el crecimiento microbiano y/o que simplemente se utilice de manera oportuna antes de que la proliferación microbiana la torne no apta para el uso previsto. También dependiendo del material que se utilice para el envasado, podría haber compuestos extraíbles lixiviándose desde el envase al agua. Aunque este artículo debe cumplir con los mismos límites de pureza química que el agua a granel, las sustancias extraíbles del envase ocasionarán que el agua envasada sea menos pura que el agua a granel. La naturaleza de estas impurezas incluso podría hacer que esta agua fuera una elección inapropiada para algunas aplicaciones. Es responsabilidad del usuario garantizar la aptitud para el uso de este artículo envasado cuando se usa para aplicaciones de fabricación, clínicas o analíticas en las que se indica la forma de agua pura a granel. Agua para Inyección-El Agua para Inyección (ver monografía de la USP) se emplea como excipiente en la producción de preparaciones parenterales y en otras preparaciones donde se debe controlar el contenido de endotoxinas, así como en otras aplicaciones farmacéuticas, como por ejemplo la limpieza de determinados equipos y componentes que entran en contacto con el producto parenteral. La calidad mínima del agua de alimentación para la generación de Agua para Inyección es la del Agua Potable, según la definen la EPA de los EE.UU., la Unión Europea, Japón o la OMS. Esta agua de alimentación puede someterse a tratamiento previo para hacerla adecuada para su posterior destilación (o cualquier otro proceso validado que se emplee conforme a la monografía). El agua terminada debe cumplir con todos los requisitos químicos para el Agua Purificada así como con una especificación adicional de endotoxinas bacterianas. Dado que las endotoxinas son producidas por tipos de microorganismos proclives a habitar en el agua, los equipos y procedimientos usados por el sistema para purificar, almacenar y distribuir el Agua para Inyección deben estar diseñados para reducir al mínimo o evitar la contaminación microbiana así como para eliminar las endotoxinas que ingresan desde el agua inicial. Los sistemas de Agua para lnyecciónse deben validar para producir y distribuir esta calidad de agua de manera confiable y regular. La monografía del Agua para Inyección también permite su envasado a granel para uso comercial. A diferencia del Agua Estéril para Inyección, no se requiere que el Agua para Inyección envasada a granel sea estéril. Sin embargo, para descartar cambios significativos en su contenido microbiano y de endotoxinas durante el almacenamiento, esta forma de Agua para Inyección debe prepararse y almacenarse de manera que se limite el crecimiento microbiano y/o que simplemente se utilice de manera oportuna antes de que la proliferación microbiana la torne no apta para el uso previsto. También, dependiendo del material que se utilice para el envasado, podría haber compuestos extraíbles lixiviándose desde el envase al agua. Aunque este artículo debe cumplir con los mismos límites de pureza química que el agua a granel, las sustancias extraíbles del envase ocasionarán que el agua envasada sea menos pura que el agua a granel. La naturaleza de estas impurezas incluso podría hacer que esta agua fuera una elección inapropiada para algunas aplicaciones. Es responsabilidad del usuario garantizar la aptitud para el uso de este artículo envasado cuando se usa en aplicaciones de fabricación, clínicas o analíticas en las que se indica la forma más pura de agua a granel. Agua para Hemodiálisis-EI Agua para Hemodiálisis(ver monografía de la USP) se usa en aplicaciones de hemodiálisis, principalmente para la dilución de soluciones concentradas de hemodiálisis. Se produce en el mismo lugar donde se usa, a partir de Agua Potable de la EPA adicionalmente purificada para reducir los componentes químicos y microbiológicos. Se puede envasar y almacenar en envases no reactivos que imposibiliten el ingreso de bacterias. La expresión "envases no reactivos" implica que el envase, en especial las superficies que están en contacto con el agua, no sufren modificación alguna por el agua, como por ejemplo la lixiviación de compuestos relacionados del envase en agua o cualquier reacción química o corrosión ocasionada por el agua. El agua no contiene ningún agente antimicrobiano agregado y no está destinada para inyección. Sus atri-
1852 (1231) Agua para Uso Farmacéutico / Información General
USP 39
butos incluyen especificaciones de conductividad del agua, carbono orgánico total (o sustancias oxidables), límites microbianos y endotoxinas bacterianas. Los atributos de conductividad del agua y carbono orgánico total son idénticos a los establecidos para el Agua Purificada y el Agua para Inyección; sin embargo, en vez del carbono orgánico total, se puede medir alternativamente el contenido orgánico mediante la prueba de Sustancias oxidables. El atributo de límites microbianos es exclusivo para este tipo de agua entre las monografías de agua "a granel" pero se justifica por la aplicación específica de esta agua cuyos requisitos relativos al contenido microbiano se relacionan con la seguridad para este uso. El atributo de endotoxinas bacterianas se establece igualmente a un nivel que se relaciona con la seguridad para este uso. Vapor Puro-El Vapor Puro (ver monografía de la USP) también se denomina a veces "vapor limpio". Se usa cuando el vapor o su condensado entra en contacto directo con artículos oficiales o las superficies en contacto con los artículos, como por ejemplo durante su preparación, esterilización o limpieza, cuando no se usan etapas posteriores de procesamiento para eliminar cualquier residuo de impurezas codepositado. Estas aplicaciones de Vapor Puro incluyen, aunque no exclusivamente, los procesos de esterilización de cargas porosas, el calentamiento por inyección directa de vapor de soluciones de limpieza o de productos, o a los procesos de humidificación en los que se usa la inyección de vapor para controlar la humedad en los recipientes de procesamiento en donde se exponen los artículos oficiales o sus productos en proceso. La intención principal al usar esta calidad de vapor es asegurar que los artículos oficiales o las superficies en contacto con los artículos no se contaminen con los residuos contenidos en el vapor. El Vapor Puro se prepara a partir de agua de alimentación previamente tratada en forma adecuada, de manera análoga al tratamiento previo que se usa para el Agua Purificada o el Agua para Inyección. El agua se vaporiza con una eliminación de niebla adecuada y se distribuye a presión. Las fuentes de contaminantes indeseables en el Vapor Puro pueden provenir de gotitas de agua del suministro de agua arrastradas desde la fuente, aditivos anticorrosión del vapor o residuos provenientes del sistema de producción y distribución del vapor en sí. Los atributos en la monografía Vapor Puro deben detectar la mayoría de los contaminantes que pudieran provenir de estas fuentes. Si el artículo oficial expuesto a posibles residuos de Vapor Puro está destinado al uso parenteral u otras aplicaciones en las que el contenido pirogénico debe controlarse, el Vapor Puro debe también cumplir con la especificación para Prueba de Endotoxinas Bacterianas (85). Estos atributos de pureza se miden en el condensado del artículo más que en el artículo en sí. Esto, por supuesto, confiere una gran importancia a la limpieza del proceso de generación y recolección del condensado de Vapor Puro ya que este proceso no debe afectar la calidad del líquido condensado resultante. Otros atributos del vapor que no se detallan en la monografía, en particular la presencia de gases no condensables, incluso en cantidades pequeñas, o la existencia de un estado seco o sobrecalentado, también pueden ser importantes para aplicaciones como por ejemplo, la esterilización. La gran liberación de energía (calor latente de condensación) a medida que el agua cambia del estado gaseoso al líquido es la clave de la eficacia de la esterilización por vapor, y en general, la clave de su eficiencia como agente de transferencia de calor. Si no se permite el cambio de estado (condensación) porque el vapor está extremadamente caliente y persiste en estado seco y sobrecalentado, entonces su utilidad se comprometería seriamente. Los gases no condensables en el vapor tienden a estratificarse o acumularse en determinadas áreas de la cámara de esterilización o en su carga. Debido a esto, estas superficies estarían parcialmente aisladas del fenómeno de condensación de vapor, impidiendo que reciban toda la energía de las condiciones de esterilización. Por lo tanto, el control de estos tipos de atributos del vapor, además de su pureza química, también puede ser importante para determinadas aplicaciones del Vapor Puro. Sin embargo, no se mencionan atributos adicionales en la monografía del Vapor Puro porque éstos dependen del uso específico. Tomar en cuenta que el "vapor de planta", menos puro, puede usarse para la esterilización por vapor de cargas no porosas que no están en contacto con el producto, para la limpieza general de equipos que no están en contacto con el producto, como medio de intercambio de calor que no entra en contacto con el producto y en todas las aplicaciones compatibles relacionadas con la fabricación a granel de sustancias químicas farmacéuticas e ingredientes activos farmacéuticos. Finalmente, debido a las propiedades esterilizantes del Vapor Puro, no es necesario monitorear el control microbiano dentro de un sistema de vapor. Por consiguiente, no es necesario el análisis microbiano del condensado de vapor.
Aguas Estériles con Monografía Las siguientes aguas con monografía son formas envasadas de Agua Purificada o Agua para Inyección que se han esterilizado para conservar sus propiedades microbiológicas. Estas aguas pueden destinarse a usos específicos según lo indican sus nombres y también pueden tener restricciones referentes a la configuración del envasado relacionadas con tales usos. En general, estas aguas estériles envasadas se pueden usar en una variedad de aplicaciones en lugar de la forma de agua a granel de la que se derivan. No obstante, existe una marcada diferencia entre las pruebas de calidad y la pureza para estas aguas a granel en comparación con las aguas estériles envasadas. Dichas pruebas de calidad y especificaciones para aguas estériles envasadas discrepan de aquéllas para las aguas a granel a fin de adaptarse a una amplia variedad de tipos de envases, propiedades, volúmenes y usos. Como resultado, las especificaciones de impurezas inorgánicas y orgánicas y los niveles de las formas de agua a granel y estéril envasada no son equivalentes, a pesar de la similitud de sus nombres. Los materiales de envasado y los cierres elastoméricos son las fuentes principales de estas impurezas, que tienden a incrementarse durante la vida útil de estos artículos envasados. Por lo tanto, se deben tener consideraciones apropiadas con respecto a la aptitud de la pureza química para el uso de las formas de aguas estériles envasadas cuando se emplean en aplicaciones de fabricación, analíticas y de limpieza en lugar de las aguas a granel de las que se derivan. Es responsabilidad del usuario garantizar la aptitud para el uso en dichas aplicacio-
USP 39
Información General/ (1231) Agua para Uso Farmacéutico 1853
nes de estas aguas estériles envasadas. Sin embargo, para las aplicaciones que se analizan más adelante para cada tipo de agua estéril envasada, las respectivas restricciones de pureza y envasado por lo general las hacen adecuadas por definición. Agua Purificada Estéril-El Agua Purificada Estéril (ver monografía de la USP) es Agua Purificada, envasada y esterilizada. Se emplea en la preparación de formas farmacéuticas no parenterales de la farmacopea o en aplicaciones analíticas que requieran Agua Purificada cuando el acceso a un sistema validado de Agua Purificada no sea práctico, cuando sólo se necesita una cantidad relativamente pequeña, cuando se requiere Agua Purificada Estéril o cuando el Agua Purificada envasada a granel no está controlada microbiológicamente de manera adecuada. Agua Estéril para Inyección-El Agua Estéril para Inyección (ver monografía de la USP) es Agua para Inyección envasada y esterilizada. Se emplea para preparaciones magistrales extemporáneas recetadas y como diluyente estéril para productos parenterales. También se puede usar para otras aplicaciones en las que se indica Agua para Inyección a granel o Agua Purificada pero cuando el acceso a un sistema de agua validado no es práctico o cuando sólo se necesita una cantidad relativamente pequeña. El Agua Estéril para lnyecciónse envasa en envases monodosis de tamaño no superior a 1 L. Agua Bacteriostática para Inyección-El Agua Bacteriostática para Inyección (ver monografía de la USP) es Agua para Inyección estéril a la que se le ha agregado uno o más conservantes antimicrobianos adecuados. Está destinada al uso como diluyente en la preparación de productos parenterales, más típicamente para productos multidosis en los que se requiere retirar parte del contenido de manera reiterada. Se puede envasar en envases monodosis o multidosis de no más de 30 ml. Agua Estéril para Irrigación-El Agua Estéril para Irrigación (ver monografía de la USP) es Agua para Inyección envasada y esterilizada en envases monodosis de tamaño superior a 1 L que permitan una rápida salida de su contenido. No es necesario que cumpla con los requisitos de inyecciones de pequeño volumen en el capítulo de pruebas generales Partículas en Inyectables (788). También se puede usar en otras aplicaciones, que no tengan especificaciones referentes a partículas, en las que se indique Agua para Inyección o Agua Purificada a granel cuando el acceso a un sistema de agua validado no es práctico o cuando se necesitan cantidades algo mayores que las proporcionadas como Agua Estéril para Inyección. Agua Estéril para Inhalación-El Agua Estéril para Inhalación (ver monografía de la USP) es Agua para Inyección envasada y esterilizada y está destinada para uso en inhaladores y en la preparación de soluciones para inhalación. Tiene una especificación menos estricta para endotoxinas bacterianas que el Agua Estéril para Inyección, y por lo tanto no es adecuada para aplicaciones parenterales.
Aguas para Fabricación sin Monografía Además de las aguas a granel con monografía que se describen anteriormente, las aguas sin monografía también se pueden usar en etapas de procesamiento farmacéutico, como por ejemplo en la limpieza, en etapas de síntesis o un material inicial para una purificación adicional. A continuación sigue una descripción de varias de estas aguas sin monografía que se citan en diversas partes de esta farmacopea. Agua Potable-Este tipo de agua denominada Agua Potable, significa agua bebible o apta para beber. También se hace referencia a ella como Agua Potable Primaria Nacional, Agua Potable Primaria o Agua Potable Nacional. Con excepción de los casos donde se establece una única especificación de agua potable (como por ejemplo las reglamentaciones NPDWR [Reglamentación Nacional Primaria de Agua Potable de la Agencia de Protección Ambiental de los EE.UU., conforme se mencionan en 40 CFR Parte 141 ]), esta agua debe cumplir con los atributos de calidad de las NPDWR, o las reglamentaciones para agua potable de la Unión Europea o Japón, o con las Guías para el Agua Potable de la OMS. Puede provenir de distintas fuentes, incluyendo los servicios públicos de agua, un suministro de agua privado (p.ej., un pozo) o una combinación de estas fuentes. El Agua Potable se puede usar en las primeras etapas de limpieza de los equipos de fabricación farmacéutica y de componentes en contacto con los productos. El Agua Potable es también la mínima calidad de agua a usar en la preparación de sustancias oficiales y otros ingredientes farmacéuticos a granel. Los niveles de contaminantes permitidos en el Agua Potable se consideran generalmente seguros para emplearla con sustancias oficiales y otros fármacos, siempre que sean compatibles con los procesos. Cuando el procesamiento de los materiales así lo requiera para lograr su pureza final, pueden ser necesarias calidades de agua superiores en ciertas etapas de fabricación, tal vez incluso tanto como la del Agua para Inyección o la del Agua Purificada. Tales aguas de pureza superior, sin embargo, podrían requerir sólo atributos seleccionados para ser de pureza superior a la del Agua Potable (ver la Figura 2). El Agua Potable es el agua que se indica como agua fuente o agua de alimentación para la producción de aguas de uso farmacéutico a granel con monografía. El empleo de especificaciones de Agua Potable establece un conjunto razonable de máximos niveles permitidos de contaminantes químicos y microbiológicos con los que se enfrentará un sistema de purificación de agua. Como pueden ocurrir variaciones estacionales en los atributos de calidad del Agua Potable, se deben tener en cuenta sus usos en síntesis y en limpieza. Las etapas de procesamiento en la producción de aguas para uso farmacéutico deben estar diseñadas para ajustarse a esta variabilidad.
1854 (1231) Agua para Uso Farmacéutico/ Información General
USP 39
1ntención de uso
Ingredientes farmacéuticos activos (API)
Formas farmacéuticas
Reactivo analito
¿La form farmacéutica es para uso parentera!?
SI ¿Agua potable es de pureza suficiente para el uso?
Sí
No
No Usar agua adecuada para el uso destinado
Sí
Usar agua de calidad superior a la de agua purificada***
Usar agua purificada***
Sí Usar agua para inyección**
Usar agua potable•
Usar agua potable* químicamente purificada**
Usar agua potable* controlada en endotoxinas**
Usar agua potable* químicamente purificada
y controlada en endotoxinas**
*El agua potable cumple con los reglamentos para el agua potable de la EPA de EEUU (NPDWR) o de la Unión Europea o de Japón, o con los Guias para el agua potable de la OMS. **El agua para API estériles o para formas farmacéuticas estériles debe esterilizarse si no hubiera una etapa de esterilización posterior en el proceso donde se usa ***Ver las guías en este capítulo en donde se indica que en algunas pruebas y valoraciones de !a USP se requiere agua de una calidad distinta a la del agua purificada. Nota: Todos los sistemas deben validarse para proveer un control microbiológico adecuado para el uso destinado del agua.
Figura 2. Selección de agua para usos farmacéuticos. Agua Purificada Caliente-Esta agua se usa en las instrucciones de preparación de artículos USP-NF y con claridad se pretende que sea Agua Purificada que se haya calentado hasta una temperatura no especificada para aumentar la solubilización de otros ingredientes. No hay un límite superior de temperatura para el agua (excepto que ha de ser inferior a 100º), pero para cada monografía hay un límite inferior implícito por debajo del cual el efecto de solubilización deseado no ocurre.
Aguas Analíticas sin Monografía Tanto las Advertencias y Requisitos Generales como la sección introductoria de Reactivos, Indicadores y Soluciones indican con claridad que cuando se indica el término "agua", sin ninguna calificación u otra especificación, para su uso en análisis la calidad de agua será la de Agua Purificada. Sin embargo, hay numerosas calificaciones. Algunas de estas calificaciones implican métodos de preparación, que van desde especificar la etapa de purificación primaria hasta especificar una purificación adicional. Otras calificaciones requieren que se cumplan atributos específicos que en caso contrario, podrían interferir con los procesos analíticos. En la mayoría de estos últimos casos, los atributos requeridos no se analizan específicamente. En su lugar, se especifica un "proceso de purificación" adicional que ostensiblemente permite que el agua cumpla en forma adecuada con este atributo requerido. Sin embargo, las instrucciones de preparación para muchos reactivos se tomaron del laboratorio del innovador y se trasladaron a la monografía introducida inicialmente para un artículo USP-NF o al capítulo de pruebas generales. La calidad del agua grado reactivo que se describe en estas pruebas puede reflejar la designación de calidad de agua del laboratorio del innovador. Estas designaciones de agua específicas se pueden haber originado sin que el innovador se diera cuenta del requisito de Agua Purificada en las pruebas de USP-NF. Independientemente de la razón original para la creación de estas numerosas aguas analí-
USP 39
Información General/ (1231) Agua para Uso Farmacéutico 1855
ticas especiales, es posible que se pueda cumplir ahora con los requisitos de Jos atributos de estas aguas especiales mediante las etapas de preparación básicas y las especificaciones actuales del Agua Purificada. Sin embargo, en algunos casos algunas de las etapas posteriores al procesamiento citadas aún son necesarias para lograr de manera confiable los atributos requeridos. Los usuarios no están obligados a emplear formas específicas de agua analítica, quizás generadas de una forma arcaica, cuando pueden existir alternativas con una calidad, disponibilidad o desempeño analítico igual o superior. La regularidad y confiabilidad para producir estas aguas analíticas alternativas deberían ser verificadas en Jo que respecta a la producción de los atributos deseados. Asimismo, el usuario debe evaluar toda agua analítica alternativa individualmente para cada aplicación para garantizar su aptitud. A continuación se ofrece un resumen de las distintas aguas analíticas sin monografía que se mencionan en USP-NF. Agua Destilada-Esta agua se produce vaporizando agua líquida y condensándola en un estado más puro. Se usa principalmente como disolvente para la preparación de reactivos, pero también se especifica en la ejecución de otros aspectos de pruebas, como por ejemplo para enjuagar un analito, transferir materiales de prueba en forma de suspensión espesa, como estándar de calibración o blanco analítico y para la limpieza de aparatos de prueba. También se menciona como agua inicial a emplear para la preparación de Agua de Alta Pureza. Debido a que ninguno de los usos mencionados de esta agua implica que es necesario un atributo de pureza determinado que solamente pueda derivar de la destilación, el agua que cumpla los requisitos del Agua Purificada derivada de otros medios de purificación podría ser igualmente aceptable cuando se especifica Agua Destilada.
Agua Recién Destilada-También denominada "agua recientemente destilada", se produce de modo similar al Agua Destilada y debe usarse rápidamente después de su generación. Esto implica la necesidad de evitar Ja contaminación con endotoxinas así como con otras formas adventicias de contaminación provenientes del aire o de los envases que podría surgir con un almacenamiento prolongado. Se usa para preparar soluciones para inyecciones subcutáneas de pruebas realizadas en animales y como disolvente de reactivos en pruebas para las que no parece que se necesite un agua de alta pureza determinada que pueda ser atribuible a estar "recién destilada". En el uso para pruebas en animales, el término "recién destilada" y su uso en la prueba implica una pureza química, de endotoxinas, y microbiológica que podría ser igualmente satisfecha por el Agua para Inyección (aunque no se hace referencia a estos atributos químicos, microbianos o relativos a las endotoxinas o a una protección específica de la recontaminación). Para los usos que no están relacionados con animales, el agua que cumple con los requisitos del Agua Purificada derivada por otros medios de purificación y/o períodos de almacenamiento, o ambos, podría ser igualmente adecuada cuando se especifica "agua recientemente destilada" o Agua Recién Destilada. Agua Desionizada-Esta agua se produce mediante un proceso de intercambio de iones en el que los iones contaminantes se reemplazan con iones H+ u OH-. De manera similar al Agua Destilada, el Agua Desionizada se usa principalmente como disolvente para la preparación de reactivos, pero también se especifica en la ejecución de otras operaciones en las pruebas, como por ejemplo para transferir un analito en un procedimiento de prueba, como estándar de calibración o blanco analítico y para Ja limpieza de aparatos de prueba. Asimismo, ninguno de los usos mencionados de esta agua implican la necesidad de atributo de pureza alguno que se pueda lograr exclusivamente mediante la desionización. Por lo tanto, el agua que cumpla con los requisitos del Agua Purificada que se derive por otros medios de purificación podría ser igualmente adecuada cuando se especifica Agua Desionizada. Agua Recién Desionizada-Esta agua se prepara de manera similar al Agua Desionizada, aunque como su nombre sugiere, debe usarse rápidamente después de su producción. Esto implica la necesidad de evitar toda contaminación adventicia que pudiera surgir con el almacenamiento. Esta agua está indicada para su uso como disolvente de reactivos así como para limpieza. Debido a la naturaleza de las pruebas, el Agua Purificada podría ser una alternativa razonable para estas aplicaciones. Agua Destilada y Desionizada-Esta agua se produce mediante la desionización (ver Agua Desionizada) del Agua Destilada. Esta agua se usa como reactivo en pruebas de cromatografía de líquidos que requieren una alta pureza. Debido a la importancia de esta alta pureza, es posible que el agua que apenas cumple con los requisitos del Agua Purificada no sea aceptable. El Agua de Alta Pureza(ver más adelante) podría ser una alternativa razonable para esta agua. Agua Filtrada-Esta agua es Agua Purificada que se ha filtrado para eliminar las partículas que podrían interferir con los análisis en los que se especifique su uso. En ocasiones, se usa de manera intercambiable con Agua Exenta de Partículas y Agua Ultrafiltrada y se cita en algunas monografías y capítulos generales, así como en Ja sección de Reactivos. Dependiendo de su ubicación, se define de manera diversa como agua que se ha pasado a través de filtros con un tamaño de poro de 1,2 µm, 0,22 µm, 0,2 µm o no especificado. Aunque no existe uniformidad en Ja definición de Jos nombres del agua y los tamaños de poro de los filtros usados para producir estas aguas, se debe considerar como universalmente aceptable el uso de Agua Purificada filtrada a través de un filtro con un tamaño de poro de 0,2 µm para todas las aplicaciones donde se especifique el uso de Agua Exenta de Partículas, Agua Filtrada o Agua Ultrafiltrada. Agua de Alta Pureza-Esta agua se puede preparar desionizando agua previamente destilada y Juego filtrándola a través de una membrana con un tamaño de poro de 0,45 µm. Esta agua debe tener una conductividad en línea que no supere 0, 15 µS/cm (no menos de 6,67 Mohmio-cm) a 25º. Si el agua de esta pureza entra en contacto con la atmósfera, incluso brevemente cuando se está usando o extrayendo de su sistema de purificación, su conductividad aumentará inmediatamente hasta aproximadamente 1,0 µS/cm, ya que el dióxido de carbono de Ja atmósfera se disuelve en el agua y se equilibra con iones de hidrógeno y bicarbonato. Por lo tanto, si el uso analítico requiere que Ja conductividad del agua permanezca tan baja como sea posible o que los niveles de bicarbonato/dióxido de carbono sean Jo más bajos posible, debe usarse protegiéndola de Ja exposición a Ja atmósfera. Esta agua se usa como reactivo, como disolvente para preparaciones de reactivos y para Ja limpieza de aparatos de prueba cuando aguas menos puras no tienen un desempeño aceptable. Sin embargo, si el Agua Purificada
1856 (1231 >Agua para Uso Farmacéutico/ Información General
USP 39
comúnmente disponible para un usuario es filtrada y cumple o excede las especificaciones de conductividad de Agua de Alta Pureza, se podría utilizar en lugar del Agua de Alta Pureza. Agua Exenta de Amoníaco-Funcionalmente, esta agua debe tener una concentración de amoníaco inapreciable para impedir que interfiera en las pruebas sensibles al amoníaco. Se ha equiparado al Agua de Alta Pureza que tiene una especificación de conductividad de Etapa 1 (ver Conductividad del Agua (645)) significativamente más restringida que el Agua Purificada debido a que esta última permite un nivel mínimo de amonio entre otros iones. Sin embargo, si el Agua Purificada del usuario estuviera filtrada y cumpliera con las especificaciones de conductividad del Agua de Alta Purezao las excediera, contendría cantidades inapreciables de amoníaco o de otros iones y podría usarse en lugar del Agua de Alta Pureza. Agua Exenta de Dióxido de Carbono-La sección introductoria del apartado Reactivos, Indicadores y Soluciones define esta agua como Agua Purificada que se ha llevado a ebullición vigorosa durante un mínimo de 5 minutos y luego se ha enfriado y protegido de la absorción de dióxido de carbono de la atmósfera. Debido a que la absorción de dióxido de carbono tiende a hacer descender el pH del agua, la mayoría de los usos que se le dan al Agua Exenta de Dióxido de Carbono están asociados con su uso como disolvente en determinaciones relacionadas con el pH o sensibles al pH, o como disolvente de reactivos sensibles a los carbonatos o determinaciones sensibles a los carbonatos. Otro de los usos de esta agua es para determinadas pruebas de rotación óptica y transparencia y color de la solución. Aunque es posible que esta agua esté indicada para estas pruebas simplemente por su pureza, también es posible que los efectos del pH del agua que contiene dióxido de carbono pudieran interferir con los resultados de estas pruebas. Una tercera razón posible para indicar este tipo de agua, es que la evolución de burbujas de aire podría interferir con estas pruebas de tipo fotométrico. El enfoque de la preparación de agua hervida también reduce en gran medida las concentraciones de muchos otros gases disueltos junto con el dióxido de carbono. Por lo tanto, en algunas de las aplicaciones del Agua Exenta de Dióxido de Carbono podría ser que el efecto inadvertido de desgasificación sea el que torne adecuada esta agua. Además de la ebullición, la desionización es tal vez un proceso incluso más eficiente para eliminar el dióxido de carbono disuelto (al desplazar el equilibrio del gas disuelto hacia el estado ionizado con la posterior eliminación mediante las resinas de intercambio iónico). Si el Agua Purificada inicial se prepara mediante un proceso de desionización eficiente y se protege contra la exposición al aire de la atmósfera después de la desionización, se puede obtener efectivamente agua exenta de dióxido de carbono sin la aplicación de calor. Sin embargo, este proceso de desionización no logra la desgasificación del agua, así que si el Agua Purificada preparada mediante la desionización se considera como sustituta del agua en pruebas que requieren Agua Exenta de Dióxido de Carbono, el usuario debe verificar que lo que en realidad se necesita para la prueba no es Agua Desgasificada (que se trata a continuación). Tal como se indica en el Agua de Alta Pureza, incluso un breve contacto con la atmósfera puede hacer que pequeñas cantidades de dióxido de carbono se disuelvan, ionicen y degraden de manera significativa la conductividad y que disminuyan el pH. Si el uso analítico requiere que el agua siga siendo de pH tan neutro y que siga estando tan exenta de dióxido de carbono como sea posible, incluso el análisis debería protegerse de la exposición atmosférica. Sin embargo, en la mayoría de las aplicaciones, la exposición atmosférica durante la prueba no afecta en forma significativa su aptitud para la misma. Agua Exenta de Amoníaco y de Dióxido de Carbono-Según indica su nombre, esta agua se debe preparar mediante enfoques que sean compatibles con los que se mencionan para el Agua Exenta de Amoníaco y el Agua Exenta de Dióxido de Carbono. Debido a que el atributo de estar exenta de dióxido de carbono requiere una posterior protección de la exposición a la atmósfera, es apropiado hacer que el agua sea en primer lugar agua exenta de amoníaco usando el proceso del Agua de Alta Pureza seguido de un proceso de ebullición y enfriamiento protegido del dióxido de carbono. El proceso de desionización del Agua de Alta Pureza para crear Agua Exenta de Amoníaco también eliminará los iones generados por el dióxido de carbono disuelto y finalmente, por equilibrio forzado al estado ionizado, eliminará todo el dióxido de carbono disuelto. Por lo tanto, dependiendo de su uso, un procedimiento aceptable para hacer Agua Exenta de Amoníaco y de Dióxido de Carbonopodría ser transferir y recolectar Agua de Alta Pureza en un envase protegido contra el ingreso de dióxido de carbono. Agua Desgasificada-Esta agua es Agua Purificada que ha sido tratada para reducir el contenido de aire disuelto mediante "medios adecuados". En la sección Reactivos, se proveen enfoques para llevar a ebullición, enfriar (de manera similar al Agua Exenta de Dióxido de Carbono pero sin la protección contra el dióxido de carbono de la atmósfera) y someter a ultrasonido que son aplicables para su uso en pruebas distintas de las pruebas de disolución y de liberación de fármacos. Aunque el Agua Desgasificada no se menciona con este nombre en Disolución (711 ), entre los métodos para desgasificar los medios de disolución (que puede ser agua) se sugiere calentar hasta 41 º,filtrar al vacío a través de una membrana con un tamaño de poro de 0,45 µm y mezclar vigorosamente el filtrado mientras se mantiene el vacío. Este capítulo indica específicamente que se pueden usar otros métodos validados. En otras monografías que tampoco mencionan el nombre de Agua Desgasificada, la desgasificación del agua y otros reactivos se logra mediante el burbujeo con helio. El Agua Desgasificadase usa en las pruebas de disolución y en aplicaciones de cromatografía de líquidos en las cuales la evolución de gas podría interferir con el análisis en sí u ocasionar resultados erróneos debido a inexactitudes al tomar alícuotas volumétricamente. Las aplicaciones en las que los reactivos se preparan con agua a temperatura ambiente, pero las pruebas en sí mismas se realizan a temperaturas más elevadas, son candidatas a sufrir los efectos de la evolución de gases. Si la evolución de gas pudiera interferir con el desempeño de la prueba, incluyendo mediciones de flujo cromatográfico, colorimetría o fotometría, o exactitud volumétrica, entonces es probable que se deba usar el Agua Desgasificada, ya sea que ésta se especifique en el análisis o no. Los métodos de desgasificación anteriormente mencionados podrían no producir agua "exenta de gases". A lo sumo pueden reducir las concentraciones de gas disuelto de manera que la evolución de gas ocasionada por los cambios de temperatura no sea probable. Agua Recién Hervida-Esta agua puede incluir agua recientemente hervida (con o sin mención al enfriamiento en el título), pero se entiende que el agua se enfría antes de usar. Ocasionalmente es necesario emplearla cuando aún está caliente. El
USP 39
Información General/ (1231) Agua para Uso Farmacéutico 1857
Agua Recién Hervida se especifica en pruebas relativas al pH o en reactivos sensibles a los carbonatos, en pruebas o reactivos sensibles al oxígeno o en pruebas en las que la desgasificación podría interferir con el análisis tal como en pruebas de peso específico o apariencia. Agua Exenta de Oxígeno-La preparación de esta agua no se describe específicamente en la farmacopea. Tampoco se menciona ninguna prueba o especificación relativa al oxígeno. Sin embargo, todos los usos implican análisis de materiales que podrían ser sensibles a la oxidación por el oxígeno atmosférico. Los procedimientos para la eliminación del oxígeno disuelto de disolventes, aunque no sean necesariamente agua, se mencionan en Po/orografía (801 ). •. (AFOl-m•y-2016) Estos procedimientos implican el burbujeo difuso con un gas inerte tal como nitrógeno o helio seguido de la aplicación de una atmósfera de gas inerte sobre el producto para evitar la reabsorción de oxígeno. Los tiempos de burbujeo mencionados varían desde 5 a 15 minutos hasta un período no especificado. Algunos sistemas de Agua Purificada y Agua para Inyección producen agua que se mantiene en estado caliente y que está en una atmósfera de gas inerte durante su preparación y su almacenamiento y distribución. Aunque el oxígeno es escasamente soluble en agua caliente, es posible que esta agua no esté exenta de oxígeno. Se debe verificar que todo procedimiento que se utilice para eliminar oxígeno produzca de manera confiable agua apta para el uso indicado. Agua para PEB-Esta agua también se denomina agua reactivo para LAL Por lo general se trata de Agua para Inyección, que puede haber sido esterilizada. Está exenta de endotoxinas a un nivel tal que no se produzca ninguna reacción detectable o interferencia con el reactivo de Lisado de Amebocitos de Limulus usado en la Prueba de Endotoxinas Bacterianas (85). Agua Exenta de Sustancias Orgánicas-Esta agua, según se define en Disolventes Residuales (467), no produce una interferencia significativa con los picos de la cromatografía de gases. Las monografías que hacen referencia a esta agua especifican su uso como disolvente para la preparación de soluciones estándar y de prueba para la prueba de Disolventes Residuales. Agua Exenta de Plomo-Esta agua se usa como diluyente de transferencia para un analito en la prueba de Plomo (251 ). Aunque no se dan instrucciones específicas para su preparación, no debe contener plomo detectable. El Agua Purificada debería ser un sustituto adecuado para esta agua. Agua Exenta de Cloruros-Esta agua se especifica como el disolvente a usar en una valoración que contenga un reactante que precipite en presencia de cloruros. Aunque no se dan instrucciones específicas de preparación para esta agua, su atributo, que es bastante obvio, consiste en tener un nivel de cloruros tan bajo que no reaccione con este reactante sensible a los cloruros. Se podría usar Agua Purificada en lugar de esta agua pero se debe analizar para garantizar que no es reactiva. Agua Caliente-Los usos de esta agua incluyen su uso como disolvente para lograr o aumentar la solubilización de reactivos, para restaurar el volumen original de soluciones calientes o que han sido sometidas a ebullición, enjuagar analitos insolubles exentos de impurezas solubles en agua caliente, como disolvente para la recristalización de reactivos, la limpieza de aparatos y como atributo de solubilidad para distintos artículos USP-NF. Solamente en una monografía se especifica una temperatura de agua "caliente"; así que en los restantes casos, la temperatura del agua es menos importante, pero debe ser lo suficientemente alta para lograr el efecto deseado. En todos los casos, se considera implícitamente que la calidad química del agua es la del Agua Purificada.
VALIDACIÓN Y CALIFICACIÓN DE LOS SISTEMAS DE PURIFICACIÓN, ALMACENAMIENTO Y DISTRIBUCIÓN DE AGUA Establecer la confiabilidad de los sistemas de purificación, almacenamiento y distribución de agua para uso farmacéutico, requiere un período apropiado de observación y seguimiento. Usualmente se presentan pocos problemas relacionados con el mantenimiento de la pureza química del Agua Purificada y el Agua para Inyección. Sin embargo, el uso de la conductividad y del carbono orgánico total para definir la pureza química ha permitido que el usuario evalúe más cuantitativamente la pureza química del agua y su variabilidad como una función del mantenimiento y regeneración de rutina del sistema de tratamiento previo. Incluso la presencia de unidades operativas tales como intercambiadores de calor y el uso de mangueras puntuales pueden poner en peligro la calidad química del agua contenida en un sistema de agua y la que se suministra desde tal sistema, que de otra manera estaría bien controlado. Por lo tanto, la evaluación de la continuidad de la pureza química del agua a lo largo del tiempo debe ser parte del programa de validación. Sin embargo, incluso a pesar de que la calidad química del agua esté mejor controlada, a menudo es más difícil cumplir de manera constante con los criterios de calidad microbiológica debido a los fenómenos que suceden durante y después de la purificación química. Un programa típico incluye un muestreo y un análisis intensivo diario de los principales puntos del proceso como mínimo durante un mes después de haber adoptado criterios de operación para cada operación unitaria, puntos de uso y puntos de muestreo. Un aspecto de la validación del sistema de agua que a menudo se pasa por alto es la entrega del agua a la ubicación donde se usa realmente. Si este proceso de transferencia desde las salidas del sistema de distribución hasta los lugares de uso del agua (por lo general con mangueras) se define como externo al sistema de agua, entonces aún se necesita validar este proceso de transferencia para asegurar que la calidad del agua no se afecta de manera adversa hasta no ser apta para su uso. Debido a que el seguimiento microbiológico de rutina se realiza para los mismos componentes y procesos de transferencia (p.ej., mangueras e intercambiadores de calor) que los del uso de agua rutinario (ver Consideraciones Relativas al Muestreo), es lógico incluir este proceso de transferencia de agua en la validación del sistema de distribución. La validación es el proceso mediante el cual se adquiere y documenta con un alto grado de seguridad la justificación de que un proceso específico producirá, de manera regular, un producto que se ajusta a un conjunto establecido de atributos de calidad. Antes y durante las primeras etapas de la validación se establecen los parámetros críticos del proceso y sus intervalos de
USP 39
1858 (1231) Agua para Uso Farmacéutico / Información General
operación. Un programa de validación califica y documenta el diseño, la instalación, la operación y el desempeño del equipo. Comienza cuando se define el sistema y continúa a través de varias etapas: calificación de la instalación (CI), calificación operativa (CO) y calificación de funcionamiento (CF). En la Figura 3 se representa gráficamente un ciclo de validación típico de un sistema de agua.
1 SISTEMA/ EQUIPO/ CAMBIOS/ AJUSTES
1
-
DEFINICIÓN DE LOS ATRIBUTOS DE CALIDAD DEL AGUA
1
~ Definir los Sistemas y Subsistemas incluyendo Tecnologías de Procesamiento, Parámetros Operativos y Características de las Medidas Correctivas para Cumplir con los Atributos de Calidad del Agua
Instalar Equipos, Cañerías y Sistemas de Control
1
Identificar Parámetros de los Procesos Críticos y Establecer los Rangos Operativos
Calificación de Instalación (CI)
Establecer los Niveles de Alerta e Intervención para los Atributos Claves de Calidad
Calificación Operativa (CO)
Establecer Medidas Correctivas como Respuesta
i 1
CAMBIOS
-
CAMBIOS
CAMBIOS ~
+
Calificación de Funcionamiento (CF)
t Fase Prospectiva-Confirmar Aptitud de los Rangos para los Parámetros Operativos del Proceso Crítico
-
i Fase Retrospectiva y/o Concurrente
-
• Establecer la reproducibilidad y confiabilidad del sistema
-
• Evaluar los efectos de los cambios estacionales • Confirmar la aptitud de los niveles de alerta e intervención y el programa de medidas correctivas
¿ Mantenimiento de la Validación • Control de los cambios • Revisión periódica
Figura 3. Ciclo de validación de un sistema de agua. Típicamente, un plan de validación para un sistema de agua incluye las siguientes etapas: (1) establecer normas para los atributos de calidad del agua terminada y del suministro de agua; (2) definir las operaciones unitarias adecuadas y sus parámetros operativos para lograr los atributos de calidad deseados del agua terminada, a partir del suministro de agua disponible; (3) seleccionar cañerías, equipos, controles y tecnologías de seguimiento; (4) desarrollar una etapa de calificación de instalación
USP 39
Información General/ (1231) Agua para Uso Farmacéutico 1859
(CI) que consiste en calibrar los instrumentos, realizar inspecciones para verificar que los planos ilustran exactamente la configuración final del sistema de agua y, cuando fuera necesario, realizar pruebas especiales para comprobar que la instalación cumple con los requisitos del diseño; (5) desarrollar una etapa de calificación operativa (CO) que consiste en pruebas e inspecciones para verificar que el equipo, el sistema de alarmas y los controles operan en forma confiable y que se han establecido niveles de alerta y acción apropiados (esta fase de la calificación puede superponerse con algunos aspectos del siguiente paso); y (6) desarrollar una etapa de calificación prospectiva del funcionamiento del sistema (CF) para confirmar que los intervalos operativos de los parámetros críticos del proceso son apropiados (durante esta fase de validación, se verifican los niveles de alerta y acción para los atributos clave de calidad y los parámetros operativos); (7) garantizar la adecuación de los procedimientos continuos de control, p.ej., la frecuencia de la higienización; (8) proporcionar un programa de mantenimiento de validación (también denominado ciclo de validación continua) que incluya un mecanismo para controlar los cambios en el sistema de agua y establecer y realizar el mantenimiento preventivo programado, lo que incluye la recalibración de los instrumentos (asimismo, el mantenimiento de la validación incluye un programa de seguimiento de los parámetros críticos del proceso y un programa de acción correctiva); (9) establecer un programa de revisión periódica del funcionamiento del sistema y su recalificación; y (1 O) completar los protocolos y documentación de los Pasos 1 a 9.
SISTEMAS DE AGUA PURIFICADA Y AGUA PARA INYECCIÓN El diseño, la instalación y la operación de sistemas para producir Agua Purificada y Agua para Inyección incluyen componentes, técnicas de control y procedimientos similares. Los atributos de calidad de ambas aguas sólo difieren en la existencia de un requisito relativo a endotoxinas bacterianas para el Agua para Inyección y en sus métodos de preparación, al menos durante la última etapa de la preparación. Las semejanzas en los atributos de calidad proporcionan una base común considerable para el diseño de sistemas de agua que cumplan con alguno de estos requisitos. La diferencia crítica consiste en el grado de control del sistema y en las etapas firiales de purificación necesarias para asegurar la eliminación de bacterias y endotoxinas bacterianas. La producción de agua para uso farmacéutico emplea operaciones unitarias secuenciales (etapas del proceso) que tratan los atributos específicos de calidad del agua y que protegen la operación de pasos subsiguientes del tratamiento. En el diagrama de decisión de la Figura 2 se muestra un proceso de evaluación típico para seleccionar una calidad adecuada de agua para un uso farmacéutico determinado. Este diagrama se puede usar para ayudar a definir requisitos para usos específicos del agua y para la selección de las operaciones unitarias. La operación unitaria final usada para producir Agua para Inyección se ha limitado a la destilación u otros procesos equivalentes o superiores a la destilación para la eliminación de impurezas químicas así como microorganismos y sus componentes. La destilación tiene una larga historia de desempeño confiable y puede validarse como una operación unitaria para la producción de Agua para Inyección, aunque otras tecnologías o combinaciones de tecnologías se pueden validar como equivalentes en efectividad. Otras tecnologías, como por ejemplo la ultrafiltración posterior a otro proceso de purificación química, pueden ser apropiadas para la producción de Agua para Inyección, si se demuestra mediante la validación que son tan efectivas y confiables como la destilación. La aparición de nuevos materiales para tecnologías antiguas, tal como la ósmosis inversa y la ultrafiltración, que permiten una operación intermitente o continua a temperaturas microbianas elevadas, son prometedoras en lo que respecta a su uso válido para producir Agua para Inyección. El plan de validación debe estar diseñado para establecer la aptitud del sistema y proporcionar una comprensión exhaustiva del mecanismo de purificación, el intervalo de condiciones operativas, el tratamiento previo requerido y la causa más probable de modos de falla. También es necesario demostrar la eficacia del esquema de seguimiento y establecer la documentación y los requisitos de calificación para el mantenimiento de la validación del sistema. Las pruebas realizadas en una instalación piloto pueden ser valiosas para definir los parámetros operativos, la calidad de agua esperada y para identificar los modos de falla. Sin embargo, la calificación de una operación unitaria específica sólo se puede realizar como parte de la validación del sistema operativo instalado. La selección de operaciones unitarias específicas y las características del diseño de un sistema de agua deben tener en cuenta la calidad del agua de alimentación, la tecnología elegida para las etapas de procesamiento posteriores, el grado y complejidad del sistema de distribución del agua y los requisitos farmacopeicos apropiados. Por ejemplo, en el diseño de un sistema para Agua para Inyección, el proceso final (la destilación o cualquier otro proceso validado que se utilice conforme a la monografía) debe tener una capacidad efectiva para reducir las endotoxinas bacterianas y debe ser validado.
CUESTIONES RELACIONADAS CON OPERACIONES UNITARIAS A continuación se ofrece una breve explicación de operaciones unitarias seleccionadas y las cuestiones de operación y validación asociadas a éstas. No se discuten todas las operaciones unitarias ni se tratan todos los problemas potenciales. El propósito es destacar temas que se centran en el diseño, la instalación, la operación, el mantenimiento y los parámetros de seguimiento que facilitan la validación del sistema de agua.
Filtración Previa El propósito de la filtración previa-también denominada filtración inicial, gruesa o de profundidad-es eliminar los contaminantes sólidos que tengan un tamaño mayor de 7-1 O µm provenientes del suministro de agua que ingresa al sistema y pro-
1860 (1231) Agua para Uso Farmacéutico / Información General
USP 39
teger de las partículas a los componentes del mismo que se ubican a continuación, dado que aquellas pueden inhibir su desempeño y acortar su vida útil. Esta tecnología de filtración gruesa usa principalmente efectos de tamizado para la captura de partículas y un medio de filtración de profundidad que tiene una gran capacidad de "carga sucia". Tales unidades de filtración están disponibles en una amplia gama de diseños y para diferentes aplicaciones. La eficiencia y capacidad de eliminación difiere significativamente ya que puede variar desde filtros de lecho granular como los de medios múltiples, o los de arena para sistemas de agua más grandes, hasta cartuchos filtrantes de profundidad para sistemas de agua más pequeños. Las configuraciones de la unidad y del sistema varían mucho con el tipo medio de filtración usado y la localización de los mismos en el proceso. Los filtros granulares o los filtros de cartucho para filtración previa a menudo están situados cerca de la cabecera del sistema de tratamiento previo de agua y antes de las operaciones unitarias diseñadas para eliminar los desinfectantes del suministro de agua. Esta ubicación no excluye la necesidad de un control microbiano periódico ya que las biopelículas todavía pueden proliferar, aunque a una velocidad menor en virtud de la presencia de desinfectantes en el suminstro de agua del sistema. Los problemas relativos al diseño y operación que pueden tener un impacto sobre el funcionamiento de los filtros de profundidad incluyen la formación de canales en los medios filtrantes, la obstrucción por la formación de sedimento, el crecimiento microbiano y la pérdida del medio de filtración durante un lavado a contracorriente inadecuado. Las medidas de control incluyen el seguimiento de la presión y del flujo durante el uso y el lavado a contracorriente, la higienización y el reemplazo de los medios de filtración. Una cuestión importante relativa al diseño es determinar el tamaño apropiado del filtro para impedir la formación de canales o la pérdida de medios a consecuencia de una velocidad inapropiada del flujo de agua, así como el tamaño apropiado para reducir al mínimo los lavados a contracorriente excesivamente frecuentes o infrecuentes o el reemplazo del filtro de cartucho.
Carbón Activado Los lechos de carbón activado granulado adsorben material orgánico de bajo peso molecular y aditivos oxidantes, como por ejemplo, compuestos que contengan cloro y cloramina, eliminándolos del agua. Se usan para lograr ciertos atributos de calidad y para proteger de ciertas reacciones a las superficies de acero inoxidable, a las resinas y a las membranas que están a continuación en el sistema. Las cuestiones operativas principales relativas a los lechos de carbón activado incluyen la propensión de este material a desarrollar crecimiento bacteriano, la posibilidad de formación de canales, la capacidad de adsorción orgánica, las velocidades de flujo de agua y tiempo de contacto adecuados, la incapacidad de regeneración in situ y el desprendimiento de bacterias, endotoxinas, productos químicos orgánicos y partículas finas de carbón. Las medidas de control pueden incluir el monitoreo de las velocidades de flujo y de las presiones diferenciales, la higienización con agua caliente o vapor, el lavado a contracorriente, las pruebas de capacidad de adsorción y el reemplazo frecuente del lecho de carbón. Si el lecho de carbón activado está destinado a lograr una reducción de sustancias orgánicas, también puede ser apropiado realizar un seguimiento del COT (Carbono Orgánico Total) del flujo entrante y del efluente. Es importante notar que con frecuencia el uso de vapor para la higienización de los lechos de carbón no es completamente efectivo, debido a que se forman canales de vapor en vez de lograr una permeación uniforme a través del lecho. Generalmente se puede evitar este fenómeno empleando la higienización con agua caliente. También es importante observar que el desarrollo de una biopelícula microbiana en la superficie de las partículas de carbón granulado (así como en otras partículas como por ejemplo las que se encuentran en los lechos desionizadores y en los lechos de medios múltiples) puede ocasionar que los gránulos adyacentes del lecho se aglomeren. Cuando se aglomeran grandes masas de gránulos de esta manera, es posible que los parámetros de flujo normales de lavado a contracorriente y fluidificación de lecho no sean suficientes para lograr su dispersión ocasionando una inefectiva eliminación de los residuos atrapados, que se desprenda la biopelícula y que se pierdan las condiciones de control microbiano (lo mismo pasa con los químicos regenerantes en el caso de las resinas desionizadoras aglomeradas). Se pueden usar tecnologías alternativas en lugar de los lechos de carbón activado para evitar los problemas microbianos propios de estos lechos, como por ejemplo los aditivos químicos que neutralizan desinfectantes y los dispositivos de captura de materia orgánica regenerables. Sin embargo, estas alternativas no tienen el mismo mecanismo de acción que el carbón activado, pueden no ser tan eficaces para eliminar los desinfectantes o algunas sustancias orgánicas, y tienen un conjunto de problemas operativos y medidas de control diferentes que pueden ser tan problemáticos como los lechos de carbón activado.
Aditivos Los aditivos químicos se emplean en los sistemas de agua (a) para controlar microorganismos mediante el uso de sustancias higienizantes como los compuestos dorados y el ozono, (b) para mejorar la eliminación de sólidos en suspensión mediante el uso de agentes floculantes, (c) para eliminar compuestos dorados, (d) para evitar el depósito de sarro sobre las membranas de ósmosis inversa y (e) para ajustar el pH y lograr una eliminación más efectiva de compuestos que contienen amoníaco y carbonatos mediante ósmosis inversa. Estos aditivos no constituyen "sustancias agregadas" en tanto se eliminen mediante etapas de procesamiento posteriores o mientras estén ausentes de alguna otra manera del agua terminada. El control de los aditivos para asegurar una concentración efectiva continua y su posterior seguimiento para asegurar su eliminación deben formar parte del diseño del sistema y estar incluidos dentro del programa de seguimiento.
USP 39
Información General/ (1231) Agua para Uso Farmacéutico 1861
Barrido Orgánico Los dispositivos de barrido orgánico emplean resinas de intercambio aniónico débilmente básicas macrorreticulares capaces de eliminar del agua materiales orgánicos y endotoxinas. Pueden regenerarse con soluciones de salmuera cáustica biocidas apropiadas. Los problemas operativos se asocian con la capacidad de barrido orgánico, las partículas, la contaminación microbiológica y química de la superficie de la resina reactiva, la velocidad de flujo, la frecuencia de regeneración y la descamación de fragmentos de resina. Las medidas de control incluyen el análisis del COT del flujo de entrada y del efluente, el lavado a contracorriente, el seguimiento del desempeño hidráulico y el uso de filtros ubicados a continuación en el sistema para eliminar escamas de resina.
Ablandadores Los ablandadores de agua pueden estar ubicados antes o a continuación de las unidades de eliminación de desinfectante. Usan resinas de intercambio catiónico en su forma sódica para eliminar los iones que confieren la dureza al agua, como por ejemplo el calcio y el magnesio, que podrían ensuciar o interferir con el desempeño de los equipos de procesamiento ubicados a continuación en el sistema, como por ejemplo las membranas de ósmosis inversa, los dispositivos de desionización y las unidades de destilación. Los ablandadores de agua también se pueden usar para eliminar cationes de menor afinidad tal como el ión amonio, que se puede liberar a partir de los desinfectantes que contienen cloramina comúnmente usados en el agua potable y que de otra manera podrían trasladarse a las operaciones unitarias que están a continuación en el sistema. Si la eliminación del amonio es uno de sus propósitos, el ablandador debe estar ubicado en el sistema después de la operación de eliminación de desinfectante, que en sí puede liberar amonio de los desinfectantes neutralizados que contienen cloramina. Los lechos de resina ablandadora de agua se regeneran con solución de cloruro de sodio concentrada (salmuera). Las cuestiones de mayor inquietud incluyen la proliferación de microorganismos, la formación de canales debido a la aglomeración en biopelícula de partículas de resina, las velocidades de flujo y los tiempos de contacto adecuados del agua, la capacidad de intercambio iónico, la contaminación superficial de la resina con sustancias orgánicas y partículas, el lixiviado orgánico de resinas nuevas, la fractura de las perlas de resina, la degradación de la resina por agua excesivamente dorada y la contaminación proveniente de la solución de salmuera usada para regenerar el sistema. Las medidas de control incluyen la recirculación de agua durante los períodos de escaso uso de agua, la higienización periódica del sistema de resina y salmuera, el uso de dispositivos de control microbiano (p.ej., luz UV y cloro), ubicar antes el paso de eliminación del desinfectante en el sistema (si se usa exclusivamente para ablandar el agua), una frecuencia de regeneración apropiada, el seguimiento químico de los efluentes {p.ej., de los iones de dureza y la posibilidad de que haya amonio) y la filtración posterior en el sistema para eliminar escamas de resina. Si se usa un ablandador para la eliminación del amonio del agua fuente que contiene cloramina, entonces la capacidad, el tiempo de contacto, la contaminación superficial de la resina, el pH y la frecuencia de regeneración son muy importantes.
Desion ización La desionización {DI) y la electrodesionización continua (EDIC) son métodos eficaces para mejorar los atributos de calidad química del agua mediante la eliminación de cationes y aniones. Los sistemas de DI tienen resinas cargadas que requieren una regeneración periódica con un ácido y una base. Usualmente, las resinas catiónicas se regeneran empleando ácido clorhídrico o ácido sulfúrico, que reemplazan los iones positivos capturados con iones hidrógeno. Las resinas aniónicas se regeneran con hidróxido de sodio o de potasio, que reemplazan los iones negativos capturados con iones hidróxido. Debido a que las endotoxinas libres tienen carga negativa, se produce algo de eliminación de endotoxinas ocasionada por la resina aniónica. Ambos regenerantes químicos son biocidas y ofrecen una medida de control microbiano. El sistema puede estar diseñado de tal manera que las resinas catiónicas y aniónicas estén en lechos separados o "gemelos" o pueden estar mezcladas entre sí para formar un lecho mixto. Los lechos gemelos se pueden regenerar con facilidad pero desionizan el agua de manera menos eficiente que los lechos mixtos, que tienen un proceso de regeneración considerablemente más complejo. También se pueden emplear envases de resina recargables para este fin. El sistema de EDIC emplea una combinación de resina mixta, membranas selectivamente permeables y una carga eléctrica que proporciona un flujo continuo (del producto y del concentrado de desecho) y una regeneración continua. El agua ingresa tanto por la sección de resina como por la sección de desechos (concentrados). A medida que el agua pasa a través de la resina, se produce la desionización para convertirse en agua producto. La resina actúa como un conductor de electricidad que permite que el potencial eléctrico impulse los cationes y aniones capturados a través de la resina y las membranas apropiadas para concentrarlos y eliminarlos en la corriente de agua de desecho. El potencial eléctrico también separa el agua en la sección de la resina (producto) en iones hidrógeno e hidróxido. Esto permite la regeneración continua de la resina sin la necesidad de agregar regeneradores. Sin embargo, a diferencia de las unidades de desionización convencional, las unidades EDIC se deben alimentar con agua que ya esté parcialmente purificada porque generalmente no pueden producir una calidad de Agua Purificada cuando la carga de iones del agua de alimentación sin purificar es muy pesada. En todas las formas de desionización es importante el control microbiano y de endotoxinas, el impacto de los aditivos químicos sobre las resinas y membranas, y la pérdida, degradación y contaminación de las resinas. Los problemas específicos relativos a las unidades de desionización incluyen la frecuencia y completitud de la regeneración, la formación de canales causada por la aglomeración de partículas de resina provocada por la formación de biopelículas, la lixiviación de material orgánico des-
1862 (1231) Agua para Uso Farmacéutico / Información General
USP 39
de resinas nuevas, el logro de una separación completa de las resinas para regeneración del lecho mixto y la contaminación por el aire al mezclar las resinas (lechos mixtos). Las medidas de control varían pero incluyen típicamente circuitos de recirculación, control antimicrobiano del efluente mediante luz UV, seguimiento de la conductividad, análisis de la resina, filtración microporosa del aire de mezclado, seguimiento microbiano, regeneración frecuente para reducir al mínimo y controlar el crecimiento de microorganismos, uso de un equipo de tamaño adecuado para obtener un flujo de agua y un tiempo de contacto adecuado y el uso de temperaturas elevadas. Las cañerías de regeneración y del distribuidor interno para unidades de lecho mixto se deben configurar de manera que se asegure que los productos químicos de regeneración entren en contacto con todas las superficies internas del lecho y las cañerías y las resinas. Los envases recargables pueden ser una fuente de contaminación y se les debe realizar un seguimiento cuidadoso. El conocimiento cabal del uso previo de la resina, la minimizacón del tiempo de almacenamiento entre la regeneración y el uso, y los procedimientos de higienización apropiados son factores clave que garantizan un funcionamiento adecuado.
Ósmosis Inversa Las unidades de ósmosis inversa (01) emplean membranas semipermeables. Los "poros" de las membranas de 01 son en realidad espacios intersegmentales entre las moléculas del polímero. Estos espacios son lo suficientemente grandes para la permeación de las moléculas de agua, pero demasiado pequeños para permitir el pasaje de iones químicos hidratados. Sin embargo, muchos factores, incluyendo el pH, la temperatura y la presión diferencial a través de la membrana afectan la selectividad de esta permeación. Con los controles adecuados, las membranas de 01 pueden lograr mejorar la calidad química y de contenido microbiano y de endotoxinas. Las corrientes del proceso están formadas por agua de suministro, agua producto (permeato) y agua residual (desecho). Dependiendo de la fuente de agua empleada pueden ser necesarias variaciones en el tratamiento previo y en la configuración del sistema para lograr el desempeño y la confiabilidad deseados. Un factor importante que afecta el desempeño de la 01 es la velocidad de recuperación del permeato, es decir la cantidad de agua que pasa a través de la membrana en comparación con la cantidad que se rechaza. Esto se ve influenciado por varios factores, pero el más significativo es la presión de la bomba. Las recuperaciones de 75% son típicas y pueden lograr una purificación de 1-2 unidades logarítmicas de la mayoría de las impurezas. Para la mayoría de las aguas de alimentación, por lo general no es suficiente cumplir con las especificaciones de conductividad del Agua Purificada. Por lo general, un segundo pasaje de esta agua de permeato a través de otra etapa de 01 logrará la pureza de permeato necesaria si otros factores como el pH y la temperatura se han ajustado apropiadamente y se ha eliminado previamente el amoníaco proveniente del suministro de agua cloraminada. Incrementar la recuperación con presiones más altas para lograr reducir el volumen de agua rechazada producirá una reducción en la pureza del permeato. Si es necesario incrementar la presión a lo largo del tiempo para lograr el mismo flujo de permeato, es una indicación de que hay un bloqueo parcial de la membrana que necesita ser corregido antes de que se contamine superficialmente de manera irreversible y reemplazar la membrana, que es costosa, sea la única opción. Otras cuestiones asociadas con el diseño y la operación de unidades de 01 incluyen la sensibilidad extrema de los materiales de la membrana a los agentes higienizantes y la contaminación superficial microbiana, química y por partículas de la membrana; la integridad de la membrana y el sello; el pasaje de gases disueltos, como por ejemplo dióxido de carbono y amoníaco; y el volumen de agua residual, en particular cuando la eliminación de agua está estrictamente regulada por las autoridades locales. Las fallas en la integridad de la membrana o el sello darán lugar a la contaminación del agua producto. Los métodos de control involucran el tratamiento previo adecuado de la corriente de agua que ingresa al sistema, la selección de un material de membrana apropiado, desafíos a la integridad, el diseño de la membrana y la tolerancia al calor, la higienización periódica y el seguimiento de las presiones diferenciales, la conductividad, los niveles microbianos y el COT. El desarrollo de unidades de 01 que pueden tolerar temperaturas de higienización de agua y operar eficientemente y de manera continua a temperaturas elevadas ha contribuido al control microbiano y a prevenir la contaminación biológica. Las unidades 01 pueden emplearse solas o en combinación con unidades DI y EDIC así como también con la ultrafiltración para mejorar la operatividad y la calidad del agua.
U ltrafiltración La ultrafiltración es una tecnología que se usa muy a menudo en los sistemas de agua para uso farmacéutico para eliminar endotoxinas de una corriente de agua. También puede usar membranas semipermeables, pero a diferencia de la 01, éstas típicamente usan membranas de polisulfona cuyos "poros" intersegmentales se han exagerado intencionalmente durante su fabricación al evitar que las moléculas de polímero alcancen su menor proximidad en equilibrio entre sí. Dependiendo del nivel de control de equilibrio durante su fabricación, se pueden crear membranas con "cortes" de pesos moleculares diferentes de manera que las moléculas con pesos moleculares superiores a los nominales de corte sean rechazadas y no puedan penetrar la matriz de filtración. Los ultrafiltros de cerámica son otra tecnología de tamizado molecular. Los ultrafiltros de cerámica se autosoportan y son extremadamente duraderos, admiten el lavado a contracorriente, la limpieza química y la esterilización por vapor. Sin embargo, pueden requerir presiones de operación más altas que los ultrafiltros de tipo membrana. Todos los dispositivos de ultrafiltración funcionan principalmente mediante un principio de tamizado molecular. Los ultrafiltros con un corte de pesos moleculares de 1O000-20 000 Da se usan típicamente para eliminar endotoxinas en sistemas de
USP 39
Información General/ (1231) Agua para Uso Farmacéutico 1863
agua. Esta tecnología puede ser apropiada como una etapa de purificación intermedia o final. De manera similar a la 01, el desempeño satisfactorio depende del tratamiento previo del agua con operaciones unitarias anteriores. Los problemas a tener en cuenta con los ultrafiltros incluyen la compatibilidad del material de la membrana con agentes higienizantes y con el calor, la integridad de la membrana, la contaminación superficial con partículas y microorganismos y la integridad del sello. Las medidas de control implican la selección del medio de filtración, la higienización, el diseño del flujo (sin salida versus tangencial), pruebas de desafío de la integridad, reemplazo regular del cartucho, temperatura elevada del agua de alimentación y seguimiento del COT y de la presión diferencial. Una flexibilidad adicional en la operación es posible basada en la disposición de las unidades de ultrafiltración, como por ejemplo en configuraciones en paralelo o en serie. Deben tomarse precauciones para evitar el estancamiento del agua, lo cual podría promover el crecimiento de microorganismos en las unidades de reserva o de espera.
Filtración de Carga Modificada Los filtros de carga modificada son por lo general filtros de retención microbiana que se han sometido a un tratamiento durante su fabricación para que tengan una carga positiva en su superficie. La filtración de retención microbiana se describe en un apartado posterior, pero la característica significativa de estas membranas es su carga electrostática superficial. Tales filtros con carga pueden reducir los niveles de endotoxinas existentes en los fluidos que los atraviesan mediante adsorción (debido a la carga negativa de las endotoxinas) en la superficie de las membranas. A pesar de que los ultrafiltros se emplean más a menudo como una operación de unidad para eliminar endotoxinas en sistemas de agua, los filtros con carga modificada también pueden tener un lugar en la eliminación de endotoxinas, en particular cuando las presiones en la parte precedente del sistema no son suficientes para la ultrafiltración y para un uso único, durante un período relativamente corto. Los filtros con carga modificada pueden ser difíciles de validar para la retención de endotoxinas durante períodos largos o grandes volúmenes. Incluso aunque su retención de endotoxina estándar purificada puede ser bien caracterizada, su capacidad de retención para endotoxinas "naturales" es difícil de calibrar. Sin embargo, su utilidad se puede demostrar y validar como filtros de un único uso a corto plazo en puntos de uso en sistemas de agua que no están diseñados para controlar endotoxinas o cuando se necesita tan solo un "pulido" de endotoxinas (eliminación de niveles ligeros u ocasionales de endotoxinas). Las cuestiones relativas al control y la validación incluyen el volumen y la duración de uso, la velocidad de flujo, la pureza y conductividad del agua, y la constancia y concentración de los niveles de endotoxinas que se eliminan. Es posible que todos estos factores deban ser evaluados y sometidos a una prueba de desafío antes de usar este enfoque, lo que hace que esta aplicación sea difícil de validar. Incluso así, es posible que sea necesaria una prueba de endotoxinas de respaldo realizada en puntos anteriores y posteriores al filtro.
Filtros de Retención Microbiana Durante la pasada década, hubo una evolución en la comprensión de los filtros de retención microbiana que ha motivado que se reconsiderara la opinión sobre los mecanismos de retención teóricos. Estos filtros tienen un "tamaño de poro" efectivo mayor que los ultrafiltros y están destinados a evitar el pasaje de microorganismos y partículas de tamaños similares sin restringir indebidamente el flujo. Este tipo de filtración se usa ampliamente en los sistemas de agua para filtrar las bacterias del agua y de los gases comprimidos así como para filtros de ventilación en tanques y alambiques y otras operaciones unitarias. Sin embargo, las propiedades de los microorganismos del sistema de agua parecen desafiar la retención microbiana del agua de un filtro con fenómenos que están ausentes en otras aplicaciones de filtración asépticas, como por ejemplo la esterilización del filtro de formulaciones farmacéuticas antes del envasado. En esta última aplicación, generalmente se considera que los filtros de grado de esterilización tienen un tamaño de poro nominal de 0,2 ó 0,22 µm. Esta clasificación bastante arbitraria está asociada a filtros que tienen la capacidad de retener en la prueba de desafío un alto nivel de un inóculo especialmente preparado de Brevundimonas (anteriormente Pseudomonas) diminuta. Éste es un pequeño microorganismo aislado originalmente décadas atrás a partir de un producto que se había "esterilizado por filtración" usando un filtro con una clasificación de 0,45 µm. Estudios adicionales revelaron que un porcentaje de las células de este microorganismo podrían penetrar de manera reproducible los filtros de esterilización de 0,45 µm. A través de la correlación histórica de filtros con una retención más estricta de B. diminuta, que se cree que son dos veces mejores que los filtros de 0,45 µm, con tamaños de poro nominal de 0,2 µm o 0,22 µm con un uso exitoso en la esterilización por filtrado de soluciones de producto, tanto la clasificación de este filtro como su nivel asociado de desafío de B. diminuta se han convertido en las referencias generales actuales para la filtración esterilizante. Nuevas evidencias sugieren en la actualidad que B. diminuta puede no ser el mejor modelo de microorganismo para los filtros de retención microbiana usados para el agua para uso farmacéutico. Una comprensión anticuada de la filtración de retención microbiana induciría a considerar erróneamente que la clasificación de un filtro es equivalente a un simple tamiz o criba que retiene de manera absoluta partículas con tamaños de la clasificación del filtro o superiores. Una comprensión actual de los mecanismos implicados en la retención microbiana y las variables que pueden afectar esos mecanismos ha producido una interacción de fenómenos mucho más compleja que la que se comprendía hasta ahora. Actualmente se sabe que la retención microbiana se logra por una combinación de los efectos de tamizado simple y de una adsorción sobre la superficie. Todas las variables que figuran a continuación interactúan para crear un fenómeno de retención inusual y sorprendente para los microorganismos del sistema de agua: la variabilidad en el intervalo y tamaño promedio de poro creado por los distintos
1864 (1231) Agua para Uso Farmacéutico / Información General
USP 39
procesos de fabricación de membranas, la variabilidad de la química de superficie y la estructura de tres dimensiones relacionada con los diferentes polímeros empleados en estas matrices de filtros, y el tamaño y propiedades de superficie de los microorganismos que se pretende que sean retenidos por los filtros. La B. diminuta puede no ser el mejor microorganismo para la prueba de desafío para demostrar la retención bacteriana de filtros con tamaño de poro nominal de 0,2 µm a 0,22 µm para su uso en sistemas de aguas porque parece ser retenida con más facilidad por estos filtros que otros microorganismos de la flora del sistema de agua. La aparición bien documentada de microorganismos del sistema de agua en los lados de las partes ubicadas a continuación de algunos filtros con tamaño de poro nominal de 0,2 µm a 0,22 µm después de un período de uso relativamente corto parece confirmar que ocurren algunos fenómenos de penetración. No se sabe con certeza si esta aparición en puntos posteriores al filtro está causada por un fenómeno de "soplado" o algún otro fenómeno de traspaso del filtro que sucede como resultado de que las células sean muy pequeñas, por una "adherencia" menor de las células, o por un fenómeno de "crecimiento" como resultado de una hipotética replicación celular a través de los poros hacia la siguiente parte del sistema. Cualquiera sea el mecanismo de penetración, es posible que las membranas con tamaño de poro nominal de 0,2 µm a 0,22 µm no sean la mejor elección para algunos usos de sistemas de agua. Se han registrado éxitos en la retención microbiana en sistemas de agua con el uso de filtros de fabricantes clasificados arbitrariamente como de O, 1 µm. Hay consenso general con respecto a que los filtros de un fabricante dado con tamaño de poro nominal de O, 1 µm tienen un tamaño de poro real menor que los filtros clasificados como de 0,2 µm a 0,22 µm. Sin embargo, es posible que filtros con una clasificación comparable de distintos fabricantes de aplicaciones de filtración de agua no se comporten de manera equivalente debido a los distintos procesos de fabricación de filtros y a los procesos de pruebas de desafío de retención microbiana no normalizados que se usan actualmente para definir la clasificación de filtro de O, l µm. Debe tenerse en cuenta que el uso de membranas clasificadas como O, 1 µm por lo general da como resultado un sacrificio de la velocidad de flujo en comparación con las membranas de 0,2 µm a 0,22 µm, así que indistintamente de la membrana que se elija para una aplicación de un sistema de agua, el usuario debe verificar que las membranas son adecuadas para la aplicación a la que están destinadas, el período de uso y los procesos de uso, incluyendo la velocidad de flujo. Para la filtración de gases de retención microbiana, operan los mismos fenómenos de tamizado y de adsorción que en la filtración de líquidos, pero el fenómeno de adsorción mejora debido a interacciones electrostáticas adicionales entre las partículas y la matriz del filtro. Estas interacciones electrostáticas son tan fuertes que la retención de partículas para un filtro con una clasificación dada es significativamente más eficaz para filtrar gases que para filtrar agua o productos en solución. Esta adsorción adicional hace que estos filtros con clasificación de 0,2 µm-0,22 µm sean incuestionablemente aptos para la retención microbiana en la filtración Ge gases. Cuando se usan filtros de retención microbiana en estas aplicaciones, la superficie de la membrana es típicamente hidrófoba (no es humedecible por el agua). Un área que merece consideración referente a la filtración de gases es el bloqueo de las ventilaciones de los tanques ocasionado por el condensado de vapor de agua, que puede ocasionar daños mecánicos al tanque. Las medidas de control incluyen el rastreo eléctrico o con vapor y la orientación autodrenante de los soportes de los filtros de ventilación para evitar la acumulación del condensado del vapor. Sin embargo, una temperatura de filtrado continuamente alta representaría una carga oxidativa para los componentes de polipropileno del filtro, así que se recomiendan, como métodos de control, la esterilización de la unidad antes de su uso inicial y periódicamente con posterioridad, así como inspecciones visuales regulares, pruebas de integridad y reemplazos. En aplicaciones para agua, los filtros de retención microbiana se pueden usar en puntos posteriores a las operaciones unitarias que tienden a liberar microorganismos, o en ubicaciones anteriores a operaciones unitarias que son sensibles a los microorganismos. Los filtros de retención microbiana también se pueden usar para filtrar el agua que alimenta el sistema de distribución. Se debe tener en cuenta que las autoridades normativas permiten el uso de filtros de retención microbiana en los sistemas de distribución o incluso en los puntos de uso si se han validado debidamente y si están mantenidos apropiadamente. Un filtro de punto de uso sólo debe estar destinado a "pulir" la calidad microbiana de un sistema que por otro lado está bien mantenido y no deben estar destinados para su uso como dispositivo de control microbiano principal. La eficacia del sistema de medidas de control microbiano sólo puede evaluarse mediante el muestreo del agua en ubicaciones en el sistema anteriores a los filtros. Como medida de protección adicional, se pueden usar lámparas UV en línea, de tamaño adecuado a la velocidad de flujo (ver Higienización), ubicadas en el sistema justo antes de los filtros de retención microbiana, para inactivar los microorganismos antes de que los capture el filtro. Este enfoque dual tiende a retrasar de forma considerable el fenómeno de penetración microbiana potencial y puede alargar sustancialmente la vida de servicio del filtro.
Luz Ultravioleta El uso de lámparas UV a presión reducida que emiten una longitud de onda de 254 nm para el control microbiano se trata en Higienización, pero también está surgiendo la aplicación de luz UV en la purificación química. Esta longitud de onda de 254 nm también es útil para la destrucción del ozono. Con emisiones intensas a longitudes de onda de aproximadamente 185 nm (así como también a 254 nm), las lámparas UV a presión media han demostrado utilidad para la destrucción de los desinfectantes que contienen cloro usados en el agua de alimentación, así como para las etapas intermedias del tratamiento previo del agua. Las altas intensidades de estas longitudes de onda solas o en combinación con otros higienizantes por oxidación, como por ejemplo el peróxido de hidrógeno, se han usado para hacer descender los niveles de COT en los sistemas de distribución recirculantes. Estas sustancias orgánicas se convierten típicamente en dióxido de carbono, que se equilibra en bicarbonato y en ácidos carboxílicos no completamente oxidados, y ambas sustancias se pueden eliminar fácilmente mediante el pulido de resinas de intercambio iónico. Los aspectos que se deben tener en consideración incluyen una intensidad UV y un tiempo de per-
USP 39
Información General/ (1231) Agua para Uso Farmacéutico 1865
manencia adecuados, la pérdida gradual de la capacidad de emisión UV con el tiempo de vida de la lámpara, la formación gradual de una película que absorbe UV en la superficie de contacto con el agua, la fotodegradación incompleta durante una imprevista hipercloración del suministro de agua, la liberación de amoníaco proveniente de la fotodegradación de cloramina, fallas no evidentes de la lámpara UV y degradación de la conductividad en los sistemas de distribución que usan lámparas UV de 185 nm. Las medidas de control incluyen inspecciones regulares o alarmas de emisión para detectar fallas de la lámpara u oclusiones de la película, limpieza y secado regular del manguito de la lámpara UV, detectores de cloro ubicados más adelante en el sistema, desionizadores de pulido ubicados más adelante en el sistema y reemplazo regular de la lámpara (aproximadamente cada año).
Destilación Las unidades de destilación proporcionan purificación química y microbiana por vaporización térmica, eliminación de niebla y condensación de vapor de agua. Existe una variedad de diseños disponibles que incluyen destiladores de efecto sencillo, de efecto múltiple y por compresión de vapor. Generalmente estas dos últimas configuraciones se usan en sistemas más grandes dada su capacidad de generación y eficiencia. Los sistemas de agua destilada requieren controles del agua de alimentación distintos de los que requieren los sistemas de membrana. Para la destilación, se debe tener en consideración la eliminación previa de la dureza del agua y las impurezas silíceas que pueden contaminar o corroer las superficies de transferencia de calor así como la eliminación previa de aquellas impurezas que podrían volatilizarse y condensarse junto con el vapor de agua. A pesar de la percepción general, incluso el mejor proceso de destilación no puede proporcionar la eliminación absoluta de los iones y endotoxinas contaminantes. Se reconoce que la mayoría de los alambiques son capaces de lograr como mínimo una reducción de 3-4 unidades logarítmicas de estas concentraciones de impurezas. Las áreas a considerar incluyen el arrastre de impurezas orgánicas volátiles como por ejemplo los trihalometanos (ver Consideraciones Relativas al Agua de Alimentación) e impurezas gaseosas tales como el amoníaco y el dióxido de carbono, fallas en la eliminación de la niebla, desborde del evaporador, soplado inadecuado, agua estancada en los condensadores y evaporadores, diseño de los sellos de la bomba y del compresor, fugas por pinchaduras en el evaporador y el condensador, y variaciones de la conductividad (calidad) durante la activación y operación del sistema. Los métodos de control pueden incluir las etapas preliminares de descarbonación para eliminar el dióxido de carbono disuelto y otras impurezas volátiles o no condensables; la eliminación confiable de la niebla para reducir al mínimo el arrastre de gotitas al agua de alimentación; indicadores visuales o automatizados del nivel máximo del agua para detectar el desborde y el derrame por ebullición de la caldera; el uso de bombas y compresores sanitarios para reducir al mínimo la contaminación microbiana y con lubricantes del agua de alimentación y el condensado; drenaje adecuado durante los períodos de inactividad para reducir al mínimo el crecimiento microbiano y la acumulación de endotoxinas asociadas en el agua de la caldera; control de soplado para limitar el efecto de concentración de impurezas en la caldera hasta niveles manejables; empleo de sensores de conductividad en línea con desviación automatizada del agua de calidad inaceptable a la corriente de desechos para evitar que ingrese al sistema de distribución del agua terminada con la puesta en marcha o el mal funcionamiento del alambique; y pruebas periódicas de integridad para detectar fugas por pinchaduras para asegurar de manera rutinaria que el condensado no está afectado por contaminantes no volátiles del suministro de agua.
Tanques de Almacenamiento Los tanques de almacenamiento se incluyen como parte de los sistemas de distribución de agua para optimizar la capacidad del equipo de procesamiento. El almacenamiento también permite el mantenimiento de rutina dentro del tratamiento previo mientras se mantiene un suministro continuo de agua para satisfacer las necesidades de producción. Se necesita tener en cuenta el diseño y las condiciones de operación para impedir o reducir al mínimo el desarrollo de biopelículas, minimizar la corrosión, ayudar a usar la higienización química de los tanques y proteger la integridad mecánica. Estas consideraciones pueden incluir el uso de tanques cerrados con interiores lisos, la capacidad de rociar el espacio libre superior del tanque usando aspersores en ciclos de recirculación de retorno y el uso de tanques con aislamiento o camisas. Esto reduce al mínimo la corrosión y el desarrollo de una biopelícula y facilita la higienización térmica y química. Los tanques de almacenamiento requieren ventilación para compensar la dinámica del cambio de los niveles de agua. Esto puede lograrse con un soporte de filtro con rastreo térmico y debidamente orientado equipado con un filtro de membrana hidrófobo de retención microbiana unido a una ventilación atmosférica. Alternativamente, puede emplearse un sistema automático para proporcionar una atmósfera de gas comprimido filtrado por membrana. En ambos casos se deben usar discos de ruptura equipados con un dispositivo de alarma como una protección adicional para la integridad mecánica del tanque. Las áreas a tener en cuenta incluyen el crecimiento microbiano o la corrosión ocasionada por una higienización irregular o incompleta y la contaminación microbiana por fallas en los discos de ruptura sin alarma ocasionadas por los filtros de ventilación ocluidos por condensado.
Sistemas de Distribución La configuración del sistema de distribución debe permitir el flujo continuo de agua en la cañería por medio de la recirculación. El uso de sistemas o segmentos de sistemas de un solo sentido, sin salida o no recirculantes debe evitarse siempre que
1866 (1231) Agua para Uso Farmacéutico / Información General
USP 39
sea posible. Si no fuera posible, estos sistemas se deben purgar periódicamente y realizar un seguimiento con más detenimiento. La experiencia ha indicado que los sistemas de recirculación continua son más fáciles de mantener. Las bombas deben estar diseñadas para que proporcionen condiciones de flujo de turbulencia total para facilitar la distribución exhaustiva del calor (para sistemas higienizados mediante agua caliente) así como para facilitar una distribución exhaustiva de las sustancias químicas higienizantes. El flujo turbulento también parece retardar el desarrollo de biopelículas o reducir la tendencia a desprender bacterias al agua de estas biopelículas. Si se usan bombas redundantes, éstas deben estar configuradas y usarse de manera que se impida la contaminación del sistema. Los componentes y las líneas de distribución deben tener una pendiente y estar equipados con puntos de drenaje, de modo que el sistema pueda vaciarse por completo. En los sistemas de distribución de acero inoxidable donde el agua circula a temperaturas altas, se deben evitar las vías muertas y las condiciones de flujo bajo, y los puntos de conexión con válvulas deben tener una relación de longitud con respecto al diámetro de seis o menor. Si están fabricados con plástico con tolerancia al calor, esta relación debe ser incluso menor para evitar puntos fríos en donde pudiera producirse el desarrollo de biopelícula. En los sistemas de distribución a temperatura ambiente, se debe prestar especial atención para prevenir o reducir al mínimo las relaciones de vías muertas de cualquier tamaño y permitir un drenaje completo. Si el sistema está destinado a ser higienizado con vapor, es crucial realizar un drenaje cuidadoso por pendiente y punto bajo para lograr una buena eliminación del condensado e higienización. Si se quiere que los componentes de drenaje o las líneas de distribución sirvan como estrategia para el control microbiano, también deben estar configurados para permitir un secado completo usando aire comprimido seco (o nitrógeno tomando medidas de seguridad adecuadas para los empleados). Las superficies drenadas pero todavía húmedas continuarán promoviendo la proliferación microbiana. El agua que sale del sistema de distribución no debe retornar al sistema sin pasar antes a través de todo o parte del conjunto de purificación. El diseño de distribución debe incluir la colocación de válvulas de muestreo en el tanque de almacenamiento y en otros sitios, como por ejemplo, en la línea de retorno del sistema de recirculación de agua. Cuando sea factible, los sitios principales de muestreo de agua deben ser las válvulas que suministran agua a los puntos de uso. Las conexiones directas a procesos o equipos auxiliares deben estar diseñadas para impedir el flujo inverso hacia el sistema de agua controlado. Las mangueras y los intercambiadores de calor que están unidos en los puntos de uso para administrar agua para un propósito determinado no deben degradar la calidad del agua ni química ni microbiológicamente. El sistema de distribución debe permitir la higienización para el control de los microorganismos. El sistema puede operarse de manera continua en condiciones de higienización o ser higienizado en forma periódica.
INSTALACIÓN, MATERIALES DE CONSTRUCCIÓN V SELECCIÓN DE COMPONENTES Las técnicas de instalación son importantes porque pueden afectar la integridad mecánica, sanitaria y de corrosión del sistema. La instalación de válvulas debe hacerse a una altura tal que favorezca el drenaje por gravedad. Los soportes de las cañerías se deben instalar de forma que confieran pendientes apropiadas para el drenaje y estar diseñados para dar soporte a la cañería adecuadamente aun en las condiciones térmicas y de flujo más adversas. Los métodos de conexión de los componentes del sistema incluyendo unidades de operación, tanques y cañerías de distribución requieren una atención cuidadosa para excluir problemas potenciales. Las soldaduras de acero inoxidable deben proporcionar juntas confiables que posean superficies internas lisas y exentas de corrosión. El acero inoxidable de bajo contenido de carbono, el relleno de alambre compatible, cuando fuera necesario, el gas inerte, las máquinas de soldadura automática, y la inspección regular y la documentación ayudan a asegurar una calidad de soldadura aceptable. El seguimiento de la limpieza y la pasivación son importantes para eliminar los productos de contaminación y corrosión y restablecer la superficie resistente a la corrosión pasiva. Los materiales plásticos se pueden fundir (soldar) en algunos casos y también requieren superficies internas lisas y uniformes. Se deben evitar los adhesivos y los disolventes puesto que los mismos pueden potencialmente producir vacíos y sustancias extraíbles. Los métodos mecánicos de unión, como por ejemplo, los conectores de brida, requieren atención para evitar la creación de desviaciones, brechas, penetraciones y vacíos. Las medidas de control incluyen una buena alineación, selección de un tamaño adecuado para las juntas, espaciamiento apropiado, fuerza de sellado uniforme y evitar los accesorios con uniones de rosca. Se deben seleccionar materiales de construcción que sean compatibles con las medidas de control, tales como la higienización, la limpieza y la pasivación. El intervalo de temperatura es un factor crítico para la elección de materiales apropiados puesto que puede requerirse que las superficies soporten temperaturas elevadas para la operación e higienización del sistema. Si se emplean productos químicos o aditivos para limpiar, controlar o higienizar el sistema, se deben usar materiales resistentes a estos productos químicos o aditivos. Los materiales deben ser capaces de soportar un flujo turbulento y altas velocidades sin desgastar la película resistente a la corrosión, como por ejemplo la superficie de óxido de cromo pasivo del acero inoxidable. El acabado de los materiales metálicos, como por ejemplo del acero inoxidable, ya sea un acabado de fábrica, un pulido hasta cierta textura específica, o un tratamiento de electropulido, debe complementar el diseño del sistema y proporcionar un grado satisfactorio de resistencia a la corrosión y al desarrollo microbiano y se debe poder higienizar químicamente. El equipo auxiliar y los accesorios con uniones que requieran sellos, juntas, diafragmas, medios de filtración y membranas deben excluir materiales que permitan la posibilidad de extracción de sus componentes, la descamación y el desarrollo microbiano. Los materiales aislantes expuestos a las superficies de acero inoxidable deben estar exentos de cloruros para evitar el fenómeno de fisura corrosiva por estrés, ya que puede producir la contaminación del sistema y la destrucción de los tanques y de componentes críticos del sistema.
USP 39
Información General/ (1231) Agua para Uso Farmacéutico 1867
Las especificaciones son importantes para asegurar la selección adecuada de materiales y sirven como una referencia para la calificación y el mantenimiento del sistema. Se deben revisar para constatar su aptitud y retener como referencia informaciones tales como los datos provistos por el fabricante del acero inoxidable y los informes referentes a la composición, clasificación y capacidad de manejo de sustancias no metálicas. La selección de componentes (equipo auxiliar) se debe realizar asegurándose de que no generen una fuente de ingreso de contaminación. Se deben construir intercambiadores de calor para evitar filtraciones de medio de transferencia de calor al agua para uso farmacéutico y para el caso de los diseños de intercambiadores de calor en los que la prevención puede fallar, deben existir medios para detectar fugas. Las bombas deben tener un diseño sanitario con sellos que impidan la contaminación del agua. Las válvulas deben poseer superficies internas lisas con el asiento y el dispositivo de cierre expuestos a la acción de descarga del agua como ocurre, por ejemplo, con las válvulas de diafragma. Se debe evitar el empleo de válvulas con cámaras o dispositivos de cierre (p.ej., esféricas, de tapón, de compuerta, de globo) que se desplacen entrando y saliendo de las áreas de flujo.
HIGIENIZACIÓN En los sistemas de agua, el control microbiano se logra principalmente mediante prácticas de higienización. Los sistemas se pueden higienizar empleando medios térmicos o químicos. Los enfoques térmicos para la higienización del sistema incluyen la circulación periódica o continua del agua caliente y el uso de vapor. Comúnmente se usan para este propósito temperaturas de al menos 80º, pero una recirculación continua de agua a una temperatura de al menos 65º también se ha empleado eficazmente en sistemas de distribución de acero inoxidable aislados cuando se presta atención a la uniformidad y distribución de tales temperaturas de autohigienización. Estas técnicas están limitadas a sistemas compatibles con las altas temperaturas que se requieren para lograr la higienización. Aunque los métodos térmicos controlan el crecimiento de biopelículas al inhibir continuamente su crecimiento o en el caso de aplicaciones intermitentes, al matar los microorganismos de las biopelículas, no son eficaces para eliminar las biopelículas que ya se han establecido. Las biopelículas con microorganismos ya muertos pero intactas pueden convertirse en una fuente de nutrientes para un nuevo crecimiento de la biopelícula después de que las condiciones de higienización se eliminan o cesan. En tales casos puede ser más efectiva una combinación de higienización térmica de rutina suplementada periódicamente con una higienización química. Cuanto más frecuente sea la higienización térmica, más probable será que se pueda eliminar el desarrollo y un nuevo crecimiento de la biopelícula. Se pueden emplear métodos químicos, dependiendo de su compatibilidad, sobre una amplia variedad de materiales de construcción. Típicamente estos métodos emplean agentes oxidantes, como por ejemplo, compuestos halogenados, peróxido de hidrógeno, ozono, ácido peracético o combinaciones de éstos. Los compuestos halogenados son higienizantes eficaces aunque difíciles de eliminar por lavado del sistema y tienden a dejar intactas las biopelículas. Los compuestos, como por ejemplo el peróxido de hidrógeno, el ozono y el ácido peracético, oxidan las bacterias y biopelículas formando peróxidos reactivos y radicales libres (en particular, radicales hidroxilo). La breve vida media particularmente del ozono, y su limitación con respecto a las concentraciones que se pueden lograr, requiere una adición continua durante el proceso de higienización. El peróxido de hidrógeno y el ozono se degradan rápidamente en agua y oxígeno; el ácido peracético se convierte en ácido acético en presencia de luz UV. De hecho, la facilidad del ozono para degradarse a oxígeno usando luz UV a 254 nm en los puntos de uso permite su uso con mucha efectividad de manera continua para proporcionar condiciones de higienización continuas. La luz UV en línea a una longitud de onda de 254 nm también se puede usar para "higienizar" de manera continua el agua que circula en el sistema, pero el tamaño de estos dispositivos debe determinarse adecuadamente para el flujo de agua. Tales dispositivos inactivan un alto porcentaje (pero no el 100%) de los microorganismos que fluyen a través del dispositivo, pero no se pueden usar directamente para controlar la biopelícula existente en ubicaciones en el sistema anteriores o posteriores a la del dispositivo. Sin embargo, cuando se suma a las tecnologías de higienización térmica o química convencional o se ubica inmediatamente antes de un filtro de retención microbiana es muy efectiva y puede prolongar el intervalo entre las higienizaciones del sistema. Es importante señalar que los microorganismos en una biopelícula bien desarrollada pueden ser muy difíciles de matar, incluso por biocidas oxidantes agresivos. Cuanto menos desarrollada y por lo tanto, más fina sea la biopelícula, más efectiva será la acción del biocida. Por lo tanto, el control biocida óptimo se logra mediante un uso frecuente de biocidas que no permita un desarrollo significativo de biopelícula entre los tratamientos. Los pasos de higienización requieren validación para demostrar la capacidad de reducir y mantener la contaminación microbiana a niveles aceptables. La validación de los métodos térmicos debe incluir un estudio de distribución del calor para demostrar que las temperaturas de higienización se logran en todo el sistema, incluyendo el cuerpo de las válvulas de punto de uso. La validación de los métodos químicos requiere una demostración de la concentración química adecuada en la totalidad del sistema, la exposición de todas las superficies húmedas, incluyendo el cuerpo de las válvulas de punto de uso y la completa eliminación del higienizante del sistema al completarse el tratamiento. La validación de los métodos para la detección y cuantificación de residuos del higienizante o los productos de su degradación objetables es una parte esencial del programa de validación. La frecuencia de higienización debe estar avalada, si no disparada, por los resultados del seguimiento microbiano del sistema. Se deben emplear las conclusiones obtenidas del análisis de tendencias de los datos microbiológicos como el mecanismo de alarma para el mantenimiento del sistema. Se debe establecer la frecuencia de higienización de tal manera que el sistema opere en un estado de control microbiológico y no exceda en forma rutinaria los niveles de alerta (ver Niveles de Alerta y Acción y Específícacíones).
1868 (1231) Agua para Uso Farmacéutico / Información General
USP 39
OPERACIÓN, MANTENIMIENTO Y CONTROL Se debe establecer un programa de mantenimiento preventivo que asegure que el sistema de agua permanece en un estado de control. El programa debe incluir: (1) procedimientos para operar el sistema, (2) programas de seguimiento de los atributos de calidad críticos y de las condiciones operativas que incluyan la calibración de instrumentos críticos, (3) un programa periódico de higienización, (4) el mantenimiento preventivo de los componentes y (5) el control de cambios en el sistema mecánico y las condiciones de funcionamiento. Procedimientos Operativos-Los procedimientos operativos del sistema de agua y la realización del mantenimiento de rutina y acciones correctivas deben estar por escrito; éstos además deben definir cuándo es necesaria una acción. Los procedimientos deben estar bien documentados, definiendo en detalle la función de cada tarea, asignando las personas responsables del cumplimiento del trabajo y describiendo cómo se debe realizar el trabajo. La efectividad de estos procedimientos debe evaluarse durante la validación del sistema de agua. Programa de Seguimiento-Los atributos clave de calidad y los parámetros operativos deben estar documentados y se debe realizar un seguimiento. El programa puede incluir una combinación de sensores o instrumentos automáticos en línea (p.ej., para COT, conductividad, dureza y cloro), documentación manual o automática de parámetros operativos (como por ejemplo, velocidades de flujo o caída de presión en el lecho de carbón, el filtro o la unidad de 01) y pruebas de laboratorio (p.ej., recuentos microbianos totales). Se deben incluir la frecuencia de muestreo, el requisito para evaluar resultados de prueba y la necesidad de iniciación de medidas correctivas. Higienización-Según el diseño del sistema y las unidades de operación seleccionadas, puede requerirse una higienización periódica de rutina para el sistema en un estado de control microbiano. Las tecnologías de higienización se han descrito anteriormente. Mantenimiento Preventivo-Se debe desarrollar un programa de mantenimiento preventivo. El programa debe establecer el tipo de mantenimiento preventivo que se debe realizar, la frecuencia de tal trabajo de mantenimiento y cómo se debe documentar este trabajo. Control de Cambios-Se deben controlar la configuración mecánica y las condiciones operativas. Se deben evaluar los cambios propuestos, considerando su impacto en el sistema total. Se debe determinar la necesidad de recalificar el sistema después de efectuados los cambios. Después de una decisión que modifique un sistema de agua, se deben revisar los planos, manuales y procedimientos afectados.
CONSIDERACIONES DE MUESTREO Se debe realizar un seguimiento a los sistemas de agua con la debida frecuencia para asegurar que el sistema está bajo control y que continúa produciendo agua de calidad aceptable. Se deben tomar muestras en sitios representativos dentro del sistema de procesamiento y distribución del agua. La frecuencia del muestreo se debe establecer basándose en los datos de validación del sistema y debe cubrir las áreas críticas incluyendo los sitios de las operaciones unitarias. El plan de muestreo debe tener en cuenta los atributos deseados del agua de la que se toman las muestras. Por ejemplo, los sistemas de Agua para Inyección pueden requerir una frecuencia de muestreo más rigurosa debido a que sus requisitos microbiológicos son más importantes. Los análisis de muestras de agua a menudo sirven para dos fines: realizar evaluaciones de control en proceso y evaluaciones de control de la calidad final. Los análisis de control en proceso por lo general se centran en los atributos del agua en el sistema. El control de calidad se ocupa principalmente de los atributos del agua suministrada por el sistema a sus distintos lugares de uso. Este último por lo general emplea algún tipo de dispositivo de transferencia, a menudo una manguera flexible, para unir el tramo entre la válvula de punto de uso del sistema de distribución y la ubicación real donde se usa el agua. El problema de la ubicación de la recolección de muestras y el procedimiento de muestreo a menudo se debate calurosamente debido al uso típicamente mezclado de datos generados a partir de las muestras, tanto para el control en proceso como para el control de calidad. En estas situaciones de una única muestra y uso mezclado de datos, se debe usar el peor caso hipotético. Es decir, las muestras se deben recolectar de puntos de uso que usan los mismos dispositivos de suministro, como por ejemplo mangueras, y los mismos procedimientos, como por ejemplo descarga de salida o manguera preliminar, tal y como son usados por la producción desde esos puntos de uso. Cuando no se pueden tomar muestras de los puntos de uso per se, como por ejemplo en el caso de conexiones de cañería rígida al equipo, se pueden usar puertos de muestreo especiales. En todos los casos la muestra debe representar de manera tan semejante como sea posible la calidad del agua usada en la producción. Si se emplea un filtro de punto de uso, es necesario realizar el muestreo antes y después del filtro dado que el filtro enmascarará el control microbiano logrado por los procedimientos operativos normales del sistema. Es necesario neutralizar las muestras que contienen agentes químicos higienizantes antes de su análisis microbiológico. Las muestras para análisis microbiológico deben analizarse de inmediato o refrigerarse adecuadamente para conservar los atributos microbianos originales hasta que se pueda comenzar el análisis. Las muestras tomadas del agua que fluye sólo indican la concentración de microorganismos del plancton (microorganismos que flotan libremente) presentes en el sistema. Los microorganismos de las biopelículas (aquellos unidos a la superficie de los sistemas de agua), por lo general están presentes en mayor número y son la fuente de la población del plancton recuperada de las muestras tomadas. Los microorganismos de la biopelícula representan una fuente continua de contaminación y son difíciles de muestrear y cuantificar directamente. Por consiguiente, la población del plancton se emplea generalmente como un indicador del nivel de contaminación del sistema y es la
USP 39
Información General/ (1231) Agua para Uso Farmacéutico 1869
base para los Niveles de Alerta y Acción y Especificaciones del sistema. La aparición persistente de altos niveles de plancton es generalmente una indicación del desarrollo avanzado de biopelícula que requiere un control correctivo. El control del sistema y la higienización son la clave para controlar la formación de la biopelícula y la consiguiente población del plancton. El muestreo para análisis químicos se realiza también con fines de control en proceso y de control de calidad. Sin embargo, a diferencia de los análisis microbiológicos, los análisis químicos pueden ser realizados y a menudo se realizan usando instrumental en línea. Este tipo de prueba en línea tiene fines de control en proceso inequívocos porque no se realiza en el agua entregada por el sistema. Sin embargo, a diferencia de los atributos microbianos, las mangueras no degradan los atributos químicos significativamente. Por lo tanto, a través del análisis de verificación, es posible mostrar que los atributos químicos detectados por el instrumental en línea (análisis en proceso) son equivalentes a los detectados en los extremos de las mangueras de los puntos de uso (análisis de control de calidad). Esto nuevamente crea un caso de una sola muestra y un uso mezclado de datos. Es mucho mejor operar el instrumental de manera continua, generando grandes volúmenes de datos en proceso, pero usando solamente una muestra pequeña definida de esos datos para fines de Control de Calidad. Los ejemplos de enfoques aceptables incluyen usar los valores más altos para un período dado, el mayor promedio ponderado en el tiempo para un período dado (a partir de subperíodos fijos o rotativos) o valores a un momento prefijado del día. Cada enfoque tiene ventajas y desventajas con referencia a la complejidad del cálculo y su reflejo de calidad continua, de manera que el usuario debe decidir qué enfoque es el más adecuado o justificable.
CONSIDERACIONES QUÍMICAS Los atributos químicos del Agua Purificada y del Agua para Inyección, vigentes antes del compendio USP 23, fueron especificados mediante una serie de pruebas químicas para varios atributos específicos y no específicos con la intención de detectar la especie química indicativa de una purificación incompleta o inadecuada. A pesar de que estos métodos podrían haber sido considerados escasamente adecuados para controlar la calidad de estas aguas, sin embargo superaron la prueba del tiempo. Esto se debe en parte a que la operación del sistema de agua estaba basada (y todavía lo está) en mediciones de conductividad en línea y en especificaciones que generalmente se piensa que imposibilitan la falla de estas pruebas arcaicas de atributos químicos. La USP dejó estas pruebas de atributos químicos reemplazándolas con tecnologías analíticas contemporáneas para las aguas a granel Agua Purificada y Agua para Inyección. La intención fue actualizar las tecnologías analíticas sin hacer más estrictos los requisitos de calidad. Las dos tecnologías analíticas contemporáneas usadas fueron el COT y la conductividad. La prueba de COT reemplazó la prueba de Sustancias Oxidables que principalmente apuntaba a contaminantes orgánicos. Una prueba de Conductividad de múltiples etapas que detecta contaminantes iónicos (la mayoría inorgánicos) reemplazó, con la excepción de la prueba de Metales pesados, todas las pruebas químicas inorgánicas (es decir, Amoníaco, Calcio, Dióxido de carbono, Cloruros, Sulfatos). Se consideró innecesario reemplazar el atributo de metales pesados porque (a) las especificaciones del suministro de agua (que se encuentran en la NPDWR) para Metales pesados en forma individual eran más estrictas que el límite de detección aproximado de la prueba de Metales pesados para USP XXII Agua para Inyección y Agua Purificada(aproximadamente O, 1 ppm), (b) los materiales de construcción de los sistemas de agua contemporáneos no lixivian metales pesados contaminantes, y (c) los resultados de la prueba para este atributo han sido uniformemente negativos-no ha habido un caso confirmado de falla de una sola prueba (falla exclusiva de la prueba de Metales pesados mientras los demás atributos pasaban las pruebas) desde que se han implementado las normas actuales de metales pesados en agua potable. Sin embargo, dado que la presencia de metales pesados en el Agua Purificada o el Agua para Inyección podría tener serias consecuencias, su ausencia debe estar documentada como mínimo durante la comisión y validación del nuevo sistema de agua o durante los registros de resultados de pruebas anteriores. Los Sólidos totales y el pH fueron las únicas pruebas que no están cubiertas por la prueba de conductividad. La prueba de Sólidos totales se consideró redundante porque las pruebas no selectivas de conductividad y COT podrían detectar la mayoría de las especies químicas excepto sílice, que podría permanecer sin detectar en su forma coloidal. El sílice coloidal en el Agua Purificada y el Agua para Inyección se elimina con facilidad mediante la mayoría de las etapas de tratamiento previo del agua e incluso si está presente en el agua, no constituye un riesgo médico o funcional excepto en situaciones extremas e infrecuentes. En tales situaciones extremas, es probable que se detecten otros atributos extremos. Sin embargo, es responsabilidad del usuario garantizar la aptitud para su uso. Si el sílice es un componente significativo en el suministro de agua y las operaciones unitarias de purificación pudieran operarse o fallar y permitir selectivamente que se libere sílice en el agua terminada (en ausencia de contaminantes conjuntos detectables por conductividad), entonces se deben usar las pruebas específicas para sílice o las del tipo de sólidos totales para supervisar y realizar un seguimiento de este problema poco común. El atributo del pH finalmente se reconoció que era redundante para la prueba de conductividad (que incluía el pH como un aspecto de la prueba y especificación); por lo tanto se dejó de usar el pH como una prueba de atributo separada. La justificación usada por la USP para establecer sus especificaciones de conductividad de Agua Purificada y Agua para Inyección tomó en cuenta la conductividad contribuida por los dos atributos anteriores de menor conductividad de Cloruros y Amoníaco, por lo tanto imposibilitando su falla si estas pruebas de química húmeda se hubieran realizado. En esencia, las especificaciones de conductividad de la Etapa 3 (ver Conductividad del Agua, Agua a Granel (645)) se establecieron a partir de la suma de las conductividades de las concentraciones límite de los iones cloruro (desde un pH de 5,0-6,2) y los iones amoníaco (desde un pH de 6,3-7,0), más la inevitable contribución de otros iones que contribuyen conductividad, provenientes del agua (H+ y
USP 39
1870 (1231) Agua para Uso Farmacéutico / Información General
OH-), C0 2 atmosférico disuelto (como HC0 3-), y una cantidad para proporcionar equilibrio eléctrico de Na+ o CI-, dependiendo del desequilibrio iónico inducido por el pH (ver la Tabla 7). La especificación de conductividad de la Etapa 2 es el valor menor de esta tabla, 2, 1 µS/cm. Las especificaciones de la Etapa 1, diseñadas principalmente para mediciones en línea, se derivaron esencialmente sumando los valores menores de las columnas de los iones contribuyentes para cada tabla de una serie de tablas similares a la Tabla 1, creada para cada incremento de 5º entre Oº y 100º. A fines ilustrativos, los valores en cursivas en la Tabla 1, la tabla de datos de conductividad para 25º, se sumaron para dar un valor conservador de 1,3 µS/cm, la especificación de la Etapa 1 para una muestra de agua no equilibrada con la atmósfera y no compensada con la temperatura que realmente tuvo una temperatura medida de 25º-29º. Cada incremento de 5º en la tabla se trató de manera similar para proporcionar los valores individuales enumerados en la tabla de las especificaciones de la Etapa 1 (ver Conductividad del Agua, Agua a Granel (645)). Tabla 1. Conductividades de Iones Contribuyentes del Modelo Cloruro-Amoníaco como una Función del pH
(en agua equilibrada en la atmósfera a 25º) Conductividad (µS/cm) pH
H+
OH-
HCOf
c11,01
o, 19 0,29
0,03
1,01
0,38
0,04
1,01
0,46
0,05
1,01
0,52
0,06
1,01
0,58
0,08
1,01
0,63
0,10
1,01
0,68
0,12
1,01
0,73
0,16
1,01
0,78
0,20
1,01
0,84
0,25
1,01
0,90
0,31
1,01
0,99
2,53
2,5
0,39
0,63
o o o
1,22
2,42
2,4
1,22
2,31
2,3
1,22
2,18
2,2
0,04
1,22
2,14
2,1
0,27
1,22
2,56
2,6
0,56
1,22
3,09
3, 1
0,93
1,22
3,77
3,8
1,39
1,22
4,63
4,6
0,35 0,28
6,2
0,22
6,3
0,18
6,4
0,14
0,01
0,49
0,45
6,5
0,11
0,01
0,62
0,22
6,6
0,09
0,01
0,78
o o o o o
5,2
2,20
5,3
1,75
5,4
1,39
5,5
1,10
5,6
0,88
5,7
0,70
5,8
0,55
5,9
0,44
Límite de Etapa 3
1,01
6,1
2,77
Conductividades Combinadas
0,02
6,0
3,49
5,1
NH 4 +
0,02
o o o o o o o o o o o o o o
5,0
Na•
6,7
0,07
0,01
0,99
6,8
0,06
0,01
1,24
6,9
0,04
0,02
1,56
7,0
0,03
0,02
1,97
o o o o o o o o o o o o o
4,71
4,7
4,09
4,1
3,62
3,6
3,26
3,3
2,97
3,0
2,75
2,8
2,60
2,6
2,49
2,5
2,41
2,4
2,39
2,4
2,40
2,4
2,44
2,4
Tal como se indicó anteriormente, este cambio radical al usar un atributo de conductividad así como la inclusión del COT permitieron las mediciones en línea. Éste fue un cambio filosófico importante y permitió que la industria realizara importantes ahorros. Las pruebas de conductividad y de COT también se pueden realizar "fuera de línea" en los laboratorios usando muestras recolectadas, aunque la recolección de muestras tiende a introducir la posibilidad de contaminación adventicia que puede ocasionar lecturas altas falsas. Sin embargo, la recolección de datos en línea no está exenta de riesgos. Las lecturas continuas tienden a crear cantidades voluminosas de datos en donde antes sólo estaba disponible un solo punto de dato. Tal como se indica en Consideraciones Relativas al Muestreo, los datos continuos en proceso son excelentes para entender cómo se desempeña un sistema de agua durante la totalidad de sus variados usos y ocasiones de mantenimiento en tiempo real, pero son demasiados datos para fines de control de calidad. Por lo tanto, se puede usar una fracción justificable o un promedio de datos que siga siendo representativo de la calidad del agua general que se usa. Las aguas envasadas y estériles presentan un dilema particular con respecto a los atributos de conductividad y COT. El envase en sí es la fuente de sustancias químicas (inorgánicas y orgánicas) que lixivian a lo largo del tiempo en el agua envasada y que se pueden detectar fácilmente mediante las pruebas de conductividad y de COT. Antes de la llegada de la prueba de COT para agua a granel, cuando la prueba de Sustancias Oxidables era la única prueba de "pureza orgánica" tanto para las monografías de aguas a granel como para aguas envasadas y estériles de la USP, no se tenía en cuenta la falta de sensibilidad de esa prueba para muchas de las sustancias orgánicas lixiviables procedentes de los materiales de envasado plásticos y elastoméricos, lo cual permitía niveles relativamente altos de sustancias orgánicas en el agua envasada y estéril (posiblemente varias veces la especificación de COT para agua a granel). De manera similar, los envases de vidrio también pueden lixiviar sustancias inorgánicas, como por ejemplo sodio, que se detectan con facilidad mediante la conductividad, pero que no se detectan con facilidad mediante las anteriores pruebas de límite de química húmeda. Según la opinión general y las normas actuales, la mayoría de estas sustancias lixiviables se consideran inocuas a las concentraciones bastante significativas en las que están presentes. No
USP 39
Información General/ (1231) Agua para Uso Farmacéutico 1871
obstante, degradan efectivamente la calidad de las aguas de alta pureza que se colocan en esos sistemas de envases. Algunos materiales de envasado contienen más sustancias lixiviables que otros y pueden no ser tan adecuados para contener agua y mantener su pureza. Los atributos de conductividad y COT tienden a revelar más sobre las sustancias lixiviables del envasado que sobre la pureza original del agua. Estas sustancias lixiviables "permitidas" actualmente podrían hacer que las versiones estériles envasadas del agua a granel equivalente original fueran esencialmente inadecuadas para muchos usos en los que las aguas a granel son perfectamente adecuadas. Por lo tanto, el capítulo Conductividad del Agua (645) se divide en dos secciones para controlar mejor las sustancias lixiviables iónicas del envasado. La primera se denomina Agua a Granel, que se aplica a Agua Purificada, Agua para Inyección, Agua para Hemodiálisis y Vapor Puro, e incluye las especificaciones e instrucciones de las pruebas de conductividad en tres etapas. La segunda se denomina Agua Estéril, que se aplica a Agua Purificada Estéril, Agua Estéril para Inyección, Agua Estéril para Inhalación y Agua Estéril para Irrigación. La sección Agua Estéril incluye las especificaciones de conductividad similares a las de la Etapa 2 porque está destinada como una prueba de laboratorio y estas aguas estériles fueron preparadas a partir de agua a granel que ya cumplió previamente con la prueba de conductividad en tres etapas. En esencia, las sustancias iónicas lixiviables del envasado son los "analitos" principales que se determinan mediante las pruebas de conductividad en la sección Agua Estéril de Conductividad del Agua (645). El efecto sobre las sustancias lixiviables potenciales debido a envases con tamaños diferentes es la justificación para tener dos especificaciones separadas, una para envases pequeños de volúmenes nominales de 1 O mL o menos y la otra para envases más grandes. Estas especificaciones de conductividad están armonizadas con las especificaciones de conductividad de la Farmacopea Europea para Agua Estéril para Inyección. Todas las monografías de agua, salvo el Agua Bacteriostática para Inyección, tienen una especificación de conductividad indicando que el usuario debe utilizar la sección Agua a Granel o Agua Estéril de Conductividad del Agua (645). Para las monografías de agua estéril envasada, esta especificación de conductividad del agua reemplaza las pruebas de límites de química húmeda que resultan redundantes y que están destinadas para detectar contaminantes inorgánicos previamente especificados en estas monografías. Controlar la pureza orgánica de estas aguas estériles envasadas, en particular de aquéllas en envases de plástico, representa un desafío mayor. Aunque la prueba de COT ofrece una mejor detección y, por lo tanto, es mejor para su uso en el monitoreo y control de dichas impurezas que la prueba vigente de Sustancias Oxidables, ésta última tiene muchos precedentes que datan de varias décadas y es flexible ante la variedad de tipos de envases y volúmentes aplicables a estas aguas estériles envasadas. Sin embargo, la prueba de COT para estas aguas estériles en envases de plástico actualmente permitidas presenta niveles importantes de sustancias orgánicas lixiviables derivadas del plástico, las cuales hacen que estas aguas sean orgánicamente menos puras, posiblemente en el orden de las magnitudes generalmente alcanzadas con las aguas a granel. Por lo tanto, el uso de estas aguas estériles envasadas en aplicaciones analíticas, de fabricación y de limpieza sólo debería permitirse después de haber garantizado la aptitud de la pureza de las aguas para dichas aplicaciones. Existe una división análoga de Carbono Orgánico Total (643) para un mejor control de las sustancias orgánicas lixiviables del envasado. La primera parte se titula Agua a Granel y se aplica al método de COT en Agua Purificada, Agua para Inyección, Agua para Hemodiálisis y Vapor Puro. La segunda parte se titula Agua Estéril y se aplica al método de COT para Agua Purificada Estéril, Agua Estéril para Inyección, Agua Estéril para Inhalación y Agua Estéril para Irrigación. Para estas aguas estériles, se proporciona el método de COT como una prueba alternativa a la de Sustancias Oxidables. Los límites de COT para aguas estériles se fijan a valores más altos que los límites de COT para aguas a granel.
CONSIDERACIONES MICROBIOLÓGICAS La principal fuente exógena de contaminación microbiana del agua para uso farmacéutico a granel es el agua fuente o de alimentación. La calidad del agua de alimentación debe reunir, como mínimo, los atributos de calidad del Agua Potable, para la cual se reglamenta el nivel de coliformes. Pueden estar presentes en el agua que ingresa una amplia gama de otros microorganismos, principalmente bacterias Gram negativas. Estos microorganismos pueden poner en riesgo los pasos de purificación posteriores. Los ejemplos de otras fuentes exógenas potenciales de contaminación microbiana incluyen las ventilaciones sin protección, los filtros de aire defectuosos, los discos de ruptura rotos, el flujo inverso de agua proveniente de salidas contaminadas, "aberturas" del sistema de distribución no higienizadas, incluyendo el reemplazo de componentes, inspecciones, reparaciones y extensiones de rutina, un drenaje e interruptores de aire inadecuados y el reemplazo del carbón activado, las resinas desionizantes y las sustancias químicas regenerantes. En estas situaciones, los contaminantes exógenos pueden no ser bacterias acuáticas normales sino de microorganismos del suelo o incluso de origen humano. La detección de microorganismos no acuáticos puede ser una indicación de una falla de un componente del sistema, que debería disparar investigaciones que repararan su fuente. Se debe prestar especial atención al diseño del sistema y al mantenimiento para minimizar la contaminación microbiana proveniente de estas fuentes exógenas. Las operaciones unitarias pueden ser una fuente importante de contaminación microbiana endógena. Los microorganismos presentes en el agua de alimentación pueden adsorberse en los lechos de carbón, las resinas desionizantes, las membranas de los filtros y otras superficies de las operaciones unitarias e iniciar la formación de una biopelícula. En un sistema de agua de alta pureza la biopelícula es una respuesta de adaptación de ciertos microorganismos para sobrevivir en un medio ambiente con escasos nutrientes. La colonización en ubicaciones posteriores en el sistema puede ocurrir cuando se desprenden los microorganismos de las superficies colonizadas por biopelículas y se trasladan a otras áreas del sistema de agua. Los microorganismos también pueden adherirse a partículas en suspensión, como por ejemplo partículas de los lechos de carbón o partículas de
1872 (1231) Agua para Uso Farmacéutico / Información General
USP 39
resina fracturadas. Cuando los microorganismos se convierten en plancton, sirven como fuente de contaminación para el equipo de purificación que está a continuación (poniendo en peligro su funcionalidad) y para los sistemas de distribución. Otra fuente de contaminación microbiana endógena es el sistema de distribución en sí. Los microorganismos pueden formar colonias en la superficie de las cañerías, las soldaduras ásperas, los rebordes mal alineados, las válvulas y otras vías muertas no identificadas, en donde proliferan formando una biopelícula. La composición y el grado de lisura de la superficie pueden afectar la velocidad de adsorción microbiana inicial, pero una vez producida la adsorción, se desarrolla la biopelícula independientemente de la superficie, a menos que se inhiba de alguna otra manera mediante las condiciones de higienización. Una vez formada la biopelícula constituye una fuente de contaminación microbiana continua.
CONSIDERACIONES RELATIVAS A LAS ENDOTOXINAS Las endotoxinas son lipopolisacáridos que se encuentran en la envoltura celular externa a la pared celular de las bacterias Gram negativas, de la que se desprenden. Las bacterias Gram negativas forman fácilmente biopelículas que pueden convertirse en una fuente de endotoxinas en las aguas para uso farmacéutico. Las endotoxinas pueden presentarse como grupos de moléculas de lipopolisacáridos asociadas a microorganismos vivos, a fragmentos de microorganismos muertos, o a la capa mucosa de polisacáridos que rodea las bacterias de la biopelícula, o como moléculas libres. La forma libre de las endotoxinas puede desprenderse de la superficie celular de las bacterias que colonizan el sistema de agua o provenir del agua de alimentación que puede ingresar al sistema de agua. Debido a la multiplicidad de las fuentes de endotoxinas en un sistema de agua, la cuantificación de las endotoxinas en un sistema de agua no es un buen indicador del nivel de la abundancia de la biopelícula en un sistema de agua. Los niveles de endotoxina pueden reducirse al mínimo controlando la entrada de endotoxinas libres y microorganismos en el agua de alimentación y reduciendo al mínimo la proliferación microbiana dentro del sistema. Esto puede lograrse mediante la exclusión normal o una acción de eliminación a través de diversas operaciones unitarias dentro del sistema de tratamiento, así como también mediante la higienización del sistema. Otros métodos de control incluyen el uso de ultrafiltros o filtros modificadores de carga, tanto en línea como en el punto de uso. Se puede hacer un seguimiento de la presencia de endotoxinas según se describe en el capítulo Prueba de Endotoxinas Bacterianas (85).
CONSIDERACIONES RELATIVAS AL RECUENTO MICROBIANO El objetivo de un programa de seguimiento microbiológico del sistema de agua es proporcionar suficiente información para controlar y evaluar la calidad microbiológica del agua producida. Los requisitos de calidad del producto deben dictar las especificaciones de calidad del agua. Se puede mantener un nivel apropiado de control mediante el empleo de técnicas de tendencia de datos y si fuera necesario, limitando los microorganismos contraindicados específicos. Por consiguiente, puede no ser necesario detectar todas las especies de microorganismos presentes en una muestra dada. El programa de seguimiento y la metodología deben indicar las tendencias adversas y detectar los microorganismos que sean potencialmente nocivos para el producto terminado, el proceso o para el consumidor. La selección final de las variables del método debe basarse en los requisitos individuales del sistema que se está monitoreando. Se debe reconocer que no existe un solo método que sea capaz de detectar todos los contaminantes microbianos potenciales de un sistema de agua. Los métodos usados para el control microbiológico deben tener la capacidad de aislar el número y tipo de organismos que se consideran significativos en relación al control del sistema durante el proceso y al impacto del producto para cada sistema individual. Se deben considerar varios criterios al seleccionar un método para el seguimiento microbiológico de un sistema de agua para uso farmacéutico. Estos criterios incluyen la sensibilidad del método, la gama de tipos de organismos o especies recuperados, la capacidad global de procesamiento de muestras, los períodos de incubación, el costo y la complejidad metodológica. Una propuesta alternativa al uso de los enfoques clásicos de "cultivo" es un instrumental sofisticado o un método de prueba rápido que pueda proporcionar resultados más oportunos. Sin embargo se debe tener cuidado al seleccionar tales enfoques alternativos para asegurarse de que tienen sensibilidad y que hay una correlación con los enfoques de cultivo clásicos, que se consideran generalmente como las normas aceptadas para el recuento microbiano. Se debe considerar también la oportunidad de la prueba de recuento microbiano después de la recolección de la muestra. El número de bacterias provenientes del plancton detectables en una muestra recolectada en un envase para muestras escrupulosamente limpio por lo general descenderá a medida que transcurra el tiempo. Las bacterias del plancton que están en la muestra tenderán a morir o a adsorberse de manera irreversible en las paredes del envase, reduciendo el número de bacterias viables del plancton que se pueden extraer de la muestra para su análisis. También puede suceder el efecto opuesto si el envase de la muestra no está escrupulosamente limpio y contiene una concentración baja de algún nutriente microbiano que pudiera promover el crecimiento microbiano en el envase de la muestra. Dado que la cantidad de bacterias recuperables en una muestra puede cambiar positiva o negativamente con el transcurso del tiempo después de la recolección, es mejor realizar las pruebas tan pronto como sea posible después de recolectarlas. Si no fuera posible analizar la muestra dentro de las 2 horas después de su recolección, la muestra debe mantenerse a temperaturas de refrigeración (de 2º-8º) durante un máximo de 12 horas para mantener los atributos microbianos hasta el análisis. En situaciones en las que incluso esto no sea posible (como cuando se usan laboratorios contratados externos), el análisis de estas muestras refrigeradas debe realizarse dentro de las 48 horas con posterioridad a la recolección de las muestras. En el caso de un análisis retrasado, los niveles microbianos recuperados pueden no ser iguales a los que se habrían recuperado si la prueba se hubiera realizado rápidamente después de la recolección de la
USP 39
Información General/ (1231) Agua para Uso Farmacéutico 1873
muestra. Por lo tanto, se deben realizar estudios para determinar la existencia y la aceptabilidad de aberraciones potenciales del recuento microbiano ocasionadas por retrasos prolongados en los análisis.
Enfoque Clásico de Cultivo Los enfoques clásicos de cultivo para el análisis microbiológico del agua incluyen, de manera no taxativa, la prueba de vertido en placa, la dispersión en placa, la filtración por membranas y la prueba del número más probable (MPN, por sus siglas en inglés). Por lo general, estos métodos son fáciles de realizar, son menos costosos y proporcionan una excelente capacidad global de procesamiento de muestras. Se puede aumentar la sensibilidad del método mediante el uso de muestras de mayor tamaño. Esta estrategia se usa en el método de filtración por membrana. Más adelante se definen los enfoques de cultivo según el tipo de medio empleado en combinación con la temperatura y duración de la incubación. Esta combinación debe seleccionarse según las necesidades de control que presenta un sistema específico de agua, así como también por su capacidad de recuperación de los microorganismos de interés: los que pudieran ejercer un efecto perjudicial sobre el producto o los usos del proceso así como los que reflejan el estado de control microbiano del sistema. Existen dos formas básicas de medios disponibles para realizar el análisis microbiológico tradicional: los medios con "alto contenido de nutrientes" y los medios con "bajo contenido de nutrientes". Los medios con alto contenido de nutrientes como por ejemplo el agar de recuento de placa (TGYA) y el agar m-HPC (anteriormente agar m-SPC) están concebidos como medios generales para conseguir el aislamiento y la enumeración de las bacterias heterotróficas o "copiotróficas". Los medios con bajo contenido de nutrientes como por ejemplo el agar R2A y el agar NWRI (HPCA) pueden ser beneficiosos para aislar las bacterias "oligotróficas" de crecimiento lento y las bacterias que requieren niveles bajos de nutrientes para crecer de manera óptima. A menudo algunas bacterias oligotróficas facultativas son capaces de crecer en medios con alto contenido de nutrientes y algunas bacterias copiotróficas facultativas son capaces de crecer en medios con bajo contenido de nutrientes, pero esta superposición no es completa. Los enfoques de cultivo con alto y bajo contenido de nutrientes se pueden usar en forma conjunta, especialmente durante la validación de un sistema de agua, así como periódicamente con posterioridad. Este análisis conjunto podría determinar si se pueden recuperar preferentemente cantidades o tipos adicionales de bacterias mediante uno de los enfoques. Si así fuera, se podría evaluar el impacto de estas bacterias aisladas adicionales sobre el sistema de control y los usos finales del agua. Asimismo, la eficacia de los sistemas de control y la higienización de estos microorganismos aislados se podría evaluar. La duración y la temperatura de incubación son también aspectos importantes de un método de prueba microbiológico. Las metodologías clásicas que emplean medios con alto contenido de nutrientes típicamente realizan la incubación a una temperatura de 30º-35º, durante 48-72 horas. Debido a la flora presente en ciertos sistemas de agua, la incubación a temperaturas inferiores (p.ej., 20º-25º) durante períodos más largos (p.ej., de 5-7 días) puede producir recuentos microbianos mayores cuando se comparan con los métodos clásicos. Los medios con bajo contenido en nutrientes están diseñados para estas temperaturas inferiores y estas condiciones de incubación más prolongadas (algunas veces prolongadas hasta 14 días para maximizar la recuperación de microorganismos lesionados por la sustancia higienizante u oligotrofos de crecimiento muy lento), pero incluso los medios de alto contenido en nutrientes pueden algunas veces incrementar su recuperación con estas condiciones de incubación más prolongadas y más frías. Si un sistema determinado necesita o no usar medios con alto o bajo contenido de nutrientes con temperaturas de incubación más altas o más bajas o con tiempos de incubación mayores o menores se debe determinar durante o antes de la validación del sistema y reevaluarse periódicamente a medida que la flora microbiana de un nuevo sistema de agua establece gradualmente un estado estacionario con respecto a sus procedimientos de higienización y mantenimiento de rutina. Hasta que se establezca un "estado estacionario" pueden pasar meses o incluso años y se puede interrumpir por un cambio en los patrones de uso, un cambio en el mantenimiento de rutina y preventivo o en los procedimientos y frecuencias de higienización u otro tipo de intrusión en el sistema, tal como el reemplazo, eliminación o adición de un componente. La decisión de emplear períodos de incubación más largos debe tomarse después de sopesar la necesidad de información oportuna y el tipo de medidas correctivas que se requieren cuando se excede un nivel de alerta o de acción frente a la capacidad de recuperar los microorganismos de interés. Las ventajas ganadas al prolongar las incubaciones durante períodos más largos, ya sean debidas a la recuperación de microorganismos lesionados, de crecimiento lento o a la presencia de microorganismos exigentes, debe sopesarse frente a la necesidad de realizar una investigación oportuna y efectuar las medidas correctivas, así como de la capacidad de estos microorganismos de afectar perjudicialmente los productos o procesos. Sin embargo, en ningún caso la incubación a una temperatura de 30º-35º debe ser inferior a 48 horas o inferior a 96 horas a una temperatura de 20º-25º. Normalmente los microorganismos que pueden prosperar en ambientes con condiciones extremas se cultivan mejor en el laboratorio usando condiciones que simulen ese entorno con condiciones extremas del que se tomaron. Por lo tanto, las bacterias termofílicas podrían ser capaces de existir en los entornos con condiciones extremas de los sistemas calientes de agua para uso farmacéutico, y si ese fuera el caso, solo se podrían recuperar y cultivar en el laboratorio si se proporcionaran condiciones térmicas similares. Los microorganismos acuáticos termofílicos existen en la naturaleza pero típicamente derivan su energía para crecer del aprovechamiento de la energía de la luz solar, de las reacciones de oxidación-reducción de elementos tales como el azufre o el hierro, o indirectamente de otros microorganismos que derivan su energía de estos procesos. Tales condiciones químicas o nutricionales no existen en los sistemas de agua de alta pureza, ya sea a temperatura ambiente o caliente. Por lo tanto, generalmente se considera inútil investigar la existencia de microorganismos termofílicos provenientes de los sistemas calientes de agua para uso farmacéutico debido a su incapacidad para crecer en los mismos.
1874 (1231) Agua para Uso Farmacéutico/ Información General
USP 39
Los microorganismos que viven en los sistemas calientes tienden a ser encontrados en lugares mucho más fríos dentro de estos sistemas, por ejemplo en las mangueras de transferencia o los intercambiadores de calor de los puntos de uso. Si esto sucede, el tipo de microorganismos recuperados es generalmente del mismo tipo que el que se esperaría recuperar de sistemas de agua a temperatura ambiente. Por lo tanto las condiciones mesofílicas de cultivo microbiano que se describen posteriormente en este capítulo son generalmente adecuadas para su recuperación.
Enfoques "Instrumentales" Dentro de los ejemplos de enfoques instrumentales se incluyen las técnicas de recuento visual microscópico (p.ej., por epifluorescencia e inmunofluorescencia), y enfoques similares por barrido de láser automático y las metodologías radiométricas, impedométricas y las basadas en la bioquímica. Todos estos métodos poseen una variedad de ventajas y desventajas. Las ventajas podrían ser su precisión y exactitud o la velocidad de la disponibilidad del resultado de la prueba en comparación con el enfoque de cultivo clásico. En general, los enfoques instrumentales permiten obtener resultados con tiempos de espera menores, lo que facilita el control oportuno del sistema. Sin embargo, a menudo esta ventaja se ve contrarrestada por el limitado rendimiento global del procesamiento de muestras debido a tiempos más largos de recolección de muestras, un procesamiento de muestras que demanda más trabajo o que tiene mayores costos y otras limitaciones de los instrumentos y la sensibilidad. Además, los enfoques que emplean instrumentos son generalmente destructivos, lo que impide manipulaciones posteriores de los microorganismos aislados con propósitos de caracterización. Generalmente, alguna forma de caracterización del aislamiento microbiano, si no una completa identificación, puede ser un elemento requerido del seguimiento del sistema de agua. Por consiguiente, tradicionalmente se han preferido los enfoques de cultivo sobre los procedimientos instrumentales porque ofrecen un equilibrio de atributos de prueba deseables y tienen capacidades ulteriores a la realización de la prueba.
Metodologías Sugeridas Los siguientes métodos generales se obtuvieron originalmente de Standard Methods far the Examination of Water and Wastewater, 17th Edition, American Public Health Association, Washington, DC 20005. A pesar de que esta publicación ha sufrido varias revisiones desde que se citó por primera vez en este capítulo, los métodos todavía se siguen considerando apropiados para establecer tendencias en el número de unidades formadoras de colonias observadas en el control microbiológico de rutina de las aguas para uso farmacéutico. Sin embargo, se reconoce que otras combinaciones de medios, tiempos y temperatura de incubación pueden ocasionalmente, y aún sistemáticamente, dar como resultado que se observen cantidades mayores de unidades formadoras de colonias o que se recuperen distintas especies o ambas cosas. Los períodos de incubación prolongados que requieren generalmente algunos de los métodos alternativos disponibles ofrecen desventajas que pueden superar las ventajas de los mayores recuentos que se pueden obtener. Los recuentos de línea de base algo mayores que se pueden observar usando condiciones de cultivo alternativas, no tendrían necesariamente una mayor utilidad en la detección de una variación o de una tendencia. Además, algunas condiciones de cultivo alternativas que usan medios con bajo contenido de nutrientes tienden a producir el desarrollo de colonias microbianas que están mucho menos diferenciadas en lo que respecta a la apariencia de la colonia, un atributo en el que se basan los microbiólogos cuando seleccionan los tipos microbianos para una caracterización posterior. También es irónico que la naturaleza de algunos de los microorganismos de crecimiento lento y los tiempos de incubación más prolongados necesarios para su desarrollo en forma de colonias visibles también puede llevar a que estas colonias sean en gran parte no viables, lo que limita su posterior caracterización y excluye su subcultivo e identificación. Las metodologías que se pueden sugerir como generalmente satisfactorias para realizar un seguimiento de los sistemas de agua para uso farmacéutico aparecen a continuación. Sin embargo, se debe considerar que estas metodologías no son métodos determinantes ni son necesariamente óptimas para recuperar microorganismos de todos los sistemas de agua. Los usuarios deben determinar mediante la experimentación con varios enfoques qué metodologías son las mejores para realizar el seguimiento de sus sistemas de agua para fines de control en proceso y de control de calidad, así como para recuperar toda especie contraindicada que pueda haber especificado.
USP 39
Agua Potable
Información General/ (1231) Agua para Uso Farmacéutico 1875
Método de Vertido en Placa o Método de Filtración por Membranaª Volumen de muestra-1,0 ml mínimob Medio de crecimiento-Agar de Recuento en Placa< Tiempo de incubación-48-72 horas mínimo Temperatura de incubación-30º-35º
Agua Purificada
Método de Vertido en Placa o Método de Filtración por Membranaª Volumen de muestra-1,0 ml mínimob Medio de crecimiento--Agar de Recuento en Placa< Tiempo de incubación-48-72 horas mínimo Temperatura de incubación-30º-35º
Agua para Inyección
Método de Filtración por Membranaª Volumen de muestra-100 ml mínimob Medio de crecimiento--Agar de Recuento en Placa< Tiempo de incubación-48-72 horas mínimo Temperatura de incubación-30º-35º
ª Generalmente se considera preferible un filtro con membrana con clasificación de 0,45 µm incluso aunque el ancho celular de algunas bacterias en la muestra sea menor a este valor. La eficiencia del proceso de filtración todavía permite la retención de un porcentaje muy alto de estas células más pequeñas y es adecuado para esta aplicación. Los filtros con clasificaciones más pequeñas se pueden usar si se desea, pero por diferentes razones la capacidad que tienen las células retenidas de desarrollarse hasta formar colonias visibles se puede poner en peligro, así que se debe verificar la exactitud del recuento mediante un enfoque de referencia. b Cuando los recuentos de colonias son de bajos a indetectables usando el volumen de muestra mínimo indicado, se reconoce generalmente que se debería analizar un volumen mayor de muestra para tener una mayor seguridad de que el recuento de colonias es más representativo desde el punto de vista estadístico. El volumen de muestra a considerar para su análisis depende de lo que necesite conocer el usuario (que está relacionado con los niveles de alerta y acción establecidos y las capacidades de control microbiano del sistema de agua) y de la confiabilidad estadística del recuento de colonias resultante. Para analizar un volumen de muestra mayor es posible que se necesiten cambiar las técnicas de análisis, p.ej., cambiar de un enfoque de vertido en placa a filtración por membrana. Sin embargo, en una situación de recuento con valores de muy bajos a cero, se considera generalmente que un volumen de muestra máximo de aproximadamente 250-300 mL representa un equilibrio razonable entre la facilidad de recolección de la muestra y del procesamiento y el aumento de la confiabilidad estadística. Sin embargo, cuando se necesitan volúmenes de muestra mayores a aproximadamente 2 mL, éstos sólo se pueden procesar usando el método de filtración por membrana. e También conocido como Agar de Métodos Estándar, Agar de Recuento de Placa de Métodos Estándar o TGYA, este medio contiene triptona (digerido pancreático de caseína), glucosa y extracto de levadura.
IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS La identificación de los microorganismos aislados, recuperados por los métodos de seguimiento del agua, puede ser importante en los casos en que los microorganismos específicos que se propagan en agua pueden ser perjudiciales para los productos o los procesos en los que se emplea el agua. La información sobre microorganismos como la descrita anteriormente, también puede ser útil cuando se identifica la fuente de contaminación microbiana en un producto o proceso. A menudo se recupera de manera rutinaria un grupo limitado de microorganismos de un sistema de agua. Después de una recuperación y caracterización repetida, un microbiólogo experimentado puede saber a ciencia cierta su identificación basándose solamente en unos pocos rasgos reconocibles, como por ejemplo, la morfología de la colonia y las características de tinción. Esto puede permitir una reducción del número de identificaciones a realizar hasta llegar a un tipo de colonia representativo o, con la adecuada calificación del analista, puede incluso analizar atajos a tomar para estas identificaciones microbianas.
NIVELES DE ALERTA Y ACCIÓN Y ESPECIFICACIONES Aunque el uso de niveles de alerta y acción está asociado en su mayoría a datos microbianos, éstos se pueden asociar con cualquier atributo. En los sistemas de agua para uso farmacéutico casi todos los atributos de calidad, distintos de la calidad microbiana, se pueden determinar con rapidez, obteniendo resultados casi en tiempo real. Estos datos con poca demora pueden proporcionar información inmediata sobre el desempeño del sistema, sirviendo como indicadores continuos del control del proceso. Sin embargo, debido a que es posible que a algunos atributos no se les realice un seguimiento continuo o que se produzcan largos retrasos en la disponibilidad de datos (como en el caso de los datos de seguimiento microbiano), los Niveles de Alerta y Acción y Especificaciones apropiadamente establecidos pueden servir como una advertencia o indicación temprana de que se aproxima un posible cambio de calidad que sucederá entre seguimientos o en el momento del siguiente seguimiento periódico. En un sistema de agua validado, los controles de proceso deberían proporcionar valores relativamente constantes y más que adecuados para estos atributos a los que se les realiza el seguimiento de manera que sus Niveles de Alerta y Acción y Especificaciones se abordan raras veces. Como indicadores de control de proceso, los niveles de alerta y acción están diseñados para permitir que se tomen las acciones correctivas que impedirán que un sistema se desvíe totalmente fuera de control y produzca agua no apta para su uso previsto. Esta calidad mínima del "uso previsto" se denomina algunas veces "especificación" o "límite". En los párrafos introductorios de este capítulo se justificaba la falta de especificaciones microbianas en el texto de las monografías del agua a granel (Agua Purificada yAgua para Inyección ). Esto no significa que el usuario no deba tener especificaciones microbiológicas para estas aguas. Por el contrario, en la mayoría de las situaciones, tales especificaciones deberán ser establecidas por el usuario. Las especificaciones microbianas deben reflejar el nivel microbiano máximo en el que el agua es todavía apta para su uso sin com-
1876 (1231) Agua para Uso Farmacéutico/ Información General
USP 39
prometer las necesidades de calidad del proceso o producto en el que se usa el agua. Dado que el agua de un sistema dado puede tener muchos usos, se debe usar el más estricto de esos usos para establecer esta especificación. Cuando sea adecuado, una especificación microbiana podría ser cualitativa así como cuantitativa. En otras palabras, la cantidad total de microorganismos puede ser tan importante como la cantidad de un microorganismo específico o incluso la ausencia de un microorganismo específico. Los microorganismos que se sabe que son problemáticos podrían incluir los patógenos oportunistas o manifiestos, los indicadores no patogénicos de patógenos potencialmente no detectados o los microorganismos que se sabe que ponen en peligro un proceso o producto, tal como los que son resistentes a un conservante o los que son capaces de proliferar en un producto o degradarlo. Estos microorganismos comprenden un grupo a menudo mal definido denominado "microorganismos objetables". Dado que objetable es un término que se refiere al uso del agua, la lista de los microorganismos que forman parte de ese grupo deberá adaptarse a esas especies que tengan el potencial de estar presentes y ser problemáticas. Su impacto negativo se demuestra con mayor frecuencia cuando están presentes en grandes cantidades, pero dependiendo de la especie puede existir un nivel permisible, por debajo del cual no serán consideradas objetables. Como se indicó anteriormente, los niveles de alerta y acción para un atributo de control de un proceso dado se usan para ayudar a mantener el control del sistema y evitar exceder la especificación de aceptar o rechazar para ese atributo. Los niveles de alerta y acción pueden ser tanto cuantitativos como cualitativos. Pueden implicar niveles de recuentos microbianos totales o recuperaciones de microorganismos específicos. Los niveles de alerta son episodios o niveles que cuando ocurren o se exceden, indican que un proceso puede haber experimentado un desvío con respecto a su condición operativa normal. Las variaciones en un nivel de alerta constituyen una advertencia y no requieren necesariamente una acción correctiva. Sin embargo, las desviaciones de nivel de alerta generalmente conducen a alertar al personal de operación del sistema de agua así como al de garantía de calidad. Las desviaciones de nivel de alerta también pueden conducir a un seguimiento adicional con un escrutinio más intenso de los resultados y de los datos adyacentes así como de otros indicadores del proceso. Los niveles de acción son sucesos o niveles más altos que, cuando tienen lugar o se exceden, indican que un proceso puede haber experimentado un desvío de su intervalo operativo normal. Los ejemplos de tipos de "sucesos" de nivel de acción incluyen exceder repetidamente los niveles de alerta o exceder una sola vez el nivel máximo microbiano en múltiples localizaciones en forma simultánea; o la recuperación individual o repetida de microorganismos objetables específicos. Exceder un nivel de acción deberá llevar a notificar de inmediato tanto al personal de garantía de calidad como al personal que participa en las operaciones del sistema de agua de manera que se puedan emprender acciones correctivas de inmediato para hacer que el sistema regrese a su intervalo operativo normal. Tales acciones correctivas deben incluir esfuerzos para entender y eliminar o por lo menos reducir la incidencia de que suceda de nuevo en el futuro. Es posible que se necesite una investigación del origen del problema para desarrollar una estrategia de acción preventiva eficaz. Dependiendo de la naturaleza del desvío del nivel de acción, puede ser también necesario evaluar su impacto sobre los usos del agua durante ese tiempo. Las evaluaciones del impacto pueden incluir la descripción de los lotes afectados y pruebas de producto más extensivas o adicionales. También puede involucrar pruebas de desafío de producto experimentales. Los niveles de alerta y acción deben derivarse de una evaluación de datos de seguimiento históricos denominada análisis de tendencias. Se han publicado otras guías sobre enfoques que se pueden usar, que van desde las de tipo "inspección" hasta la evaluación estadística de los datos históricos. El propósito final es entender la variabilidad normal de los datos durante lo que se considera un período operativo normal. Luego, se pueden establecer niveles o puntos disparadores que señalarán cuando los datos futuros puedan estar acercándose (nivel de alerta) o excediendo (nivel de acción) los límites de esa "variabilidad normal". Tales niveles de alerta y acción se basan en la capacidad de control del sistema según estaba siendo controlado y mantenido durante ese período histórico de control típico. En los sistemas de agua nuevos en donde hay muy pocos o ningún dato histórico a partir de los cuales se podrían derivar tendencias de datos, es común establecer sencillamente niveles iniciales de alerta y acción basados en una combinación de las capacidades de diseño del equipo pero por debajo de las especificaciones para el proceso y el producto en donde se usa el agua. También es común, especialmente para sistemas de agua a temperatura ambiente, "madurar" microbiológicamente durante el primer año de uso. Al final de este período se habrá permitido o promovido el desarrollo de un estado de población microbiana (niveles y tipos de microorganismos) relativamente estacionario como resultado de los esfuerzos colectivos de operación y mantenimiento rutinario del sistema, incluyendo la frecuencia de la reposición del lecho, los lavados a contracorriente, las regeneraciones e higienizaciones de la operación de unidad. Esta población microbiana será típicamente mayor que la que se observaba cuando el sistema de agua era nuevo, así que se debe esperar que las tendencias de los datos (y los niveles de alerta y acción resultantes) se incrementarán a lo largo de este período de "maduración" y eventualmente se equilibrarán. Un sistema de agua debe estar diseñado de manera tal que los niveles de alerta y acción basados en el desempeño estén bien por debajo de las especificaciones para el agua. Con los sistemas de agua que tienen un diseño o un mantenimiento deficiente, el propietario del sistema puede descubrir que los niveles microbianos iniciales del sistema nuevo eran aceptables para las especificaciones y usos del agua, pero los niveles del sistema maduro no. Ésta es una situación grave, que si no se puede corregir con una higienización y mantenimiento del sistema más frecuente, puede requerir una costosa renovación del sistema de agua o incluso su reemplazo. Por lo tanto, no es excesivo el énfasis que se pone en aclarar que los sistemas de agua deben estar diseñados para facilitar el control microbiano de manera que cuando se controla frente a los niveles de alerta y acción, y se mantiene en consecuencia, el agua cumple de manera continua todas las especificaciones aplicables. No se debe establecer un nivel de acción a un nivel equivalente al de la especificación. Esto no dejaría margen para el mantenimiento correctivo del sistema que podría evitar un desvío de una especificación. Exceder una especificación es mucho más grave que una desviación del nivel de acción. Un desvío de una especificación puede disparar una investigación detallada del
USP 39
Información General/ (1234) Vacunas para Uso Humano 1877
impacto sobre el producto terminado, acciones correctivas sustanciales en el sistema de agua que puede incluir un cierre total y posiblemente incluso el rechazo del producto. Otra situación que debe evitarse es el establecimiento de un nivel de acción arbitrariamente alto y generalmente basado en la falta de desempeño. Tales niveles de acción no realistas privan a los usuarios de valores indicadores significativos que podrían disparar un mantenimiento del sistema correctivo. Los niveles de acción exageradamente altos permiten que los sistemas se salgan totalmente de control antes de que se tome alguna acción, cuando su propósito debiera ser detectar un desequilibrio antes de que quede totalmente fuera de control. Dado que los niveles de alerta y acción deben basarse en el desempeño real del sistema, y los datos de desempeño del sistema por lo general son generados por un método de prueba determinado se infiere que los niveles de alerta y acción deben ser válidos solamente para los resultados de la prueba generados por el mismo método de prueba. No es válido aplicar criterios de nivel de alerta y acción a resultados de pruebas generados por métodos de prueba distintos. Es posible que los dos métodos de prueba no recuperen microorganismos en forma equivalente partiendo de las mismas muestras de agua. Del mismo modo, tampoco es válido usar datos de tendencia para derivar niveles de alerta y acción para un sistema de agua, sino aplicar esos niveles de alerta y acción a un sistema de agua distinto. Los niveles de alerta y acción son específicos para el sistema de agua y el método de prueba. Sin embargo hay determinados niveles microbianos máximos por encima de los cuales no se deben establecer nunca niveles de acción. Los sistemas de agua con estos niveles deben considerase fuera de control de manera indiscutible. Usando las metodologías de enumeración microbiana sugeridas anteriormente, por lo general los niveles de acción considerados máximos son de 100 ufc/mL para el Agua Purificada y 1O ufc/100 mL para el Agua para Inyección. Sin embargo, si un sistema de agua dado controla los microorganismos de forma mucho más estricta que estos niveles, los niveles de alerta y acción se deben establecer a partir de estos niveles de control más estrictos, de manera que puedan indicar fehacientemente cuando los sistemas de agua están empezando a salirse de control. Estos parámetros de control microbiano en proceso se deben establecer bien por debajo de las especificaciones microbianas definidas por el usuario que determinan la aptitud del agua para su uso. Se debe prestar una atención especial para establecer niveles microbianos máximos de acción para el Agua Potable porque el agua se suministra a la instalación en condiciones sobre las que el usuario tiene poco control. Los altos niveles microbianos en el Agua Potable pueden indicar una perturbación en el sistema de agua municipal, una cañería principal de agua rota o una desinfección inadecuada y por lo tanto una contaminación potencial con microorganismos objetables. Usando la metodología de enumeración microbiana sugerida, un nivel máximo de acción razonable para el Agua Potable es de 500 ufc/ml. Teniendo en cuenta la preocupación potencial por la cantidad de microorganismos objetables que surge por dichos niveles microbianos altos en el agua de alimentación, un primer paso inmediato debe ser informar del problema a la municipalidad de manera que se puedan emprender acciones correctivas. Las acciones correctivas internas pueden ser necesarias o no, pero podrían incluir realizar pruebas adicionales de coliformes en el agua que ingresa y tratar previamente el agua ya sea con cloración adicional o con filtración o irradiación con luz UV o una combinación de ambos enfoques.
(1234) VACUNAS PARA USO HUMANO-VACUNAS DE POLISACÁRIDOS Y GLICOCONJUGADOS INTRODUCCIÓN Este capítulo describe las mejores prácticas para la producción, conjugación y caracterización de vacunas de polisacáridos y de glicoconjugados. Además, describe propiedades de calidad claves en cada etapa del proceso y sugiere los mejores métodos para evaluar estos atributos. El alcance de este capítulo incluye vacunas que contienen uno o más polisacáridos purificados (tales como vacunas anti-neumocóccica, anti-meningocóccica y anti-Tifoidea Vi) y componentes implicados en su producción, así como vacunas que contienen uno o más inmunógenos glicoconjugados en los que un sacárido se ha acoplado de manera covalente a una proteína transportadora adecuada. La última categoría incluye vacunas de conjugado de Haemophilus influenzae tipo b (Hib), anti-neumocóccica, anti-meningocóccica. El capítulo no incluye vacunas combinadas en las que los conjugados de Hib se combinan con inmunógenos no relacionados contra la difteria, el tétanos y la tosferina.
ANTECEDENTES Incidencia de Polisacáridos Capsulares Muchas bacterias patógenas poseen una cápsula de polisacáridos que envuelve a la célula, la cual modula el flujo de nutrientes hacia la superficie celular y protege contra la deshidratación. Cuando una bacteria establece una infección en un anfitrión mamífero, la cápsula de polisacáridos esconde los componentes en la superficie celular de los elementos del sistema inmune mamífero, tal como anticuerpos y proteínas del complemento que, de otro modo, activarían los mecanismos para matar al patógeno. Aunque las cápsulas de polisacáridos son por sí mismas inmunogénicas en niños y adultos, el desarrollo de una res-
1878 (1234) Vacunas para Uso Humano/ Información General
USP 39
puesta inmune protectora puede ser demasiado lenta para defender al anfitrión contra la enfermedad. En muchos casos, los anticuerpos dirigidos contra el polisacárido capsular son protectores y la existencia previa de estos anticuerpos previene el establecimiento de la infección; éste es el fundamento para su uso como vacunas o componentes de vacunas de conjugados. Muchas especies bacterianas pueden ser clasificadas en serogrupos o serotipos los cuales expresan polisacáridos capsulares estructural e inmunológicamente distintos. El número de serotipos conocidos difiere entre organismos. Existen seis serotipos conocidos de Haemophilus influenzae y más de 90 serotipos de Streptococcus pneumoniae. Los serotipos diferentes (o serogrupos) del mismo organismo pueden tener diferente infectividad. Por ejemplo, la gran mayoría de las enfermedades ocasionadas por H. influenzae se deben al serotipo b. Los diferentes serotipos pueden ocasionar enfermedades en diversas regiones geográficas, pueden producir un espectro diferente de enfermedades o pueden prevalecer en diferentes franjas etarias. El patrón de enfermedad de un serotipo específico puede cambiar con el paso del tiempo dentro de una región geográfica dada. Por estas razones, muchas vacunas de polisacáridos y de conjugados contienen múltiples inmunógenos sacáridos.
Estructuras de Polisacáridos Capsulares Los polisacáridos capsulares son polímeros de alto peso molecular que contienen una unidad de repetición estricta. Esta unidad de repetición puede ser una sola unidad de monosacárido o puede ser una unidad de oligosacárido que contenga hasta ocho residuos de azúcares. Las unidades de repetición pueden ser lineales o ramificadas y en ocasiones están unidas entre sí mediante enlaces de fosfodiéster. Los polisacáridos bacterianos a menudo contienen residuos de azúcares inusuales que no se encuentran en otras partes y sus grupos funcionales pueden sustituirse con una amplia variedad de grupos acilantes (los grupos O-acetilo son los más comunes) y sustituyentes fosforilados tales como fosfoglicerol. La 0-acetilación incompleta y la migración de grupos O-acetilo entre diferentes grupos hidroxilo llevan a un grado de heterogeneidad en los polisacáridos.
Respuestas Inmunes a Polisacáridos Capsulares Los polisacáridos capsulares son inmunógenos tipo 2 independientes de las células T. Estos inmunógenos no provocan el cambio de isotipos de anticuerpos, la maduración por afinidad ni la memoria inmunológica. Debido al desarrollo relativamente tardío del brazo pertinente del sistema inmune humano, las vacunas de polisacáridos no conjugados por lo regular inducen únicamente una respuesta inmune deficiente en infantes menores de dos años y, por ende, no se usan para este grupo poblacional. Los adyuvantes en vacunas de polisacáridos no mejoran la respuesta inmune. En una población de estudio adulta típica, se requiere únicamente una dosis para inducir una respuesta inmune protectora. Ante la ausencia de memoria inmunológica, resulta necesaria la revacunación regular, a menudo en intervalos de cinco años. La vacunación repetida puede llevar a una hiposensibilidad a la vacuna.
Conjugación de Polisacáridos a Proteínas Transportadoras El acoplamiento covalente de un polisacárido capsular o de un oligosacárido derivado del mismo, a una proteína transportadora crea una vacuna de conjugado. La inmunización con una vacuna de conjugado induce la inmunidad humoral mediante un mecanismo molecular distinto que no requiere el entrecruzamiento de proteínas en la superficie de las células de sistema inmune involucradas en el procesamiento del antígeno. Por esta razón, las vacunas de conjugado efectivas pueden producirse usando haptenos de oligosacáridos que pueden derivarse de un polisacárido capsular o de polisacáridos con un peso molecular inherentemente menor tales como la cadena O de un lipopolisacárido. Los conjugados también pueden producirse usando polisacáridos que por naturaleza tienen una masa alta o usando cadenas más cortas obtenidas mediante la reducción controlada de polisacáridos de peso molecular alto. Dependiendo del proceso de fabricación, existen tres modelos estructurales básicos para las vacunas de conjugados: • conjugados en los que una proteína transportadora se modifica con múltiples cadenas de oligosacáridos que tienen uno o dos sitios de activación para permitir el acoplamiento a una proteína transportadora, lo cual resulta en un glicoconjugado monomérico o un glicoconjugado con entrecruzamiento limitado • conjugados entrecruzados en los que múltiples cadenas de polisacáridos activados y proteínas transportadoras se acoplan a múltiples cadenas de polisacáridos, creando una red de entrecruzamiento de proteínas y glicanos • conjugados en los que un polisacárido de tamaño reducido se acopla de manera covalente a un complejo de proteínas, por lo general proteínas de la superficie bacteriana, mediante múltiples acoplamientos.
Proteína Transportadora Las proteínas transportadoras de uso más amplio están relacionadas con toxinas bacterianas que se detoxifican por medios químicos o genéticos. Las vacunas de conjugados inducen una respuesta dependiente de las células T que se desarrollan durante las primeras etapas de la vida y que conducen a la memoria inmunológica y a la estimulación de la respuesta mediante dosis adicionales de la vacuna, por lo que son adecuadas para la inmunización de infantes. El papel de la proteína transportadora en la modulación de la respuesta inmune se discute a continuación.
USP 39
Información General/ (1234) Vacunas para Uso Humano 1879
Química de Conjugación Los polisacáridos pueden unirse de manera covalente a las proteínas, aunque se requiere la activación del polisacárido. En ocasiones, la proteína transportadora también se activa para crear grupos reactivos compatibles. Los polisacáridos pueden activarse inicialmente mediante la creación de grupos aldehído reactivos, mediante la oxidación con peryodato o desprotegiendo el extremo reductor de los azúcares, mediante la reacción de grupos hidroxilo con reactantes altamente reactivos tales como bromuro de cianógeno (o tetrafluoroborato de 1-ciano-4-dimetilaminopiridinio [CDAP, por sus siglas en inglés] como una alternativa cristalina) o carbonildiimidazol, usando grupos de ácido carboxílico o, si estuvieran disponibles, mediante grupos amino libres o grupos fosfato. La oxidación con peryodato, la hidrólisis con ácido diluido y algunos otros métodos para la activación de polisacáridos pueden, dependiendo de la estructura del polisacárido, llevar a la despolimerización de oligosacáridos, los productos de la despolarización por lo regular se fraccionan por tamaño y una fracción apropiada se acopla a la proteína transportadora. Los grupos reactivos "naturales" en proteínas incluyen grupos E-amino lisina, grupos amino N-terminales, ácidos carboxílicos en aspartato o glutamato, o grupos tiol. La activación de proteínas transportadoras puede también implicar además la creación de grupos hidrazida o tioles de unión. El acoplamiento covalente entre el polisacárido activado y la proteína transportadora, activada o no, puede llevarse a cabo mediante el uso de ésteres activados, a veces creados in situ con un reactivo de carbodiimida soluble en agua, mediante la reducción de bases de Schiff, mediante la reacción de un tiol con maleimida o mediante la eliminación de bromuro. La conjugación puede ser directa, como en la aminación reductiva, o por la introducción de un enlazante bifuncional adecuado. En general, la selección de la química de conjugación se define por la estructura de la unidad de repetición del polisacárido o el deseo de producir un conjugado de una familia estructural específica.
Respuestas Inmunes a Vacunas de Conjugados La respuesta inmune al componente sacárido de las vacunas de conjugados es dependiente de las células T y es similar a la respuesta para proteínas, aunque este proceso aún no se entiende en su totalidad con respecto a los glicoconjugados. Debido a que esta vía inmunológica existe incluso en los infantes, las vacunas de conjugados se desarrollaron inicialmente para su uso en infantes. Después de la interacción con células del sistema inmune, especializadas en la presentación de antígenos tales como células dendríticas, macrófagos y células B, las vacunas de gliconconjugados son internalizadas y procesadas en pequeños péptidos y glicopéptidos que son posteriormente transportados a la superficie celular donde, en asociación con las moléculas del complejo principal de histocompatibilidad clase 11, son presentados a linfocitos. Normalmente, se requieren múltiples inmunizaciones en un infante cuyo sistema inmune aún no ha sido expuesto a ningún estímulo para generar una respuesta de anticuerpos, aunque ocurren procesos tales como cambio de isotipos y madurez por afinidad los cuales estimulan la memoria inmunológica. En términos generales, estos procesos resultan en la introducción de anticuerpos de alta afinidad y larga duración que son efectivos para prevenir que los patógenos bacterianos establezcan una infección. Los coadyuvantes en vacunas de glicoconjugados son eficaces para estimular las respuestas inmunes. Asimismo, para los casos de Hib, meningococo y neumococo, se ha demostrado que estas vacunas eliminan el transporte nasofaríngeo de organismos, por lo que un aspecto importante de su efectividad surge de suprimir la transmisión de serotipos infecciosos entre individuos, lo cual se denomina efecto de rebaño.
PARÁMETROS DE CALIDAD CLAVE PARA POLISACÁRIDOS A GRANEL El polisacárido monovalente a granel se purifica a partir de un cultivo celular bacteriano y es un producto intermedio estable clave para la fabricación de vacunas de polisacáridos y de conjugados. Resulta posible efectuar una evaluación inicial de un gran número de parámetros de calidad para vacunas finales mediante el análisis de polisacáridos monovalentes a granel o usando pruebas críticas realizadas durante el proceso que sustenten el proceso de fabricación. Los parámetros de calidad importantes para polisacáridos purificados incluyen la identidad, la pureza, la composición y el tamaño molecular, las cuales dependen del tipo y del grado de procesamiento adicional. El proceso de purificación se valida para producir de manera constante material que cumpla con los requisitos. La pureza de los polisacáridos depende de las etapas de purificación, incluyendo métodos de recolección, clarificación y procesos posteriores de purificación. Para la purificación, se puede usar una combinación de precipitación, filtración y procedimientos cromatográficos, dependiendo de la naturaleza química del polisacárido. El paso final de purificación puede consistir en el intercambio y filtración de amortiguadores seguido del almacenamiento del polisacárido purificado (congelado) o precipitación adicional y lavado final del precipitado con disolvente antes del secado, seguido de almacenamiento. El secado de polisacáridos se puede llevar a cabo en desecadores y puede incluir diversas etapas de molienda o esponjado y devolverlos a los desecadores para secado adicional. Los fabricantes deben tener cuidado durante estas etapas debido a que la manipulación mecánica del polisacárido puede reducir su tamaño molecular. El polisacárido purificado se almacena a una temperatura adecuada en condiciones que eviten la captación de humedad. Además, resulta posible la liofilización de polisacáridos. Se debe demostrar la estabilidad del polisacárido en condiciones específicas de almacenamiento; esto puede incluir la evaluación del contenido de humedad óptimo del material secado. Diferenciar entre las pruebas que se deben usar para la liberación de polisacáridos y las que mejor se ajustan al análisis durante el proceso para asegurar la uniformidad del proceso depende del proceso y de la forma en que el polisacárido será sorne-
1880 (1234) Vacunas para Uso Humano/ Información General
USP 39
tido a procesamiento adicional. Las decisiones finales sobre los parámetros del proceso por lo regular se toman después de las conversaciones con las autoridades reglamentarias.
Peso Seco Debido a que el peso seco se usa para calcular los resultados de ciertas pruebas con respecto a la sustancia seca y para calcular las cantidades necesarias para los procesos subsiguientes, la materia volátil, incluyendo el agua, en el polisacárido purificado se determina mediante una combinación de métodos adecuados que incluyen los siguientes: • termogravimetría (ver Pérdida por Secado (731 )) • Karl Fischer (agua únicamente: ver Determinación de Agua (921 )) • disolventes residuales determinados mediante cromatografía de gases (ver Disolventes Residuales (467) y Cromatografía (621 )) y mediante espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN) (ver Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear (761 )) o métodos colorimétricos.
Identidad de los Polisacáridos El fabricante debe confirmar la identidad del componente activo presente en el polisacárido purificado. Si se producen otros polisacáridos en el mismo sitio de fabricación, se debe validar el método para demostrar que distingue al polisacárido deseado de todos los demás polisacáridos producidos en dichas instalaciones (ver el Título 21 del CFR 610.14). La identidad se determina mediante una combinación previamente especificada de métodos adecuados tales como: • Métodos de pruebas inmunológicas: Estos métodos requieren acceso a antisueros altamente específicos que son capaces de distinguir entre antígenos de polisacáridos estrechamente relacionados. Los métodos usados comúnmente para este propósito son la imunoprecipitación, la immunoelectroforesis y el ensayo por inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA, por sus siglas en inglés). La especificidad (serológica) del antisuero debe demostrarse mediante la comprobación de la ausencia de reactividad cruzada con polisacáridos heterólogos fabricados en las mismas instalaciones. Se puede encontrar más información sobre estos métodos en los capítulos Métodos de Pruebas Inmunológicas-Consideraciones Generales (1102), Métodos de Pruebas Inmunológicas-Ensayo por lnmunoadsorción Ligado a Enzimas (EL/SA)- (1103) y Métodos de Pruebas Inmunológicas-Análisis por lnmunotransferencia (1104). • Espectroscopía de RMN (ver el capítulo (761 )): Los métodos de RMN requieren acceso a muestras auténticas del polisacárido o a espectros de referencia. La comparación se realiza de manera visual en términos de las posiciones, las intensidades relativas y la multiplicidad de resonancias significativas, o mediante el uso de otros métodos objetivos. • La identidad de polisacáridos también puede evaluarse usando una matriz de valoraciones composicionales, por lo regular con lecturas colorimétricas o cromatográficas, que definen factores tales como las cantidades de diversos tipos de azúcares (p.ej., azúcares amino, ácidos urónicos o pentosas metílicas, dependiendo del polisacárido), la cantidad de sustituyentes (p.ej., grupos O-acetilo), y el contenido de nitrógeno y fósforo.
Cantidad y Pureza de Polisacáridos VALORACIONES COLORIMÉTRICAS Históricamente, el contenido de polisacáridos en comparación con el peso seco (pureza) se estimaba usando una variedad de valoraciones colorimétricas para grupos funcionales específicos del antígeno polisacárido. Debido a que el estándar de referencia es por lo general un monosacárido puro o un compuesto modelo similar, y puesto que las valoraciones por lo regular fueron determinadas antes de que se conociese la mayoría de las estructuras, la cuantificación de componentes puede no ser paralela a la verdadera estequiometría. Por ende, los fabricantes deben desarrollar correlaciones entre métodos alternativos. La pureza se puede calcular basándose en el método empleado y la forma salina presente. La Tabla 1 provee una lista de pruebas colorimétricas que pueden ser apropiadas para determinar la composición de un polisacárido particular dentro de una vacuna. Los factores de respuesta para las unidades de azúcar en el polisacárido pueden diferir de aquéllas de un estándar de referencia de monosacárido puro. Los fabricantes deben tratar estas posibles discrepancias durante la validación del método.
USP 39
Información General/ (1234) Vacunas para Uso Humano 1881
' Ido Ta bl a 1 Va 1orac ones eo 1or1met • - r1 cas para eompos1c1on y Cantiºd a d d e Po 11 sacar ValoraValoraclón de ValoraValoraResorclnol clón de clón de clón de ValoraÁcido ClsOrclnol clón de (Reactivo Digestión ValoraDimetilaValoraclón de mino benteín Sulfúclón de Mollbdato Sellwacon Ácido (Reactivo (Chen) noff) Sulfúrico Carbazol zaldehído rico Hestrlnaª Blal) Antígeno PS Hib PRP
Rlbosa
Fosfato
X
Ácido Slállco
Nitrógeno Total
Ácido Urónlco
Hexosaminas
Metllpentosas
Valoraclón de Ácido Antrona-Sulfúrlco Azúcar Total
O-Acetilo
X X
MenA
X
Mene
X
X
MenY
X
X
X
MenW135
X
X
X
X
X
Pneumo (Específico del Serotipo)
X
X
X
X
X
X
X
Vi
ª
La valoración de hestrina es apropiada para el análisis composicional y de identidad, pero, debido a que el grado de 0-acetilación puede variar entre partidas de polisacáridos, normalmente no resulta una valoración adecuada para cuantificación de polisacáridos.
HIDRÓLISIS Y ANÁLISIS COMPOSICIONAL MEDIANTE CROMATOGRAFÍA La hidrólisis ácida o básica despolimeriza polisacáridos en oligosacáridos, monosacáridos o fragmentos más pequeños que son específicos de cada polisacárido para las condiciones optimizadas de hidrólisis empleadas. Las condiciones de hidrólisis agresivas pueden destruir algunos componentes del polisacárido. Estos fragmentos pueden cuantificarse directamente usando, por ejemplo, cromatografía de intercambio aniónico de alta resolución con detección amperométrica por pulsos (HPAEC-PAD, por sus siglas en inglés) o con detección de conductividad para iones (HPAEC-CD), o mediante cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) en fase reversa de azúcares marcados con fluoróforos. Como alternativa, el hidrolizado se puede derivatizar y analizar mediante cromatografía de gases con ionización a la llama (GC-FID) o detección espectrométrica de masas (GC-MS). Se requieren materiales de referencia de polisacáridos o monosacáridos adecuados, mientras que las condiciones de hidrólisis son específicas del polisacárido. La Tabla 2 resume el tipo hidrólisis aplicada, los métodos analíticos y los analitos que se han cuantificado para los diferentes polisacáridos. - Id osª c1ona 1y euant lfl cae I'on d e Vacunas d e p o 11sacar s s eompos1. Ta bl a 2 M'etod os eromatogra'fl cos para Ana'111 Hldróllsls Ácida, MetMarcado de anóllsls y Hldróllsls HF Hldróllsls Bases Hidrólisis Ácida Fluoróforos y Cromatografía de yHPAEC HPLC yHPAEC Gases o HPAEC Antígeno PS y HPAEC Ribitol
-
Fosfato
Monómero de PRP
-
MenA
ManN-6-P
-
Fosfato
O-acetilo
-
Mene
Neu5Ac
-
MenY
Glc, Neu5Ac
Neu5Ac
MenW135
Gal, Neu5Ac
Neu5Ac
PRP
Pneumo (Específico del Serotipo) Vi
Alditoles, metilpentosas, hexosas, hexosaminas, ácidos urónicos, Piruvato
-
-
-
O-acetilo
-
-
O-acetilo
-
Fosfato
-
O-acetilo
O-acetilo Fragmento Vi de monómero de O-acetilo
Alditoles, metilpentosas, hexosas, hexosaminas, ácidos urónicos
-
ª
PS = polisacárido; HF =ácido hidrofluórico; PRP =fosfato de poliribosilribitol; MenA = Meningococo grupo A; Mene = Meningococo grupo C; MenY = Meningococo grupo Y; MenWl 35 = Meningococo grupo Wl 35; Pneumo = Neumococo; Man = manosa; Neu = ácido neuramínico; Ac =acetilo; Glc = glucosamina; Gal = galactosa.
ELECTROFORESIS CAPILAR La electroforesis en zona capilar se ha usado para la identificación polimerización.
y cuantificación de polisacáridos de meningococo sin des-
1882 (1234) Vacunas para Uso Humano/ Información General
USP 39
ENSAYOS INMUNOQUÍMICOS Los ensayos inmunoquímicos como la inmunonefelometría o el ELISA requieren acceso a antisueros específicos que deben calibrarse contra materiales de referencia. La respuesta se puede modificar mediante la matriz o el tamaño del polisacárido. ESPECTROSCOPÍA DE RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR (RMN) Las intensidades relativas de las resonancias características pueden confirmar las proporciones de los diferentes tipos de residuos de azúcares y sustituyentes tales como N- u O-acetilo o piruvato que están presentes en el polisacárido. La cuantificación se puede lograr comparando dichas intensidades con la de un estándar interno agregado (ver el capítulo (761 )). Con respecto a la determinación de fósforo, se debe tener en cuenta que una variedad de polisacáridos bacterianos contienen enlaces de fosfodiéster. El polisacárido se puede cuantificar basándose en su contenido de fósforo mediante valoraciones colorimétricas o métodos instrumentales tales como espectrometría de emisión óptica de plasma por acoplamiento inductivo (ICP-OES, por sus siglas en inglés) o espectrometría de masas ICP (ICP-MS, por sus siglas en inglés). CONTRAIONES Si la pureza porcentual de los materiales a granel de polisacáridos (en comparación con el peso seco) es parte del programa de liberación del producto, se debe considerar la cantidad y el tipo de contraión presente que, por ejemplo, se puede determinar mediante ICP-MS. Esto es por lo regular una etapa de control durante el proceso.
Distribución del Tamaño Molecular de los Polisacáridos La distribución del tamaño molecular por lo general se evalúa mediante cromatografía de líquidos usando procedimientos de filtración en gel blando o cromatografía de líquidos de alta resolución de exclusión por tamaño (SEC-HPLC, por sus siglas en inglés) equipada con detector de índice de refracción en línea (RI, por sus siglas en inglés). Los resultados se informan como el coeficiente de distribución (K0 ) determinado a partir del pico principal de la curva de elución o como el porcentaje de material que eluye antes de un valor de corte, K0 , definido. El peso molecular absoluto del polisacárido y su radio hidrodinámico (rotación) se pueden determinar acoplando detectores de dispersión estática de luz y de RI a la columna SEC-HPLC y midiendo el incremento del RI (dn/dc) usando polisacáridos de referencia. Los requisitos basados en el peso molecular pueden expresarse en términos similares a los basados en el tamaño molecular y relacionados con valores de picos o con la proporción que eluye antes de un valor de corte definido.
Nivel de Contaminación de las Proteínas El contenido de proteína residual de la preparación del polisacárido debe determinarse mediante una valoración apropiada y debe demostrarse que está por debajo de la especificación aprobada. Estas especificaciones por lo regular varían según el polisacárido y el serotipo. La validación del método debe evaluar la necesidad de pretratamiento de la muestra antes de la determinación de proteínas y de la interferencia específica por parte del polisacárido en la valoración de proteínas. Además, la validación del método debe demostrar que la sensibilidad de la valoración es apropiada para la especificación. El capítulo Artículos Obtenidos por Biotecnología-Valoración de Proteína Total (1057) contiene información relacionada con estas valoraciones. Los métodos que por lo regular se aplican a los polisacáridos incluyen valoraciones colorimétricas (p.ej., valoración de Lowry, de Biuret, ensayo de ácido bicincónico o de Bradford) y absorbancia UV.
Nivel de Contaminación de Ácido Nucleico Se debe determinar el contenido de ácidos nucleicos del polisacárido purificado además de demostrar que cumple con las especificaciones, las cuales generalmente son menos del 1% p/p. El capítulo Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Enfoques de Detección de Trazas de Ácidos Nucleicos (Análisis de ADN Residual) (1130) provee información adicional acerca de estos métodos.
Cuantificación de Impurezas Relacionadas con el Proceso y con el Producto Dependiendo de los requisitos de análisis durante el proceso de producción o de liberación del producto, se pueden usar métodos cromatográficos y espectroscópicos para cuantificar los productos residuales de las etapas de fermentación y aislamiento/purificación. Estos productos residuales pueden incluir agentes antiespumantes, fenol, bromuro de cetiltrimetilamonio, etanol y otros disolventes residuales. Además, se deben cuantificar otras impurezas usando pruebas apropiadas, que incluyen: • endotoxinas bacterianas (ver el capítulo Prueba de Endotoxinas Bacterianas (85)) • pirógenos (ver el capítulo Pruebas para Pirógenos (151 )) •esterilidad (ver el capítulo Pruebas de Esterilidad (71 )), si fuera necesario
USP 39
Información General/ (1234) Vacunas para Uso Humano 1883
• biocarga (ver el capítulo Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano (61 )), cuando sea apropiado. Al igual que en el control durante el proceso, la proporción de polisacárido de neumococo C en los polisacáridos capsulares de neumococo se puede determinar mediante una combinación de 1 H y espectroscopía de RMN 31 P o mediante análisis por HPAEC-PAD de ribitol. Como alternativa, se puede derivar del análisis composicional.
Pruebas Indicadoras de la Estabilidad El polisacárido puede perder integridad debido a la hidrólisis gradual, lo que resulta en una reducción del tamaño molecular, y dicha degradación se puede monitorear mediante cromatografía de exclusión por tamaño o mediante cromatografía de alta resolución de exclusión por tamaño (HPSEC, por sus siglas en inglés) con detectores de dispersión estática de luz para peso molecular. La pérdida de grupos O-acetilo se puede monitorear usando métodos de HPLC. Es posible rastrear mediante espectroscopía de RMN la pérdida o migración de grupos O-acetilo y la integridad de los polisacáridos que contienen fosfatos. Asimismo, se pueden usar métodos inmunoquímicos para monitorear la integridad de los polisacáridos, aunque deben validarse para dicho propósito.
PARÁMETROS DE CALIDAD CLAVE PARA VACUNAS DE POLISACÁRIDOS FORMULADAS A GRANEL El término vacuna de polisacáridos formulada a granel se refiere a una solución que contiene una mezcla de cantidades apropiadas de los polisacáridos monovalentes a granel requeridos, así como cualquier sal amortiguadora, excipientes, coadyuvantes o conservantes antimicrobianos presentes en la vacuna. Por lo regular, la vacuna se esteriliza, generalmente por filtración, y está lista para rellenar las formas farmacéuticas finales.
Conservante Antimicrobiano Si se encuentra presente un conservante antimicrobiano el cual no se valora en una etapa posterior, se puede valorar su concentración en esta etapa usando una valoración química, fisicoquímica, cromatográfica o espectroscópica validada apropiada. Aunque la especificación dependerá de la agencia reglamentaria, por lo regular la cantidad de conservante no debe exceder el 120% del valor esperado, y el fabricante debe demostrar que el conservante es eficaz a dicha concentración (ver el capítulo Pruebas de Efectividad Antimicrobiana (51 )).
Esterilidad En esta etapa, si la expectativa es que el material sea estéril, entonces la esterilidad debe demostrarse usando una valoración validada apropiada tal como una de las descritas el capítulo (71). Para otros procesos de fabricación, la medición de cierta combinación de biocarga, recuento de endotoxinas o pirogenicidad puede resultar suficiente.
Cantidad de Polisacárido Para asegurar la dilución correcta de la mayor parte del material antes del llenado final y, a menos que se cuente con otros mecanismos de control, puede ser necesario determinar el contenido de serotipos individuales o el contenido de polisacáridos totales usando métodos fisicoquímicos o inmunoquímicos validados apropiados conforme a lo definido en la sección de polisacáridos a granel.
pH, Osmolaridad/lsotonicidad y Excipientes El formato final de una vacuna puede ser líquido o liofilizado. Si en esta etapa el formato no cambia durante el llenado final y no se analiza posteriormente, entonces los fabricantes deben valorar este material a granel con respecto a lo siguiente: • pH (ver pH (791 )) • posiblemente osmolaridad o isotonicidad (ver Osmolalidad y Osmolaridad (785)). Cuando así lo apruebe una agencia reglamentaria, el análisis de osmolaridad de rutina puede omitirse siempre que el fabricante haya demostrado la uniformidad en el desarrollo y en los lotes clínicos. • contenido de excipientes, si estuvieran presentes.
PARÁMETROS DE CALIDAD CLAVE PARA VACUNAS DE POLISACÁRIDOS: LLENADOS FINALES De acuerdo con el Título 21 del CFR 610.1, "Ningún lote de un producto autorizado deberá ser liberado por el fabricante antes de la culminación de las pruebas para demostrar el cumplimiento con los estándares aplicables a dicho producto. Cada lote deberá someterse a cada una de las pruebas aplicables después de la culminación de todos los procesos de fabricación
1884 (1234) Vacunas para Uso Humano/ Información General
USP 39
que pudieran afectar el cumplimiento con la norma aplicable a la prueba correspondiente. Los resultados de todas las pruebas realizadas deberá tomarse en cuenta al momento de determinar si los resultados de prueba cumplen o no con el objetivo de la misma, excepto cuando un resultado de prueba pueda descartarse cuando se haya determinado que la prueba es inválida debido a causas no relacionadas con el producto." Los métodos de prueba deben verificarse y validarse de manera apropiada.
Descripción y Solubilidad Las vacunas líquidas son, por lo regular, líquidos incoloros y transparentes esencialmente exentos de partículas visibles. Los productos liofilizados son generalmente polvos o pellets de color blanco o crema fácilmente solubles en agua y que producen líquidos incoloros y transparentes exentos de partículas visibles.
Identidad de los Polisacáridos El fabricante debe demostrar que todos los polisacáridos esperados estén presentes en el llenado final. La prueba puede ser inmunoquímica, fisicoquímica o química. La norma del Título 21 del CFR 610.14 requiere que la prueba de identidad distinga al producto de otros productos manipulados en las mismas instalaciones. En algunos casos, también se pueden especificar atributos de calidad específicos del polisacárido relacionados con la identidad, tales como el contenido de O-acetilo, los cuales deberán valorarse durante esta etapa de llenado final cuando no se hayan evaluado en una etapa anterior. A menudo, es posible confirmar y determinar la identidad y cantidad de polisacáridos usando la misma valoración.
Cantidad de Polisacáridos El contenido de cada polisacárido presente en el lote final debe determinarse usando un método inmunoquímico o fisicoquímico validado adecuado. Por lo regular, las vacunas anti-Tifoidea Vi y de polisacárido anti-neumocóccica contienen 25 µg de cada serotipo en una sola dosis humana, mientras que las vacunas de polisacárido anti-meningocóccica contienen 50 µg de cada serogrupo en una sola dosis humana. Cuando se usen métodos inmunoquímicos, los antisueros deberán ser específicos para cada polisacárido de la vacuna, incluyendo, en el caso de los serotipos de neumococo, especies que presentan reacciones cruzadas inmunológicas. Las especificaciones se establecen para cada caso, aunque, por lo regular, el contenido de cada polisacárido en la vacuna debe estar entre 70% y 130% o entre 80% y 120% de la cantidad declarada.
Integridad Estructural y Tamaño Molecular de los Polisacáridos Ante la ausencia de datos de validación adecuados que demuestren que no ocurrieron cambios durante el llenado y el almacenamiento, se debe evaluar la integridad estructural y el tamaño molecular de los componentes de polisacáridos individuales en la mayor medida posible después del llenado final. Dependiendo de la naturaleza del polisacárido y de la complejidad de la vacuna, la integridad de serotipos o serogrupos individuales puede establecerse mediante una combinación de mediciones indicadoras de la estabilidad inmunoquímica (p.ej., ELISA, nefelometría cinética o métodos fisicoquímicos), usando únicamente la determinación del tamaño y peso molecular o en combinación con valoraciones para serotipos específicos o la cuantificación de grupos específicos tales como grupos O-acetilo que han demostrado ser críticos para la inmunogenicidad. Junto con la cuantificación de serotipos específicos, estas valoraciones actúan como sustituto para una valoración de potencia.
pH Se debe determinar el pH del llenado final para productos líquidos o productos liofilizados que se han disuelto nuevamente de conformidad con el capítulo (791) y éste debe cumplir los requisitos de la autoridad pertinente que otorga la autorización. Este atributo debe incluirse en los programas de análisis de estabilidad.
Conservante Antimicrobiano Cuando resulte aplicable, se debe determinar la cantidad de conservante antimicrobiano usando un enfoque validado adecuado. Por lo regular, el valor no debe exceder el 120% de la cantidad declarada en la etiqueta. El límite inferior aprobado no debe ser menor que la cantidad mínima cuya efectividad haya sido demostrada durante toda la vida útil del producto.
Impurezas del Proceso A menos que el producto se haya analizado en una etapa temprana de fabricación y, dependiendo del proceso de fabricación usado, se deben analizar las impurezas o productos residuales del proceso tales como fenol o formaldehído mediante valoraciones validadas apropiadas. Para mayor información acerca de impurezas del proceso permisibles, ver el capítulo Vacunas para Uso Humano-Vacunas Bacterianas (1238).
USP 39
Información General/ (1234) Vacunas para Uso Humano 1885
Esterilidad Se debe asegurar la esterilidad de cada lote de acuerdo con los procedimientos descritos en el capítulo (71) y el Título 21 del CFR 610.12. El producto debe cumplir con los requisitos de las pruebas.
Pirógenos o Endotoxinas Bacterianas Dependiendo de los requisitos reglamentarios, se debe determinar el contenido de endotoxinas o la pirogenicidad del producto y se debe demostrar el cumplimiento con las especificaciones pertinentes. El capítulo (85) provee métodos para el análisis de endotoxinas. El capítulo (151) provee métodos para las pruebas de pirógenos.
Osmolaridad y/o lsotonicidad, Excipientes y Contenido de Humedad Si la vacuna es una preparación líquida, se deben analizar el pH y la osmolaridad/isotonicidad de cada lote final y se debe demostrar que están dentro de las especificaciones previamente aprobadas. Para una preparación liofilizada, los analistas deben medir el pH después de la reconstitución con el diluyente apropiado. La categoría funcional del excipiente (en ocasiones denominada funcionalidad) es un término amplio, cualitativo y descriptivo del propósito o el papel que un excipiente desempeña en una formulación. No obstante, resultan de mayor importancia los requisitos de desempeño cuantitativo (es decir, los atributos críticos de los materiales) de los excipientes que se deben evaluar y controlar a fin de asegurar el desempeño uniforme durante todo el ciclo de vida del producto. Los fabricantes deben anticipar la variabilidad entre lotes y entre proveedores en las propiedades de los excipientes y deben implementar controles apropiados, en caso necesario, para asegurar el desempeño uniforme del excipiente (consultar las pautas del capítulo Desempeño de los Excipientes (1059)). Con respecto al contenido de humedad en productos liofilizados, conforme a lo especificado en el Título 21 del CFR 610.13, cada lote de producto seco debe analizarse para detectar la humedad residual y deben cumplir, mas no exceder, los límites establecidos conforme a lo especificado mediante un método aprobado (ver también los capítulos (731) y (921 )).
Diluyente para Productos Liofilizados Se deben proveer datos para sustentar la esterilidad del diluyente (ver el capítulo (71 )) y para asegurar que no se presente contaminación por microbios adventicios en las condiciones de reconstitución (es decir, los diluyentes no deben introducir contaminación) o durante el almacenamiento conforme a lo descrito en el prospecto del empaque. Si se usa un conservante antimicrobiano (como es comúnmente el caso sólo en productos multidosis), se recomienda analizar de acuerdo con el capítulo (51) para demostrar la aceptabilidad. El análisis puede no ser necesario para todos los lotes una vez que se han establecido los controles y la uniformidad del proceso.
Seguridad General Dependiendo de los requisitos reglamentarios, puede ser necesaria una prueba general de seguridad conforme a lo establecido en el Título 21 del CFR 610.11 (g), y el producto debe cumplir con las especificaciones.
PARÁMETROS DE CALIDAD CLAVE PARA LA PROTEÍNA TRANSPORTADORA Se ha utilizado una variedad de proteínas transportadoras en la evaluación preclínica y clínica de vacunas de conjugados. Inicialmente, considerando el registro de rastreo de seguridad acumulado con las vacunas de tétanos y difteria, los toxoides diftéricos y tetánicos se seleccionaron como proteínas transportadoras. Estos toxoides se derivan de las toxinas respectivas después de la detoxificación química con formaldehído. Dichas proteínas se emplean hoy en día como transportadoras para vacunas anti-meningocóccicas, Hib y anti-neumocóccicas en diversos países alrededor del mundo. El CRM197, una mutante notóxica de la toxina diftérica, también se usa como proteína transportadora para vacunas de conjugados autorizadas de Hib, anti-neumocóccica y anti-meningocóccica y para otras vacunas que se están desarrollando. Un complejo de proteínas de membrana externa (OMPC, por sus siglas en inglés) de meningococo de serogrupo B es la transportadora de una vacuna autorizada de conjugado de Hib. Una proteína relacionada con Hib, la Proteína D, es la transportadora para la mayoría de los polisacáridos incluidos en una vacuna autorizada de conjugados de neumococo.
Parámetros de Calidad Clave para la Proteína Transportadora En la actualidad, se emplean cinco proteínas transportadoras para vacunas de conjugados cuyo uso ha sido aprobado por diversas autoridades reglamentarias: El Toxoide Diftérico, el Toxoide Tetánico, el CRM197, la Proteína D Haemophilus y el OMPC. Cuando la proteína transportadora es un componente de una vacuna aprobada como las de toxoides diftéricos y tetánicos, los primeros parámetros de calidad clave son aquéllos definidos por las pruebas de liberación en los materiales a granel
1886 (1234) Vacunas para Uso Humano/ Información General
USP 39
concentrados para estos componentes. Otros parámetros de calidad incluyen el nivel de oligomerización (monómero vs. formas multiméricas). Para proteínas transportadoras que no están autorizadas como vacunas de uso individual, la lista de los atributos de calidad clave debe incluir por lo menos la identidad, la esterilidad o la biocarga (dependiendo del proceso de fabricación), las endotoxinas y la pureza. En algunos casos específicos, puede ser necesario medir atributos de calidad adicionales. IDENTIDAD DE LA PROTEÍNA TRANSPORTADORA La identidad de las proteínas transportadoras se puede determinar mediante métodos adecuados que pueden dividirse en dos categorías: • Métodos inmunoquímicos: inmunoprecipitación (floculación, inmunodifusión radial y nefelometría), métodos inmunoelectroforéticos (inmunoelectroforesis de cohete) y métodos inmunoenzimáticos (inmunotransferencias y ELISA) • Métodos fisicoquímicos estándar usados para otras proteínas purificadas: espectrometría de masas, mapeo de péptidos y determinación de masa molecular. Mediante estos métodos, se compara una preparación de muestra con una preparación de referencia para demostrar la concordancia. Las pruebas citadas en este capítulo pueden no ser apropiadas para las proteínas toxoides. ESTERILIDAD O BIOCARGA La esterilidad y la biocarga se determinan de acuerdo con los procedimientos descritos en los capítulos (71) y (61 ), respectivamente, y en el Título 21 del CFR 610.12. EN DOTO XI NAS Para asegurar un nivel aceptable de endotoxinas en el producto final, los fabricantes pueden determinar el contenido de endotoxinas de la proteína transportadora de acuerdo con el capítulo (85) y pueden así demostrar que los niveles de endotoxinas están dentro de los límites aceptables. Para algunos productos, el análisis de pirogenicidad en conejos (ver el capítulo (151 )) puede ser una prueba más pertinente.
Toxoide Diftérico PUREZA ANTÍGENA Dependiendo del proceso de fabricación, la preparación del toxoide diftérico puede presentar diversos grados de pureza. Por lo regular, la pureza antígena para el toxoide diftérico según se determina mediante la prueba de floculación, debe ser al menos 1500 unidades Lf (límite de floculación)/mg de proteína. MONÓMERO, DÍMERO O CONTENIDO AGREGADO La toxina diftérica se caracteriza por la presencia de formas de agregación dimérica y multimérica que también están presentes en las preparaciones detoxificadas correspondientes. Con respecto a este parámetro, los analistas pueden monitorear la uniformidad en la fabricación de toxoide diftérico mediante la determinación del contenido de monómeros con respecto a dímeros y otros agregados, usando un método adecuado tal como SEC-HPLC acoplado con un detector de dispersión estática de luz. En algunos casos, debido a la baja pureza de la preparación, el perfil de HPLC puede mostrar un pico ancho que no se puede resolver dentro de la contribución de las especies individuales.
Toxoide Tetánico PUREZA ANTÍGENA Por lo general, la pureza antígena del toxoide tetánico según se determina mediante la prueba de floculación debe ser al menos 1500 unidades Lf/mg de proteína. MONÓMERO, DÍMERO O CONTENIDO AGREGADO El proceso de detoxificación de la toxina tetánica resulta en la oligomerización hasta un grado tal que depende de las condiciones del proceso. De manera similar al toxoide diftérico, la uniformidad fisicoquímica del toxoide tetánico se puede monitorear mediante la determinación de las formas monoméricas en función de las formas diméricas y otros agregados, usando métodos adecuados como SEC-HPLC acoplado con detección de dispersión estática de luz. Se pueden aplicar otros métodos como el análisis por ultracentrifugación, aunque pueden ser menos adecuados para el análisis de rutina.
Información General/ (1234) Vacunas para Uso Humano 1887
USP 39
CRM197 La proteína CRMl 97 es una toxina diftérica no toxigénica aislada del sobrenadante de cultivos de Corynebacterium diphtheriae C7(/3 197)10x- y purificada mediante una secuencia de etapas cromatográficas y de diafiltración. El capítulo (1238) provee una pauta para la producción y el control de proteínas bacterianas usadas en la fabricación de vacunas. La CRMl 97 recombinante debe cumplir con los requisitos para materiales no recombinantes, aunque puede ser necesaria una caracterización adicional apropiada para proteínas recombinantes. PUREZA La pureza de las partidas de CRMl 97 debe determinarse usando métodos adecuados, p.ej., HPLC (ver el capítulo (621 )), electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE, por sus siglas en inglés, ver el capítulo Artículos Obtenidos por Biotecnología-Electroforesis en Gel de Poliacrilamida (1056)) o Electroforesis Capilar (1053). Las expectativas típicas son que la pureza de la CRMl 97 debe ser al menos 90% y a menudo mayor de 95%. GRADO DE CORTE La CRMl 97 contiene un bucle expuesto de tres residuos de arginina que puede ser cortado por las proteasas presentes en el medio de cultivo, lo que produciría la denominada forma cortada. El proceso de fabricación debe ser capaz, de manera demostrable, de producir regularmente CRMl 97 con un grado constantemente bajo de corte. Ante la presencia de un agente reductor tal como ditiotreitol, la forma cortada se rompe en dos polipéptidos distintos denominados fragmentos A y B que se pueden detectar fácilmente mediante SDS-PAGE, el cual es, por consiguiente, un método adecuado para determinar el grado de corte. En un proceso validado, el análisis del grado de corte puede requerirse como un control durante el proceso.
Proteína O de Haemophilus La Proteína D de Haemophilus se obtiene como una proteína recombinante a partir de células de E. coli cultivadas en medios de fermentación. Después de la extracción de la proteína D de las células de E. coli, esta proteína se purifica mediante una serie de etapas cromatográficas y de diafiltración para, finalmente, ser esterilizada por filtración. Las pruebas de liberación de rutina para la proteína D incluyen pruebas de identidad, pureza, esterilidad, contenido de proteína y contenido de endotoxinas. Asimismo, se deben analizar las proteínas de células hospederas y el ADN de células hospederas a menos que la validación del proceso haya demostrado una depuración uniforme. PUREZA La pureza debe monitorearse con una prueba apropiada tal como HPLC, SDS-PAGE o electroforesis capilar (CE, por sus siglas en inglés).
Complejo de Proteínas de la Membrana Externa El complejo de proteínas de la membrana externa (OMPC) del grupo B de Neisseria meningitidis se deriva de células bacterianas del serogroupo B de meningococo mediante extracción con un detergente que contiene amortiguadores. Los analistas pueden monitorear la uniformidad de la fabricación mediante la determinación de la composición del OMPC purificado con SDS-PAGE u otro método adecuado. CONTENIDO O PIROGENICIDAD DE ENDOTOXINAS Para asegurar un nivel aceptable de endotoxina en el producto final, los analistas pueden determinar el contenido de endotoxina de la proteína transportadora y pueden demostrar que cae dentro de los límites aceptables, de acuerdo con el capítulo (85). Como alternativa, las preparaciones OMPC deben pasar la prueba de pirogenicidad en conejos después de la inyección en conejos por lo general a 0,25 µg/kg de masa corporal (ver el capítulo (151 )). REQUISITOS DE
OMPC
DE MENINGOCOCCO-PUREZA Y CONTENIDO DE LIPOPOLISACÁRIDOS
Se debe monitorear la uniformidad de la composición de la proteína transportadora del OMPC de meningococo usando SDS-PAGE u otro método adecuado. Por lo regular, el contenido de lipopolisacáridos no debe exceder (LPS, por sus siglas en inglés) 8% en peso. Los métodos adecuados para la determinación de LPS incluyen HPLC, análisis colorimétrico, SDS-PAGE y GC-MS.
1888 (1234) Vacunas para Uso Humano/ Información General
USP 39
PARÁMETROS DE CALIDAD CLAVE PARA PRODUCTOS INTERMEDIOS ACTIVADOS Se pueden aplicar diversas estrategias químicas a la síntesis de vacunas de glicoconjugados. Tradicionalmente, se han empleado dos estrategias principales para la preparación de vacunas de glicoconjugados: el primero se basa en una activación química aleatoria a lo largo de la cadena del polisacárido nativo o cadenas de polisacáridos cuyo tamaño se ha reducido ligeramente, seguida de la conjugación de los polisacáridos con la proteína transportadora; el otro se basa en una activación selectiva de grupos terminales de oligosacáridos generados mediante la fragmentación controlada del polisacárido nativo y el acoplamiento subsiguiente a la proteína transportadora. Dependiendo de la química de conjugación, se puede usar un espaciador químico para facilitar el acoplamiento de la proteína a los antígenos sacáridos y, en algunos casos, también se requiere la derivatización previa de las proteínas transportadoras. En ocasiones, se aisla el polisacárido u oligosacárido activado o derivatizado y el producto aislado se considera un producto intermedio del proceso de fabricación de vacunas de glicoconjugados. Para asegurar la producción de un producto reproducible mediante la aplicación uniforme de la estequiometría de conjugación apropiada, los fabricantes deben usar métodos apropiados para determinar el grado de activación o derivatización del poli u oligosacárido y de la proteína transportadora.
Grado de Activación del Polisacárido Activado Cuando resulte apropiado, se pueden aplicar diversas estrategias de activación o derivatización a poli u oligosacáridos para hacerlos más adecuados para acoplamiento covalente a la proteína transportadora. En algunos casos, los grupos hidroxilo del polisacárido se hacen reaccionar primero con bromuro de cianógeno o CDAP o carbonildiimidazol para formar ésteres activos. Posteriormente, estos productos intermedios activos se pueden hacer reaccionar in situ con dihidrazida de ácido adípico u otras aminas bifuncionales para introducir un enlazante amino. Algunos polisacáridos bacterianos poseen grupos carboxilo o fosfato que se pueden usar para la introducción de un enlazante amino usando química mediada por carbodiimidas. El acoplamiento subsiguiente de la proteína transportadora a los grupos carboxilo para obtener el glicoconjugado deseado puede realizarse usando, por ejemplo, química mediada por carbodiimidas solubles. Como alternativa, el enlazante amino incorporado a la estructura del polisacárido se puede derivatizar adicionalmente para obtener un bromoacilo o una función maleimido que es adecuada para acoplamiento con un grupo tiol que está presente o que se incorporó previamente a la proteína transportadora. En otros casos, los grupos aldehído se pueden introducir en la estructura del polisacárido mediante reacción de grupos hidroxilo vecinales con el reactivo oxidante metaperyodato de sodio (Nal0 4 ). Dependiendo de la estructura del polisacárido, se puede usar el tratamiento con Nal0 4 para despolimerización controlada y generación de grupos aldehído simultáneos. Posteriormente, se pueden acoplar de manera covalente grupos aldehído que están presentes en los poli u oligosacáridos a residuos de lisina y a los grupos amino N-terminal de la proteína portadora mediante aminación reductiva en presencia de cianoborohidruro de sodio (NaBH 3 CN) u otros agentes reductores que son selectivos para las bases de Schiff. Algunas estrategias de fabricación se basan en la hidrólisis controlada de los polisacáridos nativos para producir oligosacáridos que se pueden derivatizar específicamente mediante una secuencia de etapas que conllevan a la introducción de una función activa de éster en sus terminales reductoras. Posteriormente, el conjugado deseado se obtiene mediante reacción de los oligosacáridos activados con residuos de lisina y grupos amino N-terminal de la proteína transportadora. Para asegurar una estequiometría de conjugación uniforme y, por ende, un proceso de fabricación uniforme, los fabricantes deben determinar el nivel de derivatización o activación de los productos intermedios poli u oligosacáridos. Se debe contar con métodos apropiados para la determinación de las funciones químicas recientemente introducidas en las estructuras de sacáridos y éstos podrían incluir, por ejemplo, métodos calorimétricos y otros métodos adecuados. Para casos en los que el polisacárido activado se conjuga sin aislamiento, la uniformidad en el grado de activación de polisacáridos también se puede demostrar como parte de la validación del proceso o reflejarse en las características del material a granel conjugado final. El cálculo del grado de derivatización de poli u oligosacáridos puede requerir la determinación de la cantidad total de sacárido que se puede medir aplicando, por ejemplo, HPAEC-PAD, valoración calorimétrica y otros métodos adecuados disponibles. En un proceso validado donde se ha establecido la uniformidad en la producción y, dependiendo de la química de conjugación usada y de los resultados de ensayos clínicos, se puede usar este análisis como un control durante el proceso. El enlazante residual no conjugado que podría interferir con las etapas subsiguientes se debe controlar a través de mediciones o validación del proceso.
Determinación del Tamaño Molecular de Polisacárido Activado, Derivatizado o Procesado El tamaño molecular y el grado de polimerización de los productos intermedios de poli u oligosacáridos dependen del proceso de fabricación particular y debe medirse debido a que dichas propiedades pueden afectar la uniformidad del proceso de conjugación. Se deben aplicar pruebas adecuadas a combinaciones de productos intermedios que se seleccionan tomando como base los diferentes procesos de fabricación. Algunos ejemplos de métodos adecuados para generar perfiles de tamaños moleculares y para determinar el grado de polimerización de poli y oligosacáridos son: La SEC acoplada con detectores UV, RI o de dispersión estática de luz; las valoraciones calorimétricas basadas en la determinación de grupos totales o terminales; HPAEC-PAD o espectroscopía de RMN. En un proceso validado, el análisis del tamaño molecular y el grado de polimerización de los productos intermedios puede usarse como un control durante el proceso.
USP 39
Información General/ (1234) Vacunas para Uso Humano 1889
Grado de Activación de la Proteína Transportadora Activada Como se mencionó anteriormente, algunos procedimientos de fabricación de vacunas de glicoconjugados también puede requerir la activación de la proteína transportadora. Esta etapa del proceso introduce en las cadenas laterales de proteína grupos funcionales adicionales que reaccionan con los productos intermedios de poli u oligosacáridos activados con el grupo funcional apropiado. En general, dichos grupos funcionales se introducen mediante derivatización de cadenas laterales de aminoácido proteínico tales como ácido glutámico o aspártico con un reactivo bifuncional (p.ej., dihidrazida o hidrazida de ácido adípico) de tal manera que se disponga de un grupo de hidrazida altamente nucleófilo para acoplamiento con el polisacárido. En otras estrategias de fabricación, las cadenas laterales de lisina de la proteína transportadora se pueden derivatizar para introducir diferentes grupos reactivos (p.ej., grupos bromoacilo, tiol o maleimido). Se debe contar con métodos apropiados para la determinación de funciones químicas recientemente formadas que se introducen en las proteínas portadoras y pueden incluir valoraciones espectrofotométricas y espectrometría de masas. El cálculo del grado de activación o derivatización de la proteína transportadora también puede requerir la determinación de la cantidad de proteína total (p.ej., mediante valoraciones colorimétricas u otros métodos apropiados). En un proceso validado donde se ha establecido la uniformidad de la producción y, dependiendo de la química de conjugación usada y los resultados de ensayos clínicos, se puede usar análisis como un control durante el proceso. Dependiendo de la química de conjugación usada (es decir, conjugación inmediata después de la activación), la uniformidad en el grado de activación de la proteína transportadora también puede demostrarse como parte de la validación del proceso o reflejarse en las características del material a granel conjugado final.
Contenido de Monómero de Proteína Transportadora En algunos casos, los procedimientos para activación o derivatización de la proteína transportadora puede resultar en cierto grado de agregación covalente del portador mismo, y esto debe monitorearse con pruebas apropiadas tales como SEC-HPLC acoplado con detección de dispersión estática de luz, SDS-PAGE, espectrometría de masas con ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDI, por sus siglas en inglés) u otras pruebas adecuadas.
PARÁMETROS DE CALIDAD CLAVE PAIJA CONJUGADOS MONOVALENTES A GRANEL (FARMACO) Conjugación La conjugación del antígeno de polisacárido a la proteína transportadora o al complejo de proteínas es el componente crítico del proceso de fabricación para vacunas de conjugados. El capítulo (1238) provee información general sobre un proceso de conjugación. Además de desarrollar una descripción del equipo de procesamiento crítico, reactivos y etapas de procesamiento, los fabricantes deben proveer la justificación para la química de conjugación seleccionada y las etapas de purificación, si las hubiere, usadas para eliminar componentes de reacción no deseados. La eliminación de impurezas relacionadas con el producto (p.ej., polisacáridos no conjugados o proteínas transportadoras no conjugadas) debe monitorearse y controlarse. Dependiendo de la naturaleza del proceso de fabricación, los materiales a granel conjugados monovalentes deben considerarse fármacos o productos intermedios del proceso. Durante la conjugación, los grupos funcionales reactivos presentes en el antígeno del polisacárido se hacen reaccionar con los grupos funcionales localizados en la proteína transportadora o el complejo portador para formar enlaces covalentes estables. Se emplean muchos tipos de procedimientos químicos distintos, incluyendo la aminación reductiva, la tio-alquilación o la química CDAP. La elección del método químico debe basarse en la disponibilidad de grupos funcionales, ya sea que ocurran naturalmente o que se introduzcan mediante una activación o proceso de carga de cadena lateral, y la capacidad para controlar el proceso de fabricación para producir un producto estable y uniforme. Aunque el proceso de conjugación puede ser sencillo desde el punto de vista conceptual, dicho proceso debe controlarse de manera adecuada. El proceso por lo regular consiste en mezclar el polisacárido activado con la proteína transportadora seleccionada y en la incubación posterior de esta mezcla durante un tiempo adecuado y a temperatura constante para permitir la reacción de los componentes. Dependiendo de la naturaleza de la reacción química, puede ser necesario un reactante químico adicional para completar la reacción o estabilizar el producto conjugado. Por ejemplo, en el caso de la aminación reductiva, puede ser necesario agregar un agente reductor para convertir el enlace de una base de Schiff relativamente inestable a una amina secundaria más estable. Asimismo, puede ser necesaria la desactivación química o el bloqueo de grupos reactivos residuales. Finalmente, los niveles residuales de componentes que no reaccionaron tales como proteína libre, polisacárido libre, reactivos químicos y subproductos deben eliminarse del proceso mediante validación o se deben monitorear mediante análisis. Las autoridades reglamentarias pueden solicitar la evaluación de la estabilidad de estos productos intermedios debido a que los datos pueden sustentar predicciones de estabilidad para vacunas multivalentes cuya recolección de datos sea más complicada. Para definir y controlar los procesos de conjugación, el fabricante debe establecer valores para los parámetros y límites de tolerancia del proceso para todas las etapas críticas del proceso cuando sea posible, incluyendo el grado de activación, relaciones de carga para cada componente de reacción, tiempo de reacción, temperatura de reacción, pH de reacción y condiciones
1890 (1234) Vacunas para Uso Humano / Información General
USP 39
de mezclado. Además, se deben establecer tolerancias para la pureza de cada uno de los componentes de reacción, incluyendo el polisacárido, la proteína transportadora y cualquier componente químico conforme a lo indicado anteriormente. A continuación se describen los atributos de calidad clave comunes para conjugados monovalentes, la justificación para monitorear estos parámetros y los métodos de prueba adecuados.
Identidad del Polisacárido La identidad del polisacárido confirma que se haya usado el antígeno correcto durante el proceso de fabricación y que no se haya perdido ningún epítope crítico durante la conjugación. La identidad del polisacárido debe confirmarse usando un método inmunológico o químico adecuado. Entre los ejemplos de métodos inmunológicos se incluye el ELISA, el análisis de inmunotransferencia y la nefelometría cinética. La especificidad del método de prueba debe asegurarse mediante la selección de los reactivos apropiados. Como alternativa, la identidad del polisacárido se puede confirmar usando un método químico o físico tal como HPLC, HPAEC-PAD, cromatografía de gases o resonancia magnética nuclear siempre que se pueda demostrar una especificidad aceptable y se pueda demostrar que la proteína transportadora no interfiere sustancialmente con la identificación del polisacárido.
Identidad de la Proteína Transportadora Dependiendo de la naturaleza del proceso de fabricación y de los controles de fabricación, puede ser necesario confirmar la identidad de la proteína transportadora, p.ej., durante un proceso de fabricación para un producto multivalente en el que diferentes antígenos se conjugan en diferentes proteínas transportadoras dentro de las mismas instalaciones. La identificación de la proteína transportadora también se puede realizar usando un método inmunológico tal como ELISA o, si fuera posible, un método químico apropiado tal como mapeo de péptidos (ver el capítulo Artículos Obtenidos por Biotecnología-Mapeo de Péptidos (1055)). Si fuera apropiado, se puede evaluar la identidad de la proteína transportadora en la misma valoración que se usa para la identidad del polisacárido.
Cantidad de Polisacárido La cantidad o concentración de polisacárido se debe confirmar para todos los lotes de conjugado monovalente debido a que se relaciona directamente con la dosis de producto. La cantidad o concentración del polisacárido también puede ser un indicador útil para la uniformidad del proceso. Se dispone de una variedad de métodos adecuados que pueden ser usados en la determinación de la concentración de polisacárido. Éstos incluyen métodos colorimétricos tales como valoraciones con fenolácido sulfúrico, orcinol y antrona-ácido sulfúrico, alternativamente el polisacárido se hidroliza y los monosacáridos producidos se analizan mediante HPAEC-PAD, HPLC con detección de fluorescencia (HPLC-FD) o cromatografía de gases. Los métodos inmunológicos que pueden ser adecuados incluyen ELISA o nefelometría cinética. La aptitud de estos métodos depende de la disponibilidad de reactivos apropiados. La selección del método debe realizarse teniendo en cuenta su precisión y exactitud. Se debe evitar la interferencia de la proteína transportadora. Además, los analistas deben tomar en cuenta la composición química del antígeno polisacárido al seleccionar el método. Por ejemplo, la valoración de fenol-ácido sulfúrico puede no ser adecuada para su uso si el antígeno está compuesto en gran medida por azúcares amino o ácido siálico. Los métodos adecuados para la cuantificación de polisacárido se listan en las secciones anteriores de este capítulo.
Cantidad de Proteína Transportadora La concentración de la proteína transportadora debe confirmarse para todos los lotes del conjugado monovalente. Las vacunas de conjugados por lo regular se formulan basándose en la concentración de polisacárido, no en la concentración de proteína transportadora. No obstante, la concentración de proteína transportadora es necesaria para determinar la relación polisacárido-proteína, que es un indicador clave de la uniformidad del proceso de fabricación de la vacuna. Los analistas deben seleccionar un método de prueba que sea específico para la proteína transportadora y que no sufra interferencia del polisacárido presente en el conjugado. Los métodos adecuados pueden incluir análisis de aminoácidos (ver el capítulo Artículos Obtenidos por Biotecnología-Análisis de Aminoácidos (1052)), pruebas colorimétricas de proteína tales como la valoración del ácido bicinconínico o la determinación de la concentración de proteínas por espectrometría UV (ver el capítulo (1057) para ambos tipos de métodos) o el resultado específico para proteínas de la HPSEC con dispersión estática de luz, RI o detección UV.
Relación Polisacárido-Proteína Tal como se indicó en Cantidad de Proteína Transportadora, la relación polisacárido-proteína puede ser un indicador de la uniformidad del proceso. Por lo tanto, se deben establecer tolerancias para dos de los tres parámetros: concentración de polisacárido, concentración de proteína y relación polisacárido-proteína. No es necesario establecer límites para los tres parámetros debido a que la relación polisacárido-proteína por lo general se calcula a partir de las concentraciones medidas de polisa-
USP 39
Información General/ (1234) Vacunas para Uso Humano 1891
cárido y proteína transportadora. Debido a que el procesamiento posterior y las diluciones por lo regular se basan en la cantidad de polisacárido presente en los materiales a granel monovalentes, el límite para el contenido de polisacárido se puede basar en la concentración mínima requerida para el procesamiento posterior.
Distribución o Integridad del Tamaño Molecular o Evidencia de Covalencia El tamaño molecular del conjugado es un indicador clave de la uniformidad del proceso. Los conjugados inusualmente pequeños pueden indicar una conjugación incompleta mientras que los conjugados inusualmente grandes pueden indicar agregación y pueden resultar en una pérdida de rendimiento durante las etapas de filtración posteriores. El tamaño molecular promedio y la distribución del tamaño deben medirse usando métodos apropiados de establecimiento de tamaño tales como SEC, HPSEC, HPSEC con dispersión estática de luz o detección RI, o ultracentrifugación analítica. La selección del método debe realizarse tomando como fundamento el tamaño esperado del conjugado y la disponibilidad de un cromóforo para la detección.
Proporción de Polisacárido Libre (o No Conjugado) La proporción de polisacárido no conjugado debe monitorearse para cada lote de conjugado monovalente debido a la posibilidad de que la presencia de una gran cantidad de polisacárido no conjugado pueda suprimir la respuesta inmune al antígeno. Asimismo, la presencia de polisacárido libre es un indicador clave de la uniformidad del proceso y es una medición indirecta del acoplamiento covalente a la proteína transportadora. La medición de la proporción de polisacárido no conjugado se puede usar como una prueba indicadora de la estabilidad si se valida de manera apropiada. Para medir el nivel de polisacárido no conjugado, los analistas deben separar el polisacárido no conjugado del polisacárido conjugado. Esto puede lograrse mediante cromatografía o mediante precipitación química del conjugado con ácidos o detergentes, adsorción de aluminio, electroforesis capilar, filtración en gel, ultrafiltración por centrifugación, extracción de fase sólida o inmunoprecipitación. La cantidad de polisacárido libre puede cuantificarse posteriormente usando el método que se usó para cuantificar el nivel de polisacárido total, si dicho método tiene suficiente sensibilidad, mediante detección UV si está presente un cromóforo, o usando métodos inmunológicos o fisicoquímicos apropiados. El nivel de polisacárido no conjugado debe medirse al momento de la liberación y durante el análisis de estabilidad debido a que la desconjugación es un mecanismo de degradación potencial.
Proporción de Proteína Transportadora No Conjugada El nivel de proteína transportadora no conjugada debe monitorearse para cada lote de conjugado monovalente debido a que este nivel es un marcador clave de la uniformidad del proceso y es una medición indirecta de su grado de acoplamiento covalente al polisacárido. Para medir la cantidad de proteína no conjugada, se debe separar la proteína no conjugada del conjugado. Esto se puede realizar cromatográficamente o mediante electroforesis (en placa o capilar). Una vez separada, la cantidad de proteína no conjugada se puede monitorear mediante espectrometría UV o por un método calorimétrico (ver el capítulo (1057)). La selección del método debe basarse en la sensibilidad, la precisión y la especificidad de los diferentes métodos para determinar la proteína no conjugada.
Grupos Funcionales que No Reaccionaron Durante el proceso de conjugación, los grupos funcionales reactivos en el polisacárido reaccionan con grupos funcionales de la proteína transportadora. No obstante, la reacción por lo regular no se lleva a cabo hasta el punto donde la totalidad de los grupos funcionales hayan reaccionado y puede ser necesario un proceso de bloqueo de los grupos reactivos remanentes, dependiendo de la naturaleza de los grupos reactivos residuales, la química de conjugación usada y la optimización del proceso de fabricación. El método seleccionado para bloquear grupos reactivos depende de la química de conjugación usada. Incluso así, pueden quedar algunos grupos reactivos en el conjugado después de que se haya detenido la reacción mediante reducción o después de que los grupos reactivos remanentes se hayan bloqueado químicamente. Las preocupaciones relacionadas con la seguridad, si las hubiera, dependen de la naturaleza de los grupos reactivos y del nivel de grupos reactivos remanentes. El nivel de grupos reactivos residuales debe monitorearse como una medida de la uniformidad del proceso, a menos que la validación del proceso haya demostrado que los grupos funcionales no reaccionados detectables en esta etapa se eliminan durante los proceso de fabricación subsiguientes. Además, la presencia de grupos reactivos residuales puede afectar la estabilidad del producto durante el almacenamiento. El método de prueba usado para evaluar grupos reactivos residuales depende de la química de activación usada y de la naturaleza del antígeno polisacárido. Los métodos apropiados pueden incluir cromatografía de gases, HPLC con fluorescencia o detección UV seguida de hidrólisis.
1892 (1234) Vacunas para Uso Humano/ Información General
USP 39
Reactivos Residuales La uniformidad de la cantidad de reactivos residuales de la reacción de conjugación se puede demostrar durante el desarrollo del proceso, y éste puede validarse por la eliminación de los mismos. Esta validación incluye no solo la determinación de la prescencia de polisacárido y proteína no conjugados, sino también de amortiguadores, sales, componentes de reacción de pequeñas moléculas y de subproductos generados durante la conjugación. Siempre que se recuperen niveles uniformes de disolventes residuales, dicho análisis puede servir como un control durante el proceso.
Esterilidad o Biocarga Dependiendo del proceso de fabricación, se debe analizar la biocarga o esterilidad de los materiales a granel conjugados monovalentes. Si los materiales a granel conjugados monovalentes se someten a etapas adicionales del proceso sin retenciones durante el mismo, en algunos casos puede ser apropiado realizar la prueba de esterilidad o biocarga en una etapa posterior.
Endotoxinas Bacterianas Los materiales a granel conjugados monovalentes deben analizarse para determinar la presencia de endotoxinas bacterianas. Si los materiales a granel conjugados monovalentes se someten a etapas adicionales del proceso sin retenciones durante el mismo, en algunos casos puede ser apropiado realizar la prueba de endotoxinas en una etapa posterior.
MATERIALES A GRANEL CONJUGADOS FORMULADOS Y COADYUVADOS (CUANDO RESULTE APROPIADO) Los materiales a granel conjugados monovalentes se pueden adsorber y formular individualmente como materiales a granel monovalentes antes del mezclado durante la preparación de la vacuna final.
Contenido de Coadyuvantes Cuando se haya agregado un coadyuvante al material a granel conjugado, se debe determinar su contenido usando un método apropiado. Si se usa aluminio como coadyuvante, los valores máximos típicos son 0,85 mg de aluminio por dosis, aunque se pueden aceptar límites mayores de hasta 1,25 mg de aluminio por dosis siempre que se justifique, y podrían aplicarse límites inferiores de acuerdo con los requisitos de la agencia reglamentaria.
Contenido de Polisacárido Se puede requerir la evaluación del contenido de polisacárido, aunque es a menudo difícil en esta etapa debido a la presencia de coadyuvantes o excipientes. Se encuentran disponibles diversos métodos que son adecuados para su uso en la determinación de la concentración de polisacárido. Estos incluyen métodos colorimétricos tales como valoraciones con fenol-ácido sulfúrico, orcinol y antrona-ácido sulfúrico; y análisis de monosacáridos post-hidrólisis mediante HPAEC-PAD, HPLC-FD, o cromatografía de gases. Los métodos inmunológicos adecuados incluyen ELISA o nefelometría cinética. Si fuera posible, se debe usar el mismo método tanto para esta etapa como para la etapa de fabricación de material a granel conjugado. La selección del método debe basarse en la precisión, la exactitud y la especificidad. Se debe evitar la interferencia de la matriz. Asimismo, los analistas deben considerar la química del antígeno del polisacárido al seleccionar el método.
Polisacárido Libre (o No Conjugado) El contenido de polisacárido libre debe medirse como una prueba de liberación para material a granel formulado monovalente si el polisacárido libre no se puede medir de manera precisa o exacta en el producto final. Para la mayoría de las aplicaciones, el análisis del polisacárido es un marcador de uniformidad; es decir, se monitorea para cada material a granel para establecer la uniformidad de la producción. La prueba puede omitirse cuando se ha demostrado la uniformidad en la fabricación, o la prueba se puede usar como un control durante el proceso. Cuando el polisacárido libre pudiera adsorberse en el coadyuvante, puede ser necesaria una etapa de desorción, por ejemplo, con solución amortiguadora de fosfato. El polisacárido no conjugado debe separarse del polisacárido conjugado adsorbido y no adsorbido. El conjugado adsorbido se puede eliminar mediante centrifugación y el conjugado no adsorbido se puede eliminar por cromatografía; mediante precipitación química del conjugado con ácido o detergente o adsorción con aluminio; mediante precipitación inmunoquímica con anticuerpos anti-portadores; mediante electroforesis capilar; o mediante filtración o ultrafiltración en gel o en membrana. Posteriormente, la cantidad de polisacárido libre se puede cuantificar usando el mismo método que se usó para cuantificar el nivel de polisacárido total si éste es lo suficientemente sensible y exacto. Las pruebas cuantitativas para polisacáridos incluyen métodos colorimétricos tales como valoraciones con fenol-ácido sulfúrico, orcinol y antrona-ácido sulfúrico; y alternativamente el polisacárido se
USP 39
Información General/ (1234) Vacunas para Uso Humano 1893
hidroliza y los monosacáridos producidos se analizan mediante HPAEC-PAD, HPLC-FD o cromatografía de gases. Los métodos inmunológicos adecuados incluyen ELISA o nefelometría cinética. Los resultados deben expresarse como el porcentaje de polisacáridos no conjugados en función del contenido total determinado experimentalmente o, si no es posible determinar dicho valor por la vía experimental, puede ser posible calcularlo a partir de un valor teórico. El nivel de polisacárido no conjugado debe medirse durante los estudios de estabilidad debido a que la desconjugación es un mecanismo potencial de degradación.
Nivel de Adsorción al Coadyuvante El nivel de adsorción en materiales a granel formulados monovalentes debe llevarse a cabo como una prueba de liberación cuando no se pueda realizar en el producto final. Si no es una prueba de liberación, entonces la prueba de adsorción es un marcador de uniformidad, y se realiza en cada material a granel para establecer la uniformidad de la producción. Esta prueba podrá omitirse después de que se haya demostrado una producción de calidad uniforme. Después de la centrifugación del producto, se cuantifica el conjugado no adsorbido en el sobrenadante. El conjugado adsorbido se cuantifica posteriormente usando un método validado adecuado, el cual puede ser la misma prueba usada para el contenido conjugado total. Si el método físico o químico usado para la cuantificación no es específico para la forma conjugada del sacárido, la cantidad de polisacárido libre se resta del polisacárido total para determinar la cantidad de conjugado adsorbido. De otra manera, se puede usar un método inmunológicamente específico (p.ej., ELISA). Los resultados pueden expresarse como el porcentaje de conjugado no adsorbido en función del contenido determinado experimentalmente. Cuando no sea posible determinar experimentalmente la cantidad de conjugado no adsorbido, entonces puede ser posible calcularla a partir de un valor teórico. El nivel de adsorción al coadyuvante debe medirse durante el análisis de estabilidad.
Esterilidad La esterilidad de cada lote debe medirse de acuerdo con los procedimientos descritos en el capítulo (71) y el Título 21 del CFR610.12.
PARÁMETROS DE CALIDAD CLAVE PARA MEDICAMENTOS DE VACUNAS DE CONJUGADOS Descripción y Solubilidad Cada envase en el llenado o medicamento final debe inspeccionarse visualmente (de forma manual o con sistemas de inspección automática) y deberán descartarse aquellos envases que presenten anormalidades, tales como sellado inapropiado, falta de integridad o turbidez. De manera similar, la presencia de aglomeración o partículas puede indicar fallas en el producto.
Identidad del Polisacárido Las pruebas de identidad de polisacárido confirman el uso del antígeno correcto durante el proceso de fabricación. La identidad del polisacárido se debe confirmar usando un método inmunológico o fisicoquímico adecuado, p.ej., ELISA, inmunotransferencias o nefelometría cinética. La especificidad del método de prueba debe asegurarse usando reactivos apropiados. Se debe demostrar la especificidad aceptable y las pruebas deben demostrar que la proteína transportadora no interfiere de manera importante con la identificación del polisacárido. Asimismo, pueden resultar aceptables las valoraciones basadas en hidrólisis y la identificación cromatográfica de componentes sacáridos de la vacuna (p.ej., HPAEC) después de la hidrólisis de polisacáridos.
Cantidad de Polisacárido Por lo regular, las vacunas de conjugados monovalentes contienen 1O µg de sacárido, y las vacunas multivalentes contienen entre 1 y 1O µg de cada serotipo o serogroupo por dosis humana individual. La evaluación del contenido de polisacárido puede ser difícil debido a la presencia de coadyuvantes o excipientes, en especial cuando se encuentran presentes múltiples componentes. Puede ser necesario determinar la cantidad de cada polisacárido para calcular el contenido de polisacárido libre y la proporción de conjugado no adsorbido, o esta información se puede usar durante el procesamiento de la formulación final de la vacuna. La cantidad o concentración de polisacárido debe confirmarse para todos los tipos de conjugados monovalentes debido a que se relaciona directamente con la dosis de producto. Se encuentra disponible una variedad de métodos que son adecuados para su uso en la determinación de la concentración de polisacárido [ver la información sobre cuantificación de polisacárido en la sección Parámetros de Calidad Clave para Conjugado a Granel Monovalente (Fármaco) anterior].
1894 (1234) Vacunas para Uso Humano/ Información General
USP 39
Identidad de la Proteína Transportadora (cuando Sea Apropiado) Dependiendo de la naturaleza del proceso de fabricación y de los controles de fabricación, cuando la identidad de la proteína transportadora no se haya confirmado en una etapa anterior, puede ser necesario hacerlo antes de la liberación del producto. Por ejemplo, puede ser necesaria una prueba de identidad para la proteína transportadora durante el proceso de fabricación para un producto multivalente para el cual se conjugan diferentes antígenos a diferentes proteínas portadoras dentro de las mismas instalaciones. La proteína transportadora se puede identificar usando un método inmunológico tal como inmunotransferencia o ELISA, o usando un método químico apropiado tal como mapeo de péptidos. Cuando resulte apropiado, se puede evaluar la identidad de la proteína transportadora en la misma valoración usada para identificar el polisacárido.
Tamaño Molecular (cuando Resulte Viable o Apropiado) Si la distribución del tamaño molecular no se ha establecido para los conjugados a granel monovalentes individuales usados en la formulación del producto, la distribución del tamaño molecular de los conjugados debe determinarse en el llenado final o en el medicamento. El tamaño molecular del conjugado es un indicador clave de la uniformidad del proceso. El tamaño molecular promedio y la distribución del tamaño deben medirse usando métodos de determinación del tamaño apropiados tales como SEC, HPSEC, HPSEC con dispersión estática de luz o detección RI, ultracentrifugación analítica o dispersión dinámica de luz. La selección del método debe basarse en el tamaño esperado del conjugado y en la disponibilidad de un cromóforo o fluoróforo para la detección. En el caso de las determinaciones de la distribución del tamaño molecular en el llenado final o en los medicamentos compuestos por polisacáridos multivalentes, pueden ser necesarios métodos de detección para serotipos específicos para los conjugados monovalentes individuales. El tamaño molecular es un indicador sensible de la estabilidad del conjugado y, cuando sea posible, debe medirse durante los estudios de estabilidad.
Proporción de Polisacárido libre (o No Conjugado) Para medir el nivel de polisacárido no conjugado, los analistas deben separar el polisacárido no conjugado del polisacárido conjugado adsorbido y no adsorbido y de las sustancias interferentes. Si el polisacárido no conjugado puede adsorberse en coadyuvante, será necesaria la desorción previa con, por ejemplo, solución amortiguadora de fosfato. Los métodos de separación y medición de polisacárido conjugado y no conjugado se describieron anteriormente en Materiales a Granel Conjugados Formulados y Coadyuvados. El nivel de polisacárido no conjugado es una medición indicadora de estabilidad debido a que la desconjugación es un mecanismo de degradación potencial y debe medirse durante los estudios de estabilidad. No obstante, evaluar el nivel de polisacárido no conjugado y la estabilidad de productos multivalentes complejos es técnicamente complicada, mientras que las estrategias alternativas para evaluar la integridad del antígeno incluyen la determinación del peso molecular, la evaluación del contenido de grupos O-acetilo o la medición inmunológica. Las valoraciones específicas pueden proveer información parcial pero que al mismo tiempo se superpone, por lo que deben hacerse corresponder con el producto. Los datos de sacárido libre obtenidos para conjugados monovalentes individuales también pueden ser valiosos y predictivos.
pH, Osmolaridad/lsotonicidad y Excipientes Si la vacuna es una preparación líquida, el pH y la osmolaridad/isotonicidad de cada lote final debe analizarse y se debe demostrar que está dentro de las especificaciones previamente aprobadas. Para una preparación liofilizada, se recomienda medir el pH después de la reconstitución con el diluyente apropiado. Asimismo, se debe determinar la humedad residual en productos liofilizados. Ver los comentarios anteriores relacionados con la funcionalidad del excipiente.
Cantidades de Coadyuvante (cuando Resulte Apropiado) Si se ha agregado un coadyuvante al material a granel conjugado, se debe determinar su contenido usando un método apropiado. Si se usan como coadyuvantes compuestos de aluminio (tales como hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio hidratado), la cantidad de aluminio no debe exceder 1,25 mg por dosis humana individual o conforme lo requiera la agencia reglamentaria (ver también el Título 21 del CFR 610.15).
Conservante Antimicrobiano (cuando Resulte Apropiado) Durante el desarrollo del producto, los fabricantes deben considerar la estabilidad del conservante seleccionado y las posibles interacciones entre los componentes de la vacuna y el conservante. Si se ha agregado un conservante a la vacuna, el contenido de conservante debe determinarse usando un método apropiado (ver el capítulo Agentes Antimicrobianos-Contenido (341 )). Se debe demostrar que la cantidad de conservante en la dosis de vacunas no tenga efectos deletéreos sobre el antígeno ni que perjudique la seguridad del producto en humanos. Si estuviera presente, la cantidad no debe ser menor que la cantidad mínima efectiva demostrada y, por lo regular, deber ser no más de 120% de la cantidad declarada en la etiqueta.
USP 39
Información General/ (1235) Vacunas para Uso Humano-Consideraciones Generales 1895
Contenido de Humedad (Productos Liofilizados) Si la vacuna es liofilizada, el contenido promedio de humedad debe determinarse usando un método apropiado. Los valores deben estar dentro de los límites establecidos durante los estudios de estabilidad del producto. Por lo regular, el contenido promedio de humedad residual debe ser no más del 2,5%, y ningún vial debe tener un contenido de humedad residual del 3% o mayor.
Esterilidad La esterilidad de cada lote debe determinarse de acuerdo con los procedimientos descritos en el capítulo <71) y en el Título 21 del CFR 610.12.
Pirógenos y Endotoxinas El contenido de endotoxinas (ver el capítulo <85)) o la actividad pirógena (ver el capítulo (151 )) deben estar dentro de las especificaciones aprobadas para el producto.
Diluyente para la Reconstitución de Vacunas Liofilizadas Los fabricantes deben generar datos que demuestren la ausencia de crecimiento de contaminación por microbios adventicios en las condiciones de reconstitución (p.ej., con diluyentes que se usarán para la reconstitución) o en las condiciones de almacenamiento especificadas. Normalmente no se requiere un conservante para viales monodosis cuando el producto se va a usar inmediatamente después de su reconstitución, pero los viales multidosis requieren conservantes. Se recomienda el análisis en conformidad con el capítulo <51) para demostrar aceptabilidad, aunque puede no ser necesario de manera rutinaria después de haber establecido el control y la uniformidad del proceso.
Seguridad General o Toxicidad Anormal Se debe establecer la seguridad general o la toxicidad anormal para vacunas mediante la evaluación apropiada y debe ser congruente con los niveles considerados aceptables en los lotes de vacunas usados en ensayos clínicos.
(1235) VACUNAS PARA USO HUMANO-CONSIDERACIONES GENERALES INTRODUCCIÓN Las vacunas se han usado durante siglos para inmunizar a las personas contra organismos patogénicos con el objetivo de prevenir la enfermedad asociada. Las vacunas son productos biológicos que contienen antígenos capaces de inducir una respuesta inmune adquirida específica y activa en el cuerpo. Los antígenos presentes en las vacunas son procesados en el sistema inmunológico del cuerpo por células especializadas, lo que resulta en el desarrollo de proteínas sanguíneas conocidas como anticuerpos (es decir, inmunidad humoral) o linfocitos especializados (es decir, inmunidad mediada por células) o ambos. Por lo tanto, las respuestas inmunes pueden ser mediadas por anticuerpos, por células, o por ambos. Por esta razón, los antígenos son críticos para la función de la vacuna y generalmente consisten en una porción del organismo patógeno o en una forma atenuada del microorganismo entero. En el caso de las vacunas de ADN (actualmente en desarrollo), la vacuna contendría secuencias de nucleótidos (material genético) que codifican los antígenos microbianos. El Apéndice 7 presenta ejemplos de vacunas autorizadas. Una lista actualizada de vacunas autorizadas en los Estados Unidos se encuentra disponible en www.fda.gov/cber/. Las vacunas pueden ser de varios tipos, dependiendo de su diseño y los procesos implicados en su fabricación. Las vacunas para uso humano pueden contener organismos enteros muertos o atenuados (p.ej., bacterias o virus) o antígenos derivados de porciones de un patógeno, ya sea por fraccionamiento y purificación u obtenidos mediante el uso de tecnología recombinante (Tabla 7). Algunas vacunas de polisacáridos se conjugan con un portador a fin de mejorar su respuesta inmune.
1896 (1235) Vacunas para Uso Humano-Consideraciones Generales / Información General
USP 39
Tabla 1. Vacunas Bacterianas y Virales Células o virus enteros vivos atenuadosª lnactivados/muertosb Células o virus enterosc Proteínas recombinantesd Subunidadese Polisacáridos Proteínas Toxinas modificadas
ª
Las vacunas bacterianas o virales vivas atenuadas son formas debilitadas (atenuadas) de un patógeno. Contienen antígenos que son similares a los microbios causantes de las enfermedades. Se pueden derivar del patógeno mismo o de un organismo diferente que contiene antígenos que ocasionan una reacción cruzada con el microbio virulento (p.ej., vaccinia y variola). b Las vacunas bacterianas y virales inactivadas se producen mediante el crecimiento de células de bacterias o virus causantes de enfermedades en sustratos celulares y su inactivación subsiguiente para prevenir su replicación en el receptor.
e Las vacunas de células o virus enteros inactivados/muertos constan de microorganismos enteros que han sido previamente inactivados. Estas preparaciones pueden o no estar completa o parcialmente purificadas. d Las vacunas virales y bacterianas de proteínas recombinantes se obtienen de células huésped que se han transformado con vectores de expresión, los cuales portan genes que codifican material antigénico de agentes infecciosos. Las células de expresión se cultivan en biorreactores para producir el material antigénico recombinante. e Las vacunas de subunidades son extractos de virus o bacterias inactivados/muertos. Por lo general, las vacunas de subunidades se someten a algún grado de purificación.
Además del antígeno(s), las vacunas pueden contener otros componentes tales como los adyuvantes que mejoran la respuesta inmune al antígeno de la vacuna, conservadores para evitar la contaminación bacteriana o fúngica de viales multidosis, u otros excipientes necesarios para la fabricación farmacéutica o la estabilización de la vacuna. También pueden estar presentes componentes residuales del proceso de fabricación en las preparaciones de vacunas. En la Tabla 2 se listan ejemplos de estas categorías. Tabla 2. Componentes de las Vacunas Antígenos Organismos enteros Componentes/subunidades Proteínas recombinantes Adyuvantes Sales de aluminio Conservantes antimicrobianos Timerosal 2-Fenoxietanol Cloruro de bencetonio Fenol Estabilizantes Sales Aminoácidos Azúcares Proteínas Otros Residuos de fabricación Residuos celulares Materiales de origen animal Residuos de antibióticos Agentes químicos inactivantes Otros
Los diferentes antígenos de las vacunas con frecuencia se combinan en una formulación final a fin de generar inmunidad contra múltiples enfermedades y para reducir el número de administraciones separadas necesarias para lograr la inmunidad a los diversos antígenos de las vacunas. A pesar de las múltiples formas en que se pueden presentar las vacunas, la fabricación y el análisis de las mismas se caracterizan por varios factores en común. Este capítulo se enfoca en las características comunes de todo el proceso de fabricación, desde las calificaciones de las materias primas hasta las pruebas finales de liberación.
USP 39
Información General/ (1235) Vacunas para Uso Humano-Consideraciones Generales 1897
Reglamentaciones y Normas Las vacunas están reglamentadas por la FDA como productos biológicos. Los requisitos generales se listan en la legislación nacional y en las guías internacionales. Para EE.UU., los requisitos nacionales se reglamentan en el Título 21 del CFR, secciones 200 y 600, con recomendaciones adicionales disponibles en los documentos Points to Consider and Guidance (Puntos a Considerar y Guías) de la FDA (www.fda.gov). Las guías internacionales están disponibles de la Conferencia Internacional de Armonización (ICH) (www.ich.org; ver el Apéndice 2) y de la Organización Mundial de la Salud. Se encuentran en constante proceso de desarrollo y validación nuevas metodologías que se incluirán en la USP conforme se pongan a disposición. Se pueden obtener estándares de referencia de la USP y la FDA.
PLAN GENERAL DE FABRICACIÓN Al considerar el plan general de fabricación de una vacuna, es necesario que los fabricantes tomen en cuenta los siguientes factores: • Instalaciones físicas; • Materias primas y adyuvantes del proceso; • Proceso de fabricación real, incluyendo a. el proceso inicial (producción de virus/bacterias y materiales recombinantes); b. los procesos aguas abajo (purificación o modificación química, si aplican); • Modificaciones del antígeno tales como conjugación o destoxificación; • Almacenamiento de productos intermedios del proceso y producto final a granel; • Regímenes de análisis y esquemas de control del producto en proceso y final; • Adición de adyuvantes, si aplica; • Formulación y llenado; • Sistema de envase y cierre; y • Programa de estabilidad que respalde el periodo de vida útil del producto. Se necesitan sistemas de calidad para respaldar el desarrollo del proceso de fabricación siguiente: especificaciones de materias primas, productos intermedios del proceso y producto final; control de cambios; e investigaciones sobre fallas y quejas. Todos estos elementos son importantes en el ciclo de vida de la vacuna. El objetivo general de un programa de fabricación exhaustivo es producir de manera constante una vacuna que sea segura y efectiva. De manera concurrente con el desarrollo clínico de la vacuna, se debe refinar el proceso de fabricación y validar los procesos y métodos de prueba para mantener congruencia. Esto incluye sistemas para controlar los cambios en el proceso o insumos. Los fabricantes deben prever la necesidad de cambios durante el ciclo de vida de fabricación de una vacuna y utilizar necesariamente datos derivados del desarrollo y de la fabricación de rutina para evaluar el proceso y los cambios propuestos. Los fabricantes deben adoptar sistemas que evalúen continuamente todos los aspectos de la fabricación para identificar cambios no anticipados en la calidad de las vacunas y para evaluarlos con la mayor rapidez posible.
Instalaciones y Sistemas de Fabricación Los fabricantes deben contar con un plano general de las instalaciones de fabricación, incluyendo diagramas que muestren lo siguiente: flujo de materias primas e insumos del proceso; movimiento del producto, productos intermedios, desechos y personal; y flujos de aire y niveles de presurización. Estos diagramas ayudan a minimizar el riesgo de contaminación potencial del producto desde varias fuentes. Estas fuentes pueden incluir contaminación cruzada con otros productos, contaminación con otras partidas del mismo producto y contaminación extraña proveniente de microorganismos y personal. La evaluación de los diagramas de flujo puede facilitar las estrategias de desarrollo de controles de ingeniería, procedimientos relativos al personal y sistemas de monitoreo, para permitir el cumplimiento con las Buenas Prácticas de Fabricación (GMP, por sus siglas en inglés). El análisis de riesgos potenciales también puede proveer mayor compresión sobre la información que se debe registrar en la documentación de las partidas para facilitar una fabricación uniforme, así como las investigaciones sobre fallas. En conjunto, las instalaciones físicas, procedimientos, personal, capacitación y sistemas de calidad crean un ambiente de GMP en el que se producirá una vacuna.
Proceso de Fabricación El proceso de fabricación incluye insumos del proceso tales como materias primas y coadyuvantes del procesamiento, así como operaciones unitarias, que comprenden tanto las etapas iniciales como las etapas aguas abajo del procesamiento. Un mapa de flujo del proceso de fabricación es de utilidad y ayuda en la validación del proceso de fabricación. Este mapa presenta todas las operaciones unitarias, los insumos para cada operación y los productos para las etapas de fabricación subsiguientes. Se pueden agregar al mapa las pruebas analíticas realizadas en las etapas pertinentes y las especificaciones requeridas para proceder con la siguiente etapa de procesamiento. Un mapa de proceso también respalda un espacio de procesamiento para faci-
1898 (1235) Vacunas para Uso Humano-Consideraciones Generales/ Información General
USP 39
litar un proceso robusto, es decir, uno basado en estudios de caracterización adecuados para establecer los límites dentro de los que pueda ocurrir la fabricación para promover resultados invariables de seguridad y eficacia. El mapa de flujo del proceso debe incluir todos los pasos, desde la preparación del banco de siembra/celular (descrito a continuación) hasta la formulación y llenado del producto final. La estrategia de validación debe incluir las etapas que requieran de validación, junto con la identificación del espacio de proceso, los parámetros críticos del proceso (CPP, por sus siglas en inglés) y los atributos de calidad críticos (CQA, por sus siglas en inglés) asociados. Los parámetros críticos del proceso son aquellos que afectan directamente los atributos centrales de calidad necesarios para fabricar de manera exitosa una partida de producto. Algunos fabricantes identifican otros parámetros de procesamiento que son importantes para el procesamiento pero que no afectan los atributos de calidad críticos. Estos factores importantes, aunque no críticos, ayudan a identificar el espacio de desarrollo del proceso, pueden contribuir al desarrollo de un proceso robusto o pueden ser útiles cuando la compañía evalúa desviaciones de procesamiento. Los conceptos de calidad por diseño y la exploración del espacio de proceso son relativamente nuevos para la industria de productos biológicos/vacunas, pero se están volviendo de consideración para el proceso general de desarrollo y planeación.
Vigilancia de la Fabricación La vigilancia de la fabricación consiste en la observación continua del desempeño del proceso y del producto resultante. Aunque esta sección no es exhaustiva, los puntos aquí analizados enfatizan los tipos de consideraciones recomendadas para un fabricante durante el desarrollo de una vacuna. La vigilancia de la fabricación incluye lo siguiente: • Revisión periódica del desempeño del proceso de fabricación; • Ensayos analíticos; • Programas de estabilidad; • Quejas sobre el producto; • Informes de eventos adversos; • Investigaciones sobre fallas del producto; • Eventos atípicos o desviaciones. Cuando se toman en conjunto, estas actividades permiten al fabricante evaluar el estado del proceso y del producto, así como evaluar qué operaciones, si fuera necesario, necesitan ser modificadas. Estos mismos sistemas también proporcionan una matriz de vigilancia para evaluar cambios. En cualquiera de estos programas, es también de gran valor desarrollar ensayos de caracterización adicionales que no se usan para los productos intermedios del proceso o para propósitos de liberación del producto, pero que se pueden usar para una evaluación adicional cuando se requiera o se desee información complementaria. Estos ensayos adicionales de caracterización a menudo se basan en diversos procedimientos analíticos relacionados para proporcionar diferentes maneras de evaluar materiales. Los procesos de vigilancia de rutina se implementan cada vez más en un intento por detectar cambios en los procesos antes de que se vea afectado cualquier atributo de calidad crítico. No es posible caracterizar todos los procesos de las vacunas al mismo grado o nivel (p.ej., una vacuna de virus vivo vs una vacuna de proteína recombinante), y a menudo se usan herramientas estadísticas para determinar niveles de alerta o acción en programas de vigilancia. Cuando se exceden estos niveles, el fabricante se ve en la necesidad de evaluar la situación, lo cual no necesariamente señala una falla en el producto. La fabricación usando GMP implica diseño de instalaciones, desarrollo del proceso, sistemas de calidad y vigilancia de la fabricación. Estos sistemas en conjunto ayudan al fabricante a controlar la producción de una vacuna. Como se mencionó anteriormente, son muchos los tipos de vacunas que se comercializan; cada una tiene sus características propias y, por lo tanto, requiere de diferentes planes para cada uno de los pasos mencionados en esta sección.
SISTEMAS DE LOTES DE SIEMBRA Los lotes de siembra (o lotes semilla) son los lotes de cepas específicas de bacterias, virus, o células modificadas por biotecnología usadas para expresar los antígenos de las vacunas. Todos los lotes de siembra se deben documentar en términos de su aislamiento, derivación (o construcción, en el caso de vectores recombinantes o células modificadas por biotecnología) e historial de pasajes. El propósito de un sistema de lote de siembra (o sistema de lote semilla), que por lo general incluye lotes de siembra maestro y de trabajo, y los bancos de células maestro y de trabajo asociados, es ayudar a que se garantice la uniformidad en la fabricación de vacunas. El uso de lotes de siembra maestros y de trabajo proporciona un método para limitar la replicación de la siembra y para minimizar la posibilidad de variación genética. Un lote de siembra maestro es una preparación físicamente homogénea derivada de una siembra o semilla original procesada en una sola etapa y sometida a un número limitado de pasajes. El lote de siembra maestro se caracteriza para determinar sus características biológicas, bioquímicas y genéticas, y para asegurar su pureza, su exención de agentes adventicios, y su capacidad clínica para producir una vacuna efectiva. Los cultivos del lote de siembra de trabajo deben tener las mismas características que el lote de siembra maestro del que se derivaron. Para vacunas contra la influenza, que se pueden reformular cada año con nuevos antígenos virales, es posible obtener lotes de siembra certificados de agencias reglamentarias nacionales.
USP 39
Información General/ (1235) Vacunas para Uso Humano-Consideraciones Generales 1899
Un lote de siembra de trabajo se deriva del lote de siembra maestro dentro de un número limitado de pasajes. La siembra de trabajo se analiza para asegurar su pureza, exención de agentes adventicios y propiedades bioquímicas. La siembra de trabajo se usa para la producción de vacunas sin la intervención de pasajes.
Sistema de Lotes de Siembra de Vacunas Bacterianas En el sistema de lotes de siembra bacteriano se subcultiva una siembra maestra para producir una siembra de trabajo un pasaje más allá de la siembra maestra. Posteriormente, se expande una alícuota de la siembra de trabajo para producir un lote de vacuna. La cepa o cepas usadas para los lotes de siembra maestros se identifican mediante registros históricos que incluyen información sobre su origen. La información sobre el sistema de lotes de siembra bacteriano debe incluir la fuente, el historial de pasajes y las materias primas a las que se expuso, con énfasis específico en materias primas derivadas de animales rumiantes. Las siembras se deben almacenar a una temperatura apropiada en más de un lugar dentro de una instalación o en un sitio distante a fin de disminuir el riesgo catastrófico. Las pruebas de identidad pueden incluir inoculación en medios bioquímicos adecuados, tinción de Gram, genotipo e identificación serológica con antisueros específicos adecuados. Se pueden agregar pruebas especiales, por ejemplo, para mostrar la viabilidad del cultivo pero también la avirulencia. La pureza de las cepas bacterianas usadas para los lotes de siembra se verifica por métodos de sensibilidad adecuada para asegurar la ausencia de agentes adventicios. Estas pruebas de pureza por lo regular se realizan en presencia de la siembra en condiciones que inhiben el crecimiento por la presencia o ausencia de nutrientes específicos. También es posible usar una siembra en estrías para mostrar que la siembra cultivada es un cultivo puro.
Sistema de Lotes de Siembra de Vacunas Virales La historia de derivación y pasajes de las siembras (semillas) virales se debe registrar al detalle. Cualquier manipulación del fenotipo viral (p.ej., adaptación al frío, desarrollo de sensibilidad a la temperatura, o atenuación de virulencia) o manipulaciones genéticas intencionales (p.ej., reordenamiento o recombinación) deben quedar documentadas. Estas siembras virales se diferencian comúnmente en una siembra viral maestra y siembras virales de trabajo. Las siembras virales se deben almacenar a temperaturas criogénicas para promover la estabilidad y en más de un lugar dentro de una instalación o en un sitio distante para reducir el riesgo catastrófico. Los fabricantes deben evaluar las siguientes características del lote de siembra viral: • Características de crecimiento en el sustrato celular de producción previsto; •Tropismo tisular; • Marcadores genéticos; • Identidad (para vectores recombinantes); •Viabilidad durante el almacenamiento; • Estabilidad genética a través de la producción; • Propiedades de atenuación; • Pureza; • Ausencia de agentes adventicios. Si la atenuación o derivación se logra mediante pasajes a través de diferentes especies, la siembra viral se debe evaluar para determinar la ausencia de agentes adventicios comunes para dichas especies. La siembra viral maestra se debe caracterizar ampliamente para demostrar la estabilidad del genotipo y fenotipo para un número de pasajes superior al nivel usado en la producción. Por lo general, durante la evaluación de la estabilidad genética, una siembra maestra se somete a un mínimo de cinco pasajes más allá del pasaje que producirá la vacuna final. Se deben realizar pruebas para identidad (p.ej., secuenciación del virus entero o una porción del mismo), agentes adventicios, fenotipo viral, estabilidad genética y, si aplica, agentes que pudieran estar presentes en la siembra como resultado de su historial de pasajes). El fenotipo viral se puede evaluar adicionalmente para determinar tropismo tisular, propiedades de atenuación y sensibilidad a la temperatura. Cabe la posibilidad de que no todas estas pruebas sean necesarias para cada cepa de siembra viral. En algunos casos las siembras virales pueden poseer un intervalo amplio de anfitriones y, por lo tanto, pueden requerir de neutralización del virus de la vacuna antes de analizarlas para determinar la presencia de agentes adventicios. De ser posible, el análisis de agentes adventicios se debe realizar sin neutralización a fin de evitar un antisuero que pueda neutralizar de manera inadvertida un agente adventicio presente en la siembra. En ocasiones no es posible neutralizar efectivamente una siembra viral y en tales casos se pueden usa estrategias alternativas. Por ejemplo, la prueba se puede realizar en un sustrato celular que no permita la replicación del virus de la vacuna. Sin embargo, tal sustitución del sustrato celular puede comprometer la sensibilidad de la prueba para la detección de otros agentes adventicios. Por lo tanto, las pruebas pueden suplementarse usando ensayos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés). La evaluación de neurovirulencia puede ser apropiada si se sabe que el virus es neurotrópico. Los fabricantes deben consultar con las autoridades reguladoras acerca de los modelos animales, métodos y sistemas de clasificación (scoring) apropiados para esta evaluación antes de iniciar dichos estudios. Para virus neurovirulentos o que pueden se pueden tornar neurovirulentos (p.ej., poliovirus), puede ser necesario evaluar la neurovirulencia más allá de la siembra maestra.
1900 (1235) Vacunas para Uso Humano-Consideraciones Generales / Información General
USP 39
Si la siembra viral maestra está bien caracterizada, es posible que la siembra viral de trabajo no requiera de una caracterización excesiva. Por ejemplo, podría no ser necesario repetir las pruebas para todos los virus pertinentes del historial de derivación.
Sistemas para Vacunas Obtenidas por Biotecnología Para una vacuna producida mediante un sistema de expresión celular modificado por biotecnología, se establecerá un lote de siembra maestro o un banco de células maestro durante el desarrollo del producto. El lote de siembra o bancos de células deben ser homogéneos, lo cual a menudo se logra limitando las diluciones. El sistema de lotes de siembra o de bancos de células se debe caracterizar en una manera análoga a la usada para el sustrato celular discutido en la sección siguiente, y se pueden usar pruebas adicionales para demostrar la estabilidad genética del sistema de expresión.
MEDIOS DE FERMENTACIÓN Y CULTIVO CELULAR Un medio es el material en el que se lleva a cabo el crecimiento y la amplificación de un organismo en cantidades necesarias para producir material en gran escala para la producción de vacunas. Su composición es diversa y depende de los tipos de células que el medio sustente, y abarca desde medios químicos bien definidos hasta medios químicamente indefinidos que contienen componentes naturales tales como sueros de origen animal (ver Suero Bovino (1024)). Los medios de cultivo deben ser adecuados para el propósito previsto y deben estar exentos de agentes adventicios y de componentes indeseables conocidos tales como toxinas, alérgenos y compuestos similares. Si se requieren ingredientes indefinidos, la cantidad de estos debe mantenerse por debajo de los niveles que han demostrado ser seguros para el producto final.
Medios de Fermentación para Crecimiento Bacteriano Los nutrientes consisten en materiales como proteínas, azúcares, oligoelementos inorgánicos, aminoácidos y vitaminas necesarias para el crecimiento bacteriano. El componente proteico puede ser tan simple como caseína libre (proteína de la leche) o tan complejo como extractos de fuentes bacterianas, vegetales o animales. Cualquier nutriente de fermentación de origen animal se debe seleccionar cuidadosamente y analizarse para determinar agentes adventicios. La composición de un medio por lo regular se adapta para optimizar los atributos de calidad del producto. Se deben evitar componentes del medio que se sepa ocasionan reacciones alérgicas.
Medios de Cultivo Celular para Vacunas Virales Es necesario registrar al detalle los tipos y la composición de los medios usados para el aislamiento, así como para todos los cultivos subsiguientes de componentes de las vacunas virales. Se prefieren los medios definidos químicamente sin materiales de origen animal. El medio se debe analizar para determinar su esterilidad y aptitud para las células usadas en la producción del producto. Si se usan materiales de origen animal, estos se evalúan para determinar la ausencia de agentes adventicios. Si se usa albúmina humana en una vacuna autorizada en EE.UU., debe estar autorizada por la FDA. El producto final debe estar dentro de los límites especificados de componentes residuales del medio tales como suero, antibióticos, agentes de selección o reactivos agregados para mejorar el crecimiento.
Medios para Células Modificadas por Biotecnología El requisito para los medios usados en la fermentación y propagación de células modificadas por biotecnología es igual al citado anteriormente para la fermentación bacteriana y el crecimiento de células en cultivo.
PROPAGACIÓN Y RECOLECCIÓN Las fas.es de propagación y recolección (cosecha) siguen al proceso de fabricación desde el inicio del crecimiento celular en el banco de células de trabajo hasta la separación del fármaco crudo. Además, en estas etapas del proceso de fabricación, las materias primas, medios, y soluciones se deben calificar para su uso previsto. Los números de partida se deben asignar claramente según sea necesario y la relación entre las recolecciones de componentes y las partidas de fármacos individuales se debe registrar de manera clara.
Propagación y Recolección para Vacunas Bacterianas La propagación de bacterias para vacunas bacterianas se realiza en condiciones específicas para la preparación del inóculo y las fases de fermentación. Se deben llevar a cabo monitoreos y pruebas durante el proceso para asegurar la calidad. Todos los controles y análisis realizados después de la producción (p.ej., pureza, viabilidad, rendimiento de antígeno, e identidad fenotípica) deben quedar documentados. La primera etapa de recuperación del fármaco es la recolección o cosecha en el biorreac-
USP 39
Información General/ (1235) Vacunas para Uso Humano-Consideraciones Generales 1901
tor. Se encuentra disponible una variedad de equipos, y el equipo de procesamiento usado depende de la naturaleza del proceso. Se deben establecer procedimientos para asegurar la contención y prevenir la contaminación durante la recolección, así como para monitorear la biocarga (incluyendo criterios de aceptación) o esterilidad. Se deben describir las condiciones de almacenamiento y el límite de tiempo de estabilidad para el material recolectado. Para la mayoría de las vacunas bacterianas, se requiere de una etapa de inactivación. El personal implicado en la inactivación bacteriana debe considerar lo siguiente: la forma en que se verifica la pureza del cultivo celular después de la inactivación, la necesidad de definir la pureza del cultivo antes de la inactivación, la selección del agente inactivante y la validación de los procedimientos.
Propagación y Recolección para Vacunas Virales La fabricación de vacunas virales usando cultivos de células eucarióticas incluye un proceso de producción de dos fases. La primera consiste en la expansión de los cultivos celulares usados como sustrato para la replicación viral. La segunda fase incluye la infección inicial con el virus, la replicación subsiguiente y la producción del virus. FASE DE CRECIMIENTO DEL SUSTRATO CELULAR El proceso de expansión del sustrato celular para producción viral es la fase diseñada para preparar las células en un estado fisiológico apropiado para sustentar el crecimiento del virus. Los sustratos celulares a menudo requieren de suplementos complejos derivados de animales tales como suero. El origen y análisis de suero bovino están sujetos a requisitos reglamentarios (ver Suero Bovino (1024)). FASE DE PRODUCCIÓN DE VIRUS Son relativamente pocos los tipos de células que se han usado como sustratos en vacunas virales autorizadas en EE.UU, aunque estas incluyen células primarias (p.ej., ciertas células derivadas del tejido de mono, pollo o ratón), líneas celulares diploides (p.ej., Wl38, MRC-5 ó FRhL-2) y líneas celulares continuas (p.ej., Vero). Los fabricantes de vacunas han optimizado los requisitos de nutrientes, factores de crecimiento y concentración de suero para sustentar el crecimiento a gran escala y la alta productividad de virus para estas líneas celulares.
PURIFICACIÓN El objetivo de las etapas de purificación es eliminar la mayor cantidad posible de impurezas en la recolección inicial y maximizar la pureza de la vacuna final. Los residuos del proceso pueden consistir en materiales del medio de cultivo y/o componentes celulares. Los procedimientos de purificación se deben optimizar y validar. Cuando sea aplicable, se deben incluir y validar etapas de depuración viral (eliminación o inactivación viral) usando virus modelo pertinentes. Se deben observar consideraciones especiales dependiendo de los tipos de vacunas y el sistema de producción usado, según se analiza a continuación.
Fermentación Bacteriana Las fermentaciones bacterianas por lo regular son altamente productivas y generan grandes cantidades de biomasa. Para productos de subunidades bacterianas o componentes recombinantes expresados por bacterias, la fermentación puede producir concentraciones muy elevadas del ingrediente activo deseado. Los fabricantes deben iniciar el análisis de pureza del cultivo antes del procesamiento adicional. VACUNAS DE BACTERIAS VIVAS Las vacunas de bacterias vivas tales como Bacillus Calmette-Guérin (BCG) y Salmone//a typhi Ty21 a son relativamente frágiles como productos farmacéuticos y por lo tanto toleran únicamente métodos de purificación bastante suaves. Si se restringen las fuerzas osmóticas y de corte generalmente resulta posible mantener la integridad de las bacterias. VACUNAS DE BACTERIAS INACTIVADAS Actualmente, no existen vacunas bacterianas de células enteras inactivadas autorizadas para su uso en EE.UU. ANTÍGENOS BACTERIANOS PURIFICADOS La purificación de componentes bacterianos (p.ej., proteínas, toxinas y polisacáridos) por lo general requiere de disrupción celular. Se pueden usar métodos de purificación más selectivos para eliminar impurezas del medio de cultivo y bacterianas, así como para lograr una alta pureza del componente bacteriano diana.
1902 (1235) Vacunas para Uso Humano-Consideraciones Generales / Información General
USP 39
Células Modificadas por Biotecnología El problema de los componentes residuales de las células huésped que pueden producir una respuesta inmunogénica adversa en pacientes es de especial preocupación al momento de purificar componentes de vacunas derivados de productos recombinantes. Esta respuesta se puede exacerbar por la presencia de adyuvantes de vacunas. PARTÍCULAS RECOMBINANTES SEMEJANTES AVIRUS (VLP, POR SUS SIGLAS EN INGLÉS) La formación de VLP puede resultar de manera coincidente en la incorporación de componentes de las células huésped (p.ej., ADN) en la estructura cuaternaria del ensamble molecular, lo que resulta en una clase de impurezas que presenta una estrecha asociación con el ingrediente farmacéutico activo. Como resultado, los métodos modernos de producción de VLP incluyen, en algunos casos, una etapa de desensamblaje que disocia a las impurezas de las proteínas virales. A este procedimiento le sigue una etapa de reensamblaje que vuelve a formar las VLP en ausencia de los componentes de las células huésped. Se pueden usar extracciones en fase líquida y procedimientos cromatográficos para proporcionar componentes de alta pureza para uso en vacunas sin riesgo sustancial de transportar componentes residuales significativos de las células huésped.
Vacunas Virales Derivadas de Cultivos Celulares VACUNAS VIRALES DERIVADAS DE LÍNEAS CELULARES CONTINUAS Si se usa una línea celular continua (p.ej., Vero) para la producción de vacunas, resulta necesaria una etapa de filtración validada para separar al virus de las células intactas. También se debe determinar la cantidad y tamaño de cualquier ADN residual de la célula huésped (ver el capítulo de información general Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Enfoques para Detectar Trazas de Ácidos Nucleicos (Análisis de ADN Residual) (1130)). En la actualidad, se permiten 1 O ng de ADN de células huésped por dosis de una vacuna administrada por vía parenteral; además, las agencias reglamentarias continúan considerando caso por caso el nivel de riesgo presentado por el ADN de células huésped para vacunas que se administran por otras vías (p.ej, nasal u oral). Resultan convenientes múltiples métodos de purificación para reducir el tamaño y la cantidad de ADN residual de células huésped presente en la vacuna, los cuales incluyen etapas tales como el tratamiento con ADNasa, diafiltración, ultrafiltración y cromatografía en columna. VACUNAS VIRALES DERIVADAS DE CULTIVOS DE CÉLULAS DIPLOIDES HUMANAS La FDA ha autorizado diversas vacunas que se fabrican usando células diploides humanas. Las dos líneas celulares diploides más comúnmente usadas son MRC-5 y Wl-38, ambas derivadas de células embrionarias humanas y que tienen el número diploide normal de cromosomas humanos. Estas líneas se usan ampliamente para fabricar vacunas debido a que no han mostrado potencial tumorigénico u oncogénico y han demostrado ser susceptibles a una amplia variedad de virus humanos. Sin embargo, a diferencia de las líneas celulares continuas que se pueden someter a pasajes indefinidamente, las líneas de células diploides humanas son capaces de conseguir únicamente un cierto número de duplicaciones de la población, después de lo cual experimentan un rápido declive en su capacidad para proliferar. Este problema se enfrenta congelando múltiples alícuotas de los bancos de células maestros y de trabajo. VACUNAS VIRALES DERIVADAS DE CULTIVOS CELULARES PRIMARIOS Al igual que las células diploides, las células primarias por lo general no son tumorigénicas ni oncogénicas. Sin embargo, cuando se usan células primarias para fabricar vacunas vivas, los animales donantes de los que se obtienen las células primarias se analizan exhaustivamente para determinar la presencia de una variedad de patógenos antes de su uso. Por ejemplo, las bandadas de pollos usadas para preparar células de riñón de embrión de pollo se someten a extensos análisis serológicos para agentes adventicios antes de que se pueda usar a la bandada para preparar las células. Algunas de estas pruebas se describen en el Code of Federal Regulations (Código de Reglamentos Federales o CFR, por sus siglas en inglés; ver las secciones listadas en el Apéndice 2) y en el capítulo de información general de la USP Métodos de Pruebas Virológicas (1237).
Vacunas Virales Derivadas de Huevos de Gallina El huevo de gallina embrionado es un sustrato de crecimiento altamente productivo para ciertos virus tales como aquellos que se usan para fabricar vacunas contra la fiebre amarilla y diversas vacunas contra la influenza. En el caso de las vacunas contra la influenza, el virus de la vacuna se recolecta del fluido alantoico del huevo. En el caso de la vacuna contra la fiebre amarilla, el virus de la vacuna se recolecta a partir de tejidos embrionarios. Por lo tanto, los componentes residuales del huevo o del embrión son de especial interés durante la purificación de las vacunas. La producción de vacunas en huevos, al igual que todas las expansiones de biomasa, requiere de cuidado y control de calidad de los lotes de siembra del virus y sustratos de huevo para evitar la contaminación con otros organismos.
USP 39
Información General/ (1235) Vacunas para Uso Humano-Consideraciones Generales 1903
VACUNAS DE VIRUS VIVOS ATENUADOS Los virus para vacunas vivas (p.ej., fiebre amarilla o influenza viva) se producen usando huevos Libres de Patógenos Específicos (SPF, por sus siglas en inglés). Estos huevos se producen con bandadas de pollos sometidas a análisis regulares de patógenos aviares (p.ej., virus de la leucosis aviar) y mantenidas usando prácticas de cría de animales apropiadas. Para preservar la infectividad y la integridad antigénica de los virus para vacunas, al tiempo que se eliminan los componentes derivados del huevo, se usan métodos suaves relativamente simples (p.ej., centrifugación zonal en gradiente de sacarosa y diafiltración) para la concentración del virus, purificación e intercambio de amortiguadores. VACUNAS DE VIRUS ENTEROS INACTIVADOS Los virus para vacunas inactivadas se pueden producir usando huevos que no sean SPF debido a las etapas de inactivación química requeridas en el proceso de fabricación. Dado que el virus para vacuna necesita mantenerse intacto mientras se eliminan los componentes derivados del huevo y los químicos inactivantes, se usan métodos de purificación y concentración relativamente moderados (p.ej., centrifugación zonal en gradiente de sacarosa). Si se usan agentes químicos en el proceso, estos se deben minimizar en el producto final a un nivel por debajo de los niveles preespecificados. VACUNAS DE VIRUS FRACCIONADOS Y SUBUNIDADES PURIFICADAS Los virus para vacunas de virus fraccionados y subunidades purificadas contra la influenza se producen en huevos embrionados que no son SPF. La inactivación y purificación de virus para vacunas se logran mediante tratamiento químico (p.ej., formaldehído o f3 -propiolactona) y centrifugación zonal en gradiente de sacarosa, respectivamente. Las vacunas de virus fraccionados se preparan mediante la disruption de las partículas del virus de las vacunas usando un detergente (p.ej, desoxicolato de sodio) que conserva la integridad antigénica.
PRODUCTOS INTERMEDIOS Los productos intermedios se definen en este capítulo como las sustancias activas (inmunogénicas) sin formular que se procesan antes de la formulación final y que se pueden almacenar durante periodos prolongados antes de su procesamiento adicional. Estos productos intermedios se pueden almacenar y deben incluirse en un programa formal de estabilidad. Ejemplos de productos intermedios incluyen polisacáridos, proteínas recombinantes purificadas (concentrados) y conjugados a granel.
Producción de Productos Intermedios Los productos intermedios se fabrican a partir de materiales iniciales mediante un proceso o una combinación de distintos procesos (p.ej., fermentación, cultivo, aislamiento o síntesis). Las etapas subsiguientes del procedimiento involucran la preparación, caracterización y purificación, lo que eventualmente resulta en la sustancia activa. Es importante adoptar documentos de sistemas de calidad para la producción, además de registrar toda la información aplicable en un documento controlado (es decir, un registro de partida). Cuando sea aplicable, se deben realizar estudios de estabilidad y pruebas de liberación antes de proceder con las etapas siguientes (ver a continuación).
Pruebas para Productos Intermedios Los atributos de calidad del producto intermedio se analizan comúnmente en conjunto con el procesamiento adicional. Se debe considerar una caracterización más allá de las pruebas de liberación. Los métodos de caracterización pueden usar procedimientos apropiadamente calificados. Algunas pruebas se realizan de manera rutinaria antes de que los productos intermedios se conviertan en el producto final a granel, dependiendo de las vacunas individuales. Si se requiere almacenar los productos intermedios y/o su envío subsiguiente a un lugar diferente para el procesamiento adicional, se debe demostrar la estabilidad de estos materiales. Las pruebas de estabilidad pueden ser una combinación de análisis fisicoquímicos y valoraciones biológicas.
PRODUCTO FINAL A GRANEL El producto final a granel es el producto farmacéutico a granel que contiene el (los) fármaco(s), excipientes y demás ingredientes a las concentraciones deseadas y que está listo para el llenado en envases individuales.
Producción del Producto Final a Granel Se mezclan de manera uniforme cantidades apropiadamente controladas de todos los ingredientes para producir el producto final a granel. El procesamiento puede incluir una o más etapas tales como el intercambio de amortiguadores y la adición de
1904 (1235) Vacunas para Uso Humano-Consideraciones Generales / Información General
USP 39
diluyentes, agentes de volumen, excipientes estabilizantes, adyuvantes y conservantes. El producto final a granel se puede preparar asépticamente o el procesamiento puede incluir una etapa de esterilización.
Pruebas para el Producto Final a Granel Se deben analizar los atributos de calidad del producto final a granel. Deben realizarse pruebas apropiadas relacionados con la identidad, pureza, potencia, esterilidad (ver Pruebas de Esterilidad (71 )) y eficacia antimicrobiana (ver Pruebas de Eficacia Antimicrobiana (51 )). Si aplica, se realizan pruebas que demuestren la seguridad. La lista incluye, por ejemplo, pruebas para determinar la ausencia de agentes adventicios, micoplasmas y otros microorganismos. Se requiere de análisis para impurezas específicas relacionadas con el proceso y con el producto, dependiendo de las vacunas que se estén fabricando. Además, se requiere de pruebas para los agentes de volumen, excipientes estabilizantes, adyuvantes y/o conservantes, en caso de que se usen. Todas las pruebas se deben realizar de acuerdo con los procedimientos operativos estándares correspondientes (SOP, por sus siglas en inglés) y todas las pruebas deben contar con especificaciones (o especificaciones provisionales, cuando sea aplicable).
Prueba de Estabilidad para el Producto Final a Granel Si los productos finales a granel se almacenan y/o envían posteriormente a un lugar diferente para el procesamiento adicional, se debe demostrar la estabilidad de estos materiales. Las pruebas de estabilidad pueden ser una combinación de análisis fisicoquímicos y valoraciones biológicas. La implementación de un programa de estabilidad se requiere para los estudios de estabilidad formales, y los estudios se deben realizar de acuerdo con un protocolo que contenga información detallada sobre los tipos de pruebas, incluyendo especificaciones, intervalos de análisis, así como datos y análisis.
ENVASE FINAL El envase final de una vacuna contiene el (los) ingrediente(s) activo(s) (es decir, antígeno(s)) así como componentes adicionales tales como estabilizantes, adyuvantes o conservantes antimicrobianos. También pueden incluir materiales residuales del proceso de fabricación.
Excipientes y Otros Aditivos Además de los antígenos específicos, las vacunas a menudo incluyen excipientes y otros aditivos que el fabricante agrega intencionalmente a la vacuna para un propósito específico. Estos incluyen adyuvantes, conservantes antimicrobianos y estabilizantes. Las vacunas también contienen residuos de fabricación, los cuales son trazas de varios componentes usados durante la fabricación. De esta forma, las combinaciones de estos componentes constituyen y definen el producto completo de la de vacuna. Los fabricantes deben apegarse a las reglamentaciones que dictan los límites permisibles de tales componentes, según se indica en la autorización del producto. ADYUVANTES Los adyuvantes son agentes que se incorporan en formulaciones de vacunas para mejorar e incrementar las respuestas inmunes generadas por los antígenos de la vacuna. Específicamente, pueden incrementar la cantidad de anticuerpo producido, dirigir la respuesta inmune (Thl o Th2), incrementar la duración de la presencia de anticuerpos (persistencia) o producir una combinación de estos efectos. Los compuestos de aluminio han sido durante mucho tiempo los adyuvantes más usados a nivel mundial. Tradicionalmente, se han usado dos métodos para combinar el adyuvante de aluminio con el antígeno para formar vacunas absorbidas en aluminio. El primero implica agregar la solución del antígeno a un precipitado de aluminio previamente formado. El segundo método implica agregar un antígeno a aluminio en solución y un compuesto que coprecipite la sal de aluminio y el antígeno in situ. Las soluciones de sulfato de aluminio y potasio, también conocidas como alumbre o cloruro de aluminio, se han usado en conjunto con sales fosfatos como agentes de precipitación. Se usa una variedad de formulaciones de adyuvantes de aluminio en las vacunas. Las pruebas para aluminio se basan en pruebas de detección de metales descritas en el capítulo de pruebas generales Aluminio (206). Las reglamentaciones limitan la cantidad de aluminio permitido en una dosis de vacuna. El Code of Federal Regulations (Código de Reglamentos Federales) [Título 21 del CFR 61O.l5(a), lngredients, preservatives, diluents, adjuvants] indica que "la cantidad de aluminio en la dosis individual recomendada de un producto biológico no deberá exceder de: 1. 0,85 miligramos si se determina mediante valoración; 2. l, 14 miligramos si se determina mediante cálculos basándose en la cantidad de compuesto de aluminio agregado; o 3. 1,25 miligramos determinados mediante valoración siempre que los datos demuestren que la cantidad de aluminio usada es segura y necesaria para producir el efecto previsto y que se presenten para su aprobación y sean aprobados por el Di-
USP 39
Información General/ (1235) Vacunas para Uso Humano-Consideraciones Generales 1905
rector del CBER [Center for Biologics Evaluation and Research (Centro de Evaluación e Investigación de Productos Biológicos) de la FDA]." El tercer criterio citado anteriormente alinea las reglamentaciones de EE.UU. con las guías de la Organización Mundial de la Salud para el contenido de aluminio en una dosis individual para humanos de una vacuna. Se debe tomar en cuenta que los adyuvantes no se autorizan como tales y que no constituyen un producto. Más bien, una vacuna que consiste en un antígeno(s) específico(s) y un adyuvante reciben la autorización conjunta como un producto farmacéutico. CONSERVANTES ANTIMICROBIANOS En el caso de los envases multidosis, los conservantes antimicrobianos se agregan para inhibir el crecimiento de microrganismos que pudieran ser introducidos por la punción repetida de los viales multidosis. Salvo algunas excepciones, se requiere que un conservante esté presente en las vacunas comercializadas en envases multidosis [Título 21 del CFR 610.15(a)]. Las excepciones incluyen la vacuna contra la fiebre amarilla; sarampión, paperas y rubeola (MMR, por sus siglas en inglés); y vacunas desecadas cuando el diluyente que las acompaña contiene un conservante. Los conservantes antimicrobianos que se usan actualmente en vacunas son timerosal, 2-fenoxietanol, cloruro de bencetonio y fenol. Estos agentes deben pasar la prueba de eficacia antimicrobiana adecuada, según se indica en Prueba de Eficacia Antimicrobiana (51 ). Las pruebas de desafío antimicrobiano se deben realizar como parte del programa normal y formal de estabilidad, incluyendo el momento de la fecha de caducidad. Se pueden encontrar diversas pruebas para conservantes en Agentes Antimicrobianos-Contenido (341 ). ESTABI LIZANTES El propósito principal de los estabilizantes es proteger a ciertas vacunas de condiciones adversas tales como el calor, o servir como crioconservante durante el proceso de liofilización, por lo general en la etapa de congelación. Los materiales particulares seleccionados para este propósito incluyen azúcares (p.ej., sacarosa o lactosa), aminoácidos (p.ej., glicina o ácido glutámico [sal monosódica]), glicerol y proteínas (p.ej., albúmina sérica humana [HSA] o gelatina). Los materiales se deben adaptar a una formulación de vacuna específica y se deben seleccionar teniendo en mente la seguridad del paciente. Cuando se selecciona una proteína como estabilizador, se presentan dos inquietudes principales relacionadas con la seguridad. Una se centra en la fuente de la proteína: el origen animal o humano presenta la posibilidad de la presencia de un agente adventicio. La segunda inquietud recae en la posibilidad de una reacción alérgica en personas sensibles a dicha proteína. Lo anterior se debe evaluar como parte del programa clínico durante el desarrollo de la vacuna. En la actualidad se usan dos proteínas como estabilizantes para vacunas: HSA y gelatina. La FDA requiere que cualquier albúmina derivada de suero que se use en la fabricación sea una HSA autorizada en EE.UU. Las guías de la FDA recomiendan además que se provea una leyenda que indique la fuente y los riesgos relacionados en la sección de "Advertencias" del etiquetado de los productos que contengan HSA. La gelatina o gelatina procesada también se usa como estabilizante para vacunas. La fuente de la gelatina puede ser bovina o porcina. Aunque las condiciones de fabricación de la gelatina son rigurosas (es decir, el producto se somete a niveles extremos de calor y pH), persisten inquietudes relacionadas con fuentes bovinas con respecto a la presencia del agente de la encefalopatía espongiforme transmisible (TSE, por sus siglas en inglés), pues se sabe que este agente es resistene a tales condiciones. Por lo tanto, si la gelatina agregada a una vacuna o usada en la fabricación es de origen bovino, el material debe contar con la documentación apropiada que certifique que proviene de un país o región que cumple con las guías sobre TSE para la industria. RESIDUOS DE FABRICACIÓN Las vacunas pueden contener cantidades residuales de cualquier material usado en el proceso de fabricación. A estos materiales se les denomina residuos de fabricación. Como principio general, no es posible eliminar por completo una sustancia en particular, ni tampoco es posible demostrar de manera concluyente que una sustancia en particular ha sido completamente eliminada. Por lo tanto, el objetivo es reducir estas sustancias a un nivel indetectable usando una metodología analítica sensible y validada. Algunos productos se analizan para determinar la presencia de sustancias pirógenas como residuos de fabricación (ver Prueba de Pirógenos (151)); y, si el producto es liofilizado, se debe analizar para determinar humedad residual (ver Pérdida por Secado (731 )). Se deben justificar los niveles residuales de materiales de fabricación, incluyendo, si aplican, los agentes inactivantes. Las especificaciones de liberación de estos componentes se requieren como parte de la licencia aprobada. RESIDUOS CELULARES Las vacunas de bacterias vivas atenuadas por lo general no se someten a un alto grado de purificación posterior a la expansión. Sin embargo, las vacunas de componentes de bacterias muertas por lo general se someten a una purificación importante para reducir los residuos celulares. Los componentes celulares comunes que se deben reducir son proteínas, ácidos nucleicos y
1906 (1235) Vacunas para Uso Humano-Consideraciones Generales / Información General
USP 39
polisacáridos Las valoraciones de estos componentes se realizan de manera rutinaria, si resulta apropiado, para asegurar la pureza. Un residuo común en vacunas bacterianas fabricadas a partir de bacterias Gram negativas es el lipopolisacárido (LPS, por sus siglas en inglés), comúnmente conocido como endotoxina. La prueba de endotoxinas se realiza durante el proceso de fabricación para cualquier vacuna de bacterias Gram negativas. En el caso de las vacunas de bacterias Gram positivas, la prueba de endotoxinas se debe realizar a fin de asegurar que no haya presente ningún contaminante del cultivo de bacterias Gram negativas. Asimismo, debe existir una especificación de liberación para este residuo. En la actualidad se usan dos pruebas para detectar LPS en productos biológicos, la prueba de lisado de amebocitos de Limulus (LAL) (ver Prueba de Endotoxinas Bacterianas (85)) y la prueba de pirógenos en conejos (ver Prueba de Pirógenos (151 )). El lisado de Limulus que se usa para la prueba de endotoxinas bacterianas en los productos regulados por la FDA es por sí mismo un producto autorizado en EE.UU. La prueba de pirogenocidad en conejos requiere el uso de animales y es más difícil de realizar; por lo tanto, no se usa tan ampliamente como la prueba de LAL. La fabricación de vacunas virales requiere de sustratos celulares para producir los virus, los cuales luego se someten a procesos de purificación. Por lo general, las vacunas de virus muertos presentan un mayor grado de purificación que las vacunas de virus vivos atenuados. Dependiendo del método usado para fabricar la vacuna, los fabricantes trabajan con la FDA para desarrollar especificaciones prudentes para la vacuna final. Las células huésped derivadas de animales se han usado ampliamente en la fabricación de vacunas, en particular de vacunas virales. Por ejemplo, las vacunas contra la influenza y la fiebre amarilla se producen, respectivamente, en fluido alantoico de huevo y en embriones de pollo. Las vacunas contra el sarampión y paperas y algunas vacunas contra la rabia se producen en células de embrión de pollo. Las etiquetas de estos productos deben indicar la posible presencia de proteínas residuales de pollo en la vacuna final; así mismo, la etiqueta puede indicar la cantidad presente. Además, la etiqueta exhorta al profesional de la salud a tener cuidado al momento de vacunar a una persona que padezca de hipersensibilidad al huevo. Dos vacunas contra la hepatitis B autorizadas en EE.UU. están basadas en proteínas derivadas de ADN recombinante expresadas en cultivos de levaduras. En ambos casos, las etiquetas notifican a los profesionales de la salud que la proteína de levadura puede estar presente en la vacuna y recomiendan tomar precauciones adecuadas. En el caso de las vacunas de virus vivos, es posible considerar la reducción de materiales residuales celulares (p.ej., ADN de las células huésped, proteínas). MATERIALES DE ORIGEN ANIMAL Algunas materias primas y reactivos, tales como gelatina, suero de ternera (ver Suero Bovino (1024)) o tripsina para la fabricación de vacunas conlleva algunas inquietudes relacionadas con la presencia potencial de agentes adventicios. Las materias primas se deben obtener de países aceptables para la FDA. Además, los fabricantes deben analizar estos materiales cuando sea posible para minimizar los riesgos de contaminación con agentes adventicios. Durante el procesamiento, se debe considerar la reducción de los componentes del suero (p.ej. BSA). RESIDUOS DE ANTIBIÓTICOS Algunos antibióticos (exceptuando la penicilina) se pueden usar en cantidades mínimas en el proceso de fabricación para vacunas virales, de acuerdo con el Título 21 del CFR 610.15(c). Los antibióticos que se han usado incluyen gentamicina, estreptomicina, neomicina y polimixina B. No existe un requisito para pruebas de niveles residuales de estos antibióticos en la vacuna final. Sin embargo, de acuerdo con el Título 21 del CFR 610.61 (m), se debe declarar en la etiqueta del producto la cantidad calculada que se espera se mantenga como residuo en la vacuna final basándose en la cantidad agregada y el factor de dilución en el proceso de fabricación. AGENTES QUÍMICOS INACTIVANTES Diversos agentes químicos han sido usados para inactivar bacterias y virus o para la destoxificación de toxinas en procesos de producción de vacunas. El formaldehído y la p -propiolactona son los agentes inactivantes que se usan con mayor frecuencia. Otros agentes inactivantes de menor uso incluyen glutaraldehído y peróxido de hidrógeno. Como residuo de fabricación, el agente inactivantes se debe eliminar del producto final en la mayor medida posible. El límite superior para formaldehído es generalmente 0,02%, equivalente a O, 1 mg por dosis de vacuna de 0,5 ml. El límite para p -propiolactona debe estar por debajo del límite de detección.
EVALUACIÓN DE LA ESTABILIDAD DE LAS VACUNAS La estabilidad de las vacunas depende de la naturaleza del antígeno de la vacuna, de la formualción del producto y del control del almacenamiento de la vacuna antes de su uso. Las vacunas se evalúan mediante programas que incluyen almacenamiento a largo plazo en tiempo real en las condiciones prescritas. El uso de temperaturas extremas para acelerar potencialmente la degradación puede ayudar a los fabricantes a comprender la estabilidad del producto.
USP 39
Información General/ (1235) Vacunas para Uso Humano-Consideraciones Generales 1907
Las vacunas, al igual que todos los productos farmacéuticos, se deben evaluar para definir condiciones adecuadas de almacenamiento (Título 21 del CFR 610.50 y 610.53). Los principios generales de las pruebas de estabilidad para productos biológicos están descritos en Calidad de Productos Biotecnológicos: Pruebas de Estabilidad de Productos Biotecnológicos o Biológicos (1049). Por lo regular, estas inquietudes se enfocan en el producto final de la vacuna, pero también se requiere de evaluaciones para productos intermedios a granel para justificar las condiciones en las que deben mantenerse. En ambos casos, los fabricantes definen de antemano las condiciones a las que se expondrá el producto (p.ej., temperatura, luz y humedad) así como el intervalo de tiempo durante el cual el producto se expondrá a tales condiciones. Los estudios de estabilidad deben evaluar todas las condiciones de almacenamiento a las que probablemente se expondrá el producto o producto intermedio durante la producción, manejo, transporte y almacenamiento de manera que se establezcan los límites de tiempo apropiados de exposición a tales condiciones. Los criterios primarios para definir las condiciones de almacenamiento para estos productos intermedios y finales por lo general se enfocan en un matenimiento aceptable de la potencia; no obstante, según se analizará más adelante, existen a menudo otros atributos que requieren de consideración. La evaluación de la estabilidad de las vacunas comprende tres propósitos generales. Primero, se demuestra que los productos mantienen un perfil analítico aceptable durante la fabricación y uso para conservar su seguridad y eficacia. Segundo, los estudios de estabilidad a través de diversas partidas de producto proveen una forma efectiva de caracterizar las propiedades inherentes del producto. Esto a su vez conlleva al tercer propósito que consiste en demostrar la regularidad en la fabricación del producto.
Protocolos de Estabilidad El plan experimental general para la evaluación del perfil de estabilidad de un set determinado de partidas de un producto o productos intermedio regularmente incluye una definición específica de las condiciones en las que las muestras serán almacenadas y la razón por la que dichas condiciones son relevantes, el periodo durante el cual se almacenarán las muestras en cada condición, el momento en el que las muestras se analizarán durante este periodo y las mediciones analíticas en cada tiempo de análisis. Además, estos protocolos de estabilidad incluyen la puntualización de los procedimientos analíticos que se van a utilizar. Para los estudios de estabilidad que ocurren de manera temprana en el desarrollo del producto, los estudios se pueden llevar a cabo para confirmar la aptitud de la formulación del producto y/o las condiciones de almacenamiento. En una etapa posterior del desarrollo, los estudios de estabilidad se realizan generalmente para proveer de datos que respalden el periodo de vida útil del producto o el tiempo de retención o almacenamiento (hold time) de los productos intermedios, a fin de proporcionar una caracterización más elaborada del producto y para evaluar la regularidad de la fabricación. Estos últimos estudios definen las especificaciones de caducidad del producto (end-expiry specifications) que permiten definir productos aceptables e inaceptables. Un producto inaceptable se define como un producto que ya no es aceptable para su uso en estudios clínicos o para uso comercial (p.ej., debido a la degradación o pérdida de potencia). Los estudios de estabilidad se deben llevar a cabo durante un tiempo suficiente para determinar el punto de pérdida de la potencia aceptable u otros parámetros pertinentes.
Mediciones Analíticas Los fabricantes deben considerar el rigor de los métodos analíticos usados para evaluar la estabilidad de productos complejos y mejorar su comprensión sobre los parámetros que son críticos para la inmunogenicidad (incluyendo parámetros indicadores de estabilidad). La selección de los parámetros indicadores de estabilidad varía con las características únicas de cada vacuna. El parámetro primario que refleja la estabilidad para la mayoría de las vacunas es la valoración de potencia (ver Pruebas de Potencia en Pruebas de Liberación de Lote, a continuación). Esta valoración puede tomar muchas formas, dependiendo de las vacunas individuales (p.ej., un ensayo de infectividad para una vacuna de virus vivo o una medida de la proporción de polisacárido conjugado para una vacuna de conjugado de polisacárido-proteína). La valoración de potencia es por lo general el resultado analítico clave que predice si una vacuna se mantiene apta para su uso y si producirá la respuesta clínica esperada. Otras mediciones analíticas pueden proporcionar datos suplementarios importantes, en particular aquellos que cuenten con un claro vínculo con la potencia del producto. Ejemplos de estas incluyen el perfil de degradación, la disociación de una proteína portadora de vacunas conjugadas y la disociación de un adyuvante de un complejo de antígeno. Asimismo, se realizan otros ensayos comunes generalmente como parte del estudio de estabilidad, los cuales pueden determinar cambios físicos o químicos en el producto que podrían o no afectar su potencia (p.ej., seguridad general, grado de aglomeración, pH, humedad, envase, conservante y envoltura).
Evaluación Formal de los Datos de Estabilidad y Fecha de Caducidad del Producto Las vacunas deben permanecer dentro de las especificaciones de potencia a la fecha de caducidad, siempre que el producto se haya almacenado en las condiciones normales especificadas. Los fabricantes deben realizar estudios de estabilidad para determinar aquellas condiciones de almacenamiento y periodo de vida útil que demuestren que el producto se mantiene dentro de las especificaciones de potencia. Los fabricantes deben realizar estudios de estabilidad de manera continua. Si un proceso
1908 (1235) Vacunas para Uso Humano-Consideraciones Generales / Información General
USP 39
de fabricación principal cambia, se deben realizar studios de estabilidad adicionales para verificar que no existe un impacto adverso en el perfil de estabilidad. Ante ciertas condiciones tales como cambios en el proceso, se pueden realizar estudios de estabilidad acelerados. Un estudio acelerado que implica tanto temperaturas mayores como menores que las temperaturas de rutina puede evaluar el impacto de las variaciones de temperatura sobre los productos. Se debe realizar una evaluación similar para productos intermedios a fin de establecer el tiempo que se puede mantener un producto intermedio determinado en condiciones definidas antes de su procesamiento adicional o descarte.
NOMENCLATURA No existen sistemas uniformes para denominar nuevas vacunas. El Título 21 del CFR 299 describe la cooperación entre la FDA y el U.S. Adopted Names Council (USAN) para denominar fármacos, incluidas las vacunas. El USAN es una organización privada auspiciada por la American Medica! Association, la USP y la American Pharmacists Association. La Sección 262 en el Título 42 de la Public Health Service Act (Ley de Servicios de Salud Pública) requiere que cada empaque de un producto biológico lleve claramente impreso el nombre propio (nombre designado en la autorización, Título 21 del CFR 600.3) del producto biológico contenido en el empaque.
ETIQUETADO El etiquetado de las vacunas está regulado de conformidad con el Título 21 del CFR 201 y 61 O. Se establecen requisitos para el etiquetado del envase y el etiquetado del empaque.
Etiqueta del Envase Las siguientes etiquetas están sujetas a las disposiciones provistas: • Etiqueta completa; • Etiqueta parcial; y • Ausencia de etiqueta en el envase cuando los envases no pueden portar una etiqueta que incluya toda la información requerida, debiéndose colocar en un empaque que incluya toda la información requerida. La etiqueta se debe colocar en el envase de una manera que permita la inspección visual del contenido en todo el largo o circunsferencia del envase. Si no se usa ningún empaque, el envase lleva toda la información requerida para la etiqueta del empaque. La etiqueta completa del envase normalmente contiene lo siguiente: • Nombre propio del producto; • Nombre, dirección y número de autorización del fabricante; • Número de lote u otra identificación del lote; • Fecha de caducidad; • Dosis individual recomendada, para envases multidosis; • La frase Solamente Rx para productos biológicos de venta bajo receta; y • Cualquier declaración precautoria aplicable.
Etiqueta del Empaque Además de la información requerida en la etiqueta del envase, la etiqueta del empaque debe describir lo siguiente: • Cualquier conservante usado y su concentración o las palabras sin conservador si no se usa conservante y su ausencia es un factor de seguridad; • Número de envases, si es más de uno; o • Cantidad de producto en el envase, expresada como número de dosis, volumen, unidades de potencia, peso, y volumen equivalente (para producto seco que se debe reconstituir); o • Una combinación de lo anterior para proveer una descripción exacta del contenido, según sea aplicable; •Temperatura de almacenamiento recomendada; • Las frases agitar bien, no congelar, o el equivalente, así como otras instrucciones cuando lo indique el carácter del producto; • Dosis individual recomendada, para envases multidosis; •Vía de administración recomendada o referencia a dichas instrucciones en un documento adjunto; • Presencia de sustancias sensibilizantes conocidas; •Tipos de antibióticos agregados durante la fabricación y la cantidad calculada que se mantiene en el producto final; • Ingredientes inactivos, cuando constituyen un factor de seguridad o se referencian en un documento adjunto; • Adyuvante, si estuviera presente; • Origen del producto, cuando pudiera ser un factor para la administración segura;
USP 39
Información General/ (1235) Vacunas para Uso Humano-Consideraciones Generales 1909
• Identidad de cada microorganismo usado en la fabricación y, si aplica, el medio de producción y el método de inactivación o la referencia a un documento adjunto; •Potencia mínima en términos del estándar oficial de potencia, o las palabras no existe estándar de potencia de EE.UU.
Información Sobre Prescripción La información detallada acerca de una vacuna se presenta en su información sobre prescripción, comúnmente denominada inserto o prospecto del empaque. La distribución de vacunas con insertos o prospectos para el paciente escritos en lenguaje llano es cada vez más frecuente. La información sobre prescripción (Título 21 del CFR 201 .56 y 201.57) incluye lo siguiente • Puntos relevantes de la información sobre prescripción • Nombres del producto y demás información requerida • Advertencia en recuadro (boxed warning) • Cambios recientes importantes a. Indicaciones y uso b. Dosificación y administración c. Formas farmacéuticas y concentraciones d. Contraindicaciones e. Advertencias y precauciones f. Reacciones adversas g. Interacciones medicamentosas h. Uso en poblaciones específicas (p.ej., embarazo, madres lactantes, uso pediátrico, uso geriátrico) i. Abuso y dependencia del medicamento j. Sobredosificación k. Descripción l. Farmacología clínica m. Toxicología no clínica n. Estudios clínicos o. Referencias p. Forma en que se suministra el producto/almacenamiento y manejo q. Información de asesoramiento para el paciente
PRUEBAS DE LIBERACIÓN DE LOTE Principios Generales Los fabricantes realizan todas las pruebas adecuadas para las especificaciones autorizadas del producto, de conformidad con el Título 21 del CFR 610.1 y 610.2. Muestras de cada lote y protocolos autorizados que contengan los resultados de las pruebas del fabricante se envían a la FDA. Después de que la FDA evalúa el protocol para asegurar que se cumplen las especificaciones del producto, y después de realizar pruebas de confirmación satisfactorias, la FDA aprueba la liberación del lote si todas las pruebas cumplen con los estándares de seguridad, pureza y potencia establecidos para la vacuna en particular. Después de otorgada la aprobación, el fabricante distribuye y comercializa el producto. Existen guías relacionadas con alternativas para la liberación de lote y un sistema de vigilancia. Todas estas variaciones están sujetas a las reglamentaciones del Título 21 del CFR 610.2 que permiten a la FDA requerir que le sean enviadas muestras de cualquier lote de un producto autorizado (p.ej., vacuna), junto con los protocolos que presentan los resultados de las pruebas aplicables.
Pruebas Comunes Las pruebas comunes para todos los lotes de todos los productos incluyen pruebas de potencia, seguridad general, esterilidad, pureza, identidad y materiales constituyentes. El fabricante completa estas pruebas para determinar el cumplimiento con las normas aplicables a cada producto. Los resultados de todas estas pruebas son tomados en cuenta, excepto cuando una prueba ha sido invalidada como resultado de causas no relacionadas con el producto (Título 21 del CFR 61O.1 ). PRUEBAS DE POTENCIA (ESPECÍFICAS DE LA VACUNA) El Título 21 del CFR 600.3 y 61O.1 O proporciona la definición y requisitos básicos para potencia de vacunas y valoraciones de potencia. Una valoración de potencia de una vacuna debe indicar la actividad terapéutica del producto farmacéutico según lo indicado por pruebas de laboratorio apropiadas o por datos clínicos adecuadamente desarrollados y controlados. La potencia se puede expresar en términos de unidades en referencia a un estándar. Las pruebas de potencia del producto varían según los tipos de vacunas (p.ej., virales, bacterianas, vivas atenuadas, inactivadas, o de polisacáridos). En consecuencia, las valorado-
191 O (1235) Vacunas para Uso Humano-Consideraciones Generales / Información General
USP 39
nes de potencia para vacunas abarcan una variedad de métodos para la expresión de potencia. Las pruebas de potencia in vitro para virus vivos pueden incluir ensayos de formación de placas, ensayos de punto final de dilución (p.ej., la dosis infectiva del cultivo tisular [TCID 50 ], ensayos de neutralización de virus o ensayos cuantitativos de reacción en cadena de la polimerasa [PCR]). Los ensayos cuantitativos de formación de colonias se usan para vacunas de bacterias vivas atenuadas. Las pruebas de desafío en animales para ensayos de inmunogenicidad para potencia, tales como aquellas para la difteria y el tétanos (U.S. Department of Health, Education, and Welfare, 1953; ver el Apéndice 2) o rabia y antrax, presentan respuestas in vivo. Los ensayos de antigenicidad emplean enzimoinmunoensayos (ELISA), p.ej, con hepatitis A o nefelometría cinética e inmunoelectroforesis en cohete (p.ej., con polisacáridos de neumococo). Las pruebas de potencia para vacunas bacterianas, tales como los polisacáridos de meningococo, polisacáridos de neumococo, o vacunas de conjugado de proteína de Haemophilus b emplean ensayos químicos y fisicoquímicos. En el caso de vacunas de polisacáridos puros, se ha demostrado que la concentración o cantidad del componente de la vacuna (polisacárido) y su calidad (p.ej., tamaño) son indicativas de la respuesta inmune humana. La precisión y reproducibilidad de la valoración varía con las diferentes metodologías que se usan en las valoraciones de potencia, abarcando desde la alta exactitud y precisión de las pruebas químicas en un extremo del espectro hasta los ensayos biológicos en el otro extremo. El capítulo de pruebas generales Diseño y Análisis de Valoraciones Biológicas (111) proporciona pautas para valoraciones biológicas y aplica a las valoraciones de potencia de vacunas. Las demás pruebas se deben validar según se describe en el capítulo de información general Validación de Procedimientos Farmacopéicos (1225). PRUEBAS DE LIBERACIÓN La liberación oficial de vacunas por parte de la autoridad reglamentaria puede estar basada en el producto a granel o en el envase final. Se recomienda ampliamente realizar las pruebas de potencia en el envase final. Sin embargo, bajo ciertas circunstancias esto puede no resultar práctico o incluso posible; en consecuencia, se requeriría de una metodología para cada caso individual. La eleción de analizar el granel o el envase final se deriva de una serie de consideraciones tales como la cantidad de vacuna disponible para las pruebas en las diversas etapas de la fabricación. Para ciertas vacunas, tanto el producto a granel como en el envase final reciben la liberación oficial. La prueba de potencia se requiere generalmente para el envase final. En caso de que no sea factible realizar la prueba de potencia en el producto farmacéutico final, la prueba se realiza en el material a granel. SEGURIDAD GENERAL Para productos biológicos destinados a administracón en humanos, los fabricantes realizan una prueba de seguridad general a fin de detectar cualquier contaminante tóxico extraño. Los procedimientos y excepciones se especifican en el Título 21 del CFR 610.11. ESTERILIDAD Se realiza una prueba de esterilidad de cada lote de producto de acuerdo con los procedimientos descritos en Pruebas de Esterilidad (71) y el Título 21 del CFR 610.12 tanto para el material a granel como en el envase final. ENDOTOXINAS BACTERIANAS Cada lote de envases finales de una vacuna destinada para inyección se analiza para determinar la presencia de endotoxinas bacterianas, según se indica en Prueba de Endotoxinas Bacterianas (85). PUREZA Las vacunas necesitan estar libres de materia extraña. Las solicitudes de autorización de vacunas aprobadas indican los materiales extraños que son inevitables en el proceso de fabricación de un producto específico. La solicitud puede indicar resultados de pruebas y límites permisibles para dichos materiales, de conformidad con los procedimientos descritos en el Título 21 del CFR 610.13. HUMEDAD RESIDUAL Cada lote de un producto seco se analiza para determinar la humedad residual [ver el Título 21 del CFR 610.13 (a), Pérdida por Secado (731) y Guideline for the Determination of Residual Moisture in Dried Biological Products de la FDA (ver Apéndice 2)].
USP 39
Información General/ (1235) Vacunas para Uso Humano-Consideraciones Generales 1911
PIRÓGENOS Cada lote de envases finales de una vacuna destinada para inyección se analiza para determinar la presencia de sustancias pirógenas, según se indica en Prueba de Pirógenos (151) y en el Título 21 del CFR 610.13 (b). IDENTIDAD El contenido de un envase final de cada llenado de cada lote se analiza para determinar la identidad después de completar el etiquetado. La identidad se establece mediante las características físicas o químicas de la vacuna, inspección por métodos macroscópicos o microscópicos, pruebas de cultivos específicas, o pruebas inmunológicas in vivo o in vitro. Estas pruebas de identidad se llevan a cabo en gran medida para distinguir la vacuna en cuestión de otros materiales fabricados en el mismo lugar (Título 21 del CFR 610.14). MATERIALES CONSTITUYENTES Los ingredientes, conservantes, diluyentes, adyuvantes, proteína extraña, vacunas producidas mediante cultivos celulares y antibióticos se analizan de conformidad con el Título 21 del CFR 610.15.
Combinaciones Permitidas Las formulaciones que combinan diversas vacunas deben autorizarse como combinaciones (Título 21 del CFR 610.17). La potencia de cada vacuna en las combinaciones se debe analizar de manera individual y debe cumplir con las especificaciones en el contexto del producto final combinado; otras pruebas de calidad apropiadas también son aplicables. Para vacunas que se combinan físicamente en sitios clínicos justo antes de su administración a un paciente, la información sobre prescripción debe describir los procedimientos específicos a seguir en estos sitios.
Calidad En general, los sistemas de control de calidad para la fabricación de vacunas son idénticos a los que se emplean de manera rutinaria en la producción de otros productos farmacéuticos. Estos incluyen el análisis y la liberación de materias primas, fabricación, documentación de control de procesos, y procesamiento aséptico. Los fabricantes asignan formalmente responsabilidades al personal designado para mantener la continuidad de la seguridad, pureza y potencia del producto y para asegurar el cumplimiento con todas las normas del producto y del establecimiento que sean aplicables, junto con el cumplimiento de las GMP vigentes. Los analistas usan estándares de referencia y métodos validados para determinar ingredientes activos, productos residuales e impurezas. Los fabricantes determinan la seguridad del producto en una variedad de formas que pueden incluir el uso de animales de experimentación, procedimientos para demostrar la esterilidad del producto y pruebas para asegurar la potencia del producto. La complejidad de los sistemas de control de calidad para vacunas radica en la variedad de métodos usados para producir y controlar la producción. Las pruebas de liberación de lote se realizan de conformidad con el Título 21 del CFR 610.2 e implican la evaluación de los lotes para determinar su seguridad, pureza y potencia antes de la liberación. Los fabricantes siguen las normas de la FDA y las normas internacionales aplicables para el análisis y la validación. Las consideraciones básicas para la validación se incluyen en Validación de Procedimientos Farmacopéicos (1225), además de los documentos guía emitidos por la FDA y la lnternational Conference on Harmonization (ICH) (ver el Apéndice 2).
Pruebas Alternativas La modificación de los métodos de prueba o procesos de fabricación conforme a lo autorizado es permisible si se puede asegurar a la autoridad reglamentaria que las modificaciones no provocan una reducción en la seguridad, pureza, potencia y efectividad del producto biológico. Es posible que el fabricante necesite presentar los cambios propuestos antes de implementarlos (Título 21 del CFR 601.12 y Título 21 del CFR 610.9).
GLOSARIO Agente adventicio: Microorganismo (p.ej., bacteria, hongo, micoplasma, espiroplasma, micobacteria, rickettsia, virus, protozoo, parásito, agente de TSE) que se introduce inadvertidamente en la producción de un producto biológico. Banco de células: Viales de células de composición uniforme (no necesariamente clonales) derivadas de un solo tejido o célula, distribuidas en alícuotas en recipientes de almacenamiento adecuados y almacenados en condiciones apropiadas. Banco de células maestro: Banco de un sustrato celular a partir del cual se derivarán todos los bancos celulares subsiguientes usados para la producción de vacunas. El banco de células maestro representa una recolección caracterizada de células derivadas de un solo tejido o célula.
1912 (1235) Vacunas para Uso Humano-Consideraciones Generales / Información General
USP 39
Banco de células de trabajo: Banco celular derivado mediante propagación de células del banco de células maestro en condiciones definidas y usado para iniciar la producción de cultivos celulares lote por lote. Calificación: Determinación de la aptitud de un material para la fabricación basándose en su caracterización. Caracterización: Determinación de las propiedades de una sustancia. Células control: Células que se separan del cultivo de producción y se mantienen en paralelo en las mismas condiciones y usando los mismos reactivos (p.ej., medio de cultivo) para realizar las pruebas de control de calidad en células que no se han expuesto al virus de la vacuna (lo cual puede interferir con algunas pruebas). Células del final de la producción: Células cosechadas al final de un ciclo de producción o células cultivadas del banco de células maestro o del banco de células de trabajo a un nivel de pasaje o nivel de duplicación de la población comparable o superior al nivel más alto alcanzado en la producción. Células primarias: Células que se colocan en cultivo inmediatamente después de que un embrión, tejido u órgano es extraído de un animal o humano y es homogeneizado, cortado o separado de otra manera para formar una suspensión de células. Las células primarias se pueden mantener en medio, pero no se someten a pasajes. Componente: Cualquier ingrediente destinado al uso en la fabricación de un producto farmacéutico, incluyendo aquellos que pueden no aparecer en dicho producto farmacéutico. Control: Se refiere a la responsabilidad de mantener la seguridad, pureza y potencia contínuas del producto y de cumplir con las normas aplicables al producto y al establecimiento, así como con las buenas prácticas de fabricación vigentes. Criterios de aceptación: Especificaciones de un producto y criterios de aceptación o rechazo, con un plan de muestreo asociado, necesarios para tomar la decisión de aceptar o rechazar un lote o partida (o cualquier otro subgrupo conveniente de unidades fabricadas). Depuración viral: Combinación de la eliminación física de partículas virales y la reducción de infectividad viral a través de la inactivación. Diploide: Que tiene el número esperado de cromosomas para una especie, (es decir, dos de cada cromosoma autosómico y dos cromosomas sexuales). Empaque: Caja, receptáculo o envoltorio inmediato, incluyendo todo el material de etiquetado que se encuentra sobre y dentro de los mismos, y el contenido de uno o más envases adjuntos. Si no se usa un empaque, se deberá considerar al envase como el empaque. Envase (también envase final): Unidad, frasco, vial, ampolla, tubo u otro receptáculo inmediato que contiene el producto para su distribución en la venta, trueque o intercambio. Especificación: Norma de calidad (p.ej., pruebas, procedimientos analíticos, criterios de aceptación) provista en una solicitud de registro aprobada para confirmar la calidad de los productos, productos intermedios, materias primas, reactivos, componentes, materiales en proceso, sistemas de envase-cierre y demás materiales usados en la producción de un producto. Esterilidad: Exención de microorganismos contaminantes viables, según lo determinan las pruebas prescritas por la FDA. Etiqueta: Cualquier material escrito, impreso o gráfico en el envase o empaque, o cualquiera de esos materiales claramente visibles a través de la caja, receptáculo o envoltorio inmediato. Exento (libre) de: Para que una sustancia se considere exenta de un contaminante, se debe demostrar mediante una valoración que una cantidad definida de la sustancia es negativa para ese contaminante a un nivel definido de sensibilidad. El nivel de sensibilidad de la valoración se define por la elección de la valoración y se puede determinar experimentalmente usando reactivos estandarizados. Alternativamente, para demostrar que la sustancia está exenta de un contaminante, se puede usar un proceso validado que haya demostrado eliminar dicho contaminante hasta un nivel definido. Fabricación: Todas las etapas en la propagación o fabricación y preparación de productos. Incluye, de manera enunciativa más no limitativa, el llenado, análisis, etiquetado, envasado, control de calidad y almacenamiento por parte del fabricante. Fabricante: Cualquier persona o entidad legal que se dedique a la fabricación de un producto sujeto a una autorización en cumplimiento con la Public Health Service (PHS) Act (Ley de Servicios de Salud Pública). El término fabricante también incluye a cualquier persona o entidad legal que presente una solicitud de autorización en la que el solicitante asume la responsabilidad de cumplir con las normas aplicables al producto y establecimiento. Fecha de caducidad: Mes y año calendario, y cuando sea aplicable, el día y la hora, en que finaliza el período de vida útil. Ingrediente activo: Cualquier componente destinado a proporcionar una actividad farmacológica u otro efecto directo en el diagnóstico, cura, mitigación, tratamiento o prevención de enfermedades, o a afectar la estructura de cualquier función del cuerpo humano o de otros animales. El término incluye aquellos componentes que pudieran experimentar un cambio químico en la fabricación del producto farmacéutico y que pueden estar presentes en el producto farmacéutico en una forma modificada destinada a proporcionar la actividad o efecto específico. Ingrediente inactivo: Cualquier componente distinto a un ingrediente activo. Línea celular: Células que se han propagado en cultivo desde el establecimiento de un cultivo primario y que han sobrevivido a crisis y senescencia. Las células supervivientes no mueren ni envejecen. Se han establecido cepas de células diploides a partir de cultivos primarios y se han expandido en bancos de células, pero no se han pasado a través de crisis celular y no son inmortales. Lote: Partida, o porción específica identificada de una partida, con carácter y calidad uniformes dentro de los límites especificados; o, en el caso de un producto farmacéutico producido mediante un proceso continuo, cantidad específica identificada producida en una unidad de tiempo o cantidad, en una manera que asegure su carácter y calidad uniformes dentro de los límites especificados.
USP 39
Información General/ (1235) Vacunas para Uso Humano-Consideraciones Generales 191 3
Lote de llenado: Grupo de envases finales idénticos en todos los aspectos, los cuales se han llenado con el mismo producto del mismo lote a granel sin ningún cambio que afecte la integridad de la unidad de llenado. Material en proceso: Cualquier material fabricado, preparado magistralmente, mezclado o derivado por reacción química que se produce y usa para la preparación del producto farmacéutico. Nivel de duplicación de la población: Número de veces que un cultivo se ha duplicado en número de células desde su establecimiento a partir de un cultivo celular primario. Nivel de pasaje: Número de veces que un cultivo ha sido dividido o resembrado desde su establecimiento a partir de un cultivo celular primario. Nivel de pasaje al final de la producción: Nivel máximo de pasajes logrado durante la fabricación al momento de la recolección final de la vacuna. Las células se pueden evaluar en este nivel o en un nivel mayor. Nombre propio: Periodo después del cual ya no puede esperarse, sin duda razonable, que el producto rinda sus resultados específicos. Normas: Especificaciones y procedimientos aplicables a un etablecimiento o a la fabricación o liberación de productos, los cuales se prescriben en este subcapítulo o se establecen en la solicitud de autorización para productos biológicos, y que están diseñados para garantizar la seguridad, pureza y potencia contínuas de tales productos. Número de lote, número de control o número de partida: Cualquier combinación distintiva de letras, números o símbolos o cualquier combinación de los mismos, a partir de la que se puede determinar la historia completa de la fabricación, procesamiento, envasado, retención y distribución de una partida o lote de un producto farmacéutico u otro material. Oncogenicidad: Propiedad de ciertos agentes (p.ej., virus) o materiales (p.ej., ácidos nucleicos) biológicos que son capaces de inmortalizar células y dotarlas con la capacidad de formar tumores. La oncogenicidad es diferente de la tumorigenicidad. Partida: Cantidad específica de un medicamento u otro material destinado a mantener un carácter y calidad uniformes, dentro de los límites especificados, y que se produce de acuerdo con una sola orden de fabricación durante el mismo ciclo de fabricación. Periodo de vida útil: Periodo después del cual ya no puede esperarse, sin duda razonable, que el producto rinda sus resultados específicos. Potencia: Actividad terapéutica del producto farmacéutico conforme a lo indicado por pruebas de laboratorio apropiadas o mediante datos clínicos desarrollados y controlados adecuadamente. La potencia se puede expresar en términos de unidades en referencia a un estándar. Proceso: Etapa de fabricación que se lleva a cabo sobre el producto mismo y que puede afectar su seguridad, pureza o potencia, a diferencia de las etapas de fabricación en las que no se afecta intrínsecamente la seguridad, pureza o potencia del producto. Producto biológico: Cualquier virus, suero terapéutico, toxina, antitoxina o producto análogo que se puede aplicar a la prevención, tratamiento o cura de enfermedades o lesiones en el ser humano. Producto farmacéutico: Forma farmacéutica terminada (p.ej., solución, suspensión) que contiene un ingrediente farmacéutico activo generalmente en asociación con otros ingredientes inactivos. Producto final a granel: Etapa de producción de la vacuna directamente anterior al llenado de viales individuales. Producto inaceptable: Producto que ya no es aceptable para su uso en estudios clínicos o para uso comercial (p.ej., debido a la degradación o pérdida de potencia). Productos intermedios: Ingredientes activos sin formular que se procesan antes de la formulación final y que se pueden almacenar durante largos periodos antes del procesamiento adicional. Pureza: Exención relativa de materia extraña en el producto terminado, sea o no perjudicial para el receptor o nociva para el producto. La pureza incluye, de manera enunciativa más no limitativa, la exención relativa de humedad residual u otras sustancias volátiles y sustancias pirógenas. Recolección (cosecha): Recoleción de material al final de la propagación del virus de una vacuna en un cultivo celular, a partir del cual se preparará la vacuna. Este material puede ser el sobrenadante del cultivo, las células mismas (a menudo rotas) o alguna combinación de los mismos. Seguridad: Exención relativa de un efecto perjudicial en las personas afectadas, directa o indirectamente, por un producto cuando éste se administra de manera prudente, tomando en cuenta el carácter del producto en relación con la condición del receptor en el momento de la administración. Siembra de virus de trabajo (semilla viral de trabajo): Siembra (semilla) de virus derivada mediante propagación del virus de la siembra de virus maestra en condiciones definidas y usada para iniciar la producción de cultivos celulares lote por lote. Siembra de virus maestra (semilla viral maestra): Siembra (semilla) viral de un virus de vacuna seleccionado a partir de la cual se derivará toda la producción futura de la vacuna, ya sea directamente o mediante siembras de virus de trabajo. Siembra de virus o siembra (semilla) viral: Preparación de virus vivos de composición uniforme (no necesariamente clonal) derivada de un solo proceso de cultivo, distribuida en alícuotas en recipientes de almacenamiento adecuados, y almacenada en condiciones apropiadas. Tumorigenicidad: Proceso mediante el que las células inmortalizadas forman tumores cuando se inoculan en animales. La tumorigenicidad es diferente de la oncogenicidad. Tumorigénico: Propiedad de ciertos tipos de células para formar tumores cuando se inoculan en animales (por lo general un anfitrión singénico, alogénico inmunosuprimido o xenogénico inmunosuprimido). Estos tumores se pueden encontrar en el sitio de inyección o en un sitio distinto y pueden también provocar metástasis en otros sitios.
1914 (1235) Vacunas para Uso Humano-Consideraciones Generales / Información General
USP 39
Validación: Características de desempeño de un procedimiento analítico, basadas en la demostración de que el procedimiento es adecuado para su uso o propósito previsto. La validación de un proceso es la determinación del grado en que un proceso cumple con los requisitos de las diferentes características de desempeño y la demostración de que el proceso tiene un desempeño uniforme para las características definidas. La validación por lo general se lleva a cabo de conformidad con el capítulo Validación de Procedimientos Farmacopeicos (1225) y las guías pertinentes de la ICH. Virus endógeno: Virus cuyo genoma está presente en una forma integrada en un sustrato celular por herencia. Las secuencias virales endógenas pueden o no codificar para un virus intacto o infeccioso. Virus latente: Se considera microbiológicamente latente a un virus que está presente en una célula sin evidencia de una replicación activa, pero con el potencial de reactivarse.
APÉNDICES Apéndice 1: Tipos de Vacunas Actualmente Autorizadas en los EE.UU. (ejemplos) • Bacterianas, bacterias vivas atenuadas (p.ej., Salmonel/a typh1) •Bacterianas, polisacárido (p.ej., de meningococo, de neumococo) • Bacterianas, conjugado de polisacárido-proteína (p.ej., de meningococo, de neumococo) • Bacterianas, toxoide (p.ej., difteria, tétano) • Bacterianas, extractos (p.ej., pertussis, ántrax) • Virales, virus vivos atenuados (p.ej., influenza, sarampión, paperas, rubeola) • Virales, virus enteros inactivados (p.ej., rabia) •Virales, subunidades (p.ej., influenza, hepatitis B, virus del papiloma humano)
Apéndice 2: Documentos Reglamentarios Seleccionados • • • • • •
•
•
•
• •
•
21 CFR 201. 21 CFR 299. 21 CFR 600. 21 CFR 61 O. Sección 262 del Título 42 de la Public Health Service Act Center for Biologics Evaluation and Research (Centro de Evaluación e Investigación de Productos Biológicos o CBER), U.S. Food and Drug Administration (Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos o FDA). Guidance for lndustry-Revised Preventive Measures to Reduce the Possible Risk of Transmission of Creutzfeldt-/akob Disease (C/D) and Variant Creutzfeldt-/akob Disease (vCJD) by Blood and Blood Products (Guías para la Industria-Medidas Preventivas Revisadas para Prevenir el Posible Riesgo de Transmisión de la Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (ECJ) y la Variante de la Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (vECJ) por Sangre y Productos Sanguíneos) (enero de 2002). http://www.fda.gov/cber/gdlns/ cjdvcjd.pdf Center for Biologics Evaluation and Research (CBER), U.S. Food and Drug Administration (FDA). Guideline for the Determination of Residual Moisture in Dried Biological Products (Guía para la Determinación de Humedad Residual en Productos Biológicos Secos) (enero de 1990). http://www.fda.gov/cber/gdlns/moisture.pdf Center for Biologics Evaluation and Research (CBER), U.S. Food and Drug Administration (FDA). Guidance on Alternatives to Lot Release for Licensed Biological Products (Guía sobre Alternativas para la Liberación de Lote de Productos Biológicos). Federal Register (Registro Federal) 1993;58(137): 38771-38773. http://www.fda.gov/cber/gdlns/altrntvlot071493.pdf Center for Biologics Evaluation and Research (CBER), U.S. Food and Drug Administration (FDA). Guidance For lndustryCharacterization and Qualification of Ce// Substrates and Other Biological Starting Materials Used in the Production of Viral Vaccines for the Prevention and Treatment of lnfectious Diseases (Guías para la Industria-Caracterización y Calificación de Sustratos Celulares y Otros Materiales Biológicos Iniciales Usados en la Producción de Vacunas Virales para la Prevención y Tratamiento de Enfermedades Infecciosas) (septiembre de 2006). http://www.fda.gov/cber/gdlns/vaccsubstrates.pdf La FDA emite o actualiza periódicamente las Guidance for lndustry (Guías para la Industria) y publica estos documentos en http://www.fda.gov/cber/guidelines.htm Department of Health, Education, and Welfare (ahora denominado como National lnstitutes of Health). Mínimum Requirements for lmmune Serum Globulin (Human) (Requisitos Mínimos para lnmunoglobulina Sérica Humana) 3ra rev. Bethesda, MD: Department of Health, Education, and Welfare, 1953. lnternational Conference on Harmonization (ICH). Q2(Rl ). Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology (Validación de Procedimientos Analíticos: Texto y Metodología) Ginebra, Suiza: ICH, 2005. http://www.ich.org/LOB/media/ MEDIA417.pdf
USP 39
Información General/ (1237) Métodos de Pruebas Virológicas 1915
(1237) MÉTODOS DE PRUEBAS VIROLÓGICAS INTRODUCCIÓN Este capítulo describe los métodos de pruebas virológicas aplicables al desarrollo de medicamentos biológicos, tales como proteínas recombinantes, vacunas de subunidades, anticuerpos monoclonales terapéuticos y hormonas de crecimiento. Los siguientes temas están fuera del alcance de este capítulo: • Los productos derivados de sangre y plasma, y la sangre entera y plasma usados directamente en transplantes o infusión. Sin embargo, los principios básicos, estrategias y métodos de análisis para garantizar productos libres de virus también se aplican a estos productos. • Metodologías para análisis de seguridad de vacunas de virus vivos. • Métodos específicos para estudios de depuración viral, los cuales se describen en el capítulo de información general de la USP, Evaluación de la Seguridad Viral en Productos Biotecnológicos Obtenidos de Líneas Celulares de Origen Humano o Animal (1050).
Los métodos de pruebas virológicas se han empleado históricamente en situaciones clínicas de diagnóstico, intervención y contención de enfermedades, pero el desarrollo de productos biológicos (productos biológicos y obtenidos por biotecnología), y terapias para uso humano o animal ha creado la necesidad de detección viral sensible para el uso en la producción y análisis de productos biológicos que sigan las Buenas Prácticas de Fabricación (GMP, por sus siglas en inglés). Esta necesidad no se limita a la producción de vacunas virales, sino que se aplica también al desarrollo y fabricación de proteínas recombinantes, terapias celulares y génicas y otros productos. Los métodos sensibles de pruebas virológicas para el control de calidad de productos biológicos son necesarios por varias razones. La producción de productos biológicos requiere a menudo una variedad de materias primas y reactivos de procesamiento de origen animal que potencialmente pueden introducir, en diferentes grados, contaminantes virales. La producción de productos biológicos puede permitir la replicación de agentes adventicios durante el procesamiento y, por lo tanto, estos materiales deben ser pretamizados para evitar la oportunidad de contaminación del producto. Otro punto para tener en cuenta con respecto a los ensayos de detección viral (viral screening assay) de estos materiales es que el producto puede no ser compatible con los métodos de procesamiento usados para eliminar o inactivar los agentes adventicios. Debido a la naturaleza de los productos biológicos, el proceso de producción tiene que incluir regímenes adecuados de análisis que monitoreen la posible introducción de agentes adventicios y/o virales dentro de los sistemas usados. Por estas razones, se requieren métodos sensibles de detección viral, no solo para los análisis de liberación de los productos farmacéuticos biológicos, sino durante las etapas intermedias del procesamiento, desarrollo del proceso y fabricación de rutina. Las fases importantes para tener en cuenta incluyen el desarrollo de sustratos y bancos celulares, materias primas de origen animal, intermediarios del proceso y excipientes críticos cuando provienen de tejidos animales. Esta estrategia debe reforzarse con estudios de depuración e inactivación viral siempre que sea posible. En el caso de productos destinados a contener virus vivos (p.ej., virus oncolíticos infecciosos y productos de vectores virales vivos usados en terapia génica), los métodos de infectividad en animales y células, discutidos en este capítulo, pueden ser útiles solo después de la neutralización de la entidad viral específica contenida en el producto. Como alternativa, se puede considerar la selección de líneas celulares indicadoras apropiadas, o modelos animales en los cuales se sepa que la entidad viral específica no se replica. También cabe esperar que los sistemas de ensayo basados en la detección de partículas o componentes virales indiquen la presencia de la entidad viral misma en dichos productos, pero pueden no indicar la viabilidad del virus. El resto del capítulo está dividido en tres secciones que discuten los ensayos para los tres temas: (1) Detección de virus viables, (2) Detección de componentes virales, y (3) Detección de anticuerpos contra antígenos virales. El capítulo abarca los métodos clásicos de virología que se usan aún en forma rutinaria, así como los métodos moleculares e inmunológicos modernos. Los métodos descritos en estas secciones pueden presentar sensibilidades diferentes a diversos virus; por lo tanto, están destinados a complementarse entre sí con el fin de ofrecer fundamentos científicos para la detección de virus adventicios. Se pueden usar múltiples métodos en forma complementaria para mejorar el margen de seguridad patogénica del producto. La identificación de virus detectados en ensayos sobre células, basados en los efectos citopáticos, depende a menudo del uso de análisis moleculares e inmunológicos; por lo tanto, estos análisis son relevantes, tanto para la detección viral como para la identificación viral subsiguiente. El capítulo proporciona una visión general de la detección y análisis de los grupos más importantes de virus, así como de las técnicas usadas con más frecuencia. Se excluyen las pruebas específicas de vacunas o productos biológicos individuales, debido a que se espera incluirlos en las monografías de esos productos. Los métodos reconocidos, con escasa variación en la práctica, se describen en más detalle, mientras que los métodos más flexibles se describen en términos generales, tanto en el desempeño de las pruebas como en las consideraciones para su aceptación. Las referencias reglamentarias pertinentes se encuentran en el Apéndice. Se deben consultar los capítulos generales de la USP correspondientes al diseño del bioensayo, el análisis de datos, la interpretación y la validación del ensayo.
1916 (1237) Métodos de Pruebas Virológicas / Información General
USP 39
DETECCIÓN DE VIRUS VIABLES Las partículas virales infecciosas que contaminan productos biológicos y obtenidos por biotecnología presentan graves preocupaciones por la seguridad, debido a que pueden causar potencialmente infecciones serias, que pueden poner en peligro la vida de los pacientes tratados. En especial, si los pacientes están inmunocomprometidos. Aunque nunca se puede tener completa garantía de la seguridad viral de los productos biológicos terminados, se puede establecer un margen de seguridad significativo por medio de los métodos de detección viral aplicados a materias primas y a granel no procesadas antes de la purificación, en combinación con los procesos de purificación que demuestran la capacidad de inactivar o remover los posibles contaminantes virales presentes en niveles demasiado bajos para ser detectados. (Ver Evaluación de la Seguridad Viral en Productos Biotecnológicos Obtenidos de Líneas Celulares de Origen Humano o Animal (1050) para obtener información sobre métodos de depuración e inactivación viral). Para productos de terapia génica y celular que no tienen pasos extensos de purificación, se pueden analizar los productos finales en forma directa, con el fin de detectar la presencia de virus contaminantes relevantes. Esta sección describe dos sistemas amplios para la detección de virus infecciosos: ensayos de infectividad basados en cultivos celulares y ensayos de infectividad in vivo. Estos sistemas pueden poseer sensibilidades complementarias para los virus y, como resultado, ambos métodos se pueden usar como pruebas de límite para la caracterización de bancos celulares y materias primas y para las pruebas de liberación de lotes de productos biológicos y obtenidos por biotecnología. Se discuten las consideraciones para optimizar la preparación de la muestra para estas pruebas, seguidas de una descripción de los ensayos de detección más comúnmente empleados. Por último, para garantizar la confiabilidad de los resultados experimentales, se discuten las cuestiones de control de calidad en general y el cálculo del límite de detección en particular.
Selección y Preparación de la Muestra para Ensayos de Detección Viral en Células y Animales Los requisitos para la selección, preparación y almacenamiento de las muestras de prueba para los métodos de detección viral (en células y animales) están determinados por por la labilidad de los virus que se van a detectar. La capacidad que tiene un virus para permanecer infeccioso en ausencia de una célula huésped es muy variable. La infectividad del virus puede también diferir según su sensibilidad a ciclos repetidos de congelación y descongelación. La preparación de la muestra involucra por lo general el almacenamiento a bajas temperaturas (idealmente a -60º o menos), tan pronto como sea factible después de la recolección. Cuando estén destinadas al uso en un ensayo de detección viral, se deben preparar alícuotas de las muestras para evitar múltiples pasos de congelación y descongelación. Las muestras destinadas a ensayos de infectividad viral por lo general se transportan con suficiente hielo seco para que duren varios días más del tiempo requerido para el viaje. Cuando se recibe en el laboratorio de análisis, la muestra se debe examinar para verificar que todavía esté congelada; también se debe completar la documentación apropiada. En cualquier condición de almacenamiento o demora, se debe evaluar empíricamente el impacto de la situación sobre la viabilidad viral y garantizar un manejo adecuado de la cadena de frío. A continuación se describen los tipos comunes de muestra para ensayos de detección viral. USADOS CELULARES Las muestras de prueba obtenidas de sustratos celulares (bancos celulares maestros y de trabajo, muestras de células del final de la producción) se preparan de una manera que permita el muestreo, tanto de las células (para virus asociados a las células), como del medio acondicionado (para los virus liberados al medio). Para conseguir ésto, se muestrea un cultivo de células. Se prepara una suspensión de células de -10 7 células por mL en medio acondicionado y se congela (idealmente a -60º o menos). Dado que el medio no contiene crioconservante, la mayoría de las células se lisan después de la descongelación de la muestra, liberando los virus asociados a ellas. La centrifugación a baja velocidad retirará los restos celulares más grandes y producirá un sobrenadante que puede inocularse directamente en las células detectoras en ensayos de infectividad viral en células. Para análisis de agentes virales adventicios in vivo se prepara una muestra similar. Sin embargo, en este caso, la muestra de prueba se descongela e inyecta sin clarificación en los diversos sistemas animales, a través de las distintas rutas descritas. MUESTRAS DE COSECHA A GRANEL PARA BIOTECNOLOGÍA (COSECHA A GRANEL NO PROCESADA) Los análsis de rutina de las muestras de cosecha a granel son obligatorios para la mayoría de los tipos de productos biológicos (ver Evaluación de la Seguridad Viral en Productos Biotecnológicos Obtenidos de Líneas Celulares de Origen Humano o Animal (1050)). El muestreo se debe hacer en la etapa de la cosecha a granel no procesada, porque los procesos de purificación posteriores pueden eliminar o inactivar cualquier virus que pudiera contaminar los materiales iniciales. La muestra cosechada del biorreactor se debe recoger y almacenar sin manipulación adicional, tan pronto como sea posible, a -60º o menos. Para evitar múltiples ciclos de congelación y descongelación se deben preparar alícuotas individuales para cada ensayo que se vaya a realizar. En caso de que sea necesario repetir las pruebas, se deben conservar alícuotas adicionales. Dependiendo de la naturaleza del proceso de fabricación, las muestras de cosecha a granel pueden contener cantidades variables de las células del sustrato de la producción. Dado que la cosecha a granel no contiene crioconservante, la mayoría de las células presentes se lisan después de la descongelación de la muestra, liberando los virus asociados a ellas. La centrifugación a baja velocidad para clarificar
USP 39
Información General/ (1237) Métodos de Pruebas Virológicas 1917
la muestra producirá un sobrenadante que puede inocularse directamente en las células detectoras en ensayos de infectividad viral en células. Puede haber casos en los cuales la muestra de prueba sea citotóxica para las células detectoras de los ensayos en células y el procedimiento puede requerir modificaciones para resolver estos casos. Para análisis de seguridad viral in vivo se prepara una muestra similar. Sin embargo, en este caso, la muestra de prueba se descongela e inyecta sin clarificación en los diversos sistemas animales, a través de las distintas rutas descritas. MATERIAS PRIMAS DE ORIGEN ANIMAL Los ingredientes de origen animal usados en la fabricación de productos biológicos para uso humano o veterinario se deben analizar en busca de virus específicos de especie que presenten riesgos, según se describe en 9 CFR 113.53 (ver también el capítulo de información general de la USP, Suero Bovino (1024), en preparación para publicación futura). Las materias primas se pueden almacenar en una gran variedad de condiciones, según sea apropiado. La preparación de la muestra y el método de aplicación al sistema de prueba depende de la naturaleza de la muestra. Debe tenerse en cuenta la posibilidad de que materias primas de origen animal puedan contener contaminantes bacterianos o fúngicos. En algunos casos, puede ser necesario tratar las muestras con antibióticos o filtrarlas (tamaño de poro, 0,22 ó 0,45 micrones) antes de la inoculación, con el fin de prevenir el crecimiento bacteriano o fúngico dentro del sistema de prueba. Los sueros animales se reciben generalmente congelados y se descongelan e incorporan dentro del medio de crecimiento en una concentración apropiada (por lo general 15% v/v) para exponer las células detectoras. La tripsina en polvo (no menos de 5 gramos, según 9 CFR 113.53) se suspende en un diluyente apropiado, como solución salina amortiguada con fosfatos y se somete posteriormente a centrifugación a alta velocidad para convertir en pellet cualquier virión que pudiera estar presente. El pellet concentrado se resuspende en solución salina amortiguada con fosfatos y el material resultante se usa para inocular las células detectoras apropiadas. Los aditivos del medio de cultivo, como la trombina bovina, se pueden incorporar al medio de crecimiento en una concentración predeterminada, múltiplo de la concentración nominal que se usará en el proceso de fabricación. El medio de crecimiento resultante que contiene los aditivos se usa entonces para exponer las células detectoras al material de prueba. El múltiplo exacto que se usará en dichas pruebas puede estar limitado por factores tales como la solubilidad en el medio de crecimiento o la citotoxicidad a las células detectoras. Estos factores se deben evaluar antes de llevar a cabo los análisis. Se debe seguir el principio de usar concentraciones más altas en el método de detección que durante el proceso, dentro de los límites de toxicidad de la célula indicadora, para aumentar la sensibilidad de la detección. CÉLULAS ENTERAS En ciertos ensayos de detección viral se usan células viables intactas como muestra de prueba. Debido a que las células de prueba pueden unirse y proliferar en el recipiente de cultivo junto con las células detectoras, los ensayos que usan este tipo de muestra se conocen como ensayos de cocultivo. Los requisitos para el ensayo específico pueden variar de acuerdo con las proporciones respectivas de células detectoras y de prueba, la viabilidad de las células de prueba o la confluencia de células de prueba en el momento de la recolección.
Métodos de Detección Viral Basados en Cultivos Celulares Para garantizar la ausencia de agentes virales adventicios, se usan ensayos de detección viral basados en cultivos celulares para una gran variedad de propósitos, incluidos entre otros, procedimientos de diagnóstico clínico; evaluación de materias primas y sustratos celulares; análisis de la identidad viral, pureza y potencia de los lotes de siembra de virus (virus seed stocks) y análisis de liberación de lote de cosechas a granel no procesadas durante la elaboración de productos biológicos. Una distinción importante entre ensayos en células y ensayos de detección directa (ver la sección Detección de Componentes Virales) es que los primeros detectarán sólo virus replicantes, mientras que los segundos detectarán antígenos virales, material genómico viral y similares, que pueden ser indicio o no de la presencia de virus replicantes. De manera parecida, la detección de anticuerpos circulantes dirigidos contra los antígenos virales (discutidos en la sección Detección de Anticuerpos contra Antígenos Virales), puede ser indicio de una infección actual o previa de un animal y no necesariamente indica que el animal alberga actualmente una infección. Los virus infecciosos detectados en células o en materiales derivados de células caen dentro de dos categorías amplias, de acuerdo con las expectativas del analista. Los virus endógenos son aquellos que se detectan normalmente en las células como resultado de la integración del material genómico viral dentro del ADN de la célula huésped. Los virus exógenos son aquellos que no están normalmente presentes en la célula, sino que se encuentran como resultado de una infección viral de las células. La suposición subyacente para todos los métodos de detección viral en células es que los virus tienen la capacidad para replicarse en una célula huésped apropiada. Los virus carecen de la maquinaria celular requerida para producir su propio material genómico y sus proteínas estructurales y por lo tanto están obligados a entrar en una célula huésped y subordinarla para conseguir este propósito. Los ensayos de infectividad viral en células usan células indicadoras (detectoras) que sirven como células huésped para los viriones viables presentes en las muestras de prueba. Los ensayos de infectividad en células pueden ubicarse en tres categorías amplias, según el tipo de virus que se va a detectar: (1) ensayos retrovirales, (2) ensayos de virus específicos, y (3) ensayos de detección viral. Los tipos de puntos finales usados
1918 (1237) Métodos de Pruebas Virológicas / Información General
USP 39
para detectar los virus pueden diferir según la categoría. Aunque los ensayos de detección viral por lo general no se optimizan para entidades virales individuales, los ensayos específicos de virus y los ensayos de titulación, al igual que algunos de los ensayos retrovirales, se pueden optimizar hasta cierto punto para virus específicos. Es de suma importancia titular con exactitud las suspensiones madre de virus (stock viruses) que se usan como controles positivos o para determinar el límite de detección de un ensayo. Las normas reglamentarias asociadas con las diversas pruebas de seguridad viral dependen de la naturaleza de las muestras que se van a evaluar, por lo que los analistas serán referidos a sus propios ámbitos reglamentarios para más detalle en cuanto a la documentación pertinente.
Requisitos Generales de los Ensayos en Cultivos de Células CÉLULAS DETECTORAS Y CONCEPTO DEL ESPECTRO DE ANFITRIONES DEL VIRUS El espectro de virus detectables usando ensayos de infectividad en células depende de un número de factores que incluyen el tipo de célula huésped usada como cultivo indicador (detector) y los puntos finales de detección usados en el ensayo. Los virus difieren en su capacidad para infectar tipos específicos de células huésped. La mayoría de los virus exhiben al menos cierto grado de tropismo por la célula huésped (es decir, la capacidad de infectar una especie o tipo de tejido específico). El atributo se debe típicamente a un requisito de interacción de un virión con un receptor de membrana celular específico durante el proceso de infección de la célula huésped. Una célula susceptible a la infección y capaz de producir la progenie de un virus determinado se conoce como permisiva para el virus; las células que no se prestan a la proliferación viral se conocen como no permisivas o restringidas para el virus. Como consecuencia de las diferencias en el tropismo por la célula huésped, los ensayos destinados a detectar una amplia gama de virus deben incluir múltiples tipos de células detectoras. Por la misma razón, el diseño de un ensayo de infectividad celular para un virus específico debe incluir una célula detectora que sea permisiva para ese virus. SUSCEPTIBILIDAD A LOS VIRUS DE LAS LÍNEAS DE CÉLULAS COMUNES En la mayoría de los ensayos de punto final usados para determinar si una célula huésped está infectada por un virus se prefiere un cultivo en monocapa y no un cultivo semiadherente o en suspensión. Por ejemplo, el efecto citopático y la hemadsorción se visualizan microscópicamente. Las células que no son adherentes tienen poca morfología para evaluar y la hemadsorción no se puede evaluar apropiadamente en un cultivo en suspensión. Por esta razón, algunos documentos reglamentarios relacionados con los ensayos de infectividad viral en células estipulan el uso de cultivos detectores en monocapa. En la Tabla 1 se proporciona una lista de las líneas celulares indicadoras comúnmente empleadas y su aplicación en los ensayos de detección viral. Respecto al tropismo viral de estas células, "Points to Consider in the Characterization of Cell Lines Used to Produce Biologicals" (1993) y las guías del ICH, QSA (Rl) (ver estas referencias en el Apéndice), exigen que las células diploides humanas, como la MRC-51 y la Wl-38, que son permisivas para una gama de virus peligrosos para los seres humanos y los cultivos en monocapa de las mismas especies que las del sustrato celular usado para elaborar el producto se incluyan en la prueba de detección viral para productos biológicos para uso en seres humanos. En la Tabla 2 se proporciona una lista de las líneas celulares indicadoras comúnmente empleadas y su aplicación en ensayos de análisis de materias primas. Tabla 1. Líneas Celulares Indicadoras (Detectoras) Usadas para Ensayos de Detección Viral de Virus Adventicios Línea Celular"
Origen Líneas celulares con un tropismo viral relativamente amplio:
Puntos Flnalesb
1
Virus Diana
1
1
BHK-21
[ Hámster sirio
f
CPE, HAd, HA
[ Virus transmitidos por insectos (arbovirus)
Vero
[ Mono verde africano
f
CPE, HAd, HA
[ Virus infecciosos para seres humanos
y primates
Para procesos que involucren sustratos de células humanas: Hela
[ Humano
f
CPE, HAd, HA
[ Virus infecciosos para seres humanos
MRC-5
[ Humano
f
CPE, HAd, HA
[ Virus infecciosos para seres humanos
f
CPE, HAd, HA
[ Virus infecciosos para hámsters chinos
f
CPE, HAd, HA
[ Virus infecciosos para células de ratón
Para procesos que involucren sustratos de células de hámster chino: CHO-KI
[ Hámster chino
Para procesos que involucren sustratos de células de ratón: MEF
ª
[ Ratón
Se muestran ejemplos de líneas celulares usadas para ensayos de detección viral. En todos los ensayos se usan células MRC-5 y Vero, o células con espectros de anfitriones similares. Dependiendo del sustrato celular utilizado en la fabricación de un producto biológico, se usan también líneas celulares adicionales en el ensayo de detección. También se podría incluir una célula bovina si se usó suero bovino en el proceso de fabricación. b CPE, efecto citopático; HAd, hemadsorción; HA, hemaglutinación (opcional). e La inclusión de una célula bovina en la detección de un virus no se debe interpretar como un reemplazo o una alternativa para el análisis de materias primas. Las pruebas de materias primas están reglamentadas en EE.UU por el 9 CFR 113.47 y el 113.52, y las líneas celulares usadas para estos análisis se describen en la
Tabla 2.
Información General/ (1237) Métodos de Pruebas Virológicas 1919
USP 39
Tabla 1. Líneas Celulares Indicadoras (Detectoras) Usadas para Ensayos de Detección Viral de Virus Adventicios (Continuación) Puntos Finalesb Virus Diana Origen Línea Celular" NIH/3T3
CPE, HAd, HA
Ratón
Virus infecciosos para células de ratón
Para procesos que involucren sustratos de células bovinas o materias primas bovinas:<
MDBK
Bovino
CPE, HAd, HA
BT
Bovino
CPE, HAd, HA
Virus bovinos Virus bovinos
EBTr
Bovino
CPE, HAd, HA
Virus bovinos
ª Se muestran ejemplos de líneas celulares usadas para ensayos de detección viral. En todos los ensayos se usan células MRC-5 y Vero, o células con espectros de anfitriones similares. Dependiendo del sustrato celular utilizado en la fabricación de un producto biológico, se usan también líneas celulares adicionales en el ensayo de detección. También se podría incluir una célula bovina si se usó suero bovino en el proceso de fabricación. b CPE, efecto citopático; HAd, hemadsorción; HA, hemaglutinación (opcional). e La inclusión de una célula bovina en la detección de un virus no se debe interpretar como un reemplazo o una alternativa para el análisis de materias primas. Las pruebas de materias primas están reglamentadas en EE.UU por el 9 CFR 113.47 y el 113.52, y las líneas celulares usadas para estos análisis se describen en la Tabla 2.
Línea Celular"
Tabla 2. Líneas Celulares Indicadoras (Detectoras) Usadas en en Análisis de Materias Primas Puntos Finalesb Tipo de Ensayo Origen Animal de la Materia Prima
Vero
Aislamiento/detección
CPE, HAd, AIF
Todas las fuentes
BT
Aislamiento/detección
CPE, HAd, AIF
Bovino; todas las fuentes (VDVB)C
EBTr
Aislamiento/detección
CPE, HAd, IFA
Bovino; todas las fuentes (VDVB)<
MDBK
Aislamiento/detección
CPE, HAd, AIF
Bovino; todas las fuentes (VDVB)<
PT-1
Aislamiento/detección
CPE, HAd, IFA
Porcino
PK-1
Aislamiento/detección
CPE, HAd, AIF
Porcino
MDCK
Aislamiento/detección
CPE, HAd, IFA
Canino
GT
Aislamiento/detección
CPE, HAd, AIF
Caprino
ª
El requisito (9 CFR 113.47 y 11 3.52) para evaluar materias primas de origen animal es usar (1) Células Vero, (2) una célula bovina para detectar VDVB, y (3) una línea celular de la misma especie de origen de la materia prima para detectar virus peligrosos provenientes de esas especies. Se indican ejemplos de líneas celulares que se usan en la industria. b CPE, efecto citopático; HAd, hemadsorción; AIF, tinción con anticuerpos inmunofluorescentes. e Según 9 CFR 113.47, las materias de origen animal se deben analizar en busca de virus de la diarrea viral bovina (VDVB).
Las células detectoras para ciertos virus pueden tener requisitos muy específicos. Por ejemplo, los ensayos destinados a detectar VIH infeccioso usan linfocitos humanos de sangre periférica e involucran un punto final del enzimoinmunoensayo de captura de antígeno p24. En la Tabla 3 se proporciona una lista de las líneas celulares indicadoras comúnmente empleadas y su aplicación en la detección de virus específicos. Línea Celular"
Tabla 3. Líneas de Células Indicadoras (Detectoras) Usadas para la Detección de Virus Específicos Puntos Flnalesb Virus Diana Tipo de Ensayo
324K
Aislamiento/detección
CPE, HAd, AIF
Virus diminuto del ratón
A9
Aislamiento/detección
CPE, HAd, AIF
Virus diminuto del ratón
BHK-21
Aislamiento/detección
CPE, HAd
Arbovirus<
MRC-Sd
Aislamiento/detección
CPE
Citomegalovirus humano
ª
Ejemplos de líneas celulares para optimizar la detección de virus específicos o tipos de virus. En muchos casos, los métodos de ensayo se deben también optimizar para la detección de virus diana. b CPE, efecto citopático; HAd, hemadsorción; AIF, tinción con anticuerpos inmunofluorescentes. e El grupo de virus transmitidos por insectos se conoce como arbovirus. Este término no tiene importancia taxonómica. d Otras líneas de células diploides humanas como la Wl-38 son también adecuadas. El ensayo debe durar como mínimo 28 días.
REQUISITOS DE CRECIMIENTO PARA CÉLULAS DETECTORAS La proliferación viral dentro de una célula huésped permisiva puede depender de la velocidad de proliferación de la célula huésped. Especialmente en el caso de virus que muestran dependencia del ciclo celular para la generación de la progenie viral. Para la mayoría de los ensayos de detección, los cultivos de células detectoras se siembran con una densidad destinada a conseguir una monocapa celular en crecimiento exponencial. Esto corresponde a una confluencia celular de 50% o menos (la densidad celular óptima puede depender del tipo de ensayo y de la célula detectora que se va a usar) en el momento de la inoculación de los cultivos con virus o muestras de prueba. Por las mismas razones, el diseño del ensayo puede considerar el subcultivo de células detectoras (recolección de células del cultivo original y siembra de una fracción predeterminada de ellas en un nuevo matraz). Como alternativa, se puede hacer un pasaje, que consiste en la recolección de medio de cultivo preparado a partir del cultivo original y la inoculación de este material dentro de un cultivo secundario de células detectoras que está en fase de crecimiento logarítmico. La frecuencia del subcultivo o pasaje requerida en un ensayo se determina en gran medida por la velocidad de crecimiento de las células detectoras. La incorporación de estos pasos en los diseños de los ensayos de
1920 (1237) Métodos de Pruebas Virológicas / Información General
USP 39
detección ayuda a garantizar que las condiciones permanezcan óptimas para la amplificación de la progenie viral dentro de las células huésped. NECESIDAD DE IDENTIFICACIÓN DE LAS CÉLULAS DETECTORAS Y CREACIÓN DE BANCOS CELULARES Las células detectoras usadas para ensayos de detección viral en células son un reactivo crítico para garantizar la seguridad, la potencia, la identidad y la capacidad de depuración viral en esquemas de purificación. En muchos casos, este análisis está destinado a respaldar procesos de Buenas Prácticas de Fabricación; por lo tanto, los bancos de células detectoras se deben preparar y calificar de la misma manera que otros reactivos críticos. Los detalles de los métodos de evaluación de la seguridad viral se describen en Evaluación de la Seguridad Viral en Productos Biotecnológicos Obtenidos de Líneas Celulares de Origen Humano o Animal (1050). Independientemente de los requisitos específicos de cumplimiento, una buena práctica es hacer la identificación y calificación periódica de los bancos de células detectoras que se usarán subsiguientemente para los ensayos de infectividad viral. Los siguientes puntos se deben considerar como análisis mínimos de control de calidad para dichos bancos de células detectoras: esterilidad, detección viral y de micoplasma e identidad celular por huella genética, cariología o análisis de isoenzimas. Además, pueden requerirse ensayos específicos para virus bovinos y porcinos, si se usaron materias primas bovinas o porcinas en la preparación de los bancos. Se debe consultar el capítulo Suero Bovino (1024) y las monografías de materiales auxiliares específicos del tipo de suero correspondiente cuando se usen productos de suero en los medios de cultivo de crecimiento celular.
Puntos Finales para la Detección de la Infección Viral Los diversos puntos finales usados para identificar la infección de una célula detectora con un virus incluyen: • Observación visual de los efectos citopáticos. • Hemaglutinación o hemadsorción de eritrocitos. • Tinción inmunofluorescente. • Cocultivo con otros tipos de células detectoras. • Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (PCRq) para la detección directa de secuencias genómicas virales. •Análisis con microscopio electrónico de pellets virales o células fijadas para la visualización de partículas virales. • Puntos finales bioquímicos, como ensayos de transcriptasa reversa, los cuales detectan la actividad enzimática específica del virus. Estos diversos puntos finales se usan en una forma complementaria, dado que un virus determinado puede no causar una respuesta positiva en cada punto final. Por ejemplo, algunos virus pueden crecer hasta títulos altos sin producir efectos citopáticos visibles y por lo tanto deben detectarse usando otros puntos finales. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y el análisis con microscopio electrónico per se no son capaces de distinguir entre virus viables y no viables. Sin embargo, cuando se usan conjuntamente con cinéticas de crecimiento de cultivo celular, estos enfoques pueden ser poderosos métodos ortogonales de detección para demostrar el incremento de la replicación viral y por lo tanto, los virus viables. La ausencia de observación de partículas virales en el análisis con microscopio electrónico de células fijadas no se debe considerar prueba absoluta de la ausencia de virus infecciosos en las células. En general, lo mismo es cierto para cada uno de los puntos finales de detección discutidos anteriormente. Cada punto final tiene un límite de detección por debajo del cual un virus puede estar presente sin ser detectado. EFECTOS CITOPÁTICOS VIRALES Las manifestaciones de la infección de las células huésped susceptibles a ciertos tipos de virus, que se pueden visualizar, se conocen colectivamente como efectos citopáticos virales (CPE, por sus siglas en inglés). Aunque los CPE se pueden considerar como una detección indirecta de la infección viral, en el contexto de células huésped específicas pueden tener manifestaciones morfológicas características, entre las que se cuentan la aparición de cuerpos de inclusión, morfología celular anormal, cambios en la confluencia del cultivo, muerte y lisis celular y otros. La naturaleza de los CPE observados puede depender de la célula huésped y del virus infectante. Para virus que normalmente causan CPE, pueden existir variantes que no causen CPE. Los CPE se pueden diferenciar del efecto citotóxico por la tendencia que tienen los primeros de exhibir una progresión irreversible con el tiempo, mientras que los segundos pueden ser reversibles. En ciertos casos, las proteínas estructurales de los virus pueden ocasionar efectos citotóxicos similares a los efectos citopáticos de los virus infecciosos. La diferenciación del efecto citotóxico de tales proteínas del efecto citopático de los virus infecciosos puede requerir la observación del cultivo durante cierto tiempo, para determinar si el efecto progresa o si las células parecen recuperarse. Como alternativa, para diferenciar estas dos manifestaciones aparentemente similares se puede usar el pasaje libre de células del cultivo original a células detectoras frescas. La citotoxicidad asociada con las proteínas estructurales en ausencia de virus infecciosos no debería pasar al cultivo secundario. La tinción de Giemsa puede optimizar la habilidad de los operarios para visualizar ciertos cuerpos de inclusión (acúmulos de partículas virales), que son característicos del efecto citopático viral, y está indicada por el 9 CFR 113.53 en ensayos usados para demostrar que las materias primas bovinas, porcinas, equinas y ovinas están libres de virus específicos de la especie.
USP 39
Información General/ (1237) Métodos de Pruebas Virológicas 1921
DETECCIÓN DE VIRUS HEMAGLUTINANTES Una característica de ciertos virus (conocidos como virus hemaglutinantes) es que una o más de sus proteínas virales producen hemaglutinación de uno o más tipos de eritrocitos. La hemaglutinación es una interacción entre las proteínas virales o hemaglutininas y los eritrocitos, que ocasiona la adherencia de los eritrocitos a superficies, células y entre sí. Esta propiedad constituye la base para dos procedimientos de punto final que se emplean en los ensayos de infectividad viral en células: la hemadsorción y la hemaglutinación. La hemadsorción se efectúa agregando una suspensión de uno o más tipos de eritrocitos directamente sobre el cultivo en monocapa de células detectoras. Si las proteínas virales de un virus hemaglutinante se expresan en las membranas celulares infectadas, los eritrocitos susceptibles se unirán firmemente a las membranas celulares. Las células no infectadas no presentan esta unión; por lo tanto, la técnica se puede usar para visualizar un foco de células infectadas contra un fondo de células no infectadas. Por esta razón, este punto final en particular puede exhibir una mayor sensibilidad de detección que otros ensayos de punto final, como el efecto citopático o la hemaglutinación. En las etapas avanzadas de la infección, se puede observar la unión de los eritrocitos a las células, o entre sí, y a superficies plásticas abiertas en el recipiente de cultivo. El procedimiento de hemaglutinación se efectúa sobre el medio acondicionado y es, en esencia, una evaluación de virus libres o de hemaglutininas en solución. Una alícuota del medio acondicionado de un cultivo de células detectoras se combina con uno o más tipos de eritrocitos en una placa de micropocillos con fondo en forma de v. Las placas se evalúan después de una cantidad apropiada de tiempo. La ausencia de hemaglutinación se manifiesta por un pellet bien definido (botón) de eritrocitos, que se sedimenta al fondo del pocillo. En comparación, la hemaglutinación se manifiesta por la ausencia de un botón, o por un botón con forma irregular. La valoración (scoring) de éste último depende de la subjetividad del operario. Además, este punto final se puede considerar el menos sensible entre los ensayos de detección, porque depende de que se alcance una concentración suficiente de hemaglutininas virales en solución. Por estas razones, la hemadsorción, por lo general, se considera como el método más útil y confiable de las técnicas para detectar virus hemaglutinantes. Las respuestas obtenidas en los ensayos de detección usando puntos finales de hemadsorción y hemaglutinación depende en gran medida del virus que se está analizando, así como de los tipos de eritrocitos usados. Muchos de los virus que son motivo de preocupación en la industria biotecnológica no ocasionan hemadsorción ni hemaglutinación o sus hemaglutininas reaccionan con tipos de eritrocitos que no se encuentran comúnmente en los ensayos de detección. DETECCIÓN POR TINCIÓN CON ANTICUERPOS INMUNOFLUORESCENTES (AIF) Ciertos ensayos de detección viral en células están destinados a detectar entidades virales específicas y se requieren para pruebas de materias primas obtenidas de materiales bovinos, porcinos, equinos y ovinos (9 CFR 11 3-53). Con este fin, los ensayos se deben optimizar con respecto a la selección de la célula huésped, el diseño del estudio y la preparación de la muestra. La especificidad de la detección se consigue también por medio del uso de técnicas de tinción con AIF. Se emplean antisueros primarios o anticuerpos monoclonales dirigidos contra los antígenos virales de interés, tanto en aplicaciones de tinción directa como en asociación con un antisuero secundario conjugado con un fluorocromo. Las monocapas de células detectoras inmunoteñidas se visualizan entonces con un microscopio de epifluorescencia para revelar la presencia de las células reactivas infectadas.
Diseño de Ensayos Virales en Células ENSAYOS DE DETECCIÓN VIRAL Los cultivos de células detectoras se siembran y se dejan incubar durante la cantidad de tiempo apropiada. Las muestras virales se pueden inocular directamente en el medio de cultivo en la fase mitótica celular, pero con más frecuencia se retira el medio del cultivo de células detectoras después de una noche y se reemplaza con la muestra de prueba. Para este último método, la muestra de prueba debe ser aproximadamente isotónica y los agentes citotóxicos, como son los agentes de selección, deben mantenerse dentro de niveles tolerables para la célula detectora. Para las muestras de prueba compuestas por células vivas, la muestra se debe someter a congelación y descongelación antes de la inoculación, con el fin de lisar las células de la muestra. Si las células no se lisan, se producirá un cocultivo que involucre las células detectoras y las células de muestra. Esto último forma parte del diseño de los ensayos de cocultivo. Pero para la mayoría de los ensayos de infectividad en células, no se pretende hacer un cocultivo que podría impactar adversamente la sensibilidad del ensayo. La muestra de prueba por lo general se deja adsorber a las monocapas de células detectoras por una cantidad de tiempo apropiada. Luego se retira y reemplaza con el medio de crecimiento adecuado para la célula detectora. Una vez inoculado, el ensayo de detección involucra la incubación de las células detectoras por un tiempo determinado, agregando medio periódicamente, de ser necesario. Las evaluaciones de punto final descritas anteriormente se efectúan de acuerdo con el diseño del estudio. Se pueden usar variaciones del procedimiento dado para exponer células detectoras a materias primas. Para materias primas, la exposición a células detectoras puede consistir en la incorporación de los materiales de prueba dentro del medio de crecimiento usado para mantener las células detectoras a lo largo del ensayo.
1922 (1237) Métodos de Pruebas Virológicas / Información General
USP 39
ENSAYOS DE TITULACIÓN VIRAL Los ensayos de titulación viral están diseñados para generar información cuantitativa sobre el virus de interés. Estos ensayos no cuantifican cantidades absolutas de partículas virales; los resultados se expresan en términos de unidades infecciosas. Una unidad infecciosa es la cantidad de virus requerida para establecer una infección productiva y se usan varias categorías de ensayos de titulación. Varían de acuerdo con el tipo de punto final usado para demostrar infección e incluyen titulación viral en placa o unidades formadoras de placa (unidades: UFP por mL); dosis infecciosa 50 de cultivo tisular (unidades: DICT50 por mL); y dosis infecciosa 50 de anticuerpos fluorescentes (unidades: DIAF50 por mL). La cantidad de virus hemaglutinantes en una muestra también se puede expresar en términos del título hemaglutinante (unidades: dilución del punto final; es decir: la dilución más alta de la muestra que presente todavía una respuesta de hemaglutinación positiva o HA). Independientemente del punto final usado, un diseño de ensayo de titulación típico consta de una secuencia de diluciones de la muestra que se realizan en incrementos de 0,5 log 10 o de 1 log 10 • Las diversas diluciones de la muestra se agregan entonces a un número apropiado de monocapas de células detectoras permisivas. Después de un tiempo de incubación adecuado, las monocapas se evalúan directamente por el efecto citopático (ensayo DICT50), se fijan y procesan para inmunotinción y evaluación de células reactivas (ensayo DIAF50) o se recubren con agarosa y se procesan con el ensayo UFP de formación de placas. Las titulaciones DICT50 y DIAF 50 se calculan por lo general usando fórmulas publicadas, como la de Spearman-Karber y la de Reed-Muench. Los controles del ensayo para tales evaluaciones cuantitativas deben incluir rutinariamente una muestra de referencia de potencia conocida.
Detección de Retrovirus Los retrovirus representan un caso especial para el ensayo de detección viral en células, debido a que la infección retroviral ocurre con ausencia de respuestas a los puntos finales típicos discutidos. Con el fin de detectar retrovirus, los científicos pueden emplear diferentes puntos finales. En la Tabla 4 se proporciona una lista de las líneas celulares indicadoras y los puntos finales asociados usados más comúnmente y su aplicación en los ensayos de detección de retrovirus. Tabla 4. Líneas Celulares Indicadoras (Detectoras) Usadas en Análisis de lnfectlvldad de Retrovlrus Línea Celular SC-1/XC
Tipo de Ensayo
Puntos Finales•
Virus Diana
Aislamiento/detección directa
Placas (XC); RT
Balb/C
Aislamiento/detección directa
Placas (XC); RT
Retrovirus murino B-trópico
NIH/3T3
Aislamiento/detección directa
Placas (XC); RT
Retrovirus murino N-trópico
Pulmón de visón
Aislamiento
RT; visón S+L-
Retrovirus murino anfotrópico, xenotrópico
Visón S+L-
Detección directa
Focos
Retrovirus murino anfotrópico, xenotrópico
Felino S+L-
Detección directa
Focos
Retrovirus murino anfotrópico, xenotrópico; virus de la leucemia de gibón (GALV) y retrovirus felino RD-114
Mus dunni
Aislamiento, cocultivo
RT; S+L-
Retrovirus murino y retrovirus infeccioso para seres humanos
QT6b
Aislamiento, cocultivo
RT
Retrovirus aviar
RD
Aislamiento, cocultivo
RT; S+L-
Retrovirus infecciosos para seres humanos
Retrovirus murino ecotrópico
MRC-5
Aislamiento, cocultivo
RT; S+L-
Retrovirus infecciosos para seres humanos
Wl-38
Aislamiento, cocultivo
RT; S+L-
Retrovirus infecciosos para seres humanos
293
Aislamiento, cocultivo
RT; S+L-
Retrovirus infecciosos para seres humanos
A549
Aislamiento, cocultivo
RT; S+L-
Retrovirus infecciosos para seres humanos
Raji
Aislamiento, cocultivo
RT
Retrovirus infecciosos para seres humanos
PBMC humano
Aislamiento, cocultivo
RT, HIV p24 EIA
VIH y otros retrovirus de seres humanos
ª
Los ensayos de punto final incluyen: RT, transcriptasa reversa, PERT, transcriptasa reversa con producto aumentado (incluye también ensayos de transcriptasa reversa con producto aumentado y transcriptasa reversa con producto aumentado, cuantitativa, en tiempo real) y EIA, inmunoensayo enzimático. b Célula de codorniz; también se usan en ocasiones cultivos primarios de fibroblastos de pollo o pavo.
La infección retroviral depende de la presencia de receptores sobre las membranas de la célula huésped. La presencia de dichos receptores confiere el tropismo de la célula huésped. DISEÑO DE LOS ENSAYOS DE INFECTIVIDAD DE RETROVIRUS Se usan dos tipos de ensayos de infectividad, dependiendo de la naturaleza del material de prueba. Para materiales que no contienen células intactas, el material de prueba se inocula dentro de una o más variedades de células detectoras, que luego se someten a un pasaje según se requiera para amplificar cualquier virus presente. Debido a la naturaleza de la replicación viral, los efectos citopáticos por lo general no ocurren durante la infección, aunque existen algunas excepciones. Antes del primer subcultivo y al término del pasaje final, se emplean uno o más ensayos de punto final para detectar la presencia de un retrovirus. Para materiales de prueba que contienen células intactas, las células detectoras se siembran e inoculan subsiguientemente
USP 39
Información General/ (1237) Métodos de Pruebas Virológicas 1923
con las células de prueba, lo que da lugar a un cocultivo. Se hacen cinco o más pasajes de los cultivos. Antes del primer subcultivo y al término del pasaje final, se emplean uno o más ensayos de punto final para detectar la presencia de un retrovirus. ENSAYOS DE PUNTO FINAL PARA LA DETECCIÓN DE RETROVIRUS Los ensayos de punto final se pueden clasificar como directos, los cuales conducen a cambios morfológicos definidos en las células detectoras; o indirectos, los cuales se miden por la detección de marcadores bioquímicos, moleculares o inmunológicos de la infección. Ensayo de Formación de Placas en Células XC-El ensayo de formación de placas en células XC se desarrolló como un medio directo para detectar retrovirus murino infeccioso. La detección del retrovirus se consigue irradiando con radiación ultravioleta a las células detectoras usadas para amplificar el virus y recubriéndolas luego con una célula de rata específica (XC). La presencia de retrovirus murino infeccioso en las células detectoras se refleja por la formación de sincicios definidos en la monocapa de células XC, los cuales se visualizan fácilmente cuando los cultivos se fijan y tiñen con un colorante apropiado, como cristal violeta. El tropismo N/B de un virus murino ecotrópico se puede determinar inoculando células detectoras Balb/c y NIH Swiss con el aislado, efectuando uno o dos pasajes en cada línea celular y comparando el título de la placa en células XC después del pasaje con el determinado para el aislado inicial. Ensayos de Formación de Focos con Células de Visón y Felino S+L- -El punto final del foco S+L- se desarrolló para facilitar la detección directa de los virus infecciosos murinos xenotrópico y anfotrópico. La muestra de prueba se puede inocular directamente en cultivos de células S+L- o, como alternativa, se pueden amplificar primero por inoculación en células detectoras de pulmón de visón, humanas o de Mus dunni. Los sobrenadantes libres de células, provenientes de los cultivos de células detectoras, se usan para inocular las células S+L-. Estas últimas se infectan con un virus de sarcoma que tiene una replicación defectuosa, lo cual requiere la presencia de un virus de leucemia auxiliar que lo vuelva capaz de ocasionar la transformación de la célula huésped. La presencia de retrovirus infecciosos en los cultivos de células detectoras se evidencia por la formación de áreas focales características de transformación celular en las células S+L-, causadas por el virus de sarcoma rescatado. Detección de Transcriptasa Reversa Retroviral-Los ensayos diseñados para medir la actividad de la transcriptasa reversa (RT) son útiles como un método de detección indirecto, porque la enzima indica la presencia de todos los retrovirus, sean infecciosos o no. La enzima RT es codificada en el genoma retroviral y usada por el virus para transcribir la información genética del ARN genómico viral en ADN proviral. Ensayo de Incorporación de Nucleótido Radiomarcado-Los primeros métodos para medir la actividad de RT se basaban en la medición de incorporación de nucleótidos marcados con 32 P- o 3 H- al producto de ADN complementario, ADNc, usando un molde de ARN apropiado. La incorporación de nucleótido radiomarcado a niveles más altos que un umbral predeterminado se interpreta como prueba de la presencia de actividad RT retroviral. La contribución de la ADN polimerasa celular puede descartarse por medio de un ensayo en doble molde (que tenga moldes tanto para el ARN como para el ADN) o la inclusión de ADN de timo de ternero activado. Ensayo de Transcriptasa Reversa con Producto Aumentado (PERT) o PERT cuantitativa (Q-PERT)-La amplificación por medio de la reacción en cadena de la polimerasa se ha usado para mejorar la sensibilidad de la medición de la actividad de RT. La actividad de RT se detecta por amplificación con PCR del ADN complementario, recién sintetizado a partir de un molde de ARN, por transcriptasa reversa. El ensayo se puede efectuar con un punto final en gel (PERT) o como un ensayo cuantitativo (Q-PERT). Este método ha ganado creciente aceptación entre las agencias reglamentarias. Para más detalles sobre las técnicas basadas en PCR, ver el capítulo de información general de la USP Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Amplificación (1127). MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA La microscopía electrónica de transmisión (MET) se puede usar para detectar y enumerar las partículas virales dentro de las células. Además, la técnica permite la diferenciación de los retrovirus de tipos A, B, C y D, de acuerdo con las características morfológicas y puede usarse para localizar partículas virales dentro de la célula. La MET de células seccionadas es sumamente valiosa como técnica para la identificación de virus (incluyendo virus ARN y ADN en general). A partir de las células, que por lo general se muestrean durante la fase logarítmica de crecimiento, se obtienen pellets por centrifugación a baja velocidad y el pellet celular se fija con un fijador apropiado. El pellet de células fijadas se incluye, se corta, se tiñe y se observa con MET. Con esta técnica se pueden determinar el tamaño (diámetro) de las partículas, la morfología, la presencia o ausencia de características de superficie como envolturas o espículas y la ubicación dentro de la célula. Dicha información es importante para la identificación de un virus. Sin embargo, el que no se observen partículas virales con este método no es prueba concluyente de la ausencia de contaminación viral en la muestra. Los líquidos biológicos pueden evaluarse también por MET, principalmente para establecer el tamaño y la concentración de las partículas. El sobrenadante libre de células se somete a ultracentrifugación para obtener un pellet de cualquier virus presente. El pellet resultante se fija con un fijador apropiado. Se evalúan un número predeterminado de espacios de la rejilla que contienen áreas representativas de secciones finas del pellet en busca de partículas. Los resultados del recuento obtenido pueden mostrar un alto grado de variabilidad y el que no se observen partículas no implica que no hubiera ninguna presente en la
1924 (1237) Métodos de Pruebas Virológicas / Información General
USP 39
muestra. Los puntos finales moleculares (PCR cuantitativa y PERT cuantitativa) también se han usado como métodos alternativos para el cálculo de la carga de partículas virales en las muestras. INMUNOENSAYO ENZIMÁTICO DE CAPTURA DE ANTÍGENO Una manera de determinar la presencia de un retrovirus puede ser por medio de la detección de proteínas virales específicas (p.ej., antígeno p24 del VIH o proteínas de la envoltura del virus de la leucosis aviar). Los antígenos virales son capturados por anticuerpos específicos que recubren los pocillos de la placa de microtitulación y se detectan por la adición de un segundo anticuerpo marcado y el sustrato apropiado.
Ensayos Diseñados para Detectar Virus Específicos Se han desarrollado metodologías adicionales para permitir la detección de virus específicos o grupos de virus. Estos tipos de ensayos se usan a menudo para la evaluación de materia prima. En algunos casos, estos ensayos específicos se desarrollaron porque los virus diana no causan respuestas de punto final en los ensayos de detección viral. En contraste con los ensayos de detección viral, los ensayos de virus específicos generalmente se optimizan para la detección del virus o los virus diana. Esta optimización tiene en cuenta la labilidad del virus, el espectro de anfitriones, las posibles respuestas de punto final desencadenadas y cualquier requisito especial del virus o los virus diana. El uso de virus bien caracterizados como controles positivos en dichos ensayos ofrece garantía de que los métodos son aptos para el virus diana. La adición de cantidades conocidas del control positivo del virus a la matriz de la muestra de prueba permite al investigador medir la posible interferencia de la matriz y evaluar el límite de detección del método. Dichas consideraciones no son aplicables a los ensayos de detección viral. A continuación se discuten los análisis específicos del virus para materias primas de origen bovino y porcino. La evaluación de materias primas caprinas, ovinas, equinas, caninas y felinas también se estipula en 9 CFR sección 113.47. Esta sección se debe consultar con respecto a los virus que causan preocupación y 9 CFR 113.52 se debe consultar en lo que respecta a metodología. En la Tabla 2 se proporciona una lista de las líneas celulares indicadoras comúnmente empleadas y su aplicación en análisis de materias primas. También se proporciona una lista de las líneas celulares indicadoras comúnmente empleadas y su aplicación en la detección de virus específicos (ver Tabla 3). DETECCIÓN DE CONTAMINACIÓN CON VIRUS BOVINO Las materias primas de origen bovino incluyen componentes de los medios de cultivo empleados comúnmente, como suero fetal bovino y de ternera, albúmina sérica, colágeno, trombina y tripsina. Cada uno de estos aditivos representa una ruta de entrada para contaminantes virales adventicios en un cultivo celular o en un proceso de fabricación. Los requisitos para la evaluación de dichos materiales garantizan la ausencia de virus contaminantes. Para detalles sobre los análisis para suero bovino y sus derivados, ver el futuro capítulo general Suero Bovino (1024). DETECCIÓN DE CONTAMINANTES CON VIRUS PORCINOS Las materias primas de origen porcino incluyen tripsina, así como otros reactivos de cultivo celular. Los virus porcinos específicos que son motivo de preocupación en Estados Unidos se especifican en 9 CFR 113.47 e incluyen parvovirus, adenovirus, virus de la gastroenteritis transmisible y virus de la encefalitis hemaglutinante porcina. Además, las materias primas porcinas se deben evaluar para detectar la presencia de virus de la diarrea viral bovina (VDVB), reovirus y virus de la rabia. Los tejidos porcinos destinados a xenotransplante en humanos también se evalúan rutinariamente para retrovirus endógeno porcino (PERV). Las células huésped usadas generalmente en la detección de virus porcinos son células de testículos o riñón porcino, células bovinas y células Vero. La metodología descrita en 9 CFR 113.52 es análoga a la de la evaluación de materias primas bovinas e incluye la provisión de múltiples subcultivos para la tinción con Giemsa de células fijadas, análisis de hemadsorción y uso de inmunotinciones específicas de células fijadas. DETECCIÓN EN CÉLULAS DE VIRUS DIMINUTO DEL RATÓN El virus diminuto del ratón (MMV) es un parvovirus murino que se ha detectado en productos biológicos que involucran sustratos de células de hámster chino. Al igual que otros parvovirus, el MMV representa un caso especial pues el virus es difícil de inactivar con los agentes de limpieza usados corrientemente y es capaz de sobrevivir por periodos prolongados sobre las superficies. Los ensayos en células para MMV involucran líneas de células detectoras que son especialmente susceptibles a este virus, como la 324K (una célula humana) y la A9 (una célula de ratón). La optimización de la detección de un parvovirus incluye también la provisión de subcultivos de células detectoras que permanezcan en fase logarítmica de división durante una parte significativa del periodo de incubación. Los puntos finales para la detección de MMV incluyen uno o más de los siguientes: efecto citopático, hemaglutinación de eritrocitos de ratón y cobayo, inmunotinción y reacción en cadena de la polimerasa.
USP 39
Información General/ (1237) Métodos de Pruebas Virológicas 1925
DETECCIÓN EN CÉLULAS DE VIRUS TRANSMITIDOS POR INSECTOS Los virus transmitidos por insectos incluyen los virus que infectan solamente a células de insectos (p.ej., baculovirus) y los transmitidos a células de mamífero a través de insectos vectores (arbovirus). La detección de los primeros se puede lograr usando una célula de insecto como célula detectora. Los sustratos apropiados podrían incluir células de Spodoptera, Trichoplusia, Drosophila, mosquito u otro insecto. Tales células se cultivan por lo general a temperaturas más bajas (25º a 28º) que las células de mamífero y muchos de esos cultivos se hacen en forma semiadherente o en suspensión. Los puntos finales pueden incluir efecto citopático, microscopía electrónica y PCR. De mayor importancia para la seguridad del paciente es la detección de arbovirus (virus transmitidos por insectos que son infecciosos para animales y seres humanos). Esto se puede conseguir con el uso de una célula detectora de mamífero adecuada. La célula de riñón de hámster sirio (BHK-21) es una línea celular que muestra susceptibilidad a una amplia gama de arbovirus. Esta línea celular crece en un cultivo en monocapa y los puntos finales que podrían usarse incluyen efecto citopático, hemadsorción y hemaglutinación y PCR. DETECCIÓN EN CÉLULAS DE CITOMEGALOVIRUS HUMANO El citomegalovirus humano (CMV) es un virus de crecimiento lento, motivo de preocupación especial en productos biológicos elaborados con sustratos de células humanas. Puede detectarse en ensayos celulares usando células detectoras diploides humanas como Wl-38 o MRC-5, siempre y cuando se empleen periodos de incubación suficientemente largos (28 días o más). Los puntos finales incluyen efectos citopáticos e inmunotinción y/o PCR.
Métodos In Vivo Los animales intactos y susceptibles pueden servir como organismos anfitriones posibles para la detección de virus en muestras de prueba. En este caso, la proliferación viral en los tejidos del animal anfitrión puede reflejarse como efectos adversos para la salud (incluso la muerte) que se pueden monitorear y registrar. Los ensayos de detección viral que utilizan animales intactos están destinados a complementar los ensayos in vitro, dado que algunos virus que no causan una respuesta en los ensayos in vitro pueden ser detectables en los sistemas animales (y viceversa). Los estudios de seguridad viral que emplean animales vivos se deben efectuar de acuerdo con las normas regionales aplicables para el uso ético de animales, usando laboratorios acreditados para albergar los animales. DETECCIÓN VIRAL IN VIVO La detección viral in vivo se usa principalmente para bancos de células, lotes de siembra de virus y análisis de vacunas virales y se considera un complemento de los ensayos de detección viral in vitro. Para proporcionar una amplia gama de tejidos anfitriones y respuestas posibles se emplean múltiples especies animales, así como múltiples vías de inyección. En la Tabla 5 se muestra una lista de animales anfitriones, vías de inoculación y virus diana usados comúnmente. Tabla 5. Ensayos de Detección Viral In Vivo Animal Anfitrión Ratón lactante
Vía de Inoculación
Virus Diana
Inyección intraperitoneal
Arbovirus
Inyección intracraneana
Coxsackie A y B
Inyección Oral
Herpes simplex Tipo 1 y 2 Togavirus ]un in Herpes B
Ratón adulto
Cobayo
Inyección intraperitoneal
Rabdovirus
Inyección intracraneana
Togavirus
Inyección Oral
Virus de coriomeningitis linfocítica (LCMV)
Inyección intraperitoneal
Rabdovirus
Inyección intracraneana
LCMV Lassa ]unin Marburg Ebola Virus vaccinia
Huevos de gallina embrionados
Alantóico
Arbovirus
Saco vitelino
Virus de la encefalomielitis equina
USP 39
1926 (1237) Métodos de Pruebas Virológicas / Información General
Tabla 5. Ensayos de Detección Viral In Vivo (Continuación) Animal Anfitrión
Vía de Inoculación Membrana corioalantoidea
Virus Diana Virus del herpes Influenza Parotiditis Enfermedad de Newcastle Parainfluenza Tipos 1 y 2 Rabia Vaccinia Variola Linfogranuloma venéreo O mitosis
Después de la inyección de la muestra de prueba, cada modelo animal se monitorea durante un periodo apropiado que permite la observación de signos clínicos de infección viral. Cualquier anomalía se investiga para establecer la causa del efecto. Los ratones lactantes se observan por un tiempo adecuado. Los homogenizados combinados de todos los animales sobrevivientes se inoculan en camadas adicionales de ratones lactantes. Estas últimas se observan por un tiempo adicional adecuado. En los cobayos se observan los signos clínicos de infección viral y lesiones en el sitio de inyección. Para ciertos tipos de muestras de prueba se efectúa necropsia de macrolesiones tuberculares. Los fluidos alantoicos de los huevos se pueden analizar por hemaglutinación de eritrocitos de pollo, cobayo y humano tipo O. Los fluidos adicionales se combinan para cada grupo de tratamiento (artículo de prueba y control) y estos se inoculan en un nuevo grupo de huevos embrionados. Después de un periodo de incubación apropiado (que se mide por lo general en días), se analizan de nuevo los fluidos alantoicos por hemaglutinación de eritrocitos de pollo, cobayo y humano tipo O. Después de la inyección en el saco vitelino, los huevos se incuban durante 9 días como mínimo y se evalúa su viabilidad. Los sacos vitelinos se cosechan y combinan para cada grupo (artículo de prueba y control) y una solución al 10% del material resultante se inocula por la misma vía en un nuevo grupo de huevos embrionados. Los huevos se incuban de nuevo por un tiempo adecuado (días) y se evalúa su viabilidad.
ENSAYOS IN VIVO DESTINADOS A DETECTAR VIRUS ESPECÍFICOS Algunos ensayos in vivo están diseñados para detectar, si no virus específicos, cuando menos grupos de virus específicos. Los ensayos de producción de anticuerpos usan la producción de una respuesta inmune humoral en animales anfitriones susceptibles, inoculados con las muestras de prueba. La muestra de prueba se inyecta en varias especies de animales libres de anticuerpos virales. Al final de un periodo de incubación apropiado, se pueden efectuar uno o más ensayos de punto final para detectar en el suero del animal la generación de una respuesta humoral de anticuerpos. La producción en el animal de anticuerpos dirigidos contra un virus específico proporciona evidencia de la presencia de antígeno viral o de un virus infeccioso en la muestra de prueba. Este tipo de ensayo se usa generalmente para garantizar que los bancos de células de roedor y los lotes de siembra de virus están libres de virus adventicios. En la Tabla 6 se resumen tres ensayos de producción de anticuerpos, junto con la vía de inyección y los virus diana.
USP 39
Información General/ (1237) Métodos de Pruebas Virológicas 1927
"'dAI T a bl a 6 Ensayos dPd e nt cuerpos 1n VIvo e ro ucc1on Ensayo de Producción de Anticuerpos Vía de Inoculación Ensayo de producción de anticuerpos murinos (MAP)
Virus Diana
lntranasal
Ectromelia
lntraperitoneal
Hantaan
lntracraneano
Ratón K Virus elevador de la lactato deshidrogenasa Virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV)* Virus diminuto de ratón Adenovirus de ratón Citomegalovirus de ratón Virus de encefalomielitis de ratón de tipo 11 Virus de la hepatitis de ratón Diarrea epizoótica de los ratones lactantes Virus de la neumonía del ratón Poliomavirus Reovirus tipo 3 Sendai Virus tímico del ratón
Ensayo de producción de anticuerpos en el hámster (HAP)
lntranasal
Virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV)*
lntraperitoneal
Poliomavirus
lntracraneana
Reovirus tipo 3 Sendai Virus de simio 5
Ensayo de producción de anticuerpos de rata (RAP)
lntranasal
Hantaan
lntraperitoneal
Virus de Kilham de rata
lntracraneana
Virus de encefalomielitis de ratón de tipo 11 Poliomavirus Reovirus tipo 3 Sendai Virus Hl de Toolan Coronavirus y virus de sialodacrioadenitis de rata
• Un grupo de ratones inyectados con la muestra de prueba se desafían con una dosis letal conocida de LCMV auténtico. Si este grupo de ratones no muere con la dosis de desafío, se usa un segundo grupo con doble número de ratones para repetir el desafío. Si hay sobrevivientes en este grupo, la muestra de prueba se considera positiva para LCMV.
Consideraciones para la Validación, Calificación de la Matriz y Control de Calidad de Sistemas de Prueba en Células y Animales Se espera que los ensayos de detección viral usados para garantizar la seguridad viral de los métodos terapéuticos en seres humanos y animales hayan sido sometidos a validación. El enfoque de la validación depende de la naturaleza del ensayo y del grado de cumplimiento reglamentario asociado. Todo ensayo debe estar suficientemente desarrollado para que se pueda efectuar con una serie apropiada de criterios predeterminados de aptitud del sistema y criterios de aceptación. Estos criterios por lo general incluyen el uso de controles positivos y negativos pertinentes pero también pueden incluir requisitos para linealidad y para alcanzar un límite de detección predeterminado. Los resultados que indican una respuesta positiva o negativa en el ensayo se deben establecer antes de ejecutar la validación. Se espera que un ensayo efectuado en cumplimiento con las Buenas Prácticas de Fabricación haya sido validado de acuerdo con las pautas adecuadas. Un ensayo usado para garantizar la seguridad de un producto biológico comercializado en el mercado debe ser caracterizado además para aptitud en presencia de la matriz específica del producto. El estudio de calificación de la matriz debe tratar la posible interferencia específica con los puntos finales de detección viral usados en el ensayo y por lo general incluye la adición (spiking) de uno o más modelos de virus en la matriz del producto, en concentraciones que se aproximen al límite de detección, para garantizar la ausencia de interferencia. Para ensayos de detección cuantitativos, se debe establecer el límite de detección. Esto habitualmente involucra la adición del modelo de virus en cantidades decrecientes en el medio de cultivo o en la matriz del producto. La menor cantidad de virus adicionado que se detecta confiablemente se usa como una aproximación del límite real de detección del ensayo. Se espera que el error experimental de estos ensayos en cultivos de células esté entre 0,5 y 1 loglO" La determinación de un límite de detección es menos significativa para las pruebas de límite y los ensayos de detección viral en general. Para estos últimos, el
1928 (1237) Métodos de Pruebas Virológicas / Información General
USP 39
conocimiento de un límite de detección para un virus no implica un límite similar para otro. Dado que los ensayos de detección no se optimizan para un virus específico, el límite de detección para el ensayo puede variar enormemente de un virus a otro. Los sistemas de detección viral en animales, por lo general no están sujetos a los requisitos de validación, calificación de la matriz, uso de controles positivos y determinación del límite de detección que las agencias reguladoras esperan de las pruebas bioquímicas y en células. El uso de animales para análisis de seguridad está sometido a las pautas regionales para el uso ético de animales y los tipos de actividades enumeradas anteriormente por lo general no se consideran apropiadas para su uso en animales. Sin embargo, en estos ensayos se incluyen animales para control negativo, y en ocasiones es posible hacer una validación retrospectiva o un análisis de brechas basado en la incidencia histórica de fallas en la aptitud del sistema o hallazgos positivos.
DETECCIÓN DE COMPONENTES VIRALES La detección directa de componentes virales puede proporcionar una medición directa de las concentraciones virales en una preparación de muestra. Esto se ha vuelto especialmente importante para la detección o identificación de virus en productos biológicos o en las materias primas usadas en su fabricación. Actualmente se cuenta con sistemas capaces de identificar componentes exclusivos de fases específicas asociadas con la latencia y la replicación viral. En el transcurso de la interacción con sus células huésped, los virus pueden incorporar moléculas modificadas del anfitrión durante la producción de nuevas partículas de virus intacto o pueden inducir cambios apreciables en la constitución o función de la célula huésped. La mayoría de los métodos y reactivos inmunológicos disponibles en la actualidad detectan los constituyentes de viriones intactos. La relativa abundancia de estas proteínas es lo que los hace más aptos para el desarrollo de reactivos basados en anticuerpos. La abundancia de proteínas también los convierte en dianas óptimas para la detección del virus. Los reactivos recientemente desarrollados para seleccionar y detectar componentes virales menores que se pueden encontrar solamente durante fases específicas de la replicación, permiten un análisis más detallado de la etapa de infección viral. La metodología básica para la detección de antígenos virales está bien establecida pero las innovaciones más recientes en el desarrollo de materiales y reactivos han ampliado su aplicación. Los avances en la selección y detección de componentes del ácido nucleico viral han conducido a sistemas enzimáticos para la amplificación de ácidos nucleicos in vitro e in situ (ver Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Amplificación (1127)). La posible especificidad de este método de detección permite analizar con un alto grado de confianza los sistemas biológicos para la presencia o ausencia de un virus específico para el que está dirigido. Se cuenta con una gran variedad de reactivos, plataformas tecnológicas y metodologías. El objetivo de esta sección consiste en presentar minuciosamente las prácticas y plataformas más comunes usadas en la detección de componentes virales.
Selección y Preparación de la Muestra para la Detección de Componentes Virales Esta subsección presenta las consideraciones generales para los diversos tipos de muestras de prueba y dianas más comunes de los ensayos (proteínas y ácidos nucleicos virales). Las proteínas diana pueden tener grados variables de modificación postraduccional (p.ej., glicosilación, fosforilación) y los ácidos nucleicos diana pueden ser ARN o ADN, de cadena simple o doble. Por lo tanto, es importante tener una comprensión básica de la naturaleza fisicoquímica del virus en estudio, de manera que los procedimientos de manipulación de la muestra contribuyan a la detección del componente diana. Para consideraciones detalladas con respecto a la extracción de ácidos nucleicos, ver el capítulo de información general de la USP Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Extracción, Detección y Secuenciación (1126).
Tipos de Muestras CELULARES Cuando los componentes virales se asocian con células intactas, las muestras deben generarse como lisados completos de células o como fracciones subcelulares. Manteniendo la temperatura de las muestras de prueba cercana al punto de congelación (Oº a 4º) durante el procesamiento y limitando el tiempo que las muestras se mantienen descongeladas se reduce la posibilidad de pérdida de antígenos y ácidos nucleicos diana debido a enzimas citosólicas (proteasas, nucleasas), presentes en los lisados celulares. Se pueden usar reactivos que inactiven o limiten la actividad de dichas enzimas para evitar la degradación de los componentes diana, especialmente cuando se tienen que manipular muestras excepcionalmente lábiles a temperatura ambiente. La centrifugación de células intactas permite cierta manipulación adicional de la matriz de la muestra. Se puede descartar el medio de crecimiento y suspender las células en una solución amortiguadora formulada para mejorar la recuperación y detección del componente viral diana. Los parámetros de recolección y almacenamiento deben también tener en cuenta la presencia de ADN celular. Esto puede incrementar la viscosidad de la muestra, haciendo que el pipeteo sea más difícil.
USP 39
Información General/ (1237) Métodos de Pruebas Virológicas 1929
SOBRENADANTE DEL CULTIVO DE TEJIDOS Dependiendo de la etapa de la infección y el tipo de virus involucrado, el medio acondicionado puede representar la muestra de prueba preferida. Una ventaja es que la presencia de restos celulares puede reducirse usualmente por medio de un paso de centrifugación a baja velocidad (clarificación). La principal desventaja es la concentración posiblemente baja del analito y por lo tanto puede ser necesario concentrar la muestra. PROCESO INTERMEDIO (COSECHA A GRANEL NO PROCESADA) Por lo general, los análisis de seguridad viral para liberación del lote se hacen en la etapa de cosecha a granel antes de cualquier purificación. Esto se hace, independientemente de que el ensayo detecte virus infecciosos o componentes virales. La presencia de ADN de la célula huésped puede tener que evaluarse en el caso de productos biológicos fabricados en células animales.
Estabilidad de la Muestra y Efecto de la Matriz La estabilidad de la muestra es un elemento clave en la detección exitosa de los componentes virales. La estructura proteica puede alterarse por numerosos factores ambientales, incluidos el pH, la fuerza iónica, disolventes, detergentes, temperatura y radicales libres. Además, las matrices biológicas complejas frecuentemente contienen enzimas proteolíticas que pueden alterar o destruir las características antigénicas clave de una proteína o péptido. La recolección, almacenamiento y manipulación de las muestras deben permitir el mantenimiento de las características antigénicas a las que están dirigidos los anticuerpos de los reactivos. Los cambios que afectan la oportunidad de detección de un antígeno, son difíciles de tratar. Dependiendo de los reactivos requeridos para la detección, puede ser necesario hacer cambios conformacionales para la detección antigénica. Por ejemplo, si se producen anticuerpos para un sistema de detección de antígeno usando un antígeno viral nativo, entonces resulta esencial desenmascarar y mantener la conformación del antígeno durante toda la preparación de la muestra. En cambio, si se usan fragmentos de péptido para producir anticuerpos, entonces puede requerirse un paso de desnaturalización para permitir la detección eficaz del antígeno. Las condiciones asociadas con la preparación de la muestra se deben investigar en forma combinatoria, en donde un parámetro o componente se varía mientras los demás permanecen fijos. De esta manera, la formulación de soluciones amortiguadoras de lisis y procesamiento se pueden optimizar en cuanto a pH, fuerza iónica y tipos de detergentes y desnaturalizantes. Los pasos de preparación de la muestra deben acondicionar el antígeno diana con el fin de obtener la forma más fácilmente reconocida por el anticuerpo del reactivo. La estabilidad de los ácidos nucleicos en las muestras de prueba se ve afectada en gran medida por la actividad de las nucleasas presentes en la muestra y el grado de protección brindado por la estructura intacta de la partícula viral. Los ácidos nucleicos encapsidados son especialmente estables, siempre y cuando se mantenga la integridad de la cápside. Las cápsides virales son vulnerables a la digestión proteolítica. Las partículas virales almacenadas a temperatura ambiente como parte de una compleja matriz biológica son especialmente susceptibles a degradación por las proteasas. Para limitar la actividad proteolítica se puede realizar el almacenamiento a temperaturas refrigeradas (2º a 8º) por cortos periodos o a temperaturas por debajo del punto de congelación. Cuando las muestras se almacenan a temperaturas de congelación, se deben limitar los ciclos de congelación-descongelación. Bajo condiciones en las cuales una muestra individual se debe evaluar múltiples veces, se aconseja la preparación de alícuotas. RECOLECCIÓN DE LA MUESTRA En biotecnología, la recolección de la muestra está establecida por los planes de muestreo que cumplan con los requisitos reglamentarios. El análisis de ácidos nucleicos, en asociación con un paso de amplificación, tiene la posibilidad de detectar un virus en las etapas tempranas de la infección. El uso de métodos de amplificación de ácidos nucleicos reduce la dependencia del tiempo y la cantidad de material requerido, porque el proceso de amplificación potencia eficazmente la sensibilidad, al aumentar la cantidad de diana con respecto al fondo. Los aspectos generales de la preparación de la muestra de ácido nucleico y su estabilidad se discuten en Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Extracción, Detección y Secuenciación (1126). La siguiente sección trata específicamente los aspectos exclusivos de la selección y preparación de la muestra viral. ALMACENAMIENTO DE LA MUESTRA Las condiciones para el almacenamiento de la muestra deben ser acordes con el mantenimiento de las propiedades antigénicas de las proteínas virales diana y/o la preservación del contenido de ácido nucleico de la muestra. La duración y temperatura de almacenamiento están dictadas también por los ciclos asociados con el análisis.
1930 (1237) Métodos de Pruebas Virológicas / Información General
USP 39
DISRUPCIÓN DEL COMPLEJO INMUNE Se puede producir el enmascaramiento de los epitopes del antígeno cuando otras proteínas se asocian en el epitope o cerca del epitope contra el que están dirigidos los anticuerpos del reactivo. Para los antígenos virales esto puede ocurrir cuando el antígeno comprende el componente estructural del virus. Dichos antígenos virales tienen la probabilidad de conservar fuertes afinidades por otras proteínas virales o la habilidad de existir en forma multimérica en las condiciones normales de detección. Otro obstáculo para el reconocimiento del epitope es el complejo inmune que se forma naturalmente cuando los anticuerpos del reactivo se han desarrollado para detectar proteínas nativas en una matriz de plasma sanguíneo. Los complejos inmunes entre los antígenos virales y los anticuerpos del anfitrión son normales en tales muestras fisiológicas. Cuanto más fuerte sea la respuesta inmune del anfitrión, mayor será la probabilidad de enmascaramiento del antígeno, debido a la formación del complejo inmune. Los métodos que tienen como objetivo la preparación de muestras de sangre y plasma para la detección deben resolver la presencia de complejos inmunes preexistentes e incorporar pasos diseñados para producir la disrupción de dichos complejos, con el fin de mejorar la detección del antígeno viral.
Detección de Antígenos Virales Las proteínas de la cápside viral son objetivos comunes para los métodos de detección antigénica. Las proteínas estructurales que conforman el marco del núcleo viral son a menudo algunas de las proteínas virales más abundantes producidas durante la replicación viral. En virus que carecen de envoltura, las proteínas estructurales del núcleo tienen la probabilidad de proporcionar características antigénicas dominantes. Cuando el virus tiene envoltura, las proteínas asociadas con la envoltura a menudo proporcionan características antigénicas clave. Esta sección examina los métodos usados comúnmente para detectar antígenos virales y trata factores encaminados a optimizar la formación del complejo inmune apropiado. ENSAYOS USADOS PARA LA DETECCIÓN DE ANTÍGENOS VIRALES Las metodologías inmunológicas usadas para detectar antígenos virales se basan en la especificidad y afinidad del anticuerpo y la interacción con el antígeno viral. De las diversas plataformas disponibles, una comúnmente empleada en los análisis de seguridad viral es la tinción con anticuerpos inmunofluorescentes. Esto confiere cierto grado de especificidad viral a los métodos basados en células, descritos en la primera parte de este capítulo. Otras técnicas incluyen enzimoinmunoensayo (ELISA), radioinmunoensayo y transferencia Western. Los principios y métodos generales para estos ensayos se describirán en los capítulos de información general de la USP Métodos de Pruebas Inmunológicas-Consideraciones Generales (1102), Métodos de Pruebas Inmunológicas-Desarrollo de Reactivos (1103), Métodos de Pruebas Inmunológicas-Metodologías de lnmunoensayo (1104), y Métodos de Pruebas Inmunológicas-Diseño del Ensayo, Control de Calidad y Análisis de Datos (1105), que se están preparando para publicación futura. Las siguientes secciones tratarán de manera general aspectos específicos de su uso en virología. Ensayo de lnmunofluorescencia-EI ensayo de inmunofluorescencia (conocido también como tinción con anticuerpos inmunofluorescentes) se usa para detectar proteínas virales expresadas en diversos compartimientos celulares. Debido a que la técnica puede detectar antígenos virales dentro de células individuales, ofrece un alto grado de sensibilidad y permite detectar la infección en una etapa muy temprana. La técnica a menudo se emplea como punto final de detección en ensayos de infectividad viral en células para proporcionar sensibilidad y especificidad adicionales (ver pruebas para materias primas según lo descrito en 9 CFR 113.53). Además, la técnica se emplea para verificar la identidad de las suspensiones madre de virus (viral stocks) y es útil como medio de identifición de virus detectados en los ensayos de detección viral. Enzimoinmunoensayo (ELISA)-EI método ELISA está indicado para la detección de anticuerpos y antígenos solubles en una variedad de muestras de prueba. La sensibilidad, cuantificación, robustez, facilidad de uso, asequibilidad y bajo costo de los reactivos lo hacen adaptable a un ambiente de alto rendimiento. Para la detección de antígenos virales se usa comúnmente un ensayo ELISA tipo sándwich. Un anticuerpo específico contra el antígeno viral (de preferencia un anticuerpo monoclonal con alta afinidad), se inmoviliza primero en una fase sólida. La muestra de prueba se incuba luego durante un periodo predeterminado bajo las condiciones apropiadas. Después del lavado se incuba con un segundo anticuerpo que reconoce el antígeno viral. El segundo anticuerpo está unido a una enzima o a un reactivo cromomérico que, en presencia de un sustrato apropiado, emite una señal que puede registrarse con un instrumento adecuado. El ensayo se puede efectuar de manera cualitativa o cuantitativa. Para un ensayo ELISA cualitativo se requieren suficientes determinaciones repetidas de los controles positivo y negativo, con el fin de determinar el valor de corte y los criterios de aceptación apropiados. El valor medio de una muestra de prueba que sea igual o mayor que el valor de corte se considera positivo. Para un ensayo ELISA cuantitativo se debe realizar una curva estándar adicional con cantidades conocidas de un material estándar de referencia positivo. El número de determinaciones repetidas debe ser adecuado para determinar la variación y linealidad del ensayo. La cantidad de muestra de prueba se puede calcular por medio de la curva estándar. Radioinmunoensayo (RIA)-EI radioinmunoensayo es un inmunoensayo cuantitativo versátil que se puede usar para detectar sustancias que incluyen antígenos virales y anticuerpos. Incluso se puede aplicar a moléculas no proteicas, siempre y cuando se cuente con un anticuerpo que se una específicamente a la sustancia de prueba. Los radioinmunoensayos se pueden personalizar en formatos diferentes para adaptarse a los requisitos específicos de la prueba. Muchas de las consideraciones tenidas en cuenta con otros ensayos inmunológicos se aplican al RIA. En general, los radioinmunoensayos se pueden dividir en dos categorías principales: radioinmunoensayos en solución (homólogos) y radioinmunoensayos en fase sólida. Ambos métodos
USP 39
Información General/ (1237) Métodos de Pruebas Virológicas 1931
han sido usados exitosamente para detectar y cuantificar una gran variedad de antígenos virales o componentes de virus, como en la hepatitis A, By C; retrovirus humano y murino; adenovirus; virus aviar tipo C; virus de la rubeola y virus sincicial respiratorio. Transferencia Western (lnmunotransferencia)-La transferencia Western, también conocida como inmunotransferencia, se usa para identificar antígenos específicos en presencia de otros posibles antígenos de reacción cruzada. En este caso, la especificidad requerida se obtiene combinando la reacción antígeno-anticuerpo con alguna forma de separación (por lo general electroforesis). Dependiendo de los métodos de visualización empleados (incluidos métodos digitales como la densitometría), este método puede ser bastante sensible e incluso semicuantitativo. Una ventaja de este enfoque es que, además de detectar el antígeno usando un enfoque inmunológico, se pueden obtener los datos sobre la masa aproximada de la proteína diana. Una salvedad posible es que la mayoría de las proteínas de prueba se desnaturalizan durante este procedimiento y el anticuerpo que depende de la conformación del epitope puede no reconocer los epitopes lineales.
Detección de Ácidos Nucleicos Virales La detección de ácidos nucleicos virales proporciona otra vía para la determinación de las cargas virales y para establecer la identidad de un contaminante. Los ácidos nucleicos, como los antígenos proteicos, son componentes esenciales de los virus y las cantidades detectables son usualmente indicio de la presencia viral. Los ensayos de detección se pueden diseñar y desarrollar en algunos casos para analizar la viremia en fases, especialmente cuando la diferenciación de los ácidos nucleicos, junto con formas y configuraciones funcionales, puede proporcionar una visión clara de la actividad viral. Los ensayos se pueden diseñar para determinar si el ADN viral se ha integrado dentro del genoma anfitrión o sigue encapsidado. La viremia temprana se puede detectar en forma de transcritos de ARNm viral antes de la acumulación de partículas virales detectables. Los ácidos nucleicos pueden ser el único componente viral detectable de los virus que no se replican bien en los sistemas de cultivo de tejidos. Dichos sistemas pueden no producir partículas virales maduras, pero la detección de los transcritos virales permite comprender si el virus tiene la habilidad de infectar la célula. El análisis de ácidos nucleicos representa el punto final más útil para la detección de ciertos virus que no ocasionan respuestas cuando se usan puntos finales típicos. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA: CONSIDERACIONES ESPECIALES PARA EL ANÁLISIS DE ÁCIDOS NUCLEICOS La degradación de ácidos nucleicos en las muestras puede limitarse por medio de las prácticas adecuadas de almacenamiento y manipulación e incluso puede mejorarse si se enlazan los pasos de recolección y preparación de la muestra. Además de preparar ácidos nucleicos para procesamiento adicional, la desnaturalización es un paso importante para estabilizar los ácidos nucleicos cuando las temperaturas de almacenamiento suben por encima de Oº. Desnaturalización y Disociación de Viriones (Lisis Viral)-Los detergentes caotrópicos y las sales pueden ser agentes importantes de disrupción y remoción de las proteínas virales que constituyen la cápside viral. Su adición puede proporcionar un primer paso útil cuando la concentración de viriones no es necesaria o ni siquiera posible. En cantidad suficiente desnaturalizan rápidamente todo el contenido de una muestra biológica, fijando fundamentalmente el contenido del ácido nucleico a través de la inactivación de las nucleasas y otras proteínas que podrían afectar la estabilidad de la muestra. Las soluciones saturadas que contienen sales de guanidio, como el clorhidrato de guanidina o el isotiocianato de guanidina, se usan comúnmente para disociar los ácidos nucleicos de los componentes proteicos. Estas soluciones se pueden usar solas o en combinación con detergentes iónicos y otros desnaturalizantes como el fenol. La principal ventaja de las sales de guanidio es que se eliminan fácilmente durante la concentración de ácidos nucleicos virales, usando etanol o isopropanol. También se puede usar urea como agente desnaturalizante suave, aunque para alterar las partículas virales no funciona tan eficazmente como la guanidina. Desproteinización-La remoción de proteínas durante el procesamiento de las muestras para la detección de ácidos nucleicos virales es útil para garantizar la reproducibilidad y robustez de los ensayos, particularmente de aquellos que dependen de la amplificación para detectar cantidades excepcionalmente bajas de ácidos nucleicos. Se pueden usar varias estrategias para facilitar la desproteinización de la muestra, las cuales se discuten en Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Extracción, Detección y Secuenciación (1126). Recuperación de Ácidos Nucleicos Virales-La separación y recuperación de los ácidos nucleicos extraídos son pasos importantes en el análisis de ácidos nucleicos. El rendimiento y la pureza del ácido nucleico obtenido en este paso son factores determinantes críticos de la robustez del ensayo. Una mala recuperación y una limitada purificación del ácido nucleico pueden inhibir la amplificación y la reacción de detección, dando como resultado un ensayo de baja sensibilidad. El desarrollo de pasos de recuperación de alto rendimiento y alta pureza es una meta importante en la optimización de los métodos de detección de ácidos nucleicos. Los detalles sobre los aspectos generales de la extracción y detección de ácidos nucleicos se discuten en Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Extracción, Detección y Secuenciación (1126). Sin embargo, si no se identifican componentes inhibidores en el sistema, la prueba directa de una alícuota de la muestra puede aumentar la sensibilidad del ensayo. Aislamiento del ADN Viral-Los genomas virales integrados se deben recuperar y procesar junto con el genoma de la célula huésped. El genoma viral se analiza dentro del contexto del genoma anfitrión y por lo tanto, las similitudes entre los genomas del virus y del anfitrión se deben tener en cuenta para garantizar que los resultados del ensayo sean específicos del virus y no reflejen simplemente la presencia de secuencias del genoma anfitrión en reacción cruzada. Los genomas virales que existen como entidades episomales requieren consideración similar, pero pueden haber oportunidades durante la preparación de la muestra para limitar la cantidad de ácido nucleico anfitrión presente en la preparación. Los gradientes de sedimentación o la
1932 (1237) Métodos de Pruebas Virológicas / Información General
USP 39
cromatografía de separación en sílice pueden a menudo usarse para enriquecer ácidos nucleicos episomales por medio de exclusión relacionada con el tamaño o fraccionamiento de los ácidos nucleicos procesados. La recuperación de genomas virales encapsidados puede permitir obtener cantidades más grandes de material, especialmente si el virus diana se ha acumulado en gran cantidad en el sistema que se está monitoreando. Cuando la cantidad de material disponible para la recuperación es baja o el procesamiento de grandes cantidades del material resulta poco práctico, el proceso de aislar y acondicionar las partículas del virus y subsiguientemente el genoma encapsidado, tiene que ser compatible con el sistema del ensayo que se usará. Puede ser necesario amplificar las porciones del genoma viral, o puede capturarse el genoma mismo en un proceso elaborado que permita la detección a través de la generación de una señal amplificada. Puede ser necesario modificar apropiadamente un método estándar para aislar genomas virales, con el fin de garantizar que los materiales usados en la preparación no interfieran con los pasos efectuados más tarde en el proceso. Los genomas virales constituidos por ARN se convierten por lo general en ADN intermediario que es más fácil de manipular y almacenar. Sin embargo, los métodos destinados al aislamiento de genomas virales constituidos por ARN requieren consideraciones similares en lo que respecta a la localización del genoma: los genomas virales de ARN replicante pueden recuperarse como parte de una preparación de ARN total anfitrión o incluso de ARNm si el genoma contiene secuencias poliA. El ARN se presta más eficazmente para métodos de captura de híbridos durante el aislamiento, y la captura de híbridos se puede usar para enriquecer preparaciones de ARN, específicamente para genomas virales de ARN. Los genomas de ARN se pueden extraer de partículas de virus en una forma similar a la extracción de genomas virales de ADN. Los genomas de ARN se convierten a secuencias complementarias (ADNc) usando RT retroviral. El almacenamiento es un tema de preocupación importante para los ARN virales desnudos. El almacenamiento de ARN usualmente requiere temperaturas por debajo de -20º.
Detección de Genomas Virales Frente a Transcritos Virales Los genomas virales existen como ADN o ARN; algunas veces como ambos: en el caso de retrovirus, el genoma integrado es ADN, mientras que la forma encapsidada es ARN. La habilidad para diferenciar entre las diversas formas de ácidos nucleicos virales puede ayudar a dilucidar el curso de las infecciones virales específicas. Los ensayos de actividad de los ácidos nucleicos pueden diferenciar fácilmente entre genomas integrados y encapsidados cuando la forma del ácido nucleico viral varía entre un estado y otro, como es el caso de los retrovirus. La incorporación de nucleasas específicas dentro de la metodología del ensayo se puede usar para reducir o eliminar una forma y dejar la otra. Si se sabe que los genomas virales se integran en sitios específicos dentro del genoma anfitrión, se pueden desarrollar cebadores y sondas alrededor del sitio de integración e incorporar elementos significativos, tanto del genoma anfitrión como del genoma viral. Algunos ARNm virales contienen sitios de empalme y la diferenciación de secuencias de ácido nucleico empalmadas de secuencias no empalmadas crea un mecanismo único para determinar el estado de localización e infección del ácido nucleico. CARACTERIZACIÓN DE GENOMAS VIRALES DE ADN Los métodos para la recuperación y preparación de genomas virales para la caracterización dependen del estado del genoma viral. Si el genoma ha sido incorporado dentro de un compartimiento celular, la estrategia de recuperación y preparación debe tener en cuenta los componentes celulares que constituyen la matriz de la muestra. Si el genoma viral al que se dirige el análisis está en forma encapsidada, los métodos deben enfocarse en la recuperación de la partícula viral e incluir pasos adicionales encaminados a extraer el ácido nucleico de las partículas individuales. La identificación y caracterización de los genomas virales requiere sondas y cebadores específicos de ácido nucleico complementario, cuya secuencia dependerá de la información disponible sobre la secuencia de los ácidos nucleicos virales diana y del tipo de ensayo que se usará. La determinación de la secuencia del ácido nucleico viral de interés por lo general proporciona el medio más inequívoco para la caracterización. Sin embargo, se pueden usar un gran número de métodos como indicadores simples de la presencia o ausencia de características específicas basadas en la secuencia. Por ejemplo, se pueden usar los perfiles de la curva de fusión, usando secuencias cortas de oligonucleótido, para establecer si un genotipo viral específico está presente. IDENTIFICACIÓN Y ANÁLISIS DEL GENOTIPO El análisis de ácidos nucleicos se usa a menudo para identificar aislamientos virales obtenidos de los ensayos de detección viral o para proporcionar la identidad de suspensiones madre de virus. Los métodos usados para la identificación de genomas virales se usan en otras aplicaciones en el campo de la biología molecular. Por lo general, se requiere un paso de amplificación con el fin de conseguir cantidades suficientes para el análisis. Se puede emplear la secuenciación amplificada de los amplicones o la aplicación de una técnica estándar de hibridación para obtener más detalle sobre la naturaleza de la señal amplificada. Para obtener más detalles, consulte Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Amplificación (1127). TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN Una gran variedad de técnicas de hibridación se usan para detectar las secuencias de ácido nucleico viral, incluidas transferencia de Southern (Southern blot), transferencia Northern (Northern blot), protección de ADNasa y ARNasa, hibridación in
USP 39
Información General/ (1237) Métodos de Pruebas Virológicas 1933
situ, tecnología de microarreglos o micromatrices (microarray) y otras técnicas. La descripción de estos métodos está fuera del alcance de este capítulo y puede encontrarse en Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Extracción, Detección y Secuenciación (1126).
DETECCIÓN DE ANTICUERPOS CONTRA ANTÍGENOS VIRALES Se cuenta con una gran variedad de métodos para la detección y cuantificación de anticuerpos contra agentes virales que incluyen neutralización, fijación de complemento e inmunoensayos basados en reactivos enzimáticos o marcados con fluorescencia. Aunque muchos detalles de los métodos inmunológicos mencionados anteriormente están fuera del alcance del capítulo, esta sección trata aspectos específicos de la aplicación de la detección de anticuerpos virales, incluyendo la preparación y almacenamiento de las muestras de prueba, los métodos de ensayo y las plataformas comunes disponibles, así como ejemplos específicos de cómo pueden usarse estos ensayos para medir anticuerpos contra agentes virales específicos.
Estructura Viral con Respecto a la Composición Antigénica y Selección del Ensayo de Anticuerpos Los virus de mamífero varían considerablemente en su contenido de ácidos nucleicos, y por lo tanto, en la cantidad de proteínas antigénicas producidas, específicas del virus. Muchas de las proteínas o glicoproteínas son sumamente antigénicas e inducen una potente respuesta inmune humoral durante la infección natural, tanto en modelos humanos como animales. En la mayoría de los casos, el sistema inmunitario responde cuando el virus y su antígeno aparecen en el líquido extracelular o en las membranas de las células infectadas. El grado en el cual se expresan los antígenos virales está gobernado por la replicación intracelular y la síntesis de proteínas de los virus en los tejidos de los órganos anfitriones, así como por varios tipos posibles de interacción de la célula huésped y el virus. Los anticuerpos producidos como resultado de la infección viral natural probablemente representen la respuesta más amplia a los antígenos en su estado nativo. Al seleccionar, desarrollar o evaluar un método de ensayo para la medición de anticuerpos contra las proteínas virales, el analista debe tener en cuenta la fuente de los anticuerpos y el método por el cual se obtuvieron o prepararon. Los detalles se presentarán en Métodos de Pruebas Inmunológicas-Desarrollo de Reactivos (1103) y Métodos de Pruebas Inmunológicas-Metodologías de lnmunoensayo (1104).
Consideraciones Generales Relacionadas con la Preparación de la Muestra para la Detección de Anticuerpos contra Antígenos Virales Los anticuerpos son relativamente estables, pero se debe tener cuidado de garantizar la integridad de los anticuerpos de la prueba durante la preparación y almacenamiento de la muestra. Se pueden desarrollar pruebas serológicas para medir anticuerpos contra agentes virales en líquidos biológicos sin fraccionar. Se debe considerar la posibilidad de interferencia de la matriz con el método de detección del anticuerpo. En general, las muestras biológicas de prueba se deben clarificar por centrifugación o filtración, dependiendo de su uso previsto. Las muestras de suero no deben estar hemolizadas, lipémicas ni ictéricas. En ciertos casos, la muestra se debe tratar también con calor para inactivar el complemento endógeno y otros componentes. Las muestras de prueba se deben procesar tan pronto como sea posible. Cuando sea necesario almacenar muestras, la mayoría de las muestras de prueba se deben almacenar a -20º durante corto tiempo y por debajo de -80º en caso de almacenamiento prolongado. Para todas las muestras, es necesario evaluar experimentalmente la estabilidad del material. Se deben preparar alícuotas del volumen apropiado, de acuerdo con los procedimientos de la prueba, para evitar ciclos innecesarios de congelación-descongelación.
Métodos para Anticuerpos Esta sección discute los métodos principales para detectar anticuerpos contra antígenos virales. Los métodos de ensayo incluyen a menudo una variedad de formatos alternativos para la detección de anticuerpos. En esta sección sólo se discuten los formatos más comúnmente usados para la detección de anticuerpos. Algunos métodos, incluidos los ensayos de anticuerpos fluorescentes y los enzimoinmunoensayos se pueden aplicar ampliamente en la detección de anticuerpos contra muchos agentes virales diferentes; otros se limitan a virus seleccionados que tengan determinadas propiedades (ej., hemaglutininas). MICROSCOPÍA DE INMUNOFLUORESCENCIA PARA DETECCIÓN DE ANTICUERPOS Cuando el isotiocianato de fluoresceína (FITC) se une químicamente a una molécula de anticuerpo, el anticuerpo marcado con FITC resultante puede usarse como una sonda de anticuerpo secundario para detectar la presencia de un anticuerpo primario específico contra el virus, unido a una célula infectada por el virus sobre un portaobjetos para microscopio (inmunofluorescencia indirecta).
1934 (1237) Métodos de Pruebas Virológicas / Información General
USP 39
El ensayo de inmunofluorescencia indirecta o del anticuerpo fluorescente indirecto (AIF) es uno de los métodos más básicos y útiles para la detección de anticuerpos contra los virus. El ensayo se puede usar para detectar anticuerpos de las clases lgG e lgM específicos contra el virus. Cuando el ensayo se usa para detectar anticuerpos lgM, por lo general requiere la remoción física o la inactivación y unión de anticuerpos lgG. En ausencia de este paso, la presencia de anticuerpos específicos lgM puede estar enmascarada por un exceso de anticuerpo específico lgG compitiendo por los sitios de unión primarios sobre la superficie del sustrato. Los ensayos AIF pueden ser cualitativos o cuantitativos. El ensayo AIF para anticuerpos contra agentes virales requiere el uso de células infectadas por el virus que expresen antígenos virales en las membranas celulares. Las suspensiones madre de virus se preparan, titulan y usan para infectar células permisivas en cultivos de tejido. Las células se recolectan en los momentos apropiados, se lavan y se colocan sobre portaobjetos de múltiples pocillos en una densidad apropiada. También se preparan portaobjetos de control con células sin infectar. Los portaobjetos se dejan secar al aire y se fijan con acetona fría. Los portaobjetos fijados se pueden almacenar en condiciones apropiadas durante periodos prolongados. Se debe confirmar la estabilidad de los antígenos virales con el tiempo. El artículo de prueba que se va a examinar para la presencia de anticuerpos específicos contra el virus se puede aplicar al portaobjetos, seguido de un anticuerpo secundario apropiado, conjugado con una marca fluorescente que se pueda visualizar con un microscopio de fluorescencia. Los anticuerpos específicos lgG o lgM se pueden distinguir usando un anticuerpo secundario apropiadamente preparado. La lectura e interpretación correcta de los puntos finales del método AIF para la detección de anticuerpos sobre portaobjetos, requieren un analista experimentado, en especial cuando la ubicación celular y los patrones de fluorescencia son críticos para un virus específico. Dicha interpretación requiere el uso de controles apropiados y asignación de calificación (scoring) o intensidad de la fluorescencia. Esto depende en gran medida de la calidad de los reactivos, del microscopio de fluorescencia y la fuente de luz que se está usando, así como de la experiencia del analista. ENZIMOINMUNOENSAYO PARA LA DETECCIÓN DE ANTICUERPOS El EIA y sus variaciones son los métodos más ampliamente usados para la detección de anticuerpos virales en suero y otros productos biológicos. El EIA más usado para la detección de anticuerpos se conoce como EIA en fase sólida no competitivo para la detección de anticuerpos. La configuración típica de un EIA para anticuerpos involucra el recubrimiento de tubos o placas de micropocillos con antígenos virales, la adición del suero o producto de prueba a los tubos o pocillos, la unión del anticuerpo específico del suero o producto al antígeno y la detección del anticuerpo unido por adición de un segundo anticuerpo con afinidad de unión al anticuerpo primario, el cual está marcado para permitir su detección. Los ensayos pueden ser específicos para anticuerpos de clase lgG o lgM o pueden detectar anticuerpos totales. Los ensayos para lgM pueden mejorar su especificidad cuando se efectúan como ensayos de captura de lgM. Estos ensayos involucran el uso de placas o pocillos recubiertos con anticuerpos anti lgM para capturar la lgM total en el suero o producto como primer paso. Posteriormente se agrega el antígeno viral que se une a la placa sólo si el anticuerpo lgM específico contra el virus ha sido capturado inicialmente y se detecta por adición de un segundo anticuerpo marcado, específico contra el antígeno viral. El ensayo se efectúa con mucha frecuencia como una medida cualitativa de la presencia de un anticuerpo contra un virus específico. Se requieren suficientes determinaciones repetidas de los controles positivo y negativo con el fin de determinar el valor de corte apropiado y el criterio de aceptación. Se considera positivo un valor medio de una muestra de prueba que sea igual o mayor que el valor de corte. PRUEBA DE FIJACIÓN DEL COMPLEMENTO La fijación del complemento tiene un valor selectivo al permitir ensayos simultáneos de anticuerpos frente a una gran variedad de agentes virales. El procedimiento involucra múltiples variables que constan de dos pares de reacciones antígeno-anticuerpo. La primera reacción entre un antígeno viral conocido y un anticuerpo específico en la muestra de prueba, tiene lugar en presencia de una cantidad predeterminada de complemento exógeno. El complemento es consumido por el complejo antígeno-anticuerpo. La segunda reacción antígeno-anticuerpo consta de eritrocitos de oveja (SRBC) y hemolisina (anticuerpo contra SRBC). Cuando se agrega este sistema indicador a la mezcla de la reacción, los SRBC sensibilizados se lisan sólo en presencia de complemento libre. El grado de lisis de los SRBC se correlaciona inversamente con la cantidad de anticuerpo en el artículo de prueba. El procedimiento experimental involucra la titulación óptima de las concentraciones de suero hemolítico, complemento y antígeno viral, usando un formato de tablero de ajedrez. Si se usa suero humano como muestra de prueba, se debe incubar a 56º durante 30 minutos, con el fin de inactivar el complemento endógeno. Se deben correr un número importante de controles junto con la prueba y sus resultados deben estar dentro de los límites antes de que la prueba se pueda interpretar adecuadamente. Estos incluyen la sensibilidad de los SRBC a la lisis y la concentración de complemento usada. La cantidad relativa presente del anticuerpo específico contra el virus se puede determinar analizando diluciones seriadas del suero o producto. El título de la fijación de complemento es la inversa de la dilución más alta que evita el 50% de la hemólisis.
USP 39
Información General/ (1237) Métodos de Pruebas Virológicas 1935
NEUTRALIZACIÓN PARA DETECCIÓN DE ANTICUERPOS La neutralización para medir los anticuerpos contra agentes virales es todavía uno de los ensayos más valiosos disponibles, debido a su alta especificidad y a su habilidad para detectar anticuerpos neutralizantes. La neutralización se define como la pérdida de infectividad viral por medio de la unión de anticuerpos específicos a las proteínas de la cubierta viral (o glicoproteínas de la envoltura) sobre la superficie de la partícula viral infecciosa. El ensayo se puede usar para medir la presencia de anticuerpos contra un virus conocido en una muestra de suero o producto, o por el contrario, para identificar un virus desconocido, usando una muestra de suero o producto que contiene anticuerpos conocidos. Antes de efectuar un ensayo de neutralización para medir la presencia de anticuerpos en el suero o producto, se debe hacer crecer un virus conocido y se lo debe titular en el sistema de prueba en el cual se va a llevar a cabo el ensayo de neutralización. En el caso de virus preparados en cultivo celular, esto usualmente involucra la inoculación de cultivos susceptibles con relativamente baja multiplicidad de infección (MOi <1 UFP por célula) y la recolección de las células infectadas cuando se demuestra un efecto citopático (CPE) de 50% a 75%. La preparación del virus se titula entonces efectuando diluciones seriadas múltiples e inoculando varios tubos repetidos o placas de cultivo con un volumen fijo de la preparación del virus. El punto final de la titulación es la dilución del virus que afectará al 50% de los cultivos celulares inoculados. Se dice que este punto final contiene una dosis infecciosa 50 de cultivo tisular (DICT50) en el volumen utilizado. Si el sistema de prueba involucra letalidad animal, el punto final se conoce como una dosis letal 50 (DL50). La cantidad de virus usada en el ensayo de neutralización que sigue se estandariza por lo general para que contenga 100 DICT50 o DL50 • El sistema de prueba o anfitrión usado en los ensayos de neutralización se escoge en base al virus específico que se va a analizar y su capacidad para replicarse en el sistema. Los sistemas anfitriones comúnmente usados incluyen cultivos celulares, huevos de gallina embrionados y ratones. El cultivo celular es habitualmente el sistema preferido, ya que los virus usados en el ensayo de neutralización se replican y producen CPE fácilmente. Las células huésped susceptibles se desarrollan en monocapas en cultivos en cápsulas o placas de múltiples pocillos. Después de agregar la mezcla de virus y suero neutralizante, los cultivos se cubren con medio de cultivo que contenga agar para restringir la diseminación de CPE y permitir el desarrollo de placas virales. La prevención del desarrollo de placas indica la presencia del anticuerpo neutralizante. Como alternativa, la neutralización se puede efectuar en cultivos en monocapa en tubo o incluso en cultivos tisulares en suspensión. Los huevos embrionados se pueden usar cuando el virus que se va a usar o analizar no produce placas en los sistemas de cultivo tisular. La vía de inoculación y el punto final dependen del virus. Los ensayos de neutralización se pueden configurar de diversas maneras, dependiendo del virus específico de interés y del suero o producto en el que se va a analizar la actividad neutralizante. En general, una cantidad fija de virus infecciosos se preincuba con el suero o producto en el que se va a analizar la actividad neutralizante sin diluir y en diluciones seriadas, y por separado, con suero preinmune o producto de control; este enfoque se conoce como método de virus constante-suero variable. Después de la preincubación, las mezclas se inyectan o se agregan por separado al sistema de prueba. La reducción en infectividad entre el suero o producto de prueba y el control se mide de diversas maneras, dependiendo del sistema de prueba. El punto final del ensayo se define generalmente como la dilución más alta del suero o producto que neutraliza la mitad del inóculo viral inicial, calculado por el método de Reed-Muench o de Spearman-Karber. El título de anticuerpo neutralizante en el suero o producto de prueba es la inversa de la dilución más alta que inhibe completamente el CPE u otro efecto del virus en el sistema de prueba. Se dice que esta dilución contiene 1 unidad de anticuerpo neutralizante por unidad de volumen usado en la titulación. Cuando un suero o producto que contiene anticuerpo neutralizante se usa en un ensayo para determinar la identidad de un virus desconocido, generalmente se usan 20 unidades de anticuerpo neutralizante en un volumen fijo. Los sueros de control positivo y negativo deben dar la reactividad esperada en el ensayo. INHIBICIÓN DE LA HEMAGLUTINACIÓN (HAI) Los virus con envoltura que incluyen los virus de influenza y parainfluenza, adquieren en su superficie los receptores proteicos capaces de unirse a los eritrocitos (hemaglutininas) de diversas especies animales, a medida que pasan a través de las membranas plasmáticas de la célula infectada durante la maduración viral. Además, algunos virus sin envoltura, como los adenovirus y ciertos enterovirus, tienen hemaglutininas en su cápside externa. Esta propiedad permite la detección de un virus específico en una muestra, si está disponible un anticuerpo específico conocido contra el virus. Como alternativa, se puede detectar la presencia de un anticuerpo específico contra el virus y cuantificarse por su habilidad para inhibir la hemaglutinación. Este es el principio de la prueba de inhibición de la hemaglutinación (HAI). La prueba de HAI para anticuerpos se efectúa preparando diluciones seriadas de la muestra que se va a analizar y mezclando las diluciones con una cantidad fija del virus o de la hemaglutinina viral en un tubo o placa de microtitulación. Se agregan los RBC indicadores de la especie animal apropiada, se mezcla la suspensión y los tubos o placas se dejan en reposo por un tiempo predeterminado. Si el anticuerpo específico está presente, el virus se unirá y los RBC no se aglutinarán; se sedimentarán en el fondo del tubo o placa y formarán un "botón" de RBC. Si el anticuerpo específico está ausente, los RBC serán aglutinados por el virus y formarán una película difusa. El título del suero o producto es la inversa de la dilución que inhibe completamente la aglutinación. La HAI es muy útil para subtipificar aislados de virus de la influenza. Una serie de factores contribuyen a la posible variabilidad de la prueba HAI. Ciertas muestras de suero y productos pueden contener inhibidores no específicos de las aglutininas de
1936 (1237) Métodos de Pruebas Virológicas / Información General
USP 39
RBC, lo cual puede arrojar resultados falsos positivos. Se ha desarrollado un gran número de procedimientos para eliminar dichos inhibidores, que incluyen procedimientos de adsorción e inactivación por calor. Las muestras pueden contener también aglutininas de RBC distintas del anticuerpo específico y éstas pueden contribuir a los resultados falsos negativos. La preparación y titulación apropiadas de los reactivos, incluyendo las suspensiones madre y de trabajo de RBC y hemaglutininas virales, son críticas. Además, los controles para aglutinación no específica o inhibidores de la aglutinación deben incluirse en todos los ensayos. ENSAYO WESTERN BLOT (O INMUNOTRANSFERENCIA) PARA LA DETECCIÓN DE ANTICUERPOS El ensayo de inmunotransferencia o Western blot es una técnica para la detección simultánea de anticuerpos contra diversos antígenos proteicos de un virus determinado. El término ensayo de inmunotransferencia recombinante (RIBA) se aplica cuando las mezclas de proteínas iniciales son proteínas recombinantes obtenidas a partir de sistemas de expresión de células procarióticas o eucarióticas en lugar de virus crudos o parcialmente purificados, provenientes de células infectadas. El método se usa a menudo en forma diagnóstica como una prueba complementaria o confirmatoria, en situaciones donde un ensayo inicial para anticuerpos carece de la suficiente especificidad o se sabe que tiene tendencia a arrojar resultados falsos positivos. Esto es especialmente importante cuando la prueba se está usando para el diagnóstico de una infección de importancia clínica como la infección por el VIH o el VHC. Están diponibles en el mercado numerosos kits de inmunotransferencia, en especial para virus como VIH o VHC; varios de ellos cuentan con aprobación reglamentaria para uso diagnóstico. Como alternativa, se pueden producir internamente preparaciones de antígeno viral o comprarse, junto con otros reactivos requeridos para los ensayos. El control cuidadoso y/o la fuente de estos reactivos son críticos para garantizar que se mantenga el cumplimiento de los requisitos. Para agentes virales seleccionados, existen estándares interpretativos generalmente aceptados para el análisis de reactividad o resultados positivos en un ensayo de inmunotransferencia. Sin embargo, la presencia de bandas no específicas se puede deber a reactividad del anticuerpo con los antígenos proteicos celulares ocasionados por enfermedades autoinmunes y/o al uso de proteínas crudas de células infectadas por el virus como el antígeno en el ensayo. También pueden ocurrir reacciones indeterminadas si sólo se observa un número limitado de bandas de anticuerpo específicas. Los sueros apropiados para control positivo y negativo deben estar incluidos en cada ensayo y su reactividad se debe medir tanto para la presencia como para la intensidad de las bandas proteicas esperadas.
Aplicación de los Métodos para Detección de Anticuerpos contra Virus Específicos Los patógenos transmitidos por la sangre humana que pueden estar presentes en forma infecciosa en sangre humana de donantes, usada directamente en la elaboración de productos biológicos, son motivo de preocupación porque pueden presentar un riesgo de transmisión a otros. El análisis de anticuerpos específicos del virus en sangre de donantes sirve como procedimiento de tamizaje para la eliminación de las unidades sospechosas. Como alternativa, los virus pueden representar agentes importantes para los cuales se han desarrollado o se están desarrollando vacunas humanas. Por lo tanto, la habilidad para detectar anticuerpos específicos contra el virus en un individuo o modelo de animal inmunizado puede ser importante para demostrar la eficacia de la vacuna. Actualmente, en Estados Unidos, se puede efectuar un gran número de pruebas de tamizaje o definitivas, aprobadas por la FDA, sobre unidades de sangre de donantes, para evidenciar la presencia de agentes de enfermedades infecciosas, que incluyen los virus de las hepatitis By C, el virus de la inmunodeficiencia humana y el virus del Nilo occidental. Además, el plasma enviado para fraccionamiento antes de la elaboración de productos derivados de plasma debe examinarse para virus de hepatitis A (VHA) y parvovirus humano B-19.
GLOSARIO Adición: Acción de agregar una cantidad conocida de analito de un estándar de laboratorio que actúa como rastreador para verificar un método para la recuperación o exactitud. ADNc: ADN Complementario. Dos hebras de ácido nucleico que se pueden hibridizar por apareamiento de bases específicas entre los nucleótidos. Agente Adventicio: Contaminante accidental adquirido en una línea celular, como virus y toxinas; el agente es a menudo infeccioso. Amplicón: Segmento de ADN generado por el proceso de PCR, cuya secuencia está definida por cebadores directos e inversos. Anticuerpo: Molécula proteica para combatir infecciones y que se une, neutraliza y ayuda a destruir microorganismos extraños o toxinas. También conocidos como inmunoglobulinas, los anticuerpos son producidos por el sistema inmunitario en respuesta a antígenos. Antígeno: Cualquier agente que induce la producción de un anticuerpo y reacciona específicamente con él. Aptitud del Sistema: Verificación de un sistema para garantizar el desempeño del mismo antes o durante el análisis de incógnitas. Los parámetros como el recuento en placa, el factor de asimetría, la resolución y la reproducibilidad se determinan y
USP 39
Información General/ (1237) Métodos de Pruebas Virológicas 1937
comparan contra las especificaciones fijadas para el método. Estos parámetros se miden durante el análisis de una muestra de aptitud del sistema, la cual es una mezcla de los componentes principales y los subproductos esperados. Banco de Células: Población definida de células, como una línea celular inmortalizada, desarrollada por un proceso definido y crioconservada en un proceso definido y dentro de una cantidad de pasajes definida. La suposición es que cada vial de un banco celular es comparable a otro y que cuando se descongela y agrega a un recipiente de fabricación (o a un ensayo analítico) se desempeñará de manera uniforme. Bioensayo: Método analítico que emplea animales vivos, células, tejidos u organismos como sujetos de prueba. Caotrópico: Reactivo que causa la disrupción de la estructura molecular; en particular, aquellas formadas por fuerzas no covalentes como los puentes de hidrógeno, las fuerzas de van der Waals y el efecto hidrófobo. Cápside: Cubierta proteica externa de una partícula de virus. Citopático: Que daña las células, haciendo que exhiban signos de enfermedad o muerte celular. Complemento: Grupo de proteínas de la sangre que funciona conjuntamente con otras proteínas y células (como anticuerpos) del sistema inmunitario para atrapar sustancias extrañas. Confluencia: Se refiere al punto en el cual 100% del área superficial del recipiente está cubierto de células. Cosecha a Granel: Ver Cosecha a Granel No Procesada. Cosecha a Granel No Procesada: Cosecha combinada de líquidos de cultivo celular que constituye una mezcla homogénea para fabricar un único lote de producto. Crioconservante: Reactivo usado para mantener viva una célula en condiciones de congelación intensa (por lo general en nitrógeno líquido). Criterios de Aceptación: Resultados anticipados, que pueden ser límites numéricos, intervalos u otra caracterización para las pruebas descritas. Establecen los estándares a que se debe ajustar un fármaco o medicamento con el fin de ser considerado aceptable para su uso previsto. DICT50 : Dosis infecciosa 50 de cultivo tisular. Grado de dilución de un virus en el cual la mitad de una serie de pocillos de laboratorio contiene virus activos, en crecimiento. ELISA: Enzimoinmunoensayo. Técnica bioquímica utilizada para detectar la presencia de anticuerpos o antígenos en una muestra. Ensayo de punto final: Método analítico que mide la cantidad de producto acumulado al final del ensayo. Epitope: Región molecular en la superficie de un antígeno que es reconocida por un anticuerpo y se puede combinar con el anticuerpo específico producido por tal respuesta; también llamado determinante o determinante antigénico. Glicoproteína: Proteína que contiene cadenas laterales de azúcar agregadas como un proceso postraduccional; la presencia de cadenas laterales de azúcar a menudo afecta la actividad, antigenicidad y estabilidad in vivo. ICH: Conferencia Internacional sobre Armonización de Requisitos Técnicos para el Registro de Productos Farmacéuticos para Uso Humano. Límite de Detección (LOD): Concentración más baja de un analito en una muestra que se puede detectar, pero que no se cuantifica. Es una prueba de límite que especifica si un analito se encuentra o no por encima o por debajo de un determinado valor. Se expresa como una concentración en una relación señal-ruido específica, por lo general, 2 ó 3. Materias Primas: Todos los componentes usados para fabricar un fármaco o medicamento, reglamentados por 21 CFR 211. Micoplasma: Microorganismo parásito que infecta células de mamífero y posee algunas características tanto de bacteria como de virus. Los microorganismos procarióticos pertenecen a la familia Mycoplasmataceae y carecen de paredes celulares. Pueden crecer adheridos o junto a las superficies celulares en el citoplasma y cambian sutilmente las propiedades de las células. Pasaje: Procedimiento operativo usado para alimentar células cultivadas, por lo general suministrándoles medio de cultivo fresco y una dilución de células en un nuevo recipiente de cultivo. La cantidad de dichas operaciones se conoce como número de pasajes. No es lo mismo que número de generación celular, el cual se refiere estrictamente al tiempo de duplicación celular. PCRq: Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa. Modificación de la reacción en cadena de la polimerasa usada para medir la cantidad de ADN, ADN complementario o ácido ribonucleico presente en una muestra. Al igual que otras formas de reacción en cadena de la polimerasa, el proceso se usa para amplificar muestras de ADN por medio de la enzima ADN polimerasa. Producto Obtenido por Biotecnología: Artículo macromolecular obtenido por procesos de biotecnología como la tecnología de ADN recombinante (ADNr), tecnología de hibridoma y similares. Productos Biológicos: Algunos productos como por ejemplo antitoxinas, antivenenos, sangre, hemoderivados, antisueros, elementos auxiliares para el diagnóstico inmunológico, toxoides, vacunas y artículos relacionados que se producen bajo licencia, en conformidad con los términos de la Ley Federal de Servicios de Salud Pública (Estat. 58 682) aprobada el 1 de julio de 1944 como enmienda, se han conocido durante mucho tiempo como "productos biológicos." Sin embargo, en la Tabla 111, Parte F de la Ley, el término "productos biológicos" se aplica al grupo de productos autorizados en conjunto. A efectos de esta Farmacopea, el término "productos biológicos" hace referencia a aquellos productos que deben estar autorizados según la Ley y cumplir con el Reglamento sobre Alimentos y Medicamentos-Código de Reglamentos Federales, Título 21, Partes 600-680, relativas al control federal de estos productos (excepto ciertos elementos de diagnóstico), según la administración del Centro de Investigación y Evaluación de Productos Biológicos (Center for Biologics Evaluation and Research) o, en el caso de los elementos auxiliares de diagnóstico pertinentes, del Centro de Dispositivos y Radiología (Center for Devices and Radiological Health) de la Administración Federal de Alimentos y Medicamentos. [Definición de Productos Biológicos (1041 ), USP-NFvol. 32
(2007), p. 414.]
1938 (1237) Métodos de Pruebas Virológicas / Información General
USP 39
RT-PCR: Reacción en cadena de la polimerasa por transcripción reversa. Una variación de la técnica de PCR en la cual se obtiene ADNc a partir de ARN por transcripción reversa. El ADNc se amplifica después usando protocolos de PCR estándar. Serotipo: Clase de microorganismo que se caracteriza mediante el análisis de antígenos reconocibles sobre la superficie de las células del microorganismo. Sincicio: Masa multinucleada de citoplasma que no está separada en células individuales. Tropismo de la Célula Anfitriona: Espectro de células susceptibles que puede infectar un microorganismo en particular. Validación del Ensayo: Demostración formal, documentada, del desempeño analítico de un ensayo, que proporciona justificación para el uso del ensayo para el propósito previsto y un intervalo de valores de potencia aceptables.
APÉNDICE Referencias Reglamentarias Pertinentes 1. CBER-Centro de Investigación y Evaluación de Productos Biológicos (Center for Biologics Evaluation and Research), Administración de Alimentos y Medicamentos de EE.UU. Points to Consider in the Characterization of Cell Lines Used to Produce Biologicals. 1993. 2. CBER-Centro de Investigación y Evaluación de Productos Biológicos (Center for Biologics Evaluation and Research), Administración de Alimentos y Medicamentos de EE.UU. Letter to manufacturers of biological products. 2000. 3. 9 CFR 113.53. 4. 9 CFR 113.47. 5. 9 CFR 113.52. 6. 21 CFR 211. 7. 21 CFR 600.3. 8. Ley Federal de Alimentos, Medicamentos y Cosméticos (Ley FDyC), secciones 201 (g) y (h). 9. Guidance on Virus Validation Studies (CPMP/BWP/268/95 EMEA, Feb. 1996). 1 O. Conferencia Internacional sobre Armonización de Requisitos Técnicos para el Registro de Productos Farmacéuticos destinados para Uso en Seres Humanos {ICH). Q5A {Rl ): Evaluación de Seguridad Viral de Productos Biotecnológicos Obtenidos de Líneas Celulares de Origen Humano o Animal. 1997 (Viral Safety Evaluation of Biotechnology Products Derived from Cell Lines of Human or Animal Origin. 1997) 11. Ley de Servicio de Salud Pública, sección 351 (i). 12. Evaluación de la Seguridad Viral en Productos Biotecnológicos Obtenidos de Líneas Celulares de Origen Humano o Animal (1050). USP-NF vol. 30 (2007), pp. 491-500.
(1238) VACUNAS PARA USO HUMANO-VACUNAS BACTERIANAS INTRODUCCIÓN El capítulo Vacunas para Uso Humano-Consideraciones Generales (1235) presenta generalidades sobre las vacunas para uso humano. Las vacunas bacterianas se pueden derivar de células enteras muertas o cuya capacidad de ocasionar enfermedades ha sido atenuada, o de algunos componentes de la célula intacta que son importantes para causar virulencia o daños al hospedero. Los toxoides, derivados de toxinas, son otro subconjunto de vacunas bacterianas. Las vacunas bacterianas pueden ser mezclas de componentes de diferentes especies, de diferentes cepas o de diferentes serotipos de la misma especie, o de diferentes componentes de células de la misma especie. Las vacunas bacterianas más simples consisten en los polisacáridos capsulares (PSC) purificados de la superficie celular de organismos tales como Salmonella enterica serovar Typhi, diversos serogrupos de meningococo o serotipos de neumococo causantes de meningitis, otitis media, infecciones respiratorias agudas y neumonía. Aunque la vacuna contra la fiebre tifoidea consta de un solo polisacárido, las vacunas contra meningococo contienen hasta cuatro polisacáridos capsulares de serogrupo específico, mientras que la vacuna contra neumococo contiene 23 serotipos. La respuesta inmunológica a los polisacáridos de meningococo y neumococo y al polisacárido capsular de la Haemophilus influenzae tipo b (Hib) se mejora mediante el acoplamiento covalente del polisacárido o de un oligosacárido derivado de éste a una proteína portadora adecuada. La respuesta inmunológica a estas vacunas de glicoconjugado se genera mediante rutas inmunológicas diferentes de las inducidas por polisacáridos purificados, crea una respuesta dependiente de las células T y establece una memoria inmunológica. Las proteínas portadoras son por lo regular toxoides bacterianos o vesículas proteicas de la membrana exterior bacteriana, aunque también pueden derivarse de otras fuentes. Para estos productos, los anticuerpos anti-PSC parecen ser suficientes para proteger contra enfermedades, aunque las vacunas de glicoconjugados también pueden reducir el transporte de organismos en la nasofaringe. Debido a la complejidad de sus procesos de fabricación, las vacunas de glicoconjugados tienden a contener menos serotipos o serogrupos que las vacunas relacionadas de polisacáridos purificados.
USP 39
Información General/ (1238) Vacunas para Uso Humano 1939
Muchos patógenos bacterianos, incluyendo aquéllos causantes de la difteria y el tétanos, producen toxinas que destruyen tejidos. La neutralización inmunológica de estas toxinas es suficiente para prevenir enfermedades. Estas vacunas de subunidades están compuestas por toxinas químicamente detoxificadas (toxoides) que se purifican a partir del sobrenadante de un cultivo y son capaces de generar anticuerpos neutralizantes contra la toxina nativa. Asimismo, es posible desarrollar otros tipos de subunidades purificadas y de procesos de purificación. Aunque las primeras vacunas contra pertussis estaban compuestas por decenas de miles de componentes de células enteras y toxinas químicamente inactivados, los productos acelulares de la actualidad contienen diversas combinaciones de proteínas específicas purificadas, en ocasiones toxoidadas (p.ej., fimbrias y otros componentes proteicos de la superficie celular). En comparación con productos más antiguos, estas vacunas aparentemente generan protección mediante un mecanismo de acción distinto, pero tienen una menor incidencia de eventos adversos. Una combinación de toxoide diftérico y tetánico y una vacuna acelular contra pertussis constituyen los componentes centrales de muchas vacunas combinadas polivalentes pediátricas y para adultos. A dichas vacunas también se les puede agregar un glicoconjugado para Hib, hepatitis By/o inmunógenos de poliovirus inactivados. En la actualidad, las vacunas de bacterias vivas atenuadas se limitan a Bacillus Calmette-Guérin (BCG), que protege contra la tuberculosis cuando se administra por vía intradérmica, y la construcción 5. typhi Ty21 a, que es una vacuna oral contra la fiebre tifoidea. La respuesta inmune contra estos antígenos de polisacáridos y proteínas bacterianas se puede incrementar mediante la inclusión de coadyuvantes. El principal coadyuvante autorizado en los Estados Unidos se basa en sales de aluminio tales como hidróxido de aluminio y fosfato de aluminio, aunque el desarrollo y la caracterización de nuevos coadyuvantes es un área de investigación activa.
MATERIAS PRIMAS Las materias primas pueden afectar directamente la identidad, potencia, calidad y pureza de las vacunas bacterianas. Un proceso uniforme de fabricación tiene una dependencia crítica en el uso de materias primas uniformes (p.ej., durante la formación del banco de siembra, fermentación, cosecha, purificación y formulación; ver el capítulo Vacunas para Uso Humano-Consideraciones Generales (1235)). Las materias primas para los medios de cultivo bacteriano generalmente constan de entidades químicas bien definidas (p.ej., aminoácidos, carbohidratos, vitaminas, minerales) y componentes más complejos (p.ej., hidrolizados de proteínas, extractos de levadura, peptonas). Los fabricantes deben considerar la fuente de cada una de estas materias primas para asegurarse de que provienen de proveedores confiables que se apegan a los estándares de calidad de las buenas prácticas de fabricación actuales y que pueden asegurar un abastecimiento a largo plazo. Los fabricantes deben comunicarse con los proveedores de materias primas para evitar cualquier cambio en el origen o la fabricación de los componentes y para evitar escasez del suministro. Sin tales comunicaciones, la uniformidad de los procesos de fermentación y el abastecimiento de la vacuna pueden verse afectados negativamente. La uniformidad de las materias primas es particularmente crítica para componentes de fermentación más complejos, tales como extracto de levadura o peptonas, para los que puede ser más difícil la detección de cambios pero que son propensos a tener un efecto directo sobre la fermentación. Se deben mantener registros exactos de la composición y origen del medio de cultivo usado en la creación del banco de siembra y fermentación de rutina, y documentar los criterios de liberación para materias primas o componentes. Los fabricantes deben determinar si alguna de sus materias primas es de origen animal. Si se agregan aditivos de origen animal al medio de cultivo, se debe certificar que están exentos de contaminantes y agentes adventicios tales como los causantes de encefalopatía espongiforme bovina o encefalopatía espongiforme transmisible. Los proveedores/fabricantes deben proveer información sobre la identidad y el origen de los aditivos, además de realizar pruebas para determinar la presencia de agentes adventicios. Se debe minimizar o evitar el uso de antibióticos para asegurar que no se incluya ningún antibiótico no deseado en el producto farmacéutico, a menos que se usen intencionalmente durante la fabricación (p.ej., marcadores selectivos). A medida que los fabricantes aumentan la fermentación a una escala de producción piloto (es decir, dentro de diez veces la escala de fabricación final), también deben asegurar, en la medida de lo posible, la disponibilidad de múltiples fuentes para todas las materias primas. De esta forma, se asegura que la inestabilidad de abastecimiento por parte de un proveedor no se convierta en un factor restrictivo para la fabricación de la vacuna.
BANCOS DE CÉLULAS Origen e Historial Se debe documentar el origen de las células usadas en los bancos de células. El aislado original debe incluir, cuando sea posible, la edad, el género y la especie del donante; el historial médico del donante y, si estuviera disponible, el historial de cultivo incluyendo los métodos usados para el aislamiento de la bacteria a partir del sustrato. Se debe declarar el origen de la células de las que se derivó la cepa, además de citar referencias relevantes de la literatura científica. La fuente debe generar una cantidad suficiente de antígenos para cumplir con la necesidad médica. Asimismo, se prefiere la información obtenida directamente del laboratorio de origen. Cuando ésta no esté disponible, se pueden usar referencias a la literatura para proveer la clasificación bacteriana (es decir, género, especie y designación de cepa), así como rasgos fenotípicos y/o genotípicos. Para sistemas de expresión microbiana tales como E. coli o S. pneumoniae, el fabricante debe des-
1940 (1238) Vacunas para Uso Humano / Información General
USP 39
cribir el método usado para preparar el ADN codificante de la proteína, incluyendo la célula y el origen del ácido nucleico fuente. Se deben documentar todas las propagaciones que se realizan con el aislado original incluyendo, según corresponda, el método usado para subcultivo, el uso de cualquier material de origen animal, los registros de subcultivos y las condiciones de almacenamiento. Además, se deben describir los componentes del medio de cultivo, en particular los materiales de origen humano o animal, tales como suero, enzimas, hidrolizados u otras células vivas. Para sistemas de expresión microbiana, se deben describir detalladamente los pasos para armar la construcción de expresión. Esta descripción debe incluir el origen y la función de las partes que componen la construcción de expresión (p.ej., orígenes de la replicación, genes de resistencia a antibióticos, promotores, potenciadores y si la proteína se sintetizó como proteína de fusión). Los fabricantes deben proveer mapas de digestión con endonucleasas de restricción que ilustren los sitios usados para la preparación de la construcción de expresión y los sitios usados en la identificación de fragmentos de ADN. Se debe llevar a cabo un análisis completo de la secuencia de nucleótidos de la región de la construcción de expresión que codifica para la proteína de interés. Asimismo, se debe proveer el análisis de la secuencia que debe incluir una descripción completa de todas las características importantes de la secuencia. Es indispensable determinar el número de copias y el estado físico de la construcción de expresión.
Genealogía
y Linaje del Banco de Células
Se puede utilizar un diagrama de flujo para demostrar la preparación del linaje del banco de células desde la fuente original, pasando por los bancos de células preliminares (o bancos de células para el desarrollo del proceso, según corresponda), hasta el Banco de Células Maestro (BCM) y los Bancos de Células de Trabajo (BCT). Los fabricantes deben describir su estrategia para proveer un suministro continuo de células de sus bancos celulares, incluyendo el tamaño del lote y la velocidad de uso prevista del banco de células para producción, los intervalos esperados entre la generación de nuevos bancos de células y los criterios de calificación de los mismos. Para aquellos casos en los que se hayan utilizado múltiples BCT para ensayos clínicos, la validación del proceso o el suministro comercial y los diagramas de flujo pueden ilustrar el origen común (es decir, el BCM) del que se derivó el BCT. Una vez que se ha producido un BCM, se debe generar un sistema de banco de células para prevenir desviaciones indeseadas que pudieran surgir de subcultivos repetidos o de generaciones múltiples. El sistema debe asegurar la existencia de un suministro adecuado de células equivalentes durante el ciclo de vida entero del producto. Por lo regular, el sistema de banco de células consta de dos niveles: un BCM y una serie de BCT derivados del BCM. Cuando se preparan niveles adicionales de BCT, los fabricantes deben identificar claramente la generación que se usará para el BCT.
Fabricación de Bancos de Células El BCM, por lo general, se produce a partir de un banco de células preliminar derivado de la fuente original o directamente a partir de un don inicial. Por lo regular, los fabricantes preparan las células para bancos expandiendo cultivos en un número de vasos progresivamente mayor o en vasos más grandes hasta obtener un acervo de células. Si los fabricantes emplean más de un vaso, pueden asegurar la composición uniforme del contenido combinando las células de todos los vasos de cultivo. Para sistemas de expresión microbiana, se propaga una célula hospedera individual que contiene la construcción de expresión para generar el BCM. Los fabricantes deben documentar el historial de clonación de las células, así como el método de transferencia de la construcción de expresión a la célula hospedera. Asimismo, deben proveer una descripción completa de los métodos y criterios usados para amplificar la construcción de expresión y para seleccionar el don celular para producción. El proceso para el BCT que se usa en ensayos clínicos y para el abastecimiento comercial debe ser similar al proceso del BCM. Un BCT se deriva de uno o más recipientes del BCM y, a menudo, se usa para proporcionar células directamente al proceso de fabricación. Según se requiera, se pueden generar BCT adicionales, a partir del BCM. De preferencia, los BCM y BCT deben prepararse de manera similar, aunque pueden diferir en algunos aspectos (p.ej., componentes y condiciones de cultivo). De manera similar, las condiciones de cultivo usadas para preparar el BCM y el BCT pueden ser distintas a aquéllas usadas para el proceso de producción o entre materiales para ensayos clínicos o suministro comercial. Por lo tanto, se deben describir los procedimientos de preparación para todos los procesos de cultivo celular y documentar los detalles de los cambios en los procesos. Además, se debe demostrar la comparabilidad de calidad del producto cuando ocurran cambios en los procesos entre BCTs. Los bancos de células se deben fabricar con apego a las Buenas Prácticas de Fabricación vigentes debido a que se espera que su duración se extienda durante toda la vida del producto. Las operaciones en las instalaciones deben minimizar la probabilidad de contaminación microbiana y se debe contar con procedimientos para prevenir la contaminación cruzada con otros materiales. Resulta necesario calificar los equipos críticos usados en la preparación de los bancos de células. Los fabricantes deben establecer el banco celular en un ambiente adecuadamente controlado para proteger al banco y al personal encargado de su manipulación. Durante el establecimiento del banco de células, no deberá manipularse simultáneamente ningún otro material infeccioso vivo (p.ej., virus, líneas celulares o cepas celulares) en la misma área.
USP 39
Información General/ (1238) Vacunas para Uso Humano 1941
Validación del Banco de Células El proceso de generación del banco de células se debe tratar como una operación unitaria, por lo que es necesario validarlo. El proceso comienza con el vial del BCM y el proceso de generación del banco de células validado para preparar el BCT. La aptitud del BCT para su uso previsto se debe demostrar adicionalmente a través de la uniformidad y la calidad de las partidas de producto sucesivas. Deben usarse bancos calificados para la validación del proceso de fermentación, fármaco, etc. Cuando esto no sea posible, entonces los fabricantes deben llevar a cabo una demostración a pequeña escala para determinar si el banco de células es apropiado. Además, se aplican los principios básicos de validación de procesos, incluyendo el uso de métodos analíticos validados y evaluaciones de estabilidad. Los fabricantes deben describir los métodos usados para conservar los bancos de células, incluyendo el crioprotector y los medios usados. Además, se deben describir los envases de almacenamiento (p.ej., viales, ampollas y demás vasos adecuados) y los sistemas de cierre. Los sistemas de envase-cierre deben incorporar materiales y diseños que soporten el almacenamiento y la recuperación sin presentar roturas o fugas y que sean física y químicamente compatibles con el material almacenado.
Análisis del Banco de Células Un banco de células preparado recientemente (BCM o BCT) se debe evaluar mediante una serie de pruebas de liberación y caracterización apropiadas en una alícuota del banco de células o en cultivos derivados del mismo, según corresponda. El número de análisis requeridos para un BCM influye en el número de análisis requeridos para los BCT subsiguientes, y el número de análisis de ambos influye en el análisis requerido para la producción de cultivos celulares. Los fabricantes deben evaluar la identidad, pureza de cultivo y viabilidad de todos los bancos celulares, incluyendo cultivos bacterianos o sistemas recombinantes de expresión bacteriana. Asimismo, los fabricantes deben evaluar la estabilidad genética y la productividad uniforme de todas las líneas celulares. Para confirmar la identidad, los fabricantes deben llevar a cabo pruebas adecuadas para determinar que las células del banco son lo que se espera que sean. Se pueden usar las características fenotípicas o genotípicas en las pruebas de identidad para clasificar las cepas bacterianas hasta el nivel de especies y, cuando corresponda, se pueden llevar a cabo pruebas serológicas suplementarias. Para la mayoría de las células microbianas y transfectadas, a menudo resultan adecuados los análisis de crecimiento en medios selectivos para confirmar la identidad de la célula hospedera. Cuando es posible emplear una variedad de cepas, los métodos de caracterización biológica tales como la tipificación de fagos deberían tenerse en cuenta como pruebas suplementarias. La expresión del producto deseado también se considera adecuada para confirmar la identidad del sistema de expresión microbiano. Se debe demostrar también que los bancos de células son biológicamente puros (es decir, exentos de agentes microbianos adventicios). El análisis de agentes adventicios debe incluir pruebas de detección de bacterias, hongos, micoplasmas y virus, según corresponda. Además, todos los bancos celulares deben analizarse para confirmar la viabilidad de las células. Se deben llevar a cabo recuentos de células viables o pruebas de crecimiento para demostrar que el cultivo celular tiene una viabilidad suficiente y que es adecuado para el uso posterior previsto. La evaluación de estabilidad genética y la persistencia de la productividad son un reflejo de la cantidad de duplicaciones que las células pueden tolerar sin comprometer su integridad genética (p.ej., retención de plásmidos) ni su productividad (p.ej., masa de producto por célula). Dicho análisis es crítico para asegurar que el comportamiento de la línea celular es confiable durante todo el curso del proceso de producción, desde la etapa inicial del BCM hasta la producción más larga prevista. Como parte de esta evaluación, los fabricantes deben documentar el número de pasajes derivados de la fuente original, el número de subcultivos desde la fuente original al BCM, desde el BCM al BCT y desde el BCT al producto final a granel. Se deben evaluar los estadíos de cultivo más tempranos y más recientes (p.ej., BCM y de producción final) para asegurar la persistencia de las características deseadas. Dicha demostración de la estabilidad de la línea celular regularmente se lleva a cabo una vez para cada solicitud de comercialización del producto. Las pruebas de caracterización pueden ser útiles para demostrar que el banco de células está compuesto por células con las características fenotípicas/genotípicas previstas. Dichas pruebas pueden incluir la morfología celular y de la colonia (es decir, el uso de medios selectivos y/o diferenciales), perfiles bioquímicos (actividad enzimática o utilización del sustrato), identidad inmunológica, crecimiento característico y susceptibilidad a antibióticos. De manera adicional, para líneas de células de expresión bacteriana recombinantes (p.ej., E. col1) el análisis de caracterización molecular puede incluir secuenciación de ADN de la secuencia génica diana junto con las regiones adyacentes, la retención de la construcción de expresión y el número de copias de plásmido. El análisis de la construcción de expresión a nivel del ácido nucleico se debe llevar a cabo tomando en cuenta que éste únicamente verifica la secuencia codificante de un gen recombinante. Se puede emplear el mapeo con endonucleasas de restricción u otras técnicas adecuadas para analizar la construcción de expresión para inserciones o deleciones y para el número de sitios de integración. Para sistemas de expresión extracromosómicos, el porcentaje de células hospederas que pueden retener la construcción de expresión se debe determinar en las condiciones de crecimiento selectivas y no selectivas. Para células con copias cromosómicas de la construcción de expresión, la secuencia de nucleótidos que codifica el producto se podría verificar mediante reclonación y secuenciación de copias cromosómicas.
1942 (1238) Vacunas para Uso Humano / Información General
USP 39
De ser posible, una gran parte de estos análisis debe llevarse a cabo con el BCM, lo que eliminaría la necesidad de repetir una gran parte de los mismos con cada BCT o lote de producción, aunque, en ocasiones, puede resultar conveniente la realización de análisis redundantes (en el BCM y el BCT). A menudo, se realizan análisis de identidad limitados en cada BCT cuando se han realizado análisis de identidad extensos en el BCM. Para productos recombinantes, se debe evaluar la identidad del BCT mediante mapeo con endonucleasas de restricción de la construcción de expresión para el número de copias y para las inserciones o deleciones. Asimismo, cuando corresponda, el BCT se debe identificar mediante caracterización fenotípica (p.ej., auxotrofia, resistencia a antibióticos). Para cada lote de BCT derivado del BCM, los fabricantes deben realizar de manera rutinaria pruebas para contaminantes que pudieran haberse introducido a partir del medio de cultivo durante la preparación. Se pueden realizar pruebas de pureza en el BCT, tales como las realizadas en el BCM para analizar agentes adventicios. Además, se pueden aplicar las características del producto de proteínas recombinantes (ver a continuación) como otro medio para definir el resultado final de la línea celular. En caso de que sea necesario un nuevo BCM, el análisis realizado a éste deberá ser el mismo que el realizado al BCM original, a menos que se justifique algo distinto. Si se va a generar un nuevo BCM mediante la transferencia de la construcción de expresión a células hospederas, seguida de selección clonal, entonces se deben describir y justificar criterios de aceptación para el clan nuevo y para la proteína producida por el clan.
Almacenamiento de Bancos de Células Por lo general, en el caso de los BCM y BCT del mismo producto, se utilizan durante el almacenamiento envases similares (tales como viales para crioconservación), los cuales se tratan de manera idéntica. La ubicación, identidad e inventario detallado de las ampollas individuales de células se debe documentar minuciosamente con procedimientos que permitan rastrear los envases de los bancos de células. El etiquetado debe indicar claramente el nombre biológico de los componentes, el número único del envase, el número de lote o partida, si corresponde, y el tipo de banco (BCM o BCT). La etiqueta debe ser capaz de tolerar el almacenamiento y la recuperación sin perder su integridad o información. Los bancos de células deben establecerse, almacenarse y usarse de manera tal que se minimice el riesgo de contaminación o contaminación cruzada por otros tipos de células que pudieran estar presentes en el almacenamiento. Una vez emitidos, los materiales del banco no pueden ser devueltos al área de almacenamiento controlada. El acceso al material de los bancos debe controlarse mediante un estricto sistema de control de inventarios con acceso restringido al personal autorizado. Los bancos de células bacterianas se deben almacenar en la fase líquida o gaseosa de nitrógeno líquido o en congeladores mecánicos (generalmente a s-60º). Las condiciones de almacenamiento (por lo general s-60º) pueden ser aceptables siempre que estén sustentadas por datos que demuestren que se mantiene un nivel mínimo de viabilidad celular y que ésta es adecuada para su uso en la producción. La temperatura de almacenamiento y demás condiciones críticas se deben mantener dentro de los límites validados. Las temperaturas deben monitorearse y registrarse de manera continua, preferentemente en un sistema de alarmas. Los envases para transporte usados para transportar bancos de células crioconservados a instalaciones externas de almacenamiento o a instalaciones de fabricación deben ser validados y se debe llevar a cabo una calificación del transporte antes de su uso. Debido a su mayor frecuencia de uso y como medida de protección para el BCM, los BCT deben almacenarse separados del BCM. Los bancos de células también se pueden almacenar en dos o más áreas ampliamente separadas dentro de la instalación de producción, al igual que en un sitio distante para evitar la pérdida del banco de células (p.ej. a causa de fallas en el equipo o desastres en el sitio). Cuando se almacenan en ubicaciones diferentes, los bancos de células deben mantenerse bajo las mismas condiciones. Como parte del plan de recuperación de desastres, el fabricante debe documentar los pasos y los plazos requeridos para reiniciar la producción de nuevos bancos de células y/o planes de contigencia para una producción de fabricación continua.
Estabilidad Durante el Almacenamiento El BCM y el BCT deben incluirse en un programa de estabilidad. Por lo regular, la evidencia de la estabilidad de las células del banco en condiciones de almacenamiento definidas se genera durante la producción de material para ensayos clínicos o material comercial derivado de las células del banco. Cuando las células conservadas se reconstituyen para suministros de ensayos clínicos, los datos obtenidos de la determinación de la viabilidad celular pueden verificar que las células reanimadas han sobrevivido al proceso de conservación. Los datos obtenidos de la preparación de materiales clínicos se usan para demostrar que las células reanimadas pueden emplearse en la preparación del producto deseado. Se debe incluir en el programa de estabilidad una cantidad suficiente de material del BCM para toda la vida del producto (se debe poner suficiente material del BCT en el programa de estabilidad para sustentar toda la vida del BCT), lo que puede representar un gran volumen debido a que la vida del producto puede ser considerablemente larga (p.ej., 50 años). Durante la preparación del BCM, el tamaño del lote debe ser lo suficientemente grande para permitir un inventario adecuado que sustente la vida del estudio de estabilidad, así como la producción durante la vida del producto. Los tiempos de muestreo para estudios a tan largo plazo pueden incluir O, 6 y 12 meses, y, sucesivamente, quizás cada 1-3 años. Por lo regular, no se usa una fecha de caducidad para los bancos de células debido a que se usan estudios de estabilidad para confirmar la aptitud del material. En
USP 39
Información General/ (1238) Vacunas para Uso Humano 1943
efecto, se depende en mayor medida del cultivo exitoso (y típico) de las células mismas. Se debe documentar el monitoreo propuesto en protocolos preaprobados. Los tiempos de muestreo se pueden reducir (p.ej., incrementar el tiempo entre los tiempos de muestreo) si los datos indican estabilidad. Asimismo, se pueden agregar tiempos de muestreo si se cuenta con material suficiente y si los datos sugieren la necesidad de mayor monitoreo. El plan de estabilidad depende de la velocidad de uso en la fabricación.
FERMENTACIÓN La producción del fármaco para una vacuna bacteriana requiere de un proceso de fermentación uniforme y lo suficientemente productivo para sustentar la producción comercial. El enfoque para lograr lo anterior se ha estandarizado de manera significativa y ofrece una probabilidad de éxito relativamente alta para la producción temprana de partidas a fin de sustentar un programa de desarrollo. Sin embargo, aún representa un desafío significativo lograr una productividad suficiente para sustentar la fabricación comercial de un producto autorizado. El proceso de recolección viene inmediatamente después de cualquier proceso de fermentación, y sirve como una etapa de transición entre la expansión de biomasa y las etapas posteriores del proceso. Para los propósitos de este capítulo, la recolección se considera una extensión del proceso de fermentación.
Materiales Iniciales de Fermentación: lnóculo de Células El inóculo de células para el proceso de fermentación es el componente individual más importante para establecer un proceso de fermentación reproducible. En el desarrollo temprano antes de finalizar las condiciones de fermentación, los fabricantes a menudo deben generar una fuente intermedia de este inóculo, es decir, un Banco de Células para el Desarrollo del Proceso (BCDP). El origen del BCDP debe ser un aislado clona! de la cepa original transfectada o aislada que demuestre propiedades de crecimiento adecuadas y que produzca el antígeno de interés en cantidad y calidad suficientes para el propósito previsto. El uso de aislados clonales asegura que el punto de inicio genético para cada partida es el mismo y que las variaciones sutiles en las condiciones del proceso no permitirán inadvertidamente que una población domine el cultivo frente a otra. Esto significa que el BCDP se usa para el desarrollo de la fermentación para asegurar que las variaciones en las condiciones de fermentación se pueden interpretar sin superponer la competencia entre poblaciones de transfectantes. El desarrollo inicial del proceso de fermentación, preferiblemente con el BCDP, por lo regular precede a la producción del BCM y del BCT. La mejor práctica es derivar estos bancos de células del mismo aislado clona! que el BCDP para reducir la necesidad de un segundo ciclo de desarrollo de fermentación cuando se despliega el BCT. El uso de un BCDP en lugar de un BCT en las etapas finales del desarrollo de la fermentación es una práctica común, aunque se debe tener cuidado de limitar dichos experimentos a la optimización del proceso de fermentación. La sección de bancos de células anterior proporciona más detalles.
Equipo de Fermentación El proceso de producción de biomasa por lo regular comienza con un inóculo de pequeño volumen en un volumen de fermentación inicial que es de 20 a 100 veces mayor que el volumen de inóculo inicial. El pasaje inicial es a menudo seguido por una o más fermentaciones intermedias que expanden el volumen de producción de 20 a 100 veces en cada etapa hasta que se alcanza el volumen de fermentación para producción (regularmente, 500-3000 L). La fabricación de rutina en estas escalas requiere de condiciones de fermentación bien controladas y de instalaciones físicas que cumplan con los requisitos económicos y de Buenas Prácticas de Fabricación vigentes para un producto exitoso. Las fermentaciones bacterianas se han llevado a cabo tradicionalmente en fermentadores de vidrio, revestidos de vidrio o de acero inoxidable no reactivo que cumplen con los requisitos de las Buenas Prácticas de Fabricación vigentes, en particular cuando se usan fermentadores grandes (p.ej., aquéllos con volúmenes de trabajo para >1000 L) debido a los problemas de contención con volúmenes tan grandes de líquido. Los sistemas de fermentación tradicionales requieren de sistemas de control de tuberías duras que tengan la capacidad de tolerar la limpieza y el uso de vapor en el lugar. La biocarga y la complejidad de la instalación se incrementan cuando las operaciones de fermentación también deben alojar múltiples líneas de producción. Se presenta un incremento en el número de partidas de fermentación más pequeñas que se realizan en biorreactores desechables tales como bolsas de un solo uso con superficies de contacto con el producto completamente desechables, incluidos sensores y sondas. La disponibilidad de estos sistemas ha ido en aumento, son más asequibles y más flexibles que los equipos fijos, y cumplen con las necesidades de competencia comercial y con las expectativas y requisitos de las Buenas Prácticas de Fabricación vigentes. No obstante, es necesario tomar precauciones, puesto que esta tecnología desechable puede llevar a cambios en el material de las superficies de contacto con el producto, los cuales requerirían la reevaluación y, en ocasiones, la revalidación del proceso de fabricación para el desarrollo en etapas finales y de productos comerciales. Por consiguiente, la reducción en la carga que representa la limpieza puede generar un incremento en la necesidad de estudios de lixiviación y extractabilidad.
1944 (1238) Vacunas para Uso Humano / Información General
USP 39
Equipo de Recolección La recolección del producto de fermentación se puede enfocar en la recuperación de la masa de células húmeda de la que se extraerá el producto o en el caldo de fermentación del cual se purificará directamente el producto. En el primer caso, por lo regular, se emplea la separación mediante centrifugación. Las centrífugas de escala de producción pueden ser operaciones cerradas con un volumen fijo de ingreso y recuperación manual del pellet u operaciones de flujo continuo que expulsan automáticamente el sobrenadante transparente y/o el pellet acumulado. Aunque las centrífugas son eficientes para la recolección de un producto de fermentación, las fuerzas de cizallamiento pueden tener efectos significativos sobre la corriente del producto (p.ej., células lisadas, moléculas cizalladas en solución). Alternativamente y, en particular cuando el producto se secreta en la solución en vez de quedar retenido en las células, se pueden usar sistemas de filtración por membrana para clarificar la corriente de producto para su purificación subsiguiente. Los sistemas de flujo tangencial y de filtración profunda pueden ser medios efectivos para recuperar un producto soluble sin tanta preocupación por las fuerzas de cizallamiento. Para todos los casos, el monitoreo del procesamiento de los resultados de la fermentación y la eliminación de sólidos de la matriz de líquido pueden ser medios simples pero efectivos para monitorear la uniformidad y comparabilidad del proceso. Las herramientas fuera de línea tales como cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), electroforesis en gel de poliacrilamidadodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) o análisis de transferencia Western pueden rastrear cuestiones relacionadas con la integridad del producto tales como la agregación o proteolisis.
Desarrollo del Proceso Un proceso de fermentación productivo y robusto es el resultado de la consideración meticulosa de numerosas variables, analizadas de manera individual y en conjunto con el diseño y las etapas de procesamiento posteriores. Las variables del proceso de fermentación incluyen información química (p.ej., fuentes de carbono, minerales, vitaminas, trazas de elementos, antiespumante y gases), información física (p.ej., temperatura, mezclado y pH) y procesos biológicos (p.ej., velocidad de uso de nutrientes, niveles de metabolitos e inductores [cantidad/tipo/duración de la adición]).
Requisitos de Producción Una consideración crítica en el desarrollo del proceso consiste en anticipar la cantidad de producto que será requerida. Una cantidad demasiado pequeña de producto ocasionada por operaciones a una escala muy pequeña impone limitaciones en el suministro y, a menudo, el surgimiento de una necesidad urgente posterior al otorgamiento de la licencia, por aumentar la escala del proceso. Por el contrario, una cantidad demasiado grande de producto genera un exceso de inventario, lotes caducos, baja frecuencia de fabricación (lo que de por sí representa un problema) y, en líneas generales, una economía deficiente. Es necesaria una evaluación clara del mercado antes de diseñar el proceso de fabricación o de comprometerse a realizar un proceso que aumente o disminuya en escala.
Diseño del Proceso Cuando se tiene una necesidad de producción razonablemente definida, así como una estimación inicial de generación de producto, resulta posible extrapolar la escala de la fermentación a partir del volumen (producción), de la frecuencia de producción y de la productividad esperada. La fermentación comercial de cultivos bacterianos se lleva a cabo de manera rutinaria en volúmenes tan grandes como 3000 L, aunque también se usan volúmenes más grandes. Unos pocos lotes grandes por año pueden ser ventajosos para un proceso muy robusto, pero se pueden ver limitados por las capacidades de los procesos posteriores y/o la estabilidad del producto de fermentación como producto intermedio de producción. Un aspecto más a considerar es la dificultad que puede representar la generación de suficientes lotes para asegurar que el proceso de fermentación sea, en efecto, robusto. Las fallas de un lote grande conllevan importantes riesgos financieros y de inventario. Un gran número de lotes puede generar problemas logísticos si el tiempo de cada ciclo es demasiado estricto o si la coordinación de eventos posteriores se vuelve demasiado compleja. La logística incluye pruebas de control de calidad, las cuales dependen del número más que del tamaño de los lotes. Una producción que implique un gran número de lotes pequeños también podría requerir el mezclado de múltiples lotes de productos intermedios para producir un lote de producto final. Esto puede representar un desafío si se presentan problemas relacionados con el producto y puede requerir la investigación de la causa inicial. En general, el establecimiento de un tamaño de fermentación apropiado resulta en un proceso con ciclos de menos de una semana, el cual se puede implementar con una o unas cuantas etapas de purificación, y que resulta en uno a varios llenados de producto final después de cada ciclo de purificación.
Consideraciones para las Etapas Tempranas del Desarrollo Durante las etapas tempranas del desarrollo de una producto biológico, las consideraciones más importantes sobre fermentación son un BCM apropiado y bien definido y un proceso de fermentación que sea razonablemente productivo, reproducible
USP 39
Información General/ (1238) Vacunas para Uso Humano 1945
y escalable. Esto último a menudo se desestima al considerar el control físico, químico y biológico de los procesos a medida que cambian los volúmenes del proceso en varios órdenes de magnitud. La mecánica del proceso de fermentación representa un aspecto importante a considerar. Las fermentaciones a menudo se estudian en experimentos que se realizan en matraces de agitación o incluso en reactores a microescala que pueden alojar fácilmente muchos experimentos realizados en paralelo. Aunque esto resulta atractivo para la identificación inicial de las condiciones del proceso, finalmente el vaso de cultivo debe ser un fermentador controlado en el que las condiciones de crecimiento se puedan controlar y monitorear de manera más rigurosa y completa. Los fabricantes deben comenzar el trabajo en fermentadores a pequeña escala tan pronto como sea posible para asegurar que se pueden desarrollar experimentos robustos y controlados para perfeccionar las condiciones iniciales de fermentación. Asimismo, los procesos de recolección de la fermentación también deben ser escalables. Aunque es posible escalar las condiciones de centrifugación, resulta un desafío mantener condiciones de centrifugación equivalentes, en particular en un modo de flujo continuo. Los procesos de filtración a menudo se pueden escalar de manera más predecible, siempre que el fabricante de la membrana se anticipe a las necesidades del científico de desarrollo del proceso. Cuando los fabricantes definen un proceso, deben evaluar su robustez mediante desviaciones intencionadas tales como cambios en las fuentes de materias primas y en los límites de tiempo y temperatura de las operaciones unitarias. Tales evaluaciones ayudan a justificar de mejor manera los límites establecidos del proceso y a definir cuáles son los más críticos para el éxito del proceso de fabricación.
Monitoreo del Procesamiento Basándose en los datos de caracterización de las etapas tempranas del desarrollo de proceso, los fabricantes deben ser capaces de identificar medidas analíticas claves que, si se aplican a todos los lotes, pueden verificar el progreso correcto del proceso o servir como centinela para determinar si una partida específica presenta señales de desviación del perfil típico. Ante la ausencia de dichos datos, un proceso aberrante podría pasar inadvertido o podría no detectarse hasta el análisis de un producto intermedio del proceso que presente un resultado fuera de las tendencias o fuera de la especificación. Para un proceso de fermentación, se pueden medir muchas variables críticas (p.ej., densidad óptica, pH y niveles de nutrientes específicos) en línea y en tiempo real para permitir la intervención potencial a fin de llevar un proceso determinado de vuelta al intervalo normal o al menos para identificar el punto del proceso en el que ocurrió la desviación. Dichos datos pueden ser valiosos para identificar mejoras potenciales del proceso. Por el contrario, ante la ausencia de tales datos, la resolución de problemas puede ser un proceso complicado y extenso.
Aumento de Escala Así como el desarrollo temprano requiere enfocarse en la operaciones a pequeña escala, el aumento de escala se torna esencial en algún punto para asegurar que es posible producir lotes suficientemente grandes para cumplir con las necesidades del programa. A medida que dichas necesidades se vuelven más complejas, los lotes de mayor tamaño se vuelven esenciales para asegurar que se pueden enlazar múltiples experimentos y observaciones con el mismo lote de producto, lo cual, a su vez, resulta crítico para comprender las variables críticas del proceso y del producto. Si se tomaron en cuenta consideraciones adecuadas de ingeniería del proceso en la escala de producción menor, el aumento de escala generalmente puede llevarse a cabo en incrementos de diez veces el volumen, manteniendo una expectativa razonable de que no se observarán cambios significativos en el desempeño del proceso o en el producto. Esta metodología puede requerir ajustes en una escala intermedia si la fermentación inicial se basó en un volumen muy pequeño o si la escala de producción final es muy grande. Una vez más, los datos de monitoreo del proceso pueden ser de gran utilidad para evaluar el éxito del proceso cuya escala se ha aumentado. Si se realizan estudios de desarrollo clínico a una escala menor que la de fabricación total, como generalmente sucede, los fabricantes se verán obligados a relacionar la comparación del desempeño del proceso y las características del producto en escalas distintas. Los datos analíticos pueden ser convincentes, pero cuando no se cuenta con estos o si se presentan diferencias, los fabricantes deben demostrar que las diferencias relacionadas con la escala no son clínicamente significativas. No obstante, el uso de protocolos de comparabilidad para cambios en la escala deberá ser aprobado por la autoridad reglamentaria local. A fin de evitar reparaciones innecesarias, los analistas deben tener cuidado de separar las diferencias ocasionadas por el aumento de la escala de fermentación de los cambios ocasionados por la recolección o el aumento de la escala de purificación. Una forma de lograr lo anterior es comparando los productos intermedios del proceso obtenidos, en la medida de lo posible, durante los procesos de fermentación y recolección. Por ejemplo, se puede usar el monitoreo en línea de condiciones de fermentación, tales como pH o nivel de glucosa, para demostrar similitudes durante el transcurso de la fermentación. De manera similar, las mediciones al final del proceso de fermentación (p.ej., densidad celular final, viabilidad celular), así como las mediciones de productos intermedios durante la recolección (p.ej., turbidez del caldo clarificado, masa celular húmeda en el pellet) ofrecen información útil para evaluar la similitud o diferencias durante el aumento de la escala.
1946 (1238) Vacunas para Uso Humano / Información General
USP 39
PURIFICACIÓN El capítulo de la USP Vacunas para Uso Humano-Consideraciones Generales (1235) presenta una visión general de la purificación de vacunas derivadas de bacterias. Además de una descripción de reactivos, etapas y equipos críticos para el procesamiento, los fabricantes deben proveer una justificación sobre el proceso de purificación seleccionado para los componentes antigénicos recuperados de la recolección en crudo. Al igual que con los demás procesos, los analistas deben considerar la fuente de todas las materias primas y asegurarse de que provienen de proveedores confiables que se apegan a las Buenas Prácticas de Fabricación vigentes y que pueden asegurar el suministro a largo plazo. Las Buenas Prácticas de Fabricación vigentes habrán de aplicarse a los suministros clínicos de las etapas finales y a los materiales comerciales. Además, se debe verificar la eliminación de impurezas no relacionadas con el producto (p.ej., reactivos de procesamiento, endotoxinas, proteínas celulares o ácidos nucleicos contaminantes y demás contaminantes residuales). El fármaco puede ser uno de varios tipos de compuestos: p.ej., polisacáridos (de tipo nativo o modificados), proteínas (de tipo nativo, mutante, toxoides o recombinantes) o productos conjugados de polisacáridos y proteínas, o productos conjugados de péptidos y proteínas. Para definir y controlar los procesos de purificación para fármacos y productos farmacéuticos, el fabricante debe establecer objetivos para parámetros y tolerancias del proceso para todas las etapas críticas del mismo, incluyendo rendimiento, actividad y pureza para asegurar la eficacia, seguridad y uniformidad del producto final. Si fuera necesario, se deben establecer requisitos para combinación de producto (pooling). Los requisitos y condiciones de almacenamiento de envases con productos intermedios, a granel y finales se deben establecer mediante un programa oficial de estabilidad. Asimismo, se debe validar el uso, reuso, regeneración y limpieza de todos los equipos en contacto con medicamentos/fármacos (p.ej., filtros, columnas cromatográficas y resinas, cámaras y líneas del proceso). Además, los estudios de materiales extraíbles/lixiviables se deben llevar a cabo para todo el equipo en contacto con el producto final (p.ej., sistemas de bolsas desechables, resinas de columnas cromatográficas y líneas del proceso).
Purificación de Polisacáridos Las etapas de purificación de polisacáridos dependen del fenotipo (p.ej., gram negativo o positivo), presentación del polisacárido (p.ej., unido a la membrana o excretado dentro del sobrenadante) y la naturaleza química del polisacárido mismo [p.ej., enlaces de la cadena principal ideal (unión glicosídica, unión fosfodiéster), carga neta, tipos de grupos cargados y tipos de modificaciones de los grupos laterales (O-acetilo, ácido urónico, ácido siálico, N-acetilo, piruvato u O-metilo)]. Los métodos de recolección de los polisacáridos determinan los requisitos de clarificación y purificación posterior. Los métodos de clarificación dependen de si es necesario llevar a cabo una lisis celular o únicamente separar el caldo sin células de los desechos celulares. Las técnicas de recolección o cosecha incluyen centrifugación, filtración profunda, filtración de flujo tangencial, microfiltración, filtración por tamaño o una combinación de técnicas. El cultivo puede inactivarse o se pueden eliminar los contaminantes residuales mediante precipitación selectiva (p.ej., desnaturalización de proteínas) usando calor o tratamientos químicos (p.ej., sales, detergentes, enzimas o fenol). Esto puede requerir el asentamiento mediante almacenamiento en frío antes de clarificar. Los métodos para precipitación de polisacáridos posterior a la clarificación se usan para el aislamiento y la purificación. Los métodos de precipitación fraccionada se basan en la carga neta o en las afinidades de unión catiónica del polisacárido (p.ej., precipitación alcohólica, cromatogtafía de intercambio aniónico). Los agentes tales como detergentes catiónicos, sales y disolventes se pueden usar para precipitar de manera diferencial las especies cargadas de moléculas sin carga. La precipitación se puede llevar a cabo en etapas para eliminar las impurezas residuales del polisacárido o mediante una serie de precipitaciones para lograr la pureza deseada. El polisacárido puede estar contenido en el precipitado o sobrenadante, dependiendo de la carga y la naturaleza del polisacárido. La precipitación se continúa de pasos de aislamiento, tales como centrifugación y/o filtración durante los cuales el precipitado se desecha o resuspende en un agente de precipitación secundario hasta recuperar el polisacárido. En ocasiones, se usa la extracción con disolventes tales como fenol para eliminar impurezas. Una metodología alternativa y adicional para los métodos selectivos de precipitación es el uso de métodos cromatográficos. La cromatografía de intercambio iónico (p.ej., DEAE Sefarosa), la cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) y la cromatografía de permeación en gel se han usado por separado y en conjunto para la purificación exitosa de polisacáridos. A pH neutro, se puede usar la carga de los polisacáridos ácidos en intercambiadores de aniones para separar los polisacáridos ácidos de las impurezas. Los intercambiadores de iones también se pueden usar para purificar polisacáridos neutros en modo de flujo continuo, uniendo impurezas mientras los polisacáridos neutros fluyen a través de la columna. La HIC también se puede usar para unir impurezas mientras el polisacárido pasa por la fracción de flujo continuo. Si no hubiese grupos básicos débiles, la carga en los polisacáridos neutros y ácidos se puede modificar mediante la adición de base para ionizar los hidroxilos antes de la cromatografía. Las condiciones básicas usadas controlan el nivel de N-acetilación y los polisacáridos pueden volver a acetilarse según resulte necesario. Se pueden usar sales de borato para mejorar la separación durante la cromatografía de intercambio iónico. Asimismo, se puede usar una combinación de precipitación, filtración y procedimientos cromatográficos. Se pueden utilizar diafiltraciones, ultrafiltraciones y etapas de secado intermedio, según se requieran, para concentrar polisacáridos al mismo tiempo que se eliminan impurezas de bajo peso molecular o se reemplazan sales y disolventes de procesamiento. Los precipitados o fracciones de las columna se pueden purificar adicionalmente usando métodos adecuados (p.ej.,
USP 39
Información General/ (1238) Vacunas para Uso Humano 1947
tratamientos con enzimas, extracciones con disolventes o cromatografía en columna) para eliminar impurezas tales como ácidos nucleicos, proteínas y lipopolisacáridos. Asimismo, se puede incluir una modificación preliminar del grupo lateral en el proceso de purificación (p.ej., des-0-acetilación, despiruvilación parcial). El paso final de purificación puede consistir en el intercambio de amortiguadores y filtración seguido por el almacenamiento del polisacárido líquido purificado (congelado) o precipitación adicional y lavado final del precipitado con disolvente antes del secado, seguido de almacenamiento. El secado se puede realizar mediante diversos tipos de procesos (p.ej., secado al vacío o en desecadores o mediante liofilización). El secado de polisacáridos se puede llevar a cabo en desecadores (a varias temperaturas) y puede incluir diversas etapas de molido o esponjado y volver a los desecadores para secado adicional. Cuando el proceso requiere retener agua unida, los polisacáridos se pueden liofilizar empleando controles apropiados. Algunos polisacáridos pueden requerir una cantidad residual de humedad para mantener la estabilidad a lo largo del tiempo. Posteriormente, el polisacárido se almacena en condiciones adecuadas para evitar la captación de humedad.
Controles de Proceso Los fabricantes deben identificar las etapas críticas del proceso y llevar a cabo pruebas apropiadas para monitorear el proceso de purificación. Estas últimas incluyen pruebas de integridad del filtro, Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano (61 ), Prueba de Endotoxinas Bacterianas (85) y otras pruebas adecuadas para residuos de reactivos (p.ej., reactivos, disolventes, enzimas o cationes residuales) usados en la purificación. El tamaño de los polisacáridos se puede ver influenciado durante todo el proceso de producción, desde las condiciones de fermentación hasta las condiciones de secado o mediante la acción de agitadores mecánicos, rotores o dispositivos de filtrado. Si el tamaño molecular es un atributo crítico de calidad, los analistas pueden llevar a cabo análisis de proceso para tamaño (p.ej., cromatografía de alta resolución de exclusión por tamaño acoplada a dispersión de luz láser de águlo múltiple [HPSEC-MALLS por sus siglas en inglés]) en las etapas apropiadas del proceso para monitorear y controlar el tamaño del polisacárido. A fin de demostrar el desempeño y la confiabilidad del proceso, los fabricantes deben caracterizar los contaminantes residuales inherentes (p.ej., proteínas, ADN y endotoxinas). Cuando la eliminación de agentes residuales haya sido demostrada mediante estudios de validación, se puede omitir el análisis de los polisacáridos purificados. Si se requiere que el material sea estéril, los analistas pueden llevar a cabo las Pruebas de Esterilidad (71 ).
Purificación de Proteínas Las clases de vacunas de proteínas bacterianas incluyen toxoides, no toxoides (p.ej., antígenos de pertussis), mutantes naturales (p.ej., CRMl 97) como proteínas portadoras y productos recombinantes modificados por ingeniería. TOXOIDES Al final de la fermentación, el medio de cultivo que contiene toxinas se debe separar asépticamente de la masa bacteriana lo antes posible o se debe colocar en un cuarto frío hasta que se pueda llevar a cabo la separación. El contenido de toxinas (Lf/mL) se verifica mediante una valoración por floculación usando el estándar de antitoxina adecuado para monitorear la uniformidad de la producción (el cultivo debe contener no menos de 40 Lf/mL). La toxina primero se purifica para eliminar cualquier componente que pudiera causar reacciones adversas en humanos. Un proceso típico incluye filtración profunda seguida de filtración de 0,2 µm para ayudar a eliminar los desechos celulares. Después de la purificación preliminar, la toxina se detoxifica con formaldehído, glutaraldehído o cualquier reactivo químico adecuado por un método que evite la alteración de la potencia inmunogénica del toxoide y la reversión del toxoide a toxina, en particular durante la exposición al calor. Algunos toxoides requieren una sola adición de formaldehído, mientras que otros pueden requerir múltiples adiciones. Como alternativa, la toxina se puede detoxificar y, posteriormente, purificarse de manera parcial o total mediante filtración profunda, detoxificarse mediante la adición de un volumen adecuado de aldehído, filtrarse usando filtración de 0,2 µm, y luego combinarse (pooled). La solución de toxoide combinado se purifica adicionalmente mediante clarificación con carbón activado, seguida de múltiples pasos de precipitación con sulfato de amonio que fraccionan y concentran aún más el toxoide. Los pasos típicos adicionales de purificación incluyen concentración, diafiltración y/o cromatografía. La purificación antes de la detoxificación genera un producto más puro y puede representar ventajas si el toxoide se va a usar como el componente proteico de un conjugado proteína-carbohidrato (debido a que los glicanos de alto peso molecular copurificados serán eliminados antes de la detoxificación). Durante la detoxificación y purificación, se lleva a cabo el análisis de endotoxinas de conformidad con el capítulo Prueba de Endotoxinas Bacterianas (85) y el análisis de formaldehído, contenido de proteínas y de irreversibilidad del toxoide, a fin de controlar y asegurar la uniformidad del proceso de purificación. Si se requiere que el material sea estéril, se pueden llevar a cabo las Pruebas de Esterilidad (71 ). PROTEÍNAS/PROTEÍNAS RECOMBINANTES Las proteínas usadas para fabricar vacunas pueden ser recombinantes (en su estado nativo o modificadas por ingeniería para alterar ciertos aminoácidos) o mutantes naturales, las cuales no presentan actividad del tipo salvaje pero son capaces de indu-
1948 (1238) Vacunas para Uso Humano/ Información General
USP 39
cir la respuesta inmune apropiada. Las proteínas se cosechan del fermentador, se extraen (p.ej., mediante disrupción mecánica y química) y posteriormente se purifican por métodos adecuados que generalmente consisten en etapas de filtración-concentración (p.ej., ultrafiltración, filtración en flujo tangencial, diafiltración, centrifugación, precipitación selectiva e inclusive captura directa usando cromatografía de lecho expandido o tecnologías de partículas grandes). La solución de proteínas enriquecida se puede purificar adicionalmente usando etapas de filtración y cromatográficas apropiadas. Los fabricantes deben evaluar las sustancias extraíbles y lixiviables para todo el equipo que entra en contacto con el fármaco (p.ej., resinas cromatográficas, membranas, sistemas de bolsas desechables o líneas de proceso). Los analistas deben determinar la vida de la resina de la columna para todos los sistemas cromatográficos usados en la purificación (incluyendo el número de usos, los requisitos de reacondicionamiento y las condiciones de almacenamiento). El tipo de cromatografía usada para purificar las proteínas depende de las propiedades físicas/químicas tanto de la proteína deseada, así como también de las otras entidades moleculares encontradas en el cultivo. Por ejemplo, la CRM 197 se puede purificar usando un proceso cromatográfico de etapas múltiples: El material de producción primero se somete a diafiltración y posteriormente se separa mediante cromatografía de intercambio iónico (DEAE-Sefarosa) para purificar la proteína diana de otras entidades moleculares presentes en las etapas de purificación. Después, se recolecta el pico de interés y se agrega sulfato de amonio, seguido de filtración de 0,22 µm para acondicionar el material antes de cargarlo en la columna cromatográfica de interacción hidrofóbica (Fenil Sefarosa) para purificar la proteína diana basándose en la hidrofobicidad de su superficie. Posteriormente, se diluye la fracción del pico con Agua para Inyección y se separa en una columna de hidroxiapatita de cerámica para purificar aún más la proteína diana basándose en su carga superficial. Se intercambia el amortiguador del pico eluido con el amortiguador de almacenamiento mediante ultrafiltración/diafiltración usando filtración por membrana de flujo cruzado seguida por filtración de 0,22 µm para generar un concentrado purificado estéril. El control de proceso de la purificación de proteínas incluye el monitoreo del contenido proteico específico y las etapas críticas del proceso, así como el monitoreo de la eliminación de componentes de la fermentación y de la purificación no deseados. El pH es crítico para la cromatografía de intercambio iónico y, por consiguiente, se debe monitorear. En las etapas diseñadas para eliminar endotoxinas, los procedimientos del capítulo Prueba de Endotoxinas Bacterianas (85) se usan para monitorear los eluyentes de la columna. La biocarga se monitorea de acuerdo con el capítulo Examen Microbiológico de Productos no Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano (61) después de los pasos de filtración y cromatografía. Si se requiere que el material sea estéril, se debe llevar a cabo la prueba de esterilidad del capítulo Pruebas de Esterilidad (71 ). CONJUGADOS DE POLISACÁRIDO-PROTEÍNA Los polisacáridos usados para reacciones de conjugación varían en tamaño y van desde polisacáridos nativos de alto peso molecular hasta oligosacáridos producidos mediante despolimerización controlada. Algunos polisacáridos pueden ser modificados (p.ej., des-0-acetilados, parcialmente despiruvilados). La determinación del tamaño/despolimerización de los polisacáridos se lleva a cabo de diversas maneras (p.ej., catálisis ácida/básica, oxidación/reducción química, microfluidización o tratamiento mecánico). La activación de los polisacáridos se puede llevar a cabo mediante distintos métodos, dependiendo de la labilidad de los epítopes particulares en diferentes condiciones de despolimerización o el tipo de conjugado deseado (p.ej., neoglicoconjugado o conjugado tipo Lattice, usando una molécula enlazante o conjugación directa, o aminación reductiva). Los polisacáridos de tamaño apropiado y/o activados se purifican a través de métodos adecuados que por lo regular consisten en varias combinaciones de concentración y filtración (ultrafiltración/diafiltración) y métodos cromatográficos (cromatografía de exclusión por tamaño, SEC). El análisis realizado para monitorear el proceso de despolimerización y de activación depende del proceso empleado. Las pruebas de control típicas son el monitoreo del pH y el monitoreo de la temperatura de las reacciones de despolimerización y de activación. La determinación del tamaño del polisacárido durante la despolimerización va posiblemente seguida de un procedimiento cromatográfico apropiado (p.ej., HPLC-SEC RI o MALLS). Puede ser necesario un análisis de polisacárido despolimerizado para determinados grupos funcionales (p.ej., grupos O-acetilo, N-acetilo o piruvilo) que se puede determinar mediante resonancia magnética nuclear (ver .•Espectroscopia déBes()na(1CÍa Magn~ticaf'Ju<.:lear(76J)•
USP 39
Información General/ (1238) Vacunas para Uso Humano 1949
mediante pruebas adecuadas o a través de la validación del proceso de purificación. Se deben llevar a cabo pruebas adecuadas para determinar la presencia de residuos de reactivos empleados durante la inactivación y la purificación. Es posible omitir las pruebas en los polisacáridos purificados conjugados siempre que la eliminación de agentes residuales haya sido demostrada mediante estudios de validación. El uso de procedimientos cromatográficos adecuados (HIC, SEC) y/o de filtración (ultrafiltración/diafiltración, filtración por flujo tangencial) permite eliminar polisacáridos que no reaccionaron, proteínas, químicos residuales y sales que se usan en la conjugación o que son subproductos de la conjugación. El análisis de biocarga (ver Examen Microbiológico de Productos no Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano (61)) se lleva a cabo antes de la filtración estéril.
PRODUCTOS INTERMEDIOS Un producto intermedio o producto intermedio del proceso durante la fabricación de vacunas es el producto de reacción de cada etapa del proceso, con excepción de la última, en la que se forma el producto final. Los ejemplos de productos intermedios incluyen polisacáridos purificados a granel, proteínas y polisacáridos activados que se conjugan a proteína. La mayoría de los procesos de producción de vacunas se realizan en etapas y requieren más de una etapa elemental para su culminación. Un producto intermedio se produce a partir de las materias primas en una o más etapas del proceso (p.ej., crecimiento bacteriano, extracción y purificación, y modificación química), lo que eventualmente resulta en el fármaco. La identificación de los productos intermedios claves, su producción y muestreo para pruebas analíticas se debe definir mediante documentos controlados (p.ej., registros de partida, protocolos analíticos). Los productos intermedios se pueden almacenar durante periodos considerables antes de su procesamiento adicional y se pueden incluir en un programa formal de estabilidad (ver la sección Estabilidad Durante el Almacenamiento anterior). Se deben llevar a cabo estudios de estabilidad en condiciones normales o aceleradas para definir el tiempo de espera (hold time) máximo para productos intermedios y siempre que se implementen cambios significativos del proceso. Desde las materias primas hasta el fármaco terminado, la realización de análisis durante todo el proceso asegura un producto de calidad. El análisis de productos intermedios es una etapa clave de control de calidad para asegurar su identidad y pureza. Los atributos de calidad de productos intermedios por lo regular se analizan en conjunto con el procesamiento adicional, además de que se debe considerar un análisis de liberación. Se deben definir adecuadamente procedimientos operativos estándar (POE) para las pruebas de control analíticas. Debido a su papel fundamental en el proceso de producción, algunos productos intermedios claves podrían incluirse en el análisis formal de liberación, además de los productos intermedios identificados para el análisis de proceso. Los ejemplos de pruebas para la caracterización estructural de productos intermedios basados en carbohidratos incluyen lo siguiente: • identidad y nivel de 0-acetilación (resonancia magnética nuclear) • tamaño molecular y polidispersión (SEC-UV, SEC-Índice de Refracción, SEC-MALLS, SEC-Fluorescencia) •contenido de sacáridos [valoraciones calorimétricas, cromatografía de intercambio aniónico a pH alto con detección amperométrica por pulsos (HPAEC-PAD), Fluorescencia] • rotación específica, ver Rotación Óptica (781) • contenido de sacáridos, contenido de O-acetilo (valoraciones calorimétricas) •contenido de contraiones, p.ej., Na+ y Ca 2 + (espectrometría de masas de plasma inductivamente acoplado, absorción atómica). Los ejemplos de pruebas para determinar la pureza de productos intermedios basados en carbohidratos, las cuales se basan en estimaciones de impurezas del producto y del proceso incluyen lo siguiente: • contenido de endotoxinas (Prueba de Endotoxinas Bacterianas (85)) • proteínas, ácidos nucleicos, proteínas, cetavlón (valoraciones calorimétricas) • contenido de agua (valoración de Karl Fischer; ver Determinación de Agua (921)) • sustancias volátiles (termogravimetría) •disolventes orgánicos, p.ej. etanol, fenal, acetona, DMSO o acetato de etilo (detección por cromatografía de gases-ionización a la llama; ver Disolventes Residuales (467)) • biocarga (recuento total de microorganismos aerobios contaminantes viables; ver Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano (61))
Los ejemplos de pruebas para la caracterización estructural y estimación de pureza de productos intermedios basados en proteínas incluyen lo siguiente: • identidad y tamaño molecular (SDS-PAGE, Transferencia Western, SEC-UV, SEC-Fluorescencia, SEC-MALLS, cromatografía en fase reversa) • contenido de endotoxinas (ver Prueba de Endotoxinas Bacterianas (85)) •ácidos nucleicos residuales [valoración calorimétrica; ver Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Enfoques para Detectar Trazas de Ácidos Nucleicos (Análisis de ADN Residual) (1130)]
• biocarga (recuento total de microorganismos aerobios contaminantes viables; ver Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano (61))
• otras proteínas como impurezas (SDS-Page, Transferencia Western, SEC-UV, SEC-Fluorescencia, cromatografía en fase reversa)
1950 (1238) Vacunas para Uso Humano / Información General
USP 39
Las pruebas previamente mencionadas para productos intermedios basados en proteínas también son aplicables al fármaco cuando éste es un producto basado en proteína. Además de los ejemplos arriba citados, se pueden aplicar muchas otras metodologías para la evaluación de identidad y pureza. Las pruebas de estabilidad para productos intermedios pueden incluir métodos fisicoquímicos (ver anteriormente en Productos Intermedios) incluidos formalmente como parte de un panel analítico para el estudio de estabilidad. Asimismo, se pueden incluir pruebas biológicas e inmunoquímicas [p.ej., ensayo por inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA)]. El análisis de biocarga y endotoxinas puede no ser necesario para cada nivel (cada producto intermedio, fármaco) siempre que el análisis se lleve a cabo en un número de etapas suficientes durante el proceso general de producción. El análisis de biocarga a menudo se lleva a cabo antes de la filtración estéril mediante el análisis del proceso. Cuando resulta necesario almacenar y/o transportar los productos intermedios a un lugar diferente para su procesamiento adicional, se debe demostrar la estabilidad de dichos materiales.
FÁRMACO El fármaco es el producto final a granel que contiene el antígeno a la concentración deseada y que está listo para la adición de otros ingredientes (p.ej., diluyentes, agentes de volumen, excipientes estabilizantes, coadyuvantes o conservantes) para producir la formulación farmacéutica final. El fármaco es el producto final del proceso de fabricación del antígeno, antes de la formulación de la dosis de vacuna final. El producto final a granel se puede preparar asépticamente o puede incluir una etapa de esterilización. El muestreo para las pruebas analíticas de liberación y los estudios de estabilidad (ver Estabilidad Durante el Almacenamiento) se debe definir mediante documentos controlados (p.ej., registros de partida, protocolos analíticos). Los fármacos se pueden almacenar durante un periodo considerable antes de su procesamiento adicional; sin embargo, si el fármaco se almacena, deberá incluirse en un programa formal de estabilidad (ver Estabilidad Durante el Almacenamiento). Se deben llevar a cabo estudios de estabilidad en condiciones normales o aceleradas para definir los tiempos de espera (hold times) máximos. Resulta necesario un programa de estabilidad para estudios formales de estabilidad, los cuales se deben realizar de acuerdo con un protocolo que contenga información detallada sobre los tipos de pruebas, especificaciones, intervalos de análisis y tiempos de muestreo. El fármaco debe analizarse para asegurar su identidad y pureza. Todos los análisis deben llevarse a cabo de conformidad con los POE establecidos y se deben proporcionar especificaciones (o especificaciones provisorias, cuando corresponda) para todas las pruebas. Los ejemplos de pruebas para la caracterización estructural de productos basados en carbohidratos incluyen lo siguiente: • identidad y nivel de 0-acetilación [resonancia magnética nuclear (RMN)] • contenido de sacárido total y libre [HPAEC-PAD, electroforesis capilar (EC) o valoraciones calorimétricas] • contenido de proteína total y libre (valoración calorimétrica, SEC con UV, RI o detección de fluorescencia, EC) • contenido de O-acetilo (valoraciones calorimétricas) • tamaño molecular (SEC-UV, -RI, -Fluorescencia o -MALLS) Los ejemplos de pruebas para determinar la pureza de fármacos basados en carbohidratos, las cuales se basan en estimaciones de impurezas del producto y del proceso incluyen lo siguiente: •contenido de endotoxinas (Prueba de Endotoxinas Bacterianas (85)) • productos residuales relacionados con el proceso cuando en la validación del proceso se demuestre que no fueron eliminados (p.ej., cianuro, yodato, bromuro, sulfato de amonio o disolventes orgánicos) • Biocarga (recuento total de microorganismos aerobios contaminantes viables; ver Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano (61 )) Además de los ejemplos arriba citados, se pueden aplicar muchas otras metodologías para la evaluación de identidad y pureza. Por ejemplo, las impurezas específicas que requieren ser medidas se determinan mediante negociaciones entre los fabricantes y la agencia nacional reglamentaria de fármacos durante el proceso de otorgamiento de licencias. El análisis de biocarga y endotoxinas puede no ser necesario para cada nivel (cada producto intermedio, fármaco) siempre que el análisis se lleve a cabo en un número de etapas suficiente durante el proceso general de producción. El análisis de biocarga a menudo se lleva a cabo antes de la filtración estéril mediante el análisis de proceso. Todos los resultados se deben informar en un documento controlado. Las pruebas de estabilidad pueden incluir métodos fisicoquímicos (ver la sección de información de estabilidad anterior) y pruebas biológicas/inmunoquímicas (p.ej. ELISA y SBA; ver Calidad de Productos Biotecnológicos: Pruebas de Estabilidad de Productos Biotecnológicos o Biológicos (1049)).
PRODUCTO FARMACÉUTICO Y LIBERACIÓN DE LOTE Los principios generales se encuentran descritos en el capítulo Vacunas para Uso Humano--Consideraciones Generales (1235), el cual detalla el procedimiento de liberación de lotes de conformidad con el Título 21 del CFR 610.1 y el Título 21 del CFR 610.2. Para aquellos productos que se utilizarán en los Estados Unidos, deberán presentarse ante la FDA muestras y protocolos que incluyan todas las pruebas apropiadas para su revisión y/o análisis. Si la FDA determina que el lote cumple con los estándares de seguridad, pureza y potencia requeridos para la vacuna particular, el lote queda aprobado para su liberación, distribución y comercialización.
USP 39
Información General/ (1238) Vacunas para Uso Humano 1951
Las pruebas requeridas para cada protocolo de liberación de lote incluyen potencia, seguridad general, esterilidad, pureza, identidad y materiales constituyentes. Las pruebas de potencia y relacionadas con la potencia son diferentes para cada vacuna bacteriana. La inclusión de estas pruebas hace que cada protocolo de liberación de lote de vacunas bacterianas sea único. La identidad del contenido de un envase final de cada lote de llenado se analiza después de que se ha completado el etiquetado. La identidad se establece mediante las características físicas o químicas de la vacuna, inspección por métodos macroscópicos o microscópicos, pruebas de cultivo específicas o pruebas inmunológicas in vivo o in vitro. En su mayoría, las pruebas de identidad se llevan a cabo para distinguir a la vacuna de otros materiales que se fabrican en el mismo sitio (Título 21 del CFR 610.14). Las mismas pruebas para establecer la identidad también pueden ser adecuadas para definir la cantidad de inmunógeno presente en el vial final. Esto es especialmente importante para vacunas basadas en carbohidratos que se dosifican por masa y para las que se usan medidas fisicoquímicas de calidad del antígeno. Los métodos inmunoquímicos, que incluyen métodos de inmunoprecipitación e inmunoelectroforéticos, han resultado de utilidad. Los métodos de inmunoprecipitación, floculación y precipitación, se pueden llevar a cabo en solución o en una matriz de gel e implican el mezclado del antígeno con un anticuerpo apropiado, lo que lleva a la formación de agregados de flóculos o precipitados que se pueden detectar visualmente o mediante dispersión de luz (dispersión de luz o nefelometría). Se debe variar la relación de reactantes para optimizar la respuesta detectada. En solución, esto se puede lograr valorando un reactante con el otro y se puede obtener una mayor sensibilidad usando partículas recubiertas con antígeno o anticuerpo (p.ej., látex) como reactantes. Para los sistemas en gel, se genera un gradiente a medida que uno o más de los reactantes difunden, creando una línea visible donde ocurre la precipitación. La inmunoelectroforesis (IE) es una técnica cualitativa que combina dos métodos: electroforesis en gel seguida por inmunodifusión. La IE cruzada es una modificación del método de IE, que es adecuada para análisis cualitativos y cuantitativos. La visualización y caracterización de líneas de inmunoprecipitación se puede llevar a cabo mediante tinciones selectivas o no selectivas, fluorescencia, marcado con enzimas o isótopos u otras técnicas pertinentes. Los métodos de tinción selectiva por lo regular se realizan para caracterizar sustancias no proteicas en los precipitados. En geles translúcidos, tales como agar o agarosa, la línea de precipitación se tornará claramente visible en el gel siempre que la concentración de cada reactante sea la adecuada. Cuando se presentan múltiples componentes activos como resultado de la copurificación (p.ej., ciertas vacunas de pertussis acelulares), el fabricante debe demostrar que la composición del producto es uniforme entre partidas, a menos que ésta se haya validado durante el desarrollo del proceso de fabricación. Para algunas vacunas, especialmente aquéllas que emplean inmunógenos de polisacáridos purificados, la identidad y la cantidad de inmunógeno se pueden demostrar usando uno o más enfoques químicos y fisicoquímicos tales como determinaciones colorimétricas de los diferentes grupos de residuos de azúcares que se espera estén presentes, cromatografía o espectroscopía de resonancia magnética nuclear de campo elevado. Diversas valoraciones colorimétricas clásicas para cuantificación de varias clases de azúcares se han utilizado para definir la composición de polisacáridos que se usan como vacunas, incluyendo la valoración de orcinol para ribosa, fósforo, ácido siálico, ácidos urónicos y aminoazúcares. En general, estos enfoques han sido reemplazados por métodos cromatográficos, que incluyen cromatografía de gases y HPAEC, la cual se usa ampliamente para determinar los inmunógenos glicoconjugados Hib-PRP en vacunas monovalentes o combinadas y en inmunógenos conjugados de meningococo. Los métodos inmunoquímicos que se han usado para cuantificar los antígenos de polisacárido incluyen (a) inmunoelectroforesis de cohete y (b) nefelometría de velocidad. El electroinmunoensayo, también denominado inmuno electroforesis de cohete, es un método cuantitativo para determinar antígenos cuya carga difiere de la de los anticuerpos. La electroforesis del antígeno que se va a determinar se lleva a cabo en un gel que tiene una concentración más baja del anticuerpo correspondiente. Los métodos por nefelometría se han usado para cuantificar antígenos en vacunas conjugadas contra neumococo. La uniformidad del tamaño molecular y de la distribución del tamaño molecular de las vacunas conjugadas que contienen polisacáridos y carbohidratos se puede determinar mediante cromatografía de permeación en gel sobre resinas adecuadas, calibradas con marcadores de pesos moleculares adecuados o acopladas a un equipo de dispersión de luz láser que indica el peso molecular absoluto si se conoce un valor para el incremento del índice de refracción (dn/dc). La medición del tamaño molecular de conjugados formulados puede no ser factible para vacunas de glicoconjugados multivalentes. La integridad del conjugado se puede demostrar a través de métodos alternativos y específicos del producto. Otra alternativa para demostrar la integridad de los glicoconjugados en el producto final es la medición del tamaño molecular como parte de los estudios de estabilidad en el conjugado monovalente a granel antes de formular la vacuna multivalente. A menos que se haya validado lo contrario, los fabricantes deben demostrar que no se ha revertido la toxicidad (y que no ocurrirá durante la vida útil) de un producto derivado o que contiene un material toxoide. Esto puede requerir el uso de una línea celular o de una prueba in vivo, aunque se estén validando enfoques enzimáticos. La prueba para pureza antigénica es una valoración que evalúa la cantidad de antígeno y se usa para vacunas de toxoides de difteria y tétanos. El contenido de antígeno se determina mediante una valoración por floculación. El fabricante debe demostrar un nivel alto y uniforme de adsorción del inmunógeno a cualquier coadyuvante en fase sólida (tal como fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio) que sea congruente con la especificación de liberación. Para algunas vacunas tales como las vacunas contra el ántrax y vacunas de toxoides, el fabricante debe demostrar que la vacuna protege contra la enfermedad o muerte en modelos animales inoculados con una dosis predefinida del patógeno diana. Esto por lo general requiere definir el modelo animal, la ruta de administración, las diluciones requeridas de la vacuna, la manera de observar los efectos y una vacuna de referencia contra los efectos que se están comparando. Los datos se deben analizar adecuadamente (ver el capítulo Análisis de Valoraciones Biológicas (1034)).
1952 (1238) Vacunas para Uso Humano/ Información General
USP 39
Para determinar la estabilidad del producto, se utilizan valoraciones indicadoras de estabilidad. La valoración de potencia tiene una importancia primaria, aunque la degradación de glicanos puede ser importante en vacunas de glicoconjugados.
Propiedades y Otros Componentes de las Vacunas En los EE.UU., los compuestos de aluminio son los coadyuvantes primarios que se usan para las vacunas. El capítulo general Vacunas para Uso Humano-Consideraciones Generales (1235) provee disposiciones del Título 21 del CFR 610.15 que rigen el
uso de aluminio y las cantidades permitidas. Los coadyuvantes que se usan ampliamente en vacunas bacterianas incluyen sulfato potásico de aluminio (alum), fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio y combinaciones de estos compuestos. Las vacunas bacterianas formuladas con los coadyuvantes mencionados reciben el nombre de vacunas adsorbidas, y dicho término se puede incluir en el nombre oficial de la vacuna. Asimismo, se pueden evaluar otros sistemas coadyuvantes. El aluminio se cuantifica usando colorimetría, volumetría, espectrofotometría de absorción o emisión atómica o espectrometría de masas con plasma inductivamente acoplado. Para reglamentaciones con respecto a los reactivos de fabricación residuales, ver el documento de la FDA de 1999, Guidance far lndustry: Content and Format of Chemistry, Manufacturing, and Controls lnfarmation and Establishment Description lnfarmation far a Vaccine or Related Product. Los reactivos de fabricación tales como formaldehído y glutaraldehído en ocasiones se usan
para la inactivación, en procesos de fabricación de toxoides, o en otras etapas durante la fabricación, y pueden estar presentes en cantidades residuales en el producto final. Los límites de formaldehído y otros compuestos se deben minimizar de acuerdo con la licencia de producto aprobado. Los conservantes comunes usados en las vacunas bacterianas incluyen timerosal, fenol, 2-fenoxietanol y cloruro de benzalconio. El capítulo Vacunas para Uso Humano-Consideraciones Generales (1235) y el Título 21 del CFR 610.15 proporcionan información adicional sobre la minimización de contenido de timerosal y la producción de vacunas exentas de timerosal. En la licencia del producto se establecen los límites y especificaciones de contenido para cada vacuna bacteriana. Cada lote de envases finales de una vacuna destinada para su uso mediante inyección se debe analizar para determinar la presencia de endotoxinas bacterianas, según se indica en el capítulo Prueba de Endotoxinas Bacterianas (85). Cada lote de envases finales de una vacuna destinada para su uso mediante inyección se puede analizar para determinar la presencia de sustancias pirógenas según se indica en el capítulo Prueba de Pirógenos (151) y en el Título 21 del CFR 610.14. Además, se debe analizar la humedad residual de cada lote de producto seco (ver Pérdida por Secado (731) y el documento de la FDA de enero de 1990, Guideline far the Oetermination of Residual Moisture in Dried Biological Products). La humedad residual se debe determinar para vacunas liofilizadas. Se debe realizar una prueba de seguridad general a los productos biológicos destinados para administración a humanos con el propósito de detectar contaminantes tóxicos extraños. El Título 21 del CFR 610.11 especifica procedimientos y excepciones. La identidad y cantidad de excipientes, conservantes, diluyentes, coadyuvantes, proteínas extrañas y las vacunas producidas con cultivos celulares y antibióticos se analizan de conformidad con el título 21 del CFR 610.15 y/o los documentos guía apropiados. El sacárido "libre" o no conjugado en las vacunas de glicoconjugados se considera indeseable y está sujeto a especificaciones de límite. Como alternativa para controlar un sacárido libre o no conjugado, la integridad de los conjugados en el producto final se puede demostrar a través de un método apropiado el cual depende de las propiedades del producto final (composición, adsorción, etc). Los métodos de prueba que miden el incremento en la cantidad de un sacárido libre son los métodos indicadores de estabilidad. Los métodos adoptados dependen de la separación del sacárido del conjugado y de la aplicación de los métodos descritos anteriormente para cuantificar el sacárido no conjugado. Los métodos de separación usados incluyen separación por membrana (tal como diálisis), el uso de medios hidrofóbicos para atrapar específicamente el conjugado, extracción con disolventes y precipitación inmunoquímica selectiva del conjugado usando anticuerpos contra el portador. El análisis de esterilidad de cada lote de producto se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos descritos en Pruebas de Esterilidad (71) y el Título 21 del CFR 610.12 para materiales a granel y en envase final.
Inserto informativo (Etiqueta) El etiquetado de la vacuna está reglamentado de conformidad con el Título 21 del CFR 201 y 61 O. Asimismo, se establecen requisitos para el etiquetado del envase y el etiquetado del empaque.
OTROS REQUISITOS Las muestras para retención son conservadas por el fabricante durante al menos seis meses después de la fecha de caducidad. Se debe retener suficiente material de cada lote de cada producto para examinar y analizar su seguridad y potencia (ver el Título 21 del CFR 600.13). Asimismo, se deben mantener registros acordes a cada etapa de la fabricación y distribución del producto de manera que se pueda rastrear en todo momento cualquier etapa sucesiva de fabricación y distribución (ver el Título 21 del CFR 600.12). Para condiciones de almacenamiento, ver el Título 21 del CFR 610.50 y 53. Para vida útil/fecha de caducidad, ver el Título 21 del CFR 610.50 y 53.
USP 39
Información General J (1240) Análisis de Plasma Humano 1953
(1240) ANÁLISIS DE VIRUS EN PLASMA HUMANO PARA FABRICACIÓN POSTERIOR ALCANCE El alcance de este capítulo se limita al análisis de virus realizado en plasma humano que va a ser usado posteriormente para la fabricación de productos farmacéuticos, los cuales se denominan productos derivados de plasma (ver Métodos de Pruebas Virológicas (1237) para análisis de virus de otros productos terapéuticos). Estos tipos de plasma incluyen plasma de origen recolectado por aféresis o plasma recuperado obtenido de la recolección de sangre entera o como un subproducto en la producción de componentes sanguíneos. En todos los casos, el material fuente se obtiene mediante donaciones voluntarias. Los siguientes temas se excluyen específicamente del alcance de este capítulo: •Análisis de virus de sangre o plasma no humanos; por ejemplo, suero fetal bovino (ver Suero Bovino (1024) para más información sobre el análisis de dicho material), el cual se puede usar en la producción de productos terapéuticos biológicos o recombinantes • Análisis de virus de sangre entera derivada de humanos, componentes sanguíneos usados para transfusión y materiales en bancos de tejidos y órganos •Análisis de organismos no virales; por ejemplo, bacterias, hongos y parásitos (algunos de estos temas se discuten en el capítulo Pruebas de Esterilidad (71 )) o el agente causante de la encefalopatía espongiforme transmisible. Este capítulo introduce el análisis de virus que se realiza al plasma usado para la producción de proteínas terapéuticas. Los temas tratados incluyen: 1. La justificación de la implementación de pruebas para virus 2. Los tipos de análisis aplicados a donaciones de plasma destinados para fabricación posterior 3. El entorno reglamentario actual para dichos análisis de virus El capítulo también incluye un Apéndice que contiene pautas reglamentarias pertinentes y referencias de sustento.
INTRODUCCIÓN Los productos derivados de plasma humano se usan para tratar trastornos de coagulación, inmunodeficiencia primaria y enfisema congénito así como otras enfermedades (ver Plasma Humano (1180)). Debido a que estos productos se fabrican a partir de donaciones combinadas de plasma humano, la presencia de patógenos virales transmitidos por la sangre de donaciones individuales de plasma tienen el potencial de contaminar los productos finales resultantes que se fabrican a partir de una gran combinación de donaciones y, en consecuencia, transmitir el virus a muchos pacientes. Se deben tomar medidas suficientes para asegurar que estos productos sean lo más seguros posibles. Para minimizar el riesgo de transmisión de virus por estos productos, los fabricantes emplean diversas estrategias, que incluyen: •Selección y gestión de donantes (ver también el capítulo (1180)) •Selección y gestión de donaciones o unidades (ver también el capítulo (1180)) •Análisis de patógenos virales infecciosos en plasma en forma de muestras de donaciones individuales o combinadas (pooled) y combinados de muestras (pool) para fraccionamiento (definidos para los propósitos de este documento como el primer combinado homogéneo o producto intermedio de producción temprana adecuado para el análisis y representativo del material que se va a usar para la fabricación del producto) • Métodos de selección de donantes, que también incluyen un procedimiento en retrospectiva para la cuarentena y la destrucción de unidades sin usar previamente donadas por un donante infectado (ver también el capítulo (1180)) • Incorporación de etapas de inactivación y eliminación de virus validadas (etapas de reducción de patógenos) en los procesos de fabricación (ver también el capítulo (1180)) • Monitoreo e investigación de eventos adversos en receptores de productos finales, tanto en hemovigilancia y farmacovigilancia (ver también el capítulo (1180)) •Apego a las Buenas Prácticas de Fabricación a todos los niveles de los procesos de producción como una estrategia con el fin de reducir el riesgo de transmisión de virus (ver GAO-HEHS-98-205, Título 21 del CFR Parte 606 e Informe Técnico de la OMS Serie 941 citado en el Apéndice). El plasma usado para fabricación posterior puede ser plasma de origen o recuperado. En los Estados Unidos, los productos autorizados de plasma humano se derivan principalmente de plasma de origen. Debido a que el plasma para fabricación posterior se obtiene combinando un gran número de donaciones, existe el riesgo de contaminación viral del combinado, lo que resulta en un potencial de riesgo mucho más alto de transmisión de virus a múltiples pacientes que en el caso de la transfusión sanguínea. El proceso de fabricación que se usa para purificar y concentrar la proteína deseada no tiene la capacidad de eliminar por completo la carga viral y, por lo tanto, se incluyen en el proceso de fabricación etapas validadas de reducción de virus capaces de reducir de manera efectiva los virus transmisibles por transfusión en el material inicial. Un análisis detallado sobre procedimientos de inactivación y eliminación de virus para la reducción de patógenos se puede encontrar en el Informe Técnico Serie 924 de la OMS 2004 citado en el Apéndice.
1954 (1240) Análisis de Plasma Humano/ Información General
USP 39
Las estrategias para análisis de plasma para fabricación posterior se pueden categorizar en dos grupos: uno que incluye los métodos de selección de donantes y el otro que contiene los métodos para determinar la presencia de virus durante el proceso de fabricación de los productos terapéuticos. Los métodos de selección de donantes toman en cuenta no sólo el producto final derivado de plasma, sino también al donante del plasma. Esta categoría de análisis se requiere a menudo para virus de transmisión sanguínea tales como el virus de inmunodeficiencia humana (VIH), el virus de hepatitis C (VHC) y el virus de hepatitis B (VHB). La transmisión de virus es una gran preocupación para la seguridad pública debido a que las infecciones con estos virus altamente patogénicos por lo general llegan a convertirse en infecciones crónicas. Durante la selección de donantes, el objetivo del laboratorio de pruebas o del fabricante no es sólo identificar unidades positivas para su destrucción antes de la combinación para producción, sino también identificar y notificar a los donantes infectados. La elegibilidad de aquellos donantes que resulten positivos para VHC o VIH será permanentemente suspendida y no podrán donar sangre ni plasma. Asimismo, aunque menos del 5% de adultos infectados con VHB desarrollan una infección asintomática persistente (es decir, un estado de portador), la elegibilidad de los donantes VHB positivos queda permanentemente suspendida. En ocasiones se permite recolectar plasma de origen de donantes convalecientes del VHB para fabricación posterior en productos derivados de plasma tales como lnmunoglobulina de Hepatitis B (Humana) [Título 21 del CFR 610.41 (3)]. Al contrario de los virus que se relacionan con la selección de donantes, los virus tales como el virus de hepatitis A (VHA) y el parvovirus Bl 9 (Bl 9V) por lo general ocasionan infecciones autolimitantes en personas inmunocompetentes y, por ende, los fabricantes utilizan análisis por tecnologías de amplificación de ácidos nucleicos (NAT, por sus siglas en inglés) durante el proceso que eliminan únicamente las unidades de plasma con altos niveles de virus antes de la combinación para producción. En estos casos, no existe un procedimiento de gestión de donantes y, por lo tanto, tampoco un requisito para informar al donante del resultado. Este método se enfoca principalmente en el producto, no en el donante, debido a que algunos receptores de estos productos son susceptibles a una infección que podría ocurrir si el producto derivado de plasma contuviera patógenos. La industria de la sangre y el plasma cuenta con procedimientos de gestión de donantes y de donaciones bien desarrollados, y se pueden obtener mayores detalles sobre estos temas específicos en el capítulo (1180). Existen otros criterios para la suspensión permanente o temporal de la elegibilidad de donantes para evitar donaciones de individuos potencialmente infectados basados en la vigilancia epidemiológica de un país, región o población de donantes para infecciones transmisibles por transfusión importantes para la seguridad de los componentes sanguíneos. Los virus que afectan de gran manera la salud pública, tales como el VIH, el VHB y el VHC, se detectan mediante valoraciones serológicas que miden un antígeno viral, como el antígeno de superficie del virus de Hepatitis B (AGsHB) o un anticuerpo, como los anticuerpos anti-VHC o anti-VIH-1 /2, en donantes infectados y donaciones relacionadas. Estos inmunoensayos para detectar marcadores virales en donaciones de plasma deben ser sensibles y capaces de detectar una infección viral tan pronto como sea posible después de la infección para identificar y excluir donaciones potencialmente infecciosas. Existe un tiempo finito, conocido como periodo de ventana, entre la infección de un donante y el tiempo en el que el método de prueba puede detectar la respuesta del anticuerpo al virus, a los antígenos virales o al ácido nucleico viral. Este periodo de ventana varía entre enfermedades así como entre individuos. El periodo de ventana puede "acortarse" de manera efectiva pasando de una prueba basada en la detección de anticuerpos a una basada en la detección directa del virus, principalmente el antígeno viral o, en especial, el ácido nucleico viral (ver la Figura 7), rechazando así donaciones que contengan virus transmisibles por transfusión. Las pruebas para detectar los ácidos nucleicos virales (es decir, las pruebas NAT) se introdujeron en la década de 1990. Las pruebas NAT son sensibles y pueden acortar considerablemente el periodo de ventana (ver la Figura 7). En un desarrollo posterior, después de los incidentes de transmisión del virus Bl 9 que involucraron productos derivados de plasma, se inició el análisis usando las pruebas NAT para rechazar donaciones con títulos altos, con lo que se redujo la carga del virus Bl 9 en los combinados de fabricación.
USP 39
Información General/ (1240) Análisis de Plasma Humano 1955
Título -Ácido Nucleico--- Anticuerpo•••• Antígeno
Infección
+-------_. Período de ventana del anticuerpo
Tiempo
<111(;------!),.. Período de ventana del antígeno <11(;----),.. Período de ventana de NAT
Figura 1. Dinámica de replicación y detección de virus de una infección. Tanto el plasma de origen como el plasma recuperado se analizan mediante pruebas serológicas y NAT aprobadas por autoridades reglamentarias competentes o, en el caso de análisis durante el proceso, validadas según los requisitos de los fabricantes. Las unidades de plasma consideradas aceptables mediante estas pruebas se mezclan en combinaciones de gran tamaño denominadas combinados de muestras (pool) para fraccionamiento, para la fabricación de productos derivados de plasma. El tamaño del combinado de muestras (pool) para fraccionamiento puede variar desde varios cientos de donaciones (generalmente usadas para la producción de inmunoglobulinas específicas) hasta varios miles (usadas, por ejemplo, para la fabricación de albúmina). Finalmente, los combinados de muestras (pool) para fraccionamiento se analizan nuevamente para determinar la presencia de los virus esperados. El análisis de donaciones de plasma, al nivel individual o de minicombinado, y los combinados de muestras (pool) para fraccionamiento son dos de los elementos que los fabricantes ponen en práctica para mantener los márgenes de seguridad de dichos productos. El análisis serológico se realiza en donaciones individuales. En contraste con las pruebas serológicas, las pruebas NAT de la actualidad son altamente sensibles y específicas; por lo tanto, los fabricantes, además de analizar donaciones individuales, analizan minicombinados compuestos por volúmenes iguales de cada donación. En la actualidad, el tamaño del minicombinado usado para el análisis NAT varía de 6 a 512 donaciones. La alta sensibilidad de las pruebas NAT también permite una detección más temprana del virus en comparación con una prueba basada en antígenos o anticuerpos, con lo que se reduce la duración promedio del periodo de ventana. Los productos derivados de plasma se producen a partir de combinados de muestras (pool) para fraccionamiento y se someten a fabricación posterior usando una combinación de etapas de fraccionamiento y purificación. Estas etapas pueden tener cierto potencial inherente para eliminar o inactivar virus y reducir así los contaminantes virales que pudieran estar presentes en el plasma inicial. No obstante, la fabricación de productos derivados de plasma también incluye etapas dedicadas exclusivamente diseñadas para inactivar (p.ej., mediante tratamiento con detergente disolvente) o eliminar (p.ej., mediante filtración de virus) contaminantes virales potenciales.
JUSTIFICACIÓN PARA EL ANÁLISIS DE VIRUS EN PLASMA PARA FABRICACIÓN POSTERIOR Históricamente, los métodos de pruebas virológicas se han usado para detectar antígenos o anticuerpos virales en ambientes clínicos para el diagnóstico, intervención y contención de enfermedades. Posteriormente, estos métodos se adaptaron para detectar en la sangre y en el plasma, con alta sensibilidad y especificidad, virus transmitidos por transfusión. Para desarrollar una nueva prueba de detección de virus, los científicos deben conocer las propiedades bioquímicas de un nuevo patógeno emergente (p.ej., la secuencia de ácidos nucleicos) para el desarrollo de una prueba NAT o de la proteína (p.ej., antígeno) para pruebas inmunológicas. Al implementar una prueba de ese tipo para un patógeno dado, se deben considerar las implicaciones para la salud pública de los resultados positivos de prueba y el potencial para la intervención y el tratamiento temprano de la enfermedad. Además, se debe tomar en cuenta la disponibilidad del plasma para fabricación posterior y los efectos del virus sobre la seguridad del producto terminado. El surgimiento de un patógeno viral en la población de donantes puede resultar en una carga viral considerable en las donaciones de plasma y en los combinados de muestras (pool) para fraccionamiento resultantes. Para virus tales como VHB, VHC, VIH-1 y VIH-2 que pueden ocasionar enfermedades crónicas con efectos potenciales para la salud pública, todas las donaciones que resulten positivas para uno o más de estos virus, independientemente del título viral, deberán ser eliminadas y el donante deberá ser informado. Algunos virus tales como el virus Bl 9 son preponderantes en la población (hasta 1 por cada 5000 individuos pueden estar infectados durante un periodo epidémico) y podrían estar presentes con títulos virales elevados en personas infectadas. Por consiguiente, la eliminación de todas las donaciones con virus Bl 9 positivo pueden generar escasez de plasma.
1956 (1240) Análisis de Plasma Humano / Información General
USP 39
En su lugar, el análisis NAT durante el proceso se realiza para vetar donaciones con títulos altos, limitando así la carga de virus Bl 9 en la combinación para fabricación. La justificación para dicha selección es que el virus Bl 9 ocasiona una infección autolimitante en la mayoría de los individuos inmunocompetentes. Después de la recuperación, dichos individuos cuentan con anticuerpos neutralizantes para el virus Bl 9. La seroconversión ocurre en la etapa temprana de vida, debido a que la infección por virus Bl 9 es común durante la infancia y aproximadamente 50% de los adolescentes de 15 años de edad tienen anticuerpos virus Bl 9. La infección de individuos susceptibles continúa durante toda la vida adulta y la seroprevalencia del virus Bl 9 se incrementa con la edad. Los anticuerpos neutralizantes del virus B19 presentes en un combinado de plasma y las etapas validadas de reducción de virus incluidas en los procesos de fabricación aseguran que la inclusión de dichas donaciones no comprometan la seguridad de los productos derivados de plasma ni la disponibilidad del plasma para fabricación posterior. En algunas instancias podría no ser necesario o factible analizar un virus transmitido por la sangre. Por ejemplo, no se requiere el análisis de plasma para virus asociados a células tales como los virus linfotrópicos de células T humanas (VLTH) tipos 1y 11, que no presenta carga viral o presenta solo una carga viral limitada en el plasma (pero con una carga viral considerable en las donaciones de sangre entera). De manera similar, el análisis del Virus del Nilo Occidental (VNO), un miembro de la familia Flaviviridae, es innecesario debido a que la carga viral es baja durante el periodo de ventana asintomático, su prevalencia en la población de donantes es baja (lo cual resulta en una carga viral baja en un combinado de plasma para fraccionamiento), y el proceso de fabricación puede inactivar de manera efectiva este virus, conforme se demuestra en estudios de validación usando virus modelo Flaviviridae pertinentes. Por lo tanto, no se requiere el análisis NAT de VNO para plasma (de origen y recuperado) para fabricación posterior. No obstante, en los Estados Unidos, la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA, por sus siglas en inglés) recomienda el análisis NAT de VNO para sangre y componentes sanguíneos para transfusiones debido a la situación epidemiológica y al riesgo de transmisión de VNO por componentes sanguíneos (ver la Guía de la FDA para la Industria citada en el Apéndice). Otros virus patógenos tales como los virus de la influenza y el coronavirus del síndrome agudo respiratorio severo (SARS-CoV, por sus siglas en inglés) se asocian con la enfermedad clínica después de un periodo corto de incubación y no tienen carga viral o la tienen baja durante el periodo de ventana asintomático. No se ha informado transmisión de estos virus por transfusión sanguínea o productos derivados de plasma. Además, el proceso de fabricación para productos derivados de plasma ha demostrado ser efectivo para inactivar los virus de la influenza. Por lo tanto, el análisis NAT para plasma no es necesario para estos virus. Para un virus con prevalencia alta en la población de donantes pero sin implicaciones clínicas conocidas, no se requiere un programa de selección por NAT o serológico debido a que la mayoría de los donantes no serán elegibles para donar, lo que amenazaría el abastecimiento de sangre y plasma y de productos derivados de plasma. Los virus que caen en esta categoría son el Virus Torque Teno (TTV, por sus siglas en inglés), que está presente en más del 80% de la población general y el virus GB tipo C (VGB-C, previamente conocido como virus de la hepatitis G, VHG). Los patógenos de reciente surgimiento como el virus de la hepatitis E (VHE) pueden ingresar potencialmente en la población de donantes de sangre y plasma, generando infecciones virales en receptores de sangre y productos derivados de plasma. El monitoreo del surgimiento de dichos agentes es un esfuerzo continuo que involucra al mundo académico, a las organizaciones públicas que monitorean la salud y desarrollan sistemas de advertencia temprana, a las agencias reglamentarias y a la industria. En la actualidad, se utilizan diversos sistemas de vigilancia epidemiológica que incluyen la hemovigilancia o biovigilancia para tratar el riesgo potencial de patógenos emergentes en los receptores de sangre y productos derivados de plasma. Este riesgo se puede mitigar con medidas apropiadas, tales como la suspensión de elegibilidad de donantes debido al riesgo geográfico o de comportamiento, el análisis de donaciones, cuando resulte apropiado, y la inclusión de etapas de reducción de virus para un amplio rango de virus con y sin envoltura durante el proceso de fabricación.
ESTRATEGIAS DE ANÁLISIS Los ensayos de detección virológica están diseñados para detectar anticuerpos, antígenos o secuencias de ácidos nucleicos de los virus infecciosos mediante análisis serológico o NAT. Los métodos de pruebas virológicas sensibles son un prerrequisito para determinar la presencia de los virus en un combinado de muestras (pool) para fraccionamiento, lo cual permite rechazar y descartar donaciones infectadas antes de que los fabricantes procesen dichas donaciones en combinados para producir productos derivados de plasma. Todas las valoraciones usadas para seleccionar donaciones de sangre o plasma deben estar diseñadas para el uso pretendido y deben cumplir con los requisitos de desempeño especificados por las pautas del Clinical and Laboratory Standards lnstitute (Instituto de Normas Clínicas y de Laboratorio o CLSI) para pruebas cualitativas y cuantitativas. Las valoraciones también deben cumplir con las guías de las autoridades reglamentarias tales como las especificaciones técnicas de la Comunidad Europea para valoraciones de diagnóstico in vitro (ver el Apéndice). Los calibradores o materiales de control asociados deben ser rastreables a materiales de referencia de un orden superior o a procedimientos de medición de referencia. El Apéndice incluye documentos guía de la FDA relacionados con la fabricación y la evaluación clínica de estas valoraciones y el uso de controles. Los requisitos o recomendaciones de los EE.UU. y la Unión Europea para pruebas de selección de plasma para fabricación posterior se describen en la sección de Entorno Reglamentario.
USP 39
Información General/ (1240) Análisis de Plasma Humano 1957
Valoraciones Serológicas (Inmunológicas) Las valoraciones serológicas detectan anticuerpos, antígenos o una combinación de ambos. Los ensayos de detección de anticuerpos por lo general se realizan incubando un antígeno viral inmovilizado (lisado viral o, con mayor frecuencia en la actualidad, proteínas virales producidas mediante tecnología de proteína recombinante) con una muestra de plasma. Si se encuentran presentes anticuerpos específicos de la proteína viral en la muestra, éstos se unen al antígeno esperado. A su vez, el anticuerpo unido específico del virus se incuba con un anticuerpo marcado secundario que es específico para éste. La marca produce una señal que se detecta posteriormente. Como alternativa, para la medición de un antígeno viral presente en una muestra, los anticuerpos inmovilizados específicos para el antígeno viral primero se incuban con una muestra de plasma, se agrega un anticuerpo marcado (a menudo un anticuerpo monoclonal) contra la proteína viral y se incuba la mezcla. Para más detalles sobre estos ensayos, ver el capítulo Métodos de Pruebas Inmunológicas-Ensayo por lnmunoadsorción Ligado a Enzimas (ELISA) (1103).
Pruebas de Tecnología de Amplificación de Ácidos Nucleicos La Tecnología de Amplificación de Ácidos Nucleicos (NAT) es un término colectivo para los diversos métodos que se usan para amplificar y detectar las secuencias genómicas específicas en varios tipos de muestra. Estos métodos incluyen la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés), la amplificación mediada por transcripción (TMA, por sus siglas en inglés) y el ADN ramificado (DNAb, por sus siglas en inglés), los cuales se detallan en los capítulos Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Generalidades (1125), Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Extracción, Detección y Secuenciación (1126) y Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Amplificación (1127). Las pruebas NAT por lo general emplean oligonucleótidos para genes específicos (p.ej., cebadores, sondas), reactivos de amplificación enzimática (p.ej., amortiguadores, nucleótidos, enzimas, cofactores) y un método que permite la detección de los productos resultantes de la amplificación. En la actualidad, las pruebas NAT para VHB, VHC, VIH, virus Bl 9 y, en algunos casos, VHA, se usan para seleccionar plasma para fabricación posterior. Para análisis de alto rendimiento, que es recomendable para el análisis de donaciones de plasma usado para fabricación posterior, la NAT ofrece ventajas notables sobre el análisis serológico. Primero, debido a la alta sensibilidad de estos métodos, la muestras de donaciones de plasma se pueden incorporar en combinados (minipool) -minicombinados- que permiten el análisis simultáneo de múltiples muestras, en contraste con las valoraciones serológicas que se realizan en muestras individuales. Aunque la logística operativa usada en el análisis de minicombinados de donaciones es más complicada que la requerida para analizar donaciones individuales, la estrategia de minicombinado por lo general permite que la culminación del proceso para la liberación de muestras negativas sea más rápida que con el método tradicional sin combinación. Se desmonta un minicombinado reactivo para identificar cualquier donación positiva. Sin embargo, debido a la dilución de virus en cualquier donación dada, el análisis de minicombinados tiene una sensibilidad reducida inherente en comparación con el análisis de donaciones. La Tabla 1 muestra los valores de la carga viral potencial, que se puede evitar mediante análisis NAT, en un combinado de muestras (pool) para fraccionamiento como resultado de la inclusión de una sola donación en periodo de ventana serológica para los cinco virus principales transmitidos por transfusión. Tabla 1
Virus
Carga Viral Potencial en Combinados de Muestras (pool) para Fraccionamiento Ocasionada por la Contaminación con Una Donación en Periodo de Ventana (Valores Aproximados)ª
VHB
8 x1os UI
VHC
8 xl0 1 UI
VIH-1
8xl09UI
º
VHA
8 x10 9 UI
Virus Bl 9
8 x10 14 UI
ª
Asumiendo que una donación de plasma es aproximadamente 800 ml. las referencias que sustentan estos valores se encuentran en el Apéndice.
ENTORNO REGLAMENTARIO Las agencias reglamentarias tienen como objetivo asegurar que los productos derivados de plasma sean seguros con respecto al riesgo derivado de patógenos transmitidos por sangre. Además de regular los productos finales, las agencias reglamentarias también verifican los ensayos usados para analizar agentes infecciosos y establecen políticas sobre la forma en que deben usarse dichas pruebas. Aunque las agencias reglamentarias en los Estados Unidos y Europa comparten el objetivo común de la seguridad, éstas emplean estructuras y estrategias legales distintas. En general, la jerarquía de los documentos reglamentarios es similar. Ambos comienzan con leyes que establecen requisitos definitivos para la selección de donantes y análisis de selección de plasma. En los Estados Unidos, las leyes primarias que regulan los productos derivados de plasma y las valoraciones que analizan su seguridad son la Public Health Service Act (Ley de Servicios de Salud Pública o PHS) y la Federal Food, Drug, and Cosmetic Act (Ley Federal de Alimentos, Medicamentos y Cosméticos o FD&C). La Ley PHS trata los productos biológicos y controles para
1958 (1240) Análisis de Plasma Humano/ Información General
USP 39
enfermedades transmisibles, mientras que la Ley FD&C abarca medicamentos y dispositivos médicos. Las pruebas de selección de donantes se autorizan con base en la Ley PHS en lugar de ser autorizadas o aprobadas con base en las disposiciones sobre dispositivos médicos de la Ley FD&C. Los requisitos de análisis para agentes de enfermedades transmisibles, incluyendo patógenos virales tales como VHB, VHC y VIH se fundamentan en el Título 21 del CFR, que incluye no solo los requisitos de prueba (Título 21 del CFR 610.40) sino también la suspensión de elegibilidad de donantes (Título 21 del CFR 610.41) y los requisitos retrospectivos (Título 21 del CFR 610.46 a 610.48). Si una donación de plasma o de sangre reacciona en una de las pruebas de selección, especialmente en las pruebas de selección de donantes para VHB, VHC o VIH, se deben realizar pruebas suplementarias o de confirmación para confirmar si el donante está infectado [Título 21 del CFR 61 O(b)]. El donante debe ser informado (Título 21 del CFR 630.6) y se debe suspender su elegibilidad para donar sangre o plasma (de manera temporal o permanente de acuerdo con el Título 21 del CFR 630.6) y los fabricantes deben iniciar un procedimiento retrospectivo (título 21 del CFR 610.40-48). Para VIH y VHC, el procedimiento no solo incluye la puesta en cuarentena y destrucción de las unidades sin usar previamente donadas por un donante infectado, sino también el análisis adicional del donante y la notificación a los receptores de la sangre y los componentes sanguíneos (Título 21 del CFR 610.47-48). El periodo retrospectivo puede ser tan largo como 1 año (Título 21 del CFR 610.46-48). La responsabilidad legislativa de la Unión Europea (UE) es una tarea compartida entre la UE y sus Estados Miembros. La Comisión Europea (CE) es responsable de regular el mercado común europeo y, por ende, es responsable de los productos medicinales para uso humano, mientras que los Estados Miembros son responsable del cuidado de la salud, el cual incluye el abastecimiento de hospitales con componentes sanguíneos tales como plasma y componentes celulares para transfusión. Debido a que la CE es responsable de regular los productos medicinales derivados de sangre o plasma humanos, también es, por consiguiente, responsable de la reglamentación del plasma para fabricación posterior. Las leyes de la UE se fundamentan en reglamentos y directrices de la CE y en las monografías legalmente vinculantes de la Farmacopea Europea (Ph. Eur.). Se han desarrollado pruebas y especificaciones adicionales para plasma para fabricación posterior como parte del Programa de Estándares Voluntarios de la Plasma Product Therapeutics Association (Asociación de Productos Terapéuticos de Plasma o PPTA). El Estándar de Calidad de Excelencia, Garantía y Liderazgo de la PPTA (Quality Standard for Excellence, Assurance, and Leadership o QSEAL) incluye análisis adicionales de rutina de donaciones de sangre y plasma o combinaciones de plasma para detectar ARN de VHC, ARN de VIH, ADN de VHB, ARN de VHA y ADN de virus Bl 9. Las compañías certificadas por la PPTA con base en el programa QSEAL han implementado dichos análisis.
Análisis de Plasma para Fabricación Posterior En los Estados Unidos, todas las pruebas de virus destinadas para selección de donantes, tales como VHB, VHC y VIH se reglamentan como productos biológicos y están sujetas a validación y autorización clínica por parte del Center for Biologics Evaluation and Research (Centro de Evaluación e Investigación de Productos Biológicos o CBER) de la FDA. Se debe evaluar y demostrar la especificidad clínica con donantes sanos y pruebas de seguimiento cuando corresponda, además de que se debe evaluar y demostrar la sensibilidad clínica con donantes de alto riesgo y análisis de seguimiento. El uso de paneles de referencia (de la FDA o una fuente designada) es necesario para la liberación de cada lote de kits destinados para distribución comercial. Las pruebas durante el proceso tales como las pruebas NAT para VHA o virus Bl 9 no requieren ensayos clínicos para demostrar la efectividad del ensayo. No obstante, los fabricantes de productos derivados de plasma deben realizar una validación preclínica y presentar los datos para revisión y aprobación por parte del CBER como procedimientos analíticos para productos derivados de plasma. En la Unión Europea, las pruebas de selección de donaciones se reglamentan como dispositivos médicos. Específicamente, la Directiva 98/79/CE describe los requisitos para la aprobación de pruebas o kits de prueba, lo cual requiere la marca CE antes de su comercialización y uso para análisis. La marca CE confirma que la prueba o el kit de prueba cumple con los criterios de calidad especificados. Las pruebas de selección de combinaciones para fabricación deben ser validadas por el usuario final siguiendo pautas específicas. Al igual que en los Estados Unidos, las pruebas durante el proceso no están autorizadas y el usuario final es responsable de validar la prueba. En Europa, además de la detección de virus en combinados de plasma por parte de los fabricantes de productos derivados de plasma, la detección de virus definidos forma parte del procedimiento oficial de liberación de partidas. La CE y el Consejo de Europa acordaron en mayo de 1994 crear una red de Laboratorios Oficiales de Control de Medicamentos (LOCM, por sus siglas en inglés). Los LOCM realizan pruebas en cada partida de productos medicinales derivados de plasma, incluyendo el análisis de virus en el combinado para fraccionamiento usado para la producción de la partida. Todas las pruebas requeridas se realizan y documentan en el Certificado Europeo de Liberación de Partida que es aceptado por cada Estado Miembro como fundamento para comercialización del producto. Para cumplir con los límites de sensibilidad establecidos para el análisis NAT, el fabricante o los centros de donación de sangre, donde se realiza la recolección y el análisis de sangre o plasma, analizan minicombinados de varios tamaños (6-512 donaciones). Sólo las donaciones que cumplen con los requisitos se usan para combinación.
USP 39
Información General/ (1240) Análisis de Plasma Humano 1959
Pruebas Serológicas REQUISITOS O RECOMENDACIONES DE LA FDA Una donación individual de plasma de origen o de plasma recuperado derivada de sangre entera se debe analizar para detectar la presencia de HBsAg, anti-VIH-1, anti-VIH-2 y anti-VHC, pero no para anti-HBc, anti-HTLV-1 ni -HTLV-11 usando pruebas serológicas autorizadas por la FDA para selección de donantes (Tabla 2). Una donación reactiva debe analizarse adicionalmente mediante una prueba suplementaria (es decir, adicional y más específica) aprobada para dicho uso. Aún cuando se implementan las pruebas NAT correspondientes, debe realizarse el análisis serológico de cada donación. En la actualidad, la FDA recomienda usar kits autorizados de selección de donantes que sean capaces de detectar anti-HBsAg, el anticuerpo capaz de neutralizar el VHB, a 0,5 ng/mL o menos. En ocasiones, la sangre entera se analiza para detectar anti-HBc, pero, debido a que el anti-HBsAg a menudo se presenta con anti-HBc, no se requiere analizar el plasma para fabricación posterior para detectar anti-HBc. Por lo tanto, aunque el plasma recuperado se deriva de donaciones de sangre entera que podrían haber sido analizadas para detectar anti-HBc, se puede enviar para fabricación posterior sin importar los resultados de la prueba. La FDA recomendó por primera vez en 1981 pruebas de selección de donante estandarizadas para anti-VIH-1 en una versión preliminar de un documento llamado "Puntos a Considerar", en el que se describía la fabricación del kit y los estudios preclínicos y clínicos necesarios para obtener la autorización, y dicha recomendación se puede aplicar generalmente a otras pruebas serológicas. Desde la disponibilidad en 1991-1992 de los kits serológicos autorizados para detección simultánea de anticuerpos de VIH-1 y VIH-2, la FDA recomienda además el uso de una prueba combinada autorizada o de dos pruebas separadas autorizadas para la selección de donantes. En 1992, la FDA autorizó una prueba anti-VHC que contiene múltiples antígenos recombinantes, y otra pauta subsiguiente recomendó que todas las donaciones de sangre y componentes sanguíneos destinados para transfusión y de plasma de origen destinado para fabricación posterior deben someterse a análisis usando una prueba autorizada por la FDA para anti-VHC. REQUISITOS DE LA UE En 2003, se lanzaron en Europa los requisitos para recolección de sangre y plasma, para selección de donantes y para análisis de donaciones. Las Directrices 2002/98/EC y 2003/63/EC contienen criterios de selección de donantes y requisitos de análisis para sangre y plasma, independientemente de su uso. Los requisitos de las directrices son normas para plasma para fabricación posterior pero pueden ser extendidas por un Estado Miembro para la reglamentación de componentes sanguíneos. Se provee una perspectiva general en los Informes del Comité Europeo (Acuerdo Parcial) sobre Transfusión Sanguínea (CD-P-TS). El informe indica que, además de las pruebas serológicas estándar que son obligatorias para el análisis de plasma para fraccionamiento (resumido en la Tabla 2), en algunos de los Estados Miembros se requiere el análisis para antígeno de VIH, anticuerpos anti-HBc, antígeno de VHC, anticuerpos de anti-HTLV-1 y anti-HTLV-11, además de que el análisis de anticuerpos contra citomegalovirus se realiza en algunos casos. Sin embargo, estas reglas adicionales son aplicables únicamente si se producen componentes sanguíneos para transfusión (eritrocitos, plaquetas o plasma). El régimen de pruebas requerido para donaciones usadas para la producción de derivados del plasma se resume en la monografía de la Farm. Eur. Plasma Humano para Fraccionamiento (0853). Sólo se pueden usar pruebas o kits de prueba autorizados para la selección de donantes. Las pruebas autorizadas tienen la marca CE, la cual confirma que la calidad de la prueba cumple con los criterios predefinidos (p.ej., una prueba de detección de VHB debe detectar HBsAg en una concentración de 0,5 ng/mL o menor). Los atributos de calidad más importantes, especialmente la especificidad y la sensibilidad, se analizan en ensayos clínicos usando muestras de donantes (mínimo 5000 muestras) y muestras clínicas (mínimo 200 muestras). La sensibilidad de las pruebas debe demostrarse con muestras positivas (mínimo 400 muestras) y con paneles de seroconversión (mínimo 20 paneles). Las pruebas para HBsAg y de anticuerpos contra VIH Tipos 1 y 2 también se usan para el análisis de combinados de muestras (pool) para fraccionamiento. El fabricante de productos terapéuticos derivados de plasma debe demostrar que la prueba está calificada para dicho uso y que cumple con los requisitos establecidos en las guías pertinentes de la European Medecines Agency (Agencia Europea de Medicamentos). El régimen de prueba actual se discute de manera regular entre los Estados Miembros de la UE y puede someterse a cambios si se considera necesario debido a una situación epidemiológica. Si se realizaran cambios en los requisitos, la monografía de Plasma Humano para Fraccionamiento (0853) de la Farm. Eur. y las monografías específicas del producto deberán adoptarse de manera correspondiente (p.ej., se propone un cambio en la monografía Plasma Humano (combinado -pooled- y tratado para inactivación de virus) (7 646); requiere de análisis para VHE mediante NAT).
Pruebas NAT Conforme a lo descrito previamente, se requieren únicamente pruebas serológicas autorizadas que empleen tecnología de detección de anticuerpos o antígenos para seleccionar plasma en un formato de donación única. No obstante, el análisis NAT por lo general puede detectar evidencia de infección viral en cualquier etapa temprana y la FDA autorizó pruebas NAT para
1960 (1240) Análisis de Plasma Humano / Información General
USP 39
VIH-1 y VHC en 2001 para donantes de plasma de origen y en 2002 para recolecciones de sangre entera. De este modo, las pruebas NAT se usan para seleccionar donaciones de plasma, por lo general en un formato de minicombinado, usando combinados (pools) compuestos por un número de muestras determinado, la cantidad de muestras mezcladas depende de la sensibilidad analítica de la prueba NAT y, en algunos casos (VHC y virus Bl 9), del combinado de muestras (pool) para fraccionamiento. En general, las donaciones de plasma se seleccionan en un formato de minicombinado en el que el tamaño del combinado (pool) depende de la sensibilidad analítica de la prueba NAT. El tamaño del minicombinado usado para analizar donaciones de plasma de origen por lo general es mucho mayor que el del análisis de donaciones de sangre (hasta 512 en comparación con 96 para donaciones de sangre). El periodo requerido para volver a realizar el análisis de un combinado (pool) reactivo para identificar la donación reactiva es menos crítico para el plasma si se compara con el de la sangre para transfusión debido a que algunos componentes sanguíneos tales como las plaquetas tienen una vida útil corta. REQUISITOS O RECOMENDACIONES DE LA FDA Para reducir de manera adecuada y apropiada el riesgo de transmisiones de VIH-1, VHC y VHB, se requieren pruebas NAT autorizadas por la FDA para la selección de donantes. El sitio de la FDA provee una lista de pruebas NAT de selección de donantes autorizadas por la FDA que se actualiza según se requiera. La pauta inicial de la FDA de 1999 para las pruebas NAT para VIH recomendaba estándares para la fabricación y la evaluación clínica de pruebas para detectar secuencias de ácidos nucleicos de VIH-1 y VIH-2 para recibir la autorización. Esta pauta proveía algunos de los principales lineamientos reglamentarios y científicos para ensayos NAT no sólo para VIH, sino también para otros virus transmitidos por transfusión. Desde entonces, la FDA ha revisado los requisitos para la sensibilidad analítica de las pruebas NAT para VIH-1 y VHC a 100 Ul/mL para ARN de VIH-1 y ARN de VCH cuando se analiza en un minicombinado (minipool) o a 1O 000 Ul/mL para ARN de VIH-1 ó 5000 Ul/mL para ARN de VHC cuando se analiza en una donación individual. La pauta del 2004 de la FDA sobre detección por NAT de VIH-1 y VHC en sangre entera de donante, componentes sanguíneos y plasma de origen, así como una pauta adicional del 201 O, contienen recomendaciones sobre el análisis, el desecho de productos y la suspensión de la elegibilidad y readmisión del donante. Esta última pauta reemplaza las recomendaciones previas sobre suspensión de la elegibilidad y readmisión del donante debido a los resultados de análisis serológicos para anti-VIH-1 y anti-VHC. La industria que utiliza el plasma de origen para la fabricación de productos terapéuticos ha implementado voluntariamente el análisis NAT para VHB en formato de minicombinado (minipool). Se encuentran disponibles diversas pruebas NAT para VHB autorizadas por la FDA para la selección de donantes. En 2012, la FDA finalizó una pauta en la que recomienda el uso de NAT para VHB en muestras combinadas (pool) e individuales de donantes de sangre entera y componentes sanguíneos para transfusión o para fabricación posterior, incluyendo plasma recuperado y plasma de origen. La pauta recomienda una sensibilidad de la prueba NAT de 100 Ul/mL para el análisis de donaciones individuales de sangre entera y componentes sanguíneos destinados para transfusión. Debido a las etapas de reducción de virus usadas durante la fabricación de productos derivados de plasma y a la presencia de anti-HBsAg neutralizante en los combinados de nuestras (pools) para fabricación, la FDA recomienda una sensibilidad de la prueba NAT de 500 Ul/mL para donaciones individuales cuando los fabricantes analicen minicombinados (minipools) de plasma para fabricación posterior. La pauta también contiene recomendaciones sobre el análisis y el desecho de productos, la gestión de donantes, los métodos para volver a calificar a los donantes y el etiquetado del producto. Además, la pauta reemplaza las recomendaciones pertinentes basándose en los resultados del análisis serológico con HBsAg y anti-HBc. En 2009, la FDA emitió una pauta final para el análisis NAT del virus Bl 9 después de que el informe de un estudio de vigilancia posterior a la comercialización mencionó un incidente de transmisión de virus Bl 9 relacionado con plasma combinado tratado con disolvente y detergente. La pauta recomienda el uso de NAT para virus Bl 9 como una prueba durante el proceso de fabricación de productos terapéuticos derivados de plasma, en particular, la determinación del nivel del virus Bl 9 en el combinado de muestras (pool) para fabricación posterior a fin de que el nivel del ADN del virus Bl 9 en este combinado no exceda de 104 Ul/ml. El documento guía recomienda que los cebadores (primers) y sondas seleccionados para la prueba NAT para virus Bl 9 detecten todos los genotipos conocidos del virus. El Panel Internacional de la OMS sobre Genotipo del virus Bl 9 que contiene tres genotipos está disponible para propósitos de validación. En la actualidad, el análisis NAT para VHA durante el proceso es ampliamente implementado por fabricantes que usan plasma de origen como fuente de material para la fabricación de productos terapéuticos, aunque la FDA no ha emitido un documento guía pertinente sobre el tema. Debido a que la prueba NAT para virus Bl 9 durante el proceso se usa para limitar la carga viral en el combinado (pool) de plasma, dichas pruebas deben ser capaces de cuantificar el virus Bl 9 (a diferencia de las pruebas NAT para VHB, VHC, VIH y VHA, que son pruebas NAT cualitativas). REQUISITOS EUROPEOS Las pruebas NAT usadas para selección de donantes están sujetas a autorización y a recibir la marca CE cuando la prueba cumpla con las especificaciones de prueba previamente definidas. Las pruebas NAT para muestras combinadas de plasma deben validarse de acuerdo con el capítulo de pruebas generales Técnicas de Amplificación de Ácidos Nucleicos (20627) de la Ph. Eur. En la actualidad, el plasma para fabricación (plasmas combinados [pools] para fraccionamiento) debe analizarse para determinar la presencia de ARN de VHC mediante una prueba NAT, aunque no existen requisitos para el análisis NAT de ADN de
USP 39
Información General/ (1240) Análisis de Plasma Humano 1961
VHB y ARN de VIH, aunque la mayoría de los fabricantes de plasma realizan pruebas voluntariamente para los tres virus. La pauta requiere que una prueba sea capaz de detectar todos los genotipos de VHC. Sin embargo, considerando la dificultad de obtener genotipos raros de VHC, resulta suficiente detectar al menos los genotipos más prevalentes (en Europa, genotipos 1 y 3) a un nivel adecuado. El plasma debe arrojar resultados negativos cuando se analiza con una prueba capaz de detectar una muestra que contenga 100 Ul/mL de ARN de VHC (calibrado contra el Estándar Internacional de la OMS para VHC). Por lo general, no se requiere el análisis de ADN del virus Bl 9, aunque debe realizarse para productos en los que se determine un mayor riesgo para pacientes si dicho virus estuviera presente (p.ej., productos de inmunoglobulina anti-D y plasma combinado y que se inactiva mediante tratamiento con disolvente y detergente). Además, este último producto debe analizarse y se debe determinar que no es reactivo para ARN de VHA y, en el futuro se requerirá la demostración de que tampoco debe ser reactivo para ARN de VHE. A diferencia del análisis para VHC y VHA en el que la combinación para fraccionamiento debe ser no reactiva para dichos virus, para el análisis de virus Bl 9, la carga viral en la combinación para fraccionamiento y en el plasma combinado tratado con disolvente y detergente no debe exceder 1O Ul/µL de ADN de virus Bl 9. Los requisitos se detallan en las monografías de la Ph. Eur. específicas para el producto. Para evitar un combinado de muestras (pool) reactivo, el cual tendría que ser descartado, los análisis NAT también se llevan a cabo en donaciones individuales o, de preferencia, en minicombinados (minipools) que consten de 16-512 donaciones. Aunque el requisito de análisis NAT para virus Bl 9 de VHA se aplica sólo a plasma usado para la fabricación de plasma combinado y tratado con disolvente y detergente y productos de inmunoglobulina anti-D, la mayoría de los fabricantes de productos terapéuticos derivados de plasma realizan pruebas de manera voluntaria al plasma destinado para la fabricación de todos los productos derivados de plasma a fin de reducir la carga viral en los combinados de muestras para fraccionamiento. Los requisitos vigentes de la FDA y de la Unión Europea para el análisis de plasma para fabricación posterior se resumen en la Tabla 2 y la Tabla 3. Tabla 2. Requisitos de An á llsls Serológlco de la FDA y la UE para Plasma para Fabricación Posterior Prueba de Detección
FDA
UE
Análisis Serológico de Donaciones Individuales de Plasma (Recuperado y de Oriqen) HBsAq
Requerido
Requerido
Anti-HBc
No requerido
No requerido
Anti-VIH-1 /Anti-VIH-2
Requerido
Requerido
Anti-VLTH-1/11
No requerido
No requerido
Anti-VHC
Requerido
Requerido
Análisis Serológico de los Combinados de Muestras para fraccionamiento HBsAg
No requerido pero ampliamente implementado por los fabricantes de productos terapéuticos
Requerido
Anti-VIH
No requerido pero ampliamente implementado por los fabricantes de productos terapéuticos
Requerido
Tabla 3. Requisitos de Anállsls NAT de la FDA y la EU Para Plasma para Fabricación Posterior Prueba de Detección
FDA
UE
Análisis NAT de Donaciones de Plasma en Formato de Minicombinación (Minipool) ARN deVIH-1
Requerido, usando pruebas con una sensibilidad de 1 O No requerido pero ampliamente implementado por los fabri000 Ul/ml para la donación individual cantes de productos terapéuticos
ARN deVHC
Requerido, usando pruebas con una sensibilidad de 5000 Ul/ml para la donación individual
No requerido pero recomendado para evitar la pérdida innecesaria de un combinado de muestras (pool) para fraccionamiento (ver más adelante)
ARN deVNO
No requerido
No requerido
ADN deVHB
Requerido, usando pruebas con una sensibilidad de 500 Ul/ml para la donación individual
No requerido pero ampliamente implementado por los fabricantes de productos terapéuticos
ADN del virus Bl 9
Requerido con un límite de combinado de muestras para fabricación $104 Ul/ml de ADN del virus Bl 9
Requerido para productos específicos (inmunoglobulina anti-D y plasma combinado tratado con disolvente y detergente); se requiere un límite de combinación para fabricación de ADN del virus Bl 9 $1 O Ul/µL. Este límite es implementado de manera voluntaria por la mayoría de los fraccionadores de plasma para todos los productos.
ARN deVHA
No requerido pero ampliamente implementado por los fabricantes de productos terapéuticos
Requerido sólo para plasma tratado con disolvente y detergente; no requerido para otros productos pero ampliamente implementado por la mayoría de los fraccionadores de plasma
ª
La nueva monografía se implementará próximamente. Ver la versión preliminar de la monografía de la Ph. Eur. Plasma Humano (Combinado y Tratado para lnactivación Viral (1640)). http://pharmeuropa.edqm.eu/TextsForComment/NetisUtils/srvrutii_getdoc.aspx/2L30qDZGmCLmnDZGsHlveT6qO//l 646E.pdf. Consultada el 20 de febrero de 201 3.
1962 (1240) Análisis de Plasma Humano / Información General
USP 39
Tabla 3. Requisitos de Análisis NAT de la FDA y la EU Para Plasma para Fabricación Posterior (Continuación) Prueba de Detección
VHE
FDA
UE Análisis aún no requerido; los requisitos de análisis se presentarán solamente para un producto específico (plasma combinado tratado con disolvente y detergente).
No requerido actualmente
Análisis NAT del Combinado de Muestras (pool) para Fraccionamiento ARN de VIH-1
No requerido pero ampliamente implementado por los fabricantes de productos terapéuticos
No requerido pero ampliamente implementado por los fabricantes de productos terapéuticos
ARN deVHC
No requerido pero ampliamente implementado por los fabricantes de productos terapéuticos
Requerido; se debe demostrar que el combinado de muestras (pool) para fraccionamiento no es reactivo usando una prueba que detecte 100 Ul/ml de ARN de VHC.
ARN DEVNO
No requerido
No requerido
ADN deVHB
No requerido pero ampliamente implementado por los fabricantes de productos terapéuticos
No requerido pero ampliamente implementado por los fabricantes de productos terapéuticos
Requerido; se requiere un límite de ,,;104 Ul/ml de ADN del virus Bl 9 para combinados de muestras (pool) para fraccionamiento.
Requerido para productos específicos (anti-inmunoglobulina D y plasma combinado y tratado con disolvente y detergente); se requiere un límite de ADN del virus Bl 9 de ,,;1 O Ul/µL para combinados de muestras (pool) para fraccionamiento. Este límite es implementado de manera voluntaria por la mayoría de los fabricantes de productos terapéuticos para todos los produetos.
No requerido pero ampliamente implementado por los fabricantes de productos terapéuticos de plasma
Requerido sólo para un producto específico (plasma combinado tratado con disolvente y detergente); se debe demostrar que el combinado de muestras (pool) para fraccionamiento no es reactivo usando una prueba que detecte 100 Ul/ml.
No requerido
Análisis aún no requerido; los requisitos de análisis se presentarán solamente para un producto específico (plasma combinado tratado con disolvente y detergente). Después de implementar el requisito, se debe demostrar que el combinado de plasma no es reactivo usando una prueba capaz de detectar 2,5 log 10 Ul/ml de ARN de VHRª.
ADN del virus B19
ARN deVHA
VHE
ª La nueva monografía se implementará próximamente. Ver la versión preliminar de la monografía de la Ph. Eur. Plasma Humano (Combinado y Tratado para lnactivación Viral (1640 )). http://pharmeuropa.edqm.eu/TextsForComment/NetisUtils/srvrutil_getdoc.aspx/2L30qDZGmCLmnDZGsHlveT6q0//1646E.pdf. Consultada el 20 de febrero de 2013.
CONCLUSIONES Todas las medidas tratadas en este capítulo junto con las etapas de reducción de virus incluidas durante el proceso de fabricación aseguran la seguridad de los productos derivados de plasma. No obstante, el análisis de plasma para fabricación posterior representa sólo una de las etapas implementadas para asegurar la seguridad de los productos finales derivados de plasma. Tanto los fabricantes como las agencias reglamentarias se enfrentan a continuos desafíos debido al surgimiento de nuevos virus transmitidos por la sangre, mutaciones y variantes de virus existentes que no pueden ser detectados por la tecnología serológica/NAT de la actualidad. El desarrollo de nuevas pruebas de detección y de documentos reglamentarios guía depende de si el virus emergente representa un riesgo para la seguridad de los productos derivados de plasma.
APÉNDICE Pautas Reglamentarias • GAO-HEHS-98-205: General Accounting Office, Blood Plasma Safety: Plasma product risks are low if good manufacturing practices are followed. • 21 CFR 606: Current good manufacturing practice for blood and blood components. • WHO. Technical report, series 941, 2007: Recommendations for the production, control and regulation of human plasma for fractionation. • FDA. Guidance for industry: use of nucleic acid tests on pooled and individual samples from donors of whole blood and blood components, including source plasma, to reduce the risk of transmission of hepatitis B virus. http://www.fda.gov/ downloads/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatorylnformation/Guidances/Blood/UCM327895.pdf. Consultado el 21 de febrero de 2013. • FDA. Guidance for industry: use of nucleic acid tests to reduce the risk of transmission of West Nile Virus from donors of whole blood and blood components intended for transfusion. • 21 CFR 610.40-610.48, Part 630 o Part 640.
USP 39
Información General/ (1240) Análisis de Plasma Humano 1963
• WHO. Technical report, series 924, annex 4: guidelines on viral inactivation and removal procedures intended to assure the viral safety of human blood plasma products. http://www.who.int/bloodproducts/publications/ WHO_TRS_924_A4.pdf. Consultado el 20 de febrero de 2013. • EMEA/CHMP/BWP/706271 /201 O. Guideline on plasma-derived medicinal products. http://www.ema.europa.eu/docs/ en_GB/document_library/Scientific_guideline/2011 /07/WC500109627.pdf. Consultado el 25 de febrero de 2013. • FDA. Guidance for industry: nucleic acid testing (NAT) for human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV): testing, product disposition, and donor deferral and reentry. http://www.fda.gov/downloads/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatorylnformation/Guidances/Blood/ucm210270.pdf. Consultado el 21 de febrero de 2013. • PPTA. Quality standards for excellence, assurance, and leadership (QSEAL). http://www.pptaglobal.org/safety-quality/ standards/qseal. Consultado el 21 de febrero de 2013. • Council of Europe. Directive 98/79/EC of the European Parliament and of the Council of 27 October 1998 on in vitro diagnostic medical devices. Official 07 December 1998. Strasbourg, France: EMEA; 1998:1-37. • Council of Europe. Directive 98/79/EC, Annex 11 List A in combination with Article 9(2), (3). Strasbourg, France: EMEA; 1998. • Council of Europe. Commission Decision of 7 May 2002 on common technical specifications for in vitro-diagnostic medica! devices (2002/364/EC); Official Journal L131 of 16/05/2002, p. 17-30. http://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2002:131 :0017:0030:EN:PDF. Consultado el 25 de febrero de 2013. • EDQM. General European OMCL network. http://www.edqm.eu/site/General-European-OMCL-Network-46.html. Consultado el 21 de febrero de 2013. • EDQM. Heads of Medicines Agencies (HMA) Working Group on Product Testing. Principies for mutual recognition of control results. http://www.edqm.eu/medias/fichiers/NEW_Principles_for_Mutual_Recognition_of_Control_r.pdf. Consultado el 21 de febrero de 2013. • EDQM. Official Control Authority Batch Release (OCABR) for human biologicals: vaccines, blood, and plasma derivatives. http://www.edqm.eu/site/Human_Biologicals_OCABR-61 l .html. Consultado el 21 de febrero de 2013. • FDA. Guidance for industry: adequate and appropriate donor screening tests for hepatitis B; hepatitis B surface antigen (HBsAg) assays used to test donors of whole blood and blood components, including source plasma and source leukocytes. http://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatorylnformation/Guidances/Blood/ ucm072543.htm. Consultado el 21 de febrero de 2013. • FDA. Recommendations concerning testing for antibody to hepatitis B core antigen (Anti-HBc). http://www.fda.gov/ downloads/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatorylnformation/OtherRecommendationsforManufacturers/MemorandumtoBloodEstablishments/ucm062847.pdf. Consultado el 21 de febrero de 2013. • FDA. Draft of points to consider in the manufacture and clinical evaluation of in vitro tests to detect antibodies to the human immunodeficiency virus type 1. http://www.fda.gov/downloads/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatorylnformation/Guidances/Blood/ucm080958.pdf. Consultado el 21 de febrero de 2013. • FDA. Revised recommendations for the prevention of human immunodeficiency virus (HIV) transmission by blood and blood products. http://www.fda.gov/downloads/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatorylnformation/ Other RecommendationsforManufacturers/MemorandumtoBloodEstablishments/ucm062834.pdf. Consultado el 21 de febrero de 2013. • FDA. Revised recommendations for testing whole blood, blood components, source plasma, and source leukocytes for antibody to hepatitis C virus encoded antigen (anti-HCV). http://www.fda.gov/downloads/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatorylnformation/Other RecommendationsforManufacturers/MemorandumtoBloodEstablishments/ ucm062832.pdf. Consultado el 21 de febrero de 2013. • Directive 2002/98/EC of the European Parliament and of the Council of 27 January 2003 setting standards of quality and safety for the collection, testing, processing, storage and distribution of human blood and blood components and amending Directive 2001 /83/EC. OJEU. 2003;L33:30-40. http://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L: 2003:033:0030:0040:EN:PDF. Consultado el 25 de febrero de 2013. • Commission Directive 2004/33/EC of 22 March 2004 implementing Directive 2002/98/EC of the European Parliament and of the Council as regards certain technical requirement for blood and blood components. OJEU. 2004;L91 :25-39. http://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2004:091 :0025:0039:EN:PDF. Consultado el 25 de febrero de 2013. • EDQM, Council of Europe. The collection, testing, and use of blood and blood components in Europe. http:// www.edqm.eu/medias/fichiers/The_Collection_Testing_and_Use_of_Blood_and_Blood_3.pdf. Consultado el 21 de febrero de 2013. • EMEA/CHMP/BWP/298390/2005. Guideline on validation of immunoassay for the detection of hepatitis B virus surface antigen (HBsAg) in plasma pools. http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/ 2009/09/WC500003704.pdf. Consultado el 25 de febrero de 2013. • EMEA/CHMP/BWP/298388/2005. Guideline on validation of immunoassay for the detection of antibody to human immunodeficiency virus (anti-HIV) in plasma pools. http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2009/09/WC500003685.pdf. Consultado el 25 de febrero de 2013.
1964 (1240) Análisis de Plasma Humano / Información General
USP 39
• FDA. Complete list of donor screening assays for infectious agents and HIV diagnostic assays. http://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/BloodBloodProducts/ApprovedProducts/LicensedProductsBLAs/BloodDonorScreening/lnfectiousDisease/ucm080466.htm. Consultado el 21 de febrero de 2013. • FDA. Guidance for industry: in the manufacture and clinical evaluation of in vitro tests to detect nucleic acid sequences of human immunodeficiency viruses types 1 and 2. http://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatorylnformation/Guidances/Blood/ucm077067.htm. Consultado el 21 de febrero de 2013. • FDA. Guidance for industry: use of nucleic acid tests on pooled and individual samples from donors of whole blood and blood components (including source plasma and source leukocytes) to adequately and appropriately reduce the risk of transmission of HIV-1 and HCV. http://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatorylnformation/ Guidances/Blood/ucm074934.htm. Consultado el 21 de febrero de 2013. • FDA. Recommendations for the management of donors and units that are initially reactive for hepatitis B surface antigen (H BsAg) [letter]. http://www. fda .gov/ down loads/Biolog icsBloodVacci nes/GuidanceCom pi ianceRegu latorylnformation/ OtherRecommendationsforManufacturers/MemorandumtoBloodEstablishments/ucm06301 l .pdf. Consultado el 21 de febrero de 201 3. • FDA. Guidance for industry: nucleic acid testing (NAT) to reduce the possible risk of human parvovirus Bl 9 transmission by plasma-derived products. http://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatorylnformation/ Guidances/Blood/ucm071592.htm. Consultado el 21 de febrero de 2013. • FDA, Blood Products Advisory Committee. Nucleic acid testing of blood donors for human parvovirus Bl 9. http:// www.fda.gov/ohrms/dockets/ac/99/transcpt/3548tl b.pdf and http://www.fda.gov/ohrms/dockets/ac/99/transcpt/ 3548tl c.pdf. Consultado el 21 de febrero de 2013.
Referencias de la Tabla 1 1. Glynn SA, Wright DJ, Kleinman SH, et al. Dynamics of viremia in early hepatitis C virus infection. Transfusion. 2005;45:994-1002. 2. ludicone P, Miceli M, Palange M, et al. Hepatitis B virus blood screening: impact of nucleic amplification technology testing implementation on identifying hepatitis B surface antigen non-reactive window period and chronic infections. Vox Sanguinis. 2009;96:292-297. 3. Ribeiro RM, Qin L, Chavez LL, Li D, Self SG, Perelsoni AS. Estimation of the initial viral growth rate and basic reproductive number during acute HIV-1 infection. j Viro/. 2010;84:6096-6102. 4. Tobler LH, Stramer SL, Lee SR, et al. Performance of ORTHO HCV core antigen and trak-C assays for detection of viraemia in pre-seroconversion plasma and whole blood donors. Vox Sanguinis. 2005;89:201-207. 5. Weimer T, Streichert S, Watson C, Groner A. Hepatitis A virus prevalence in plasma donations. j Med Viro/. 2002;67:469471. 6. Young NS, Brown KE. Mechanisms of disease: parvovirus Bl 9. N Engl j Med. 2004;350:586-597.
(1241) INTERACCIONES AGUA-SÓLIDO EN SISTEMAS FARMACÉUTICOS INTRODUCCIÓN Este capítulo general se ha armonizado con los capítulos correspondientes de la Farmacopea Europea y/o de la Farmacopea japonesa. Estas farmacopeas se han comprometido a no realizar ningún cambio unilateral a este capítulo armonizado. Las partes del texto de este capítulo general que son texto USP nacional y, por lo tanto, no forman parte del texto armonizado, están indicadas con los símbolos (..) para especificar este hecho. Los sólidos farmacéuticos como materias primas o constituyentes de formas farmacéuticas a menudo entran en contacto con el agua durante el procesamiento y el almacenamiento. Esto puede ocurrir (a) durante la cristalización, liofilización, granulación húmeda o secado al rocío y (b) debido a la exposición, durante su manipulación y almacenamiento, a una atmósfera que contenga vapor de agua o por exposición a otros materiales de la forma farmacéutica que contengan agua capaz de transferirse a otros ingredientes. Entre las propiedades que, según se ha comprobado, resultan alteradas por la asociación de sólidos con agua se encuentran la velocidad de degradación química en "estado sólido", el crecimiento y la disolución de cristales, propiedades de dispersión y humectación, fluidez del polvo, lubricación, compactabilidad de polvos, fuerza de compresión y contaminación microbiana. Aunque pueden tomarse precauciones cuando se percibe que el agua puede causar problemas, como por ejemplo, eliminar toda la humedad, reducir el contacto con la atmósfera o controlar la humedad relativa de la atmósfera, por lo general dichas precauciones aumentan los gastos del proceso y no garantizan que no aparezcan nuevos problemas asociados con la humedad durante la vida útil del producto. También es importante reconocer que en muchas situaciones un sólido requiere un cierto
USP 39
Información General/ (1241) Interacciones Agua-Sólido en Sistemas Farmacéuticos 1965
nivel de agua para su funcionamiento adecuado, por ejemplo en la compactación de polvos. En consecuencia, es fundamental por ambas razones conocer lo mejor posible los efectos de la humedad en los sólidos antes de desarrollar estrategias para su manipulación, almacenamiento y uso. Algunos de los datos más importantes que se deben conocer con relación a las interacciones agua-sólido son: - la cantidad total de agua presente; - el grado de adsorción y absorción; - la posibilidad de que se formen hidratos; - la superficie específica del sólido y otras propiedades tales como el grado de cristalinidad, el grado de porosidad y las temperaturas de transición vítrea y de fusión; - el lugar de interacción del agua, el grado de unión y el grado de movilidad molecular; - los efectos de la temperatura y humedad relativa; - la hidratación esencialmente irreversible; - la cinética de la captación de humedad; - los diversos factores que podrían influir en la velocidad a la que un sólido puede absorber el vapor de agua; - las condiciones en las que se produce la disolución en el caso de sólidos que se disuelven en el agua sorbida.
ESTADOS FÍSICOS DEL AGUA SORBIDA El agua puede interactuar físicamente con los sólidos de diferentes maneras. Puede interactuar únicamente en la superficie (adsorción) o penetrar en la masa de la estructura sólida (absorción). Cuando se produce tanto adsorción como absorción, suele utilizarse el término sorción. La adsorción afecta particularmente las propiedades de los sólidos cuando la superficie es grande. Se encuentran superficies grandes en sólidos que tienen partículas muy pequeñas, así como en sólidos que tienen un alto grado de porosidad intraparticular. La absorción se caracteriza por una asociación de agua por gramo de sólido que es mucho mayor que la resultante de la formación de una capa monomolecular sobre la superficie disponible, y en una cantidad que es generalmente independiente del área específica. La mayoría de los sólidos cristalinos no absorben agua en la masa de sus estructuras debido a la alta compactación y grado de ordenamiento del retículo cristalino. De hecho, se ha comprobado que el grado de absorción en sólidos que exhiben una cristalinidad parcial y una estructura amorfa parcial suele ser inversamente proporcional al grado de cristalinidad. No obstante, en algunos sólidos cristalinos se pueden formar hidratos cristalinos. Estos hidratos pueden exhibir una relación estequiométrica, en términos de moléculas de agua unidas por molécula de sólido, o una relación no estequiométrica. Al deshidratarse, los hidratos cristalinos pueden conservar su estructura cristalina original, perder su cristalinidad y volverse amorfos, o convertirse en una nueva forma cristalina anhidra o menos hidratada. Los sólidos amorfos o parcialmente amorfos pueden absorber grandes cantidades de agua cuando hay un desorden molecular suficiente en el sólido para permitir la penetración, hinchazón o disolución de las moléculas de agua. Dicho comportamiento se observa con la mayoría de los polímeros amorfos y con los sólidos de bajo peso molecular que se han vuelto amorfos durante su preparación, por ejemplo, en la liofilización o después de la molienda. La introducción de defectos en sólidos altamente cristalinos también genera este comportamiento. Cuanto mayor sea la afinidad química del agua por el sólido, mayor será la cantidad total que puede absorberse. Cuando el agua es absorbida por sólidos amorfos, las propiedades originales de la masa del sólido pueden verse considerablemente alteradas. Se sabe fehacientemente, por ejemplo, que los sólidos amorfos, según la temperatura, pueden existir en al menos uno de dos estados: "vítreo" o "fluido"; la temperatura a la que un estado pasa a otro es la temperatura de transición vítrea, TG· El agua absorbida en la masa de la estructura sólida, debido a su efecto sobre el volumen libre del sólido, puede actuar como un plastificante eficiente y reducir el valor de TG· Debido a que las propiedades reológicas de los estados "fluido" y "vítreo" son bastante diferentes, es decir, el estado "fluido" presenta mucha menos viscosidad a medida que aumenta la temperatura por encima de la temperatura de transición vítrea, no es sorprendente que una cantidad de propiedades originales importantes que dependen de la reología del sólido se vean afectadas por el contenido de humedad. Puesto que los sólidos amorfos son metaestables en relación con la forma cristalina del material, es posible que en materiales de bajo peso molecular, la humedad absorbida inicie la reversión del sólido a la forma cristalina, particularmente si el sólido es transformado por el agua sorbida a un estado "fluido". Esta es la base del "colapso" que suele observarse durante el proceso de liofilización. Otro fenómeno observado específicamente en sólidos solubles en agua es su tendencia a la delicuescencia, es decir a disolverse en su propia agua sorbida, a humedades relativas, HR1, que exceden la humedad relativa de una solución saturada del sólido, HR 0 • La delicuescencia se produce debido a la alta solubilidad del sólido en agua y al efecto significativo que tiene en las propiedades coligativas del agua. Se trata de un proceso dinámico que continúa ocurriendo siempre que la HR, sea mayor que la HR 0 • La clave para entender los efectos que puede tener el agua sobre las propiedades de los sólidos, y viceversa, radica en entender la ubicación de la molécula de agua y su estado físico. Más específicamente, el agua asociada con los sólidos puede existir en un estado en que está unida directamente al sólido, así como en un estado de movilidad que se acerca al del agua a granel. Esta diferencia en movilidad se ha observado a través de mediciones tales como calor de sorción, punto de congelación, resonancia magnética nuclear, propiedades dieléctricas y difusión. Se ha considerado que dichos cambios de movilidad se deben a los cambios en el estado termodinámico del agua a medida que se sorbe más y más agua. En consecuencia, el agua unida directamente a un sólido suele considerarse no disponible para afectar a las propiedades del sólido, mientras que cantidades más grandes de agua sorbida tienden a agruparse más y formar
1966 (1241) Interacciones Agua-Sólido en Sistemas Farmacéuticos / Información General
USP 39
agua con mayores propiedades disolventes. En el caso de los hidratos cristalinos, la combinación de fuerzas intermoleculares (puentes de hidrógeno) con la compactación de los cristales pueden producir interacciones agua-sólido muy fuertes. Al reconocer que la presencia de agua en un sólido amorfo puede afectar la temperatura de transición vítrea y, en consecuencia, el estado físico del sólido, a bajos niveles de agua, la mayoría de los sólidos amorfos polares se encuentran en un estado vítreo altamente viscoso debido a sus altos valores de Te· En consecuencia, el agua se "congela" en la estructura sólida y se torna inmóvil por la alta viscosidad, p.ej., 1013 Pa ·s. A medida que la cantidad de agua sorbida se incrementa y que Te disminuye, acercándose a las temperaturas ambiente, el estado vítreo se acerca al de un estado "fluido" y la movilidad del agua junto con la movilidad del sólido mismo se incrementa significativamente. A una HR elevada, el grado de plastificación del sólido por el agua puede ser lo suficientemente alto como para que el agua y el sólido puedan alcanzar un nivel importante de movilidad. Por consiguiente, esta imagen de la naturaleza del agua sorbida, generalmente ayuda a explicar el efecto sumamente importante que puede tener la humedad en una serie de propiedades de los sólidos, tales como la reactividad química y la deformación mecánica. También sugiere enfáticamente que los métodos utilizados para evaluar la estabilidad química y física de los sólidos y las formas farmacéuticas sólidas tomen en cuenta los efectos que el agua sorbida puede tener en el sólido, particularmente cuando ingresa en la estructura del sólido y actúa como plastificante.
Velocidades de Captación de Agua La velocidad y el grado al que los sólidos expuestos a la atmósfera podrían sorber o desorber vapor de agua puede ser un factor crítico en la manipulación de los sólidos. Incluso el simple acto de pesar muestras de sólidos en una balanza analítica y la exposición, por consiguiente, de una capa delgada de polvo a la atmósfera durante algunos minutos puede llevar a un error significativo, por ejemplo, en la estimación de los valores de pérdida por secado. Está bien establecido que los sólidos solubles en agua expuestos a humedades relativas superiores a la exhibida por una solución saturada de ese sólido se disuelven espontáneamente por delicuescencia y continúan su disolución durante un periodo prolongado. La velocidad de captación de agua, en general, depende de una serie de parámetros que no se consideran críticos en las mediciones de equilibrio debido a que las velocidades de sorción están controladas principalmente por la transferencia de masa, con cierta intervención de los mecanismos de transferencia térmica. En consecuencia, algunos factores, como por ejemplo los coeficientes de difusión del vapor en el aire y en el sólido, el flujo de aire convectivo, la superficie y geometría del lecho sólido y el entorno pueden desempeñar un papel importante. De hecho, el método utilizado para efectuar dichas mediciones puede ser con frecuencia el factor determinante de la velocidad debido a estos factores ambientales y geométricos.
DETERMINACIÓN DE ISOTERMAS DE SORCIÓN-DESORCIÓN Principio La mejor manera de determinar la tendencia a la captación de vapor de agua es midiendo la sordón o desorción en función de la humedad relativa, a temperatura constante, y en condiciones en las que la sorción o desorción se producen independientemente del tiempo, es decir en equilibrio. La humedad relativa, HR, se define mediante la siguiente ecuación: HR =(Pe x 1 OO)/P 0 Pe= presión de vapor de agua en el sistema P0 =presión por saturación de vapor de agua en las mismas condiciones Se hace referencia al cociente Pcf P0 como la presión relativa. La mejor manera de determinar la sordón o captación de agua es comenzando con muestras secas y sometiéndolas a una humedad relativa conocida. La desorción se estudia reduciendo la humedad relativa en un sistema que ya contiene agua sorbida. Como el nombre lo indica, la isoterma de sorción-desorción es válida únicamente para la temperatura de referencia; por consiguiente, existe una isoterma especial para cada temperatura. Normalmente, en condiciones de equilibrio, el contenido de humedad a una humedad relativa determinada debe ser el mismo, ya sea determinado a partir de la medición de la sorción o de la desorción. No obstante, es común observar histéresis de sorción-desorción.
Métodos Las muestras se pueden almacenar en cámaras a diversas humedades relativas. Posteriormente, se mide el peso ganado o perdido para cada muestra. La principal ventaja de este método es su conveniencia mientras que las principales desventajas son la baja velocidad en alcanzar un peso constante, particularmente a altas humedades relativas y el error introducido al abrir y cerrar la cámara para pesar las muestras. Los sistemas gravimétricos de sorción dinámica de agua permiten el pesaje en línea de una muestra en un sistema controlado para evaluar la interacción del material con humedad en diversos niveles programables de humedad relativa a una temperatura constante. El mayor beneficio de un sistema controlado es que se pueden establecer con mayor facilidad las condiciones isotérmicas y que se puede monitorear la respuesta dinámica de la muestra a condiciones cambiantes (ver la Figura 1).
USP 39
Información General/ (1241) Interacciones Agua-Sólido en Sistemas Farmacéuticos 1967
e
-H
A. Controlador de humedad D. Módulo de regulación
B. Cámara controlada termostáticamente C. Módulo de equilibrio
de humedad
E. Referencia F. Muestra
G. Humidificador de vapor H. Módulo de control de flujo l. Gas seco
Figura 1. Ejemplo de un aparato para la determinación de la sordón de agua (son posibles otros diseños). Los puntos de datos para la determinación de la isoterma de sordón (p.ej., HR desde 0% hasta aproximadamente 95%, sin condensación) únicamente se toman después de que una señal lo suficientemente constante indique que la muestra ha alcanzado el equilibrio a un nivel dado de humedad. En algunos casos (p.ej, delicuescencia), el tiempo máximo se puede restringir aunque no se alcance el nivel de equilibrio. El aparato debe controlar adecuadamente la temperatura para asegurar una buena estabilidad en la línea base, así como un control exacto de la generación de humedad relativa. Las humedades relativas requeridas se pueden generar, por ejemplo, mezclando con exactitud gas de vapor seco y saturado con controladores de flujo. El comportamiento electrostático del polvo también debe considerarse. La verificación de la temperatura y la humedad relativa (controlada con, por ejemplo, un higrómetro certificado, soluciones salinas certificadas o puntos de delicuescencia de sales certificadas durante un intervalo adecuado) deben ser coherentes con la especificación del instrumento. El balance debe proporcionar una resolución de masa suficiente y estabilidad a largo plazo. Además, es posible medir cantidades de captación de agua no detectables gravimétricamente usando técnicas volumétricas. En el caso de la adsorción, para mejorar la sensibilidad, se puede aumentar la superficie específica de la muestra reduciendo el tamaño de las partículas o usando muestras más grandes para aumentar el área total. No obstante, es importante que dicha conminución del sólido no altere la estructura de su superficie y que no lo haga más amorfo ni desordene su cristalinidad. En el caso de la absorción, en la que la captación de agua es independiente de la superficie específica, sólo será útil aumentar el tamaño de la muestra. Sin embargo, al aumentar el tamaño de la muestra aumentará el tiempo necesario para establecer algún tipo de equilibrio. Para establecer valores exactos, es importante lograr la desolvatación de la muestra lo mejor posible. Las temperaturas más altas y las presiones más bajas (vacío) facilitan este proceso. No obstante, es importante tener cuidado de notar los efectos adversos que esto podría tener sobre el sólido, como por ejemplo deshidratación, degradación química o sublimación. El uso de temperaturas más altas para inducir la desorción, como en un aparato termogravimétrico, también debe realizarse con cuidado debido a estas posibles dificultades.
Informe e Interpretación de los Datos Los datos de sorción se informan generalmente en forma de gráfica del cambio de peso aparente, como porcentaje de la masa de la muestra seca, en función de la humedad relativa o tiempo. Las isotermas de sorción se informan tanto en forma de tabla como de gráfica. El método de medición y los datos deben ser rastreables La histéresis de adsorción-deserción se puede interpretar, por ejemplo, en términos de porosidad de la muestra, su estado de aglomeración (condensación capilar), la formación de hidratos, cambio polimórfico, o licuefacción de la muestra. Ciertos tipos de sistemas, particularmente aquellos con sólidos microporosos y sólidos amorfos, son capaces de sorber grandes cantidades de vapor de agua. En estos casos, la cantidad de agua asociada con el sólido a medida que se reduce la humedad relativa es mayor que la cantidad que se sorbió originalmente con el aumento de la humedad relativa. En el caso de los sólidos microporosos, la histéresis de adsorción-desorción de vapor es un fenómeno de equilibrio asociado con el proceso de conden-
1968 (1241) Interacciones Agua-Sólido en Sistemas Farmacéuticos/ Información General
USP 39
sación capilar. Este proceso tiene lugar debido al alto grado de curvatura irregular de los microporos y al hecho de que "se llenan" (adsorción) y "se vacían" (desorción) bajo diferentes condiciones de equilibrio. En el caso de los sólidos no porosos capaces de absorber agua, la histéresis se produce por cambios en el grado de interacción vapor-sólido debido a un cambio en el estado de equilibrio del sólido, como por ejemplo la conformación de cadenas de polímeros, o debido a que la escala de tiempo para el equilibrio estructural es mayor que la escala de tiempo para la desorción del agua. Por lo tanto, al medir las isotermas de sorción-desorción es importante establecer que se ha alcanzado un estado cercano a un estado de equilibrio. Particularmente con los polímeros hidrófilos a humedades relativas altas, resulta bastante difícil establecer valores de sordón o desorción de agua independientes del tiempo, debido a que, por lo regular, se trata con un polímero plastificado en su estado "fluido", cuando el sólido experimenta un cambio significativo. En el caso de la formación de hidratos cristalinos, la gráfica de captación de agua en función de la presión o humedad relativa presentará en estos casos un incremento importante en la captación a una presión particular y la cantidad de agua captada por lo regular presentará una relación estequiométrica mol:mol de agua a sólido. En algunos casos, no obstante, los hidratos cristalinos no sufren un cambio de fase evidente o la forma anhidra tiene un aspecto amorfo. En consecuencia, la sordón o desorción de agua puede asemejarse más a la observada en los procesos de adsorción. El análisis cristalográfico por rayos X y el análisis térmico son particularmente útiles para el estudio de tales sistemas. En los casos en los que predomina la adsorción de vapor de agua, es muy útil medir la superficie específica del sólido utilizando un método independiente y expresar la adsorción como el peso del agua sorbida por unidad de superficie del sólido. Esto puede ser muy útil para evaluar la posible importancia de la sordón de agua y cómo afecta a las propiedades del sólido. Por ejemplo, una captación de agua de 0,5% p/p apenas podría cubrir una superficie descubierta de un sólido que tenga una superficie específica de 100 m 2/g, mientras que esto equivale a una cobertura 100 veces mayor en un sólido con una superficie específica de 1,0 m2/g. En el caso de los sólidos farmacéuticos que tienen una superficie específica entre 0,01 m 2/g y 1O m 2/g, lo que parece un menor contenido de agua podría representar una cantidad significativa de agua para la superficie disponible. Debido a que la "superficie seca" no influye en la absorción, la sordón de agua en sólidos amorfos o parcialmente amorfos se puede expresar mejor con referencia a la unidad de masa corregida según la cristalinidad cuando el cristal no sorbe cantidades considerables de agua en relación con las regiones amorfas.
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DEL AGUA Principio La actividad del agua, Aw, es el cociente entre la presión de vapor de agua en el producto (P) y la presión de saturación de vapor de agua {P0) a la misma temperatura. Es numéricamente igual a 1/100 de la humedad relativa (HR) generada por el producto en un sistema cerrado. La HR se puede calcular a partir de mediciones directas de presión parcial de vapor o punto de rocío, o a partir de la medición indirecta mediante sensores cuyas características físicas o eléctricas se ven alteradas por la HR a la que se exponen. Al ignorar los coeficientes de la actividad, la relación entre Aw y la humedad relativa en equilibrio (HRE) se representan mediante las siguientes ecuaciones: Aw = P/P0 HRE(%)
=Aw x 100
Método La actividad del agua se determina colocando la muestra en un pequeño vaso impermeable a los gases dentro del cual se puede establecer el equilibrio entre el agua en el sólido y la fase gaseosa. El volumen de la fase gaseosa debe ser pequeño en relación con el volumen de la muestra a fin de no cambiar el estado de sordón de la muestra durante la prueba. El equilibrio como un proceso termodinámico lleva tiempo pero se puede acelerar mediante circulación forzada dentro de la celda. El valor de actividad del agua adquirida es válido únicamente para la temperatura determinada simultáneamente. Esto requiere un dispositivo de medición de temperatura preciso como parte del equipo. Además, la sonda se debe aislar térmicamente para garantizar una temperatura constante durante la prueba. El sensor que mide la humedad de la fase gaseosa por encima de la muestra es un componente clave. Teóricamente, se pueden usar todos los tipos de higrómetros, pero para propósitos analíticos, la miniaturización y la robustez son una condición previa. La medición de Aw se puede realizar usando el método del espejo enfriado/punto de rocío.1 Se usa un espejo pulido y enfriado como superficie de condensación. El sistema de enfriamiento se conecta electrónicamente a una celda fotoeléctrica en la cual se refleja luz desde el espejo de condensación. Se dirige una corriente de aire, en equilibrio con la muestra de prueba, hacia el espejo, el cual se enfría hasta que ocurra la condensación en el espejo. La temperatura a la que se inicia la condensación es el punto de rocío a partir del cual se determina la HRE. Se deben evaluar los instrumentos comercialmente disponibles que usen el método del espejo enfriado/punto de rocío u otras tecnologías en relación con su aptitud, validación y calibración cuando se usen para realizar determinaciones de la actividad del agua. 1
Método Oficial 978.18 de la AOAC lnternational.
USP 39
Información General/ (1251) Pesada en una Balanza Analítica 1969
Estos instrumentos se calibran generalmente durante un intervalo adecuado, por ejemplo, usando algunas soluciones salinas saturadas a 25º tales como las listadas en la Tabla 1. Tabla 1. Soluciones Salinas Saturadas Estándar Soluciones Salinas Saturadas a 25º Sulfato de potasio
(K 7 S0 4 )
HRE (%)
Aw
97,3
0,973
Cloruro de bario (BaCI,)
90,2
0,902
Cloruro de sodio (NaCI)
7S,3
0,7S3
Nitrato de magnesio (Mg(NO,),)
S2,9
0,S29
Cloruro de magnesio (MgCl 2)
32,8
0,328
Cloruro de litio (LiCI,)
11,2
0,112
(1251) PESADA EN UNA BALANZA ANALÍTICA
INTRODUCCIÓN Pesar es un paso frecuente en los procedimientos analíticos y la balanza es una pieza esencial en el equipo de laboratorio. La información general descrita en este capítulo se aplica directamente a las balanzas electrónicas usadas en procedimientos analíticos. Aunque muchas partes del capítulo se aplican a todas las balanzas, algunas se aplican únicamente a las balanzas analíticas. Este capítulo no constituye un recurso definitivo, por lo que otras fuentes de información (p.ej., el US National lnstitute Science and Technology [Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología de los EE.UU.] y los fabricantes de balanzas) pueden resultar aplicables y útiles para los analistas al momento de realizar operaciones de pesada o de implementar un procedimiento de pesada . • • La información provista en este capítulo no sólo se aplica a las balanzas usadas para materiales que deben pesarse con exactitud (ver el capítulo Balanzas (41 )), sino también a las balanzas usadas en todos los procedimientos anaíticos.
CALIFICACIÓN Los usuarios deben consultar el capítulo Calificación de Instrumentos Analíticos (1058), los procedimiento operativos estándar y las recomendaciones de los fabricantes durante el desarrollo de planes de calificación.
Instalación El desempeño de la balanza depende de las condiciones del lugar en el que se va a instalar. Los analistas deben consultar la información provista por el fabricante antes de instalar una balanza. SUPERFICIE DE SOPORTE La balanza debe instalarse sobre una superficie sólida, nivelada y no magnética que minimice la transmisión de vibraciones (p.ej., un banco de pesada de granito montado sobre el suelo). Si se emplea una superficie de soporte metálica, ésta debe poseer una descarga a tierra para prevenir la acumulación de electricidad estática. UBICACIÓN Si fuera posible, la balanza debe colocarse en un cuarto con temperatura y humedad controladas. El lugar debe contar con una fuente de energía eléctrica limpia y constante, además de estar libre de corrientes de aire y no estar cerca de hornos, estufas, conductos de aire acondicionado ni ventiladores de enfriamiento de otros equipos o computadoras. La balanza debe colocarse lejos de las ventanas exteriores de modo que se evite el contacto directo con la luz solar. La balanza no debe instalarse cerca de fuentes de radiación electromagnética tales como generadores de radiofrecuencia, motores eléctricos o dispositivos
1970 (1251) Pesada en una Balanza Analítica / Información General
USP 39
portátiles de comunicación (tales como teléfonos inalámbricos, teléfonos celulares y radiocomunicadores). La balanza no debe colocarse cerca de campos magnéticos inducidos por instrumentos de laboratorio u otros equipos. El desempeño de la balanza debe evaluarse después de la instalación y antes de su uso para demostrar el desempeño adecuado. En algunas situaciones, puede que no sea posible colocar la balanza en un ambiente óptimo. Ejemplos de dificultades potenciales de los emplazamientos incluyen lo siguiente: 1. Hay corrientes de aire ocasionales en el laboratorio. 2. La temperatura del laboratorio varía de manera excesiva (verificar la literatura del fabricante sobre la sensibilidad a la temperatura). 3. La humedad es muy alta o muy baja. Cualquiera de las circunstancias anteriores puede aumentar la velocidad de variación del peso de la muestra debido a la captación o pérdida de agua. Una humedad baja incrementa la acumulación de electricidad estática. 4. Las operaciones adyacentes producen vibraciones. 5. Se usan materiales corrosivos en un área cercana o se pesan rutinariamente. 6. La balanza está colocada dentro de una campana de extracción debido a que se usa para pesar materiales corrosivos o peligrosos. 7. La balanza está adyacente a equipos que producen un campo magnético (p.ej., un agitador magnético). 8. La balanza está expuesta a la luz solar directa. Cuando la balanza se ubica cerca de equipos o sistemas que induzcan vibraciones, corrientes de aire, radiación electromagnética, campos magnéticos o cambios en la temperatura o humedad, la evaluación deberá realizarse con dichos sistemas en operación para duplicar la situación más desafiante.
Calificación Operativa Después de la instalación del equipo, se debe llevar a cabo una calificación operativa por parte del usuario o de un proveedor calificado. Como mínimo, se debe encender la corriente eléctrica y se debe permitir que la balanza se equilibre de acuerdo con las instrucciones del fabricante (1-24 horas, dependiendo del tipo de balanza) antes de usarla. Dependiendo del tipo de balanza, los analistas deben incluir los siguientes procedimientos en la calificación operativa: 1. Movilidad mecánica de todas las partes móviles 2. Lectura estable 3. Ajuste manual o automático mediante pesas integradas 4. Operación de equipo auxiliar 5. Función de tara 6. Calibración inicial Diversos tipos de balanzas electrónicas emplean pesas integradas para un ajuste activado manual o mecánicamente. Por lo regular, este ajuste se aplica para reducir la fluctuación de la balanza que se presentan con el paso del tiempo y para compensar por fluctuaciones ocasionadas por variaciones en la temperatura ambiente. La calibración normalmente se lleva a cabo como parte de la calificación operativa, aunque también se puede realizar subsiguientemente de manera periódica. La calibración debe realizarse en el lugar en el que la balanza se usa para la operación normal.
Calificación del Desempeño La Tabla 7 provee una lista de las propiedades más importantes de las balanzas que se deben evaluar durante la calificación del desempeño. Algunas de estas pruebas pueden omitirse dependiendo del riesgo de la aplicación y de la tolerancia requerida para el proceso de pesada. Asimismo, las pruebas pueden omitirse si existe evidencia de que la propiedad en cuestión tiene solamente un efecto mínimo sobre el desempeño de la pesada. Cualquier procedimiento usado debe ser congruente con los procedimientos operativos estándar internos que sean aplicables a la balanza específica y estar adecuadamente justificado. La calificación del desempeño debe realizarse periódicamente según se describe en los procedimientos operativos estándar, mientras que la frecuencia de cada una de las pruebas individuales puede variar dependiendo de la criticidad de la propiedad. Las pesas que se usan para realizar las pruebas deben almacenarse y manejarse de manera tal que se minimice la contaminación. Antes de ejecutar las pruebas, el ,t,téc'níco usp39 debe colocar las pesas en las inmediaciones de la balanza durante un tiempo adecuado para conseguir el suficiente equilibrio térmico. De ser posible, • .usm las pruebas deben realizarse con una sola pesa de prueba para minimizar los errores de manipulación, aunque se permiten múltiples pesas de prueba. Las pruebas deben registrarse de tal manera que se puedan usar los datos para rastrear fácilmente el desempeño de la balanza y para ayudar con las investigaciones del laboratorio, según se requiera. Se pueden establecer criterios de aceptación significativos dependiendo de la tolerancia requerida de la pesada, es decir, la desviación máxima permitida por las especificaciones, reglamentos, etcétera, de una cantidad a pesar a partir de su valor diana. Se debe contar con procedimientos para tratar resultados de prueba que queden fuera de los intervalos aceptables y para garantizar que la limpieza de la balanza y el ambiente no han afectado el resultado. Además, se debe contar con un procedimiento para retirar del servicio una balanza cuando los resultados observados caigan fuera de los intervalos aceptables.
USP 39
Información General/ (1251) Pesada en una Balanza Analítica 1971
Tabla 1. Pruebas de Desempeño y Criterios de Ace taclón Sugeridos Pro iedad
La carga de prueba es igual o suficientemente cercana a la capacidad de la balanza.
sea aplicable el capítulo ( ara otros usos, el requisito respectivo de tolerancia dividido or 2.
Linealidad
Capacidad de una balanza para seguir la relación lineal entre una carga y el valor de pesada indicado. La falta de linealidad a menudo se expresa como la magnitud más grande de cualquier desviación de linealidad dentro del De 3 a 6 puntos sobre el intervalo de la balanza. intervalo de prueba.
Desviación de no más de 0,05%, cuando sea aplicable el capítulo (41 ). Para otros usos, el requisito respectivo de tolerancia dividido or 2.
Excentricidad
Desviación en el valor de medición ocasionado por carga excéntrica-es decir, la colocación asimétrica del centro de gravedad de la carga con respecto al centro de gravedad del receptor de la carga. La excentricidad a menudo se expresa como la magnitud más grande de cualquiera de las desviaciones entre una lectura fuera del centro y la lectura en el centro para una car a de rueba dada.
Se realiza en el centro de gravedad y los cuatro cuadrantes (para receptores de forma rectangular) o en ubicaciones análogas para otras formas de receptores. La carga de prueba por lo general debe ser 30% o más de la capacidad de la balanza (referirse al manual del fabricante para verificar si la balanza posee un límite superior).
Desviación de no más de 0,05%, cuando sea aplicable el capítulo (41). Para otros usos, el requisito respectivo de tolerancia dividido or 2.
Repetibilidad
Capacidad de un instrumento de pesada para mostrar valores de medición idénticos para pesadas repetidas de los mismos objetos en las mismas condiciones, p.ej., el mismo procedimiento de medición, el mismo operador, el mismo sistema de medición, las mismas condiciones operativas y la misma ubicación 1 O pesadas repetidas (usando una durante un periodo corto. La repetibilidad pesa de prueba equivalente a un por lo general se expresa como la desviación pequeño porcentaje de la capacidad nominal de la balanza). estándar de múlti les pesadas.
Sensibilidad
Requisito del capítulo (41) cuando sea aplicable. Para otros usos, se aplicarán los requisitos especificados or el usuario.
Tanto la sensibilidad, como la linealidad y la excentricidad representan las desviaciones sistemáticas; es decir, limitan la exactitud de la balanza (basándose en la definición de exactitud en el capítulo Validación de Procedimientos Farmacopeicos (1225) y en la Pauta Q2 de la ICH). En el Vocabulario Internacional de Metrología (VIM) y en los documentos de la lnternational Organization for Standardization (Organización Internacional para la Estandarización), se hace referencia a este concepto como veracidad. Debido a que las desviaciones son, en gran medida, independientes entre sí, es improbable que todas las desviaciones ocurran simultáneamente y que tengan el mismo signo algebraico. Por lo tanto, la suma aritmética de todas las desviaciones individuales para evaluar la exactitud de la balanza se consideraría más como un enfoque conservador. Una suma de cuadrados de las desviaciones individuales es un enfoque más realista. Mediante la asignación del 50% del total de tolerancia de la pesada a los criterios de aceptación de las propiedades individuales, tales como sensibilidad, linealidad y excentricidad, los analistas aseguran el apego a la tolerancia requerida de la pesada. Por lo tanto, los criterios de aceptación para las propiedades individuales que se toman en cuenta para las desviaciones sistemáticas se ajustan a la tolerancia de la pesada dividida por 2. También se pueden tomar dichas propiedades -o un subconjunto de ellas- para cumplir con el requisito de exactitud descrito en el capítulo (41 ). En este caso, los criterios de aceptación permiten, por lo tanto, una desviación máxima de 0,05% para sensibilidad, linealidad y excentricidad. La repetibilidad se analiza con una pesa de prueba equivalente a un pequeño porcentaje de la capacidad de la balanza. En el límite inferior de su intervalo de medición, el desempeño de las balanzas del laboratorio se ve limitado por la repetibilidad finita y, por lo general, resultan despreciables las limitaciones inducidas por las desviaciones sistemáticas. Por ende, se puede asignar todo el presupuesto de tolerancia de la pesada al criterio de aceptación de la prueba de repetibilidad. Para las pruebas de sensibilidad y linealidad descritas anteriormente, los analistas deben usar pesas certificadas de una clase apropiada (p.ej., de acuerdo con la Pauta Rl 11 de la Organización Internacional de Metrología Legal o la Pauta E617 de la American Society for Testing and Materials, disponibles en www.oiml.org y www.astm.org, respectivamente). [NOTA-Si se usa un método diferencial para la prueba de linealidad, posiblemente no se requieran pesas certificadas.] Dependiendo del criterio de aceptación, puede ser suficiente considerar únicamente el valor de peso nominal de las pesas de prueba. Si se considera el valor nominal de la pesa de prueba, los analistas deben asegurar que el error máximo permisible no exceda de un tercio del criterio de aceptación. Alternativamente, si se considera el valor certificado de la pesa de prueba, su incertidumbre de calibración no debe exceder de un tercio del criterio de aceptación. Si se usa más de una pesa para realizar la prueba, se deben sumar las incertidumbres de calibración de las pesas y la suma no debe exceder de un tercio del criterio de aceptación. Para pruebas tales como excentricidad o repetibilidad, resulta opcional el uso de pesas certificadas, pero los analistas deben asegurar que la masa de la pesa no cambie durante la prueba.
1972 (1251) Pesada en una Balanza Analítica/ Información General
USP 39
Las pruebas antes descritas también se pueden incluir en la calibración formal periódica para cumplir con los requisitos aplicables de las buenas prácticas de fabricación.
Verificaciones de la Balanza Verificar la balanza usando una pesa externa ayuda a asegurar que la balanza cumple con los requisitos de tolerancia de la pesada. La verificación de la balanza se realiza en intervalos apropiados basándose en los procedimientos operativos estándar aplicables. La frecuencia de la verificación de la balanza depende del riesgo de la aplicación y de la tolerancia requerida de la pesada. Las verificaciones con pesas externas se pueden reemplazar parcialmente usando un ajuste activado manual o mecánicamente mediante pesas integradas. Cuando los analistas realizan la verificación de la balanza con una pesa externa, se pueden aplicar los mismos criterios de aceptación conforme a lo descrito anteriormente para la prueba de sensibilidad.
Peso Mínimo El peso neto de muestra mínimo, ·•también cónoeido cortio peso mínimo,.usm de expresar mediante la ecuación: mmin
mmín1
de una balanza •analítica•usm se pue-
= k X S/tolerancia requerida de pesada
donde k es el factor de cobertura (generalmente 2 o superior) y ses la desviación estándar (en una unidad de masa, p.ej., en mg) de no menos de 1O mediciones repetidas de una pesa de prueba. •Si la desviación estándar obtenida es menor que 0,41 d,. donde des.el intervalo cie la escala, la .desviación eS;tándane reemplaza por 0,4ld. El·ffmite inferiórde 0,4ld para la desviaeión estándar resulta del .error de redondeo de la indicación digital de un instrumento de pesada. El error de redondeo que se asigna a una lectura individual. se calcula como 0,29d. Tener eri cuenta que una pesada siempre. t()l')sta de dos lecturas, una antes y una después de colocar/retirar la muestra sobre/de la ban(:leja, siendo la diferencia entre las dos. ihdicaciones el p~so néto de la muestra. Los dos erróres de redondeo .individuales· por lo general se sj.Jln;ilh .de fatroa cuadrátrica, lo que lleva a Oí41 d: Tarar el .instrumento después de colocar el recipiente de. tara sobre la ba!")deja. no. afecta. el error de. redondeo debido a que la. indiéación cero también ~e redondéa;.t.:usrs9 El peso mínimo describe el límite inferior de la balanza por debajo del cual no existe un apego a la tolerancia de pesada requerida. La ecuación anterior toma en cuenta que el desempeño de las balanzas •analít,tas.1o.IJSp39 en el límite inferior del intervalo de medición está limitado por la repetibilidad finita. Para los materiales que se deben pesar con exactitud, el capítulo (41) estipula que la repetibilidad es satisfactoria si el doble de la desviación •estándar d.el• .ERRCOl·fun-:!ol.5J valor pesado dividido por el, •peso neto más pequeño deseado (el peso neto más pequeño que los usuarios planean usar en dicha balanza),.usri9 no excede de O, 10%. Para este criterio, la ecuación anterior se simplifica a: mmín
=
2000
X
5
•Si la desviación estándar obtenJda es menor que 0;4 l d, donde d es elintervalo de la escala, la desvíacióh estándar se reemplaza por 0,4 ld. ,¡. usP39 Cuando no esté sujeto a los requisitos del capítulo (41 ), el valor de peso mínimo puede variar dependiendo de la tolerancia de pesada requerida y del uso específico de la balanza. Para facilitar la manipulación, no se requiere que la pesa de prueba que se usa para la prueba de repetibilidad sea igual al valor de peso mínimo, sino que puede ser mayor debido a que la desviación estándar de repetibilidad es únicamente una función débil del valor de la pesa de prueba. Para cumplir con la tolerancia de pesada requerida, al pesar las muestras, la cantidad de masa de muestra (es decir, el peso neto) debe ser igual o mayor que el peso mínimo. El peso mínimo se aplica al peso de muestra, no a la tara ni al peso bruto. Los factores que pueden influenciar la repetibilidad cuando la balanza está en uso incluyen: 1. El desempeño de la balanza y, por ende, el peso mínimo, pueden variar con el paso del tiempo debido a las condiciones ambientales cambiantes. 2. Diversos operadores pueden pesar de manera distinta en la balanza-es decir, el peso mínimo determinado por diferentes operadores puede ser diferente. 3. La desviación estándar relativa de un número finito de pesadas repetidas es únicamente una estimación de la desviación estándar verdadera, la cual se desconoce. 4. La determinación del peso mínimo con una pesa de prueba puede no ser completamente representativa de la aplicación de la pesada. 5. El vaso de tara también puede influenciar el peso mínimo debido a la interacción del ambiente con la superficie del vaso de tara. Por estas razones, cuando sea posible, las pesadas deberán realizarse en valores más grandes que el peso mínimo, •es decir, él peso neto más pequeño deseado que los usuaricís planean usar en diéha balanza debe .ser mayor que el peso mínimo..1o.usr39
USP 39
Información General/ (1251) Pesada en una Balanza Analítica 1973
OPERACIÓN DE LA BALANZA ANALÍTICA Seleccionar la balanza apropiada para la cantidad y desempeño que se requieran. El capítulo general (41) provee requisitos para balanzas usadas para materiales que deben pesarse con exactitud. El usuario de la balanza debe verificar el ambiente de la misma (vibración, corrientes de aire y limpieza), así como el estado de la calibración antes de su uso.
Recipientes Receptores Para asegurar un desempeño adecuado al medir el peso de una muestra, los analistas deben considerar la selección de un recipiente receptor apropiado para el material. CARACTECTERÍSTICAS GENERALES Todos los recipientes receptores deben estar limpios, secos y ser inertes. El peso total del recipiente receptor más la muestra no debe exceder la capacidad máxima de la balanza. Usando una balanza de laboratorio adecuadamente mantenida y ajustada, la incertidumbre de pesada para muestras pequeñas, es decir, los pesos netos con una masa que generalmente no excede un porcentaje pequeño de la capacidad de la balanza, se determina esencialmente mediante la repetibilidad. No obstante, la repetibilidad depende del tamaño y área superficial del objeto pesado. Por esta razón, los recipientes receptores grandes o pesados introducen una desviación a partir de las condiciones en las que se determinó la repetibilidad sin considerar a los recipientes receptores. Por lo tanto, se deben usar recipientes receptores que tengan una masa baja y una superficie pequeña (especialmente cuando se estén midiendo muestras de bajo peso) o la prueba de repetibilidad se puede realizar con el recipiente receptor colocado sobre el platillo de la balanza a manera de precarga. Los receptores deben estar fabricados con materiales no magnéticos para prevenir la interferencia magnética con los componentes electrónicos de la balanza. Los recipientes receptores deben usarse a temperatura ambiente para prevenir la formación de corrientes de aire dentro de la cámara de pesada. MUESTRAS SÓLIDAS Los recipientes receptores para pesar materiales sólidos incluyen papel para pesada, platos para pesada, embudos para pesada o vasos cerrados, incluidos frascos, viales y matraces. No se recomiendan los papeles higroscópicos para pesada debido a que pueden introducir un error en los resultados observados. Los platos de pesada generalmente están hechos de polímero o aluminio. Los platos de pesada antiestáticos están disponibles para medir materiales que retienen electricidad estática. Los embudos de pesada generalmente están hechos de vidrio o polímero. El diseño de este tipo de recipientes receptores combina los atributos de un plato de pesada y de un embudo de transferencia, lo cual puede simplificar la transferencia analítica de un polvo pesado a un recipiente de cuello estrecho tal como un matraz volumétrico. Para muestras sólidas que son volátiles o delicuescentes, los analistas deben pesar el material en un vaso cerrado. Cuando resulte práctico, los analistas deben usar un vaso cerrado con una pequeña abertura para reducir la pérdida de peso de la muestra derivada de la volatilización, o la ganancia de peso derivada de la adsorción y absorción de agua atmosférica. MUESTRAS LÍQUIDAS Los recipientes receptores para muestras líquidas por lo general son vasos cerrados inertes. Para muestras líquidas que son volátiles o delicuescentes, los analistas deben usar un vaso cerrado con una pequeña apertura y cuya tapa debe colocarse de nuevo rápidamente después de transferir el material. Se deben tomar precauciones especiales para asegurar que el recipiente receptor y el cierre estén fabricados con un material que sea compatible con la muestra líquida. El receptor y el cierre deben tener un sello lo suficientemente bueno para evitar fugas de un líquido con baja viscosidad o que tenga una tensión superficial baja o un punto de ebullición bajo.
Tipos de Pesada PESADA PARA ANÁLISIS CUANTITATIVOS El paso inicial para muchos análisis cuantitativos consiste en pesar con exactitud una cantidad especificada de una muestra. La sección en Advertencias Generales, 6.50.20 estipula que las soluciones para mediciones cuantitativas deben prepararse usando analitos pesados con exactitud: es decir, los analistas deben usar una balanza que cumpla con los criterios del capítulo (41 ). Los errores introducidos durante la pesada de una muestra pueden afectar la exactitud de todas las mediciones analíticas subsiguientes.
1974 (1251) Pesada en una Balanza Analítica/ Información General
USP 39
PESADA POR ADICIÓN Las pesadas por adición generalmente se usan para muestras sólidas o líquidas cuya volatilidad no representa un problema. El recipiente receptor se coloca sobre la balanza. Después de que la lectura de la balanza se estabilice, los analistas deben tarar la balanza, agregar al recipiente receptor la cantidad deseada de material, dejar que la lectura de la balanza se estabilice, registrar el peso y transferir cuantitativamente el material a un recipiente apropiado o, cuando no se pueda garantizar la transferencia de la cantidad total, pesar nuevamente el recipiente receptor y anotar la diferencia de peso. PESADA POR DISPENSACIÓN La pesada por dispensación generalmente se usa para pesar emulsiones o líquidos viscosos tales como ungüentos. En estas situaciones, resulta poco práctico pesar el material en un recipiente receptor común. El analista debe tarar la balanza de manera acorde, colocar la muestra sobre la balanza en un recipiente adecuado (p.ej., un frasco, tubo, pipeta de transferencia o jeringa) cuya parte exterior haya sido previamente limpiada, registrar el peso después de que la lectura de la balanza se estabilice, transferir la cantidad deseada de muestra a un vaso receptor apropiado tal como un matraz volumétrico y colocar la pipeta o jeringa de nuevo en la balanza. La diferencia entre las dos pesadas es igual al peso de la muestra transferida. DOSIFICACIÓN GRAVIMÉTRICA La dosificación gravimétrica por lo general se usa para preparaciones muestra y estándar o para relleno de cápsulas. En el caso de dicha pesada, el analista coloca el matraz volumétrico, vial o cubierta de la cápsula sobre la balanza, tara la balanza después de que la lectura de la balanza se estabilice, agrega los componentes sólidos o líquidos en el recipiente receptor mediante unidades de dosificación y registra los pesos respectivos.
Muestras Problemáticas MUESTRAS Y RECIPIENTES RECEPTORES CON CARGA ELÉCTRICA Los polvos secos finamente divididos pueden estar cargados con electricidad estática que puede hacer que el polvo sea atraído o repelido por el recipiente receptor o la balanza, lo que ocasiona mediciones de peso inexactas y pérdida de muestra durante la transferencia. Una fluctuación en las lecturas de la balanza debe alertar al operador sobre la posibilidad de que el material tenga una carga estática. Se pueden usar balanzas disponibles comercialmente con un dispositivo antiestático incorporado para resolver el problema. Tales dispositivos pueden utilizar componentes piezoeléctricos o una pequeña cantidad de elemento radioactivo (generalmente polonio) para generar una corriente de iones que disipe la carga estática cuando pase sobre el polvo que se está pesando. También se encuentran disponibles comercialmente bandejas antiestáticas para pesada, pistolas antiestáticas y pantallas antiestáticas. La carga estática depende también de la humedad relativa del laboratorio, que a su vez depende de las condiciones atmosféricas. En determinadas condiciones, la carga estática es ocasionada por el tipo de ropa que lleva el operador, y esta carga puede producir grandes errores en la pesada. Los recipientes receptores de plástico y vidrio de borosilicato tienen una propensidad bien conocida a acumular carga estática, especialmente a una humedad relativa baja. Los guantes usados para proteger al operador también pueden incrementar el potencial de un problema de carga estática. Colocar el envase en un sujetador metálico puede ayudar a resguardar contra la carga estática, además los guantes antiestáticos también pueden ayudar a mitigar el problema. MUESTRAS VOLÁTILES Cuando se pesa un líquido que tiene un punto de ebullición bajo, los analistas deben recibir la muestra en un vaso con cierre hermético a los gases con un diámetro pequeño. Luego, el analista tara el vaso y el cierre, agrega la cantidad deseada de muestra y vuelve a colocar el cierre. Después de que la lectura de la balanza se estabiliza, el analista registra el peso de la muestra. MUESTRAS FRÍAS O CALIENTES Las muestras frías o calientes deben equilibrarse en el laboratorio, de otro modo las lecturas de peso pueden resultar erróneas. Con respecto a las muestras calientes, el peso aparente es menor que el peso real debido a la convección del calor. Por ejemplo, un matraz que está más caliente que el aire ambiental calienta dicho aire, el cual posteriormente fluye hacia arriba y a lo largo del matraz, reduciendo el peso aparente del contenido mediante fricción viscosa.
USP 39
Información General/ (1265) Información Escrita de los Medicamentos Recetados 1975
MUESTRAS HIGROSCÓPICAS Los materiales higroscópicos absorben fácilmente la humedad de la atmósfera y ganan peso de manera constante si se les deja expuestos. Por lo tanto, las muestras higroscópicas deben pesarse rápidamente o colocarse en un recipiente con cierre hermético a los gases. Para un recipiente hermético a los gases, los analistas deben tarar el recipiente y el cierre, agregar la cantidad deseada de muestra y volver a colocar el cierre. Después de que la lectura de la balanza se estabilice, el analista puede registrar el peso de la muestra. MUESTRAS ASÉPTICAS O DE RIESGO BIOLÓGICO La pesada de muestras estériles o de riesgo biológico se debe llevar a cabo dentro de los límites de un banco limpio, de una cabina de seguridad biológica, aislador o un dispositivo de contención similar. El flujo de aire dentro de la campana puede ocasionar inestabilidad en la balanza, por lo que después de instalar una balanza bajo una campana, los analistas deben realizar un estudio de calificación riguroso con artefactos de peso adecuados (ver el capítulo (41)) para determinar la aceptabilidad del desempeño de la balanza en este ambiente. PESADA DE MATERIALES CORROSIVOS Muchos productos químicos, como por ejemplo las sales, son corrosivos y los materiales de esta naturaleza no deben derramarse sobre el platillo de la balanza o dentro de la caja de la balanza. Es esencial tener un cuidado extremo cuando se pesen materiales de esta naturaleza. Los analistas deben considerar el uso de recipientes sellados tales como frascos de pesada y jeringas. En caso de derrame, puede ser necesario volver a calificar la balanza, dependiendo de la naturaleza del derrame.
Consideraciones de Seguridad al Realizar la Pesada Durante una pesada, el analista puede estar expuesto a altas concentraciones de una sustancia pura. Antes de pesar una sustancia, el analista debe tomar en cuenta dicha posibilidad en todo momento y debe familiarizarse con las precauciones descritas en la Hoja de Datos de Seguridad de Materiales (Material Safety Data Sheet) para la sustancia. Los materiales peligrosos se deben manipular en un lugar cerrado que tenga filtros de aire adecuados. Muchas sustancias tóxicas-y posiblemente alérgenas-se encuentran presentes como líquidos o partículas finamente divididas. Cuando se pesan dichas sustancias, los analistas deben utilizar una máscara que cubra la nariz y la boca para evitar la inhalación de la misma, además deben usar guantes para prevenir el contacto con la piel. [NOTA-El uso de guantes es una buena práctica para manipular cualquier producto químico. Si fuera necesario manipular el recipiente que se está pesando, el analista debe utilizar guantes, no sólo como autoprotección sino para evitar además que se deposite humedad o grasa en el recipiente pesado.]
(1265) INFORMACIÓN ESCRITA DE LOS MEDICAMENTOS RECETADOS-GUÍAS El objetivo de estas guías-referentes al formato, el contenido y la accesibilidad de los prospectos de medicamentos recetados-consiste en ayudar a garantizar que los prospectos sean de utilidad. En este contexto, se entiende por "de utilidad" que los destinatarios reciban, entiendan y se vean motivados a aplicar la información escrita acerca de sus medicamentos a fin de conseguir el máximo beneficio y minimizar los efectos nocivos. Los profesionales que dispensan y recetan medicamentos y los prestadores de servicios médicos que aconsejan a los pacientes acerca de los medicamentos y los pacientes mismos son los principales beneficiarios de estas guías.
CRITERIOS (DEL PLAN DE ACCIÓN DE KEYSTONE 1) La información escrita que acompañe a los medicamentos recetados debe cumplir con los siguientes criterios: 1 . Exactitud científica, 2. Imparcialidad en contenido y tono, 3. Especificidad y amplitud suficientes, EN DICIEMBRE DE 1996, SE PRESENTÓ ANTE EL SECRETARIO DE SALUD Y SERVICIOS SOCIALES DE LOS ESTADOS UNIDOS DE AMÉRICA EL "PLAN DE ACCIÓN PARA PROPORCIONAR INFORMACIÓN ÚTIL EN LOS MEDICAMENTOS RECETADOS". EL PLAN, CONOCIDO COMÚNMENTE COMO EL "PLAN KEYSTONE", DESCRIBE ALGUNOS CRITERIOS REFERENTES A LA INFORMACIÓN ESCRITA QUE DEBE ACOMPAÑAR A LOS MEDICAMENTOS RECETADOS. ESTOS CRITERIOS SE DESCRIBEN EN DETALLE EN EL PLAN DE ACCIÓN, QUE PUEDE CONSULTARSE EN WWW.FDA.GOV/CDER/OFFICES/ODS/KEYSTONE.PDF. 1
1976 (1265) Información Escrita de los Medicamentos Recetados/ Información General
USP 39
4. Formato comprensible y legible que sea fácil de entender para los consumidores, 5. Información pertinente y actualizada, e 6. Información útil.
GUÍAS DE FORMATO 1. Agrupar toda la información de la misma categoría empleando títulos breves y claros, y viñetas o subtítulos, según sea necesario. No utilizar símbolos ni subtítulos que no estén vinculados directamente con la información a la que hacen referencia. 2. Ser coherente en la ubicación y la rotulación de las categorías de la información en todos los prospectos. 3. Redactar la información para un público que tenga un nivel de lectura de sexto grado o inferior, si es posible (que no supere en ningún caso el nivel de lectura de octavo grado). No excluir información para lograr un nivel inferior de lectura. 4. Usar términos simples, comunes y exactos (por ejemplo, usar "ruido en los oídos" en lugar de "acúfenos"). 5. Utilizar un lenguaje directo que evite las palabras con significado opuesto (por ejemplo, usar "bajar la presión arterial", en lugar de "aumentar el efecto de presión arterial baja"). 6. Proporcionar las razones de las instrucciones (por ejemplo, "tomar junto con las comidas para evitar el malestar estomacal"). 7. Hacer hincapié en la información más importante. Distinguir con claridad las advertencias de las instrucciones o de otra información que pueda ser malinterpretada como advertencia. 8. De utilizar pictogramas, si se usa, colocar el texto correspondiente junto al símbolo empleado. Utilizar los pictogramas más simples que sea posible. En el caso de los pictogramas destinados a que los pacientes hagan preguntas o informen a los prestadores de atención médica, agregar, por ejemplo, "Avisar al médico" o "Preguntar al farmacéutico". 9. Facilitar la lectura empleando un tamaño de letra de 12 puntos o superior, tanto mayúsculas como minúsculas, una tipografía fácil de leer (por ejemplo, un tipo serif) y dejar espacio suficiente entre líneas y entre párrafos. Para atraer la atención hacia la información importante, emplear letras más grandes y negrita. 1 O. Evaluar el formato llevando a cabo pruebas de legibilidad, comprensión, memoria, resolución de problemas y eficiencia e intención de conducta con muestras representativas de la población objetivo.
GUÍAS DE CONTENIDO 1. Proporcionar información bien detallada para facilitar el uso correcto, conseguir el máximo beneficio y minimizar los efectos nocivos, incluso identificar las actividades (como por ejemplo, conducir o tomar sol) que el paciente debe evitar.
2. Redactar el texto con imparcialidad en cuanto a contenido y tono, y con exactitud científica. Los usos descritos deben coincidir con la información del etiquetado aprobado por la FDA o estar permitidos en alguna otra disposición de la FDA, o deben estar reconocidos en compendios farmacéuticos reconocidos a nivel federal en los Estados Unidos de América. Distinguir el uso que figura en el etiquetado del que no figura en el etiquetado. 3. En el caso de los medicamentos vendidos con una marca, consignar tanto el nombre comercial de la marca como el genérico e incluir una guía de pronunciación para cada uno. 4. Describir el medicamento y la forma farmacéutica. Incluir indicaciones y contraindicaciones, instrucciones específicas de uso, qué hacer si se saltea la toma de una dosis y qué hacer en el caso de sobredosis o intoxicación. 5. No utilizar abreviaturas. 6. Indicar qué tipo de beneficio se espera del medicamento (por ejemplo, "cura", "prevención", "ayuda a aliviar los síntomas"). Indicar cómo-y en qué lapso-el paciente debe percibir el beneficio y qué debe hacer si no observa ningún efecto. 7. Proporcionar una evaluación equilibrada de los riesgos y los beneficios. 8. Enumerar los efectos colaterales, en orden de gravedad, como por ejemplo "graves", "más frecuentes" y otros tipos de agrupamientos similares. No es aconsejable brindar información demasiado detallada para que el paciente pueda evaluar los efectos colaterales graves o frecuentes. Indicar al paciente que consulte con un médico o con el farmacéutico y aclarar que no se mencionan todos los efectos colaterales posibles. 9. La información incluida debe ser lo suficientemente específica y amplia como para abarcar todos los riesgos importantes. Hay que aconsejar a los pacientes que informen al prestador de atención médica acerca de los medicamentos que toman. 1O. Indicar la posibilidad de duplicación terapéutica si el medicamento está disponible con distintos nombres o como venta libre, o si el ingrediente activo está incluido en otros productos. 11. Si se la conoce, consignar la inocuidad en el empleo del medicamento en presencia de otras afecciones y durante el embarazo y la lactancia. Indicar a los pacientes afectados que conversen acerca de su afección con los prestadores de atención médica. Si no se ha comprobado que el medicamento sea seguro durante el embarazo o la lactancia, consignarlo. 12. Indicar si el medicamento es seguro y eficaz para las poblaciones pediátrica y geriátrica, y para otras poblaciones especiales. Se debe alentar a los pacientes a que consulten con los prestadores de servicios médicos los ajustes de la dosis. 13. Ilustrar la información con diagramas cuando sea apropiado. Rotular los componentes de los diagramas (por ejemplo, de las partes de un dispositivo) si no son evidentes. Las palabras de los rótulos deben ocupar un lugar prominente con una
USP 39
Información General/ (1285) Preparación de Muestras Biológicas 1977
notoriedad tal y en términos tales que sean leídas y comprendidas por una persona normal en condiciones habituales de compra y uso. 14. Incluir la siguiente información: a. Una declaración de que el producto sólo debe ser utilizado por la persona a la que le fue recetado, b. La información relativa al almacenamiento, c. Un descargo de responsabilidad en el que se le aconseje al paciente conversar con el prestador de servicios médicos, d. El editor del prospecto y la fecha de redacción o revisión, e. Las fuentes de las cuales se extrajo la información exhaustiva y las respuestas a las preguntas y f. Otras declaraciones generales que sean pertinentes. 15. Es preciso advertir al paciente acerca de los riesgos de dependencia o tolerancia que pueden devenir del uso del medicamento.
PAUTAS DE ACCESSIBILIDAD 1. Proporcionar información escrita que sea relevante para el uso pretendido del medicamento. 2. Diseñar los prospectos para que sean fáciles de reconocer, coherentes en formato y fáciles de guardar y consultar. 3. Suplementar los prospectos con orientación oral personalizada a los pacientes, incluso a niños, ancianos y a las personas encargadas de su cuidado. 4. Incluir una declaración instando al paciente a que lea el prospecto más de una vez. 5. Distribuir prospectos junto con todos los medicamentos recetados a los consumidores (es decir, a las personas que sean responsables de cualquier aspecto del uso del medicamento o de dar el medicamento a otros). 6. Redactar prospectos en español, inglés y otros idiomas y definir criterios de redacción en otros idiomas y para poblaciones especiales (por ejemplo, para niños, personas con dificultades visuales) [NOTA-Lo ideal sería que los prospectos informativos sobre medicamentos recetados estuvieran adaptados a la afección del paciente y a otras características pertinentes (por ejemplo, sexo, edad o limitaciones físicas), y que estuvieran disponibles en la lengua madre del paciente. En la actualidad, esta adaptación no es ni factible ni práctica, pero el objetivo queda propuesto.]
(1285) PREPARACIÓN DE MUESTRAS BIOLÓGICAS PARA ANÁLISIS HISTOLÓGICO E INMUNOHISTOQUÍMICO INTRODUCCIÓN La histología y la inmunohistoquímica (IHC, por sus siglas en inglés) se usan comúnmente para visualizar los componentes celulares y bioquímicos de los tejidos. Independientemente de si la detección de los atributos que se van a analizar se basa en reacciones químicas (histoquímica) o usando anticuerpos (inmunohistoquímica) o lectinas con especificidades conocidas, la preparación de la muestra para tinción representa una fase crítica del análisis. La preparación a menudo implica (1) la fijación del tejido, (2) el montaje del tejido en un medio de inclusión para permitir un corte que sea lo suficientemente delgado para observar el tejido al microscopio y, posteriormente, (3) la eliminación de cualquier medio de inclusión antes de la evaluación histoquímica o inmunohistoquímica. El propósito de este capítulo es identificar los factores que se deben controlar para optimizar la uniformidad de los resultados de la tinción de tejidos. Las siguientes secciones tratan la fijación de tejidos que se usa para prevenir la degradación y para preparar el tejido para corte y tinción. Puesto que estos métodos, por lo general, se usan para caracterizar productos terapéuticos basados en tejidos, así como para establecer la idoneidad de los métodos utilizados en el procesamiento del tejido, la USP en ocasiones incluye herramientas visuales para sustentar las monografías de dichos productos. Las Referencias Visuales Auténticas de la USP (AVR, por sus siglas en inglés) son generalmente imágenes histológicas que han sido preparadas conforme a lo descrito en este capítulo y que se usan como estándares de referencia relacionados con las monografías del producto. El propósito del análisis histológico es generar imágenes visuales que se puedan usar con fines ilustrativos o como referencias visuales. Cuando se usan como referencias visuales auténticas, el conjunto de imágenes debe incluir imágenes representativas con diferentes aumentos tanto de las muestras que cumplen como de las que no cumplen con los requisitos. Las referencias visuales auténticas se pueden usar para aclarar de mejor manera las especificaciones y los criterios de aceptación relacionados, por ejemplo, con el contenido celular, la estructura del colágeno o la integridad.
PRINCIPIOS BÁSICOS La muestra de tejido debe tratarse de manera apropiada y adecuada o se debe fijar para limitar los cambios en los elementos de la matriz extracelular o en componentes específicos, tales como células o proteínas. La fijación del tejido por lo regular em-
1978 (1285) Preparación de Muestras Biológicas / Información General
USP 39
plea un químico que puede permear rápidamente el tejido para entrecruzar proteínas de manera efectiva y limitar la degradación ocasionada por la acción química o enzimática. Los métodos de fijación estándar, por lo general, emplean formalina amortiguada neutra de grado histológico al 10% y son adecuados para la mayoría, si no es que para todos, los análisis histoquímicos. La fijación con formalina provee material adecuado para el análisis inmunohistoquímico siempre que se ponga atención adecuada a los tratamientos posteriores a la fijación (referidos en conjunto como recuperación de antígenos). Una vez que el tejido se ha fijado adecuadamente, éste está listo para ser incluido. El tejido se incluye en un medio que es lo suficientemente rígido para mantener la geometría de la muestra y la orientación deseada para el corte, pero también lo suficientemente blando para poder cortarlo de manera rápida y fácil sin que se deforme. El medio más usado comúnmente es la parafina, aunque no es adecuada para tejidos duros sin descalcificar ni otros materiales rígidos (p.ej., polímeros duros o metales). Debido a que la parafina es insoluble en agua, el tejido, por lo general, se pasa a través de una serie gradual de concentraciones crecientes de etanol y finalmente se lo coloca en xileno (o un sustituto adecuado) en el que la cera de parafina es soluble. Se debe permitir que transcurra un tiempo suficiente para que la parafina pueda permear el tejido. Posteriormente, se corta el bloque con el espesor deseado. Los tejidos duros, por lo regular, se incluyen en plásticos duros tales como poli(metil metacrilato). Después de cortar las muestras, éstas se dejan flotar en agua tibia con o sin gelatina de modo que se puedan transferir a portaobjetos para microscopio. Si los cortes se van a usar para análisis inmunohistoquímico, se recomienda que la gelatina no se use con agua, debido a que puede contribuir de manera significativa con la tinción del fondo. Asimismo, se recomiendan los portaobjetos con carga positiva para ayudar en la retención de muestras durante el procesamiento del análisis inmunohistoquímico. Se debe dejar que los cortes se sequen al aire, en un calentador de portaobjetos o en una estufa a una temperatura que no exceda de 50º. Debido a que la mayoría de los procedimientos histoquímicos e inmunohistoquímicos se llevan a cabo en condiciones acuosas, se debe eliminar la parafina que se encuentra dentro de las secciones de tejido, lo cual se logra invirtiendo la secuencia de los enjuagues de xileno y alcohol hasta que las muestras se enjuaguen en agua inmediatamente antes de la tinción. En ese punto, las secciones montadas se encuentran listas para la tinción histoquímica. Cuando se vaya a utilizar un método de tinción inmunológico, será necesaria, en la mayoría de los casos, una etapa de recuperación de antígeno para romper los entrecruzamientos proteicos formados por la fijación de la formalina. Para lograr lo anterior, se encuentra disponible una gran cantidad de procedimientos, y aunque el tratamiento con calor en vapor ácido parece ser efectivo en la recuperación de la reactividad de la mayoría de los antígenos en los tejidos, la elección final puede depender de las características del antígeno que se va a evaluar.
PROCEDIMIENTOS-CONSIDERACIONES Fijación Los fijadores más comúnmente usados son aldehídos, alcoholes y agentes oxidantes. Cada uno presenta ventajas y desventajas, dependiendo del propósito particular (ver la Tabla 7). Tabla 1. Atributos de los Fijadores de Tejido Comunes Nombre del Fijador
Formaldehído (p.ej., formalina amortiguada neutra al 10%)
Mecanismo
Entrecruza la proteína
Ventajas
Desventajas
Notas
Alteración mínima de la estructura de la proteína y de la antigenicidad; buena penetración
Se prefiere la versión amortiguada para contrarrestar la oxidación del formaldehído en ácido fórmico, el cual tiende a ocasionar un artefacto de color marrón.
Pueden formarse precipitados no amortiguados los cuales serán ácidos (pH 34,6). Usar con cortes de tejidos de 2-3 µm de espesor. Abre estructuras tales como vasos sanguíneos para mejorar el acceso a todas las superficies del tejido y para prevenir que las superficies opuestas se unan entre sí
Glutaraldehído (p.ej., 0,25%-4%)
Entrecruza la proteína
Morfología adecuada para microscopía electrónica
Deforma la estructura a-helicoidal de la proteína, por lo que no es apto para procesos inmunohistoquímicos; penetración lenta
Alcoholes (p.ej., metanol o etanol)
Desnaturalizan proteínas
Se aplican mejor a frotis citológicos; buena penetración
Pueden ocasionar rigidez y ruptura de tejidos, lo cual dificulta el corte
Permanganatos, dicromatos o tetróxido de osmio
Agentes oxidantes que entrecruzan proteínas
Fijación de citoplasma sin precipitación; fijación de lípidos, en especial fosfolípidos
Ocasiona una desnaturalización importante; poco común
Picratos
Agentes oxidantes que entrecruzan proteínas
Buena retención de la estructura nuclear con endurecimiento limitado del tejido
Riesgo de explosión; ocasiona contracción celular
USP 39
Información General/ (1285) Preparación de Muestras Biológicas 1979
El tejido que no se fija apropiadamente no se integrará ni podrá cortarse adecuadamente y, en consecuencia, no podrá teñirse de manera apropiada. Un tiempo de fijación adecuado es de principal importancia para la garantía de calidad. Los fijadores, por lo general, se usan en proporciones de 15:1 a 20:1 de volumen de fijación con respecto a la masa de tejido. Como alternativa, se pueden usar múltiples cambios de fijador, con agitación. Es importante exponer los tejidos a fijadores durante un tiempo suficiente, asegurando que la muestra no se seque antes o durante este proceso. Incluso los pequeños trozos de tejido pueden requerir un tiempo de exposición de 12-24 horas. La manipulación de tejido también es importante debido a que las áreas que están sujetas físicamente al portaobjetos podrían no fijarse tan rápido como las áreas que no lo están. Las concentraciones típicas para algunos fijadores se muestran en la Tabla 1. Se debe tomar en cuenta que si las concentraciones de fijación son demasiado altas o si el tiempo de fijación es demasiado extenso, se podrían formar artefactos estructurales. La temperatura de fijación se puede incrementar en cierta medida, pero no hasta un punto que ocasione la desnaturalización de la proteína. Los amortiguadores también son importantes para una fijación de alta calidad. Por lo regular, resulta mejor un intervalo de pH 6-8 dada la alta probabilidad de que así se mantenga la estructura del tejido nativo. La amortiguación debe ser suficiente para superar la acidificación ocasionada por hipoxia y para prevenir depósitos negros de formalina-hemo.
Procesamiento de Tejidos DESHIDRATACIÓN Una vez que el tejido ha sido fijado de manera adecuada, se encuentra listo para el proceso de deshidratación e inclusión. Los deshidratantes más comúnmente usados son los alcoholes, pero en ocasiones se usa acetona debido a que fija rápidamente el tejido (aunque representa un riesgo de incendio). Los tejidos pueden sufrir daños físicos si no están lo suficientemente deshidratados, a menudo como consecuencia de la contaminación del agua en las soluciones etanólicas de lavado. Después de la deshidratación, el tejido se coloca en un agente aclarante antes de la inclusión. Algunos agentes aclarantes comunes son: xileno, tolueno, cloroformo, salicilato de metilo, limoneno (un aceite volátil que se encuentra en la cáscara de los cítricos), u otros sustitutos comerciales de xileno. 1 INCLUSIÓN Dependiendo del tipo de tejido y del protocolo de tinción subsiguiente, existen diversas opciones de inclusión y medios de montaje. La parafina es el medio más comúnmente usado para la inclusión de tejidos. Su densidad es similar a la de la mayoría de los tejidos, lo que facilita el corte, y se pueden evaluar múltiples tipos de parafina con diversos puntos de fusión si los cortes de tejido no son uniformes. Cuando se requieran cortes delgados o cuando se vayan a incluir tejidos más duros (p.ej., hueso), los plásticos representan una buena opción (p.ej., metacrilato, glicol metacrilato, resina de araldita, o epón). Una vez que se ha seleccionado el medio de montaje, la muestra debe alinearse y orientarse cuidadosamente en el mismo con respecto al plano de corte deseado. Los tejidos que se fijan e incluyen de manera adecuada pueden mantenerse en esta forma de manera indefinida antes de la tinción, siempre que se almacenen adecuadamente. Los tejidos se pueden incluir manualmente o mediante sistemas automatizados. Algunos sistemas de inclusión tienen una cámara para conservar los moldes y las muestras calientes y listas para la inclusión. Asimismo, pueden contar con una cámara separada para fundir la parafina, un dispensador incorporado para verter la parafina en los moldes de inclusión, además de una placa fría separada para enfriar los tejidos recientemente sometidos a la inclusión. Los métodos manuales y automatizados son esencialmente iguales y son bien aceptados como métodos de inclusión de tejidos. La única diferencia es que éstos últimos son semiautomáticos por lo que el sistema opera durante una hora o menos (es decir, se funde la parafina, se calientan las cámaras de calentamiento y se enfría la placa fría). Los métodos manuales son hasta cierto punto más lentos. Independientemente del sistema que se use, no se debe comprometer la integridad del corte histológico. CORTE Cuando los bloques de tejido están listos para la tinción, se realizan cortes usando una cuchilla afilada o cuchillas desechables. Los cortes de tejido incluidos en parafina tienen, por lo general, un espesor de 4-8 µm, mientras que los tejidos incluidos en plástico son, por lo regular, de 2 µm de espesor. Los cortes de tejido se colocan sobre portaobjetos y se pueden almacenar en dicho estado. Los portaobjetos se aclaran nuevamente (para disolver la parafina) y se rehidratan antes de la tinción o del proceso inmunohistoquímico. En todos los casos, los analistas deben ser conscientes de la importancia de cada etapa para evitar la producción de artefactos (p.ej., la contracción relacionada con la fijación o muescas, dobleces o rasgaduras en los cortes de tejido ocasionados por un uso inadecuado del micrótomo o una cuchilla sin afilar). Una vez completado el proceso de tinción, los analistas deben aplicar suficiente medio de montaje sobre los cortes de tejido para evitar el atrapamiento de burbujas de aire al momento de aplicar una cubierta.
1
Por ejemplo, Clear Rite, Pro Par Clearant.
1980 (1285) Preparación de Muestras Biológicas/ Información General
USP 39
Ejemplo de Protocolo A continuación se presenta un ejemplo de fijación, inclusión en parafina y método de procesamiento comúnmente usados antes de la tinción con hematoxilina y eosina (H&E) para estudiar la efectividad de los procesos de descelularización de tejidos. Solución de fijación: fosfato de sodio O, 1 M, pH 7, que contenga formalina al 10%. Parafina: Fundir parafina a 60º durante 3 horas antes del análisis. [NOTA-Para lograr una infiltración adecuada y el éxito de los pasos subsiguientes, lo mejor es mantener la Parafina fresca (exenta de agentes aclarantes) con cambios frecuentes de parafina (al menos dos cambios). La temperatura de la Parafina debe ser no más de 2º-4º por encima de su punto de fusión; de otro modo, los tejidos expuestos a la Parafina sobrecalentada sufrirán un sobreendurecimiento.] Solución de parafina 1: Parafina y xileno (1 :3) o un sustituto de xileno2 Solución de parafina 2: Parafina y xileno (1: 1) o un sustituto de xileno Solución de parafina 3: Parafina y xileno (3: 1) o un sustituto de xileno Fijación y deshidratación, aclarado e infiltración de la parafina en el tejido: Colocar cada muestra de tejido (no más de 1 cm 3) en Solución de fijación durante un mínimo de 6-8 horas. El volumen de la Solución de fijación debe ser no menos de 15-20 veces el volumen de la muestra de tejido. [NOTA-Al procesar muestras de hueso, fijar minuciosamente antes de la descalcificación y el proceso de fijación/deshidratación/aclarado/infiltración de la parafina en el tejido. En este caso, después de la fijación, enjuagar la muestra con Agua Purificada y colocar en una solución descalcificadora rápida 3 durante el tiempo recomendado. Después de la descalcificación, enjuagar nuevamente las muestras de hueso con Agua Purificada y volver a colocarlas a en la Solución de fijación.] Colocar cada muestra de tejido en un casete de inclusión y marcar el casete con un lápiz o bolígrafo para histología. Colocar los casetes durante 30 minutos en cada una de las soluciones de la siguiente serie: 2 cambios de etanol al 70%, 2 cambios de etanol al 95% y 3 cambios de etanol al 100%. [NOTA-Opcionalmente se pueden transferir los casetes directamente de etanol al 100% a xileno al 100% durante 3 cambios. Colocar los casetes en Parafina calentada a 2º-4 º por encima de su punto de fusión haciendo 1-3 cambios durante no menos de 90 minutos y no más de 180 minutos. La exposición al calor prolongado ocasiona contracción y endurecimiento de los tejidos. Se debe evitar el tratamiento durante toda la noche.] A continuación, colocar los casetes durante 60 minutos en cada una de las soluciones de la siguiente serie a 60º: Solución de parafina 1, Solución de parafina 2 y Solución de parafina 3. Inclusión de tejidos: [NOTA-Este ejemplo es un método manual, pero se puede sustituir con un método de inclusión automatizado.] Mover el recipiente con los casetes descritos desde la incubadora a un baño de agua a 60º para prevenir que la parafina infiltrada se solidifique durante el procedimiento de inclusión. [NOTA-Los moldes de inclusión se pueden rociar con un concentrado diluido para liberación de moldes a fin de simplificar la liberación posterior de su contenido.] Colocar una pequeña cantidad de Parafina en la base de un molde a temperatura ambiente. Con ayuda de fórceps, retirar un casete que contenga tejido del recipiente que contiene la Parafina líquida y colocar el corte de tejido con la orientación deseada en el molde antes de que la Parafina se solidifique. [NOTA-Si no es posible colocar la muestra de tejido adecuadamente, ésta puede colocarse de nuevo en el casete de tejido que contiene la Parafina líquida y, posteriormente, se puede preparar un nuevo molde e intentar de nuevo colocar el tejido.] Una vez que el tejido esté en su lugar, colocar la porción marcada del casete sobre el molde y agregar Parafina hasta un nivel justo por debajo del borde del casete. Colocar el molde y el casete ensamblados en una placa fría congelada. Cuando la Parafina comience a solidificarse en la parte superior, transferir el ensamblaje a un baño de hielo hasta que todo el bloque se haya solidificado (aproximadamente 20 minutos). Una vez que la Parafina se haya solidificado, separar con cuidado la base del molde del tejido incluido sin aplicar fuerza excesiva. Almacenar los bloques a 4º hasta que se requieran para corte. Los bloques pueden ser cortados de inmediato, pero se recomienda esperar al menos 24 horas para conseguir mejores resultados. Corte del tejido incluido en parafina: Con ayuda de un marcador apropiado, etiquetar los portaobjetos de vidrio con un identificador de las muestras de tejido. Seleccionar un bloque de tejido incluido y recortar exceso de cera remanente alrededor de los bordes del bloque. Llenar un baño de flotación con Agua Purificada, con o sin gelatina (únicamente muestras para histología), y entibiar a 36º-46º. Colocar con cuidado una nueva cuchilla para micrótomo en el soporte de cuchillas. Asegurar que la cuchilla esté bien fija en su lugar. Según el aparato que se use, seleccionar el modo manual o motorizado del micrótomo. Colocar el bloque de tejido en el soporte del micrótomo y ajustar su orientación usando los tornillos de ajuste hasta que el bloque quede correctamente colocado de forma vertical y horizontal con respecto a la cuchilla. Seleccionar la configuración del corte. [NOTA-La configuración del corte, por lo general, se ajusta a 15-16 µm, aunque ésta puede incrementarse cuando se requiere una gran cantidad de cortes, o se puede reducir cuando el bloque presenta sólo una pequeña cantidad de tejido. Además, los bloques pueden ser refrigerados o colocados en hielo antes del corte para mantenerlos fríos y firmes.] Mover el bloque hacia adelante hasta la posición deseada. Una vez que el bloque está en posición, comenzar a cortarlo. Cuando en los cortes se visualiza el tejido, ajustar a una profundidad de corte adecuada y comenzar a recoger los cortes de tejido. [NOTA-Los cortes para realizar tinción con H&E de rutina deben ser de aproximadamente 6 µm, pero el espesor del corte se puede ajustar a 4-8 µm, según sea necesario, cuando resulte complicado obtener cortes de buena calidad.] Con ayuda de fórceps, transferir los cortes al baño de flotación de tejidos. Colocar cuidadosamente la cinta de los cortes sobre la superficie del agua mientras se tira de ésta suavemente para eliminar cualquier arruga. [NOTA-Si el agua en el baño de flotación se calienta demasiado, los cortes de tejido se fragmentarán. Cuando esto ocurra, reducir la temperatura del baño y dejar que el agua se enfríe antes de 2 Por ejemplo, CitriSolv, Clear Rite 3, Pro Par Clearant o equivalente. 3 Por ejemplo, Solución de Descalcificación, Richard-Allen.
USP 39
Información General/ (1285) Preparación de Muestras Biológicas 1981
proceder.] Posteriormente, separar de la cinta uno o dos cortes completos, adyacentes e intactos, con una sonda de disección afilada o fórceps. Usando un portaobjetos de vidrio colocado en un ángulo de aproximadamente 45º por debajo del corte, colocar los cortes en el portaobjetos. Retirar el exceso de agua golpeando suavemente y dejar que la muestra se seque. Según se requiera, repetir el proceso de corte para las muestras adicionales. Después de preparar todos los portaobjetos y antes de la tinción, dejar que los portaobjetos se sequen al aire durante no menos de 15 minutos o hasta que no se visualice ninguna gotita de agua. Retirar los bloques de cera del micrótomo y almacenar apropiadamente. Eliminación de la parafina y rehidratación de los portamuestras histológicos: Antes de la tinción, colocar los portaobjetos con las muestras de tejido montadas en vasos de Coplin, cubetas para reactivos o gradillas de tinción. Colocar los portaobjetos durante al menos 3 minutos en cada una de las siguientes soluciones: 3 cambios de xileno (o un sustituto de xileno), luego etanol al 100%, luego etanol al 95%, luego etanol al 70%, luego 2 cambios de Agua Purificada. Proceder con el procedimiento de tinción deseado. [NOTA-Los portaobjetos pueden dejarse en el agua durante varias horas, pero deben teñirse posteriormente.]
DESARROLLO Y VALIDACIÓN DEL MÉTODO: PUNTOS A CONSIDERAR Los métodos histológicos en ocasiones se usan para demostrar que las células dentro de una muestra de tejido siguen siendo viables (p.ej., al evaluar el desempeño del método de crioconservación). En otras circunstancias, el método se usa para evaluar la ausencia de células viables después de un proceso de desceluralización. Cada caso presenta desafíos específicos para la validación. La tinción con H&E provee una herramienta útil para determinar si cantidades importantes de células siguen siendo viables después de su conservación. Durante la validación del método, se pueden usar las tinciones inmunohistológicas para asegurar que los tipos específicos de células aún se encuentran presentes en las muestras conservadas. El análisis de las muestras para todos los tipos de células esperados durante la fase de validación provee sustento para la tinción H&E menos específica (la cual teñirá todas las células y no sólo tipos específicos de éstas) durante el monitoreo de rutina. Al validar cualquier método histológico, los analistas deben demostrar que observadores distintos pueden detectar la misma calidad (o cantidad) de un objeto, tipo de tejido, cuerpo celular, núcleo, entre otros, y que la caracterización por parte de diversos observadores se puede reproducir en diversas muestras siguiendo el mismo proceso. Las muestras para la evaluación pueden consistir en múltiples tipos de células, proteínas de matrices extracelulares y glicosaminoglicanos, u otros componentes. Algunos de estos componentes pueden ser resistentes a los procesos de descelularización o pueden ser difíciles de teñir. Durante la evaluación de la reproducibilidad del método, los analistas deben evaluar múltiples áreas de la muestra para asegurarse de que son representativas de los tipos de materiales que se espera encontrar en la matriz. Además, dada la posibilidad de que los procedimientos de descelularización sean inadecuados y no eliminen todas las células del material, es importante tomar muestras de múltiples partes del tejido para no subestimar las células remanentes. La reproducibilidad entre operadores también debe ser parte de la evaluación debido a que la señal relativamente más débil de un número menor de células positivamente teñidas podrían dificultar más la visualización para algunos técnicos. Cuando se valida un método se deben usar muestras que hayan experimentado condiciones sumamente exigentes durante el procesamiento de descelularización conforme a lo determinado por el modelo estadístico para asegurar que las células residuales puedan identificarse y cuantificarse en estas muestras marginales. Finalmente, la validación del método debe incluir muestras de control para confirmar la aptitud del sistema de tinción (ver el capítulo Tinción con Hematoxilina y Eosina de Cortes de Tejidos para Examen Microscópico (1285.1 )). La evaluación histológica de productos de matrices de tejidos descelularizados es una herramienta para caracterizar la matriz, pero no puede considerarse como el único indicador de la calidad del producto. Por una parte, el procesamiento puede generar productos de matrices descelularizadas sin células detectables, pero puede carecer de otros atributos críticos de calidad. Por otro lado, los productos de matrices de tejidos que se someten a otros procesos de descelularización pueden resultar en productos con una gran reducción de contenido celular (aunque pueden permanecer algunas células) que conservan las características necesarias de desempeño para tal propósito terapéutico.
Selección de la Muestra para el Análisis de un Proceso de Descelularización No siempre es posible tomar muestras de un sitio aleatorio dentro del producto. Por ejemplo, resulta muy poco práctico obtener una muestra del centro de una lámina de pericardio descelularizado sin crear un defecto que podría volver indeseable el producto final. Cuando los planes de muestreo de rutina requieran el muestreo de los bordes o de la porción de desecho de una matriz en particular, se recomienda que los analistas realicen un estudio de validación inicial que confirme que dicha muestra es representativa de la unidad completa. Esto es importante debido a que la geometría de la matriz puede afectar la exposición de la misma a las soluciones del proceso de descelularización. Por ejemplo, si la matriz de tejidos es tubular, p.ej., un segmento de un nervio, y se toma una muestra del extremo para evaluación histológica, entonces esta muestra sufrirá una exposición diferente a las soluciones que la de una muestra tomada del centro del segmento del nervio. Por ende, el muestreo puede no ser representativo de una evaluación de las condiciones más exigentes y la aptitud de la muestra deberá determinarse mediante un estudio de validación.
1982 (1285) Preparación de Muestras Biológicas/ Información General
USP 39
CONCLUSIONES Este capítulo describe las etapas para preparar muestras de tejido u órganos para un análisis con microscopía de luz después de la tinción o del tratamiento con sondas específicas para estructuras. Cada una de estas etapas puede producir artefactos en las muestras que podrían interferir con la observación o incluso introducir estructuras que no estaban presentes en la muestra original (p.ej., algunos artefactos químicos bien conocidos). Por lo tanto, la atención adecuada y la ejecución uniforme de cada etapa son factores críticos para generar cortes que reflejen el carácter del tejido y que provean una tinción reproducible.
(1285.1) TINCIÓN CON HEMATOXILINA Y EOSINA DE CORTES DE TEJIDOS PARA EXAMEN MICROSCÓPICO INTRODUCCIÓN Los métodos histológicos implican la preparación de órganos, tejidos o células para el análisis microscópico de sus elementos constituyentes. Las muestras son expuestas a procesos químicos particulares o a procedimientos de tinción inmunoquímica. Los métodos histológicos tienen diversos objetivos y a menudo se usan para evaluar la calidad de productos terapéuticos tales como tejidos naturales o productos derivados de tejidos naturales. Por ejemplo, estos métodos se pueden usar para establecer la integridad del tejido con respecto al contenido celular y a los componentes extracelulares. La intensidad de la tinción nuclear y la forma del núcleo podrían verse alteradas si la recuperación o la manipulación del tejido no se hicieran correctamente. Además, los componentes estructurales y componentes extracelulares tales como colágeno, elastina y glicosaminoglicanos se pueden teñir específicamente para determinar su presencia y ubicación. Los métodos histológicos son particularmente útiles para detectar tendencias en el contenido (p.ej., número de células y cantidades de componentes de los tejidos). Por ende, ha sido de gran valor para el desarrollo y la verificación de métodos de procesamiento de tejidos. En particular, para aquellos métodos diseñados para la preparación de matrices extracelulares tridimensionales por descelularización. En este caso, la descelularización (reducción o eliminación del contenido celular) es detectada por la disminución en el número de núcleos teñidos (por ejemplo con hematoxilina). Mientras que el mantenimiento de la estructura extracelular y sus componentes son revelados por la persistencia de la tinción de glicosaminoglicanos u otros carbohidratos (por ejemplo, tinción con azul Alcián). El análisis histológico de tejidos, por lo general, comienza con un procedimiento de tinción de rutina que emplea hematoxilina y eosina (H&E) para detectar cromatina y citoplasma celular, así como estructuras extracelulares (p.ej., colágeno y músculo). La hematoxilina actúa como un colorante básico. En un complejo metálico, se une a estructuras ácidas tales como los ácidos nucleicos celulares (ADN o ARN), produciendo una típica tinción púrpura azulada correspondiente a los núcleos. Además, en tejidos calcificados, forma un precipitado azul o púrpura. La eosina actúa como colorante ácido y tiñe materiales básicos en diversas tonalidades desde rojo (músculo) a rosado (colágeno). La tinción con eosina es responsable de la detección del citoplasma y de las proteínas intracelulares y extracelulares, pero no permite la identificación de estructuras o proteínas intracelulares específicas. La H&E no tiñe grasa por sí misma, pero se pueden identificar áreas grasas mediante la tinción del estroma, produciendo un dealineamiento de adipocitos. La tinción con H&E a menudo se usa para demostrar la reducción del número de núcleos después de los procesos de descelularización de tejidos, aunque la tinción con H&E también provee información estructural. La tinción con H&E revela que las fibras de colágeno Tipo 1tienen una disposición particular y un patrón ondulado dependiendo del tejido observado y de la orientación de la muestra. Los patrones alterados de las fibras de colágeno, p.ej., manchas y pérdidas de fibras, pueden sugerir una alteración de la estructura natural del tejido. Los métodos de descelularización, que pueden alterar la integridad de la estructura del tejido, pueden reducir la intensidad de la tinción del colágeno. Se tiene que tener en cuenta que la intensidad de la tinción se puede incrementar de manera artificial si permanecen en el tejido químicos cargados residuales usados en el procesamiento. La tinción con H&E puede ayudar a identificar las estructuras proteicas que no contienen colágeno. Por ejemplo, las fibras de elastina no se tiñen específicamente usando este método, pero las fibras gruesas de elastina tales como las láminas elásticas internas de las arterias se detectan fácilmente debido a sus ondulaciones profundas y a la ubicación dentro de la capa íntima mostrada por la tinción. Una matriz mineralizada (p.ej., en hueso) se observa como una tinción granular de color rojo oscuro a púrpura (dependiendo de la hematoxilina elegida) dentro del campo de fibras proteicas estructurales. La tinción con H&E es un punto de partida para un análisis histológico más detallado. La tinción diferencial del colágeno (por lo general de color azul) se logra con colorante Tricrómico de Masson, mientras que los colorantes de Verhoeff y Van Gieson y Pentacrómico de Movat resaltan la elastina (negro). Los otros componentes principales de los tejidos conectivos son los glicosaminoglicanos, y éstos se pueden detectar y, hasta cierto grado, diferenciar con diversos colorantes catiónicos tales como el azul Alcián en el colorante Pentacrómico de Movat. El análisis más detallado de la composición de los tejidos y las observaciones sobre los efectos de los métodos de descelularización requieren de sondas específicas para estructuras. A nivel de microscopía de luz, esta especificidad se provee mediante tinción inmunohistoquímica usando anticuerpos contra proteínas estructurales y componentes de la matriz extracelular especí-
USP 39
Información General/ (1285.1) Tinción con Hematoxilina y Eosina 1983
ficos, o usando sondas de lectina marcadas para detectar ciertas estructuras de azúcares. Éstas últimas son particularmente útiles para evaluar la eliminación de importantes epítopes xenoantigénicos. El propósito de este capítulo es identificar los factores que se deben controlar para optimizar la uniformidad de los resultados de la tinción de tejidos con H&E. Asimismo, el capítulo provee un procedimiento común de tinción con H&E.
PRINCIPIOS BÁSICOS La hematoxilina se oxida a hemateína, que se compleja con un catión metálico, se une a grupos cargados negativamente y tiñe sustancias basófilas tales como ácidos nucleicos. El catión más comúnmente usado para esta aplicación es el aluminio (111), aunque el hierro (111) y el tungsteno también son importantes. La hematoxilina también tiñe depósitos de calcio. El metal más comúnmente usado en la tinción con hematoxilina es el aluminio, y el colorante resultante produce un color azul. La hematoxilina en forma de sal de aluminio requiere de un pH >5 para formar un complejo de hemateína alumínica insoluble de color azul. El pH elevado se obtiene en una etapa de azulado usando una solución de álcali débil tal como hidróxido de amonio. Debido a que a menudo se usan materiales aniónicos para procesar los tejidos (p.ej., detergentes aniónicos), estos materiales deben primero eliminarse del tejido, para evitar una tinción con hematoxilina no específica. La eosina es un colorante ácido con afinidad por aminoácidos catiónicos tales como arginina y lisina en las proteínas. El citoplasma, el músculo, el tejido conectivo, los coloides, los eritrocitos y la matriz de hueso descalcificado se tiñen todos de rosado a rosado/anaranjado/rojo con eosina. Los métodos con eosina emplean soluciones que contienen diversas proporciones de agua, etanol y ácido acético. La entrada de eosina a las células se promueve usando una concentración mayor de eosina, una proporción mayor de agua que de etanol y la inclusión de ácido acético.
PROCEDIMIENTOS-CONSIDERACIONES Es importante controlar la uniformidad y calidad de los reactivos y procesos de tinción. Se debe calificar cada nuevo lote de colorantes con muestras de control conocidas para asegurar procesos uniformes de tinción. Asimismo, se debe monitorear el color de la solución, y cuando las soluciones incoloras adquieran algún color, éstas deberán ser desechadas (especialmente los alcoholes y el xileno). Las soluciones de tinción pueden envejecer y su efectividad para tinción se modifica con el paso del tiempo. Por ende, los analistas deben establecer o asignar una vida útil a los reactivos de tinción críticos. Algunos reactivos forman precipitados o experimentan cambios de color con el paso del tiempo. Las mejores prácticas indican que dichas soluciones deben reemplazarse. Es necesario seguir de cerca las fechas de caducidad marcadas de los colorantes comerciales. Cuando los reactivos se preparan en el laboratorio, los analistas deben monitorear su desempeño con el paso del tiempo usando muestras de control para evaluar la intensidad y capacidad de diferenciación de la tinción. Se deben agregar fechas de caducidad para cada reactivo del laboratorio. Las mejores prácticas requieren que, en la medida de lo posible, las muestras que se van a comparar se tiñan al mismo tiempo. Para facilitar la comparación, la tinción se debe monitorear y corregir en caso necesario. Se puede llevar a cabo una tinción regresiva cuando se presente una sobretinción con hematoxilina. En este caso, el colorante en exceso se elimina con ácido (p.ej., HCI al 0,5% en etanol al 70%) en una etapa denominada diferenciación. La tinción en exceso con hematoxilina puede bloquear la tinción con eosina. Idealmente, debería ocurrir una tinción progresiva o un monitoreo del proceso de tinción en tiempo real hasta la intensidad deseada. Al igual que con cualquier método de tinción de tejidos, la intensidad de la tinción con H&E se puede ver afectada por los pasos realizados antes del proceso de tinción, por los químicos usados y por el comportamiento del tinte mismo. El espesor del corte puede afectar la profundidad general de la muestra y puede influir sobre la tinción aparente. La eliminación inadecuada de la cera de parafina puede impedir la interacción de las soluciones acuosas de los pasos de tinción con el tejido. El color puede ser demasiado intenso si no se diluyen ciertos reactivos de hematoxilina antes de su uso, si el colorante se aplica durante un periodo demasiado largo, si el paso de diferenciación es demasiado corto o si el ácido está demasiado diluido. Una tinción débil puede ser el resultado del agotamiento de la hematoxilina, de un tiempo de tinción corto, de una excesiva etapa de diferenciación o de un pH bajo durante la etapa de azulado.
APTITUD DEL SISTEMA Se debe usar tejido de control durante cada corrida para asegurar que todos los reactivos funcionen de manera adecuada y que el régimen de procesamiento no afecte de manera adversa la tinción. El tejido fresco sin tratar equivale a un buen control positivo, debido a la ausencia de reactivos de procesamiento que pudieran afectar el proceso de tinción. Un control negativo apropiado es una muestra sin tratar de un lote previo que cumplió con todos los criterios de calidad del producto del análisis con H&E. Los controles son importantes debido a que las metodologías de procesamiento tales como descelularización o entrecruzamiento pueden afectar de manera negativa o positiva la capacidad de los reactivos para teñir el tejido según lo esperado y pueden contribuir con la variabilidad entre lotes en lo que respecta a la intensidad de la tinción.
1984 (1285. 1) Tinción con Hematoxilina y Eosina / Información General
USP 39
CUANTIFICACIÓN Se prefiere un recuento físico de células teñidas positivamente en un área determinada (células/mm2) en lugar de comparar simplemente una muestra con una referencia visual previamente utilizada, en particular para productos que se someten a un proceso de descelularización en el que se produce una gran reducción (sin llegar a cero) en el número de células teñidas positivamente. Un gran número de muestras de tejidos, aunque no todas, que han sido sometidas a un proceso de eliminación de células aún conservan residuos celulares identificables después del procesamiento. Resulta difícil comparar estas muestras cuya eliminación celular no llega a cero con una referencia visual, por lo que un recuento estandarizado por área representa una mejor comparación de la efectividad del proceso. Los sistemas automatizados de recuento celular basados en software que están disponibles en muchos sistemas de microscopía deben validarse para confirmar que el software realiza un recuento adecuado de las células y del área de la muestra. Cuando el tejido no ha sido descelularizado, debe existir un valor alto de señales positivas, y el sistema debe ser capaz de diferenciar dicho tejido de otras muestras con recuentos celulares bajos. La validación es importante cuando los analistas pretenden cuantificar el número de células en un área determinada en muestras con formas irregulares debido a que el algoritmo usado para estimar áreas puede tener limitaciones cuando se aplica a estos tipos de muestras. El área de la muestra debe medirse con exactitud cuando se presenta un recuento celular bajo, puesto que un error de gran magnitud en el denominador puede ocasionar un error importante en la densidad celular informada.
EJEMPLO DE PROTOCOLO A continuación se describe un método típico de tinción con H&E. Los analistas pueden seguir este ejemplo después de preparar y de retirar la parafina de los portaobjetos con las muestras de tejidos de acuerdo a los métodos descritos en el capítulo Preparación de Muestras Biológicas para Análisis Histológico e lnmunohistoquímico (1285). Este protocolo se usa comúnmente para estudiar la efectividad de la descelularización de tejidos. Reactivo de azulado: 3 mL de hidróxido de amonio al 28% en 1 L de Agua Purificada Método de tinción: Después de retirar la parafina de los portaobjetos que contienen los tejidos, colocar los portaobjetos en la solución de hematoxilina 1 durante 1,5-3 minutos. [NOTA-Los tiempos de tinción pueden variar dependiendo de las marcas (y tipos) de hematoxilina y de los tejidos que se van a teñir, por lo que se requiere la optimización del tiempo de tinción en esta etapa. Por esta razón, los laboratorios deben monitorear las fuentes de los reactivos para asegurar la uniformidad.] Enjuagar los portaobjetos en agua corriente durante 0,5-3 minutos. Si fuera necesario, realizar una etapa de diferenciación para eliminar el exceso de colorante de modo que el elemento o estructura deseados se conserve teñido al colocarlo en una solución aclarante 2 durante 30-60 segundos seguidos de enjuague en agua corriente durante 30-60 segundos. A continuación, colocar los portaobjetos en Reactivo de azulado durante 1-2 minutos. Sumergir los portaobjetos 12 veces en Agua Purificada. Enjuagar minuciosamente en agua corriente durante 0,5-2 minutos para eliminar el Reactivo de azulado. [NOTA-Un enjuagado insuficiente afecta la tinción subsiguiente debido a un cambio en el pH.] Posteriormente, colocar los portaobjetos en las siguientes soluciones durante los tiempos especificados: etanol al 95% durante 30 segundos a 1 minuto [NOTA-El tiempo variará dependiendo del tipo de eosina y de los componentes.] y luego colocar los portaobjetos en solución de eosina 3 durante 45 segundos a 3 minutos, etanol al 70% durante 3 minutos, etanol al 95% durante 3 minutos y finalmente etanol al 100% durante 3 minutos. [NOTA-Se debe monitorear cuidadosamente el lavado con alcohol para evitar la eliminación excesiva del colorante de eosina. La eliminación excesiva de eosina de la matriz extracelular se manifiesta como una tinción en color rosado pálido.] Colocar los portaobjetos en tres cambios de xileno fresco o sustituto de xileno durante 1-3 minutos cada uno. Colocar un par de gotas de medio de montaje sobre el portaobjetos y colocar un cubreobjetos. Resultados esperados: Los núcleos deben teñirse de color azul. El cartílago y los depósitos de calcio deben teñirse de diversos tonos de azul. El citoplasma y otros constituyentes del tejido deben teñirse de diversos tonos de rosado. Los eritrocitos y gránulos eosinofílicos se tiñen de color rosado brillante a rojo.
CONCLUSIONES El análisis y la verificación de las condiciones de tinción tienen una importancia crítica para cada nuevo tejido que se va a estudiar. La intensidad de la tinción se puede alterar en el tratamiento del tejido antes de su procesamiento. Un ejemplo notorio es el tratamiento de tejidos para descelularizarlos o modificarlos antigénicamente, debido a que estos procedimientos pueden afectar los componentes del tejido y alterar la tinción de los componentes remanentes.
1
Richard Allan Scientific #7231 o equivalente adecuado.
2 Solución aclarante (Clarifier) 2 de Richard Allan Scientific o un equivalente adecuado. 3 Richard Allan Scientific #7111 o un equivalente adecuado.
Información General/ (1601) Productos para Nebulización 1985
USP 39
(1601) PRODUCTOS PARA NEBULIZACIÓN-PRUEBAS DE CARACTERIZACIÓN Los productos usados para nebulización y destinados para liberación pulmonar se caracterizan usando las siguientes pruebas: -
Velocidad de Descarga del Fármaco y Cantidad Total Descargada de Fármaco; Evaluación Aerodinámica de Aerosoles Nebulizados.
Estas pruebas estandarizan el método de evaluación de la dosis que se administra a un paciente pero no están destinadas a la evaluación del dispositivo nebulizador. 1 Para evaluar el desempeño del producto, la masa es más adecuada que la distribución de tamaño ponderado por número. La masa del fármaco como función del diámetro aerodinámico es un mejor indicio del efecto terapéutico dentro del tracto respiratorio.
VELOCIDAD DE DESCARGA DEL FÁRMACO V CANTIDAD TOTAL DESCARGADA DE FÁRMACO Estas pruebas se llevan a cabo para evaluar la velocidad de descarga y la cantidad total de fármaco administrado en el paciente usando condiciones estandarizadas de velocidad de flujo volumétrico. Los nebulizadores potenciados por la respiración y los nebulizadores accionados por la respiración deben ser evaluados mediante un simulador de respiración debido a que los resultados de estos tipos de dispositivos dependen en gran medida de la velocidad de flujo de inhalación. La metodología siguiente describe el uso de un patrón de respiración estándar definido para adultos. Cuando se indica que un producto para nebulización es únicamente para uso pediátrico, es decir, para su uso en recién nacidos, infantes o niños, deben usarse patrones de respiración pediátricos. 2 Para proporcionar una medida más apropiada de la masa de fármaco que se administraría a los pacientes se usan patrones de respiración en lugar de velocidades de flujo continuo. La velocidad de descarga del fármaco y la cantidad total descargada son cualidades apropiadas debido a que permiten caracterizar de una manera estándar a la masa de fármaco administrado, independientemente del nebulizador usado. Por tanto, la metodología de prueba descrita a continuación (a) mide la masa de fármaco descargada en el primer periodo (típicamente de 1 minuto) y, por consiguiente, proporciona una evaluación de la velocidad de descarga del fármaco y (b) captura la masa total descargada de fármaco.
Aparato SIMULADOR DE RESPIRACIÓN Se usa para la prueba un simulador de respiración que esté disponible comercialmente y sea capaz de generar los perfiles de respiración especificados en la Tabla 7. Se usa el perfil de respiración indicado para adultos a menos que el producto medicinal esté destinado específicamente para uso pediátrico, en cuyo caso se deben usar patrones alternativos, según se indican en la Tabla 7. Tabla 1. Especificación para el Simulador de Respiración Ítem
Volumen total Frecuencia Forma de onda Relación inhalación:exhalación
Especificación Adultos
Recién nacidos
500 ml
25 ml
Infantes 50 ml
155 ml
15 ciclos/min
40 ciclos/min
30 ciclos/min
25 ciclos/min
sinusoidal
sinusoidal
sinusoidal
sinusoidal
1:1
1 :3
1 :3
1:2
Niños
SISTEMA DE FILTRACIÓN Utilizar para la prueba un filtro de baja resistencia adecuadamente validado, capaz de recolectar cuantitativamente el aerosol y que permita la recuperación del fármaco con un disolvente apropiado. El volumen muerto de la carcasa del filtro no excede de 10% del volumen corriente (tidal) usado en la simulación de la respiración.
1 Norma Europea 1 3544-1 :2001. Respiratory Therapy Equipment. Parte 1: Sistema de nebulización y sus componentes. European Committee tor Standardization (Comité Europeo de Normalización). Bruselas, Bélgica. 2001 2 Los patrones respiratorios adecuados para uso pediátrico se pueden encontrar, por ejemplo, en la Norma Canadiense CAN/CSA/Z264. l-02:2002, Spacers and Holding Chambers far Use with Metered Dose lnhalers. Canadian Standards Association (Asociación Canadiense de Normas), Mississauga, Canadá 2002.
1986 (1601) Productos para Nebulización / Información General
USP 39
Procedimiento Acoplar el filtro (contenido en el portafiltro) (A) al simulador de respiración (B) de acuerdo con la Figura 7. Llenar el nebulizador (C) con el volumen de medicamento especificado en las instrucciones para el paciente. Acoplar la boquilla del nebulizador al filtro de inhalación usando un adaptador de boquilla, si fuera necesario, asegurándose de que las conexiones sean herméticas. Colocar el nebulizador en la misma orientación indicada para su uso. Puede ser necesario inclinar el simulador de respiración y el portafiltro. Ajustar el simulador de respiración para generar el patrón de respiración especificado.
e A
A. Filtro de inhalación y portafiltro
B
B. Simulador de respiración
C. Nebulizador
Figura 1. Configuración Experimental para la Prueba con el Simulador de Respiración. Poner en marcha el simulador de respiración y, al inicio de un ciclo de inhalación, poner en marcha el nebulizador. Operar el nebulizador durante un periodo inicial definido. La duración del intervalo de tiempo asegura el depósito en el filtro de inhalación de una cantidad suficiente de fármaco para el análisis cuantitativo. Un tiempo de 60 ± 1 segundos generalmente permite determinar en forma directa la velocidad de descarga del fármaco. El tiempo seleccionado, por lo general 60 ± 1 segundo, debe permitir el depósito de suficiente fármaco en el filtro de inhalación para poder realizar el análisis cuantitativo. Si la cantidad de fármaco depositado en el filtro de inhalación en 60 segundos es insuficiente para este análisis, se puede incrementar la duración del intervalo de tiempo para la recolección de aerosol. Este tiempo puede reducirse en caso de que el filtro se impregne con el producto. Una vez concluido este periodo inicial, parar el nebulizador. Colocar un filtro nuevo y el portafiltro en su lugar y continuar hasta que cese la nebulización. Interrumpir la nebulización y cambiar filtros, si fuera necesario, para evitar que el filtro se sature.
Resultados Determinar la masa de fármaco recolectada en los filtros y en portafiltros durante cada intervalo de tiempo usando un método de análisis adecuado. Determinar la velocidad de descarga del fármaco dividiendo la masa de fármaco recolectada en el primer filtro de inhalación por el intervalo de tiempo usado para la recolección. Determinar la masa total descargada de fármaco sumando las masas de fármaco recolectadas en todos los filtros de inhalación.
EVALUACIÓN AERODINÁMICA DE AEROSOLES NEBULIZADOS Resulta necesario caracterizar por tamaño los productos nebulizados a velocidades de flujo menores a las del intervalo típicamente usado para los inhaladores de polvos y de dosis fija. La norma del CEN recomienda una velocidad de flujo de 15 L/min debido a que este valor representa una buena aproximación a la velocidad de flujo de inhalación media que puede conseguir un adulto saludable respirando a un volumen corriente de 500 ml. Aunque los instrumentos de dispersión de luz láser de ángulo bajo (difractómetros láser) pueden proveer mediciones rápidas de la distribución del tamaño de aerosoles generados con nebulizadores, estas técnicas no detectan el fármaco, sino que miden la distribución del tamaño de las gotitas independientemente de su contenido. Esto puede no representar ningún problema con soluciones homogéneas, pero puede arrojar errores significativos si el producto que se va a nebulizar es una suspensión o si la evaporación de gotitas es significativa, como puede suceder con ciertos tipos de nebulizadores. Los impactadores en cascada permiten caracterizar el aerosol inequívocamente en términos de la masa de fármaco en función del diámetro aerodinámico. Es posible utilizar la difracción láser siempre que se valide contra un método de impacto en cascada. El aparato 5 (ver el capítulo de información general Aerosoles, Atomizadores Nasales, Inhaladores de Dosis Fija e Inhaladores de Polvo Seco (601 )), un impactador en cascada, ha sido calibrado a 15 L/min específicamente para cumplir con la recomendación de la Norma del CEN y, por lo tanto, se usa para esta prueba. 3 Determinar el balance de masa de la misma manera que para inhaladores de polvo e inhaladores de dosis fija no es una labor sencilla debido a que la dosis se captura como una emisión continua y, por consiguiente, no está incluida. Se deben llevar a cabo experimentos de recuperación como parte del desarrollo y la validación del método. Controlar la evaporación de gotitas producidas por los nebulizadores puede ser crítico para evitar el sesgo en el proceso de evaluación del tamaño de las gotitas. La evaporación se puede minimizar enfriando el impacta-
3 Marple VA, Olson BA, Santhanakrishnan K, et al. Next generation pharmaceutical impactor: A new impactor for pharmaceutical inhaler testing. Part 111: Extension of archiva! calibration to 15 L/min. j Aerosol Med 2004; 17(4):335-343.
USP 39
Información General/ (1601) Productos para Nebulización 1987
dora una temperatura de aproximadamente 5º, lo cual se logra regularmente enfriando el impactador en un refrigerador durante aproximadamente 90 minutos. Por lo general se debe limpiar completamente el aparato, por lo menos después de cada día de uso, incluyendo los pasajes interestacionales, debido al gran riesgo de corrosión provocada por la condensación/acumulación de gotitas de solución salina en la estructura metálica interestacional asociadas con el enfriamiento del impactador. Todas las superficies del aparato deben secarse después de cada prueba usando, por ejemplo, aire comprimido. [NOTA-El colector con microorificios (MOC, por sus siglas en inglés) no debe secarse con aire comprimido.]
Aparatos El capítulo (601) contiene una descripción detallada del Aparato 5 y del tubo de admisión e incluye detalles sobre dimensiones críticas y del proceso de calificación del impactador (medición de estación). Además del MOC, se debe usar un filtro terminal para asegurar la recuperación cuantitativa del fármaco a partir del aerosol nebulizado a la velocidad de flujo especificada de 15 L/min. El filtro se coloca debajo del MOC (opción de filtro interno) o se usa un filtro en portafiltro externo al impactador para capturar cualquier gotita fina que supere la última estación de fraccionamiento por tamaño. En el análisis de aerosoles generados por nebulizadores no se usa un preseparador.
Validación del Método SOBRECARGA DE LAS ESTACIONES DEL IMPACTADOR Durante el desarrollo y la validación del método, se debe confirmar que el volumen de líquido muestreado del nebulizador no sobrecargue el impactador. La inspección visual de las superficies de recolección en las estaciones que recolectan la mayor parte de las gotitas puede evidenciar la presencia de estrías si ha ocurrido una sobrecarga. Resulta común que este fenómeno se asocie también con un incremento en la masa del fármaco recolectada en la estación final y en el filtro terminal. Reducir el periodo de muestreo (T0 ) es la manera más efectiva de evitar la sobrecarga de cualquier sistema, balanceando la sobrecarga con sensibilidad analítica. REINGRESO POR ARRASTRE El rebote de las gotitas y el reingreso por arrastre de las mismas son menos probables con las gotitas producidas por nebulizadores que con las partículas sólidas de inhaladores, por lo que normalmente no sería necesario el recubrimiento de las superficies de recolección de partículas.
Procedimiento Enfriar el impactador ya acoplado y el tubo de admisión en un refrigerador (ajustado a aproximadamente 5º) durante no menos de 90 minutos e iniciar la determinación dentro de los 5 minutos posteriores al retiro del impactador del refrigerador. Asimismo, se pueden emplear otros métodos que mantengan el impactador a una temperatura constante (p.ej., el uso de un gabinete de enfriamiento) siempre que estén validados. Conectar el nebulizador al suministro de gas impulsor (por lo regular aire u oxígeno) o usar un compresor a la presión y velocidad de flujo especificadas por el fabricante del nebulizador. Asegurarse de que la línea de suministro de gas no se desprenda del nebulizador cuando esté bajo presión. Llenar el nebulizador con el volumen del producto medicinal según se especifica en las instrucciones para el paciente. Retirar el impactador del refrigerador. Acoplar el tubo de admisión al impactador y conectar la salida del impactador/filtro externo a una fuente de vacío capaz de extraer el aire a través del sistema a 15 L/min, según se especifica en la Figura 2. Iniciar el flujo a través del impactador.
nebulizador
aparato 5
t
fuente de vacio
control Figura 2. Aparato 5 para Medir la Distribución del Tamaño de Productos para Nebulización.
1988 (1601) Productos para Nebulización / Información General
USP 39
Conectar un medidor de flujo, calibrado para el flujo volumétrico que abandona el medidor, al tubo de admisión. Ajustar la válvula de control de flujo que se localiza entre el impactador y la fuente de vacío hasta lograr un flujo estable a través del sistema de 15 L/min (±5%). Retirar el medidor de flujo. Colocar el nebulizador en la misma orientación que la indicada para su uso, luego acoplar la boquilla del nebulizador al tubo de admisión, usando un adaptador de boquilla si fuera necesario. Poner en marcha el flujo/compresor del nebulizador. Muestrear durante un tiempo predeterminado (T0 ). Una vez determinado, este tiempo (T0 ) deberá ser definido y usado en el método analítico para un medicamento en particular a fin de asegurar que los datos de fraccionamiento de masa puedan ser comparados. Al final del periodo de muestreo, parar el flujo de gas impulsor/compresor del nebulizador, retirar el nebulizador del tubo de admisión, y parar el flujo de la fuente de vacío hacia el impactador. Desarmar el impactador y, usando un método de análisis adecuado, determinar la masa de fármaco recolectada en el tubo de admisión en cada estación y en el filtro terminal según se describe para el Aparato 5 (ver el capítulo (601 )). Sumar la masa de fármaco recolectada en el MOC a la depositada en el filtro terminal/filtro externo y tratarla como una sola muestra para los propósitos de los cálculos subsiguientes. Calcular la masa de partículas finas del fármaco basándose en el tiempo predeterminado (T0 ). Calcular la fracción de masa (F m,comp) de fármaco depositada en cada componente del impactador, comenzando con el tubo de admisión y procediendo en orden por todo el impactador, usando la siguiente expresión: Fm,comp = mcomp/M mcomp = masa asociada con el componente en evaluación; M = masa total recolectada por el sistema. Presentar cada Fm,comp en el orden de ubicación dentro del equipo de medición, comenzando por el tubo de admisión y finalizando con el filtro terminal del impactador (ver la Figura 3). Los valores de Fm,comp para estaciones adyacentes del impactador se pueden combinar a fin de informar la fracción de masa recolectada en un grupo de estaciones como un sólo valor. 0.4 . . . - - - - - - - - - - - - - - - -
0.3
0.1
o.o e
cu •O "tJ ·¡;;
o·-
..o
E
1-
<
:>"'C
N
e
•O
'ü
~
w
e
-o
'ü
~
w
"'e
... "' e e
IO
e
. .. . .
•O
'ü t; w
•O
'ü t; w
•O
'ü t; w
•O
'ü t; w
"e
•O
'ü
~
w
u
o
i
¡¡::
Figura 3. Ejemplo de Fracción de Masa de Gotitas Presentado en Términos de su Ubicación dentro del Sistema de Muestreo. Determinar la distribución acumulativa de tamaño de partículas ponderada por masa del aerosol fraccionado por tamaño por el impactador de acuerdo con el procedimiento provisto en el capítulo (601 ). Comenzando por el filtro, obtener la masa acumulativa en función del diámetro límite efectivo de las estaciones respectivas (ver la Tabla 2 para los diámetros límite apropiados a 15 L/min). Graficar la fracción acumulativa de fármaco en función del diámetro límite en un formato adecuado, p.ej., formato logarítmico o de probabilidad logarítmica. Cuando corresponda, usar esta gráfica para determinar por interpolación la fracción, ya sea menor que un tamaño dado o entre un límite de tamaño superior e inferior. Tabla 2. Tamaños Límite para el Aparato 5 a 15 L/min Estación
Diámetro Límite (µm)
1
14, 1
2
8,61
3
5,39
4
3,30
5
2,08
6
1,36
7
0,98
Si fuera necesario y según corresponda, usar esta gráfica para determinar los valores para la mediana del diámetro aerodinámico de la masa (MMAD, por sus siglas en inglés) y la desviación estándar geométrica (GSD, por sus siglas en inglés).
USP 39
Información General/ (1644) Teoría y Práctica de Mediciones 1989
(1644) TEORÍA Y PRÁCTICA DE MEDICIONES DE CONDUCTIVIDAD ELÉCTRICA DE SOLUCIONES Este capítulo general proporciona información que sirve de sustento para los métodos instrumentales de los procedimientos que miden la conductividad eléctrica. Las aplicaciones farmacéuticas incluyen: dosificación química, limpieza en el sitio (proceso cip), control de la fermentación, verificación de las mezclas de líquidos, entre otros. Aunque el capítulo general se enfoca en sistemas acuosos, las mediciones de conductividad se pueden extender a fluidos orgánicos. Este capítulo general también se enfoca en las mediciones de conductividad de contacto y no abarca aplicaciones que pudieran emplear conductividad inductiva sin contacto. El presente capítulo general ofrece una introducción y, posteriormente, abarca los siguientes temas principales: teoría de operación, consideraciones operativas, calibración y operación para procedimientos de medición en corriente lateral, en línea y fuera de línea.
INTRODUCCIÓN La conductividad es la medición de la capacidad de un fluido para conducir electricidad mediante iones químicos. La capacidad de cualquier ión para conducir electricidad está directamente relacionada con su movilidad. Algunas de las aplicaciones comunes de las mediciones de conductividad incluyen el tratamiento y purificación de aguas, el manejo de fluidos en procesos de limpieza en el sitio, el monitoreo de procesos de fermentación, aplicaciones de dosificación, preparación de medios de nutrientes, producción de soluciones amortiguadoras (p.ej., distribución y dilución para aplicaciones de diálisis y cromatográficas), detección cromatográfica de gradientes y eluyentes, síntesis química de ingredientes farmacéuticos activos y determinación de la concentración de productos químicos básicos. Los fluidos deben medirse en una sola fase homogénea-es decir, la conductividad no debe aplicarse a fluidos inmiscibles excepto que estén separados. Las mediciones de conductividad eléctrica no se pueden aplicar a sólidos o gases, pero sí a los condensados de gases. Además de su uso para monitorear concentraciones iónicas de fluidos en proceso, la conductividad también es útil para detectar impurezas iónicas en aguas farmacopeicas (ver Conductividad del Agua (645)) y para la detección de impurezas iónicas en matrices orgánicas. La medición no es específica para iones aunque todos los iones responden con diferente eficiencia o conductancia específica, /.... A pesar de la falta de especificidad iónica, la conductividad es una herramienta valiosa de laboratorio y del proceso para medir y controlar el contenido iónico total puesto que es proporcional a la suma de la concentración de cada especie iónica (aniones y cationes) según se describe en la Ecuación 1: Todos /os iones
t<
= 1000,Lc).,¡ i
donde K es la conductividad {S/cm), C; es la concentración del ión químico i (mol/L) y 'A; es la conductancia específica del ión i (S · cm 2/mol). Aunque S/m es la unidad SI apropiada para conductividad (es decir, las unidades SI de base son el amperio y el metro), históricamente, se han seleccionado las unidades de S/cm como la unidad de expresión aceptada. En concentraciones iónicas bajas (por lo general <1 Q-3 mol/L), la relación conductividad-concentración es lineal y válida puesto que /... es una constante para cada ión. Sin embargo, existen tres excepciones a esta regla estricta de linealidad y proporcionalidad: Primero, en concentraciones más altas (aproximadamente 10-3 a 1 mol/L), surgen pequeñas desviaciones negativas de la linealidad (menos de 5% por cada 1O unidades) debido a la reducción de /... para cada ión, y estas desviaciones negativas varían de ión a ión. Segundo, en concentraciones más altas para ácidos y bases débiles, el grado de disociación en iones se reduce dependiendo de sus constantes de disociación. A medida que se incrementa la concentración de un ácido/ base débil, la concentración de cationes/aniones conjugada se incrementa como la raíz cuadrada de la concentración de ácido/base. En la tercera excepción, en altas concentraciones (>20%) de algunos ácidos fuertes tales como HN0 3 y H2S0 4, las desviaciones negativas persisten y, en algunos casos, la conductividad se reduce con el aumento de la concentración. La conductividad de sistemas ácidos de alta concentración está bien documentada. Otra variable que influencia las mediciones de conductividad es la temperatura del fluído. Una expresión más estricta de la Ecuación 1 se muestra a continuación como Ecuación 2: Todos los iones
IC(T} = 1000
L C¡ (T)A,¡ (T) i
donde la medición de condutividad, las concentraciones iónicas y las conductancias iónicas específicas dependen de la temperatura (7). A medida que se incrementa la temperatura del fluido, los iones se hacen conductores eléctricos más eficientes, lo que hace de este fenómeno fisicoquímico la razón predominante para el requisito de compensación de la temperatura cuando se analizan fluidos conductivos. La conductancia específica del ión aumenta en todos los iones con el aumento de la tempera-
1990 (1644) Teoría y Práctica de Mediciones / Información General
USP 39
tura. Asimismo, la concentración de iones puede cambiar como función de la temperatura. Por ejemplo, la constante de autodisociación del agua, Kw, incrementa con la temperatura de Oº a 100º, lo que resulta en un aumento en la producción de H+ y OH-. En un sentido estricto, resulta complicado compensar perfectamente la medición de conductividad con respecto a una temperatura de referencia a menos que se conozcan bien las especies iónicas. En muchas aplicaciones, las especies iónicas son bien conocidas y, para casi todos los demás casos, algunas suposiciones simples reducen la complejidad de dicha cuestión. La compensación por temperatura se analiza más adelante, en mayor detalle, en la sección Compensación por Temperatura.
TEORÍA DE LA OPERACIÓN Método de Medición por Corriente Alterna La conductividad se mide aplicando un voltaje (o corriente) entre dos electrodos conductores y midiendo la resistencia del fluido mediante la ley de Ohm. Son varios los métodos que se emplean para aplicar el voltaje/corriente, aunque todos tienen la propiedad de usar un voltaje/corriente alterna (AC, por sus siglas en inglés) para minimizar la polarización (o recolección de iones) en los electrodos o cualquier reacción electrolítica. Si se emplea un voltaje/corriente directa (DC, por sus siglas en inglés), el electrodo negativo atraerá los iones positivos, mientras que el electrodo positivo atraerá los iones negativos. La recolección de iones en el electrodo impide el flujo de corriente y afecta de manera negativa la exactitud y estabilidad de la medición de conductividad. La frecuencia de medición de la señal de corriente alterna depende de la tecnología y puede variar desde un valor tan bajo como 30 Hz para fluidos de baja conductividad hasta 4 kHz para fluidos de alta conductividad. Las frecuencias específicas no son importantes para la operación del sistema debido a que la frecuencia de accionamiento está incorporada en los sistemas de medición del instrumento y está íntegramente vinculada con la tecnología de medición del proveedor. Este capítulo no pretende evaluar las diversas tecnologías de medición debido a que, por lo regular, se trata de sistemas controlados por microprocesadores y de patente. La técnica de medición de corriente alterna con dos electrodos es válida para su uso con todas las concentraciones de especies iónicas que van desde ácidos y bases (alta conductividad) hasta Agua para Inyección y Agua Purificada (baja conductividad) e incluso hasta productos orgánicos débilmente iónicos tales como alcoholes y glicoles. La medición puede ser sensible a concentraciones iónicas tan bajas como 0,05 µg/L. Para altas concentraciones iónicas, los analistas pueden usar un método alternativo de medición con 4 electrodos en el que la corriente se aplica entre dos de los electrodos y el voltaje se mide entre los otros dos electrodos. Los iones se trasladan hacia los electrodos con corriente, mientras que los electrodos con voltaje realizan la medición con efectos de polarización limitados.
Unidades de Expresión No existen diferencias entre la medición física de la conductividad y de la resistividad-son mediciones inversamente multiplicativas entre sí. Por lo tanto, si se conoce una medición, entonces será fácil calcular el otro valor tomando el recíproco del valor numérico y las unidades. Tampoco existen diferencias en lo que respecta a los instrumentos ni a los sensores. La única diferencia es cómo se informa o presenta el valor medido de forma conveniente para el analista. Por ejemplo, 18,2 Mn ·cm = 0,0550 µS/cm y 5,23 kn ·cm = 0, 191 mS/cm = 191 µS/cm. Aunque las unidades apropiadas del SI son n · m o S/m, las unidades que regularmente se usan son n ·cm o S/cm. La Figura 7 presenta las relaciones entre conductividad, resistividad y algunos ejemplos de fluidos de proceso con varios grados de pureza. La conductividad de los fluidos en sistemas farmacéuticos varía en aproximadamente 8 órdenes de magnitud. En los sistemas de agua de alta pureza, la cantidad de iones presentes en el Agua Purificada o en el Agua para Inyección es muy baja, lo que resulta en una conductividad menor de 5 µS/cm y que, a menudo, es cercana a 0,055 µS/cm o menos. [NOTA-La conductividad de las aguas más puras a temperaturas inferiores a 25º es menos de 0,055 µS/cm.] La conductividad de las aguas potables puede variar de 30 a 2000 µS/cm. En las separaciones cromatográficas, la conductividad del eluyente puede variar de 0, 1 a 100 mS/cm. Para ácidos concentrados calientes, la conductividad puede ser tan alta como 1 S/cm.
Información General/ (1644) Teoría y Práctica de Mediciones 1991
USP 39
Conductividad (µS/cm) 0.01 Resistividad
100M
0.1
1
10
100
1k
10k
100k
10M
1M
100k 1
10k
1k
100
10
1
1
1
1
1
1
(Qcm)
1000k
Agua pura Fria
Caliente
1
Agua para inyección/purificada/destilada/depurada 1
1
Agua ultrapura expuesta al aire
Intervalos de aplicación
gua potable Agua residual Agua de mar/salobre -
Concentración lónica (como ppm NaCI)
1
1
Ácidos/bases para regeneración - - - -
0,021
4,6
0,44
46
1
1
500
5,5k
Figura 1. Relaciones entre conductividad, resistividad y algunos ejemplos de fluidos de proceso con varios grados de pureza.
Determinación de la Constante de Celda El propósito de la constante de celda del sensor es normalizar la medición de conductancia/resistencia para la construcción geométrica de los dos electrodos. Cuando se colocan dos electrodos en un fluido conductor y se les aplica un voltaje, existe una conductancia (resistencia) entre los electrodos. Si los electrodos se colocan separados, la conductancia se reduce (aumenta la resistencia). Si el área de los electrodos se incrementa, entonces la conductancia aumenta (se reduce la resistencia). En ambos casos, las concentraciones iónicas entre los electrodos no cambia, pero la construcción geométrica del sensor (constante de celda) altera la conductancia medida (resistencia). La conductividad de una solución (K, S/cm) se relaciona con la conductancia, G (siemens) de acuerdo con la Ecuación 3:
K=Gx(%J=Gxe donde A es el área de los electrodos conductores (cm 2) y des la distancia entre los electrodos (cm). La otra unidad de expresión común es el concepto recíproco de conductividad, la resistividad, p (n ·cm), según se describe en la Ecuación 4:
1 1 R p=-=--=Gxe e 1(
donde Res la resistencia del fluido entre los electrodos (1 n = 1 S- 1). La relación geométrica, d/A (o 8), también se conoce como la constante de celda (cm-1) del sensor. La determinación de la constante de celda a través de la medición directa de d y A resulta poco práctica debido a las variaciones en las configuraciones geométricas y a la falta de uniformidad del campo eléctrico entre los electrodos. Prácticamente, la constante de celda se determina a través de la medición de soluciones acuosas con conductividad conocida. Ver Calibración más adelante.
Compensación de Temperatura La compensación de temperatura es un requisito típico para la mayoría de las mediciones de conductividad, aunque existen excepciones tales como las contenidas en el capítulo general Conductividad del Agua (645). Tal como se indicó anteriormente, la conductividad de un fluido se relaciona con su temperatura. A medida que aumenta la temperatura, los iones presentan una mayor movilidad y la conductividad se incrementa. El efecto de la temperatura depende del tipo y la concentración del ión, pero para la mayoría de las soluciones> 1 O µS/cm el impacto de la temperatura está dentro del intervalo de 1,9%/° a 2,2%/°. Para ácidos fuertes, esto puede ser tan bajo como 1,5%/°. Para aguas farmacopeicas de alta pureza, el coeficiente de temperatura varía de 2,0%/° a 7,5%/°, dependiendo de la temperatura y la pureza del agua. Para cada caso descrito en este capítulo, es necesario contar con algo de conocimiento sobre el tipo de impureza para asegurar una compensación de temperatura adecuada. Si la función de conductividad vs. temperatura es lineal y el coeficiente de temperatura es constante, la ecuación que relaciona la conductividad compensada con la conductividad no compensada por temperatura se describe en la Ecuación 5: =
K 25
Kr
[1+a(T -25)]
1992 (1644) Teoría y Práctica de Mediciones/ Información General
USP 39
en donde Tes la temperatura medida, K25 es la conductividad compensada a 25º, Kr es la conductividad a la temperatura Ty a es 0,02 para un coeficiente de temperatura de 2%/°. La mayoría de los sistemas de medición de conductividad miden la conductividad/resistividad no compensadas y la temperatura, mientras que la conductividad compensada por temperatura se determina mediante algoritmos matemáticos (p.ej., aplicando la Ecuación 5) en el microprocesador del transmisor. Dependiendo de la aplicación y del conocimiento sobre el contenido del fluido, se puede contar con diversos algoritmos de compensación. Para la mayoría de las aplicaciones de control de procesos, se recomienda la compensación de temperatura debido a que cuando la conductividad no compensada cambia, resulta poco práctico distinguir si este cambio fue ocasionado por fluctuaciones en la temperatura o por un cambio en el contenido iónico. La compensación de temperatura permite al analista distinguir entre cambios en la temperatura y el contenido iónico. La compensación a una temperatura de referencia de 25º es una práctica estándar, aunque algunos métodos especifican compensar la temperatura a 20º. La mayoría de los sensores de conductividad cuentan con dispositivos de temperatura tales como un RTD (dispositivo de resistencia de temperatura) de platino o un termistor NTC (coeficiente negativo de temperatura) instalado dentro del sensor, aunque también es posible realizar una medición externa de la temperatura.
CONSIDERACIONES OPERATIVAS Componentes del Sistema Los componentes usuales de un sistema de medición de conductividad son el sensor, el transmisor y el cable que conecta el sensor con el transmisor. El sensor es el dispositivo que está en contacto directo con el fluido y que consta de electrodos, generalmente de un dispositivo de temperatura instalado y de una conexión de proceso (p.ej., de triple abrazadera si el sensor está destinado para aplicaciones sanitarias durante el proceso). Los sensores, por lo regular, son dispositivos electromecánicos pasivos y no contienen circuitos de medición.El transmisor es el dispositivo que mide la resistencia entre los electrodos del sensor, mide la resistencia del dispositivo de medición de temperatura, convierte la medición de resistencia en conductividad (o resistividad) y realiza correcciones de temperatura para compensar la señal a una temperatura de referencia. El cable conecta el sensor al transmisor. En los sistemas de control o monitoreo de procesos, el cable permite acoplar el sensor a un tanque o tubo de proceso y el transmisor puede ubicarse en un panel de control o, si fuera necesario, en una ubicación remota. La distancia entre el sensor y el transmisor puede afectar la exactitud de la medición ocasionada debido a la resistencia agregada del cable y a la susceptibilidad del cable al ruido externo. Por lo tanto, se debe tomar en cuenta dicha distancia durante la selección del sistema de medición. En algunos sistemas de medición de conductividad, los circuitos de medición están directamente acoplados al sensor de conductividad, lo que permite transferir digitalmente los resultados de la medición a una pantalla remota a mayores distancias que con los sistemas de medición tradicionales con transmisión alámbrica de señales análogas.
Materiales de Construcción Los materiales de construcción del sensor representan un aspecto crítico cuando el sensor pudiera entrar en contacto directo o indirecto con el producto. Para casi todas las demás aplicaciones del laboratorio, los materiales de construcción resultan menos críticos. Todos los sensores contienen electrodos de medición y un material aislante entre los electrodos. Técnicamente, los únicos requisitos son que los electrodos conduzcan electricidad y que sean capaces de soportar el ambiente físico y químico. Los electrodos pueden estar fabricados de acero inoxidable de varios grados, titanio, grafito y muchos otros metales. Los materiales aislantes deben aislar los electrodos entre sí, de modo que solamente se mida la conductividad del fluido. A menudo, los materiales aislantes se fabrican con polímeros, resina epoxi o cerámica inertes. Si el sensor se conecta directamente a un vaso de proceso o al sistema de tubos, entonces los materiales de construcción del sensor deberán cumplir con los requisitos térmicos e hidráulicos (presión) del sistema de proceso. El sensor debe contar con una conexión de proceso adecuada al vaso/tubos. Dependiendo de la aplicación, también es posible que el sensor deba cumplir con requisitos de compatibilidad biológica, de material o de diseño higiénico. El sensor no debe degradarse durante su instalación y operación. El sensor debe ser capaz de soportar cualquier otro proceso incluido en el sistema, como por ejemplo, procesos de limpieza o de vapor en el sitio. De lo contrario, es posible que los analistas tengan que eliminar el sensor del proceso. Cuando la inmersión del sensor en el fluido de proceso represente un riesgo para el proceso, el sensor deberá instalarse en un receptáculo que se colocará en una corriente lateral. De esta forma, una fracción del fluido de proceso fluirá hacia el receptáculo que contiene el sensor y luego se lo drena, permitiendo así una medición indirecta del fluido de proceso sin dañar el proceso o el producto. Cuando la medición de conductividad se realiza fuera de línea, p.ej., en un ambiente de laboratorio, las consideraciones operativas se reducen porque se eliminan o reducen las cuestiones térmicas, hidráulicas o de contacto con el producto.
CALIBRACIÓN El proceso para calibrar un sistema completo de medición de conductividad generalmente consta de tres partes. Primero, se calibran los circuitos electrónicos del transmisor. Segundo, se calibra el dispositivo sensor de temperatura. Tercero, se determi-
USP 39
Información General/ (1644) Teoría y Práctica de Mediciones 1993
na la constante de celda del sensor de conductividad. En cada caso, puede ser necesario realizar una verificación antes de calibrar para determinar la necesidad de ajustes. Para la mayoría de los instrumentos controlados por microprocesador, no existe un ajuste mecánico o electrónico formal de estos subsistemas, en cambio estos ajustes a menudo se realizan en las calibraciones controladas por software que son computadas automáticamente por el transmisor. Se debe usar un transmisor calibrado para calibrar el sensor de temperatura y la constante de celda. El transmisor que se usa para calibrar el sensor de temperatura y la constante de celda puede ser el transmisor empleado durante la operación normal o se puede usar otro transmisor en su lugar. Debido a las diferencias de compatibilidad electrónica y de cableado entre los fabricantes, podría ser necesario utilizar el mismo tipo de transmisor. Al igual que para todos los métodos basados en instrumentos, la frecuencia de calibración depende de muchos factores. Dependiendo del tipo de sensor y transmisor de conductividad, los ciclos de calibración pueden ser semanales o anuales, basándose en las recomendaciones del fabricante, en el desempeño histórico del instrumento, en los requisitos internos y en la importancia de la aplicación. En el caso de instrumentos de proceso robustos, los ciclos de calibración típicos para los componentes electrónicos y el sensor se llevan a cabo aproximadamente cada 12 meses. Cuando la constante de celda del sensor se ve alterada por el fluido o por las condiciones del proceso, puede ser necesario llevar a cabo la calibración con mayor frecuencia.
Calibración del Instrumento Los circuitos electrónicos del transmisor se calibran desconectando el sensor del transmisor, conectando resistores de precisión (resistores de utilidad demostrada) al transmisor y comparando el valor de resistencia rastreable con el valor de resistencia medido. Los valores de resistencia deben ser rastreables a una autoridad nacional competente. Los valores de resistencia deben seleccionarse de tal modo que se encuentren dentro del intervalo de (1) la capacidad de medición del transmisor y de (2) la resistencia que se medirá durante la operación. El transmisor puede tener múltiples circuitos internos, por lo que es necesario verificar el circuito adecuado (o todos los circuitos) y el intervalo de medición. La comparación de la resistencia medida con la resistencia real verifica si el transmisor está calibrado adecuadamente. La diferencia resultante debe estar dentro de un x1% predeterminado de la resistencia real, donde x1 indica el desempeño de los componentes electrónicos del circuito de conductividad deseado. El desempeño de los componentes electrónicos del circuito de conductividad típico está dentro del intervalo de 2% o menos del valor a medir. De lo contrario, se recomienda ajustar el circuito de medición de resistencia. Un ejemplo del proceso de calibración de los componentes electrónicos de medición del transmisor es el siguiente: un intervalo operativo típico para un proceso de limpieza en el sitio puede ser de 50 a 75 mS/cm. En este ejemplo, se usa un sensor con una constante de celda de 5,0 cm-1 • Basándose en la Ecuación 4, esto requiere una resistencia de medida de 67 a 100 Q. Para verificar el circuito de medición de conductividad durante la calibración, los analistas deben usar un resistor con un valor rastreable o cercano a este intervalo. Cuando se utilizan aguas farmacopeicas, las mediciones típicas están dentro del intervalo de 1 a 20 MQ · cm y se emplean sensores con una constante de celda de O, 1 cm-1 • Esto calcula una resistencia de O, 1 a 2 MQ. Se deben usar resistores con un valor rastreable en este intervalo. Si los valores registrados se encuentran dentro del intervalo de los criterios de aceptación preestablecidos (x 1%), entonces no será necesario el ajuste.
Medición de Temperatura y Calibración del Sensor Cuando el circuito de medición de temperatura está integrado en el transmisor y se usa como parte del sistema de medición, entonces será necesaria su verificación y/o calibración. Dependiendo del tipo de dispositivo de temperatura en el sensor, se debe hacer ingresar una fuente de señal apropiada en el transmisor (p.ej., resistencia). La comparación de la temperatura medida con la temperatura simulada verifica si el circuito de medición de temperatura está calibrado adecuadamente. La diferencia resultante debe estar dentro de x/ de la temperatura simulada, donde x2 indica el desempeño de los componentes electrónicos del circuito de temperatura deseado. El desempeño de los componentes electrónicos del circuito de temperatura típico, por lo general, está dentro del intervalo de ±1º o menos. Si la diferencia cumple con los criterios de aceptación preestablecidos, entonces no se requieren acciones adicionales. De lo contrario, se recomienda ajustar el circuito de medición de temperatura usando el protocolo en la función de calibración del transmisor. Cuando un sensor de temperatura está integrado en el sensor de conductividad, el sensor de temperatura puede calibrarse comparando la medición obtenida con un sistema de referencia. Lo anterior se logra sumergiendo los sensores de proceso y de referencia en el mismo fluido. El sistema de referencia puede ser otro dispositivo de medición de temperatura rastreable o un sistema de fluido con temperatura conocida, tal como agua hirviendo (corregida por la elevación, si resulta necesario este grado de exactitud) o un baño de agua y hielo. La exactitud de la calibración se relaciona con la exactitud del sensor de referencia, con la homogeneidad térmica del fluido y con la eliminación o reducción de cualquier artefacto que pudiera influir negativamente la exactitud. Por ejemplo, si el sensor no está totalmente sumergido en el fluido, la conducción térmica del entorno ambiental puede alterar la medición de la temperatura. La instalación cuidadosa del sensor con respecto al entorno ambiental puede mejorar la exactitud de las mediciones de temperatura, en particular si la temperatura de referencia es significativamente distinta a la temperatura ambiente. La comparación de la temperatura medida con la temperatura de referencia verifica si el sensor de temperatura está calibrado adecuadamente. La diferencia resultante debe estár dentro de x3º de la temperatura de referencia, donde x3 indica la exactitud de temperatura deseada que se requiere para el proceso. La exactitud del sensor de temperatura, por lo general, está den-
1994 (1644) Teoría y Práctica de Mediciones/ Información General
USP 39
tro del intervalo de ±2º o menos. Si la diferencia cumple con los criterios de aceptación preestablecidos, entonces no se requieren acciones adicionales. De lo contrario, se recomienda ajustar los factores de calibración del sensor de temperatura usando el protocolo en la función de calibración del sensor.
Calibración de la Constante de Celda La constante de celda del sensor se determina comparando la medición de conductividad del sistema con la de un sistema de conductividad de referencia y ajustando la constante de celda. Colocar el sensor en una solución de referencia de conductividad conocida con un valor rastreable a una autoridad competente. La solución de referencia puede ser una solución cuya conductividad se conoce mediante una de las siguientes maneras: (1) La solución se produce de acuerdo con un método estándar que es rastreable a una autoridad competente. Un método consiste en preparar una de las soluciones listadas en ASTM Dl 125. Otro método consiste en usar agua desionizada ultrapura sin exposición al aire de conductividad conocida. (2) La solución puede ser proporcionada por un proveedor y ser rastreable a una autoridad aceptada. La calibración de la constante de celda se debe llevar a cabo dentro del intervalo de temperatura recomendado de la solución de referencia. (3) La solución puede ser cualquier fluido del que se conozca su conductividad a través de una medición con un sistema de medición de conductividad de referencia, alternativo y rastreable. Para los tres casos, independientemente del tipo de metodología de calibración, existen algunos requisitos fundamentales. La constante de celda del sensor se debe calibrar a una conductividad que esté dentro del intervalo de medición del sistema de medición. Por ejemplo, si el sistema se diseña para medir en el intervalo de 0-100 µS/cm, entonces no se recomienda usar una solución de referencia de 1000 µS/cm. Debido a que la constante de celda es una propiedad geométrica del sensor y es una constante, no es necesario que su determinación y/o calibración esté dentro del intervalo operativo del proceso farmacéutico, siempre y cuando la conductividad se encuentre dentro del intervalo operativo del sistema de medición. Asimismo, debido a que la constante de celda es una propiedad geométrica del sensor, por lo general resulta suficiente una calibración de un solo punto. En algunas aplicaciones, una calibración de 2 puntos puede proveer una exactitud mejorada a una conductividad muy alta. Dependiendo de la solución de referencia, la calibración de la constante de celda se puede llevar a cabo con o sin compensación de temperatura. Para soluciones de referencia que exceden de 1 O µS/cm, si se requiere la compensación de temperatura, resulta suficiente un coeficiente de temperatura (a) de 2%/° sobre un intervalo de 25 ± 1 Oº, a menos que se indique de otro modo. El ajuste de la constante de celda se recomienda cuando la diferencia entre la conductividad medida y de referencia excede de x4% de la conductividad de referencia, donde x4 indica la exactitud de conductividad requerida para el proceso. La exactitud de conductividad típica es 5% o menos. Si la medición de exactitud cumple con los criterios de aceptación preestablecidos, entonces no se requieren acciones adicionales. De lo contrario, se recomienda ajustar la celda del sensor usando el protocolo en la función de calibración del sensor.
OPERACIÓN Mediciones En Línea, En Corriente Lateral y Fuera de Línea Dependiendo de la aplicación, las mediciones en línea, en corriente lateral y fuera de línea tienen requisitos universales específicos. Cada una tiene ventajas y desventajas, dependiendo de la aplicación, pero las tecnologías fundamentales (medición por AC) que sustentan cada tipo de medición son las mismas. Las diferencias principales entre los sistemas en línea/en corriente lateral y los sistemas fuera de línea son las características del sensor relacionadas con la robustez del proceso y tas características del transmisor relacionadas con tas funciones de salida, capacidades de comunicación externa y tos costos de instalación del sistema. Los sistemas en línea y en corriente lateral tienen los beneficios añadidos de las mediciones en tiempo real y la obtención continua de datos. Asimismo, sus costos de instalación eléctrica y de cañerías se pagan una única vez y los instrumentos se sitúan de manera fija en una ubicación específica para un solo propósito y proceso. Además, la muestra se desvía para drenarla, lo que resulta en una pérdida de producto. Se debe tomar en cuenta que la velocidad de flujo del fluido debe ser to suficientemente atta como para que la velocidad no afecte la medición. Los sistemas fuera de línea (o basados en laboratorio) tienen el beneficio de medir muchos tipos de muestras en condiciones controladas. El análisis de partidas fuera de línea tiene costos adicionales relacionados con la limpieza de envases y la recolección de muestras, así como riesgos de contaminación de las muestras. Las mediciones de conductividad en línea son adecuadas cuando se cumplen las siguientes condiciones: (1) existe la necesidad o se valoran los datos continuos en tiempo real; (2) el sensor y la aplicación/fluido son compatibles y no se dañan entre sí; y (3) se debe evitar la contaminación atmosférica. Para estos casos se cuenta con controles, decisiones e intervención continuos para et proceso. Las mediciones de conductividad en corriente lateral (o en un desvío de la corriente) son adecuadas cuando se cumplen las siguientes condiciones: (1) existe la necesidad o se valoran los datos continuos en tiempo real; (2) el sensor y la aplicación son compatibles entre sí; (3) el sensor puede dañar la aplicación o el fluido; y (4) se debe evitar la contaminación atmosférica. Para tales casos, la medición se lleva a cabo administrando la muestra a partir del tanque/sistema de tubería usando presión hidráulica (flujo) hacia el sensor de conductividad, y el fluido pasa a través del sensor en dirección al drenaje. Para estos casos se
USP 39
Información General/ (1644) Teoría y Práctica de Mediciones 1995
cuenta con controles, decisiones e intervención continuos para el proceso y no tienen efecto alguno sobre el producto o la aplicación. El único requisito es la presión positiva antes del sensor para evitar que el fluido de muestra regrese al proceso. Las mediciones de conductividad fuera de línea son adecuadas cuando se cumplen las siguientes condiciones: (1) no existe necesidad o no se valoran los datos continuos en tiempo real; (2) el sensor y la aplicación son compatibles entre sí, pero el sensor puede dañar la aplicación y/o el fluido; y (3) las necesidades de muestreo son poco frecuentes o limitadas.
Preparación de la Muestra y Medición Fuera de Línea Cuando se llevan a cabo mediciones fuera de línea, los analistas deben asegurar que el envase usado para recolectar la muestra fluida esté lo suficientemente limpio como para que no altere el resultado. Se debe recolectar una cantidad de fluido requerida para enjuagar y medir. Para muestras tales como Agua Purificada, en las que los gases pueden afectar el análisis, los envases deben llenarse por completo para reducir la fase gaseosa. El volumen de fluido requerido para realizar una medición depende del diseño del sensor y puede variar desde menos de 1O mL hasta 1 L. Se debe transferir una porción del fluido de muestra al envase de medición limpio para enjuagar sus paredes. Posteriormente, se desecha el fluido. Además, el envase de la muestra se puede usar como vaso de medición. El sensor debe enjuagarse con agua de calidad adecuada u otro fluido adecuado para que la medición no se vea afectada y después se enjuaga al menos una vez con la solución que se va a medir, que posteriormente se desecha. Este enjuague con la solución muestra elimina cualquier residuo o fluidos con los que el sensor de conductividad haya estado previamente en contacto. El procedimiento exacto varía dependiendo de la solución analizada. Por ejemplo, cuando se analizan muestras con muy baja conductividad tales como Agua Purificada, los analistas deben realizar enjuagues adicionales para eliminar cualquier residuo remanente en el sensor. Para algunas muestras con baja conductividad tales como aguas de alta pureza, es necesario controlar el tiempo de espera máximo, la temperatura y el tipo de envase debido al potencial impacto de los lixiviables iónicos de ciertos envases. Transferir el fluido al envase de medición, sumergir el sensor en el fluido y asegurarse de que no haya obstrucciones en el área de medición del sensor. Mezclar o agitar la muestra para evitar que las burbujas se acoplen a los electrodos e interrumpan la medición. Si se utiliza una medición por compensación de temperatura, se debe seleccionar el algoritmo de compensación de temperatura apropiado en el transmisor y, si fuera necesario, ajustar la temperatura de la muestra al intervalo recomendado usando un baño a la temperatura adecuada. De lo contrario, se debe deshabilitar la compensación de temperatura. Verificar que la temperatura sea lo suficientemente estable (un cambio de menos de 0,25º por minuto) y registrar la lectura de conductividad y la temperatura, si fuera necesario.
Medición en Línea Para el análisis en línea, el sensor se instala en la tubería o en el vaso de proceso. La orientación del sensor con respecto al flujo del fluido es crítica para asegurar que (1) no se recolecten partículas ni sedimento entre los electrodos de medición y (2) que no queden atrapadas bolsas de aire entre los electrodos de medición. Ambos factores pueden afectar de manera negativa la exactitud de la medición. Dependiendo del diseño de los electrodos, los fabricantes generalmente proporcionan recomendaciones. Se debe asegurar que el sensor esté limpio antes de su instalación. Después de sumergir el sensor en un sistema cerrado de proceso, como por ejemplo, un sistema de tuberías o tanque, no será necesario retirarlo ni limpiarlo antes de realizar una medición. Si se utiliza una medición por compensación de temperatura, se debe seleccionar el algoritmo de compensación de temperatura apropiado. De lo contrario, se debe deshabilitar la compensación de temperatura. Aunque se desea la estabilidad de la temperatura, ésta puede ser difícil de lograr, dependiendo del control de temperatura del proceso. Registrar la lectura de conductividad y la temperatura, si fuera necesario.
Medición en Corriente Lateral Para las mediciones en corriente lateral, se utiliza una pieza de tubería para conectar el vaso/tubería de proceso a al sensor y su receptáculo. La tubería debe limpiarse o purgarse con un agente de limpieza adecuado para eliminar cualquier impureza que pudiera alterar la medición de conductividad. La tubería puede estar fabricada de metal o plástico, dependiendo de la aplicación y la compatibilidad química. La instalación del sensor en un receptáculo permite dirigir el fluido directamente al sensor y luego al drenaje. Los aspectos a considerar con respecto a la instalación son similares a los de las instalaciones en línea. Se debe asegurar que el sensor y el receptáculo estén limpios antes de su instalación. Después de conectar el sensor y su receptáculo a la corriente lateral, no será necesario retirarlo ni limpiarlo antes de realizar una medición. Si se utiliza una medición por compensación de temperatura, se debe seleccionar el algoritmo de compensación de temperatura apropiado. De lo contrario, se debe deshabilitar la compensación de temperatura. Aunque se desea la estabilidad de la temperatura, ésta puede ser difícil de lograr, dependiendo del control de temperatura del proceso. Registrar la lectura de conductividad y la temperatura, si fuera necesario.
1996 (1644) Teoría y Práctica de Mediciones/ Información General
USP 39
Otras Consideraciones Por lo general, para todos lo caso mencionados con anterioridad, no se recomienda el uso de materiales abrasivos para limpiar el sensor. Existen dos razones para evitar el uso de materiales de limpieza abrasivos: (1) podría destruirse la capa pasiva de los sensores de acero inoxidable (si éste fuera el material del sensor) y (2) la superficie del área de medición puede afectar la exactitud de la medición. Por tales motivos, se prefiere el uso de fluidos adecuados químicamente compatibles en lugar de los métodos mecánicos para limpieza. A diferencia de los requisitos para muchas mediciones electroquímicas, un flujo fluido, circulante o agitante no es un requisito fundamental para una medición de conductividad. Aunque, en general, no existen diferencias en la medición de conductividad de una muestra estática o fluida, se deben cumplir dos condiciones para las muestras estáticas: Primero, no debe permitirse la acumulación de burbujas en el área de medición de los electrodos debido a que pueden interferir con el flujo de la medición de conductividad de la corriente. Segundo, si la homogeneidad de la muestra se ve afectada por la falta de agitación o circulación, entonces la medida de conductividad puede no ser representativa de la conductividad del fluido a granel. En todos los casos, la instalación del sensor debe tomar en cuenta los efectos de las paredes del vaso, tuberías o recipiente de laboratorio. Si la proximidad de la pared interfiere con el campo electromagnético para la medición de conductividad, la medición podría verse alterada de manera positiva o negativa. Algunos diseños de sensor de 2 electrodos, tales como los electrodos concéntricos coaxiales, no se ven afectados por los objetos próximos. Las instrucciones de instalación del sensor pueden indicar si es necesario tomar en cuenta el punto anterior. Si se observan lecturas de conductividad inestables, algunas causas comunes pueden ser la conexión a tierra inadecuada del sistema de agua, el ruido electrónico de las bombas y otros generadores de alta frecuencia o por fugas internas del sensor. Se encuentran disponibles diversas metodologías de diagnóstico que pueden ayudar a identificar la causa.
(1660) ENVASES DE VIDRIO-EVALUACIÓN DE LA DURABILIDAD DE LA SUPERFICIE INTERNA PROPÓSITO Este capítulo de información general provee información sobre factores que afectan la durabilidad de la superficie interna de los envases de vidrio. Los enfoques recomendados se proporcionan para evaluar el potencial de un medicamento de ocasionar la formación de partículas de vidrio y la descamación de la superficie interna. Asimismo, se proveen métodos de selección para detectar partículas de vidrio y descamación, lo que permite realizar una comparación de la durabilidad del vidrio entre lotes o entre diversos fabricantes de vidrio.
ALCANCE Este capítulo se refiere a frascos y viales fabricados mediante moldeo, así como ampollas, cartuchos, viales y jeringas prellenables fabricadas de tubos de vidrio. El vidrio para envasado farmacéutico se clasifica como vidrio de borosilicato Tipo 1, vidrio tratado de cal sodada y sílice Tipo 11 o vidrio Tipo 111 de cal sodada y sílice basándose en la resistencia hidrolítica del vidrio, según se definen en el capítulo Envases-Vidrio (660). Los envases de vidrio Tipo 1 son adecuados para la mayoría de los productos para uso parenteral y no parenteral. Los envases de vidrio Tipo 11 son adecuados para la mayoría de los productos acuosos ácidos y neutros para usos parenterales y no parenterales, y se pueden usar para productos parenterales alcalinos cuando los datos de estabilidad demuestran su aptitud. Los envases de vidrio Tipo 111 por lo regular no se usan para productos parenterales ni para polvos para uso parenteral, excepto cuando los datos de las pruebas de estabilidad adecuadas indican que el vidrio Tipo 111 es satisfactorio. Este capítulo se enfoca principalmente en el vidrio Tipo 1, debido a que es el que se usa de manera más amplia en la industria farmacéutica y biofarmacéutica para productos parenterales aunque las pautas se pueden aplicar de igual manera a los vidrios Tipo 11 y Tipo 111 usados para productos parenterales. El capítulo debe ser útil para los siguientes: • Fabricantes de vidrio y de envases de vidrio moldeados y tubulares • Compañías farmacéuticas y biofarmacéuticas • Organizaciones fabricantes y de llenado por contrato La descamación del vidrio se puede describir como la aparición de copos flexibles y delgados de vidrio (o laminillas) cuyo tamaño puede variar desde <50 µm hasta 200 µm en una solución de medicamento. La descamación representa un asunto serio para la calidad y puede derivar en el retiro de un producto del mercado. La aparición de laminillas de vidrio es un indicador tardío de una fuerte interacción entre el medicamento y la superficie interna del vidrio. Aunque la descamación es el indicador visual más evidente, ésta representa la etapa final de una compleja reacción de corrosión del vidrio, y se puede observar únicamente en un punto en el que ya no es posible prevenirla. Para agregarle una mayor complejidad a la detección, la ener-
USP 39
Información General/ (1660) Durabilidad de los Envases de Vidrio 1997
gía mecánica de la agitación o el contacto entre viales durante el transporte puede ser necesario para desprender las laminillas de la superficie interna de un vial lleno y facilitar la observación. Las pruebas de descamación combinan el examen visual de la solución, un examen de la superficie interna del vial y el análisis de una solución de prueba agresiva para evaluar la tendencia de la superficie interna del vidrio de los viales a descamarse. Estos exámenes y el uso de una solución de prueba agresiva deben ser realizados por el fabricante farmacéutico, no por el fabricante de vidrio o de los envases.
TIPOS DE VIDRIO Los vidrios en su forma pura consisten en dióxido de silicio con un punto de fusión superior a 1700º. No obstante, su uso comercial es poco común debido al costo de trabajar a temperaturas tan elevadas. Los modificadores agregados de entramado tales como sodio, potasio u óxido de boro, reducen el punto de fusión y la durabilidad química, mientras que los estabilizantes agregados de entramado, tales como óxidos de calcio y aluminio, mejoran la durabilidad del vidrio. Los vidrios de color (p.ej., vidrio ámbar) se producen mediante la transición de óxidos metálicos tales como óxidos de hierro. Todos los aditivos que se agregan al dióxido de silicio puro, al igual que el propio silicio, se pueden considerar sustancias extraíbles potenciales de los envases de vidrio. Las composiciones de vidrio no existen como compuestos químicos estequiométricos, sino que se expresan usando las proporciones de sus compuestos. Por ende, existe una variación permisible dentro del tipo de vidrio, además de que los tipos de vidrios pueden variar ligeramente entre los productores de vidrio. El vidrio de cal sodada y sílice consiste en dióxido de silicio (60-75 % en peso), óxidos de sodio y potasio (12-18 % en peso) y cantidades menores de óxido de calcio, magnesio y aluminio (5-12 % en peso). Este vidrio tiene un coeficiente de expansión (COE, por sus siglas en inglés) relativamente alto de 8090 x 10-7 por grado y es susceptible a la ruptura por choque térmico. El vidrio de borosilicato consiste en sílice (65-80 % en peso), óxido bórico (7-13 % en peso) y cantidades menores de óxido de sodio, potasio y aluminio. La presencia de boro provee una mayor resistencia al choque térmico mediante una reducción del coeficiente de expansión y al ataque hidrolítico mediante un incremento en la conectividad del entramado vítreo. El vidrio Tipo 1 está disponible en múltiples formulaciones: el vidrio tubular está disponible con un coeficiente de expansión bajo, descrito como vidrio con coeficiente de expansión 32-33 y con un coeficiente de expansión relativamente bajo (con un intervalo de expansión 48-56), por ejemplo, vidrio con coeficiente de expansión 51, en referencia a sus coeficientes de expansión individuales de 32,5 x 10-7 por grado y 51,0 x 10-7 por grado, respectivamente. El vidrio moldeado tiene un coeficiente de expansión mayor situado en la región de un coeficiente de expansión 60-63.
FORMACIÓN DE ENVASES DE VIDRIO MOLDEADOS Y TUBULARES La formación de envases de vidrio moldeados y tubulares requiere de diversas etapas. La calidad del envase usado en el envasado depende de las condiciones y el control de calidad de cada etapa. Los envases moldeados y tubulares se producen en un horno para vidrio y se emplean hornos diferentes para los vidrios de borosilicato o de cal sodada y sílice. Los ladrillos refractarios que recubren internamente la superficie del horno se deterioran con el tiempo y deben ser reemplazados. Los ladrillos gastados pueden contribuir con los defectos cosméticos tales como piedras (incrustadas en el vidrio) que se incorporan en los envases de vidrio moldeado o en los tubos de vidrio. Los viales y frascos de vidrio moldeado se fabrican en un proceso de una sola etapa mediante el cual una corriente de vidrio fundido se corta en un trozo de masa vítrea, la cual posteriormente se introduce en un molde en el que se emplea aire o un conjunto de herramientas para dar al envase la forma del molde. La formación de envases a partir de tubos de vidrio es un proceso de dos etapas. Los tubos de vidrio con un diámetro específico se forman a partir de una corriente de vidrio fundido que sale del horno, se enfría y posteriormente se corta usando longitudes estándares. Más adelante, el fabricante de vidrio o fabricantes de envases independientes convierten estos tubos en envases de vidrio (ampollas, cartuchos, jeringas o viales). Resulta técnicamente complicado formar un tubo de vidrio con un diámetro suficientemente adecuado para fabricar frascos de 100 mL o más, por lo que estos envases se producen mediante moldeo. Se utilizan llamas de gas para suavizar el tubo de vidrio para formar el cuello, para fundir el vidrio para formar la base de ámpulas o viales, así como para separar el envase del tubo de vidrio. En el caso de los cartuchos y jeringas prellenables, el tubo de vidrio se corta a la longitud deseada y los extremos se ablandan para formar la boquilla y la brida de la jeringa, así como el cuello y el anverso del cartucho. La velocidad de calentamiento, la temperatura máxima del vidrio y la velocidad de producción son parámetros críticos que se pueden ajustar en las máquinas formadoras individuales. Después de formados, los envases tubulares y moldeados pasan a través de un horno de templado (lehr) que calienta los envases a una temperatura 20º a 30º por encima de la temperatura de transformación (T9) de la formulación individual del vidrio (la T9 para el vidrio de borosilicato es de aproximadamente 570º) y luego los enfría gradualmente para eliminar las tensiones en el envase derivadas del proceso de fabricación. Esto constituye un paso crítico debido a que los envases con un templado deficiente presentan una durabilidad química y mecánica reducida. El proceso de formación de viales y ámpulas tubulares tiene un efecto sobre la composición de la superficie local del vidrio. Durante la formación del cuello y particularmente de la base, la temperatura de la superficie interna de los envases puede exceder el punto de evaporación de algunos componentes del vidrio tales como boratos alcalinos. En ciertas condiciones de tiempo-temperatura, el vidrio puede presentar una separación de fases durante la formación creando una falta de homogenei-
1998 (1660) Durabilidad de los Envases de Vidrio / Información General
USP 39
dad en Ja química de Ja superficie en el interior del envase. Ambos escenarios son inadecuados para el almacenamiento de líquidos agresivos desde Ja perspectiva de Ja durabilidad química de Ja superficie. Se puede obtener evidencia de lo anterior atacando apropiadamente el vidrio con ácido, después de lo cual aparecerá un anillo opaco por encima del talón del envase, lo cual indica un cambio negativo en la química de Ja superficie interna. El mismo fenómeno se puede observar también en el hombro del envase, aunque, en muchos casos, esta área no experimenta contacto prolongado con un líquido.
PROCESAMIENTO DE ENVASES DE VIDRIO MOLDEADOS Y TUBULARES En ocasiones, las superficies internas de las ampollas, viales y frascos de vidrio se someten a tratamientos adicionales. Por ejemplo, el calentamiento del vidrio propaga el óxido de sodio hacia la superficie interna del envase, pero el lavado con agua no elimina el óxido de sodio dada la limitada solubilidad de éste último. Cuando el vidrio se expone a una solución acuosa, los iones de sodio se dispersan en la solución desde la superficie del vidrio para producir iones de hidróxido, lo que genera un pH elevado en soluciones no amortiguadas. Un tratamiento común es el uso de sulfato de amonio, el cual convierte el óxido de sodio en la superficie interna a una profundidad de aproximadamente 10-100 nm en sulfato de sodio altamente soluble que se puede eliminar posteriormente mediante lavado. Aunque la eliminación de iones de sodio de la superficie reduce la tendencia al cambio de pH, el tratamiento elimina a su vez elementos estructurales, dejando una delgada capa rica en sílice en la superficie interna. El proceso originalmente se diseñó para elevar Ja resistencia hidrolítica de la superficie del vidrio de cal sodada y sílice Tipo Jll a la del vidrio Tipo JI a fin de imitar la resistencia hidrolítica del vidrio Tipo l. Este proceso también puede aplicarse al vidrio Tipo l. En resumen, los factores clave que influencian la durabilidad de la superficie del vidrio de los envases fabricados a partir de vidrio Tipo 1son principalmente las condiciones de fabricación, tales como la temperatura de formado, el tiempo de exposición al calor y las condiciones de templado. Las temperaturas usadas para las etapas subsiguientes son menores que las usadas para la formación y el templado (ver la Tabla 1), y no representan un riesgo adicional para la durabilidad química del vidrio derivado de la separación de fases o la volatilización. Las operaciones posteriores a la fabricación tales como almacenamiento y procesamiento en condiciones húmedas, por ejemplo, despirogenización en presencia de vapor de agua y esterilización terminal mediante autoclave, también pueden tener un impacto sobre la durabilidad química de la superficie del vidrio. Tabla 1. Temperaturas Encontradas Durante la Formacion y el Procesamiento de Envases de Vidrio Tubulares Tipo 1 Operaciones Claves
Temperaturas Típicas (º)
1500-1650 1300-1500 1000-1250 750-850 550-600 250-350 110-130
Horno Corte del tubo y formación de la base 1ntervalo de trabajo Suavizado Templado Intervalo de despirogenización Esterilización terminal
ORIGEN DE LOS ENVASES DE VIDRIO Un fabricante farmacéutico tiene una variedad de opciones para seleccionar un envase de vidrio para un medicamento. Éstas incluyen el tipo de vidrio (1, JI o IJI), el método de producción (tubular o moldeado), los tratamientos de la superficie, así como el tamaño y el acabado del cuello del envase. Resulta importante que los fabricantes farmacéuticos provean suficiente información sobre sus requisitos, tal como la formulación y Jos procesos de fabricación y llenado del medicamento, para permitir que los proveedores de vidrio tomen decisiones informadas sobre el tipo de envase recomendado. Los fabricantes farmacéuticos deben considerar la procedencia original de los envases que compran de modo que tengan suficiente conocimiento sobre los procesos de fabricación y la composición del vidrio. Esto es esencial para calificar un envase de vidrio dado para un medicamento particular obtenido de un fabricante de vidrio. Conocer los siguientes puntos es de gran utilidad: • Formulación del vidrio • Coeficiente de expansión para vidrio tubular Tipo 1(expansión 32-33 ó 48-56) • Si el fabricante de envases de vidrio fabrica sus propias materias primas para el vidrio o las obtiene de terceros. • El sitio de fabricación para Jos envases de vidrio. Cuando los envases de vidrio para un producto dado se fabriquen en diversos sitios, deberían buscar información para determinar si los envases de vidrio fabricados en dichos sitios distintos tendrán un desempeño uniforme. • Si la superficie de vidrio ha sido modificada por el fabricante de vidrio o de los envases de vidrio mediante tratamiento químico tal como sulfato de amonio. El fabricante y el usuario de un envase de vidrio deben colaborar para garantizar el monitoreo de la calidad del vidrio y que ésta sé mantenga durante todo el ciclo de la relación para suministro de vidrio. La calidad del vidrio también debe ser moriitoreada e inferida por el usuario mediante observaciones hechas durante la vida útil del producto. Los programas de gestión de calidad del fabricante y del usuario del vidrio deben incluir lo siguiente:
USP 39
Información General/ (1660) Durabilidad de los Envases de Vidrio 1999
•Auditorías de calidad al proveedor de vidrio (fabricante de vidrio y/o fabricante de envases) por parte del usuario del vidrio • Establecer niveles de calidad aceptables mutuamente convenidos para los lotes de envases de vidrio • Monitoreo y análisis de tendencias de la calidad de las partidas de vidrio, incluyendo, entre otros, el monitoreo de valores obtenidos mediante la Prueba de Vidrio Superficial del capítulo (660) • Monitoreo y análisis de tendencias de la calidad del vidrio y del desempeño del proceso de fabricación de vidrio por parte del fabricante de envases de vidrio, incluyendo la efectividad de los métodos usados durante el proceso de fabricación del envase de vidrio para medir las tolerancias geométricas e identificar defectos cosméticos • Garantizar que las diferencias entre los diversos sitios de fabricación de vidrio no afecten significativamente la calidad de un envase de vidrio especificado obtenido de múltiples sitios • Presencia de un sistema para monitorear y calificar los cambios realizados al proceso de fabricación del vidrio y para informar a los clientes sobre dichos cambios.
QUÍMICA DE LA SUPERFICIE DEL VIDRIO Después de que los fabricantes se hayan asegurado de la calidad y uniformidad de los envases de vidrio adquiridos, pueden usar la química acuosa compleja de la superficie del vidrio para tomar decisiones sobre la potencial formulación del medicamento y los pasos de tratamiento que pudieran incrementar la estabilidad del vidrio. La primera reacción entre la superficie del vidrio y la fase acuosa (agua o vapor de agua) implica el intercambio iónico entre los iones de hidrógeno (o iones hidronio Hp+) de la fase acuosa y los iones alcalinos del vidrio (Ecuación 7). Este intercambio iónico ocurre en un tiempo corto de reacción en soluciones ácidas o neutras. En soluciones básicas, la reacción ocurre en la interfase de vidrio/agua y disuelve la red de sílice. Posteriormente el sílice reacciona liberando ácido silícico en la solución, con lo que se reduce el pH (Ecuación 2). De estas reacciones resulta una superficie de vidrio hidratada con una capa enriquecida en sílice y empobrecida en álcali.
w + Na•s¡o- (vidrio) => SiOH + Na•
[1]
[2]
La presencia de agua en el lixiviado promueve la hidrólisis del enlace Si-O formando una capa de gel de sílice (Ecuación 3).
H20 + Si-O-Si <=> 2 SiOH
[3]
Las propiedades mecánicas del gel de la superficie que se forma son distintas a las del vidrio a granel. La hidratación y deshidratación repetidas de la capa conllevan a la ruptura de la capa de gel y a la eventual generación de partículas. Este proceso se empeora a medida que la capa de gel aumenta su espesor. Este fenómeno (conocido como meteorización) es bien conocido en el vidrio expuesto a la humedad ambiental. A valores elevados de pH, el mecanismo de degradación del vidrio cambia de lixivización de elementos alcalinos a la disolución de la red de silicatos, tal como se muestra en las Ecuaciones 4 y 5.
[4] [5] La reacción (Ecuación 5) incrementa la solubilidad del ácido silícico en la solución, lo cual impulsa la reacción. En algún punto, se excede el límite de solubilidad y se forman partículas por precipitación. Si la solución no está amortiguada, ocurrirá una reducción en el pH de la solución. Estas reacciones y escenarios se aplican únicamente a las reacciones de vidrio con agua; la presencia de formulaciones de productos farmacéuticos puede complicar la situación considerablemente.
FACTORES QUE INFLUENCIAN LA DURABILIDAD DE LA SUPERFICIE INTERNA Existen diversos factores que tienen el potencial de influenciar negativamente la durabilidad química de la superficie interna de los envases de vidrio. Estos factores incluyen la composición de vidrio, las condiciones en las que se formaron los envases, el manejo y los tratamientos subsiguientes, y el medicamento en el envase (Tabla 2). No sólo los medicamentos agresivos pueden corroer la superficie interna, sino que también los excipientes tales como soluciones amortiguadoras, agentes quelantes, ácidos orgánicos y pH elevados pueden ocasionar deterioros. Por ejemplo, las soluciones neutras de citrato de sodio atacan el vidrio con una severidad similar a la de las soluciones sustancialmente alcalinas. Los ácidos orgánicos tales como ácidos glucónico y malónico, también corroen el vidrio a través de un mecanismo propuesto de una reacción de intercambio iónico en la que los iones metálicos en la superficie del vidrio se reemplazan con iones de hidrógeno del ácido. No todos los factores citados afectan negativamente la durabilidad de la superficie al mismo nivel, además de que pueden contribuir con la descamación actuando solos o combinados. Debido al rango de variables, los usuarios finales deben examinar todas las variables pertinentes para un medicamento individual y evaluar el grado de riesgo de descamación y formación de partículas de vidrio subvisibles y visibles. En algunas situaciones, la acumulación de factores de riesgo puede indicar que la selección de un envase de
2000 (1660) Durabilidad de los Envases de Vidrio / Información General
USP 39
vidrio para una formulación particular debe realizarse siguiendo un estudio de selección predictivo para establecer requisitos de calidad del vidrio más estrictos o puede indicar que un envase de vidrio no debe usarse para cierta formulación. Tabla 2. Factores Que Influencian la Durabilidad de la Superficie Interna del Vidrio
Fabricación del Envase
• Composición del vidrio • Envase moldeado o tubular • Proceso de fabricación tubular: - Velocidad de conversión - Temperatura de conversión
Procesamiento y Almacenamiento del Envase
•Tratamientos posteriores a la formación: - Sulfato de amonio - Lavado - Despirogenización • Condiciones de almacenamiento: - Alta humedad
Medicamento: Formulación, Procesamiento y Almacenamiento •Fármaco • Formulación: - Soluciones amortiguadoras de acetato, citrato y fosfato - Sales sódicas de ácidos orgánicos, p.ej., gluconato, malato, succinato, tartrato - Concentración iónica elevada, p.ej., >0, 1 M de sales alcalinas -Agentes complejantes, p.ej., EDTA - pH elevado, p.ej., >8,0 • Esterilización terminal • Condiciones declaradas de almacenamiento (refrigerado o temperatura ambiente controlada) • Vída útil
EVALUACIÓN DE LA DURABILIDAD DE LA SUPERFICIE INTERNA Cada lote de envases de vidrio Tipo 1, 11 o 111 recibido por un fabricante farmacéutico debe cumplir con la Prueba de Vidrio Superficial del capítulo (660). Esta prueba provee una indicación de la durabilidad química de la superficie interna, aunque al parecer no provee una correlación clara directa con la tendencia a formar partículas de vidrio o a la descamación. El valor de alcalinidad representa la suma de todas las superficies internas del envase, y aunque esto es representativo para los envases moldeados, los viales de vidrio tubular pueden tener grados distintos de durabilidad química superficial, dependiendo de la ubicación (p.ej., justo por encima del talón en comparación con las paredes laterales). Se puede obtener un valor de alcalinidad superficial bajo de envases tratados con sulfato de amonio, pero el tratamiento en sí puede reducir la durabilidad química de la superficie interna, dependiendo de la formulación del medicamento usado para llenar el vial. La variable más importante que afecta la durabilidad de la superficie es el medicamento mismo y, debido a que éste usa agua como medio de extracción, la Prueba de Vidrio Superficial no toma en cuenta dicho factor. Por ende, la Prueba de Vidrio Superficial representa únicamente un primer paso en el control de calidad de la durabilidad química de la superficie, y se deben usar métodos de selección adicionales para demostrar la aptitud de los viales para una formulación derivada de una fuente particular antes de iniciar los estudios formales de estabilidad.
Métodos de Selección Predictivos Los métodos de selección ayudan a evaluar los envases de vidrio de distintos proveedores (moldeados o tubulares), formulaciones de vidrio (p.ej., coeficiente de expansión 32-33 ó 48-56 para vidrio tubular) y tratamientos posteriores a la formación. La selección establece además la variación entre lotes de proveedores individuales durante el proceso de desarrollo del medicamento, así como las variaciones entre lotes para productos que han demostrado tener una tendencia particular a formar partículas de vidrio o a descamarse. Los métodos de selección pueden usar una variedad de tecnologías distintas para examinar tres parámetros clave: examen visual y perfil químico de la capa de la superficie interna, la cantidad e identidad de los elementos extraídos en la solución y el número de partículas subvisibles y visibles en la solución. Estos elementos se evalúan en conjunto mediante pruebas predictivas para detectar la formación de partículas de vidrio y descamación, procesos que son indicativos de una reducción en la durabilidad. Las pruebas predictivas deben buscar precursores que conlleven a la descamación en lugar de buscar únicamente laminillas de vidrio, y deben ser capaces de proveer rápidamente una previsión de la durabilidad de la superficie. Esto hace que las pruebas no sólo sean útiles para la selección de proveedores, sino también para la evaluación de lotes individuales en caso necesario. Algunas de las técnicas analíticas de uso más común para evaluar los tres parámetros clave se presentan en la Tabla 3. Tabla 3. Técnicas Analíticas para Estudios de Selección Parámetro
Parámetro de Prueba
Instrumentos
Superficie interna del vidrio
• Grado de perforación superficial • Composición química como función de la profundidad
• Microscopía DICª o EMb • SIMS<
Elementos extraídos en la solución
• Conductividad/pH • Concentración de Si0 7
• Medidor de conductividad/pH • IC-MSd o ICP-OES•
ª Microscopia de contraste por interferencia diferencial. b Microscopía electrónica. e Espectrometría de masas de iones secundarios. d Plasma inductivamente acoplado-espectroscopía de masas. e Plasma inductivamente acoplado-espectroscopía de emisión óptica. 1 Microscopía electrónica de barrido con espectroscopía de rayos X de energía dispersiva.
Información General/ (1 660) Durabilidad de los Envases de Vidrio 2001
USP 39
Tabla 3. Técnicas Analíticas para Estudios de Selección (Continuación) Instrumentos
Parámetro de Prueba
Parámetro
• Presencia de laminillas y de partículas visibles • Número y tamaño de laminillas o partículas • Morfología y composición de laminillas o partículas
Laminillas y partículas visibles y subvisibles de vidrio
• Inspección visual • Analizador de tamaño de partículas • SEM-EDX1
ª
Microscopia de contraste por interferencia diferencial. Microscopía electrónica. e Espectrometría de masas de iones secundarios. d Plasma inductivamente acoplado-espectroscopía de masas. e Plasma inductivamente acoplado-espectroscopía de emisión óptica. f Microscopía electrónica de barrido con espectroscopía de rayos X de energía dispersiva. b
Condiciones de Selección Agresivas Al seleccionar un envase primario de vidrio apropiado para líquidos farmacéuticos, los analistas deben considerar dos enfoques. El primero es una serie de exposiciones de temperatura aceleradas usando condiciones agresivas que establezcan, en orden de importancia, la durabilidad química del envase sin ninguna referencia específica a un compuesto dado. Dicha prueba puede ser útil cuando se selecciona un sistema de envase para el cual se desee el vidrio con mayor durabilidad química. Esta prueba también puede ser útil para determinar si han ocurrido cambios en la calidad del vidrio o para evaluar cambios en el procesamiento efectuados por el fabricante primario. La Tabla 4 provee tres ejemplos de sistemas modelo que se pueden usar para esta evaluación. Asimismo, los usuarios finales pueden desarrollar otros sistemas modelo. Tabla 4. Formulaciones y Condiciones Usa d as para Ace erar a Descamacló n KCI al 0,90/o de pH 8,0
Citrato de Sodio al 30/o de pH 8,0
Gllclna 20mM de pH 10,0
1 hora a 121 º 1 ó 2 ciclos
24 horas a 80º
24 horas a 50º
Formulación Condiciones
Estrategia de Selección para Medicamentos Los indicadores incluyen la aparición de una superficie interna fracturada y con puntuaciones, particularmente alrededor del talón del vial en lugar de una superficie lisa, así como una variedad de cambios en la solución de prueba, especialmente incrementos en la concentración de Si0 2, el número de partículas subvisibles en la solución y un cambio en el pH. Cuando el propósito de la selección del vidrio sea determinar la aptitud de un envase de vidrio dado para un producto específico, la prueba propuesta en la Tabla 4 resultará insuficiente. Las condiciones de exposición son demasiado agresivas y no ofrecen un vínculo directo con el producto mismo. En estos casos, las condiciones aceleradas siguen siendo relevantes, pero deben vincularse con las condiciones pertinentes para el producto específico. Por ejemplo, si se va a almacenar un producto a 5º y las condiciones aceleradas apropiadas son 30º, entonces la prueba debe realizarse a 30º. Muchos productos o formulaciones no pueden soportar las temperaturas elevadas o el pH elevado que se presenta en la Tabla 4. Asimismo, podrían obtenerse resultados de prueba falsos positivos debido a que las temperaturas inusualmente elevadas que se presentan en la Tabla 4 podrían ocasionar señales de descamación, pero la exposición moderada a 30º no produciría evidencia de incompatibilidad del vidrio. Debido a que se requieren temperaturas más bajas para el análisis real del producto, la duración de la prueba debe ser mayor, desde semanas hasta meses. Un mayor número de viales también es apropiado para este escenario debido a que la meta de la prueba es asegurar que los resultados sean representativos de la calidad del vidrio que se usará para el medicamento. La Tabla 5 presenta algunas de las condiciones que podrían usarse para el análisis con un producto específico. Ta bl a 5 Estrateg1a 1 d e Se 1ecc1'on para Vº1a1es d e Vºd º 1 r10 Prueba de Estrés
Control de Agua
Control del Medicamento
• Viales: lavados, despirogenados • Llenados con Solución para la Prueba de Estrés • Condiciones de tratamiento aceleradas de tiempo y temperatura
• Viales: lavados, despirogenados • Llenados con Agua para Inyección • Autoclavar, si aplicase para el Medicamento • Condiciones aceleradas de estabilidad del Medicamento durante el almacenamiento
• Viales: lavados, despirogenados • Llenados con Medicamento • Autoclavar, si aplicase • Condiciones aceleradas de estabilidad del Medicamento durante el almacenamiento
CONCLUSIONES La evaluación de la superficie interna de los envases de vidrio comienza con la Prueba de Vidrio Superficial, la cual emplea agua como medio de extracción. Un valor bajo no siempre indica una superficie interna durable si los resultados se obtienen usando tratamientos superficiales (p.ej., sulfato de amonio). Dichos tratamientos pueden llevar a una capa en la superficie interna rica en sílice que representa una estructura debilitada del vidrio, además de un incremento en el riesgo de descamación cuando el vial se llena con formulaciones que contienen agentes agresivos tales como ácidos orgánicos, EDTA o soluciones con
2002 (1660) Durabilidad de los Envases de Vidrio / Información General
USP 39
concentración iónica alta o pH elevado. Los métodos y estrategias de selección descritos en este capítulo pueden ayudar a evaluar los envases de vidrio de diversos proveedores o entre lotes, además de que pueden proveer una indicación de la tendencia de la formulación seleccionada a ocasionar descamación con el paso del tiempo. La selección de los viales de vidrio destinados para contener un medicamento con uno o más de los factores de riesgo de la formulación identificados en la Tabla 2 debe realizarse con especial escrutinio.
Agregar lo siguiente:
·(1661) EVALUACIÓN DE SISTEMAS DE ENVASES PLÁSTICOS Y SUS MATERIALES DE CONSTRUCCIÓN CON RESPECTO A SU IMPACTO SOBRE LA SEGURIDAD DEL USUARIO INTRODUCCIÓN Los medicamentos pueden interactuar químicamente con sus sistemas de envases asociados y/o los materiales plásticos del sistema y con tos componentes de construcción durante la fabricación, el traslado, el almacenamiento y la administración del producto. La magnitud de estas interacciones no debe ser tal que éstas afecten de manera adversa la aptitud de uso del medicamento o el sistema de envase. Mientras que la aptitud de uso incluye diversos aspectos de calidad del medicamento envasado y su desempeño, la aptitud de uso tratada en este capítulo es la seguridad del paciente. El impacto potencial sobre la seguridad del paciente de las interacciones entre un medicamento y su envase se evalúa y establece mediante las pruebas adecuadas de los sistemas de envases y sus materiales y los componentes de construcción. El capítulo Sistemas de Envases Plásticos y sus Materiales. de Construcción (661) establece las pruebas y especificaciones que son necesarias y apropiadas para asegurar que dichos sistemas son adecuados para el uso previsto y específicamente seguros para su uso. El capítulo {661) incluye dos subcapítulos, Materiales Plásticos de Construcción (661.1) y Sistemas de Envases Plásticos para Uso Farmacéutico (661.2).
ALCANCE El propósito de este capítulo es comunicar los conceptos clave detrás del capítulo (661) y sus subcapítulos relacionados, (661.1) y (661.2), así corno proveer información adicional y guías sobre la aplicación y la aplicabilidad de este conjunto de capítulos. Debido a la amplitud y diversidad del mercado farmacéutico, la aplicación y el uso adecuado del conjunto de capítulos (661) puede no ser intuitiva para algunas partes interesadas. Por lo tanto, este capítulo está destinado a ayudar a los usuarios a comprender y a utilizar dicho conjunto de capítulos.
PRINCIPIOS GENERALES Proceso de Evaluación General El objetivo de las normas de la USP para sistemas de envases es establecer las pruebas y las especificaciones que aseguran que los sistemas de envases no tengan un impacto material sobre la seguridad o la efectividad de los medicamentos. Dada la compleja naturaleza de los sistemas de envases y sus procesos de desarrollo y fabricación, se requieren múltiples procedimientos de análisis para establecer su aptitud de uso con un medicamento específico. El desarrollo lógico y el progreso del proceso de fabricación para medicamentos envasados que comienza con los materiales de construcción del sistema de envase, continúa con el sistema de envase mismo y termina con el medicamento envasado, forma las bases de un enfoque de tres etapas para la calificación de los sistemas de envases, según se ilustra en la Figura 1.
USP 39
Información General/ (1661) Evaluación de Sistemas de Envases 2003
Caracterizar materiales de construcción y determinar sí son apropiados para su aplicación; USP <66 l, l >
Evaluación y Calificación de Sistemas de Envases Analizar el sistema de envase para determinar la presencia de sustancias exrraíbles y evaluar el impacto potencial sobre la seguridad del perfil de sustancias extraíbles; USP <66L2> con referetldaa <1663>
Evaluación y Calificación del Producto Analizar el producto envasado para determin~r la presencia de sustánclas fodvíab)es y evaluar el impacto potencial sobre la seguridad del perfil de sustancias lixíviables; USP<6612>con
Figura 1. El proceso de tres etapas para la caracterizaciqn y la .calificación de seguridad de .los sistemas de envases y sus materiales de construcción. . El proceso para.establecer la aptitud de uso de un sistema de envase incluye lo siguiente: la.caracterización de sus materiales de c:;onstrucción (ingredientes); el análisis y la evaluación del sistema mismo. (sustancias extraíbles); y el análisisy la evaluaci611 del medicamento envasado (sustancias lixiviables). El paso inicial del proceso implica la caracterización química de los mat~ria~ les candidatos de construcción al grado de que la elección de los materiales que se van a usar en la construcción de un sistema de e11vase puede realizarse de manera racional y justificarse científicamente. El paso intermedio de la evaluaciórtdel sistema es útil y necesario, ya que une la brecha entre la evaluación de riesgos de los materiales de partida y la del producto terminado analizado, al mismo tiempo que provee un medio para optimizar el análisis del medicamento. La prueba intermedia es necesaria debido a que los materiales de construcción experimentan un estrés considerable, tal como la exposición a altas temperatu~ ras, al tiempo que son convertidos en componentes del sistema de envase o en el sistema de envase mismo. Además, se pue~ den introducir coadyuvantes de procesamiento y aditivos adicionales durante el proceso de fabricación de un sistema de envase. Por ende, es probable que el perfil de las sustancias extraíbles de un sistema sea diferente y potencialmente más complejo que la suma de los perfiles de las sustancias extraíbles de sus materiales de construcción. Por lo tanto, la evaluación inicial de riesgos realizada durante la selección del material se retoma de manera apropiada mediante el análisis y la calificación del sistema de envase mismo. Por último, el efecto que puede tener el envase sobre el usuario del medicamento es mediado por las sustanci~s derivadas del envase que están presentes en el medicamento. La tercera etapa del proceso es la evaluación del producto, específicamente el análisis de las sustancias lixiviables del producto envasado y la evaluación de su impacto, que tiene en cuenta la exposición del usuario a las sustancias lixiviables.
Evaluación de Materiales: Caracterización, Evaluación y Selección, USP (661.1) Para asegurar que un sistema de envase es adecuado para el uso previsto, es importante seleccionar materiales de construcción que sean adecuados para su uso en sistemas de envases. El análisis y la caracterización de materiales de construcción con respecto a los atributos pertinentes para su aptitud proveen un fundamento racional para la selección de materiales al moment.o de diseñar un sistema de envase. La selección intencional de materiales bien caracterizados minimiza el riesgo de que un sistema fabricado a partir de dichos materiales sea inadecuado. Al considerar específicamente la seguridad, la selección de materiales con una tendencia a ser seguros incrementa la posibilidad de que los sistemas de envases fabricados a partir de estos sean seguros. Por lo tanto, la caracterización de materiales de construcción es el primer paso en el proceso para desarrollar y calificar materiales de envases seguros. Además, los datos de caracterización química pueden también proveer fundamentos parli un control de cambio efectivo y adecuado. La intención del capítulo (661.1) es establecer, con un grado de confianza, si los candidatos potenciales a materiales podrían afe<:tar de manera adversa la calidad y seguridad de los medicamentos. El principio básico de la evaluación de materiales, tal como se refleja en el capítulo {661.1 ), indica que conocer la composición general y ciertas características generales de un material de construcción permite lo siguiente:
2004 (1661) Evaluación de Sistemas de Envases/ Información General
USP 39
USP 39
Información General/ (1661) Evaluación de Sistemas de Envases 2005
~~~1t~Q;;~1·~~l1¡:~1:;g,11•tllH:11Jlillltt~l•
liill~Rlíl
~~l:~lef materfülpára sU·.i:i.Stie~ ·sisteffiaii ·Cié.en· apJk:aciones de .envase. Es responsabiliqad: delta cuado para la aplicación prevista. Por ende, es l(l cj.elcapítulo (66 l .1), ·aunadq iatt~::p¡:tra·.su usoén :µria.·aplitacl·: :•· .• · : <::arno•:ai:temati\fa, ~tr~sljltado:d~ .qr¡aliza:r sístemílls .. e: •. probablelmpa't::to ~o!,ie• la seg~~~clad 1de ~kh~sÜte•.
•\··. (te'r:eactiylcladb:!91 . •·• .••qµ~f'idos po(elll;i:
.·an~lisjs 1~i~ic()t;J~~mkoy:e1 •.. ....· ·1-~): ·.&or'.>~r"de, un· si3fe · ·
. .y.que rum~!e:con la~ ~sp~ific
· 4;fxistendosmediosparademoStrar.queun•material:~e(o.r.1sti:u . ¡·........ . · Hprimer rnedlo es.el. análisis.ditettoyel cumplimiant()cpnl~~~~ujsl(cl~. en usar al material •corí un medi.cámento terminado attu~'mente· i!pl'otfatfcl,1 / · ·.
USP 39
2006 (1661) Evaluación de Sistemas de Envases/ Información General
5. La aplicación de los capítulos <661.1) y (661 .2) a materiales de construcción o sistemas distintos a los sistemas de envase para medicamentos terminados está fuera defakance de estos capítulos, aunque los conceptos y los principios de di<,:hos capítulos pueden ser aplicables y .pertinentes para otros sistemas (y sus materiales de cohstruccíón) tales como dispositivos médicos para la administración de medicamentos; sistemas de fabricación para medicamentos y sistemas de envases/
almacenamiento para• medicamentos. Se espera que en un futuro. se desarrollen capítulos farmacopeicospara tratar estos otros sistemas de irnportancia farmacéutica. 6. El alcance del capitulo (661 .l) son los materiales de construccióh, mientras que el del \661.2)son ·los sistemas de envases. los componentes, que son un tercertipmponente del sistema•de envase que induye la bolsa. Debido a que un componente se fabrica a partir de materiales y es parte de un sistema, si se considera necesario el análisis de componentes, el análisis y las espedficadol'les pertinentes para el componente se encuentran en el capítulo <661.2). las disposiciones en el capítulo {66 l.2) para sistemas de envases se deben cumplir en el caso de los componentes para los que se considere necesario el análisis. El componente debe e~tar fabricado a partir de materiales que cumplan con los requisitos del capítulo (661.1) y el componente debe ser ah(llizado mediante los métodos y cumplir con las especificaciones contenidas en el capítulo \961.2). 7. El af)áfü;is de.111 laminada y IE! etiqueta se consicleran ''sin contacto. directo" debido a que existe al menos una barrera fí~ica (el envase. primado) entre el medi<:amento envasolsa laminada puede considerarse como un componente·"con potencial de interatci~n'' debido a queJas sus~ancias de la sobrebolsa larninaq¡:¡ podrían. migrar a través del envase primario, enespecial .en las condiciones de alta temperatura de Ja esteriliz11ciónJer01inal. Por otra parte, la etiqueta es un componente "sin interacción" debido a que {J) la . sobrebolsalamiriada es irnpermeable y (2) la etiqueta se aplica después del estrés térmico asociado con la esterHizacfón terminal. Por ende, la diferenci(,l entre un cornponente"coJ'.l potencial·de ir:iteracción'' y un componente u sin interacción" "sin contacto .directo" es la permeabilidad de la barrera que separaJos componentes ''sin contacto directo" del. medicamento. Si 1.a barrera es incompleta, entonces el cornponente.(ysusmateriales de construcción) tiene "potencial de interacción" y los materiales deberán analiz11rse de tonformidCld c<>n el ('.apftulo (661.1 ). Si· la l:>arrera es completil, entonces el componente (y sus materiales de constrl..!cdón) son "sin interacci6n''. y no es necesario el análisis delos materiales en conformidad con el capítulo{6ó.l .1). /1
Aplicación ],.Existen dos formas de demostrar que unmate(ial de construc<::ión ha cumplido con los requisitos del capítulo (661.1;. ta primera es realizar el análisis contenk;lo en el capítulo {66 Ll) y cumplir con las especificaciones del capítulo (66 l .1 ). La segunda es usar unmatedal en el sistema de envase de un medicamento terminado y actualmente aprobado .. De manera específica, el capítulo{6.6Ll) indica que los"materiales plásticos de construcción individuales se consideran bien caracte. rizados y adecuados para su uso siempre que se utilicen en un sistema de envase que. cumpla con los requisitos del capítu~ lo{66l.2:) o.si el sistema de envasebasidoconsi.derado adecuado para uso farmacéutico por la autoridad reglamentaria apropiada '.Sin embargo, se hace hincaplé)epque dicha conclusión sólo es válida para el· sistema de envase específico que cumple con los reqL1isitos del capítulo ~~ól.2).Y n~ puede extenderse aotros sistemas de. envases que usen el mismo material (o materiales) de construcc;ión. Si se usa el 111ismo material de construcción en otro sistema de envase, entonces se deberá establecer su aptitud de uso el'! dicho sis~ema de envase. Z. El resultado del análisis dél c;ipítulo (661.l) es que elmateri
USP 39
Información General/ (1661) Evaluación de Sistemas de Envases 2007
el uso adecuado del material analizado. Sin embargo, los datos de caracterización no califican.demanera específica9uni. versal el material para su uso en sistemas de envases debido a que el uso del material puede variar dependiendo de las aplicaciones de los envases. Como alternativa, el resultado del análisis de sistemas de envases plásticos mediante el capítulo (661.2) es una evaluación del probable impacto de la seguridad de dicho sistema sobre el medicamento envasado. Esta evaluación se basa en el análisis de reactívidad biológica, el análisis fisicoquímlco y el análisis de las sustancias extra{bles/ sustancias lixiviables que son requeridos por el capítulo (661.2). Por.ende, un sistema de envase que ha sido analizado en conformidad con el capítulo (661.2) y que cumple con fas espedficaciones contenidas en el capítulo (661.2), incluyendo una evaluación de la seguridad toxicológica de los datos de las sustancias extraíbles y/o las sústarn::ias lixiviables, estáéalifícado para su uso consistente con las condiciones en fas que fue analizado, sujeto a la aprobación .por parte de. la qutoridad reglamentaria apropiada. 3. Las pruebas de identificación requeridas en el capítulo <661.1) sirven al propósito de categorizarun material de modo que se analice de manera adecuada y se evalúe contra las especificaciones adecuadas. Las especificaciones para la lde.ntificac ción se basan en una comparación del resultado de prueba obtenido con el material de prueba versus el del· Estándar de Referencia pertinente. Esta comparación se basa en el concepto de equivalencia sustancial en lugar de especificaciones cuantitativas rigurosas. El establecimiento de la equivalencia sustancial requiere que los resultados del análisisyque el material de prueba contra el Estándar de Referencia se determinen como equivalentes. Aunque las especificaciones individl)ales para los materiales individuales contenidos en el capítulo (661.1) pueden incluir información pertinente para .est¿¡blecer la equivalencia sustancial, esta información por sí misma no se considera una especificación: Por ejemplo, aunquelas especificaciones para la Identificación en el infrarrojo (IR) pueden incluir números de onda específicos, éstos no son especificaciones sino que sirven para el propósito de establecer las característícas generales esperadas de los espectros IR. S.e considera que una prueba de identificación se ha completado con éxito si los resultados analíticos obtenid()s para el artículo de prueba y el Estándar de Referencia son sustancialmente equivalentes y cuando todas las diferencias entre los resultados de prueba para el artículo y el Estándar son explicadas por la naturaleza, el procesamiento y/o la composición del artículo de prueba. 4. El establecimiento del impacto potencial para la seguridad de un material de construcción no puede basarse en una sola estrategia de análisis debido a que una sola estrategia de análisis no es suficiente para identificar todos los atributospotenciales que impactan la seguridad de un material. Por consiguiente, el análisis químico prescrito en el capítuf() {66l.l) es ortogonal: las pruebas fisicoquímicas proveen una visión general de las sustancias extraídas; las pruebas para metales extraíbles tratan fuentes potenciales de impurezas elementales; mientras que las pruebas para aditivos plásticos tratan sustancias extraíbles orgánicas potenciales. También puede suceder que el análisis químico por sísolo·no pueda demostrar todos los atributos potenciales que impactan en la seguridad. Por lo tanto, el análisis químico se incrementa mediante el enfoque ortogonal de establecer reactividad biológica. 5. Un material plástico bien caracterizado se analiza para determinar sus niveles de sustancias extraíbles en relación contados los metales que son componentes conocidos del material plástico. Estos pueden derivarse de los.materialesdepartida usados para fabricar el material plástico, de los reactivos usados en el proceso de fabricación (p.ej., catalizadores) y de los aditivos presentes en los materiales plásticos. Dichos metales se denominan "metales relevantes", Además, f()S materiales se analizan para detectar metales que se especifican en otros documentos farmacopeicos como pertinentes paramateriac les plásticos. Por último, los materiales se analizan para detectar metales que han sido considerados como impurezas elementales que son aplicables a todas las formas farmacéuticas de medicamentos independientemente de. si la fuente eje fas impurezas elementales es agregada de forma intencional o no intencional al medicamento, a sus ingredientes oasu siste~ ma de envase. 6. Los umbrales de informe para metales extraíbles contenidos en el capítulo (661.1) no deben interpretarse como límites. En vez de esto, los umbrales de informe establecen la convención para informar los resultados de los metales extraíbles. En relación con esto, la especificación de la USP para niveles de sustancias extraíbleS: no se basa en que esténpor debajo de un cierto límite, sino en que se informen según lo especificado en el capítulo (661.1 ). 7. Puede darse el caso de que no todos los metales relevantes para un material de construcci6n particular estén indicados en el capítulo (661.1) y de que algunos metales pertinentes se conozcan mediante otros medios (por ejemplo, a través de la certificación del proveedor). Se debe analizar la presencia de todos los metales relevantes, independientemente de su inclusión en el capítulo (661.1 ). Se deben establecer los procedimientos para metales relevantes que no estén especificados en el capítulo (661.1) y deben ser consistentes con los procedimientos usados para metales que se especifican en el capítulo (661.1 ). Se deben establecer especificaciones para metales relevantes que no estén indicados en el capítulo (661.1); dichas especificaciones deben ser consistentes con las especificaciones para metales establecidas en el capítulo (661.1 ). 8. El análisis de metales extraíbles descrito en el capítulo (661.1) se exige para todos los materiales de construcción usados en los sistemas de envases, independientemente de si el material se especifica en el capítulo (661.1 ). Se deben establ~cer procedimientos de prueba para metales extraíbles para materiales que no estén indicados en el capítulo (661. l) y deben ser consistentes con los procedimientos usados para materiales que están indicados en el capítulo (661.1 ). Se deben e.stablecer especificaciones para metales extraíbles para materiales que no estén indicados en el capítulo (661.1 ); didias especificaciones deben ser consistentes con las especificaciones establecidas para materiales indicados en el capítulo {661.1 J. 9. El listado de metales extraíbles específicos en el capítulo (661. l) no tiene la intención de limitar a los patrocinadores o usuarios de materiales que pudieran desear establecer niveles de metales extraíbles distintos a los indicados en el capítulo (661.1 ). Este puede ser el caso debido a que ciertos metales extraíbles adicionales pueden ser aplicables a algunas formas
2008 (1661) Evaluación de Sistemas de Envases/ Información General
USP 39
farmacéuticas y debido a que los métodos analíticos que pueden ser aplicados .a los análisis de metales extraíbles podrían proveer de manera rutinaria datos de metales extraídos distintos a los indicados en el capítulo (661.1 ). Para los casos en los que los patrocinadores indiViduales obtienen resultados de prueba para metales extrafbles distintos a los indicados en el capítulo {661.l}, la expectativa es que dichos metales extraíbles adicionales sean informados de la manera indicada en el capítulo {661. l} para aquellos metales extraíbles indicados en el capítulo (66 U). 1O. El análisis de aditivos plásticos descrito en el capítulo (661 .l) se exige para todos los materiales de construcción usados en sistemas de envases, independientemente de si el material se indica en el capítulo {661..l >. Se deben establecer procedimientos para materiales que no estén indicados en el capítulo {661. l) y deben ser consistentes con los procedimientos usados para m~teriales que están indicados en el capítulo (661.1 ). Se deben establecer especificaciones para materiales que no estén indicados en el capítulo (661.1 ); dichas especificaciones deben ser consistentes ton las especificaciones establecidas para materiales que están indicados en el capítulo {661.1 ). 11, Es responsabilidad del usuario de los materiales que no se encuentren actualmente listados en el capítulo {661.1 ): (a) desarrollar los métodos de prueba y especificaciones requeridas de acuerdo con los puntos citados previamente; (b) justificar dichos métodos de prueba y especificaciones, considerando específicamente su consistencia con métodos de prueba y especificaciones existentes para materiales actualmente listados en el capítulo (661.1 ); y (c} poseer los resultados de prueba obtenidos al analizar el material, de acuerdb con las pruebas descritas en los puntos citados con anterioridad. 12: Además, es posible qúe los materiales indicados en el capítulo. puedan contener aditivos que no se tratan en el capítulo (661,1}. Estos materiales deben analizarse para determinar la prese!'lcia de dichos aditivos; Se deben establece.r procedimientos para aditivos que no estén indicados en el. capítulo {661'1 /y de.ben ser consistentes con los procedimientos usa. dos .para materiales que están indicado,} en el capítulo {661 .1 ), Se. deben establece.r ·especificaciones para aditivos que no estén indicados en el capítulo (661.1 }; dichas especificaciones deben ser consistentes con las especificaciones establecidas . . . . · . . · para materiales. que e~tán indicados en el capítulo (661.l ); 13.. El únic;.o propósito de las pruebas para aditivos plásticos es establecer qué aditivos están presentes y asegurar que se conozqm 1.os niveles de estos aditivos. Esta información es relevante debídó a que .los aditivos, por lo regular, s~m una fuente de sustancias e~trafbles y sustancias lixiviables. . . . . . . •. . .· .. l•t La recomendaci6n depruebasespet;íficas1 métodos de prueba y pat'.ámetrosde prueba.en el capítulo.(661 :nne>.restrin· · gen el uso de otros métodos1 pr!)c;.edlmientos o pacámetros. adecuados, aunque las condiciones presentadas en el capítulo {~61 ;l)tiehen prlondad para propósitos oficiales. Se debe demostrar que los méto(!os de. prueba y las c;.ondkic;¡nes alternatiyas.sén apropiados mediante datos devalidación adecuadosysuficiéntes; Entre los.aspectos .importantes delos·. métodos alternativos se ·incluye la. totalidad del proceso de extracción y ·la especificidad, la sensibilidad y fa apli<:abilídad ele los métodos de prueba analíticos. Los métodos de extracción empleados deben tener una capacidad demos~rada para· transferir cuantitativamente. aditivos del rn¡1tertal al medio de extracción y deben hace'l'lo sin modificarla naturalezaqi.Jímí<;é\ · del aditNo~ a menos que dicha m0dif1<:ación s.ea una parte integral de la metodplogía de prueba~ Los m~~odQs de prueba >empleados det:>entener una capacidad equivalente cómparada con los méte>dos de Prueba contenidos en e1 capítulo ·•(661.1} para prpducir !Jna identiftcación clara y no ambigua.de todos los aditivos pertinentes a niveles que sean al menos tan bajos como los r:iiveles indicados éo el capítulo \661.1 ); . . ·. . . ... . . .. . .·.. . . l:S·. A pesa.r'del pu11to 14, no es adecuado sustituir las pruebas requeridas pone! capítulo {661.l)con .ptuebas alternativas. Por · · <;onsiguieote,. a mane~ de ejemplo,. no es adecuado sustitt¡ir la prueba de Carbono. Orgán.ico Tot(1/ i11dícada en 'f}.ru.ebas Físícoq1.1ímicas eón una prueba de sustancias oxidables. Además, no. se permite s.ustituír las .especifi~aeion~s presentes en el capítulo ((;i6'Ll) a menos que se }ustifique y que es.tén su¡etas a .la, aprobación de 1.a aútoriqad r.eglamen~aria apropiada. 16. En al menos dos secciones (Metales Extraíbles y Aditivos Plásticos), el capítulo {661.1 > requiere analizados mate.riales para todos los analitos l'elevantes. Claramente, un arialifo estará. presente en ún ·materi~I si se agrega de maner.a lnú'lnc.ional o •qué se sabe que se na agregado al material durante su producción o..si el análisís del matefía.1 ha>revetadóla preseocia del ·. analito. Aunque los métodos de prueba incluidos en el {'.apítulo. (661.l) pueden tener un alcance sufidentemente amplio .para detectar todos l9s m.etales o·aditivos relevantes, este no síempre es el c;.aso, por lo.que no se Puecle esperar que tos métodos revelentodüS lo.s. a.nalitos r:elev¡:mtes ...Puede presentarse el caso en.queel proveedor dél material cuente.con có~ nacimiento. que pudiera no.estar disponible para el ysuario delma.terial y que esté relacionado con el establecimientode analitos .relevantes. Por ende, es t'azonableesperarque losproveedores y los usuarios del materialtrabajen·juntospara crear una lista completa y sólida de analitos relevantes. Es de particular importancia que el proveedor del material informe al usuario del material cuando sea claro para el proveedor que el usuario ha fallado en detectar un analito relevante en el análisis del usuario. . . . Es razqnable anticipar que puede haber información que el provéedor no está en posición de compartir con el usµario del material: Sin embargo, es de primordial interés para el proveedor y el usuario que un material esté bien caracterizado y que la caracterización incluya todos los analitos relevantes. Por ende, se recomienda firmemente que el proveedor y el usuario encuentren una forma de.establecer todos los analitos relevantes. Por ejemplo,. considérese el. caso de los metales extraíbles. Aunque puede darse el c;.aso de que el proveedor del material rechace compartir información detallada sobre el. uso de un reactivo que contiene cinc en la preparación de un material, es adecuado pata propósitos de caracterización del material que el proveedor informe que el cinc debe tratarse como un analito de interés.
USP 39
Información General/ (1661) Evaluación de Sistemas de Envases 2009
Descripción de Polímeros Contenidos en el Capítulo <661 .1 ) POLIETILENOS Los polietilenos de alta y baja densidad son polímeros basados en etileno de cadena larga sintetizados en condiciones controladas de calor y presión con ayuda de catalizadores a partir de no menos de 85,0% de etileno y no menos de 95,0% de olefinas totales. Los ingredientes distintos a las olefinas de uso más frecuente son el buteno, et hexeno y el propileno. El polietileno de baja densidad (LDPE, por sus siglas en inglés) contiene muchas ramas de cadena larga a lo largo de la estructura del polfmero, lo cual evita la alineación y la compactación de las cadenas; formando así un material de baja densidad. El polietileno lineal. de baja densidad (LLDPE, por sus siglas en inglés) contiene diversas cadenas cortas a lo largo de la estructura pofünérica que evita la alineación y la compactación de las cadenas poliméricas, creando asíun·material cristalino pobre. El polietileno de alta densidad (HDPE, por sus siglas en inglés) contiene rel.ativamente pocas cadenas laterales, lo que permite a la estruc~ tura polimérica alinearse y compactarse, produciendo así un plástico cristalino de alta de.nsidad. Los polietilenos de alta, baja y lineal de baja dehsidad tienen un espectro de absorción IR que es distintivo para el polietileno y cada uno posee propiedades térmicas característieas. Elpolietileno de alta densidad tiene una densidad de entre 0,94ly 0,965 g/cm3. El polietileno de baja densidad tiene una densidad de entre 0,850 y 0,940 g/cm3. los aditivos se agregan al polímero para optimizar sus propiedades químicas, físicas y mecánicas, lo que lo vuelve adecuado para.el uso previsto. Estos aditivos pueden incluir agentes nudeantes, agentes clarificantes, antioxidantes, colorantes, lubricantes, agentes antibloqueo, entre otros. Estos aditivos por lo regular están presentes de manera in.dividua! en eJ polietileno a niveles de 0,01 a 0, 3 en% en peso, y los niveles totales de anti· oxidantes son por lo regular menores a 0,3%. Por lo general, se encuentran prese11tes otros aditivos, específicamente amidas y estearatos, de manera individual en .los polietilenos a niveles de 0,5 % en peso o menos.. los materiales de polietileno que prqveen protección contra la luz pueden contener hasta 4% en peso de óxido de titanio. POLIPROPILENO Los.polímeros de polipropileno son polímeros de cadena larga sintetizados a partir de propileno.u otras olefinas, por ejemplo, el etileno o el buteno,.en condiciones controladas de calor y presión con ayuda de cataliz.adores..Sé agrega un determina· do número de aditivos al. polímero .para optimizar sus· propiedades químicasr físicas y mecánicas, lo que lo vuelve adecuado para el uso previsto. Estos aditivos pueden incluir agentes nudeantes, agentes clariflcantes, antioxidantes, colorantesí lubricantes, agentes antibkiqueo, entre otros. Estos aditivos por lo regular están presentes de manera: individual en los polipropilenos a nivetes de 0,01 a 0, 3 .% en peso; y léls nivel.es totales de los antioxidantes por lo general son menores a 0,3%, El polipropileno que provee protección contra la luz puede contener tanto como 4% en peso' de óxido de titanio. OLEHNAS CÍCLICAS Los copolímeros de olefina cíclica se fabrican mediante la copolimerizaciónde una olefiha cíclica (p.ej., cjclopenteho, norbofneno) con una .dlefiha tal como el etilerto o el propileno. La reatción de polimerizar una cit;:loolefina que resulta en Un polímero se éohoce c Las resinas de polímero de olefiha cíclica por lo regular :se sóministran en forma de pellety son adecuadas para técnicas de procesamiento de. polí)l:teros tales como extrusión, moldeado por inyección; moldeado por :Soplado dé inyección, moldeado por compresión, .termo formación, entre otros. Debido a .que son amorfas, y dada su alta· pureza, capacidad de barrera. cohtta la humedad, la claridad y la compatibilidad con la esterilización, las olefinas ·cíclicas son 1.1na alternativa excelente al vidrio en una amplia variedad de productos médicos, ineluyendo erenvasado. las olefinas cíclicas presentan una buena resistenci¡¡ qoímkíl y, por lo general, se consíderan de alta pureza con niveles bajos de sustancias extraíbles. Sin embargo,los copolímeros de olefína eíclica pueden contener coadyuvantes de procesamiento~ residuales, colorantes y antioxidantes. TEREFTALATO DE POLIETILENO Y TEREFTALATO G DE POLIETILENO Los polímeros de tereftalato de polietileno (PET, por sus siglas en inglés) son polímeros cristalinos de cadena larga preparados mediante la condensación de etilenglicol con tereftalato de dimetilo o ácido tereftálico. las resinas de copolímero de PET se preparan de manera similar, excepto que además pueden contener una pequeña cantidad de ácido isoftálico (no más de 3% en base molar) o 1,4-ciclohexanodimetanol (no más de 5% en base molar). la polimerización se lleva a cabo con ayuda de catalizadores y estabilizantes. Los polímeros de PET pueden contener sílice o silicatos (no más de 0,5% en peso) y pueden contener colorantes. CLORURO DE POLIVINILO PLASTIFICADO Los polímeros de cloruro de polivinilo (PVC, por sus siglas en inglés) son polímeros de cloruro de polivinilo de cadena larga sintetízados a partir de monómeros de cloruro de polivinilo mediante polimerización de radicales libres. Se incorporan diversos aditivos en el PVC para proveer materiales con propiedades que los hagan adecuados para el uso previsto. Estos aditivos pue-
201 O (1661) Evaluación de Sistemas de Envases/ Información General
USP 39
den incluir estabilizantes de calor, plastificantes primarios y secundarios, estabilizantes, modificadores de impacto, lubricantes, pigmentos, entre otros. Estos aditivos por lo regular están presentes de manera individual en el PVC a niveles que van de O, 1 a 45% en peso.
APLICABILIDAD Y APLICACIÓN DEL CAPÍTULO (661.2)
Aplicabilidad 1. El titular de la solicitud del medicamento y el fabricante del medicamento (como es el caso de muchos productos de venta libre, en el que no existe una solicitud) tienen la responsabilidad primordial y están obligados a asegurar el cumplimiento de los requisitos del capítulo. Los medios por los que el titular de fa solicitud del medicamento y el fabricante del medicamento obtengan la información para cumplir con los requisitos quedan a discreción del titular. 2. El capítulo (661.2) trata únicamente con sistemas de envases. Los componentes de los sistemas de envases pueden analizarse de acuerdo con el capítulo (661.2) a discreción del titular de la solicitud del medicamento y de acuerdo con lo aprobado por la autoridad reglamentaría. Los materiales de construcción no se analizan usando el capítulo \661.2).
Aplicación 1 . La caracterización química de tos extractos de los sistemas de envases (sustancias extraíbles) o de los medicamentos envasados (sustancias líxiviables), seguida por la evaluación de la seguridad toxicológica, se reconoce universalmente como un medio necesario y adecuado para establecer el impacto de la seguridad entre los sistemas de envases y sus cohten.idos. Por ende, el capítulo (661.2) requiere demostrar que todos los sistemas de envases son seguros mediante la realización de una evaluación química. Sin embargo, el capítulo {661.2) no especifica los detalles del proceso de evaluación química en lo que respecta a los métodos de prueba o a las especificaciones. En su lugar, el capítulo (661.2) hace referencia a capítulos informativos pertinentes ((1663) para sustancias extraíbles y (1664) para sustancias lixiviables) con lo que provee a los usuarios del capítulo \661.2) medios para diseñar e implementar evaluaciones de las sustancias lixiviables o sustancias extraíbles efectivas, eficaces, basadas en riesgos y hasta cierto punto personalizadas que cumplen con los requisitos regla~ mentarios. 2. El capítulo (661.2) provee a los titulares de solicitudes de los sistemas de envases o medicamentos y/o a los fabricantes de medicamentos Ja flexibilidad de operar dentro del contexto de su situación específica y su propia filosofía de gestión de riesgos. la desventaja de tener tal flexibilidad es que es responsabilidad de los titulares y los fabricantes justifitar sus métodos de prueba y especificaciones. Resulta apropiado y adecuado que exista la justificación y que esta pueda juzgarse (y aprobarse) fundamentalmente por sus méritos científicos individuales y de gestión de riesgos. 3. Las sustancias lixiviables cuyas fórmulas químicas incluyan metales de transición, metaloides, otros metales y lantánidos y actínidos son impurezas elementales. En la medida en que las sustancias extraíbles sean un reflejo de las sustancias lixiviables, las sustancias extraíbles pueden considerarse como potenciales impurezas elementales. El capítulo Impurezas Elementales-Límites (232) contiene especificaciones para impurezas elementales en los medicamentos. De cierta manera, estas especificaciones son relevantes para los sistemas de envases debido a que las sustancias lixiviables de composición adecuada representan una cierta proporción de la carga de impurezas elementales de un medicamento. Sin embargo, si no se conoce la proporción, entonces las especificaciones del capítulo (232) para los medicamentos no pueden traducirse directamente a especificaciones para sustancias lixiviables que son por sí mismas impurezas elementales. Por consiguiente, el. capítulo (661.2) requiere que los 1ixiviables que son impurezas elementales sean evaluados toxicológicamente de manera apropiada para determinar su impacto potencial sobre la seguridad y correctamente hacer notar la existencía del capítulo (232). Sin embargo, el capítulo <661.2} no pretende, particularmente, usar las especificaciones de producto contenidas en el capítulo (232) para establecer especificaciones para las sustancias lixiviables como un medio para establecer el impacto sobre la seguridad . .&USP39
(1663) EVALUACIÓN DE SUSTANCIAS EXTRAÍBLES RELACIONADAS CON ENVASES FARMACÉUTICOS Y SISTEMAS DE ADMINISTRACIÓN PROPÓSITO Este capítulo de información general presenta un marco para el diseño, la justificación y la ejecución de una evaluación de sustancias extraíbles para envases farmacéuticos y sistemas de administración. Este capítulo establece los alcances críticos de una evaluación de sustancias extraíbles y analiza los aspectos prácticos y técnicos de cada alcance. Aunque está destinado a ser
USP 39
Información General/ (1663) Sustancias Extraíbles 2011
un recurso útil y de aplicación general, este capítulo es para propósitos informativos y no establece condiciones específicas de extracción, procedimientos analíticos o especificaciones para sustancias extraíbles ni criterios de aceptación obligatorios para envases y sistemas de administración o formas farmacéuticas particulares; tampoco describe cada situación en la que se requiere una evaluación de sustancias extraíbles. Resulta imposible anticipar y abarcar en una explicación general para todas las situaciones en las que podría requerirse una evaluación de sustancias extraíbles. Diseñar una evaluación individual de sustancias extraíbles es un proceso que requiere el equilibrio entre conocimientos científicos, la asignación prudente de recursos y la gestión efectiva de riesgos. Lograr este equilibrio es responsabilidad y obligación del fabricante del medicamento y supone tener debidamente en cuenta todos los requisitos legales y reglamentarios aplicables. Los principios y las mejores prácticas demostradas que se describen en este capítulo general representan una interpretación consensuada de conocimientos científicos y, por lo tanto, se puede aplicar a cualquier situación en la que se requiera una evaluación de sustancias extraíbles para la aplicación farmacéutica.
TÉRMINOS CLAVE Este capítulo general usa los términos clave listados a continuación ( 7, 2; ver también Requisitos de Envasado y Almacenamiento (659)). Se debe tener en cuenta que los términos Sistema de Envase, Componente del Envase, Componentes de los Envases Primarios, Componentes de los Envases Secundarios y Materiales de Construcción también se definen en el capítulo (659), y que las definiciones aquí presentadas se proveen a modo de aclaración dentro del contexto de este capítulo y no pretenden reemplazar a las provistas en el capítulo (659). Sistema de Envase (también referido como sistema de envase-cierre): Se refiere al conjunto de componentes de los envases y materiales que contienen y protegen el artículo, e incluye los componentes de los envases primarios, secundarios y terciarios. Sistema de Administración: Se refiere al conjunto de componentes y materiales que se usan para transportar un medicamento de su envase al punto de administración al paciente. Por ejemplo, un equipo de administración es un sistema de administración que se usa para transferir medicamentos líquidos de su sistema de envase plástico al sitio de administración en el paciente. Debe tomarse en cuenta que, en algunos casos, el sistema de envase por sí mismo puede llevar a cabo la función de administración. Envase: Recipiente que contiene un compuesto intermedio, ingrediente farmacéutico activo, excipiente o forma farmacéutica, y que está en contacto directo con el artículo. Cierre: Material que sella un espacio abierto en un envase y que provee protección al contenido. Además, provee acceso a los contenidos del envase. El Componente del Envase se refiere a cualquier parte del envase o del sistema de envase-cierre, incluyendo el envase (p.ej., ampollas, jeringas prellenadas, viales, frascos); los cierres (p.ej., tapas de rosca, tapones); los casquillos y sobresellos; los recubrimientos internos del cierre; los sellos internos; los puertos de administración; las envolturas; los accesorios de administración; las etiquetas; las cajas de cartón y el envoltorio plástico. Los Componentes de los Envases Primarios son componentes de los envases que están en contacto directo o que pueden entrar en contacto directo con el artículo.(p.ej., bolsa IV). Los Componentes de los Envases Secundarios son componentes de los envases que están en contacto directo con un componente de los envases primarios y puede proveer protección adicional para el producto (p.ej., sobre bolsa o forro para una bolsa IV). El Envase Terciario es un componente de los envases que está en contacto directo con un componente de los envases secundarios y que puede proveer protección adicional del producto durante el transporte y/o el almacenamiento (p.ej., caja de cartón para el transporte de una bolsa IV con sobre bolsa). Los Componentes Auxiliares son componentes o entidades que pueden entrar en contacto con uno de los componentes de los envases terciarios durante la distribución, el almacenamiento y el transporte del producto envasado (p.ej., paletas, tarimas, envoltorio plástico). Los Materiales de Construcción de los envases son las sustancias que se usan para fabricar los componentes de los envases. También se les denominan Materias Primas. Las Sustancias extraíbles son entidades químicas orgánicas e inorgánicas liberadas a partir de un envase farmacéutico/sistema de administración, componente del envase o materiales de construcción de los envases y en un disolvente de extracción en condiciones de laboratorio. Dependiendo del propósito específico del estudio de extracción (que se analiza más adelante), dichas condiciones de laboratorio (p.ej., disolvente, temperatura, estequiometría, etc.) pueden acelerar o exagerar las condiciones normales de almacenamiento y uso para una forma farmacéutica envasada. Las sustancias extraíbles por sí mismas, o las sustancias derivadas de estas, tienen el potencial de lixiviarse en un medicamento en condiciones normales de almacenamiento y uso, y, por ende, se convierten en lixiviables. Los lixiviables son entidades químicas extrañas orgánicas e inorgánicas que están presentes en un medicamento envasado debido a que se han lixiviado en el medicamento envasado a partir de un envase /sistema de administración, componente del envase o materiales de construcción de los envases en condiciones normales de almacenamiento y uso o durante estudios acelerados de estabilidad del medicamento. Debido a que los lixiviables se derivan del envase o sistema de administración, no se relacionan con el medicamento mismo ni con el vehículo o ingredientes de éste. Los lixiviables están presentes en un medicamento envasado debido a la acción directa del medicamento sobre la fuente del lixiviable. Por lo tanto, los lixiviables generalmente se derivan de los envases primarios o secundarios, debido a que los envases primarios o secundarios pueden servir co-
2012 (1663) Sustancias Extraíbles / Información General
USP 39
mo una barrera entre el medicamento envasado y otras fuentes potenciales de entidades químicas extrañas (tales como envases terciarios y componentes auxiliares). En ciertas circunstancias, el envase puede entrar en contacto directo con el paciente bajo condiciones clínicas típicas del uso regular (por ejemplo, la boquilla de un inhalador de dosis fija). Como resultado de este contacto, los pacientes pueden quedar expuestos a los lixiviables de los envases sin la acción del medicamento. Los lixiviables son por lo regular un subconjunto de sustancias extraíbles o se derivan de éstas. Los materiales migrantes también son entidades químicas orgánicas e inorgánicas extrañas que están presentes en un medicamento envasado debido a que se han lixiviado en el medicamento envasado a partir de un envase/sistema de administración, componente del envase o material de construcción de los envases en condiciones normales de almacenamiento y uso o durante estudios acelerados de estabilidad del medicamento. Sin embargo, la diferencia entre los materiales migrantes y los lixiviables es que los primeros se acumulan en el medicamento envasado después de que han cruzado una barrera física, tal como la provista por un envase primario o secundario. Debido a que los materiales migrantes cruzan una barrera física, su presencia en el medicamento envasado no se debe a la acción directa del medicamento sobre la fuente del material migrante, puesto que la barrera evita dicha acción directa. Por ende, los materiales migrantes se derivan de los envases secundarios y terciarios y de los componentes auxiliares. Independientemente de si una sustancia es un lixiviable o un material migrante, sigue siendo una sustancia extraña en el medicamento envasado, por lo que su impacto debe evaluarse de la misma manera. Sin embargo, debido a que los medios que generan la presencia de lixiviables y de materiales migrantes en un medicamento envasado pueden ser diferentes, los estudios de sustancias extraíbles, cuyo propósito es tratar los lixiviables, pueden diseñarse e implementarse de manera distinta a los estudios de sustancias extraíbles enfocados en tratar materiales migrantes. Los Estudios de Extracción son los procesos generales de laboratorio requeridos para crear perfiles de sustancias extraíbles de envases farmacéuticos/sistemas de administración, componentes de envases o materiales de construcción particulares. Los estudios de extracción también reciben el nombre de Estudios de Extracción Controlada. La Caracterización se refiere al descubrimiento, a la identificación y cuantificación de cada entidad química orgánica e inorgánica individual presente en un extracto por encima de un nivel o umbral especificado. Dichos umbrales pueden estar basados en aspectos a considerar con respecto a la seguridad del paciente, de los materiales, las capacidades de la tecnología analítica, entre otros. La Exploración es el proceso de adquirir información química general que provea entendimiento sobre la naturaleza y la magnitud de las sustancias extraíbles. El Descubrimiento es el proceso de buscar, y finalmente encontrar, entidades químicas orgánicas e inorgánicas individuales presentes en un extracto. La identificación es el proceso de asignar una estructura molecular a una sustancia extraíble orgánica, o de asignar elementos constituyentes en el caso de una sustancia extraíble inorgánica. La cuantificación es el proceso de medir el nivel o la concentración de una entidad química individual orgánica o inorgánica contenida en un extracto. Los Perfiles de Sustancias Extraíbles son representaciones analíticas cualitativas y/o cuantitativas del contenido de sustancias extraíbles de un medio de extracción particular y un conjunto de condiciones de extracción de laboratorio. Las correlaciones entre lixiviables-sustancias extraíbles se establecen cuando los lixiviables observados del medicamento están vinculados cualitativa y cuantitativamente con las sustancias extraíbles derivadas del envase /sistemas de administración asociados, de los componentes de los envases o de los materiales de construcción. El Umbral de Preocupación de Seguridad (SCT, por sus siglas en inglés) es el umbral por debajo del cual un lixiviable tiene una dosis tan baja que presenta riesgos inapreciables para la seguridad a partir de efectos tóxicos carcinógenos y no cancerígenos. El Umbral de Evaluación Analítica (AET, por sus siglas en inglés) es el umbral en el cual o por encima del cual un lixiviable debería ser caracterizado e informado para su evaluación toxicológica. El Umbral de Evaluación Analítica se puede derivar matemáticamente del Umbral de Preocupación de Seguridad (o de otros conceptos de umbrales) basándose en factores que incluyan los parámetros de dosificación del medicamento. Cuando se realiza un estudio de extracción con el propósito de estimar los niveles de acumulación de lixiviables, el Umbral de Evaluación Analítica puede ser aplicable a las sustancias extraíbles y a los lixiviables. El concepto del Umbral de Evaluación Analítica se trata en gran detalle en el capítulo Evaluación de Sustancias Lixiviables en Medicamentos Relacionadas con Envases Farmacéutico y Sistemas de Administración (1664). Tal como se mencionó, se encuentra disponible terminología y definiciones relacionadas adicionales ( 1, 2 y el capítulo (659)).
ALCANCE Se pretende que los principios científicos y las mejores prácticas descritas en este capítulo general sean aplicables a todas las evaluaciones de sustancias extraíbles o estudios de extracción de envases farmacéuticos/sistemas de administración, componentes de los envases o materiales de construcción, cuyos resultados se vayan a utilizar para el establecimiento de perfiles de sustancias extraíbles. Los perfiles de sustancias extraíbles se pueden usar en una variedad de aplicaciones de desarrollo y fabricación farmacéuticos, incluyendo caracterización, selección y calificación de materiales de construcción, componentes de los envases o envasado/sistemas de administración; establecimiento de correlaciones entre lixiviables-sustancias extraíbles; y/o para simular perfiles de lixiviables de medicamentos en las condiciones más exigentes. Cuando resulte apropiado, los perfiles de sustancias extraíbles también pueden usarse para establecer correlaciones ente lixiviables-sustancias extraíbles conforme a lo descrito en el capítulo Evaluación de Sustancias Lixiviables en Medicamentos Relacionadas con Envases Farmacéuticos y Sistemas de
USP 39
Información General/ (1663) Sustancias Extraíbles 201 3
Administración (1664). Estos principios científicos y mejores prácticas también pueden aplicarse a materiales de construcción y componentes funcionales del equipo usado para fabricar fármacos y medicamentos, p.ej., filtros, tuberías y cisternas. Además, estos principios y mejores prácticas pueden aplicarse a materiales de construcción para los componentes de dispositivos médicos de un producto de combinación (2), teniendo en cuenta las guías y los reglamentos que aplican específicamente a dispositivos médicos. Los principios científicos y mejores prácticas son aplicables a todas las organizaciones e individuos implicados en la fabricación de fármacos, medicamentos y en sus estudios de estabilidad, incluidos pero no limitados: • Fabricantes de fármacos y medicamentos para uso humano y veterinario cuya fabricación implique operaciones en las instalaciones del titular de la solicitud del registro (es decir, instalaciones que pertenezcan al titular de una Solicitud aprobada para Nuevo Medicamento o Solicitud Abreviada para Nuevo Medicamento aprobada) o en las de un contratista del titular de la solicitud • Fabricantes de productos de combinación • Operaciones de envasado por parte del fabricante o de un contratista designado por el titular de la solicitud • Operaciones de reenvasado en las que el medicamento pudiera ser propiedad de una organización diferente al fabricante primario Los fabricantes y productores de envases farmacéuticos/sistemas de administración, componentes de los envases y materiales de construcción también pueden aplicar estos principios científicos y mejores prácticas, según sea apropiado.
ANTECEDENTES Durante el transcurso de su fabricación, envasado, almacenamiento, distribución y administración, las formas farmacéuticas y sus componentes pueden entrar en contacto con componentes y materiales de construcción de equipo de fabricación y envasado, así como con componentes y sistemas de envases primarios y secundarios. Dicho contacto puede generar interacciones entre la forma farmacéutica y estos componentes y materiales. Una de estas interacciones es la migración o lixiviación de sustancias a partir de cualquiera de estos componentes y materiales dentro la forma farmacéutica con la administración subsiguiente al paciente durante la administración del medicamento. Los pacientes también pueden quedar expuestos directamente a sustancias mediante contacto directo con el envase/sistema de administración durante la administración del medicamento. Los lixiviables, que pueden incluir entidades químicas orgánicas e inorgánicas de amplia diversidad química, son un asunto de interés debido a su riesgo potencial para la seguridad de los pacientes y a los riesgos potenciales para la compatibilidad del medicamento (p.ej., interacción/degradación del fármaco, cambio de pH, cambio de apariencia, formación de partículas, agregación de proteínas/cambio de estructura, entre otros). Para evaluar estos riesgos y para gestionar los problemas potenciales presentados por los lixiviables, es necesario conocer sus identidades y niveles de acumulación en el medicamento terminado durante la vida útil. Estos dos datos pueden usarse para establecer la magnitud de la exposición al paciente (dosis) y, por lo tanto, el riesgo de seguridad que presenta un lixiviable individual, así como la probabilidad de cualquier problema de compatibilidad relacionado con el medicamento. Las guías reglamentarias y las diversas recomendaciones de las mejores prácticas establecen que la evaluación del impacto potencial del contacto entre un componente o material y una forma farmacéutica final implica evaluar la forma farmacéutica final con respecto a los lixiviables. Esta evaluación puede incluir un estudio de migración o de lixiviables cuyo propósito es descubrir, identificar y cuantificar lixiviables que hayan migrado del sistema, componentes o materiales contactados y que se hayan acumulado en la forma farmacéutica. Alternativamente, esta evaluación puede implicar la realización de un estudio de simulación de extracción, cuando pueda justificarse el uso de dicho estudio en lugar de un estudio de migración. Existen muchas razones científicas y prácticas por las que, regularmente, la evaluación de lixiviables no debe usarse como el único medio de evaluación. Debido a que el envase farmacéutico/sistema de administración es la fuente primaria de lixiviables potenciales, por lo general resulta apropiado que toda evaluación de lixiviables esté precedida por una evaluación de sustancias extraíbles realizada al envase/sistema de administración, a los componentes de su envase primario y a algunos componentes críticos de los envases secundarios que no entran en contacto pero que potencialmente podrían interactuar, y/o a los materiales de construcción del envase y sistema de administración, en apego a las guías reglamentarias y las recomendaciones de mejores prácticas. Dicha evaluación de sustancias extraíbles también se puede llevar a cabo en componentes y/o materiales de construcción del equipo de fabricación y envasado particulares, así como en ciertos componentes de los envases terciarios, que consideren un alto potencial de lixiviación y que hayan estado involucrados en un problema identificado de lixiviables en un medicamento dado. La evaluación de sustancias extraíbles se puede usar para: • Caracterizar el envase/sistemas de administración, los componentes de los envases, los componentes de dispositivos médicos de productos de combinación, los componentes de fabricación y sus diversos materiales de construcción • Facilitar el desarrollo oportuno de envase/sistemas de administración de formas farmacéuticas, sistemas y procesos de fabricación efectivos y seguros, al ayudar con la selección de componentes y materiales de construcción • Entender los efectos que tienen los diversos procesos de fabricación (p.ej., esterilización) sobre los componentes de los envases y sus lixiviables potenciales • Establecer el perfil de lixiviables potenciales en las condiciones más exigentes de una manera que facilite el estudio de los lixiviables, el desarrollo de especificaciones y criterios de aceptación para lixiviables (cuando así se requiera) y la evaluación de seguridad/calificación de lixiviables potenciales y reales
2014 (1663) Sustancias Extraíbles / Información General
USP 39
• Establecer el perfil de lixiviables potenciales en las condiciones más exigentes de una manera que facilite la evaluación de seguridad/calificación de probables lixiviables cuando no sea científicamente posible determinar los lixiviables reales • Facilitar la evaluación de la exposición del paciente a las entidades químicas que resultan del contacto directo entre un tejido corporal del paciente (p.ej., boca, mucosa nasal) y un componente de los envases o de un dispositivo médico de un producto de combinación (p.ej., el accionador o la boquilla de plástico de un inhalador de dosis fija) • Facilitar el establecimiento de correlaciones cualitativas y cuantitativas entre lixiviables-sustancias extraíbles •Facilitar el desarrollo de especificaciones y criterios de aceptación de sustancias extraíbles (cuando así se requiera) para los componentes de los envases, componentes de dispositivos médicos de productos de combinación y materiales de construcción • Facilitar investigaciones sobre los orígenes de lixiviables identificados cuya presencia ocasione problemas de calidad y/o seguridad (tales como resultados fuera de la especificación) para un producto comercializado Estas son las formas en las que las evaluaciones de sustancias extraíbles pueden sustentar los principios de Calidad por Diseño (QbD, por sus siglas en inglés) para el desarrollo y la fabricación de envases farmacéuticos/sistemas de administración y de medicamentos. Se debe tener en cuenta que, aunque la caracterización de los envases /sistemas de administración y materiales es un objetivo de las muchas evaluaciones de sustancias extraíbles, las guías reglamentarias y las recomendaciones de mejores prácticas claramente enfatizan que las evaluaciones de sustancias extraíbles también sirven como investigaciones de lixiviables potenciales (7-6). Como se mencionó previamente, este capítulo no tiene como objetivo identificar cada uno de los casos en los que se requiere una evaluación de sustancias extraíbles para envases/sistemas de administración, componentes individuales de los envases o materiales de construcción para algún tipo de forma farmacéutica particular. Esto es responsabilidad del Titular de la Solicitud de Nuevo Medicamento (titular de la solicitud) quien asume los aspectos apropiadas a considerar con respecto a las guías reglamentarias aplicables. Este capítulo trata la cuestión de "Si es necesaria una evaluación de sustancias extraíbles, así como los principios científicos y las mejores prácticas demostradas en las que debe basarse su realización." Debido a que llevar a cabo una evaluación de sustancias extraíbles implica los procesos de descubrimiento e identificación, conocer el artículo de prueba, en especial su composición, puede facilitar dicha evaluación. Por ende, se recomienda ampliamente que el evaluador del artículo de prueba y el proveedor del artículo de prueba colaboren de tal manera que el primero tenga acceso a información crítica que ayude al diseño y a la implementación de un estudio de extracción efectivo y eficiente. Asimismo, se hace énfasis en que la caracterización del artículo de prueba de acuerdo con el capítulo Materiales Plásticos de Construcción (661.1) proveerá información que es útil para el diseño y la implementación de estudios de extracción. Lograr los objetivos de una evaluación de sustancias extraíbles requiere llevar a cabo un estudio de extracción para crear perfiles de sustancias extraíbles. Un estudio de extracción tiene dos dimensiones críticas: generación en el laboratorio del extracto (extracción) y análisis del extracto (caracterización).
GENERACIÓN DEL EXTRACTO Conceptos Generales y Parámetros Críticos del Diseño Experimental Las sustancias extraíbles se derivan de diversas fuentes y tienen una extensa diversidad química. Las fuentes primarias de sustancias extraíbles incluyen: • Aditivos químicos en componentes de envases elastoméricos/poliméricos individuales y materias primas, incluyendo impurezas en dichos aditivos • Entidades químicas y aditivos que están presentes en los componentes de los envases de vidrio y metal • Entidades relacionadas con la disolución del componente del envase mismo (p.ej., hierro extraído de un material de acero inoxidable, silicio extraído del vidrio) • Monómeros y oligómeros con pesos moleculares mayores derivados de la polimerización incompleta • Migrantes de componentes de envases secundarios y terciarios, tales como tintas, adhesivos de etiquetas y sustancias volátiles provenientes del embalaje de cartón, bolsas plásticas de almacenamiento y otros materiales de ayuda para el transporte tales como tarimas de madera • Residuos superficiales, tales como aceites pesados y agentes desengrasantes en latas y envases metálicos • Sustancias químicas en las superficies de la maquinaria de fabricación de componentes u otros sistemas de fabricación de medicamentos, tales como agentes desmoldantes, antiestáticos y antideslizantes • Aditivos químicos, monómeros/oligómeros, impurezas, etc., en diversas partes de la maquinaria de fabricación de componentes u otros sistemas de fabricación de medicamentos Tal como se explicó anteriormente, la diversidad química de las sustancias extraíbles es significativa. Por ejemplo, la categoría de aditivo químico antioxidantes incluye fenoles con impedimento esterico, aminas aromáticas secundarias, aminas con impedimento esterico, compuestos organosulfurados, compuestos organofosforados y otras clases de químicos. La extracción es un proceso mediante el cual se trata un material con un disolvente para eliminar sustancias solubles. La extracción es un proceso complejo que se ve influido por el tiempo, la temperatura, la relación entre área superficial y volumen (es decir, la estequiometría), el medio de extracción y el equilibro de las fases del material (3). Existen dos razones por las que un estudio de extracción se considera el medio necesario y apropiado para lograr los diversos objetivos de una evaluación de sustancias extraíbles. Primera, no existe otra alternativa analítica viable. Caracterizar un material por lixiviables potenciales en
USP 39
Información General/ (1663) Sustancias Extraíbles 2015
su estado sólido natural es, más que un logro, un objetivo de la química analítica moderna. Segunda, incluso si se pudiera lograr una caracterización directa, como mucho únicamente se establecerían las identidades y los niveles de entidades químicas presentes en el material, sin evaluar las características de lixiviación de dichas entidades químicas. Una evaluación de composición no considera las reacciones químicas que puedan alterar las estructuras moleculares de lixiviables potenciales durante el ciclo de vida de la forma farmacéutica. Por ejemplo, en el caso de los antioxidantes fenólicos que son lixiviados por un medicamento acuoso, se pueden acumular productos de hidrólisis y oxidación en dicho medicamento. El único medio viable para producir datos relacionados con la lixiviación es usar un proceso tal como una extracción en laboratorio que es mecánicamente similar a la lixiviación. El diseño de un estudio de extracción está regido por el propósito de la evaluación de sustancias extraíbles y las cuestiones presentadas, así como por la información disponible con respecto a la composición química de los artículos de prueba que se van a extraer. Los estudios de extracción pueden estar diseñados para responder preguntas tales como: •¿Cuáles son los aditivos químicos en un componente de envases o material de construcción particular? • ¿Cuáles son las acumulaciones máximas de aditivos químicos a partir de un componente de envasado particular en la forma farmacéutica? •¿Cuál es el contenido probable de un perfil de lixiviables al final de la vida útil de un medicamento? Tratar cada una de estas cuestiones requiere de un conjunto particular de parámetros, tales como tiempo de extracción, temperatura de extracción, disolvente de extracción, técnica de extracción, relación entre área superficial de la muestra y volumen de disolvente de extracción, entre otros. Claramente, la intención de la evaluación de sustancias extraíbles debe establecerse antes de completar el diseño del estudio. Por ejemplo, si el propósito del estudio de extracción es simular un perfil de lixiviables en las condiciones más exigentes, entonces dicho estudio se puede referir como un estudio de simulación el cual debería producir un extracto que: • Contenga todas las sustancias (sustancias extraíbles) que podrían lixiviarse en el producto final a niveles que se consideren potencialmente significativos • Contenga estas sustancias extraíbles en concentraciones que son mayores o iguales a la concentración máxima en que estas entidades químicas se acumularán en el medicamento como lixiviables en cualquier momento durante la vida útil • Se genera de manera más eficiente y en menos tiempo que el requerido para un estudio de lixiviables de un medicamento • Es susceptible al análisis químico El concepto de un estudio de simulación se trata en mayor detalle en el capítulo Evaluación de Sustancias Lixiviables en Medicamentos Relacionadas con Envases Farmacéuticos y Sistemas de Administración (1664). Los medios por los cuales se logra un proceso de extracción se reflejan en la yuxtaposición de diversos parámetros experimentales, que incluyen: • La naturaleza química de los medios de extracción • La duración del proceso de extracción • La temperatura y la presión a la que se realiza la extracción • La estequiometría del proceso de extracción (área superficial extraída por volumen unitario de solución de extracción) • El mecanismo o proceso mediante el cual se logra la extracción Los procesos de extracción han sido descritos como "acelerados", "agresivos", "exhaustivos", "vigorosos", "rigurosos", entre otros, y algunos de estos términos han sido definidos para estudios de dispositivos médicos (7). En general, los procesos de extracción deberían poder completarse en un marco de tiempo razonable, pero no de una manera tan agresiva que altere la naturaleza cualitativa y/o cuantitativa del perfil resultante de sustancias extraíbles. Las condiciones de extracción más agresivas se reservan para la determinación cuantitativa de contenidos de aditivos químicos en componentes y materiales. Debido a que dichos estudios tienen el propósito de cuantificar aditivos químicos específicos conocidos y no el de simular un perfil de lixiviables del medicamento, se considera aceptable usar condiciones de extracción que afecten o disuelvan el componente o material que se está extrayendo y, de esta forma, alterar el perfil resultante de sustancias extraíbles, al tiempo que se recuperan los aditivos esperados sin pérdida o descomposición química.
Naturaleza Química de los Medios de Extracción De todos los parámetros implicados en la generación del extracto, el medio de extracción es el más crítico debido a que es éste el que logra la extracción, mientras que todos los demás parámetros simplemente facilitan la extracción. Establecer y justificar el medio (o los medios) de extracción es estratégicamente fácil y tácticamente complejo. Estratégicamente, si el propósito de un estudio de extracción particular es, por ejemplo, simular el perfil de lixiviables en las condiciones más exigentes, entonces lo ideal sería que el disolvente de extracción tuviera una tendencia similar o mayor a extraer sustancias que la de la formulación, con lo que se obtendría un perfil similar de sustancias extraíbles cualitativo y cuantitativo. Esto se establece claramente en las guías reglamentarias y en las recomendaciones de las mejores prácticas ( 1, 4-6). Por lo tanto, la táctica más lógica para este estudio de simulación es usar la formulación misma como medio de extracción, enfoque que es recomendable en ausencia de factores que generen complicaciones. Sin embargo, en algunos casos, el uso de la formulación como medio de extracción complica la caracterización del extracto a tal grado que se vuelve proco práctica. Las diversas guías y recomendaciones sugieren que cuando no sea factible el uso de un medicamento como disolvente de extracción, entonces se puede usar el vehículo del medicamento o un placebo como medio de extracción efectivo. Esta recomendación se deriva del hecho de que el fármaco mismo por lo regular no genera el "poder de lixiviación" de un medicamento, sino que son los ingredientes de la
2016 (1663) Sustancias Extraíbles / Información General
USP 39
formulación (vehículo del medicamento) los que establecen la capacidad del medicamento para lixiviar sustancias a partir de un material con el que tiene contacto. Cuando las circunstancias requieren completar un estudio de extracción con un disolvente de simulación, es necesario establecer y justificar la composición de dichos disolventes. Para lograr este objetivo, se deben considerar todas las características fisicoquímicas de una formulación y/o disolvente de simulación que influyan sobre su "poder de extracción". En ciertas circunstancias, la formulación es suficientemente simple, por lo que las características críticas se pueden definir y simular fácilmente. Por ejemplo, el poder de extracción de los medicamentos acuosos polares que están compuestos por ingredientes solubles (tales como un inyectable con un fármaco, amortiguadores y diluyente), en el caso de sustancias extraíbles orgánicas, se ve determinado principalmente por el pH del medicamento. En tal circunstancia, puede ser apropiado y justificable simular el pH del medicamento con un sistema amortiguador analíticamente viable para el estudio de extracción. En el caso de sustancias extraíbles inorgánicas, también puede ser apropiado y justificable el uso de un disolvente de simulación con propiedades quelantes de metales similares a las del vehículo del medicamento. Asimismo, puede ser posible simular de manera fácil medicamentos esencialmente no polares con disolventes orgánicos analíticamente apropiados. Por ejemplo, los propelentes de clorofluorocarbono e hidrofluoroalcanos que se usan en inhaladores de dosis fijas (MDI, por sus siglas en inglés) se pueden simular con diclorometano como disolvente de extracción, además de que se puede usar isopropanol para simular etanol, un codisolvente común en formulaciones de inhaladores de dosis fija. Muchos medicamentos tienen una composición intermedia entre los ejemplos polares y no polares anteriormente descritos. Entre los ejemplos de dichos productos se incluyen los medicamentos "acuosos" que contienen estabilizantes, agentes solubilizantes, agentes quelantes y amortiguadores, productos que contienen lípidos y productos biotecnológicos que contienen proteínas, péptidos y productos hemoderivados. Dichos productos tienen una polaridad característica que establece su "poder de extracción". Por consiguiente, un disolvente de simulación apropiado tendrá una polaridad que corresponde a la del medicamento. Las mezclas binarias de disolventes miscibles (tales como alcohol/agua) han sido utilizadas como disolventes de simulación para estos tipos de medicamentos. Puede darse el caso de que no sea posible establecer ni justificar un disolvente de simulación individual para un medicamento específico, o que el enfoque de la evaluación de sustancias extraíbles sea un material o sistema que vaya a ser caracterizado para su uso con múltiples medicamentos con composiciones diversas. En tales circunstancias, la capacidad del medicamento de lixiviar entidades químicas a partir de un sistema de envase se puede establecer basándose en el uso de múltiples disolventes de extracción, cada uno de los cuales trata uno (o más) de los "mecanismos" de extracción relevante para el medicamento (o medicamentos) que se están investigando. El uso de múltiples disolventes se apega a las recomendaciones de mejores prácticas impulsadas por la industria para medicamentos que presentan un riesgo relativamente elevado de interacción de la forma farmacéutica con el sistema de envase y un riesgo para la seguridad relativamente alto con respecto a la vía de administración (p.ej, aerosoles y soluciones para inhalación, inyectables y suspensiones inyectables) ( 7). Por lo tanto, el uso de múltiples disolventes (o medios de extracción) con distintas polaridades, pH, concentración iónica o poderes de extracción, es recomendable para componentes y materiales de los sistemas de envases de formas farmacéuticas de alto riesgo que requieren estudios de extracción para simular un perfil de lixiviables de medicamento (ver la Tabla 7). Tabla 1. Posibles Medios de Extracción con respecto a Componentes Particulares de Envases Componente del Envase
Posibles Medios de Extracción•
Sello de elastómero de la válvula de un inhalador de dosis fija (la formulación para inhaladores de dosis fija contiene 1, 1, 1,2-tetrafluoroetano y etanol)
Disolventes no acuosos (p.ej., Diclorometano, lsopropanol,Hexano)b
Boquilla de inhalador de polvo seco
Agua (sin amortiguar) lsopropanol<
Tapón de goma para vial de parenteral de pequeño volumen (formulación acuosa amortiguada a un pH 6,5)
Agua (pH 5,2) Agua (pH 9,5) lsopropanol:agua (50:5Q)d
Bolsa de plástico para parenteral de gran volumen (formulación acuosa amortiguada a un pH 7,2)
Agua (pH 5,2) Agua (pH 9,5) lsopropanol:agua (50:50)d
ª
Las posibilidades listadas en la Tabla 1 se proveen sólo a manera de ejemplo y no deben interpretarse como recomendaciones de prácticas estándar. b Estos medios de extracción reflejan las polaridades variables de los disolventes orgánicos usados en las formulaciones para inhaladores de dosis fija. e Estos medios de extracción reflejan el carácter hidrofílico y lipofílico de la saliva humana y permiten la caracterización de materiales. d Estos medios de extracción reflejan la naturaleza química de la formulación. El uso de medios cuyos intervalos de pH abarcan, y exceden ligeramente, los límites de pH del producto trata el efecto potencial que tiene el pH sobre el perfil de sustancias extraíbles. El uso de una mezcla acuosa que contenga un disolvente orgánico considera la posible presencia de aditivos de formulación tales como agentes solubilizantes que pueden influir sobre el poder de lixiviación de la formulación. El disolvente orgánico específico usado y su proporción en el medio de extracción dependen de la naturaleza química específica de la formulación y de cuestiones prácticas relacionadas con el análisis del extracto.
Si el objetivo de una evaluación de sustancias extraíbles es la caracterización de materiales, entonces es innecesario y nada deseable simular un vehículo de un medicamento, puesto que dicho objetivo requiere extracciones efectivas desde el punto de vista cualitativo y cuantitativo. Dichas extracciones por lo general se logran únicamente con sistemas de disolventes orgánicos relativamente poderosos capaces de ablandar, hinchar o disolver la matriz de polímero del material y de liberar niveles cuantitativos de aditivos y otras entidades químicas.
USP 39
Información General/ (1663) Sustancias Extraíbles 201 7
Tiempo y Temperatura de Extracción El tiempo y la temperatura de extracción son factores críticos en el proceso de extracción. Aunque la naturaleza del disolvente de extracción establece la magnitud de la extracción (es decir, la cantidad de sustancias que se pueden extraer de un material al equilibrio), la combinación de tiempo y temperatura de extracción establece la magnitud de la fuerza de impulso y el grado al que en realidad se alcanza el equilibrio. En un estudio de extracción por simulación, el propósito de una temperatura elevada es incrementar la velocidad de extracción, de modo que un tiempo experimental corto puede simular tiempos de lixiviación más largos ( 7, 5-9). Debido a que la extracción es un proceso de difusión, la relación entre la velocidad y la temperatura de difusión se puede expresar empíricamente mediante la ecuación de Arrhenius. Las matemáticas implicadas en un proceso impulsado por la cinética de Arrhenius están establecidas en el documento ASTM Fl 980-07 (2011) Standard Guide for Accelerated Aging of Sterile Barrier Systems for Medica! Devices (Guía Estándar para el Envejecimiento Acelerado de Sistemas de Barrera Estéril para Dispositivos Médicos) ( 7O), el cual puede ser una guía útil para establecer condiciones de contacto aceleradas. Al igual que con todos los modelos de su tipo, el uso adecuado de este modelo requiere un entendimiento de los fundamentos del mismo y de los principios, suposiciones y limitaciones esenciales (2). El equilibrio o la obtención de niveles asintóticos de sustancias extraíbles puede y debería monitorearse en los perfiles de sustancias extraíbles obtenidos con un medio y una técnica de extracción dados (ver la Figura 7). 1.60 1.40 Ul
"'~ '"' Ul
1.20 1.00
__..._ BHT
0,80
······•····· "2, 2, 6"
- - ._. - - Ácido esteárico
.!!1
be:
-·-0--·
Ql
Irganox 1076
2e: 0,60 Ql
"ü
o u
OAO 0,20
º·ºº o
2
4
6
8
10
12
14
16
18
Tiempo, h
Figura 1. Representación gráfica de una extracción que ha logrado el equilibrio conforme a lo indicado por la consecución de niveles asintóticos de sustancias extraíbles individuales esperadas como una función del tiempo de extracción (es decir, cocientes entre las áreas de los picos obtenidos por GC/MS de las sustancias extraíbles esperadas con respecto a un estándar interno graficado en función del tiempo de extracción).
Estequiometría de la Extracción La estequiometría de la extracción considera la masa física y/o el área superficial del artículo de prueba con respecto al volumen del medio de extracción, así como el estado físico real del material al momento de su extracción. La estequiometría de la extracción puede manipularse para facilitar la producción de un extracto más concentrado. Por ejemplo, se puede considerar el caso de un tapón de goma para un vial que contiene 5 mL de un medicamento líquido. Se podría producir un extracto más concentrado que del medicamento (es decir, un extracto que contenga niveles más altos de sustancias extraíbles que el nivel de lixiviables en el medicamento) extrayendo 20 tapones en 200 mL de disolvente de extracción. Otro aspecto de la estequiometría de la extracción es el estado físico del artículo de prueba. No es extraño que los componentes o materiales estén cortados, abiertos, molidos o que presenten otro tipo de alteración en su tamaño o configuración antes de su extracción. Para materiales no homogéneos o con capas tales como laminados de películas, el proceso de corte o molienda antes de la extracción puede alterar el perfil de sustancias extraíbles, ya que puede generar un medio para que el disolvente de extracción entre en contacto con (y por ende extraiga de manera más efectiva) los materiales (capas) que están sellados para evitar su contacto con la solución en condiciones normales de uso. Se puede argumentar que el uso de materiales de tal tamaño facilitaría aún más el proceso de extracción; sin embargo, es posible que la modificación del tamaño revele sustancias extraíbles que podrían no presentarse como lixiviables. No obstante, la modificación del tamaño de algunos componentes o materiales antes de la extracción puede ser útil en algunas situaciones y para ciertos propósitos, que incluyen: (a) reducción en la variabilidad entre muestras mediante la preparación uniforme de material polimérico homogéneo molido; (b) reducción de los tamaños de los componentes de los envases grandes que permita el uso de material de vidrio de laboratorio estándar para los estudios de extracción; (c) incremento del área superficial de un componente de los envases o artículo de prueba del material (p.ej., mediante extrusión, prensado o molienda) para incrementar la eficiencia de la extracción. En cualquier caso, se debe tener muy en cuenta el efecto de la modificación física de tamaño de los artículos de prueba en el perfil de sustancias extraíbles antes de emplear dichos métodos de modificación de tamaño en los estudios de extracción.
USP 39
2018 (1663) Sustancias Extraíbles / Información General
Para evaluaciones de sustancias extraíbles que impliquen componentes o materiales cuyos ingredientes químicos se conozcan basándose en información del fabricante o proveedor, se puede manipular la estequiometría de la extracción basándose en los niveles conocidos de aditivos químicos y la sensibilidad conocida de la técnica analítica que se usará para caracterizar el extracto. Por ejemplo, se puede considerar la formulación para una junta de monómero de etileno propileno dieno (es decir, EPDM) curada con peróxido de la válvula de un inhalador de dosis fija mostrada en la Tabla 2. Tabla 2. Ingredientes en un Artículo de Prueba de una Junta de Goma Curada con Peróxido que se Usa en un Inhalador de Dosis Fija Ingrediente del Elastómero
Cantidad (Nominal)
Polímero EPDM
64,0%
Rellenos minerales (pueden incluir ácido esteárico)
34,4%
Antioxidante 1: (butilhidroxitolueno)
0,3%
Antioxidante 2: (2,2'-metilen-bis-[6-(1, 1-dimetiletil)-4-metil] fenol)
0,3%
Agente curante de peróxido
1,0%
Dicha información, cuando se pueda obtener del proveedor de componentes y materiales, puede ser útil para el diseño de un estudio de extracción. Los analistas también pueden fundamentar la estequiometría de la extracción en los umbrales de seguridad establecido para los lixiviables. Por ejemplo, se ha propuesto una exposición de una ingesta total diaria de O, 15 µg/día para un lixiviable orgánico individual como Umbral de Preocupación de la Seguridad para medicamentos para inhalación, también denominados medicamentos para inhalación oral y nasal (5). Los lixiviables presentes en o por encima del Umbral de Preocupación de Seguridad, por ejemplo en un inhalador de dosis fija, deben evaluarse analítica y toxicológicamente, lo cual sugiere que la evaluación de sustancias extraíbles también debe estar guiada teniendo en cuenta el Umbral de Riesgo para la Salud. La aplicación de umbrales tales como el Umbral de Preocupación de Seguridad y el Umbral de Evaluación Analítica a las evaluaciones de lixiviables se trata en mayor detalle en el capítulo Evaluación de Sustancias Lixiviables en Medicamentos Relacionadas con Envases Far-
macéuticos y Sistemas de Administración (1664). En resumen, la estequiometría de la extracción (y, por ende la "sensibilidad" de un estudio de extracción) se puede basar en: • Los ingredientes químicos conocidos en un componente o material • Los umbrales basados en seguridad para lixiviables en medicamentos • Las sensibilidades conocidas o determinadas de la instrumentación analítica usadas para la caracterización del extracto
Mecanismo de Extracción-Técnica de Extracción Una extracción se puede lograr de diversas maneras. Es necesario que los medios para realizar la extracción se ajusten a los objetivos de la evaluación de sustancias extraíbles. Las técnicas de extracción en laboratorio comunes incluyen: • Maceración (empapado en disolvente)-en la que se deja empapar el artículo de prueba durante un periodo en un disolvente de extracción orgánico o acuoso a temperaturas por debajo del punto de ebullición del disolvente. Los analistas también pueden llenar las unidades de sistemas de envases con disolvente de extracción y almacenarlas a temperaturas pertinentes. • Reflujo-- en el cual el artículo de prueba se sumerge en un disolvente en ebullición durante un periodo. • El Aparato Soxhlet-en el cual el artículo de prueba se coloca en el "cartucho de extracción" de un aparato de extracción Soxhlet que se llena lentamente con disolvente redestilado proveniente de un sistema de matraz/condensador; y, periódicamente, el disolvente de extracción (que contiene sustancias extraíbles) se regresa al matraz de ebullición por efecto de sifón y el proceso comienza de nuevo (tantas veces como sea necesario para lograr el equilibrio). • Recipiente sellado-en el cual el artículo de prueba y el disolvente de extracción se sellan dentro de un recipiente capaz de tolerar temperaturas y presiones elevadas, se coloca en un autoclave de laboratorio y se calienta con vapor durante un periodo específico. • Extracción con disolvente basada en instrumentos-en la que el artículo de prueba se coloca dentro de un aparato sellado y se extrae en un ciclo automático; los ejemplos incluyen extracción con fluido presurizado, extracción asistida con microondas y extracción con fluido supercrítico. • Ultrasonido-en el cual el artículo de prueba y el disolvente de extracción se colocan en un envase de vidrio y se sumergen parcialmente en agua dentro de un baño ultrasónico. Cada uno de estos mecanismos/técnicas de extracción tiene sus propias ventajas y limitaciones. Por ejemplo, la extracción por reflujo es muy eficiente, pero puede ser demasiado agresiva para ciertas aplicaciones y puede originar la descomposición térmica de ciertas sustancias extraíbles orgánicas; el poder de extracción del ultrasonido puede ser difícil de controlar; y, debido a su punto de ebullición relativamente alto, el agua tiene un desempeño deficiente en el reflujo y en Soxhlet, aunque funciona bien en un recipiente sellado. Cuando el objetivo de la evaluación de sustancias extraíbles es identificar o cuantificar el contenido de aditivo químico de un componente o material, es común usar técnicas y procesos de extracción que ablandan, hinchan o disuelven (o, en el caso de
USP 39
Información General/ (1663) Sustancias Extraíbles 2019
sustancias extraíbles inorgánicas, digieren) el componente o material, liberando así cantidades cuantitativas de aditivos químicos para análisis.
Extracciones No Mediadas con Disolventes No todas las situaciones de contacto con medicamentos o materiales son mediadas por soluciones, y no todos los problemas relacionados con la lixiviación de entidades derivadas de materiales implican una fase en solución. Por ejemplo, las dosis de polvo para inhalación contenidas en una cápsula o paquete de blísteres para uso en un inhalador de polvo seco pueden tener sustancias volátiles lixiviadas del material de la cápsula o del blíster o lixiviadas por aditivos superficiales especiales tales como agentes desmoldantes; una forma farmacéutica oral sólida podría contener lixiviables volátiles derivados del adhesivo de una etiqueta de papel adherida al frasco de plástico que contiene la forma farmacéutica; y las soluciones para inhalación envasadas en envases de polietileno de baja densidad podrían contener migrantes volátiles provenientes de envases terciarios o componentes auxiliares tales como tarimas de madera para transporte. En los últimos dos casos, las entidades químicas pueden migrar a través de envases plásticos y volatilizarse en el espacio aéreo, acumulándose de manera subsiguiente como migrantes en las formas farmacéuticas. Las técnicas de extracción específicamente diseñadas para su aplicación a compuestos orgánicos volátiles por lo regular se acoplan directamente a instrumentos analíticos. Estas técnicas de extracción incluyen análisis de la fase gaseosa (como cromatografía de gases con muestreador de fase gaseosa; HD/GC, por sus siglas en inglés), desorción térmica directa (por lo general usada en conjunto con la cromatografía de gases; TD/GC, por sus siglas en inglés), y análisis termogravimétrico (TGA/GC, por sus siglas en inglés).
CARACTERIZACIÓN DEL EXTRACTO Objetivos y Desafíos Una vez que se ha generado el extracto, el siguiente objetivo es realizar una caracterización química minuciosa del mismo. El establecimiento de un umbral (según se describió anteriormente), el cual es un nivel específico de una entidad química individual extraída que requiere caracterización, puede basarse en consideraciones de seguridad tales como el Umbral de Preocupación de Seguridad; en consideraciones funcionales que incluyen niveles nominales de aditivos químicos conocidos en la formulación de un componente o material extraído; o consideraciones tecnológicas tales como la sensibilidad conocida o determinada de una tecnología, instrumento o método analítico. La fase de caracterización del extracto del estudio de extracción debe permitir la consecución de los objetivos generales de la evaluación de sustancias extraíbles. No en todos los casos es posible conseguir el objetivo final de una caracterización minuciosa del extracto según se definió anteriormente, incluso cuando se aplica un método analítico químico de vanguardia con el mayor rigor y capacidades disponibles. La realidad es que no existe una técnica analítica o combinación de técnicas analíticas que sea capaz de descubrir, identificar y cuantificar todas y cada una de las entidades químicas extraíbles orgánicas e inorgánicas científicamente conocidas. En algunos casos, pueden no existir compuestos de referencia auténticos para sustancias extraíbles orgánicas para la confirmación de las identificaciones o para la calibración del instrumento cuantitativo. Por consiguiente, el objetivo práctico de la caracterización del extracto debe ser un ejercicio de debido rigor para el descubrimiento, la identificación y la cuantificación a un grado razonable de certidumbre científica de todas las entidades químicas extraíbles presentes en un extracto por encima de un nivel o umbral especificado.
Procesos Implicados en la Caracterización del Extracto 1. EXPLORACIÓN
Las técnicas analíticas más útiles en un ejercicio de exploración no se centran en compuestos específicos, debido a que no proveen información química específica sobre la estructura molecular de ninguna sustancia extraíble o clase química de sustancias extraíbles en particular. Estas técnicas analíticas proveen información relacionada con las propiedades químicas básicas de entidades químicas orgánicas y/o inorgánicas presentes en un extracto, la cual se puede usar para guiar el descubrimiento, la identificación y la cuantificación de sustancias extraíbles. El análisis exploratorio por sí mismo no tiene la capacidad de lograr el objetivo práctico de la caracterización del extracto, independientemente de la técnica o combinación de técnicas exploratorias aplicadas. Las técnicas analíticas que se pueden emplear para los estudios exploratorios se listan en la Tabla 3, junto con la propiedad química básica particular (y la utilidad potencial de esta propiedad) disponible a partir de cada técnica. Algunos ejemplos de la utilidad de la exploración incluyen lo siguiente: • Los niveles significativos de residuo no volátil determinados mediante análisis gravimétrico pueden sugerir la presencia de niveles significativos de entidades químicas inorgánicas en el extracto. Lo anterior se vería reforzado si se mantuviese una masa significativa del residuo no volátil extraído después de la incineración (residuo de incineración).
2020 (1663) Sustancias Extraíbles / Información General
USP 39
• Una absorbancia UV significativa de un extracto sugiere la presencia de entidades químicas orgánicas las cuales contienen cromóforos UV dentro de su estructura molecular, tales como antioxidantes fenólicos. • Los aspectos característicos presentados en un espectro infrarrojo de este extracto podrían proveer mayor entendimiento detallado sobre las clases químicas de las sustancias extraíbles orgánicas presentes. Dicho entendimiento se puede usar para el desarrollo y la aplicación de métodos analíticos para el descubrimiento y la identificación con los que se detectarían las clases químicas de sustancias extraíbles sugeridas por el proceso exploratorio. • Para extractos acuosos, el carbono orgánico total provee una medición de la cantidad total de sustancias extraíbles orgánicas presentes. El proceso exploratorio y los análisis exploratorios son opcionales para la caracterización del extracto. La utilidad de la exploración se centra en su uso potencial como guía para el descubrimiento, la identificación y la cuantificación. Tabla 3. Visión General de los Métodos Analíticos para Análisis de Extracción Aplicación Técnica Analítica
Método Analítico
uv Espectroscopía
Análisis Químico por Vía Húmeda
FTIRª
Descubrimiento
X
X
Identificación
Cuantificaclón
Información/Utilidad
X
Propiedad básica de sustancias extraíbles orgánicas que absorben luz UV; semicuantitativa con capacidad limitada de identificación
X
Propiedad básica de sustancias extraíbles orgánicas que absorben radiación IR, capacidad moderada de identificación
NVRb, ROie
X
Propiedad básica que refleja la cantidad total de sustancias extraíbles no volátiles orgánicas y/o inorgánicas
pH
X
Propiedad básica de sustancias extraíbles ácidas o básicas
TOCd
X
Medición cuantitativa de sustancias extraíbles orgánicas
FIDe
MS
Cromatografía de Gases
Exploraclón
FTIRª
X
X
X
X
X
X
X
Descubrimiento y evaluación cuantitativa de sustancias extraíbles orgánicas individuales; se debe tener en cuenta que es posible la identificación cualitativa
X
Descubrimiento, identificación y cuantificación de sustancias extraíbles orgánicas individuales; se debe tener en cuenta que la identificación puede ser cualitativa o estructural Descubrimiento e identificación de sustancias extraíbles orgánicas individuales; se debe tener en cuenta que la FTIR tiene limitaciones con respecto al análisis estructural (no obstante, es posible la identificación mediante análisis cualitativo)
ª FTIR = Espectroscopía en el Infrarrojo por Transformada de Fourier. b NVR = Residuo No Volátil. e ROi = Residuo de Incineración. d TOC =Carbono Orgánico Total. e FID =Detección por Ionización a la Llama. Detectores adicionales de Cromatografía de Gases, tales como el Detector para Análisis de Energía Térmica (TEA, por sus siglas en inglés), pueden proveer una mayor sensibilidad para clases específicas de compuestos. f CAD = Detector de Aerosol Cargado. g ELSD = Detector Evaporativo de Dispersión de Luz. h NMR = Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear. i IMS = Espectrometría de Movilidad lónica. i MS = Espectroscopía de Absorción Atómica. k ICP-AES = Espectroscopía de Emisión Atómica de Plasma Inductivamente Acoplado. 1 ICP/MS = Espectrometría de Masas de Plasma Inductivamente Acoplado.
USP 39
Información General/ (1663) Sustancias Extraíbles 2021
Tabla 3. Visión General de los Métodos Analíticos para Análisis de Extracción (Continuación) Aplicación Técnica Analítica
Método Analítico
UV, CAD1 y ELSD9
MS
FTIRª Cromatografía de Líquidos
Cromatografía lónica
Espectrometría
Espectroscopía Atómica
Exploración
Descubrimiento
Cuantlflcación
X
X
X
NMRh
X
Conductividad
X
MS
Identificación
X
X
Información/Utilidad
X
Descubrimiento y evaluación cuantitativa de sustandas extraíbles orgánicas individuales; se debe tener en cuenta que es posible la identificación mediante análisis cualitativo y que los detectores UV de Arreglo de Diodos pueden ayudar con el análisis estructural
X
Descubrimiento, identificación y cuantificación de sustancias extraíbles orgánicas individuales; se debe tener en cuenta que la identificación se pueden llevar a cabo de manera cualitativa o estructura! y que se encuentran disponibles fuentes de ionización con distintas selectividades
X
Descubrimiento e identificación de sustancias extraíbles orgánicas individuales; se debe tener en cuenta que la FTIR tiene limitaciones con respecto al análisis estructural (no obstante, es posible la identificación mediante análisis cualitativo)
X
Identificación de sustancias extraíbles orgánicas individuales; se debe tener en cuenta que la identificación puede ser cualitativa o estructural
X
X
Descubrimiento y cuantificación, por lo regular de especies iónicas individuales
X
Descubrimiento, identificación y cuantificación de sustancias extraíbles iónicas individuales; se debe tener en cuenta se pueden llevar a cabo de manera cualitativa o estructural y que se encuentran disponibles fuentes de ionización con distintas selectividades
MS
X
Identificación de sustancias extraíbles orgánicas individuales
NMRh
X
Identificación de sustancias extraíbles orgánicas individuales Descubrimiento y evaluación cuantitativa de sustandas extraíbles orgánicas individuales; se debe tener en cuenta que se encuentran disponibles diversas fuentes de ionización y que es posible la identificación cualitativa
IMSi
X
X
X
AA Si
X
X
X
ICP-AESk
X
X
X
ICP/MS 1
X
X
X
Descubrimiento, identificación y cuantificación de elementos extraídos individuales (elementos traza, metales); se debe tener en cuenta que la AAS puede aplicarse únicamente a un elemento a la vez. La identificación de la forma química o la especiación del elemento extraído pueden requerir análisis adicionales
ª FTIR = Espectroscopía en el Infrarrojo por Transformada de Fourier. b NVR = Residuo No Volátil. e ROi = Residuo de Incineración. d TOC = Carbono Orgánico Total. • FID =Detección por Ionización a la Llama. Detectores adicionales de Cromatografía de Gases, tales como el Detector para Análisis de Energía Térmica (TEA, por sus siglas en inglés), pueden proveer una mayor sensibilidad para clases específicas de compuestos. 1 CAD = Detector de Aerosol Cargado. 9 ELSD = Detector Evaporativo de Dispersión de Luz. h NMR = Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear. i IMS = Espectrometría de Movilidad lónica. i AAS = Espectroscopía de Absorción Atómica. k ICP-AES = Espectroscopía de Emisión Atómica de Plasma Inductivamente Acoplado. 1 ICP/MS = Espectrometría de Masas de Plasma Inductivamente Acoplado.
2. DESCUBRIMIENTO El proceso de descubrimiento implica analizar un extracto y, de esta forma, producir uno o más resultados analíticos que sean atribuibles a sustancias extraíbles individuales. El proceso de descubrimiento se logra mediante la detección de respuestas instrumentales de las sustancias extraíbles orgánicas e inorgánicas individuales que son proporcionales a los niveles de dichas sustancias extraíbles individuales dentro del extracto. Es durante el proceso de descubrimiento donde se requieren por primera
2022 (1663) Sustancias Extraíbles / Información General
USP 39
vez las técnicas analíticas generalmente asociadas con el análisis de trazas orgánicas e inorgánicas para la caracterización del extracto. El análisis de trazas orgánicas por lo regular implica el uso de técnicas de cromatografía, en particular cromatografía de gases (GC) y cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC). La cromatografía de gases tiene una gran capacidad de separación para compuestos orgánicos volátiles y semivolátiles, mientras que la HPLC tiene una mayor aplicación a compuestos orgánicos semivolátiles y relativamente no volátiles, lo que vuelve a las dos técnicas de separación complementarias y ortogonales para su aplicación a la importante diversidad química de sustancias extraíbles. El capítulo Cromatografía (621) ofrece un análisis sobre los principios de las cromatografías de gases y de líquidos. La diversidad química de las sustancias extraíbles con respecto a la polaridad y la volatilidad, puede requerir de técnicas alternativas de introducción de muestras o la modificación de muestras, en particular para la cromatografía de gases. Las sustancias extraíbles relativamente volátiles tales como metanol son más susceptibles al muestreo de la fase gaseosa de extractos basados en agua en un cromatógrafo de gases. A menudo, los ácidos y bases orgánicos pueden analizarse de manera más efectiva mediante cromatografía de gases después de una derivatización química, tal como metilación o sililación para ácidos orgánicos. Tanto la cromatografía de gases como la HPLC pueden emplear sistemas de detección con diferentes especificidades (Tabla 3) lo cual toma ventaja de las propiedades estructurales únicas de diversas clases químicas de sustancias extraíbles. Las técnicas analíticas útiles para el descubrimiento de sustancias extraíbles orgánicas también pueden aplicarse a la identificación y a la cuantificación. Las técnicas analíticas tales como la cromatografía de gases/espectrometría de masas (GC/MS), que se aplican más a menudo a la identificación, también pueden usarse para el descubrimiento y la cuantificación (Tabla 3). Las sustancias extraíbles inorgánicas tales como trazas de elementos y metales por lo regular se descubren, identifican y cuantifican mediante el mismo conjunto de técnicas analíticas, tales como espectroscopía de emisión atómica. Las técnicas analíticas diseñadas para el estudio de especiación inorgánicas, en particular los extractos acuosos, están más allá del alcance de este capítulo. Es importante indicar que los objetivos generales de un estudio de extracción siempre requieren las identidades y las cantidades cuantitativas de sustancias extraíbles orgánicas e inorgánicas individuales, por lo que el simple descubrimiento de las sustancias extraíbles no logra los objetivos principales de un estudio de extracción. 3. IDENTIFICACIÓN La identificación de una sustancia extraíble puede lograrse mediante análisis estructural o análisis cualitativo. El Análisis estructural es el proceso mediante el cual se elucida la estructura molecular de un analito desconocido a partir de datos específicos del compuesto y, por lo tanto, requiere de detección específica para el compuesto del analito desconocido . Un detector específico para el compuesto es aquél que provee información específica sobre la estructura molecular del analito individual desconocido (no sólo su clase química). El Análisis cualitativo es el proceso mediante el cual se determina la correspondencia de un analito desconocido con un compuesto de referencia auténtico mediante una o más técnicas analíticas. Las técnicas analíticas usadas para el análisis cualitativo pueden ser específicas para compuestos, aunque esto no es un requisito. Las técnicas analíticas que se aplican mayormente al análisis estructural, y a problemas generales en el análisis de trazas orgánicas, implican la combinación de cromatografía con espectrometría de masas. Éstas son las denominadas técnicas "acopladas" de GC/MS y cromatografía de líquidos de alta resolución/espectrometría de masas (LC/MS). El capítulo Espectrometría de Masas (736) provee un análisis sobre los principios de la espectrometría de masas (incluyendo la GC/MS y la LC/MS). La GC/MS y la LC/MS son capaces de generar perfiles de sustancias extraíbles en forma de cromatogramas. No obstante, debido a que la LC/MS incluye un fondo químico relativamente elevado de iones de fase móvil de la HPLC, es común incluir un detector UV no destructivo en serie con el espectrómetro de masas para ayudar en la localización de los picos de sustancias extraíbles individuales. Los datos sobre compuestos específicos disponibles a partir de la espectrometría de masas incluyen: • El peso molecular monoisotópico de la sustancia extraíble que se basa en una confirmación del ión molecular de uno o más procesos de ionización • La fórmula molecular de la sustancia extraíble que se basa en mediciones exactas de masa, y/o mediciones exactas de proporciones de isótopos, del ión molecular • El comportamiento de fragmentación de la sustancia extraíble basándose en una fragmentación en la fuente o en espectrometría de masas en tándem Una GC/MS en interfase con ionización electrónica produce espectros de masas que pueden ser cotejados usando bases de datos computarizadas o bibliotecas de espectros de masas derivadas de compuestos conocidos. Se debe tener en cuenta que, por lo general, no se encuentran disponibles espectros de masas cotejables para los procesos de ionización con LC/MS, debido a la variabilidad de dichos espectros con el paso del tiempo y entre diversos instrumentos y laboratorios. La GC/MS y la LC/MS también incluyen el tiempo de retención (o índice de retención) de la sustancia extraíble desconocida, que se puede comparar con el de los compuestos de referencia auténticos. Debido al número y la diversidad química de las sustancias extraíbles orgánicas, es poco razonable esperar que los compuestos de referencia auténticos estarán disponibles (o que puedan estar disponibles) para confirmar todas las identificaciones. Por lo tanto, es necesario establecer y usar de manera apropiada los niveles de confianza para la identificación. Los datos típicamente disponibles a partir de los análisis GC/MS y LC/MS (ver los puntos que se mencionan a continuación) se usan para designar identificaciones de sustancias extraíbles individuales en las categorías de Confirmada, Confiable o Tentativa (2, 5): a. Comportamiento de la fragmentación espectrométrica de masas/interpretación experta del espectro de masas b. Confirmación del peso molecular
USP 39
Información General/ (1663) Sustancias Extraíbles 2023
c. d. e. f.
Confirmación de la composición elemental El espectro de masas se corresponde con el espectro de la biblioteca o literatura automatizadas El espectro de masas y el índice de retención cromatográfico se corresponden con el compuesto de referencia auténtico Información espectral de sustento derivada de un método ortogonal (p.ej., resonancia magnética nuclear) • Una identificación tentativa significa que los datos obtenidos son congruentes únicamente con una clase de molécula. Este por lo regular es el caso cuando está disponible únicamente información tal como a o d. • Una identificación confiable quiere decir que la identificación tentativa ha sido reforzada mediante suficiente información de confirmación adicional para descartar todas las estructuras, exceptuando las estructuras más estrechamente relacionadas. Por ejemplo, este sería el caso cuando la información tentativa (a y/o d) se aumentó con b, c ó f. Cuanta más información de confirmación se obtenga, mayor será el nivel de confianza. • Una identificación confirmada quiere decir que la preponderancia de la evidencia confirma que la entidad en cuestión puede ser únicamente la identificación provista. Aunque es posible que una identificación muy confiable pueda cumplir con el estándar implicado por la preponderancia de la evidencia (por ejemplo, teniendo a, b, c, e y f), el único medio para proveer una identificación confirmada es mediante la correspondencia de los espectros de masas y el tiempo de retención que corresponda a un compuesto de referencia auténtico (punto e). Aunque estas categorías de identificación se basan en la espectrometría de masas, es posible usar datos de otras técnicas analíticas para ayudar en la identificación de sustancias extraíbles. Dichas técnicas incluyen GC/FTIR (Espectroscopía Infrarroja por Transformada de Fourier) y LC/NMR (Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear). Éstas, y potencialmente otras técnicas analíticas, son capaces de producir datos sobre compuestos específicos que son complementarios a la espectrometría de masas. El nivel de identificación requerido para cualquier sustancia extraíble individual depende del uso pretendido de dicha identificación. Queda a criterio de la organización responsable del estudio de extracción determinar lo anterior después de considerar debidamente las guías reglamentarias aplicables. Debido a que la lista de sustancias extraíbles inorgánicas potenciales, tales como elementos y metales traza, es finita en comparación con la población de sustancias extraíbles orgánicas, la identificación y el análisis cuantitativo para sustancias extraíbles inorgánicas se logran de manera simultánea. Aunque el análisis elemental es relativamente simple, presenta ciertos desafíos. El problema de respuestas falsas positivas y la interferencia espectral o de masas deben ser tratadas a fin de que las identificaciones basadas en espectroscopía atómica sean rigurosas y exactas. Asimismo, se hace hincapié en que el análisis elemental provee identificaciones y cuantificaciones para elementos específicos, y no la especiación química de la sustancia extraíble. Por ende, la interpretación del impacto de los resultados elementales puede requerir de estudios adicionales, tales como una especiación química detallada de los elementos que se consideren importantes. Por ejemplo, aunque encontrar azufre en un extracto mediante espectroscopía atómica es un resultado importante, no es posible establecer el impacto de seguridad que tiene este descubrimiento hasta que se haya establecido la especiación del azufre. Esto se debe a que el impacto de seguridad que tiene el azufre como azufre elemental puede ser diferente que el del azufre como sulfato. 4. CUANTIFICACIÓN La cuantificación por lo regular se basa en la respuesta instrumental de una sustancia extraíble individual con respecto a un compuesto de referencia auténtico y, por lo tanto, requiere la separación de sustancias extraíbles individuales (de manera directa con cromatografía o indirecta con detección selectiva) y la producción de respuestas en el detector que sean directamente proporcionales al nivel (o concentración) de la sustancia extraíble en un extracto dado. La calibración de un sistema analítico se logra mediante el análisis de compuestos de referencia auténticos (estándares externos). También se pueden incluir uno o más estándares internos tanto en el extracto como en las soluciones de calibración de referencia para incrementar la exactitud y la precisión. Los niveles de sustancias extraíbles para las que no estén disponibles los compuestos de referencia auténticos se pueden estimar usando sus respuestas (o factores de respuesta) con respecto a estándares internos u otros compuestos de referencia sustitutos con estructura molecular similar. Aunque dicho proceso analítico puede proveer estimados de concentraciones exactos y fidedignos, el establecimiento y la justificación de la selección y el uso de estándares internos deben tratarse con debida diligencia. Se han descrito criterios para la selección de estándares internos apropiados (2, 5).
Preparación de Extractos para Análisis Los extractos a menudo pueden analizarse de manera directa sin necesidad de preparación o concentración significativa. Muchos extractos de disolventes orgánicos (p.ej., diclorometano, acetato de etilo, hexano) se pueden inyectar directamente en un cromatógrafo de gases, mientras que otros (p.ej., metano!, etanol, isopropanol) son demasiado reactivos en el inyector del cromatógrafo de gases caliente o bullen demasiado. Los extractos de disolventes orgánicos con propiedades físicas/químicas inadecuadas para el análisis directo por cromatografía de gases se pueden cambiar por disolventes más apropiados. Algunas sustancias extraíbles, tales como ácidos grasos (p.ej., ácido palmítico, ácido esteárico) tienen un mejor desempeño en el análisis de cromatografía de gases cuando se derivatizan a ésteres metílicos o ésteres trimetilsilílicos. Por lo general se considera inapropiado analizar directamente extractos acuosos mediante cromatografía de gases, debido a la reactividad y al alto punto de ebullición del agua. Además, los extractos acuosos con pH amortiguado contienen sales no volátiles que no son adecuadas para su inyección en el cromatógrafo de gases. Los extractos acuosos por lo general se extraen
2024 (1663) Sustancias Extraíbles / Información General
USP 39
nuevamente con un disolvente orgánico para eliminar sustancias extraíbles orgánicas derivadas del agua, para posteriormente inyectar el extracto orgánico resultante en el cromatógrafo de gases. A diferencia de la cromatografía de gases, la cromatografía de líquidos (HPLC, LC/MS) está perfectamente adaptada al análisis directo de extractos acuosos, debido a que la mayoría de métodos HPLC incluyen agua y fases móviles miscibles en agua. Los disolventes orgánicos inmiscibles en agua (p.ej., hexano) no pueden ser inyectados en estos sistemas de HPLC en fase reversa, por lo que estos deben secarse y el residuo extraíble resultante se mezcla en un disolvente adecuado para HPLC (p.ej., acetonitrilo, metano! o mezclas de estos con agua). Los extractos orgánicos o acuosos con niveles insuficientes de sustancias extraíbles para análisis pueden concentrarse mediante diversas técnicas. Muchos disolventes orgánicos se pueden secar bajo gas inerte, un evaporador rotatorio o un concentrador Kuderna-Danish. Los extractos acuosos pueden liofilizarse, concentrarse al vacío o volverse a extraer en un disolvente orgánico el cual después se somete a concentración adicional. La concentración final a la que se analiza el extracto depende de los objetivos de la evaluación de sustancias extraíbles y las sensibilidades inherentes de las técnicas analíticas aplicadas. Una buena "regla general" es que para lograr un análisis estructural completo de una sustancia extraíble desconocida, una GC/MS requiere aproximadamente 5 ng inyectados en el instrumento. Esto sugiere una concentración en el extracto inyectado de 5 ng/µL o 5 µg/ml. En un extracto de diclorometano de 200 mL, esto convierte un total de 1 mg de esta sustancia extraíble particular recuperada del artículo de prueba extraído. Si esta concentración de analito es insuficiente para cumplir el objetivo de las evaluaciones de sustancias extraíbles, entonces se pueden optimizar los siguientes parámetros: • La estequiometría de extracción (es decir, extraer más material o usar más disolvente de extracción) • Las condiciones de extracción (es decir, usar temperaturas más altas, tiempos más largos, disolventes con mayor poder de extracción, técnica de extracción más agresiva, etc.) • El procesamiento de la extracción (es decir, concentración del extracto)
RESUMEN Determinación de la Totalidad en la Evaluación de Sustancias Extraíbles La integridad de una evaluación de sustancias extraíbles sólo puede juzgarse en función de los objetivos generales de la evaluación. Por ejemplo, una evaluación de sustancias extraíbles lograda únicamente para la caracterización de materiales puede incluir un disolvente de extracción, una técnica de extracción y un conjunto de condiciones de extracción; además de un umbral basado en materiales (p.ej., 1 O ppm p/p). Dicha evaluación de sustancias extraíbles puede considerarse completa si todas las sustancias extraíbles por encima del umbral definido se identificaron y cuantificaron al nivel de confianza (anteriormente definido). Para una evaluación de sustancias extraíbles diseñada para establecer una correlación rigurosa entre lixiviables-sustancias extraíbles para un medicamento de alto riesgo, en donde puede aplicar un umbral de seguridad desafiante (p.ej., O, 15 µg/día; ver la referencia 5), las buenas prácticas científicas y la debida diligencia requieren lo siguiente: • La generación de extractos debe lograrse usando 1. Múltiples disolventes o medios de extracción con poder de extracción variable basados en el poder de extracción conocido del vehículo del medicamento; 2. Múltiples técnicas de extracción complementarias, incluyendo aquéllas con la capacidad de análisis de sustancias volátiles; 3. Condiciones de extracción que permitan lograr el equilibrio. • La caracterización de extractos debería usar 1. Múltiples técnicas analíticas complementarias; 2. Preparación cuidadosa de la muestra, teniendo en cuenta las técnicas analíticas; 3. Un proceso sistemático para la identificación y cuantificación de sustancias extraíbles. En este caso, la evaluación de sustancias extraíbles puede considerarse completa si todas las sustancias extraíbles por encima del umbral definido se identificaron al menos a el nivel de confianza, cuantificado y correlacionado tanto cualitativa como cuantitativamente con datos de lixiviables del medicamento (si estuvieran disponibles) y los ingredientes conocidos en el sistema de envase, los componentes de los envases o materiales de construcción. Se debe tener en cuenta que las evaluaciones de sustancias extraíbles limitadas con objetivos relativamente estrechos pueden lograrse al nivel de totalidad requerido con un esfuerzo relativamente enfocado. Por ejemplo, los estudios de extracción diseñados para cuantificar los niveles de aditivos químicos específicos en componentes/materiales de envasado se realizar con de extracción métodos analíticos ., ••,.,r·1t1r·:.r1 Además, se refiere al lector a diversas fuentes que describen evaluaciones sustancias extraíbles y estudios de para aplicaciones farmacéuticas (2, 5, 6), así como a otras fuentes generales que hacen referencia a las evaluaciones de sustancias extraíbles para dispositivos médicos (9) y contacto con alimentos ( 11). También se hace referencia a capítulos farmacopeicos de este Compendio que incluyen estudios de extracción con objetivos y propósitos específicos: 1. Pruebas de Reactividad Biológica, In Vitro (87)
Información General/ (1663) Sustancias Extraíbles 2025
USP 39 2. Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo (88) 3. Tapones Elastoméricos para Inyectables (381) 4. '
Ejemplo de Perfiles de Sustancias Extraíbles-Caracterización de Materiales Según se indicó anteriormente, los estudios de extracción por lo regular están diseñados para producir perfiles de sustancias extraíbles, los cuales son representaciones analíticas cualitativas y/o cuantitativas del contenido de sustancias extraíbles de un medio de extracción particular. Para ilustrar el concepto de un perfil de sustancias extraíbles, a continuación se presenta un ejemplo de un estudio de sustancias extraíbles realizado con el propósito de caracterizar materiales. Los perfiles de sustancias extraíbles por lo regular se producen mediante extractos de análisis de laboratorio usando técnicas cromatográficas instrumentales. La Figura 2 y la Figura 3 presentan ejemplos de perfiles de sustancias extraíbles (GC/MS y HPLC/UV, respectivamente) a partir de la extracción usando un Soxhlet con hexano de un material de construcción de copolímero de olefina cíclica (COC) ( 12). Los materiales de copolímero de olefina cíclica se usan en la fabricación de jeringas prellenadas, viales para parenterales de pequeño volumen y bolsas para parenterales de gran volumen. Los extractos se generaron sometiendo aproximadamente 5 g de material con un tamaño adecuado a extracción en un Soxhlet con 125 mL de hexano durante 16 horas. Se agregaron al extracto resultante cantidades conocidas de estándares internos (detalles que no son relevantes para este estudio) y se analizó directamente mediante GC/MS (ver la Tabla 4). Para el análisis con HPLC/UV, se redujo el volumen de una alícuota del extracto de hexano y se diluyó con metano! antes del análisis (ver la Tabla 5). Debido a que el propósito de esta evaluación de sustancias extraíbles era la caracterización de materiales, los parámetros del estudio de extracción fueron ajustados con respecto a un umbral de identificación de sustancias extraíbles de 1O ppm (µg/g). A partir de estos cromatogramas, es claro que las técnicas usadas son complementarias y ortogonales, lo que ilustra el concepto de la necesidad de múltiples métodos analíticos para elucidar regularmente el perfil completo de las sustancias extraíbles.
IS
2
7 IS IS
3
Tiempo--->
5
10
6
15
20
25
30
35
Figura 2. Cromatograma GC/MS (perfil de sustancias extraíbles) para una extracción en Soxhlet con hexano de un copolímero de olefina cíclica ( 12). Los estándares internos {IS, por sus siglas en inglés) que producen picos en este cromatograma incluyen: 2-Fluorobifenil a 10,7 minutos, lrganox 415 a 22,0 minutos y Bisfenol M a 23,0 minutos. Los picos numerados representan las sustancias extraíbles identificadas por encima del umbral basado en los materiales.
2026 (1663) Sustancias Extraíbles / Información General
USP 39
2
IS IS IS
.
' 1
1
2,5
5
1
7,5
J
&•
1
1
12,5
10
1
1
15
17,5
2o
1
22,5
Figura 3. Cromatograma HPLC/UV O- = 220 nm; perfil de sustancias extraíbles) para una extracción en Soxhlet con hexano de un copolímero de olefina cíclica ( 12). Los estándares internos (IS, por sus siglas en inglés) que producen picos en este cromatograma incluyen: Bisfenol M a 7,6 minutos, 2-Fluorobifenil a 7,8 minutos e lrganox 415 a 8,7 minutos. El pico principal de este perfil de sustancias extraíbles por encima del umbral basado en los materiales es el aditivo conocido (antioxidante) lrganox 101 O (Pico 2). Tabla 4. Parámetros Operativos, Análisis por GC/MS de la Extracción en Soxhlet con Hexano de un copolímero de olefina cíclica (72)
Parámetro Operativo Columna Programa del Horno
Valor Operativo j&W DB-5HT, 30 m x 0,25 mm, espesor de película de 0,25 µm Comenzar a 50º, mantener durante 1 minuto; rampa a 12º/minutos hasta 315º, mantener durante 16 minutos
Gas Transportador
He a 1,2 ml/min
Inyección
Dividida (1 :5); 1 µL
Temperatura del Inyector
300º
Temperatura del Detector FID
N/A
Temperatura de la Línea de Transferencia del MS Detalles de la Detección por MS
180º 70 eV (+) El (ionización electrónica), relación de masa de 33-650 amu (retraso del disolvente de 3,0 min)
Tabla 5. Parámetros Operativos, Análisis por HPLC/UV de la Extracción en Soxhlet con Hexano de un copolímero de oleflna cíclica (72)
Parámetro Operativo Columna
Valor Operativo Agilent Zorbax Eclipse Plus C18, 100 x 3,0 mm, partículas de 3,5 µm
Temperatura de la Columna
40º-50º A = acetato de amonio 1O mM, B = acetonitrilo
Componentes de la Fase Móvil
Tiempo
Gradiente de la Fase Móvil Velocidad de Flujo de la Fase Móvil Tamaño de la Muestra
%B
0,0
5,0
8,4
100,0
35,0
100,0
36,0
5,0
39,0
5,0 0,8 ml/min 10-50 µL
USP 39
Información General/ (1664) Evaluación de Sustancias Lixiviables 2027
Tabla 5. Parámetros Operativos, Análisis por HPLC/UV de la Extracción en Soxhlet con Hexano de un copolímero de olefina cíclica ( 12) (Continuación)
Valor Operativo
Parámetro Operativo Detección, UV
205-300 nm; espectros registrados a "A= 21 O; 220; 230; 250 y 270 nm
REFERENCIAS 1. FDA. Guidance for industry: container-closure systems for packaging human drugs and biologics. Rockville, MD: FDA; 1999. 2. Ball D., Norwood D., Stults C., Nagao L., eds. Leachables and Extractables Handbook. New York: J. Wiley and Sons; 2012. 3. ANSl/AAMI. BE 823:2006 Biological evaluation of medical devices-part 18: chemical characterization of materials. 2006. http://webstore.ansi.org/Record Detail.aspx?sku=ANSl%2fAAMl+BE83%3a2006+(R2011 )+(AN Sl%2fAAM l+BE +83%3a2006+(R2011 )). Consultado el 19 de marzo de 2013. 4. European Medicines Agency. Guideline on plastic immediate packaging materials. 2005. http://www.ema.europa.eu/ docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2009/09/WC500003448.pdf. Consultado el 19 de marzo de 2013. 5. PQRI Leachables and Extractables Working Group. Safety thresholds and best practices for extractables and leachables in orally inhaled and nasal drug products. 2006. http://www.pqri.org/pdfs/LE_Recommendations_to_FDA_09-29-06.pdf. Consultado el 19 de marzo de 201 3. 6. jenke D. Compatibility of Pharmaceutical Solutions and Contact Materials: Safety Considerations Associated with Extractables and Leachables. New York: john Wiley and Sons; 2009. 7. ANSl/AAMl/ISO. 10993-12:2012. Biological evaluation of medical devices-part 12: sample preparation and reference materials. 2012. http://marketplace.aami.org/eseries/scriptcontent/docs/Preview%20Files/10993-12_1207_preview.pdf. Consultado el 19 de marzo de 2013. 8. Martín j., Fitzgerald R., Pothier N., Ding W. Recommendations far Testing and Evaluation of Extractables from Single-Use Process Equipment. Washington, DC: Bio-Process Systems Alliance; 201 O. 9. ANSl/AAMl/ISO. 10993-12:2007. Biological evaluation of medical devices-part 12: sample preparation and reference materials. 2007. https://marketplace.aami.org/eseries/scriptcontent/docs/Preview%20Files%5C10993-12_preview.pdf. Consultado el 19 de marzo de 2013. 1O. ASTM lnternational. ASTM F 1980-07 Standard guide for accelerated aging of sterile barrier systems for medical devices. 2011. http://webstore.ansi.org/RecordDetail.aspx?sku=ASTM%20F1980-07(2011 )&source=msn&adgroup=astm. Consultado el 19 de marzo de 2013. 11. 21 CFR 177 lndirect Food Additives: Polymers. 12. Pennino S., Norwood D. Controlled extraction study on cyclic olefin copolymer (COC). 2011. http://www.pqri.org/ workshops/PODP11 /pdfs/posters/Cyclic_Olefin_Copolymer.pdf. Consultado el 19 de marzo de 2013.
(1664) EVALUACIÓN DE SUSTANCIAS LIXIVIABLES EN MEDICAMENTOS RELACIONADAS CON ENVASES FARMACÉUTICOS Y SISTEMAS DE ADMINISTRACIÓN PROPÓSITO Este capítulo de información general presenta un marco para el diseño, la justificación y la implementación de evaluaciones de sustancias lixiviables en medicamentos, derivados de los envases farmacéuticos y de los sistemas de administración. La evaluación científica de lixiviables es importante para los fabricantes y sus diversos proveedores primordialmente como medio para establecer la aptitud de uso de los envases farmacéuticos/sistemas de administración, debido a que los lixiviables pueden afectar potencialmente la eficacia, la seguridad y la calidad del medicamento. Asimismo, dicha evaluación de lixiviables puede proveer una visión sobre las fuentes de lixiviables así como la forma de evaluar y gestionar las sustancias lixiviables durante los procesos de desarrollo y fabricación del medicamento. Este capítulo establece las dimensiones críticas de una evaluación de lixiviables y analiza los aspectos prácticos y técnicos de cada dimensión. Este capítulo no establece métodos analíticos o especificaciones para lixiviables específicos ni criterios de aceptación para ninguna forma farmacéutica, sistema de envase o combinación de medicamentos particular; tampoco describe todas las situaciones en las que se requiere una evaluación de lixiviables. Resulta imposible anticipar y abarcar en una explicación general de sustancias lixiviables en medicamentos todas las situaciones que pueden presentarse en la industria farmacéutica en las que podría requerirse una evaluación de sustancias lixiviables. Diseñar una evaluación de sustancias lixiviables individuales es un proceso que requiere el equilibrio entre los conocimientos científicos, la asignación prudente de recursos y una gestión de riesgos efectiva con énfasis en la seguridad del paciente y la calidad del producto. Lograr este equilibrio es responsabilidad y obligación del fabricante del medicamento y supone tener
2028 (1664) Evaluación de Sustancias Lixiviables / Información General
USP 39
debidamente en cuenta todos los requisitos legales y reglamentarios aplicables. Los principios y las mejores prácticas demostradas que se describen en este capítulo general representan una interpretación consensuada de conocimientos científicos y, por lo tanto, se pueden extrapolar y aplicar a cualquier situación en la que se requiera una evaluación de lixiviables para la aplicación farmacéutica. En muchos casos, las evaluaciones de lixiviables en medicamentos se basan o se facilitan por el conocimiento obtenido de las evaluaciones de lixiviables logradas para sistemas de envase de medicamentos, componentes de los envases y materiales de construcción de los envases (ver Evaluación de Sustancias Extraíbles Relacionadas con Envases Farmacéuticos y Sistemas de Administración (1663)).
TÉRMINOS CLAVE Este capítulo general usa los términos clave listados a continuación (7 ,2; ver también Requisitos de Envasado y Almacenamiento (659)). Se debe tener en cuenta que los términos Sistema de Envase, Componente del Envase, Componentes de los Envases Primarios, Componentes de los Envases Secundarios y Materiales de Construcción también se definen en el capítulo (659), y que las definiciones aquí presentadas se proveen a modo de aclaración dentro del contexto de este capítulo y no pretenden reemplazar a las provistas en el capítulo (659). Sistemas de Envases se refiere al conjunto de los componentes de los envases que contienen y protegen la forma farmacéutica. Los sistemas de envases también reciben el nombre de Sistemas de Envase-Cierre y pueden incluir los envases primarios, secundarios y terciarios. Un Envase es un recipiente que contiene un compuesto intermedio, ingrediente farmacéutico activo, excipiente o forma farmacéutica, y que está en contacto directo con el producto. Un Cierre es un material que sella un espacio abierto en un envase y que provee protección al contenido. Además, provee acceso a los contenidos del envase. El Componente del Envase se refiere cualquier parte del envase o del sistema de envase-cierre, incluyendo el envase (p.ej., ampollas, jeringas prellenadas, viales, frascos); cierres (p.ej., tapas de rosca, tapones); los casquillos y sobresellos; recubrimiento interno del cierre; sellos internos; puertos de administración; envolturas; accesorios de administración; etiquetas; cajas de cartón y envoltorio plástico. Los Componentes de los Envases Primarios están en contacto directo o pueden entrar en contacto directo con el producto. (p.ej., bolsa IV). Los Componentes de los Envases Secundarios están en contacto directo con un componente de los envases primarios y puede proveer protección adicional para el producto (p.ej., sobre bolsa o forro para una bolsa IV). Un Componente de los Envases Terciarios está en contacto directo con un componente de los envases secundarios y puede proveer protección adicional del producto durante el transporte y/o el almacenamiento (p.ej., caja de cartón para el transporte de una bolsa IV con sobre bolsa). Los Componentes Auxiliares son componentes o entidades que pueden entrar en contacto con uno de los componentes de los envases terciarios durante la distribución, el almacenamiento y el transporte del producto envasado (p.ej., paletas, tarimas, envoltorio plástico, envases activos). Los Materiales de Construcción de los Envases son las sustancias que se usan para fabricar los componentes de los envases. También se les denominan Materias Primas. Un Sistema de Administración es el conjunto de componentes y materiales que se usan para transportar un medicamento de su envase al punto de administración al paciente. Por ejemplo, un equipo de administración es un sistema de administración que se usa para transferir medicamentos líquidos de su sistema de envase plástico al sitio de administración en el paciente. Las Sustancias extraíbles son entidades químicas orgánicas e inorgánicas que pueden liberarse a partir de un envase farmacéutico/sistema de administración, componente de los envases o sus materiales de construcción y en un disolvente de extracción en condiciones de laboratorio. Dependiendo del propósito específico del estudio de extracción (que se analiza más adelante), dichas condiciones de laboratorio (p.ej., disolvente, temperatura, estequiometría, etc.) pueden acelerar o exagerar las condiciones normales de almacenamiento y uso para una forma farmacéutica envasada. Las sustancias extraíbles por sí mismas, o las sustancias derivadas de estas, tienen el potencial de lixiviarse en un medicamento en condiciones normales de almacenamiento y uso, y, por ende, se convierten en lixiviables. Por lo tanto, las sustancias extraíbles son lixiviables potenciales. Los Lixiviables son entidades químicas extrañas orgánicas e inorgánicas que están presentes en un medicamento envasado debido a que se han lixiviado en el medicamento envasado a partir de un envase /sistema de administración, componente del envase o material de construcción de los envases en condiciones normales de almacenamiento y uso o durante estudios acelerados de estabilidad del medicamento. Debido a que los lixiviables se derivan del envase o sistema de administración, no se relacionan con el medicamento mismo ni con el vehículo o ingredientes de éste. Los lixiviables están presentes en un medicamento envasado debido a la acción directa del medicamento sobre la fuente del lixiviable. Por lo tanto, los lixiviables generalmente se derivan de los envases primarios y secundarios, debido a que los envases primarios y secundarios pueden servir como una barrera entre el medicamento envasado y otras fuentes potenciales de entidades químicas extrañas (tales como envases terciarios y componentes auxiliares). En ciertas circunstancias, el envase puede entrar en contacto directo con el paciente bajo condiciones clínicas típicas del uso regular (por ejemplo, la boquilla de un inhalador de dosis fija). Como resultado de este contacto, los pacientes pueden quedar expuestos a los lixiviables de los envases sin la acción del medicamento. Los lixiviables
USP 39
Información General/ (1664) Evaluación de Sustancias Lixiviables 2029
son por lo regular un subconjunto de sustancias extraíbles o se derivan de éstas. Se debe tener en cuenta que las entidades químicas también pueden migrar del envase/sistemas de administración hacia los pacientes mediante el contacto directo. Los materiales migrantes también son entidades químicas extrañas orgánicas e inorgánicas que están presentes en un medicamento envasado debido a que se han lixiviado en éste a partir de un envase/sistema de administración, componente del envase o material de construcción de los envases en condiciones normales de almacenamiento y uso o durante estudios acelerados de estabilidad del medicamento. Sin embargo, la diferencia entre los materiales migrantes y los lixiviables es el hecho de que los primeros se acumulan en el medicamento envasado después de que han cruzado una barrera física, tal como la provista por un envase primario o secundario. Debido a que los materiales migrantes cruzan una barrera física, su presencia en el medicamento envasado no se debe a la acción directa del medicamento sobre la fuente del material migrante, puesto que la barrera evita dicha acción directa. Por ende, los materiales migrantes se derivan de los envases secundarios y terciarios y de los componentes auxiliares. Independientemente de si una sustancia es un lixiviable o un material migrante, sigue siendo una sustancia extraña en el medicamento envasado, por lo que su impacto debe evaluarse de la misma manera. Sin embargo, debido a que los medios que generan la presencia de lixiviables y de materiales migrantes en un medicamento envasado pueden ser diferentes, los estudios de sustancias extraíbles, cuyo propósito es tratar los lixiviables, pueden diseñarse e implementarse de manera distinta a los estudios de sustancias extraíbles enfocados en tratar materiales migrantes. Los Estudios de Lixiviables son investigaciones de laboratorio sobre la naturaleza cualitativa y cuantitativa de uno o varios perfiles de lixiviables particulares durante la vida útil propuesta de un medicamento particular. La Caracterización se refiere al descubrimiento, a la identificación y a la cuantificación de cada lixiviable orgánico e inorgánico individual presente en una formulación de medicamento por encima de un nivel o umbral predeterminado. Dichos umbrales deben estar basados principalmente en consideraciones de seguridad para el paciente, teniendo en mente las capacidades de la tecnología analítica, entre otras cuestiones. La Identificación es el proceso de asignar una estructura molecular a un lixiviable orgánico, o de asignar elementos constituyentes en el caso de un lixiviable inorgánico. La Cuantificación es el proceso de medir el nivel o la concentración de un lixiviable orgánico o inorgánico individual contenido en una formulación de medicamento. Los Perfiles de Lixiviables son representaciones analíticas cualitativas y/o cuantitativas del contenido de lixiviables de una formulación de un medicamento particular. Las Correlaciones entre Lixiviables-Sustancias Extraíbles se establecen cuando los lixiviables observados en el medicamento están vinculados cualitativa y cuantitativamente con las sustancias extraíbles del envase/ sistemas de administración, componentes de los envases o materiales de construcción asociados. El Umbral de Preocupación Toxicológica (TTC, por sus siglas en inglés) es un nivel de exposición para todos las entidades químicas, independientemente de si existen o no datos de toxicidad específicos, por debajo de los cuales no existiría un riesgo apreciable para la salud humana (6). El enfoque de Umbral de Preocupación Toxicológica es una forma de caracterización de riesgos en la que las incertidumbres que surgen del uso de datos sobre otros compuestos se compensan en función del nivel bajo de exposición. El Umbral de Preocupación de Seguridad (SCT, por sus siglas en inglés) es el umbral por debajo del cual un lixiviable tiene una dosis tan baja que presenta riesgos inapreciables para la seguridad con respecto a efectos tóxicos carcinógenos y no carcinógenos. El Umbral de Calificación (QT, por sus siglas en inglés) es el umbral por debajo del cual un lixiviable no carcinógeno no se considera para calificar su seguridad (evaluaciones toxicológicas) a menos que el lixiviable genere preocupaciones con respecto a la relación entre estructura y actividad (SAR, por sus siglas en inglés). El Umbral de Evaluación Analítica (AET, por sus siglas en inglés) es el umbral en el cual o por encima del cual un lixiviable debería ser caracterizado e informado para evaluación toxicológica. El Umbral de Evaluación Analítica se puede derivar matemáticamente del Umbral de Preocupación de Seguridad (o de otros conceptos de umbrales) basándose en factores que incluyan los parámetros de dosificación del medicamento. Tal como se mencionó anteriormente, se encuentra disponible terminología y definiciones relacionadas adicionales ( 7,2; ver también el capítulo (659)).
ANTECEDENTES La gestión de lixiviables es importante para los fabricantes de productos farmacéuticos y biotecnológicos/productos biológicos, así como para las autoridades reglamentarias debido a que algunos lixiviables por encima de concentraciones específicas pueden generar riesgos para la seguridad de los pacientes y/o problemas de compatibilidad para formulaciones de medicamentos. Durante la década de 1980, la Administración de Alimentos y Medicamentos de los EE.UU. (FDA, por sus siglas en inglés) comenzó a abordar de manera formal e integral los lixiviables en los medicamentos después de hallazgos de sensibilidad en pacientes inducida por los lixiviables, así como otros riesgos potenciales para la seguridad relacionados con los mismos (2-4). Desde entonces, la gestión de sustancias extraíbles y lixiviables en sistemas de envases y medicamentos finales se ha convertido en una parte importante del desarrollo farmacéutico y de las presentaciones reglamentarias para muchos tipos de formas farmacéuticas, en particular para aquéllos que presentan riesgos relativamente altos para la interacción de las formas farmacéuticas con el sistema de envase, junto con un riesgo relativamente alto para la seguridad relacionado con la vía de
USP 39
2030 (1664) Evaluación de Sustancias Lixiviables / Información General
administración (ver la Tabla 1). Se debe tener en cuenta que la Tabla 1 es una versión del concepto original que aparece en la Guía de la FDA Container Closure Systems far Packaging Human Drugs and Biologics (Sistemas de Envase-Cierre para el Envasado de Medicamentos y Productos Biológicos para Humanos) (7), en la cual se ha reducido la categoría de ciertas formas farmacéuticas con respecto al original para representar un potencial más bajo de interacción con los componentes de los envases. Las formas farmacéuticas restantes de riesgo relativamente alto incluyen: aerosoles y soluciones para inhalación, inyectables y suspensiones para inyectables, oftálmicos y ungüentos y parches transdérmicos. Sin embargo, es importante destacar que incluso las formas farmacéuticas de bajo riesgo presentan algunos riesgos y que las evaluaciones pertinentemente rigurosas de lixiviables pueden ser importantes para medicamentos particulares categorizados como formas farmacéuticas de bajo riesgo (p.ej., formas farmacéuticas tópicas y orales, etc.). Tabla 1. Enfoque Modificado FDA/CDER/CBER Basado en Riesgos para Consideración de Lixiviablesª ( 7) Ejemplos de Preocupaciones con respecto al Envase para Clases Comunes de Medicamentos Grado de Preocupación Asociado con la Vía de Administración
Probabilidad de Interacción entre Componente del Envase-Forma Farmacéutica Alta
Media
Más alta
Aerosoles y Atomizadores para lnhalación
Inyectables y Suspensiones para lnyectables; Soluciones para Inhalación
Alta
Ungüentos y Parches Transdérmicos
Soluciones y Suspensiones Oftálmicas; Aerosoles y Atomizadores Nasales
Baja
Soluciones y Suspensiones Tópicas; Aerosoles Tópicos y Linguales; Soluciones y Suspensiones Orales
-
Baja
Polvos Estériles y Polvos para Inyección; Polvos para Inhalación -
Tabletas Orales y Cápsulas Orales (Gelatina Dura y Blanda); Polvos Tópicos; Polvos Orales
ª Aunque esta tabla provee un resumen conveniente del nivel general de preocupación reglamentaria para diversas formas farmacéuticas con respecto a los lixiviables, no debe inferirse que las formas farmacéuticas de "bajo riesgo" (p.ej., tabletas orales) por definición no conllevan riesgos de problemas con lixiviables.
Este capítulo describe principios científicos y mejores prácticas para la evaluación de lixiviables en medicamentos, asimismo abarca diversos conceptos importantes, que incluyen: 1) requisitos para los estudios de lixiviables; 2) conceptos fundamentales para los estudios de lixiviables; 3) fundamentos de los umbrales para lixiviables y una guía general sobre la aplicación de dichos umbrales; 4) diseño e implementación de estudios de lixiviables; 5) desarrollo y validación del método de lixiviables; 6) correlación de resultados de evaluaciones de sustancias extraíbles y análisis de rutina de lixiviables con estudios de lixiviables; y 7) establecimiento de especificaciones de lixiviables incluyendo criterios de aceptación. Estos principios científicos y mejores prácticas se aplican a todas las organizaciones e individuos implicados en la fabricación, la comercialización y la calificación de medicamentos y sus estudios de estabilidad, incluyendo, entre otros: • Fabricantes de medicamentos para uso humano y veterinario cuya fabricación implique operaciones en las instalaciones del titular de la solicitud del registro (es decir, instalaciones que pertenezcan al titular de una Solicitud Aprobada para Nuevo Medicamento o Solicitud Abreviada para Nuevo Medicamento) o en las de un contratista del titular de la solicitud. • Fabricantes de medicamentos de combinación • Operaciones de envasado por parte del fabricante o de un contratista designado por el titular de la solicitud • Operaciones de reenvasado en las que el medicamento pudiera ser propiedad de una organización diferente al fabricante primario Aunque en última instancia es responsabilidad del solicitante del medicamento asegurarse de que se completen las evaluaciones de lixiviables apropiadas, los fabricantes y productores de envases farmacéuticos/sistemas de administración, componentes de los envases y materiales de construcción también deberían aplicar estos principios científicos y mejores prácticas, según sea apropiado. Asimismo, se recomienda a los solicitantes colaborar con los fabricantes y productores de componentes para dicho propósito.
CONCEPTOS Conceptos Generales para la Evaluación de Lixiviables Durante el transcurso de su fabricación, envasado, almacenamiento, distribución y administración, las formas farmacéuticas y/o los componentes de la formulación pueden entrar en contacto con componentes y materiales de construcción de equipo de fabricación y envasado, así como con componentes y sistemas y envases primarios y secundarios. Dicho contacto puede generar interacciones entre la forma farmacéutica y estos componentes y materiales. Una de estas interacciones es la migración o lixiviación de sustancias a partir de cualquiera de estos componentes y materiales en la forma farmacéutica. Los lixiviables, que pueden incluir entidades químicas orgánicas e inorgánicas (es decir, elementales) de amplia diversidad química, son un factor de riesgo debido a su riesgo potencial para la seguridad de los pacientes y a los riesgos potenciales de compatibilidad para el medicamento. Para evaluar estos riesgos y gestionar los problemas potenciales presentados por los lixiviables, es necesario conocer sus identidades y niveles de acumulación en el medicamento terminado durante la vida útil. Estas dos piezas de información pueden usarse para establecer la magnitud de la exposición del paciente (dosis) y, por lo tanto, el riesgo para la
USP 39
Información General/ (1664) Evaluación de Sustancias Lixiviables 2031
seguridad que presenta un lixiviable individual, así como la probabilidad de cualquier problema de compatibilidad relacionado con el medicamento. Las guías reglamentarias, los requisitos y las diversas recomendaciones de las mejores prácticas establecen que la evaluación definitiva del impacto potencial del contacto entre un envase/sistema de administración y una forma farmacéutica final implica un análisis de lixiviables en el medicamento final. En su forma más esencial, esta evaluación de impacto implica realizar un estudio de migración o de lixiviables cuyo propósito es descubrir, identificar y cuantificar lixiviables que hayan migrado del sistema, componentes o materiales con los que estuvieron en contacto y que se hayan acumulado en la forma farmacéutica terminada en las condiciones reales de fabricación, almacenamiento y uso clínico del producto. Los estudios de lixiviables son investigaciones de laboratorio sobre la naturaleza cualitativa y cuantitativa de uno o varios perfiles de lixiviables particulares durante la vida útil propuesta de un medicamento particular. El propósito de un estudio de lixiviables es identificar y cuantificar sistemática y racionalmente (es decir, caracterizar) lixiviables en el medicamento en la medida de lo posible y dentro de ciertos parámetros de umbral analítico definidos. Los resultados de los estudios de lixiviables se usan en la evaluación general de lixiviables para entender el impacto de estos sobre la seguridad del paciente, y sobre la calidad y la estabilidad del medicamento. Los estudios de lixiviables pueden usarse dentro del contexto de una evaluación general de lixiviables para: • Facilitar el desarrollo oportuno de envase/sistemas de administración de formas farmacéuticas, sistemas de fabricación y procesos efectivos y seguros, al ayudar con la selección de componentes y materiales de construcción • Facilitar el establecimiento de correlaciones entre lixiviables-sustancias extraíbles cualitativas y cuantitativas en medicamentos, cuando se use en conjunto con una evaluación de sustancias extraíbles apropiada. • Establecer el perfil de lixiviables en medicamentos en las condiciones más exigentes de manera que facilite el desarrollo de especificaciones y criterios de aceptación para lixiviables en medicamentos (cuando así se requiera) y la evaluación de seguridad/calificación de lixiviables • Identificar tendencias en los niveles de acumulación de lixiviables en medicamentos durante el transcurso de la vida útil de un medicamento particular • Facilitar los procesos de control de cambios para el envase/sistemas de administración de medicamentos (según corresponda), componentes de los envases, materiales de construcción, componentes de la formulación, etc. • Facilitar investigaciones sobre los orígenes de lixiviables identificados cuya presencia ocasione resultados fuera de la especificación (OOS, por sus siglas en inglés) para un medicamento comercializado. Estas son las formas en las que las evaluaciones y estudios de lixiviables pueden sustentar los principios de Calidad por Diseño (QbD, por sus siglas en inglés) para el desarrollo y la fabricación de envases farmacéuticos/sistemas de administración y medicamentos. Una evaluación completa de lixiviables incluye entender el impacto que tienen los lixiviables individuales sobre la seguridad, la calificación de seguridad de los lixiviables individuales y el desarrollo de un entendimiento de su impacto sobre la estabilidad del medicamento (es decir, compatibilidad) y la estabilidad. Aunque la calificación sobre la seguridad se presenta en términos generales, los detalles para lograr este objetivo están más allá del alcance de este capítulo, el cual se limita a principios científicos generales y mejores prácticas para la realización de estudios de lixiviables y otros usos enunciados de los resultados de estudios lixiviables dentro de una evaluación general de lixiviables. Se refiere al lector a escritos acreditados sobre este tema (2,8,9). Se debe tener en cuenta que algunos componentes de los envases y de los dispositivos médicos de productos de combinación están (o pueden llegar a estar) en contacto directo con la boca, la mucosa nasal u otros tejidos corporales de un paciente durante el uso normal del medicamento. Dichos componentes de los envases incluyen boquillas de inhaladores de dosis fija e inhaladores de polvo seco, parches transdérmicos, entre otros. Los pacientes están potencialmente expuestos a entidades químicas a través del contacto directo con dichos componentes. La evaluación de la exposición del paciente en dichos casos de contacto directo se logra de mejor manera a través de evaluaciones de sustancias extraíbles y estudios de extracción apropiados, por lo que se recomienda consultar el capítulo (1663).
Umbrales de Seguridad Aunque los lixiviables representan una clase particular de impurezas de los medicamentos, las guías reglamentarias vigentes para impurezas en medicamentos considera específicamente que los lixiviables están fuera de su alcance (5). Los umbrales que han sido específicamente propuestos para lixiviables en medicamentos están basados en aspectos a considerar sobre la seguridad del paciente o en las capacidades actuales de la tecnología analítica. Los umbrales de seguridad son particularmente importantes en una evaluación de lixiviables debido a que la tecnología analítica actual permite la detección de trazas de entidades químicas orgánicas e inorgánicas a niveles extremadamente bajos (es decir, ng/mL; ng/g). La identificación y la evaluación de riesgos (o calificación) de cada entidad química individual en un perfil de lixiviables típico dentro de los límites de la tecnología analítica de la actualidad son innecesarias desde un punto de vista toxicológico e inviables para un medicamento típico. Los umbrales de seguridad permiten una determinación científica basada en riesgos de niveles aceptables de lixiviables y pueden estar basados en información toxicológica establecida, así como en factores de riesgos de seguridad adicionales que consideren, p.ej., la vía de administración, la exposición diaria y la duración del tratamiento. Debido a que los umbrales de seguridad se derivan de los datos de exposición, se consideran en términos de unidades de exposición, tales como Consumo Total Diario (TDI, por sus siglas en inglés). Por ende, todos los umbrales de seguridad deben convertirse a unidades de concentra-
2032 (1664) Evaluación de Sustancias Lixiviables / Información General
USP 39
ción (p.ej., µg/mL) de modo que puedan aplicarse como umbral analítico en el laboratorio. El umbral analítico es una guía sobre qué entidades químicas en el perfil de lixiviables deberían considerarse para su caracterización química (es decir, identificación confirmada) y para la evaluación y calificación de seguridad. Un ejemplo del concepto de umbral de seguridad que ha tenido una aplicación práctica en el desarrollo farmacéutico es el enfoque de Umbral de Preocupación Toxicológica (TIC, por sus siglas en inglés) (6). El concepto del Umbral de Preocupación Toxicológica fue adoptado por la Agencia Europea de Medicamentos (EMA, por sus siglas en inglés) para evaluar impurezas genotóxícas, usando un factor de exceso de riesgo cancerígeno de 10-5 (1 en 100 000) (7). El umbral de seguridad propuesto por la Agencia Europea de Medicamentos para impurezas genotóxicas usando el enfoque de Umbral de Preocupación Toxicológica es un Consumo Total Diario de 1,5 µg/día. Otros ejemplos de umbrales de seguridad incluyen el Umbral de Preocupación de Seguridad y el Umbral de Calificación del Instituto de Investigación de Calidad de Productos (Product Quality Research lnstítute o PQRI), derivado y propuesto para lixiviables orgánicos individuales en Medicamentos Nasales y para Inhalación Oral (OINDP, por sus siglas en inglés) (2,8,9). El Umbral de Preocupación de Seguridad contempla una ingesta total diaria de O, 15 µg/día, y el Umbral de Calificación propuesto contempla una íngesta total diaria de 5 µg/día para un lixiviable orgánico individual. El desarrollo del enfoque de Umbral de Preocupación Toxicológica generó las bases, sentó un precedente y proveyó una guía para la derivación del Umbral de Riesgo para la Seguridad del Instituto de Investigación de Calidad de Productos, el cual incorpora un factor de riesgo de 10-6 (1 en 1 000 000) en lugar del valor 10-5 usado para el umbral de la Agencia Europea de Medicamentos. Se consideró que este umbral más bajo era apropiado para líxívíables en Medicamentos Nasales y para Inhalación Oral debido a las consideraciones con respecto a la administración directa de algunas de estas formas farmacéuticas en órganos enfermos de una población de pacientes sensibles y asumiendo una exposición de por vida. Además, los lixiviables son por lo regular sustancias químicas industriales sin relación estructural directa con los ingredientes activos u otros componentes de la formulación. Cuando el valor se encuentra por debajo del Umbral de Riesgo para la Seguridad, generalmente no es necesaria la identificación ni la evaluación de la seguridad de los lixiviables. Por debajo del Umbral de Calificación, los lixiviables sin alertas estructurales de carcínogE!nicídad o irritación no requerirían una evaluación de riesgos para la seguridad específica del compuesto. Se debe tener en cuenta que ni el Umbral de Riesgo para la Seguridad ni el Umbral de Calificación representan umbrales de control o límites motivados por la seguridad, sino que son umbrales para la evaluación de lixívíables. El Umbral de Preocupación de Seguridad en particular está diseñado para establecer un umbral para la caracterización de líxívíables de medicamentos desconocidos. Se pueden determinar niveles individuales de preocupación de la seguridad para líxíviables conocidos y líxiviables potenciales (es decir, sustancias extraíbles), que sean diferentes del valor del Umbral de Preocupación de Seguridad. En el caso de los medicamentos nasales y para inhalación oral, existen algunos compuestos y clases de compuestos que representan "casos especiales" para los cuales, debido a riesgos particulares para la seguridad (p.ej., compuestos carcínógenos), se consideró necesarios umbrales más bajos basándose en las capacidades de las tecnologías y los métodos analíticos específicos. Estos compuestos especiales para los medicamentos nasales y para inhalación oral incluyen: hidrocarburos poliaromáticos o aromáticos polinucleares (PAH o PNA, por sus respectivas siglas en inglés), N-nitrosamínas y la entidad química individual 2-mercaptobenzotíazol (ver Medicamentos Nasales y para Inhalación Oral (1664.1 )).
Intercambio de Información Para gestionar los lixiviables de manera exitosa durante el ciclo de vida del medicamento, resulta crítico que las partes interesadas responsables de la calidad del medicamento establezcan una comunicación estrecha y regular durante el desarrollo y el ciclo de vida del mismo: químicos, toxicólogos, ingenieros de envasado, operaciones de fabricación, adquisiciones, etc. Con respecto a los lixivíables, se considera crítica la comunicación entre el químico analítico y el toxicólogo. Por ejemplo, sí se encuentra que un líxiviable está por encima de un límite aceptado, o sí se encuentra un nuevo lixívíable, deberá realizarse una evaluación de seguridad. El químico deberá proveer al toxicólogo información que ayude a calificar el líxívíable, incluyendo la identidad del líxívíable, lo cual puede incluir la clase del compuesto o información más específica, tal como la fórmula y la estructura químicas, así como la cantidad y la concentración del líxívíable en el medicamento. El intercambio de información entre los fabricantes/proveedores de los componentes de los envases y los desarrolladores/ fabricantes del medicamento también es importante para guiar la selección de los componentes de los envases y de los materiales de construcción, proveer conocimiento sobre sustancias extraíbles y lixíviables potenciales, y facilitar las correlaciones entre líxiviables-sustancias extraíbles mediante conocimiento sobre las composiciones químicas de los componentes de los envases y demás elementos (ver también el capítulo (1663)).
DISEÑO DEL ESTUDIO DE LIXIVIABLES Aunque los estudios de líxiviables pueden realizarse en cualquier momento durante el ciclo de vida de desarrollo/fabricación del medicamento, se vuelven especialmente relevantes durante las etapas avanzadas del desarrollo del medicamento o durante la evaluación formal de la estabilidad del mismo. La manera idónea de llevar a cabo la evaluación de líxíviables es la siguiente: • La evaluación se lleva a cabo con el medicamento real y no con simulaciones del mismo (no obstante, consultar la sección Estudios de Simulación).
• La evaluación se lleva a cabo con el envase y sistema de administración reales en la forma en que será comercializado, no con prototipos ni con los componentes del sistema.
USP 39
Información General/ (1664) Evaluación de Sustancias Lixiviables 2033
• Las evaluaciones de sustancias extraíbles relacionadas se realizan con los mismos lotes de componentes de los envases usados en la fabricación de los lotes del medicamento con los que se llevan a cabo las evaluaciones de lixiviables. • La evaluación se lleva a cabo en un medicamento fabricado en condiciones que reflejen los procesos comerciales reales de la producción del medicamento y del envase/sistema de administración, llenado del medicamento en el envase/sistema de administración, tratamiento del envase lleno posterior al llenado (p.ej., esterilización terminal), distribución, almacenamiento y uso clínico del medicamento. Aunque los estudios de lixiviables pueden incluir condiciones de almacenamiento aceleradas, no pueden limitarse a dichas condiciones y deben incluir evaluaciones en tiempo real. Los estudios de lixiviables también pueden llevarse a cabo en una etapa temprana del proceso de desarrollo del medicamento (p.ej., etapa preclínica) para facilitar la selección de los componentes de los envases y sus materiales de construcción. Dichos estudios de lixiviables son particularmente útiles para algunas formas farmacéuticas "de alto riesgo" (ver la Tabla 1) para las cuales resulta crítico seleccionar los componentes de los envases y los materiales de construcción apropiados. Es posible evaluar al mismo tiempo una variedad de componentes de los envases y materiales de construcción, además de que se pueden determinar y evaluar perfiles de lixiviables en medicamentos para cada configuración. Para los sistemas de envases primarios o productos combinados de medicamento/dispositivo, esto puede lograrse usando la formulación del medicamento o una formulación placebo que entre en contacto con el sistema de envase propuesto. En el último caso, la formulación placebo puede considerarse como un disolvente de simulación para caracterizar sustancias extraíbles como probables lixiviables (ver Estudios de Simulación). En cualquier caso, las condiciones de estudio de los lixiviables (es decir el tiempo, la temperatura, etc.) deberían estar basadas en condiciones que sean pertinentes para el tiempo de uso o la vida útil del medicamento. Los estudios de lixiviables en la etapa de desarrollo preclínico pueden designarse de manera sistemática para sustentar los procesos y principios de Calidad por Diseño. También es importante tener en cuenta que durante la etapa temprana del desarrollo del medicamento para formas farmacéuticas de alto riesgo, se recomienda realizar la caracterización de lixiviables para cualquier partida de medicamento que se use como artículo de prueba en estudios toxicológicos o clínicos definitivos. Para las formas farmacéuticas de "bajo riesgo" (p.ej., sólidas orales, polvos tópicos) los estudios de lixiviables realizados a lo largo del desarrollo pueden ser apropiados para evaluar, y de esta forma evitar, problemas con los sistemas de envases que pudieran presentarse en una etapa avanzada del desarrollo o en el producto comercializado. Durante la etapa avanzada del desarrollo de formas farmacéuticas de alto riesgo para sustentar el registro del medicamento, cuando se encuentra disponible la forma final del medicamento comercial envasado, los estudios de lixiviables pueden llevarse a cabo en partidas definitivas del medicamento para registro durante el transcurso de los estudios generales de estabilidad del producto. Los resultados de estos estudios de estabilidad de lixiviables pueden usarse para establecer correlaciones entre lixiviables-sustancias extraíbles, identificar tendencias en los niveles de acumulación, evaluar los lixiviables individuales y calificarlos teniendo en cuenta la seguridad, así como desarrollar especificaciones para lixiviables con criterios de aceptación (cuando así se requieran). En el caso de los aerosoles para inhalación y otros medicamentos nasales y para inhalación oral, el análisis de lixiviables debe ser una parte integral de un programa más amplio de estabilidad ICH para el registro (2), y las condiciones de almacenamiento y los tiempos de muestreo de estabilidad deben planearse de manera correspondiente. Para aquellos casos en los que un componente del envase/administración entre en contacto directo con el paciente (p.ej., la boquilla de un inhalador de dosis fija o del accionador de un inhalador de polvo seco), se deben evaluar como sustancias extraíbles (es decir, lixiviables potenciales) las entidades químicas a las que el paciente pudiera estar expuesto usando fluidos de simulación apropiados en condiciones de tiempo/temperatura de exposición pertinentes al uso pretendido (ver el capítulo (1663)). Además, las evaluaciones de lixiviables pueden ser apropiadas en ciertos casos después de la comercialización. Por ejemplo, los estudios de lixiviables en medicamentos también pueden ser apropiados en muchos casos en los que se apliquen cambios necesarios o deseados a un medicamento comercializado. Dichos estudios de lixiviables por lo regular se requieren para sustentar los procesos de control de cambios para muchas formas farmacéuticas de alto riesgo, en particular aquellas para las que se dispone de especificaciones de lixiviables y criterios de aceptación, y también podrían ser apropiadas para otros tipos de formas farmacéuticas, productos de combinación de medicamento/dispositivo, entre otros. Los cambios pueden aplicarse, entre otros, a lo siguiente: la composición de la formulación del medicamento; los procesos de fabricación para el medicamento; los componentes de los envases primarios y secundarios o sus materiales de construcción; los procesos de fabricación o ensamblaje para componentes de los envases primarios o secundarios o sus materiales de construcción; y los sistemas de administración que son parte del etiquetado del medicamento. Cualquier cambio que resulte de la exposición del paciente a un perfil de lixiviables diferente del aprobado durante el registro requerirá de estudios de lixiviables como parte de cualquier proceso de control de cambios, a menos que se provea justificación científica adecuada de lo opuesto. Aunque para las formas farmacéuticas de bajo riesgo (p.ej., sólidas orales, polvos tópicos) por lo general no se requieren rigurosamente estudios de lixiviables como parte del proceso de registro del medicamento( Tabla 7), es posible que aparezcan lixiviables en los perfiles de impurezas del medicamento durante los estudios de estabilidad para el registro o en los medicamentos comercializados. Por ejemplo, se ha documentado que los aditivos químicos en los adhesivos de las etiquetas pueden migrar a través del envase primario plástico y aparecer en perfiles de impurezas de formas farmacéuticas sólidas orales envasadas dentro de estos envases. Por tanto, resulta apropiado considerar para ciertos casos realizar estudios de lixiviables en formas farmacéuticas de "bajo riesgo". Si la evaluación de lixiviables no se realiza de manera proactiva, esto puede llevar a un resultado fuera de la especificación para un producto en desarrollo o comercializado, además de requerir un estudio de "emergencia" de lixiviables como parte del proceso de investigación. El diseño de este tipo de estudio de lixiviables depende de la situación particular; sin embargo, en general, sería necesario identificar y cuantificar los lixiviables, evaluar la seguridad y posiblemente calificar los lixiviables, y correlacionar los lixiviables con las sustancias extraíbles de los componentes de los envases. Además, es
2034 (1664) Evaluación de Sustancias Lixiviables / Información General
USP 39
posible que los lixiviables puedan ser el resultado del contacto con el equipo de fabricación y con sistemas de envases terciarios (p.ej., materiales de transporte). El diseño de un estudio de lixiviables particular depende del propósito y de los objetivos de la evaluación general de lixiviables. Aunque los estudios de lixiviables descritos anteriormente tienen propósitos distintos y objetivos generales, requieren de tipos similares de información para su diseño apropiado. Primero, es importante contar con información sobre las identidades y niveles máximos de acumulación posibles de todos los lixiviables potenciales. Los fabricantes de componentes de envases pueden proveer detalles sobre la composición química para el envase/sistema de administración y diversos materiales de construcción, así como detalles relacionados con los procesos de fabricación para dichos componentes y materiales. Dicha información puede presentarse en forma de hojas de datos de seguridad de materiales, hojas de datos técnicos, informes de pruebas o comunicaciones confidenciales, y se puede usar para inferir lixiviables potenciales. Una evaluación de sustancias extraíbles (incluyendo un estudio de extracción) también puede realizarse en los componentes de los envases y/o sus materiales de construcción para evaluar directamente lixiviables potenciales (ver el capítulo (1663)). Independientemente de cómo se obtenga la información química, es importante asegurarse de que se estén considerando todas las fuentes posibles de lixiviables potenciales derivados del sistema de envase terminado. Éstas pueden incluir entidades químicas de cualquiera de los componentes de los envases primarios y secundarios y sus materiales de construcción, recubrimientos, limpieza, lubricación, corte, esterilización, ensamblaje u otros procesos relacionados con la fabricación del envase/sistema de administración final tal como se usa en el medicamento. La información química sobre el envase y el sistema de administración se usa para crear una lista de lixiviables potenciales y sus posibles niveles de acumulación. Los lixiviables potenciales tienen una diversidad química significativa y, por ende, una diversidad de propiedades físicas y químicas, que incluyen polaridad, volatilidad, solubilidad, entre otras. Mientras que los compuestos relativamente volátiles pueden migrar con mayor facilidad a cualquier tipo de formulación a través del contacto indirecto, los no volátiles por lo general requieren de contacto directo. Se deben considerar dos aspectos del contacto con la formulación: la naturaleza del contacto con la formulación (es decir, directo o indirecto) y el tiempo de contacto (temporal o continuo). Si la formulación no está en contacto directo con el componente del envase (p.ej., polvo para inhalación en una cápsula envasada en un blíster), existe una probabilidad menor de que algún compuesto relativamente no volátil migrase a la formulación desde el sistema de envase; sin embargo, los compuestos volátiles sí podrían. Si la formulación únicamente entra en contacto de manera breve con el componente del envase (p.ej., la boquilla de un inhalador) es menos probable que ocurra alguna migración de sustancias químicas desde el componente durante este periodo de tiempo efímero. Sin embargo, si la formulación entra en contacto constante con el componente del envase (p.ej., un parenteral en una bolsa que se administra a través de un equipo para administración) entonces compuestos de todo tipo podrían potencialmente migrar a la formulación. Una evaluación rigurosa de lixiviables considera los lixiviables de fuentes distintas al envase primario, tales como envases secundarios necesarios y, en ciertos casos, envases terciarios. Si el envase primario consta de un polímero semipermeable (p.ej., un envase de polietileno de baja densidad), entonces se deben evaluar los lixiviables potenciales derivados de etiquetas, tintas, adhesivos y demás materiales que se usan en el envase secundario. De manera similar, los compuestos volátiles que están presentes en el envase terciario (p.ej., tarimas de madera, cajas de cartón, envolturas plásticas, etc.) podrían migrar a una formulación contenida en dicho frasco de plástico. Estos migrantes que se derivan de los envases terciarios deben considerarse en caso de que se detecte o se sospeche la presencia de una impureza desconocida en el medicamento. Además, se deben considerar diversas características de la formulación del medicamento al momento de diseñar cualquier estudio de lixiviables. Por ejemplo, las formulaciones son regularmente sólidas o líquidas, y está bien documentado que el estado físico afecta el proceso de lixiviación. En caso de que una formulación presente un cambio de estado durante el curso de la producción (p.ej., liofilización; líquido a sólido) entonces el estudio de lixiviables deberá diseñarse teniendo en cuenta los periodos en que se espera que la formulación se encuentre en cada estado físico. En caso de que una formulación presente un cambio de estado durante el periodo de uso (p.ej., nebulización de un líquido a vapor) entonces se deben tener en cuenta los lixiviables adquiridos del envase del líquido durante el almacenamiento y aquéllos adquiridos durante el uso del dispositivo de administración prescrito. Además, por lo regular únicamente se evalúa el medicamento envasado final para detectar lixiviables; no obstante, puede haber casos en los que un producto intermedio (p.ej., cápsula a granel para un polvo para inhalación) se almacene durante periodos prolongados en diversos envases primarios (p.ej., bolsa de papel aluminio) de los que pueden lixiviar algunos compuestos. Si estos compuestos que migran del envase a granel persisten durante el proceso de fabricación del medicamento y se arrastran al medicamento terminado, entonces deben tratarse apropiadamente como lixiviables. Además, se debe considerar la naturaleza de cualquier contacto que se produzca entre el envasado y el sistema de administración y el paciente. Si el contacto es sólo superficial, entonces la probabilidad de migración química directa al paciente es mucho menor que si el contacto es con mucosas, tejidos, huesos o dentina. Las diversas categorías de contacto se describen en el capítulo Biocompatibílidad de Materiales Usados en Envases de Medicamentos, Dispositivos Médicos e Implantes (1031) o ISO 10993 (70).
CARACTERIZACIÓN DE LIXIVIABLES El objetivo principal de cualquier estudio de lixiviables es su caracterización, es decir, el descubrimiento, la identificación y la cuantificación de lixiviables presentes en un medicamento particular. Los métodos analíticos para la caracterización de lixiviables se desarrollan basándose en la naturaleza de la matriz del medicamento, las identidades y los posibles niveles de acumulación de lixiviables potenciales, así como la sensibilidad requerida basándose en un umbral de evaluación de lixiviables adopta-
USP 39
Información General/ (1664) Evaluación de Sustancias Lixiviables 2035
do y las capacidades de los métodos analíticos empleados. A diferencia de un método típico de impurezas en medicamentos en el que los analitos esperados están relacionados con el fármaco, los lixiviables tienen una amplia diversidad química y pueden provenir de diversas fuentes del envase/sistema de administración. Los lixiviables también presentan una amplia variedad de niveles de acumulación posibles en un medicamento. Cuando se consideran en conjunto, estos factores presentan un desafío significativo para el análisis de trazas, en especial en el caso de la identificación de lixiviables orgánicos. En ciertas circunstancias, este desafío se puede mitigar llevando a cabo el proceso de identificación de lixiviables potenciales fuera de la evaluación de lixiviables, por ejemplo, mediante la evaluación de lixiviables en estudios de sustancias extraíbles simulados (Ver Estudios de Simulación). Antes de describir los procesos, las técnicas analíticas y los métodos implicados en la caracterización de lixiviables, resulta apropiado indicar que el objetivo final de una caracterización minuciosa de lixiviables según se definió anteriormente no puede lograrse para todos los casos, incluso cuando se lleva a cabo un método químico analítico de vanguardia con el mayor rigor y capacidades disponibles. La realidad es que no existe una técnica analítica o combinación de técnicas analíticas que sea capaz de descubrir, identificar y cuantificar todos y cada uno de los lixiviables orgánicos e inorgánicos. Por ejemplo, pueden no existir en todos los casos compuestos de referencia auténticos para lixiviables orgánicos para la confirmación de las identificaciones o para la calibración del instrumento cuantitativo. Ante dichas circunstancias, el objetivo práctico de la caracterización de lixiviables debe ser por tanto el descubrimiento, la identificación y la cuantificación, a un grado razonable de certidumbre científica, de los lixiviables individuales presentes en un medicamento por encima de un nivel, o "umbral", predeterminado, llevados a cabo con el debido rigor.
Umbrales Analíticos La acción inicial en el desarrollo de un método para lixiviables es establecer el nivel de desempeño de dicho método para lograr las funciones apropiadas de caracterización de lixiviables. Dicho nivel se conoce como umbral analítico. Como mínimo, un método apropiado debe funcionar a todos los niveles mayores o iguales al umbral analítico. Según se discutió previamente, dicho umbral analítico pude basarse en diversos criterios, incluyendo consideraciones de seguridad. Un ejemplo de un umbral basado en la seguridad es el Umbral de Preocupación de Seguridad establecido para Medicamentos Nasales y para Inhalación Oral. Para definir el Umbral de Preocupación de Seguridad en términos que faciliten el análisis de laboratorio, se debe convertir de unidades de exposición (es decir, µg/día) a unidades de concentración (p.ej., µg/mL, µg/g, µg/lata, µg/vial, etc.). Esto se logra considerando los parámetros de dosis para un medicamento determinado de acuerdo con lo declarado en la etiqueta del mismo. El umbral resultante útil desde un punto de vista analítico se denomina Umbral de Evaluación Analítica (AET, por sus siglas en inglés) (2). Los lixiviables esperados previamente caracterizados contarán con perfiles de seguridad conocidos y umbrales para lixiviables previamente establecidos. En cualquier caso, los umbrales pueden usarse para cimentar el desarrollo del método analítico a menos que otros aspectos del producto a considerar, tales como la compatibilidad, indiquen la necesidad de un nivel más bajo. Una fórmula general para convertir el Umbral de Preocupación de Seguridad (O, 15 µg/día) en un Umbral de Evaluación Analítico es la siguiente: Umbral de Evaluación ( Analítica
µg envase
)
= (O,lSµ_g I ?íª) X {dosis declaradas\ dos1s/d1a
\
envase
}
Además, para las formas farmacéuticas líquidas:
Umbral de (
Evalu~ción
Anal1t1ca
µg )
mL =
µg
-e~n~va~s-e-
mL '-en_v_a_s_e_
De igual forma, para las formas farmacéuticas sólidas:
Umbral de Evaluación Analítica
µg (µg) g =
envase
g envase
Este Umbral de Evaluación Analítica establece el nivel al que se deben identificar y cuantificar los lixiviables desconocidos en un medicamento particular y, por lo tanto, se puede usar como fundamento para el desarrollo del método analítico.
2036 (1664) Evaluación de Sustancias Lixiviables / Información General
USP 39
Requisitos del Método Analítico Los requisitos del método analítico para la caracterización de lixiviables se basan en el Umbral de Evaluación Analítica determinado (o un concepto alternativo de umbral válido) e información sobre lixiviables potenciales obtenida de las evaluaciones de sustancias extraíbles de componentes y materiales de los envases, incluyendo información de los proveedores de componentes/materiales. Debido a que los lixiviables son por lo regular un subconjunto de sustancias extraíbles o están químicamente vinculados a éstas, es posible que los métodos analíticos usados para la caracterización de lixiviables pueda basarse en aquéllos usados para la caracterización de sustancias extraíbles (ver (1663)). Cualquier método analítico para lixiviables que se use para los estudios de estabilidad del medicamento como sustento para el registro del producto, el establecimiento de correlaciones entre lixiviables-sustancias extraíbles para formas farmacéuticas de alto riesgo, o el desarrollo de especificaciones y criterios de aceptación para lixiviables debe someterse a una validación completa usando prácticas de validación aceptadas en la industria.
Preparación del Medicamento para el Análisis-Preparación de la Muestra La preparación de la muestra para la caracterización de lixiviables es una función de la naturaleza química de los lixiviables potenciales, la naturaleza química de la matriz de muestra del medicamento y las técnicas analíticas que se van a aplicar. La matriz de medicamento puede presentar un desafío significativo para la caracterización de lixiviables orgánicos. Las matrices de medicamentos contienen el ingrediente farmacéutico activo y los excipientes, los cuales, por lo regular, se presentan en niveles altos con respecto a los lixiviables (excepto por algunos medicamentos de alta potencia). Los métodos analíticos para lixiviables orgánicos por lo regular incorporan procedimientos de preparación de muestras para separar lixiviables de la matriz del medicamento y concentrarlos para el análisis. Los detalles exactos de los procedimientos de preparación de la muestra son únicos para cada medicamento individual y, aunque es imposible anticipar todos los casos, se pueden establecer los siguientes conceptos generales: • Los lixiviables de las formas farmacéuticas acuosas (p.ej., soluciones para inhalación, parenterales de pequeño y gran volumen, soluciones oftálmicas, entre otros) se pueden recuperar usando extracción líquido-líquido con disolventes orgánicos no miscibles en agua, tales como diclorometano, hexano o éter de petróleo, entre otros. El pH de la muestra acuosa puede manipularse (es decir, aumentarse o disminuirse) para mejorar la extracción de lixiviables débilmente ácidos o básicos, o para reducir problemas de extracción ocasionados por la concentración relativamente alta del ingrediente farmacéutico activo y de los excipientes. De ser necesario, el extracto orgánico resultante se puede secar (p.ej., con un agente secante de sulfato de magnesio) y concentrarse mediante técnicas que eliminen el disolvente, tales como evaporación con una corriente suave de nitrógeno seco, evaporación rotatoria o en un concentrador Kuderna-Danish, entre otras. Los extractos orgánicos concentrados pueden analizarse directamente usando métodos basados en cromatografía de gases; sin embargo, para métodos basados en HPLC que emplean fases móviles acuosas, el extracto orgánico puede reducirse hasta sequedad (o casi hasta sequedad) y el residuo resultante de lixiviables puede mezclarse con un disolvente miscible con agua (p,ej., acetonitrilo, metanol, etc.). Los lixiviables volátiles (p.ej., disolventes) pueden analizarse directamente a partir de muestras acuosas de medicamentos con cromatografía de gases combinada con muestreo de la fase gaseosa. Se debe tener en cuenta que las recuperaciones de algunos lixiviables se puede ver afectada por los procedimientos de extracción y de concentración del extracto. • Los lixiviables de formas farmacéuticas sólidas (p.ej., sólidos orales, polvos para inhalación, polvos liofilizados, etc.) se pueden recuperar (por ejemplo) disolviendo el medicamento con una solución acuosa y aplicando una extracción líquido-líquido y concentración del extracto, según se indicó anteriormente. El muestreo de la fase gaseosa y análisis por cromatografía de gases de los lixiviables volátiles pueden realizarse en las muestras acuosas o, en algunos casos, directamente en la forma farmacéutica sólida. Asimismo, es posible disolver la muestra de medicamento en otro medio apropiado y analíticamente conveniente (p.ej., un disolvente orgánico) para el análisis directo por cromatografía de gases; sin embargo, es posible que se presenten efectos matriz e interferencias de los ingredientes activos y de los excipientes. • Los lixiviables de las formas farmacéuticas orales líquidas pueden recuperarse diluyendo la muestra de medicamento en solución acuosa y aplicando extracción líquido-líquido y concentración del extracto, según se indicó anteriormente. El muestreo de la fase gaseosa y análisis por cromatografía de gases de los lixiviables volátiles pueden realizarse en las muestras acuosas o, en algunos casos, directamente en la forma farmacéutica líquida oral. Asimismo, es posible disolver la muestra de medicamento en otro medio apropiado y analíticamente conveniente (p.ej., un disolvente orgánico) para el análisis directo por cromatografía de gases; sin embargo, es posible que se presenten efectos matriz e interferencias de los ingredientes activos y de los excipientes. • Los lixiviables de las formas farmacéuticas en cremas y ungüentos pueden recuperarse disolviendo la muestra de medicamento en una solución acuosa, filtrando y aplicando extracción líquido-líquido y concentración del extracto, según se indicó anteriormente. El muestreo de la fase gaseosa y análisis por cromatografía de gases de los lixiviables volátiles pueden realizarse en las muestras acuosas. Asimismo, es posible disolver la muestra de medicamento en otro medio apropiado y analíticamente conveniente (p.ej., un disolvente orgánico) para el análisis directo por cromatografía de gases; sin embargo, es posible que se presenten efectos matriz e interferencias de los ingredientes activos y de los excipientes.
USP 39
Información General/ (1664) Evaluación de Sustancias Lixiviables 2037
• Las formas farmacéuticas con vehículos no acuosos para medicamento (p.ej., inhaladores de dosis fija con propelentes de disolventes orgánicos) requieren de procedimientos especiales de preparación de muestras, los cuales se tratan en el capítulo (1664, 1 ). El desarrollo de los métodos de preparación de muestras para la caracterización de lixiviables puede lograrse mediante el uso de muestras de prueba apropiadas, tales como muestras de estudios estabilidad de medicamentos bajo condiciones aceleradas (p.ej., 40º/75% de humedad relativa en un almacenamiento de 3 meses), muestras de medicamento o placebo con cantidades agregadas conocidas de lixiviables potenciales, y/o una matriz de medicamento simulada con cantidades agregadas conocidas de lixiviables potenciales. Las recuperaciones de lixiviables potenciales agregados en cantidades conocidas deben evaluarse y optimizarse durante el desarrollo del método. Se pueden incluir estándares internos para mejorar la exactitud y la precisión cuantitativas. Se debe tener en cuenta que la preparación de muestras para la caracterización de lixiviables debe crear una muestra de prueba presentada en una forma que sea adecuada para la técnica analítica que se va a aplicar, y deberá estar concentrada de manera apropiada de modo que se puedan caracterizar lixiviables individuales con respecto al umbral seleccionado.
Técnicas Analíticas Las técnicas analíticas aplicadas a la caracterización de lixiviables son las mismas que se aplican a la caracterización de sustancias extraíbles, las cuales se resumen y analizan en el capítulo (1663). Los análisis de exploración por lo general no se aplican a la caracterización de lixiviables, debido a que la formulación del medicamento puede interferir con los métodos de exploración (ver el capítulo (1663)). Las técnicas analíticas más útiles para el descubrimiento, la identificación (ya sea por análisis cualitativo o estructural) y la cuantificación de lixiviables orgánicos, son aquellas que combinan cromatografía de gases y HPLC con espectrometría de masas [es decir, GC/MS y HPLC (o LC)/MS]. EL muestreo de la fase gaseosa también puede combinarse con GC/MS para tratar compuestos volátiles. Otros sistemas de detección para la cromatografía de gases y la HPLC que no son para compuestos específicos (p.ej., FID, UV, entre otros.) son potencialmente útiles para el descubrimiento y la cuantificación de lixiviables, pero no generalmente para la identificación. La combinación de técnicas de cromatografía de gases y HPLC tiene la sensibilidad y especificidad requeridas para caracterizar la diversidad de compuestos químicos encontrados en muchas muestras de lixiviables. Los métodos analíticos para lixiviables deben ser capaces de caracterizar lixiviables esperados y nuevos (o no especificados) (p.ej., barrido mediante GC/MS o LC/MS); no obstante, cuando se requiere de sensibilidad adicional debido al uso de umbrales desafiantes desde el punto de vista analítico, se pueden usar métodos dedicados para compuestos esperados (p.ej., GC/MS con monitoreo de iones seleccionados). También es posible, con la validación apropiada, usar métodos basados en técnicas que no sean para compuestos específicos (es decir, GC/FID, HPLC/UV, entre otras.). El análisis estructural de lixiviables debe lograrse con un proceso sistemático idéntico al descrito en el capítulo (1663) para sustancias extraíbles, y a un nivel de confianza suficiente para la evaluación de seguridad. El capítulo Cromatografía (621) ofrece un análisis sobre los principios de las cromatografías de gases y de líquidos. El capítulo Espectrometría de Masas (736) provee un análisis sobre los principios de la espectrometría de masas (incluyendo la GC/MS y la LC/MS). Aunque las técnicas analíticas híbridas basadas en cromatografía se aplican con mayor regularidad a la caracterización de lixiviables, se pueden emplear otras técnicas analíticas con capacidad de detección de compuestos específicos (p.ej., espectroscopía de resonancia magnética nuclear).
Métodos Cuantitativos-Consideraciones sobre la Validación La validación de los métodos cuantitativos para lixiviables debe lograrse de acuerdo con las prácticas, los criterios y los estándares aceptados por la industria, tales como el capítulo Validación de Procedimientos Farmacopeicos (1225) y ( 11). El grado de validación requerido depende de los objetivos del estudio de los lixiviables en los que se está utilizando el método analítico. Los parámetros de validación pueden incluir: exactitud, precisión (repetibilidad, precisión intermedia), especificidad, límite de detección, límite de cuantificación, linealidad e intervalo, y robustez. Asimismo, se deberían desarrollar pruebas y criterios de aptitud del sistema para cada método para lixiviables. A continuación se presentan consideraciones especiales para los parámetros de validación individuales con respecto a los métodos para lixiviables: • Exactitud y precisión-Los parámetros de validación de exactitud y precisión (repetibilidad y precisión intermedia) por lo regular se evalúan usando muestras de medicamentos con cantidades agregadas conocidas de lixiviables esperados. La opción de matriz de cantidades agregadas conocidas al medicamento elegida para estas evaluaciones debería ser una que haya tenido poco o ningún contacto con los materiales de envasado usados en el medicamento final, y por lo tanto, con niveles bajos a inmedibles de lixiviables endógenos. Las matrices adecuadas de cantidades agregadas conocidas pueden incluir medicamentos fabricados recientemente y vehículos de medicamento simulados. Los niveles de cantidades agregadas conocidas deben determinarse basándose en los resultados de estudios de estabilidad acelerados o estimarse a partir de las cantidades conocidas de lixiviables esperados potenciales determinados en estudios de extracción. La exactitud por lo general se lleva a cabo en tres niveles de cantidades agregadas conocidas, que también pueden determinarse basándose en los resultados de estudios de estabilidad acelerados o estimarse a partir de las cantidades conocidas de lixiviables esperados potenciales determinados en estudios de extracción. • Linealidad e intervalo-Debido a la amplia variación en los niveles de lixiviables potenciales presentes en los componentes de los envases, los lixiviables reales en el medicamento pueden de igual forma presentarse en niveles ampliamente varia-
2038 (1664) Evaluación de Sustancias Lixiviables / Información General
USP 39
bles. La mejor exactitud y precisión se logran cuando el intervalo lineal validado tiene en cuenta los niveles de acumulación máximos potenciales de cada lixiviable o clase química de lixiviables esperados. • Límite de detección/Límite de cuantificación-Para detectar y cuantificar lixiviables desconocidos, el límite de cuantificación debería ser igual o menor al umbral analítico designado (p.ej. Umbral de Evaluación Analítico). • Especificidad-La evaluación de la especificidad del método puede lograrse evaluando la pureza de los picos cromatográficos en muestras de medicamentos con cantidades agregadas conocidas y sin éstas. Para métodos cuantitativos basados en cromatografía de gases, esto puede lograrse mediante GC/MS. Para métodos basados en HPLC, se puede usar LC/MS o LC/DAD (detección por arreglo de diodos). La especificidad puede demostrarse cualitativamente si no existen interferencias observables del método relacionadas con las entidades químicas presentes en el medicamento. • Robustez-Se debe usar un enfoque estadístico de diseño de experimentos que considere parámetros críticos del método analítico (p.ej., velocidad de flujo de la HPLC, columna de la HPLC, gradiente de la fase móvil, etc.) para crear protocolos de evaluación de robustez. También se pueden aplicar otros enfoques tales como el cambio en serie de parámetros críticos. •Aptitud del sistema-Los métodos analíticos basados en cromatografía, tales como los descritos en el capítulo (621 ), debe incluir criterios de aptitud del sistema apropiados para la evaluación de rutina del método, incluyendo pruebas de linealidad, precisión, sensibilidad y especificidad del método, según resulte apropiado. Estos parámetros deberían evaluarse con mezclas de prueba adecuadamente constituidas cada vez que se use el método cuantitativo para lixiviables, y debería incluir criterios de aceptación de aptitud del sistema apropiados basados en los resultados de la validación del método. Por ejemplo, la sensibilidad se puede confirmar mediante el análisis de estándares preparados en el umbral analítico. Se han documentado en la literatura química diversos ejemplos de métodos validados para lixiviables tomados de la literatura científica (7 2-7 7).
ESTABLECIMIENTO DE UNA CORRELACIÓN DE LIXIVIABLES-SUSTANCIAS EXTRAÍBLES Una correlación entre lixiviables-sustancias extraíbles se establece cuando los lixiviables de un medicamento pueden ser vinculados de manera cuantitativa o cualitativa con sustancias extraíbles de las evaluaciones de sustancias extraíbles correspondientes de materiales de construcción, componentes de los envases o sistemas de envases individuales. Las correlaciones entre lixiviables-sustancias extraíbles son importantes por diversas razones, las cuales incluyen justificar el uso de pruebas de liberación de sustancias extraíbles de rutina aplicadas a los componentes de los envases como una alternativa al análisis de lixiviables durante los estudios de estabilidad para medicamentos de alto riesgo, establecer la fuente de un lixiviable que produce un resultado fuera de la especificación para un medicamento de bajo riesgo, control de cambios y control de calidad continuo, entre otros. Una correlación cualitativa se demuestra cuando un lixiviable se puede vincular de manera directa o indirecta a una sustancia extraíble (es decir, un lixiviable potencial). Por ejemplo, el ácido hexadecanoico observado en un perfil de lixiviables puede vincularse directamente con el ácido hexadecanoico observado en los perfiles de sustancias extraíbles de uno o más componentes de los envases primarios. El hexadecanoato de etilo observado en el mismo perfil de lixiviables puede vincularse de manera indirecta con el ácido hexadecanoico observado en uno o más perfiles de sustancias extraíbles, si el etanol es un componente conocido de la formulación del medicamento y se demuestra que puede ocurrir una reacción de esterificación en el medicamento durante el almacenamiento. Para que exista una correlación entre lixiviables-sustancias extraíbles cuantitativa apropiada, la cantidad de lixiviables individuales durante la vida útil de un medicamento debe relacionarse matemáticamente con la cantidad de la sustancia extraíble correspondiente en su fuente. Una de las relaciones matemáticas más simples entre un extraíble y un lixiviable es que la cantidad del lixiviable en el medicamento debería ser menor o igual que la cantidad de la sustancia extraíble correspondiente. Por ejemplo, se determinó que la concentración de butil hidroxitolueno (BHT) presente en una formulación de medicamento era de 5 µg/ml. El butil hidroxitolueno se extrajo de un componente del sistema de envase primario a un nivel de 300 µg/componente. Si el sistema de envase del medicamento incorpora uno de estos componentes por cada forma farmacéutica y la formulación envasada tiene un volumen de 50 mL, entonces se establece una correlación cuantitativa entre lixiviables-sustancias extraíbles, debido a que se extrajo un total 300 µg (300 µg/componente x 1 componente) de butil hidroxitolueno y se lixivió un total de 250 µg (5 µg/mL x 50 mL). Como resultado, se puede concluir que en el promedio no se toman en cuenta 50 µg de butil hidroxitolueno para (300 µg extraídos - 250 µg lixiviados), y que dicha cantidad no se lixiviaba del componente del envase a la formulación (lo más probable) o se perdió en algún otro proceso (lo menos probable). Para medicamentos de alto riesgo, las correlaciones entre lixiviables-sustancias extraíbles pueden establecerse en múltiples partidas de medicamento (acelerado o al final de la vida útil) y en múltiples partidas de componentes de los envases. Idealmente, los estudios de sustancias extraíbles deberían realizarse con los mismos lotes de componentes que se usaron para fabricar las partidas de medicamento usadas en los estudios primarios de estabilidad (y por lo tanto, en las partidas de medicamentos en las que se realizó el análisis de lixiviables para establecer correlaciones entre lixiviables-sustancias extraíbles). Si el nivel máximo de cualquier lixiviable específico en la formulación durante los estudios de estabilidad fue sustancialmente mayor que los niveles máximos de acumulación potencial calculados de ese mismo lixiviable conforme fueron establecidos por el estudio de extracción, y los estudios de extracción se realizaron con los mismos lotes de componentes usados para fabricar las partidas primarias de estabilidad del medicamento, se puede concluir que el estudio de extracción fue incompleto y que, por ende, no se puede establecer una correlación entre lixiviables-sustancias extraíbles para dicho lixiviable específico. En este
USP 39
Información General/ (1664) Evaluación de Sustancias Lixiviables 2039
caso, se puede aumentar el estudio de extracción con experimentos que produzcan un nivel de sustancias extraíbles que exceda el nivel máximo del lixiviable, o el lixiviable puede controlarse mediante las especificaciones del medicamento para análisis de estabilidad durante la vida útil, y el análisis de liberación como una sustancia extraíble al nivel del componente es inadecuado para controlar este lixiviable. Algunas explicaciones para los casos en los que no es posible establecer una correlación entre lixiviables-sustancias extraíbles incluyen: evaluaciones de sustancias extraíbles inadecuadas de los componentes de los envases (ver el capítulo (1663)); cambios no informados en la composición de componentes de los envases o procesos de fabricación; cambios no informados en la identidad de los componentes de los envases.
CONSIDERACIONES PARA EL DESARROLLO DE ESPECIFICACIONES V CRITERIOS DE ACEPTACIÓN PARA LIXIVIABLES Los métodos analíticos validados y la información obtenida a partir de estos métodos en un estudio de lixiviables en medicamentos pueden usarse para desarrollar especificaciones y criterios de aceptación (es decir, límites) para lixiviables en medicamentos. En ciertas circunstancias, que se encuentran con mayor regularidad en las formas farmacéuticas de alto riesgo (como en el caso de medicamentos nasales y para inhalación oral), puede ser importante, útil y en ocasiones necesario, monitorear de manera rutinaria los lixiviables en medicamentos terminados. En dichas circunstancias, se deben establecer especificaciones y criterios de aceptación para lixiviables. Un medio por el cual se podrían desarrollar dichas especificaciones y criterios de aceptación incluye analizar un mínimo de tres partidas de medicamento para determinar sus niveles de lixiviables. Después de una evaluación química y de seguridad minuciosa, los datos de prueba de las tres o más partidas pueden usarse para establecer criterios de aceptación para lixiviables esperados, que sean uniformes con respecto a 1) los resultados cualitativos y/o cuantitativos de los estudios de lixiviables, 2) una consideración de las capacidades del proceso de fabricación del medicamento, y 3) una consideración del impacto potencial en la seguridad, compatibilidad y/o calidad del medicamento de los lixiviables. Es importante tener en cuenta que las especificaciones para lixiviables deberían aplicarse a un producto durante todas las etapas de su vida útil, incluyendo la liberación y al final de la misma. Esto se debe a que los lixiviables se acumulan durante toda la vida útil de un medicamento. Cuando ocurre un cambio en un producto para el que se han establecido especificaciones y criterios de aceptación para lixiviables, es importante revisar el método analítico y reevaluar los criterios de aceptación y hacer ajustes a las especificaciones y criterios de aceptación según resulte apropiado y justificado desde el punto de vista científico. Un cambio en los componentes que resulta en un incremento en las concentraciones de lixiviables más allá de los niveles calificados requerirá la evaluación toxicológica de los niveles propuestos, como sería el caso para cualquier impureza. Los criterios de aceptación pueden ser cualitativos y cuantitativos para lixiviables conocidos y no especificados. Por ejemplo, una especificación típica de lixiviables podría incluir: • El extremo cuantitativo de los límites de la vida útil para lixiviables esperados, el cual se aplica durante la vida útil del medicamento • Un límite cuantitativo para lixiviables "no especificados" (es decir, no identificados ni correlacionados previamente) (se requiere una identificación de lixiviables no especificados para una cuantificación y evaluación toxicológica exactas).
CONSIDERACIONES ADICIONALES
Estudios de Simulación Pueden surgir casos en los que no sea analíticamente viable (por ejemplo, debido a umbrales desafiantes) descubrir e identificar con éxito todos los lixiviables reales en un estudio de lixiviables en medicamentos. Esta circunstancia puede manejarse si las actividades de descubrimiento e identificación de probables lixiviables se logran en un estudio de extracción, en el que las muestras y concentraciones de analitos se manipulan con mayor facilidad para lograr el desempeño analítico necesario. En dicha circunstancia, la evaluación de lixiviables reales en el medicamento se simplifica a una cuantificación de alta sensibilidad de lixiviables esperados que hayan sido descubiertos e identificados como parte de este estudio de extracción. Para facilitar el descubrimiento y la identificación de probables lixiviables, el estudio de extracción debe ser similar en diseño a un estudio de lixiviables en medicamentos. Dicho estudio de extracción busca simular las circunstancias experimentadas por el medicamento, pero debería producir una muestra de prueba que sea más fácil de caracterizar que el medicamento mismo. Para que dicho estudio sea relevante durante el establecimiento de lixiviables esperados apropiados, los disolventes usados para generar la muestra de prueba deben tener una propensión casi idéntica a lixiviar que la formulación del medicamento. Dicho estudio debería acelerarse en función del estudio de lixiviables de modo que las sustancias extraíbles, que reflejan los lixiviables esperados potenciales, puedan ser descubiertos e identificados de manera oportuna. Las diferencias en el diseño del estudio entre este estudio de simulación y el estudio de lixiviables en el medicamento son: 1) la formulación del medicamento se ha reemplazada con un disolvente de simulación que replica la formulación; 2) las condiciones de contacto se han acelerado para incrementar las concentraciones de probables lixiviables y las velocidades de migración de probables lixiviables en el disolvente de simulación; y 3) que el artículo de prueba puede tratarse del envase y el sistema de administración completos o de componentes separados de dicho sistema. Los factores a considerar para el diseño y la justificación de los disolventes de simulación, así como las recomendaciones sobre el enfoque analítico usado para caracterizar el extracto de simulación para sustan-
2040 (1664) Evaluación de Sustancias Lixiviables /Información General
USP 39
cias extraíbles como lixiviables esperados potenciales se tratan en el capítulo (1663). Dada la intención del estudio de simulación, que es el descubrimiento y la identificación de sustancias extraíbles como lixiviables esperados, los estudios de simulación también deben conducirse mediante umbrales pertinentes. Es posible que en los casos de umbrales muy bajos (p.ej., el umbral de evaluación analítica), la cuantificación de lixiviables en el medicamento pudiera continuar no siendo viable desde el punto de vista analítico, incluso con métodos analíticos de alta sensibilidad para compuestos esperados. En tales casos, los resultados del estudio de simulación (identidades y concentraciones de los probables lixiviables) pueden ser suficientes para establecer el impacto sobre la seguridad y la calidad del paciente de los lixiviables reales en el medicamento. En la medida en que el estudio de simulación replique el estudio de lixiviables en medicamentos, el impacto potencial sobre la seguridad o la calidad de un compuesto como sustancia extraíble representa una estimación del impacto potencial sobre la seguridad o la calidad del compuesto como un lixiviable real. Si se puede establecer que un compuesto cuantificado como una sustancia extraíble en estas condiciones tiene un impacto aceptablemente pequeño sobre la seguridad y la calidad, entonces se puede asumir que el mismo compuesto, como lixiviable en la formulación del medicamento, tiene un impacto similarmente bajo sobre la seguridad y la calidad como lixiviable en la formulación del medicamento. La aceptabilidad de este enfoque para cualquier medicamento particular requiere de justificación científica por parte del solicitante del medicamento. Si un compuesto se mide como una sustancia extraíble en un estudio de simulación y se trata como un lixiviable esperado en un estudio de lixiviables en el medicamento, los datos de sustancias extraíbles y lixiviables para dicho compuesto se convierten en el fundamento con el que podría establecerse una correlación entre lixiviables-sustancias extraíbles. Para que dicha correlación se considere válida, es necesario que cada concentración de lixiviables en el medicamento sea menor o igual que la concentración de sustancias extraíbles correspondiente en el extracto simulado, teniendo en cuenta la incertidumbre en las mediciones analíticas y cualquier "factor de exageración" justificable que pudiera haberse usado en el estudio de simulación. Se debe tener en cuenta que en ciertas circunstancias justificables, se pueden usar partidas de placebo de medicamento como artículos de prueba en estudios de lixiviables en medicamentos (estudios de estabilidad). Sin embargo, existen circunstancias en las que no son aceptables las partidas de placebo, como cuando existe una razón importante para creer que los lixiviables podrían tener un efecto adverso sobre un ingrediente activo farmacéutico (p.ej., proteínas terapéuticas).
Lixiviables Inorgánicos (Elementales) El tema de los lixiviables como impurezas elementales en los medicamentos se puede tratar dentro del contexto general de las impurezas elementales en los medicamentos (p.ej., Impurezas Elementales-Límites (232). Las impurezas elementales lixiviadas del envase o de los sistemas de administración representan únicamente una de las fuentes de impurezas elementales en un medicamento y, por ende, analizar un medicamento para detectar impurezas elementales no establece que las impurezas sean lixiviables. El análisis de los sistemas de envases plásticos y sus materiales de construcción establecerá aquellas impurezas elementales extraíbles que sean relevantes para un sistema de envase particular, además de que puede ser apropiado cuantificar dichas impurezas elementales como lixiviables en el medicamento. Por lo tanto, los resultados de los análisis de los sistemas de envases plásticos deberían usarse para establecer aquellas impurezas elementales que deberían monitorearse como lixiviables elementales esperados en el medicamento. En general, las guías y las recomendaciones sobre impurezas elementales en medicamentos tratan riesgos para la seguridad relacionados con las impurezas elementales. Sin embargo, es apropiado considerar a los lixiviables elementales desde la perspectiva más amplia de la calidad general del medicamento. Por ende, el proceso de evaluar lixiviables elementales puede incluir aspectos relacionados con la seguridad del paciente y la calidad del producto. Se debe tener en cuenta que una de las diferencias entre el análisis de lixiviables (y sustancias extraíbles) orgánicos y de impurezas elementales es la naturaleza de la información generada. El análisis de lixiviables orgánicos se basa en el establecimiento previo de la identidad del compuesto químico que es el lixiviable. Como alternativa, los métodos de prueba que se usan de manera más común para tratar impurezas elementales (espectroscopía atómica) no establecen el compuesto, o forma, en la que se presenta el elemento detectado. Por ejemplo, el azufre puede estar presente en forma de azufre elemental (S 8), como sulfato (S0 4- 2), o corno un compuesto orgánico que contiene azufre (p.ej., 2-mercaptobenzotiazol). Además, el silicio puede estar presente como aceite de silicona o como dióxido de silicio (Si0 2). Debido a que la forma de la impureza elemental puede tener un efecto marcado con respecto al impacto de la impureza sobre la calidad o la seguridad del producto, puede darse el caso en que resulte necesario un análisis más allá de la generación de perfiles de impurezas elementales para establecer la forma química exacta de la impureza elemental y, de esta manera, establecer su impacto potencial sobre la seguridad o el producto. Un aspecto importante a considerar durante el análisis de medicamentos para detectar lixiviables elementales es establecer los elementos que se van a medir como lixiviables. Teniendo en cuenta lo anterior, se debe considerar que el análisis de los sistemas de envases plásticos y sus materiales de construcción establecerán aquellas impurezas elementales extraíbles que son relevantes para un sistema de envase específico. Por lo tanto, los resultados del análisis de sistemas de envases plásticos deberían usarse como una forma para establecer aquellas impurezas elementales que deberían monitorearse como lixiviables elementales esperados.
USP 39
Información General/ (1 664) Evaluación de Sustancias Lixiviables 2041
Cambio en la tedaccl6n:
RESUMEN Los requisitos de una evaluación de lixiviables y su completitud para cualquier medicamento particular sólo pueden ser determinados por el solicitante del medicamento con referencia a guías reglamentarias apropiadas. El capítulo (1664, 1) presenta recomendaciones detalladas para Medicamentos Nasales y para Inhalación Oral. También se hace referencia a otros capítulos farmacopeicos de este Compendio que describen estudios de extracción relacionados: 1 . Pruebas de Reactividad Biológica, In Vitro (87) 2. Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo (88) 3. Tapones Elastoméricos para Inyección (381) 4. •Sistemas de Envases Plásticos y sus Materiales de Construcción {661)
5. Materiales Plásticos de Construcción {661.1) 6. Sistemas de Envases Plásticos para Uso FarmacéutiCo {661.2) •
· (AF oHnay.2016¡
REFERENCIAS 1. FDA. Guidance for industry: container-closure systems for packaging human drugs and biologics. Rockville, MD: FDA; 1999. 2. Ball D, Norwood D, Stults C, Nagao L, eds. Leachables and Extractables Handbook. New York: J. Wiley and Sons; 2012. 3. Schroeder A. Leachables and extractables in OINDP: an FDA perspective. Documento de investigación presentado en: PQRI Leachables and Extractables Workshop; 5-6 December 2008; Bethesda, MD. 4. Poochikian G. Leachables and extractables: evolution of regulatory aspects and perspectives on PQRI recommendations. Documento de investigación presentado en: IPAC-RS 2011 Conference: Bringing Value to the Patient in a Changing World; 31 March 2011; Rockville, MD. 5. lnternational Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use. ICH Q3B (R2): lmpurities in New Drug Products, ICH Harmonized Tripartite Guideline, 2006. 6. Kroes R, Renwick A, Cheeseman M, Kleiner ], Mangelsdorf 1, Piersma A, Schilter B, Schlatter J, van Schothorst F, Vos ], Würtzen G. Structure-based threshold of toxicological concern (TIC): Guidance for application to substances present at low levels in the diet. Food. Chem. Toxico!. 2004;42:65. 7. European Medicines Agency. CPMP/SWP/5199/02. Committee for Medicinal Products for Human Use. Guideline on the limits of genotoxic impurities; 2006. 8. PQRI Leachables and Extractables Working Group. Safety thresholds and best practices for extractables and leachables in orally inhaled and nasal drug products; 2006. http://www.pqri.org/pdfs/LE_Recommendations_to_FDA_09-29-06.pdf. Consultado el 19 de marzo de 201 3. 9. Ball D, Blanchard ], ]acobson-Kram D, McClellan R, McGovern T, Norwood D, Vogel M, Wolff R, Nagao L. Development of safety qualification thresholds and their use in orally inhaled and nasal drug product evaluation. Toxico/. Sci. 2007;97(2):226. 1O. ISO 10993-18. Biological Evaluation of Medical Devices - Part 18: Chemical Characterization of Materials. lnternational Organization for Standardization, 2005. 11. Swartz M, Krull l. Analytical Method Development and Validation. New York: Marcel Dekker; 1997. 12. ]enke D, Poss M, Story J, Odufu A, Zietlow D, Tsilipetros T. Development and validation of chromatographic methods for the identification and quantitation of organic compounds leached from laminated polyolefin material. j. Chromatogr. Sci. 2004;42:388. 13. ]enke D. Guidelines for the design, implementation and interpretation of validations for chromatographic methods used to quantitate leachables/extractables in pharmaceutical solutions. j. Liq. Chromatogr & Refated Technol. 2004;27(20):1. 14. Jenke D, Garber M, Zietlow D. Validation of a liquid chromatographic method for quantitation of organic compounds leached from a plastic container into a pharmaceutical formulation. j. Liq. Chromatogr & Related Technol. 2005;28(2):199. 15. Xiao B, Gozo S, Herz L. Development and validation of HPLC methods for the determination of potential extractables from elastomeric stoppers in the presence of a complex surfactant vehicle used in the preparation of drug products. j. Pharm Biomed Anal. 2007;43:558. 16. Norwood D, Prime D, Downey B, Creasey ], Sethi S, Haywood P. Analysis of polycyclic aromatic hydrocarbons in metered dose inhaler drug formulations by isotope dilution gas chromatography/mass spectrometry. J. Pharm Biomed Anal. 1995;13(3):293. 17. Norwood D, Mullis ], Feinberg T, Davis L. N-nitrosamines as "Special Case" leachables in a metered dose inhaler drug product. PDA J. Pharm Sci Technol. 2009;63(4):307.
2042 (1664.1) Medicamentos Nasales/Inhalación / Información General
USP 39
(1664.1) MEDICAMENTOS NASALES Y PARA INHALACIÓN ORAL INTRODUCCIÓN Esta sección trata consideraciones específicas para lixiviables en medicamentos nasales y para inhalación oral (OINDP, por sus siglas en inglés), incluyendo inhaladores de dosis fija (MDI, por sus siglas en inglés); atomizadores nasales; soluciones para inhalación, suspensiones y atomizadores; así como inhaladores de polvo seco (DPI, por sus siglas en inglés). Aunque los medicamentos nasales y para inhalación oral pueden ser una combinación de productos formada por un medicamento y las partes que constituyen el dispositivo, el modo de acción principal es por lo regular a través del medicamento. Por esta razón, los medicamentos nasales y para inhalación oral se tratan como medicamentos desde el punto de vista reglamentario. Se encuentran disponibles documentos guía reglamentarios y recomendaciones de mejores prácticas específicas para los medicamentos nasales y para inhalación oral (7-5). Se debe tener en cuenta que el análisis siguiente se enfoca principalmente en lixiviables orgánicos. Para fundamentos sobre lixiviables inorgánicos (es decir, elementales), ver el capítulo Evaluación de Sustancias Lixiviables en Medicamentos Relacionadas con Envases Farmacéuticos y Sistemas de Administración (1664).
TÉRMINOS CLAVE Además de los términos clave listados en el capítulo (1664), a continuación se presentan algunos términos clave más específicos para los medicamentos nasales y para inhalación oral: • Los Componentes críticos son los componentes de los envases que están en contacto con la formulación del medicamento o con el paciente, o que afectan la mecánica del desempeño general del envase y sistema de liberación, incluyendo todos los envases secundarios necesarios. La identificación de componentes críticos para una forma farmacéutica en forma de medicamento nasal y para inhalación oral particular es responsabilidad del solicitante con el asesoramiento de las autoridades reglamentarias apropiadas. • Los Compuestos que constituyen casos especiales son compuestos (o clases de compuestos) individuales que presentan preocupaciones especiales para la seguridad o históricas como lixiviables en medicamentos nasales y para inhalación oral, y, por tanto, deben evaluarse y controlarse como lixiviables (y sustancias extraíbles) mediante técnicas analíticas específicas y umbrales definidos mediante el uso de tecnología. Las referencias citadas ( 7-5) proveen terminología adicional y definiciones relacionadas con medicamentos nasales y para inhalación oral específicos.
JUSTIFICACIÓN DE LA EVALUACIÓN DE LIXIVIABLES EN MEDICAMENTOS NASALES V PARA INHALACIÓN ORAL Los medicamentos nasales y para inhalación oral por lo general se categorizan como formas farmacéuticas de alto riesgo debido a las cuestiones de seguridad relacionadas con la vía de administración y la alta probabilidad de interacción de los componentes de los envases con la formulación (ver la Tabla 7 del capítulo (1664)). Los sistemas de envases usados en estos medicamentos incorporan componentes de diversos tipos, incluyendo componentes compuestos de materias primas poliméricas (plásticas o elastoméricas) con composiciones químicas complejas y, por lo tanto, con una variedad de lixiviables potenciales. Las entidades químicas pueden migrar (es decir, lixiviar) al interior de la formulación cuando existe contacto directo con el envase primario y los componentes de administración durante periodos prolongados. En algunos casos, existe también el potencial de lixiviación desde los envases secundarios y terciarios. Además, en el caso de los medicamentos nasales y para inhalación oral, generalmente se prevé el contacto entre el dispositivo de administración y el tejido mucoso (bucal o nasal). Los estudios de lixiviables en algunos medicamentos nasales y para inhalación oral pueden considerarse por separado en lo que respecta a componentes de los envases que están en contacto continuo con la formulación (p.ej., viales, frascos, blísteres, componentes de la válvula dosificadora) contra aquéllos que sólo experimentan un contacto temporal (p.ej., boquilla del inhalador de polvo seco, boquilla del inhalador de dosis fija). Los Medicamentos Nasales y para Inhalación Oral por lo regular requieren: • Un estudio de estabilidad de lixiviables para el registro del medicamento que sustente las condiciones de almacenamiento y uso a lo largo de la vida útil propuesta (ver la Tabla 7), idealmente usando partidas primarias de estabilidad del medicamento fabricadas con los mismos lotes de componentes de envases usados en los estudios de extracción (para facilitar la correlación entre lixiviables-sustancias extraíbles) • Métodos analíticos para lixiviables sensibles, selectivos y completamente validados • Evaluaciones de lixiviables basadas en umbrales de seguridad [Umbral de Preocupación de Seguridad (SCT, por sus siglas en inglés): 0, 15 µg/día, y Umbral de Calificación (QT, por sus siglas en inglés): lngesta Total Diaria (TDI, por sus siglas en inglés) de 5 µg/día para un lixiviable orgánico individual; no obstante, revisar las excepciones en la sección Compuestos
que Constituyen Casos Especiales]
USP 39
Información General/ (1664.1) Medicamentos Nasales/Inhalación 2043
• Correlaciones entre lixiviables-extraíbles cualitativas y cuantitativas completas (que requieran llevar a cabo evaluaciones de sustancias extraíbles en todos los componentes críticos de los envases; ver el capítulo Evaluación de Sustancias Extraíbles Relacionadas con Envases Farmacéuticos y Sistemas de Administración (1663)) • Especificaciones de lixiviables que incluyan criterios de aceptación (supone una evaluación de sustancias extraíbles completa para cada componente crítico de los envases). (Se debe tener en cuenta que en muchos casos el análisis de sustancias extraíbles de rutina para la liberación de componentes críticos se puede usar para controlar los lixiviables en medicamentos en lugar del análisis de rutina de lixiviables en medicamentos, siempre que se establezca una correlación integral entre lixiviables-sustancias extraíbles.) Para formas farmacéuticas de medicamentos nasales y para inhalación oral basadas en formulaciones con un potencial de lixiviación relativamente menor de compuestos orgánicos (p.ej., formulaciones acuosas, formulaciones de polvo seco), los requisitos anteriores deben tenerse en cuenta y evaluarse para cada caso, incluyendo el asesoramiento con las autoridades reglamentarias apropiadas. Tabla 1. Ejemplo de Condiciones de Almacenamiento y Puntos de Muestreo de Análisis de Estabilidad para Un Estudio de Lixlviables para el Registro de Medicamentos Nasales y para Inhalación Oral (5) Condición (temperatura/humedad relativa)
Tiempos de Muestreo (meses)
25 ± 2ºC/60 ± 5% de humedad relativa
3; 6; 12; 18; 24; 36 (hasta el final de la vida útil)
30 ± 2ºC/65 ± 5% de humedad relativa
3; 6; 12; 18; 24; 36 (hasta el final de la vida útil)
40 ± 2ºC/75 ± 5% de humedad relativa
3; 6
TIPOS DE FORMAS FARMACÉUTICAS EN MEDICAMENTOS NASALES Y PARA INHALACIÓN ORAL Inhaladores de Dosis Fija Los inhaladores de dosis fija o inhaladores de dosis fija presurizados (pMDI, por sus siglas en inglés) se definen como "medicamentos que contienen ingredientes activos disueltos o suspendidos en un propelente, mezcla de propelentes, o una mezcla de disolventes, propelentes y/u otros excipientes en dispensadores compactos de aerosol presurizados" (2,5). Los inhaladores de dosis fija típicos incluyen envases de metal (de acero o aluminio inoxidable; recubiertas o sin recubrimiento), una válvula dosificadora de volumen fijo (con componentes plásticos o elastoméricos), sellos elastoméricos y un accionador o boquilla plásticos (ver Medicamentos Nasales y para Inhalación: Aerosoles, Atomizadores y Polvos-Pruebas de Calidad de Desempeño (601 )). Los inhaladores de dosis fija son sistemas de envase-cierre y liberación de medicamentos multidosis que pueden contener suficiente formulación para proveer cientos de accionamientos (conforme a la cantidad declarada) por envase. Debido a que muchos de los componentes críticos de los envases están en contacto continuo con una formulación basada en disolventes orgánicos, el inhalador de dosis fija presenta el riesgo más alto de interacción entre la formulación y los componentes de los envases, y por ende el riesgo más alto de lixiviables de todas las formas farmacéuticas como medicamentos nasales y para inhalación oral (y de cualquier otra forma farmacéutica). Debido al potencial de lixiviación de sus formulaciones basadas en disolventes orgánicos, por lo regular se esperaría que los inhaladores de dosis fija presentasen correlaciones entre lixiviablessustancias extraíbles cualitativas y cuantitativas completas. Los lixiviables en los inhaladores de dosis fija deben caracterizarse (es decir, identificarse y cuantificarse) a niveles por encima de un umbral de evaluación analítica calculado (AET, por sus siglas en inglés). Se puede calcular un umbral de evaluación analítica para cualquier forma farmacéutica como medicamento nasal y para inhalación oral teniendo en cuenta el Umbral de Preocupación de Seguridad del medicamento nasal y para inhalación oral (es decir, O, 15 µg/día para un lixiviable orgánico individual). Un ejemplo de cálculo de umbral de evaluación analítica para un inhalador de dosis fija es el siguiente. En el caso de un medicamento en inhalador de dosis fija con 200 accionamientos declarados por envase, una exposición máxima del paciente recomendada de 12 accionamientos por día y una masa de componentes críticos por válvula de 200 mg, para un lixiviable orgánico individual derivado de este componente de la válvula, se puede estimar el siguiente umbral de evaluación analítica: Umbral de Evaluación ( · d = Ana 1·11·ica Es11ma o
0,15 µg/día
Jx
12 accionamientos/día
(200
. .
acc1onam1entos declarados/envases)
Umbral de Evaluación Analítica Estimado para Lixiviables = 2,5 µg/envase Para convertir a un umbral de evaluación analítica estimado, lo cual sería una guía útil para caracterizar lixiviables potenciales mediante estudios de extracción de este componente de válvula particular ver el capítulo (1663)): Umbral de Evaluación ( 1 envase/válvula Analítica Estimado para Sustancias = ( 2,5 µg/Envase ) x . . Extraíbles 0,2 g elastomero/valvula
j
Umbral de Evaluación Analítica Estimado para Sustancias Extraíbles = 12,5 µg/g
2044 (1664.1) Medicamentos Nasales/Inhalación / Información General
USP 39
El cálculo del umbral de evaluación analítica no debería modificarse para tener en cuenta variables, tales como un relleno en exceso del envase durante la fabricación para compensar velocidad de fuga o la variabilidad del llenado, a menos que dicha modificación pueda justificarse científicamente. Los métodos analíticos para el análisis de lixiviables en medicamentos en inhaladores de dosis fija pueden basarse en procesos tales como la "filtración en frío" de formulaciones en suspensión para eliminar partículas del ingrediente activo y de excipientes (6) o el venteo cuidadoso del propelente orgánico volátil, el cual retiene lixiviables en un residuo dentro del envase (7). Debido a que los procedimientos de preparación de muestras para formulaciones en inhaladores de dosis fija pueden ser complejos y por lo regular en algún momento requieren reducir hasta sequedad el propelente volátil, lo que genera la posibilidad de pérdida de lixiviables antes del análisis de la muestra, es particularmente importante demostrar las recuperaciones adecuadas de lixiviables a través de muestras de inhaladores de dosis fija con cantidades agregadas conocidas. Aunque es poco probable contribuir con lixiviables a la nube del aerosol del medicamento emitida, la exposición potencial del paciente a entidades químicas del accionador o boquilla plásticos del inhalador de dosis fija debería evaluarse a un umbral de 20 µg/g (ver el capítulo (1663)). Los estudios y referencias adicionales requeridos para evaluar la exposición del paciente a los químicos derivados del accionador -o boquilla- incluyen referencia a reglamentaciones indirectas para aditivos alimentarios y la aplicación de los capítulos Pruebas de Reactividad Biológica, In Vitro (87) y Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo (88) (2). Se debe tener en cuenta que los "espaciadores" y otros dispositivos diseñados para su uso con inhaladores de dosis fija también deben caracterizarse cuando se especifica un dispositivo particular en la etiqueta del medicamento(3). Cuando se construyen a partir de materiales aceptables para contacto con alimentos, los accionadores y boquillas de los inhaladores de dosis fija, "espaciadores" y demás componentes y dispositivos especificados en el etiquetado del medicamento, por lo genera sólo requieren de caracterización apropiada (es decir, estudios de extracción y análisis de sustancias extraíbles de rutina) para asegurar una composición uniforme continua del componente o dispositivo. Asimismo, basándose en las guías reglamentarias aplicables (2), los solicitantes de medicamentos deben considerar lo siguiente (ver el capítulo (1663)): • Desarrollo y validación de pruebas de liberación para residuos orgánicos superficiales en envases de metal sin recubrimiento entrantes, con criterios de aceptación apropiados • Desarrollo y validación de pruebas de liberación para sustancias extraíbles en las superficies internas de los envases recubiertos entrantes, con criterios de aceptación apropiados • Desarrollo y validación de pruebas de liberación para sustancias extraíbles en componentes críticos de las válvulas dosificadoras entrantes, con criterios de aceptación apropiados • Desarrollo y validación de pruebas de liberación para perfiles de sustancias extraíbles en accionadores y boquillas entrantes, con criterios de aceptación cualitativos y cuantitativos apropiados
Atomizadores Nasales Los atomizadores nasales se definen como "medicamentos que contienen ingredientes activos disueltos o suspendidos en una formulación, por lo regular basada en agua, que pueden contener otros excipientes y que están destinados para uso por inhalación nasal" (7,5). Los atomizadores nasales incluyen un envase de plástico y componentes (por lo general plásticos) que son responsables de medir, atomizar y administrar la formulación al paciente (ver el capítulo (601 )). Los componentes críticos incluyen aquellos que están en contacto constante con la formulación (p.ej., el envase, el tubo de inmersión) así como los componentes que están en la vía del líquido durante el accionamiento del dispositivo y que no permiten una evaporación rápida del líquido residual en la superficie (4). Debido a que los atomizadores nasales son por lo general formulaciones basadas en agua, y la mayoría de los lixiviables orgánicos potenciales son relativamente lipofílicos, el riesgo de interacción entre la formulación y el componente de envasado es menor con respecto a los inhaladores de dosis fija basados en propelentes orgánicos, por lo que el riesgo de lixiviables orgánicos es menor. Los lixiviables en los atomizadores nasales deben caracterizarse (es decir, identificarse y cuantificarse) a niveles por encima de un umbral de evaluación analítica calculado. Se puede calcular un umbral de evaluación analítica para cualquier forma farmacéutica como medicamento nasal y para inhalación oral teniendo en cuenta el Umbral de Preocupación de Seguridad del medicamento nasal y para inhalación oral (es decir, 0, 15 µg/día para un lixiviable orgánico individual). Un ejemplo de cálculo de umbral de evaluación analítica para un atomizador nasal es el siguiente. En el caso de un medicamento en atomizador nasal con 120 accionamientos declarados por envase, una exposición máxima del paciente recomendada de 4 accionamientos por día y una masa de componentes críticos (tubo de inmersión plástico) de 250 mg, para un lixiviable orgánico individual derivado de este componente, se puede estimar el siguiente umbral de evaluación analítica: Umbral de Evaluación ( Analítica Estimado =
0,15 µg/día . . , 4 acc1onam1entos/d1a
J (120 . . x
acc1onam1entos declarados/envase)
Umbral de Evaluación Analítica Estimado para Lixiviables = 4,5 µg/envase Considerando un volumen total de llenado de 1 O mL: Umbral de Evaluación Analítica Estimado= (4,5 µg/envase)/(l O mL/envase) Umbral de Evaluación Analítica Estimado = 0,45 µg/mL
USP 39
Información General/ (1664.1) Medicamentos Nasales/Inhalación 2045
Para convertir a un umbral de evaluación analítica estimado, lo cual sería una guía útil para caracterizar lixiviables potenciales mediante estudios de extracción de este tubo de inmersión plástico particular (ver el capítulo (1663)): Umbral de Evaluación Analítica Estimado para Sustancias Extraíbles
(
/
= 4 , 5 µg envase
)
(
1 envase
)
~,25 g material/tubo
Umbral de Evaluación Analítica Estimado para Sustancias Extraíbles = 18 µg/g El cálculo del umbral de evaluación analítica no debe modificarse para tomar en cuenta variables, tales como un relleno en exceso durante la fabricación, a menos que dicha modificación pueda justificarse científicamente. Todos los componentes críticos del sistema de envase del atomizador nasal deben someterse a las evaluaciones de sustancias extraíbles (ver el capítulo (1663)). La exposición potencial del paciente a entidades químicas de los componentes críticos del atomizador nasal que no están en contacto continuo con la formulación del medicamento deben evaluarse a un umbral de 20 µg/g (ver el capítulo (1663)). Los estudios y referencias adicionales requeridos para evaluar la exposición del paciente a los químicos derivados de componentes críticos que no están en contacto con la formulación incluyen referencia a reglamentaciones indirectas para aditivos alimentarios y la aplicación de los capítulos (87) y (88) (7). Cuando se construyen a partir de materiales aceptables para contacto con alimentos, los componentes críticos de los atomizadores nasales que no están en contacto continuo con la formulación del medicamento por lo general sólo requieren de caracterización apropiada (es decir, estudios de extracción y análisis de sustancias extraíbles de rutina) para asegurar una composición uniforme continua del componente. Asimismo, basándose en las guías reglamentarias aplicables (7), los solicitantes de medicamentos deben considerar lo siguiente (ver el capítulo (1663)): • Desarrollo y validación de pruebas de liberación para sustancias extraíbles en componentes críticos de cierres y bombas de envases entrantes, con criterios de aceptación cualitativos y cuantitativos apropiados.
Soluciones, Suspensiones y Atomizadores para Inhalación Las soluciones, suspensiones y atomizadores para inhalación se definen como "medicamentos que contienen ingredientes activos disueltos o suspendidos en una formulación, por lo regular basada en agua, que pueden contener otros excipientes y que están destinados para uso por inhalación oral" ( 1,5). Las soluciones y suspensiones para inhalación están destinadas para su uso con un nebulizador ( 7,5). Los atomizadores para inhalación, tales como los inhaladores de dosis fija y los atomizadores nasales, son productos de combinación en los que los componentes responsables de la medición, atomización y administración de la formulación al paciente son una parte del sistema de envase-cierre (7 ,5). Los componentes críticos incluyen componentes que están en contacto constante con la formulación, así como componentes que están en la vía del líquido durante el accionamiento del dispositivo y que no permiten una evaporación rápida del líquido residual en la superficie (3). Los lixiviables en los atomizadores para inhalación deben caracterizarse (es decir, identificarse y cuantificarse) a niveles por encima de un umbral de evaluación analítica calculado. Se puede calcular un umbral de evaluación analítica para cualquier forma farmacéutica como medicamento nasal y para inhalación oral teniendo en cuenta el Umbral de Preocupación de Seguridad del medicamento nasal y para inhalación oral (es decir, O, 15 µg/día para un lixiviable orgánico individual). Un ejemplo de cálculo de umbral de evaluación analítica para un atomizador para inhalación es el siguiente. En el caso de un medicamento en atomizador para inhalación con 120 accionamientos por envase declarados, una exposición máxima del paciente recomendada de 4 accionamientos por día y una masa de componentes críticos (tubo de inmersión plástico) de 400 mg, para un lixiviable orgánico individual derivado de este componente, se puede estimar el siguiente umbral de evaluación analítica: Umbral de Evaluación ( Analítica Estimado =
0,15 µg/día .
.
,
4 acc1onam1entos/d1a
)
. . x (120 acc1onam1entos declarados/envase)
Umbral de Evaluación Analítica Estimado para Lixiviables = 4,5 µg/envase Considerando un volumen total de llenado de 4,5 mL: Umbral de Evaluación Analítica Estimado= (4,5 µg/envase)/(4,5 mL/envase) Umbral de Evaluación An,alítica Estimado = 1 µg/mL Para convertir a un umbral de evaluación analítica estimado, lo cual sería una guía útil para caracterizar lixiviables potenciales mediante estudios de extracción de este tubo de inmersión plástico particular (ver el capítulo (1663)): Umbral de Evaluación ( Analítica Estimado =
0,15 µg/día ) . . . . , x (120 acc1onam1entos declarados/envase) 4 acc1onam1entos/d1a
Umbral de Evaluación Analítica Estimado para Sustancias Extraíbles = 11, 3 µg/g
2046 (1664.1) Medicamentos Nasales/Inhalación / Información General
USP 39
El cálculo del umbral de evaluación analítica no debe modificarse para tomar en cuenta variables, tales como un relleno en exceso durante la fabricación, a menos que dicha modificación pueda justificarse científicamente. Debido a que las soluciones y suspensiones para inhalación son similares a los medicamentos en atomizador nasal y para inhalación en donde por lo general son formulaciones basadas en agua, y la mayoría de los lixiviables orgánicos potenciales son relativamente lípofílicos, el riesgo de interacción entre la formulación y el componente de envasado es menor con respecto a los inhaladores de dosis fija orgánicos basados en propelentes, por lo que el riesgo de lixiviables orgánicos es menor. Sin embargo, a diferencia de los inhaladores de dosis fija, los productos farmacéuticos como atomizadores nasales y para inhalación, soluciones y suspensiones para inhalación por lo regular se envasan en envases plásticos de dosis única (caso de nebulizaciones). La lixiviación puede ocurrir potencialmente en el envase de dosis única [p.ej., polietileno de baja-densidad], que está en contacto continuo a largo plazo con la formulación del medicamento. Además, es posible que entidades químicas orgánicas relacionadas con etiquetas de papel, adhesivos, tintas, entre otros, que están en contacto directo con el envase de dosis única permeable puedan migrar a través del envase hacia el interior de la formulación. Asimismo, también está la posibilidad de lixiviables derivados de los sistemas de envases terciarios (p.ej., envases de cartón para transporte). Los lixiviables en las soluciones y suspensiones para inhalación deben caracterizarse (es decir, identificarse y cuantificarse) a niveles por encima de un umbral de evaluación analítica calculado. Se puede calcular un umbral de evaluación analítica para cualquier forma farmacéutica como medicamento nasal y para inhalación oral teniendo en cuenta el Umbral de Preocupación de Seguridad del medicamento nasal y para inhalación oral (es decir, O, 15 µg/día para un lixiviable orgánico individual). Un ejemplo de cálculo de umbral de evaluación analítica para una solución para inhalación es el siguiente. En el caso de una solución para inhalación con 3 mL de medicamento contenidos en un vial de dosis única de polietileno de baja densidad (1 g en peso total de polietileno de baja densidad), con una exposición máxima del paciente recomendada de tres viales por día, para un lixiviable individual orgánico derivado de este componente, se puede estimar el siguiente umbral de evaluación analítica:
Umbr~l .de Evaluación=( Anal1t1ca Estimado
t(
O, 15 µg/día 3 dosis /día )
1 dosis declarada/envase )
Umbral de Evaluación Analítica Estimado para Lixiviables = 0,05 µg/envase Umbral de Evaluación Analítica Estimado= (0,05 µg/envase)/(3 mL/envase) Umbral de Evaluación Analítica Estimado= 0,017 µg/mL Para convertir a un umbral de evaluación analítica estimado, lo cual sería una guía útil para caracterizar lixiviables potenciales mediante estudios de extracción de este vial de plástico de dosis única particular (ver el capítulo (1663)):
~mbral de Evaluació.n Analíti~a Estimado para Sustancias Extra1bles
= ( 0105 µg/envase ) x (
l
1 envase 1 g material/envase )
Umbral de Evaluación Analítica Estimado para Sustancias Extraíbles = 0,05 µg/g El desafío de caracterizar lixiviables en un medicamento a niveles de 1 7 ng/mL en un medicamento acuoso es considerable, incluso con las capacidades de la química analítica moderna. Para este ejemplo particular de solución para inhalación, puede ser apropiado implementar un estudio de simulación (ver el capítulo (1663) y (1664)) para facilitar el descubrimiento y la identificación de probables lixiviables, cuantificando lixiviables reales del medicamento (en caso necesario) con técnicas y métodos analíticos de alta sensibilidad para el compuesto esperado. Todos los componentes críticos del sistema de envase de las soluciones, suspensiones y atomizadores para inhalación deben someterse a evaluaciones de sustancias extraíbles (ver el capítulo (1663)). La exposición potencial del paciente a entidades químicas de los componentes críticos de las soluciones, suspensiones y atomizadores para inhalación que no están en contacto continuo con la formulación del medicamento deben evaluarse a un umbral de 20 µg/g (ver el capítulo (1663)). Los estudios y referencias adicionales requeridos para evaluar la exposición del paciente a los químicos derivados de componentes críticos que no están en contacto con la formulación incluyen referencia a reglamentaciones indirectas para aditivos alimentarios y la aplicación de los capítulos (87) y (88) ( 7). Cuando se construyen a partir de materiales aceptables para contacto con alimentos, los componentes críticos de las soluciones, suspensiones y atomizadores para inhalación que no están en contacto directo con la formulación del medicamento por lo general sólo requieren de caracterización apropiada (es decir, estudios de extracción y análisis de sustancias extraíbles de rutina) para asegurar una composición uniforme continua del componente. Los componentes críticos de los nebulizadores y otros dispositivos diseña.dos para su uso con soluciones y suspensiones para inhalación también deben caracterizarse con respecto a sustancias extraíbles y lixiviables cuando el etiquetado del medicamento especifica un dispositivo particular. Asimismo, basándose en las guías reglamentarias aplicables para soluciones, suspensiones y atomizadores para inhalación ( 7), los solicitantes de medicamentos deben considerar lo siguiente (ver el capítulo (1663)): • Desarrollo y validación de pruebas de liberación para sustancias extraíbles en componentes críticos de cierres y bombas de envases entrantes, con criterios de aceptación cualitativos y cuantitativos apropiados. • Consideración de pruebas validadas para probables lixiviables derivados de etiquetas, tintas y adhesivos, entre otros., con criterios de aceptación apropiados (cuando resulten apropiados y aplicables).
USP 39
Información General/ (1664. l) Medicamentos Nasales/Inhalación 2047
Inhaladores de Polvo Seco y Polvos para Inhalación Los inhaladores de polvo seco se definen como "medicamentos diseñados para dispensar polvos para inhalación" (2,5). El fármaco en un polvo para inhalación tiene una distribución de tamaño de partícula dentro del intervalo respirable, y puede ser una mezcla física de ingredientes farmacéuticos activos con partículas portadoras o una combinación formulada de ingrediente activo y excipientes (ver el capítulo (601 )). El polvo puede estar contenido en un sistema de envase de dosis única (p.ej., cápsula, blíster), o estar alojado a granel en un reservorio dentro del dispositivo de administración mismo. En este último caso, Ja dosis fija es medida por el dispositivo. El dispositivo de administración puede dispersar el polvo de manera activa desde el envase o estar basado en Ja inspiración del paciente para suministrar la energía necesaria para dispersar las partículas. Los componentes y el diseño del dispositivo son integrales a las características del aerosol (es decir, distribución de masa y de tamaño de partícula) de la formulación administrada al paciente. Existe una amplia diversidad de diseños y características de los inhaladores de polvo seco (2). Para todos los medicamentos nasales y para inhalación oral, el inhalador de polvo seco presenta el riesgo más bajo de exposición de un paciente a niveles significativos de lixiviables. Las razones son: 1. La formulación de un medicamento para un inhalador de polvo seco es un polvo seco y no contiene disolventes orgánicos ni acuosos que pudieran promover la lixiviación de entidades químicas orgánicas (o inorgánicas). 2. En un inhalador de polvo seco de dosis única, Ja formulación del medicamento está contenida en un sistema de envase separado, y por lo regular sólo entra en contacto temporalmente con los componentes críticos del dispositivo mismo. La fuente más probable de lixiviables en un inhalador de polvo seco de dosis única sería el material que compone el envase de dosis única, tal como un blíster de papel aluminio o el material de Ja cápsula, o el material que compone el reservorio del medicamento en un inhalador de polvo seco multidosis (incluyendo aditivos superficiales antiestáticos). La lixiviación tendría que ocurrir por el contacto directo del polvo del medicamento con el material del envase, mediante la volatilización de entidades químicas orgánicas del material del cierre del envase precipitándose en el polvo seco, o mediante la migración de entidades químicas orgánicas a través del material del envase primario precipitándose en el polvo seco. La mejor forma de evaluar la posibilidad de observar lixiviables provenientes del envase de dosis única del inhalador de polvo seco es mediante estudios de extracción detallados en el material del envase para identificar lixiviables potenciales, los cuales podrían migrar al polvo seco por el contacto entre sólidos o la volatilización, además de presentar problemas potenciales para la seguridad. El dispositivo y los materiales de Jos envases por Jo regular se evalúan para detectar lixiviables potenciales mediante estudios de extracción y de simulación (ver el capítulo (1663)) para determinar la presencia de entidades químicas a niveles que pudieran significar una preocupación para la seguridad. La evaluación de materiales que contienen el polvo para inhalación debe tener en cuenta las tintas y demás coadyuvantes del procesamiento que se usan en la fabricación del envase a fin de caracterizar todos los lixiviables potenciales. Los tipos de compuestos que ocasionan las mayores preocupaciones en los polvos para inhalación son aquellos que migran de los envases primarios (es decir, envases de dosis única o envases multidosis) a la formulación. Los estudios de extracción y simulación deberían tener en cuenta todos los mecanismos posibles de lixiviación, incluida la volatilización. Los lixiviables reales y potenciales en los polvos para inhalación derivados de los componentes críticos del sistema o dispositivo de envasado que pudieran estar en contacto directo continuo y a largo plazo con la formulación del medicamento deben ser caracterizados (es decir, identificados y cuantificados) a niveles por encima de un umbral de evaluación analítica calculado. Se puede calcular un umbral de evaluación analítica para cualquier forma farmacéutica como medicamento nasal y para inhalación oral teniendo en cuenta el Umbral de Preocupación de Seguridad del medicamento nasal y para inhalación oral (es decir, 0, 15 µg/día para un lixiviable orgánico individual). Un ejemplo de cálculo de umbral de evaluación analítica para un polvo para inhalación es el siguiente. Considerando un inhalador de polvo seco que contenga 13 mg de polvo para inhalación en un blíster de dosis única con 50 mg de material del blíster que esté en contacto directo con la formulación o que sea capaz de volatilizar lixiviables en la cámara gaseosa superior de la formulación, con una exposición diaria máxima recomendada de 2 accionamientos por día, para un lixiviable orgánico individual derivado de dicho material, se puede estimar el siguiente umbral de evaluación analítica: Umbral de Evaluación= ( Analltlca Estimado
O,lS µg/día Jx ( 1 dosis declarada/ blíster) 2 dosis /día
Umbral de Evaluación Analítica Estimado para Lixiviables = 0,075 µg/blíster Para convertir con respecto a la masa total de medicamento en un blíster: Umbral de evaluación analítica estimado = (0,075 µg/blíster)/(0,013 µg medicamento/blíster) Umbral de evaluación analítica estimado
= 5,8 µg/g de medicamento
Para convertir a un umbral de evaluación analítica estimado, lo cual sería una guía útil para caracterizar lixiviables potenciales mediante estudios de extracción de este material de blíster particular (ver el capítulo (1663)): Umbral de Evaluac.16n Anal'1t"1ca Estimado para Sustancias Extraíbles -
( o' 075 µg/bl'ist er
)
( x
1 blíster O,OS g material/ blíster
J
Umbral de Evaluación Analítica Estimado para Sustancias Extraíbles = 1,5 µg/g
USP 39
2048 (1664.1) Medicamentos Nasales/Inhalación / Información General
El desafío de caracterizar lixiviables en un medicamento a niveles de 5,8 µg/g en un polvo para inhalación es considerable, incluso con las capacidades de la química analítica moderna. Para este ejemplo particular de inhalador de polvo seco, puede ser apropiado implementar un estudio de simulación (ver el capítulo (1663) y (1664)) para facilitar el descubrimiento y la identificación de probables lixiviables del material del blíster, cuantificando lixiviables reales del medicamento (en caso necesario) con técnicas y métodos analíticos de alta sensibilidad para el compuesto esperado. Todos los componentes críticos del sistema de envase de polvo para inhalación y del dispositivo del inhalador de polvo seco deberían someterse a evaluaciones de sustancias extraíbles (ver el capítulo (1663)). La exposición potencial del paciente a entidades químicas de los componentes críticos del sistema de envase de polvo para inhalación y del dispositivo inhalador de polvo seco que no están en contacto continuo con la formulación del medicamento deberían evaluarse a un umbral de 20 µg/g (ver el capítulo (1663)). Pueden requerirse estudios adicionales para evaluar la exposición del paciente a los químicos derivados de componentes críticos que no están en contacto con la formulación, incluyendo referencias a reglamentaciones para aditivos alimentarios y la aplicación de los capítulos (87) y (88) (2). Cuando se construyen a partir de materiales aceptables para contacto con alimentos, los componentes críticos del sistema de envase de polvo para inhalación y del dispositivo de polvo seco para inhalación que no están en contacto directo con la formulación del medicamento por lo general sólo requieren de caracterización apropiada (es decir, estudios de extracción y análisis de sustancias extraíbles de rutina) para asegurar una composición uniforme continua del componente. Asimismo, para inhaladores de polvo seco y polvos para inhalación, y basándose en las guías reglamentarias aplicables (2), los solicitantes de medicamentos deben considerar lo siguiente (ver el capítulo (1663)): • Desarrollo y validación de pruebas de liberación para sustancias extraíbles en componentes críticos del sistema de envase de polvo para inhalación y del dispositivo de inhaladores de polvo seco entrantes, con criterios de aceptación cualitativos y cuantitativos apropiados.
CONSIDERACIONES ADICIONALES Incertidumbre Analítica El Umbral de Evaluación Analítica es la concentración por encima de la cual los lixiviables desconocidos deben ser caracterizados e informados para evaluación toxicológica. Los lixiviables esperados (previamente caracterizados como lixiviables potenciales o probables a partir de estudios de sustancias extraíbles o de simulación) contarán con perfiles de seguridad conocidos y umbrales para lixiviables previamente establecidos. Asimismo, los compuestos de referencia para lixiviables potenciales previamente caracterizados permitirán cuantificaciones exactas y precisas de aquellos lixiviables esperados como lixiviables reales del medicamento. La caracterización de lixiviables desconocidos requiere tener en cuenta la incertidumbre analítica, debido a que la ubicación de un umbral de evaluación analítica en un perfil de lixiviables dado (p.ej., un cromatograma de una cromatografía de gases/espectrometría de masas [GC/MS]) debe determinarse con respecto a un estándar interno dentro del perfil de lixiviables. La incertidumbre analítica para una técnica o método analítico particular se puede estimar basándose en el análisis de una serie de compuestos de referencia para crear una base de datos de factores de respuesta. Los compuestos de referencia incluidos en esta base de datos deben representar a todos los lixiviables potenciales conocidos (es decir, según se determinan en las evaluaciones de sustancias extraíbles). Para los Medicamentos Nasales y para Inhalación Oral, se recomienda (3,5) reducir el umbral de evaluación analítica estimado por un factor definido como desviación estándar relativa de 1% en una base de datos de factores de respuesta generada de manera apropiada, o un factor de 50% del umbral de evaluación analítica estimado, lo que sea mayor. Se encuentran disponibles ejemplos detallados de bases de datos de factores de respuesta, así como determinaciones de umbrales de evaluación analítica (3,5).
Compuestos que Representan Casos Especiales Los Hidrocarburos Aromáticos Policíclicos (PAH, por sus siglas en inglés) o los Aromáticos Polinucleares (PNA, por sus siglas en inglés), las N-nitrosaminas y el 2-mercaptobenzotiozol (2-MBT) se consideran compuestos que representan "casos especiales" (es decir, compuestos que presentan preocupaciones de seguridad e histórica especiales), los cuales requieren de estudios especiales de caracterización que utilizan técnicas y métodos analíticos específicos (1-3,5). Los umbrales para la caracterización de estos compuestos como sustancias extraíbles o lixiviables en Medicamentos Nasales y para Inhalación Oral por lo regular se basan en los límites de estas técnicas y métodos analíticos específicos. La Tabla 2 lista los compuestos Aromáticos Polinucleares y las N-nitrosaminas que, junto con el 2-MBT, por lo regular se investigan como sustancias extraíbles y lixiviables en los medicamentos nasales y para inhalación oral. Tabla 2. Hidrocarburos Aromáticos Policíclicos, Aromáticos Polinucleares y N-Nitrosaminas Típicamente Investigados como Sustancias Extraíbles y Lixlviables en los Medicamentos Nasales y para Inhalación Oral. PAH/PNA esperados Naftaleno
N-nitrosamlnas esperadas N-Nitrosodimetilamina
Acenaftileno
N-Nitrosodietilamina
Acenafteno
N-Nitrosodi-n-butilamina
Fluoreno
N-Nitrosomorfolina
USP 39
Información General/ (1664.1) Medicamentos Nasales/Inhalación 2049
Tabla 2. Hidrocarburos Aromáticos Pollcícllcos, Aromáticos Polinucleares y N-Nltrosamlnas Típicamente Investigados como Sustancias Extraíbles y Llxlvlables en los Medicamentos Nasales y para Inhalación Oral. (Continuación) N-nitrosamlnas esperadas PAH/PNA esperados Fenantreno
N-Nitrosopiperidina
Antraceno
N-Nitrosopirrolidina
-
Fluoranteno Piren o
-
Benzo( a)antraceno Criseno
-
Benzo(b)fluoranteno
-
Benzo(k)fluoranteno
-
Benzo( e)pireno Benzo( a)pireno
-
lndeno(l 23-cd)pireno
-
Dibenzo(ah)antraceno
-
Benzo(ght)perileno
-
Los hidrocarburos aromáticos polinucleares se han relacionado con el relleno de carbono negro usado en muchos tipos de elastómeros. El análisis de hidrocarburos aromáticos polinucleares, como sustancias extraíbles de elastómeros o como lixiviables de medicamentos, por lo regular implica la extracción cuantitativa seguida por un análisis de alta especificidad y sensibilidad de las sustancias extraíbles resultantes. Se ha documentado la GC/MS con monitoreo de iones selectos para el análisis de hidrocarburos aromáticos polinucleares como lixiviables en medicamentos en inhaladores de dosis fija, por ejemplo (6). Las Nnitrosaminas son productos de la reacción entre moléculas precursoras orgánicas específicas, aminas secundarias (R2 NH) y un "agente nitrosante". En la composición del caucho, es posible que las aminas secundarias estén formadas a partir de ciertos aceleradores de vulcanización tales como tiouramas y ditiocarbamatos. Los agentes nitrosantes potenciales incluyen NO+, N 2 0 3, N 2 0 4, entre otros, algunos de los cuales pueden formarse a partir de químicos comúnmente usados tales como nitrito de sodio (NaN0 2), que tiene una gran cantidad de usos industriales. El análisis de N-nitrosaminas en goma como lixiviables potenciales implica la extracción cuantitativa seguida por un análisis de extractos mediante cromatografía de gases/detección por análisis de energía térmica (GC/TEA, por sus siglas en inglés) (8). Se ha documentado el análisis mediante GC/TEA de Nnitrosaminas como lixiviables en medicamentos como inhaladores de dosis fija (7). El 2-MBT es un acelerador de la vulcanización que se usa en ciertos elastómeros curados con azufre y que puede analizarse mediante extracción seguida por LC/MS (5).
REFERENCIAS 1. Guidance for lndustry. Nasal Spray and lnhalation Solution, Suspension, and Spray Drug Products-Chemistry, Manufacturing, and Controls Documentation. U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration; Rockville, MD, July 2002. 2. Draft Guidance for lndustry. Metered Dose lnhaler (MDI) and Dry Powder lnhaler (DPI) Drug Products-Chemistry, Manufacturing, and Controls Documentation. U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration; Rockville, MD, May 1999. 3. Leachables and Extractables Working Group. Safety thresholds and best practices for extractables and leachables in orally inhaled and nasal drug products. Product Quality Research lnstitute (PQRI); Arlington, VA, 6 September 2006. http:// www.pqri.org/pdfs/LE_Recommendations_to_FDA_09-29-06.pdf. Consultado el 19 de marzo de 201 3. 4. Reviewer Guidance for Nebulizers, Metered Dose lnhalers, Spacers, and Actuators. U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Devices and Radiological Health; Rockville, MD, October 1993. 5. Ball D, Norwood D, Stults C, Nagao L, eds. Leachables and Extractables Handbook. New York: J. Wiley and Sons: 2012. 6. Norwood D, Prime D, Downey B, et al. Analysis of polycyclic aromatic hydrocarbons in metered dose inhaler drug formulations by isotope dilution gas chromatography/mass spectrometry. J Pharm Biomed Anal. 1995;13(3): 293. 7. Norwood D, Mullis J, Feinberg T, et al. N-Nitrosamines as "special case" leachables in a metered dose inhaler drug product. PDAJ Pharm Sci Technol. 2009;63(4): 307. 8. AOAC lnternational Official Methods of Analysis. N-Nitrosamines in baby bottle rubber nipples. Official Method 987.05, Chapter 48, 7-8; Gaithersburg, MD, 2000.
2050 (1724) Medicamentos Semisólidos / Información General
USP 39
(1724) MEDICAMENTOS SEMISÓLIDOS-PRUEBAS DE DESEMPEÑO ALCANCE El alcance de este capítulo general es proveer información general para las pruebas de desempeño de medicamentos semisólidos, de sus aplicaciones potenciales y de los diversos equipos usados en dichas pruebas.
PROPÓSITO Este capítulo proporciona información general sobre las pruebas de desempeño para medicamentos semisólidos, la teoría y aplicaciones de dichas pruebas, la información sobre la disponibilidad del equipo apropiado y los posibles avances en las pruebas de desempeño de medicamentos semisólidos. El capítulo general Medicamentos Tópicos y Transdérmicos-Pruebas de Calidad del Producto (3) provee información relacionada con las pruebas de calidad de productos en formas farmacéuticas tópicas y transdérmicas; el capítulo Liberación de Fármacos (724) provee procedimientos y detalles para las pruebas de liberación de fármacos a partir de sistemas transdérmicos; y el presente capítulo, (1724), procedimientos para determinar la liberación de fármacos a partir de formas farmacéuticas semisólidas.
INTRODUCCIÓN Este capítulo provee información general sobre pruebas in vitro de medicamentos semisólidos. Las formas farmacéuticas semisólidas incluyen cremas, ungüentos, geles y lociones. Estas formas farmacéuticas pueden considerarse preparaciones de liberación prolongada donde la liberación del fármaco depende en gran medida de la formulación y del proceso de fabricación. La velocidad de liberación de un producto determinado, elaborado por diversos fabricantes, probablemente será diferente.
PRUEBAS DE CALIDAD V DE DESEMPEÑO DE MEDICAMENTOS Una monografía de medicamento de la USP contiene pruebas, procedimientos analíticos y criterios de aceptación. Las pruebas para medicamentos se dividen en dos categorías: (1) aquéllas que evalúan los atributos generales de calidad y (2) aquéllas que evalúan el desempeño del producto, p.ej., la liberación in vitro del fármaco a partir del medicamento. Las pruebas de calidad evalúan la integridad de la forma farmacéutica, mientras que las pruebas de desempeño, tales como la liberación de fármacos, evalúan los atributos que se relacionan con el desempeño del medicamento in vivo. En conjunto, las pruebas de calidad y de desempeño están destinadas a asegurar la identidad, contenido, calidad, pureza, comparabilidad y desempeño de los medicamentos semisólidos. El capítulo (3) proporciona detalles sobre las pruebas de calidad del medicamento para medicamentos semisólidos. Las pruebas de desempeño del producto para medicamentos semisólidos se llevan a cabo para evaluar la liberación de fármacos a partir de formas farmacéuticas fabricadas. No obstante, las pruebas de desempeño in vitro para productos semisólidos no predicen directamente el desempeño in vivo de los medicamentos, puesto que el factor principal que afecta la biodisponibilidad y el desempeño clínico son las propiedades de barrera epitelial en el sitio donde se aplica el producto (tejidos epidérmicos o mucosas). Aunque las pruebas de desempeño del producto no miden directamente la biodisponibilidad ni la biodisponibilidad relativa (bioequivalencia), pueden detectar cambios in vitro que podrían corresponder a un desempeño alterado in vivo de la forma farmacéutica. Estos cambios pueden derivarse de cambios en las características fisicoquímicas del fármaco y/o de los excipientes o de la formulación en sí, cambios en el proceso de fabricación, efectos derivados del transporte y el almacenamiento, efectos del paso del tiempo y otros factores de la formulación y/o el proceso. En la actualidad, se encuentran disponibles pruebas de desempeño para evaluar la liberación de fármacos in vitro en cremas, ungüentos, lociones y geles. Se pueden usar diversos aparatos disponibles para dicha evaluación, incluidas la celda de difusión vertical, la celda de inmersión y una celda especial usada con el Aparato 4 de la USP. Debido al impacto significativo de los parámetros de prueba in vitro, tales como los medio de liberación, la membrana porosa y la dosificación, así como la interacción de dichos parámetros con un medicamento dado, las pruebas de liberación de fármacos in vitro se usan principalmente para un análisis de comparación en el que cualquier diferencia en la velocidad de liberación se considera indeseable. La prueba de liberación de fármacos es más adecuada para la evaluación de cambios menores en la formulación y en el proceso, cambios en el sitio de fabricación y pruebas de estabilidad. La evaluación o comparación de cambios mayores en la formulación puede arrojar resultados sin sentido, salvo que se lleve a cabo una extensa validación para seleccionar parámetros de prueba que aseguren que la sensibilidad de la prueba guarda una correlación con el desempeño in vivo. El único uso reglamentario requerido para la prueba de liberación in vitro es el de determinar la aceptabilidad de cambios menores en el proceso y/o en la formulación en formas farmacéuticas semisólidas aprobadas (ver la Guidance far lndustry-Nonsterile Semiso/id Dosage Forms-Scale-Up and Postapproval Changes: Chemistry, Manufacturing, and Controls; In Vitro Release Testing and In Vivo Bioequivalence Documentation (Guía para la Industria-Formas Farmacéuticas Semisólidas No Estériles-Aumento en la Escala de Producción y Cambios Posteriores a la Aprobación: Procesos Químicos, Fabricación y Controles; Prueba de Liberación In Vitro y Documentación sobre Bioequiva-
USP 39
Información General/ (1724) Medicamentos Semisólidos 2051
/encía In Vivo) de la FDA; (disponible sólo en inglés en http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatorylnformation/Guidances/UCM070930.pdf). Este capítulo ofrece información general para las pruebas de desempeño in vitro de medicamentos semisólidos.
PRUEBAS DE DESEMPEÑO IN VITRO Teoría La celda de difusión es un medio confiable y reproducible para medir la liberación de fármacos a partir de formas farmacéuticas semisólidas. Se coloca una capa gruesa del producto semisólido que se está evaluando en contacto con un medio en un depósito, donde éste último actúa como receptor al difundirse el fármaco en toda la formulación, a través de la membrana y al depósito. La difusión ocurre a través de una membrana de soporte inerte, altamente permeable. La membrana tiene el propósito de mantener el producto y el medio receptor separados y distintos. Las membranas deben ofrecer la menor resistencia difusional posible y no deben controlar la velocidad. Se retiran muestras de la cámara receptora, por lo general en intervalos de 1 hora durante un periodo de 4-6 horas. Después de un corto periodo de latencia, la liberación del fármaco a partir de la forma farmacéutica semisólida se describe cinéticamente mediante la difusión de una sustancia química hacia un medio semiinfinito en un exceso de medio. La velocidad de liberación momentánea indica la profundidad de penetración del gradiente que se forma dentro del semisólido. A partir del momento en que la resistencia difusional de la capa fronteriza que se retrae asume el dominio de la cinética de liberación, la cantidad de fármaco liberado, m, se vuelve proporcional a -{t (donde t =tiempo) tanto para un sistema de solución, como de suspensión o de emulsión semisólida por igual. La velocidad momentánea de liberación de fármaco, dm/dt, se vuelve proporcional a 1/W, lo cual refleja la reducción en la velocidad de liberación del fármaco con el paso del tiempo. Se debe mantener un depósito grande de manera que, durante todo el experimento, la concentración del fármaco liberado en un medio se mantenga altamente diluida con respecto a la concentración de fármaco disuelto en el semisólido. En estas circunstancias, se dice que la liberación de fármacos ocurre en condiciones de exceso de medio difusional. Cuando un fármaco se encuentra totalmente en solución en la forma farmacéutica, la cantidad de fármaco liberado en función del tiempo se puede describir mediante la Ecuación 1:
donde m es la cantidad de fármaco liberado al medio en exceso por cm 2, C0 es la concentración de fármaco en la matriz de liberación y D es el coeficiente de difusión de fármaco en toda la matriz. Una gráfica de m en función de -{t será lineal con una pendiente de:
2xC0
l
La Ecuación 2 describe la liberación de fármaco cuando el fármaco se presenta en forma de suspensión en la forma farmacéutica:
donde Dm es el coeficiente de difusión de fármaco en la matriz de semisólido; ( 5 es la solubilidad del fármaco en la matriz de liberación; y Q es la cantidad total de fármaco en solución y suspendido en la matriz. Cuando Q >> C5, la Ecuación 2 se simplifica a la Ecuación 3:
m=~2xQxDm xC8 xt Una gráfica de m en función de -{t será lineal con una pendiente de:
m=~2xQxDmxC8 Las partículas gruesas pueden disolverse con tal lentitud que la capa fronteriza móvil puede retroceder hasta detrás de las partículas. Dicha situación introduce una curvatura notoria en la gráfica -ft debido a un efecto del tamaño de partícula. Durante los experimentos de velocidad de liberación, se debe hacer todo lo razonablemente posible para mantener la composición de la formulación sin cambios durante el periodo de liberación.
2052 (1724) Medicamentos Semisólidos / Información General
USP 39
Determinación de la Velocidad de Liberación de Fármaco Usando un Aparato de Celda de Difusión Vertical Muchos sistemas de celda de difusión vertical (VDC, por sus siglas en inglés) están compuestos de 6 unidades de celdas. Cada ensamblaje de celda de difusión vertical consta de dos cámaras (una cámara donadora y una cámara receptora) separadas por una membrana y sujetadas con una abrazadera, una parte superior atornillable u otros medios (ver la Figura 7-Modelo A, la Figura 2-Modelo By la Figura 3-Modelo C). Asimismo, se pueden usar otras celdas de difusión que sean similares en lo que respecta al diseño general. En la cámara donadora, la forma farmacéutica semisólida reposa sobre una membrana de soporte sintética, inerte y altamente permeable. Para el Modelo A de celda de difusión vertical, la muestra reposa sobre la membrana de soporte dentro de la cavidad de la cámara de muestra cubierta con un disco de vidrio. Por lo general, se usan cantidades de muestra semisólida no menores de 200 mg. La comunicación difusiva entre la muestra semisólida y el depósito se da a través de la membrana de soporte. La membrana tiene el propósito de mantener la muestra de medicamento y el medio receptor separados y distintos. Se debe usar una camisa de calentamiento o un dispositivo adecuado para mantener la temperatura dentro de la celda. El experimento de velocidad de liberación se lleva a cabo a 32 ± 1 º, excepto en el caso de medicamentos vaginales cuya temperatura debe ser 37±1 º. Por lo regular, se operan al mismo tiempo conjuntos de 6 celdas (es decir, una sola corrida). A menudo, el muestreo se lleva a cabo durante un periodo de 4-6 horas y el volumen retirado se reemplaza con medio receptor madre. Para lograr la condición de exceso de medio, el medio receptor debe tener una alta capacidad para disolver el fármaco, además de que, idealmente, la concentración del fármaco en el medio receptor al final de la prueba debe ser lo más baja posible. Para cada celda, se determina la cantidad de fármaco liberado (µg/cm 2 ) en cada tiempo de muestreo (t 7, t2 , etc.) y la cantidad liberada acumulada se grafica en función de -ft. La pendiente de la línea resultante es una medición de la velocidad de liberación del fármaco. La prueba a menudo se lleva a cabo con un grupo de 6 ó 12 celdas por corrida de prueba. El promedio de 6 pendientes para cada prueba y cada producto de referencia es una medida de la liberación del fármaco a partir de la forma farmacéutica.
Información General/ (1724) Medicamentos Semisólidos 2053
USP 39
Anillo de Alineación
Disco de Soporte
I
--1....___I_
___._.l
'f"
-·1
1----!
l.__.- - 0 3 8 - - - - ' · Compartimiento de Dosificación -~--_J_..
__j_
___.._1 --~' t 015
1--
1,5
61 Celda de Difusión Vertical Orificio de 15 mm x 7 ml
Figura 1. Celda de difusión vertical-Modelo A (Todas las dimensiones están en mm. Las medidas de todos los diámetros son ±0,5 mm. Las medidas de todas las longitudes son ±2 mm).
2054 (1 724) Medicamentos Semisólidos / Información General
USP 39
-----------------------------Abrazadera de la Celda
1
------------------------------
_ _ _ _ _ _,.,,---"\111
Flujo de Regreso a la Bomba de Circulación
Todas las dimensiones están en mm. Las medidas de todos los diámetros son +/- 0,5 mm. Las medidas de todas las longitudes son +/-2 mm.
-------------
---------------,
11
11
1
57
!
Cámara Receptora
Camisa de Calentamiento
1
1
_____________¡
Flujo de la Bomba de Circulación
Barra de Agitación Recubierta de Teflón
----------------30
i----D..,IÁMET_R_O ____~
Figura 2. Celda de difusión vertical-Modelo B (Todas las dimensiones están en mm. Las medidas de todos los diámetros son ±0,5 mm. Las medidas de todas las longitudes son ±2 mm).
15-·--il---
l 1 DIÁMETRO
Diámetro del Orificio
Cámara Donadora
Abrazadera de la Celda
Flujo de Regreso a la Bomba de Circulación Todas las dimensiones están en mm. Las medidas de todos los diámetros son +/- 0,5 mm. Las medidas de todas las longitudes son +/-2 mm.
------------1
Cámara Receptora
57
1
Camisa de Calentamiento Flujo de la Bomba de Circulación
Barra de Agitación Recubierta de Teflón
30
-----D..,IÁMET-RO---I
Figura 3. Celda de difusión vertical-Modelo C (Todas las dimensiones están en mm. Las medidas de todos los diámetros son ±0,5 mm. Las medidas de todas las longitudes son ±2 mm). La estructura de la celda de difusión vertical (es decir, las cámaras donadora y receptora) por lo regular están hechas de vidrio de borosilicato, aunque se pueden usar materiales diferentes para fabricar la estructura y demás partes del ensamble de la celda de difusión vertical. Se recomienda que los materiales del ensamblaje de la celda no sean adsorbentes, absorbentes, y que no reaccionen significativamente con el producto ni con las muestras de prueba. La forma farmacéutica semisólida se coloca en una membrana dentro de la cavidad de la cámara de dosificación, la cual puede ocluirse. Las medidas de los diámetros de los orificios de la cámara donadora y de la cámara receptora, que definen el área superficial de liberación de la dosis para la prueba, deben estar dentro de ±5% del diámetro especificado. El diámetro de los orificios de las cámaras donadora y receptora puede variar dependiendo de la aplicación. El orificio de la cámara receptora nunca debe ser de menor tamaño que el orificio de la cámara donadora, sino del mismo tamaño. El diseño de la celda de difusión vertical debe facilitar la alineación apropiada de la cámara donadora y del orificio receptor. La cámara receptora debe fabricarse con una altura y geometría uniformes. To-
USP 39
Información General/ (1724) Medicamentos Semisólidos 2055
das las celdas deben tener el mismo valor nominal, además de que se debe medir el volumen verdadero para cada celda individual. Se debe tener cuidado de minimizar la variabilidad del volumen entre celdas. Para la prueba, las unidades de la celda de difusión vertical generalmente se colocan en una gradilla para mezclador (no mostrada) que sostiene las múltiples unidades de la celda de difusión vertical (p.ej., en grupos de 6) en la orientación correcta, con lo que se provee un mezclado magnético a una velocidad calibrada y se facilita el suministro de un flujo de agua caliente circulante a la camisa de agua de la celda de difusión vertical. La gradilla de la celda de difusión vertical generalmente se conecta a un recirculador de baño de agua controlado termostáticamente. El agua de la bomba circulante fluye hacia la camisa de calentamiento de la celda de difusión vertical desde el puerto inferior y fluye hacia afuera desde el puerto superior para facilitar la eliminación de cualquier burbuja de aire formada en la camisa de calentamiento. Usar una barra mezcladora magnética antiadherente (recubierta de teflón) en la cámara receptora como mecanismo interno de mezclado. Las alícuotas se retiran del medio receptor a través del brazo de muestreo en intervalos a lo largo de la prueba y se reemplazan con un volumen equivalente de medio receptor madre hasta el nivel de la marca de calibración del brazo de muestreo. MODELO A El grosor de la cámara de muestra normalmente es de 1,5 mm. Dicho grosor debe estar dentro del ± 10% del grosor especificado. El disco de vidrio de soporte se usa para ocluir la forma farmacéutica semisólida. Se usa un mezclador en la celda receptora y un agitador magnético como mecanismo de agitación interno. MODELOS BY C Los estilos clásicos de celdas de difusión vertical se ilustran en la Figura 2 y en la Figura 3; asimismo, se ilustran variaciones menores de diseño entre los modelos calificados.
Procedimientos de Prueba: Método General Antes de iniciar la prueba, los analistas deben determinar el volumen de cada celda de difusión vertical con el dispositivo de mezclado interno ya colocado. Durante toda la prueba, la temperatura del medio receptor se debe mantener a 32 ± 1 º, o a 37±1 º para preparaciones vaginales. La tolerancia a la velocidad de agitación rotatoria debe ser± 10% de la velocidad del método (normalmente 600 rpm). La velocidad de agitación debe asegurar el mezclado adecuado del medio receptor durante el periodo de prueba. Se deben obtener muestras de cada celda en los tiempos especificados en el método dentro de una tolerancia de ±2 minutos. A menos que el método especifique algo distinto, la calificación del aparato habrá sido verificada cuando los analistas determinen que la temperatura de prueba y la velocidad de mezclado están dentro de sus requisitos especificados y resulte en una prueba de verificación del desempeño satisfactoria (es decir, la velocidad de liberación de fármaco). A menos que se especifique de otro modo en el método, desgasificar el medio usando una técnica apropiada. Determinar la cantidad de fármaco en las alícuotas de muestra de medio receptor usando un procedimiento analítico validado. Las siguientes secciones proveen instrucciones para el uso adecuado de los Modelos A, By C. PROCEDIMIENTOS DE PRUEBA: MODELO A Con el mecanismo de mezclado ya colocado, llenar la cámara receptora con el medio especificado, con los mezcladores rotando, y un menisco positivo cubriendo la parte superior de cada celda. Dejar que transcurra algo de tiempo para que el medio se equilibre a la temperatura especificada. Detener el mezclador antes de colocar la muestra de prueba en la celda. Si fuera necesario, saturar la membrana en el medio especificado (generalmente, el medio receptor) durante 30 minutos. Colocar la membrana en la cámara donadora e invertir. Aplicar el material que se va a analizar en la cavidad de la cámara de la muestra, esparciendo el semisólido para llenar toda la cavidad de la cámara de muestra. Colocar la cámara de la muestra llena en la cámara receptora con la membrana hacia abajo y en contacto con el medio receptor. Durante este procedimiento, es importante asegurar que no haya burbujas debajo de la membrana. Luego, ensamblar por completo la celda. Una vez completado el ensamblado de las cámaras donadoras y receptoras, y de los componentes restantes de la celda (es decir, disco, anillo de alineación y abrazadera), encender el dispositivo de agitación, acción que constituye el inicio de la prueba o tiempo cero. El muestreo por lo general se lleva a cabo durante un periodo de 4-6 horas. Seguir el procedimiento de muestreo especificado y recoger una alícuota de cada cámara receptora de la celda para su análisis. Detener el mezclador y, usando una jeringa, reemplazar el volumen retirado con medio receptor madre entibiado a la temperatura específica y continuar mezclando. Asegurarse de que durante los procesos de muestro y relleno con medio no se introduzcan burbujas en la celda. PROCEDIMIENTOS DE PRUEBA: MODELOS B Y C Colocar una barra mezcladora antiadherente (recubierta de teflón) dentro de la cámara receptora de la celda de difusión vertical. Se sujeta la membrana especificada en el método de prueba con la abrazadera por encima del anillo O, si estuviera
2056 (1 724) Medicamentos Semisólidos / Información General
USP 39
presente, entre las cámaras donadora y receptora alineadas de la celda de difusión vertical. Sellar la periferia expuesta de la bisagra entre los compartimentos donador y receptor (p.ej., delineando con una película estirada de cera de parafina). La cámara receptora se llena con medio receptor a través del brazo de muestreo, a menos que ya se encuentre llena antes de montar la membrana. El ensamblaje de la celda de difusión vertical se inclina en múltiples orientaciones y se inspecciona para asegurarse de que ninguna de las burbujas de aire atrapadas debajo de la membrana, o dentro de la cámara receptora, pueda escapar por el puerto del brazo de muestreo. Se ajusta el volumen del medio receptor al nivel calibrado marcado en el puerto del brazo de muestreo. Se deja que la membrana se equilibre con el medio receptor, in situ, durante al menos 30 minutos antes de la aplicación de la forma farmacéutica, o se puede preincubar con una solución humectante (por lo general, el medio receptor), según se indica en el método de prueba. Las unidades de celda de difusión vertical se colocan en una gradilla para mezclador. Se recomienda contar con tubos que tengan aproximadamente 10-20 cm de holgura en la conexión con los puertos de la camisa de agua de la celda de difusión vertical con la gradilla de la celda de difusión vertical para facilitar la manipulación posterior de la celda de difusión vertical durante la prueba. Se ajusta la temperatura de referencia del baño de agua antes de la dosificación para que la membrana se encuentre a la temperatura correcta. Esto se puede verificar midiendo la temperatura de la membrana antes de la dosificación, usando un termómetro infrarrojo calibrado. Se inicia la agitación y se puede mantener de manera continuada durante toda la prueba. Se dispersa la forma farmacéutica de manera uniforme directamente sobre la superficie de la membrana. La cantidad de muestra recomendada es no menos de aproximadamente 1,0 mL/cm2 ó 1,0 g/cm 2 para asegurar una condición de dosis seudoinfinita. Para esparcir la muestra, generalmente se comienza desde el borde externo y se procede usando un patrón en espiral hacia la parte interna para garantizar una cobertura completa de los bordes del área de dosificación sin espacios de aire. La colocación de la muestra representa el inicio de la prueba o el tiempo cero. Posteriormente, la cámara donadora se sella con una película oclusiva para prevenir la pérdida de componentes volátiles de la formulación de prueba. Se verifica la ausencia de burbujas de aire en el lado inferior de la membrana y, si estuvieran presentes, se eliminan inclinando el aparato de manera tal que permita el escape de las burbujas de aire. Confirmar el volumen receptor en la marca de volumen calibrada y ajustar según se requiera. Antes de la recolección de las muestras, por lo general cada hora durante el periodo de 4-6 horas después de la introducción de la muestra, se confirma el volumen en el brazo de muestreo 1O minutos antes del muestreo y se ajusta a la marca de calibración en el brazo de muestreo, según se requiera. En los intervalos predeterminados posteriores al inicio de la prueba, generalmente cada hora durante 6 horas, los analistas deben recolectar alícuotas del medio receptor (p.ej., 150 µL) mediante el brazo de muestreo, retirando del centro bien mezclado de la cámara receptora. Se inspecciona para buscar la presencia de burbujas de aire en el ensamblaje de la celda de difusión vertical y se eliminan según sea necesario. Se reemplaza el medio receptor para llevar el volumen de medio receptor de vuelta al nivel indicado en el brazo de muestreo de la celda de difusión vertical.
Determinación de la Velocidad de Liberación de Fármaco Usando un Aparato de Celda de Inmersión La celda consta de los siguientes componentes (ver la Figura 4 y la Figura 5 para el Modelo A, y la Figura 6 y la Figura 7 para el Modelo B): un anillo de retención o bloqueo que asegura la membrana a la estructura de la celda y garantiza el contacto total con la muestra; una junta que provee un sello a prueba de fugas entre la membrana, el anillo de retención y la estructura de la celda; la membrana (por lo regular, una membrana sintética) que debe mantener la muestra en el compartimento de la muestra; y la estructura de la celda, que provee un recipiente de profundidad variable para la muestra. El Modelo A también tiene una placa de ajuste que permite a los operadores variar el volumen del recipiente dentro del armazón de la celda. La placa se puede colocar a la altura adecuada para cada prueba y se puede retirar por completo para facilitar la limpieza. La combinación del anillo O con la placa de ajuste previene fugas.
USP 39
Información General/ (1724) Medicamentos Semisólidos 2057
ºArandela
o...--n......--
~
Membrana o Piel
Placa de Ajuste con Junta Tipo Anillo
Cuerpo de la Celda
Herramienta de Ajuste Herramienta de Alineación
Figura 4. Celda de inmersión-Modelo A-Componentes de la celda.
N
o
Ui
00 ,.,...__
_.
'J
N _¡:,..
'-"'
~ ro
TODAS LAS UNIDADES ESTÁN EN MILÍMETROS (mm) A MENOS QUE SE INDIQUE ALGO DIFERENTE
Q_
¡:;-
~
e ., ti)
ll1
(")
ro
O:
~
ti)
El aspa rígida metálica o apropiadamente inerte y el eje consisten en una sola pieza. Se puede usar un diseño desmontable de dos partes adecuado, siempre y cuando el ensamble permanezca firmemente engranado durante la prueba. El aspa de la paleta y el eje pueden estar recubiertos con una cubierta adecuada para hacerlos inertes.
3
n~~
ro
:J
......
o
V>
Vl
ro
Vidrio de Borosilicato
3 v;·
º' o: o
V>
---S-
([)
:;
O'
3 ([) V:
5; =( :S:::
o
o..
Las dimensiones de A y B no exceden 0,5 mm cuando la parte se rota sobre el eje de la línea central.
ª
Q
O. o, ~
2,0-2,6
R 16,3 - 16,8
TUERCA DE RETENCIÓN MATERIAL: TEFLÓN (PATRÓN DE NUDOS EN LA SUPERFICIE)
([)
o
A
)>
11,6-12,2
203-207
([)
:;
(')
~
l'I)
ª-
V> ti)
JUNTA DE RETENCIÓN MATERIAL: TEFLÓN
3
o¡:;;o..
1,26-1,79
o
MEMBRANA
([)
:;
COMPARTIMENTO DE DOSIFICACIÓN
e
:;
3 :;
< ti) V>
!:l
29,6 -30,0
PLACA DE AJUSTE MATERIAL: TEFLÓN
6-=r 58' - 62'
CUERPO DE LA CELDA POTENCIADORA MATERIAL: TEFLÓN (PROTUBERANCIA SOBRE LA SUPERFICIE EXTERNA) Área de la celda 4 cm 2 2 cm 2 0,5 cm 2
~
31,4- 32,1
e 22,48 - 22,73 15,82 - 16,08 7,90-8,16
D 22,22 - 22,30 15,88 - 15,90 7,95 - 7,98
eVl "'O
w
\O
eVl
-o
l.IJ
\O
Fabricado con Materiales Inertes Rígidos. Se Puede Aplicar Recubrimiento Inerte al Aspa y al Eje.
"'TI
i.e· e: ¡;¡ ?'
6,2-6,6
n
¡-
l'D
a:
"'o... l'D
::J
3
Las dimensiones de A y B no exceden 0,5 mm cuando la parte se rota sobre el eje de la línea central.
¡LZJ---1
l'D
Vl
o~ ::J
1
~
o o... l'D
o c::J 1
n o
3 "O o
::J
l'D
::J
..... l'D
7,3-8,2
39-43
:JI J J
-¡
-----
Vaso de Vidrio de Borosilicato con Capacidad de 150 ml
B 37,8~.4
168-172
16-18
R 15-17
1 29~1 L
26-28 Altura de Ensamblaje
14,87-15,13
~
VI
C)
~
C"I:>
0 25
<1>14,87-15,13
o... n
l'D
a:
"'
ª-
....._
,,,..._ __.
".¡:,,,.
l\J
l'D
¡¡¡
~
Q
a. º' ~ Membrana
2,87-3,13
5" O'
-...,.-
Ll.3-1.8
Compartimento de la dosificación
Junta tipo anillo
15x3
~
(1)
c.. ¡:;· tll
3
(1)
:J
r+
Celda de Inmersión Mojada Materiales: PTFE, Vidrio Borosilicato, Junta Tipo Anillo Viten
oVI
Vl
(1)
3 ¡¡:¡· Q::
e: o VI
l\J
o
Vi \O
2060 (1 724) Medicamentos Semisólidos / Información General
USP 39
Conector del Puerto de Regreso (opcional)
Recipiente de ...... . Fondo Plano
Mini Paleta Giratoria Ensamblaje de -·--- Celdas de Ungüento
Figura 7. Celda de inmersión-Modelo B ensamblado en un vaso. La celda de inmersión se puede usar con el Aparato 2 de la USP (ver el capítulo general Disolución (711 )) con volúmenes de vaso que varían desde 100 mL hasta 4 L, aunque los vasos de 150 ó 200 mL son los de uso más común. Se puede usar una variación de fondo plano para el vaso de 150 ó 200 mL para evitar el problema de espacio muerto bajo la celda cuando se usa en un vaso de fondo redondo. Si los analistas van a utilizar un vaso de 150 ó 200 mL con el Aparato 2 de la USP, entonces se deben realizar las modificaciones apropiadas, incluidos los sujetadores para los vasos de pequeño volumen y el reemplazo de la paleta estándar con la paleta apropiada. Asimismo, puede ser necesario el reposicionamiento de cualquier dispositivo de muestreo automático y/o distribuidor. Se debe ajustar el baño de agua o el calentador del vaso para que la temperatura del medio sea 32,0 ± 0,5º ó 37,0 ± 0,5º. Antes de cargar las celdas y de colocar el medio en el vaso, ajustar la altura de la paleta, la cual debe estar a 1,0 ± 0,2 cm por encima de la superficie de la membrana. Se deben ajustar todos los demás parámetros operativos, tales como nivel, vibración, fluctuaciones, etc., a las mismas condiciones que las definidas para el Aparato 2 de la USP. La condición de pequeño volumen se califica primero usando la configuración estándar del Aparato 2 y la Prueba de Verificación del Desempeño, Aparatos 7 y 2 (ver Disolución (711 )). Cortar la membrana a un tamaño apropiado. Si fuera necesario, remojar la membrana en el medio receptor durante al menos 30 minutos antes de la carga. Si la membrana es gruesa, podría ser necesario un tiempo de remojo más prolongado. Preparar los componentes de la celda de inmersión según lo especificado por el fabricante del dispositivo. Llenar el área de depósito de la dosificación con la muestra en análisis. Asegurarse de que el recipiente esté lleno hasta el tope para minimizar la posibilidad de formación de burbujas de aire entre la superficie de la muestra y la membrana. Usar una espátula puede ayudar a obtener una superficie uniforme. La cantidad típica de muestra es entre 300 mg y 2 g, dependiendo del tipo de celda de inmersión usado. Se requiere un exceso de muestra para obtener una velocidad de liberación de fármaco estable. Con ayuda de pinzas o tenacillas, retirar la membrana del medio de remojo y colocarla sobre la parte superior del compartimiento de la muestra. Asegurarse de que la membrana no tenga arrugas. Ensamblar los componentes de la celda de inmersión según lo especificado por el fabricante del dispositivo. Colocar cuidadosamente el ensamblaje completo en la parte inferior del vaso de disolución con la membrana orientada hacia arriba. El medio apropiado precalentado puede precargarse en el vaso o se puede agregar después de la inmersión de la celda de inmersión para iniciar la prueba. Se deben obtener muestras de al menos 5 tiempos de muestreo en la porción estable (lineal) del perfil de liberación de fármacos. Los datos obtenidos en cada tiempo de muestreo son acumulativos y se expresan en concentración por área superficial, por lo general en cm2, como una función de la raíz cuadrada del tiempo. El muestro por lo general se lleva a cabo durante un periodo de 4-6 horas. La pendiente de la línea es la velocidad de liberación in vitro de fármaco a partir del producto. Al final del periodo de prueba, desarmar la celda y examinar el contenido para detectar cualquier aspecto inusual que pudiera explicar la obtención de datos anómalos (p.ej., fugas, burbujas, etc.). CALIFICACIÓN El Aparato 2 de la USP debe calificarse de conformidad con el procedimiento descrito en Disolución (711 ).
USP 39
Información General/ (1724) Medicamentos Semisólidos 2061
Determinación de la Liberación de Fármaco Usando el Aparato 4 de la USP (Celda de Flujo) El adaptador para formas farmacéuticas semisólidas (ver la Figura 8) se usa con la celda de 22,6 mm del Aparato 4 de la USP descrito en Disolución (711 ). El adaptador consiste en un depósito y un anillo para sostener la membrana. El depósito está disponible en diversos tamaños que pueden recibir desde 400 hasta 1200 µL de producto. El uso de las celdas del Aparato 4 de la USP asegura el control de la temperatura y de la hidrodinámica. La temperatura puede mantenerse a 32,0 ± 0,5º ó 37,0 ± 0,5º, dependiendo del sitio previsto de administración de la formulación. La velocidad de flujo debe cumplir con los requisitos de Disolución (711) con un perfil de flujo sinusoidal con una pulsación de 120 ± 1 O pulsos/minuto y una precisión de ±5% de la velocidad de flujo nominal.
E E o.--!
A-A
>< •ro :E
0 14 mm Figura 8. Adaptador para formas farmacéuticas tópicas en el Aparato 4 de la USP (todas las dimensiones están en mm).
Procedimiento La membrana, que se puede remojar en el medio receptor con anticipación, se carga en el anillo para membrana usando la herramienta provista. La membrana debe ser de tamaño suficiente para superponerse al borde superior del cuerpo del depósito con un diámetro de 18 mm. La muestra se carga en el depósito. Se puede usar el otro lado de la herramienta para sostener el depósito mientras se carga la muestra. Si fuera necesario, se puede eliminar el exceso de muestra con una espátula. Atornillar el anillo para membrana en el depósito de muestra. Asegurarse de que la membrana no se arrugue mientras se atornilla. Retirar el adaptador de muestra semisólida de la herramienta y deslizarlo en la parte cilíndrica de la celda de 22,6 mm con la membrana orientada hacia abajo. El posicionamiento vertical dentro de la celda se puede ajustar usando la orientación del portatabletas, si así se desea (ver la Figura 9). Si se selecciona la posición inferior, la liberación puede ser mayor dada la proximidad a la entrada del flujo. El sistema a menudo se configura como un sistema cerrado (ver la Figura 7O), aunque en algunos casos, se puede usar un sistema abierto. La celda preparada se inserta en una camisa de calentamiento.
2062 (1 724) Medicamentos Semisólidos / Información General
USP 39
Figura 9. Posicionamiento vertical del inserto usando la orientación del portatabletas (todas las dimensiones están en mm).
Bomba
Depósito del Medio
Figura 1O. Configuración de sistema cerrado. Se introduce el volumen definido de medio de liberación en el depósito. A menos que se especifique de otro modo, el medio debe desgasificarse para minimizar el riesgo de burbujas de aire. El capítulo Disolución (711) describe un procedimiento de desgasificación, aunque se pueden usar otras técnicas validadas de desgasificación. El depósito se puede adaptar al volumen requerido para lograr las condiciones de exceso de medio y para asegurar la precisión del método analítico. Los volúmenes típicos van desde 50 hasta 1000 mL, aunque también se pueden usar valores superiores o inferiores a dicho intervalo conforme la formulación lo requiera. Al encender la bomba, el medio será bombeado a través de la celda. Esto representa el tiempo cero de la prueba. Las velocidades de flujo típicas son 16 mL/minuto y 24 mL/minuto, pero la velocidad de flujo es un parámetro del desarrollo del método por lo que debe optimizarse de manera correspondiente. El paso del flujo a través de la celda asegura la agitación y renovación del medio receptor en la interfase con la membrana. El muestreo se puede llevar a cabo de forma manual o automática directamente del depósito de medio, con lo que se asegura una interferencia nula con el flujo y su contenido. Un recolector de fracción automático puede ser adecuado para periodos de liberación superiores a 6 horas. Después de la cuantificación, graficar la cantidad de liberación de fármaco por área superficial en función de la raíz cuadrada del tiempo, donde la pendiente de la línea representa la velocidad de liberación in vitro.
Cálculo de la Velocidad y de la Cantidad de Fármaco Liberado Calcular la velocidad de liberación de fármacos usando los pasos siguientes. Se calcula la cantidad liberada (µg/cm 2 ) en un tiempo dado (t 1, t2, etc.) (AR;) para cada muestra: Cantidad liberada en t 1AR 1 = (Auif A5) x C5 x 1000 x (Ve! A0) Cantidad liberada en t 2AR2 = (Awf A5) x C5 x 1000 x (Ve! A0) + [AR 7 x (V5/Ve)l
USP 39
Información General/ (1724) Medicamentos Semisólidos 2063
AR= cantidad de fármaco liberado (µg/cm 2 ) Au = respuesta (p.ej., área del pico, altura del pico o absorbancia) de la Solución muestra A5 = respuesta promedio (p.ej., área del pico, o altura del pico o absorbancia) de la Solución estándar C5 =concentración de la Solución estándar (mg/mL) Ve= volumen de la celda de difusión (mL) A0 = área del orificio (cm 2 ) V5 =volumen de muestra tomado (mL) Para cada celda, se grafíca la cantidad individual de fármaco liberado en función de la raíz cuadrada del tiempo. La pendiente de la línea resultante es la velocidad de liberación del fármaco. El promedio de 6 pendientes para cada prueba y cada producto de referencia representa la velocidad de liberación de fármaco de la forma farmacéutica y se utiliza como la norma para el medicamento.
Aplicación de la Liberación de Fármacos Se puede utilizar la prueba de desempeño del producto para evaluar la equivalencia del medicamento después de los cambios posteriores a la aprobación. Debido a que los artefactos de análisis comunes, como por ejemplo burbujas de aire y defectos de la membrana, generan mediciones que normalmente no se distribuyen, se usa una técnica estadística no paramétrica para evaluar los resultados de la prueba. La prueba U de Mann-Whitney se usa para calcular el intervalo de confianza del 90% para el cociente de las pendientes entre las partidas de prueba y de referencia. Esto se ilustra mediante el ejemplo siguiente en el que se hace referencia a la partida inicial de medicamento como la partida de referencia (R) y la partida cambiada o subsiguiente se denomina partida de prueba (T). Las cantidades individuales de fármaco liberado de R se grafíca en función del tiempo y se determinan las pendientes resultantes. Ésas son las pendientes de referencia. El proceso se repite para la partida de prueba (T). Los cocientes de las pendientes TI R se calculan para cada pendiente de prueba a referencia. Este procedimiento se facilita con una tabla en la que se listan los valores para las pendientes de las partidas de prueba y de referencia en la parte izquierda y a lo largo de la parte superior de la tabla, respectivamente. Posteriormente, se determinan los cocientes entre las pendientes T/R. Ver la Tabla 7. Tabla 1. Comparación de Pendientes de Prueba y de Referencia
TSl TS2 TS3 TS4 TSS TS6
RS1
RS2
RS3
RS4
RS5
RS6
TSl/RSl TS2/RS1 TS3/RS1 TS4/RS1 TSS/RSl TS6/RS1
TS1/RS2 TS2/RS2 TS3/RS2 TS4/RS2 TS5/RS2 TS6/RS2
TS1/RS3 TS2/RS3 TS3/RS3 TS4/RS3 TS5/RS3 TS6/RS3
TS1/RS4 TS2/RS4 TS3/RS4 TS4/RS4 TS5/RS4 TS6/RS4
TS1/RS5 TS2/RS5 TS3/RS5 TS4/RS5 TSS/RSS TS6/RS5
TS1/RS6 TS2/RS6 TS3/RS6 TS4/RS6 TSS/RS6 TS6/RS6
Después de que se hayan calculado los cocientes entre T/R, se ordenan desde el más bajo hasta el más alto. Los cocientes T/R 8° y 29° se identifican y convierten en porcentajes (multiplicados por 100). Estos valores representan el intervalo de confianza de 90% para el cociente entre las velocidades de liberación de prueba y de referencia. Para aprobar el análisis de la primera etapa, dichos cocientes deben estar dentro del intervalo de 75%-133,33%. Si los resultados no cumplen con este criterio, se deben llevar a cabo cuatro pruebas adicionales de 6 celdas, las cuales resultan en 12 determinaciones adicionales de pendientes para cada producto analizado. Determinar los cocientes entre las pendientes T/R para las 18 pendientes para cada producto analizado. Ordenar los 324 cocientes entre las pendientes T/R individuales del más bajo al más alto. Para aprobar esta segunda etapa de análisis, los cocientes de las pendientes 110° y 215•, que representan el intervalo de confianza del 90%, deben estar dentro el intervalo de 75%-133,33%.
2064 (1 730) Espectroquímica de Plasma / Información General
USP 39
Agregar lo siguiente:
•(l 730) ESPECTROQUÍMICA DE Pl.ASMA-·.•TEORÍA Y PRÁCTICA ÍNDICE 1. lntroduccíón 2. Preparación de la Muestra 3. Jntróducción de la Muestra 4, Preparación del Estándar 5. Plasma lnductivamente.Acoplqqq (ICP) .... . / . . ·...••.... · ·•· · ..•. · • .· . · . ····.···· .....•.. 6'. Espectroscopía
'l.•••.INTRODUCCIÓN Hprppósít<;>. de este.capffulo·•geperaf es proveer úria. pe[$pectiva gE)héralsobreJós p[incj.pjq$ fJJl)ºa[ÓeQtalE)s1.··elinsth.1rr:iefüal yla aplicación.de la espedroscopfa de etrl.i~lóri óptica de plasma indt.lctlvarnefite acópladó(ICP-OES, . pof' füs •siglas.~r1Jng(és) y la• e.spec~rqrnet~ía. de .mas.as de . plasrna irjductivamenteacópla<;i<:>.(ICP7f\11$1 pqr·.sl;ls ~iglas.·.en1ngl~s). •Este capftuJo·•acqrr:ipana al capf~ulo. Espedr<>quírnk:a í:/eflc.1$md \730) . SeprqVeeufi glosario (;le término$ ~I firjalde .~ste capítulq general.
La •preparación de.Ja ·muestra .• es cdtíp¡:fpara ele~itó•delaflálisisl:)ásádoen plásmiiy e.sel primerp<'ls<:>para reali~¡¡.r.cualquier a11álisis·•·mediante ·la ICP~QE$ o. la .ICP-..MS,•·Lastécl'.litaspásadás el)plasma·dependen en• gran····rneciida pé] ~ransp(;)r~e· dela muestra·..nacia. eí.ü1teti.()r del plasma. y, debidó••.á q~e,•la. lcP__.Oes,y lá. lcP...-MS.eompa!ten el rnfsl"r\9.·sisten-táde intro<;lúc<:;ióh de la rti;uestrat los medios mediante l<:>sque• se.prepararilas muestras. pueden sérapli('.¡:¡bles.a cualquiera ·de. lastéCfücas.EfrnEldío rnásn ··otras Opciones de. disolventeii, se puede ·usar peró~iclo de hídróge:nór ácido· dól'hídricó1áddo· súlfúric;;<:>;áeídóperdorlcó,.cornbína~ ciones·de ácidof o. divers¡¡scooeel'!tra<::iqnes.t:le.•áddps p:ar.a disolverla.muestra .paraelJ1.nálisJ.s,·.$e:·•· puedé Lisleta!Jtes.afácido flíJ()Fhíclrlc;;o, Asírnismq, ·~e clebensegt.iirproce<;iimientóSde seguridad ·apr<:>piados para• proteger al·•. ahali$ta. Además/se pueden .em~ plear,rr:iedios•¡¡¡ltetnativos para disolver la níl..lestra•..E$tosinchJyén, •perp no selirnitíil.rfa:· usodef)ases••cl1luida~1 disolventes orgá~ nko(purps o (jlluidos, . q:imbínaci.Ones de áddos •o•.basesy. combinaciones <;iedisolyentes orgánito.s, ocualq(líer d.isólyefite.q(le sea•c;;prnpatlble·conel.·instrt.tmental: Cli(}nd<;>·•las .muestras se .iritrodu<;:enen elplasmas eh· los que la exactitud y la· precisióo n.o sean adecuadas. El. uso de. unestán<;lar .interno debe considerarse corno la regla, y no la excepción, en• el tas<:> de los análisis (:fe ICP-'MS. En cu;alqurercaso, la selección de unestálldar inter110 apropiado debe <::onsíderar ef analifo en cuestión, Ja energía de fohizadón, l(ls longitudes de onda o másas yla nattiralez:a de larnatrii de la muestra. Cuando se determina que una muestra no es sOluble en• ningún disolvente aceptable, se püede emplear una variedad de técnicas de digestíón,Jas cualesinc;luyen digestión por calentamiento en placa y digestión asistidapormícroonclas1 así' mrno enfoques de vaso abiert<:> y vaso cerrado. La decisión relacionada con el tipo de técnica de digestipn que se va a usar depende dela.naturaleza•deJa·muestra que se digiere, asfcomo de.los analitos de i.fiterés.
USP 39
Información General/ (1 730) Espectroquímica de Plasma 2065
4. PREPARACIÓN DEL ESTÁNDAR Se pueden comprar soluciones estándar de múltiples elementos o elementos individuales, cuyas concentraciones son ti'á:Z:ables a estándares de referencia primarios, tales como lós del Nl5T para usarlos en la preparación de soluciones estándar de trabajo. Como alternativa, se pueden preparar con exactitud soluciones estándar de elementos a partir de materiales estándar, según corresponda y sus concentraciones pueden determinarse de manera independiente. Las soluciones estándar de trabajo, en especial aquellas que se usan para análisis a nivel de ultratraza, pueden tener una vida útil limitada, dependiendo del analito
2066 (1 730) Espectroquímica de Plasma / Información General
USP 39
en cuestión, del tipo de recipiente de almacenamiento, de la concentración de la solución y de las condiciones de almacenamiento. Como regla general, las soluciones estándar de trabajo con concentraciones inferiores a 1O ppm (p/v) no deben ser conservadas durante más de 24 horas, a menos que se demuestre su estabilidad experimentalmente. La selección de la matriz estándar es de fundamental importancia para la preparación de las soluciones estándar de elementos. Los experimentos de recuperación de cantidades conocidas agregadas deben realizarse con matrices de muestra específicas para determinar la exactitud del método. Si los efectos de la matriz de muestra ocasionan inexactitudes excesivas, se deben igualar las matrices de los estándares, los blancos y las soluciones muestras, de ser posible, para minimizar las interferencias de la matriz. Cuando no sea posible lograr Ja correspondencia de las matrices, se debe usar un estándar interno apropiado o el método de adiciones estándar para la ICP-OES o la ICP-MS. Puede ser necesario el método de adiciones estándar1 incluso con el uso de soluciones con matrices correspondientes y estándares internos. En cualquier caso, la selección de un estándar interno apropiado debe considerar los analitos en cuestión, sus energías de ionización y excitación, su comportamiento químico, sus longitudes de onda o masas y la naturaleza de la matriz de muestra. Básicamente, se debe demostrar de forma experimental que la selección de un estándar interno provee especificidad, sensibilidad, linealidad, exactitud y precisión suficientes para los análisis en cuestión. El método de adiciones estándar implica agregar una concentración conocida del elemento anafito a la muestra a no menos de dos niveles de concentración más un.a preparación de fa muestra sin el agregado de cantidades conocidas. La respuesta del instrumento se grafica contra la concentración del elemento analito agregado y se traza una línea de regresión lineal a través de los puntos de datos. El valor absoluto de la intersección x multiplicado por cualquier factor de dilución es la concentración del analito en la muestra. La optimización del método de la ICP-OES o de la ICP-MS también depende en gran medida de los parámetros de plasma y del medio de introducción de la muestra. La potencia directa, las velocidades de flujo de gas y la posición de la antorcha pueden optimizarse para proveer la mejor señal. Se debe considerar cuidadosamente la selección de longitudes de onda o de isótopos. La presencia de .carbono disuelto en concentraciones de un porcentaje pequeño en soluciones acuosas mejora la ioniza~ ción de selenio y arsénico en un plasma de argón inductivamente acoplado. Este fenómeno con frecuencia resulta en un sesga· do positivo para las mediciones de cuantificación de selenio y arsénico mediante la ICP-OES y la ICP-MS, lo cual .puedE;i resolverse usando el método de adiciones estándar o agregando un pequeño porcentaje de carbono, tal como ácido acético glacial analíticamente puro a Jos estándares de linealidad.
5. PLASMA INDUCTIVAMENTE ACOPLADO Los componentes que forman la fuente de excitación del plasma inductivamente acoplado (ICP, por sus siglas en inglés) incluyen un suministro de gas argón, una antorcha, una bobina de inducción de radiofrecuencia (RF), una unidad de acoplamiento de impedancias y un generador de radiofrecuencia. El argón es el gas de uso casi universal en el plasma inductivamente acoplado. La antorcha de plasma consiste en tres tubos concéntricos diseñados como tubo interno, intermedio y externo. Los tubos intermedio y externo se fabrican casi universalmente de cuarzo. El tubo interno puede estar fabricado de cuarzo o alúmina si el análisis se realiza con soluciones que contengan ácido fluorhídrico. El flujo de gas nebulizador transporta el aerosol de la solución de muestra hacia el interior y a través del tubo interno de la antorcha y hacia el interior del plasma. El tubo intermedio transporta el gas intermedio (en ocasiones denominado gas auxiliar). El flujo de gas intermedio ayuda a despegar el plasma de los tubos interno e intermedio para evitar su fusión y la deposición de carbono y sales en el tubo interno. El tubo externo transporta el gas externo (en ocasiones denominado plasma o refrigerante), el cual se usa para formar y sustentar el plasma toroidal. El flujo tangencial del gas refrigerante a través de Ja antorcha constriñe el plasma y evita que el plasma inductivamente acoplado se expanda y llene el tubo exterior, impidiendo así que la antorcha se funda. Una bobina de inducción de radiofrecuencia, también denominada bobina de carga, rodea la antorcha y produce un campo magnético oscilante, el cual a su vez establece una corriente oscilante en los iones y los electrones producidos por el argón. El acoplador de impedancias sirve para acoplar de manera eficiente la energía de radiofrecuencia del generador a la bobina de carga. La unidad puede ser de tipo activa o pasiva. Una unidad acopladora activa ajusta la impedancia de la energía de radiofrecuencia mediante una red capacitiva, mientras que la de tipo pasiva ajusta la impedancia directamente a través del circuito generador. La transferencia de energía entre la bobina y el argón que se produce dentro de la bobina de carga del generador de radiofrecuencia genera un plasma autónomo. Las colisiones de los iones y los electrones liberados del argón ionizan y excitan los átomos de analito que están en el plasma a alta temperatura. La temperatura del plasma es de 6000-1 O 000 K, por lo que se elimina la mayoría de los enlaces covalentes y las interacciones entre analitos.
6. ESPECTROSCOPÍA DE EMISIÓN ÓPTICA DE PLASMA INDUCTIVAMENTE ACOPLADO (ICPOES) El plasma inductivamente acoplado puede usar un sistema de detección espectral óptico o de masas. En ef primer caso, en la ICP-OES, fa detección de analitos se logra a una longitud de onda de emisión del anallto en cuestión. Debido a diferencias en tecnología, se encuentra disponible una amplia variedad de sistemas de ICP-OES, cada uno con diferentes capacidades así como diferentes ventajas y desventajas. Los sistemas de detección simultáneos son capaces de analizar múltiples elementos al mismo tiempo, con lo que se acorta el tiempo de análisis y se mejora la detección y corrección de fondo. Los sistemas secuen-
USP 39
Información General/ (1 730) Espectroquímica de Plasma 2067
ciales se mueven de una longitud de onda a la siguiente (lo que en ocasiones se denomina rotación) para realizar análisis y a menudo proveen un número mayor de líneas analíticas para escoger. Los instrumentos modernos por lo general emplean detectores. de arreglos como dispositivos de detección. Los detectores de arreglos, incluidos los dispositivos de acoplamiento de carga y los de inyección de carga, tienen detectores ensamblados en ull chip, lo que facilita combinar las ventajas de los sistemas simultáneos y secuenciales. EStos tipos de dispositivos de detecc.íón se usan en la mayoría de los espectrómetros más avanzados, laque provee un rápido
2068 (1 730) Espectroquímica de Plasma / Información General
USP 39
altura de observación o el flujo de gas nebulizador, o agregando un agente de supresión de ionización a las muestras y están· dares. Cuando se usan disolventes orgánicos, a menudo es necesarío usar una configuración de potencia directa más alta, flujos de gas intermedio y externo más altos y un flujo de gas nebulizador más bajó que los que se emplearían para soluciones acuosas. Puede ser necesario reducir la velocidad de la bomba peristáltica y alterar la selección de la cámara de rocío. Al vsar disolventes orgánicos, puede ser necesario liberar cantidades pequeñas de oxígeno en la antorcha para prevenir la acumulación de carbono en la misma.
6. 1 Calibración La exactitud de la longitud de onda para la detección mediante ICP-OES debe cumplir con los procedimientos operativos aplicables de.1 fabricante. Debido a las diferencias inherentes entre los tipos de instrumentos disponibles, no existe un procedimiento general de aptitud del sistema que pueda emplearse. Se deben seguir las rutinas de calibración recomendadas por el fabricante para un instrumento de ICP-OES dado.
6;2 Estandarización El instrumento debe estandarizarse para la cuantificación al momento de su uso. Debido a que la ICP.:.OES es una .técnka que por lo general se considera lineal a lo largo de un intervalo de 6:..8 órdenes de magnitud, no siempre es necesario demostrar continuamente la linealidad mediarlte el uso de una curVa estándar compuesta pot múltiples est¡)ndares. Una vez que se ha desarrollac:Jo el método y se usa de manera rutinaria, es posible calll:>rar con un blanco y un solo estándar. las estandarizaciónes de un punto son adecuadas. para realizar prµebas de lfmltes, además de otros análisis, en los ínateríates de producción y los productos finales si elmétódo ·ha .sido valiaado rigurosamente con suficiente espécificidad, sensibilidad, linealidad, exactitud, precisión, tolerancia y robustez. El uso de la estandarización dé· url solo pontci también es aceptable para análisis cualitativos meaiante la ICP-OES, erl los que el propósito del experimento es confirmar la prE:iseiicia o la ausencia de elementos sin el requisito de una cuantificación exacta. Se debe valorar una solución blimto y estándare.s apropiados que abarquen el irltervalo esperado de las eoncentraciones de la muestra y se debe graficar la respuesta det detector en función de la concentración de anallto1 como en los .casos en los que lá concentración de un componente eonocido esté siendo.determinada dentró dé una tolerancia espedficada. la gráfica de fa concentración del analitó en función de las concentraciones conocidas de componentes por lo general es realizada autómáti" camente por el instrumento. No siempre es posible emplear un estándar que abarque el intervalo esperado de concentraciones al realizar un ánálísis én, o cerca del límite de dete.cción ..Esta taita de un estándar que abarque el intervalo espet¡!lcfode concentraciones es aceptable para los análisis realizados. para demostrar la ausencia o la eliminación de elementos por debajo de Un límite especificado. El número y las concentraeiones de soluciones estápdar us¡Jda.s deben bas¡'lrse e.n el propósitci de ll;l cuantificación, en .el analito en cµestión, en la sensibilidad deseada y en la matriz. de muestra.· Se deben emplear análisís de regresión de la curva de calibración para évaluar la. linealidad de la respuesta del detector, .miej'ltras que fos monografías individualé$ pueden establecer otros criterios.
6.3 Procedimiento Es importante seguir el. procedimiento para los paráme~ros del iQS.trumento,. según se indh::a enla monógrafía indivídual. la especificación c:le los par~metros definitivos en una monografía no excluye el uso de .<'.>tras condición.es .operativas adecuadas, además de que pueden ser necesarios ajustes. én las condiciqnés operativas. Debido .a las .diferencias eáJa$ <;9nfüuracJones del equipo de cada fabricante, se pueden usar las condiciones predeterminadas sugeridas por ef fabricante y moqificarlaS. según s.e req.µíera. las. condicion~ afternativ¡¡¡s.dei:;>en estar sµstentaclas por :Patos de validación adec4ados1 mientras.que las condiciones en·1a IT}onografía .tendrán prioridad para propósitos oficiales, losd.atos recolectados a pa:rtir. de una introducci.ón de. muestra individual se. tratan como un res¡jltado indlvitjµal. Este resultado puede ser él promeqio de tjatO.S recoléctad9s a partirtjé repeticiones de lecturas secuenciales iomacfas crur<:inteJa intr:üducción individuál .de una Solución del est~ndarapropiado. o dé .una soludónde muestra. Las concentradónes de. la muestra se calculan en función .de la corva: de trabajo ¡:repda pór la gráfica eje respu.esta del .detector en fündón de la concentra<::.ión del analito en las• so,utio!'les estándar, que es a .menudo ~n cálculo reaJi. zado directamente por el instrllment<>,
7. ESPECTROMETRÍA DE MASA.S DE. PLASMA INDUCUVAMENTE ACOPLADO (ICP-MS) Cuando se usa la ICP-::MS, los analitos son detectad.os directa.mente por sus masas. atómicas. Debido a .que estas .masas deben cargarse para. poder ~er detectadas en la JCP-MS, el método se basa en la capacidad de la tu ente .de plasma para atomizar e ionizar los componentes de ll'l muestra. Como e.n el caso de la ICP-OES, se encuentran disponíbles una pmpfia variedad de sistemas de instrumentos para la ICP-'"MS.
USP 39
Información General/ (1730) Espectroquímica de Plasma 2069
Los· sistemas ·que más se usan sortlos sistemashas.:idos en cuadrupolos. Asimismo, se encuentranqisponibles instrumentt>s de .alta resoluc:ión de•·se(;tores.y de ·tiempo de vuéJo,·•así'c:órno. sistemas. de <::uadrupolos ··múltip!es...1ndependier1tel'hénte qet qi" seño o dela Configüradón dél instrumento, la ltP-"MS. proveetanto· una medición cualitativa torno ct.l~mtítativadelofcófap6· nentes dela muestra, Los iones son generado$poretplasmaapartir·de.·lósátomos del . anatlfoy, posteriormente/ los iones son extraídó5.d.él plas; míl;que éstá·a presión••a~mosfética,· á traV~S·•de Un C:QhO de .muestreo ·hacia únázona de··pre$ión•·rnás.·baja,quepor1Ó.g$!1eral se m.:intienea úna presió11 cercaná al Tort. En este proceso de extraceión, los gases de plasma rn4estread6s/locfuidás.lás especies del arrnlito, forman un h.:iz supersónico, et cual dicta muchas de las propiedades de los iones delanal1toresultarl'te$. Un ·•cono• de·selección, localizado •detrás•del cónodemt1éstreo, ·''separa 'el haz.•supersónico de• iones artiedidá queé.metgeh del tonoJfü muestreo. Detrás del cóno de selecci<)ri se enéi.1entra una zona de baja presióhj que a .menudo se mantiere er)el intervalo de miliTofr. Pór úh:;irno, los iónessepáradofpasan por uh otifítio de lérteta .·etapa para ingré$ar áuh<Í zól'lS de descomposición. Tambiénse forman óxiqos e iones de analito ton• c.:irga múltiple, l(>s cuale~ pqecienil'lcreme:f'ltaf la complejidad ·de lps espectros de· masaresultantes...·uas intérferencias pueden· seííninirniiad(IS mediahtffü opti!"J'liz¡:¡qióp ap['.()~ piacla· de!9spar~rnetros9pérat!vos, •. 1rcluidosl(>sflüjos de gas (velocidades. ele flujo degascentralí i.ntérrT!edi()¡ yel
flujódesolucióncieml.le$tra,liJPotentiadeRf,·el\l(>ltajedelentede.extracción,entreotros1ómediariteel.l.ls9
col isíón·• o reacc!6h. uóperai;:ióh.de pla~rna fttO/Si $e eriG:ue;ntradisponible•er:1.Un.·•instrumento. dado• A menós..tju~l.!n l~OOt
rio.esté•g~nerando.·.o·•.ex:amif'\aridP·.isófopc;>s 1qüent>t>(:Orren.de.for'mz1natotal,.1¡:iH.s~·deisótopos.ql.le.6curten.·~e·f9rm~toattttál
pr(i)Veerá•91.· analista.·lsó~pos.acep.ta!:>.les para.·prpp6sitos.··ani;tlíficos .. Los ·.patrones1·is(iltópicos. tambiéil seCpueden•.l.lsar pat~ifa~~l·i~ tar.·.1.aidentiti<;aclón•.'lf eonfirrna~ióndeeletl"lent(ls~··*9eroás,.sepuedenusa.rtaol.:is·de•interlerenciascom~nmentE! . ~rit,ont#~dí.ls 1y de irtter"f(lren(;i.:is í$dbál'ica$ ••póli(ltómli::as.·y f
to. La ICP-MS por..ló general•ofrecemeiQresiímitesde;detecciónqueJa ICP-"OES,•e.ri.grar:1medidí.ldebi~9aLruid9clé.fot"lclQ extremadamente b.:ijo que genera. Esta capaeidad es una ventaja importante dela ICP,.,MS para la determinación de c0 nce1'1~ fradones de analito muy bajas o cuando se requiere la elif'hJnación de interferencias de la matriz: Ene! último caso, se1pueden evitar algunas interferendás simplemente medi¡mte una.dilución adicional de la solución de muestra. En algunas apll(:f SUS siglas (11'1 inglés) usando la. ICP~M5. <;:orno regla generalr laJCP-.tvlS como técnica requiere que lai müestras i::onteílgan un tQ~ali~ig¡ljfí cativamente menor de sólidos disueltos quela ICP-.OES. La selecdón de.la masa ánalítka que seva a cletermin!lr es crítica para el éxito• del análisis• me(l.iantl;.la l(;P'"'"MS; lndepenciiehc temente del diseño delinstfumento. Al1nq4e algunas masas a·•rnenudo se considenm como masas primarías depido á s!J.éll:l\l¡:¡da abundánciá natúral, en muchas oca~íones se· ¡,ísa Una masa alternativa para un elemento dado p.:ira evit~· sándose en lasxecornendaciones del fabricante o en las publiciJdones de tablas de isótopos que ocurren de forma nátl.lral(.7). La·optirnizacl<)n deLmétodo de Ja l<'.:P"'MS·también depende en gran medida de los •parámetrofdelplasmay del(>smeclios de introducción de la muestra .. La pptenda directa, las velocidades de flujo de gas y la posición de la antorcha püede!'l optimizarse para proveer la mejor señal. Cuando se emplean disolventes orgánicos, a menudo es necesario usar .una confígura(¡Jól"l dé potencia directa más alta y una velocidad de flujo del nebulizador menor que la. que se usaría ensolucione~ acl!osas. J\.demás, cuando se usan disolvente~ orgánicos, puede ser necesário introducir pequeñas.cahtidades de oxígeno en el. gas.G:eotr,iJI Qirt• termedio para prevenir la acumulación de carbono en la antorcha o en el orificio del cono de r;nuestreo. ASimisrnó1 puede se( necesario usar un cono de. muestreo o de .selección con punta de platino para reducir la degradación deleonp c:ona.lgunQs disolventes orgánicos.
7.1 Calibración La exactitud espectral de la masa para la detección por ICP..,.MS debe coincidir con los procedimientos operativos aplic:
7.2 Estandarización El instrumento debe estandarizarse para cuantificación al momento de su uso. Debido a que la resp.uesta (seña.lvs. concen" tración) de la ICP-M5 por lo general se considera lineal en un intervalo de 6-8 órdenes de magnitud, no síempfe és necesario demostrar continuamente la linealidad mediante el uso de una curva de trabajo. Una vez que se ha desarrollado un método y
2070 (1730) Espectroquímica de Plasma / Información General
USP 39
se usa de manera rutinaria, es una práctica común calibrarlo con un blanco y un solo estándar. Las estandarizaciones de un punto son adecuadas para llevar a cabo los límites de pruebas en materiales de producción y productos finales, siempre que el método haya sido rigurosamente validado con suficiente especificidad, sensibílídad, linealidad, exactitud, precisión, tolerancia y robustez. Se debe valorar una solución blanco y estándares apropiados que abarquen el intervalo esperado de concentraciones de la muestra y se debe graficar la respuesta del detector en función de la concentración de analito, siendo estos cálculos en general realizados por el instrumento. La cantidad y la concentración de las soluciones estándar usadas deben basarse en el analito en cuestión, en las concentraciones esperadas y en Ja matriz de muestra, y deberán dejarse a discreción del analista. El método de adiciones estándar debe emplearse en situaciones en las que se esperen o sospechen interferencias de la matriz. Este método implica agregar una concentración conocida del elemento analito a Ja solución de muestra a no menos de dos niveles de concentración. La respuesta del instrumento se grafica contra la concentración del elemento analito agregado y se traza una línea de regresión lineal a través de los puntos de datos. El valor absoluto de la intersección x multiplicado por cualquier factor de dilución es la concentración del analito en la muestra. En muchos casos, el instrumento realizará este cálculo automáticamente después de haber sido programado para usar el método de adiciones estándar.
7.3 Procedimiento Seguir el procedimiento para el modo de detección y los parámetros instrumentales para ICP-MS, según se indica en la monografía individual. La especificación de los parámetros definitivos en una monografía no excluye el uso de otras condiciones operativas adecuadas, además de que pueden ser necesarios ajustes en las condiciones operativas . .Las condiciones alternativas deben estar suste.ntadas por datos de validación adecuados, mientras que las condiciones en la monografía tendrán prioridad para propósitos oficiales. Debido a las diferencias en las configuraciones del equipo de cada fabticante, el analista puede comenzar usando tas condiciones predeterminadas sugeridas por el fabricante y modificarlas según se requiera;. Los datos recolectados a partir de una introducción de muestra Individual se tratan corno un resultado individual. los datos recolectados a partir de lecturas secuenciales. repetidas a partir de una introducción individual del estándar apropiado o de las solucion.es de muestra estándar se pro.median como un solo resultado. Las concentraciones de la muestra se calculan en función de la curva de trabajo generada mediante la gráfica de respuesta del detector en función de la concentración del analito en las soluciones estándar. Con los instrumentos modernos, este cálculo es a menudo realízado por el. instrumento.
8. GLOSARIO Gas auxiliar: Ver Gas íntermedío (o auxíliar). Vista axial: Configuración del plasma para espectrometría de emisión atómica (AES, por sus siglas en inglés) en la que el plasma se dirige hacia el camino óptico del espectrómetro, también denominada "vista terminal." Gas central (o nebulizador): Uno de tres flujos de gas argón en una antorcha para plasma inductivamente acoplado. El gas central se usa para ayudar a crear una niebla fina de la solución de muestra cuando se emplean soluciones de nebulización. Esta niebla fina posteriormente es dirigida a través del tubo central de ta antorcha y hacia el plasma. Celda de colisión: Una característica de diseño de algunos instrumentos de ICP-MS. Las celdas de colisión se usan para reducir las interferencias derivadas de las especies de argón o de los iones poliatómicos y para facilitar los análisis de elementos que pueden ser afectados por aquellas interferencias. Plasma frío: Condiciones de plasma usadas para la ICP-MS que resultan en un plasma que es más frío que el normalmente usado para un análisis. Esta condición se logra usando una configuración de potencia directa menor y una velocidad de flujo de gas central mayor; y se usa para ayudar a reducir las interferencias isotópicas ocasionadas por el argón y algunos iones poliatóm icos. Gas refrigerante: Ver Gas externo (o refrigerante o plasma). Potencia directa: El número de vatios usados para encender y sustentar el plasma durante un análisis. Los requisitos de potencia directa pueden variar, dependiendo de la matriz de muestra y el analíto. Gas intermedio (o auxiliar): Gas usado para "despegar" el plasma de la superficie de la antorcha, con Jo que se previene la fusión del tubo intermedio y la formación de depósitos de carbono y de sales en el tubo interno. Estándar interno: Un elemento que se agrega o que está presente en la misma concentración en los blancos, en los estándares y en las muestras para actuar como una referencia de intensidad para el análisis. Se debería usar un estándar interno para los trabajos con ICP-AES y su uso es siempre requerido para los análisis cuantitativos por ICP-MS. Vista lateral: Ver Vista radial. ín: La masa iónica de interés. rones con carga múltiple: Átomos que, al someterlos a la temperatura de alta ionización del plasma inductivamente acoplado, pueden formar iones cargados doble o tríplemente (X++, X+++, etcétera). Al ser detectados por espectrornetría de masas, la masa aparente de estos iones será 1/2 o 1/, de su masa atómica. Nebuli.zador: Se usa para formar un aerosol uniforme de muestra que se mezcla con el gas argón, el cual se envía de manera subsiguiente al interior del plasma inductivamente acoplado. Gas externo (o refrigerante o plasma): El abastecimiento principal de gas para el plasma. Gas de plasma: Ver Gas externo (o refrigerante o plasma).
USP 39
Información General/ (1 735) Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X 2071
2072 (1 735) Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X / Información General
USP 39
4.2 Muestras en Polvo 5. lnsm¡mentos 5.1 Tubo de Rayos.X 5.2 Filtro del Haz Primario 5. 3 E.spectrometda de. Fluorescencia de. Rayqs X por Longitud de Onda Dispersiva 5A Es.pectrometría de fluorescencia de Rayos X por Energía Oispersíva 5.5 E.spedrometría de Rayos X Polarizados 5.(j Espectrometrfa de: Fluorescencia de Rayos X por Reflexión Total 6. Análisis de Fluorescencia de Rayos X Cualitativos 6.1 Espectros de: Rayos X· 6.2 Análisis Cualitativo 7.. Análisis de: Fluorescencia de. Rayos X Cuantitativo 7.1 Se/ecdón de la Línea Analítica 7.2.Fécnicas de Corre:cdón de Matri? 7. 3 Desarrollo del Método de Medición y Calibración 7, 4 Criterios (Je Aptitud del Sistema 8. Fuéntes Adicionales de Información 9. Referencias
1. INTRODUCCIÓN Este capítulo general provee información con respecto a la teoría y prácticas aceptables para el análisis y la interpretación t-Onsistente.s de los datos de la.espectroscopía de fluorescencia de rayos )t La espectrometría de fluoresqmcia de rayos X (XRF, por sus. sigl(I$ en inglés} es una técnica inst.rurriental basada. en la .medición de fotones de rayos.X característicos o.casionados por I¡:¡ excitación de electrones de la capa interna del átomo mediante una fuente .primaria de .rayo$ X. La técnica de E$pectrometría de Fluote$tencia d.eRayosX pl,.lede.Usatsetanto pata análisis cl,.lalitativos como cuantitativos de líquidos, polvos y materiales sólidos. Aunque algunos vendedores proveen instrumentos con fuentes basadas en isótopos radioactivos, casi todo$ los in$trumentos modernos emplean; !:.In tubo d.e rayos X como fuente.
2. PRINCIPIOS DE LA ESPECTROMETRÍA DE FLUORESCENCIA DE RAYOS X Los .rayos X produddo.s por un tubo de rayos X incluyen líne¡:¡s característica$ que corresponi;ien al material del ánodo y una radiación contin.ua también ccinodda como radiación Bremsstrahlung. Se. pueden usar ambos tipos de rayos X para exdtar átomos en un~ muestra y, de ese modo, Inducir rayos X. l..a it"lterisidad de ambos típos puede aju$tarse medí¡:mte la ccit'lfígura• dón de voltaje y corriente del generador de rayos X. Estos parámetros pueden ajustar$e para optimizar el flujo de fotones de rayos X para cada elemento de int.erés; Se pueden usar ajustes adicionales, tales como la adición de filtros en el haz primario, para eliminar líneas espectrales del tubo indeseadas y potencialmente interlerentes. Se pueden usar objetivos secundarios para producir un oaz de rayos X de excitación que difiera del espectro primario del. tubo.de rayo$ X con el objetivo de lograr condi~ dones óptimá$ de exdtadón. ·Se utilizan numerosos. disefjo$ de instrumentos cori diversas configuraciones geométrica$, tales como filtros secundarios y polad,zación, para . optimizar I¡:¡ detección de. rayos Xy reducir 1.as contribuciones del .fondo. Aunque pueden existir muC:;has variaciones, elinstrumental para Espectrometría de Fluore.st:enda .de Rayos X puede dividirse en dos categorías: instrumentos para Espectrometría de fh,Jore$Cericia.. de Rayos Xde dispersión de longitud de onda (WDXRF, por sus siglas en inglés) y para Espectrometría de Fluoréscentia de Rayos X de dispersión de energía (EDXRF, por sus siglas en inglés). El factor principal de distinción entre estas dos tecnologfas es el método usado para separar el espectro emitido por todos los átomos en la muestra de acuerdo con la energía fotónica de los rayos X. La energía (o la longitud de onda} del fotón de rayos X es característica de una transición electrónica dada en un átomo y es, por lo tanto, de naturaleza cualitativa. La intensidad de la radiación emitida es indicativa del número de átomos en la muestra y, por lo tanto, constituye la natu.raleza cuantitativa de la técnica.
3. EXCITACIÓN Y.EMISIÓN DE RAYOS X
3. l Ionización y Efecto Fotoeléctrico La emisi.óndela radíación característica: de los rayos X resulta de una transición de .electrones entre dos capas internas de un átomo, después de la ionización; Por ejemplo, después de la eyección de un electrón de la capa K, él átomo se ioniza y el ión queda en un estado de energía.alta, f 1, donde f 1 e$ igual a la energía requerida para remover el electrón Kele la capa hasta una situac.ión en la que permanezca eti reposo (sin energía cinética remanente) a una distancia infinita del núcleo. Aesta interacdón entre la radiadón electrom¡:¡gnétita (un fotón) y un átomo resultando en la excitación de un electrón se le denomina efecto fotoeléctrico y es por lo. regulár la contribución más grande para la absorción de los rayos K Por ende, E, corresponde a la. energía de enlace del· electrón, que es. idéntica a la energía del nivel atómico. El estado excitado tiene uria duración muy
USP 39
Información General/ (1735) Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X 2073
2074 (1735) Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X/ Información General
USP 39
Ji.+*"""' "-e~ x = o,0/2:43-{1 :-eo&j¡)A AA ~0,024Ájiarnq; "'-911'
Figura l. Dispersión de Compton de un fotón de rayos X;.
3.3 Conversión entre Energía y Longitud de Onda los fotones presentan una dualidad onqa ..partícula {4]. la energía; E, de la "partícula" yla longitud de on,da t.. de la"onda" se relacionan a través de la constante de Planck, h:
h!!E X
[5)
donde E.es la energía del fotón; hes la constante de Planck; y ces la velocidad de la luz enel vado.Al sustituir estosvalores en fa Ecuación [5} y expresar la energía del fotón E en keV y la longitud de onda 'A en nm, se obtiene lo siguiente: f"' 1.24 X
[6]
Esto permite una conversión rápida y fádl entre la energía y las escalas de longitud de onda. Se debe tomar en.cuenta que las longitudes de onda más cortas corresponden a energías más altas; Comúnmente, los textos diseñados bas~ndose en la WDXRF usarán unidades de longitud de onda para la radiaci.ón característica. Por otra parte, al tratar con la EDXRF, la escala utilizada es una escala de energía con keV como unidad. La energía del fotón puede convertirse a longitud de onda del fotón, y viceversa, usando la Ecuación {6}. la frecuencia de la radiadón electromagnética (que se puede calcular usando c/l o a partirde E/h) no se usa cuando se trata del análisis por Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X.
3.4 El Espectro Electromagnético El intervalo de rayos X es pbr lo regular el intervalo espectral entre 0,01 y 1O nm y abarca 4 órdenes de magnitud, No obs" tante, en la práctica, el intervalo de rayos X que se analiza .comúnmente varía de aproximadamente 0,04 a 1 nm. la región de rayos X del espectro electromagnético también puede expresarse eri términos de la radiación característica de los elementos. La mayoría de los espectrómetros de rayos X de dispersión de longitud de onda pueden equiparse .para analizar líneas características E!ntre aproximadamente 0,04 y 4,4 nm. Esto permite analizar todos los elementos en la tabla periódica desde carbono hacia arriba(Z = 6). Con analizadores dedicados, el intervalo elemental puede extenderse para incluir berilio, aunque los. problemas con la especificidad y .la sensibilidad limitadas limitan .severamente las aplicaciones prácticas paraef aná" lisis cuantitativo de berilio.
3.5 Reglas de Selección Las transiciones en el proceso descrito anteriormente se ven regidas por las reglas de selección de la mecánica cuántica. La radiación de Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X se observa con probabilidad razonable únicamente a partir de aque~ llas transiciones en las que Aj= -1; 0,+l
y Al= -1 ó +1
donde j y I son los números cuánticos usuales. La. correspondencia entre las designaciones de la capa (K, L, M... ) y los números cuánticos n, I y m se proveen en la Tabla 1. Esto significa que en transiciones tales como K +-- L1 y L1 +-- M1, ambas capas con I = O para el estado inicial y final son transiciones radiativas prohibidas. Sin embargo, estas transiciones pueden estar acompañadas por la emisión de un electrón Auger.
USP 39
Información General/ (1735) Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X 2075
"'il ~
1
¡¡ ~
~
~i
:a
Q
l
'
l
m ~
f;¡
Jil~1ifi~yifirfa.t;l~il~~.;~.iciQnes ~n. la..~~pecveme~f~:~~i1'/!Jy.q;r:e~~t'l~i:~·q.e. :J:i~~!~.1~~.~~~!l!.'rlíil!~~~~~it#~·r¡;~!l'l~···W~.tt¡ilsi~ ll~11:¡¡.q;~..~~:~1~~~º~;.~t~Qt:i~nt~.~.f\tr~ ~1.qiJmtli~1.qei~Rt.tllne~ 1~¡¡¡;\\l~t:!q~í'.11~{q¡t¡1¿¡ ~1;~:t1~,m~;.~~1 m~~;.g~gi;:t: .~1 ~.r:!'f>r •m.~i~l;.~9'.í'.1''~.~nt~~.~11 tibil ·iiltensida<'.J· ·m~q¡~a·,pué!le•. ~a•~i.11~r~e·l\!~nq1P
2076 (1735) Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X / Información General
USP 39
USP 39
Información General/ (1735) Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X 2077
Rayos X puede acomodar .masas grandes de muestra (por lo regular en el intervalo de peso en gramos); con lo que se minimizan .!.os errores de muestreo analítico. Esto mejora el nivel en el que la muestra presentada en el espectrómetro representa et material. a granel.sometido al análisis, Uoa preocupación principal es qoe la superficie.final de la muestra sea plana al colocarla en la posición dé medición. Las mediciones pueden reálízarse en. diversas condiciones ambientales, incluyendo aire; nitrógeno, hel.io y al vac(o. Lél mayoría de los espectrómetros de rayos X por lo regular usan vado como medio de análisis, excepto por algunos instrumentos de mesada. Las muestras líquidas son incompatibles con los ambientes de vacío, por lo ql1e se usa helio, aire o nitrógeno él presión cerca de ta ambiental: El aíre y el nitrógeno absorben fácilmente rayos X de energí¡;¡ baja; por lo tanto, su uso generalmente se limita al análisis de (ayos X de alta energía. Las muestras líquidas y en polvo comúnmente se analizan en helio, debido a que esto disminuye significativamente ta absorción de la radiación carac.terística de. la muestra, en comparación con los efectos del aire o el nitrógeno.
4.1 Muestras Líquidas Las muestras líquidas deben ser colocadas en portamuestras desechables antes de introducirlas en el espectrómetro. El portamuestras debe estar fabricado con una película de soporte adecuada y exeota de elemeotos contaminantes. Las películas adecuadas, tales como poliéster o polípropileno, pueden tener on espesor tan reducido como 1,5 µm. Asimismo, es importánte que el portamuestras desecha.ble sea de tamaño adecuado de modo que no pueda ser observado por el espectrómetro; esto asegura que las señales medidas vengan únicarneote de ta muestra y no del portamuéstras. Además, es importante entendet las relaciones entre la matriz de muestra,. elementos de interés y concepto de espesor infinito. En geoeral, al analizar las muestras compuestas de elementos con número atómico bajo (p.ej., matrices orgánicas), es importaote usar uoa muestra más gruesa que al analizar los mismos elementos en una matriz más pesada.(p.ej., metálica). Esto asegura que la intensidad de los rayos X producidos (y detectados) solo depende de la composición de la muestra y oo también de la cantidad de .masa analizada. El espesor en el cual las intensidades no dependen mas del espesor de la muestra presetltadél al:e,spectrómetro recibe el nómbre de. espesor crftico {también conocido com.o espesor infinito):· El espesor crítico depende de las energías de.las. líneas de emisión consideradas, de la matriz de muestra y .también-en un menor grodo-,.de las condiciones de excitación. En mucl¡os casos, puede no ser posible obtener muestras con espesor infinito debido a la falta pe material suficiente o debido a que el espesor crítico puede exceder la profundidad del portamuestras; esto último puede qcu~ rrir al analizar líquidos que están compuestos principalmente de agua o compuestos orgánicos. En estos casos, son aplicables los procedimientos de corrección. En muchos casos, es suficiente una modificación simple al procedimiento analítico-asegurando que todas. las muestras analizadas tengan una masa constante-para evitar problemas con respecto al espesor no infinito. Una .consideradóo adicional es la variación de la deosidad entre muestras y estándares: El análisis de muestras que oo satisfacen el requisito de espesor crítico se volverá más complicado debido a las limltadones impuestas por la geometría del instrumento. La luz incidente de los rayos X en la muestra y los rayos x emitidos a partir de la muestra toman una forma compleja en tres dimensiones que es esencialmente un cono. Se hace referencia a esta geometría como cuneiforme. Esta geometría limita la utilidad de la corrección de matriz tradicional debido a que estos métodos convencionales asumen un volumen de muestreo de rayos X uniforme, al cootrario de lo .que ocurre en un cono. En la mayoría de los casos, la diferencia entre una geometría en forma de cono y el modelo de geometría más simple es insignificante. Este efecto es más pronunciado cuando se miden elementos pesados en muestras de matriz liviana (tales como elementos orgánicos). En estos caso.s, dicho efecto puede tener efectos severos sobre las concentraciones calculadas si no se tiene en consideración. No obstante, es posible incluir un modelo geométrico de. la cuña con una técnica de corrección por matriz referida como corrección de efecto de cuña [ 7]. Una solución alternativa es tener una capa infioitamente delgada, con lo que se elimina cualquier posible interferencia de la muestra (efectos ·de matriz), as( como el efecto geométrico descrito. anteriormente. Esto no siempre es práctico y en la práctica puede ser difícil preparar muestras y estándares reproducibles.
4.2 Muestras en Polvo Para asegurar un espesor de muestra infinito, las muestras de polvo suelto pueden simplemente pesarse y colocarse en un portamuestras desechable según se describió anteriormente. Por las razones descritas anteriormente, a menudo resulta ventajoso compactar levemente el polvo, usando presión constante y una herramienta limpia. Las variaciones en la compactación de la muestra debida a la presión manual pueden compensarse usando las correcclones Compton, que pueden tener en cuenta variaciones pequeñas en el espesor de la muestra y o la densidad. Estos polvos también pueden molerse a un tamaño de partí· cula menor (si es necesario) y luego compactarse para producir un pellet sólido. De preferencia, todas las muestras sólidas no homogéneas, tales como tabletas recubiertas, deben molerse usaodo un dispositívo de molieoda. De manera similar, cualquier muestra homogénea y plana que tenga un área demasiado pequeña para abarcar la abertura óptica del instrumento deberá ser molida. Para materiales blandos, un mortero puede ser suficiente, mientras que para otros materiales pueden ser necesarios molinos oscilaotes, molinos de bolas y/o molinos criogénicos. Los analistas deben asegurar que el medio de molienda no contribuya coo trazas de los elementos a analizar; lo cual puede asegurarse fácilmente triturando/moliendo compue.stos puros y comparaodo los espectros. Por convención, el tamaño de partícula máximo del polvo debe ser 50 µm o menos. Sin embargo, es más importante tener un tamaño de partícula uniforme para estánda-
2078 (1735) Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X/ Información General
USP 39
res y muestras. Esto asegura la homogeneidad de la muestrayprovee una representación ex.acta de la muestra completa, no solo la capa cerca.na a la superficie. De este modo, será posible cargar una muestra en un portarnuestras desechable o compac· tar la muestra en un pellet. La desventaja decompactarüna·rnuestra en un peHet esq\,Je puede ser necesario mei;daru11aglu• tinante (p.ej., cera o celulosa) con la muestra. El uso de dicho material debe considerarse como una posible fuente de contaminación; Se encuentra disponible una yariedad de aglomerantes para mejorar las propiedades mecánicas del pellet. Una ventaja de compactar· una muestra .es que elimina espacios de aire,. los cuales pueden absorber rayos X, por lo que después de CQtn~ pactar, las mediciones por lo general presentan una mejor reproducibilidad para íos elementoslivianos. Además, es posible medir directamente 1.m pellet compactado sin una película de soporte. Es importante tener en.cuenta que las películas de soporte pueden generar una a~enuación de. la señal, dependiendo del elemento de interés. Este efetto por lo regular se observa· con elementos más livíanos ·tales como sodio (Na), magnesio (Mg) yaluminio(AI). La otraVentaJa dave es que el pellet garantiza una superficie plana disponible para la ex.citación reproducible desde todos los ángulos. Además,. las muestras en pellet pueden medirse en condiciones de vacío y esto reduce cualquier absorción de fotones por parte del aire o de otros gases tales como helio (He). Alguhos materialestales como lactosa y celulosa son autoaglomerantes, por lo que no existen aspectos nocivos al moment() de preparar unpellet, excepto por el tiempo adicional invertido en la preparación de la muestra.·Es importante notar que los estándares y.lasrnµestras deben ser tratados de.la·misma forma en la preparacion . <:le la muestra y durante el análisis. Debido a que la mayoría de los materi.áles farmal'léuticostienen una matri.<;.orgánica, se. recomien<;la usar una cantidad de material correspondiente a un espes()r de aprox.Imadajnentel,5 cm. Esto se .puede usartanto paraJíquldo$cornoparamües. tras de polvo sueltas (siempre que todaslasmL;Jestrasyestándares . teqg<;inuna.compqsiciónde matri(;simU~r),Adein~s,<;llal· quier variación menor en el espesotdela muestrap!Jede C()mpensarse mediante torreccic:>qes de C:ompton;
s . .••·1.NSJ'RUMENTOS Todos· los espectrómetros incluyen una fuente (p.eJ•1 tubo de rayos X), algún tipo de mecanismo de fíltr:ación(je la fuente, una.· cámara· de müestra y un detectór.. •Adil;ironalmenté,Jos sistEih1ás.9elóngltüd de.óhda Qf$persiva ~iénehüñ . tonJtihtP:decl'>JI~ madptesy un crist
',
-,
Figura. 2. Diagrama •esquerpátic()de·•·unespectróm~tr()Espettrometría dEifluQres~encia ae Kavoi; J\:ae persiva y sus componentes principales.
5.1Jubode Rayos)(; Los·.dos componentes más importantes deün t1;,1bo.de rayos X son..el.fiJamento.{usado como .cátodo)yelánQd<;>. Ef .fil/ilmen· to es la.fuente de electtónes, los cuales se aceleMnháda el matel'ial c¡lél ánodo mediante·· un· campo eléctriéofüerte entré el filamento y.el ánoqo.AI impactar con el ánodo, loselettron.es pueden perder su energía cinética graquafmente, generando calor y un espectro cC)ntinuQ de.radiaciáncfo.ra}'os)<·.en gilproceso, .Como alternativi!l, .cuandoJos electronesJonizan átomós del ánQdo, las vacantes resultantes puedendetaer emitiendo radiación de rayos Xcaracterística,l~or lo tanto,. el espectro total de un tubo de rayos X consta de las líneas caraderísticas del elemento del ánodo (que es de carácter discreto} superpuesto a un espectro continuo .. Se debe tener enc1;,1enta qoe.lar(}qladóncQntinua, dispersada por la muestra; es la fuente principal del fondo observado en el análisis Espectrometría de Fluorescencia de Rayosx. 5 ..2.Filtro del HazPrimario
La mayoría de los espectrómetros de rayos X están equipados con uno o más filtros de haz programables. Estos filtros son láminas metálicas delgadas (por lo regular de entre 50 y 1000 micrones de espesor) que se montan en un dispositivo mecáni-
USP 39
Información General/ (1 735) Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X 2079
2080 (1 735) Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X / Información General
USP 39
USP 39
Información General/ (1735) Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X 2081
Por otra parte, las ventanas de polímero tienen pequeñísimos orificios, los cuales permiten la fuga gradual del gas de conteo. Dichos detectores tendrían únicamente una vida muy corta antes de que el gas de conteo se haya fugado por completo o se contamine tanto que volvería completamente inútil el detector. Para compensar las fugas, se usa un flujo constante de gas de conteo, cuyo exceso se ventila fuera de la cámara del espectrómetro; por lo tanto, dichos detectores reciben el nombre de contadores de flujo proporcional (o detectores de flujo de gas). Sólo una fracción de este flujo se fuga a la cámara del espectrómetro, mientras que el restante abandona el detector a través de un tubo y es ventilado hacia la atmósfera. Resulta esencia! para la estabilidad general del espectrómetro que la presión y la temperatura del gas se mantengan constantes. Por lo tanto, la mayoría de los instrumentos están equipados con un estabilizador de densidad de gas. Los contadores proporcionales de flujo de gas son los contadores preferidos para la detección de rayos X con longitudes de onda muy largas en espectrómetros de longitud de onda de dispersión. La eficiencia del conteo de los detectores rellenos de gas se determina mediante la absorción en la ventana de entrada y la eficiencia de captura (absorción de la radiación incidental) del gas de conteo para las longitudes de onda de interés. La eficiencia de captura depende de la longitud de paso disponible dentro del detector,de la composición del gas de conteo y de su presión. Las propiedades de absorción de la ventana determinan la eficiencia del detector a las longitudes de onda largas, mientras que las propiedades de absorción del gas determinan la eficiencia a las longitudes de onda más cortas. Teniendo en cuenta las dimensiones típicas, la naturaleza del gas y la presión, se puede calcular la absorción del gas como una función de la longitud de onda del fotón incidente. Cerca de las longitudes de onda 0,2-0,3 nm, aproximadamente la mitad de los fotones incidentes no son absorbidos, lo que refleja una baja eficiencia. Esta es la razón principal por la que los instrumentos para WDXRF secuencial están equipados con más de un detector. Contadores de centelleo: Los instrumentos para WDXRF por lo general están equipados con un contador de centelleo para la detección di'! longitudes de onda más cortas para las que el contador de gas proporcional es menos eficiente. La operación del contador de centelleo se basa en dos etapas distintas: un cristal de centelleo y un tubo fotomultiplicador (ver la Figuras). +HV
Cristal del Centelleadqr
Figura 5. Diagrama esquemático de un contador de centelleo. En la primera etapa, el fotón entrante es absorbido por un "cristal de centelleo". Un centelleador es un material que emite luz cuando es excitado por radiación ionizante, tal como los rayos X. Existen muchos materiales de centelleo diferentes con diversas propiedades relacionadas con la dureza a la radiación, el intervalo de temperatura de operación, los tiempos de decaimiento, las propiedades ópticas, entre otras. El material de centelleo de uso más común en los instrumentos para WDXRF es un cristal de yoduro de sodio (Nal) dopado con talio {TI). El cristal de centelleo se acopla ópticamente a un "fotomultiplicador", que consta de un fotocátodo y una serie de dinodos. En la segunda etapa, al ser impactado por un fotón, el fotocátodo produce electrones libres, los cuales posteriormente son acelerados hacia una serie de dinodos. En cada dinodo, el impacto de los electrones genera más electrones. Si se usan 1Odinodos, la amplificación total provista es aproximadamente de un factor de 106 • La eficiencia de conteo del contador de centelleo es determinada principalmente por el espesor del cristal de yoduro de sodio y talio [Nal(TI)]. La eficiencia de conteo para un cristal con un espesor de 3 mm es mejor que el 99% para longitudes de onda de 0,05 nm y más largas. Esto permite la detección de fotones de alta energía tales como Sn Ka con alta eficiencia. La producción de fotones de luz es mayor en el detector de centelleo que el número de pares de electrón-ión creados en un contador de flujo; esto debería llevar a una mejor resolución. Sin embargo, esta ventaja queda cancelada por la baja producción de fotoelectrones por el fotocátodo, donde se libera menos de 1 electrón por cada 1O fotones de luz incidental. En comparación con los contadores rellenos de gas, la resolución de un contador de centelleo es más deficiente. El uso de la técnica de WDXRF (por lo regular con potencias en el intervalo de kW) para el análisis de muestras de matrices orgánicas es limitado debido a que el calor generado por los. rayos X puede ser suficiente para inducir una alteración significativa de la muestra, tal como coloración marrón o el quemado de la superficie de la muestra. Además, incluso si la muestra se mide durante un periodo muy corto mediante WDXRF, el calor impartido a la superficie de ésta pude inducir la pérdida de elementos volátiles [p.ej., mercurio (Hg) y selenio (Se)]. Sin embargo, la técnica de WDXRF se ajusta perfectamente para medir materiales inorgánicos que pueden tolerar temperaturas elevadas. Los ejemplos de materiales inorgánicos comunes que son adecuados para medición por WDXRF incluyen carbonato de calcio (CaC0 3) y cloruro de sodio (NaCI).
2082 (1735) Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X / Información General
USP 39
USP 39
Información General/ (1 735) Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X 2083
2084 (1 735) Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X/ Información General
USP 39
Por lo regular, Jos instrumentos para TXRF emplean una fuente de rayos X que se dirige a la muestra en un ángulo muy pequeño con respecto a la superficie. El detector por lo regular se coloca por encima de la muestra en un ángulo de 90°. La técnica de TXRF generalmente emplea estándares internos (que se mezclan crin las muestras desconocidas) y relaciones geométricas para determinar las concentraciones elementales.
6. ANÁLISIS DE FLUORESCENCIA DE RAYOS X CUALITATIVOS Esta sección es aplicable a la WDXRF y la EDXRF.
6.1 Espectros de Rayos X El análisis cualitativo mediante fluorescencia de rayos X es relativamente simple debido a que los espectros de las líneas características de los elementos son simples y no se ven afectados por los enlaces químicos; es decir~ estos espectros son verdad(;.: ramente elementales. Para análisis cualitativos (y cuantitativos}, las líneas principales son aquellas derivadas de las series Ky L. Las líneas K resultan de las transiciones de electrones después de la expulsión de uno de los electrones. K. Debido a las reglas de selección de la mecánica cuántica1 no todas las transiciones son permitidas. Las transicionei>.de~de la capa L hacia la capa Kse limitan a transiciones que impliquen L2 y l3, debido a que se prohíben las transiciones radiativas entre la capa L1 y la capa K. Estas transi.cíones son las más probables y producen la línea más dominante en el espectro. Para la mayoría de los elementos, la diferencia de energía entre la capa L2 y la capa L3 es en realkfad peqve.ña (en el orden de unos euantQS.e\f), p()F lo quejas líneas emitidas por lo regular no están separadas y simplemente se consideran .un doblete. Tarribi~n ocurren transicion.es radiativas desde las capas M y N hacia la capa K, las cuales dan lugar a una parte más compleja del espectro K. No obstante; en Ía práctica, sólo es importante el doblete K/J 1, 3 (que resulta de las transiciones entre M3 y K y M2 y K) . .La intensidad relativa entre Ka y KfJ varía de 1 en 1000 para sodio (Na) hasta 1 en 6 para plutonio (Pu), con Ka siendo siempre la línea más íntensa de la serie. La línea K« es generada por una transición de electrones a partir de un electrón en la capa L?1 despvés de la eliminación de un electrón de la capa K. La línea Ka. es la línea más dominante en la serie de un elemento. Sin embargo, los electrqnes Kde un elemento tienen la energía de enlace más alta de todos los electrones en el áoorno y, por ende,. sólo se excitan medianff:l fotones incidentes de alta energía. Esto por lo general no es. un problema para los elementos c.on. números atómico~ baj9s y medios, pero la excitación de las líneas K de elementos con números atómicos por encima de 50, por ejemplo, puede no ser posible, puesto que el potencial de excitación es más alto que el voltaje operativo máximo en la mayoría de lqs tubos de rayos
X. Mientras qµe los espectros de la.línea Kpor lo regular se limitan a: dos líne.as únicamente, la situación para.los espectros de la serie Les más complicada. En el caso de plomo (Pb), se listan un.total de 46.líneas Len 6earden[:.?], miJchas de las cuales son débiles o son dobletes. Para análisis cualitativos, no s.e deben considerar todas e~as líneas. Para todos los casos, es importante tener en cuenta que si K/3 es visible, entonces Ka debe ser visible también y debe tener una intensidad mayor.
6.2 Análisis Cualitativo El análisis cualitativo por lo general consiste en pocos pasos simplei>. 0espués de haber recopilado tos espectros, se .debe restar el fondo. Esta sustracción de fondo puede realii¡;¡rse en un paso separado, o se puede reali.?:ar en conjunto con un álgoritmo de búsqueda de picos. Una fracción de estos fotones se propaga en la direcciqndel cristah:le análisis (WDXRf) o directa~ mente hada el detector .(EDXRF). A continuación, se 11eva a cabo una búsqueda de picos y; fínalment~, estos pico~ son ldentifi: cadas, es decir, se atribuye cada uno a un. elemento piirticular. Los algoritmos efieientes p¡¡ra análisis cu:alitiitivo .bus~an la pre~ senda de cada elemento en lugar de intentar identificar cada pieo. Esto es distinto a la difracdón ·de rayoi> X, <;tonde .se verifica la correspondencia de cada pico con una fase; En este método, se fe!lliza primero Ja. búsqueda de pi<;os~ Pes¡::més, pa¡-a c¡¡ida elemento, se verifica la presencia del doblete· Ka1, 2• Si se ,encuentra esta línea en el espec~ro,. entonces se iov.estigan la.s fíne¡¡is más débiles de. la misma serie (K/J 1, 3 y K/J 2), Se debe tener en cuenta que deben aparecer todas las líneas. cara<;terístl.cas en.la misma serie, excepto para casos en los que la intensídad de una línea más débil. sea similar a la .intensidad del l(:)nd(k Para elementos con números atómicos más altos en los que las líneas K no están excit!ldas (o no se detec.tan debido a limitaciones en el hardware de detección) el proceso inicia con los espectros de la linea L. las relaciones de intensida(;$ de, .por ejempl.o, .Ka a KfJ se listan en diversas bases .de datos (8,$1}. Las relaciones tabuladas son para el átomo ''aislado''; éstas ref:lej9h lasintfilnsi~ dades según se obtienen a partir de un átomo sin ningún efecto matriz. Estas relaciones. pueden corregirse f~ttiimente. para efectos de matriz, incluso en el caso de IJneas superpuestas. Ror lo regular únicamente los elementos q1:1e están presentes.a niveles de trazas (con intensidades comparables a le<;orisideran"no.presen· tes". Se debe tener en cuenta que, en principio,· la interferencia de línea entre elementos no representa un problem9 ma1or en el análisis cualitativo; esto se debe al hecho de que en los análisis cualitativos, se encuentran disponibles muchos más puntos de datos que abarcan líneas alternativas. Pot consiguiente, el impacto sobre el establecimien.to de, Ja ptesencia de elementos no es tan grande como podría sospecharse. Asimismo, en la espectrometría de energía de dispersión, en la que la superposición de líneas ei> más severa, se pueden realizar correcciones adecuadas debido a que la forma del pko se conoce bastante bien. 1
USP 39
Información General/ (1 735) Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X 2085
7. ANÁLISIS DE FLUORESCENCIA DE RAYOS X CUANTITATIVO 7.1 Selección de la Línea Analítica Los espectros de emisión característicos de la mayoría de los elementos contienen diversas líneas. La selección de la línea analítica para un elemento dado depende en gran medida de tres factores: la concentración del elemento en la muestra, las líneas potencialmente interferentes y las capacidades de excitación del espectrómetro. E.n la mayoría de los casos, se prefiere la línea de emisión Ka del elemento. Cuando no es posible la excitación de las líneas K debido a las limitaciones del tubo y/o del generador, se vuelve necesario el uso de líneas L con su baja energía. El uso de la línea La (cuando la línea Ka no se excita) no implica un gran detrimento debido a que para dichos elementos, la intensidad de las líneas Les bastante alta. Además, la eficiencia de detección de los fotones de la línea L es entonces mucho más alta que la de las líneas K de alta energía del mismo elemento. Para elementos con números atómicos altos (es decir, Z es mayor que aproximadamente 72), L/J ofrece una muy buena alternativa a La y estas líneas tienen sensibilidades comparables. En general, en un instrumento para WDXRF típico, se miden todos los elementos con números atómicos de hasta 56 en su línea Ka. Para elementos con números atómicos mayores, se usa la línea La. Para espectrómetros EDXRF equipados con generadores (y tubos) que emplean SDD con un voltaje máximo de al menos 30 kV, se encuentran disponibles líneas K para medir elementos con valores aproximados de.hasta.Z 47; los espectros de la línea L se usan para todos los elementos con núrneros atómicos más altos. El punto exacto en el que ocurre el cambio entre los espectros de la línea K y la línea L depende de facto~ res tales como la aplicación y el material del ánodo del tubo de rayos X usado. Los procedimientos de cuantificación se llevan a cabo usando técnicas espectroscópicas de rutina que implican la medición de blancos y estándares con concentraciones elementales diversas. Posteriormente, se corrige el fondo y la superposición de líneas en las intensidades medidas, de ser necesario. En diversos casos, se puede e.stablecer una relación líneal directa entre la intensidad del analito y su concentración. Este es especialmente el caso con concentraciones bajas en una matriz constante. Sin embargo, en un caso más general, son necesarias lt}s correcciones para los efectos de matriz. Los efectos de matriz no son el factor limitante en la precisión del análisis final, pero deben tenerse en cuenta para obtener una medición exacta.
=
7.2 Técnicas de Corrección de Matriz 7 .2.1 ORIGEN DE LOS EFECTOS DE MATRIZ
La Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X por lo general se aplica a muestras condensadas, sin recurrir a la disolución de la muestra en una cantidad abundante de ácidos u otros disolventes. Por ende, las muestras se mantienen concentradas, al contrario de muchas otras técnicas. Debido a esto, la técnica de Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X es propensa a efectos de matriz, en la que la relación entre la intensidad de un analito particular y su concentración no es generalmente tan simple y sencilla como con las muestras diluidas. Con éstas últimas, esta relación entre concentración e intensidad a menudo se expresa como una línea recta. Sin embargo, la presencia de otros elementos en altas concentraciones puede ocasionar desviaciones de esta relación lineal. La física de la emisión y la detección de rayos X es bien comprendida y relativamente simple para materiales a granel, lo cual provee fundamentos teóricos sólidos para una descripción matemática de los efectos de matriz. Por consiguiente, se pueden describir correctamente y con exactitud los efectos de la matriz usando una variedad de técnicas matemáticas, y se han desarrollado diversos métodos para abordarlos. Se pueden distinguir dos efectos de matriz principales los cuales se tratan a continuación-absorción e incremento de señal. Absorción: La absorción como un efecto de matriz ocurre cuando los elementos de la matriz y el elemento del analito tienen propiedades de absorción diferentes para la radiación característica del analito. Si el coeficiente de atenuación másico de uno o más de los elementos de la matriz es mayor que el coeficiente de atenuación másico del analito, la matriz absorberá más radiación del analito que la esperada y la intensidad medida del analito será menor. Esto resulta en una curva de calibración cóncava. Si, por otra parte, la absorción de los elementos de la matriz es menor, se medirá una mayor intensidad del analito y se observará una curva de calibración convexa. La absorción como un efecto de la matriz puede ser grande, reduciendo la intensidad tanto como un 100% (y más) o "aumentándola'' tanto como en un 10%, dependiendo del analito y los elementos de la matriz. La magnitud del efecto de absorción depende de la longitud de onda de la línea analítica considerada y de la composición de la muestra. En una muestra dada1 el efecto de absorción puede ser significativo para Ja línea característica de un analíto y más bien insignificante para otro. El efecto de absorción también puede diferir significativamente para el mismo analito cuando se mide en dos líneas características diferentes. Los tres procesos que ocasionan la absorción son el efecto fotoeléctrico, la dispersión coherente y fa dispersión incoherente. En términos generales, los fotones con una energía dada serán absorbidos en mayor medida al aumentar el número atómico del elemento absorbente. Asimismo, ta absorción por parte de un elemento dado se reduce de manera estable y uniforme cuando la energía del fotón se incrementa. Sin embargo, cuando la energía de los fotones excede la energía de unión de los electrones en una capa interna, el efecto fotoeléctrico (ver 3.1 Ionización y el Efecto Fotoeléctrico) ocasiona un incremento en la absorción. Esto lleva a discontinuidades en la curva de absorción a energías que corresponden a la energía de enlace de los niveles de electrones. Estas discontinuidades se denominan bordes de absorción; la energía en la que ocurre el borde de absorción es igual a la energía de enlace de la capa de electrón de interés.
2086 (1 735) Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X / Información General
USP 39
El incremento de señal como efecto matriz es el proceso mediante el cual la radiación característica de los elementos de la matriz es absorbida por los átomos del analito, ocasionando en consecuencia radiación característica del analito. De esta manera, se incrementa la intensidad del analito, lo que lleva a curvas de calibración cóncavas. Para un analito dado, todas las líneas características de la misma serie se incrementan al mismo grado. Esto se debe a que Ja causa de origen del incremento es la absorción fotoeléctrica de radiación de los elementos de la matriz. El efecto de increlT}ento por lo regular es más pequeño que el de Ja absorción, siendo IT}ás pronunciado en aleaciones de los elementos. de transición de fa primera fila, donde puede alcanzar 25%. En muchas otras aplicaciones, el efecto de incremento es más pequeño, pero co11la impor~ tancia suficiente para tenerlo en cuenta y corregirlo. Incremento de señal:
7.2.2 MÉTODOS DE PARÁMETROS FUNDAMENTALES Los procesos físicos implicados en la absorción yla excitación e.n la fluorescencia de rayos X son bien conoeidosy fáciles de modelar matemáticamente. Todas las entidades requeridas se listan en diversas tablas y bases de datos. Anteriormente, los cálculos eran tediosos y llevaban mucho tiempo, pero con los recursos informáticos de .la actualidad, los cálculos yá. no represen~ tan un obstáculo. Los métodos de parámetros fundamentales se basan en los procesos físicos subyacentes que rigenJafluorés" cencia del-ayos X, incluyendo aspectos específicos de la geometría del instrumento, el material del ánodo deltubodé ráyos X, el voltaje del tubo y la composición de la muestra. La derivación de las ecuaciones está más all.á del alcance de este capítulo, pero se trata en la obra de Criss y Birks •[ 1O] y de Shiraiwa y Fujino{7 1J.
7.2.3 CORRECCIÓN COMPTON El uso deradiadóndispersáColT}pton corno un medio para corregir efectos de.Jamatriz (así como paf'a variaciones en la preparación de la muestra) ha sido descrito por Reynolds f 12], así corno por Taylor y Anderrnarm [13}; Lá correcdón Comptoh se basa en el hecho de que la intensidad de la dispersión incoherente (o Cotnpton) está inversamente relacionada .cofre' coefi· ciente de atenuación másico de·la muestra. En la práctica, se usa una línea de alta energía taracterísticadel ánodo del tobo. Medir la intensidad de la línea dispersJi Compton del tubo revela entonces información sobre tas propiedades de absorción a la longitud de onda de la línea dispersa Compton. A primera vista, esto parece tener un uso limitado, pero en el campo delos rayos X, los valores de los coeficientes de atenuaeión de la masa para la misma muestra a diferentes energías/longitudes de onda son proporcionales. Esta relación, y el hecho de que la absorción ésla mayor fuente de efectos de matriz, explica por qué la eorrección Compton es un poderoso metodo de correceión en una variedad de matrices. Sin embargo,. no es aplicable en forma general, y se presentarán casos en los que existan .bordes de absórción sig:nificatívo~ entre las longitudes de onda de la radiación dispersa Cornpton a la longitud de ondá de la línea analífü:a usada'. la corrección se basa en la relación entre la dispersiónCompton y las propiedades de absoreión de la muestra, y no corrige elincremento de señal. 7 .2,4 ALGORITMOS ()E COEFICIENTES DE INFLUENCIA
los métodos de correceión de matriz basados en coeficientes de influ.encia tienen el siguiente formato general: C1 =K,11 f1+¿·". a;C¡J.
[18]
J~l
/''
(conbase en lachancey Traíll [ 74])donde Cí y e¡ son las concentraciones del analito iy del elemento interferente j, resp~diva· mente, y. aq es el coeficiente de influeneia, expresando la i.nfluenda del elem.ento interferente }sobre el analito i,)"odé!$ l~s concentraeiones se expresan como fracciones de peso. La sumatoria de la Ecuación [18] tienen - l términos; para ur1a muestta que constá de n elementos o compuestos; esto es una característica simple, aunque esencial del algoritmo. El mismo conjunto de ecuaciones con n términos en la sumatoria· conllevaría a un conjunto homogé11eo de ecuadones simultáneas, a partir de lás cuales únicamente se. podrían derivar coci<:mtes en lugar de valores absolµtos. Debido a que la suma de las concentraeiones de todos 1.ós ·elementOs (independientemente de si se miden o nb) en una muestra siempre da como total 1, se puede elirni11ar un elemento. La mayoría de los algoritmos dé coeficiente de influencia en software se basan en esta ecuación, aunque pueden diferir en la forma en que se calculan los va(ores ~e los coeficüjntes.
7.2.5 COEFICIENTES DE INFLUENCIA EMPÍRICOS Lachance y Traill {14] indican que el valor de los coeficientes debe calcularse teóricamente, aunque sólo p~ov~n un método simple y limitado que falla en considerar la i rlterlsificación de señal o. ía naturaleza policromática defhaz inddénte. Portanto, en rnüchos casos, los cbeficiehtéfueton determinados usando múltiples métodos de regresión. Muthasde las primeras\(ersiones de los algoritmos de los t:oefieientes de influencia se basaban en técnicas de regresión que eran.usad<1s para calcular el valor de Jos coeficientes. Sin embargo, se desaconseja el uso de métodos de regresión puesto que a menudo llevatra aproximaciones muy optimistas de la precisión y con frecuencia fallan durante la validación. Esto es especialmente problemático si
Información General/ (1735) Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X 2087
USP 39
no se usan ·suficientes materiales de referencia certificados en la calibración. El número mínimo de estándares usado debe ser al menos 3 veces el número de parámetros. Cada 1Jno de los coeficientes de influencia wyo valor se determine mediante regresión consume un grado de libertad, al igual q1Je la determinación de pendiente e intersección. El número total de parámetros q1Je se van a determinar puede crecer rápidamente para 1Jn solo analito. Por ejemplo, supóngase que existen tres elementos interferentes y, por consiguiente, con la pendiente y la intersección, es necesario determinar un total de cinco parámetros. Esto requiere un mínimo de 15 muestras estándar independientes y no correlacionadas. Hay q1Je teneten cuenta que las determinaciones repetidas de la misma muestra estándar no cuentan como muestras individuales, sino que. cuentan como una sola; esto. es una fuente de error común. Asimismo, se debe tener cuidado de asegurar que los estánc dares no están correlacionados. Esto implica que no es posible usar una serie de diludones derivadas de un estándar dado cuando se van a determinar coeficientes de influencia empíricos. En una serie de diluciones, dos (o más) componentes A y B se incrementan (o se reducen) en la misma dirección. Por ende, no es posible distinguir el efecto del componente A sobre la intensidaddel analito de los efectos del componente B, lo que lleva a valores erróneos para los coeficientes de influencia. 7. .2,6 COEFICIENTES DE INFLUENCIA CALCÜLADOS TEÓRICAMENTE De Jc>ngh [75] fue el primero en publícar un método que detalla el cálculo de los coeficientes de influencia, usando la teoría sól(> para eliminar un compuesto distinto alanalito. El algoritmo continúa siendo de uso común en la actualidad. El compuesto eliminado puede serla matriz no fluorescente, tal corno celulosa, o ta matriz cuando su concentración no está certificada. Hay qué tener C:Uenta que el intervalo de concentración· so~re .el cual el algoritmo da. resultados prt:!dsós es más bienlifl:litai::Jo cuando los .efe<.:tos de. matriz . son severos. Estó es una consecuencia directa del hedió de que lós valores del coeficiente de lnfluenc;ia se calculan· para üna composición. particular de la .muestra; En• el caso de análisis de rutina que implican· intervalos de concentración rela~ivamente limitados, el algoritmo provee resultados excelentes. Al contrario de la situación en la que los valores de los coeficientes de influencia se determinan por regresión (ver 7.2.S Coeficientes de ..fnf/uencia tmpíricos ), en este caso es factible calibrar usando series. de diluciones.
en
7.3 De.sárroUo del Método de Medición y Calibración 7.3.1 ASPECTOS GENERALES Una vez que los elementos de interés han sido identificados, se deben configurar apropiadamente los parámetros de medición del espectrómetro. Esto implica determinar las condiciones de medición "ideales" para cada elemento. La lista de parámetros a seleccionar para cada analito puede incluir, pór ejemplo, el voltaje y la corriente del tubo de rayos X, el cristal y el colimador (WDXRF),el tipo de filtro de haz primario (si se usa), entre otros parámetros. Para elementos con números atómicos similares, las configuraciones serán bastante similares. La precisión de las mediciones de Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X está teóricamente limitada por el error estadístico de conteo. Se ha demostrado que el error estadístico de conteo de una medición de N conteos (fotones) está dado por la raíz cuadrada de N. Se considera una práctica generalmente aceptada determinar los tiempos de medición que obtienen un error estadístico de conteo aceptable para cada elemento de interés. tos errores de preparación de la muestra y el error estadístico de conteo son los mayores contribuyentes a la precisión analítica total. Una vez que se ha establecido el tiempo de medición, resulta importante asegurar que las posiciones de fondo y los métodos para el ajuste de picos también son apropiados. Después de que se han obtenido las intensidades netas de los elementos de interés a partir de un número adecuado de estándares de referencia, se puede realizar una calibración. Para concentraciones bajas de analitos en una matriz constante, puede ser apropiada la regresión lineal. Al evaluar muestras con concentraciones más altas de analitos, la calibración también implica la corrección de efectos de matriz, El hecho de que la técnica de EDXRF no sea capaz de medir los constituyentes orgánicos de una composición farmacéutica real es de poca importancia. Esto efectivamente es cierto si la composición de la matriz es constante y si el contenido total de elementos medibles es bajo. Sin embargo, si no se satisfacen estas dos condiciones, la diferencia ~n las propiedades de dispersión puede resultar en errores de cálculo si no es corregida. Por fortuna, existen numerosas estrategias que tienen en cuenta estas diferencias, tales como el método de parámetros fundamentales o el método de corrección Cornpton. La naturaleza de los efectos de la matriz, así como los métodos para corregirlos, han sido tratados con anterioridad. La aplicación de dichos métodos a la calibración y el análisis de elementos desconocidos se tratará en las secciones siguientes. 7.3.2 CALIBRACIÓN MEDIANTE ALGORITMOS DE COEFICIENTES DE INFLUENCIA
La calibración mediante coeficientes de influencia es bastante sencilla. Una vez que se han calculado los valores de los coeficientes para cada una de las muestras estándar, se puede calcular la sumatoria
M;;ll+t,a;¡C¡l we
J
[19]
2088 (1735) Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X / Información General
USP 39
USP 39
Información General/ (1 735) Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X 2089
2090 (1735) Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X/ Información General
USP 39
7.4.4 CÁLCULOS E INFORME En caso de que se use el método de muestreo de pellets por compresión libre (es decir, compactado sin aglomerante), los resultados del espectrómetro representan concentraciones de muestra finales y no se requieren. cálculos adicionales. De manera similar, ambos polvos sueltos (es decir, materiales puros y finos) y líquidos sin diluir medidos en recipientes desechables para muestras no requieren cálculos adicionales y los resultados del espectrómetro representan concentraciones finales delas muestras. Cualquier material .que haya sido diluido, tal como un• líquido o pellet compactado, requerirá. cálculos adicionales. la mayoría de los instrurnentos Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X modernús vienen con paquetes de software que incluye funciones de cálcwlos que acomodan factores de dilución y retrocalculan automáticamente las concentraciones de laf muestras. Para muestras de pellets compactadas diluidas, las unidades informadas pueden ser en % en peso 9 pprn. Las unidades para las concentraciones son de poca importancia, siempre que se haya tenido. cuidado de trabajar con· 1os factores. de conversión apropiados. Si se configura una calibración para muestras líquidas para generar resultados en µg/mL, se puede calcular la cqncentración final de un elemento dado eh µg/g a partir de la concentración elemental
8. FUENTES ADICIONALES DE INFORMACIÓN 1... ,.Be •..c. k·h. Springer ff ª.'· . K.ª.•.n. ngieBe. B· · . '. L.ª. n·Q.•h·.· º. ff....· . N.•.·. w. . .ede·n····H···. . ·. olff ·H.·., editor.s. . . · ·.· E·. n: Hand.boo.•k of. .p.ra···. c. ···.t•..•i.·tal. . x. •.·.-.r. ª· •y· .·.· .· .·f·•·J·.··u.·º. .·.r· .e.•.st·e··.··. ·.•n·· ·.·c· ·.·e· ·.·•·.·.·ª.·..n··.· ª.· .·.·.1·y· •..·s•·.•i.•s.•.·.•.· Berlín:. Verlag;r.·2006. p. . 1,.,.878. .•.... '.·. . .w 2. Buhrke VE, Jenkins. R, Smith DK, edítors. A prac;ticalgµide for the preparation of specimensfor X•ray fluorescence and. x~ . ray diffraction analysis. New York: John Wiley&Sons;. l 998. . . . . . · 3.. Greiner W. Quantum mechanic.s.: An introduction. 1st ed. Berlin: Springer Verlag; 1994. 4; IUPAC. Compendium of chemical terminology (the "Gold Book"). 2nd ed. McNaught AD, Wilkinson A, compilers. Oxford: Blackwell Scientífíc Publications; 199 7. [Nic M, Jirat J, Kosat.a B. Versión KML disponible en línea: http://goldbook.iupac.org. Jenkins A, updated cor:npilation; 2006.] 5. IUPAC Nomendature, symbols,. µnits .and their usage ln spectrochemical analysis-Vlll. Nomenclature sy~tern for X~ray spec;troscopy.(Recommendations 1991 ). 6. fenkins R, tvlanl'le R, Robin R, Sénémaund (. Nomenclature, symbóls, units and their U:sage jn spectrochel11kal analysis. VIII. Nomenclature system for X-ray spectroscopy. Pure Appl Chem. 1991 ;63:735-746. 7. Jenki ns R, Man ne R, Robín R,. Sénér:naund C Nomend~ture, S)".mbols, units and their usage in spectrochemical analysis. VIII. Nomendature system for Xcray spectroscopy. X-Ray Spectrom.1991;20:149-155. 8. Klockenkamper R. Total-reflection X-ray floorescence analysis. New York: John Wiley &. Sons; 1996. 9. van Grieken R, Markowicz A, editors. En: Handbook ofX-ray spectrometry. Second edition: revised and opdated. Ne\iv York: Marce! Dekker; 1968. 10.Vtebos B. x~ray fluorescence arialysis. En: CuJlen M, editor. Atornk spectroscopy in elemental analysis. Boca Raton,fl: Blackwell Publishing Ltd.; 2003. 11. Willis JP, Duncéln AR. Understanding XRF spectrometry. 2nd ed. Vol 1. Almelo: PANalytical B.V.; 2013. º.··
9. REFERENCIAS 1. Veigele WJ. En: Robinson JW, editor. Handbook ofspectróscopy. Cleveland OH: CRC Press, 1974.p. 28. 2. Bearden JA. X•ray wavelengths. Rev Mod Phys.1967;39;78-124. 3. Willis /P, Duncan AR. Understandirtg XRFspectrometry. Vol l, Almelo: PANalytital B.V,; 2008. 4. GreinerW. Quantum mechanics:an introduction. 4thed. Berlin:SpringerVerlag; 200L 5. BambynekW1 Crasemann B, FinkRW, .Freund JiiU, MarkH,·SwiftCD, PriceRE, Venugopala Rao P.ReVModJNws. 1972;44:716-:813. 6. Hubbell JH, TrehanPN,Singh N, Chand B1 MehtaD1 Garg ML, Garg RR, Singh S, Purí S. Areview, bibliography, ándtábu· lation ofK, l, and higher atomic shell x-ray fluorescence yields. J Phys Chem Ref Oata.1994;23(2):339-364. 7. Wolska J, Vrebos B, BroU:wer P. Analysis óf fuels, lubricants, •and greases using X-ray fluorescente spectl'ometry.fASTMlnt. 2006;3{1):98~107.
8. Venogopala Rao P, Chen MH, traseman B. Atornicvacancydistribútions prodUced by inner•shell i.onization, PhysRevA 1972;5:997. 9. Elam WT, Ravel BD, Sieber JR. A new atomic database for X-ray spectroscopic calculations. Rad Phys Chem. ~002;63: 121 ... 128. 1O. Criss JW, Birks LS. Calculation methods for fluorescent X-ray spectrornetry empirical coefficients vs. fundamental parameters. Anal Chem. 1968¡40: 1080-1086. ll.ShiraiwaT, Fujino N. AdvX•RayAnal.J968;ll:63-94. . . . . . . . ·.• .•· .·· . . . . . • >. <> 12. Reynolds RC Jr. Matrix correctíons in tr(lce element analysis by XcrayJluorescence: estimation of themassabsorptloncoefficient by Compton scattering. Am Mineral. 1963;48:1133-1143. . 13. Taylor DL, Andermann G. Evaluation of an isolated-atom model for interna! standardization in X-ray fluorescence analysis. Anal Chern. 1971;43:712-716. 14. Lachance GR, Traíll RJ. A practica! solution to the matrix problem in X-ray analysis. Can JSpectrosc. 1966;11:43.c.48.
USP 39
Información General/ (1 736) Aplicaciones de la Espectrometría 2091
(1736) APLICACIONES DE LA ESPECTROMETRÍA DE MASAS l. INTRODUCCIÓN La Espectrometría de Masas (MS, por sus siglas en inglés) es una parte integral de la investigación y el desarrollo farmacéutico moderno en los laboratorios académicos, industriales y clínicos. La medición analítica de trazas (tanto cualitativa como cuantitativa), específicamente los análisis de mezclas de trazas han incrementado la necesidad de esta poderosa herramienta. En muchos casos, los requerimientos de los análisis de mezclas de trazas han hecho de la MS el método preferido para valoraciones cualitativas y cuantitativas de blancos analíticos tales como proteínas, péptidos, fármacos, metabolitos, impurezas y productos de degradación. Debido a sus capacidades analíticas, la MS se ha aplicado de manera extensa en la industria farmacéutica. Específicamente dentro del contexto farmacopeico, la MS ha sido aplicada o tiene el potencial de ser aplicada tanto a mediciones cualitativas (pruebas de identificación) como cuantitativas (valoraciones). Para pruebas cualitativas, los métodos basados en MS pueden proveer información mediante la detección del ión o iones moleculares relacionados con la masa molecular del analito como primer nivel o paso de la identificación. Los diversos métodos instrumentales de la MS permiten realizar determinaciones de masa molecular para una amplia variedad de sustancias, incluyendo biomoléculas de alto peso molecular (p.ej., proteínas) y polímeros. Junto con la información de masa molecular, la MS también puede proveer información estructural única mediante la generación de fragmentos iónicos. Las diferentes formas de fragmentación disponibles en la MS moderna permiten obtener fragmentos iónicos estructuralmente relevantes para una amplia gama de sustancias importantes en el entorno farmacopeico (p.ej., moléculas pequeñas y péptidos). De esta forma, la medida de la masa molecular por MS puede utilizarse para la confirmación de una estructura, o incluso para la identificación de un compuesto esperado, especialmente si se utiliza con estandares analíticos o acoplada a un método cromatográfico. Los estudios avanzados que implican una o más dimensiones de análisis de masas se pueden usar también para obtener detalles estructurales específicos (fragmentos iónicos que corresponden a partes estructuralmente únicas de la molécula esperada), o para lograr mayor selectividad en aproximaciones cuantitativas. Asimismo, los métodos de MS de alta resolución acoplados a separaciones cromatográficas pueden ser muy útiles en determinaciones de rutina. La MS analítica moderna incluye una amplia variedad de instrumentos y de enfoques experimentales. El espectrómetro de masas específico y, por supuesto, los procesos químicos específicos (es decir, la preparación de la muestra, la cromatografía y la ionización) definen el procedimiento analítico final.
2. ESPECTRÓMETROS DE MASAS Las siguientes secciones describen los principios de la MS, incluyendo el diseño instrumental general para la MS moderna usado en la industria farmacéutica y sus componentes específicos (introducción de la muestra, ionización y analizador de masas). Esta sección también incluye una breve descripción de los modos operativos de un espectrómetro de masas, enfocándose en la producción y análisis de patrones de fragmentación.
2.1 Generalidades Las mediciones analíticas que emplean MS por lo general implican los siguientes procesos: preparación de la muestra, cromatografía o introducción de la muestra, ionización y análisis y detección de masas. La información obtenida en el espectrómetro de masas sobre los iones formados en la fuente de ionización se representa en un espectro de masas, que se visualiza mediante un gráfico de la relación masa/carga (miz) en función de la intensidad. Los iones se separan mediante sus diferencias en la relación miz, donde m es la masa del ión y z es el número de cargas en el ión. El método por el cual se separan los iones es lo que define el tipo de espectrómetro de masas. Independientemente del tipo, el analizador de masas separa los iones de acuerdo a la relación miz. El analizador de masas adquiere continuamente datos en un intervalo definido de miz para generar los espectros de masas resultantes.
2.2 Diseño General La Figura 1 presenta un diseño general de la plataforma de un espectrómetro de masas para análisis farmacéutico. Las muestras se preparan según un procedimiento específico definido para esa matriz y analito. La muestra preparada se inyecta posteriormente en el espectrómetro de masas mediante inyección directa o mediante un sistema cromatográfico tal como cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC, por sus siglas en inglés) o cromatografía de gases (GC, por sus siglas en inglés) o
USP 39
2092 (1736) Aplicaciones de la Espectrometría / Información General
mediante inyección directa. En la introducción, los analitos son ionizados para el análisis de MS subsiguiente. Todos los espectrómetros de masas requieren de cuatro componentes: 1. Una técnica de introducción de la muestra 2. Una fuente de ionización para ionizar el analito 3. Un analizador de masas para separar los analitos en una escala de masa/carga (miz) 4. Un detector para medir los iones
Separación
Detección
Análisis Espectrométrico de Masas
j_Al___A_ HPLC
Espectrómetro de Masas en Tándem
uv
Figura 1. Sistema General de MS. HPLC = cromatografía de líquidos de alta resolución; UV =detector ultravioleta. (Cortesía de Milestone Development Services, Newtown, PA) La MS se puede categorizar por las dimensiones de análisis de masas: espectrómetros de masas de una sola etapa, espectrómetros de masas híbridos o en tándem (MS/MS) y espectrómetros de masas de etapas múltiples (MS"). Esta sección describe estas configuraciones de espectrómetros de masas. 2.2.1 ESPECTRÓMETRO DE MASAS DE UNA SOLA ETAPA Un espectrómetro de masas de una sola etapa provee una dimensión de análisis de masas. Conforme se muestra en el esquema de la Figura 2, se puede considerar que un espectrómetro de masas de una sola etapa detecta los iones generados únicamente en la fuente de ionización. Por ejemplo, si se inyecta una mezcla de 1 O componentes en el cromatógrafo y cada componente se separa con resolución adecuada, entonces el espectrómetro de masas proveería una medición discreta de la relación masa/carga de cada uno de los 1 O componentes. Se genera un espectro de masas para cada componente que será subsecuentemente interpretado para asignar las masas moleculares correspondientes.
"O
cu ."O ¡¡;
e
.....e()) i miz Figura 2. Barrido de MS unidimensional. Ql = espectrómetro de masas de una sola etapa o una sola etapa de análisis. (Cortesía de Milestone Development Services, Newtown, PA) 2.2.2 ESPECTROMETRÍA DE MASAS EN TÁNDEM (MS/MS) Un sistema capaz de realizar dos etapas de análisis de miz secuencialmente (es decir, un espectrómetro de masas en tándem) provee una mayor selectividad para la elucidación estructural de moléculas, o para análisis cuantitativo.
USP 39
Información General/ (1736) Aplicaciones de la Espectrometría 2093
2.2.3 ETAPAS MÚLTIPLES (MSn) Una característica única de algunos formatos de MS es la capacidad de realizar múltiples etapas de MS generando información sobre los fragmentos iónicos. Estos espectrómetros de masas son capaces de aislar un ión de interés, de inducir su fragmentación, luego aislar un ión producto específico, y repetir este proceso con el ión producto seleccionado.
2.3 Introducción de la Muestra Se pueden usar diversos métodos para introducir la muestra en el espectrómetro de masas. Esta sección describe los procedimientos directos, por infusión a través de métodos cromatográficos. 2.3.1 INTRODUCCIÓN DIRECTA Para algunos tipos de muestras y aplicaciones, se usa una sonda de inserción directa para introducir la muestra en el espectrómetro de masas. La muestra, que es generalmente un compuesto puro o relativamente puro, se disuelve en un disolvente apropiado. Se deposita una pequeña cantidad de la muestra (por lo general 1 µL o menos) en la sonda. Generalmente, la sonda consta de un filamento metálico, por ejemplo de platino, localizado en la punta. El filamento metálico se calienta y la muestra se desorbe en la fuente de iones del espectrómetro de masas. Posteriormente, la sonda se retira del espectrómetro de masas y se prepara para la siguiente muestra. 2.3.2 INTRODUCCIÓN POR INFUSIÓN La introducción de la muestra por infusión se realiza típicamente cuando se requiere un tiempo de análisis relativamente extenso o para realizar una evaluación rápida de una muestra. La introducción por infusión se utiliza para optimizar las condiciones instrumentales (los parámetros operativos de la fuente y del espectrómetro de masas), así como para acumular un mayor número de espectros de un analito dado. Este método de introducción de la muestra puede requerir más muestra que con otros métodos de inyección. Sin embargo, la introducción por infusión de la muestra se usa ampliamente para aplicaciones de ionización por nanoatomización (nanospray) para el análisis de proteínas y péptidos, así como en aplicaciones especializadas de nanoatomización con moléculas pequeñas en el estudio del metabolismo de fármacos para determinar la estructura o los cocientes de respuesta equimolares. 2.3.3 INTRODUCCIÓN CROMATOGRÁFICA El uso de métodos cromatográficos para la introducción de la muestra en el espectrómetro de masas es quizás la práctica más común. 2.3.3.1 Cromatografía de gases: Los procedimientos de cromatografía de gases (GC) son los preferidos para analitos volátiles no polares (ver Cromatografía (621 ). Las muestras contenidas en disolventes se inyectan en el inyector del cromatógrafo de gases. La muestra se volatiliza y un gas inerte no reactivo, tal como helio, transporta la muestra a través de la columna para GC, la cual está contenida en un horno con temperatura controlada. La combinación del gas transportador y del calor mueve el analito a través de la columna. Las columnas capilares para GC son de uso común en las aplicaciones farmacéuticas. Las moléculas se separan en la columna capilar y se introducen directamente en la fuente de iones del espectrómetro de masas. 2.3.3.2 Cromatografía de líquidos de alta resolución: Una aproximación muy utilizada para la introducción de la muestra en el espectrómetro de masas es la cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) (ver el capítulo (621 )). Los procedimientos de HPLC se prefieren para analitos no volátiles y termolábiles, pero son adecuados para su uso con cualquier analito que pueda ionizarse fácilmente en una solución que contenga los modificadores químicos apropiados. Las muestras se preparan en solución y posteriormente se inyectan en la columna para HPLC. Los analitos se separan basándose en la partición entre la fase móvil y la fase estacionaria y luego se introducen en la fuente de ionización del espectrómetro de masas. El efluente se volatiliza en la fuente de ionización y ocurre el proceso de ionización. Los iones formados se introducen en el espectrómetro de masas para su análisis. 2.3.3.3 Electroforesis capilar: La electroforesis capilar (CE, por sus siglas en inglés), también denominada electroforesis capilar de zona (CZE, por sus siglas en inglés), es un método de separación que explota las diferencias sutiles en la composición iónica de los analitos para separarlos basándose en la movilidad electroforética en un líquido conductor. El capítulo Electroforesis Capilar (1053) provee detalles sobre los principios y el uso de esta metodología. Durante los últimos 15 años, este método de separación se ha usado acoplado a MS como alternativa a la LC-MS para ciertas clases de compuestos. Sin embargo, con el amplio uso de la HPLC en los laboratorios analíticos y de MS, los métodos de MS acoplada con CE a menudo se ven reemplazados por los métodos LC-MS.
2094 (1 736) Aplicaciones de la Espectrometría / Información General
USP 39
2.4 Polaridad tónica La ionización implica el proceso de pasar el analito a la fase gaseosa y depositar una carga en la molécula. La carga final del analito determina la polaridad iónica que se va a usar en el análisis de masas. Por lo general, la selección del modo de ionización depende de la capacidad del analito deseado de aceptar o perder un protón durante el proceso de ionización. La MS se puede realizar en el modo de polaridad de ión positivo o negativo. 2.4.1 MODO DE IÓN POSITIVO Muchos análisis farmacéuticos de MS usan el modo de ión positivo. Por ejemplo, los compuestos que contienen un grupo funcional básico tal como una amina (p.ej., proteínas y péptidos) son excelentes candidatos para los análisis de MS en el modo de ión positivo debido a que en condiciones ácidas estos compuestos aceptan fácilmente un protón para formar iones con carga positiva. 2.4.2 MODO DE IÓN NEGATIVO El modo de ión negativo es adecuado para compuestos que pueden perder un protón con facilidad. Por ejemplo, los compuestos que contienen un ácido carboxílico, fosfato o un azúcar, son buenos candidatos para MS de ión negativo.
2.5 Procedimientos de Ionización Se pueden usar varios métodos de ionización en un espectrómetro de masas para análisis farmacéutico. En esta sección se describen los diversos procedimientos de ionización. 2.5.1 IONIZACIÓN POR ELECTRONES La ionización por electrones (El, por sus siglas en inglés) se usa mayoritariamente con aplicaciones de cromatografía de gases cuando los analitos de interés son no polares y se volatilizan con facilidad. Los espectros de masas producidos mediante procedimientos de El se caracterizan por una extensa fragmentación. Debido a que la El por lo general produce fragmentación extensa, este método se considera un modo de ionización dura. Los espectros de masas se obtienen cuando un haz de electrones de 70 eV ingresa en la fuente e impacta las moléculas de analito presentes en la fase gaseosa: M
+e-~
M+· + 2e-
Casi todas las aplicaciones de El se realizan en el modo de ión positivo. Estos espectros son altamente reproducibles. Por consiguiente, se pueden usar las bases de datos de espectros de El para determinar la estructura y para confirmar la identidad de compuestos desconocidos. Asimismo, los mecanismos y patrones de fragmentación han sido ampliamente estudiados para la ionización de electrones y pueden ayudar a determinar la estructura de compuestos desconocidos. 2.5.2 IONIZACIÓN QUÍMICA Los procedimientos de ionización química (CI, por sus siglas en inglés) se basan en la ionización por electrones (El) de reactivos como metano, amoníaco o isobuteno. Los iones de estos reactivos reaccionan con las moléculas de analitos (reacción iónmolécula) en la fuente del espectrómetro de masas. En el modo de ión positivo, las moléculas de analito se ionizan mediante transferencia de protones y/o formación de aductos, produciendo especies iónicas de electrones apareados o iones aducto. Dependiendo del analito, se pueden obtener espectros positivos y negativos con los procedimientos de CI. La CI se considera un modo de ionización más suave (menor fragmentación de los iones moleculares) que la El, aunque algunos enfoques pueden inducir fragmentación dependiendo del gas de CI seleccionado y de la estructura de la molécula de analito. La CI es muy útil para compuestos reactivos e inestables en los que se desea una determinación de la masa molecular. A continuación se presentan las reacciones de ionización por CI representativas para los métodos GC-MS y LC-MS. Formación de moléculas protonadas (ejemplo de GC-MS): CH 4 +e-~ CH 4+ + 2eCH4+ + CH 4 ~ CH 5+ + CH 3 CH 3+ + CH 4 ~ C2 H5 + + H2 M + C2 H5+ ~ [M + H]+ + C2 H4 Formación de moléculas protonadas (ejemplo de LC-MS): M + NH 4+ ~ NH 3 + [M + H]+ Formación de iones aducto (ejemplo LC-MS):
USP 39
Información General/ (1 736) Aplicaciones de la Espectrometría 2095
2.5.3 IONIZACIÓN A PRESIÓN ATMOSFÉRICA Los procedimientos de ionización a presión atmosférica (API, por sus siglas en inglés) permiten la introducción directa de muestras en el espectrómetro de masas a partir de una interfase líquida tal como una HPLC. Las dos formas más comunes de API usadas en los análisis farmacéuticos son la ionización por electroespray (ESI, por sus siglas en inglés) y la ionización química a presión atmosférica (APCI, por sus siglas en inglés). 2.5.3.1 Ionización por electroespray: La ESI es un método que produce finas gotitas cargadas de una fase líquida que transporta el analito de interés. La fase líquida por lo general es una combinación de agua y disolvente orgánico volátil (p.ej., acetonitrilo o metano!). Se incluye también un reactivo en pequeñas cantidades (p.ej., ácido fórmico al O, 1%) para incrementar la conductividad de la solución. ESI se usa generalmente para las separaciones por HPLC e implica la nebulización del efluente que contiene la muestra y que fluye a velocidades de flujo que van desde nL/min hasta mL/min para producir un rocío fino de gotitas (radio = 0,5-1,0 µm). La evaporación del disolvente resulta en un incremento en la concentración de carga en la superficie de la gotita hasta que los iones se liberan directamente de la gotita. Los iones se transportan o enfocan directamente al interior del espectrómetro de masas y los espectros resultantes contienen iones que típicamente indican la masa molecular del analito. A menudo, se hace referencia a la ESI como un procedimiento de ionización suave debido a que, por lo general no resulta en la fragmentación del analito durante el proceso de ionización. El desarrollo de esta tecnología de ionización fue crucial para el análisis de biopolímeros grandes (p.ej., proteínas) debido a que permite la adición de múltiples cargas a una sola molécula, llevando de esa manera la escala miz del analito a un intervalo de escala miz adecuado para muchos tipos de analizadores de masa. Por ejemplo, la Figura 3 muestra la distribución del estado de la carga de los iones ESI para apomioglobina de corazón equino analizada en un instrumento de un solo cuadrupolo con un límite superior de miz 2000 en el rango de barrido de miz. La serie de iones con múltiples cargas permite obtener el espectro dentro del rango de miz de trabajo del instrumento. La capacidad de calcular la masa de la proteína intacta a partir de la combinación de todos los iones con múltiples cargas permite determinar la masa promedio en forma más precisa (ver el recuadro de la Figura 3) (con un error de O, 1% en un instrumento cuadrupolo simple). Por consiguiente, los métodos de ESI tienen una importancia crítica para el análisis de biomoléculas grandes.
+19 +18
16951,5
Perfil de masas reconstruido
+20 893 •2 942,7 8486 +17 '
998,1
+16 +21
1060,5
808,2
+15 1131,1
+14
16500
16700
16900
+22
17100
17300
Masa
1211, 9
+13
771,5
1305,0
+12 1413,7
+11 1542,1
+10 +9
1696,2
1884,5
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
Masa/carga (miz) Figura 3. Espectro de masa de ionización por electroespray para apomioglobina de corazón equino.
2.5.3.2 Ionización química a presión atmosférica: Los procedimientos de ionización química a presión atmosférica (APCI, por sus siglas en inglés) se usan con HPLC e implican la nebulización y el calentamiento de la muestra para liberar moléculas neutras. Una descarga corona produce iones reactivos (p.ej., H30+ ó NH 4 +) a partir de la fase móvil. Los iones reactivos reaccionan con las moléculas de analito a través de la transferencia de protones o la formación de aductos. El espectro de ión positivo resultante por lo general contiene iones [M + H]+ que indican la masa molecular y fragmentos iónicos que corresponden a subestructuras específicas de la molécula del analito. Los espectros de iones negativos se generan cuando iones reactivos (p.ej., OH- ó CH 3COO-) reaccionan con la molécula del analito para producir iones [M - H]-.
USP 39
2096 (1 736) Aplicaciones de la Espectrometría / Información General
2.5.4 IONIZACIÓN POR DESORCIÓN LÁSER ASISTIDA POR MATRIZ La ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDI, por sus siglas en inglés) es un procedimiento de ionización suave usado principalmente para biomoléculas, que se basa en la co-cristalización de un compuesto químico (matriz) con el analito de interés. Este compuesto de matriz puede absorber energía de láser a una longitud de onda particular durante el proceso de ablación láser. Algunos de los protones generados en la matriz pueden, mediante un mecanismo que aún no ha sido dilucidado por completo, transferir protones al analito, y los iones en fase gaseosa resultantes se enfocan en el espectrómetro de masas. Se han desarrollado empíricamente matrices específicas para diversas clases de analitos, incluyendo el ácido 3,5-dimetoxi-4-hidroxicinámico (ácido sinapínico) y el ácido a-ciano-4-hidroxicinámico para proteínas y péptidos, así como el ácido picolínico para oligonucleótidos. A diferencia de ESI, MALDI produce generalmente iones con menor carga, siendo los iones con una sola carga los más favorecidos. 2.5.5 PROCEDIMIENTOS DE IONIZACIÓN EN CONDICIONES AMBIENTALES La ionización en condiciones ambientales generalmente se refiere a un grupo de procedimientos de MS que permiten el muestreo y análisis de sustancias en forma directa a partir de la matriz de la muestra o de bajo condiciones ambientales y con un poco o ningún pretratamiento. En años recientes, el número y tipo de procedimientos de ionización en condiciones ambientales se han expandido rápidamente, lo cual se evidencia por la proliferación en la literatura reciente de acrónimos que representan los diversos procedimientos de ionización en condiciones ambientales. La ionización en condiciones ambientales ha gozado de una amplia aplicación en campos que incluyen ciencias forenses, seguridad alimentaria, monitoreo de contaminantes ambientales, polímeros, combustibles, detección de explosivos y narcóticos, generación de imágenes moleculares de superficies y tejidos; generación de perfiles químicos y caracterización de metabolitos, proteínas y biomoléculas; así como monitoreo de reacciones y procesos químicos. Los procedimientos de ionización en condiciones ambientales típicamente producen iones de analitos directamente desde las superficies de las muestras o requieren una producción inicial de analitos que posteriormente se ionizan mediante algunos de los diversos procesos disponibles. Por tanto, los procedimientos de ionización en condiciones ambientales se pueden categorizar, en principio, en mecanismos de ionización directa o mecanismos con múltiples etapas. Los procedimientos de ionización directa generan iones de analitos a partir de una solución muestra o de una gota en un campo eléctrico, o desorben iones de analitos al impactar la superficie de la muestra con gotitas cargadas o iones, fotones o átomos metaestables de disolvente. Los procedimientos de ionización en múltiples etapas inicialmente producen partículas o gotitas de analito con una corriente de líquido o gas, desorción térmica, irradiación o ablación con un láser o nebulización. Posteriormente, los analitos reaccionan con una especie cargada o con átomos metaestables generados mediante ESI, APCI o fotoionización para producir iones de analitos. La Tabla 7 provee una lista representativa, aunque no exhaustiva, de los procedimientos de ionización en condiciones ambientales e ilustra la diversidad y similitudes entre varios enfoques. Tabla 1. Procedimientos de Ionización en Condiciones Ambientales Decrlpclón
Acrónimo en Inglés
Mecanismos
Ionización por descarga de resplandor con deserción a presión atmosférica
Deserción térmica, ionización por descarga de gases
APPelª
Ionización de Penninq a presión atmosférica
Similar a APCI
AP-TD/ESIª
Ionización por electroespray con deserción térmica a presión atmosférica
Deserción térmica, ESI
ASAPª
Sonda de análisis de sólidos a presión atmosférica
Deserción térmica
DAPCI
Ionización química por deserción a presión atmosférica
Deserción térmica, APCI
APGDDI
DAPPIª
Fotoionización con deserción a presión atmosférica
Fotoionización con deserción térmica
DARP
Análisis directo en tiempo real
Ionización por descarga de gases
DBDI
Ionización por descarga de barrera dieléctrica
Deserción térmica, ionización por descarqa de gases
DCBI
Ionización por deserción con haz en corona
Deserción térmica, APCI
DESI
Ionización por electroespray con deserción
Similar a ESI
EADESI
Ionización por electroespray con deserción asistida por electrodos
Similar a ESI
EASI
Ionización por espray sónico en condiciones ambientales
Ionización por espray supersónico
EESIª
Ionización por electroespray extractivo
Similar a ESI
ELDIª
Ionización electroespray con deserción láser
Deserción o ablación con láser, ESI
ª Procedimiento de ionización en múltiples etapas.
USP 39
Información General/ (1 736) Aplicaciones de la Espectrometría 2097
Tabla 1. Procedimientos de Ionización en Condiciones Ambientales (Continuación) Acrónimo en inglés
Decrlpción
Mecanismos
FD-ESIª
Ionización por electroespray con gotas fundidas
Similar a ESI
IR-LADESIª
Ionización por electroespray con desorción asistida con láser infrarrojo
Desorción o ablación con láser, ESI
LAESIª
Ionización por electroespray con ablación por láser
Desorción o ablación con láser, ESI
LD-APCIª
Ionización química a presión atmosférica con desorción por láser
Desorción con láser, APCI
LD-ESIª
Ionización por electroespray con desorción por láser
Desorción láser, ESI
LDSPIª
Postionización por espray con desorción con láser
Desorción o ablación con láser
LDTDª
Desorción térmica con diodo láser
Desorción térmica
LEMSª
Espectrometría de masas por electroespray láser
Desorción o ablación con láser
LESA"
Análisis por extracción líquida de superficies
Similar a la ESI, extracción superficial con gotita de disolvente
LIAD-ES!ª
Ionización por electroespray con desorción acústica inducida por láser
Desorción o ablación con láser, similar ESI
LPl-MSª
Espectrometría de masas por ionización de Penning en superficie líquida
Similar a APCI
LSI
Ionización por espray con láser
Desorción o ablación con láser
MALDESIª
Ionización por electroespray con desorción con láser asistida por matriz
Desorción o ablación con láser
PADI
Ionización con desorción asistida por plasma
Desorción térmica, ioinización con descarga de gases
SESIª
Ionización secundaria por electroespray
Similar a ESI
TDAMSª
Espectrometría de masas en condiciones ambientales basada en desorción térmica
Desorción térmica
TD/APCIª
Ionización por desorción térmica/química a presión atmosférica
Desorción térmica, similar a APCI
ª Procedimiento de ionización en múltiples etapas.
3. ANÁLISIS DE MASAS En general, el tipo de espectrómetro de masas se define basándose en el método por el cual se separan los iones. Esencialmente, el analizador de masas es responsable de filtrar los iones generados durante el proceso de ionización. Esta sección describe los diversos analizadores de masas que por lo general se usan en la industria farmacéutica.
3.1 Cuadrupolo Un espectrómetro de masas de tipo cuadrupolo consta de un conjunto de cuatro varillas paralelas. Cuando se aplica una combinación de voltaje constante (DC, por sus siglas en inglés) y alterno (AC, por sus siglas en inglés) a las varillas opuestas, respectivamente, los campos eléctricos resultantes permiten que los iones de una relación miz dada transiten de manera estable por el cuadrupolo, pasando hacia el detector. Los espectrómetros de masas cuadrupolos son instrumentos relativamente asequibles y proveen buenas capacidades analíticas cualitativas y cuantitativas. Por lo general, los espectrómetros de masas cuadrupolos proveen espectros de masas de baja resolución.
3.2 Sector Magnético Un espectrómetro de masas de sector magnético filtra iones mediante la aplicación de un campo magnético. El campo magnético varía y los iones se desvían de modo que sigan una trayectoria curva separando los iones con cocientes miz distintos.
3.3 Trampas de Iones y Resonancia Ciclotrónica de Iones la mayoría de los espectrómetros de masas comerciales se dividen en dos categorías: aquéllos que se basan en haces continuos de iones que se transmiten a un detector para detección secuencial de las diferentes relaciones de miz (como autos en una carretera conduciendo del punto A al punto B), y aquéllos dispositivos que "atrapan" iones en órbitas discretas y repetitivas (como autos en una pista de carreras). Estos últimos dispositivos se denominan generalmente como trampas de iones. Las rutas orbitales son complejas y únicas para cada dispositivo. los iones pueden atraparse mediante campos eléctricos estáticos (voltaje DC), campos eléctricos cuadrupolares dinámicos [voltaje AC de radiofrecuencia (RF)], campos magnéticos o algunas combinaciones de éstos. la detección de iones puede suscitarse mediante expulsión secuencial de iones (después de ser confi-
USP 39
2098 (1736) Aplicaciones de la Espectrometría / Información General
nadas, y luego expulsados de acuerdo a su miz), o mediante todos los iones de manera simultánea [mientras se encuentran atrapados, es decir, por detección de la imagen de las corrientes y la posterior transformada de Fourier {FT, por sus siglas en inglés) de los datos]. Entre los ejemplos se incluyen los sistemas ampliamente utilizados de MS lineal y de trampa de iones 30 (con voltaje AC de RF con expulsión de iones para su detección), la MS con trampas orbitales con FT (que emplea voltaje DC y campo cuadrupolar para atrapar los iones, y con detección de imágenes de las corrientes), y la menos común MS de Resonancia Ciclotrónica de Iones con FT (que emplea un imán superconductor para proveer el campo de atrapamiento primario). Los instrumentos de FT por lo general proveen una muy alta resolución de masas (p.ej., 1OL106 a miz 400) a velocidades de barrido razonables (1 Hz), mientras que los dispositivos basados en RF por lo regular ofrecen velocidades rápidas de barrido {O, 1 Hz) pero una resolución más baja (10 3). Por último, el equipo de FT más utilizado se ha acoplado con un analizador cuadrupolo RF (especialmente con la trampa lineal) para proveer un instrumento híbrido capaz de realizar experimentos de multiplexación (múltiples experimentos secuenciales de MS-MS con determinaciones de miz exactas para elucidación estructural). 3.3.1 TIEMPO DE VUELO Un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo {TOF, por sus siglas en inglés) emplea diferencias en el tiempo de tránsito a través de una región de deriva libre de campo para separar iones. Los iones generados en la fuente iónica se introducen mediante pulsos en la región de deriva libre de campo (tubo de vuelo) usando un campo eléctrico. Los iones más ligeros tienen una mayor velocidad y alcanzan el detector más rápido. El espectrómetro de masas de TOF ha mejorado su desempeño mediante el uso de componentes electrónicos y computadoras rápidos para proveer sistemas caracterizados por su alta velocidad, alta sensibilidad y alta resolución.
4. INSTRUMENTAL PARA ESPECTROMETRÍA MS/MS Y MSN Se encuentra disponible una gran variedad de instrumentos para MS en tándem para la investigación y el desarrollo farmacéuticos. Cada uno de los instrumentos en tándem presenta algunas características únicas que lo convierten en particularmente adecuado para algunas aplicaciones específicas, pero esto no impide el uso de otros instrumentos en tándem para cumplir con un requisito analítico específico. La selección apropiada de un instrumento en tándem para cumplir con una necesidad específica depende del tipo de análisis requerido (p.ej., cuantificación o elucidación de la estructura), de una variedad de factores específicos de la muestra (p.ej., concentración de analito o la complejidad de la matriz) y de si el fraccionamiento de la muestra ocurre antes de introducirla en el espectrómetro de masas (p.ej., mediante LC-MS). A continuación se presenta un breve resumen de algunos tipos comunes de instrumentos en tándem, resaltando algunas de sus aplicaciones típicas.
4.1 Espectrómetros para MS/MS y MSn 4.1 .1 TRIPLE CUADRUPOLO El espectrómetro de masas de triple cuadrupolo se usa para análisis cuantitativos y cualitativos. Un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo presenta una primera etapa de análisis de masas (Q1) para la selección de un ión precursor, seguido de un cuadrupolo de RF solamente (Q2) que es la cámara de colisión. Se emplea una segunda etapa de análisis de masas (Q3) para el análisis de los iones producto. La mayoría de los análisis cuantitativos basados en LC-MS utilizan espectrómetros de masas de triple cuadrupolo. Además, el espectrómetro de masas de triple cuadrupolo es capaz de proveer la mayoría de los modos de barrido cualitativo más comunes: barrido completo, de iones del producto, del ión precursor y de pérdida neutra (ver la Figura 4 y el apartado 4.2 Modos Operativos de la Espectrometría MSIMS y MSn).
M+H+
1
miz A. Barrido Completo
USP 39
Información General/ (1 736) Aplicaciones de la Espectrometría 2099
-·-·-·-·-·-·+ -·-·-·-·-·-·+ -·-·-·-·-·-·+ -·-·-·-·-·-·+
M+H+
-·-·-·-·-·-·+ -·-·-·-·-·-·+
B. Barrido de Iones Producto
-·-·-·-·-·-·+ -·-·-·-·-·-·+ -·-·-·-·-·-·+ -·-·-·-·-·-·+ -·-·-·-·-·-·+ -·-·-·-·-·-·+
[M+H]+
1
C. Barrido de Ión Precursor
-·-·-·-·-·-·+ -·-·-·-·-·-·+ -·-·-·-·-·-·+ -·-·-·-·-·-·+ -·-·-·-·-·-·+ -·-·-·-·-·-·+
[M+H]+
miz D. Barrido de Pérdida Neutra Figura 4. MS de triple cuadrupolo. (A) Barrido completo--Ql barre los iones producidos en la fuente iónica. Este barrido también se puede realizar con Q3. (B) Barrido de iones producto--Ql se ajusta para seleccionar un ión molecular específico producido en la fuente iónica. La fragmentación de los iones seleccionados en Ql ocurre en la celda de colisión (Q2). Q3 barre los fragmentos resultantes. El espectro del ión producto contiene todos los fragmentos de los iones precursores seleccionados. (C) Barrido de ión precursor-Ql barre los iones producidos en la fuente iónica. Los iones se fragmentan en la celda de colisión (Q2). Q3 se ajusta para seleccionar un ión producto específico (derivado del espectro del ión producto). El barrido produce un espectro que contiene todos los iones precursores que generan el ión producto específico. (D) Barrido de pérdida neutra-Ql barre los iones producidos en la fuente iónica y los iones se fragmentan en la celda de colisión (Q2). Q3 también efectúa un barrido, pero a una diferencia de masa igual a la pérdida neutra seleccionada (tal como se deriva del espectro del ión producto). El barrido resulta en un espectro que contiene todos los iones moleculares que generan un fragmento de pérdida neutra específica. (Cortesía de Milestone Development Services, Newtown, PA) 4.1.2 SISTEMA TOF-TOF Una configuración de sistemas TOF en tándem se usa regularmente para la caracterización y secuenciación de péptidos y de otras biomoléculas a partir de mezclas relativamente simples (p.ej., digestión proteolítica de un producto terapéutico de una sola proteína). Estos sistemas a menudo se configuran para ionización mediante MALDI, lo cual permite confirmar la secuencia de péptidos sin necesidad de una separación inicial. La relativa facilidad de uso de dichos instrumentos y los robustos datos de fragmentación recolectados para la confirmación de los péptidos podrían permitir en el futuro el uso de instrumentos TOFTOF para pruebas de identificación de monografías. 4.1.3 SECTOR MAGNÉTICO Las configuraciones en tándem para instrumentos de sector magnético se han usado tradicionalmente para análisis que requieren alta resolución y exactitud de masas, tales como la elucidación estructural de componentes desconocidos. Sin embargo, debido a la creciente disponibilidad de una mayor resolución y exactitud de masas en otras plataformas de MS en tándem (p.ej., trampas iónicas y dispositivos cuadrupolos TOF), los instrumentos de sector magnético son hoy en día menos comunes para dichos propósitos.
2100 (1736) Aplicaciones de la Espectrometría / Información General
USP 39
4.1.4 TRAMPA IÓNICA La configuración en tándem para sistemas de trampa iónica permite aislar y fragmentar los iones de forma secuencial en el tiempo, a diferencia de otros instrumentos en tándem que cuentan con analizadores de masa acoplados en los cuales el proceso ocurre secuencialmente en distintas regiones del instrumento por las que transita el haz de iones. Una ventaja del proceso de atrapamiento-aislamiento-fragmentación-detección en un instrumento de trampa iónica es la capacidad de volver a aislar los iones producto provenientes del ion precursor original para producir una fragmentación adicional. Esta fragmentación secuencial permite una determinación estructural más detallada para ayudar a elucidar componentes desconocidos. Para aplicaciones de proteínas y péptidos, los instrumentos de trampa iónica se han usado ampliamente con el propósito de identificar y secuenciar péptidos y para caracterizar modificaciones de proteínas (p.ej., fosforilación y glicosilación). 4.1.5 RESONANCIA CICLOTRÓNICA DE IONES POR TRANSFORMADA DE FOURIER Los espectrómetros de masas de resonancia ciclotrónica de iones por transformada de Fourier (FT-ICR), al igual que las trampas iónicas, facilitan el aislamiento en el tiempo de los iones. Los analizadores de masas FT-ICR ofrecen alta resolución (por lo regular, 1OL106) y pueden lograr una exactitud de masa de subpartes por millón, lo cual permite una determinación precisa de la masa y de la composición elemental de compuestos desconocidos con un alto grado de certidumbre. Los iones se pueden excitar o expulsar de la celda del ICR de manera selectiva mediante la generación de una onda conteniendo frecuencias resonantes de los valores miz de los iones de interés. Se encuentran disponibles diversos procedimientos de fragmentación para lograr la caracterización estructural de moléculas grandes y pequeñas con MS FT-ICR, incluyendo disociación inducida por colisión (CID, por sus siglas en inglés), disociación por captura de electrones (ECD, por sus siglas en inglés) y disociación multifotónica infrarroja (IRMPD, por sus siglas en inglés). Algunos sistemas comerciales de MS FT-ICR emplean una trampa iónica en tándem para aislar y fragmentar iones precursores, siendo los iones producto posteriormente transferidos a la celda de ICR para detección o fragmentación adicional mediante otros procedimientos. La alta resolución y exactitud en la medida de las masas de la MS por FT-ICR hace que este instrumento esté particularmente bien adaptado para la caracterización estructural de componentes que comprenden mezclas altamente complejas de moléculas orgánicas pequeñas y grandes. La MS FT-ICR también se ha usado ampliamente en la caracterización de lípidos y carbohidratos y en la caracterización y secuenciación de péptidos y proteínas, incluyendo el examen de características únicas tales como modificaciones post traduccionales. 4.1.6 HÍBRIDOS Ha surgido una variedad de espectrómetros de masas en tándem para mejorar aplicaciones específicas o para ampliar la utilidad general del instrumento en una variedad de aplicaciones. En la actualidad, el instrumento híbrido más común usado para la caracterización farmacéutica es el espectrómetro de masas cuadrupolo TOF (Quad-TOF, por sus siglas en inglés), que combina la velocidad de barrido de un filtro de masas cuadrupolo con el poder de resolución y la exactitud de masas del analizador TOF. Esta combinación es adecuada para la elucidación de estructuras debido a que la resolución y la exactitud de masas del TOF (mayores que las de un cuadrupolo) permiten un mayor grado de certeza al determinar la probable composición elemental de los iones precursores y del producto. Además, el uso de un filtro de masa cuadrupolo en esta configuración en tándem permite funciones de barrido tales como las descritas para un instrumento de triple cuadrupolo (Figura 4), aunque se requiere procesamiento adicional posterior de los datos. Se han puesto en el mercado un creciente número de configuraciones híbridas para aprovechar las ventajas características de las combinaciones con respecto a la resolución, exactitud de masas y cuantificación. Algunas de estas configuraciones incluyen Cuadrupolo-Trampa, Trampa-TOF, Trampa-IRC, así como espectrómetros de masas de trampas orbitales.
4.2 Modos Operativos de Espectrometría MS/MS y MSn 4.2.1 MODOS DE PRODUCCIÓN POR FRAGMENTACIÓN La Disociación Inducida por Colisión (CID, por sus siglas en inglés), también conocida como, Disociación Activada por Colisión (CAD, por sus siglas en inglés) es el proceso mediante el cual un ión precursor seleccionado experimenta colisiones con moléculas de gas neutro en una región de colisión para producir iones producto. La fragmentación ocurre a energías relativamente bajas (1-100 eV) principalmente en los sitios de ionización para producir un fragmento iónico y una molécula neutra. En general, se emplea nitrógeno, argón o helio como gas de colisión con energías de colisión en el intervalo de 10-50 eV. La Disociación por Captura de Electrones (ECD, por sus siglas en inglés) y la Disociación por Transferencia de Electrones (ETD, por sus siglas en inglés) son dos métodos de fragmentación distintos pero relacionados que se usan principalmente para fragmentar proteínas y péptidos a fin de generar iones de tipo e y z que son útiles para determinar la secuencia proteica y la caracterización de modificaciones proteicas. La fragmentación en cada caso se basa en la introducción de un electrón libre (ECD) o de un anión radical (ETD) en la fase gaseosa para inducir una fragmentación química de moléculas cargadas positivamente. La ventaja de estos métodos para proteínas y péptidos en comparación con la CID es que la fragmentación química
USP 39
Información General/ (1 736) Aplicaciones de la Espectrometría 2101
ocurre casi exclusivamente en el esqueleto de la cadena peptídica, con lo que se conserva la posición y el contexto de la modificación proteica que a menudo se pierden durante la CID. 4.2.2 MODOS DE ANÁLISIS DE FRAGMENTACIÓN
Esta sección describe los modos de barrido MS/MS más comunes. 4.2.2.1 Iones producto: El modo de barrido de iones producto se ilustra en la Figura 48 para un instrumento de triple cuadrupolo (QQQ, por sus siglas en inglés). La aplicación del modo de barrido iones producto se realiza cuando el primer analizador de masas (Ql) se mantiene en un m/ z específico. Este ión, por lo regular la molécula protonada, [M + H]•, se fragmenta en la celda de colisión (Q2). El segundo analizador de masas (Q3) barre los iones producto resultantes. Para un espectrómetro de masas de tipo trampa iónica, los iones con un m/ z específico se aislan, se activan mediante colisión, y se realiza un barrido de los iones producto. En ambos casos, el espectro MS-MS de los iones producto resultantes contiene los fragmentos iónicos de diagnóstico que indican las subestructuras características del analito seleccionado. Este modo de MS-MS requiere obtener un espectro de barrido completo de masas completo antes del experimento del ión producto para determinar la selección apropiada del ión molecular (por lo regular, [M + H]•). El modo de barrido de iones producto está disponible en todos los espectrómetros de masas capaces de operar en el modo MS-MS. 4.2.2.2 Ión precursor: El modo de barrido de ión precursor se ilustra en la Figura 4C. La aplicación del modo de barrido de ión precursor se realiza cuando se produce el barrido en el primer analizador de masas (Ql) permitiendo que todos los iones creados en la fuente iónica pasen al interior de la celda de colisión (Q2). El segundo analizador de masas (Q3) se mantiene a una relación miz específica que se corresponde con un ión diagnóstico o un fragmento iónico característico de la molécula o grupo de moléculas blanco. El espectro MS-MS de los iones precursores resultantes contiene todos los iones moleculares que contienen un ión fragmentario de diagnóstico. El modo de barrido de ión precursor requiere la realización de un experimento de iones producto para confirmar los iones fragmento de diagnóstico. Este modo de barrido se puede usar para detectar moléculas con una característica subestructura! específica tal como un residuo peptídico. El modo de barrido de ión precursor está disponible en los instrumentos de triple cuadrupolo, de sector magnético y en algunos híbridos. 4.2.2.3 Pérdida neutra: El modo de barrido de pérdida neutra se ilustra en la Figura 40. La aplicación del modo de barrido de pérdida neutra se realiza cuando ambos analizadores de masas (Ql y Q3) realizan el barrido a la misma velocidad. El segundo analizador de masas (Q3) presenta un desplazamiento (más abajo) con respecto al primero por una diferencia constante de miz. Los iones moleculares ingresan al Q1 y se fragmentan en la celda de colisión (Q2), mientras que los iones fragmento resultantes se detectan después de pasar a través del Q3. Debido a la diferencia constante de miz en el barrido en Q1 y Q3, el espectro resultante presenta todos los iones moleculares que han experimentado la pérdida neutra seleccionada. Este modo de barrido también requiere que el barrido de iones producto confirme la o las pérdidas neutras de diagnóstico. Al igual que el modo de barrido de ión precursor, este modo de barrido se usa para detectar moléculas con una característica estructural de diagnóstico tal como conjugación con un grupo fosfato o con glucurónido. El modo de barrido de ión de pérdida neutra está disponible en los instrumentos de triple cuadrupolo, de sector magnético y en algunos híbridos. 4.2.2.4 MSn: El modo de adquisición MSn es básicamente una aplicación secuencial del barrido de ión producto descrito en la sección 4.2.2.1 Iones producto. Se usa para la fragmentación adicional de iones producto derivados de un experimento previo de iones producto. Por consiguiente, se puede utilizar para obtener información estructural adicional para la identificación de analitos. Este modo de adquisición por lo regular está disponible sólo en los instrumentos de trampa iónica o FT-ICR.
5. ANÁLISIS CUALITATIVO La espectrometría de masas (MS) es un método poderoso y una herramienta importante para la identificación de estructuras debido a su capacidad de proveer información sobre la masa, la composición elemental y las características estructurales de entidades moleculares conocidas y desconocidas. En su formato más sencillo, una espectrometría de masas separa y mide la masa de los iones relacionados con la muestra. Un espectrómetro de masas separa, detecta y registra la presencia de iones, no de moléculas neutras. Para los propósitos de la espectrometría de masas de moléculas orgánicas pequeñas, la carga (z) es generalmente 1. Se encuentra disponible una amplia variedad de espectrómetros de masas y de interfases de ionización para mediciones específicas por MS. Por ende, se pueden emplear una variedad de enfoques experimentales para cualquier medición de MS requerida. Algunos de los enfoques más comunes y aplicables se presentan en esta sección. La idoneidad de un enfoque experimental de MS dado se demuestra mediante los datos de validación descriptos en los documentos presentados para una nueva monografía o un nuevo procedimiento.
5.1 El Espectro de Masas El espectro de masas en general se muestra como una gráfica de intensidades iónicas en la ordenada en función de las miz en la abscisa, y con frecuencia se normaliza con respecto al ión más intenso en el espectro. Algunos aspectos característicos en un espectro de masas de barrido completo incluyen (dependiendo del procedimiento de ionización) el ión molecular (p.ej., M•), moléculas protonadas o desprotonadas ([M + H]• ó [M - H]-), o iones de aductos (p.ej., [M + NH 4 ]•), los cuales son todos
2102 (1736) Aplicaciones de la Espectrometría / Información General
USP 39
indicadores de la masa molecular del analito. Los espectros de masas pueden ser más o menos complejos, dependiendo de los analitos específicos y de los iones detectados. Los espectros de masas de El en general contienen abundantes iones fragmento, pero las formas de ionización suave y API pueden producir espectros con pocos fragmentos iónicos aunque a menudo muestran picos de alta intensidad o picos base que son indicativos del peso molecular del analito. Por lo tanto, la interpretación de los espectros de masas puede ser más o menos directa. Por lo regular, la disponibilidad de cualquier información de sustento sobre la muestra (p.ej., origen, historia, preparación, estabilidad, solubilidad) puede ayudar de gran manera con la interpretación. Dos consideraciones primarias ameritan una discusión inicial debido a su importancia en la interpretación de espectros de masas: la resolución y la exactitud de la masa. 5.1 .1 RESOLUCIÓN DE MASAS En la MS, la resolución es el grado en que dos iones de miz adyacentes se pueden distinguir entre sí y se ha expresado de diversas maneras. Dos picos adyacentes en un espectro a valores m y m - Llm pueden estar separados por un valle, que en su punto más bajo, es una cantidad máxima especificada de superposición entre los picos. La resolución se expresaría como miLlm. Por ejemplo, el término "valle de 10%" describe una cantidad del 10% de superposición entre dos picos y es apropiado cuando éstos son iguales en altura y forma. No obstante, en la práctica, raramente se observan picos adyacentes de igual altura y forma. Por lo tanto, la resolución también se puede calcular usando el ancho aparente de un solo pico en un punto dado Llm, y a menudo se expresa como el ancho de un pico medido a altura media (FWHM, por sus siglas en inglés). La resolución es un factor importante para establecer la exactitud de la masa, evaluar los patrones y abundancias isotópicas, determinar la carga de iones con múltiples cargas y distinguir interferencias isobáricas nominales. Los instrumentos de espectrometría de masas nominales por lo regular proveen una resolución de masa en el orden de 1000, mientras que para la espectrometría de masas de alta resolución (HRMS, por sus siglas en inglés) ésta puede ir de 5000 hasta 1 000 000. Una resolución brinda la capacidad de separar y distinguir las interferencias isobáricas (analitos con la misma masa nominal pero diferentes fórmulas empíricas) y para extraer conjuntos de datos complejos de manera más eficiente (usando una especificidad mejorada). 5.1.1.1 Resolución nominal: Diversos tipos de espectrómetros de masas son capaces de generar espectros de masas con una resolución nominal. Probablemente, el espectrómetro de masas más común usado para trabajos de resolución nominal es el espectrómetro de masas de tipo cuadrupolo. En un espectrómetro de masas cuadrupolo, los iones pasan a través de un conjunto de cuatro varillas de modo que las varillas opuestas varían en RF o DC, barriendo de manera efectiva todo el intervalo de miz y permitiendo que únicamente pase una miz en un momento dado. El efecto neto es obtener una resolución de masa nominal (p.ej., miz 400 se puede distinguir fácilmente de miz 399 y miz 401) y obtener un espectro que pueda definir la masa monoisotópica y los aglomerados (clusters) isotópicos asociados (p.ej., A+ 1 y A+ 2). Con este tipo de espectrómetro de masas (resolución nominal), la información primaria obtenida es una indicación de la masa molecular del analito y, dependiendo del enfoque experimental usado (p.ej., ionización El), de fragmentos iónicos relacionados con la estructura del analito. 5.1.1.2 Alta resolución: La HRMS presenta importantes ventajas para la identificación de analitos. Las diversas formas de esta tecnología permiten determinar la masa de moléculas pequeñas hasta el tercer o cuarto dígito decimal (es decir, un error de masa de aproximadamente O, l hasta 1O ppm). Esto provee un grado adicional de especificidad (certeza) que, cuando se combina con la información del patrón isotópico y de la racionalidad química, resulta en la elucidación de la fórmula empírica del analito como punto de partida para un análisis adicional. Por ende, la HRMS ofrece ventajas en comparación con la MS nominal, en la que la masa nominal es el punto de partida. La HRMS se puede realizar con diversas tecnologías, incluyendo TOFMS, así como MS de trampas orbitales y MS de resonancia ciclotrónica de iones, en donde los últimos dos enfoques emplean transformada de Fourier para procesar los datos brutos. Estos sistemas tienen diversas ventajas, incluyendo una mayor sensibilidad para obtener datos de espectro completo (a diferencia de los instrumentos de barrido como los cuadrupolos), así como resolución, exactitud de la masa y cálculo de las intensidades del cociente isotópico. 5.1.2 EXACTITUD DE MASAS La exactitud es la comparación de una miz determinada de modo experimental con el cociente miz verdadero. La exactitud se ve influenciada por diversos factores, incluyendo la resolución, la abundancia de señales, el tipo y los algoritmos de calibración, la selección y el número de calibradores usados, las interferencias como el ruido químico y el intervalo dinámico lineal inherente con un tipo particular de espectrómetro de masas. La exactitud de las masas puede expresarse como unidad de milimasa (0,001 µ) diferencial o ppm. La exactitud de las masas, como ppm, se calcula mediante la siguiente fórmula:
valor medido masa calculada o verdadera Aunque la resolución y la exactitud pueden no estar directamente correlacionadas, la HRMS por lo general permite una mejor asignación de masa exacta. En la práctica, tanto la alta resolución como la alta exactitud de las masas son necesarias para minimizar el error introducido en la medición de masas por interferencias isobáricas. Una resolución y exactitud de las masas mmeas = mtrue =
USP 39
Información General/ (1 736) Aplicaciones de la Espectrometría 2103
suficientemente altas pueden facilitar la asignación de una composición elemental a los iones de un espectro de masas, lo que ayuda a confirmar o elucidar la estructura, respectivamente, para compuestos conocidos o desconocidos.
5.2 Interpretación de Espectros de Masas Cuando se interpretan los espectros de las masas de compuestos desconocidos, los analistas pueden diferenciar compuestos desconocidos en dos categorías amplias. La primera categoría, que representa la situación más común, se puede describir como compuestos desconocidos conocidos o compuestos cuya información de sustento puede estar disponible o se puede determinar mediante comparación con estándares, sustancias relacionadas, metabolitos, impurezas sintéticas o productos intermedios. En este caso, el objetivo es verificar la identidad de un compuesto demostrando su correlación con un material estándar usando criterios preestablecidos. Este objetivo a menudo se logra mediante la comparación directa de las características espectrales de la masa de un compuesto desconocido con un estándar analizado de manera paralela o un espectro de masas estándar procedente de una base de datos que se genera con instrumentos y en condiciones similares. Para espectros de masas exactos de alta resolución, la confirmación de la identidad puede incluir la verificación de la composición elemental. Los patrones de fragmentación característicos obtenidos en condiciones estandarizadas también se pueden usar para confirmar la identidad brindando una huella dactilar que indique grupos funcionales, sustituyentes y diferencias o modificaciones estructurales. La importancia de la separación cromatográfica (es decir, demostración de las características de retención que son similares a un estándar) también deben considerarse como parte de una confirmación general de la identificación. La importancia de la separación cromatográfica es particularmente evidente para la identificación de diversos isómeros o enantiómeros estructurales para los que la MS por sí sola podría no proveer distinción suficiente. La segunda categoría comprende compuestos desconocidos verdaderos o compuestos de los que se dispone de información limitada o nula sobre sus antecedentes y representan los casos más complejos para la interpretación de espectros. Los compuestos desconocidos verdaderos se encuentran con menor frecuencia y a menudo necesitan la combinación de múltiples procedimientos espectrales para lograr la elucidación estructural completa. Para compuestos desconocidos verdaderos, cualquier información relevante (p.ej., origen, preparación, matriz, solubilidad, otros compuestos cuando la muestra es una mezcla) pueden ayudar con la interpretación. El primer paso en la interpretación de espectros de masas es la determinación de la masa monoisotópica. Este pico es altamente dependiente del procedimiento de ionización empleado, de las condiciones analíticas y de las características de las moléculas de las que se forman los iones. Existen diferencias relevantes entre los espectros de masas El y API, los cuales, para los fines de este capítulo, son el resultado de los métodos de ionización dura y suave, respectivamente. El forma principalmente un catión radical de electrones desapareados, M+·, mientras que la API y los demás procedimientos de ionización suave por lo general producen moléculas protonadas [M + H]+ o desprotonadas [M - H]- con electrones apareados. La Regla de Nitrógeno puede ser útil para identificar el pico de ión molecular: indica que un ión con electrones desapareados que contenga un número par de átomos de nitrógeno o ninguno, será observado a una masa nominal par, mientras que un ión con electrones desapareados que contenga un número impar de átomos de nitrógeno aparecerá con una masa nominal impar debido a que el nitrógeno tiene una masa par (14) y una valencia impar (3). Esta regla es aplicable a todos los compuestos que contienen carbono, hidrógeno, oxígeno, nitrógeno, azufre y halógenos, así como fósforo, boro, silicio, azufre y metales alcalinos térreos. Cuando se aplica a los iones con electrones apareados (p.ej., [M + H]+ o [M - H]-), la Regla de Nitrógeno indica que un ión con electrones apareados que no contenga nitrógeno o que contenga un número par de átomos de nitrógeno se observará en una masa nominal impar y que un ión con electrones apareados que contenga un número impar de átomos de nitrógeno aparecerá en una masa nominal par. La formación de aductos moleculares puede ayudar a determinar y verificar la masa en modos de ionización positiva y negativa. Algunos aductos comunes que se observan en los espectros de masa con iones positivos son los aductos [M + Na]+, [M + K]+ y [M + NH 4 ]+. Asimismo, también pueden generarse aductos con otros cationes inorgánicos u orgánicos, tales como Li, Ag, Cs, H2 0, acetonitrilo, metano!, isopropanol y aminas orgánicas protonadas o cuaternarias. Los aductos presentes en espectros de masa con iones negativos incluyen aquéllos formados con CI, Br y ácido fórmico o triflouoroacético. Los aductos múltiples son comunes en espectros de masas de modos de ionización positivos o negativos derivados de la API y otros procedimientos de ionización suave, y pueden incluir combinaciones de moléculas protonadas o desprotonadas, acompañadas por protones adicionales, múltiples cationes inorgánicos u orgánicos o aniones. Para algunas aplicaciones, se recomienda producir aductos de manera deliberada mediante la modificación de la solución de la muestra, la matriz o fase móvil para inducir fragmentación característica o para indicar componentes en una mezcla con características estructurales comunes o únicas. Se pueden observar iones de analitos diméricos o poliméricos [2M + H]+ o [2M - H]- en espectros de masas de API con iones positivos o negativos respectivamente, a menudo con altas concentraciones de analito. También se pueden formar y observar aductos diméricos análogos con Na, K y otros cationes inorgánicos y pueden proveer verificación de la MW. En general, la formación de aductos y, en última instancia, la presencia de picos de iones de aductos en espectros de masas son altamente dependientes del procedimiento de ionización, de las condiciones de la fuente de ionización, del tipo de espectrómetro o analizador de masas, de la matriz de la muestra, de la composición de la fase móvil y del analito mismo. La intensidad relativa de los picos del espectro de masa puede proveer información sobre la estructura molecular e iónica. El pico más intenso en un espectro de masas se conoce como el pico base y representa una abundancia relativa del 1 00% en espectros de masas normalizados. En los espectros de masas de El, el pico base puede o no representar el ión molecular. Sin
2104 (1736) Aplicaciones de la Espectrometría / Información General
USP 39
embargo, con los métodos API y métodos de ionización suave, [M + H]+ o [M - H]- a menudo aparecen como un pico prominente en el espectro de masas. Las intensidades relativas de los picos en los espectros de masas de El y en cierto grado en los espectros de masas de API y otros, pueden indicar estabilidad del ion.
5.3 Composición Elemental y Estructura Cada molécula tiene una fórmula o composición elemental específica que, por sí misma, no sugiere nada con respecto a la estructura de la molécula, debido a que moléculas completamente diferentes pueden tener una composición empírica idéntica. El espectro de masas de un analito indica su masa monoisotópica, pero cuanto más grande sea la masa, mayor será el número de fórmulas empíricas posibles o combinaciones de átomos que pudieran producir la misma señal a esa miz nominal.
5.4 Patrones Isotópicos La intensidad relativa y la posición de los picos del aglomerado (cluster) isotópico en un espectro de masas brindan información ortogonal a los de datos miz. Los isótopos representan variantes de un elemento dado con el mismo número de protones y un número diferente de neutrones. El número y la abundancia relativa de los isótopos son únicos para cada elemento y juntos comprenden un patrón isotópico para una molécula particular en un espectro de masas. La abundancia relativa de cada isótopo también es una función del número de átomos de cada elemento en una molécula. Las abundancias isotópicas naturales dependen de la fuente u origen de un material y se ven influenciadas por las variaciones de las abundancias isotópicas de sus elementos constituyentes. Debido a que una fórmula elemental única se refleja consistentemente en cada pico coincidente con la miz y la abundancia relativa de cada isótopo en la fórmula molecular, el patrón isotópico resultante puede ser una poderosa herramienta para predecir la composición elemental. El cloro y el bromo son ejemplos de elementos que producen patrones isotópicos fácilmente reconocibles en un espectro de masas. Los átomos de cloro se caracterizan por los isótopos 35 Cl:3 7 CI (aproximadamente 3:1) y los átomos de bromo por dobletes inconfundibles (7 9 Br:ª1Br = aproximadamente 1 :1) que permiten la fácil identificación de iones que contienen estos átomos en un espectro de masas. Las combinaciones de múltiples átomos de CI o Br en una molécula generan picos de isótopos característicos que difieren en dos unidades y tienen abundancias relativas calculables. Para algunos tipos de HRMS (en particular la TOF), las intensidades relativas del patrón isotópico se pueden determinar en detalle. Debido a que la intensidad relativa del aglomerado isotópico es exactamente una función de la composición elemental de la molécula (que se calcula fácilmente), el ajuste de datos experimentales a la abundancia isotópica teórica puede ayudar a proveer la fórmula correcta. La Figura 5 presenta el patrón isotópico en la región del ión molecular para n-butilbencenosulfonamida obtenida mediante ionización ESI con diferentes espectrómetros de masa, cada uno con diferente resolución. Con resolución de masa nominal (es decir, espectrómetro de masas cuadrupolo), se puede observar claramente los picos A+ 1 (m/ z 215) y A+ 2 (miz 216) del ión [M + H]+ a miz 214. La mayor contribución al pico A + 1 resulta de la ocurrencia de la molécula con 13 C, y la mayor contribución al pico A + 2 es el 34 5 que ocurre naturalmente. Con un espectro de masas de mayor resolución, las abundancias relativas calculadas con mayor exactitud de los picos A + 1 y A + 2 se pueden usar para estimar el número de átomos de carbono y azufre en la molécula. Un examen del espectro de masas por FT-ICR ilustra la información isotópica adicional que se puede obtener en condiciones de aún mayor resolución. Este espectro muestra claramente que el pico A + 1, que fue visto como un único pico con el otro espectrómetro de masas, también presenta contribuciones de otros isótopos. A las resoluciones obtenidas con los espectrómetros de masas ICR o trampas orbitales, se pueden observar los diversos contibuyentes del pico A + 1 y es posible obtener una estimación más exacta de los átomos presentes.
USP 39
Información General/ (1736) Aplicaciones de la Espectrometría 2105
214,1
100
ro
> ro
~
Cuadrupolo
(1) l....
R- 1500
ro ·5 e ro "O e :::J
..e <(
o
214
215
216
miz 215,0928
100
214,0894
100
Detalle del pico del isótopo A +1
MS FT-ICR
·uero
R-200,000
15N
335
215,0866
215 0895
~
ro
"O
e :::J ..e
215,08
\ 215,09
miz
215,10
215,11
<(
216,0852 0......,._-'-~~~~-,..~~~~~--,,.---'--~~~~..,--~~~~~......-~~
214,0
214,5
215,0
miz
215,5
216,0
Figura 5. Espectro de masas ESI parcial de n-butilbencenosulfonamida en diferentes condiciones de resolución de masas. El examen de los picos isotópicos también puede revelar información con respecto al estado de carga de un ión. Por ejemplo, la diferencia entre los picos de isótopos A y A+ 1 es 1 miz para unión con una carga, una diferencia de masa de 0,5 miz denota un ión doblemente cargado, mientras que una diferencia de masa de 0,3 miz denota un ión triplemente cargado. De este modo, se puede determinar el estado de carga correcto cuando está presente un pico o un grupo de picos isotópicos, lo cual sustenta la determinación de MW y la composición elemental. Debido a que la masa exacta y el ajuste isotópico son datos ortogonales que, cada uno por separado, pueden reducir en gran medida el número de fórmulas empíricas posibles para una masa nominal dada, la información usada en conjunto puede reducir los datos experimentales a una o a un grupo limitado de estructuras posibles.
5.5 El Ión Monoisotópico El ión monoisotópico es una característica importante de un espectro de masas y reconocer este ión es de gran valor para determinar la composición elemental de una molécula o ión, en particular con mediciones exactas de masa. La masa monoisotópica de un ión o molécula es la masa exacta que se calcula usando la masa del isótopo natural más abundante de cada elemento constituyente. Por lo tanto, el ión monoisotópico compuesto por los isótopos más abundantes de sus elementos. Es
2106 (1 736) Aplicaciones de la Espectrometría / Información General
USP 39
importante notar que la MS observa la masa monoisotópica del analito, no su peso molecular (es decir, el peso promedio incluyendo las contribuciones de isótopos pesados). Reconocer el pico del ión monoisotópico puede ser sencillo, y algunos iones mono cargados y elementos presentan patrones isotópicos que se reconocen fácilmente. Sin embargo, la combinación de iones con carga múltiple y diversos elementos que contribuyen colectivamente a patrones isotópicos complejos pueden ocasionalmente dificultar la determinacón del ión monoisotópico, en particular con polímeros y moléculas biológicas. En dichos casos el beneficio del instrumental que ofrece mayor poder de resolución es claramente aparente.
5.6 Fragmentación La fragmentación de una molécula orgánica en un espectrómetro de masas y el examen de los iones producidos en el proceso de fragmentación pueden proveer información detallada sobre características estructurales únicas tales como grupos funcionales, sustituyentes y conectividad. La fragmentación es generalmente la disociación de un ión de analito activado. Las fragmentaciones observadas son bastante diversas y pueden variar desde eventos simples tales como pérdida de agua o amoníaco hasta rutas altamente complejas que implican aducción, rearreglos múltiples y migración de átomos. En la MS, la fragmentación es altamente dependiente del tipo de instrumental y de las condiciones operativas. Las consideraciones primarias incluyen la fuente de ionización, las condiciones de la zona de colisión y el tipo de analizador de masas. Hasta cierto grado, controlar estos factores permite seleccionar y optimizar las condiciones que llevan a la fragmentación deseada o fragmentación que sea estructuralmente diagnóstica. La fragmentación de El resulta exclusivamente de una disociación unimolecular que ocurre en alto vacío. La formación de un ión molecular radical (M+ ) en un haz de electrones (por lo general 70 eV) está acompañada por la redistribución y acumulación de energía en modos vibracionales diferentes y, como resultado, el ión molecular puede experimentar fragmentación. La fragmentación por lo general ocurre por la ruptura de enlaces y produce un catión de electrones apareados y un radical neutro de electrones desapareados. Lo contrario también puede ocurrir, aunque con menor frecuencia: se observa un catión radical con electrones desapareados con una pérdida de un fragmento neutro con electrones apareados. Los iones fragmentarios pueden disociarse aún más para generar fragmentos adicionales. En general, la fragmentación de iones con electrones desapareados puede producir iones con electrones desapareados o con electrones apareados, pero los iones con electrones apareados se fragmentan dando otros iones con electrones apareados. La probabilidad de ruptura de un enlace particular en una molécula se puede correlacionar con la fuerza de la unión y la estabilidad relativa de los iones fragmentarios resultantes. Existen algunos principios generales con respecto a la presencia de picos de iones fragmentarios observados en el espectro de masas de El y pueden ayudar a la interpretación. Estos principios se han tratado ampliamente en numerosos textos sobre el tema por lo que no se tratan en este capítulo. La API y los procedimientos de ionización suave producen predominantemente iones tales como [M + H]+ o [M - H]- que presentan fragmentación limitada. La API y procedimientos de ionización suave logran la fragmentación al activar los iones de diversas maneras, dependiendo del tipo de instrumentación.
5.7 Biomacromoléculas La elucidación estructural de biomacromoléculas usando la MS presenta diversos desafíos que no son comunes entre los fármacos tradicionales descritos previamente en el capítulo. Para comenzar, los productos terapéuticos biomacromoleculares abarcan muchos compuestos con propiedades químicas muy diferentes que van desde proteínas y péptidos hasta una variedad de glicoconjugados, lípidos e incluso complejos de ADN y ARN. Para complicar aún más el tema, la masa molecular de las biomacromoléculas puede variar desde un valor por debajo de 1000 en el caso de péptidos bioactivos y lípidos hasta muy por encima de 1 00 000 para vacunas, anticuerpos y complejos de heparina. Asimismo, muchas de estas sustancias de origen biológico presentan una heterogeneidad considerable y, por ende, podría no ser posible caracterizarlas como un fármaco individual sino como una mezcla la cual se monitorea su uniformidad entre partidas usando una variedad de métodos analíticos. Esta sección provee pautas sobre la caracterización por MS de biomacromoléculas. Debido a la complejidad de esta clase de compuestos, esta sección se enfoca en unos pocos compuestos para ilustrar los beneficios de la MS y luego trata brevemente la forma en que se puede implementar la MS para otros compuestos biomacromoleculares. 5.7 .1 PÉPTIDOS Y PROTEÍNAS El capítulo Artículos Obtenidos por Biotecnología-Mapeo de Péptidos (1055) provee detalles sobre el proceso para caracterizar proteínas y péptidos, por lo que únicamente se resumen en esta sección a manera de contexto. 5.7.1.1 Interpretación de espectros: La evaluación de espectros de masas de proteínas y péptidos por lo general abarca datos de MS de los compuestos intactos para establecer la masa total de la proteína seguidos de la MS en tándem para generar información sobre la secuencia primaria de aminoácidos de la proteína o para caracterizar sitios de modificación de proteínas. La interpretación de espectros de fragmentación para generar la información de secuencias es un componente crítico de esta aproximación experimental y, por consiguiente, se proveen diversas pautas para la interpretación de espectros de fragmentos de péptidos en la sección 5.7. 7.2 Búsqueda en bases de datos. Han surgido enfoques primarios y secundarios basados en MS
Información General/ (1736) Aplicaciones de la Espectrometría 2107
USP 39
como métodos estándar para la secuenciación de proteínas mediante fragmentación y son conocidos como secuenciación ascendente (bottom-up) y descendente (top-down). 5. 7.1.1.1 Ascendente-Este enfoque implica el fraccionamiento de péptidos individuales generados por digestión proteolítica y la secuenciación de dichos péptidos mediante MS tándem. Posteriormente, se obtiene la secuencia proteica completa ensamblando las secuencias individuales. Para obtener una cobertura completa de la proteína, resulta necesario realizar digestiones por separado con múltiples proteasas con diferentes especificidades de ruptura para obtener una cobertura de superposición de secuencias a fin de reconstruir la secuencia general. Este enfoque es, en la actualidad, la aproximación basada en MS más utilizada que se usa para caracterizar productos terapéuticos de proteínas. 5. 7.1. 1.2 Descendente-Los avances en las tecnologías basadas en MS y en particular en la fragmentación ECD y ETD ofrecen otro enfoque para la secuenciación de proteínas, en el cual la proteína intacta se fragmenta para generar información de secuencias sin necesidad de una digestión previa de la proteína en péptidos más pequeños. Los desafíos actuales con este enfoque incluyen la necesidad de proteínas purificadas, la dificultad para obtener la cobertura de la secuencia completa, en particular para proteínas más grandes; la necesidad de cantidades considerablemente mayores de proteínas que para el enfoque ascendente, así como la necesidad de contar con un instrumento de alta resolución con capacidades ECD o ETD. Sin embargo, durante el desarrollo de productos terapéuticos de proteínas, la disponibilidad de grandes cantidades de proteínas purificadas es un escenario probable y, con el continuo avance de las tecnologías de MS, los enfoques proteómicos descendentes pueden ofrecer en el futuro una opción directa para la caracterización de algunos productos terapéuticos de proteínas. 5.7.1.2 Búsqueda en bases de datos: Debido al progreso en la secuenciación de genomas completos y al poder de cálculo de algoritmos predictivos para la anotación de todos los genes posibles, ARNm y proteínas a partir de información genómica, la caracterización de productos terapéuticos de proteínas y péptidos desconocidos raramente requiere la evaluación de secuencias de novo completa. En vez de esto, el compuesto se puede identificar inicialmente por digestión y secuenciación mediante fragmentación de péptidos. Esto es posible debido a que varias estrategias de fragmentación (p.ej., CID y ETD, según se describió anteriormente) producen fragmentos iónicos en fase gaseosa de péptidos protonados, con sitios de fragmentación consistentes en el esqueleto peptídico. La nomenclatura Roepstorff para fragmentación general de péptidos a lo largo del esqueleto peptídico se muestra en la Figura 6A. Los fragmentos de péptidos que mantienen una carga en el e-terminal son los iones x, y ó z, mientras que aquéllos que mantienen una carga en el N-terminal se conocen como iones a, b ó c. Al optimizar las energías de fragmentación y el gas de colisión para lograr un único evento de fragmentación por molécula peptídica protonada, los analistas pueden usar los espectros de fragmentación de un péptido dado para producir un conjunto de iones fragmento de la misma serie (es decir, iones b o iones y) cuya diferencia de masa corresponde a cada residuo aminoacídico en la secuencia. De esta manera, pueden derivar la secuencia. La Figura 68 presenta un esquema de un perfil de fragmentación peptídica con un conjunto completo de iones y. El conjunto completo de iones y permite determinar la secuencia a partir de la diferencia de masa entre los iones que corresponden a las masas de cada residuo aminoacídico. Con el desarrollo de bases de datos completas de muchos genes, transcripciones y proteínas, se ha desarrollado una serie de algoritmos disponibles comercialmente para buscar concordancias entre los datos experimentales de masas de fragmentos peptídicos con las secuencias de proteínas de las bases de datos. Como resultado, la confirmación de secuencias proteicas para proteínas conocidas puede automatizarse por completo para la recolección y evaluación de datos.
+
o
NH,~~
OH
-Figura 6A. Nomenclatura de fragmentación de péptidos.
USP 39
2108 (1736) Aplicaciones de la Espectrometría / Información General
H,N·Yts-l:PtT-tstP-1.S,COOH ~
Yions
n ........1_2_34_ _ •
519 4;;.;;.l;;;..8_ _ __
Y6
5 1 5 - - - - - -.... 703
Ys
V1
Y2
s
87 200
V1
Y3 p
97
s
Y4
87
T
101
400
p
97
s
87
MH+ y
163
600
800
miz
Figura 6B. Secuencia de fragmentación de péptidos. 5.7.1.3 Enfoques de secuenciación de novo: Cuando una proteína es completamente desconocida, se puede usar la fragmentación basada en MS para generar información de secuencias tal como se describió anteriormente. El desafío principal es la dificultad de obtener en todos los casos la información completa e inequívoca sobre las secuencias para algunos péptidos mediante fragmentación con MS debido a su vez, a la dificultad para asignar todos los aminoácidos en un espectro de fragmentación dado sin una plantilla de secuencias conocidas. En casos como éstos, puede ser necesaria una combinación de secuenciación química usando degradación de Edman y MS. Como alternativa, puede ser necesario digerir y secuenciar la proteína con múltiples proteasas para generar secuencias superpuestas a fin de asegurar la confiabilidad de las asignaciones de las secuencias.
5.7.2 GLICOCONJUGADOS El análisis de fármacos de esta clase se trata en el capítulo Análisis de Glicoproteínas y Glicanos-Consideraciones Generales (1084). Por ende, esta sección trata únicamente la aplicación de la MS a la caracterización de glicosilación proteica. Muchos productos biofarmacéuticos son glicoproteínas en las que la glicosilación desempeña papeles críticos para mantener la función, la estabilidad y la solubilidad. Las glicosilaciones más comunes son la glicosilación ligada a N y ligada a O, además de otras modificaciones por glicosilación tales como anclajes GPI. La N-glicosilación se refiere a la modificación de glicanos en la cadena lateral de asparagina, mientras que la 0-glicosilación ocurre en las cadenas laterales de serina y treonina. El análisis de MS de glicosilación de proteínas se puede realizar en tres niveles distintos: proteínas intactas, péptidos y glicanos. Esta sección provee una breve descripción general del análisis de glicoproteínas. 5.7.2.1 Análisis de proteínas intactas: Para proteínas de tamaño pequeño o glicosilación relativamente simple, el análisis directo de MS de proteínas intactas provee un perfil de masa que refleja la secuencia primaria de la proteína así como modificaciones mayores, incluyendo la glicosilación. Este tipo de experimentos en general se realiza usando analizadores TOF o analizadores con mayor resolución equipados con ionización ESI o MALDI. MALDI forma principalmente iones con una sola carga y requiere analizadores de MS con un intervalo amplio de miz para la medición de masa de proteínas intactas (p.ej.,TOF). El ESlMS es de uso común debido a que conlleva a la formación de iones de proteínas con cargas múltiples en el intervalo miz de 700-5000, lo que resulta en una mayor exactitud en la medición de la masa de proteínas (<100 ppm cuando se combina con un espectrómetro de masas de alta resolución). El análisis de MS puede, en muchos casos, resolver picos de proteínas por su distribución en glicoformas debido a las diferencias de masa (p.ej., hexosa 162 Da, HexNAc 203 Da y ácido N-acetilneuramínico 291 Da). La información sobre la masa puede llevar a la identificación de la composición de monosacáridos de las glicoformas. La intensidad de los picos de proteína intacta se puede usar para una estimación general de la distribución en glicoformas de la proteína. Para anticuerpos monoclonales modificados principalmente por N-glicanos neutros, la cuantificación de la distribución de la glicosilación mediante análisis de proteínas intactas parece ser comparable con la medición usando métodos de separación de glicanos. Los anticuerpos que contienen múltiples sitios de glicosilación se pueden escindir enzimáticamente en grandes dominios principales antes del análisis por MS para obtener información más específica sobre la posición de la glicosilación en la proteína intacta. 5.7.2.2 Análisis de péptidos: Para proteínas con glicoformas complicadas y múltiples sitios de glicosilación, en general es deseable obtener información sobre los sitios específicos donde ocurre la glicosilación en la proteína. Esta información se obtiene usando un enfoque proteómico "bottom-up", mediante el análisis de péptidos generados por digestión enzimática. Los péptidos se separan mediante HPLC en fase reversa seguida de análisis ESl-MSIMS. La fragmentación por MS-MS se puede realizar usando CID o ETD. En la CID-MSIMS, los péptidos pueden identificarse como péptidos glicosilados mediate la detección de iones oxonio en los espectros de péptidos MS-MS [p.ej., miz 163 (hexosa), 204 (HexNAc), 292 (ácido siálico) y 366
USP 39
Información General/ (1 736) Aplicaciones de la Espectrometría 2109
(hexosa-HexNAc)]. No obstante, los espectros de CID-MS/MS de péptidos glicosilados a menudo están dominados por fragmentación del glicano con fragmentación mínima entre los residuos de aminoácido de la cadena peptídica, lo que dificulta la capacidad de identificar la secuencia de proteínas. Los espectros ETD-MS-MS de péptidos glicosilados contienen principalmente fragmentación entre los aminoácidos (p.ej., rupturas en la cadena peptídica de tipo c y z), mientras que los glicanos adjuntos se mantienen intactos. La ETD-MS-MS provee información sobre la secuencia peptídica, el sitio de glicosilación, y la masa de los glicanos de los péptidos glicosilados. Se puede alternar el uso de la CID- y la ETD-MS-MS en el mismo análisis de HPLC-MS de digeridos de proteínas complejas, lo cual puede proveer la información necesaria para la identificación de secuencias, sitios de glicosilación, masa de glicanos y ramificación de glicanos. Los péptidos 0-glicosilados también pueden analizarse usando enfoques similares. La glicosilación de péptidos se puede identificar observando iones oxonio como por ejemplo el ión miz 204 en CID-MS-MS, y la secuencia de péptidos se identifica mediante ETD-MS-MS cuando las fracciones 0-glicano se mantienen unidas al péptido. 5.7.2.3 Análisis de glicanos: Los N-glicanos y 0-glicanos se pueden escindir enzimática o químicamente de las proteínas y luego ser analizados por MALDl-MS o ESl-MS ya sea directamente o después de la derivatización con etiquetas (tags) químicas para mejorar su ionización. El análisis MALDl-MS directo de glicanos escindidos se puede realizar en modo positivo o negativo para la detección de glicanos neutros y ácidos, respectivamente. Las matrices comúnmente usadas incluyen ácido 2,5-dihidroxibenzoico (DHB) y 2',4 6'-trihidroxiacetofenona. Los glicanos neutros en general se detectan como [M +Na]+ en iones positivos MALDl-MS. El análisis ESl-MS de glicanos presenta una pobre ionización de los glicanos, por lo que este método se utiliza sólo después de la derivatización química. Por ejemplo, la derivatización de glicanos escindidos de glicoproteínas se puede realizar en el residuo terminal reductor de los glicanos mediante aminación reductiva usando etiquetas fluorescentes tales como 2-aminobenzamida. Los glicanos marcados se analizan usando cromatografía de interacción hidrofílica seguida de análisis ESl-MS en modo de ionización positiva. Se puede determinar la masa molecular de los glicanos y el análisis MS-MS subsiguiente puede proveer información estructural sobre éstos. La permetilación es otro método importante de derivatización de glicanos que neutraliza glicanos ácidos y que permite detectar los glicanos neutros y ácidos mediante la MS en el modo de ión positivo. Los espectros de MS/MS de glicanos contienen iones de dos tipos principales de rupturas, según se ilustra en la Figura 1. La fragmentación glicosídica ocurre en los enlaces entre dos anillos de azúcares y resulta en iones B, C, Y y Z, lo cual provee información importante relacionada con la secuencia de monosacáridos y ramificación de glicanos. Las fragmentaciones en los anillos de los azúcares (mostradas en la Figura 7 por líneas discontinuas) implican la ruptura de dos enlaces en el mismo anillo de azúcar y produce iones A y X que ayudan a identificar el tipo de azúcares presentes en la cadena de los glicanos. Gracias al creciente conocimiento sobre la fragmentación de glicanos, la identificación de los mismos a partir de su espectro MS-MS es ahora posible mediante búsquedas en bases de datos usando algortimos generados por computadora recientemente desarrollados. 1,
Y2
,
1.sx1 Z2
,
,
'
1
CH20H:1
1
... ,
;
'o
1
1
,
'o
o
1
1 1
o
Zo
1
CH20H:
o
Yo
,~
Z1
1 1
CH20H
1,5Xo
Y1
o
R
1 I
1 1
,
OH
OH
o.2A1
,,
,,
81 C1
2.4A2
OH
,
1>' 82
2.sA3
83
C3
C2
Figura 7. Nomenclatura de fragmentación de carbohidratos. Fuente: Adaptado de Domon By Costello CE (1988). Glycoconj. /. 5, 397-409. 5.7.3 VACUNAS Las vacunas representan un desafío único debido a que a menudo incluyen mezclas complejas de proteínas, polisacáridos y lípidos en forma de bacterias o virus intactos, preparaciones de vesícula de membrana externa o combinaciones de proteínas recombinantes. El capítulo Vacunas para Uso Humano-Vacunas Bacterianas (1238) provee información general sobre vacunas bacterianas. El control de calidad de dichas mezclas por lo general se basa en la caracterización mediante SDS-PAGE, SEC, análisis de composición de aminoácidos o monosacáridos, RP-HPLC y otros métodos analíticos. Sin embargo, a la fecha, la MS no se ha usado como método de control de calidad primario a pesar de que se usa frecuentemente para confirmar la identidad y caracterización de impurezas. Debido a las muchas ventajas de la MS descritas en este capítulo y a su amplio uso en la caracterización de productos bioterapéuticos y vacunas que contienen mezclas de proteínas complejas, la MS y la MS-MS tienen la
211 O (1 736) Aplicaciones de la Espectrometría / Información General
USP 39
capacidad de identificar productos e impurezas de manera simultánea y, en un futuro, probablemente se adaptará para los entornos de control de calidad rutinario. Asimismo, cuando se presenta alguna complicación (p.ej., discrepancia entre valoraciones, actividad que cambia después de la formulación o modificación postraduccional), puede ser deseable la cuantificación de la proteína recombinante (dentro de un proteoma complejo) o un antígeno clave en una vacuna compleja de proteínas mediante un procedimiento altamente específico tal como la MS. El uso de métodos de dilución isotópica por MS-MS en combinación con barridos de monitoreo de reacciones múltiples puede proveer cuantificación altamente específica y exacta de proteínas en muestras complejas.
5.8 Métodos de las Monografías para Identificación Cualitativa Las descripciones de este capítulo y de Espectrometría de Masas (736) que abarcan las capacidades cualitativas de la MS proveen una fuerte justificación técnica para su uso como parte de una estrategia de identificación farmacopeica para una amplia variedad de clases de moléculas. La información estructural (p.ej., masa molecular, fórmula empírica, fragmentación estructuralmente importante y la caracterización de modificaciones biomoleculares tales como glicosilación) ha sido y seguirá siendo una parte integral de las estrategias de identificación. Se pueden combinar uno o más aspectos específicos de la información sobre los espectros de masas a fin de incrementar la especificidad y confiabilidad de la prueba propuesta. El desarrollo de la parte de espectrometría de masas en la prueba de identificación farmacopeica debe intentar proveer información única y complementaria que pueda usarse con otras pruebas de identificación propuestas en la monografía. El desarrollo del método también debe considerar la disponibilidad de un estándar de referencia para una exitosa identificación por espectrometría de masas.
6. ANÁLISIS CUANTITATIVO La MS es útil para la determinación cuantitativa de ingredientes activos o impurezas en un fármaco o en un medicamento debido a su selectividad y sensibilidad. La primera es un factor importante cuando los compuestos blanco están en matrices complejas (p.ej., naturales o formuladas), mientras que la segunda es relevante cuando deben medirse impurezas a bajas concentraciones. La selectividad se logra en métodos basados en MS mediante la combinación de atributos bien caracterizados del compuesto esperado, incluyendo masa molecular, características intrínsecas de ionización y fragmentación con datos adicionales tales como el tiempo de retención cromatográfico. Además de la selectividad cromatográfica, el uso de una separación cromatográfica ayuda a separar el compuesto esperado de otras entidades químicas de la muestra que podrían crear artefactos problemáticos (p.ej., supresión de ionización) si se introdujesen concomitantemente. Este enfoque general para analizar muestras (es decir, cromatografía combinada con espectrometría de masas) típicamente introduce el compuesto esperado en el espectrómetro de masas como un pico bien definido (idealmente, Gaussiano) que se puede integrar de manera reproducible para cuantificación óptima. Aunque existe la posibilidad de usar otras formas de introducción de la muestra (p.ej., procedimientos de inyección de flujo y de inserción directa tales como MALDI) y pueden ser necesarias en algunas aplicaciones, los sistemas de introducción cromatográfica son más comunes y se prefieren para la cuantificación con MS. Asimismo, aunque se pueden usar diversos tipos de espectrómetros de masas, el cuadrupolo y, en particular, el triple cuadrupolo son los más empleados para el análisis cuantitativo. Estos instrumentos proveen una combinación de especificidad, sensibilidad, estabilidad y respuesta lineal, la cual es esencial para la medición correcta de compuestos esperados, en particular con formulaciones complejas. Por estas razones, el resto de esta descripción sobre cuantificación enfatiza el uso de separaciones cromatográficas en conjunto con una detección mediante espectrómetro de masas cuadrupolo.
6.1 Información General sobre Cuantificación con Espectrometría de Masas Cuando se utiliza una separación cromatográfica previa al análisis por MS, la solución muestra se introduce mediante inyección en una columna cromatográfica apropiada y un flujo transportador (fase móvil de gas o líquido) haciendo avanzar los compuestos esperados y los demás componentes de la matriz a través de la columna a diversas velocidades determinadas por la fuerza de elución de la fase móvil (características del gas para GC, y fase orgánica, y modificadores de la fase móvil para HPLC), por la temperatura, y por la afinidad por la fase estacionaria (ver el capítulo (621 )). El efluente cromatográfico presurizado o cercano a la presión atmosférica se pasa a través de una interfase apropiada hacia la región de vacío del espectrómetro de masas. De esta manera, los componentes químicos dentro de la muestra entran en el espectrómetro de masas como picos cromatográficos que están sujetos a ionización conforme se define por el modo de ionización seleccionado y según la tendencia de cada producto químico a ionizarse en dichas condiciones experimentales. En el caso de la detección por MS de un solo cuadrupolo, el analizador de masas se ajusta para pasar al detector un ión con un valor miz que sea característico del compuesto de interés. En este modo de monitoreo de ión seleccionado (SIM, por sus siglas en inglés), se crea un perfil cromatográfico para un solo valor m/ z. Este proceso general produce un pico cromatográfico al tiempo de retención esperado para el compuesto esperado. Cuando el área por debajo de este pico se integra, se obtiene una medida de la concentración del compuesto de interés en la muestra original. La exactitud en una valoración cuantitativa
USP 39
Información General/ (1736) Aplicaciones de la Espectrometría 2111
basada en MS se logra mediante el uso apropiado de un estándar de referencia bien caracterizado e, idealmente, un estándar interno apropiado, conforme se describe en la sección 6.2.1 Estándares Internos. Para muchos análisis, la combinación de separación cromatográfica y análisis SIM MS proveerá suficiente selectividad para generar un análisis que esté lo suficientemente libre de interferencia química para cumplir con el requisito de la medición. No obstante, en algunos casos, puede ser necesario usar la selectividad adicional dada por la detección por MS en tándem que generalmente brinda un instrumento de triple cuadrupolo. Esta necesidad puede ser particularmente importante en los procedimientos analíticos de Categoría JI en los que se debe medir una traza de impurezas dentro de una formulación compleja. El beneficio relativo de la detección MS/MS se ilustra en el ejemplo extremo presentado en la Figura 8. El dextrometorfano antitusivo (Dex) está presente en un extracto de plasma a 100 pg/ml. Este extracto se analiza primero mediante HPLC-MS usando ESl-SIM a miz 272 (molécula protonada). En este experimento, el pico cromatográfico SIM correspondiente a Dex es apenas perceptible sobre el ruido relativamente alto. Como alternativa, se puede emplear un triple cuadrupolo para configurar un esquema de monitoreo de reacción seleccionada (SRM, por sus siglas en inglés) para lograr una mayor selectividad. El SRM es un caso especial de MS-MS de iones del producto en el que el segundo analizador de masas se ajusta para pasar únicamente un ión fragmentario seleccionado correspondiente al Dex (miz 147 en este ejemplo). Resulta evidente una marcada mejora en la selectividad y, por lo tanto, en la relación señal-ruido, y conlleva generalmente una mejora en el desempeño de los métodos analíticos cuantitativos.
(a) LC-MS (SIM,m/z272) 100
100 pg/mL Dex en Extracto de Plasma Productos del Espectro miz 272
50
147
100
171
213
~
-~
ñí
~
(b) LC-MS/MS (SRM,m/z272 --147)
272 50
MH+ DEX
121
"U
ro
"U
"iñ e: Q)
DEX
-e
44 80
120
160
200
240
280
masa-carga 50
o.o
0.4
0.8 Tiempo (min)
1.2
1.6
Figura 8. MS (SIM) contra MS-MS (SRM) para métodos cuantitativos.
6.2 Consideraciones y Procedimientos de Cuantificación Los métodos adecuados para aplicaciones de Categoría 1 y Categoría 11 requieren el uso de un estándar de referencia para cada analito de interés. La cuantificación de un compuesto de interés en una muestra de prueba preparada de manera apropiada se logra comparando su respuesta de espectrometría de masas (p.ej., área del pico cromatográfico derivado del SRM) con las respuestas de los estándares de referencia preparados de manera similar y que abarcan el intervalo de concentración requerido (ver Espectrometría de Masas (736), Validación y Verificación de Procedimientos Analíticos de Espectrometría de Masas).
6.2.1 ESTÁNDARES INTERNOS Para una precisión y exactitud óptimas, se deben usar estándares internos a una concentración uniforme en las muestra de prueba y en los estándares de referencia. Los estándares internos compensan por todas las pequeñas diferencias entre muestras con respecto al volumen de dilución o la pérdida de material durante el procesamiento de la muestra. Asimismo, compensan por fluctuaciones en la respuesta de MS entre análisis o por la variación en la sensibilidad durante el curso de los análisis de partidas, los cuales ocurren en todos los métodos basados en MS. En la práctica, los esquemas de detección selectiva se confi-
2112 (1 736) Aplicaciones de la Espectrometría / Información General
USP 39
guran para monitorear el compuesto esperado (analito) y su estándar interno correspondiente. Por lo tanto, la medición instrumental clave para cada estándar y muestra de prueba es un cociente entre las áreas de los picos cromatográficos del analito y el estándar interno. Los estándares internos pueden ser análogos del analito estructurales, o marcados con isótopos estables, del compuesto esperado. Los primeros pueden ser adecuados y a menudo tienen la ventaja de disponibilidad y menor costo. La alternativa de análogos marcados con isótopos (p.ej., 2 H, 13C, or 15N) ofrece un desempeño superior del método puesto que es esencialmente idéntico al analito en cuanto a propiedades químicas y físicas, a excepción de una masa molecular mayor. Los únicos requisitos son que los trazadores isotópicos no sean susceptibles de intercambio químico durante el almacenamiento o preparación de las muestras, que se conserven en el proceso de ionización de MS y que brinden un cambio suficiente respecto a la masa molecular del analito (típicamente 3+ Da utilizando varios trazadores) para asegurar que las interferencias entre las señales del analito y del estándar interno serán despreciables (debido a los isótopos naturales y a la resolución de m/z variable en los diferentes analizadores de masas). Además, se debe tener cuidado de asegurar que el estándar interno contenga niveles despreciables de impurezas del compuesto de interés sin marcar, ya que podrían potencialmente ocasionar resultados sesgados. La aptitud del estándar interno se confirma después de la culminación exitosa de la validación del procedimiento analítico. 6.2.2 ADQUISICIÓN DE DATOS Para la integración exacta de los picos cromatográficos del analito y el estándar interno, los parámetros de adquisición de datos (p.ej., velocidad de muestreo, intervalo de barrido o masas monitoreadas) deben proveer un número suficiente de datos que abarquen el pico cromatográfico en todo su ancho. El número de datos adquiridos puede variar dependiendo de los requisitos de desempeño del método (ver la Tabla 7 del capítulo general (736)) y de las consideraciones prácticas relacionadas con las condiciones cromatográficas, el tipo de espectrómetro de masas y el número de analitos y estándares internos monitoreados. Por ejemplo, para valoraciones de un solo analito en los instrumentos basados en cuadrupolos, en los esquemas de monitoreo por SIM o SRM del analito y del estándar interno las señales se muestrean de manera alternada durante la corrida analítica. Con los instrumentos de cuadrupolo modernos, se logran fácilmente tiempos de residencia de 100 ms o menores por punto de muestreo y deben resultar en al menos ocho muestras a través de cada pico cromatográfico (éste es el mínimo sugerido para una buena representación cuantitativa del pico). 6.2.3 CALIBRACIÓN
Una curva de calibración se crea graficando los cocientes entre las áreas de los picos del analito y el estándar interno en función de la concentración de los estándares de referencia analizados. Para el intervalo de calibración algo acotado requerido para las mediciones de Categoría 1y Categoría 11, resulta suficiente un ajuste lineal (no ponderado) para definir esta función de respuesta frente a la concentración. No obstante, también se puede usar una ponderación 1 /x ó 1 /x2 , así como funciones no lineales (p.ej., cuadráticas) según se sustente mediante datos de validación apropiados. El intervalo de concentración de calibración se selecciona basándose en la sensibilidad del instrumento y los requerimientos de desempeño del método. En general, la concentración más baja debe generar señal suficiente para la reproducibilidad, mientras que la concentración más alta idealmente debe estar dentro del intervalo de respuesta lineal del sistema de MS. En casos extremos, el límite superior del intervalo de respuesta lineal puede ser el resultado de las limitaciones del analizador o detector de masas (p.ej., como en el caso de los instrumentos TOF y MS de trampa iónica, pero mucho menos en el caso de los analizadores de masa cuadrupolos). En la mayoría de los casos, la pérdida de linealidad resulta de una disminución de la eficiencia en la ionización a concentraciones más altas. Lo anterior es un aspecto general a considerar, por ejemplo, en el caso de ionización por electroespray en la que las altas concentraciones de analito pueden agotar cada vez más los iones de aductos ionizantes disponibles, lo que lleva a que, a medida que aumenta la concentración, el aumento de la señal detectada sea menor que el esperado de acuerdo a la proporcionalidad lineal. Este denominado fenómeno de supresión puede compensarse hasta cierto punto usando un estándar interno marcado con isótopos estables que coeluya con el analito y que, por ende, experimente una supresión proporcional similar. No obstante, el mejor desempeño del método se logra cuando la calibración cae dentro del intervalo lineal. 6.2.4 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA DE PRUEBA El alcance de los procedimientos aceptables de preparación de la muestra para análisis de MS cuantitativos es amplio y depende de muchos factores, incluyendo la clase química del analito, la composición y complejidad de la matriz, la concentración del analito esperado y el tipo de instrumental analítico disponible. Cuando resulte apropiada, la aproximación preferida será la simple disolución de la muestra seguida de la adición de estándar interno y posteriormente la dilución hasta una concentración esperada dentro del intervalo de calibración. Esta simplicidad minimiza la probabilidad de problemas de recuperación de analito y contaminación u otros errores del procedimiento que pueden comprometer la robustez de métodos más complejos. Siempre que el instrumento posea sensibilidad suficiente, el desempeño óptimo del método se logra generalmente con factores de dilución mayores (concentraciones menores de analito en la muestra preparada). Este enfoque no solo evita
USP 39
Información General/ (1 736) Aplicaciones de la Espectrometría 2113
problemas de autosupresión, sino que también minimiza la posibilidad de supresión de la ionización debida a componentes de la matriz que co-eluyen con el analito. Pueden ser necesarios procedimientos de preparación de la muestra más complejos para tratar los problemas relacionados con la clase química o la concentración de analito, así como la naturaleza de la matriz. En dichos casos, el uso de un estándar interno (particularmente estándares marcados con isótopos estables) es casi esencial para asegurar el desempeño adecuado del método. Para mejores resultados, la adición del estándar interno debe llevarse a cabo en la etapa práctica más temprana de la preparación de la muestra (p.ej., inmediatamente después de la disolución de la muestra de prueba). Por ejemplo, pueden ser necesarios procedimientos tales como extracciones líquido-líquido o extracciones en fase sólida para enriquecer (concentrar) los analitos de interés para lograr una mayor sensibilidad en el ensayo de valoración o para separar el analito de otros componentes de la matriz presentes en altos niveles y que pueden causar supresión de la ionización (p.ej., sales u otros excipientes). Puede resultar deseable la derivatización química de ciertos grupos funcionales de un analito para estabilizar la muestra (p.ej., para el análisis de Cromatografía de Gases-MS), mejorar el desempeño cromatográfico del método o mejorar la sensibilidad intrínseca para la detección (p.ej., para la ESI). Aunque dichos procedimientos agregan complejidad, son aceptables siempre y cuando el procedimiento analítico general pueda validarse apropiadamente. Un caso especial de preparación de muestra compleja que puede ser necesario para la cuantificación de compuestos macromoleculares tales como vacunas y productos bioterapéuticos implica la degradación intencional de las moléculas de analito en especies de menor tamaño que son más susceptibles al análisis cuantitativo con MS. Por ejemplo, la degradación parcial de una proteína terapéutica se puede lograr mediante digestión hidrolítica (química) o basada en enzimas (p.ej., tríptica) para generar fragmentos de péptidos que son característicos de la proteína original. Estas moléculas de menor tamaño pueden analizarse usando los principios descritos en esta sección (incluyendo el uso de estándares internos marcados con isótopos estables de cada péptido esperado) y los resultados pueden correlacionarse para determinar la concentración de la proteína esperada original. Además, mediante la medición de múltiples péptidos derivados de la proteína de interés, los analistas pueden lograr la verificación cualitativa (identidad) de la proteína con el mismo método. Por supuesto, este enfoque indirecto por lo general requiere cierto grado de purificación e identificación cualitativa de la macromolécula para asegurar que la subsiguiente medición cuantitativa de los péptidos representativos es relevante.
7. APLICACIONES EMERGENTES DE LA ESPECTROMETRÍA DE MASAS 7.1 Autentificación de Medicamentos y Detección de Contaminación Los materiales farmacéuticos falsificados, contaminados o adulterados son un amenaza para la seguridad del paciente, la confianza del consumidor y la seguridad del producto y, por lo tanto, representan una preocupación para los fabricantes farmacéuticos y los organismos reglamentarios. Debido a que el aumento en la incidencia de materiales farmacéuticos falsificados y contaminados ha aumentado las preocupaciones sobre la seguridad de la salud pública y de los productos, se han empleado numerosas medidas para detectar medicamentos falsificados y contaminados, así como para asegurar la integridad de la cadena de suministro. Dada su sensibilidad y especificidad, la espectrometría de masas es una herramienta analítica efectiva de aplicación amplia para determinar la autenticidad, la fuente o la contaminación de medicamentos. Los enfoques incluyen verificar la identidad de los ingredientes activos, determinar y comparar perfiles de impurezas, y la caracterización isotópica. 7 .1.1 IDENTIFICACIÓN Y/O VERIFICACIÓN DEL INGREDIENTE ACTIVO Los medicamentos falsificados pueden contener múltiples o diferentes ingredientes activos o ningún ingrediente activo. Los procedimientos de Cromatografía de Gases-MS, HPLC-MS o MS de infusión directa pueden proveer una verificación de la presencia o ausencia de un ingrediente activo o la identidad de otros ingredientes activos que pudieran estar presentes. Los medicamentos falsificados que contienen múltiples ingredientes activos o niveles muy altos de un solo ingrediente activo (muestras superpotentes), en general representan un mayor problema para la seguridad humana que aquéllos con pocos o ningún ingrediente activo. En tales casos, la MS puede proveer evidencia positiva e inequívoca de los componentes, así como información cuantitativa suficiente para perseguir a los responsables de producir productos falsificados. 7 .1 .2 PERFIL DE IMPUREZAS Los perfiles de impurezas pueden indicar la contaminación de un medicamento o pueden distinguir un producto auténtico de uno falsificado. Los perfiles de impurezas sirven como huellas dactilares para un fármaco o producto formulado proveniente de una fuente en particular. Se pueden usar técnicas combinadas tales como HPLC-MS y Cromatografía de Gases-MS para resolver e identificar impurezas específicas del proceso que son características de una vía sintética particular, lo cual puede ser útil para determinar el origen y la distribución de materiales falsificados. Las variaciones en el perfil de impurezas del material auténtico y los cambios en el perfil con el paso del tiempo y las condiciones de procesamiento deben ser considerados por los analistas al usar los perfiles de impurezas para la identificación o como indicadores de contaminación potencial. En el caso de productos que se sospeche sean falsificados, la similitud de los perfiles de impurezas no necesariamente indica que una mues-
2114 (1736) Aplicaciones de la Espectrometría / Información General
USP 39
tra sospechosa sea auténtica. En dichos casos, puede ser necesaria la investigación adicional usando procedimientos ortogonales. 7.1 . 3 CARACTERIZACIÓN ISOTÓPICA Los isótopos estables de elementos tales como carbono, nitrógeno, hidrógeno y oxígeno ocurren de forma natural en productos farmacéuticos y materias primas. Las relaciones isotópicas dependen principalmente de los materiales iniciales y de los procesos usados para producir fármacos y medicamentos, y pueden ser altamente específicas para una partida dada. Por ende, las relaciones isotópicas pueden definir una huella dactilar isotópica para un material dado, y las diferencias observadas en las relaciones isotópicas específicas entre partidas pueden usarse para autentificar materiales o indicar su posible contaminación. La espectrometría de masas por relación isotópica (IRMS, por sus siglas en inglés) es una poderosa herramienta para la autentificación farmacéutica o la detección de una posible contaminación en medicamentos y materias primas. La IRMS consigue un alto nivel de especificidad, exactitud y precisión en la determinación de ciertas relaciones isotópicas elementales (p.ej., carbono, nitrógeno, oxígeno e hidrógeno) en fármacos o medicamentos. Debido a que las relaciones isotópicas específicas pueden verse influidas por múltiples factores tales como la ubicación, el clima, las diferencias de proceso, y el origen y calidad de las materias primas, la IRMS es capaz de proveer información que no sólo es útil para autentificar un medicamento, sino también para indicar el origen del medicamento u otro material. Esto es particularmente importante al determinar si los medicamentos falsificados que se hayan obtenido en lugares distintos provienen de un mismo proceso de fabricación, o para vincular un producto con su sitio de fabricación original. La Figura 9 ilustra las diferencias sutiles pero notorias entre muestras de medicamentos auténticos de tres sitios de fabricación globales y las obvias diferencias entre los medicamentos auténticos y tres medicamentos falsificados. Además, la IRMS aborda la autentificación desde una perspectiva posterior a la producción y no requiere de marcado ni alteración del medicamento, como podrían requerir otras tecnologías de autentificación farmacéutica.
'1' e:. al
o
o.
:>
o
...tO
®
e~
<'?
~
C2
Figura 9. Gráfica bivariada de composición isotópica estable (oBC contra 81 5 N) de medicamentos auténticos de tres sitios de fabricación globales (Sitios 1-3) y tres medicamentos falsificados (Cl-C3).
(1761) APLICACIONES DE LA ESPECTROSCOPÍA DE RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR Cambio en la redacción:
PRINCIPIOS GENERALES DE LA RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR La espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN) es una técnica analítica basada en las propiedades magnéticas de algunos núcleos atómicos. La RMN es similar a otros tipos de espectroscopía en el sentido de que la absorción de energía electromagnética a frecuencias características proporciona información analítica. Sin embargo, la RMN se diferencia de otros tipos
USP 39
Información General/ (1761) Aplicaciones de la Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear 2115
de espectroscopía debido a que los niveles discretos de energía entre los cuales ocurren las transiciones se generan colocando los núcleos en un campo magnético con una intensidad H0 • Aunque la intensidad inicial del campo aplicado es H0, al colocar la muestra en el magneto, la intensidad del campo en la muestra 80, se define a continuación:
Ba = µsHo
[1]
en donde µ 5 es la susceptibilidad magnética de la muestra. Los núcleos atómicos se comportan como si giraran alrededor de su eje. El momento angular del núcleo, p 0, se caracteriza por un número cuántico de espín (f). El componente máximo observable del vector angular, p, es p
= lh/2n = lh
[2]
en donde h es la constante de Planck y h es la constante de Planck modificada. La Tabla 1 presenta los valores de I en función del número de masa y del número atómico. Tbl1 spm 'N º ' dei os Numeros d e Masa y A' a a . Va ores d e E ucIear En Func1on tomco Número de Masa
Número Atómico
Espín Nuclear (1)
Impar
Par o Impar
1/2, 3/2, 5/2 ...
Par
Par
o
Par
Impar
1, 2, 3 ...
El momento angular crea un momento magnético, µ, que es paralelo y directamente proporcional a p.
µ = yp = ylh
[3]
donde y es la constante giromagnética que es igual para todos los núcleos de un isótopo dado, independientemente de su posición en una molécula. Cuando se someten a un campo magnético externo estático y uniforme, los núcleos con un número cuántico de espín I * O se alinean con dicho campo en ciertas orientaciones posibles (21 + 1). Por lo tanto, para núcleos con I = 1/2, que incluye a la mayoría de los isótopos analíticamente importantes (Tabla 2), existen dos orientaciones posibles que corresponden a dos estados de energía distintos. Las energías de estos dos estados son ± µ8 0 y su separación es
E= µ8 0 -
(-
µ8 0) = 2µ8 0
[4]
con un exceso de núcleos poblando el estado de energía más bajo (-µ8 0) con respecto al estado de energía alta más alto (+µ8 0). Las poblaciones concuerdan con la distribución de Boltzmann: N+f N_ = exp(-E!kl)
[5]
donde N+ y N_ son las poblaciones de los estados de energía altos y bajos, respectivamente; k es la constante de Boltzmann; y Tes la temperatura en K. Una resonancia nuclear es la transición entre estos estados, y las transiciones hacia estados superiores o inferiores son igualmente posibles. En un campo magnético estático, el eje magnético nuclear presenta un movimiento de precesión (precesión de Larmor) sobre el eje 80• La velocidad angular del movimiento de precesión a menudo se denomina frecuencia de Larmor, ro 0, y se relaciona con 80:
E=hv=2µB 0 = 2ylfiB0
= yfiB0 V=
OJo
rBo/27r
= YBo
[6)
La resonancia se logra irradiando energía de un campo oscilante de radiofrecuencia (rf), cuando la frecuencia del campo de frecuencias de radio iguala a la velocidad angular del movimiento precesional. Aunque la probabilidad de una transición hacia un nivel superior es igual que la de hacia un nivel inferior, ocurren más transiciones hacia niveles superiores debido a que N_ es mayor que N+. Por consiguiente, ocurre una absorción general de energía. Tal como se muestra en la Tabla 2, la frecuencia de resonancia de un núcleo es directamente proporcional a la intensidad del campo magnético.
2116 (1761) Aplicaciones de la Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear/ Información General
USP 39
Tabla 2. Propiedades de Algunos Núcleos Susceptibles de Estudio Mediante RMN Frecuencia de Resonancia (MHz) en el
I
Abundancia Natural (%)
lH
1/2
99,98
1,00
13(
1/2
1,108
0,0159
15,087
75,432
125,721
19F
1/2
100
0,83
56,446
282,231
470,385
Núcleo
Sensibilidad
1,4093 p
7,0463 T
11,7440 T
60,000
300,000
500,000
31 p
1/2
100
0,0663
24,289
121,442
202,404
llB
(3/2)
80,42
0,17
19,250
96,251
160,419
ª T ~tesla: 1,4093 T ~ 14,093 kilogauss. La RMN es una técnica de alta especificidad pero con sensibilidad relativamente baja. La razón de su baja sensibilidad reside básicamente en la comparativamente pequeña diferencia de energía entre los estados superior e inferior de energía (intensidad de campo de 0,08 joules a 1,5 a 2,0 T), lo que resulta en una diferencia de población entre los dos niveles de apenas unas pocas partes por millón. Otro aspecto importante del fenómeno de la RMN que afecta negativamente la sensibilidad son los largos tiempos de permanencia en el estado excitado de la mayoría de los núcleos, lo que afecta el diseño de la prueba analítica de RMN, en especial en experimentos de pulsos repetitivos. La adquisición simultánea del espectro completo de frecuencias de resonancia en lugar de barrer las frecuencias permite mayor sensibilidad por unidad de tiempo. Todas las características de la señal (desplazamiento químico, multiplicidad, ancho de la línea, constantes de acoplamiento, intensidad relativa y tiempo de relajación) proporcionan información analítica. La utilidad analítica de la RMN se basa en la observación de que los mismos tipos de núcleos, cuando se ubican en diferentes ambientes moleculares, presentan frecuencias de resonancia diferentes. La razón de esta diferencia es que el campo efectivo asociado con un núcleo particular se compone del campo externo provisto por el instrumento y el campo generado por la circulación de los electrones circundantes. Este último campo generalmente se opone al campo externo y reduce la intensidad general del campo en el sitio nuclear. Este fenómeno se denomina apantallamiento. En consecuencia, los núcleos más apantallados tendrán frecuencias de Larmor menores. La medición exacta de los valores absolutos de las frecuencias de transición, tal como se lleva a cabo con otros procedimientos espectroscópicos, no es conveniente. Sin embargo, conviene medir con exactitud la diferencia de las frecuencias entre dos señales de resonancia. La posición de una señal en un espectro de RMN se describe mediante su separación de otra señal de resonancia tomada arbitrariamente como estándar. Dicha separación se denomina desplazamiento químico y se puede expresar en unidades de campo magnético o en unidades de frecuencia que se pueden convertir recíprocamente mediante la ecuación para la condición de resonancia, la Ecuación 6. Cuando la separación se expresa en unidades de frecuencia, esta ecuación muestra que la resonancia es directamente proporcional a la intensidad del campo. Por lo tanto, resulta más conveniente expresar el desplazamiento químico en términos de la unidad dimensional o, la cual es independiente de la intensidad del campo y se define mediante
donde Y 55 es la frecuencia de resonancia de la sustancia de prueba, en Hz; YRs es la frecuencia de resonancia de referencia en Hz; y Yo es la frecuencia del instrumento, en MHz. Cuando Yo se expresa en unidades de MHz, entonces la Ecuación 7 se expresa en unidades como partes por millón (ppm). Por consiguiente, resulta común usar la unidad ppm para expresar la diferencia de desplazamiento químico entre el pico de resonancia de la sustancia de prueba y aquél de la referencia. Mediante esta ecuación, resulta posible usar como referencia de desplazamiento químico (tomando las precauciones adecuadas) el desplazamiento químico de cualquier muestra conocida (tal como el correspondiente a los 1 H residuales en un disolvente deuterado). Esta ecuación, hoy en día de uso común, se puede aplicar a casi todos los núcleos. El tetrametilsilano (TMS) es la referencia de desplazamiento químico de uso más amplio para espectros de protones y carbono. Es químicamente inerte, presenta sólo un pico (que está más apantallado que la mayoría de las señales) y es volátil, lo que permite una fácil recuperación de la muestra. Tanto 2,2,3,3-d 4 -3-(trimetilsilil)propionato de sodio (TMSP, por sus siglas en inglés) como 2,2-dimetil-2-silapentano-5-sulfonato de sodio (DSS) se usan como referencias en la RMN en soluciones acuosas. La frecuencia de resonancia de los grupos metilo de TMSP o de DSS se aproxima mucho a la de la señal del TMS. Cuando no es aconsejable usar un material de referencia interno para la RMN, se puede usar un material de referencia externo tal como un estándar de referencia en otro tubo de RMN. Los espectros de RMN convencionales se presentan con un aumento en el apantallamiento y una disminución en el desplazamiento químico de izquierda a derecha debido a que los núcleos menos apantallados tienen frecuencias de Larmor más altas que los núcleos más apantallados. Se dice que los picos de resonancia que aparecen a la derecha presentan un mayor apantallamiento (es decir, presentan una mayor densidad electrónica) que los que aparecen a la izquierda; éstos últimos carecen de apantallamiento (menor densidad electrónica). A menudo, se denominan las resonancias de los núcleos con mayor apantallamiento y con menor apantallamiento inapropiadamente como picos de campo alto o campo elevado y de campo bajo o campo inferior, respectivamente, como resultado del método desactualizado de adquisición de datos mediante barrido del campo
USP 39
Información General/ (1761) Aplicaciones de la Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear 2117
magnético. En la actualidad, la abrumante mayoría de los espectros se adquieren por pulsos en un espectrómetro de transformada de Fourier (FT), el cual no realiza barridos del campo magnético ni de radiofrecuencia. Por lo tanto, resulta más apropiado referirse a las resonancias del lado izquierdo del espectro como resonancias de alta frecuencia o desapantalladas y a aquéllas del lado derecho como resonancias de baja frecuencia o apantalladas. El sistema de acoplamiento entre dos núcleos se puede describir en términos de la constante de acoplamiento de espín-espín, /, que es la separación (en hercios) entre los picos individuales de un multiplete. Cuando dos núcleos interactúan ocasionan una división recíproca de sus resonancias, y las constantes de acoplamiento medidas en los dos multipletes resultantes son iguales. Además, /es independiente de la intensidad del campo magnético. A menudo, los sistemas de acoplamiento por espín se citan como débiles o fuertes. Estos términos se relacionan con la separación de las frecuencias de Larmor de los núcleos acoplados en comparación con la constante de acoplamiento entre ellos. Ambos valores se miden fácilmente a partir del espectro. La separación !J.v se mide en Hz y se la compara con /, que siempre se expresa en Hz, en consecuencia, el cociente entre los dos es adimensional. Para un sistema de acoplamiento débil, el cociente es grande. Por lo general, los espectroscopistas consideran débil un cociente superior a 1O. Únicamente los sistemas de acoplamiento por espín débiles producen espectros de primer orden, que son relativamente fáciles de analizar. Se pueden predecir el número de picos individuales que se espera estén presentes en un multiplete y las intensidades relativas de los picos. El número de picos se determina mediante 2 ni + 1, donde n es el número de núcleos idénticos en grupos adyacentes que están activos en la división e I es el espín de aquellos núcleos que ocasionan la división. Para los protones, esto se transforma en picos de (n + 1). En general, la intensidad relativa de cada pico en el multiplete prosigue al coeficiente de la expansión binómica (a+ b)n. Estos coeficientes se pueden encontrar convenientemente usando el triángulo de Pascal, el cual produce las siguientes áreas relativas para los multipletes especificados: doblete, 1 :1; triplete, 1 :2:1; cuarteto, 1 :3:3:1; quinteto, 1 :4:6:4:1; sexteto, 1:5:10:10:5:1; y septeto, 1 :6:15:20:15:6:1. La Figura 7 presenta dos ejemplos de espectros de primer orden que surgen de acoplamientos débiles.
v, ÍAX
JAX
__.;..+ 1 I 1
'14---
1
-+: :+
v,
Figura 1. Representación en diagrama de espectros simples que resultan de sistemas de espín de acoplamiento débil. El acoplamiento puede ocurrir entre 1 H y otros núcleos, tales como 19 F, 13 C y 31 P. Este tipo de acoplamiento con frecuencia puede observarse entre núcleos separados por enlaces 1-5. Los núcleos magnéticamente activos con/~ 1, tales como el 14 N, poseen momento nuclear cuadrupolar, el cual produce un ensanchamiento de las señales de los núcleos colindantes. Otra característica de una señal de RMN es su intensidad relativa, la cual tiene una amplia variedad de aplicaciones analíticas. En experimentos cuidadosamente diseñados, el área o la intensidad de una señal es directamente proporcional al número de protones que dan origen a la señal. Como resultado, la RMN se puede usar para cuantificación (ver Análisis Cuantitativo en estecapítuloyenelcapítulo 4 '" · ••• ·.•• " ."· .,. ••····· ··• .:"··· · · : 1.-11&11......l&fllllllfl Los espectros de RMN pueden presentar bandas de giro laterales, que son picos que aparecen simétricamente localizados a ambos lados de cada señal. Estas señales se deben a la incapacidad de compensar las resonancias fuera del eje (x e y) óptimamente. La homogeneidad de los magnetos superconductores modernos, aunados con técnicas de compensación por computadora, reducen la necesidad de giro de la muestra y eliminan por completo dichas bandas laterales.
llllllJm).
2118 (1 761) Aplicaciones de la Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear/ Información General
USP 39
ESPECTRÓMETROS DE RMN Introducción Los espectrómetros de RMN han evolucionado desde la producción en 1952 del primer instrumento comercial, el Varian HR-30 que operaba a 30 MHz. En un inicio, los espectrómetros de RMN empleaban una técnica de adquisición de datos conocida como onda continua (CW, por sus siglas en inglés), que se basaba en el barrido del campo magnético. Las limitaciones de un espectrómetro de onda continua incluyen una baja sensibilidad y un tiempo largo de análisis. Hoy en día, los espectrómetros operan a frecuencias de hasta 1 GHz y aplican un pulso de radiofrecuencia a la muestra para producir una señal en dominio de tiempo conocida como señal de decaimiento libre inducida (FID, por sus siglas en inglés), que posteriormente se somete a una transformada de Fourier para obtener una señal en el dominio de frecuencia. Esta técnica se conoce como espectroscopía de RMN por Transformada de Fourier. Los espectrómetros de RMN actuales presentan varios componentes clave: el magneto, la sonda, la consola y la computadora. Los instrumentos se describen por la frecuencia de resonancia aproximada de la resonancia de 1H, p.ej., 600 MHz o por su intensidad de campo, p.ej., 14, 1 T.
El Magneto Hasta principios de la década de 1970, los magnetos para RMN eran electro-imanes con núcleo ferromagnético o imanes permanentes que operaban a intensidades de campo de 1,41-2,35 T, que corresponden a frecuencias de resonancia de ,H de 60; 80; 90 y 100 MHz. Los primeros magnetos para RMN basados en superconductores se introdujeron en la década de 1960 y permitieron el acceso a intensidades de campo mucho más fuertes, en la actualidad tan grandes como 23,5 T (1 GHz). El magneto superconductor es el componente más caro de un espectrómeto de RMN y su precio puede alcanzar hasta varios millones de dólares. Estos magnetos están compuestos por kilómetros de alambre Nb 3Sn o NbTi. Se logra convertirlos en materiales superconductores enrollándolos en un solenoide que posteriormente se sumerge en helio líquido a 4,2 K. El hecho de ser superconductores permite inducirles una corriente eléctrica que se mantendrá por muchos años incluso después de retirar la fuente de energía. Dicha corriente eléctrica, que es esencialmente constante, se usa para generar campos magnéticos estáticos elevados que pueden superar ampliamente a los obtenidos con imanes de núcleo ferromagnético. El único mantenimiento requerido para conservar dichos campos elevados es asegurarse de que la bobina superconductora esté sumergida en helio líquido en todo momento. La Figura 2 contiene un diagrama de un magneto superconductor típico. El solenoide superconductor se sumerge en una unidad Dewar con helio líquido a 4,2 K. Esta unidad a su vez se encuentra contenida en una unidad Dewar con nitrógeno líquido a 77,4 K. Cada unidad Dewar está rodeada por un espacio al vacío y un recubrimiento de película reflectora que evita el ingreso de calor externo del laboratorio en la unidad Dewar que contiene el helio. El núcleo central u orificio a temperatura ambiente provee espacio para la pila que contiene las bobinas compensadoras para realizar la compensación a temperatura ambiente. Finalmente la sonda se inserta en la pila. Las muestras se insertan o se extraen de la sonda mediante un chorro de aire o nitrógeno filtrado y seco.
Orificio a temperatura ambiente N, liquido
He liquido
Bobina principa.!....I------11-+--Hf--ll---t=H del magneto
Figura 2. Representación esquemática de un magneto superconductor.
USP 39
Información General/ (1761) Aplicaciones de la Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear 2119
Un avance reciente importante en la tecnología de los magnetos es la construcción de magnetos blindados con campos de dispersión que pueden extenderse en tres dimensiones hasta sólo uno o dos metros desde el centro, por lo que son mucho más fáciles de instalar que los magnetos sin blindaje. Además del solenoide principal, la unidad Dewar que contiene helio también contiene otras varias bobinas superconductoras que se usan para compensar el campo magnético principal como primera etapa para conseguir una homogeneidad de campo muy alta. La compensación adicional se logra con 20-30 bobinas en la pila de compensación para temperatura ambiente que se inserta en el hueco del magneto. Dichas bobinas operan a temperatura ambiente y se usan para generar pequeños campos magnéticos que se oponen y cancelan la falta de homogeneidad ocasionada por el entorno, por la sonda o por la muestra misma. El software de la computadora se hace cargo de gran parte del trabajo tedioso que implica la compensación de la homogeneidad del magneto, una tarea crítica para obtener buenos datos de RMN. Los espectroscopistas pueden generar un mapa de campo para cada una de las bobinas de compensación usando la señal de fijación de campo de la muestra. Posteriormente, usando dicho mapa, la computadora calcula la cantidad de corriente que se debe aplicar a cada una de las bobinas de compensación para maximizar la homogeneidad del magneto. Por lo regular, esta operación toma menos de un minuto para la compensación de las bobinas de compensación en el eje (z 7 a z6 ). Las faltas de homogeneidad fuera de este eje (x/y) se pueden compensar de manera similar aunque, generalmente, se requiere un periodo más largo (15-20 minutos) debido al mayor número de bobinas fuera del eje vertical.
La Sonda La sonda para RMN es posiblemente la parte más importante del instrumento. La sonda consta de una o dos bobinas de radiofrecuencia, cada una de las cuales es inductiva (L) y se encuentran en un circuito que contiene varios elementos capacitivos (C) ajustables. Estos elementos se ajustan para permitir que la sonda transmita y reciba a la frecuencia de Larmor, v 0• Para un núcleo dado, el ajuste de la sonda se determina mediante [v = 1 /(2rc(LC) 1 12 )]. Un pulso de radiofrecuencia a la frecuencia de Larmor resulta en un campo magnético aplicado (8 7). Para inducir una transición, 8 7 debe aplicarse de manera perpendicular al campo estático generado por la bobina superconductora del magneto. La bobina de radiofrecuencia no sólo transmite el pulso de excitación, sino que también se modifica electrónicamente para recibir la señal de radiofrecuencia de la muestra. El tubo de muestra para RMN más común es el tubo para RMN de 5 mm (diámetro externo). Sin embargo, los diseños de las sondas son muy variados. Algunas sondas pueden acomodar tubos de 1 O ó 20 mm para muestras abundantes, tales como petróleo y polímeros. Para casos donde sólo se cuenta con cantidades limitadas de muestras valiosas, se han diseñado sondas que permiten aceptar tubos muy pequeños de hasta 1 mm, los cuales pueden acomodar soluciones de muy poco volumen de hasta 5 µL. Asimismo, se encuentran disponibles sondas de flujo para obtener directamente los datos de un efluente de cromatografía líquida. Las sondas están disponibles en una gran variedad de configuraciones de bobinas, donde la más común generalmente contiene una bobina receptora u observadora de banda ancha ajustable a un amplio rango de frecuencias (3 1 P a 1º9 Ag), una bobina desacopladora para protones ( 1 H) y una bobina ajustable al deuterio (2 H) para fijar la frecuencia de campo. Por lo general, la bobina desacopladora se somete a un doble ajuste para 1 H y 2 H. Las configuraciones de la sonda pueden incluir hasta cuatro canales para trabajo multidimensional con macromoléculas biológicas. La sonda puede presentarse en un formato en el que la bobina observadora de núcleo X (p.ej., 13 C) se enrolla lo más cerca posible de la muestra para conseguir la sensibilidad más alta, mientras que la bobina desacopladora (1 H) se encuentra más alejada. También se encuentra disponible la configuración inversa para proveer la máxima relación señal-ruido (S/N) para 1 H, el núcleo detectado en experimentos heteronucleares indirectos bidimensionales tales como espectroscopía de coherencia heteronuclear cuántica sencilla (HSQC, por sus siglas en inglés) y correlación heteronuclear de enlaces múltiples (HMBC, por sus siglas en inglés) donde el núcleo X se detecta de manera indirecta mediante la frecuencia de 1 H. Los avances recientes en la tecnología de las sondas han resultado en una sonda individual que combina la sensibilidad de las sondas de detección directa e inversa descritas anteriormente. Otro avance en el diseño es la sonda enfriada criogénicamente en la que las bobinas de radiofrecuencia y sus preamplificadores se mantienen cerca de las temperaturas del helio líquido (20 K). Debido a que los electrónicos de radiofrecuencia generan niveles menores de ruido a temperaturas más bajas, se pueden incrementar las relaciones señal-ruido en factor de cuatro o mayor usando estas sondas. Puesto que la relación señal-ruido de un espectro es provista por ni1 2, donde n es el número de adquisiciones, una mejoría por un factor de cuatro en la relación señal-ruido inicial se traduce en un ahorro de tiempo 16 veces menor, o una reducción a la cuarta parte en la cantidad de muestra. Además, las sondas pueden estar equipadas con bobinas de gradiente capaces de aplicar un gradiente de campo magnético únicamente en la dirección z o en las direcciones x, y y z. Estos gradientes se usan para estudiar la difusión o, con mayor regularidad, como partes integrales de las secuencias de pulso debido a que proveen un medio eficiente para seleccionar coherencias específicas en experimentos bidimensionales. Además de las bobinas electrónicas, las sondas por lo general están equipadas con un bobina calentable que permite trabajar con una temperatura variable de -100º a+ 150º. Asimismo, las sondas tienen entradas para gases para permitir la inserción o expulsión de la muestra, y para permitir que la muestra gire. Para muestras en estado sólido, las sondas incluyen rotores cilíndricos que se llenan con la muestra y posteriormente se tapan. Es posible orientar todo el rotor a un ángulo de 54,74º (conocido como el ángulo mágico) con respecto a la dirección del campo magnético y se hace girar a velocidades de hasta 70 kHz. La rápida rotación en dicho ángulo ayuda a eliminar la aniso-
2120 (1761) Aplicaciones de la Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear/ Información General
USP 39
tropía por desplazamiento químico y el acoplamiento dipolar, con lo que es posible reducir considerablemente las resonancias de gran amplitud observadas en el estado sólido.
La Consola y la Computadora La consola de RMN tiene la función primaria de generar las diferentes frecuencias de Larmor requeridas para un experimento dado, amplificando y transmitiendo dichas frecuencias a la sonda, y detectando la señales resultantes que se transmiten desde la sonda de modo que se puedan usar para crear un espectro de RMN. Además de dichas funciones primarias, la consola lleva a cabo muchas más operaciones las cuales son controladas en su totalidad por una computadora. La Figura 3 presenta un diagrama esquemático que ilustra los diversos componentes de la mayoría de las consolas de los espectrómetros de la actualidad. r---~~;~~~;~~~-~-~-~~~~-;--------------------------------------------------1
Impresora
Computadora
'------~-i~i!~!--~--~~-~I~~-ª-------------------------------------- ----------------- __ ¡ ·------------- ·- -· - ---------------------------- ----------------------------- -------------------------------------------------------------- --------------------------1 ;
Sintetizador
B
Transmisor
Programador
C
de pulsos
de frecuencias
D
observador
Oscilador local
Oscilador local
Amplificador de FI
Mezclador
Convertidor de señal
K
análoga a digital
J
Amplificador
N
de audio
Detector de fase
Preamplificador H
en cuadratura
! L_____________________________________________ ------- -------------------------------------------------------------------------------------..------------------------------]
Desacoplador
E
·------------------·-----------------------------------·¡
Transmisor de A fijación de campo
Receptor de fijación
Amplificador F de gradiente
Control de frecuencia de campo 1
'
r··----------------------------.l:..,,_.,,=--~.,,=---"-="-·-·-·=:::.-:.=-:.·.-:.-=-.-.:.:."::"."::".:.-:.-.":.-.:.-=--"::".:.-:-."::".:.·::::.-:.-.:.""--"-=-!.---------------1
Figura 3. Diagrama esquemático de un espectrómetro de RMN. La computadora controla continuamente la señal que va al transmisor de fijación de campo (A) de modo que se pueda detectar la resonancia del material de fijación en el receptor de fijación para mantener control sobre el campo y la frecuencia. La computadora también controla el sintetizador de frecuencias (8) que genera las diversas frecuencias que son cercanas a las
USP 39
Información General/ (1 761) Aplicaciones de la Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear 2121
frecuencias de Larmor de los núcleos observados o perturbados. Para un experimento específico, la computadora activa el programador de pulsos (C) controlando el ancho, fase y forma de pulso, el cual a su vez envía señales temporizadas al transmisor observador (D), al desacoplador (E) y al amplificador de gradiente (F), dependiendo de las unidades requeridas para el experimento. Una vez que el núcleo observado en la sonda (G) ha sido excitado por un pulso del transmisor observador, la señal de radiofrecuencia resultante es amplificada en el preamplificador (H). Posteriormente, la señal se mezcla en el mezclador (f) con un oscilador local (/) para generar una frecuencia de radiofrecuencia menor, denominada frecuencia intermedia (FI) que se amplifica aún más (K). Una segunda etapa de mezclado, esta vez con un oscilador local diferente (L), resulta en una señal de audio que posteriormente se detecta en un detector de fase en cuadratura (M) antes de ser amplificada (N), convertida (O) de señal análoga a digital y almacenada en la computadora. Después de procesar la señal para crear un espectro, es posible convertir los datos digitales nuevamente en una señal análoga usando un convertidor de señal digital a análoga (P) e imprimirlos. El detector sensible a la fase (M) produce una salida denominada señal de decaimiento libre inducida (FID), que es una señal en dominio de tiempo, f(t). Cuando se utilizan dos detectores (M) con sus frecuencias de referencia desplazadas a 90º una de la otra, es posible distinguir las frecuencias que son positivas con respecto a la referencia de aquéllas que son negativas. Este sistema recibe el nombre de detección en cuadratura sensible a la fase (QPD, por sus siglas en inglés). Cada detector produce una FID, pero éstas estarán siempre desfasadas 90º entre sí. A una de las FID se la denomina "real", mientras que a la otra se la denomina imaginaria. La transformada de Fourier que se lleva a cabo en este caso recibe el nombre de transformada de Fourier compleja. La combinación de las señales de decaimiento libres inducidas real e imaginaria produce el espectro de frecuencia, F(w).
F(m) =
r: f
(t)exp-iOJt dt
[8]
Además del proceso de transformada de Fourier, la computadora también se utiliza para procesar los datos posteriormente a la adquisición. De este modo, el espectro en dominio de frecuencia que resulta de la transformada de Fourier compleja puede luego dividirse en fases, corregirse por línea base para eliminar distorsiones, integrarse para obtener las áreas de los picos y seleccionar los picos para proveer información de desplazamiento químico. La computadora también es capaz de proveer espectros calculados a partir de valores desplazamientos químicos y de constantes de acoplamiento, realizar ajustes de curvas de resonancia y resolver picos complejos superpuestos. Finalmente, los datos digitales se pueden convertir a su forma análoga mediante un conversor digital-análogo (O) e imprimirse.
RELAJACIÓN La RMN incluye dos tipos de relajación: La Relajación de Espín-Espín, en ocasiones denominada Relajación Transversal, o Relajación T2, y la Relajación de Espín-Entorno (red o retículo), en ocasiones denominada Relajación Longitudinal o Relajación T1• Al menos dos mecanismos contribuyen con la Relajación Transversal: la pérdida de señal debida a la falta de homogeneidad 80 y la relajación natural que ocurriría aunque el campo fuera perfectamente homogéneo. Los efectos combinados de estos dos mecanismos de relajación producen una nueva constante de tiempo para la relajación transversal, denominada T/.
Relajación Espín-Espín (Relajación Transversal) Después de un pulso de radiofrecuencia, el componente del vector de magnetización M 0 en el plano (x,y), Mxy, decaerá gradualmente hacia cero. El proceso es de primer orden y, tal como ocurre con otros procesos de primer orden, la velocidad instantánea de decaimiento de Mxy es directamente proporcional a su desplazamiento a partir del equilibrio. Cuanto más se desplace Mxy de cero, más veloz es su decaimiento y, a medida que se acerca a cero, el decaimiento se enlentece cada vez más. Por consiguiente, se aplica la Ecuación 9.
dMx/dt
OC
(-Mxy)
[9]
El proceso es análogo al decaimiento de un elemento radioactivo. Sin embargo, los espectroscopistas no se refieren a la velocidad de decaimiento de una FID en términos de su vida media, sino que se refieren a su vida 1/e, es decir, al tiempo que la FID toma en decaer a un valor que sea igual a 1/e de su valor original en el tiempo cero. Las manipulaciones matemáticas estándar de la Ecuación 9 producen
Mxy = M 0exp(-t/T/)
[1 O]
donde M 0 es la distribución de equilibrio dada por la Ecuación 9 y T/ es la constante de velocidad para el decaimiento. T/ es una medida de la velocidad con la que decae la señal, no del tiempo que le toma decaer. La velocidad de decaimiento es más rápida inmediatamente después del pulso debido a que en ese momento se encuentra más lejos de su posición de equilibrio, cero. Si la velocidad se mantiene constante a esta velocidad inicial, entonces la señal presentaría un decaimiento completo después de un T/. La Tabla 3 se preparó a partir de la Ecuación 7Oy presenta el porcentaje de Mxy remanente como una función de tiempo después de un pulso de 90º. En la Tabla 3 el tiempo se proporciona como el número de T/s.
2122 (1761) Aplicaciones de la Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear/ Información General
Remanente como una Función de Tlem o, en Unidades de T •
Tabla 3. Porcentaje de M Tiempo/T •
% Remanente
USP 39
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
3,0
4,0
5,0
100,0
60,7
36,8
22,3
13,5
5,0
1,8
0,7
Mxy se acerca asintomáticamente a cero y le tomaría un tiempo infinitamente largo para decaer por completo, pero el decaimiento por lo regular se considera completo cuando el tiempo ha alcanzado de 3 a 5 veces T/. Por tanto, dichos tiempos se usan comúnmente como tiempos de adquisición. Si se usan tiempos de adquisición menores de 3 veces T/, la FID se trunca y la subsiguiente transformada de Fourier conlleva a artefactos visibles de la línea base. El decaimiento de la señal produce el ancho del pico en el espectro final. Cuanto más rápido se produzca el decaimiento, más ancha será la línea. La relación matemática es: Av 112
= 1/{nT/)
[11]
donde Av 112 es el ancho del pico a su altura media.
Relajación de Espín-Entorno (Relajación Longitudinal) Después de un pulso de radiofrecuencia, los núcleos se excitan y pasan del estado de baja energía al estado de alta energía. Eventualmente los núcleos se relajarán volviendo al estado fundamental para restablecer la distribución de Boltzmann (ver la Ecuación 5). Este proceso se denomina relajación de espín-entorno. El proceso de recuperación es de primer orden y, tal como ocurre con otros procesos de primer orden, la velocidad instantánea de crecimiento de M, es directamente proporcional a su desplazamiento del equilibrio. Cuanto más se decrezca M, y más se aleje de M0, más rápido volverá a crecer, y a medida que se acerque a M 0 se en lentecerá su velocidad de crecimiento. Por tanto, se aplica la Ecuación 72. dM,/dt oc (M 0 - M,)
[12]
Las manipulaciones matemáticas estándar generan M, = M0{1 - exp(- t/T1)
[13]
Se debe tomar en cuenta que T1 es una medida de la velocidad con la que M, vuelve a crecer a M 0-no de cuánto tiempo tarda dicho crecimiento. La Tabla 4 se preparó a partir de la Ecuación 73 y presenta el porcentaje de recuperación de M, como una función del tiempo después de un pulso de 90º. En esta tabla, el tiempo se proporciona como el número de T1s. Tabla 4. Porcenta e de Recuperación de M, como una Función de Tiempo, en Unidades de T Tiem o/T1
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
3,0
4,0
5,0
% de Recuperación
0,0
39,3
63,2
77,7
86,5
95
98,2
99,3
A medida que M, se acerca asintomáticamente a M 0, su recuperación al 100% toma un tiempo infinitamente largo. Sin embargo, la recuperación normalmente se considera completa cuando ha alcanzado el 99%. Por tanto, los retrasos en la relajación de 5 T1 se usan comúnmente en secuencias de pulso. La velocidad de regreso más rápida a M 0 se da inmediatamente después del pulso puesto que es el momento en que M 0 se encuentra más alejado de su posición de equilibrio. Si la velocidad se mantuvo constante a esta velocidad inicial, entonces se lograría la recuperación total después de un T1•
ÁNGULO DE DEFLEXIÓN Durante un pulso de radiofrecuencia, se aplica un campo magnético (8 7) a la muestra. El vector de magnetización M realiza un movimiento de precesión sobre 8 1 de acuerdo con ro 1 = y8 1
[14]
donde ro 1 es la frecuencia de precesión y 8 1 es la intensidad del campo magnético aplicado a la muestra. Durante el tiempo que se aplica el pulso, M realiza un movimiento de precesión hacia un ángulo (a) dado por la velocidad del movimiento de precesión multiplicada por el ancho del pulso, en tiempo, (PW). Entonces, PW x ro 1 = a
= PW x y8 1
[15]
Los ángulos de deflexión por lo general se expresan en unidades de grados o en radianes. Por ejemplo, un pulso de 90º en ocasiones se denomina pulso n/2.
Ángulo de Deflexión Óptimo o Ángulo de Ernst El tiempo promedio requerido para optimizar la relación señal-ruido resulta de una secuencia de espera-pulso-adquisición que se repite tantas veces como sea necesario. Supóngase que durante un primer pulso, M 0 realiza un movimiento de precesión de 30º sobre 8 1 antes de apagar el pulso. En este momento, la magnitud de M, es M 0cos 30º. Al final del pulso, M, comen-
USP 39
Información General/ (1761) Aplicaciones de la Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear 2123
zará a crecer de nuevo hacia su valor de equilibrio, M0 • Por lo regular, el segundo pulso se aplica antes de que Mz alcance M0, lo cual reduce aún más Mz enviándolo más lejos de M0 • En consecuencia, Mz comienza a crecer nuevamente más rápido que antes debido a que se encuentra más lejos de su valor de equilibrio. Después de 6-1 O pulsos, Mz volverá a crecer en una cantidad igual al desplazamiento gradual ocasionado por cada pulso sucesivo y alcanzará un nuevo equilibrio o estado estacionario. Cada pulso sucesivo produce una deflexión de este nuevo valor de estado estacionario de Mz en 30º, resultando en una intensidad de señal para cada pulso. La posición del equilibrio en estado estacionario se determina mediante tres factores: la T1, el ángulo de deflexión y el tiempo entre pulsos. Por un lado, para un T, y tiempo entre pulsos determinados, si el ángulo de deflexión es demasiado grande, entonces el valor de estado estacionario de Mz estará cerca del origen, por lo que únicamente se conseguirá una señal pequeña. Por otra parte, si el ángulo de deflexión es demasiado pequeño, p.ej., 5º, entonces el valor de estado estacionario será grande, pero con un ángulo pequeño, el valor de M,sen 5º también será pequeño, por lo que nuevamente se conseguirá una señal pequeña. El ángulo óptimo a menudo recibe el nombre de ángulo de Ernst, que se calcula mediante: cos aopt
aopt
== exp(-PR/T1)
[16]
[17]
==are cos[exp(-PR/T,)]
donde PR es el tiempo entre pulsos o el tiempo de repetición de pulsos. Este tiempo es la suma del tiempo de adquisición usado para recolectar la FID libre inducida más los periodos de espera por relajación usado. Este ángulo provee un valor de estado estacionario razonablemente grande combinado con un ángulo razonablemente grande y producirá la mejor relación señal-ruido por unidad de tiempo. El valor de T, que se va a usar en la Ecuación 77 debe ser para el núcleo con la relajación más larga en la molécula.
PERIODO DE ESPERA POR RELAJACIÓN La relación señal-ruido óptima por unidad de tiempo se obtiene sorprendentemente cuando no se utiliza periodo de espera por relajación para un T, dado; es decir cuando el PR es igual al tiempo de adquisición AT. Sin embargo, debido a que en la mayoría de las moléculas los núcleos no tienen los mismos valores de T,, se perderá la relación de intensidad relativa. Para experimentos típicos de cuantificación, se usa un periodo de espera por relajación que debe ser al menos cinco veces el T, más largo esperado para cualquiera de los núcleos en la molécula; asimismo, el ancho del pulso debe establecerse a 90º. La sección Aplicaciones Cuantitativas proporciona mayores detalles.
RESOLUCIÓN En la espectroscopía de RMN, la resolución se define comúnmente como la capacidad para distinguir entre dos picos de resonancia situados cerca el uno del otro en un espectro. La norma industrial para medir la resolución se basa en medir el ancho de un solo pico, en unidades de Hz, a su altura media. El principio de incertidumbre determina la mejor resolución que se puede lograr en un espectro de RMN. La máxima resolución posible, o la mínima separación que se puede observar entre dos frecuencias, Liv, en un espectro es igual al recíproco del tiempo de adquisición, AT, de la FID. Li v == 1/ M == 1 /A T
[18]
El tiempo establecido por el operador del espectrómetro no debe exceder el AT requerido, debido a que esto resultaría solamente en la recolección de ruido después de haber decaído la señal hasta cerca de cero. La recolección de dicho ruido no mejora la resolución.
PROCESAMIENTO POSTERIOR A LA ADQUISICIÓN DE DATOS A menudo, la apariencia final del espectro se puede mejorar aplicando una variedad de procedimientos matemáticos a la FID antes de realizar la transformada de Fourier. Los dos procedimientos más comunes son multiplicar la FID por una función matemática, generalmente conocida como una función ventana; o agregando ceros al final de la FID, generalmente conocido como completado de ceros.
Funciones de Ventana Por lo general, se usan dos tipos: uno para incrementar la resolución y otro para incrementar la relación señal-ruido. INCREMENTO DE LA RESOLUCIÓN El decaimiento de la señal produce un ensanchamiento de los picos en el espectro, y si es posible eliminar dicho decaimiento, entonces el ancho del pico de resonancia consistiría en un solo punto, es decir, un pico infinitamente estrecho. El decai-
2124 (1761) Aplicaciones de la Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear/ Información General
USP 39
miento de la señal se puede representar mediante exp(- t/T/). Por consiguiente, la ecuación completa que representa la señal en decaimiento es
A(t)
= A0exp(- t/T/)cos(rot + 0)
[19]
Si la FID se multiplica por una función creciente que cancele exactamente el decaimiento, entonces se eliminará el ensanchamiento de los picos. Esto se puede lograr multiplicando la FID por exp(t/Tz*). Entonces, la Ecuación 19 se convierte en
A(t)
= A0exp(O)cos(rot + 0) = A0cos(rot + 0)
[20]
Desafortunadamente, la aplicación de esta función, según se describió anteriormente, también incrementará de manera desproporcionada la intensidad del ruido en la cola de la FID. La relación señal-ruido en el espectro final es tan deficiente que esta función no se puede usar sin realizar modificaciones. Por lo regular, el inicio de la FID, donde la relación señal-ruido es mejor, se multiplica para intensificar la señal, pero después la cola de la FID, donde la relación señal-ruido es más deficiente, se multiplica para disminuir la señal. Para la resolución, las dos funciones comúnmente usadas para lograr lo anterior son la función gaussiana y la transformada de adición de FIDs invertidas (TRAF, por sus siglas en inglés). Ésta última en ocasiones recibe el nombre de TRAFR por parte de los fabricantes de instrumentos y consigue la misma mejora en la resolución que la función gaussiana pero con una degradación mucho menor en la relación señal-ruido general. Aunque existen otras muchas propuestas de funciones de ventana, su uso no siempre es tan amplio. Es importante señalar que se debe tener cuidado cuando se usa incremento de la resolución en los experimentos cuantitativos ya que puede alterar la exactitud de la integración de las señales espectrales. INCREMENTO DE LA RELACIÓN SEÑAL-RUIDO En general, es posible incrementar la relación señal-ruido en el espectro ponderando los puntos de la FID en mayor grado al principio y en menor grado en la cola. Esto se debe a que la relación señal-ruido más alta se da al inicio y la más baja en la cola. La ponderación a menudo se logra multiplicando la FID bruta por una función que decrece con el tiempo. Una función que goza de reconocimiento y que provee el mayor incremento en la relación señal-ruido es la denominada función de filtro pareado, la cual pondera a cada punto en la señal FID por una cantidad proporcional a la relación señal-ruido en dicho punto. Una función que logra este efecto debe corresponderse con el decaimiento. Por ende, la señal FID se multiplica por exp(- ti Tz*). La penalidad por el uso del filtro pareado es una pérdida de resolución que duplica el ancho de los picos. Cuando el decaimiento original se multiplica por la función de filtro pareado, entonces el nuevo decaimiento se describe por la siguiente ecuación: exp(- t/T/) x exp(- t/T/) = exp(- 2t/T2*) =exp(- t/0,5Tz*)
[21]
La señal FID parecerá haber decaído con un T/ igual a la mitad del original y se duplicará el ancho de los picos, de acuerdo con las Ecuaciones 11 y 18. Intentar multiplicar la FID por una función más abrupta para sobreponderar los puntos del comienzo de la FID sólo resultaría en un exiguo incremento de relación señal-ruido y en un ensanchamiento de los picos. Otra función que así mismo logra incrementar la relación señal-ruido, pero sin cambio alguno en la resolución, es la función TRAF para sensibilidad, a la cual los fabricantes de instrumentos en ocasiones se refieren como TRAFS.
Completado de Ceros Los espectroscopistas pueden mejorar la apariencia general del espectro de manera considerable agregando puntos con intensidad cero al final de la FID antes de realizar la transformada de Fourier. Este proceso resulta en la colocación de más puntos en cada pico de resonancia en el espectro. El procedimiento más común es agregar una cantidad de ceros igual al número de puntos usados para recolectar la FID. Agregar más ceros únicamente resultará en una muy leve mejoría adicional. Aunque todos los picos quedan mejor definidos mediante el llenado de ceros, no se presenta un incremento en la resolución. Por ejemplo, en un caso en el que la separación entre dos líneas es menor que el ancho de los picos, sólo se conseguirá ensanchar una línea simple. El llenado de ceros no resolverá estos picos-únicamente colocará más puntos en una línea ya ensanchada. Solamente un incremento en el tiempo de adquisición de la señal o el uso de una función de ventana podría resolver estos picos. El llenado de ceros tiene un efecto benéfico en la cuantificación. La integración de un espectro digital se logra tomando la intensidad en un punto dado y sumándole la intensidad de los puntos sucesivos. Si el número de puntos de datos es insuficiente para representar la forma real del pico, la integral resultante de dicho pico no se podrá determinar con exactitud. Por lo tanto, el llenado de ceros hasta que cada pico quede representado en al menos 7-1 O puntos de datos resulta en una integración más exacta. Para obtener una buena representación del pico y una confiable integración cuantitativa del mismo, deben existir al menos 4-5 puntos de datos por encima del ancho completo de un pico a su altura media.
USP 39
Información General/ (1761) Aplicaciones de la Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear 2125
PROCEDIMIENTO GENERAL PARA LA IDENTIFICACIÓN DE ESTRUCTURAS La espectroscopía de RMN es una técnica poderosa para la identificación de estructuras debido a su especificidad para detectar ciertos núcleos tales como 1 H, BC, 31 P y 19F. Por lo regular, se puede llevar a cabo una prueba de identificación de rutina mediante espectroscopía de RMN 1 H en un periodo corto para moléculas simples. La identificación se fundamenta en una comparación de las señales de la muestra de prueba con las señales esperadas de un estándar de referencia calificado. Se puede concluir que una identificación es positiva cuando los desplazamientos químicos, multiplicidades y las constantes de acoplamiento del espectro de la muestra de prueba se corresponden con aquéllos del estándar de referencia o, en el caso de una monografía de USP, con los valores ahí citados. Los datos pueden ser inaceptables para su análisis cuando la preparación incorrecta de la muestra o un ajuste deficiente de los parámetros del espectrómetro conlleven a una resolución deficiente, a una reducción en la sensibilidad o a artefactos espectrales. Es preferible que el operador esté familiarizado con la teoría básica de la RMN y la operación del espectrómetro. Resulta esencial verificar el desempeño del instrumento de manera frecuente. Los procedimientos aquí analizados se refieren específicamente a la RMN de 1 H y 13 C, pero son aplicables, con sus respectivas modificaciones, a otros núcleos. La discusión supone que los espectros de RMN se obtienen a partir de soluciones en disolventes apropiados.
Selección del Disolvente A menudo, se emplean disolventes deuterados para preparar las soluciones analíticas de RMN debido a que se los puede conseguir con cierta facilidad, a que las señales de 1 H de estos disolventes están reducidas en gran medida en los espectros de 1 H, y tienen la ventaja adicional de proveer una señal para la fijación del campo. Se debe seleccionar un disolvente cuyas señales residuales de 1 H no interfieran con las señales del analito. Cuando un pico residual de disolvente de 1 H pudiera interferir con cualquiera de las señales de la solución muestra y no fuera posible usar otro disolvente, entonces la pureza isotópica 2H del disolvente debe ser lo más alta posible. Algunos disolventes (p.ej., 0 2 0 o COpO) presentan protones lábiles que pueden intervenir en reacciones de intercambio rápido con protones lábiles en el analito. Esto puede eliminar las señales de resonancia de grupos estructurales -COOH, -OH y-NH 2 • Los disolventes más empleados para la RMN de protones y carbono se enumeran en la Tabla 5 junto con sus desplazamientos químicos residuales de 1 H 13 C, así como las multiplicidades de estas resonancias ocasionadas por el acoplamiento a deuterio. Tabla 5. Disolventes Usados Comúnmente para RMN de Desplazamientos Químicos de 1H/13C Disolvente CDCI, CD,OD (CD,),CO
Señal Residual de 1 H/13C (8ª·b) y Multiplicidad
,H
13(
7,27
77,23 (3)
3,35; 4,78
49,15 (7)
2,05
206,68 (1) 29,92 (7)
D,O
4,7<
(CD 3)zSO
2,50
39,51 (7)
C6D6
7,20
128,39 (3)
Dioxano-d8
3,55
66,66 (5)
2,05; 11,65'
178,99 (1) 20,0 (7)
2,77; 2,93; 8,05
163, 15 (3) 34,89 (7) 29,76 (7)
CD,C0 7 D
(CD,),NCDO
ª b
e
-
Los desplazamientos químicos se midieron a 295 K>. 8 en ppm relativa a TMS a O ppm. Hidrógeno lábil.
Preparación de la Muestra Por lo general, las instrucciones para los procedimientos USP se proporcionan en las monografías individuales. La concentración de soluto depende del objetivo del experimento. Generalmente, la concentración de las soluciones muestra para RMN va desde unos pocos mg por mL hasta 50 mg/ml. La detección de contaminantes minoritarios puede requerir concentraciones más altas. En algunos casos, tales como en el caso de polímeros, se pueden usar concentraciones aún más altas. Las soluciones se preparan en viales individuales y se transfieren al tubo para RMN. El volumen requerido depende del tamaño del tubo para RMN y de la geometría de la sonda. El nivel de la solución en el tubo debe extenderse más allá de las bobinas una vez que el tubo esté insertado en la sonda del instrumento. Los tubos para RMN deben cumplir estrictas especificaciones de tolerancia en diámetro, espesor de pared, concentricidad y curvatura. Los tubos más usados tienen un diámetro externo de 5 ó 1O mm y miden entre 15 y 20 cm de largo, pero los tubos
2126 (1761) Aplicaciones de la Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear/ Información General
USP 39
para RMN con un diámetro externo de 1 y 3 mm son cada vez más comunes; asimismo, se han usado tubos con diámetros externos de hasta 20 mm.
Procedimiento El tubo para RMN se coloca en una sonda ubicada en el campo magnético. Aunque, tradicionalmente, se ha hecho girar las muestras para promediar los gradientes de campo no radiales, el requisito de giro ya no es necesario dada la calidad de las bobinas de compensación y, en el caso de muchos experimentos bidimensionales, la muestra no debe hacerse girar. La homogeneidad del campo magnético se optimiza realizando una compensación, una función que actualmente es realizada mayormente por la computadora en casi todos los espectrómetros modernos. La sintonización de la sonda se optimiza para la frecuencia que se va a observar y se ajusta a la impedancia del espectrómetro. La computadora controla todas las operaciones del espectrómetro, desde la ejecución del programa de pulsos hasta el almacenamiento y procesamiento de datos. El diseño experimental implica la asignación de valores a un gran número de variables, incluyendo el ancho del espectro que se va a examinar, la duración del pulso de excitación (PW), el intervalo de tiempo de adquisición de datos (A1), el número de transientes acumulados y el periodo de espera entre una adquisición de datos y la siguiente (tiempo de espera por relajación). El tiempo de adquisición para un transiente se encuentra en el orden de los segundos. El número de transientes se determina en función de la concentración de la muestra, el tipo de núcleo y el objetivo del experimento, y puede variar de unos cuantos para la mayoría de los experimentos con 1 H hasta varios miles para el espectro 13C. Al finalizar el experimento, la señal {FID) se almacena digitalmente en la memoria de la computadora y puede ser presentada en el monitor. La señal puede procesarse matemáticamente para mejorar la resolución o la sensibilidad, y puede convertirse en espectros con dominio en frecuencia usando la transformada de Fourier, los cuales pueden analizarse en mayor medida para obtener posiciones (desplazamientos químicos) e intensidades de los picos.
Elucidación de Estructuras mediante RMN El caso más simple de uso de la espectroscopía de RMN para elucidar una estructura desconocida consiste en obtener una correspondencia con un espectro a partir de un estándar de referencia o de una base de datos. La información contenida en un espectro de RMN es suficiente para deducir estructuras de moléculas orgánicas incluso cuando no se dispone de estándares de referencia o espectros calificados. Se pueden indentificar estructuras relativamente simples usando desplazamientos químicos, patrones de acoplamiento e intensidades obtenidas a partir de espectros unidimensionales de 1H y BC. Para estructuras más complejas, puede ser necesario que los espectroscopistas obtengan espectros bidimensionales a partir de experimentos desarrollados para determinar conectividades horno o heteronucleares. Los espectros bidimensionales se caracterizan por dos ejes de frecuencia. La intensidad, que matemáticamente es otra dimensión, no se considera una dimensión en la RMN bidimensional debido a que no se extiende al desplazamiento químico. Todos los experimentos modernos bidimensionales constan al menos de dos pulsos separados por un periodo, marcado como t 1, el periodo de evolución, y el periodo usado para recolectar las señales, que se designa t2, el periodo de detección. La secuencia de Espectroscopía de Correlación (COSY, por sus siglas en inglés) es la secuencia más simple de todas y se presenta en la Figura 4.
Figura 4. Secuencia de pulso para un experimento COSY.
USP 39
Información General/ (1761) Aplicaciones de la Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear 2127
Se lleva a cabo una serie de estas secuencias aplicando un aumento gradual del periodo de evolución t7• Se acumulan las transformadas de Fourier de las FIDs para cada uno de los periodos de detección t2, y se realiza una segunda transformada de Fourier sobre el nuevo eje t 7 lo cual resulta en una gráfica de contorno a lo largo de los dos ejes de frecuencia, F2 y F1• La adición más simple a la secuencia de COSY es agregar otro pulso. La secuencia de Espectroscopía de Efecto Nuclear Overhauser (NOESY, por sus siglas en inglés) es un ejemplo y se muestra en la Figura 5.
Figura 5. Secuencia de pulso para un experimento NOESY. Nuevamente, el periodo de evolución es el tiempo entre los primeros dos pulsos y se incrementa al igual que en experimento COSY. El tiempo entre el segundo y el tercer pulso es fijo y no se incrementa. A este periodo se lo designa y se lo denomina tiempo de mezclado. Durante este periodo ocurre una polarización cruzada. Las secuencias COSY y NOESY descritas anteriormente son los experimentos bidimensionales más simples de realizar. Se han desarrollado muchos otros experimentos que contienen series de pulsos muy complicadas con diferentes anchos de pulso, periodos de espera, desacoplamiento restringido y gradientes de campo por pulsos. Algunos de estos experimentos se describen a continuación.
'm
Estrategias para el Establecimiento de Conectividades Homonucleares La asignación de señales basándose en desplazamientos químicos, multiplicidad de espín y constantes de acoplamiento sirve como punto de partida para la elucidación de estructuras. La elucidación de estructuras se simplifica cuando es posible establecer la conectividad molecular entre espines homonucleares. Esto se puede lograr usando correlaciones a través de enlaces (acoplamiento escalar, en ocasiones denominado acoplamiento/) o mediante interacciones espaciales (acoplamiento dipolar). Esta sección describe técnicas de RMN que se pueden usar para el estudio de la conectividad homonuclear. Los experimentos más reconocidos de esta categoría son el experimento COSY, la espectroscopía de correlación total (TOCSY, por sus siglas en inglés), el experimento NOESY, y la espectroscopía de marco rotante y efecto Overhauser (ROESY, por sus siglas en inglés). COSY El experimento COSY se ha convertido en un experimento de rutina de RMN bidimensional de 1 H que permite identificar fácilmente la conectividad entre protones para sistemas de espín conectados a través de dos o tres enlaces químicos. El espectro COSY es una gráfica de contorno que presenta picos que se cruzan sobre la diagonal y fuera de la diagonal. La diagonal es el espacio bidimensional donde se cruzan los desplazamientos químicos de los picos que corresponden al mismo núcleo en el espectro de RMN unidimensional de lH. En el espacio bidimensional fuera de la diagonal se cruzan los picos acoplados cuyos desplazamientos químicos son diferentes. El espectro COSY permite identificar a los espines escalarmente acoplados que se encuentran en posiciones geminales o vecinales. Por lo general, el proceso de asignación se inicia seleccionado una resonancia en el espectro COSY que ya ha sido identificada en el espectro de RMN monodimensional de 1 H. Posteriormente, los picos cruzados fuera de la diagonal entre ésta y cualquier otra resonancia determinan las resonancias de los protones cercanos a los que está acoplado. Luego, los protones cercanos identificados de esta manera sirven como puntos de observación para observar los siguientes picos cruzados con otros protones, y así sucesivamente. El proceso continúa hasta que se hayan identificado todos los sistemas de espín acoplados. Por ende, un experimento COSY puede ofrecer información útil sobre la conectividad entre protones de los diversos fragmentos de las moléculas en análisis. La relación entre estos fragmentos puede ser difícil de establecer debido a una interrupción del acoplamiento entre los dos fragmentos. Por ejemplo, cuando dos segmentos están conectados a través de carbonos cuaternarios o heteronúcleos, los acoplamientos entre los protones en cada uno de los dos fragmentos, que se encuentran separados por cuatro enlaces, son tan pequeños que no es posible detectarlos mediante COSY. A menudo, los experimentos
2128 (1761) Aplicaciones de la Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear/ Información General
USP 39
COSY básicos se procesan usando el modo de magnitud, lo cual resulta en picos de base muy ancha. Los picos sobre la diagonal pueden ser tan anchos que impiden observar los sistemas de espín con desplazamientos químicos cercanos, debido a que ocurre superposición entre los picos sobre la diagonal con los picos fuera de la diagonal. La Figura 6 presenta un ejemplo de un experimento COSY, específicamente uno de gradiente (gCOSY, por sus siglas en inglés).
g4 g2 ·~
;•·•; •
fl
•
" ..;--·····º . . . <§)
.f4,IS •
g3 ..•........ g2,g3
~
~
. 13, 14
o--;4@ 1
.
13º 1
e 4.0
3.8
3.6
3A
F2!ppm¡
Figura 6. Espectro COSY parcial de sacarosa. Las líneas punteadas muestran la forma en que se relacionan dos contornos fuera de la diagonal (f3, f4 y g2, g3) para determinar cuales son los núcleos que se acoplan entre sí. Se han desarrollado varios experimentos COSY para mejorar el original. Posiblemente, la mejora más importante haya sido el uso de gradientes para adquirir un espectro gCOSY. El experimento COSY clásico emplea un pulso de 90º para generar una magnetización transversal y necesita de una elaborada ciclización de fase durante una gran cantidad de barridos para cancelar señales no deseadas, lo que resulta en largos tiempos experimentales. Un experimento gCOSY requiere una sonda adecuada para pulsos de gradiente de campo (PFG, por sus siglas en inglés). El pulso de gradiente de campo magnético desfasa cualquier magnetización coherente en el plano xy. Si se aplica un segundo pulso de gradiente de intensidad adecuada en Ja dirección contraria, éste ocasionará el reenfoque de cualquier magnetización desfasada por dos cuantos. Por ende, sólo se recibirán esas señales. Las intensidades de los gradientes se pueden usar para seleccionar coherencias cuánticas simples, dobles o triples. Los pulsos de gradiente en experimentos gCOSY se pueden usar para prevenir el reenfoque de magnetizaciones que ocasionan artefactos en experimentos COSY clásicos. De este modo, en lugar de requerir un mínimo de ocho adquisiciones cíclicas en fase por cada incremento de datos en la segunda dimensión, un espectro gCOSY requiere una sola adquisición por incremento. Para muestras que tienen una concentración suficiente para producir una relación señal-ruido aceptable en una sola adquisición, esto reduce enormemente el tiempo del experimento. Se han desarrollado experimentos COSY sensibles a la corrección de fase para superar el problema de superposición con desplazamientos químicos muy cercanos entre sí. Un experimento COSY sensible a la corrección de fase resulta en picos de absorción puros con picos más estrechos que los generados mediante los clásicos COSY de magnitud. Estos picos más estrechos permiten una mejor resolución de resonancias cercanas a los picos en la diagonal. El experimento de COSY con filtro de doble cuanto (DQF-COSY, por sus siglas en inglés) se desarrolló para resolver el problema ocasionado por las señales intensas derivadas de grupos funcionales tales como metilos. Los singuletes de estos grupos no proveen información de conectividad útil, pero su intensidad a menudo limita el intervalo dinámico del experimento, lo que dificulta la observación de otras señales más débiles. Las secuencias de pulsos de la DQF-COSY detectan los sistemas de espín que tienen únicamente transiciones cuánticas dobles. Los singuletes aislados no se detectan y por ello, se filtran siendo eliminados del espectro bidimensional final. Asimismo, se logra una reducción de la intensidad general de las señales en diagonal con un aumento en las intensidades de las señales fuera de diagonal. ESPECTROSCOPÍA DE CORRELACIÓN TOTAL (TOCSY, POR SUS SIGLAS EN INGLÉS) (O EXPERIMENTO HARTMANN HAHN HOMONUCLEAR-HOHAHA, POR SUS SIGLAS EN INGLÉS) Aunque el experimento TOCSY de 1 H-1 H está estrechamente relacionado con el experimento COSY, ambos se diferencian en que el primero produce correlaciones para todos los espines de una red acoplada. Esto es especialmente útil cuando se superponen multipletes o cuando se presenta un fuerte y extenso acoplamiento. Por ejemplo, consideremos la red -CHa-
USP 39
Información General/ (1761) Aplicaciones de la Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear 2129
CHb-CHc-CHd-CHe-, en donde cada CHn representa un espín que se ha acoplado a través de tres enlaces al espín adyacente. Un espectro COSY presentaría correlaciones para cada par de hidrógenos adyacentes. De este modo, la resonancia de Hb presentaría conectividades con Ha y con He, pero no con Hd, ya que COSY solo revela una correlación parcial para cada CHn. En cambio, un espectro TOCSY presentaría contornos fuera de la diagonal para cada espín de esta red. Esto significa que se presentarían contornos fuera de la diagonal correspondientes a CHa, CHb, CHc, CHd y CHe. Por consiguiente, un espectro TOCSY como el presentado en la Figura 7, identifica de manera positiva a todos los espines dentro de la misma red de acoplamiento. Este patrón se reconoce fácilmente, en especial cuando se presenta una superposición extensa con otras redes acopladas. No obstante, un experimento TOCSY no puede establecer conectividad entre redes separadas interrumpidas por átomos heteronucleares, carbonos cuaternarios o por un carbono que sólo tiene protones intercambiables. Un experimento TOCSY resulta útil para el estudio de moléculas grandes con muchas redes de acoplamiento separadas tales como péptidos, proteínas, oligosacáridos y polisacáridos.
4.2
40
38
36
3.4
F2 [ppm]
Figura 7. Espectro parcial TOCSY de sacarosa que presenta dos conjuntos de contornos que corresponden a todos los núcleos que se acoplan en el anillo de glucosa y los que se acoplane en el anillo de fructosa de la sacarosa. El contorno para la resonancia f1 cae dentro del sistema de espín de glucosa y no presenta acoplamiento. ESPECTROSCOPÍA DE EFECTO NUCLEAR OVERHAUSER (NOESY, POR SUS SIGLAS EN INGLÉS) El experimento NOESY provee correlaciones entre protones espacialmente cercanos entre sí, aunque no estuvieran conectados por enlaces. Estas correlaciones a través del espacio se realizan mediante relajación espín-entorno. Las interacciones dipolares entre protones cercanos generan transferencias de efecto nuclear Overhauser (NOE, por sus siglas en inglés), mientras que la magnetización se alinea a lo largo del eje z (8 0), produciendo cambios de intensidad positiva o negativa que generan picos cruzados, los cuales por lo regular no se observan en un espectro COSY. La señal de los picos de NOESY depende del tamaño y la movilidad de la molécula que se estudia. Cuando se utiliza en conjunto con otras técnicas, un experimento NOESY puede establecer relaciones espaciales para espines particulares y puede proveer información estructural crítica y sobre conformaciones de anillos. ESPECTROSCOPÍA DE MARCO ROTANTE Y EFECTO OVERHAUSER (ROESY, POR SUS SIGLAS EN INGLÉS) DE 1 H-1 H El experimento ROESY es similar al experimento de NOESY hasta el punto en que ambos proveen correlaciones entre protones cercanos entre sí, estén o no conectados mediante enlaces. Un espectro de experimento ROESY genera correlaciones a través del espacio mediante relajación espín-espín en un marco rotante. El experimento ROESY emplea una secuencia de fijación de espines como tiempo de mezclado durante el cual ocurre la transferencia del efecto nuclear de Overhauser entre todos los componentes de los espines fijos en el plano xy. Al contrario de un experimento NOESY, en el que las transferencias de efecto nuclear de Overhauser ocurren cuando las magnetizaciones se alinean a lo largo del eje z (8 0) produciendo cambios de intensidad positiva o negativa, en el experimento ROESY las transferencias de efecto nuclear de Overhauser ocurren en el mar-
2130 (1761) Aplicaciones de la Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear/ Información General
USP 39
co rotante bajo la influencia de un campo magnético 8 7• Esto siempre dará como resultado señales positivas, sin importar qué tan grande sea la molécula o si su movimiento es rápido o lento. Por lo tanto, un experimento ROESY proveerá frecuentemente correlaciones a través del espacio cuando no sea posible detectar dichas correlaciones en un experimento NOESY debido a la movilidad de la molécula. EXPERIMENTO DE DOBLE TRANSFERENCIA CUÁNTICA DE INCREÍBLE ABUNDANCIA NATURAL (INADEQUATE, POR SUS SIGLAS EN INGLÉS) DE lH-lH El INADEQUATE emplea una doble coherencia cuántica para proveer información sobre los núcleos de 13 C directamente acoplados con otros núcleos de ne. En consecuencia, éste provee el mismo tipo de información disponible al usar un experimento COSY para acoplamientos de protones. Debido a la baja probabilidad de que dos núcleos de 13 C se conecten entre sí (únicamente 1 en 1O000 moléculas), esta técnica se utiliza generalmente como último recurso. La gran sensibilidad de las sondas enfriadas criogénicamente que se usan en los instrumentos modernos hacen que este experimento sea práctico para algunos casos.
Estrategias para el Establecimiento de Conectividades Heteronucleares A pesar de que la conectividad homonuclear de 1H-1 H es un aspecto importante para la elucidación de estructuras de moléculas orgánicas, el establecimiento de conectividades heteronucleares es igualmente importante, aunque quizás un poco más difícil de lograr dada la menor abundancia de la mayoría de heteroátomos. Cuando se cuenta con asignaciones parciales en el espectro de 1 H o ne, conocer dicha conectividad conduce a una asignación más completa de ambos espectros. Los espectros heteronucleares bidimiensionales no presentan una diagonal, a diferencia de las correlaciones homonucleares, sólo presentan picos cruzados en el espacio bidimensional en los puntos de intersección de los desplazamientos químicos de 1H y ne tal como se muestra en la Figura 8.
g4
g2
e
e
13
IS
42
4.0
3.8
3.6
3A
3.2
F2(ppm(
Figura 8. Espectro parcial de 1 H;nc HSQC de sacarosa que presenta contornos que indican la correlación de enlaces entre un hidrógeno dado y el carbono al que está unido. Los espectros heteronucleares bidimensionales se diseñan de tal manera que 1 H sea el núcleo detectado y, por lo general, se adquieren usando las sondas de detección invertidas, ya que la bobina de 1 H se enrolla más cerca de la muestra que la bobina de banda ancha. Esto resulta en un mejor factor de llenado y en una mayor sensibilidad para la bobina de 1 H. Se debe tomar en cuenta el desarrollo de configuraciones de bobinas más novedosas que ofrecen la misma sensibilidad y que no utilizan la inversión de bobinas de detección. Los experimentos heteronucleares bidimensionales típicos incluyen los experimentos de Coherencia Cuántica Simple Heteronuclear (HSQC, por sus siglas en inglés), Coherencia Cuántica Múltiple Heteronuclear (HMQC, por sus siglas en inglés) y Correlación Heteronuclear de Enlaces Múltiples (HMBC, por sus siglas en inglés).
USP 39
Información General/ (1761) Aplicaciones de la Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear 2131
COHERENCIA CUÁNTICA HETERONUCLEAR MÚLTIPLE (HMQC, POR SUS SIGLAS EN INGLÉS) El HMQC bidimensional provee información sobre la correlación entre protones y sus heteronúcleos acoplados mediante acoplamiento escalar heteronuclear. La secuencia selecciona una transferencia de coherencia cuántica doble entre espines acoplados escalarmente (BC_, H). COHERENCIA CUÁNTICA HETERONUCLEAR SIMPLE (HSQC, POR SUS SIGLAS EN INGLÉS) La espectroscopía HSQC también es un experimento de correlación de desplazamiento químico inverso que genera la misma información que el experimento HMQC, es decir, la identificación de interacciones entre hidrógeno-carbono enlazados directamente. La correlación entre heteronúcleos se detecta mediante la selección de una transferencia de coherencia cuántica simple usando secuencias de transferencia insensibles a la amplificación por polarización (INEPT, por sus siglas en inglés). La principal ventaja de usar esta secuencia en lugar de HMQC es que el dominio F, no contiene acoplamientos entre protones, mejorando la resolución. Una modificación interesante de esta secuencia es el experimento HSQC editado. Se trata de un experimento sensible a la fase que no sólo provee correlaciones de un enlace hidrógeno-carbono, sino que también presenta los picos de metilo y metino a 180º de la fase de las resonancias correspondientes a metilenos. CORRELACIÓN HETERONUCLEAR DE ENLACES MÚLTIPLES (HMBC, POR SUS SIGLAS EN INGLÉS) La espectroscopía HMBC es una versión modificada del experimento HSQC y es adecuado para determinar la conectividad 1 H-BC a larga distancia (> 1 enlace). La espectroscopía de correlación heteronuclear a larga distancia puede generar señales para aquellos núcleos que están separados por 2-4 enlaces. Este experimento, en conjunto con los otros experimentos bidimensionales tratados con anterioridad, permite definir la estructura de una molécula con gran detalle.
APLICACIONES CUANTITATIVAS La RMN es una de las técnicas más útiles para análisis cuantitativos en el campo de la química. Cuando se seleccionan las condiciones experimentales apropiadas, las intensidades relativas de las resonancias son proporcionales a la población de los núcleos que ocasionan tales resonancias. Los experimentos de RMN se pueden diseñar para cuantificaciones relativas o absolutas, en ambos casos con o sin un estándar interno.
Diseño Experimental para RMN Cuantitativa El diseño de cuantificación implica la eliminación o una medición precisa de las diferencias en las intensidades debidas a la relajación espín-entorno y al efecto nuclear de Overhauser. El tiempo de relajación espín-entorno (T1) para todas las resonancias usadas en el procedimiento se pueden medir con una secuencia de pulsos de recuperación por inversión. Cuando se usa un pulso de 90º para excitación, se puede lograr un nivel de cuantificación de 99,3% con una repetición del ciclo luego de un tiempo T, (la suma del periodo de espera por relajación y el tiempo de adquisición), que sea 5 veces T1, y mejorar aún más usando T, más largos o pulsos más cortos. La ecuación general para el grado de cuantificación, Q, de una resonancia como una función del ángulo de pulso, a, y de T, y T1 es:
1 -e-rrm
Q=------1 - [e-rrm · cos(a)]
[22]
Si se usa un ángulo de excitación de 45º, con un T, = 5 T1, Q = 0,998. No obstante, la exactitud de la cuantificación en el espectro final no sólo depende de los valores Q de las resonancias, sino también de la exactitud del método de integración y de la relación señal-ruido del espectro. Por consiguiente, es válido usar valores Q algo menores que la unidad y otros ángulos y tiempos de repetición de ciclos. La reducción del sesgo sistemático para la cuantificación debe ser suficientemente adecuada para el uso pretendido del procedimiento. Alternativamente, se pueden desarrollar procedimientos cuantitativos usando condiciones en las que Q no sea la unidad para algunas o todas las resonancias, siempre que se conozca el valor de Q con precisión y se realicen correcciones por dicho valor. Para métodos cuantitativos que emplean heteronúcleos, se debe evitar que el efecto nuclear de Overhauser sea posible usando un T, de al menos 5 veces el valor T1 más largo y usando desacoplamiento acotado inverso (usando el desacoplador acotado únicamente durante el tiempo de adquisición). De preferencia, se deben usar pulsos de 90º. Para métodos cuantitativos, a menudo se usan agentes de relajación para recortar los valores T1 de los heteronúcleos. La reproducibilidad de un método de RMN depende de una variedad de parámetros de adquisición y procesamiento, los cuales deberán describirse con todo detalle en el procedimiento. Éstos incluyen ángulo del pulso, tiempo de adquisición, tiempo de espera por relajación, ancho del espectro, número de puntos en la FID, número de adquisiciones, número de puntos
2132 (1761) Aplicaciones de la Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear/ Información General
USP 39
usados (si los hubiera) para completado de ceros, ensanchamiento de la línea, corrección de la línea base, fracciones de integración y temperatura. Para una mejor reproducibilidad, las fracciones de integración deben ser de 0,01 ppm para métodos de RMN de 1H y de 0, 1 ppm para métodos de 13(. Los análisis cuantitativos, así como la detección de trazas de impurezas, se han mejorado significativamente gracias a los instrumentos modernos. En años recientes, la sensibilidad de los procedimientos de RMN se ha visto mejorada gracias a campos magnéticos más fuertes y a los avances en la tecnología de las sondas.
RMN PARA MUESTRAS EN ESTADO SÓLIDO La utilidad analítica de la espectroscopía de RMN para el estudio de muestras de materiales en estado sólido se basa en el hecho de que los mismos tipos de núcleos presentan diferentes frecuencias de resonancias en los diferentes ambientes del estado sólido. Las aplicaciones de esta técnica en el análisis farmacéutico van desde la identificación en formas sólidas (polimorfos, solvatos) y la cuantificación en fármacos a granel, hasta la caracterización de formas farmacéuticas mediante patrones físico-químicos. Esta técnica tiene la capacidad única de sondear ambientes electrónicos de núcleos específicos en estado sólido durante una escala de tiempo larga sin necesidad de que los sustratos se presenten en un solo cristal o incluso de que las muestras sean homogéneas. Los métodos y procedimientos presentados en este capítulo están dirigidos a la observación de 13 C, el núcleo de RMN más popular para sólidos. Los conceptos se pueden aplicar de igual manera a otros núcleos con número de espín 1 /2 tales como el 1sN de baja abundancia natural, así como el 31 P de alta abundancia natural.
Técnica de RMN de Polarización Cruzada con Giro al Ángulo Mágico (CPMAS, por sus siglas en inglés) Los principios básicos de RMN son los mismos para las mediciones en solución y en estado sólido, aunque las técnicas convencionales que se usan para la adquisición de datos de RMN unidimensional en fase de solución normalmente no producen espectros detectables para muestras sólidas debido a la baja sensibilidad y al extenso ensanchamiento de la línea. La sensibilidad del experimento en estado sólido es baja para 13C porque su abundancia natural es sólo de 1, 1% y porque los tiempos de relajación espín-entorno (T7) son largos. El ensanchamiento de la línea surge principalmente de las interacciones entre dipolos y de la anisotropía de desplazamiento químico (CSA, por sus siglas en inglés), que no se promedian a cero debido a la orientación fija de las moléculas empacadas en una muestra sólida en comparación con la rápida rotación molecular de las moléculas cuando están en solución. Cuando no se promedia, la anisotropía de desplazamiento químico resulta en la observación simultánea de todas las orientaciones diferentes de moléculas con respecto al campo magnético aplicado. Los patrones de la anisotropía de desplazamiento químico pueden abarcar el ancho de todo un espectro obtenido en estado líquido. Para lograr espectros de RMN de materiales en estado sólido de alta resolución, se utilizan regularmente combinaciones de tres modificaciones a los típicos métodos en solución: polarización cruzada, giro al ángulo mágico y desacoplamiento de 1H de alta potencia. POLARIZACIÓN CRUZADA La polarización cruzada trata la baja sensibilidad asociada con la recolección de espectros de RMN de núcleos de 1/2 espín diluidos, tales como 13(. La polarización cruzada es un procedimiento de resonancia doble en el que una cantidad abundante de espines de 1H y una limitada de 13 C se hacen resonar mediante la aplicación simultánea de dos campos de radiofrecuencia de fijación de espín (81H y B1c), cuya magnitud cumplirá con la condición de correspondencia de Hartmann-Hahn,
YHB1H = YcB1c
[23]
Durante este tiempo de contacto ocurre la transferencia por polarización que permite a los pocos espines de 13 C dominar la magnetización y el comportamiento de relajación de la gran cantidad de espines de 1H, lo que genera un aumento en la sensibilidad (de hasta cuatro veces basándose en el cociente entre las constantes giromagnéticas del 1H y del 13 C) y en una reducción en el tiempo de repetición de pulsos. Reducir el tiempo de repetición de pulsos permite acumular un mayor número de adquisiciones por unidad de tiempo, lo que genera una mejor relación señal-ruido. Para los casos en los que puede ser complicado o imposible registrar los espectros de polarización cruzada debido al acoplamiento débil de 13 C-1H o a tiempos cortos de relajación de espín-entorno en el marco rotante (T1,H), la polarización directa (decaimiento de Bloch) puede ser el único método para registrar los espectros de RMN de muestras en estado sólido. GIRO AL ÁNGULO MÁGICO (MAS, POR SUS SIGLAS EN INGLÉS) El ensanchamiento de la línea en la RMN en estado sólido se elimina o promedia mediante MAS y desacoplamiento de 1H de alta potencia. El MAS implica hacer girar la muestra por medios mecánicos a un ángulo de 54,7° (el ángulo mágico) con respecto al campo magnético estático a fin de simular la rápida rotación molecular en solución. Hacer girar una muestra sólida al ángulo mágico para minimizar el ensanchamiento de la línea requiere que la muestra se haga girar más rápido (en Hz) que el ancho de la anisotropía de desplazamiento químico. La tecnología actual de sondas para giro al ángulo mágico permite alcanzar altas velocidades de giro, aunque se pueden presentar complicaciones con la polarización cruzada y requerirse técnicas ta-
USP 39
Información General/ (1761) Aplicaciones de la Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear 2133
les como la polarización cruzada de amplitud en rampa (RAMP-CP, por sus siglas en inglés) y la polarización cruzada de amplitud variada (VACP, por sus siglas en inglés) para mejorar la eficiencia de la transferencia de magnetización desde los 1 H. Asimismo, el MAS puede elevar la temperatura de la muestra de forma significativa si no se controla, y las presiones en la periferia del rotor pueden ser miles de veces superiores a la presión atmosférica. Dichas tensiones pueden inducir transiciones de fase, pérdida de solvatos y otros efectos. SUPRESIÓN DE LA BANDA LATERAL Tal como se muestra en la Figura 9, se pueden usar velocidades de giro más lentas para evitar comprometer la muestra sólida, pero aparecerán bandas laterales giratorias en los espectros de RMN en estado sólido si no se promediara por completo la anisotropía de desplazamiento químico. Estos artefactos se separan de las bandas centrales mediante múltiplos enteros de la velocidad de giro (en Hz) y se pueden identificar fácilmente como picos que se desplazan en espectros adquiridos a distintas velocidades de giro. Las bandas laterales giratorias contienen información útil pero pueden interferir con las señales de interés y pueden ser particularmente problemáticas al utilizar instrumentos de campo alto. El procedimiento de supresión total de las bandas laterales giratorias (TOSS, por sus siglas en inglés) se usa comúnmente para eliminar las bandas laterales giratorias del espectro de RMN en estado sólido.
estático
250
200
150
100
50
O [ppm
Figura 9. Espectros 13C de RMN CPMAS de a-glicina policristalina tomados a diferentes velocidades de giro (MAS) de la muestra. Las bandas laterales giratorias aparecen en los espectros de RMN en estado sólido cuando la frecuencia de giro de la muestra es menor que el ancho del patrón de anisotropía de desplazamiento químico. DESACOPLAMIENTO DE 1 H DE ALTA POTENCIA El desacoplamiento de , H de alta potencia se usa para reducir aún más el ensanchamiento de la línea causado por el acoplamiento di polar a los espines de los 1 H en el estado sólido. Se requieren instrumentos especializados para proporcionar la radiofrecuencia a la potencia necesaria para desacoplar los 1H en sólidos, la cual debe ser dos órdenes de magnitud mayor que la requerida para eliminar el acoplamiento escalar en líquidos. El desacoplamiento de onda continua (CW, por sus siglas en inglés) se usa regularmente en la RMN en estado sólido, aunque el desacoplamiento de fase modulado por dos pulsos y la pequeña alteración creciente de fase (SPINAL-64) se usan cada vez más para mejorar la sensibilidad y la resolución de espectros de espines diluidos. Por lo regular, sólo las interacciones dipolares heteronucleares de 1H-13 C son significativas cuando se adquieren espectros de RMN 13C en estado sólido de materiales orgánicos. Las interacciones de acoplamiento escalar y dipolo-dipolo homonuclear 13C-13C son despreciables. Debido a su baja abundancia natural, la probabilidad de que dos núcleos de 13 C estén cerca uno de otro es muy pequeña. Sin embargo, los acoplamientos dipolares 13 C-13 C pueden ser de importancia para los sustratos marcados con 13(. CONFIGURACIÓN EXPERIMENTAL La configuración básica para un experimento CPMAS necesariamente debe incluir el ajuste al ángulo mágico, la compensación del magneto, la calibración de pulso, el pareo de Hartmann-Hahn y la referencia espectral, todo lo cual se realiza típicamente sobre estándares. En los experimentos de RMN en estado sólido es esencial que se mida con exactitud la duración del pulso y el nivel de potencia de la radiofrecuencia asociada. Establecer el ángulo mágico, compensar una sonda para CPMAS y
2134 (1761) Aplicaciones de la Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear/ Información General
USP 39
medir su sensibilidad para los diferentes intervalos de sintonía son partes esenciales de la configuración de la sonda y la evaluación del desempeño. Compensar una sonda de RMN en estado sólido para Giro al Ángulo Mágico es más complicado que hacerlo para una sonda para soluciones, debido a que los gradientes de compensación están diseñados para una orientación vertical de los tubos para RMN en solución. Las sondas de RMN en estado sólido no tienen un canal para fijación de 2 H, por lo que la compensación se debe realizar manualmente. Debido a que los picos son intrínsecamente anchos, la compensación no es tan crítica en la RMN de estado sólido como en la RMN de solución. Los estándares usados para fijar el ángulo mágico y optimizar la duración de los pulsos, y los niveles de potencia de la radiofrecuencia asociada para polarización cruzada se citan en la Tabla 6. El KBr es comúnmente utilizado para ajustar el ángulo mágico, observando la resonancia del 79 Br y ajustando el ángulo de giro de la muestra para maximizar la duración del tren de eco rotacional en la FID (a 1O ms o más). Se pueden usar muestras líquidas para compensar las sondas de RMN en estado sólido, aunque a menudo se usa adamantano sólido para dicho propósito. El adamantano, la glicina y el hexametilbenceno (HMB) se utilizan comúnmente para el pareo de Hartmann-Hahn y probar la sensibilidad. Por lo general, la referencia para probar la sensibilidad se empaca permanentemente dentro de un rotor para asegurar el uso de la misma cantidad de muestra. Tabla 6. Muestras Estandar Comunmente Usadas para Confl gurar Experimentos de Gi ro a 1 Angu 1o M.ag ico por Po 1ar1zac i.on Cruzad a Muestras Estándar Núcleo Procedimiento de Ajuste Configuración del ángulo mágico
79Br
KBr
Compensación
13(
adamantano
Calibración del pulso
1H, 13C
adamantano, HMB
Correspondencia Hartmann-Hahn
lH/BC
adamantano, HMB
13(
HMB, adamantano, a-glicina
Sensibilidad
Los espectrómetros de RMN de estado sólido por lo general se utilizan sin fijar al campo o la frequencia, de forma que los desplazamientos químicos resultantes son menos exactos que los que se obtienen en solución. La calibración de los desplazamientos químicos se puede realizar usando un estándar primario o secundario. El referenciado espectral generalmente se lleva a cabo reemplazando las muestras (referenciado externo). Los estándares comúnmente usados para el referenciado espectral en la RMN de estado sólido se citan en la Tabla 7. Se debe tomar en cuenta que la glicina es polimórfica, por lo que se debe asegurar su forma cristalina antes de usarla para obtener referenciados espectrales.
Núcleo
Tabla 7. Compuestos de Referencia Comúnmente Usados para RMN en Estado Sólido Desplazamiento Químico en ppm a partir del Estándar Primario Estándares Secundarlos Estándar Primario
TMS
HMB adamantano a-qlicina
17,35 (CH 3) 38,48 (CH 2) 176,45 (carboxilo)
1sN
nitrometano
NH4lSN03 15 NH 4 CI a-glicina- 1SN
-5,1 (N0 3) -338, 1 -349,5
31p
13(
85% H,P04
CaHP0 4 • 2H 70 (brushita)
1,4
29Si
TMS
tetratrimetilsililmetano
-1,4
19F
CF,CI
perfluorobenceno
-166,4
Procedimiento de Prueba General El desempeño del espectrómetro se debe demostrar primero para una muestra de referencia tal como se describe en Técnica de RMN de Polarización Cruzada con Giro al Ángulo Mágico, Configuración Experimental. El ángulo mágico, la duración del pulso y los niveles de potencia de la radiofrecuencia asociada para polarización cruzada que se establecen usando compuestos de referencia son independientes de la muestra. Para obtener un espectro de polarización cruzada de la muestra, únicamente se requiere seleccionar el tiempo de espera para la repetición del ciclo, seguido del tiempo de contacto. Cuando no se requieren intensidades cuantitativas de las señales, un tiempo de espera óptimo para la repetición de ciclos, es decir, el que produce la mejor relación señal-ruido, es 1,2 T1H, y el tiempo de contacto es generalmente el que produce una óptima relación señal-ruido o el que muestra mejor las características de interés. Para la polarización cruzada cuantitativa, se recomienda utilizar un tiempo de espera para la repetición del ciclo de al menos cinco veces el T1H más largo de una mezcla heterogénea para asegurar una relajación completa, y se debe realizar un análisis completo de la señal de polarización cruzada en función del tiempo de contacto. Ver la subsección Análisis Cuantitativo. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA Los procedimientos para la manipulación de la muestra usados en RMN de estado sólido son significativamente distintos a los usados en RMN de líquidos. Las muestras sólidas se empacan en rotores cerámicos que se tapan con extremos dentados específicamente diseñados para hacer girar la muestra al Ángulo Mágico. Los polvos finos a menudo se apisonan en los rotores
USP 39
Información General/ (1761) Aplicaciones de la Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear 2135
para giro al ángulo mágico, aunque sólidos en bloque tipo tapón, p.ej., tabletas enteras, pueden cortarse para ajustarse a las dimensiones internas exactas del rotor y se puedan insertar directamente en el rotor. Asimismo, la muestra puede reducirse a polvo fino mediante trituración o molienda, pero se deben tomar precauciones para no inducir transiciones de fase. Dependiendo de la compresibilidad del polvo y del volumen del rotor, generalmente se requieren entre 40 y 400 mg de material para llenar un rotor de muestra.
Caracterización Física Los componentes específicos de los sistemas heterogéneos se puede buscar basándose en un núcleo único o en diversas propiedades de relajación de RMN. Se puede lograr la identificación de materiales cristalinos y amorfos mediante la comparación del espectro de RMN en estado sólido de una preparación de muestra con la de un estándar de referencia. En dicha comparación se pueden usar los desplazamientos químicos y las intensidades relativas de los picos. Los materiales amorfos generalmente producen un buen espectro MAS con picos más anchos que los observados para materiales cristalinos. Las muestras altamente cristalinas típicamente producen anchos de línea de 13 ( en el orden de unas pocas decenas de Hz. La forma de las señales es entre lorentziana y gaussiana, este hecho se debe tener en cuenta al resolver espectros superpuestos.
Relajación Los parámetros de relajación de interés en los sólidos incluyen la relajación espín-entorno (T1), la relajación espín-entorno en marco rotante (T 1) , la relajación espín-espín (T2 ) y la relajación cruzada (Tep). En los sólidos órganicos, la difusión del espín 1 H es generalmente eficiente de modo que los compuestos puros normalmente producen valores singulares para cada uno de los tiempos de relajación, T1 y T1P. Para los experimentos de polarización cruzada, el T1H se usa para establecer el tiempo de espera de repetición de ciclos entre adquisiciones. Los tiempos de relajación T1H se pueden medir usando tanto secuencias de pulso de saturación progresiva o de recuperación por inversión. En los experimentos de polarización cruzada, el Ter y el T1pH caracterizan el crecimiento y decaimiento de la magnetización, respectivamente. El T1pH se mide mediante la señal de 13 ( usando una secuencia de pulsos de polarización cruzada de contacto retardado que tiene un tiempo de retraso variable antes del contacto de la polarización cruzada.
Análisis Cuantitativo Para evaluar cuantitativamente un espectro de RMN en estado sólido en condiciones de polarización cruzada se deben tomar mediciones adicionales. Además de asegurar que el eje de rotación de la muestra esté precisamente ajustado al ángulo mágico (54,7º) para minimizar el ensanchamiento por Anisotropía de Desplazamiento Químico, se deben controlar cuidadosamente la temperatura y la velocidad de giro y se debe sintonizar apropiadamente la sonda MAS. Para asegurar que la magnetización retorne a su valor de equilibrio completo, se sugiere que se ubiquen tiempos de espera de 5 T1H para la repetición de ciclos entre pulsos sucesivos. En la selección del tiempo de contacto se debe tomar en cuenta tanto la relajación Tep como la relajación T1pH· Por lo regular, el tiempo de contacto de polarización cruzada seleccionado será el que provea la máxima sensibilidad para las señales de interés. Los análisis cuantitativos se pueden realizar usando métodos de referencia internos o externos. El uso de estándares internos puede compensar la variabilidad en el volumen de muestra y la falta de homogeneidad de 8 1 en toda la muestra. Resulta posible obtener señales que sean proporcionales al número de núcleos que las producen mediante la configuración apropiada de los parámetros de adquisición de datos (tiempo de repetición de ciclos, anchos de pulsos, tiempo de contacto, pareo Hartmann-Hahn e intensidad de desacoplamiento para cada sistema químico). Para análisis cuantitativos, se deben usar intensidades de señales integradas en lugar de alturas de picos puesto que, a menudo, se presentan variaciones en los anchos de líneas en los espectros de muestras en estado sólido. Cuando no se eliminan las bandas laterales de giro mediante MAS, se deben sumar las intensidades de las múltiples bandas laterales de giro a la intensidad de la banda central.
Edición de Espectros Un paso clave del análisis de cualquier espectro RMN es la asignación de resonancias individuales a fases únicas y, en algunos casos, a átomos específicos de la molécula. Se encuentran disponibles secuencias de pulsos especiales que pueden ayudar a simplificar los espectros de CPMAS y la asignación de señales. El desfase dipolar, también conocido como supresión no cuaternaria o desacoplamiento interrumpido, genera espectros que, por lo general, únicamente contienen señales de carbonos cuaternarios y metilos. La sustracción espectral de los espectros del desfase dipolar a partir de los espectros normales de polarización cruzada o de polarización cruzada con un tiempo corto de contacto se puede usar para producir subespectros que contengan únicamente señales de carbonos de metileno y metino. Se pueden usar técnicas de inversión por polarización para identificar carbonos de metileno y metino.
2136 (1761) Aplicaciones de la Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear/ Información General
USP 39
RMN DE CAMPO BAJO Los experimentos de RMN de campo bajo, en ocasiones denominados RMN de dominio de tiempo (TD-NMR, por sus siglas en inglés), se llevan a cabo midiendo la relajación, relaxometría o difusión. Los instrumentos para estas aplicaciones se basan en tecnologías de imanes permanentes de campo bajo que operan en el intervalo de frecuencia de 2-25 MHz. Se encuentran disponibles espectrómetros de RMN de dominio de tiempo de bajo precio fijos para mesada de laboratorio y portátiles. Los tamaños de orificios típicos son de 1 O a 50 mm de diámetro. Los diseños más recientes de espectrómetros emplean sondas tipo ratón móviles como una alternativa al magneto fijo. Este diseño permite el análisis de muestras sin restricción de tamaño. La mayoría de las aplicaciones de RMN de dominio de tiempo se basan en secuencias de pulsos simples, que incluyen FID, Hahn-echo, Carr-Purcell-Meiboom-Gill y la adquisición sólido-eco. La selección de la secuencia de pulsos depende de las propiedades físicas y químicas de la muestra, así como de la información que se desee obtener del experimento. Estos sistemas se pueden usar para medir los tiempos de relajación longitudinales (espín-entorno, T7) y transversales (espín-espín, T2). Se pueden aprovechar las propiedades de difusión de los compuestos usando experimentos de gradiente de campo pulsado. La aplicación clásica de la relaxometría es la determinación de componentes en alimentos basándose en las diferencias entre los tiempos de relajación longitudinales y transversales del agua, grasas y proteínas.
Relaxividad La relaxividad es la magnitud de la capacidad de una sustancia para mejorar la velocidad de relajación de un núcleo y se expresa en unidades de sec-1 mM-1• Un ejemplo de una sustancia de este tipo comúnmente usada para la espectroscopía de RMN es el acetilacetonato de cromo paramagnético. Las muestras paramagnéticas se usan en la industria médica como agentes de contraste para la generación de imágenes por resonancia magnética. La relaxividad de una sustancia se determina experimentalmente a través de la medición del tiempo de relajación espín-entorno (T7) de una sustancia de prueba y graficando 1 /T7 en función de la concentración en unidades de mM (mmol/L). La pendiente de la curva es la relaxividad numérica.
USP 39
Información General/ (1 787) Medición de Partículas Subvisibles 2137
(1787) MEDICIÓN DE PARTÍCULAS SUBVISIBLES EN INYECTABLES DE ,. ,. PROTEINAS TERAPEUTICAS INTRODUCCIÓN Los productos parenterales deben diseñarse y fabricarse de tal manera que se minimice la presencia de partículas, las cuales se diferencian en dos amplias categorías: visibles y subvisibles. El límite absoluto de visibilidad, o detectabilidad, depende de las condiciones de prueba y de la naturaleza de las partículas. Este capítulo de información general abarca partículas subvisibles en el intervalo de 2-100 µm. Las partículas con tamaños mayores a 100 µm por lo general se consideran partículas visibles (ver Partículas Visibles en Inyectables (790)). La materia extraña y las partículas son indeseables en el producto final y tienen dos orígenes: materia extraña o extrínseca y materia intrínseca o relacionada con el producto. La materia extrínseca es aquella que no puede asociarse con el producto o el proceso. Las partículas intrínsecas pueden derivarse del ensamblado del producto o resultar de cambios debidos al paso del tiempo. Una tercera categoría, la materia inherente, describe un estado físico o partículas que son un atributo esperado del producto. El objetivo de este capítulo es proveer información adicional para sustentar el capítulo Partículas Subvisibles en Inyectables de Proteínas Terapéuticas (787), el cual tiene límites para contenidos de partículas de :<>1 O µm y :<>25 µm. Debido a que el monitoreo de la población de partículas inferiores a 1O µm puede ser un parámetro importante de calidad del producto, se recomienda la recopilación de datos en el intervalo de 2-1 O µm (p.ej., 2-5 µm y 5-1 O µm). Este capítulo se enfoca en el recuento, caracterización y, cuando sea posible, la identificación de partículas inherentes, distinguiéndolas de las partículas extrínsecas e intrínsecas. El capítulo no abarca formulaciones en suspensión o emulsión, ni aquellas que contengan componentes particulados como coadyuvantes u otros propósitos similares. Sin embargo, las partículas y materias extrañas deben minimizarse en el medicamento final y es el fabricante quien en última instancia determina la estrategia y los métodos utilizados. Partículas extrínsecas: Se trata de materia que no es parte de la formulación, del envase o del proceso de ensamblaje, sino que es extraña e inesperada. Los ejemplos de partículas extrínsecas incluyen materiales de origen biológico (p.ej., fibras, partes de insectos, polen y material vegetal), del proceso y de materiales de construcción (p.ej., celulosa, pelusa, minerales, vidrio, plásticos, caucho, metal y pintura), y del personal (p.ej., células epiteliales, fragmentos de ropa y cabello). Partículas intrínsecas: Se trata de materiales que se presentan en el producto final y que provienen de los mismos ingredientes de la formulación, del envase o del proceso de ensamblaje. La relación con el proceso de producción y/o la procedencia del envase pueden indicar problemas sistémicos. Por ejemplo, el aceite de silicona es un importante componente de la fabricación y del producto que puede afectar los recuentos de partículas y que, en exceso, se considera intrínseco. La incidencia de partículas relacionadas con el aceite de silicona puede correlacionarse con ciertas secuencias de procesamiento o ciertos componentes de la formulación. La detección, identificación y medición de las partículas relacionadas con el aceite de silicona se tratan en mayor detalle en otra sección de este capítulo. Las partículas intrínsecas pueden ser similares de varias maneras a las partículas extrínsecas tales como caucho, metal, plástico y vidrio, pero pueden derivarse de una limpieza inadecuada del equipo de procesamiento. Las partículas intrínsecas también pueden derivarse de cambios en el producto con el paso del tiempo. Estos cambios pueden relacionarse con extractos iónicos u orgánicos, inestabilidad del ingrediente farmacéutico activo (API, por sus siglas en inglés), degradación de la formulación o de la interacción producto-envase. Las partículas intrínsecas pueden promover la agregación de proteína, por lo que se debe tener en cuenta dicha posibilidad. Partículas inherentes: Se trata de materiales que se espera se deriven del fármaco y de otros componentes de la formulación y que, por lo tanto, representan una característica potencialmente aceptable del producto. En el contexto de los inyectables de proteínas terapéuticas, el origen primario de partículas inherentes son los agregados proteínicos que se forman únicamente de las interacciones de la proteína consigo misma o en combinación con otros ingredientes de la formulación. La presencia de partículas proteínicas debe evaluarse con respecto a la uniformidad del proceso y la calidad del producto. Resulta crítico identificar y caracterizar los agregados para distinguirlos de las partículas extrínsecas e intrínsecas. Las herramientas y técnicas tratadas en este capítulo son aplicables a materias de todos los orígenes, aunque resultan especialmente útiles para la caracterización de agregados de proteínas.
2138 (1787) Medición de Partículas Subvisibles / Información General
USP 39
Las partículas heterogéneas consisten en más de una entidad química y se clasifican como extrínsecas o intrínsecas basándose en el componente no proteínico que presente el mayor riesgo. Históricamente, los métodos de prueba contenidos en el capítulo Partículas en Inyectables (788) se desarrollaron para la detección y control del contenido de partículas extrínsecas e intrínsecas y se basan en la obstrucción de luz (LO, por sus siglas en inglés) y/o en la determinación microscópica de partículas que están entre intervalos de 1 Oy 25 µm. Estos tamaños se seleccionaron con el objetivo de permitir una medición uniforme del contenido de partículas subvisibles y permitir la determinación de la aceptabilidad del producto desde la perspectiva de seguridad del paciente y de la uniformidad del proceso. El método de microscopía luego de filtración por membrana se desarrolló primero y se usó únicamente para productos de gran volumen (> 100 mL). Posteriormente, las mejoras en el método microscópico y el desarrollo de un método automatizado de extinción (obstrucción) de luz proveyeron métodos eficientes y robustos para rastrear el contenido de partículas en una variedad de productos con diferentes volúmenes de llenado. La evolución de las aplicaciones analíticas es típica en el proceso de establecimiento de normas farmacopeicas, en el que los métodos se actualizan para reflejar los avances tecnológicos, las consideraciones sobre la seguridad del paciente y los requisitos reglamentarios. Desde la oficialización del capítulo (788), la variedad de formas farmacéuticas y el número de productos terapéuticos proteicos se ha incrementado considerablemente. El método de obstrucción de luz descrito en el capítulo (788) presenta algunas limitaciones técnicas cuando se usa para analizar ciertos tipos de partículas (p.ej., aquéllas con bajo contraste en la matriz del producto o que pueden cambiar de tamaño o forma durante el análisis, como regularmente sucede con las partículas inherentes en inyectables de proteínas terapéuticas). Otras limitaciones del capítulo (788) para productos de proteínas terapéuticas se relacionan con la manipulación de la muestra y los pequeños volúmenes de producto. Dichas consideraciones han llevado al desarrollo del capítulo Medición de Partículas Subvisibles en Inyectables de Proteínas Terapéuticas (787).
OBJETIVO Este capítulo se desarrolló con el objetivo de describir estrategias para identificar y caracterizar poblaciones de partículas extrínsecas e intrínsecas en comparación con poblaciones de partículas proteínicas inherentes en inyectables de proteínas terapéuticas. Se trata información sobre métodos específicos que se pueden usar para estos propósitos, así como sus ventajas y limitaciones; dicha información se aplica a productos inyectables de proteínas terapéuticas y a sus diluciones o soluciones para infusión. El objetivo general es proveer una guía integral sobre el uso de una amplia variedad de métodos analíticos que se pueden usar además de los métodos descritos en los capítulos (787) y (788). Con esto, se espera lograr una caracterización mejorada u ortogonal de productos de proteínas terapéuticas durante su desarrollo y justificación, análisis de las causas de origen en investigaciones de incumplimientos, y estudios de estabilidad, entre otros. Este capítulo incluye métodos que permiten la evaluación de una variedad de características de los agregados inherentes de proteínas incluyendo su morfología, conformación, reversibilidad/disociación y modificación covalente. Las pautas sobre manipulación y preparación de la muestra se tratan de manera general.
ANTECEDENTES Las partículas extrínsecas e intrínsecas deben minimizarse en todos los productos parenterales. Sin embargo, hay partículas relacionadas con proteínas que pueden ser inherentes a productos de proteínas terapéuticas. Es necesario comprender y controlar las partículas inherentes. Estas partículas inherentes se conocen y se espera su presencia, la cual se deriva de la asociación de moléculas de proteínas que pueden estar presente en una sucesión continua de tamaños, que va desde los nanómetros (dímeros) hasta los cientos de micrones (multímeros y partículas visibles). La distribución del tamaño de partícula se ve afectada por la secuencia de aminoácidos, por las condiciones de la solución, y por el historial de manipulación de la muestra, entre otros factores. El fenómeno específico de la asociación de proteínas que da origen a las partículas se denomina agregación. Los términos "partículas proteínicas" y "agregados" se usan de manera intercambiable en este capítulo. Debido a que existen múltiples fuentes potenciales de partículas, es importante identificar las partículas y determinar si son extrínsecas, intrínsecas o inherentes. Una vez logrado lo anterior, es posible desarrollar y aplicar estrategias de control apropiadas. Si se presentan desviaciones, la identidad de las partículas guiará el análisis de causas originales, la evaluación de riesgos, las acciones correctivas y la estrategia de control. Los agregados de proteína inherentes en los productos de proteínas terapéuticas pueden estar formados por una población heterogénea y, por tanto, sus tamaños por sí solos no representan una descripción adecuada. Al comparar las poblaciones de agregados entre productos, laboratorios, etc., es importante considerar otras características tales como la morfología, la capacidad de disociación, las conformaciones de la proteína (o estructuras de orden mayor) dentro de los agregados y las modificaciones químicas presentes (7). Tales características se resumen en la Tabla 7 [adaptada de (7)]. Es importante tener en cuenta que los resultados obtenidos dependen de la técnica y la metodología usada; por lo tanto, la información acerca del método usado debe incluirse en todas las descripciones de caracterización de agregados de proteínas. Las herramientas disponibles para la caracterización de agregados se describen más adelante en este capítulo. Las herramientas usadas y las características analizadas deberán seleccionarse cuidadosamente basándose en la proteína que se está estudiando. A continuación se presenta una descripción más detallada de los atributos que deben considerarse durante la caracterización de agregados. El tamaño es el atributo de las partículas históricamente monitoreado y que sigue siendo un elemento descriptivo primario. Al informar las mediciones, se debe incluir el intervalo de tamaño medido y la técnica usada. Por ende, las partículas subvisi-
USP 39
Información General/ (1787) Medición de Partículas Subvisibles 2139
bles también pueden describirse como agregados/partículas entre 1 y 1 00 µm basándose en: el diámetro circular equivalente, que se determina usando obstrucción de luz; la cuerda más larga, usando microscopía de luz; el volumen esférico equivalente, usando detección de zona eléctrica; u otras dimensiones pertinentes que se obtienen usando otras tecnologías disponibles. La preparación de la muestra, el método de determinación y los algoritmos aplicados representan todos factores importantes que se deben incluir al informar los resultados. La capacidad de cualquier especie de agregado para disociarse (es decir, revertir al estado monomérico) y las condiciones requeridas para lograr esta disociación son características importantes que también se deben tomar en cuenta. La preparación de la muestra puede afectar los resultados obtenidos si los agregados son disociables; por lo tanto, comprender este aspecto de los agregados es crítico al seleccionar técnicas para el recuento, medición y caracterización. La capacidad de disociación de los agregados de proteínas se puede evaluar diluyendo los agregados en la solución amortiguadora de la formulación u otras soluciones, y volviéndolos a analizar con la técnica original. Esto también puede incluir simplemente retornar la muestra a las condiciones originales y evaluar cuánto del agregado se ha disociado. La capacidad de disociación es, por tanto, una característica de agregados de proteínas que puede proveer información sobre la manipulación y preparación de la muestra (p.ej., condiciones de dilución) para recuento de partículas. La capacidad de disociación también puede aplicarse a las especies de partículas intrínsecas y, en un grado menor, a las extrínsecas. La estructura y conformación de moléculas de proteínas en los agregados se puede investigar usando diversas técnicas biofísicas. Los hallazgos pueden ayudar en la investigación y la resolución de problemas. Asimismo, resulta útil contar con información sobre la presencia de modificaciones químicas tales como oxidación, desamidación, entrecruzamientos o fragmentación en el agregado. La conformación de moléculas de proteínas dentro de los agregados de proteínas, así como su estado de modificación covalente, puede ayudar a explicar el impacto biológico potencial de la partícula inherente. La morfología de las partículas puede servir como otro elemento descriptivo además de ayudar en la identificación de su origen. De manera más específica, la caracterización de la morfología puede ayudar a distinguir entre partículas que son inherentes al producto de proteínas terapéuticas y a aquéllas que son extrínsecas o intrínsecas. Las partículas proteínicas así como muchas intrínsecas y extrínsecas por lo general tienen formas irregulares, mientras que las burbujas de aceite de silicona y de aire tienden a ser esféricas. La morfología de los agregados de proteína también forma parte de los datos importantes que pueden facilitar las comparaciones entre estudios y a través del tiempo. La Tabla 7 provee una descripción general sobre las características de los agregados de proteínas que se deben tomar en cuenta que pueden servir para clasificarlos. Tabla 1. Descripción de Categorías de Agregados de Proteínas ( 7) Categoría
Tamaño
Clasificación <100 nm (nanómetro) 100-1000 nm (submicrómetro) 1-100 µm (subvisible) >100 µm (visible)
Disociabilidad
Reversible (revierte al estado inicial al volver a las condiciones originales) Irreversible (no se disocia en las condiciones analizadas) Disociable (se disocia en las condiciones específicas analizadas, p.ej., dilución, cambios en la solución amortiguadora, etc.) Disociable en condiciones fisiológicas
Reversibilidad
Reversible Irreversible Disociable Disociable en condiciones fisiológicas Disociable en condiciones definidas (lista)
Estructura secundaria/ terciaria
Nativa Parcialmente desplegada Desplegada Inherentemente desordenado Ordenado (p.ej., amiloide)
Modificación covalente
Entrecruzado (reducible y no reducible) Modificación intramolecular Oxidación Desamidación Fragmentación Sin modificación
Morfología
Número de subunidades monoméricas Relación de aspecto Rugosidad de la superficie Morfología interna Propiedades ópticas Heterogéneo (p.ej., proteína-aceite de silicona)
Aceite de silicona: Un lubricante común para productos farmacéuticos y envasado. En exceso, puede contribuir a recuentos elevados de partículas en los productos. Cuando resulta pertinente, la evaluación del efecto del aceite de silicona en recuentos de partículas en inyectables de proteínas terapéuticas es crítica para la estrategia de control general de partículas. En la fabrica-
2140 (1 787) Medición de Partículas Subvisibles / Información General
USP 39
ción de parenterales, el aceite de silicona se usa principalmente para facilitar la manipulación de componentes de envasado, para aliviar la adherencia de las partes de caucho, para permitir el flujo libre de los tapones en el cuenco/tolva y para facilitar su transporte hasta el envase lleno que está en espera. El aceite de silicona también se usa como lubricante para reducir la fuerza de deslizamiento y permitir el movimiento del tapón del émbolo en las presentaciones de jeringa prellenadas de vidrio. Las etapas controladas de lavado, enjuague, siliconización y esterilización se consideran de rutina en la preparación de envases parenterales. El rodado de cierres (p.ej., tapones de viales) con una cantidad medida de silicona se usa como un proceso de rutina para recubrir uniformemente las superficies antes de su uso. Resulta común la aplicación de una cantidad conocida de un lubricante aceptado, que se ha esterilizado. Incluso cuando se aplica con mucho cuidado, el aceite de silicona puede migrar con el tiempo desde la superficie de contacto del producto hacia el contenido durante el transporte, almacenamiento y uso del producto. Las gotitas de silicona pueden contribuir significativamente a los recuentos de partículas subvisibles del producto, específicamente, partículas en el intervalo de <1 O µm en el caso de inyectables de proteínas terapéuticas. El recuento de partículas depende de la cantidad de aceite de silicona y, en algunos casos, pequeñas cantidades de dicho aceite pueden tener un efecto importante sobre los recuentos de partículas (2). Las proteínas pueden adsorberse a las gotitas de aceite de silicona dentro de los productos terapéuticos a base de proteínas. La agitación resuspende y reacomoda las partículas de la matriz oleosa en diferentes formas y tamaños. El intervalo de tamaño de las gotitas de aceite de silicona en formulaciones de proteínas puede ser similar al de las partículas inherentes de proteínas, aunque las dos sustancias difieren en morfología y propiedades ópticas. El aceite de silicona en dispersión acuosa es por lo regular esférico, con un índice de refracción mayor que el de agregados de proteína y con una reducción regular en el contraste desde el exterior hacia el centro de la partícula. Esto es diferente en los agregados de proteína, los cuales son por lo regular amorfos y traslúcidos y tienen un índice de refracción muy similar al basal del monómero de la proteína en la formulación farmacéutica. Estas distinciones pueden usarse para desarrollar algoritmos para diferenciar las partículas de aceite de silicona de las partículas de proteínas. Asimismo, es posible monitorear los cambios en una población y distinguirlos de los cambios en otra. Debido a que el aceite de silicona tiene una función en el producto, los recuentos de partículas derivados del aceite se consideran intrínsecos y, por lo general, variarán con el paso del tiempo. Sin embargo, los procesos de aplicación mal controlados pueden generar cantidades excesivas de aceite de silicona. Se recomienda un diseno, control y aplicación cuidadosos del aceite de silicona para obtener una funcionalidad apropiada con la mínima cantidad requerida durante la vida útil del producto.
ESTÁNDARES DE PARTÍCULAS El análisis de la distribución de tamaño de partículas depende del instrumento usado y su método de calibración. Algunos estándares de partículas disponibles (recuento y tamaño) son esferas de látex, de poliestireno, esferas de sílice o polimetilmetacrilato (PMMA, por sus siglas en inglés) monodispersas y esferas de vidrio polidispersas. Todos estos estándares son esferas con un índice de refracción y una densidad que son marcadamente diferentes de las de los productos de proteínas terapéuticas. Debido a que las partículas de proteínas típicas tienen una morfología irregular y un contraste óptico bajo, no existen actualmente estándares disponibles que repliquen de manera uniforme la morfología y los parámetros de las partículas de proteínas. Las partículas de proteínas tienen un índice de refracción que es bastante cercano al de la matriz en solución. Esta diferencia en el índice de refracción es un parámetro crítico para la detección de partículas de proteínas mediante métodos que se basan en la interacción de la luz para medir la distribución del tamaño. Resulta importante establecer materiales de referencia estándar que repliquen las propiedades de las partículas de proteínas (3). Actualmente, se investiga activamente el desarrollo de estándares que simulen de mejor manera las partículas de proteínas. Estos estándares deben funcionar como sucedáneos de las partículas reales de proteínas basándose en que las propiedades del sucedáneo replican aquéllas de las proteínas reales para el método de detección seleccionado. Este enfoque es necesario debido a que los estándares que emplean proteínas se ven limitados por los siguientes factores: (a) el almacenamiento y el transporte deben realizarse a temperaturas cercanas a los -80º para lograr una estabilidad aceptable; (b) cualquier técnica no ambiental puede afectar el estándar; y (c) las partículas de proteínas son por sí mismas bastante variables, lo que dificulta contar con una sola proteína que se ajuste a todas las aplicaciones.
MEDICIÓN Y TECNOLOGÍAS DE CARACTERIZACIÓN DE PARTÍCULAS SUBVISIBLES Las siguientes secciones analizan las ventajas, las limitaciones y los usos apropiados de las metodologías (ver la Tabla 2) que permiten evaluar varias características de todas las partículas para los agregados de proteínas inherentes en especial, incluyendo el tamaño y la distribución, el tamaño y la morfología y la caracterización. La metodología seleccionada afectará el tamaño de partícula informado debido a los principios instrumentales de medición, el modo de medición, las características de las partículas, la preparación y la manipulación. Asimismo, se puede ver afectado por los algoritmos aplicados para estimar el tamaño, el volumen y el recuento. De esta forma, con cualquier medición del tamaño, se debe especificar el método usado. Además, las unidades deben indicarse claramente, debido a que el tamaño se puede proveer usando diversos parámetros, por lo regular el diámetro hidrodinámico, el diámetro circular equivalente (ECO, por sus siglas en inglés), la cuerda más larga, el diámetro esférico equivalente (ESC, por sus siglas en inglés), el diámetro de Feret o el peso molecular. La lista de la Tabla 2 no es exhaustiva.
Información General/ (1 787) Medición de Partículas Subvisibles 2141
USP 39
Tabla 2. Metodologías Otiles para la Medición de las Propiedades de Partículas Subvlslbles Sección 1: Tamaño y Distribución Principios de Operación
Intervalo
Obstrucción de luz
El tamaño de partícula en un producto líquido se determina mediante la cantidad de luz que bloquea al pasar entre la fuente y el detector.
1-300 µm
Zona de detección eléctrica (Coulter)
El tamaño de la partícula en un producto líquido o en un electrolito seleccionado se mide en términos del cambio en la resistencia a medida que la partícula pasa a través de un microcanal (orificio).
0,4-1600 µm
Difracción láser
El tamaño de las partículas en el producto líquido o en una dilución se determina midiendo el ángulo de la luz dispersada.
0,1-3500 µm
Técnica
Sección 11: Tamaño y Morfología Técnica
Principios de Operación
Intervalo
Microscopía de luz
Captura de imágenes fotónicas de las sustancias directamente en el producto líquido o de montajes del producto o de muestras aisladas en sustratos
0,3µma1 mm
Análisis de imágenes de flujo
Captura de imágenes digitales de las partículas en el producto líquido que fluye, la imagen magnificada revela el tamaño, la forma y las propiedades ópticas
0,7-100 µm para distribución del tamaño; 4-100 µm para morfología
Microscopía electrónica (EM, por sus siglas en inglés): Microscopía electrónica de barrido, microscopía electrónica de barrido de transmisión y microscopía electrónica de transmisión
Captura de imagen de electrones de especímenes aislados en sustratos. Se requiere alto vacío o presión casi ambiental.
Aa mm
Sección 111: Caracterización Técnica
Principios de Operación
Microespectroscopía lnfrarroja con Transformada de Fourier (FTIR)
Captura de imágenes de fotones de especímenes aislados en sustratos
Microespectroscopía Raman-Dispersiva
Captura de imágenes de fotones de especímenes aislados en sustratos o en productos líquicios o en montajes de productos líquidos
Intervalo
10µma1 mm 0,5µma1 mm
Aa mm para formación de Microscopía electrónica con espectroscopía por dispersión de rayos X (EDS, por sus siglas en inglés)
Emisión de fotones de rayos X a partir de muestras energizadas mediante un haz de electrones enfocado
Microscopía electrónica con espectroscopía por pérdida de energía electrónica (EELS, por sus siglas en inglés)
Dispersión inelástica a partir de muestras energizadas mediante un haz electrónico enfocado; la pérdida de energía es característica del elemento fuente; complementaria a la espectroscopía por dispersión de rayos X
A a mm
Espectrómetro de Masas de Iones Secundarios con analizadores de Tiempo de Vuelo (TOF-SIMS, por sus siglas en inqlés) Identificación de partículas de acuerdo con su perfil de espectros de masas Valoración por tinción
imágenes; 1 µm a 1 mm para composición elemental
Tinción visible para obtener una confirmación cualitativa de materiales desconocidos
para generación de imágenes; 0,5 µm a 1 mm para composición elemental
µm hasta mm 0,3 µm a 1 mm
La exactitud del equipo usado para determinar la distribución del tamaño de partículas se verifica mediante calibración con partículas de referencia de concentración conocida y de tamaño rastreable al Sistema Internacional de Unidades. El concepto de tamaño de partícula tridimensional es crítico para entender la forma en que los estándares de partículas interactúan con los diversos tipos de equipos medición y cómo comparar los resultados entre metodologías. Las diferentes técnicas emplean diferentes mediciones y algoritmos para determinar el tamaño (p.ej., diámetro de volumen equivalente, diámetro superficial equivalente y diámetro de arrastre o de Stokes).
2142 (1787) Medición de Partículas Subvisibles / Información General
USP 39
DISTRIBUCIÓN DE TAMAÑO Y RECUENTO Obstrucción de Luz (intervalo de trabajo de 1-300 µm) PRINCIPIOS DE OPERACIÓN La muestra se pasa entre una fuente de luz y un sensor. Los recuentos se generan cuando las partículas individuales pasan entre los dos, alterando el paso de la luz, lo cual genera un pico de voltaje. La altura de cada pico de voltaje depende del tamaño de la partícula que lo ocasiona. El tamaño de partícula que se va a registrar se genera a partir de una curva de calibración de tamaño-respuesta de voltaje que se genera usando estándares monoesféricos de tamaño de referencia certificados (por lo general, esferas de poliestireno). La obstrucción de luz tabula el tamaño de partícula como el diámetro de un círculo que tiene una sección cruzada equivalente. El producto puede muestrearse directamente a partir del envase, a partir de una combinación del contenido de varios envases o prepararse en forma de dilución (ver los capítulos generales Distribución del Tamaño de Glóbulos en Emulsiones Inyectables de Lípidos (729), Partículas en Inyectables (788), Partículas en Soluciones Oftálmicas (789) y Métodos para la Determinación de Partículas en Inyectables y Soluciones Oftálmicas (1788)). Ventajas • Método primario de los compendios USP-NF con gran cantidad de datos históricos en archivos • Las partículas se observan directamente en la solución • Las mediciones son simples y rápidas • Permite el muestreo unidad-unidad; analiza casi la totalidad de la muestra • Fácil implementación • Capacidad de procesamiento de muestras media a alta Limitaciones • Un solo cabezal de sensor no puede abarcar el intervalo completo de trabajo • Tabula el tamaño de partículas como el diámetro de un círculo que tiene una sección cruzada equivalente • Puede requerir la dilución de la muestra y puede cambiar las propiedades de ésta • Los límites superiores para la carga de partículas que se pueden medir dependen del sensor usado y del potencial para el recuento de coincidencias • Puede subestimar las partículas de proteínas subvisibles que se forman en la formulación debido a un contraste bajo • El medio debe ser transparente para la luz láser • Sensible a las burbujas de aire y algunas técnicas de desgasificación pueden cambiar las propiedades de la muestra • Destructiva, es decir, la muestra no puede volver a ser usada
Zona de Detección Eléctrica (Principio de Coulter) (intervalo de trabajo de 0,4-1600 µm) PRINCIPIO DE OPERACIÓN La muestra se diluye en una solución electrolítica y se la hace atravesar una pequeña apertura, pasando entre los electrodos activos, interrumpiendo un campo eléctrico. La respuesta se basa en el volumen desplazado del electrolito y, por ende, el tamaño se informa como el diámetro esférico equivalente (el diámetro de una esfera estándar de calibración del mismo volumen que la partícula). La respuesta no se ve afectada por el tipo de partícula (p.ej., variaciones de color, dureza, opacidad, índice de refracción). Ventajas • Determina el tamaño de partícula en términos del volumen esférico equivalente • No se ve afectada por las propiedades ópticas de la solución • Es una técnica ortogonal a los métodos basados en luz, como la obstrucción de luz • Capacidad media a alta de procesamiento de muestras para un sólo orificio. Limitaciones • Se requiere una baja concentración de partículas •Cada orificio tiene un intervalo de medición limitado (2%-60% del diámetro del orificio) • Cerca del extremo inferior del intervalo de trabajo, el ruido eléctrico puede ser difícil de distinguir de los recuentos de partículas reales • Para una amplia distribución de tamaño de partícula, puede requerirse más de un orificio, lo cual implicará una reducción en la capacidad de procesamiento de muestras • La muestra debe diluirse en una solución electrolítica si el amortiguador de la formulación no tiene suficiente conductividad; la dilución puede alterar las propiedades de la muestra • Los orificios de menor tamaño requieren una conductividad mayor de medio y pueden requerir una concentración significativamente mayor del amortiguador • Destructiva, es decir, la muestra no puede volver a ser usada
USP 39
Información General/ (1787) Medición de Partículas Subvisibles 2143
Difracción Láser (intervalo de trabajo de O, 1-3500 µm) PRINCIPIO DE OPERACIÓN La difracción láser detecta partículas que pasan a través de un haz de láser a medida que dispersan la luz en una distribución de intensidad angular que depende del tamaño de las partículas. Por lo tanto, es posible calcular las distribuciones del tamaño de partículas si la intensidad de la luz dispersada de una muestra se mide como una función de ángulo. Esta información angular debe compararse con un modelo de dispersión (teoría de Míe) para calcular la distribución del tamaño. Ventajas
•Tiempo corto de análisis (hasta 30 segundos) • Se pueden recuperar muestras analíticas • Preparación limitada de muestras • El patrón de dispersión permite calcular la masa molecular • Capacidad alta de procesamiento de muestras • Intervalo dinámico grande. Limitaciones
• La intensidad es directamente proporcional al tamaño, lo cual puede llevar a una interpretación errónea de la población • El análisis se basa en un ajuste teórico que requiere un índice de refracción y otros factores ópticos • El medio debe ser transparente para la luz láser • Asume que las partículas son esféricas y que no interactúan entre sí • Se requiere una concentración baja de partículas; puede ser necesaria la dilución y puede cambiar las propiedades de la muestra • Se pueden presentar complicaciones al comparar datos entre proveedores de instrumentos • Las interacciones partícula-partícula y la ocasional dispersión múltiple pueden generar resultados de tamaño aparente que difieran significativamente del tamaño de partícula real • Resultados deficientes para polidispersiones cuando se presentan simultáneamente partículas pequeñas y grandes • Para el cálculo del peso molecular exacto, se requieren partículas monodispersadas
TAMAÑO V MORFOLOGÍA Microscopía de Luz (LM, por sus siglas en inglés) (intervalo de trabajo 0,3 µm a 1 mm) PRINCIPIO DE OPERACIÓN La microscopía óptica o de luz implica el paso de luz a través de una serie de lentes después de transmitirla a través de la muestra preparada o reflejándola desde ésta última. La imagen formada por la luz proveniente de la muestra puede ser directamente detectada por el analista, puede ser capturada en una placa fotográfica o ser capturada digitalmente. Las muestras pueden analizarse directamente o después de la captura en el filtro. La microscopía de luz se puede combinar con análisis de imágenes estáticas, permitiendo así la captura de imágenes digitales y la deconvulción adicional usando sistemas de software para el análisis de imágenes. Al usar análisis de imágenes, se pueden seleccionar ciertos parámetros para descartar artefactos o poblaciones de partículas no deseados (circularidad, relación de aspecto, entre otros) y posteriormente comenzar el estudio de del conjunto poblacional seleccionado (ver Microscopía Óptica (776), (788), (789) y (1788)). Ventajas
• Observación directa de partículas en el producto fluido y de partículas capturadas en filtros • La visualización, el recuento, la determinación del tamaño y la caracterización morfológica de partículas se obtienen fácilmente • La observación directa de partículas puede proveer reconocimiento e identificación inmediatos • Se puede acoplar con análisis espectroscópicos (infrarrojo, Raman) para identificar la composición química • La identificación de partículas se puede mejorar mediante la búsqueda y comparación en la base de datos de imágenes • Se requiere sólo un pequeño volumen de muestra para la observación directa • La filtración por membrana es un método secundario al de Obstrucción de Luz del capítulo (788) Limitaciones
•Toma mucho tiempo • Capacidad baja de procesamiento de muestras • La profundidad limitada del campo a un aumento alto puede afectar la exactitud de la determinación del tamaño • Sólo se analiza un pequeño volumen de muestra, por lo que el muestreo debe realizarse cuidadosamente • Para muestras que se capturan en un filtro, algunas partículas de proteínas pueden pasar a través de las membranas y pueden presentarse como un fondo amorfo • Para muestras capturadas en el filtro, existe el potencial de artefactos de la preparación de las muestras
2144 (1 787) Medición de Partículas Subvisibles / Información General
USP 39
• Difícil de visualizar partículas con bajo contraste óptico; se debe usar microscopía de contraste de fases por interferencia diferencial, microscopía de luz polarizada y otros métodos • Destructiva, es decir, la muestra no puede volver a ser usada una vez capturada en el filtro
Análisis de Generación de Imágenes de Flujo [intervalo de trabajo 0,7-100 µm (tamaño) y 4-100 µm (morfología)] PRINCIPIO DE OPERACIÓN Este método captura imágenes digitales de materiales dentro de una corriente de muestra fluyente y emplea análisis posterior de las imágenes colectadas y almacenadas. Al igual que en la microscopía óptica, la cual es esencialmente un sistema de análisis de imágenes estáticas, los análisis de imágenes dinámicas o la microscopía de flujo capturan múltiples imágenes separadas, en este caso usando un sistema de flujo dinámico. El análisis de imágenes dinámicas usa los componentes de un microscopio (iluminación, lentes del objetivo y de enfoque), y agrega una celda de flujo dimensional cerrada con una ruta de fluido definida, además de una cámara y un procesador para la adquisición y análisis de imágenes. De este modo, el método provee condiciones in situ con vistas realistas de las partículas. La visualización de las partículas de gases, líquidos, semisólidos o sólidos con esta técnica ayuda a la interpretación de otras mediciones en suspensión que no pueden visualizar las partículas que se están estudiando. Las partículas se mueven y probablemente se encuentran girando, lo cual debe tomarse en cuenta durante el diseño del sistema o la consideración de los datos. Incrementando la magnificación del sistema y la resolución pixelar, así como reduciendo la profundidad de la celda de flujo aumentará la calidad de la imagen capturada. Una ventaja adicional de la microscopía de flujo dinámica es la capacidad de aplicar análisis de tamaño y características a la imagen de partículas. Asimismo, se puede aplicar cualquier número de algoritmos adicionales para estudiar el conjunto de imágenes recolectadas según se requiera. la claridad, el contraste y la forma de la imagen de las partículas pueden indicar el posible origen o tipo de partícula y, cuando se cuenta con suficientes datos de comparación, se pueden aplicar filtros matemáticos para analizar y cuantificar diferentes poblaciones en una muestra. Este enfoque se ha usado para ayudar a distinguir el aceite de silicona de los agregados de proteínas. Ventajas • Observación directa de las partículas en el producto líquido (in situ) • El análisis de imágenes digitales capturadas permite la visualización, el recuento, la determinación del tamaño y la caracterización de partículas • las imágenes capturadas pueden someterse a análisis adicionales mediante diversos algoritmos • las imágenes reales de las partículas facilitan el entendimiento de las fuentes de contaminación y de la naturaleza del producto • En comparación con la obstrucción de luz o la microscopía en membrana, este método presenta una mayor capacidad de procesamiento de muestras y un tiempo de análisis reducido • la morfología y el índice de refracción relativa de partículas aparentes se calibran con facilidad • la técnica puede usarse con bases de datos de imágenes para identificar algunas partículas • Alta repetitividad, alta resolución y buena selectividad • Capacidad media a alta de procesamiento de muestras Limitaciones •Tamaño de partícula mínimo necesario • los resultados dependen del algoritmo usado para seleccionar, clasificar y determinar el tamaño de partículas • Dificultad para visualizar y cuantificar apropiadamente el número y el tamaño de partículas con contraste óptico bajo, tales como las proteínas traslúcidas • Puede requerir la dilución de la muestra y esto puede cambiar las propiedades de la misma • Destructiva, es decir, la muestra no puede volver a ser usada
Microscopía Electrónica (intervalo de trabajo de Angstrms a mm) PRINCIPIO DE OPERACIÓN En la Microscopía Electrónica, se usa un haz de electrones para iluminar las muestras y producir una imagen aumentada. El límite de resolución espacial práctico de la microscopía electrónica para muestras biológicas es aproximadamente 1 nm, lo cual excede en gran medida los requisitos de resolución para partículas típicas >0, 1 µm en soluciones de proteína. Para el análisis de microscopía electrónica, las partículas subvisibles deben aislarse individualmente o capturarse en un filtro adecuado y, posteriormente, deben montarse en grillas o soportes especiales para observación al microscopio electrónico. la microscopía electrónica tradicional opera a alto vacío (aproximadamente 1Q-6 Torr). La preparación de las muestras requiere secado y recubrimiento. Las tecnologías más nuevas permiten examinar muestras no recubiertas tal como se encuentran (microscopía electrónica ambiental o húmeda). Las técnicas de detección se dividen de la siguiente manera: (a) microscopía electrónica de barrido (SEM, por sus siglas en inglés), la cual puede usar señales electrónicas secundarias o de retrodispersión; (b) microscopía elec-
USP 39
Información General/ (1787) Medición de Partículas Subvisibles 2145
trónica de transmisión (TEM, por sus siglas en inglés), la cual visualiza electrones que pasan a través de la muestra; y (c) microscopía electrónica de tunelización de barrido (STEM, por sus siglas en inglés), la cual combina los principios SEM y TEM (ver también el capítulo Microscopía Electrónica de Barrido (1181 )). Ventajas • La visualización, el recuento, la determinación del tamaño y la caracterización morfológica de partículas se obtienen fácilmente • La observación directa puede permitir el inmediato reconocimiento e identificación de la muestra • Alta repetitividad, alta resolución y buena selectividad • Se puede obtener información sobre la composición química del objeto usando espectroscopía por dispersión de energías (EDS, por sus siglas en inglés) o espectroscopía electrónica por pérdida de energía (EELS, por sus siglas en inglés) (ver a continuación) • Profundidad de campo mejorada en comparación con los métodos que usan fotones • El análisis y la reconstrucción de imágenes permiten generar imágenes cuasi-tridimensionales de partículas Limitaciones • La preparación y el análisis de las muestras consumen mucho tiempo • Capacidad baja de procesamiento de muestras • Pueden surgir cambios en la estructura y el tamaño de las partículas debidos a la preparación de la muestra y a la operación a alto vacío • Las muestras pueden requerir una preparación especializada de la muestra dependiendo de su naturaleza • Puede ser necesario teñir las muestras con sales de metales pesados para mejorar el contraste con las proteínas • Las partículas de proteínas son flexibles y pueden pasar a través de las membranas • Destructiva, es decir, la muestra no puede volver a ser utilizada
Cambio en la redacción:
CARACTERIZACIÓN La caracterización del ingrediente activo proteico incluye determinar la naturaleza química de la proteína primaria así como la conformación, la agregación y las especies auto-asociadas (ver la Tabla 1) además de la evaluación de la distribución de tamaños. Es importante el tamaño de partícula de los agregados fundamentales; sin embargo, la naturaleza de los sólidos y su asociación con otras especies tienen importancia similar.
Microespectroscopía Infrarroja por Transformada de Fourier (FTIR) (intervalo de trabajo de 1O µm a 1 mm o mayor) PRINCIPIO DE OPERACIÓN Cuando la luz interactúa con una sustancia, la luz puede ser reflejada, absorbida o dispersada. En la espectroscopía infrarroja se analizan las propiedades vibratorias de la materia, por lo regular en el intervalo de 200-4000 cm-1, mediante la detección de la absorción de fotones durante la interacción con la luz. Además, el uso de instrumentos asociados a microscopios, es decir, microespectroscopía, permite seleccionar partículas individuales o zonas de interés aprovechando los filtros y polarizadores de los microscopios y la capacidad para capturar una imagen junto con los datos vibratorios u otros datos de generación de imágenes. Las técnicas de espectroscopía vibratoria son particularmente útiles para el análisis de partículas en soluciones de proteínas. Las partículas pueden aislarse individualmente o capturarse en un filtro de membrana y, posteriormente, analizarse usando microscopía FTIR. Debido a que la señal del agua en el infrarrojo presenta una fuerte interferencia con las bandas de proteína, estas muestras por lo regular requieren un secado minucioso antes del análisis. Por lo regular, los microscopios FTIR pueden operar en modo de imagen o medición directa en el campo del objetivo. En el modo de imagen, las señales infrarrojas se recolectan a partir de pixeles individuales en el área predefinida. Sin embargo, el modo de medición de campo por lo regular genera una mejor relación señal-ruido, debido a que se colecta la señal infrarroja combinada de un área definida por el tamaño de la apertura. Muchos compuestos orgánicos tienen huellas dactilares infrarrojas únicas. Los espectros obtenidos de una partícula individual se pueden analizar realizando una búsqueda en una biblioteca de espectros infrarrojos o comparando los espectros obtenidos de la partícula con los espectros de materiales sospechados. •e (AFOl-may. 2QHíJ Ventajas • La microespectroscopía tiene las mismas ventajas de muestra que la microscopía de luz • Los instrumentos FT son excelentes en comparación con los espectrómetros dispersivos (monocromador de red de dispersión) para el análisis de partículas • Provee una rápida identificación y clasificación química de las partículas, de forma manual o automática, mediante comparación con bases de datos espectrales. • La identificación, estructura y composición de la partícula pueden derivarse a partir de los datos espectrales. • Provee cierta información sobre la estructura de la proteína
2146 (1787) Medición de Partículas Subvisibles / Información General
USP 39
• No destructiva, las muestras se pueden volver a analizar Limitaciones • Puede tener las mismas limitaciones que la microscopía de luz • Materiales comunes, tales como siliconas, agua y vidrio, producen absorción fuerte en la FTIR, lo cual puede interferir o comprometer el análisis de la muestra. • La identificación depende de la disponibilidad de información sobre posibles componentes en base de datos espectrales. • El límite de tamaño de partícula depende de la resolución del instrumento (-1 O µm para FTIR) • El proceso de identificación de partículas requiere mucho tiempo, cuando no se encuentra una coincidencia en una base de datos • La FTIR no es sensible a muchos materiales inorgánicos u otras moléculas que no poseen un momento dipolar • Ciertos detectores no son sensibles a materiales inorgánicos
Microespectroscopía Raman- Dispersiva (intervalo de trabajo 0,5 µm y mayor) PRINCIPIO DE OPERACIÓN Al igual que la espectroscopía infrarroja, la espectroscopía Raman estudia la forma en que la luz interactúa con una sustancia. Una fuente de fotones monocromáticos definida (láser) se enfoca sobre la muestra, con lo que se produce reflexión, absorción y dispersión, sondeando los mismos estados vibratorios que se sondean mediante microespectroscopía infrarroja. Específicamente, la espectroscopía Raman es el estudio de los fotones dispersados inelásticamente (dispersión Raman). Los fotones también son dispersados elásticamente (dispersión Rayleigh) sin cambios en la longitud de onda, pero se usan únicamente para marcar la energía de excitación láser. Se logra un estado de excitación virtual, el cual posteriormente se relaja a un estado vibratorio o giratorio base, emitiendo energía característica de un grupo funcional tal como los átomos moleculares y relacionados. Se registran desplazamientos más bajos (Stokes) y más altos (anti-Stokes) debido a la interacción con la nube de electrones de los enlaces de los grupos funcionales. Se utilizan láseres debido a que sólo una proporción muy pequeña de fotones dispersados por Raman (aproximadamente sólo 1 en 10 6-108 ) presenta desplazamientos en la longitud de onda. La microespectroscopía Raman combina un microscopio de luz con un láser coincidente y una vía de luz blanca. El uso de un microscopio permite aprovechar los filtros y polarizadores para ayudar en la selección de partículas individuales o de zonas de interés y permitir la captura de una imagen junto con espectros vibratorios. La espectroscopía Raman con Transformada de Fourier por lo general es complementaria a la espectroscopía Raman dispersiva, y al usar una excitación de longitud de onda más larga produce poca fluorescencia de muestra. Una ventaja importante de la microscopía Raman en comparación con la infrarroja es la capacidad de analizar muestras acuosas directamente, a menudo en portamuestras de vidrio. Las partículas individuales pueden analizarse in situ y, en algunos casos, directamente en el envase, siempre que no interfiera con la señal Raman. De manera similar al análisis infrarrojo, los espectros desconocidos pueden analizarse mediante una búsqueda en la base de datos espectral o mediante correspondencia con espectros de compuestos de referencia individuales. La teoría y las técnicas de la espectroscopía Raman se describen en mayor detalle en el capítulo Espectroscopía Raman (1120). Ventajas • Tiene las mismas ventajas de la muestra que la microscopía de luz • Los instrumentos dispersivos son mucho mejores que los espectrómetros de transformada de Fourier para análisis de partículas • Rápida identificación y clasificación química de partículas, de forma manual o automática mediante comparación con bases de datos espectrales • La identificación, estructura y composición de la partícula pueden derivarse a partir de los datos espectrales • Provee cierta información sobre la estructura de la proteína • Buen límite de tamaño inferior; la resolución del instrumento es -0,5 µm para la técnica Raman dispersiva • El análisis Raman es viable para muchos compuestos orgánicos y la mayoría de compuestos inorgánicos • La identificación usa datos de desplazamiento Raman, conocidos para categorías moleculares y grupos funcionales • No destructivo, las muestras se pueden volver a analizar • Los envases de vidrio y plástico tienen espectros Raman débiles, por lo que se minimiza la interferencia de los envases Limitaciones • Mismas limitaciones que la microscopía de luz • La fluorescencia de la muestra puede interferir con la recolección de datos •Con muestras lábiles, pueden presentarse cambios inducidos por el láser (calor, luz) • Muchas especies orgánicas no generan desplazamiento Raman; es decir, no existe polarización molecular • La identificación puede depender de información disponible en bibliotecas espectrales públicas o patentadas
USP 39
Información General/ (1787) Medición de Partículas Subvisibles 2147
Microscopía electrónica (EM, por sus siglas en inglés) con espectrometría de rayos X por dispersión de energías (EDS o EDX, por sus siglas en inglés) (intervalo de trabajo para análisis cualitativos, partículas O, 1 a 3 µm; para análisis semicuantitativos, partículas >3-µm) PRINCIPIO DE OPERACIÓN La espectrometría de rayos X por dispersión de energías (EDS o EDX) se basa en la emisión característica de fotones de rayos X generada a partir de una muestra mediante la interacción con una fuente de alta energía, tal como un haz de electrones. Por lo regular, se grafica la intensidad de la emisión elemental de rayos X en función de las energías , lo cual se correlaciona con las energías de transición por debajo de la capa de valencia atómica. La tecnología de los instrumentos actuales emplea detectores con ventanas de espesor delgado y sin ventana colocados cerca de la muestra en los sistemas de microscopía electrónica, lo cual mejora la detección y la relación señal-ruido para todos los elementos, en especial los elementos más livianos, p.ej., Z < 11 (sodio). Se logra conocer inmediatamente la composición cualitativa elemental de las muestras solidas (ver también (1181) para información general sobre microscopía electrónica y espectrometría por dispersión de energías). Ventajas • Complementaria a la microscopía de luz y disponible para la mayoría de los microscopios electrónicos comerciales • Determina la composición elemental de la muestra - Rápida recolección cualitativa para partículas pequeñas - Análisis semicuantitativo (1 % LDL y ±20% RSD) posible en experimentos controlados • De gran utilidad en investigaciones del origen de las partículas •Permite un sondeo de elementos en forma manual y/o mediante una búsqueda en bases de datos • El mapeo de elementos puede ayudar a la visualización de partículas de proteínas Limitaciones • No todos los instrumentos están equipados para la determinación de elementos livianos (p.ej, Z < 11) • El análisis cuantitativo requiere medir las intensidades de la línea para cada elemento en la muestra y para los mismos elementos en los estándares de calibración de composición conocida • El material de la membrana y el recubrimiento de la muestra pueden contribuir con un fuerte ruido de base
Microscopía Electrónica (EM) con Espectroscopía por Pérdida de Energía Electrónica (EELS) (intervalo de trabajo 0,5 µm a 1 mm) PRINCIPIO DE OPERACIÓN La espectroscopía por pérdida de energía electrónica (EELS) mide el movimiento vibratorio de átomos y moléculas en la superficie y sus proximidades analizando el espectro de energía de los electrones de baja energía que se retrodispersan desde la superficie. Ventajas • Se usa en conjunto con la microscopía electrónica de transmisión •Determina la composición elemental de la muestra, en especial los elementos livianos (p.ej., Z < 11) • Puede proveer información sobre los enlaces químicos • Es posible realizar análisis cualitativos y cuantitativos • Tiene límites de detección menores que la espectroscopía por dispersión de energías. Limitaciones • Difícil de interpretar • Fuerte ruido de fondo • El análisis cuantitativo requiere medir las intensidades de la línea para cada elemento en la muestra y para los mismos elementos en los estándares de calibración de composición conocida.
Espectrómetro de Masas de Tiempo de Vuelo de Iones Secundarios (TOF-SIMS) (intervalo de traoajo desde µm hasta casi mm) PRINCIPIO DE OPERACIÓN El Espectrómetro Masas de Tiempo de Vuelo de Iones Secundarios (TOF-SIMS) es un método analítico sensible a la superficie que emplea un haz de iones pulsado[ cesio (Cs) o galio (Ga) microenfocado] para desprender moléculas de la superficie más externa de la muestra. Los iones secundarios se desprenden de monocapas en la superficie. Estos iones posteriormente se aceleran al interior de un "tubo de vuelo" y su masa se determina midiendo el tiempo exacto que les toma alcanzar el detector (es decir, el tiempo de vuelo). Ventajas
2148 (1787) Medición de Partículas Subvisibles / Información General
USP 39
• Mide todas las masas de los materiales de las superficies; éstas pueden incluir iones individuales (positivos o negativos), isótopos individuales y compuestos moleculares • Permite un mapeo elemental y químico a escala submicrónica • Alta resolución de masas, para distinguir especies de masa nominal similar • Alta sensibilidad para trazas de elementos o compuestos, en el orden de g/g hasta ng/g (ppm hasta ppb; por las siglas en inglés correspondientes a partes por millón y partes por millardo, es decir mil millones, respectivamente) para la mayoría de las especies • Se pueden analizar superficies de muestras aislantes y conductoras • Permite caracterizar un perfil de profundidad (en las proximidades de la superficie, en el orden de capas atómicas individuales hasta decenas de nanómetros) • Análisis no destructivo • Análisis retrospectivo, para análisis posterior a la adquisición de datos e interpretación de imágenes y espectros almacenados Limitaciones • Por lo general, no produce análisis cuantitativos (semicuantitativos en el mejor de los casos) • Por lo regular presenta capacidades ópticas limitadas, lo que dificulta encontrar gránulos o regiones localizadas de interés para el análisis • Las cargas pueden representar un problema para algunas muestras, aunque las rutinas de compensación de cargas por lo general son suficientes para superar dichos problemas • Comúnmente, se presenta un desplazamiento de la imagen al cambiar del modo de recolección de datos de iones positivos a negativos, lo que dificulta la recolección de datos de iones positivos y negativos exactamente en el mismo punto.
Valoración por Tinción (intervalo de trabajo de 0,3 µm a 1 mm) PRINCIPIO DE OPERACIÓN Los métodos de tinción emplean reactivos para generar reacciones específicas, tales como tinción visible o de fluorescencia, lo cual provee una confirmación cualitativa de identidad o de categorías de materiales. desconocidos. Por lo general se llevan a cabo usando métodos microscópicos; están sujetos a ventajas y limitaciones de la microscopia. Ventajas • Observación directa de los efectos de la tinción en las partículas en un fluido del producto y mediante captura en filtro • Fácil visualización, recuento, determinación del tamaño y caracterización morfológica de partículas • La observación directa puede permitir la inmediata identificación y reconocimiento de las partículas • Se puede acoplar con análisis espectroscópicos (infrarrojo, Raman) para identificar la composición química • Análisis de superficie de muestras aislantes y conductoras • La identificación de partículas puede mejorarse mediante una búsqueda y comparación en una base de datos de imágenes • Sólo se requiere un volumen de muestra pequeño para la observación directa Limitaciones • Baja capacidad de procesamiento de la muestra • Profundidad de campo limitada a gran aumento • Sólo se analiza un pequeño volumen de muestra, por lo que el muestreo debe realizarse cuidadosamente • En muestras capturadas en filtros, las partículas de proteínas pueden pasar a través de las membranas y pueden aparecer como un fondo amorfo • En muestras capturadas en filtros, se pueden producir artefactos derivados de la preparación de la muestra • Las partículas con bajo contraste óptico son difíciles de visualizar; se debe usar microscopía de contraste de fases por interferencia diferencial , microscopía de luz polarizada y otros métodos • Destructiva, es decir, no se pueden volver a analizar las muestras capturadas en filtros
ESTRATEGIA Las partículas en productos de proteínas terapéuticas por lo general presentan una distribución continua de tamaños con números exponencialmente mayores para las partículas más pequeñas (<10 µm). La información que se genera a partir del análisis de partículas de proteínas inherentes puede usarse para guiar las tareas de desarrollo y para facilitar la comunicación y comprensión de este importante atributo de calidad de los productos de proteínas terapéuticas. Se debe desarrollar una estrategia racional para caracterizar agregados o partículas de proteínas. Las categorías de la Tabla 7 proveen pautas sobre las diferencias observadas entre los tipos de agregados de proteínas, reconociendo que el análisis de distribución del tamaño de partículas de estas especies es importante, aunque no es la única característica informativa. La descripción de las características de los agregados proteicos tal como se muestra en la Tabla 7 puede ayudar a definir la población y/o las características más importantes para la evaluación de los efectos sobre la calidad del producto.
USP 39
Información General/ (1 787) Medición de Partículas Subvisibles 2149
Para obtener una caracterización integral de la distribución de partículas, es necesario aplicar una variedad de técnicas analíticas. Existen diversas técnicas disponibles para medir y caracterizar partículas, cada una con sus ventajas y limitaciones. Se requieren múltiples métodos porque difieren en cuanto a su capacidad para analizar atributos específicos de la partícula. El uso de métodos ortogonales permite determinar de mejor manera la naturaleza de las partículas (extrínsecas, intrínsecas o inherentes), la distribución del tamaño y otros aspectos que pueden permitir la diferenciación entre partículas. La información sobre las características de las partículas se puede usar para evaluar riesgos sobre la presencia de agregados y puede ayudar a identificar los mecanismos potenciales de su formación. Este conocimiento sobre las características de las partículas también se puede usar durante la formulación y el desarrollo del proceso a fin de tomar decisiones informadas acerca de las etapas de formulación y del proceso, lo que puede ayudar a reducir el contenido general de partículas del medicamento. Una estrategia integral para la evaluación de partículas subvisibles implica múltiples fases, desde el desarrollo, pasando por la comercialización y durante la comercialización. La medición/caracterización de partículas puede comenzar tan pronto como en la etapa de selección de candidatos, usando técnicas de alta capacidad de procesamiento de muestras para predecir las tendencias de formación de partículas de las moléculas que se están considerando. Esto implica usar pequeñas cantidades de material y proveer una clasificación correspondiente de la tendencia a la agregación.
Desarrollo Temprano En esta etapa, el enfoque se centra en entender el perfil típico de las partículas para el producto, incluyendo la distribución de tamaño y las características de los agregados más comúnmente observados en el medicamento. El tamaño y el recuento de partículas en el intervalo de 1 a 100 µm debe monitorearse al momento de la fabricación y durante la estabilidad.
Desarrollo Tardío En esta etapa, el enfoque se centra en entender el medicamento y la comparación entre lotes, así como el vínculo entre el análisis de tamaño de partícula y la formulación, la fabricación y el uso. El tamaño y el recuento de partículas en el intervalo de 1 a 100 µm deben monitorearse en las partidas para estudios clínicos. Se debe llevar a cabo una mejor caracterización de los agregados y de las partículas, incluyendo a las partidas que representan. Se deben recolectar datos cuantitativos y cualitativos sobre las partículas subvisibles que se forman en las condiciones de almacenamiento, de uso y de estrés, y se deben crear estrategias para la disminución de riesgos. Al seleccionar el método final para monitorear el tamaño y el recuento de partículas del producto, se deben establecer estrategias de control para partículas inherentes e intrínsecas. La estrategia general de control desarrollada puede incluir límites de acción además de los requeridos para una investigación.
Comercialización En esta etapa, resulta necesario recolectar datos de las partidas comerciales para alinearlos con la estrategia de control general, lo cual puede incluir el intervalo sub-1 O µm (1 a 1O µm). Usar análisis cuantitativos y cualitativos para controlar los cambios realizados durante el ciclo de vida posterior a la comercialización. Cuando se lleva a cabo una investigación, el conocimiento obtenido durante el desarrollo puede usarse para diseñar estrategias de mitigación. Los estudios de estabilidad también forman parte de la gestión del ciclo de vida y se tratan más adelante en el apartado Aplicación.
Perspectiva General La profunda caracterización de agregados realizada durante la etapa de desarrollo, junto con la correlación de los resultados obtenidos de estas pruebas con aquéllos usados durante la liberación del producto (tales como obstrucción de luz), puede proveer los fundamentos para una estrategia racional general de control. Los agregados por lo regular están presentes en un continuo de tamaño desde oligómeros hasta partículas de cientos de micrómetros. Cuando sea posible demostrar una correlación (u otra relación matemática) entre los recuentos de partículas desde oligómeros hasta tamaños >25 µm según se evalúan como parte del método farmacopeico, puede ser posible basarse en el método de obstrucción de luz para la determinación del contenido de partículas >1Oy >25 µm y revelar el efecto de los cambios y tendencias en la fabricación en partículas de 1 a 1 O µm. En dicho caso, se usaría la estrategia general de control para establecer los límites de acción para partículas >1 O µm, los cuales al ser excedidos desencadenarían una investigación, incluyendo los métodos de caracterización tratados en este capítulo.
CONSIDERACIONES DE LA MUESTRA Algunos aspectos del manejo y del volumen de la muestra requieren consideración especial. Es necesario desarrollar y aplicar procedimientos de manipulación y desgasificación para evitar artefactos tales como falsos positivos atribuibles a burbujas, o agregados generados durante las etapas de preparaéión de la muestra. En ciertas circunstancias, puede ser necesario diluir las muestras para obtener resultados confiables. El capítulo (787) describe aspectos sobre la manipulación de muestras.
2150 (1787) Medición de Partículas Subvisibles / Información General
USP 39
APLICACIÓN Un enfoque clave durante el desarrollo de un medicamento de proteínas es adquirir conocimiento sobre la naturaleza, el origen y el número de partículas/agregados inherentes que se encuentran presentes en la fórmula terapéutica, así como su estabilidad y efectos generales sobre la calidad, la seguridad y la eficacia del producto. Los agregados de proteína en el intervalo de 1 a 1 O µm también pueden conllevar el riesgo de potenciar inmunogenicidad contra la actividad terapéutica (4,5). Desde una perspectiva de desarrollo del producto, los cambios en las concentraciones de partículas proteicas subvisibles, en particular en el intervalo 1 a 10-µm, pueden ser un indicador temprano y sensible de problemas potenciales con la estabilidad el producto (6,7). Aparte de la estabilidad, también se deben medir las partículas que tengan estos intervalos de tamaño como parte del ejercicio de evaluación de riesgos para mejorar el entendimiento de cómo los varios factores de estrés y condiciones de uso afectan al producto. Dichas condiciones pueden incluir características térmicas, de congelación/descongelación, luz, transporte, dilución/mezclado y uso. Los recuentos de partículas en el intervalo de 1 a 1 O µm tienden a ser significativamente mayores (en órdenes de magnitud) que los del intervalo ~1 Oµm. Esto hace el intervalo de 1 a 1 O µm útil para el propósito descrito anteriormente, debido a que se pueden observar más fácilmente los cambios. Sin embargo, los recuentos también tienden a presentar una variación significativa y, por ende, la capacidad de discernir tendencias requiere de controles apropiados, de muestreos adecuados y de una buena técnica. La caracterización detallada de partículas subvisibles, en especial de partículas inherentes, provee información que puede sustentar la formulación y el programa de desarrollo del producto, lo que conlleva a un proceso robusto y a una estrategia de control comercial. Por otra parte, aunque la caracterización por sí sola podría no revelar posibles correlaciones entre una respuesta inmune y agregados/partículas, el uso de múltiples métodos aplicados a múltiples lotes de medicamentos ayuda a generar información para definir la calidad del producto, lo que puede vincularse con los datos de seguridad y eficacia obtenidos a partir de los ensayos clínicos. Dicho conocimiento también es útil para la gestión del ciclo de vida, tal como en el caso de movimientos de productos entre sitios de fabricación, cambios en la presentación (líquida a liofilizada; vial a jeringa prellenada) y cambios en la concentración. Para ilustrar dichos puntos, a continuación se presentan dos ejemplos, los cuales demuestran la forma en la que pueden usarse técnicas complementarias para adquirir conocimiento sobre el producto.
Ejemplo 1: Comparación de Configuraciones de Medicamentos No todos los productos se formulan como líquidos. En un caso, se desarrolló una formulación líquida en una configuración de jeringa prellenada para facilitar la administración en pacientes, partiendo de un medicamento liofilizado envasado en viales de vidrio. Se esperaba que una comparación de recuentos de partículas subvisibles mediante obstrucción de luz mostrara que el recuento de partículas de la formulación liofilizada reconstituida fuera mayor que los de la formulación líquida, pero se observaron resultados opuestos, en los que la formulación líquida presentaba niveles significativamente más altos de partículas >2 µm [-130 000 partículas por envase (ppe) en comparación con -30 000 ppe]. Dichas muestras se evaluaron posteriormente usando el método de microscopía en membrana, y los resultados fueron más coherentes con el resultado esperado: para tamaños de partículas >5 µm, la formulación liofilizada contenía -70 ppe en comparación con -14 ppe para la formulación líquida. Posteriormente, el análisis se realizó usando microscopía de flujo para entender la discrepancia de los resultados entre los métodos de microscopía en membrana y de obstrucción de luz. La microscopía de flujo sustentó los resultados de obstrucción de luz, en los que la formulación líquida mostró números más altos de partículas >2 µm (-600 000 ppe) en comparación con la formulación liofilizada (-150 000 ppe). El examen de la estructura de las partículas reveló una morfología diferente en la formulación líquida, con un número predominante de las partículas que presentan una forma esférica, lo que resulta congruente con la presencia de gotitas de aceite de silicona provenientes del envase de jeringa prellenada. Estos resultados se confirmaron analizando una muestra de la formulación líquida que no había sido expuesta a la jeringa prellenada (la fuente de procedencia del aceite de silicona), que mostraba <20 000 ppe. Una vez que fueron tomadas en cuenta las gotitas de aceite de silicona, el número de partículas restantes en la formulación líquida en la jeringa prellenada fue menor que en la formulación liofilizada, lo que es congruente con los resultados de la microscopía en membrana.
Ejemplo 2: Selección de Tecnología de Llenado Los procesos de llenado pueden afectar la calidad del producto mediante la introducción de tensiones físicas tales como absorción, cizallamiento, fricción y formación de cavidades, lo que puede llevar a la agregación de proteínas. Algunas bombas de llenado de medicamentos pueden cizallar partículas extrínsecas que pueden originar una agregación heterogénea inducida por nucleación. Se investigó el efecto de usar un pistón de desplazamiento de acero inoxidable sobre el contenido de partículas subvisibles de las soluciones usando múltiples técnicas para analizar las partículas en solución (8). El análisis con un contador Coulter de una solución amortiguadora pasada a través de la bomba reveló que la bomba cizallaba partículas en solución, con la solución bombeada conteniendo >13 000 partículas por mL en el intervalo de 1,5 a 6 µm. El análisis elemental confirmó que las partículas eran acero inoxidable. El análisis de la distribución del tamaño de partícula en esta solución, que se llevó a cabo usando un determinador de tamaño de partícula por difracción láser, mostró que la mayoría de las partículas estaban entre 0,25 y 0,95 µm. La incubación de las nanopartículas de acero inoxidable con una solución de MAb-Y llevó a aumentos tanto en el
USP 39
Información General/ (1787) Medición de Partículas Subvisibles 2151
número de partículas como en la distribución del tamaño de partículas con el paso del tiempo. La caracterización de las partículas mediante espectroscopía FTIR mostró que la proteína absorbida sobre las partículas metálicas contenía una estructura secundaria levemente perturbada al compararla con la proteína en solución. Se concluyó que las partículas metálicas servían como sitios de nucleación para la agregación de proteínas. En este caso, podría ser necesario seleccionar un aparato de llenado de otro tipo para mitigar la agregación de partículas. Se realizó una comparación del efecto de diversos tipos de bombas en la formación de partículas subvisibles en una solución de MAb-Z (9). La microscopía de flujo mostró que las bombas de pistón, fabricadas con acero inoxidable o cerámica, producían partículas en el intervalo de tamaño 1-100 µm a niveles aproximadamente 100 veces más grandes que las muestras de control. El examen de las imágenes microscópicas de estas partículas reveló que las partículas eran traslúcidas, lo que sugirió que estaban constituidas principalmente por proteínas. La incubación de la solución de proteínas con partículas cizalladas de las bombas de pistón no generó un aumento significativo en la distribución del tamaño de partícula ni en los recuentos de partículas para dichas soluciones, lo cual indica que las partículas extrínsecas no funcionan como sitios nucleación para la proteína. En este caso, se consideró que la formación de partículas en la solución se derivó de la tensión de cizallamiento ocasionada durante la operación de la bomba. Estos resultados fueron sustentados por el examen de otros tipos de aparatos de relleno (peristálticos, tiempo-presión y diafragma rodante), los cuales produjeron soluciones con cargas de partículas significativamente menores.
RESUMEN Este capítulo provee estrategias para describir, caracterizar e identificar el contenido de partículas en inyecciones de proteínas terapéuticas, incluyendo la población de partículas extrínsecas e intrínsecas. Además, se trata información sobre métodos específicos que se pueden usar para estos propósitos, así como sus ventajas y limitaciones. Se puede desarrollar una estrategia de control racional e integral fundamentada en una exhaustiva caracterización de los agregados durante el desarrollo, junto a una correlación de los resultados obtenidos de dichas pruebas con los usados para la liberación. Los agregados por lo general están presentes en un continuo de tamaños, desde oligómeros hasta partículas con tamaños de cientos de micrómetros. La correlación en los recuentos de partículas que van desde oligómeros pasando por un tamaño >25-µm, evaluada como parte del método farmacopeico, puede generar confianza en la determinación por obstrucción de luz por sí sola para revelar cambios y tendencias en la fabricación. Ante esta situación, se usaría una estrategia de control general para establecer límites de acción para partículas >1 O µm, los cuales al ser excedidos desencadenarían una investigación, incluyendo los métodos de caracterización tratados en este capítulo.
REFERENCIAS 1. Narhi LO, Schmit J, Bechtold-Peters K, Sharma D. Classification of protein aggregates. j Pharm Sci. 2012; 101 (2):493-498. 2. Felsovalyi F, ]anvier S, ]ouffray S, Soukiassian H, Mangiagalli P. Silicone-oil-based subvisible particles: their detection, interactions, and regulation in prefilled container closure systems for biopharmaceuticals. j Pharm Sci. 2012; 101 (12): 45694583. 3. Ripple DC, Wayment JR, Carrier MJ. Standards for the optical detection of protein particles. Am Pharm Rev. 2011; ]uly lssue. http://www.americanpharmaceuticalreview.com/Featured-Articles/36988-Standards-for-the-Optical-Detection-ofProtein-Particles/. Consultado el 1 O de enero de 2013. 4. Carpenter JF, Randolph TW, Jiskoot W, Crommelin DJ, Middaugh CR, Winter G, et al. Overlooking subvisible particles in therapeutic protein products: gaps that may compromise product quality. j Pharm Sci. 2009; 98(4): 1201-1205. 5. Singh SK, Afonina N, Awwad M, Bechtold-Peters K, Blue JT, Chou D, et al. An industry perspective on the monitoring of subvisible particles as a quality attribute for protein therapeutics. j Pharm Sci. 201 O; 99(8):3302-3321. 6. Barnard JG, Singh S, Randolph TW, Carpenter ]F. Subvisible particle counting provides a sensitive method of detecting and quantifying aggregation of monoclonal antibody caused by freeze-thawing: insights into the roles of particles in the protein aggregation pathway. j Pharm Sci. 2011; 100(2):492-503. 7. Cao S, Jiang Y, Narhi L. A light obscuration method specific for quantifying subvisible particles in protein therapeutics. Foro Farmacopeico. 201 O; 36(3):824-834. 8. Tyagi AK, Randolph TW, Dong A, Maloney KM, Hitscherich C, Jr, Carpenter JF. lgG particle formation during filling pump operation: a case study of heterogeneous nucleation on stainless steel nanoparticles. j Pharm Sci. 2009; 98(1):94-104. 9. Nayak A, Colandene J, Bradford V, Perkins M. Characterization of subvisible particle formation during the filling pump operation of a monoclonal antibody formation solution. j Pharm Sci. 2011; 100(10):4198-4204.
2152 (1 788) Determinación de Partículas / Información General
USP 39
(1788) MÉTODOS PARA LA DETERMINACIÓN DE PARTÍCULAS EN INYECTABLES Y SOLUCIONES OFTÁLMICAS
INTRODUCCIÓN El propósito de los capítulos de pruebas generales de la USP IBlllllllll~~···-· y envasado;¡~ f~~~~¡~~ió"n\e ~,el0e~cionen y desar~oll~n (o p~rfeccio~en) teniendo en cuenta la limpieza y estabilidad del producto comercial. Los flujos del proceso, el equipo, las líneas de llenado, las bombas, los tanques estacionarios, el atuendo y comportamiento del personal, así como la calidad ambiental, pueden aportar partículas en el producto llenado. La limpieza insuficiente de los componentes del producto y la selección inadecuada de los sistemas de envase/cierre y de los componentes de la fórmula pueden contribuir a la generación inmediata, e incluso a largo plazo, de partículas. Todos estos factores que contribuyen con partículas y que afectan la calidad del producto final se pueden evaluar usando los métodos del capítulo (788) o variaciones de los mismos. Se deben tomar en cuenta los requisitos del capítulo (788) para todas las preparaciones parenterales, a menos que queden específicamente exentos por el capítulo (788) o por la monografía. En el caso de las formas farmacéuticas para las que no es posible aplicar directamente el capítulo (788), se deben considerar métodos alternativos y/o la evaluación de flujos del proceso, vehículos o componentes. Por ejemplo, es imposible aplicar obstrucción de luz para la detección de materia extraña en suspensiones estériles con ingredientes activos sólidos. Para suspensiones de sólidos con tamaño de partícula mayor a la porosidad nominal de las membranas del capítulo (788), la valoración microscópica de las membranas presentará una interferencia importante por parte de los sólidos. Para estos sistemas de suspensión solamente es posible la evaluación directa de los enjuagues de envase/cierre y del vehículo del producto mediante los métodos del capítulo (788). Se pueden explorar otras metodologías alternativas tales como (a) determinación de partículas del producto tratado con disolvente para disolver todos los productos sólidos, o (b) uso de centrifugación para separar los sólidos en el producto del vehículo, o (c) uso de mallas o tamices seleccionados para separar los sólidos del vehículo del producto y así minimizar la interferencia por parte de los sólidos del producto. Durante la investigación del diseño más apropiado del producto se hace todo lo posible para emplear los métodos del capítulo (788), variaciones del capítulo (788) y estrategias de métodos alternativos, lo que puede continuar en la selección de evaluaciones durante la producción comercial. El capítulo (788) de USP, que se ha armonizado con la Farmacopea Europea y la Farmacopea Japonesa, contiene la metodología para la determinación de partículas en inyectables. Las secciones que tratan la estandarización del instrumento para obstrucción de luz y demás detalles sobre el método fueron excluidas del capítulo armonizado. El Capítulo (789), Partículas en Soluciones Oftálmicas, no ha sido armonizado. El capítulo (1788) incluye información importante sobre estandarización y calibración de instrumentos aplicable a los capítulos (788) y (789); asimismo, incluye recomendaciones para la manipulación de muestras, entorno del laboratorio, capacitación del operador y recomendaciones generales aplicables al método microscópico. El capítulo (1) requiere que los inyectables estén esencialmente libres de partículas que puedan observarse mediante inspección visual. La expresión "esencialmente libre" ha sido difícil de definir debido a que el número y tamaño de las partículas, entre otros factores, influyen sobre la capacidad de detección de las mismas. El límite absoluto de visibilidad o capacidad de detección, es equívoco y depende de las condiciones de la prueba y la naturaleza de las partículas. El límite inferior del intervalo visible ciertamente se solapa con las capacidades de detección de elementos subvisibles de los capítulos (788) y (789). En la literatura se informa que la visibilidad se extiende hasta tamaños de 50 µm, 100 µm y 150 µm (ver las Referencias 1 y 2), y con el ensayo de membrana se puede aislar y determinar el tamaño de partículas de hasta 1000 µm y mayores. El capítulo (788) especifica límites para el contenido de partículas subvisibles en inyectables en dos umbrales de tamaño. Asimismo, el Capítulo (789) establece límites para el contenido de partículas en soluciones oftálmicas en dos (Obstrucción de Luz u OL) o tres (Conteo Microscópico en Membrana o MM, por sus siglas en inglés) umbrales de tamaño. Las pruebas descritas en los capítulos (788) y (789) son pruebas físicas de límite cuyo propósito es enumerar las partículas subvisibles [partículas] dentro de intervalos de tamaño específicos (ver la Figura 1). Partículas en Inyectables (788) es que los sistemas, el
USP 39
Información General/ (1788) Determinación de Partículas 2153
Domínios de Tamaf'io considerados en los capítulos <1>, <788> y <789> de USP
Figura 1. Incremento en la Probabilidad de Detección Visual El Capítulo (788) indica que, "Las partículas [... ] consisten en partículas no disueltas móviles, que no son burbujas gaseosas, accidentalmente presentes en las soluciones." Mediante el uso de los métodos de prueba del Capítulo (788), se tabulará cualquier material semisólido a sólido (e incluso líquidos inmiscibles) que provoque una respuesta del detector OL por encima del umbral de tamaño seleccionado. Existen dos categorías generales de fuentes de partículas: extrínsecas e intrínsecas. Los métodos de OL y MM detectarán y tabularán partículas de ambas categorías. El material extrínseco es aditivo, extraño, se mantiene sin cambios y no forma parte de la formulación, del envase o del proceso de ensamblaje. Entre los ejemplos de material extrínseco se incluyen fibras, materia celulósica, materia vegetal, productos de corrosión, pintura/recubrimientos y materiales de construcción tales como yeso, hormigón, metal y plástico. Las partículas extrínsecas son aditivas y por lo general no cambian durante la vida del producto, a menos que experimenten fragmentación, hinchamiento (hidratación) o degradación. Los fragmentos de caucho, plástico, metal y vidrio son ejemplos de partículas extrínsecas depositadas en el producto durante su acondicionamiento primario o que no se han eliminado durante el proceso de preparación de los envases. No obstante, cuando esta clase de partículas, típicamente extrínsecas, se han derivado del envase y/o proceso específico de manera constante o crónica, entonces se puede considerar que su presencia es de la variedad intrínseca, con un nivel de preocupación similar. El material intrínseco está relacionado con el envase, los ingredientes de formulación y el proceso de ensamblaje o comercial. El material intrínseco también puede ser material extraño acarreado por el envase o el proceso y cuya eliminación fue insuficiente. El material intrínseco puede efectivamente cambiar con el paso del tiempo debido a un cambio en la concentración, degradación y aceleración de reacción. Las fuentes intrínsecas son inherentes al producto y el proceso-formulación, envase y etapas de acondicionamiento primario. Las fuentes intrínsecas representan una variedad de fenómenos que generan sustancias no deseadas; estos incluyen: (a) extracción, (b) lixiviación, (c) degradación de un ingrediente (activo o excipiente), (d) cambio de un ingrediente por precipitación/forma salina/forma cristalina, (e) cambio en la integridad física del envase, (f) cambio del nivel de impurezas, (g) cambio de asociación micelar, (h) oligomerización y (i) materiales relacionados con el envase o el proceso no eliminados durante el acondicionamiento primario del producto. La combinación de todo lo anterior con fenómenos físicos tales como la agregación, la sedimentación y la coalescencia por la matriz (aceites, semisólidos) puede llevar partículas más pequeñas (<1 O µm) a la zona de detección del método de prueba {;?:l O µm). Las fuentes intrínsecas de partículas detectables son de gran preocupación puesto que la sustancia puede estar presente y, sin embargo, no evidenciarse hasta la formación de partículas con el paso del tiempo, incluso mucho después de la liberación del lote. Se debe reconocer a la categorización "intrínseca" como algo diferente del carácter inherente de la formulación. Las propiedades de las soluciones, tales como una ligera opacidad en el color de fórmulas de alta concentración y formulaciones proteicas, son ejemplos típicos de una característica inherente del producto y, a pesar de que pueden ocasionar dificultades durante la inspección o ensayo OL, no se relacionan con las partículas. El análisis de algunas formulaciones puede resultar complicado mediante OL. El método OL puede presentar problemas con un producto que no tenga una transparencia y viscosidad similares a las del agua. Además, las características de la formulación tales como color, alta viscosidad o propiedades inherentes a la formulación, como por ejemplo cambios inducidos por cizallamiento, pueden generar datos de OL erróneos. De manera similar, los productos que producen burbujas de aire o gas al introducirlos en el sensor OL, tales como formulaciones amortiguadas con bicarbonato, pueden generar datos erróneos. Puede ser necesario usar el método MM para estos tipos de productos. La documentación que demuestre que el procedimiento de OL es inadecuado para analizar el artículo de prueba o produce resultados inválidos puede ayudar en la estrategia de registro regulatorio. Se espera que la mayoría de los artículos de prueba cumplan con los requisitos basándose únicamente en la prueba de OL; sin embargo, puede ser necesario analizar algunos artículos de prueba con el método OL seguido del método MM a fin de lograr una conclusión. Puede ser deseable analizar volúmenes más bajos de ciertos productos debido a la cantidad limitada de muestra, a los altos costos del producto, al bajo volumen del envase o a las características especiales de liberación del líquido. Ejemplos de lo anterior incluyen productos biofarmacéuticos, productos parenterales y oftálmicos de bajo volumen y formulaciones en envases novedosos destinados a objetivos médicos específicos. Aunque se espera que los productos cumplan con los límites, es posible emplear métodos validados por el fabricante para demostrar el cumplimiento con los límites de prueba. Puede ser necesario usar tomadores de muestras de bajo volumen especiales "sippers" para la toma de muestra para OL y combinar múltiples uni-
2154 (1 788) Determinación de Partículas/ Información General
USP 39
dades de estos tipos de presentaciones de envases. Considerar el siguiente ejemplo: un producto de bajo volumen (1 00 µL) se envasa en una jeringa estéril prellenada. La naturaleza del envase permite la administración directa del producto en solución y se puede usar para el muestreo directo, pero el volumen de 100 µL impide su combinación en volúmenes más grandes (-25 mL) para el método de OL. El muestreo directo en una membrana pequeña para conteo microscópico y la evaluación del contenido de partículas de un envase individual y de envases combinados pueden ser los medios óptimos para la recolección de datos. Además, en este ejemplo será necesario evaluar estadísticamente, con cuidado, la población de la partida usando volúmenes de muestra pequeños (pero no dosis) para validar la aceptabilidad del producto.
PRUEBA DE CONTEO DE PARTÍCULAS POR OBSTRUCCIÓN DE LUZ Aparato de Prueba El aparato es un sistema de conteo de partículas en líquidos que usa un sensor de obstrucción de luz con un dispositivo de alimentación de muestra adecuado para liberar alícuotas controladas de muestra para su análisis. Las partículas suspendidas en la muestra líquida que fluyen entre una fuente de luz y el sensor producen cambios en la señal que se correlacionan con la dimensión de las partículas. Debido a la naturaleza del sistema de detección y conteo, las burbujas de aire y los líquidos inmiscibles pueden obstruir suficiente luz como para que se registren junto con las partículas suspendidas pretendidas. Estos artefactos deben disminuirse mediante técnicas de preparación apropiadas. Las soluciones con cantidades excesivas de líquidos inmiscibles pueden no ser adecuadas para el análisis de OL. Existe una variedad de dispositivos adecuados de este tipo disponibles comercialmente. El personal que lleva a cabo la prueba es responsable de asegurar que los parámetros operativos de los instrumentos sean adecuados a la exactitud y precisión requeridas del resultado de la prueba, además de eliminar o tener en cuenta los artefactos e interferencias inherentes a ciertos productos y ciertos métodos de preparación. Se puede citar como ejemplo a una formulación proteica que puede formar semisólidos inducidos por cizallamiento debidos al mezclado y que se cuentan como "partículas". Se debe proveer capacitación adecuada a los responsables de la realización técnica de la prueba. Es importante tomar en cuenta que para las aplicaciones farmacopeicas, el objetivo final es que el contador de partículas determine el tamaño y cuente, de manera reproducible, las partículas presentes en el material que se está investigando. Los instrumentos disponibles varían desde sistemas en los que la calibración y demás componentes de la estandarización se deben llevar a cabo mediante procedimientos manuales hasta sistemas sofisticados que incorporan funciones basadas en hardware y software para los procedimientos de estandarización. Por consiguiente, resulta imposible especificar métodos exactos a seguir para la estandarización del instrumento, siendo más importante enfatizar el resultado final requerido de un procedimiento de estandarización que un método específico para obtener dicho resultado. Esta sección está destinada a enfatizar los criterios con los que debe cumplir el sistema más que los métodos específicos a usar para su determinación. El usuario tiene la responsabilidad de aplicar los diversos métodos de estandarización que sean aplicables a un instrumento específico. Los criterios operativos críticos comprenden lo siguiente: Límites de Concentración del Sensor-Usar un instrumento que tenga un límite de concentración (el número máximo de partículas por mL) identificado por el fabricante que sea mayor que la concentración de partículas a contar en la muestra de prueba. El límite de concentración certificado por el proveedor para un sensor se especifica como aquel nivel de conteo en el que los conteos coincidentes debidos a la presencia simultánea de dos o más partículas en el volumen de observación del sensor comprenden menos del 10% de los conteos recolectados para partículas de 1 O µm. Intervalo Dinámico del Sensor-El intervalo dinámico del sensor del instrumento usado (intervalo de tamaños de partículas que se pueden medir y contar con exactitud) debe incluir el tamaño más pequeño de partículas que se van a contar en los productos.
Pruebas de Estandarización del Instrumento El siguiente apartado sobre estandarización del instrumento hace mayor énfasis en los criterios de desempeño que en los métodos específicos para calibrar o estandarizar un sistema instrumental dado. Este enfoque es particularmente obvio en la descripción de calibración, en donde se deben considerar los métodos manuales así como aquéllos basados en firmware, software o el uso de instrumentos de prueba electrónicos. La calificación adecuada del instrumento es esencial para el desempeño de la prueba de acuerdo con los requisitos. Puesto que es posible usar instrumentos de diferentes marcas en la prueba, el usuario tiene la responsabilidad de asegurar que el contador usado se opera de acuerdo con las instrucciones específicas del fabricante; a continuación se definen los principios a seguir para asegurar que los instrumentos operan dentro de los intervalos adecuados. La siguiente información para la estandarización del instrumento ayuda a asegurar que la exactitud del volumen de la muestra, la velocidad de flujo de la muestra, la curva de respuesta del tamaño de partícula, la resolución del sensor y la exactitud del conteo sean adecuadas para la realización de la prueba. Estos procedimientos se deben realizar en intervalos de no más de seis meses.
USP 39
Información General/ (1 788) Determinación de Partículas 2155
EXACTITUD DEL VOLUMEN DE LA MUESTRA Debido a que el conteo de partículas de una alícuota de muestra varía directamente con el volumen de líquido muestreado, es importante saber que la exactitud del muestreo se encuentra dentro de cierto intervalo. Para la determinación del volumen de la muestra, determinar el volumen muerto (tara) en el alimentador de muestras con agua exenta de partículas. 1 Transferir un volumen de agua exenta de partículas que sea mayor al volumen de la muestra a un recipiente y pesar. Usando el dispositivo alimentador de muestras, retirar un volumen adecuado para el muestreador específico y pesar nuevamente el envase. Determinar el volumen de la muestra restando el volumen de tara a los volúmenes combinados de la muestra y la tara. Verificar que el valor obtenido esté dentro del 5% del volumen de muestra adecuado para la prueba. El volumen de muestra se puede determinar alternativamente usando una probeta graduada Clase A adecuada (ver Aparatos Volumétricos (31 )). [NOTA-Los instrumentos de este tipo requieren de un volumen de tara variable. Ésa es la cantidad de muestra retirada antes del conteo. Para muestreadores operados por jeringa este volumen se puede determinar ajustando el volumen de muestra a cero e iniciando el muestreo, de manera que el único volumen de solución retirado sea la tara. Restar el volumen de tara del volumen total de solución retirado en el ciclo de muestreo para determinar el volumen de muestra.] VELOCIDAD DE FLUJO DE LA MUESTRA Verificar que la velocidad de flujo esté dentro de las especificaciones del fabricante para el sensor usado. Lo anterior se puede lograr usando un cronómetro calibrado para medir el tiempo requerido por el instrumento para retirar y contar un volumen de muestra específico (es decir, el tiempo entre el inicio y el final del ciclo de conteo según lo indican las luces indicadoras u otros medios del instrumento). Los sensores se pueden operar con exactitud en un intervalo de velocidades de flujo. Efectuar el Procedimiento de Prueba indicado a continuación a la misma velocidad de flujo que la seleccionada para la calibración del instrumento. CALIBRACIÓN El capítulo (788) de la USP especifica el uso de dispersiones de partículas esféricas de tamaños conocidos entre 1O µm y 25 µm en agua exenta de partículas. A continuación se presentan más opciones: Método Manual-Calibrar el instrumento con un mínimo de tres calibradores, tales como esferas de poliestireno de tamaño casi uniforme con diámetros de aproximadamente 1O, 15 y 25 µm, en un vehículo acuoso exento de partículas. Las esferas de calibración deben tener un diámetro promedio que esté dentro del 5% de los diámetros nominales y deben estandarizarse contra materiales rastreables a materiales de referencia estándares del Instituto Nacional de Normas y Tecnología (NIST).2 El número total de esferas contadas debe estar dentro del límite de concentración del sensor. Preparar suspensiones de las esferas de calibración en agua a una concentración de 1000 a 5000 partículas/mL y determinar el canal que corresponda al máximo valor de conteo para la distribución de las esferas. Lo anterior se determina usando el umbral de conteo más alto para dividir la distribución en dos compartimentos (intervalos/clases) que contengan números iguales de conteos, con el instrumento ajustado en el modo de conteo diferencial (método de moving window half-count o MWHC, por sus siglas en inglés). Usar únicamente la porción central de la distribución en este cálculo para evitar la inclusión de porciones asimétricas del pico. La porción de la distribución, que debe dividirse equitativamente, es la ventana de conteo. La ventana está delimitada por los valores del umbral que definirán una ventana de voltaje del umbral de ±20% alrededor del diámetro medio de las esferas de prueba. Se pretende que la ventana incluya todas las esferas individuales, tomando en cuenta la desviación estándar de las esferas y la resolución del sensor, excluyendo el ruido y los agregados de esferas. El valor de 20% se seleccionó basándose en la resolución del sensor en el peor de los casos de 10% y en la desviación estándar de las esferas en el peor de los casos de 1 0%. Debido a que los umbrales son proporcionales al área transversal de las esferas (y de todas las partículas) más que al diámetro, los valores de ajuste de voltaje inferior y superior se determinan mediante las ecuaciones:
Vt
= 0,64V5
en donde V¡ es el voltaje inferior y V5 es el voltaje en el centro del pico, y
Vu = l,44V5 en donde Vu es el voltaje superior. Una vez que se hayan determinado los umbrales del centro del pico, usar estos umbrales de los estándares para crear una regresión del logaritmo del voltaje en función del logaritmo del tamaño de partícula, a partir de la cual se pueden determinar los ajustes del instrumento para los tamaños de 1O y 25 µm. Método Automatizado-La curva de calibración (respuesta del tamaño) se puede determinar para el sistema instrumentosensor usando las rutinas de software validadas ofrecidas por los proveedores de los instrumentos, las cuales pueden estar incluidas como parte del software del instrumento o usarse con un microcomputador conectado por interfase al contador. El uso de estos métodos automatizados es adecuado cuando el proveedor certifica por escrito que el software proporciona una curva
1 2
Pasada a través de un filtro con un tamaño de poro nominal de 1,2 µm o menor. La norma ASTM F658-00a ofrece análisis útiles relacionados con procedimientos de calibración que emplean esferas de látex de tamaño casi uniforme.
2156 (1 788) Determinación de Partículas / Información General
USP 39
de respuesta equivalente a la lograda por el método manual y cuando el usuario valida la calibración automatizada según sea necesario. Método Electrónico-Usando un analizador multicanal de altura de picos, determinar el canal central de la respuesta de pulsos del contador de partículas para cada suspensión estándar. Este valor de voltaje de pico se convierte en el umbral usado para calcular la curva de respuesta de voltaje para el instrumento. Las suspensiones estándar usadas para la calibración se analizan en orden y se determinan los voltajes de pulsos medios para cada una. Estos umbrales se usan posteriormente para generar la curva de respuesta del tamaño manualmente o mediante rutinas de software. Luego, los umbrales determinados a partir de los datos del analizador multicanal se transfieren al contador para completar la calibración. RESOLUCIÓN DEL SENSOR La resolución del tamaño de partículas del instrumento contador de partículas depende del sensor usado y puede variar con sensores individuales del mismo modelo. Determinar la resolución del contador de partículas para partículas de 1 O µm usando las esferas de calibración de 1O µm. La desviación estándar relativa de la distribución del tamaño de las partículas estándar usadas es no más de 5%. Los métodos aceptables para determinar la resolución del tamaño de partículas son: (1) la determinación manual del ensanchamiento del pico debido a la respuesta del instrumento; (2) el uso de un método electrónico de medición y clasificación del voltaje de salida del sensor de partículas con un analizador multicanal; y (3) los métodos automatizados. Método Manual-Ajustar el contador de partículas para que opere en el modo acumulativo o en el modo de conteo total. Referirse a la curva de calibración obtenida con anterioridad y determinar el voltaje del umbral para las esferas de 1 O µm. Ajustar 3 canales del contador para usarlos en el procedimiento de calibración según se indica a continuación: El Canal 1 se ajusta al 90% del voltaje del umbral. El Canal 2 se ajusta al voltaje del umbral. El Canal 3 se ajusta al 110% del voltaje del umbral. Pasar una muestra a través del sensor observando el conteo en el Canal 2. Cuando el conteo de partículas en dicho canal haya alcanzado aproximadamente 1000, detener el conteo y observar los conteos en los Canales 1 y 3. Verificar si los conteos del Canal 1 y del Canal 3 son 1,68 ± 10% y 0,32 ± 10%, respectivamente, del conteo en el Canal 2. Si no se obtienen dichos resultados, ajustar los umbrales del Canal 1 y del Canal 3 para que cumplan con estos criterios. Cuando se hayan cumplido tales criterios, pasar una muestra de suspensión a través del contador hasta que los conteos en el Canal 2 hayan alcanzado aproximadamente 1O000, o hasta que se haya contado un volumen adecuado (p.ej., 1O mL) de la suspensión de esferas. Verificar que los conteos del Canal 1 y del Canal 3 sean 1,68 ± 3% y 0,32 ± 3%, respectivamente, del conteo del Canal 2. Registrar el tamaño de partícula de los umbrales que se acaban de determinar para los Canales 1, 2 y 3. Restar el tamaño de partícula para el Canal 2 del tamaño para el Canal 3. Restar el tamaño de partícula para el Canal 1 del tamaño para el Canal 2. Los valores así determinados son las desviaciones estándar observadas en el lado positivo y negativo del conteo medio para el estándar de 1 O µm. A continuación se indica un método usado frecuentemente para calcular el porcentaje de resolución del sensor:
% resolución= (100/0) x [(50 b,) 2 - (5std)2] 112 en donde 5obs es la desviación estándar máxima observada determinada con las esferas estándar; 5std es la desviación estándar para las esferas informada por el proveedor; y O es el diámetro, en µm, de las esferas según lo especificado por el proveedor. La resolución es no más de 10%. Método Automatizado-El software que permite la determinación automatizada de la resolución del sensor se encuentra disponible para algunos contadores. Este software puede estar incluido en el instrumento o usarse con un microcomputador conectado por interfase al contador. El uso de estos métodos automatizados es adecuado siempre que el proveedor certifique por escrito que el software ofrece una determinación de la resolución equivalente a la del método manual y cuando el usuario valida la determinación de la resolución automatizada según sea necesario. Método Electrónico-Registrar la distribución del voltaje de salida del sensor de partículas, usando un analizador multicanal mientras se analiza una suspensión del estándar de tamaño de partícula de 1O µm. Para determinar la resolución, mover el cursor del analizador multicanal hacia arriba y hacia abajo en la escala de potencial eléctrico a partir del voltaje de pulso medio para identificar un canal en cada lado del pico de 1O µm que tenga aproximadamente 61 % de los conteos observados en el canal central. El uso de la curva de respuesta de tamaño del contador para convertir los valores mV de estos dos canales en tamaños de partículas proporciona el tamaño de partícula dentro de una desviación estándar del estándar de 1O µm. Usar estos valores para calcular la resolución según se describe en Método Manual. EXACTITUD DEL CONTEO DE PARTÍCULAS-APTITUD DEL SISTEMA Determinar la exactitud del conteo de partículas del instrumento usando el Método 1 (para sensores que requieren del método MWHC para la calibración), el Método 2 (para sensores muticanales) o el Método 3 para cualquier instrumento (desde la comparación manual hasta el método microscópico en membrana).
USP 39
Información General/ (1788) Determinación de Partículas 2157
Método 1-lnstrumentos de MWHC Procedimiento-Preparar la suspensión y el blanco usando el ER Recuento de Partículas USP. Con el instrumento ajustado para contar en el modo acumulativo (total), recolectar los conteos correspondientes a valores de ajuste::?: 1 O µm y ::?:15 µm. Preparar el blanco y la muestra en suspensión de la misma manera. Desgasificar la mezcla usando uno de los tres medios siguientes: sometiendo a ultrasonido (de 80-20 vatios) durante aproximadamente 30 segundos, dejando en reposo, o aplicando vacío. Mezclar suavemente el contenido agitando por rotación suave de forma manual o mecánica, teniendo cuidado de no introducir burbujas de aire o contaminación. Mezclar continuamente durante todo el análisis. Extraer directamente del envase tres volúmenes consecutivos. Históricamente, estos volúmenes han sido de no menos de 5 ml cada uno, debido a las limitaciones del instrumento y al deseo de maximizar el volumen de muestra. No obstante, si fuera necesario, se pueden utilizar volúmenes que cumplan con los criterios de estandarización y que contemplen las sensibilidades de la formulación. Obtener los conteos de partículas y desechar los datos de la primera porción. [NOTA-Completar el procedimiento dentro de los cinco minutos.] Repetir el procedimiento usando la suspensión en lugar del blanco. A partir de los promedios de los conteos resultantes del análisis de las dos porciones de la suspensión para el valor de ajuste del instrumento ::?:1 O µm y del análisis de las dos porciones del blanco para el valor de ajuste ;::>: 1O µm, calcular el número de partículas en cada ml por la fórmula:
(P5 - P8 )/V en donde P5 es el conteo de partículas promedio obtenido de la suspensión; P8 es el conteo de partículas promedio obtenido del blanco; y V es el volumen promedio, en ml, de las 4 porciones analizadas. Repetir los cálculos usando los resultados obtenidos para un valor relacionado de no menos de 15 µm. Interpretación-El instrumento de MWHC cumple con los requisitos de Exactitud de Conteo de Partículas si el conteo obtenido a ::?:1 O µm y el cociente entre los conteos obtenidos a un valor de ajuste ::?:1 O µm y aquellos obtenidos a un valor de ajuste ::?:15 µm se ajustan a los valores que acompañan al ER Recuento de Partículas USP. Si el instrumento no cumple con los requisitos de Exactitud de Conteo de Partículas y si se conservan volúmenes de prueba adecuados, repetir el procedimiento con dichos volúmenes; si no se conservan volúmenes suficientes, preparar una nueva suspensión y un blanco y luego repetir el procedimiento. Si los resultados de la segunda prueba están dentro de los límites provistos anteriormente, el instrumento cumple con los requisitos de la prueba de Exactitud de Conteo de Partículas. Si el sistema no cumple con los requisitos de la prueba al segundo intento, determinar y corregir el origen de las fallas y volver a probar el instrumento. Método 2-lnstrumentos Multicanales Procedimiento-Usar uno de los tres estándares siguientes: (1) una dilución de ER Recuento de Partículas USP; (2) una preparación comercial de esferas de calibración estándar con un diámetro nominal de 15 a 30 µm en una suspensión que contenga entre 50 y 200 partículas/ml, certificada por el fabricante; o (3) una suspensión de esferas de calibración estándar con un diámetro nominal de 15 a 30 µm, que contenga entre 50 y 200 partículas/ml, preparada en el laboratorio. Se acepta el uso de los estándares 2 y 3 no pertenecientes a la USP siempre que cumplan con los criterios de estandarización de la USP: cinco conteos sucesivos resultan en no más de ±10% de la concentración declarada. Desgasificar la suspensión usando uno de los tres medios siguientes: sometiendo a ultrasonido (de 80 a 120 vatios) durante aproximadamente 30 segundos, dejando en reposo o aplicando vacío. Mezclar suavemente el contenido agitando por rotación suave de forma manual o mecánicamente, teniendo cuidado de no introducir burbujas de aire o contaminación. Mezclar continuamente durante todo el análisis y realizar cinco conteos en volúmenes de 5 ml de la suspensión usando el umbral de tamaño de 1 O µm del contador de partículas. Obtener el conteo de partículas acumulativo promedio por ml. Interpretación-El instrumento cumple con los requisitos de Exactitud de Conteo de Partículas si el conteo obtenido para un valor de ajuste::?: 1O µm se ajusta a los valores que acompañan al ER Recuento de Partículas USP. Si el instrumento no cumple con los requisitos de Exactitud de Conteo de Partículas, repetir el procedimiento. Si los resultados de la segunda prueba están dentro de los límites provistos anteriormente, el instrumento cumple con los requisitos de la prueba de Exactitud de Conteo de Partículas. Si el sistema no cumple con los requisitos de la prueba al segundo intento, determinar y corregir el origen de las fallas y volver a probar el instrumento. Método 3-Método Manual Alternativo Procedimiento-Preparar una suspensión de esferas de calibración estándar con un diámetro nominal de 15 a 30 µm, que contenga entre 50 y 200 partículas/ml. Desgasificar la suspensión usando uno de los tres medios siguientes: sometiendo a ultrasonido (de 80 a 120 vatios) durante aproximadamente 30 segundos, dejando en reposo o aplicando vacío. Mezclar suavemente el contenido agitando por rotación suave de forma manual o mecánicamente, teniendo cuidado de no introducir burbujas de aire o contaminación. Mezclar continuamente durante todo el análisis y realizar cinco conteos en volúmenes de 5 ml de la suspensión usando el umbral de tamaño de 1O µm del contador de partículas. Obtener el conteo de partículas acumulativo promedio por ml. Pipetear un volumen de esta suspensión que contenga 250 a 500 partículas y transferir a un embudo de filtración preparado según se describe a continuación en Prueba de Conteo Microscópico de Partículas, Aparato de Filtración. Después de secar la membrana, contar el número total de esferas estándar recolectadas en el filtro de membrana. Este conteo debe estar dentro del 20% del conteo instrumental promedio por ml para la suspensión.
Entorno de Prueba Las muestras deben limpiarse hasta un grado tal que el nivel de partículas agregadas por la prueba tenga un efecto inapreciable en el resultado de la misma.
2158 (1788) Determinación de Partículas/ Información General
USP 39
De preferencia, el material de vidrio, los cierres y demás equipos requeridos se limpian por inmersión y lavado en solución detergente no iónica tibia. Enjuagar en un flujo de agua corriente y luego enjuagar de nuevo en un flujo de agua filtrada. También se pueden usar disolventes orgánicos para facilitar la limpieza. [NOTA-Estas etapas describen una manera de limpiar el equipo; alternativamente, se puede obtener materiales exentos de partículas de un proveedor adecuado.] De preferencia, la muestra de prueba, el material de vidrio, los cierres y demás equipos requeridos se enjuagan finalmente con agua filtrada, usando una boquilla atomizadora manual con un filtro terminal u otra fuente de agua filtrada adecuada dentro de un ambiente protegido por filtros de alta eficiencia para partículas aéreas (HEPA, por sus siglas en inglés). Al realizar el ensayo, se deben usar vestimentas que no desprendan partículas y guantes libres de polvo dentro del ambiente HEPA. Llevar a cabo la prueba en un ambiente que no aporte ninguna cantidad significativa de partículas. Para recolectar los conteos del blanco, usar un recipiente limpio del tipo y volumen representativos del que se usará en la prueba. Colocar un volumen de 50 mL o mayor de agua filtrada en el recipiente y agitar la muestra de agua en el material de vidrio limpio invirtiendo o agitando por rotación suave. [NOTA-Se puede usar un volumen menor que se corresponda con el artículo a analizar.] Desgasificar usando uno de los tres medios siguientes, pero empleando el mismo método que se vaya a usar para las muestras del producto: someter a ultrasonido (de 80 a 120 vatios) durante aproximadamente 30 segundos, aplicar vacío o dejar en reposo. Agitar por rotación suave manualmente el recipiente que contenga la muestra de agua o agitar mecánicamente hasta suspender las partículas. Según se describe en el capítulo (788): Determinar las partículas en 5 muestras de agua filtrada, cada una de 5 mL. Si el número de partículas de 7O µm o mayor tamaño excede de 25 para Jos 25 mL combinados (no más de 7/mL), las precauciones tomadas para Ja prueba son insuficientes.
Si además, al utilizar la prueba para el método del Capítulo (789), el número de partículas de 25 µm o mayor tamaño excede de 3 en el blanco, se debe considerar que la prueba del blanco ha fallado.
Procedimiento de Prueba PREPARACIÓN DE PRUEBA Preparar las muestras de prueba en el orden siguiente. Fuera del gabinete de flujo de aire unidireccional que se va a usar para la prueba, retirar los cierres externos y las bandas de sellado pero no quitar el cierre de sellado. Si se observa que el desprendimiento de partículas de las etiquetas resultase un problema, retirar o cubrir con cinta las etiquetas del producto. Colocar las muestras en el gabinete de prueba y enjuagar el exterior de los envases con agua filtrada según se indica en Entorno de Prueba. Proteger los envases de la contaminación ambiental hasta el momento de su análisis. Después de mezclar adecuadamente, abrir y retirar, verter o muestrear de otro modo el contenido de los envases de tal manera que se disminuya al mínimo la probabilidad de que se generen partículas que pudieran entrar en la muestra de prueba. El contenido de los envases con tapones removibles puede verterse directamente después de retirar los cierres. Asimismo, es posible utilizar dispositivos de muestreo que cuenten con una aguja para penetrar el cierre de la unidad. Los productos en envases de plástico flexible se pueden muestrear cortando el tubo de administración o una esquina de la unidad con una hoja de afeitar o tijera limpiada adecuadamente. Los productos secos o liofilizados pueden reconstituirse usando su diluyente, retirando el cierre para agregar el diluyente provisto con el producto, o inyectando agua filtrada con una jeringa hipodérmica. Si se van a combinar las muestras de prueba, retirar el cierre y vaciar los contenidos en un envase limpio. NÚMERO DE MUESTRAS DE PRUEBA El Capítulo (788) de USP proporciona un plan de muestreo de acuerdo al volumen del producto. Para todos los productos, independientemente del volumen, la experiencia integral relacionada con la integridad y la uniformidad de la partida se obtiene durante todo el desarrollo, permitiendo la aplicación de planes de muestreo adecuados a la producción comercial que aseguren que la selección de la muestra es representativa de la calidad de la partida. Todas las partidas deben contar con planes de muestreo que contemplen mediciones estadísticas adecuadas de la calidad de la partida y que faciliten el control del proceso. DETERMINACIÓN DEL PRODUCTO Dependiendo de la forma farmacéutica a analizar, proceder según se indica en la categoría apropiada indicada a continuación.
Preparaciones LíquidasVo/umen en Envase de Menos de 25 mL-Preparar los envases según se indica en Preparación de Prueba. Mezclar y suspender las partículas en cada unidad invirtiendo la unidad 20 veces. [NOTA-Debido al pequeño volumen de algunos productos, puede ser necesario agitar la solución de manera más vigorosa para suspender las partículas adecuadamente.] Abrir y combinar el contenido de 1O o más unidades en un recipiente limpio para obtener un volumen de no menos de 25 ml. Desgasificar la solución combinada usando uno de los tres medios siguientes: sometiendo a ultrasonido durante aproximadamente 30 segundos, aplicando vacío, o dejando la solución en reposo.
USP 39
Información General/ (1 788) Determinación de Partículas 2159
Mezclar suavemente el contenido del recipiente agitando por rotación suave manualmente o mecánicamente, teniendo cuidado de no introducir burbujas de aire o contaminación. Retirar cuatro porciones que se ajusten a los volúmenes utilizados en Pruebas de Estandarización del Instrumento y contar el número de partículas con un tamaño ¿1 O µm y a 25 µm. No tomar en cuenta el resultado obtenido para la primera porción. [NOTA-Para productos de volumen bajo, puede ser necesario combinar 15 o más unidades para lograr un volumen combinado suficiente para tomar cuatro alícuotas de muestra de 5 ml. Se pueden usar alícuotas de muestra más pequeñas (es decir,< 5 ml) si se valida que el resultado del ensayo obtenido con las alícuotas más pequeñas proporciona una evaluación de la aptitud de la partida equivalente a la obtenida con las alícuotas de 5 ml especificadas anteriormente] Volumen en Envase de 25 mL o Más-Preparar los envases según se indica en Preparación de Prueba. Mezclar y suspender las partículas de cada unidad invirtiendo la unidad 20 veces antes de abrir el envase para desgasificar. Desgasificar la solución usando uno de los tres métodos siguientes: sometiendo a ultrasonido durante aproximadamente 30 segundos, aplicando vacío o dejando la solución en reposo. Al momento del muestreo, asegurar que la sonda del contador pueda insertarse en el medio de la solución. Mezclar suavemente el contenido de la unidad agitando por rotación suave manualmente o mecánicamente. Retirar cuatro porciones, cada una de no menos de 5 ml, y contar el número de partículas con un tamaño ¿1 O µm y a 25 µm. No tomar en cuenta el resultado obtenido para la primera porción. Preparaciones Secas o Liofilizadas-Preparar los envase según se indica en Preparación de Prueba. Abrir cada envase teniendo cuidado de no contaminar la boca o tapa del envase. Reconstituir según se indica en el etiquetado, de acuerdo con Preparación de Prueba. Dependiendo del experimento, usar alternativamente: • agua filtrada o • si fuera adecuado, un diluyente apropiado filtrado en el laboratorio. Colocar nuevamente el cierre y agitar manualmente el envase durante el tiempo necesario para asegurar la disolución del producto farmacéutico. [NOTA-Para algunos productos secos o liofilizados, puede ser necesario dejar los envases en reposo durante un intervalo adecuado y luego agitar nuevamente para lograr la disolución completa.] Después de que el producto farmacéutico en la muestra reconstituida se haya disuelto por completo, desgasificar la solución sometiendo a ultrasonido durante aproximadamente 30 segundos, o aplicando vacío, o dejando la solución en reposo. Al momento del muestreo, asegurar que la sonda de conteo pueda insertarse en el medio de la solución. Mezclar suavemente el contenido de la unidad agitando por rotación suave manualmente o mecánicamente para suspender cualquier partícula. Proceder según se indica para el volumen de unidad adecuado en Preparaciones Líquidas y analizar tomando un mínimo de cuatro porciones, cada una de no menos de 5 ml, y contando el número de partículas con un tamaño ¿1 O µm y a 25 µm. No tomar en cuenta el resultado obtenido para la primera porción. Productos Envasados con Compartimentos Duales Diseñados para Mantener el Producto Farmacéutico y un Disolvente en Compartimentos Separados-Preparar las unidades a analizar según se indica en Preparación de Prueba y de acuerdo con las instrucciones en el prospecto del producto. Mezclar cada unidad según se indica en el etiquetado, activando y agitando para asegurar el mezclado completo de los componentes separados y la disolución del producto farmacéutico. Abrir y desgasificar las unidades o la muestra combinada a analizar usando uno de los tres medios siguientes: sometiendo a ultrasonido, aplicando vacío o dejando la solución en reposo. Proceder según se indica para el volumen de unidad adecuado en Preparaciones Líquidas, mezclar, y suspender las partículas presentes en cada unidad mediante inversión o agitando por rotación suave o mecánicamente, y analizar retirando un mínimo de cuatro porciones, cada una de no menos de 5 ml, y contando el número de partículas con un tamaño ¿1 O µm y a 25 µm. No tomar en cuenta el resultado obtenido para la primera porción. Productos Etiquetados como "Empaque a Granel para Farmacias No Destinado a Infusión Directa"-Proceder según se indica en Preparaciones Líquidas con un volumen de 25 ml o más. Calcular el resultado de la prueba en una porción que sea equivalente a la dosis máxima provista en el etiquetado. Por ejemplo, si el volumen total del envase a granel es 100 ml y el volumen de dosis máxima es 1O ml, entonces el conteo promedio de partículas por OL por ml se multiplicaría por 1O para obtener el resultado de prueba basándose en la dosis máxima de 1 O ml. [NOTA-Para los cálculos de los resultados de la prueba, considerar que esta porción de dosis máxima es equivalente al contenido de un envase lleno.]
Cálculo por OL Debe considerarse que los límites de partículas se deben informar como todas las partículas¿ 1O µm y todas las partículas¿ 25 µm. Si el instrumento ha sido configurado para contar en compartimentos diferenciales, tales como¿ 10-25 µm, ¿ 2550 µm, ¿ 50 µm, etcétera., se deben sumar todos los compartimentos¿ 1O µm para producir el conteo total de partículas¿ 1 O µm; es necesario sumar todos los compartimentos¿ 25 µm para producir el conteo total de partículas de¿ 25 µm. Por ejemplo, el analista ha contado las muestras de prueba en ocho compartimentos: a)¿ 10-15 µm, b) ¿ 15 µm-25 µm, c) ¿ 25 µm-40 µm, d) ¿ 40 µm-75 µm e)¿ 75 µm-100 µm y f) ¿ 100 µm. Entonces, se calcularía P¿, 10 como: P¿;dO
=
P¿)0-75 ;1m
+
p>75-25 µm
p>75-700 µm
+
+
p>25-40 µm
+
P,40-75 µm
+
p>700 µm
Muestras Combinadas-Promediar los conteos de las dos o más alícuotas analizadas. Calcular el número de partículas en
cada envase por las fórmulas:
2160 (1 788) Determinación de Partículas / Información General
USP 39
PE10VrlVAn Pu5 Vr/VAn en donde Pm es el conteo promedio de partículas por umbral obtenido de todas las porciones analizadas y Pw es el conteo promedio de partículas por umbral obtenido de todas las porciones ~25 µm analizadas. Vr es el volumen de muestra combinada, en mL; VA es el volumen, en mL, de cada porción analizada; y n es el número de envases combinados. Muestras Individuales-Promediar los conteos obtenidos para las alícuotas de 5 mL o mayores de cada unidad separada analizada, y calcular el número de partículas en cada envase por las fórmulas:
PmV/VA PwV/VA en donde Pm es el conteo promedio de partículas por umbral obtenido de todas las porciones analizadas; y Pw es el conteo promedio de partículas por umbral obtenido de todas las porciones ~25 µm analizadas. V es el volumen, en mL, de la unidad analizada; y VA es el volumen, en mL, de cada porción analizada. Muestras de Unidades Individua/es-Promediar los conteos obtenidos para las dos o más alícuotas de 5 mL tomadas de la unidad de solución. Calcular el número de partículas en cada mL de solución de producto tomado por las fórmulas:
Pm/V Pw!V en donde Pm es conteo promedio de partículas por umbral obtenido de todas las porciones analizadas y Pus es el conteo promedio de partículas por umbral obtenido de todas las porciones ~25 µm analizadas. V es el volumen, en mL, de la porción tomada. Para todos los tipos de productos, cuando el material analizado se diluya para disminuir su viscosidad, debe tomarse en cuenta el factor de dilución en el cálculo del resultado de prueba final. Para todos los resultados de prueba, el conteo de partículas~ 1 O µm representa todos los conteos de compartimentos umbrales.
PRUEBA DE CONTEO DE PARTÍCULAS MICROSCÓPICO EN MEMBRANA La prueba de conteo microscópico de partículas se puede aplicar a inyecciones parenterales de gran volumen y pequeño volumen, así como a productos de soluciones oftálmicas. Esta prueba enumera esencialmente partículas sólidas 3 ~1 O µm en estos productos, después de la recolección, enjuague y secado en un filtro de membrana microporoso. Debido a que es posible utilizar una amplia gama de alícuotas de prueba, los conteos de partículas se pueden determinar por volumen o por envase sin dilución o extrapolación. Durante la realización del ensayo microscópico en membrana, se estima el tamaño de los sólidos retenidos vistos con un aumento de 1 OOx, tabulándolos en categorías de tamaño específicas. En este proceso, es posible encontrar materiales en la superficie de la membrana que no parecen sólidos o sustanciales, que presentan poco o ningún relieve en la superficie, tal como una "mancha" o discontinuidad en la membrana. El Capítulo (788) recomienda no intentar determinar el tamaño ni enumerar dichas partículas semisólidas, debido a comentarios históricos de fabricantes de productos parenterales de gran volumen de esterilización terminal que encontraron residuos que semejan manchas de color marrón después de la esterilización por calor de soluciones de Dextrosa. No obstante, si no se está muestreando una solución de carbohidratos o una formulación de desempeño similar, el reconocimiento de la presencia de dicho material agrega una medida de la robustez de la formulación. La evidencia continua de dichos materiales puede ser indicativo de que se requiere más investigación de desarrollo adicional para comprender su contenido. La naturaleza de estos materiales y la decisión subsiguiente de contar o investigar debe basarse en la experiencia con la formulación del producto. Se puede ayudar a la interpretación de la enumeración microscópica analizando una muestra de la solución mediante el conteo de partículas por OL o un método alternativo validado. El Capítulo (788) proporciona una descripción del Aparato de Prueba. A continuación se presentan comentarios adicionales: • Usar un microscopio binocular que corrija por cambios en la distancia interpupilar manteniendo una longitud de tubo constante. • El objetivo debe ser un aumento nominal de 1 Ox, plano acromático o de calidad superior, con una abertura numérica mínima de 0,25. • El objetivo debe ser compatible con un accesorio de iluminación episcópica. • Los oculares deben ser pareados (matched). Además, un ocular debe estar diseñado para aceptar y enfocar una retícula para ocular. El microscopio debe tener una platina mecánica capaz de mantener fija y permitir recorrer toda el área de filtración de un filtro de membrana de 25 mm o 47 mm. • Se requieren dos iluminadores. Ambos iluminadores deben tener una potencia suficiente para proporcionar una fuente de iluminación brillante y uniforme y se pueden equipar con filtros azules para luz diurna para disminuir la fatiga del operador durante el uso. 3
También pueden retenerse partículas blandas y sustancias semisólidas.
USP 39
Información General/ (1788) Determinación de Partículas 2161
• Se usa la retícula circular USP descrita en el Capítulo (788). Micrómetro de Platina-Graduado en incrementos de 1O µm, se utiliza cada día de uso. Para la calibración inicial, utilizar un micrómetro de platina certificado por el NIST para verificar la instalación de la retícula circular USP. Posteriormente, para la calibración/verificación diarias, se puede utilizar un micrómetro de platina comercial graduado en incrementos de 1 O µm para verificar el ajuste adecuado. Aparato de Filtración-Usar un embudo de filtración adecuado para el volumen a analizar, el cual generalmente tiene un diámetro interno de aproximadamente 16 mm para membranas de 25 mm o aproximadamente 37 mm para membranas de 47 mm. El embudo es de plástico, vidrio o acero inoxidable. Usar un soporte de filtro de malla de acero inoxidable o vidrio sinterizado como difusor de filtración. Un dispensador de disolventes capaz de suministrar disolventes filtrados a través de un filtro de membrana en un intervalo de presiones de 1O psi a 80 psi. Membranas-Según se describen en el Capítulo (788); no obstante, las opciones con tamaños de poro menores tendrán superficies más uniformes, lo que facilitará el examen microscópico, aunque pueden impedir el paso de muestras más viscosas durante el ensayo.
Entorno de Prueba En la siguiente sección, se recomiendan detalles operativos para mejorar la ejecución del ensayo MM. Resulta ideal el uso de dos campanas de flujo de aire unidireccional (UAFH, por sus siglas en inglés) u otros recintos de flujo de aire unidireccional, uno para las preparaciones de muestras "húmedas" y el otro para la fase de conteo microscópico. La UAFH tiene una capacidad suficiente para abarcar el área en la que se prepara el análisis. La UAFH proporciona aire filtrado por HEPA que típicamente no contiene más de 100 partículas (0,5 µm o mayores) por pie cúbico. Resulta necesaria una determinación con un blanco al inicio de cada secuencia de prueba para verificar la contribución mínima de fondo, equipos y operaciones del personal. ¿Cómo se define una secuencia de prueba? ¿Debe ser una por turno, una por familia de producto, una por serie de filtraciones (manifold) o una por muestra? Cualquiera de las definiciones anteriores puede ser adecuada, dependiendo de las necesidades operativas del sistema del laboratorio. La capacidad de limpiar el material de vidrio entre muestras, el número de productos diferentes en análisis y el volumen de muestras que se procesan en el laboratorio determinarán el control adecuado. No obstante, se debe considerar a la prueba con el blanco como una verificación de aptitud del sistema y, si no cumple con los requisitos, deberán considerarse sospechosas todas las muestras analizadas con anterioridad al blanco hasta la prueba previa con un blanco. Para determinar el conteo del blanco, duplicar el proceso de preparación de la muestra, en relación con el aparato y tipos de membrana. Armar un aparato de filtración limpio con una membrana nueva, enjuagar el interior con agua filtrada y drenar, luego transferir un volumen de 50 mL o mayor de agua filtrada al embudo de filtración aplicando vacío, y pasar todo el volumen de agua a través del filtro de membrana. Retirar la membrana de la base del embudo y colocar sobre un dispositivo de sujeción similar al que se usará para las muestras de prueba; típicamente, se coloca encima de una tira de cinta adhesiva doble sobre un portaobjetos para microscopio o en un sujetador de membrana comercial o placa de Petri. Después de dejar que se seque la membrana (el conteo se realiza en seco), observar toda el área de filtración al microscopio con un aumento de 1 OOx. Si se encuentran presentes no más de 20 partículas ~ 1O µm ni más de 5 partículas ~25 µm o más grandes dentro del área de filtración, el nivel de partículas de fondo es lo suficientemente bajo para realizar el ensayo microscópico del Capítulo (788). Si la carga de partículas excede estos límites, repetir el procedimiento. Resulta valioso limitar más las partículas de fondo para las pruebas de los Capítulos (788) y (789) en relación con las buenas prácticas de laboratorio, y más específicamente en relación con los límites para partículas~ 25 µm y~ 50 µm del Capítulo (789), los cuales se pueden considerar más restrictivos que los límites para inyectables con respecto al contenido total de partículas permitido para los volúmenes de unidades (generalmente) pequeños. Comparar la carga total de partículas para una inyección de pequeño volumen (SVI, por sus siglas en inglés) y una inyección de gran volumen (LVI, por sus siglas en inglés) con respecto a un producto oftálmico de 5 mL en la Tabla 1. ' 1te para Prod uctos Selecciona d os. Ta bl a 1. ComparacI'on d e Carga Total L1m Tamaño Límite
Conteo del Blanco
~10
µm
20
~25
µm
5
~50µm
No definido
SVI, 5mL
LVI, 125mL
3000 partículas 300 partículas
1500 partículas 250 partículas
N/A
N/A
Producto Oftálmico, 5mL
250 partículas 25 partículas 10 partículas
Por lo tanto, en las aplicaciones del Capítulo (789) para volúmenes más pequeños y en productos inyectables con un conteo de partículas bajo, el laboratorio debe esforzarse ein,conseguir.conteos de blancos que sean uniformes y bajos tales como no más de 5 ~ 1O µm, no más de 1 ~ 25 µm y ninguna~ 50 µm por blanco. Durante todo el procedimiento operativo (en el ambiente HEPA), es preferible usar guantes exentos de polvo y vestimentas que no desprendan partículas. Antes de llevar a cabo la prueba, limpiar las superficies de trabajo del recinto de flujo unidirec-
2162 (1788) Determinación de Partículas / Información General
USP 39
cional con un disolvente adecuado y filtrado. El material de vidrio y el equipo deben enjuagarse sucesivamente con una solución de detergente tibia y exenta de residuos, agua caliente, agua filtrada destilada o desionizada y alcohol isopropílico. [NOTA-Antes de su uso, pasar el agua destilada o desionizada y el alcohol isopropílico a través de filtros de membrana con un tamaño de poro nominal de 0,2 µm o menor.] El procedimiento de enjuague se realiza en el recinto de flujo de aire unidireccional. Dejar que se seque el material de vidrio y el aparato de filtración en el recinto de flujo de aire unidireccional, antes de realizar todas las demás operaciones. De preferencia, el recinto se encuentra en un cuarto separado en el que se suministra aire acondicionado filtrado y se mantiene bajo presión positiva con respecto a las áreas adyacentes. PREPARACIÓN DEL MICROSCOPIO La alineación óptica e iluminación del microscopio son críticas para el éxito de este método. Aunque no es difícil diferenciar una partícula de 1 O µm de otra de 25 µm en un aumento de 1OOx con luz reflejada, puede ser difícil tomar decisiones en los límites de cada categoría de tamaño si no se cuenta con el equipo, mantenimiento o alineación óptica adecuados. Asimismo, la alineación inadecuada del microscopio ocasiona la fatiga del operador. Será necesario tomar decisiones tales como: "¿esta partícula es de 9 µm u 11 µm?" y" ¿esta partícula es de 24 µm o 26 µm?" La resolución optimizada del sistema, que se define como la capacidad de discernir puntos discretos de separación mínima, depende de sistemas ópticos adecuados y bien alineados. Los factores tales como la limpieza del instrumento, la resolución, p.ej., A.N. del objetivo, 4 el enfoque de ambos oculares y la retícula circular desempeñarán papeles importantes en la obtención de las mejores imágenes. Para optimizar el uso del microscopio binocular compuesto, lo mejor es utilizar operadores familiarizados con el instrumento y que trabajen cómodamente con la alineación. El operador que lleva a cabo el método debe alinear los sistemas ópticos y la iluminación para su uso, con la aprobación de su supervisor/capacitador. Se recomienda iniciar la alineación del microscopio para una observación típica de iluminación transmitida usando una muestra conocida. Bastará cualquier muestra con la que esté familiarizada el operador; sin embargo, la opción recomendada es una suspensión del estándar de referencia para conteo de partículas como el ER Recuento de Partículas USP, puesto que también se utiliza en la evaluación de aptitud del sistema del método. Colocar una gota de ER Recuento de Partículas USP entre un portaobjetos de vidrio para microscopio y un cubreobjetos y observar microscópicamente. 5 El operador examina al microscopio los campos de esferas suspendidas usando una distancia interpupilar adecuada y sentado en una posición cómoda. Se deben observar las pequeñas esferas estándar nítidamente en un campo combinado (con facilidad) para ambos ojos. El enfoque preciso y la facilidad de observación se logran después del ajuste focal separado de cada ocular para un sólo punto en la muestra. Girar la retícula circular en el ocular derecho del microscopio de modo que la escala lineal se ubique en la parte inferior del campo de visión y enfocar nítidamente la retícula circular ajustando el anillo dióptrico del ocular derecho al tiempo que se observa una muestra fuera de foco. Enfocar el microscopio sobre una muestra, observando a través del ocular derecho únicamente. Luego, mirando a través del ocular izquierdo, ajustar el dióptrico del ocular izquierdo hasta enfocar la muestra nítidamente. Si el operador no se siente cómodo usando el microscopio o no consigue un enfoque preciso equivalente para cada ojo en el campo de visión fusionado, el conteo resultará complicado y se generará fatiga y una comparación de tamaño fallida. Examinar una membrana de prueba como un control positivo es la mejor forma de preparar al operador para el conteo de partículas. Los microscopistas experimentados pueden no requerir de dicha etapa; sin embargo, para los operadores nuevos o las personas que lleven a cabo una gran cantidad de métodos distintos en el laboratorio moderno, resulta prudente el ejercicio de familiarización. Un filtro de membrana del tipo que se usa para el método, como por ejemplo un filtro de 25 mm de contraste de color, liso, con un tamaño de poro nominal de 0,45 µm que contenga partículas, resulta una buena opción. Se puede usar muestra del método anterior, que contiene varios tipos de partículas, o una preparada para familiarización. Esta prueba de control positivo contendrá partículas comunes (escamas, filamentos, partículas equidimensionales, varios colores/opacidades, una variedad de tamaños, etc.) para refrescar de manera efectiva la sensibilidad del operador y facilitar la alineación del microscopio y la iluminación para una observación óptima. Sería necesario examinar la preparación de la membrana, ubicar un formación típica de partículas y primero alinear adecuadamente la iluminación: 1. Ajustar la iluminación externa incidente en un ángulo oblicuo (10-20º para el método) de modo que se pueda observar una elipse uniforme de luz reflejada sobre la membrana y una iluminación uniforme a través del campo de visión del ocular (uniforme a través del campo completo). Se evidenciarán las sombras de las partículas de mayor tamaño, como aquellas con un eje z de> 5µm (el eje z es el eje óptico del microscopio). 2. Ajustar el iluminador episcópico interno para campo claro hasta proporcionar una iluminación uniforme en un valor alto de ajuste del control del transformador, pero lo más importante, es que al disminuir la intensidad de la iluminación se vuelven evidentes la sombras de las partículas más grandes. De esta forma, resulta evidente la alta reflectividad de partículas vítreas planas (encontrar una) y las sombras nítidas de las partículas más equidimensionales (x:y:z - 1 :1 :1 ).
y, por consiguiente, de resolución. Una A.N. alta se correlaciona con una resolución alta. 5 El objetivo del microscopio requiere un espesor definido para el cubreobjetos nominalmente de 1 70 µm o No. 1 1/2.
4 A.N. es la apertura numérica, un indicador de la capacidad de recolección de luz óptica
USP 39
Información General/ (1788) Determinación de Partículas 2163
USO DE LA RETÍCULA CIRCULAR La retícula circular USP se fabrica específicamente para cada microscopio. El error relativo de la retícula circular usada debe ser de ±2% y se mide inicialmente con un micrómetro de platina certificado por el NIST. Para lograr lo anterior, se debe alinear la escala micrométrica de la retícula circular con el micrómetro de platina de modo que sean paralelos. (Comparar las escalas usando el mayor número de graduaciones posible en cada una.) Leer el número de divisiones de la escala de la retícula circular (GSD, por sus siglas en inglés) en comparación con las divisiones del micrómetro de platina (SMD, por sus siglas en inglés). Calcular el error relativo por la fórmula:
1OO[(GSO - SMD)/SMD] Un error relativo de ±2% es aceptable y verifica la buena alineación, el enfoque y el aumento adecuado. A partir de entonces, será suficiente una verificación en los días de uso del microscopio por parte del operador usando el micrómetro de platina NIST o un micrómetro de platina comercial para demostrar el ajuste adecuado. La técnica básica de medición aplicada con el uso del diámetro de la retícula circular consiste en contar todas las partículas de 1O µm y mayores, categorizando adicionalmente las partículas¿ 1O µm y ¿25 µm. La zona circular o el campo de visión de la retícula es una zona útil para la determinación de tamaño y el conteo de partículas. Las partículas se comparan con la escala lineal y/o círculos para determinar su tamaño en diámetro circular equivalente. Lo anterior se lleva a cabo transformando mentalmente la imagen de cada partícula en un círculo y luego comparando con los círculos de referencia de 1O y 25 µm de la retícula circular. El proceso de determinación de tamaño se lleva a cabo sin superponer la partícula con los círculos de referencia; las partículas no se mueven de sus ubicaciones dentro del campo de visión de la retícula circular (el círculo grande) para comparación con los círculos de referencia. Comparar el área de la partícula cuyo tamaño se está determinando con la de los círculos negros o transparentes. Usar el área de los círculos transparentes de referencia de la retícula circular para determinar el tamaño de las partículas blancas o transparentes. Usar el área de los círculos negros de referencia para determinar el tamaño de las partículas oscuras. La intención de comparar las partículas con un diámetro circular equivalente es obtener una correlación con la metodología de determinación de tamaño de partículas por OL, para la cual los fabricantes cuentan con extensas bases de datos. En la práctica, las partículas con áreas casi circulares se correlacionarán bien con los diámetros circulares de la retícula circular. Para partículas con un eje largo, tales como varillas o agujas, la conversión al área circular producirá un sesgo más significativo hacia tamaños estimados más pequeños. Contar las partículas en el diámetro mayor puede ser más simple y conservador. Por citar un ejemplo extremo, el conteo total de monodispersiones de cristales de aguja finos variaría en gran medida dependiendo de la determinación de tamaño utilizada. A fin de enfocar adecuadamente los lentes oculares y lograr un campo de visión único balanceado, cada operador debe enfocar nítidamente las líneas de la retícula circular USP ajustando el anillo dióptrico del ocular (ayuda tener una visión "infinita" o una muestra fuera de foco). A continuación, enfocar el microscopio sobre la muestra, a través del mismo ocular, y luego observando únicamente a través del otro ocular, y ajustar su anillo dióptrico hasta enfocar nítidamente la muestra. La retícula circular USP y las partículas de la muestra están ahora enfocadas en un campo de iluminación bien balanceado. La Preparación del Aparato de Filtración y las Preparaciones de Prueba están cubiertas por el Capítulo (788). Además, preparar las muestras de prueba en la siguiente secuencia. Fuera del gabinete de flujo de aire unidireccional que se va a usar para la prueba, retirar los cierres externos, las bandas de sellado, y retirar o cubrir con cinta la etiquetas. Enjuagar el exterior de los envases con agua filtrada según se indica en Entorno de Prueba. Proteger los envases de la contaminación ambiental hasta el momento de su análisis. Dentro del gabinete HEPA, abrir y extraer, verter o muestrear de otro modo el contenido de los envases en análisis de tal manera que se disminuya al mínimo la probabilidad de que se generen partículas que pudieran entrar en la muestra de prueba. El contenido de los envases con tapones removibles se puede retirar directamente quitando los cierres. Asimismo, es posible utilizar dispositivos de muestreo que cuenten con una aguja para penetrar el cierre de la unidad. Los productos en envases de plástico flexible se pueden muestrear cortando el tubo de administración o una esquina de la unidad con una hoja de afeitar o tijera limpiadas adecuadamente. Para todos los productos, independientemente del volumen, la experiencia integral relacionada con la integridad y la uniformidad de la partida se obtiene durante todo el desarrollo, permitiendo la aplicación de planes de muestreo adecuados a la producción comercial que aseguren que la selección de la muestra es representativa de la calidad de la partida. Todas las partidas deben contar con planes de muestreo que contemplen mediciones estadísticas deseadas de la calidad de la partida y que faciliten el control del proceso. DETERMINACIÓN DEL CONTEO DE PARTÍCULAS DEL PRODUCTO Dependiendo de la forma farmacéutica analizada, proceder según se indica en la categoría adecuada indicada a continuación. Preparaciones Líquidas-Mezclar bien las unidades a analizar invirtiendolas 20 veces. Abrir las unidades de tal manera que se genere el mínimo número posible de partículas de fondo. Para productos con un volumen de menos de 25 mL, se pueden abrir y drenar individualmente en el embudo de filtración, o combinar el contenido de 1O o más unidades en un recipiente limpio. [NOTA-Cuando se combina el contenido de envases, estos deben incluirse en el paso de determinación con un blan-
2164 (1 788) Determinación de Partículas / Información General
USP 39
co.] Filtrar las unidades de inyecciones de gran volumen de manera individual. Las unidades de inyecciones de pequeño volumen con un volumen de 25 mL o más se pueden filtrar individualmente. Transferir al embudo de filtración el volumen total de una solución combinada o de una unidad individual y aplicar vacío. Si el volumen de la solución que se va a filtrar excede el volumen del embudo de filtración, agregar, en etapas, porciones de la solución hasta que se filtre todo el volumen. Resulta prudente mantener el volumen de líquido en el embudo de filtración por encima de la mitad de la capacidad del embudo entre cada llenado, especialmente si se va a usar el procedimiento de conteo parcial (ver Enumeración de Partículas, Procedimiento de Conteo Parcial, a continuación). [NOTA-Esto es necesario para asegurar una distribución uniforme de partículas en la membrana analítica.] Después de la última adición de solución, iniciar el enjuague de las paredes del embudo dirigiendo una corriente de agua filtrada a baja presión en un patrón circular a lo largo de las paredes del embudo y detener el enjuague antes de que el volumen caiga por debajo de un cuarto del nivel de llenado. Mantener el vacío hasta que se haya expulsado todo el líquido del embudo. Retirar el embudo de filtración de la base de filtración manteniendo el vacío, luego apagar el vacío, y retirar el filtro de membrana con pinzas no dentadas. Colocar el filtro en el dispositivo de sujeción preparado y etiquetar con la identificación de la muestra. Dejar que el filtro se seque al aire en el recinto de flujo de aire unidireccional con la tapa entreabierta. Preparaciones Secas o Liofilizadas-Preparar los envases según se indica en Preparación de Prueba. Abrir cada envase teniendo cuidado de no contaminar la boca o tapa del mismo. Reconstituir según se indica en el etiquetado, de acuerdo con Preparación de Prueba. Dependiendo del experimento, usar alternativamente: • agua filtrada o un diluyente apropiado filtrado en el laboratorio, si fuera adecuado. Productos Envasados con Compartimentos Duales Diseñados para Mantener el Producto Farmacéutico y un Disolvente en Compartimentos Separados-Activar cada unidad según se indica en el etiquetado, agitando el contenido para asegurar el mezclado completo de los componentes separados, y luego proceder según se indica en Preparaciones Líquidas. Empaque a Granel para Farmacias o Envases Multidosis-Para Productos Etiquetados como "Empaque a Granel para Farmacias-No Destinado a Infusión Directa" o para envases multidosis, proceder según se indica en Preparaciones Líquidas, filtrando el volumen total de la unidad. Calcular el resultado de la prueba en una porción igual a la dosis máxima provista en el etiquetado. Considerar esta porción como equivalente al contenido de un envase lleno. Por ejemplo, si el volumen total del empaque a granel es 100 mL y la dosis máxima listada es 1O mL, el resultado de la prueba de conteo microscópico del volumen total de la unidad se multiplicaría por O, 1 para obtener el resultado de la prueba correspondiente al volumen de dosis de 1O ml. [NOTA-Para el cálculo del resultado de la prueba, considerar que esta porción es equivalente al contenido de un envase lleno.]
Enumeración de Partículas La prueba microscópica descrita en esta sección es flexible en el sentido de que los artefactos típicos tales como aire y líquidos inmiscibles no interfieren con el conteo final. Si se aplica el procedimiento de conteo parcial, el método tiene un intervalo amplio de detección de tamaño y conteo. Este método se puede usar cuando se cuentan todas las partículas sobre la superficie de una membrana o cuando únicamente se cuentan las partículas en una fracción del área de la superficie de la membrana. PROCEDIMIENTO DE CONTEO TOTAL El método microscópico puede ser tedioso (aburrido), impreciso (falta de coincidencia intra e ínter laboratorio) y la determinación de tamaño de partícula puede ser inexacta para formas de partículas no esféricas o equidimensionales. El ajuste ergonómico inadecuado (la altura de la silla), el enfoque ocular inadecuado o desbalanceado y el movimiento excesivo de los ojos son factores que promueven la fatiga del operador. Limitar el movimiento de los ojos a una retícula con un campo definido como la retícula circular para conteo USP que restringe el movimiento de los ojos al tercio central del campo de visión. Esto limita significativamente el movimiento de los ojos y, en consecuencia, la fatiga. El tamaño de la muestra es una consideración importante para la precisión del conteo. Se debe tener cuidado de muestrear muchos envases dentro de una partida para una buena representación de la distribución de las partículas. De la misma forma, la porción del empaque individual muestreado es la clave. Las partículas pueden flotar o sedimentarse. Muestrear únicamente los primeros 25 mL de un producto parenteral de gran volumen o muestrear sin un mezclado adecuado y reciente es un error que resultará en un conteo deficiente serio. Muestrear envases completos bien mezclados con las partículas en suspensión es el mejor método. Contar las partículas aisladas es un parámetro importante. Contar todas las partículas retenidas en la membrana es ciertamente el mejor método, y el problema simple es determinar el tamaño correcto para ubicarlas en los compartimentos de umbrales, de 1O µm y 25 µm. Esto adquirirá una importancia mayor para métodos que utilizan compartimentos adicionales para determinación de la población, como por ejemplo de 5 µm, 50 µm, 100 µm, etc. Tomar en cuenta que los límites de partículas para los Capítulos (788) y (789) se deben informar como todas las partículas ;?:1 O µm y todas las partículas ;?:25 µm. Si el método del laboratorio ha sido configurado para contar en varios compartimentos, tales como ¿ 10-25 µm, ;?:25-50 µm, ;?:50 µm, etc., se deben sumar todos los compartimentos ¿ 1O µm para producir el conteo total ¿ 1O µm; es necesario sumar todos los compartimentos ;?:25 µm para producir el conteo total ;?:25 µm. Usar un número de compartimentos de tamaño más estrecho puede ser beneficioso para los esfuerzos de mejoramiento del producto para separar los grupos de partículas.
USP 39
Información General/ (1 788) Determinación de Partículas 2165
Al realizar un conteo total, el campo de visión de la retícula o campo reticular (GFOV, por sus siglas en inglés) está definido por el círculo grande de la retícula circular, y el filamento señalador vertical se usa como diana de conteo. Examinar progresivamente la membrana en recorridos que cubran el área efectiva de filtración (EFA, por sus siglas en inglés), colindando pero sin traslapar a los recorridos de observación previos. Repetir este procedimiento, tabulando los conteos de partículas por lo menos en los umbrales 21 O µm-25 µm y 225 µm, moviéndose a través de la membrana hasta que se cuenten todas las partículas dentro del EFA de la membrana. Registrar el número total de partículas 21 O µm-25 µm y el número de partículas 225 µm. Para productos de gran volumen, calcular el conteo de partículas, en partículas por mL, para cada unidad analizada por las fórmulas:
/V
Pr.,, 0 PD. 25
/V
en donde Pr., 10 es el conteo total de partículas obtenido de todas las porciones analizadas, Pr.,25 es el conteo total de partículas obtenido de todas las porciones 225 µm analizadas, y V es el volumen, en mL, de la solución analizada. Por ejemplo, el analista ha contado las muestras de prueba en cuatro compartimentos: (a) 210-25 µm, (b) 225 µm-50 µm, (c) 250 µm -100 µm y (d) 2100 µm. Luego, debería calcularse como: Pr.~10
= p>10-25µm + p~25µm-50µm + pó0µm-100µm + p~100µm
Para productos de pequeño volumen, calcular el conteo de partículas, en partículas por envase, por las fórmulas: Pr.,10/n Pr., 25/n
en donde Pr., 10 es el conteo total de partículas obtenido de todas las porciones analizadas, PD.25 es el conteo total de partículas obtenido de todas las porciones 225 µm analizadas, y n es el número de unidades combinadas (1 en el caso de una unidad individual). PROCEDIMIENTO DE CONTEO PARCIAL Cuando se encuentra una membrana llena de partículas, la tarea de contarlas todas, apropiadamente, es desalentadora. Considérese que una preparación parenteral de pequeño volumen (PPPV) con un contenido de partículas en el límite, muestreada en una combinación de 1O viales tendría 30 000 partículas de 1O µm en la membrana. El conteo parcial o estadístico del área de filtración efectiva de la membrana puede ser el único medio para lograr resultados razonables. El conteo parcial no debe usarse para reducir los tiempos de conteo, sino sólo como un medio para estimar la carga total en un aislado de conteo alto. Existen buenos antecedentes sobre el uso de dispositivos de definición del campo, como por ejemplo rejillas o retículas sobre la superficie de la membrana o un campo reticular ocular. Una retícula ocular proporciona un límite nítido para la definición del área. Las líneas reticulares de las membranas son más bien anchas y tienen salpicaduras de tinta que se puede confundir con partículas. ¿Qué porciones y que tanto del EFA se debe contar? Al considerar las membranas de 25 mm, el EFA tiene un diámetro de 16 mm si se usan embudos de filtración comerciales comunes y, por consiguiente (pi x rz) = 201 mm 2. Basándose en propuestas anteriores del comité HIMA y el análisis de Draftz (ver la Referencia 3), los intervalos de confianza aceptables (distribución de Poisson, 2 desviaciones estándar) indican que para muestras con menos de 1000 partículas, la imprecisión del conteo estadístico es objetable. Se recomienda el conteo total para tales muestras. Para muestras con más de 1000 partículas en la membrana aislada, usando una membrana de 25 mm, se logra un estimado razonable de la población de partículas usando 20 GFOV. Si se desea un intervalo de confianza más pequeño sobre el resultado, se puede contar un mayor número de campos y partículas. Para membranas de 47 mm, el EFA es de 37 mm. Estas membranas de mayor diámetro se pueden seleccionar para formulaciones que requieren más área superficial de membrana (con características de flujo lento a través de membranas de 25 mm); el EFA =(pi x rz) =(pi x 18,5 mm2) = 1075 mm 2. Por consiguiente, para el EFA de membranas de 47 mm, se deben contar muchas más GFOV para lograr una confianza similar. Usar 100 GFOV para el conteo parcial de membranas de 47 mm proporciona una confianza estadística similar al enfoque de 20 GFOV/25 mm. Por lo tanto, cuando se presente una carga de partículas de 1000 o menos, se recomienda un conteo total. Cuando se va a realizar un conteo parcial en una membrana, el analista debe asegurarse primero de que la distribución de las partículas en la membrana sea uniforme. Lo anterior se evalúa mediante un recorrido rápido a 50x para examinar cualitativamente la heterogeneidad o agregados de partículas. Si se observa heterogeneidad, se debe realizar un conteo total en la membrana. A continuación, contar las partículas de 1O µm o mayores en un GFOV en el borde del área de filtración así como en el centro de la membrana. El número de partículas 210 µm en el GFOV con el conteo de partículas totales más alto no debe ser ooás del doble del GFOV con el conteo de partículas más bajo. Contar completamente la membrana que no cumpla con estos criterios. Para llevar a cabo un conteo parcial de las partículas en una membrana, incluir todas las partículas 210-25 µm y 225 µm dentro del GFOV y aquéllas que están en contacto con el lado derecho del círculo del GFOV. No contar partículas fuera del
2166 (1788) Determinación de Partículas/ Información General
USP 39
GFOV. Ignorar aquéllas que toquen el lado izquierdo del círculo del GFOV. La línea divisoria entre los lados izquierdo y derecho del círculo del GFOV es el filamento señalador vertical y es una línea de conteo útil. [NOTA-Usar la mejor estimación posible con respecto al tamaño de partícula sin cambiar la posición de la membrana, el aumento del microscopio o la iluminación.] Comenzar por el borde central del área de filtración y contando los GFOV adyacentes. Cuando se haya alcanzado el otro borde del área de filtración, moverse un GFOV hacia la parte superior del filtro y continuar contando los GFOV moviéndose en la dirección opuesta. Moverse de un GOFV al siguiente se puede lograr usando uno de dos métodos. Un método es definir un punto de referencia (partícula o irregularidad de superficie en el filtro) y moverse sobre un GFOV con respecto al punto de referencia. El segundo método consiste en usar el vernier del microscopio para moverse 1 mm entre los GFOV. Para facilitar esto último, ajustar los controles de posicionamiento por coordenadas x e y del microscopio a un número entero en la posición inicial en el borde central derecho del área de filtración; posteriormente, cada GFOV será una división entera del movimiento del control de posicionamiento en la coordenada x. Si se alcanza la parte superior del área de filtración antes del número de GFOV deseados, comenzar nuevamente en el borde central derecho del área de filtración a un GFOV más abajo que la primera vez. Esta vez, moverse hacia abajo sobre la membrana cuando se alcance el final de una hilera de GFOV. Continuar igual que antes hasta completar el número de GFOV. Para productos de gran volumen, extrapolar el conteo total de partículas por mL por las fórmulas:
Pr. 1oArfApV PwAr/ApV en donde Pm es el conteo total de partículas obtenido de todos los campos de visión y de todos los umbrales de tamaño; Pw es el conteo total de partículas obtenido de todos los campos de visión y de todos los umbrales de tamaño ;:::25 µm; Ar es el área de filtración, en mm 2, de la membrana (diámetro interno del embudo de filtración); Ap es el área parcial contada, en mm 2, basándose en el número de campos reticulares contados (área del GFOV x número de GFOV contados); y V es el volumen, en mL, de solución filtrada. Para una combinación de soluciones (para unidades de productos de pequeño volumen que contengan menos de 25 mL) o para una sola unidad de un producto de pequeño volumen, extrapolar el conteo total de partículas por unidad por las fórmulas:
PwArf Apn en donde Pm es el conteo total de partículas obtenido de todos los campos de visión y de todos los umbrales de tamaño, Pw es el conteo total de partículas obtenido de todos los campos de visión y de todos los umbrales de tamaño ;:::25 µm, y n es el número de unidades contadas (1 en el caso de una unidad individual). Para todos los tipos de productos, cuando el material analizado se diluya para disminuir su viscosidad, debe tomarse en cuenta el factor de dilución en el cálculo del resultado de la prueba final. REFERENCIAS
1. Groves MJ. The formulation of parenteral products. In: Parenteral Products: The Preparation and Quality Control of Products for lnjection. William Heinemann Medical Books, Ltd. London, 1973: 43-45. 2. Knapp, J.Z and HK Kushner (1980). Generalized Methodology for Evaluation of Parenteral lnspection Procedures, J. Parenteral Drug Association, 34:14. 3. Draftz RG. "Microscopical Counting, Sizing and Statistical Strategies for LVP Contaminants," in Conference Proceedings, lnternational Conference on Liquid Borne Particle lnspection and Metrology, May 11-13, 1987, Arlington VA. pp. 458-466.
(1852) ESPECTROSCOPÍA DE ABSORCIÓN ATÓMICA-TEORÍA Y PRÁCTICA ASPECTOS TEÓRICOS La técnica instrumental de espectrometría de absorción atómica (AAS, por sus siglas en inglés; ver el Apéndice para un listado de acrónimos de este capítulo) emplea la Ley de Beer-Lambert (Ley de Beer), que relaciona la concentración de un analito en una muestra con la absorción de radiación electromagnética de la muestra. La Ley de Beer indica que la absorbancia óptica de un cromóforo en un disolvente transparente es linealmente proporcional a la concentración del cromóforo y también a la longitud de paso o camino óptico de la celda de muestra. La Ley de Beer es aplicable únicamente cuando el ancho de banda' espectral de la luz es estrecho en comparación con los anchos de las líneas espectrales en el espectro y se expresa de la siguiente manera:
Información General/ (1852) Espectroscopía de Absorción Atómica 2167
USP 39
A=
EbC
A = absorbancia E = absortividad molar [L/(mol ·cm)] b =longitud de paso de la celda de muestra (cm) e= concentración (mol/L) Además: A= log 10(P0/P) = log 10(1/7) = log, 0 (100/%7) = 2- log 10%T P0 = intensidad de la luz que pasa a través de una muestra P = intensidad de la luz saliente de la muestra T = transmitancia
%T= 100 xT Los métodos de espectrometría de absorción atómica (MS) se dividen en dos categorías: a la llama (FMS, por sus siglas en inglés) y sin llama. Los métodos sin llama incluyen espectrometría de absorción atómica en horno de grafito (GFMS, por sus siglas en inglés), también conocida como espectrometría de absorción atómica por vaporización electrotérmica (ETVMS, por sus siglas en inglés), para análisis de ultra trazas. Otros métodos sin llama son la espectrometría de absorción atómica con vapor frío (CVMS, por sus siglas en inglés), destinada específicamente para el análisis de mercurio, y la espectrometría de absorción atómica con generación de hidruros (HGMS, por sus siglas en inglés), destinada específicamente para el análisis de arsénico, bismuto, germanio, plomo, antimonio, selenio, estaño y telurio. Un aparato básico de MS consta de una fuente de radiación, un dispositivo de introducción de la muestra, un medio para atomizar la muestra, un monocromador o un policromador, un detector y medios para la adquisición de datos (por lo regular una computadora). La mayoría de los instrumentos también cuentan con algún tipo de sistema de corrección de fondo, el cual se analizará más adelante en este capítulo. En el caso de la FMS, la llama a través de la cual se pasa la muestra se considera la celda de muestra. En el caso de la vaporización electrotérmica (ETV, por sus siglas en inglés), el tubo de grafito en el que se deposita la muestra se considera la celda de muestra. En el caso de la CVMS, se monta una celda de absorción de cuarzo sobre el cabezal del mechero, donde la celda de la muestra es el espacio por encima del mechero en el paso óptico. En el caso de la generación de hidruros, los hidruros se deslizan hacia el interior de una celda calentada.
INSTRUMENTAL Fuente de líneas
Celda de muestra
Selector de longitud de
onda
Sistema de detecc1on
Procesamiento de señal
Figura 1. Componentes básicos de un espectrofotómetro de absorción atómica. Todos los espectrofotómetros de absorción atómica comparten componentes fundamentales (Figura 1). Se encuentra disponible una amplia variedad de espectrofotómetros de absorción atómica, los cuales se basan en uno de dos diseños: un paso de luz de haz individual o de doble haz. La Figura 2 ilustra el paso de luz para un espectrofotómetro de haz individual. La línea punteada representa la señal de luz modulada proveniente de la fuente de luz externa (fuente de líneas) y la línea sólida representa la señal de corriente directa proveniente del atomizador, representada por una llama. Los óvalos representan las lentes. En este ejemplo, el haz proveniente de la fuente de líneas se modula de forma eléctrica y un amplificador colocado después del detector se ajusta a dicha frecuencia de modulación. El haz proveniente de la fuente de líneas se codifica de esta manera. El resultado es la eliminación del ruido proveniente de la radiación emitida en todas las frecuencias, excepto por la frecuencia de resonancia, y la mejora en la relación señal ruido. Los espectrofotómetros de haz individual se basan en una fuente de líneas muy estable para mantener la exactitud. También es necesario correr una solución blanco para proveer un ajuste correcto del 1 00% de T.
~ i=-----~---~----~-----~-----i--------Lámpara de cátodo hueco
Atomizador
Monocromador
Figura 2. Esquema de un espectrofotómetro de absorción atómica de haz individual. Reproducido con autorización de la Royal Society of Chemistry (Real Sociedad de Química).
USP 39
2168 (1852) Espectroscopía de Absorción Atómica/ Información General
La Figura 3 ilustra el paso de la luz para un espectrofotómetro de doble haz. El haz de radiación proveniente de la fuente de líneas se divide mediante un espejo cortador reflectante. Una mitad se dirige a través del atomizador (haz de muestra) y la otra mitad se dirige alrededor de éste (haz de referencia). Se debe tomar en cuenta que el haz proveniente de la fuente de líneas se modula mecánicamente mediante el cortador reflectante. Posteriormente, los dos haces se recombinan mediante un espejo semitransparente y se dirigen a un monocromador en donde los fotones a la longitud de onda característica son medidos por el detector. La relación entre la señal de la muestra y la señal de referencia se amplifica y se procesa como la lectura de absorbancia. Debido a que los haces de muestra y de referencia se generan a partir de una fuente de líneas común, son separados en sus longitudes de onda características por el mismo monocromador, y son procesados por los mismos componentes electrónicos, se cancela cualquier variación en la fuente de radiación, en las propiedades del detector o en los componentes electrónicos. En principio, la estabilidad de un espectrofotómetro de doble haz es superior a la de un espectrofotómetro de haz individual.
==t.(==-'[ __ -t-__ ___ : ____ ~~z-d::_e~~e:~ª1 1
Lámpara de cátodo hueco
THaz de muestra
____
~ 1 1
l'
1 1
~------------ ----~Atomizador
Monocromador
Figura 3. Esquema de un espectrofotómetro de absorción atómica de doble haz. Reproducido con autorización de la Royal Society of Chemistry (Real Sociedad de Química).
DISEÑOS DE LA CELDA DE MUESTRA Espectrometría de Absorción Atómica a la Llama En la espectrometría de absorción atómica a la llama (FAAS), se aspira una muestra líquida en una llama a través de un nebulizador. Mediante el nebulizador, la muestra se convierte en una niebla compuesta por gotitas uniformes que se introducen fácilmente en la llama. La llama desolvata y atomiza la muestra proveyendo una fuente de átomos o moléculas neutros para su análisis en el espectrofotómetro. Aunque se han documentado otros tipos de llama, la más comúnmente usada es la llama de aire-acetileno. Debido a que la temperatura de la llama de aire-acetileno no es suficiente para destruir los óxidos que se pueden formar o que están presentes, a menudo se usa una llama de óxido nitroso-acetileno, dependiendo del analito y de la naturaleza de la muestra. La llama de aire-acetileno arde en un intervalo de temperatura de 2125º-2400º, pero la llama de óxido nitroso-acetileno arde en un intervalo de temperatura de 2650º-2800º. Las llamas pueden optimizarse para un análisis particular aumentando o reduciendo la relación entre combustible y oxidante. La relación entre combustible y oxidante se puede ajustar para que sea una -oxidación o reducción- baja o rica, dependiendo del analito de interés. La mayoría de los fabricantes de instrumentos proveen pautas con respecto al tipo de llama que se debe usar para un elemento específico, por lo que se recomienda a los analistas referirse al manual provisto por el fabricante del instrumento con respecto a las condiciones óptimas de llama para un analito dado. Algunos instrumentos de AAS también pueden usarse en el modo de emisión de llama. En la emisión de llama, los átomos y las moléculas logran un estado electrónico excitado después de las colisiones térmicas dentro de la llama y, cuando vuelven a un estado electrónico más bajo o basal, emiten luz a longitudes de onda características para cada analito. Aunque el instrumental puede ser capaz de operar en el modo de emisión de llama, dicho modo no se trata en este capítulo.
Espectrometría de Absorción Atómica por Vaporización Electrotérmica-Horno de Grafito (ETV-
GFAAS) En la ElV o la GFAAS, se deposita una muestra líquida a través de una pequeña abertura en el interior de un tubo de grafito conocido como horno mini Massmann. En el interior del horno, la muestra se calienta a temperaturas crecientes hasta que se evapore el disolvente, el residuo sólido se incinere o pirolice y los átomos neutros se atomicen en sus estados basales. Posteriormente, los átomos se excitan mediante la absorción de radiación a longitudes de onda características. Las muestras pueden" depositarse directamente en la pared del horno de grafito o en una plataforma pequeña de grafito, conocida como plataforma
USP 39
Información General/ (1852) Espectroscopía de Absorción Atómica 2169
L'vov, que está situada en el interior del horno de grafito. Con la ETV, a menudo se llevan a cabo una serie de etapas de calentamiento, incluyendo secado, carbonización o incineración, atomización y limpieza. Se pueden usar otras etapas de calentamiento intermedias, dependiendo de la naturaleza de la muestra. Durante el proceso de calentamiento, el horno de grafito se purga con un gas inerte, por lo regular nitrógeno o argón. En la etapa de atomización, el horno se calienta rápidamente a una temperatura alta (generalmente hasta lograr la incandescencia). El flujo de gas de purgado se detiene temporalmente mientras se mide una señal de absorción transitoria producida por el analito atomizado. En la FAAS, se puede usar la Ley de Beer para relacionar la concentración del analito y la señal de absorción.
Espectrometría de Absorción Atómica con Vapor Frío y Generación de Hidruros Las técnicas con vapor frío y con generación de hidruros a menudo se usan para la determinación de mercurio o para ciertos elementos formadores de hidruros tales como estaño, arsénico, selenio, antimonio y bismuto. En el caso del mercurio, una reducción química genera átomos y una corriente de gas inerte arrastra el vapor frío al interior de una celda de cuarzo fría en el paso óptico del instrumento. La técnica es muy sensible y tiene límites de detección que van desde partes por mil millones o millardo (ppb, por sus siglas en inglés) hasta partes por billón (ppt, por sus siglas en inglés) dependiendo de la muestra y del ambiente de laboratorio. En el caso de los elementos formadores de hidruros, una reacción con borohidruro de sodio y ácido clorhídrico genera el hidruro del analito de interés. El gas resultante se arrastra al interior de una celda de cuarzo inerte que se coloca en la parte superior del mechero. La celda se puede calentar externamente o se puede calentar con una llama de aire-acetileno. El calor de la llama rompe el hidruro y crea la forma elemental del analito. Esto se conoce como modo de transferencia directa con generación de hidruros. Los generadores comerciales de hidruro por transferencia directa están disponibles en dos configuraciones, de flujo continuo y de inyección en flujo. Al igual que con la detección con vapor frío para mercurio, la generación de hidruros también puede ser muy sensible y tiene límites de detección en el orden de ppb o ppt.
FUENTES DE LÍNEAS Se usa una fuente de luz externa (fuente de líneas) para emitir líneas espectrales correspondientes a la energía requerida para generar la transición electrónica desde el estado basal hasta un estado excitado en la muestra. Las fuentes de luz externas que se usan con mayor regularidad son las lámparas de cátodo hueco (HCL, por sus siglas en inglés) o las lámparas de descarga continua sin electrodos (EDL, por sus siglas en inglés). La absorción de radiación de la fuente de luz externa es proporcional a la población de las especies de analito en el estado basal, la cual es proporcional a la concentración del analito que se aspiró hacia el interior de la llama, lo cual posibilita el uso de la Ley de Beer para determinar la concentración de un analito en la muestra. La absorción se mide mediante la diferencia en la señal transmitida en presencia y ausencia del analito. Una fuente de líneas adecuada para AAS debe: • Producir líneas de anchos de banda suficientemente estrechos específicas de un pico de absorción atómica particular • Producir un haz de radiación con una intensidad suficiente para permitir mediciones de absorción de señal-ruido altas • Producir un haz de radiación que sea estable durante periodos extensos • Ser fácil de iniciar y con un tiempo corto de calentamiento y una vida útil prolongada. El gas contenido dentro del tubo de la lámpara de cátodo hueco se ioniza al aplicar un potencial eléctrico a través de los electrodos. Posteriormente, los cationes gaseosos adquieren energía cinética suficiente para expulsar algunos de los átomos metálicos de la superficie del ánodo, proceso que se conoce como desprendimiento por bombardeo (sputtering). Después, se excita una porción de la nube de iones metálicos resultante. Al relajarse al estado basal, los iones emiten fotones a las longitudes de onda características para dicho metal. Las lámparas de cátodo hueco están disponibles en una variedad de configuraciones y pueden ser específicas para un elemento individual o para elementos múltiples. Para ciertos elementos, las lámparas de descarga continua sin electrodos producen haces de radiación mucho más intensos que las lámparas de cátodo hueco. Éstas lámparas se encuentran disponibles para el análisis de antimonio, arsénico, bismuto, cadmio, cesio, germanio, plomo, mercurio, fósforo, selenio, telurio, talio, estaño y cinc. Son similares a las de cátodo hueco debido a que se basan en el desprendimiento de un metal por bombardeo mediante iones acelerados, pero ionizan el gas inerte mediante un campo intenso de radiofrecuencia en lugar de los electrodos alámbricos. El requisito de una fuente de líneas individual para cada metal limita la absorción atómica a una técnica para un sólo elemento. Algunos sistemas modernos permiten el análisis de elementos múltiples mediante transición automática de lámparas o colocando múltiples lámparas en un arreglo. La espectrometría de absorción atómica con fuente continua de alta resolución combina un monocromador Echelle de alta resolución con una lámpara de arco corto de Xenón para obtener capacidades analíticas para elementos múltiples (ver ta Referencia 7 para detalles adicionales).
SELECTORES DE LONGITUD DE ONDA Debido a que tas líneas de resonancia atómica son estrechas, con frecuencia, los espectrómetros están equipados con monocromadores de red de dispersión de resolución moderada, tates como sistemas monocromadores Ebert y Czerny-Turner.
2170 (1852) Espectroscopía de Absorción Atómica/ Información General
USP 39
Aunque la aplicación no es común, los policromadores Echelle de alta resolución se han usado en los espectrofotómetros de absorción atómica diseñados para mediciones simultáneas de elementos múltiples. Los espectrofotómetros de este tipo por lo general se acoplan con un policromador de alta resolución con una fuente continua de arco de Xenón o diversas fuentes de líneas individuales. Estos por lo regular se equipan con un sistema detector de estado sólido.
SISTEMAS DE DETECCIÓN Los sistemas de detección convierten energía radiante, fotones, en una señal electrónica proporcional a la concentración. Esta señal es amplificada y procesada en una lectura de absorbancia o una concentración, tal como se ilustra en la Figura 7. Los tubos fotomultiplicadores se usan ampliamente en la espectrometría de absorción atómica para convertir en voltajes los fotones que pasan a través del monocromador. Algunos espectrofotómetros están diseñados de modo que las corrientes aplicadas a los tubos fotomultiplicadores estén bajo el control del operador. Tal como se mencionó anteriormente, algunos espectrómetros de absorción atómica están equipados con sistemas detectores de estado sólido. Existen dos tipos: un dispositivo de inyección de carga o un dispositivo de acoplamiento de carga. Las ventajas y desventajas de cada diseño dependen de las aplicaciones específicas. En algunas aplicaciones, un detector de estado sólido puede producir una relación señal-ruido superior, proveer una respuesta más plana a lo largo del espectro UV/Vis y/o tener capacidades de corrección de fondo mejoradas en comparación con un tubo fotomultiplicador.
CORRECCIÓN DE FONDO La absorción no específica puede comprometer la exactitud de las mediciones de la espectrometría de absorción atómica. Este es el caso en particular para los análisis de ultra trazas que usan GFAAS. El tipo de corrección de fondo usado para la GFAAS puede tener un gran impacto en el éxito del análisis. Se encuentran disponibles tres tipos de diseños de corrección de fondo para la espectrometría de absorción atómica moderna: de fuente continua, Smith-Hieftje o pulso gigante variable y con efecto Zeeman.
Fuente Continua Una fuente continua, con frecuencia una lámpara de deuterio, se configura en los elementos ópticos del espectrofotómetro de modo que la radiación de la fuente continua y de la fuente de líneas se pasa de manera alternada a través de la celda de muestra mediante un cortador reflectante de haces (Figura 4). El ancho del paso de banda de la fuente continua es igual al ancho de la ranura.
Monocromador Detector
Lámpara de deuterio
Atomizador
Lámpara de cátodo hueco
Figura 4. Esquema de un espectrofotómetro de absorción atómica con un corrector de fondo de fuente continua. Reproducido con autorización de la Royal Society of Chemistry (Real Sociedad de Química). Posteriormente, se puede medir la intensidad de la señal proveniente de ambas fuentes y se puede calcular el cociente. La Figura 5 muestra la operación de un sistema de corrección de fondo de fuente continua. Antes del análisis, la intensidad de la lámpara de deuterio se iguala a la de la lámpara de cátodo hueco a la longitud de onda de resonancia del analito. Asimismo, se debe tomar en cuenta que el ancho de banda de la fuente continua es igual al ancho de la ranura de salida del mono-
USP 39
Información General/ (1852) Espectroscopía de Absorción Atómica 2171
cromador, por lo regular 0,2-0,7 nm, en comparación con el ancho de la línea de resonancia de aproximadamente 0,002 nm. Si se introduce una solución que contiene el analito de interés, las señales de ambas fuentes se atenúan debido a la absorción atómica (Figura 5, Paneles A y B). Si se introduce una solución que contiene el analito de interés además de componentes que lleven a una absorbancia de banda ancha no específica, la intensidad de la absorción atómica de la fuente de líneas (lámpara de cátodo hueco) se resta correctamente de la intensidad de la fuente continua (Figura 5, Paneles C y D).
©I
©I
Figura 5. Paneles A y B: sólo para absorción atómica. Paneles C y D: absorción atómica con absorción de fondo. Reproducido con autorización de la Royal Society of Chemistry (Real Sociedad de Química). A pesar de la utilidad del diseño de corrección de fondo de fuente continua, éste presenta algunas limitaciones. Básicamente, la introducción de una lámpara adicional y de un cortador reflectante ocasiona una degradación de la relación señal-ruido general de las mediciones. Además, si la fuente de líneas y la fuente continua no están perfectamente alineadas, se producirá una corrección errónea al pasar los haces individuales a través de una muestra gaseosa no homogénea, como ocurre frecuentemente en la celda de muestra. Este es el caso particular para fondos altamente estructurados. La intensidad radiante de la fuente de deuterio en la región visible es demasiado baja para usarla con longitudes de onda analíticas superiores a 350 nm. Algunos fabricantes de instrumentos equipan sus espectrofotómetros con fuentes continuas alternativas, tales como lámparas de halógeno y tungsteno, para resolver este problema.
Smith-Hieftje Al aplicar corrientes altas a una lámpara de cátodo hueco, se altera el perfil de la línea de emisión: la línea se ensancha y aparece una depresión en el centro debido a la autoabsorción. La autoabsorción ocurre cuando los fotones emitidos por los átomos excitados son absorbidos por átomos gaseosos en estado basal contenidos dentro del tubo de cuarzo de la lámpara de cátodo hueco. A las corrientes usadas para la adquisición normal de datos, la lámpara de cátodo hueco se usa para medir la suma de la absorbancia del elemento de interés y el fondo no específico. A las corrientes altas de la lámpara, la absorbancia medida es ocasionada principalmente por el fondo. La absorbancia ocasionada por el elemento de interés es la diferencia entre las intensidades del analito y las absorbancias de fondo no específicas. La Figura 6 ilustra el proceso de corrección de fondo Smith-Hieftje.
Frecuencia Figura 6. Perfil de emisión de una lámpara de cátodo hueco (A) a corriente baja y (B) a corriente alta. La absorbancia a corriente baja es ocasionada por el fondo mas el analito. La corriente alta es solamente absorbancia de fondo. Adaptado de S.B. Smith, Jr. y G.M. Hieftje, Appl Spectrosc, 1983, 37, 419.
2172 (1852) Espectroscopía de Absorción Atómica/ Información General
USP 39
Las ventajas de la corrección de fondo Smith-Hieftje se basan en que la lámpara de cátodo hueco funciona como fuente individual para cualquier longitud de onda, obviando cualquier problema de alineación que surja de la fuente continua alternativa. Este sistema permite la corrección de fondos estructurados muy cerca de la longitud de onda de resonancia. Las desventajas incluyen una reducción notable de la vida útil de las lámparas de cátodo hueco. En comparación con la corrección de fondo de fuente continua, el procedimiento Smith-Hieftje puede resultar en un intervalo dinámico más corto y/o puede requerir mayores diluciones de la muestra para reducir las absorbancias de fondo.
Efecto Zeeman La corrección de fondo por el efecto Zeeman se basa en el principio de que, ante la presencia de un campo magnético, la línea de absorción de un elemento se divide en tres componentes polarizados ópticamente. El componente re se coloca en el centro de la línea de resonancia. Colocados a distancias iguales de cada lado del componente re se encuentran los componentes cr+ y cr-. Los componentes cr están linealmente polarizados y perpendiculares al campo magnético. La distancia de separación de los componentes cr+ y cr- del componente re aumenta a medida que se incrementa la fuerza del campo magnético. Los instrumentos comerciales emplean imanes con fuerzas de campo de aproximadamente 1 Tesla, la cual corresponde a una separación del componente cr de aproximadamente 0,01 nm en cada lado del componente re. Las líneas de absorbancia de los diferentes elementos pueden presentar patrones Zeeman normales o anómalos. Los patrones normales Zeeman están compuestos por un solo componente re y dos componentes cr. Un patrón normal Zeeman ocurre para longitudes de onda de absorbancia que corresponden a una transición electrónica en singulete. Un patrón anómalo Zeeman tiene una división adicional de los componentes re y cr, y ocurre para longitudes de onda que corresponden a transiciones electrónicas más complejas. Se encuentran disponibles tres diseños básicos para espectrofotómetros de absorción atómica comerciales equipados con corrección de fondo Zeeman: espectrofotómetros de absorción atómica de corriente directa transversal con Zeeman, espectrofotómetros de absorción atómica de corriente alterna transversal con Zeeman y espectrofotómetros de absorción atómica de corriente alterna longitudinal con Zeeman. ESPECTROMETRÍA DE ABSORCIÓN ATÓMICA DE CORRIENTE DIRECTA TRANSVERSAL CON ZEEMAN Este diseño emplea un imán de corriente directa colocado alrededor del atomizador. El término transversal se refiere a la alineación paralela del campo magnético con el eje óptico. El efecto Zeeman se aplica permanentemente en este diseño. Se coloca un polarizador giratorio en el paso de la luz entre la fuente de líneas y el atomizador. Este divide la radiación incidente proveniente de la fuente de líneas en los componentes característicos re y cr. Ver la Figura 7 para una representación esquemática de la configuración y para una ilustración de la operación del espectrofotómetro de absorción atómica de corriente directa transversal con Zeeman. Lámpara de Polarizador cátodo hueco
le
1
I
,
Mono-
Foto-
Computadora Grabadora
0-1§ l~,:1 @i H 111 Atomizador de grafito o mechero
Fondo
,.-1\.~
L.-¡/
Absorción atómica
Luz polarizada
Absorción atómica
_____, Fondo
~EJ Figura 7. Configuración y operación de un espectrofotómetro de absorción atómica de corriente directa transversal con Zeeman. Adaptado de H. Koizumi and K. Yasuda, Spectrochim Acta, 1976, 31 B, 523.
Información General/ (1852) Espectroscopía de Absorción Atómica 21 73
USP 39
ESPECTROMETRÍA DE ABSORCIÓN ATÓMICA DE CORRIENTE ALTERNA TRANSVERSAL CON ZEEMAN Este diseño emplea un imán de corriente alterna colocado alrededor del atomizador. El campo magnético se encuentra en alineación paralela con el eje óptico. El imán de corriente alterna se enciende y se apaga a la mitad de la frecuencia de modulación de la fuente de líneas (por lo general, 50 ó 60 Hz). Se coloca un polarizador fijo entre el atomizador y el monocromador. Ver la Figura 8 y la Figura 9 para ilustraciones de la operación del espectrofotómetro de absorción atómica de corriente alterna transversal con Zeeman.
campo encendido (sólo absorción de fondo)
campo apagado (absorción atómica +de fondo)
u-v~,
íl -
_Jb--
Líneas de
absor~ión
Línea de emisión
\
~1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
Corriente del imál (imán de corriente alterna 60 Hz)
~~~~~~~~~!---~~~~~~~~~~-!'--~~~~!---~
Fuente de radiación
L
(120 Hz)
Figura 8. Principio de operación de un espectrofotómetro de absorción atómica de corriente alterna ransversal con Zeeman. ©2011 PerkinElmer, lnc. Todos los derechos reservados. Impreso con autorización. Imán "apagado" Fondo
Componente (con polarización
tl
Componente (con
1 polarización-+)
Línea de emisiJn (componente con orientación f)
Líne-a-de_e_m-is-ión (componente con orientación fl
Figura 9. Ilustración de la operación de un espectrofotómetro de absorción atómica de corriente alterna transversal con Zeeman. ©2011 PerkinElmer, lnc. Todos los derechos reservados. Impreso con autorización. ESPECTROMETRÍA DE ABSORCIÓN ATÓMICA DE CORRIENTE ALTERNA LONGITUDINAL CON ZEEMAN En este diseño, el campo magnético se encuentra en alineación perpendicular con el eje óptico. Con esta configuración, el componente n está ausente y los componentes cr se polarizan de manera circular, de modo que no se requiere un polarizador. Ver la Figura 7O para una comparación entre espectrofotómetros de absorción atómica de corriente alterna transversal y longitudinal con Zeeman.
USP 39
2174 (1852) Espectroscopía de Absorción Atómica/ Información General
Efecto Zeeman Longitudinal
Efecto Zeeman Transversal Absorción en la línea del analito
Absorción { :: en la línea del analito ''
¡:
¡¡componente (con polarización-+)
1Línea de emisión (componente con orientación
d'
f)
f)
componente (con polarización(}
--L-íne-a~d· l'e-m-is-ión-(todos los planos de polarización)
Figura 1O. Comparación de espectrofotómetros de absorción atómica de corriente alterna transversal y longitudinal con Zeeman. ©2011 PerkinElmer, lnc. Todos los derechos reservados. Impreso con autorización. La corrección de fondo con efecto Zeeman ofrece la ventaja de corrección de fondo a la longitud de onda de resonancia y una corrección de absorbancias no específicas relativamente altas. En comparación con la corrección de fondo de fuente continua, la corrección de fondo con efecto Zeeman puede resultar en una reducción del intervalo dinámico lineal en algunas aplicaciones y puede requerir la dilución adicional de las soluciones de prueba. Dependiendo del analito específico y de la aplicación, la corrección de fondo con efecto Zeeman ofrece ventajas y desventajas que deben tomarse en cuenta para cada aplicación.
CONSIDERACIONES ANALÍTICAS Preparación de la Muestra La FAAS requiere la introducción de una muestra líquida en el nebulizador. La ETV /GFAAS por lo regular se lleva a cabo usando muestras líquidas, aunque los análisis se pueden realizar usando suspensiones espesas y muestras sólidas. Debido a que el análisis de suspensiones espesas líquidas es mucho más común, el análisis de muestras sólidas no se discute en este capítulo. Las muestras pueden prepararse de diversas formas para disolverlas o solubilizarlas. En algunos casos, la dilución directa de una muestra sólida se puede realizar usando agua desionizada, ácidos diluidos o disolventes orgánicos. No obstante, cuando una muestra no se disuelve, se requiere alguna forma de digestión ácida. La digestión ácida también es necesaria si la muestra se ha incinerado previamente. Las opciones para la digestión ácida incluyen digestiones en placa de calentamiento, digestión en microondas en recipiente abierto y digestión en microondas en recipiente cerrado. Los procedimientos para digestión ácida son específicos para una matriz de muestra y analito determinados. Al usar sistemas de digestión en microondas, los analistas deben referirse a las pautas del fabricante del microondas con respecto al uso y la programación del instrumento.
Interferencias La espectrometría de absorción atómica está sujeta a diversos tipos de interferencias. Las más comunes son: • Interferencias espectrales: Se pueden presentar interferencias espectrales cuando existe una señal superpuesta de otro elemento que es un componente de la muestra o de la matriz de muestra. • Ionización del analito: Algunos elementos tales como sodio, potasio, calcio y cesio se ionizan fácilmente, y la ionización del analito reduce la señal analítica. • Efectos de la matriz: Las interferencias pueden surgir de las diferencias entre las viscosidades de la muestra, del estándar y del blanco, o se pueden introducir mediante tensión superficial. • Ensanchamiento de la línea espectral: El ensanchamiento de la línea espectral puede derivarse de diversos factores, incluyendo la autoabsorción, el efecto de Lorentz, el efecto de Doppler o la extinción (quenching). • Compuestos que no se disocian en la llama.
Modificación de la Matriz, Agentes de Liberación y Supresores de Ionización Para contrarrestar las interferencias potenciales o para mejorar su capacidad de monitorear un analito, los analistas en ocasiones emplean un modificador de matriz, un agente de liberación o un supresor de ionización. Los modificadores de matriz se agregan a muestras, estándares y blancos con la GFAAS con el objetivo principal de cambiar la naturaleza de la muestra o del analito en la muestra mediante: • El aumento en la volatilidad de la matriz de muestra de modo que sus componentes sean eliminados durante la etapa de incineración o pirolisis • La reducción de la volatilidad del analito, la cual ayuda a eliminar la pérdida del analito durante la etapa de incineración o pirolisis
USP 39
Información General/ (1852) Espectroscopía de Absorción Atómica 2175
• La reducción de la absorción de fondo eliminando los componentes de la matriz de modo que no interfieran con la señal del analito durante la atomización. Puede ser necesario usar más de un modificador de matriz durante un análisis. Los modificadores de matriz de uso común incluyen nitrato de magnesio, nitrato de níquel, paladio y lantano. Los fabricantes de los instrumentos de horno de grafito proveen información detallada con respecto al uso de los modificadores de matriz, y los analistas deben consultar dicha información al realizar un análisis. En algunas instancias, los análisis por GFAAS requieren aplicar el método de estándar agregado para superar los sesgos en los resultados inducidos por la matriz. Muchos sistemas modernos de GFAAS están equipados con muestreadores automáticos que agregan automáticamente cantidades conocidas de soluciones muestra a múltiples niveles según lo especificado por el analista, realizan la regresión lineal e informan los resultados de la concentración final basándose en la ordenada al origen. Los agentes de liberación y los supresores de ionización se usan en la FAAS para eliminar ciertas interferencias potenciales. Los agentes de liberación se agregan en exceso a las muestras, a los estándares y a los blancos para prevenir la formación de compuestos refractantes al combinarse con un interferente potencial. Los supresores de ionización se agregan en exceso a las muestras, a los estándares y a los blancos para ayudar a controlar la ionización del analito. Al agregar un supresor de ionización que tiene un potencial de ionización menor que el del analito los analistas crean un exceso de electrones en la llama y se suprime la ionización del analito. Los agentes de liberación de uso común incluyen lantano y estroncio. Los supresores de ionización de uso común incluyen sodio, potasio, cesio y lantano. Los fabricantes de instrumental de absorción atómica (AA) a la llama proveen información detallada sobre el uso de agentes de liberación y supresores de ionización, y los analistas deben consultar dicha información al realizar un análisis. Debido a la separación del analito de la matriz en la absorción atómica con vapor frío y con generación de hidruros, las interferencias espectrales se reducen notablemente al compararlas con otros métodos de absorción atómica. Sin embargo, se pueden presentar interferencias de fondo no selectivas cuando se transporta a la celda una cantidad suficiente de una especie absorbente. Por lo regular, esto ocurre cuando se introduce un exceso de otra especie formadora de hidruros desde la matriz de muestra o, en el caso de la formación de hidruros, cuando se usan medios no acuosos. Las interferencias del transporte suceden durante el transporte de un hidruro de la solución muestra a la celda de muestra. Esto ocasiona un retraso en la formación de hidruros, conocido como interferencia con la cinética de transporte, o una pérdida del hidruro, conocida como interferencia con la eficiencia de transporte. Los compuestos volátiles transportados a la celda con el hidruro también pueden interferir de manera no selectiva. Estas interferencias se pueden resolver usando el método de estándar agregado o diluyendo adicionalmente la muestra.
REFERENCIAS (1) Welz B., Becker-Ross H., Florek S., Heitmann U., High Resolution Continuum Source AAS, Wiley-VCH, 2005, pp. 53-61. (2) Skoog, O.A., Holler, F.J., Nieman, T.A., Principies of Instrumental Analysis, Saunders College Publishing, 5th Ed., 1998, pp. 214-220. (3) Ebdon, L., Evans, E.H., Fisher, A., Hill, S.J., An lntroduction to Analytical Atomic Spectrometry, John Wiley and Sons, 1998, pp. 17-23. (4) Lajunen, L.H.J. and Peramaki, P., Spectrochemical Analysis by Atomic Absorption and Emission, The Royal Society of Chemistry, 2nd Ed., 2004, pp. 78-87, 151-152, 156, 161, 164, 168. (5) Cullen, M., Atomic Spectroscopy in Elemental Analysis, CRC Press, 2004, pp. 228-237, 251. (6) Dedina, J. and Dimiter, L., Hydride Generation Atomic Absorption Spectrometry, Chemical Analysis, Volume 130, John Wiley and Sons, 1995, pp. 91-93.
APÉNDICE: ACRÓNIMOS EN INGLÉS A: absorción AA: absorción atómica AAS: espectrometría de absorción atómica CVAAS: espectrometría de absorción atómica con vapor frío EDL: lámpara de descarga sin electrodos ETV: vaporización electrotérmica FAAS: espectrometría de absorción atómica a la llama GFAAS: espectrometría de absorción atómica en horno de grafito HCL: lámpara de cátodo hueco HGAAS: espectrometría de absorción atómica con generación de hidruros PMT: tubo fotomultiplicador T = transmitancia
2176 (1853) Espectroscopía de Fluorescencia/ Información General
USP 39
(1853) ESPECTROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA-TEORÍA Y PRÁCTICA ASPECTOS TEÓRICOS La fluorescencia es un proceso de dos etapas que requiere la absorción de luz seguida de una emisión. [NOTA-Muchos de los términos y variables usados en este capítulo general se explican en el Apéndice: Definiciones.] La espectroscopía de fluorescencia es un método espectroscópico electrónico relacionado con la espectroscopía de absorción en el ultravioleta-visible-en el infrarrojo cercano (UV-Vis-NIR, por sus siglas en inglés). Se trata además de un método libre de fondo que involucra la luz emitida de las muestras en todas las direcciones, tal como en el caso de la espectroscopía Raman. La absorción inicial de un fotón por parte de una molécula en la muestra promueve un electrón a un estado de excitación. El electrón excitado vuelve a su estado electrónico basal mediante la emisión de un fotón. Si la emisión surge de una transición "permitida", que por lo general tiene una vida útil corta de entre 1 nanosegundo y 1O nanosegundos, entonces se denomina fluorescencia. Si la emisión surge de una transición "prohibida", que por lo general tiene una vida útil larga de entre 1 milisegundo y 1 segundo, entonces se denomina fosforescencia. En condiciones similares, la fosforescencia por lo regular es menos intensa que la fluorescencia. Este capítulo general trata sobre la espectroscopía de fluorescencia, aunque toca diversos puntos que también se aplican a la fosforescencia. Los conceptos básicos que respaldan la espectroscopía de fluorescencia han sido apropiadamente establecidos, pero sus aplicaciones y estandarización siguen en expansión y progresando, lo que la convierte en un método en desarrollo y aún no maduro.
Excitación
-- Emisión
0,8
i
~
0,6
1 0.4 e:
~
0,2
390
440
490
540
590
Longitud de onda (nm)
Figura 1. Espectros de excitación y emisión de fluorescencia para fluoresceína en solución amortiguadora de borato. El eje de la longitud de onda muestra longitudes de onda de excitación y de emisión. El tipo más común de muestra fluorescente es una solución transparente diluida que absorbe la luz siguiendo la Ley de Lambert-Beer y que emite una intensidad de fluorescencia correspondiente directamente proporcional a la concentración, la absortividad y el rendimiento cuántico de fluorescencia de las especies fluorescentes o del fluoróforo. Un espectrómetro de fluorescencia convencional tiene selectores de longitud de onda de excitación y de emisión, y recopila un espectro fijando la longitud de onda de uno de los selectores y barriendo el otro selector de longitud de onda a lo largo de un intervalo. Cuando se fija la longitud de onda de excitación y se barre la longitud de onda de emisión, el espectro resultante recibe el nombre de espectro de emisión. Por el contrario, cuando se fija la longitud de onda de emisión y se barre la longitud de onda de excitación, el espectro resultante recibe el nombre de espectro de excitación (Figura 1). El espectro de fluorescencia se grafica como la intensidad relativa o los fotones contados de fluorescencia en función de la longitud de onda. La apariencia de un espectro de fluorescencia es muy parecida a la de un espectro de absorción UV-Vis-NIR. De hecho, la forma o el contorno de un espectro de excitación es a menudo idéntico al del espectro de absorción correspondiente para un tinte orgánico en solución en el mismo intervalo de longitud de onda. Los fluoróforos poliatómicos en medios condensados (p.ej, soluciones, películas delgadas y sólidos a temperatura ambiente) existen en estados electrónicos basales o excitados en una amplia distribución de niveles de energía vibratorios y ocasionan ensanchamiento homogéneo de los espectros de excitación o emisión, respectivamente. Un microambiente o cubierta también rodea cada fluoróforo en los medios condensados, y las diferencias en las estructuras de estas cubiertas entre los fluoróforos individuales ocasionan ensanchamiento inhomogéneo. Estos dos tipos de ensanchamiento ocasionan que los espectros de fluorescencia sean más anchos que algunos otros tipos de espectros (p.ej., espectros en el infrarrojo medio o Raman). El ancho de banda típico de una banda de fluorescencia es entre 1 O nm y 100 nm. Una vez que se excita electrónicamente, un fluoróforo poliatómico experimenta una relajación vibratoria antes de emitir un fotón, lo que ocasiona un desplazamiento hacia el rojo o desplazamiento de Stokes del espectro de fluorescencia con respecto a la longitud de onda en la cual se excitó. Son pocos los compuestos biológicos naturales que emiten una fuerte fluorescencia. Sin embargo, el desarrollo de una gran variedad de colorantes indicadores fluorescentes, usados principalmente para unirse a iones o indicar el pH o la polaridad, ha llevado a un aumento en el interés de uso de las técnicas de fluorescencia tanto directas como secundarias, como es el caso de
Información General/ (1853) Espectroscopía de Fluorescencia 2177
USP 39
la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET, por sus siglas en inglés). Aunque muchas de estas sondas inherentemente no presentan rendimientos cuánticos muy altos, sus fluorescencias cambian de gran manera cuando se unen y cuando sufren el proceso químico en solución asociado. Por ejemplo, el pH de la solución de la muestra es un factor importante que se debe controlar cuando se toma en cuenta no solo su impacto sobre la fluorescencia de la sonda, sino también en la detección de otras posibles fluorescencias de las especies de colorantes fluorescentes ligantes. Algunas sondas fluorescentes, tales como fluoresceína (dependientes del pH) y rodamina y sus derivados, tienen absortividades muy altas y rendimientos cuánticos que se aproximan a uno-es decir, producen fluorescencia en casi la misma cantidad de fotones que absorben. Los métodos de fluorescencia también se denominan exentos de fondo debido a la muy poca luz de excitación que alcanza el detector. Estas ventajas dan una gran sensibilidad a la detección de fluorescencia, en algunos casos hasta proveer una detección de moléculas individuales. La especificidad y sensibilidad son dos de los puntos fuertes más importantes de los métodos de fluorescencia. Por lo regular, la espectroscopía de fluorescencia tampoco es destructiva para la muestra y las mediciones pueden realizarse rápidamente (en el orden de segundos a minutos). Por lo regular se usa un ángulo recto o una geometría de 0º/90º para medir las soluciones diluidas y otras muestras transparentes. En tales casos, el haz de excitación es normal a la muestra y la fluorescencia se detecta a un ángulo de 90º con respecto al haz (Figura 2a). Se utiliza una geometría de cara frontal para medir muestras ópticamente densas donde el haz de excitación es incidente en la muestra a <90º y se recopila la fluorescencia a un ángulo s90º (Figura 2b). La geometría de epifluorescencia es un caso especial de la geometría de cara frontal que a menudo se usa en la microscopía de fluorescencia y en los fluorómetros basados en fibra óptica. En la geometría de epifluorescencia, tanto el haz de excitación como la fluorescencia recopilada son normales a la muestra y están en el mismo lado de la misma, es decir, una geometría 0º/0º. A menudo se usa una geometría de transmisión Oº /180º en la microscopía (Figura 2c).
a)
l E M &.EM EX
b)
EX e)
EM
Figura 2. Esquema del haz de excitación (EX) y de las orientaciones de emisión (EM) detectadas para (a) transmisión en ángulo recto Oº /90º, (b) cara frontal y (c) geometrías de transmisión Oº /180º. El número de valoraciones químicas y métodos de detección que usan detección por fluorescencia continúa creciendo rápidamente y ha resultado en un crecimiento consecuente de la necesidad de estandarización de las mediciones de fluorescencia. Se han establecido de manera apropiada únicamente algunos métodos estándar y materiales de referencia que están fácilmente disponibles para la caracterización de sistemas de medición de fluorescencia. Los institutos de metrología nacional y las organizaciones de estándares internacionales están trabajando para proporcionar nuevos materiales estándar y métodos de fluorescencia en el futuro cercano. Este capítulo general discute brevemente los principales aspectos que deben tomar en cuenta los usuarios de los instrumentos de fluorescencia que buscan obtener mediciones de alta calidad. Asimismo, se describen los métodos y materiales estándar en los casos apropiados. Aunque han aparecido algunas pautas y recomendaciones, este capítulo general será de mayor utilidad para los usuarios inexpertos de espectrómetros de fluorescencia.
INSTRUMENTOS Todas las mediciones modernas de fluorescencia implican irradiar la muestra con el haz desde una fuente de luz adecuada, seleccionar la longitud de onda de excitación, recopilar la fluorescencia resultante, rechazar la luz dispersada Rayleigh, seleccionar la longitud de onda de emisión y detectar la señal de fluorescencia. Las siguientes funciones se analizarán individualmente, junto con el equipo usado para lograr estas funciones en instrumentos comerciales: 1 . fuente de luz de excitación 2. selector de longitud de onda de excitación 3. dispositivo de muestreo 4. selector de longitud de onda de emisión 5. detector
Fuente de Luz de Excitación Se usa una variedad de lámparas, láseres y diodos de emisión de luz (LED, por sus siglas en inglés) como fuentes de excitación. Las versiones continuas y pulsadas de estas fuentes se usan para instrumentos de estado estacionario y de resolución en el tiempo, respectivamente. Las lámparas de xenón son las de uso más común debido a su intensidad relativamente alta y al amplio intervalo de longitud de onda (UV a infrarrojo cercano). Los láseres son las fuentes de intensidad más alta y se usan en
2178 (1853) Espectroscopía de Fluorescencia /Información General
USP 39
aplicaciones que requieren tiempos cortos de recopilación y cantidades pequeñas de muestra, p.ej., para citometría de flujo o microarreglos.
Selector de Longitud de Onda de Excitación La intensidad de luz dispersa a la longitud de onda de excitación (es decir, dispersión de Rayleigh) puede ser comparable o mayor que la de la fluorescencia en la muestra. Por lo tanto, el perfil de longitud de onda de excitación no debe superponerse a la región de longitud de onda de emisión que se está detectando. En el caso de las lámparas, esto se logra usando un selector de longitud de onda de excitación (p.ej., un filtro o un monocromador con una longitud de onda y ancho de banda de transmisión de pico conocidas) entre la lámpara y la muestra. El ancho de banda inherente de la radiación proveniente de un láser o un LED a menudo es lo suficientemente estrecho por lo que no es necesario un selector de longitud de onda de excitación. Asimismo, este selector permite resolver espectros de excitación de fluorescencia.
Dispositivo de Muestreo El dispositivo de muestreo incluye todos los elementos ópticos y demás equipos necesarios para enfocar el haz de excitación en la muestra, recopilar la emisión de la muestra y mantener la muestra en su lugar. Los formatos de muestra incluyen cubetas, placas de micropocillos, microarreglos, portamuestras para microscopio y sistemas de flujo, y pueden estar acompañados por una variedad de sistemas ópticos de entrega y recopilación, incluyendo sistemas convencionales de transmisión, de cara frontal y de epifluorescencia, y sondas basadas en fibra óptica.
Selector de Longitud de Onda de Emisión Al igual que con el selector de excitación, el selector de longitud de onda de emisión ayuda a asegurar que la región de longitud de onda de emisión que se está detectando no se superponga con el perfil de longitud de onda de excitación. Este enfoque permite la detección de bandas de fluorescencia individuales cuando se encuentran presentes múltiples bandas y per- · mite resolver los espectros de emisión. Los selectores de longitud de onda de emisión también son importantes para el rechazo de la luz parásita. Los filtros, monocromadores y policromadores de red de dispersión a menudo se usan para la selección de longitud de onda de emisión.
Detector Para la detección de luz emitida, se coloca un tubo fotomultiplicador (PMT, por sus siglas en inglés) o un arreglo de dispositivo de acoplamiento de carga (CCD, por sus siglas en inglés) después del selector de longitud de onda de emisión. La detección del haz de excitación para monitorear su intensidad por lo regular se lleva a cabo mediante un detector de tipo contador cuántico o un fotodiodo colocado antes de la muestra y para el cual se ha separado una pequeña fracción del haz de excitación.
FACTORES QUE AFECTAN LA CUANTIFICACIÓN Factores Basados en los Instrumentos Las mediciones en un instrumento de fluorescencia requieren el ajuste de diversos parámetros del instrumento tales como las longitudes de onda, los anchos de banda y la ganancia del detector. Todos estos parámetros se pueden ajustar con diversos grados de repetibilidad y exactitud, dependiendo del instrumento usado. Estos factores pueden introducir incertidumbre o sesgo en la medición, lo cual tiene una importancia particular al comparar valores entre instrumentos. Por ejemplo, las posiciones del pico medido de las bandas de emisión de dos analitos pueden diferir entre instrumentos debido a un sesgo en la longitud de onda. Un sesgo correspondiente entre instrumentos podría introducirse en los resultados de una valoración que depende del cociente entre las intensidades de fluorescencia a las dos longitudes de onda de emisión especificadas. La intensidad del haz de excitación puede cambiar significativamente con la longitud de onda de excitación o con el paso del tiempo debido a la dependencia de la intensidad de la fuente de luz y de la transmitancia del selector de longitud de onda de excitación con la longitud de onda, o con la dependencia de la intensidad de la fuente de luz con el tiempo. Por ende, se debe monitorear la intensidad del haz de excitación y corregir la intensidad de fluorescencia medida para dichas fluctuaciones. Dicho monitoreo puede ser particularmente importante cuando se recopilan los espectros de excitación debido a que la intensidad de excitación a menudo presenta picos y valles pronunciados cuando se usan lámparas tales como la lámpara de xenón (Xe).
La capacidad de respuesta de un sistema de detección no es lineal con la intensidad en todas las intensidades, por lo que es necesario conocer el intervalo lineal de intensidad del sistema de detección usado. El intervalo lineal para la mayoría de los sistemas de detección va desde su límite de detección hasta un umbral de intensidad por encima del cual la capacidad de
USP 39
Información General/ (1853) Espectroscopía de Fluorescencia 2179
respuesta pierde linealidad con el aumento en la intensidad. Los analistas deben establecer el intervalo lineal del sistema de detección de fluorescencia antes de intentar calibrar la capacidad de respuesta del sistema de detección. La capacidad de respuesta del sistema de detección también es un resultado de la dependencia de la longitud de onda con la transmitancia del selector de longitud de onda de emisión y con la capacidad de respuesta del detector. Estos factores pueden afectar la forma de un espectro de emisión medido. La eficiencia de difracción de las redes de dispersión y la capacidad de respuesta de los detectores a menudo dependen de la polarización. Los cambios en las configuraciones de polarización de los instrumentos pueden resultar en cambios en la intensidad de la excitación observada y la capacidad de respuesta del sistema de detección. Incluso cuando no se usan polarizadores dentro del instrumento, el propio sistema óptico puede polarizar el haz de excitación y afectar la capacidad de respuesta del sistema de detección, y es dependiente del instrumento. Además, los efectos de la polarización de la emisión no sólo pueden ocasionar diferencias en la intensidad, sino que también pueden cambiar los factores de corrección espectral. El paso de múltiples longitudes de onda por una red de dispersión para difracción puede introducir picos pronunciados inesperados en un espectro de fluorescencia. Para que la luz incidente se difracte a la longitud de onda deseada, se usa una ecuación de red de difracción para ajustar el ángulo de la red de difracción con respecto a la luz incidente:
mA = d(sin a + sin
/J ), m = O,
1, 2, ...
m = orden de difracción d = espaciado entre las canaletas de la red de dispersión a = ángulo del frente de onda incidente con respecto a la normal de la red de dispersión f3 = ángulo del frente de onda difractado con respecto a la normal de la red de dispersión El valor de mA, no A, es fijo, donde m es un número entero denominado orden de difracción. Por lo tanto, la ecuación de la red de dispersión puede ser satisfecha por más de una longitud de onda para una posición individual de la red de difracción. Por ejemplo, si una red de difracción en el monocromador de emisión se ajusta para que pase una luz de 500 nm en el primer orden, también pasará una luz de 250 nm en el segundo orden. Como resultado, la luz dispersada proveniente de un haz de excitación de 250 nm será detectada como un pico a una longitud de onda de emisión de 500 nm, a menos que se inserte el filtro óptico adecuado en el haz.
Factores Basados en la Muestra La intensidad de fluorescencia de muestras ópticamente densas (p.ej., absorbancia A >0,05 a una longitud de paso de 1 cm) no incrementa linealmente con la concentración debido a la absorción significativa del haz de excitación y/o la emisión (reabsorción) por parte de la muestra. Estos efectos de filtros internos también pueden reducir en gran medida la cantidad de fluorescencia que alcanza el detector, en especial cuando se usa una geometría de transmisión en ángulo recto. La intensidad de fluorescencia puede volverse fuertemente dependiente de la posición de la muestra y de la geometría óptica. A concentraciones incluso más altas, por lo regular ocurre la agregación de fluoróforos, lo que ocasiona que la forma del espectro de fluorescencia sea diferente al de una muestra diluida, ocasionando además un comportamiento de concentración no lineal. La intensidad de fluorescencia de una muestra puede reducirse con el tiempo de exposición a la luz debido al fotoblanqueo y a la fotodegradación. Esto es particularmente cierto para la mayoría de los colorantes orgánicos, que son las sondas fluorescentes de mayor uso. Se debe limitar el tiempo de exposición de dichas muestras a la luz para obtener intensidades de fluorescencia reproducibles y, en algunos casos, incluso formas espectrales reproducibles. La intensidad de la fluorescencia de los fluoróforos depende de la temperatura. Por lo regular, las velocidades de los procesos de extinción de fluorescencia, tales como extinción por colisión en soluciones aumentan con la temperatura y ocasionan una reducción en la intensidad de la fluorescencia. Los coeficientes de temperatura para la intensidad de fluorescencia de los fluoróforos particulares se pueden usar para corregir por dicha dependencia a la temperatura. La absorbancia y, por consiguiente, la intensidad de la fluorescencia de una muestra dependen de la orientación del dipolo de transición de absorción de la muestra con respecto a la polarización de la luz de excitación. La polarización de fluorescencia es paralela a la dirección de la polarización del dipolo de transición de emisión de las especies fluorescentes. La polarización de fluorescencia es paralela a la orientación del dipolo de transición de emisión de las especies fluorescentes. La anisotropía de fluorescencia (r) se usa para describir el grado de polarización de la emisión y se define mediante:
r = (111
-
IJ_)/(111 + 21 J_)
/ 11 = intensidad de fluorescencia observada cuando el polarizador de emisión del fluorómetro se orienta en paralelo a la dirección de la excitación polarizada /J_ =intensidad de fluorescencia observada cuando el polarizador de emisión del fluorómetro se orienta de forma perpendicular a la dirección de la excitación polarizada Una muestra cuyos fluoróforos estén orientados de forma no aleatoria y que tengan un periodo rotatorio largo en comparación con la duración de su fluorescencia emitirá una fluorescencia anisotrópica. La forma espectral y la intensidad de dicha fluorescencia depende del ángulo de visión y de los factores de polarización del instrumento. A menudo, la intensidad de fluorescencia de un fluoróforo y la posición del pico -y en ocasiones incluso su forma espectraldependen del ambiente, lo que incluye cambios ocasionados por el disolvente usado, el pH de la solución o las especies a las que esté unido el fluoróforo. Por las razones anteriores, se debe procurar tener en cuenta dichos factores durante el diseño
2180 (1853) Espectroscopía de Fluorescencia / Información General
USP 39
experimental de una nueva metodología, y usar la misma matriz en las muestras de referencia y en las muestras desconocidas, según resulte apropiado. Una señal Raman puede introducir picos en el espectro de fluorescencia, siendo los picos Raman del disolvente o de la matriz de la muestra los que se encuentran con mayor regularidad. Por ejemplo, el pico Raman de agua, que se presenta un desplazamiento hacia el rojo de 3382 cm~ 1 a partir de la longitud de onda de excitación seleccionada, por lo regular se observa en el espectro de fluorescencia de cualquier solución acuosa excitada mediante luz UV o azul.
CALIBRACIÓN DE LOS INSTRUMENTOS DE FLUORESCENCIA Se utilizan dos tipos de calibración de instrumentos de fluorescencia. La primera y de uso más común es específica del analito y determina la relación entre la respuesta del instrumento (intensidad de fluorescencia) y la concentración o cantidad de un analito específico. La segunda es independiente del analito y está destinada para instrumentos espectrales. En este caso, la exactitud de la longitud de onda para emisión y excitación y la capacidad de respuesta espectral del sistema de detección se calibran para la totalidad o para una parte continua del intervalo de longitud de onda del instrumento.
Curvas de Concentración-Calibración del Analito Las curvas de calibración de la respuesta del instrumento (intensidad de fluorescencia) en función de la concentración de analito se determinan usando materiales de referencia que contienen el analito de interés. Por ejemplo, las intensidades de fluorescencia de un conjunto de soluciones a diferentes concentraciones conocidas de analito que abarcan un intervalo deseado de concentración pueden medirse y graficarse en función de la concentración. Posteriormente, la gráfica se ajusta a un polinomio, por lo regular una línea recta. La curva de calibración resultante es específica del analito y del instrumento y se puede usar para determinar las concentraciones de analito de muestras desconocidas. Este tipo de calibración puede no ser exacta cuando el microambiente que rodea al fluoróforo es diferente en las muestras de referencia y desconocidas. Además, se debe asegurar que las intensidades de fluorescencia de las muestras sean reproducibles y que no disminuyan con el paso del tiempo al excitarlas y medirlas debido a que los colorantes orgánicos que por lo general se usan pueden ser propensos al fotoblanqueo. En algunos casos, pueden no estar disponibles muestras de calibración con concentraciones conocidas y preparadas a partir de materiales de referencia apropiados. En primer lugar, los colorantes orgánicos que se usan como sondas fluorescentes a menudo no están disponibles comercialmente a una alta pureza conocida que permita la producción de soluciones de referencia. En segundo lugar, en sistemas complejos en donde los fluoróforos se unen a moléculas grandes, celdas o microperlas, puede ser difícil de determinar la concentración de fluoróforos unidos en una solución o suspensión. En este último caso, la escala de moléculas de fluoróforo soluble equivalente se ha propuesto como una alternativa de uso de las curvas de calibración para cuantificar la intensidad de la fluorescencia de un analito en particular.
Longitud de Onda de Emisión y Ancho de Ranura Espectral Se han propuesto diversos estándares de referencia para su uso en la determinación de la exactitud de la longitud de onda de emisión, incluyendo lámparas atómicas y fluoróforos orgánicos e inorgánicos. De estos, los de mayor uso y mejor caracterizados son las lámparas atómicas de baja presión, comúnmente denominadas lámparas estilo bolígrafo (pen lamps). En este caso, el tipo de lámpara estilo bolígrafo (p.ej., Hg, Xe, etc.) se selecciona de modo que sus líneas atómicas radiadas estén dentro del intervalo de longitud de onda deseado. La lámpara se coloca en la posición de la muestra de modo que la luz quede centrada en el paso óptico del sistema de detección del instrumento. La exactitud de este método puede reducirse si la lámpara estilo bolígrafo no está apropiadamente alineada. Posteriormente, el selector-detector de longitud de onda de emisión mide la señal a lo largo de un intervalo de longitud de onda de interés. Luego, las posiciones de longitud de onda medidas de los picos pronunciados resultantes se comparan con las posiciones conocidas para determinar la exactitud de la longitud de onda. La exactitud del ancho de ranura espectral del selector de longitud de onda de emisión se puede confirmar midiendo el ancho de banda espectral, que se considera como el ancho total a la mitad del máximo del pico, de una línea individual de una lámpara estilo bolígrafo. Para los espectrómetros de fluorescencia que tienen tanto monocromadores de excitación como de emisión, se puede usar un método alternativo cuando uno de los monocromadores se barre sobre la posición del otro.
Longitud de Onda de Excitación y Ancho de Ranura Espectral Muchas de las muestras de referencia que se usan para determinar la exactitud de la longitud de onda de emisión también se pueden usar para determinar la exactitud de la longitud de onda de excitación. Por ejemplo, se puede colocar una lámpara estilo bolígrafo en la posición de la fuente de luz de excitación de modo que el espectro resultante sea detectado después del selector de longitud de onda de excitación usando el detector de referencia del instrumento. Sin embargo, en este caso, una señal relativamente débil puede limitar el número de líneas atómicas útiles y, por lo tanto, la alineación de dicha lámpara es más crítica para este caso que para la determinación de la exactitud de la longitud de onda de emisión.
USP 39
Información General/ (1853) Espectroscopía de Fluorescencia 2181
Una vez que se ha determinado la exactitud del selector de longitud de onda de emisión, se emplea un dispersor difuso, p.ej., una solución de dispersión o un reflector difuso, en la muestra para dispersar una fracción del haz de excitación en el sistema de detección para determinar la exactitud de la longitud de onda de excitación. Un selector de longitud de onda se ajusta a la longitud de onda fija y el otro se ajusta sobre la misma longitud de onda para obtener un espectro. El sesgo de la longitud de onda entre los dos selectores de longitud de onda es igual a la diferencia entre la posición de longitud de onda ajustada y la posición del pico observado del espectro recopilado. Este método se puede usar a cualquier longitud de onda, a diferencia de muchos otros métodos que dependen de un número limitado de longitudes de onda de excitación establecidas y determinadas por el material de referencia seleccionado. También se pueden usar métodos similares a los usados para la exactitud del ancho de ranura espectral del selector de longitud de onda de emisión para determinar la exactitud del ancho de ranura espectral del selector de longitud de onda de excitación.
Linealidad del Sistema de Detección Se encuentran disponibles diversos enfoques para determinar el intervalo de intensidad lineal del sistema de detección, los cuales pueden separarse en tres tipos, basándose en las herramientas usadas para variar la intensidad de la luz que alcanza el detector: (1) apertura doble, (2) filtros ópticos y/o polarizadores, y (3) concentraciones de fluoróforo. El método de apertura doble es el mejor establecido y, probablemente, el más exacto cuando se realiza correctamente, aunque es también el más difícil de realizar. Se han reportado una variedad de métodos que usan filtros ópticos, polarizadores o una combinación de ambos. Estos métodos requieren componentes de alta calidad, a menudo costosos, y cierta pericia por parte del usuario. El tercer método es el más popular y el más fácil. Emplea un conjunto de soluciones obtenidas mediante la dilución en serie de una solución madre fluorescente que es similar a una usada para obtener curvas de calibración para la concentración del analito, conforme a lo descrito anteriormente. En este caso, los analistas emplean soluciones con baja concentración (A <0,05 a una longitud de paso de 1 cm), pero la absorción de fluoróforo en las paredes de la cubeta puede afectar las mediciones a concentraciones muy bajas. Los usuarios deben asegurar que las intensidades de fluorescencia de las muestras sean reproducibles y que no disminuyan durante el tiempo que están siendo excitadas y medidas, debido a que los colorantes orgánicos que por lo general se usan pueden ser propensos al fotoblanqueo.
Nivel de Señal (Emisión Relativa) La calibración de la capacidad de respuesta relativa del sistema de detección de emisión con longitud de onda de emisión, también denominada corrección espectral de la emisión, es necesaria para lograr una cuantificación exitosa al comparar los cocientes de intensidad a diferentes longitudes de onda de emisión o cuando se debe conocer la forma real o la posición máxima del pico de un espectro de emisión. Dicha calibración es necesaria debido a que la capacidad de respuesta espectral relativa de un sistema de detección puede cambiar significativamente a lo largo del intervalo de longitud de onda (Figura 3). Resulta necesario conocer el grado de precisión fotométrica requerido para una cuantificación exitosa. El intervalo lineal del sistema de detección se determina antes de realizar esta calibración de modo que se sigan los pasos apropiados (p.ej., el uso de atenuadores) para asegurar que todas las intensidades medidas durante esta calibración estén dentro del intervalo lineal. Cuando se utiliza un polarizador de emisión, la corrección espectral para la emisión depende de la configuración del polarizador. Existen dos métodos preferidos para calibrar la capacidad de respuesta fotométrica: uno (el Método A) usa luz proveniente de una fuente calibrada, y el otro (el Método B) usa materiales de referencia certificados (CRM, por sus siglas en inglés). Ambos proveen resultados que son rastreables a los institutos nacionales de metrología. Para el Método A se usa con mayor regularidad una fuente de luz blanca de tungsteno la cual abarca el intervalo de longitud de onda desde aproximadamente 350 nm hacia el infrarrojo cercano. Actualmente, se encuentran disponibles materiales de referencia estándar del Instituto Nacional de Estándares y Tecnología de EE.UU. (U.S. National lnstitute of Standards and Technology), así como materiales de referencia certificados del Instituto Federal Alemán de Investigación y Análisis de Materiales (German Federal lnstitute for Materials Research and Testing) para su uso en el Método B. Asimismo, se ha informado en la literatura acerca de espectros de emisión corregidos de algunos colorantes de uso común. El Método A es más difícil de implementar que el Método By requiere la recertificación periódica de la fuente calibrada. Un tercer método, el Método C, usa un detector calibrado y un reflector difuso calibrado. Este método por lo regular tiene incertidumbres más grandes que el Método A y el Método B pero se recomienda en las regiones de longitud de onda UV e infrarrojo cercano que no están cubiertas por ninguno de los otros dos métodos.
USP 39
2182 (1853) Espectroscopía de Fluorescencia / Información General
"' ~
0,8
1l!.,
0,6
~
:::J
c.
.,~
0,4
"' ~
0,2
"O "O
a"'
c.
o 300
-·-,------,
400
500 600 Longitud de onda (nm)
700
800
Figura 3. Ejemplo de la capacidad de respuesta espectral relativa de un sistema de detección de emisión (monocromador de red de difracción basado en fotomultiplicador) para el cual se debe aplicar una corrección a un espectro de emisión medido para obtener la forma espectral verdadera (intensidades relativas). MÉTODO A En el Método A, se dirige la luz de la fuente calibrada al interior del sistema de detección de emisión colocando la fuente calibrada en la posición de la muestra. Si la fuente calibrada es demasiado grande para colocarla en la posición de la muestra, se puede colocar un reflector difuso calibrado en la posición de la muestra para reflejar la luz proveniente de la fuente calibrada en el sistema de detección de emisión. El selector de longitud de onda de emisión se barre a lo largo de la región de emisión de interés usando la misma configuración instrumental que la usada con la muestra y se recopila la salida del canal de la señal (5'?. La radiancia conocida de la luz incidente de la fuente calibrada en el sistema de detección (L) se puede usar para calcular el factor de corrección relativo (Ces) de modo que:
Ces= L/5" Ces = factor de corrección relativo L = radiancia de la luz incidente de la fuente calibrada en el sistema de detección 5" = señal del canal de salida La intensidad de la emisión corregida es igual al producto de la señal de salida de la muestra y Ces· MÉTODO B En el Método B, se coloca el estándar de fluorescencia en la posición de la muestra. Su espectro se recopila y se compara con el espectro certificado de acuerdo con las instrucciones provistas en el certificado adjunto, el cual produce factores de corrección espectrales para el instrumento. MÉTODO C El Método C implica dos etapas: La etapa 1 emplea un detector calibrado en la posición de la muestra para medir el flujo del haz de excitación como una función de la longitud de onda de excitación. La etapa 2 emplea un detector calibrado para reflejar una fracción conocida del flujo del haz de excitación hacia el interior del sistema de detección. Esto se realiza colocando el detector calibrado en la posición de la muestra a un ángulo de 45º, asumiendo una geometría del instrumento de 0º/90º y barriendo sincronizadamente ambos selectores de longitud de onda de excitación y de emisión a lo largo de la región de emisión de interés mientras se recolecta tanto la señal de salida y la salida de la referencia. Este método permite calcular el factor de corrección relativa. Este método tiene incertidumbres más grandes que las del Método A o el Método By por lo general es más difícil de implementar.
Nivel de Señal de Referencia (Excitación Relativa) La calibración de la intensidad de excitación con la longitud de onda de excitación es necesaria para conseguir una cuantificación exitosa al comparar los cocientes de las intensidades en diferentes longitudes de onda de excitación o cuando se conoce la forma verdadera o la posición máxima del pico de un espectro de excitación. Dicha calibración es necesaria debido a que el flujo espectral relativo de un haz de excitación en la muestra puede cambiar ampliamente a lo largo de su intervalo de longitud de onda (Figura 4). La falta de atención a los factores de corrección de la intensidad de excitación puede ocasionar errores más grandes que con los factores de corrección de emisión. Afortunadamente, muchos instrumentos de fluorescencia tienen incorporado un sistema de detección de referencia para monitorear la intensidad del haz de excitación. Este monitoreo por lo
USP 39
Información General/ (1853) Espectroscopía de Fluorescencia 2183
general se realiza usando un fotodiodo, fotomultiplicador, dispositivo de acoplamiento de carga o un detector de tipo contador cuántico para medir una fracción del haz de excitación que se divide del resto del haz. La señal de referencia recolectada se puede usar para corregir la señal de fluorescencia por fluctuaciones ocasionadas por cambios en la intensidad del haz de excitación. A menudo, Jos detectores de referencia no se calibran con la longitud de onda de excitación, Jo cual introduce errores que pueden ser particularmente grandes a lo largo de intervalos de longitud de onda de excitación más largos (p.ej., >50 nm) o en una región de longitud de onda en la que la intensidad de excitación cambia rápidamente con Ja longitud de onda de excitación (p.ej., el intervalo UV). Cuando se utiliza un polarizador de excitación, la corrección espectral para Ja intensidad de excitación depende de la configuración del polarizador.
0,8
. ~
:¡;;
0,6
~
o
"5' u: 0.4
0,2
o 200
300
400
500
600
700
800
Longitud de onda (nm)
Figura 4. Ejemplo del flujo relativo de un haz de excitación (monocromador de red de dispersión con lámpara de Xe) para el cual se debe aplicar una corrección a un espectro de excitación medido para obtener su forma espectral verdadera. Cuando un instrumento no incorpora un detector de referencia, se requiere una corrección espectral para el canal de referencia o una corrección espectral independiente de la intensidad de excitación. Se pueden usar tres métodos para determinar la corrección espectral de la intensidad de excitación: un detector calibrado (Método 1); un reflector difuso calibrado (Método 2); o un contador cuántico (Método 3). Los últimos dos métodos usan el sistema de detección de fluorescencia como detector. Para los Métodos 1 y 2, el detector y el reflector difuso se calibran para Ja capacidad de respuesta y Ja reflectancia, respectivamente, como una función de la longitud de onda. Para el Método 2, Jos selectores de longitud de onda de excitación y de emisión se barren de manera sincronizada, y se debe aplicar la corrección espectral para el canal de emisión [ver Nivel de Señal (Emisión Relativa)] a las intensidades medidas. El Método 3 deberá usarse únicamente en el intervalo efectivo de longitud de onda del contador cuántico en el que se pueda lograr una respuesta independiente de la longitud de onda. El Método 1 que emplea un detector calibrado tiene menos puntos precautorios que los otros dos métodos. El detector calibrado se coloca en la posición de la muestra, y la salida se mide como una función de la longitud de onda de emisión barriendo el selector de longitud de onda de excitación a lo largo de la región de excitación de interés usando las mismas configuraciones instrumentales que las usadas con la muestra. La capacidad de respuesta conocida del detector calibrado se usa para calcular el flujo del haz de excitación. Si se usa el detector de referencia del instrumento para medir la intensidad del haz de excitación de manera simultánea con el detector calibrado, entonces también es posible calcular el factor de corrección para la capacidad de respuesta del detector de referencia.
Intensidad y Sensibilidad El valor absoluto de la señal de fluorescencia medida por el sistema de detección no sólo depende de la muestra misma, sino también de la intensidad de excitación de la muestra y de Ja geometría óptica del instrumento. Por ende, puede resultar complicado determinar la intensidad de la fluorescencia independiente del instrumento de cualquier muestra o la capacidad de respuesta absoluta de cualquier sistema de detección en términos de la intensidad de la muestra o medida por el detector, respectivamente, con respecto a la intensidad de excitación. La forma más exacta de calibrar un instrumento para la intensidad absoluta es usar métodos convencionales basados en estándares tales como aquellos que emplean una fuente de luz calibrada o un detector calibrado en combinación con un reflector calibrado. Estos métodos requieren pericia y conocimientos por parte del usuario, además de que la certificación y la recertificación (que por lo general se realizan anualmente) son costosas. Asimismo, estos estándares tienden a ser voluminosos y no son compatibles con muchos instrumentos. Por lo tanto, la mayoría de los investigadores usan estándares y métodos alternativos más simples. Un enfoque consiste en correlacionar las señales de fluorescencia con las concentraciones de analito usando curvas de calibración o unidades de moléculas de fluoróforo soluble equivalente (ver Curvas de Concentración-Calibración del Analito). Otro enfoque se basa en medir la intensidad de una muestra estándar, la cual se espera que provea siempre la misma intensidad de fluorescencia en las mismas condiciones.
2184 (1853) Espectroscopía de Fluorescencia/ Información General
USP 39
Los colorantes orgánicos tales como los usados como sondas de fluorescencia, por lo general no son opciones adecuadas para usarlos como estándares de intensidad debido a los problemas de fotoblanqueo, estabilidad y concentración reproducible. Si se usan colorantes orgánicos, entonces se recomiendan para un solo uso (es decir, se debe usar una solución preparada en el momento de su uso para cada medición) aquéllos con una alta pureza y vida útil conocidas, tales como los producidos por los institutos nacionales de metrología. Una mejor alternativa consiste en usar muestras fluorescentes que sean estables con el paso del tiempo, incluso si se exponen a la luz. Por ejemplo, se encuentran disponibles comercialmente vidrios fluorescentes inorgánicos con una fotoestabilidad y propiedades espectrales bien caracterizadas y vidas útiles prolongadas. Dichos materiales pueden usarse para determinar una escala de intensidad casi absoluta midiendo la señal fluorescente a valores fijos de longitud de onda dentro de su intervalo recomendado usando parámetros experimentales tales como anchos de banda, intensidades de excitación y temperaturas. La sensibilidad de un instrumento de fluorescencia se determina midiendo la relación señal-ruido de la señal de fluorescencia de los estándares de intensidad. La línea Raman del agua a menudo se usa para medir la sensibilidad de manera similar, aunque, por lo regular, la señal Raman presenta una intensidad que sólo es útil en la región UV. Se pueden usar soluciones de colorantes orgánicos para medir la sensibilidad del instrumento o los límites de detección, aunque con las mismas precauciones que surgen del uso de las soluciones como estándares de intensidad. Los métodos descritos en este capítulo producen una escala de intensidad casi absoluta que debe ser independiente del instrumento para instrumentos con geometrías ópticas, diseños y configuraciones similares. Los resultados de estas mediciones permiten comparar la sensibilidad de diversos instrumentos de fluorescencia, pero estas comparaciones deben tratarse con cuidado debido a que las incertidumbres relacionadas son relativamente grandes y difíciles de cuantificar.
VALIDACIÓN DEL PROCEDIMIENTO La validación de un procedimiento analítico usando fluorescencia demuestra que el resultado es válido dentro de un presupuesto de incertidumbre aceptable especificado. La calificación del instrumento, que también puede implicar la calibración del instrumento, por lo regular forma parte del proceso, y es obligatorio tener en cuenta los errores relacionados con la muestra (ver Factores Basados en la Muestra). Dichos errores pueden derivarse de la concentración, la anisotropía, la fotoestabilidad y la forma de la muestra, en conjunto con los efectos de la geometría óptica del instrumento. Todos los errores sospechados deben ser cuantificados y combinados para proveer un error estimado total que debe ser menor que el límite aceptable para el método específico.
APÉNDICE: DEFINICIONES Absortividad (a): Medida de la absorción de radiación a partir de un haz incidente a medida que atraviesa una muestra, y que es igual al cociente de:
A/be
A = absorbancia b = longitud de paso o camino óptico (cm) e= concentración (mg/ml) También es denominado coeficiente de absorción específico por la Unión Internacional de Química Pura y Aplicada (lnternational Union of Pure and Applied Chemistry). Coeficiente de absorción (a): Medición de la absorción de radiación a partir de un haz incidente a medida que atraviesa una muestra de acuerdo con la Ley de Bouguer:
I/ lo
= e-<'b
/ = intensidad transmitida = intensidad incidente e= base de logaritmo natural a = absortividad b = longitud de paso del haz a través de la muestra Se debe tomar en cuenta que la transmitancia T = 1/10 y la absorbancia A= -log T. Ley de Lambert-Beer (o Ley de Beer o Ley de Lambert-Beer-Bouguer): Ante la ausencia de cualquier otro factor físico o químico, Ai. es proporcional a la longitud de paso, b, a través de la cual pasa la radiación, y a la concentración, e, de la sustancia en solución de acuerdo con lo siguiente: /0
Ei.
= absortividad molar
e = concentración de soluto (M/L) b = longitud de paso o camino óptico (cm)
USP 39
Información General/ (1853) Espectroscopía de Fluorescencia 2185
Detector calibrado : Detector de luz cuya capacidad de respuesta en función de la longitud de onda ha sido determinada junto con las incertidumbres correspondientes. Fuente de luz calibrada : Fuente de luz cuya radiancia en función de la longitud de onda ha sido determinada junto con las incertidumbres correspondientes. Reflector difuso calibrado: Reflector lamberciano cuya reflectancia en función de la longitud de onda ha sido determinada junto con las incertidumbres correspondientes. Material de referencia certificado (CRM): Material con propiedades de interés cuyos valores e incertidumbres correspondientes han sido certificados mediante un grupo u organización de estandarización. "Material de referencia que está acompañado por documentación emitida por un organismo con autoridad, y que provee uno o más valores de propiedades especificados con incertidumbres y rastreabilidades asociadas, usando procedimientos válidos" [Vocabulario Internacional de Metrología 5.14]. Dispersor difuso: Material que dispersa la luz en múltiples direcciones. Esto incluye reflectores difusos, los cuales a menudo son lambercianos, y soluciones difusoras, las cuales no son lambercianas. Anisotropía de fluorescencia (r): Medición del grado de polarización de fluorescencia:
r = (1
11 -
I~)/(1 1 + 21 ~)
111 = intensidad de fluorescencia observada cuando el polarizador de emisión del fluorómetro se orienta en paralelo a la dirección de la excitación polarizada I~ = intensidad de fluorescencia observada cuando el polarizador de emisión del fluorómetro se orienta de forma perpendicular a la dirección de la excitación polarizada Banda de fluorescencia: Región de un espectro fluorescente en el que la intensidad pasa por un máximo, que por lo regular corresponde a una transición electrónica discreta. Vida útil de fluorescencia: 1 Parámetro que describe el decaimiento en el tiempo de la intensidad de la fluorescencia de un componente de una muestra. Si una muestra decae por cinética de primer orden, éste es el tiempo requerido para que su intensidad de fluorescencia y su correspondiente población en estado de excitación se reduzcan a 1/e de su valor inicial. Eficiencia cuántica de fluorescencia: El cociente del número de fotones de fluorescencia que abandonan un emisor en función del número de fotones absorbidos. Rendimiento cuántico de fluorescencia (
/3)
m = orden de difracción d = espaciado entre las canaletas de la red de dispersión a = ángulo del frente de onda incidente con respecto a la normal de la red de dispersión
f3 = ángulo del frente de onda difractado con respecto a la normal de la red de dispersión Efectos del filtro interno: Se trata de una reducción en eficiencia cuántica medida de una muestra ocasionada por la absorción extensa del haz de excitación o la reabsorción de la emisión por parte de la muestra misma. Esto ocasiona que la eficiencia cuántica medida dependa de la absorbancia, de la concentración y de las longitudes de paso de excitación y emisión de la muestra. Intensidad: Medición de la cantidad de energía electromagnética presente. Esta definición general es igual o directamente proporcional a la señal de salida de un fotodetector o al flujo de una muestra o fuente de luz. Una definición más específica a menudo usada en la radiometría es: el flujo radiante por unidad de ángulo sólido a partir de una fuente puntual, que por lo general se expresa en vatios por esteradiano (W/sr). [NOTA-Esteradiano corresponde a la unidad internacional del Sistema Internacional de ángulo sólido.] Reflector lamberciano: Superficie que refleja la luz de acuerdo con la ley de Lambert, es decir, la luz es despolarizada y tiene una radiancia que es isotrópica o independente del ángulo de visión. Límite de detección (LOD, por sus siglas en inglés): Es una estimación de la concentración más baja de un analito que se puede medir con un procedimiento dado, y que a menudo se considera que es la concentración del analito con una relación señal-ruido medida de 3. Nivel de ruido: Es el ruido entre picos de un blanco.
1 Boens N, Qin W, Basaric N, et al., Fluorescence lifetime standards for time and frequency domain fluorescence spectroscopy.
Anal Chem. 2007;79(5):2137-2149.
USP 39
2186 (1853) Espectroscopía de Fluorescencia / Información General
Fotoblanqueo: Es la pérdida de intensidad de emisión o absorción por parte de una muestra ocasionada por la exposición a la luz. Dicha pérdida puede ser reversible o irreversible, y ésta última a menudo se conoce como fotodegradación o fotodescom-
posición. Contador cuántico: Es un emisor fotoluminiscente con una eficiencia cuántica que es independiente de la longitud de onda de excitación en un intervalo espectral definido. La combinación de un contador cuántico con un detector para ofrecer una respuesta proporcional al número de fotones incidentes se denomina detector con contador cuántico. Escala de intensidad de fluorescencia casi absoluta: Es una escala de intensidad de fluorescencia que ha sido normalizada a la intensidad de una muestra o artefacto de referencia fluorescente en un conjunto fijo de condiciones instrumentales y experimentales. Este artefacto debe producir, de manera demostrable, una intensidad de fluorescencia que sea reproducible con el paso del tiempo y entre instrumentos en un conjunto de condiciones fijas. Dispersión Raman: Es la dispersión inelástica de radiación (las longitudes de onda de la radiación dispersada e incidente no son iguales) por parte de una muestra que ocurre debido a cambios en la capacidad de polarización de los enlaces pertinentes de una muestra durante una vibración molecular. A diferencia de la fluorescencia, no se requiere que la radiación que se está dispersando esté en resonancia con las transiciones electrónicas de la muestra. Dispersión de Rayleigh: Es la dispersión elástica de radiación por parte de una muestra; es decir, la radiación dispersada tiene la misma energía (misma longitud de onda) que la radiación incidente. Capacidad de respuesta (espectral): Es el cociente entre la salida de fotocorriente y la potencia radiante recopilada por un sistema de detección de luz. La capacidad de respuesta espectral es la capacidad de respuesta por unidad de ancho de banda espectral. Sensibilidad: Medida de la capacidad de un instrumento para detectar un analito en un conjunto de condiciones particulares. Ancho de banda espectral (o paso de banda o resolución espectral): Es una medida de la capacidad de un espectrómetro para separar radiación o resolver picos espectrales con longitudes de onda similares. Este parámetro, por lo general observado como la dispersión triangular de una línea de emisión, se considera como el ancho total a la mitad del máximo del pico. Ancho de ranura espectral: Se refiere al ancho mecánico de la ranura de salida de un espectrómetro dividido por la dispersión lineal en el plano de la ranura de salida. En la práctica, este ancho, observado como la dispersión triangular de una línea de emisión, incluye todas las longitudes de onda transmitidas para una configuración de ranura dada. Momento de transición dipolar: Es un momento de oscilación dipolar inducido en una especie molecular por una onda electromagnética que es resonante con una transición de energía de la especie, p.ej., una transición electrónica. Su dirección define la polarización de transición y su cuadrado determina la intensidad de la transición.
;
;
(1854) ESPECTROSCOPIA EN EL INFRARROJO MEDIO-TEORIA Y PRACTICA ;
PRINCIPIOS DE LA ESPECTROSCOPÍA EN EL INFRARROJO MEDIO La espectroscopía en el infrarrojo medio (mid-IR, por sus siglas en inglés) implica la medición de la absorción de radiación electromagnética a lo largo del intervalo de número de onda de 4000-400 cm- 1 (que corresponde al intervalo de longitud de onda de 2,5-25 µm) ocasionado por la promoción de moléculas desde el estado basal de sus modos vibratorios a un estado vibratorio de excitación. El parámetro de uso más común para indicar la energía de las transiciones es el número de onda, es decir, el número de ondas por centímetro. La longitud de onda, 'A (µm), y el número de onda, v (cm-1), de radiación están relacionados por la siguiente expresión:
El espectro en el infrarrojo medio se extiende desde 4000 cm- 1 (2,5 µm) hasta 400 cm- 1 (25 µm). Las moléculas pueden moverse en una cierta cantidad de modos vibratorios. La energía del modo i, viene dada por:
E;= hcv;(v; + ~)+hcv; xx;(v; + ~r
(2)
h = constante de Planck
c =velocidad de la luz
v; =frecuencia vibratoria fundamental del modo i (cm-
1)
número cuántico vibratorio de este modo X;= constante de la denominada anarmonicidad Las bandas más fuertes en el espectro en el infrarrojo medio son ocasionadas por transiciones fundamentales desde el estado basal de un modo dado (v; =O) hasta su primer estado vibratorio de excitación (v; = 1), aunque también se observan en el espectro bandas más débiles de sobretono y de combinación. Las bandas de sobretono son ocasionadas por la promoción de V;=
USP 39
Información General/ (1854) Espectroscopía en el Infrarrojo Medio 2187
moléculas desde su estado basal a sus estados vibratorios secundarios y superiores (v; = 2, 3, etc.). Los sobretonos se observan únicamente en aquellos modos en los que X; es diferente a cero. Las bandas de combinación son ocasionadas por la promoción simultánea de moléculas hacia dos estados vibratorios de excitación. Los modos vibratorios implican el movimiento de todos los átomos de la molécula. Muchos modos implican únicamente vibraciones de gran amplitud de los átomos en regiones localizadas de la molécula, y los átomos remanentes se mantienen considerablemente sin afectación. Cuando las moléculas contienen un cierto grupo funcional, las transiciones a menudo ocurren en intervalos espectrales estrechos. En este caso, los números de onda en los que ocurren dichas transiciones se conocen como frecuencias de grupos funcionales. Cuando un modo vibratorio implica movimientos atómicos de un número mayor que unos pocos átomos, las frecuencias ocurren a lo largo de intervalos espectrales más amplios y no son característicos de un grupo funcional particular, sino que son más característicos de las moléculas en conjunto. Dichas bandas se conocen como bandas de la huella dactilar o de identificación. Todas las bandas fuertes que absorben a números de onda por encima de 1500 cm-1 son frecuencias de grupos funcionales. Las bandas fuertes que absorben por debajo de 1500 cm- 1 pueden ser frecuencias de grupos funcionales o bandas de la huella dactilar. Por lo tanto, no todas las bandas fuertes en el espectro IR de una molécula dada se pueden atribuir a la presencia de un grupo funcional particular. El movimiento de los átomos durante un modo vibratorio particular, i, se caracteriza por la coordenada normal, Q;. La intensidad de las bandas fundamentales se rige por el cuadrado del cambio en el momento del dipolo, µ, durante el ciclo vibratorio (8µ/8Q;)2. Por ende, las transiciones vibratorias de los modos que implican grupos polares, tales como C-0, C=O, 0-H, N-H y C-F, por lo regular generan bandas fuertes en el espectro. Cuando (8µ/8Q;) es pequeño, las transiciones son débiles. Cuando la simetría de una molécula conlleva a la condición en la que (8µ/8Q;) = O para cierto modo, la banda correspondiente a dicho modo no aparece en el espectro IR. Las bandas de sobretono y de combinación son siempre más débiles que los modos fundamentales de las que se derivan. Para grupos funcionales que tienen la forma XY2 (tales como -CH 2, -NH 2, -N0 2 y-50 2) y XY 3 (tales como -CH 3 y -NH 3•), puede ocurrir el acoplamiento de primer orden, de manera que el modo se divide en un modo simétrico (en el que ambos átomos Y se mueven desde y hacia el átomo X con la misma fase) y un modo antisimétrico (en el que un átomo Y se desfasa 180º del otro). El grado de separación entre las dos bandas depende del ángulo Y-X-Y. Entre más cercano sea este ángulo a 180º, mayor será la separación. En consecuencia, por ejemplo, para los modos de alargamiento simétrico y antisimétrico de cetenos e isocianatos en los que el ángulo es aproximadamente 180º, la separación puede acercarse a 1000 cm-1, mientras que para los grupos CH 2 y CH 3 en los que el ángulo es aproximadamente 108º, la separación está en el orden de 100 cm- 1 • El acoplamiento de segundo orden, en ocasiones referido como resonancia Fermi, ocurre cuando una banda de sobretono o de combinación se presenta en el mismo número de onda (o en uno casi igual) que un modo fundamental de la molécula que implica el movimiento de los mismos átomos. En este caso, la banda de sobretono o de combinación toma intensidad prestada de la banda fundamental y las dos bandas presentan una separación de hasta 40 cm-1 • Entre más cerca estén las bandas que interactúan de esta manera, mayor será la separación y más cercana será la intensidad para las bandas resultantes.
PROCEDIMIENTOS DE MUESTREO Los espectros en el infrarrojo medio se pueden medir mediante transmisión, reflexión externa, reflexión interna [a menudo denominada reflectancia total atenuada], reflexión difusa y espectroscopía fotoacústica. A continuación se presenta cada uno de los principales enfoques.
Mediciones de Transmisión El disco de haluros alcalinos y los procedimientos de suspensión son los métodos de presentación de la muestra tradicionales para la transmisión en el infrarrojo medio para materiales en forma de polvo finamente dividido, como es el caso de muchos fármacos y excipientes. Durante la preparación de una muestra adecuada para espectroscopía IR, el material en polvo se dispersa uniformemente a través del haluro alcalino o del agente de suspensión, que actúa como matriz de soporte para el analito. Otros procedimientos mediante los cuales se pueden adquirir los espectros de transmisión incluyen el uso de soluciones y celdas de compresión. Los compuestos sin diluir pueden examinarse en una celda de compresión, en forma de película autoportante (para polímeros), en forma de película capilar entre las ventanas de la celda transparente para IR (para líquidos y semisólidos) y en forma de gas. El cociente entre el espectro del haz individual de la muestra y un espectro de fondo apropiado a un número de onda dado, v, se conoce como transmitancia, T-(V). Un espectro de transmitancia es la salida directa de la mayoría de los espectrofotómetros de prisma o de red de difracción. Para espectros medidos en un espectrofotómetro IR por transformada de Fourier (FT-IR, por sus siglas en inglés), los dos espectros del haz individual se miden en tiempos distintos y, posteriormente, se obtiene el cociente. Se debe medir un espectro de ruido de fondo apropiado. Para discos de haluros alcalinos y suspensiones de aceites minerales en los que el diámetro de la muestra por lo regular es mayor que el del haz enfocado, el fondo se mide con el compartimento de la muestra vacío. Si el diámetro de la muestra es menor que el del haz, el portamuestras vacío deberá ser colocado al momento de medir el espectro de fondo. De manera similar, el ruido de fondo para las mediciones realizadas con un microscopio IR debe medirse con la misma apertura que la usada para medir el espectro de la muestra. Para la medición de espectros de reflectancia total atenuada, el espectro de ruido de fondo debe ser el elemento de reflexión interna limpio.
2188 (1854) Espectroscopía en el Infrarrojo Medio / Información General
USP 39
Debido a que los espectros de transmisión de muestras no dispersadas obedecen a la Ley de Lambert-Beer (por lo general abreviada Ley de Beer), la transmitancia comúnmente se convierte en absorbancia, A (V), es decir, log 10 1/T (V). La Ley de Beer establece que la absorbancia del componente i al número de onda, A; (V), es el producto de la absortividad de i a dicho número de onda, a; (V), la longitud de paso o camino óptico de la muestra, b, y la concentración de i, C;. La absorbancia medida de una mezcla a cada número de onda es la suma de las absorbancias de cada componente de la mezcla. Algunos haluros alcalinos en polvo tales como bromuro de potasio, cloruro de potasio y yoduro de cesio se fusionan bajo alta presión y pueden formar discos autoportantes, que son transparentes a la radiación en el infrarrojo medio.
Discos de Bromuro de Potasio (KBr) El haluro alcalino que se usa más comúnmente es el bromuro de potasio seco en polvo de alta pureza, que es transparente a una radiación en el infrarrojo medio hasta aproximadamente 400 cm- 1 • A partir de este punto, los discos de haluros alcalinos serán referidos como Discos de KBr incluso si están fabricados con otros haluros alcalinos tales como cloruro de potasio y yoduro de cesio. El bromuro de potasio de grado espectroscópico para IR con un tamaño de partícula de malla 100-200 (aproximadamente 100 µm de diámetro) se puede adquirir comercialmente. Los materiales que no son de grado espectroscópico pueden contener impurezas con bandas de absorción en la región en el infrarrojo medio. Una de las impurezas más comunes es el nitrato de potasio, que tiene una banda de absorción pronunciada a aproximadamente 1378 cm- 1 • El bromuro de potasio en polvo tiene una tendencia a adsorber moléculas del aire durante un periodo prolongado, por lo que se debe almacenar de manera apropiada. Si el bromuro de potasio no es seco, su espectro presenta una banda de absorción ancha ocasionada por el agua adsorbida a aproximadamente 3400 cm- 1, junto con una banda más débil cerca de 1640 cm- 1 • Se encuentran disponibles prensas y matrices comerciales en una variedad de diámetros para la preparación de discos de haluros alcalinos y similares. El diámetro más común de los discos de KBr es 13 mm, aunque se pueden preparar minidiscos con un diámetro tan pequeño como 0,5 mm usando prensas disponibles comercialmente. Se deben seguir los procedimientos recomendados del fabricante para operar el accesorio para la fabricación de discos y la prensa. Por lo regular, la relación de peso entre la muestra y el haluro alcalino está en el orden de 1 parte de la muestra a 100-400 partes de bromuro de potasio. Un procedimiento óptimo para preparar un disco con un diámetro de 13 mm es moler previamente la muestra hasta un tamaño de partícula fino en un mortero de ágata. Asimismo, se puede usar un molino de ágata vibratorio o de bolas de acero. Posteriormente, se pesa 1-2 mg de la muestra molida y se transfiere a un mortero (o vial) limpio. Luego, se agrega una cantidad pesada de polvo de bromuro de potasio molido y seco (300 mg) y se mezcla suavemente con el analito para formar una mezcla homogénea. La forma óptima de lograr la homogeneidad es agregar aproximadamente 1O mg de bromuro de potasio molido a la muestra en un mortero y luego mezclar suavemente con la mano del mortero. Posteriormente, se agregan sucesivamente cantidades dobles de bromuro de potasio (es decir, aproximadamente 20; 40; 80 y 160 mg) mezclando después de cada adición. La acción aplicada con la mano del mortero debe inducir un buen mezclado con una molienda mínima debido a que la reducción adicional del tamaño de partícula del bromuro de potasio generará una mayor absorción de agua. (Si el mezclado se realiza en un vial, entonces se reduce el tiempo de mezclado.) Posteriormente, la mezcla de bromuro de potasio y de analito se transfiere completamente a una matriz de 13 mm, la cual se rellena y ensambla de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Cuando la matriz se conecta a una bomba de vacío rotatoria, se debe evacuar durante aproximadamente 2 minutos. Colocar la matriz (aún al vacío) en una prensa hidráulica y aplicar una presión suficiente para formar un disco que presente una transparencia uniforme. Descartar cualquier disco que presente una falta de transparencia uniforme o que exhiba una transmitancia deficiente a aproximadamente 2000 cm- 1 • Los discos con fallas, no satisfactorios o de baja calidad pueden ser una consecuencia del molido inadecuado o en exceso, de la captación de agua/humedad o de impurezas en el medio de dispersión.
Suspensiones Para preparar una suspensión, la muestra en polvo finamente dividida se debe distribuir de manera homogénea en una capa delgada de un líquido viscoso que sea semitransparente a la radiación en el infrarrojo medio y que tenga un índice de refracción casi idéntico al de la muestra. La suspensión preparada se coloca entre un par de ventanas transparentes para infrarrojo medio y se registra un espectro de transmisión de la preparación de la suspensión. La suspensión, que debe tener la consistencia de una pasta, se forma de tal manera que se minimicen los efectos dispersantes de la radiación (la dispersión de radiación proveniente de las partículas es peor cuando existe una desigualdad mayor entre el índice de refracción del dispersante y del medio que lo rodea). La muestra comprimida de la suspensión puede graparse en una celda para suspensiones. Se encuentran disponibles celdas comerciales para suspensiones para micro y para macro preparaciones. El agente de suspensión de uso más extenso para la región de infrarrojo medio es un aceite mineral de hidrocarburo saturado (parafina líquida, Nujol). Este material tiene bandas de absorción fuertes de 3000-2800 cm- 1 y de 1500-1340 cm- 1, y una banda más débil a 720 cm- 1 que puede oscurecer las bandas de absorción de la muestra en éstas regiones. En este caso, una suspensión puede requerir ser preparada en un aceite químicamente diferente. Esto se puede lograr usando un agente de suspensión de aceite perhalogenado, tal como polímeros de clorofluoro sustituidos. Combinar los espectros de la muestra preparada en los dos aceites de suspensión e ignorar las regiones en los que uno de ellos tiene bandas de absorción fuertes, permite la observación del espectro completo de absorción en el infrarrojo medio con una interferencia mínima.
USP 39
Información General/ (1854) Espectroscopía en el Infrarrojo Medio 2189
Para la preparación de una suspensión de aceite mineral, el tamaño de partícula de la muestra debe reducirse por debajo del de la longitud de onda más corta de la radiación interrogante (2,5 µm) para minimizar los efectos de dispersión de luz que reducen el contraste espectral y ocasionan distorsiones en las bandas. El espectro de un polvo grueso o de uno que esté molido de manera deficiente presentará un alto grado de dispersión que se manifiesta como una línea base inclinada que disminuye hacia longitudes de onda más cortas (números de onda más altos). Asimismo, un polvo más grueso incrementará el efecto Christiansen, que es ocasionado por la reflexión proveniente de la interfaz entre materiales con índices de refracción distintos. El índice de refracción de materiales con bandas de absorción fuertes varía de una manera que es similar a la de la primera derivada del perfil de la banda de absorción-fenómeno al cual se le denomina dispersión anómala. El efecto Christiansen se manifiesta como un aumento de transmisión en el lado de la longitud de onda corta (número de onda alto) de una banda de absorción con una reducción concomitante en el lado de la longitud de onda más larga. Además, un polvo grueso dispersado de manera deficiente puede generar un espectro en el infrarrojo medio severamente distorsionado en el que se mejora la intensidad relativa de las bandas más débiles, mientras que la intensidad de las bandas más intensas en el espectro parece más débil y distorsionada. Estos efectos son una consecuencia de la radiación que ha alcanzado al detector pero que no ha sido transmitida a través de una muestra representativa del analito. Se pueden observar efectos similares en los espectros de discos de KBr con una preparación deficiente. Durante la preparación de suspensiones y discos de KBr, se aplica alguna acción al analito, tal como molienda, mezclado o presionado, por lo que existe la probabilidad de inducir transformaciones a la forma en estado sólido. Aunque los molinos mecánicos de laboratorio pueden producir polvos con un tamaño de partícula pequeño, moler a mano usando un mortero y la mano del mortero por lo general ofrece un mejor control y un procesamiento menos agresivo para materiales farmacéuticos orgánicos. Los profesionales por lo general aceptan que de los dos procedimientos, el procedimiento de suspensión es menos agresivo y menos propenso a inducir cambios de forma en el estado sólido tales como cambios en la cristalinidad (polimorfismo) o cambios en el estado de hidratación o solvatación (pseudopolimorfismo). No obstante, el procedimiento con discos de KBr tiene ventajas sobre el método en suspensión debido a que el bromuro de potasio no presenta bandas de absorción por encima de 400 cm-1 (sin tomar en cuenta el agua ni las impurezas adsorbidas) y está mejor adaptado a preparaciones de micro muestras. Cuando la muestra es una sal, como ocurre frecuentemente en el caso de los ingredientes activos farmacéuticos (API, por sus siglas en inglés), se puede presentar intercambio iónico entre el analito y el haluro alcalino, por lo que la muestra se prepara de mejor manera en forma de suspensión.
Celdas de Compresión El uso de una celda de compresión se ha vuelto un procedimiento de muestreo popular para registrar el espectro de transmisión en el infrarrojo medio de una muestra sólida pequeña o en cantidad limitada tal como una sola partícula de un ingrediente activo farmacéutico o excipiente, un contaminante tal como una fibra de longitud corta o un fragmento pequeño de un material de envasado. Este es particularmente el caso de las investigaciones que usan un sistema de microscopio IR. Los diamantes tipo lla son bastante transparentes a lo largo de una gran parte de la región en el infrarrojo medio, aunque presentan una absorción bastante fuerte entre aproximadamente 2000 y 2400 cm- 1• Debido a la alta resistencia del diamante, se utiliza comúnmente como material para las ventanas de las celdas de compresión. La muestra se coloca entre las ventanas de diamante de la celda, la cual posteriormente se aprieta y el espesor de la muestra se reduce a una medida óptima para la medición de la transmisión. De este modo, se puede examinar la muestra comprimida mientras está contenida dentro de la celda de compresión.
Películas de Polímero Autoportantes El espectro de transmisión en el infrarrojo medio de muchos polímeros usados como materiales de envasado se puede registrar a partir de muestras preparadas en forma de películas delgadas autoportantes. Las películas con un espesor apropiado pueden prepararse, por ejemplo, moldeando una muestra por compresión caliente o por microtomía de una sección delgada de una muestra. Los sólidos blandos y los sólidos con temperatura de fusión baja que no se cristalizan al enfriarse se pueden preparar como una capa delgada colocada entre dos ventanas transparentes para infrarrojo medio, entibiando suavemente la muestra o a partir del material fundido. Las películas delgadas de algunos materiales se pueden moldear vertiendo solución en una ventana transparente para IR.
Películas Capilares Los líquidos no volátiles pueden examinarse sin diluir en forma de una capa delgada colocada entre dos ventanas iguales que sean transparentes a la radiación IR. La capa de líquido debe estar exenta de burbujas y debe cubrir completamente el diámetro del haz del infrarrojo que se enfoca sobre la muestra.
2190 (1854) Espectroscopía en el Infrarrojo Medio/ Información General
USP 39
Líquidos y Soluciones en Celdas de Transmisión Para examinar muestras líquidas y en solución, se encuentran disponibles comercialmente montajes de celdas de transmisión en configuraciones para micro y macromuestras que constan de un par de ventanas construidas con materiales transparentes en el infrarrojo medio, tales como espaciadores de bromuro de potasio, puertos de llenado, y un soporte. Además, pueden estar selladas, ser semipermanentes o de flujo. Se encuentra disponible una amplia variedad de espaciadores con espesor estándar y de materiales de ventana. Para aplicaciones de laboratorio, los espaciadores a menudo se forman a partir de plomo, poli(tetrafluoroetileno) o poli(etilentereftalato), y se pueden proveer, dependiendo de los materiales del espaciador, con longitudes de paso de espesor estándar que van de aproximadamente 6 µm hasta 1 mm o mayores. Usualmente se debe determinar de manera empírica la longitud de paso óptima requerida para examinar un líquido o solución particular que dependerá de sus características de absorción y de si la aplicación es cualitativa o cuantitativa. En algunos casos para el trabajo cualitativo, las celdas de transmisión se pueden reemplazar con medios porosos desechables tales como polietileno o poli(tetrafluoroetileno) montados en un soporte adecuado.
Gases Las celdas de transmisión en el infrarrojo medio para el muestreo de gas y vapor estático o en flujo están disponibles en una amplia variedad de materiales para ajustarse a la aplicación, de escalas de laboratorio hasta escalas de proceso. En el laboratorio, la celda tradicional para gas ha sido un cilindro de 1O cm de largo de vidrio de borosilicato o acero inoxidable con una apertura a cada extremo de aproximadamente 40 mm. Cada extremo abierto está cubierto con un cabezal de cierre (end-cap) que contiene un par de ventanas transparentes para infrarrojo medio hechas de, por ejemplo, bromuro de potasio, seleniuro de cinc o fluoruro de calcio. El armazón de la celda se ajusta con los puertos apropiados de entrada y salida. Gases diferentes pueden presentar diferentes requisitos de sellado que se deben tomar en cuenta. Para la detección de gases al nivel de ppm, se usan celdas de camino óptico largo hechas de vidrio de borosilicato o metal. Estas celdas pueden tener una longitud de paso fija de hasta aproximadamente 2 m o longitudes de paso variables de 10-200 m. Las celdas de gas pueden encamisarse y operarse a temperaturas de 250º o mayores, y sus intervalos de presión pueden ir desde el vacío hasta más de 50 atmósferas. Las diferencias pequeñas en la temperatura y la presión tienen efectos significativos en el espectro, por lo que se debe tener cuidado de asegurar que la calibración y el análisis se realicen en condiciones similares de modo que la calibración siga siendo válida.
Espectroscopía de Reflectancia Total Atenuada La espectroscopía de reflectancia total atenuada, igualmente conocida como espectroscopía de reflexión interna o espectroscopía de onda evanescente, se ha convertido en un procedimiento ampliamente usado. Esto es en gran parte consecuencia de una nueva generación de accesorios de reflexión individual fáciles de usar. La espectroscopía de reflectancia total atenuada se basa en la propiedad óptica en la que la radiación que pasa a través de un medio con un índice de refracción alto, n2 [el medio ópticamente denso, también conocido como elemento de reflexión interna (IRE, por sus siglas en inglés)], a un ángulo de incidencia mayor que el ángulo crítico, se reflejará por completo internamente en un borde que está en contacto con un material con un índice de refracción menor, la muestra, n 1 (el medio ópticamente delgado). El ángulo crítico, ()0 viene dado por n 1/n 2 • El campo eléctrico de la radiación penetra a una corta distancia en el medio ópticamente delgado. La intensidad de este campo eléctrico, que se conoce como la onda evanescente, se confina dentro de las inmediaciones de la superficie del medio más denso. Su intensidad se reduce exponencialmente con la distancia, normal a la superficie, hacia el interior del medio ópticamente delgado. Por lo tanto, se puede visualizar como penetrando la capa de la superficie del medio más delgado. La profundidad de la penetración, dP' es un término comparativo conveniente para diversos arreglos experimentales. Se refiere a la distancia desde la superficie del elemento de reflexión interna en el que la amplitud del campo eléctrico cae a 37% (1 /e) de su valor en la superficie: d
' 21m,J (sin 0-n i) 2
(3)
1
A.0 = longitud de onda de la radiación al vacío (} = ángulo en el que el haz impacta la superficie interna del elemento de reflexión interna n 12 = n2/n 1 Se debe tomar en cuenta que, para lograr la reflexión interna total, (}debe ser mayor que (}0 de modo que n2 es por lo general mayor que 2,3. Algunos de los materiales para el elemento de reflexión interna de uso más común son los siguientes: seleniuro de cinc (n 2 - 2,4), diamante Tipo lla (n 2 - 2,4), silicio (n 2 - 3,4) y germanio (n 2 - 4,0). Asimismo, dP se reduce con el aumento del ángulo de incidencia y se incrementa con el aumento en la longitud de onda (reducción del número de onda). Como consecuencia del aumento de dP por el aumento de la longitud de onda, las intensidades de la banda dentro de un espectro de reflectancia total atenuada-al compararlas con un espectro de transmisión convencional-parecen presentar un aumento creciente con la reducción del número de onda.
USP 39
Información General/ (1854) Espectroscopía en el Infrarrojo Medio 2191
Asimismo, el índice de refracción de todas las moléculas no es constante y varía a lo largo de las bandas de absorción (dispersión anómala). Para bandas de absorción fuertes, n 1 puede variar entre aproximadamente 1 y 2. Este efecto ocasiona una desviación en el número de onda medido de una banda con respecto a los espectros de transmisión. En particular, cuando el equipo opera a ángulos altos de incidencia o con un elemento de reflexión interna con un índice de refracción bajo tal como seleniuro de cinc o diamante, las bandas fuertes también pueden estar acompañadas por la aparición de una forma subyacente con la forma de la primera derivada (ver las secciones anteriores para información sobre el efecto Christiansen en los discos de KBr). Se usan muchas formas geométricas y tamaños distintos para los elementos de reflexión interna. Comúnmente, se incorpora un elemento de reflexión interna trapezoidal en las denol')'linadas unidades de reflectancia total atenuada horizontal (H-ATR, por sus siglas en inglés). Los elementos de reflexión interna hemisféricos son el centro de algunos accesorios de reflectancia total atenuada para micromuestreo. Los elementos de reflexión interna en varilla o en forma similar a varillas de reflexión múltiple a menudo se usan para el monitoreo en línea de procesos líquidos. Los elementos de reflexión interna múltiple permiten que la radiación reflejada internamente en el elemento de reflexión interna interactúe varias o muchas veces con la capa de la superficie de la muestra con la que está en contacto, incrementando así la intensidad (longitud de paso efectiva) del espectro de la muestra registrado. No obstante, el espectro registrado es característico únicamente de la profundidad muestreada por una reflexión individual. El número de reflexiones internas depende de la longitud y el espesor del elemento de reflexión interna. Los elementos de reflexión interna múltiple pueden tener varios centímetros de longitud. Una configuración típica para un elemento de reflexión interna montado verticalmente a un ángulo de 45º de incidencia puede permitir 25 reflexiones internas. Hoy en día, los sistemas de reflexión interna múltiple de uso más común en el laboratorio farmacéutico son aquéllos en los que el elemento de reflexión interna se monta horizontalmente. A estos se les denomina comúnmente como accesorios de reflectancia total atenuada horizontal (accesorios H-ATR). Los sistemas de reflexión interna múltiple basados en varillas cilíndricas con extremos en forma de cono o en formas geometrías similares a menudo se incorporan como dispositivos de muestreo líquido en celdas de flujo para soluciones o se usan para el monitoreo en línea del proceso. Los elementos de reflexión interna múltiple con forma trapezoidal incorporados en los accesorios H-ATR permiten o facilitan el estudio de una amplia variedad de formas de muestras, incluyendo líquidos, soluciones, dispersiones, cremas, pastas, ceras, semisólidos y blandos, sólidos de superficie plana continua, soluciones, películas moldeadas a partir de soluciones, entre muchos otros. Los micro y macroaccesorios H-ATR están disponibles comercialmente con 1; 3; 9 o más reflexiones de interacción con las muestras. Los elementos de reflexión interna de prisma individual y reflexión individual, y de diseño novedoso también se usan en unidades comerciales H-ATR. Estos proveen medios efectivos y convenientes para analizar y estudiar muestras en un rango variado de formas físicas. En particular, dentro de la industria farmacéutica, los accesorios H-ATR con área de contacto pequeña, reflexión individual y ángulo fijo de incidencia y que no requieren preparación de muestra se han convertido en dispositivos populares de muestreo debido a que proveen medios listos para registrar de manera simple y rápida un espectro en el infrarrojo medio a partir de una cantidad limitada de casi cualquier material en fase condensada. Los elementos de reflexión interna hemisféricos actúan como lentes de enfoque de modo que el área muestreada es por lo general más pequeña que la muestreada con los elementos de reflexión interna prismáticos. Aunque los elementos de reflexión interna pueden ser opacos a la luz visible, muchos accesorios citados anteriormente permiten cierta capacidad de observación de modo que se pueda inspeccionar la muestra en análisis. Las unidades de microreflectancia total atenuada de una sola reflexión tienen la ventaja de prácticamente no requerir que una muestra sólida tenga una superficie uniformemente plana. La muestra de prueba se coloca en contacto con el área de muestreo del elemento de reflexión interna y, si se trata de un sólido, se usa una abrazadera para compactar y asegurar la muestra contra el elemento de reflexión interna. Los elementos de reflectancia total atenuada hemisféricos de seleniuro de cinc, germanio y silicio también forman los elementos sensores para los objetivos de reflectancia total atenuada que se pueden incorporar a los microscopios para infrarrojo medio y FT-IR. Diversos accesorios son capaces de operar a temperaturas elevadas controladas que permiten, por ejemplo, realizar estudios con respecto a las transformaciones de forma en estado sólido inducidas térmicamente. La firmeza, la resistencia a los rasguños, la inercia química y la transparencia en el infrarrojo medio a lo largo de un intervalo amplio de número de onda hacen del diamante Tipo lla un material único para las mediciones de reflectancia total atenuada. Aunque tiene una amplia absorción característica entre aproximadamente 2400 y 2000 cm- 1, para la mayoría de las aplicaciones farmacéuticas, esto no es un impedimento debido a que está en la región en la que sólo ocurren bandas de estiramiento característico para enlaces triples y dobles acumulados. Debido a su costo, el uso de diamante Tipo lla como material para elemento de reflexión interna por lo general se limita a accesorios de microreflectancia total atenuada o cuando el elemento de reflexión interna se usa como el elemento sensor en una sonda de inmersión de reflectancia total atenuada para el monitoreo de un proceso. El diamante tiene un índice de refracción que corresponde cercanamente al del seleniuro de cinc, por lo que se pueden construir elementos de reflexión interna compuestos. Los elementos ópticos de menor costo para enfoque o soporte fabricados con seleniuro de cinc se pueden unir ópticamente mediante interfaz a un elemento sensor con reflectancia total atenuada de diamante Tipo lla, con lo que se minimiza el costo general del elemento de reflexión interna al mismo tiempo que se siguen obteniendo beneficios de las propiedades del diamante. Basándose en esta tecnología, se han diseñado configuraciones de 3 y 9 reflexiones internas múltiples para sistemas de laboratorio y sondas de procesamiento.
2192 (1854) Espectroscopía en el Infrarrojo Medio/ Información General
USP 39
Espectroscopía de Reflexión Externa Se pueden medir varios tipos de espectros IR de reflexión externa. Entre estos se encuentra la espectroscopía de reflexión de Fresnel, transflexión, espectroscopía de reflexión-absorción y la espectroscopía fotoacústica, aunque salvo por la reflexión difusa, no son de uso amplio en las aplicaciones farmacéuticas.
Reflexión Difusa Los espectros registrados a partir de polvos o muestras granulares considerablemente finas se conocen como espectros de reflexión difusa. La mayor parte del espectro se origina de la radiación que ha penetrado a través de la superficie de la muestra y que ha sido transmitida a través de múltiples partículas. Una fracción relativamente pequeña del espectro de reflexión difusa se origina a partir de la radiación que ha sido reflejada desde la superficie frontal de las muestras y, por lo tanto, tiene la forma de un espectro de reflexión de Fresnel. Debido a que las formas de bandas en los espectros de reflexión de Fresnel en el infrarrojo medio son asimétricas, la fracción de la reflexión de Fresnel que contribuye a un espectro de reflexión difusa debe reducirse para que sea lo más pequeña posible. Aunque existen diversas formas de lograr lo anterior, la forma más importante y de uso común es diluir la muestra mezclándola con diluyentes no absorbentes al 900/o-99% tales como bromuro de potasio o cloruro de potasio reducidos a polvo fino. Diluir la muestra tiene el beneficio adicional de reducir las intensidades de la banda de absorción a un nivel apropiado. Los espectros de reflexión difusa en su mayoría resultan de fotones que han sido transmitidos a través de decenas a centenas de partículas y, por lo tanto, tienen una apariencia similar a la de los espectros de transmisión. Sin embargo, los espectros de reflexión difusa no obedecen la Ley de Beer. En vez de eso, el espectro de reflexión difusa medido a profundidad infinita, R00 (es decir, las intensidades de banda no cambian si se aumenta el espesor de la muestra), se convierte mediante la función Kubelka-Munk:
f(R ) = (1-Roo)2 00
2Roo
(4)
La función f(R00) es igual al cociente entre el coeficiente de absorción y el coeficiente de dispersión de la muestra. La reflexión difusa por lo general se calcula tomando el cociente entre el espectro de haz individual de la muestra diluida y el espectro de haz individual del diluyente puro. Idealmente, la muestra se muele hasta un punto en el que el diámetro promedio de partícula es <5 µm. La mezcla muestra-diluyente es lo suficientemente espesa para que ningún aumento en su espesor genere un cambio en el espectro. Se dice que las muestras medidas de esta manera se miden a profundidad infinita, y la reflectancia se da mediante el símbolo, R00 • Para espectrometría de reflexión difusa en el infrarrojo medio, por lo regular se obedece el criterio de profundidad infinita cuando el espesor es al menos 100 µm, pero desde un enfoque conservador, la profundidad de la mayoría de las cubetas de muestreo para espectrometría de reflexión difusa en el infrarrojo medio es de al menos 1 mm. Una forma común de preparar muestras para espectrometría de reflexión difusa es sobrellenar la cubeta y nivelar la muestra con una espátula o cuchilla. No obstante, esta forma de preparar la muestra puede llevar a una diferencia entre el coeficiente de dispersión cerca de la superficie y en el volumen de la muestra. Debido a que la intensidad de los espectros de reflexión difusa depende del coeficiente de dispersión, un mejor procedimiento de preparación de la muestra consiste en sobrellenar ligeramente la cubeta y golpetear la base de ésta última sobre una mesa de trabajo hasta que la superficie superior esté a nivel con el borde de la cubeta. Se usan diversos tipos de accesorios para la medición de espectros de reflexión difusa. Los accesorios de reflexión difusa en eje o de campo brillante son similares a los accesorios de reflexión especular de gran eficiencia, los cuales son los dispositivos más eficientes para la medición de espectros de reflexión difusa pero por lo general proveen el menor rechazo a la reflexión de Fresnel. Los accesorios de reflexión difusa fuera del eje o de campo oscuro son menos eficientes que los dispositivos en eje, pero rechazan la reflexión especular de manera más eficiente. Los concentradores parabólicos compuestos también han sido adaptados para la medición de reflexión difusa y parecen tener un lugar intermedio con respecto a la eficiencia y el rechazo a la reflexión de Fresnel entre los accesorios en eje y fuera de eje. Finalmente, se han usado esferas de integración para la espectrometría de reflexión difusa. Estos dispositivos son los más exactos desde el punto de vista fotométrico pero son los menos eficientes.
MICROSPECTROSCOPÍA Y FORMACIÓN DE IMÁGENES Microscopía de Transmisión En todos los microscopios, el área de una muestra en estudio se define mediante una o más aperturas remotas de enmascaramiento montadas en el conjugado de planos enfocados de la imagen con el plano de enfoque de la muestra. Si la muestra se monta en una platina x-y controlada por computadora, entonces se pueden enmascarar de manera secuencial las regiones aledañas o especificadas. Estos espectros de un solo punto se pueden usar para generar mapas de contorno de absorbancia-
USP 39
Información General/ (1854) Espectroscopía en el Infrarrojo Medio 2193
intensidad o imágenes de falso color que resalten las diferencias o faltas de homogeneidad a lo largo del área cartografiada. Dichos mapas también pueden generarse moviendo la muestra manualmente, aunque dicho procedimiento puede consumir mucho tiempo. La dimensión lineal de la muestra más pequeña que se puede estudiar mediante microscopía FT-IR en el infrarrojo medio es aproximadamente igual a la longitud de onda, es decir, aproximadamente 1O µm. En la práctica, por lo general es posible registrar un espectro de un solo punto con una relación señal-ruido aceptable (SNR, por sus siglas en inglés) y una resolución espectral dentro de una escala de tiempo razonable a partir de un área de muestra enmascarada con un diámetro de 1O µm en aproximadamente 1 minuto. Para el mapeo de un área de muestra relativamente grande, en la que se requieren cientos o incluso miles de espectros, un procedimiento mucho más eficiente con respecto al tiempo consiste en usar un microscopio FT-IR equipado con un detector de arreglos. Los estudios de temperatura variable con observaciones por termomicroscopía y los estudios de temperatura variable en un microscopio FT-IR pueden ser particularmente útiles para el estudio de formas de estado sólido y transiciones inducidas térmicamente in situ. Al igual que en el muestreo macroscópico, las micromuestras presentadas para las mediciones mediante microscopía FT-IR deben ser planas. Para un espectro completo de identificación en el infrarrojo medio, las muestras deben tener un espesor apropiado que, en el caso de muchos ingredientes farmacéuticos activos, puede requerir una muestra de aproximadamente 1O µm de espesor o menor. Las celdas de compresión son particularmente útiles para hacer más delgadas las muestras. Una muestra fina puede examinarse bajo compresión o (menos preferible) retirando la ventana superior de la celda y montando la muestra delgada en la ventana inferior para su análisis. Una buena forma práctica de proveer una muestra apropiada a partir de la cual se pueda registrar un espectro de fondo de haz individual consiste en montar una partícula pequeña de bromuro de potasio a un costado de la muestra y hacer ambas más delgadas mediante compresión en las mismas condiciones. Posteriormente, se pueden medir los espectros de haz individual de la muestra y de los materiales de referencia en las mismas condiciones simplemente moviendo la celda de compresión que usa la platina x-y del microscopio. Muchos sólidos continuos tales como los polímeros usados en el envasado o las fibras encontradas como contaminantes pueden prepararse de modo que tengan un espesor apropiado y examinarse en una celda de compresión mediante microscopía FT-IR. En ocasiones, laminar con una herramienta específicamente diseñada para este propósito también puede reducir el espesor de las muestras blandas. Se pueden cortar en secciones las muestras laminadas usando un micrótomo y pueden examinarse de manera independiente o colocadas en una ventana transparente para IR. Por lo regular se usa un micrótomo para obtener una sección transversal de una película laminada de polímero multicapa de modo que la estructura de sus capas pueda ser analizada mediante microscopía FT-IR.
Microscopía de Reflexión Todos los tipos principales de espectroscopía de reflexión tratados anteriormente pueden implementarse en microscopios. La mayoría de los microscopios tienen configuraciones ópticas que les permiten cambiar de mediciones de transmisión a mediciones de reflexión con un simple cambio de espejo desprendible por parte del operador. El ángulo de incidencia para estas mediciones es por lo regular entre 30º y 45º de modo que se pueden realizar fácilmente las mediciones de reflexión de Fresnel y de transflexión. Por el contrario, se requieren objetivos especiales para microscopio para la espectrometría de reflectancia total atenuada o de reflexión-absorción. Para la microespectroscopía de reflectancia total atenuada, la muestra que se está investigando se monta en la platina del microscopio y el objetivo para reflectancia total atenuada se baja hasta que el elemento de reflexión interna esté en contacto óptico con la superficie superior de la muestra. Una presión de contacto reproducible puede lograrse usando un manómetro. Una desventaja de usar un elemento de reflexión interna de germanio es que, a diferencia del seleniuro de cinc, no transmite luz visible, lo que impide la inspección visual in situ de la muestra. También es posible el mapeo de reflectancia total atenuada usando una platina de mapeo controlada por computadora de una manera análoga a la del mapeo de transmisión, pero esto por lo general se limita a materiales blandos.
Formación de Imágenes Hiperespectrales El término formación de imágenes hiperespectrales se usa para describir el proceso mediante el cual se usa un detector de arreglo plano focal (FPA, por sus siglas en inglés) para registrar de manera simultánea un arreglo de espectros a partir de una muestra estacionaria. Cada pixel del arreglo registra un espectro de una región diferente de la muestra. Este enfoque es un proceso mucho más eficiente con respecto al tiempo que el mapeo de un solo punto cuando se miden muchos espectros a partir de un área grande de muestra. Los tamaños de arreglos típicos para las aplicaciones de infrarrojo medio son 256 x 256; 128 x 128 y 64 x 64. Los elementos individuales (pixeles) del detector de teluro de mercurio-cadmio (MCT, por sus siglas en inglés) de la mayoría de los arreglos planos focales miden 6,25 µm x 6,25 µm. Los detectores que se incorporan en los arreglos planos focales son detectores fotovoltaicos (PV, por sus siglas en inglés), a diferencia de los detectores de teluro de mercuriocadmio fotoconductores (PC, por sus siglas en inglés) de un solo elemento que se usan para muchas mediciones de FT-IR (ver a continuación). Mientras que los detectores de teluro de mercurio-cadmio fotoconductores operan al menos hasta 750 cm- 1, los detectores fotovoltaicos que se instalan en los arreglos planos focales pór lo general tienen un corte de número de onda más bajo en la región de aproximadamente 900 cm-1. Los avances en los aparatos electrónicos digitales y el diseño del arreglo plano focal permiten usar detectores de teluro de mercurio-cadmio con arreglos planos focales de 64 x 64 con un espectrofotómetro FT-IR que opera en el modo convencional de barrido continuo. Los arreglos tridimensionales de conjuntos de datos,
2194 (1854) Espectroscopía en el Infrarrojo Medio/ Información General
USP 39
dos espaciales y uno espectral, registrados mediante este tipo de medición de formación de imágenes, se conocen como hipercubos o cubos de datos. Un método alternativo a la formación de imágenes hiperespectrales que se encuentra ahora disponible comercialmente es un enfoque híbrido en el cual se usa un arreglo lineal de detectores PC MCT pequeños en combinación con una platina de mapeo controlada por computadora. Las regiones adyacentes se vuelven a posicionar rápidamente bajo el detector de arreglos hasta que se haya cubierto toda la región espacial de interés. La imagen de campo completo se construye como un mosaico de las imágenes de áreas individuales registradas. En un sistema, el cual incorpora un arreglo lineal de 16 detectores, el corte de número de onda más bajo es de aproximadamente 700 cm- 1 •
INSTRUMENTAL La mayoría de los espectros en el infrarrojo medio se miden con un espectrofotómetro FT-IR. Estos instrumentos por lo general incorporan una fuente de carburo de silicio incandescente (tipo Globar®). La radiación emitida por la fuente es colimada y pasada al interior de un interferómetro de dos haces de barrido continuo. La velocidad de cambio de la diferencia de paso óptico en el interferómetro (que por lo general se denomina velocidad óptica) está regularmente en el orden de 0,2-5,0 cm· s-1 • El valor real depende del detector y del convertidor análogo a digital. Posteriormente, el haz que emerge del interferómetro se enfoca en el centro del compartimento de la muestra del espectrofotómetro mediante un espejo paraboloidal fuera del eje. Después de ser transmitido o reflejado a través de la muestra, el haz se enfoca en el detector. Esta señal se denomina interferograma. El interferograma es un registro de la variación del componente AC de energía incidente en el detector como una función de la diferencia de paso óptico (retardo) del interferómetro. La transformada de Fourier del interferograma es el espectro de haz individual. La medición por lo regular implica pasar un rayo láser a través del centro del interferómetro, midiendo el interferograma sinusoidal resultante con un detector de radiación visible al mismo tiempo que se mide el interferograma en el detector IR. El láser que comúnmente se usa para este propósito es un láser de helio-neón (HeNe) con una longitud de onda de 632,8 nm (15 802 cm- 1). Este interferograma láser permite determinar la posición exacta del elemento óptico móvil en el interferómetro. Los espectrofotómetros FT-IR equipados con un convertidor análogo a digital externamente activado, la señal IR se digitaliza en cada longitud de onda del interferograma láser, por lo regular en los cruces por cero. Si el interferograma IR se muestrea una vez por longitud de onda de un láser de HeNe, el intervalo espectral se restringe a 0-7901 cm-1, es decir, la mitad del número de onda del láser. En algunos espectrofotómetros FT-IR contemporáneos, se usa un convertidor análogo a digital sigma-delta. Estos convertidores muestrean el interferograma a intervalos de tiempo constantes en lugar de intervalos constantes de diferencia de paso óptico, pero tienen un mayor intervalo dinámico que los convertidores análogo a digital activados externamente. En el último caso, el software del instrumento calcula cuál habría sido el valor del interferograma en los cruces por cero del láser. Al obtener el espectro de una muestra, se miden el espectro del haz individual de la muestra y de una referencia apropiada, y se calcula el cociente entre estos dos espectros de haz individual. Si se obtiene el espectro en el modo de transmisión, el cociente se conoce como el espectro de transmitancia, T(V). Para muchas mediciones, el logaritmo negativo de T(V) se calcula para proveer la absorbancia, A(V). Si la muestra se interroga en el modo de reflexión, el cociente es el espectro de reflectancia, R(V). Para la reflectancia total atenuada, las mediciones de transflexión y de reflexión-absorción, R(V), por lo general se convierten en absorbancia de la misma manera que para la espectroscopía de transmisión. La conversión a A(V) es esencial para mediciones cuantitativas. Para las mediciones de reflexión de Fresnel, R(V) a menudo se somete a una transformación de KramersKronig para generar los espectros de índice de absorción, k(V) y los espectros de índice de refracción, n(V). Para las mediciones de reflexión difusa en el infrarrojo medio, R(V) por lo general se convierten mediante la función Kubelka-Munk (ver la Ecuación 4). El detector estándar usado en los espectrofotómetros FT-IR es un bolómetro piroeléctrico a temperatura ambiente, siendo el más común el sulfato de triglicina deuterado o el sulfato de triglicina deuterado dopado con L-alanina. Estos detectores responden a la radiación IR de todas las longitudes de onda y su corte de número de onda se determina por la ventana detrás de la cual están montados. La selección de la ventana por lo regular se hace de manera que ésta corresponda con el material en el que se deposita el divisor de haz, y a menudo es bromuro de potasio, de modo que el intervalo se restringe a 400 cm- 1. Cuando la sensibilidad de los bolómetros piroeléctricos sea inadecuada, p.ej., para mediciones realizadas a través de un microscopio o con una interfaz de cromatografía de gases, se usa el detector de teluro de mercurio-cadmio más sensible. Los detectores de teluro de mercurio-cadmio por lo general se operan en el modo fotoconductor y regularmente se enfrían a 77 K con nitrógeno líquido (LN 2, por sus siglas en inglés). Se encuentran disponibles detectores de teluro de mercurio-cadmio enfriados termoeléctricamente, pero su corte de número de onda por lo regular es muy por encima de 1000 cm- 1 y no son tan sensibles como los detectores de teluro de mercurio-cadmio enfriados con LN 2 • También se pueden usar detectores de indioantimonio (lnSb) enfriados con nitrógeno líquido. Estos detectores son más sensibles que los de teluro de mercurio-cadmio pero tienen un corte a 1800 cm-1. Existen dos problemas con los detectores de teluro de mercurio-cadmio que deben considerarse. Primero, debido a que son más sensibles que los detectores DTGS, deben usarse sólo cuando \éil.muestra o el accesorio de muestreo atenúa el haz en por los menos un factor de 1O. De otro modo, el convertidor análogo a digital se sobrecargará y la exactitud fotométrica del espectrofotómetro se verá seriamente afectada. Si el instrumento está equipado únicamente con un detector de teluro de mercurio-cadmio (circunstancia poco común), se puede montar un filtro de densidad neutra en el haz del espectrofotómetro para
USP 39
Información General/ (1854) Espectroscopía en el Infrarrojo Medio 2195
reducir la energía del haz en el detector a un nivel apropiado. Segundo, incluso si el convertidor análogo a digital no está saturado, la respuesta de los detectores de teluro de mercurio-cadmio a menudo es no lineal a niveles de señal alta cerca de la ráfaga central del interferograma. El efecto de esta falta de linealidad es un desplazamiento del cero de la línea base del espectro de haz individual calculado. Este efecto se puede observar fácilmente al graficar el espectro de haz individual entre O y 4000 cm- 1 • Si la energía promedio del espectro de haz individual entre, por ejemplo, 400 y 300 cm- 1 está por encima o por debajo de cero, el detector está respondiendo de manera no lineal en la región de la ráfaga central, y la exactitud fotométrica de la medición se degrada concomitantemente. Algunos proveedores tienen disponible software para corregir este efecto, pero por lo general la señal debe reducirse insertando un filtro de densidad neutra en el haz, y no una restricción de apertura.
FACTORES QUE IMPACTAN EL DESEMPEÑO DE LA MEDICIÓN Resolución Espectral El factor principal que afecta la resolución de un espectrofotómetro FT-IR es la diferencia de paso óptico máxima del interferograma. La resolución nominal, ~v, es el recíproco de la diferencia de paso óptico máxima. El ángulo de divergencia del haz que pasa a través del interferómetro también puede degradar la resolución. La colimación efectiva del haz que pasa a través del interferómetro se determina limitando la apertura del sistema óptico. En instrumentos diseñados para alta resolución (~v > 0,5 cm- 1) se instala entre la fuente y el interferómetro una apertura ajustable que tiene el mismo propósito que la apertura de entrada de un monocromador. A medida que se incrementa la resolución deseada (es decir, ~v se hace numéricamente más pequeña), se reduce el diámetro de esta apertura, que se conoce como parada de jacquinot o parada-] (]-stop), lo que hace más pequeño el ángulo de divergencia del haz en el interferómetro; sin embargo, este procedimiento puede incrementar el ruido en el espectro. En instrumentos de resolución más baja (por lo regular aquéllos con una resolución máxima de 1 ó 2 cm- 1), el detector cumple con el propósito de la parada de ]acquinot. Si el ancho total verdadero a la altura media de las bandas o líneas en el espectro es menos de ~v, se observan lóbulos laterales en cada rasgo espectral estrecho. Estos lóbulos laterales pueden eliminarse mediante apodización, es decir, multiplicando el interferograma por una función que sea igual a 1 en la ráfaga central y que decaiga monotónicamente con la diferencia de paso óptico. Además de reducir la amplitud de los lóbulos laterales, la apodización también tiene el efecto de degradar la resolución (ensanchamiento de las bandas). Cuando no se pondera un interferograma, a menudo se dice (incorrectamente) que está apodizado con una función de apodización "boxear", aunque un mejor término sería función de truncamiento "boxear". La selección de la función de apodización debe realizarse de acuerdo al propósito del experimento, pero por lo general se limita a unas pocas opciones. Las funciones de apodización de Norton-Beer débil, media y fuerte proveen la combinación óptima de amplitud de lóbulo lateral para una pérdida de resolución de 20%; 40% y 60%, respectivamente. La función de apodización media de NortonBeer es por lo general apropiada para muchas mediciones de muestras en fase condensada. La función de apodización de Happ-Genzel también es una función casi óptima que degrada la resolución en aproximadamente 50% (es decir, está en un punto medio entre las funciones media y fuerte de Norton-Beer). Una función comúnmente disponible es la función de apodización triangular. Esta función tiene el efecto de ocasionar desviaciones significativas de la Ley de Beer por lo que no se recomienda.
Exactitud del Número de Onda Los factores principales que afectan la exactitud del número de onda son la alineación del láser y los haces IR en el interferómetro y la divergencia del haz pasando a través del interferómetro tal como se observa en el detector IR. Se puede pensar que, debido a que el número de onda del rayo láser se conoce con mucha exactitud, la escala de número de onda de un espectro medido en un espectrofotómetro FT-IR debería conocerse con la misma exactitud. Sin embargo, el rayo láser está altamente colimado, a diferencia del haz de la fuente IR (un haz colimado sólo puede obtenerse a partir de una fuente puntual). Debido a que la fuente y el detector tienen un tamaño finito, nunca puede esperarse una exactitud idéntica (del número de onda del rayo láser y de la escala del número de onda del espectro medido). A medida que se reduce el diámetro de la parada ]acquinot, se observará un pequeño desplazamiento del número de onda (siempre menor a 0,25 ~v). Cuando el diámetro de una muestra es menor que el diámetro del enfoque del haz en el compartimiento de la muestra o en el accesorio de muestreo, el efecto también es el de resumir el haz (es decir., reducir la apertura del haz), y se observará un pequeño desplazamiento en la longitud de onda.
Exactitud Fotométrica El factor principal que afecta la exactitud fotométrica de los espectrofotómetros FT-IR es la linealidad de la respuesta del detector. Tal como se mencionó anteriormente, la respuesta de los bolómetros piroeléctricos por lo general varía linealmente con la energía del detector, aunque este no es el caso de los detectores de teluro de mercurio-cadmio. Con los detectores de teluro de mercurio-cadmio, la mejor forma de detectar el error fotométrico es la medición de la energía no física en el espectro del haz individual por debajo del corte del detector.
USP 39
2196 (1854) Espectroscopía en el Infrarrojo Medio / Información General
Sensibilidad La sensibilidad del instrumento puede determinarse midiendo dos espectros de haz individual exactamente en las mismas condiciones y calculando su cociente para producir lo que comúnmente se conoce como una línea al 100%. El nivel de ruido en diferentes regiones espectrales puede estimarse como el nivel de ruido entre picos, es decir, la diferencia entre los valores máximos y mínimos de la transmisión porcentual en las regiones espectrales seleccionadas, o la raíz cuadrática media (RMS, por sus siglas en inglés) del ruido, es decir, la desviación estándar del espectro en dicha región. La raíz cuadrática media de nivel del ruido es la métrica preferida debido a que este cálculo implica todos los datos en la región seleccionada, en lugar de simplemente los dos puntos más desviados. Un ejemplo de condiciones de medición adecuadas para analizar la sensibilidad de un espectrofotómetro FT-IR equipado con un detector DTGS son 16 barridos co-sumados, una resolución de 2 cm- 1 y una apodización de Norton-Beer media. La región espectral más comúnmente usada es 2200-2000 cm-1 debido a que (a) es ahí donde se presenta el mayor desempeño de la mayoría de los espectrofotómetros de infrarrojo medio y (b) ningún interferente atmosférico común tal como agua o dióxido de carbono. absorbe fuertemente en esta región. Sin embargo, se deben analizar otras regiones cercanas a los extremos del espectro, tales como 650-450 cm-1 y 4000-3800 cm-1. La relación señal-ruido del espectrofotómetro que opera con ciertos parámetros en una región espectral dada se estima como 100/(raíz cuadrática media del nivel de ruido en transmisión porcentual).
Linealidad de La Ley de Beer Para mediciones cuantitativas, el espectro se mide a una resolución que sea al menos el doble de estrecha que la banda más estrecha en el espectro. Se recomienda el uso de la función de apodización Norton-Beer media o Happ-Genzel. Para una exactitud fotométrica óptima, la absorbancia máxima de las bandas analíticas no es mayor que 1,0 unidades de absorbancia. Se pueden tolerar valores de absorbancia más altos con ciertas combinaciones de resolución y funciones de apodización. El efecto del ancho de banda y de la absorbancia del pico en la linealidad de la Ley de Beer para bandas fuertes depende de la resolución y de la función de apodización, y debe validarse caso por caso.
;
;
(1857) ESPECTROSCOPIA ULTRAVIOLETA-VISIBLE-TEORIA Y PRACTICA ;
ASPECTOS TEÓRICOS La espectroscopía ultravioleta-visible (UV-Vis) es una técnica espectroscópica de transición electrónica en la que la interacción entre la radiación incidente y los electrones resulta en la promoción de un estado basal a un estado de energía superior de uno o más de los electrones externos o de unión. Este efecto cuántico genera una absorción específica de radiación, cuya frecuencia y longitud de onda se ven regidas por la ecuación:
E= hv= (he/A.) x 109 donde: E= energía h =constante de Planck (6,63 x 10-34). s) v= frecuencia (Hz), con respecto al cambio de energía Af, inducida cuando se absorbe radiación electromagnética (ti.E= hvporfotón) e= velocidad de la luz (2,998 x 1 ms-1) 'A= longitud de onda (nm) Incluso las moléculas más simples tienen un gran número de niveles discretos de energía, con niveles cercanos adyacentes a ellos ocasionados por la vibración atómica dentro de la molécula. La superposición de estas bandas vibratorias en el espectro electrónico ocasiona que los espectros medidos se presenten como un pico ancho con forma de campana. Como regla general, la mayoría de las moléculas presentan absorbancia en alguna parte de la región UV-Vis. Cuanto más se deslocalicen los electrones p, más larga será la longitud de onda de la primera banda de absorción, es decir, la banda con la energía más baja y la longitud de onda más larga.
os
Espectroscopía Derivada Las ventajas de la espectroscopía derivada como herramienta analítica se conocen desde la década de 1950. Antes de que estuviese disponible la computadora personal, la generación electrónica de espectros derivados era compleja y difícil, y por esta razón dicha técnica se usaba raramente. La introducción de microcomputadoras al final de la década de 1970 simplificó la
USP 39
Información General/ (1857) Espectroscopía UV-Vis 2197
generación de espectros digitales y las manipulaciones matemáticas asociadas requeridas para producir derivadas de primer o mayor orden. Esto incrementó significativamente el uso de la técnica derivada. La espectroscopía derivada usa derivadas de absorbancia de primer o mayores(A) con respecto a la longitud de onda para el análisis cualitativo y para la cuantificación, en donde: A = f(I..) Orden cero
OA/o/.,, = f'(A,) Derivada de primer orden o2A/o/.,, 2 = f"(A,) Derivada de segundo orden
o
_fl_ Orden cero
+
2'º
o
+
o
Figura 1. Banda de absorción gaussiana y sus derivadas del primer al cuarto orden. Una derivada de primer orden es la velocidad de cambio de absorbancia con respecto a la longitud de onda (Figura 7). Una derivada de primer orden comienza y termina en cero. También pasa a través de cero a la misma longitud de onda que /.,,máx de la banda de absorbancia. En cualquiera de los lados de este punto están las bandas positivas o negativas con un máximo y un mínimo a las mismas longitudes de onda que los puntos de inflexión en la banda de absorbancia. Esta función bipolar es característica de todas las derivadas de orden impar. Las derivadas de primer orden se usan principalmente para la minimización o eliminación de absorción de fondo para mediciones en soluciones y suspensiones turbias dispersantes y para el análisis de componentes a nivel de trazas en matrices absorbentes complejas. El rasgo más característico de una derivada de segundo orden es una banda negativa con un mínimo a la misma longitud de onda que el máximo en la banda de orden cero. Un espectro derivado de segundo orden también presenta dos bandas satelitales positivas adicionales en cualquiera de los lados de la banda principal. Un espectro derivado de cuarto orden presenta una banda positiva. Una banda fuerte negativa o positiva con un mínimo o un máximo a la misma longitud de onda que /.,,máx de la banda de absorción es característica de las derivadas de orden par. Las derivadas de orden superior (segundo y mayores ) pueden usarse para: • mejorar la resolución de los picos que se superponen para la separación de espectros superimpuestos-particularmente útil en análisis de componentes múltiples • ayudar en la determinación cuantitativa de componentes a nivel de trazas • ayudar en la caracterización de componentes individuales puros, particularmente para propósitos de archivo y para complementar la información obtenida a partir de otras técnicas tales como espectroscopía en el infrarrojo, de resonancia magnética nuclear y de masas • ayudar en el análisis de pureza de productos Se debe tener en cuenta que el número mínimo de batidas observado es igual al orden de derivada más uno.
2198 (1857) Espectroscopía UV-Vis / Información General
USP 39
INSTRUMENTAL Todas las mediciones modernas UV-Vis implican la detección y medición del cociente de intensidad de la radiación a cierta longitud de onda en presencia o ausencia de la muestra absorbente. La Figura 2 es una representación esquemática de un espectrofotómetro de doble haz. La dispersión de luz para alcanzar la resolución deseada puede ocurrir antes o después de introducir la muestra, pero todos los instrumentos UV-Vis comerciales comparten las siguientes características para realizar dichas funciones: • fuente continua • monocromador o policromador • área de muestreo •detector
<¡>··-·
Monocromador
f----'l<---1
Referencia
Detector
Muestra
Detector
Figura 2. Espectrofotómetro de doble haz típico Se debe tener cuidado de asegurar que el haz de luz incidente no degrade la muestra y de minimizar cualquier efecto del calentamiento. Esto es particularmente importante cuando se usan instrumentos de arreglo de diodos ya que la muestra se irradia a todas las longitudes de onda.
Fuente Continua Actualmente se utilizan dos tipos principales de fuente continua: continua y pulsada. Las fuentes continuas incluyen las de tungsteno-halógeno para visible, arco de deuterio para UV y arco de xenón para ambas. La fuente para radiación pulsada es la lámpara de destellos de xenón. Muchos sistemas de instrumentos UV-Vis usan una combinación de deuterio y tungsteno-halógeno para abarcar de manera efectiva las regiones UV y visible, respectivamente. Por necesidad, la selección de la fuente se logra mediante el uso de un espejo o por el movimiento físico de las lámparas. Este cambio por lo general se realiza en la región de 320-350 nm por lo que la calificación del sistema debe realizarse usando tanto posiciones de la fuente como del espejo. Los sistemas basados en lámparas de xenón tienen el beneficio de una sola fuente y una salida de energía mayor, pero son más costosos.
Monocromador La escala de longitud de onda se puede codificar mediante un monocromador de barrido o un policromador de red (ver la Figura 3), como es el caso para los espectrofotómetros equipados con detectores de arreglos lineales o bidimensionales. El análisis de los beneficios y desventajas específicos de cada uno de estos diseños de dispersión se encuentra fuera del alcance de este capítulo general. Cualquier instrumento apropiadamente calificado debería ser adecuado para las mediciones cualitativas. Se debe tener cuidado al momento de seleccionar un instrumento para mediciones cuantitativas debido a que la dispersión, la linealidad de la respuesta y la luz espuria pueden no ser uniformes a lo largo de todo el intervalo espectral.
~:dllllllllllll'
Ranura de entrada
Ranura de salida
Figura 3. Monocromador de red de dispersión.
USP 39
Información General/ (1857) Espectroscopía UV-Vis 2199
Área de muestreo Se encuentra disponible una gran variedad de arreglos de muestreo además de los portaceldas que están diseñados para ajustarse a varias configuraciones de longitud de paso basándose en celdas rectangulares convencionales. Estos incluyen celdas de flujo, sondas de inmersión basadas en fibra óptica, configuraciones de placa de micropocillos y cargadores de muestra automáticos, entre otros. Se deben evaluar aspectos tales como el volumen de muestreo, la velocidad de medición y la reproducibilidad de la presentación de la muestra para optimizar el dispositivo de muestreo para aplicaciones específicas.
Detector Los detectores fotoeléctricos, que son la forma más común de detectores UV-Vis, generan una corriente eléctrica que es directamente proporcional a la intensidad de la energía radiante incidente que actúa sobre estos. Los detectores pueden presentarse en forma de dispositivos semiconductores fotosensibles, como detectores discretos, arreglos lineales o bidimensionales, o fotomultiplicadores. Los dispositivos semiconductores fotosensibles incluyen fotodiodos de estado sólido, arreglos de dispositivos de acoplamiento de carga (CCD, por sus siglas en inglés) y fototransistores. El material semiconductor más común es el silicio, que es sensible a longitudes de onda de 400-800 nm, pero algunos dispositivos de silicio tienen una sensibilidad extendida que va desde una longitud de onda de 190 nm hasta longitudes de onda de 1100 nm. La respuesta dinámica de estos detectores por lo general es de cuatro órdenes de magnitud. La mayoría de los detectores de arreglos están fabricados con silicio y, por ende, tienen una respuesta de longitud de onda similar. Otros materiales semiconductores pueden proveer una respuesta de longitud de onda de hasta varios micrómetros. En constraste, los fotomultiplicadores son detectores al vacío que tienen un fotocátodo en el que la energía del fotón libera electrones que son dirigidos por el campo aplicado hacia las placas sensibles a los electrones. Mediante un efecto de cascada, estos dínodos amplifican los electrones liberados inicialmente por la absorción de la radiación incidente. Los fotomultiplicadores tienen respuestas de longitud de onda típicas de 160-900 nm, aunque algunos materiales de fotocátodos pueden proveer respuestas a longitudes de onda mayores. La respuesta dinámica de estos detectores por lo general es de seis órdenes de magnitud o mayores.
Configuraciones Alternativas de Detectores UV-Vis INSTRUMENTOS DE ARREGLOS DE DIODOS En los arreglos de diodos, la configuración óptica se revierte respecto de la de un espectrofotómetro convencional, y el haz de luz pasa a través de la muestra antes de ser dispersada por el policromador. Esto provee el beneficio de datos espectrales completos en forma rápida, sin partes móviles que puedan desgastarse. Por lo tanto, la percepción es que los arreglos de diodos son más confiables que otros detectores. Dicha percepción es cierta, pero el diseño de óptica reversa requiere que tanto la muestra como los elementos ópticos antes del elemento dispersante (por lo general una red de dispersión) sean sometidos a la radiación del espectro completo también encontrada por estos componentes en un espectrofotómetro convencional. En un espectrofotómetro convencional, la muestra y los elementos ópticos están fuera del monocromador, y la desviación y/o dispersión del haz óptico simplemente reduce la intensidad de la luz que entra al monocromador. En un espectrofotómetro basado en arreglos, la desviación ocurre dentro del monocromador, ocasionando dispersión dentro del ambiente confinado y un aumento asociado de luz espuria que lleva a la reducción del intervalo fotométrico óptimo. DETECTORES HPLC El diseño de un espectrofotómetro UV-Vis es siempre el resultado de tener en cuenta diversos compromisos. Por ejemplo, el desempeño óptico (resolución de longitud de onda absoluta) se rige por la distancia focal del monocromador, que a su vez dicta el tamaño físico del instrumento. En el caso de los detectores HPLC, la necesidad de proveer una señal de salida con relación señal-ruido baja y de alta estabilidad a altos niveles de transmitancia a través de una celda de flujo de apertura pequeña hace que, por diseño, estos sistemas no puedan tener el intervalo dinámico o la exactitud de longitud de onda de sus contrapartes espectroscópicas convencionales. SISTEMAS MODULARES BASADOS EN FIBRA ÓPTICA En años recientes, ha existido un rápido aumento en la disponibilidad y el uso de sistemas construidos teniendo en cuenta la capacidad de la fibra óptica para canalizar y multiplexar sistemas ópticos. A pesar de que estos sistemas tienen la ventaja de ser flexibles y fáciles de usar, además de que permiten realizar mediciones en microplacas, sistemas personalizados, etc., se deben tener en cuenta las siguientes desventajas: • En ocasiones se asume que estos sistemas de fibra óptica basados en arreglos son inmunes a la interferencia de la luz ambiental en la interfaz de la muestra, lo cual puede o no ser cierto. Esta suposición se evalúa fácilmente usando una bolsa
2200 (1857) Espectroscopía UV-Vis /Información General
USP 39
negra para cambio de película fotográfica o un simple paño negro. El uso de una técnica de enmascarado no debe cambiar el valor medido si esta suposición es verdadera. • Los sistemas de construcción personalizada no tienen obturación, filtro de luz espuria u otras capacidades adicionales provistas por los espectrofotómetros de diseño comercial y, por ende, sus características de desempeño, es decir, el intervalo fotométrico óptimo, puede verse reducido significativamente. • Los niveles de luz transmitidos directamente hacia las fibras desde las fuentes de alta intensidad, tales como lámparas de destellos de Xenón, pueden ocasionar fotodegradación. En sistemas simples construidos autónomamente, la fuente puede estar acoplada mediante fibra directamente a la interfaz de la muestra, y el único control es el interruptor de encendido y apagado.
CALIBRACIÓN La calibración del instrumento UV-Vis implica dos componentes: longitud de onda primaria (eje x) e intensidad (eje y), y a menudo se lleva a cabo al inicializar el instrumento. La mayoría de los instrumentos UV-Vis dispersivos usan líneas de emisión atómica de la fuente o de una lámpara secundaria para la calibración de la longitud de onda primaria (eje x), además de la posición de orden cero en el monocromador. Dependiendo de la configuración del instrumento por parte del proveedor, estos procedimientos de calibración pueden estar disponibles para el usuario. La calibración de la escala fotométrica (eje y) es crítica para el éxito de la cuantificación y la transferencia de método entre instrumentos. Aunque la medición fundamental depende de una simple medición de cociente, los instrumentos modernos pueden usar diversas configuraciones de ganancia o factores de amplificación para asegurar una respuesta del detector lineal, particularmente a niveles de baja intensidad y configuraciones de alta potencia. Estas configuraciones de ganancia a menudo son establecidas inicialmente por el fabricante, pero se pueden recalibrar a medida que envejecen los elementos ópticos o cuando se llevan a cabo otros cambios. Se recomienda una validación funcional detallada basada en materiales de referencia certificados para demostrar la aptitud de los instrumentos de laboratorio, incluso para instrumentos que poseen capacidad de calibración interna. El uso de materiales de referencia externos no elimina la necesidad de procedimientos de controles de calidad internos, sino que provee documentación independiente sobre la aptitud del instrumento para realizar el análisis específico.
CONSIDERACIONES ANALÍTICAS Factores Instrumentales ANCHO DE BANDA ESPECTRAL El ancho de banda espectral tiene una gran importancia debido a que la mayoría de los procedimientos espectrofotométricos requieren una buena resolución espectral. Se debe usar el ancho de ranura más estrecho que provea una relación señalruido adecuada dado que la resolución óptima se logra al maximizar la relación señal-ruido. Si se dispone de acceso a un instrumento con ancho de banda variable, entonces la configuración óptima puede definirse como el mayor ancho de banda en el que no se observa una reducción significativa en la intensidad de los picos. En términos prácticos para moléculas de interés farmacéutico en solución, se considera adecuado un ancho de banda espectral de 2 nm. LUZ ESPURIA La radiación espuria, comúnmente llamada luz espuria, puede definirse como la energía radiante a longitudes de onda diferentes a las indicadas por la configuración del monocromador y toda la energía radiante que alcanza al detector sin haber pasado a través de la muestra o de las soluciones de referencia (ver la Figura 4). Puede ser ocasionada por cualquier radiación dispersada por las imperfecciones en el medio de dispersión, que comúnmente es una red de dispersión. El uso de una red de dispersión holográfica reduce significativamente los niveles de esta fuente de radiación espuria. Las redes de dispersión pautadas de alta calidad generan un nivel bajo de radiación dispersada. En los instrumentos de mayor desempeño, la radiación espuria puede reducirse mediante el uso de monocromadores dobles o monocromadores de doble paso. La radiación espuria, o radiación espuria aparente, también puede ser ocasionada por fugas de luz en el sistema, calibración incorrecta de la longitud de onda, alineación óptica incorrecta, salida reducida de la fuente o respuesta reducida del detector.
USP 39
Información General/ (1857> Espectroscopía UV-Vis 2201
5,0 -+- Monocromador
4,5
---- Luz espuria a 2A (1,00 %1) --..- Luz espuria a 2,SA (0,32 %7) -*- Luz espuria a 2,8A (0,16 %1)
4,0 ~
3,5 3,0
2
·o e
2,5
.e
5
.e "' <:(
2,0 1,5 1,0 0,5
o.o o
2
3
4
5
Absorbancia medida (A) Figura 4. Efecto de la luz espuria en la absorbancia medida.
INTERVALO FOTOMÉTRICO DE TRABAJO ÓPTIMO La determinación del intervalo fotométrico óptimo es fundamental para establecer la capacidad de un instrumento dado antes y durante la validación del método. La importancia de este procedimiento puede demostrarse por el hecho de que en 1945 Vandenbelt et al. (1) intentaron establecer el intervalo de absorbancia óptimo en el entonces novedoso espectrofotómetro Beckman DU. Sugirieron un enfoque simple en el que las absortividades molares de varios compuestos se miden a diferentes concentraciones. Este enfoque se muestra teóricamente en la Figura 5, en donde el centro de la meseta se usa para definir el intervalo fotométrico.
,,¡!%
":!cm
--------------=---~~-~~~---"-'··..:.:-··············
Absorbancia de la solución Figura 5. Curva de respuesta fotométrica teórica. En la práctica, los datos son más variables. La Figura 6 presenta tres curvas típicas.
USP 39
2202 (1857) Espectroscopía UV-Vis / Información General
(a)
7,5 7,0
•
....RJ
~5000 "O RJ "O
:~ ~ oU> .e
4800
(b)
•
4600 3800
3600 0,2
0,8
1·,6
Absorbancia
2,4
Figura 6. Absortividad molar vs. absorbancia para 3 compuestos: (a) nitrato de potasio acuoso medido a 301 nm, (b) cromato de potasio en hidróxido de potasio 50 mM a 373 nm y (c) cromato de potasio en hidróxido de potasio 50 mM a 273 nm. Rediseñado con autorización de (2). Youmans y Brown (3) proveen un método más riguroso para estimar la región de máxima precisión de un instrumento. El error en la medición de la concentración de una solución de transmisión T puede expresarse como:
1
T
~C=-log-----ª!'..... sb Tmin
donde ~e es el cambio en la concentración, E es la absortividad molar del compuesto, bes el camino óptico o longitud de paso, y T0 v y Tmín son los valores medios y mínimos, respectivamente, de una serie de n mediciones de la misma muestra. El error estadístico es (ver la Figura 7): i'!c = _ _ 1_ log Tav e -logTav Tm1n
Información General/ (1857) Espectroscopía UV-Vis 2203
USP 39
0,10
o
20
Transmitancia(%1 40 60
80
100
Q,4
0,1
o
0,08
0,()6 ~
~
e
0,04
in
0,02
o lp
2,0
0,6
0,2
Absorbancia
Figura 7. Gráfica de Youmans y Brown. Rediseñado con autorización de (2). Los niveles de ruido y, por ende, la precisión de la medición, dependen principalmente del tipo de ruido del detector, tal como se muestra en la figura Figura 8. 6
5
.... •. •• •• •• ••
•• t
4
3
... .. ..•. ..• .. ... •.. ..
ª· = 0,4343 ~ C
log, 0 T T
t
2
.
•.
'•
'
..
, _ '
~._..
~~_...,,,.
_____
-. .. "'"'
.:.~a,,i.._.r::=---7--.,,.,.
... .... ... ... _, .......
...
CT 0 4343 -.!-=-'--k
,,_----
..................... _ .. __
C
log 10 T
::1
--------------
0 .......-...........- ...........----...---.-.......- ...................-....._........,..............______
o.o
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
Absorbancia
Desviación estándar de una medición ar
Fuente de variabilidad
Función de error relativo
Detector térmico, amplificador y ruido de corriente oscura
[Independiente de n Ruido de disparo (shot-noise) del detector Colocación de la celda, errores de falta de paralelismo y fluctuaciones en la intensidad del haz incidente Figura 8. Precisión de la medición como una función del tipo de ruido. Calculado y rediseñado con autorización de (4). Ambos enfoques muestran claramente que, además del aumento en el error esperado a niveles de absorbancia más altos ocasionados por la luz espuria y otros factores, existe una posibilidad similar, sino mayor, de un aumento en el error a niveles
2204 (1857) Espectroscopía UV-Vis /Información General
USP 39
de absorbancia bajos ocasionados por varianzas instrumentales en la forma del ruido del detector, de la fuente, entre otros. Esta varianza a menudo se pasa por alto debido al deseo de economizar la escala, cuando se utilizan muestras más pequeñas y longitudes de paso más cortas y, por lo tanto, valores menores de absorbancia medidos.
Factores Basados en la Muestra Los factores basados en la muestra más importantes que afectan de manera negativa la espectrofotometría UV-Vis cuantitativa son la fluorescencia y la dispersión de luz. Si la matriz de la muestra incluye compuestos fluorescentes, la señal medida por lo regular contendrá una contribución de la fluorescencia. El intervalo de longitud de onda y la intensidad de la fluorescencia dependen de la composición química del material fluorescente. Las partículas suspendidas dispersan luz por el efecto Tyndall, ocasionando una reducción en la intensidad medida que aumenta a medida que se reduce la longitud de onda. A menos que no exista otra alternativa, la absorbancia no debe determinarse en muestras turbias. Los procedimientos para eliminar la turbidez incluyen filtrar, centrifugar o flocular la muestra y se llevan a cabo antes de cualquier procedimiento adicional que genere un cromóforo, siempre que no afecten la concentración del analito o del cromóforo en la solución de prueba. Cualquier medición realizada en una solución turbia es altamente específica para ese instrumento y se puede usar sólo para propósitos de comparación en el mismo sistema. Una complicación adicional puede surgir a mayores concentraciones de analito con respecto a la química de coordinación y a la matriz del sistema. La asociación iónica, la formación de complejos y factores similares pueden ocasionar una desviación de la respuesta lineal esperada.
Factores de Muestreo CELDAS Las mediciones de absorbancia cuantitativas por lo regular se realizan en soluciones de la sustancia en celdas para contener líquidos. La longitud de paso de la celda más común es 1O mm, aunque se encuentran disponibles comercialmente longitudes de paso de 0,01 a 100 mm (ver la Figura 9). Para muestras con baja absorbancia, por lo general se puede obtener una sensibilidad mejor incrementando la longitud de paso de la celda. Por ejemplo, la absorbancia teórica de una solución en una celda de 50 mm es mayor por un factor de cinco en comparación con la misma solución en una celda de 1O mm. Los errores en las lecturas de absorción que surgen de las celdas casi siempre son ocasionados por ventanas sucias que pueden absorber una proporción significativa del haz de luz incidente. Las causas de error menos frecuentes son una selección incorrecta del material de la celda para la longitud de onda requerida, p.ej., uso de celdas de vidrio menores de 320 nm, falta de repetibilidad del posicionamiento de la celda, diferencias en el espesor de la ventana de la celda, ventanas ópticas no paralelas o impurezas en los materiales de la ventana de la celda. Una celda de 1 O mm fabricada con una tolerancia de ± 0,05 mm agregará una contribución de 0,005 A a la incertidumbre general, al medir valores de absorbancia en el nivel 1 A. Se encuentran disponibles comercialmente celdas de diez milímetros con una tolerancia de ± 0,01 mm. Como guía general, la celda seleccionada debe tener un valor de transmitancia mayor de 75% cuando se llena con el disolvente apropiado y se mide a la longitud de onda de interés.
Figura 9. Tipos de celdas usados comúnmente: celdas regulares de 1O mm, celdas de bajo volumen y celdas de flujo (de izquierda a derecha). El apego a las siguientes prácticas puede reducir la variabilidad introducida por las celdas. Limpiar cuidadosamente las celdas antes de su uso y almacenarlas de tal manera que se evite la contaminación cuando no se estén usando. Las celdas de uso frecuente y repetido, p.ej., celdas de flujo, se pueden almacenar húmedas en agua de alta pureza o en ácido nítrico al 1% (v/v). No usar celdas rayadas o quebradas. Limpiar cuidadosamente las celdas con un paño suave, limpio y exento de pelusa antes de colocarlas en el espectrofotómetro. No usar papel para limpiar lentes ni ningún otro tipo de papel de limpieza ya que rayarán o permitirán la introducción de contaminación en la cara óptica.
USP 39
Información General/ (1857) Espectroscopía UV-Vis 2205
Es preferible usar una sola celda para todas las mediciones de la referencia y de las muestras. Cuando se deban analizar múltiples celdas de muestra contra una celda de referencia, sus características deben corresponder cercanamente. Siempre que sea posible, medir los estándares y las muestras al mismo tiempo y en las mismas condiciones para minimizar el potencial de sesgo. La celda de referencia debe contener el mismo disolvente que la celda de muestra y debe verificarse contra la celda de muestra a todas las longitudes de onda en las que se requieran mediciones. Se pueden aplicar correcciones para las diferencias entre las celdas a las lecturas de absorbancia obtenidas con las soluciones que se están analizando. La corrección máxima permisible es ± 0,01 unidades de absorbancia. Las mejores prácticas incluyen usar la misma celda en el haz de referencia con la misma cara incidente a la luz del haz y nivelando la celda de la muestra tres veces con la solución muestra antes del llenado final previo a la medición. El uso de celdas de flujo trata de manera efectiva muchos de estos problemas de manipulación y llenado de las celdas. El contenido en la celda de muestra y la celda de referencia debe estar exento de burbujas y de partículas. Si se usan celdas de flujo, puede ser necesario desgasificar las soluciones antes de la medición para evitar la formación de burbujas de aire en la celda. Se emplea una secuencia de actividades para monitorear la calidad del proceso de medición y para asegurar que el contenido sea representativo de la muestra que se está midiendo. La deriva de la línea base espectrofotométrica puede detectarse midiendo el blanco al inicio y al final de la secuencia de muestra. La nivelación adecuada de la celda puede confirmarse alternando entre la medición del estándar (alta concentración) y del blanco (concentración cero) al inicio de la secuencia de medición. Esta última verificación es particularmente importante para sistemas automatizados que pueden generar resultados reproducibles pero inexactos debido a la nivelación inadecuada. CUIDADO DE LAS CELDAS Las celdas contaminadas son la mayor fuente de error individual en espectrofotometría. Las celdas nunca deben manipularse tocando las caras ópticas pulidas, y se debe enjuagar cualquier residuo o derrame de solución. Si las celdas se cuidan apropiadamente, raramente se requerirán métodos rigurosos de limpieza, en especial si las celdas se limpian inmediatamente después de su uso. Aunque las soluciones ácidas simplemente contaminarán las superficies, las soluciones alcalinas pueden grabar todos los tipos de superficies de vidrio, y el grado del daño dependerá del pH y del tiempo de contacto. Al limpiar las celdas, se debe asegurar que las caras ópticas no se rayen o quiebren. Se encuentran disponibles soluciones de limpieza comerciales que se pueden usar, siempre y cuando se diluyan antes de su uso de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Después de limpiarlas con dichos agentes, las celdas deben enjuagarse minuciosa y cuidadosamente con agua de alta pureza. Si esto no es efectivo para limpiar las celdas, entonces es aceptable remojarlas en ácido nítrico o ácido clorhídrico concentrado y frío. Las celdas de flujo se limpian mejor in situ, siempre que el disolvente no interactúe con las tuberías conectoras. Si las celdas se almacenan durante un periodo prolongado, entonces deben secarse rápidamente después de la limpieza usando una corriente de gas comprimido en un ambiente limpio y libre de polvo. ALINEACIÓN Y LLENADO DE LAS CELDAS Las celdas deben alinearse de modo que el haz de luz incida siempre en la misma cara. La mayoría de las celdas cuentan con identificación grabada en una cara: esto se puede usar para asegurar una orientación uniforme. Si no hay ninguna identificación, se puede hacer una pequeña marca en una cara fuera del área del haz de luz. No se recomienda usar celdas sin marcas, pero en caso de que se utilicen, se debe confirmar su aptitud para la aplicación prevista. Si las celdas se proveen junto con el instrumento, los portaceldas individuales se deberán usar siempre en el mismo haz según se identifique, por ejemplo, mediante marcas apropiadas. CORRECCIONES DE LA CELDA Si se usan múltiples celdas, las diferencias en la transparencia óptica de las celdas individuales pueden introducir un sesgo sistemático, a menos que éste último se tenga en cuenta mediante una corrección de las celdas. No se deben usar correcciones que excedan de 0,01 unidades de absorbancia. Para determinar si son necesarias las correcciones de la celda, se pueden llenar todas las celdas con el disolvente apropiado y medir las diferencias de absorbancia a las longitudes de onda analítica requeridas. Estas mediciones se repiten después de la limpieza para asegurar que las diferencias de absorbancia estén relacionadas con las celdas y no sean el resultado de contaminación. Se deben llenar y verificar las celdas repetidamente hasta que los resultados sean uniformes, y se debe investigar cualquier cambio apreciable en la corrección de las celdas debido a que esto indica contaminación, daño en la celdas o ajuste incorrecto del instrumento.
OTRAS FUENTES DE INFORMACIÓN (1) Vandenbelt, J.M., Forsyth, J. and Garrett, A. (1945) Anal. Chem. (Industria/ and Engineering Chemistry, Analytical Edition), 17(4), 1945, 235 (2) Standards and Best Practice in Absorption Spectrometry, Ed. C. Burgess & T. Frost, Blackwell Science, (1999), ISBN 0-632-05313-5.
USP 39
2206 (1857) Espectroscopía UV-Vis / Información General
(3) Youmans, H.L. and Brown, W.D. (1976) Anal. Chem., 48, 1152. (4) Skoog, West & Holler (7th Ed) 1996, Tabla 24-4.
(1911) REOMETRÍA • VISCOSIDAD NEWTONIANA
Cuando se ejerce una tensión externa sobre un fluido, éste fluirá hasta cierto grado, el cual es determinado por las fuerzas de fricción interna derivadas de las interacciones moleculares internas y por la magnitud de la tensión externa aplicada. La medida de resistencia al flujo se define como la viscosidad del fluido. El coeficiente de viscosidad, 77, denominado históricamente como viscosidad absoluta, se define mediante la ley de Newton para los fluidos viscosos: (j
=11 •
r
c1)
u
= tensión de corte, que se define como la tensión aplicada que ocasiona el movimiento relativo de capas paralelas
y
=velocidad de corte, que se define como la velocidad de cambio de deformación de corte con el tiempo
sucesivas entre sí a lo largo de sus propios planos en un cuerpo material Se debe tomar en cuenta que, aunque tensión y deformación en ocasiones se usan de manera intercambiable (en el inglés stress vs. strain), dicho uso no se aplica en reología. En el campo de la reología, tensión es sinónimo de fuerza por unidad de área o un sistema de fuerzas por unidad de área, mientras que deformación se refiere a un cambio en la forma o tamaño. Se dice que un fluido presenta flujo newtoniano si la viscosidad es una constante independiente de la velocidad de corte o de la tensión de corte aplicada. Debido a que la viscosidad depende de la temperatura, la temperatura de la sustancia que se está midiendo debe controlarse con una aproximación de ±0, 1 º. En general, los líquidos de bajo peso molecular y las soluciones de solutos de bajo peso molecular en disolventes de bajo peso molecular obedecen a la ley de Newton. No obstante, los líquidos de alto peso molecular, las soluciones que contienen solutos de alto peso molecular y las dispersiones coloidales (p.ej., suspensiones y emulsiones) a menudo no obedecen a la ley de la viscosidad de Newton y se denominan fluidos no newtonianos. En el Sistema Internacional de Unidades (SI), la unidad para viscosidad es el pascal por segundo (Pa · s), que equivale a 1 kg · m- 1 · s-1 ó 1O Poises en el sistema de centímetro-gramo-segundo (cgs). Las viscosidades de la mayoría de los fluidos newtonianos se miden en milipascales por segundos (1 Pa · s = 1000 mPa · s; 1 mPa · s = 1 centipoise). La viscocidad cinemática, v, relaciona la fuerza viscosa con la fuerza inercial mediante la relación de la viscosidad newtoniana de un fluido con su densidad, p, a la misma temperatura: (2)
Las unidades para viscosidad cinemática en unidades del SI son mi. s-1 o, más comúnmente, mm2. s-1. [NOTA-1 mm2. s-1 = 1 centistoke (cS o cSt). Los Stokes o centistokes son las unidades del sistema cgs para la viscosidad cinemática.] Medición de Viscosidad Newtoniana Usando un Viscosímetro Capilar
La viscosidad de un fluido newtoniano se mide usando viscosímetros capilares de vidrio, ejemplos de los cuales se proveen en la Figura 7 (viscosímetro capilar simple de tubo en forma de U, también denominado viscosímetro capilar tipo Ostwald) y en la Figura 2 (viscosímetro de nivel constante o suspendido, también denominado viscosímetro capilar tipo Ubbelohde). [NOTA-Cuando el término viscosidad aparezca en este capítulo, se referirá a la viscosidad absoluta o newtoniana.] El viscosímetro de nivel constante o suspendido es un diseño más robusto que se ve menos influenciado por las variaciones de temperatura.
Información General/ (1911) Reometría 2207
USP 39
V
L
l_ Figura 1. Viscosímetro capilar simple de tubo en forma de U (o viscosímetro tipo Ostwald). [NOTA-Las variables están definidas en el texto.]
LM
N
..
R
Figura 2. Viscosímetro capilar de nivel suspendido (o tipo Ubbelohde). [NOTA-Las variables se definen en el capítulo Viscosidad-Métodos Capilares (911 ).] El siguiente ejemplo se basa en la Figura 7, y el mismo principio se puede aplicar a la Figura 2. Con el aparato de la Figura 7, se mide el tiempo de flujo, t, que le toma a un volumen dado de fluido, V, según se define entre las líneas 1 y 2 de la Figura 1, para fluir a través de un tubo capilar con una longitud igual a L y un radio igual a r. Siempre que se conozca la densidad del fluido, p, se puede calcular la viscosidad mediante la ecuación de Poiseuille: (3)
USP 39
2208 (1911 > Reometría / Información General
P =presión La diferencial de presión aplicada, L!P, se define como:
¿jp = (h¡ - h2 )
X
g
X
(4)
p
=altura del fluido en el tubo en la línea 1 medida desde la posición inferior = altura del fluido en el tubo en la línea 2 medida desde la posición inferior g = aceleración gravitacional (valor estándar = 9,80665 m · s- 2) Los viscosímetros capilares de vidrio por lo general se categorizan como instrumentos de baja tensión de corte debido a que !1P es relativamente pequeña. Los intervalos típicos para tensión de corte, u, y velocidad de corte, f(en la pared), son 0, 1-15 Pa y 100-20 000 s- 1, respectivamente. Las dimensiones absolutas de un tubo capilar por lo regular son muy difíciles de medir de manera conveniente. Por lo tanto, cada tubo viscosímetro se calibra empíricamente. Reuniendo todas las constantes de las Ecuaciones 3 y 4 en una sola constante del viscosímetro, k, produce la ecuación aproximada para la viscosidad cinemática: h1 h2
v=kxt
(5)
Para determinar k, los analistas miden el tiempo de flujo para un líquido con una viscosidad conocida a una temperatura dada. Este resultado se usa para calcular la constante del viscosímetro para dicha temperatura en particular. Para trabajos que requieren un alto grado de exactitud, los analistas pueden usar la siguiente ecuación: V=
k x t- (f/t2)
(6)
= factor de energía cinética, en mm 2 • s La constante del viscosímetro, k, y el factor cinético, E, se determinan a partir de tiempos de flujo medidos para un conjunto de fluidos newtonianos estables y limpios con una viscosidad cinemática conocida (materiales estándares de referencia para viscosidad). Una vez que se han determinado las constantes del viscosímetro para una temperatura dada usando estándares de viscosidad apropiados, se pueden usar los valores a menos que el viscosímetro se someta a una tensión térmica o mecánica que altere las dimensiones del capilar. Por lo general, la calibración, operación y limpieza de los viscosímetros debe realizarse de acuerdo con las recomendaciones del fabricante del instrumento. Los viscosímetros capilares deben limpiarse escrupulosamente y deben estar libres de contaminación por residuos adsorbidos o partículas orgánicas o inorgánicas. Los contaminantes en la superficie pueden alterar las dimensiones de la tensión capilar e interfacial. Los procedimientos detallados en el capítulo Viscosidad-Métodos Capilares (911) están destinados para usarse en fluidos que presentan comportamiento newtoniano al someterlos a tensión de corte. Dichos procedimientos no son adecuados para la caracterización de fluidos no newtonianos debido a que pueden arrojar resultados erróneos y variables si se usan con dichos fluidos. Los viscosímetros capilares descritos en el capítulo (911) por lo general miden las propiedades reológicas a una sola velocidad de corte y durante un pasaje único de la muestra a través del capilar. Debido a la relación no lineal entre velocidad de corte y tensión de corte en los fluidos no newtonianos, esta medición resulta inadecuada a menos que se dispongan mediciones de flujo a múltiples velocidades de corte. La disminución de la velocidad de corte desde la pared capilar hacia el centro del mismo y la variación en la tensión de corte con el paso del tiempo a medida que se reduce el nivel de líquido en el viscosímetro capilar representan problemas mayores para los fluidos no newtonianos. Por ende, los viscosímetros capilares son inherentemente inadecuados para su uso en la caracterización de fluidos no newtonianos. Debido a la pequeña L!P que se obtiene con los viscosímetros capilares de vidrio, su uso en mediciones de fluidos de alta viscosidad es poco práctico. Los viscosímetros de extrusión capilar que usan un depósito externo de gas presurizado u otra fuente de presión constante representan la única alternativa práctica de instrumental capilar para estos casos. Además, los viscosímetros de extrusión capilar pueden permitir al operador variar la velocidad o tensión de corte, permitiendo así la caracterízación de fluidos no newtonianos. El capítulo (911) no trata dichos dispositivos. Medición de la Viscosidad Newtoniana Usando un Viscosímetro Rotatorio El principio del método consiste en medir la fuerza (torque) que actúa sobre un rotor cuando éste gira a una velocidad angular constante (velocidad de rotación) en un líquido. Los viscosímetros rotatorios se usan para medir la viscosidad de los fluidos newtonianos o la viscosidad aparente de fluidos no newtonianos. Los métodos y procedimientos detallados para los instrumentos giratorios se proveen en el capítulo Viscosidad-Métodos Rotatorios (912). La medición de la viscosidad newtoniana se puede realizar en viscosímetros/reómetros rotatorios siguiendo los métodos y procedimientos propuestos en el capítulo Viscosidad-Métodos Rotatorios (912). La viscosidad calculada de los fluidos newtonianos debe ser la misma (dentro del error experimental), sin importar la velocidad de corte (o velocidad de rotación). E
• REOLOGÍA No NEWTONIANA
La ley de Newton de la deformación o flujo viscoso, tratada en la sección sobre viscosidad newtoniana, describe la relación entre una tensión aplicada, u, y el flujo resultante con una velocidad de corte, o gradiente de velocidad, de f. Los sistemas dispersos (es decir, suspensiones o emulsiones) o fluidos que contienen componentes macromoleculares, por lo regular no obedecen a la ley de Newton. Estas excepciones al comportamiento newtoniano son los temas a tratar en esta sección.
Información General/ (1911) Reometría 2209
USP 39
No es rígida la categorización de tales excepciones en distintos comportamientos de flujo tales como adelgazamiento por corte (pseudoplástico), engrosamiento por corte (dilatante), Bingham, entre otros. Los fluidos no newtonianos pueden presentar un comportamiento reológico diferente, dependiendo de la velocidad de corte, la tensión de corte y la temperatura. El comportamiento reológico que depende del tiempo, tal como reopexia o tixotropía, no se considera en este capítulo. El comportamiento reológico de un fluido no newtoniano es evidente cuando la tensión de corte se grafica como una función de la velocidad de corte. La relación tensión de corte-velocidad de corte para composiciones newtonianas es lineal y pasa a través del origen, mientras que la relación tensión de corte-velocidad de corte para fluidos no newtonianos no es lineal y puede no pasar a través del origen, o es lineal pero no pasa a través del origen (cuerpo de Bingham). Las curvas de flujo o reogramas de algunos fluidos no newtonianos típicos se contrastan con aquellos fluidos newtonianos de la Figura 3.
Bingham
Velocidad de corte (s-1 )
Figura 3. Reogramas de fluidos newtonianos y de fluidos no newtonianos típicos independientes del tiempo. Todos los reogramas de la Figura 3 se pueden describir mediante la ecuación Herschel-Bulkley: O"
= K . r·n + O"o
(7)
a K
= tensión de corte, en Pa = coeficiente de consistencia t = velocidad de corte, en s-1 n = índice de comportamiento del flujo a0 = tensión de cedencia, en Pa Para fluidos newtonianos y fluidos plásticos de Bingham, K se designa como la viscosidad (r¡) y la viscosidad plástica (r¡p 1), respectivamente. Debido a que la viscosidad de fluidos newtonianos y la viscosidad plástica de los fluidos plásticos de Bingham son independientes de la tensión de corte o de la velocidad de corte, el índice de comportamiento del flujo, n, es igual a 1 para fluidos newtonianos y para los fluidos plásticos de Bingham. Para fluidos con adelgazamiento por corte, O< n < 1, y para fluidos con engrosamiento por corte, 1 < n < oo. El adelgazamiento por corte se puede observar en ciertas soluciones complejas tales como soluciones hidrocoloidales acuosas. El comportamiento dilatante por lo general se presenta en suspensiones concentradas de partículas sólidas monodispersas sin agregación tales como mezclas de almidón de maíz y agua. A viscosidades muy elevadas o tensiones de corte muy bajas, los fluidos plásticos de Bingham presentan una tensión de cedencia, a0, que es una tensión de corte por debajo de la cual no ocurre ninguna deformación aparente (Figura 3). Otros fluidos no newtonianos no parecen presentar una tensión de cedencia, a 0, debido a que el flujo se presenta a incluso tensiones de corte muy bajas. Por ende, para cuerpos no Binghamianos, ante la ausencia de a 0 la ecuación Herschel-Bulkley se reduce a la ley de potencia, es decir, la ecuación Ostwald-de Waele:
(8) Muchos materiales farmacéuticos macromoleculares presentan un comportamiento no newtoniano en solución. Aunque la viscosidad de los fluidos newtonianos es una constante, es decir, r¡ = a/f de modo que r¡ es independente de la velocidad de corte o tensión de corte, para los fluidos no newtonianos no existe un valor único de viscosidad porque la viscosidad de los fluidos no newtonianos varía con la velocidad de corte o la tensión de corte. Por lo tanto, resulta inapropiado aplicar el concepto newtoniano de viscosidad a fluidos no newtonianos. El valor de viscosidad observado para un fluido no newtoniano es una viscosidad aparente, r¡ªPP' y es una función de las condiciones de medición. A medida que la velocidad
USP 39
221 O (1911) Reometría / Información General
de corte o la tensión de corte cambia, es probable que también cambie la viscosidad aparente. La Figura 4 ilustra la dependencia que tiene 17app de la velocidad de corte para una solución acuosa de un hidrocoloide típico.
!_ Región de la _I 1
Ley de Potencia
1
10º
104 10°
10'
10'
Velocidad de corte (s- 1 )
Figura 4. Gráfica log-log de la dependencia que tiene
de la velocidad de corte para una solución acuosa de un hidrocoloide típico.
17app
La Figura 4 ilustra viscosidades aparentes, r¡ªPP' que van desde valores altos a velocidades muy bajas de corte hasta valores bajos a velocidades muy altas de corte. Las asíntotas de la curva-correspondientes a la viscocidad de corte cero (r¡ 0) y a la viscosidad de corte infinito (77 )-junto con la región log-log lineal a velocidades intermedias de corte, son características del comportamiento de adelgazamiento por corte de estos materiales. Durante el transcurso de la fabricación, los materiales del proceso que presentan un comportamiento no newtoniano se pueden someter a intervalos amplios de velocidades de corte y tensiones de corte. Las condiciones dinámicas de los fluidos durante el almacenamiento y la administración del medicamento, así como la liberación de los componentes activos, podrían ampliar aún más dichos intervalos. Para materiales que presentan un comportamiento no newtoniano en una solución o dispersión, el perfil reológico (reograma o curva de flujo), conforme a lo descrito en la Figura 3, provee una mejor caracterización funcional que una simple medición de la viscosidad aparente a una sola velocidad de corte. La determinación de perfiles reológicos de las soluciones o dispersiones no newtonianas requiere el uso de un reómetro o viscosímetro capaz de medir el comportamiento reológico en todo el intervalo de velocidades de corte y/o tensiones de corte que abarcan las condiciones con las que podría encontrarse el excipiente o producto. La caracterización matemática exacta de la deformación y flujo de una sustancia de prueba requiere la delineación precisa de las dimensiones de la muestra, de las fuerzas aplicadas y de la deformación o flujo resultante. Los instrumentos que permiten un análisis minucioso y geométricamente exacto de la deformación y del flujo se denominan reómetros absolutos. Estos reómetros son los preferidos para mediciones de fluidos no newtonianos de modo que los resultados puedan ser comparables de instrumento a instrumento para intervalos correspondientes de tensiones de corte y de velocidades de corte. Cuando el flujo o la deformación no está bien definida o es indeterminada, cabe la posibilidad de que las mediciones resultantes correspondan, en el mejor de los casos, a aproximaciones del verdadero comportamiento reológico de la muestra. Los reómetros que pueden proveer información útil sobre el comportamiento del material, pero que no permiten determinar el verdadero carácter reológico del material, se conocen como reómetros relativos. Dichos instrumentos están sujetos a limitaciones dependientes de la geometría. Los resultados obtenidos con reómetros relativos por lo general no son comparables a los obtenidos con los reómetros absolutos o a otros reómetros relativos configurados de forma distinta. Los reómetros relativos a menudo reciben el nombre de viscosímetros. No obstante, el término viscosímetro debe reservarse para un subconjunto de reómetros que miden únicamente un flujo de corte constante y la viscosidad newtoniana correspondiente. El control de la temperatura durante el transcurso de la medición es crítico para la evaluación reológica de fluidos no newtonianos. La siguiente ecuación tipo Arrhenius a menudo se usa para caracterizar las propiedades de flujos newtonianos y no newtonianos en función de la temperatura: 00
l
=A _
8 [~[Y-T:1))
(9)
1lref
r¡ 17ret
A E0 R
= viscosidad newtoniana o no newtoniana a alguna temperatura absoluta T = viscosidad newtoniana o no newtoniana a alguna temperatura de referencia = constante = energía para el flujo viscoso = constante universal de los gases
T,e1
Información General/ (1911) Reometría 2211
USP 39
Las energías para el flujo viscoso y la constante A se determinan a partir de datos experimentales. La disipación de energía por el fluido viscoso depende de la geometría del sistema de medición, el control de temperatura, la velocidad de corte y la tensión de corte, pero se observa un aumento en la variabilidad particularmente a velocidades altas de corte y en fluidos que presentan una viscosidad aparente elevada. Las temperaturas de muestras de fluidos no newtonianos deben controlarse con una aproximación de ±0, 1 º, como en el caso de las mediciones de viscosidad newtoniana. Medición de la Viscosidad Usando un Reómetro Rotatorio Los reómetros rotatorios representan una alternativa más útil a la mayoría de los viscosímetros capilares para medir las características reológicas de fluidos no newtonianos siempre que se puedan minimizar las variaciones en la velocidad de corte, en la temperatura de la muestra y en los efectos en los extremos y los bordes. Los diseños de reómetros rotatorios absolutos más comunes incluyen los de cilindro concéntrico (coaxial), los de cono y placa, y los instrumentos de placas paralelas. Todos ellos se encuentran disponibles en modelos que pueden proveer datos reológicos absolutos-es decir, datos que no requieren correcciones importantes para efectos en los extremos y los bordes, calentamiento viscoso o variaciones en la velocidad de corte o tensión de corte en la muestra que se está evaluando. Los reómetros de huso rotatorioque a menudo se describen como viscosímetros-son reómetros relativos que por lo general se usan para evaluar la viscosidad aparente. Un factor adicional con todos los reómetros/viscosímetros que debe tomarse en cuenta, en particular con materiales multifase, es la potencial formación de una capa delgada menos viscosa de fluido en la pared del instrumento. Cuando se presentan efectos de pared o deslizamiento en la pared, las mediciones del instrumento pueden ser engañosas debido al comportamiento reológico verdadero de la muestra. La identificación de los efectos de pared es específica para cada instrumento. Un método útil consiste en comparar los resultados de un rotor rugoso en comparación con uno liso. Los fabricantes de instrumentos por lo general proveen recomendaciones para identificar y corregir el deslizamiento en la pared. Por lo general, la calibración, operación y limpieza de los reómetros se debe llevar a cabo de acuerdo con las recomendaciones del fabricante del instrumento. El capítulo general Viscosidad-Métodos Rotatorios (912) describe los procedimientos para los tipos más comunes de reómetros: reómetros de huso (viscosímetros) y de cilindro concéntrico (coaxiales), de cono y placa, e instrumentos de placas paralelas (discos paralelos). Cálculo de la velocidad de corte, tensión de corte y viscosidad usando un reómetro de cilindro concéntrico (coaxial): Para líquidos no newtonianos, resulta esencial especificar la tensión de corte, cr, o la velocidad de corte, y, a la que se mide la viscocidad. Cuando se presentan condiciones de brecha estrecha (condiciones satisfechas en reómetros absolutos), la velocidad de corte yen s- 1 y la tensión de corte cr, en Pa (N · m- 2 o kg · m- 1 • s- 2), se calculan usando las ecuaciones siguientes: ~o)
(11)
R0 R,
= radio del cilindro externo (m) = radio del cilindro interno (m) OJ = velocidad angular (radianes/s) M = torque que actúa sobre la superficie del cilindro (N · m) h =altura de inmersión del cilindro interno en el medio líquido (m) Por lo general, la viscosidad angular se puede calcular usando la ecuación:
m=(~~}
(12)
n
= velocidad rotacional, en revoluciones por minuto (rpm) Para flujo laminar, la viscosidad r¡ (o viscosidad aparente TlApp), en Pa · s, se proporciona mediante la siguiente ecuación: [NOTA-1 Pa. s = 1000 mPa. s.]
k = constante del aparato (radianes/m 3) Cálculo de la velocidad de corte, tensión de corte y viscosidad usando un reómetro de cono y placa: La velocidad de corte, y, en s- 1 y la tensión de corte, cr, en Pa, se calculan usando las ecuaciones siguientes:
2212 (1911) Reometría / Información General
USP 39
r=(: )m
~~[ ~:R' JM a R
(14)
(1s)
ángulo entre la placa plana y el cono (radianes) radio del cono (m) w velocidad angular (radianes/s) M torque que actúa sobre la superficie del cilindro (N · m) Para flujo laminar, la viscosidad r¡ (o viscosidad aparente 1'/App), en Pa · s, se provee mediante la siguiente ecuación: = = = =
~ ó ~App=( 2 !;3 )(:)=k: k
(16)
= constante del aparato (radianes/m3)
Medición de Propiedades Reológicas Usando un Reómetro No Rotatorio
Los procedimientos alternativos con reómetros no rotatorios para medir propiedades reológicas de fluidos no newtonianos incluyen reómetros de ranura, reómetros basados en corte oscilatorio de amplitud grande y pequeña, y reómetros elongacionales de ruptura capilar. Los fabricantes de equipo por lo general proveen procedimientos detallados, además de que estos instrumentos y métodos pueden ser apropiados para su uso después de que los usuarios hayan completado los estudios de caracterización y validación para el equipo y el material en análisis. Estos tipos de reómetros no se describen en el capítulo Viscosidad-Métodos Rotatorios (912) puesto que no son reómetros rotatorios.
Suplementos Dietéticos/ (2021) Pruebas de Recuento Microbiano 221 3
USP 39
Capítulos de Suplementos Dietéticos Información General (2021) PRUEBAS DE RECUENTO MICROBIANO-SUPLEMENTOS NUTRICIONALES Y DIETÉTICOS INTRODUCCIÓN Este capítulo describe una serie de pruebas utilizadas para estimar el número de microorganismos aerobios viables presentes en suplementos nutricionales de todo tipo, desde materias primas hasta productos finales. Pueden utilizarse otros métodos en lugar de estas pruebas, siempre y cuando se haya comprobado debidamente que sus resultados son equivalentes o mejores. Durante la preparación y realización de las pruebas, deben tomarse las precauciones asépticas necesarias para la manipulación de las muestras. El término "crecimiento" se usa aquí con un sentido especial y se refiere a la presencia y supuesta proliferación de microorganismos viables.
PRUEBAS PREPARATORIAS La validez de los resultados de las pruebas que se describen en este capítulo depende, en gran medida, de que pueda demostrarse de manera adecuada, que en las condiciones de prueba, las muestras en análisis no inhiben por sí solas la multiplicación de los microorganismos que pudieran estar presentes. En consecuencia, antes de realizar una prueba habitualmente y, si las circunstancias lo exigen, con posterioridad a la misma, se deben inocular las muestras diluidas del material que se desea analizar con cultivos viables separados de los microorganismos de desafío. En el caso del Medio Agar Digerido de Caseína y Soja utilizado para el Recuento Total de Microorganismos Aerobios, inocular dos placas iguales con 25-250 ufc de Staphylococcus aureus (ATCC 1 Nº 6538), Escherichia coli (ATCC Nº 8739) y Bacillus subtilis (ATCC Nº 6633) para demostrar una recuperación de biocarga mayor de 70% en comparación con un medio de control. Para el Medio Agar Sabouraud Dextrosa utilizado para el Recuento Combinado Total de Hongos Filamentosos y Levaduras, inocular dos placas iguales con 25-250 ufc de Candida albicans (ATCC Nº 10231) y Aspergillus brasiliensis (ATCC Nº 16404) para demostrar una recuperación de biocarga mayor de 70% en comparación con un medio de control. Para las Determinaciones del Número Probable de Enterobacterias (Bacterias Gram-Negativas Tolerantes a la Bilis), se utilizan diluciones adecuadas de Escherichia coli (ATCC Nº 8739) y Salmonel/a typhimurium (ATCC Nº 13311 ). Si el o los microorganismos no crecen en el medio pertinente, queda invalidada esa parte del análisis y debe modificarse el procedimiento (1) mediante un aumento en el volumen de diluyente, manteniendo la misma cantidad de material de prueba, o (2) mediante la incorporación de una cantidad suficiente de agentes inactivantes adecuados en los diluyentes, o (3) mediante una combinación adecuada de modificaciones en (1) y (2) para permitir el crecimiento del inóculo. Los siguientes son ejemplos de ingredientes y las concentraciones en las que pueden agregarse al medio de cultivo para neutralizar las sustancias inhibidoras presentes en la muestra: lecitina de soja, 0,5%; y polisorbato 20, 4,0%. Como alternativa, se puede repetir la prueba según se describe en el párrafo anterior, utilizando Medio Líquido de Digerido de Caseína-Lecitina de Soja-Polisorbato 20 para demostrar la neutralización de los conservantes u otros agentes antimicrobianos presentes en el material de prueba. En aquellos casos en que el producto contenga sustancias inhibidoras y sea soluble, puede utilizarse una adaptación validada adecuada de uno de los procedimientos que se describen en Procedimientos utilizando el Método de Filtración por Membrana.
1 Disponible a través de ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209. Pueden utilizarse microorganismos equivalentes en lugar de cepas ATCC, siempre y cuando procedan de un banco de microorganismos nacional. No obstante, los microorganismos viables empleados en la prueba no deben pasarse más de cinco veces del cultivo ATCC o de un banco nacional original.
2214 (2021) Pruebas de Recuento Microbiano / Suplementos Dietéticos
USP 39
Si a pesar de la incorporación de agentes inactivantes apropiados y un aumento sustancial del volumen de diluyente, aún no es posible recuperar los cultivos viables descritos anteriormente y si no es posible utilizar el método de filtración por membrana con ese artículo, puede suponerse que la imposibilidad de aislar el microorganismo inoculado es atribuible a una actividad bactericida o bacteriostática de tal magnitud que los tratamientos no pueden anularla. Esta información permite deducir que no es probable que el artículo permita la proliferación o contaminación con esa determinada especie de microorganismo. Debería realizarse un seguimiento continuo para determinar el intervalo inhibidor y la actividad bactericida del artículo.
SOLUCIÓN AMORTIGUADORA V MEDIOS Los medios de cultivo pueden prepararse según se indica a continuación, o bien pueden utilizarse medios de cultivo deshidratados, siempre y cuando, una vez reconstituidos según las indicaciones del fabricante o distribuidor, contengan ingredientes similares y/o produzcan medios comparables a los obtenidos con las fórmulas aquí proporcionadas. Para preparar un medio según las fórmulas que aquí se describen, disolver los sólidos solubles en el agua, usando calor si fuera necesario para lograr una completa disolución y agregar soluciones de ácido clorhídrico o hidróxido de sodio en cantidades suficientes para obtener el pH deseado en el medio cuando esté listo para usar. Determinar el pH a 25 ± 2º. Cuando la fórmula requiera agar, usar agar que contenga una humedad no mayor de 15%. Cuando la fórmula requiera agua, usar Agua Purificada.
Solución Amortiguadora de Fosfato de pH 7,2 Preparar una solución madre disolviendo 34 g de fosfato monobásico de potasio en aproximadamente 500 ml de agua en un matraz volumétrico de 1000 ml. Ajustar a un pH de 7,2 ± O, 1 agregando hidróxido de sodio SR (aproximadamente 175 ml), agregar agua a volumen y mezclar. Verter en recipientes y esterilizar. Almacenar bajo refrigeración. Antes de utilizar, diluir la solución madre con agua en una proporción de 1-800, verter en un recipiente adecuado y esterilizar.
Medios Preparar los medios para las pruebas según se describe a continuación. Como alternativa, pueden utilizarse formulaciones deshidratadas siempre y cuando, una vez reconstituidas según las indicaciones del fabricante o distribuidor, cumplan con los requisitos de la Prueba de Promoción del Crecimiento. A menos que se indique lo contrario en otra parte de este capítulo, los medios deben esterilizarse en autoclave utilizando un proceso validado. El tiempo de exposición dentro del autoclave a una temperatura de 121 ºdependerá del volumen de medio que se desee esterilizar. En consecuencia, por ejemplo, un volumen de 500 ml debería esterilizarse en el autoclave utilizando una relación de temperatura y tiempo que asegure que el medio ha alcanzado al menos un F0 de 12-15 en el proceso de esterilización. No obstante, el tiempo y la temperatura adecuados para la esterilización de medios preparados a un volumen determinado deberían confirmarse mediante un estudio de penetración térmica colocando un termopar o una termosonda dentro del medio líquido. MEDIO LÍQUIDO DE DIGERIDO DE CASEÍNA-LECITINA DE SOJA-POUSORBATO 20 Digerido Pancreático de Caseína
20 g
Lecitina de Soja
5g
Polisorbato 20
40ml
Agua
960 ml
Disolver el Digerido Pancreático de Caseína y la Lecitina de Soja en 960 ml de agua, calentando en un baño de agua a una temperatura de 48º-50º durante aproximadamente 30 minutos para lograr la disolución. Agregar 40 ml de Polisorbato 20. Mezclar, verter en un recipiente adecuado y esterilizar. MEDIO AGAR DIGERIDO DE CASEÍNA Y SOJA Digerido Pancreático de Caseína
15,0 g
Diqerido Papaínico de Harina de Soja
5,0 q
Cloruro de Sodio
5,0 g
Agar
15,0 q
Agua
1000 ml
pH después de la esterilización: 7,3 ± 0,2
Suplementos Dietéticos/ (2021) Pruebas de Recuento Microbiano 2215
USP 39
MEDIO LÍQUIDO DE DIGERIDO DE CASEÍNA Y SOJA Digerido Pancreático de Caseína
17,0 g
Digerido Papaínico de Harina de Soja
3,0 g
Cloruro de Sodio
5,0 g
Fosfato Dibásico de Potasio
2,5 g
Dextrosa
2,5 g
Agua Purificada
1000 mL
Disolver los sólidos en el agua, calentando ligeramente para lograr la disolución. Enfriar la solución a temperatura ambiente y ajustar el pH con hidróxido de sodio 1 N de modo que, después de la esterilización, tenga un pH de 7,3 ± 0,2. Filtrar, si fuera necesario, y verter en recipientes adecuados. Esterilizar a una relación de temperatura y tiempo que asegure que el medio ha alcanzado al menos un F0 de 12-15 en el proceso de esterilización, o mediante un proceso de filtración validado. MEDIO AGAR SABOURAUD DEXTROSA Dextrosa
40,0 g
Mezcla de Digerido Péptico de Tejido Animal y Digerido Pancreático de Caseína (1 :1)
10,0 g
Agar
15,0 g
Agua
1000 mL
Mezclar y calentar a ebullición para disolver. pH después de la esterilización: 5,6 ± 0,2 AGAR VIOLETA ROJO BILIS CON GLUCOSA Y LACTOSA Extracto de Levadura
3,0 q
Diqerido Pancreático de Gelatina
7,0 q
Sales Biliares
1,5 g
Lactosa
10,0 g
Cloruro de Sodio
5,0 g
D-Glucosa Monohidrato
10,0 g
Agar
15,0 g
Rojo Neutro
30 mg
Cristal Violeta
2 mg
Aqua
1000 mL
Ajustar el pH para que sea de 7,4 ± 0,2 después de calentar. Calentar hasta el punto de ebullición, pero no calentar en autoclave. Verter en placas. CALDO MOSSEL PARA ENRIQUECIMIENTO DE ENTEROBACTERIAS Digerido Pancreático de Gelatina
10,0 g
D-Glucosa Monohidrato
5,0 g
Bilis de Buey Deshidratada
20,0 g
Fosfato Monobásico de Potasio
2,0 g
Fosfato Dibásico de Potasio
8,0 g
Verde Brillante
15 mg
Agua
1000 mL
Suspender los sólidos en agua y calentar hasta el punto de ebullición durante 1-2 minutos. Transferir porciones de 120 mL a matraces volumétricos de 250 mL o porciones de 9 mL a tubos de ensayo y tapar con tapones de algodón o tapas no ajustadas. Calentar en un baño de vapor durante 30 minutos. Ajustar el pH para que sea de 7,2 ± 0,2 después del calentamiento.
2216 (2021) Pruebas de Recuento Microbiano/ Suplementos Dietéticos
USP 39
PRUEBA DE PROMOCIÓN DEL CRECIMIENTO Cada lote de medio deshidratado que lleve el número de identificación del fabricante, o cada lote de medio preparado a partir de ingredientes básicos, debe analizarse para determinar las respectivas cualidades de promoción del crecimiento. Para ello se usan cultivos de Staphylococcus aureus (ATCC Nº 6538), Escherichia coli (ATCC Nº 8739), Bacillus subtilis (ATCC Nº 6633), Candida albicans (ATCC Nº 10231) y Aspergillus brasiliensis (ATCC Nº 16404). En la primera dilución, puede utilizarse una dilución de 10-3 de un cultivo de 24 horas en caldo del microorganismo (en Solución Amortiguadora de Fosfato de pH 1,2 o Medio Líquido de Digerido de Caseína y Soja) como inóculos. Estriar en serie las placas que contienen el medio con los inóculos adecuados a fin de obtener colonias aisladas para comprobar las cualidades de promoción del crecimiento de los medios Agar Digerido de Caseína y Soja y Agar Sabouraud Dextrosa. Inocular el Medio Líquido de Digerido de Caseína y Soja y el Caldo Mossel para Enriquecimiento de Enterobacterias con 10-100 ufc de los microorganismos de desafío adecuados para comprobar sus cualidades de promoción del crecimiento.
MUESTREO Suministrar muestras de 1O mL o 1Og para las pruebas requeridas en la monografía correspondiente.
PROCEDIMIENTO Preparar la muestra que se desea analizar con un tratamiento que sea adecuado a las características físicas de la misma y que no altere el número y tipo de microorganismos presentes originalmente, a fin de obtener una solución o suspensión de la totalidad o parte de la muestra en una forma que sea adecuada para los procedimientos de prueba que se deben llevar a cabo. En el caso de sólidos que se disuelven en parte pero no totalmente, reducir la sustancia a un polvo moderadamente fino, suspenderlo en el vehículo especificado y proceder según se indica en Recuento Total de Microorganismos Aerobios. En el caso de muestras líquidas que constan de una solución verdadera, o una suspensión en agua o un vehículo hidroalcohólico que contenga menos de 30% de alcohol, y para aquellos sólidos de disolución fácil y casi total en 90 mL de Solución Amortiguadora de Fosfato de pH 7,2 o en los medios especificados, proceder según se indica en Recuento Total de Microorganismos Aerobios. En el caso de productos inmiscibles en agua, preparar una suspensión con ayuda de una cantidad mínima de un agente emulsionante estéril adecuado (por ejemplo, uno de los polisorbatos), utilizando una licuadora mecánica y calentando a una temperatura que no exceda de 45º, si fuera necesario, y proceder con la suspensión según se indica en Recuento Total de Microorganismos Aerobios.
Recuento Total de Microorganismos Aerobios En el caso de muestras fácilmente solubles, usar el Método de Filtración por Membrana o el Método en Placa. En el caso de muestras que son lo suficientemente solubles o translúcidas para permitir el uso del Método en Placa, usar dicho método; de lo contrario, usar el Método en Tubos Múltiples. Con cualquiera de los métodos, primero disolver o suspender 10,0 g de la muestra si es sólida, o 1O mL, medidos con exactitud, si la muestra es líquida, en Solución Amortiguadora de Fosfato de pH 7,2, Medio Líquido de Digerido de Caseína y Soja o Medio Líquido de Digerido de Caseína-Lecitina de Soja-Polisorbato 20 hasta obtener 100 ml. En el caso de muestras viscosas que no se puedan pipetear a esta dilución inicial de 1 :1 O, diluir la muestra hasta obtener una suspensión, es decir, 1:50ó1:100, etc., que pueda pipetearse. Realizar la prueba de ausencia de propiedades inhibidoras (antimicrobianas) según se describe en Pruebas Preparatorias antes de determinar el Recuento Total de Microorganismos Aerobios. Agregar la muestra al medio no más de 1 hora después de preparar las diluciones adecuadas para inoculación. MÉTODO DE FILTRACIÓN POR MEMBRANA Diluir el líquido aún más, si fuera necesario, para que 1 mL permita obtener 30-300 colonias. Pipetear y transferir 1 mL de la dilución final a 5-1 O mL de Solución Amortiguadora de Fosfato de pH 7,2, Medio Líquido de Digerido de Caseína y Soja o Medio Líquido de Digerido de Caseína-Lecitina de Soja-Polisorbato 20. Lavar cada membrana con una cantidad adecuada de uno de los diluyentes anteriores. Transferir cada membrana a una placa de Petri que contenga Medio Agar Digerido de Caseína y Soja, previamente solidificado a temperatura ambiente. Incubar las placas a una temperatura de 30º-35º durante 48-72 horas. Una vez finalizada la incubación, observar las placas para verificar el crecimiento del microorganismo, contar el número de colonias y expresar el promedio de las dos placas en términos del número de microorganismos por g o por mL de muestra. En caso de no recuperarse colonias microbianas de las placas que representen la dilución inicial 1: 1O de la muestra, expresar los resultados como "menos de 1 O microorganismos por g o por mL de muestra".
Suplementos Dietéticos/ (2021) Pruebas de Recuento Microbiano 2217
USP 39
MÉTODO EN PLACA Diluir el líquido aún más, si fuera necesario, para que 1 mL permita obtener 30-300 colonias. Pipetear y transferir 1 mL de la dilución final a dos placas de Petri estériles. Agregar de inmediato a cada placa 15-20 mL de Medio Agar Digerido de Caseína y Soja, previamente fundido y enfriado a aproximadamente 45º. Cubrir las placas de Petri, mezclar la muestra con agar inclinando ligeramente o rotando suavemente las placas, y dejar que el contenido se solidifique a temperatura ambiente. Invertir las placas de Petri e incubar durante 48-72 horas. Una vez finalizada la incubación, observar las placas para verificar el crecimiento del microorganismo, contar el número de colonias y expresar el promedio de las dos placas en términos del número de microorganismos por g o por mL de muestra. En caso de no recuperarse colonias microbianas de las placas que representen la dilución inicial 1 :1 O de la muestra, expresar los resultados como "menos de 1 O microorganismos porgo por mL de muestra". MÉTODO EN TUBOS MÚLTIPLES Colocar en cada uno de 14 tubos de ensayo de tamaño similar, 9,0 mL de Medio Líquido de Digerido de Caseína y Soja estéril. Distribuir 12 de los tubos en cuatro juegos de tres tubos cada uno. Dejar a un lado un juego de tres tubos para utilizarlo como control. Mediante una pipeta, transferir 1 mL de la solución o suspensión de la muestra en cada uno de los tres tubos de un juego ("l 00") y en un cuarto tubo (A), y mezclar. Pipetear 1 mL del tubo A y transferir al tubo restante (B), no incluido en un juego, y mezclar. Estos dos tubos contienen 100 mg o 100 µL y 1 O mg o 1O µL de la muestra, respectivamente. En cada uno de los tres tubos del segundo juego ("1 O"), pipetear y tranferir 1 mL del tubo A y en cada tubo del tercer juego ("1 "), pipetear y transferir 1 mL del tubo B. Desechar el contenido no utilizado de los tubos A y B. Cerrar bien e incubar todos los tubos. Una vez incubados, observar los tubos para verificar el crecimiento del microorganismo: los tres tubos de control se mantienen transparentes y los resultados observados en los tubos que contienen la muestra, interpretados según la Tabla 7, indican el número más probable de microorganismos por g o por ml. Tabla 1. Recuento Más Probable según el Método en Tubos Múltiples Combinaciones Observadas de Números de Tubos que Muestran Crecimiento en Cada Juego Número de mg o µL de muestra por tubo 100
10
1
Número Más Probable de Microorganismos por q o por ml
3
3
3
Más de 1100
3
2
1100
3 3
3
1
500
3
3
o
200
3
2
3
290
3
2
2
210
3
2
1
150
3
2
o
90
3
1
3
160
3
1
2
120
3
1
1
70
3
1
o
40
3
3
o o o o
2
2
3 3
3
95
2
60
1
40
o o
23 20
21
2
1
1
2
1
o
15
2
1
14
2
o o
1
2
1
1
1
o
o o
1
o
o o o o o o
9 11 7 4 3 <3
2218 (2021) Pruebas de Recuento Microbiano/ Suplementos Dietéticos
USP 39
Recuento Total Combinado de Hongos Filamentosos y Levaduras PROCEDIMIENTO Proceder según se indica en Método de Filtración por Membrana o Método en Placa en Recuento Total de Microorganismos Aerobios, pero utilizar la misma cantidad de Medio Agar Sabouraud Dextrosa en lugar de Medio Agar de Digerido de Caseína y Soja e incubar las placas durante 5-7 días a una temperatura de 20º-25º. PRUEBAS ADICIONALES Para confirmar un resultado dudoso obtenido con cualquiera de los procedimientos descritos, después de su aplicación a una muestra de 1Og, puede realizarse una nueva prueba con una muestra adicional de 1Og tomada de la muestra original y una muestra de 1Og tomada de la nueva muestra del suplemento nutricional. Proceder según se indica en Procedimiento.
Recuento de Enterobacterias (Bacterias Gram-negativas Tolerantes a la Bilis) Disolver o suspender la muestra en un volumen suficiente de Solución Amortiguadora de Fosfato de pH 7,2 o en Medio Líquido de Digerido de Caseína y Soja y diluir con Medio Líquido de Digerido de Caseína y Soja hasta 100 ml. Pre-incubar durante 2-5 horas a 20º-25º en diluyente de Caldo de Digerido de Caseína y Soja; inocular cantidades adecuadas de Caldo Mossel para Enriquecimiento de Enterobacterias para que contengan O, 1; 0,01 ó 0,001 g o mL del producto. Incubar a 30º-35º durante 24-48 horas. Subcultivar en una placa de Agar Violeta Rojo Bilis con Glucosa y Lactosa e incubar a 30º-35º durante 18-24 horas. El crecimiento de colonias bien desarrolladas de bacterias Gram-Negativas, generalmente de color rojo o rojizo, revela la presencia de enterobacterias. Determinar el número más probable de microorganismos porgo por mL refiriéndose a la Tabla 2. Tabla 2. Recuento Más Probable de Enterobacterlas Presencia Observada de Enterobacterlas Número de g o ml de muestra por tubo +
+
+
+
-
Número Más Probable de Enterobacterlas por g o porml Más de 103 Menos de 10 3 pero más de 102
+
-
-
Menos de 102 pero más de 101
-
-
-
Menos de 101
0,1
0,01
0,001
+
(2022) PROCEDIMIENTOS MICROBIOLÓGICOS PARA COMPROBAR LA AUSENCIA DE MICROORGANISMOS ESPECÍFICOS-SUPLEMENTOS NUTRICIONALES Y DIETÉTICOS INTRODUCCIÓN Las buenas prácticas de fabricación establecen que los productos nutricionales y dietéticos no estériles deben estar libres de microorganismos inaceptables. Un microorganismo se considera inaceptable si representa un riesgo potencial para la salud de la persona que utiliza el producto según las indicaciones, o si tal microorganismo puede desarrollarse en el producto. Los microorganismos inaceptables se definen como contaminantes que, según la especie microbiana a la que pertenecen, el número de microorganismos, la forma farmacéutica, el uso que se le pretende dar al producto y la población de pacientes, podrían tener un impacto adverso sobre la seguridad del producto. Los microorganismos también pueden considerarse inaceptables si afectan en forma adversa la estabilidad del producto o si pueden dañar la integridad del sistema de cierre del envase. En este capítulo se describen las pruebas a las que deben someterse los productos nutricionales y dietéticos para la detección de determinados microorganismos especificados en las monografías individuales o cuya ausencia se recomienda en la sección Atributos Microbiológicos de los Suplementos Nutricionales y Dietéticos No Estériles (2023). Cuando no se especifican microorganismos inaceptables en una determinada monografía, es responsabilidad de los fabricantes determinar cuáles son los microorganismos inaceptables en sus productos. No es necesario probar todos los productos nutricionales y dietéticos no estériles para verificar que no contengan ninguno de los microorganismos mencionados en este capítulo, ni tampoco se deben restringir las pruebas a los microorganismos enumerados en este capítulo.
USP 39
Suplementos Dietéticos/ (2022) Procedimientos Microbiológicos 2219
Pueden utilizarse otros métodos microbiológicos, fisicoquímicos y biotecnológicos, incluyendo métodos automatizados, en lugar de estas pruebas, siempre y cuando se haya determinado que son igualmente eficaces para verificar que las sustancias cumplen con los requisitos.
SOLUCIÓN AMORTIGUADORA Y MEDIOS Consideraciones Generales Ver Solución Amortiguadora y Medios en Pruebas de Recuento Microbiano-Suplementos Nutricionales y Dietéticos (2021 ). Debe evaluarse cada medio para determinar si es adecuado para el propósito para el que se lo va a utilizar. También se utiliza Medio Líquido de Digerido de Caseína-Soja para Pruebas Preparatorias para evaluar si dichos medios son adecuados para promover el desarrollo de los microorganismos especificados. Para otros medios, estriar placas de agar de tal modo que se obtengan colonias aisladas de los microorganismos adecuados e inocular los medios líquidos con los microorganismos correspondientes a una concentración final de menos de 100 ufc por ml. Observar su crecimiento para establecer si los medios son adecuados.
Solución Amortiguadora Solución Amortiguadora Madre y Solución Amortiguadora de Fosfato de pH 7,2-Proceder como se indica en Pruebas de Recuento Microbiano-Suplementos Nutricionales y Dietéticos (2021 ).
Medios MEDIO LÍQUIDO DE DIGERIDO DE CASEÍNA-SOJA Preparar según se indica en Pruebas de Recuento Microbiano-Suplementos Nutricionales
y Dietéticos (2021 ).
MEDIO AGAR MANITOL SALADO Digerido Pancreático de Caseína
5,0 g
Digerido Péptico de Tejido Animal
5,0 q
Extracto de Carne
1,0 g
D-Manitol
10,0 g
Cloruro de Sodio
75,0 g
Aqar
15,0 g
Rojo Fenol
0,025 g
Agua
1000 ml
Mezclar, luego calentar agitando frecuentemente y hervir durante 1 minuto para disolver. pH después de la esterilización: 7,4 ± 0,2. MEDIO LÍQUIDO TETRATIONATO Digerido Pancreático de Caseína
2,5 g
Digerido Péptico de Grasa Animal
2,5 g
Sales Biliares
1,0 q
Carbonato de Calcio
10,0 g
Tiosulfato de Sodio
30,0 g
Aqua
1000 ml
Calentar hasta punto de ebullición. No colocar en autoclave; utilizar el mismo día. Inmediatamente antes de utilizar, agregar una solución de 5 g de yoduro de potasio y 6 g de yodo disueltos en 20 mL de agua. Luego agregar 1O mL de una solución de verde brillante (1 en 1000) y mezclar. No calentar después de agregar la solución de verde brillante. MEDIO AGAR-VERDE BRILLANTE Extracto de Levadura
3,0 g
Digerido Péptico de Tejido Animal
5,0 g
Digerido Pancreático de Caseína
5,0 g
USP 39
2220 (2022) Procedimientos Microbiológicos / Suplementos Dietéticos
Lactosa
10,0 g
Cloruro de Sodio
5,0q
Sacarosa
10,0 q
Rojo Fenol
80,0 q
Agar
20,0 q
Verde Brillante
12,5 mq
Aqua
1000 mL
Hervir durante 1 minuto. Esterilizar inmediatamente antes de utilizar, derretir, verter en placas Petri y dejar enfriar. pH después de la esterilización: 6,9 ± 0,2. MEDIO AGAR XILOSA LISINA DESOXICOLATO Xilosa
3,5 g
L-Lisina
5,0g
Lactosa
7,5 q
Sacarosa
7,5 q
Cloruro de Sodio
5,0q
Extracto de Levadura
3,0g
Rojo Fenol
80mg
Agar
13,5 g
Desoxicolato de Sodio (como Sales Biliares)
2,5 g
Tiosulfato de Sodio
6,8 q
Citrato Férrico Amónico
800 mq
Agua
1000 mL
Calentar, agitando por rotación suave, hasta el punto de ebullición. No sobrecalentar ni esterilizar. Transferir de inmediato a un baño de agua mantenido a aproximadamente 50º y verter en placas Petri en cuanto el Medio se haya enfriado. pH final: 7,4 ± 0,2. MEDIO AGAR ENTÉRICO DE HEKTOEN Proteasa Peptona
12,0 g
Extracto de Levadura
3,0 g
Lactosa
12,0 g
Sacarosa
2,0g
Salicina
9,0g
Sales Biliares Nº 3
9,0g
Cloruro de Sodio
5,0g
Tiosulfato de Sodio
5,0g
Citrato Férrico Amónico
1,5 g
Fucsina Ácida
0,1 g
Azul de Bromotimol
65 mg
Aqar
14,0 g
Aqua
1000 mL
Mezclar y dejar en reposo durante 1O minutos. Calentar moderadamente y dejar hervir durante algunos segundos para disolver el agar. No esterilizar. Enfriar a 60º y verter en placas Petri. pH final: 7,5 ± 0,2. MEDIO AGAR DE HIERRO Y TRIPLE AZÚCAR Digerido Pancreático de Caseína
10,0 q
Digerido Pancreático de Tejido Animal
10,0 q
Lactosa
10,0 q
Sacarosa
10,0 q
'
Suplementos Dietéticos/ (2022) Procedimientos Microbiológicos 2221
USP 39
Dextrosa
1,0 g
Sulfato Amónico Ferroso
200 mg
Cloruro de Sodio
5,0 g
Tiosulfato de Sodio
200 mg
Agar
13,0 q
Rojo Fenol
25 mq
Agua
1000 mL
pH después de esterilización: 7,3 ± 0,2. MEDIO AGAR MACCONKEY Digerido Pancreático de Gelatina
17,0 g
Diqerido Pancreático de Caseína
1,5 q
Diqerido Péptico de Tejido Animal
1,5 q
Lactosa
10,0 g
Mezcla de Sales Biliares
1,5 q
Mezcla de Sales de Sodio
5,0q
Aqar
13,5 g
Rojo Neutro
30mg
Cristal Violeta
1,0 mg
Aqua
1000 mL
Hervir durante 1 minuto para disolver. pH después de la esterilización: 7, 1 ± 0,2. MEDIO AGAR DE LEVINE EOSINA-AZUL DE METILENO Digerido Pancreático de Gelatina
10,0 g
Fosfato Dibásico de Potasio
2,0 q
Agar
15,0 g
Lactosa
10,0 g
Eosina Y
400mg
Azul de Metileno
65 mg
Aqua
1000 mL
Disolver con calentamiento el digerido pancreático de gelatina, el fosfato dibásico de potasio y el agar en agua, y dejar enfriar. Inmediatamente antes de usar, licuar la solución de agar gelificada y añadir los ingredientes restantes, en forma de soluciones, en las siguientes cantidades: por cada 100 ml de la solución de agar licuada, añadir 5 ml de solución de lactosa (1 en 5), 2 ml de solución de eosina Y (1 en 50) y 2 ml de solución de azul de metileno (1 en 300). Mezclar. Es posible que el Medio terminado no sea transparente. pH después de la esterilización: 7, 1 ± 0,2. MEDIO AGAR DE BAIRD-PARKER Digerido Pancreático de Caseína
10,0 g
Extracto de Carne
5,0 g
Extracto de Levadura
1,0 g
Cloruro de Litio
5,0 g
Aqar
20,0g
Glicina
12,0 g
Piruvato de Sodio
10,0 g
Aqua
950 mL
Calentar agitando frecuentemente y hervir durante 1 minuto. Esterilizar, enfriar a una temperatura entre 45º y 50º y añadir 1O ml de solución de telurito de potasio estéril (1 en 100) y 50 ml de emulsión de yema de huevo preparada según se indica a continuación. Desinfectar la superficie de la cáscara de los huevos, cascarlos asépticamente, transferir las yemas intactas a una probeta graduada estéril, añadir solución salina estéril SR para obtener una proporción de yema-solución salina de 3 a 7,
2222 (2022) Procedimientos Microbiológicos/ Suplementos Dietéticos
USP 39
incorporar a la taza estéril de la licuadora y mezclar a alta velocidad durante 5 segundos. Mezclar bien todos los ingredientes suavemente y verter en placas. pH después de la esterilización: 6,8 ± 0,2. MEDIO AGAR DE VOGEL-JOHNSON Digerido Pancreático de Caseína
10,0 g
Extracto de Levadura
5,0 g
Manitol
10,0 g
Fosfato Dibásico de Potasio
5,0g
Cloruro de Litio
5,0 CJ
Glicina
10,0 g
Agar
16,0 g
Rojo Fenol
25,0 mg
Agua
1000 mL
Hervir durante 1 minuto. Esterilizar, enfriar a una temperatura entre 45º y 50º potasio estéril (1 en 100). pH después de la esterilización: 7,2 ± 0,2.
y añadir 20 mL de solución de telurito de
MEDIO LÍQUIDO DE SELENITO-CISTINA Diqerido Pancreático de Caseína
5,0 q
Lactosa
4,0 q
Fosfato de Sodio
10,0 g
Selenito Ácido de Sodio
4,0g
L-Cistina
10,0 g
Agua
1000 mL
Mezclar y calentar para disolver. Luego calentar en una corriente durante 15 minutos. No esterilizar. pH final: 7,0 ± 0,2. MEDIO REFORZADO PARA CLOSTRIDIOS Extracto de Carne
10,0 g
Peptona
10,0 q
Extracto de Levadura
3,0 q
Almidón Soluble
1,0 g
Glucosa Monohidrato
5,0g
Clorhidrato de Cisteína
0,5 g
Cloruro de Sodio
5,0 g
Acetato de Sodio
3,0 g
Agar
0,5 g
Agua
1000 ml
Disolver agar en agua calentando hasta el punto de ebullición
y revolviendo en forma continua. Ajustar el pH si es necesario
y esterilizar. pH después de la esterilización: 6,8 ± 0,2. AGAR COLUMBIA · Digerido Pancreático de Caseína Digerido Péptico de Carne
10,0 g 5,0g
Digerido Pancreático de Corazón
3,0 CJ
Extracto de Levadura
5,0 CJ
Almidón de Maíz
1,0 g
Cloruro de Sodio
5,0 g
Suplementos Dietéticos/ (2022) Procedimientos Microbiológicos 2223
USP 39
1
15,0g
Agar Agua
1000 ml
Disolver agar en agua calentando hasta el punto de ebullición y revolviendo en forma continua. En caso de ser necesario, ajustar el pH. Esterilizar y dejar enfriar a una temperatura de 45º a 50º. Agregar, cuando sea necesario, sulfato de gentamicina, que equivalga aproximadamente a 20 mg de gentamicina base y verter en placas Petri. Se recomienda reducir previamente el medio. pH después de la esterilización: 7,3 ± 0,2. CALDO RAPPAPORT VASSILIADIS PARA ENRIQUECIMIENTO DE SALMONELLA Peptona de Soja
4,5 g
Cloruro de Magnesio Hexahidrato
29,0 g
Cloruro de Sodio
8,0 g
Fosfato Dipotásico
0,4 g
Fosfato Monobásico de Potasio
0,6 g
Verde Malaquita
0,036 g
Agua Purificada
1000 ml
Disolver calentando ligeramente. Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo validado a una temperatura que no exceda de 115º. El pH es de 5,2 ± 0,2 a 25º después de calentar y esterilizar en autoclave.
PRUEBAS PREPARATORIAS Proceder según se indica para las Pruebas Preparatorias en Pruebas de Recuento Microbiano-Suplementos Nutricionales y Dietéticos (2021 ). Para caldos de enriquecimiento, medios selectivos y medios diferenciales, utilizar un ansa de inoculación para transferir el inóculo de cada microorganismo de prueba al medio en placa o líquido que se está probando. Si se está probando un medio en placa, estriar la superficie de la placa con el ansa en cuatro direcciones para obtener un patrón de colonias aisladas. Incubar los medios y examinar los medios en placa o líquidos para determinar el crecimiento característico de los inóculos (ver Tablas 1, 2, 3 y 4).
MUESTREO Proceder según se indica para Muestreo en Pruebas de Recuento Microbiano-Suplementos Nutricionales y Dietéticos (2021 ).
PROCEDIMIENTOS DE PRUEBA Preparación de Prueba-Preparar según se indica en Muestreo. Transferir a un recipiente adecuado con 100 ml de Medio Líquido de Digerido de Caseína-Soja (FSCD, por sus siglas en inglés). Mezclar agitando suavemente. [NOTA-Según los resultados de las Pruebas Preparatorias, modificar la Preparación de Prueba según corresponda.]
Prueba de Ausencia de Staphylococcus aureus Incubar a una temperatura de 30º a 35º durante 18 a 24 horas. Estriar con un ansa llena con FSCD la superficie de uno o más de los siguientes medios: Medio Agar de Vogel-johnson (Agar VJ), Medio Agar Manito/ Salado (Agar MS) y Medio Agar de Baird-Parker (Agar BP). Cubrir las placas Petri, invertirlas e incubar a una temperatura de 30º a 35º durante 24 a 48 horas. Examinar las placas de Agar Vj, Agar MS y/o Agar BP e interpretar los resultados refiriéndose a la Tabla 1: si ninguna placa contiene colonias con las características descritas, la muestra de prueba cumple con los requisitos para confirmar la ausencia de Staphylococcus aureus. Si hay presentes colonias características, realizar la prueba de coagulasa según se indica a continuación. Transferir colonias representativas en tubos separados que contengan 0,5 ml de plasma de conejo, plasma de caballo o plasma de cualquier otro mamífero. Incubar en un baño de agua a 37º. Examinar para verificar su coagulación después de 3 horas de incubación y a intervalos adecuados hasta 24 horas. Comparando con controles positivos y negativos, la ausencia de una reacción de coagulasa indica la ausencia de Staphylococcus aureus en el producto probado. Ta bl a 1 Caracter1s ' ti cas d e Stap,h yIococcus aureus en M e d"1os A gar Espec1'fi cos
MedloAgar
Morfología de las Colonias
Vogel-/ohnson Manito/ Salado
Negras rodeadas por zona amarilla
(+),cocos
Colonias amarillas con zona amarilla
(+),cocos
Tlnción de Gram
2224 (2022) Procedimientos Microbiológicos J Suplementos Dietéticos
USP 39
Tabla 1. Características de Staphylococcus aureus en Medios Agar Específicos (Continuación) Tlnclón de Gram
Medio Agar
Morfología de las Colonias
Baird-Parker
Negras brillantes rodeadas por zonas transparentes de 2-5 mm
(+),cocos
Prueba de Ausencia de Salmonella spp. Incubar a una temperatura de 30º a 35º durante 18 a 24 horas. Pipetear una alícuota de 1 ml del medio agar FSCD, y agregar a 1 O ml de mezcla de Caldo Rappaport Vassiliadis para Enriquecimiento de Salmonella, mezclar e incubar a una temperatura de 30º a 35º durante 18 a 24 horas. Estriar con un ansa llena con ambos medios incubados superficies individuales de uno o más de los siguientes medios: Medio Agar Verde Brillante (Agar VB), Medio Agar Xi/osa Lisina Desoxicolato (Agar XLDC) y Medio Agar Entérico de Hektoen (Agar EH). Cubrir, invertir las placas e incubar a una temperatura de 30º a 35º durante 24 a 48 horas. Examinar las placas inoculadas de Agar VB, Agar XLDC y/o Agar EH e interpretar los resultados refiriéndose a la Tabla 2: si no se observan colonias que tengan las características descritas, la muestra de prueba cumple con los requisitos para confirmar la ausencia de Salmonella spp. Si se encuentran colonias con las características descritas en la Tabla 2, las colonias sospechosas se transfieren a un tubo inclinado de Medio Agar de Hierro y Triple Azúcar (HTA) utilizando un alambre de inoculación, estriando primero la superficie del tubo y luego clavando el alambre bien por debajo de la superficie. Incubar a una temperatura de 30º a 35º durante 24 a 48 horas. Si los tubos no tienen líneas oblicuas alcalinas rojas y extremos ácidos amarillos, con o sin un ennegrecimiento concomitante de los extremos por producción de sulfuro de hidrógeno, la muestra de prueba cumple con los requisitos para confirmar la ausencia de Salmonella spp. Tabla 2. Características de Salmonella spp. en Medios Agar Específicos Medio Agar
Morfología de las Colonias
Tinclón de Gram
Verde Brillante
Pequeñas, transparentes e incoloras; u opacas, rosadas o blancas (a menudo rodeadas por una zona de color rosado a rojo)
(-), bacilos
Xi/osa Lisina Desoxico/ato
Rojas, con o sin centros negros
(-),bacilos
Entérico de Hektoen
Verde azuladas, con o sin centros negros
(-), bacilos
Prueba de Ausencia de Escherichia coli Incubar a una temperatura de 30º a 35º durante 24 a 48 horas. Pipetear una alícuota de 1 ml del medio FSCD, transferir a un recipiente que contenga 1 O ml de mezcla de Caldo MacConkey, mezclar e incubar a una temperatura de 42º a 44º durante 24 a 48 horas. Estriar con un bucle lleno de ambos medios incubados superficies individuales de Medio Agar MacConkey (Agar MC) e incubar a una temperatura de 30º a 35º durante 18 a 24 horas. Examinar la placa de Agar MC inoculada e interpretar los resultados refiriéndose a la Tabla 3: si no se observan colonias que tengan las características descritas, la muestra de prueba cumple con los requisitos para confirmar la ausencia de Escherichia coli. Las colonias sospechosas que presenten las características descritas en la Tabla 3 se transfieren en forma individual, utilizando un bucle de inoculación, a la superficie de una placa con Medio Agar de Levine Eosina-Azul de Metileno (Agar EAML). Si debe transferirse un número grande de colonias sospechosas, dividir la superficie de cada placa en cuadrantes e inocular cada uno con una colonia diferente. Cubrir las placas, invertirlas e incubar a una temperatura de 30º a 35º durante 24 a 48 horas. Si ninguna de las colonias muestra un brillo metálico característico bajo luz reflejada y si ninguna de ellas presenta un aspecto azul-negro bajo luz transmitida, la muestra de prueba cumple con los requisitos para confirmar la ausencia de Escherichia coli. Tabla 3. Características de Escherichia coli en Medio Agar de MacConkey Tinclón de Gram
Morfología de las Colonias
(-), bacilos
Rojas ladrillo, puede estar rodeadas por una zona de bilis precipitada
Prueba de Ausencia de Clostridium spp. Preparación de Prueba-Preparar según se indica en Muestreo. [NOTA-Según los resultados de las Pruebas Preparatorias, modificar la Preparación de Prueba según corresponda.] Procedimiento-Tomar dos porciones iguales de la Preparación de Prueba, calentar una a 80º durante 1 O minutos y enfriar rápidamente. Transferir 1 O ml de cada porción a recipientes separados que contengan cada uno 100 ml de Medio Reforzado para Clostridios e incubar bajo condiciones anaeróbicas a una temperatura de 35º a 37º durante 48 horas. Después de incubar, subcultivar cada muestra en Medio Agar Columbia al que se ha agregado gentamicina e incubar bajo condiciones anaeróbicas a una temperatura de 35º a 37º durante 48 horas. Examinar las placas e interpretar refiriéndose a la Tabla 4: si no se observa el crecimiento de microorganismos, la muestra de prueba cumple con los requisitos para confirmar la ausencia de Clostridium spp. Tabla 4. Características de Clostridium s Medio Medio Reforzado para Clostridios
. en Medios Es ecíflcos Tinclón de Gram (+),bacilos
Cata lasa
USP 39
Suplementos Dietéticos/ (2023) Atributos Microbiológicos 2225 Tabla 4. Características de Clostridium spp. en Medios Específicos (Continuación)
Medio Agar Columbia
Tlnclón de Gram
Cata lasa
(+), bacilos
Negativo
Si se produce crecimiento, subcultivar cada colonia diferente en Medio Agar Columbia e incubar por separado en condiciones aeróbicas y anaeróbicas a una temperatura de 35º a 37º durante 48 horas. El crecimiento anaeróbico de bacilos grampositivos únicamente, que producen una reacción de catalasa negativa, indica la presencia de Clostridium sporogenes. Para realizar la prueba de catalasa, transferir colonias separadas a portaobjetos de vidrio y aplicar una gota de solución de peróxido de hidrógeno diluida: la reacción es negativa si no se forman burbujas de gas. Si la muestra de prueba no presenta ninguna de estas características, cumple con los requisitos para confirmar la ausencia de Clostridium spp.
Repetición de la Prueba A los efectos de confirmar un resultado dudoso mediante cualquiera de los procedimientos descritos en las pruebas anteriores después de su realización en una muestra de 1Og, puede realizarse una nueva prueba con una muestra de 25 g del suplemento nutricional o dietético. Proceder según se indica en Procedimiento teniendo en cuenta que la muestra es más grande.
(2023) ATRIBUTOS MICROBIOLÓGICOS DE LOS SUPLEMENTOS NUTRICIONALES Y DIETÉTICOS NO ESTÉRILES Las materias primas, ingredientes farmacéuticos e ingredientes activos utilizados en la fabricación de productos nutricionales y dietéticos pueden incluir desde vitaminas químicamente sintetizadas a extractos vegetales y productos derivados de animales. Normalmente, estos ingredientes no son estériles. Se ha acumulado una experiencia considerable con estos ingredientes farmacéuticos de origen vegetal y animal altamente refinados, como la celulosa microcristalina, almidón modificado, lactosa y estearato de magnesio. Sus atributos microbiológicos están bien establecidos. Los productos botánicos pueden contaminarse microbiológicamente en cualquier momento durante su cultivo, cosecha, procesamiento, empacado y distribución. Las principales fuentes de contaminación microbiana son la materia fecal humana o animal utilizada como abono, el agua de irrigación y/o agua de proceso contaminada y los malos hábitos de higiene y desinfección de los trabajadores durante la cosecha, clasificación, procesamiento, empacado y transporte. Asimismo, es fundamental reducir al mínimo la contaminación microbiológica durante la fabricación de suplementos dietéticos no estériles. Para lograrlo, se utilizan las Buenas Prácticas de Fabricación y se establecen especificaciones microbiológicas adecuadas. Es necesario el control del proceso microbiológico, el control de la biocarga de las materias primas y el control del proceso de fabricación para reducir al mínimo la contaminación cruzada para garantizar una calidad microbiana aceptable en las formas farmacéuticas finales. Debido a que las formas farmacéuticas no acuosas o secas no promueven el crecimiento microbiano por su baja actividad hídrica, la calidad microbiana de dichos productos depende de los microorganismos introducidos a través de los ingredientes o durante su procesamiento. Además de tener en cuenta el uso al que está destinado el producto, la frecuencia de las pruebas microbianas en los suplementos dietéticos terminados no estériles debe depender de los datos históricos de las pruebas microbianas de dicho producto, el conocimiento de los procesos de fabricación, la susceptibilidad de la formulación a la proliferación microbiana y la eficacia comprobada de los programas que controlan las materias primas.
FORMULACIÓN Y DISEÑO DEL PROCESO Desde una perspectiva microbiológica, el desarrollo de la formulación de suplementos nutricionales o dietéticos incluye una evaluación de las materias primas y sus proveedores y el aporte realizado a los productos por cada ingrediente y los procesos de fabricación. La caracterización de estos elementos permite comprobar si el proceso de fabricación es adecuado. Por ejemplo, si un producto está formulado con un ingrediente de origen botánico o animal que posee un nivel alto, variable o impredecible de contaminación microbiológica, es necesario asegurarse de que el seguimiento microbiológico identifique los ingredientes que tienen un nivel de biocarga inadecuado y si un proceso previo a la fabricación, como secado, extracción, tratamiento térmico, irradiación o tratamiento de esterilización gaseosa, inactivará o eliminará cualquier contaminante inaceptable que pudiera encontrarse presente. No obstante, la técnica de tratamiento escogida no debería tener ningún efecto adverso. El tratamiento de materias primas por irradiación y óxido de etileno podría causar cambios no deseados que afectan la seguridad y eficacia de la materia prima. Por ejemplo, cuando se tratan con óxido de etileno, los extractos crudos que contienen alcaloides han demostrado una reducción en su contenido de estas sustancias. El tratamiento con calor seco también se ha utilizado para la inactivación, pero requiere más evaluación ya que podría afectar en forma adversa la estabilidad y degradación de la materia prima. Con respecto al diseño del proceso de fabricación, debería considerarse en forma adecuada el efecto microbiológico de los procesos de fabricación de granulación húmeda. El humedecimiento de un polvo seco podría dar como resultado un aumento en los niveles
2226 (2023) Atributos Microbiológicos / Suplementos Dietéticos
USP 39
de microorganismos si la granulación se almacena antes de secarla. No obstante, se ha comprobado que la presión y temperatura asociadas con la compresión de tabletas reducen los niveles microbianos. La actividad antimicrobiana también puede lograrse, especialmente en las preparaciones acuosas, agregando productos químicos que tengan propiedades antimicrobianas si fuera necesario, y que sean compatibles con la formulación. Sin embargo, la preservación antimicrobiana no reemplaza las Buenas Prácticas de Fabricación. Debe diseñarse un proceso para reducir al mínimo la población microbiológica y establecerse procedimientos operativos y límites de tiempo y temperatura, incluyendo tiempos de conservación, para proteger el producto de la contaminación y crecimiento microbiológicos. Todos los procesos deben ser validados para los propósitos para los que están destinados. Además, deberían identificarse e implementarse controles y pruebas durante el proceso de fabricación para asegurar la calidad microbiológica.
INSTALACIONES, EQUIPOS, AGUA Y DESINFECCIÓN Instalaciones Las instalaciones, incluyendo el edificio y los sistemas de calefacción, ventilación y aire acondicionado (HVAC, por sus siglas en inglés), deberían diseñarse para reducir al mínimo la contaminación microbiológica. El diseño de las instalaciones utilizadas para la fabricación de suplementos y sus parámetros operativos deberían documentarse y la documentación debería incluir, cuando corresponda, los tipos de filtro de HVAC, diferenciales de presión de espacio, temperatura y cambios en la humedad relativa y aire. Los productos secos procesados en un entorno seco no poseen un alto potencial de aumento en los niveles microbianos. No obstante, se requiere cierto control para reducir al mínimo la contaminación microbiológica y química. Las áreas potencialmente problemáticas son las que utilizan Agua Purificada para la granulación húmeda, agrupamiento de productos líquidos y recubrimiento de tabletas con película, ya que el agua promueve el crecimiento microbiano.
Equipos Los equipos utilizados para el procesamiento de suplementos semisólidos y secos deberían promover las condiciones sanitarias y estar diseñados para secarse por sí solos y limpiarse fácilmente. Los secadores, hornos, equipos de granulación húmeda, tanques para material a granel y equipos para la preparación de soluciones de recubrimiento deben evaluarse periódicamente para asegurar que los procedimientos de limpieza sean adecuados.
Agua Como uno de los principales componentes de los procesos de fabricación de suplementos nutricionales y dietéticos, el agua merece especial consideración en el control microbiológico de estos productos. Es un medio de crecimiento para diferentes microorganismos que representan una amenaza para la calidad, seguridad, conservación y estabilidad del producto. El agua puede actuar incluso como portadora de microorganismos inaceptables. Por esta razón, en la fabricación se utiliza Agua Purificada. Para la fabricación de materias primas, puede utilizarse agua de proceso que cumpla con los límites microbiológicos específicos y con las normas aplicables al agua potable de la Dirección de Protección Ambiental de los EE.UU. o con normas europeas y japonesas equivalentes.
Limpieza y Desinfección Deberían evaluarse, desarrollarse y validarse procedimientos de limpieza y desinfección detallados y específicos, prestando especial atención a las superficies de contacto de los productos. El personal debería contar con un conocimiento suficiente sobre estos procedimientos.
COMPONENTES DE LOS SUPLEMENTOS Las materias primas, excipientes y sustancias activas utilizados como componentes de los suplementos nutricionales y dietéticos pueden ser una fuente primaria de contaminación microbiológica. Deberían desarrollarse especificaciones y utilizarse planes de muestreo y procedimientos de prueba para garantizar que estos materiales posean las características microbiológicas deseadas. La naturaleza y nivel de pruebas microbiológicas deberían basarse en el conocimiento del origen del material, su proceso de fabricación, su uso y los datos y experiencia históricos. Por ejemplo, los materiales de origen animal o botánico que no sean altamente refinados pueden requerir pruebas especiales y más frecuentes que los productos sintéticos. Como los miembros de la familia Enterobacteriaceae son un componente importante de la microflora epifítica y endofítica normales (p.ej., miembros de los géneros Klebsiella, Enterobacter y Erwinia) y se han asociado con las semillas, vainas, raíces, hojas y tallos de plantas de importancia económica, los niveles de recuento de coliformes o enterobacterias no constituyen un criterio microbiológico general adecuado para los productos botánicos. No obstante, cuando se considere una ventaja, los niveles de coliformes o enterobacterias podrán incluirse en las monografías individuales. Normalmente en la microflora de las hojas nuevas predominan las bacterias, mientras que las levaduras y hongos filamentosos suceden a las bacterias y se tornan
Suplementos Dietéticos/ (2023) Atributos Microbiológicos 2227
USP 39
dominantes más adelante en la época de crecimiento. Con los productos botánicos secos, la población bacteriana tiende a cambiar de bacterias Gram-negativas a formadores de esporas Gram-positivos y hongos. El refinamiento de los productos botánicos de material vegetal troceado o en polvo a extractos en polvo utilizando materiales de extracción a base de alcohol, alcalinos, ácidos hidroalcohólicos o acuosos reducirá la probabilidad de que se desarrollen microorganismos vegetativos dentro del material botánico. La Tabla 7 contiene la clasificación de los materiales botánicos. Tabla 1. Definiciones de una Serle de Materiales Botánicos Preparación botánica
Definición
Productos Botánicos Troceados o en Polvo
Partes seleccionadas del producto botánico (p.ej., hojas, flores, raíces, túberculos, etc.) que se secan con aire y se trocean, desmenuzan, seccionan, trituran o pulverizan hasta obtener la consistencia de un polvo.
Extractos Botánicos
Los extractos son sólidos o preparaciones semisólidas de un producto botánico preparado previamente por percolado, filtrado y concentración por evaporación del percolado. El material de extracción puede ser alcohólico, alcalino, ácido, hidroalcohólico o acuoso. Normalmente, un extracto es de 4-1 O veces más concentrado que el producto botánico original. Los extractos pueden ser semisólidos o polvos secos denominados extractos en polvo.
Tinturas
Las tinturas son soluciones de sustancias botánicas en alcohol obtenidas mediante la extracción del producto botánico en polvo, desmenuzado o seccionado.
Infusiones
Las infusiones son soluciones de principios botánicos que se obtienen sumergiendo el producto botánico en polvo en agua caliente o fría durante un tiempo determinado y luego escurriéndolo. Normalmente, las infusiones tienen una concentración del 5%.
Decocciones
Las decocciones son soluciones de productos botánicos que se elaboran hirviendo el material en agua durante al menos 15 minutos y luego escurriéndolo. Normalmente, las decocciones tienen una concentración del 5%.
Extractos líquidos
Un extracto líquido es un extracto líquido alcohólico elaborado mediante la percolación de un producto botánico de modo tal que 1 mL del extracto líquido represente 1 g del producto botánico.
Artículos botánicos que se tratan con agua hirviendo antes de su uso
Productos botánicos secos a los que se añade agua hirviendo inmediatamente antes de su consumo.
PRUEBAS MICROBIOLÓGICAS Frecuencia de Muestreo y Pruebas Los planes de muestreo y pruebas de atributos microbiológicos varían considerablemente. En algunos casos no es necesario un muestreo o pruebas; otros productos requieren un seguimiento periódico y algunos incluso requieren el muestreo y prueba de cada partida. El diseño de los planes de muestreo y pruebas, y el tipo de atributos examinados dependen de la aplicación y del tipo de producto, del potencial de contaminación de los componentes y el procesamiento, de las propiedades de promoción o inhibición del crecimiento de la formulación y de la población diana a la que está destinado el suplemento. Por ejemplo, un producto botánico en polvo puede tener atributos microbiológicos altamente variables, por lo que se tomarían muestras de cada partida pero no serían necesarias pruebas compuestas, mientras que un extracto botánico altamente refinado podría no requerir una prueba microbiana de rutina. De la misma manera, los productos con una baja actividad hídrica no serán susceptibles de crecimiento microbiano durante su vida útil siempre y cuando estén protegidos contra la humedad elevada en sus envases.
Pruebas de Recuento Microbiano Ver la Introducción en Pruebas de Recuento Microbiano-Suplementos Nutricionales y Dietéticos (2021 ). Estas pruebas proporcionan información importante sobre la aceptabilidad microbiológica de los excipientes, sustancias activas y formulaciones de suplementos no estériles. Si la monografía individual no especifica límites de recuento microbiano, deben seguirse las pautas proporcionadas en este capítulo. En la Tabla 2 se indican los niveles microbianos generales aceptables para las materias primas, excipientes y productos botánicos, y en la Tabla 3 los niveles correspondientes a las materias primas, excipientes, ingredientes activos y otros productos terminados no estériles que son suplementos nutricionales pero no contienen productos botánicos. Tabla 2. Límites Microbianos Recomendados para Ingredientes y Productos Botánicos Material
Requisitos de Límites Microbianos Recomendados (ufc/g o mL) Recuento Total de Microorganismos Aerobios
'.Ó
105
Recuento Total Combinado de Hongos Filamentosos y Levaduras Bacterias Gram-negativas Tolerantes a la Bilis '.Ó 1 Q3 Productos Botánicos Secos o en Polvo
Ausencia de Salmonella spp y E. coli en 1O g
'.Ó
1Q3
2228 (2023) Atributos Microbiológicos/ Suplementos Dietéticos
USP 39
Tabla 2. Límites Microbianos Recomendados para Ingredientes y Productos Botánicos (Continuación) Requisitos de Límites Microbianos Recomendados (ufc/g o mL)
Material
Recuento Total de Microorganismos Aerobios 5 104 Recuento Total Combinado de Hongos Filamentosos y Levaduras 5 10 3 Extractos Botánicos en Polvo
Ausencia de Sa/monella spp y E. coli en 1 O g
Tinturas
Recuento Total Combinado de Hongos Filamentosos y Levaduras 5 103
Recuento Total de Microorganismos Aerobios 5 104
Recuento Total de Microorganismos Aerobios 5 104 Recuento Total Combinado de Hongos Filamentosos y Levaduras 5 10 3
Extractos Líquidos
Recuento Total de Microorganismos Aerobios 5 102 Infusiones/Decocciones
Recuento Total Combinado de Hongos Filamentosos y Levaduras 5 1 O Recuento Total de Microorganismos Aerobios 5 104 Recuento Total Combinado de Hongos Filamentosos y Levaduras 5 103
Suplementos Nutricionales con Productos Botánicos
Ausencia de Salmonella spp y E. coli en 1O g Recuento Total de Microorganismos Aerobios 5 106 Recuento Total Combinado de Hongos Filamentosos y Levaduras 5 104
Artículos botánicos que se tratan con agua hirviendo antes de su uso
Bacterias Gram negativas tolerantes a la bilis 5 1 0 2 Ausencia de E. coli y Salmone//a spp. en 1O g
Tabla 3. Límites Microbianos Recomendados para Ingredientes y Productos de Suplementos Dietéticos Requisitos de Límites Microbianos Recomendados (ufc/g o mL)
Material
Recuento Total de Microorganismos Aerobios 5 103 Recuento Total Combinado de Hongos Filamentosos Otras materias primas e ingredientes de suplementos dietéticos
y Levaduras 5 10 2
Ausencia de E. coli en 1O g Recuento Total de Microorganismos Aerobios 5 1 0 3
Suplementos nutricionales con ingredientes sintéticos o altamente refinados
Recuento Total Combinado de Hongos Filamentosos
y Levaduras 5 102
Ausencia de E. coli en 1O q
Ausencia de Microorganismos Inaceptables Ver Introducción en Procedimientos Microbiológicos para Determinar la Ausencia de Microorganismos Específicos-Suplementos Nutricionales y Dietéticos (2022). En algunas monografías individuales se requiere la ausencia de una o más especies de microorganismos inaceptables.
Prueba de Aflatoxinas Los productos dietéticos y nutricionales que contienen productos botánicos con antecedentes de contaminación por micotoxina también suelen probarse para detectar la presencia de aflatoxinas, especialmente si el material se obtiene de raíces o rizomas. Ver Artículos de Origen Botánico (561) para más detalles sobre la prueba de aflatoxinas. Si fuera necesario, esta prueba se incluye en la monografía individual.
Formas Farmacéuticas Orales Sólidas Entre todas las formas farmacéuticas, las orales sólidas presentan el menor riesgo microbiológico debido a su método de fabricación, baja actividad de agua y vía de administración. Cuando se justifica, puede ser adecuada una prueba microbiológica reducida.
Otras Preocupaciones La presencia de algunos microorganismos en artículos puede ser un indicador de procesos que no se encuentran bajo control microbiológico. Por ejemplo, el Agua Purificada utilizada en alguna etapa de la fabricación de estos productos podría contener una flora típica de microorganismos Gram-negativos. Al igual que con los productos farmacéuticos, el procesamiento inadecuado del agua y el mal mantenimiento de los sistemas de agua pueden llevar a la contaminación de las formulaciones procesadas con microorganismos Gram-negativos.
USP 39
Suplementos Dietéticos/ (2030) Información Complementaria 2229
(2030) INFORMACIÓN COMPLEMENTARIA PARA ARTÍCULOS DE ORIGEN BOTÁNICO Este capítulo general proporciona información sobre diversos aspectos de los artículos botánicos que no están contemplados en las normas de las monografías USP. Aunque las normas en las monografías tratan cuestiones de calidad relacionadas con materiales vegetales, extractos y preparaciones botánicas de artículos farmacopeicos, es necesario desarrollar información apropiada con el objeto de optimizar las condiciones previas a la cosecha para obtener un crecimiento adecuado y la manipulación posterior a la cosecha para lograr una calidad uniforme con variaciones mínimas en la composición química.
LISTA DE PROTOCOLOS Cimicífuga Racemosa (Actaea racemosa L.) jengibre (Zingiber officinale Roscoe) Valeriana (Valeriana officinalis L.) Olmo (U/mus rubra Muhlenberg)
GUÍA GENERAL Como mínimo, se recomienda que los productores y otras personas involucradas en la manipulación y distribución de productos botánicos se familiaricen y cumplan con la guía de la OMS sobre buenas prácticas de agricultura y recolección de plantas medicinales. Puede obtenerse información sobre este documento en http://www.who.int/medicinedocs/collect/ edmweb/pdf/s4928e/s4928e.pdf. El intercambio comercial de productos naturales se realiza en un mercado global. El material de origen local debe producirse conforme a todas las leyes federales de los Estados Unidos. El material de origen extranjero importado a los EE.UU. debe producirse y transportarse conforme a las leyes de los EE.UU., a las del país de origen y a los tratados internacionales pertinentes. Éstos incluyen, pero no se limitan, a lo siguiente: 1. La Convención sobre el Comercio Internacional de Especies Amenazadas de Fauna y Flora Silvestres (Convention on lnternational Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora, CITES) es un acuerdo internacional entre gobiernos. Su objetivo es garantizar que el comercio internacional de especies de animales y plantas silvestres no represente una amenaza para su supervivencia. Se encuentra información disponible sobre CITES en http://www.cites.org. 2. La Convención sobre la Diversidad Biológica (Convention on Biological Diversity, CBD) establece tres metas principales: la preservación de la diversidad biológica, el uso sustentable de sus componentes y el uso compartido justo y equitativo de los recursos genéticos y sus beneficios. Cada país que haya ratificado y sea parte de la Convención es responsable de la implementación por medio de la legislación nacional habilitante que puede diferir entre países. 3. La Ley de Especies en Peligro de Extinción (Endangered Species Act, ESA) se aprobó originalmente en 1973. La ESA es una ley dirigida a proteger las especies de peces, vida silvestre y plantas que se consideran en peligro de extinción. La ESA está administrada principalmente por el Servicio de Pesca y Vida Silvestre de EE.UU. El texto completo de la ley se encuentra disponible en: http://www.fws.gov/endangered/laws-policies/esa.html. A continuación, se proporciona información adicional no incluida en las especificaciones oficiales: historia farmacopeica; procedencia; recolección y cultivo, incluidos adulterantes comunes; y secado, almacenamiento y transporte. Esta información se proporciona como complemento de las normas de control de calidad en las monografías de artículos botánicos. Historia Farmacopeica-Esta sección se concentra en el uso histórico farmacopeico con validez sólida, y sólo una breve referencia al uso anecdótico. Ésta es una información importante porque el uso tradicional es uno de los elementos considerados para respaldar la seguridad y las presunciones de los beneficios de los suplementos dietéticos botánicos. Procedencia-Aquí se incluye el lugar de origen del material botánico y abarca los lugares de cultivo (definido como cultivo agrícola) y de recolección de plantas (definido como recolección en su medio natural), junto con un listado de las principales áreas geográficas (nativas) de producción. Recolección y Cultivo-Esta sección trata sobre la recolección de plantas en su medio natural, la conservación de especies restringidas y raras, y la tendencia al cultivo como alternativa ecológica; estas prácticas de cosecha y recolección óptimas sirven para preservar la integridad de las especies y productos botánicos. Se subdivide en tres subsecciones: 1. Recolección (preservación y ecología) 2. Prácticas de Cultivo 3. Temporadas Óptimas para la Cosecha Manipulación Posterior a la Cosecha (Prácticas Óptimas de Manipulación y Procesamiento, Secado, Almacenamiento y Transporte-Los factores importantes relacionados con el almacenamiento de productos herbarios y su mantenimiento, incluyen lo siguiente: 1. Luz: Es importante proteger los artículos botánicos de la luz. La luz acelera diversos procesos químicos que pueden producir degradación o cambios en los constituyentes de los artículos.
2230 (2030) Información Complementaria / Suplementos Dietéticos
USP 39
2. Temperatura: Las temperaturas de almacenamiento en esta Farmacopea se definen en las Advertencias Generales. El calor excesivo puede afectar el contenido de los componentes volátiles (aceites esenciales) y acelerar procesos de degradación. Sin embargo, los tratamientos térmicos a veces son útiles para el mantenimiento de la calidad del artículo y pueden usarse en el secado, la reducción de la carga microbiana y la inhibición de determinadas enzimas. La aplicación de calor durante estos procesos debe controlarse con cuidado para lograr el equilibrio deseado entre la degradación y la preservación de la calidad. 3. Humedad: La humedad de los artículos puede permitir que ciertas enzimas como las glicosidasas se activen, degradando así sus componentes. La humedad elevada aumenta además el peligro de la proliferación microbiana. Como norma, se aconseja almacenar los artículos botánicos a una humedad relativa inferior al 60%. Aunque ahora se exigen depósitos con humedad y temperatura controladas en muchas buenas prácticas de fabricación de productos naturales, aún se carece de acceso a este tipo de instalaciones en muchas partes del mundo. 4. Grado de Pulverización: El grado de pulverización cumple una función en la determinación de la estabilidad de los artículos botánicos durante el almacenamiento. El aumento del área superficial en los polvos finos permite que la oxidación y otros procesos de degradación ocurran más extensivamente y con mayor rapidez que en el caso de un artículo entero. Las plantas que contienen taninos, principios amargos y aceites esenciales son particularmente sensibles al grado de pulverización. En general, los productos botánicos secados en crudo deben almacenarse en una forma mínimamente procesada. 5. Envases: Los envases apropiados se definen en esta Farmacopea en las Advertencias Generales. Componentes-En los casos en que se conocen, las sustancias principalmente responsables de la actividad del producto se detallan junto a otros componentes de la planta.
INFORMACIÓN COMPLEMENTARIA Y PROTOCOLOS DE GUÍA GENERAL Cimicífuga Racemosa
Actaea racemosa L. [Cimicifuga racemosa (L.) Nutt.] (Fam. Ranunculaceae) IDENTIFICACIÓN BOTÁNICA
Actaea racemosa L. Herbácea perenne con rizoma.
Tallo: Erecto, solitario, de hasta 2,5 m de altura, glabro. Hojas: Basales y caulinares, alternadas, compuestas en ternas de 2-4, pecíolos de 15 cm a 60 cm de longitud, bases sujetas al tallo; 20 a 70 folíolos; folíolo terminal de 3 lóbulos de división central, de 6 cm a 15 cm de longitud, de 6 cm a 16,5 cm de ancho, con 3 venas prominentes que surgen de la base; folíolos subterminales con limbos ovado-lanceolados a obovados, de 4 cm a 12 cm de longitud y de 3 cm a 8 cm de ancho; bordes dentados a muy dentados; verde en la parte superior, más pálidas en la parte inferior; glabras o escasamente pubescentes a lo largo de las venas de la superficie posterior. Inflorescencias: Panojas terminales de 4 a 9 ramificaciones delgadas, cada una de 7 cm a 60 cm de longitud, pubescentes; 1 bráctea que delimita cada pedúnculo. Flores: Perfectas, radialmente simétricas; 4 sépalos de color blanco verdoso, caducos; O pétalos; estaminodios petaloides (1-) 4 (-8), de color crema, de 2 mm a 3 mm de longitud, curvos, de ápice bífido; 55 a 11 O estambres; pistilos 1 (-3), glabros a pubescentes, ovario superior, estilo corto, estigma de 0,5 mm de ancho. Fruto: Folículo de muchas semillas, de 5 mm a 1O mm de longitud, ovoide, comprimido lateralmente con pico curvo y robusto (estilo persistente), pubescente; semillas hemisféricas, marrones, sin escamas. Número de cromosomas: n = 8. Actualmente existen dos variedades de A. racemosa reconocidas según las diferencias en la morfología de las hojas: var. racemosa y var. dissecta. La primera variedad tiene hojas triternadas pinnadas, con bordes aserrados, mientras que la última tiene hojas cuadriternadas pinnadas muy dentadas con lóbulos aserrados. La variedad dissecta es conocida únicamente a través de muy pocas muestras de herbario, todas recolectadas hace más de 100 años, siendo en consecuencia de importancia taxonómica incierta. HISTORIA FARMACOPEICA La Cimicífuga racemosa apareció en la lista secundaria de sustancias en la primera Farmacopea de los Estados Unidos (USP) de 1820, donde aparecía citada como antiinflamatorio y antiespasmódico. Pronto pasó a la lista principal en 1830, posición que conservó hasta la 1 O• revisión decenal de 1920. La Cimicífuga racemosa apareció en la primera edición del United States Dispensatory (USO) en 1833 y se mantuvo hasta 1955, durante un total de 122 años. Continuando con el uso tradicional nativo estadounidense de la Cimicífuga racemosa para trastornos de la mujer y el uso de Barton para molestias en la garganta, la terapéutica actual utiliza esta planta en diversas preparaciones para la tos y trastornos ginecológicos. En 2001, tanto el rizoma como el extracto del rizoma seco de Cimicífuga racemosa se propusieron nuevamente para su inclusión en la Farmacopea de los Estados Unidos-Formulario Nacional ( USP-NF) (ver propuesta revisada en la página 1455 del PF 28(5) [sep-oct 2002]). La monografía se oficializó en el Segundo Suplemento de USP 30-NF 25.
USP 39
Suplementos Dietéticos/ (2030) Información Complementaria 2231 COMPONENTES
Los principales componentes de la Cimicífuga racemosa son glicósidos triterpénicos, como beta-xilopiranósidos y alfa-arabinopiranósidos. Las agliconas derivan mayormente de acteol y cimigenol. La nomenclatura de estos componentes es bastante confusa en la literatura, a menudo con diferentes nombres para los mismos componentes. El anillo de ciclopropano es una característica común de estos componentes, que se relacionan estructuralmente con el cicloartenol. La isoflavona formononetina se ha citado en algunas publicaciones, sin embargo la evidencia reciente indica su ausencia en las raíces y rizomas de Actaea racemosa. Otros componentes incluyen taninos, resina, ácidos grasos, almidón, azúcares y ácidos aromáticos, incluyendo el ácido ferúlico, el ácido isoferúlico, el ácido cafeico y el ácido salicílico. PROCEDENCIA Y DISTRIBUCIÓN Procedencia-La Cimicífuga racemosa puede encontrarse en bosques húmedos caducifolios, barrancos, praderas húmedas, márgenes de arroyos y terrenos montañosos. La Cimicífuga racemosa florece de junio a septiembre y es originaria del este de Norteamérica, desde Ontario hacia el sur hasta Georgia y hacia el oeste hasta Missouri. Todo el suministro de Cimicífuga racemosa proviene de los Estados Unidos. Los principales productores de Cimicífuga racemosa son Kentucky y Tennessee, con suministros adicionales provenientes de Carolina del Norte, Carolina del Sur, Georgia, Michigan, Ohio, Virginia, Virginia Occidental, y Wisconsin. Aunque existen informes de que la Cimicífuga racemosa se cultiva en China e India para su exportación, la verdadera identidad del material cultivado no se ha verificado y puede ser una especie asiática de Actaea tal como A. cimicifuga (sinón. Cimicifuga foetida). La mayor parte de la Cimicífuga racemosa comercial se recoge en su medio natural. El interés en la preservación de la Cimicífuga racemosa debido a su creciente demanda, hace de esta especie un buen candidato para el cultivo. Distribución-Norte América (Ontario; Carolina del Norte, Carolina del Sur, Georgia, Kentucky, Michigan, Missouri, Ohio, Tennessee, Virginia, Virginia Occidental y Wisconsin); China; e India. RECOLECCIÓN Y CULTIVO Recolección (Preservación y Ecología)-Tradicionalmente, la Cimicífuga racemosa ha sido cosechada una vez que las plantas se vuelven reproductoras, hecho que ocurre entre los 2 y los 8 años de edad en plantas cultivadas, según las técnicas de cultivo (ver Prácticas de Cultivo). Una porción del rizoma con un brote visible debe quedar en el suelo para rebrotar al año siguiente. No existe información publicada sobre la relación entre el perfil de constituyentes del rizoma y su edad, las condiciones de cultivo o lugar de origen, aunque dichos estudios se encuentran en proceso de realización. Actualmente se desconoce el impacto de la cosecha sobre la población silvestre de Cimicífuga racemosa y las opiniones de las fuentes difieren al respecto. Mientras que algunos sostienen que los niveles actuales de recolección atentan contra la viabilidad de la población silvestre, otros consideran que la recolección sustentable es posible dentro de los niveles actuales de demanda. Actualmente se encuentra en proceso el estudio de los límites de recolección sustentable. El estado reglamentario respecto de la comercialización de la Cimicífuga racemosa está en revisión por parte de la CITES. La abstención de la cosecha de plantas hasta después de que hayan producido semillas y el hecho de dejar una porción del rizoma en el suelo para el rebrote, son componentes claves para una recolección sustentable. Prácticas de Cultivo-La Cimicífuga racemosa crece a partir de cortes de rizomas o semillas y necesita un poco de sombra, según la altura y otras condiciones ambientales. Si crece a partir de cortes de rizomas, una planta necesita de 2 a 3 años para ser reproductora; la que crece a partir de semillas sembradas en invernadero y luego plantadas, necesita de 4-a 6 años; la que crece por siembra directa puede necesitar de 6 a 8 años. Un trabajo preliminar indica que la Cimicífuga racemosa puede multiplicarse con éxito mediante técnicas in vitro. Tiempos Óptimos para la Cosecha-Los rizomas y las raíces deben recogerse en otoño, cuando la planta se encuentra en estado latente. En ese momento, las porciones subterráneas de la planta tienen menor contenido de humedad que en otras estaciones. La cosecha en otoño permite además que las plantas produzcan semillas maduras antes de colectar la raíz. MANIPULACIÓN POSTERIOR A LA COSECHA Prácticas Óptimas de Manipulación y Procesamiento-Los rizomas con raíces pueden procesarse frescos o secos. Deben estar bien lavados directamente después de la cosecha y luego ponerse a secar. Las raíces cosechadas recientemente deben ser sólidas, pero no leñosas. Secado-Los rizomas con raíces se cortan y se secan al aire a una temperatura de 35º a 45º. Cuando están completamente secos y no hay evidencia de humedad en un corte transversal, tanto visible como al tacto, se vuelven quebradizos y se parten con facilidad. Almacenamiento-Seguir las guías generales de almacenamiento, envasando en envases herméticos protegidos de la luz, el calor, la humedad y la infestación por insectos.
2232 (2030) Información Complementaria / Suplementos Dietéticos
USP 39
ADULTERANTES Y CONTAMINANTES Otras especies de Actaea, especialmente el cohosh amarillo (A. podocarpa sinón. Cimicifuga americana), se han confundido comúnmente con A. racemosa (cohosh negro) debido a la similitud en el aspecto de sus partes aéreas y el hábitat de crecimiento común entre las especies. Ambas especies pueden distinguirse por las diferencias en sus partes subterráneas recién cosechadas: el rizoma fresco de A. podocarpa tiene un matiz amarillento distintivo, mientras que el de A. racemosa es negro. Los rizomas de ambas especies son mucho más difíciles de diferenciar cuando están secos porque la A. podocarpa se oscurece con el secado. Las porciones subterráneas del cohosh blanco [baneberry] (Actaea pachypoda y A. rubra) aparecen como adulterantes ocasionales de la Cimicífuga racemosa. Las plantas con frutos de cohosh blanco, pueden distinguirse de la Cimicífuga racemosa por sus bayas blancas carnosas o sus bayas rojas venenosas, que contrastan con los folículos secos de la Cimicífuga racemosa. No se dispone de información sobre cómo distinguir entre las porciones subterráneas de Cimicífuga racemosa y de cohosh blanco. Según un distribuidor de hierbas, las raíces de cohosh blanco son más pequeñas que las de Cimicífuga racemosa y, por lo tanto, a menudo no son recolectadas por los recolectores de plantas silvestres. En la costa Noroeste, Actaea elata (sinón. Cimicifuga elata), se recolecta para uso medicinal.
Jengibre
Zingiber officinale Roscoe (Fam. Zingiberaceae) IDENTIFICACIÓN BOTÁNICA
Zingiber officinale Roscoe. Herbácea perenne de rizoma tuberoso, aromática por la presencia de aceites volátiles.
Tallo: Erecto, pseudotallo sin ramas formado por una apretada superposición de vainas en las bases de las hojas de recubrimiento; de 0,9 m a 1,5 m de altura. Hoja: Simple, alternada y de dos alineaciones, sésil o pecíolos cortos con vainas en las bases que recubren el tallo y una lígula donde la base de la hoja se une con el tallo; lámina lineal a lanceolada angosta, de 15 cm a 25 cm de longitud, de 1,5 cm a 3 cm de ancho; borde entero; glabra a pubescente. Inflorescencias: Espiga terminal de 3,5 cm a 8 cm de longitud, de 1,5 cm a 2 cm de ancho, con brácteas primarias llamativas en espiral; generalmente nacen en tallos especializados sin hojas. Flor: Perfecta, simétrica bilateralmente; cáliz tubular con 3 lóbulos; tubo de la corola de 2 cm a 2,5 cm de longitud con lóbulos apicales lanceolados de 1,5 cm a 2 cm de longitud, de 2 mm a 3,5 mm de ancho, color amarillo verdoso; 1 estambre, antera de color crema con púrpura oscuro, parte conectiva superior que sostiene el estilo elongada; 4 estaminodios, petaloides, 2 unidos en un labio erecto, oblongo-ovado que es púrpura oscuro con moteado color crema; ovario inferior; 1 estilo, delgado, aplicado más allá del conectivo. Fruto: Cápsula loculicida; semillas color negro brillante con arilo blanco. Número de cromosomas: n = 11. Existen diversas variedades y formas diferentes de jengibre. Las características morfológicas variables de las mismas se detallan en la Tabla 7. Tabla 1. Características morfológicas y claves del Jengibre en diferentes áreas de producción Fuente África
Forma
Aroma
Color (Externo)
Superficies planas, mayormente peladas, rica en almidón y fibrosa; 9 cm de longitud, 1,5 cm de ancho
La mala calidad se reconoce por su aroma a alcanfor
Superficie sin cortar, oscura, color marrón grisáceo; superficie cortada color negro amarronado
Similar a cítricos
Beige
Australia Bengala
Superficies planas, raspadas
China
Lóbulos cortos mochos, sin raspar, mayormente rebanados
Fuerte, floral a cítrico
Marrón pálido
Cochin
Superficies laterales sin súber
Fuerte, floral a cítrico
Color crema con numerosos puntos de resina negros
Jamaica (sin blanquear)
Hasta 12 cm de longitud, 1 cm de ancho; superficies completamente peladas; corteza delgada, rica en almidón y fibrosa
Delicado, similar a cítricos
Todas las superficies color marrón amariliento
Japón
Hasta 7 cm de longitud, 12 mm de ancho; superficies generalmente planas; completamente peladas; corteza gruesa rica en almidón y fibrosa
Similar a la bergamota
Externamente blanco grisáceo a marrón grisáceo claro, generalmente con polvo blanco proveniente del recubrimiento con cal
Malabar (Cochin y Calcuta)
Capa de súber completamente removida, mayormente tratada con tiza
Similar a cítricos
Casi blanco
Nigeria
Menor tamaño que otras variedades, raspada con menor profundidad
Delicado
Algo más oscuro que otras variedades
Marrón grisáceo
USP 39
Suplementos Dietéticos/ (2030) Información Complementaria 2233 HISTORIA FARMACOPEICA
El jengibre fue oficial en la Farmacopea de los Estados Unidos desde la primera edición de 1820 hasta la decimocuarta revisión de 1950, apareciendo a menudo en diversas preparaciones. También apareció en todas las ediciones del United States Dispensatory desde 1833 hasta la última edición de 1973, donde se describió como "un estimulante y carminativo que se ha utilizado para el tratamiento de la dispepsia y el meteorismo". COMPONENTES Los aceites esenciales y los principios acres constituyen algunos de los principales componentes del rizoma del jengibre:
4,0% a 10,0% del rizoma está formado por una oleorresina compuesta de principios no volátiles acres (fenoles, como gingeroles y sus productos de deshidratación relacionados, shogaoles); grasas no acres y sus ceras. El aceite esencial (1 % a 3%) contiene sesquiterpenos y monoterpenos, principalmente geranial y nerales. Generalmente, pero no siempre, predominan los sesquiterpenos (30% a 70%), como el zengibereno, sesquifelandreno y beta-bisaboleno, que se descomponen al secarse y almacenarse. Los principios acres no volátiles incluyen fenilalcanonas, gingeroles, y fenilalcanonoles, shogaoles con longitudes de cadena variables. PROCEDENCIA Y DISTRIBUCIÓN
Procedencia-El jengibre se cultiva en la mayoría de los países tropicales y subtropicales en mayor o menor grado. Se calcula que la producción mundial es de 100 000 toneladas. Se ha informado que China e India son las principales áreas de producción. Aproximadamente 5000 toneladas de jengibre se importan a los Estados Unidos. Aproximadamente un 80% de esta cifra proviene de China. Se ha informado que en China, las provincias de Sichuan y Guizhou producen las mayores cantidades y la mejor calidad. También se produce en las provincias de Guangdong, Hubei, Shandong, Shanxi y Zhejian. A la mayor parte del jengibre seco de China disponible en los Estados Unidos se le retira o raspa la corteza antes de secarlo. Esto le da un aspecto blancuzco. La raíz recién extraída se embebe toda la noche en agua, se raspa con un cuchillo para quitar la corteza externa y luego se seca al sol. Se ha informado que los altos niveles de arsénico en el suelo del condado de Changning, de la provincia de Hunan, China, han tenido un efecto negativo sobre la producción de jengibre. En India, el jengibre se cultiva en gran escala en las regiones cálidas y húmedas de Madras y Cochin, y en menor medida, en Bengala y Punjab. Se ha informado que las variedades cultivadas en Bengala representan el material de mejor calidad en la India. Otras áreas de producción incluyen África (Nigeria y Sierra Leona), Australia, Fiji, Indias Orientales, Jamaica y Hawai. Las características morfológicas del jengibre cultivado en estas diferentes áreas, se describen en la Tabla 7. En la literatura más antigua, el jengibre jamaiquino se presenta como el de mejor calidad y el más aromático, aunque los suministros son limitados. Distribución-La mayoría de los países tropicales y subtropicales, tales como Australia, China (provincias de Guangdong, Guizhou, Hubei, Shandong, Shanxi, Sichuan y Zhejian), India (Bengal, Cochin, Malabar), las Indias Orientales, Fiji, Jamaica, Japón, Nigeria y Sierra Leona. Hawai en los Estados Unidos. RECOLECCIÓN Y CULTIVO
Recolección (Preservación y Ecología)-Cuando los tallos se marchitan y están blancos, los rizomas están listos para la recolección. Generalmente, el jengibre se cosecha después de 6 meses de crecimiento como mínimo y, a veces, no antes de los 20 meses; o para obtener raíces más grandes, se cosecha en enero o febrero del segundo año de crecimiento. En áreas tropicales y subtropicales, las raíces se cosechan a los 4 meses de crecimiento, ya que tienden a volverse más fibrosas y resistentes a medida que envejecen. A medida que el jengibre madura, se vuelve más fibroso y adquiere un sabor más intenso. La cosecha de jengibre puede describirse en tres etapas: 1. El jengibre de cosecha temprana se conoce como jengibre verde y se comercializa como jengibre fresco. Es suculento y tierno, maduro, y tiene un ligero aroma floral o a limón, y un suave sabor. 2. El jengibre cosechado unos meses más tarde es más fibroso y seco, se cosecha para secarse y puede venderse como jengibre entero seco, de sabor pleno y acre. 3. La última cosecha se realiza generalmente a los 9 meses y produce el jengibre más fuerte, el cual es bastante seco y además es rico en componentes acre. Este jengibre se seca y luego se muele para obtener polvo. Prácticas de Cultivo-El jengibre es una hierba perenne que crece bien a temperaturas subtropicales, donde las precipitaciones alcanzan al menos 1, 98 metros al año. La planta es estéril y se cultiva por medios vegetativos. Los trozos de rizoma seleccionados ("fragmentos de siembra" o "esquejes"), cada uno con un brote, se plantan en orificios o surcos. Idealmente, el suelo debería drenarse bien y ser rico en marga de arcilla. Las condiciones de cultivo se asemejan a las del cultivo de la papa. Es necesario el mantillo o abono, ya que la planta agota rápidamente los nutrientes del suelo. El jengibre es sensible al anegamiento y a la pudrición de la raíz. Los métodos preventivos incluyen el uso sólo del jengibre más limpio para la plantación y el lavado con fungicida antes de realizar la plantación. Un estudio del cultivo hidropónico de
2234 (2030) Información Complementaria /
Suplementos Dietéticos
USP 39
jengibre tuvo un rendimiento de hasta 125 toneladas por hectárea en 6 a 7 meses, en comparación con las 35 toneladas por hectárea cuando se cultivó en el suelo. Tiempos Óptimos para la Cosecha-típicamente en diciembre o enero. MANIPULACIÓN POSTERIOR A LA COSECHA Prácticas Óptimas de Manipulación y Procesamiento-Después de la cosecha, el rizoma se limpia y se retiran los tallos y las raíces. Cada región procesa su jengibre de diferente manera después de la cosecha. Esto tiene efectos en las diferentes calidades y los grados comerciales disponibles en el mercado. El jengibre verde es el rizoma comercializado sin secar. Las variedades sin raspar o parcialmente peladas se comercializan como jengibre recubierto o negro. Estos rizomas se han hervido en agua y se han secado rápidamente. Una vez seco, el jengibre negro se quiebra y su fractura es córnea, negruzca y en cierta manera diáfana, debido a la consistencia pastosa del almidón. El jengibre blanco generalmente se blanquea frotando con tiza o cal para aclarar su color y evitar la infestación por insectos. El jengibre en conserva consiste de trozos blandos, de color marrón amarillento, obtenidos al sumergir el jengibre fresco en jarabe caliente y·embotellarlo cuidadosamente. Es blando, traslúcido y tiene un color amarillo amarronado. Cuando se hornea, el jengibre pierde su pungencia y adquiere un sabor amargo. Secado-En general, después de la cosecha, las raíces frescas se lavan y se quita toda la piel oscura externa, compuesta de súber y un poco de parénquima subyacente. Este raspado acelera el tiempo de secado del material en crudo. Sin embargo, un raspado excesivo puede producir concentraciones más reducidas de aceite esencial que se pierde con el tejido epidérmico que se desecha. Después del raspado, los rizomas se tienden sobre pisos limpios y se secan al sol durante 7 a 1O días. Durante este tiempo, se dan vuelta ocasionalmente y se apilan todas las noches. Si los rizomas frescos son demasiado carnosos o húmedos, el secado llevará más tiempo y el producto terminará con aspecto arrugado. Para obtener un producto más blanco, el jengibre se humedece después de 5 ó 6 días y se seca durante otros 2 días, momento en el que estará listo para la exportación. El jengibre seco tiene un sabor más acre e intenso que el jengibre fresco. Almacenamiento-Almacenar en un envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz y la humedad, en un área fresca. Se realizó un estudio con el jengibre cosechado después de 8; 9,5; 11 ó 12 meses. Las muestras se almacenaron entre 1Oº y 15º y entre 45% y 55% de humedad relativa, o entre 25º y 30º y a 75% de humedad relativa durante O, 4 u 8 semanas. Los rendimientos de aceite y de oleorresina aumentaron con la edad del jenjibre. El almacenamiento a temperatura ambiente tuvo efectos adversos, pero el almacenamiento refrigerado hasta 4 semanas no afectó la calidad. Cuando se almacena durante períodos prolongados, el jengibre molido pierde su acritud. ADULTERANTES Debido a que el jengibre es tan característico, son poco frecuentes los adulterantes involuntarios. Sin embargo, en Asia oriental a veces se usan Zedoary cassumer y Zedoary zerumbet junto con Alpinia allughas, que son más grandes, y se hallan en el mercado europeo. Son fáciles de distinguir por sus aromas característicos. En ocasiones, el "jengibre" confitado con azúcar de China se prepara con Alpinia galangal. La literatura más antigua dice que otras hierbas eran utilizadas como adulterantes. Estas incluyen varias especies de Cúrcuma, Cápsico y Pimienta Malagueta (Amomum melegueta) añadidas a material agotado para realzar el color y la acritud. El polvo de jengibre a veces se adultera con almidones de plantas, como los de trigo, papa, maíz, cebada, arroz, legumbres, bellotas, semilla de lino molida, yuca, torta de aceite de semilla de lino, semilla de raps, mostaza, harina de almendras, semilla de palma o aceitunas, cáscara de avellana y aditivos minerales. Estos pueden identificarse microscópicamente con facilidad. En el mercado, se desconoce el grado de este tipo de adulteración. El material agotado debe considerarse un adulterante.
Valeriana
Valeriana officinalis L. (Fam. Valerianaceae) IDENTIFICACIÓN BOTÁNICA
Valeriana officinalis L. Herbácea perenne, rizomatosa.
Tallo: Solitario, hueco, de 15 cm a 150 cm. Hoja: Basal y caulinar, opuesta, extrañamente con lóbulo pinnado sólo una vez, de 11 a 21 lóbulos lanceolados, entera o dentada, hojas basales pecioladas, hojas subsésiles caulinares de sujeción. Inflorescencias: Cima compuesta, terminal o axilar, muchas flores color rosado pálido a blanco, intensamente aromáticas. Flor: Cáliz con 5 lóbulos, lóbulos poco visibles en la flor, se elongan y asemejan al vilano en el fruto, corola en forma de embudo, con leve forma de saco en la base, de 5 lóbulos, tubo de 4 mm, lóbulos de 1 mm, 3 estambres, filamentos adheridos al tubo de la corola alternado con los lóbulos de la corola, ovario inferior, con tres lóculos, uni-ovular, sólo 1 lóculo fértil, estigma tripartito. Fruto: El aquenio está rodeado por un cáliz persistente, oblongo lanceolado, de 4,5 mm a 5 mm, piloso o glabro. Las poblaciones de V. officinalis varían en nivel de ploidía desde diploide a tetraploide u octaploide. La V. officinalis británica generalmente es octaploide, y los suministros de Europa central son tetraploides.
USP 39
Suplementos Dietéticos/ (2030) Información Complementaria 2235
Existen tres subespecies de V. officinalis: ssp. officinalis, ssp. collina (Wallr.) Nyman y ssp. sambucifo/ia (Mikan fil.) Celak. Estas tres subespecies, así como las demás especies europeas de valeriana, V. repens Host, se han considerado material de origen aceptable para preparaciones medicinales. Identificación Macroscópica-Los diferentes quimiotipos tendrán características levemente diferentes. Al secarse, todo el rizoma tiene hasta 50 mm de longitud y 30 mm de diámetro, obcónico a cilíndrico, con una base elongada o comprimida. Tiene una parte externa marrón amarillenta a marrón oscura, con un tallo cilíndrico y cicatrices en las hojas. El rizoma contiene varias radículas gruesas, de color marrón claro a oscuro, ubicadas alrededor de un cordón delgado y leñoso. La raíz presenta arrugas longitudinales, tiene aproximadamente 100 mm de longitud y de 1 mm a 3 mm de diámetro, casi cilíndrica y casi del mismo color que el rizoma. En un corte longitudinal, la médula presenta una cavidad central atravesada por tabiques. Los estolones tienen de 20 mm a 50 mm de longitud, son de color gris amarillento pálido, con nudos prominentes separados por internudos estriados longitudinalmente. Comúnmente se corta a la mitad para lograr una limpieza más sencilla. Las radículas, que contienen la mayor parte del aceite esencial, son frágiles y se quiebran en fracturas cortas y callosas, y por dentro son blancuzcas o amarillentas. Aroma: Cuando se seca correctamente, la V. officinalis L., s.I. sólo tiene un aroma característico muy tenue, similar al ácido valérico, que se intensifica con el tiempo. El material viejo o secado incorrectamente posee un olor intenso característico debido a la hidrólisis enzimática de los ésteres de los valepotriatos (ácido isovalérico y ácido hidroxivalérico). Sabor: Sabor moderadamente dulce y alcanforado, con un resabio levemente amargo y picante. HISTORIA FARMACOPEICA La valeriana fue oficial en la Farmacopea de los Estados Unidos desde la primera edición de 1820 hasta la decimoprimera revisión de 1930, apareciendo a menudo en diversas preparaciones. En su punto máximo, desde 1850 hasta 1880, apareció de seis a siete veces en diferentes preparaciones. La valeriana está entre los 30 productos botánicos más citados en la historia de la USP. La raíz de la valeriana se ha utilizado como sedante y espasmolítico en Europa desde el siglo XVI. COMPONENTES Los componentes principales de la valeriana se han identificado como sesquiterpenos de aceites volátiles e iridoides (epoxitriésteres), conocidos como valepotriatos. El contenido total de aceite volátil varía ampliamente dentro de una única especie y entre diferentes especies. La Valeriana officinalis L. de Europa generalmente contiene O, 1% a 2,8% de aceite volátil. El aceite está compuesto de mezclas de derivados de monoterpenos y sesquiterpenos. La cantidad de valepotriatos presente también varía ampliamente entre las especies y los géneros, incluso dentro de una especie, que generalmente va de 0,5% a 1,2%. Los valepotriatos son particularmente inestables; se descomponen con facilidad bajo los efectos de la humedad, las temperaturas superiores a los 40º (104 ºF), o la acidez (pH < 3). La valeriana también contiene pequeñas cantidades de ácidos alifáticos, alcaloides, aminoácidos, ácidos fenólicos, flavonoides, ácidos grasos libres, azúcares y sales. Los componentes de la valeriana que posiblemente tengan efectos sedantes incluyen el ácido acetoxivalerénico, 1-acevaltrato, baldrinal, didrovaltrato, ácido hidroxivalerénico, derivados de kessanos, valeranona, valerenal, ácido valerénico y valtrato. PROCEDENCIA Y DISTRIBUCIÓN Procedencia-La valeriana se halla en praderas húmedas o secas, matorrales o bosques en la mayor parte de Europa, aunque difícilmente se la encuentre en el sur, y se cultiva y se aclimata en Norteamérica. La valeriana se cultiva en Alemania, Bélgica, Europa Oriental, Francia, Gran Bretaña, Japón, Norteamérica y Rusia. La mayoría de los extractos estandarizados y los materiales crudos cortados y tamizados del mercado local están preparados con suministros europeos. Una gran cantidad de extractos líquidos se preparan con materiales cultivados localmente. Se ha informado que muchas especies diferentes a V. officinalis se comercializan como valeriana medicinal. Éstas incluyen V. edulis Nutt. ex Torr. & A. Gray, V. corneana Briq. k, V. stubendorfi Kreyer ex Kom., V. amurensis P. Smirn. ex Kom., V. hardwickiiWall., V. exaltata Mikan, y V. wallichi DC. sinón. V. jatamansi Jones. * Las especies de Norteamérica usadas con más frecuencia incluyen V. sitchensis Bong y V. edulis Nutt. * = V. edulis Nutt. ex Torr. & Gray ssp. procera. Otras especies que se han informado como de uso local incluyen V. arizonica Gray, V. capitata Pall ex Link., V. diocia L., y V. scouleri Rydb. Faltan análisis químicos detallados de la mayoría de las especies de los Estados Unidos. Una cantidad limitada de valoraciones del material que se cultiva en la costa Noroeste presenta niveles variables de aceite esencial que van desde 0,4% a 1,3%. Se descubrió que el ácido valerénico y los valepotriatos están presentes en muestras frescas y secas de V. sitchensis Bong. V. sitchensis Bong presenta una intensa acritud cuando está fresca. Se ha informado que el material de alta calidad contiene de 1,0% a 1,5% de aceite esencial, ~30% de materia extraíble y ~0,5% de ácido valerénico. Distribución-Europa (Alemania, Bélgica, Europa Oriental, Francia, Gran Bretaña, Holanda), Japón, Norte América y Rusia.
• V. wallichi DC. y V. edulis Nutt. no contienen ácido valerénico ni sus derivados.
2236 (2030) Información Complementaria / Suplementos Dietéticos
USP 39
RECOLECCIÓN Y CULTIVO Recolección (Preservación y Ecología)-La mayor parte de la valeriana comercializada proviene de material cultivado. Las temporadas de cosecha varían geográficamente. La composición de los aceites esenciales varía ampliamente entre las diferentes poblaciones de la misma subespecie, incluso entre la misma población de plantas de año a año. El contenido de aceite esencial también varía con los genotipos, las temporadas de cosecha, las condiciones de cultivo, edad de la raíz, técnicas de secado y método de análisis. Se ha informado que la valeriana que se cosecha en elevaciones más altas, que crecieron en regiones más secas o se cultivaron en suelos ricos en fosfato, producen un nivel relativamente alto de aceite esencial. La literatura más antigua informa que la valeriana debe cosecharse en otoño, entre agosto y septiembre, preferentemente durante el segundo año de crecimiento. Los análisis del material cultivado en Holanda informan que la mayor parte de los componentes, incluso el aceite esencial y el ácido valerénico, se encontraban presentes en mayor cantidad en las raíces cosechadas durante el primer año de crecimiento, encontrando las mayores cantidades de aceite esencial en septiembre y noviembre (de 1,2% a 2, 1%). El siguiente nivel más alto de aceite esencial se informó para el material cosechado en marzo (de 0,9% a 1,6%). El ácido valerénico y sus derivados se encontraron en mayor cantidad en febrero y marzo (de 0,7% a 0,9%) seguido por el material cosechado en septiembre (de 0,5% a 0,7%), y luego en enero (de 0,3% a 0,4%). Desde el punto de vista comercial, es más rentable cosechar las raíces durante el mismo año en que se siembran las plantas que durante el segundo año. Prácticas de Cultivo-Se ha informado que se prefiere la siembra de semillas a la plantación de plántulas. Los mejores resultados se lograron mediante la plantación en terrenos planos en hileras espaciadas a 50 cm y una cantidad de 3 kg de semillas por hectárea. Cortar las partes superiores con flores antes de que la planta haya dado semillas hace que el rizoma se desarrolle con más plenitud. Tiempos Óptimos para la Cosecha-Wagner informa que la cosecha debe realizarse por la mañana durante climas relativamente frescos, una recomendación general para las raíces ricas en aceites esenciales. MANIPULACIÓN POSTERIOR A LA COSECHA Prácticas Óptimas de Manipulación y Procesamiento-El aceite esencial se ubica en la hipodermis del rizoma en grandes células con paredes delgadas. Por lo tanto, debe tenerse cuidado de no dañar estas células durante la manipulación. El excesivo lavado de las raíces puede producir una significativa reducción de materia extraíble. Debido a la sensibilidad de los aceites volátiles al calor, es necesario reducir la cantidad de tiempo del proceso de molienda o pulverización, por medio del procesamiento de pequeños lotes al mismo tiempo, con interrupciones frecuentes, o mediante la utilización de un molino criogénico. Secado-Para una máxima preservación de los aceites esenciales, la valeriana debe secarse a 40º con una velocidad de flujo de 0,05 kg por segundo por m2 • Como alternativa, también se informan como apropiados el secado a 20º durante aproximadamente 1O días, el secado a la sombra aproximadamente a 45º, el secado al vacío a baja temperatura y la liofilización. El secado descuidado o prolongado produce un color más oscuro en las raíces y produce la hidrólisis de los ésteres isovaleriánicos y la liberación de ácido isovalérico e hidroxiisovalérico. Esto es lo que produce el aroma característico de la valeriana. La valeriana secada en forma adecuada producirá el mismo aroma con el correr del tiempo. Almacenamiento-Almacenar en envases cerrados. Proteger de la luz, el aire y la humedad. El ácido hidroxivalerénico, producto de la descomposición del ácido acetoxivalerénico, se forma cuando la hierba se almacena en lugares de muy alta humedad. Las condiciones de almacenamiento inadecuadas pueden producir un deterioro significativo del material. Aunque el aceite esencial es relativamente estable, puede evaporarse por la excesiva exposición al aire. El aceite esencial puede degradarse rápidamente en el material en polvo. En las raíces en polvo, el contenido de aceite esencial puede reducirse en un 50% en 6 meses. Los valepotriatos son sensibles a la humedad, a temperaturas superiores a los 40º, a los medios ácidos (pH <3) y generalmente no se detectan en los productos comercializados después de los 60 días. ADULTERANTES Otras especies de valeriana: en la comercialización de la valeriana puede encontrarse una especie no identificada de Apiaceae. La adulteración de la valeriana en el mercado de los Estados Unidos no es común. Se ha informado que muchas especies diferentes a V. officina/is se comercializan como valeriana medicinal. Éstas incluyen V. edulis Nutt. ex Torr. & A. Gray, V. coreana Briq.k, V. stubendorfi Kreyer ex Kom., V. amurensis P. Smirn. ex Kom., V. hardwickii Wall, V. exaltata Mikan y V. wallichi DC. sinón. V. jatamansi Janes.
Suplementos Dietéticos/ (2030) Información Complementaria 2237
USP 39
Olmo
U/mus rubra Muhlenberg [U/mus fu/va Michaux] (Fam. Ulmaceae) IDENTIFICACIÓN BOTÁNICA
U/mus rubra Muhlenberg; árbol de hasta 35 m de alto, con ramas dispersas y corona abierta y plana; las preparaciones se derivan de la corteza interna. El U. rubra parece estar más estrechamente relacionado con las especies asiáticas introducidas U. pumila L. que con las otras especies nativas americanas de U/mus; cuando los dos coexisten, es común la hibridación. Tronco: De 18 a 35 m de altura, de hasta 1 m de diámetro; el tronco no presenta ramas hasta aproximadamente 5 a 6 metros de altura. Ramas: Erectas, dispersas; las ramas delgadas jóvenes son escabrosas y pubescentes. Corteza: De color marrón oscuro a marrón rojizo, profundamente surcada. La corteza interna es blancuzca (la superficie externa es de color anaranjado amarillento; la superficie interna es de color amarillo pálido), fragrante (al reducirla a polvo, produce un olor característico parecido al fenogreco) y muy mucilaginosa al masticarla o humedecerla. Hojas: Alternadas; simples; pecioladas con pecíolos de (3-)5-7(-9) mm de largo; 7-18(-23) cm de largo, 5-10(-15) cm de ancho; elípticas a ovadas, oblongas, u obovadas con base oblicua y ápice acuminado; bordes aserrados hacia la base, y en las demás partes doblemente aserradas; la superficie superior es áspera; la superficie inferior es tomentosa; las venas secundarias son paralelas, ligeramente curvas, que se extienden hasta las puntas de los dientes del borde. Inflorescencias: Fascículos axilares, casi hemisféricos, de hasta 1,5 (-2,5) cm de diámetro. Flores: Pequeñas, perfectas; pedicelos de 1-2(-3) mm de largo; cáliz campanulado, con 5-9 lóbulos en el ápice, de aproximadamente 2,6-3,5 mm de diámetro, pubescencia de color rojizo; sin pétalos; 5-9 estambres, que sobresalen de las flores; con 2 estilos. Las flores se presentan antes que las hojas desde marzo hasta principios de mayo. Fruto: Sámara alada, de color amarillento, irregularmente suborbicular o en ocasiones ampliamente elíptica a obovada, de 10-20 mm de diámetro, con pubescencia rojiza sobre la semilla; el ala tiene una textura papirácea.
HISTORIA FARMACOPEICA La corteza interna del olmo (Ulmus) rojo (resbaladizo) apareció en la lista de materiales medicinales en la primera Farmacopea de los Estados Unidos (USP) de 1820 y conservó su estado oficial hasta que fue retirada de la USP XI (1936). La USP 7820 incluyó instrucciones para la preparación de Infusión de Olmo Rojo: "Tomar una onza de olmo rojo en rebanadas. Una pinta de agua hirviendo. Someter a infusión durante doce horas en un vaso cubierto, cerca del fuego agitando frecuentemente y filtrar." Inmediatamente después de su eliminación de USP XI (oficial: 1 de junio de 1936), la Corteza de Olmo Rojo se convirtió en monografía oficial en la sexta edición del Formulario Nacional (NF; oficial: 1 de junio de 1936) hasta su eliminación de la 11 edición (oficial: 1 de octubre de 1961). Se oficializó nuevamente como Olmo, el 15 de noviembre de 1995, en la sección del Tercer Suplemento de la Farmacopea de los Estados Unidos de América-Formulario Nacional ( USP 23-NF 18). Se publicó una revisión en el Séptimo Suplemento el 15 de noviembre de 1997. En 1982, la Corteza de Olmo apareció en la Advance Notice of Proposed Rulemaking (ANPR) de la Food and Drug Administration (Administración de Alimentos y Medicamentos o FDA) para el establecimiento de una monografía terapéutica para medicamentos para el cuidado de la salud bucal para uso humano de venta libre (OTC, por sus siglas en inglés). En la ANPR (1982), al igual que en la subsiguiente monografía final tentativa de 1988 y en la enmienda a la monografía de 1991, la corteza de Olmo fue clasificada como Ingrediente activo demulcente oral de venta libre de categoría 1 (Generalmente Reconocido como Seguro y Eficaz (GRASE, por sus siglas en inglés)); asimismo, se promovió el desarrollo de normas adecuadas en los compendios oficiales. Aparte de los compendios USP-NF, la monografía de Olmo ya había aparecido en la segunda edición de The Dispensatory of the United States of America (1834), y su última aparición ocurrió en la 25a. edición en 1960. COMPONENTES Los componentes importantes para cumplir con la prueba de Identificación A en Olmo son sustancias mucilaginosas. El mucílago de la corteza interna del olmo se puede extraer fácilmente con agua y consiste principalmente en un polisacárido cuya hidrólisis produce o-galactosa, D-metil galactosa, L-ramnosa y glucosa. La reducción con borohidruro del polisacárido oxidado con peryodato produce, en hidrólisis parcial con ácido caliente, tres oligosacáridos: 0-(3-0-metil-P-o-galactopiranosil)-(l ~4)0-(3-0-metil-P-D-galactopiranosil)-(l ~4)-L-ramnosa, 0-(3-0-metil-fi-D-galactopiranosil)-(1 ~4)-L-ramnosa y 0-(3-0-metil-PD-galactopiranosil)-(l ~4)-3-0-metil-o-galactosa. Otros componentes del Olmo son trazas de taninos, incluidos proantocianidinas, algo de almidón, trazas de sales de oxalato, beta-sitosterol y minerales. PROCEDENCIA Y DISTRIBUCIÓN Procedencia-La corteza de olmo rojo se cosecha de poblaciones silvestres en el este de Canadá y en los Estados Unidos, desde la parte sur de Quebec hacia el oeste hasta Dakota del Norte, en la región sur hasta la región centro-sur de Texas y en
2238 (2030) Información Complementaria / Suplementos Dietéticos
USP 39
Florida. Es común en toda la región oriental, sureña y del medio oeste de los EE.UU., y crece en más de 25 estados. Está aumentando la cantidad de suministro comercial cosechada de conformidad con los planes de administración de recursos silvestres sustentables porque estas prácticas se requieren como condición para la certificación orgánica de colecta silvestre. Por otro lado, desde que se encontró por primera vez en 1930 en los Estados Unidos, la enfermedad del olmo holandés ha tenido un impacto negativo importante en las poblaciones de olmo, afectando a más del 50% de los árboles de olmo en los estados norteños. Distribución-Canadá (New Brunswick, Ontario, Quebec), Estados Unidos (Alabama, Arkansas, Carolina del Norte, Carolina del Sur, Connecticut, Dakota del Norte, Dakota del Sur, Delaware, el Distrito de Columbia, Florida, Georgia, lllinois, Indiana, lowa, Kansas, Kentucky, Louisiana, Maine, Maryland, Massachusetts, Michigan, Minnesota, Mississippi, Missouri, Nueva Hampshire, Nueva Jersey, Nueva York, Ohio, Oklahoma, Pennsylvania, Rhode lsland, Tennessee, Texas, Virginia, Vermont, Wisconsin y Virginia Occidental). RECOLECCIÓN Y CULTIVO Recolección (Preservación y Ecología )-Se cosecha "natural" (tanto corteza interna como externa) y "pelada" (únicamente corteza interna), pero solamente la corteza pelada cumplirá con las normas de la monografía USP. La cosecha debe realizarse durante días secos y de preferencia cálidos sin probabilidad de lluvia, y por lo general comienza al final de la mañana después de que hayan pasado el rocío y la humedad matutinas. Lo anterior se debe a que el procesamiento posterior a la cosecha (retiro de la corteza gruesa externa) por lo general se lleva a cabo en el sitio de recolección al aire libre y la humedad puede dañar la calidad de la corteza interna. Puesto que la corteza interna contiene polisacárido mucilaginoso, al entrar en contacto con la humedad comienza a convertirse en gel. La corteza, derivada de árboles con una edad mínima de 1 O años (algunos recolectores recomiendan seleccionar árboles de al menos 12 a 15 años) se obtiene principalmente podando o cortando las ramas principales y otras ramas bajas, pero también se puede obtener del tronco y, en muy raras ocasiones, de las raíces en los casos en los que se ha derribado el árbol completo. Aunque se sabe que la corteza interna de la raíz contiene más mucílago que el tronco o las ramas, la administración de recursos silvestres sustentable dictamina cosechar únicamente las ramas de los árboles maduros. En la práctica, es más probable que los recolectores de corteza comercial seleccionen ramas de los árboles con una edad de al menos 30 a 50 años a fin de obtener una producción lo suficientemente alta. Luego de retirar la corteza, el árbol se recuperará en las partes cosechadas y continuará su crecimiento, pero la corteza del tronco y/o de las ramas nunca debe retirarse en toda la circunferencia completa (anillado) porque esto mataría al árbol. El anillado consiste en retirar totalmente la corteza que rodea el tronco o a una rama. En la práctica, el método más sustentable de recolección de árboles maduros saludables es extraer la corteza de todas las ramas bajas de manera que no se lastime al árbol. Si se aserra de manera adecuada para que el agua de lluvia no caiga directamente en el área cortada expuesta, el árbol recuperará el área cortada dentro de un par de años. El corte adecuado, que se realiza justo por afuera del collar de ramas y la cresta de corteza de las ramas, ocasiona el menor daño a los árboles. Aunque la corteza del olmo no debe recogerse de árboles muertos, la recolección selectiva de árboles moribundos-por ejemplo, aquellos afectados con la enfermedad de olmo holandés- es factible. El hongo que ocasiona la enfermedad del olmo holandés, Ophiostoma u/mi y Ophiostoma novo-u/mi (sin: Graphium u/mi o Ceratocystis ulm1), es transportado de árbol a árbol por el escarabajo de la corteza del olmo europeo (Scolytus multistriatus), el cual llegó a Norte América en un cargamento que portaba troncos de Europa aproximadamente en 1930, y en un grado mucho menor, por el escarabajo de la corteza del olmo nativo (Hylurgopinus rufipes). Los olmos parecen sucumbir ante la enfermedad aproximadamente a los 1O años de edad y luego mueren en un período de dos años. Una vez que se diagnostica a un árbol con la enfermedad del olmo holandés, la corteza saludable aún puede cosecharse durante aproximadamente dos años, hasta el momento en que el árbol esté casi muerto. Para controlar por cuánto tiempo puede continuar la recolección, se puede usar una sierra de dos mangos para tomar muestras. El árbol está casi muerto una vez que la corteza interna muestra un incremento importante de bandas negras, y a medida que mueren más y más ramas principales y la caída de la corteza se hace evidente. El árbol casi muerto puede derribarse, y se puede retirar la corteza sana remanente de todo el árbol. La corteza interna con cambios de coloración (con bandas negras) se debe separar y desechar. El corte de la corteza de las ramas bajas principales de árboles sanos y/o la recolección selectiva de árboles viejos completos que estén cerca de morir pueden ser métodos aceptables como parte de un plan de administración de recursos sustentable para un área específica de bosque bajo supervisión orgánica. Seguir las reglas del sistema de producción orgánica (p.ej., para la selección del sitio de cosecha, ausencia de sustancias prohibidas, análisis de suelo y agua, insumos no permitidos, análisis periódico de residuos, control de documentación, inspección independiente) muy probablemente resultará en materia prima botánica que cumpla con los requisitos generales para límites de residuos de plaguicidas y de metales pesados, entre otros contaminantes potenciales. La producción orgánica certificada de corteza de olmo silvestre requiere que los productores promuevan el balance ecológico y que conserven la biodiversidad. La corteza de olmo silvestre recolectada que se va a certificar como orgánica debe cosecharse de un área designada a la que no se le haya aplicado ninguna sustancia prohibida durante un período de 3 años inmediatamente anterior a la cosecha, y debe cosecharse de manera que se asegure que la recolección no destruirá el ambiente y sustentará el crecimiento y la producción del cultivo silvestre. Los recolectores de plantas silvestres deben cumplir con los mismos requisitos y condiciones del plan del sistema de producción orgánica, según corresponda a su operación, que las contrapartes que producen plantas cultivadas. El productor de corteza de olmo silvestre orgánica debe implementar prácticas que respalden la biodiversidad y que eviten, en la medida de lo posible, cualquier actividad que la disminuya. Las prácticas de producción deben mantener o mejorar los re-
USP 39
Suplementos Dietéticos/ (2030) Información Complementaria 2239
cursos naturales de la operación, incluyendo suelo, agua, pantanos, bosques y vida silvestre. Lo anterior se logra en parte desarrollando y ejecutando un plan de administración de recursos que requiera la cosecha silvestre de poblaciones estables, minimizando los trastornos en especies prioritarias/hábitats sensibles, evitando la erosión, permitiendo el restablecimiento, y monitoreando la sustentabilidad del cultivo silvestre. Prácticas de Cultivo-Aunque el suministro comercial se cosecha a partir de poblaciones silvestres, los árboles de olmo rojo se pueden propagar mediante cortes o siembra. Para efectuar la propagación mediante semillas se deben recolectar las semillas maduras de abril a junio de árboles saludables y prósperos (dominantes) en un área similar al sitio propuesto para la plantación. Un indicador de madurez es el color verde de las sámaras (frutos). Lo mejor es recolectar las semillas de árboles dentro de 160 km al norte o al sur del sitio de plantación, debido al óptimo potencial de éxito que representa mantenerse dentro de esta distancia de los árboles padres. Se pueden dispersar veinticinco semillas por pie cuadrado, a una profundidad de 0,6 cm. El olmo rojo se puede sembrar en su ciclo normal en la primavera en un suelo de turba elevado y cama de arena. Los semilleros pueden requerir de una cubierta de alambre para proteger a las plantas jóvenes del semillero. El poder germinativo es 10% a 25%, con un ligero germinado en el verano que aumenta durante la primavera siguiente. Los árboles jóvenes se pueden trasplantar en protectores para árboles dentro del primer mes de germinado y se pueden plantar en el campo después de uno o dos años, dependiendo del tamaño del protector del árbol. Los árboles jovenes deben regarse en temporadas de sequía y verificarse de manera rutinaria para determinar la presencia de insectos predadores y la necesidad de fertilización. Tiempos Óptimos para la Cosecha-De preferencia, la cosecha debe realizarse durante la primavera (marzo a mayo), pero también se puede realizar durante el otoño. Durante la primavera, la corteza se cosecha de árboles maduros (con un mínimo de 1 O años) cuando la savia comienza a surgir. MANIPULACIÓN POSTERIOR A LA COSECHA Prácticas Óptimas de Manipulación y Procesamiento-A fin de producir corteza interna de olmo de calidad farmacopeica, se debe retirar la capa suberosa exterior de la corteza, quedando expuesta la corteza interna. Si se lleva a cabo el procesamiento posterior a la cosecha en el sitio de recolección silvestre, las ramas principales y demás ramas a las que se les retiró la corteza exterior deben colocarse sobre lonas limpias y no directamente sobre el suelo. Las ramas muy pequeñas con hojas se separan a mano de las ramas principales y se desechan. Para optimizar el cumplimiento con las normas de composición, identidad, pureza y calidad (p.ej., no más de 2% de corteza externa adherida, no más de 2% de materia orgánica extraña, no más de 10% de cenizas totales y no más de 0,65% de cenizas insolubles en ácido), se debe usar un pelador de corteza (herramienta de mano con agarradera y cuchilla) para desprender la corteza externa. Al material áspero y escamoso sobre la superficie de la corteza se le denomina cáscara, y pelar la corteza significa raspar o rasurar la corteza externa de la rama principal. Un individuo experimentado en la cosecha de la corteza exterior puede discernir visualmente si al menos el 98% de la corteza externa ha sido desprendida. La corteza interna es de color blanco (en la primavera; rojiza en una etapa posterior de la temporada) que contrasta visiblemente con el color marrón de la capa de la corteza externa. Después de haber pelado la mayor parte de la corteza exterior, se debe tener mayor cuidado para retirar la capa delgada remanente de corteza exterior a fin de no desperdiciar nada de la corteza interna en el proceso. Después de retirar la corteza exterior, la corteza interna puede retirarse en tiras, cuadrados o trozos. Se hace una incisión con una cuchilla limpia de arriba hacia el centro de la rama principal. Luego, se desliza una barreta por debajo de la incisión a fin de levantar y desprender la corteza interna del cambium. Las tiras de corteza interna se apilan en una lona limpia y posteriormente se atan para transportarlas a la instalación de secado. Secado-El Olmo USP requiere un límite de pérdida por secado de no más de 12%. Siempre que no se esperen lluvias, la corteza interna fresca de olmo se puede curar al sol dentro de un intervalo de temperatura de 32º a 60º. El secado se puede llevar a cabo en un cuarto cálido con flujo de aire o en un invernadero. El secado en invernadero toma aproximadamente de 3 a 4 días. El secado bajo techo puede tomar de 5 a 7 días, dependiendo de la fuente de calor. No obstante, el secado a escala comercial se realiza típicamente en cámaras de secado cerradas, en las que se puede controlar mejor el tiempo y la temperatura. Las tiras de corteza de olmo se colocan sobre un piso de malla limpio y se secan durante aproximadamente 2 días y a aproximadamente 50º con calor forzado por un ventilador a través del piso. Debido a los requisitos fitosanitarios adicionales para la exportación de cortezas de árbol a Europa, es necesaria la exposición a calor más alto, por lo regular a una temperatura de al menos 65º pero hasta de 93º por hasta dos días. Después del secado, las tiras de corteza interna se pueden cortar o aserrar en piezas de igual longitud y atarse en grupos con alambre. Los grupos atados generalmente consisten de piezas oblongas y planas, de aproximadamente 30 cm de largo y de 1 O a 15 cm de ancho. La tiras de corteza se pueden almacenar de esta manera hasta que se programe el procesamiento adicional (p.ej., cortado o pulverización). Almacenamiento-Para mantener la pureza y calidad farmacopeicas (p.ej., para prevenir la acumulación de humedad excesiva), la corteza interna de olmo seca debe conservarse en envases bien cerrados y almacenarse en un lugar fresco y seco. ADULTERANTES Y CONTAMINANTES Los contaminantes comunes que pueden ocasionar el incumplimiento de un material con las pruebas de identificación en la monografía de Olmo en USP incluyen otras partes de la planta: por ejemplo, más de 2% de corteza exterior, la cual carece de mucílago. El rasurado o pelado insuficiente de corteza exterior puede ocasionar que el material exceda el límite de la monografía de no más de 2% de corteza exterior adherida. Otros posibles contaminantes incluirían corteza interna que presenta una coloración atípica notable, aunque no se ha establecido un límite máximo (por ejemplo, la corteza interna con bandas visibles
2240 (2030) Información Complementaria / Suplementos Dietéticos
USP 39
de color negro obtenida de un árbol muerto). La corteza reducida a polvo también puede estar adulterada con harina de maíz, harina de arroz, almidón u otras sustancias ricas en almidón. Las consecuencias de contaminación por corteza exterior o adulteración con harina o almidón incluyen un menor contenido de mucílago, un valor menor de índice de aumento de volumen y un efecto lenitivo terapéutico correspondientemente menor que depende del mucílago. El exceso de corteza exterior también puede ocasionar que el material no cumpla con la norma cuantitativa de no más de 10% de cenizas totales. Los métodos para determinar la presencia de adulterantes incluyen el examen microscópico con el fin de determinar la presencia del exceso de corteza exterior o de cualquier otro adulterante y la concentración de células de mucílago. La prueba de mucílago para Olmo (Identificación A) así como la prueba modificada de aumento de volumen (basándose en la prueba de la monografía USP de Cubierta de la Semilla de Psyllium) también puede ser útil para investigar cualquier sospecha de adulteración.
(2040) DESINTEGRACIÓN Y DISOLUCIÓN DE SUPLEMENTOS DIETÉTICOS INTRODUCCIÓN El objetivo de este capítulo general es determinar el cumplimiento de las normas de desintegración y disolución de suplementos dietéticos cuando se indiquen en las monografías individuales. A los efectos de este capítulo, las formas farmacéuticas de los suplementos dietéticos se han dividido en tres categorías: Formas Farmacéuticas de Vitaminas y Minerales, Formas Farmacéuticas de Productos Botánicos y Formas Farmacéuticas de Suplementos Dietéticos Diferentes de Vitaminas, Minerales y Productos Botánicos. Las Formas Farmacéuticas de Vitaminas y Minerales incluyen artículos preparados con vitaminas, minerales o combinaciones de estos ingredientes dietéticos según se describe en la Tabla 1. Las Formas Farmacéuticas de Productos Botánicos comprenden formulaciones que contienen ingredientes de origen botánico, incluidos materiales vegetales y extractos. Las Formas Farmacéuticas de Suplementos Dietéticas Diferentes de Vitaminas, Minerales y Productos Botánicos abarcan suplementos dietéticos formulados con ingredientes dietéticos legalmente reconocidos que difieren de los que pertenecen a las dos categorías anteriores (p.ej., aminoácidos, condroitina y glucosamina). Cuando un suplemento dietético representa una combinación de las categorías mencionadas anteriormente y existe una diferencia entre los requisitos para las categorías individuales, se aplican los requisitos más estrictos. [NOTA-"Requisitos más estrictos" significa criterios de aceptación más estrictos y/o condiciones operativas más suaves.] Las pruebas de desintegración y disolución que se describen en este capítulo son herramientas de control de calidad para evaluar las características de desempeño de las formas farmacéuticas terminadas de suplementos dietéticos. Estas normas de desempeño tienen como propósito detectar problemas que puedan surgir debido al uso, mal uso de, o a cambios en recubrimientos, lubricantes, desintegrantes y otros componentes. Estas pruebas de desempeño también se destinan a detectar problemas en el proceso de fabricación, tales como el exceso de compresión y de secado, que podrían afectar las características de liberación de las formas farmacéuticas finales. Estas pruebas no están destinadas a usarse como una demostración o como un sucedáneo de la absorción in vivo, biodisponibilidad, o efectividad, a menos que se haya establecido una correlación in vitro-in vivo.
DESINTEGRACIÓN Esta prueba sirve para determinar si las tabletas o cápsulas de suplementos dietéticos se desintegran dentro del tiempo establecido cuando se colocan en un medio líquido en las condiciones experimentales que se presentan a continuación. Se requiere el cumplimiento de los límites de Desintegración establecidos en las monografías individuales para suplementos dietéticos, excepto cuando la etiqueta indica que los productos están destinados para su uso en trociscos o para ser masticados, o están diseñados como formas farmacéuticas de liberación prolongada. Los suplementos dietéticos declarados como formas farmacéuticas de liberación prolongada deben cumplir con normas diferentes a las de desintegración para verificar que la liberación de los ingredientes dietéticos de la forma farmacéutica se efectúa durante un período definido. Los suplementos dietéticos declarados como formas farmacéuticas de liberación prolongada no deben etiquetarse como si cumplieran con la USP, a menos que exista una monografía de la USP para dicho producto. Determinar el tipo de unidades que se va a analizar de acuerdo con el etiquetado y por observación, y aplicar el procedimiento que corresponda a 6 o más unidades. A los efectos de esta prueba, la desintegración no implica la disolución completa de la unidad ni de su ingrediente activo. Se define como desintegración completa al estado en el cual los residuos de la unidad constituyen una masa blanda sin un núcleo firme al tacto, con excepción de los fragmentos del recubrimiento insoluble o, en el caso de las cápsulas, de la cubierta insoluble, que permanezcan en el tamiz del aparato de prueba o se adhieran a la superficie inferior del disco, si se usara.
USP 39
Suplementos Dietéticos / (2040) Desintegración y Disolución 2241 Aparato
Aparato A: Emplear el Aparato que se describe en Desintegración (701) para tabletas o cápsulas de no más de 18 mm de longitud. Para tabletas o cápsulas más grandes, emplear el Aparato B. Aparato B: El aparato consiste en un montaje de canastilla-gradilla, un vaso de precipitados de paredes bajas de 1000 ml para el líquido de inmersión, un dispositivo termostático para calentar el líquido entre 35º y 39º, y un dispositivo para hacer ascender y descender la canastilla en el líquido de inmersión a una frecuencia constante de entre 29 y 32 ciclos por minuto a lo largo de una distancia de 53-57 mm. El volumen del líquido en el vaso es tal que, en el punto más alto del recorrido ascendente, la malla de alambre permanece por lo menos 15 mm por debajo de la superficie del líquido y desciende a no menos de 25 mm desde el fondo del vaso en el recorrido descendente. En ningún momento debe quedar sumergida la parte superior del montaje de canastilla-gradilla. El tiempo requerido para el recorrido ascendente es igual al tiempo requerido para el recorrido descendente, y el cambio en la dirección del recorrido se produce en una transición suave y no mediante un movimiento abrupto. El montaje de canastilla-gradilla se mueve verticalmente a lo largo de su eje. No se produce movimiento horizontal apreciable ni un desplazamiento del eje de su vertical. Montaje de canastilla-gradilla: El montaje de canastilla-gradilla (ver la Figura 7) consta de tres tubos transparentes abiertos en sus extremos, de 77,5 ± 2,5 mm de longitud cada uno, con un diámetro interno de 32,0-34,6 mm y una pared de 2,0-3,0 mm de espesor; los tubos están sostenidos en posición vertical por dos placas de plástico, de 97 ± 2 mm de diámetro y de 7,510,5 mm de espesor cada una, con tres orificios de 36,0-40,6 mm de diámetro cada uno, equidistantes del centro de la placa y entre sí. Debajo de la superficie de la placa inferior, se fija una tela de alambre de acero inoxidable de malla 1O, Nº 23 de la calibración W. & M. (W. = Washburn; M. = Moen) (0,025 pulgadas) de trama cuadrada. Las partes del aparato se ensamblan y se sostienen rígidamente mediante tres pernos que pasan a través de las dos placas de plástico. El montaje de canastilla-gradilla se suspende por medios adecuados al dispositivo mecánico de ascenso y descenso, que proporciona el movimiento vertical en un punto de su eje. El diseño del montaje de canastilla-gradilla puede variar siempre que se mantengan las especificaciones para los tubos de vidrio y el tamaño de malla del tamiz.
2242 (2040) Desintegración y Disolución / Suplementos Dietéticos
USP 39
........i..+----1~-i.-........- . ..........- -...............,.....,~_l
+--'-W~~.......... -1
.......
-H
o
ai
~"'?"17"?""]
i------------+-------+---------1 ~¡
•• ~~
.•
-•
Figura 1. Montaje de canastilla-gradilla, Desintegración, Aparato B (dimensiones en mm).
Vaso de precipitados: Paredes bajas, de 1000 ml; la diferencia entre el diámetro de las placas de plástico, que sostienen los tubos en posición vertical, y el diámetro interno del vaso de precipitados debe ser no más de 6 mm. 1 Discos: Se provee cada tubo con un disco cilíndrico perforado de 15,3 ± 0, 15 mm de espesor y 31,4±0,13 mm de diámetro. El disco está hecho de un material adecuado de plástico transparente, con un peso específico entre l, 18 y 1,20. Siete perforaciones de 3, 15 ± O, 1 mm de diámetro se extienden entre las bases del cilindro, una de las cuales se encuentra en el centro y las otras seis son paralelas a ésta y tangencialmente equidistantes entre sí para formar un círculo con un radio de 4,2 mm desde el centro del disco. Todas las superficies del disco son lisas. 2 Procedimiento Analizar 6 unidades de la forma farmacéutica según se describe a continuación, para cada tipo de forma farmacéutica. [NOTA-Para el Aparato B, se necesitan dos montajes de canastilla, para un total de 6 tubos.] Si 1 ó 2 formas farmacéuticas no se desintegran completamente, repetir la prueba con 12 formas farmacéuticas adicionales. Tabletas sin cubierta: Colocar 1 tableta en cada uno de los tubos de la canastilla y, si se indica, agregar un disco a cada tubo. Poner el aparato en funcionamiento, usando agua o el medio especificado como líquido de inmersión, mantenido a 37 ± 2º. A los 30 minutos, levantar la canastilla del líquido y observar las tabletas.
Los vasos de precipitados de paredes bajas de 1000 ml, diseñados de conformidad con las especificaciones vigentes de la ASTM E 960 Tipo 1o Tipo 11 o ISO 3819, cumplen con los requisitos de tamaño. 2 El uso de detección automática empleando discos modificados está permitido cuando se especifica o se autoriza el uso de discos. Esos discos deben cumplir con los requisitos de densidad y dimensiones que se proporcionan en este capítulo. 1
USP 39
Suplementos Dietéticos/ (2040) Desintegración y Disolución 2243
Tabletas con cubierta simple: Colocar 1 tableta en cada uno de los tubos de la canastilla y, si la tableta tiene una cubierta externa de azúcar soluble, sumergir la canastilla en agua a temperatura ambiente durante 5 minutos. Luego, si se indica, agregar un disco a cada tubo, y poner el aparato en funcionamiento, usando agua o el medio especificado como líquido de inmersión, mantenido a 37 ± 2º. A los 30 minutos, levantar la canastilla del líquido y observar las tabletas. Tabletas de liberación retardada (con recubrimiento entérico): Omitir el uso de discos. Colocar 1 tableta en cada uno de los 6 tubos de la canastilla y, si la tableta tiene una cubierta externa de azúcar soluble, sumergir la canastilla en agua a temperatura ambiente durante 5 minutos. Luego, poner el aparato en funcionamiento, usando fluido gástrico simulado SR, mantenido a 37 ± 2º, como líquido de inmersión. Después de 1 hora de operación en fluido gástrico simulado SR, levantar la canastilla del líquido y observar las tabletas: las tabletas no presentan evidencia de desintegración, resquebrajamiento o ablandamiento. Poner el aparato en funcionamiento, usando fluido intestinal simulado SR, mantenido a 37 ± 2º como líquido de inmersión, durante el tiempo especificado en la monografía. Levantar la canastilla del líquido y observar las tabletas. Cápsulas blandas de liberación retardada (con recubrimiento entérico): Colocar 1 cápsula blanda en cada uno de los 6 tubos de la canastilla. Omitir el uso de discos. Poner el aparato en funcionamiento, usando fluido gástrico simulado SR, mantenido a 37 ± 2º, como líquido de inmersión. Después de 1 hora de operación en fluido gástrico simulado SR, levantar la canastilla del líquido y observar las cápsulas blandas: las cápsulas blandas no presentan evidencia de desintegración o ruptura que permita la salida del contenido. Poner el aparato en funcionamiento con discos, usando fluido intestinal simulado SR, mantenido a 37 ± 2º, como líquido de inmersión durante no más de 60 minutos. Levantar la canastilla del líquido y observar las cápsulas. Cápsulas duras: Aplicar la prueba para Tabletas sin cubierta, usando como líquido de inmersión una solución amortiguadora de acetato 0,05 M, mantenida a 37 ± 2º y preparada mezclando 2,99 g de acetato de sodio trihidrato y 1,66 mL de ácido acético glacial con agua hasta obtener 1000 mL de solución con un pH de 4,50 ± 0,05. Fijar a la superficie de la placa superior del montaje de canastilla-gradilla, una tela de alambre desmontable, según se describe en Montaje de canastilla-gradilla. A los 30 minutos, levantar la canastilla del líquido y observar las cápsulas. Cápsulas blandas: Proceder según se indica en la Prueba de Ruptura para Cápsulas Blandas.
Uso de Discos Formas farmacéuticas de vitaminas y minerales: Agregar un disco a cada tubo a menos que se especifique algo diferente en el Procedimiento anterior o en la monografía individual. Formas farmacéuticas de productos botánicos: Omitir el uso de discos a menos que se especifique algo diferente en el Procedimiento anterior o en la monografía individual. Formas farmacéuticas de suplementos dietéticos diferentes de vitaminas, minerales y productos botánicos: Omitir el uso de discos a menos que se especifique algo diferente en la monografía individual.
Tolerancias Las 6 formas farmacéuticas analizadas inicialmente se desintegran completamente o no menos de 16 de un total de 18 formas farmacéuticas analizadas se desintegran completamente.
PRUEBA DE RUPTURA PARA CÁPSULAS BLANDAS Medio: Agua; 500 ml Aparato: Usar el Aparato 2 según se describe en Disolución (711 ), a 50 rpm. Tiempo: 15 min Procedimiento: Colocar 1 cápsula en cada vaso y dejar que la cápsula se hunda hasta el fondo del vaso antes de comenzar la rotación del aspa. Si las cápsulas flotan, usar dispositivos de sumersión. Observar las cápsulas y registrar el tiempo de ruptura de la cubierta de cada una de las cápsulas. Tolerancias: Las cápsulas analizadas cumplen con los requisitos si todas se rompen en no más de 15 minutos. Si 1 ó 2 de las cápsulas se rompen en más de 15 minutos pero en no más de 30 minutos, repetir la prueba con 12 adicionales: analizadas se en más de 15 en no más de 30 minutos. •~J«¡¡ij¡.~íl~~m!Jl~i:~I no más de 2 del total de 18
2244 (2040) Desintegración y Disolución / Suplementos Dietéticos
USP 39
Cambio en la redaccl6n:
DISOLUCIÓN Esta prueba se realiza a efectos de determinar el cumplimiento de los requisitos de Disolución establecidos en la monografía individual para los suplementos dietéticos .... ... usp39 La premisa operativa inherente en esta prueba es que si la vitamina o el mineral indicador, o el compuesto marcador para un producto botánico se disuelve dentro del intervalo de tiempo y en las condiciones especificadas, la forma farmacéutica no está afectada por problemas de formulación o de fabricación que afecten la liberación adecuada de los ingredientes activos . .t.
Para Formas Farmacéuticas que Contienen o Están Recubiertas con· Gelatina
Para cápsulas de gelatina dura o blanda y tabletas recubiertas con gelatina que no cumplen con. lá especificación pára ·disolución debido a la presencia de entrecruzamiento, se debe repetir el procedimiento de di~olución agregando enzimas al me~ dio, según se describe a continuación. MEDIO DE DISOLUCIÓN DE PH ~4,0
Enzima: Pepsina, cuya actividad ha sido determinada mediante el procedimiento. para pepsina de la sección Especificaciones de Reactivos Cantidad: Una cantidad de pepsina que resulte en una actividad de no más de 750 000 Unidades/L de medio de disolución MEDIO DE DISOLUCIÓN DE
PH >4,0 Y <6,8
Enzimas: Papaína cuya actividad ha sído determinada. mediante la prueba de Valoración en la monografía de Papafna; o bromelina, cuya actividad ha sido determinada mediante el procedimiento para bromelina de la sección Especificaciones de Reactivos Cantidad: Una cantidad de papaína que resulte en una actividad de no más de 550 000.Unidades/L de medip .de pisolución, o una cantidad de bromelina que resulte en una actividad de no más de 30 GDU/L de medio de disolución MEDIO DE DISOLUCIÓN DE
PH 2:6,8
Enzima: Pancreatina, cuya actividad de proteasa ha sido determinada mediante el procedimiento de Valoración de actividad de proteasa (Poder de digestión de caseína) en la monografía de Pancreatina Cantidad: Una cantidad de pancreatina que resulte en una actividad de proteasa de no más de 2000 Unidades/L de medío de disolución MEDIO DE DISOLUCIÓN QUE CONTIENE AGENTES TENSOACTIVOS U OTROS COMPONENTES QUE DESNATURALIZAN LAS ENZIMAS
Si el medio de disolución contiene agentes tensoactivos u otros componentes que desnaturalízan la enzima usada, se debe aplicar una etapa de pretratamiento. Esta etapa de pretratamiento se realiza usando tas mismas condiciones de disolución, (aparato, rotación y velocidad de flujo), excepto que se debe usar un medio con la cantidad correspondiente de enzima según se indica en la sección anterior y sin el agente tensoactivo o componente que desnaturaliza la enzima. Para óbtener el volumen de medio final especificado para la prueba de disolución, la etapa de pretratamiento se puede realizar con un volumen más pequeño de medio sin el agente tensoactivo o componente, de manera que el volumen final especificado se obtenga después de agregar el agente tensoactivo o componente al final de la etapa de pretratamientó. Realizar la etapa de ptetl'atamientó hasta que se rompa la cápsula, pero durante no más de la mitad del tiempo de disolución total especificado en el .procedimiento. El tiempo de pretratamiento se incluye en el tiempo total de disolución especificado en el procedimiento. iusm
Aparato Ver (711) donde aparece la descripción del aparato utilizado, Prueba de Aptitud del Aparato y otra información relacionada. La Figura 2 presenta una vista esquemática de una celda de flujo (Aparato 4 de la USP) diseñada específicamente para la disolución de cápsulas blandas rellenas de lípidos. La parte inferior ( 7) consiste en dos cámaras adyacentes conectadas a un dispositivo de rebosadero. El medio de disolución pasa a través de la cámara A en flujo ascendente. El flujo en la cámara B se dirige de manera descendente hacia un orificio de salida de tamaño pequeño que conduce de manera ascendente hacia el ensamblaje del filtro. La parte media (2) de la celda tiene una cavidad diseñada para recolectar los excipientes lipofílicos que flotan en el medio de disolución. Una rejilla metálica funciona como filtro grueso. La parte superior (3) sostiene una unidad de filtro para filtros de papel, fibra de vidrio o celulosa.
Suplementos Dietéticos/ (2040) Desintegración y Disolución 2245
USP 39
"'"'
Figura 2. Celda de flujo diseñada para cápsulas de gelatina blanda rellenas de lípidos (dimensiones en mm). De los tipos de aparatos descritos en (711 ), utilizar el que se especifique en la monografía individual.
Formas Farmacéuticas de Vitaminas y Minerales Todas las tabletas o cápsulas de suplementos dietéticos que contienen ácido fálico están sujetas a la prueba de disolución y a los criterios descritos en este capítulo para ácido fálico. Esta prueba se requiere debido a la importancia de las relaciones entre la deficiencia de folato y el riesgo de defectos del tubo neural. Las tabletas y cápsulas de suplementos dietéticos que contienen vitaminas hidrosolubles, minerales, o una combinación de ambos están sujetas a la prueba de disolución y a los criterios descritos en este capítulo para vitaminas indicadoras, minerales indicadores o ambos. Las formas farmacéuticas en tabletas y cápsulas duras de suplementos dietéticos con contenido sólido que contienen vitamina A están sujetas a la prueba de disolución y a los criterios descritos en este capítulo para vitamina A. Para los suplementos dietéticos en cápsulas blandas rellenas con líquidos no se han establecido las normas de disolución para vitamina A, y por lo tanto los estándares de disolución de vitamina A no son aplicables. La Tabla 1 resume los requisitos de disolución para las clases designadas de suplementos dietéticos USP. Las combinaciones de vitaminas y minerales que no pertenencen a ninguna de las clases USP listadas en la Tabla 1 están sujetas a la prueba de Disolución y a los criterios especificados en las monografías individuales. Tabla 1. Suplementos Dietéticos-Formas Farmacéuticas de Vitaminas y Minerales
Clase USP
Ingredientes
Requisitos de Disolución para Tabletas y Cápsulas Duras Con Contenido Sólido
Requisitos de Disolución para Cápsulas Blandas Rellenas Con Líquidos
1
Vitaminas Oleosolubles
Vitamina A (si estuviera presente)
No es aplicable
11
Vitaminas Hidrosolubles
Una vitamina hidrosoluble indicadora y ácido fólico (si estuviera presente)
Una vitamina hidrosoluble indicadora y ácido fálico (si estuviera presente)
Vitaminas Hidrosolubles con Minerales
Una vitamina hidrosoluble indicadora, un elemento indicador y ácido fálico (si estuviera presente)
Una vitamina hidrosoluble indicadora, un elemento indicador y ácido fálico (si estuviera presente)
Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles
Vitamina A (si estuviera presente), una vitamina hidrosoluble indicadora y ácido fálico (si estuviera presente)
Una vitamina hidrosoluble indicadora y ácido fálico (si estuviera presente)
Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales
Vitamina A (si estuviera presente), una vitamina hidrosoluble indicadora, un elemento indicador y ácido fálico (si estuviera presente)
Una vitamina hidrosoluble indicadora, un elemento indicador y ácido fálico (si estuviera presente)
111
IV
V
2246 (2040) Desintegración y Disolución / Suplementos Dietéticos
USP 39
Tabla 1. Suplementos Dietéticos-Formas Farmacéuticas de Vitaminas y Minerales (Continuación)
Clase USP
Ingredientes
Requisitos de Disolución para Tabletas y Cápsulas Duras Con Contenido Sólido
Requisitos de Disolución para Cápsulas Blandas Rellenas Con Líquidos
VI
Minerales
Un elemento indicador
Un elemento indicador
VII
Vitaminas Oleosolubles con Minerales
Vitamina A (si estuviera presente) y un elemento indicador
Un elemento indicador
SELECCIÓN DE VITAMINAS HIDROSOLUBLES INDICADORAS Y ELEMENTOS INDICADORES El cumplimiento con los requisitos de disolución para los suplementos dietéticos que representan combinaciones de vitaminas hidrosolubles (Vitaminas Hidrosolubles, Cápsulas y Vitaminas Hidrosolubles, Tabletas) y combinaciones de vitaminas oleosolubles e hidrosolubles (Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles, Cápsulas y Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles, Tabletas) se determina midiendo la disolución de una sola vitamina indicadora de entre las vitaminas hidrosolubles presentes. La riboflavina, cuando está presente en la formulación, es la vitamina indicadora. Para formulaciones que no contienen riboflavina, piridoxina es la vitamina indicadora. En el caso que ni la riboflavina ni la piridoxina estuvieran presentes en la formulación, la vitamina indicadora es niacinamida (o niacina), y en ausencia de niacinamida (o niacina), la vitamina indicadora es tiamina. Si ninguna de las cuatro vitaminas hidrosolubles mencionadas estuviera presente en la formulación, la vitamina indicadora es el ácido ascórbico. El cumplimiento con los requisitos de disolución para los suplementos dietéticos que representan combinaciones de minerales (Minerales, Cápsulas y Minerales, Tabletas) se determina midiendo la disolución de un solo elemento indicador. El hierro, cuando está presente en la formulación, es el elemento indicador. Para las formulaciones que no contienen hierro, el elemento indicador es el calcio. Si no hay hierro ni calcio presente, el elemento indicador es el cinc. En ausencia de estos tres elementos, el elemento indicador es el magnesio. El cumplimiento con los requisitos de disolución para los suplementos dietéticos que representan combinaciones de vitaminas hidrosolubles y minerales (Vitaminas Hidrosolubles con Minerales, Cápsulas y Vitaminas Hidrosolubles con Minerales, Tabletas) y combinaciones de vitaminas oleosolubles e hidrosolubles con minerales (Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales, Cápsulas y Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales, Tabletas) se determina midiendo la disolución de una vitamina hidrosoluble indicadora y un elemento indicador, designados según las respectivas jerarquías descritas anteriormente. CONDICIONES DE DISOLUCIÓN PARA TABLETAS DE VITAMINA A NOTA-Realizar esta prueba en condiciones de iluminación que minimicen la fotodegradación. Medio: Ascorbato de sodio al 1% (p/v) y octoxinol 9 al 1% (p/v) en solución amortiguadora de fosfato 0,05 M de pH 6,8; 900 mL Aparato 2: 75 rpm Tiempo: 45 min CONDICIONES DE DISOLUCIÓN PARA EL ÁCIDO FÓLICO NOTA-Realizar esta prueba en condiciones de iluminación que minimicen la fotodegradación. Prueba 1 Medio: Agua; 900 ml. Si las unidades analizadas no cumplen con los requisitos de disolución en agua, someter 6 unidades de dosificación adicionales a la prueba de disolución en un medio de 900 mL de solución amortiguadora de citrato 0,05 M de pH 6,0, que se prepara mezclando 9,5 mL de ácido cítrico monohidrato O, 1 M y 40,5 mL de citrato de sodio dihidrato O, 1 M en un matraz volumétrico de 100 mL, diluyendo con agua a volumen, mezclando y ajustando a un pH de 6,0 con una solución de ácido clorhídrico O, 1 M o de hidróxido de sodio O, 1 M. Aparato 1: 100 rpm, para cápsulas Aparato 2: 75 rpm, para tabletas Tiempo: 1 h Prueba 2: Si el producto cumple con esta prueba, el etiquetado indica que cumple con la Prueba de Disolución 2 de la USP. Medio: Solución amortiguadora de citrato 45 mM de pH 6,0; 250 mL Aparato 3: 30 dpm Tamiz (superior e inferior): Malla 56 Tiempo: 1 h NOTA-El cumplimiento de los requisitos de disolución para ácido fólico no exime al producto de las pruebas de disolución de la vitamina indicadora pertinente o del mineral indicador correspondiente.
Suplementos Dietéticos/ (2040) Desintegración y Disolución 2247
USP 39
CONDICIONES DE DISOLUCIÓN PARA VITAMINAS HIDROSOLUBLES INDICADORAS Y MINERALES INDICADORES Prueba 1 Medio: Ácido clorhídrico 0, 1 N; 900 mL Aparato 1: 100 rpm, para cápsulas Aparato 2: 75 rpm, para tabletas Tiempo: 1 h Para las formulaciones que contengan 25 mg o más de la vitamina indicadora, riboflavina, usar las siguientes condiciones: Medio: Ácido clorhídrico O, 1 N; 1800 mL Aparato 1: 100 rpm, para cápsulas Aparato 2: 75 rpm, para tabletas Tiempo: 1 h Prueba 2 (no adecuada para minerales): Si el producto cumple con esta prueba, el etiquetado indica que cumple con la Prueba de Disolución 2 de la USP. Medio: Solución amortiguadora de citrato 45 mM de pH 6,0; 250 mL Aparato 3: 30 dpm Tamiz (superior e inferior): Malla 56 Tiempo: 1 h NOTA-El cumplimiento de los requisitos de disolución de la vitamina indicadora apropiada o del mineral indicador correspondiente no exime al producto de las pruebas de disolución de ácido fálico, si estuviera presente. PROCEDIMIENTOS En los siguientes procedimientos, combinar volúmenes iguales de las soluciones filtradas de las 6 muestras individuales tomadas y determinar la cantidad de vitamina A, ácido fálico o de vitamina indicadora o elemento indicador disuelto, basándose en el promedio de las 6 unidades analizadas. Hacer las modificaciones necesarias incluyendo la concentración del analito en el volumen de la Solución muestra tomada. Emplear el Medio para la preparación de la Solución estándar y si fuera necesario, para diluir la Solución muestra. Vitamina A: Determinar la cantidad disuelta de acetato de retinilo o de palmitato de retinilo, como porcentaje, usando el siguiente procedimiento. Solución estándar: Disolver una cantidad adecuada de ER Acetato de Retinilo USP o ER Palmitato de Retinilo USP en alcohol isopropílico y diluir con Medio hasta obtener una concentración similar a la esperada en la Solución muestra. [NOTA-La cantidad de alcohol debe ser 5%-10%.] Solución muestra: Retirar una porción de la solución en análisis, pasar a través de un filtro adecuado con un tamaño de poro de 0,45 µm y usar la muestra combinada como muestra de prueba. Solución A: Metanol y agua (90:1 O) Solución B: Metanol y alcohol isopropílico (55:45) Fase móvil: Ver la Tabla 2. Tabla 2 Tiempo (min)
Solución A (%)
Solución B (%)
o
100
o
8
o o
100 100
100 100
o o
13 13,1 15
Sistema cromatográfico (Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.) Modo: HPLC Detector: UV 325 nm Columna: 4,6 mm x 1O cm; relleno L1 de 3 µm Velocidad de flujo: 1,0 mL/min Volumen de inyección: 50 µL Aptitud del sistema Muestra: Solución estándar Requisitos de aptitud Factor de asimetría: No más de 1,5 para acetato de retinilo y no más de 2,0 para palmitato de retinilo Desviación estándar relativa: No más de 2,0%
2248 (2040) Desintegración y Disolución /Suplementos Dietéticos
Análisis Muestras:
USP 39
Solución estándar y Solución muestra apropiadas Resultado= (rufr5) x [C5 x (VIL)] x 100
ru =área del pico de la forma todo trans del éster de retinilo de la Solución muestra r5 = área del pico de la forma todo trans del éster de retinilo de la Solución estándar correspondiente C5 = concentración de retino! en la Solución estándar correspondiente (µg/mL) V =volumen de Medio, 900 mL L =cantidad declarada de vitamina A, como retinol (µg/Tableta) Ácido fálico: Determinar la cantidad de ácido fólico (C 19 H19 N,06) disuelta, empleando el procedimiento establecido en la valoración de Ácido Fálico en Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales, Tabletas, en comparación con una Solución estándar con una concentración conocida de ER Ácido Fólico USP en el mismo Medio. Niacina o Niacinamida, Piridoxina, Riboflavina y Tiamina: Determinar la cantidad disuelta de la vitamina indicadora designada, empleando el procedimiento establecido en la Valoración de Niacina o Niacinamida, Clorhidrato de Piridoxina, Riboflavina y Tiamina en Vitaminas Hidrosolubles, Tabletas. Ácido ascórbico: Determinar la cantidad de ácido ascórbico (C 6H80 6) disuelta, agregando 1O mL de ácido sulfúrico 1,0 N y 3 mL de almidón SR a 100,0 mL de Solución muestra y valorando inmediatamente con yodo 0,01 N SV. Realizar una determinación con un blanco y hacer las correcciones necesarias. Hierro, Calcio, Magnesio y Cinc: Determinar la cantidad disuelta del elemento indicador designado, empleando el procedimiento establecido en la valoración correspondiente en Minerales, Cápsulas. TOLERANCIAS Los requisitos se cumplen si se disuelve no menos de 75% del contenido declarado de vitamina A, no menos de 75% del contenido declarado de ácido fólico y no menos de 75% del contenido declarado de la vitamina indicadora o elemento indicador de las unidades analizadas.
Formas Farmacéuticas de Productos Botánicos El cumplimiento con los requisitos de disolución requiere analizar 6 unidades de dosificación individuales, o analizar 2 o más unidades de dosificación contadas en cada uno de los 6 vasos del aparato de disolución, y midiendo la disolución de 1 o más compuestos indicadores o marcadores, o el extracto especificado en la monografía individual. PROCEDIMIENTOS Combinar volúmenes iguales de las soluciones filtradas de las 6 o más muestras individuales tomadas, y emplear la muestra combinada como Solución muestra. Determinar la cantidad disuelta promedio de los compuestos indicadores o marcadores, o del extracto, en la muestra combinada, mediante el procedimiento especificado en la monografía individual. Hacer las modificaciones necesarias, incluyendo la concentración del analito en el volumen de la Solución muestra tomada. Emplear el Medio para la preparación de la Solución estándar y si fuera necesario, para diluir la Solución muestra. TOLERANCIAS A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, los requisitos se cumplen si no menos de 75% del contenido declarado de los compuestos indicadores o marcadores, o del extracto contenido en las unidades analizadas, se disuelve en 1 hora.
Formas Farmacéuticas de Suplementos Dietéticos Diferentes de Vitaminas, Minerales y Productos Botánicos A menos que se especifique algo diferente en las monografías individuales de formas farmacéuticas para suplementos dietéticos en esta categoría, el cumplimiento exige analizar 6 unidades individuales, midiendo la disolución del ingrediente dietético como el promedio de las 6 unidades analizadas. PROCEDIMIENTOS Combinar volúmenes iguales de las soluciones filtradas de las 6 muestras tomadas y usar la muestra combinada como Solución muestra. Determinar la cantidad disuelta promedio del ingrediente dietético, en la muestra combinada, mediante el procedimiento especificado en la monografía individual. Hacer las modificaciones necesarias, incluyendo la concentración del ana-
USP 39
Suplementos Dietéticos / (2091) Variación de Peso de Suplementos Dietéticos 2249
lito en el volumen de la Solución muestra tomada. Emplear el Medio para la preparación de la Solución estándar y si fuera necesario, para diluir la Solución muestra. TOLERANCIAS Debido a la diversidad de las características químicas y de las solubilidades de los ingredientes dietéticos pertenecientes a esta categoría, no es posible establecer tolerancias generales. Ver Tolerancias en las monografías individuales. Estándares de Referencia USP (11) ER Ácido Fólico USP ER Acetato de Retinilo USP ER Palmitato de Retinilo USP
(2091) VARIACIÓN DE PESO DE SUPLEMENTOS DIETÉTICOS Las siguientes pruebas proporcionan los límites para las variaciones permisibles en el peso de tabletas o cápsulas individuales, expresados en función de la desviación permitida del peso promedio de una muestra. Aquí se describen diferentes procedimientos y límites para cápsulas, tabletas sin cubierta y tabletas recubiertas destinadas a usarse como suplementos dietéticos.
CÁPSULAS Las cápsulas cumplen con los requisitos de la siguiente prueba en cuanto a la variación de peso del contenido.
Cápsulas Duras Pesar individualmente 20 cápsulas intactas y determinar el peso promedio. Los requisitos se cumplen si cada peso individual está entre el 90% y 11 0% del peso promedio. Si no todas las cápsulas están dentro de los límites mencionados, pesar individualmente las 20 cápsulas, teniendo cuidado de conservar la identidad de cada cápsula y retirar el contenido de cada cápsula con la ayuda de un pequeño cepillo o trozo de algodón. Pesar individualmente las cubiertas vacías y calcular para cada cápsula el peso neto de su contenido restando el peso de la cubierta del peso bruto respectivo. Determinar el contenido neto promedio a partir de la suma de los pesos netos individuales. Luego determinar la diferencia entre cada contenido neto individual y el contenido neto promedio: los requisitos se cumplen si (a) no más de 2 de las diferencias son mayores al 10% del contenido neto promedio y (b) en ningún caso la diferencia es mayor al 25%. Si más de 2 pero no más de 6 cápsulas se apartan del promedio en 10% a 25%, determinar el contenido neto de 40 cápsulas adicionales y determinar el contenido promedio de las 60 cápsulas. Determinar las 60 desviaciones del promedio nuevo: los requisitos se cumplen si (a) en no más de 6 de las 60 cápsulas la diferencia excede el 10% del contenido neto promedio y (b) en ningún caso la diferencia excede el 25%.
Cápsulas Blandas Proceder según se indica en Cápsulas Duras, pero determinar el peso neto del contenido de las cápsulas individuales del siguiente modo. Pesar las cápsulas intactas individualmente para obtener sus pesos brutos, procurando preservar la identidad de cada cápsula. Luego, cortar y abrir las cápsulas con un instrumento cortante adecuado, limpio y seco, como por ejemplo una tijera o una cuchilla afilada, y retirar el contenido por lavado con un disolvente adecuado. Dejar que el disolvente ocluido se evapore de las cubiertas a temperatura ambiente durante un período de aproximadamente 30 minutos, tomando precauciones para evitar la absorción o la pérdida de humedad. Pesar las cubiertas individuales y calcular el contenido neto. Los requisitos son los que se indican en Cápsulas Duras.
TABLETAS Las Tabletas se ajustan a los criterios de la tabla adjunta.
Tabletas sin Cubierta y Tabletas Recubiertas con Película Pesar individualmente 20 tabletas enteras y calcular el peso promedio. Los requisitos se cumplen si el peso de no más de 2 de las tabletas difieren del peso promedio en más del porcentaje especificado en la tabla adjunta y ninguna tableta difiere en peso en más del doble de ese porcentaje.
2250 (2091) Variación de Peso de Suplementos Dietéticos / Suplementos Dietéticos
USP 39
Tabletas Recubiertas {A Excepción de las Tabletas Recubiertas con Película) Pesar individualmente 20 tabletas enteras y calcular el peso promedio. Si las tabletas recubiertas no se ajustan a los criterios de la tabla adjunta, colocar 20 tabletas en un vaso de precipitados con agua a 37° y agitar por rotación moderada durante no más de 5 minutos. Examinar las partes centrales para ver si existen indicios de desintegración y repetir el procedimiento durante un período más breve en caso de haber comenzado la desintegración. Secar las partes centrales a 50º durante 30 minutos. Pesar con exactitud la parte central de 20 tabletas individuales y calcular el peso promedio. Los requisitos se cumplen si los pesos de no más de 2 de las tabletas difiere del peso promedio en más del porcentaje especificado en la tabla adjunta y ninguna tableta difiere en peso en más del doble de ese porcentaje.
Criterios Tolerancias para la Variación de Peso de Tabletas sin Cubierta, Tabletas Recubiertas con Película y Tabletas Recubiertas (A Excepción de las Tabletas Recubiertas con Película) Diferencia Porcentual
Peso Promedio de las Tabletas, mg 130 o menos
10
De 130 a 324
7,5 5
Más de 324
<2232) CONTAMINANTES ELEMENTALES EN SUPLEMENTOS DIETÉTICOS El objetivo de este capítulo general es limitar la cantidad de contaminantes elementales en formas farmacéuticas terminadas de suplementos dietéticos cuyos etiquetados indican cumplir con las normas de la USP o del NF. Este capítulo general no está destinado a fijar límites para los ingredientes dietéticos. Esos límites se fijan en las monografías individuales correspondientes. Este capítulo general se concentra en los cuatro elementos de mayor importancia toxicológica: arsénico, cadmio, plomo y mercurio. La frecuencia y la cantidad de pruebas a realizar se puede determinar usando un enfoque basado en riesgo tomando en cuenta la probabilidad de contaminación. Los fabricantes deberían considerar la presencia inesperada de contaminantes elementales para determinar el cumplimiento.
LÍMITES DE CONTAMINANTES ELEMENTALES Los niveles de contaminantes elementales deben restringirse según se indica en la Tabla 1, excepto que se indique lo contrario en la monografía individual. Algunas monografías específicas pueden fijar límites diferentes para artículos que deben consumirse en grandes cantidades. Tabla 1 Elemento
Exposición Diaria Permitida (µg/día)ª
Arsénico (inorgánico)
15
Cadmio
5
Plomo
5
Mercurio (total)
15
Metilmercurio (como Hg)
2
ª
La Exposición Diaria Permitida (EDP) se deriva de las lngestas Semanales Tolerables Provisionales (PTWI) recomendadas por la Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y Agricultura (FAO/OMS) sustrayendo la exposición diaria (µg/día) a cada contaminante elemental derivado del aire, alimentos y agua potable. Se usa un peso corporal de 50 kg y un factor de seguridad para calcular la EDP. Otras reglamentaciones estatales, p.ej., la Proposición 65 de California, pueden requerir límites diferentes; los fabricantes son responsables del cumplimiento de otros requisitos locales que apliquen y que sean distintos de los valores de EDP aquí señalados.
El arsénico se puede medir usando un procedimiento analítico sin especiación, presuponiendo que todo el arsénico presente en el suplemento dietético está en forma inorgánica. Si el límite se excediera usando un procedimiento sin especiación, se deberá demostrar el cumplimiento con el límite de arsénico inorgánico basándose en un procedimiento con especiación. La determinación de metilmercurio no es necesaria si el contenido de mercurio total es menor que el límite para metilmercurio.
Suplementos Dietéticos/ (2232) Contaminantes Elementales 2251
USP 39
OPCIONES PARA CUMPLIR CON LOS LÍMITES DE CONTAMINANTES ELEMENTALES Para que una forma farmacéutica terminada de un suplemento dietético cumpla con los límites de contaminantes elementales de este capítulo, el nivel de contaminante elemental en el suplemento dietético terminado deberá ser no mayor que la EDP. Las tres opciones siguientes están disponibles para determinar el cumplimiento con los límites de contaminantes elementales en suplementos dietéticos.
Opción de Análisis del Suplemento Dietético Esta opción se puede aplicar de forma general. En esta opción, la forma farmacéutica terminada del suplemento dietético se analiza de acuerdo con los procedimientos analíticos del capítulo general Impurezas Elementales-Procedimientos (233) o con los procedimientos de especiación proporcionados en este capítulo. Los resultados obtenidos a partir del análisis de una ración típica, escalada a la ingesta diaria máxima, se comparan con la EDP indicada en la Tabla 7. Análisis: Proceder según se indica más adelante en este capítulo. Calcular la cantidad medida de cada contaminante elemental, en µg/ingesta diaria, como: Resultado = MVSS x N
MVSS = cantidad medida de cada contaminante elemental (µg/ración) N = ingesta diaria máxima del suplemento recomendada en el etiquetado (raciones/día) Criterios de aceptación: La cantidad medida/ingesta diaria es no mayor que el valor de EDP provisto en la Tabla 7.
Opción de Componentes Individuales Esta opción se puede aplicar a formas farmacéuticas terminadas de suplementos dietéticos con una ingesta diaria máxima no mayor de 1Og del producto terminado de suplemento dietético. Análisis: A menos que se indique lo contrario en la monografía individual, proceder con el ingrediente individual según se indica más adelante en este capítulo. Criterios de aceptación: El producto cumple con los requisitos si cada componente usado en la preparación del suplemento dietético terminado cumple con los límites provistos en la Tabla 2. Tabla 2 Límites en Componentes Individuales (µg/g)ª
Elemento Arsénico (inorgánico)b
1,5
Cadmio
0,5
Plomo
0,5
Mercurio (total)
1,5
Metilmercurio (como Hg)<
0,2
ª
Los límites en los componentes individuales se basan en una ingesta diaria máxima de 1 O g del suplemento dietético y están destinados sólo para su uso con
Opciones para el Cumplimiento de los Límites de Contaminantes Elementales, Opción de Componentes Individua/es. b El arsénico se puede medir usando un procedimiento analítico sin especiación, presuponiendo que todo el arsénico presente en el suplemento está en forma inorgánica. Si el límite se excediera usando un procedimiento sin especiación, se deberá demostrar el cumplimiento con el límite de arsénico inorgánico, basándose en un procedimiento con especiación. e La determinación de metilmercurio no es necesaria si el contenido de mercurio total es menor que el límite para metilmercurio.
[NOTA-Si todos los componentes en una formulación cumplen con los límites proporcionados en Límites de Componentes Individuales, estos componentes se pueden usar en cualquier proporción. No se necesitan cálculos adicionales.]
Opción de Sumatoria Esta opción se puede usar para formas farmacéuticas terminadas de suplementos dietéticos que se consumen en cantidades mayores de 1Og/día o cuando los límites de aceptación para cualquier contaminante en cualquiera de los componentes del suplemento dietético exceden los Límites de Componentes Individua/es aplicables. Análisis: A menos que se indique lo contrario en la monografía individual, proceder con el ingrediente individual según se indica más adelante en este capítulo. Calcular la cantidad de cada contaminante elemental, en µg/ingesta diaria, presente en la forma farmacéutica terminada del suplemento dietético: Resultado= :2:(C; x W;) x N C; =concentración de contaminante elemental en el componente individual (µg/g)
2252 (2232) Contaminantes Elementales / Suplementos Dietéticos
USP 39
W; = peso de cada componente individual por ración del suplemento dietético (g/ración) N = ingesta diaria máxima del suplemento recomendada en el etiquetado (raciones/día) Criterios de aceptación: La cantidad calculada de cada contaminante elemental/ingesta diaria es no mayor que el valor de EDP provisto en la Tabla 7.
PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS PARA CONTAMINANTES ELEMENTALES TOTALES La metodología basada en desempeño para el análisis de contaminantes elementales totales descritos en el capítulo general
Impurezas Elementales-Procedimientos (233) es aplicable a los suplementos dietéticos. La necesidad de validación depende de cada situación. En las tres opciones descritas en la sección Opciones para Cumplir con los Límites de Contaminantes Elementales, el uso de Validación de Procedimientos de Límite (ver Impurezas Elementales-Procedimientos (233)) puede ser apropiado. Sin embargo, para la Opción de Sumatoria, los niveles aceptables de validación deben determinarse caso por caso. La validación de un procedimiento usando Validación de Procedimientos Cuantitativos (ver Impurezas Elementales-Procedimientos (233)) es aceptable para todas las opciones bajo todas las circunstancias y generalmente es lo que se prefiere. El nivel de validación necesario es determinado a discreción de los fabricantes y las autoridades reglamentarias competentes.
Procedimiento Analítico para Arsénico Inorgánico Cuando el nivel de arsénico total excede el límite recomendado en este capítulo, se puede usar un procedimiento de especiación para determinar la cantidad de arsénico inorgánico presente. El siguiente procedimiento se sugiere para la determinación de arsénico inorgánico, pero se puede usar cualquier procedimiento validado que demuestre producir resultados equivalentes o mejores. Aparato Ver la Figura 7.
'
' 20•cm
'
1
1
'
...L
Figura 1. Aparato especial para la determinación de arsénico inorgánico (A, matraz de destilación de 250 mL; B, cámara de recepción, aproximadamente 50 mL de capacidad; C, condensador de reflujo; D, cabezal para evitar salpicaduras o embudo de seguridad). Reactivos Solución reductora para destilación: 30,0 g de yoduro de potasio en 100 mL de agua. [NOTA-Preparar en el día de su uso.] Control: 6,0 µg de arsénico (As) (6,0 mL de Solución Estándar de Arsénico). [NOTA-Usar esta cantidad en lugar de los 3,0 mL especificados para la Preparación Estándar en el capítulo general Arsénico (211 ), Método l.] Solución muestra: Transferir a un matraz de destilación (A) una muestra de 2,00 g que haya sido previamente molida y pasada a través de un tamiz de malla 60. Agregar al matraz 35 mL de ácido clorhídrico 6,6 N y 15 mL de Solución reductora para destilación, dejar en reposo durante 5 minutos para asegurar la reducción de arsénico [As(V)], conectar el matraz a la cámara de recepción (8), completar el ensamblaje del aparato y comenzar la circulación de agua corriente a través del condensador (C). Llenar con agua hasta la mitad los dos bulbos inferiores del cabezal para evitar salpicaduras (D). Abrir la llave de paso para que el contenido de la cámara de recepción pase al matraz de destilación, calentar el matraz hasta que la temperatura por encima de la solución alcance los 100º-11 Oº y continuar el reflujo a esta temperatura durante 15 minutos. Cerrar la llave de paso, continuar el calentamiento a 108º-11 Oº y recoger 30-33 mL de destilado en la cámara de recepción. Retirar la fuente de calor y dejar que la temperatura descienda hasta aproximadamente 80º.
USP 39
Suplementos Dietéticos/ (2232) Contaminantes Elementales 2253
Cerrar la llave de paso y agregar al matraz de destilación una segunda porción de 35 ml de ácido chlorhídrico 6,6 N (HCI) y 15 ml de Solución reductora para destilación a través de la apertura del termómetro. Volver a colocar el termómetro, aumentar la temperatura a 100º-110º y recoger una segunda porción de 30 a 33 ml de destilado en la cámara de recepción. Escurrir completamente el segundo destilado en el vaso de precipitados que contiene el primer destilado y enfriar el destilado combinado a temperatura ambiente. Desmontar el cabezal para evitar salpicaduras y lavarlo recogiendo los lavados en el vaso de precipitados. Lavar también el interior del condensador y la cámara de recepción con agua, recogiendo los lavados en el vaso de precipitados. Transferir a un matraz volumétrico de 100 ml y completar con agua a volumen. Análisis: Determinar el contenido de arsénico mediante el procedimiento ICP-MS en Impurezas Elementales-Procedimientos (233). Como alternativa, agregar 2 ml de yoduro de potasio SR y 0,5 ml de solución ácida concentrada de cloruro estannoso SR a la Solución muestra contenida en el matraz Erlenmeyer, y proceder según se indica en Arsénico (211 ), Método 1, Procedimiento, comenzando donde dice "Dejar en reposo a temperatura ambiente durante 30 minutos."
Procedimiento Analítico para Metilmercurio Cuando se requiera la determinación de metilmercurio, se sugiere el siguiente procedimiento. Sin embargo, se puede usar cualquier procedimiento validado que demuestre producir resultados equivalentes o mejores. Procedimiento 1 Este procedimiento emplea una extracción acuosa de las especies de mercurio con una solución de L-cisteína, separación por HPLC de las especies de mercurio derivatizadas con una fase móvil que también contenga L-cisteína y detección mediante ICP-MS. Solución de cisteína: Clorhidrato de L-cisteína monohidrato al 1% en agua Fase móvil: Clorhidrato de L-cisteína monohidrato al O, 1% y L-cisteína base libre al 1,0% en agua Solución madre del estándar: 1 µg/ml de mercurio (Hg) como cloruro de metilmercurio y 1 µg de mercurio (Hg) como cloruro de mercurio en ácido clorhídrico al 5% que contenga 0,2 mg/ml de clorhidrato de L-cisteína monohidrato Solución estándar: 2 ng/ml de mercurio como metilmercurio, a partir de Solución madre del estándar en Solución de cisteína
Soluciones muestra Para suplementos en forma de tableta: Pesar y reducir a polvo fino un número contado de tabletas. Transferir a un vial tarado una porción de polvo, pesada con exactitud, equivalente a 0,5 veces la ingesta diaria recomendada. Agregar 50,0 ml de Solución de cisteína pesada con exactitud, cerrar el vial y agitar vigorosamente. Colocar el vial en un baño de agua a 60º durante 60 minutos. Agitar otra vez el vial y colocar nuevamente en el baño de agua durante 60 minutos. Agitar otra vez el vial y dejar que se enfríe a temperatura ambiente durante aproximadamente 20 minutos. Filtrar a través de una membrana de polietileno con un tamaño de poro de 0,45 µm. [NOTA-Preparar en el día de su uso.] Para suplementos en forma de cápsula: Pesar con exactitud, no menos de 20 cápsulas y determinar el peso promedio. Colocar un número de cápsulas equivalente aproximadamente a 5 veces la ingesta diaria recomendada en un mezclador de alta velocidad, agregar 500,0 ml de Solución de cisteína y mezclar para obtener una suspensión analítica homogénea. Transferir 50,0 ml de esta suspensión analítica al vial, cerrar el vial y agitar vigorosamente. Colocar el vial en un baño de agua a 60º durante 60 minutos. Agitar otra vez el vial y colocar nuevamente en el baño de agua durante 60 minutos. Agitar otra vez el vial y dejar que se enfríe a temperatura ambiente durante aproximadamente 20 minutos. Filtrar a través de una membrana de polietileno con un tamaño de poro de 0,45 µm. [NOTA-Preparar en el día de su uso.] Para suplementos en forma líquida: Pesar con exactitud en un vial una cantidad de líquido, equivalente a 0,5 veces la ingesta diaria recomendada, y agregar 50,0 ml de Solución de cisteína. Cerrar el vial y agitar vigorosamente. Colocar el vial en un baño de agua a 60º durante 60 minutos. Agitar otra vez el vial y colocar nuevamente en el baño de agua durante otros 60 minutos. Agitar otra vez el vial y dejar que se enfríe a temperatura ambiente durante aproximadamente 20 minutos. Filtrar a través de una membrana de polietileno con un tamaño de poro de 0,45 µm. [NOTA-Preparar en el día de su uso.] Sistema cromatográfico (Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.) Modo: HPLC Detector: ICP-MS a un cociente masa/carga de 202 Columna: 4,6 mm x 15 cm; relleno L1 de 4 µm Velocidad de flujo: 1 ml/min Volumen de inyección: 50 µL Aptitud del sistema Muestra: Solución estándar Requisitos de aptitud Resolución: No menos de 3 entre el pico que representa a las especies de mercurio (Hg 2 •) a un tiempo de retención relativo de aproximadamente 0,56 y el pico que representa a las especies de metilmercurio (MeHg•) a un tiempo de retención relativo de 1,0. Desviación estándar relativa: No más de 10,0%, Solución estándar Análisis Muestras: Solución estándar y la Solución muestra correspondiente
2254 (2232) Contaminantes Elementales / Suplementos Dietéticos
USP 39
Determinar el área del pico que representa a metilmercurio en los cromatogramas de la Solución muestra y la Solución están-
dar. Criterios de aceptación:
0,2 µg/ingesta diaria: El área del pico de metilmercurio en el cromatograma de la Solución mues-
tra es no mayor que el área del pico de metilmercurio en el cromatograma de la Solución estándar.
(2250) DETECCIÓN DE SUPLEMENTOS DIETÉTICOS IRRADIADOS INTRODUCCIÓN Los reglamentos federales no permiten la irradiación de ingredientes ni suplementos dietéticos con el propósito de disminuir la carga microbiana. De conformidad con la sección 201 (s) de la Ley Federal de Alimentos, Medicamentos y Cosméticos (Federal Food, Drug, and Cosmetic Act) [Título 21 del USC 321 (s)], la irradiación se considera un aditivo y, como tal, requiere la aprobación de la FDA. Los alimentos irradiados deben etiquetarse adecuadamente de conformidad con las pautas internacionales y nacionales con indicaciones tales como "Tratado con radiación" o "Tratado por irradiación", además de la información requerida por otros reglamentos, incluyendo el logotipo de irradiación: la Radura [Título 21 del USC 321 (s)]. La sobreexposición a la irradiación puede tener efectos negativos sobre la calidad del producto. En la actualidad, se emplean diversos métodos independientes para identificar alimentos irradiados, incluyendo suplementos dietéticos, los cuales han sido validados y reconocidos a nivel mundial. Los procedimientos basados en luminiscencia se aplican extensamente e incluyen la detección mediante luminiscencia fotoestimulada (PSL, por sus siglas en inglés), que es un método rápido y simple que sirve para detección preliminar de irradiación, y un procedimiento subsiguiente de termoluminescencia (TL, por sus siglas en inglés) para confirmar que la muestra ha sido irradiada. La PSL requiere menos tiempo que la TL debido a que la fuente mineral inorgánica/silicato de luminiscencia no requiere aislamiento de ningún componente orgánico presente. Las intensidades de la señal de la PSL y de la TL se ven afectadas por la dosis de irradiación y por la naturaleza y la cantidad de material inorgánico. El análisis con TL es uno de los métodos de detección usados para confirmar la presencia de alimentos, hierbas, especias, vegetales y frutas irradiadas, aunque presenta algunas limitaciones: por ejemplo, las muestras deben contener cantidades suficientes de silicatos que se puedan separar con éxito de las muestras. El largo tiempo de preparación y la necesidad de irradiación para todos los casos limita la TL a un número reducido de laboratorios. Los procedimientos descritos en este capítulo pueden ser usados tanto por autoridades reglamentarias como por productores y proveedores de alimentos, incluyendo suplementos dietéticos, para detectar productos irradiados en el mercado, cuando tal hecho no se indica en el etiquetado, para poder determinar el cumplimiento con las reglamentaciones.
PRINCIPIOS DE LUMINISCENCIA FOTOESTIMULADA Y TERMOLUMINISCENCIA La mayoría de los ingredientes dietéticos naturales que se cultivan o crecen de manera silvestre contienen minerales silicatos, calcita o hidroxiapatita. La exposición a la radiación ionizante de rayos gamma ( 6°Co ó 137 Cs), haces de electrones (hasta 1O MeV) o rayos X (hasta 5 MeV) estimula los electrones en esos tipos de cristales, lo que resulta en el almacenamiento de los electrones energizados en la red del cristal. Los electrones de alta energía atrapados pueden liberarse mediante estimulación con luz o calor controlado, dejando huecos de electrones en la red del cristal. La energía así liberada se detecta como luminiscencia. La PSL ocurre al aplicar luz al sistema, mientras que la TL ocurre al aplicarle calor. La intensidad de la luminiscencia registrada es proporcional a la dosis de radiación inicial absorbida. Las muestras para las mediciones de PSL y TL deben tomarse en las muestras a granel desde una zona protegida de la luz, y luego se debe evitar la exposición a altas temperaturas y a la luz. La preparación de la muestra y la medición subsiguiente de PSL o TL debe realizarse en condiciones de luz tenue siempre que sea posible. La TL se ha usado extensamente para detectar irradiación en alimentos e ingredientes dietéticos a partir de los cuales se pueden aislar minerales silicatos. En este capítulo, la PSL y la TL se describen como los métodos de detección más apropiados para los materiales generalmente usados como ingredientes dietéticos. Los dos métodos son fenómenos específicos de radiación, y se basan en la observación de que los conteos de fotones de las muestras irradiadas por lo general son mayores que los de las muestras no irradiadas. No obstante, todos los métodos disponibles tienen algunas limitaciones en lo que respecta a su rango específico de aplicación, a la variación entre productos, a la complejidad o interferencia de la matriz del alimento y a la baja concentración de marcadores inducidos por radiación.
USP 39
Suplementos Dietéticos / (2250) Detección de Suplementos Dietéticos 2255
PROCEDIMIENTO GENERAL PARA LA DETECCIÓN ~E IRRADIACIÓN EN INGREDIENTES Y SUPLEMENTOS DIETETICOS Detección Mediante Luminiscencia Fotoestimulada La PSL, también conocida como luminiscencia por estimulación óptica, se basa en la emisión de luz en el intervalo de 300600 nm a partir de muestras irradiadas cuando se iluminan a longitudes de onda más largas en la región del infrarrojo cercano. El análisis por PSL permite realizar mediciones múltiples sin pretratamiento de la muestra en un periodo corto. La PSL es además un método no destructivo que no requiere la separación de minerales inorgánicos ni de compuestos orgánicos. La PSL se basa en la estimulación óptica de desechos minerales, por lo general silicatos, y materiales bioinorgánicos tales como calcita, feldespatos o hidroxiapatita, y su sensibilidad depende de las cantidades y tipos de minerales presentes en la muestra. Antes de la medición por PSL, se establecen dos umbrales: el más bajo por lo general se ajusta a 700 conteos/minuto (Tl) y el superior se ajusta a 5000 conteos/minuto (T2). Estos dos umbrales sirven para clasificar las muestras. Después de realizar la detección inicial de la intensidad de la PSL de las muestras, los resultados se clasifican en negativo (conteos/minuto menores que Tl ), intermedio (conteos/minuto no menores que Tl y no mayores que T2) o positivos (conteos/minuto mayores que T2). Se aplica una segunda medición después de una dosis de irradiación conocida, denominada PSL calibrada (CalPSL, por sus siglas en inglés), para casos de matrices de muestras definidas deficientemente cuyas sensibilidades de luminiscencia no se encuentran bien establecidas. Al comparar la medición de detección por PSL contra su respuesta de CalPSL, los analistas pueden tomar en cuenta la variación en la sensibilidad de detección debida a cantidades variables y diferentes tipos de minerales presentes en una muestra dada. Las mediciones de CalPSL se recomiendan para descartar resultados falsos negativos debidos a un contenido mineral bajo. INSTRUMENTAL El sistema de PSL consta de fuentes de IR por pulsos para fotoestimulación, un sistema de conteo de un solo fotón para detección altamente sensible de luminiscencia, una cámara de muestra y una computadora para análisis de datos. El procedimiento de ajuste del instrumental incluye verificaciones de materiales irradiados y no irradiados, así como el establecimiento de parámetros de medición (tiempo de ciclo, umbrales y condiciones de registro de datos). La medición de conteos de fondo iniciales y la medición periódica de conteos en la cámara vacía deben realizarse bajo luz tenue para confirmar la ausencia de contaminación en el instrumento. Las señales de PSL (conteos de fotones) emitidas de la muestra/segundo se acumulan automáticamente en la computadora y se informan como conteos/minuto. [NOTA-Todos los experimentos deben realizarse bajo luz tenue. Para minimizar el riesgo de contaminación cruzada, todas las preparaciones se realizan en una cabina de flujo laminar.] MEDICIÓN DE LUMINISCENCIA FOTOESTIMULADA Procedimiento Detección por PSL-Dispensar y pesar dos porciones de la muestra (5-1 Og, dependiendo de la densidad del producto) en sen-
das placas de Petri desechables de 50 mm de modo que se cubran sus bases con una capa delgada de material. Dispensar las muestras bajo luz tenue para minimizar el blanqueado y en una cabina de flujo laminar para minimizar la contaminación cruzada. Medir la PSL de la muestra durante 1 minuto en las alícuotas duplicadas y calcular el promedio. PSL Calibrada (Ca/PSL)-{NOTA-EI análisis de CalPSL se puede realizar sólo una vez como parte de la validación del procedimiento para cada material.] Dispensar y pesar dos porciones de la muestra (5-1 Og, dependiendo de la densidad del producto) en sendas placas de Petri desechables de 50 mm de modo que se cubran sus bases con una capa delgada. Medir la PSL de la muestra durante 1 minuto en alícuotas duplicadas y calcular el promedio para cada una de las muestras. Irradiar la muestra hasta una dosis conocida de 1 kGy después de la detección inicial. Repetir la medición de la PSL (CalPSL). Evaluación-Clasificar los resultados de la siguiente manera: Tl y T2: positivo, señal más fuerte. Criterios de aceptación-Las muestras no irradiadas producen resultados negativos en la detección de PSL y se sabe que producen resultados positivos en la CalPSL. [NOTA-Las señales negativas en la detección de PSL por lo general se asocian con material no irradiado, pero pueden resultar de materiales irradiados de baja sensibilidad. Para evaluar si una muestra es un material de baja sensibilidad, resulta necesaria la evaluación de las señales usando la opción de CalPSL. Las señales positivas en la detección de PSL se asocian con material irradiado. Las muestras que se clasifican como intermedias requieren investigación adicional usando el método de TL para determinar su estado de irradiación.]
2256 (2250) Detección de Suplementos Dietéticos/ Suplementos Dietéticos
USP 39
Análisis Confirmatorio con Termoluminiscencia El análisis por Termoluminiscencia (TL) se basa en cambios físicos en minerales silicatos que están presentes en muchas muestras de alimentos e ingredientes dietéticos. Los minerales silicatos pueden almacenar la energía de radiación absorbida. Un lector de TL mide la cantidad de luz emitida durante el calentamiento controlado. La TL de la muestra (TL 1) se compara con la de la misma muestra después de la irradiación a 1 kGy (TL 2 ). Si el cociente de la TL (TL¡/TL2 ) es mayor que O, 1, se considera que la muestra ha sido irradiada. Para poder usar el método de TL para la detección de alimentos o ingredientes dietéticos irradiados, los minerales silicatos deben aislarse de las muestras. INSTRUMENTAL Las mediciones de TL se pueden realizar con un detector de TL que cumpla con las especificaciones de la Tabla 1. Tabla 1. Especificaciones del Detector de Termolumlnlscencla•
Radiaciónb
Fotón: energías >5 keV Neutrón: térmica a 100 MeV Electrón/beta: energías >70 keV
Intervalos de medición
1O µGy a 1 Gy (1 mrad a 100 rad) lineal 1 Gy a 20 Gy (100 rad a 2000 rad) supralineal
Repetibilidad
Para dosis de 1 mGy (100 mrad) de mediciones secuenciales
Placa de calentamiento
50º a aproximadamente 500º, aproximadamente 6º/s
ª b
137 Cs,
desviación estándar <2% de 1O
Los detectores Harshaw TLD 3500 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) y Nanogray TL2000 (Nanogray, Osaka, Japan) son adecuados. Los rayos gamma de 60(o o haces de electrones de 1O MeV son fuentes adecuadas de radiación.
PROCEDIMIENTO PARA PREPARACIÓN DE LA MUESTRA Solución de politungstato de sodio:
Preparar una solución de politungstato de sodio en agua con una densidad final de
2g/ml. Extracción de minerales: Suspender 3-20 g de muestra con 50-100 mL de agua pura y someter a ultrasonido durante aproximadamente 5 minutos. Tamizar en un vaso de precipitados más grande (500-1000 mL) a través de una malla de nailon de 250 µm, enjuagando la malla con agua cada vez usando un chorro fuerte de un frasco de lavado. Dejar que los minerales sedimenten durante 5 minutos y decantar la mayor parte del agua, dejando los minerales en <50 mL de agua. Transferir la fracción mineral a un tubo de centrífuga y centrifugar durante 1 minuto a 1000 x g. Desechar la capa acuosa. Separación por densidad previa a la concentración: Agregar 5 mL de Solución de politungstato de sodio a los minerales en el tubo de centrífuga. Agitar o mezclar en un mezclador de vórtice, luego someter a ultrasonido durante 5-15 minutos. Centrifugar durante 2 minutos a 1000 x g. Los minerales silicatos (densidad de 2,5-2,7 g/mL) precipitan, mientras que los componentes orgánicos flotan. Superponer cuidadosamente una capa de agua sobre la Solución de politungstato de sodio y desechar la capa acuosa y los materiales orgánicos por decantación o succión al vacío, dejando los minerales en la capa de politungstato. Retirar cuidadosamente la capa de Solución de politungstato de sodio y lavar los minerales dos veces con agua (centrifugar brevemente a 1000 x g). Agregar 1-2 mL de ácido clorhídrico 1 M, agitar y dejar en la oscuridad durante 1 O minutos hasta disolver los carbonatos que se adhieren a los materiales silicatos. Neutralizar el ácido con hidróxido de amonio 1 M. Llenar el tubo con agua. Dejar que los minerales sedimenten y centrifugar. Desechar el agua y lavar los minerales dos veces con agua. Fijar los materiales sobre el disco para la medición de TL: Agregar 3 mL de acetona a los minerales preconcentrados y agitar para desplazar el agua residual. Usar un disco de acero inoxidable adecuado para el lector de TL que se esté usando. [NOTA-Los discos por lo regular tienen un diámetro de 9-1 O mm y 0,25-0,50 mm de espesor.] Limpiar cuidadosamente el disco enjuagándolo con agua, lavar de dos a tres veces con acetona y secar en una estufa. Almacenar en condiciones libres de polvo. Registrar el peso del disco limpio inmediatamente antes de su uso. Transferir los minerales (en acetona) y secar el disco a 50º durante toda la noche (en una estufa de laboratorio). Pesar el disco y calcular la masa de minerales. Repetir la extracción, si fuera necesario, para cumplir con los requisitos de aptitud del sistema. [NOTA-La cantidad de muestra mineral es por lo general entre O, 1 mg y 5 mg.] Los minerales depositados se pueden fijar en el disco usando espray de silicona (o aplicando una capa de carboximetilcelulosa al 0,2%) y secando a 50º durante toda la noche. Discos blanco: Usar discos limpios. MEDICIÓN DE LA TL Las mediciones de TL se realizan usando un lector de TL. Registrar la emisión de TL como una función de la temperatura (curvas de resplandor).
USP 39
Suplementos Dietéticos/ (2750) Prácticas de Fabricación 2257
Nivel mínimo detectable de intensidad de TL integrada (MOL, por sus siglas en inglés): Integrar la intensidad de la TL del primer resplandor de los discos blanco y calcular la desviación estándar. El MDL es tres veces la desviación estándar de la intensidad de TL integrada de los discos blanco. Aptitud del sistema: La intensidad de TL integrada de la muestra irradiada (TL 2) debe ser al menos 1O veces la MDL. Medición de Tl 1 Medición TL 1 del primer resplandor-Ajustar el instrumento a una temperatura inicial de 70º, a una velocidad de calentamiento de 6º/segundo y a una temperatura final de 350º. Purgar la cámara con nitrógeno. Colocar el disco muestra sobre la placa de calentamiento del lector de TL y medir la curva de resplandor. Determinar la TL, como la señal de TL integrada entre 150º y 250º. Medir el resplandor de fondo para la muestra (BG 1) después de enfriarla a 50º. Después de la medición de TL 1 y BG 11 medir el peso de la muestra (BW1). lrradiación-frradiar el disco con los minerales con una dosis de radiación definida de aproximadamente 1 kGy. [NOTA-Una fuente de rayos gamma de 6°Co es adecuada.] Almacenar a 50º durante toda la noche. Medición de Tl 2 Medición TL 2 del segundo resplandor-Medir la TL para la muestra irradiada (TL 2 ) según se describe para TL,. Medir el resplandor de fondo para la muestra irradiada (BG 2 ) después de enfriarla a 50º y registrar el peso de la placa muestra con la muestra (BW2 ). Medir los niveles del blanco para control del proceso (sin la muestra), siguiendo los procedimientos en cada etapa. Calcular el MDL como la intensidad de TL integrada del blanco más tres desviaciones estándar. Cociente de resplandor de TL: El cociente de resplandor de TL por peso de la muestra se calcula según se indica a continuación: cociente de resplandor de TL = [(TL 1 - BG 1)/BW1]/[(TL2 - BG 2)/BW2]
TL 1 = muestra irradiada para la medición de primer resplandor BG 1 = resplandor de fondo para la muestra irradiada de primer resplandor BW1 = peso de la muestra irradiada del primer resplandor TL 2 = muestra irradiada para la medición del segundo resplandor BG2 =flujo de fondo para la muestra irradiada del segundo resplandor BW2 = peso de la muestra irradiada del segundo resplandor Evaluación: Los cocientes de resplandor de la TL de las muestras irradiadas son por lo general mayores que O, 1. Los cocientes de las muestras no irradiadas son menores de O, 1. Criterios de aceptación: La temperatura que provee el máximo resplandor de la medición de TL 1 debe ser igual o mayor que el de una muestra no irradiada. El cociente de resplandor de TL debe ser no más de O, 1 para materiales no irradiados.
(2750) PRÁCTICAS DE FABRICACIÓN PARA SUPLEMENTOS DIETÉTICOS GENERALIDADES Los principios incluidos en este capítulo contienen recomendaciones mínimas de buenas prácticas de fabricación para los métodos, instalaciones y controles a implementar en la fabricación, conservación, envasado, almacenamiento y distribución de ingredientes dietéticos y suplementos dietéticos. Estos principios se establecen para asegurar que tales productos cumplan con los requisitos de seguridad, identidad, contenido, calidad y pureza que declaran tener. Quedan excluidos de este capítulo los establecimientos que se dedican únicamente al cultivo, almacenamiento o distribución de una o más "materias primas agrícolas" ("raw agricultura! commodities") según se definen en la Sección 201 (r) de la Federal Food, Drug, and Cosmetic Act (Ley Federal de Alimentos, Medicamentos y Cosméticos) (Título 21 del U.S.C. 321 (r)), que por lo regular se lavan, preparan, tratan o procesan de algún otro modo antes de ser comercializados al público consumidor. Los requisitos relacionados con la conservación de ingredientes dietéticos y suplementos dietéticos no aplican a la conservación de dichos suplementos dietéticos en un establecimiento minorista con el único propósito de venta directa a consumidores individuales. Un establecimiento comercial no incluye bodegas o depósitos o cualquier otra instalación de almacenamiento para un minorista ni bodegas o cualquier otra instalación de almacenamiento que venda directamente a consumidores individuales. Al final de este capítulo se proporciona un glosario de los términos usados.
2258 (2750) Prácticas de Fabricación / Suplementos Dietéticos
USP 39
ORGANIZACIÓN V PERSONAL Responsabilidades de la Unidad de Control de Calidad Se ha de crear una unidad de control de calidad que tenga la responsabilidad y facultad de aprobar o rechazar todas las materias primas, envases de productos, cierres, materiales en proceso, material de empaque, etiquetado y suplementos dietéticos terminados, así como la facultad de revisar los registros de producción para asegurarse de que no se hayan producido errores o, en caso de que se hubieran producido, que se hayan investigado exhaustivamente. Se recomienda que la unidad de control de calidad sea responsable de aprobar o rechazar productos fabricados, procesados, envasados o conservados bajo contrato por otra compañía. La unidad de control de calidad debe contar con un laboratorio satisfactorio para la prueba y aprobación (o rechazo) de materias primas, envases de productos, cierres, materiales de empaque, materiales en proceso, ingredientes dietéticos y suplementos dietéticos. La unidad de control de calidad debe tener la responsabilidad de aprobar o rechazar todos los procedimientos o especificaciones que repercutan sobre la identidad, el contenido, la calidad y la pureza del suplemento dietético. Todas las responsabilidades y procedimientos aplicables a la unidad de control de calidad han de registrarse por escrito. La persona designada dentro de la Unidad de Control de Calidad que realiza la revisión del material y toma la decisión de desecharlo debe, al momento de realizar la revisión, documentar dicha revisión del material y su decisión de desecharlo.
Requisitos del Personal Todas las personas que participen en la fabricación de ingredientes dietéticos y suplementos dietéticos deben tener la formación, capacitación y experiencia apropiadas (o cualquier combinación de ellas) necesarias para cumplir con las funciones asignadas. La capacitación debe contemplar las tareas específicas que el empleado tiene a su cargo, en la medida en que se relacionen con las funciones que cumple. La compañía ha de conservar documentación apropiada sobre la capacitación del empleado. Todas las personas responsables de supervisar la fabricación de un ingrediente dietético, un suplemento dietético, o ambos deben tener la formación, la capacitación y la experiencia apropiadas (o cualquier combinación de ellas) para cumplir con las funciones asignadas, de tal manera que se pueda garantizar que el producto tiene la seguridad, identidad, contenido, calidad y pureza que declara poseer. Debe proporcionarse la cantidad suficiente de personal calificado para la fabricación y supervisión de cada ingrediente dietético, suplemento dietético o ambos.
Responsabilidades del Personal La administración de la compañía ha de tomar todas las medidas y precauciones razonables para asegurar lo siguiente: 1. Control de enfermedades. Toda persona que, según se determine mediante un examen médico u observación del supervisor, tenga, o aparente tener, una enfermedad, lesión abierta, incluyendo furúnculos, llagas o heridas infectadas, o cualquier otra fuente anormal de contaminación microbiana que represente una posibilidad razonable de adulteración de un ingrediente dietético o suplemento dietético en proceso o terminado, o de contaminación de equipos de procesamiento, utensilios o materiales de envasado, ha de ser excluida de cualquier operación que pudiera dar lugar a dicha adulteración o contaminación hasta que se corrija su situación. Se ha de instruir al personal para que comunique dichas condiciones de salud a sus supervisores. 2. Higiene. Todas las personas que trabajan en contacto directo con materias primas, ingredientes dietéticos y suplementos dietéticos, en proceso o terminados, equipos de procesamiento, utensilios o materiales de empaque han de cumplir con las prácticas higiénicas correspondientes en la medida de lo necesario mientras se encuentren en servicio, a fin de evitar la adulteración o contaminación de dichos materiales. Los métodos de higiene incluyen, entre otros, los siguientes: - Usar ropa exterior adecuada para la operación que se está realizando para evitar la adulteración de las materias primas, ingredientes dietéticos y suplementos dietéticos, en proceso o terminados o la contaminación de equipos de procesamiento, utensilios o materiales de envasado; - Mantener una higiene personal satisfactoria; - Quitarse los cosméticos de sitios del cuerpo que puedan entrar en contacto con materias primas, ingredientes dietéticos y suplementos dietéticos, en proceso o terminados, equipos, utensilios o envases; - Lavarse bien las manos (y si fuera necesario desinfectarlas para evitar la contaminación con microorganismos indeseables) en una instalación satisfactoria para el lavado de manos antes de iniciar las tareas, cada vez que se reanuda una tarea y en todos los casos en que las manos pudieran haberse ensuciado o contaminado; - Quitarse todas las joyas sueltas y otros objetos que pudieran caer en las materias primas, ingredientes dietéticos y suplementos dietéticos, en proceso o terminados, equipos o envases y todas las joyas usadas en las manos que no puedan sanitizarse debidamente durante los períodos en que debe manipularse el producto en proceso o terminado. En caso de que no fuera posible quitarse dichas joyas y cosméticos, podrán cubrirse con un material que pueda man-
USP 39
-
-
-
Suplementos Dietéticos/ (2750) Prácticas de Fabricación 2259 tenerse intacto, limpio e higienizado y que proteja de manera eficaz contra la adulteración de los ingredientes dietéticos y suplementos dietéticos o la contaminación de los equipos de procesamiento, utensilios o materiales de envasado; Mantener los guantes intactos, limpios e higienizados en caso de utilizarlos para la manipulación de materias primas o de productos en proceso o terminados. Los guantes deben ser de un material que proteja de manera satisfactoria el producto contra la contaminación; Usar de manera eficaz, cuando corresponda, redecillas para el cabello, gorras, cubrebarbas u otros accesorios eficaces para sujetar el cabello; Guardar la ropa u otros efectos personales en lugares en los que el producto en proceso o terminado no esté expuesto o en lugares no utilizados para lavar los equipos de procesamiento o los utensilios; Restringir las siguientes actividades a lugares en los que no se almacenen ni expongan productos en proceso o terminados o a lugares no utilizados para lavar los equipos de procesamiento o utensilios: consumo de alimentos, de goma de mascar, de bebidas o el uso de tabaco; y Tomar todas las demás precauciones que sean necesarias para evitar la adulteración de materias primas, productos en proceso o terminados o la contaminación de equipos de procesamiento, utensilios o materiales de envasado con microorganismos o sustancias extrañas, incluyendo, aunque no en forma excluyente, sudor, cabellos, cosméticos, tabaco, sustancias químicas y medicamentos aplicados sobre la piel.
TERRENOS, EDIFICIOS E INSTALACIONES Terrenos Los terrenos circundantes de una planta de fabricación de ingredientes dietéticos y de una planta de fabricación de suplementos dietéticos bajo el control del operador han de mantenerse en condiciones tales que impidan la adulteración de los ingredientes dietéticos y suplementos dietéticos. Los métodos para el mantenimiento satisfactorio de los terrenos incluyen, entre otros: - Almacenamiento satisfactorio de los equipos, eliminación de los residuos y desechos y eliminación de malezas o césped en las proximidades de la planta o estructuras que pudieran atraer, albergar o fomentar la proliferación de plagas; - Mantener los caminos, jardines y estacionamientos de modo tal que no constituyan una fuente de adulteración en áreas en las que se encuentra expuesto el producto; - Drenar de forma satisfactoria las áreas que pudieran contribuir a la adulteración del producto por filtraciones o suciedad transportada con el calzado o fomentar la proliferación de plagas; y - Utilizar los sistemas para el tratamiento y eliminación de desechos de forma satisfactoria para que no constituyan una fuente de adulteración en áreas en las que se encuentra expuesto el producto. Si los terrenos en los que se encuentra la planta están rodeados por terrenos que no están bajo el control del operador y no son mantenidos de la manera arriba descrita, han de tomarse las precauciones necesarias en la planta mediante la inspección, exterminación u otros medios para mantener alejadas las plagas, tierra y suciedad que pudieran constituir una fuente de adulteración del producto.
Diseño de los Edificios Todos los edificios utilizados para la fabricación de un ingrediente dietético, suplemento dietético o ambos deben tener un tamaño adecuado y han de estar construidos de manera tal que los pisos, paredes y cielos rasos puedan limpiarse de forma satisfactoria y mantenerse limpios y en buen estado, que el goteo o condensación de los artefactos, conductos y tuberías no adulteren las materias primas o los ingredientes dietéticos y suplementos dietéticos, en proceso o terminados, ni contaminen los envases de los productos, utensilios o materiales de envasado, y que haya pasillos o espacios de trabajo entre los equipos y paredes de la anchura suficiente y libres de obstáculos para permitir a los empleados cumplir con sus tareas y evitar la adulteración de los productos en proceso o terminados o la contaminación de equipos de procesamiento por contacto personal o con la ropa. Donde sea necesario, se deben instalar mallas adecuadas u otra protección contra plagas e insectos. El edificio debe tener espacio suficiente para organizar los equipos y materiales de manera ordenada a fin de evitar confusiones entre las diferentes materias primas, envases de productos, cierres, etiquetado, materiales en proceso o productos terminados y a fin de impedir la contaminación. El flujo de materias primas, envases de productos, cierres, etiquetado, materiales en proceso y productos a través del edificio o de los edificios debe estar diseñado de manera tal que se evite su contaminación. Las operaciones deben realizarse dentro de áreas específicamente designadas y de tamaño suficiente para evitar la contaminación, confusiones o adulteraciones de ingredientes dietéticos y suplementos dietéticos en proceso o terminados o la contaminación de equipos de procesamiento, utensilios o materiales de envasado con microorganismos, sustancias químicas, suciedad u otros materiales extraños. La posibilidad de confundir y adulterar los productos puede reducirse mediante controles de seguridad del producto y prácticas operativas satisfactorias o mediante un diseño eficaz que incluya la separación de aquellas operaciones en las que exista el riesgo de contaminación, mediante uno o más de los siguientes métodos: ubicación, tiempo, separación, flujo de aire, sistemas cerrados u otros métodos eficaces. Deben haber áreas separadas o definidas como las siguientes:
2260 (2750) Prácticas de Fabricación / Suplementos Dietéticos
USP 39
1. Un área para la recepción, identificación, almacenamiento y retención de componentes, envases de productos, cierres y etiquetado, hasta que la unidad de control de calidad haya realizado el muestreo, prueba o examen adecuados previamente a liberarlos para la fabricación o envasado; 2. Un área para el almacenamiento de componentes liberados, envases de productos, cierres y etiquetado; 3. Un área para el almacenamiento de materiales en proceso; 4. Un área para las operaciones de fabricación y procesamiento; 5. Un área para las operaciones de envasado y etiquetado; y 6. Un área para las operaciones de control y laboratorio. Todo edificio utilizado para la fabricación de un ingrediente dietético o un suplemento dietético ha de permitir la adopción de las precauciones suficientes para proteger los ingredientes o suplementos dietéticos en tanques de fermentación al aire libre mediante métodos eficaces, como los siguientes: (i) Uso de cubiertas protectoras. (ii) Control de las áreas que se encuentran por encima y alrededor de los tanques para eliminar posibles focos de proliferación de plagas. (iii) Inspección periódica para detectar la presencia e infestación de plagas. (iv) Limpieza de la superficie de los tanques de fermentación, según sea necesario.
Iluminación Todas las áreas han de contar con una iluminación suficiente, y dicha iluminación no debe exponer los productos a granel o terminados a adulteración o contaminación. Debe proporcionarse iluminación suficiente en las áreas para el lavado de manos, vestuarios y baños, así como en todas las áreas en las que se examinen, procesen o almacenen productos y en aquellas utilizadas para limpiar los equipos o utensilios; asimismo, se deben proveer bombillas eléctricas, artefactos, tragaluces u otros vidrios de seguridad que se encuentren suspendidos sobre productos expuestos en todas las etapas de su preparación o, de lo contrario, debe proporcionarse protección suficiente para impedir la adulteración de los productos en caso de rotura de vidrios.
Ventilación, Filtrado de Aire, Calefacción y Refrigeración Ha de proporcionarse ventilación suficiente, así como equipos para el control satisfactorio de microorganismos, polvo, humedad y temperatura cuando se los utilice para la fabricación de un ingrediente dietético o un suplemento dietético a fin de reducir al mínimo olores y vapores (incluyendo vapor y humos nocivos) en áreas en las que podrían adulterarse ingredientes dietéticos y suplementos dietéticos; y han de ubicarse y utilizarse ventiladores y otros equipos similares de manera tal que reduzcan al mínimo la posibilidad de adulteración de materias primas, ingredientes dietéticos y suplementos dietéticos, en proceso o terminados o la posible contaminación de equipos de procesamiento, utensilios o materiales de empaque.
Cañerías Las cañerías en la planta física deben ser de tamaño y diseño adecuados y deben instalarse y mantenerse en condiciones adecuadas para: - Transportar cantidades suficientes de agua a los sitios requeridos en toda la planta física; - Transportar de manera apropiada las aguas residuales y los desechos líquidos de la planta física; y - Evitar ser una fuente de contaminación para los componentes, materias primas, ingredientes dietéticos, suplementos dietéticos, suministros de agua o cualquier superficie de contacto, o crear una condición insalubre. Debe suministrarse agua potable a una temperatura adecuada y a la presión necesaria a través de un sistema de cañerías sin defectos que pudieran contribuir a la contaminación de cualquier ingrediente dietético y suplemento dietético. El agua potable debe cumplir con las normas establecidas en las Reglamentaciones Básicas relativas al Agua Potable de la Dirección de Protección Ambiental (40 CFR Parte 141) o cualquier requisito estatal o local sobre el agua potable que sea más estricto. No debe permitirse el ingreso de agua que no cumpla con dichas normas en el sistema de agua potable para Agua Purificada. Si se utilizara agua potable como materia prima, debe purificarse para que cumpla con los requisitos farmacopeicos. Los drenajes deben tener el tamaño suficiente y, en aquellos casos en que estén directamente conectados a una cloaca, deben tener un freno de aire u otro dispositivo mecánico que impida el reflujo.
Aguas Residuales y Desechos Las aguas residuales, la basura y otros desechos que se encuentren dentro del edificio e instalaciones próximas o que provengan de ellos han de desecharse de manera segura y en condiciones sanitarias satisfactorias.
USP 39
Suplementos Dietéticos/ (2750) Prácticas de Fabricación 2261 Lavatorios y Baños
Han de proporcionarse lavatorios satisfactorios que incluyan agua fría y caliente, jabón o detergente, secadores de aire o toallas desechables, así como baños limpios de fácil acceso desde las áreas de trabajo.
Mantenimiento y Sanitización General Todos los edificios utilizados para la fabricación de un ingrediente dietético, suplemento dietético o ambos deben mantenerse limpios, en buenas condiciones higiénicas y han de estar en buen estado de reparación para evitar la adulteración de materias primas y de ingredientes dietéticos y suplementos dietéticos en proceso o terminados. Asimismo, han de estar libres de roedores, aves, insectos y otras alimañas. La basura y los desechos orgánicos han de mantenerse y desecharse en el momento adecuado y en condiciones sanitarias apropiadas. Los compuestos limpiadores y agentes sanitizantes utilizados para limpieza y sanitización han de estar exentos de microorganismos indeseables y han de ser seguros y satisfactorios en las condiciones de uso. El cumplimiento de este requisito podrá verificarse mediante cualquier medio eficaz, incluyendo la compra de estas sustancias bajo garantía o certificación del proveedor o el análisis de dichas sustancias para detectar cualquier contaminación. Sólo los siguientes materiales tóxicos podrán utilizarse o almacenarse en una planta en la que se procesan o exponen productos: 1. Aquellos requeridos para mantener las condiciones de limpieza e higiene necesarias; 2. Aquellos necesarios para realizar procedimientos de análisis de laboratorio; 3. Aquellos necesarios para el mantenimiento y operación de plantas y equipos; y 4. Aquellos necesarios en las operaciones de la planta. Se ha de contar con procedimientos escritos que asignen responsabilidades en el mantenimiento de la sanitización y que describan con suficiente detalle la frecuencia de limpieza, métodos, equipos y materiales a utilizar para la limpieza del edificio y las instalaciones. Los compuestos de limpieza, agentes sanitizantes y plaguicidas tóxicos han de identificarse, utilizarse, conservarse y almacenarse de manera tal de evitar la adulteración de materias primas, productos en proceso o terminados o la contaminación de equipos de procesamiento o materiales de envasado. Deben cumplirse todas las reglamentaciones pertinentes promulgadas por otros organismos gubernamentales federales, estatales y locales relativas a la aplicación, uso o conservación de estos productos. No se ha de permitir la presencia de plagas en ningún área de una planta de fabricación de ingredientes dietéticos y de una planta de fabricación de suplementos dietéticos. Han de tomarse medidas eficaces para mantener alejadas las plagas de las áreas de procesamiento y para evitar que adulteren el producto en las instalaciones. El uso de insecticidas o rodenticidas sólo se permite bajo precauciones y restricciones que eviten la adulteración de materias primas, productos en proceso o terminados o la contaminación de equipos de procesamiento, utensilios o materiales de envasado. También se requieren procedimientos escritos para el uso de rodenticidas, insecticidas, fungicidas, agentes de fumigación y agentes de limpieza y sanitización adecuados. Estos procedimientos deben estar diseñados para evitar la contaminación de equipos, materias primas, envases de productos, cierres, empaques, materiales de etiquetado o productos. Los rodenticidas, insecticidas y fungicidas deben registrarse y utilizarse conforme a la Ley Federal de Insecticidas, Fungicidas y Rodenticidas. Los procedimientos de sanitización han de aplicarse a las tareas realizadas por contratistas o empleados temporales, así como a las tareas realizadas por empleados de tiempo completo durante el desarrollo normal de las operaciones.
EQUIPOS Y UTENSILIOS Los equipos y utensilios usados en la fabricación de ingredientes dietéticos y suplementos dietéticos tendrán un diseño o selección apropiados y el tamaño adecuado, y estarán ubicados en un lugar que facilite su uso, limpieza y mantenimiento y para asegurar que las especificaciones para ingredientes dietéticos y suplementes dietéticos sean correctas y se cumplan. El equipo y utensilios incluyen, de manera enunciativa mas no limitativa, lo siguiente: - Equipo usado para mantener o transportar; - Equipo usado para medir; - Equipo que usa gas o aire comprimido; - Equipo que se usa para llevar a cabo procesos en tubos y recipientes cerrados; y - Equipo usado en sistemas automáticos, mecánicos o electrónicos.
Construcción Todos los equipos y utensilios deben ser: - Construidos de manera que las superficies que entran en contacto con las materias primas, materiales en proceso o productos terminados no sean reactivas, aditivas o absorbentes y que pudieran alterar la seguridad, identidad, contenido, calidad o pureza del producto más allá de los requisitos establecidos; - Hechos de materiales no tóxicos;
2262 (2750) Prácticas de Fabricación / Suplementos Dietéticos
USP 39
- Diseñados y construidos para soportar el ambiente en el que se usan; la acción de materias primas, materiales en proceso, ingredientes dietéticos o suplementos dietéticos; y, si aplica, compuestos de limpieza y agentes de sanitización; y - Mantenidos para proteger a las materias primas, materiales en proceso, ingredientes dietéticos y suplementos dietéticos de la contaminación por cualquier fuente. El equipo y utensilios deben tener soldaduras pulidas o mantenidas para minimizar la acumulación de suciedad, mugre, material orgánico, partículas de materias primas, materiales en proceso, ingredientes dietéticos o suplementos dietéticos, o cualquier otro material extraño o contaminante, a fin de reducir la oportunidad de crecimiento de microorganismos. Cada congelador, refrigerador y compartimento de almacenamiento en frío usado para mantener materias primas, materiales en proceso, ingredientes dietéticos o suplementos dietéticos - Debe equiparse con un termómetro indicador, dispositivo medidor de temperatura o dispositivo que registre la temperatura que muestre, indique y registre, o que permita registrar manualmente la temperatura dentro del compartimento de manera exacta; y - Debe tener un dispositivo automatizado para regular la temperatura o un sistema de alarma automatizado que indique un cambio significativo en la temperatura durante la operación manual. El diseño, la construcción y el uso de equipos y utensilios han de ser tales que eviten la adulteración de materias primas, materiales de envasado, materiales en proceso o productos terminados con cualquier sustancia requerida para su funcionamiento, como: - Lubricantes, - Combustible, - Refrigerantes, - Fragmentos metálicos o vítreos, - Mugre o cualquier otro material extraño, - Agua contaminada o - Cualquier otro contaminante. Los instrumentos o controles usados en la fabricación, envasado, etiquetado o manutención de un ingrediente dietético, suplemento dietético o ambos, y los instrumentos o controles que se usan para medir, regular o registrar temperaturas, concentración de ión de hidrógeno (pH), actividad del agua u otras condiciones, y para controlar o prevenir el crecimiento de microorganismos u otra contaminación deberán ser: - Exactos y precisos, - Mantenidos adecuadamente, y - En número adecuado para sus usos designados. Para cualquier equipo automatizado, mecánico o electrónico que se usa en la fabricación, envasado, etiquetado o manutención de un ingrediente dietético, suplemento dietético o ambos: - La aptitud del equipo deberá determinarse asegurando que es capaz de operar satisfactoriamente dentro de los límites operativos requeridos por el proceso; - El equipo se debe calibrar, inspeccionar o verificar de manera rutinaria para asegurar el desempeño apropiado. La unidad de control de calidad debe aprobar estas calibraciones, inspecciones o verificaciones; - Se deben establecer y usar controles apropiados para equipos automatizados, mecánicos y electrónicos (incluido el software para un proceso controlado por computadora) para asegurar que cualquier cambio en la fabricación, envasado, etiquetado, manutención o demás operaciones sea aprobado por la unidad de control de calidad y efectuado únicamente por personal autorizado; y - Se deben establecer y usar controles apropiados para asegurar que el equipo funcione de acuerdo con su uso pretendido. Estos controles deben ser aprobados por la unidad de control de calidad. El aire comprimido u otros gases introducidos por medios mecánicos en o sobre las materias primas, materiales en proceso, ingredientes dietéticos, suplementos dietéticos o superficies de contacto, o que se usan para limpiar cualquier superficie de contacto, se deben tratar de una manera que evite la contaminación de materias primas, materiales en proceso, ingredientes dietéticos, suplementos dietético o superfices de contacto.
Limpieza y Mantenimiento Los equipos y utensilios han de limpiarse, mantenerse y sanitizarse con la frecuencia suficiente, entre la fabricación de diferentes partidas del mismo producto y la fabricación de diferentes productos, a fin de evitar cualquier defecto de funcionamiento o contaminación que pudiera alterar la seguridad, la identidad, el contenido, la calidad o la pureza del producto fuera de los , requisitos establecidos. En el procesamiento húmedo durante la fabricación, todas las superficies de contacto deben limpiarse y sanitizarse, según sea necesario, para proteger contra la introducción de microorganismos en componentes, ingredientes dietéticos o suplementos dietéticos. Cuando sea necesario limpiar y desinfectar, todas las superficies de contacto se deben limpiar y sanitizar antes de su uso y después de cualquier interrupción durante la cual la superficie de contacto pudiera haberse contaminado. En una operación de producción continua o en operaciones consecutivas, las cuales implican diferentes partidas del mismo ingrediente dietético o suplemento dietético, las superficies de contacto se deben limpiar y sanitizar adecuadamente.
USP 39
Suplementos Dietéticos/ (2750) Prácticas de Fabricación 2263
Las superficies que no entran en contacto directo con materias primas, materiales en proceso, ingredientes dietéticos o suplementos dietéticos se deben limpiar tan frecuentemente como sea necesario para proteger a las materias primas, materiales en proceso, ingredientes dietéticos o suplementos dietéticos de la contaminación. Los artículos desechables (tales como utensilios destinados para usarlos una sola vez, vasos de plástico y toallas de papel) deberán: - Almacenarse en recipientes adecuados; y - Manipularse, dispensarse, usarse y desecharse de tal manera que se proteja a las materias primas, materiales en proceso, ingredientes dietéticos, suplementos dietéticos o cualquier superficie de contacto de la contaminación. Los compuestos de limpieza y agentes de sanitización deben ser adecuados para el uso al que están destinados y seguros en sus condiciones de uso. El equipo y utensilios portátiles que tengan superficies de contacto deben limpiarse, sanitizarse y luego almacenarse en un lugar y forma tales que se les proteja de la contaminación. Deben establecerse y observarse procedimientos escritos para la limpieza y mantenimiento de los equipos, incluyendo los utensilios, utilizados en la fabricación de un producto. Estos procedimientos deben incluir, entre otros, los siguientes: - La asignación de la responsabilidad de limpieza y mantenimiento de los equipos; - La frecuencia de mantenimiento y limpieza, incluyendo, cuando corresponda, la frecuencia de sanitización; - Una descripción suficientemente detallada de los métodos, equipos y materiales utilizados en las operaciones de limpieza y mantenimiento y los métodos para desarmar y volver a armar los equipos, según sea necesario, para asegurar su limpieza satisfactoria y su mantenimiento; - Eliminación y obliteración de la identificación de partida previa; - Identificación y protección de los equipos limpios de toda contaminación antes de su uso; - Inspección de los equipos para verificar que se encuentren limpios inmediatamente antes de su uso; - Se deben realizar calibraciones e inspecciones periódicas de equipos, o controles periódicos de máquinas para garantizar el desempeño y función apropiados: (a) Antes de su primer uso; y (b) Con la frecuencia especificada por escrito y debidamente justificada. - Los instrumentos o controles que no se puedan ajustar para que concuerden con el estándar de referencia deberán ser reparados o reemplazados. Ha de llevarse un registro escrito de la calibración, inspección, mantenimiento del equipo y de la limpieza y del uso de los principales equipos en registros individuales donde se consigne la fecha, producto y número de lote de cada partida procesada. Las personas a cargo de la limpieza han de consignar en el registro que la tarea fue realizada. Las entradas en el registro deben realizarse en orden cronológico. Los siguientes puntos se especifican a fin de mantener registros relacionados con el equipo electrónico o automatizado: - Deben existir copias de seguridad del software vigente (y de software desactualizado que sea necesario para recuperar los registros que sea necesario conservar, de acuerdo con la sección Registros e Informes de este capítulo, cuando el software vigente no pueda recuperar tales registros) y de los datos ingresados en sistemas computacionales usados para fabricar, envasar, etiquetar o conservar suplementos dietéticos. (a) Una copia de seguridad que sea un registro exacto y completo de los datos ingresados (p.ej., una copia en papel de los datos ingresados, discos flexibles, cintas, microfilm o discos compactos). (b) Las copias de seguridad del software y los datos deben mantenerse en lugares seguros para evitar alteraciones, borrado involuntario de datos o pérdidas.
MATERIAS PRIMAS, ENVASES DE PRODUCTOS Y CIERRES Deben proporcionarse procedimientos escritos que describan en suficiente detalle la recepción, la identificación, el almacenamiento, la manipulación, el muestreo, las pruebas y la aprobación o el rechazo de materias primas, envases de productos y cierres. Las materias primas, envases de productos y cierres deben manipularse y almacenarse en todos los casos de manera tal de evitar su contaminación. Las materias primas agrícolas que contengan suciedad u otros contaminantes han de lavarse o limpiarse según fuera necesario. El agua utilizada para lavar, enjuagar o transportar materias primas agrícolas ha de ser segura y de calidad sanitaria satisfactoria. No obstante el requisito general de agua potable, el agua podrá reutilizarse para lavar, enjuagar o transportar materias primas agrícolas siempre y cuando no aumente el nivel de contaminación de dichos materiales. Las materias primas de envases de productos o cierres que se encuentren en bolsas o cajas deben almacenarse de manera tal que no queden en contacto con el piso y tengan una separación suficiente, a fin de permitir su limpieza e inspección. Cada lote debe identificarse de manera satisfactoria según su situación (es decir, en cuarentena, aprobado o rechazado).
Recepción y Almacenamiento de Materias Primas, Envases de Productos y Cierres sin Analizar Han de establecerse y observarse procedimientos escritos que describan la recepción, la identificación, el examen, la manipulación y el muestreo de las materias primas. Una vez recibidos y antes de su aceptación, cada envase o grupo de envases de
2264 (2750) Prácticas de Fabricación / Suplementos Dietéticos
USP 39
materias primas, envases de productos y cierres deben examinarse visualmente para verificar que se encuentren debidamente etiquetados, verificando su contenido, que no se encuentren dañados o que no tengan sellos rotos, y que no estén contaminados. Luego se almacenan en cuarentena hasta que se analicen o examinen, según corresponda, y se los libere. Las materias primas se han de conservar a granel, o en envases diseñados y construidos para impedir su adulteración, y a la temperatura y humedad relativa y de la manera que impida la adulteración de los ingredientes o suplementos dietéticos. Las materias primas congeladas y otros ingredientes han de conservarse congelados. En caso de requerirse su descongelación antes de su uso, ha de hacerse de manera tal de evitar que las materias primas y otros ingredientes se adulteren, de acuerdo con la interpretación de la Ley.
Análisis y Aprobación o Rechazo Cada lote de materia prima, envase de productos y cierre debe ser muestreado, analizado o examinado, según corresponda, y liberado para su uso por la unidad de control de calidad. Se puede usar un plan de análisis por lote salteado basado en una verificación satisfactoria del proceso, controles durante el proceso y confianza estadística, como alternativa al análisis completo de cada partida siempre que se lleve a cabo al menos una prueba de identidad. Se debe reservar una cantidad apropiada de cada lote de materias primas durante 3 años, a partir de la fecha de vida útil que aparece en la etiqueta de los suplementos dietéticos terminados en donde se usen las materias primas. En caso de que se reciban informes de reacciones adversas, las materias primas en reserva se deben mantener durante 6 años (eventos graves) o 3 años (eventos no graves) a partir de la fecha de recepción del primer informe. Deben recogerse muestras representativas para su análisis o examen. El muestreo de productos botánicos debe cumplir con las disposiciones en Artículos de Origen Botánico (561 ). El número de envases muestreados y la cantidad de material tomada de cada uno, debe basarse en criterios satisfactorios tales como criterios estadísticos de variabilidad de la materia prima, niveles de confiabilidad y grado de precisión deseado, los antecedentes de calidad del proveedor y la cantidad necesaria para análisis y reserva en aquellos casos en que sea necesario. Deben utilizarse los siguientes procedimientos para recoger las muestras: - Los envases de materias primas seleccionados deben limpiarse, en aquellos casos en que sea necesario, con los medios satisfactorios. - Los envases deben abrirse, muestrearse y volver a sellarse de manera tal de evitar la contaminación de su contenido y la contaminación de otras materias primas, envases de productos o cierres. - Estos envases deben identificarse con la siguiente información: nombre del material muestreado, número de lote, envase del que se tomó la muestra, fecha en la que se tomó la muestra y nombre de la persona que tomó la muestra. Utilizar el siguiente procedimiento para examinar y analizar las muestras: - Incluso en casos en los que se utiliza el método de análisis por lote salteado, debe realizarse como mínimo una prueba para verificar la identidad de cada materia prima de un producto. Dichas pruebas pueden incluir cualquier prueba satisfactoria con suficiente especificidad establecida como para determinar la identidad, incluyendo pruebas químicas y de laboratorio, análisis organoléptico, identificación microscópica o análisis de marcadores constituyentes. - Todas las materias primas deben analizarse para verificar que cumplan con todas las especificaciones escritas de pureza, contenido y calidad correspondientes. No obstante, puede aceptarse el informe de un análisis de materia prima realizado por el proveedor, siempre y cuando establezca la confiabilidad de sus análisis y que el fabricante realice como mínimo una prueba de identidad en dicha materia prima. - Los envases y cierres deben analizarse para verificar que cumplan con todos los procedimientos escritos correspondientes. No obstante, podrá aceptarse un certificado de prueba del proveedor, siempre y cuando el fabricante realice como mínimo una identificación visual de dichos envases o cierres. - Todos los lotes de materia prima, producto reelaborado, envase de producto o cierre sujetos a contaminación con suciedad, infestación por insectos u otros adulterantes extraños deben examinarse en relación con las especificaciones establecidas para dicha contaminación y han de cumplir con todas las reglamentaciones y guías aplicables establecidas por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los EE.UU. En estos casos no debe aplicarse el método de análisis por lote salteado. - Todos los lotes de materia prima propensos a contaminación microbiológica que sea objetable en vista del uso al que están destinados han de someterse a pruebas microbiológicas antes de su uso. Las materias primas no han de contener niveles de microorganismos que pudieran producir intoxicación u otras enfermedades en los seres humanos, o de lo contrario han de tratarse durante las operaciones de fabricación para que dejen de contener niveles que pudieran causar la adulteración del producto, de acuerdo con la interpretación de la Ley. En lugar de tales pruebas realizadas por el fabricante, podrá aceptarse, por parte del proveedor, una garantía o certificación de análisis de un componente, siempre y cuando el fabricante determine la confiabilidad del análisis del proveedor. - Las materias primas y otros ingredientes susceptibles de adulteración con aflatoxina, otras toxinas naturales y plaguicidas o metales pesados, han de cumplir con las reglamentaciones, guías y niveles de acción vigentes de la Administración de Alimentos y Medicamentos para sustancias tóxicas o nocivas y con los requisitos del capítulo Artículos de Origen Botánico (561 ), o en cada monografía, antes de que puedan ser incorporados a un ingrediente o suplemento dietético terminado. El cumplimiento de este requisito podrá lograrse analizando estos materiales e ingredientes para verificar que no contengan aflatoxinas ni otras toxinas naturales o, en lugar de dichos análisis realizados por el fabricante, podrá aceptarse una
USP 39
Suplementos Dietéticos/ (2750) Prácticas de Fabricación 2265
garantía o certificación de análisis del proveedor de una materia prima siempre y cuando el fabricante determine la confiabilidad del análisis del proveedor. - Todo lote de materia prima, envase de producto o cierre que cumpla con las especificaciones escritas correspondientes de identidad, contenido, calidad y pureza, y análisis relacionados podrá ser aprobado y liberado para su uso. Aquellos lotes que no cumplan con dichas especificaciones deben rechazarse.
Uso de Materias Primas, Envases de Productos y Cierres Aprobados Las materias primas, envases de productos y cierres aprobados para su uso deben rotarse de manera tal de utilizar primero aquellos que fueron aprobados antes. Se permiten desviaciones respecto del requisito si éstas son temporales y adecuadas.
Reevaluación de Materias Primas, Envases de Productos y Cierres Aprobados Las materias primas, envases de productos y cierres deben volver a analizarse o examinarse, según corresponda, para verificar su identidad, contenido, calidad y pureza y deben ser aprobados o rechazados por la unidad de control de calidad después de un tiempo especificado en almacenamiento o según sea necesario, p.ej., después de su exposición al aire, calor u otras condiciones que pudieran afectar adversamente la materia prima, el envase del producto o cierre o después del almacenamiento de ingredientes activos e inactivos y materiales en proceso durante períodos prolongados.
Materias Primas, Envases de Productos y Cierres Rechazados Las materias primas, los envases de productos y los cierres rechazados deben identificarse y controlarse bajo un sistema de cuarentena que impida su uso en operaciones de fabricación o procesamiento para las que no son satisfactorios.
PRODUCCIÓN V CONTROLES DE PROCESO Procedimientos Escritos Deben proporcionarse procedimientos escritos para el control de la producción y procesos destinados a asegurar que los ingredientes dietéticos y suplementos dietéticos tengan la identidad, contenido, calidad y pureza que supuestamente poseen. Estos procedimientos deben ser redactados, revisados y aprobados por las unidades organizacionales correspondientes y, además, revisados y aprobados por la unidad de control de calidad. Estos procedimientos de control de la producción y proceso deben aplicarse a la ejecución de las diferentes funciones de control de producción y procesos y documentarse en el momento de su realización. Toda desviación respecto de los procedimientos escritos deben registrarse y justificarse. (1) Todas las operaciones de recepción, inspección, transporte, segregación, preparación, fabricación, envasado y almacenamiento de ingredientes dietéticos y suplementos dietéticos han de realizarse de conformidad con los principios de higiene satisfactorios. (2) Han de tomarse todas las precauciones razonables para asegurar que los procedimientos de producción no contribuyan a que se produzca ninguna clase de adulteración. Han de utilizarse los procedimientos de análisis químicos, microbianos o de materiales extraños en todos aquellos casos en que sea necesario para identificar fallas sanitarias o la posible adulteración del producto. (3) Todos los productos que se hayan contaminado al punto de haber sido adulterados según la interpretación de la Ley han de ser rechazados o, si está permitido, tratados o procesados para eliminar la contaminación. (4) Toda la fabricación del producto, incluyendo su envasado y almacenamiento, ha de realizarse bajo las condiciones y controles necesarios para reducir al mínimo el potencial de crecimiento de microorganismos o la adulteración de materias primas, materiales en proceso y productos terminados. (5) Las medidas tomadas para destruir los microorganismos, reducir la carga microbiana o prevenir el crecimiento de microorganismos indeseables, especialmente aquellas de importancia para la salud pública, deben ser satisfactorias bajo las condiciones de fabricación, manipulación y distribución para evitar la adulteración de los ingredientes y suplementos dietéticos según la interpretación de la Ley. Estas medidas deben cumplir también con las reglamentaciones vigentes de ingredientes y suplementos dietéticos. (6) Los trabajos en proceso han de manipularse de manera tal de protegerlos contra la adulteración. (7) Los materiales en proceso se deben mantener en condiciones apropiadas de temperatura, humedad y luz. (8) Han de tomarse medidas eficaces para proteger los ingredientes y suplementos dietéticos terminados de la posible adulteración por materias primas, materiales en proceso o desechos. Cuando las materias primas, materiales en proceso o desechos no estén protegidos, no han de manipularse juntos en un área de recepción, carga o expedición si dicha manipulación pudiera causar la adulteración de los ingredientes dietéticos y suplementos dietéticos. Los ingredientes y suplementos dietéticos trasladados por cinta transportadora han de estar protegidos contra cualquier posible adulteración, según sea necesario.
2266 (2750) Prácticas de Fabricación/ Suplementos Dietéticos
USP 39
(9) Han de tomarse las medidas eficaces necesarias para proteger los productos contra la infiltración de metal u otros materiales extraños. El cumplimiento de este requisito podrá lograrse utilizando tamices, trampas, imanes, detectores de metal electrónicos u otros medios eficaces que sean satisfactorios. (1 O) Han de realizarse etapas de fabricación mecánica como corte, clasificación, inspección, triturado, secado, molido, mezclado y tamizado para proteger los ingredientes y suplementos dietéticos contra su posible adulteración. El cumplimiento de este requisito puede lograrse proporcionando protección física satisfactoria para los ingredientes dietéticos y suplementos dietéticos con el objeto de evitar su contacto con agentes adulterantes. Esta protección podrá proporcionarse mediante la limpieza satisfactoria y sanitización de todo el equipo de procesamiento entre cada etapa de fabricación. (11) El blanqueado térmico, cuando sea necesario para la preparación de un ingrediente dietético o suplemento dietético, debe realizarse calentando el producto a la temperatura requerida, manteniéndolo a esta temperatura durante el tiempo requerido y luego enfriándolo rápidamente o pasándolo a la etapa de fabricación subsiguiente sin demora. El crecimiento termofílico y la contaminación en blanqueadores debe reducirse al mínimo mediante el uso de temperaturas satisfactorias y mediante una limpieza periódica. En aquellos casos en que el producto blanqueado se lave antes del llenado, ha de utilizarse agua potable. (12) Los intermedios de ingredientes dietéticos y suplementos dietéticos deshidratados que dependan de la actividad del agua (aw) para impedir el crecimiento de microorganismos indeseables han de procesarse y mantenerse a un nivel de humedad seguro. El cumplimiento de este requisito puede lograrse por cualquier medio eficaz, incluyendo el uso de una o más de las siguientes prácticas: (i) Monitoreo de la actividad de agua (aw) del material; (ii) Control de la relación de sólidos solubles-agua en el producto terminado; y (iii) Protección del producto terminado contra la acumulación de humedad, mediante el uso de una barrera de humedad o por otros medios, para que la actividad de agua (aw) del producto no aumente a un nivel no seguro. (13) Los ingredientes y suplementos dietéticos que dependen principalmente del control del pH para impedir el crecimiento de microorganismos indeseables han de monitorearse y mantenerse a un pH suficiente. El cumplimiento de este requisito podrá lograrse por cualquier medio eficaz, incluyendo el empleo de una o más de las prácticas siguientes: (i) Monitoreo del pH y la actividad de agua, si corresponde, de las materias primas, materiales en proceso y productos terminados; y (ii) Control de la cantidad de ácido añadido al producto. (14) Cuando se utiliza hielo en contacto con ingredientes dietéticos y suplementos dietéticos, ha de hacerse con agua potable y ha de utilizarse sólo si se ha fabricado de conformidad con las buenas prácticas de fabricación para la fabricación, envasado o almacenamiento de alimentos para consumo humano vigentes que se describen en 21 CFR Parte 11 O.
Carga de Materias Primas Para asegurar que los suplementos dietéticos tengan la identidad, el contenido, la calidad y la pureza que supuestamente poseen, los procedimientos escritos de producción y control deben incluir lo siguiente: - La partida debe formularse con la intención de proporcionar no menos de 100 por ciento de la cantidad de ingrediente dietético establecida o declarada en la etiqueta. - Las materias primas para la fabricación del producto deben pesarse, medirse o fraccionarse según corresponda y deben registrarse las firmas correspondientes en el registro de partidas. - Los rendimientos reales y los porcentajes de rendimiento teórico deben determinarse en las fases apropiadas de procesamiento. El material asignado a reelaboración ha de identificarse como tal.
Identificación de los Equipos Todos los recipientes de preparación, envases de almacenamiento, líneas de procesamiento y los principales equipos utilizados durante la producción de una partida de producto deben identificarse en forma satisfactoria para indicar su contenido y, en aquellos casos en que sea necesario, para indicar la fase de procesamiento de la partida.
Muestreo y Prueba de Materiales en Proceso, Ingredientes Dietéticos y Suplementos Dietéticos Para asegurar la uniformidad de la partida y la integridad de los suplementos dietéticos, deben establecerse y observarse procedimientos escritos que describan los controles y las pruebas o los exámenes en proceso que deben realizarse sobre muestras adecuadas de materiales en proceso. Basándose en la verificación del proceso, los controles de proceso y la confianza estadística, un plan de análisis por lote salteado es una alternativa para el análisis de cada partida de productos terminados siempre que se lleve a cabo como mínimo una medición representativa Deben establecerse procedimientos de control para monitorear el resultado de los procesos de fabricación que pudieran ser responsables de causar variabilidad en las características del material en proceso y en el producto terminado. Dichos procedimientos de control podrán incluir, entre otros, los siguientes, según corresponda:
USP 39
Suplementos Dietéticos/ (2750) Prácticas de Fabricación 2267
- Friabilidad - Variación del peso - Tiempo de desintegración - Tiempo de disolución - Transparencia, totalidad o pH de las soluciones. - Homogeneidad de mezcla Las especificaciones en proceso para dichas características deben ser coherentes con las especificaciones del producto terminado. El examen y la prueba de las muestras deben asegurar que el material en proceso y el suplemento dietético cumplan con las especificaciones establecidas. Los materiales en proceso deben analizarse para verificar que su identidad, contenido, calidad y pureza sean satisfactorios y deben ser aprobados o rechazados por la unidad de control de calidad durante el proceso de producción, p.ej., al iniciar o terminar fases significativas o después de su almacenamiento durante períodos prolongados. Los materiales en proceso rechazados o adulterados deben ser identificados y controlados bajo un sistema de cuarentena diseñado para evitar su uso en operaciones de fabricación o procesamiento para las cuales no son satisfactorios, y para evitar la adulteración de otros productos.
ETIQUETADO V ENVASADO Criterios de Examen y Uso de Materiales Deben proporcionarse procedimientos escritos que describan en suficiente detalle la recepción, la identificación, el almacenamiento, la manipulación, el muestreo, el examen o la prueba de los materiales de etiquetado y envasado o de los productos recibidos para envasado y etiquetado. Cada envío de envase inmediato o grupo de envases inmediatos de producto recibido para envasado o etiquetado, o de materiales de envasado y etiquetado, se debe examinar visualmente para confirmar que contenga la etiqueta apropiada, daños en el envase o sellos rotos para determinar si la condición del envase pudiera haber resultado en la contaminación o deterioro del producto recibido. Se debe examinar visualmente la factura, garantía o certificación del proveedor en un envío del producto recibido para asegurar que el producto recibido concuerde con la orden de compra. Los materiales de etiquetado y envasado o los productos recibidos para envasado y etiquetado deben ser puestos en cuarentena hasta que: - Se recolecten muestras representativas de cada envío único, y de cada lote único dentro de cada envío único de producto recibido para envasado o etiquetado, o de materiales de envasado y etiquetado; - La unidad de control de calidad debe revisar y aprobar la documentación para determinar si el producto recibido para envasado o etiquetado, o los materiales de envasado y etiquetado, cumplen con las especificaciones; y - La unidad de control de calidad debe aprobar el producto recibido para envasado o etiquetado, o los materiales de envasado y etiquetado, y liberarlos de la cuarentena para su uso. Aquellos que no cumplan con dichas especificaciones deben identificarse y rechazarse para evitar su uso en operaciones para las que no son satisfactorios. Debe llevarse un registro de cada envío recibido de cada material de etiquetado y envasado diferente o de cada uno de los diferentes productos recibidos para envasado o etiquetado, donde conste su recepción, la fecha de examen o prueba y si fue aceptado o rechazado. Cada lote único dentro de cada envío de producto recibido para envasado o etiquetado, o de materiales de envasado y etiquetado, se debe identificar de tal manera que permita al receptor rastrear el lote hasta el proveedor, la fecha de recepción, el nombre del producto recibido, el estatus del producto recibido (p.ej., en cuarentena, aprobado o rechazado), y hasta el producto que fue envasado o etiquetado y distribuido. Este identificador único debe usarse siempre que se registre el desecho de cada lote único dentro de cada envío único del producto recibido para envasado o etiquetado, o de los materiales de envasado y etiquetado. Las etiquetas y otros materiales de etiquetado para cada producto, contenido, tipo de producto o cantidad de contenido diferente deben almacenarse por separado en condiciones que los protejan de la contaminación y el deterioro y para evitar que se mezclen. Sólo el personal autorizado debe tener acceso al área de almacenamiento. Los envases y etiquetas se deben mantener en condiciones apropiadas para que los envases y las etiquetas no se vean adversamente afectados (p.ej. contaminación, deterioro). Debe reducirse al mínimo la impresión conjunta de etiquetas que se deban utilizar con diferentes productos o con diferentes contenidos del mismo producto (o etiquetado del mismo tamaño y formato o colores idénticos o similares). En caso de utilizar impresión conjunta, deben preverse procedimientos de control especiales para las operaciones de envasado y etiquetado, teniendo en cuenta el diseño de la hoja, apilado, corte y manipulación durante y después de la impresión. Los dispositivos de impresión existentes en las líneas de fabricación o asociados con ellas que se utilicen para imprimir sobre la etiqueta o caja del producto deben controlarse para asegurar que la impresión se ajuste a las especificaciones incluidas en el registro de producción de la partida. Las etiquetas, etiquetado, otros materiales de empaque y productos recibidos para envasado y etiquetado obsoletos y caducos deben destruirse y documentarse.
2268 (2750) Prácticas de Fabricación / Suplementos Dietéticos
USP 39
Emisión de Etiquetado Debe ejercerse un estricto control sobre el etiquetado emitidos para usar en operaciones de etiquetado de productos. Los procedimientos de control empleados deben registrarse por escrito con suficiente detalle. Los materiales de etiquetado emitidos para una determinada partida deben examinarse con cuidado para verificar su identidad y conformidad con el etiquetado especificado en el registro maestro y de producción de partida. Deben utilizarse procedimientos para conciliar las cantidades de etiquetado emitido, utilizado y devuelto, y se recomienda requerir la evaluación de las discrepancias encontradas. Si se encuentran discrepancias entre la cantidad de producto terminado y la cantidad de etiquetado emitido y se encuentran fuera de los límites preestablecidos según los datos operativos históricos, tales discrepancias deben investigarse. El etiquetado devuelto debe mantenerse y clasificarse de manera tal de evitar confusiones y proporcionar una identificación satisfactoria. Todos los etiquetados sobrantes que lleven números de lote o de control deben destruirse y documentarse.
Operaciones Los procedimientos escritos diseñados para asegurar que se utilicen las etiquetas, el etiquetado y el material de empaque correctos para los suplementos dietéticos deben incorporar las siguientes características: - Prevención de confusiones y contaminación cruzada mediante la separación física o espacial de las operaciones con otros productos; - Identificación del producto con un número de lote o de control; - Evaluación de los materiales de envasado y etiquetado para verificar que sean satisfactorios y correctos antes de las operaciones de envasado, y documentación de dicho examen en el registro de producción de la partida; - Inspección de las instalaciones de envasado y etiquetado inmediatamente antes de su uso para asegurar que se hayan retirado todos los productos de operaciones previas. También debe realizarse una inspección para asegurarse de que los materiales de envasado y etiquetado no satisfactorios para operaciones posteriores hayan sido eliminados. Los resultados de la inspección deben documentarse en los registros de producción de la partida.
Reetiquetado y Reenvasado -
Los ingredientes dietéticos y suplementos dietéticos podrán reenvasarse y reetiquetarse únicamente después de que la unidad de control de calidad haya aprobado tal reenvasado o reetiquetado. - Se debe examinar una muestra representativa de cada partida de ingredientes dietéticos y suplementos dietéticos reenvasados o reetiquetados para determinar si los ingredientes dietéticos y suplementos dietéticos reenvasados o reetiquetados cumplen con todas las especificaciones establecidas. - La unidad de control de calidad debe aprobar o rechazar cada partida de ingredientes dietéticos y suplementos dietéticos reenvasados o reetiquetados antes de liberarlos para su distribución.
Envases a Prueba de Alteración Intencional REQUISITOS Todos los fabricantes y envasadores que envasen un suplemento dietético para su venta al público han de envasar el producto en un envase a prueba de alteración intencional, en caso de que el público tenga acceso a dicho producto en el lugar de venta. Un envase a prueba de alteración intencional es un envase que tiene un indicador o barrera de entrada que, si se rompe o falta, puede ser interpretado razonablemente por el consumidor como una evidencia visible de que el envase ha sido alterado. Para reducir las probabilidades de reemplazo de la prueba de alteración intencional de un envase después de haber sido alterado, el indicador o barrera de entrada debe tener un diseño distintivo o alguna característica que lo identifique (p.ej., un patrón, nombre, marca registrada, logotipo o imagen). A los efectos de lo establecido en este apartado, el término "diseño distintivo" apunta a que el envase no pueda ser duplicado utilizando materiales o procesos de uso difundido. Un envase a prueba de alteración intencional puede incluir un sistema de envase primario y cierre o un sistema de envase secundario o caja, o cualquier combinación de sistemas diseñados para proporcionar una indicación visual de la integridad del envase. La característica a prueba de alteración intencional debe estar diseñada para mantenerse intacta cuando se la manipula de manera razonable durante su fabricación, distribución y exhibición al público. ETIQUETADO Todos los envases de suplementos dietéticos de venta al público contemplados en este apartado han de llevar una leyenda en un lugar destacado que alerte a los consumidores acerca de la característica a prueba de alteración intencional del envase. La leyenda debe colocarse de manera tal que permanezca intacta en caso de rotura o falta de la característica a prueba de
USP 39
Suplementos Dietéticos/ (2750) Prácticas de Fabricación 2269
alteración intencional del envase. Si la característica a prueba de alteración intencional elegida para cumplir con el requisito anterior utiliza una característica que la identifique, debe hacerse referencia a esa característica en la leyenda. Por ejemplo, la leyenda en la etiqueta de un frasco con una banda retráctil podría decir "Para su protección, este frasco tiene un sello impreso alrededor del cuello."
Examen de Suplementos Dietéticos Los productos empacados y etiquetados deben examinarse durante las operaciones de terminado para asegurar que los envases y empaques del lote tengan la etiqueta correcta. Debe tomarse una muestra representativa de unidades al finalizar las operaciones de terminado y examinarse visualmente para verificar que estén debidamente etiquetadas. Los resultados de estos exámenes deben documentarse en los registros de producción o control de la partida.
Información de Contacto El fabricante, envasador o distribuidor de los suplementos dietéticos debe cumplir con los requisitos de etiquetado de la ley vigente, que incluyen también una dirección o número telefónico nacional en el cual se pueda recibir un informe de evento adverso para un suplemento dietético.
Vida Útil Los suplementos dietéticos deben llevar una fecha que indique su vida útil, determinada según pruebas adecuadas, para asegurarse de que cumplan con las normas vigentes de identidad, contenido, calidad y pureza hasta la fecha de vida útil declarada. La vida útil debe estar relacionada con las condiciones de almacenamiento declaradas en el etiquetado.
CONSERVACIÓN Y DISTRIBUCIÓN Procedimientos de Almacenamiento El almacenamiento y transporte del producto terminado ha de realizarse bajo condiciones que protejan el producto contra posibles adulteraciones físicas, químicas y microbianas, así como contra el deterioro del producto y el envase. Deben establecerse y observarse procedimientos escritos que describan el almacenamiento de los suplementos dietéticos y que incluyan lo siguiente: - Cuarentena de productos terminados antes de ponerlos a disposición de la unidad de control de calidad; y - Almacenamiento de productos terminados bajo condiciones suficientes de temperatura, humedad y luz que no afecten su identidad, contenido, calidad y pureza.
Procedimientos de Distribución Han de establecerse y observarse procedimientos escritos que describan la distribución de los suplementos dietéticos y que incluyan lo siguiente: - Un procedimiento por el cual los primeros productos aprobados sean los primeros en distribuirse. (Se permiten desviaciones respecto de este requisito siempre y cuando éstas sean temporales y adecuadas.) - Un sistema por el que pueda determinarse fácilmente la distribución de cada lote de producto para facilitar su retiro en caso de ser necesario.
OPERACIONES DE CONTROL DE CALIDAD Las especificaciones, las normas, los planes de muestreo, los procedimientos de prueba u otros mecanismos de control de laboratorio requeridos por este capítulo general, incluyendo cualquier cambio en dichas especificaciones, normas, planes de muestreo, procedimientos de prueba u otros mecanismos de control de laboratorio, han de ser redactados por la unidad organizacional correspondiente y revisados y aprobados por la unidad de control de calidad. Los requisitos de este apartado deben observarse y documentarse en el momento de su realización. Toda desviación respecto de las especificaciones escritas, normas, planes de muestreo, procedimientos de prueba u otros mecanismos de control de laboratorio ha de registrarse y justificarse. El control de calidad incluye el establecimiento de especificaciones, normas, planes de muestreo y procedimientos de prueba científicamente válidos y apropiados, y diseñados para asegurar que las materias primas, los envases de productos, los cierres, los materiales en proceso, el etiquetado, los productos recibidos para operaciones de etiquetado y envasado como suplementos dietéticos, y los productos terminados cumplan con las normas satisfactorias de identidad, contenido, calidad y pureza. Estos controles incluyen los siguientes:
2270 (2750) Prácticas de Fabricación / Suplementos Dietéticos
USP 39
- Determinación de conformidad con las especificaciones escritas correspondientes para la aceptación de cada lote dentro de cada envío de materias primas, envases de productos, cierres y etiquetado utilizados en la fabricación de ingredientes dietéticos y suplementos dietéticos, y de productos recibidos para operaciones de etiquetado y envasado como suplementos dietéticos. (Las especificaciones incluyen una descripción de los procedimientos de muestreo y prueba utilizados. Las muestras deben ser representativas y estar debidamente identificadas. Dichos procedimientos también requieren la reevaluación satisfactoria de cualquier materia prima, envase de producto o cierre que estén sujetos a deterioro.) Basado en una verificación de proceso, en controles en proceso y en un nivel de confianza estadística suficientes, un plan de análisis por lote salteado es una alternativa para el análisis de cada partida, excluyendo materias primas, las cuales requieren de una prueba de identidad en el 100% de los lotes recibidos. - Determinación de conformidad con las especificaciones escritas y una descripción de los procedimientos de muestreo y prueba para materiales en proceso. (Dichas muestras deben ser representativas y estar debidamente identificadas.) - Determinación de conformidad con las descripciones escritas de los procedimientos de muestreo y especificaciones adecuadas para los productos terminados. (Dichas muestras deben ser representativas y estar debidamente identificadas.) - La calibración de instrumentos, con una frecuencia adecuada y de acuerdo con un programa escrito establecido que contenga instrucciones específicas, frecuencias, límites de exactitud y precisión y disposiciones para acciones correctivas en el caso de que no se cumplan los límites de exactitud y/o de precisión. Los instrumentos que no cumplan con las especificaciones establecidas no han de usarse hasta que sean reparados.
Prueba y Liberación para Distribución Debe determinarse adecuadamente en el laboratorio el cumplimiento del producto terminado en relación con las especificaciones, incluyendo la identidad y contenido, antes de su liberación. Un plan de análisis por lote salteado o muestra combinada es una alternativa al análisis de cada partida siempre que dicho plan se base en una satisfactoria verificación del proceso, controles de proceso o confianza estadística. Deben realizarse las pruebas de laboratorio adecuadas, según sea necesario, de cada partida de suplemento dietético que deba estar exenta de microorganismos inaceptables. Deben establecerse y documentarse la exactitud, linealidad, sensibilidad, especificidad y precisión de los métodos de prueba utilizados por la firma, cuando difieran de los métodos farmacopeicos. Los procedimientos escritos deben describir todos los planes de muestreo y pruebas e incluir el método de muestreo y el número de unidades por partida que se deben someter a prueba. Los productos que no cumplan con las normas o especificaciones establecidas y cualquier otro criterio de control de calidad pertinente deben ser rechazados. Los ingredientes dietéticos y suplementos dietéticos rechazados o adulterados han de ser identificados, almacenados y desechados de tal manera que se proteja a los demás productos contra su adulteración. Puede realizarse su reprocesamiento. Antes de su aceptación y uso, el material reprocesado debe cumplir con las normas, especificaciones y con cualquier otro criterio pertinente. Han de establecerse y observarse procedimientos escritos que establezcan el método para el reprocesamiento de partidas o materiales de inicio de operaciones que no cumplan con las normas o especificaciones para artículos terminados. Los artículos terminados fabricados en los que se hayan utilizado dichos materiales han de cumplir con todas las normas de pureza, composición y calidad.
Pruebas de Estabilidad Debe diseñarse un protocolo escrito para evaluar las características de estabilidad de los suplementos dietéticos. Los resultados de dichas pruebas deben utilizarse para determinar las condiciones de almacenamiento y vida útil adecuadas. Este protocolo debe incluir lo siguiente: - El tamaño de la muestra y los intervalos de prueba basados en criterios estadísticos para cada atributo deben examinarse para asegurar que los cálculos de estabilidad sean válidos; - Las condiciones de almacenamiento para muestras retenidas para su evaluación; - Deben utilizarse métodos de prueba confiables, significativos y específicos; y - El suplemento dietético debe analizarse en el mismo tipo de sistema de envase-cierre en el que se comercializa. Debe evaluarse un número suficiente de partidas de cada suplemento dietético para determinar una vida útil satisfactoria, y debe llevarse un registro de estos datos. Podrán utilizarse estudios acelerados combinados con información de estabilidad básica de las materias primas, los suplementos dietéticos y los sistemas de envase-cierre a fin de avalar la vida útil tentativa, siempre y cuando no se cuenten con estudios de vida útil completos. Podrán utilizarse procedimientos de prueba de estabilidad simplificados en aquellos casos en que se cuenten con datos de formulaciones de productos similares para avalar la estimación de la vida útil de un producto nuevo. En aquellos casos en que se utilicen datos de estudios acelerados para proyectar una fecha de vida útil tentativa posterior a una fecha avalada por estudios de vida útil reales, deben realizarse estudios de estabilidad, incluyendo pruebas de los suplementos dietéticos con la frecuencia apropiada, hasta confirmar la vida útil tentativa o hasta determinar la vida útil satisfactoria.
USP 39
Suplementos Dietéticos/ (2750) Prácticas de Fabricación 2271 Muestras de Reserva
Una muestra de reserva representativa de cada lote o partida de suplemento dietético debe conservarse y almacenarse en condiciones coherentes con el etiquetado del producto durante al menos 3 años después de la vida útil del producto. La muestra de reserva debe almacenarse en el mismo sistema de envase-cierre primario en el que se comercializa el producto terminado o en uno de las mismas características. La muestra de reserva consta de al menos el doble de la cantidad necesaria para realizar todas las pruebas requeridas. Si se recibe el informe de un evento adverso, se deben analizar las muestras de reserva de los suplementos e ingredientes dietéticos del mismo lote o partida por el procedimiento apropiado, para confirmar su identidad y determinar cualquier adulteración o contaminación. Las muestras recuperadas asociadas con los informes de eventos adversos de los consumidores, distribuidores o ambos se deben analizar siguiendo el mismo método usado para las muestras de reserva, de ser posible. Los resultados junto con la demás información requerida deberán informarse a la autoridad federal utilizando el formulario adecuado. Las muestras de reserva de un lote o partida en particular asociadas con los informes de eventos adversos se deben conservar durante 6 años (eventos graves) o 3 años (eventos no graves) a partir de la fecha en que se recibe el primer informe de evento adverso del fabricante, envasador o distribuidor.
REGISTROS E INFORMES Todo registro de producción, control operaciones de control de calidad, o distribución que deba mantenerse y esté específicamente asociado con una partida de un producto debe conservarse durante al menos 3 años después de la vida útil de la partida. Deben llevarse registros para todas las materias primas, envases de productos, cierres y etiquetado durante al menos 3 años después de concluida la vida útil del último lote de producto que incorpore la materia prima o que utilice el envase, cierre o etiquetado.
Registros Maestros de Producción y Control Para asegurar la uniformidad de una partida a otra, los registros maestros de producción y control deben ser preparados, fechados y firmados por una sola persona y verificados, fechados y firmados por una segunda persona de la unidad de control de calidad. Los registros maestros de producción y control deben incluir lo siguiente: - El nombre y el contenido del producto; - El nombre y el peso o medida de cada ingrediente dietético por unidad o porción o por unidad de peso o medida del producto, y una declaración del peso o medida total de cualquier unidad de dosificación; - Una lista completa de las materias primas designadas por nombres o códigos lo suficientemente específicos como para indicar cualquier característica de calidad especial; - Una declaración exacta del peso o medida de cada materia prima, utilizando el mismo sistema de peso (métrico, avoirdupois o apotecario) para cada materia prima; - Una declaración relativa a cualquier exceso de materia prima calculado; - Una declaración de peso o medida teóricos en las fases de procesamiento correspondientes; - Una declaración de rendimiento teórico, incluyendo los porcentajes máximos y mínimos de rendimiento teórico más allá de los cuales se requiere una investigación; - Una descripción de los envases del producto, cierres y materiales de empaque, incluyendo un ejemplar o copia de cada etiqueta y todo otro etiquetado firmado y fechado por las personas responsables de la aprobación de tal etiquetado o, en lugar de los ejemplares o copias de cada etiqueta u otro etiquetado, una identificación positiva de todo el etiquetado utilizado; - Instrucciones de fabricación y control completas, procedimientos de análisis, límites de aceptación, notas especiales y precauciones a observar; - Acciones específicas necesarias para llevar a cabo y verificar los puntos, pasos o etapas en el proceso de fabricación que requieren la aplicación de controles a fin de asegurar la calidad de ingredientes dietéticos y suplementos dietéticos, así como para asegurar que los ingredientes dietéticos y suplementos dietéticos se envasan y etiquetan según se especifica en el registro maestro de producción. (a) Tales acciones específicas deben incluir la verificación del peso o la medición de cualquier componente, así como la verificación de la adición de cualquier componente; y (b) Para operaciones manuales, tales acciones específicas deben incluir: (i) Una persona que pese o mida un componente y otra persona que verifique el peso o medición; / (ii) Una persona que agregue el componente y otra persona que verifique la adición - Planes de acciones correctivas que se usan cuando no se cumple con una especificación
2272 (2750) Prácticas de Fabricación /Suplementos Dietéticos
USP 39
Registros de Producción y Control de Partidas Deben prepararse registros de producción y control de partidas para cada partida de producto elaborada, y dichos registros deben incluir información completa sobre la producción y control de cada una de ellas. Estos registros deben ser revisados y firmados por una segunda persona de la unidad de control de calidad. Estos registros deben incluir una reproducción exacta del registro de producción o control maestro y documentación que avalen que se llevó a cabo cada etapa significativa de la fabricación, procesamiento, envasado o retención de la partida, incluyendo lo siguiente: - Fechas; - Identidad de los principales equipos y líneas utilizados; - Identificación específica de cada partida de materia prima o material en proceso utilizado; - Pesos y medidas de las materias primas utilizadas durante el procesamiento; - Resultados de control en proceso y laboratorio; - Inspección de las áreas de envasado y etiquetado antes y después de cada uso; - Una declaración del rendimiento real y una declaración del porcentaje de rendimiento teórico en las fases de procesamiento correspondientes; - Descripción de los envases de producto y cierres utilizados; - Registros de control de etiquetado completos, incluyendo: (a) El identificador único asignado a los envases y etiquetas usadas, la cantidad de envases y etiquetas usadas, y, cuando sea necesario conciliar etiquetas, la conciliación de cualquier discrepancia entre la emisión y el uso de etiquetas; y (b) Una etiqueta real o representativa, o una referencia cruzada a la ubicación física de la etiqueta real o representativa especificada en el registro maestro de producción; - Cualquier muestreo realizado; - Identificación de las personas que realizan y supervisan o verifican directamente cualquier paso de la operación; - Cualquier investigación realizada; - Los resultados de cualquier prueba o examen realizado a los suplementos dietéticos envasados y etiquetados (incluyendo suplementos dietéticos reenvasados o reetiquetados), o una referencia cruzada a la ubicación física de tales resultados; - Documentación al momento en que la unidad de control de calidad: (a) Revisó el registro de producción de partida, incluyendo: (i) La revisión de cualquier operación de monitoreo requerida, y (ii) La revisión de los resultados de cualquier prueba y examen, incluyendo pruebas y exámenes realizados a componentes, materiales en proceso, partidas terminadas de suplementos dietéticos e ingredientes dietéticos y suplementos dietéticos envasados y etiquetados; (b) Aprobó o rechazó cualquier reprocesamiento o reetiquetado; (c) Aprobó y liberó, o rechazó, la partida para distribución, incluyendo cualquier partida reprocesada; y (d) Aprobó y liberó, o rechazó, el suplemento dietético envasado y etiquetado, incluyendo cualquier suplemento dietético reenvasado o reetiquetado; - Documentación al momento de llevar a cabo cualquier revisión del material y decisión de desecharlo requeridas; y - Documentación al momento de llevar a cabo cualquier reprocesamiento.
Registros para Materias Primas, Envasado y Etiquetas y para Producto Recibido para Envasado o Etiquetado como Suplemento Dietético Se deben crear y conservar los siguientes registros: - Procedimientos escritos para cumplir con los requisitos para materias primas, envasado y etiquetas y para productos recibidos para envasado o etiquetado; - Registros de recepción (incluyendo registros tales como certificados de análisis, facturas de proveedores y garantías de proveedores) para componentes, envasado y etiquetas para productos recibidos para envasado y etiquetado; y - Documentación que demuestre el cumplimiento con los requisitos de Materias Primas, Etiquetado y Envasado: (a) La persona que realice la operación requerida debe documentar, al momento de llevar a cabo la acción, que se llevó a cabo la operación requerida; y (b) La documentación debe incluir: (i) La fecha de recepción de las materias primas, empaques, etiquetas o productos recibidos para envasado y etiquetado como suplemento dietético; (ii) Las iniciales de la persona que realiza la operación requerida; (iii) Los resultados de cualquier prueba o examen realizado sobre las materias primas, empaques o etiquetas y de cualquier examen visual de productos recibidos para envasado o etiquetado como suplemento dietético; y (iv) Cualquier revisión de material y decisión de desecharlo realizadas en materias primas, empaques, etiquetas o productos recibidos para envasado o etiquetado como suplemento dietético.
USP 39
Suplementos Dietéticos/ (2750) Prácticas de Fabricación 2273 Registros de Laboratorio
Los registros de laboratorio deben incluir datos completos derivados de todas las pruebas necesarias para asegurar el cumplimiento con las especificaciones y normas establecidas, incluyendo evaluaciones y valoraciones, del siguiente modo: - Una descripción de la muestra recibida para analizar con la identificación de su origen (es decir, el lugar del que se obtiene la muestra), cantidad, número de lote u otro código distintivo y la fecha en que se tomó la muestra. - Una declaración de cada método utilizado en el análisis de la muestra. - Una declaración del peso o medida de la muestra utilizados para cada prueba, según corresponda. - Un registro completo de todos los datos obtenidos durante el curso de cada prueba, incluyendo todos los gráficos, cuadros y todos los espectros obtenidos con el instrumental de laboratorio, con la debida identificación de la materia prima, el envase de producto, el cierre, el material en proceso o producto terminado, y el lote específicamente analizado. - Un registro de todos los cálculos realizados en relación con la prueba, incluyendo unidades de medición, factores de conversión y factores de equivalencia. - Una declaración de los resultados de las pruebas y cómo se comparan los resultados con las normas de identidad, contenido, calidad y pureza establecidas para materia prima, envase de producto, cierre, material en proceso o producto terminado probados. - Las iniciales o firma de la persona que realiza cada prueba y la(s) fecha(s) en que se realizaron las pruebas. Deben mantenerse registros completos de toda modificación de un método establecido empleado en las pruebas. Dichos registros deben incluir el motivo de la modificación y datos para verificar que la modificación produjo resultados que son al menos tan exactos y confiables para el material sometido a prueba como los resultados del método establecido. Deben llevarse registros completos de toda prueba y normalización de estándares de referencia de laboratorio, reactivos y soluciones estándar, de la calibración periódica de instrumentos de laboratorio y de todas las pruebas de estabilidad realizadas. Cualquier desviación debe ser revisada y firmada por la dirección de la unidad de control de calidad.
Registros de Operación de Control de Calidad Se deben crear y conservar los siguientes registros: - Procedimientos escritos sobre las responsabilidades de las operaciones de control de calidad, incluyendo procedimientos escritos para realizar una revisión de material y tomar decisiones de desecho y procedimientos escritos para aprobar o rechazar cualquier reprocesamiento; - Documentar por escrito, al momento de la realización, que la unidad de control de calidad cumplió con los requisitos de revisión, aprobación o rechazo, registrando lo siguiente: (i) Fecha en que se llevó a cabo la revisión, aprobación o rechazo; y (ii) Firma de la persona que lleva a cabo la revisión, aprobación o rechazo; y - Documentación de cualquier revisión de material y decisión de desecho y seguimiento. Tal documentación deberá incluirse en el registro de producción de partida apropiado e incluir: (i) Una descripción de la investigación sobre la causa de la desviación de la especificación o del evento no anticipado; (ii) Una evaluación para determinar si la desviación o evento no anticipado ha resultado o pudiera ocasionar que no sea posible asegurar la calidad del suplemento dietético o que no se pueda envasar y etiquetar el suplemento dietético según lo especificado en el registro de fabricación maestro; (iii) Una identificación de las acciones tomadas para corregir y evitar la recurrencia de la desviación o evento no anticipado; (iv) Una explicación de las acciones tomadas con la materia prima, suplemento dietético, envase o etiqueta; (v) Una razón científicamente válida para cualquier reprocesamiento de un suplemento dietético que haya sido rechazado o cualquier tratamiento o ajuste durante el proceso de un componente rechazado; y (vi) Las firmas de (1) los individuos designados para llevar a cabo la operación de control de calidad, quienes han realizado la revisión del material y tomaron la desición de desecharlo; y además, (2) de cada persona calificada que haya provisto información pertinente a la revisión del material y a la decisión para desecharlo.
Registros de Distribución Los registros de distribución deben incluir el nombre y contenido del producto, el nombre y la dirección del consignatario, la fecha y cantidad enviada y el número de control o lote del producto terminado.
Conservación de Registros El fabricante, envasador o distribuidor de los suplementos dietéticos debe conservar todos los registros requeridos, según se muestra en este capítulo, durante 3 años a partir del vencimiento de la vida útil de los suplementos dietéticos asociados con dichos registros. Si se reciben informes de eventos adversos, esos registros se deben conservar durante 6 años a partir de la
2274 (2750) Prácticas de Fabricación/ Suplementos Dietéticos
USP 39
fecha en que se recibió el primer informe. Las autoridades reglamentarias deben tener acceso a todos los registros cuando lo soliciten. Los registros deben mantenerse como registros originales, como copias fieles (por ejemplo, fotocopias, microfilmes, microficheros u otras reproducciones exactas de los registros originales) o como registros electrónicos. Todos los registros electrónicos deben cumplir con la parte 11 del Code of Federal Regulations (Código de Reglamentos Federales) Title 21 (Título 21 del CFR parte 11 ). Si se usan técnicas de reducción tales como microfilmación, se debe poner a disposición de auditores e inspectores el equipo lector y de fotocopiado.
Archivos de Quejas Han de establecerse y observarse procedimientos escritos que describan el procesamiento de todas las quejas presentadas en forma oral o escrita en relación con un suplemento dietético. Estos procedimientos deben incluir disposiciones para que la unidad de control de calidad analice toda queja relacionada con el posible incumplimiento, por parte de un producto, de cualquiera de sus especificaciones y determine si es necesario realizar una investigación. Toda queja debe incorporarse a un archivo diseñado especialmente para las quejas relacionadas con los suplementos dietéticos. Los registros escritos deben mantenerse durante al menos 3 años después de concluida la vida útil del producto o 3 años a partir de la fecha en que se recibió la queja, según el período que sea más prolongado. El registro escrito debe incluir la siguiente información, en aquellos casos en que se conozca dicha información: el nombre y contenido del producto, el número de lote, el nombre de la persona que presentó la queja, los motivos de la queja y la respuesta proporcionada. En caso de que sea necesaria una investigación, el registro escrito debe incluir los hallazgos de la investigación y su seguimiento. La revisión e investigación de la queja del producto por parte de una persona calificada, la revisión por parte de la unidad de control de calidad sobre si debe investigar una queja de producto y los hallazgos y acciones de seguimiento de cualquier investigación realizada deberán extenderse a todas las partidas y registros pertinentes.
Informes de Eventos Adversos Los informes sobre eventos adversos incluyen informes sobre cualquier evento adverso relacionado con la salud que esté asociado con el uso de un suplemento dietético que sea adverso. Lo anterior incluye tanto informes de eventos adversos graves y no graves. El fabricante, envasador o distribuidor de un suplemento dietético (denominado como la persona responsable) cuyo nombre aparezca en la etiqueta ha de ser el responsable de mantener informes sobre todos los eventos adversos no graves en conjunto con cualquier informe relacionado (p.ej., registros de comunicaciones con la persona que informó el evento no grave). Todos estos registros de eventos adversos no graves deben mantenerse por un periodo de 6 años. La persona responsable cuyo nombre aparezca en la etiqueta, debe ser responsable de informar a la autoridad reglamentaria cualquier evento adverso serio reportado asociado con un suplemento dietético que se comercialice y use en el mismo país tan pronto como sea apropiado, pero no más de 15 días hábiles después de recibido el informe, usando el formulario adecuado según lo definido por la reglamentación (http://www.fda.gov/Food/dietarysupplements/reportadverseevent/ ucml 1111 O.htm). Un evento adverso grave es un evento que resulta en cualquiera de lo siguiente: 1. Muerte, 2. Una experiencia que ponga en peligro la vida, 3. Hospitalización, 4. Una persistente o significativa incapacidad o discapacidad, 5. Una anomalía congénita o defecto de nacimiento, o 6. Una afección que requiera, de acuerdo con el juicio médico razonable, una intervención médica o quirúrgica para evitar uno de los cinco resultados enumerados arriba. Un minorista cuyo nombre aparezca en la etiqueta como distribuidor, puede autorizar por contrato al fabricante o envasador para presentar los informes requeridos a las autoridades reglamentarias siempre y cuando el minorista dirija todos los informes de eventos adversos recibidos al fabricante o envasador. Todo informe de evento adverso serio debe incluir una copia de la etiqueta del producto, la información descrita en la sección precedente Archivos de Quejas, y de ser posible, la información de contacto de quien presenta la queja, la ingesta diaria, el consumo de alcohol y la cantidad, uso de medicamentos bajo prescripción y de venta libre, incluida la dosis diaria y otra información médica. La información asociada con la identificación personal y los registros médicos se debe obtener solo para los informes y mantener a salvo de divulgación. Cualquier información médica nueva relacionada con un informe de evento adverso serio ya presentado que se reciba dentro del primer año del informe inicial se debe presentar a la autoridad reglamentaria tan pronto como sea posible, pero no más de 15 días hábiles después de recibir la información. Los registros relacionados con cada informe de evento adverso grave recibido por el fabricante, envasador o minorista se deben conservar por 6 años. Se le debe permitir el acceso a estos registros a la persona autorizada, designada por la autoridad reglamentaria.
USP 39
Suplementos Dietéticos/ (2750) Prácticas de Fabricación 2275
PRODUCTOS DEVUELTOS Y RESCATADOS Suplementos Dietéticos Devueltos Los productos devueltos deben identificarse como tales y conservarse. Si las condiciones bajo las cuales se han conservado, almacenado o enviado los ingredientes dietéticos y suplementos dietéticos devueltos antes o durante su devolución, o si la condición del producto, su envase, caja o etiquetado, como resultado de su almacenamiento o envío, arroja dudas sobre la seguridad, identidad, contenido, calidad o pureza del producto, el producto devuelto debe destruirse a menos que un examen, prueba u otras investigaciones demuestren que cumple con las normas suficientes de seguridad, identidad, contenido, calidad y pureza. Los productos devueltos asociados con eventos adversos se deben destruir después de conservar suficiente cantidad de muestra de los productos para propósitos de investigación posterior únicamente. Los productos relacionados con un evento adverso que sean devueltos se deben conservar durante 6 años (eventos graves) o 3 años (eventos no graves) a partir de la fecha en que se recibió el primer informe. Un producto puede reprocesarse siempre y cuando el producto subsiguiente obtenido cumpla con las normas, especificaciones y características suficientes. Deben llevarse registros de los productos devueltos que incluyan el nombre y potencia declarada en la etiqueta del producto, el número de lote (o número de control o número de partida), el motivo de la devolución, la cantidad devuelta, la fecha de disposición y la disposición final del producto devuelto. Si el motivo por el que se devuelve el producto alcanza a partidas asociadas, es necesario realizar una investigación apropiada.
Rescate de Suplementos Dietéticos Los productos que han sido involucrados en eventos adversos o sometidos a condiciones de almacenamiento insuficientes, incluyendo temperatura y humedad extremas, humo, gases, presión, antigüedad o radiación debido a desastres naturales, incendios, accidentes o fallas en los equipos, no deben rescatarse y devolverse al mercado. Toda vez que se dude si los productos han sido sometidos a dichas condiciones, podrán realizarse operaciones de rescate únicamente si (a) hay evidencia mediante pruebas y ensayos de laboratorio de que los productos cumplen con todas las normas aplicables de identidad, contenido, calidad y pureza, y (b) hay evidencia de que los productos y sus envases no fueron sometidos a condiciones de almacenamiento inadecuadas como resultado del desastre o accidente. Los exámenes organolépticos deben aceptarse únicamente como evidencia complementaria de que el suplemento dietético cumple con las normas suficientes de identidad, contenido, calidad y pureza. Deben llevarse registros que incluyan el nombre, número de lote y disposición de los productos rescatados. Si los productos están involucrados en eventos adversos, se deben seguir las instrucciones descritas en la sección precedente Registros e Informes.
Niveles de Acción en Caso de Defectos Algunos ingredientes y suplementos dietéticos, incluso cuando se elaboran según las buenas prácticas de fabricación vigentes, pueden contener defectos naturales o inevitables que a bajos niveles no representan un riesgo para la salud. La Administración de Alimentos y Medicamentos de los EE.UU. establece niveles máximos para estos defectos en los ingredientes dietéticos y suplementos dietéticos elaborados conforme a las buenas prácticas de fabricación vigentes y utiliza estos niveles para determinar si es conveniente recomendar la implementación de medidas reglamentarias. Los niveles de acción en caso de defectos se establecen para los ingredientes dietéticos y suplementos dietéticos cada vez que es necesario y factible hacerlo. Estos niveles están sujetos a cambios con el desarrollo de nueva tecnología o la disponibilidad de nueva información. El cumplimiento de los niveles de acción en caso de defectos no excusa la violación del requisito de la sección 402(a)(4) de la Ley, que establece que los ingredientes dietéticos y suplementos dietéticos no deben prepararse, envasarse o conservarse bajo condiciones no sanitarias ni de los requisitos de esta parte, que los fabricantes, distribuidores y conservadores tanto de ingredientes dietéticos como suplementos dietéticos han de cumplir con las buenas prácticas de fabricación vigentes. En caso de evidencia de que se haya violado algún requisito, el ingrediente dietético y el suplemento dietético se considerará adulterado según la interpretación de la Ley, aunque las cantidades de defectos naturales o inevitables sean más bajas que los niveles de acción vigentes establecidos en caso de defectos. El fabricante, distribuidor y conservador de un ingrediente dietético o suplemento dietético ha de utilizar siempre controles de calidad que reduzcan los defectos naturales o inevitables al nivel más bajo factible en ese momento. No está permitida la mezcla de un ingrediente o un suplemento dietético que contenga defectos por encima del nivel de acción con otro lote de ingrediente o suplemento dietético, y la existencia de dicha mezcla determinará que el producto final se considere adulterado según la interpretación de la Ley, independientemente del nivel de defecto del producto final. Puede obtenerse un listado de los niveles de acción vigentes en caso de defectos naturales o inevitables en ingredientes dietéticos y suplementos dietéticos que no presentan riesgos para la salud solicitándolo a lndustry Activities Staff (HFS-565), Center for Food Safety and Applied Nutrition, U.S. Food and Drug Administration, 5100 Paint Branch Parkway, College Park, MD 20740-3835.
2276 (2750) Prácticas de Fabricación / Suplementos Dietéticos
USP 39
GLOSARIO Actividad de agua (aw) es una medida de la humedad libre en un ingrediente o suplemento dietético y es igual al cociente de la presión del vapor de agua de la sustancia dividido por la presión del vapor del agua pura a la misma temperatura. Blanqueado se refiere a un tratamiento térmico previo al envasado aplicado a un ingrediente dietético y a un suplemento dietético durante un tiempo suficiente y a suficiente temperatura para inactivar de forma parcial o total las enzimas naturales y efectuar otros cambios físicos o bioquímicos en el producto. Composición es (1) la identidad de un ingrediente o suplemento dietético y (2) la concentración de un ingrediente dietético (p.ej., peso u otra unidad de uso/peso o volumen), o la potencia o actividad de uno o más ingredientes dietéticos, según se indique en los procedimientos correspondientes. Contenido se refiere a la concentración de la sustancia activa (peso/peso, peso/volumen o unidad de uso/volumen o peso) y/o a la potencia, es decir, a la actividad del producto según lo indicado por pruebas de laboratorio adecuadas. Criterios de aceptación se refiere a las especificaciones del producto y a los criterios de aceptación o rechazo, como por ejemplo un nivel de calidad aceptable y un nivel de calidad no aceptable, con un plan de muestreo asociado, necesarios para tomar la decisión de aceptar o rechazar un lote o partida (o cualquier otro subgrupo conveniente de unidades fabricadas). Debe(n) se usa para referirse a procedimientos recomendados o aconsejables o a equipos que se recomienda utilizar. Evaluación del proceso es un conjunto de pruebas aplicadas a un proceso para evaluar su capacidad de producir en forma consistente los resultados para los que fue diseñado. Evento adverso es cualquier evento relacionado con la salud que sea adverso y esté asociado con el uso de un suplemento dietético. Fecha de vida útil es la fecha después de la cual no se garantiza que el suplemento dietético cumpla con las normas aplicables de identidad, contenido, calidad y pureza. Ha(n) de (El verbo "haber" seguido de la preposición "de") se usa para referirse a aquellos requisitos que se deberían cumplir conforme a lo dispuesto en estas guías, como traducción de la palabra inglesa shall. Informe de evento adverso es el informe de un evento adverso (ver la definición más arriba). 0/er también Informe de evento adverso serio). Informe de evento adverso serio es un informe de evento adverso que se considere serio porque cumple con determinados criterios (ver la subsección Informe de evento adverso). La Dietary Supplement and Nonprescription Drug Consumer Protection
Act (Ley de Protección al Consumidor de Suplementos Dietéticos y Medicamentos Sin Prescripción) exige que los fabricantes y distribuidores de suplementos dietéticos y medicamentos de venta libre informen todos los eventos adversos serios a la Secretaría de la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA). Este es un requisito nuevo para los suplementos dietéticos. Ingrediente dietético es un ingrediente utilizado o destinado a ser utilizado en un suplemento dietético y puede ser: - una vitamina; - un mineral; - una hierba u otro producto botánico; - un aminoácido; - una sustancia dietética para ser utilizada por el hombre para complementar su dieta aumentando la ingesta dietética total, o un concentrado, metabolito, constituyente, extracto; o - una combinación de cualquiera de los ingredientes anteriores. Ingrediente inactivo es cualquier materia prima que no sea un ingrediente dietético. Ley se refiere a la Ley de Alimentos, Fármacos y Cosméticos (United States Code [USC) Título 21, Capítulo 9). Lote es una partida, o una porción específica de una partida, de carácter y calidad uniformes dentro de límites especificados. Manufactura o fabricación incluye todas las operaciones asociadas con la producción de ingredientes dietéticos y suplementos dietéticos, incluyendo las operaciones de envasado y etiquetado, pruebas y control de calidad de un ingrediente dietético o suplemento dietético. Materia prima se refiere a cualquier ingrediente destinado a ser utilizado en la fabricación de un ingrediente o suplemento dietético, incluyendo aquellos que no aparecen en el producto terminado. (Un ingrediente dietético se considera una materia prima cuando se utiliza para la fabricación de un suplemento dietético). Material en proceso es cualquier material fabricado, compuesto, combinado, triturado, extraído, tamizado, esterilizado o procesado de cualquier otra manera, que es producido para la preparación del suplemento dietético y utilizado en la elaboración de éste. Microorganismos se refiere a levaduras, hongos, bacterias y virus e incluye, entre otras, especies que tienen relevancia para la salud pública. El término "microorganismos indeseables" incluye los microorganismos que tienen relevancia para la salud pública, que producen la descomposición de un ingrediente dietético o de un suplemento dietético que indican que un ingrediente o suplemento dietético está contaminado con suciedad o que de otro modo podrían producir la adulteración de un ingrediente dietético o de un suplemento dietético según la interpretación de la Ley. Ocasionalmente en estas reglamentaciones, se utiliza el adjetivo "microbiano" en lugar de una frase adjetiva que contenga la palabra "microorganismo". Muestra representativa es una muestra que consiste de un número de unidades extraídas conforme a criterios racionales, como por ejemplo muestreo aleatorio, para asegurar que la muestra tomada representa de manera exacta el material que se está analizando.
USP 39
Suplementos Dietéticos/ (2750) Prácticas de Fabricación 2277
El análisis (o muestreo) por lote salteado es un nivel reducido de análisis (o muestreo) para uno o más parámetros específicos basado en uno o más de los siguientes métodos: - Análisis estadístico de una cantidad suficiente de datos de prueba históricos; - Confianza estadística en la capacidad del proceso de fabricación según lo determinado mediante una verificación satisfactoria; o - Seguimiento permanente del proceso utilizando técnicas de control estadístico de procesos reconocidas (SPC, por sus siglas en inglés). Número de lote, número de control o número de partida es cualquier combinación distintiva de letras, números o símbolos o cualquier combinación de éstos que permite determinar el historial completo de la fabricación, procesamiento, empaque, conservación y distribución de una partida o lote de ingrediente dietético terminado, suplemento dietético u otro material. Operación de control de calidad es un procedimiento planeado y sistemático para tomar todas las medidas necesarias para evitar la adulteración de un ingrediente dietético y de un suplemento dietético. Partida es una cantidad específica de un producto terminado u otro material que debe tener las mismas características y calidad, dentro de límites establecidos, y que está producida como parte de una única orden de fabricación durante el mismo ciclo de fabricación. Plaga se refiere a cualquier animal o insecto inaceptable incluyendo, entre otros, aves, roedores, moscas y larvas. Planta se refiere al edificio o instalación, o partes de éstos, utilizados para o en relación con la fabricación, envasado, etiquetado o conservación de un ingrediente dietético y de un suplemento dietético. Ree/aboración se refiere a un material limpio y no adulterado que se ha retirado de procesamiento por razones no sanitarias o que se ha reacondicionado exitosamente mediante su reprocesamiento y, en consecuencia, es satisfactorio para su utilización en la fabricación de un ingrediente dietético o de un suplemento dietético. Sanitizar consiste en el tratamiento satisfactorio de los equipos, envases o utensilios mediante un proceso capaz de destruir de forma eficaz las células vegetativas de microorganismos de relevancia para la salud pública, y de reducir sustancialmente otros microorganismos indeseables sin afectar el producto o su seguridad para el consumidor. Satisfactorio o Suficiente significa lo necesario para lograr el propósito deseado conforme a las buenas prácticas de salud pública. Suplemento dietético es un producto (excepto el tabaco) cuyo propósito es complementar la dieta y que lleva o contiene uno más de los siguientes ingredientes dietéticos: una vitamina, un mineral, una hierba u otro producto botánico, un aminoácido, una sustancia dietética para ser utilizada por el hombre para complementar su dieta aumentando la ingesta diaria total, o un concentrado, metabolito, constituyente, extracto o combinación de estos ingredientes, diseñado para ser ingerido en forma de píldora, cápsula, tableta o líquido y no está destinado para ser utilizado como un alimento convencional o como el único componente de una comida o dieta. El suplemento dietético se declara como tal en la etiqueta e incluye productos como un fármaco, antibiótico certificado o producto biológico autorizado nuevo que fue comercializado como suplemento dietético o alimento antes de su aprobación, certificación o licencia, a menos que una autoridad sanitaria exceptúe la aplicación de esta disposición. Unidad de control de calidad se refiere a cualquier persona o elemento de la organización designado por la firma como responsable de las tareas relacionadas con las operaciones de control de calidad. Vida útil es la cantidad de tiempo después de la fabricación durante la que se garantiza que el suplemento dietético cumplirá con las normas aplicables de identidad, contenido, calidad y pureza.
Reactivos / Reactivos 22 79
USP 39
Reactivos, Indicadores y Soluciones 1. ALCANCE Los reactivos requeridos para las pruebas y valoraciones de los artículos de la Farmacopea de los EE.UU. y del Formulario Nacional, así como aquellos requeri~os única.mente para determinar la calidad de otr~s. rea.ct1vos, se lis.tan en esta sección, incluyendo las especificaciones apropiadas para el uso previsto. . Tal como se declara en Advertencias Generales, 6. 70 Reactivos el listado de reactivos, indicadores y soluciones en la Far'macopea de Jos EE.UU. de ningún modo implica gue tengan utilidad terapéutica. Por lo tant9,. tod~ refer,enc!a a,!ª USP o el NF en su etiquetado debera incluir el termino reactivo" o "grado reactivo". . Cuando se mencione una marca o fuente particular de un material, instrumento o equipo, o el nombre y direcsió.n de un fabricante (por lo regular en una nota o pie d~ pa9ina), esta identificación se ofrece exclusivamente con fines informativos sin ninguna implicación de aprobación, aval o certificación. 1.1 Grado Reactivo ACS (American Chemical Society) Cuando se indique "Usar grado reactivo ~<:;S",. deberá emplearse un reactivo que cumpla las espec1f1cac1one~ correspondientes a la edi.ción vigen!e del R~agent Chem1cals, publicado por la American Chem1cal Society. 1.2 Grado Adecuado Cuando no exista una monografía de reactivo de la ACS o cuando el reactivo se encuentre di~f?Onible en difere.nte~, grados de cal~dad,. c,ada. uno esp~c1~!co para una apl1cac1on particular, se inclu1ra la instrucc1on Usar un grado ade~ cuado". Con lo anterior se pretende el uso de un reactivo , de grado adecuado dispo_nible comerci.a~mente. En ocasiones una o mas pruebas ad1c1onales ampl1an la designación de' "grado adecuado", según se indica en el texto. También se incluyen en el listado algunos de los reactivos, aunque no todos, que son requeridos solamente para determinar la calidad de otros reactivos. Se pueden obtener especificaciones satisfactorias en publicaciones de referencia estándar para los reactivos que no están en la lista. 1.3 Grado USP, NF o FCC En aquellos casos en los que un reactivo requerido en una prueba o valoración de la Farmacopea d~ ~os EE.UU. o el Formulario Nacional cumple con los requ1s1tos de la monografía para dicho artículo que aparece en la ~Gl:lf1aCC!pea de Jos EE.UU. o el Formulario Nacional o en la ed1c1on vigente del Food Chemicals Codex (FCC), será suficiente consultar la monografía de dicho artículo en uno de estos tres ~?mRen dios. En tales casos, debe entenderse que las espec1f1cac10nes son requisitos mínimos y que cualquier otra susta~ci~ que cumpla especificaciones más rígidas de pureza qu1m1ca es adecuada.
2. ENVASADO V ALMACENAMIENTO Los reactivos y las soluciones se deben conserva~ en envases impermeables de vidrio resistente u otro. materi~I adecuado. Deben seguirse cuidadosamente las instrucciones de almacenamiento en envases resistentes a la luz. Los tapones y llaves de paso que entren en con!a.cto con sustancias capaces de atacar o penetrar sus superf1c1es pueden tener un recubrimiento protector compuesto por una
fina película de lubricante adecuado, a menos que se indique específicamente lo contrario.
3. SOLUCIONES ESTÁNDAR DE IONES METÁLICOS La fotometría de absorción atómica y de llama requieren el uso de soluciones estándar de iones metálicos. Aunque las monografías indi~iduales normaln:ente ofrecen i~strucciones para la preparacion de estas solu~1ones, se p~rm1te el uso de soluciones estandarizadas de los tones apropiados preparadas comercialmente, siempre que el analista confirme la aptitud de las soluciones y tenga datos que respalden su uso.
4. DEFINICIONES 4.1 Reactivos: Son sustancias utilizadas como tales o como componentes de soluciones. 4.2 Indicadores: Son reactivos usados para determinar el punto final especificado en una reacción química, para medir la concentración de iones hidrógeno (pH), o para indicar que se ha llevado a cabo uí! c~mbio deseado de pH. Se citan junto con los papeles indicadores de pr~eba. . 4.3 Soluciones Amortiguadoras: Las soluciones amortiguadoras resisten cambios en la actividad. de un ió~ .ante la adición de sustancias que se espera cambien la act1v1dad de dicho ión. 4.4. Soluciones Colorimétricas (SC): Son soluciones que se utilizan en la preparación de estándares colorimétricos para comparación. 4.5 Soluciones Reactivo (SR): Son soluciones de reactivos en disolventes y con concentraciones definidas que resultan apropiadas para los fines especificados. 4.6 Soluciones Volumétricas (SV): Son soluciones de reactivos de concentración conocida destinadas principalmente para su uso en determinaciones cuantitativas. 4.7 Agua: Como en el resto de la Farmacopea de Jos EE.UU., cuando se menciona "agua", sin calificación, en las pruebas para reactivos o en las instrucciones par~ _preparar cualquier solución siempre debe usarse Agua Punftcada (monografía de la USP). 4.7.1 AGUA EXENTA DE DIÓXIDO DE CARBONO: Se trata de Agua Purificada que se ha cale~tado a ebulli.ción vig~rosa mente durante 5 minutos o mas y se ha dejado enfriar, protegiéndola de la absorci?.n de dióxi~o de carboí!o.d.e la atmósfera, o bien Agua Punftcada que tiene una res1st1v1dad no menor de 18 Mohmios-cm. 4.7.2 AGUA DESGASIFICADA: Para fines distintos de la disolución o las pruebas de liberación de fármacos! se trata de Agua Purificada que h~ sido tr~tada. por medios adecu~dos para reducir el contenido de aire disuelto, como por eien;plo calentán~ola a ebullició.n vigorosa~en.t~ duran.te 5 .r;i1nutos y enfriandola, o mediante la aphcac1on de v1brac1on ultrasonica. 4.7.3 AGUA EXENTA DE PARTÍCULAS: Se trata de agua que se ha pasado a través de un filtro adecuado con un tamaño de poro de 0,22 µm. , 4.7.4 AGUA EXENTA DE SUSTANCIAS ÜRGANICAS: Se trata de Agua Purificada que no produce picos que interfieran, significativamente cuando se lleva a cabo una cromatograf1a se-
2280 Reactivos / Reactivos
USP 39
gún se indica en Disolventes Residuales (467), Identificación, Control y Cuantificación de Disolventes Residuales.
5. DISOLVENTES CROMATOGRÁFICOS Y GASES TRANSPORTADORES Los procedimientos cromatográficos establecidos en la Farmacopea de los EE.UU. pueden requerir el uso de disolventes y gases que se han purificado especialmente para dicho uso. El propósito puede ser (a) excluir determinadas impurezas que interfieren con la realización adecuada del
procedimiento de prueba o (b) prolongar la vida de una columna al reducir la acumulación de impurezas en ésta. Cuando se requieren disolventes y gases en procedimientos cromatográficos, el analista tiene la responsabilidad de asegurar la aptitud del disolvente o gas para el uso específico. En varias empresas proveedoras de reactivos se encuentran disponibles, como productos especiales, disolventes y gases adecuados para cromatografía de alta presión u otros usos cromatográficos específicos. No obstante, no hay ninguna garantía de que productos similares de proveedores diferentes sean equivalentes para un determinado procedimiento.
Reactivos 1. DEFINICIONES 1.1 Blanco Un blanco es una preparación que consta de las mismas cantidades de los mismos reactivos tratados de la misma manera que la muestra que se está analizando. 1.2 Control Un control es un blanco al que se le ha agregado la cantidad límite de la sustancia que se está analizancfo o es una solución de comparación específica preparada según las indicaciones de cada prueba.
2. DESCRIPCIÓN DE LA INFORMACIÓN DEL REACTIVO Ver la Figura 7.
3. COMPARACIONES VISUALES Los tu os para comparacion de co or usados en este procedimiento suelen denominarse "tubos de Nessler". Al realizar comparaciones visuales de las densidades en líquidos turbios, compensar las diferencias de color, en caso de ser necesario, visualizando la turbidez a través de una columna de agua, cuya profundidad debe determinarse según el volumen indicado en las especificaciones de cada reactivo. Colocar el agua en dos tubos para comparación de color y sostener uno ae los tubos sobre el tubo de control y el otro debajo del tubo con la muestra.
4. CONSERVAR EL FILTRADO "Conservar el filtrado", debe entenderse, a menos que se indique lo contrario, que los lavados del residuo no deben agregarse al filtrado obtenido.
La expresión Rz03 indica el residuo de incineración de compuestos precipitados al agregar hidróxido de amonio, como por ejemplo óxido de hierro (Fe2Ü3) y óxido de aluminio (Alz03).
6. PRUEBAS GENERALES PARA REACTIVOS Los siguientes métodos de prueba generales se suministran para examinar los reactivos a fin de determinar si cumplen con las especificaciones de los reactivos individuales y deben utilizarse a menos que se indique lo contrario en dichas especificaciones. 6.1 Intervalo de Ebullición o Destilación para Reactivos Usar el siguiente procedimiento para determinar el intervalo de ebullición o destilación de los reactivos, a menos que se indique lo contrario en las especificaciones individuales: APARATOS: Usar aparatos similares a los especificados para el Intervalo de Destilación (721 ), Método 1, excepto que el matraz de destilación debe tener una capacidad de 250 mL y un cuello corto, y debe conectarse al condensador por medio de un tubo conector de tres vías equipado con iuntas de vidrio esmerilado estándar. PROCEDIMIENTO: Colocar el matraz de destilación en posición vertical en la perforación de la tabla de asbestos y conectarlo al condensador. Medir 100 mL del líquido que se va a analizar en una probeta graduada y transferirlos al matraz de ebullición iunto con algún dispositivo para evitar la ebullición violenta. Usar la probeta como receptor del destilado. Insertar el termómetro y calentar de manera que se destile a una velocidad de 3-5 mL/minuto. Realizar una prueba preliminar, si fuera necesario, para determinar el ajuste del calentamiento para lograr la velocidad adecuada. Leer el termómetro cuando se hayan destilado aproximadamente 20 gotas y, posteriormente, a volúmenes de destilado de 5, 1O, 40, 50, 60, 90 y 95 ml. Continuar con la destilación hasta alcanzar el punto seco. El Intervalo de Ebullición o Destilación es el intervalo entre las temperaturas a las que se han destilado 1 mL y 95 mL, respectivamente. 6.2 Prueba de Nitrógeno Amino en Reactivos Determinar el porcentaje de pérdida por secado de la muestra en condiciones apropiadas. Transferir aproximadamente 500 mg de la muestra a un vaso de precipitados de 100 ml. Agregar 20 mL de agua. Ajustar el pH potenciométricamente con ácido clorhídrico O, 1 N o hidróxido de sodio 0,2 N hasta 6,0. Agre~ar 1 O mL de solución de formaldehído. Valorar la solucion potenciométricamente con hidróxido de sodio 0,2 N hasta un pH de 9,0. Calcular el porcentaje de nitrógeno amino: 0
•
•
•
_
VNaOH
X NNaOH X 2,8X100
Yo rntrogeno amino - mg de muestra x(1,0 - %LOD/100)
USP
Reactivos/ Pruebas
39
Bromuro de Dodeclltrlmetilamonio {8forril.lro de laurilfrimetllamonlo). CH,,(cti2)11N(CHa)>Sr-308.3
Generales para Reactivos 2281
[1119-94-4]-Usar un
grado adec:uad<>.
(Nota-Un grado adec:uacto se lllleuentra disponible con el f>f' de catálogo 05047 en Slgma-Aldril:h, www-s!Qrm-aldrl!lll.oom.} t~ adk::ionel
tal como posible$ pmvaadores o calidad de grado aspeclfica
Figura 1. Componentes de la información del reactivo. donde %LOD es el porcentaje de pérdida por secado. 6.3 Arsénico en Reactivos Para esta prueba, seleccionar reactivos con bajo contenido de arsénico, de modo tal que una prueba con un blanco no produzca manchas o produzca manchas apenas perceptibles. APARATOS: Preparar un generador colocando un tapón de goma con 1 orificio en un frasco de boca ancha con una capacidad de aproximadamente 60 ml. A través de la perforación, insertar un tubo de salida vertical de aproximadamente 12 cm de longitud total y 1 cm de diámetro a lo largo de toda la parte superior (aproximadamente 8 cm) y estrechado en su extremidad inferior a un tubo de aproximadamente 4 cm de longitud y aproximadamente 5 mm de diámetro. La porción más pequeña del tubo deberá extenderse ligeramente por debajo del tapón. Colocar arena lavada o un trozo de algodón purificado en la porción superior aproximadamente a 3 cm de la parte superior del tubo. Humedecer la arena o el algodón de manera uniforme con acetato de plomo SR y eliminar cualquier exceso o gotitas adheridas de este último de las paredes del tubo. En el extremo superior de este tubo, insertar un segundo tubo de vidrio de 12 cm de longitud, con un diámetro interno de 2,5-3 mm, por medio de un tapón de goma. justo antes de realizar la prueba, colocar una tira de papel de prueba de bromuro mercúrico (ver Papeles Indicadores y de Prueba) en este tubo, fijando el extremo superior de la tira para que se mantenga en su posición a aproximadamente 2 cm por encima del tapón de goma. Limpiar y secar meticulosamente el tubo cada vez que se utilice. SOLUCIÓN ESTÁNDAR DE ARSÉNICO: Usar la Preparación Estándar preparada según se indica en Arsénico (211 ). PREPARACIÓN DE PRUEBA: Agregar 1 mL de ácido sulfúrico a 5 mL de una solución de la sustancia química (1 en 25), a menos que se indique otra cantidad en las especificaciones de cada reactivo individual. No agregar en el caso de ácidos inorgánicos. A menos que se indique algo diferente, agregar 1O mL de ácido sulfuroso. Evaporar el líquido en un vaso de precipitados pegueño, sobre un baño de vapor, hasta que esté exento de acido sulfuroso y se haya reducido aproximadamente a 2 mL de volumen. Diluir con agua a 5 mL para obtener la Preparación de prueba. Las sustancias sometidas a los tratamientos especiales indicados en las especificaciones de cada reactivo pueden usarse directamente como Preparación de prueba. [NOTA-No se considerará que las soluciones preparadas mediante la disolución de las sustancias químicas en ácidos diluidos se han sometido a un tratamiento especial.] MANCHA ESTÁNDAR: Colocar en el frasco del generador 5 mL de yoduro de potasio SR, 2,0 mL de Solución estándar de arsénico, 5 mL de solución ácida de cloruro estannoso SR y 28 mL de agua. Agregar 1,5 g de cinc granulado (en polvo Nº 20) e insertar inmediatamente el tapón que contiene el tubo de salida. Mantener el frasco del generador sumer9ido en agua a 25º durante la prueba para moderar la reaccion de modo tal que la mancha tome la forma de una banda distintiva para facilitar la comparación de la intensi-
dad del color. Cuando la evolución del hidrógeno ha continuado durante 1 hora, retirar el papel de prueba de bromuro mercúrico para realizar la comparación. Esta mancha representa 2 µg de arsénico. PROCEDIMIENTO: Pipetear y transferir 5 mL de yoduro de potasio SR y 5 mL de la Preparación de prueba al frasco del generador, y agregar 5 mL de solución ácida de cloruro estannoso SR. Dejar en reposo el aparato a temperatura ambiente durante 1O minutos y luego agregar 25 mL de agua y 1,5 g de cinc granulado (en polvo Nº 20), y proceder según se indica en Mancha estándar. Retirar el papel de prueba de bromuro mercúrico y comparar la mancha obtenida con la Mancha estándar: la longitud o intensidad del color de la mancha producida por la sustancia química analizada no debe exceder las de la Mancha estándar, lo que indica que no hay más de 1O partes de arsénico por millón de partes de la sustancia que se está analizando. Dado que la luz, el calor y la humedad hacen que la mancha se desvanezca rápidamente, colocar los papeles en tubos secos y limpios, y realizar las comparaciones de inmediato. SUSTANCIAS QUÍMICAS INTERFERENTES: El antimonio, si estuviera presente en la sustancia que se está analizando, produce una mancha gris. Los sulfitos, sulfuros, tiosulfatos y otros compuestos que liberan sulfuro de hidrógeno o dióxido de azufre cuando se tratan con ácido sulfúrico deben oxidarse con ácido nítrico y luego reducirse con dióxido de azufre según se indica en la Preparación de prueba antes de colocarlos en el aparato. Ciertos compuestos a base de azufre y también la fosfina producen una banda de color amarillo brillante en el papel de prueba. Si estuvieran presentes compuestos a base de azufre, el algodón humedecido con acetato de plomo o la arena tomarán un color oscuro. En ese caso, repetir la operación según se indica en Preparación de prueba con una porción nueva de la solución que se está analizando y proceder con sumo cuidado al eliminar completamente e ácido sulfuroso. Cuando se analizan hipofosfitos, asegurarse de oxidar completamente la solución que se está analizando según las indicaciones ya que, de lo contrario, la evolución de la fosfina podría producir una mancha amarilla que podría confundirse con el color amarillo anaranjado producido por la arsina. La mancha producida por la fosfina puede diferenciarse de la producida por la arsma humedeciéndola con hidróxido de amonio 6 N. La mancha producida por la arsina se oscurece cuando se la trata de esta manera, pero la mancha producida por la fosfina no cambia sustancialmente de color. 6.4 Cloruros en Reactivos SOLUCIÓN ESTÁNDAR DE CLORURO: Disolver 165,0 mg de cloruro de sodio seco en agua hasta completar 1000,0 ml. Esta solución contiene el equivalente a O, 1O mg de cloro (CI) en cada ml. PROCEDIMIENTO: Neutralizar, si fuera alcalina, una solución de la cantidad de reactivo indicada en la prueba en 25 mL de agua, o una solución preparada segun se indica en la prueba, con ácido nítrico, utilizando papel tornasol como indicador y agregar 3 mL más de ácido nítrico. Filtrar la solución, si fuera necesario, a través de un papel de filtro
2282 Pruebas Generales para Reactivos /
Reactivos
previamente lavado con agua hasta que el papel esté exento de cloruro y agregar 1 mL de nitrato de plata SR. Mezclar y dejar en reposo, protegido de la luz solar directa, durante 5 minutos. Comparar la turbidez, si la hubiera, con la producida en un control realizado con las mismas cantidades de los mismos reactivos que se emplean en la prueba final y un volumen de Solución estándar de cloruro equivalente a la cantidad de cloruro (CI) que se permite en la prueba. Ajustar las dos soluciones con agua al mismo volumen antes de agregar el nitrato de plata SR y comparar la turbidez de ambas. Al analizar sales de bario, neutralizar con ácido nítrico la solución que contiene el reactivo, si fuera alcalina, y agregar sólo 3 gotas más de ácido nítrico. Realizar el resto de la prueba según se describió anteriormente. Al analizar sales que producen soluciones coloreadas, disolver 2 g del reactivo en 25 mL de agua y agregar 3 mL de ácido nítrico. Filtrar la solución, si fuera necesario, a través de un papel de filtro previamente lavado con agua '/, dividir el filtrado en dos porciones iguales. Tratar una porción con 1 mL de nitrato de plata SR, dejar en reposo durante 1 O minutos y, en caso de producirse turbidez, filtrar a través de un papel de filtro lavado hasta que quede transparente y usar el filtrado como blanco. Tratar la otra porción con 1 mL de nitrato de plata SR, mezclar y dejar en reposo durante 5 minutos protegida de la luz solar directa. Comparar la turbidez con la producida en el blanco agregando un volumen de Solución estándar de cloruro equivalente a la cantidad de cloruro (CI) permitida en la prueba, ajustando ambas soluciones al mismo volumen con agua. 6.5 Fotometría a la Llama para Reactivos En las especificaciones de algunos de los reactivos se requiere el uso de procedimientos fotométricos a la llama para determinar trazas de calcio, potasio, sodio y estroncio. La aptitud de dichas determinaciones depende del uso de aparatos adecuados y están disponibles varios instrumentos de selectividad adecuada. El tipo de fotómetro a la llama preferido es el fotómetro con un fototubo sensible al rojo, un fototubo multiplicador, un monocromador, un control de anchura de ranura ajustable, un interruptor selector y un control de sensibilidad. Pueden usarse otros tipos de fotómetros, siempre y cuando el operador haya comprobado que el instrumento determinará en forma exacta la cantidad de impurezas permitidas en el reactivo a analizar. Los procedimientos fotométricos a la llama dependen del uso de estándares semi-internos y, en consecuencia, requieren una Solución muestra y una Solución control. Para la Solución muestra, se disuelve un peso especificado de la muestra y se diluye hasta un volumen definido. Para la Solución control, se disuelve la misma cantidad de muestra, se agregan las cantidades límite de las impurezas cuya presencia se sospecha y luego se diluye la solución hasta el mismo volumen definido que la Solución muestra. El fotómetro a la llama se configura según se indica en los procedimientos generales y luego se ajusta para obtener una lectura de emisión lo más cercana posible a una transmitancia del 100% con la Solución control a la longitud de onda especificada para la impureza particular en cuestión. Sin cambiar los ajustes del instrumento, se lee la emisión de la Solución muestra a la misma longitud de onda y a una longitud de onda de referencia especificada. Luego se utiliza la lectura de referencia para corregir la emisión observada con la Solución muestra en función de la emisión debida a la muestra y al disolvente. La muestra que se está analizando contiene menos del límite especificado de impureza si la diferencia entre la emisión de referencia y la emisión total observadas para la Solución muestra es menor que la diferencia entre las emisiones observadas para la Solución control y la Solución muestra a la longitud de onda designada para esa impureza en particular. CALCIO EN REACTIVOS Solución estándar de calcio: Disolver 250 mg de carbonato de calcio en una mezcla de 20 mL de agua y 5 mL de ácido clorhídrico diluido y, una vez completa la solución,
USP 39
diluir con agua hasta 1 L. Esta solución contiene O, 1 O mg de calcio (Ca) por ml. Procedimiento: Usar la Solución muestra y la Solución control preparadas según se indica en el procedimiento de prueba individual. Ajustar el control de anchura de ranura de un fotómetro a la llama adecuado a 0,03 mm y el interruptor selector a O, 1. Ajustar el instrumento para obtener la maxima emisión con la Solución control en la línea de calcio a 422,7 nm y registrar la transmitancia. Sin modificar ningún parámetro del instrumento, registrar la transmitancia para la emisión de la Solución muestra a 422,7 nm. Cambiar el monocromador a la longitud de onda especificada en cada procedimiento de prueba individual y registrar la transmitancia de referencia para la emisión de referencia de la Solución muestra: la diferencia entre las transmitancias para la Solución muestra a 422,7 nm y a la longitud de onda de referencia no es mayor que la diferencia entre las transmitancias observadas a 422,7 nm para la Solución muestra y la Solución control. POTASIO EN REACTIVOS Solución estándar de potasio: Disolver 191 mg de cloruro de potasio en unos pocos mL de agua y diluir con agua hasta 1 L. Diluir una porción de esta solución con agua en una relación de 1 :1 O para obtener una concentración de 0,01 mg de potasio (K) por ml. Procedimiento: Usar la Solución muestra y la Solución control preparadas según se indica en el procedimiento de prueba individual. [NOTA-Al analizar sales de calcio, usar un mechero de oxihidrógeno.] Ajustar el control de anchura de ranura de un fotómetro a la llama adecuado equipado con un detector sensible al rojo a O, 1 mm, a menos que se indique algo diferente, y el interruptor selector a O, 1. Ajustar el instrumento para obtener la máxima emisión con la Solución control en la línea del potasio a 766,5 nm y registrar la transmitancia. Sin modificar ningún parámetro del instrumento, registrar la transmitancia para la emisión de la Solución muestra a 766,5 nm. Cambiar el monocromador a 750 nm y registrar la transmitancia de referencia para la emisión de referencia de la Solución muestra: la diferencia entre las transmitancias para la Solución muestra a 766,5 nm y 750 nm no es mayor que la diferencia entre las transmitancias observadas a 766,5 nm para la Solución muestra y la Solución control. SODIO EN REACTIVOS Solución estándar de sodio: Disolver 254 mg de cloruro de sodio en unos pocos mL de agua y diluir con agua hasta 1 L. Diluir una porción de esta solución con a_gua en una relación de 1 :1 O para obtener una concentracion de 0,01 mg de sodio (Na) por ml. Procedimiento: Usar la Solución muestra y la Solución control preparadas según se indica en el procedimiento de prueba individual. Ajustar el control de anchura de ranura de un fotómetro a la llama adecuado a 0,01 mm y el interruptor selector a O, 1. Ajustar el instrumento para obtener la maxima emisión con la Solución control en la línea del sodio a 589 nm y re$Jistrar la transmitancia. Sin modificar ningún parámetro del instrumento, registrar la transmitancia para la emisión de la Solución muestra a 589 nm. Cambiar el monocromador a 580 nm y registrar la transmitancia de referencia para la emisión de referencia de la Solución muestra: la diferencia entre las transmitancias para la Solución muestra a 589 nm y 580 nm no es mayor que la diferencia entre las transmitancias observadas a 589 nm para la Solución muestra y la Solución control.
ESTRONCIO EN REACTIVOS Solución estándar de estroncio: Disolver 242 mg de nitrato de estroncio en unos pocos mL de agua y diluir con agua hasta 1 L. Diluir una porción de esta solución con agua en una relación de 1 :1 O para obtener una concentración de 0,01 mg de estroncio (Sr) por ml. Procedimiento: Usar la Solución muestra y la Solución control preparadas según se indica en el procedimiento de prueba individual.
USP 39 Ajustar el control de anchura de ranura de un fotómetro a la llama adecuado a 0,03 mm y el interruptor selector a O, 1. Ajustar el instrumento para obtener la maxima emisión con la Solución control en la línea de estroncio a 460,7 nm y registrar la transmitancia. Sin modificar ningún parámetro del instrumento, registrar la transmitancia para la emisión de la Solución muestra a 460,7 nm. Cambiar el monocromador a la longitud de onda especificada en cada procedimiento de prueba y registrar la transmitancia de referencia para la emisión de referencia de la Solución muestra: la diferencia entre las transmitancias para la Solución muestra a 460,7 nm y a la longitud de onda de referencia no es mayor que la diferencia entre las transmitancias observadas a 460,7 nm para la Solución muestra y la Solución control. 6.6 Metales Pesados en Reactivos SOLUCIÓN ESTÁNDAR DE PLOMO: Usar Asoluclón estándar de plomo SR.,..usp39 Cada mL de esta solución contiene el equivalente a 0,01 mg de plomo (Pb). PROCEDIMIENTO: A menos que se indique algo diferente, realizar la prueba de metales pesados de la siguiente manera: (a) Si el límite de metales pesados es de 0,0005% (5 ppm), disolver 6,0 g de la muestra en agua para obtener 42 mL. (b) Si el límite de metales pesados es de 0,001 % (1 O ppm) o más, o en el caso de solubilidad limitada, usar 4 g y disolver en agua para obtener 40 mL, entibiando, si fuera necesario, para facilitar la disolución. Para el contro, transferir 7 mL de la solución de (a) a un tubo para comparación de color y agregar un volumen de Solución estándar de plomo equivalente a la cantidad de plomo permitida en 4 g del reactivo. Diluir con agua hasta 35 mL y agregar ácido acético diluido o amoníaco SR hasta obtener un pH de aproximadamente 3,5, determinado potenciométricamente, y luego diluir con agua hasta 40 mL y mezclar. Transferir los 35 mL restantes de la solución de (a) a un tubo para comparación de color similar al utilizado para el control y agregar ácido acético diluido o amoníaco SR hasta obtener un pH de aproximadamente 3,5, determinado potenciométricamente, y luego diluir con agua hasta 40 mL y mezclar. Luego agregar a cada tubo 1O mL de sulfuro de hidrógeno SR, mezclar y comparar los colores observando a través del tubo para comparación de color hacia abajo contra una superficie blanca. El color de la muestra de prueba no es más oscuro que el del control. Si la solución del reactivo se prepara como en (b), usar para el control 1O mL de la solucion y agregar un volumen de Solución estándar de plomo equivalente a la cantidad de plomo permitida en 2 g del reactivo. Diluir los 30 mL restantes de solución (b) con agua hasta 35 mL y proceder según se indica en el párrafo anterior, comenzando donde dice "agregar ácido acético diluido o amoníaco SR", en la segunda oración. Si el reactivo a analizar para metales pesados es una sal de un ácido orgánico alifático, usar ácido clorhídrico 1 N en lugar del ácido acético diluido especificado en el método anterior. 6.7 Materia Insoluble en Reactivos Disolver la cantidad de reactivo especificada en la prueba en 100 mL de agua, calentar a ebullición, a menos que se indique algo diferente, en un vaso de precipitados cubierto y entibiar en un baño de vapor durante 1 hora. Filtrar la solución caliente a través de un crisol de vidrio sinterizado tarado de porosidad fina. Lavar minuciosamente el vaso de precipitados y el filtro con agua caliente, secar a 105º, enfriar en un desecador y pesar. 6.8 Pérdida por Secado en Reactivos Determinar según se indica en Pérdida por Secado (731 ). 6.9 Nitratos en Reactivos SOLUCIÓN ESTÁNDAR DE NITRATO: Disolver 163 mg de nitrato de potasio en agua, agregar agua hasta obtener 100 mL y diluir 1 O mL de esta solución con agua hasta 1 L, para obtener una solución que contenga la cantidad equivalente a 0,01 mg de nitrato (N03) por ml.
Reactivos / Pruebas Generales para Reactivos 2283 SOLUCIÓN DE SULFATO DE BRUCINA: Disolver 600 mg de sulfato de brucina en 600 mL de ácido sulfúrico diluido exento de nitrato (2 en 3) previamente enfriado a temperatura ambiente y diluir con el ácido hasta 1 L. [NOTA-Preparar el ácido sulfúrico exento de nitrato agregando 4 partes de ácido sulfúrico a 1 parte de agua, calentando la solución hasta que se formen humos densos de trióxido de azufre y enfriando. Repetir la dilución y el calentamiento tres o cuatro veces.J SOLUCION MUESTRA: Al peso de muestra indicado en las especificaciones de cada reactivo individual, disuelto en el volumen designado de agua, agregar Solución de sulfato de brucina hasta obtener 50 mL. SOLUCIÓN CONTROL: A un volumen de Solución estándar de nitrato equivalente al peso de nitrato (N03) indicado en las especificaciones de cada reactivo individual, agregar el peso de muestra indicado en las especificaciones de cada reactivo individual y luego agregar Solución de sulfato de brucina hasta obtener 50 mL. SOLUCIÓN BLANCO: Usar 50 mL de Solución de sulfato de brucina.
PROCEDIMIENTO: Calentar la Solución muestra, la Solución control y la Solución blanco en un baño de agua en ebullición durante 1O minutos, luego enfriar rápidamente en un baño de hielo a temperatura ambiente. Ajustar un espectrofotómetro adecuado a absorbancia cero a 41 O nm con la Solución blanco. Determinar la absorbancia de la Solución muestra, observar el resultado y ajustar el instrumento a absorbancia cero con la Solución muestra. Determinar la absorbancia de la Solución control: la lectura de absorbancia de la Solución muestra no excede la de la Solución control. 6.10 Compuestos Nitrogenados en Reactivos PROCEDIMIENTO: A menos que se indique algo diferente, realizar la prueba de compuestos nitrogenados de la siguiente manera: Disolver la cantidad especificada de muestra de prueba en 60 mL de agua exenta de amoníaco en un matraz Kjeldahl conectado a través de una trampa de rocío a un condensador, cuyo extremo esté sumergido por debajo de la superficie de 1O mL de ácido clorhídrico O, 1 N. Agregar 1O mL de solución de hidróxido de sodio recientemente calentada a ebullición (1 en 1O) y 500 mg de alambre de aluminio, en pequeños trozos, al matraz Kjeldahl y dejar en reposo durante 1 hora, protegido de la pérdida de amoníaco y de la exposición a éste. Destilar 35 mL y diluir el destilado con agua hasta 50 ml. Agregar 2 mL de solución de hidróxido de sodio recientemente calentada a ebullición (1 en 1O), mezclar, agregar 2 mL de yodomercuriato de potasio alcalino SR y volver a mezclar: el color producido no es más oscuro que el de un control que contiene la cantidad de N agregada (como cloruro de amonio) que se especifica en el procedimiento de prueba correspondiente. 6.11 Fosfatos en Reactivos SOLUCIÓN ESTÁNDAR DE FOSFATO: Disolver en agua 143,3 mg de fosfato monobásico de potasio seco (KH2P04), hasta obtener 1000,0 ml. Esta solución contiene el equivalente a O, 1O mg de fosfato (P04) en cada ml. REACTIVO PARA FOSFATOS A: Disolver 5 g de molibdato de amonio en ácido sulfúrico 1 N hasta obtener 100 ml. REACTIVO PARA FOSFATOS B: Disolver 200 mg de sulfato de pmetilaminofenol en 100 mL de agua y agregar 20 g de bisulfito de sodio. Almacenar este reactivo en frascos completamente llenos y cerrados herméticamente, y utilizar dentro del mes de su preparación. PROCEDIMIENTO: [NOTA-Las pruebas con la muestra y el control deben realizarse preferentemente en tubos idénticos para comparación de color.] Disolver en 20 mL de agua la cantidad del reactivo especificada en la prueba o el residuo obtenido después del tratamiento prescrito, entibiando, si fuera necesario, agregar 2,5 mL de ácido sulfúrico diluido (1 en 7) y diluir con agua hasta 25 ml. (Si fuera preferible, la muestra de prueba o el residuo pueden disolverse en 25 mL de ácido sulfúrico aproximadamente 0,5 N). Luego, agregar 1 mL de Reactivo para fosfatos A y de Reactivo para fosfatos
2284 Pruebas Generales para Reactivos / Reactivos B, mezclar y dejar en reposo a temperatura ambiente durante 2 horas. Comparar el color azul producido con el que se produce en un control realizado con las mismas cantidades de los mismos reactivos empleados en la prueba con la muestra y un volumen de Solución estándar de fosfato equivalente a la cantidad de fosfato (P04) designada en las especificaciones de los reactivos. 6.12 Residuo de Incineración en Reactivos PROCEDIMIENTO: A menos que se indique algo diferente, determinar el residuo de incineración según se indica a continuación: pesar con exactitud 1-2 g de la sustancia a analizar en un crisol adecuado previamente calcinado, enfriado y pesado. Incinerar la sustancia, suave y lentamente al principio y luego con más rapidez, hasta que esté completamente carbonizada, si es or9ánica, o hasta que esté totalmente volatilizada, si es inorganica. Si se especifica el uso de ácido sulfúrico, enfriar el crisol, agregar la cantidad especificada de ácido e incinerar el crisol suavemente hasta que dejen de generarse humos. Luego calcinar el crisol a 800 ± 25º, enfriar en un desecador adecuado y pesar. Si no se especifica el uso de ácido sulfúrico, no es necesario enfriar el crisol y se puede incinerar directamente a 800 ± 25º una vez finalizada la carbonización o volatilización. Continuar la incineración hasta lograr un peso constante, a menos que se especifique algo diferente. Realizar la incineración en una campana bien ventilada, pero protegiendo de las corrientes de aire y a la menor temperatura posible para lograr la combustión completa del carbón. Puede usarse una mufla, si se desea, y se recomienda su uso para la calcinación final a 800 ± 25º. 6.13 Sulfatos en Reactivos SOLUCIÓN ESTÁNDAR DE SULFATO: Disolver 181,4 mg de sulfato de potasio (secados a 105º durante 2 horas) en agua hasta obtener 1000 ml. Esta solución contiene el equivalente a O, 1O mg de sulfato (S04) por mL. PROCEDIMIENTO Método 1: Neutralizar con ácido clorhídrico o con amoníaco SR, si fuera necesario, una solución de la cantidad de reactivo o residuo indicada en la prueba en 25 mL de agua, o una solución preparada segun se indica en la prueba, utilizando papel de tornasol como indicador y agregar 1 mL de ácido clorhídrico 1 N. Filtrar la solución, si fuera necesario, a través de papel de filtro previamente lavado con agua y agregar 2 mL de cloruro de bario SR. Mezclar, dejar en reposo durante 1O minutos y comparar la turbidez, si la hubiera, con la producida en un control que contiene las mismas cantidades de los mismos reactivos usados en la prueba y una cantidad de Solución estándar de sulfato equivalente a la cantidad de sulfato (S04) permitida en la prueba. Ajustar las dos soluciones al mismo volumen con agua antes de agregar el cloruro de bario SR. Método 11: Calentar hasta ebullición la solución preparada según se indica en el procedimiento de cada prueba, o el filtrado designado en el procedimiento y agregar 5 mL de cloruro de bario SR. Luego digerir la solución en un baño de vapor durante 2 horas y dejar en reposo hasta el día siguiente. Si se forma precipitado, filtrar la solución a través de papel, lavar el residuo con agua caliente y transferir el papel que contiene el residuo a un crisol tarado. Carbonizar el papel, sin combustión, e incinerar el crisol y su contenido hasta peso constante. Realizar una determinación con un blanco al mismo tiempo que la determinación de la muestra de prueba y sustraer el peso de residuo obtenido del obtenido en la determinación de la muestra de prueba para obtener el peso de residuo atribuible al contenido de sulfato de la muestra.
ESPECIFICACIONES DE REACTIVOS Aceite de Canola, [120962-03-0]-Usar un grado adecuado.
USP 39 Aceite de Cedro (para aclarar cortes de muestras para microscopía) [8000-27-9]-Se debe usar un aceite seleccionado y destilado de la madera del cedro rojo, juniperus virginiana L. (Fam. Pinaceae), para este propósito. Indice de refracción: aproximadamente 1,504 a 20º. Para usarse con lentes de inmersión homogénea, se requiere un aceite especialmente preparado con un índice de refracción de 1,5150 ± 0,0002 a 20°. Aceite de Girasol, [8001-21-6]-Usar un grado adecuado. Acetal, C6H1402-l 18,2-Usar un grado adecuado. Acetaldehído (Etanol; Aldehído Acético), CH3CH0-44,05 [75-07-0]-Líquido incoloro. Miscible con agua y con alcohol. Usar grado reactivo ACS. Acetanilida (Fenilacetamida; Antifebrina), CsH9N0-135, 16 [103-84-4]-Cristales blancos brillantes, generalmente en escamas o polvo cristalino blanco. Es estable al aire. Fácilmente soluble en alcohol y en cloroformo; soluble en agua en ebullición, en éter y en glicerina; poco soluble en agua. INTERVALO DE FUSIÓN (741): entre 114º y 116°. REACCIÓN: La solución saturada es neutra al tornasol. PÉRDIDA POR SECADO (731 ): Secar sobre ácido sulfúrico durante 2 horas: no pierde más de 0,5% de su peso. RESIDUO DE INCINERACIÓN (Prueba para reactivos): no más de 0,05%. Acetato Cobaltoso (Acetato de Cobalto), Co(C2H302)2 · 4H20-249,08 [6147-53-1 ]-Cristales rojos en forma de aguja. Soluble en agua y en alcohol. Usar grado reactivo ACS. Acetato Cúprico, Cu(C2H302)2 · H20-199,65 [6046-93-1 J-Usar grado reactivo ACS. Acetato de Amilo (Acetato de Pentilo), CH3(0 2CsH11130, 18 [628-63-7]-Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 99%. Acetato de Amonio, NH4C2H30z--77,08 Usar grado reactivo ACS. Acetato de Bario, C4H6Ba04-255,43 grado reactivo ACS.
[631-61-8]-
[543-80-6]-Usar
Acetato de (-)-Bornilo (Acetato de 1,7,7-trimetilbiciclo[2,2, 7]-heptan-2-ol), C12H2002-196,29 [5655-61-8]-Usar un grado adecuado. Acetato de Butilo Normal, CH3COO(CH2)3CH3-l l 6, 16 [123-86-4]-Usar grado reactivo ACS. Acetato de Cadmio, C4H6Cd04 · 2H20-266,53 [543-90-8]-Cristales incoloros, de transparentes a traslúcidos. Fácilmente soluble en agua; soluble en alcohol. MATERIA INSOLUBLE (Prueba para reactivos): no más de 1 mg, a partir de 20 g (0,005%). CLORUROS (Prueba para reactivos): Un g presenta no más de 0,01 mg de CI (0,001 %). SULFATOS (Prueba para reactivos, Método //): Disolver 1O g en 100 mL de agua, agregar 1 mL de ácido clorhídrico y filtrar: el residuo no pesa más de 1,2 mg más que el residuo obtenido en una prueba completa con un blanco (0,005%). SUSTANCIAS NO PRECIPITADAS POR SULFURO DE HIDRÓGENO: Disolver 2 g en una mezcla de 135 mL de agua y 15 mL de ácido sulfúrico 1 N, calentar a ebullición y pasar una corriente rápida de sulfuro de hidrógeno a través de la solución mientras se enfría. Filtrar y agregar 0,25 mL de ácido sulfúrico a 75 mL del filtrado transparente, luego evaporar hasta sequedad e incinerar suavemente: el residuo no pesa más de 1 mg (O, 1%).
Reactivos / Especificaciones de Reactivos 2285
USP 39 Acetato de Calcio, Ca(C2H3Ü2)2 · Hz0-176, 18 [5743-26-0]-Polvo o gránulos cristalinos de color blanco. Soluble en aproximadamente 3 partes de agua; poco soluble en alcohol. Usar grado reactivo ACS. Acetato de Cinc, Zn(CH3C00)2 · 2H20-219,51 [557-34-6]-Usar grado reactivo ACS. Acetato de Estroncio, Sr(CH3C00)2 · 1/2H20-214,72 [543-94-2]-Polvo cristalino blanco. Soluble en 3 partes de agua; poco soluble en alcohol. VALORACIÓN: Incinerar aproximadamente 3 g, pesados con exactitud, en un crisol de platino, protegiendo del sulfuro en la llama. Enfriar, transferir el crisol con el residuo a un vaso de precipitados, y agregar 50 mL de agua y 40,0 mL de ácido clorhídrico 1 N SV. Calentar a ebullición suave durante 30 minutos o más, si fuera necesario; filtrar, lavar con agua caliente hasta que los lavados sean neutros, agre$Jar rojo de metilo SR y valorar el exceso de ácido con hidroxido de sodio 1 N SV. Cada mL de ácido clorhídrico 1 N equivale a 107,4 mg de Sr(CH3C00)2 · 1/2H20: no se encuentra menos de 99%. MATERIA INSOLUBLE (Prueba para reactivos): no más de ~ mg, a partir eje 1O g (0,02%). ALCALI LIBRE o ACIDO LIBRE: Disolver 3 g en 30 mL de agua y agregar 3 gotas de fenolftaleína SR: no se produce color rosado. Valorar con hidróxido de sodio O, 1 N SV hasta un color rosado: no se requieren más de 0,30 mL de hidróxido de sodio O, 1 N. BARIO: Disolver 1 g en 1O mL de agua y a~regar 1 gota de ácido acético glacial y 5 gotas de solucion de dicromato de potasio (1 en 1O): no se produce turbidez dentro de los 2 minutos (aproximadamente 0,02%). CALCIO: Incinerar 1 g hasta que se carbonice por completo. Entibiar el residuo con una mezcla de 3 mL de ácido nítrico y 1O mL de agua, filtrar, lavar con 5 mL de agua y evaporar el filtrado en un baño de vapor hasta sequedad. Pulverizar el residuo y secar a 120º durante 3 horas. Someter el polvo seco a reflujo con 15 mL de alcohol deshidratado durante 1O minutos, enfriar en hielo y filtrar. Repetir la extracción con 1O ml de alcohol deshidratado. Evaporar los filtrados combinados hasta sequedad, agregar 0,5 mL de ácido sulfúrico e incinerar: el peso del residuo no es más de 1O mg (0,3% de Ca). CLORUROS (Prueba para reactivos): Un g no presenta más de O, 1 mg de CI (0,01 %). METALES PESADOS (Prueba para reactivos): 0,001 %. HIERRO (241 ): Disolver 1,0 g en 45 mL de agua y agregar 2 mL de ácido clorhídrico: la solución no presenta más de 0,01 mg de Fe (0,001 %). SALES ALCALINAS: Disolver 2 g en 80 mL de agua, calentar a ebullición, agregar un exceso de carbonato de amonio SR, mantener en ebullición durante 5 minutos, diluir con agua hasta 100 mL y filtrar. Evaporar 50 mL del filtrado e incinerar: el residuo, después de corregir por el residuo de incineración que deja la mitad del volumen usado de carbonato de amonio SR transparente, no es más de 3 mg (0,3%). NITRATOS: Disolver 1 g en 1O mL de agua, agregar O, 1O mL de carmín de índigo SR y luego agregar 1O mL de ácido sulfúrico: el color azul persiste durante 5 minutos (aproximadamente 0,01 % de N03). Acetato de Etilo, CH3COOC2Hs---88, 11 grado reactivo ACS.
[141-78-6]-Usar
Acetato de Gadolinio (Gd 111) Hidrato, (CH3CÜ2)3Gd · xH20-334,38 [100587-93-7]-Polvo blanco cristalino higroscópico. Irritante. Usar un grado adecuado. Acetato de lsobutilo, C6H12Ü2-116, 16 [110-19-0]-Líquido incoloro y transparente. Poco soluble en agua. Miscible con alcohol.
VALORACIÓN: Inyectar una muestra apropiada en un cromatógrafo de gases adecuado (ver Cromatografía (621 )) equipado con un detector de ionización a la llama, usando helio como gas transportador. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas: una columna capilar de 0,25 mm x 30 m recubierta con fase G2. Mantener la temperatura del inyector a 1 30º; mantener la temperatura de la columna a 30º y programarla para que aumente 1Oº por minuto hasta 180º y se mantenga así durante 1O minutos. Mantener la temperatura del detector a 300º. El área del pico principal no es menos de 99% del área total. ~ESO ESPECIFICO (8~ 1): entre 0,863 y 0,868. INDICE DE REFRACCION (831): entre 1,3900 y 1,3920 a 20º. Acetato de lsoflupredona (Acetato de 9-a-F/uoroprednisolona), CnH29F06-420,47-Usar Acetato de /soflupredona(monografía de la USP). Acetato de lsopropilo, CsH10Ü2-102, 13 Usar un grado adecuado.
[108-21-4]-
Acetato de Magnesio, Mg(C2H3Ü2)2 · 4Hz0-214,45 [142-72-3]-Usar grado reactivo ACS. Acetato de Metilo, C3H602-74,08 [74-20-9]-Líquido incoloro. Soluble en agua. Miscible con alcohol y con éter. PESO ESPECÍFICO (841 ): aproximadamente 0,933. ÍNDICE DE REFRACCIÓN (831): entre 1,3615 y 1,3625, a 20º. INTERVALO DE EBULLICIÓN (Prueba para reactivos): No menos de 95% destila entre 57º y 58º. Acetato de Plomo, Pb(C2H3Ü2)2 · 3H20-379,33 [6080-56-4]-Usar grado reactivo ACS. Acetato de Potasio, KC2H3Ü2-98, 14 grado reactivo ACS.
[127-08-2]-Usar
Acetato de Pregnenolona (3{3-Acetoxi-5-pregnen-20-ona, Acetato de 5-Pregnen-3{3-ol-20-ona), CnH 340 3-358,51 [1 778-02-5]-Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 99%. Acetato de Sodio, NaC2H3Üz · 3H20-136,08 [ 61 31-90-4 ]-Usar Acetato de Sodio Trihidrato de grado reactivo ACS. Acetato de Sodio Anhidro, NaC2H3Ü2-82,03 [127-09-3]-Usar grado reactivo ACS. Acetato de Tionina, C12H9N3S · C2H4Ü2-287,34 [78338-22-4]-Usar un grado adecuado. Acetato de Tris(hidroximetil)aminometano, C4H110 3 · NCH3-181, 19 [6850-28-8]-Polvo blanco con grumos. Usar un grado adecuado. Acetato de Uranilo (Acetato de Uranio), U02(C2H3Ü2)2 · 2Hz0-424, 15 [541-09-3]-Usar grado reactivo ACS. Acetato de Vinilo, CH3COOCH=CH 2-86,09 [108-05-4]-Líquido. VALORACIÓN: lnjectar un volumen apropiado en un cromatógrafo de gases (ver Cromatografía (621 )) equipado con un detector de ionización de la llama, usando helio como gas transportador. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas: una columna capilar de 0,25 mm x 30 m recubierta con una capa de 1 µm de fase G2; mantener la temperatura del inyector a 100º; mantener la temperatura del detector a 300º; y mantener la temperatura de la columna a 100º y programarla para que aumente 1Oº por minuto hasta 150º. El área del pico de CH 3COOCH=CH 2 no es menos de 99% del área total.
2286 Especificaciones de Reactivos /
Reactivos
Acetato Mercúrico, Hg(C2H302)2-318,68 Usar grado reactivo ACS.
[1600-27-7]-
Acetilacetona (2,4-Pentanodiona; Diacetilmetano), CsHsOr100, 12 [123-54-6]-Líquido inflamable transparente, incoloro a ligeramente amarillo. Soluble en agua; miscible con alcohol, con cloroformo, con acetona, con éter y con ácido acético glacial. VALORACIÓN: No menos de 98% de CsHs02, empleando un cromatógrafo de gases adecuado equipado con un detector de ionización a la llama y helio como gas transportador. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas: una columna de acero inoxidable de 3 mm x 1,83 m rellena con fase G43 al 10% sobre soporte Sl A; mantener las temperaturas del inyector y del detector a 250º y 310º, respectivamente; y programar la temperatura de la columna para que aumente 8º por minuto, de 50º a 220º. ÍNDICE DE REFRACCIÓN (831 ): entre 1,4505 y 1,4525, a 20º. Acetofenona (Feniletanona; Fenil Metil Cetona), CH3COC6H5-120, 15 [98-86-2]-Líquido. Poco soluble en agua, fácilmente soJuble en alcohol y en éter. INTERVALO DE FUSION (741): entre 19º y 20º. ÍNDICE DE REFRACCIÓN (831): aproximadamente 1,534 a 20º. PESO ESPECÍFICO (841 ): aproximadamente 1,03. Acetona (Propanona; Dimetilformaldehído), CH3COCH358,08 [67-64-1 ]-Usar 9rado reactivo ACS. [NOTA-Para determinaciones espectrofotométricas UV, usar Acetona Adecuada para Uso en Espectrofotometría UV de grado reactivo ACS.] Acetona Anhidra, CH3COCH3-58,08-Usar Acetona de grado reactivo ACS. Acetona Neutralizada-A una cantidad adecuada de acetona, agregar 2 ó 3 gotas de fenolftaleína SR y una cantidad suficiente de hidróxido de sodio 0,02 ó 0,01 N para producir un leve color rosado. Preparar la acetona neutralizada inmediatamente antes de usar. Acetonitrilo (Cianuro de Metilo; Cianometano), CH3CN41,05 [75-05-8]-Usar grado reactivo ACS. Acetonitrilo Espectrofotométrico-Usar grado reactivo ACS, que cumple también con los requisitos de la siguiente prueba. PUREZA ESPECTRAL: Medir en una celda de 1 cm entre 250 nm y 280 nm, con un espectrofotómetro adecuado, con aire como blanco: la absorbancia no es mayor de 0,01. p-Acetotoluidida, (9H11N0-149,19 [103-89-9]-Polvo blanco a blanquecino. VALORACIÓN: Inyectar un volumen apropiado en un cromatógrafo de gases (ver Cromatografía (621 )) equipado con un detector de ionización a la llama, usando helio como gas transportador. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas: una columna capilar de 0,25 mm x 30 m, recubierta con una capa de fase G2 de 1 µm; mantener la temperatura del inyector a 230º; mantener la temperatura del detector a 300º; y mantener la temperatura de la columna a 130º, y pro9ramarla para que aumente 1Oº por minuto hasta 280º. El area del pico de (9H11NO no es menos de 98,5% del área total. INTERVALO DE FUSIÓN (741): entre 145º y 151º. Ácido Acético (Ácido Acético 6 N)-Usar Ácido Acético (monowafía del NF) o preparar una dilución apropiada de ácido acetico ~lacial de tal manera como para obtener una concentracion final de ácido acético entre 36,0% y 37,0%, por peso.
USP 39 Ácido Acético Diluido (Ácido Acético 1 N)-Diluir 60,0 mL de ácido acético glacial con agua para obtener 1000 ml. RESIDUO DE EVAPORACIÓN: Evaporar 50 mL en un baño de vapor y secar el residuo a 105º durante 2 horas: el residuo no pesa más de 1 mg (0,002%). CLORUROS (Prueba para reactivos): Cinco mL no presentan más de 0,01 mg de CI (2 ppm). SULFATOS (Prueba para reactivos, Método /): Diez mL no presentan más de 0,5 mg de S04 (50 ppm). METALES PESADOS (Prueba para reactivos): Evaporar hasta sequedad 20 mL en un baño de vapor. Agregar 2 mL del ácido al residuo, diluir con agua hasta 25 mL y a9regar 1O mL de sulfuro de hidrógeno SR: el color marron producido no es más oscuro que el color de un control que contenga 0,04 mg de Pb agregado y 2 mL del ácido acético diluido (2 ppm). Ácido Acético Glacial, CH3(00H--60,05 Usar grado reactivo ACS.
[64-19-7]-
Ácido 3-Acetiltio-2-metilpropanoico, C6H1003S-162,21Usar un grado adecuado. , [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado como Acido /3-(Acet1lmercapto)isobutírico, número de catálogo 39059, en Senn Chemicals AG www.sennchem.com.] Ácido Acrílico (Ácido 2-Propenoico; Ácido Vinilfórmico), C3H40 2-72,06 [79-10-7]-Líquido incoloro. Miscible con agua, con alcohol y con éter. VALORACIÓN: Inyectar una muestra apropiada en un cromatógrafo de gases (ver Cromatograf1a (621)) equipado con un detector de ionización a la llama y emplear helio como gas transportador. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas: una columna capilar de 0,25 mm x 30 m recubierta con una capa de 1 µm de fase G2; mantener la temperatura del inyector a 150º; mantener la temperatura del detector a 300º; y mantener la temperatura de la columna a 50º y programarla para que aumente 1Oº por minuto hasta 200º. El área del pico de (3H402 no es menos de 99% del área total. ÍNDICE DE REFRACCIÓN (831): entre 1,419º y 1,423º a 20º. Ácido Adípico (Ácido Hexanodioico; Ácido 1,4-Butanodicarboxílico), C6H1004-146, 14 [124-04-9]-Polvo cristalino, de incoloro a blanco. Poco soluble en agua y en ciclohexano; soluble en alcohol, en metanol y en acetona; prácticamente insoluble en benceno y en bencina de petróleo. VALORACIÓN: Pesar aproximadamente 0,3 g con exactitud y disolver en 50 mL de alcohol. Agregar 25 mL de agua, mezclar y valorar con hidróxido de sodio 0,5 N SV a un pH de 9,5. Realizar una determinación con un blanco y hacer las correcciones necesarias. Cada mL de hidróxido de sodio 0,5 N equivale a 36,54 mg de C6H1004. No se encuentra menos de 98%. INTERVALO DE FUSIÓN (741): entre 151º y 155º, pero el intervalo entre el comienzo y el final de la fusión no excede de 2º. Ácido 4-Amino-2-clorobenzoico, C6H3Cl(NH2)(COOH)171,58 [2457-76-3]-Cristales blancos o polvo cristalino blanco. INTERVALO DE FUSIÓN (741): entre 208º y 212º. Ácido 4-Amino-3-hidro}Ci-1-naftalensulfónico (Ácido 1,2, 4-Aminonaftolsulfónico; Acido 1-Amino-2-naftol-4-sulfónico),
C10H9N04S-239,25 [116-63-2)-Polvo de color púrpura claro. Usar grado reactivo ACS. Ácido Aminoacético (Glicina), NH2CH2COOH-75,07 [56-40-6)-Polvo blanco cristalino. Muy soluble en agua; poco soluble en alcohol. CONTENIDO DE NITRÓGENO {Prueba para reactivos): Determinar por medio del método Kjeldahl, con una muestra de prueba secada previamente a 105º durante 2 horas: se en-
Reactivos /Especificaciones de Reactivos 2287
USP 39
cuentra entre 18,4% y 18,8% de N, que corresponde a no menos de 98,5% de C2HsN02. MATERIA INSOLUBLE (Prueba para reactivos): no más de 1 mg, a partir de 1O g (0,01 %). RESIDUO DE INCINERACIÓN (Prueba para reactivos): no más de 0,05%. CLORUROS (Prueba para reactivos): Un g presenta no más de O, 1 mg de CI (0,01 %). SULFATOS (Prueba para reactivos, Método I ): Dos g no presentan más de O, 1 mg de S04 (0,005%). METALES PESADOS (Prueba para reactivos): 0,001 %, usando 5 ml de ácido clorhídrico 1 N SV para acidificar la solución de la muestra de prueba. HIERRO <241 ): Un g, disuelto en 47 ml de agua que contenga 3 ml de ácido clorhídrico, no presenta más de 0,01 mg de Fe (0,001 %). Ácido p-Aminobenzoico-Ver Ácido Para Aminobenzoico. Ácido Para-Aminobenzoico (Ácido p-Aminobenzoico), H2NC 6H4COOH-137, 14 [150-1 3-0]-Polvo cristalino o cristales de color blanco o ligeramente amarillo, que presenta un cambio en su coloración al exponerse al aire o a la luz. Un g s,e disuelve en 1 70 ml de agua, en 9 m~ de a~u.a en ebullicion en 8 ml de alcohol y en 50 ml de eter. Fac1lmente solubi'e en soluciones de carbonatos e hidróxidos alcalinos; soluble en glicerina tibia; moderadamente soluble en ácido clorhídrico diluido; poco soluble en cloroformo. Almacenar en envases impermeables y resistentes a la luz. VALORACIÓN: Pesar con exactitud aproximadamente 300 mg, previamente secados a 105º duran~e. 2 horas y transferir a una cápsula o a un vaso de prec1p1tados. Agregar 5 ml de ácido clorhídrico y 50 ml de agua, y mezclar nasta que se disuelva. Enfriar aproximadamente a 15º, agregar aproximadamente 25 g de hielo picado y valorar lentamente con nitrito de sodio O, l M SV hasta que una varilla de vidrio sumergida en la solución valorada produzca, de inmediato, un anillo de color azul al contacto con papel de y~duro-almidó~. Cuando se haya comple~ tado la valoracion, el punto final es reproduoble despues de que la mezcla se haya. dejado er:i reposo dur~nte 1 minuto. Cada ml de nitrito de sodio 0, 1 M equivale a 13,71 mg de C 7 H~N02. No se encuentra menos de 98,5%. INTERVALO DE FUSION <7 41 ): entre 186º y 189º. PÉRDIDA POR SECADO <731 ): Secar a 105º durante 2 horas: no pierde más de 0,2% de su peso. RESIDUO DE INCINERACIÓN (Prueba para reactivos): no más de 0,1%. Ácido 7-Aminodesacetoxicefalosporánico, CaH10N203S214,2-Polvo amarillo claro. IMPUREZAS COMUNES <466) Solución de prueba: hidróxido de amonio 1 N. Solución estándar: hidróxido de amonio 1 N. Fase móvil: Cloruro de sodio 0,5 N. Visualización: 1. Ácido 1,2,4-Aminonaftolsulfónico: 3-hidroxi-1-naftalensulfónico.
Ver Ácido 4-Amino-
Ácido 3-Aminopropiónico ([3-Alanina), NH 2CH2CH2COOH-89,09 [107-95-9]-Usar un grado adecuado. Ácido 3-Aminosalicílico, C1H1N03-l 53, 14 [570-23-0]Polvo gris parduzco. Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 97%. Ácido Arsenazo 111, C22H1aAs2N4014S2-776,38 [1668-00-4]-Polvo marrón. Estable al aire. Almacenar a temperatura ambiente en un lugar seco.
TEMPERATURA DE FUSIÓN <7 41 ):
más de 320º.
Ácido L-Aspártico, C4H1N04-l 33, 1 [56-84-8]-Polvo blanco a bfanquecino. Usar un grado adecuado. Ácido Barbitúrico, CH4N203-l28,09 [65-52-7]-Polvo ligeramente beige. Soluble en agua, en alcohol, en cloroformo y en éter. Funde con descomposición a 251,6º. Usar un grado adecuado. Ácido Benzoico, C6H 5COOH-122, 12 [ 65-85-0]-Usar grado reactivo ACS. , [NOTA-Se puede obtener Acido Benzoico de calidad adecuada para usar somo estándar pri~ario ~n la Oficina de Materiales de Estandar de Referencia (Office of Standard Reference Materials) del Instituto de Normas y Tecnología de los EE.UU. (NIST, por sus siglas en inglés), www.nist.gov, como muestra de estándar Nº 350.] Ácido 3-Benzoilbenzoico, C14H1003-226,23 [579-18-0]-Polvo de color blanco a blanquecino. VALORACIÓN: Preparar una mezcla de ácido trifluoroacético al 1% en agua y ácido trifluoroacético al 1% en acetonitrilo (55:45) para la fase móvil. Inyectar aproximadamente 20 µL en un cromatógrafo de líquidos adecuado (ver Cromatografía <621 )) equipado con un detector de 230 nm y una columna de 4,6 mm x 15 cm rellena con material L1 . La velocidad de flujo es de aproximadamente 1,5 ml por minuto. El, área del pico de C14H1003 no es menos de 98,5% del area total. Ácido Benzoilfórmico (Ácido Fenilglioxílico), C6HsCOC02H150, 14 [611-73-1]-Polvo. Soluble en metanol. INTERVALO DE FUSION <741): entre 62º y 67°. Ácido 4,4' -Bis(4-amino-1-naftilazo)-2,2'-estilbenodisulfónico, C34H26N60 6S2-678,74 [5463-64-9]-Usar un grado adecuado. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado de TCI America, www.tciamerica.com.] Ácido Bis(2-etilhexil)fosfórico [Fosfato de Bis-(2-etilhexilo)], [CH3(CH2)3CH(C2Hs)CH2]2HP04-322,42 [298-07-7]-Lí-, quicio viscoso de color amarillo claro. Insoluble en. ag4a; !acilmente soluble en cloroformo y en acetato de etilo. Indice de refracción: aproximadamente 1,443. Peso específico: aproximadamente 0,997. VALORACIÓN: Disolver aproximadamente 250 mg, pesados con exactitud, en 50 ml de dimetilformamida, agregar 3 gotas de una solución 1 en 100 de azul de timol SR en dimetilformamida y valorar con metóxido de sodio 0, 1 N SV hasta un punto final azul. Realizar una determinación con un blanco y hacer las correcciones necesarias. Cada ml de metóxido de sodio 0, 1 N equivale a 32,24 mg de (CaH11)2HP04. Se encuentra entre 95% y 105%. SOLUBILIDAD: Un volumen se disuelve en 9 volúmenes de cloroformo y produce una solución transparente. Un volumen se disuelve en 9 volúmenes de acetato de etilo y produce una solución transparente. COLOR: Una solución 1 en 100 en cloroformo presenta una absortividad de no más de 0,03 a 420 nm. Ácido Bórico, H3B03-61,83 reactivo ACS.
[10043-35-3]-Usar grado
Ácido 4-(Butilamino)benzoico, C11 HsN02-193,25 [4740-24-3]-Usar un grado adecuado. [NOTA-Se puede obtener ufl grado adecuado en SigmaAldrich, lnc., P.O. Box 2060, Milwaukee, WI 53201; www. sigma-aldrich.com.] Ácido n-Butilborónico (Ácido 7-Butanoborónico), C4H9 B(OH)2-101,94 [4426-47-5]-Usar un grado adecuado.
2288 Especificaciones de Reactivos /
Reactivos
[NOTA-Por lo general este reactivo se transporta y almacena bajo agua. Antes de usar, retirar el exceso de agua mediante filtración al vacío suave. Se puede obtener un grado adecuado en Sigma-Aldrich, www.sigma-aldrich.com.] [107-92-6]-Líquido Ácido Butírico, C4Hs02-88, 11 transparente, de incoloro a amarillo pálido. Miscible con agua y con metanol. VALORACIÓN: Pesar con exactitud aproximadamente 500 mg, transferir a un recipiente adecuado, agregar 30 mL de agua y mezclar. Agregar 40 mL de agua y mezclar. Agregar fenolftaleína SR y valorar con hidróxido de sodio O, 1 N SV. Cada mL de hidróxido de sodio O, 1 N equivale a 8,81 mg de C4Hs02: no se encuentra menos de 99,0% de C4Hs02. ÍNDICE DE REFRACCIÓN (831): aproximadamente 1,398 a 20º. Ácido Calconcarboxílico (Ácido 3-hidroxi-4-[(J-hidroxi4-suffo- 7-naftalenil)azo]-2-naftalencarboxílico; Acido Calcon3-carboxílico; Cal-Red), C21 Hi4N201S--438,42 [3737-95-9]-Usar un grado adecuado. Ácido Calconcarboxílico Triturado-Mezclar 1 parte de ácido calconcarboxílico con 99 partes de cloruro de sodio. PRUEBA DE SENSIBILIDAD: Disolver 50 mg de ácido calconcarboxílico triturado en una mezcla de 2 mL de hidróxido de sodio 1O N y 100 mL de agua. La solución es azul pero se torna color violeta con la adición de 1 mL de una solución de sulfato de magnesio de 1O g por L y O, 1 mL de una solución de cloruro de calcio de 1,5 g por L y se torna azul puro con la adición de O, 15 mL de edetato sódico 0,01 M. Ácido, d-10-Canforsulfónico [Ácido {1 S)-(+)- 70-canforsulfónico; Acido (7 S)-canfor-7 O-su/fónico; Acido (+)-canfor-7 O-su/fónico (/3)), C10H16Ü4S-232,30 [3144-16-9]-Usar un grado adecuado. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado como número de catálogo C2107 en www.sigma-aldrich.com.]
Á~ido d/-10-Canforsulfónico, [Ácido canfor- 7O-su/fónico (/3)]; [Acido (RS)-7 0-canforsulfónico], C10H16Ü4S-232,30 [5872-08-2]- Es ópticamente inactivo. Usar un grado adecuado. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado como número de catálogo 147923 en www.sigma-aldrich.com.] Ácido Cáprico (Ácido Decanoico), C1aH2002-172,26 [334-48-5]-Fundido solidificado o fragmentos de color blanco. Soluble en alcohol, en cloroformo y en éter; prácticamente insoluble en agua. VALORACIÓN: Inyectar una muestra apropiada disuelta en acetona en un cromatógrafo de gases (ver Cromatografía (621 )) equipado con un detector de ionización a la llama y una columna capilar de 0,53 mm x 30 m, recubierta con una capa de fase G25. El gas transportador es helio, que fluye a una velocidad de 9 mL por minuto. Programar el cromatógrafo según se indica a continuación. Equilibrar la temperatura de fa columna inicialmente a 150º, después aumentar la temperatura a una velocidad de 1Oº por minuto hasta 250º. Mantener la temperatura del inyector a 240º y la del detector a 265º. El área del pico de ácido cáprico no es menos de 98,5% del área total. INTERVALO DE FUSIÓN (741): entre 30º y 33º. Ácido Cianoacético, (3H3N02-85,06 [372-09-8]-Sólido cristalino blanco a amarillo claro. Muy soluble en agua. VALORACIÓN: Disolver aproximadamente 300 mg, pesados con exactitud, en 25 mL de agua y 25 mL de alcohol. Valorar con hidróxido de sodio O, 1 N SV, determinando el punto final potenciométricamente. Realizar una determinación con un blanco y hacer las correcciones necesarias.
USP 39 Cada mL de hidróxido de sodio O, 1 N equivale a 85,06 mg de C3H3N02. No se encuentra menos de 99%. Ácido (1,2-Ciclohexilendinitrilo)tetraacético (Ácido trans7, 2-Diaminociclohexano-N, N, N', N' -tetraacético), C14H22N20s · Hz0-364,35-Usar grado reactivo ACS. Ácido Cítrico: de la USP).
Usar Ácido Cítrico Monohidrato (monografía
Ácido Cítrico Anhidro [77-92-9]-Usar Ácido Cítrico Anhidro (monografía de la USP). Ácido Clorhídrico, HCl-36,46 reactivo ACS.
[7647-01-0]-Usar grado
Ácido Clorhídrico Diluido (1 O por ciento) [7647-01-0]Preparar mezclando 226 mL de ácido clorhídrico con suficiente agua para obtener 1000 ml. Ácido 2-Cloro-4-aminobenzoico-Ver Ácido 4-Amino-2-clorobenzoico. Ácido 4-Clorobenzoico, CIC6H4COOH-156,57 [74-11-3]-Sólido cristalino blanco. VALORACIÓN: Disolver aproximadamente 700 mg, pesados con exactitud, en una mezcla de 100 mL de alcohol caliente y 50 mL de agua. Valorar con hidróxido de sodio 0,5 N SV, determinando el punto final potenciométricamente. Realizar una determinación con un blanco y hacer las correcciones necesarias. Cada mL de hidróxido de sodio 0,5 N equivale a 78,28 mg de CIC6H4COOH. No se encuentra menos de 98%. SOLUBILIDAD: Un g disuelto en 25 mL de hidróxido de sodio 0,5 N produce una solución completa y transparente. Ácido m-Clorobenzoico (Ácido 3-Clorobenzoico), C1HsCI02-156,57 [535-80-8]-Usar un grado adecuado. Ácido Clorogénico, C16H1s0~354,31 [327-97-9]Polvo blanco a blanquecino. Usar un grado adecuado. VALORACIÓN: Cuando se analiza mediante cromatografía en capa delgada (ver Cromatografía (621)) empleando placas recubiertas con mezcla de gel de sílice para cromatografía y una fase móvil constituida por una mezcla de alcohol butílico, agua y ácido acético (60:25:15) y se examina bajo luz UV de longitud de onda corta, se observa una sola mancha, con trazas de impurezas. Ácido 2-Cloronicotínico, C6H4CIN02-157,55 [2942-59-8)-Polvo blanquecino. VALORACION: Inyectar un volumen apropiado en un cromatógrafo de gases (ver Cromatografía (621 )) equipado con un detector de ionización a la llama, usando helio como gas transportador. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas: una columna capilar de 0,25 mm x 30 m, recubierta con una capa de fase G2 de 1 µm; mantener la temperatura del inyector a 280º; mantener la temperatura del detector a 300º; mantener la temperatura de la columna a 180º y programarla para que aumente 1Oº por minuto hasta 280º. El área del pico de C6H4CIN02 no es menos de 98% del área total. Ácido Cloroplatínico,.. HzPtCl6 · 6H20-517,90 [18497-13-7j-Usar Acido Cloroplatínico Hexahidrato de grado reactivo ACS. Ácido 5-Clorosalicílico, C1HsCI03-l 72,57 [321-14-2]Polvo blanco a blanquecino. VALORACIÓN: Cuando se analiza mediante cromatografía en capa delgada (ver Cromatografía (621)) usando placas recubiertas con una mezcla de gel de sílice para cromatografía y una fase móvil constituida por una mezcla de ciclohexano, cloroformo y ácido acético (14:4:2) y se exa-
USP 39
mina visualmente y bajo luz UV de longitud de onda larga o rocío de yodo, se observa una sola mancha. INTERVALO DE FUSIÓN (741): entre 172º y 178º. Ácido Cromotrópico (Ácido 4,5-Dihidroxi-2,7-naftalenodisul[148-25-4], para la fónico), C10HsOsS2 · 2H20-356,33 forma anhidra-Usar un grado adecuado. Ácido 1,3-Dicafeoilquínico (Cinarina; Ácido (1 R,3R,4S,5R)1, 3-bis[{3-(3,4-dihidroxifenil)propenoil]oxi]-4,5-dihidroxiciclohe[30964-13-7]-Usar xanocarboxílico), C2sH24Ü12-516,45
un grado adecuado. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado como número de catálogo 3991 en www.chromadex.com.] [79-43-6]-LíÁcido Dicloroacético, C2H2Cl202-128,9 quido incoloro. Miscible con agua, con alcohol y con éter. Usar un grado adecuado. Ácido 2,6-Diclorofenilacético, CsH6Cb02-205,04 [6575-24-2]-Polvo blanco. VALORACIÓN: Inyectar una muestra apropiada en un cromatógrafo de gases (ver Cromatografía (621 )) equipado con un detector de ionización a la llama, usando helio como gas transportador. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas: una columna capilar de 0,25 mm x 30 m recubierta con una capa de fase G2 de 1 µm; mantener la temperatura del inyector a 250º; mantener la temperatura del detector a 300º; y mantener la temperatura de la columna a 150º y programarla para que aumente 1Oº por minuto hasta 280º. El área del pico de CsH6Cb02 no es menos de 97% del área total. Ácido 2,5-Dihidroxibenzoico, C1H 604-l 54, 12 [303-07-1 ]-Polvo blanquecino. Fácilmente soluble en alcohol; r.roduce una solución transparente de color amarillo muy palido. VALORACIÓN: Disolver aproximadamente 75 mg, pesados con exactitud, en 30 ml de metanol. Agregar lentamente 40 ml de agua. Valorar con hidróxido de sodio 0, 1 N SV, determinando el punto final potenciométricamente. Realizar una determinación con un blanco y hacer las correcciones necesarias. Cada ml de hidróxido de sodio 0, 1 N equivale a 15,41 mg de C1H5Ü4. No se encuentra menos de 99%. INTERVALO DE FUSIÓN (741 ): aproximadamente 207º, con descomposición.
Ácid~ Edético (EOTA; Edatamil; Ácido Etilendiaminotetraacético; Acido [Etilencljnitrilo]tetraacético), C10H16N20s-292,24 [60-00-4]-Usar Acido (Etilendinitrilo)tetraacético de grado reactivo ACS. Ácido Esteárico, C13H35Ü2-284,48 [57-11-4]-Cristales blancos duros, o polvo blanco amorfo. Fácilmente soluble en cloroformo y en éter; soluble en alcohol y en éter de petróleo. TEMPERATURA DE SOLIDIFICACIÓN (651): entre 67º y 69º. ~NDICE DE ACIDEZ (401): entre 196 y 199. INDICE DE YODO (401 ): no más de 1. ÍNDICE DE SAPONIFICACIÓN (401 ): entre 197 y 200. ÁCIDO P,l\LMÍTJCO: Determinar se9ún se indica en Valoración en Acido Esteárico (monograf1a del NF): no se encuentra más de 5,0%. Ácido Etanosulfónico, C2HsS03H-llO, l3 [594-45-6]Líquido entre incoloro y amarillo claro. Soluble en agua. VALORACIÓN: Pesar con exactitud aproximadamente 300 mg, disolver en 30 ml de agua, agregar fenolftaleína SR y valorar con hidróxido de sodio O, 1 N SV. Cada ml de hidróxido de sodio O, 1 N equivale a 11,013 mg de C2HsS03H: se encuentra entre 94,0% y 106,0%.
Reactivos /
Especificaciones de Reactivos 2289
ÍNDICE DE REFRACCIÓN (831 ):
entre 1,432 y 1,436 a 20º.
Ácido 2-Etil-2-Metilsuccínico, C1H1204-l 60, 17-Cristales blancos. VALORACIÓN: Transferir aproximadamente 80 mg, pesados con exactitud, a un vaso de precipitados adecuado, agregar 30 ml de metanol y mezclar para disolver. Agregar íentamente 40 ml de agua desionizada. [NOTA-Si al agregar agua desionizada se produce turbidez, disolver en 50 ml de metanol solamente.] Cuando se haya disuelto por completo, valorar con hidróxido de sodio O, 1 N SV, determinando el punto final potenciométricamente. Realizar una valoración volumétrica con un blanco y hacer las correcciones necesarias. Cada ml de hidróxido de sodio O, 1 N equivale a 16,02 mg de C1H12Ü4. No se encuentra menos de 98,5% de C1H12Ü4. INTERVALO DE FUSIÓN (741): entre 101° y 103º. Ácido 3-Fenoxibenzoico, C13H10Ü3-214,22 [3739-38-6]-Usar un grado adecuado. INTERVALO DE FUSIÓN (7 41 ): entre 149º y 150º. Ácido Ferúlico (Ácido 4-hidroxi-3-metoxicinámico), C10H10Ü4-l94, 19 [1135-24-6]-Usar un grado adecuado. Ácido Fluorhídrico, HF-20,01 reactivo ACS.
[7664-39-3]-Usar grado
Ácido Fórmico, HCOOH-46,03 [64-18-6]-Usar Ácido Fórmico al 88 por ciento, de grado reactivo ACS. Ácido Fórmico a[ 96 por ciento, HCOOH-46,03 [64-18-6]-Usar Acido Fórmico al 96 por ciento, de grado reactivo ACS.
Agngor lo siguiente: •Ácido Fórmico al 98 pór ciento, HCOOH--46,03 [64-18·6]~Usar l)n grado adecuado con un contenido de no menos de 98-0'6 .•usP39 Ácido Fórmico Anhidro-Usar Ácido Fórmico al 96 por ciento, de grado reactivo ACS. Ácido Fosfomolíbdico, aproximadamente 20Mo03 · P20s · 51 H20-3939,49 [51429-74-4]-Usar grado reactivo ACS. Ácido Fosfórico, H3P04-98,00 grado reactivo ACS.
[7664-38-2]-Usar
Ácido Fosforoso (Ácido Fosfónico), H303P-82,00 [13598-36-2]-Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 99%. Ácido Fosfotúngstico, aproximadamente 24W03 · P20s · 51 H20-6624,84-Polvo cristalino o cristales blancos o verde amarillentos. Soluble en agua, en alcohol y en éter. MATERIA INSOLUBLE (Prueba para reactivos): no más de 1 mg, a partir de 5 g (0,02%). CLORUROS (Prueba para reactivos): Un g muestra no más de 0,3 mg de CI (0,03%). NITRATOS: Disolver 500 mg en 1O ml de agua y agregar aproximadamente 1O mg de cloruro de sodio, O, 1 ml de índigo carmín SR y 1O ml de ácido sulfúrico: el color azul no desaparece en el transcurso de 1 minuto (aproximadamente 0,01 %). SULFATOS (Prueba para reactivos, Método /): Una porción de 500 mg no presenta más de O, 1 mg de S0 4 (0,02%).
2290 Especificaciones de Reactivos / Ácido Ftálico, CaH6Q4-l66, 13 reactivo ACS.
Reactivos
[88-99-3]-Usar grado
Ácido Glicólico, C2H4Ü3-76,05 [79-14-1 ]-Polvo o terrones cristalinos blancos. VALORACIÓN Reactivo silanizante: Piridina, hexametildisilazano, clorotrimetilsilano (9:3:1) Preparación de muestra: Pesar aproximadamente 25 mg (aproximadamente 3 gotas) de la muestra en un tubo de ensayo. Agregar 2 ml de Reactivo silanizante y tapar el tubo de ensayo. Mezclar bien e incubar a temperatura ambiente durante un mínimo de 2 horas. Se forma un precipitado blanco de cloruro de amonio. Centrifugar y usar el sobrenadante transparente para la inyección. Procedimiento: Inyectar un volumen apropiado de la Preparación de muestra en un cromatógrafo de gases (ver Cromatografía (621 )) equipado con un detector de ionización a la llama, usando helio como gas transportador. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas: una columna capilar de 0,25 mm x 30 m, recubierta con una capa de fase G2 de 1 µm. Mantener la temperatura del inyector a 250º; la temperatura del detector a 300º; y la temperatura de la columna a 100º, programada para que aumente 1Oº por minuto hasta 250º. El área del pico que corresponde a C2H4Q3 es no menos de 98,5% del área total. Ácido D-Glucónico al 50 por ciento en Agua, C6H1201196, 16 [526-95-4]-Líquido amarillo pálido. VALORACIÓN: Diluir aproximadamente 200 mg de la solución, pesados con exactitud, en 30 ml de agua. Valorar con hidróxido de sodio O, 1 N SV, determinando el punto final potenciométricamente. Realizar una determinación con un blanco y hacer las correcciones necesarias. Cada ml de hidróxido de sodio O, 1 N equivale a 19,62 mg de C6H1201. No se encuentra menos de 49,0%. ÍNDICE DE REFRACCIÓN (831 ): entre 1,4160 y 1,4180 a 20º. ROTACIÓN ESPECÍFICA (781 ): entre +9,9º y +11,9º, determinada sobre la solución tal cual a 20º. Ácido Glutámico, CsH9NQ4-l 47, 13 grado adecuado.
[56-86-0]-Usar un
USP 39 Ácido N-(2-hidroxietil)piperazin-N'-(2-etanosulfónico), CaH1aN2Ü4S-238,3 [7365-45-9]-Usar un grado adecuado. Ácido Hipofosforoso al 50 por ciento (Ácido Hipofosforoso), HPH202---66,00 [6303-21-5]-Líquido incoloro a ligeramente amarillo. Miscible con agua y con alcohol. VALORACIÓN: Pesar con exactitud aproximadamente 4 ml, diluir con 25 ml de agua, agregar rojo de metilo SR y valorar con hidróxido de sodio 1 N SV: cada ml de hidróxido de sodio 1 N equivale a 66,00 mg de HPH202. No se encuentra menos de 48%. CLORUROS: Agregar 0,2 ml a una mezcla de 1O ml de nitrato de plata SR y 5 ml de ácido nítrico, y calentar hasta que dejen de producirse humos marrones: cualquier residuo insoluble blanco remanente es inapreciable. FOSFATOS: Diluir 1 ml con agua hasta 50 ml, alcalinizar con amoníaco SR, filtrar si se forma un precipitado y agregar 5 ml de mezcla de magnesia SR al filtrado: no se forma más que un precipitado leve dentro de los 5 minutos. SULFATOS (Prueba para reactivos, Método /): Diluir 1 ml con agua hasta 50 ml: 20 ml de la solución no presentan más efe 0,2 mg de S04. Ácido lminodiacético, C4H1N04-l 33, 1O [142-73-4]Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 98,0%. Ácido lndol-3-carboxílico, C9H1N0,-161,2 [771-50-6]-Usar un grado adecuado. Ácido lsonicotínico, C6HsN02-123, 11 un grado adecuado.
[52-22-1 ]-Usar
Ácido)sovalérico (Ácido 3-Metilbutanoico, Ácido /sovaleriánico, Acido lsopropilacético), CsH1002-l 02, 13 [503-74-2]-Usar un grado adecuado. Ácido Linoleico, C1sH32Ü2-280,4 [60-33-3]-Líquido transparente, incoloro. Usar un grado adecuado. Ácido a-Lipoico, CaH1402S2-206,3 amarillo. Usar un grado adecuado.
[1077-28-7]-Polvo
[56-86-0]-Polvo Ácido L-Glutámico, CsH9NQ4-l 47, 1 blanco o polvo blanco con un leve matiz amarillo. Usar un grado adecuado. Ácido Heptafluorobutírico, C4F102H-214,04 [375-22-4j-Usar un grado adecuado. Ácido Hidrobrómico, HBr-80,91 grado reactivo ACS.
[10035-10-6]-Usar
Ácido p-Hidroxibenzoico, C1H603-l 38, 12 [99-96-7]Cristales blancos. VALORACIÓN: Transferir aproximadamente 700 mg, pesados con exactitud, a un recipiente adecuado y disolver en 50 ml de acetona. Agregar 100 ml de agua, mezclar y valorar con hidróxido de sodio 0,5 N SV, determinando el punto final potenciométricamente. Realizar una determinación con un blanco y hacer las correcciones necesarias. Cada ml de hidróxido de sodio 0,5 N equivale a 69,06 mg de C1H6Q3: no se encuentra menos de 97%. INTERVALO DE FUSIÓN (741 ): en un intervalo de 2º que incluye 216º. Ácido 4-Hidroxibutano-1-sulfónico (Ácido 4-Hidroxi- 7-butanosulfónico), C4H10Ü4S-154, 19 [26978-64-3]-Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 95%. LNOTA-Se puede obtener un grado adecuado en www. anaxlab.com con número de catálogo RM-967-C50.]
Ácido Maleico, C4H4Ü4-l l 6,07 [110-16-7]-Polvo cristalino blanco. Soluble en 1,5 partes de agua, en 2 partes de alcohol y en 12 partes de éter. VALORACIÓN: Disolver aproximadamente 2 g, pesados con exactitud, en 100 ml de agua y valorar con hidróxido de sodio 1 N SV, usando fenofftaleína SR como indicador. Cada ml de hidróxido de sodio 1 N equivale a 58,04 mg de C4H4Q4: no se encuentra menos de 99% de C4H4Q4, calculado con respecto a la sustancia seca. PÉRDIDA POR SECADO (731 ): Secar al vacío sobre pentóxido de fósforo durante 2 horas: no pierde más de 1,5% de su peso. RESIDUO DE INCINERACIÓN (281 ): no más de o, 1%. Ácido Metacrílico [79-41-4]-Usar un grado adecuado. Ácido Metafosfórico (Metafosfato Ácido de Sodio Vítreo), HP03-79,98 [37267-86-0]-Usar grado reactivo ACS. Ácido Metanosulfónico, CH4Q3S-96, 11 un grado adecuado.
[75-75-2]-Usar
Reactivos / Especificaciones de Reactivos 2291
USP 39 Ácido 5,5' -Metilendisalicílico (Ácido 3, 3' -Metilen-bis[6-hidro[122-25-8]-Usar un xibenzoico]), C15H1206-288,25 grado adecuado.
Ácido Nitrilotriacético, N(CH2COOH)3-l91, 14 [139-1 3-9]-Usar grado reactivo ACS. Ácido 4-Nitrobenzoico (Ácido p-Nitrobenzoico), C1H 5N04167, 12 [62-23-7]-Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 98%.
Ácido 5-Metoxi-2-metil-3-indolacético, C12H13NQ3-2l 9,24 [2882-15-7)-Polvo blanquecino. VALORACION: Transferir aproximadamente 11 O mg, pesados con exactitud, a un vaso de precipitados de 100 ml. Agregar 30 ml de metanol y disolver mezclando. Agregar 40 ml de agua y mezclar. Valorar con hidróxido de sodio O, 1 N SV determinando el punto final potenciométricamente. Realizar una determinación con un blanco y hacer las correcciones necesarias. Cada ml de hidróxido de sodio O, 1 N equivale a 21,92 mg de C12H13NÜ3. No se encuentra menos de 98%. INTERVALO DE FUSIÓN (741 ): entre 161 o y 168º, pero el intervalo entre el comienzo y el final de la fusión no excede de 3º.
[112-05-0]-Líquido Ácido Nonanoico, C9H1802-l 58,24 transparente de incoloro a amarillo pálido. Miscible con agua y con metanol. VALORACIÓN: Pesar con exactitud aproximadamente 500 mg, transferir a un recipiente adecuado, agregar 30 ml de agua y mezclar. Agregar 40 ml de agua y mezclar. Agregar fenolftaleína SR y valorar con hidróxido de sodio O, 1 N SV. Cada ml de hidróxido de sodio O, 1 N equivale a 15,82 mg de C9H1s02: no se encuentra menos de 96,0% de C9H1s02. ÍNDICE DE REFRACCIÓN (831): aproximadamente 1,432 a 20º.
Ácido Metoxifenilacético (Ácido a-Metoxifenilacético), C9H10Ü3-l66,2 [7027-09-2]-Usar un grado adecuado.
Ácido Oxálico, HiC204 · 2H20-126,07 Usar grado reactivo ACS.
Ácido Mineral-Usar Ácido Clorhídrico o Ácido Sulfúrico (monografías del NF).
Ácido Pentafluoropropanoico (Ácido Pentafluoropropiónico), C3HF502-164,03 [422-64-0]-Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 97%.
Ácido Molíbdico (Ácido Molíbdico al 85 por ciento) [7782-91-4]-Usar grado reactivo ACS. Ácido Monocloroacético (Ácido Cloroacético, Ácido Cloroeta[79-11-8]-Usar grado reacnoico), CH2CICOOH-94,50 tivo ACS. Ácido 2-Naftalenosulfónico, C10H 80 3S · Hi0-226,25 [120-18-3]-Cristales de color blanquecino a gris claro. Soluble en agua. VALORACIÓN: Disolver aproximadamente 1 g, pesado con exactitud, en 100 ml de agua, agregar fenolftaleína SR y valorar con hidróxido de sodio O, 1 N SV. Realizar una determinación con un blanco y hacer las correcciones necesarias. Cada ml de hidróxido de sodio O, 1 N equivale a 22,63 mg de C10Ha03S · H20. No se encuentra menos de 98,0%. INTERVALO DE FUSIÓN (741): entre 122º y 126º, pero el intervalo entre el comienzo y el final de la fusión no excede de 2º. Ácido Nicotínico-Usar Niacina (monografía de la USP). Ácido Nítrico, HNOr-63,01 activo ACS.
[7697-37-2]-Usar grado re-
Ácido Nítrico Diluido, HNQ3 [7697-37-2]-Diluir 143 ml de ácido nítrico con agua hasta 1000 ml.
Ácido Nítrico Exento de Plomo: Usar grado reactivo ACS. PLOMO: A 100 g agregar O, 1 g de carbonato de sodio anhidro y evaporar hasta sequedad. Disolver el residuo en agua, calentando levemente y diluir con el mismo disol-
r¡¡¡·~~~i~iiiUi) ~,.~
diendo la absorbancia a 283,3 nm o a 217,0 nm usando una lámpara de plomo de cátodo hueco y una llama de aire-acetileno. No contiene más de O, 1 ppm de plomo (Pb).
Ácido Nítrico Fumante (Ácido Nítric9 al 90 por ciento), HNOr-63,01 [7697-37-2]-Usar Acido Nítrico al 90 por ciento de grado reactivo ACS.
[6153-56-6]-
Ácido Perclórico (Ácido Perclórico al 70 por ciento), HCI04-100,46 [7601-90-3]-Usar grado reactivo ACS (que contenga entre 69,0% y 72,0% de HCIQ4). Ácido Peryódico, H5106-227,94 [10450-60-9]-Cristales de color blanco a amarillo pálido. Muy soluble en agua. Se descompone lentamente a ácido yódico. Usar grado reactivo ACS. Ácido Pícrico (2,4,6-Trinitrofenol; Trinitrofenol), C6H2(0H)(N02)3-1,2,4,6-229, 1O [88-89-1 ]-Usar grado reactivo ACS. Ácido Picrolónico (3-Metil-4-nitro-7-(p-nitrofenil)-5-pirazo[550-74-3]-Polvo cristalino lona), C10HaN4Q5-264, 19 de color amarillo a amarillo amarronado. Poco soluble en agua; soluble en alcohol, en cloroformo, en éter, en benceno y en soluciones de hidróxidos alcalinos. INTERVALO DE FUSIÓN (741 ): entre 115º y 117º. RESIDUO DE INCINERACIÓN (Prueba para reactivos): inapreciable, usando 200 mg. SENSIBILIDAD: Disolver 25 mg en 1O ml de agua tibia que contenga O, 1 ml de ácido acético glacial y fiítrar la solución, si fuera necesario. Disolver 100 mg de cloruro de calcio en 250 ml de agua y mezclar. Calentar 1 ml de la solución de cloruro de calcio en un tubo de ensayo aproximadamente a 60º y luego agregar 1 ml de la sofución de ácido picrolónico: se forma un precipitado voluminoso dentro de los 5 minutos. Ácido Pipemídico (Ácido 8-etil-3,8-dihidro-5-oxo-2-(7-piperazinil)pirido[2, 3-d]-pirimidin-6-carboxílico), C14H11N5Q3-303,3 [51940-44-4]-Usar un grado adecuado. Ácido Pirúvico, CH3CQCOOH--88,06 [127-17-3]-Líquido incoloro a amarillo claro. Miscible con agua, con alcohol y con éter. ÍNDICE DE REFRACCIÓN (831 ): aproximadamente 1,43 a 20º. VALORACIÓN: Pesar con exactitud aproximadamente 1 g, transferir a un recipiente adecuado y agregar 100 ml de agua. Mezclar, agregar fenolftaleína SR y valorar con hidróxido de sodio 0,5 N SV. Cada ml de hidróxido de sodio 0,5 N equivale a 44,03 mg de CH3CQCOOH: no se encuentra menos de 98% de CH3CQCOOH. Ácido Protocatéquico (Ácido 3,4-Dihidroxibenzoico), C1H6Q4-l 54, 12 [99-50-3]-Usar un grado adecuado.
2292 Especificaciones de Reactivos
/Reactivos
Cambio en la redaccl6n:
Ácido Quenodesoxicólico, C24H4004-392,57 [474-25-9]-Polvo blanco a blanquecino. •Usar un grado adecuado ton un contenido de no menos de 95% ..o.usl'39 Ácido Salicílico-Usar Ácido Salicílico (monografía de la USP). Ácido Selenioso (Ácido Selenoso), H2Se0 3-128,97 [7783-00-8]-Cristales incoloros o blancos, eflorescentes en aire seco e higroscópicos en aire húmedo. Soluble en agua y en alcohol. VALORACIÓN: Pesar con exactitud aproximadamente 100 mg, transferir a un matraz con tapón de vidrio y disolver en 50 ml de agua. Agregar 1O ml de solución de yoduro de potasio (3 en 1O) y 5 ml de ácido clorhídrico, mezclar, tapar el matraz y dejar en reposo durante 1O minutos. Diluir con 50 ml de agua, agregar 3 ml de almidón SR y valorar con tiosulfato de sodio O, 1 N SV hasta que el color deje de disminuir y luego valorar con yodo 0, 1 N SV hasta un color azul. Restar el volumen de solución de yodo O, 1 N del volumen de tiosulfato de sodio O, 1 N para obtener el volumen de tiosulfato O, 1 N equivalente al ácido selenioso. Cada ml de tiosulfato de sodio O, 1 N equivale a 3,225 mg de H1Se03: no se encuentra menos de 93%. MATERIA INSOLUBLE: Disolver 1 g en 5 ml de agua: la solución es transparente y completa. RESIDUO DE INCINERACIÓN (Prueba para reactivos): no más de 1,0 mg (0,01 %), en 1O g. SELENATOS y SULFATOS: Disolver 500 mg en 1o ml de agua y agregar O, l ml de ácido clorhídrico y 1 ml de cloruro de bario SR: no se produce turbidez ni precipitado en el plazo de 1O minutos. Ácido Silícico, Si02 · xH20-(anhidro) 60,08 [1343-98-2]-Polvo blanco, amorfo. Insoluble en agua y en ácidos; soluble en soluciones calientes de álcalis fuertes. RESIDUO DE INCINERACIÓN (Prueba para reactivos): no menos de 80,0%. RESIDUO No VOLÁTIL CON ÁCIDO FLUORHÍDRICO: Calentar 500 mg con 1 ml de ácido sulfúrico y 1O ml de ácido fluorhídrico en un crisol de platino hasta sequedad e incinerar hasta peso constante: el peso del residuo no excede de 1,0 mg (0,2%). CLORUROS (Prueba para reactivos): Un g no presenta más de 0,05 mg de CI (0,005%). SULFATOS (Prueba para reactivos): Calentar a ebullición 2 g con 20 ml de ácido clorhídrico diluido (1 en 40), filtrar, neutralizar el filtrado con amoníaco SR y diluir con agua hasta obtener 20,0 ml. Una alícuota de 1O ml de la solución no presenta más de O, l mg de S04 (0,01 %). METALES PESADOS (Prueba para reactivos): Calentar a ebullición 2,5 g con 50 ml de ácido clorhídrico diluido (1 en 1O) durante 5 minutos, filtrar en caliente y evaporar el filtrado sobre un baño de vapor hasta sequedad. Recoger el residuo en 20 ml de ácido clorhídrico diluido (1 en 500), digerir durante 5 minutos, enfriar, agregar agua para obtener 100 ml y filtrar. A 40 ml del filtrado, agregar 1O ml de sulfuro de hidrógeno SR: si se produce color, éste no es más oscuro que el producido agregando 1O ml de sulfuro de hidrógeno SR a un control que contenga 0,03 mg de Pb (0,003%). HIERRO (241 ): A 20 ml del filtrado obtenido en la prueba para Metales Pesados agregar 1 ml de ácido clorhídrico y diluir con agua hasta 47 ml: la solución no presenta mas de 0,015 mg de Fe (0,003%). Ácido Silicotúngstico n-Hidrato (Ácido Tungstosilícico), H4Si(W3010)4·nH20-2878,17 (anhidro) [12027-38-2]Polvo verde. VALORACIÓN: Disolver aproximadamente 1 g, pesado con exactitud, en 25 ml de ácido clorhídrico diluido (1 en 5).
USP 39 Agregar 50 ml de una solución de 5 g de cinconina en ácido clorhídrico diluido (1 en 2). Entibiar en un baño de vapor durante aproximadamente 30 minutos. Enfriar, filtrar a través de un crisol tarado e incinerar a 800º hasta peso constante. El peso del residuo multiplicado por 1,047 es igual al peso del ácido silicotúngstico dihidrato en la muestra tomada. No se encuentra menos de 98%. Ácido Succínico, C4H604-118,09 grado reactivo ACS.
[110-15-6]-Usar
Ácido Sulfámico, HS03NH2-97,09 grado reactivo ACS.
[5329-14-6]-Usar
Ácido Sulfanílico, p-NH2C6H4S03H · H10-191,21 [121-57-3]-Usar grado reactivo ACS. Ácido Sulfosalicílico, C6H3(COOH)(OH)(S03H)-1,2,5 · 2H20-254,22 [97-05-2]-Usar grado reactivo ACS. Ácido Sulfúrico, H1S04-98,08 reactivo ACS.
[7664-93-9]-Usar grado
Ácido Sulfúrico Diluido (1 O por ciento)-Agregar cuidadosamente 57 ml de ácido sulfúrico a aproximadamente 100 ml de agua, enfriar a temperatura ambiente y diluir con agua hasta 1000 ml. Ácido Sulfúrico Exento de Nitrógeno, H1S04-98,08 [7664-93-9]-Usar un grado adecuado. , [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado como Acido Sulfúrico, Ultrex 11, número de catálogo 6902-05 en www.avantormaterials.com.] Ácido Sulfúrico Fluorométrico-Usar Ácido Sulfúrico grado reactivo ACS que se ajuste a la siguiente prueba adicional: FLUORESCENCIA: Usando un fluorómetro adecuado con un filtro de corte agudo a una excitación de 360 nm y un filtro de corte agudo a una excitación de 415 nm, determinar la fluorescencia del ácido sulfúrico en una cubeta previamente enjuagada con agua seguido por varias porciones del ácido a examinar: la fluorescencia no excede la de la solución de sulfato de quinina (1 en 1 600 000 000), medida de manera similar. Ácido Sulfúrico Fumante, H1S04 más SOi libre [8014-95-7]-con un contenido nominal de 15%, 20% o 30% de S03 libre-Usar grado reactivo ACS (que contenga entre 15,0% y 18,0%, entre 20,0% y 23,0%, o entre 30,0% y 33,0% de S03 libre). Ácido Sulfuroso, H1SOr-82,08 [7782-99-2]-Solución de dióxido de azufre en agua. Usar grado reactivo ACS. Ácido Tánico (Tanino) [1401-55-4]-Usar grado reactivo ACS. Ácido Tartárico, H1C4H406-150,09-Usar grado reactivo ACS. Ácido Tetrahidro-2-furanocarboxílico (Ácido ± Tetrahidro[16874-33-2]-Usar un 2-furoico), CsHa03-116, 12 grado adecuado con un contenido de no menos de 97%. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado en www. sigma-aldrich.com, número de catálogo 341517.] Ácido 2-Tiobarbitúrico, C4H4N 20 2S-144, 15 [504-17-6]-Laminilla~ blancas. Poco soluble en agua. TEMPERATURA DE FUSION (741): 236º, con descomposición. [ 68-11-1 ]-LíÁcido Tioglicólico, HSCH2COOH-92, 12 quido incoloro o casi incoloro. Es miscible con agua. Soluble en alcohol.
Reactivos / Especificaciones de Reactivos 2293
USP 39
SENSIBILIDAD: Mezclar 1 ml con 2 ml de hidróxido de amonio y diluir con agua hasta 20 ml. Agregar 1 ml de esta solución a una mezcla de 20 ml de agua y O, 1 ml de cloruro férrico diluido SR (1 en 100), luego agregar 5 ml de amoníaco SR: aparece un color rosado nítido. Ácido p-Toluenosulfónico, CH3C6H4SÜ3H · H20-190,22 [6192-52-5]-Usar grado reactivo ACS. Ácido p-Toluico, CH3C6H4COOH-136, 15 [99-94-5]Polvo cristalino blanco. Moderadamente soluble en agua caliente; muy soluble en alcohol, en metanol y en éter. VALORACIÓN: Transferir aproximadamente 650 mg, pesados con exactitud, a un recipiente adecuado, disolver en 125 ml de alcohol, agregar 25 ml de agua y mezclar. Valorar con hidróxido de sodio 0,5 N SV, determinando el punto final potenciométricamente. Realizar una determinación con un blanco y hacer las correcciones necesarias. Cada ml de hidróxido de sodio 0,5 N equivale a 68,07 mg de CsHs02: no se encuentra menos de 98%. INTERVALO DE FUSIÓN (741 ): en un intervalo de 2° que incluye 181 º. Ácido Tricloroacético, CCbCOOH-163,39 Usar grado reactivo ACS.
Ácido 2,4,6-Trinitrobencenosulfónico, C6H2(N02)3SQ3H · 3H20-347,21 [2508-19-2]-Cristales de color amarillo pálido a tostado. Usar un grado adecuado. También disponible como solución acuosa al 5% (p/v) o solución acuosa 1 M. [529-64-6]-Usar un
Ácido Túngstico, H2W04-249,85 [7783-03-1 ]-Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 99%. Ácido Valérico, CsH10Ü2-102, 13 [109-52-4]-Líquido incoloro y transparente. VALORACIÓN: Pesar con exactitud aproximadamente 500 mg, transferir a un recipiente adecuado, agregar 30 ml de agua y mezclar. Agregar 40 ml de agua y mezclar. Agregar fenolftaleína SR y valorar con hidróxido de sodio O, 1 N SV. Cada ml de hidróxido de sodio O, 1 N equivale a 10,21 mg de CsH1o02: no se encuentra menos de 99,0% de CsH1o02. Ácido Yodhídrico, Hl-127,91 [10034-85-2]-Utilizar grado reactivo ACS (que contenga no menos de 47,0% de HI). [NOTA-Para determinación de grupos metoxilo (ver Determinación de Grupos Metoxi/o (431 )), usar ácido yodhídrico al 55% de grado reactivo ACS. Usar también este grado para determinaciones de grupos alcoxilo en las valoraciones de las monografías individuales.] Ácido Yódico, HI03-l 75,91 activo ACS.
ADN de Timo de Ternero-Usar un grado adecuado. [NOTA-Se puede obtener comercialmente un grado adecuado de Worthington Biochemical Corp., www.worthing tonbiochem.com.] ADN Polimerasa: ADN Polimerasa recombinante, termoestable. Usar un grado adecuado. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado en Applied Biosystems, www.appliedbiosystems.com.] Agar-Usar Agar (monografía del NF). Cuando se usa para fines bacteriológicos, debe secarse hasta que el contenido de agua no sea más de 20%. Agar Sulfito de Bismuto-Usar un grado adecuado. Agarosa [9012-36-6]-Polisacárido constituido por /3-D-galactopiranosa enlazada mediante uniones 1,3 y 3,6-anhidrocH-galactopiranosa enlazada mediante uniones 1,4. Usar un grado adecuado.
[76-03-9]-
Ácido Trifluoroacético, C2Hf30r-l 14,02 [76-05-1 ]-Líquido incoloro. Miscible con éter, con acetona, con etanol, con bence~o, con tetracloruro de carbono y con hexano. VALORACION: Disolver aproximadamente 300 mg, pesados con exactitud, en 25 ml de agua y 25 ml de alcohol. Valorar con hidróxido de sodio O, 1 N SV, determinando el punto final potenciométricamente. Realizar una determinación con un blanco y hacer las correcciones necesarias. Cada ml de hidróxido de sodio O, 1 N equivale a 11,40 mg de C2HF302. No se encuentra menos de 99%.
Ácido Trópico, C9H10Ü3-l 66, 18 grado adecuado.
Adamantano, C10H16-136,23 [281-23-2] INTERVALO DE FUSIÓN (741): entre 270º y 271º.
[7782-68-5]-Usar grado re-
Acrilato de Etilo [140-88-5]-Usar un grado adecuado.
Agente de Lisis de Eritrocitos-El reactivo está disponible como una solución que contiene cianuro de potasio al 0,33% y nitroprusiato de sodio al O, 11 % y una sal de amonio cuaternario como agente tensoactivo (5,5%). [NOTA-El reactivo es fabricado por Coulter Electronics Diagnostics, Hialeah, FL y se puede obtener de muchos proveedores bajo el nombre de Zapoglobin® (o Zap-oglobin®).] Agente Humectante No lónico-Usar un agente tensoactivo anfótero adecuado. [NOTA-Se puede obtener comercialmente un grado adecuado como Triton X-100 u Octoxynol 9.] Agua Desgasificada-Ver Agua en la sección introductoria. Agua Deuterada-Ver Óxido de Deuterio. Agua Exenta de Amoníaco, H20-18,02-Usar Agua de Afta Pureza según se define en Envases-Vidrio (660), Resistencia Química. A~ua
Exenta de Dióxido de Carbono-Ver Agua en la seccion introductoria.
Alambre de Hierro, Fe-Peso atómico 55,847-Usar un grado adecuado. Albúmina Sérica Bovina [9048-46-8]-Polvo casi incoloro a levemente amarillo. No menos de 95% de pureza. Solubilidad, 40 mg en 1 ml de agua. El peso molecular es aproximadamente 66 000. Usar un grado adecuado. Almacenar entre 2º y 8º. Alcohol, (Etanol, Alcohol Etílico), C2H 50H-46,07 [64-17-5]-Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 92,3% y no más de 93,8%, en peso, correspondiente a no menos de 94,9% y no más de 96% en volumen, a 15,56º. Alcohol Absoluto, C2HsOH-46,07-Usar Alcohol Etílico Absoluto de grado reactivo ACS. Alcohol al 70 por ciento, 80 por ciento y 90 por ciento-Preparar mezclando alcohol con agua en las proporciones dadas, y hacer las mediciones a 25º.
2294 Especificaciones de Reactivos /
Reactivos
Proporciones Relativas
Porcentaje por Volumen de C2HsOH a 15 56º 70 80 90
Peso específico a 25º o 884 o 857 o 827
Alcohol, mL 38 6 45 5 51
Agua, mL 15 95 3
Volumen en mL de Alcohol, 94,9°/o v/v, Requerido para 100 mL 73 7 84 3 94 8
Determinar las proporciones de alcohol y agua tomadas para preparar estas u otras soluciones en porcentaje (v/v) de la siguiente forma. Calcular la cantidad, en mL, de agua a ser mezclada con 100 mL de alcohol tomados por la fórmula: ' [94,9(d/c) - 0,8096]100 en donde 94,9 es el porcentaje (v/v) de C2 H50H en alcohol· 0,8096 es el peso específico de alcohol al 94 9%· d es el ' peso específico, obtenido de la Tabla Alcohoi'imétrica (ver Tablas de Referencia), de la solución con c% (v/v) de C2HsOH, y 100 es el volumen, en mL, de alcohol tomado. Alcohol Alfa-(2-(metilamino)etil-bencílico-Usar un grado adecuado. Alcohol Amílico (Alcohol lsoamílico), C5 H11 0H-88, 15 [123-51-3]-Usar Alcohol lsopentílico de grado reactivo ACS. Alcohol terc-Amílico, CsH120-88, 15 [75-85-4]-Líquido transparente; incoloro, inflamable y volátil. PESO ESPECIFICO (841 >: aproximadamente 0,81. INTERVALO DE EBULLICIÓN (Prueba para reactivos): no menos de 95%, entre 100º y 103º. RE~IDUO DE EVAPORACIÓN: Evaporar 50 mL (40 g) en un bano de vapor y secar a 105º durante 1 hora: el residuo fJº pesa rlJªS de 1,6 mg (0,004%). ACIDOS y ESTERES: Diluir 20 mL con 20 mL de alcohol, agreg~r 5,0 mL de hidróxido de sodio O, 1 N SV y calentar a reflujo moderadamente durante 1O minutos. Enfriar, agre~a.r 2 gotas ~e fenol!t~leína SR y valorar el exceso de h1drox1do de sodio con ac1do clorh1drico O, 1 N SV: no se consume más de 0,75 mL del hidróxido de sodio O 1O N realizando correcciones por la cantidad consumida 1en un' blane<~ (0,06% como acetato de amilo). ALDEHIDOS: Agitar 5 mL con 5 mL de solución de hidróx!d~ de potasio (3~ en 100) en una probeta con tapón de vidrio durante 5 m1nu~os y dejar que las capas se separen: no aparece color en ninguna capa. Alcohol Butílico (7-Butanol; Alcohol Butílico Normal), CH 3 (CH2)zCH20H-74, 12 [71-36-3]-Usar grado reactivo ACS. Alcohol Butílico Normal-Ver Alcohol Butílico. Alcohol Butílico Secundario (2-Butano/), CH3CH2CH(OH)CH3-74, 12 [78-92-2]-Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 99%. Alcohol Butílico Terciario, (CH 3) 3COH-74, 12 [75-65-0]-Usar Alcohol terc-Butílico de grado reactivo ACS. Alcohol Deshi~~atado (Alcohol Absoluto), C2H5 0H-46,07Usar Alcohol Et1hco Absoluto de grado reactivo ACS. Alcohol Desnaturalizado-Es alcohol etílico al que se ha agregado algunas sustancias que, aunque permitan usar el alcohol en la mayoría de sus aplicaciones, hacen que resulte
USP 39 completamente inepto para el consumo como bebida. Los desnaturalizantes más comúnes, usados individualmente o en combinación, son los siguientes: metanol, alcanfor, aldehol, alcohol amílico, gasolina, isopropanol, terpineol, benceno, aceite de ricino, acetona, nicotina, colorantes de anilina, éter, yoduro de cadmio, bases de piridina, ácido sulfúrico, queroseno y ftalato de dietilo. Usar un grado adecuado. Alcohol Diluido-Usar Alcohol Diluido (monografía del NF). Alcohol Dodecílico-Ver 1-Dodecanol. Alcohol Estearílico (1-0ctadecanol), C13H3s0-270 49 [112-92-5]-Cristales, gránulos o escamas de color 1blanco. Soluble en alcohol, en éter, en acetona y en benceno; insoluble en agua. INTERVALO DE FUSIÓN (741): entre 56º y 58º. / OTROS R,EQUISITOS: Cumple con las pruebas de Indice de Acidez, Indice de Yodo e Indice de Hidroxilo en Alcohol Estearílico (monografía del NF). Alcohol Etílico (Alcohol; Etanol), C2HsOH-46,07-Usar Alcohol.
Alcohol Exento de Aldehídos-Disolver 2,5 g de acetato de plomo en 5 mL de agua, agregar la solución a 1000 mL de alcoho! contenidos en. un, f~asco con tapón de vidrio y mezclar. Disolver 5 g de h1drox1do de potasio en 25 mL de alcohol tibio, enfriar la solución y agregarla lentamente sin mezcla,do, a la solució~ en alcohol d~ acetato de plo~o. Despues de 1 hora agitar la mezcla vigorosamente, dejar en reposo durante toda la noche, decantar el líquido transparente y recuperar el alcohol mediante destilación. Alcohol 2-Hidroxibencílico, C7Hs02-124, 14 [90-01-7]Escamas blanquecinas. Muy soluble en alcohol, en cloroformo y en éter; soluble en 15 partes de agua y en benceno. VAL~RACIÓN: Inyectar una muestra apropiada en un cromatografo de gases _(ve_r C~o,matografta (621 )) equipado con un detector de 1ornzac1on a la llama, usando helio como gas transportador. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas: una columna capilar de 0,25 mm x 30 m, recubierta con ~na capa de fase G2 de 1 µm; mantener la temperatura del inyector a 250º; mantener la temperatura del detector a 300º; y mantener la temperatura de la columna a 150º y programarla para que aumente 1Oº por minuto hasta 280º. El área del pico de (7Hs02 no es menos de 99% del área total. INTERVALO DE FUSIÓN (741): entre 83º y 85º. Alcohol lsoamílico-Usar Alcohol Amílico. Alcohol lsobutílico (2-Metil-1-propanol), (CH 3)zCHCH20H74, 12 [78-83-1 ]-Usar grado reactivo ACS. Alcohol lsopropílico (2-Propanol), (CH3)2CHOH-60, 10 [67-63-0]-Usar grado reactivo ACS. [NOTA-Para valoraciones y pruebas de espectrofotometría UV, usar Alcohol lsopropílico wado reactivo ACS Adecuado para Uso en Espectrofotometna UV.] Alcohol lsopropílico Deshidratado [67-63-0]-Usar Alcohol lsopropílico previamente secado por medio de agitación con un tamiz molecular adecuado capaz de adsorber agua y filtrado. ' Alcohol Metílico-Ver Metano/. Alcohol Neutralizado-A una cantidad adecuada de alcohol, agregar 2 ó 3 gotas de fenolftaleína SR y sólo la cantidad suficiente de hidróxido de sodio 0,02 N o 0, 1 N para
USP 39
Reactivos / Especificaciones de Reactivos 2295
producir un color levemente rosado. Preparar alcohol neutralizado justo antes de usar. Alcohol 1-Nonílico (7-Nonanol), CH 3(CH2)sOH-144,25 [143-08-8]-Líquido incoloro. VALORACIÓN: Se encuentra no menos de 97% de C9H20 0 empleando un cromatógrafo de gases adecuado equipad~ con un detector de ionización a la llama y usando helio C?mo gas transportador a una velocidad de flujo de aproximadamente 40 mL por minuto. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas: usar una columna de acero inoxidable de 3,2 mm x 1,83 m rellena con fase Gl 6 al 20% sobre soporte Sl A; mantener las temperaturas del inyector, la columna y el detector aproximadamente a 250º, 160º y 31 Oº, respectivamente. ÍNDICE DE REFRACCIÓN (831 ): entre 1,432 y 1,434, a 20º. Alcohol Polivinílico, (C2H40)n [9002-89-5]-Polvo blanco. Soluble en agua; insoluble en disolventes orgánicos. P~ (791 ): entre 5,0 y 8,0, en una solución (1 en 25). PERDIDA POR SECADO (731 ): Secar a 11 Oº hasta peso constante: no pierde más de 5% de su peso. RESIDUO DE INCINERACIÓN: no más de 0,75%. [NOTA-Se puede obtener grados adecuados con el número de catálogo U 232, en ]. T. Baker Chemical Co., www.jtbaker.com.] Alcohol n-Propílico (7 -Propano/), CH 3CH2CH20H-60, 10 [71-23-8]-Usar grado reactivo ACS. Aldehído Deshidrogenasa-Polvo blanco. Un mg contiene no menos de 2 unidades de actividad enzimática. VALORACIÓN: Transferir aproximadamente 20 mg, pesados con exactitud, a un matraz volumétrico de 200 mL, disolver en 1 mL de agua, diluir a volumen con una solución de albúmina sérica bovina helada (1 en 100) y mezclar. Usar esta solución como Preparación de valoración. Disolver 3,3 g de pirofosfato de potasio, 15 mg de ditiotreitol y 40 mg de edetato disódico en 70 mL de agua, ajustar con solución de ácido cítrico monohidrato (2, 1 en 1O) hasta un pH de 9,0 ± O, 1, diluir con agua a 100 mL y mezclar para obtener una Solución amortiguadora de pH 9,0. Disolver una cantidad, pesada con exactitud, de {3-nicotinamida adenina dinucleótido (,B-NAD) en agua para obtener una Solución de ,B-NAD con una concentracion conocida de aproximadamente 20 mg por ml. Pipetear O, 1 mL de la Preparqci?n de valoraci~n y transferir a una celda espectrofotometnca de 1 cm. Pipetear O, 1 mL de agua y transferir a una segunda celda espectrofotométrica de 1 cm para obtener el blanco de reactivo. Agregar 2,5 mL de Solución amortiguadora de pH 9,0; 0,2 mL de Solución ,B-NAD y O, 1 mL de solución de pirazol (0,68 en 100) a cada celda y mezclar. Tapar las celdas y dejar en reposo durante 2 minutos a 25 ± 1º. Agregar 0,01 mL de solución de acetaldehído (0,3 en 100) a cada celda y mezclar. Tapar las celdas y determinar la absorbancia de la solución obtenida a partir de la Preparación de valoración a una longitud de onda de 340 nm, usando la solución obtenida a partir del blanco de reactivo como referencia. Calcular el cambio M, en absorbancia por minuto para la solución obtenida a partir de la Preparación de valoración, comenzando en el punto en que la relación absorbancia-tiempo se vuelve lineal. Una unidad de actividad enzimática se define como la cantidad de enzima que oxida 1 µmol de acetaldehído por minuto cuando la prueba se realiza bajo las condiciones descritas en esta valoración. Calcular las unidades de actividad enzimática en cada mg de aldehído deshidrogenasa tomado, por la fórmula: [(2,91)(200)/(6,3)(0,1 )(1 OOO)](M/W)
Aleación de Devarda (Metal de Devarda), [8049-11-4 ] Polvo gris compuesto por 50 partes de cobre, 45 partes de aluminio y 5 partes de cinc. Alfa Ciclodextrina Hidrato (Dextrina Alfa-Schardinger· Ciclohexaamilosa), C36H60030 · xH20 [51211-51-9]-Usar u~ grado adecuado con un contenido de no menos de 98%. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado en www. acros.com con número de catálogo 22729.] Alfa Lactosa Monohidrato (a-o-Lactosa Monohidrato), C12H22011 · Hz0-360,31-Polvo blanco. El contenido de ,BD-lactosa es menos de 3%. VALORACIÓN: Inyectar una muestra derivatizada apropiada en un cromatógrafo de gases (ver Cromatografía (621)) equipado con un detector de ionización a fa llama, usando helio como gas transportador. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas: una columna capilar de O 25 mm x 30 m, recubierta con una capa de fase G2 de 1 µ~; mantener la temperatura del inyector a 250º; mantener la temperatura del detector a 280º; mantener la temperatura de la columna a 230º y programar para que aumente 4° por minuto hasta 280º. El área del pico de Ci2H220 11 . H20 no es menos de 97% del área total. Alfa-Quimotripsina-25 kDa [9004-07-3]-Usar un _grado adecuado exento de sales para secuenciación de prote1nas. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado con el número de catálogo 4423 en www.sigma-aldrich.com.] Alfanaftol-Ver 7-Nafta/. Algodón Absorbente-Usar Algodón Purificado (monografía de la USP). Alizarina Complexona (Ácido Alizarin-3-metiliminodiacético· Azul de Alizarina Flúor), C19H1sNOs-385,32 [3952-78-1 ].'.__ Usar un grado adecuado. Alizarinsulfonato de Sodio (Rojo de Alizarina S; Monosulfonato Sódico de Alizarina), C14H1Na01S · Hz0-360,27-Polvo marrón amarillento o amarillo anaranjado. Fácilmente soluble en agua, con producción de un color amarillo; moderadamente soluble en alcohol. SENSIBILIDAD: Agregar 3 gotas de una solución del artículo (~ en 100) ~ 100 mL de agua y agregar 0,25 mL de hidróxido de sodio 0,02 N: se produce un color rojo. Agregar 0,25 mL de ácido clorhídrico 0,02 N: aparece nuevamente el color amarillo original. Almidón de Papa-El almidón separado de los túberculos de Solanum tuberosum L. (Fam. Solanaceae). Polvo más o menos finamente granulado, constituido por granos de almidón de forma y apariencia características cuando se lo examina microscópicamente. Almidón Soluble (para yodometría) grado reactivo ACS.
Almidón Soluble Purificado-Polvo blanco amorfo· el examen microscópico revela la forma característica del 'almidón de papa. Soluble en agua caliente; muy poco soluble en alcohol. SOLUCIÓN DE PRUEBA PARA LA DETERMINACIÓN DEL PH Y DE LA SENSIBILIDAD: . ~,ezclar 2,0 g en 1O mL de agua, agregar agua en ebull1c1on para obtener 100 mL y calentar a ebullición durante 2 minutos. La solución caliente es casi transparente. Al f'.nfriarse la solución puede tornarse opalescente o turbia, pero no forma gel. Utilizarla como Solución de prueba.
PH (791 ): en donde M se define anteriormente y W es el peso en g ' ' de aldehído deshidrogenasa tomado.
[9005-84-9]-Usar
El pH de la Solución de prueba está entre 6,0
y 7,5. Sensibilidad: Mezclar 2,5 mL de la Solución de prueba, 97,5 mL de agua y 0,50 mL de yodo 0,01 O N: se pro-
2296 Especificaciones de Reactivos /
Reactivos
duce un color azul característico que desaparece al agregar 0,50 ml de tiosulfato de sodio 0,01 O N. ABSORBANCIA: Preparar una solución amortiguadora de pH 5,3 disolviendo en a_gua 43,5 g de acetato de sodio (trihidrato) y 4,5 ml de acido acético ~!acial, transferir la solución obtenida a un matraz volumetrico de 250 ml, agregar agua a volumen y mezclar. Disolver entibiando 1,00 g de Almidón Soluble Purificado en 2,5 ml de solución amortiguadora, transferir a un matraz volumétrico de 100 ml, agregar agua a volumen y mezclar. Agregar 0,50 ml de esta sofución a un matraz volumétrico de 100 ml que contenga aproximadamente 75 ml de agua, 1 ml de ácido clorhídrico 1 N y 1,5 ml de yodo 0,020 N, agitando el matraz por rotación suave durante el agregado. Agregar agua a volumen, mezclar y dejar en reposo durante 1 hora en la oscuridad. La absorbancia de esta solución, medida a 575 nm en celdas de 1 cm contra un blanco, está entre 0,5 y 0,6. SUSTANCIAS REDUCTORAS: Agitar durante 15 minutos 10,0 g con 100 ml de agua y dejar sedimentar durante aproximadamente 12 horas. Filtrar una porción del sobrenadante a través de un filtro de vidrio sinterizado fino. A 50 ml del filtrado, agregar 50 ml de tartrato cúprico alcalino SR y calentar a ebullición durante 1 a 2 minutos. Filtrar el óxido cuproso obtenido, lavarlo con agua caliente, luego con alcohol y secar a 105º durante 2 horas: no se encuentra más de 47 mg, correspondientes a 0,7% de azúcares reductores como maltosa. PÉRDIDA POR SECADO (731 ): Secar a 105° durante 2 horas: no pierde más de 10% de su peso. RESIDUO DE INCINERACIÓN (281 ): no más de 0,5%. Alquilfenoxipolietoxietanol-Surfactante no iónico. Usar un grado adecuado. [NOTA-Se e.uede obtener comercialmente un grado adecuado como 'Triton X-100" en Sigma-Aldrich, www.sigmaaldrich.com.] Alumbre (Alumbre de Amonio, Sulfato de Aluminio y Amonio), AINH4(SQ4)2 · 12H20-453,33 [7784-26-1 ]-Cristales incoloros grandes o fragmentos cristalinos o polvo blanco. Soluble en 7 partes _d.~ ag~a y en aproximadamente 0,5 partes de agua en ebulhc1on; insoluble en alcohol. Usar grado reactivo ACS. Alumbre de Amonio-Ver Alumbre. Alumbre de Potasio-Usar Alumbre de Potasio (monografía de la USP). Alúmina-Ver Óxido de Aluminio Lavado con Ácido. Alúmina Activada (Óxido de Aluminio), [1 344-28-1 ]-Usar un grado adecuado. Alúmina Anhidra (Óxido de Aluminio; Alúmina preparada especialmente para análisis cromatográfico), [1 344-28-1 ]-Polvo blanco o practicamente blanco de malla 80 a 200. No se ablanda, hincha ni descompone en agua. No está lavada con ácido. Almacenar en envases bien cerrados.
USP 39
amarillento. Fácilmente soluble en agua. Usar grado reactivo ACS. Amalgama de Cinc-Agregar 54 g de cinc musgoso o granular a 100 ml de mercurio en un vaso de precipitados. Calentar mezclando ,en una placa de calenta~iento bajo una campana, [PRECAUCION: El vapor de mercurio es extremadamente tóxico.] hasta que la disolución del cinc sea completa o prácticamente completa. Dejar que se enfríe a temperatura ambiente y, si fuera necesario, agregar mercurio suficiente para evitar la solidificación de la amalgama. Transferir la amalgama a un frasco con tapón de vidrio y agitar algunas veces con ácido clorhídrico diluido (1 en 2) para eliminar el óxido de cinc formado. Amaranto, C20H11 N2Na3Ü10Sr-604,48 [915-67-3]-Polvo fino marrón intenso o marrón rojizo oscuro. Usar un grado adecuado.
~marillo de Metanilo (Amarillo Ácido 36; Sal Sódica del Acido 3-(4-Anilinofenilazo)bencenosu/fónico), C1sH14N3Na03S-375,38 [587-98-4]-Usar un grado adecuado con un contenido de colorante de no menos de 70%. Amarillo de Metilo (p-Dimetilaminoazobenceno), C14H1sN3-225,3 [60-11-7]-Usar un grado adecuado. Amarillo de Tiazol (CI Amarillo Directo 9; Amarillo Clayton; Amarillo Titán), C2sH19NsNa206S4---695,74 [1829-00-1 ] Polvo marrón amarillento. Soluble en agua y en alcohol, produciendo en ambos casos una solución amarilla; soluble en álcalis diluidos con los que produce una solución de color rojo amarronado. Proteger de la luz. SOLUBILIDAD: Una porción de 200 mg mezclada con 50 ml de agua presenta no más que una leve turbidez. RESIDUO DE INCINERACIÓN: Pesar con exactitud aproximadamente 1,5 g, previamente secados a 105º durante 2 horas, e incinerar hasta que se carbonice por completo. Enfriar, agregar 2 ml de ácido nítrico y 2 ml de ácido sulfúrico, incinerar suavemente para expulsar el exceso de ácido y luego incinerar entre 600º y 800º hasta peso constante: el residuo de sulfato de sodio (Na2S04) está entre 19,8% y 21,5% del peso de la muestra de prueba (en teoría es 20,4%). SENSIBILIDAD AL MAGNESIO: Agregar 0,2 ml de una solución (1 en 1O 000) y 2 ml de hidróxido de sodio 1 N a una mezcla de 9,5 ml de agua y 0,5 ml de una solución que se prepara disolviendo 1,014 g de cristales de sulfato de magnesio transparentes en agua, diluyendo con agua a 100 ml, y luego diluyendo 1O ml de la solución resuftante con agua hasta 1 L: se produce un color rosado nítido dentro de los 1O minutos. a-Amilasa-Usar un grado adecuado. Puede ser de origen vegetal, animal o microbiológico.
Aluminio, Al-Peso atómico 26,98154 [7429-90-5]Usar grado reactivo ACS, que también cumple con los requisitos ~e la siguiente prueba. ARSENICO: Colocar 750 mg en el frasco generador (ver Arsénico en Reactivos en Pruebas Generales para Reactivos), omitiendo el trozo de algodón. Agregar 1O ml de agua y 1O ml de solución de hiaróxido de sodio (3 en 1O) y dejar que la reacción continúe durante 30 minutos: no se produce más que una mancha apenas perceptible en el papel de prueba de bromuro mercurico.
4-Amino-6-cloro-1,3-bencenodisulfonamida, C6HsCIN3Q4S2-285,73 [121-30-2]-Polvo blanco. Insoluble en agua y en cloroformo; soluble en amoníaco SR. RESIDUO DE INCINERACIÓN (Prueba para reactivos): no más de 2 mg, usando 2 g (O, 1%). ABSORBANCIA: Una solución 1 en 200 000 en metano! presenta máximos de absorbancia aproximadamente a 223
Aluminón (Sal [tri] Amónica del Ácido Aurín Tricarboxílico), C22H23N3Ü9-473,43 [569-58-4]-Polvo vítreo marrón
2-Amino-5-clorobenzofenona, C13H10CIN0-231,68 [719-59-5]-Usar ER 2-Amino-5-clorobenzofenona USP.
-~JriM¡i¡iili)(~e~~1!'41J aproximadamente 64,0.
Reactivos / Especificaciones de Reactivos 2297
USP 39 3-Amino-1-propanol, H2N(CH2hOH-75, 11 [156-87-6]-Líquido. INTERVALO DE EBULLICIÓN (Prueba para reactivos): entre J84ºy188º. ' INDICE DE REFRACCION (831): entre 1,461 y 1,463 a 20º. 4-Aminoantipirina, C11Hi3N30-203,24 [83-07-8]-Polvo cristalino de color amarillo claro. Una porción de 500 mg se disuelve completamente en 30 mL de agua y produce una solución transparente. INTERVALO DE FUSIÓN (741): entre 108º y 110º. 4-Aminobenzoato de Metilo, CsH9N02-151, 16 [619-45-4]-Polvo blanquecino. VALORACIÓN: Disolver aproximadamente 38 mg, pesados con exactitud, en 50 mL de ácido acético glacial. Valorar con ácido perclórico O, 1 N SV determinando el punto final potenciométricamente. Realizar una determinación con un blanco y hacer las correcciones necesarias. Cada mL de ácido perclórico O, 1 N equivale a 15, 12 mg de CsH9NÜ2. No se encuentra menos de 99,0%. INTERVALO DE FUSIÓN (741 ): entre 108º y 11 Oº. 2-Aminobenzonitrilo (Antranilonitrilo), C1H6N2-118, 14 [1885-29-6]-Usar 2-Aminobenzonitrilo al 98%. INTERVALO DE FUSIÓN (741): entre 49º y 52º. 1-(2-Aminoetil)piperazina, C6H1sN3-129,20 [140-31-8]-Líquido viscoso incoloro. VALORACIÓN: Inyectar una muestra apropiada en un cromatógrafo de gases adecuado.Cv~r cr:~matografía (621)) equipado con un detector de 1ornza_cio~ a la llama! ~sando helio como gas transportador. Las s1gu1ente.s cond1c1ones se consideran adecuadas: una columna capilar de 0,25 mm x 30 m recubierta con fase G2. Mantener la temperatura del inyector a 280º; mantener la temperatura de la columna a 180º y programarla para qu~ aumente 1Oº .por minuto hasta 280º y se mantenga as1 durante 1O minutos. Mantener la temperatura del detector a 300º. El área del pico principal no es menos de 97% del área total. INDICE DE REFRACCIÓN (831 ): entre 1,4978 y 1,501 o a 20º. 2-Aminofenol (o-Aminofenol; 2-Hidroxianilina), C6H1N0109, 13 [95-55-6]-Polvo blanquecino. Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 99%. m-Aminofenol (3-Amino- 7-Hidroxibenceno), C6H7N0109, 13 [591-27-5]-Escamas de color c~em~ ~amarillo pálido. Moderadamente soluble en agua fria; facilmente soluble en agua caliente, en alcohol y en éter. VALORACIÓN: Disolver aproximadamente 1,5 g, pesados con exactitud, en aproximadamente 400 mL de agua en un matraz volumétrico de 500 mL, diluir a volumen con agua y mezclar. Transferir 25,0 mL de esta solución a un matraz para yodo, agregar 50,0 mL de bro~o. O, 1 N diluir con 50 mL de agua, agregar 5 mL de ac1do clorh1drico y tapar inmediatamente el matraz. Agitar durante 1 minuto, dejar en reposo durant~ 2 minut?s )'. agregar 5 mL de yoduro de potasio SR a traves del tapon ligeramente abierto. Agitar meticulosamente, dejar en reposo durante 5 minutos quitar el tapón, enjuagar el tapón y el cuello del matraz ~on 20 mL de agua y agregar el enjuague al matraz. Valorar el yodo liberado con tiosulfato de sodio O, 1 N SV, agregando 3 mL de almidón SR cerca. del punto final. A partir del volumen de tiosulfato de sodio O, 1 N SV usado, calcular el volumen, en mL, de bromo O, 1 N consumido por la muestra de prueba. Cada mL de bromo O, 1 N equivale a 1,819 mg de C6H7NO: no se encuentra menos de 99,5%. INTERVALO DE FUSIÓN (741): entre 121º y 123º. PÉRDIDA POR SECADO (731): Secar sobre cloruro de calcio durante 4 horas: la pérdida en peso es inapreciable.
sy,
RESIDUO DE INCINERACIÓN (Prueba para reactivos): ciable, usando 2 g.
inapre-
p-Aminofenol (p-Hidroxianilina), C6H7N0-109, 13 L123-30-8]-Polvo cristalino, fino y amarillento. Poco soluble en agua y en alcohol. Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 99%. 2-Aminoheptano (2-Heptilamina; 7-Metilhexilamina), C7H17N-115,22 [123-82-0]-Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 99%. N-Aminohexametilenimina (N-Aminohomopiperidina, 7-Aminohomopiperidina), C6H14N2-114, 19 [5906-35-4]-Líquido incoloro. VALORACIÓN: Inyectar una muestra apropiada en un cromatógrafo de gases adecuado (ver Cromatografía (621 )) equipado con un detector de ioniza.ció.n a la llama! .usando helio como gas transportador. Las s1gu1ente.s cond1c1ones se consideran adecuadas: una columna capilar de 0,25 mm x 30 m recubierta con fase G2. Mantener la temperatura del inyector a 180º; mantener la temperatura de la columna a 80º y programarla para que aumente 1Oº por. minuto hasta 230º y se mantenga a 230º durante 5 minutos. Mantener la temperatura del detector a 300º. El área del pico principal no es menos de 95% del área total. ÍNDICE DE REFRACCIÓN (831): entre 1,4840 y 1,4860 a 20º. Amortiguadores-Ver Soluciones Amortiguadoras en Soluciones. Anaranjado G (la sal sódica del ácido azobenceno-betanaftol disulfónico), C6HsN:NC10H4(0H)(S03Na)r2,6,8-452,37 [1936-15-8]-Polvo de color anaranjado a rojo ladrillo o cristales de color rojo oscuro. Fácilmente soluble en agua, produce una solución de un color amarillo anaranjado; poco soluble en alcohol; insoluble en éter y en cloroformo. La adición de ácido tánico SR a su solución 1 en 500 no produce precipitación (color ácido). La adición de ácido clorhídrico a una mezcla de 500 mg de polvo de cinc y 1O mL de su solución 1 en 500 produce decoloración. Al filtrarlo, el filtrado incoloro no recupera su color original cuando se lo deja expuesto al aire (presencia de grupo azo). Al calentarlo, el anaranjado G no deflagra (diferenciación de los nitrocolorantes). La adición de cloruro de bario o de calcio SR a una solución concentrada de anaranjado G produce un precipitado coloreado cristalino. La adición de ácido clorh1drico a su solución 1 en 500 no produce cambios; la adición de hidróxido de sodio SR a una solución similar produce un color rojo amarillento a bordó, pero no produce precipitación. El anaranjado G se disuelve en ácido sulfúrico con un color anaranjado a rojo amarillento. Al diluir la solución cuidadosamente con agua, no se produce ningún cambio de color. (f)-Anetol (7-Metoxi-4-(7-propenil)benceno), C10H120148,20 [4180-23-8]-Usar un grado adecuado de isómero trans. Anhídrido Acético (Óxido Acético; Óxido Acetílico), (CH 3C0) 2 0-102,09 [108-24-7]-Usar grado reactivo ACS. Anhídrido Ftálico, CsH4Ü3-148, 12 grado reactivo ACS.
[85-44-9]-Usar
Anhídrido Propiónico, C6H10Ü3-130, 14 [123-62-6]-Líquido incoloro. Se descompone en agua. Soluble en metano!, en alcohol, en éter y en cloroformo. VALORACIÓN: Pesar con exactitud aproximadamente 350 mg en un matraz tarado, con tapón de vidrio, que contenga 50 mL de di~etilformamida previamente ~e~tra lizada hasta el punto final de azul de timol con metox1do de sodio O, 1 N en metano! SV. Valorar con metóxido de
2298 Especificaciones de Reactivos /
Reactivos
sodio O, 1 N en metanol SV hasta el punto final de azul de timol. Realizar una determinación con un blanco y hacer las correcciones necesarias. Cada mL de metóxido de sodio O, 1 N equivale a 13,014 mg de C6H10Ü3. No se encuentra menos de 97,0%. ÍNDICE DE REFRACCIÓN (831 ): entre 1,4035 y 1,4045, a 20º. Anhídrido Trifluoroacético, (F3CC0)20-210,03 [407-25-0]-Líquido incoloro. Llega a la ebullición entre 40º y 42º. Sumamente volátil. Evitar la exposición al aire o al agua. , VALORACION: Transferir aproximadamente 0,8 g, pesados con exactitud, a un matraz con tapón de vidrio que contenga 50 mL de metanol. Agregar 500 mg de fenolftaleína y valorar con metóxido de sodio O, 1 N SV hasta un punto final rosado. Calcular A por la fórmula:
V/W en donde V es el volumen, en mL, de metóxido de sodio O, 1 N y W es el peso, en m!;j, de la muestra de prueba. A un segundo matraz con tapon de vidrio que contenga 50 mL de una mezcla de dimetilformamida y agua (1 :1 ), transferir 0,4 g, pesados con exactitud, de la muestra en análisis, agregar 500 mg de fenolftaleína y valorar con hidróxido de sodio O, 1 N SV hasta un punto final rosado. Calcular B por la fórmula: v1¡w1 en donde V1 es el volumen, en mL, de hidróxido de sodio O, 1 N y w1 es el peso, en mg, de la muestra de prueba. Calcular el porcentaje de (F3CC0)20 por la fórmula: 2100,3(B - A) No se encuentra menos de 97%. Si 2A es mayor que B, calcular el porcentaje de F3CCOOH por la fórmula: l 140,3(2A - B) Anilina, C6HsNH2-93, 13 ACS.
[62-53-3]-Usar grado reactivo
p-Anisaldehído ( 4-Metoxibenzaldehído), C8 H802-l 36, 15 L123-11-5]-Líquido transparente e incoloro. TEMPERATURA DE EBULLICION: 248º. DENSIDAD: entre 1, 119 y 1, 123. ÍNDICE DE REFRACCIÓN (831): entre 1,5725 y 1,5730 a 20º. p-Anisidina, C1H 9N0-123,06 [104-94-9]-Cristales marrones. Usar un grado adecuado. Anisol, CH30C6H 5-108, 14 [100-66-3]-Líquido incoloro. VALORACIÓN: Inyectar una muestra apropiada (aproximadamente 0,5 µL) en un cromatógrafo de gases adecuado (ver Cromatografía (621 )) equipado con un detector de ionización a la llama; el gas transportador es nitrógeno. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas: una columna capilar de 30 m recubierta con fase G3; mantener la temperatura del inyector y del detector a 140º y 300º, respectivamente; mantener la temperatura de la columna a 70º y programarla para que aumente 1Oº por minuto hasta 170º. El área del pico de anisol no es menos de 99% del área total. ÍNDICE DE REFRACCIÓN (831 ): 1,5160 a 20º. Antitrombina 111: La Antitrombina 111 humana (cofactor de heparina, inhibidor del factor 11. e inhibidor del factor X.) es un inhibidor de la proteasa de serina. Es una glicoproteína con un peso molecular de 58 000 Da.
USP 39
Una Unidad de Antitrombina 111 es la cantidad que se encuentra en 1 mL de plasma humano normal. La potencia de la antitrombina 111 no es menos de 4,0 Unidades de Antitrombina 111 por mg de proteína cuando se analiza en presencia de heparina. Presenta el 90% de homogeneidad cuando se analiza mediante Electroforesis en Gel de Poliacrilamida con Dodecil Sulfato de Sodio. La Antitrombina 111 utilizada para pruebas o valoraciones no contiene heparina en cantidades detectables. Analizar según se indica a continuación. A una solución que contenga 1 Unidad de Antitrombina 111 por mL, agregar 1 µL de solución de azul de toluidina. En presencia de heparina, el color cambia de azul a púrpura. Antraceno, C14H10-178,23 [120-12-7]-Cristales o plaquetas blancas a blanquecinas. Se oscurece al exponerlo a la luz solar. Insoluble en agua; moderadamente soluble en alcohol, en benceno y en cloroformo. INTERVALO DE FUSION (741): entre 215º y 218º. Antrona, C14H100-194,23 tivo ACS.
[90-44-8]-Usar grado reac-
Aprobarbital, C10H14N203-210,23 [77-02-1 ]-Polvo fino bfanco cristalino. Poco soluble en agua fría; soluble en alcohol, en cloroformo y en éter. VALORACIÓN: Disolver aproximadamente 200 mg, previamente secados a 105º durante 2 horas y pesados con exactitud, en 20 mL de dimetilformamida en un matraz Erlenmeyer de 100 ml. Agregar 4 gotas de solución azul de timol (1 en 200 en metanol) y valorar con metóxido de litio O, 1 N utilizando una bureta de 1O mL, un mezclador magnético y cubriendo el matraz para proteger contra el dióxido de carbono ambiental. Realizar una determinación con un blanco y hacer las correcciones necesarias. Cada mL de metóxido de litio O, 1 N equivale a 21,02 mg de C10H14N203. Se encuentra entre 98,5% y 101,0% de C10H14N203. INTERVALO DE FUSIÓN (741): entre 140º y 143º. Araquidato de Etilo, C22H44Q,-340,6 Usar un grado adecuado.
[18281-05-5]-
Araquidato de Metilo (Éster metílico del ácido eicosanoico), C21 H4202-326,56 [1120-28-1 ]-Escamas blanquecinas. VALORACIÓN: Inyectar una muestra apropiada en un cromatógrafo de gases (ver Cromatografta (621 )) equipado con un detector de conductividad térmica y usar helio como gas transportador. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas: una columna de vidrio de 2,0 mm x 1,8 m rellena con fase G2 al 5% sobre soporte Sl A; mantener la temperatura del inyector a 300º y mantener la temperatura del detector a 300º; mantener la temperatura de la columna a 230º y programarla para que aumente 3º por minuto hasta 280º. El área del pico de C2H42Ü2 no es menos de 99% del área total. INTERVALO DE FUSIÓN (741): entre 46º y 51º. Arena Estándar de Malla 20 a 30-Arena de sílice, compuesta casi en su totalidad por granos naturalmente redondeados de cuarzo casi puro. Principalmente estandarizada para pasar un tamiz de 850 µm (Nº 20) (porcentaje de pasada 85 a 100) y para quedar retenida en un tamiz de 600 µm (Nº 30) (porcentaje de pasada O a 5). [NOTA-Una arena de grado adecuado disponible es Ottawa Standard Sand de Thomas Scientific, 99 High Hill Road en 1-295, P.O. Box 99, Swedesboro, NJ 08085-0099.] Arena Lavada-Puede prepararse del siguiente modo: Digerir arena dura limpia a temperatura ambiente con una mezcla de 1 parte de ácido clorhídrico y 2 partes de agua (aproximadamente 13% de HCI) durante varios días, o a una temperatura elevada durante varias horas. Recoger la arena en un filtro y lavar con agua hasta que los lavados sean
USP 39 neutros y presenten sólo una ligera reacción al cloruro; luego, secar. La arena lavada cumple con las siguientes pruebas. SUSTANCIAS SOLUBLES EN ÁCIDO CLORHÍDRICO: Digerir 1o g con una mezcla de 1O mL de ácido clorhídrico y 40 mL de agua en un baño de vapor durante 4 horas, reponiendo ocasionalmente el agua perdida por evaporacion. Filtrar, y a 25 mL del filtrado, agregar 5 gotas de ácido sulfúrico, evaporar e incinerar hasta peso constante: el residuo no pesa más de 8 mg (O, 16%). CLORUROS (Prueba para reactivos): Agitar 1 g con 20 mL de agua durante 5 minutos, filtrar y agregar al filtrado 1 mL de ácido nítrico y 1 mL de nitrato de plata SR: cualquier turbidez producida se corresponde con no más de 0,03 mg de CI (0,003%). Arseniato Monobásico de Potasio, KH2AsÜ4-180,03 [7784-41-0]-Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 98%. Arseniato de Sodio (Sal Sódica de Ácido Arsénico), Na2HAs04 · 7H20-312,01 [10048-95-0]-Usar grado reactivo ACS. Arsenito de Sodio, NaAs02-129,91 [7784-46-5]-Polvo cristalino bJanco. Soluble en agua; poco soluble en alcohol. VALORACION: Transferir aproximadamente 5,5 g, pesados con exactitud, a un matraz volumétrico de 500 mL, disolver y diluir a volumen con agua y mezclar. Pipetear 25 mL de esta solución y transferirlos a un recipiente adecuado, agregar 50 mL de agua y 5 g de fosfato dibásico de sodio, agitar por rotación suave hasta disolver y valorar con yodo O, 1 N SV, agregando 3 mL de almidón SR cerca del punto final. Cada mL de yodo O, 1 N equivale a 3,746 mg de As. Se encuentra entre 57,0% y 60,5% (equivalente a entre 98,8% y 104,9% de NaAs02). CLORUROS (Prueba para reactivos): Un g no presenta más de O, 1O mg de CI (0,01 %). METALES PESADOS: Disolver 200 mg en 8 mL de ácido clorhídrico diluido (3 en 8) y evaporar hasta sequedad en un baño de vapor. Disolver el residuo en 5 mL de ácido clorhídrico diluido (2 en 5) y nuevamente evaporar hasta sequedad. Disolver el residuo en 1O mL de agua y agregar 2 mL de ácido acético diluido y 1O mL de sulfuro de hidrógeno SR. Si se produce color marrón, éste no es más oscuro que el de un control que contenga 0,01 mg de Pb agregado (0,005%). HIERRO: Disolver 1 g en 20 mL de ácido clorhídrico diluido (1 en 5) y agregar, gota a gota, un ligero exceso de bromo SR. Calentar a ebullición la solución para eliminar el exceso de bromo, enfriar, diluir con agua a 40 mL y agregar 1O mL de solución de tiocianato de amonio (3 en 1O). Si se produce color rojo, éste no es más oscuro que el de un control que contenga 0,02 mg de Fe agregado (0,02%). SULFUROS: Disolver 1 g en 20 mL de agua y agregar 5 90tas de acetato de plomo SR: no se produce color marron (aproximadamente 0,0005%). SULFATOS (Prueba para reactivos, Método lf): Disolver 5 g en 100 mL de a~ua, agregar anaranjado de metilo SR, neutralizar con acido dornídrico 1 N, agregar 3 mL del ácido en exceso y filtrar: el filtrado no contiene más de 3 mg de residuo (0,02%). Aserrín Purificado-Puede prepararse según se indica a continuación. Extraer aserrín en un percolador, primero con solución de hidróxido de sodio (1 en 100) y luego con ácido clorhídrico diluido (1 en 100) hasta que ef percolado ácido resulte negativo en la prueba de alcaloides con yodomercuriato de potasio SR o con yodo SR. Luego, lavar con agua hasta que quede libre de acido y sales solubles, y secar. El aserrín purificado cumple con la siguiente prueba. ALCALOIDES: A 5 g de aserrín purificado contenidos en un matraz agregar 50 mL de una mezcla de 2 volúmenes de
Reactivos / Especificaciones de Reactivos 2299 éter y 1 volumen de cloroformo, y 1O mL de amoníaco SR; agitar frecuentemente durante 2 horas. Decantar 20 mL de la mezcla de éter-cloroformo transparente y evaporar hasta sequedad. Disolver el residuo en 2 mL de acido clorhídrico diluido (1 en 12) y dividir en dos porciones. A 1 porción agregar yodomercuriato de potasio SR y a la otra yodo SR: no se produce turbidez en ninguna de las porciones.
L-Asparagina (Ácido L-2-Aminosuccinámico), COOHCH(NH2)CH2CONH2·H20-150,13 [70-47-3]Cristales incoloros. Un g se disuelve en 50 mL de agua; soluble en ácidos y en álcalis; insoluble en alcohol y en éter. Las soluciones neutras o alcalinas son levógiras; las soluciones ácidas son dextrógiras. ROTACIÓN ESPECÍFICA (781): entre +31º y +33º, determinado en una solución en ácido clorhídrico diluido que contenga el equivalente a 5 g (con respecto a la sustancia anhidra, según se determina al secar a 105º durante 5 horas) por cada 100 ml. RESIDUO DE INCINERACIÓN (Prueba para reactivos): no más de 0,1%. CLORUROS (Prueba para reactivos): Un g presenta no más de 0,03 mg de CI (0,003%). SULFATOS (Prueba para reactivos, Método f): Un g presenta no más de 0,05 mg de SQ4 (0,005%). METALES PESADOS Prueba ara reactivos : 0,002%. se encuentra entre 1 Azida Sódica, NaNr-65,01 [26628-22-8]-Polvo blanco. VALORACIÓN [PRECAUCIÓN: La azida sódica es un veneno potente. Su ácido conjugado HN 3 es más tóxico que el cianuro de hidrógeno y se libera fácilmente de soluciones acuosas neutras. El contacto de NaN3 o ácido hidrazoico (HN3) con ciertos metales puede producir sales explosivas. Trabajar en una campana bien ventilada y manipular la muestra con cuidado.j Disolver aproximadamente 100 mg, pesados con exactitud, en 50 mL de agua y agregar 3 gotas de fenolftaleína. Si fuera necesario, ajustar el pH a 7,0 y agregar 35,0 mL de ácido perclórico O, 1 N. Pipetear y transferir a la solución, mientras se mezcla, 2,5 mL de nitrito de sodio 1,0 M y mezclar durante 15 segundos. Valorar rápidamente con hidróxido de sodio 0, 1 N hasta el punto final de la fenolftaleína. El punto final debe alcanzarse en menos de 4 minutos después de awegar el ácido perclórico debido a que el HN3 se volatiza facilmente. Calcular el porcentaje de azida por la fórmula: [(Np)(Vp) - (N,)(V,)](65,01)(100)/2C en donde Np es la normalidad de la solución de ácido perclórico; Vp es el volumen tomado de ácido perclórico, en mL; N, es la normalidad de la solución de hidróxido de sodio; V, es el volumen tomado de hidróxido de sodio, en mL; 65,01 es el peso molecular de la azida sódica; y C es el peso, en mg, de azida sódica. No se encuentra menos de 98,5% de NaN3. Azufre-Usar Azufre Precipitado (monografía de la USP). Azul Brillante Coomassie R-250, C4sH44N3Ü7S2Na-825,97 [6104-58-1 ]-Polvo marrón. Azul de Anilina (Azul de Anílína Biológico Certificado), [8004-91-9]-Colorante soluble en agua constituido por una mezcla de trisulfonatos de trifenilpararosanilina y de difenilrosanilina.
2300 Especificaciones de Reactivos /Reactivos Azul de Coomassie G-250 (Azul Brillante de Coomassie G250, Azul Serva G), C41H4sN301S2Na-854,0 [6104-58-1 ]-Polvo azul oscuro. Soluble en agua. Usar un grado adecuado. Almacenar a una temperatura entre 15º y 30º. Azul de Hidroxinaftol (Sal Disódica del Ácido 7-(ácido2-naftolazo-3,6-disulfónico-2-naftol-4-sulfónico
C20H12N2011S3Na2-598,50 [165660-27-5]-Depositado sobre cristales de cloruro de sodio en una concentración de aproximadamente 1%. Usar grado reactivo ACS. Azul de Metileno, C16H1sCIN3S · 3H20-373,90 [7220-79-3]-Polvo cristalino o cristales de color verde oscuro con un brillo similar al bronce. Un g se disuelve en aproximadamente 25 ml de agua y en aproximadamente 65 ml de alcohol. Soluble en cloroformo. Usar un grado adecuado con un contenido de colorante no menor de 85%.
Azul de Tetrazolio (Dicloruro 3,3'-(3,3'-dimetoxi[7, 7'-bifenil]4,4'-diil)bis[2,5-difenil-2H-tetrazolio]), C40H32ClzNs02-727,64 [1871-22-3]-Cristales de color amarillo limón. Poco soluble en agua; fácilmente soluble en cloroformo y en metanol; insoluble en acetona y en éter. SOLUBILIDAD EN METANOL: Disolver 1 g en 100 ml de metano!: se disuelve completamente y la solución es transparente. COLOR: Transferir una porción de la solución en metanol obtenida en la prueba anterior a una celda de 1 cm y determinar su absorbancia a 525 nm, empleando agua como
~~~~~~~¡~t~,ITT~~~,~~4'~~X!?!,,ct;:"Q'~~~'iw0~1!~ií1illlf!li!!. mr~~~-••m*il~·
Su absortividad molar en metanol, a 252 nm, no es menor de 50 000. PRUEBA DE APTITUD Preparación Estándar: Disolver en alcohol una cantidad adecuada de ER Hidrocortisona USP, previamente secada a 105º durante 3 horas y pesada con exactitud, y preparar por diluciones sucesivas una solución que contenga aproximadamente 1Oµg por ml. Procedimiento: Pipetear porciones de 1O, 15 y 20 ml de la Preparación Estándar y transferir a sendos matraces Erlenmeyer, de 50 ml, con tapones de vidrio. Agregar 1O ml y 5 ml de alcohol, respectivamente, a los matraces que contienen las porciones de 1O y 15 ml de la Preparación Estándar, y mezclar agitando por rotación suave. A cada uno de los matraces y a un cuarto matraz que contenga 20 ml de alcohol, agregar 2,0 ml de una solución preparada mediante la disolución de 50 mg de azul de tetrazolio en 1O ml de alcohol, mezclar, y luego agregar 2,0 ml de una solución preparada mediante la dilución de 1 ml de hidróxido de tetrametilamonio SR con alcohol hasta 1O ml. Mezclar, dejar los matraces en reposo en la oscuridad durante 90 minutos y determinar las absorbancias de las tres soluciones del estándar de esteroide a 525 nm, con un espectrofotómetro adecuado, usando la solución del cuarto matraz como blanco. Graficar las absorbancias sobre la abcisa y la cantidad de hidrocortisona sobre la ordenada de un papel de coordenadas aritméticas y trazar la curva de mejor ajuste: la absorbancia de cada solución es proporcional a la concentración y la absorbancia de la solucion que contiene 200 µg de hidrocortisona no es menor de 0,50. Azul de Toluidina, (C1sH16CIN3S)2 · ZnClz-747,95 [6586-04-5]-Usar un grado adecuado. Azul de Toluidina O, C1sH16N3SCl-305,8 Usar un grado adecuado.
[92-31-9]-
USP 39 Azul de Tripán (Azul Directo 74), C34H24N6Na4Ü14S4-960,8 [72-57-1 ]-Usar un grado adecuado. Azul FD&C Nº 1 (Azul Brillante), C31H34N209S3Na2792,86 [3844-45-9]-Usar un grado adecuado. Azur A, C14H14CIN3S-291,80 adecuado.
[531-53-3]-Usar un grado
Bálsamo de Canadá [8007-47-4]-Producto natural obtenido de la resina del Abies balsamea. Usar un grado adecuado. Barbital Sódico, CsH11 NiNa03-206,2 [144-02-5]-Polvo blanco cristalino o cristales incoloros. Fácilmente soluble en agua; poco soluble en alcohol. Usar un grado reactivo adecuado. Beclometasona, C22H29CIOs-408,92 [4419-39-0]-Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 99%. [929-77-1 ] Behenato de Metilo, C23H46Ü2-354,61 Polvo blanco. VALORACIÓN: Inyectar una muestra apropiada en un cromatógrafo de gases (ver Cromatografta (621 )) equipado con un detector de conductividad térmica; usando helio como gas transportador. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas: una columna de vidrio de 2,0 mm x 1,8 m, rellena con fase G3 al 5% sobre soporte SlA; mantener la temperatura del inyector a 300º, mantener la temperatura del detector a 300º, la temperatura inicial del horno es 220º, la cual se mantiene durante 2 minutos, y luego programar para que aumente 3º por minuto hasta alcanzar una temperatura final de 270º, la cual se mantiene durante 1O minutos. El área del pico de C23H4602 no es menos de 98% del área total. INTERVALO DE FUSIÓN (741 ): entre 54º y 56°. Benceno, C6H6-78, 11 ACS.
[71-43-2]-Usar grado reactivo
Bencenosulfonamida, C6HsS02NH2-157, 19 [98-10-2]Cristales blancos a beige pálido. INTERVALO DE FUSIÓN (741): entre 150º y 153º. Bencenosulfonato de Metilo, C1Hs03S-172,20 [80-18-2]-Usar un grado adecuado. 2-Bencilaminopiridina, C12H12Nz-184,24 Usar un grado adecuado.
[ 6935-27-9]-
1-Bencilimidazol, C10H10N2-158,20 [4238-71-5]-Cristales blancos. VALORACIÓN: Transferir aproximadamente 40 mg, pesados con exactitud, a un vaso de precipitados de 100 ml. Disolver en 50 ml de ácido acético glacial. Valorar con ácido perclórico O, 1 N SV, determinando el punto final potenciométricamente con un electrodo combinado de calomelplatino. Realizar una determinación con un blanco y hacer las correcciones necesarias. Cada ml de ácido perclórico O, 1 N equivale a 15,82 mg de C10H10N2. No se encuentra menos de 99%. Bencina de Petróleo-Ver Éter de Petróleo. Benzaldehído, C1H60-106, 12 [100-52-7]-Líquido incoloro, muy refractivo. Soluble en agua; miscible con alcohol, con éter, y con aceites fijos y volátiles. VALORACIÓN: Pipetear aproximadamente 1 ml, transferir a un frasco para pesada con tapón de vidrio tarado y pesar con exactitud. Aflojar el tapón y transferir el frasco para pesada y su contenido a un matraz Erlenmeyer de 250 ml que contenga 25 ml de una solución hidroalcohólica de
Reactivos/ Especificaciones de Reactivos 2301
USP 39 clorhidrato de hidroxilamina (que se prepara disolviendo 34,7 g de clorhidrato de hidroxilamina en 160 mL de agua, luego agregar alcohol hasta 1000 mL y neutralizar frente a azul de bromofenol agregando hidróxido de sodio SR). Empleando una probeta graduada para medir el volumen, enjuagar las paredes del matraz con 50 mL adicionales de esta solución reactivo. Dejar la solución en reposo durante 1O minutos, agre~ar 1 mL de azul de bromofenol SR y valorar el ácido clorh1drico liberado con hidróxido de sodio 1 N SV. Realizar una determinación con un blanco utilizando las mismas cantidades de los mismos reactivos y hacer las correcciones necesarias. Cada mL de hidróxido de sodio 1 N consumido equivale a 106, 1 mg de C1H60. No se encuentra menos de 98%. PESO ESPECÍFICO (841 ): entre 1,041 y 1,046. ÍNDICE DE REFRACCIÓN (831 ): entre 1,5440 y 1,5465 a 20º. ÁCIDO CIANHÍDRICO: Agitar 0,5 mL con 5 mL de agua, agregar 0,5 mL de hidróxido de sodio SR y O, 1 mL de sulfato ferroso SR, y entibiar la mezcla moderadamente. Agregar un pequeño exceso de ácido clorhídrico: no se observa un color azul verdoso ni un precipitado azul dentro de los 15 minutos. Benzanilida, C13H11 N0-197,23 [93-98-1 ]-Polvo blanquecino o gris claro a verde grisáceo. Insoluble en agua; moderadamente soluble en alcohol; poco soluble en éter. INTERVALO DE FUSIÓN (741): entre 162º y 165º. SOLUBILIDAD EN ACETONA: Una porción de 1,0 g se disuelve completamente en 50 mL de acetona y produce una solución transparente. Benzhidrol (a-Fenilbencenometanol), C13H120-184,23 [91-01-0]-Cristales blancos a amarillo pálido. Muy poco soluble en agua; soluble en alcohol, en éter y en cloroformo. INTERVALO DE FUSIÓN (741): entre 65º y 67º, pero el intervalo entre el comienzo y el final de la fusión no excede de 2º. Benzoato de Butilo, C11 H1402-178,23 [136-60-7]-Líquido espeso, oleoso, de incoloro a amarillo pálido. Prácticamente insoluble en agua; soluble en alcohol y en éter. VALORACIÓN: La pureza, cuando se examina mediante cromatografía de gas-líquidos, no es menos de 98%. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas para valorarlo: una columna de acero inoxidable de 3 mm x 1,8 m rellena con fase líquida G4 sobre soporte Sl A. Usar helio como gas transportador, mantener la temperatura del inyector a 180º, la temperatura de la columna a 190º y mantener el detector de ionización a la llama a 280º. El tiempo de retención es de aproximadamente 15 minutos. ÍNDICE DE REFRACCIÓN (831 ): entre 1,4980 y 1,5000 a 20º. Benzoato de Colesterilo, C34HsoÜ2-490,76 Usar un grado adecuado.
[604-32-0]-
Benzoato de Etilo, C9H10Ü2-150,17 [93-89-0]-Líquido incoloro y transparente. Prácticamente insoluble en agua, miscible con alcohol, cloroformo y éter. VALORACIÓN: Inyectar una muestra apropiada en un cromatógrafo de gases adecuado (ver Cromatografía (621 )), usando helio como gas transportador. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas: una columna de acero inoxidable de 3 mm x 2,4 m con fase Gl 6 al 20% sobre un soporte Sl A; las temperaturas del inyector, de la columna y del detector deben mantenerse a 180º, 195º y 250º, respectivamente. El área del pico de benzoato de etilo no es menos de 98% del área total. ÍNDICE DE REFRACCIÓN (831): entre 1,5048 y 1,5058 a 20º. Benzoato de Testosterona (Benzoato de 4-Androsten- 71/3ol-3-ona), C26H32Ü3-392,54--Usar un grado adecuado.
Benzofenona, (C6Hs)2C0-182,22 [119-61-9]-Polvo cristalino blanco. INTERVALO DE FUSIÓN (741): entre 47º y 49º. p-Benzoquinona, (Quinona), C6H4Ü2-l 08,09 [106-51-4]-Polvo amarillo oscuro con un matiz verde. Poco soluble en agua; soluble en alcohol, en éter y en soluciones de álcalis fijos. Puede oscurecerse en reposo. El material oscurecido puede purificarse mediante sublimación al vacío. INTERVALO DE FUSIÓN (741): entre 113º y 115º. Beta Lactosa (/3-D-Lactosa), C12H22011-342,30-Polvo de color blanco a amarillo pálido. El contenido de a-o-lactosa no es más de 35%. VALORACIÓN: Inyectar una muestra derivatizada apropiada en un cromatógrafo de gases (ver Cromatografía (621 )) equipado con un detector de ionización a ía llama, usando helio como gas transportador. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas: una columna capilar de 0,25 mm x 30 m, recubierta con una capa de fase G43 de 1 µm; mantener la temperatura del inyector a 250º; mantener la temperatura del detector a 250º; mantener la temperatura de la columna a 20º y programar para que aumente 8º por minuto hasta 280º. El área del pico de C12H22011 no es menos de 99% del área total. Beta-lactamasa-La Beta-lactamasa es una enzima producida por varias bacterias, pero suele obtenerse a partir de filtrados de cultivo de una cepa de Bacillus cereus. Tiene la propiedad específica de inactivar las penicilinas y las cefalosporinas rompiendo la unión entre el nitrógeno de la tiazolidina y el carbono del carbonilo adyacente. Se presenta en forma de piezas o gránulos pequeños y fácilmente pulverizables de color marrón. Fácilmente soluble en agua, formando una solución ligeramente opalescente que es prácticamente neutra al papel tornasol. Precipita de sus soluciones acuosas con acetona, alcohol y dioxano, y se inactiva por el contacto con estos disolventes. Se inactiva rápidamente con acetato de etilo y se destruye de forma irreversible a una temperatura de aproximadamente 80º. La valoración de la beta-lactamasa se realiza utilizando un procedimiento basado en la determinación de la cantidad de penicilina G potásica o penicilina G sódica destruida a un pH de 7,0 en una solución a una concentración tal que la inactivación tiene lugar como una reacción de orden cero. Betanaftol-Ver 2-Naftol. Bibencilo (Dibencilo), C14H14-182,26 [103-29-7]-Cristales incoloros. Fácilmente soluble en cloroformo y en éter; moderadamente soluble en alcohol; prácticamente insoluble en agua. INTERVALO DE FUSIÓN (741): entre 53° y 55°. Bicarbonato de Aminoguanidina (Carbonato Ácido de Aminoguanidina), CH6N4 · H2CÜ3-l 36, 11 [2582-30-1 ]-Polvo blanco. VALORACIÓN: Disolver aproximadamente 34 mg, pesados con exactitud, en 50 mL de ácido acético glacial. Valorar con ácido perclórico O, 1 N SV determinando el punto final potenciométricamente. Realizar una determinación con un blanco y hacer las correcciones necesarias. Cada mL de ácido perclórico O, 1 N equivale a 13,61 mg de CH 6N4 . H2C03. No se encuentra menos de 98,5%. PUNTO DE FUSIÓN (741 ): aproximadamente 170º, con descomposición. Bicarbonato de Amonio (Carbonato Ácido de Amonio), NH4HC03-79,06 [1066-33-7]-Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 99,0%. Bicarbonato de Potasio, KHC03-l 00, 12 Usar grado reactivo ACS.
[298-14-6]-
2302 Especificaciones de Reactivos /Reactivos Bicarbonato de Sodio, NaHCOr--84,01 Usar grado reactivo ACS.
[144-55-8]-
Bifenilo, C12H10-154,21 [92-52-4]-Polvo cristalino o cristales incoloros a blancos. Insoluble en agua; soluble en alcohol y en éter. Su punto de ebullición es aproximadamente de 254 º. INTERVALO DE FUSIÓN (741 ): entre 68º y 72º. Bifenilo de Sodio, C12H9Na-l76, 19-Está disponible como una solución en 2-etoxietil éter o en 1,2-dimetoxietano (diéter de dietilenglicol). ACTIVIDAD: Colocar 20 mL de tolueno seco en un matraz para volumetría equipado con una barra mezcladora magnética y un tapón que tenga un orificio adecuado para introducir la punta de descarga de una bureta para pesar. Agregar una cantidad de bifenilo de sodio suficiente hasta producir un color azul en la mezcla y valorar con alcohol amílico, contenido en la bureta para pesar, hasta que desaparezca el color azul. (No tomar en cuenta las cantidades de bifenilo de sodio y alcohol amílico utilizadas en este ajuste). Pesar con exactitud la bureta para pesar que contiene el alcohol amílico. Transferir el contenido de un vial de muestra de prueba, bien mezclada, al matraz para volumetría y valorar, rápidamente, con el alcohol amílico hasta que desaparezca el color azul. Pesar la bureta para determinar el peso del alcohol amílico consumido y calcular la actividad, en mEq/vial, por la fórmula: Resultado
= 11,25W
en donde W es el peso del alcohol amílico consumido. Se encuentra no menos de 10% de actividad. CONTENIDO DE YODO: Agregar 1o mL a 5 mL de tolueno contenido en un separador de 125 mL, equipado con una llave de paso de plastico inerte adecuada, y agitar vigorosamente durante 2 minutos. Extraer cuidadosamente con tres porciones de 1O mL de ácido fosfórico diluido (1 en 3), combinando las fases inferiores en un matraz para yodo de 125 ml. Agregar hipoclorito de sodio SR, gota a gota, a los extractos combinados hasta que la solución se torne marrón y luego agregar 0,5 mL en exceso. Agitar intermitentemente durante 3 minutos, agregar 5 mL de una solución de fenol saturada recién preparada, mezclar, y dejar en reposo durante 1 minuto, cronometrado con exactitud. Agregar 1 g de yoduro de potasio, agitar durante 30 segundos, agregar 3 mL de almidón SR y valorar con tiosulfato de sodio O, 1 N SV: consume no más de O, 1 mL de tiosulfato de sodio O, 1 N. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado como número de catálogo 277134 en www.sigma-aldrich.com o como número de catálogo 54101 en www.gfschemicals. com.] Bifosfato de Potasio-Ver Fosfato Monobásico de Potasio. Bifosfato de Sodio, NaH2PÜ4 · H20-137,99-Usar Fosfato Monobásico de Sodio de grado reactivo ACS. Biftalato qe Potasio (Ftalato Ácido de Potasio; Sal Monppotásica del Acido Ftálico; Estándar Acidimétrico de Ftalato Acido de Potasio), KHC6H4(C00)2-204,22 [877-24-7]-Usar
Estándar Acidimétrico de Ftalato Acido de Potasio de grado reactivo ACS. 2,2'-Bipiridina (a,a' -Dipiridilo), C10HsN2-156, 18 [366-18-7]-Polvo cristalino blanco o rosado. Soluble en agua y en alcohol. Funde aproximadamente a 69º y entra en ebullición aproximadamente a 272º. SENSIBILIDAD: Preparar las siguientes soluciones: (A)-Disolver 350 mg de sulfato de amonio ferroso en 50 mL de agua que contenga 1 mL de ácido sulfúrico y agregar 500 mg de sulfato de hidrazina, después agregar agua para obtener 500 ml. Para utilizarla, diluir esta solución
USP 39 con agua en la proporción de 1 en 100 ml. (B)-Disolver 8,3 g de acetato de sodio y 12 mL de ácido acético glacial en agua para obtener un volumen de 100 ml. Agregar 1 mL de una solución de la muestra (1 en 1000) a una mezcla de 1O mL de agua, 1 mL de solución A y 1 mL de solución B: de inmediato aparece un color rosado. SOLUBILIDAD: Una porción de 100 mg se disuelve completamente en 1O mL de agua. RESIDUO DE INCINERACIÓN (Prueba para reactivos): no más de 0,2%. Bismuto, Bi-208,98 [7440-69-9]-Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 99,999%. Bis(4-Sulfobutil) Éter Disódico, Na2CsH1607S2-334,32Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 95%. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado en www. cydexpharma.com con número de catálogo RM-969-C50.] Bis(trimetilsilil)acetamida (N, 0-Bis(trimetilsilil)acetamida; BSA), CH3CON[Si(CH3)3)i-203,43 [10416-59-8]-Líquido transparente incoloro. Se hidroliza rápidamente cuando se expone al aire húmedo. Manipular bajo nitrógeno y guardar en un lugar fresco. VALORACIÓN: No menos de 90% de CH3CON[Si(CH3)3)i, empleando un cromatógrafo de gases adecuado equipado con un detector de conductividad térmica. Las siguientes condiciones son adecuadas y proporcionan un tiempo de retención de aproximadamente 15 minutos. Columna: de acero inoxidable de 3 mm x 1,83 m con fase G1 al 5% sobre soporte Sl A. Temperatura del inyector: 160º. Temperatura de la columna: 90º, programada para aumentar 4º por minuto hasta 160º. , Gas transportad9r: Helio. INDICE DE REFRACCION (831): entre 1,4150y1,4170 a 20º. Bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida (N,0-Bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida; BSTFA), CF3CQN[Si(CH3)3]r-257,40 [25561-30-2]-Líquido transparente incoloro. Se hidroliza rápidamente cuando se expone al aire húmedo. Almacenar en un lugar fresco. VALORACIÓN: No menos de 98% de CF3CQN[Si(CH3)3)i, empleando un cromatógrafo de gases adecuado equipado con un detector de conductividad térmica. Las siguientes condiciones son adecuadas y proporcionan un tiempo de retención de aproximadamente 15 minutos. Columna: de acero inoxidable de 3 mm x 1,83 m con fase Gl al 5% sobre soporte Sl A. Temperatura del inyector: 170º. Temperatura de la columna: 70º, programada para aumentar 4º por minuto hasta 140º. Gas transportador: Helio. ÍNDICE DE REFRACCIÓN (831): entre 1,3820 y 1,3860 a 20º. Bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida con Trimetilclorosilano [25561-30-2]-Usar un grado adecuado. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado en SigmaAldrich, www.sigma-aldrich.com.] Bisulfato de Amonio (Sulfato Ácido de Amonio), NH4HS04115, 11 [7803-63-6]-Cristales blancos. Fácilmente soluble en agua; prácticamente insoluble en alcohol, en acetona y en piridina. VALORACIÓN: Disolver aproximadamente 300 mg, pesados con exactitud, en 50 mL de una mezcla de agua y alcohol (25:25). Valorar con hidróxido de sodio O, 1 N SV, determinando el punto final potenciométricamente. Realizar una determinación con un blanco y hacer las correcciones necesarias. Cada mL de hidróxido de sodio O, 1 N equivale a 11,51 mg de NH4HS04. No se encuentra menos de 98%.
USP 39 Bisulfato de Potasio, KHS04-l 36, 17 [7646-93-7]Masas o gránulos fundidos, blancos, delicuescentes. Muy soluble en agua. Cuando se incinera, produce S03 y H20, cambiando primero a pirosulfato de potasio y luego a sulfato. ACIDEZ: Disolver 4 g, pesados con exactitud, en 50 ml de agua, agregar fenolftaleína SR y valorar con álcali 1 N: contiene entre 34% y 36%, calculados como H2S04. MATERIA INSOLUBLE y PRECIPITADO DE HIDRÓXIDO DE AMONIO: Disolver 1 O g en 1 00 ml de agua, agregar rojo de metilo SR, alcalinizar ligeramente con amoníaco SR, calentar a ebullición durante 1 minuto y digerir en un baño de vapor durante 1 hora. Pasar a traves de un crisol para filtración tarado, lavar meticulosamente y secar a 105º durante 2 horas: el precipitado pesa no más de 1 mg (0,01 %). Para las siguientes pruebas preparar una Solución de prueba según se indica a continuación. Disolver 6 g en 45 ml de agua, agregar 2 ml de ácido clorhídrico, calentar a ebullición moderada durante 1O minutos, enfriar y diluir con agua hasta 60 ml. METALES PESADOS (Prueba para reactivos): A 30 ml de Solución de prueba agregar fenolftaleína SR y neutralizar con amoníaco SR. Agregar 0,5 ml de ácido acético glacial, diluir con agua hasta 40 ml y agregar 1 O ml de sulfuro de hidrógeno SR: el color marrón producido no es más oscuro que el de una solución control que contenga 1 O ml de Solución de prueba y 0,02 mg de Pb agregado (0,001 %). HIERRO (241 ): A 5 ml de Solución de prueba agregar 2 ml de ácido clorhídrico y diluir con agua hasta 47 ml: la solución no presenta más de 0,01 mg de Fe (0,002%). Bisulfito de Sodio [7631-90-5]-Este reactivo generalmente es una mezcla de bisulfito de sodio y metabisulfito de sodio [7681-57-4]. Usar Bisulfito de Sodio de grado reactivo ACS. Bitartrato de Sodio, NaHC4H406 · H20-190,08 [6131-98-2]-Cristales blancos o polvo cristalino. Soluble en agua fría. VALORACIÓN: Disolver aproximadamente 500 mg, pesados con exactitud, en 30 ml de agua. Agregar fenolftafeína SR y valorar con hidróxido de sodio O, 1 N SV: cada ml de hidróxido de sodio O, 1 N equivale a 19,01 mg de NaHC4H406 · H20. Se encuentra entre 99% y 100,5%. MATERIA INSOLUBLE (Prueba para reactivos): no más de 1 mg, a partir de 1O g (0,01 %) CLORUROS (Prueba para reactivos): Un g presenta no más de 0,2 mg de CI (0,02%). METALES PESADOS (Prueba para reactivos): Disolver 4 g en 25 ml de agua, agregar 2 gotas de fenolftaleína SR y fuego agregar amoníaco SR, gota a gota, hasta que la solución se torne ligeramente rosada. Agregar 4 ml de ácido clorhídrico 1 N, diluir con agua hasta 40 ml y agre9ar 1O ml de sulfuro de hidrógeno SR: cualquier color marran que se produzca no es más oscuro que el de un control que contenga 0,04 mg de Pb agregado (0,001 %). SULFATOS (Prueba para reactivos, Método /): Un g presenta no más de 0,2 mg de S04 (0,02%). Boldina (2, 9-Dihidroxi-1, 10-dimetoxiaporfina), C, 9H21 N04327,37 [476-70-0]-Usar un grado adecuado. Borato de Sodio (Bórax; Tetraborato de Sodio), Na2B401 · 1 OH20-381,37 [1303-96-4]-Usar grado reactivo ACS. [NOTA-El Bórax certificado se puede obtener en el Instituto de Normas y Tecnología de los EE.UU. (NIST, por sus siglas en inglés), www.nist.gov, como muestra de estándar Nº 187.] Borohidruro de Sodio, NaBH4-37,83 [16940-66-2]-Sólido cristalino blanco. Fácilmente soluble en agua; soluble (con reacción) en metanol. Sus soluciones se descomponen rápidamente por ebullición.
Reactivos
/Especificaciones de Reactivos 2303
VALORACIÓN Solución de yodato de potasio: Disolver en agua 8,917 g, previamente secados a 11 Oº hasta peso constante y pesados con exactitud, para obtener 1000,0 ml. Procedimiento: Disolver en un matraz volumétrico de 250 ml, aproximadamente 500 mg, pesados con exactitud, en 125 ml de solución de hidróxido de sodio (1 en 25), diluir a volumen con la solución de hidróxido de sodio y mezclar. Pipetear 1 O ml de la solución y transferir a un matraz para yodo de 250 ml, agregar 35,0 ml de Solución de yodato de potasio y mezclar. Agregar 2 g de yoduro de potasio, mezclar, agregar 1 O ml de ácido sulfúrico diluido (1 en 1 O), tapar el matraz y dejar en reposo durante 3 minutos en la oscuridad. Valorar la solución con tiosulfato de sodio O, 1 N SV, agregando 3 ml de almidón SR cerca del punto final. Calcular la cantidad, en mg, de NaBH4 en la muestra valorada, por la fórmula: ([(35,0)(0,25)] - 0, 1V)4,729 en donde V es el volumen, en ml, del tiosulfato de sodio O, 1 N usado en la valoración. No se encuentra menos de 98%. Bromato de Potasio, KBr03-167,00 grado reactivo ACS.
[7758-01-2]-Usar
Cambio en la redacción: Bromelina_.[9001-00-7] Una glicoproteína que es tiol-proteinasa altamente activa. Se encuentra en las hojas y los tallos de la planta de la piña. Polvo de color blanco amarillento a bronceado. DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD Agua de pH 4,5; Ajustar con ácido clorhídrico O, 1 N a un pH de 4,5. Sustrato de gelatina: Disolver 25 g de gelatina en 375 ml de agua caliente. Calentar a ebulfición. Enfriar a 45º. Ajustar con ácido clorhídrico O, l N a un pH de 4,5. Diluir con Agua de pH 4,5 hasta 500 mL Mantener a 45°. Este sustrato debe prepararse a diario. Solución amortiguadora: Agregar 150 mg de cloruro de sodio a 700 ml de Agua de pH 4,5, mezclar hasta disolver,. luego agregar 5,7 ml de ácido acético.. Ajustar con hidróxido de soaio al 50% a un pH de 4,51 sí fuera neces¡'lrio. Diluir hasta 1 litro. Solución de peróxido de hidrógeno al 3%: Transferir 2,5 ml de peróxido de hidrógeno a un matraz volumétrico de 25. ml. Diluir con Agua de pH 4,5 a volumen. Solución de formafdehído de pH 9,0: Ajustar una solución de formaldehído de 100 ml con hidroxído de sodio 0,1 Na un pH de 9,0. Preparación de bromelina: Pesar 100 mg de bromelina con una actividad teórica de 2400 GDU/g. Si la .actividad de la muestra difiere en más de 10% de 2400 GDU/g, determinar el peso de la muestra: mg de muestra = (2400 x 100)/activídad teórica Transferir la muestra a un matraz volumétrico de 50 ml. Agregar 8,3 ml de Solución amortiguadora. Dejar en reposo durante 30 minutos a temperatura ambiente. Diluir con Agua de pH 4,5 a volumen. Agregar una barra mezcladora pequeña y mezclar durante 10-15 minutos. Esta solución debe analizarse dentro de 10~ 30 minutos posteriores a la adición de la Solución amr,:tiguadora. Procedimiento: Transferir 25 ml de Sustrato de gelatina a cada uno de dos vasos de precipitados de 100 ml que contienen barras mezcladoras y colocarlos en un baño de agua a 45º durante 5 minutos. Uno de los vasos de precipitados se usa para la Solución de prueba y el otro para la Solución blanco.
USP 39
2304 Especificaciones de Reactivos /Reactivos
50 ml de ácido acético glacial SR. Agregar cristal violeta SR y valorar con ácido perclórico O, 1 N SV. Realizar una determinación con un blanco y hacer las correcciones necesarias. Cada ml de ácido perclórico O, 1 N equivale a 17,20 mg de C6H 6BrN. No se encuentra menos de 98%. INTERVALO DE FUSIÓN (741 ): entre 60º y 65º, dentro de un intervalo de 2º. Bromofluorometano:
Usar un grado adecuado.
N-Bromosuccinimida, C4H4BrN02-l 77,98 [128-08-5]Polvo o cristales de color blanco a blanquecino. Fácilmente soluble en agua, acetona y ácido acético glacial. [PRECAUCIÓN-Sumamente irritante para los ojos, fa piel y las membranas mucosas.] VALORACIÓN: Transferir 200 mg, pesados con exactitud, a un matraz Erlenmeyer, agregar 25 ml de hidróxido de potasio alcohólico 0,5 N, tapar con un vidrio de reloj, calentar hasta ebullición y mantener en ebullición durante 5 minutos. Enfriar, transferir la solución a un vaso de precipitados, enjuagar el matraz con agua hasta que el volumen total de solución más los enjuagues sea de aproximadamente 100 ml y agregar 1O ml de ácido acetico glacial. Insertar electrodos adecuados, valorar con nitrato de plata O, 1 N SV y determinar el punto final potenciométricamente. Cada ml de nitrato de plata O, 1 N equivale a 17,80 mg de C4H4BrN02. No se encuentra menos de 98%. Bromuro de Amonio, NH4Br-97,94 grado reactivo ACS.
[12124-97-9]-Usar
Bromuro de Cetiltrimetilamonio (CTAB; Cetrimida; Bromuro de Hexadeciltrimetilamonio), C19H42BrN-364,46 [57-09-0]-Usar un grado adecuado. Para cualquier aplicación cromatográfica, usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 99,0%. Bromuro de Cianógeno, BrCN-105,92 [506-68-3]Cristales incoloros. Volátil a temperatura ambiente. Sus vapores son altamente irritantes y muy tóxicos. Funde aproximadamente a 52º. Fácilmente soluble en agua y en alcohol. Almacenar en envases impermeables en un lugar frío. SOLUBILIDAD: Sendas porciones de 1 g se disuelven completamente en 1O ml de agua y en 1O ml de alcohol, respectivamente, y producen soluciones incoloras. Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolio, C1sH16NsSBr-414,3 [298-93-1 ]-Polvo de color amarillo a anaranjado. Usar un grado adecuado. Bromuro de Dodeciltrimetilamonio (Bromuro de /auriftrimetilamonio), CH3(CH2)11N(CH3)3Br-308,3 [1119-94-4]Usar un grado adecuado. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado en SigmaAldrich, www.sigma-aldrich.com., con número de catálogo 05047.] Bromuro de Etidio, C21H20N3Br-394,3 [1239-45-8]Polvo de color púrpura a rojo purpúra. Usar un grado adecuado. Bromo, Br-Peso atómico 79,904 grado reactivo ACS.
[7726-95-6]-Usar
a-Bromo-2'-acetonaftona (Bromometif 2-naftil cetona), C12H9Br0-249, 10-Cristales de color rosado-tostado. INTERVALO DE FUSIÓN (741): entre 81º y 83º. p-Bromoanilina, C6H6BrN-l 72,02 [106-40-1 ]-Cristales blancos a blanquecinos. Insoluble en agua; soluble en alcohol y en éter. · VALORACIÓN: Transferir aproximadamente 650 mg, pesados con exactitud, a un recipiente adecuado y disolver en
Bromuro de Hexadeciltrimetilamonio-Ver Bromuro de Cetiltrimetilamonio. Bromuro de Hexadimetrina, (C13H30Br2N2)n [28728-55-4]Polvo blanco a blanquecino, higroscópico, polímero amorfo. Soluble en agua hasta 10%, produciéndose una solución incolora a amarillo claro. Usar un grado adecuado. Bromuro de Miristiltrimetilamonio (MTA, Bromuro de Tetradeciltrimetilamonio; Bromuro de Trimetil(tetradecil)amonio),
C11H 38 BrN-336,39 [1119-97-7]-Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 99%.
Reactivos / Especificaciones de Reactivos 2305
USP 39 Bromuro de p-Nitrobencilo, N02C6H4CH2Br-216,03-Cristales de color casi blanco a amarillo pálido que se oscurecen con la exposición a la luz. Prácticamente insoluble en agua; fácilmente soluble en alcohol, en éter y en ácido acético glacial. Almacenar en envases impermeables y resistentes a la luz. INTERVALO DE FUSIÓN (741): entre 98º y 100º. SOLUBILIDAD: Sendas porciones de 200 mg producen soluciones transparentes en 5 mL de alcohol y en 5 mL de ácido acético glacial. RESIDUO DE INCINERACIÓN (Prueba para reactivos): inapreciable, usando 200 mg. Bromuro de Potasio, KBr-119,00 grado reactivo ACS. Bromuro de Sodio, NaBr-102,89 grado reactivo ACS.
[7758-02-3]-Usar [7647-15-6]-Usar
Bromuro de Tetrabutilamonio, (C4H9)4NBr-322,37 [1643-19-2]-Usar grado reactivo ACS. Bromuro de Tetradecilamonio (Bromuro de Tetrakis(deci/)amonio), C40Hs4BrN-659,01 [14937-42-9]-Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 99%. Bromuro de Tetraheptilamonio, (C1H1s)4NBr-490,70 [4368-51-8]-Polvo escamoso blanco. INTERVALO DE FUSIÓN (741): entre 89º y 91º. Bromuro de Tetrametilamonio, (CH3)4NBr-154,05 [64-20-0]-Usar grado reactivo ACS. Bromuro de Trimetilestaño, C3H9BrSn-243,72 [1 066-44-0]-Usar un grado adecuado. Bromuro Mercúrico, HgBr2-360,40 grado reactivo ACS.
[7789-47-1 ]-Usar
1,4-Butano Sultona (Ácido 4-Hidroxibutano- 7-su/fónico deltasultona), C4H8 0 3S-136, 17 [1633-83-6]-Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 99%. 1,2-Butanodiol, (4H1002-90, 12 [584-03-2]-Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 97%. 1,3-Butanodiol (7,3-Butilenglicol), (4H1002-90, 12 [107-88-0]-Líquido viscoso incoloro. Muy higroscópico. Soluble en agua, en alcohol, en acetona y en metil etil cetona; prácticamente insoluble en hidrocarburos alifáticos, en benceno y en tolueno. VALORACIÓN: Inyectar una muestra apropiada en un cromatógrafo de gases adecuado (ver Cromatografía (621 )) equipado con un detector de ionización a la llama y usando helio como gas transportador. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas: una columna de acero inoxidable de 3 mm x 1,8 m, con fase Gl 6 al 20% sobre un soporte 51 A; mantener la temperatura del inyector a 265º; mantener la temperatura de la columna a 150º y programar para que aumente 8º por minuto hasta 21 Oº. El área del pico de butanodiol no es menos de 98% del área total. ÍNDICE DE REFRACCIÓN (831): entre 1,4390 y 1,4410 a 20º. 1,4-Butanodiol (7,4-Butilenglicol), CH10Ü2-90, 12 [110-63-4]-Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 98%. 2,3-Butanodiol (2,3-Butilenglicol), C4H10Ü2-90, 12 [513-85-9]-Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 97%. 2,3-Butanodiona (Diacetilo), CH3COCOCH3-86,09 [431-03-8]-Líquido de color amarillo brillante a verde ama-
rillento. Soluble en agua. Miscible con alcohol y con éter. Alcanza el punto de ebullición aproximadamente a 88º. VALORACION Solución de clorhidrato de hidroxilamina: Disolver 20 g de clorhidrato de hidroxilamina en 40 mL de agua y diluir con alcohol hasta 400 mL. Agregar mezclando 300 mL de hidróxido de potasio alcohólico 0,5 N SV y filtrar. Desechar después de 2 días. Procedimiento: Transferir aproximadamente 1 g, pesado con exactitud, a un matraz de 250 mL con tapón de vidrio, agregar 75,0 mL de Solución de clorhidrato de hidroxilamina y tapar el matraz. Calentar la mezcla a reflujo durante 1 hora, luego enfriar a temperatura ambiente. Agregar azul de bromofenol SR y valorar con ácido clorhídrico 0,5 N SV hasta un punto final amarillo verdoso. [NOTA-Alternativamente, se puede valorar la solución potenciométricamente a un pH de 3,4.] Realizar una prueba con un blanco utilizando las mismas cantidades de reactivos que las empleadas para la muestra de prueba y hacer las correcciones necesarias. Cada mL de ácido clorhídrico 0,5 N equivale a 43,05 mg de CH3COCOCH3. No se encuentra menos de 97% de CH3COCOCH3. TEMPERATURA DE SOLIDIFICACIÓN (651 ): entre -2,0º y -5,5º. ÍNDICE DE REFRACCIÓN (831): entre 1,3935 y 1,3965 a 20º. PESO ESPECÍFICO (841 ): aproximadamente O, 98. Butanol-Ver Alcohol Butílico. sec-Butanol-Ver Alcohol Butílico Secundario. terc-Butil Metil Éter, CsH120-88, 15 [1634-04-4]-Líquido incoloro. VALORACIÓN: Inyectar una muestra apropiada en un cromatógrafo de gases (ver Cromatograf1a (621 )) equipado con un detector de ionización a la llama, usando helio como gas transportador. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas: una columna capilar de 0,25 mm x 30 m recubierta con una capa de 1 µm de fase G2; mantener la temperatura del inyector a 100º; mantener la temperatura del detector a 300º y mantener la temperatura de la columna a temperatura ambiente y programarla para que aumente 1Oº por minuto hasta 150º. El área del pico de CsH120 no es menos de 99,8% del área total. ÍNDICE DE REFRACCIÓN (831): entre 1,367 y 1,371 a 20º.
C:anibio en la l'f!dacdqn: n-Butilamina, (H3CH2CH2CH2NH2-73, 14 [109-73-9]Líquido inflamable, incoloro a amarillo pálido. Miscible con agua, con alcohol y con éter. Almacenar en envases impermeables. Peso específico: aproximadamente 0,740. INTERVALO DE DESTILACIÓN, Método I (721 ): No menos de 95% destila entre 76º y 78º. •DETERMINACIÓN DE AGUA, Método 1 (921 )e {Af 01-may,2a16): no más de 1,0%, determinado por el Método Volumétrico. CLORUROS (Prueba para reactivos): Un g (1,5 mL) no presenta más de 0,01 mg de CI (0,001 %). IMPUREZAS ÁCIDAS: A 50 mL agregar 5 gotas de una solución saturada de azo violeta en benceno y valorar rápidamente con metóxido de sodio O, 1 N SV hasta un punto final azul intenso tomando precauciones para impedir la absorción de dióxido de carbono atmosferico, por ejemplo, mediante el empleo de una atmósfera de nitrógeno: para la neutralización no se requiere más de 1,0 mL de metóxido de sodio O, 1 N. Butilamina Normal-Ver n-Butilamina. terc-Butilamina, (3H9CNH2-73, 14
[75-64-9]-Líquido.
USP 39
2306 Especificaciones de Reactivos /Reactivos VALORACIÓN: Inyectar un volumen apropiado en un cromatógrafo de gases (ver Cromatografía (621 )) equipado con un detector de ionización a la llama; usando helio como gas transportador. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas: una columna capilar de 0,25 mm x 30 m, recubierta con una capa de fase G2 de 1 µm; mantener la temperatura del inyector a 230º; mantener la temperatura del detector a 300º; mantener la temperatura de la columna a 1 30º y programar para que aumente 1Oº por minuto hasta 280º. El área del pico de C3H9CNH 2 no es menos de 99,5% del área total. ÍNDICE DE REFRACCIÓN (831): entre 1,3770 y 1,3790 a 20º. terc-Butildimetilclorosilano en N-Metil-N-terc-butildimetilsililtrifluoroacetamida, (1 en 100)-Usar un grado adecuado. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado como MTBSTFA al 99%, TBDMCS al 1% en Regis Chemical Company, 821 O Austin Ave., P.O. Box 519, Morton Grave, IL 60053.] 4-terc-Butilfenol, C10H140-150,22 [98-54-4]-Agujas o escamas cristalinas blancas. Prácticamente insoluble en agua; soluble en alcohol y en éter. INTERVALO DE FUSIÓN (741 ): entre 98º y 101 º. t-Butiltiol (terc-Butiltiol; terc-Butil Mercaptan; 2-Metil-2-propanotiol; TBM), (CH3)3CSH-90, 19 [75-66-1 ]-Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 98,0%. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado como número de catálogo 20230 en www.sigma-aldrich.com.] Butiraldehído (Butano/), C4Hs0-72, 11 [123-72-8]-Usar un grado adecuado, purificado por redestilación, con un contenido de no menos de 99,5%.
VALORACIÓN: Inyectar un volumen apropiado en un cromatógrafo de gases (ver Cromatografía (621 )) equipado con un detector de ionización a la llama, usando helio como gas transportador. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas: una columna capilar de 0,25 mm x 30 m, recubierta con una capa de fase G2 de 1 µm; mantener la temperatura del inyector a 230º; mantener la temperatura del detector a 300º; mantener la temperatura de la columna a 1 30º y programar para que aumente 1Oº por minuto hasta 280º. El área del pico de C9H1s02 no es menos de 98,5% del área total. Carbamato de Metilo, C2HsN02-75,07 [598-55-0]Cristales blancos. Fácilmente soluble en agua. INTERVALO DE FUSIÓN (741 ): entre 54º y 56°. Carbazol, C12H9N-167,21 [86-74-8]-Polvo de color blanquecino a tostado. VALORACIÓN: Inyectar un volumen apropiado en un cromatógrafo de gases (ver Cromatografía (621 )) equipado con un detector de ionización a la llama, usando helio como gas transportador. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas: una columna capilar de 0,25 mm x 30 m recubierta con una capa de 1 µm de fase G2; mantener la temperatura del inyector a 280º; mantener la temperatura del detector a 300º y mantener la temperatura de la columna a 280º. El área del pico de C12H9N no es menos de 95,5% del área total. Carbón Activado (Carbón Activado; Carbón Decolorante) C-12,01 [7440-44-0]-Polvo fino, negro, que constituye el residuo obtenido a partir de la destilación destructiva de diversos materiales orgánicos, tratado para aumentar su gran capacidad de adsorción de sustancias colorantes orgánicas, como así también bases nitrogenadas. Usar Carbón Activado (monografía de la USP).
Butirofenona (Fenil Propil Cetona), C10H120-148,21 [495-40-9]-Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 98,0%.
Carbonato de Amonio (Cuerno de Ciervo (Hartshorn Salt)) [506-87-6]-Usar grado reactivo ACS.
Butirolactona, (Dihidro-2-(3H)-furanona, y-butiro/actona)86, 1 [96-48-0]-Líquido aceitoso, transparente, incoloro a prácticamente incoloro. Es miscible con agua. Soluble en metano! y en éter. ~NTERVALO DE EBULL)CIÓN (721): entre 193º y 208°. INDICE DE REFRACCION (831 ): aproximadamente 1,435 a 20º. PESO ESPECÍFICO (841 ): entre 1, 128 y 1, 135.
Carbonato de Calcio, CaCQ3-l00,09 [471-34-1 ] Usar grado reactivo ACS. [NOTA-Un Carbonato de Calcio de calidad adecuada para su uso como estándar primario se encuentra disponible en la Oficina de Materiales de Estándar de Referencia (Office of Standard Reference Materials) del Instituto de Normas y Tecnología de los EE.UU. (NIST, por sus si~las en inglés), www. nist.gov, como muestra de estándar N 915.]
Cal Sodada-Usar Cal Sodada (monografía del NF).
Carbonato de Calcio, Estándar para Quelatometría, CaC03-100,09 [471-34-1 ]-Usar grado reactivo ACS.
dl-Canfeno, C10H16-136,24 [79-92-5]-Usar un grado adecuado. [NOTA-SE puede obtener un grado adecuado en SigmaAldrich, www.sigma-aldrich.com disponible como canfeno, 95%, número de catálogo 45,606-5.]
Carbonato de Potasio-Ver Carbonato de Potasio Anhidro. Carbonato de Potasio Anhidro, KiCÜ3-l 38,21 [584-08-7]-Usar grado reactivo ACS. Carbonato de Sodio-Usar Carbonato de Sodio Anhidro.
Cap rato de Metilo, C11Hi20i-l86,29 [110-42-9]-Líquido incoloro. VALORACIÓN: Inyectar un volumen apropiado en un cromatógrafo de gases (ver Cromatografía (621)) equipado con un detector de ionización a la llama, usando helio como gas transportador. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas: una columna capilar de 0,25 mm x 30 m, recubierta con una capa de fase G2 de 1 µm; mantener la temperatura del inyector a 250º; mantener la temperatura del detector a 300º; mantener la temperatura de la columna a 150º y programar para que aumente 1Oº por minuto hasta 280º. El área del pico de C11H2202 no es menos de 98,5% del área total.
Carmín (Laca de Alumbre del Ácido Carmínico), C22H20Ü13 · xAI [1390-65-4]-Polvo rojo. Usar un grado adecuado.
Caprilato de Metilo, C9H1s02-l 58,24 quido incoloro.
(R)-(-)-Carvona (2-Metil-5-(1-metiletenil)-2-cic/ohexen-1-ona), C10H140-150,22 [6485-40-1 ]-Usar un grado adecuado.
[111-11-5]-Lí-
Carbonato de Sodio Anhidro, Na2C03-l05,99 [497-19-8]-Usar grado reactivo ACS. Carbonato de Sodio Monohidrato, Na2C03 · Hi0-124,00 [5968-11-6]-Usar grado reactivo ACS. Carburo de Silicio, SiC-40, 1O [ 409-21-2]-Trocitos pequeños limpios, adecuados para favorecer la ebullición.
USP 39
Cambio en la redacción: Caseína [9000-71-9]-Polvo granulado blanco o levemente amarillo. Insoluble en agua y en otros disolventes neutros; se disuelve fácilmente en amoníaco SR y en soluciones de hidróxidos alcalinos, y forma por lo general una solución turbia. RESIDUO DE INCINERACIÓN (Prueba para reactivos): Incinerar 2 ,cr el residuo no pesa más de 20 mg (1,0%). PERDIDA POR SECADO (731 ): Secar a 105º hasta peso constante: no pierde más de 10,0% de su peso. ALCALINIDAD: Agitar 1 g con 20 ml de agua durante 1O minutos y filtrar: el filtrado no es alcalino al papel tornasol rojo. SUSTANCIAS SOLUBLES: Cuando el filtrado de la prueba de Alcalinidad se evapora y se seca a 105º, el residuo no pesa más de 1 mg (O, 1%). GRASAS: Disolver 1 g en una mezcla de 1O ml de agua y 5 ml de amoníaco alcohólico SR y agitar con dos porciones de 20 ml de éter de petróleo. Evaporar el éter de petróleo a una temperatura baja y secar a 80º: el peso del residuo no excede de 5 mg (0,5%). •onERMINActÓN DE NITRÓGENO {461), Método 1. (AF 01-may2016¡: Se encuentra entre 15,2% y 16,0% de N, con respecto a la sustancia anhidra. Cuando se requiera caseína exenta de vitaminas, usar caseína a la que se le hayan extraído las vitaminas liposolubles mediante extracción continua con alcohol caliente durante 48 horas, seguida por secado al aire para eliminar el disolvente. Caseína de grado Hammersten [9000-71-9]. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado en www. emdchemicals.com, número de catálogo CX0525-1.]
Cambio en la redacción: Caseinato de Calcio-Polvo casi inodoro de color blanco o levemente amarillo. Insoluble en agua fría, pero forma una solución lechosa cuando se suspende en agua, se mezcla y se calienta. RESIDUO DE INCINERACIÓN (Prueba para reactivos): Incinerar 5 g a 550º: el residuo pesa entre 150 mg y 300 mg (3,0% a 6,0%). CALCIO: Tratar el residuo obtenido en la prueba anterior con 1O ml de ácido clorhídrico diluido, fiftrar y agregar 5 ml de oxalato de amonio SR al filtrado transparente: a¡Jarece un precipitado blanco en reposo. PÉRDIDA POR SECADO (731 ): Secar al vacío a 70º hasta peso constante: no pierde más de 7,0% de su peso. GRASA: Suspender 1,0 g en 5 ml de alcohol en un matraz Mojonnier, agregar 0,8 ml de hidróxido de amonio y 9 ml de agua, y agitar. Agregar una segunda porción de 5 ml de alcohol y luego agregar porciones sucesivas de éter y de éter de petróleo de 25 ml cada uno, agitando después de cada adición invirtiendo el matraz 30 veces. Centrifugar, decantar la capa de disolvente, evaporar a baja temperatura y secar en un baño de vapor: el residuo no pesa más de 20 mg (2,0%). •oETERMINACION DE NITRÓGENO (461 ), Método '· (AF 01-may2016): Se encuentra entre 12,5% y 14,3% de N, calculado con respecto a la sustancia anhidra. CAPACIDAD DE SUSPENSIÓN EN AGUA: Colocar 2 g en un vaso de precipitados y agregar lentamente agua fresca mezclando hasta formar una pasta suave y homogénea. Agregar más agua hasta obtener 100 ml en total. Mezclar y calentar hasta 80º: se forma una suspensión lechosa que no sedimenta luego de haberla dejado 2 horas en reposo. Catalizador de Níquel-Aluminio-Usar un grado adecuado.
Reactivos/ Especificaciones de Reactivos 2307 [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado como "Raney Nickel, Active Catalyst," disponible como "aluminum-nickel alloy" con el número de catálogo 72240 en Fluka Chemical Corp., fax 1-800-962-9591, www.sigmaaldrich.com.] Catalizador de Paladio-Usar un grado adecuado. [NOTA-Se puede obtener comercialmente un grado adecuado como "Palladium Catalyst, Type 1 (5% Palladium on Calcium Carbonate)," en Engelhard Industries, lnc., número de fax (864) 885-1375.] Catecol (o-Dihidroxibenceno; Pirocatecol), C6H4(0H) 2110, 11 [120-80-9]-Cristales blancos que presentan un cambio en su coloración al exponerse al aire y a la luz. Fácilmente soluble en agua, en alcohol, en benceno, en éter, en cloroformo y en piridina, formando soluciones transparentes. Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 99%. Celulosa Microcristalina-Usar Celulosa Microcristalina FCC. Celulosa para Cromatografía-Usar un grado adecuado. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado en EMD Chemicals, www.emdchemicals.com.] Cetrimida-Ver Bromuro de Cetiltrimetilamonio. Cianoacetato de Etilo, CNCH2COOC2Hs-113, 11 [105-56-6]-Líquido incoloro a amarillo pálido. Poco soluble en agua. Miscible con alcohol y con éter. A presión atmosférica, entra en ebullición a una temperatura entre 205º y 209º, con descomposición. A una presión de 1O mm de mercurio, destila aproximadamente a 90º. PESO ESPECÍFICO (841 ): entre 1,05 7 y 1,062. ACIDEZ: Disolver 2 ml en 25 ml de alcohol neutralizado, agregar fenolftaleína SR y valorar con hidróxido de sodio O, 1O N: no se requiere más de 1,5 ml para producir un color rosado. 4-Cianofenol (4-Hidroxibenzonitrilo), C6H 4 CNOH-119, 12 [767-00-0]-Usar reactivo al 95 por ciento. Cianuro de Potasio, KCN-65, 12 grado reactivo ACS.
[151-50-8]-Usar
Cianuro de Sodio, NaCN-49,01 grado reactivo ACS.
[1433-33-9]-Usar
Ciclam (1,4,8, 7 1-Tetraazaciclotetradecano), C10H24N4200,33 [295-37-4]-Usar reactivo al 98 por ciento. cx-Ciclodextrina (Ciclomaltohexaosa; ex-Dextrina de Schardin[10016-20-3]-Usar un grado ger), C36H60Ü30-972,86 adecuado con un contenido de no menos de 98,0%. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado en Fluka, www.sigma-aldrich.com, número de católogo 28705.] f3-Ciclodextrina (f3-Schardinger dextrina; Cicloheptaamilosa), C2H70Ü3s · xH20-l 134,98 (anhidra) [68168-23-0]-Usar un grado adecuado hidratado. Ciclohexano, C6H12-84, 16 tivo ACS.
[110-82-7]-Usar grado reac-
Ciclohexanol, C6H120-l 00, 16 [108-93-0]-Líquido transparente. Fácilmente soluble en agua. Miscible con alcohol, con acetato de etilo y con hidrocarburos aromáticos. VALORACIÓN: Cuando se examina mediante cromatografía de gas-líquido, usando un cromatógrafo de gases y condiciones adecuadas, presenta una pureza de no menos de 98%.
2308 Especificaciones de Reactivos / Reactivos TEMPERATURA DE FUSIÓN: aproximadamente 23º. PESO ESPECÍFICO: aproximadamente 0,962, a 20º.
USP 39 Citrato Cúprico ([Citrato(4-)] de dicobre), Cu2C6H4Q7315, 18 [866-82-0]-Usar un grado adecuado.
Ciclohexilmetanol, C7H1 4 0-l l 4, 19-Usar un grado adecuado. Cinc, Zn-Peso atómico 65,39 reactivo ACS.
[7440-66-6]-Usar grado
Cinc, Activado-Colocar pellets de. cinc en un matraz: ~rlen meyer y agr~gar una canti9~d suficiente ~e una soluc1on ~e 50 ppm de acido cloroplat1rnco para cubrir los pell~t,s. De1ar que el metal se mantenga en contacto con .la soh.~c1on durante 1O minutos, escurrir, lavar y secar de inmediato. VALORACIÓN: Agregar a 5 g de cinc activado 15 ~~de ácido clorhídrico 25 ml de agua, O, 1 ml de soluc1on de cloruro estannos~ (235 mg/ml en ácido clorhídrico) y 5 ml de solución de yoduro de potasio (166 mg/ml en agua). No se produce mancha cuando entra en contacto con papel de bromuro d~ i:nercurio. R~~etir la prueba e~ presencia de 1 µg de arsernco en solucion usa_ndo los mismos reactivos. Se produce una mancha aprec1a~l.e cuando entra en contacto con papel de bromuro mercunco. Cinconidina, C19H22N20-294,39 [485-71-2]-Cristales o polvo cristalino o granulado de color blanco. Soluble en alcohol y en cloroformo; prácticamente insoluble en agua. VALORACIÓN: Disolver aprox~~adam~~te 125 i:ng, pesados con exactitud en 50 ml de ac1do acet1co glacial. Agregar algunas gotas' de p-naftolbenceína SR y "'.afor~; con ácido perclórico O, 1 N SV. Realizar una determinac1on con un blanco y hacer las correcciones necesarias. Cada ml de ácido perclórico O, 1 N equivale a 14,72 mg de C19H22N20. No se encuentra menos de 99,0%. PÉRDIDA POR SECADO (731 ): Secar a 105º hasta peso constante: no pierde más de 1,0% de su peso. INTERVALO DE FUSIÓN (741): entre 200º y 205º. ROTACIÓN ESPECÍFICA (781 ): entre -105º y -115º, calculada con respecto a la sustancia seca, determinada en una solución en alcohol que contenga 1O mg por ml. Cinconina, C19H22N20-294,39 [118-10-5]-Cristales o polvo cristalino o granulado de color blanco. Poco solu~le. en cloroformo, moderadamente soluble en alcohol y pract1camente insoluble en agua. VALORACIÓN: Disolver aprox~~adam~~te 125 i:ng, pesados con exactitud en 50 ml de ac1do acet1co glacial. Agregar algunas gotas' de p-naftol.benceína SR y "'.alor~; con ácido perclórico O, 1 N SV. Realizar una determinac1on con un blanco y hacer las correcciones necesarias. Cada ml de ácido perclórico O, 1 N equivale a 14,72 mg de C19H22N20. No se encuentra menos de 99,0%. PÉRDIDA POR SECADO (731 ): Secar a 105º hasta peso constante: no pierde más de 1,0% de su peso. INTERVALO DE FUSIÓN (741 ): entre 255º y 261 º. ROTACIÓN ESPECÍFICA (781 ): entre +219º y +229º, calculada con respecto a la sustancia seca, determinada en una solución en alcohol que contenga 50 mg por 1O ml. L-Cistina HOOC(N H2)CHCH2S-SCH2CH(NH2)COOH240 30 ' [58-89-3]-Polvo blanco cristalino. Muy poco solubl~ en agua; soluble en ácidos minerales diluidos y en soluciones de hidróxidos alcalinos; insoluble en alcohol y en otros disolventes orgánicos. ROTACIÓN ESPECÍFICA (781 ): entre -215º y -225º, determinada en una solución 2 en 100 de la muestra de prueba, previamente secada sobre gel de sílice durante 4 horas, en ácido clorhídrico diluido (1 en 1O) a una temperatura de 20º. PÉRDIDA POR SECADO (731 ): Secar sobre gel de sílice durante 4 horas: no pierde más de 0,2% de su peso. RESIDUO DE INCINERACIÓN (Prueba para reactivos): no más de 0,1%.
Citrato de Calcio, Ca3(C6Hs07)i · 4H20-570,49 [813-94-5]-Polvo cristalino de 5=~1or blancp .. Poco soluble en agua; fácilmente soluble en ac1do clorh1dnco 3 N,Y. en ácido nítrico 2 N; insoluble en alcohol. ~ 15 ml .de ac1do sulfúrico 2 N caliente agregar en pequenas porciones, y . mezclando, aproximadamen!e 500 mg de c~trato de 7alc10. Calentar la mezcla a ebullicion durante 5 minutos y filtrar mientras está caliente: el filtrado enfriado responde a la prueba de identificación de Identificación-Pruebas Generales, Citratos (1 91 ) . VALORACIÓN: Pesar con exactitud aproximadamente 400 mg de la sal, previamente secada a _1 ~Oº hasta peso constante, y transferir a un vaso de prec1p1tados de 250 ml. Disolver la muestra de prueba en 150 ml de a~ua con 2 ml de ácido clorhídrico 3 N, agregar 15 ml de hidróxido de sodio 1 N y 250 mg de azul de hidroxinaftol, y valorar con edetato disódico 0,05 M SV hasta que la sol~ ción cambie a color azul intenso. Cada ml de edetato d1sódico 0,05 M equivale a 8,307 mg de Ca3(C6Hs07)i: se encuentra entre 97,5% y 101 %. CARBONATO y ÓXIDO DE CALCIO: Triturar 1 g de citrato de calcio con 5 ml de agua durante 1 minuto: la mezcla no hace que el papel tornasol rojo se torne azul. Luego agregar 5 ml de ácido clorhídrico 3 N tibio: sólo se ooservan algunas burbujas aisladas. MATERIA INSOLUBLE EN ÁCIDO CLORHÍDRICO: Disolver 5 g calentando con una mezcla de 1O ml de ácido clorhídrico y 50 ml de agua durante 30 minutos: no queda más de 2 5 mg de residuo insoluble (0,05%). P~RDIDA POR SECADO (731 ): Secar a 150º hasta peso constante: pierde entre 12,2% y 13,3% de su peso. ARSÉNICO (211 ): Proceder con 0,50 g según se indica para
~~:i~~~\~~.it~LS~~~~~"'~l?w~'''~ .... ~l•mllIT..,.IJlJ?tllElilllll~-"" . . ":
0,002%.
Citrato Dibásico de Amonio (Sal Diamónica de Ácido Cítrico), (NH 4) 2HC6H5 0 7-226, 18 [3012-65-5]-Usar grado reactivo ACS. Citrato Férrico Amónico-Gránulos o escamas delgadas y transparentes de color rojo granate o polvo amarillo amarronado. Es delicuescente y se ve afectado por la luz. Muy soluble en agua; insoluble en alcohol. VALORACIÓN: Pesar con exactitud aproximadame~te 1 g, disolver en 25 ml de agua en un matraz con tapon de vidrio, awegar 5 ml de ácido clorhídrico y 4 g de yodur<;> de potasio, tapar el matraz y dejar en reposo en la oscuridad durante 15 minutos. Agregar 100 ml de agua y valorar el yodo liberado con tiosulfato de sodio O, 1 N_ SV, agregando 3 ml de almidón SR cerca del punto final. Realizar una determinación con un blanco y hacer 1.as correcciones necesarias. Cada ml de tiosulfato de sodio O, 1 N equivale a 5,585 mg de Fe: se encuentra entre 16,5% y 18,5%. CITRATO FÉRRICO: A 250 mg disueltos en 25 ml de agua, agregar 1 ml de ferrocianuro de potasio SR: no se forma precipitado azul. TARTRATO: Disolver 1 g en 1O ml de agua, .a~;egar 1 ml de hidróxido de potasio SR, calentar a e,bull!c1~n _para coagular el hidróxido férrico, agregando .fl!ªS h1drox1do _de potasio SR si fuera necesario, para prec1p1tar todo el hierro, filtrar y ~cidificar el filtrad9 .ligeran;~nte co~ ácido _acético glacial. Agregar 2 ml de ac1do acet1co glacial y de1ar en reposo durante 24 horas: no se forma precipitado blanco cristalino. PLOMO (251 ): Disolver 1,0 g en 30 ml de agua, agreg~r 5 ml de ácido nítrico diluido (1 en 21 ), calentar a ebulh-
USP 39
Reactivos / Especificaciones de Reactivos 2309
ción suave durante 5 minutos, enfriar y diluir con a9ua hasta 50 mL: 20 mL de la solución no presentan mas de 0,008 mg de Pb (0,002%). Citrato de Sodio Dihidrato (Ácido 2-hidroxi-1,2,3-propanotricarboxílico, Sal Trisódica, Dihidrato), Na3C6Hs01 · 2H20294, 10 [6132-04-3]-Usar grado reactivo ACS. Cloramina T (p-Toluensulfoncloramida de Sodio), C1H1CINNa02S · 3H20-281,69 [7080-50-4]-Usar grado reactivo ACS. Clorato de Potasio, KCI03-l 22,55 grado reactivo ACS.
[3811-04-9]-Usar
Clorhidrato de Alprenolol, C1sH23N02 · HCl-285,8 [13707-88-5]-Usar un grado adecuado. Clorhidrato de Benzamidina Hidrato, (Monoclorhidrato de Bencenocarboximidamida Hidrato), C1HsN2 · HCI · xH20156,6 [206752-36-5]-Polvo blanco a blanquecino. Usar un grado adecuado. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado en SigmaAldrich, www.sigma-aldrich.com.] Clorhidrato de Benzfetamina, C11H21N · HCl-275,82 [5411-22-3]-Polvo cristalino de color blanco a blanquecino. Fácilmente soluble en agua, en alcohol y en cloroformo; poco soluble en éter. VALORACIÓN: Disolver aproximadamente 500 mg, pesados con exactitud, en una mezcla de 50 mL de ácido acético glacial y 1O mL de acetato mercúrico SR, agregar 1 gota de cristal violeta SR y valorar con ácido perclórico O, 1 N SV hasta un punto finar verde azulado. Realizar una determinación con un blanco y hacer las correcciones necesarias. Cada mL de ácido perclórico O, 1 N equivale a 27,58 mg de C11H21 N · HCI. Se encuentra entre 98,0% y 101,0%, calculado con respecto a la sustancia seca. INTERVALO DE FUSIÓN (741): entre 152º y 158º. ROTACIÓN ESPECÍFICA (781): entre +22º y +26º, determinada en una solución que contenga 200 mg en 1O mL, secando previamente la muestra al vacío a 60º durante 3 horas. PÉRDIDA POR SECADO (731 ): Secar al vacío a 60º durante 3 horas: no pierde más de 1% de su peso. RESIDUO DE INCINERACIÓN (281 ): no más de 0,2%. Clorhidrato de Clortetraciclina-Usar Clorhidrato de Clortetraciclina (monografía de la USP). Clorhidrato de 3,3'-Diaminobenzidina, (NH2)2C6H3C6H3(NH2)2 · 4HCl-360, 11 [7411-49-6]-Cristales aciculares blancos a color tostado amarillento (ocasionalmente púrpura). Soluble en agua. Estable en disolventes orgánicos pero inestable en solución acuosa a temperatura ambiente. Almacenar las soluciones acuosas en el refrigerador. MATERIA INSOLUBLE: Disolver 2 g en 100 mL de agua, sin calentar, y filtrar de inmediato: el residuo insoluble no excede de 1 mg (0,05%). RESIDUO DE INCINERACION (Prueba para reactivos): no más de 1 mg, a partir de 2 g (0,05%). PRUEBA DE APTITUD PARA LA DETECCIÓN DE SELENIO: Disolver en agua 1,633 g de ácido selenioso (H 2Se03) y diluir con agua hasta 1 L. Diluir 1O mL de esta solución con agua hasta 1 L para obtener una solución que contenga 0,01 O mg de Se por ml. Colocar 1 mL de la solución resultante en un vaso de precipitados de 100 mL, agregar 2 mL de solución de ácido fórmico (1 en 7) y diluir con agua hasta 50 ml. Agregar 2 mL de solución de clorhidrato de 3,3'-diaminobenzidina (1 en 200) y dejar en reposo de 30 a 50 minutos. Ajustar con hidróxido de amonio 6 N a un pH entre 6 y 7. Transferir a un separador de 125 mL, agregar 10,0 mL de tolueno y agitar vigorosamente durante 30
segundos: se produce un color amarillo evidente en la capa de tolueno. Un blanco que contiene clorhidrato de diaminobenzidina pero carece de estándar de selenio, tratado del mismo modo, no presenta ningún color en la capa de tolueno. Clorhidrato de Dihidroquinidina, C20H21CIN202-362,89 [1476-98-8]-Láminas en forma de rombo. Fácilmente soluble en metanol y en cloroformo. VALORACIÓN Fase móvil: Preparar una mezcla de agua, acetonitrilo, dietilamina y ácido metanosulfónico (860:100:20:20). Procedimiento: Inyectar aproximadamente 20 µL en un cromatógrafo de líquidos adecuado (ver Cromatografía (621 )) equipado con un detector a 235 nm y una columna de 4,6 mm x 15 cm rellena con material L1. La velocidad de flujo es de aproximadamente 1,5 mL por minuto. El área del pico de C20H21CIN202 no es menos de 97,5% del área total. Clorhidrato de 2-Etilaminopropiofenona, C6HsCOCH(CH3)NHC2Hs · HCl-213,70 [51553-17-4]Usar un grado adecuado.
~a~bio ~,; la redfled9n: Clorhidrato de p-Fenilendiamina (Diclorhidrato de 1,4-Diaminobenceno), C6HsN2 · 2HCl-181,06-Polvo cristalino o cristales de color blanco a tostado pálido, que se tornan rojos con la exposición al aire. Fácilmente soluble en agua; poco soluble en alcohol y en éter. Conservar en envases bien cerrados. Proteger de la luz. MATERIA INSOLUBLE: Disolver 1 g en 1o mL de agua: la solución es transparente y completa. A.B.SORTIVIDAD MOLAR (ver •tspectroscopíq Ultrávioleta-Vis/ble (857)• (AF oi-m•y·W16J): Disolver 60 mg en 100,0 mL de agua y mezclar. Pipetear 2 mL de esta solución y transferir a un matraz volumétrico de 50 mL, diluir a volumen con solución amortiguadora de pH 7 y mezclar. La absortividad molar de esta solución, a 239 nm, no es menor de 9000. Clorhidrato de Fenilhidrazina, C6HsNHNH2 · HCl-144,60 [59-88-1 ]-Polvo o cristales blancos o amarillentos. Soluble en agua y en alcohol. Almacenar en envases impermeables. Proteger de la luz. Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 99%. Clorhidrato de Fenoxibenzamina [Clorhidrato de N-(2-cloroetil)-N-(1-metil-2-fenoxietil)bencilamina], C1sH 22 CINO · HCl-340,29 [63-92-3]-Polvo cristalino blanco. INTERVALO DE FUSIÓN (741): entre 137º y 140°. ABSORTIVIDAD: Su absortividad, 1%, 1 cm, en el intervalo de 272 nm a 290 nm, en solución clorofórmica es aproximadamente 1 78. Clorhidrato de Guanidina, (Clorhidrato de Aminoformamidina; Clorhidrato de Aminometanamidina), CHsN 3 · HCl95,53 [50-01-1 ]-Polvo cristalino blanco. Fácilmente soluble en agua y en alcohol. Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 99%. Clorhidrato de Guanina, CsHsNsO · HCI · H20-205,60 [635-39-2]-Polvo blanco cristalino. Funde por encima de 250º, con descomposición. Poco soluble en agua y en alcohol; soluble en agua acidulada y en hidróxido de sodio SR. Sus soluciones no precipitan con yodo SR ni con yodomercuriato de potasio SR, pero forman un precipitado con trinitrofenol SR. RESIDUO DE INCINERACIÓN (Prueba para reactivos): inapreci?ble, usando 100 mg. PERDIDA POR SECADO (731 ): Secar a 105º hasta peso constante: no pierde más de 10,0% de su peso.
231 O Especificaciones de Reactivos/
Reactivos
Clorhidrato de Hidrazona de Metilbenzotiazolona, CsH10CJN3S · Hz0-233,7 [38894-11-0] (forma monohidrato)-215,70 {forma anhidra); [149022-15-1] (forma hidrato)-Polvo cristalino casi blanco o amarillento. APTITUD PARA DETERMINACIÓN DE ALDEHÍDOS: A 2 mL de metano! exento de aldehídos agre~ar 60 µL de una solución de 1 g por L de propionaldehtdo en metano! exento de aldehídos y 5 mL de una solución de 4 g por L de clorhidrato de hidrazona de metilbenzotiazolona. Mezclar y dejar en reposo durante 30 minutos. Preparar un blanco, omitiendo la solución de propionaldehído. Agregar 25,0 mL de una solución de 2 g por L de cloruro férrico a la solución de prueba y al blanco, diluir con acetona hasta 100,0 mL y mezclar. La absorbancia de la solución de prueba, medida a 660 nm y usando el blanco como líquido de compensación, no es menor de 0,62. Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 97%. Clorhidrato de Hidroxilamina, NH20H · HCl-69,49 [5470-11-1 ]-Usar grado reactivo ACS. Clorhidrato de L-Histidina Monohidrato, C6H9N 302 · HCI · Hz0-209,63 [5934-29-2]-Usar un grado adecuado. Clorhidrato de Metafenilendiamina (Diclorhidrato de Metafenilendiamina), C6H4(NH2)z · 2HCl-181,06--Polvo cristalino blanco o ligeramente blanco rojizo. Fácilmente soluble en agua. Adquiere un color rojizo con la exposición a la luz. Almacenar protegido de la luz. SOLUBILIDAD: Una solución de 1 g en 200 mL de agua es incolora. RESIDUO DE INCINERACIÓN (Prueba para reactivos): Incinerar 1 g con 0,5 mL de ácido sulfúrico: el residuo no pesa más de 1 mg (0,1%). [NOTA-La solución de clorhidrato de metafenilendiamina puede ser decolorada tratándola con una pequeña cantidad de carbón activado.] Clorhidrato de Metilamina, CHsN · HCl-67,52 [593-51-1 ]-Usar un grado adecuado. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado en www.sigma-aldrich.com con número efe catálogo M0505.] Clorhidrato de 1-Naftilamina, C10H7NH2 · HCl-179,65 [552-46-5]-Polvo cristalino blanco que se torna azulado tras la exposición al aire y a la luz. Soluble en agua, en alcohol y en éter. Una solución 1 en 100, acidificada levemente con ácido acético, da un color violeta con 5 gotas de cloruro férrico SR. Una solución 1 en 40 en ácido acético diluido es incolora y no más que levemente opalescente. RESIDUO DE INCINERACIÓN (Prueba para reactivos): Incinerar 200 mg con unas gotas de ácido sulfúrico: el peso del residuo es inapreciable. Clorhidrato de Piridoxal, CsH9N03 · HCl-203,62 [65-22-5]-Cristales o polvo cristalino blanco a ligeramente amarillo. Se oscurece paulatinamente por exposición al aire o a la luz solar. Un g se disuelve en aproximadamente 2 mL de agua y en aproximadamente 25 mL de alcohol. Insoluble en acetona, en cloroformo y en éter. Sus soluciones son ácidas (pH de aproximadamente 3). INTERVALO DE FUSIÓN (741 ): entre 171 o y 175º con descomposición parcial. RESIDUO DE INCINERACIÓN (Prueba para reactivos): no más de 0,1%. PÉRDIDA POR SECADO (731): Secar a 105º durante 2 horas: no pierde más de 01 5% de su peso. CONTENIDO DE NITROGENO (Prueba para reactivos): Determinar por medio del método Kjeldahl, usando una muestra de prueba previamente secada a 105º durante 2 horas: se encuentra entre 6,7% y 7, 1% de N.
USP 39 CONTENIDO DE CLORUROS: Pesar con exactitud aproximadamente 500 mg, secados previamente a 105º durante 2 horas, y disolver en 50 mL de agua. Agregar 3 mL de ácido nítrico y 50,0 mL de nitrato de plata O, 1 N SV, luego agregar 5 mL de nitrobenceno, agitar durante aproximadamente 2 minutos, agregar sulfato férrico amónico SR y valorar el exceso de nitrato de plata con tiocianato de amonio O, 1 N SV: cada mL de nitrato de plata O, 1 N equivale a 3,545 mg de CI. Se encuentra entre 17,2% y 17,7%. Clorhidrato de Propilamina (Clorhidrato de 1-Propanamina; Clorhidrato de n-Propilamina), C3H9N · HCl-95,57 [556-53-6]-Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 99%. Clorhidrato de Trietilamina, C6H1 5 N · HCl-137,65 [554-68-7]-Polvo blanco a blanquecino. VALORACIÓN: Transferir aproximadamente 35 mg, pesados con exactitud, a un vaso de precipitados adecuado, agregar 50 mL de ácido acético glacial y mezclar hasta disolver. Agregar 5 mL de acetato mercúrico SR, mezclando. Cuando se haya disuelto por completo, valorar con ácido perclórico O, 1 N SV determinando el punto final potenciométricamente. Realizar una valoración con un blanco y hacer las correcciones necesarias. Cada mL de ácido perclórico O, 1 N equivale a 13,77 mg de C6H1sN · HCI. No se encuentra menos de 97,5% de C6H1sN · HCI. INTERVALO DE FUSIÓN (741 ): entre 256º y 259°, con descomposición. Clorhidrato de Tris(hidroximetil)aminometano, C4H11N03 · HCl-157,60 [1185-53-1 ]-Cristales incoloros. Usar un grado adecuado. Clorhidrato del Éster Etílico de N-Benzoil-L-arginina, C1sH22N403 · HCl-342,82-Determinar la aptitud para uso como sustrato según se indica en Tripsina Cristalizada (monografía de la USP). Clorhidrato del Éster Metílico de p-Toluenosulfonil-L-arginina (Clorhidrato del éster metílico de Na.-p-tosil-L-arginina; TAME), C14H22N404S · HCl-378,88 [1784-03-8]-Determinar su aptitud según se indica en la prueba de Tripsina en Quimotripsina (monografía de la USP). Cloro, Clz-70,9 [7782-50-5]-Gas amarillo verdoso. Se puede obtener un grado de alta pureza de la mayoría de los proveedores de gases especiales. 5-Cloro-2-aminobenzofenona-Ver 2-Amino-5-clorobenzofenona.
4-Cloro-1-naftol, C10H 7CIO-l 78,6 [604-44-4]-Polvo blanco a blanquecino, con un punto de fusión entre 118º y 120º. Usar un grado adecuado. Almacenar por debajo de Oº. 2-Cloro-4-nitroanilina al 99%, C6HsCIN20z--172,57 [121-87-9]-Polvo blanco a blanquecino. INTERVALO DE FUSIÓN (741): entre 107º y 109º. 1-Cloro-2,2,2-trifluoroetilclorodifluorometil Éter-Usar un grado adecuado. m-Cloroacetanilida, CsHsCIN0-169,61-Gránulos blanquecinos a beige. VALORACIÓN Fase móvil: Preparar una mezcla de acetonitrilo y agua (22:3). Procedimiento: Inyectar aproximadamente 20 µL en un cromatógrafo de líquidos adecuado (ver Cromatografía (621)) equipado con un detector a 254 nm y una columna de 4,6 mm x 15 cm rellena con material L1. La
Reactivos/ Especificaciones de Reactivos 2311
USP 39 velocidad de flujo es de aproximadamente 1,5 mL por minuto. El área del pico de CaHaCINO no es menos de 99,9% del área total. INTERVALO DE FUSIÓN (741 ): entre 79º y 80º. p-Cloroacetanilida, CaHaCIN0-169,61-Polvo cristalino o cristales con forma de agujas de color blanco o amarillo pálido. Insoluble en agua; soluble en alcohol y en éter. SOLUBILIDAD: Un g se disuelve en 30 mL de alcohol y produce una solución transparente. INTERVALO DE FUSIÓN (741 ): entre 178º y 181 º. RESIDUO DE INCINERACIÓN (Prueba para reactivos): no más de 0,1%. 1-Cloroadamantano, C10H1sCl-170,68 [935-56-8]-Sólido cristalino blanco. VALORACIÓN: Inyectar un volumen apropiado en un cromatógrafo de gases (ver Cromatografía (621 )) equipado con un detector de ionización a la llama, usando helio como gas transportador. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas: una columna capilar de 0,25 mm x 30 m, recubierta con una capa de fase G2 de 1 µm; mantener la temperatura del inyector a 250º; mantener la temperatura del detector a 300º; mantener la temperatura de la columna a 150º y programarla para que aumente 1Oº por minuto hasta 280º. El área del pico de C10H1sCI no es menos de 97,5% del área total. 3-Cloroanilina, C6H6CIN-127,57 [108-42-9]-Líquido incoloro a marrón claro. Soluble en ácido y en la mayoría de los disolventes orgánicos; prácticamente insoluble en agua. VALORACIÓN: Inyectar una muestra apropiada en un cromatógrafo de gases (ver Cromatograf1a (621 )) equipado con un detector de ionización a la llama, usando helio como gas transportador. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas: una columna capilar de 0,25 mm x 30 m, recubierta con una capa de fase G2 de 1 µm; mantener la temperatura del inyector a 250º; mantener la temperatura del detector a 300º; y mantener la temperatura de la columna a 150º y programarla para que aumente 1Oº por minuto hasta 280º. El área del pico de C6H6CIN no es menos de 99% del área total. ÍNDICE DE REFRACCIÓN (831): entre 1,592 y 1,596, a 20º. p-Cloroanilina, ( 4-Cloroanilina), C6H6CIN-127,57 L106-47-8]-Usar un grado adecuado. Clorobenceno, C6HsCl-1l2,56 [108-90-7]-Líquido transréirente e incoloro. Insoluble en agua; soluble en alcoho, en benceno, en cloroformo y en éter. Usar grado reactivo ACS. 4-Clorobenzofenona, C13H9CI0-216,66 Usar un grado adecuado.
[134-85-0]-
1-Clorobutano-Ver Cloruro de n-Butilo. 2-Cloroetanol (Etilen Clorhidrina), C2HsCI0-80,51 [107-07-3]-Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 99%. Cloroformiato de 9-Fluorenilmetilo, C1sH11CI02-258,70 [28920-43-6]-Sólido incoloro transparente. Funde aproximadamente a 62º. Cloroformo, CHC'3-119,38 tivo ACS.
[67-66-3]-Usar grado reac-
Cloroformo Exento de Alcohol-Usar un grado adecuado que no contenga alcohol como estabilizante. 1-Cloronaftaleno (a-Cloronaftaleno), C10H7Cl-162,62 [90-13-1 ]-Líquido incoloro a amarillo claro.
VALORACIÓN: Emplear un cromatógrafo de gases equipado con un detector de ionización a la llama. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas: una columna de acero inoxidable de 3,2 mm x 1,83 m rellena con fase G2 al 7% sobre soporte SlA; mantener la temperatura del inyector a 250º y del detector a 31 Oº; y programar la temperatura de la columna para que aumente a una velocidad de 1Oº por minuto de 50º a 250º. No se encuentra menos de 90% de C10H7CI, del cual no más de 10% es 2-cloronaftaleno. ÍNDICE DE REFRACCIÓN (831 ): entre 1,6320 y 1,6340, a 20º. Cloroplatinato de Potasio, K2PtCl6-485,99-Polvo pesado de color amarillo. Soluble en ácido clorhídrico y en ácido nítrico. VALORACIÓN: Pesar con exactitud aproximadamente 300 mg, transferir a un vaso de precipitados de 600 mL, agregar 20 mL de ácido clorhídrico y calentar suavemente, si fuera necesario, para lograr la disolución completa. Agregar gránulos de cinc lentamente hasta que dejen de disolverse y luego agregar 2 mL de ácido clorhídrico y digerir durante 1 nora en un baño de vapor para coagular el platino reducido. Agregar más ácido, si fuera necesario, para asegurar que se haya disuelto todo el cinc. Filtrar a través de papel, enjuagando el vaso de precipitados con ácido clorhídrico diluido hasta que todo el precipitado se haya transferido al filtro; luego lavar con varias porciones pequeñas de agua. Incinerar el filtro en un crisol tarado a 800º ± 25º hasta peso constante. Cada mg de residuo equivale a 1,0 mg de platino. No se encuentra menos de 40%.
Clorotrimetilsilano (Cloruro de Trimetilsililo), C3H9CISi108,64 [75-77-4]-Líquido transparente, incoloro a amarillo claro. ~roduce humos cuando se expone al aire húmedo. [PRECAUCION-Reacciona vigorosamente con agua, alcoholes y otros dadores de hidrógeno. Almacenar en envases impermeables de vidrio.] ÍNDICE DE REFRACCIÓN (831 ): entre 1,3850 y 1,3890, a 20º. Cloruro Básico de Zirconilo Octahidrato-Usar Oxicloruro de Zirconio.
Cloruro Cobaltoso-Ver Cloruro de Cobalto. Cloruro Cúprico, CuC'2 · 2H20-170,48 [7447-39-4]Cristales delicuescentes de color verde azulado. Fácilmente soluble en agua; soluble en alcohol; poco soluble en éter. Usar grado reactivo ACS. Cloruro de Acetilcolina, (Cloruro de Trimetiletanaminio; Acecolina), [CH3CQOCH2CH2N(CH3)3]Cl-l8l,66 [60-31-1 ] Polvo cristalino blanco. Muy delicuescente; muy soluble en agua; fácilmente soluble en alcohol. INTERVALO DE FUSIÓN (741 ): Cuando se seca previamente a 11 Oº en un tubo capilar durante 1 hora, funde a una temperatura entre 149º y 152º. REACCIÓN: Una solución (1 en 1O) es neutra al tornasol. RESIDUO DE INCINERACIÓN (Prueba para reactivos): inapreciable, desde 200 mg. SOLUBILIDAD EN ALCOHOL: 500 mg se disuelven completamente en 5 mL de alcohol y la solución resultante es incolora.
USP 39
2312 Especificaciones de Reactivos/ Reactivos PORCENTAJE DE ACETILO (CH3CQ): Pesar con exactitud aproximadamente 400 mg, previamente secados a 105º durante 3 horas, y disolver en 15 ml de agua en un matraz Erlenmeyer con tapón de vidrio. Agregar 40,0 ml de hidróxido de sodio O, 1 N SV y calentar en un baño de vapor durante 30 minutos. Insertar el tapón, dejar que se enfríe, agregar fenolftaleína SR y valorar el exceso de álcali con ácido sulfúrico O, l N SV. Determinar la normalidad exacta del hidróxido de sodio O, 1 N valorando 40,0 ml después de haberlo tratado de la misma manera que en la prueba. Cada ml de hidróxido de sodio O, 1 N equivale a 4,305 mg de CH 3CO. Se encuentra entre 23,2% y 24,2%. PORCENTAJE DE CLORO (CL): Pesar con exactitud aproximadamente 400 mg, previamente secados a 105º durante 3 horas, y disolver en 50 mL de agua en un matraz de 125 ml con tapón de vidrio. Agregar agitando 30,0 ml de nitrato de plata O, 1 N SV, luego agregar 5 ml de ácido nítrico y 5 ml de nitrobenceno, agitar, agregar 2 ml de sulfato férrico amónico SR y valorar el exceso de nitrato de plata con tiocianato de amonio O, 1 N SV: cada ml de nitrato de plata O, 1 N equivale a 3,545 mg de CI. Se encuentra entre 19,3% y 19,8% de CI. Cloruro de Acetilo, CH3COCl-78,50 [75-36-5]-Líquido transparente e incoloro. Se descompone en agua y en alcohol. Miscible con benceno y con cloroformo. Usar grado reactivo ACS. PESO ESPECÍFICO (841 ): aproximadamente 1, 1. Cloruro de Amonio (Salmiac), NH4Cl-53,49 [12125-02-9]-Usar grado reactivo ACS. Cloruro de Bario, BaCli · 2H20-244,26 Usar grado reactivo ACS.
[10326-27-9]-
Cloruro de Bario Anhidro, BaCli-208,23 [10361-37-2]-Se puede preparar secando cloruro de bario en capas delgadas a 125º hasta que la pérdida de peso entre dos períodos de secado sucesivos, de 3 horas de duración, no exceda de 1%. Cloruro de Bario Dihidrato-Usar Cloruro de Bario. Cloruro de Bencenosulfonilo, C6H5S02Cl-176,62 [98-09-9]-Líquido aceitoso incoloro. Insoluble en agua fría; soluble en alcohol y en éter. Solidifica a Oº. INTERVALO DE FUSIÓN (741 ): entre 14º y 17º. INTERVALO DE EBULLICIÓN (Prueba para reactivos): entre 251 o y 252°. Cloruro de Benciltrimetilamonio, C6H5CH2N(CH3)3Cl185,69 [56-93-9]-Disponible como solución acuosa al 60%. Es transparente e incolora o no más que ligeramente amarilla. VALORACIÓN: Pipetear 2 ml, transferir a un matraz volumétrico de 50 ml y agregar agua a volumen. Pipetear 20 ml de la solución y transferir a un matraz Erlenmeyer de 125 ml, agregar aproximadamente 30 ml de agua, luego agregar 0,25 ml de diclorofluoresceína SR y valorar con nitrato de plata O, 1 N SV. Cada ml de nitrato de plata O, 1 N equivale a 18,57 mg de C6H5CH2N(CH3)3CI. Se encuentra entre 59,5% y 60,5%. Cloruro de Benzalconio-Usar Cloruro de Benza/conio (monografía del NF). Cloruro de Benzoílo, C6H5COCl-140,57 Usar grado reactivo ACS.
[98-88-4]-
Cloruro de n-Butilo (7-Clorobutano), C4H9Cl-92,57 [109-99-3]-Líquido transparente, incoloro y volátil. [PRECAUCION-Extremadamente inflamable.] Prácticamente insoluble en agua. Miscible con alcohol y con éter. Usar grado HPLC.
Cloruro de Calcio, CaCli · 2H20-147,01 [10035-04-8]Usar Cloruro de Calcio Dihidrato de grado reactivo ACS. Cloruro de Calcio Anhidro (para secado), CaCli-110,98 [10043-52-4]-Usar Cloruro de Calcio Desecante de grado reactivo ACS. Cloruro de Cesio, CsCl-168,36 [7647-17-8]-Polvo blanco. Muy soluble en agua; fácilmente soluble en metano!; prácticamente insoluble en acetona. Usar un grado adecuado. Cloruro de Cetiltrimetilamonio al 25 por ciento en Agua, C19H42CIN-320,00-Usar un grado adecuado. Cloruro de Cinc Anhidro en Polvo-Usar Cloruro de Cinc (monografía de la USP) que se ha secado y pulverizado. Cloruro de Cobalto (Cloruro Coba/toso), CoCli · 6H20237,93 [7791-13-1 ]-Usar grado reactivo ACS. Cloruro de Colina, HOCH2CH2N(CH3)3Cl-139,62 [67-48-1 ]-Cristales o polvo cristalino blanco. Muy soluble en agua. Es higroscópico. Almacenar en envases impermeables. VALORACIÓN: Transferir aproximadamente 100 mg, previamente secados a 105º durante 2 horas y pesados con exactitud, a un vaso de precipitados, agregar 20 ml de agua y 1 gota de solucion de cloruro de aíuminio (1 en 1O) y mezclar. Agregar, lentamente, 20 ml de una solución de tetrafeniíborato sódico (1 en 50) recién preparada y filtrada, y dejar la mezcla en reposo durante 30 minutos, agitando ocasionalmente por rotación suave. Pasar a través de un filtro de vidrio sinterizado de porosidad media, y lavar el vaso de precipitados y el precipitado con cuatro porciones de 1O ml de agua. El peso del precipitado, determinado después de secar a 105º durante 2 horas, y multiplicado por 0,3298, da el peso equivalente de C5H14CINO. No se encuentra menos de 99,5%. RESIDUO DE INCINERACIÓN (281 ): no más de o, 1%. Cloruro de Deuterio (Ácido Deutero Clorhídrico), DCl37,47 [7698-05-7]-Gas tóxico. Usar un grado adecuado con un grado de deuteración de no menos de 99%. Cloruro de Dimetiletil(3-hidroxifenil)amonio-Ver Cloruro de Edrofonio (monografía de la USP). Cloruro de 3,5-Dinitrobenzoilo, C1H3CIN2Ü5-230,56 [99-33-2]-Polvo cristalino de color amarillo pálido. Fácilmente soluble en soluciones de hidróxido de sodio diluido; soluble en alcohol. [PRECAUCIÓN-Corrosivo, sensible a la humedad, lacrimógeno y posible mutágeno. Almacenar bajo nitrógeno.] INTERVALO DE FUSIÓN (741 ): entre 69º y 71 º. SOLUBILIDAD EN HIDRÓXIDO DE SODIO: Una solución de 500 mg en 25 ml de hidróxido de sodio 1 N es transparente o no más que ligeramente turbia. RESIDUO DE INCINERACION: Incinerar 1 g con 0,5 ml de ácido sulfúrico: el residuo no pesa más de 1 mg (O, 1%). Cloruro de 3-Hidroxifenildimetiletil Amonio [Cloruro de Dimetileti/(3-hidroxifenil)amonio]-Usar Cloruro de Edrofonio. Cloruro de Lantano, LaCh · (6-7)H20 [10025-84-0]-Este reactivo está disponible en grados de hidratación que oscilan entre 6 y 7 moléculas de agua. Usar grado reactivo ACS. Cloruro de Litio, LiCl--42,39 reactivo ACS.
[7447-41-8]-Usar grado
Cloruro de Magnesio, MgCli · 6H20-203,30 [7791-18-6]-Usar grado reactivo ACS.
USP 39
Reactivos/
Cloruro de Metileno (Diclorometano), CH2Cb-84,93 [75-09-2]-Usar Diclorometano de grado reactivo ACS. Cloruro de Oro (Ácido Cloráurico), HAuCl4 · 3H20-393,83 [16903-35-8]-Usar grado reactivo ACS. Cloruro de Paladio, PdCb-177,33 [7647-10-1]-Polvo cristalino marrón. Soluble en agua, en alcohol, en acetona y en ácido clorhídrico diluido. VALORACIÓN: Disolver 80 mg, pesados con exactitud, en 1O ml de ácido clorhídrico diluido, diluir con agua a 50 ml y agregar 25 ml de una solución 1 en 100 de dimetilglioxima en alcohol. Dejar en reposo durante 1 hora y filtrar. Verificar si ocurre precipitación completa con la solución de dimetilglioxima. Incinerar el precipitado en un crisol de platino tarado a 850º durante 2 horas, enfriar y pesar el paladio. El peso del residuo no es menos de 59,0% del peso de la muestra de prueba. Cloruro de Potasio, KCl-74,55 grado reactivo ACS. Cloruro de Sodio, NaCl-58,44 reactivo ACS.
Especificaciones de Reactivos 2313
INTERVALO DE FUSIÓN (741): entre 185º y 192º, determinado después de la recristalización en alcohol caliente, si fuera necesario. RESIDUO DE INCINERACIÓN (Prueba para reactivos): Incinerar 1 g con 0,5 ml de ácido sulfúrico: el residuo no pesa más delOmg(lo/o). Cloruro de Tubocurarina (Cloruro de 7', 12'-dihidroxi-6,6'-dimetoxi-2,2',2'-trimetiltubocuraranio), C31H42CbN206-681,65 [6989-98-6]-Usar un grado adecuado con un resultado de valoración entre 98,0% y 102,0%. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado en Acros Organics, número de catálogo 24349, www.acros.com.] Cloruro Estannoso, SnCl2 · 2H20-225,65 [10025-69-1 ]-Usar grado reactivo ACS. Cloruro Férrico, FeCb · 6H20-270,29 Usar grado reactivo ACS.
[10025-77-1 ] -
[7447-40-7]-Usar [7647-14-5]-Usar grado
Cloruro de Tetrametilamonio, (CH3)4NCl-l 09,60 [75-57-0]-Cristales incoloros. Soluble en agua y en alcohol; insoluble en cloroformo. VALORACIÓN: Transferir a un vaso de precipitados aproximadamente 200 mg, pesados con exactitud, agregar 50 ml de agua y 1O ml de ácido nítrico diluido, agitar por rotación suave para disolver la muestra de prueba, agregar 50,0 ml de nitrato de plata O, 1 N SV y mezclar. Agregar 2 ml de sulfato férrico amónico SR y 5 ml de nitrobenceno, agitar y valorar el exceso de nitrato de plata con tiocianato de amonio O, 1 N SV: cada ml de nitrato de plata O, 1 N equivale a 10, 96 mg de (CH3)4NCI. No se encuentra menos de 98%. Cloruro de Tetrapropilamonio, C12H2aCIN-221,82 [5810-42-4]-Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 98,0%. Cloruro de Trifeniltetrazolio, C19H1sCIN4-334,80 [298-96-4]-Polvo cristalino, blanco a amarillento. Soluble en aproximadamente 1O partes de agua y de alcohol; poco soluble en acetona; insoluble en éter. Por lo general contiene disolvente de cristalización y cuando se seca a 105º funde aproximadamente a 240º, con descomposición. SOLUBILIDAD: Sendas porciones de 100 mg se disuelven por completo en 1O ml de agua y en 1O ml de alcohol, respectivamente, para producir soluciones que son transparentes o prácticamente transparentes. PÉRDIDA POR SECADO (731 ): Secar a 105º hasta peso constante: no pierde más de 5,0% de su peso. RESIDUO DE INCINERACIÓN (Prueba para reactivos): inapreciable, usando 100 mg. SENSIBILIDAD: Disolver 1O mg en 1O ml de alcohol deshidratado (A). Luego disolver 1O mg de dextrosa en 20 ml de alcohol deshidratado (8). A 0,2 ml de B agregar 1 ml de alcohol deshidratado y 0,5 ml de hidróxido de tetrametilamonio SR diluido (1 volumen diluido con 9 volúmenes de alcohol deshidratado), luego agregar 0,2 ml de A: se produce un color rojo intenso dentro de aproximadamente 10 minutos. Cloruro de Trimetilacetidrazidoamonio (Cloruro de Betaína Hidrazida, Reactivo de Girard T).
[(CH3)3N+CH2CONHNH2]Cl--167,64 [123-46-6]-Cristales incoloros o blancos. Fácilmente soluble en agua. Un g se disuelve en aproximadamente 25 ml de alcohol. Insoluble en cloroformo y en éter. Es higroscópico.
Cloruro Ferroso Tetrahidrato (Cloruro de Hierro (//) Tetrahidrato), FeCb · 4H20-198,81 [13478-10-9]-Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 99,0%. Cloruro Mercúrico, HgCl2-271,50 grado reactivo ACS.
[7487-94-7]-Usar
Cloruro Paladoso-Ver Cloruro de Paladio. Cloruro Platínico (Ácido Cloropjatínico), H2PtCl6 · 6H20517,90 [18497-13-7]-Usar Acido Cloroplatínico de grado reactivo ACS. Cloruro Talioso, TICl-239,84-Polvo fino, blanco, cristalino. Soluble en aproximadamente 260 partes de agua fría y en aproximadamente 70 partes de agua en ebullición; insoluble en alcohol. Venenoso; usar con ventilación adecuada. VALORACIÓN: Disolver aproximadamente 500 mg, pesados con exactitud, en una mezcla de 80 ml de agua y 0,5 ml de ácido sulfúrico. Cuando la disolución esté completa, agregar 20 ml de ácido clorhídrico. Calentar a 60º y mantener la temperatura durante la valoración con sulfato cérico O, 1 N SV, determinando el punto final potenciométricamente, usando electrodos de plata-cloruro de plata y de platino. Cada ml de sulfato cérico O, 1 N equivale a 11,99 mg de TICI. No se encuentra menos de 99%. Cobaltinitrito de Sodio, Na3Co(N02)6-403,94 [1 3600-98-1 ]-Usar grado reactivo ACS. Cobre, Cu-Peso atómico 63,546 grado reactivo ACS.
[7440-50-8]-Usar
Coenzima Q9 (Ubiquinona 45), Cs4Ha2Ü4-795,2 [303-97-9]-Polvo amarillo a anaranjado amarillento. Solución amarilla transparente, a una concentración de 1 mg por ml en una mezcla de cloroformo y etanol (9:1 ). ABSORTIVIDAD: Su absortividad a 275 nm, en solución de alcohol, es aproximadamente 1 700. Colagenasa: Usar un grado adecuado. [NOTA-Se puede obtener comercialmente un grado adecuado como Collagenase Type 2 (Colagenasa Tipo 2), CLS-2 en Worthington Biochemicaf Corp., www.worthington-biochem.com.J Colágeno: Usar un grado adecuado. [NOTA-Se puede obtener comercialmente un grado adecuado como Collagen Type 1 (Colágeno Tipo 1) de piel de ternero, soluble en ácidos en Sigma-Aldrich Corp., www. sigma-aldrich.com; número de catálogo C3511.J Colágeno Bovino: Usar un grado adecuado que contenga menos de 1 µg de glicosaminoglicano por mg.
2 314 Especificaciones de Reactivos / Reactivos [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado en SigmaAldrich, www.sigma-aldrich.com.] Colágeno de Cola de Rata-Usar un grado adecuado. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado en BD Biosciences, www.bdbiosciences.com.] Colato de Sodio Hidrato (sal sódica del ácido 3a, la, 12atrihidroxi-5f3-colan-24-oico; sal sódica del ácido colálico),
C24H39Naüs · xH20-430,55 (anhidro) [206986-87-0]-Se puede obtener de bilis de buey o de oveja. Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 99%. Colestano, C21H4s-372,67 adecuado.
USP 39
disolver la muestra de prueba: el residuo no pesa más de 2,4 mg (0,01 %). Cromotropato de Sodio-Ver Ácido Cromotrópico. Cromotropato Disódico (Sal Disódica del Ácido 4,5-dihidroxi-2,1-naftalenodisulfónico), ~ioH60sS2Na2 · 2H20400,29-Usar Sal Disódica del Acido Cromotrópico de grado reactivo ACS. Cromotropo 2R, C16H10N2Na20sS2-468,4 [4197-07-3]-Cristales o polvo rojo. Usar un grado adecuado.
[481-21-0]-Usar un grado
Colestanol ({3-Colestanol, Dihidrocolesterol, Zimostanol, Colestan-3{3-ol, 3{3-Hidroxi-Sa-Co/estano, Dihidrocolesterina),
C21H4s0-388,67 [80-97-7]-Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 95%. Almacenar a -20º. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado en www. sigmaaldrich.com o www.avantilipids.com.] Colesterol, C21H460-386,66 [57-88-5]-Usar un grado adecuado (monografía del NF). Compactina, C23H34Üs-390,52 [73573-88-3]-Usar un grado adecuado. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado en SigmaAldrich, www.sigma-aldrich.com.] Cortisona, C21 HisÜs-360,44 [53-06-5]-Polvo cristalino blanco. Prácticamente insoluble en agua; moderadamente soluble en alcohol y en acetona. Funde aproximadamente a 220º, con descomposición. MÁXIMO DE ABSORCIÓN: El espectro de absorción uv de una solución 1 en 100 000 en alcohol presenta un máximo aproximadamente a 238 nm. ROTACIÓN EsPECÍFICA (781 ): aproximadamente +209º, determinada en una solución 1 en 100 en alcohol. Cromato de Potasio, KiCr04-l 94, 19 Usar grado reactivo ACS.
DEAE-Agarosa [57407-08-6]-Perlas de agarosa unidas químicamente a dietilaminoetano y suspendidas en una solución de etanol al 20% en agua. [NOTA-Disponible comercialmente como DEAESepharosa.] Decanol (Alcohol n-Decílico), C10H220-158,28 [112-30-1 ]-Líquido viscoso transparente. Peso específico: aproximadamente 0,83 a 20º. Solidifica aproximadamente a 6,5º. Insoluble en agua; soluble en alcohol y en éter. VALORACIÓN: Cuando se examina mediante cromatografía de gas-líquido, usando un cromatógrafo y condiciones adecuadas, presenta una pureza de no menos de 99%. 1-Decanosulfonato de Sodio (Sal Sódica del Ácido 1-DecaC10H21 Na03S-244,33 [13419-61-9]-Usar un grado adecuado para cromatografía de par iónico con un contenido de no menos de 99,0%. nosulfónico),
Decil Sulfato de Sodio, C10H21Naü4S-260,33-Sólido cristalino blanco. VALORACIÓN: Transferir aproximadamente 1 g, pesado con exactitud, a un crisol adecuado tarado; humedecer con algunas gotas de ácido sulfúrico e incinerar moderadamente nasta peso constante. Cada mg de residuo equivale a 3,662 mg de C10H21Naü4S. No se encuentra menos de 95%.
[7789-00-6]-
Cromato de Sodio, Na2CrÜ4 · 4H20-234,03 [7775-11-3]-Cristales de color amarillo limón. Soluble en agua. VALORACIÓN: Pesar con exactitud aproximadamente 300 mg y disolver en 1O ml de agua contenidos en un matraz de 500 ml. Agregar 3 g de yoduro de potasio y 1O ml de ácido sulfúrico diluido y diluir con 350 ml de agua exenta de oxí~eno y dióxido de carbono. Valorar el yodo liberado con t1osulfato de sodio O, 1 N SV, agregando 3 ml de almidón SR cerca del punto final. Cada ml de tiosulfato de sodio O, 1 N consumido equivale a 7,802 mg de Na2Crü4 · 4H20. No se encuentra menos de 99%. MATERIA INSOLUBLE (Prueba para reactivos): no más de 1 mg, a partir de 20 g disueltos en 150 ml de agua (0,005%). ALUMINIO: Disolver 20 g en 140 ml de agua, filtrar y a9re$1ar 5 ml de ácido acético glacial al fiftrado. Agregar h1droxido de amonio hasta alcalinizar y digerir durante 2 horas en un baño de vapor. Pasar a través de papel de filtro endurecido, lavar meticulosamente, incinerar y pesar: el residuo no pesa más de 0,8 mg (0,002%). CALCIO: Determinar según se indica en la prueba para calcio en Cromato de Potasio grado reactivo ACS (0,005%). CLORUROS: Determinar según se indica en la prueba para cloruros en Cromato de Potasio grado reactivo ACS (aproximadamente 0,005%). SULFATOS: Determinar según se indica en la prueba para sulfatos en Dicromato de Potasio grado reactivo ACS, pero agregar 4,5 ml de ácido clorhídrico al agua usada para
Delta-8-tetrahidrocannabinol (Ll-8-Tetrahidrocannabinol), C21H30Ü2-314,47 [5957-75-5]-Usar un grado adecuado ya sea material sólido o solución en metano!. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado como solución metanólica (1 mg/ml) en www.cerilliant.com, número de catálogo T-032.] Designaciones G-Ver fases para cromatografía de gases en Reactivos, Columnas Cromatográficas. Designaciones L-Ver rellenos para cromatografía de líquidos de alta presión en la sección Reactivos, Columnas Cromatográficas. Designaciones S-Ver soportes para cromato~rafía de gases en la sección Reactivos, Columnas Cromatograficas.
Desoxiadenosina Trifosfato, C10H16Ns012P3-491, 18 [1927-31-7]-Usar un grado adecuado.
USP 39 [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado en BD Biosciences, www.bdbiosciences.com o en Applied Biosystems, www.appliedbiosystems.com.] Desoxicitidina Trifosfato, C9H16N3Ü13P3-467, 16 [2056-98-6]-Usar un grado adecuado. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado en BD Biosciences, www.bdbiosciences.com o en Applied Biosystems, www.appliedbiosystems.com.]
Reactivos / Especificaciones de Reactivos 2 31 5 Dextro Pantotenato de Calcio-Usar Pantotenato de Calcio (monografía de la USP). Dextrosa Anhidra, C6H1206-180, 16-Usar D-Glucosa Anhidra de grado reactivo ACS. Diacetilo-Ver 2, 3-Butanodiona. 2,3-Diaminonaftaleno, C10H10N2-158,20 Usar un grado adecuado.
[771-97-1 ] -
Desoxicolato de Sodio-Usar Sales Biliares. Desoxiguanosina Trifosfato, C10H16Ns013P3-507, 18 [2564-35-4]-Usar un grado adecuado. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado en BD Biosciences, www.bdbiosciences.com, o en Applied Biosystems, www.appliedbiosystems.com.]
Diaveridina (5-({3,4-Dimetoxifenil]meti/)-2,4-pirimidindia(5355-16-8]-Usar un grado mina), C13H16N402-260,3 adecuado. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado como número de catálogo 46174 en www.sigma-aldrich. com.] Dibencilo-Ver Bibencilo.
Desoxitimidina Trifosfato, C10H11N2Ü14Pr-482, 17-Usar un grado adecuado. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado en BD Biosciences, www.bdbiosciences.com, o en Applied Biosystems, www.appliedbiosystems.com.] Deuterocloroformo, CDCl3- l 20,38-Usar un grado adecuado. Dextrano de Alto Peso Molecular [9004-54-0]-Un estándar de peso molecular de dextrano con un peso molecular promedio en peso, Mw, de 1 a 2 x 106 Da y un cociente entre el peso molecular promedio en peso y el peso molecular promedio en número, Mw!MN, de 1,0 a 1,8. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado en American Polymer Standards Corporation, www.ampolymer.com.] Dextrina, (C6H100s)n · xH20 (9004-53-9]-Polvo amorfo blanco. Lentamente soluble en agua fría; más fácilmente soluble en agua caliente; insoluble en alcohol. MATERIA INSOLUBLE: Calentar a ebullición 1 g con 30 mL de agua en un matraz pequeño: la solución es incolora y transparente, o no más que opalescente. PÉRDIDA POR SECADO (731 ): Secar a 105º hasta peso constante: no pierde más de 10,0% de su peso. RESIDUO DE INCINERACIÓN (Prueba para reactivos): Incinerar 1 g con 0,5 mL de ácido sulfúrico: el residuo no pesa más de 5 mg (0,5%). CLORUROS (Prueba para reactivos): Disolver 3 g en 75 mL de agua en ebullición, enfriar, diluir con agua a 75 mL y filtrar si fuera necesario. A 25 mL del filtrado, agregar 2 mL de ácido nítrico y 1 mL de nitrato de plata SR y dejar en reposo durante 5 minutos: si se produce turbidez, ésta no excede la turbidez de un control que contenga 0,02 mg de CI agregado (0,002%). SULFATOS (Prueba para reactivos, Método /): A una porción de 25 mL del filtrado de la prueba anterior agregar 0,5 mL de ácido clorhídrico diluido y 2 mL de cloruro de bario SR y dejar en reposo durante 1O minutos: si se produce turbidez, ésta no excede la turbidez de un control que contenga 0,2 mg de S04 agregado (0,02%). SUSTANCIAS SOLUBLES EN ALCOHOL: Calentar a ebullición 1 g con 20 mL de alcohol durante 5 minutos bajo un condensador de reflujo y filtrar mientras está caliente. Evaporar 1O mL del filtrado en un baño de vapor y secar a 105º: el residuo no pesa más de 5 mg (1 %). AzÚCARES REDUCTORES: Agitar 2 g con 100 mL de agua durante 1O minutos y filtrar hasta que esté transparente. A 50 mL del filtrado agregar 50 mL de tartrato cúprico alcalino SR y calentar hasta ebullición durante 3 minutos. Filtrar a través de un crisol de filtrado tarado, lavar con agua, luego con alcohol y finalmente con éter, y secar a 105º durante 2 horas: el precipitado de óxido cuproso no pesa más de 115 mg (lo que corresponde aproximadamente a 5% de azúcares reductores como dextrosa).
2,6-Dibromoquinona-clorimida (2,6-Dibromo-N-cloro-p-benzoquinona /mina; Reactivo DBQ), O:C6H2Br2:NCl-299,35 [537-45-1 ]-Polvo cristalino amarillo. Insoluble en agua; soluble en alcohol y en soluciones de hidróxidos alcalinos diluidas. INTERVALO DE FUSIÓN (741): entre 82º y 84º. SOLUBILIDAD EN ALCOHOL: Una solución de 100 mg en 1O mL de alcohol no es más que ligeramente turbia. RESIDUO DE INCINERACIÓN (Prueba para reactivos): Incinerar 500 mg con 0,5 mL de ácido sulfúrico: el residuo no pesa más de 1 mg (0,2%). SENSIBILIDAD: A 1O mL de una solución en agua que contenga 0,01 mg de fenol, agregar 0,3 mL de una solución amortiguadora de borato de sodio (preparada disolviendo 2,84 g de borato de sodio cristalizado en 90 mL de agua tibia, agregando 8,2 mL de hidróxido de sodio 1 N y diluyendo con agua a 100 mL) y O, 1 mL de una solución de 1O mg de la muestra de prueba en 20 mL de alcohol: se desarrolla un color azul distintivo dentro de los 1O minutos. Dibromuro de Dimetilestaño, C2H6Br2Sn-308,59 [2767-47-7]-Usar un grado adecuado. Dibutilamina, CsH19N-129,24 (111-92-2]-Líquido incoloro. VALORACIÓN: Inyectar un volumen apropiado en un cromatógrafo de gases (ver Cromatografía (621 )) equipado con un detector de ionización a la llama, usando helio como gas transportador. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas: una columna capilar de 0,25 mm x 30 m, recubierta con una capa de fase G2 de 1 µm; mantener la temperatura del inyector a 200º; mantener la temperatura del detector a 300º; mantener la temperatura de la columna a 100º y programarla para que aumente 1Oº por minuto hasta 200º. El área del pico de CsH19N no es menos de 99% del área total. ÍNDICE DE REFRACCIÓN (831): entre 1,415 y 1,419, a 20º. Diciclohexilamina, (C6H 11 )2N H-181,32 (1 O1-8 3-7]-Líquido transparente, fuertemente alcalino. Moderadamente soluble en agua. Miscible con disolventes orgánicos comunes. Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 98%. Diciclohexilo, (Biciclohexilo) C12H22-166,31 Usar un grado adecuado.
[92-51-3]-
Diclorhidrato de N,N-Dimetil-p-fenilendiamina, (CH3)2NC6H4NH2·2HCl-209,12 [99-89-9]-Sólido higroscópico, cristalino, fino, casi blanco que puede tener un tinte rosado. Fácilmente soluble en agua; soluble en alcohol. VALORACIÓN: Transferir aproximadamente 400 mg, pesados con exactitud, a un vaso de precipitados de 250 mL y disolver en aproximadamente 75 mL de agua. Valorar con
2316 Especificaciones de Reactivos/ Reactivos hidróxido de sodio O, 1 N SV, determinando el punto final potenciométricamente. Cada ml de hidróxido de sodio O, 1 N equivale a 10,46 mg de CsH12N2 · 2HCI. No se encuentra menos de 98%. SOLUBILIDAD: Una solución de 1 g en 1O ml de agua no produce más que una leve turbidez. Diclorhidrato de o-Fenilendiamina, C6HsN2 · 2HCl181, 1-Polvo blanco. VALORACIÓN: Cuando se analiza por cromatografía en capa delgada, usando placas recubiertas con mezcla de gel de sílice para cromatografía y una fase móvil constituida por una mezcla de alcohol butílico, agua y ácido acético (12:5:3), y se observa bajo luz UV de longitud de onda corta, presenta una sola mancha con trazas de impurezas. Diclorhidrato de p-Fenilendiamina-Ver Clorhidrato de pFenilendiamina.
Diclorhidrato de Hidrazina, (NH2)2 · 2HCl-104,97 [5341-61-7]-Polvo blanco. VALORACIÓN: Disolver aproximadamente 34 mg, pesados con exactitud, en 50 ml de agua. Agregar cuidadosamente 1 g de bicarbonato de sodio mezclando. [PRECAUCIÓN: Se puede liberar dióxido de carbono rápidamente.] Valorar con solución de yodo O, 1 N determinando el punto final potenciométricamente. Realizar una determinación con un blanco y hacer las correcciones necesarias. Cada ml de solución de yodo O, l N equivale a 2,63 mg de (NH2)2 · 2HCI. No se encuentra menos de 98%. Diclorhidrato de Histamina, CsH9N3 · 2HCl-184,07-Usar ER Diclorhidrato de Histamina USP. Diclorhidrato de N-(1-Naftil)etilendiamina, C10H1NH(CH2)2NH2 · 2HCl-259, 17 [1465-25-4]-Usar grado reactivo ACS. Diclorhidrato de Piridoxamina, CsH12N202·2HCl-241,11 [524-36-7]-Polvo cristalino o cristales de color blanco a ligeramente amarillo. Se oscurece paulatinamente por exposición al aire o a la luz solar. Un g se disuelve en aproximadamente 1 ml de agua y en aproximadamente 60 ml de alcohol. Insoluble en cloroformo y en éter. Sus soluciones son ácidas. INTERVALO DE FUSIÓN (741 ): entre 225º y 230º, con descomposición parcial. RESIDUO DE INCINERACIÓN (Prueba para reactivos): no más de 0,15%. PÉRDIDA POR SECADO (731 ): Secar a 105º durante 2 horas: no pierde más de 01 5% de su peso. CONTENIDO DE NITROGENO (Prueba para reactivos): Determinar por medio del método Kjeldahl, usando una muestra de prueba secada previamente a 105º durante 2 horas: se encuentra entre 11,3% y 11,8% de N. CONTENIDO DE CLORUROS: Determinar según se indica en la rueba de Contenido de Cloruro en Clorhidrato de Piridoxa: se encuentra entre 29, 1% y 29,6% de CI.
f
Diclorhidrato de Putrescina, C4H12N2 · 2HCl-161,07 [333-93-7]-Polvo cristalino blanco. Usar un grado adecuado. 1, 1-Dicloro-2,2-bis(p-clorofenil)etano (p,p' -000), C14H10C14-320,03 [72-54-8]-Usar un grado adecuado. [NOTA-Un grado adecuado se encuentra disponible con el número de catálogo BOl 32 en www.tciamerica.com.] 2,5-Dicloroanilina, Cl2C6H3NH2-162,02 [95-82-9]-Cristales aciculares de color blanco. Poco soluble en agua; soluble en alcohol y en éter.
USP 39 INTERVALO DE FUSIÓN, Clase I (7 41 ):
entre 49º y 50º.
2,6-Dicloroanilina, C6HsC'2N-162,02 [608-31-1 ]-Polvo blanquecino. , INTERVALO DE FUSION (7 41 ): entre 38º y 41 o. o-Diclorobenceno, C6H4C'2-147,00 [95-50-1 ]-Líquido transparente, con un leve tinte marrón amarillento (aproximadamente APHA 20). Prácticamente insoluble en agua. Miscible con alcohol y con éter. Alcanza el punto de ebullición aproximadamente a 180º. VALORACIÓN: Cuando se examina mediante cromatografía de gas-líquido, en condiciones adecuadas y con aparatos adecuados, presenta una pureza de no menos de 98%. DENSIDAD: entre 1,299 y 1,301. ÍNDICE DE REFRACCIÓN \831): entre 1,548 y 1,550 a 25º. RESIDUO DE EVAPORACION: Evaporar 80 ml en un baño de vapor y secar a 105º durante 1 hora: el residuo no pesa más de 50 mg (0,005%). ACIDEZ: Agregar fenolftaleína SR a 25 ml de metanol y valorar con hidróxido de potasio alcohólico 0,02 N SV hasta que persista un leve color rosado durante 15 segundos. Pipetear 25 ml de la muestra de prueba y transferir a la solución, mezclar, evitando la exposición a la atmósfera y valorar con hidróxido de potasio alcohólico 0,02 N SV: no se requieren más de 2,2 ml para restablecer el color rosado (aproximadamente 0,005%). 1,2-Dicloroetano-Ver Dicloruro de Etileno. 2,6-Diclorofenol-indofenol Sódico (2,6-0icloro-indofenol Sódico), O:C6H2Cb:NC6H40Na con aproximadamente 2H20290,08 (anhidro) [620-45-1 ]-Usar grado reactivo ACS. Diclorofluoresceína, C20H10Cl20s-401,20 [76-54-0][NOTA-Esta especificación abarca tanto al isómero 4,5 como al isómero 2,7 de diclorofluoresceína, cualquiera de los cuales es adecuado para preparar diclorofluoresceína SR.] Polvo cristalino de color anaranjado tenue. Moderadamente soluble en agua; soluble en alcohol y en soluciones de hidróxidos alcalinos. RESIDUO DE INCINERACIÓN (Prueba para reactivos): Incinerar 200 mg con 5 gotas de ácido sulfúrico: el residuo no pesa más de 1 mg (0,5%). SENSIBILIDAD: Disolver 100 mg en 60 ml de alcohol, agregar 2,5 ml de hidróxido de sodio O, 1 N y diluir con a_gua nasta completar 100 ml. Agregar 1 ml de esta solucion a una solución de yoduro de potasio que se prepara disolviendo 100 mg de yoduro de potasio, previamente secado a 105º hasta peso constante y pesado con exactitud, en 50 ml de agua que contenga 1 ml de ácido acético glacial, y valorar con nitrato de plata O, 1 N SV hasta que el color del precipitado cambie de anaranjado amarillento pálido a rosado. El volumen de nitrato de plata O, 1 N consumido no es más de 0, 1O ml mayor que el volumen calculado, basándose este último en el contenido de KI de la muestra seca según se determina en Valoración en Yoduro de Potasio (monografía de la USP). Diclorofluorometano, CHCbF-102,92 [75-43-4]-Gas incoloro. VALORACIÓN: Inyectar una muestra apropiada en un cromatógrafo de gases (ver Cromatograf1a (621 )) equipado con un detector de conductividad térmica y emplear helio como gas transportador. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas: una columna capilar de 0,53 mm x 30 m recubierta con una capa de 5 µm de fase G2; mantener la temperatura del inyector a 200º; mantener la temperatura del detector a 200º; mantener la temperatura de la columna a Oº y programarla para que aumente 5º por minuto hasta 40º, y después para que aumente 1Oº por minuto hasta 180º. El área del pico de CHCbF no es menos de 98% del área total.
USP 39 2,6-Dicloroindofenol Sódico-Ver 2,6-Diclorofenolindofenol Sódico.
Reactivos/
Especificaciones de Reactivos 2317
Miscible con agua, con alcohol, con éter y con acetona. Insoluble en benceno y en tetracloruro de carbono. Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 99,0%.
Diclorometano-Usar Cloruro de Metileno. 2,4-Dicloro- l-naftol, C10H60Cb-213,06 [2050-76-2]Polvo tostado claro. INTERVALO DE FUSIÓN (741): entre 103º y 107º, pero el intervalo entre el comienzo y el final de la fusión no excede de 2º. 2,6-Dicloroquinona-clorimida (2,6-0icloro-N-cloro-p-benzoquinona /mina), O:C6H2C'2:NCl-210,44-Polvo cristalino de color amarillo pálido. Insoluble en agua; soluble en alcohol y en soluciones de hidróxidos alcalinos diluidas. INTERVALO DE FUSIÓN (741): entre 65º y 67º. SOLUBILIDAD EN ALCOHOL: Una solución de 100 mg en 1O mL de alcohol es completa y es transparente. RESIDUO DE INCINERACIÓN: Incinerar 500 mg con 0,5 mL de ácido sulfúrico: el residuo no pesa más de 1 mg (0,2%). SENSIBILIDAD: Cumple con los requisitos de la prueba de Sensibilidad en 2, 6-0ibromoquinona-clorimida. Dicloruro de Etileno (1,2-0icloroetano), C2H4C'2-98,96 [l 07-06-2]-Usar 1,2-Dicloroetano de grado reactivo ACS. Dicromato de Potasio, K1Cr201-294, 18 [7778-50-9]Usar grado reactivo ACS. [NOTA-El Dícromato de potasio de calidad adecuada como estándar primario se puede obtener en el Instituto de Normas y Tecnología de los EE.UU. (NIST, por sus siglas en inglés), www.nist.gov, como muestra de estándar Nº 136.] Dicromato de Sodio, Na2Cr201 · 2H20 (para mezcla limpiadora de ácido crómico)-298,00 [7789-12-0]-Usar grado reactivo ACS. Dietil Sulfona (Etil Su/fono), (C2Hs)2S02-l 22, 19 [597-35-3]-Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 97%. Dietilamina, (C2Hs)2NH-73, 14 [l 09-89-7]-Líquido incoloro, inflamable, fuertemente alcalino. Miscible con agua y con alcohol. Forma un hidrato con agua. Puede ser irritante para la piel y las membranas mucosas. Almacenar en envases bien cerrados. Usar grado reactivo ACS. N,N-Dietilanilina, C6HsN(C2Hs)2-149,23 [91-66-7]-Líquido ámbar a amarillo claro. VALORACIÓN: Inyectar una muestra apropiada (aproximadamente 0,2 µL) en un cromatógrafo de gases adecuado (ver Cromatografía (621 )) equipado con un detector de ionización a la llama, usando helio como gas transportador, que fluye a una velocidad de aproximadamente 40 mL por minuto. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas: una columna de acero inoxidable de 3 mm x 1,8 m, con fase Gl 6 al 20% sobre soporte Sl A; mantener la temperatura del inyector a 250º; mantener la temperatura de la columna a 140º y programarla para que aumente 6º por minuto hasta 200º. Mantener la temperatura del detector a 310º. El área del pico de N,N-dietilanilina con un tiempo de retención de aproximadamente 4,9 minutos no es menos de 99% del área total. ÍNDICE DE REFRACCIÓN (831 ): entre 1,5405 y 1,5425 a 20º. Dietilditiocarbamato de Plata, (C2H5)2NCS2Ag-256, 14 [1470-61-7]-Usar grado reactivo ACS. Dietilditiocarbamato de Sodio, (C2Hs)2NCS2Na · 3H20225,31 [20624-25-3]-Usar grado reactivo ACS. Qietilenglicol (Bis(2-hidroxietil) Éter; Oiglicol; 2-Hidroxietil Eter; 2,2' -Oxidietanol), C4H100i-106, 12 [111-46-6]-Líquido viscoso, higroscópico, de incoloro a amarillo tenue.
Dietilentriamina, CH13N3-l 03, 17 [111-40-0]-Líquido incoloro. VALORACIÓN: Inyectar una muestra apropiada en un cromatógrafo de gases adecuado (ver Cromatografía (621 )) equipado con un detector de ionización a la llama, usando helio como gas transportador. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas: una columna capilar de 0,25 mm x 30 m recubierta con G2. Mantener la temperatura del inyector a 200º; mantener la temperatura de la columna a 100º y programarla para que aumente 1Oº por minuto hasta 250º y se mantenga a esta temperatura durante 5 minutos. Mantener la temperatura del detector a 300º. El ~rea del pico princ}pal no es menos de 95% del área total. INDICE DE REFRACCION (831): entre 1,4815 y 1,4845 a 20º. Di(2-etilhexil)ftalato [Ftalato de bis(2-etilhexilo)}, C24H3sÜ4-390,56 [117-81-7]-Usar un grado adecuado. Dietilpirocarbonato, C6H100s-162, 14 [1609-47-8]-Líquido transparente e incoloro. Usar un grado adecuado. Difenilamina, (C6Hs)2NH-169,22 grado reactivo ACS.
[122-39-4]-Usar
Difepilborinato de 2-Aminoetilo-Ver Éster Aminoetílico del Acido Difenilborínico. Difenilcarbazida, (C6HsNHNH)2C0-242,28 [140-22-7]Usar 1,5-Difenilcarbohidrazida de grado reactivo ACS. Difenilcarbazona [Oifenilcarbazona con s-Oifenilcarbazida (7: 7)}, C6HsNHNHCON:NC6Hs · C6HsNHNHCONHNHC6Hs482,54 [538-62-5]-Usar Difenilcarbazona con s-Difenilcarbazida (1 :1) grado reactivo ACS. 2,2-Difenilglicina, C14H13N02-227,26 [3060-50-2]Polvo blanquecino. Funde aproximadamente a 244º, con descomposición. VALORACIÓN: Disolver aproximadamente 115 mg, pesados con exactitud, en 30 mL de metano!. Agregar en forma lenta aproximadamente 20 mL de agua, calentando levemente si fuera necesario para completar la disolución. Valorar con hidróxido de sodio O, 1 N SV, determinando el punto final potenciométricamente. Realizar una determinación con un blanco y hacer las correcciones necesarias. Cada mL de hidróxido de sodio O, 1 N equivale a 22,73 mg de C14H13N02. No se encuentra menos de 98,0%. Digerido Pancreático de Caseína (una peptona bacteriológica; Triptona)-Polvo amarillo grisáceo con un olor característico pero no putrefacto. Fácilmente soluble en agua; insoluble en alcohol y en éter. PÉRDIDA POR SECADO (731) Análisis: Secar a 100º hasta peso constante. Criterios de aceptación: No más de 7,0% RESIDUO DE INCINERACIÓN (281) Análisis: Incinerar 500 mg con 1 mL de ácido sulfúrico. Criterios de aceptación: No más de 75 mg (15%) CONTENIDO MICROBl~NO: No más de 104 ufc/g. CONTENIDO DE NITROGENO (Prueba para reactivos) Análisis: Determinar por el método Kjeldahl. Criterios de aceptación: Se encuentra entre 9,0%-14,0% CONTENIDO DE NITRÓGENO AMINO: 5,0%-5,6% Digerido Papaínico de Harina de Soja-Material nutriente soluble preparado por la acción de la enzima papaína sobre
2318 Especificaciones de Reactivos/ Reactivos la harina de soja, seguida de una adecuada purificación y concentración. Contiene carbohidratos fermentables. PÉRDIDA POR SECADO (731) Análisis: Secar el artículo a 100º hasta peso constante. Criterios de aceptación: No más de 7,0% RESIDUO DE INCINERACIÓN (Prueba para reactivos) Análisis: Incinerar 500 mg con 1 mL de ácido sulfúrico. Criterios de aceptación: No más de 75 mg (15,0%) CONTENIDO MICROBIANO: No más de 104 ufc/g CONTENIDO DE NITRÓGENO (Prueba para reactivos) Análisis: Determinar por medio del método Kjeldahl, con una muestra de prueba secada previamente a 105º hasta peso constante. Criterios de aceptación: Se encuentra no menos de 8,5% CONTENIDO DE NITRÓGENO AMINO: 1,8%-3,2% Digerido Péptico de Tejido Animal (una peptona bacteriológica)-Polvo de color tostado, con un olor característico, pero no putrescente. Soluble en agua; insoluble en alcohol y en éter. Una solución (2 en 100) en un autoclave es transparente y neutra o casi neutra en su reacción. PÉRDIDA POR SECADO (731) Análisis: Secar a 100º hasta peso constante. Criterios de aceptación: No más de 7,0% RESIDUO DE INCINERACIÓN (281) Análisis: Incinerar 500 mg con 1 mL de ácido sulfúrico. Criterios de aceptación: No más de 75 mg (15%) CONTENIDO MICROBIANO: No más de 104 ufc/g CONTENIDO DE NITRÓGENO Análisis: Determinar por medio del método Kjeldahl, con una muestra de prueba previamente secada a 105º hasta peso constante. Criterios de aceptación: Se encuentra entre 9,0% y 14,0% CONTENIDO DE NITRÓGENO AMINO: 2,7%-3,7% Digitonina, Cs6H92Ü29-1229,31 [11024-24-1 ]-Polvo cristalino blanco. Casi insoluble en agua; soluble en alcohol tibio, en ácido acético glacial y en ácido acético al 75%; insoluble en cloroformo y en éter. Funde aproximadamente a 230º, con descomposición. ROTACIÓN ESPECÍFICA (781 ): entre -47º y -49º, determinada en una solución de ácido acético al 75% que contenga 100 mg por ml. SOLUBILIDAD EN ALCOHOL: Una solución de 500 mg en 20 mL de alcohol tibio es incolora y completa. PÉRDIDA POR SECADO (731): Secar a 105º hasta peso constante: no pierde más de 6% de su peso. RESIDUO DE INCINERACIÓN (Prueba para reactivos): no más de 0,3%. Digoxigenina (Lactona del Ácido 3[3, 72[3, 74[3,2 7-Tetrahidroxi20(22)-norcolénico; 3[3, 72[3, 74-Trihidroxi-5[3,20(22)-cardenolida; 5[3,20(22)-Cardenolida-3[3, 72[3, 74-triol; Lanadigenina), CnH34Üs-390,51
[1672-46-4]-Usar un grado adecuado.
24,25-Dihidrolanosterol (Lanostenol, Lanost-8-en-3[3-ol, 5aLanost-8-en-3[3-ol, DHL), C30Hs20-428,73 [911660-54-3]-Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 99%. Almacenar a -20º. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado en www.avantilipids.com.] Dihidroquinina (Hidroquinina), C20H26N202-326,43 [522-66-7]-Fácilmente soluble en acetona, en alcohol y en cloroformo; casi insoluble en agua. VALORACIÓN Fase móvil: Preparar una mezcla de agua, acetonitrilo, dietilamina y ácido metanosulfónico (860:100:20:20) y metanol (82:18).
USP 39 Procedimiento: Inyectar aproximadamente 20 µL en un cromatógrafo de líquidos adecuado (ver Cromatografía (621 )) equipado con un detector a 235 nm y una columna de 4,6 mm x 15 cm rellena con material L1. La velocidad de flujo es de aproximadamente 1,5 mL por minuto. El área del pico de C20H26N202 no es menos de 97,5% del área total. 2,7-Dihidroxinaftaleno-Ver 2,7-Naftalenodiol. Diisopropilamina, [(CH3)2CH]2NH-101, 19 [108-18-9]Líquido incoloro. VALORACIÓN: No se encuentra menos de 98% de C6H1sN, empleando un cromatógrafo de gases adecuado equipado con un detector de ionización a la llama. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas: rellenar una columna de acero inoxidable de 3,2 mm x 1,83 m con soporte de poliestireno entrecruzado; mantener la temperatura del inyector a 250º y la del detector a 31 Oº; programar la temperatura de la columna para que aumente 1Oº por minuto de 50º a 220º. ÍNDICE DE REFRACCIÓN (831): entre 1,3915 y 1,3935, a 20º. Diisopropiletilamina (N,N-Diisopropiletilamina), CsH19N129,24 [7087-68-5]-Líquido transparente e incoloro. Soluble en ácido acético glacial. VALORACIÓN: Pesar con exactitud aproximadamente 500 mg, disolver en 50 mL de ácido acético glacial, mezclar, agregar cristal violeta SR y valorar con ácido perclórico O, l N SV. Cada mL de ácido perclórico 0, 1 N equivale a 12,92 mg de CsH19N. No se encuentra menos de 98%. ÍNDICE DE REFRACCIÓN (831 ): entre 1,4125 y 1,4145 a 20º. 1,2-Dilinoleoil-3-oleoil-rac-glicerol, Cs1H10006-881,4 [2190-21-8]-Usar un grado adecuado. 1,2-Dilinoleoil-3-palmitoil-rac-glicerol, CssH9sÜ6-855,4 [2190-15-0]-Usar un grado adecuado. Dimeticona de 500 centistokes de viscosidad [Poli(dimetilsiloxano) de 500 centistokes de viscosidad], [-Si(CH3)20-]n [ 63148-62-9]-Usar un grado adecuado. 1,9-Dimetil-Azul de Metileno, C36H46Cl4N60S2Zn-850, 1 [23481-50-7]-Polvo verde oscuro. Usar un grado adecuado. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado en SigmaAldrich, www.sigma-aldrich.com.] 5,5-Dimetil-1,3-ciclohexanodiona, CsH1202-140, 18 [126-81-8]-Sólido cristalino blanco. Poco soluble en agua; soluble en alcohol, en metano!, en cloroformo y en ácido acético. INTERVALO DE FUSIÓN (741): entre 148º y 150º. 1,3-Dimetil-2-imidazolidinona, CsH10N20-114, 15 [80-73-9]-Usar un grado adecuado. N,N-Dimetil-1-naftilamina, C12HnN-171,24 [86-56-6]Líquido aromático de color amarillo pálido a amarillo. Soluble en alcohol y en éter. VALORACIÓN: Transferir aproximadamente 250 mg, pesados con exactitud, a un vaso de precipitados adecuado, agregar 100 mL de ácido acético glacial y mezclar para disolver. Cuando se haya disuelto por completo, valorar con ácido perclórico O, 1 N SV determinando el punto final potenciométricamente. Realizar una determinación con un blanco y hacer las correcciones necesarias. Cada mL de ácido perclórico 0, 1 N equivale a 17, 12 mg de C12HnN. No se encuentra menos de 98%. ÍNDICE DE REFRACCIÓN (831 ): entre 1,621 Oº y 1,6230º, a 20º, empleando luz de sodio.
USP 39 PRUEBA DE SULFANILAMIDA: Disolver 20 mg de ER Sulfanilamida USP en 100 mL de agua para obtener la Solución de sulfanilamida. Pipetear 1,0 mL y 2,5 mL de la Solución de sulfanilamida y transferirlos a sendos vasos de precipitados de 150 ml. Diluir con agua hasta 90 ml. Para el blanco, colocar 90 mL de agua en un tercer vaso de precipitados. A~regar a cada vaso 8,0 mL de solución de ácido tricloroacetico (3 en 20) y 1,0 mL de solución de nitrito de sodio (1 en 1000). Mezclar las soluciones durante 5 minutos, luego agregar 1O mL de solución amortiguadora de acetato SR y 1,0 mL de una solución 1 en 1000 de N,N-dimetil-1-naftilamina en alcohol. El pH es de aproximadamente 5 a 6, usando papel indicador de pH. Mezclar otros 5 minutos y luego agregar 20 mL de ácido acético glacial. El pH es de aproximadamente 3 a 4, usando papel indicador de pH. En comparación con el blanco, el vaso de precipitados que contiene 1,0 mL de la Solución de sulfanilamida presenta un color rosado, mientras que el otro presenta un color de rosado intenso a rojo. 2,2-Dimetil-2-silapentano-5-sulfonato de sodio-Ver 3-(Trimetilsilil)-1-propano sulfonato de sodio. N,N-Dimetilacetamida, C4H9N0-87, 12 [127-19-5)-Líquido transparente e incoloro. Miscible con agua y con muchos disolventes orgánicos. Usar un grado espectroscópico o HPLC adecuado. p-Dimetilaminoazobenceno (Amarillo de Metilo, Amarillo [60-11-7]Mantequilla), C6HsN:NC6H4N(CH3)2-225,29 Laminillas amarillas o polvo cristalino amarillo. SOLUBILIDAD: Insoluble en agua; moderadamente soluble en cloroformo, en éter o en ácidos grasos. Disolver 100 mg en 20 mL de alcohol: la solución es completa o prácticamente completa y transparente. INTERVALO DE FUSIÓN (741 ): entre 115º y 117º. RESIDUO DE INCINERACIÓN (281 ): no más de 0, 1%. SENSIBILIDAD: Agregar 0,05 mL de una solución de alcohol (1 en 200) y 2 g de cloruro de amonio a 25 mL de agua exenta de dióxido de carbono: el color amarillo limón de la solución se torna anaranjado por la adición de 0,05 mL de ácido clorhídrico O, 1 N y se restablece con la adición subsiguiente de 0,05 mL de hidróxido de sodio O, 1 N. P.:"Dimetilaminobenzaldehído, (CH3)2NC6H4CH0-149, 19 L100-10-7]-Usar grado reactivo ACS. p-Dimetilaminocinamaldehído, (CH3)2NC6H4CH:CHCH0175,23-Polvo amarillo anaranjado. Soluble en acetona, en alcohol y en benceno. INTERVALO DE FUSIÓN (741): entre 132º y 136º. Dimetilaminofenol (isómero meta), CsH11N0-137,18--Sólido cristalino de color negro-purpúreo, gris o tostado. INTERVALO DE FUSIÓN (741): entre 83º y 85º. 2,6-Dimetilanilina, CsHnN-121, 18 [87-62-7)-Líquido amarillo. ÍNDICE DE REFRACCIÓN (831 ): aproximadamente 1,5609, a 20º. N,N-Dimetilanilina, C6HsN(CH3)2-121, 18 [121-69-7)-Líquido amarillo claro. Líquido transparente, incoloro cuando está recién destilado, pero que adquiere un color rojizo a marrón-rojizo. Peso específico: aproximadamente 0,960. Punto de congelación aproximadamente 2º. Insoluble en agua; soluble en alcohol, en cloroformo, en éter y en ácidos minerales diluidos. VALORACIÓN: Inyectar una muestra apropiada (aproximadamente 0,2 µL) en un cromatógrafo de gases adecuado (ver Cromatografía (621)) equipado con un detector de ionización a la llama, usando helio como gas transportador con una velocidad de flujo de aproximadamente 40 mL
Reactivos/ Especificaciones de Reactivos 2319 por minuto. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas: una columna de acero inoxidable de 3 mm x 1,8 m, con fase Gl 6 al 20% sobre un soporte Sl A; la temperatura del inyector se mantiene a 250º, la temperatura de la columna se mantiene a 50º y se programa para que aumente 1Oº por minuto hasta 200º. Mantener la temperatura del detector a 31 Oº. El área del pico de N,N-dimetilanilina, con un tiempo de retención de aproximadamente 11,5 minutos, no es menos de 99% del área total. ÍNDICE DE REFRACCIÓN )831): entre 1,5571 y 1,5591 a 20º. INTERVALO DE EBULLICION (Prueba para reactivos): Destilar 100 mL: la diferencia entre las temperaturas observadas, cuando se han destilado 1 mL y 95 mL, no es mayor de 2,5º. Su temperatura de ebullición a una presión de 760 mm de mercurio es de 194,2º. HIDROCARBUROS: Disolver 5 mL en una mezcla de 1O mL de ácido clorhídrico y 15 mL de agua: se produce una solución transparente y permanece transparente al enfriarse hasta aproximadamente 1Oº. ANILINA o MONOMETILANILINA: Colocar 5 mL en un matraz con tapón de vidrio, agregar 5 mL de una solución de anhídrido acético en benceno (1 en 1O), mezclar y dejar reposar durante 30 minutos. Agregar 30,0 mL de hidróxido de sodio 0,5 N SV, agitar la mezcla, agregar fenolftaleína SR y valorar con ácido clorhídrico 0,5 N SV. Realizar una determinación con un blanco y hacer las correcciones necesarias. La muestra de prueba no consume más de 0,30 mL de hidróxido de sodio 0,5 N. 3,4-Dimetilbenzofenona, C1sH140-210,27 [2571-39-3)-Terrones blancos que funden aproximadamente a 45º. VALORACIÓN: Inyectar una muestra apropiada en un cromatógrafo de gases adecuado (ver Cromatografía (621)) equipado con un detector de ionización a la llama, usando helio como gas transportador. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas: una columna capilar de 0,25 mm x 30 m recubierta con fase Gl: mantener la temperatura del detector y la del inyector a 300º; mantener la temperatura de la columna a 180º y programarla para que aumente a una velocidad de 1Oº por minuto hasta 280º y se mantenga a esa temperatura durante 1O minutos. El área del pico principal no es menos de 99% del área total. N,N-Dimetildecilamina (1-(Dimetilamino)decano), C4H9N0-185,35 [1120-24-7]-Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 98%. N,N-Dimetildodecilamina-N-óxido (Laurildimetilamina-Nóxido), CH3(CH2)11 NO(CH3)2-229,40 [1643-20-5]-Usar un grado adecuado. [NOTA-N,N-Dimetildodecilamina-Nóxido, O, 1 N en Agua y N,N-Dimetildodecilamina-N-óxido al 30 por Ciento también son grados adecuados.] 2,5-Dimetilfenol, CsHio0-122, 16 grado adecuado.
[95-87-4]-Usar un
2,6-Dimetilfenol, (CH3)2C6H30H-122, 16 [576-26-1 ] Sólido cristalino de color blanco a amarillo pálido. VALORACIÓN: Inyectar una solución 1 en 3 del artículo en xileno en un cromatógrafo de gases adecuado equipado con un detector de ionización a la llama, usando helio como gas transportador que fluye a una velocidad de aproximadamente 40 mL por minuto. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas: una columna de acero inoxidable de 3,2 mm 1,83 m, rellena con fase G25 al 10% sobre soporte Sl A; mantener la temperatura del inyector aproximadamente a 250º y la del detector aproximadamente a 31 Oº; y programar la temperatura de la columna para que aumente 8º por minuto de 100º a 200º. Inyectar de manera similar una muestra de xileno. El área del pico de CsH1oO no es menos de 98% del área total, corregida por xileno.
2320 Especificaciones de Reactivos / INTERVALO DE FUSIÓN (741):
Reactivos
entre 44° y 46°.
3,5-Dimetilfenol, CsHio0-122, 16 [108-68-9]-Usar un grado adecuado. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado en www. alfa.com, disponible como número de producto 5600.] Dimetilformamida (N,N-Dimetilformamida), HCON(CH3)273,09 [68-12-2]-Usar grado reactivo ACS. N,N-Dimetilformamida Dietil Acetal-147,22 [1188-33-6]-Usar un grado adecuado. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado en SigmaAldrich, www.sigma-aldrich.com.] N,N-Dimetiloctilamina, C10H 23 N-157,30 [7378-99-6]Lí~uido incoloro. ÍNDICE DE REFRACCIÓN (831 ): 1,4243 a 20º. Dimetil Sulfona (Metí/ Sulfona), (CH3)2S02-94, 13 [67-71-0]-Cristales blancos. INTERVALO DE FUSIÓN (741): entre 109º y 111º. Dimetil Sulfóxido (Metí/ Sulfóxido), (CH3)2S0-78, 13-Usar metil sulfóxido de grado reactivo ACS. Dimetil Sulfóxido, Grado Espectrofotométrico [67-68-5]-Usar metil sulfóxido de grado reactivo espectrofotométrico ACS. 2,5-Dimetoxibenzaldehído, C9H10Ü3-l66, 17 [93-02-7]-Cristales blanquecinos. VALORACIÓN: Inyectar una muestra apropiada en un cromatógrafo de gases adecuado (ver Cromatografía (621 )) equipado con un detector de ionización a la llama y emplear nitrógeno como gas transportador. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas: una columna capilar de 0,3 mm x 30 m recubierta con fase Gl; mantener la temperatura del inyector a 270º; mantener la temperatura del detector a 300º; mantener la temperatura de la columna a 150º y programarla para que aumente 1Oº por minuto hasta 270º. El área del pico principal no es menos de 97% del área total. INTERVALO DE FUSIÓN (741 ): entre 50° y 52º.
Cambio en la redacción:
1,2-Dimetoxietano, CH1002-90, 12 [110-71-4]-Líquido incoloro y transparente. Miscible con agua y con alcohol. Soluble en disolventes hidrocarbonados. En reposo, puede formar peróxidos. INTERVALO DE EBULLICIÓN (Prueba para reactivos): No menos de 95% destila entre 83º y 86º. ÍNDICE DE REFRACCIÓN (831): entre 1,379 y 1,381, a 20º. ACIDEZ: Agregar azul de bromofenol SR a 20 ml y valorar con hidróxido de sodio 0,020 N: no se consumen más de 2,0 ml (aproximadamente 0,015% como CH3CQOH). llon.EitMINAqÓN PE .A.GUA, Método./ <921}• (Af 01·m~Í"í0!1~i: no más de 0,2%. (3,4-Dimetoxifenil)acetonitrilo (Homoveratronitrilo), C10H11 N02-177,20 [93-17-4]-Fibras blanquecinas. INTERVALO DE FUSIÓN (741): entre 65º y 67°. Dimetoximetano (Formaldehído Dimetil Aceta/, Metilo/), C3Hs02-76, 10 [109-87-5]-Usar un grado adecuado. m-Dinitrobenceno, C6H4(N02)2-l 68, 11 [99-65-0]Polvo cristalino o cristales amarillo pálido. Casi insoluble en agua fría; poco soluble en agua caliente. Soluble en cloroformo y en benceno; moderadamente soluble en alcohol. Volátil en vapor.
USP 39
INTERVALO DE FUSIÓN (7 41 ): entre 89º y 92º. RESIDUO DE INCINERACIÓN (Prueba para reactivos): de 0,5%.
no más
2,4-Dinitroclorobenceno, C6H3(N02)2Cl-202,55 [97-00-7]-Cristales de color amarillo a amarillo amarronado. Insoluble en agua; soluble en alcohol caliente, en éter y en benceno. INTERVALO DE FUSIÓN (741): entre 51º y 53º. RESIDUO DE INCINERACIÓN: Incinerar 500 mg con 5 gotas de ácido sulfúrico: el residuo no pesa más de 1 mg (0,2%). 2,4-Dinitrofenilhidrazina, 2,4-C6H3(N02)2NHNH2-198, 14 [119-26-6]-Cristales de color rojo anaranjado, que en el microscopio se observan individualmente como agujas en forma de listones de color amarillo limón. Muy poco soluble en agua; poco soluble en alcohol; moderadamente soluble en ácidos inorgánicos diluidos. Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 97%. 2,4-Dinitrofluorobenceno (7-Fluoro-2,4-dinitrobenceno), C6H3FN204-186, 10 [70-34-8]-Sólido de color amarillo claro. Usar un grado adecuado. Dioctil Sulfosuccinato Sódico-Usar Docusato Sódico (monografía de la USP). Dioxano (Dióxido de Dietileno; 1,4-Dioxano), C4Hs02-88, 11 [123-91-1 ]-Usar grado reactivo ACS. Dióxido de Manganeso: vado.
Ver Dióxido de Manganeso Acti-
Dióxido de Manganeso Activado (Óxido de Manganeso (IV) Activado), Mn02-86,94 [1313-13-9]-Usar un grado adecuado. Dipicrilamina-Ver Hexanitrodifenilamina. a,a'-Dipiridilo-Ver 2,2'-Bipiridina. 4,4'-Dipiridilo, C10HsN2-156, 18 [553-26-4]-Usar un grado adecuado. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado en Sigma-Aldrich, número de catálogo 289426.] Disulfuro de Carbono, CS2 [75-15-0]-Usar grado reactivo ACS. Disulfuro de Carbono para Cromatografía-Usar un grado adecuado. 5,5'-Ditio bis (Ácido 2-Nitrobenzoico) (Disulfuro de 3-carboxi-4-nitrofenilo; Reactivo de El/man), C14HsN20sS2-396,35 [69-78-3]-Polvo amarillo; funde aproximadamente a 242º. Moderadamente soluble en alcohol. Ditionito de Sodio-Usar Hidrosulfito de Sodio. Ditiotreitol (Reactivo de Cleland, Treo-1,4-dimercapto-2,3-butanodiol, DTT) HSCH2CH(OH)CH(OH)CH2SH-154,25 [3483-12-3]-A~ujas levemente higroscópicas obtenidas a partir de éter. Facilmente soluble en agua, en alcohol, en acetona, en acetato de etilo y en éter. INTERVALO DE FUSIÓN (741): entre 42º y 44º. Ditizona (Difeniltiocarbazona; Ácido Fenilazotiofórmico 2-Fenilhidrazida), C6HsN:NCSNHNHC6Hs-256,33 [60-10-6]Usar grado reactivo ACS. Diyodofluoresceína, C20H10b0s-584, 10 [31395-16-1 ] Polvo de color rojo anaranjado. Poco soluble en agua; soluble en alcohol y en soluciones de hidróxidos alcalinos.
Reactivos/ Especificaciones de Reactivos 2321
USP 39 RESIDUO DE INCINERACIÓN: Incinerar 200 mg con 5 gotas de ácido sulfúrico: el peso del residuo no excede de 1,0 mg (0,5%). SENSIBILIDAD: Pesar con exactitud aproximadamente 100 mg de yoduro de potasio, previamente secados a 105º hasta peso constante, y disolverlo en 50 ml de agua. Agregar 1 ml de diyodofluoresceína SR preparada a partir de la muestra de prueba y 1 ml de ácido acético glacial, y valorar con nitrato de plata O, 1 N SV hasta que el color del precipitado cambie de rojo amarronado a rojo azulado. El volumen de nitrato de plata O, 1 N consumido no excede de O, 1O ml del volumen calculado, basado en el contenido de KI del yoduro de potasio seco determinado según se indica a continuación. Disolver aproximadamente 500 mg de yoduro de potasio, pesados con exactitud, en aproximadamente 1O ml de agua y agregar 35 ml de ácido clorhídrico y 5 ml de cloroformo. Valorar con yodato de potasio 0,05 M SV hasta que el color púrpura del yodo desaparezca del cloroformo. Agregar gota a gota las últimas porciones de la solución de yodato, agitando de manera vigorosa y continua. Despues de que el cloroformo se haya decolorado, dejar la mezcla en reposo durante 5 minutos. Si en el cloroformo aparece un color púrpura, valorar otra vez con la solución de yodato. Cada ml de yodato de potasio 0,05 M equivale a 16,60 mg de KI. 1-Dodecanol (Alcohol Dodecílico), CH 3(CH2)110H-186,33 [112-53-8]-Líquido transparente e incoloro. Cristaliza como laminillas a partir de una solución de alcohol diluido. Usar grado reactivo ACS. t-Dodecil Mercaptano Etoxilado (Poli(oxi-7,2-etandiil), a[2-(terc-Dodeciltio)eti/]-ro-hidroxi-), (C2H40)nC14H30ÜS [9004-83-5]-Disponible comercialmente como una solución acuosa al 1% ó 2%. Usar un grado adecuado. [NOTASe puede obtener un grado adecuado en www.fishersci.com con número de catálogo 805716 o en www.riccachemical. com con número de catálogo R8057000.] Dodecil Sulfato de Litio (Dodecil Sulfato de Litio, Lauril Sul[2044-56-6]-Polvo fato de Litio), C12H2sliQ4S-272,3 blanco a blanquecino; una solución de 50 mg por ml en agua a temperatura ambiente es transparente a levemente turbia, incolora a levemente amarilla. La absorbancia UV de una solución O, 1 M es menor de 0,05 tanto a 260 nm como a 280 nm. El pH de una solución O, 1 M en agua es 7,0 ± 0,5. Usar un grado adecuado. Dodecil Sulfato de Sodio (Lauril Sulfato de Sodio), C12H2sS04Na-288,38 [151-21-3]-Polvo cristalino amarillo claro. Dodecil Sulfo1Jato de Sodio (7 -Dodecanosulfonato de Sodio; Sal Sódica del Acido 7-Dodecanosulfónico), C12H2sS03Na272,38 [2386-53-0]-Sólido polvoriento blanco. Un g se disuelve en 50 ml de agua tibia y produce una solución incolora y transparente. Usar un grado adecuado. INTERVALO DE FUSIÓN (741 ): superior a 300º. 3-~Dodecildimetilamonio)pro~anosulfonato (Lauril sulfobe-
tama, N, N-dimeti/-N-dodecif-N-(3-sulfof-ropil)amonio betaína),
C17H37NQ3S-335,54 cuado.
[14933-08-5 -Usar un grado ade-
Edetato Disódico (Etilendiaminotetraacetato Disódico) C.::10H14N20sNa2 · 2H20-372,24--Usar la Sal Disódica del Acido (Etilendinitrilo)tetraacético Dihidrato de grado reactivo ACS. n-Eicosano, C20H42-282,55 [112-95-8]-Sólido cristalino blanco. INTERVALO DE FUSIÓN (741): entre 37º y 39º. Eicosanol [629-96-9]-Usar un grado adecuado.
Enzima Fosfatasa Alcalina-Usar un grado adecuado de origen intestinal. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado en Worthington Biochemical Corp., www.worthington-biochem.com.] Enzima Fosfática-Preparación enzimática de origen microbiano con alta actividad de fosfatasa y amilasa; la actividad de fosfatasa la hace adecuada para usar en la liberación de tiamina a partir de sus ésteres ortofosfato y pirofosfato. Polvo color crema claro o levemente gris. Facilmente soluble en agua. Hidroliza 300 veces su peso de almidón en 30 minutos. ACTIVIDAD DE AMILASA: Colocar en un tubo de ensayo 5 ml de una solución 1 en 50 de almidón soluble en solución amortiguadora de acetato de sodio 0,2 M de pH 5 (que contenga 1,6 g de acetato de sodio anhidro por L y suficiente ácido acético glacial para ajustar a un pH de 5) y agregar 4 ml de agua. Mezclar y colocar en un baño de agua a 40º. Agregar 1 ml de una solución que contenga 0,3 mg de enzima fosfática, mezclar y cronometrar. Después de 30 minutos, retirar 1,0 ml de la mezcla y agregarla a 5,0 ml de yodo 0,0005 N en un tubo de ensayo de 20 mm x 150 mm: se produce un color rojo transparente. Eosina Y (Eosina Amarillenta Y) (Eosina Y Biológica Certificada; Tetrabromofluoresceína Sódica), C20H6Br4Na20s-691,85 [17372-87-1 ]-Polvo o trozos de color rojo a rojo amarronado. Usar grado reactivo ACS. Epiandrosterona (trans-Androsterona, 5a-Androstan-3f3-ol77-ona), C19H30Ü2-290,44 [481-29-8]-Usar un grado adecuado. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado en www. sigma-aldrich.com con número de catálogo E3375.] 15-Epicarboprost (7 5(R)-Meti/prostaglandina F2a), C21H36Üs-368,5 [35864-81-4]-Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 98%. Almacenar a -20º. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado en www. caymanchem.com con número de catálogo 16730.] Equilenina, C1sH1s02-266,33 [517-09-9]-Polvo cristalino o cristales incoloros o blancos. Insoluble en agua; soluble en cloroformo y en dioxano; moderadamente soluble en alcohol. INTERVALO DE FUSIÓN, Clase 11 (741 ): entre 256º y 260º. ROTACIÓN ESPECÍFICA (781 ): entre +85º y +88º, determinada en una solución en dioxano que contenga 75 mg de equilenina cada 1O ml. ABSORCIÓN MÁXIMA: Una solución de alcohol presenta máximos de absorción a 231, 282, 325 y 340 nm. a-Ergocriptina, C32H41 NsOs-575,70 un grado adecuado.
[511-09-1 ]-Usar
Eriocromo Cianina R, C23H1sNa3Q9S-536,40 [3564-18-9]-Polvo marrón rojizo oscuro. Fácilmente soluble en agua; insoluble en alcohol. SOLUBILIDAD: 200 mg en 100 ml de agua producen una solución que permanece transparente y exenta de materia no disuelta durante 30 minutos. PÉRDIDA POR SECADO (731 ): Secar al vacío sobre gel de sílice hasta peso constante: no pierde más de 2% de su peso. RESIDUO DE INCINERACIÓN (Prueba para reactivos): 0,5 ~' tratado con 1 ml de ácido sulfúrico y 2 ml de ácido rntrico, produce entre 42,0% y 44,0% del peso seco (el producto teórico es 42,9% de Na2S04). SENSIBILIDAD: Agregar 2 ml de una solución (1 en 1000) a 1 ml de solución de sulfato de aluminio (1 en 1O 000), calentar a 37 ± 3º durante 5 minutos, enfriar y agregar 1 ml de acetato de sodio SR: se produce un color efe rojo fuerte a violeta rojizo en no más de 5 minutos.
2322 Especificaciones de Reactivos
/Reactivos
Eritrocitos del Grupo Sanguíneo Al y Eritrocitos del Grupo Sanguíneo B: Estas células deben obtenerse de fabricantes o proveedores autorizados por el Center far Biologics Evaluation and Research (Centro de Evaluación e Investigación de Productos Biológicos) de la FDA. El uso de reactivos provenientes de un fabricante o proveedor no autorizado puede invalidar los resultados. Generalmente, se encuentran disponibles como parte de un kit para análisis de Grupo Sanguíneo ABO. Las células autorizadas para su uso en tubos de ensayo también pueden utilizarse en el método de placa de microtitulación descrito en las monografías de Eritrocitos y Sangre Entera. [NOTA-Existen muchos fabricantes y proveedores de estos reactivos que están autorizados por el Center far Biologics Evaluation and Research (Centro de Evaluación e Investigación de Productos Biológicos) de la FDA. Se encuentran entre los fabricantes o proveedores autorizados, por ejemplo, los siguientes: Gamma Biologics, Houston, TX y Ortho Diagnostics, Raritan, Nj.] Eritrocitos Recubiertos de lgG: Eritrocitos recubiertos con inmunoglobulina humana (lgG). El reactivo debe obtenerse de fabricantes o proveedores autorizados por el Center far Biologics Evaluation and Research (Centro de Evaluación e Investigación de Productos Biológicos) de la FDA. El uso de reactivos provenientes de un fabricante o proveedor no autorizado puede invalidar los resultados. [NOTA-Existen muchos fabricantes y proveedores de estos reactivos que están autorizados por el Center far Biologics Evaluation and Research (Centro de Evaluación e Investigación de Productos Biológicos) de la FDA. Se encuentran entre los fabricantes o proveedores autorizados, por ejemplo, los siguientes: Gamma Biologics, Houston, TX y Ortho Diagnostics, Raritan, Nj.] Erucato de Metilo, C23H44Ü2-352,59 quido incoloro.
USP 39 Estándar Certificado de Oxígeno-Helio-Una mezcla de oxígeno al 1,0% en helio de grado industrial. Se puede obtener de la mayoría de los proveedores de gases especiales. Estándares de Pesos Moleculares de Polisacáridos-Polímeros de polimaltotriosa con diferentes valores de peso molecular promedio en peso, Mw, que varían de 5000 a 400 000 Da. [NOTA-Se puede obtener un set adecuado en Shodex (www.shodex.com) como Kit P-82.] Estándar de Pesos Moleculares Proteínicos-También se conocen como marcadores de peso molecular de proteínas (para SDS-PAGE) y están constituidos por una mezcla de varias proteínas con pesos moleculares bien definidos. Los productos generalmente están disponibles en una solución amortiguadora adecuada que contiene un agente reductor adecuado (generalmente, 100 mM DTI), un conservante (por ejemplo, azida sódica) y glicerol al 50% para evitar el congelamiento. Usar un grado adecuado. Almacenar a -20º. Estándares de Pululano de Peso Molecular (PM) 5800, 23 700 y 100 000 (un set comercial de Estándar de Pululano contiene estándares con varios pesos moleculares: 5800; 12 000; 24 000; 48 000; 100 000; 186 000; 380 000 y 750 000) [9057-02-7]-Usar un grado adecuado. Cada Estándar de Pululano individual con un peso molecular diferente, tal como 5800, 24 000 ó 100 000, se usa en forma equivalente. [NOTA-Se puede obtener un set de estándares en SigmaAldrich (www.sigma-aldrich.com) y en Waters (www.waters. com).] Estaño, Sn-Peso atómico 118,71 grado reactivo ACS.
[7440-31-5]-Usar
[1120-34-9]-LíEstaquiosa Hidrato, C24H42Ü21 · xH20-666,58 [10094-58-3]-Usar un grado adecuado.
Escina [6805-41-0]-Usar un grado adecuado. Estándar Certificado de Aire-Helio-Una mezcla de aire al 1,0% en helio de grado industrial. Se puede obtener de la mayoría de los proveedores de gases especiales. Estándar Certificado de Albúmina Sérica Bovina al 7 por ciento-Se puede obtener en el Instituto Nacional de Normas y Tecnología (NIST, por sus siglas en inglés), www.nist. gov, disponible como SRM 927. Estándar Certificado de Nitrógeno-Se puede obtener un estándar certificado de nitrógeno adecuado con un contenido de no menos de 99,99% en la mayoría de los proveedores de gases especiales. Estándar Certificado de Óxido Nitroso [10024-97-2]-Envase de óxido nitroso al 99,9%. Se puede obtener de la mayoría de los proveedores de gases especiales. Estándar Certificado de Oxígeno-Se puede obtener un estándar certificado de oxígeno adecuado con un contenido de no menos de 99,99% en la mayoría de los proveedores de gases especiales. Estándar Certificado de Oxígeno al 21%-Se puede obtener una mezcla estándar certificada de oxígeno absoluto al 21,0 ± 0,3% en nitrógeno adecuada en la mayoría de los proveedores de gases especiales. Estándar Certificado de Oxígeno al 93%-Se puede obtener una mezcla estándar certfficada de oxígeno absoluto al 93,0 ± O, 1% en nitrógeno adecuada en la mayoría de los proveedores de gases especiales.
Estearato de Metilo, C19H3sÜ2-298,50 [112-61-8]-Sólido cristalino blanquecino. VALORACIÓN: Inyectar una muestra apropiada en un cromatógrafo de gases adecuado (ver Cromatografía (621 )) equipado con un detector de ionización a la llama, usando helio como gas transportador. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas: usar una columna capilar recubierta con una capa de fase G2 de 1 µm; mantener la temperatura del inyector a 300º; mantener la temperatura del detector a 300º; mantener la temperatura de la columna a 200º y programarla para que aumente 1Oº por minuto hasta 300º. El área del pico de C19H3sÜ2 no es menos de 99% del área total. INTERVALO DE FUSIÓN (741): entre 40º y 42º. Éster Aminoetílico del Ácido Difenilborínico, (Oifenilborinato de 2-Aminoetilo), C14H16BN0-225,09-Polvo cristalino blanco. Usar un grado adecuado. INTERVALO DE FUSIÓN (741 ): entre 192º y 194º. Éster Etílico de N-Acetil-L-tirosina, CnH11NÜ4-251,28Determinar la aptitud del material según se indica en Valoración en Quimotripsina (monografía de la USP). Éster lsopropílico del Ácido 4-Hidroxibenzoico, HOC6H4COOCH(CH2)2-180, 18 [4191-73-5]-Usar un grado adecuado. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado en TCI America, www.tciamerica.com.] INTERVALO DE FUSIÓN (741): entre 84º y 87º. Éter-Ver Éter Etílico. Éter Absoluto-Ver Éter Etílico Anhidro.
USP 39
Reactivos/ Especificaciones de Reactivos 2323
se desarrolla color. Alternativamente, se pueden usar tiras reactivas para la determinación de peróxidos. [NOTA-Pueden obtenerse tiras reactivas adecuadas para la determinación de peróxidos en EMD Chemicals, www. em.dchemicals.com.] Éter Fenílico-Ver Éter Difenílico.,
Éter Butílico (Éter n-Dibutílico), CsHis0-130,23 [142-96-1 ]-Usar un grado adecuado.
Éter lsopropílico-Ver Éter Diisopropílico.
Éter de Petróleo (Bencina de Petróleo; Solvente Hexano, Ligroína) [8032-32-4)-Líquido transparente y volátil. Prácticamente insoluble en agua; soluble en alcohol absoluto. Miscible con éter, con cloroformo, con benceno y con la mayoría de los aceite} fijos y volátiles. . [PRECAUCION: Es sumamente inflamable. Mantener alejado de las llamas y almacenar en envases impermeables en un lugar fresco.] Usar Eter de Petróleo grado reactivo ACS. Éter Difenílico (Éter Fenílico), (C6Hs)i0-l 70,21 [101-84-8)-Líquido incoloro. Insoluble en agua; soluble en ácido acético glacial y en la mayoría de los disolventes orgánicos. Alcanza la ebullición aproximadamente a 259º. INTERVALO DE FUSIÓN (741 ): entre 26º y 28º.
Éter Laurílico de Polioxietileno 1O (Éter Monqdodecílico de Decaetilenglicol), C32H66011---626,86
1111111111-
Usar un grado adecuado. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado con el número de catálogo P9769 en http://www.sigma-aldrich.com.]
Éter Laurílico de Polioxietileno (23) (Brij-35)-Usar un grado adecuado. [NOTA-Se puede obtener comercialmente un grado adecuado como "Brij-35" .) Éter Metílico de Dietilenglicol (2-(2-Metoxietoxi)etanol; Metildiglicol), CsH12Ü3-l 20, 15 [111-77-3)-Usar un grado adecuado.
Éter Diisopropílico (Éter lsopropílico), [(CH3)2CH)i0102, 17 L108-20-3)-Líquido móvil e incoloro. Poco sq,luble en agua. Miscible con alcohol y con éter. [PRECAUCIONEs sumamente inflamable. No usar donde pueda encenderse. No evaporar hasta el punto cercano a sequedad, ya que tiende a formar peróxidos explosivos.] PESO ESPECÍFICO (841 ): entre 0,716 y 0,720. INTERVALO DE DESTILACIÓN, Método 11 (721 ): No menos de 95% destila entre 65º y 70º. PERÓXIDOS: A 1O mL, contenidos en una probeta limpia con tapón de vidrio previamente enjuagada con una porción del éter en análisis, agregar 1 mL de solución de yoduro de potasio (1 en 1O) recién preparada. Agitar y dejar en reposo durante 1 minuto: no se observa color amarino en ninguna de las dos capas (aproximadamente 0,001 % como H202). RESIDUO DE EVAPORACIÓN: [NOTA-Si hubiera peróxido, no efectuar este procedimiento.] Evaporar 14 mL (1 O g) en una cápsula tarada poco profunda y secar a 105º durante 1 hora: el residuo no pesa más de 1 mg (0,01 %). ACIDEZ: A 1O mL de agua contenidos en un matraz de 50 mL con tapón de vidrio, agregar 2 gotas de azul de bromotimol SR y valorar con hidróxido de sodio 0,01 O N hasta que persista un color azul después de agitar vigorosamente. Agregar 5 mL de eter diisopropílico y valorar con hidróxido de sodio 0,01 O N: no se requieren más de 0,30 mL para restaurar el color azul (0,005% como CH3COOH). [NOTA-Para las determinaciones espectrofotométricas, utilizar éter diisopropílico que cumpla con el siguiente requisito adicional.J ABSORBANCIA: La absorbancia a 255 nm, en una celda de cuarzo de 1O mm, no excede de 0,2 utilizando agua como blanco.
Etilendiaminotetraacetato Disódico-Ver Edetato Disódico.
Éter Etílico (Dietil Éter; Éter), (C2Hs)20-74, 12 Usar grado reactivo ACS.
~tilendiaminotetraacetato Tetrasódico (Sal Tetrasódica del Acido (Etilendinitrilo)tetraacético), C10H12N2Na4Üs-380, 17-
[60-29-7)-
Éter Monoetílico de Etilenglicol-Ver 2-Etoxietanol. Éter Nonilfenólico Polioxietilenado, (CH3hCCH2C(CH3)iCH2C6H40(CH2CH20)xH, en donde x es aproximadamente de 40 a 1900-2100 [9016-45-9)-Sólido blanco; funde aproximadamente a 44º. Usar un grado adecuado. Etilbenceno, CsH10-106, 17 99,5%.
[100-41-4)-No menos de
4-Etilbenzaldehído, C2HsC6H4CH0-134, 18 [4748-78-lj-Líquido incoloro a amarillo pálido. VALORACION: Disolver aproximadamente 600 mg, pesados con exactitud, en una mezcla de 100 mL de alcohol y 25 mL de clorhidrato de hidroxilamina 1 M en un vaso de precipitados. Cubrir el vaso de precipitados con un vidrio de reloj. Calentar moderadamente hasta que comience a formarse un condensado sobre el vidrio de reloj. Dejar que se enfríe durante aproximadamente 30 minutos. Valorar con hidróxido de sodio 0,5 N SV, determinando el punto final potenciométricamente. Realizar una determinación con un blanco y hacer las correcciones necesarias. Cada mL de hidróxido de sodio 0,5 N equivale a 67,09 mg de C2HsC6H4CHO. No se encuentra menos de 98%. Etilendiamina (1,2-Diaminoetano) C2HsN2---60, 1O [107-15-3)-Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 99%.
É~Uílico Anhidro (Dietil Éter Anhidro; Éter Absoluto), C¡-2Hs)20-74, 12 [60-29-7)-Usar grado reactivo ACS.
Polvo fino blanco cristalino. Soluble en agua. PÉRDIDA POR SECADO (731 ): Secar a 105º durante 4 horas: no pierde más de 8% de su peso.
Éter Exento de Peróxido (Dietil Éter; Éter), (C2Hs)2074, 12-Usar grado reactivo ACS. PERÓXIDO: Transferir 8 mL de yoduro de potasio y almidón SR a una probeta de 12 mL, con tapón de vidrio esmerilado, de aproximadamente 15 mm de diámetro. Llenar completamente con la sustancia en análisis, mezclar y dejar en reposo. Proteger de la luz durante 5 minutos. No
Etilenglicol, HOCH2CH20H---62,07 [107-21-1 ]-Líquido transparente, incoloro, levemente viscoso e higroscópico. Poco soluble en éter; prácticamente insoluble en benceno. Miscible con agua y con alcohol.
2324 Especificaciones de Reactivos /Reactivos PESO ESPECÍFICO (841 ): aproximadamente 1, 11. INTERVALO DE EBULLICIÓN (Prueba para reactivos): entre 194º y 200º. RESIDUO DE INCINERACIÓN: Evaporar 100 ml (11 o g) en una cápsula de evaporación tarada sobre una llama hasta que los vapores continúen ardiendo después de quitar la llama. Dejar que los vapores ardan hasta que la muestra .se consuma. Incinerar a 800º ± 25º durante 1 hora, enfriar y pesar: el residuo no pesa más de 5,5 mg (0,005%). ACIDEZ: Agregar 0,2 ml de rojo de fenol SR a 50 ml de agua y valorar con hidróxido de sodio 0, 1 N. hast~ un punto final rojo., Agregar 50 i:nL (55 g) de et1leng~1col y , valorar con hidroxido de sodio 0, 1 N: no se requiere mas de 1 ml para restituir el color rojo (0,01 % como CH3COOH).
~'~¡¡¡~7¡¡¡¡¡¡¡~-~~~ :~ mas de 0,20%.
N-Etilmaleimida (7-Etil-7 H-pirrol 2,5-Diona), C6H1N02125,12 [128-53-9)-Usar un grado adecuado. INTERVALO DE FUSION (741 ): entre 43º y 47º. 4'-Etoxiacetofenona, C10H120:z-164,20 [1676-63-7)Cristales de color blanco a tostado. VALORACIÓN: Disolver aproximadamente 50 mg en 1 .l'!IL de éter. Inyectar aproximadamente 1 µL de esta soluc1on en un cromatógrafo de gases adecua~o .
USP 39
PÉRDIDA POR SECADO (731) Análisis: Secar a 105º hasta peso constante. Criterios de aceptación: No más de 6% RESIDUO DE INCINERACIÓN (Prueba para reactivos) Análisis: Incinerar 500 mg con 1 ml de ácido sulfúrico. Criterios de aceptación: No más de 75 mg (15,0%) CLORUROS (Prueba para reactivos): No más de 5% de cloruro (CI), calculado como cloruro de sodio. CONTENIDO DE NITRÓGENO (Prueba para reactivos) Análisis: Determinar por medio del método Kjeldahl, secada previamente a 105º hasta peso constante. Criterios de aceptación: Se encuentra entre 7,2% y 13,0% de N. CONTENIDO MICROBIANO: No más de 104 ufc/g CONTENIDO DE NITRÓGENO AMINO: 6,0o/o-6,9% Factor de Crecimiento del Fibroblasto-2: Usar un grado adecuado. [NOTA-Se puede obtener un grado ~decua~o en Roche Diagnostics Corporation, www.roche-d1agnost1cs.com.]
x.
Factor (Factor X Activado) para la Prueba de Antifactor X.-EI Factor es la enzima proteolítica obtenida de plasma bovino, que escinde a la protrombina para formar trombina. Es una glicoproteína con un peso molecular de 40 000. Una Unidad de Factor X. es la cantidad de Factor X endógeno activado (55 000 Da cuando no está activado) que se encuentra en 1 ml de plasma normal. Se usa veneno de víbora de Russell para activar la enzima, la que luego se extrae. La preparación se estabiliza y se liofiliza. El Factor X. está exento de trombina a la concentración usada en la prueba. Cuando se prueba frente a fibrinógeno puro, no se produce coagulación dentro .de las 24 horas siguientes. Contiene no menos de 40 Unidades de Factor por mg de proteína y presenta 90% de homogeneidad cuando se prueba por electroforesis de disco. Una Unidad de Factor por ml produce un tiempo de coagulación de 15 segundos cuando se analiz~, de la siguiente manera. Mezclar O, 1 ml de una soluc1on saturada de cefalina (obtenida a partir de polvo de cerebro de conejo-acetona o de una cantidad equivalente de trom~oplas tina de cerebro de conejo) en 0, 1 ml de plasma bovino con citrato y 0, 1 ml de cloruro de calcio 0,025 M. Agregar inmediatamente O, 1 ml de una solución de factor X. (1 en 1O) e incubar a 37º.
x.
x.
x.
Fases para Cromatografía de Gases-Ver fases para cromatograf1a de gases en Cromatografía (621 ), Columnas Cromatográficas. Fast Green FCF, C31H34N2Na2010Sr-808,86 [2353-45-9)-Cristales o polvo de color rojo a violeta amarronado. Soluble en agua y moderadamente soluble en alcohol. Usar un grado adecuado. Fenacetina [62-44-2]-Usar un grado adecuado. 1, 10-Fenantrolina (Ortofenantrolina), C12HsN2 · Hi0198,22 [5144-89-8)-Usar grado reactivo ACS. 2-Fenilacetamida (a-Fenilacetamida), CsH9N0-135, 16 [103-81-1 )-Placas o escamas bimorfas. Poco soluble en agua. Usar un grado adecuado. INTERVALO DE FUSIÓN (741): entre 156º y 158º. d/-Fenilalanina, C9H11N02-165, 19 grado adecuado.
[150-30-1]-Usar un
3-Fenilfenol (m-Fenilfenol), C6HsC6H40H-170,21 . [580-51-8)-Polvo cristalino de color blanco a blanquecino. VALORACIÓN: Inyectar una muestra apropiada en un cromatógrafo de gases adecuado.(vE'.r C~
USP 39 helio como gas transportador. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas: una columna capilar de 0,25 mm x 30 m recubierta con fase Gl; mantener la temperatura del inyector a 250º; la temperatura de la columna a 150º y programarla para que aumente 15º por minuto hasta 250º y mantener la temperatura del detector a 31 Oº. El área del pico de 3-fenilfenol no es menos de 98% del área total. INTERVALO DE FUSIÓN (741): entre 76º y 79º.
Reactivos / Especificaciones de Reactivos 2325 de nitrato de plata SR: cualquier turbidez producida no excede la de un control que contiene 0,02 mg de CI, 2 ml de ácido nítrico, 1 ml de nitrato de plata SR y suficiente sulfato cúprico para igualar el color de la Solución de prueba. SULFATOS: Disolver 5 g en 100 ml de agua sin calentar, filtrar y al filtrado agregar 0,25 ml de ácido acético glacial y 5 ml de cloruro de bario SR: no se produce turbidez en un período de 1O minutos (aproximadamente 0,01 o/o como SQ4).
Fenilglicina (o(-)-2-Fenilglícina), (C 6H5 CH(NH2)COOH)151, 17 [875-74-1]-Usar un grado adecuado. Fenilhidrazina, C6HsNHNH2-108, 14 [100-63-0]-Líquido muy refractivo, incoloro o levemente amarillento. [NOTA-Proteger de la luz y destilar bajo presión reducida poco tiempo antes de usar.] TEMPERATURA DE SOLIDIFICACIÓN (651): no inferior a 16º. MATERIA INSOLUBLE: Agitar 1 ml con 20 ml de ácido acético diluido: la solución resultante es transparente o prácticamente transparente. RESIDUO DE INCINERACIÓN (Prueba para reactivos): Incinerar 1 ml con 0,5 ml de ácido sulfúrico: el residuo no pesa más de 1 mg (O, 1 %). Fenol [108-95-2]-Usar grado reactivo ACS. Fenolsulfonftaleína-Usar Rojo de Fenal (ver Indicadores en
Indicadores y Papeles Indicadores). 2-Fenoxietanol, C6HsOCH2CH20H-138, 16 [122-99-6]-Líquido incoloro y levemente viscoso. Soluble en agua. Miscible con alcohol, con acetona y con glicerina. Densidad: aproximadamente 1, 107. VALORACIÓN: A 2 g, pesados con exactitud, agregar 1O ml de una solución recién preparada, disolviendo 25 g de anhídrido acético en 100 g de piridina anhidra. Agitar por rotación suave para mezclar los líquidos, calentar en un baño de vapor durante 45 minutos, agregar 1 O ml de agua, calentar durante 2 minutos más y enfriar. Agregar 1O ml de alcohol butílico normal, agitar vi~orosamente, agregar fenolftaleína SR y valorar con hidroxido de sodio 1 N SV. Realizar una prueba con un blanco usando las mismas cantidades de los mismos reactivos, preparados de la misma manera y hacer las correcciones necesarias. Cada ml de hidróxido de sodio 1 N equivale a 138,2 mg de CaH10Ü2. No se encuentra menos de 99%. FENOL: Agregar 0,2 ml del artículo a 20 ml de agua, mezclar y a 5 ml de la mezcla agregar 0,2 ml del reactivo de Millon. Entibiar la solución a 60º durante 90 segundos y dejar en reposo: no se produce un color rosado ni rojo dentro de 1 minuto. Ferricianuro de P.otasio, K3Fe(CN)6-329,24 [13746-66-2]-Usar grado reactivo ACS. Ferrocianuro de Potasio, K4Fe(CN)6 · 3H20-422,39 [14459-95-1 ]-Usar grado reactivo ACS. Ferrocianuro de Sodio, Na4Fe(CN)6 · 1OH20-484,06 [13601-19-9]-Cristales o gránulos amarillos. Fácilmente soluble en agua. VALORACIÓN: Disolver 2 g, pesados con exactitud, en 400 ml de agua, agregar 1O ml de ácido sulfúrico y valorar con permanganato de potasio O, 1 N SV. Cada ml de permanganato de potasio O, 1 N equivale a 48,41 mg de Na4Fe(CN)6 · 1OH20. No se encuentra menos de 98%. MATERIA INSOLUBLE (Prueba para reactivos): no más de 1 mg, a partir de 1 O g (0,01 %). CLORUROS (Prueba para reactivos): Disolver 1 g en 75 ml de agua, agregar una solución que se prepara disolviendo 1,2 g de sulfato cúprico en 25 ml de agua, mezclar y dejar en reposo durante 15 minutos. A 20 ml del líquido transparente decantado, agregar 2 ml de ácido nítrico y 1 ml
Ferrocifeno (Complejo diciano-bis(7, 70-fenantrolina) de hierro (//)), (C12HsN2)2Fe(CN)i-468,3-Polvo marrón a negro. Una solución de 1O mg por ml en ácido acético glacial es de color rojo oscuro. Soluble en cloroformo y en agua a 5 mg por ml; produce una solución púrpura transparente en cloroformo y una solución anaraniada transparente en aa,ua. 1-11·1~• no mas de 10%.
. . . . .mlBlllml:
Floroglucinol, C6H3(0H)3·2H20-162,14 [6099-90-7]Polvo cristalino o cristales blancos o blanco amarillentos. Soluble en alcohol y en éter; poco soluble en agua. INSOLUBLE EN ALCOHOL: Disolver 1 g en 20 ml de alcohol: se disuelve completamente formanao una solución transparente. INTERVALO DE FUSIÓN, c;1ase la (741 ): entre 215° y 219º. RESIDUO DE INCINERACION (Prueba para reactivos): Incinerar 1 g con 0,5 ml de ácido sulfúrico: el residuo no pesa más de 1 mg (O, 1%). DIRESORCINOL: Calentar a ebullición una solución de 100 mg en 1O ml de anhídrido acético, enfriar la solución y colocarla encima de 1O ml de ácido sulfúrico: no aparece un color violeta en la zona de contacto de los líquidos. Floxina B (Ácido rojo 92; Eosina 708; sal disódica de 2 ~4 ',5 ', 7'-tetrabromo-4,5, 6, 7-tetraclorofluoresceína), C20 H2 Br4 Cl4Na20s--829,63 [18472-87-2]-Usar un grado adecuado con un contenido de colorante de no menos de 80%, certificado por la Biological Stain Commission (Comisión de Colorantes Biológicos). Fluoreno, C13H10-166,22 [86-73-7]-Polvo o cristales blancos a blanquecinos. Soluble en benceno, en disulfuro de carbono, en éter y en alcohol caliente; fácilmente soluble en ácido acético glacial. PRUEBA DE SOLUBILIDAD: Un g se disuelve en 1 o ml de acetona para producir una disolución completa y transparente. 1NTERVALO DE FUSIÓN ( 741 ): entre 11 3o y 11 7º' dentro de un intervalo de 2º. Fluorescamina, C11H10Ü4-278,26 [38183-12-9]-Polvo blanco a blanquecino. Muy poco soluble en agua; fácilmente soluble en cloruro de metileno; soluble en alcohol; poco soluble en cloroformo. VALORACIÓN: Disolver aproximadamente 600 mg en 75 ml de dimetilformamida y valorar con metóxido de litio O, 1 N hasta un punto final azul, usando azul de timol al 1% en dimetilformamida como indicador. Realizar una determinación con un blanco y hacer las correcciones necesarias. Cada ml de metóxido de litio O, 1 N equivale a 2!,83 mg de C11H1004. No se encuentra menos de 99%. PERDIDA POR SECADO (731 ): Secar a 105º durante 4 horas: no pierde más de 0,5% de su peso. Fluoresceína Sódica, C20H10Na20s-376,28-Polvo higroscópico, rojo anaranjado. Fácilmente soluble en agua; poco
2326 Especificaciones de Reactivos /
Reactivos
soluble en alcohol. Su solución en agua es de color rojo amarillento y presenta una fuerte fluorescencia verde amarillenta que desaparece c~ando la sol~ción se acidific~ y reaparece cuando la solucion se neutraliza o se hace bas1ca. PÉRDIDA POR SECADO (731 ): Secar a 120º hasta peso constante: no pierde más de 7,0% de su peso. 4'-Fluoroacetofenona, FC6H4COCH3-l 38, 14 [403-42-9]-Líquido incoloro. VALORACIÓN: Inyectar una muestra apropiada en un cromatógrafo de gases adecuado_(v~r cr:c:matografía (621)) equipado con un detector de 1ornza.c10!1 a la llama! ~sando helio como gas transportador. Las s1gu1ente_s cond1c1ones se consideran adecuadas: una columna capilar de 25 mm x 30 m recubierta con una capa de 1 µm de fase G2; mantener la temperatura del inyector a 200º; la temperatura del detector a 250º· y la temperatura de la columna a 100º y programada pa;a que aumente 1Oº por minuto hasta alcanzar los 250º. El área del pico de FC6H4COCH3 no es menos de 99% del área total. ÍNDICE DE REFRACCIÓN (831): 1,510 a 20º. Fluoruro de Amonio, NH4F-37,04 grado reactivo ACS.
[12125-01-8]-Usar
Fluoruro de Fenilmetilsulfonilo, C1H1F02S-174,2 [329-98-6]-Polvo de color blanco a levemente amarillo. Usar un grado adecuado. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado en SigmaAldrich, www.sigma-aldrich.com.] Fluoruro de Sodio, NaF--41,99 reactivo ACS.
[7681-49-4]-Usar grado
Formamida, HCONH2--45,04 [75-12-7]-Usar grado reactivo ACS. PREPARACIÓN PARA VALORACIÓN DE DIGITOXINA: Para asegurar la ausencia de amoníaco, tratar la Formamida según se indica a continuación. Agitar una cantidad adecuada de forma mida con aproximadamente 10% d_e su pes~ de carbonato de potasio anhidro durante 15 minutos y filtrar. Destilar el filtrado, en un aparato que ~ea totalmente de vidrio, al vacío a una presion de apro_x1madame!1~e 25 mm de mercurio o menor. Desechar la primera porc1on del destilado que contiene agua y recoger la fracción que ebulle a aproximadamente 115º a una presión de 25 mm ~e mercurio o a 101 º a una presión de 12 mm de mercurio. Almacenar en envases impermeables. Proteger de la luz. Formamida Anhidra, HCONH2--45,04 [75-12-7]-Usar formamida cuyo contenido de agua sea menos de O, 1%. Formiato de Amonio (Sal de Amonio de Ácido Fórmico), CH 5 N02-63,06 [540-69-2]-Usar un grado adecuado. Fosfato de Dibutilamonio: Usar un grado adecuado. [NOTA-Se puede obtener un g!ado ~decuado en Waters Corporation, www.waters.com, disponible como PIC Reagent D4.] Fosfato de Dietilamina (Ácido Fosfórico: Dietilamina), C4H11 N · H3P04-171,13 [68109-72-8]-Usar un grado adecuado. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado en www.richmanchemical.com.] Fosfato de Dodeciltrietilamonio 0,5 M, [C12H2sN · (C2Hs)3]3P04-906,52-Usar un grado adecuado. . [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado en Reg1s Technologies, lnc., www.registech.com, disponible como Ion Pair Cocktail Ql 2 (número de catálogo 404031 ).] 5-Fosfato de Piridoxal, 4-CHOCsHN-2-CH3, 3-0H, 5-CH2P04H2 · H20-265,16 [41468-25-1]-Polvo amarillo claro. Usar un grado adecuado.
USP 39
Fosfato de Sodio y Amonio Tetrahidra~o (Sa! Microcósmica), NaNH4HP04; 4H20-209,07-Cristales ~ncoloros o gránulos blancos. Facilmente soluble en agua; insoluble en alcohol. Eflorescente en el aire con pérdid~ de amoníaco. MATERIA INSOLUBLE Y PRECIPITADO DE HIDROXIDO DE AMONIO Análisis: Disolver 1O g en 100 ml de agua, agregar 1O ml de amoníaco SR y calenta_r ~n un ~año de vap~r durante 1 hora. Si se forma prec1p1tado, filtrar, lavar bien con agua e incinerar. Criterios de aceptación: No más de 1 mg (0,01 %) CLORUROS (Prueba para reactivos): Un g presenta no más de 0,02 mg de CI (0,002%). METALES PESADOS Análisis: Disolver 3 g en 25 ml de agua, agregar 15 ml de ácido sulfúrico 1 N, luego agregar 1O ml de sulfuro de hidrógeno SR. Criterios de aceptación: Cualquier color marrón que se desarrolle en 1 minuto no es m~sk,?o~~~r~w¡9U~ ~L~~º ~n controU1ue contenga 3 ml de lllllBlllJI y 0,5 ml de ácido sulfúrico 1 N (0,001 %). NITRATOS Análisis: Disolver 1 g en 1O ml de agua, agregar O, 1 ml de índigo c;,armín SR Y. después agregar, mezclando, 1O ml de acido sulfurico. Criterios de aceptación: El color azul persiste durante 1O minutos (aproximadamente 0,005%). SULFATOS (Prueba para reactivos, Método JI) Análisis: Disolver 1O g en 100 ml de agua, agre9ar 5 ml de ácido clorhídrico y filtrar, si fuera necesario. Criterios de aceptación: No más de 5 mg (0,02%)
wnlllJlll'llflllll
Fosfato de Tetrabutilamonio, (C4H9)4NH2P04-339,46 [5574-97-0J-Polvo blanco a blanquecino. Soluble en agua. VALORACION: Disolver aproximadamente 1,~ g, pesados con exactitud en 100 ml de agua. Valorar sin demora con hidróxido de ~odio 0,5 N SV, determinando el punto final potenciométricamente. Realizar una determinación con un blanco y hacer las correcciones necesarias. Cada ml de hidróxido de sodio 0,5 N equivale a 169,7 mg de (C4H9)4NH2P04. No se encuentra menos de 97,0%. Fosfato de Tributilo (Fosfato de Tri-n-butilo), (C4H9)3P04266,31 [126-73-8]-Líquido transp?rente casi inc_?l?ro. Poco soluble en agua. Miscible con disolventes orgarncos comunes. Peso específico: aproximadamente 0,976. ÍNDICE DE REFRACCIÓN (831 ): entre 1,4205 y 1,4225. Fosfato de Trietilamina (Fosfato de Trietilamonio), C6H1sN · H30 4P-199, 19-Usar un grado adecuado. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado en www. tciamerica.com, número de catálogo Tl 300.] Fosfato Diácido de Amonio-Ver Fosfato Monobásico de Amonio.
Fosfato Dibásico de Amonio (Fosfato Ácido Diamónico), (NH 4) 2HP04-132,06 [7783-28-0]-Usar grado reactivo ACS. Fosfato Dibásico de Potasio (Fosfato Ácido Dipotásico; Fosfato Dipotásico), KiHP04-l 74, 18 [7758-11-4]-Usar grado reactivo ACS. Fosfato Dibásico de Potasio Trihidrato (Fosfato Ácido Dipotásico Trihidrato; Fosfato Dipotásico), KiHP04 · 3H20228,22 [16788-57-1 ]-Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 99,0%. Fosfato Dibásico de Sodio (Fosfato Disódico; Fosfato Ácido Disódico; Fosfato Dibásico de Sodio Heptahidrato), Na2HP04 ·
USP 39 7H20-268,07 [7782-85-6]-Usar Fosfato Dibásico de Sodio Heptahidrato de grado reactivo ACS. Fosfato Dibásico de Sodio Anhidro (Fosfato Ácido Disódico Anhidro) (para soluciones amorti¡Juadoras), Na2HP04-141,96 [7558-79-4]-Usar Fosfato Dibasico de Sodio Anhidro de grado reactivo ACS. Fosfato Dibási~o de Sodio Dihidrato (Fosfato Monoácido de Sodio; Fosfato Acido Disódico), Na2HP04 · 2H20-177,99 [10028-24-7]-Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 99,5%. [NOTA-Se puede obtener un $1rado adecuado en www.emdchemicals.com, número de catalogo SX0713.] Fosfato Dibásico de Sodio Dodecahidrato (Fosfato Ácido Disódico Dodecahidrato), Na2HP04 · 12H20-358, 14 [10039-32-4]-Usar un grado adecuado con un contenido entre 98,0% y 102,0% de Na2HP04 · 12H20. Fosfato Dibásico de Sodio Heptahidrato (Fosfato Ácido Disódico Heptahidrato; Fosfato Disódico), Na2HP04 · 7H20268,07 [7782-85-6]-Usar grado reactivo ACS. Fosfato Disódico-Ver Fosfato Sódico. Fosfato Monobásico de Amonio (Fosfato Diácido de Amo[7722-76-1 ]-Usar grado reacnio), NH4H2P04- ll 5,03 tivo ACS. Fosfato Monobásico de Potasio (Bifosfato de Potasio; Fosfato Diácido de Potasio), KH2P04-136,09 [7778-77-0]Usar grado reactivo ACS. [NOTA-El Fosfato Diácido de Potasio certificado se puede obtener en el Instituto de Normas y Tecnología de los EE. UU. (NIST, por sus siglas en inglés), www.nist.gov, como muestra de estándar Nº 186.] Fosfato Monobásico de ~odio (Bifosfato de Sodio; Fosfato Diácido de Sodio; Fosfato Acido de Sodio; Ortofosfato Monosó[10049-21-5]-Usar grado dico), NaH2P04 · H20-137,99 reactivo ACS. Fosfato Monobásico de Sodio Anhidro (Bifosfato de Sodio; Fosfato Diácido de Sodio; Fosfato Acido de Sodio; Ortofosfato Monosódico), NaH2P04-1l9,98 [7558-80-7]-Usar un
grado adecuado con un contenido de no menos de 99,0%. Fosfato Monobásico de Sodio Dihidrato (Fosfato Diácido de Sodio Dihidrato), NaH2PÜ4 · 2H20-156,0l [1 3472-35-0]-Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 99,0%. Fosfato Tribásico de Potasio, K3P04-212,27 [7778-5 3-2]-Cristales delicuescentes ortorrómbicos. Usar grado reactivo ACS. Fosfato Tribásico de Sodio, Na3PÜ4 · 12H20-380, 12 [10101-89-0]-Usar grado reactivo ACS. Fosfito de Sodio Pentahidrato (Fosfito Dibásico de Sodio), Na2HP03 · 5H20-216,04 [13517-23-2]-Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 98%. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado en Fluka, www.sigma-aldrich.com, número de del catálogo 04283.] Fósforo Rojo, P-Peso atómico 30,97376-Polvo rojo oscuro. Insoluble en agua y en ácidos diluidos; soluble en alcohol deshidratado. FÓSFORO AMARILLO: Agitar 20 g con 75 ml de disulfuro de carbono en un vaso con tapón de vidrio y dejar en reposo en la oscuridad durante toda la noche. Filtrar y lavar el residuo con disulfuro de carbono hasta que el filtrado, recolectado en una probeta graduada, mida 100 ml. Evaporar el disolvente hasta 1O ml sumergiendo la probeta en
Reactivos / Especificaciones de Reactivos 2327 agua caliente. Sumergir una tira de papel de prueba de sulfato cúprico en el disolvente restante: no se produce más color que en una tira similar sumergida en 1O ml de solución en disulfuro de carbono que contenga 3 mg de fósforo amarillo (0,015% como P). SUSTANCIAS SOLUBLES: Digerir 2 g con 30 ml de ácido acético en un baño de vapor durante 15 minutos. Enfriar, diluir con agua hasta 40 ml y filtrar. Evaporar 20 ml del filtrado en un baño de vapor y secar a 105º durante 2 horas: el residuo no pesa más de 6 mg (0,6%). o-Ftalaldehído (Dicarboxaldehído Ftálico), C5H4(CH0)2[643-79-8]-Usar un grado adecuado. 134, 13 Ftalato de Bis(2-etilhexilo), C5H4-1,2-[COOCH2(C2Hs)CH (CH2)3CH3]2-390,56 [117-81-7]-Líquido incoloro a amarillo claro. ÍNDICE DE REFRACCIÓN (831): entre 1,4855 y 1,4875 a 20º. Ftalato de Dibutilo, C16H22Ü4-278,34 [84-74-2]-Líquido transparente e incoloro. VALORACIÓN: Pesar con exactitud aproximadamente 2 g en un matraz adecuado, agregar 25,0 ml de hidróxido de sodio 1 N y 30 ml de alcohol isopropílico, y mezclar. Digerir la mezcla a una temperatura aproximada a la de ebullición durante 30 minutos, después enfriar en un baño de agua a temperatura ambiente. Agregar fenolftaleína SR y valorar con ácido sulfúrico 1 N SV hasta gue desaparezca el color rosado. Realizar una determinacion completa con un blanco y hacer las correcciones necesarias. Cada ml de ácido sulfúrico 1 N consumido equivale a 139,2 mg de C16H22Ü4. No se encuentra menos de 98%. ÍNDICE DE REFRA_!:CIÓN (831): entre 1,491 y 1,493, a 20º. CONTENIDO DE ACIDO: Pesar con exactitud aproximadamente 1O g y disolver en 100 ml de una mezcla de alcohol y éter (1: 1). Agregar fenolftaleína SR y valorar de inmediato con hidróxido de potasio alcohólico 0,05 N SV. Cada ml de hidróxido de potasio alcohólico 0,05 N equivale a 4, 15 mg de ácido ftálico: no se encuentra más de 0,02%. Ftalato de Diciclohexilo, C20H25Ü4-330,42 [84-61-7]. INTERVALO DE FUSIÓN (741 ): entre 62º y 66º. Ftalato de Diisodecilo [Ftalato de bis(isodecilo)}, C2sH45Ü4446,66 [26761-40-0]-Usar un grado adecuado. Ftalato de Dimetilo, C10H10Ü4-l94,19 [131-11-3]-Líquido viscoso e incoloro. VALORACIÓN Fase móvil: Preparar una mezcla filtrada y desgasificada de n-heptano para cromatografía y alcohol n-propílico (grado HPLC) (97:3). Hacer ajustes si fuera necesario (ver Aptitud del Sistema en Cromatografía (621 )). Solución estándar: Disolver una cantidad adecuada de ftalato de dimetilo en Fase móvil para obtener una solución con una concentración conocida de aproximadamente 0,26 mg por ml. Procedimiento: Inyectar aproximadamente 20 µL en un cromatógrafo de líquidos adecuado (ver Cromatografía (621 )), equipado con un detector a 238 nm y una columna de 4,6 mm 25 cm rellena con material L1O. La velocidad de flujo es de aproximadamente 1,0 ml por minuto. El área del pico de ftalato de dimetilo no es menos de 99% del área total. ÍNDICE DE REFRACCIÓN (831): entre 1,514 y 1,518, a 20º. Ftalato de Dipropilo, Ci4H1 sÜ4-250,29 [1 31-16-8]-Líquido viscoso incoloro. VALORACIÓN Fase móvil: Preparar una mezcla de acetonitrilo y agua (52:48).
2328 Especificaciones de Reactivos / Reactivos Procedimiento: Inyectar aproximadamente 20 µL en un cromatógrafo de líquidos adecuado (ver Cromatografía (621 )), equipado con un detector a 230 nm y una columna de 4,6 mm x 15 cm rellena con material L1. La velocidad de flujo es de aproximadamente 2,0 mL por minuto. El área del pico de C14H1s04 no es menos de 99% del área total. ÍNDICE DE REFRACCIÓN (831): entre 1,495 y 1,499 a 20º. Ftalazina, CsH5N2-l30, 15 [253-52-1 ]-Cristales de color amarillo a tostado. INTERVALO DE FUSIÓN (741 ): entre 89º y 92º. [85-41-6]-Polvo blanco. Ftalimida, CsHsN02-147, 13 VALORACIÓN Fase Móvil: Preparar una mezcla de isooctano y éter metil-terc-butílico (88:12). Procedimiento: Inyectar aproximadamente 20 µL en un cromatógrafo de líquidos adecuado (ver Cromatografía (621 )) equipado con un detector a 230 nm y una columna de 4,6 mm x 15 cm rellena con material L3. La velocidad de flu¡·o es de aproximadamente 2 mL por minuto. El área de pico de CsHsN02 no es menos de 99% del área total. INTERVALO DE FUSIÓN (741 ): entre 233º y 235º, con descomposición. Fucsina Básica (Rojo Básico 9, Clorhidrato de Parafucsina), C19H17N3 · HCl-323,82 [569-61-9]-Usar un grado adecuado.
USP 39 Gel de Sílice Poroso-Usar un grado adecuado para cromatografía de líquidos de alta presión. LNOTA-Se puede obtener un grado adecuado para cromatografía de líquidos de alta presión en fase reversa como "LiChrosorb Sl60, Reverse Phase" .] Geneticina (G418; 0-2-Amino-2, 7-dideoxi-D-glicero-alfa-Dglucoheptopiranosil-( 1-4)-0-(3-deoxi-4-C-metil-3-(metí/amino)beta-L-arabinopiranosi/-(1-6)-0-estreptamina), C20H40N401 o496,55 [49863-47-0]-Usar un grado adecuado, probado en cultivo celular. Gitoxina, C41 H54Ü14-780,94 [4562-36-1 ]-Polvo cristalino blanco. Prácticamente insoluble en agua, en cloroformo y en éter; poco soluble en piridina y en alcohol diluido. Funde awoximaqamente a 250º, con descomposición. ROTACION ESPECIFICA (781 ): entre +3,8º y +4,8º, determinada en una solución de piridina que contenga 1O mg por mL, usando una luz de mercurio a 546, 1 nm; entre +21 º y +25º, determinada en una solución de partes iguales de cloroformo y metanol que contenga 5 mg por mL, usando una luz de sodio. APTITUD: Disolver 1O mg de ER Digitoxina USP, previamente secados, 1O mg de ER Digoxina USP, previamente secados, y 1O mg de gitoxina en sendas porciones de 5 mL de una mezcla de 2 partes de cloroformo y 1 parte de metano!, y diluir cada una con fase móvil adicional hasta 1O ml. Luego proceder según se indica en Prueba de identificación en Digoxina. El cromatograma de la gitoxina muestra una mancha fluorescente ubicada entre las manchas de digoxina y digitoxina. Glicerina (Glicerol) [56-81-5]-Usar Glicerol de grado reactivo ACS.
Furfural (2-Furancarboxialdehído; 2-Furaldehído), C4H3QCH0-96,08 [98-01-1 ]-Usar grado reactivo ACS. Gel de Sílice-Un Si02 amorfo, parcialmente hidratado que se presenta en gránulos vítreos de diversos tamaños. Cuando se usa como desecante, con frecuencia está recubierto de una sustancia que cambia de color cuando la capacidad de absorber agua se ha agotado. Estos productos coloreados pueden regenerarse (es decir, pueden recobrar su capacidad de absorber agua) al calentarse a 11 Oº hasta que el gel recupere su color original. Para usar como desecante, usar Gel de Sílice Desecante de grado ACS. Gel de Sílice Exento de Aglutinante-Gel de sílice para uso cromatográfico formulado sin aglutinante ya que sólo se ~san formas activadas del gel de sílice como el agente aglutinante. [NOTA-Se J?.Uede obtener comercialmente un grado adecuado como 'Gel de Sílice H" .] Gel de Sílice Octadecilsilanizada para CromatografíaUsar un grado adecuado. [NOTA-Se p,uede obtener comercialmente un wado adecuado como 'Analtech Reversed Phase Uniplates en www. spectrumchemical.com.] Gel de Sílice para Cromatografía-Usar un grado adecuado. [NOTA-Se puede obtener comercialmente un grado adecuado como "Silica Gel G".]
Glicocolato de Sodio, C25H42NNa06--487,60 [863-57-0]-Polvo blanco a tostado. Es higroscópico. Fácilmente soluble en agua y en alcohol. ROTACIÓN ESPECÍFICA (781 ): entre +28º y +31 º, calculado con respecto a la sustancia seca (se torna anhidro mediante secado a 100º durante 2 horas), determinado a 20º en una solución que contiene 1O m or ml. : se encuentra entre , o y 3,2% con respecto a la sustancia seca.
e N, ca cu ado
Glucosa, C5H12Ü5-l80,2 [50-99-7]-Usar un grado adecuado. Polvo blanco cristalino. Fácilmente soluble en agua; moderadamente soluble en alcohol. D-Glucuronolactona, C6H80 6- l 76, 12 Usar un grado adecuado.
[32449-92-6]-
L-Glutamina, CsH10N203-l 46, 15 [56-85-9]-Polvo blanco cristalino. Usar un grado adecuado. Goma de Semillas de Algarrobo-Goma obtenida de los endospermos molidos de Ceratonia siliqua L. Taub. (Fam. Leguminosae). Usar Locust Bean Gum (Goma de Semillas de Algarrobo, monografía del FCC). Guayaco! (o-Metoxifenol), C7Hs02-124,14 [95-05-1]Líquido refractivo, de incoloro a amarillento. Soluble en aproximadamente 65 partes de agua; soluble en solución de hidróxido de sodio; miscible con alcohol, con cloroformo, con éter y ,con ácido acético glacial. VALORACION: Cuando se examina mediante cromatografía de gas-líquido, presenta una pureza de no menos de 98%. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas para valorarlo: una columna de acero inoxidable de 3 mm x 1,8
Reactivos/ Especificaciones de Reactivos 2329
USP 39
m rellena con fase líquida Gl 6 sobre soporte SlA de malla 60 a 80. Usar helio como gas transportador; mantener la temperatura del inyector a 180º, la temperatura de la columna a 200º y la temperatura del detector de ionización a la llama a 280º. El tiempo de retención es de aproximadamente 8 minutos. ÍNDICE DE REFRACCIÓN (831): entre 1,5430 y 1,5450, a 20º. Hemateína, C16H1206-300,26 [475-25-2]-Preparada a partir de extracto de palo de Campeche o de hematoxilina mediante tratamiento con amoníaco y exposición al aire. Cristales de color marrón rojizo con un brillo metálico verde amarillento. Muy poco soluble en agua (aproximadamente 1 en 1 700); poco soluble en alcohol y en éter; insoluble en benceno y en cloroformo; fácilmente soluble en solución de amoníaco diluido, para formar una solución de color rojo púrpura oscuro, y en una solución acuosa de hidróxido de sodio (1 en 50), para formar una solución roja brillante, observadas en cada caso a través de una capa de 1 cm de profundidad. Funde a una temperatura superior a 200º y tiende a descomponerse a 250º. Hematoxilina (Hidroxibrasilina), C16H1406 · 3H20-356,32 [517-28-2]-Sustancia cristalina derivada del duramen de Haematoxylon campechianum L. (Fam. Leguminosae). Prismas incoloros a amarillos. Muy poco soluble en agua fría y en éter; rápidamente soluble en agua caliente y en alcohol caliente. La exposición a la luz la torna roja y produce una solución amarilla. Se disuelve en amoníaco SR y en soluciones de hidróxidos y carbonatos alcalinos. Disuelta en soluciones de las siguientes sales, presenta los colores indicados: un color rojo en solución de alumbre; un color rosado en solución de cloruro estannoso; un color gris verdoso en soluciones de sales cúpricas. Se torna gradualmente negra en solución de dicromato de potasio. Almacenar la hematoxilina y sus soluciones protegidas de la luz y del aire. Hemiclorhidrato de Carboximetoxilamina, 2(C2HsN03) · HCl-218,59 [2921-14-4]-Polvo cristalino blanco. Usar un grado adecuado. Hemoglobina Bovina [9008-02-0]-Usar un grado adecuado. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado como polvo sustrato de Hemoglobina Bovina en Sigma-Aldrich, www.sigma-aldrich.com.] Heptadecanoato de Metilo, Cl8H3602-284,48 [1731-92-6]-Escamas cristalinas blancas. VALORACIÓN: Inyectar una muestra apropiada en un cromatógrafo de gases (ver Cromatografía (621 )) equipado con un detector de ionización a la llama, usando helio como gas transportador. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas: una columna capilar de 0,25 mm x 30 m, recubierta con una capa de fase G8 de 1 µm; mantener la temperatura del inyector a 220º; mantener la temperatura del detector a 220º; mantener la temperatura de la columna a 180º y programar para que aumente 4º por minuto hasta 220º. El área del pico de C1sH36Ü2 no es menos de 99% del área total. INTERVALO DE FUSIÓN (741): entre 31º y 32º. 1-Heptadecanol, Ci 1H360-256,48 un grado adecuado.
[1454-85-9]-Usar
Heptakis-(2,6-d i-0-metil)-,B-ciclodextri na (2, 6-Di-0-metil-,Bcicfodextrina; Dimetil-,B-ciclodextrina), Cs6H9sÜ3s-1331,36 [51166-71-3]-Usar un grado adecuado.
rente, constituido principalmente por C1H16. Prácticamente insoluble en agua; soluble en alcohol absoluto. Miscible con éter, con cloroformo, con benceno y con la mayoría de los aceites fijos y volátiles. Usar un grado adecuado, cromatográfico o HPLC, con un contenido de no menos de 99%. 1-Heptanosulfonato de Sodio (Sal Sódica del Ácido 7-Heptanosulfónico), C1H1sNa03S-202,25 [22767-50-6]-Usar un grado adecuado. 1-Heptanosulfonato de Sodio Monohidrato, C1H1sNa03S · Hz0-220,26 [22767-50-6]-Usar un grado adecuado. Heptil p-Hidroxibenz9ato (Heptil 4-Hidroxibenzoato; /\j-Heptil 4-Hidroxibenzoato; Acido Benzoico, 4-Hidroxi-, Heptil Ester), C14H20Ü3-236,31 [1085-12-7]-Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 98%. n-Heptilato de Colesterilo-Usar un grado adecuado. Hexadecanoato de Hexadecilo (Palmitato de Hexadecilo; Palmitato de Cetilo), C32H6402-480,85 [540-10-3]-Usar un grado adecuado. [NOTA-Se encuentran disponibles comerci51lmente grados ades:uados como Palmitato de Hexadecilo y Ester Palmitílico de Acido Palmítico en Sigma-Aldrich, www.sigma-aldrich. com y Palmitato de Cetilo, Número de catálogo Cl 203, en Spectrum Chemical Mfg. Corp., www.spectrumchemical. com.] [999-97-3]-LíHexametildisilazano, C6H19NSi2-161,39 quido transparente e incoloro. VALORACIÓN: Cuando se examina mediante cromatografía de gas-líquidos, presenta una pureza de no menos de 95%. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas para la valoración del artículo: Una columna de vidrio de 2 mm x 1,8 m rellena con fase G3 sobre soporte Sl. El gas transportador es helio, que fluye a una velocidad de aproximadamente 40 mL por minuto; mantener la temperatura del detector aproximadamente a 31 Oº, la del inyector aproximadamente a 100º y programar la temperatura de la columna para comenzar a 35º, mantenerse a esta temperatura durante 5 minutos y luego aumentar a una velocidad de 8º por minuto hasta 200º. Utilizar un detector de ionización a la llama. RESIDUO POSTERIOR A LA EVAPORACIÓN: Transferir 200 g a una cápsula tarada y evaporar en un baño de vapor hasta sequedad. Secar el residuo a 105º durante 1 hora, enfriar y pesar: no se encuentra más de 0,0025% de residuo. Hexametilenimina (Homopiperidina), C6H12NH-99, 17 [111-49-9]-Líquido de incoloro a casi incoloro. ÍNDICE DE REFRACCIÓN (831): entre 1,4640 y 1,4660 a 20º. Hexametilentetramina-Ver Metenamina.
Cambio en Ja redacción: Hexanitrodifenilamina (Oipicrilamina), C12HsN1012-439,21 [1} 1-73-7]-Prismas o polvo de color amarillo oro. [PRECAUCION-Explosivo.] Por lo general contiene aproximadamente 15% de agua como precaución de seguridad. Insoluble en agua, en alcohol, en acetona y en éter; soluble en ácido acético glacial Y. en sustancias alcalinas. •oETER~INActÓN DE AGUA, Método I (921 )e CAF 01-may-2016): no más de 16%.
n-Heptano-Usar n-Heptano para Cromatografía.
n-Hexano, C6H14-86, 18 [110-54-3] (para uso en espectrofotometría)-Usar Hexanos.
n-Heptano para Cromatografía, C1H16-l 00,21 [142-82-5]-Líquido inflamable, volátil, incoloro y transpa-
Hexano para Cromatografía: para HPLC.
Usar grado reactivo ACS
2330 Especificaciones de Reactivos /Reactivos Hexanoato de Metilo (Éster Metílico del Ácido Caproico; Caproato de Metilo), C1H140z-130, 18 [106-70-7]-Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 99%. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado con el número de catálogo 259942 en www.sigma-aldrich.com.] Hexanofenona, C12H160-176,25 [942-92-7]-Líquido amarillo. VALORACIÓN: Inyectar una muestra apropiada en un cromatógrafo de gases adecuado (ver Cromatografía (621 )) equipado con un detector de ionización a la llama, usando helio como gas transportador. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas: una columna capilar de 0,25 mm x 30 m, recubierta con una capa de fase G3 de 1 µm; mantener la temperatura del inyector a 280º; mantener la temperatura del detector a 300º; mantener la temperatura de la columna a 180º y programar para que aumente 1Oº por minuto hasta 280º. El área del pico de C12H160 no es menos de 98% del área total. ÍNDICE DE REFRACCIÓN (831 ): 1,511 ± 0,002 a 20º. Hexanos (adecuado para uso en espectrofotometría UV); por lo general una mezcla de varios isómeros de hexano (C6H14), predominantemente n-hexano y metilciclopentano (C6H12)-Usar grado reactivo ACS para espectrofotometría. 1-Hexanosulfonato de Sodio (Sal Sódica del Ácido 7-Hexa[2832-45-3]-Usar un nosu/fónico), C6H13Na03S-188,22 grado adecuado. 1-Hexanosulfonato de Sodio Monohidrato, C6HBNa03S · H20-206,23 [2832-45-3]-Usar un grado adecuado. Hexilamina (7-Aminohexano), C6H1sN-101,19 [111-26-2]-Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 99%. Hialuronato de Potasio-Polvo de color blanco a crema. Fácilmente soluble en agua. Almacenar en envases impermeables, en un refrigerador. CONTENIDO DE INHIBIDOR: Preparar, según se indica en la Valoración en Hialuronidasa para Inyección (monografía de la USP), una cantidad de Solución estándar que contenga 1 Unidad USP de Hialuronidasa en cada mL y una cantidad similar de Solución estándar amorti~uada con acetato, utilizando como disolvente una solucion amortiguadora de acetato de sodio O, 1 M de pH 6 (obtenida por dilución de la solución amortiguadora 0,2 M que se prepara según se indica a continuación con un volumen igual de agua). Preparar, a partir del hialuronato de potasio en análisis, 1O mL de Solución madre de hialuronato de potasio y diluir 2 mL de la misma con la Solución amortiguadora de fosfato especificada para obtener una Solución de hialuronato. De la misma manera, y al mismo tiempo, diluir una segunda porción de 2 mL de la solución madre con solución amortiguadora de acetato de sodio 0,2 M de pH 6 (que contenga 16,4 g de acetato de sodio anhidro y 0,45 mL de ácido acético glacial por cada 1000 mL). Colocar porciones de 0,50 mL de la Solución de hialuronato en cuatro tubos de ensayo de 16 x 100 mm y colocar porciones de 0,50 mL de la Solución de hialuronato amortiguada con acetato en dos tubos similares. Agregar a dos de los cuatro tubos que contienen Solución de hialuronato 0,50 mL de Diluyente para soluciones de hialuronidasa, preparado según se indica en la Valoración en Hialuronidasa para Inyección (monografía de la USP). Agregar a los dos tubos restantes, siguiendo un plan estricto, 0,50 mL de Solución estándar a intervalos de 30 segundos. De modo similar, agregar a los dos tubos que contienen la Solución de hialuronato amorti~uada con acetato, porciones de 0,50 mL de Solucion estándar amortiguada con acetato a intervalos de 30 segundos. Luego proceder según se indica en el segundo párrafo del Procedimiento, empezando con "Mezclar el contenido", hasta "Graficar el valor prome-
USP 39 dio". La reducción en la absorbancia de la Solución de hialuronato amortiguada con acetato, no es menos de 25% de la observada en la Solución de hialuronato. PRODUCCIÓN DE TURBIDEZ: La absorbancia promedio de las soluciones en los dos tubos que contienen Solución de hialuronato y Diluyente para soluciones de hialuronidasa preparados en la prueba para Contenido de lnhibidor no es menor de 0,26 a una longitud de onda de 640 nm en un espectrofotómetro adecuado utilizando una celda de 1 cm. Hidrazida del Ácido lsonicotínico-Usar /soniazida (monografía de la USP). Hidrazina Hidrato al 85% en Agua, (NH2)2 · H20-50,06 [7803-57-8)-Líquido incoloro. VALORACION: Transferir 600 mg, pesados con exactitud, a un matraz volumétrico de 100 ml. Diluir a volumen con agua y mezclar. Pipetear 1O mL y transferirlos a un vaso de precipitados adecuado, agregar 1,0 g de bicarbonato de sodio y 50,0 mL de yodo O, 1 N SV. Valorar el exceso de yodo con tiosulfato de sodio O, 1 N SV, usando almidón SR como indicador. Realizar una determinación con un blanco y hacer las correcciones necesarias. Cada mL de yodo O, 1 N equivale a 1,252 mg de (NH2)2 · H20. No se encuentra menos de 83%. Hidrindantina (2,2'-Dihidroxi-2,2'-biindan-1, 7',3,3'-tetrona), C1sH1006-322,27 [5103-42-4]-Moderadamente soluble en agua caliente; soluble en metoxietanol. Cuando se calienta por encima c:!e 200º, se torna de color marrón rojizo. INTERVALO DE FUSION (741): entre 249º y 254º. Hidrocodona Diol, C1sH23NÜ4-317,4--Usar un grado adecuado. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado en www.mallinckrodt.comcon número de catálogo 1584.] [123-31-9]-Cristales Hidroquinona, C6H4(0H)2-11O,11 finos en forma de aguja, incoloros o blancos. Se oscurece al exponerla a la luz y al aire. Soluble en agua, en alcohol y en éter. VALORACIÓN: Pesar con exactitud aproximadamente 250 mg y disolver en una mezcla de 100 mL de agua y 1O mL de ácido sulfúrico O, 1 N en un matraz Erlenmeyer de 250 ml. Agre_gar 3 gotas de una solución 1 en 100 de difenilamina en acido sulfúrico y valorar con sulfato cérico O, 1 N SV hasta que la solución adquiera un color violeta rojizo. Cada mL de sulfato cérico O, 1 N equivale a 5,506 mg de C6H4(0H)i. No se encuentra menos de 99%. INTERVALO DE FUSIÓN (741 ): entre 172º y 174º. Hidrosulfito de Sodio (Ditionito de Sodio), Na2S204174, 11 [7775-14-6]-Polvo cristalino de color blanco o blanco grisáceo. Soluble en agua; poco soluble en alcohol. Se oxida gradualmente a bisulfito en contacto con el aire, más fácilmente cuando está en solución, produciendo una reacción ácida. Es afectado por la luz. VALORACIÓN: Pesar con exactitud aproximadamente 1 g, disolverlo en una mezcla de 1O mL de formaldehído SR y 1O mL de agua en un matraz pequeño con tapón de vidrio, y dejarlo en reposo durante 30 minutos agitando frecuentemente. Transferir la solución a un matraz volumétrico de 250 mL, agregar 150 mL de agua y 3 gotas de anaranjado de metilo SR, y luego agregar acido sulfúrico 1 N, gota a gota, hasta obtener una reacción ligeramente ácida. Diluir con agua hasta 250 mL y mezclar. A 50,0 mL de la dilución, agregar 2 gotas de fenolftaleína SR e hidróxido de sodio O, 1 N en cantidad suficiente para obtener un ligero color rosa, luego valorar con yodo O, 1 N, agregando 3 mL de almidón SR como indicador. Eliminar el color azul de la solución con 1 gota de tiosulfato de sodio O, 1 N, y valorar con hidróxido de sodio O, 1 N SV hasta obtener un color rosa: cada mL de hidróxido de sodio O, 1 N equivale a 3,482 mg de Na2S204. No se encuentra menos de 88%.
USP 39 SULFUROS: Agregar una solución de hidróxido de sodio (1 en 1O) a acetato de plomo SR hasta que el precipitado se disuelva. Agregar 5 gotas de esta solución a una solución de 1 g de hidrosulfito de sodio en 1O mL de agua: no se observa oscurecimiento inmediato. METALES PESADOS: Disolver 1 g en 1O mL de agua, agregar 1O mL de ácido clorhídrico y evaporar en un baño de vapor hasta sequedad. Disolver el residuo en 20 mL de agua y 0,5 mL de ácido clorhídrico diluido, filtrar, y agregar al filtrado 1O mL de sulfuro de hidrógeno SR: no se produce oscurecimiento. Alcalinizar la solución con amoníaco SR: puede producirse un ligero color verdoso, pero no se produce un precipitado blanco u oscuro. APTITUD PARA LA VALORACIÓN DE RIBOFLAVINA: A cada uno de 2 o más tubos, agregar 1O mL de agua y 1,0 mL de solución de riboflavina estándar que contenga 20 µg de riboflavina por mL y mezclar. Agregar a cada tubo 1,0 mL de ácido acético 9lacial, mezclar, agregar mezclando 0,5 mL de solucion de permanganato de potasio (1 en 25) y dejar en reposo durante 2 minutos. Luego a9re~ar mezclando, a cada tubo, 0,5 mL de peróxido de h1drogeno SR: el color del permanganato desaparece dentro de los 1O segundos. Agitar vigorosamente los tubos hasta expulsar el exceso de oxígeno. Si persisten las burbujas de gas en las paredes de los tubos después que la producción de espuma haya cesado, eliminar las burbujas inclinando los tubos de tal forma que la solución fluya suavemente de un extremo a otro. Medir la fluorescencia de la solución en un fluorómetro adecuado. Luego agregar, mezclando, 8,0 mg de hidrosulfito de sodio: la riboflavina se reduce completamente en no más de 5 segundos. 3'-Hidroxiacetofenona, CsHs02-136, 15 [121-71-1 ]-Escamas o terrones de polvo marrón claro. Funde aproximadamente a 96º. Moderadamente soluble en cloroformo, produciendo una solución transparente de color amarillo claro. VALORACIÓN: Inyectar una muestra apropiada en un cromatógrafo de gases adecuado (ver Cromatografía (621)) equipado con un detector de ionización a la llama, usando helio como gas transportador. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas: una columna capilar de 0,25 mm x 30 m recubierta con fase G1; mantener las temperaturas del inyector y del detector a 300º; la de la columna a 180º, programada para aumentar 1Oº por minuto hasta 280º y mantenerse en dicha temperatura durante 1O minutos. El área del pico principal no es menos de 97% del área total. 4'-Hidroxiacetofenona, HOC6H4COCH3-l 36, 15 [99-93-4]-Polvo gris; funde aproximadamente a 109º. 4-Hidroxi-2-butanona (2-Hidroxietil Metí/ Cetona), (4Hs0 288, 11 [590-90-9]-Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 94%. Hidróxido de Amonio (Amonio Acuoso), [1336-21-6]-Usar grado reactivo ACS. Hidróxido de Amonio (Hidróxido de Amonio Concentrado)- [1336-21-6]-Usar Hidróxido de Amonio de grado reactivo ACS. Hidróxido de Amonio 6 N-Preparar mediante la dilución de 400 mL de Hidróxido de Amonio Concentrado (ver sección Reactivos) con agua para obtener 1000 ml. Hidróxido de Amonio al 25 por ciento [1336-21-6]-Usar un grado adecuado. Hidróxido de Bario, Ba(OH)2 · 8H20-315,46 [12230-71-6]-Usar grado reactivo ACS. Hidróxido de Calcio [1305-62-0]-Usar grado reactivo ACS.
Reactivos/ Especificaciones de Reactivos 2331 Hidróxido de Estroncio (Hidróxido de Estroncio Octahidrato), Sr(OH)2 · 8H20-265,76 [18480-07-4]-Polvo blanco, cristalino, que fluye con facilidad. Moderadamente soluble en agua. Puede absorber dióxido de carbono del aire. Mantener herméticamente cerrado. VALORACIÓN y CARBONATOS: Pesar con exactitud aproximadamente 5 g, disolver en 200 mL de agua tibia exenta de dióxido de carbono en un matraz de 500 mL con tapón de vidrio, agregar fenolftaleína SR y valorar con ácido clorhídrico 1 N SV para determinar la alcalinidad del hidróxido. Luego agre9ar anaranjado de metilo SR y valorar con ácido clorh1drico 1 N SV. Cada mL de ácido clorhídrico 1 N necesario para alcanzar el punto final de fenolftaleína equivale a 132,9 mg de Sr(OH)2 · 8H20 y cada mL adicional de ácido clorhídrico 1 N SV necesario para alcanzar el punto final de anaranjado de metilo equivale a 73,8 mg de SrCQ3. Se encuentra no menos de 95,0% de Sr(OH)i · 8H20 y no más de 3,0% de SrCQ3. CLORUROS (Prueba para reactivos): Disolver 1,0 g en 100 mL de agua y filtrar si fuera necesario: 1,0 mL de la solución no presenta más de 0,01 mg de CI (0, 1%). CALCIO (Prueba para reactivos) Solución de prueba: Disolver 5,0 g en agua y diluir con agua hasta 100 ml. Solución muestra: Diluir 10,0 mL de la Solución de prueba con agua hasta 100 ml. Solución control: A 10,0 mL de la Solución de prueba agregar 0,50 mg de ión calcio (Ca) y diluir con agua hasta 100 ml. Procedimiento: Determinar la emisión de fondo a 416, 7 nm: el límite es O, 1%. HIERRO: Disolver 1 g en agua tibia y diluir con agua hasta 100 ml. A 20 mL de esta solución agregar 2 mL de ácido clorhídrico y O, 1 mL de permanganato de potasio O, 1 N, dejar en reposo durante 5 minutos y agregar 3 mL de solución de tiocianato de amonio (3 en 1O). Si se produce color rojo, éste no es más oscuro que el de un control que contenga 0,03 mg de hierro (Fe) agregado (0,015%). METALES PESADOS: Disolver 2,0 g en 14 mL de ácido clorhídrico diluido (1 en 6) y evaporar en un baño de vapor hasta sequedad. Recoger el residuo en 25 mL de agua, filtrar y diluir con agua hasta 100 mL (Solución de prueba). A 5,0 mL de la Solución de prueba agregar 0,02 mg de plomo (Pb) y diluir con agua hasta 30 mL, para proporcionar el estándar. Para la muestra de prueba, utilizar 30 mL de la Solución de prueba. Ajustar cada solución con ácido acético diluido o amoníaco SR a un pH entre 3,0 y 4,0 (utilizando papel de pH de intervalo corto), diluir con agua hasta 40 mL y agregar 1O mL de sulfuro de hidrógeno SR recién preparado: si se produce color marrón en la Solución muestra, aquel no es más oscuro que el de la Solución control (0,004%). Hidróxido de Litio, LiOH · H20-41,96 Usar grado reactivo ACS. Hidróxido de Potasio, KOH-56, 11 grado reactivo ACS. Hidróxido de Sodio, NaOH-40,00 grado reactivo ACS.
[1310-65-2][1 310-58-3]-Usar
[1310-73-2]-Usar
Hidróxido de Tetrabutilamonio al 40 por Ciento en Agua, [CH3(CH2)3]4NOH-259,47 [2052-49-5]-Usar un grado adecuado. Hidróxido de Tetrabutilamonio 0,4 M en Agua, C16H37NQ- 259,47 [2052-49-5]-Usar un grado adecuado. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado en www. fishersci.com con número de catálogo 420120025.] Hidróxido de Tetrabutilamonio 1,0 M en Metanol [2052-49-5]-Usar un grado adecuado.
2332 Especificaciones de Reactivos
/Reactivos
Hidróxido de Tetrabutilamonio 30-Hidrato, C16H37NO · 30H20-799,93 [2052-49-5]-Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 98,0%. Hidróxido de Tetrametilamonio, (CH3)4NQH-91, 15 [75-59-2]-Disponible corno una solución acuosa aproximadamente al 10% o al 25%, o como pentahidrato cristalino. Es transparente e incoloro. El Hidróxido de tetrametilamonio es una base más fuerte que el amoníaco y absorbe rápidamente el dióxido de carbono del aire. Almacenar en envases impermeables. VALORACIÓN: Pesar con exactitud un matraz con tapón de vidrio que contenga aproximadamente 15 mL de agua. Agregar una cantidad de una solución de hidróxido de tetrametilamonio, que equivalga aproximadamente a 200 mg de (CH3)4NQH, y pesar de nuevo. Agregar rojo de metilo SR y valorar la solución con ácido clorhídrico O, 1 N SV: cada mL de ácido clorhídrico O, 1 N equivale a 9, 115 rng de (CH3)4NOH. RESIDUO DE EVAPORACIÓN: Evaporar 5 mL de la solución en un baño de vapor y secar a 105º durante 1 hora: el peso del residuo equivale a no más de 0,02% del peso de la muestra de prueba. AMONÍACO y OTRAS AMINAS: Pesar con exactitud una cantidad de solución, que corresponda aproximadamente a 300 mg de (CH3)4NQH en un frasco para pesada de poca profundidad tarado con 5 mL de agua. Agregar un pequeño exceso de ácido clorhídrico 1 N (aproximadamente 4 mL), evaporar hasta sequedad en un baño de vapor y secar a 105º durante 2 horas: el peso del cloruro de tetrametilamonio así obtenido, multiplicado por 0,8317, representa la cantidad, en mg, de (CH3)4NOH en la porción de muestra de prueba tomada y corresponde a un peso 0,2% mayor o menor que el hallado en la Valoración. Hidróxido de Tetrametilamonio Pentahidrato, (CH3)4NOH · 5H20-181,23 [10424-65-4]-Cristales de color blanco a blanquecino. Es higroscópico. Base fuerte. Mantener 9ien cerrado. Soluble en agua y en metanol. VALORACION: Pesar con exactitud aproximadamente 800 mg, disolver en 100 mL de agua y valorar con ácido clorhídrico O, 1 N SV, determinando el punto final potenciométricamente. Realizar una determinación con un blanco y hacer las correcciones necesarias. Cada mL de ácido clorhídrico O, 1 N equivale a 18,22 mg de (CH3)4NQH · 5H20: no se encuentra menos de 98%. Hidróxido de Tributiletilamonio, C14H33N0-231,42-Usar un grado adecuado. Hidróxido de (m-Trifluorometilfenil) Trimetilamonio en Metanol-Usar un grado adecuado. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado en Fisher Scientific, www.fischersci.com, disponible como "Meth-Prep
11" .]
USP 39 acetato de etilo, en benceno y en ácido acético glacial; soluble en álcalis y en ácidos minerales; fácilmente soluble en ácido clorhídrico tibio al 20% v/v. INTERVALO DE FUSIÓN (741 ): entre 220º y 247°, con descomposición. 10/3-Hidroxinorandrostendiona (10/3-Hidroxi- 79-norandrost4-eno-3, 77-diona), C1sH24Ü3-288,38-Usar un grado adecuado. Hidroxipropil-/3-ciclodextrina, (Hidroxipropilbetadex), C42H70Ü3s(C3H60), con x = 7 MS (MS: sustitución molar) [94035-02-6]-Usar un grado adecuado con un grado de sustitución entre 0,40 y 1,50. 8-Hidroxic¡uinolina (Oxina), C9H7N0-145, 16 [148-24-3]-Usar 8-Quinolinol de grado reactivo ACS. Hierro (En Polvo), Fe-55,85 [7439-89-6]-Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 99,9%. [68-94-0]-Polvo Hipoxantina, C5 H4 N40-136, 11 blanco a blanco amarillento. Soluble en hidróxido de sodio 1 N. Usar un grado adecuado. Hoja de Microfibra de Vidrio Impregnada con Gel de Sílice-Usar un grado adecuado. [NOTA-Se puede obtener comercialmente un grado adecuado como Cámara "Seprachrom" con Tipo SG ITLC, Nº de producto 51923, en Gelrnan lnstrument Co., Ann Arbor, MI 48106.] tfojas de Microfilamentos de Vidrio Impregnadas en Ac1do Silícico con Indicador Fluorescente-Usar un grado adecuado. [NOTA-Un ejemplo de un grado adecuado son las hojas "ITLC Tipo SAF", disponibles en Gelman lnstrument Co., 600 South Wagner Rd., Ann Arbor, MI 48106.] lmidazol, C3H4N2-68,08 [288-32-4]-Cristales blancos a amarillo claro. Fácilmente soluble en agua. Usar grado reactivo ACS. lndeno, C~Hs-116, 16 [95-13-6]-Líquido incoloro. VALORACION: Inyectar una muestra apropiada en un cromatógrafo de gases adecuado (ver Cromatografía (621 )) equipado con un detector de ionización a la llama, usando helio como gas transportador. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas: una columna capilar de 0,25 mm x 1O m, recubierta con una capa de 1 µm de metilsilicona; mantener la temperatura del inyector a 200º, la del detector a 300º y la de la columna a 100º, programada para que aumente 1 Oº por minuto hasta 250º. El área del pico de indeno no es menos de 99% del área total. ÍNDICE DE REFRACCIÓN (831): entre 1,5749 y 1,5769 a 20º. Indicador de Negro de Eriocromo T-Cloruro de SodioMezclar O, 1 g de negro de eriocrorno T y 1O g de cloruro de sodio y triturar hasta que la mezcla sea homogénea.
4-(4-Hidroxifenil)-2-butanona, C10H120r-164,20 [5471-51-2)-Polvo blanco. VALORACION: Inyectar un volumen apropiado en un crornatógrafo de gases (ver Cromatografía (621 )) equipado con un detector de ionización a la llama, usando helio como gas transportador. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas: una columna capilar de 0,25 mm x 30 m, recubierta con una capa de fase G43 de 1 µm; mantener la temperatura del inyector a 280º; mantener la temperatura del detector a 300º; mantener la temperatura de la columna a 180º y programar para que aumente 1Oº por minuto hasta 280º. El área del pico de C10H1202 no es menos de 98,5% del área total. INTERVALO DE FUSIÓN (741 ): entre 81 o y 87º.
Índigo Carmín-Usar lndigotindisuffonato Sódico (monografía de la USP).
D-a-4-Hidroxifenilglicina, CsH9NÜ3- l 67, 16 [22818-40-2]-Laminillas brillantes. Moderadamente soluble en agua, en alcohol, en acetona, en éter, en cloroformo, en
lnosina, C10H12N40s-268,23 blanco.
Indicadores-Ver subsección correspondiente.
lndol (2,3-Benzopirrol), CsH7N-117, 14 un grado adecuado.
[120-72-9]-Usar
lnhibidor de la Ribonucleasa-Usar un grado adecuado. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado en BD Biosciences, www.bdbiosciences.com.] [58-63-9]-Polvo cristalino
Reactivos/ Especificaciones de Reactivos 2333
USP 39
PUNTO DE FUSIÓN (741 ):
aproximadamente 90º.
lnositol (Hexahidroxiciclohexano), C6H6(0H)6-180, 16 [87-89-8]-Cristales finos blancos o polvo cristalino bla,nco; estable al aire. Sus soluciones son neutras al tornasol. Opticamente inactivo. Un g se disuelve en 5,7 ml de agua. Poco soluble en alcohol; insoluble en éter y en cloroformo. Almacenar en envases bien cerrados. INTERVALO DE FUSIÓN (741): entre 223º y 226º. PÉRDIDA POR SECADO (731 ): Secar a 105º durante 4 horas: no pierde más de 0,5% de su peso. RESIDUO DE INCINERACIÓN (Prueba para reactivos): no más de 0,1%. 4-lsobutilacetofenona, C12H160-176-Líquido amarillo pálido. Soluble en cloroformo, en glicerol, en alcohol, en éter y en aceites grasos; insoluble en agua. Usar un grado adecuado. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado en TCI America, www.tciamerica.com.] N-lsobutilpiperidona, C9H11N0-155,24-Usar un grado adecuado.
Agregar .lo$1guiente,: •1s~b1:1tir111tQ. de. Preg.ne(l()IQl)a (l~ol:Jutir~t~ deS-pregnen, 3•ol-2Q•ona);. C2srbs0s~386,;~.1~~r.tin. 9 ad~C;\JªPº
qmti!nide);:Je no menos (fe 9.9%. A""'":'Se. puede obtener un·grado.adecul'!do. cpn\el.númerode catálogo . EPP!9200.OQ.en. w.w.·.w.IQ.·
lsocianato de Fenilo, C6HsNC0-119, 12 [103-71-9]Líquido de mediana vola,tilidad, transparente y de incoloro a amarillo ocre. [PRECAUCION: El lsocianato de Fenilo es una sustancia sumamente lacrimógena, y el vapor es altamente tóxico. Manipular con cuidado.] VALORACIÓN: Transferir 250 m$), pesados con exactitud, a un matraz de 250 ml con tapon de vidrio. Tomar precauciones para evitar pérdida por volatilización y evitar aspirar el vapor. Agregar 20 ml de solución de butilamina (25 g de butilamina diluida a 1000 ml con dioxano previamente secado sobre pellets de hidróxido de potasio), tapar el matraz y dejar en reposo durante 15 minutos. Agregar unas gotas de rojo de metilo SR y 25 ml de agua, y valorar el exceso de amina con ácido sulfúrico O, 1 N SV. Realizar una valoración con un blanco en 20 ml de la solución de butilamina (ver Volumetría (541 )). Restar el volumen de ácido sulfúrico O, 1 N consumido en la valoración de la muestra de prueba al volumen consumido en la valoración con el blanco. Cada ml de ácido sulfúrico O, 1 N, que representa esta diferencia, equivale a 11,91 mg de C6HsNCO: no se encuentra menos de 97,0% de C6HsNCO. (R)-( + )-lsocianato de alfa-Metilbenzilo ((R)-( +)-1-/socianato de Feniletilo), C9H9N0-147, 17 [33375-06-3]-Usar un
grado adecuado con un contenido de no menos de 99,0%. L-lsoleucina (Ácido (25,35)-2-Amino-3-metilpentanoico), C6H13N02-131,17 [73-32-5]-Usar un grado adecuado. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado en www. sigma-aldrich.com con número de catálogo 12752.] lsomaltotriosa (a-D-Glucosil-( 1-6)-a-D-glucosil-( 1-6)-a-D-glu[3371-50-4)-Polvo liofilizado cosa), C1sH32Ü16-504,4 blanco. Usar un grado adecuado. lsooctano-Ver 2,2,4-Trimetilpentano. lsopropilamina (2-Aminopropano), C3H1NH2-59, 11 [75-31-0)-Líquido inflamable, incoloro y transparente. Miscible con agua, con alcohol y con éter.
VALORACIÓN: Transferir aproximadamente 0,2 g, pesados con exactitud, a un recipiente adecuado, a9regar 50 ml de agua y mezclar. Valorar con ácido clorh1drico O, 1 N SV, usando una mezcla de verde de bromocresol SR y rojo de metilo SR (5:1) como indicador. Cada ml de ácido clorhídrico O, 1 N equivale a 59, 11 mg de C3H9N. No se encuentra menos de 98%. INTERVALO DE EBULLICIÓN (Prueba para reactivos): No menos de 95% destila entre 31º y 33º. ÍNDICE DE REFRACCIÓN (831): entre 1,3743 y 1,3753, a 20º. lsoramnetina, C16H1201-316,27 [418-19-3]-Polvo amarillo. INTERVALO DE FUSIÓN (741): mayor de 300º. lsotiocianato de Guanidina, C2H6N4S-118,2 [593-84-0]-Polvo blanco o cristales incoloros. Usar un grado adecuado. Kaempferol, C1sH1006-286,24 [520-18-3]-Polvo amarillo claro a amarillo. Es una solución transparente, de color amarillo brillante en alcohol. Lactato de Calcio, (CH3CHOHC00)2Ca · 5H20-308,29 [814-80-2]-Polvo o gránulos blancos. Es algo eflorescente y se torna anhidro a 120º. Un g se disuelve en 20 ml de agua; prácticamente insoluble en alcohol. Almacenar en envases impermeables. VALORACIÓN: Pesar con exactitud aproximadamente 500 mg, previamente secados a 120º durante 4 horas, transferir a un recipiente adecuado y disolver en 150 ml de agua que contenga 2 ml de ácido clorhídrico diluido. Agregar 15 ml de hidróxido de sodio SR y 300 mg de indicador azul de hidroxinaftol y valorar con edetato disódico 0,05 M SV hasta que la solución se torne de color azul intenso. Cada ml de edetato disódico 0,05 M equivale a 10,91 mg de C6H10Ca06. No se encuentra menos de 98%. PÉRDIDA POR SECADO (731 ): Secar a 120º durante 4 horas: pierde entre 25,0% y 30,0% de su peso. ACIDEZ: Agregar fenolftaleína SR a 20 ml de una solución 1 en 20 y valorar con hidróxido de sodio O, 1O N: no se requiere más de 0,50 ml para producir un color rosado. METALES PESADOS (Prueba para reactivos): Disolver 1 g en 2,5 ml de ácido clorhídrico diluido, diluir con agua hasta 40 ml y agregar 1O ml de sulfuro de hidrógeno SR: cualquier color marrón que se produzca no es más oscuro que el de una solución control que contenga 0,02 mg de Pb agregado (0,002%). MAGNESIO y SALES ALCALINAS: Mezclar 1 9 con 40 ml de agua, agregar cuidadosamente 5 ml de acido clorhídrico, calentar la solución, mantener en ebullición durante 1 minuto y agregar rápidamente 40 ml de ácido oxálico SR. Inmediatamente, agregar a la mezcla tibia 2 gotas de rojo de metilo SR, luego agregar amoníaco SR gota a gota, desde una bureta, hasta que la mezcla se torne apenas alcalina. Enfriar hasta temperatura ambiente, transferir a una probeta graduada de 100 ml, diluir con agua hasta 100 ml, mezclar y dejar en reposo durante 4 horas o durante toda la noche. Filtrar y transferir a una cápsula de platino 50 ml del filtrado transparente, al que se le ha agregado 0,5 ml de ácido sulfurico. Evaporar la mezcla en un baño de vapor hasta un volumen pequeño. Calentar cuidadosamente hasta sequedad sobre una llama libre y continuar calentando hasta completar la descomposicion y volatilización de las sales de amonio. Finalmente, incinerar el residuo a 800º ± 25º durante 15 minutos: el residuo no r,esa más de 5 mg (1 %). ACIDOS GRASOS VOLATILES: Mezclar aproximadamente 500 mg con 1 ml de ácido sulfúrico y entibiar: la mezcla no emana un olor a ácido graso volátil.
2334 Especificaciones de Reactivos /Reactivos Lactosa, Ci2H220 11 • Hi0-360,31 reactivo ACS.
[64-42-3]-Usar grado
Lana de Vidrio-Hilos finos de vidrio. SUSTANCIAS SOLUBLES EN ÁCIDO: Calentar a ebullición 1 g durante 30 minutos con 30 mL de ácido clorhídrico diluido y filtrar. Evaporar el filtrado y secar el residuo a 105º hasta peso constante: el residuo no pesa más de 5 mg (0,5%). METALES PESADOS: Calentar a ebullición 2 g con una mezcla de 25 mL de ácido nítrico diluido y 25 mL de agua durante 5 minutos y filtrar. Evaporar la mitad del fiftrado hasta sequedad, disolver el residuo en 1O mL de agua a la que se le han agregado 3 gotas de ácido clorhídrico, filtrar s1 fuera necesario, y agregar un volumen igual de sulfuro de hidrógeno SR al filtrado: no se produce oscurecimiento.
USP 39 del detector a 300º; mantener la temperatura de la columna a 180º y programarla para que aumente 1Oº por minuto hasta 280º. El área del pico de C19H32Ü3 no es menos de 99% del área total. ÍNDICE DE REFRACCIÓN (831 ): entre 1,469 y 1,473 a 20º.
L-Lisina Ácido 2,6-Diaminohexanoico), C6H14N20z-146, 19 [56-87-1 ]-Agujas cristalinas o placas hexagonales. Soluble en agua;, muy p~co soluble en alcohol; insoluble en éter. ROTACION ESPECIFICA (781 ): entre +25,5º y +26,0º. SOLUCIÓN DE PRUEBA: 20 mg por mL, en ácido clorhídrico diluido 1 en 2 . se encuentra entre , oy , o e N, correspondiente a no menos de 98,5% de C6H14N202, habiendo secado previamente la muestra de prueba a 105º durante 2 horas.
Laurato de Metilo, C13H2602-214,34 [110-82-0]-Líquido incoloro. VALORACIÓN: Inyectar un volumen apropiado en un cromatógrafo de gases (ver Cromatografía (621 )) equipado con un detector de ionización a la llama, usando helio como gas transportador. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas: una columna capilar de 0,25 mm x 30 m, recubierta con una capa de fase G2 de 1 µm; mantener la temperatura del inyector a 280º; mantener la temperatura del detector a 300º; mantener la temperatura de la columna a 180º y programar para que aumente 1Oº por minuto hasta 280º. El área del pico de C13H2602 no es menos de 99,45% del área total. Lauril Sulfato de Sodio-Ver Dodecil Sulfato de Sodio. Lignocerato de Metilo, C2sHso02-382,66 Cristales blancos.
[2442-49-1 ] -
Linalool (3, 7-Dimetil-1, 6-octadien-3-o/), C10H1s0-154,25 [78-70-6]-Usar un grado adecuado. Linoleato de Metilo, C19H34Ü2-294,47 [112-63-0]-Líquido incoloro. VALORACIÓN: Inyectar un volumen apropiado en un cromatógrafo de gases (ver Cromatografía (621 )) equipado con un detector de ionización a la llama, usando helio como gas transportador. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas: una columna capilar de 0,25 mm x 30 m, recubierta con una capa de fase G2 de 1 µm; mantener la temperatura del inyector a 300º; mantener la temperatura del detector a 300º; mantener la temperatura de la columna a 200º y programar para que aumente 1Oº por minuto hasta 300º. El área del pico de C19H34Ü2 no es menos de 99% del área total. Linolenato de Metilo, C19H32Ü2-292,46 [301-00-8]-Líquido incoloro. VALORACIÓN: Inyectar un volumen apropiado en un cromatógrafo de gases (ver Cromatografía (621)) equipado con un detector de ionización a la llama, usando helio como gas transportador. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas: una columna capilar de 0,25 mm x 30 m, recubierta con una capa de 1 µm de fase de cianopropilfenilo al 14% y dimetilpolisiloxano al 86%; mantener la temperatura del inyector a 280º; mantener la temperatura
Magnesio, Mg-24,305 [7439-95-4]-Metal plateado en forma de cinta. Reacciona lentamente con agua a temperatura ambiente. Se disuelve fácilmente en ácidos diluidos, liberando hidrógeno. VALORACIÓN: Transferir 1 g, pesado con exactitud, a un matraz volumétrico de 250 mL, y disolver en una mezcla de 15 mL de ácido clorhídrico y 85 mL de agua. Al terminar la disolución, diluir a volumen con agua y mezclar. Pipetear 25 mL de la dilución y transferir a un vaso de precipitados de 400 mL, diluir con agua a 250 mL, agregar 20 mL de amoníaco-cloruro de amonio SR y algunos mg de triturado de negro de eriocromo T y valorar con edetato disódico O, 1 M SV hasta un punto final azul. Cada mL de edetato disódico O, 1 M SV equivale a 2,430 mg de Mg. Se encuentra no menos de 99%. Maleato de Bis(2-etilhexilo), C20H36Ü4-340,50 [142-16-5]-Líquido transparente, incoloro a amari~lo pálido. Miscible con acetona y con alcohol. El peso específico es aproximadamente 0,945. VALORACIÓN: Colocar aproximadamente 2,5 g, pesados con exactitud, en un matraz de 250 mL, agregar 50,0 mL de hidróxido de potasio alcohólico 0,5 N SV y someter a reflujo durante 45 minutos. Enfriar, as¡regar 0,5 mL de fenolftaleína SR y valorar el exceso de alcafi con ácido clorhídrico 0,5 N SV. Realizar una determinación con un blanco al mismo tiempo, empleando la misma cantidad de hidróxido de potasio alcohólico 0,5 N (ver Valoraciones Residuales en Volumetría (541 )). La diferencia, en mL, entre los volúmenes de ácido clorhídrico 0,5 N consumidos en la valoración de la prueba y en la valoración del blanco, multiplicada por 85, 1, representa la cantidad, en mg, de maleato de bis(2-etilhexilo) en la porción tomada. No se encuentra menos de 97%. Maltotriosa, C1sH32Ü16-504,44 [1109-28-0]-Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 95%. Manganeso, Mn-54,94 [7439-96-5]-Polvo; usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 99,99%. Melamina (2,4,6-Triamino-1,3,5-triazina), C3H6N6-126, 1 [108-78-1 ]-Usar un grado adecuado. 2-Mercaptoetanol ({3-Mercaptoetanol), C2H60S-78, 13 [60-24-2j-Usar un grado adecuado. Mercurio, Hg-Peso atómico 200,59 grado reactivo ACS.
[7439-97-6]-Usar
Reactivos/ Especificaciones de Reactivos 2335
USP 39
Metabisulfito de Potasio (Disulfito de Potasio; Pirosulfito de [16731-55-8]-Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 98%.
2-Metil-2-propil-1,3-propanodiol, C1H16Ü2-l 32,20 [78-26-2]-Cristales blancos; funden aproximadamente a 58º.
Metabisulfito de Sodio, Na2S20s-l 90, 11 Usar grado reactivo ACS.
Metil Sulfóxido [67-68-5]-Ver Dimetil Sulfóxido.
Potasio), K2S20 5-222,32
Metaborato de Litio, LiB02-49,75 grado reactivo ACS.
[7681-57-4]-
[13453-69-5]-Usar
Metacrilato de Butilo, CsH14Ü2-142,20 un grado adecuado.
[97-88-1 ]-Usar
Metacrilato de 2-(Dimetilamino)etilo, CsH1sN02-157,2 [2867-47-2]-Usar un grado adecuado. Metacrilato de Metilo [80-62-6]-Usar un grado adecuado. Metanol (Alcohol Metílico), CH30H-32,04 Usar grado reactivo ACS.
[ 67-56- 1] -
Metanol Anhidro-Usar Metanol. Metano! Deuterado (Metanof- 12 C-d4, Metil- 12 C-d3alcohol-d1)-36, 1 [811-98-3]-EI grado de deuteración no es menos de 99,8%. Es un líquido incoloro, transparente, miscible con agua, con alcoh<;>I Y. con cloruro 9,e metilenoj densidad a 20º: 0,888 g/ml; 1nd1ce de refrarnon a 20º (11nea D): 1,326; punto efe ebullición 65,4º (760 mm Hg). Metano! Exento de Aldehídos, CH30H-32,04-Disolver 25 g de yodo en 1 L de metanol y verter la solución, mezclando constantemente, en 400 ml de hidróxido de sodio 1 N. Agregar 150 ml de agua y dejar en reposo durante 16 horas. Filtrar y calentar a ebullición bajo un condensado: de reflujo hasta que desaparezca el olor a yodoformo. Destilar la solución por destilación fraccionada. Contiene no más de 0,001 % de aldehídos y cetonas. Metano! para Espectrofotometría-Usar Metanol Adecuado para Uso en Espectrofotometría UV, de grado reactivo ACS. Metaperyodato de Sodio, Nal04-2l 3,89 [7790-28-5]Usar Peryodato de Sodio de grado reactivo ACS. Metenamina (Hexametilentetramina; Urotropina; Uritona; Hexamina), C6H12 N4-l 40, 19 [1 00-97-0]-Usar Hexametilentetramina de grado reactivo ACS. Metil Cloroformo (Metilcloroformo; 1, 1, 7-Tricloroetano), CH 3CCl3- l 33,40 [71-55-6]-Usar grado reactivo ACS. Metil Etil Cetona, CH3COC2Hs-72, 11 2-butanona de grado reactivo ACS.
[78-93-3]-Usar
Metil lsobutil Cetona-Ver 4-Metil-2-pentanona. 2-Metil-5-nitroimidazol, (4H4N302-127, 1O [88052-22-2]-Usar un grado adecuado. [NOTA-Se puede obtener en Sigma-Aldrich, www.sig maaldrich.com, como Nº de Catálogo, 13,625-5.] N-Metil-N-nitroso-p-toluensulfonamida (p-Tofjlsulfonilmetilnitrosamida), C8 H10N203S-214,24-Polvo o cristales de color amarillo claro. Insoluble en agua; soluble en benceno, en tetracloruro de carbono y en cloroformo. INTERVALO DE FUSIÓN (741): entre 59º y 63º, pero el intervalo entre el comienzo y el final de la fusión no excede de 2º. 4-Metil-2-pentanona (Metí/ /sobutil Cetona), (CH3)2CH CH2COCH 3-100, 16 [108-10-1 ]-Usar grado reactivo ACS.
Metilamina al 40 por ciento en Agua, CHsN-31,06 [74-89-5]-Líquido incoloro. VALORACIÓN: Usando una jeringa, transferir aproximadamente 0,5 ml de una muestra bien agitada a un punto bajo la superficie de 100 ml de agua. Determinar el peso de la muestra pesando la jeringa antes y después de la transferencia. Mezclar y valorar con ácido clorhídrico 0,5 N SV, determinando el punto final potenciométricamente con un electrodo de pH de plata-clorur~ de plata y un . electrodo de referencia de calomel. Realizar una determinación con un blanco y hacer las correcciones necesarias. Cada ml de ácido clorhídrico 0,5 N equivale a 15,53 mg de CHsN: se encuentra entre 39,0% y 41,0%. ÍNDICE DE REFRACCIÓN (831 ): entre 1,3680 y 1,371 o a 20º. (5)-(-)-a-Metilbencil lsocianato, C9H9N0-147, 18 [14649-03-7]-Usar un grado adecuado. 4-Metilbenzofenona, C14H120-196,25 [134-84-9]-Usar un grado adecuad~. INTERVALO DE FUSION (741 ): entre 56,5º y 57º. 3-0-Metilestrona, C19H24Ü2-284,39-Usar un grado adecuado. [NOTA-Disponible comercialmente con el número de catálogo 1883-5 en Research Plus, lnc., P.O. Box 324, Bayonne, NJ 07002, número de fax 908-754-2901, sitio web: www.researchplus.com.] 2-Metilpentano (2-Metil-pentano; 7, 7-Dimetilbutano; lsohexano), C6H14-86, l8 [107-83-5]-Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 99,0%. 4-Metilpentan-2-ol, C6H14Ü-l 02,2-Usar un grado adecuado. N-Metilpirrolidina (1 -Metilpirrolidina), C4HsNCHr-85, 15 [120-94-5]-Usar un grado adecuado. 5-Metoxi-1 H-benzimidazol-2-tiol (5-Metoxi-2-benzimidazoltiol), C8 H8 N20S-180,23 [37052-78-1 ]-Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 99,0%. 7-Metoxicumarina (Herniarina; Metí/ Umbeliferil Éter), C10H803-l 76, 17 [531-59-9]-Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 98%. Metóxido de Sodio, CH30Na-54,02 [124-41-4]-Polvo fino, blanco. Reacciona violentamente con agua con desarrollo de calor. Soluble en alcohol y en metanol. VALORACIÓN: Transferir aproximadamente 220 mg a un matraz tarado con tapón de vidrio y pesar con exactitud. Disolver la mJestra de prueba en aproximadamente 1O ml de metanol, luego agregar, lentamente y mezclando, 100 ml de agua. Agregar fenolftaleína SR y _valo:ar con ácido clorhídrico O, 1 N SV hasta un punto final incoloro: cada ml de ácido clorhídrico O, 1 N SV equivale a 5,402 mg de CH30Na. No se encuentra menos de 98,0%. Metoxietanol (Éter Monometílico de Etilenglirol; 2-Metoxieta[109-86-4]-Usar grado nol), CH 30CH2CH20H-76,09 reactivo ACS. 2-Metoxietanol (Éter Monometílico de Etilenglicol; Metoxieta[109-36-4]-Ver Metoxienol), CH30CH2CH20H-76,09 tanol.
2336 Especificaciones de Reactivos
/Reactivos
Mezcla de Alizarina Complexona y Lantano-Disolver 47,9 mg de mezcla de alizarina complexona en una mezcla de O, 1 mL de hidróxido de amonio, 1,0 mL de acetato de amonio al 20% (p/v) y unos pocos mL de agua. Filtrar la solución en un matraz volumétrico de 200 mL que contenga 8,2 g de acetato de sodio anhidro, 6,0 mL de ácido acético glacial y suficiente agua para disolver los sólidos. Lavar el filtro con un pequeño volumen de agua. Lentamente, agregar 100 mL de acetona, mientras se agita por rotación suave. Disolver 140,45 mg de nitrato de lantano hexahidrato en 2,5 mL de ácido clorhídrico 2 M, entibiando suavemente para facilitar la disolución. Transferir esta solución a un matraz volumétrico de 200 mL que contenga la solución acuosa de acetona. Diluir con agua a volumen. Mezclar bien y reajustar el volumen después de 30 minutos. Este reactivo permanece estable durante una semana. Mezcla de Celulosa para Cromatografía-Usar un grado adecuado. [NOTA-Se puede obtener comercialmente un grado adecuado como placa previamente recubierta, con indicador fluorescente en EMD Chemicals, www.emdchemicals.com.] Mezcla de Gel de Sílice con Grupos Amino Químicamente Unidos para Cromatografía-Usar un grado adecuado. Mezcla de Gel de Sílice Dimetilsilanizada para Cromatografía-Usar un grado adecuado. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado en EMD Chemicals, www.emdchemicals.com, como "Silica Gel 60 silanized RP-2 F254" .] Mezcla de Gel de Sílice Octadecilsilanizada para Cromatografía-Usar un grado adecuado. LNOTA-Se puede obtener comercialmente un grado adecuado en Whatman Chemical Separation, lnc., 9 Bridewell Place, Clifton, NJ 07014, como KC-18F.] Mezcla de Gel de Sílice Octilsilanizada para Cromatografía-Usar una mezcla de gel de sílice RP-8 para cromatografía con una sustancia fluorescente adecuada. Mezcla de Gel de Sílice para Cromatografía-Mezcla de gel de sílice con una sustancia fluorescente adecuada. [NOTA-Se euede obtener comercialmente un grado adecuado como 'Gel de Sílice GF 254" .] Mezcla de Nicotinamida Adenina Dinucleótido Fosfato-5'trifosfato-adenosina-Usar un grado adecuado. APTITUD: Cuando se utilice en la valoración de lactulosa, asegurar la obtención de una pendiente adecuada de absorbancia en función de la concentración, usando ER Lactulosa USP, siendo la absorbancia del blanco de reactivo no más de 0,020. El reactivo comercialmente disponible contiene 64 mg de nicotinamida adenina dinucleótido fosfato y 160 mg de 5'-trifosfato de adenosina por vial. La mezcla está amortiguada y estabilizada. Para usarse en la Valoración de lactulosa se diluye con agua a 100 mL Microesferas de Sílice-Usar un grado adecuado. [NOTA-Se puede obtener comercialmente un grado adecuado, en forma esférica y porosa, de diámetro controlado, como "Zorbax Sil", en Agilent, www.agilent.com.] Miristato de lsopropilo, C11H340,-270,45 [110-27-0]Usar Miristato de /sopropilo (monografía del NF). Para uso como disolvente en procedimientos de pruebas de esterilidad, el Miristato de lsopropilo cumple con la siguiente especificación adicional: PH DEL EXTRACTO Acuoso: Transferir 100 mL a un frasco de centrífuga de 250 mL, agregar 1O mL de agua bidestilada, tapar el frasco con una tapa adecuada y agitar vigorosamente durante 60 minutos. Centrifugar la mezcla a
USP 39
1800 rpm durante 20 minutos, succionar la capa superior (miristato de isopropilo) y determinar el pH de la capa acuosa residual: el pH no es menor de 6,5. El Miristato de lsopropilo que no se ajusta a la prueba de pH del Extracto Acuoso puede adecuarse para el uso en procedimientos de pruebas de esterilidad del siguiente modo: Usando una columna de vidrio de 20 mm x 20 cm, agregar alúmina activada y apisonar hasta una altura de 15 cm. Pasar 500 mL del miristato de isopropilo a través de la columna, usando una leve presión positiva para mantener un flujo constante y usar ef eluato recogido directamente en el procedimie.nto de la prueba de esterilidad. Miristato de Metilo, C1sH300r-242,40 [124-10-7]-Líquido incoloro. VALORACIÓN: Inyectar un volumen apropiado en un cromatógrafo de gases (ver Cromatografía (621 )) equipado con un detector de ionización a la llama, usando helio como gas transportador. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas: una columna capilar de 0,25 mm x 30 m, recubierta con una capa de fase G2 de 1 µm; mantener la temperatura del inyector a 300º; mantener la temperatura del detector a 300º; mantener la temperatura de la columna a 200º y programar para que aumente 1Oº por minuto hasta 300º. El área del pico de C1sH30Ü2 no es menos de 99% del área total. ÍNDICE DE REFRACCIÓN (831): entre 1,434 y 1,438 a 20º. Molibdato de Amonio, (NH4)6Mo1Ü24 · 4H20-1235,86 [12054-85-2]-Usar grado reactivo ACS. Molibdato de Sodio, Na2Mo04 · 2H20-241,95 [7631-95-0]-Usar grado reactivo ACS. Molibdeno, Mo-95,94 [7439-98-7]-Alambre. Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 99,9%. Monobromuro de Yodo, IBr-206,81 [7789-33-5]-Terrones cristalinos, agujas cristalinas o cristales de color negro, gris o púrpura azulado. VALORACIÓN: Colocar aproximadamente 100 mL de ácido acético en un vaso de precipitados de 150 ml. Disolver por separado 2 g de yoduro de potasio en un volumen mínimo de agua, agregar esta solución al ácido acético y mezclar. Transferir aproximadamente 200 mg de Monobromuro de Yodo, pesados con exactitud, al vaso de precipitados que contiene la mezcla de yoduro de potasio y ácido acético y mezclar para disolver. Valorar de inmediato con tiosulfato de sodio O, 1 N SV, determinando el punto final potenciométricamente (ver Volumetría (541)). Realizar una determinación con un blanco y hacer las correcciones necesarias. Cada mL de tiosulfato de sodio O, 1 N equivale a 20,681 mg de IBr: No se encuentra menos de 97,5%. Monoclorhidrato de 2-Cloroetilamina, C2H6CIN · HCl115,99-Polvo blanquecino. VALORACIÓN: Inyectar una muestra apropiada en un cromatógrafo de gases (ver Cromatograf1a (621 )) equipado con un detector de ionización a la llama, usando helio como gas transportador. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas: una columna capilar de 0,25 mm x 30 m, recubierta con una capa de 1 µm de una fase constituida por 14% cianopropilfenilo-86% dimetilpolisiloxano; mantener la temperatura del inyector a 150º; mantener la temperatura del detector a 300º; mantener la temperatura de la columna a 50º y prowamar para que aumente 1Oº por minuto hasta 200º. El area del pico de C2H6CIN · HCI no es menos de 99% del área total. INTERVALO DE FUSIÓN (741): entre 150º y 246º. Monoclorhidrato de o-Fenantrolina Monohidrato, C1 2HaN2 · HCI · H20-234,69 [3829-86-5]-Usar un grado adecuado.
Reactivos/ Especificaciones de Reactivos 2337
USP 39 Monocloruro de Yodo, ICl-162,36 grado reactivo ACS.
[7790-99-0)-Usar
Naftaleno, C10H8-128, 17 [91-20-3)-Placas prismáticas monoclínicas, o polvo o escamas de color blanco. Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 98%. 1,3-Naftalenodiol (Naftoresorcinol), C10H6(0H)2-160, 17 [132-86-5)-Polvo o cristales de color blanco grisáceo a tostado. Fácilmente soluble en metano!; moderadamente soluble en agua, en alc9hol y en éter. INTERVALO DE FUSION (741): entre 122º y 127º. SOLUBILIDAD EN METANOL: Disolver 500 mg en 50 ml de metano!: la solución es transparente y completa.
Monoetanolamina, (2-Aminoetano/), C2H7N0-61,08--Usar grado reactivo ACS. Monolaurato de Sorbitán de Polioxietileno (20), [9005-64-5)-Líquido viscoso de color amarillo claro a verde amarillento. Usar un grado adecuado.
2,7-Naftalenodiol (2,7-Dihidroxinaftaleno), C10Hs02-160, 17 [582-17-2)-Polvo o sólido cristalino de color blanquecino a amarillo. Se disuelve en acetona. INTERVALO DE FUSIÓN (741): entre 187° y 191º. 2-Naftil Cloroformiato (Éster 2-Naftílico del Ácido Clorofór[7693-50-7)-Usar un grado mico), CICOOC10H,-206,62 adecuado. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado de TCI America, www.tciamerica.com.] 1-Naftilamina, C10H9N-143, 19 grado adecuado.
[134-32-7]-Usar un
1-Naftol (Affanaftol), C10H70H-144, 17 [90-15-3)-Polvo cristalino o cristales incoloros o levemente rosáceos. Monóxido de Plomo (Litargirio), Pb0-223,20 [1317-36-8)-Polvo pesado de color amarillento o amarillo rojizo. Insoluble en agua y en alcohol; soluble en ácido acético, en ácido nítrico diluido y en soluciones tibias de los hidróxidos alcalinos fijos. VALORACIÓN: Pesar con exactitud aproximadamente 300 mg, recién incinerados en una mufla a 600 ± 50º y disolver entibiando con 1O ml de agua y 1 ml de ácido acético glacial. Diluir con 75 ml de agua, calentar a ebullición, agregar 50,0 ml de dicromato de potasio O, 1 N SV y mantener a ebullición durante 2 a 3 minutos. Enfriar, transferir a un matraz volumétrico de 200 ml con ayuda de agua, diluir a volumen con agua, mezclar y dejar que sedimente. Retirar 100,0 ml del líquido transparente y transferirlo a un matraz con tapón de vidrio. Agregar 1O ml de ácido sulfúrico diluido y 1 g de yoduro de potasio, tapar, mezclar suaverryente y dejar en re¡;ioso durante 1O minutos. A continuacion valorar el yodo liberado, que representa el exceso de dicromato, con tiosulfato de sodio O, 1 N SV, agregando 3 ml de almidón SR cerca del punto final: cada ml de dicromato de potasio O, 1 N equivale a 7,440 mg de PbO. No se ~ncuentr~ menos ~e 98%. SUSTANCIAS INSOLUBLES EN ACIDO ACHICO: Disolver 2 g en 30 ml de ácido acético glacial diluido (1 en 2), calentar a ebullición suave durante 5 minutos, filtrar, lavar el residuo con ácido acético diluido y secar a 105º durante 2 horas: el residuo no pesa más de 1O mg (0,5%). , SUSTANCIAS No PRECIPITADAS CON SULFURO DE HIDROGENO: Precipitar completamente el plomo del fi!trado obtenido en la prueba de Sustancía_s lf]solubles en Ací~o Acét~co haciendo pasar sulfuro de h1drogeno por el mismo, filtrar y lavar el precipitado con 20 ml de agua. A una mitad de la mezcla del filtrado y los lavados agregar 5 gotas de ácido sulfúrico, evaporar a sequedad e inciner~r a 800 ± 25º durante 15 minutos: el residuo no pesa mas de 5 mg (0,5%). SUSTANCIAS VOLÁTILES: Pesar con exactitud aproximadamente 5 g y calentar intensamente en un crisol de porcelana cubierto: no pierde más de 2,0% de su peso. Morfolina (Tetrahidro- 1,4-oxazina), C4H9N0-87, 12 [110-91-8)-Usar grado reactivo ACS. Morina (Marina Hidrato; 2',3,4',5,1-Pentahidroxiflavona Mo[480-16-0)-Usar un nohidrato), C1sH10Ü7 · H20-320,25 grado adecuado.
2-Naftol (Betanaftol), C10H70H-144, 17 [135-19-3)Polvo cristalino o laminillas de color blanco. Cambia de coloración con la exposición a la luz. Muy poco soluble en agua; soluble en alcohol, en éter, en cloroformo y en soluciones de hidróxidos alcalinos. INTERVALO DE FUSIÓN (741): entre 121º y 123º. SOLUBILIDAD EN ALCOHOL: Un g se disuelve completamente en 1O ml de alcohol y se obtiene una solución incolora o prácticamente incolora. RESIDUO DE INCINERACIÓN (Prueba para reactivos): no más de 0,05%. ACIDEZ: Agitar ocasionalmente 1 g con 50 ml de agua durante 15 minutos y filtrar: el filtrado es neutro al tornasol. 1-NAFTOL: Calentar a ebullición 100 mg con 1O ml de agua hasta disolver, enfriar y filtrar. Agregar al filtrado 0,3 ml de hidróxido de sodio 1 N y 0,3 ml de yodo O, l N: no se produce un color violeta. SUSTANCIAS INSOLUBLES EN AMONÍACO (naftaleno, etc.): Agitar 500 mg con 30 ml de amoníaco SR: el 2-naftol se disuelve completamente y la solución no es más oscura que amarillo pálido. Naftol Disulfonato de Potasio (2-Naftol-6,8-disulfonato de potasio), C10H6K207S2-380,48 [842-18-2)-Usar un grado adecuado. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado como "sal dipotásica del ácido 2-naftil-6,8-disulfónico" en Pfaltz and Bauer, lnc., www.pfaltzandbauer.com.] Naftol Disulfonato de Sodio (2-Naftol-3,6-disulfonato de sodio), C10H6Na207S2-348,26-Usar un grado adecuado. p-Naftolbenceína, C27H1s02-374,43 [145-50-6)-Polvo marrón rojizo. Usar un grado adecuado. f3-Naftoquinona-4-Sulfonato de sodio, C10HsNaOsS260,20-Polvo cristalino o cristales de color amarillo a amarillo anaranjado. Soluble en aproximadamente 1O partes de agua; insoluble en alcohol. PÉRDIDA POR SECADO (731 ): Secar al vacío aproximadamente a 50º: no pierde más de 2,0% de su peso. RESIDUO DE INCINERACIÓN (Prueba para reactivos): Incinerar 1 g de la muestra seca con 3 ml de ácido sulfúrico: el
2338 Especificaciones de Reactivos /
Reactivos
residuo pesa entre 265 mg y 280 mg (entre 26,5% y 28,0%). Naftoresorcinol (1, 3-Dihidroresorcinof), C10H 802-160, 17 [1 32-86-5]-Usar un grado adecuado. ,6-Nicotinamida Adenina Dinucleótido, C21 H21N1Ü14P2663,4 [53-84-9]-Polvo blanco muy higroscópico. Fácilmente soluble en agua. Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 98%. Ninhidrina, (9H4Ü3·H20-178,14 grado reactivo ACS. Níquel, Ni-58,6934 cuado.
[485-47-2]-Usar
[7440-02-0]-Usar un grado ade-
Nitrato Cérico Amónico, Ce(N03)4 · 2NH4NÜ3-548,22Usar grado reactivo ACS. Nitrato Cúprico [3251-23-8]-Usar Nitrato Cúprico Hidratado de grado reactivo ACS.
Cambio en la redacción: Nitrato Cúprico Hidrato, Cu(N03)2 · 2,5H20-232,59 " [19004-19-4]"usm; Cu(N03)2 · 3H20-241,60 [1 0031-43-3]-Usar grado reactivo ACS. [NOTA-Este reactivo está disponible con un contenido de 2,5 ó 3 moléculas de agua de hidratación.] Nitrato de Amonio, NH4NÜ3-80,04 grado reactivo ACS. Nitrato de Bario, Ba(N03)2-261,34 grado reactivo ACS.
[6484-52-2]-Usar [l 0022-31-8]-Usar
Nitrato de Bismuto Pentahidrato, Bi(N03)3 · 5H20485,07 [10035-06-0]-Usar grado reactivo ACS. Nitrato de Cadmio, Cd(N03)i · 4H20-308,48 [l 0325-94-7]-Cristales incoloros higroscópicos. Muy soluble en agua; soluble en alcohol. MATERIA INSOLUBLE (Prueba para reactivos): no más de 1 mg, a partir de 20 g (0,005%). CLORUROS (CL) (Prueba para reactivos): Un g no presenta más de 0,01 mg de CI (0,001 %). SULFATOS (Prueba para reactivos, Método //): Evaporar una mezcla de 12 g de muestra y 25 ml de ácido clorhídrico en un baño de vapor hasta sequedad. Agregar otros 15 ml de ácido clorhídrico y nuevamente evaporar hasta sequedad. Disolver el residuo en 100 ml de agua, filtrar y agregar 1 ml de ácido clorhídrico: el residuo no pesa más de 1,0 mg más que el residuo obtenido en la prueba con un blanco (0,003%). COBRE (CU): Disolver 0,5 g en 1O ml de agua, agregar 1O m L de Solución de Citrato de Amonio (ver Plomo (251)) y ajustar la reacción a un pH de aproximadamente 9 agregando hidróxido de amonio 1 N (aproximadamente 30 ml). Agregar 1 ml de solución de dietilditiocarbamato de sodio (1 en 1000) y mezclar. Agregar 5 ml de alcohol amílico, agitar durante aproximadamente 1 minuto y permitir que las capas se separen: si se produce color amarillo en la capa de alcohol amílico, aquel no es más oscuro que el de un blanco al que se le ha agregado 0,01 mg de Cu (0,002%). HIERRO (FE): Disolver 1 g en 15 ml de agua, agregar 2 ml de ácido clorhídrico y calentar hasta ebullición durante 2 minutos. Enfriar y agregar aproximadamente 30 mg de persulfato de amonio y 15 ml de una solución de tiocianato de potasio en alcohol butílico normal (preparado por disolución de 1O g de tiocianato de potasio en 1O ml de
USP 39
agua, entibiando la solución aproximadamente a 30º, diluyendo con alcohol butílico normal hasta 100 ml y agitando hasta que se torne transparente). Agitar vigorosamente durante 30 segundos y permitir que las capas se separen: si se produce color rojo en la capa alcohólica transparente, aquel no es más oscuro que el de un blanco al que se le ha agregado 0,01 mg de Fe (0,001 %). PLOMO (PB): Disolver 1,0 g en 1O ml de agua, agregar 0,2 ml de ácido acético glacial y filtrar si fuera necesario. A una porción de 7 ml de agua, agregar 0,2 ml de ácido acético glacial y 3 ml de Solución de Plomo Estándar (ver Plomo (251 )) y mezclar para obtener un blanco. Agregar luego a cada solución 1,0 ml de solución de cromato de potasio (1 en 1O) y mezclar: después de 5 minutos, la solución de prueba no es más turbia que el blanco (0,003%). SUSTANCIAS No PRECIPITADAS POR SULFURO DE HIDRÓGENO: Disolver 2 g en 145 ml de agua, agregar 5 ml de ácido sulfúrico (1 en 1O), calentar hasta ebullición y pasar una corriente rápida de sulfuro de hidrógeno a través de la solución mientras se enfría. Filtrar y, a 75 ml del filtrado transparente, agregar 0,25 ml de ácido sulfúrico, luego evaporar hasta sequedad e incinerar suavemente: el residuo no pesa más de 1 mg (O, l %). Nitrato de Calcio, Ca(N03)2 · 4H20-236, 15 [13780-06-8]-Usar grado reactivo ACS. Nitrato de Cobalto, Co(N03)2 · 6H20-291,03 [l 0026-22-9]-Usar grado reactivo ACS. Nitrato de Lantano Hexahidrato, La(N03)3 · 6H20-433,01 [l 0277-43-7]-Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 99,9%. Nitrato de Litio, LiN03-68,95 [7790-69-4]-Cristales incoloros. Usar un grado adecuado que declare contener no menos de 97,0%. Nitrato de Magnesio, Mg(N03)2 · 6H20-256,41 [l 3446-18-9]-Usar grado reactivo ACS. Nitrato de Plata, AgN03-169,87 grado reactivo ACS.
[7761-88-8]-Usar
Nitrato de Plomo, Pb(N03)2-331,21 Usar grado reactivo ACS. Nitrato de Potasio, KN03-101, 10 grado reactivo ACS. Nitrato de Sodio, NaN03-84,99 grado reactivo ACS.
[l 0099-74-8][7757-79-1 ]-Usar
[7631-99-4]-Usar
Nitrato de Tetrametilamonio, (CH3)4NN03-136, 15 [1941-24-8]-Cristales blancos. Fácilmente soluble en agua.
camblf> en ·111 redactlint Nitrato de forio~ Th(N03)4 · 4H20-552, 12 [1547(}-07.-0l&usm-Usar grado reactivo ACS. Nitrato de Zirconilo, ZrO(N03)2-231,23 Usar un grado adecuado.
[13826-66-9]-
Nitrato Férrico, Fe(N03)3 · 9H20-404,00 Usar grado reactivo ACS.
[10421-48-4]-
Nitrato Mercúrico, Hg(N03)2 · xH20-342,62 [10045-94-0]-Usar grado reactivo ACS. Este reactivo está disponible como monohidrato o como dihidrato.
Reactivos / Especificaciones de Reactivos 2339
USP 39
Nitrato Mercurioso Dihidrato (Nitrato de Mercurio (/) Dihidrato), Hg2(N03)2 · 2H20-561,22-Usar grado reactivo ACS. Nitrito de Butilo Normal-Ver Nitrito de n-Butilo. Nitrito de Potasio, KN02-85, 10 grado reactivo ACS. Nitrito de Sodio, NaN02-69,00 grado reactivo ACS.
(7758-09-0]-Usar [7632-00-0]-Usar
5-Nitro-1, 10-fenantrolina, C12H1N3Ü2-225,20 [4199-88-6]-Polv~ blanco. Soluble en agua. INTERVALO DE FUSION (741 ): entre 198º y 200º. APTITUD COMO INDICADOR REDOX: Disolver 25 mg en un volumen mínimo de ácido sulfúrico diluido, agregar 1O mg de sulfato ferroso y diluir con agua a 100 mL: la solución es color rojo intenso y presenta un máximo de absorción a 51 O nm. A 1,0 mL de la solución, agregar 1,0 mL de sulfato cérico 0,01 M: desaparece el color rojo. 4'-Nitroacetofenona (p'-Nitroacetofenona), CsH1N03165, 15 Jl 00-19-6]-Cristales amarillos. VALORACION: Inyectar una solución etérea apropiada de la muestra (aproximadamente 0,5 µL) en un cromatógrafo de gases adecuado (ver Cromatografía (621 )) equipado con un detector de conductividad térmica y usar helio como gas transportador. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas: usar una columna de acero inoxidable de 4 mm x 1,8 m con fase Gl al 10% sobre soporte SlA; mantener el inyector y el detector a 200º y 300º, respectivamente; mantener la temperatura de la columna a 170º y programarla para que aumente 3º por minuto hasta 220º. El área del pico de 4'-nitroacetofenona no es menos de 97% del área total. INTERVALO DE FUSIÓN (741): entre 78º y 80º. o-Nitroanilina, N02C5H4NH2-138, 12 (88-74-4]-Cristales de color amarillo anaranjado. Poco soluble en agua fría; soluble en agua caliente; fácilmente soluble en alcohol y en cloroformo. Forma sales solubles en agua con ácidos minerales. INTERVALO DE FUSIÓN (741): entre 71º y 72º. p-Nitroanilina, N02C5H4NH2-138, 12 (100-01-6]-Polvo cristalino amarillo brillante. Insoluble en agua; soluble en alcohol y en éter. INTERVALO DE FUSIÓN (741 ): entre 146º y 148º. SOLUBILIDAD: Sendas porciones de 1 g disueltas en 30 mL de alcohol y en 40 mL de éter producen soluciones transparentes o prácticamente transparentes. RESIDUO DE INCINERACIÓN (Prueba para reactivos): no más de 0,2%. Nitrobenceno, (5HsN02-123, 11 reactivo ACS.
[98-95-3]-Usar grado
4-(p-Nitrobencil)piridina, Ci 2H10N202-214,22 (1083-48-3]-Cristales amarillos. Soluble en acetona. Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 98%. Nitroferricianuro de Sodio (Nitroprusiato de Sodio), Na2Fe (NO)(CN) 5 • 2H20-297,95 [13755-38-9]-Usar grado reactivo ACS. Nitrometano, (H3N02-61,04 reactivo ACS.
[75-52-5]-Usar grado
1-Nitroso-2-naftol, C10H1N02-173, 17 [131-91-9]Polvo de color marrón a marrón amarillento. Insoluble en agua; soluble en alcohol, en benceno, en éter, en tetracloruro de carbono y en ácido acético.
VALORACIÓN: Transferir aproximadamente 250 mg, previamente secados sobre gel de sílice hasta peso constante y pesados con exactitud, a un matraz con tapón de vidrio y disolver en 1O mL de solución de hidróxido de sodio (1 en 1O). Enfriar la solución en un baño de hielo, agregar ácido sulfúrico diluido (1 en 6) hasta que se forme un precipitado ligero y permanente y la solución sea ligeramente ácida, luego agregar 3 g de yoduro de potasio, agitar para disolver, agregar 20 mL de acido sulfúrico diluido (1 en 6), tapar inmediatamente el matraz y dejar en reposo en la oscuridad durante 2 horas. Valorar el yodo liberado con tiosulfato de sodio O, 1 N SV, agregando 3 mL de almidón SR cerca del punto final. Realizar una determinación completa con un blanco y hacer las correcciones necesarias. Cada mL de tiosulfato de sodio O, 1 N equivale a 8,66 mg de C10H1N02: no se encuentra menos de 95,0%. INTERVALO DE FUSIÓN (741 ): entre 109º y 111 º. RESIDUO DE INCINERACIÓN (Prueba para reactivos): no más de 0,2%. Nonadecano, C19H40-268,52 [ 629-92-5]-Sólido blanco. VALORACIÓN: Inyectar una muestra apropiada en un cromatógrafo de gases adecuado (ver Cromatografía (621 )) equipado con un detector de conductividad térmica, usando helio como gas transportador. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas: una columna de acero inoxidable de 3 mm x 1,8 m con fase G2 al 5% sobre soporte Sl AB; mantener la temperatura del inyector a 330º, mantener la temperatura del detector a 300º; mantener la temperatura del horno inicialmente a 190º y dejar que aumente gradualmente hasta 250º. El área del pico de nonadecano no es menos de 99% del área total. INTERVALO DE FUSIÓN (741): entre 31,5º y 33,5º. n-Nonilamina (7-Aminononano), (9H21 N-143,27 [112-20-9]-Usar un grado adecuado. Nonil Fenil Polietilenglicol Éter-Ver (p-terc-Octilfenox1)nonaetoxietanol. Nonilfenoxipoli ( etilenoxi)etanol-Líquido transparente, viscoso, de color amarillo pálido. Puede presentar una ligera solidificación al enfriarse; recupera su condición original al entibiarse bajo agitación. Densidad: aproximadamente 1,06. Soluble en alcohol, en xileno y en agua. Adecuado para usarse en cromatografía gas-líquido. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado como "lgepal CO 71 O", en General Aniline and Film Corp., 140 West 51 st St., New York, NY 10020.] Nonoxinol-9 (lgepal C0-630, Semicid, Staycept, Tergitol TP-9, Sterox), (C2H4Ü)nC1sH24Ü- [26027-38-3]-Usar un grado adecuado. [593-45-3]n-Octadecano, CH3(CH2)16CH3-254,49 Usar un estándar para cromatografía de gases con un contenido de no menos de 99,5%. Octadecil Silano [18623-11-5]-Este reactivo se prepara in situ por medio de la reacción del soporte de la columna con un agente sililante adecuado como octadecil triclorosilano. Octanofenona, (i4H 20 0-204,31 (1674-37-9]-Líquido incoloro. VALORACIÓN Fase Móvil: Preparar una mezcla filtrada y desgasificada de acetonitrilo y agua (7:3). Procedimiento: Inyectar aproximadamente 20 µ.L en un cromatógrafo de líquidos adecuado (ver Cromatografía (621 )), equipado con un detector a 254 nm y una columna de 4,6 mm x 15,0 cm rellena con material L1. La velocidad de flujo es de aproximadamente 2 mL por mi-
2340 Especificaciones de Reactivos
USP 39
/Reactivos
nuto. El área del pico de C14H200 no es menos de 99% del área total. ÍNDICE DE REFRACCIÓN (831): 1,5043 a 20º. 1-0ctanol (Alcohol CB; Alcohol Caprílico; Alcohol Octílico), C8H180-130,23 [111-87-5]-Usar grado reactivo ACS. 1-0ctanosulfonato de Sodio-Ver Sal Sódica del Ácido Octanosulfónico. (p-terc-Octilfenoxi)nonaetoxietanol, C34H62011-646,85Usar un grado adecuado. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado de prove~ dores de reactivos, disponible comercialmente como "Terg1tol Nonionic NPX" y como "Triton Nl 01 ".] (p-terc-Octilfenoxi)polietoxietanol-Usar un grado adecuado. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado de los proveedores de reactivos, disponible comercialmente como "Triton 100".] Octoxinol 9-Ver Agente Humectante No lónico. Oleato de Metilo, C19H360r-296,49 [112-62-9]-Líquido incoloro. VALORACIÓN: Inyectar una muestra apropiada en un cromatógrafo de gases adecuado_ (v~r cr:~matografía (621 )) equipado con un detector de 1ornza_cio!1 a la llama! ~sando helio como gas transportador. Las siguientes cond1c1ones se consideran adecuadas: usar una columna capilar recubierta con una capa de 1 µm de fase G2; mantener la temperatura del inyector a 300º; mantener la temperatura del detector a 300º; mantener la temperatura de la columna a 230º y programarla para que aumente 1Oº por minuto hasta 280º. El área del pico de C19H3602 no es menos de 99% del área total. ÍNDICE DE REFRACCIÓN (831 ): 1,452 a 20º. Oligo desoxitimidina-Longitud polimérica: 18. Usar un grado adecuado. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado de BD Biosciences, www.bdbiosciences.com.]
Materiales de Estándar de Referencia (Office of Standard Reference Materials) del Instituto de Normas y Tecnología de los EE.UU. (NIST, por sus siglas en inglés), www.nist.gov, como muestra de estándar Nº 40.] 3,3'-Oxidipropionitrilo, O(CH2CH2CN)2-124, 14 [1656-48-0]-Líquido transparente incoloro a ligeramente amarillo. ÍNDICE DE REFRACCIÓN: aproximadamente 1,446 a 20º. INTERVALO DE EBULLICIÓN: entre 174º y 176º a 1o mm de mercurio. Óxido de Aluminio, Lavado con Ácido (Alúmina preparada especialmente para usar en análisis cromatográficos),
[1344-28-1 ]-Polvo o gránulos finos de color blanco o prácticamente blanco. Muy higroscópico. Almacenar en envases impermeables. PH DE LA SUSPENSIÓN ESPESA: El pH de una suspensión espesa bien mezclada de 5 .$! en 150 mL de agua exenta de amoníaco y exenta de dioxido de carbono, después de reposar 1O minutos, está entre 3,5 y 4,5. PERDIDA POR INCINERACIÓN: Pesar con exactitud aproximadamente 1 g e incinerar, preferiblemente en una mufla, entre 800º y 825º hasta peso constante: no pierde más de 5,0% de su peso. SÍLICE: Fundir 500 mg con 1O g de bisulfato de potasio durante 1 hora en un crisol de platino, enfriar y disolver en agua caliente: no queda más que una pequeña cantidad de residuo insoluble. APTITUD PARA ADSORCIÓN (ROMATOGRÁFICA: Disolver 50 mg de o-nitroanilina en benceno para completar 50,0 ml. Diluir 1O mL de la solución resultante con benceno hasta 100,0 mL y mezclar (Solución A). Rápidamente, pesar aproximadamente 2 (±0,005) g de muestra en un frasco para pesada con tapón de vidrio y transferir rápidamente a un tubo de ensayo seco con tapón de vidrio. Agregar 20,0. mL de Sol11ción A, tap~r, agitar vigorosamente durante 3 minutos y dejar que sedimente. Pipetear 1O mL del sp~renadante transRar~nte y transferir a un matraz volumetrico de 100 mL, d1lu1r a volumen con benceno y mezclar (Solución B). Determinar las absorbancias de las Soluciones A y B a 395 nm con un espectrofotómetro adecuado, usando benceno como blanco. Calcular, en mg, la cantidad adsorbida por g de muestra de prueba, por la fórmula: [2(1 - As/~)]/W
Orcinol (5-Metilresorcinol), C7Hs02 · Hi0-142, 15 [6153-39-5]-Cristales de color blanco a tostado claro. VALORACIÓN: Transferir aproximadamente 60 mg, pesados con exactitud, a un matraz volumétrico de 100 mL, disolver en metanol, diluir a volumen con metanol y mezclar. Transferir 5,0 mL de esta solución a un matraz volumétrico de 50 mL diluir a volumen con metanol y mezclar. Empleando ~n espectrofotómetro adecuado, celdas de 1 cm y metanol como blanco, registrar la absorbancia de la solución a la longitud de onda de n:iáxima absorbanc~a, aproximadamente a 273 nm. A partir . e la absorbanc1a observada calcular la absortividad ver : la a sort1vidad no es menor e 13,2, correspon iente a no menos de 98% de C7Hs02 · HiO. INTERVALO DE FUSIÓN (741): entre 58º y 61º. Ortofenantrolina-Ver 7, 70-Fenantrolina. Oxalato de Amonio, (NH4)2C204·Hi0-142,11 [6009-70-7]-Usar grado reactivo ACS. Oxalato de Sodio, Na2C204-134,00 [62-76-0]-Usar grado reactivo ACS. [NOTA-El Oxalato de Sodio con una calidad adecuada se puede obtener como un estándar primario en la Oficina de
en donde AA y As son las absorbancias de las ~o~uciones A y B, respectivamente, y W es el peso, en g, del ox1d.o de . aluminio. Se adsorbe no menos de 0,3 mg de o-rntroarnlina por cada g de óxido de aluminio. Óxido de Deuterio, Di0-20,032 [7789-20-0]-Usar un grado adecuado con una pureza isotópica mínima de 99,8% atómico de deuterio. Óxido de Escandio, Sc203-l 37,91 fino blanco.
[12060-01-1 ]-Polvo
Óxido de Etileno en Cloruro de Metileno (50 mg/ml)Usar un grado adecuado. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado en Sigma Aldrich Corporation, www.sigma-aldrich.com.] Óxido de Lantano, La203-325,82 [1312-81-8]-Polvo amorfo, casi blanco y prácticamente insoluble en agua. Se disuelve en soluciones diluidas de ácidos minerales y absorbe el dióxido de carbono atmosférico. Usar grado para Espectroscopía de Absorción Atómica. Óxido de Lauril Dimetil Amina (N-Óxido de N,N-Dimetildodecilamina), C14H31NO [1643-20-5]-229,41-Usar un grado adecuado.
Reactivos/ Especificaciones de Reactivos 2341
USP 39 [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado de Fluka, número de catálogo 40234, www.sigma-aldrich.com.] Óxido de Magnesio, Mg0-40,30 grado reactivo ACS.
fenolftaleína SR y valorar con ácido clorhídrico 0,02 N SV hasta que desaparezca cualquier color rosado: no se requiere más de 0,20 mL (0,016% como NaOH).
[1309-48-4]-Usar
Óxido de Magnesio para Cromatografía-Usar un grado adecuado. Óxido de Mesitilo, C5H100-98,14 [141-79-7]-Líquido incoloro. VALORACIÓN: Inyectar una muestra apropiada en un cromatógrafo de gases adecuado (ver Cromatografía (621)) equipado con un detector de ionización a la llama, usando helio como gas transportador. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas: una columna capilar de 0,25 mm x 30 m, recubierta con una capa de fase G2 de 1 µm; mantener la temperatura del inyector a 150º; mantener la temperatura del detector a 300º; mantener la temperatura de la columna a 50º y programar para que aumente 1Oº por minuto hasta 200º. El área del pico de C5H100 no es menos de 98% del área total. ÍNDICE DE REFRACCIÓN (831): entre 1,443 y 1,447 a 20º. Óxido de Plata, Ag20-231,74 [20667-12-3]-Polvo pesado, de color negro amarronado. Se descompone lentamente por exposición a la luz. Absorbe dióxido de carbono cuando está húmedo. Prácticamente insoluble en agua; fácilmente soluble en ácido nítrico diluido y en amoníaco; insoluble en alcohol. Almacenar en envases bien cerrados; no exponer a humos de amoníaco ni a sustancias fácilmente oxidables. VALORACIÓN: Disolver aproximadamente 500 mg, previamente secados a 120º durante 3 horas y pesados con exactitud, en una mezcla de 20 mL de agua y 5 mL de ácido nítrico. Diluir con 100 mL de agua, agregar 2 mL de sulfato férrico amónico SR y valorar con tiocianato de amonio O, 1 N SV hasta un color marrón rojizo permanente. Cada mL de tiocianato de amonio 0, 1 N equivale a 11,59 mg de Ag20: no se encuentra menos de 99,7% de Ag20. PERDIDA POR SECADO (731 ): Secar a 120º durante 3 horas: no pierde más de 0,25% de su peso. NITRATO: A 500 mg agregar 30 mg de carbonato de sodio y 2 mL de ácido fenoldisulfónico SR, mezclar y calentar en un baño de vapor durante 15 minutos. Enfriar, agregar con cuidado 20 mL de agua, alcalinizar con amoníaco SR y diluir con agua hasta 30 mL: si se produce color en la solución de prueba, aquel no es más oscuro que el producido en una solución control que contenga 0,01 mg de N03 (0,002%). SUSTANCIAS INSOLUBLES EN ÁCIDO NÍTRICO: Disolver 5 g en una mezcla de 5 mL de ácido nítrico y 1O mL de agua, diluir con agua aproximadamente a 65 mL y filtrar todo residuo no disuelto en un crisol para filtración tarado (retener ~I filtrado para la prueba de Sustancias No Precipitadas por Acido Clorhídrico). Lavar el crisol con agua hasta que el último lavado no muestre opalescencia con 1 gota de ácido clorhídrico y secar a 105º hasta peso constante: el residuo no pesa más de 1 mg (0,,02%). , SUSTANCIAS No PRECIPITADAS POR ACIDO CLORHIDRICO: Diluir ~I filtrado obtenido en la prueba de Sustancias Insolubles en Acido Nítrico con agua hasta 250 mL, calentar hasta ebullición y agregar, gota a gota, suficiente ácido clorhídrico para precipitar toda la plata (aproximadamente 5 mL), evitando cualquier exceso grande. Enfriar, diluir con agua a 300 mL y dejar en reposo durante la noche. Filtrar, evaporar 200 mL del filtrado hasta sequedad en una cápsula de porcelana tarada adecuada e incinerar: el residuo no pesa más de 1,7 mg (0,05%). ALCALINIDAD: Calentar 2 g con 40 mL de agua en un baño de vapor durante 15 minutos, enfriar y diluir con agua hasta 50 ml. Filtrar desechando los primeros 1O mL del filtrado. A 25 mL del filtrado subsiguiente agregar 2 gotas de
Óxido de Trioctilfosfina, C24Hs1 P0-386,63 [78-50-2]Polvo cristalino blanco. Insoluble en agua; soluble en disolventes orgánicos. INTERVALO DE FUSIÓN (741): entre 54° y 56º. Óxido Mercúrico Amarillo, Hg0-216,59 [21908-53-2]-Usar grado reactivo ACS. Palmitato de Metilo, C11H3402-270,45 [112-39-0]-Sólido blanco. VALORACIÓN: Inyectar un volumen apropiado en un cromatógrafo de gases (ver Cromatografía (621 )) equipado con un detector de ionización a la llama, usando helio como gas transportador. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas: una columna capilar de 0,25 mm x 30 m, recubierta con una capa de fase G2 de 1 µm; mantener la temperatura del inyector a 300º; mantener la temperatura del detector a 300º; mantener la temperatura de la columna a 200º y programar para que aumente 1Oº por minuto hasta 300º. El área del pico de C11H 3402 no es menos de 96,5% del área total. Palmitato de Retinilo, C35H5002-524,9-Líquido amarillo. VALORACIÓN Fase móvil: Preparar una mezcla de acetonitrilo y tetrahidrofurano (55:15). Procedimiento: Inyectar aproximadamente 1O µL en un cromatógrafo de líquidos adecuado (ver Cromatografía (621 )), equipado con un detector a 320 nm y una columna de 4,6 mm x 15 cm rellena con material L1. La velocidad de flu¡·o es de aproximadamente 1 mL por minuto. El área de pico de C36H6002 no es menos de 93% del área total. Palmitoleato d~ Metilo (cis-9-Hexadecenoato de Metilo; Éster Metílico del Acido Palmitoleico), C11H3202-268,43 [1120-25-8]-Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 99%. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado con el número de catálogo P9667 ó 76176 en www. sigma-aldrich.com.] Pancreatina [8049-47-6]-Usar un grado de pancreatina que cumpla con los requisitos de la USP para actividad de amilasa, lipasa y proteasa especificados para la sustancia oficial. Pantotenato de Calcio Dextrógiro-Usar Pantotenato de Calcio (monografía de la USP).
Papel Absorbente Inodoro-Ver Papel de Filtro Cuantitativo. Papel de Acetato de Plomo: Sumergir papel de filtro de aproximadamente 80 g por metro cuadrado en una mezcla de ácido acético diluido y acetato de plomo SR (1 :10). Retirar, secar y cortar en tiras de 15 mm x 40 mm. Papel de Filtro Cuantitativo-Para el Papel de Prueba de Bromuro Mercúrico usado para detectar arsénico, utilizar papel de filtro Swedish O u otras marcas de superficie, calidad y cenizas similares. Paraformaldehído, (CH20)n [30525-89-4]-Polvo fino blanco. VALORACIÓN: Transferir aproximadamente 1 g, pesado con exactitud, a un matraz Erlenmeyer de 250 mL que contenga 50,0 mL de hidróxido de sodio 1 N SV y mezclar agitando por rotación suave. De inmediato, y lentamente, agregar 50 mL de peróxido de hidrógeno SR, previamente neutralizado frente al azul de bromotimol, a través de un
2342 Especificaciones de Reactivos
/Reactivos
USP 39
embudo pequeño colocado en el cuello del matraz. Una vez moderada la reacción, enjuagar con agua el embudo y la pared interna del matraz, dejar la solución en reposo durante 30 minutos, agregar azul de bromotimol SR y valorar el exceso de álcali con ácido sulfúrico 1 N SV. Cada mL de hidróxido de sodio 1 N equivale a 30,03 mg de HCHO: no se encuentra menos de 95%. RESIDUO DE INCINERACIÓN: no más de O, 1%. SOLUBILIDAD EN AMONÍACO: Disolver 5 g en 50 mL de amoníaco SR: se produce una solución prácticamente transparente e incolora. REACCIÓN: Agitar 1 g con 20 mL de agua durante aproximadamente 1 minuto y filtrar: el filtrado es neutro al tornasol.
Cambio en la redacción: Pectato Liasa [9015-75-2]-Una enzima obtenida de Aspergillus sp. Líquido viscoso de color marrón claro. El peso específico es de aproximadamente 1,5. Es fácilmente soluble en agua. Se suministra en una concentración de aproximadamente 14 unidades por mL a un pH de 8,0 en solución amortiguadora de Tris-HCI [Tris(hidroximetil)aminometano 50 mM que contiene CaC'2 1 mM de pH 8,0] en una solución de glicerol al 50% y azida de sodio al 0,02%. Una unidad se define como la actividad enzimática que produce 1 µmol de producto no saturado por minuto. ACTIVIDAD Solución de pectina: Transferir una cantidad de Pectina, equivalente a 0,05 g con respecto a la sustancia seca, a un matraz volumétrico de 100 ml. [NOTA-La Pectina tiene un peso molecular de 103 000 Da; su grado de esterificación (porcentaje de grupos del ácido galacturónico metotilados) es 12.J Humedecer con O, 1 mL de 2-propanol. Agregar 50 mL de agua al matraz y mezclar la solución con un agitador magnético. Usar hidróxido de sodio 0,5 N para ajustar la solución a un pH de 12. Detener el agitador y dejar la solución en reposo sin mover a temperatura ambiente durante 15 minutos. Ajustar la solucion con ácido clorhídrico 0,5 N a un pH de 8,0. Diluir con agua a volumen. Solución amortiguadora de Tris: Transferir 6,055 g de Tris(hidroximetil)aminometano y O, 147 g de cloruro de calcio a un matraz volumétrico de 1000 mL que contiene 950 mL de agua y mezclar. Ajustar la solución con ácido clorhídrico 1 N a un pH de 8,0. Diluir con agua a volumen. Pectato liasa diluida: Transferir 0,5 mL de Pectato Liasa a un matraz volumétrico de 50 mL, diluir con Solución amortiguadora de Tris a volumen y mezclar. Procedimiento: Agregar las soluciones indicadas en la tabla siguiente a celdas de cuarzo. Solución Amortiguadora de Tris Etiaueta Blanco de enzimas Blanco de arueba Solución de orueba
(ml)
Solución de Pectina (ml)
Pectato Liasa Diluida (ml)
05
1o
o
1o
05
o
05
15
05
05
05
1
o
Agua (ml)
Realizar la prueba con las soluciones así obtenidas, usando un espectrofotómetro UV-Vis adecuado (ver •Espectroscopía Ultravíoleta-Visible (857)e (Af 01-may-2016)) y usando agua como blanco. Mezclar las soluciones bien al tiempo O e inmediatamente medir las absorbancias a 235 nm. Registrar el valor para el Blanco de enzimas, Ao-BE; para el Blanco de prueba, Ao-Br; y para la Solución de
prueba, Ao-sr. Después de incubar a temperatura am-
biente durante 30 minutos, determinar la absorbancia nuevamente a 235 nm para el Blanco de enzimas, A3o-BE; para el Blanco de prueba, A3o-Br; y para la Solución de prueba, A3o-sr. Una unidad se define como la actividad enzimática que produce 1 µmol de producto no saturado a partir de pectina por minuto. Calcular la actividad de Pectato Liasa, en unidades por mL, usando la fórmula siguiente: 50(10 3)[(A3o-sr - A3o-BE- A3o-Br) - (Ao-sr - Ao-BE- Ao-Br)]/ 30EmL en donde 50 es el volumen, en mL, de Pectato liasa diluida; 10 3 es el factor de conversión de unidades; 30 es el tiempo, en minutos, de la reacción; Em es el coeficiente de extinción molar, en M- 1 cm-1, del producto de reacción (4600 M- 1 cm- 1); y Les la longitud de paso, en cm, de la celda de reacción (1 cm). Alternativamente, estas soluciones, después de mezclarse en las celdas, pueden medirse inmediatamente a 235 nm en forma continua en un espectrofotómetro UV-Vis con registrador configurado para valoraciones cinéticas. El resultado se obtiene corrigiendo la determinación con el Blanco de enzimas y el Blanco de prueba.
Penicilinasa-Ver Beta-lactamasa. Pentacianoaminoferrato Trisódico [Aminopentacianoferrato [14099-05-9](3-)Trisódico], Na3[Fe(CN)sNH3]-271,93 Polvo amarillo a tostado. Soluble en agua. SOLUBILIDAD: Disolver 500 mg en 50 mL de agua y dejar en reposo durante 1 hora: la solución es transparente y está exenta de materia extraña. SENSIBILIDAD Solución estándar de 1, 1-dimetilhidrazina: Colocar 500 mL de agua en un matraz volumétrico de 1 L y agregar 1,27 mL de 1, 1-dimetilhidrazina anhidra desde una bureta. Diluir a volumen con agua y mezclar. Pipetear 1O mL de esta solución, transferir a un matraz volumétrico de 100 mL y diluir a volumen con agua. Cada mL de esta solución contiene el equivalente a 100 µg de 1, 1dimetilhidrazina .. Solución amortiguadora: Transferir 4,8 g de ácido cítrico monohidrato a un matraz volumétrico de 1 L, disolver en agua, agregar 14,6 g de fosfato de sodio, agitar por rotación suave para disolver y diluir a volumen con agua. Preparación de prueba: Disolver 100 mg de pentacianoaminoferrato trisódico en 100 mL de agua. Procedimiento: Pipetear y transferir a cinco matraces volumétricos de 25 mL O mL; 0,25 mL; 0,50 mL; 1,0 mL y 1,5 mL, respectivamente, de la Solución estándar de 1, 1-dimetilhidrazina; a cada uno agregar 15 mL de la Solución amortiguadora y mezclar agitando por rotación suave. A cada matraz agregar, con una pipeta, 2 mL de la Preparación de prueba, mezclar, diluir a volumen con la Solución amortiguadora y dejar en reposo durante 1 hora. Usando un espectrofotometro adecuado, con celdas de 1 cm y la solución que no contiene Solución estándar de 1, 1-dimetilhidrazina como blanco, determinar las absorbancias de las soluciones restantes a 500 nm. Graficar en papel milimetrado la absorbancia observada como la ordenada, en función de la concentración del estándar, como la abscisa, y trazar la curva que mejor se ajuste. La gráfica es lineal y la absorbancia de la solución de 150 µg no es menor de 0,65. Pentacloruro de Antimonio, SbCls-299,02 [7647-18-9]-Líquido transparente, amarillo rojizo, aceitoso, higroscópico y cáustico. Emite vapores en el aire húmedo y se solidifica por absorción de una molécula de agua. Se descompone en agua; soluble en ácido clorhídrico diluido y en cloroformo. Alcanza la ebullición aproximadamente a 92º a
Reactivos/ Especificaciones de Reactivos 2343
USP 39 una presión de 30 mm de mercurio y tiene un peso específico de apro~imadamente 2,34 a 25º. [PRECAUCION-EI pentacloruro de antimonio causa quemaduras grav~s y su vapor es peligroso.] VALORACION (SBCLs): Pesar con exactitud un matraz de 125 mL con tapón de vidrio, introducir con rapidez aproximadamente 0,3 mL de la muestra de prueba y volver a pesar. Disolver con 20 mL de ácido clorhídrico diluido (1 en 5) y agregar 1O mL de solución de yoduro de potasio (1 en 1O) y 1 mL de disulfuro de carbono. Valorar el yodo liberado con tiosulfato de sodio O, 1 N SV. El color marrón desaparecerá de la solución gradualmente y las últimas trazas del yodo libre se recogerán en el disulfuro de carbono, dando un color rosado. El punto final se alcanza cuando desaparece este color rosado. Cada mL de tiosulfato de sodio 0, 1 N equivale a 14,95 mg de SbCl 5 : no se encuentra menos de 99,0% de SbCls. SULFATO (Prueba para reactivos, Método //): Disolver 4,3 mL (1 O g) en el volumen mínimo de ácido clorhídrico, diluir con agua hasta 150 mL, neutralizar con hidróxido de amonio y filtrar. Al filtrado, agregar 2 mL de ácido clorhídrico: la solución, usando 1O mL de cloruro de bario SR, produce no más de 1,3 mg de residuo, corregido por una pru~ba completa con un blanco (0,005%). ARSENICO: Agregar 1O mL de una solución preparada recientemente de 20 g de cloruro estannoso en 30 mL de ácido clorhídrico, a 100 mg de muestra disuelta en 5 mL de ácido clorhídrico. Mezclar, transferir a un tubo de comparación de color y dejar en reposo durante 30 minutos. Si se obtiene color con la solución de la muestra, aquel no debe ser más oscuro que el de un control que contenga 0,02 mg de arsénico (As), tratado en forma similar a la muestra de prueba, al observarlo hacia abajo contra una superficie blanca (0,02% de As). SUSTANCIAS NO PRECIPITADAS POR SULFURO DE HIDRÓGENO (como S04): Disolver 0,90 mL (2 g) en 5 mL de ácido clorhídrico y diluir con 95 mL de agua. Precipitar el antimonio completamente con sulfuro de hidrógeno, dejar que el precipitado sedimente y filtrar con cuidado de no transferir mucho del precipitado al papel de filtro. (Conservar el precipitado). Agregar 0,5 mL de ácido sulfúrico a 50 mL del filtrado, evaporar en un crisol de porcelana tarado hasta sequedad e incinerar a 800 ± 25º durante 15 minutos. (Conservar el residuo). El peso del residuo incinerado no debe ser más de 0,001 O g mayor que el del peso obtenido en una prueba completa con un blanco (0, 10%). HIERRO (241 ): Al residuo de la prueba de Sustancias No Precipitadas por Sulfuro de Hidrógeno agregar 2 mL de ácido clorhídrico y 5 gotas de ácido nítrico y evaporar en baño de vapor hasta sequedad. Recoger el residuo en 2 mL de ácido clorhídrico y diluir con agua a 47 ml: la solución no presenta más de 0,01 mg de Fe (0,001 %). OTROS METALES PESADOS (como PB): Disolver el precipitado en el papel de filtro de la prueba de Sustancias No Precipitadas por Sulfuro de Hidrógeno con 75 mL de una solución que contenga 6 g de sulfuro de sodio y 4 g de hidróxido de sodio disueltos en agua y diluidos con agua a 100 mL. Recolectar el filtrado en el matraz original que contenga el resto del precipitado de sulfuro. Entibiar la solución para disolver los sulfuros solubles y dejar que sedimenten los sulfuros insolubles. Filtrar, lavar meticulosamente con sulfuro de hidrógeno SR y disolver el precipitado que haya quedado en el papel de filtro con 1O mL de ácido clorhídrico diluido caliente. Diluir el filtrado con agua hasta 50 ml. Neutralizar una porción de 25 mL de esta solución con hidróxido de sodio 1 N y agre9ar 1 mL de ácido acético 1 N y 1O mL de sulfuro de hidrogeno SR. Si se obtiene color marrón, éste no debe exceder el producido por 0,05 mg de ión plomo en un volumen igual de solución que contenga 1 mL de ácido acético 1 N y 1O mL de sulfuro de hidrógeno SR (0,005%). Pentadecano, C1sH32-212,41 coloro.
[629-62-9]-Líquido in-
VALORACIÓN: Inyectar una muestra apropiada en un cromatógrafo de gases (ver Cromatografía (621 )) equipado con un detector de ionización a la llama, usando helio como gas transportador. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas: una columna capilar de 0,25 mm x 30 m, recubierta con una capa de fase G2 de 1 µm; mantener la temperatura del inyector a 280º; mantener la temperatura del detector a 300º; mantener la temperatura de la columna a 180º y programarla para que aumente 1Oº por minuto hasta 280º. El área del pico de C1sH32 no es menos de 99% del área total. ÍNDICE DE REFRACCIÓN (831): entre 1,430 y 1,434, a 20º. 1-Pentadecanol (Alcohol Pentadecílico, n-Pentadecanol), C1sH320-228,41 [629-76-5]-Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 98%. [l 09-66-0]-Líquido Pentano (n-Pentano), CsH12-72, 15 inflamable, incoloro y transparente. Muy poco soluble en agua. Miscible con alcohol, con éter y con muchos disolventes orgánicos. Peso específico: aproximadamente 0,62. INTERVALO DE EBULLICIÓN (Prueba para reactivos): No menos de 95% destila entre 34º y 36º. 2-Pentanona, CsH1o0-86, 13 grado adecuado.
[107-87-9]-Usar un
1-Pentanosulfonato de Sodio (Sal Sódica del Ácido 1-Pentanosulfónico), CsH11Na03$ · Hz0-192,21 [207605-40-1 ]-Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 98,0%. 1-Pentanosulfonato de Sodio Anhidro (Sal Sódica del Ácido 1-Pentanosulfónico, Anhidro), CsH1iS0 3Na-l74, 19 [22767-49-3]-Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 98%. Pentóxido de Fósforo (Anhídrido Fosfórico), P20 5-141,94 [1314-56-3]-Usar grado reactivo ACS. Pentóxido de Vanadio, V20s-l8l,88 [1314-62-1 ] Polvo fino de color amarillo a amarillo anaranjado. Poco soluble en agua; soluble en ácidos concentrados y en álcalis; insoluble en alcohol. VALORACIÓN: Transferir aproximadamente 400 mg, pesados con exactitud, a un matraz Erlenmeyer de 500 mL y agregar 150 mL de agua y 30 mL de ácido sulfúrico diluido (1 en 2). Calentar a ebullición la solución sobre una placa de calentamiento durante 5 minutos, agregar 50 mL de agua y continuar el calentamiento a ebullición hasta obtener una solución de color amarillo. Transferir la placa de calentamiento y el matraz a una campana bien ventilada y burbujear dióxido de azufre a través de la solución durante 1O minutos o hasta que la solución se vuelva transparente, de un color azul brillante. Enjuagar el tubo de suministro de gas en el matraz con algunos mL de agua y lue_go burbujear dióxido de carbono a través de la solucion durante 30 minutos mientras se continúa calentando la solución suavemente a ebullición. Enfriar la solución aproximadamente a 80º y valorar con permanganato de potasio O, l N SV hasta un punto final anaranjado amarillento. Realizar una determinación completa con un blanco y hacer las correcciones necesarias. Cada mL de permanganato de potasio O, l N equivale a 9,095 mg de V20s. No se encuentra menos de 99,5%. Pepsina [9001-75-6]-Usar Pepsina (Preparaciones Enzimáticas) (monografía de FCC), con una actividad de 1,0 a 1, 17 unidades de Pepsina por mg. La Pepsina de mayor actividad puede ser reducida a esta actividad mezclándola con pepsina de menor actividad o con lactosa. Pepsina Purificada-Polvo blanco o blanco amarillento, masa esponjosa, o escamas o gránulos translúcidos. Fácil-
2344 Especificaciones de Reactivos
/Reactivos
mente soluble en agua, produciendo una solución más o menos opalescente; prácticamente insoluble en alcohol, en cloroformo y en éter. La Pepsina Purificada utilizada en la segunda etapa de la prueba de Disolución tiene una actividad que se determina mediante el método que se indica a continuación. ACTIVIDAD Solución de pepsina: Transferir aproximadamente 2,5 mg de Pepsina Purificada, pesados con exactitud, a un matraz volumétrico de 100 mL, diluir a volumen con ácido clorhídrico 1O mM y mezclar. [NOTA-Preparar inmediatamente antes de su uso.] Solución de hemo9lobina al 2,0%: Disolver y diluir 2,5 g de hemoglobina bovina con agua hasta 100 ml. Diluir 80 mL de esta solución con ácido clorhídrico 0,3 M hasta un volumen de 100 ml. Solución de ácido tricloroacético: Diluir 5 g de ácido tricloroacético con agua hasta 100 ml. Solución de prueba: Transferir 5,0 mL de Solución de hemoglobina al 2,0% a un recipiente adecuado equilibrado a 37º. Agregar 1,0 mL de Solución de pepsina, mezclar agitando por rotación suave e incubar a 37º durante 1O minutos. Agregar inmediatamente 10,0 mL de Solución de ácido tricloroacético, mezclar agitando por rotación suave e incubar a 37º durante 5 minutos. Pasar a través de un filtro con un tamaño de poro de 0,8 µm o menor. Solución de control: Transferir 5,0 ml de Solución de hemoglobina al 2,0% a un recipiente adecuado equilibrado a 37º. Mezclar agitando por rotación suave e incubar a 37º durante 1O minutos. Agregar inmediatamente 10,0 ml de Solución de ácido tricforoacético y 1,0 mL de Solución de pepsina, mezclar agitando por rotación suave e incubar a 37º durante 5 minutos. Pasar a través de un filtro con un tamaño de poro de 0,8 µm o menor. Procedimiento: Determinar las absorbancias de la Solución de prueba y la Solución de control, en celdas de 1 cm, a una longitud de onda de aproximadamente 280 nm, utilizando agua como referencia. Calcular la actividad de la porción efe Pepsina Purificada tomada, por la fórmula: 1O OOO(Au - Ac) en donde Au y Ac son las absorbancias de la Solución de prueba y la Solución de control, respectivamente. Peptona Seca (Peptona de Carne)-Polvo de color amarillo rojizo a marrón, con un olor característico pero no putrefacto. Soluble en agua, formando una solución marrón amarillenta con una ligera reacción ácida; insoluble en alcohol y en éter. COMPUESTOS DE NITRÓGENO (Prueba para reactivos): Determinar por medio del método Kjeldahl, con una muestra de prueba secada previamente a 105º hasta peso constante: se encuentra entre 12% y 18% de nitrógeno. RESIDUO DE INCINERACIÓN (Prueba para reactivos): Incinerar 500 mg con 1 mL de ácido sulfúrico: el residuo pesa no más de 75 mg (15,0%). PÉRDIDA POR SECADO (731 ): Secar a 105º hasta peso constante: pierde no más de 7,0% de su peso. PROTEÍNA COAGULABLE: Calentar una solución filtrada (1 en 20) hasta el punto de ebullición: no se forma precipitado. CONTENIDO MICROBIANO: No más de 104 ufc/g Perclorato de Litio, LiCI04-106,39 grado reactivo ACS.
[7791-03-9]-Usar
Perclorato de Magnesio Anhidro, Mg(CIQ4)2-223,21 [10034-81-8]-Usar grado reactivo ACS. Perclorato de Plomo, Pb(CIQ4)2 · 3H20--460, 15-Usar grado reactivo ACS.
USP 39
Perclorato de Potasio, KCIQ4-138,55 Usar grado reactivo ACS.
[7778-74-7]-
Perclorato de Sodio, NaCIQ4 · H20-140,46 [7791-07-3]-Usar grado reactivo ACS. Perclorato de Tetraetilamonio, (C2Hs)4NCIQ4-229,70-Cristales blancos. Soluble en agua. Usar un grado adecuado. Perlas de Copolímero de Estireno-Divinilbenceno-Perlas neutras, porosas, entrecruzadas, de malla 200-400, intervalo operativo de peso molecular de hasta 2000 (basado en perlas totalmente hinchadas en benceno). Adecuadas para uso en separación por permeación en gel de polímeros lipofílicos y otros solutos que requieren eluyentes orgánicos. [NOTA-Se ~uede obtener comercialmente un grado adecuado como 'BioBeads S-X" en Bio-Rad, www.bio-rad.com.] Permanganato de Potasio, KMn04-l 58,03 [7722-64-7]-Usar grado reactivo ACS. Peroxidasa de Rábano Picante Conjugada con lgG Antirratón de Cabra: Anticuerpo policlonal purificado por afinidad contra las cadenas livianas y pesadas (lgG completa) de lnmunoglobulina (lgG) de Ratón, producido en Cabras y marcado con peroxidasa de rábano picante. Disponible como polvo liofilizado o como solución en una solución amortiguadora adecuada, generalmente fosfato de sodio 1O mM, pH 7,4, con un conservante adecuado como por ejemplo timerosal al 0,01 % y proteína(s) inactiva(s) para evitar la adsorción en la superficie del envase. Usar un grado adecuado. Almacenar a -20º. Peróxido de Hidrógeno, H202-34,01 [7722-84-1 ]-Usar grado reactivo ACS con un contenido de valoración entre 29,0% y 32,0%. Peróxido de Hidró~eno al 10 por ciento, H202-34,01Diluir 30 mL de peroxido de hiarógeno al 30 por ciento con agua hasta 100 ml. Peróxido de Hidrógeno al 30 por ciento Sin Estabilizar, H20 2-34,01 [7722-84-1 ]-Usar grado reactivo ACS, con un contenido de valoración entre 29,0% y 32,0%, sin agregado de estabilizante. Peróxido de Hidrógeno al 50 por ciento en Agua, H20 2-34,0l [7722-84-1 ]-Usar un grado adecuado. Peróxido de Sodio, Na202-77,98 grado reactivo ACS.
[1313-60-6]-Usar
Persulfato de Amonio (Peroxidisulfato de Amonio), (NH 4) 2S20 8-228,20 [7727-54-0]-Usar Peroxidisulfato de Amonio grado reactivo ACS. Persulfato de Potasio, KiS20s-270,32 [7727-21-1 ] Usar Peroxidisulfato de Potasio de grado reactivo ACS. Peryodato de Potasio (meta-Peryodato de Potasio), KI04230,00 [7790-21-8]-Usar grado reactivo ACS. 2-Picolina, C6H1N-93, 13 [109-06-8]-Líquido de incoloro a amarillento. VALORACIÓN: Inyectar una muestra apropiada en un cromatógrafo de gases adecuado (ver Cromatografía (621)) equipado con un detector de ionización a la llama, usando helio como gas transportador. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas: una columna de vidrio de 2 mm x 2 m rellena con fase líquida Gl 6 al 20% sobre soporte Sl C de malla 80 a 100; mantener la temperatura del inyector a 140º; mantener la temperatura del detector a 300º; mantener la temperatura de la columna a 90º y programarla para que aumente 3º por minuto hasta 140º. El
USP 39 área del pico de C6H1N no es menos de 98% del área total. ÍNDICE DE REFRACCIÓN (831 ): 1,500 ± 0,002, a 20º. Piedra Pómez-Sustancia de origen volcánico compuesta principalmente de silicatos complejos de aluminio y metales alcalinos. Se presenta en forma de masas grises, porosa~, ásperas, duras y muy liv~a~as o ~º':1'1º polvo de c~l?r gris. Es insoluble en agua y los aqdos diluidos no la mod1f1can. SUSTANCIAS SOLUBLES EN ACIDO y EN AGUA: Calentar a ebullición 2,0 g de piedra pómez pulverizada con 50 ml d.e ácido clorhídrico diluido bajo un condensador de reflujo durante 30 minutos. Enfriar y filtrar. Agregar 5 gotas de ácido sulfúrico a la mitad del filtrado, evaporar hasta sequedad, incinerar y pesar: el residuo no pesa más de 60 mg (6,0%).
Reactivos /
Especificaciones de Reactivos 2345
Piridina, C5 H5 N-79, 1O ACS.
[110-86-1 ]-Usar grado reactivo
Piridina Seca [11 0-86-1 ]-Usar grado reactivo ACS. Piroantimoniato de Potasio (Hexahidroxiantimoniato de po[12208-13-8]-Cristales blancos tasio), KSb(OH)6-262,90 o polvo cristalino blanco. Moderadamente soluble en agua. Usar un grado adecuado. Pirofosfato de Potasio, K4P201-330,34 [7320-34-5]Gránulos delicuescentes incoloros. Fácilmente soluble en agua; insoluble en alcohol. Pirofosfato de Sodio, Na4P201 · 1OH20-446,06 [1 3472-36-1 ]-Usar grado reactivo ACS.
Piperazina (Oietilendiamina), C4H10N2 · 6H20-194,23-Usar un grado adecuado.
Pirogalol, C6H3(0H)3- l 26, 11 reactivo ACS.
[110-89-4]-~í~uido inc~loro. Piperidina, C5H11 N-85, 15 Miscible con agua y con alcohol. Peso espeoflco: aproximadamente 0,860. INTERVALO DE SOLIDIFICACIÓN (651): entre 12º y 15º. INTERVALO DE EBULLICIÓN (Prueba para reactivos): No menos de 95% destila entre 104º y 106º. ÍNDICE DE REFRACCIÓN (831 ): aproximadamente 1,454.
Pirosulfato de Potasio [7790-62-7]-Por lo general, disponible como una mezcla de pirosulfato de potasio (K2S201) y bisulfato de potasio (KHS04). Usar grado reactivo ACS.
Pirazol, C3H4N2 [288-1 3-1 ]-Polvo cristalino o cristales de color blanco a amarillo pálido. Soluble en agua, en alcohol y en éter. INTERVALO DE FUSIÓN (741 ): entre 67º y 71 º.
[87-66-1 ]-Usar grado
Pirrol, C4H5 N-67,09 [l 09-97-7]-Líquido transparente que es incoloro cuando está recién ;Jestilado y adg~iere un color amarillo al cabo de algunos d1as. Peso espec1f1co: aproximadamente 0,94. Insoluble en agua; soluble en alcohol, en benceno y en éter. INTERVALO DE EBULLICIÓN (Prueba para reactivos): No menos de 90% destila entre 128º y 1 32º. Pirrolidinditiocarbamato de Amonio, (Sal de amonio de CsH12N2S2-164,29 [5108-96-3]-Usar un grado adecuado. ácido 7-pirrolidincarboditioico),
Cambio efl la redacción: Pireno, C16H10-202,25 [129-00-0]-Cristales blancos a amarillo claro. VALORACIÓN: Transferir aproximadamente 9 mg, pesados con exactitud, a un matraz volumétrico de 100 ml, disolver en metanol, diluir a volumen con metanol y mezclar. Transferir 2,0 ml de esta solución a un matraz volumétrico de 100 ml diluir a volumen con metanol y mezclar. Empleando u~ espectrofotómetro adecuado, celdas de 1 cm y metanol como blanco, registrar la absorbancia de la solución a la longitud de onda de máxima absorción, aproximadamente a 238 nm. A partir de la .ab.sorbancia observada, calcu.lar .la absortividad (ver • Espectroscopíá Wtravi°Qletá·Vísible (857}• CAF 01.may:.2016)): la absortividad no es menor de 432,9, lo que corresponde a no menos de 98% de C16H10. INTERVALO DE FUSIÓN (741): entre 149º y 153º, dentro de un intervalo de 2º. 1-(2-Piridilazo)-2-naftol, C1sH11 N30-249,27 [85-85-8]-Cristales estables de color rojo anaranjado. Soluble en alcohol y en soluciones calientes de álcalis diluidos; poco soluble en agua. INTERVALO DE FUSIÓN (741): entre 140º y 142º. SENSIBILIDAD: Agregar O, 1 ml de una solución 1 en 1000 del artículo en alcohol a una mezcla de 1O ml de agua y 1 ml de una solución amortiguadora preparada mezclando 80 ml de ácido acético 0,2 M y 20 ml de solución d~, acetato de sodio (8 2 en 100) y mezclar. A esta soluc1on agregar 1 ml de u~a mezcla de 1 ml de sulfato cúprico SR y 2 ml de agua, y mezclar: el color cambia de amarillo a rojo. 4-(2-Piridilazo)resorcinol (PAR), C11 HgN302, ácido libre; C11HaN3Na02, sal monosódica-215,21, ácido libre237,21, sal monosódica [1141-59-9, ácido libre; 16593-81-0, sal monosódica]-Usar grado reactivo ACS.
Agregar lo siguiente: •2·Pirrolidona, C4H1N0--85,1 l [616-45-5]-Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 98,0% (por Cromatografíá de Gases). fNOTA.-,...Se puede obtener un grado adecuado con el número de catálogo TCl-P0575 en www.spectrumchemical.com.].usm Piruvato de Sodio, CH3COC02Na-l l 0,04 [11 3-24-6]Sólido cristalino o polvo blanco a prácticamente blanco. Soluble en agua. VALORACIÓN: Transferir aproximadamente 300 mg, pesados con exactitud, a un vaso de precipitados para volumetría de forma alta, agregar 150 ml de ácido acético glacial y mezclar hasta que s~ disuelva. Valorar. con ácido perc;_ló~ rico O, 1 N SV, determinando el punto final potenc1ometncamente usando un electrodo de vidrio y uno de calomel modificado de modo que utilice cloruro de tetrametilamonio O 1 N en metanol como electrolito. Realizar una determina~ión con un blanco y hacer las correcciones necesarias. Cada ml de ácido perclórico O, 1 N equivale a 11,00 mg de CH 3COC02Na: no se encuentra menos de 98,0%. SOLUBILIDAD: Disolver 1,5 g en 25 ml de agua: la solución es transparente y completa. ÁCIDO LIBRE: Disolver 1O g en 150 ml de agua y valorar con hidróxido de sodio 0,5 N SV, determinando el punto final potenciométricamente: no se consume más de 2,8 ml de hidróxido de sodio 0,5 N (aproximadamente 1% como C3H4Ü3). Polidimetilosiloxano de 0,65 centistokes de viscosidad (Hexametildisiloxano), (CH3)3SiOSi(CH3)3-162,38
[l 07-46-0]-Líquido. Se congela aproximadamente a Oº.
2346 Especificaciones de Reactivos
/Reactivos
ÍNDICE DE ~EFRACCIÓN (831 ): aproximadamente 1,3770. PESO ESPECIFICO (841): aproximadamente 0,760. Poliéster de Succinato de Dietilenglicol, (OCH2CH20CH2CH200CCH2CH2COO)n [26183-02-8]-Líquido viscoso y transparente. Soluble en cloroformo. Se estabiliza mediante modificación del poliéster de succinato de dietilenglicol, para hacerlo adecuado al uso en cromatografía de gas-líquido a una temperatura de 200º. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado en Alltech, www.alltechweb.com.] Polietilenglicol 200, H(OCH2CH2)nOH en donde el valor promedio de n es 4-peso molecular promedio 200 L25322-68-3]-Líquido higroscópico, viscoso, incoloro o casi incoloro, transparente. Muy soluble en acetona y en alcohol; prácticamente insoluble en éter y en aceites grasos. Usar un grado adecuado. ÍNDICE DE REFRACCIÓN (831): 1,4590 a 20º. DENSIDAD: 1,127 a 25º. VISCOSIDAD: 4,3 centistokes a 98,9º. Polietilenglicol 600 [25322-68-3]-Polímero de condensación líquido, viscoso, transparente y prácticamente incoloro representado por H(OCH2CH2)nOH, en donde n varía de 12 a 14. Su peso molecular promedio es aproximadamente 600. Cumple con los requisitos de todas las pruebas en Polietilenglicol (monografía del NF), excepto Límite de Etilenglicol y Dietilenglicol.
Polietilenglicol 20 000 [25322-68-3]-lntervalo de peso molecular: 15 000-20 000. Sólido ceroso, blanco y duro, por lo general en forma de escamas. Soluble en agua con formación subsig_uiente de un gel. VISCOSIDAD-METODOS CAPILARES (911 ), Viscosidad de una solución al 25%: Agregar 50,0 g de muestra de prueba a un recipiente de 250 ml, de boca ancha, con tapa de rosca que contenga 150,0 g de agua. Acoplar con firmeza la tapa al recipiente y hacer rodar sobre un rodillo mecánico hasta que la muestra de prueba se disuelva completamente, entre 2 y 4 horas. Dejar la solución en reposo hasta que todas las burbujas de aire desaparezcan. Puede requerirse de 2 a 4 horas más. Ajustar la temperatura de la solución a 37,8 ± O, 1º y determinar la viscosidad cinemática en un viscosímetro adecuado de tipo Ubbelohde. La viscosidad no es menos de 100 centistokes. PH (791 ): entre 6,5 y 8,0 en una solución (1 en 20). [NOTA-Puede usarse una dilución al quinto de la solución de prueba preparada para la prueba de Viscosidad de una solución al 25%.] RESIDUO DE INCINERACIÓN (281): no más de 0,7%, omitiendo el uso de ácido sulfúrico. Polímero de Cloruro de Trifluorovinilo (Fluorolube; Homopolímero 7-Cloro-7,2,2-trifluoro-eteno), (C2CIF3)x-Usar un grado adecuado. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado como número de catálogo Zl 23552 en www.sigma-aldrich.com.] Polimetobromuro de 1,5-dimetil-1,5-diazaundecametileno (Polibreno), [28728-55-4]-Es un polímero cargado positivamente. Está disponible como sólido o polvo cristalino, blanquecino, y es extremadamente higroscópico. Usar un grado reactivo adecuado. [NOTA-Disponible comercialmente como Polibreno.]
USP 39 Preparación de Enzima Sulfatasa-Usar un grado adecuado. [NOTA-Se puede obtener comercialmente un grado adecuado en Sigma-Aldrich, www.sigma-aldrich.com, número de catálogo S-9626.] Preparación de Proteasa Alcalina Bacteriana: Usar un grado adecuado. [NOTA-Se ~uede obtener comercialmente un grado adecuado como 'Protex 6L" en Genencor, www.genencor. com.] Propiofenona, C9H1 0 0-134, 18 grado adecuado.
[93-55-0]-Usar un
Propionaldehído, C3H60-58,08 grado adecuado.
[123-38-6]-Usar un
Proteinasa K de Tritiraquio Album-Usar un grado adecuado. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado en Qiagen, lnc., www.qiagen.com.] Pululanasa (Amifopectin-6-gluconohidrolasa) [9075-68-7]Una enzima obtenida de Kleibsiella pneumoniae. Contiene no menos de 30 unidades por mg de proteína. Una unidad definida por su actividad enzimática libera 1,0 µmol de maltotriosa (medida como glucosa) por minuto a partir de pululano a un pH de 5,0 a 30º. Se puede suspender en solución de sulfato de amonio 3,2 M de pH 6,2. MEDICIÓN DE ACTIVIDAD RELATIVA DE PULULANASA Determinación de actividad de pululanasa Sustrato: Disolver pululano 1 en agua para conseguir una solución al 1,25% (p/v). [NOTA-Agregar pulufano al agua. Si se agrega agua al pululano, se formarán grumos.] Solución amortiguadora A de pH 5,0: Agregar fosfato disódico O, 1 M (27 g de fosfato dibásico de sodio en cada L de la solución) a ácido cítrico O, 1 M (21 g de ácido cítrico en cada L de la solución) para ajustar el pH a 5,0. Solución amortiguadora B de pH 6,0: Agregar ácido acético diluido a acetato de sodio 1 M (136 g de acetato de sodio en cada L de solución) para ajustar el pH a 6,0. Diluir con agua para preparar la solución amortiguadora final como solución amortiguadora de ácido acético 0,01 M de pH 6,0. Reactivo de Somogyi: Agregar 54 9 de fosfato disódico heptahidrato o 28 g de fosfato acido disódico anhidro y 40 g de tartrato de sodio y potasio aproximadamente a 650 ml de a9ua o aproximadamente 700 ml para fosfato ácido disodico anhidro. Agregar 100 ml de hidróxido de sodio 1 N a esta solución y mezclar. Agregar 80 ml de sulfato cúprico al 10% a la solución y mezclar. Calentar hasta que todo el sólido se disuelva completamente. Agregar 180 g de sulfato de sodio anhidro a la solución y ajustar el volumen a 1 L. Dejar la solución en reposo a temperatura ambiente durante 1 ó 2 días para permitir que la materia insoluble precipite. Filtrar la solución con papel de filtro estándar y conservar la solución en un frasco marrón con tapón de vidrio esmerilado. Reactivo de Nelson: Disolver 50 g de molibdato de amonio en 900 ml de agua. Agregar 42 g de ácido sulfúrico y mezclar. Disolver 6 g de arseniato de sodio o 3,6 g de arseniato monobásico de potasio en 50 g de agua. Dejar en reposo la solución en un frasco marrón con tapón de vidrio esmerilado a 37º durante 1 ó 2 días. Solución estándar de glucosa: Secar cristales de glucosa anhidra a menos de 50 mm Hg a 60º durante 5 horas y calcular el contenido de agua. Transferir 1
Un proveedor adecuado para pululano es www.hayashibara-intl.com.
Reactivos/ Especificaciones de Reactivos 2347
USP 39 10,00 g de glucosa seca a un matraz volumétrico de 1 L, disolver y diluir a volumen con agua, y mezclar. Transferir 10,0 mL a un matraz volumétrico de 1 L y diluir a volumen con agua. Cada mL contiene 100 µg de glucosa. Diluyente de pululanasa: Diluir pululanasa con Solución amortiguadora B de pH 6,0 para preparar una solución con una actividad enzimática de aproximadamente 0,2 unidades por ml. [NOTA-El intervalo de medición está entre O, 1 y 0,4 unidades por ml.] Registrar el factor de dilución (Fp 0 ). Este diluyente se utiliza como una solución de enzimas diluida. Procedimiento: Transferir 4 mL de Sustrato a un tubo de ensayo y agregar 0,5 mL de Solución amortiguadora A de P.H 5,0, mezclar e incubar a 30º. Agregar 0,5 mL de Dtfuyente de pululanasa y mezclar meticulosamente. Despues de 30 segundos, transferir 1 mL de esta solución a un tubo de ensayo etiquetado como "Solución de prueba de pululano 1" y a9regar 2 mL de Reactivo de Somogyi, y mezclar. Despues de 30 minutos y 30 segundos, transferir 1 mL de la mezcla de Sustrato y Diluyente de pululanasa a un segundo tubo de ensayo etiquetado como "Solución de prueba de pululano 2", agregar 2 mL de Reactivo de Somogyi y mezclar. En un tercer tubo de ensayo etiquetado como "Blanco del estándar", mezclar 2 mL de Reactivo de Somogyi y 1 mL de agua. En un cuarto tubo de ensayo etiquetado como "Solución del estándar de glucosa", mezclar 2 mL de Reactivo de Somogyíy 1 mL de la Solución del estándar de glucosa y agregar 1 mL de agua. Incubar el cuarto tubo de ensayo en un baño de agua en ebullición durante exactamente 1O minutos. Retirar el tubo y dejar que se enfríe en una corriente de agua fría. Agregar 2 mL de Reactivo de Ne/son, mezclar bien y dejar en reposo la solución durante al menos 15 minutos. Agregar 5 mL de agua a cada uno de los cuatro tubos de ensayo y mezclar meticulosamente. Determinar la absorbancia a 520 nm del Blanco del estándar, Ab1anco, de la Solución del estándar de glucosa, AEst, de la Solución de prueba de pululano 1, A0, y de la Solución de prueba de pululano 2, A3o, usando agua como blanco. Una unidad se define como la actividad enzimática que produce 1 µmol de maltotriosa (medido como glucosa) a partir del pululano por minuto. Calcular la actividad de pululanasa, PA, en unidades por mL, usando la fórmula: PA
= [(A30 -
Ao)/(AEst - Ablanco)]
X
O, 185
X
Fpo
MEDICIÓN DE LA CANTIDAD DE P~OTEÍNA (MEDIDA COMO CANTIDAD DE ALBUMINOIDE) PARA EL CALCULO DE ACTIVIDAD ESPECÍFICA Reactivo A: Preparar una solución con concentraciones conocidas de hidróxido de sodio aproximadamente O, 1 N y de carbonato de sodio aproximadamente 0,2 M. Reactivo B: Transferir 0,5 g de sulfato cúprico y 1,0 g de citrato de sodio dihidrato a un matraz volumétrico de 100 mL, disolver y diluir a volumen con agua, y mezclar. Solución de Lowry: Mezclar Reactivo A y Reactivo B en una proporción de 50:1. Reactivo Folin-Ciocalteu para Fenoles Diluido (para cuantificación de albuminoide): Preparar una dilución doble de Reactivo Folin-Ciocalteu para Fenoles 2 N disponible comercialmente o preparar una solución realizando una dilución apropiada a partir de Folin-Ciocalteu para Fenoles SR (ver Artículos Obtenidos por Biotecnología-Va/oración de Proteínas Totales (1057), Método 2). Solución madre del estándar de albúmina sérica bovina: Transferir 0,05 g de albúmina sérica bovina a un matraz volumétrico de 500 mL, disolver y diluir a volumen con agua, y mezclar. Contiene 100 µg de albúmina sérica bovina por ml. Soluciones estándar: Usando diluciones apropiadas de Solución madre del estándar de albúmina sérico bovina en agua, preparar cinco Soluciones estándar con concentra-
ciones igualmente espaciadas entre 5 y 100 µg de albúmina sérica bovina por ml. Solución de prueba: Diluir pululanasa con Solución amortiguadora B de pH 6,0 para obtener una solución con una concentración entre 60 y 70 µg de albuminoide por ml. [NOTA-Se puede usar agua como diluyente.] Registrar el factor de dilución, Frs. Solución blanco: Usar agua. Procedimiento: Agregar 3 mL de la Solución de Lowry a sendos tubos que contienen 0,3 mL de las Soluciones estándar, de la Solución de prueba y de la Solución blanco, y mezclar. Dejar incubar a temperatura ambiente durante 1O minutos. Agregar 0,3 mL de Reactivo Folin-Ciocalteu para Fenoles Diluido a cada tubo, mezclar inmediatamente y dejar en reposo a temperatura ambiente durante 60 minutos. Determinar las absorbancias de las Soluciones estándar y de la Solución de prueba a la longitud de onda de máxima absorbancia, aproximadamente a 750 nm, usando la Solución blanco como blanco. Cálculo: [NOTA-La relación entre absorbancia y concentración de proteína no es lineal; sin embargo, si el intervalo de concentraciones de la curva estándar es suficientemente pequeño, puede acercarse a la linealidad.] Usando el método de la regresión lineal, graficar las absorbancias de las Soluciones estándar en función de las concentraciones de proteína (albúmina sérica bovina), en µg por ml, y determinar la curva que mejor se ajuste. Usando la gráfica, determinar la concentración, Ca1buminoide, en µg por ml, de proteína (cantidad de albuminoide) en la Solución de prueba. Calcular la concentración de albuminoide, en mg por mL, en la pululanasa tomada, por la fórmula: Cproteína
= (Calbuminoide X
Frs)/l 000
Calcular la actividad específica, SA, en unidades por mg, de pululanasa, usando la fórmula: SA
= PA/Cproteína
Purina, CsH4N4-120, 11 [120-73-0]-Polvo blanco a blanquecino. INTERVALO DE FUSIÓN (741): entre 214º y 217º. Cuando se analiza por cromatografía en capa delgada, usando placas recubiertas con mezcla de gel de sílice para cromatografía y una fase móvil constituida por alcohol butílico, agua y acido acético glacial (60:25:15), presenta una sola mancha. Púrpura de m-Cresol, C21H1sOsS-382,43 Usar un grado adecuado.
[2303-01-7]-
Queroseno [8008-20-6]-Una mezcla de hidrocarburos, principalmente de la serie del metano. Líquido transparente e incoloro. Peso específico: aproximadamente 0,80. Destila entre 180º y 300º. Quinhidrona, C6H4(0H)2 · C6H402-218,21 [106-34-3]Cristales verdes con brillo metálico. Poco soluble en agua fría; soluble en agua caliente, en alcohol y en éter. VALORACIÓN: Transferir aproximadamente 450 mg, pesados con exactitud, a un matraz con tapón de vidrio, agregar 50 mL de ácido sulfúrico 1 N y 3 g de yoduro de potasio, tapar el matraz y agitar hasta su disolución. Valorar el yodo liberado con tiosulfato de sodio O, 1 N SV, agregando 3 mL de almidón SR cerca del punto final. Cada mL de tiosulfato de sodio O, 1 N equivale a 5,405 mg de quinona (C6H402). Se encuentra entre 49,0% y 51,0%. MATERIA INSOLUBLE EN ALCOHOL: Disolver 1o g en 100 mL de alcohol caliente, filtrar a través de un crisol tarado adecuado de porosidad fina y lavar con alcohol caliente hasta que el último lavado sea incoloro. Secar a 105º, enfriar en
2348 Especificaciones de Reactivos / Reactivos un desecador y pesar: el residuo no pesa más de 1 O mg (0,010%). ' RESIDUO DE INCINERACIÓN (Prueba para reactivos): no más de 0,050% usando una muestra de prueba de 2,0 g. Reservar el residuo. SULFATOS: Transfe~ir 1 g a un crisol de platino, agregar 1O ml de agua caliente y 0,5 g de carbonato de sodio evaporar hasta sequedad e incinerar, protegido del sulfuro e1_1 la llama, hasta que el residuo se torne casi blanco. Enfriar, agregar 20 ml de agua y 1 ml de peróxido de hidrógeno al 30 por ciento, calentar a ebullición suave durante unos pocos minutos, agregar 2 ml de ácido clorhídrico y e':'aporar en u.n baño de vapor hasta sequedad. Enfriar, disolver el residuo en 20 ml de agua, filtrar y agregar al filtrado 1 ml de ácido clorhídrico 1 N y 3 ml de cloruro de t;>ario SR: si se produce turbidez dentro de los 1O minutos, esta no excede la de un control que contenga 0,2 mg de S04 agregado y 0,5 mg de carbonato de sodio 1 ml de peró~id? de hi~rógeno al 30 por ciento y 2 ml de ácido clorh1drico previamente evaporados en un baño de vapor hasta sequedad (0,02%). METALES PESADOS: Al residuo reservado en la prueba para Residuo de ~n~inera,ci?n agregar 2 ml de ácido clorhídrico y 0,5 ml de ac1do nitrico, y evaporar en un baño de vapor ~asta sequedad. Disolver el residuo en 30 ml de agua cah~n~e que contenga 1 ml de ácido clorhídrico 1 N, enfriar, diluir con agua hasta 40 ml y mezclar. Diluir 20 ml de esta solución (~eservar el resto de la solución) con agua ha~t~, 25 m~, .ªJustar,~ un pH entre ~,O y 4,0 mediante la ad1cion de ac1do acet1co 1 N o hidroxido de amonio 6 N según sea necesario; diluir con agua hasta 40 ml y agregar 1O ml de sulfuro de hidrógeno SR recién preparado: si se produce color marrón, éste no excede el de un control que contenga 0,02 mg de Pb agregado (0,002%). HIERRO (241 ): A 1O ml de la solución reservada en la pr~eba p~r~ Metales Pesados agregar 2 ml de, ácido clorhídrico y d1lu1r con agua hasta 47 ml: la solucion no contiene más de 0,01 mg de Fe (0,002%). Quinona-Ver p-Benzoquinona. Rayón-Usar Rayón Purificado (monografía de la USP). Reactivo Anti-A para Tipificación de Grupo Sanguíneo Reactivo Anti-B para Tipificación de Grupo Sanguíneo' y Reactivo. Anti-AB para Tipificación de Grupo SanguíneoLos reactivos pueden ser monoclonales o policlonales y deben obtenerse de fabricantes o proveedores autorizados por el Center far Biologics Evaluation and Research (Centro de Evaluación e Investigación de Productos Biológicos) de la F_DA, para SI.! uso en pruebas de microplaca. El uso de reactivos provenientes de un fabricante o proveedor no autorizado puede invalidar los resultados. Generalmente los tres reactivos se encuentran disponibles como parte d~ un kit. [N?TA-Existen, mucho~ fabricantes y proveedores de estos react1v~s que estan autorizados por el Center far Biologics Evaluat1on and Research (Centro de Evaluación e Investigación de Productos Biológicos) de la FDA. Se encuentran entre lc;is f~bricantes o proveedores autorizados, por ejemplo, los s1gu1entes: Gamma Biologics, Houston, TX y Ortho Diagnostics, Raritan, NJ.] Reacti".'o Anti-D-~I reactivo puede ser monoclonal (bajo contenido de prote1nas) o poficlonal (alto contenido de prot~ínas) y debe obtenerse de fabricantes o proveedores autorizados por el Center far Biologics Evaluation and Research (Centro de Evaluación e lnvesti.gación de ~roductos Biológicos) de la FDA. El uso de reactivos provenientes de un fabricante o proveedor no autorizado puede invalidar los resultados. Se debe tener en cuenta que este reactivo es diferente del Reactivo Anti-D (Rha). Consultar la información del fabricante adjunta al envase para asegurarse de que el reactivo es adecuado para la prueba Anti-D Débil y que no contiene
USP 39 otros anticuerpos que reaccionen cuando se agregue antiinmunoglobulina humana. [NOTA-Existen muchos fabricantes y proveedores de estos reactiv~s que están autorizados por el Center far Biologics Evaluat1on and Research (Centro de Evaluación e Investigación de Productos Biológicos) de la FDA. Se encuentran entre lc;is f~bricantes o prov:eedores autorizados, por ejemplo, los s1gu1entes: Gamma B1ologics, Houston, TX y Ortho Diagnostics, Raritan, NJ.] Reactivo Anti-D (Rha): El reactivo puede ser monoclonal o policl?nal y debe obtenerse de fabricantes o proveedores autorizados por el Center far Biologics Evaluation and Res~ar~h. (Centro de Evaluación e Investigación de Productos B1olog1cos) de la FDA, para su uso en pruebas de microplaca. El uso de reactivos provenientes de un fabricante o proveedor no autorizado puede invalidar los resultados. Se debe tener en cuenta que este reactivo es diferente del Reactivo Anti-D. Consultar la información del fabricante adjunta al envase para asegurarse de que es el Reactivo Anti-D (Rha) y no el Reactivo Anti-D. [NOTA-Existen muchos fabricantes y proveedores de estos reactiv~s que están autorizados por el Center far Biologics Evaluat1on and Research (Centro de Evaluación e Investigación de Productos Biológicos) de la FDA. Se encuentran entre lc;is f.abricantes o prov:eedo.res autorizados, por ejemplo, los s1gu1entes: Gamma B1olog1cs, Houston, TX y Ortho Diagnostics, Raritan, NJ.] Reactivo Antiespumante-Emulsión de silicona-glicol al 10%, de aspecto blanco. No iónico pero miscible con agua fresca. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado de Dow Cornin~ Corporation, www.dowcorning.com, disponible como 'Reactivo Antiespumante", número de catalogo 221 O.] Reactivo de Apareamiento lónico de Sulfato Ácido de Tetrabutilamonio-Mezcla de sulfato ácido de tetrabutilamonio y solución amortiguadora de fosfato. Usar un grado adecuado. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado de la Waters Corporation, Nº de catálogo WAT084189 (www.waters. com).] Reactivo de Drabkin: El reactivo está compuesto por 100 partes de .bicarbonato de sodio, 20 partes de ferricianu,ro de potasio y 5 partes de cianu~o de potasio. [PRECAU~ION: E.1 reactivo es ALTAMENTE TOXICO. Muy tóxico si se inhala, s1 entra en contacto con la piel o si se ingiere, y existe el riesgo de sufrir lesiones oculares graves. Llevar ropa y guantes protectores adecuados, y rotección para la cara y fos ojos. No mezclar con ácidos. E contacto con ácidos libera un gas muy tóxico. En caso de ingestión, efectuar un lavado gástrico y llamar a un médico.] [NOTA-El reactivo puede obtenerse de muchos fabricantes y proveedores. A modo de ejemplo, se indican los siguientes fabricantes o proveedores: Sigma Chemical Co., St. Louis, MO y CIMA Scientific, Dallas, TX.]
f
Reactivo de Girard T-Ver Cloruro de Trimetilacethidrazidoamonio. Reactivo de Globulina Antihumana: El reactivo puede ser poliespecífico o anti-inmunoglobulina (Anti-lgG) y debe obtenerse de fabricantes o proveedores autorizados por el Center far Biologics Evaluation and Research (Centro de Evaluación e Investigación de Productos Biológicos) de la FDA. El uso de reactivos provenientes de un fabricante o proveedor no autorizado puede invalidar los resultados. [NOTA-Existen muchos fabricantes y proveedores de estos reactiv~s que están autorizados por el Center far Biologics Evaluat1on and Research (Centro de Evaluación e Investigación de Productos Biológicos) de la FDA. Se encuentran entre los fabricantes o proveedores autorizados, por ejemplo,
USP 39 los siguientes: Gamma Biologics, Houston, TX y Ortho Diagnostics, Raritan, NJ.] Reactivos Cromatográficos: Ver Reactivos, Columnas Cromatográficas. [NOTA-En el Pharmacopeial Forum se publican en forma periódica listados de las denominaciones numéricas de fases estacionarias para cromatografía de gases (G), cromatografía de líquidos (L) y soportes para cromatografía de gases (S), así también como las marcas correspondientes, como referencia para el operador del cromatografo.] Reineckato de Amonio (Sal de Reinecke), NH4 [Cr(NH3)2(SCN)4] · H20-354,44 [13573-16-5]-Cristales de color rojo oscuro o polvo cristalino rojo. Moderadamente soluble en agua fría; más soluble en agua caliente. Se descompone gradualmente en solución. SENSIBILIDAD: Disolver 50 mg en 1O mL de agua. Agregar 0,2 mL de la solución a 1 mL de una solución de 1O mg de cloruro de colina en 20 mL de a~ua y agitar suavemente: se forma un precipitado caractenstico en 5 a 1O segundos. Rellenos para Cromatografía de Líquidos de Alta Presión-Ver rellenos para cromatografía de líquidos de alta presión en Cromatografía (621 ), Columnas Cromatográficas. Resazurina (Sódica), C12H6NNa04-251, l 7 [62758-13-8]-Polvo cristalino de color púrpura marronáceo. Un g se disuelve en 100 mL de agua y forma una solución de color violeta intenso. El sulfuro de hidrógeno y otros compuestos que contienen el grupo tiol decoloran soluciones de resazurina sódica, formando dihidroresorufina. Cuando la solución decolorada se agita en presencia de aire, se desarrolla un color rosado como consecuencia de la formación de resorufina. Resina de Intercambio Aniónico de Divinilbenceno-Poliestireno Clorometilado-Resina entrecruzada fuertemente básica que contiene grupos de amonio cuaternario. Consiste en perlas pequeñas, amarillas y húmedas con un olor a amina característico. Se encuentra disponible en forma de cloruro, que puede convertirse a la forma de hidróxido por regeneración con una solución de hidróxido de sodio (1 en 4). Para lograr una regeneración satisfactoria, se necesita un tiempo de contacto de aproximadamente 25 minutos después del cual se debe lavar con agua hasta neutralizar. Apropiada para usar en cromatografía de columna. [NOTA-Una resina adecuada es "Amberlite IRA-400," producida por Sigma-Aldrich, www.sigma-aldrich.com.] Resina de Intercambio Aniónico de Estireno-Divinilbenceno-Resina entrecruzada fuertemente básica que contiene grupos amonio cuaternario y aproximadamente 8% de divinilbenceno. Se encuentra en forma de cloruro en los tamaños de malla 50 a 100, 100 a 200, y 200 a 400. Puede convertirse a la forma hidróxido por regeneración con una solución de hidróxido de sodio (5 en 100). Insoluble en agua, en metano! y en acetonitrilo. Adecuada para uso en cromatografía de columna. [NOTA-Una resina adecuada es Dowex 1X8, producida por Dow Chemical Co. (www.dow.com){ disponible en Sigma-Aldrich (www.sigma-aldrich.com). Resina de Intercambio Aniónico de Estireno-Divinilbenceno de Malla 50 a 100-Resina fuertemente básica entrecruzada que contiene grupos de amonio cuaternario y aproximadamente 4% de divinilbenceno. Está constituida por perlas de color tostado que pueden fluir con relativa facilidad. Se encuentra disponible en forma de cloruro, que puede convertirse a la forma de hidróxido por regeneración con una solución de hidróxido de sodio (5 en 100). Para una regeneración satisfactoria, se requiere un tiempo de contacto de al menos 30 minutos después del cual se debe lavar todo exceso de álcali. Es insoluble en agua, en metano!
Reactivos / Especificaciones de Reactivos 2349
y en acetonitrilo. Apropiada para usar en cromatografía de columna. [NOTA-Una resina adecuada es "Dowex 1X4," producida por Sigma-Aldrich, www.sigma-aldrich.com.] CONTENIDO DE HUMEDAD DE LA RESINA COMPLETAMENTE REGENERADA e HINCHADA: Transferir de 1O a 12 mL de la resina (como se la recibe) a un matraz y convertirla completamente a la forma de cloruro mezclando con 150 mL de ácido clorhídrico (5 en 100) durante no menos de 30 minutos. Decantar el ácido y lavar la resina de la misma manera con agua destilada hasta que el agua de lavado sea neutra frente al tornasol. Transferir de 5 a 7 mL de la resina regenerada a un crisol filtrante de vidrio y remover solamente el exceso de agua de la superficie mediante un cuidadoso filtrado por succión. Transferir la resina seca y acondicionada a un frasco para pesada tarado y pesar. Secar en un horno al vacío entre 100º a 105º y a una presión de 50 mm de mercurio durante 16 horas. Transferir del horno al vacío a un desecador y enfriar a temperatura ambiente. Volver a pesar. La pérdida de peso está entre 50% y 65%. CAPACIDAD TOTAL DEL NUEVO VOLUMEN: Transferir de 2,5 a 3 mL de la resina acondicionada y sin secar (Ver Contenido de Humedad en la sección anterior) a una probeta graduada de 5 mL y llenarla con agua. Retirar todas las burbujas de aire del lecho de la resina con un alambre de acero inoxidable y dejar que la resina sedimente a su volumen mínimo golpeteando suavemente la probeta graduada. Registrar el volumen de la resina. Transferir la resina con 100 mL de agua a un matraz de 250 ml. Agregar 2 mL de ácido sulfúrico, calentar de 70º a 80º y mantener a esa temperatura durante 5 minutos mezclando ocasionalmente (no llevar a ebullición). Enfriar a temperatura ambiente y agregar 2,5 mL de ácido nítrico (1 en 2), 2 mL de sulfato férrico amónico SR y 0,20 mL de tiocianato de amonio O, 1 N. Valorar con nitrato de plata O, 1 N SV hasta que la solución se torne incolora y agregar un exceso medido (1 a 5 mL). Calentar hasta ebullición para coagular el precipitado de cloruro de plata. Enfriar a temperatura ambiente, agregar 1O mL de nitrobenceno, agitar vigorosamente y valorar el exceso de nitrato de plata con tiocianato de amonio O, 1 N SV. (volumen neto de AgN03 en mL x N)/(volumen de resina en mL) = mEq/mL La capacidad total de intercambio de la resina regenerada y húmeda es más de 1,0 mEq por ml. ANÁLISIS POR TAMIZADO HÚMEDO: El propósito de esta prueba es identificar correctamente el tamaño de malla de la resina. Para obtener un análisis por tamizado exacto se requieren aparatos y técnicas especiales. Agregar 150 mL de resina a 200 mL de agua destilada en un frasco apropiado y dejar en reposo durante al menos 4 horas para que la resina se hinche completamente. Transferir con una probeta graduada 100 mL de resina sedimentada y completamente hinchada al tamiz superior de una serie de tamices de latón de 20,3 cm (de malla 20; 50; 100). Lavar meticulosamente la resina de cada tamiz con una corriente de agua destilada hasta que la resina se clasifique completamente, recogiendo el agua de lavado en un recipiente adecuado. Lavar las perlas que hayan quedado en los tamices respectivos y volver a transferirlas a la probeta de 100 mL; registrar el volumen de resina sedimentada en cada tamiz: no menos de 80% de la resina está entre las mallas 50 y 1OO. Resina de Intercambio Aniónico Fuerte, Levemente Entrecruzada, en la Forma de Cloruro-Usar un grado adecuado. [NOTA-Una resina adecuada es la "AG 1-X4, número de catálogo 140-1331," producida por BioRad Laboratories, www.bio-rad.com.]
2350 Especificaciones de Reactivos
/Reactivos
Resina de Intercambio Catiónico-Usar un grado adecuado. [NOTA-Se puede obtener comercialmente un grado adecuado como "Dowex 50-W-X8-100" en Sigma-Aídrich, www.sigma-aldrich.com.] Resina de Intercambio Catiónico de Ácido SulfónicoUsar un grado adecuado. [NOTA-Se P,uede obtener comercialmente un grado adecuado como 'Amberlyst 15" o como "Dowex 50-W-X2" en Sigma-Aldrich, www.sigma-aldrich.com.] Resina de Intercambio Catiónico de Carboxilato (Forma Sódica) (Malla 50 a 100)-Usar un grado adecuado. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado como "BioRex 70" en B10Rad Laboratories, www.bio-rad.com.] Resina de Intercambio Catiónico de Estireno-Divinilbenceno-Resina sulfonada entrecruzada fuertemente ácida que contiene aproximadamente 2% de divinilbenceno. Está disponible en la forma ácida en los tamaños de malla 50 a 100, 100 a 200, y 200 a 400. Puede regenerarse a la forma hidrógeno tratándola con una solución de ácido clorhídrico (5 en 100). Para realizar una regeneración satisfactoria, se requiere un tiempo de contacto de al menos 30 minutos, después del cual se tiene que lavar todo exceso de ácido. Es insoluble en agua, en metanol y en acetonitrilo. Adecuado para uso en cromatografía de columna. CONTENIDO DE HUMEDAD DE RESINA COMPLETAMENTE REGENERADA Y EXPANDIDA: Transferir 1O a 12 mL de la resina (tal como se la recibió) a un matraz y convertirla completamente en la forma de hidrógeno mezclando con 150 mL de solución de ácido clorhídrico (5 en 100) durante no menos de 30 minutos. Decantar el ácido y lavar la resina de la misma manera con agua hasta que el agua de lavado sea neutra al tornasol (pH 3,5). Transferir 5 a 7 mL de la resina regenerada a un crisol de filtración de vidrio y eliminar solamente el exceso de agua de la superficie, mediante un filtrado por succión muy cuidadoso. Transferir la resina acondicionada a un frasco para pesada tarado y pesar. Secar en un horno al vacío a una presión de 50 mm de mercurio y a una temperatura entre 100º y 105º durante 16 horas. Transferir del horno al vacío a un desecador, enfriar hasta temperatura ambiente y pesar de nuevo. La pérdida de peso está entre 75% y 83%. CAPACIDAD TOTAL DE VOLUMEN HÚMEDO: Transferir 3 a 5 mL de la resina regenerada sin secar (ver Contenido de humedad más arriba) a una probeta graduada de 5 mL y llenarla con agua. Quitar todas las burbujas de aire del lecho de resina con un alambre de acero inoxidable y sedimentar la resina a su volumen mínimo golpeteando la probeta graduada para asentar la resina. Registrar el volumen de la resina. Transferir la resina a un vaso de precipitados de 400 ml. Agregar aproximadamente 5 g de cloruro de sodio y valorar con hidróxido de sodio O, 1 N, mezclando bien, hasta el punto final azul del azul de bromotimol {pH 7,0). (volumen neto de NaOH en mL x N)/{volumen de resina en mL) = mEq/mL La capacidad total de volumen húmedo de la resina es más de 0,6 mEq por ml. ANÁLISIS POR TAMIZADO HÚMEDO: El propósito de esta prueba es identificar correctamente el tamaño de malla de la resina. Para obtener un análisis por tamizado exacto se requieren aparatos y técnicas especiales. Agregar 150 mL de resina a 200 mL de agua en un frasco apropiado y dejar en reposo durante al menos 4 horas para que la resina se hinche completamente. Transferir mediante una probeta graduada 100 mL de resina sedimentada y completamente hinchada al tamiz superior de una serie de tamices de latón de 20,3 cm con designación Estándar de los EE.UU. Lavar meticulosamente
USP 39 la resina en cada tamiz con una corriente de agua hasta que la resina esté completamente clasificada, recolectando el agua de lavado en un recipiente adecuado. Lavar las perlas de resina que hayan quedado en los tamices respectivos transfiriéndolos a la probeta graduada de 100 mL y registrar el volumen de resina sedimentada en cada tamiz. Al menos el 70% de la resina estará dentro del tamaño de malla especificado. [NOTA-Una resina adecuada es Dowex 50WX2, producida por Dow Chemical Co. (www.dow.com) y disponible en Sigma-Aldrich (www.sigma-aldrich.com).] Resina de lntercam~io Catiónico de Estireno-Divinilbenceno, Fuertemente Acida-Usar un grado adecuado. [NOTA-Se ~uede obtener comercialmente un grado adecuado como 'Dowex-50-W-X8-100" en Sigma-Afdrich, www.sigma-aldrich.com.] Resina de Intercambio Catiónico de Poliestireno-Usar un grado adecuado. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado como Dowex-50X2-100, en Sigma-Aldrich, www.sigma-aldrich.com.] Resina de Intercambio lónico-Una mezcla homogénea de 4 partes de un intercambiador catiónico fuertemente ácido en la forma ácida (producido mediante sulfonación de un copolímero de estireno-divinilbenceno, que represente entre 8 y 10% de divinilbenceno) y 6 partes de un intercambiador aniónico fuertemente básico en la forma hidroxilo (producido mediante aminación con trimetilamina de un copolímero de estireno-divinilbenceno clorometilado, que represente entre 3 y 5% de divinilbenceno). [NOTA-Una resina adecuada es "Amberlite MB-150," disponible en Sigma-Aldrich, www.sigma-aldrich.com.] Rodamina 6G, C2aH31CIN2Ü3-479,02 un grado adecuado.
[989-38-8]-Usar
Rodamina B (Tetraetí/rodamina), C2aH31CIN203-479,01 [81-88-9]-Cristales verdes o polvo de color violeta rojizo. Muy soluble en agua; produce una solución de color rojo azulado muy fluorescente cuando se diluye. Muy soluble en alcohol; poco soluble en ácidos diluidos y en soluciones alcalinas. En soluciones de ácidos fuertes, forma un complejo de color rosa con antimonio, que es soluble en éter isopropílico. TRANSPARENCIA DE LA SOLUCIÓN: Su solución (1 en 200) es completa y transparente. RESIDUO DE INCINERACIÓN (Prueba para reactivos): Incinerar 1 g con 1 mL de ácido sulfúrico: el residuo no pesa más de 2 mg (0,2%). Rojo Congo, (32H22N6Na206S2--696,67 [573-58-0]Polvo rojo oscuro o marrón rojizo. Se descompone con la exposición a humos ácidos. Sus soluciones tienen un pH de aproximadamente 8 a 9,5. Un g se disuelve en aproximadamente 30 mL de agua. Es poco soluble en alcohol. PÉRDIDA POR SECADO (731 ): Secar a 105º durante 4 horas: no pierde más de 3,0% de su peso. RESIDUO DE INCINERACIÓN: Pesar con exactitud aproximadamente 1 g, previamente secado a 105º durante 4 horas, y colocarlo en un crisol o cápsula de porcelana. Incinerar cuidadosamente hasta que esté bien carbonizado, enfriar, agregar 2 mL de ácido sulfúrico e incinerar cuidadosamente hasta que el residuo se torne blanco o casi blanco. Enfriar, agregar 0,5 mL de ácido sulfúrico y 1 mL de ácido nítrico, evaporar e incinerar nuevamente hasta peso constante: el peso del sulfato de sodio así obtenido está entre 20,0% y 24,0% del peso de la muestra seca tomada. SENSIBILIDAD: A 50 mL de agua exenta de dióxido de carbono, agregar O, 1 mL de solución de rojo congo (1 en 1000). El color rojo de la solución se torna viofeta al agregar 0,05 mL de ácido clorhídrico 0, 1O N y recupera el
USP 39 color rojo tras agregar 0,05 ml de hidróxido de sodio O 1O N. ' Rojo de Fenol Sódico, C19H130sSNa-376,4 [34487-61-1 ]-Polvo de color rojo a marrón. Usar grado reactivo ACS. Rojo_ d~ ryietilo (Ácido 2-[4-Dir!1etilaminofenilazo]benzoico, C. l. Ro¡o Acido 2), C1sH1sN 302, acido libre-269,30 [493-52-7]; C1sH14N302Na, sal sódica-291,28 [845-10-3]-Usar grado reactivo ACS. Se recomienda el ácido libre para valoraciones no acuosas, en particular c~a~do se usa un disolvente aprótico. Se recomienda la sal sod1ca para valoraciones en medios acuosos y también para valoraciones no acuosas cuando el medio es un disolvente anfiprótico. Se recomienda la sal clorhidrato para valoraciones en medios acuosos y disolventes anfiprót1cos. Rojo de Rutenio (Oxicloruro de Rutenio Amoniacal), Ru2(0H)2Cl4 · 7NH3 · 3H20-551,23 [11103-72-3]-Polvo rojo amarronado a púrpura oscuro. Soluble en agua. Rojo Directo 80, C4sH26N10Na6021S6-1373,07 [2610-10-8]-Polvo rojo. Soluble en agua; muy poco soluble en alcohol. Usar un grado adecuado. Rosa de Bengala Sódico (Sal Disódica de 4,5,6,7-Tetracloro2',4',5',l'-tetrayodofluoresceína), C20H2Cl414Na20 5-1017,64 [632-69-9]-Polvo cristalino o cristales finos de color rosado. Soluble en agua. . . [NOTA-Co_nvertir a la p~reza ade~ua_da el materi~I disponible comercialmente mediante el s1gu1ente tratamiento. Disolver 8 g en 200 ml de agua y ajustar a un pH entre 1O y 11, usando un papel indicador de pH de intervalo corto. Agregar 200 ml de acetona, mezclando suavemente, y luego a_gr~gar ácido clorhídrico diluido (1 en 1O) mientras se continua mezclando, hasta que el pH de la solución lleQUe a 4,0. Agregar 400 ml más de agua, mezclando, y continuar mezclando durante 5 minutos. Filtrar los cristales en un e.m.budo de filtración y devolver los cristales al vaso de prec1p1tados empleado para la cristalización. Recristalizar tres veces más del mismo modo y secar los cristales a 11 Oº durante 12 horas. Almacenar en un frasco de color ámbar en un refrigerador a una temperatura entre 2º y 8º. Preparar este reactivo de nuevo cada mes.] PUREZA CR~~ATOGRÁFICA: Diso~ver 100 mg de rosa de bengala sod1co, preparado segun se describe anteriormente, en 100 ml de agua y aplicar 1O µL de la solución sobre papel para cromatografía adecuado. Desarrollar el cromatograma mediante cromatografía ascendente, utilizando una n:iez~I~ de 1 parte ~e a~c~hol diluido (1 en 4) y 1 parte de h1drox1do de amomo d1lu1do (1 en 12). Examinar el cromatograma a la luz diurna y bajo luz UV (360 nm): no se observa ninguna mancha coloreada ni fluorescente que no sea la mancha de rosa de bengala sódico. [NOTA-Se puede obtener comercialmente un grado adecuado como "Gel de Sílice H".] Sacarosa-Usar Sacarosa (monografía del NF). Sacarosa Polimérica Ramificada-aproximadamente 400 kDa [26873-85-8]-Polvo blanco a blanquecino. Polímero sintético formado por la copolimerización de la sacarosa y la epiclorohidrina. Usar un grado adecuado. [NOTA-Se ~uede obtener comercialmente un grado adecuado como 'Ficoll" en Pharmacia Fine Chemicafs lnc. 800 Centennial Ave., Piscataway, NJ 08854.] ' ' Safranina O [477-73-6]-Polvo de color rojo oscuro formado por una mezcla de cloruro de 3,7-diamino-2 8-dimetil-5-fenilfenazinio, C20H19CIN4-350,85 y cloruro d~ 3 7-diamino-2,8-dimetil-5-o-tolilfenazinio, C21H21 CIN4-364,B8Moderadamente soluble en alcohol al 70 por ciento produciendo una solución de color rojo claro con una flu¿rescencia de color rojo amarillento.
Reactivos / Especificaciones de Reactivos 2 351 IDENTIFICACIÓN A: , A_ 1O ml d,e ~na solución al 0,5% p/v, ~gregar 5 ml de ac1do clorh1drico: se produce una solucion de color violeta azulado. B: A 1O ml de una solución al 0,5% p/v, agregar 5 ml de solución de hidróxido de sodio (1 en 5): se produce un precipitado rojo amarronado. C: A 100 mg, agregar 5 ml de ácido sulfúrico: se produce una solución verde que, al diluirse, cambia a color azul y, ~inalmente, a rojo., (ARACTERISTICAS DE ABSORCION: Disolver 50 mg en 250 ml de alcohol al 50 por ciento. Diluir 3 ml de esta solución con alcohol al 50 por ciento hasta obtener 200 ml. Determinar la absorbancia, en una celda de 1 cm, con un espectrofotómetr_o adecuado. La absorbancia máxima se ¡:>roduce en el intervalo de 530 a 533 nm; el cociente (P 15)/(P + 15) se encuentra entre 1, 1O y 1,32, en donde P es la longitud de onda de máxima absorbancia. [NOTA-Se, puede obtener un wado ade~uado con el número de catalogo 10,214-8 en S1gma-Aldnch, www.sigmaaldrich.com.] · Sal de Fast Blue B, C14H12N402 · ZnCl4-475,47 [91-91-8]-Polvo verde. PÉRDIDA POR SECADO (731 ): Secar al vacío a 11 Oº durante 1 hora: no pierde más de 5,0% de su peso. ABSORBANCIA: Disolver 50 mg en 100 ml de agua. En un segundo recipiente disolver 100 mg de 2-naftof en 100 ml de 2-metoxietanol. Pipetear 5 ml de la solución de prueba y 1O ml de la solución de 2-naftol, transferirlos a un matraz volumétrico de 100 ml y diluir a volumen con acetona. Para el blanco, pipetear 5 ml de agua y 1O ml de la solución de 2-naftol, transferirlos a un segundo matraz volumétrico de 100 ml y diluir a volumen con acetona. Determinar la absorbancia de la solución de prueba en una celda de 1 cm a la longitud de onda de máxima absorbancia, aproximadamente a 545 nm, con un espectrofotómetro adecuado, usando el blanco para ajustar el instrumento: la absorbancia no es menor de 0,80. Sal de Fast Blue BB, (C11H1sCIN303)2 · ZnCb--831,89 [15710-69-7]-Polvo amarillo que funde aproximadamente a 162º, con descomposición. Moderadamente soluble en agua. CLORUROS: Transferir aproximadamente 80 mg, pesados con exactitud, a un vaso de precipitados adecuado. A<;1regar 25 _mL de acetona, 25 ml de agua y 500 mg de nitrato de sodio. Mezclar hasta completar la disolución. Valorar ~on nitrato ~e p_la~a 0,01 N SV, 9eterminando el pun!o final potenc1ometncamente. Realizar una determinacion con un blanco y hacer las correcciones necesarias. No se encuentra menos de 15,0% de cloruro. Sal Disódica del Ácido Cromotrópico (Ácido 4,5-Dihidroxi2,7-naftalenodisulfónico, Sal Disódica), C10 H6 0 8 Na2 S2 • 2H20-400,29 [5808-22-0]-Usar grado reactivo ACS. Sal Disódica del Ácido 3-(2-piridil)-5 6-di(2-furil)-1 2 4-triazina-5',5"-disulfónico, (Sal Disódica de 3-(2-PirÍdÍl)-5 6-bis(5-sulfo-2-furil)-1,2,4-triazina, Hidrato), ' C16HsN4Na20sS2-494,37 [79551-14-7]-Usar un grado adecuado. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado como número de producto P4272 en Sigma-Aldrich, 1-800-558-9160; www.sigma-afdrich.com.] Sal Nitroso R (Disu/fonato de 1-Nitroso-2-nafto/-3 6-disodio) NOC10H40H(S03Na)2-377,26 [525-05-3]-PoÍvo crista- ' lino o cristales amarillos. Un g se disuelve en aproximadamente 40 ml de agua; insoluble en alcohol. SENSIBILIDAD: Disolver 500 mg de acetato de sodio en una solución de 0,4 mg de cloruro cobaltoso (O, 1 mg de cobalto) en 5 ml de agua. Agregar 1 ml de ácido acético diluido y, a continuación, 1 ml de una solución de sal
2352 Especificaciones de Reactivos /
Reactivos
nitroso R (1 en 500): de inmediato se produce un color rojo que persiste cuando la solución se calienta a ebullición con 1 mL de ácido clorhídrico durante 1 minuto. Sal Sódica de Octil Sulfato, CsH11Ü4SNa-232,27-Polvo blanco. SOLUBILIDAD: Una porción de 2 g se disuelve en 100 mL de agua. INTERVALO DE FUSIÓN (741): entre 195º y 197º, con descomposición. Sal Sódica del Ácido 1-Butanosulfónico (1-Butanosulfonato de sodio), C4H9Na03S-160, 16 [2386-54-1 ]-Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 99,0%. Sal Sódica del Ácido Octanosulfónico (7 -Octanosulfonato de sodio), CsH17NaQ3S, CsH11Na03S · H20-216,27, anhidro;-234,27, hidrato [5324-84-5, anhidro; 207596-29-0,hidrato]-Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 99,0%. Sal Sódica del Ácido 1-Pentanosulfónico-Ver 1-Pentanosulfonato de Sodio. Sales Biliares-Concentrado de bilis bovina cuyo constituyente principal es el desoxicolato de sodio, determinado como ácido cólico. Soluble en agua y en alcohol; las soluciones forman abundante espuma si se agitan. SUSTANCIAS INSOLUBLES: Disolver 5 g en 100 mL de alcohol diluido (84 en 100), calentando si fuera necesario para facilitar la disolución. Filtrar dentro los 15 minutos a través de un filtro tarado y lavar con porciones pequeñas del alcohol diluido hasta que el último lavado sea incoloro o prácticamente incoloro, luego secar el residuo a 105º durante 1 hora y pesar: el peso del residuo no es más de 0,1%. VALORACIÓN Solución estándar de ácido cólico: Disolver 50,0 mg de ácido cólico, pesados con exactitud, en ácido acético diluido (6 en 1O) para obtener 100 mL y mezclar. Almacenar en un refrigerador. Procedimiento: Disolver 1,0 g, pesado con exactitud, en 50 mL de ácido acético diluido (6 en 1O). Filtrar la solución, si fuera necesario, a un matraz volumétrico de 100 mL, lavar el recipiente original y el filtro con porciones pequeñas de ácido acético diluido (6 en 1O), agregar el mismo ácido acético a volumen y mezclar. Diluir 1O mL de esta solución, medida con exactitud, con ácido acético diluido (6 en 1O) para obtener 100 mL y mezclar. Pipetear 1 mL de la Solución estándar de ácido cólico y 1 mL de la solución de Sales Biliares y transferir a dos tubos de ensayo pareados. A cada tubo agregar 1 mL, medido con exactitud, de una solución de furfural recién preparada (1 en 100), colocar los tubos inmediatamente en un baño de hielo durante 5 minutos y luego agregar a cada tubo 1 3 mL, medidos con exactitud, efe ácido sulfúrico diluido, obtenido mezclando con cuidado 50 mL de ácido sulfúrico con 65 mL de agua. Mezclar el contenido de los tubos y colocarlos en un baño de agua a una temperatura de 70º durante 1O minutos. Transferir inmediatamente los tubos a un baño de hielo durante 2 minutos y luego determinar la absorbancia de cada solución a la longitud de onda de máxima absorbancia, aproximadamente a 670 nm, con un espectrofotómetro adecuado. Calcular la cantidad, en mg, de ácido cólico (C24H400 5) en el peso de las Sales de Bilis tomadas, por la fórmula:
500(Au/As) en donde Au y As son las absorbancias de las soluciones de las Sales Biliares y de la Solución estándar de ácido cólico, respectivamente. No se encuentra menos de 45% de ácido cólico.
USP 39 Salicilaldazina, C1 4H12N202-240,26 [959-36-4)-Usar un grado adecuado o preparar según se indica a continuación. Disolver 300 mg de sulfato de hidrazina en 5 mL de agua, agregar 1 mL de ácido acético glacial y 2 mL de una solución recién preparada de salicilaldehído en alcohol isopropílico (1 en 5), mezclar y dejar en reposo hasta que se forme un precipitado amarillo. Extraer la mezcla con dos porciones de 15 mL de cloruro de metileno. Combinar los extractos de cloruro de metileno y secar sobre sulfato de sodio anhidro. Decantar la solución de cloruro de metileno y evaporar hasta sequedad. Recristalizar el residuo de salicilaldazina a partir de una mezcla tibia de tolueno y metano! (60:40) enfriando posteriormente. Filtrar los cristales y secar al vacío. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado con el número de catálogo 218090 en MP Biochemicals (www.mp bio.com).] Salicilaldehído, (2-Hidroxibenzaldehído), 2-HOC6H4CH0122, 12 [90-02-8)-Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 98,0%. Salicilato de Etilo, C9H10Ü3-166, 17 [118-61-6)-Líquido incoloro. VALORACIÓN: Inyectar una muestra apropiada en un cromatógrafo de gases adecuado (ver Cromatografía (621 )) equipado con un detector de ionización a la llama, usando helio como gas transportador. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas: una columna capilar de 0,25 mm x 1O m, recubierta con una capa de 1 µm de metilsilicona; mantener la temperatura del inyector a 240º, la del detector a 300º y la de la columna a 150º, programada para que aumente 1Oº por minuto hasta 250º. El área del pico de salicilato de etilo no es menos de 99% del área total. ÍNDICE DE REFRACCIÓN (831): entre 1,5216 y 1,5236 a 20º. Salicilato de lsopropilo, C6H40HCOOCH(CH3)2-180,20Líquido incoloro. VALORACIÓN: Inyectar una muestra apropiada en un cromatógrafo de gases adecuado (ver Cromatografía (621 )) equipado con un detector de ionización a la llama, usando helio como gas transportador. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas: una columna de vidrio de 2 mm x 1,8 m, rellena con fase G2 al 7% sobre soporte Sl A; mantener la temperatura del inyector a 250º; mantener la temperatura del detector a 31 Oº; mantener la temperatura de la columna a 50º y programar para que aumente 1Oº por minuto hasta 250º. El área del pico principal no es menos de 97% del área total. Salicilato de Sodio [54-21-7)-Cumple con las especificaciones en Salicilato de Sodio (monografía de la USP), y además cumple con los requisitos de la siguiente prueba. NITRATOS: Disolver 100 mg en 5 mL de agua y superponer la solución sobre 5 mL de ácido sulfúrico: no aparece color rojo amarronado en la zona de contacto de los dos líquidos. Sangre (para la prueba de monóxido de carbono en gases)-Usar sangre oxalatada o desfibrinada canina, ovina, vacuna o humana dentro de las 24 horas posteriores a la extracción. Preparar sangre oxalatada agregando 1O mg de oxalato de sodio a cada mL de sangre recién extraída. Sebacato de Bis(2-etilhexilo) (Sebacato de Dioctilo), CsH1100C(CH2)sCOOCsH11-426,67 [122-62-3)-Líquido pálido de color pajizo. Insoluble en agua. Su índice de refracción es de aproximadamente 1,448. Adecuado para usarse en cr9matografía de gases. PESO ESPECIFICO, 20º/~0º(841): entre 0,913 y 0,917. INTERVALO DE EBULLICION (721 ): entre 243º y 248º a 5 mm de mercurio. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado como "Sebacato de Dioctilo" en Sigma-Aldrich, www.sigma-aldrich.com.]
Reactivos /Especificaciones de Reactivos 2353
USP 39 Selenio, Se-Peso atómico 78,96 [7782-49-2]-Polvo cristalino amorfo, de color rojo oscuro o negro azulado. Soluble en soluciones de hidróxidos o sulfuros de sodio y potasio; insoluble en agua. Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 99,99%. Selenita de Sodio, Na2Se03-172,94 [10102-18-8]Polvo blanco, inodoro, cristalino, por lo general parcialmente hidratado. Fácilmente soluble en agua; insoluble en alcohol. VALORACIÓN: Pesar con exactitud aproximadamente 180 mg, secados previamente a 120º hasta peso constante y disolverlo en 50 mL de agua en un matraz con tapón de vidrio. Agregar, sucesivamente, 3 g de yoduro de potasio y luego 5 mL de ácido clorhídrico, tapar y dejar en reposo durante 1O minutos. Agregar 50 mL de agua, 50,0 mL de tiosulfato de sodio 0, 1 N SV y 3 mL de almidón SR y de inmediato valorar con yodo O, 1 N SV hasta un color azul. Realizar una determinación con un blanco. La diferencia en los volúmenes de yodo 0, 1 N equivale a 4,323 mg de Na2Se0 3. Se encuentra entre 98% y 101 %. SOLUBILIDAD: Un g en 1O mL de agua no presenta más que una leve turbidez. CARBONATOS: A 500 mg agregar 1 mL de agua y 2 mL de ácido clorhídrico diluido: no se produce efervescencia. CLORUROS (Prueba para reactivos): Una porción de 500 mg no presenta más de 0,05 mg de CI (0,01 %). NITRATOS (Prueba para reactivos): Una porción de 200 mg disuelta en 3 mL de agua no presenta más de 0,02 mg de N03 (0,01 %). SELENATOS y SULFATOS (como S04): A 500 mg en una pequeña cápsula para evaporación agre~ar 20 mg de carbonato de sodio y 1O mL de ácido clorh1drico. Evaporar la solución, lentamente y hasta sequedad, en un baño de vapor bajo una campana de extracción. Lavar las paredes de la cápsula con 5 mL de ácido clorhídrico y volver a evaporar hasta sequedad. Disolver el residuo en una mezcla de 15 mL de agua caliente y 1 mL de ácido clorhídrico. Proceder según se indica en Sulfato en Reactivos (Prueba para reactivos, Método f), comenzando donde dice "Filtrar la solución". La muestra de prueba no presenta más turbidez que la producida por 0, 15 mg de S04 (0,03%).
Cambio en la redacción:
Selenometionina, CsH11N02Se-196,11 [1464-42-2]Manif ular con cuidado ya que este reactivo es altamente tóxico. VALORACIÓN: Pesar con exactitud aproximadamente 750 mg, disolver en 100 mL de metano!, agregar cristal violeta SR y valorar con ácido perclórico O, 1 N hasta un punto final verde azulado. Cada mL de ácido perclórico 0, 1 N equivale a 19,61 mg de CsH11 N02Se: se encuentra entre 97,0% y 103,0%, calculado con respecto a la sustancia tal como se encuentra. INTERVALO DE FUSIÓN (741 ): aproximadamente 260º, con descomposición. •DETERMINACIÓN DE NITRÓGrno {461 )e (AF 01-may-2016¡: Determinar por el método Kjeldahl: se encuentra entre 6,8% y 7,4%, calculado con respecto a la sustancia tal como se encuentra.
blanco. Insoluble en agua, en ácidos y en soluciones diluidas de hidróxidos alcalinos. PÉRDIDA POR INCINERACIÓN: Pesar con exactitud aproximadamente 4 g e incinerar hasta peso constante: no pierde más de 10,0% de su peso. IMPUREZAS ORGÁNICAS: No se oscurece visiblemente cuando se incinera. PÉRDIDA POR SECADO (731 ): Secar a 11 Oº durante 2 horas: no pierde más de 2,0% de su peso. [NOTA-"Chromosorb P" y "Chromosorb W", disponibles en Grace, www.grace.com, son grados adecuados.] Sílice Silanizada, Fundido-Calcinada y Lavada con Ácido para Cromatografía-Usar un grado adecuado. [NOTA-Existen grados adecuados disponibles comercialmente como "Aeropak 30", "Diatoport S" y "Gas-Chrom Z".] Silicona (75 por ciento Fenil, Metil)-Usar un grado adecuado. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado como "OV25".]
Cambio _en
lo redacción:
/3-Sitosterol (22:23 Dihidroestigmasterol), C29Hso0-414,7 [83-46-5]-Polvo blanco. Soluble en cloroformo. Almacenar en un congelador. ROTACIÓN ESPECÍFICA (781 S): entre -33º y -39º, determinada en una solución con 0,5 g de muestra de prueba por mL de cloroformo. •oeTERMINAClÓN. DE AGUA, Mét-odo 1(921). (AFO!-may-2016): no más de 6%. Sodio, Na-Peso atómico 22,98977 grado reactivo ACS.
[7440-23-5]-Usar
Sodio, Fosfato Monobásico de-Ver Fosfato Monobásico de Sodio.
Solución de Amoníaco Diluida-Usar Amoníaco SR. Solución de terc-Butilhidroperóxido (T-HJORO, TBHP), C4H1002-90, 12 [75-91-2j-70% p/p en agua. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado en www.sigma-aldrich. com con número de catálogo 458139.]
[PRECAUCIÓN:
Silicato de Magnesio Activado-Usar un grado adecuado. Silicato de Magnesio para Cromatografía-Gel de sílice y magnesia, duro y pulverizado (malla 60 a 100), extremadamente blanco. Adecuado para uso como adsorbente en cromatografía en columna. Sílice de Diatomeas Calcinado [68855-54-9]-Una forma de sílice (Si02) que consta de frústulas fundidas y fragmentos de diatomeas. Polvo amorfo fino, de color rosado claro o
Solución de Formaldehído, HCH0-(30,03) y agua-Usar reactivo grado ACS. Solución de Hidróxido de Cuprietilendiamina 1,0 Musar un grado adecuado. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado de GFS Chemicals, www.gfschemicals.com.] Solución de Hidróxido Tetrametilamonio en Metanol [75-59-2]-Una solución de hidróxido de tetrametilamonio [(CH3)4NOH-91, 15] en metano!. Por lo general está disponible en concentraciones de 10% y 25%. Las especificaciones siguientes se aplican específicamente a la concentración de 25%; para otras concentraciones, puede ser necesario realizar ajustes apropiados en los procedimientos. VALORACIÓN: Pesar con exactitud aproximadamente 1 g de la solución y diluir con agua hasta aproximadamente 50 mL. Agregar fenolftaleína SR y valorar con ácido clorhídrico O, 1 N SV hasta que desaparezca el color rosado: cada mL de ácido clorhídrico 0, 1 N SV equivale a 91, 15 mg de (CH 3)4NOH. Se encuentra entre 23% y 25%. TRANSPARENCIA: Una porción del artículo en un tubo de ensayo es transparente, o apenas levemente turbia, cuando se la observa transversalmente.
2354 Especificaciones de Reactivos /
Reactivos
Solución de Hipoclorito de Sodio, [7681-52-9]-Una solución de hipoclorito de sodio (NaCIO) en agua. Generalmente de color amarillo a verde amarillento. Tiene olor a cloro. Es afectada por la luz y se deteriora gradualmente. Almacenar en envases resisten,tes a la luz, preferentemente por debajo de 25º. [PRECAUCION: Esta solución es corrosiva y puede despedir gases tóxicos y corrosivos. Es un oxidante poderoso y puede reaccionar violentamente con agentes reductores. Es irritante y corrosiva para la piel y las membranas mucosas.] VALORACIÓN: Transferir a un matraz para yodo, tarado y con tapón de vidrio, aproximadamente 3 ml y pesar con exactitud. Agregar 50 ml de agua, 2 g de yoduro de potasio y 1O ml de ácido acético. Tapar el matraz y dejar en reposo durante 1O minutos en la oscuridad. Retirar el tapan, enjuagar las paredes del matraz con algunos ml de agua y valorar el yodo liberado con tiosulfato de sodio O, 1 N SV, agregando 3 ml de almidón SR a medida que se acerca al punto final. Cada ml de tiosulfato de sodio O, 1 N consumido equivale a 3,722 mg de NaCIO: se encuentra no menos de 5,25%. Si se desea calcular el porcentaje de cloro disponible, tomar en consideración que cada ml de tiosulfato de sodio O, 1 N consumido equivale a 3,545 mg de cloro disponible. CALCIO: Transferir 10,0 g a un vaso de precipitados de 150 ml, disolver en 1O ml de agua y agregar 5 ml de ácido clorhídrico y 2 g de yoduro de potasio. Calentar la mezcla durante 5 minutos, enfriar y agregar 2 ml de peróxido de hidrógeno al 30%. Evaporar hasta sequedad, enfriar y agregar 2 ml de ácido clorhídrico y 2 ml de peróxido de hidrógeno al 30%. Enjuagar las paredes internas del vaso de precipitados con algunos ml de agua y evaporar hasta sequedad. Recoger el residuo en 20 ml de agua y filtrar, si fuera necesario. Agregar hidróxido de amonio al filtrado hasta que la solución se torne apenas alcalina, luego agregar 4 gotas de hidróxido de amonio y 5 ml de oxalato de amonio SR: si se produce turbidez dentro de los 15 minutos, ésta no excede la turbidez obtenida de un blanco que contenga O, 1 mg de calcio agregado sometido al mismo procedimiento (0,001 %). FOSFATOS (Prueba para reactivos): Transferir 2 g a un vaso de precipitados y agregar 5 ml de ácido clorhídrico y 2 g de yoduro de potasio. Calentar la solución durante 5 minutos y enfriar. Agregar 2 ml de peróxido de hidrógeno al 30% y evaporar la solución hasta sequedad. Enjuagar las paredes del vaso de precipitados con algunos ml de agua y agregar 2 ml de ácido clorhídrico y 2 ml de peróxido de hidrógeno al 30%. Evaporar nuevamente hasta sequedad: el residuo presenta no más de 0,01 mg de P04 (5 ppm). Solución de Peróxido de Hidrógeno-Usar Solución Tópica de Peróxido de Hidrógeno (monografía de la USP). Solución Isotónica de Cloruro de Sodio-Usar Solución Salina SR. Solución Proteica Estándar (8 g/dl)-Una solución que contiene 5 g de Albúmina Humana y 3 g de gammaglobulina humana por dl. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado como Solución Estándar de Proteína, catálogo número 540-1 O, en Sigma-Aldrich, www.sigma-aldrich.com.] Soportes para Cromatografía de Gases-Ver soportes para cromatografía de gases en Cromatografía (621 ), Columnas Cromatográficas.
Sorbitol-Usar Sorbitol (monografía del NF). Subnitrato de Bismuto (Nitrato Básico de Bismuto(/11)), BisO(OH)g(N03)4-1461,99 [1304-85-4]-Usar Subnitrato de Bismuto (monografía de la USP).
USP 39 Sudán 111, C22H15N40-352,39 [85-86-9]-Polvo rojo a marrón rojizo. Usar un grado adecuado. VALORACIÓN: Cuando se analiza por cromatografía en capa delgada (ver Cromatografía (621 )) usando placas recubiertas con mezcla de gel de sílice para cromatografía y una fase móvil constituida por una mezcla de hexano y acetato de etilo (80:20) y se examina bajo luz UV de longitud de onda corta, presenta una única mancha con trazas de impurezas. [85-83-6]-Polvo marrón Sudán IV, C24H20N40-380,44 a marrón rojizo. VALORACIÓN: Transferir aproximadamente 25 mg, pesados con exactitud, a un matraz volumétrico de 100 ml. Disolver en cloroformo, diluir a volumen con cloroformo y mezclar. Diluir 2,0 ml de la solución resultante hasta 50,0 ml con cloroformo. Determinar la absorbancia de esta solución en celdas de 1 cm a la longitud de onda de máxima absorbancia, aproximadamente a 520 nm, con un espectrofotómetro adecuado, usando cloroformo como blanco. Calcular el porcentaje de Sudán IV en la muestra de prueba tomada, por la fórmula: (1 OOA)/(85C) en donde A es la absorbancia a 520 nm y C es la concentración de la muestra de prueba en g por L. No se encuentra menos de 90%. PÉRDIDA POR SECADO (731 ): Secar a 105º durante 2 horas: no pierde más de 10% de su peso. Sulfamato de Amonio, NH40S02NH2-114, 13 [7773-06-0]-Usar grado reactivo ACS. Sulfamerazina (4-Amino-N-(4-metil-2-pirimidinil)bencenosulfo[127-79-7]-Usar un namida), C11H12N402S-264,30 grado adecuado con un contenido de no menos de 99,0%. Sulfanilamida, C5HsN202S-172,20 [63-74-1 ]-Usar ER Punto de Fusión de Sulfanilamida USP. Sulfatiazol Sódico (Sal Sódica de 4-Amino-N-2-tiazolilbence[144-74-1 ] nosulfonamida), C9HsN3Na02S2-277,29 Usar un grado adecuado. Sulfato Ácido de Potasio, KHS04-136, 17-Cristales blancos. Soluble en agua. PUNTO DE FUSIÓN (741 ): aproximadamente 197º. Sulfato Ácido de Sodio (Bisulfato de Sodio), NaHS04120,06 [7681-38-1 ]-Fácilmente soluble en agua; muy soluble en agua en ebullición. En alcohol se descompone en sulfato de sodio y ácido sulfúrico libre. Usar un grado reactivo adecuado. PUNTO DE FUSIÓN (741): aproximadamente 315º. Sulfato Ácido de Tetrabutilamonio, C15H31N04S-339,54 [32503-27-8]-Polvo blanco cristalino. Soluble en alcohol, produciendo una solución incolora levemente turbia. VALORACIÓN: Disolver aproximadamente 170 mg, pesados con exactitud, en 40 ml de agua. Valorar con hidróxido de sodio O, 1 N SV, determinando el punto final potenciométricamente. Realizar una determinación con un blanco y hacer las correcciones necesarias. Cada ml de hidróxido de sodio O, 1 N equivale a 33,95 mg de C15H31N04S. No se encuentra menos de 97,0%. INTERVALO DE FUSIÓN (741): entre 169º y 173°. Sulfato Ácido de Tetrahexilamonio, C24Hs3NÜ4S---451,75 [32503-34-7]-Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 98,0%. Sulfato Cérico, Ce(S04)2 con una cantidad variable de agua-(anhidro) 332,24 [13590-82-4]-También puede
U~39
Reactivos / Especificaciones de Reactivos 2355
\. contener sulfatos de otros elementos térreos poco comunes asociados. Cristales o polvo cristalino de color amarillo a amarillo anaranjado. Prácticamente insoluble en a9ua fría, le~tan:i~nte soluble en ácidos mineral~s diluidos fnos, pero mas fac1lmente soluble cuando se calienta con estos disolventes. VALORACIÓN: Pesar con exactitud aproximadamente 800 mg, transferir a un matraz, agregar 25 ml de agua y 3 ml de ácido sulfúrico y entibiar hasta disolver. Enfriar y a~~egar 60 ml ,de una mezcla de 1 volumen de ácido fos; fonco y 20 volumenes de agua. Agregar 25 ml de solucion de yoduro de potasio (1 en 1O), tapar el matraz y dejar en reposo durante 15 minutos. Reemplazar el aire ubicado sobre la solución por dióxido de carbono y, mientras continúa el flujo de dióxido de carbono hacia el interior del matraz, valorar el yodo liberado con tiosulfato de sodio O, 1 N SV, agregando 3 ml de almidón SR cerca del punto final. Cada ml de tiosulfato de sodio O, 1 N equivale a 33,22 mg de Ce(SQ4)2. No se encuentra menos de 80,0%. CLORUROS (Prueba para reactivos): Disolver 1 g en una mezcla de 5 ml de ácido nítrico y 4 ml de agua. Filtrar, si fuera necesario, y diluir con agua a 20 ml. A 1O ml de la dilución, agregar 1 ml de nitrato de plata SR, dejar en reposo durante 1O minutos y filtrar hasta que se torne transparente. A los 1O ml restantes de solución de prueba, agregar 1 ml de nitrato de plata SR: si se produce turbidez, ésta no excede la de un control que se prepara agregando 0,05 mg de CI al filtrado obtenido a partir de los primeros 1O ml de la solución de prueba (0,01 %). METALES PESADOS: Calentar 500 mg con una mezcla de 1O ml de agua y 0,5 ml de ácido sulfúrico hasta que se complete la disolución. Enfriar, diluir con agua a 50 ml y hacer burbujear gas de sulfuro de hidrógeno a través de la solución hasta que esté saturada: el precipitado que se forma es blanco o no más oscuro que amarillo palido. HIERRO: Disolver 100 m9 en una mezcla de 5 ml de agua y 2 ml de ácido clorhídrico, entibiándola si fuera necesario, y enfriar. Transferir a una probeta con tapón de vidrio, diluir con agua a 25 ml y agregar 5 ml de tiocianato de amonio SR y 25 ml de éter. Agitar bien, aunque suavemente, y dejar que las capas se separen: si se produce color rosado en la capa de éter, éste no es mas oscuro que el de un control, preparado de manera similar, que contenga 0,02 mg de Fe agregado (0,02%). Sulfato Cérico Amónico, Ce(S04)2 · 2(NH4)2S04 · 2H20632,55-Cristales de color amarillo a anaranjado-amarillento. Se disuelve lentamente en agua, pero más rápidamente en presencia de ácidos minerales. Usar grado reactivo ACS. Sulfato Cúprico, CuS04 · 5H20-249,69-Usar grado reactivo ACS. Sulfato Cúprico Anhidro, CuSQ4-159,61 [7758-98-7]Polvo blanco o blanco grisáceo exento de un matiz azul. Se torna azul con la adición de una pequeña cantidad de agua. Soluble en agua. Almacenar en envases impermeables. CLORUROS (Prueba para reactivos): Un g presenta no más de 0,02 mg de CI (0,002%). SUSTANCIAS NO PRECIPITADAS POR SULFURO DE HIDRÓGENO: Determinar según se indica para Acetato Cúprico grado reactivo ACS: el residuo no pesa más de 6 mg (O, 15%). Sulfato de Adenina, (CsHsNs)2 · H2S04 · 2H20-404,36Cristales blancos o polvo cristalino. Funde, después de secar a 11 Oº, aproximadamente a 200º con algo de descomposición. Un g se disuelve en aproximadamente 160 ml de a9ua; menos soluble en alcohol. Soluble en soluciones de hidróxido de sodio. No se precipita con una solución de yodo SR o yodomercuriato de potasio SR, pero se forma un precipitado con trinitrofenol SR. RESIDUO DE INCINERACIÓN (Prueba para reactivos): inapreciable, usando 100 mg.
AGUA: Secar a 105º hasta peso constante: no pierde más de 10,0% de su peso. Sulfato de Aluminio y Potasio, AIK(S04)2 · 12H20-474,39 [10042-67-1 ]-Usar grado reactivo ACS. Sulfato de Amonio, (NH4)2S04-132, 14 Usar grado reactivo ACS.
[7783-20-2]-
Sulfato de Amonio Ferroso, Fe(NH4)i(SQ4)2 · 6H 20392, 14-Usar grado reactivo ACS. Sulfato de Anilina, C12H14N2 · H2SQ4-284,33 [542-16-5]-Usar un grado adecuado. Sulfato de Brucina, (C23H26N2Ü4)2 · H2S04 · 7H20-1013, 11 [60583-39-3]-Usar grado reactivo ACS.
~~~1Jii:1l~i,21 Dihidrato CaSQ4 · 2H20-172, 17 ·--~~Riiil!ll!ll--Usar grado reactivo ACS.
Sulfato de Cinc Heptahidrato, ZnS0 4 . 7H 20-287 54 [7446-20-0]-C~istales, gránulos o polvo inodoro. ' PUNTO DE FUSION (7 41 ): 100º. DENSIDAD: 1,97.
r
Sulfato de Cromo Potasio Dodecahidrato, CrK(S04)2 · 12H20-499,40 10279-63-7]-Usar grado reactivo ACS. Sulfato de Estricnina, (C21 H22N202)2 · H2SQ4 · 5H20856,98 [60-41-3]-Cristales incoloros o blancos, o polvo blanco cristalino. Sus soluciones son levógiras. Un g se disuelve en aproximadamente 35 partes de agua, en 85 ml de alcohol y en aproximadamente 220 ml de cloroformo. Insoluble en éter. SOLUBILIDAD: Una solución de 500 mg en 25 ml de agua es transparente e incoJora y su disolución es completa. RESIDUO DE INCINERACION (Prueba para reactivos): no más de 0,1%. BRUCINA: A 100 mg agregar 1 ml de ácido nítrico diluido (1 en 2): se puede observar un color amarillo, pero no un color rojo o marrón rojizo. Sulfato de Gadolinio, Gd2(S04)3 · 8H20-746,83 [13628-54-1 ]-Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 99,9%. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado con el número de catálogo 41111 en www.gfs chemicals.com.] Sulfato de Hidrazina, (NH2)2 · H2S04-130, 12 [10034-93-2]-Usar grado reactivo ACS. [PRECAUCIÓN-Debe tenerse extremo cuidado al manipular el sulfato de hidrazina dado que es un posible carcinógeno.] Sulfato de lobenguano (Sal Hemisu/fato de m-Yodobencilguanidina), CsH1olN3 · 1/2H2SÜ4-324, 1-Polvo blanco. Fácilmente soluble en metano!. VALORACIÓN: Cuando se analiza por cromatografía en capa delgada, empleando placas recubiertas con mezcla d~ gel de sílice para cromatografía y una fase móvil constitu19~ por una mezcla de alco~ol bu~ílico, agua y ácido acet1co (60:25:15), y se examina ba¡o luz UV de longitud de onda corta, no se observa más que una sola mancha de impurezas de no más de 0,5%. Sulfato de Litio, LbS04 · H20-127,96 Usar grado reactivo ACS.
[10377-48-7]-
Sulfato de Magnesio, MgS04 · 7H20-246,48 [10034-99-8]-Usar grado reactivo ACS.
2356 Especificaciones de Reactivos /Reactivos Sulfato de Magnesio Anhidro, M9SÜ4-120,37 [7487-88-9]-El Sulfato de Magnesio Anhidro puede prepararse del siguiente modo. Colocar en un recipiente poco profundo una cantidad adecuada de sulfato de magnesio (ver anteriormente), preferentemente en polvo, y exponer a una temperatura de aproximadamente 80º durante varias horas, mezclando ocasionalmente. Calentar luego entre 275º y 300º hasta que el peso sea prácticamente constante. Transferir el producto aún tibio a recipientes impermeables, dado que la sal anhidra es muy higroscópica. Sulfato de p-Metilaminofenol, (p-CH3NHC6H40H)2 · H2S04-344,38 [55-55-0]-Usar grado reactivo ACS. Sulfato de Níquel, NiS04 · 6H20-262,85 Usar grado reactivo ACS.
[7786-81-4]-
Sulfato de Níquel (11) Heptahidrato, NiS04 · 7H20-280,9 [10101-98-1 ]-Usar un grado adecuado. Sulfato de Potasio, K2S04-174,26 grado reactivo ACS.
[7778-80-5]-Usar
Sulfato de Sodio (Sal de Glauber), Na2S04 · 1OH20-322,20 [7727-73-3]-Usar grado reactivo ACS. Sulfato de Sodio Anhidro, Na2S04-142,04 [7757-82-6]-Usar grado reactivo ACS. Para su uso en la valoración de alcaloides mediante cromatografía de gas-líquido, también se ajusta a la prueba adicionar que se indica a continuación. APTITUD PARA VALORACIÓN DE ALCALOIDES: Transferir aproximadamente 1O m,9. de atropina, pesados con exactitud, a un matraz volumetrico de 25 ml, disolver y diluir a volumen con alcohol. Pipetear 3 ml de la solución y transferir a cada uno de dos separadores de 60 ml. Agregar a cada separador 1O ml de agua, 1 ml de hidróxido de sodio 1 N y 1O ml de cloroformo. Agitar meticulosamente y dejar que las capas se separen. Filtrar la fase orgánica de un separador a través de papel de separación de fases, colocado en un embudo y previamente lavado con 5 ml de cloroformo. Recoger el filtrado en un recipiente adecuado. Agregar 1O ml de cloroformo al separador, agitar meticulosamente y filtrar la capa orgánica a través del mismo papel de separación de fases, recogiendo y combinando los filtrados en el mismo recipiente. Designar los filtrados combinados como Solución A. Filtrar la fase orgánica del segundo separador a través de 30 g de Sulfato de Sodio Annidro, sostenido por un trozo de lana de vidrio en un pequeño embudo y previamente lavado con cloroformo, y recoger el filtrado en un recipiente adecuado. Agregar 1O ml de cloroformo al separador, agitar meticulosamente y filtrar la capa orgánica a través de fa misma porción de sulfato de sodio anhidro, recogiendo y combinando ambos filtrados en el mismo recipiente. Designar los filtrados combinados como Solucion B. Evaporar las dos soluciones al vacío hasta un volumen de aproximadamente 1 ml. Inyectar un volumen, medido con exactitud, de Solución A en un cromatógrafo de gases adecuado y registrar la altura del pico. Repetir la determinación con un segundo volumen, medido con exactitud, de Solución A, registrar la altura del pico y obtener el promedio de ambos resultados. De modo similar, determinar la altura del pico de dos porciones de Solución B y obtener el promedio de los resultados. El valor promedio obtenido para la Solución B se encuentra dentro del 5,0% del valor obtenido para la Solución A. En condiciones normales, el cromatógrafo de gases está equipado con una columna de vidrio de 4 mm x 1,2 m rellena con fase G3 al 3% sobre soporte SlA. Después del curado y acondicionado, mantener la temperatura de la columna a 21 Oº, la del inyector a 225º y la del bloque detector a 240º durante las determinaciones. El gas transportador es helio, que fluye a una velocidad de 60 ml por minuto.
USP 39 Sulfato de Sodio Decahidrato-Usar Sulfato de Sodio. Sulfato de Vanadilo, VOS04 · xH20 (anhidro)-163,00 [27774-13-6]-Cristales azules higroscópicos. Soluble lentamente, y habitualmente en forma incompleta, en agua. VALORACIÓN: Pesar con exactitud aproximadamente 400 mg de la muestra de prueba seca obtenida en la prueba para Agua y transferir con 15 a 20 ml de agua a un vaso de precipitados. Agregar 3 ml de ácido sulfúrico, cubrir el vaso de precipitados con un vidrio de reloj y calentar sobre un baño de vapor hasta que se disuelva completamente. Enfriar, diluir con 125 ml de agua y valorar con permanganato de potasio O, 1 N SV hasta la producción de un color rosáceo que se mantiene durante 1 minuto: cada ml de permanganato de potasio O, 1 N equivale a 16,30 mg de VOS04. No se encuentra menos de 97%. AGUA: Secar aproximadamente 1 g, pesado con exactitud, a 220º hasta peso constante: no pierde más de 50,0% de su peso. VANADIO PENTAVALENTE: Calentar 1 9, pesado con exactitud, con 50 ml de agua y 5 ml de acido clorhídrico en un matraz hasta que se disuelva. Enfriar, agregar 2 g de yoduro de potasio, insertar el tapón y dejar en reposo durante 30 minutos. Agregar 50 ml de agua y valorar el yodo liberado con tiosulfato de sodio O, 1 N SV, agregando 3 ml de almidón SR como indicador. Corregir por el volumen de tiosulfato consumido por un blanco. Cada ml de tiosulfato O, 1 N equivale a 5,095 mg de vanadio (V). No se encuentra más de 0,5%, calculado con respecto a la sustancia seca. SUSTANCIAS QUE No PRECIPITAN POR AMONÍACO: Disolver 1,0 g calentando con 20 ml de agua y 2 ml de ácido clorhídrico. Diluir con agua hasta aproximadamente 75 ml y neutralizar frente al papel tornasol con amoníaco SR. Transferir la solución a una probeta, agregar lentamente 5 ml de amoníaco SR y suficiente agua para completar 100 ml, y dejar en reposo durante la noche. Decantar 50 ml del sobrenadante a través de un filtro, agregar 5 gotas de ácido sulfúrico, evaporar hasta sequedad e incinerar: el residuo no pesa más de 1O mg (2,0%).
SL1lfato Férrico, Fe2(S04)3 · xH20 111-Polvo blanco grisáceo e higroscopico, o perlas de color beige, lentamente solubles en agua. VALORACIÓN: Pesar con exactitud aproximadamente 700 mg y disolver en una mezcla de 50 ml de a9ua y 3 ml de ácido clorhídrico en un matraz con tapan de vidrio. Agregar 3 g de yoduro de potasio y dejar en reposo en la oscuridad durante 30 minutos. Luego diluir con 100 ml de agua y valorar con tiosulfato de sodio O, 1 N SV, agregando 3 ml de almidón SR cerca del punto final. Cada ml de tiosulfato de sodio O, 1 N equivale a 5,585 mg de Fe: se encuentra no menos de 21,0% y no más de 23,0%. MATERIA INSOLUBLE (Prueba para reactivos): Una porción de 1O g, disuelta en una mezcla de 100 ml de agua y 5 ml de ácido sulfúrico, presenta no más de 2 mg de materia insoluble (0,02%). CLORUROS: Disolver 1 g entibiando en una mezcla de 1O ml de agua y 1 ml de ácido nítrico, agregar 4 ml de ácido nítrico adicional y diluir con agua a 50 ml. A 25 ml agregar 1 ml de ácido fosfórico y 1 ml de nitrato de plata SR. Si se produce turbidez, esta no excede la obtenida con un control que contenga 0,01 mg de ión de cloruro (CI), 1 ml de ácido nítrico, 1 ml de ácido fosfórico y 1 ml de nitrato de plata SR (0,002%). HIERRO FERROSO: Disolver 4 g entibiando con 50 ml de ácido sulfúrico diluido (1 en 1O), enfriar y valorar con permanganato de potasio O, 1 N: no se requiere más de
Reactivos/ Especificaciones de Reactivos 2357
USP 39 O, 16 mL para que aparezca un color rosado permanente (0,02% como Fe+2). [NOTA-Dado que los reactivos empleados en las pruebas de Cobre y Cinc pueden contener cantidades excesivas de cobre y de cinc, primero se los debe purificar extrayendo con Solución de Extracción de Ditizona (ver Plomo (251 )).] COBRE: Disolver 1,2 g en 100 mL de agua. A 1O mL agregar 50 mL de una solución que contenga 5 g de tartrato de amonio y 5 mL de hidróxido de amonio. Agregar 1O mL de Solución de Ditizona Estándar (ver Plomo (251)), agitar durante 2 minutos, retirar la capa de ditizona y comparar el color rosado con el de un control que contenga 6 µg de ión de cobre (Cu) y que esté tratado exactamente como la porción de 1O mL de la solución de prueba. Si el color de la solución de prueba es menos intenso que el del control, entonces la muestra de prueba contiene menos del límite de Cobre y de Cinc. Si el color de la solución de prueba es más intenso que el del control, agregar 15 mL de ácido clorhídrico diluido (1 en 250) y agitar durante 2 minutos. Retirar la solución de ditizona y agitar con una segunda porción de 15 mL de ácido clorhídrico diluido (1 en 250) durante 2 minutos. Retirar la ditizona, combinar los dos extractos ácidos y reservar para la prueba de Cinc. Si se produce color rosado en la solución de ditizona, aquel no es más oscuro que el de la solución control tratada exactamente como la solución de prueba (0,005%). CINC: A los extractos ácidos combinados reservados de la prueba de Cobre, agregar acetato de sodio 0,5 M para llevar el pH hasta un nivel comprendido entre 5,0 y 5,5, y luego agregar 1 mL de tiosulfato de sodio O, 1 N. Agregar 1O mL de Solución de Ditizona Estándar (ver Plomo (251 )), agitar durante 2 minutos y permitir que las capas se separen. Retirar la ditizona y descartar la capa de agua. Si se produce color rosado, éste no es más intenso que el de un control preparado agregando 0,006 mg de ión cinc (Zn) a los extractos ácidos combinados del control usado en la prueba de Cobre (0,005%). NITRATO: Disolver 1O g en 100 mL de ácido sulfúrico diluido (1 en 100), calentar hasta ebullición y verter, lentamente, en una mezcla de 140 mL de agua y 50 mL de amoníaco concentrado SR. Filtrar a través de un filtro plegado mientras aún está caliente, lavar con agua caliente nasta que el volumen del filtrado sea 300 mL, mezclar y enfriar. A 15 mL de esta solución, agregar 1 mL de solución de cloruro de sodio (1 en 200), O, 1O mL de índigo carmín SR y 15 mL de ácido sulfúrico. El color azul no desaparece por completo al cabo de los 5 minutos (0,01 %). SUSTANCIAS No PRECIPITADAS POR AMONÍACO: Evaporar hasta sequedad 30 mL del filtrado obtenido en la prueba de Nitrato e incinerar suavemente: el peso del residuo no excede de 1 mg (O, 10%). Sulfato Férrico Amónico, FeNH4(S04)2·l2H20-482,19Usar grado reactivo ACS. Sulfato Ferroso, FeS04 · 7H20-278,02 Usar grado reactivo ACS. Sulfato Mercúrico, HgS04-296,65 grado reactivo ACS.
[7782-63-0]-
[7783-35-9]-Usar
Sulfito de Sodio-Usar Sulfito de Sodio Anhidro. Sulfito de Sodio Anhidro (Sulfito de Sodio Desecado), Na2S03-126,04 [7757-83-7]-Usar grado reactivo ACS. p,-Sulfofenilazocromotropato de Sodio [Sal Trisódica del
[NOTA-El reactivo se encuentra disponible como Nº de Catálogo 7309 en Distillation Products Industries, Eastman Organic Chemicals Dept., Rochester, NY 14650. Se describe un procedimiento para su preparación en Z. Anal. Chem., 146, 41 7 (1955).] Sulfuro de Hidrógeno, H2S-34,08 [7783-06-4]-Gas incoloro y venenoso, más pesado que el aire. Soluble en agua. Se genera tratando sulfuro ferroso con ácido clorhídrico diluido o ácido sulfúrico diluido. Se pueden usar otros sulfuros que produzcan sulfuro de hidrógeno con ácidos diluidos. También está disponible en forma comprimida en cilindros. Sulfuro de Sodio, Na2S · 9H20-240, 18 Usar grado reactivo ACS.
[l 31 3-84-4 ] -
Sustrato Cromogénico para la Prueba Amidolítica-Moléculas sintéticas que consisten en tripéptidos o tetrapéptidos acoplados a un cromóforo. El aminoácido terminal es específico para la proteasa utilizada. Los péptidos sintéticos imitan la secuencia de los péptidos (específica para el factor de coagulación activado) del sitio activo en el sustrato natural. El factor de coagulación cataliza la división del cromóforo (p-nitroanilina) del péptido. La cantidad liberada puede medirse directamente en un espectrofotómetro, porque los espectros de máxima absorbancia de los cromóforos unidos y libres difieren. El cromóforo liberado es un compuesto con color; el sustrato completo en sí mismo es incoloro. Los pesos moleculares de los diferentes sustratos varían de aproximadamente 600 a 750 Da. La solubilidad en soluciones acuosas puede variar. No todos los sustratos tienen la misma sensibilidad, y puede ser que los períodos de incubación tengan que prolongarse. Tartrato de Sodio, Na2C4H406 · 2H20-230,08 [6106-24-7]-Usar grado reactivo ACS. Tartrato de Sodio y Potasio, KNaC4H406 · 4H 20-282,22 [6381-59-5]-Usar grado reactivo ACS. Teflón-Usar Poli(tetrafluoroetileno). Telurito de Potasio (Te/urato IV de Potasio), K2Te03253,79 [7790-58-1 ]-Polvo granulado blanco. Soluble en agua. La solución es alcalina. VALORACIÓN: Pesar con exactitud aproximadamente 120 mg, transferir a un vaso de precipitados y disolver en una mezcla de 1O mL de ácido nítrico, 1O mL de ácido sulfúrico y 25 mL de agua. Calentar a ebullición y mantener en ebullición hasta que se produzcan humos abundantes de trióxido de azufre. Enfriar, agregar cuidadosamente 100 mL de agua, calentar a ebullición, agregar 6 g de fluoruro de sodio y valorar la solución caliente con permanganato de potasio O, 1 N SV. Cada mL de permanganato de potasio O, 1 N equivale a 12,69 mg de K2Te0 3. No se encuentra menos de 98%. CLORUROS (Prueba para reactivos): Un g presenta no más de O, 1 mg de CI (0,01 %). Teobromina, C1HaN402-l 80, 17 [83-67-0]-Sólido cristalino blanco. Muy poco soluble en agua y en alcohol; casi insoluble e0 benceno, en éter y en cloroformo. VALORACION: Disolver aproximadamente 34 mg, pesados con exactitud, en 50 mL de ácido acético glacial. Valorar con ácido perclórico O, 1 N SV, determinando el punto final potenciométricamente. Realizar una determinación con un blanco y hacer las correcciones necesarias. Cada mL de ácido perclórico O, 1 N equivale a 18,02 mg de C1HaN4Ü2. No se encuentra menos de 95%.
Acido 4,5-Dihidroxi-3-(p-sulfofenilazo)-2, 7-naftalendisulfónico},
C16H9N2Na3Ü11Si · 3H20-624,47-Polvo rojo brillante. Muy soluble en agua; insoluble en alcohol. Se combina con oxicloruro de zirconio para formar una laca rosada de zirconio soluble.
Tetraacetato de Plomo, CaH120 8 Pb-443,38 [546-67-8]-Cristales incoloros a rosáceos. Soluble en ácido acético glacial caliente, en cloroformo, en nitrobenceno y en
2358 Especificaciones de Reactivos /
Reactivos
tetracloroetano. Hidrolizado por el agua, produce ácido acético y dióxido de plomo color marrón. Inestable en el aire. INTERVALO DE FUSIÓN (741): entre 175º y 180º. Tetrabromofenolftaleinato de Etilo, C22H148r4Ü4661,96--Usar grado reactivo ACS. 2',4',5',7'-Tetrabromofluoresceína (Eostna Y, Eosina Amarilla, Bromoeosina ES, Disolvente Rojo 43, Acido Rojo 87), C20Hs8r405-167,8 [630-20-6j-Polvo rojo oscuro a marrón. Solubilidad O, 1% en agua (solución anaranjada transparente). Usar un grado adecuado. 2,3,7,8-Tetraclorodibenzo-p-dioxina, marcada con 13 (, 13 C12H4Cl402-333,84--Líquido transparente, incoloro. VALORACIÓN: Inyectar un volumen apropiado en un cromatógrafo de gases (ver Cromatografía (621)) equipado con un detector de captura de electrones; usando helio como gas transportador. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas: una columna capilar de 0,25 mm x 30 m, recubierta con una capa de fase G2 de 1 µm; mantener la temperatura del inyector a 300º; mantener la temperatura del detector a 300º; y mantener la temperatura de la columna a 70º y programarla para que aumente 15º por minuto hasta 300º. El área del pico de 13C12H4Cl402 no es menos de 99,0% del área total. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado en Cambridge lsotopes Laboratories,www.isotope.com.] 2,3,7,8-Tetraclorodibenzofurano, marcado con 13(, 13C12H4Cl40-317,84--Líquido transparente, incoloro. VALORACIÓN: Inyectar un volumen apropiado en un cromatógrafo de gases (ver Cromatografía (621 )) equipado con un detector de captura de electrones; usando helio como gas transportador. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas: una columna capilar de 0,32 mm x 60 m, recubierta con una capa de fase G27 de 1 µm; mantener la temperatura del inyector a 300º; mantener la temperatura del detector a 350º; y mantener la temperatura de la columna a 70º y prowamarla para que aumente 15º por minuto hasta 275º. El area del pico de 13 C12H4Cl4Q no es menos de 99,0% del área total. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado en Cambridge lsotopes Laboratories, www.isotope.com.] [630-20-6]-Lí1, 1,2,2-Tetracloroetano, C2H2Cl4-167,8 quido transparente e incoloro. Peso específico: 1,553. El índice de refracción a 20º es 1,481. Usar un grado adecuado. Tetracloruro de Carbono, CCl4-153,82 [56-23-5]-Usar un grado que cumpla con las especificaciones de la ACS en Reagent Chemicals, 8v• Edición. Tetracloruro de Titanio, TiCl4-189,68 [7550-45-0]-Líquido transparente, incoloro. Produce vapores al aire. [PRECAUCIÓN: Reacciona violentamente con agua.] VALORACIÓN: Pesar con exactitud 0,75 g en 100 mL de ácido sulfúrico 2 N contenido en una bureta Smith para pesadas. Verter la solución a través de una columna de reducción de cinc-mercurio en 50 mL de sulfato férrico amónico O, 1 N SV. Eluir con 100 mL de ácido sulfúrico 2 N y 100 mL de agua. Agregar 1O mL de ácido fosfórico y valorar con permanganato de potasio O, 1 N SV. Realizar una determinación con un blanco y hacer las correcciones necesarias. Cada mL de permanganato de potasio 0, 1 N equivale a 18, 97 mg de TiCl4. No se encuentra menos de 99,5%. INTERVALO DE EBULLICIÓN (Prueba para reactivos): entre 135º y 140º. Tetracosano, C24H50-338,66
[646-31-1 ]-Polvo blanco.
USP
INTERVALO DE FUSIÓN (741):
39
entre 51º y 53º.
Tetradecano, C14H30-198,39 [629-59-4]-Líquido transparente, incoloro. VALORACIÓN: La pureza, determinada por cromatografía de gas-líquido! no es menos de 98%. Las sigui~,ntes condiciones se consideran adecuadas para la valoracion del reactivo: una columna de acero inoxidable de 3 mm x 2,4 m rellena con fase Gl 6 sobre soporte Sl. El gas transportador es helio, que fluye a una velocidad de 27,5 mL por minuto; mantener la temperatura de la column?. a 250º, la del inyector a 200º y la del detector a 280º. Utilizar un detector de ionización a la llama. INTERVALO DE FUSIÓN, Clase 11 (741): entre 4° y 8°, dentro de un intervalo de 2º. ÍNDICE DE REFRACCIÓN (831): entre 1,4280 y 1,4300 a 20º. Tetraetilenglis:ol, CaHisOs-194,23 [112-60-7]-Líquido casi incoloro. Indice de refracción: aproximadamente 1,46. VALORACIÓN: La pureza, determinada por cromatografía de gas-líquido, utilizando un cromatógrafo de gases adecuado y condiciones cromatográficas adecuadas, no es menos de 90%. INTERVALO DE EBULLICIÓN (Prueba para reactivos): entre 177º y 187º, a una presión de 9 mm de Hg. [112-57-2]-LíTetraetilenpentamina, CaH23Ns-189,31 quido incoloro. VALORACIÓN: Inyectar un volumen apropiado en un cromatógrafo de gases (ver Cromatografía (621)) equipado con un detector de ionización a la llama; usando helio como gas transportador. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas: una columna capilar de 0,25 mm x 30 m, recubierta con una capa de fase G2 de 1 µm; mantener la temperatura del inyector a 250º; mantener la temperatura del detector a 300º; y mantener la temperatura de la columna a 150º y programarla para que aumente 1Oº por minuto hasta 280º. El área del pico de CaH23Ns no es menos de 30% del área total. ÍNDICE DE REFRACCIÓN (831): entre 1,503 y 1,507 a 20º. Tetrafenilborato de Sodio, NaB(C6Hs)4-342,22 [143-66-8]-Usar grado reactivo ACS. Tetrafenilboro Sódico-Ver Tetrafenilborato de Sodio. Tetrafluoroborato de p-Nitrobencenodiazonio, N02C6H4N28F4-236,92 [456-27-9]-Cristales coJor dorado amarillento. Soluble en acetonitrilo. [PRECAUCION: Sensible a los golpes; mantener refrigerado.] VALORACIÓN: Transferir aproximadamente 30 mg, pesados con exactitud, a un matraz volumétrico de 100 mL con protección actínica. Disolver en ácido clorhídrico 0,01 N, diluir a volumen con ácido clorhídrico 0,01 N y mezclar. Usando material de vidrio con protección actínica, diluir 2,0 mL de la solución resultante a 50,0 mL con metanol de grado espectrofotométrico. Medir la absorbancia de esta solución en una celda de 1 cm aproximadamente a 255 nm, usando metanol como blanco. Calcular la absortividad de la solución, dividiendo la absorbancia medida por la concentración en g por ml. Calcular el valor de valoración, por la fórmula: 1OOa/59,4 en donde a es la absortividad de la solución: no se encuentra menos de 95,0%. Tetrahidrofurano, C4Hs0-72, 11 grado reactivo ACS.
[1 09-99-9]-Usar
Tetrahidrofurano sin Estabilizantes-Usar un grado adecuado.
Reactivos/ Especificaciones de Reactivos 2359
USP 39 Tetrahidrofurano Exento de Peróxido, C4H80-72, 11Usar grado reactivo ACS. PEROXIDO: Transferir 8 mL de yoduro de potasio y almidón SR a una probeta de 12 mL con tapón de vidrio esmerilado de aproximadamente 15 mm de diámetro. Llenar completamente con la sustancia en análisis, mezclar y dejar en reposo protegido de la luz durante 5 minutos. No se desarrolla color. N-(2-Tetrahidrofuroil)piperazina (1-{(Tetrahidro-2-furanil)carbonil]piperazina), C9 H1 6N202-184,23-Usar un grado adecuado. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado en EMSDOTIIKON, www.ems-dottikon.ch.] 1,2,3,4-Tetrahidronaftaleno, C10H12-132,21 [119-64-2]-Líquido incoloro. ÍNDICE DE REFRACCIÓN (831 ): 1,5401 a 20º. Tetrametilbencidina, ( 4-(4-Amino-3,5-dimetilfenil)-2, 6-dimetilanilina; 3,3',5,5' Tetrametilbencidina; 3,3' 5,5' -Tetrametil-
[7, 7'-bifenil] 4,4'-diamina), C16H20N2-240,34 [54827-17-7]-Usar un grado adecuado. 4,4'-Tetrametildiaminodifenilmetano [(4,4' -Metilenbis(N,Ndimetilanilina)], [(CH3)zNC6H4]zCH2-254,38 [101-61-1 ] Cristales blanquecinos. INTERVALO DE FUSIÓN (741): entre 87º y 90º. Tetrametilsilano, (CH 3}4Si--88,23 reactivo ACS.
[75-76-3]-Usar grado
Tetróxido de Osmio (Ácido Ósmico; Anhídrido Perósmico), Os04-254,23 [20816-12-0]-Usar grado reactivo ACS. Tierra de Diatomeas [91053-39-3]-Usar un grado adecuado. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado como Celite 545-AW.] Tierra de Diatomeas Fundido-Calcinada [91053-39-3]Usar un grado adecuado. [NOTA-Un grado adecuado es "Chromosorb W, AWDMCS" .] Tierra de Diatomeas Silanizada [91053-39-3]-Usar un grado adecuado. [NOTA-Se pueden obtener comercialmente ~radas adecuados como "Anachrome Q", "Gas-Chrom Q y "Varaport 30".] Tierra de Fuller para Cromatografía-(Muy Fina y Moderadamente Gruesa)-Polvo o gránulos de color gris o blanco grisáceo constituidos principalmente por silicato de aluminio y magnesio hidratado. FINURA DE POLVOS: Ver Finura de Polvos (811 ). MATERIA SOLUBLE: Veinte g, tratados con 50 mL de agua fría y filtrada, no producen más de 60 mg de residuo al evaporarse el filtrado (0,3%). Una segunda porción de 20 g, tratada con 50 mL de alcohol frío y filtrada, no prod~ce más de 14 mg al evaporarse el filtrado (0,07%). PERDIDA POR SECADO (731 ): Secar a 105° durante 6 horas: pierde entre 7,0% 10,0% de su peso. [NOTA-Ajustar e contenido de agua, si fuera necesario, secando al vacío a temperatura ambiente, restaurando el agua necesaria y equilibrando mediante agitación durante 2 horas.]
r
Tierra Silanizada y Lavada con Ácido-Base para Cromatografía-Usar un grado adecuado. [NOTA-Se puede obtener un grado para cromatografía adecuado en Alltech, www.alltechweb.com, disponible como "Gas-Chrom Q".]
Tierra Silícea para Cromatografía-Para cromatografía de gases, usar un grado especialmente preparado que cumpla con la siguiente descripción general: Tierra silícea purificada de tamaño de malla adecuado que se haya lavado con ácido y/o base. Puede ser o no ser silanizada. Para cromatografía de partición en columna, resulta esencial que el material esté libre de sustancias de interferencia. Si se sabe o se cree que dichas interferencias se encuentran presentes, purificar el material del siguiente modo: Colocar un trozo de lana de vidrio en la base de una columna cromatográfica, con un diámetro igual o superior a 100 mm y agregar Tierra Silícea Purificada (monografía del NF) hasta una altura igual a 5 veces el diámetro de la columna. Agregar un volumen de ácido clorhídrico equivalente a un tercio del volumen de tierra silícea y permitir que el ácido percole en la columna. Lavar la columna con metanol, utilizando inicialmente volúmenes pequeños para enjuagar las paredes de la columna y continuar lavando con metanol hasta que el último lavado sea neutro al papel tornasol humedecido. Extruir la columna lavada en cápsulas poco profundas, calentar sobre un baño de vapor para eliminar el exceso de metanol y secar a 105º hasta que el material esté polvoriento y sin trazas de metanol. Almacenar el material seco en envases bien cerrados. [NOTA-Un grado adecuado es "Chromosorb W-AW".] [NOTA-Los grados silanizados adecuados para cromatografía de gases son "Gas Chrom Q," y "Chromosorb W (tratado con AW y DMCS).] [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado para cromatografía de columna como "Celite 545," lavado con ácido, en Sigma-Aldrich, www.sigma-aldrich.com.] Tierra Silícea Silanizada para Cromatografía-Colocar aproximadamente 450 g de tierra silícea purificada en un cristalizador de vidrio grande y abierto en un desecador de vacío que contenga 30 mL de un silano adecuado, por ejemplo, una mezcla de 1 volumen de dimetildiclorosilano y 1 volumen de trimetilclorosilano, o una mezcla de 1 volumen de metiltriclorosilano y 2 volúmenes de dimetildiclorosilano. Aplicar vacío intermitentemente durante varias horas hasta que no queden restos de silano líquido. Hacer flotar en agua la tierra silícea purificada, tratada y agitar suavemente para que todas las partículas sin recubrimiento se hundan. Quitar el material silanizado de la superficie, lavar en un embudo de vidrio sinterizado con metanol tibio hasta que el filtrado ya no sea ácido y secar a 11 Oº. Timidina, C10H14N20s-242,2 Usar un grado adecuado.
[50-89-5]-Polvo blanco.
Timol, C6H3[CH3][0H][CH(CH3)2]1,3,4-150,22 [89-83-8]-Cristales incoloros, a menudo grandes, o polvo cristalino blanco. Se ve afectado por la luz. Posee mayor densidad que el agua, pero al licuarse por fusión es menos denso que el agua. Sus soluciones alcohólicas son neutras al tornasol. Un g se disuelve en aproximadamente 1000 mL de agua, en 1 mL de alcohol, en 1 mL de cloroformo, en 1,5 mL de éter y en aproximadamente 2 mL de aceite de oliva. Soluble en ácido acético glacial y en aceites fijos o volátiles. Almacenar en envases impermeables y resistentes a la luz. INTERVALO DE FUSIÓN (741): entre 48º y 51º; pero cuando está fundido, permanece líquido a una temperatura considerablemente inferior. MATERIA No VOLÁTIL: Volatilizar 2 g en un baño de vapor y secar a 105º hasta peso constante: el residuo no pesa más de 1 mg (0,05%). Tinción de Wright [68988-92-1 ]-Una mezcla de azul de metileno, azur de metileno y de los eosinatos de ambos, disponible como un sólido y como una solución en metanol. Usar un grado adecuado. [NOTA-Si se usa un sólido, disolver 6,0 g de polvo de tinción de Wright (Nº de CAS 68988-92- 7, polvo verde oscuro) y 0,6 g de polvo de tin-
2360 Especificaciones de Reactivos
/Reactivos
ción de Giemsa (Nº de CAS 5 78 7 7-82-6, cristales o polvo de color verde oscuro a negro) en 1000 mL de metanol. Mezclar durante la noche y filtrar antes de usar.] Tioacetamida, C2HsNS-75, 13 activo ACS.
[62-55-5]-Usar grado re-
Tiocianato de Amonio (Rodanida de Amonio), NH4SCN76, 12 [1762-95-4]-Usar grado reactivo ACS. Tiocianato de Potasio, KSCN-97, 18 grado reactivo ACS.
Poco soluble en agua; soluble en alcohol, en éter y en ácidos diluidos. Conseryar en envases bien cerrados. Proteger de la luz. [PRECAUCION: Evitar el contacto con o-tolidina y mezclas que contengan o-tolidina, y realizar todas las pruebas en una campana de extracción bien ventilada.] Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 98,0%. Tolualdehído (o-Tolualdehído), CsHs0-120, 15 [529-20-4]-Usar un grado adecuado.
[333-20-0]-Usar
Tiocianato Mercúrico, Hg(SCN)2-316,76 [592-85-8]Polvo cristalino blanco. Muy poco soluble en agua; soluble en soluciones de cloruro de sodio; poco soluble en alcohol y en éter. 2,2'-Tiodietanol, (HOCH2CH2)2S-122, 19 [111-48-8]-Líquido de color amarillo pálido a incoloro. VALORACIÓN: No se encuentra menos de 98% de C4H1002S; se utiliza un cromatógrafo de gases adecuado equipado con un detector de ionización a la llama. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas: una columna de 4,0 mm x 1,83 m rellena con fase G25 al 10% sobre soporte Sl A; mantener la temperatura de la columna, del inyector y del detector a 200º, 250º y 31 Oº, respectivamente. ÍNDICE DE REFRACCIÓN (831 ): entre 1,4250 y 1,4270, a 20º. Tioglicolato de Sodio, HSCH2COONa-114,10 [367-51-1 ]-Polvo blanco cristalino. Muy soluble en agua; poco soluble en alcohol. Es higroscópico y se oxida al aire. Almacenar en envases impermeables y resistentes a la luz. No se debe utilizar si tiene un color amarillo pálido o más oscuro. VALORACIÓN: Pesar con exactitud aproximadamente 250 mg y disolver en 50 mL de agua exenta de oxígeno. Agregar 5 mL de ácido clorhídrico diluido, calentar a ebullición durante 2 minutos, enfriar y valorar la solución con yodo O, 1 N SV, agregando 3 mL de almidón SR hacia el final: cada mL de yodo O, 1 N equivale a 11,41 mg de HSCH2COONa. No se encuentra menos de 75%. MATERIA INSOLUBLE: Una solución de 1 g en 1o mL de agua es transparente y prácticamente completa. SULFUROS: Disolver 500 mg en 1O mL de a_Qua en un matraz pequeño, agregar 2 mL de ácido clorh1drico, luego colocar una tira de papel de filtro, humedecida con acetato de plomo SR, sobre la boca del matraz y llevar la solución a ebullición: el papel con acetato de plomo no se oscurece. Tiosulfato de Sodio, Na2S203·5H20-248,19 [10102-17-7]-Usar grado reactivo ACS. Tiourea, (NH2)2CS-76, 12 tivo ACS.
USP 39
[62-56-6]-Usar grado reac-
Tiroglobulina, [9010-34-8]-Proteína cuyo peso molecular es 670 kDa. Disponible como polvo liofilizado de color beige leve hecho a partir de la glándula tiroides bovina o porcina. Usar un grado adecuado. [69849-45-6]L-Tirosina Disódica, C9H9N03Na2-225,2 Polvo de color blanquecino a tostado. Usar un grado adecuado. L-Tiroxina Sódica-Usar Levotiroxina Sódica (monografía de la USP). o-Tolidina ( 4,4'-Diamino-3,3'-dimetilbifenilo), (NH2)(CH3)C6H3 · C6H3(CH3)(NH2)4,3,3',4'-212,29 [119-93-7]-Cristales blancos a rojizos o polvo cristalino.
p- Tolualdehído, CsHs0-120, 15 [104-87-0]-Líquido transparente, incoloro a amarillo. VALORACIÓN: La pureza, determinada por cromatografía de gas-líquido, no es menos de 98%. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas para la valoración del artículo: una columna de acero inoxidable de 3 mm x 1,8 m rellena con fase G4 al 5% sobre soporte Sl. El gas transportador es nitrógeno, con una velocidad de flujo de aproximadamente 12 mL por minuto; la temperatura del detector y de la columna es de aproximadamente 125º; y la temperatura del inyector es de aproximadamente 205º. Se emplea un detector de ionización a la llama y la muestra es una solución al 5% en disulfuro de carbono. ÍNDICE DE REFRACCIÓN (831): entre 1,544 y 1,546, a 20º. Tolueno (Toluol), C6HsCH3-92, 14 grado reactivo ACS.
p- Toluenosulfonato de Metilo
[108-88-3]-Usar
(Tolueno-4-sulfonato de Me-
tilo), CsH10S03-186,23 [80-48-8]-Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 98%. o-Toluidina (2-Aminotolueno; 2-Metilanilina), C6H4(CH3)(NH2)1,2-107,15 [95-53-4]-Líquido amarillo claro que se torna marrón rojizo por exposición al aire y a la luz. Soluble en alcohol, en éter y en ácidos diluidos; poco soluble en agua. Conservar en envases bien cerrados. Proteger de la luz. PESO ESPECÍFICO (841 ): 1,008 a 20º. INTERVALO DE EBULLICIÓN (Prueba para reactivos): entre 200º y 202º.
p- Toluidina, C1H9N-107, 15
[106-49-0]-Cristales o escamas blancas a beige. Fácilmente soluble en alcohol, en acetona, en metanol y en ácidos diluidos; poco soluble en agua. VALORACIÓN: Disolver 400 mg, pesados con exactitud, en 100 mL de ácido acético glacial y valorar con ácido perclórico O, 1 N SV, determinando el punto final potenciométricamente. Realizar una determinación con un blanco y hacer las correcciones necesarias. Cada mL de ácido perclórico O, 1 N equivale a 10,72 mg de CH3C6H4NH2. No se encuentra menos de 98% calculado con respecto a la sustancia seca. PÉRDIDA POR SECADO (731 ): Pesar con exactitud aproximadamente 1 g y secar a 30º hasta peso constante: no pierde más de 2% de su peso. Tornasol [1 393-92-6]-Pigmento azul preparado a partir de varias especies de Roce/la DeCandolle, Lecanora Acharius u otros líquenes (Fam. Parmeliaceae). DESCRIPCIÓN: Cubos, masas, fragmentos o gránulos de color azul índigo o violeta intenso. Tiene el olor combinado de índigo y violetas y tiñe la saliva de un azul intenso. Las sustancias indicadoras que contiene son solubles en agua y menos solubles o insolubles en alcohol. CENIZAS: Produce no más de 60,0% de ceniza. Transcriptasa Inversa-Usar un grado adecuado. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado de BD Biosciences, www.bdbiosciences.com.]
Reactivos / Especificaciones de Reactivos 2 361
USP 39 n-Triacontano, C30H62----422,81 grado adecuado.
[638-68-6]-Usar un
2,4,6-Triamino-5-nitrosopirimidina, C4H6N60-154, 13Polvo rosado. VALORACIÓN: Disolver aproximadamente 34 mg, pesados con exactitud, en 50 mL de ácido acético glacial. Valorar con ácido perclórico O, 1 N SV, determinando el punto final potenc1ométricamente. Realizar una determinación con un blanco y hacer las correcciones necesarias. Cada mL de ácido perdórico O, 1 N equivale a 15,41 mg de C4H6N60. No se encuentra menos de 97%. Tributirina (Tributirato de Glicerilo), C15H2606-302,36 [60-01-5]-Líquido aceitoso incoloro. Insoluble en agua; muy soluble en alcohol y en éter. VALORACIÓN: Inyectar una muestra apropiada en un cromatógrafo de gases adecuado (ver Cromatografía (621)) equipado con un detector de ionización a la llama; usando nitrógeno como gas transportador. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas: una columna de acero inoxidable de 3 mm x 1,8 m, con fase G4 sobre soporte Sl A; mantener la temperatura del inyector a 270º; y mantener la temperatura del detector a 300º. El área del pico de tributirina no es menos de 98% del área total. ÍNDICE DE REFRACCIÓN (831 ): entre 1,4345 y 1,4365, a 20º. CONTENIDO DE ÁCIDO: Transferir 1,0 g, pesado con exactitud, a un vaso de precipitados, agregar 75 mL de metanol y disolver mezclando. Cuando se completa la disolución, agregar 25 mL de agua y valorar con hidróxido de potasio 0,05 N SV, usando fenolftaleína SR como indicador. Realizar una determinación con un blanco y hacer las correcciones necesarias. Cada mL de hidróxido de potasio 0,05 N equivale a 88, 1 mg de ácido butírico: no se encuentra más de 0,5%. Triclorhidrato de 2'-(4-hidroxifenil)-5-(4-metil-1-piperazinil)-2,5'-bi-1 H-benzimidazol pentahidrato-623,97 [23491-44-3]-Polvo amarillo oscuro a tostado con un tinte verde. Usar un grado adecuado. Tricloroetano-Ver Metil Cloroformo. Triclorofluorometano, CCbF-137,37 [75-69-4]-Líquido incoloro. VALORACIÓN: Inyectar una muestra apropiada en un cromatógrafo de gases (ver Cromatografta (621 )) equipado con un detector de conductividad térmica; usando helio como gas transportador. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas: una columna de vidrio de 2,0 mm x 1,8 m, rellena con fase Gl al 10% sobre soporte SlA; mantener la temperatura del inyector a 50º; mantener la temperatura del detector a 300º; y mantener la temperatura de la columna a Oº y programarla para que aumente 3º por minuto hasta 50º. El área del pico de CC'3F no es menos de 99% del área total. ÍNDICE DE REFRACCIÓN (831): entre 1,380 y 1,384, a 20º. Triclorotrifluoroetano-Usar un grado adecuado. [NOTA-Se puede obtener una preparación adecuada de E. l. du Pont de Nemours and Co., Wilmington, DE 19898, disponible como "Freon-TF aerosol".] Tricloruro de Antimonio (Cloruro Antimonioso), SbC'3228, 12 [10025-91-9]-Usar grado reactivo ACS. Tricloruro de Titanio (Cloruro Titanoso), TiCb-154,23 [7705-07-9]-Polvo de color negro, higroscópico, inestable al aire. Soluble en agua, sedimentando ácido titánico al exponer la solución al aire. Por lo general está disponible como soluciones acuosas de 15% a 20%, de color azul violáceo oscuro. Almacenar la solución en frascos con tapón de vidrio, herméticamente cerrados. Proteger de la luz.
n-Tricosano, C23H4a-324,63 [638-67-5]-Masa incolora o blanca, más o menos translúcida, que presenta una estructura cristalina. Presenta una leve sensación grasosa al tacto. Insoluble en agua y en alcohol; soluble en cloroformo, en éter, en aceites volátiles y en la mayoría de los aceites fijos tibios; poco soluble en alcohol deshidratado. Su punto de ebullición es aproximadamente de 380º. INTERVALO DE FUSIÓN (741): entre 47º y 49°. APTITUD: Determinar su aptitud para ser utilizado en la prueba de Compuestos relacionados en Clorhidrato de Propoxifeno (monografía de la USP) según se indica a continuación. Disolver una cantidad adecuada en cloroformo para obtener una solución que contenga 20 µg por ml. Siguiendo las indicaciones de la prueba de Compuestos relacionados en Clorhidrato de Propoxifeno, inyectar en el cromatógrafo un volumen adecuado de la solución y registrar el cromatograma. Registrar concomitantemente el cromatograma de la Preparación estándar preparada según se indica en la prueba de Compuestos relacionados: sólo se obtiene un pico principal a partir de la solución de ntricosano y no se observan picos secundarios en las posiciones de los picos obtenidos para propoxifeno, acetoxi o carbinol, o cerca de ellos, en el cromatograma de la Preparación estándar. Trietanolamina-Usar Trolamina (monografía del NF). Trietilamina, (C2Hs)3N-101, 19 [121-44-8]-Líquido incoloro. Poco soluble en agua. Miscible con alcohol, con éter y con agua fría. Almacenar en envases bien cerrados. Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 99,5%. Trietilendiamina (1,4-Diazobicic/o[2.2.2]octano), C6H12N2112, 17 [280-57-9]-Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 98%. [112-27-6]-Líquido inTrietilenglicol, C6H14Ü4-150, 17 coloro a amarillo pálido. Es higroscópico. Miscible con agua, con alcohol y con tolueno. VALORACIÓN: Inyectar una muestra de prueba apropiada en un cromatógrafo de gases adecuado equipado con un detector de ionización a la llama (ver Cromatografía (621 )); usando helio como gas transportador. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas: una columna de acero inoxidable de 3 mm x 1,85 m, rellena con soporte S2; mantener las temperaturas del inyector, de la columna y del detector a 250º, 230º y 310º, respectivamente. El área sJel pico de C6H14q4 no es menos de 97% del área total. INDICE DE REFRACCION (831 ): entre 1,4550 y 1,45 70, a 20º. 1,3,5-Trifenilbenceno, (C6Hs)3C5H3-306,41 [612-71-5]Polvo blanco a blanquecino. INTERVALO DE FUSIÓN (741 ): entre 172º y 175º. Trifenilmetano, C19H15-244,34 [519-73-3]-Polvo marrón claro. VALORACIÓN: Inyectar un volumen apropiado en un cromatógrafo de gases (ver Cromatografía (621 )) equipado con un detector de ionización a la llama, usando helio como gas transportador. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas: una columna capilar de 0,25 mm x 30 m, recubierta con una capa de fase G2 de 1 µm; mantener la temperatura del inyector a 300º; mantener la temperatura del detector a 300º; y mantener la temperatura de la columna a 200º y programarla para que aumente 1Oº por minuto hasta 300º. El área del pico de C19H16 no es menos de 99% del área total. INTERVALO DE FUSIÓN (741): entre 92º y 94º. Trifenilmetanol, C19H150-260,34 blanco a blanquecino.
[76-84-6]-Polvo
2362 Especificaciones de Reactivos
/Reactivos
VALORACIÓN: Inyectar un volumen apropiado en un cromatógrafo de gases (ver Cromatografía (621 )) equipado con un detector de ionización a la llama; usando helio como gas transportador. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas: una columna capilar de 0,25 mm x 30 m, recubierta con una capa de fase G2 de 1 µm; mantener la temperatura del inyector a 280º; mantener la temperatura del detector a 300º; y mantener la temperatura de la columna a 180º. El área del pico de C19H160 no es menos de 96,5% del área total. 2,2,2-Trifluoroetanol, CF3CH20H-100,04 [75-89-8]-Líquido incoloro. VALORACIÓN: Inyectar una muestra apropiada en un cromatógrafo de gases (ver Cromatografía (621 )) equipado con un detector de ionización a la llama, usando helio como gas transportador. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas: una columna capilar de 0,25 mm x 30 m, recubierta con una capa de fase G2 de 1 µm; mantener la temperatura del inyector a 100º; mantener la temperatura del detector a 150º; y mantener la temperatura de la columna a Oº y programarla para que aumente 1Oº por minuto hasta 150º. El área del pico de CF3CH20H no es menos de 99% del área total. INTERVALO DE EBULLICIÓN: entre 77º y 80º. 2,2,2-Trifluoroetildifluorometil Éter (Difluorometil-2,2,2-trifluoroeti/ éter), C3H3Fs0-150,05-Líquido transparente. Usar un grado adecuado. INTERVALO DE EBULLICIÓN: entre 28º y 30º. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado de PCR lncorporated, P.O. Box 1466, Gainesville, FL 32602. Tel: 904-376-8246. El número de catálogo es 17151-2.] 5-(Trifluorometil)uracilo, CsH3F3N202-180,08 [54-20-6]-Polvo blanco a blanquecino. VALORACIÓN: Cuando se analiza por cromatografía en capa delgada, usando placas recubiertas con mezcla de gel de sílice para cromatografía, una fase móvil constituida por cloroformo, metanol y ácido acético (17:2:1 ), y se observa visualmente y bajo una luz UV de longitud de onda larga, presenta una sola mancha. a,a,a-Trifluoro-p-cresol (4-hidroxibenzotrifluoruro, 4-trifluorometilfenol), C1HsF30-162, 11 [402-45-9] INTERVALO DE FUSIÓN (741): entre 48º y 52º. Trifluoruro de Boro, BF 3-67,81 grado adecuado.
[7637-07-2]-Usar un
Trifluoruro de Boro al 14% en Metano! [373-57-9]-Usar un grado adecuado. Triglicéridos de Cadena Media (Triglicéridos Caprílico/Cáprico, Tricaprilato/Caprato de Glicerilo), [ 438544-49-1 ]-Usar un grado adecuado que contenga no menos de 95% de ácidos grasos saturados con 8 y 1O átomos de carbono. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado como Captex 300 Low C6 en www.abiteccorp.com.] Trimetilclorosilano-Ver Clorotrimetilsilano. 2,2,4-Trimetilpentano (/sooctano), CsHlB-114,23 [540-84-1 ]-Usar grado reactivo ACS. 2,4,6-Trimetilpiridina (5-Colidina), C8 H11N-121,18 [108-75-8]-Líquido transparente e incoloro. Soluble en agua fría y menos soluble en agua caliente; soluble en alcohol, en cloroformo y en metanol. Miscible con éter. VALORACIÓN: Inyectar una muestra de prueba apropiada en un cromatógrafo de gases adecuado (ver Cromatografía (621 )), usando helio como gas transportador. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas: una columna de acero inoxidable de 3 mm x 1,85 m, con fase Gl 6 sobre
USP 39 soporte Sl A; mantener las temperaturas del inyector, de la columna y del detector a 180º, 165º y 270º, respectivamente; y usar un detector de ionización a la llama. El área del pico de CsH11 N no es menos de 98% del área total. ÍNDICE DE REFRACCIÓN (831 ): entre 1,4970 y 1,4990, a 20º. N-(Trimetilsilil)-imidazol, C6H12N2Si-140,26 [18156-74-6]-Líquido transparente, de incoloro a amarillo claro. ÍNDICE DE REFRACCIÓN (831): entre 1,4744 y 1,4764, a 20º. 3-(Trimetilsilil)-1-propano sulfonato de sodio (2,2-Dimetil2-silapentano-5-sulfonato de sodio), C6H1 5 SiNa03S-218,32Usar un grado adecuado. Trinitrofenol-Ver Ácido Pícrico. Trióxido de Arsénico, As203-l97,84 [1327-53-3]-Usar grado reactivo ACS. [NOTA-Se puede obtener Trióxido de Arsénico de calidad apropiada para usar como estándar primario en la Oficina de Materiales de Estándar de Referencia (Office of Standard Reference Materials) del Instituto de Normas y Tecnología de los EE.UU. (NIST, por sus siglas en inglés), www.nist.gov, como muestra de estándar Nº 83.] Trióxido de Cromo, Cr03-99,99 grado reactivo ACS.
[1333-82-0]-Usar
L-Triptófano, C11H12N202-204,23 [73-22-3]-Polvo o laminillas de color blanco o no más que ligeramente amarillo. Un g se disuelve en aproximadamente 100 mL de agua; soluble en ácidos diluidos y en soluciones de hidróxidos alcalinos; poco soluble en alcohol. VALORACIÓN: Pesar con exactitud aproximadamente 300 mg, disolver en una mezcla de 3 mL de ácido fórmico y 50 mL de ácido acético glacial, agregar 2 gotas de cristal violeta SR y valorar con ácido perclórico O, 1 N SV hasta un punto final verde. Cada mL de ácido perclórico O, 1 N equivale a 20,42 mg de C11 Hi2N202. Se encuentra entre 98,0% y 102,0%, calculado con respecto a la sustancia seca. ROTACIÓN ESPECÍFICA (781 ): entre -30,0º y -33,0º, determinada en una solución que contenga 1,0 g de la muestra de prueba, previamente secada a 105º durante 3 horas, en 100 ml. PÉRDIDA POR SECADO (731 ): Secar a 105º durante 3 horas: no pierde más de 0,3% de su peso. RESIDUO DE INCINERACIÓN (Prueba para reactivos): no más de 0,1%. TIROSINA: Disolver 100 mg en 3 mL de ácido sulfúrico diluido, agregar 1O mL de sulfato mercúrico SR y calentar en un baño de vapor durante 1O minutos. Filtrar, lavar con 5 mL de sulfato mercúrico SR y agregar al filtrado combinado 0,5 mL de solución de nitrito de sodio (1 en 20): no se produce un color rojo dentro de los 15 minutos. Triptona-Usar Digerido Pancreático de Caseína. Tris(2-aminoetil)amina, C6H1sN4-l 46,23 [ 4097-89-6]Líquido amarillo. Soluble en metanol. VALORACIÓN: Disolver aproximadamente 80 mg en 30 mL de metanol. Agregar 40 mL de agua y valorar con ácido clorhídrico 1 N, determinando el punto final potenciométricamente. Realizar una determinación con un blanco y hacer las correcciones necesarias. Cada mL de ácido clorh1drico 1 N equivale a 48,75 mg de C6HJ8N4. No se encuentra menos de 98,0%. ÍNDICE DE REFRACCIÓN (831): entre 1,4956 y 1,4986, a 20º.
Reactivos /
USP 39 Tris (hidroximetil)aminometano [77-86-1 ]-Usar grado reactivo ACS-Ver también Trometamina. N-Tris(hidroximetil)metilglicina, C6H13NOs-179,2 [5704-04-1 ]-Polvo cristalino blanco. Usar un grado adecuado. Trombina Humana (Factor lla )- -33 600 [9002-04-4]Una preparación de serina proteasa (enzima) que convierte el fibrinogeno humano en fibrina. Se obtiene a partir de plasma humano y se pued~ f?reparar mediante precipi~a~ión con sales y disolventes orgarncos adecuados bajo cond1c10nes controladas de pH, fuerza iónica y temperatura. Un polvo blanco amarillento, fácilmente soluble en una solución de cloruro de sodio de 9 !] por L, que produce una solución turbia de color amarillo palido. Almacenar en un envase estéril sellado bajo nitrógeno. Proteger de la luz, a una temperatura menor de Oº. Una unidad equivale a la cantidad de enzima que hidroliza 1 µmol de acetato de Tos-Gly-Pro-Arg4-nitroanilina por minuto a un pH de 8,4 y una temperatura de 37º. Tromboplastina [9035-58-9]-Polvo beige; o suspensión opalescente o turbi~~ Presenta actividad t~?mboquinasa y se obtiene por extracc1on con acetona de tejido cerebral y/o pulmonar de conejos recientemente sacrificados. Puede contener cloruro de sodio y cloruro de calcio en proporciones adecuadas y puede contener un agente antimicrobiano adecuado.' Se usa en forma de suspensión para la determinación del tiempo y la actividad de protrombina en sangre. Su actividad tromboquinasa es tal que da como resultado un tiempo de coagulación de 11 a 16 segundos con plasma humano normal y la concentración apropiada de iones de calcio. Almacenar en envases impermeables, preferentemente a una temperatura inferior a 5º. PÉRDIDA POR SECADO (731 ): [NOTA-Esta prueba sólo se aplica a la forma seca.] Secar al vacío a 60º durante 6 horas: no pierde más de 5,0% de su peso. Trometamina [Tris(hidroximetil)aminometano; THAM; 2-Amino-2-(hidroximetil)-1, 3-propanodiol], C4H11 N03121, 14-Usar Tris(hidroximetil)aminometano de grado reactivo ACS. Tropeolina 00 (Anaranjado Ácido 5), C1sH14N3Na03S375,38 [554-73-4]-Polvo amarillo o escamas de color amarillo anaranjado. Soluble en agua. INTERVALO DE PH: de 1,4 (rojo) a 2,6 (amarillo). Tropina, C8 H15N0-141,2 adecuado.
[120-29-6]-Usar un grado
Tuberculina, Derivado Proteico Purificado (Tuberculina PPD)-Derivada de la cepa humana de Mycobacterium tuberculosis, y está disponible tanto como una solución º. c~mo un polvo liofilizado. Para el polvo liofilizado, reconst1tu1r según las instrucciones del fabricante utilizando el diluyente suministrado por el fabricante. Las soluciones J?Ueden contener un estabilizante y un conservante. Una Unidad de Tuberculina (UT) equivale a 0,02 µg de Tuberculina PPD. Tubo Detector de Amoníaco-Tubo de vidrio sellado por fusión diseñado de manera que se puede hacer pasar gas a través de él, que contiene filtros absorbentes adecuados y un medio de soporte para el indicador, que es azul de bromofenol. INTERVALO DE MEDICIÓN: 5 a 70 ppm. [NOTA-Disponible en Draeger Safety, lnc., www.drae ger.com, o en Gastec Corp., www.gastec.co.jp, distribuido en EE.UU. por www.nextteq.com.] Tubo Detector de Cloro-Tubo de vidrio sellado por fusión diseñado de modo tal que se puede hacer pasar gas a través
Especificaciones de Reactivos 2363
de él, que contiene filtros absorbentes adecuados y medios de soporte para el ind_icador o-tolidina. INTERVALO DE MEDICION: 0,2 a 3 ppm. [NOTA-Disponible en Draeger Safety, lnc., www.drae ger.com, o en Gastec Corp., www.gastec.co.jp, distribuido en EE.UU. por www.nextteq.com.] Tubo Detector de Dióxido de Azufre-Tubo de vidrio sellado por fusión diseñado de tal modo que se puede hacer pasar gas a través de éste y contiene filtros absorbentes adecuados y medios de soporte para un indicador de yodoalmidón. INTERVALO DE MEDICIÓN: 1 a 25 ppm. [NOTA-Disponible en Draeger Safety, lnc., www.drae ger.com o en Gastec Corp., www.gastec.co.jp, distribuido en EE.UU. por www.nextteq.com.] Tubo Detector de Dióxido de Carbono-Tubo de vidrio sellado por fusión diseñado de modo tal que se puede hacer pasar gas a través de él. Contiene filtros absorbentes adecuados y un medio de soporte para los indicadores hidrazina y cristal violeta. , INTERVALO DE MEDICION: 0,01 a 0,3%-Vol. [NOTA-Disponible en Draeger Safety, lnc., www.drae ger.com, o en Gastec Corp., www.gastec.co.jp, distribuido en EE.UU. por www.nextteq.com.] Tubo Detector de Dióxido de Nitrógeno-Óxido NítricoTubo de vidrio sellado por fusión diseñado de modo tal que se puede hacer pasar gas a través de él, que contiene filtros absorbentes adecuados y medios de soporte para una capa oxidante y el indicador que es difenil bencidina. INTERVALO DE MEDICIÓN: 0,5 a 1o ppm. [NOTA-Disponible en Draeger Safety, lnc., www.drae ger.com, o en Gastec Corp., www.gastec.co.jp, distribuido en EE.UU. por www.nextteq.com.] Tubo Detector de Monóxido de Carbono-Tubo de vidrio sellado por fusión diseñado de modo tal que se puede hacer pasar gas a través de él. Contiene filt~os ~bsorbentes a9~ cuados y medios de soporte para los indicadores pentox1do de yodo y dióxido de ,selenio y ácido sulfúrico fumante. INTERVALO DE MEDICION: 5 a 150 ppm. [NOTA-Disponible en Draeger Safety, lnc., www.drae ger.com, o en Gastec Corp., www.gastec.co.jp, distribuido en EE.UU. por www.nextteq.com.] Tubo Detector de Olefina-Tubo de vidrio sellado por fusión diseñado de modo tal que se puede hacer pasar gas a través de él, que contiene filtros absorbentes adecuados y medios de soporte para el indicador que es una forma estabilizada de permanganato. INTERVALO DE MEDICIÓN: 0,06 a 3,2%-Vol. Propileno; 0,04 a 2,4%-Vol. Butileno. [NOTA-Disponible en Draeger Safety, lnc., www.drae ger.com.] Tubo Detector de Sulfuro de Hidrógeno: Tubo de vidrio sellado por fusión diseñado de modo tal que se puede hacer pasar gas a través de él, que contiene filtros absorbentes adecuados y medios de soporte para el indicador, el cual es una sal de plomo ade~uada. INTERVALO DE MEDICION: 1 a 20 ppm. [NOTA-Disponible en Draeger Safety, lnc., www.drae ger.com, o en Gastec Corp., www.gastec.co.jp, distribuido en EE.UU. por www.nextteq.com.] Tubo Detector de Vapor de Agua-Tubo de vidrio sellado por fusión diseñado de tal modo que se puede hacer pasar gas a través de éste y que contiene fil~ros. absorbentes y , medios de soporte adecuados para el indicador, el cual esta formado por un sol de selenio en suspensión en ácido sulfúrico.
2364 Especificaciones de Reactivos
/Reactivos
INTERVALO DE MEDICIÓN: 5 a 250 mg por metro cúbico. [NOTA-Disponible en Draeger Safety, lnc., www.drae ger.com, o en Gastec Corp., www.gastec.co.jp, distribuido en EE.UU. por www.nextteq.com.] Tungstato de Sodio, Na2W04 · 2H20-329,85 [10213-10-2]-Usar grado reactivo ACS. Uracilo
C4H4N20 2-112,09
[66-22-8]-Polvo cristalino
blanco~ color crema. Funde por encima de 300º. Un g se disuelve en aproximadamente 500 mL de agua; menos soluble en alcohol; soluble en amoníaco SR y en hidróxido de sodio SR. Sus soluciones no producen precipitado con los precipitantes de alcaloides habituales. RESIDUO DE INCINERACIÓN (Prueba para reactivos): inapreciable, usando 100 mg. PÉRDIDA POR SECADO (731 ): Secar a 105º durante 2 horas: no pierde más de 2% de su peso. Urea, NH 2CONH2---60,06 ACS.
[57-13-6]-Usar grado reactivo
USP 39
ganato de potasio O, 1 N consumido equivale a 11,7 mg de NHN03. No se encuentra menos de 98,0%. SOLUBILIDAD EN HIDRÓXIDO DE AMONIO: Disolver 1 g en una mezcla de 3 mL de hidróxido de amonio y 50 mL de agua tibia: la solución es transparente e incolora. CARBONATO: Agregar 1 mL de agua y 2 mL de ácid~ clorhídrico diluido a 500 mg: no se produce efervescencia. CLORUROS: Disolver 250 mg en 40 mL de agua caliente, agregar 2 mL de ácido ní~rico y dejar en rep<;>so durante 1 hora. Filtrar y agregar al filtrado 0,5 mL de nitrato de plata SR: la turbidez producida no excede la turbidez de un blanco que contenga 0,5 mg de CI (0,2%) agregado. SULFATO: Disolver 500 mg en 50 mL de agua caliente y agregar 2 mL de ácido clorhídrico diluido y 1,5 g d~ clorhidrato de hidroxilamina. Calentar a 60º durante 3 minutos, filtrar, enfriar y agregar al filtrado 2 mL de cloruro de bario SR: no se produce turbidez ni precipitado en el plazo de 30 minutos. Vaselina Líquida-Usar Aceite Mineral (monografía de la USP).
Uretano (Carbamato de etilo), C3H7N02---89,09 [51-79-6]-Polvo blanco con terrones. Fácilmente soluble en agua. INTERVALO DE FUSIÓN (741 ): entre 48º y 50º.
Verde Brillante (Verde de Malaquita G), C27H34N204S482 64 [3051-11-4]-Cristales brillantes de color amarillo dor~do. Soluble en agua y en alcohol. Máximo de absorción: 623 nm.
[58-96-8]-Polvo blanco. Uridina, C9H12N20 6-244,20 VALORACIÓN Fase móvil: Preparar una m~zcla de m~t~mol y ª5=~tato de amonio 0,2 M (10:90) y a1ustar con ac1do fosforico a un pH de 7,0. Solución de prueba: 0,5 mg por mL en agua. Procedimiento: Inyectar aproximadamente 20 µL de la Solución de prueba en un cromatógrafo de líquidos (ver Cromatografía (621 )), equipado con un detector a 280 nm y una columna de 4,6 mm x 15 cm, rellena con material L1. La velocidad de flujo es de aproximadamente 2 O mL por minuto. El área del pico de C9H12N206 no es ~enos de 99% del área total. INTERVALO DE FUSIÓN (741 ): entre 166º y 171 º.
Verde de Malaquita G-Ver Verde Brillante.
Valerofenona, C1, Hi40-162,23 [1009-14-9]-Líquido incoloro. VALORACIÓN: Inyectar una muestra apropiada en un cromatógrafo de gases adecuado (ver Cromatografía (621 )) equipado con un detector de ioniza.ció~ a la llama; ~sando helio como gas transportador. Las s1gurente.s cond1cic;>nes se consideran adecuadas: una columna capilar recubierta con una capa de fase G2 de 1 µm; mantener la temperatura del inyector a 250º; mantener la temperatura del detector a 300º; y mantener la temperatura de la c~lumna a 150º y programarla para que aumente 1Oº por minuto hasta 300º. El área del pico de C11H14Ü no es menos de 98% del área total. ÍNDICE DE REFRACCIÓN (831 ): 1,5149 a 20º. INTERVALO DE EBULLICIÓN: entre 105º y 107º, a una presión de 5 mm de mercurio. Vanadato de Amonio (Metavanadato de Amonio), NHN0 3-116,98 [7803-55-6]-Polvo blanco y cristalino. Poco soluble en agua fría; soluble en agua caliente y en amoníaco diluido SR. VALORACIÓN: Pesar con exactitud aproximadamente 500 mg, transferir a un rec~iente adecuado, agregar 30 mL de agua Y, 2 mL de acido _sulfúrico diluido_ ~1. en 4), agitar por rotac1on suave para disolver y pasar d1ox1do de azufre gaseoso a través de la solución hasta que la reducción finalice y la solución tenga un color azul brill~nte. Calentar a ebullición moderada pasando una comente de dióxido de carbono a través de la solución para eliminar el exceso de dióxido de azufre, luego enfriar y valorar con permanganato de potasio O, 1 N SV. Cada mL de perman-
Verde de Metilo (Sal Doble de Verde de Metilo-Cloruro de Cinc Sal Doble de Verde de Etilo-Cloruro de Cinc; C.f. 42590), C27 35CliN3 · ZnCli-608,78 [7114-03-6]-Usar un grado adecuado para la microscopía.
H
2-Vinilpiridina, C7H7N- l 05, 14 [100-69-6]. INTERVALO DE EBULLICIÓN: entre 79º y 82º, a 29 mm de mercurio. DENSIDAD: 0,975 a 25º. ÍNDICE DE REFRACCIÓN (831 ):aproximadamente 1,5490 a 20º.
Vinilpirrolidinona (7-Vinil-2-pirrolidinona; 7-Vinil-2-pirrolidona; N-Vinilpirrolidinona; N-Vinilpirrolidona), C6H9N0111, 14 J88-12-0]-Líquido incoloro. VALORACION: Inyectar un volumen apropiado en un cromatógrafo de gases (ver Cromatografía (621 )) equipado con un detector de ionización a la llama, usando helio como gas transportador. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas: una columna capilar de 0,25 mm x 30 m recubierta con una capa de G2 de 1 µm; mantener la temperatura del inyector a 250º; mantener la temperatura del detector a 300º; y mantener la temperatura de la columna a 100º y programarla para que aumente 1Oº por minuto hasta 250º. El área del pico de C6H9NO no es menos de 99 0% del área total. '" ''";'~'"'" ,! '?Ji • ' ', · ' no ;;;á5''(:fe''6'''1'%'''C:l~te'rmirí'ad~ en 2,:s·9;· usarl'C:lo una mezcla 1 de 50 ml de metanol y 1O mL de butirolactona como disolvente. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado en Merck KGaA/EMD Chemicals, número de catálogo 8.08518.0250, www.emdchemicals.com.]
•R•ll'llWlll:
Violeta de p-Yodonitrotetrazolio, (Cloruro de 2-(4-yodofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-feniltetrazolio), C19H13CllNs02-505,70Polvo amarillo claro. VALORACIÓN: Cuando se analiza por cromatografía en capa delgada, con plac;_as recubiertas c?~ mezcl~ ~e gel de sílice para cromatograf1a y una fase mov1I const1tu1da por una mezcla de alcohol amílico, ácido fórmico y agua
Reactivos / Especificaciones de Reactivos 2365
USP 39 (8:1 :1 ), se rocía con solución de tiosulfato de sodio al O, 1%, y se examina bajo luz UV de longitud de onda corta, se observa una sola mancha con trazas de impurezas. PUNTO DE FUSIÓN (741 ): 240º, con descomposición. Xantidrol, C13 H1002-198,22 [90-46-0]-Polvo cristalino de color amarillo pálido. Insoluble en agua; soluble en alcohol, en cloroformo y en éter. Soluble en ácido acético glacial, formando una solución prácticamente incolora; pero cuando el polvo se trata con ácido clorhídrico diluido, se produce un color ª!Tiarillo limón. INTERVALO DE FUSION (741): entre 121º y 123º. RESIDUO DE INCINERACIÓN: Incinerar 500 mg con 0,5 mL de ácido sulfúrico: el residuo no pesa más de 1O mg (2,0%). [ 69-89-6]-Polvo cristalino Xantina, C5 H4N 402-152, 11 blanco. Se descompone al calentarse. Poco soluble en agua y en alcohol; soluble en hidróxido de sodio SR; moderadamente soluble en ácido clorhídrico diluido. Cuando se somete a la reacción de murexida, se produce un color púrpura con el amoníaco, pero con la adición posteri.or de hidróxidos alcalinos fijos, el color no desaparece sino que se torna violeta. RESIDUO DE INCINERACIÓN (Prueba para reactivos): inapreciable, a partir de 100 mg. PÉRDIDA POR SECADO (731): Secar a 105º durante 2 horas: no pierde más de 1o/o de su peso. Xileno, C8 H10-106, 17 ACS.
[1330-20-7]-Usar grado reactivo
m-Xileno, C6H4(CH 3)i-l 06, 17 [108-38-3]-Líqui~o. inflamable transparente e incoloro. Insoluble en agua; m1sc1ble con alcohol y con éter. Usar un grado adecuado. o-Xileno, C8 H10-106, 17 [95-47-6]-Líquido transparente, incoloro, móvil, inflamable. Insoluble en agua; miscible con alcohol y con éter. VALORACIÓN: La pureza, determinada por cromatografía de gas-líquido, no es menos de 95%. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas para la valoración de la sustancia: una columna de acero inoxidable de 3 mm x 1,8 m rellena con silicato de aluminio hidratado al 1,75% más ftalato de diisodecilo al 5,0% sobre soporte Sl. El gas transportador es helio, a una velocidad de flujo de aproximadamente 27,5 mL por minuto, la temperatura del detector es de aproximadamente 280º, la temperatura del inyector es de aproximadamente 180º y la temperatura de la columna es de 80º. Utilizar un detector de ionización a la llama. ÍNDICE DE REFRACCIÓN (831 ): entre 1,5040 y 1,5060, a 20º. p-Xileno, C8 H10-106, 17 [106-42-3]-Líquido incoloro. VALORACIÓN: Inyectar un volumen apropiado en un cromatógrafo de gases (ver Cromatografía (621 )) equipado con un detector de ionización a la llama, usando helio como gas transportador. Las siguientes condiciones se consideran adecuadas: una columna capilar de 0,25 mm x 30 m, recubierta con una capa de fase Gl4 de 1 µm; mantener la temperatura del inyector a 130º; mantener la temperatura del detector a 300º; y mantener la temperatura de la columna a 50° y prowamarla para que aumente 1Oº por minuto hasta 100º. El area del pico de CsH10 no es menos de 99% del área total.
ÍNDICE DE REFRACCIÓN (831 ):
entre 1,493 y 1,497, a 20º.
Xileno Cianol FF, C2sH21N2Na06S2-538,61 [2650-17-1 ]-Polvo azul grisáceo a azul oscuro. Soluble en agua. VALORACIÓN: Transferir aproximadamente 50 mg, pesados con exactitud, a un matraz volumétrico de 100 mL, disolver y diluir a volumen con agua, y mezclar. Transferir 2,0 mL de esta solución a un matraz volumétrico de 50 mL, diluir a volumen con solución amortiguadora de fosfato de pH 7,0 (ver Soluciones en este apartado) y mezclar. Usando un espectrofotómetro adecuado, celdas de 1 cm y agua como blanco, registrar la absorbancia de la solución a la longitud de onda de máxima absorbancia, aproximadamente a 614 nm.- (\. partir de .1.~ .~Q§<:>~b~UC:i~ .. , observ.ada~.ular la ab.sort1v1da. d (ver ~'2~1!n: • 1a :~=1~raa~~~ menor de 55,9, que corresponde aproximadamente a 83% de C2sH21N2Na06S2. PÉRDIDA POR SECADO (731 ): Secar a 11 Oº hasta peso constante: no pierde más de 6,0% de su peso.
11111111.-111111111111111>:
Xilosa, C5 H100 5- l 50, 13 cuado.
[58-86-6]-Usar un grado ade-
Yodato de Potasio, KI03-214,00 grado reactivo ACS.
[7758-05-6]-Usar
Yodato de Sodio, Nal03-l97,9 [7681-55-2]-Polvo blanco a blanco amarillento. Usar un grado reactivo adecuado. Yodo (lodo), '2-253,81 tivo ACS. Yodoetano, C2H5 1-155,9 adecuado.
[7553-56-2]-Usar grado reac[75-03-6]-Usar un grado
Yoduro de 1-Etilquinaldinio, C12H14IN-299, 15 [606-55-3]-Sólido verde amarillento. Moderadamente soluble en agua. VALORACIÓN: Disolver aproximadamente 290 mg, pesados con exactitud, en 100 mL de agua y agregar 1O mL de ácido acético glacial. Valorar con nitrato de plata O, 1 N SV y determinar el punto final potenciométricamente usando un electrodo selectivo para 1ón plata y un electrodo de referencia de calomel que contenga nitrato de potasio 1 M. Realizar una determinación con un blanco y hacer las correcciones necesarias. Cada mL de nitrato de plata O, 1 N equivale a 29,92 mg de C12H14IN: no se encuentra menos de 97,0%. Yoduro de lsopropilo (2-Yodopropano), C3H11-169,99 [75-30-9]-Usar un grado adecuado. Yoduro de Metilo (Yodometano), CH31-141,94 [74-88-4]-Líquido incoloro, pesado y transparente. Poco soluble en agua. Miscible con alcohol, éter y éter de petróleo. Se torna marrón por exposición a la luz como resultado de la liberación de yodo. Usar un grado adecuado con un contenido de no menos de 99%. Yoduro de Potasio, Kl-166,00 grado reactivo ACS.
[7681-11-0]-Usar
Yoduro de Tetrabutilamonio, (C4H9)4Nl-369,37 [311-28-4]-Escamas blancas, brillantes, cristalinas. Soluble en alcohol y en éter; poco soluble en agua. VALORACION: Disolver 370 mg, pesados con exactitud, en 60 mL de acetona, mezclando vigorosamente. Mezclar la solución mecánicamente, agregar 1O ml de ácido sulfúrico
2366 Especificaciones de Reactivos /Reactivos al 16% y valorar con nitrato de plata O, 1 N SV, determinando el punto final potenciometricamente, usando un sistema de electrodos de vidrio-plata y agregando la solución volumétrica en incrementos de O, 1 mL cerca del punto final. Realizar una determinación con un blanco y hacer las correcciones necesarias. Cada mL de nitrato de plata O, 1 N
USP 39 equivale a 36,94 mg de (C4H9)4NI: no se encuentra menos de 99,0%. Yoduro Mercúrico Rojo, Hgb-454,40 grado reactivo ACS.
[7774-29-0]-Usar
Indicadores y Papeles Indicadores INDICADORES
Indicador n-Naftolbenzeína Clorhidrato de azul nilo
1. ALCANCE En las pruebas y valoraciones Farmacopeicas se requieren indicadores para determinar el punto final especificado en una reacción química, para medir la concentración de iones hidrógeno (pH), o para indicar que se ha llevado a cabo un cambio deseado de pH. Las soluciones de indicadores necesarias se enumeran entre las Soluciones Reactivo, abreviadas como SR.
2. PREPARACIÓN DE ALGUNOS INDICADORES Las soluciones de indicadores básicos y de ftaleínas se preparan mediante disolución en alcohol. En el caso de los indicadores que contienen un grupo ácido, el ácido debe neutralizarse primero con hidróxido de sodio (NaOH) del siguiente modo: triturar 100 mg del indicador en un un mortero de superficie lisa con el volumen de hidróxido de sodio 0,05 N especificado en las instrucciones para preparar su Solución Reactivo o con el equivalente de hidróxido de sodio 0,02 N. Cuando el indicador se haya disuelto, diluir la solución con agua exenta de dióxido de carbono hasta 200 mL (concentración final 0,05%). Almacenar las soluciones en envases resistentes adecuados. Proteger de la luz.
3. INTERVALO DE pH Y CAMBIO Di COLOR PARA ALGUNOS INDICADORES UTILES Indicador Oxalato de verde de malaauita Azul de timol Roio de auinaldina Amarillo de metilo Azul de bromafenol Anaraniado de metilo Verde de bromacresol Roio de metilo Sal sódica de púrpura de bromocresol Púrpura de bromocreso! Azul de bromotimol Roio de fenol Roio neutro Roio de cresol Azul de timol Timolftaleína Fenolftaleína
Intervalo de oH 0,0-2,0
Cambio de Color
5 0-6 8
amarillo-verde roio-amarillo incoloro-roio roio-amarilla amarillo-azul rosado-amarillo amarillo-azul roio-amarillo amarillo verdoso-violeta ournúreo
5 2-6 8 60-7 6 6 8-8 2 6 8-8 o 7 2-8 8 8 0-9 2 86-100 80-100
amarillo-núrnura amarillo-azul amarillo-roio roio-anaraniado amarillo-roio amarillo-azul incoloro-azul incoloro-roio
12-28 14-32 2 9-4 o 3 0-4 6 3 2-44 4 0-5 4 4 2-62
Intervalo de nH 88-100 9 0-13
o
Cambio de Color anaraniado-verde azul-rosado
Alfazurina 2G-Usar un grado adecuado. Amarillo Brillante (C.I. 24890), C26H1aN4Na20aS-592,49Polvo de color anaranjado a color óxido. Soluble en agua. PÉRDIDA POR SECADO (731 )-Secar al vacío a 60º durante 1 hora: no pierde más de 5% de su peso. Amarillo de Metilo (p-Dimetilaminoazobenceno), C14H1sN3-225,29-Cristales amarillos que funden entre 114º y 117°. Insoluble en agua; soluble en alcohol, en benceno, en cloroformo, en éter, en ácidos minerales diluidos y en aceites. Intervalo de transición: de pH 2,9 a 4,0. Cambio de color: de rojo a amarillo. Anaranjado de Metilo (Heliantina o Tropeolina D), C14H14N3Na03S-327,33-Sal sódica del ácido dimetilaminoazobenceno sulfónico o sulfonato sódico de dimetilaminoazobenceno. Escamas cristalinas o polvo amarillo anaranjado. Poco soluble en agua fría; fácilmente soluble en agua caliente; insoluble en alcohol. Intervalo de transición: de pH 3,2 a 4,4. Cambio de color: de rosado a amarillo. Anaranjado de Xilenol (N,N'-[3H-2, 1-Benzoxatiol-3-ilidenbis[( 6-hidroxi-5-metil-3, 1-fenilen)metilen]]bis[N-(carboximetil)glicina] S,S-dióxido), C31HiaN2Na4013S-760,58-Polvo anaran-
jado. Soluble en alcohol y en agua. En solución ácida es de color amarillo limón y sus complejos metálicos son intensamente rojos. Produce un punto final bien diferenciado cuando un metal como el bismuto, cadmio, lantano, plomo, mercurio, escandio, torio o cinc se valora con edetato disódico. Azo Violeta [ 4-(p-Nitrofenilazo)resorcino~, C12H9N3Q4259,22-Polvo rojo. Funde aproximadamente a 193º, con descomposición. Azul de Bromocresol-Usar Verde de Bromocresol. Azul de Bromofenol (3', 3",5',5" -Tetrabromofenolsulfonftaleína), C19H10Br40 5 S-669,96-Cristales rosáceos. Insoluble en agua; soluble en alcohol y en soluciones de hidróxidos alcalinos. Intervalo de transición: de pH 3,0 a 4,6. Cambio de color: de amarillo a azul. Azul de Bromofenol Sódico-La sal sódica de (3',3",5',5" (Tetrabromofenolsulfonftaleína), C19H98r40sSNa-646,36Cristales rosáceos. Soluble en agua y en alcohol. Intervalo de transición: de pH 3,0 a 4,6. Cambio de color: de amarillo a azul. Azul de Bromotimol ( 3', 3" -Dibromotimolsulfonftaleína), C21H2aBr20sS-624,38-Polvo color crema. Insoluble en agua; soluble en alcohol y en soluciones de hidróxidos alcalinos. Intervalo de transición: de pH 6,0 a 7,6. Cambio de color: de amarillo a azul.
USP 39 Azul de Oracet B (Disolvente Azul 19)-Una mezcla de 1-metil-amino-4-anilinantraquinona (C21 H16N202) y 1-amino4-anilinantraquinina (C20H14N202). Cuando se utiliza para volumetría en un medio no acuoso, el color cambia de azul (básico) pasando por púrpura (neutro) a rosado (ácido). Azul de Timol (Timolsulfonftaleína), C21H300sS-466,59Polvo cristalino de color oscuro. Poco soluble en agua; soluble en alcohol y en soluciones de álcalis diluidos. Acidolntervalo de transición: de pH 1,2 a 2,8. Cambio de color: de rojo a amarillo. Alcalino-Intervalo de transición: de pH 8,0 a 9,2. Cambio de color: de amarillo a azul. Clorhidrato de Azul Nilo (Azul Nilo A como clorhidrato; Cloruro de 5-Amino-9-( dietilamino)benzo[ a ]fenoxazin-7-io), C20H20CIN30-353,85-Poco soluble en alcohol y en ácido acético glacial. Intervalo de transición: de pH 9,0 a 13,0. Cambio de color: de azul a rosado. Cristal Violeta (Cloruro de Hexametil-p-rosanilina), C2sH30CINr-407,98-Cristales verde oscuro. Poco soluble en agua; moderadamente soluble en alcohol y en ácido acético glacial. Sus soluciones son de color violeta intenso. SENSIBILIDAD: Disolver 100 mg en 100 ml de ácido acético glacial y mezclar. Pipetear 1 ml de esta solución, transferirlo a un matraz volumétrico de 100 ml y diluir a volumen con ácido acético glacial: la solución es de color azul violáceo y no presenta un tinte rojizo. Pipetear 20 ml de la solución diluida, transferirlos a un vaso de precipitados y valorar con ácido perclórico O, 1 N SV agregando el ácido perclórico lentamente desde una microbureta: no se requiere más de O, 1O ml de ácido perclórico O, 1 N para producir un color verde esmeralda. Eosina Y (Eosina Y de grado indicador, Tetrabromofluoresceína de sodio), C20 H6Br4Na20s-691,86 [17372-87-1]-Trozos o polvo de color rojo a rojo amarronado. Un g se disuelve en aproximadamente 2 ml de agua y en 50 ml de alcohol. Aproximadamente 80% de contenido de colorante. Fenolftaleína [3,3-Bis(p-hidroxifeniOftalida], C20H14Ü4318,32-Polvo cristalino blanco o levemente blanco amarillento. Insoluble en agua; soluble en alcohol. Intervalo de transición: de pH 8,0 a 10,0. Cambio de color: de incoloro a rojo. p-Naftolbenceína ( 4-[a-( 4-Hidroxi- 7-naftiObencilideno]- 7( 4H)naftalenona), (4-HOC10H6)C(:C10H6-4:0)(C6Hs)-374,43Polvo marrón rojizo. Insoluble en a9ua; soluble en alcohol, en benceno, en éter y en ácido acetico glacial. Intervalo de transición: de pH 8,8 a 10,0. Cambio de color: de anaranjado a verde. Negro de Eriocromo T [ 7-( 7-Hidroxi-2-naftilazo)5-nitro2-naftol-4-sulfonato de sodio], C20H12N3Na01S-461,38Polvo negro amarronado con un leve brillo metálico. Soluble en alcohol, en metano! y en agua caliente. SENSIBILIDAD: A 1O ml de una solución 1 en 200 000 en una mezcla de partes iguales de metano! y agua, agregar solución de hidróxido de sodio (1 en 100) hasta un pH de 1O: la solución es de color azul puro, sin turbidez. Agregar 0,01 mg de ión magnesio (Mg): el color de la solución se torna violeta rojizo y con la adición continua de ión magnesio se torna rojo vino. Negro de Eriocromo T Triturado-Triturar 200 mg de negro de eriocromo T con 20 g de cloruro de potasio hasta obtener un polvo fino. Oxalato de Verde de Malaquita, [CnH2sN2+]z · [C2H04-]z · C2H2Ü4-927,00-La sal de oxalato, cristalizada con ácido oxálico, de un colorante de trifenilmetano. Polvo verde oscuro con un brillo metálico. Moderadamente soluble en agua; soluble en ácido acético glacial. Intervalo de transi-
Indicadores y Papeles Indicadores/ Indicadores 2367 ción: de pH 0,0 a 2,0. Cambio de color: de amarillo a verde. Púrpura de Bromocresol (Dibromo-o-cresolsulfonftaleína), C21H16Br20sS-540,22-Polvo cristalino blanco a rosado. Insoluble en agua; soluble en alcohol y en soluciones de hidróxidos alcalinos. Intervalo de transición: de pH 5,2 a 6,8. Cambio de color: de amarillo a púrpura. Rojo Congo-Ver Rojo Congo en la sección de Reactivos. Rojo de Cresol (o-Cresolsulfonftaleína), C21 HisOsS382,43-Polvo marrón rojizo. Poco soluble en agua; soluble en alcohol y en soluciones diluidas de hidróxidos alcalinos. Intervalo de transición: de pH 7,2 a 8,8. Cambio de color: de amarillo a rojo. Rojo de Fenol [ 4, 4' -( 3 H-2, 7-Benzoxatiol-3-iliden)difenol, S, SDióxido], C19H14ÜsS-354,38-Polvo cristalino de rojo brillante a rojo oscuro. Muy poco soluble en agua; fácilmente soluble en soluciones de carbonatos e hidróxidos alcalinos; poco soluble en alcohol. Intervalo de transición: de pH 6,8 a 8,2. Cambio de color: de amarillo a rojo. R?jo de Met~lo (Clorhidrato del Ácido 2-[[4-(Dimetilamino)fentljazo]benzo1co), 2-[4-(CH3)2NC6H4N:N]C6H4COOH · HCl305,76-Polvo rojo oscuro o cristales violetas. Moderadamente soluble en agua; soluble en alcohol. Intervalo de transición: de pH 4,2 a 6,2. Cambio de color: de rojo a amarillo. Rojo de Metilo Sódico-La sal sódica del ácido 2-[-(dimetilamino)fenil]azo]benzoico. 2-[4-(CH 3)2NC6H4N:N] C6H4COONa-291,28-Polvo marrón anaranjado. Fácilmente soluble en agua fría y en alcohol. Intervalo de transición: de pH 4,2 a 6,2. Cambio de color: de rojo a amarillo. Rojo de Quinaldina (Yoduro de 5-Dimetilamino-2-estiriletilquinolinio), C21 HnlN2-430,33-Polvo negro azulado oscuro. Moderadamente soluble en agua; fácilmente soluble en alcohol. Funde aproximadamente a 260º, con descomposición. Intervalo de transición: de pH 1,4 a 3,2. Cambio de color: de incoloro a rojo. Rojo Neutro (Monoclorhidrato de 3-Amino-7-dimetilamino2-metilfenazina), C1sH16N4 · HCl-288,78-Polvo grueso rojizo a verde oliva. Moderadamente soluble en agua y en alcohol. Intervalo de transición: de pH 6,8 a 8,0. Cambio de color: de rojo a anaranjado. Sal Sódica de Púrpura de Bromocresol, C21H1sBr20sSNa562,20-Polvo negro. Soluble en agua. Intervalo de transición: de pH 5,0 a 6,8. Cambio de color: de amarillo verdoso a violeta purpúreo. INTERVALO DE FUSIÓN (741): entre 261º y 264°. Sal Sódica de Verde de Bromocresol-Usar un grado adecuado. Sal Trisódica del Ácido 4,5-Dihidroxi-3-(p-sulfofenilazo)2,7-naftalendisulfónico-Ver Sal Trisódica del Acido 2-(4-Sulfofenilazo)- 1,8-dihidroxi-3, 6-naftalendisulfónico. Sal Trisódica del Ácido 2-(4-Sulfofenilazq)-1,8-dihidroxi3,6-naftalendisulfónico (Sal Trisódica del Acido 4,5-Dihidroxi3-(p-sulfofenilazo)-2, 7-naftalendisulfónico), C16H9N2011 S3Na3570,42-Polvo rojo. Soluble en agua. Sulfito de Bismuto-Usar un grado adecuado. Timolftaleína, C2BH3oÜ4-430,54-Polvo cristalino blanco a levemente amarillo. Insoluble en agua; soluble en alcohol y en soluciones de hidróxidos alcalinos. Intervalo de transición: de pH 9,3 a 10,5. Cambio de color: de incoloro a azul.
2368 Indicadores / Indicadores y Papeles Indicadores Tornasol-Polvo, cubos o fragmentos azules. Parcialmente soluble en agua y en alcohol. Intervalo de transición: de un pH de aproximadamente 4,5 a 8. Cambio de color: de rojo a azul. El tornasol no es adecuado para determinar el pH de alcaloides, carbonatos y bicarbonatos. Verde Brillante-Ver Verde Brillante en la sección de Reactivos. Verde de Bromocresol (Azul de Bromocresol; Tetrabromo-mcresolsulfonftaleína), C21 H,4Br40sS--698,01-Polvo blanco o beige pálido. Poco soluble en agua; soluble en alcohol y en soluciones de hidróxidos alcalinos. Intervalo de transicion: de pH 4,0 a 5,4. Cambio de color: de amarillo a azul.
PAPELES INDICADORES Y DE PRUEBA 1. DEFINICIÓN Los papeles indicadores y de prueba son tiras de papel de tamaño y wado adecuados (ver Papel de Filtro, Cuantitativo en la seccion Especificaciones de Reactivos) impregnadas con un indicador o un reactivo suficientemente estable para proporcionar una forma conveniente de la sustancia impregnada. Algunos papeles de prueba, o equivalente, se pueden obtener comercialmente de proveedores de productos de laboratorio. Alternativamente, se pueden preparar en el laboratorio.
2. PREPARACIÓN DE PAPELES INDICADORES Y DE PRUEBA Tratar un papel de filtro blanco y resistente con ácido clorhídrico y lavarlo con agua hasta que el último lavado presente una reacción ácida al rojo de metilo. Luego, tratar con amoníaco SR y lavar nuevamente hasta que el último lavado no resulte alcalino a la fenolftaleína. Luego de un secado minucioso, saturar el papel con la concentración apropiada de las soluciones indicadoras y secar cuidadosamente al aire en reposo, a menos que se especifique algo diferente, suspendiéndolo en varillas de vidrio u otro material inerte en un espacio libre de ácidos, álcali u otros gases. Cortar el papel en tiras de un tamaño conveniente y almacenarlas en envases bien cerrados. Proteger de la luz y la humedad. Papel de Amarillo de Metilo-Usar una solución 1 en 2000 de amarillo de metilo en alcohol. Papel de Amarillo de Tiazol-Usar una solución 1 en 2000 de amarillo de tiazol en agua. Papel de Cúrcuma-Usar una solución preparada del siguiente modo: macerar 20 g de cúrcuma pulverizada, la raíz seca de Curcuma longa L. (Fam. Zingiberaceae), con cuatro porciones de 100 mL de agua fría, decantando, cada vez, la porción líquida transparente y desechándola. Secar el residuo a una temperatura de no más de 100º. Macerar con 100 mL de alcohol durante varios días y filtrar. SENSIBILIDAD: Sumergir una tira de papel de aproximadamente 1,5 cm de longitud en una solución de 1,0 mg de ácido bórico en 5 mL de agua, previamente mezclada con 1 mL de ácido clorhídrico. Luego de 1 minuto retirar el papel del líquido y dejar que se seque: el color amarillo se torna marrón. Luego, humedecer el papel con amoníaco SR: el color del papel se torna negro verdoso. Papel de Fenolftaleína-Usar una solución 1 en 1000 de fenolftaleína en alcohol diluido.
USP 39 Papel de Prueba de Acetato de Plomo-Por lo general, de un tamaño de aproximadamente 6 mm x 80 mm. Usar acetato de plomo SR y secar el papel a 100º evitando el contacto con metal. Papel de Prueba de Bromuro Mercúrico-Colocar una solución de bromuro mercúrico de 50 mg/mL en alcohol deshidratado en una cápsula y sumergir pequeños trozos de papel de filtro blanco de 80 g/m 2 (velocidad de filtración = 40-60 segundos de tiempo de filtrado por cada 100 mL de agua a 20º con una superficie de filtro de 1 O cm 2 y una presión constante de 6,7 kPa) que midan 1,5 cm por 20 cm cada uno, y que estén plegados en el centro. Dejar que se escurra el exceso de líquido y se seque el papel, protegido de la luz y suspendido sobre un hilo no metálico. Desechar 1 cm de cada uno de los extremos de cada tira, y cortar el papel remanente en cuadrados de 1,5 cm de lado o en discos de 1,5 cm de diámetro. Almacenar en un envase con tapón de vidrio envueltos con papel negro. Papel de Prueba de Sulfato Cúprico-Usar Sulfato Cúprico SR. Papel Tornasol Azul-Por lo general, de un tamaño de aproximadamente 6 mm x 50 mm. Cumple con los requisitos de las siguientes pruebas. FOSFATOS (Prueba para reactivos): Cortar 5 tiras en piezas pequeñas, mezclar con 500 mg de nitrato de magnesio en un crisol de porcelana e incinerar. Agregar al residuo 5 mL de ácido nítrico y evaporar hasta sequedad; el residuo no presenta más de 0,02 mg de P04. RESIDUO DE INCINERACIÓN: Incinerar con cuidado 1o tiras de papel hasta peso constante: el peso del residuo corresponde a no más de 0,4 mg por tira de aproximadamente 3 cm cuadrados. ÁCIDOS DE COLOFONIA: Sumergir una tira de papel azul en una solución de 100 mg de nitrato de plata en 50 mL de agua: el color del papeí no cambia en 30 segundos. SENSIBILIDAD: Dejar caer una tira de 1O mm a 12 mm en un vaso de precipitados que contenga 100 mL de ácido 0,0005 N y mezclar continuamente: el color del papel cambia dentro de los 45 segundos. El ácido 0,0005 N se prepara diluyendo 1 mL de ácido clorhídrico O, 1 N hasta 200 mL con agua purificada recién hervida y enfriada. Papel Tornasol Rojo-Por lo general, de un tamaño de aproximadamente 6 mm x 50 mm. El papel tornasol rojo cumple con los requisltos de las pruebas para Fosfatos, Residuo de Incineración y Acidos de Colofonia en Papel Tornasol Azul. SENSIBILIDAD: Dejar caer una tira de 1 O mm a 12 mm en un vaso de precipitados que contenga 100 mL de hidróxido de sodio 0,0005 N y mezclar continuamente: el color del papel cambia dentro de los 30 segundos. El hidróxido de sodio 0,0005 N se prepara diluyendo 1 mL de hidróxido de sodio O, 1 N hasta 200 mL con agua purificada recién hervida y enfriada. Papel de Verde de Metilo-Yodomercuriato-Sumergir tiras delgadas de papel de filtro adecuado en una solución de verde de metilo de 40 g por L y dejar secar al aire. Sumergir las tiras durante 1 hora en una solución que contenga 140,9 por L de yoduro de potasio y 200 g por L de yoduro mercurico. Lavar con agua hasta que los lavados se tornen prácticamente incoloros y dejar secar al aire. Almacenar protegido de la luz y utilizar dentro de las 48 horas. Papel de Yodato-Almidón-Usar una mezcla de volúmenes iguales de almidón SR y solución de yodato de potasio (1 en 20). Papel de Yoduro-Almidón-Usar una solución de 500 mg de yoduro de potasio en 100 mL de almidón SR recién preparado.
Soluciones /Soluciones Amortiguadoras 2369
USP 39 Papel Indicador de pH de Intervalo Corto-Usar un grado adecuado.
Soluciones SOLUCIONES AMORTIGUADORAS
4. SOLUCIONES ~MORTIGUADORAS ESTANDAR
1. DEFINICIÓN
Se encuentran disponibles soluciones estándar de pH definido como soluciones amortiguadoras que se preparan a partir de los reactivos adecuados. Pueden obtenerse comercialmente soluciones amortiguadoras, tabletas amortiguadoras y sólidos amortiguadores en forma preenvasada. 4.1 4. 1 Preparación Secar previamente los reactivos cristalinos a una temperatura de 110º-120º durante 1 hora, excepto en el caso del ácido bórico y del acetato de sodio trihidrato. Cuando en las determinaciones de pH se especifique el uso de agua para la disolución o dilución de sustancias de prueba, usar agua exenta de dióxido de carbono. Almacenar las soluciones preparadas en envases impermeables, químicamente resistentes, como por ejemplo frascos de vidrio Tipo 1 . Usar las soluciones dentro de los 3 meses de preparadas. Las soluciones amortiguadoras estándar para distintos intervalos entre pH 1,2 y 10,0 pueden prepararse mediante combinaciones adecuadas de las soluciones descritas en esta sección, usadas en las proporciones que se indican en la tabla adjunta. Los volúmenes que se proveen en la tabla son para 200 mL de solución amortiguadora, excepto para la Solución Amortiguadora de Acetato, donde los volúmenes indicados son para preparar 1000 mL de solución amortiguadora y para la Solución Amortiguadora de Citrato donde los volumenes son, para preparar 100 ml. 1. Acido Clorhídrico, 0,2 M e Hidróxido de Sodio, 0,2 M: Preparar y normalizar según se indica en Soluciones Volumétricas. 2. Biftalato de Potasio, 0,2 M: 40,85 g/L de biftalato de potasio en agua. 3. Fosfato de Potasio, Monobásico 0,2 M: 27,22 g/L de fpsfato monobásico de potasio en agua. 4. Acido Bórico y Cloruro de Potasio, 0,2 M: 12,37 g/L de ácido bórico y 14,91 g/L de cloruro de potasio en agua. 5. Cloruro de Potasio, 0,2 M: 14,91 g/L de cloruro de p,otasio en agua. 6. Acido Acético, 2 N: Preparar y normalizar según se inqica en Soluciones Volumétricas 7. Acido Cítrico, O, 7 M: 21,01 g/L de ácido cítrico en agua. 8. Citrato de Sodio, O, 7 M: 29,41 g/L de citrato de sodio dihidrato en agua.
Se dice que una solución está amortiguada si resiste los cambios en la actividad de un ión al agregarle sustancias que se espera que afecten la actividad de ese ión. Los amortiguadores son sustancias o combinaciones de sustancias que otorgan esta resistencia a una solución. Las soluciones amortiguadas son sistemas en los que el ión está en equilibrio con sustancias capaces de capturarlo o liberarlo.
2. CAPACIDAD AMORTIGUADORA Se refiere a la cantidad de material que podría agregarse a una solución sin provocar un cambio significativo en la actividad del ión. La capacidad amortiguadora se define como la razón entre la cantidad de ácido o de base agregada (medida en equivalentes-gramo/L) y el cambio medido en unidades de pH. La capacidad de una solución amortiguada se adapta a las condiciones de uso, normalmente mediante el ajuste de las concentraciones de las sustancias amortiguadoras.
3.USOS Buffers are used to establish and maintain an ion activity within narrow limits. The most common systems are used for the following: a. to establish hydrogen-ion activity for the calibration of pH meters b. in the preparation of dosage forms that approach isotonicity c. in analytical procedures d. to maintain stability of various dosage forms Los amortiguadores que se utilizan en sistemas fisiológicos se eligen cuidadosamente para que no interfieran con la actividad farmacológica del medicamento o la función normal del organismo. Es fundamental que los amortiguadores que se utilizan en el análisis químico sean compatioles con las sustancias a determinar y con los reactivos utilizados.
Comoosición de Soluciones Amortiauadoras Estándar Solución Amortiauadora de Ácido Clorhídrico Colocar 50 ml de la solución de cloruro de potasio en un matraz volumétrico de 200 ml, agregar el volumen especificado de la solución de ácido clorhídrico desoués aareoar aaua a volumen. oH 1 1 1 14 1 1 16 1 17 1 18 1 19 1 20 1 21 1 22 12 13 15 1 78 HCI O 2 M ml 85 o 1 67 2 1 53 2 1 41 4 1 32 4 1 26 o 1 204 1 16 2 1 13 o 1 10 2 1
Solución Amortiauadora de Ftalato Ácido Colocar 50 ml de la solución de biftalato de potasio en un matraz volumétrico de 200 ml, agregar el volumen especificado de la solución de ácido clorhídrico desoués aareaar aaua a volumen. 1 1 1 1 1 1 1 34 1 1 1 40 oH 22 24 26 28 30 32 36 38 1 1 1 1 1 1 1 10 4 1 1 1 HCI O 2 M ml 49 5 42 2 35 4 28 9 22 3 15 7 63 29 o1
2370 Soluciones Amortiguadoras /Soluciones
USP 39
Solución Amortiauadora de Ftalato Neutralizado
Colocar 50 ml de la solución de biftalato de potasio en un matraz volumétrico de 200 ml, agregar el volumen especificado de la solución de hidróxido de sodio después anreaar aaua a volumen. oH 1 1 1 1 1 1 1 1 42 44 46 52 54 56 48 50 58 1 NaOH O 2 M ml 1 1 1 1 1 1 1 1 11 1 16 5 22 6 28 8 34 1 38 8 42 3 30 66 1
Solución Amortiauadora de Fosfato
Colocar 50 ml de la solución de fosfato monobásico de potasio en un matraz volumétrico de 200 ml, agregar el volumen especificado de la solución de hidróxido de sodio después aqreqar aqua a volumen. oH 1 1 72 58 60 1 62 64 1 66 68 1 70 74 76 78 80 1 1 1 1 1 1 1 1 NaOH O 2 M ml 36 56 8 1 1 11 6 1 16 4 1 22 4 1 29 1 1 34 7 1 39 1 1 42 4 1 44 5 1 461 1 1
Solución Amortiauadora de Borato Alcalino
Colocar 50 ml de la solución de ácido bórico y solución de cloruro de potasio en un matraz volumétrico de 200 ml, agregar el volumen especificado de la solución de hidróxido de sodio después aqreqar aqua a volumen. oH 80 82 84 86 88 90 92 94 96 98 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 NaOH O 2 M ml 3 9 1 60 86 11 8 1 15 8 1 20 8 1 264 321 36 9 1 40 6 1 1 1 1 1
1 1
10 o 43 7
Solución Amortiauadora de Acetato
Colocar la cantidad especificada de acetato de sodio NaC2H,02 · 3H20 en un matraz volumétrico de 1000 ml, agregar el volumen especificado de la solución de ácido acético después aqreqar aqua a volumen v mezclar. nH 41 47 51 54 45 43 49 52 5 3 55 nH (medido) 5 40 5 48 410 4 29 4 51 4 70 5 11 518 5 30 4 90 NaC2H,02 · 3H,Q q 15 1 99 2 99 3 59 4 34 5 08 5 23 5 61 5 76 5 98 CH,COOH 2 N ml 19 5 17 7 14 o 11 8 91 63 58 44 38 30
Solución Amortiauadora de Citrato
Mezclar Ácido Cítrico oH 30 Ácido Cítrico 0,1 M, ml 82 o Citrato de Sodio 0,1 M, ml 18 o
O 7 M con Citrato de Sodio O 7 M en las orooorciones e ue se indican a continuación.
32
34
36
38
77 5
73
22 5
27
40
42
o
68 5
63 5
59
o
54
o
31 5
36 5
41
o
46
44
46
48
o
49 5
44 5
40
o
35
o
50 5
55 5
60
o
65
SOLUCIONES COLORIMÉTRICAS (SC) Cambio en la reduccióq:
1. DEFINICIÓN Las soluciones calorimétricas se usan en la preparación de los estándares calorimétricos para ciertos fármacos y para las pruebas de carbonización con ácido sulfúrico que se especifican en algunas monografías. Para la preparación de líquidos de comparación, consulte el capítulo Color y Acromatismo (631 ).
2. ALMACENAMIENTO Almacenar las soluciones calorimétricas en envases impermeables y resistentes adecuados.
3. COMPARACIÓN DE COLORES La comparación de colores según se indica en las pruebas Farmacopeicas se realiza preferentemente en tubos idénticos
52
54
56
o
30 5
25 5
21
o
69 5
74 5
79
50
58
60
62
o
16 o
11 5
80
o
84
o
88 5
92
o
para comparación de color o en un colorímetro adecuado en condiciones que aseguren que la solución calorimétrica de referencia y la muestra en análisis son tratadas de la misma forma en todos los aspectos. La comparación de colores se realiza de forma óptima en capas de igual profundidad, observados tra.nsversalme.nte contra ljn fondo bl.anrn (ver también •Nefelometrfa, Turbidlmetría y.Comparación Visual {855>• (AF Ol-may:201ó)). Es especialmente importante que las soluciones se comparen a la misma temperatura, preferentemente a 25º. Cloruro Cobaltoso SC-Disolver aproximadamente 65 g de cloruro cobaltoso (CoClz · 6H20) en una cantidad suficiente de una mezcla de 25 mL de ácido clorhídrico y 975 mL de agua para obtener 1000 ml. Pipetear 5 mL de esta solución y transferir a un matraz de yodo de 250 mL, agregar 5 mL de peróxido de hidrógeno SR y 15 mL de solución de hidróxido de sodio (1 en 5), calentar a ebullición durante 1O minutos, enfriar y agregar 2 g de yoduro de potasio y 20 mL de ácido sulfúrico diluido (1 en 4). Una vez disuelto el precipitado, valorar el yodo liberado con tiosulfato de sodio O, 1 N SV, agregando 3 mL de almidón SR como indicador. Realizar una determinación con un blanco con las mismas cantidades de los mismos reactivos y hacer las correcciones necesarias. Cada mL de tiosulfato de sodio O, l N equivale a 23,79 mg de CoClz · 6H20. Ajustar el volumen final de la solución agregando una cantidad suficiente de la
Soluciones/ Soluciones Reactivo 2371
USP 39 mezcla de ácido clorhídrico y agua de manera que cada ml contenga 59,5 mg de CoClz · 6H20. Cloruro Férrico SC-Disolver aproximadamente 55 g de cloruro férrico (FeC'3 · 6H20) en una cantidad suficiente de una mezcla de 25 ml de ácido clorhídrico y 975 ml de agua para obtener 1000 ml. Pipetear 1O ml de esta solución y transferir a un matraz de yodo de 250 ml, agregar 15 ml de agua, 3 g de yoduro de potasio y 5 ml de ácido clorhídrico y dejar la mezcla en reposo durante 15 minutos. Diluir con 100 ml de agua y valorar el yodo liberado con tiosulfato de sodio 0, 1 N SV, agregando 3 ml de almidón SR como indicador. Realizar una determinación con un blanco con las mismas cantidades de los mismos reactivos y hacer las correcciones necesarias. Cada ml de tiosulfato de sodio O, 1 N equivale a 27,03 mg de FeCb · 6H20. Ajustar el volumen final de la solución agregando una cantidad suficiente de la mezcla de ácido clorhídrico y agua de manera que cada ml contenga 45,0 mg de FeC'3 · 6H20. Sulfato Cúprico SC-Disolver aproximadamente 65 9 de sulfato cúprico (CuS04 · 5H20) en una cantidad suficiente de una mezcla de 25 ml de ácido clorhídrico y 975 ml de agua para obtener 1000 ml. Pipetear 1 O ml de esta solución y transferir a un matraz de yodo de 250 ml, agregar 40 ml de agua, 4 ml de ácido acético, 3 g de yoduro de potasio y 5 ml de ácido clorhídrico y valorar el yodo liberado con tiosulfato de sodio O, 1 N SV, agregando 3 ml de almidón SR como indicador. Realizar una determinación con un blanco con las mismas cantidades de los mismos reactivos y hacer las correcciones necesarias. Cada ml de tiosulfato de sodio O, l N equivale a 24,97 mg de CuS04 · 5H20. Ajustar el volumen final de la solución agregando una cantidad suficiente de la mezcla de ácido clorhídrico y agua de manera que cada ml contenga 62,4 mg de CuS04 · 5H20.
SOLUCIONES INDICADORAS VER SOLUCIONES REACTIVO
SOLUCIONES REACTIVO (SR) 1. USO COMO INDICADORES Algunas soluciones reactivo están destinadas para ser usadas como indicadores ácido-base en análisis volumétricos. Dichas soluciones se deben ajustar de manera tal que cuando se agreguen O, 15 ml de la solución indicadora a 25 ml de a~ua exenta de dióxido de carbono, con 0,25 ml de álcali o acido 0,02 N se produce el cambio de color característico. Soluciones similares se destinan para usar en la medición del pH. Cuando no se den instrucciones especiales para su preparación, la misma solución es adecuada para ambos propósitos.
2. SOLUCIONES VOLUMÉTRICAS USADAS COMO SOLUCIONES REACTIVO Cuando se indica que se debe usar una solución volumétrica como solución reactivo en un procedimiento cualitativo, no es necesario estandarizar la solución usada como solución reactivo.
3. SOLUCIONES PREPARADAS EN EL DÍA DE
su uso
En general cuando se indique que una solución debe prepararse "en el día de su uso" significa que la solución tiene estabilidad limitada.
Acetaldehído SR-Mezclar 4 ml de acetaldehído, 3 ml de alcohol y 1 ml de agua. Preparar esta solución en el día de su uso. Acetato Cúprico SR-Disolver 100 mg de acetato cúprico en aproximadamente 5 ml de agua a la que se han agregado unas pocas gotas de ácido acético. Diluir hasta 100 ml y filtrar, si fuera necesario. Acetato Cúprico Concentrado SR (Reactivo de Barfoed)Disolver 13,3 g de acetato cúprico en una mezcla de 195 ml de agua y 5 ml de ácido acético. Acetato de Amonio SR-Disolver 1O g de acetato de amonio en agua para obtener 100 ml. Acetato de Fenilhidrazina SR-Disolver 1O ml de fenilhidrazina y 5 ml de ácido acético glacial en agua para obtener 100 ml. Acetato de Plomo SR-Disolver 9,5 g de cristales claros, transparentes, de acetato de plomo, en agua recién hervida para obtener 100 ml. Almacenar en frascos bien tapados. Acetato de Plomo Alcohólico SR-Disolver 2 g de cristales claros, transparentes, de acetato de plomo, en alcohol para obtener 100 ml. Almacenar en envases impermeables. Acetato de Potasio SR-Disolver en agua 1O g de acetato de potasio para obtener 100 ml. Acetato de Sodio SR-Disolver 13,6 g de acetato de sodio en agua para obtener 100 ml. Acetato de Uranilo y Cinc SR-Disolver 50 9 de acetato de uranilo en una mezcla de 15 ml de ácido acetico glacial y agua para obtener 500 ml. Luego disolver 150 g de acetato de cinc en una mezcla de 15 ml de ácido acético glacial y agua para obtener 500 ml. Mezclar las dos soluciones, dejar en reposo durante la noche y pasar a través de un filtro seco, si fuera necesario. Acetato de Uranilo y Cobalto SR-Disolver, entibiando, 40 g de acetato de uranilo en una mezcla de 30 g de ácido acético glacial y agua suficiente para obtener 500 ml. De modo similar, preparar una solución con 200 ~ de acetato cobaltoso en una mezcla de 30 g de ácido acetico glacial y agua suficiente para obtener 500 ml. Mezclar las dos soluciones mientras aún estén tibias y enfriar hasta 20º. Mantener la temperatura a 20º durante aproximadamente 2 horas para separar las sales en exceso de la solución y luego pasar a través de un filtro seco. Acetato Mercúrico SR-Disolver 6,0 g de acetato mercúrico en ácido acético glacial para obtener 100 ml. Almacenar en envases impermeables. Proteger de la luz solar directa. Acetona Amortiguada SR-Disolver 8, 15 g de acetato de sodio y 42 g de cloruro de sodio en aproximadamente 100 ml de agua; agregar 68 ml de ácido clorhídrico O, 1 N y 150 ml de acetona. Mezclar y diluir con agua hasta 500 ml. Ácido Acético Concentrado SR-Agregar 300,0 ml de ácido acético glacial y diluir con agua hasta 1000 ml. Esta solución contiene aproximadamente 30% (v/v) de CH3COOH y tiene una concentración de aproximadamente 5 N. Ácido Acético Glacial SR-Determinar el contenido de agua de una muestra de ácido acético glacial mediante el Método Volumétrico (ver Determinación de Agua (921 )). Si el ácido contiene más de 0,4% de agua, agregar algunos ml de anhídrido acético, mezclar, dejar en reposo durante la noche y determinar nuevamente el contenido de agua. Si el
2372 Soluciones Reactivo /Soluciones ácido contiene menos de 0,02% de agua, agregar agua en cantidad suficiente para que la concentración final esté entre 0,02% y 0,4%, mezclar, dejar en reposo durante la noche y determinar nuevamente el contenido de agua. Volver a ajustar con anhídrido acético o agua, según sea necesario, hasta que la solución resultante tenga un contenido de agua de no más de 0,4%. Ácido Aminonaftolsulfónico SR-Pesar con exactitud 5 g de sulfito de sodio, 94,3 g de bisulfito de sodio y 700 mg de ácido 1,2,4-aminonaftolsulfónico y mezclar. Preparar el ácido aminonaftolsulfónico SR en el día de su uso, por disolución de 1,5 g de la mezcla seca en 1 O ml de agua. Ácido Cromotrópico SR-Disolver 50 mg de ácido cromotrópico o su sal disódica en 100 ml de ácido sulfúrico al 75%, que se puede preparar agregando cuidadosamente 75 ml de ácido sulfurico a 33,3 ml de agua. Ácido Diazobencensulfónico SR-Colocar en un vaso de precipitados 1,57 g de ácido sulfanílico previamente secado a 105º durante 3 horas, agregar 80 ml de agua y 1 O ml de ácido clorhídrico diluido y entibiar en un baño de vapor hasta que se disuelva. Enfriar a 15º (parte del ácido sulfanílico se puede separar pero luego se disolverá) y agregar lentamente, mezclando constantemente, 6,5 ml de solución de nitrito de sodio (1 en 1 O). Luego diluir con agua hasta 100 ml. Ácido Fenoldisulfónico SR-Disolver 2,5 g de fenol en 15 ml de ácido sulfúrico colocados en un matraz de capacidad adecuada. Agregar 7,5 ml de ácido sulfúrico fumante, mezclar bien y calentar a 100º durante 2 horas. Transferir el producto, mientras aún esté líquido, a un frasco con tapón de vidrio y, cuando se desee usar, entibiar en un baño de agua hasta licuarlo. Ácido Fosfomolíbdico SR-Disolver 20 g de ácido fosfomolíbdico en alcohol para obtener 100 ml. Filtrar la solución y usar solamente el filtrado transparente. Ácido Fosfotúngstico SR-Disolver en agua 1 g de ácido fosfotúngstico para obtener 100 ml. Ácido Metafosfórico-Ácido Acético SR-Disolver 15 g de ácido metafosfórico en 40 ml de ácido acético glacial y a9ua suficiente para obtener 500 ml. Almacenar en un lugar fno y usar dentro de los 2 días. Ácido Metoxifenilacético SR-Disolver 2,7 g de ácido metoxifenilacético en 6 ml de Hidróxido de Tetrametilamonio SR y agregar 20 ml de alcohol deshidratado. Almacenar en un recipiente de polietileno. Ácido Oxálico SR-Disolver 6,3 g de ácido oxálico en agua para obtener 100 ml. Ácido Perclórico SR-Diluir 8,5 ml de ácido perclórico con agua hasta 100 ml.
USP 39 Ácido Sulfomolíbdico SR-Disolver, con ayuda de calor, 2,5 g de molibdato de amonio en 20 ml de agua, agregar 50 ml de ácido sulfúrico 12 N y diluir con agua hasta 100 ml. Almacenar esta solucion en un envase de polietileno. Ácido Sulfúrico SR-Agregar una cantidad de ácido sulfúrico de concentración conocida a un volumen de agua suficiente para ajustar la concentración final a un valor entre 94,5% y 95,5% {p/p) de H2SQ4. [NOTA-Como la concentración de ácido puede cambiar al quedar en reposo o con el uso intermitente, la concentración se debe controlar con frecuencia y se deben desechar las soluciones cuya valoración indique más de 95,5% o menos de 94,5%.] Ácido Sulfúrico-Formaldehído SR-A9regar 1 gota de formaldehído SR a cada ml de ácido sulfurico y mezclar. Preparar esta solución en el día de su uso. Ácido Tánico SR-Disolver 1 g de ácido tánico en 1 ml de alcohol y diluir con agua hasta 1O ml. Preparar esta solución en el día de su uso. Ácido Tartárico SR-Disolver 3 g de ácido tartárico en agua para obtener 1O ml. Preparar esta solución en el día de su uso. Ácido p-Toluensulfónico SR-Disolver 2 g de ácido p-toluensuffónico en 1O ml de una mezcla de 7 partes de acetona y 3 partes de agua. Albúmina de Huevo SR-Separar cuidadosamente la clara de la yema de un huevo de gallina muy fresco. Agitar para mezclar la clara con 100 ml de agua hasta que se disuelva todo salvo la chalaza; luego filtrar. Preparar la solución en el día de su uso. Alcohol Desnaturalizado SR-Un alcohol especialmente desnaturalizado que contiene disolvente de hidrocarburo de goma, heptano o tolueno. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado en www.lyondell.com o en www.sasol. com, como Ethanol SDA 2B HEP 200, Ethanol SDA 2B TOL 200, Ethanol SDA 2B TOL 190 o Alcohol SDA 2B-2.] Alcohol-Fenol SR-Disolver 780 mg de fenol en alcohol para obtener 100 ml. Alizarinsulfonato de Sodio SR-Disolver 100 mg de alizarinsulfonato de sodio en 100 ml de agua y filtrar. Almidón SR-Mezclar 1 g de almidón soluble con 1O mg de yoduro mercúrico rojo y suficiente agua fría para obtener una pasta líquida. A9regar 200 ml de agua en ebullición y mantener a ebullicion durante 1 minuto mezclando constantemente. Enfriar y usar sólo la solución transparente. [NOTA-Se pueden usar soluciones indicadoras de almidón estabilizadas, disponibles comercialmente, incluyendo soluciones exentas de mercurio conservadas con otros compuestos tal como ácido salicílico.]
Ácido Pícrico SR-Ver Trinitrofenol SR. Ácido Sulfanílico SR-Disolver 800 mg de ácido sulfanílico en 100 ml de ácido acético. Almacenar en envases impermeables. Ácido Sulfanílico Diazotado SR-Disolver entibiando 0,9 g de ácido sulfanílico en 9 ml de ácido clorhídrico y diluir con agua hasta 100 ml. Enfriar 1O ml de esta solución en agua con hielo y agregar 1O ml de una solución de nitrito de sodio (4,5 en 100) enfriada previamente en agua con hielo. Dejar en reposo a Oº durante al menos 15 minutos (la solución se puede conservar durante 3 días a esta temperatura). Inmediatamente antes de usar, agregar 20 ml de solución de carbonato de sodio (1 en 1O).
Almidón Exento de Yoduro SR-Mezclar 1 g de almidón soluble con suficiente agua fría para obtener una pasta líquida. Mientras se mezcla, agregar 100 ml de a9ua en ebullición y dejar que se enfríe. Preparar esta solucion inmediatamente antes de usar. El almidón exento de yoduro SR presenta un color azul cuando, a 1 ml de éste, se le agregan 20 ml de solución de yoduro de potasio (1 en 400) y 0,05 ml de una solución de yodo-yoduro de potasio (que se prepara disolviendo 127 mg de yodo y 800 mg de yoduro de potasio en agua y diluyendo con agua hasta 100 ml).
USP 39
Almidón-Yoduro de Potasio SR-Disolver 500 mg de yoduro de potasio en 100 ml de almidón SR recién preparado. Preparar esta solución en el día de su uso. Amaranto SR-Disolver 20 mg de amaranto en 1 O ml de agua. Amarillo de Metilo SR-Preparar una solución en alcohol que contenga O, 1 O mg por ml.
Soluciones/ Soluciones Reactivo 2373 Azul de Oracet B SR-Una solución 1 en 200 de azul de oracet B en ácido acético glacial. Azul de Tetrazolio SR-Disolver 500 mg de azul de tetrazolio en alcohol para obtener 100 ml. Azul de Timol SR-Disolver 100 mg de azul de timol en 100 ml de alcohol y filtrar si fuera necesario. Betanaftol SR-Ver 2-Nafto/ SR.
Amarillo de Metilo-Azul de Metileno SR-Disolver 1 g de amarillo de metilo y 100 mg de azul de metileno en 125 ml de metanol. Aminoacetato de Sodio SR (Glicinato de Sodio SR)-Disolver 3,75 g de ácido aminoacético en aproximadamente 500 ml de agua, agregar 2, 1 g de hidróxido de sodio y diluir con agua hasta 1000 ml. Mezclar 9 ml de la solución resultante con 1 ml de ácido acético glacial diluido (1 en 300). Esta solución reactivo tiene un pH entre 10,4 y 10,5. Amoníaco SR-Contiene entre 9,5% y 10,5% de NH 3. Preparar por dilución de 350 ml de Hidróxido de Amonio Concentrado (ver la sección Reactivos) con agua para obtener 1000 ml. Amoníaco SR 2-Preparar diluyendo 13,5 ml de Hidróxido de Amonio Concentrado (ver Especificaciones de Reactivos en la sección Reactivos) con agua para obtener 100 ml. Amoníaco Alcohólico SR-Una solución de amoníaco gaseoso en alcohol. Líquido transparente, incoloro, con fuerte olor a amoníaco. Peso específico: aproximadamente 0,80. Contiene entre 9% y 11 % de NH3. Almacenar en envases resistentes a los álcalis, en un lugar frío. Amoníaco-Cianuro SR-Disolver 2 g de cianuro de potasio en 15 ml de hidróxido de amonio y diluir con agua hasta 100 ml. Amoníaco Concentrado SR-Usar Hidróxido de Amonio Concentrado (ver la sección Reactivos). Anaranjado de Metilo SR-Disolver 100 mg de anaranjado de metilo en 100 ml de agua y filtrar si fuera necesario. Anaranjado de Xilenol SR-Disolver 100 mg de anaranjado de xilenol en 100 ml de alcohol. Antrona SR-Dentro de las 12 horas de uso, disolver rápidamente 35 mg de antrona en una mezcla caliente de 35 ml de agua y 65 ml de ácido sulfúrico. Enfriar inmediatamente en un baño de hielo hasta temperatura ambiente y filtrar a través de lana de vidrio. Dejar la solución en reposo a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de usar. Azul Brillante G SR-Transferir 25 mg de azul brillante G a un matraz volumétrico de 100 ml, agregar 12,5 ml de alcohol y 25 ml de ácido fosfórico, diluir a volumen con agua y mezclar. Azul de Bromocresol SR-Usar Verde de Bromocresol SR. Azul de Bromofenol SR-Disolver 100 mg de azul de bromofenol en 100 ml de alcohol diluido y filtrar si fuera necesario. Azul de Bromotimol SR-Disolver 100 mg de azul de bromotimol en 100 ml de alcohol diluido y fíltrar si fuera necesario. Azul de Metileno SR-Disolver 125 mg de azul de metileno en 100 ml de alcohol y diluir con alcohol hasta 250 mL.
Bisulfito de Sodio SR-Disolver 1O g de bisulfito de sodio en agua para obtener 30 ml. Preparar esta solución en el día de su uso. Bitartrato de Sodio SR-Disolver 1 g de bitartrato de sodio en agua para obtener 1O ml. Preparar esta solución en el día de su uso. Bromo SR (Agua de Bromo)-Una solución saturada de bromo, preparada por agitación de 2 a 3 ml de bromo con 100 ml de agua fna en un frasco con tapón de vidrio, el tapón que debe estar lubricado con vaselina. Almacenar en un lugar frío, protegido de la luz. Bromo-Acetato de Sodio SR-Disolver 100 g de acetato de sodio en 1000 ml de ácido acético glacial, agregar 50 ml de bromo y mezclar. p-Bromoanilina SR-A9regar 8 g de p-bromoanilina a una mezcla de 380 ml de acido acético glacial saturado con tiourea, 1 O ml de solución de cloruro de sodio (1 en 5), 5 ml de solución de ácido oxálico (1 en 20) y 5 ml de solución de fosfato dibásico de sodio (1 en 1 O) en un frasco de vidrio con protección actínica. Mezclar y dejar en reposo durante toda la noche antes de usar. Proteger de la luz y utilizar dentro de los 7 días. Bromuro Mercúrico Alcohólico SR-Disolver 5 g de bromuro mercúrico en 1 00 ml de alcohol, calentando suavemente para facilitar la disolución. Almacenar en envases de vidrio, protegido de la luz. Carbonato de Amonio SR-Disolver 20 g de carbonato de amonio y 20 ml de amoníaco SR en agua para obtener 100 ml. Carbonato de Amonio SR 2-Preparar una solución de 158 mg/ml de carbonato de amonio en agua. Carbonato de Potasio SR-Disolver 7 g de carbonato de potasio anhidro en agua para obtener 100 ml. Carbonato de Sodio SR-Disolver 10,6 g de carbonato de sodio anhidro en agua para obtener 100 ml. Citrato Cúprico SR-Disolver 25 g de sulfato cúprico, 50 g de ácido c1trico y 144 g de carbonato de sodio anhidro en agua y diluir con agua hasta 1000 ml. Citrato Cúprico Alcalino SR-Con ayuda de calor, disolver 173 g de citrato de sodio dihidrato y 11 7 g de carbonato de sodio monohidrato en aproximadamente 700 ml de agua y filtrar a través de papel, si fuera necesario, para obtener una solución transparente. En un recipiente separado, disolver 17,3 g de sulfato cúprico en aproximadamente 100 ml de agua y agregar lentamente esta solución, mezclando constantemente, a la primera solución. Enfriar la mezcla, agregar agua para obtener 1000 ml y mezclar. Citrato Cúprico Alcalino SR 2-Disolver aproximadamente 173 g de citrato de sodio dihidrato y 11 7 g de carbonato de sodio monohidrato en aproximadamente 700 ml de agua con ayuda de calor, y filtrar. En un segundo matraz, disolver aproximadamente 27,06 g de sulfato cúprico (CuS04 ·
2374 Soluciones Reactivo/ Soluciones
USP 39
5H20) en aproximadamente 100 mL de agua. Combinar lentamente las dos soluciones mientras se mezclan y diluir con agua hasta 1000 ml.
Cloruro Estannoso, Solución Ácida SR-Disolver 8 g de cloruro estannoso en 500 mL de ácido clorhídrico. Almacenar en envases de vidrio y usar dentro de los 3 meses.
Citrato de Sodio SR-Disolver 73,5 g de citrato de sodio dihidrato en agua para obtener 250 ml.
Cloruro Estannoso, Solución Ácida Concentrada SR-Disolver 40 g de cloruro estannoso en 100 mL de ácido clorhídrico. Almacenar en envases de vidrio y usar dentro de los 3 meses.
Citrato de Sodio Alcalino SR-Disolver 50 g de citrato de sodio dihidrato y 2,5 g de hidróxido de sodio en agua para obtener 250 mL. Clorhidrato de Hidrazona de 3-Metil-2-benzotiazolinona SR-Disolver O, 1 g de clorhidrato de hidrazona de 3-metil2-benzotiazolinona monohidrato en 1O mL de agua, diluir la solución resultante con metano! hasta 100 mL y mezclar. Clorhidrato de Hidroxilamina SR-Disolver 3,5 g de clorhidrato de hidroxilamina en 95 mL de alcohol al 60% y agregar 0,5 mL de solución de azul de bromofenol (1 en 1000 de alcohol) e hidróxido de potasio alcohólico 0,5 N hasta que la solución tome un tinte verdoso. Luego agregar alcohol al 60% para obtener 100 mL. Clorhidrato de Metafenilendiamina SR-Disolver 1 g de clorhidrato de metafenilendiamina en 200 mL de agua. La solución debe ser incolora cuando se usa. Si es necesario, decolorar por calentamiento con carbón activado. Cloro SR (Agua de C/oro)-Una solución saturada de cloro en agua. Colocar la solución en envases pequeños, resistentes a la luz, completamente llenos. El Cloro SR, incluso si se mantiene protegido de la luz y el aire, tiende a deteriorase. Almacenar en un lugar frío y oscuro. Para obtener la concentración más alta, preparar esta solución en el día de su uso. Cloruro Cobaltoso SR-Disolver 2 g de cloruro cobaltoso en 1 mL de ácido clorhídrico y agua suficiente para obtener 100 ml. Cloruro de Amonio SR-Disolver 10,5 g de cloruro de amonio en agua para obtener 100 ml. Cloruro de Amonio-Hidróxido de Amonio SR-Mezclar volúmenes iguales de agua e hidróxido de amonio, y saturar con cloruro de amonio.
Cloruro Férrico SR-Disolver 9 g de cloruro férrico en agua para obtener 100 ml. Cloruro Férrico Ácido SR-Mezclar 60 mL de ácido acético glacial con 5 mL de ácido sulfúrico, agregar 1 mL de cloruro férrico SR, mezclar y enfriar. Cloruro Mercúrico SR-Disolver 6,5 g de cloruro mercúrico en agua para obtener 100 ml. Cloruro Platínico SR-Disolver 2,6 g de cloruro platínico en agua para obtener 20 ml. Cobaltinitrito de Sodio SR-Disolver 1O g de cobaltinitrito de sodio en agua para obtener 50 mL y filtrar si fuera necesario. Cristal Violeta SR-Disolver 100 mg de cristal violeta en 1O mL de ácido acético glacial. Cromato de Potasio SR-Disolver 1O g de cromato de potasio en agua para obtener 100 ml. Diclorhidrato de N-(1-Naftil)etilendiamina SR-Disolver 100 mg de diclorhidrato de N-(1-naftil)etilendiamina en 100 mL de una mezcla de 7 partes de acetona y 3 partes de agua. Diclorofluoresceína SR-Disolver 100 mg de diclorofluoresceína en 60 mL de alcohol, agregar 2,5 mL de hidróxido de sodio O, 1 N, mezclar y diluir con agua hasta 100 ml. Dicromato de Potasio SR-Disolver 7,5 g de dicromato de potasio en agua para obtener 100 ml.
Cloruro de Bario SR-Disolver 12 g de cloruro de bario en agua para obtener 100 ml.
Dietilditiocarbamato de Plata SR-Disolver 1 g de dietilditiocarbamato de plata en 200 mL de piridina obtenida de un frasco recién abierto o que haya sido destilada recientemente. Almacenar en envases resistentes a la luz y usar dentro de los 30 días.
Cloruro de Calcio SR-Disolver 7,5 g de cloruro de calcio en agua para obtener 100 ml.
Difenilamina SR-Disolver 1,0 g de difenilamina en 100 mL de. ácido sulfúrico. La solución debe ser incolora.
Cloruro de Oro SR-Disolver 1 g de cloruro de oro en 35 mL de agua.
Difenilcarbazona SR-Disolver 1 g de difenilcarbazona cristalina en 75 mL de alcohol, luego agregar alcohol para obtener 100 ml. Almacenar en un frasco de color marrón.
Cloruro de Paladio Amortiguado SR-Pesar 500 mg de cloruro de paladio en un vaso de precipitados de 250 mL, agregar 5 mL de ácido clorhídrico concentrado y entibiar la mezcla en un baño de vapor. Agregar 200 mL de agua caliente en pequeñas porciones con calentamiento continuo hasta completar la disolución. Transferir la solución a un matraz volumétrico de 250 mL y diluir a volumen con agua. Transferir 50 mL a un matraz volumétrico de 100 ml. Agregar 1O mL de acetato de sodio 1 M y 9,6 mL de ácido clornídrico 1 N. Diluir a volumen con agua Cloruro de Sodio Alcalino SR-Disolver 2 g de hidróxido de sodio en 100 mL de agua, saturar la solución con cloruro de sodio y filtrar. Cloruro de Trifeniltetrazolio SR-Disolver 500 mg de cloruro de trifeniltetrazolio en alcohol deshidratado para obtener 100 mL.
2,7-Dihidroxinaftaleno SR-Disolver 100 mg de 2,7-dihidroxinaftaleno en 1000 mL de ácido sulfúrico y dejar la solución en reposo hasta que el color amarillo desaparezca. Si la solución es muy oscura, desecharla y preparar una solución nueva a partir de ácido sulfúrico de distinta procedencia. Esta solución se mantiene estable durante aproximadamente 1 mes si se almacena en un frasco oscuro. p-Dimetilaminobenzaldehído SR-Disolver 125 mg de pdimetilaminobenzaldehído en una mezcla enfriada de 65 mL de ácido sulfúrico y 35 mL de agua, y agregar 0,05 mL de cloruro férrico SR. Usar dentro de los 7 días. Dinitrofenilhidrazina SR-Mezclar cuidadosamente 1O mL de agua y 1O mL de ácido sulfúrico y enfriar. A la mezcla, contenida en un matraz con tapón de vidrio, agregar 2 g de 2,4-dinitrofenilhidrazina y agitar hasta que se disuelva. Agregar a la solución 35 mL de agua, mezclar, enfriar y filtrar.
Soluciones /Soluciones Reactivo 2375
USP 39 Ditizona SR-Disolver 25,6 mg de ditizona en 100 ml de alcohol. Almacenar en un lugar frío y usar dentro de los 2 meses. Diyodofluoresceína SR-Disolver 500 mg de diyodofluorescema en una mezcla de 75 ml de alcohol y 30 ml de agua. Edetato Disódico SR-Disolver 1 g de edetato disódico en 950 ml de agua, agregar 50 ml efe alcohol y mezclar. Enzima Fosfática SR-Disolver 5 g de enzima fosfática en agua para obtener 50 ml. Preparar esta solución en el día de su uso. Eosina Y SR (indicador de adsorción)-Disolver 50 mg de eosina Y en 1O ml de agua. Eriocromo Cianina SR-Disolver 750 mg de eriocromo cianina R en 200 ml de agua, agregar 25 g de cloruro de sodio, 25 g de nitrato de amonio y 2 ml de ácido nítrico, y diluir con agua hasta 1000 ml.
Cada ml de esta solución corresponde a 0,01 mg de flúor (F).
Folin-Ciocalteu para Fenoles SR-En un matraz de 1500 ml introducir 100 g de tungstato de sodio, 25 g de molibdato de sodio, 700 ml de agua, 50 ml de ácido fosfórico y 100 ml de ácido clorhídrico. Someter la mezcla a reflujo suave durante aproximadamente 1O horas y agregar 150 g de sulfato de litio, 50 ml de a~ua y algunas gotas de bromo. Calentar la mezcla a ebullicion, sin el condensador, durante aproximadamente 15 minutos, o hasta que se expulse el exceso de bromo. Enfriar, diluir con agua hasta 1 L y filtrar: el filtrado no tiene ningún tinte verdoso. Antes de usar, diluir 1 parte del filtrado con 1 parte de agua. Cuando se usa para la determinación de proteínas (es decir, la valoración de Lowry), este reactivo debe diluirse aun más con agua (1 :5). Ver Método 2 en Artículos Obtenidos por Biotecnología-Valoración de Proteínas Totales (1057). Formaldehído SR-Usar Solución de Formaldehído (ver en la sección Reactivos).
Fenolftaleína SR-Disolver 1 g de fenolftaleína en 100 ml de alcohol.
Fosfato Dibásico de Amonio SR (Fosfato de Amonio SR)Disolver 1 3 g de fosfato dibásico de amonio en agua para obtener 1 00 m L.
Fenilhidrazina-Ácido Sulfúrico SR-Disolver 65 mg de clorhidrato de fenilhidrazina en 100 ml de una mezcla enfriada de volúmenes iguales de ácido sulfúrico y agua.
Fosfato Dibásico de Sodio SR-Disolver 12 g de fosfato dibásico de sodio en agua para obtener 100 ml.
Fenol SR-Disolver 1,2 g de fenol en alcohol para obtener 1 O ml. Preparar semanalmente. Ferricianuro de Potasio SR-Disolver 1 g de ferricianuro de potasio en 1O ml de agua. Preparar esta solución en el día de su uso. Ferricianuro de Potasio Amoniacal SR-Disolver 2 g de ferricianuro de potasio en 75 ml de agua, agregar 25 ml de hidróxido de amonio y mezclar. Ferrocianuro de Potasio SR-Disolver 1 g de ferrocianuro de potasio en 1O ml de agua. Preparar esta solución en el día de su uso. Ferroína SR-Disolver 0,7 g de sulfato ferroso y 1,76 g de monoclorhidrato de o-fenantrolina monohidrato en agua, y diluir con agua hasta 100 ml. Floroglucinol SR-Disolver 500 mg de floroglucinol en 25 ml de alcohol. Almacenar en envases impermeables, pro-
tegido de la luz. Fluido Gástrico Simulado SR-Disolver 2,0 g de cloruro de sodio y 3,2 g de pepsina purificada, obtenida de mucosa gástrica porcina, con una actividad de 800 a 2500 unidades por mg de proteína, en 7,0 ml de ácido clorhídrico y agua suficiente para obtener 1000 ml. [NOTA-La actividad de la pepsina se describe en las especificaciones del Food Chemicals Codex en Pruebas y Valoraciones Generales.] Esta solución reactivo tiene un pH de aproximadamente 1,2. Fluido Intestinal Simulado SR-Disolver 6,8 g de fosfato monobásico de potasio en 250 ml de agua, mezclar y agregar 77 ml de hidróxido de sodio 0,2 N y 500 ml de agua. Agregar 10,0 g de pancreatina, mezclar y ajustar la solución resultante con hidróxido de sodio 0,2 N o con ácido clorhídrico 0,2 N a un pH de 6,8 ± O, 1. Diluir con agua hasta 1000 ml. Fluoruro de Sodio SR-Secar aproximadamente 500 mg de fluoruro de sodio a 200º durante 4 horas. Pesar con exactitud 222 mg del material seco y disolver en ª,9ua para obtener 100,0 ml. Pipetear 1O ml de esta solucion, transferir a un matraz volumétrico de 1 L y diluir a volumen con agua.
Fosfotungstato de Sodio SR-A una solución de 20 g de tungstato de sodio en 100 ml de agua, agregar suficiente ácido fosfórico para producir una reacción fuertemente ácida al tornasol y fiftrar. Cuando se necesite usar, decantar la solución transparente para separarla del sedimento posible. Almacenar en envases impermeables y resistentes a la luz. Fucsina-Ácido Sulfuroso SR-Disolver 200 mg de fucsina básica en 120 ml de agua caliente y dejar que la solución se enfríe. Agregar una solución de 2 g de sulfito de sodio anhidro en 20 ml de agua, luego agregar 2 ml de ácido clorhídrico. Diluir la solución con agua hasta 200 ml y dejar en reposo durante al menos 1 hora. Preparar esta solución en el día de su uso. Fucsina-Pirogalol SR-Disolver 100 mg de fucsina básica en 50 ml de agua que previamente se ha llevado a ebullición durante 15 minutos y se ha dejado enfriar ligeramente. Enfriar, agregar 2 ml de una solución saturada de bisulfito de sodio, mezclar y dejar en reposo durante no menos de 3 horas. Agregar 0,9 ml de ácido clorhídrico, mezclar y dejar en reposo durante la noche. Agregar 100 mg de pirogalol, agitar hasta lograr su disolución y diluir con agua hasta 100 ml. Almacenar en un frasco de vidrio color ámbar en un refrigerador. Gelatina SR (para la valoración de Inyección de Corticotropina)-Disolver 340 g de precursor de gelatina tratado con ácido (Tipo A) en agua para obtener 1000 ml. Calentar la solución en autoclave a 115° durante 30 minutos después de que la temperatura de la salida haya alcanzado 115º. Enfriar la solución y agregar 1O g de fenol y 1000 ml de agua. Almacenar en envases impermeables en un refrigerador. Glicerina Básica SR-Agregar agua a 200 g de glicerina para obtener un peso total de 235 g. Agregar 140 ml de hidróxido de sodio 1 N y 50 ml de agua. Glucosa Oxidasa-Cromogénica SR-Una solución que contiene, en cada ml, 0,5 µmol de 4-aminoantipirina, 22,0 µmol de p-hidroxibenzoato de sodio, no menos de 7,0 unidades de glucosa oxidasa y no menos de 0,5 unidades de peroxidasa y amortiguada a un pH de 7,0 ± O, 1.
2376 Soluciones Reactivo /Soluciones APTITUD: Cuando se emplea para determinar glucosa en lnulina, evaluar que no se produzca color significativo por reacción con fructosa y que se obtenga una pendiente adecuada de absorbancia en función de la concentración de 9lucosa. LNOTA-La glucosa oxidasa puede proceder de Aspergillus niger.] Hematoxilina de Delafield SR-Preparar 400 mL de una solución saturada de alumbre de amonio (Solución A). Disolver 4 9 de hematoxilina en 25 mL de alcohol, mezclar con Solucion A y dejar en reposo durante 4 días en un matraz cerrado con un trozo de algodón purificado y expuesto a la luz y al aire (Solución 8). Luego filtrar la Solución By agregarla a una Solución C constituida por una mezcla de 100 mL de glicerina y 100 mL de metano!. Mezclar y dejar la mezcla en reposo en un lugar cálido, expuesta a la luz, durante 6 semanas hasta que se torne de color oscuro. Almacenar en frascos herméticamente cerrados. Para usar en la tinción de tejido endocrino, diluir esta solución de prueba con un volumen igual de agua. Hidrato de Cloral SR-Disolver 50 g de hidrato de cloral en una mezcla de 15 mL de agua y 1O mL de glicerina. Hidrosulfito de Sodio Alcalino SR-Disolver 25 g de hidróxido de potasio en 35 mL de agua y 50 g de hidrosulfito de sodio en 250 mL de agua. Cuando se necesite la solución reactivo, mezclar 40 mL de la solución de hidróxido con los 250 mL de la solución de hidrosulfito. Preparar esta solución en el día de su uso. Hidróxido de Bario SR-Una solución saturada de hidróxido de bario en agua recién hervida. Preparar la solución en el día de su uso. Hidróxido de Calcio SR-Usar Hidróxido de Calcio, Solución Tópica (monografía de la USP). Hidróxido de Potasio SR-Disolver 6,5 g de hidróxido de potasio en agua para obtener 100 ml. Hidróxido de Potasio Alcohólico SR-Usar Hidróxido de Potasio Alcohólico 0,5 N (ver la sección Soluciones Volumétricas). Hidróxido de Potasio Alcohólico SR 2-Disolver 1 30 g de hidróxido de potasio en 200 mL de agua con enfriamiento. Agregar alcohol hasta 1000 ml. Almacenar en un frasco de viario oscuro bien tapado. Hidróxido de Sodio SR-Disolver 4,0 g de hidróxido de sodio en agua para obtener 100 ml. Hidróxido de Sodio SR 2-Transferir 8,5 g de hidróxido de sodio a un matraz volumétrico de 100 mL, disolver y diluir a volumen con agua. Hidróxido de Sodio SR 3-Preparar una solución de 420 mg/mL de hidróxido de sodio en agua. Hidróxido de Tetrametilamonio SR-Usar una solución acuosa en que cada 100 mL contenga el equivalente a 1O g hidróxido de tetrametilamonio anhidro. 8-Hidroxiquinolina SR-Disolver 5 g de 8-hidroxiquinolina en alcohol para obtener 100 ml. Hierro-Fenol SR (Reactivo Hierro-Kober)-Disolver 1,054 g de sulfato ferroso amónico en 20 mL de agua y agregar 1 ml de ácido sulfúrico y 1 mL de peróxido de hidrógeno al 30 por ciento. Mezclar, calentar hasta que cese la efervescencia y diluir con agua hasta 50 ml. A 3 volúmenes de esta solución contenida en un matraz volumétrico agregar ácido sulfúrico, con enfriamiento, para obtener 100 volúmenes. Purificar el fenal mediante destilación, desechar el primer
USP 39 10% y el último 5%, recolectar el destilado, excluyendo la humedad, en un matraz seco, tarado, con tapón de vidrio, de aproximadamente dos veces el volumen del fenol. Solidificar el fenol en un baño de hielo, rompiendo la costra superficial con una varilla de vidrio para asegurar una cristalización completa. Pesar el matraz y su contenido, agregar al fenal 1, 1 3 veces su peso de la solución de hierro-ácido sulfúrico preparada según se indica, tapar el matraz y dejar en reposo, sin enfriamiento pero mezclando ocasionalmente, hasta que el fenal se licue. Agitar la mezcla vigorosamente hasta que se mezcle, dejar en reposo en la oscuridad durante 16 a 24 horas y pesar nuevamente el matraz y su contenido. Agregar a la mezcla 23,5% de su peso de una solución de 100 volúmenes de ácido sulfúrico en 11 O volúmenes de agua, mezclar, transferir a frascos secos con tapón de vidrio y almacenar en la oscuridad, protegida de la humedad atmosférica. Utilizar en un plazo no mayor a 6 meses. Dispensar el reactivo desde una bureta de diámetro pequeño, protegida de la humedad, capaz de dispensar 1 mL en 30 segundos o menos, sin lubricante en su llave de paso, con excepción del reactivo. Limpiar la punta de la bureta con papel antes de cada agregado. Hipobromito de Sodio SR-A una solución de 20 g de hidróxido de sodio en 75 mL de agua, agregar 5 mL de bromo. Después de que se disuelva, diluir con agua hasta 100 ml. Preparar esta solución en el día de su uso. Hipoclorito de Sodio SR-Usar Solución de Hipoclorito de Sodio (ver la sección Especificaciones de Reactivos). Índigo Carmín SR (Índigotindisulfonato de Sodio SR)-Disolver una cantidad de índigotindisulfonato de sodio, que equivalga a 180 mg de C16HaN202(S03Na)2, en agua para obtener 100 ml. Usar dentro de los 60 días. lndofenol-Acetato SR (para la valoración de Inyección de Corticotropina)-A 60 mL de solución estándar de diclorofenol-indofenol (ver en la sección Soluciones Volumétricas) agregar agua para obtener 250 ml. A9regar a la solución resultante un volumen igual de solucion de acetato de sodio recién preparada por disolución de 13,66 g de acetato de sodio anhidro en agua para obtener 500 mL y ajustar con ácido acético 0,5 N hasta pH 7. Almacenar en un refrigerador y usar dentro de las 2 semanas. Locke-Ringer SR (Solución de Locke-Ringer) Cloruro de Sodio Cloruro de Potasio Cloruro de Calcio Cloruro de Mannesio Bicarbonato de Sodio Dextrosa Agua, recién destilada de un matraz de vidrio arueso cantidad suficiente oara obtener
900 042 o 24 o 020
o
osa osa 1000 ml
Preparar a diario. Los componentes (excepto la dextrosa y el bicarbonato de sodio) pueden prepararse como soluciones madre y diluirse según sea necesario. Mezcla de Magnesia SR-Disolver 5,5 g de cloruro de magnesio y 7 g de cloruro de amonio en 65 mL de agua, agregar 35 mL de amoníaco SR, dejar en reposo la mezcla durante algunos días en un frasco bien tapado y filtrar. Si la solución no es perfectamente transparente, filtrar antes de usar. Molibdato de Amonio SR-Disolver 6,5 g de ácido molíbdico reducido a polvo fino en una mezcla de 14 mL de agua y 14,5 mL de hidróxido de amonio. Enfriar la solución y agregar lentamente, mezclando, a una mezcla bien enfriada de 32 mL de ácido nítrico y 40 mL de agua. Dejar en reposo
USP 39 durante 48 horas y filtrar a través de un crisol de vidrio sinterizado con un tamaño de poro fino. Esta solución se deteriora al dejarla en reposo y es inadecuada para usar si, al agregar 2 mL de fosfato dibásico de sodio SR a 5 mL de la solución, no se produce de inmediato o después de un ligero calentamiento, un abundante precipitado amarillo. Almacenar en la oscuridad. Si se forma un precipitado durante el almacenamiento, usar solamente el sobrenadante transparente. Molibdo-fosfotungstato SR (Reactivo de Folin-Denis)-Aproximadamente a 350 mL de agua contenida en un matraz de fondo redondo, as.regar 50 g de tun!;jstato de sodio, 12 g de ácido fosfomohbdico y 25 mL de acido fosfórico. Calentar la mezcla a ebullición con un condensador de reflujo durante 2 horas, luego enfriar, diluir con agua hasta 500 mL y mezclar. Almacenar en envases impermeables, protegidos de la luz y en un lugar frío. Monocloruro de Yodo SR-Disolver 1O g de yoduro de potasio y 6,44 g de yodato de potasio en 75 mL de agua, en un recipiente con tapón de vidrio. Agregar 75 mL de ácido clorhídrico y 5 mL de cloroformo, y ajustar hasta que tome un color a yodo pálido (en el cloroformo) agregando yoduro de potasio diluido o solución de yodato de potasio. Si se libera mucho yodo, emplear primero una solución más concentrada de yodato de potasio que 0,01 M, haciendo el ajuste final con el yodato de potasio 0,01 M. Almacenar en un lugar oscuro y reajustar hasta un color de yodo débil según sea necesario. 1-Naftol SR-Usar Reactivo de 1-Naftol. 2-Naftol SR (Betanaftol SR)-Disolver 1 g de 2-naftol en 100 mL de solución de hidróxido de sodio (1 en 100). p-Naftolbenceína SR-Disolver 250 mg de p-naftolbenceína en 100 mL de ácido acético glacial. Negro de Eriocromo SR-Disolver 200 mg de negro de eriocromo T y 2 g de clorhidrato de hidroxilamina en metano! para obtener 50 ml. Ninhidrina SR-Usar Tricetohidrindeno Hidrato SR. Nitrato Cérico Amónico SR-Disolver 6,25 g de nitrato cérico amónico en 1O mL de ácido nítrico 0,25 N. Usar dentro de los 3 días. Nitrato de Bario SR-Disolver 6,5 g de nitrato de bario en agua para obtener 100 ml. Nitrato de Lantano SR-Disolver 5,0 g de nitrato de lantano hexahidrato en 100 mL de agua. Nitrato de Plata SR-Usar Nitrato de Plata O, 1 N (ver la sección Soluciones Volumétricas). Nitrato de Plata Amoniacal SR-Ver Nitrato de Plata-Amoníaco SR.
Nitrato de Plata-Amoníaco SR-Disolver 1 g de nitrato de plata en 20 mL de agua. Agregar amoníaco SR, gota a gota, mezclando constantemente hasta que el precipitado se disuelva casi por completo, pero no totalmente. Filtrar y almacenar en envases impermeables y resistentes a la luz. Nitrato de Torio SR-Disolver 1 g de nitrato de torio en agua para obtener 100 ml. Filtrar si fuera necesario. Nitrato Mercúrico SR-Disolver 40 g de óxido mercúrico (rojo o amarillo) en una mezcla de 32 mL de ácido nítrico y 15 mL de agua. Almacenar en envases de vidrio, protegido de la luz.
Soluciones/ Soluciones Reactivo 2377 Nitrato Mercurioso SR-Disolver 15 g de nitrato mercurioso en una mezcla de 90 mL de agua y 1O mL de ácido nítrico diluido. Almacenar en frascos oscuros de color ámbar, donde se ha colocado un pequeño glóbulo de mercurio. p-Nitroanilina SR-A 350 mg de p-nitroanilina agregar 1,5 mL de ácido clorhídrico y mezclar. Diluir con agua hasta 50 mL, mezclar y dejar que sedimente. Colocar 5 mL del sobrenadante transparente en un matraz volumétrico de 100 mL y sumergir en un baño de hielo. Mientras está en el baño de hielo, agregar 1 mL de ácido clorhídrico, luego agregar, en porciones pequeñas, 2 mL de solución de nitrito de sodio (1 en 100), diluir a volumen con agua y mezclar. Nitrofenantrolina SR-Disolver 150 mg de 5-nitro-1, 10-fenantrolina en 15 mL de solución de sulfato ferroso recién preparada (1 en 140). Nitroferricianuro de Sodio SR-Disolver 1 g de nitroferricianuro de sodio en agua para obtener 20 ml. Preparar esta solución en el día de su uso. Ortofenantrolina SR-Disolver 150 mg de ortofenantrolina en 1O mL de una solución de sulfato ferroso, que se prepara disolviendo 700 mg de sulfato ferroso en 100 mL de agua. La solución de sulfato ferroso se debe preparar inmediatamente antes de disolver la ortofenantrolina. Almacenar en envases bien cerrados. Oxalato de Amonio SR-Disolver 3,5 g de oxalato de amonio en agua para obtener 100 ml. Óxido Cúprico Amoniacal SR (Reactivo de Schweitzer)-Disolver 1O g de sulfato cúprico en 100 mL de agua, agregar suficiente solución de hidróxido de sodio (1 en 5) para precipitar el hidróxido de cobre, recoger este último en un filtro y lavar con agua fría hasta que esté exento de sulfato. Disolver el precipitado, que se debe mantener húmedo durante todo el proceso, en la cantidad mínima de amoníaco SR necesaria para la disolución completa. Pasta de Yoduro-Almidón SR-Calentar a ebullición 100 mL de agua en un vaso de precipitados de 250 mL, agregar una solución de 0,75 g de yoduro de potasio en 5 mL de agua, luego agregar 2 g de cloruro de cinc disuelto en 1O mL de agua y, mientras la solución está en ebullición, agregar, mezclando, una suspensión homogénea de 5 g de almidón soluble en 30 mL de agua fría. Mantener en ebullición durante 2 minutos, luego enfriar. Almacenar en envases bien cerrados, en un lugar frío. La pasta de yoduro-aímidón SR debe mostrar una línea azul definida cuando una varilla de vidrio que se ha sumergida en una mezcla de 1 mL de nitrito de sodio O, 1 M, 500 mL de agua y 1O mL de ácido clorhídrico, se pasa sobre un extendido de la pasta. Perclorato de Metiltionina SR-A 500 mL de una solución de perclorato de potasio (1 en 1000) agregar, gota a gota y agitando constantemente, solución de azur de metileno (1 en 100) hasta que se produzca una leve turbidez permanente. Dejar que el precipitado sedimente, decantar el sobrenadante a través de papel y usar sólo la solución transparente. Permanganato de Potasio SR-Usar Permanganato de Potasio O, 1 N (ver la sección Soluciones Volumétricas). Peróxido de Hidrógeno SR-Usar Peróxido de Hidrógeno, Solución Tópica (monografía de la USP). Picrato Alcalino SR-Mezclar 20 mL de solución de trinitrofenol (1 en 100) con 1O mL de solución de hidróxido de sodio (1 en 20), diluir con agua hasta 100 mL y mezclar. Usar dentro de los 2 días.
2378 Soluciones Reactivo /Soluciones Piridina-Pirazolona SR-A 100 mL de una solución saturada de 1-fenil-3-metil-2-pirazolin-5-ona, agregar 20 mL de una solución 1 en 1000 de 3,3'-dimetil-l, l '-difenil-[4,4'-bi2-pirazolina]-5,5'-diona en piridina. Almacenar en un frasco oscuro y usar dentro de los 3 días.
USP 39 Reactivo de Nessler-Ver Yodomercuriato de Potasio Alcalino SR. Reactivo de Schweitzer SR-Ver Óxido Cúprico Amoniacal SR.
Piroantimoniato de Potasio SR-Disolver 2 g de piroantimoniato de potasio en 85 mL de agua caliente. Enfriar rápidamente y agregar 50 mL de una solución que contenga 50 mg/mL de hidróxido de potasio en agua y 1 mL de solución de hidróxido de sodio (8,5 en 100). Deiar en reposo durante 24 horas, filtrar y diluir con agua hasta 150 ml.
Reineckato de Amonio SR-Agitar frecuentemente, durante 1 hora, aproximadamente 500 mg de reineckato de amonio con 20 mL de agua y filtrar. Usar dentro de los 2 días.
Pirogalol Alcalino SR-Disolver 500 mg de pirogalol en 2 mL de agua. Disolver 12 g de hidróxido de potasio en 8 mL de agua. Las soluciones deben prepararse en el día de su uso y mezclarse inmediatamente antes de usar.
Rojo Congo SR-Disolver 500 mg de rojo congo en una mezcla de 1O mL de alcohol y 90 mL de agua.
Pirrolidinditiocarbamato de Amonio Saturado SR-Agregar aproximadamente 1O g de pirrolidinditiocarbamato de amonio a un matraz volumétrico de 1000 mL y diluir a volumen con agua. Platino-Cobalto SR-Disolver 1,246 g de cloroplatinato de potasio (K2PtCl6) y 1,000 g de cloruro de cobalto (CoCli · 6H20) en agua, agregar 100 mL de ácido clorhídrico y diluir con agua hasta 1 L. Polisulfuro de Amonio SR-Líquido amarillo, preparado por saturación de sulfuro de amonio SR con azufre. Púrpura de Bromocresol SR-Disolver 250 mg de púrpura de bromocresol en 20 mL de hidróxido de sodio 0,05 N y diluir con agua hasta 250 ml. Púrpura de m-Cresol SR-Disolver O, 1O g de púrpura de metacresol en 1 3 mL de hidróxido de sodio 0,01 N, diluir con agua hasta 100 mL y mezclar. Púrpura de Metilo SR-Usar Rojo de Metilo-Azul de Metifeno SR.
Resorcinol SR-Disolver 1 g de resorcinol en ácido clorhídrico para obtener 100 ml.
Rojo de Cresol SR-Triturar 100 mg de rojo de creso! en un mortero con 26,2 mL de hidróxido de sodio 0,01 N hasta su completa disolución, luego diluir la solución con agua hasta 250 ml. Rojo de Cresol-Azul de Timol SR-Agregar 15 mL de azul de timol SR a 5 mL de rojo de cresol SR y mezclar. Rojo de Metilo SR-Disolver 100 mg de rojo de metilo en 100 mL de alcohol y filtrar si fuera necesario. Rojo de Metilo SR 2-Agregar 50 mg de rojo de metilo a una mezcla de 1,86 mL de hidróxido de sodio O, 1 M y 50 mL de alcohol, y diluir con agua hasta 100 ml. Rojo de Metilo-Azul de Metileno SR-Agregar 1O mL de rojo de metilo SR a 1O mL de azul de metileno SR y mezclar. Rojo de Metilo Metanólico SR-Disolver 1 g de rojo de metilo en 100 mL de metanol y filtrar si fuera necesario. Almacenar protegido de la luz y usar dentro de los 21 días. Rojo de Quinaldina SR-Disolver 100 mg de rojo de quinaldina en 100 mL de alcohol.
Quinona SR-Disolver 500 mg de p-benzoquinona en 2,5 mL de ácido acético glacial y diluir con alcohol hasta 50 ml. Preparar esta solución en el día de su uso.
Rojo de Rutenio SR-Disolver 1O g de acetato de plomo en agua, diluir con agua hasta 100 mL y agregar 80 mg de rojo de rutenio. La solución es de color rojo vino. [NOTA-Si fuera necesario, agregar más rojo de rutenio para obtener un color rojo vino.]
Reactivo de Biuret SR-Disolver 1,5 g de sulfato cúprico y 6,0 g de tartrato de sodio y potasio en 500 mL de agua en un matraz volumétrico de 1000 ml. Agregar 300 mL de solución de hidróxido de sodio exenta de carbonato (1 en 1O), diluir con solución de hidróxido de sodio exenta de carbonato (1 en 1O) hasta 1000 mL y mezclar.
Rojo Fenol SR (Fenolsulfonftaleína SR)-Disolver 100 mg de fenolsulfonftaleína en 100 mL de alcohol y filtrar si fuera necesario.
Reactivo de Deniges-Ver Sulfato Mercúrico SR. Reactivo de Mayer-Ver Yodomercuriato de Potasio SR. Reactivo de Millon-A 2 mL de mercurio colocados en un matraz Erlenmeyer, agregar 20 mL de ácido nítrico. Agitar el matraz en una campana para deshacer el mercurio en glóbulos pequeños. Después de 1O minutos, agregar 35 mL de agua y, si aparecen cristales o un precipitado, agregar suficiente ácido nítrico diluido (1 en 5, preparado con ácido nítrico del que se hayan extraído los óxidos por burbujeo de aire hasta que se torne incoloro) para disolver el sólido separado. Agregar, gota a gota, solución de hidróxido de sodio (1 en 1O), mezclando meticulosamente, hasta que el precipitado grumoso que se forma luego del agregado de cada gota ya no se redisuelve sino que se dispersa para formar una suspensión. Agregar 5 mL más de ácido nítrico diluido y mezclar. Preparar esta solución en el día de su uso. Reactivo de 1-Naftol-Disolver 1 g de 1-naftol en 25 mL de metanol. Preparar esta solución en el día de su uso.
Ro/·º Fenal de pH 4,7 SR-Disolver 33 mg de fenolsulfonfta eína en 1,5 mL de solución de hidróxido de sodio 2 N, diluir con agua hasta 100 mL y mezclar (Solución A). Disolver 25 mg de sulfato de amonio en 235 mL de agua, agregar 105 mL de solución de hidróxido de sodio 2 N y 135 mL de ácido acético 2 N y mezclar (Solución B). Agregar 25 mL de la Solución A a la Solución B y mezclar. Si fuera necesario, ajustar el pH de esta solución a 4,7. Rojo Neutro SR-Disolver 100 mg de rojo neutro en 100 mL de alcohol al 50%. Salicilato de Hierro SR-Disolver 500 mg de sulfato férrico amónico en 250 mL de agua que contenga 1O mL de ácido sulfúrico diluido y ª!;!regar agua para obtener 500 ml. A 100 mL de la solucion resultante agregar 50 mL de una solución de salicilato de sodio al 1, 15%, 20 mL de ácido acético diluido y 80 mL de una solución de acetato de sodio al 1 3,6%, luego agregar agua para obtener 500 ml. Almacenar en un envase bien cerrado. Proteger de la luz. Usar dentro de las 2 semanas. Solución Alcohólica SR-Contiene 95 partes de alcohol especialmente desnaturalizado 3A con 5 partes de alcohol iso-
USP 39 propílico. Las concentraciones finales son aproximadamente 90% de alcohol, 5% de metano! y 5% de isopropanol. [NOTA-Se puede obtener un grado adecuado como "Reagent alcohol', número de catálogo R8382, en www.sigmaaídrich.com.]
Soluciones/ Soluciones Reactivo 2379 Sudán 111 SR-Disolver 0,05 g de Sudán 111 en 25 mL de alcohol, entibiando si fuera necesario. Enfriar, agregar 25 mL de glicerina y mezclar. Filtrar si queda material sin disolver. Sudán IV SR-Disolver 0,5 g de Sudán IV en cloroformo para obtener 100 ml.
Solución Amortiguadora de Acetato SR-Disolver 320 g de acetato de amonio en 500 mL de agua, agregar 5 mL de ácido acético glacial, diluir con agua hasta 1000,0 mL y mezclar. Esta solución tiene un pH entre 5,9 y 6,0.
Sulfanílico-a-Naftilamina SR-Ver Sulfanílico- 7-Naftilamina SR.
Solución Amortiguadora de Ácido Acético-Acetato de Amonio SR-Disolver 77, 1 g de acetato de amonio en agua, agregar 57 mL de ácido acético glacial y diluir con agua hasta 1000 ml.
Sulfanílico-1-Naftilamina SR-Disolver 500 mg de ácido sulfanílico en 150 mL de ácido acético. Disolver 100 mg de clorhidrato de 1-naftilamina en 150 mL de ácido acético y mezclar las dos soluciones. El color rosado que puede aparecer al dejar en reposo se puede eliminar mediante el tratamiento con cinc.
Solución Amortiguadora de Cloruro de Amonio-Amoníaco SR-Disolver 67,5 g de cloruro de amonio en agua, agregar 570 mL de hidróxido de amonio y diluir con agua hasta 1000 ml.
Sulfato Cúprico SR-Disolver 12,5 g de sulfato cúprico en agua para obtener 100 ml.
Solución de Dragendorff SR-Mezclar 850 mg de subnitrato de bismuto con 40 mL de agua y 1O mL de ácido acético glacial (Solución A). Disolver 8 g de yoduro de potasio en 20 mL de agua (Solución 8). Mezclar porciones iguales de Solución A y Solución B para obtener una solución madre, que se puede almacenar durante varios meses en un frasco oscuro. Mezclar 1O mL de la solución madre con 20 mL de ácido acético glacial y diluir con agua para obtener 100 ml. Solución de Fehling SR-Ver Tartrato Cúprico Alcalino SR.
Sulfato Cúprico Amónico SR-Agregar a sulfato cúprico SR, amoníaco SR, gota a gota, hasta que el precipitado formado al principio se disuelva casi totalmente pero no por completo. Dejar sedimentar y decantar la solución transparente. Preparar esta solución en el día de su uso. Sulfato de Calcio SR-Una solución saturada de sulfato de calcio en agua. Sulfato de Magnesio SR-Disolver 12 g de cristales de sulfato de magnesio, seleccionando los que no tengan eflorescencia, en agua para obtener 100 ml.
Solución de Locke-Ringer-Ver Locke-Ringer SR. Solución Estándar de Níquel SR-Disolver 4,78 g de sulfato de níquel (11) heptahidrato en agua y diluir con agua hasta 1000 ml. Inmediatamente antes de usar, diluir 10,0 mL de la solución así obtenida con agua hasta 1000 ml. También hay soluciones estándar de níquel disponibles comercialmente. Solución Estándar de Plomo SR-En el día de uso, diluir con agua 10,0 mL de solución madre de nitrato de plomo SR hasta 100,0 ml. Cada mL de solución estándar de plomo SR contiene el equivalente a 1O µg de plomo. Solución Madre de Nitrato de Plomo SR-Disolver 159,8 mg de nitrato de plomo en 100 mL de agua a la que se le ha agregado 1 mL de ácido nítrico, luego diluir con agua hasta 1000 ml. Preparar y almacenar esta solución en recipientes de vidrio libres de sales de plomo solubles. Solución Salina SR-Disolver 9,0 g de cloruro de sodio en agua para obtener 1000 ml. [NOTA-Cuando en esta Farmacopea se especifique solución salina apirógena SR, se debe usar una solución salina que ha cumplido con los requisitos de la Prueba de Pirógenos (151).] Solución Salina Apirógena SR-Ver Solución Salina SR. Subacetato de Plomo SR-Disolver 40,0 g de acetato de plomo en 90 mL de agua exenta de dióxido de carbono. Ajustar con hidróxido de sodio 1O M a un pH de 7,5, centrifugar y usar el sobrenadante transparente. Contiene no menos de 16,7% (p/p) y no más de 17,4% {p/p) de Pb en una forma correspondiente a la fórmula CaH14Ü10Pb3. La solución permanece transparente cuando se almacena en un recipiente bien cerrado. Subacetato de Plomo Diluido SR-Diluir 3,25 mL de subacetato de plomo SR con agua, recién hervida y enfriada, para obtener 100 ml. Almacenar en envases pequeños, impermeables, completamente llenos.
Sulfato de Potasio SR-Disolver 1 g de sulfato de potasio en agua para obtener 100 ml. Sulfato Férrico Amónico SR-Disolver 8 g de sulfato férrico amónico en agua para obtener 100 ml. Sulfato Ferroso SR-Disolver 8 g de cristales transparentes de sulfato ferroso en aproximadamente 100 mL de agua recién hervida y completamente enfriada. Preparar esta solución en el día de su uso. Sulfato Ferroso Ácido SR-Disolver 7 g de cristales de sulfato ferroso en 90 mL de a9ua recién hervida y completamente enfriada y agregar acido sulfúrico para obtener 100 ml. Preparar esta solución inmediatamente antes de usar. Sulfato Mercúrico SR (Reactivo de Deniges)-Mezclar 5 g de óxido mercúrico amarillo con 40 mL de agua y seguir mezclando mientras se agregan lentamente 20 mL de ácido sulfúrico, luego agregar otros 40 mL de agua y mezclar hasta que se disuelva por completo. Sulfuro de Amonio SR-Usar Solución de Sulfuro de Amonio de grado reactivo ACS. Sulfuro de Hidrógeno SR-Una solución saturada de sulfuro de hidrógeno, preparada pasando H2S por agua fría. Almacenar en frascos pequeños, de color ámbar oscuro, prácticamente llenos. No es adecuada a menos que posea un olor fuerte a H2S y a menos que produzca inmediatamente un abundante precipitado de azufre cuando se agrega a un volumen igual de cloruro férrico SR. Almacenar en un lugar frío y oscuro. Sulfuro de Sodio SR-Disolver 1 g de sulfuro de sodio en agua para obtener 1O ml. Preparar esta solución en el día de su uso. Tartrato Cúprico Alcalino SR (Solución de Fehling)SOLUCIÓN DE COBRE (A): Disolver en agua 34,66 g de cristales pequeños de sulfato de cobre, cuidadosamente selec-
USP 39
2380 Soluciones Reactivo / Soluciones cionados, que no presenten rastros de eflorescencia por humedad adherida, para obtener 500 ml. Almacenar esta solució!J en envases impermeables pequeños. SOLUCION DE TARTRATO ALCALINO (8): Disolver 173 g de tartrato de sodio y potasio cristalizado y 50 g de hidróxido de sodio en agua para obtener 500 ml. Almacenar esta solución en envases pequeños, resistentes a los álcalis. Para usar, mezclar volúmenes exactamente iguales de las Soluciones A y B en el momento en que se necesite.
Tricloruro de Titanio-Ácido Sulfúrico SR-Mezclar cuidadosamente 20 ml de tricloruro de titanio SR en 13 ml de ácido sulfúrico. Agregar suficiente r.eróxido de hidrógeno al 30% hasta producir un color amarillo. Calentar hasta que se produzcan humos blancos, dejar que se enfríe y diluir con agua. Repetir la evaporación y el a~regado de agua hasta obtener una solución incolora. Diluir con agua hasta 100 ml.
Tartrato de Sodio SR-Disolver 11,5 g de tartrato de sodio en agua para obtener 100 ml.
Trinitrofenol SR (Ácido Pícrico SR)-Disolver el equivalente a 1 g de trinitrofenol anhidro en 100 ml de agua caliente. Enfriar la solución y filtrar si fuera necesario.
Tetrabromofenolftaleinato de Etilo SR-Disolver 100 mg de tetrabromofenolftaleinato de etilo en 90 ml de ácido acético glacial y diluir con ácido acético glacial hasta 100 ml. Preparar esta solución en el día de su uso.
Vanadato de Amonio SR-Disolver 2,5 g de vanadato de amonio en 500 ml de agua en ebullición, enfriar y agregar 20 ml de ácido nítrico. Mezclar, enfriar y agregar agua para obtener 1 L. Almacenar en envases de polietileno.
Tetrafenilboro Sódico SR-Disolver 1,2 g de tetrafenilboro sódico en agua para obtener 200 ml. Si fuera necesario, mezclar durante 5 minutos con 1 g de óxido de aluminio y filtrar para clarificar.
Verde de Bromocresol SR-Disolver 50 mg de verde de bromocresol en 100 ml de alcohol y filtrar si fuera necesario.
Timolftaleína SR-Disolver 100 mg de timolftaleína en 100 ml de alcohol y filtrar si fuera necesario. Tinción de Mallory-Disolver 500 mg de azul de anilina soluble en agua, 2 g de anaranjado G y 2 g de ácido oxálico en 100 ml de agua. Tioacetamida SR-Disolver 4 g de tioacetamida en 100 ml de agua.
Verde de Bromocresol-Rojo de Metilo SR-Disolver O, 15 g de verde de bromocresol y O, 1 g de rojo de metilo en 180 ml de alcohol y diluir con agua hasta 200 ml. Verde de Malaquita SR-Disolver 1 g oxalato de verde de malaquita en 100 ml de ácido acético glacial. Violeta de Metilo SR-Usar Cristal Violeta SR. Yodo SR-Usar Yodo O, 1 N (ver en la sección Soluciones Volumétricas).
Tioacetamida-Glicerina Básica SR-Mezclar 0,2 ml de tioacetamida SR y 1 ml de glicerina básica SR y calentar en un baño de agua en ebullición durante 20 segundos. Usar la mezcla inmediatamente.
Yodo Diluido SR-Transferir 10,0 ml de yodo O, 1 N SV a un matraz volumétrico de 100 ml, diluir a volumen con agua y mezclar.
Tiocianato de Amonio SR-Disolver 8 g de tiocianato de amonio en agua para obtener 100 ml.
Yodo y Yoduro de Potasio SR 1-Disolver 500 mg de yodo y 1,5 g de yoduro de potasio en 25 ml de agua.
Tiocianato de Amonio-Cloruro Mercúrico SR-Disolver 30 g de tiocianato de amonio y 27 g de cloruro mercúrico en agua para obtener 1000 ml.
Yodo y Yoduro de Potasio SR 2-Disolver 12,7 g de yodo y 20 g de yoduro de potasio en agua, y diluir con agua hasta 1000,0 ml. A 10,0 ml de esta solución, agregar 0,6 g de yoduro de potasio y diluir con agua hasta 100,0 ml. Preparar inmediatamente antes de su uso.
Tiocianato de Potasio SR-Disolver 9,7 g de tiocianato de potasio en agua para obtener 100 ml. Tioglicolato de Sodio SR-Disolver 1,5 g de tioglicolato de sodio en 450 ml de agua y agregar 50 ml de alcohol. Usar dentro de los 3 días. Tiosulfato de Sodio SR-Usar Tiosulfato de Sodio O, 1 N (ver la sección Soluciones Volumétricas). Tornasol SR-Digerir 25 g de tornasol en polvo con tres porciones sucesivas de 100 ml de alcohol en ebullición y continuar cada extracción durante aproximadamente 1 hora. Filtrar, lavar con alcohol y desechar el filtrado de alcohol. Macerar el residuo con aproximadamente 25 ml de agua fría durante 4 horas, filtrar y desechar el filtrado. Finalmente digerir el residuo con 125 ml de agua en ebullición durante 1 hora, enfriar y filtrar. Tricetohidrindeno Hidrato SR (Ninhidrina SR)-Disolver 200 mg de tricetohidrindeno hidrato en agua para obtener 1O ml. Preparar esta solución en el día de su uso. Tricloruro de Antimonio SR-Disolver 20 g de tricloruro de antimonio en cloroformo para obtener 100 ml. Filtrar si fuera necesario. Tricloruro de Titanio SR-Disolver 15 g de tricloruro de titanio en 100 ml de solución de ácido clorhídrico al 10%.
Yodo y Yoduro de Potasio SR 3-Disolver O, 127 g de yodo y 0,20 g de yoduro de potasio en agua, y diluir con agua hasta 10,0 ml. Yodobromuro SR-Disolver 20 g de monobromuro de yodo en ácido acético glacial para obtener 1000 ml. Almacenar en envases de vidrio, protegido de la luz. Yodocloruro SR-Disolver 16,5 g de monocloruro de yodo en 1000 ml de ácido acético glacial. Yodohidroxiquinolínsulfonato de Sodio SR-Disolver 8,8 g de ácido yodohidroxiquinolínsulfónico en 200 ml de agua y agregar 6,5 ml de hidróxido de sodio 4 N. Diluir con agua hasta 250 ml, mezclar y filtrar. Yodomercuriato SR (Reactivo de Valser)-Agregar lentamente solución de yoduro de potasio (1 en 1O) a yoduro mercúrico rojo hasta casi total disolución y filtrar el exceso. Una solución que contiene 1O g de yoduro de potasio en 100 ml disuelve aproximadamente 14 g de Hg'2 a 20º. Yodomercuriato de Potasio SR (Reactivo de Mayer)-Disolver 1,358 g de cloruro mercúrico en 60 ml de agua. Disolver 5 g de yoduro de potasio en 1O ml de agua. Mezclar las dos soluciones y diluir con agua hasta 100 ml.
USP 39
Soluciones/ Soluciones Volumétricas 2381
Yodomercuriato de Potasio Alcalino SR (Reactivo de Nessler)-Disolver 143 g de hidróxido de sodio en 700 mL de agua. Disolver 50 g de yoduro mecúrico rojo y 40 g de yoduro de potasio en 200 mL de agua. Verter la solución de yoduro en la solución de hidróxido y diluir con agua hasta 1000 ml. Dejar sedimentar y usar el sobrenadante transparente. Yodoplatinato SR-Disolver 300 mg de cloruro platínico en 97 mL de agua. Inmediatamente antes de usar, agregar 3,5 mL de yoduro de potasio SR y mezclar. Yodoplatinato de Potasio SR-Disolver 200 mg de cloruro platínico en 2 mL de agua, mezclar con 25 mL de solución de yoduro de potasio (1 en 25) y agregar agua para obtener 50 ml. Yoduro Cúprico Alcalino SR-Disolver 7,5 g de sulfato cúprico (CuS04 · 5H20) en aproximadamente 100 mL de agua. En un recipiente separado, disolver 25 g de carbonato de sodio anhidro, 20 g de bicarbonato de sodio y 25 g de tartrato de sodio y potasio en aproximadamente 600 mL de agua. Mezclando constantemente, a9regar la solución de sulfato cúprico al fondo de la solucion de tartrato alcalino mediante un embudo que toque el fondo del recipiente. Agregar 1,5 g de yoduro de potasio, 200 g de sulfato de sodio anhidro, de 50 a 150 mL de yodato de potasio 0,02 M y agua suficiente para obtener 1000 ml. Yoduro de Potasio SR-Disolver 16,5 g de yoduro de potasio en agua para obtener 100 ml. Almacenar en envases resistentes a la luz. Yoduro de Potasio y Almidón SR-Disolver 0,75 g de yoduro de potasio en 100 mL de agua. Calentar a ebullición y agregar, mezclando, una solución de 0,5 g de almidón soluble en 35 mL de agua. Mantener la ebullición durante 2 minutos y dejar que se enfríe SENSIBILIDAD: Mezclar 15 mL con 0,05 mL de ácido acético glacial y 0,3 mL yodo diluido SR: se produce un color azul. Yoduro de Potasio y Bismuto SR-Disolver 12,5 g de ácido tartárico en 25 mL de agua, luego disolver 1,06 g de subnitrato de bismuto en esta mezcla (Solución A). Disolver 20 g de yoduro de potasio en 25 mL de agua (Solución B). Disolver 100 g de acido tartárico en 450 mL de agua (Solución C). Agregar las Soluciones A y B a la Solución C, y mezclar.
SOLUCIONES VOLUMÉTRICAS 1. DEFINICIONES 1.1 Soluciones normales: Las soluciones normales son soluciones que contienen 1 equivalente-gramo del compuesto por 1 L de solución. N = equivalente/L N = peso (g)/peso equivalente (g) x L Las soluciones normales y las soluciones que guardan una relación específica con las soluciones normales y que se utilizan en determinaciones volumétricas, se designan de la siguiente manera: 1 N =normal 2 N = doble normal 0,5 N = medio normal O, 1 N = décimo normal 0,02 N = cincuentavo normal 0,01 N = centésimo normal 0,001 N = milésimo normal
1.2 Soluciones molares: Las soluciones molares son soluciones que contienen 1 molécula-gramo del compuesto por 1 L de solución. M = mol/L M = peso (g)/peso mol x L Las soluciones que contienen un décimo de una moléculagramo del compuesto por 1 L se designan como décimo molar, O, 1 M; las demas molaridades se expresan de manera similar. 1.3 Factor de corrección: Por lo general, es difícil preparar soluciones estándar a una normalidad o molaridad teórica exacta, y no es indispensable hacerlo. Se preparan soluciones con una normalidad o molaridad aproximada a la deseada y se normalizan mediante volumetría contra un estándar. El factor de corrección así obtenido se utiliza en todos los cálculos en los que se emplean dichas soluciones. Si fuera necesario, se puede ajustar la concentración de la solución a una normalidad o molaridad dada, mediante dilución o la adición del reactivo apropiado. La concentración de la solución volumétrica no difiere de la prescrita en más de 10%. El factor de corrección se determina mediante un número apropiado de determinaciones repetidas. La repetibilidad no excede de 0,2% (desviación estándar relativa). El factor de corrección debe determinarse frecuentemente. 1.4 Determinaciones con blancos: En aquellos casos en que se indica que se deben realizar "las correcciones necesarias" mediante una determinación con un blanco, la determinación debe realizarse usando las mismas cantidades de los mismos reactivos tratados de la misma manera que la solución o mezcla que contiene la porción de la sustancia que se está valorando o en análisis, pero omitiendo dicha sustancia.
2. PREPARACIÓN V NORMALIZACIÓN 2.1 Alcance Cuando se utilicen soluciones de un reactivo en diferentes concentraciones, los detalles sobre la preparación y normalización se proporcionan, por lo general, para la concentración requerida con más frecuencia. Las soluciones de mayor o menor concentración se preparan y normalizan siguiendo el mismo método general descrito, pero usando cantidades proporcionales de reactivo. 2.2 Preparación mediante dilución En muchos casos, es posible preparar concentraciones más bajas con exactitud realizando una dilución exacta de una solución de mayor concentración. Las soluciones volumétricas que se preparan mediante dilución deben volver a normalizarse como se indica para la solución de mayor concentración, usando cantidades proporcionales de reactivos. Para preparar soluciones diluidas que son inestables, como por ejemplo el permanganato de potasio 0,01 N, es preferible diluir con exactitud la normalidad más alta, en el mismo día de su uso, utilizando agua sometida minuciosamente a ebullición y enfriada. 2.3 Normalización A continuación se describe un solo método de normalización, pero pueden utilizarse otros siempre y cuando tengan al menos el mismo grado de exactitud. Los valores obtenidos en la normalización de soluciones volumétricas son válidos para todos los usos Farmacopeicos de estas soluciones, independientemente del instrumental o indicadores químicos empleados en las monografías individuales. En aquellos casos en que la normalidad o molaridad aparente de una solución volumétrica dependa de las condiciones especiales de su uso, la monografía individual establece
2382 Soluciones Volumétricas
/Soluciones
las instrucciones para la normalización del reactivo en el contexto especificado. En el caso de sales normalmente disponibles como estándares primarios certificados, o como sales altamente purificadas de calidad de estándar primario, se permite preparar las soluciones pesando con exactitud una cantidad adecuada de la sal y disolverla para obtener un volumen específico de solución con una concentración conocida. Los ácidos acético, clorhídrico y sulfúrico se pueden normalizar frente a una solución de hidróxido de sodio recientemente normalizada frente a un estándar primario certificado. 2.4 Temperatura Siempre y cuando sea factible, todas las soluciones volumétricas deben prepararse, normalizarse y utilizarse a la temperatura estandar de 25º. Si la valoración volumétrica se realiza a una temperatura considerablemente diferente, debe normalizarse la solución volumétrica usada a esa misma temperatura o bien, efectuar una adecuada corrección por temperatura. Ácido Acético, Doble Normal (2 N) C2H402, 60,05 120, 1O g en 1000 mL Agregar 116 mL de ácido acético glacial a una cantidad suficiente de agua para obtener 1000 mL después de enfriar a temperatura ambiente. Ácido Clorhídrico Alcohólico, Décimo Molar (O, 1 M) HCI, 36,46 Diluir 9,0 mL de ácido clorhídrico hasta 1000 mL con alcohol exento de aldehídos. Ácido Clorhídrico, Medio Normal (0,5 N) HCI, 36,46 18,23 g en 1000 mL Agregar lentamente 43 mL de ácido clorhídrico a un matraz volumétrico de 1000 mL que contenga 40 mL de agua. Enfriar y agregar agua a volumen. Normalizar la solución según se indica a continuación. Pesar con exactitud aproximadamente 2,5 g de trometamina, secados según las instrucciones en la etiqueta o, si esta información no está disponible, secados a 105º durante 3 horas. Disolver en 50 mL de agua y agregar 2 gotas de verde de bromocresol SR. Valorar con ácido clorhídrico 0,5 N hasta un punto final amarillo pálido. Cada 60,57 mg de trometamina equivalen a 1 mL de ácido clorhídrico 0,5 N.
N = mg de trometamina 121,14x ml HCI Ácido Clorhídrico, Medio Normal (0,5 N) en Metano! HCI, 36,46 18,23 g en 1000 mL Agregar lentamente 43 mL de ácido clorhídrico a un matraz voíumétrico de 1000 mL que contenga 40 mL de agua. Enfriar y agregar metano! a volumen. Normalizar la solución según se indica a continuación. Pesar con exactitud aproximadamente 2,5 g de trometamina, secados según las instrucciones en la etiqueta o, si esta información no está disponible, s~cados a 105º durante 3 horas. Proceder según se indica en Acido Clorhídrico, Normal (1 N), comenzando donde dice "Disolver en 50 mL de agua".
N = mg de trometamina 121,14 x ml HCI Ácido Clorhídrico, Normal (1 N) HCI, 36,46 36,46 g en 1000 mL Diluir 85 mL de ácido clorhídrico con agua hasta 1000 ml. Normalizar la solución según se indica a continuación. Pesar con exactitud aproximadamente 5,0 g de trometamina, secados según las instrucciones en la etiqueta o, si
USP 39 esta información no está disponible, secados a 105º durante 3 horas. Disolver en 50 mL de agua y agregar 2 gotas de verde de bromocresol SR. Valorar con ácido clorhídrico 1 N hasta un punto final amarillo pálido. Cada 121, 14 mg de trometamina equivalen a 1 mL de ácido clorhídrico 1 N.
N = mg de trometamina 121,14 x ml HCI Ácido Oxálico, Décimo Normal (O, 1 N) H1C204 · 2H20, 126,07 6,303 g en 1000 mL Disolver 6,45 g de ácido oxálico en agua hasta 1000 ml. Normalizar la solución valorando contra permanganato de potasio O, 1 N SV recién normalizado según se indica en Permanganato de Potasio, Décimo Normal (O, 7 N). Conservar en frascos con tapón de vidrio. Proteger de la luz.
N = ml KMn0 4 x N KMn0 4 ml H2 Cp 4 Ácido Perclórico, Décimo Normal (O, 1 N) en Ácido Acético Glacial HCl04, 100,46 10,05 g en 1000 mL [NOTA-En aquellos casos en que lo requieren las pruebas y valoraciones, esta solución volumétrica se especifica como "ácido perclórico O, l N". En consecuencia, en aquellos casos en que se especifica O, 1 N u otra concentración de esta solución volumétrica, debe utilizarse la solución en ácido acético glacial,, a menos que se especifique "en dioxano". (Ver también Acido Perclórico, Décimo Normal (O, 7 N) en Dioxano.)]
Mezclar 8,5 mL de ácido perclórico con 500 mL de ácido acético glacial y 21 mL de anhídrido acético, enfriar y agregar ácido acético glacial para obtener 1000 ml. Como alternativa, la solución puede prepararse se~ún se indica a continuación. Mezclar 11 mL de ácido perclorico al 60% con 500 mL de ácido acético glacial y 30 mL de anhídrido acético, enfriar y agregar ácido acético glacial para obtener 1000 ml. Dejar la solución preparada en reposo durante 1 día para que el exceso de anhídrido acético se combine y determinar el contenido de agua mediante el Método I (ver Determinación de Agua (921 )), excepto que se debe utilizar una muestra de prueba de aproximadamente 5 g del ácido perclórico O, 1 N que se espera contenga aproximadamente 1 mg de ªS!ua y el Reactivo (ver Reactivo en Método la en Determinación de Agua (921)) diluido de modo tal que 1 mL equivalga aproximadamente a 1-2 mg de agua. Si el contenido de agua excede 0,5%, agregar más anhídrido acético. Si la solución no contiene agua valorable volumétricamente, agregar suficiente agua para obtener un contenido entre 0,02% y 0,5% de agua. Dejar la solución en reposo durante 1 día y volver a valorar el contenido de agua. La solución así obtenida contiene entre 0,02% y 0,5% de agua, lo cual indica que no contiene anhídrido acético. Normalizar la solución según se indica a continuación. Pesar con exactitud aproximadamente 700 mg de biftalato de potasio, ligera y previamente triturado y secado a 120º durante 2 horas, y disolverlo en 50 mL de ácido acético glacial en un matraz de 250 ml. A~regar 2 gotas de cristal violeta SR y valorar con la solucion de ácido perclórico hasta que el color violeta cambie a verde azulado. Deducir el volumen del ácido perclórico consumido por 50 mL de ácido acético glacial. Cada 20,422 mg de biftalato de potasio equivale a 1 mL de ácido perclórico O, 1 N. N=
g KHC 8 H.0 4 0,20422 x ml HCIO 4 (corregidos por el blán'co)
Soluciones /Soluciones Volumétricas 2383
USP 39
Ácido Perclórico, Décimo Normal (O, 1 N) en Dioxano Mezclar 8,5 ml de ácido perclórico con suficiente dioxano para obtener 1000 ml. Normalizar la solución según se indica a continuación. Pesar con exactitud aproximadamente 700 mg de biftalato de potasio, previamente triturado y secado a 120º durante 2 horas, y disolverlo en 50 ml de ácido acético glacial en un matraz de 250 ml. Agregar 2 gotas de cristal violeta SR y valorar con la solución de ácido perclórico hasta que el color violeta se convierta en verde azulado. Realizar una determinación con un blanco. Cada 20,422 mg de biftalato de potasio equivale a 1 ml de ácido perclórico O, 1 N. KHC H 0
g 8 4 4 N=~~~~~~~-=-~-"--"-"--~~~~~~ 0,20422 x mL de solución de HCI04 (corregidos por el blanco)
Ácido Sulfúrico, Medio Normal (0,5 N) en Alcohol H2S04, 98,08 24,52 g en 1000 ml Agregar lentamente, mezclando, 13,9 ml de ácido sulfúrico a una cantidad suficiente de alcohol deshidratado para obtener 1000 ml. Enfrij'lr y normalizar contra trometamina según se describe en Acido Clorhídrico, Medio Normal (0,5 N) en Metano/.
mismas cantidades de los mismos reactivos y calcular la normalidad. N = ml Na 2S 2 0 3 x N Na 2Sp3 ml de Solución de KBr0 3
Bromo, Décimo Normal (O, 1 N) Br, 79,90 7,990 g en 1000 ml Disolver 3g de bromato de potasio y 15 g de bromuro de potasio en agua para obtener 1000 ml y normalizar la solución según se indica a continuación. Medir con exactitud aproximadamente 25 ml de la solución, transferir a un matraz para yodo de 500 ml y diluir con 120 ml de agua. Agregar 5 ml de ácido clorhídrico, tapar el matraz y agitar suavemente. Luego, agregar 5 ml de yoduro de potasio SR, volver a tapar el matraz, agitar la mezcla, dejar en reposo durante 5 minutos y valorar el yodo liberado con tiosulfato de sodio O, 1 N SV, agregando 3 ml de almidón SR cerca del punto final. Almacenar en frascos de color ámbar oscuro con tapón de vidrio.
N = ml Na 2S20 3 x NNa 2S20 3 ml de Solución de Br2
N = mg de trometamina 121, 14 x ml H2S0 4
Ácido Sulfúrico, Normal (1 N) H2S04, 98,08 49,04 g en 1000 ml Agregar lentamente, mezclando, 27 ml de ácido sulfúrico a una cantidad suficiente de agua para obtener un volumen de 1000 ml. Enfriar y normalizar contra trometamina, según se describe en Acido Clorhídrico, Normal ( 1 N).
Arsenito de Sodio, Veinteavo Molar (0,05 M) NaAs02 129,91 6,496 g en 1000 ml Transferir 4,9455 g de trióxido de arsénico pulverizados y secados a 100º hasta peso constante a un matraz volumétrico de 1000 ml, disolver en 40 ml de hidróxido de sodio 1 N y agregar ácido sulfúrico 1 N o ácido clorhídrico 1 N hasta que la solución sea neutra o ligeramente ácida al tornasol. Agregar 30 g de bicarbonato de sodio, diluir a volumen con agua y mezclar. Bromato de Potasio, Décimo Normal {O, 1 N) KBr03, 167,00 2,784g en lOOOmL Disolver 2, 784 g de bromato de potasio en agua para obtener 1000 ml, y normalizar la solución según se indica a continuación. Transferir a un matraz con tapón de vidrio un volumen de aproximadamente 40 ml de la solución, medidos con exactitud, agregar 3 g de yoduro de potasio y luego 3 ml de ácido clorhídrico. Dejar en reposo durante 5 minutos y luego valorar el yodo liberado con tiosulfato de sodio O, 1 N SV, agregando 3 ml de almidón SR cerca del punto final. Corregir mediante una determinación con un blanco con las
Bromuro-Bromato de Potasio, Décimo Normal {O, 1 N) Disolver 2,78 g de bromato de potasio (KBrQ3) y 12,0 g de bromuro de potasio (KBr) en agua, y diluir con agua a 1000 ml. Normalizar según el procedimiento indicado en Bromato de Potasio, Décimo Normal (0, 1 N). N = ml Na 2 S 2 0 3 x N Na 2Sp 3 ml KBr0 3 /KBr
Bromuro de Tetrametilamonio, Décimo Molar (0, 1 M) (CH 3)4NBr, 154,05 15,41 g en 1000 ml Disolver 15,41 g de bromuro de tetrametilamonio en ag1;1a para obte~er 1q90 ml y normalizar la solución según se indica a contmuac1on. Transferir un volumen, medido con exactitud, de aproximadamente 40 ml de la solución a un vaso de precipitados, agregar 1O ml de ácido nítrico diluido y 50,0 ml de nitrato de pfata O, 1 N SV y mezclar. Agregar 2 ml de sulfato férrico amónico SR y valorar el exceso de nitrato de plata con tiocianato de amonio O, 1 N SV. M = ml AgN0 3 x N AgN0 3 ml (CH 3 ) 4 NBr
Cloruro de Magnesio, 0,01 M MgCli · 6H20, 203,30 2,0330 g en 1000 ml Disolver aproximadamente 2,04 g de cloruro de magnesio en 1000 ml de agua recién hervida y enfriada, y normalizar la solución según se indica a continuación. Medir con exactitud 25 ml de la solución preparada de cloruro de magnesio. Agregar 50 ml de agua, 3 ml de solución amortiguadora de amoníaco-cloruro de amonio SR y 0,04 g de reactivo de negro de eriocromo T-cloruro de sodio. Valorar con edetato disódico 0,05 M SV hasta que el color de la solución cambie de púrpura rojizo a púrpura azulado. M=
(mL de edetato disódico SV) x (M de edetato disódico)
ml de cloruro de magnesio
2384 Soluciones Volumétricas / Soluciones Cloruro de Tetrametilamonio, Décimo Molar (O, 1 M) (CH3)4NCI, 109,60 10,96 g en 1000 mL . . Disolver en agua 10,96 g de cloruro de tetrametilamonio para obtener 1000 mL y normalizar la solución según se indica a continuación. Transferir a un matraz un volumen, medido con exactitud, de aproximadamente 40 mL de la solución, agregar 1O mL de ácido nítrico diluido y 50,0 mL de nitrato de plata O, 1 N SV y mezclar. A,9regar 5 mL de nitrobenceno y 2 mL d~ sulfato férrico amonico SR, agitar y valorar el exceso de nitrato de plata con tiocianato de amonio O, 1 N SV.
M = ml AgN0 3 x N AgN0 3 ml (CH 3 ) 4 NCI Dicromato de Potasio, Décimo Normal (O, 1 N) K1Cr207, 294, 18 4,903 g en 1000 mL Disolver aproximadamente 5 g de dicromato de potasio en 1000 mL de agua. Normalizar la solución según se indica a continuación. Transferir 25,0 mL de esta solución a un matraz de 500 mL con tapón de vidrio, agregar 2 g de yoduro de potasio (exento de yodato), diluir con 200 mL de agua, agregar 5 mL de ácido clorhídrico, dejar en reposo durante 1O minutos en un lugar oscuro y valorar el yodo liberado con tiosulfato de sodio O, 1 N SV, agregando 3 mL de almidón SR cerca del punto final. Realizar una determinación con un blanco.
N = ml Na 2S2 0 3 x N Na 2S 20 3
USP 39
Edetato Disódico, Veinteavo Molar (0,05 M) C10H14N2Na20a · 2H20, 372,24 18,61 g en 1000 mL Disolver 18,6 g de edetato disódico en agua para obtener 1000 mL y normalizar la solución según se indica a continuación. Pesar con exactitud aproximadamente 200 m de carbonato de calcio atrón ar elatome ' os reviatrans erir a un vaso e precipitados de mL de, agua y agitar ror rotación suav~ 4 mL, agregar hasta formar una suspension espesa. Cubrir el vaso de prec1· pitados con un vidrio de reloj e introducir 2 mL de ácido clorhídrico diluido a través de una pipeta insertada entre el pico del vaso de precipitados y el b_orde del vidrio de r~l~j. Agitar por rotacion suave el contenido del vaso de prec1p1tados para disolver el carbonato de calcio. Lavar con agua las paredes del vaso de precipitados, la superficie externa d_e la pipeta y el vidrio de reloj, y diluir con agua hasta aproximadamente 100 ml. Mientras se mezcla la solución, preferiblemente con un agitador magnético, agregar aproximadamente 30 mL de la solución de edetato disódico desde una bureta de 50 ml. Agregar 15 mL de hidróxido de sodio SR y 300 mg de azul de hidroxinaftol y continuar la valoración con la solución de edetato disód1co hasta un punto final azul.
M = (g CaC0 3 )(1000)
100,09 x ml EDTA
25,0 Ferricianuro de Potasio, Veinteavo Molar (0,05 M) K3Fe(CN) 6, 329,24 16,46 g en 1000 mL Disolver en agua aproximadamente 17 Q de ferricia~~ro de potasio para obtener 1000 ml. Norma fizar la soluc1on según se indica a continuación. Transferir 50,0 mL de esta solución a un matraz de 500 mL con tapón de vidrio, diluir con 50 mL de agua, agregar 1O mL de yoduro de potasio SR y 1O mL ~e ácido cíorhídrico diluido y dejar en reposo durante 1 minuto. Luego, agregar 15 mL de solución de sulfato de cinc (1 en 1O) y valorar el yodo liberado con tiosulfato de sodio O, 1 N SV agregando 3 mL de almidón SR cerca del punto final. Proteger de la luz y volver a normalizar antes de utilizar.
M = ml Na 2S 2 0 3 x N Na 2S 20 3
50,0 Hidróxido de Potasio Alcohólico, Décimo Molar (O, 1 M) KOH, 56,11 Diluir 20 mL de hidróxido de potasio alcohólico 0,5 M hasta 100,0 mL con alcohol exento de aldehídos. Hidróxido de Potasio Alcohólico, Medio Normal (0,5 N) 28,06 g en 1000 mL Disolver aproximadamente 34 g de hidróxido de potasio en 20 mL de agua y agregar alcohol exento de aldehídos para obtener 1000 ml. Dejar la solución en reposo en un frasco herméticamente tapado durante 24 horas. Luego, decantar rápidamente el líquido sobrenadante tra_nsparente en un recipiente impermeable adecuado y normalizar la solución según se indica a continuación. Medir con exactitud aproximadamente 25 mL de ácido clorhídrico 0,5 N SV. Diluir con 50 mL de agua, a9regar 2 gotas de fenolftaleína SR y valorar con la solucion de hidróxiqo d~ potasio alcohólica hasta obtener un color rosado pálido permanente. ,,,,
USP 39
Soluciones /Soluciones Volumétricas 2385
[NOTA-Almacenar en frascos con tapón herméticamente cerrados. Proteger de la luz. ]
N = ml HCI x N HCI mLKOH Hidróxido de Potasio, Normal (1 N) KOH, 56, 11 56, 11 g en lOOOmL Disolver 68 g de hidróxido de potasio en aproximadamente 950 mL de agua. Agregar una solución saturada recientemente preparada de hidróxido de bario hasta que no se forme más precipitado. Agitar meticulosamente la mezcla y dejarla en reposo durante la noche en un frasco con tapón. Decantar el líquido transparente o filtrar la solución en un frasco de poliolefina hermetico y normalizarla según el procedimiento indicado en Hidróxido de Sodio, Normal ( 7 N).
N-
g KHC 8Hp4 0,20422 x ml KOH
Hidróxido de Potasio Metanólico, Décimo Normal (O, 1 N) 5,612 gen 1000 mL Disolver aproximadamente 6,8 g de hidróxido de potasio en 4 mL de agua y agregar metano! para obtener 1000 ml. Dejar la solución en reposo en un frasco tapado herméticamente durante 24 horas. Luego, decantar rápidamente el líquido sobrenadante transparente en un recipiente impermeable adecuado y normalizar la solución según se indica a continuación. Medir con exactitud aproximadamente 25 mL de ácido clorhídrico O, 1 N SV. Diluir con 50 mL de agua, a_gregar 2 gotas de fenolftaleína SR y valorar con la solucion de hidróxido de potasio metanólica hasta obtener un color rosado pálido permanente. [NOTA-Almacenar en frascos con tapón herméticamente cerrados. Proteger de la luz.]
N = ml HCI x N HCI mLKOH Hidróxido de Sodio Alcohólico, Décimo Normal (O, 1 N) NaOH, 40,00 A 250 mL de alcohol agregar 2 mL de una solución de hidróxido de sodio al 50% (p/v). Disolver aproximadamente 200 mg de ácido benzoico, pesados con exactitud, en 1O mL de alcohol y 2 mL de agua. Agregar 2 gotas de fenolftaleína SR y valorar la solución con hidróxido de sodio alcohólico hasta que se produzca un color rosado pálido permanente.
N= mg de ácido benzoico 122,1 xmlde hidróxido de sodio
Hidróxido de Sodio, Normal (1 N) NaOH, 40,00 40,00 g en 1000 mL Disolver 162 g de hidróxido de sodio en 150 mL de agua exenta de dióxido de carbono, enfriar la solución a temperatura ambiente y filtrar a través de papel de filtro endurecido. Transferir 54,5 mL del filtrado transparente a un recipiente de poliolefina impermeable y diluir con agua exenta de dióxido de carbono hasta 1000 ml. Pesar con exactitud aproximadamente 5 g de biftalato de potasio, previamente triturado ligeramente y secado a 120º durante 2 horas, y disolver en 75 mL de agua exenta de dióxido de carbono. Agregar 2 gotas de fenolftaleína SR y valorar con la solución de hidróxido de sodio hasta obtener
un color rosado permanente. Cada 204,22 mg de biftalato de potasio equivalen a 1 mL de hidróxido de sodio 1 N.
N = ____ g_K_H_C__;8;_H_;,4 _0_.;..4 _ __
0,20422 x ml de solución de NaOH [NOTAS-(1) Las soluciones de hidróxidos alcalinos absorben dióxido de carbono cuando se exponen al aire. Deben conservarse en frascos con tapones adecuados bien ajustados, provistos con un tubo relleno de una mezcla de hidróxido de sodio y cal (tubos de cal sodada) que absorbe el dióxido de carbono, para que el aire que ingrese en el recipiente pase a través de este tubo. (2) Preparar las soluciones de menor concentración (p.ej., O, 1 N; 0,01 N) diluyendo cuantitativamente volúmenes, medidos con exactitud, de la solución 1 N con suficiente agua exenta de dióxido de carbono para obtener la concentración deseada.] Volver a normalizar la solución con frecuencia. Hidróxido de Tetrabutilamonio, Décimo Normal (O, 1 N) (C4H9)4NOH, 259,47 25,95 g en 1000 mL Disolver 40 g de yoduro de tetra-n-butilamonio en 90 mL de metano! anhidro en un matraz con tapón de vidrio. Colocar en un baño de hielo, agregar 20 g de óxido de plata en polvo, tapar el matraz y agitar vigorosamente durante 60 minutos. Centrifugar algunos mL y analizar el líquido sobrenadante para determinar la presencia de yoduro (ver Yoduro (191 )). Si el análisis resulta positivo, agregar otros 2 g de óxido de plata y dejar en reposo durante 30 minutos agitando en forma intermitente. Una vez que todo el yoduro haya reaccionado, filtrar a través de un embudo de vidrio sinterizado de porosidad fina. Enjuagar el matraz y el embudo con tres porciones de 50 mL de tolueno anhidro, agregando los enjuagues al filtrado. Diluir con una mezcla de tres volúmenes de tolueno anhidro y 1 volumen de metano! anhidro a 1000 mL y lavar la solución durante 1O minutos con nitrógeno seco exento de dióxido de carbono. [NOTA-Si fuera necesario para obtener una solución transparente, puede agregarse más metano! anhidro en cantidades pequeñas.] Almacenar en un reservorio protegido del dióxido de carbono y la humedad, y desechar después de 60 días. Como alternativa, la solución puede prepararse diluyendo en metano! un volumen adecuado de solución de hidróxido de tetrabutilamonio disponible comercialmente con una mezcla de 4 volúmenes de tolueno anhidro y 1 volumen de metano! anhidro. [NOTA-Si fuera necesario para obtener una solución transparente, puede agregarse más metano! en cantidades pequeñas.] El día en que se va a utilizar, normalizar la solución según se indica a continuación. Disolver aproximadamente 400 mg de ácido benzoico patrón primario, pesados con exactitud, en 80 mL de dimetilformamida, agregar 3 gotas de una solución 1 en 100 de azul timol en dimetilformamida y valorar hasta un punto final azul con la solución de hidróxido de tetrabutilamonio, agregando la solución volumétrica desde una bureta equipada con una trampa de absorción de dióxido de carbono. Realizar una determinación con un blanco y hacer las correcciones necesarias. Cada mL de hidróxido de tetrabutilamonio O, 1 N equivale a 12,21 mg de ácido benzoico.
N = mg de ácido benzoico 122,1 x ml (C 4 H9 ) 4 NOH
Hidróxido de Tetrabutilamonio en Metanol/Alcohol lsopropílico, O, 1 N Preparar según se indica en Hidróxido de Tetrabutilamonio, Décimo Normal (O, 7 N) usando alcohol isopropílico en lugar de tolueno y normalizar según se describe. Como alternativa, la solución puede prepararse diluyendo un volumen adecuado de solución de hidróxido de tetrabutilamonio en
USP 39
2386 Soluciones Volumétricas / Soluciones metanol, disponible comercialmente, con 4 volúmenes de alcohol isopropílico anhidro. N=
mg de ácido benzoico 122,1 x mL (C 4 H9 ) 4 NOH
Metóxido de Litio, Cincuentavo Normal (0,02 N) en Metano! CH3LiO, 37,97 759,6 m~ en 1000 ml Disolver O, 12 g de litio metalico recién cortado en 150 ml de metanol, enfriando el matraz mientras se agrega el metal. Una vez completa la reacción, awegar 850 ml de metanol y mezclar. Almacenar la solucion preferentemente en el reservorio de una bureta automática protegida adecuadamente del dióxido de carbono y la humedad. Normalizar la solución valorando contra ácido benzoico según se describe en Metóxido de Sodio, Décimo Normal (0, 1 N) (en To/ueno), pero utilizar únicamente 100 m9 de ácido benzoico. Cada 2,442 mg de ácido benzoico equivale a 1 ml de metóxido de litio 0,02 N. [NOTA-Volver a normalizar la solución con frecuencia.] N=------m_g_d_e_ác_id_o_be_n_z_o_ic_o_ _ _ _ _ __ 122, 12 x ml de metóxido de litio (corregidos por el blanco)
Metóxido de Litio, Décimo Normal (O, 1 N) en Clorobenceno CH30Li, 37,97 3,798 g en 1000 ml Disolver 700 mg de litio metálico recién cortado en 150 ml de metanol, enfriando el matraz mientras se agrega el metal. Una vez completa la reacción, agregar 850 ml de clorobenceno. Si aparece turbidez o precipitación, agregar suficiente metanol para clarificar la solucion. Almacenar la solución preferentemente en el reservorio de una bureta automática adecuadamente protegida del dióxido de carbono y la humedad. Normalizar la solución valorando contra ácido benzoico según se describe en Metóxido de Sodio, Décimo Normal (O, 1 N) en Tolueno. [NOTA-Volver a normalizar la solución con frecuencia.] N=
mg de ácido benzoico 122, 12 x ml de metóxido de litio (corregidos por el blanco)
Metóxido de Litio, Décimo Normal (O, 1 N) en Metano! CH3Qli, 37,97 3,798 g en 1000 ml Disolver 700 mg de litio metálico recién cortado en 150 ml de metanol, enfriando el matraz mientras se agrega el metal. Una vez completa la reacción, agregar 850 ml de metanol. Si aparece turbidez o precipitación, agregar suficiente metanol para clarificar la solución. Almacenar la solución preferentemente en el reservorio de una bureta automática adecuadamente protegida del dióxido de carbono y la humedad. Normalizar la solución valorando contra ácido benzoico según se describe en Metóxido de Sodio, Décimo Normal (O, 1 N) en Tolueno. [NOTA-Volver a normalizar la solución con frecuencia.] N=------m~g~d_e_ác_id_o_be_n_z_o_ic_o_ _ _ _ _ __
122, 12 x ml de metóxido de litio (corregidos por el blanco)
Metóxido de Litio, Décimo Normal (O, 1 N) en Tolueno CH3Qli, 37,97 3,798 g en 1000 ml Disolver 700 mg de litio metálico recién cortado en 150 ml de metanol, enfriando el matraz mientras se agrega el metal. Una vez completa la reacción, a~regar 850 ml de tolueno. Si aparece turbidez o precipitacion, agregar suficiente metanol para clarificar la solución. Almacenar la solución preferentemente en el reservorio de una bureta automática adecuadamente protegida del dióxido de carbono y la humedad. Normalizar la solución valorando contra ácido
benzoico según se describe en Metóxido de Sodio, Décimo Normal (O, 1 N) en Tolueno. [NOTA-Volver a normalizar la solución con frecuencia.] N=------m~g~d_e_a_·c_id_o_b_e_n_z_oi_co _ _ _ _ _ _~
122, 12 x ml de metóxido de litio (corregidos por el blanco)
Metóxido de Sodio, Décimo Normal (O, 1 N) en Tolueno CH30Na, 54,02 5,402 g en 1000 ml Enfriar en agua helada 150 ml de metanol contenidos en un matraz volumétrico de 1000 ml y agregar, en pequeñas porciones, aproximadamente 2,5 g de sodio metálico recién cortado. Cuando el metal se haya disuelto, agregar tolueno para obtener 1000 ml y mezclar. Almacenar la solución preferentemente en el reservorio de una bureta automática adecuadamente protegida del dióxido de carbono y la humedad. Normalizar la solución según se indica a continuación. Pesar con exactitud aproximadamente 400 mg de ácido benzoico patrón primario y disolver en 80 ml de dimetilformamida en un matraz. Agregar 3 gotas de una solución 1 en 100 de azul timol en dimetilformamida y valorar con el metóxido de sodio hasta un punto final azul. Corregir en función del volumen de la solución de metóxido de sodio consumido por 80 ml de dimetilformamida. Cada 12,21 mg de ácido benzoico equivalen a 1 ml de metóxido de sodio 0,1 N. mg de ácido benzoico
N=-------~----------~
122, 1 x ml de metóxido de sodio (corregidos por el blanco)
[NOTAS-(1) Para eliminar cualquier turbidez que pudiera formarse después de la dilución con tolueno, agregar metano! (normalmente alcanza con 25 ml a 30 ml) hasta que la solución se torne transparente. (2) Volver a normalizar la solución con frecuencia.] Metóxido de Sodio, Medio Normal (0,5 N) en Metanol CH30Na, 54,02 27,01 g en 1000 ml Pesar 11,5 g de sodio metálico recién cortado y cortar en pequeños cubos. Colocar aproximadamente 0,5 ml de metano! anhidro en un matraz de 250 ml de fondo redondo equipado con una junta de vidrio esmerilado, agregar 1 cubo de sodio metálico y, cuando haya cesado Ta reacción, agregar el sodio metálico restante al matraz. Conectar un condensador con camisa de agua al matraz y agregar lentamente 250 ml de metanol annidro, en pequeñas porciones, a través de la parte superior del condensador. Regular la adición del metanol de modo tal que los vapores se condensen y no se escapen por la parte superior del condensador. Una vez finalizada la adicion del metanol, conectar un tubo de secado a la parte superior del condensador y dejar que la solución se enfríe. Transferir la solución a un matraz volumétrico de 1 L, diluir a volumen con metanol anhidro y mezclar. Normalizar la solución según se indica a continuación. Medir con exactitud aproximadamente 20 ml de ácido clorhídrico 1 N SV recién normalizado y transferir a un matraz Erlenmeyer de 250 ml, agregar 0,25 ml de fenolftaleína SR y valorar con la solución de metóxido de sodio hasta obtener por vez primera un color rosado permanente.
ml HClx N HCI N =- - - - - - - - - mL de metóxido de sodio
Nitrato Cérico Amónico, Veinteavo Normal (0,05 N) Ce(N03)4 · 2NH4NQ3, 548,22 2,741gen100 ml Disolver 2,75 g de nitrato cérico amónico en ácido nítrico 1 N para obtener 100 ml de solución y filtrar. Normalizar la solución según se indica a continuación.
Soluciones /Soluciones Volumétricas 2387
USP 39 Medir con exactitud 1O ml de sulfato ferroso amónico O, 1 N SV recién normalizado, transferir a un matraz y diluir con agua aproximadamente hasta 100 ml. Agregar 1 gota de nitrofenantrolina SR y valorar con la solucion de nitrato cérico amónico hasta un punto final incoloro.
N = ml Fe(NH 4 ) 2 (S0 4 ) 2 x N Fe(NH 4 ) 2 (S0 4 ) 2 ml Ce(N0 3 ) 4 ·2NH4 N0 3 Nitrato Cúprico, Décimo Normal (O, 1 N) Cu(N03)2 · 2,5H20, 232,59 23,26 g en 1000 ml Cu(N03)z · 3H20, 241,6024,16 g en 1000 ml Disolver en agua 23,3 g de nitrato cúprico 2,5 hidrato, o 24,2 g del trihidrato, para obtener 1000 ml. Normalizar la solución según se indica a continuación. Transferir 20,0 ml de esta solución a un vaso de precipitados de 250 ml. Agregar 2 ml de nitrato de sodio 5 M, 20 ml de acetato de amonio SR y a9ua suficiente para obtener 100 ml. Valorar con edetato disodico 0,05 M SV y determinar el punto final potenciométricamente con un sistema de electrodos para ión cúprico con doble j"unta para la referencia. Realizar una determinación con un b aneo y hacer las correcciones necesarias.
N=
se indica a continuación. A 20,0 ml de la solución de nitrato de plomo agregar 300 ml de agua. Agregar aproximadamente 50 mg de Anaranjado de Xilenol Triturado y metenamina hasta que la solución se torne de un color rosado violáceo. Valorar con edetato disódico O, 1 M SV hasta un punto final amarillo. Calcular la molaridad. Diluir 50,0 ml de Nitrato de Plomo O, 7 M con agua hasta 500,0 ml. Nitrato Mercúrico, Décimo Molar {O, 1 M) Hg(N03)2, 324,60 32,46 g en 1000 ml Disolver aproximadamente 35 g de nitrato mercúrico en una mezcla de 5 ml de ácido nítrico y 500 ml de agua, y diluir con agua hasta 1000 ml. Normalizar la solucion según se indica a continuación. Transferir a un matraz Erlenmeyer un volumen de aproximadamente 20 ml de la solución, medidos con exactitud, y agregar 2 ml de ácido nítrico y 2 ml de sulfato férrico amornco SR. Enfriar por debajo de 20º y valorar con tiocianato de amonio O, 1 N SV hasta que aparezca un color amarronado permanente.
M = ml NH 4 SCN x N NH 4SCN ml Hg(N0 3 ) 2 x 2
mL de edetato disódico (corregidos por el blanco) x M de edetato disódico
20,0
Nitrato de Bismuto, 0,01 M Bi(N03)3 · 5H20, 485,07 1000 ml de esta solución contienen 4,851 g de nitrato de bismuto pentahidrato Disolver 4,86 g de nitrato de bismuto pentahidrato en 60 ml de ácido nítrico diluido, agregar acido nítrico 0,01 N para obtener 1000 ml y normalizar Ta solución según se indica a continuación. Medir con exactitud 25 ml de la solución preparada de nitrato de bismuto, agregar 50 ml de a~ua y 1 gota de anaranjado de xilenol SR, y valorar la solucion con edetato disódico 0,01 M SV hasta que el color cambie de rojo a amarillo. Calcular el factor de molaridad.
Nitrato de Plata, Décimo Normal (O, 1 N) AgN03, 169,87 16,99 g en 1000 ml Disolver aproximadamente 17,5 g de nitrato de plata en 1000 ml de agua y normalizar la solución según se indica a continuación. Transferir a un matraz de 150 ml a roximadament x titud de · 100 m 1solver en m e agua y agregar m e ac1 o acet1co, 50 ml de metanol y aproximadamente 0,5 ml de eosina Y SR. Mezclar, preferentemente con un agitador magnético, y valorar con la solución de nitrato de plata.
N=
mg NaCI ml AgN0 3 x 58,44
Nitrato de Plomo, Centésimo Molar (0,01 M) Pb (N03)2, 331,21 3,312 g en 1000 ml ANARANJADO DE XILENOL TRITURADO: Triturar 1 parte de anaranjado de xilenol con 99 partes de nitrato de potasio. NITRATO DE PLOMO o, 1 M: Disolver 33 g de nitrato de plomo en 1000 ml de agua. Normalizar la solución según
Nitrito de Sodio, Décimo Molar {O, 1 M) NaN02, 69,00 6,900 g en 1000 ml Disolver 6,9 g de nitrito de sodio en agua para obtener 1000 ml y normalizar la solución según se indica a continuación. Pesar con exactitud aproximadamente 500 mg de ER Sulfanilamida USP, previamente secados a 105º durante 3 horas, y transferir a un vaso de precipitados adecuado. Agregar 20 ml de ácido clorhídrico y 50 ml de agua, mezclar hasta que se disuelva, y enfriar a 15º. Mantener la temperatura aproximadamente a 15º, valorar lentamente con la solución de nitrito de sodio, colocando la punta de la bureta debajo de la superficie de la solución para impedir la oxidación del nitrito de sodio con el aire, y mezclar la solución suavemente con un agitador magnético, evitando generar un vórtice de aire por debajo de la superficie. Usar el indicador especificado en la monografía individual o, en caso de que se especifique un procedimiento potenciométrico, determinar el punto final electrométricamente usando electrodos de platino-calomel o platino-platino. Cuando la valoración se encuentre dentro de 1 ml del punto final, agregar la solución volumétrica en porciones de O, 1 ml y dej·ar pasar 1 minuto entre adiciones. Cada 1 7,22 mg de su fanilamida equivalen a 1 ml de nitrito de sodio O, 1000 M.
M- mg de sulfanilamida 172,20 x ml NaN02
Perclorato de Plomo, Centésimo Molar (0,01 M) Pb(CIQ4)2, 406, 10 Pipetear con exactitud 100 ml de solución de perclorato de plomo O, 1 M comercialmente disponible, transferir a un matraz volumétrico de 1000 ml, agregar una cantidad suficiente de agua para obtener 1000 ml y normalizar la solución según se indica a continuación. Pipetear con exactitud 50 ml de solución de perclorato de plomo 0,01 M, preparada según se indica más arriba, y transferir a un matraz Erlenmeyer de 250 ml. Agregar 3 ml de solución de hexametilentetramina acuosa (2,0 g por 100 ml) y 4 gotas de indicador anaranjado de xilenol al 0,5% preparado agregando 500 mg de anaranjado de xilenol a 1O ml de alcohol y diluyendo con agua hasta 100 ml. (Omitir el alcohol si se utiliza la sal sódica del indicador.)
2388 Soluciones Volumétricas /Soluciones Valorar con edetato disódico 0,05 M SV hasta un punto final amarillo. ml de edetato disódico x M de edetato disódico
M=-----------------50,0 Perclorato de Plomo, Décimo Molar (O, 1 M) Pb(CIQ4)2 · 3H20, 460, 15 46,01 g en 1000 ml Disolver 46 g de perclorato de plomo en agua, y diluir con agua hasta 1000,0 ml. Pesar con exactitud aproximadamente 150 mg de sulfato de sodio, previamente secado a 105º durante 4 horas, y disolver en 50 ml de agua. Agregar 50 ml de una mezcla de agua y formaldehido (1 :1 ), y mezclar durante 1 minuto. Determinar el punto final potenciométricamente usando un electrodo selectivo para iones de plomo. Realizar una determinación con un blanco y hacer las correcciones necesarias. Cada 14,204 mg de sulfato de sodio equivale a 1 ml de perclorato de plomo O, 1 M.
M=
mg de sulfato de sodio
142,04 x ml de perclorato de plomo
USP 39 vidrio con ayuda de un volumen suficiente de ácido metafosfórico-ácido acético SR para obtener 50 ml. Transferir inmediatamente 2 ml de la solución de ácido ascórbico a un matraz Erlenmeyer de 50 ml que contenga 5 ml de ácido metafosfórico-ácido acético SR y valorar de forma rápida con la solución de diclorofenol-indofenol hasta obtener un color rosado purpúreo nítido que persista durante al menos 5 segundos. Realizar una valoración con un blanco valorando 7 ml de ácido metafosfórico-ácido acético SR más un volumen de agua igual al volumen de la solución de diclorofenol usado para valorar la solución de ácido ascórbico. Expresar la concentración de la solución estándar como su equivalente en mg de ácido ascórbico. Sulfato Cérico, Décimo Normal (O, 1 N) Ce(S04)2, 332,24 33,22 g en 1000 ml Usar una solución volumétrica comercialmente disponible. Normalizar la solución según se indica a continuación. Pesar, con exactitud, aproximadamente 0,2 g de oxalato de sodio patrón primario, secado según las instrucciones de la etiqueta y disolver en 75 ml de agua. Agregar, mezclando, 2 ml de ácido sulfúrico previamente mezclado con 5 ml de agua, mezclar bien, agregar 1O ml de ácido clorhídrico, y calentar entre 70º y 75º. Valorar con sulfato cérico O, 1 N hasta un color amarillo leve permanente. Cada 6,700 mg de oxalato de sodio equivalen a 1 ml de sulfato cérico 0, 1 N.
mg Na 2CzÜ 4 N = ------=---=---=---'----Permanganato de Potasio, Décimo Normal (O, 1 N) KMn04, 158,03 3, 161 g en 1000 ml Disolver aproximadamente 3,3 g de permanganato de potasio en 1000 ml de agua en un matraz y calentar a ebuflición la solución durante aproximadamente 15 minutos. Tapar el matraz, dejar en reposo durante al menos 2 días y filtrar a través de un crisol de vidrio sinterizado de porosidad fina. Si fuera necesario, el fondo del crisol de vidrio sinterizado puede recubrirse con un trozo de lana de vidrio. Normalizar la solución según se indica a continuación. Pesar cop exactj,ilJ.~L~~2~i\!l~damente 200 mg de oxalato de sodio llllllllBllllllllllll secados según ras instrucciones de'Ta''etiqueta, y disolver en 250 ml de agua. Agregar 7 ml de ácido sulfúrico, calentar hasta aproximadamente 70º y luego agregar lentamente la solución de permanganato desde una bureta mezclando en forma constante hasta obtener un color rosado pálido que persista durante 15 segundos. La temperatura al finalizar la valoración debe ser no menos de 60º. Calcular la normalidad. Cada 6,700 mg de oxalato de sodio equivalen a 1 ml de permanganato de potasio 0, 1 N. Debido a que el permanganato de potasio se reduce al entrar en contacto con sustancias orgánicas como la goma, la solución debe manipularse en equipos que sean totalmente de vidrio u otros materiales adecuadamente inertes. Debe volver a normalizarse con frecuencia. Almacenar en frascos de color ámbar con tapón de vidrio.
N = ____g_N_a=2C~zÜ_4~--ml de solución de KMn04 x 0,06700
Solución Estándar de Diclorofenol-lndofenol A 50 mg de 2,6-diclorofenol-indofenol sódico almacenado en un desecador sobre cal sodada agregar 50 ml de agua con 42 mg de bicarbonato de sodio, agitar vigorosamente y, una vez disuelto el colorante, agregar agua hasta 200 ml. Filtrar y transferir a un frasco de color ámbar con tapón de vidrio. Usar dentro de 3 días y normalizar inmediatamente antes de usar. Normalizar la solución según se indica a continuación. , Pesar con exactitud 50 mg de ER Acido Ascórbico USP y transferir a un matraz volumétrico de 50 ml con tapón de
67,00 x ml de solución de Ce(S04h
Sulfato de Cinc, Veinteavo Molar (0,05 M) ZnS04 · 7H20, 287,56 14,4 g en 1000 ml Disolver 14,4 g de sulfato de cinc en agua para obtener 1 litro. Normalizar la solución según se indica a continuación. Medir con exactitud aproximadamente 1O ml de edetato disódico 0,05 M SV y transferir a un matraz Erlenmeyer de 125 ml; luego agregar, en el orden indicado, 1O ml de solución amortiguadora de ácido acético-acetato de amonio SR, 50 ml de alcohol y 2 ml de ditizona SR. Valorar con la solución de sulfato de cinc hasta obtener un color rosado purpúreo transparente. M = ml de edetato disódico x M de edetato disódico
mL ZnS0 4
Sulfato Férrico Amónico, Décimo Normal (O, 1 N) FeNH4(SQ4)2 · 12H20, 482, 19 48,22 g en 1000 ml Disolver 50 g de sulfato férrico amónico en una mezcla de 300 ml de agua y 6 ml de ácido sulfúrico, diluir con agua hasta 1000 ml y mezclar. Normalizar la solución según se indica a continuación. Medir con exactitud aproximadamente 40 ml de la solución y transferir a un matraz con tapón de vidrio, agregar 5 ml de ácido clorhídrico, mezclar y agregar una solución de 3 g de yoduro de potasio en 1O ml de agua. Tapar el matraz, dejar en reposo durante 1O minutos y luego valorar el yodo liberado con tiosulfato de sodio 0, 1 N SV, agregando 3 ml de almidón SR cerca del punto final. Corregir mediante una determinación con un blanco usando las mismas cantidades de los mismos reactivos. Almacenar en recipientes impermeables. Proteger de la luz.
N = mL Na 2Sp3 x N Na 2SzÜ 3 mL FeNH 4 (S0 4 ) 2
USP 39
Soluciones / Soluciones Volumétricas 2389
Sulfato Ferroso Amónico, Décimo Normal (O, 1 N) Fe(NH4)i(SQ4)2 · 6H20, 392, 14 39,21 9 en 1000 ml Disolver 40 g de sulfato ferroso amonico en una mezcla previamente enfriada de 40 ml de ácido sulfúrico y 200 ml de agua, diluir con agua hasta 1000 ml y mezclar. Normalizar la solución en el día de uso según se indica a continuación. Medir con exactitud de 25 a 30 ml de la solución y transferir a un matraz, agregar 2 gotas de ortofenantrolina SR y valorar con sulfato cérico O, 1 N SV hasta que el color rojo se torne azul claro. mL de Ce 1v x N Ce 1v
N=------mL de
Solución de Fe 11
Tartrato Cúprico Alcalino (Solución de Fehling) SOLUCIÓN DE COBRE (SOLUCIÓN A): Transferir 34,639 g de sulfato cúprico a un matraz volumétrico de 500 ml, disolver y diluir con agua a volumen. Filtrar, si fuera necesario. SOLUCIÓN DE TARTRATO ALCALINO (SOLUCIÓN 8): Transferir 1 73 g de tartrato de sodio y potasio y 50 g de hidróxido de sodio a un matraz volumetrico de 500 ml, disolver y diluir con agua a volumen. Filtrar, si fuera necesario. justo antes de su uso, preparar Solución de Tartrato Cúprico Alcalino mezclando volúmenes iguales de Solución A y Solución B. Normalizar esta solución según se indica a continuación. Solución madre del estándar: Transferir 9,5 g de sacarosa a un matraz volumétrico de 1 L, disolver en 100 ml de agua, agregar 5 ml de ácido clorhídrico y almacenar durante 3 días a 20º-25°. Diluir con agua a volumen. Esta solución se mantiene estable durante varios meses. Solución de azúcar invertido: Inmediatamente antes de su uso al estandarizar el Solución de Tartrato Cúprico Alcalino, transferir 25 ml de Solución madre del estándar a un matraz volumétrico de 100 ml y diluir con agua a volumen. PROCEDIMIENTO Aparato: Montar un soporte de anillo sobre una base para anillos a 1-2 pulgadas por encima de un mechero de 9as y montar un segundo anillo a 6-7 pulgadas por encima del primero. Colocar una malla de alambre desnudo de 6 pulgadas en el anillo inferior para sostener un matraz Erlenmeyer de 400 ml y colocar un vidrio de reloj de 4 pulgadas con un orificio central sobre el anillo superior para desviar el calor. Ajustar una bureta de 50 ml a la base para anillos de manera que la punta atraviese apenas el orificio del vidrio de reloj centrado por encima del matraz. Colocar una superficie blanca iluminada indirectamente detrás del montaje para observar el punto final. Normalización: Transferir 20,0 ml de Solución de Tartrato Cúprico Alcalino a un matraz de 400 ml que contenga unas pocas perlas de ebullición y agregar 15 ml de agua y 39,0 ml de Solución de azúcar invertido. Mezclar agitando por rotación suave a temperatura ambiente y colocar inmediatamente el matraz sobre la malla de alambre del Aparato. Ajustar el mechero de manera que se alcance el punto de ebullición de la solución en aproximadamente 2 minutos. Calentar a ebullición suave y constantemente durante 2 minutos. Mientras continua la ebullición, agregar 3-4 gotas de solución de azul de metileno (1 en 100). Completar la valoración dentro del primer minuto, agregando la Solución de azúcar invertido gota a gota, hasta que el color azul desaparezca. Dejar que transcurran 5 segundos de tiempo de reacción entre gotas al final de la valoración. Ajustar el Solución de Tartrato Cúprico Alcalino para la cantidad correcta de cobre
(equivalente a 100 mg de azúcar invertido) y volver a normalizar si el volumen total de Solución de azúcar invertido es mayor o menor de 40,0 ml. Tetrafenilboro Sódico, Cincuentavo Molar (0,02 M) NaB(C6H5)4, 342,22 6,845 g en 1000 ml Disolver en agua una cantidad de tetrafenilboro sódico que equivalga a 6,845 g de NaB(C6H 5)4 para obtener 1000 ml y normalizar la solución según se indica a continuación. Pipetear dos porciones de 75 ml de la solución, transferir a sendos vasos de precipitados y agregar a cada uno 1 ml de ácido acético y 25 ml de agua. A cada vaso de precipitados agregar, lentamente y mezclando constantemente, 25 ml de solución de biftalato de potasio (1 en 20) y dejar en reposo durante 2 horas. Filtrar una de las mezclas a través de un crisol de filtrado y lavar el precipitado con agua fría. Transferir el precipitado a un recipiente, agregar 50 ml de agua, agitar en forma intermitente durante 30 minutos, filtrar y usar el filtrado como solución saturada de tetrafenilborato de potasio en el siguiente procedimiento de normalización. Filtrar la segunda mezcla a través de un crisol para filtración tarado y lavar el precipitado con tres porciones de 5 ml de solución saturada de tetrafenilborato de potasio. Secar el precipitado a 105º durante 1 hora. Cada g de tetrafenilborato de potasio (TFBK) equivale a 955, 1 mg de tetrafenilboro sódico.
M = g TFBK 342,22
x 0,9551 X
0,075
[NOTA-Preparar esta solución inmediatamente antes de su uso.] Tiocianato de Amonio, Décimo Normal (O, 1 N) NH4SCN, 76, 12 7,612 g en 1000 ml Disolver aproximadamente 8 g de tiocianato de amonio en 1000 ml de a9ua y normalizar la solución según se indica a continuacion. Medir con exactitud aproximadamente 30 ml de nitrato de plata O, 1 N SV y transferir a un matraz con tapón de vidrio. Diluir con 50 ml de agua, luego a~regar 2 ml de ácido nítrico y 2 ml de sulfato férrico amonico SR, y valorar con la solucion de tiocianato de amonio hasta que aparezca un color marrón rojizo.
N = mL AgN0 3 x N AgN0 3 mLdeSolución de NH 4SCN Si se desea, puede reemplazarse el tiocianato de amonio O, 1 N con tioc1anato de potasio O, 1 N en las pruebas y valoraciones en que se indica el uso del primero. Tiocianato de Potasio, Décimo Normal (O, 1 N) KSCN, 97, 18 9,72 g en 1000 ml Pesar con exactitud 9,72 g de tiocianato de potasio, previamente secados durante 2 horas a 11 Oº, transferir a un matraz volumétrico de 1 L, diluir a volumen con agua y mezclar bien. Normalizar según se indica a continuacion: transferir 40,0 ml de nitrato de plata O, 1 N SV recién normalizado a un matraz Erlenmeyer de 250 ml; y agregar 100 ml de ª\:lua, 1 ml de ácido nítrico y 2 ml de surtato férrico amónico SR. Valorar con solución de tiocianato de potasio, con agitación, hasta un color marrón rosado claro permanente del sobrenadante.
N= mL x N AgN0 3 ml KSCN
USP 39
2390 Soluciones Volumétricas / Soluciones
Tiosulfato de Sodio, Décimo Normal (O, 1 N) Na 2 S20 3 • 5H20, 248, 19 24,82 g en 1000 ml Disolver aproximadamente 26 g de tiosulfato de sodio y 200 mg de carbonato de sodio en 1000 ml de agua recientemente hervida y enfriada. Normalizar la solución según se indica a continuación. Pesar con exactitud aproximadamente 21 O mg de dicromato de potasio ' · · · · s secados y disolver en 100 ml de agua en un ml con taP.?n de vidrio. Agitar por r~tación matraz e suave hasta disolver los solidos, destapar y agregar rapidame~te 3 g de yo9u.ro de po!asio, 2 g de bicarbonato de sodio y 5 ml de ac1do clorh1drico. Tapar suavemente el matraz, mezclar agitando por rotación suave y dejar en reposo durante exactamente 1O minutos en un lugar oscuro. Enjuagar el tapón y las paredes interiores del matraz con agua y valorar el yodo liberado con la solución de tiosulfato de sodio hasta que la solución se torne de un color verde amarillento. Agregar 3 ml de almidón SR y continuar con la valoración hasta que el color azul haya desaparecido. Realizar una determinación con un blanco. Volver a normalizar la solución con la frecuencia que indiquen los datos de estabilidad del laboratorio. En caso de no contar con dichos datos, volver a normalizar semanalmente.
09
N=
mg K2Crp 7 49,04 x ml Na 2Sp 3
Tricloruro de Titanio, Décimo Normal (O, 1 N) TiCb, 154,23 15,42 g en 1000 ml Agregar 75 ml de solución de tricloruro de titanio (1 en 5) a 75 ml de ácido clorhídrico, diluir hasta 1000 ml y mezclar. Normalizar la solución según se indica a continuación, usando el aparato de volumetría especial que se describe. APARATOS: Almacenar la solución de tricloruro de titanio en el recipiente de un titulador de sistema cerrado en una atmósfera de hidrógeno. Usar un matraz Erlenmeyer de 500 ml de boca ancha como r~cipiente de ".aloración y conectarlo po~ medio de un tapon de goma aiustado a la bureta volumetrica un tubo de entrada para el dióxido de carbono y un tJbo de sali?a. Acondicionar para mezclar mecánicamente. Todas las ]Untas deben ser herméticas. Preparar el equipo de mo~o que el hidrógeno y el dióxido de carbono pasen a traves de botellas de lavado que contengan solución de tri~loruro d~ titanio (aproximadamente 1 en 50) para eliminar el oxigeno. Si la solución que debe valorarse ha de calentarse antes o durante la valoración, conectar el matraz de valoración con un condensador de reflujo vertical a través del tapón de goma. NORMALIZACIÓN: Colocar un volumen, medido con exactitud, de aproximadamente 40 ml de sulfato férrico amónJc? O, 1 N ~Y ~n el matraz de valoración y pasar un flujo rap1do de d1ox1do de carbono hasta eliminar todo el aire. Agregar la solución de tricloruro de titanio de la bureta hasta cerca del punto final calculado (aproximadamente ~5 f!!L), luego agre9ar a través del tubo de salida 5 ml de t1oc1anato de amomo SR y continuar la valoración hasta que la solución se torne incolora.
N=mL~N~~~~xN~N~~~~ ml TiCl 3
Yodato de Potasio, Veinteavo Molar (0,05 M) KI0 3, 214,00 10,70 gen 1000 ml Disolver en agua 10,700 g de yodato de potasio, previamente secados a 11 Oº hasta peso constante, para obtener 1000,0 ml. Normalizar la solución según se indica a continuación: A 15,0 ml de solución en un matraz para yodo de 250 ml, agregar 3 g de yoduro de potasio y 3 ml de ácido ~lorhí~rico previame~te diluido con 1 O ml de agua. Tapar inmediatamente y de1ar en resposo en la oscuridad durante 5 min~tos. Luego a9regar 50 ml de agua fría, valorar el yodo liberado con t1osulfato de sodio O, 1 N recién normalizado. Agregar 3 ml de solución indicadora de almidón cerca del final de la valoración y continuar hasta la ausencia del complejo azul de almidón-yodo.
M= ml x N Na 2Sp3 ml Kl0 3 x 6 Yodo, Centésimo Normal (0,01 N) 1, 126,90 1 269 gen 1000 ml I Disolver aproximadamente 1,4 g de yodo en una solución de 3,6 g de yoduro de potasio en 100 ml de agua agregar 3 gotas de ácido clorhídrico, diluir con agua hasta '1000 ml y normalizar la solución según se indica a continuación. Transferir 100,0 ml de solución de yodo a un matraz de 250 ml, agrega~ ,1 ml de ácido clorh1drico 1 N, mezclar agitando por rotacion suave y valorar con tiosulfato de sodio O, 1 N SV hasta que la solución se torne de un color amarillo pálido. Agregar 2 ml de almidón SR y continuar con la valoración hasta que la solución se torne incolora. Conservar en frascos de color ámbar con tapón de vidrio.
N = ml Na 2S20 3 x N Na 2 S20 3
100 Yodo, Décimo Normal (O, 1 N) 1, 126,90 12,69 g en 1000 ml Disolver aproximadamente 14 g de yodo en una solución de 36 g de yoduro de potasio en 100 ml de agua, agregar 3 gotas de acido clorh1drico, diluir con agua hasta 1000 ml y normalizar la solución según se indica a continuación. Transferir 25,0 ml de la solución de yodo a un matraz de ?5.0 ml, dil~ir. con agua hasta 1 O~ ml, agregar 1 ml de ac1do clorh1dnco 1 N, mezclar agitando por rotación suave y valorar con tiosulfato de sodio O, 1 N SV hasta que la solución se torne de un color amarillo pálido. Agregar 2 ml de almidón SR y continuar con la valoración hasta que la solución se torne incolora. Conservar en frascos de color ámbar con tapón de vidrio.
N = ml Na 2S2Q 3 x N Na 2S20 3
25 Yodo, Veinteavo Normal (0,05 N) 1, 126,90 6 33 gen 1000 ml I Disolver aproximadamente 6,5 g de yodo en una solución de 18 g de yoduro de potasio en 100 ml de agua, agregar 3 gotas de acido clorh1drico, diluir con agua hasta 1000 ml y normalizar la solución según se indica a continuación. Transferir 50,0 ml de la solución de yodo a un matraz de ?5,0 ml, dil~ir. con agua hasta 1O~ ml, agregar 1 ml de ac1do clorh1dnco 1 N, mezclar agitando por rotación suave y valorar con tiosulfato de sodio O, 1 N SV hasta que la solución produzca un color amarillo pálido. Agregar 2 ml de
Reactivos/ Columnas Cromatográficas 2391
USP 39 almidón SR y continuar valorando hasta que la solución se torne incolora.
Columnas Cromatográficas La siguiente lista de rellenos (L), fases (G) y soportes (S) pretende ser una referencia útil par~ el técnico en crom~to grafía. [NOTA-Los tamaños de part1cula que se proporcionan en esta lista son los que se puede_r:i obtener general- , mente. Cuando se requiera otro tamano, normalmente m~s fino la monografía individual especifica el tamaño de part1cula1 deseado. Dentro de cualquier categoría ~e ma~~riales de relleno o de fases que se enumeran a continu~c1on,_ puede existir una amplia variedad de columnas d1sponible_s. Cuando es necesario definir más específicamente las condiciones cromatográficas, la monografía individual así lo indica.]
Rellenos
Cambio en la l'e(lacc;ón: LlO-Grupos nitrilo unidos químicam~~te a partículas de _sílice poros(;ls, 9~ 1,5 µm a 1O µm de d1ametro, •o una varilla silícea monoht1ca .•u5p39
Comblo en ltí l'(i!ddctión: L11-Grupos fenilo unidos químicame.~te a partículas de ~í lice porosas, de 1,5 µm a 1 O µm de d1ametro, •o una varilla silke.a m~molftita,.u5p39
L12-Relleno de intercambio aniónico fuerte obtenido uniendo químicamente una amina cuaternaria a .~n núcleo esférico de sílice sólido, de 30 µm a 50 µm de d1ametro.
L1-0ctadecilsilano unido químicamente a micropartículas de sílice o cerámica porosas o no porosas, de 1,5 µm a 1O µm de diámetro, o una varilla silícea monolítica.
L13-Trimetilsilano unido químicamente a partículas de sílice porosas, de 3 µm a 1O µm de diámetro.
L2-0ctadecilsilano unido químicamente a gel de síli~e de una porosidad de superficie controlada, que se ha .~nido a un núcleo esférico solido, de 30 µm a 50 µm de d1ametro.
L14--Gel de sílice unido químicamente a un recubrimiento de intercambio aniónico de amonio cuaternario fuertemente básico, de 5 µm a 1O µm de diámetro.
U-Partículas de sílice porosas de 1,5 µm a 1O µm de diámetro, o una varilla silícea monolítica.
L15-Hexilsilano unido químicamente a partículas de sílice totalmente porosas, de 3 µm a 1O µm de diámetro.
L4--Gel de sílice de una porosidad de superficie controlada que se ha unido a un núcleo esférico sólido, de 30 µm a 50 µm de diámetro.
L16-Dimetilsilano unido químicamente a partículas de sílice porosas, de 5 µm a 1O µm de diámetro.
LS-Alúmina de un~ porosi~a~ de ,s~perficie controlada que se ha unido a un nucleo esfenco solido, de 30 µm a 50 µm de diámetro. L6-Relleno de intercambio catiónico fuerte-polímero de fluorocarbono sulfonado recubierto sobre un núcleo esférico sólido, de 30 µm a 50 µm de diámetro. L7-0ctilsilano unido químicamente a partículas de sílice totalme!1te porosas o sup_erfic!~lmente po~~sas, de 1,5-1 O µm de diametro, o una varilla s1l1cea monoht1ca.
Cambio en la redacción: LB-Capa esencialmente monomolecular de aminopropilsilano unida químicamente a un soporte de gel de sil1ce totalmente eoroso, .de 1,5 µm a 1o µm de diámetro, •o una varilla silícea monofítica .... usn9 L9-Gel de sílice totalmente poroso, irregular o esférico, unido químicamente a un recubrimiento de interC?_!11bio catiónico fuertemente ácido, de 3 µm a 1O µm de d1ametro.
L17-Resina de intercambio catiónico fuerte que consta de un copolímero sulfonac;Jo entrecruzado de estireno-~iyinil benceno, en la forma acida, de 6 µm a 12 µm de d1ametro.
L18-G,rupos amino y ciano unidos química~ente a partículas de silice porosas, de 3 µm a 1O µm de d1ametro. L19-Resina de intercambio catiónico fuerte que consta de un copolímero sulfonado entrecruzado de estireno-divinilbenceno, en la forma cálcica, de aproximadamente 9 µm de diámetro.
Cambio en la redacción: L20-Grup?~ dihidroxiprop~n? unidos químicamente a partículas de s1hce porosas o h1bndas, de 1,5 µm a 1O µm de diámetro, •o una varilla silícea monolítica •• usP39
L21-Copolímero rígido, esférico de estireno-divinilbenceno, de 3 µm a 30 µm de diámetro. L22-Resina de intercambio catiónico constituida por gel de poliestireno poroso con grupos ácidos sulfónicos, de un tamaño aproximado de 1O µm. L23-Resina de intercambio aniónico constituida por gel de poliacrilato o polimetacrilato poroso con grupos amonio cuaternario, de un tamaño de 7-12 µm.
2392 Columnas Cromatográficas /Reactivos L24-Alcohol polivinílico unido guímicamente a partículas de sílice porosas, de 5 µm de diametro. [NOTA-Está disponible como YMC-Pack PVA-SIL, fabricado por YMC Co., Ltd. y distribuido por Waters Corp. (www.waters.com).] L25-Relleno con capacidad para separar compuestos en un intervalo de peso molecular de 100-5000 (determinado con óxido de polietileno), aplicable a polímeros hidrosolubles neutros, aniónicos y catiónicos. Se determinó que una base de resina de polimetacrilato, entrecruzada con éter polihidroxilado (la superficie contiene algunos grupos funcionales carboxilo residuales) es adecuada. L26-Butilsilano unido químicamente a partículas de sílice totalmente porosas, de 1,5 µm a 1O µm de diámetro. L27-Partículas de sílice porosas, de 30 µm a 50 µm de diámetro. L28-Soporte multifuncional, que con,siste en un sustrato de sílice esférico de alta pureza, de 100 A, que se ha unido a un intercambiador aniónico, con funcionalidad amina, además de una funcionalidad en fase reversa convencional de C8. L29-Gamma alúmina de fase reversa con bajo porcentaje, en peso, de carbono, y partículas esféricas de polibutadieno con base de alú,mina, de 5 µm de diámetro con un volumen de poro de 80 A. L30-Etilsilano unido químicamente a partículas de sílice totalmente porosas, de 3 µm a 1O µm de diámetro. L31-Resina de intercambio aniónico fuerte, hidróxido-selectivo, unida por amina cuaternaria a partículas de látex ligadas a un nucleo de partículas ,macroporosas de 8,5 µm con un tamaño de poro de 2000 A y constituidas por etilvinilbenceno entrecruzado con divinilbenceno al 55%. L32-Relleno de intercambio con ligando quiral-complejo de L-prolina y cobre unido covalentemente a partículas de sílice irregulares, de 5 µm a 1O µm de diámetro. L33-Relleno con capacidad para separar dextranos de un tamaño molecular en un intervalo de entre 4000 y 500 000 Da. Es esférico con base de sílice y tiene un procesamiento que le proporciona estabilidad frente al pH. [NOTA-Está disponible como TSK-GEL G4000SWxl que se puede obtener de Tosoh Bioscience (www.tosohbioscience.com).] L34-Resina de intercambio catiónico fuerte que consiste en un copolímero sulfonado entrecruzado de estireno-divinilbenceno en la forma de plomo, de 7 µm a 9 µm de diámetro. L35-Relleno de sílice esférica estabilizada con zirconio con una fase unida que consta de una monocapa mole<;ular hidrófila (tipo diol), con un tamaño de poro de 150 A. L36-Derivado 3,5-dinitrobenzoilo de L-fenilglicina unido covalentemente a sílice aminopropílica de 5 µm. L37-Relleno con capacidad para separar proteínas por tamaño molecular en un intervalo de entre 2000 y 40 000 Da. Es un gel de polimetacrilato. L38-Relleno para exclusión por tamaño a base de metacrilato para muestras hidrosolubles. L39-Gel de polihidroximetacrilato hidrófilo de resina esférica totalmente porosa. L40-Partículas de sílice porosas recubiertas con tris-3,5-dimetilfenilcarbamato de celulosa, de 5 µm a 20 µm de diámetro.
USP 39 L41-Glicoproteína a1-ácida inmovilizada sobre partículas esféricas de sílice, de 5 µm de diámetro. L42-Grupos octilsilano y octadecilsilano unidos químicamente a partículas de sílice porosas, de 5 µm de diámetro. L43-Grupos pentafluorofenilo unidos químicamente a partículas de sílice mediante un espaciador propilo, de 1,5 µm a 1O µm de diámetro. L44-Soporte multifuncional, que cqnsiste en un sustrato de sílice esférico de alta pureza, de 60 A, que se ha unido a un intercambiador catiónico, con funcionalidad de ácido sulfónico, además de una funcionalidad en fase reversa convencional de C8. L45-Beta ciclodextrina, derivada de éter R,S hidroxipropílico, unida a partículas de sílice porosas, de 5 µm a 1O µm de diámetro. L46-Sustrato de poliestireno y divinilbenceno aglomerado con perlas de látex con funcionalidad de aminas cuaternarias, de aproximadamente 9 µm a 11 µm de diámetro. L47-Sustrato microporoso de intercambio aniónico de alta capacidad, totalmente funcionalizado con grupos trimetilamino, de 8 µm de diámetro. [NOTA-Está disponible como CarboPac MA1 y lo distribuye Dionex Corp. (www.dionex. com).] L48-Poliestireno entrecruzado sulfonado, con una capa exterior de microperlas de intercambio aniónico porosas submicrométricas, de 5 µm a 15 µm de diámetro. L49-Relleno en fase reversa obtenido por recubrimiento con una capa delgada de polibutadieno sobre partículas porosas esféricas de zirconio, de 3 µm a 1O µm de diámetro. [NOTA-Está disponible como Zirchrom PBD en www.zirch rom.com] L50-Resina multifuncional, con retención en fase reversa y funcionalidades de intercambio aniónico fuerte. La resina consta de etilvinilbenceno, entrecruzado al 55% con copolímero de divinilbenceno, de 3 µm a 15 µm de diámetro, y una superficie de no menos de 350 m2 por g. El sustrato está recubierto de partículas de látex con funcionalidad de amonio cuaternario que se componen de estireno entrecruzado con divinilbenceno. [NOTA-Está disponible como OmniPac PAX-500 y lo distribuye Dionex Corp. (www.dionex. com).] L51-Partículas de sílice esféricas, porosas, recubiertas con amilosa tris-3,5-dimetilfenilcarbamato, de 5 µm a 1O µm de diámetro. [NOTA-Está disponible como Chiralpak AD que se puede obtener de Chiral Technologies, lnc., (www.chiral tech.com).] L52-Resina de intercambio catiónico fuerte de sílice porosa con grupos sulfopropilo, de 5 µm a 1O µm de diámetro. [NOTA-Está disponible como TSK-GEL IC-Cation-SW de Tosoh Bioscience (www.tosohbioscience.com).] L53-Resina de intercambio catiónico débil que se compone de etilvinilbenceno, entrecruzado al 55% con copolímero de divinilbenceno, de 3 µm a 15 µm de diámetro. El sustrato está injertado en la superficie con ácido carboxílico y/o monómeros funcionalizados de ácido fosfórico. La capacidad es de no menos de 500 µEq/columna. [NOTA-Está disponible como lonPac CSl 4 y lo distribuye Dionex Corp. (www.dio nex.com).] L54-Medio de exclusión por tamaño constituido por dextrano unido covalentemente a perlas de agarosa porosas altamente entrecruzadas, de aproximadamente 13 µm de diámetro.
USP 39 [NOTA-Está disponible como Superdex Peptide HR 10/30 que se puede obtener de Amersham Pharmacia Biotech (www.gelifesciences.com).] L55-Resina de intercambio catiónico fuerte constituida por sílice porosa recubierta con copolímero de polibutadienoácido maleico, de aproximadamente 5 µm de diámetro. [NOTA-Está disponible como IC-Pak C M/D que se puede obtener de Waters Corp. (www.waters.com).] L56--Propilsilano unido químicamente a partículas de sílice totalmente porosas, de 3 µm a 1O µm de diámetro. [NOTAEstá disponible como Zorbax SB-C3 que se puede obtener de Agilent Technologies. (www.agilent.com/chem).] L57-Proteína de reconocimiento quiral, ovomucoide, unida químicamente a partículas de sílice, de aproximadqmente 5 µm de diámetro, con un tamaño de poro de 120 A. [NOTA-Está disponible como Ultron ES-OVM que se puede obtener de Agilent Technologies (www.agilent.com/chem).] L58-Resina de intercambio catiónico fuerte, que consiste en copolímero sulfonado entrecruzado de estireno-divinilbenceno en la forma sódica, de aproximadamente 6 µm a 30 µm de diámetro. [NOTA-Está disponible como Aminex HPX-87N que se puede obtener de Bio-Rad Laboratories, (Nº 125-0143 def catálogo 2000/01) www.bio-rad.com.] L59-Relleno para la separación de proteínas por exclusión de tamaño (separación por peso molecular) en un intervalo de 5 kDa a 7000 kDa. El relleno es de sílice o híbrido, esférico, de 1,5 µm a 1O µm, con un recubrimiento hidrofílico. L60-Gel de sílice poroso, esférico, de 1O µm de diámetro o menor, cuya superficie se ha modificado covalentemente con grupos alquil amida y recubrimiento exhaustivo (endcapped). [NOTA-Está disponible como Supelcosil LC-ABZ de Supelco (www.sigma-aldrich.com/supelco).] L61-Resina de intercambio aniónico fuerte hidróxido-selectiva compuesta de un núcleo altamente entrecruzado de partículas micropQrosas de 13 µm con un tamaño de poro de menos de 1O A y que consiste en etilvinilbenceno entrecruzado con divinilbenceno al 55%, con un recubrimiento de látex compuesto de microperlas de 85 nm de diámetro unidas con iones alcanol amonio cuaternario (6%). [NOTAEstá disponible como Ion Pac AS 11 y como AG 11 que se pueden obtener de Dionex (www.dionex.com).]
Reactivos /Columnas Cromatográficas 2393 diámetro. [NOTA-Está disponible un grado adecu,ado como
--~l de hidrógeno AG 50W-X2 en - -
L66-Un éter corona recubierto un sustrato de gel de sílice con un tamaño de partícula de 5 µm. El sitio activo es (S)18-corona-6-éter. [NOTA-Está disponible como Crownpak CR(+) en www.chiraltech.com.] L67-Copolímero de alcohol vinílico poroso con un grupo alquilo Cl 8 unido al grupo hidroxilo del polímero de 2 µm a 1O µm de diámetro. [NOTA-Disponible como apHera Cl 8 de Supelco (www.sigma-aldrich.com).] L68-Sílice poroso, esférico, de 1O µm de diámetro o menor, cuya superficie se ha modificado covalentemente con grupos alquíl amida, sin recubrimiento exhaustivo (not endcapped). [NOTA-Disponible como SUPELCOSIL SUPLEX pKb-100 de Supelco (www.sigma-aldrich.com).] L69-Sustrato de etilvinilbenceno/divinilbenceno aglomerado con perlas de látex de 130 nm con funcionalidad de aminas cuaternarias, de aproximadamente 6,5 µm de diámetro. [NOTA-Disponible como CarboPac PA20 en www. dionex.com.] L70-Sílice de 5 µm recubierto con celulosa tris(fenil carbamato). [NOTA-Disponible como Chiralcel OC-H en www. chiraltech.com.] L71-Polimetacrilato rígido, esférico, de 4 µm a 6 µm de diámetro. [NOTA-Disponible como RSpak DE-613 en www. shodex.com.] L72-(S)-Fenilglicina y 3,5-dinitroanilina enlazadas por función urea, unidas covalentemente a sílice. [NOTA-Disponible como Sumichiral OA-3300, distribuido por www.phenome nex.com.] L73-Partícula de polidivinilbenceno, rígida, esférica, de 5 µm a 1O µm de diámetro. [NOTA-Disponible como jordiGel DBV en www.jordiflp.com.]
L62-Fase de silano C30 unida a sílice esférica, totalmente porosa, de 3 µm a 15 µm de diámetro.
L74-Resina de intercambio aniónico fuerte compuesta de un núcleo altamente entrecruzado de partículas macropQrosas de 7 µm con un tamaño promedio de poro de 100 A y que consiste en etilvinilbenceno entrecruzado con divinilbenceno al 55% y una capa de intercambio aniónico injertada a la superficie, funcionalizada con iones alquilo de amonio cuaternario. [NOTA-Está disponbile como lonPac ASl 4A de Dionex (www.dionex.com).]
L63-Glicopéptido teicoplanina unid9 por enlaces covalentes múltiples a sílice esférica de 100 A. [NOTA-Disponible como Astec Chirobiotic T de Supelco (www.sigma-aldrich. com).]
L75-Una proteína de reconocimiento quiral, albúmina sérica bovina (BSA), unida químicamente a partículas de sílice, de aproximad,¡imente 7 µm de diámetro, con un tamaño de poro de 300 A.
L64-Resina de intercambio aniónico fuertemente básica constituida por un copolímero entrecruzado de estireno-divinilbenceno con grupos funcionales de amonio cuaternario en forma de cloruro al 8%, de 45 µm a 180 µm de diámetro. [NOTA-Está disponible un grado adecuado como resina en forma de cloruro AG 1-X8 en www.discover.bio-rad. com.]
L76--Material de intercambio catiónico débil con base de sílice, de 5 µm de diámetro. El sustrato está polimerizado en la superficie con polibutadieno-ácido maleico para proporcionar las funcionalidades del ácido carboxílico. Tiene una capacidad de no menos de 29 µEq/columna. [NOTA-Disponible como Metrosep C4-250 en Metrohm (www.metrohm. com).]
L65-Resina de intercambio catiónico, fuertemente acídica, constituida por un copolíi::nerq fu~yJfonado entrecruzado de estireno-divinilbenceno -~ con grupos ácidos sulfónicos en la forma de hidrógeno, de 45 µm a 250 µm de
L77-Resina de intercambio catiónico débil, que consta de etilvinilbenceno, entrecruzado al 55% con copolímero de divinilbenceno, de 6 µm a 9 µm de diámetro. La superficie del sustrato está injertada con grupos funcionalizados de ácido carboxílico. Tiene una capacidad de no menos de 500 µEq/columna (4 mm x 25 cm).
2394 Chromatographic Columns / Reactivos
USP 39
L78---Un silano con ligando que consta de grupos funcionales de fase reversa (una cadena alquílica de mayor longitud que C8) y dºe, Lnlerc~mº,~io ~[li~nico (grul:?o~ amino prim~rio, secundario, llJllllBlll) hgados qwm1camente a m1cropartículas de sílice o cerámica porosas o no porosas, de 1,0-50 µm de diámetro, o una varilla monolítica. [NOTADisponible como Acclaim Mixed-Mode WAX-1 en Thermo Fisher (www.thermofisher.com).] L79-Proteína de reconocimiento quiral, albúmina sérica humana (HSA), unida químicamente a partículas de sílice, de aproximadamente 5 µm de diámetro. L80-Partículas de sílice esféricas, porosas, recubiertas con celulosa tris(4-metilbenzoato), de 5 µm de diámetro. L81-Resina de intercambio aniónico fuerte, hidróxido-selectiva, compuesta de un núcleo altamente entrecruzado de partíc4las porosas de 9 µm con un tamaño de poro de 2000 A y que consiste en etilvinilbenceno entrecruzado con divinilbenceno al 55%, con un recubrimiento de látex compuesto de microperlas de 70 nm de diámetro (6% entrecruzado) unidas con iones alcanol amonio cuaternario .. [NOTA-Se puede obtener una columna adecuada como Dionex lonPac ASl 1-HC en www.thermofisher.com.] L82-Poliamina químicamente ligada al polímero de alcohol polivinílico entrecruzado, de 5 µm de diametro. [NOTA-Está disponible como Asahipak NH2P-50 en www.shodex.com.] L83-Resina de intercambio aniónico fuerte, hidróxido-selectiva, unida por amina cuaternaria a partículas de látex ligadas a un nucleo de partícul¡:is microporosas de 10,5 µm con un tamaño de poro de 1O A y que consisten en etilvinilbenceno entrecruzado con divinilbenceno al 55%. L84--Resina de intercambio catiónico débil que consiste en etilvinilbenceno, entrecruzado al 55% con copolímero de divinilbenceno, de 5 µm de diámetro. El sustrato está injertado en la superficie con grupos funcionalizados de ácido carboxílico. La capacidad es de no menos de 8400 µEq/ columna (5 mm x 25 cm). L85-Un silano con ligando que consta de grupos funcionales de fase reversa (una cadena alquílica de mayor longitud que C8) y de intercambio aniónico débil (grupos carboxilo) ligados químicamente a partículas porosas o no porosas, de 1,0-50 µm de diámetro. L86---Un núcleo de partículas amalgamadas de 5 µm con un ligando altamente polar con 5 grupos hidroxilo ligado a la capa exterior de gel de sílice. [NOTA-La Supelco Ascentis Express OH5 de www.sigma-aldrich.com es una columna adecuada.]
Fases Gl-Aceite de dimetilpolisiloxano. G2-Goma de dimetilpolisiloxano. G3-50% de fenilpolisiloxano y 50% de metilpolisiloxano. G4--Poliéster de succinato de dietilenglicol. G5-3-Cianopropilpolisiloxano. G6--Trifluoropropilmetilpolisiloxano. G7-50% de 3-cianopropilsilicona y 50% de fenilmetilsilicona. GS---80% de bis(3-cianopropil)polisiloxano y 20% de 3-cianopropilfenilpolisiloxano (los porcentajes hacen referencia a la sustitución molar). G9-Metilvinilpolisiloxano. GlO-Poliamida formada por reacción de un ácido dicarboxílico de ( 36 con 1,3-di-4-piperidilpropano y piperidina en la relación molar respectiva de 1,00:0,90:0,20. G11-Poliéster de sebacato de bis(2-etilhexilo). G12-Poliéster de succinato de fenildietanolamina. G 13-Sorbitol. G14--Polietilenglicol (peso molecular promedio de 950 a 1050). G15-Polietilenglicol (peso molecular promedio de 3000 a 3700). G16--Compuesto de polietilenglicol (peso molecular promedio de aproximadamente 15 000). Un compuesto de polietilenglicof de alto peso molecular con un enlazador diepóxido. [NOTA-Está disponible comercialmente como Polyethylene Glycol Compound 20M, o como Carbowax 20M, que se pue<;Jen obtener de proveedores de reactivos para cromatograf1a.] G17-75% de fenilpolisiloxano y 25% de metilpolisiloxano. G 18---Polialquilenglicol. G19-25% de fenilsilicona, 25% de cianopropilsilicona y 50% de metilsilicona. G20-Polietilenglicol (peso molecular promedio de 380 a 420).
USP 39 G21-Succinato de neopentilglicol. G22-Ftalato de bis(2-etilhexilo). G23-Adipato de polietilenglicol. G24---Ftalato de diisodecilo. G25-Compuesto de polietilenglicol y ácido tereftálico (TPA, por sus siglas en inglés). Un compuesto de alto peso molecular de un polietilenglicol y un diepóxido que se esterifica con ácido tereftálico. [NOTA-Está disponible comercialmente como Carbowax 20M-TPA que se puede obtener de proveedores de reactivos para cromatografía.] G26-25% de 2-cianoetilpolisiloxano y 75% de metilpolisiloxano. G27-5% de fenilpolisiloxano y 95% de metilpolisiloxano. G28-25% de Fenilpolisiloxano y 75% de metilpolisiloxano. G29-3,3'-Tiodipropionitrilo. G30-Tetraetilenglicol dimetil éter. G31-Nonilfenoxipoli(etilenoxi)etanol (la longitud promedio de la cadena etilenoxi es 30); Nonoxinol 30. G32-20% de Fenilmetilpolisiloxano y 80% de dimetilpolisiloxano. G33-20% de Carboranosilicona y 80% de metilsilicona. G34---Poliéster de succinato de dietilenglicol estabilizado con ácido fosfórico. G35-Compuesto de alto peso molecular de un polietilenglicol y un diepóxido que se esterifica con ácido nitrotereftá-
fico. G36-1 % de Vinilpolisiloxano y 5% de fenilmetilpolisiloxano. G37-Poliimida. G38--Fase Gl que contiene un pequeño porcentaje de inhibidor de asimetría. [NOTA-Se puede obtener comercialmente un grado adecuado como "SP2100/0.1 % Carbowax 1500" en Supelco, lnc., (www.sigma-aldrich.com/supelco).] G39-Polietilenglicol (peso molecular promedio de aproximadamente 1500). G40-Adipato de etilenglicol. G41-Fenilmetildimetilsilicona (sustituida al 10% por fenilo). G42-35% de fenilpolisiloxano y 65% de dimetilpolisiloxano (los porcentajes hacen referencia a la sustitución molar).
Reactivos/ Columnas Cromatográficas 2395 G47-Polietilenglicol (peso molecular promedio de aproximadamente 8000). G48-Cianopolisiloxano altamente polar y parcialmente entrecruzado.
Soportes [NOTA-A menos que se especifique algo diferente, se indican tamaños de malla de 80 a 100 o alternativamente de 100a120.] SlA-Tierra silícea para cromatografía de gases que ha sido fundida-calcinada mezclando diatomita con flujo de Na2CÜ3 y calcinada a una temperatura por encima de 900º. La tierra silícea se lava con ácido, luego se lava con agua hasta lograr la neutralidad, pero no se lava con bases. La tierra silícea puede ser silanizada al tratarla con un agente como dimetildiclorosilano [NOTA-A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, se indica un soporte silanizado.] enmascarar los grupos silanoles superficiales. SlAB-Tierra silícea conforme a la descripción anterior pero lavada con ácido y base. [NOTA-A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, se indica un soporte silanizado.] S1C-Soporte preparado con ladrillo refractario triturado y calcinado o quemado con arcilla como aglutinante, a una temperatura por encima de 900º y lavado posteriormente con ácido. Puede estar silanizado. Sl O-Soporte preparado con ladrillo refractario triturado y calcinado o quemado con arcilla como aglutinante, a una temperatura por encima de 900º, sin lavar con ácidos. Se puede silanizar. S1NS-Tierra silícea no tratada. S2-Copolímero de estireno-divinilbenceno con un área nominal de menos de 50 m2 por g y un diámetro de poro promedio de 0,3 µm a 0,4 µm. S3-Copolímero de etilvinilbenceno y divinilbenceno con un área nominal de 500 m 2 a 600 m 2 por g y un diámetro de poro promedio de 0,0075 µm. S4---Copolímero de estireno-divinilbenceno con grupos aromáticos -O y -N con un área nominal de 400 m 2 a 600 m 2 por g y un diámetro de poro promedio de 0,0076 µm. SS-Polímero de tetrafluoroetileno de alto peso molecular de malla 40 a 60. S6-Copolímero de estireno-divinilbenceno con un área nominal de 250 m 2 a 350 m 2 por g y un diámetro de poro promedio de 0,0091 µm. S7-Carbono grafitizado que tiene un área nominal de 12 m 2 por g. S8-Copolímero de 4-vinil-piridina y estireno-divinilbenceno. S9-Polímero poroso a base de óxido de 2,6-difenil-p-fenileno. SlO-Copolímero altamente polar entrecruzado con acrilonitrito y divinilbenceno.
G43-6% de cianopropilfenilpolisiloxano y 94% de dimetilpolisiloxano (los porcentajes hacen referencia a la sustitución molar).
Sl 1-Carbono grafitizado que tiene un área nominal de 100 m 2 por g modificado con cantidades pequeñas de vaselina y compuestos de polietilenglicol.
G44---2% de grasa de hidrocarburos de vaselina de bajo peso molecular y 1% de solución de hidróxido de potasio.
S12-Carbono grafitizado que tiene un área nominal de 100 m2 por g.
G45-Divinilbenceno-etilenglicol-dimetilacrilato. G46-14% de Cianopropilfenilpolisiloxano y 86% de metilpolisiloxano.
Tablas de Referencia/ Especificaciones del Envase 2397
USP 39
Tablas de Referencia ENVASES PARA DISPENSAR CÁPSULAS Y TABLETAS
Especificaciones del Envase para Cápsulas y Tabletas (Continuación)
La siguiente tabla sirve como fuente de información para el farmacéutico que participa en la situación típica de dispensación y que ya está familiarizado con los requisitos de Envasado y Almacenamiento establecidos en las monografías individuales. En la tabla adjunta se enumeran las cápsulas y las tabletas oficiales de la Farmacopea de los Estados Unidos y se indican las especificaciones pertinentes a los envases, impermeable (1), bien cerrado (B) y resistente a la luz (RL), en los que se deben dispensar los medicamentos que se reenvasan. Esta tabla no está destinada a remplazar los requisitos definitivos declarados en las monografías individuales ni debe interpretarse como un remplazo de los mismos. Especificaciones del Envase para Cápsulas y Tabletas
Título de la Monoarafía
Especificadones del Envase
Abacavir Tabletas
B
.
Agresfldo figule,.tf:: · "'Acetato de Abirater.ona :rabietas Aceite de Crvnthecodinium cohnii Cánsulas Aceite de Kril Cánsulas Aceite de Kril Cánsulas de Liberación Retardada Aceite de Onaora Cánsulas Aceite de Pescado con Ácidos Omeoa-3 Cánsulas Aceite de Pescado con Ácidos Omega-3, Cápsulas de Liberación Retardada Aceite de Ricino Cápsulas Aceite de Schizochvtrium Cápsulas Aceite de Semilla de Borraia Cánsulas Aceite de Semilla de Lino Cánsulas Acetaminofeno Cánsulas Acetaminofeno Tabletas Acetaminofeno Tabletas de Liberación Prolonnada Acetaminofeno v Asoirina Tabletas Acetaminofeno v Cafeína Tabletas Acetaminofeno y Citrato de Difenhidramina, Tabletas Acetaminofeno y Clorhidrato de Pseudoefedrina, Tabletas Acetaminofeno y Clorhidrato de Tramado!, Tabletas Acetaminofeno v Fosfato de Codeína Cánsulas Acetaminofeno v Fosfato de Codeína Tabletas Acetaminofeno Asoirina v Cafeína Tabletas Acetaminofeno, Clorhidrato de Difenhidramina y Clorhidrato de Pseudoefedrina Tabletas Acetaminofeno, Maleato de Clorfeniramina y Bromhidrato de Dextrometorfano Tabletas Acetato de Calcio Tabletas Acetato de Cortisona Tabletas Acetato de Flecainida Tabletas Acetato de Fludrocortisona Tabletas Acetato de Guanabenzo Tabletas Acetato de Medroxinrooesterona Tabletas
J
.,~~~-
1
RL
1 1
1 RL 1
RL
1
RL
1
1 RL 1 1
RL RL
1 1
1 1 1
1
1
1
RL 1 RL 1
1
1
1
B B B B 1 RL B
Título de la Monoorafía Acetato de Meaestrol Tabletas Acetato de Noretindrona Tabletas Acetato de Noretindrona v Etinil Estradiol Tabletas Acetazolamida Tabletas Acetohexamida Tabletas Aciclovir Cápsulas Aciclovir Tabletas Ácido Acetohidroxámico Tabletas Ácido Alfa Linoico Cápsulas Ácido Alfa Linoico Tabletas Ácido Aminocanroico Tabletas Ácido Aminosalicílico Tabletas Ácido Ascórbico Tabletas Ácido Dehidrocólico Tabletas Ácido Etacrínico Tabletas Ácido Fálico Tabletas Ácido looanoico Tabletas Ácido Mefenámico Cánsulas
Especificadones del Envase B B B 1
B 1 1
1
B B 1
1 RL 1 RL
B B B 1
RL
1
Agtegor lo si!Jule,.te: •Ácido Mitofenólico, Tabletas.de liberadón. Retardarla Ácido Nalidíxico Tabletas Ácido Valnroico Cánsulas Acitretina Cáosulas Aio Tabletas de Liberación Retardada Albendazol Tabletas Albuterol Tabletas Albuterol Tabletas de Liberación Prolonnada Alendronato Sódico Tabletas AlmotriPtán Tabletas Aloourinol Tabletas Alorazolam Tabletas Alorazolam Tabletas de Desintearación Oral Alorazolam Tabletas de Liberación Prolonoada Altretamina Cápsulas Alúmina v Carbonato de Maanesio Tabletas Alúmina v Maanesia Tabletas Alúmina v Trisilicato de Maanesio Tabletas Alúmina, Carbonato de Magnesio y Óxido de Maanesio Tabletas Alúmina, Magnesia y Carbonato de Calcio, Tabletas Alúmina Maonesia v Simeticona Tabletas Alúmina, Magnesia, Carbonato de Calcio y Simeticona Tabletas Aminobenzoato Potásico Cánsulas Aminobenzoato Potásico Tabletas Aminofilina Tabletas Aminofilina Tabletas de Liberación Retardada Aminonlutetimida Tabletas Aminosalicilato Sódico Tabletas Amlodinino v Clorhidrato de Benazenril Cánsulas
....l°i '""'" 1
1
B RL 1 1 1 1
RL RL
1 1
RL
B 1
RL
1 1 1
RL RL
1
B B 1
B B B B B 1 1
1 RL 1 RL
B
USP 39
2398 Especificaciones del Envase / Tablas de Referencia
Especificaciones del Envase para Cápsulas y Tabletas (Continuación)
Especificaciones del Envase para Cápsulas y Tabletas (Continuación)
Título de la Monoarafía
Especificadones del Envase
Amlodipino v Valsartán Tabletas
1
Amlodipino, Valsartán e Hidroclorotiazida, Tabletas
1
AmoxaPina Tabletas Amoxicilina Cápsulas
1
Título de la Monoarafía Bicarbonato de Potasio y Cloruro de Potasio, Tabletas Efervescentes Para Solución Oral Bicarbonato de Potasio, Bicarbonato de Sodio Ácido Cítrico, Tabletas Efervescentes para Solución Oral Bicarbonato de Sodio Tabletas
B
Amoxicilina Tabletas Amoxicilina y Ácido Clavulánico, Tabletas de Liberación Prolonaada
1
Amoxicilina v Clavulanato Potásico Tabletas Amoicilina Cáosulas Amoicilina Tabletas
1
Anaarelida CáPsulas
1 RL
Anastrozol Tabletas
1
1
Bisacodilo Tabletas
1
1
Bisacodilo Tabletas de Liberación Retardada Bitartrato de Hidrocodona Tabletas
1 RL
i'
RL
1 RL
slgúlénte:
'·
4Arininrazol .Tabletas
. l"-ii~~·"
:;1 ..
.o.Arininrazal. Tabletas de Desintearación Aspirina Cápsulas
Oral
·Ül4<••a 1
Aspirina Cápsulas de Liberación Retardada
1
Asnirina Tabletas
1
Asnirina Tabletas de Liberación Prolonaada Asoirina Tabletas de Liberación Retardada Asoirina Tabletas Efervescentes oara Solución Oral
1 1 1
Asoirina v Fosfato de Codeína Tabletas Asoirina Alúmina v Maanesia Tabletas
1
Asoirina Alúmina v Óxido de Maanesia Tabletas
1
Aspirina, Cafeína, Cápsulas
B RL
y Bitartrato de Dihidrocodeína,
Aspirina, Fosfato de Codeína, Alúmina Tabletas
Bitartrato de Hidrocodona Tabletas
y Acetaminofeno,
Bitartrato de Hidrocodona Homatrooina Tabletas
y Metilbromuro de
B
1
RL
1 RL
Bromhidrato de Escooolamina Tabletas
1 RL
Bromuro de MetescoPolamina Tabletas
1
Bromuro de Neostiamina Tabletas
1
<><º''
"'
...
Agregar lo siguiente:
1 RL
Cambio en· 'lti.ttda~dahí
1.
Agrega~ lo
B
1
1
Arainina Tabletas
1 1 RL
l uitoo~
'"'Aoreoítant' Cáosulas Arainina Cápsulas
1
y
Biotina Cápsulas Biotina Tabletas
L'
Agregar lo siguiente:
Especificadones del Envase
1
y Magnesia, B RL
Asoirina Amortiauada Tabletas
1
Astemizol Tabletas
1
Atenolol Tabletas
B
Atenolol v Clortalidona Tabletas Atomoxetina Cápsulas
B
Azatioprina Tabletas Azitromicina Cápsulas
RL B
Azitromicina Tabletas Baclofeno Tabletas Balsalazida Disódica Cápsulas
B
°' 0 0, 0
'o>
'
>''',
>
'>
Bromuro de Piridostiamina Tabletas
1 4RI
Bromuro de Propantelina Tabletas
B
Bumetanida Tabletas
1 RL
Busulfano Tabletas Butabarbital Sódico Tabletas
B 1
Butalbital v Aspirina Tabletas
1
Butalbital Acetaminofeno v Cafeína Cánsulas Butalbital Acetaminofeno v Cafeína Tabletas
1
Butalbital Aspirina v Cafeína Cápsulas Butalbital Aspirina v Cafeína Tabletas Butalbital, Aspirina, Cafeína Cápsulas
1
1 1
y Fosfato de Codeína, 1 RL
Caberaolina Tabletas Calcifediol Cápsulas
1 RL
Calcio con Vitamina D Tabletas
1 RL
1 RL
A11.t:e,11a.r li(tifJuiente; · -.<.:and$~artá~ blex~tllo ~ .t\idrocl1m:1ti¡¡zida, Tableta$ CaPecitabina Tabletas Cápsulas que Contienen por lo Menos Tres de los Siguientes Fármacos-Acetaminofeno y Sales de Clorfeniramina, Dextrometorfano y Pseudoefedrina
. J.;. R1 • Hrh>ll 1
1 1
1
Caotooril Tabletas CaotoPril e Hidroclorotiazida Tabletas
B
Carbamazeoina Tabletas
1
1
Carbamazeoina Tabletas de Liberación Prolonaada
1
Bendroflumetiazida Tabletas
1
Carbenicilina lndanilo Sódica Tabletas
1
Benzonatato Cáosulas
1 RL
B RL
Benzoato de Rizatrintán Tabletas
B RL
Carbidooa v Levodooa Tabletas Carbidopa y Levodopa, Tabletas de Desintegración Oral
Benzoato de Rizatriptán, Tabletas de Desintearación Oral
1
B RL
Besilato de AmlodiPino Tabletas
B RL 1 RL
Besilato de Mesoridazina Tabletas
B RL
Carbidopa y Levodopa, Tabletas de Liberación Prolonaada Carbonato de Calcio Tabletas
Beta Caroteno Cápsulas
1 RL
Carbonato de Calcio v Maanesia Tabletas
B
Betametasona Tabletas Betaxolol Tabletas
1 1
Carbonato de Calcio y Magnesia, Tabletas Masticables
B
Bicalutamida Tabletas
1
Carbonato de Litio Cápsulas Carbonato de Litio Tabletas
1
Bicarbonato de Potasio, Tabletas Efervescentes oara Solución Oral
1
"""'°
B RL B
B
USP 39
Tablas de Referencia/ Especificaciones del Envase 2399
Especificaciones del Envase para Cápsulas y Tabletas (Continuación)
Título de la Monoarafía Carbonato de Litio, Tabletas de Liberación Prolonaada Carbonato Sódico de Dihidroxialuminio Tabletas Carbonatos de Calcio v Maanesio Tabletas Carboximetilcelulosa Sódica Tabletas Carisoorodol Tabletas Carisoorodol v Asoirina Tabletas Carisoprodol, Aspirina y Fosfato de Codeína, Tabletas Carorofeno Tabletas Carvedilol Tabletas Cáscara Saarada Tabletas Cefaclor Cáosulas Cefaclor Tabletas Masticables Cefaclor Tabletas de Liberación Prolonaada Cefadroxilo Cáosulas Cefadroxilo Tabletas Cefalexina Cáosulas Cefalexina Tabletas Cefdinir Cáosulas Cefixima Tabletas Cefoodoxima Proxetilo Tabletas Ceforozilo Tabletas Cefradina Cánsulas Cefradina Tabletas Cefuroxima Axetilo Tabletas Cianocobalamina Tabletas Cianocobalamina Co 57 Cáosulas Cianocobalamina Co 58 Cáosulas Ciclofosfamida Tabletas Cicloserina Cáosulas Ciclosoorina Cáosulas Cilostazol Tabletas Cimetidina Tabletas Cimicífuaa Racemosa Tabletas Cinoxacino Cáosulas Ciorofloxacino Tabletas Ciorofloxacino Tabletas de Liberación Prolonaada Ciruelo Africano Cáosulas Citalooram Tabletas Citrato de Calcio Tabletas Citrato de Cinc Tabletas Citrato de Clomifeno Tabletas Citrato de Dietilcarbamazina Tabletas Citrato de Difenhidramina e lbuorofeno Tabletas
Citrato de Orfenadrina, Tabletas de Liberación Prolonaada Citrato de Orfenadrina, Aspirina y Cafeína, Tabletas Citrato de Pioerazina Tabletas Citrato de Potasio Tabletas Citrato de Potasio, Tabletas de Liberación Prolonaada Citrato de Tamoxifeno Tabletas Claritromicina Tabletas Claritromicina Tabletas de Liberación Prolonaada Clofazimina Cáosulas
Especificaciones del Envase para Cápsulas y Tabletas (Continuación)
Especificaclones del Envase
Especificaciones del Envase
Título de la Mono rafía Clofibrato Cá sulas
B B B 1 B B
B RL 1 RL
Clonaze am Tabletas de Desinte ración Oral Clorambucilo Tabletas Cloranfenicol Cá sulas
B RL B B RL
RL RL
B 1 1 RL 1 B 1
Clordiazepóxido y Clorhidrato de Amitriptilina, Tabletas Clorhidrato de Acebutolol Cá sulas Clorhidrato de Alfuzosina, Tabletas de Liberación Prolon ada Clorhidrato de Amantadina Cá sulas Clorhidrato de Amilorida Tabletas Clorhidrato de Amilorida e Hidroclorotiazida, Tabletas
RL
RL
RL
RL 1 B B B 1 RL RL
Clorhidrato de Benaze ril Tabletas Clorhidrato de Bi erideno Tabletas Clorhidrato de Bupropión, Tabletas de Liberación Prolon ada
B 1 RL B RL B RL 1 1 1 1 RL 1 RL 1 RL B B 1 1 B B B B 1 1
IBs 1 1 B 1 B RL 1 B B
Clorhidrato de Carteolol Tabletas Clorhidrato de Cetirizina Tabletas Clorhidrato de Cetirizina y Clorhidrato de Pseudoefedrina Tabletas de Liberación Prolon ada
B
B 1 RL 1 B B
B B
Tabletas
B B B RL
RL
Clorhidrato de Clordiazepóxido y Bromuro de Clidinio Cá sulas Clorhidrato de Clor romazina Tabletas Clorhidrato de Clortetraciclina Tabletas Clorhidrato de Cocaína, Tabletas para Solución Tó ica Clorhidrato de Colesti ol Tabletas
Clorhidrato de Diciclomina Tabletas Clorhidrato de Dietil ro ión Tabletas Clorhidrato de Difenhidramina Cá sulas
1 RL B RL 1 RL
B RL 1 RL RL B B B 1
2400 Especificaciones del Envase / Tablas de Referencia
Especificaciones del Envase para Cápsulas y Tabletas (Continuación)
Título de la Monoorafía
Especificadones del Envase
Agregar lo siguiente: •Clorhidrato de Difenhidramina y Clorhidrato de Fenilefrina Tabletas Clorhidrato de Difenoxilato y Sulfato de Atropina, Tabletas Clorhidrato de Diltiazem, Cápsulas de Liberación Prolonaada Clorhidrato de Diltiazem Tabletas Clorhidrato de Doneoezilo Tabletas Clorhidrato de Donepezilo, Tabletas de Desinteoración Oral Clorhidrato de Doxeoina Cáosulas Clorhidrato de Etambutol Tabletas Clorhidrato de Fenazooiridina Tabletas
I • "'"'º
B RL 1 1 RL
B B B B 1
Agregar lo siguiente: •Clorhidrato de fenílefrina Tabletas Clorhidrato de Fenmetrazina Tabletas Clorhidrato de Fenoxibenzamina Cáosulas Clorhidrato de Fentermina Cáosulas Clorhidrato de Fentermina Tabletas Clorhidrato de Fexofenadina Cáosulas Clorhidrato de Fexofenadina Tabletas Clorhidrato de Fexofenadina y Clorhidrato de Pseudoefedrina, Tabletas de Liberación Prolonaada Clorhidrato de Flavoxato Tabletas Clorhidrato de Flufenazina Tabletas Clorhidrato de Flurazeoam Cáosulas Clorhidrato de Granisetrón Tabletas Clorhidrato de Hidralazina Tabletas Clorhidrato de Hidromorfona Tabletas Clorhidrato de Hidroxizina Tabletas Clorhidrato de lmioramina Tabletas Clorhidrato de lsooroterenol Tabletas Clorhidrato de lsoxsuorina Tabletas Clorhidrato de Labetalol Tabletas Clorhidrato de Levamisol Tabletas Clorhidrato de Lincomicina Cáosulas Clorhidrato de Lisina Tabletas Clorhidrato de Looeramida Cáosulas Clorhidrato de Maorotilina Tabletas Clorhidrato de Mecamilamina Tabletas Clorhidrato de Meclizina Tabletas Clorhidrato de Mefloauina Tabletas Clorhidrato de Memantina Tabletas Clorhidrato de Meoeridina Tabletas Clorhidrato de Metaciclina Cápsulas Clorhidrato de Metadona Tabletas Clorhidrato de Metanfetamina Tabletas Clorhidrato de Metdilazina Tabletas Clorhidrato de Metformina Tabletas Clorhidrato de Metformina, Tabletas de Liberación Prolonaada Clorhidrato de Metilfenidato Tabletas Clorhidrato de Metilfenidato, Tabletas de Liberación Prolonaada Clorhidrato de Mexiletina Cáosulas Clorhidrato de Midodrina Tabletas
1 '""'º 1
B 1 1 1 RL
B
B B RL 1 RL 1 RL B RL 1 RL 1 RL 1 1 B RL 1 1 RL B 1 B B B B B 1 RL 1 B RL 1 RL B 1 RL 1 RL 1 B RL 1 1 1 B
USP 39 Especificaciones del Envase para Cápsulas y Tabletas (Continuación) Especificaclones del Envase
Título de la Monoorafía Clorhidrato de Minociclina Cáosulas Clorhidrato de Minociclina Tabletas Clorhidrato de Minociclina, Tabletas de Liberación Prolonaada Clorhidrato de Moexioril Tabletas Clorhidrato de Moexipril e Hidroclorotiazida, Tabletas Clorhidrato de Molindona Tabletas Clorhidrato de Moricizina Tabletas Clorhidrato de Naltrexona Tabletas Clorhidrato de Nefazodona Tabletas Clorhidrato de Nortriotilina Cáosulas Clorhidrato de Oxicodona Tabletas Clorhidrato de Oxicodona, Tabletas de Liberación Prolonaada Clorhidrato de Oxitetraciclina Cáosulas Clorhidrato de Oxitetraciclina y Sulfato de Polimixina B Tabletas Vaainales Clorhidrato de Oxorenolol Tabletas Clorhidrato de Oxprenolol, Tabletas de Liberación Prolonaada Clorhidrato de Paoaverina Tabletas Clorhidrato de Pilocaroina Tabletas Clorhidrato de Piridoxina Tabletas Clorhidrato de Prazosina Cáosulas Clorhidrato de Procainamida Cáosulas Clorhidrato de Procainamida Tabletas Clorhidrato de Procarbazina Cáosulas Clorhidrato de Prociclidina Tabletas Clorhidrato de Promazina Tabletas Clorhidrato de Prometazina Tabletas Clorhidrato de Propafenona, Cápsulas de Liberación Prolonaada Clorhidrato de Prooafenona Tabletas
Eliminar~
1 RL 1 RL 1 1 B B 1 RL 1 1 1 1 1 RL 1 RL 1 RL
B B RL B RL 1 1 B B RL 1 1 1 RL 1 1 RL 1 RL 1 1
siguiente:
.·:. :
...
Eliminar lo siguiente:.· •Clorhidrato de Propoxifeno Tabletas
·'
l~ 1i~n>n
•dorhidratQ de l'.'roo()xlfeno Cátisulas
·:
··
yAcetamlnofeno,
f;.• :.'~.>~
..
Ellmln.ar .lo .sigul!lnte:. •Clorhidrato de Propoxifenp, Aspirina y Gaí'eína, Cánsulas Clorhidrato de Propranolol, Cápsulas de Liberación Prolonaada Clorhidrato de Prooranolol Tabletas Clorhidrato de Propranolol e Hidroclorotiazida, Cáosulas de Liberación Prolonaada Clorhidrato de Propranolol e Hidroclorotiazida, Tabletas Clorhidrato de Protriotilina Tabletas Clorhidrato de Pseudoefedrina Tabletas Clorhidrato de Pseudoefedrina, Tabletas de Liberación Prolonaada Clorhidrato de Raloxifeno Tabletas Clorhidrato de Rimantadina Tabletas Clorhidrato de Ritodrina Tabletas Clorhidrato de Seleailina Cáosulas Clorhidrato de Seleailina Tabletas
···.
··.
•·· ·.
\~¡,,~•..,
B B RL B B 1 1 1 1 1 RL 1 1 RL 1 RL
Tablas de Referencia / Especificaciones del Envase 2401
USP 39 Especificaciones del Envase para Cápsulas y Tabletas (Continuación)
Título de la Monoarafía
Especificadones del Envase
Clorhidrato de Sotalol Tabletas
B RL
Clorhidrato de Tamsulosina Cáosulas
Especificaciones del Envase para Cápsulas y Tabletas (Continuación)
Título de la Monoarafía
Especificadones del Envase
1
Condroitina Sulfato de Sodio Tabletas Cromolín Sódico oara Inhalación (en Cáosulas)
1 RL 1 RL
Clorhidrato de Tetraciclina Cáosulas
1 RL
Curcuminoides Cáosulas
Clorhidrato de Tetraciclina Tabletas Clorhidrato de Tetraciclina v Nistatina Cáosulas Clorhidrato de Tetraciclina y Novobiocina Sódica, Tabletas
1 RL
Curcuminoides Tabletas Danazol Cáosulas
B RL B RL
Clorhidrato de Tetraciclina, Novobiocina Sódica Prednisolona Tabletas
1 RL 1
y
B
Dantroleno Sódico Cáosulas
1
Daosona Tabletas
B RL
Desoaestrel v Etinil Estradiol Tabletas
B
1
Dexametasona Tabletas
B
Clorhidrato de Tiamina Tabletas
1 RL
Clorhidrato de Ticlooidina Tabletas
B 1 RL
Diacetato de Etinodiol v Etinil Estradiol Tabletas Diacetato de Etinodiol v Mestranol Tabletas
B B
Clorhidrato de Tioridazina Tabletas
Diazeoam Cáosulas
1
RL
Diazeoam Cáosulas de Liberación Prolonaada Diazeoam Tabletas Diazóxido Cáosulas
1
RL
1
RL
Diclofenaco Potásico Tabletas Diclofenaco Sódico, Tabletas de Liberación Prolonaada
1
B
Diclofenaco Sódico, Tabletas de Liberación Retardada
1
1
Diclofenaco Sódico y Misoprostol, Tabletas de Liberación Retardada Diclorfenamida Tabletas
B
Clorhidrato de Trihexifenidilo Tabletas
1
Diclorhidrato de Levocetirizina Tabletas
B
Clorhidrato de Trimetobenzamida Cáosulas
B B
Dicloxacilina Sódica Cáosulas
1
Didanosina Cáosulas de Liberación Retardada
B
Clorhidrato de Triorolidina Tabletas Clorhidrato de Triprolidina y Clorhidrato de Pseudoefedrina Tabletas
1 RL
Didanosina Tabletas oara Susoensión Oral Didroaesterona Tabletas
1
1 RL
Dietilestilbestrol Tabletas Difenhidramina v Pseudoefedrina Cáosulas Difilina Tabletas
1
Difilina v Guaifenesina Tabletas
1
Diflunisal Tabletas
B
Clorhidrato de Tocainida Tabletas Clorhidrato de Tolazolina Tabletas
B B
Clorhidrato de Tramado! Tabletas
1
Clorhidrato de Tramado!, Tabletas de Liberación Prolonnada
1
Clorhidrato de Trazodona Tabletas
1 RL
Clorhidrato de Trientina Cáosulas
1
Clorhidrato de Trifluooerazina Tabletas Clorhidrato de Trifluoromazina Tabletas
B RL B RL
Clorhidrato de Trihexifenidilo, Cápsulas de Liberación Prolonaada
Clorhidrato de Trioelenamina Tabletas
Clorhidrato de Vancomicina Cáosulas
1
Clorhidrato de Verapamilo, Cápsulas de Liberación Prolonaada
1 RL
Clorhidrato de Veraoamilo Tabletas
1 RL
Clorhidrato de Verapamilo, Tabletas de Liberación Prolonnada
1 RL
Clorotiazida Tabletas
B
Clororooamida Tabletas
B
Clortalidona Tabletas
B
Cloruro de Amonio, Tabletas de Liberación Retardada
B RL
RL
1
B B 1
Difosfato Sódico de Menadiol Tabletas
B RL
Diaital Cáosulas Diaital Tabletas
1
1
Diaitoxina Tabletas
B
Diaoxina Tabletas
1
1
Dihidrotaauisterol Cáosulas
Cloruro de Betanecol Tabletas
1
B RL B RL
Cloruro de Oxibutinina Tabletas
1 RL
Dihidrotaauisterol Tabletas Dimenhidrinato Tabletas
1
Dinitrato de lsosorbida, Cápsulas de Liberación Prolonaada
Cloruro de Oxibutinina, Tabletas de Liberación Prolonaada
B B
Cloruro de Potasio, Cápsulas de Liberación Prolonaada
1
Cloruro de Potasio, Tabletas de Liberación Prolonaada
Dinitrato de lsosorbida Tabletas Dinitrato de lsosorbida, Tabletas de Liberación Prolonaada
1
Dinitrato de lsosorbida Tabletas Masticables
B
Dinitrato de lsosorbida Tabletas Sublinauales
B
Dioiridamol Tabletas Diritromicina Tabletas de Liberación Retardada
1
1
Cloruro de Sodio Tabletas
B
Disulfiram Tabletas
1
RL
Cloruro de Sodio Tabletas oara Solución Cloruro de Sodio v Dextrosa Tabletas Cloruro de Trosoium Tabletas
B B
Divalproex Sódico, Cápsulas de Liberación Retardada
1
RL
1 RL
Clorzoxazona Tabletas
1
Divalproex Sódico, Tabletas de Liberación Retardada
1
RL
Clorzoxazona v Acetaminofeno Cáosulas
1
Cloruro de Potasio, Bicarbonato de Potasio Citrato de Potasio, Tabletas Efervescentes oara Solución Oral
y
Clotrimazol Tabletas Vaainales
B
Cloxacilina Sódica Cáosulas
1 B
Clozaoina Tabletas Colecalciferol Cáosulas
1 RL
Divalproex Sódico, Tabletas de Liberación Prolonaada Docusato Cálcico Cáosulas
B B
RL
1
B 1
Docusato Potásico Cáosulas
1
Docusato Sódico Cáosulas
1
2402 Especificaciones del Envase / Tablas de Referencia Especificaciones del Envase para Cápsulas y Tabletas (Continuación)
Especificaciones del Envase para Cápsulas y Tabletas (Continuación)
Título de la Monoarafía Docusato Sódico Tabletas Doxazosina Tabletas Doxiciclina Cáosulas Doxiciclina Cáosulas de Liberación Prolonqada Doxiciclina Tabletas Dronabinol Cáosulas Drosoirenona v Etinil Estradiol Tabletas Duloxetina Cáosulas de Liberación Retardada Efavirenz Cáosulas Efavirenz Tabletas Entacaoona Tabletas
Especificaclones del Envase B 1
RL RL 1 RL B RL B 1
1
1
B B RL
Agregar lo siguiente: Entecavír Tabletas Emocalciferol Cáosulas Emocalciferol Tabletas Eritromicina Cáosulas de Liberación Retardada Eritromicina Tabletas Eritromicina Tabletas de Liberación Retardada Escitalopram Tabletas Esomeprazol Magnésico, Cápsulas de Liberación Retardada EsPironolactona Tabletas EsPironolactona e Hidroclorotiazida Tabletas Estanozolol Tabletas EsPirulina Tabletas Estavudina Cápsulas Estazolam Tabletas Ésteres Etílicos de Ácidos Omeqa-3 Cápsulas Estearato de Eritromicina Tabletas Estolato de Eritromicina Cápsulas Estolato de Eritromicina Tabletas Estradiol Tabletas Estradiol v Acetato de Noretindrona Tabletas Estróqenos Coniunados Tabletas Estrónenos Esterificados Tabletas Estrooioato Tabletas 4
J~"tMO
1
RL
1 RL 1 1 1
B 1
RL 1 RL 1 RL B RL 1
1 1 1
RL RL
1 1 1
1 RL
B B B B .
Agregar lo sigu(ente: .. •Eszooldoria ·Tabletas Etclorvinol Cáosulas Etidronato Disódico Tabletas Etilsuccinato de Eritromicina Tabletas Etinil Estradiol Tabletas Etionamida Tabletas Etodolaco Cápsulas Etodolaco Tabletas Etodolaco Tabletas de Liberación Prolonqada Etosuximida Cápsulas Etotoína Tabletas Extracto de Belladona Tabletas Famotidina Tabletas Felbamato Tabletas FelodiPino Tabletas de Liberación Prolonqada Fenilbutazona Tabletas Fenitoína Sódica de Acción Inmediata Cápsulas Fenitoína Sódica de Acción Prolonqada Cápsulas Fenitoína Tabletas Masticables Fenobarbital Tabletas
I• "'"'~ 1
RL
1 1
B B 1
1
B 1 1
RL B RL B
1
1
1 1 1
B B
USP 39
Título de la Monoarafía Fenofibrato Cápsulas Fenofibrato Tabletas Fenoprofeno Cálcico Cáosulas Fenoorofeno Cálcico Tabletas Fensuximida Cáosulas Finasterida Tabletas Fitonadiona Tabletas Flucitosina Cáosulas Fluconazol Tabletas Fluoruro de Sodio Tabletas Fluoxetina Cáosulas Fluoxetina Cápsulas de Liberación Retardada Fluoxetina Tabletas Fluoximesterona Tabletas FlurbiProfeno Tabletas Flutamida Cápsulas Fluvastatina Cápsulas Fosfato de Cloroquina Tabletas Fosfato de Codeína Tabletas Fosfato de Disopiramida Cápsulas Fosfato de Disopiramida, Cápsulas de Liberación Prolonaada Fosfato de Oseltamivir Cáosulas Fosfato de Primaquina Tabletas Fosfato Dibásico de Calcio Tabletas FosinoPril Sódico Tabletas Fosinopril Sódico e Hidroclorotiazida Tabletas Fumarato de Bisoprolol Tabletas Fumarato de Bisoprolol e Hidroclorotiazida, Tabletas Fumarato de Clemastina Tabletas Fumarato Ferroso Tabletas Fumarato Ferroso y Docusato Sódico, Tabletas de Liberación Prolonnada Furazolidona Tabletas Furosemida Tabletas Gabaoentina Cáosulas Gabaoentina Tabletas Galantamina Cáosulas de Liberación Prolonaada Galantamina Tabletas Gel de Carbonato Básico de Aluminio Desecado, Cápsulas Gel de Carbonato Básico de Aluminio Desecado, Tabletas Gel de Hidróxido de Aluminio Desecado Cápsulas Gel de Hidróxido de Aluminio Desecado Tabletas Gemfibrozilo Cápsulas Gemfibrozilo Tabletas Ginkqo Cápsulas Ginkqo Tabletas Ginsenq Americano Cápsulas Ginsenq Americano Tabletas Ginsenn Asiático Cáosulas Ginsena Asiático Tabletas Gliburida Tabletas Gliburida y Clorhidrato de Metformina, Tabletas Glicinato de Teofilina Sódica Tabletas Glicopirrolato Tabletas Glimepirida Tabletas
Especificadones del Envase B B B B 1
RL B RL 1 RL B 1
1 1
RL
1 1
B B B RL 1 RL B B RL B B B B RL B 1 1 1
RL
B B 1
B RL B RL B B 1 RL B 1
B B B B 1 1
1 RL
RL RL 1 RL 1 RL 1 RL B 1 1
1
B 1
B
RL
USP 39
Tablas de Referencia / Especificaciones del Envase 2403 Especificaciones del Envase para Cápsulas y Tabletas (Continuación)
Título de la Monoarafía GliPizida Tabletas GliPizida v Clorhidrato de Metformina Tabletas Gluconato de Calcio Tabletas Gluconato de Cinc Tabletas Gluconato de Maanesio Tabletas Gluconato de Potasio Tabletas Gluconato de Quinidina, Tabletas de Liberación Prolonaada Gluconato Ferroso CáPsulas Gluconato Ferroso Tabletas Glucosamina Tabletas Glucosamina v Metilsulfonilmetano Tabletas Glucosamina v Sulfato de Condroitina Tabletas Glucosamina, Condroitina Sulfato de Sodio v Metilsulfonilmetano Tabletas Griseofulvina Cáosulas Griseofulvina Tabletas Griseofulvina Ultramicronizada Tabletas Guaifenesina Cápsulas Guaifenesina Tabletas Guaifenesina y Clorhidrato de Pseudoefedrina, Cáosulas Guaifenesina, Clorhidrato de Pseudoefedrina y Bromhidrato de Dextrometorfano Cápsulas Guanfacina Tabletas Guaaul Tabletas Halazona Tabletas para Solución Haloperidol Tabletas Hexilresorcinol Tabletas de Disolución Bucal Hiclato de Doxiciclina Cánsulas Hiclato de Doxiciclina, Cápsulas de Liberación Retardada Hiclato de Doxiciclina Tabletas Hiclato de Doxiciclina, Tabletas de Liberación Retardada Hidrato de Cloral Cápsulas Hidroclorotiazida Cápsulas Hidroclorotiazida Tabletas Hidrocortisona Tabletas Hidroflumetiazida Tabletas Hidroxiurea Cápsulas Hiosciamina Tabletas Hipurato de Metenamina Tabletas lbuprofeno Tabletas lbuprofeno y Clorhidrato de Pseudoefedrina, Tabletas lndaPamida Tabletas lndometacina Cápsulas lndometacina Cáosulas de Liberación Prolonaada lodoauinol Tabletas lpodato Sódico Cápsulas lrbesartán Tabletas lrbesartán e Hidroclorotiazida Tabletas lsoflavonas de Soia Cápsulas lsoflavonas de Soia Tabletas lsoniazida Tabletas lsotretinoína Cánsulas lsradiPino CáPsulas lvermectina Tabletas lvermectina v Pamoato de Pirantel Tabletas
Especificadones del Envase 1
B B RL
1
B 1
B RL 1 1 1 1 1
1
RL RL RL RL
1 1
B 1 1
1
RL
RL RL B RL 1 RL 1 RL B 1 RL 1 1
1 1
1
RL RL RL
1
B B B 1 1
B RL B B 1
B B B B 1
B B RL 1 RL B RL 1
1 1
B 1
RL
Especificaciones del Envase para Cápsulas y Tabletas (Continuación)
Título de la Monoarafía
Especificadones del Envase
lenaibre Cápsulas Ketoconazol Tabletas Ketoprofeno Cápsulas
B B
Ketoprofeno Cápsulas de Liberación Prolonaada Ketorolaco Trometamina Tabletas Lactato de Calcio Tabletas Lamivudina Tabletas Lamivudina v Zidovudina Tabletas Lamotriaina Tabletas Lamotriaina Tabletas de Liberación Prolonaada Lamotrinina Tabletas para Suspensión Oral Lansonrazol Cáosulas de Liberación Retardada Leflunomida Tabletas Letrozol Tabletas Leucovorina Cálcica Tabletas Levetiracetam Tabletas Levetiracetam Tabletas de Liberación Prolonaada Levocarnitina Tabletas LevodoPa Cápsulas
1
1
B 1 1 RL B RL B B 1 RL 1 1
RL
1
B RL 1
B 1 1
Levodooa Tabletas Levofloxacino Tabletas Levonoraestrel v Etinil Estradiol Tabletas Levotiroxina Sódica Tabletas Liotironina Sódica Tabletas Liotrix Tabletas Lisinopril Tabletas
1
Lisinooril e Hidroclorotiazida Tabletas Lomustina Cápsulas Loracarbef Cápsulas Loratadina Tabletas Loratadina Tabletas de Desintearación Oral Loratadina Tabletas Masticables Lorazenam Tabletas Losartán Potásico Tabletas Losartán Potásico e Hidroclorotiazida Tabletas Lovastatina Tabletas LoxaPina CáPsulas Luteína CáPsulas Maaaldrato Tabletas Maaaldrato v Simeticona Tabletas Maanesia Tabletas Maanesia v Alúmina Tabletas Maleato de Acepromazina Tabletas Maleato de Azatadina Tabletas Maleato de Bromfeniramina Tabletas Maleato de Carbinoxamina Tabletas Maleato de Clorfeniramina, Cápsulas de Liberación Prolonaada Maleato de Clorfeniramina Tabletas Maleato de Clorfeniramina y Clorhidrato de Pseudoefedrina, Cápsulas de Liberación Prolonaada Maleato de Dexclorfeniramina Tabletas Maleato de Enalapril Tabletas Maleato de Enalapril e Hidroclorotiazida Tabletas Maleato de Eraonovina Tabletas Maleato de Fluvoxamina Tabletas Maleato de Metileraonovina Tabletas Maleato de Metiseraida Tabletas Maleato de Pirilamina Tabletas
B B B
RL RL
1
B 1
RL
1 1 1
1 1 1 1 1 1
RL RL RL
B 1 1
RL
B B B B 1
RL
B 1 1
RL
1 1
1
RL
1
B B B 1 1 1
B
RL
2404 Especificaciones del Envase / Tablas de Referencia
Especificaciones del Envase para Cápsulas y Tabletas (Continuación)
Título de la Monoarafía Maleato de Procloroerazina Tabletas Maleato de Tietiloerazina Tabletas Maleato de Timolol Tabletas Maleato de Timolol e Hidroclorotiazida Tabletas Mandelato de Metenamina Tabletas Mandelato de Metenamina, Tabletas de Liberación Retardada Mazindol Tabletas Mebendazol Tabletas Meclofenamato Sódico Cáosulas Mefenitoína Tabletas Mefobarbital Tabletas Melatonina Tabletas Melfalán Tabletas Meloxicam Tabletas Menaauinona-7 Cáosulas Menaauinona-7 Tabletas Meorobamato Tabletas Mercantonurina Tabletas Mesalamina Cápsulas de Liberación Prolonnada Mesalamina Tabletas de Liberación Retardada Mesilato de Benzatropina Tabletas Mesilato de Bromocrintina Cánsulas Mesilato de Bromocrintina Tabletas Mesilato de Dolasetrón Tabletas Mesilatos de Eraoloides Cánsulas Mesilatos de Eraoloides Tabletas Mesilatos de Eraoloides Tabletas Sublinnuales Metaxalona Tabletas Metazolamida Tabletas Metenamina Tabletas Meticlotiazida Tabletas Metilbromuro de Homatrooina Tabletas Metilcelulosa Tabletas Metildopa Tabletas Metildopa v Clorotiazida Tabletas Metildopa e Hidroclorotiazida Tabletas Metilprednisolona Tabletas Metilsulfonilmetano Tabletas Metiltestosterona Cápsulas Metiltestosterona Tabletas L-5-Metiltetrahidrofolato de Calcio Cápsulas L-5-Metiltetrahidrofolato de Calcio Tabletas Metimazol Tabletas Metiraoona Tabletas Metirosina Cáosulas Metocarbamol Tabletas Metoclooramida Tabletas Metolazona Tabletas Metotrexato Tabletas Metoxisaleno Cáosulas Metronidazol Cáosulas Metronidazol Tabletas Metsuximida Cápsulas Micofenolato de Mofetilo Cáosulas Micofenolato de Mofetilo Tabletas Minerales Cápsulas Minerales Tabletas Minoxidil Tabletas
Especificadones del Envase B 1 RL B B RL B B 1 B 1 RL B B 1 RL B RL B 1 RL 1 RL B B 1 RL 1 B 1 RL 1 RL B 1 RL 1 RL 1 RL B RL B B B 1 RL B B B B 1 1 RL B B 1 RL 1 RL B RL 1 RL B 1 1 RL 1 RL B 1 RL B RL B RL 1 B RL B RL 1 RL 1 RL 1
USP 39 Especificaciones del Envase para Cápsulas y Tabletas (Continuación) Especificaclones del Envase 1 RL RL 1 RL 1 1
Título de la Mononrafía Mirtazanina Tabletas Mirtazanina Tabletas de Desintenración Oral Mitotano Tabletas Modafinilo Tabletas Mononitrato de lsosorbida Tabletas Mononitrato de lsosorbida, Tabletas de Liberación Prolonnada Monosulfato de Guanetidina Tabletas
1
B
·...
,·:.
A9re11ar10 siflulente:
,.;,,,d,,;
•Montelu.kast Sódico Tabletas
Agregar lo s;gule1tt•t ·.
:
.
·::
B 1 1 1 1 RL B B B
:
Ellmlnar1o siguiente: ·
.....
:l... ;.~:,;,
•Nansi!ato de Pronoxifeno Tabletas
·; .........:
·....·.. ..
·· .. :
.·
•NapsiÍaté) de Propoxifeoo y ACetat:niQé)ferío, tabletas
Eliminar .to sl911lentei . •Nansilató .ti'° Prnn.axifeno " Asnirlna Táhle.tas Naratrintán Tabletas Natenlinida Tabletas Neviranina Tabletas Niacina Tabletas Niacina Tabletas de Liberación Prolonnada Niacinamida Tabletas Nifedinino Cánsulas Nifedinino Tabletas de Liberación Prolonnada Nistatina Tabletas Nistatina Tabletas Vaninales Nitrofurantoína Cánsulas Nitrofurantoína Tabletas Nitroalicerina Tabletas Nitroalicerina Tabletas Sublinnuales Noretindrona Tabletas Noretindrona v Etinil Estradiol Tabletas Noretindrona v Mestranol Tabletas Norfloxacino Tabletas Noraestimato v Etinil Estradiol Tabletas Noraestrel Tabletas Nornestrel v Etinil Estradiol Tabletas Ofloxacino Tabletas Olanzanina Tabletas Olanzanina Tabletas de Desintenración Oral Olanzanina v Fluoxetina Cánsulas Oleovitaminas A v D Cánsulas Omenrazol Cánsulas de Liberación Retardada
:/:.::
., .,.,,.,,,
•Montelukast Sódico Tabletas Mi:isticables Nabumetona Tabletas Nadolol Tabletas Nadolol v Bendroflumetiazida Tabletas Nafcilina Sódica Cáosulas Nafcilina Sódica Tabletas Naoroxeno Tabletas Naoroxeno Tabletas de Liberación Retardada Nanroxeno Sódico Tabletas
tl~inql lo siguiente:
........
•l~i~~D··~
>
l...
·.
¡,:;~;~~;,
1 1 B B 1 1 1 RL 1 RL 1 RL B RL 1 1 RL 1 1 B B B B B B B B 1 RL B 1 1 RL 1 RL
Tablas de Referencia / Especificaciones del Envase 2405
USP 39 Especificaciones del Envase para Cápsulas y Tabletas (Continuación)
Especificaciones del Envase para Cápsulas y Tabletas (Continuación)
Título de la Monoarafía
Especificadones del Envase
Título de la Monoarafía
Especificadones del Envase
Ondansetrón Tabletas
1 RL
Prednisona Tabletas
B
Ondansetrón Tabletas de Desintearación Oral
RL
Orbifloxacino Tabletas Orlistat Cápsulas
1
Primidona Tabletas Probenecid v Colchicina Tabletas Probucol Tabletas
B B RL
Oxacilina Sódica Cápsulas
1
B
Oxandrolona Tabletas Oxaprozina Tabletas
1 RL
Propiltiouracilo Tabletas Quazepam Tabletas
B
Oxazepam Cánsulas
B
Quetiapina Tabletas Quinapril Tabletas
Oxazenam Tabletas
B
Oxcarbazeoina Tabletas
B
Ouinanril e Hidroclorotiazida Tabletas Raminril Cáosulas
B RL B
Oxicodona v Acetaminofeno Cáosulas
1 RL 1 RL
Ranitidina Tabletas
1 RL
Rauwolfia Sementina Tabletas
1 RL
Reseroina Tabletas Reseroina v Clorotiazida Tabletas Resernina e Hidroclorotiazida Tabletas
1 RL
Oxicodona v Acetaminofeno Tabletas Oxicodona v Asoirina Tabletas
1
1 RL
1 RL
Óxido de Maanesio Cáosulas
B
Óxido de Maanesio Tabletas
B
Oximetolona Tabletas
B 1 RL
B RL B B
1 RL 1 RL
Oxitetraciclina v Nistatina Cáosulas Oxtrifilina Tabletas
1 RL
Reserpina, Clorhidrato de Hidralazina e Hidroclorotiazida Tabletas Ribavirina Cánsulas
1
Ribavirina Tabletas
1
Oxtrifilina Tabletas de Liberación Prolonaada
1
Oxtrifilina Tabletas de Liberación Retardada
1
Riboflavina Tabletas Rifabutina Cáosulas
B
Oxitetraciclina Tabletas
1 RL
B 1 RL
Pamoato de Hidroxizina Cápsulas
B
Rifamoín Cáosulas
1 RL
Pamoato de Pirvinio Tabletas
1 RL
1 RL
Pancreatina Tabletas Pancreolipasa Cápsulas
1
Rifamoín e lsoniazida Cáosulas Rifamoín lsoniazida v Pirazinamida Tabletas Rifampín, lsoniazida, Pirazinamida y Clorhidrato de Etambutol Tabletas
B RL
1
1 RL 1 RL
Pancreolipasa Cápsulas de Liberación Retardada
1
Pancreolipasa Tabletas
1
Pantoprazol Sódico, Tabletas de Liberación Retardada Pantotenato de Calcio Tabletas
Riluzol Tabletas Risedronato Sódico Tabletas
B
Risneridona Tabletas
1 RL
1
Risneridona Tabletas de Desintenración Oral
B RL
Ritonavir Cáosulas
1 RL 1
B
Papaína Tabletas Para Solución Tópica
1
Paroxetina Tabletas
1
Paroxetina Tabletas de Liberación Prolonaada Penicilamina Cápsulas
B
Ritonavir Tabletas Rooinirol Tabletas
1
Rufinamida Tabletas
1
Penicilamina Tabletas
1
Penicilina G Benzatínica Tabletas Penicilina G Potásica Tabletas
1
Sacarina Sódica Tabletas Salicilato de Maanesio Tabletas
1
1
Salicilato de Sodio Tabletas
B
Penicilina V Tabletas
1
Salsa lato Cáosulas
1
Penicilina V Potásica Tabletas Pentazocina v Acetaminofeno Tabletas Pentazocina v Asnirina Tabletas
1
Salsa lato Tabletas Saauinavir Cápsulas
1
1 RL 1 RL
Secobarbital Sódico Cápsulas
Pentazocina v Naloxona Tabletas
1
Pentoxifilina, Tabletas de Liberación Prolonaada Perclorato de Potasio Cápsulas
B 1 RL
Perfenazina Tabletas
1 RL
RL
RL
Secobarbital Sódico Cáosulas
B B
1 1
y Amobarbital Sódico, B
Senósidos Tabletas Serenoa Cáosulas
1 RL
Sertralina Tabletas
B
Simeticona Cáosulas
B
B
Perfenazina y Clorhidrato de Amitriptilina, Tabletas Picolinato de Cromo Tabletas
B
Simeticona Tabletas
B
B
Simvastatina Tabletas
1
Pimozida Tabletas
1 RL
Pindolol Tabletas
B RL
Agtégp;rl~ ~lg~l~'1tf!:
Pioalitazona Tabletas Pioalitazona v Glimepirida Tabletas Pioalitazona v Clorhidrato de Metformina Tabletas Pirazinamida Tabletas
1
•Sltaalfütina .Tabletas
1
Subsalicilato de Bismuto Tabletas
1
1
Succinato de Doxilamina Tabletas
B RL
Pirimetamina Tabletas Piroxicam Cápsulas
1
Succinato de Metoprolol, Tabletas de Liberación Prolonaada
1
B RL
(
...
..B"'~'"'"
1 RL
Sulfadiazina Tabletas
B RL
Pravastatina Sódica Tabletas Prazicuantel Tabletas
1
1 RL
Prednisolona Tabletas
B
Sulfadimetoxina Tabletas Sulfadoxina v Pirimetamina Tabletas Sulfametizol Tabletas
1
B RL B
2406 Especificaciones del Envase / Tablas de Referencia
Especificaciones del Envase para Cápsulas y Tabletas (Continuación)
Título de la Monoorafía
Especificaclones del Envase
USP 39 Especificaciones del Envase para Cápsulas y Tabletas (Continuación) Especificaclones del Envase
Título de la Monoorafía
Sulfametoxazol Tabletas Sulfametoxazol v Trimetoorima Tabletas Sulfaoiridina Tabletas
B RL
Temazenam Cánsulas
B RL
B RL
Teofilina Cánsulas
B
B RL
Teofilina Cáosulas de Liberación Prolonaada
Sulfasalazina Tabletas
B
B B
Sulfasalazina Tabletas de Liberación Retardada
B
Teofilina Tabletas Teofilina v Guaifenesina Cáosulas
Sulfato de Aminooentamida Tabletas Sulfato de Anfetamina Tabletas Sulfato de Atrooina Tabletas
B B
Teofilina, Clorhidrato de Efedrina Tabletas
B
Terazosina Cánsulas
Sulfato de Bario Tabletas
B
Terazosina Tabletas
Sulfato de Cinc Tabletas
B
Sulfato de Codeína Tabletas
B 1
Terbinafina Tabletas Testolactona Tabletas
Sulfato de Dextroanfetamina Cáosulas Sulfato de Dextroanfetamina Tabletas Sulfato de Efedrina Cáosulas Sulfato de Fenelzina Tabletas Sulfato de Hidroxicloroquina Tabletas Sulfato de Hiosciamina Tabletas Sulfato de Kanamicina Cánsulas Sulfato de Metanroterenol Tabletas Sulfato de Morfina, Cápsulas de Liberación Prolonqada Sulfato de Neomicina Tabletas Sulfato de Paromomicina Cáosulas
B 1 RL 1 1 RL 1 RL 1 B RL
1
y
Fenobarbital,
Tiabendazol Tabletas
1
Tioauanina Tabletas Tiotixeno Cáosulas
1
Tiroides Tabletas Tizanidina Tabletas Tolazamida Tabletas
B RL 1 1 1
Tolbutamida Tabletas
B
Tolcaoona Tabletas
1 1 B
Tolmetina Sódica Cáosulas 1 RL 1
1 B RL B RL B RL 1
Tolmetina Sódica Tabletas Tooiramato Cáosulas Tooiramato Tabletas
1
Sulfato de Quinidina Cáosulas Sulfato de Ouinidina Tabletas
1 B RL 1 RL B RL
Sulfato de Quinidina, Tabletas de Liberación Prolonqada
B RL
Sulfato de Quinina Cáosulas
1
Triamtereno Cáosulas
Sulfato de Quinina Tabletas
Triamtereno e Hidroclorotiazida Cánsulas
Sulfato de Terbutalina Tabletas Sulfato Ferroso Tabletas
B 1 1
Sulfinoirazona Cáosulas
B
Triazolam Tabletas Triclormetiazida Tabletas
Sulfinnirazona Tabletas
B
Trimetonrima Tabletas
Sulfisoxazol Tabletas
B RL
Trioxisaleno Tabletas
Sulindaco Tabletas Sumatrintán Tabletas
B B
Triole Sulfa Tabletas Vaainales Trisilicato de Maanesio Tabletas
B RL
Trisulfaoirimidinas Tabletas
B 1
Sulfato de Penbutolol Tabletas
Tabletas que Contienen por lo Menos Tres de los Siguientes Fármacos-Acetaminofeno y Sales de Clorfeniramina, Dextrometorfano y Pseudoefedrina Tacrolimus Cáosulas Tadalafilo Tabletas Talidomida Cánsulas
Tranilcioromina Tabletas Trébol Roio Tabletas Triamcinolona Tabletas
Triamtereno e Hidroclorotiazida Tabletas
Troleandomicina Cáosulas 1 1 1 B
Tartrato de Eraotamina Tabletas Tartrato de Eraotamina Tabletas Sublinauales
B RL
Tartrato de Eraotamina v Cafeína Tabletas
B RL 1
Tartrato de Fendimetrazina Cánsulas
Torsemida Tabletas Trandolaoril Tabletas
B RL
Tartrato de Fendimetrazina Tabletas Tartrato de Levorfanol Tabletas
B
Tartrato de Metoorolol Tabletas
1 RL
Tartrato de Metoprolol e Hidroclorotiazida, Tabletas Tartrato de Rivastiamina Cánsulas
1 RL
B
Ubidecarenona Cáosulas Ubidecarenona Tabletas Uña de Gato Cáosulas Uña de Gato Tabletas Urea Cl 4 Cáosulas Ursodiol Cáosulas Ursodiol Tabletas Valaciclovir Tabletas Valeriana Tabletas Valqanciclovir Tabletas Valsartán Tabletas
1 1
1 B 1 RL B 1 RL 1 RL 1 RL 1 RL 1
1 RL B RL B
1 RL 1 RL 1 RL 1 RL 1 B B 1 1 RL 1
1
Valsartán e Hidroclorotiazida Tabletas
1 B
1
Venlafaxina Tabletas Viaabatrina Tabletas
Tartrato de Trimenrazina Tabletas
B RL
Vinnocetina Cánsulas
Tartrato de Zolnidem Tabletas
B
Vinnocetina Tabletas Vitamina A Cánsulas
Tartrato de Zolpidem, Tabletas de Liberación Prolonqada
B
Telmisartán Tabletas
B
Vitamina A Tabletas Vitamina E Cáosulas
Telmisartán e Hidroclorotiazida Tabletas
B
Vitaminas Hidrosolubles Cáosulas
1 1 1 1 1 1 1
RL RL RL RL RL
USP 39
Tablas de Referencia / Especificaciones del Envase 2407 Especificaciones del Envase para Cápsulas y Tabletas (Continuación)
Especificaciones del Envase para Cápsulas y Tabletas (Continuación)
Título de la Monoarafía
Especificaclones del Envase
Título de la Monoarafía
Especificaclones del Envase
Vitaminas Hidrosolubles Tabletas
1 RL
Warfarina Sódica Tabletas
1 RL
Vitaminas Hidrosolubles con Minerales Cáosulas
1 RL
Yoduro de lsoorooamida Tabletas
B
Vitaminas Hidrosolubles con Minerales Tabletas
1 RL
1
Vitaminas Oleosolubles Cáosulas Vitaminas Oleosolubles Tabletas
1 RL 1 RL
Yoduro de Potasio Tabletas Yoduro de Potasio, Tabletas de Liberación Retardada
Vitaminas Oleosolubles con Minerales Cáosulas Vitaminas Oleosolubles con Minerales Tabletas
1 RL
Yoduro de Sodio 1 123 Cáosulas
1 RL
Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles Cáosulas
1 RL
Yoduro de Sodio 1 131 Cáosulas Zalcitabina Tabletas
Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles Tabletas Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales Cáosulas
1 RL
Zaleolón Cáosulas
RL
Zidovudina Cáosulas
1 RL
Zidovudina Tabletas
1 RL 1 RL
Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales Tabletas
1 RL
Zonisamida Cáosulas 1 RL
1
B B 1 RL
2408 Descripción y Solubilidad / Tablas de Referencia
USP 39
DESCRIPCIÓN Y SOLUBILIDAD Descripción y Solubilidad Relativa de Artículos de la USP y del NF Las declaraciones "descripción" y "solubilidad" relacionadas con un artículo (anteriormente incluidas en la monografía individual) son de índole general. La información se suministra para quienes usan, preparan y dispensan fármacos, sólo para indicar las propiedades descriptivas y de solubilidad de un artículo que cumple con las normas de la monografía. Las propiedades no son normas o pruebas de pureza en sí mismas aunque pueden contribuir indirectamente a la evaluación preliminar de la integridad de un artículo.
Sabor y Olor En muchos casos se indican características or~anolépticas porque pueden ser propiedades descriptivas y utiles de las sustancias. Sin embargo, no están destinadas para su aplicación como pruebas de identificación de sustancias. La inclusión del olor y el sabor, entre otras propiedades descriptivas, puede ayudar a identificar el agente causante después de una exposición accidental o el contacto con una sustancia. Esta información se ofrece como advertencia o para informar acerca de las sensaciones que pueden experimentarse. Se recomienda firmemente no usar el olor o el sabor como pruebas de identificación o contenido. El olor característico de una sustancia volátil aparece de inmediato al abrir el envase que lo contiene. El olor puede ser awadable (p.ej., Aceite de Menta), desagradable (p.ej., Dióxido de Azufre) o potencialmente peligroso ante la exposición prolongada (p.ej., Alquitrán de Huira). Además, se puede encontrar un olor inesperado si no se conocen las características de una sustancia o si un envase ha sido etiquetado incorrectamente. En consecuencia, los envases de tales sustancias se deben abrir con precaución, preferiblemente en una campana de extracción bien ventilada. Asimismo, se puede experimentar una sensación o un sabor característicos en la boca si trazas de material residual presente en los dedos entran inadvertidamente en contacto con la lengua o con las mucosas adyacentes.
Solubilidad Se considera una prueba de pureza sólo cuando, en la monografía individual, se la indica como prueba de solubilidad cuantitativa especial y está designada bajo el encabezado de la prueba. Las solubilidades aproximadas de sustancias de la Farmacopea y del Formulario Nacional se indican mediante los términos descriptivos de la siguiente tabla. El término "miscible" utilizado en esta Farmacopea se refiere a una sustancia que produce una mezcla homogénea al mezclarse en cualquier proporción con el disolvente designado.
Término Descriotlvo Muv soluble Fácilmente soluble Soluble Moderadamente soluble Poco soluble Muv ooco soluble Prácticamente insoluble o Insoluble
Partes de Disolvente Requeridas para 1 Parte de Soluto Menos de 1 De 1a10 De 10 a 30 De 30 a 100 De 100 a 1000 De 1000a10000 10000 o más
Los artículos solubles de la Farmacopea y del Formulario Nacional, cuando se solubilizan, pueden mostrar trazas de impurezas físicas, tales como fragmentos diminutos de papel de filtro, fibras y otras partículas, a menos que sean limitados o excluidos por pruebas definidas u otras especificaciones en las monograf1as individuales. Aceite de Almendra: Líquido insípido, aceitoso y transparente, de color pajizo o incoloro. Permanece transparente a -1 Oº y no se solidifica hasta que se enfría casi a -20º. Poco soluble en alcohol. Miscible con éter, con cloroformo, con benceno y con éter de petróleo. Categoría del NF: Saborizantes y fragancia; vehículo (oleoso); emoliente; disolvente. Aceite de Cacahuate (Aceite de Maní): Líquido aceitoso incoloro o amarillo pálido e insípido. Puede tener un olor a nueces característico. Muy poco soluble en alcohol. Miscible con éter, con cloroformo y con disulfuro ge carbono. Peso Específico (841): entre 0,912 y 0,920. Indice de refracción (831 ): entre 1,462 y 1,464 a 40º. Categoría del NF: Disolvente; vehículo (oleoso). Aceite de Canola: Líguido ligeramente viscoso, transparente, de color amarillo palido. Prácticamente insoluble en agua y en alcohol. Miscible con éter de petróleo (pe: 40º a 60º). Categoría del NF: Disolvente; emoliente; veh1culo (oleoso). Aceite de Cártamo: Aceite amarillo claro. Se espesa y se vuelve rancio ante la exposición prolongada al aire. Insoluble en agua. Miscible con éter y con cloroformo. Categoría del NF: Venículo (oleoso); emoliente; disolvente. Aceite de Coco: Líquido viscoso transparente, de color blanco a tostado amarillento claro. Fácilmente soluble en cloruro de metileno y en éter de petróleo (pe: 65º a 70º); muy poco soluble en alcohol; prácticamente insoluble en agua. Categoría del NF: Agente de recubrimiento; agente emulsionante; emoliente; base para ungüentos. Aceite de Coco Hidrogenado: Sólido graso a semisólido de color blanco a amarillento. Fácilmente soluble en éter; muy poco soluble en alcohol; prácticamente insoluble en agua. Categoría del NF: A~ente de recubrimiento; lubricante; aglutinante por vía humeda. Aceite de Girasol: Líquido transparente de color amarillo claro. Miscible con petróleo a un punto de ebuillición entre 49º y 60º. Prácticamente insoluble en agua y en alcohol. Indice de Refracción (831 ): 1,472-1,474 a 25º. Peso Específico (841): 0,914-0,924 a 20º. Categoría del NF: Agente de recubrimiento; emoliente; disolvente; diluyente; vehículo (oleoso). Aceite de Hígado de Bacalao: Líquido aceitoso, poco espeso, con característico sabor y olor a pescado que no es rancio. Fácilmente soluble en éter, en cloroformo, en disulfuro de carbono y en acetato de etilo; poco soluble en alcohol. Aceite de Maíz: Líquido aceitoso transparente de color amarillo claro con olor y sabor leves característicos. Poco soluble en alcohol. Miscible con éter, con cloroformo, con benceno y con éter de petróleo. Peso Específico (841 ): entre 0,914 y 0,921. Categona del NF: Disolvente; vehículo (oleoso). Aceite de Menta: Líquido incoloro o amarillo pálido con un olor característico fuerte y penetrante, con sabor acre, seguido por una sensación de frío cuando se aspira aire por la boca. Categoría del NF: Saborizantes y fragancia. Aceite de Oliva: Líquido aceitoso de color amarillo pálido o amarillo verdoso claro con sabor y olor leves característicos, y un resabio levemente agrio. Poco soluble en al-
USP 39
cohol. Miscible con éter, con cloroformo y con disulfuro de carbono. Peso Específico (841): entre 0,910 y 0,915. Categoría del NF: Veh1culo (oleoso). Aceite de Palma: Sólido graso a semisólido de color blanco a amarillento. Insoluble en agua. Categoría del NF: Agente de recubrimiento; agente emulsionante. Aceite de Palma Hidrogenado: Sólido graso a semisólido de color blanco a amarillento. Fácilmente soluble en éter; muy poco soluble en alcohol; prácticamente insoluble en agua. Categoría del NF: A_gente de recubrimiento; lubricante; aglutinante por vía humeda. Aceite de Pescado con Ácidos Omega-3: Líquido amarillo pálido. Muy soluble en acetona y en heptano; poco soluble en alcohol anhidro; prácticamente insoluble en agua. Aceite de Ricino: Líquido viscoso, transparente, amarillo pálido o casi incoloro. Desprende un olor leve o suave, sin olores extraños o rancios y tiene un sabor soso característico. Soluble en alcohol. Miscible con alcohol deshidratado, con ácido acético glacial, con cloroformo y con éter. Categoría del NF: Plastificante; emoliente; disolvente; vehículo. Aceite de Ricino Hidrogenado: Cera cristalina y blanca. Insoluble en agua y en la mayoría de los disolventes or$Jánicos comunes. Categoría del NF: Agente espesante; lubricante. Aceite de Ricino Hidrogenado Polioxilado 40: Pasta o líquido pastoso, blanco a amarillento, con olor y sabor leves. Muy soluble en agua, produciendo una solución prácticamente insípida, inodora e incolora; soluble en alcohol y en acetato de etilo; insoluble en aceites minerales. Categoría del NF: Agente humectante y/o solubilizante; agente emulsionante; lubricante. Aceite de Ricino Polioxilado 35: Líquido aceitoso de color amarillo, con un débil olor caracteristico y sabor algo amargo. Muy soluble en agua, produciendo una solución prácticamente inodora e incolora; soluble en alcohol y en acetato de etilo; insoluble en aceites minerales. Categoría del NF: Agente humectante y/o solubilizante; agente emulsionante; lubricante. Aceite de Rosas: Líquido incoloro o amarillo con olor y sabor característicos a rosa. A 25º es un líquido viscoso. Al enfriarse gradualmente, se transforma en una masa cristalina y traslúcida que se licúa fácilmente al calentarse. Categoría del NF: Saborizantes y fragancia. Aceite de Semilla de Colza Hidrogenado por Completo: Sólido ceroso blanco. Insoluble en agua y en alcohol. Categoría del NF: Agente de recubrimiento; agente espesante. Aceite de Semilla de Colza Hidrogenado por Completo Superglicerinado: Sólido blanco. Insoluble en agua y en alcohol. Categoría del NF: Agente de recubrimiento; agente emulsionante; agente espesante. Aceite de Semilla de Palma: Sólido graso blanco a amarillento. Insoluble en agua. Categoría del NF: Agente de recubrimiento; agente emulsionante; base para supositorios. Aceite de Semilla de Al9odón: Líquido aceitoso y amarillo pálido. Es inodoro o practicamente inodoro e ins1pido. A temperaturas inferiores a 1Oº, las partículas de grasa sólida se pueden separar del Aceite y, aproximadamente a una temperatura de Oº a -5º, el Aceite se vuelve sólido o prácticamente sólido. Peso Específico (841 ): entre 0,915 y 0,921. Poco soluble en alcohol. Miscible con éter, con cloroformo, con éter de petróleo y con disulfuro de carbono. Categoría del NF: Disolvente; vehículo (oleoso). Aceite de Semilla de Algodón Hidrogenado: Masa o polvo blanco que al calentarse se funde y se convierte en un líquido amarillo pálido transparente. Fácilmente soluble en cloruro de metileno y en tolueno; muy poco soluble en alcohol; prácticamente insoluble en agua. Aceite de Sésamo: Líquido aceitoso, amarillo pálido. Es insípido y prácticamente inodoro. Poco soluble en alcohol.
Tablas de Referencia / Descripción y Solubilidad 2409 Miscible con éter, con cloroformo, con éter de petróleo y con disulfuro de carbono. Categoría del NF: Disolvente; vehículo (oleoso). Aceite de Soja: Líquido aceitoso transparente, de color amarillo pálido, con un olor y sabor característico. Insoluble en agua. Miscible con éter y,con cloroformo. Peso Específico (841 ): entre 0,916 y 0,922. Indice de refracción (831 ): entre 1,465 y 1,475. Categoría del NF: Vehículo (oleoso); disolvente. Aceite de Soja Hidrogenado: Masa o polvo de color blanco que al calentarse se funde y se convierte en un líquido amarillo pálido transparente. Fácilmente soluble en cloruro de metileno y en hexano después de calentarse, y en tolueno; muy poco soluble en alcohol; prácticamente insoluble en agua. Categoría del NF: Emoliente. Aceite Etiodado, Inyección: Líquido aceitoso de color pajizo a ámbar. Puede tener un olor aliáceo. Soluble en acetona, en cloroformo, en éter y en éter de petróleo; insoluble en agua. Aceite Mineral: Líquido aceitoso incoloro, transparente, libre o prácticamente libre de fluorescencia. Frío es inodoro e insípido y desarrolla no más que un olor leve a petróleo cuando se calienta. Soluble en aceites volátiles; insoluble en agua y en alcohol. Miscible con la mayoría de los aceites fijos pero no con aceite de ricino. Categoría del NF: Disolvente; vehículo (oleoso); emoliente. Aceite Mineral Liviano: Líquido aceitoso incoloro, transparente, libre o prácticamente libre de fluorescencia. Frío es inodoro e insípido y desarrolla no más que un olor leve a petróleo cuando se calienta. Soluble en aceites volátiles; insoluble en agua y en alcohol. Miscible con la mayoría de los aceites fijos pero no con aceite de ricino. Categoría del NF: Vehículo (oleoso); lubricante; emoliente; disolvente. Aceite Vegetal Hidrogenado: Aceite Vegetal Hidrogenado de Tipo 1-Polvo fino, perlas o pequeñas escamas de color blanco. Aceite Vegetal Hidrogenado de Tipo 11-Plástico (semisólido) o escamas con una consistencia más suave que el Tipo l. Soluble en alcohol isopropílico caliente, en hexano y en cloroformo; insoluble en agua. Categoría del NF: Aceite Vegetal Hidrogenado-Aglutinante por vía húmeda; Aceite Ve9etal Hidrogenado de Tipo !-Lubricante; Aceite Vegetal H1drogenado de Tipo 11-Base para ungüentos. Acesulfamo Potásico: Polvo cristalino blanco o cristales incoloros. Soluble en agua; muy poco soluble en acetona y en alcohol. Categoría del NF: Agente edulcorante. Acetaminofeno: Polvo cristalino, blanco e inodoro con un leve sabor amargo. Fácilmente soluble en alcohol; soluble en agua en ebullición y en hidróxido de sodio 1 N.
Acetato de Aluminio, Solución Tópica: Líquido transparente, incoloro, con un débil olor a ácido acético y sabor astringente y levemente dulce. El peso específico es aproximadamente 1,02. Acetato de Betametasona: Polvo inodoro de color blanco a blanco cremoso. Sinteriza y vuelve a solidificarse aproximadamente a 165º y vuelve a fundir aproximadamente a 200º ó 220º, con descomposición (ver Intervalo o Temperatura de Fusión (741 )). Fácilmente soluble en acetona; soluble en alcohol y en cloroformo; prácticamente insoluble en agua.
241 O Descripción y Solubilidad / Tablas de Referencia Acetato de Calcio: Polvo cristalino blanco, inodoro o casi inodoro, higroscópico. Cuando se calienta a temperaturas superiores a 160º, se descompone en carbonato de calcio y acetona. Fácilmente soluble en agua; poco soluble en metanol; prácticamente insoluble en acetona, en alcohol deshidratado y en benceno. Categoría del NF: Conservante antimicrobiano; agente secuestrante. Acetato de Celulosa: Polvo fino de color blanco o pellets de libre fluidez. Disponible en una gama de viscosidades y contenidos de acetilo. La alta viscosidad, que refle¡·a un peso molecular alto, disminuye ligeramente la solubi idad. Los acetatos de celulosa con un alto contenido de acetilo por lo general tienen una solubilidad más limitada en los disolventes orgánicos utilizados comúnmente que los de bajo contenido de acetilo, pero son más solubles en cloruro de metileno. Los acetatos de celulosa con cualquier contenido de acetilo son solubles en dioxano y en dimetilformamida; insolubles en alcohol y en agua. Categoría del NF: Agente de recubrimiento; polímero de membrana; agente formador de película; diluyente. Acetato de Cinc: Cristales o gránulos blancos, con leve olor acetoso y sabor astringente. Es levemente eflorescente. Fácilmente soluble en agua y en alcohol en ebullición; poco soluble en alcohol. Categoría del NF: Emoliente. Acetato de Clorhexidina: Polvo microcristalino blanco o casi blanco. Soluble en alcohol; moderadamente soluble en agua; poco soluble en glicerol y en propilenglicol. Acetato de Cortisona: Polvo cristalino blanco o prácticamente blanco e inodoro. Es estable al aire. Funde aproximadamente a 240º, con cierto grado de descomposición (ver Intervalo o Temperatura de Fusión (741)). Fácilmente soluble en cloroformo; soluble en dioxano; moderadamente soluble en acetona; poco soluble en alcohol; insoluble en agua. Acetato de Desmopresina: Polvo blanco, poco denso. Soluble en agua, en alcohol y en ácido acético. Acetato de Desoxicorticosterona: Polvo cristalino blanco o blanco cremoso. Es inodoro y es estable al aire. Moderadamente soluble en alcohol, en acetona y en dioxano; poco soluble en aceites vegetales; prácticamente insoluble en agua. Acetato de Dexametasona: Polvo transparente, blanco a blanquecino, inodoro. Fácilmente soluble en metanol, en acetona y en dioxano; prácticamente insoluble en agua. Acetato de Etilo: Líquido transparente, incoloro, con un olor fragante, refrescante, ligeramente acetoso, y un sabor peculiar, acetoso y ardiente. Soluble en agua. Miscible con alcohol, con éter, con aceites fijos y con aceites volátiles. Categoría del NF: Saborizantes y fragancia; disolvente. Acetato de Flecainida: Polvo cristalino, blanco a blanquecino. Fácilmente soluble en alcohol; soluble en agua. El pK, es de 9,3. Acetato de Fludrocortisona: Polvo cristalino o cristales, de color blanco a amarillo pálido. Es inodoro o prácticamente inodoro. Es higroscopico. Moderadamente soluble en alcohol y en cloroformo; poco soluble en éter; insoluble en agua. Acetato de Gonadorelina: Polvo blanco a levemente amarillento. Soluble en agua; moderadamente soluble en metano l. Acetato de Guanabenzo: Polvo blanco o casi blanco con no más que un olor leve. Soluble en alcohol y en propilenglicol; moderadamente soluble en agua y en ácido clorhídrico 0, 1 N. Acetato de Hidrocortisona: Polvo cristalino blanco a prácticamente blanco e inodoro. Funde aproximadamente a 220º, con descomposición. Poco soluble en alcohol y en cloroformo; insoluble en agua. Acetato de Lisina: Polvo cristalino o cristales de color blanco, inodoros, con sabor ácido. Fácilmente soluble en agua.
USP 39 Acetato de Mafenida: Polvo cristalino blanco a amarillo pálido. Fácilmente soluble en agua. Acetato de Medroxiprogesterona: Polvo cristalino blanco a blanquecino, inodoro. Funde aproximadamente a 205º. Es estable al aire. Fácilmente soluble en cloroformo; soluble en acetona y en dioxano; moderadamente soluble en alcohol y en metano!; poco soluble en éter; insoluble en agua. Acetato de Megestrol: Polvo cristalino, de color blanco a blanco cremoso, insípido y esencialmente inodoro. Muy soluble en cloroformo; soluble en acetona; moderadamente soluble en alcohol; poco soluble en éter y aceites fijos; insoluble en agua. Inestable en medios acuosos a un pH de 7 o mayor. Acetato de Melengestrol: Polvo cristalino blanco a amarillo claro. Fácilmente soluble en cloroformo y en acetato de etilo; poco soluble en alcohol; insoluble en agua. Acetato de Metilprednisolona: Polvo cristalino blanco o prácticamente blanco e inodoro. Funde aproximadamente a 225º, con cierto grado de descomposición (ver Intervalo o Temperatura de Fusión (741)). Soluble en dioxano; moderadamente soluble en acetona, en alcohol, en cloroformo y en metano!; poco soluble en éter; prácticamente insoluble en agua. Acetato de Noretindrona: Polvo cristalino, inodoro, de color blanco a blanco cremoso. Muy soluble en cloroformo; fácilmente soluble en dioxano; soluble en éter y en alcohol; prácticamente insoluble en agua. Acetato de Polivinilo: Polvo blanco o blanquecino o gránulos o perlas incoloros. Fácilmente soluble en acetato de etilo; soluble en alcohol, en acetona y en cloroformo; prácticamente insoluble en agua. Es higroscópico y se hincha en agua. Categoría del NF: A9ente de recubrimiento; desecante; aglutinante por vía humeda; agente formador de película. Acetato de Polivinilo, Dispersión: Líquido ligeramente viscoso opaco de color blanco o blanquecino. Miscible con agua y con etanol. Es sensible a contaminación microbiana. Categoría del NF: Agente de recubrimiento; agente formador de película; agente modificador de liberación. Acetato de Potasio: Cristales monoclínicos incoloros o polvo cristalino de color blanco, con sabor salino y ligeramente alcalino. Es inodoro o tiene un leve olor acetoso. Es delicuescente al exponerlo al aire húmedo. Muy soluble en agua; fácilmente soluble en alcohol. Acetato de Prednisolona: Polvo cristalino blanco a prácticamente blanco e inodoro. Funde aproximadamente a 235º, con cierto grado de descomposición (ver Intervalo o Temperatura de Fusión (7 41 )). Poco soluble en acetona, en alcohol y en cloroformo; prácticamente insoluble en agua. Acetato de Sodio: Cristales incoloros, transparentes, o escamas blancas o polvo cristalino granular de color blanco. Es inodoro o tiene un débil olor acetoso y un sabor salino, ligeramente amargo. Es eflorescente en aire seco y cálido. Muy soluble en agua; soluble en alcohol. Categoría del NF: Saborizantes y fragancia; modificador de pH (agente acidificante/agente alcaíinizante/agente amortiguador); conservante antimicrobiano; ligando de transferencia. Acetato Fenilmercúrico: Polvo cristalino, blanco a blanco cremoso, o pequeños prismas o laminillas blancas. Es inodoro. Soluble en alcohol y en acetona; poco soluble en agua. Categoría del NF: Conservante antimicrobiano. Acetato-Succinato de Hipromelosa: Píldoras o polvo de color blanco a blanco amarillento. Es inodoro o tiene un olor tenue, semejante al del ácido acético, y es insípido. Prácticamente insoluble en agua, en alcohol deshidratado, en xileno y en hexano. Al agregarle una mezcla de alcohol deshidratado y diclorometano (1: 1) o acetona, se produce un líquido viscoso transparente o turbio. Se disuelve en hidróxido de sodio 1 N. Levemente higroscópico. Categoría del NF: Agente de recubrimiento; agfutinante por vía húmeda; agente formador de película.
Tablas de Referencia /Descripción y Solubilidad 2411
USP 39 Acetazolamida: Polvo blanco a blanco levemente amarillento, cristalino e inodoro. Moderadamente soluble en agua casi hirviendo; poco soluble en alcohol; muy poco soluble en agua. Acetil Sulfisoxazol: Polvo cristalino blanco o ligeramente amarillo. Moderadamente soluble en cloroformo; poco soluble en alcohol; prácticamente insoluble en agua. Acetilcisteína: Polvo cristalino blanco con un olor acético leve. Fácilmente soluble en agua y en alcohol· prácticamente insoluble en cloroformo y en éter. ' . Acetohexamida: Polvo cristalino blanco, prácticamente inodoro. Soluble en piridina y en soluciones diluidas de hidróxidos alcalinos; poco soluble en alcohol y en cloroformo· prácticamente insoluble en agua y en éter. ' Acetona: Líquido transparente, incoloro, móvil volátil con olor característico. Una solución (1 en 2) es ne~tra al ' tornasol. Miscible con a9ua, con alcohol, con éter, con cloroformo y con la mayona de los aceites volátiles. Categoría del NF: Disolvente. Acetónido de Fluocinolona: Polvo cristalino blanco o prácticamente blanco e inodoro. Es estable al aire. Funde aproximadamente a 270º, con descomposición. Soluble en metanol; poco soluble en éter y en cloroformo; insoluble en agua. Acetónido de Triamcinolona: Polvo cristalino de color blanco a crema que sólo presenta un olor leve. Moderadamente soluble en alcohol deshidratado, en cloroformo y en metanol; prácticamente insoluble en agua. Aciclovir: Polvo cristalino blanco a blanquecino. Funde con de~e
4
Ácido Aminobenzoico, Solución Tópica: Solución de color pajizo con olor a alcohol. Acido Amin~caproico: ~olvo fino, blanco y cristalino. Es inodoro o pract1camente inodoro. Sus soluciones son neutras al tornasol. Funde aproximadamente a 205º. Fácilmente soluble en agua, en acidos y en álcalis; poco soluble en metanol y en alcohol; prácticamente insoluble en cloroformo y en éter. Ácido Aminohipúrico: Polvo cristalino blanco. Cambia de color al exponerse a la luz. Funde aproximadamente a 195º, con descomposición. Fácilmente soluble en soluciones alcalinas, con algo de descomposición, y en ácido clorhídrico diluido; moderadamente soluble en agua y en alcohol; muy poco soluble en benceno, en tetracloruro de carbono en cloroformo y en éter. ' Ácido Aminosalicílico: Polvo voluminoso de color blanco o prácticamente blanco que se oscurece al exponerse a la luz y al aire. Es inodoro o tiene un leve olor acetoso. Soluble en alcohol; poco soluble en agua y en éter· prácticamente insoluble en benceno. ' Ácido Ar~anílico: Polvo cristalino blanco a blanquecino. Funde aprox1m~damente a 2~2º. Soluble en agua caliente, en alcohol amílico y en soluciones de carbonatos alcalinos· moderadamente soluble en ácidos minerales concentrado;· poco soluble en agua fría, en alcohol y en ácido acético; ' insoluble en acetona, en benceno, en cloroformo en éter y en ácidos minerales diluidos. ' Ácido Ascórbico: Polvo o cristales blancos o ligeramente amarillos. Se oscurece gradualmente al exponerse a la luz. En estado seco, es razonablemente estable al aire pero se oxida rápidamente en solución. Funde aproximadamente a 190º. Fácilmente soluble en agua· moderadamente soluble en alcohol; insoluble en cloroformb, en éter y en benceno. Categoría del NF: Antioxidante. Ácido Aspártico: Polvo cristalino blanco o casi blanco o cristales incoloros. Soluble en soluciones diluidas de hidróxidos alcalinos y en ácidos minerales diluidos· poco soluble en ~gua; prácticamente insoluble en alcohol en éter. Acido .Benzoico: Cristales, escamas o agujas de color blanco. Tiene un olor leve, que por lo general es semejante al benzaldehído o a la benzoína. Li9eramente volátil a temperaturas moderadamente tibias. Facilmente volátil en vapor. Fácilmente soluble en alcohol, en cloroformo y en éter; poco soluble en agua. Categoría del NF: Conservante antimicrobiano. Ácido Bórico: Escamas incoloras e inodoras de un ref!ejo algo perlado, o cristales, o polvo blanco que resulta ligeramente untuoso al tacto. Es estable al aire. Fácilmente soluble en glicerina, en agua en ebullición y en alcohol en e~~llición; soluble en aguay.~lcohol. Categoría del NF: Mod1f1cador de pH (agente ac1d1f1cante/ag!=n~e alcalinizante/ age!1te amortiguador); conservante ant1m1crobiano. Acido Caprílico: Líquido aceitoso de color amarillo ligero, transparente o incoloro. Muy soluble en acetona y en alcohol; muy poco soluble en agua. Se disuelve en soluciones diluidas de hidróxidos alcalinos. Categoría del NF: Agente emulsionante. Ácido ~ítri~o Anhidro: Cristales inc;oloros y translúcidos o polvo cnstahno blanco de granular a fino. Funde aproximadamente a 153º, con descomposición. Muy soluble en ~gua; fácilme,nte soluble en. ~lcohol; muy poco soluble en eter. Categona del NF: Mod1f1cador de pH (agente acidifican!e/agente alcalinizante/agente amortiguador). , :'\cido Cítrico fy'lo~ohidrato: Cristales incoloros y translucidos o polvo cnstahno, de granular a fino, de color blanco. Eflorescente en aire seco. Muy soluble en a9ua· fácil~ente soluble e.~ alcohol; muy poco soluble en eter.' Categona_ ~el NF: Mod1f1cador ~e pH (agente acidificante/agente alcahmzante/agente ~mort1guador); antioxidante; agente quelante y/o comple¡ante. Ácido Clorhídrico: Líquido incoloro, fumante con olor acre. Deja de humear al diluirse con 2 volúmenes 1de agua.
y
2412 Descripción y Solubilidad / Tablas de Referencia El peso específico es aproximadamente 1, 18. Categoría del NF: Modificador de pH (agente acidificante/agente alcalinizante/agente amortiguador). Ácido Clorhídrico Diluido: Líquido incoloro e inodoro. El peso específico es aproximadamente 1,05. Categoría del NF: Modificador de pH (agente acidificante/agente alcalinizante/agente amortiguador). Ácido Dehidrocólico: Polvo blanco, poco denso, inodoro, con un sabor amargo. Soluble en ácido acético glacial y en soluciones de carbonatos e hidróxidos alcalinos; moderadamente soluble en cloroformo (las soluciones en alcohol y en cloroformo por lo general son lir;ieramente turbias); poco soluble en alcohol y en éter; practicamente insoluble en agua. Ácido Deshidroacético: Polvo cristalino blanco o casi blanco. Soluble en soluciones acuosas de álcalis; muy poco soluble en agua. Un g de muestra se disuelve en aproximadamente 35 mL de afcohol y en 5 mL de acetona. Categoría del NF: Conservante antimicrobiano. Ácido Desoxicólico: Se presenta como polvo cristalino blanco. Fácilmente soluble en alcohol; soluble en acetona y en soluciones de hidróxidos alcalinos y carbonatos; poco soluble en cloroformo y en éter; y prácticamente insoluble en agua. Categoría del NF: Agente emulsionante. Ácido Diatrizoico: Polvo blanco e inodoro. Soluble en dimetilformamida y en soluciones de hidróxidos alcalinos; muy poco soluble en agua y en alcohol. Ácido Edético: Polvo cristalino blanco. Funde a más de 220º, con descomposición. Soluble en soluciones de hidróxidos alcalinos; muy poco soluble en agua. Categoría del NF: Agente quelante y/o complejante. Ácido Eritórbico: Polvo o cristales de color blanco o ligeramente amarillo. Se oscurece gradualmente con la exposición a la luz. En estado seco es razonablemente estable en aire, pero en solución se deteriora rápidamente en presencia de aire. Funde entre 164º y 171 º con descomposición. Un g es soluble en aproximadamente 2,5 mL de agua y en aproximadamente 20 mL de alcohol. Poco soluble en glicerina. Categoría del NF: Conservante antimicrobiano; antioxidante. Ácido Esteárico: Sólido cristalino y algo brillante, duro, blanco o ligeramente amarillento, o polvo blanco o blanco amarillento. Tiene un olor y sabor leves, parecido a los del sebo. Fácilmente soluble en cloroformo y en éter; soluble en alcohol; prácticamente insoluble en agua. Categoría del NF: Agente emulsionante; lubricante. Ácido Esteárico Purificado: Sólido cristalino y algo brillante, duro, blanco o ligeramente amarillento, o polvo blanco o blanco amarillento. Tiene un olor y sabor leves, parecido a los del sebo. Fácilmente soluble en cloroformo y en éter; soluble en alcohol; prácticamente insoluble en agua. Categoría del NF: Lubricante. Ácido Etacrínico: Polvo cristalino blanco o prácticamente blanco, inodoro o prácticamente inodoro. Fácilmente soluble en alcohol, en cloroformo y en éter; muy poco soluble en agua. Ácido Fenilbencimidazol Sulfónico: Polvo inodoro de color blanco a marfil. Soluble en alcohol; prácticamente insoluble en disolventes aceitosos y en agua. Sus sales son fácilmente solubles en agua. Ácido Fólico: Polvo cristalino amarillo, amarillo amarronado o anaranjado amarillento, inodoro. Se disuelve fácilmente en soluciones diluidas de hidróxidos y carbonatos alcalinos. Es soluble en ácido clorhídrico 3 N caliente, en ácido sulfúrico 2 N caliente, en ácido clorhídrico y en ácido sulfúrico, produciendo soluciones de color amarillo muy pálido; muy poco soluble en agua; insoluble en alcohol, en acetona, en cloroformo y en éter. Ácido Fólico, Inyección: Líquido transparente, de color amarillo a amarillo anaranjado, alcalino. Ácido Fosfórico: Líquido incoloro, inodoro y siruposo. El peso específico es aproximadamente 1,71. Miscible con
USP 39 agua y con alcohol. Categoría del NF: Modificador de pH (agente acidificante/agente alcalinizante/agente amortiguador). Ácido Fosfórico Diluido: Líquido transparente, incoloro e inodoro. El peso específico es aproximadamente 1,057. Categoría del NF: Modificador de pH (agente acidificante/ agente alcalinizante/agente amortiguacfor). Ácido Fumárico: Polvo cristalino o gránulos de color blanco, inodoros. Soluble en alcohol; poco soluble en agua y en éter; muy poco soluble en cloroformo. Categoría del NF: Modificador de pH (agente acidificante/agente alcalinizante/agente amortiguador); saborizantes y fragancia; antioxidante. Ácido Hipofosforoso: Líquido incoloro o ligeramente amarillo, inodoro. El peso específico es aproximadamente 1, 13. Categoría del NF: Antioxidante. Ácido lopanoico: Polvo de color crema. Es insípido o prácticamente insípido y tiene un débil olor característico. Es afectado por la luz. Soluble en alcohol, en cloroformo, en éter y en soluciones de hidróxidos y carbonatos alcalinos; insoluble en agua. Ácido lotalámico: Polvo blanco e inodoro. Soluble en soluciones de hidróxidos alcalinos; poco soluble en agua y en alcohol. Ácido Láctico: Líquido incoloro o amarillento, prácticamente inodoro y siruposo. Es higroscópico. Cuando se concentra por ebullición, se forma el lactato de ácido láctico. El peso específico es aproximadamente 1,20. Insoluble en cloroformo. Miscible con agua, con alcohol y con éter. Categoría del NF: Modificador de pH (agente acidificante/agente alcalinizante/agente amortiguador). Ácido Lactobiónico: Polvo cristalino blanco o casi blanco, con un punto de fusión a aproximadamente 125º con descomposición. Fácilmente soluble en agua; poco soluble en ácido acético glacial, en etanol anhidro y en metanol. Categoría del NF: Antioxidante. Ácido Láurico: Polvo o sólido cristalino de color blanco o ligeramente amarillo y algo brillante. Muy soluble en alcohol, en éter y en metanol; soluble en acetona; prácticamente insoluble en agua. Categoría del NF: Agente antiespumante; agente emulsionante; lubricante. Ácido Maleico: Polvo cristalino blanco. Fácilmente soluble en a9ua y en alcohol; moderadamente soluble en éter. Categona del NF: Modificador de pH (agente acidificante/ agente alcalinizante/agente amortiguador). Ácido Málico: Gránulos o polvo cristalino, blanco o prácticamente blanco, con un fuerte sabor ácido. Funde aproximadamente a 130°. Muy soluble en agua; fácilmente soluble en alcohol. Categoría del NF: Modificador de pH (agente acidificante/agente alcalinizante/agente amortiguador); saborizantes y fragancia; antioxidante; agente quelante y/o complejante. Ácido Mandélico: Polvo o sólido cristalino de color blanco a amarillo claro. Soluble en alcohol y en alcohol isopropílico; moderadamente soluble en agua. Categoría del NF: Conservante antimicrobiano. Ácido Mefenámico: Polvo cristalino blanco a blanquecino. Funde aproximadamente a 230º, con descomposición. Soluble en soluciones de hidróxidos alcalinos; moderadamente soluble en cloroformo; poco soluble en alcohol y en metanol; prácticamente insoluble en agua. Ácido Mirística: Sólido cristalino, duro, blanco o ligeramente amarillo y algo brillante, o polvo blanco o blanco amarillento. Soluble en alcohol, en cloroformo y en éter; prácticamente insoluble en agua. Categoría del NF: Agente antiespumante; agente emulsionante; lubricante. Ácido Nalidíxico: Polvo cristalino, blanco a amarillo muy pálido, inodoro. Soluble en cloroformo, en cloruro de metileno y en soluciones de carbonatos e hidróxidos alcalinos fi¡·os; poco soluble en acetona, en alcohol, en metanol y en to ueno; muy poco soluble en éter y en agua.
USP 39
Ácido Nítrico: Líquido fumante altamente corrosivo, que posee un olor característico muy irritante. Tiñe de amarillo los tejidos animales. Alcanza el punto de ebullición aproximadamente a 120º. El peso específico es aproximadamente 1,41. Categoría del NF: Modificador de pH (agente acidificante/agente alcalinizante/agente amortiguador). Ácido Oleico: Lí9uido aceitoso, incoloro a amarillo pálido cuando está reden preparado, pero al exponerse al aire absorbe oxígeno gradualmente y se oscurece. Tiene un olor y un sabor característico parecido al tocino. Cuando se calienta mucho en aire, se descompone con la producción de vapores acres. Prácticamente insoluble en agua. Miscible con alcohol, con cloroformo, con éter, con benceno y con aceites fijos y volátiles. Categoría del NF: Agente emulsionante. Ácido Palmítico: Sólido cristalino y algo brillante, duro, de color blanco o ligeramente amarillo, o polvo de color blanco o blanco amarillento. Tiene olor y sabor característicos leves. Soluble en alcohol, en éter y en cloroformo; prácticamente insoluble en agua. Categona del NF: Agente antiespumante; agente emulsionante; lubricante. Ácido Pentético: Polvo blanco, inodoro o casi inodoro. Funde con formación de espuma y degradación a 220º. Categoría del NF: Agente quelante y/o complejante; conservante antimicrobiano; agente secuestrante. Ácido Propiónico: Líquido aceitoso con un leve olor acre rancio. Miscible con agua, con alcohol y con varios otros disolventes orgánicos. Categoría del NF: Modificador de pH (agente acidificante/agente alcalinizante/agente amortiguador); conservante antimicrobiano; antioxidante. Ácido Salicílico: Cristales blancos, generalmente en agujas finas, o polvo cristalino blanco y poco denso. Tiene un sabor ligeramente dulce, seguido de un sabor agrio, y es estable al aire. La forma sintética es blanca e inodora. Cuando se prepara a partir de salicilato de metilo natural puede tener un tinte ligeramente amarillo o rosado y un olor tenue, similar al de la menta. Fácilmente soluble en alcohol y en éter; soluble en agua en ebullición; moderadamente soluble en cloroformo; poco soluble en agua y en benceno. Ácido Sórbico: Polvo cristalino blanco, de libre fluidez, con un olor característico. Soluble en alcohol y en éter; poco soluble en agua. Categoría del NF: Conservante antimicrobiano. Ácido Succínico: Cristales blancos, inodoros. Fácilmente solubles en agua en ebullición; solubles en agua, en alcohol y en ~licerina. Categoría del NF: Modificador de pH (agente acidif1cante/agente alcalinizante/agente amortiguador). Ácido Sulfúrico: Líquido aceitoso, transparente e incoloro. Miscible con agua y con alcohol, con generación de mucho calor. Muy cáustico y corrosivo. El peso específico es aproximadamente 1,84. Categoría del NF: Modificador de pH (agente acidificante/agente alcalinizante/agente amortiguador). Ácido Tánico: Polvo amorfo, escamas brillantes o masas esponjosas, cuyo color varía de blanco amarillento a marrón claro. Es inodoro o tiene un débil olor característico y un sabor fuertemente astringente. Muy soluble en agua, en acetona y en alcohol; fácilmente soluble en alcohol diluido; poco soluble en alcohol deshidratado; prácticamente insoluble en benceno, en cloroformo, en éter y en éter de petróleo; 1 g se disuelve en aproximadamente 1 mL de glicerina tibia. Ácido Tartárico: Cristales incoloros o translúcidos, o polvo cristalino de fino a granulado, de color blanco. Es inodoro, tiene sabor ácido y es estable al aire. Muy soluble en agua; fácilmente soluble en alcohol. Categoría del NF: Modificador de pH (agente acidificante/agente alcalinizante/ agente amortiguador); saborizantes y fragancia; agente secuestrante.
Tablas de Referencia /Descripción y Solubilidad 241 3 Ácido Tranexámico: Polvo cristalino blanco. Fácilmente soluble en agua y en ácido acético glacial; prácticamente insoluble en acetona y en alcohol. Ácido Undecilénico: Líquido transparente, de incoloro a amarillo pálido, con un olor característico. Prácticamente insoluble en agua. Miscible con alcohol, con cloroformo, con éter, con benceno y con aceites fijos y volátiles. Ácido Valproico: Líquido transparente ligeramente viscoso,,de incoloro a amarillo pálido, con un olor característico. Indice de refracción: aproximadamente 1,423 a 20º. Fácilmente soluble en hidróxido de sodio 1 N, en metanol, en alcohol, en acetona, en cloroformo, en benceno, en éter y en n-heptano; poco soluble en agua y en ácido clorhídrico
0,1 N. Acitretina: Polvo cristalino de color amarillo o verdoso. Moderadamente soluble en tetrahidrofurano; poco soluble en acetona y en alcohol; muy poco soluble en ciclohexano; prácticamente insoluble en agua. Adapaleno: Polvo blanco o casi blanco. Soluble en tetrahidrofurano; moderadamente soluble en etanol; prácticamente insoluble en agua. Adenina: Polvo cristalino o cristales de color blanco. Es inodoro e insípido. Moderadamente soluble en agua en ebullición; poco soluble en alcohol; muy poco soluble en agua; prácticamente insoluble en éter y en cloroformo. Adenosina: Polvo cristalino blanco, inodoro. Poco soluble en agua; prácticamente insoluble en alcohol. Funde aproximadamente a 235º. Adipato de Piperazina: Polvo cristalino blanco. Soluble en agua; prácticamente insoluble en alcohol. Agar: Es inodoro o tiene un olor leve y produce una sensación mucilaginosa en la lengua. Soluble en agua en ebullición; insoluble en agua fría. Categoría del NF: Agente de suspensión y/o viscosante; agente emulsionante; base para supositorios; aglutinante por vía húmeda. Agua Bacteriostática para Inyección: Líquido transparente, incoloro, inodoro o con el olor de la sustancia ant1microbiana. Categoría del NF: Vehículo (estéril); agua farmacéutica. Agua de Menta: Categoría del NF: Vehículo (saborizado y/o edulcorado). Agua de Rosas Concentrada: Prácticamente incolora y transparente, con el olor y el sabor agradables de pimpollos de rosa frescos. No tiene empireuma, olor a moho ni crecimiento fúngico. Categoría del NF: Saborizantes y fragancia. Agua de Rosas, Ungüento: Categoría del NF: Base para ungüentos. Agua Estéril para Inhalación: Solución transparente e incolora. Agua Estéril para Inyección: Líquido transparente, incoloro e inodoro. Categoría del NF: Disolvente; agua farmacéutica. Agua Estéril para Irrigación: Líquido transparente, incoloro e inodoro. Categoría del NF: Disolvente; agua farmacéutica. Agua para Inyección: Líquido transparente, incoloro e inodoro. Categoría del NF: Disolvente; agua farmacéutica. Agua Purificada: Líquido transparente, incoloro e inodoro. Categoría del NF: Disolvente; agua farmacéutica. Alanina: Polvo cristalino o cristales de color blanco, inodoros, con un sabor levemente dulce. Fácilmente soluble en agua; poco soluble en alcohol al 80%; insoluble en éter. Alantoína: Polvo cristalino blanco. Poco soluble en agua; muy poco soluble en alcohol. Funde aproximadamente a 225º, con descomposición. Albendazol: Polvo blanco a levemente amarillento. Fácilmente soluble en ácido fórmico anhidro; muy poco soluble en éter y en cloruro de metileno; prácticamente insoluble en alcohol y en agua.
2414 Descripción y Solubilidad / Tablas de Referencia Albúmina Agregada Marcada con Tecnecio Te 99m, Inyección: Suspensión lechosa cuyas partículas sedimentan en reposo. Albúmina Agregada Yodada 1 131, Inyección: Suspensión diluida de partículas blancas a ligeramente amarillas que pueden sedimentarse al estar en reposo. El envase de vidrio puede oscurecerse al estar en reposo debido a los efectos de la radiación. Albúmina Humana: Líquido transparente, amarronado, prácticamente inodoro y moderadamente viscoso. r-Albúmina Humana: Transparente, ligeramente viscoso e incoloro a color ámbar amarillento. Categoría del NF: Vehículo (estéril). Albúmina Yodada 1 125, Inyección: Solución transparente, incolora a ligeramente amarilla. En reposo, tanto la Albúmina como el envase de vidrio pueden oscurecerse como resultado de los efectos de la radiación. Albúmina Yodada 1 131, Inyección: Solución transparente, incolora a ligeramente amarilla. En reposo, tanto la Albúmina como el envase de vidrio pueden oscurecerse como resultado de los efectos de la radiación. Albuterol: Polvo cristalino blanco. Soluble en alcohol; moderadamente soluble en agua. Funde aproximadamente a 156º. Alcanfor: Cristales incoloros o blancos, gránulos, o masas cristalinas; o masas translúcidas, resistentes e incoloras a blancas. Tiene un olor penetrante característico y un sabor aromático y acre. El peso específico es aproximadamente 0,99. Se volatiliza lentamente a temperaturas normales. Muy soluble en alcohol, en cloroformo y en éter; fácilmente soluble en disulfuro de carbono, en éter de petróleo y en aceites fijos y volátiles; poco soluble en agua. Alcohol: Líquido transparente, incoloro, móvil y volátil. Posee un olor característico y produce una sensacion de ardor en la lengua. Se volatiliza fácilmente incluso a bajas temperaturas y alcanza el punto de ebullición aproximadamente a 78º. Es inflamable. Miscible con agua y con prácticamente todos los disolventes orgánicos. Categoría del NF: Disolvente; conservante antimicrobiano. Alcohol Bencílico: Líquido transr,arente, incoloro y aceitoso. Alcanza el punto de ebullición aproximadamente a 206º, sin descomposición. Es neutro al tornasol. Fácilmente soluble en alcohol al 50%; moderadamente soluble en agua. Miscible con alcohol, con éter y con cloroformo. El peso específico es entre 1,042 y 1,047. Categoría del NF: Conservante antimicrobiano; disolvente. Alcohol Butílico: Líquido transparente, incoloro, móvil, con un olor vinoso característico y penetrante. Soluble en agua. Miscible con alcohol, con eter y con muchos otros disolventes orgánicos. Categoría del NF: Disolvente. Alcohol (etílico: Escamas, gránulos, pastillas o cubos untuosos y blancos. Tiene un débil olor característico y un sabor suave e insípido. Por lo general, funde en el intervalo entre 45º y 50º. Soluble en alcohol y en éter, la solubilidad aumentando con el aumento de la temperatura; insoluble en agua. Categoría del NF: Agente espesante; agente de recubrimiento; agente emulsionante. Alcohol Cetoestearílico: Escamas o gránulos blancos untuosos, con un débil olor característico y un sabor suave e insípido. Soluble en alcohol y en éter; insoluble en agua. Categoría del NF: Agente espesante; emoliente; agente emulsionante; agente de suspensión y/o viscosante. Alcohol Deshidratado: Líquido transparente, incoloro, móvil y volátil. Posee un olor característico y produce una sensación de ardor en la lengua. Se volatiliza fácilmente incluso a bajas temperaturas y alcanza el punto de ebullición aproximadamente a 78º. Es inflamable. Miscible con agua y con prácticamente todos los disolventes orgánicos. Alcohol Diluido: Líquido móvil, transparente e incoloro con un olor característico que produce una sensación de ardor en la lengua. Categoría del NF: Disolvente.
USP 39 Alcohol Estearílico: Gránulos o escamas untuosas de color blanco. Tiene un ligero olor característico y un sabor suave, insípido. Soluble en alcohol y en éter; insoluble en agua. Categoría del NF: Agente espesante. Alcohol Feniletílico: Líquido incoloro, con olor característico a rosas y marcado sabor ardiente. Muy soluble en alcohol, en aceites fijos, en glicerina y en propilenglicol; moderadamente soluble en agua; poco soluble en aceite mineral. Categoría del NF: Conservante antimicrobiano. Alcohol lsobutílico: Líquido transparente, incoloro, móvil. Soluble en agua. Miscible con alcohol, con éter y con otros disolventes orgánicos. Categoría del NF: Saborizantes y fragancia; disolvente. Alcohol lsopropílico: Líquido transparente, incoloro, móvil, volátil, con olor característico y sabor ligeramente amargo. Es inflamable. Miscible con agua, con alcohol, con éter y con cloroformo. Categoría del NF: Disolvente. Alcohol lsopropílico Azeotrópico: Líquido transparente, incoloro, móvil, volátil, con olor característico y sabor ligeramente amargo. Es inflamable. Miscible con agua, con alcohol, con éter y con cloroformo. Alcohol Metílico: Líquido transparente, incoloro, con olor característico. Es inflamable. Miscible con agua, con alcohol, con éter, con benceno y con la mayoría de los otros disolventes orgánicos. Categona del NF: Disolvente. Alcohol Oleílico: Líquido aceitoso transparente, incoloro a amarillo claro. Tiene un débil olor característico y es insípido. Soluble en alcohol, en éter, en alcohol isopropílico y en aceite mineral liviano; insoluble en agua. Categona del NF: Emoliente; agente emulsionante. Alcohol para Fricciones: Líquido transparente, incoloro o coloreado según se desee, móvil y volátil. Es de sabor extremadamente amargo y, en ausencia de constituyentes olorosos agregados, posee un olor característico. Es inflamable. Alcohol Polivinílico: Polvo o gránulos de color blanco a crema. Es inodoro. Fácilmente soluble en agua a temperatura ambiente. A temperaturas más altas la disolución se efectúa más rápidamente. Categoría del NF: Agente de suspensión y/o viscosante; agente de recubrimiento; agente formador de película; pohmeros para uso oftálmico. Alcoholado Aromático de Amoníaco: Líquido prácticamente incoloro cuando está recién preparado, pero que adquiere gradualmente un color amarillo en reposo. Tiene sabor a amoníaco, tiene un olor aromático y acre, y es afectado por la luz. El peso específico es aproximadamente 0,90. Alcoholado de Menta: Líquido transparente e incoloro con olor a menta. Fácilmente soluble en metanol y en éter dietílico; soluble en agua. Categoría del NF: Saborizantes y fragancia. Alcoholes de Lanolina: Sólido duro, ceroso, de color ámbar con un olor característico. Fácilmente soluble en cloroformo, en éter y en éter de petróleo; poco soluble en alcohol; insoluble en agua. Categoría del NF: Agente emulsionante; base para ungüentos. Alendronato Sódico: Polvo blanco de libre fluidez. Soluble en agua; muy poco soluble en dimetil sulfóxido, en alcohol metílico y en propilenglicol; prácticamente insoluble en acetona, en acetonitrilo, en alcohol, en cloroformo y en alcohol isopropílico. Alfa-Lactoalbúmina: Polvo levemente higroscópico con libre fluidez de color crema claro. Fácilmente soluble en agua; soluble en un intervalo amplio de pH; insoluble en metano!, en alcohol, en éter y en acetona. Categoría del NF: Agente de volumen; agente de recubrimiento; agente emulsionante; agente espesante; agente de suspensión y/o viscosante; diluyente; aglutinante por vía húmeda; vehículo (transportador sólido); modificador de pH (agente acidificante/agente alcalinizante/agente amortiguador); agente quelante y/o complejante.
USP 39 Alfadex: Polvo amorfo o cristalino de color blanco o casi blanco. Fácilmente soluble en agua y en propilenglicol; prácticamente insoluble en etanol y en cloruro de metileno. Categoría del NF: Agente quelante y/o complejante. Alfentanilo, Inyección: Solución transparente e incolora. Alginato de Potasio: Polvo granular o fibroso de color blanco a amarillo. Se disuelve en agua para formar una solución coloidal viscosa; insoluble en alcohol y en soluciones hidroalcohólicas en las que el contenido de alcohol es más de 30% en peso; insoluble en cloroformo, en éter y en ácidos cuando el pH de la solución resultante es inferior a aproximadamente 3. Categoría del NF: Agente emulsionante; agente de suspensión y/o viscosidad. Alginato de Propilenglicol: Polvo granular o fibroso de color blanco a amarillento. Es prácticamente inodoro e insípido. Soluble en agua, en soluciones de ácidos orgánicos diluidos y, dependiendo del grado de esterificación, en mezclas hidroalcohólicas que contengan hasta 60% en peso de alcohol para formar soluciones coloidales viscosas estables a un pH de 3. Categoría del NF: Agente de suspensión y/o viscosante; agente emulsionante. Alginato de Sodio: Polvo grueso o fino, de color blanco amarillento, prácticamente inodoro e insípido. Soluble en agua, forma una solución coloidal viscosa; insoluble en alcohol y en soluciones hidroalcohólicas en las que el contenido de alcohol supera aproximadamente el 30% en peso, en cloroformo, en éter y en ácidos cuando el pH de la solución resultante es inferior a aproximadamente 3. Categoría del NF: Agente de suspension y/o viscosante; agente formador de película; agente modificador de liberación; desintegrante; aglutinante por vía húmeda. Algodón Purificado: Fibras finas blancas y suaves semejantes a filamentos que, bajo el microscopio, tienen el aspecto de bandas huecas, aplanadas y retorcidas, estriadas y algo engrosadas en los bordes. Prácticamente inodoro y prácticamente insípido. Soluble en óxido cúprico amoniacal SR; insoluble en disolventes comunes. Almidón de Guisante: Polvo muy fino de color blanco o casi blanco. Prácticamente insoluble en agua fría y en alcohol. Categoría del NF: Agente de suspensión y/o viscosante; diluyente; desintegrante; aglutinante por vía húmeda. Almidón de Maíz: Polvo fino o masas irregulares, angulares, de color blanco (que se pueden blanquear). Es inodoro y tiene un sabor leve característico. Insoluble en agua fría y en alcohol. Cate¡)Oría del NF: Diluyente; desintegrante; aglutinante por vía humeda; agente de suspensión y/o viscosante. Almidón de Papa: Polvo fino o masas irregulares, angulares, de color blanco (que se pueden blanquear). Es inodoro y tiene un sabor leve característico. Insoluble en agua fría y en alcohol. Categoría del NF: Agente de suspensión y/o viscosante; diluyente; desintegrante; aglutinante por vía húmeda. Almidón de Tapioca: Polvo fino o masas irregulares, angulares, de color blanco a amarillo pálido (que se pueden blanquear). Insoluble en agua fría y en alcohol. Categoría del NF: Agente de suspensión y/o viscosante; diluyente; desintegrante; aglutinante por vía húmeda. Almidón de Trigo: Polvo fino o masas irregulares, angulares, de color blanco (que se pueden blanquear). Es inodoro y tiene un sabor leve característico. Insoluble en agua fría y en alcohol. Categoría del NF: Agente de suspensión y/o viscosante; diluyente; desintegrante; aglutinante por vía húmeda. Almidón Glicolato de Sodio: Polvo blanco, insípido, inodoro, de fluidez relativamente libre; disponible en distintos grados de viscosidad. Una dispersión al 2% (p/v) en agua fría sedimenta, en reposo, en forma de una capa altamente hidratada. Categoría del NF: Desintegrante. Almidón Hidroxipropílico de Guisante: Polvo blanco o levemente amarillento. Prácticamente insoluble en agua fría
Tablas de Referencia / Descripción y Solubilidad 2415 y en alcohol. Categoría del NF: Agente de suspensión y/o viscosante; diluyente; desintegrante; aglutinante por vía húmeda; agente emulsionante. Almidón Hidroxipropílico de Guisante Pregelatinizado: Polvo blanco o levemente amarillento. Aumenta su volumen en agua y produce una mezcla coloidal, viscosa, transparente o translúcida. Categoría del NF: Agente de suspensión y/o viscosante; aglutinante por vía húmeda; diluyente; desintegrante. Almidón Hidroxipropílico de Maíz: Polvo blanco o levemente amarillento. Prácticamente insoluble en agua fría y en alcohol. Categoría del NF: Diluyente; desintegrante; aglutinante por vía húmeda; agente emulsionante; agente de suspensión y/o viscosante. Almidón Hidroxipropílico de Maíz Pregelatinizado: Polvo blanco o levemente amarillento. Aumenta su volumen en agua y produce una mezcla coloidal, viscosa, transparente o translúcida. Categoría del NF: Agente de suspensión y/o viscosante; diluyente; desintegrante; aglutinante por vía húmeda; agente emulsionante. Almidón Hidroxipropílico de Papa: Polvo blanco o levemente amarillento. Prácticamente insoluble en agua fría y en alcohol. Categoría del NF: Agente de suspensión y/o viscosante; diluyente; desintegrante; aglutinante por v1a húmeda; agente emulsionante. Almidón Hidroxipropílico de Papa Pregelatinizado: Polvo blanco o levemente amarillento. Aumenta su volumen en agua y produce una mezcla coloidal, viscosa, transparente o translúcida. Categoría del NF: Agente de suspensión y/o viscosante; aglutinante por vía húmeda; diluyente; desintegrante. Almidón Modificado Pregelatinizado: Polvo moderadamente grueso a fino, de color blanco a blanquecino. Es inodoro y tiene un sabor leve característico. Poco soluble a soluble en agua fría; insoluble en alcohol. Categoría del NF: Agente de recubrimiento; diluyente; desintegrante; aglutinante por vía húmeda; agente modificador de liberación. Almidón Pregelatinizado: Polvo moderadamente grueso a fino, de color blanco a blanquecino. Es inodoro y tiene un sabor leve característico. Poco soluble a soluble en agua fría; insoluble en alcohol. Categoría del NF: Aglutinante por vía húmeda; diluyente; desintegrante; agente modificador de liberación. Aloe: Tiene un olor característico, algo ácido y desagradable. Alopurinol: Polvo poco denso blanco a blanquecino, con un olor leve. Soluble en soluciones de hidróxido de potasio e hidróxido de sodio; muy poco soluble en agua y en alcohol; prácticamente insoluble en cloroformo y en éter. Alprazolam: Polvo cristalino blanco a blanquecino. Funde aproximadamente a 225º. Fácilmente soluble en cloroformo; soluble en alcohol; moderadamente soluble en acetona; poco soluble en acetato de etilo; insoluble en agua. Alprostadil: Polvo cristalino blanco a blanquecino. Funde aproximadamente a 11 Oº. Fácilmente soluble en alcohol; soluble en agua y en acetona; poco soluble en acetato de etilo; muy poco soluble en cloroformo y en éter. Alquitrán de Enebro: Líquido marrón oscuro, transparente y espeso, con olor a alquitrán y sabor amargo ligeramente aromático. Moderadamente soluble en éter de petróleo; muy poco soluble en agua. Un volumen se disuelve en 9 volúmenes de alcohol. Se disuelve en 3 volúmenes de éter, dejando sólo un leve residuo floculento. Miscible con alcohol amílico, con cloroformo y con ácido acético glacial. Alquitrán de Hulla: Líquido viscoso, casi negro, más pesado que el agua, con un olor característico similar al naftaleno que produce una marcada sensación de ardor en la lengua. Soluble en benceno y en nitrobenceno; poco soluble en agua, a la cual le imparte su olor y gusto característicos y una reacción ligeramente alcalina; muy poco soluble
2416 Descripción y Solubilidad / Tablas de Referencia en acetona, en alcohol, en disulfuro de carbono, en cloroformo, en éter, en metanol y en éter de petróleo. Altretamina: Polvo cristalino blanco. Soluble en cloroformo; insoluble en agua. Alumbre de Amonio: Cristales grandes e incoloros, fragmentos cristalinos o polvo blanco. Es inodoro y tiene un sabor levemente dulce y muy astringente. Sus soluciones son ácidas al tornasol. Muy soluble en agua en ebullición; fácilmente soluble en agua y en glicerina; insoluble en alcohol. Alumbre de Potasio: Cristales grandes incoloros, fragmentos cristalinos o polvo blanco. Es inodoro y tiene un sabor levemente dulce y muy astringente. Sus soluciones son ácidas al tornasol. Muy soluble en agua en ebullición; fácilmente soluble en agua y en glicerina; insoluble en alcohol.
Aluminometasilicato de Magnesio: Gránulos o polvo de color blanco con una estructura amorfa. Muy poco sol.uble en ácidos; ~.¿sp3~ prácticamente inso.luble ÁO ins~luble •usP~P en agua, *•usp,i9 en alcohol •y en .álcalls.:.t.tlsP)9 ·
cambio en la. rlldttct16ni Aluminosilicato de Magnesio: Gránulos o polvo de color blanco con una estructura amorfa. Muy poco soluble en ácidos; "•usf>39 prácticamente insoluble "a insolubh:!J1.lisP19 en agua, "'•usPJ9 en alcohol •y en álcalis .•usPJ9 Amfotericina B: Polvo inodoro o prácticamente inodoro, de color amarillo a anaranjado. Soluble en dimetilformamida, en dimetil sulfóxido y en propilenglicol; poco soluble en metanol; insoluble en agua, en alcohol anhidro, en éter, en benceno y en tolueno. Amfotericina B para Inyección: Produce una dispersión coloidal en agua. Amifostina: Polvo cristalino blanco. Fácilmente soluble en agua. Amikacina: Polvo cristalino blanco. Moderadamente soluble en agua. Aminoacetato de Dihidroxialuminio: Polvo blanco, inodoro, con un sabor ligeramente dulce. Soluble en ácidos minerales diluidos y en soluciones de álcalis fijos; insoluble en agua y en disolventes orgánicos. Aminoacetato de Dihidroxialuminio, Magma: Suspensión viscosa blanca, de la que pueden separarse pequeñas cantidades de agua cuando se deja en reposo. Aminobenzoato Potásico: Polvo cristalino blanco. El pH de una solución 1 en 100 en agua es de aproximadamente 7. Muy soluble en agua; soluble en alcohol; prácticamente insoluble en éter. Aminofilina: Gránulos o polvo blanco o ligeramente amarillento, con un leve olor a amoníaco y sabor amargo. Cuando se expone al aire, pierde gradualmente la etilendiamina y absorbe dióxido de carbono con la liberación de teofilina libre. Sus soluciones son alcalinas al tornasol. Un g se disuelve en 25 ml de agua para obtener una solución transparente; 1 g disuelto en 5 ml de agua cristaliza en reposo, pero se redisuelve cuando se agrega una pequeña cantidad de etilendiamina. Insoluble en alcohol y en éter. Aminofilina, Tabletas: Puede tener un olor leve a amoníaco. Aminoglutetimida: Polvo cristalino fino, de color blanco o blanco cremoso. Soluble en la mayoría de los disolventes orgánicos; muy poco soluble en agua. Con ácidos fuertes forma sales solubles en agua. Aminosalicilato Sódico: Polvo cristalino de color blanco a crema. Es prácticamente inodoro y tiene un sabor salino,
USP 39
dulce. Sus soluciones se descomponen lentamente y se oscurecen. Fácilmente soluble en agua; moderadamente soluble en alcohol; muy poco soluble en éter y en cloroformo. Amobarbital Sódico: Polvo granular blanco y friable. Es inodoro, tiene un sabor amargo y es higroscópico. Sus soluciones se descomponen en reposo y el calor acelera la descomposición. Muy soluble en agua; soluble en alcohol; prácticamente insoluble en éter y en cloroformo. Amodiaquina: Polvo de color amarillo muy pálido a amarillo tostado claro, inodoro. Moderadamente soluble en ácido clorhídrico 1,0 N; poco soluble en alcohol; prácticamente insoluble en agua. Amoxapina: Polvo cristalino blanco a amarillento. Fácilmente soluble en cloroformo; soluble en tetrahidrofurano; moderadamente soluble en metano! y en tolueno; poco soluble en acetona; prácticamente insoluble en agua. Amoxicilina: Polvo cristalino blanco, prácticamente inodoro. Poco soluble en agua y en metanol; insoluble en benceno, en tetracloruro de carbono y en cloroformo. Ampicilina: Polvo cristalino blanco, prácticamente inodoro. Poco soluble en agua y en metanol; insoluble en benceno, en tetracloruro de carbono y en cloroformo. Ampicilina Sódica: Polvo cristalino blanco a blanquecino, inodoro o prácticamente inodoro. Es higroscópica. Muy soluble en agua, en soluciones isotónicas de cloruro de sodio y de dextrosa. Amprolio (C14H19CIN4 · HCI): Polvo blanco a amarillo claro. Fácilmente soluble en agua, en metanol, en alcohol y en dimetilformamida; moderadamente soluble en alcohol deshidratado; prácticamente insoluble en alcohol isopropílico, en alcohol butílico y en acetona. Anastrozol: Polvo cristalino blanco a blanquecino. Muy soluble en acetonitrilo; fácilmente soluble en metano!, en acetona, en alcohol y en tetrahidrofurano. Anetol: Líquido incoloro o ligeramente amarillo a una temperatura de 23º o superior. Tiene un sabor dulce y el olor aromático del anís. Es afectado por la luz. Fácilmente soluble en alcohol; muy poco soluble en agua. Fácilmente miscible con éter y con cloroformo. Categoría del NF: Saborizantes y fragancia. Anileridina: Polvo cristalino blanco a blanco amarillento, inodoro o prácticamente inodoro. Se oxida al exponerse al aire y a la luz, volviéndose más oscuro. Presenta polimorfismo y de las dos formas cristalinas observadas, una funde aproximadamente a 80º y la otra aproximadamente a 89º. Fácilmente soluble en alcohol y en cloroformo; soluble en éter, aunque puede presentar turbidez; muy poco soluble en agua. Antígeno para Prueba Cutánea de Parotiditis: Líquido ligeramente turbio. Antipirina: Cristales incoloros o polvo cristalino blanco. Es inodoro y tiene un sabor levemente amargo. Sus soluciones son neutras al tornasol. Muy soluble en agua; fácilmente soluble en alcohol y en cloroformo; moderadamente soluble en éter. Antitoxina Botulínica: Líquido transparente o ligeramente opalescente, prácticamente incoloro y prácticamente inodoro o con un olor debido al agente antimicrobiano. Antiveneno (Micrurus Fulvius): Sólido que presenta la estructura característica de un sólido liofilizado; de color crema claro. Antiveneno Polivalente (Crotalidae): Sólido que presenta la estructura característica de un sólido liofilizado; de color crema claro. Antralina: Polvo cristalino marrón amarillento. Es inodoro e insípido. Soluble en cloroformo, en acetona, en benceno y en soluciones de hidróxidos alcalinos; poco soluble en alcohol, en éter y en ácido acético glacial; insoluble en agua.
USP 39
. Arginina: Cristales blancos, prácticamente inodoros. Fácilmente soluble en agua; poco soluble en alcohol; insoluble en éter. Aripiprazol: Polvo cristalino, de color blanco a blanquecino. Fácilmente soluble en diclorometano; moderadamente soluble en tolueno; insoluble en metanol y en agua. Ascorbato de Calcio: Polvo blanco a ligeramente amarillo, prácticamente inodoro. Fácilmente soluble en agua (aproximadamente 50 g por 100 mL); poco soluble en alcohol; insoluble en éter. Ascorbato de Sodio: Polvo cristalino o cristales de color blanco o muy ligeramente amarillo. Es inodoro o prácticamente inodoro. Es relativamente estable al aire. Se oscurece gradualmente al exponerse a la luz. Fácilmente soluble en agua; muy poco soluble en alcohol; insoluble en cloroformo y en éter. Categoría del NF: Antioxidante. Asparagina: Cristales blancos o polvo cristalino. Soluble en a~ua; práctisa~ente insoluble en alcohol y en éter. Sus soluciones son ac1das al tornasol. Funde aproximadamente a 234º. Aspartamo: Polvo cristalino blanco, inodoro, con sabor dulce. Moderadamente soluble en agua; poco soluble en alcohol. Funde aproximadamente a 246º. El pH de una solución 8 en 1000 es de aproximadamente 5. Categoría del NF: Agente edulcorante. Aspartamo Acesulfamo: Polvo cristalino blanco, inodoro. Poco soluble en agua y en etanol. Categoría del NF: Agente edulcorante. Aspirina: Cristales blancos, generalmente tabulares o en forma de aguja, o polvo cristalino blanco. Es inodora o tiene un olor tenue. Es estable al aire seco; en aire húmedo se hidroliza gradualmente en los ácidos salicílico y acético. Fácilmente soluble en alcohol; soluble en cloroformo y en éter· moderadamente soluble en éter absoluto; poco soluble en ' agua. Atapulgita Activada: Polvo no hinchable de color cr~ma, micronizado, libre de partículas arenosas. El tratamiento de temperaturas elevadas usado en su preparación hace que se produzcan suspensiones acuosas moderadamente viscosas, cuya dispersión está formada principalmente por grupos de partículas. Insoluble en agua. Categoría del NF: Agente de suspensión y/o viscosante. Atapulgita Coloidal Activada: Polvo no hinchable de color crema, micronizado, libre de partículas arenosas. Produce suspensiones acuosas viscosas, como resultado de la dispersión en sus partículas constitutivas elementales. lnsolub_le en agua. Categoría del NF: Agente de suspensión y/o v1scosante. Atenolol: Polvo inodoro, blanco o prácticamente blanco. Punto de fusión 146º-148º (cristales obtenidos con acetato de etilo). Fácilmente soluble en metanol; moderadamente soluble en alcohol; poco soluble en agua y en isopropanol. Atorvastatina Cálcica: Polvo blanco a blanquecino. Soluble a fácilmente soluble en metanol; poco soluble en alcoho~;, insolubl~ a muy poco soluble en agua destilada, en soluc1on amortiguadora de fosfato de pH 7,4 y en acetonitrilo; insoluble en soluciones acuosas de pH 4 y menor. Atovacuona: Polvo amarillo. Fácilmente soluble en Nmetil-2-pirrolidona y en tetrahidrofurano; soluble en cloroformo; moderadamente soluble en acetona, en adipato de di-n-butilo, en dimetil sulfóxido y en polietilenglicol 400; poco soluble en alcohol, en 1,3-butanodiol, en acetato de etilo, en glicerina, en octanol y en polietilenglicol 200; muy poco soluble en hidróxido de sodio O, 1 N; insoluble en agua.
Tablas de Referencia / Descripción y Solubilidad 241 7 Atropina: Cristales blancos, generalmente en forma de aguja, o polvo cristalino blanco. Su solución saturada es alcalina a la fenolftaleína SR. Es ópticamente inactiva, pero por lo general contiene parte de hiosciamina levógira. Fácilmente soluble en alcohol y en cloroformo; soluble en glicerina y en éter; moderadamente soluble en agua a 80º; poco soluble en agua. Aurotioglucosa: Polvo amarillo, inodoro o prácticamente inodoro. Es estable al aire. Una solución acuosa es inestable a largo plazo. El pH de su solución 1 en 100 es de aproximadamente 6,3. Fácilmente soluble en agua; prácticar:_nente insoluble en acetona, en alcohol, en cloroformo y en eter. Azatioprina: Polvo amarillo pálido e inodoro. Soluble en soluciones diluidas de hidróxidos alcalinos; moderadamente soluble en ácidos minerales diluidos; muy poco soluble en alcohol y en cloroformo; insoluble en agua. Azatioprina Sódica para Inyección: Masa o aglutinado amorfo e higroscópico de color amarillo brillante. Azitromicina: Polvo blanco o casi blanco. Fácilmente soluble en etanol anhidro y en cloruro de metileno· prácti' camente insoluble en agua. Aztreonam: Polvo cristalino blanco, inodoro. Soluble en dimetilformamida y en dimetil sulfóxido; poco soluble en metanol; muy poco soluble en alcohol deshidratado; prácticamente insoluble en acetato de etilo, en cloroformo y en tolueno. Azúc~r Compresible: Polvo cristalino prácticamente blanco, inodoro, con un sabor dulce. Es estable al aire. La porción de sacarosa del Azúcar Compresible es muy soluble en agua. Categoría del NF: Agente edulcorante; diluyente. Azúcar Invertido: Líquido incoloro a color amarillo pálido. Miscible con agua, con glicerina y con glicoles. Categ?ría ,del NF: Agente edulcorante; diluyente; aglutinante por v1a humeda. Azúcar para Repostería: Polvo fino blanco, inodoro, con un sabor dulce. Es estable al aire. La porción de sacarosa del Azúcar para Repostería es soluble en agua fría. El Azúc?r. para Repos~ería es fácilmente soluble en agua en ebulhc1on. Categona del NF: Agente edulcorante; diluyente· agente de recubrimiento. ' Azúcar, Esferas: Masas esféricas duras, quebradizas, que fluyen con facilidad, cuyo tamaño varía generalmente de malla 1O a 60. Generalmente blancas, pero pueden ser coloreadas. La solubilidad en agua varía de acuerdo a la relación azúcar-almidón. Categoría del NF: Vehículo (transportador sólido); diluyente. Azufre Coloidal Marcado con Tecnecio Te 99m, Inyección: Dispersión coloidal. Líquido levemente opalescente de incoloro a tostado claro. ' Azufre Precipitado: Polvo microcristalino o amorfo, muy fino, de colo_r amarillo pálido. Es inodoro e insípido. Muy ~oluble en d1sulfuro de carbono; poco soluble en aceite de oliva; muy poco soluble en alcohol; prácticamente insoluble en agua. Azufre Sublimado: Polvo cristalino fino de color amarillo con olor y sabor tenues. Moderadamente soluble en aceite de oliva; prácticamente insoluble en agua y en alcohol. Azul de Metileno: Cristales de color verde oscuro o polvo cristalino con un brillo similar al bronce. Es inodoro o prácticamente inodoro y es estable al aire. Sus soluciones en agua y en alcohol tienen un color azul intenso. Soluble en agua y en cloroformo; moderadamente soluble en alcohol. Categoría del NF: Secuestrador de radicales libres. Bacitracina: Polvo blanco a beige claro, inodoro o con un olor leve. Es higroscópico. Sus soluciones se deterioran rápidamente a temperatura ambiente. Se forma un precipitado de sus soluciones y es inactivada por sales de muchos de los metales pesados. Fácilmente soluble en agua; soluble en alcohol, en metanol y en ácido acético glacial; la solución en disolventes organicos por lo general muestra algu-
2418 Descripción y Solubilidad / Tablas de Referencia nos residuos insolubles; insoluble en acetona, en cloroformo y en éter. Bacitracina Cinc: Polvo blanco a tostado claro, inodoro o con un olor leve. Es higroscópico. Moderadamente soluble en agua. Baclofeno: Polvo cristalino blanco a blanquecino. Es inodoro o prácticamente inodoro. Poco soluble en agua; muy poco soluble en metanol; insoluble en cloroformo. Balsalazida Disódica: Polvo de color anaranjado a amarillo. Fácilmente soluble en agua y en solución salina isotónica; moderadamente soluble en metano! y en alcohol; prácticamente insoluble en cualquier otro disolvente orgánico. Barniz Farmacéutico: Solución de alcohol desnaturalizado. Categoría del NF: Agente de recubrimiento; agente formador de película. Behenato de Glicerilo: [(El título de esta monografíano cambiará hasta el 1ºde diciembre de 2019.) (Antes del 1º de diciembre de 2019, puede mantenerse el uso actual del etiquetado comercial del artículo con el nombre de Behenato de Glicerilo. Se permitirá el uso del nombre Dibehenato de Glicerilo a partir del 1º de diciembre de 2014; sin embargo, el uso de este nombre no será obligatorio hasta el 1ºde diciembre de 2019. La extensión de 60 meses proporcionará a fabricantes y usuarios el tiempo requerido para realizar los cambios necesarios.)] Bendroflumetiazida: Polvo cristalino de color blanco a crema, finamente dividido. Es inodoro o con olor leve. Funde aproximadamente a 220º. Fácilmente soluble en alcohol y en acetona; prácticamente insoluble en agua. Bentonita: Polvo muy fino, inodoro, color beige pálido o crema a grisáceo, no arenoso. Presenta un leve sabor a tierra. Es higroscópico. Insoluble en agua, pero se hincha hasta aproximadamente doce veces su volumen cuando se lo agrega a agua; insoluble en disolventes orgánicos y no se hincha en éstos. Categoría del NF: Agente de suspensión y/o viscosante. Bentonita, Magma: Categoría del NF: Agente de suspensión y/o viscosante. Bentonita Purificada: Polvo fino (micronizado), inodoro e insípido, o escamas pequeñas que son de color crema si se mira la superficie plana o de color tostado a marrón si se miran los bordes. Insoluble en agua y en alcohol. Se hincha cuando se lo agrega a agua o gílcerina. Categoría del NF: Agente de suspensión y/o viscosante. Benzaldehído: Líquido incoloro, marcadamente refractivo. Es afectado por la luz. Poco soluble en a9ua. Miscible con alcohol, con éter y con aceites fijos y volatiles. El peso específico es 1,041-1,046 a 25º (ver Peso Específíc9 (841 )), y el índice de refracción es 1,544-1,546 a 20º (ver Indice de Refracción (831)). Categoría del NF: Saborizantes y fragancia. Benzaldehído, Elíxir Compuesto: Categoría del NF: Vehículo saborizado y/o edulcorado. Benzoato de Alquilo (Cl 2-15): Líquido aceitoso, transparente, prácticamente incoloro. Soluble en acetona, en alcohol, en alcohol isopropílico, en acetato de etilo, en miristato de isopropilo, en palmitato de isopropilo, en lanolina, en aceite mineral, en aceites vegetales y en siliconas volátiles; insoluble en agua, en glicerina y en propilenglicol. Categoría del NF: Vehículo (oleoso); emoliente. Benzoato de Bencilo: Líquido aceitoso, incoloro y transparente, levemente aromático, que produce una marcada sensación de ardor en la lengua. Prácticamente insoluble en agua y en glicerina. Miscible con alcohol, con éter y con cloroformo. Categoría del NF: Disolvente; agente emulsionante; plastificante. Benzoato de Betametasona: Polvo prácticamente inodoro, de color blanco a prácticamente blanco. Funde aproximadamente a 220º, con descomposición. Soluble en alcohol, en metano! y en cloroformo; insoluble en agua.
USP 39 Benzoato de Denatonio: Muy soluble en cloroformo y en metano!; fácilmente soluble en agua y en alcohol; muy poco soluble en éter. Categoría del NF: Desnaturalizante de alcohol; saborizantes y fragancia. Benzoato de Estradiol: Polvo cristalino blanco a blanquecino. Soluble en alcohol y en acetona; poco soluble en éter dietílico; insoluble en agua. Benzoato de Metronidazol: Polvo cristalino blanco a ligeramente amarillo. Fácilmente soluble en cloruro de metileno; soluble en acetona; poco soluble en alcohol; muy poco soluble en éter etílico; prácticamente insoluble en agua. Benzoato de Potasio: Polvo granular o cristalino de color blanco, inodoro o prácticamente inodoro. Es estable al aire. Fácilmente soluble en agua; soluble en alcohol al 90%; moderadamente soluble en alcohol. Categoría del NF: Conservante antimicrobiano; lubricante. Benzoato de Rizatriptán: Polvo cristalino blanco a casi blanco. Soluble en agua; moderadamente soluble en alcohol; poco soluble en cloruro de metileno. Benzoato de Sodio: Polvo granular o cristalino de color blanco, inodoro o prácticamente inodoro. Es estable al aire. Fácilmente soluble en agua; soluble en alcohol al 90%; moderadamente soluble en alcohol. Categoría del NF: Conservante antimicrobiano; lubricante. Benzocaína: Cristales blancos pequeños o polvo cristalino blanco. Es inodoro, estable al aire y presenta propiedades anestésicas locales cuando se aplica en la lengua. Fácilmente soluble en alcohol, en cloroformo y en éter; moderadamente soluble en aceite de almendras y en aceite de oliva; muy poco soluble en agua. Se disuelve en ácidos diluidos. Benzoína: La Benzoína de Sumatra tiene un olor aromático y balsámico. Cuando se calienta no emite olor a pino. Cuando la Benzoína de Sumatra se digiere con agua en ebullición, el olor sugiere cinamatos o estoraque. Su sabor es aromático y ligeramente acre. La Benzoína de Siam tiene un olor similar a la vainilla, balsámico y agradable. Su sabor es aromático y ligeramente acre. Benzonatato: Líquido viscoso, transparente, de color amarillo pálido, con un débil olor característico. Tiene un sabor amargo y presenta propiedades anestésicas locales cuando se aplica en la lengua. Miscible con agua en todas las proporciones. Fácilmente soluble en cloroformo, en alcohol y en benceno. Besilato de Amlodipino: Polvo blanco o casi blanco. Fácilmente soluble en metano!; moderadamente soluble en alcohol; poco soluble en 2-propanol y en agua. Besilato de Atracurio: Polvo blanco a blanco amarillento, poco higroscópico. Muy soluble en acetonitrilo, en alcohol y en cloruro de metileno; soluble en agua. Besilato de Cisatracurio: Polvo blanco a amarillo pálido. Soluble en agua; poco soluble en acetonitrilo, en cloroformo, en metano! y en cloruro de metileno. Besilato de Mesoridazina: Polvo de color blanco a amarillento pálido, con un olor apenas leve. Funde aproximadamente a 178º, con descomposición. Fácilmente soluble en agua, en cloroformo y en metanol. Beta Caroteno: Polvo cristalino o cristales de color rojo o marrón rojizo a marrón violáceo. Soluble en disulfuro de carbono, en benceno y en cloroformo; moderadamente soluble en éter, en éter de petróleo y en aceites vegetales; prácticamente insoluble en metano! y en alcohol; insoluble en agua, en ácidos y en álcalis. Betadex: Polvo cristalino fino de color blanco, prácticamente inodoro, con un sabor levemente dulce. Moderadamente soluble en agua. Categoría del NF: Agente secuestrante; agente quelante y/o complejante. Betametasona: Polvo cristalino, inodoro, blanco a prácticamente blanco. Funde aproximadamente a 240º, con algo de descomposición. Moderadamente soluble en ace-
USP 39 tona, en alcohol, en dioxano y en metano!; muy poco soluble en cloroformo y en éter; insoluble en agua. Bicalutamida: Polvo fino de color blanco a blanquecino. Fácilmente soluble en tetrahidrofurano y en acetona; soluble en acetonitrilo; moderadamente soluble en metano!; poco soluble en alcohol. Bicarbonato de Potasio: Prismas incoloros, transparentes, monoclínicos o polvo granular blanco. Es inodoro y es estable al aire. Sus soluciones son neutras o alcalinas a la fenolftaleína SR. Fácilmente soluble en agua; prácticamente insoluble en alcohol. Categoría del NF: Modificador de pH (agente acidificante/agente alcalinizante/agente amortiguador). Bicarbonato de Sodio: Polvo cristalino blanco. Es estable al aire seco pero se descompone lentamente en aire húmedo. Recién preparadas con agua fría y sin agitar, sus soluciones son alcalinas al tornasol. La alcalinidad aumenta cuando se dejan en reposo las soluciones, cuando se las agita o cuando se las calienta. Soluble en agua; insoluble en aícohol. Categoría del NF: Modificador de pH (agente acidificante/agente alcalinizante/agente amortiguador). Biotina: Polvo cristalino prácticamente blanco. Muy poco soluble en agua y en alcohol; insoluble en otros disolventes orgánicos comunes. Biperideno: Polvo cristalino blanco, prácticamente inodoro. Fácilmente soluble en cloroformo; moderadamente soluble en alcohol; prácticamente insoluble en agua. Bisacodilo: Polvo cristalino blanco a blanquecino, en el cual predomina el número de partículas menores de 50 µm en su diámetro mayor. Soluble en cloroformo y en benceno; moderadamente soluble en alcohol y en metano!; poco soluble en éter; prácticamente insoluble en agua. Bisulfato de Clopidogrel: Polvo blanco a blanquecino. Fácilmente soluble a un pH de 1; prácticamente insoluble a pH neutro. Bisulfito de Sodio: Polvo cristalino blanco. Fácilmente soluble en agua fría y en agua caliente; moderadamente soluble en aícohol. Categoría del NF: Antioxidante. Bitartrato de Colina: Polvo cristalino, higroscópico, blanco. Líquido transparente e incoloro en solución. Funde entre 148º y 153º. Es inodoro o puede tener un olor tenue a trimetilamina. Fácilmente soluble en agua; poco soluble en alcohol; insoluble en éter y en cloroformo. Bitartrato de Epinefrina: Polvo cristalino blanco, o blanco grisáceo o gris amarronado claro, inodoro. Se oscurece lentamente al exponerse al aire y a la luz. Sus soluciones son ácidas al tornasol con un pH de aproximadamente 3,5. Fácilmente soluble en agua; poco soluble en alcohol; prácticamente insoluble en cloroformo y en éter. Bitartrato de Epinefrina para Solución Oftálmica: Sólido blanco a blanquecino. Bitartrato de Fenilefrina: Cristales incoloros o polvo de color blanco o casi blanco. Fácilmente soluble en agua. Bitartrato de Fenilpropanolamina: Polvo cristalino blanco. Bitartrato de Hidrocodona: Cristales blancos, finos o polvo cristalino. Es afectado por la luz. Soluble en agua; poco soluble en alcohol; insoluble en éter y en cloroformo. Bitartrato de Norepinefrina: Polvo cristalino blanco o ligeramente gris e inodoro. Se oscurece lentamente al exponerse al aire y a la luz. Sus soluciones son ácidas al tornasol, con un pH de aproximadamente 3,5. Fácilmente soluble en agua; poco soluble en alcohol; prácticamente insoluble en cíoroformo y en éter. Funde a una temperatura entre 98º y 104º sin secar previamente la muestra, y la sustancia fundida es turbia. Bitartrato de Norepinefrina, Inyección: Líquido incoloro o prácticamente incoloro, que se oscurece gradualmente al exponerse al aire y a la luz. Bitartrato de Potasio: Cristales incoloros o ligeramente opacos o polvo cristalino blanco. Una solución saturada es
Tablas de Referencia/ Descripción y Solubilidad 2419 ácida al tornasol. Soluble en agua en ebullición; poco soluble en agua; muy poco soluble en alcohol. Borato de Epinefrilo, Solución Oftálmica: Líquido transparente, amarillo pálido, que se oscurece gradualmente al exponerse a la luz y al aire. Borato de Sodio: Cristales incoloros, transparentes, o polvo cristalino blanco. Es inodoro. Sus soluciones son alcalinas a la fenolftaleína SR. Como eflorece en aire tibio y seco, a menudo los cristales están recubiertos por una capa de polvo blanco. Fácilmente soluble en agua en ebullición y en glicerina; soluble en agua; insoluble en alcohol. Categoría del NF: Modificador de pH (agente acidificante/agente alcalinizante/agente amortiguador); conservante ant1microbiano; agente emulsionante. Brinzolamida: Polvo blanco o casi blanco. Poco soluble en alcohol y en metano!; insoluble en agua. Bromhidrato de Citalopram: Polvo cristalino blanco a casi blanco. Soluble en alcohol; moderadamente soluble en agua y en alcohol deshidratado. Bromhidrato de Dextrometorfano: Polvo cristalino o cristales prácticamente blancos, con un olor leve. Funde aproximadamente a 126º, con descomposición. Fácilmente soluble en alcohol y en cloroformo; moderadamente soluble en agua; insoluble en éter. Bromhidrato de Escopolamina: Cristales incoloros o blancos, o polvo granular blanco. Funde aproximadamente a 197°, con descomposición. Es inodoro y ligeramente eflorescente en aire seco. Fácilmente soluble en agua; soluble en alcohol; poco soluble en cloroformo; insoluble en éter. Bromhidrato de Galantamina: Polvo blanco a casi blanco. Soluble en hidróxido de sodio O, 1 N; moderadamente soluble en agua; muy poco soluble en alcohol; insoluble en n-propanoL Bromhidrato de Hidroxianfetamina: Polvo cristalino blanco. Sus soluciones son ligeramente ácidas al tornasol, con un pH de aproximadamente 5. Fácilmente soluble en agua y en alcohol; poco soluble en cloroformo; prácticamente insoluble en éter. Bromhidrato de Hiosciamina: Polvo cristalino o cristales de color blanco, inodoros. El pH de una solución (1 en 20) es de aproximadamente 5,4. Es afectado por la luz. Fácilmente soluble en agua; en alcohol y en cloroformo; muy poco soluble en éter. Bromhidrato de Homatropina: Cristales blancos o polvo cristalino blanco. Se oscurece lentamente al exponerse a la luz. Fácilmente soluble en agua; moderadamente soluble en alcohol; poco soluble en cloroformo; insoluble en éter. Funde entre 214º y 217º, con ligera descomposición. Bromuro de Cetrimonio: Polvo voluminoso de libre fluidez, de color blanco a blanco cremoso, con un débil olor característico y un sabor amargo jabonoso. Fácilmente soluble en ª,9ua y en alcohol, prácticamente insoluble en éter. Categona del NF: Conservante antimicrobiano. Bromuro de Clidinio: Polvo cristalino blanco a casi blanco, prácticamente inodoro. Es ópticamente inactivo. Funde aproximadamente a 242º. Soluble en agua y en alcohol; poco soluble en benceno y en éter. Bromuro de Demecario: Polvo cristalino blanco o ligeramente amarillo, levemente higroscópico. Fácilmente soluble en agua y en alcohol; soluble en eter; moderadamente soluble en acetona. Bromuro de lpratropio: Polvo cristalino blanco a blanquecino. Fácilmente soluble en metano!; soluble en agua; poco soluble en alcohol. Bromuro de Pancuronio: Polvo cristalino de color blanco, blanco amarillento o levemente rosado. Es higroscópico. Fácilmente soluble en agua, en cloruro de metileno y en alcohol. Bromuro de Piridostigmina: Polvo cristalino de color blanco o prácticamente blanco, con un olor agradable característico. Es higroscópico. Fácilmente soluble en agua, en
2420 Descripción y Solubilidad / Tablas de Referencia alcohol y en cloroformo; poco soluble en éter de petróleo; prácticamente insoluble en éter. Bromuro de Potasio: Polvo cristalino blanco o cristales cúbicos incoloros. Fácilmente soluble en agua y en glicerol; poco soluble en alcohol. Bromuro de Propantelina: Cristales blancos o prácticamente blancos. Es inodoro y tiene un sabor amargo. Funde aproximadamente a 160º, con descomposición. Muy soluble en agua, en alcohol y en cloroformo; prácticamente insoluble en éter y en benceno. Bromuro de Rocuronio: Casi blanco o amarillo pálido. Polvo levemente higroscópico. Fácilmente soluble en agua y en alcohol deshidratado. Bromuro de Sodio: Polvo cristalino blanco o cristales cúbicos incoloros. Fácilmente soluble en agua; soluble en alcohol. Bromuro de Vecuronio: Polvo cristalino o cristales de color blanco o blanco cremoso. Moderadamente soluble en alcohol; poco soluble en agua y en acetona. Budesónida: Polvo cristalino blanco a blanquecino, inodoro. Fácilmente soluble en cloroformo; moderadamente soluble en alcohol; prácticamente insoluble en agua y en heptano. Bumetanida: Polvo prácticamente blanco. Soluble en soluciones alcalinas; poco soluble en agua. Busulfano: Polvo cristalino blanco. Moderadamente soluble en acetona; poco soluble en alcohol; muy poco soluble en agua. Butabarbital: Polvo cristalino blanco, inodoro. Soluble en alcohol, en cloroformo, en éter y en soluciones de hidróxidos y carbonatos alcalinos; muy poco soluble en agua. Butabarbital Sódico: Polvo blanco, con sabor amargo. Fácilmente soluble en agua y en alcohol; prácticamente insoluble en éter absoluto. Butalbital: Polvo blanco, cristalino, inodoro, con un leve sabor amargo. Es estable al aire. Su solución saturada es ácida al tornasol. Fácilmente soluble en alcohol, en éter y en cloroformo; soluble en agua en ebullición y en soluciones de álcalis fijos y carbonatos alcalinos; poco soluble en agua fría. Butambén: Polvo cristalino blanco. Es inodoro e insípido. Soluble en ácidos diluidos, en alcohol, en cloroformo, en éter y en aceites fijos; muy poco soluble en agua. Se hidroliza lentamente cuando se hierve con agua. Butano: Gas incoloro e inflamable (la temperatura de ebullición es de aproximadamente -0,5º). Un volumen de agua disuelve O, 15 volúmenes y 1 volumen de alcohol disuelve 18 volúmenes a 1 7º y 770 mm; 1 volumen de éter o cloroformo a 17º disuelve 25 ó 30 volúmenes, respectivamente. La presión de vapor a 21 º es de aproximadamente 1620 mm de mercurio (1 7 psig). Categoría del NF: Propelente. Butil Hidroxianisol: Sólido ceroso, blanco o ligeramente amarillo con un olor leve característico. Fácilmente soluble en alcohol, en propilenglicol, en cloroformo y en éter; insoluble en agua. Categoría del NF: Antioxidante. Butil Hidroxitolueno: Sólido cristalino blanco con un olor leve característico. Fácilmente soluble en alcohol, en cloroformo y en éter; insoluble en agua y en propilenglicol. Categoría del NF: Antioxidante. Butilenglicol: Líquido transparente, incoloro, higroscópico, viscoso. Miscible con agua, con acetona y con éter en todas las proporciones; inmiscible con aceites fijos. Disuelve la mayoría de los aceites esenciales y sustancias saborizantes sintéticas. Categoría del NF: Disolvente; agente humectante y/o solubilizante. Butilparabeno: Cristales incoloros pequeños o polvo blanco. Fácilmente soluble en acetona, en alcohol, en éter y en propilenglicol; muy poco soluble en agua y en glicerina. Categoría del NF: Conservante antimicrobiano. Butirato de Hidrocortisona: Polvo cristalino blanco a prácticamente blanco e inodoro. Fácilmente soluble en clo-
USP 39 roformo; soluble en metano!, en alcohol y en acetona; poco soluble en éter; prácticamente insoluble en agua. Butirato de Sodio: Polvo transparente, incoloro e higroscópico. Soluble en agua y en metano!. El intervalo de fusión es de aproximadamente 250º a 253º. Cabergolina: Polvo cristalino o amorfo de color blanco o casi blanco. Fácilmente soluble en alcohol (96%); poco soluble en ácido clorhídrico O, 1 M; muy poco soluble en hexano; prácticamente insoluble en agua. Cafeína: Polvo blanco o agujas blancas brillantes, generalmente unidas en forma compacta. Es inodoro y tiene un sabor amargo. Sus soluciones son neutras al tornasol. El hidrato es eflorescente al aire seco. Fácilmente soluble en cloroformo; moderadamente soluble en agua y en alcohol; poco soluble en éter. Cal: Masas o gránulos duros de color blanco o blanco grisáceo, o polvo blanco o blanco grisáceo. Es inodoro. Poco soluble en agua; muy poco soluble en agua en ebullición. Cal Baritada: Gránulos de color blanco o blanco grisáceo. Puede tener color si se ha agregado un indicador. Categoría del NF: Sorbente de dióxido de carbono. Cal Sodada: Gránulos de color blanco o blanco grisáceo. Puede tener algo de color si se le ha ª$!regado un indicador. Categoría del NF: Sorbente de dioxido de carbono. Calamina: Polvo fino, rosado, inodoro, prácticamente insípido. Soluble en ácidos minerales; insoluble en agua. Calcitriol: Cristales blancos o casi blancos. Fácilmente soluble en alcohol; soluble en éter y aceites grasos; prácticamente insoluble en agua. Es sensible al aire, al calor y a la luz. Candesartán Cilexetilo: Polvo de color blanco a blanquecino. Moderadamente soluble en metano!; prácticamente insoluble en agua. Caolín: Polvo o grumos suaves de color blanco o blanco amarillento. Tiene un sabor a tierra o arcilla y, cuando se humedece con agua, adquiere un color más oscuro y desarrolla un marcado olor similar al de la arcilla. Insoluble en agua, en ácidos diluidos fríos y en soluciones de hidróxidos alcalinos. Categoría del NF: Diluyente; agente de suspensión y/o viscosante. Capecitabina: Polvo cristalino blanco a blanquecino. Fácilmente soluble en metano!; soluble en acetonitrilo y en alcohol; moderamente soluble en agua. Caprilato de Sodio: Polvo cristalino blanco. Muy soluble o fácilmente soluble en agua; fácilmente soluble en ácido acético; moderadamente soluble en alcohol; prácticamente insoluble en acetona. Caproato de Hidroxiprogesterona: Polvo cristalino blanco o blanco cremoso. Es inodoro o tiene un olor leve. Soluble en éter; poco soluble en benceno; insoluble en agua. Capsaicina: Polvo blanquecino. Funde aproximadamente a 65º. Soluble en alcohol, en benceno y en cloroformo; muy poco soluble en disulfuro de carbono; prácticamente insoluble en agua fría. Captopril: Polvo cristalino, blanco a blanquecino que puede tener un olor característico parecido al sulfuro. Funde en el intervalo de 104º a 11 Oº. Fácilmente soluble en agua, en metano!, en alcohol y en cloroformo. Caramelo: Líquido espeso y marrón oscuro que posee el olor característico del azúcar quemado y un sabor agradable y amargo. Una parte disuelta en 1000 partes de agua produce una solucion transparente de un color anaranjado amarillento distintivo. El color de esta solución no cambia ni se forma precipitado después de exponerse a la luz solar durante 6 horas. Al extenderlo en una capa delgada sobre una placa de vidrio, parece homogéneo, marrón rojizo y transparente. Miscible con agua. Soluble en alcohol diluido hasta un 55% (v/v). No miscible con éter, con cloroformo,
USP 39 con acetona, con benceno ni con éter de petróleo. Categoría del NF: Agente de colorante. Carbacol: Polvo blanco. Fácilmente soluble en agua; moderadamente soluble en alcohol; prácticamente insoluble en cloroformo y en éter. Carbamazepina: Polvo blanco a blanquecino. Soluble en alcohol y en acetona; prácticamente insoluble en agua. Carbenicilina Disódica: Polvo cristalino blanco a blanquecino. Fácilmente soluble en agua; soluble en alcohol; prácticamente insoluble en cloroformo y en éter. Carbenicilina lndanilo Sódica: Polvo blanco a blanquecino. Soluble en agua y en alcohol. Carbidopa: Polvo blanco a blanco cremoso, inodoro o prácticamente inodoro. Fácilmente soluble en ácido clorhídrico 3 N; poco soluble en agua y en metano!; prácticamente insoluble en alcohol, en acetona, en cloroformo y en éter. Carbol-Fucsina, Solución Tópica: Líquido púrpura oscuro, que parece rojo purpúreo cuando se extiende en una película delgada. Carbómero 910: Polvo poco denso blanco con un olor leve característico. Es higroscópico. El pH de una dispersión 1 en 100 es de aproximadamente 3. Cuando se neutraliza con hidróxidos alcalinos o con aminas, se disuelve en agua, en alcohol y en glicerina. Categoría del NF: Agente de suspensión y/o viscosante. Carbómero 934: Ver Carbómero 970. Carbómero 934P: Ver Carbómero 970. Carbómero 940: Ver Carbómero 97 O. Carbómero 941: Ver Carbómero 9 7O. Carbómero 1342: Ver Carbómero 970. Carbón Activado: Polvo fino, negro, inodoro e insípido, sin materia arenosa. Categoría del NF: Sorbente. Carbonato de Amonio: Polvo blanco o masas duras, blancas o translúcidas, con un fuerte olor a amoníaco, sin empireuma y con un sabor intenso a amoníaco. Sus soluciones son alcalinas al tornasol. Cuando se expone al aire, pierde amoníaco y dióxido de carbono, tornándose opaco y finalmente se convierte en grumos porosos friables o en un polvo blanco de bicarbonato de amonio. Fácilmente soluble en agua, pero se descompone en agua caliente. Categoría del NF: Modificador de pH (agente acidificante/agente alcalinizante/agente amortiguador). Carbonato de Calcio: Polvo microcristalino fino, blanco, inodoro, insípido. Es estable al aire. Prácticamente insoluble en agua. Su solubilidad en agua aumenta con la presencia de cualquier sal de amonio o de dióxido de carbono. La presencia de cualquier hidróxido alcalino reduce su solubilidad. Insoluble en alcohol. Se disuelve con efervescencia en ácido acético 1 N, en ácido clorhídrico 3 N y en ácido nítrico 2 N. Categoría del NF: Diluyente; modificador de pH (agente acidificante/agente alcalinizante/agente amortiguador); agente de recubrimiento; aglutinante por vía húmeda. Carbonato de Litio: Polvo blanco, granular e inodoro. Moderadamente soluble en agua; muy poco soluble en alcohol. Se disuelve, con efervescencia, en ácidos minerales diluidos. Carbonato de Magnesio: Masas blancas, friables y livianas o polvo blanco y voluminoso. Es inodoro y es estable al aire. Prácticamente insoluble en agua a la cual, sin embargo, proporciona una reacción levemente alcalina; insoluble en alcohol, pero se disuelve con efervescencia por el agregado de ácidos diluidos. Categoría del NF: Diluyente. Carbonato de Sodio: Cristales incoloros o gránulos o polvo cristalino de color blanco. Es estable al aire en condiciones normales. Cuando se expone a aire seco por encima de los 50º, la sal hidratada eflorece y, a 100º, se vuelve anhidra. Muy soluble en agua en ebullición; fácilmente soluble en agua. Categoría del NF: Modificador de pH (agente acidificante/agente alcalinizante/agente amortiguador).
Tablas de Referencia / Descripción y Solubilidad 2421 Carbonato Sódico de Dihidroxialuminio: Polvo fino, blanco e inodoro. Soluble en ácidos minerales diluidos con la liberación del dióxido de carbono; prácticamente insoluble en agua y en disolventes orgánicos. Carboprost Trometamina: Polvo blanco a blanquecino. Soluble en agua. Carboximetilcelulosa Cálcica: Polvo blanco a blanco amarillento. Es higroscópico. Prácticamente insoluble en alcohol, en acetona, en éter, en cloroformo y en benceno. Se hincha con agua para formar una suspensión; el pH de la suspensión, obtenida al agitar 1 g con 100 mL de agua, está entre 4,5 y 6,0. Categoría del NF: Agente de suspensión y/o viscosante; agente de recubrimiento; agente emulsionante; agente formador de película; desintegrante. Carboximetilcelulosa Sódica: Polvo o gránulos de color blanco a crema. El polvo es higroscópico. Se dispersa fácilmente en agua y forma soluciones coloidales. Insoluble en alcohol, en éter y en la mayoría de los otros disolventes orgánicos. Categoría del NF: Agente de recubrimiento; agente de suspensión y/o viscosante; aglutinante por vía húmeda; agente formador de película; agente modificador de liberación; desintegrante. Carboximetilcelulosa Sódica 12: Polvo o gránulos incoloros o blancos a blanquecinos. Es inodoro. La solubilidad del agua depende del grado de sustitución (se dispersa fácilmente en agua a cualquier temperatura, formando una solución coloidal transparente). Insoluble en acetona, en alcohol, en éter y en tolueno. Categoría del NF: Agente de suspensión y/o viscosante. Carboximetilcelulosa Sódica de Baja Sustitución: Polvo o fibras cortas de color blanco o casi blanco. Prácticamente insoluble en acetona, en alcohol y en tolueno. Se hincha en agua y forma un gel. Carboximetilcelulosa Sódica Hidrolizada Ezimáticamente: Polvo fibroso o ,9ranular de color blanco o levemente amarillento o grisaceo, inodoro, levemente higroscópico. Soluble en agua; insoluble en alcohol. Cate9oría del NF: Agente de recubrimiento; agente de suspensión y/o viscosante; agente formador de película. Carisoprodol: Polvo cristalino blanco, con un leve olor característico y sabor amargo. Fácilmente soluble en alcohol, en cloroformo y en acetona; muy poco soluble en agua. Carmelosa: Polvo blanco. Prácticamente insoluble en etanol (99,5%). Se hincha en agua y forma una suspensión. Se vuelve viscoso en hidróxido de sodio SR. Es higroscópico. Categoría del NF: A!;Jente de suspensión y/o viscosante; polímeros para uso oftalmico. Carmustina: Polvo amarillo claro. Fácilmente soluble en éter. Carprofeno: Polvo cristalino blanco. Fácilmente soluble en éter, en acetona, en acetato de etilo y en hidróxido de sodio SR o carbonato de sodio SR; prácticamente insoluble en agua. Carragenina: Polvo wueso a fino, de color amarillento o tostado a blanco. Es practicamente inodoro y tiene un sabor mucilaginoso. Soluble en agua aproximadamente a 80º de temperatura, formando una solución viscosa, transparente o ligeramente opalescente que fluye con rapidez. Se dispersa en agua más rápidamente si es previamente humedecida con alcohol, con glicerina, o con una solución saturada de sacarosa en agua. Categoría del NF: Agente de suspensión y/o viscosante; agente modificador de liberación. Carvedilol: Polvo cristalino blanco o casi blanco. Poco soluble en alcohol; prácticamente insoluble en agua y en ácidos diluidos. Casantranol: Polvo higroscópico, amorfo, de color tostado claro a marrón. Fácilmente soluble en agua, con algún residuo; parcialmente soluble en metanol y alcohol isopropílico caliente; prácticamente insoluble en acetona. Cáscara Sagrada: Tiene un olor distintivo y un sabor amargo y ligeramente acre.
2422 Descripción y Solubilidad /Tablas de Referencia Cefaclor: Polvo cristalino blanco a blanquecino. Poco soluble en agua; prácticamente insoluble en metanol, en cloroformo y en benceno. Cefadroxilo: Polvo cristalino blanco a blanquecino. Poco soluble en agua; prácticamente insoluble en alcohol, en cloroformo y en éter. Cefalexina: Polvo cristalino blanco a blanquecino. Poco soluble en agua; prácticamente insoluble en alcohol, en cloroformo y en éter. Cefalotina Sódica: Polvo cristalino blanco a blanquecino, prácticamente inodoro. Fácilmente soluble en agua, en solución salina SR y en soluciones de dextrosa; insoluble en la mayoría de los disolventes orgánicos. Cefapirina Benzatínica: Polvo cristalino blanco. Soluble en ácido clorhídrico O, 1 N; prácticamente insoluble en agua, en éter y en tolueno; insoluble en alcohol. Cefapirina Sódica: Polvo cristalino, blanco a blanquecino, inodoro o con un olor leve. Muy soluble en agua; insoluble en la mayoría de los disolventes orgánicos. Cefazolina: Polvo cristalino blanco a ligeramente blanquecino, inodoro. Funde aproximadamente de 198º a 200º, con descomposición. Soluble en dimetilformamida y en piridina; moderadamente soluble en acetona; poco soluble en alcohol, en metanol y en agua; muy poco soluble en acetato de etilo, en alcohol isopropílico y en metil isobutil cetona; prácticamente insoluble en benceno, en cloroformo, en éter y en cloruro de metileno. Cefazolina Sódica: Polvo cristalino, prácticamente inodoro, blanco a blanquecino o sólido blanco a blanquecino. Fácilmente soluble en agua, en solución salina SR y en soluciones de dextrosa; muy poco soluble en alcohol; prácticamente insoluble en cloroformo y en éter. Cefdinir: Polvo cristalino blanco a amarillo claro. Moderadamente soluble en solución amortiguadora de fosfato O, 1 M (pH 7); prácticamente insoluble en agua, en alcohol y en éter dietílico. Cefepima para Inyección: Polvo blanco a amarillo pálido. Fácilmente soluble en agua. Cefixima: Polvo cristalino blanco a amarillo claro. Soluble en metanol y en propilenglicol; poco soluble en alcohol, en acetona y en glicerina; muy poco soluble en sorbitol al 70% y en octanol; prácticamente insoluble en éter, en acetato de etilo, en hexano y en agua. Cefmetazol Sódico: Sólido blanco. Muy soluble en agua y en metanol, soluble en acetona, prácticamente insoluble en cloroformo. Cefonicida Sódica: Sólido blanco a blanquecino. Fácilmente soluble en agua, en solución de cloruro de sodio al 0,9% y en solución de dextrosa al 5%; soluble en metanol; muy poco soluble en alcohol deshidratado. Cefoperazona Sódica: Polvo cristalino blanco a beige pálido. Fácilmente soluble en agua; soluble en metanol; poco soluble en alcohol deshidratado; insoluble en acetona, en acetato de etilo y en éter. Ceforanida: Polvo blanco a blanquecino. Muy soluble en hidróxido de sodio 1 N; prácticamente insoluble en agua, en metanol, en cloroformo y en éter. Cefotaxima Sódica: Polvo cristalino blanquecino a amarillo pálido. Fácilmente soluble en agua, prácticamente insoluble en disolventes orgánicos. Cefoxitina Sódica: Polvo o gránulos, de color blanco a blanquecino, con un olor leve característico. Es algo higroscópico. Muy soluble en agua; soluble en metanol; moderadamente soluble en dimetilformamida; poco soluble en acetona; insoluble en éter y en cloroformo. Cefpodoxima Proxetilo: Polvo blanco a blanco amarronado claro. Es inodoro o con un olor leve y tiene un sabor amargo. Fácilmente soluble en alcohol deshidratado; soluble en acetonitrilo y en metanol; poco soluble en éter; muy poco soluble en agua.
USP 39 Cefradina: Polvo cristalino blanco a blanquecino. Moderadamente soluble en agua; muy poco soluble en alcohol y en cloroformo; prácticamente insoluble en éter. Ceftazidima: Polvo cristalino blanco a color crema. Soluble en álcalis y en dimetil sulfóxido; poco soluble en dimetilformamida, en metanol y en agua; insoluble en acetona, en alcohol, en cloroformo, en dioxano, en éter, en acetato de etilo y en tolueno. Ceftizoxima Sódica: Polvo cristalino blanco a amarillo pálido. Fácilmente soluble en agua. Ceftriaxona Sódica: Polvo cristalino blanco a anaranjado amarillento. Fácilmente soluble en agua; moderadamente soluble en metanol, muy poco soluble en alcohol. Cefuroxima Axetilo: Polvo blanco a casi blanco. La forma amorfa es fácilmente soluble en acetona; soluble en cloroformo, en acetato de etilo y en metanol; poco soluble en alcohol deshidratado; insoluble en éter y en agua. La forma cristalina es fácilmente soluble en acetona; moderadamente soluble en cloroformo, en acetato de etilo y en metanol; poco soluble en alcohol deshidratado; insoluble en éter y en agua. Cefuroxima Sódica: Polvo blanco o levemente amarillo. Fácilmente soluble en agua; soluble en metanol; muy poco soluble en alcohol, en éter, en acetato de etilo y en cloroformo. Celaburato: Polvo o gránulos finos de color blanco o casi blanco. Disponible en una gama de viscosidades y contenidos de acetilo y butilo. Ligeramente higroscópico; soluble en acetona, en cloruro de metileno, en piridina y en dimetil sulfóxido; prácticamente insoluble en agua y en alcohol. Categoría del NF: Agente de recubrimiento; polímero de membrana; agente formador de película; agente modificador de liberación; diluyente. Celacefato: Polvo blanco de libre fluidez. Puede presentar un leve olor a ácido acético. Soluble en acetona y en dioxano; insoluble en agua y en alcohol. Categoría del NF: Agente de recubrimiento; agente formador de película. Celecoxib: Polvo amorfo o cristalino, de color blanco o casi blanco. Soluble a fácilmente soluble en etanol; soluble en cloruro de metileno; prácticamente insoluble en agua. Celulosa en Polvo: Polvo blanco o casi blanco. Presenta grados de finura que varían de un polvo denso de libre fluidez a un material grueso, poco denso y sin fluidez. Poco soluble en solución de hidróxido de sodio (1 en 20); insoluble en agua, en ácidos diluidos y en casi todos los disolventes orgánicos. Categoría del NF: Auxiliar de filtración; sorbente; diluyente; desintegrante; deslizante y/o agente antiaglutinante; agente de suspensión y/o viscosante. Celulosa Microcristalina: Polvo fino, de color blanco o casi blanco. Está compuesta por partículas no fibrosas de libre fluidez. Prácticamente insoluble en solución de hidróxido de sodio (1 en 20); insoluble en agua, en ácidos diluidos y en la mayoría de los disolventes orgánicos. Categoría del NF: Diluyente; desintegrante; aglutinante por vía húmeda; agente de suspensión y/o viscosante. Celulosa Microcristalina Silicificada: Polvo muy fino a moderadamente fino, de color blanco o casi blanco. Es un material de libre fluidez que puede compactarse en tabletas autoaglutinantes que se desintegran rápidamente en agua. Poco soluble en solución de hidróxido de sodio (1 en 20); prácticamente insoluble en agua, en acetona, en etanol, en tolueno y en ácido diluido. Categoría del NF: Diluyente; desintegrante; aglutinante por vía húmeda. Celulosa Microcristalina y Carboximetilcelulosa Sódica: Polvo grueso a fino, de color blanco a blanquecino, inodoro e insípido. Se hincha en agua, produciendo una dispersión o un gel blanco y opaco cuando se dispersa. Insoluble en disolventes orgánicos y ácidos diluidos. Categoría del NF: Agente de suspension y/o viscosante. Celulosa Oxidada: En forma de gasa o fibras. Es de color levemente blanquecino, de gusto ácido y tiene un li-
USP 39
gero olor a sustancia carbonizada. Soluble en álcalis diluidos; insoluble en agua y en ácidos. Celulosa Regenerada Oxidada: Tela tejida, por lo general en forma de tiras estériles. Levemente blanquecina, con un olor leve. Soluble en álcalis diluidos; insoluble en agua y en ácidos diluidos. Cera Amarilla: Sólido de color variable, de amarillo a marrón grisáceo. Tiene un olor agradable parecido al de la miel. Es un tanto quebradiza cuando está fría y al quebrarse presenta una fractura opaca, granular, no cristalina. Se torna flexible con el calor de la mano. El peso específico es aproximadamente 0,95. Moderadamente soluble en alcohol frío; insoluble en agua. El ácido cerótico y una porción de la miricina, componentes de la Cera Amarilla, se disuelven con alcohol en ebullición. Soluble en cloroformo, en éter, en aceites fijos y en aceites volátiles; poco soluble en benceno frío y en disulfuro de carbono frío; soluble en estos líquidos aproximadamente a 30º. Categoría del NF: Agente espesante. Cera Blanca: Sólido blanco amarillento, algo translúcido en capas finas. Tiene un leve olor característico y está exento de rancidez. El peso específico es aproximadamente 0,95. Moderadamente soluble en alcohol frío; insoluble en agua. El ácido cerótico y una porción de la miricina, componentes de la Cera Blanca, se disuelven con alcohol en ebullición. Completamente soluble en cloroformo, en éter y en aceites fijos y volátiles. Parcialmente soluble en benceno frío y en disulfuro de carbono frío; completamente soluble en estos líquidos aproximadamente a 30º. Categoría del NF: Agente espesante. Cera de Candelilla: Cera dura de color marrón amarillento, de opaca a translúcida. El peso específico es aproximadamente 0,983. Soluble en cloroformo y en tolueno; insoluble en agua. Cera de Carnaúba: Polvo o escamas moderadamente gruesos, de color marrón claro a amarillo pálido, con un olor leve característico y exento de rancidez. El peso específico es aproximadamente 0,99. Fácilmente soluble en benceno tibio; soluble en cloroformo tibio y en tolueno tibio; poco soluble en alcohol en ebullición; insoluble en agua. Categoría del NF: Agente de recubrimiento. Cera Emulsionante: Sólido ceroso de color blanco cremoso, con un olor leve característico. Fácilmente soluble en éter, en cloroformo, en la mayoría de los disolventes hidrocarbonados y en propelentes de aerosoles; soluble en alcohol; insoluble en agua. Categoría del NF: Agente emulsionante; agente humectante y/o solubilizante; agente espesante. Cera Microcristalina: Sólido ceroso de color blanco a crema, inodoro. Soluble en cloroformo, en éter, en aceites volátiles y en la mayoría de los aceites fijos tibios; moderadamente soluble en alcohol deshidratado; insoluble en agua. Categoría del NF: Agente de recubrimiento; agente espesante. Cetoestearil Sulfato de Sodio: Polvo blanco o amarillo pálido, amorfo o cristalino. Soluble en agua caliente dando una solución opalescente; poco soluble en alcohol; prácticamente insoluble en agua fría. Categoría del NF: Agente emulsionante. Cianocobalamina: Cristales color rojo oscuro o polvo rojo amorfo o cristalino. La forma anhidra es muy higroscópica y, cuando se la expone al aire, puede absorber aproximadamente un 12% de agua. Soluble en alcohol; moderadamente soluble en agua; insoluble en acetona, en cloroformo y en éter. Cianocobalamina Co 57, Cápsulas: Pueden contener una pequeña cantidad de sólido(s) o pueden parecer vacías. Cianocobalamina Co 57, Solución Oral: Solución transparente, de incolora a rosada. Ciclandelato: Polvo cristalino blanco. Muy soluble en acetonitrilo, en alcohol y en éter; prácticamente insoluble en agua. Funde aproximadamente a 58º.
Tablas de Referencia / Descripción y Solubilidad 2423 Ciclofosfamida: Polvo cristalino blanco. Se licua ante la pérdida del agua de cristalización. Soluble en agua y en alcohol. Ciclopirox: Polvo cristalino blanco a blanco ligeramente amarillento. Fácilmente soluble en etanol y en cloruro de metileno; soluble en éter; poco soluble en agua. Ciclopirox Olamina: Polvo cristalino blanco a blanco ligeramente amarillento. Muy soluble en alcohol y en cloruro de metileno; poco soluble en agua; prácticamente insoluble en ciclohexano. Ciclopropano: Gas incoloro con olor característico. Tiene un sabor acre. Un L a una presión de 760 mm y a una temperatura de Oº pesa aproximadamente 1,88 g. Un volumen se disuelve en aproximadamente 2,7 volúmenes de agua a 15º. Fácilmente soluble en alcohol; soluble en aceites
fiJOS. Cicloserina: Polvo cristalino blanco a amarillo pálido. Es inodoro o tiene un olor tenue. Es higroscópico y se deteriora al absorber agua. Sus soluciones son dextrógiras. Fácilmente soluble en agua. Ciclosporina: Polvo blanco a casi blanco. Soluble en acetona, en alcohol, en metanol, en éter, en cloroformo y en cloruro de metileno; poco soluble en hidrocarburos saturados; prácticamente insoluble en agua. Cilastatina Sódica: Polvo de color blanco a tostado. Soluble en agua y en metanol. Cilostazol: Cristales blancos a blanquecinos. Fácilmente soluble en cloroformo; poco soluble en metanol y en alcohol; prácticamente insoluble en agua. Cimetidina: Polvo cristalino, blanco a blanquecino, inodoro o con un olor leve a mercaptano. Fácilmente soluble en metanol; soluble en alcohol y en polietilenglicol 400; moderadamente soluble en alcohol isopropílico; poco soluble en agua y en cloroformo; prácticamente insoluble en éter. Cinoxacino: Sólido cristalino blanco a blanco amarillento. Es inodoro, tiene un sabor amargo y un resabio persistente. Soluble en solución alcalina; insoluble en agua y en la mayoría de los disolventes orgánicos comunes. Cipionato de Estradiol: Polvo cristalino, blanco a prácticamente blanco. Es inodoro o tiene un olor leve. Soluble en alcohol, en acetona, en cloroformo y en dioxano; moderadamente soluble en aceites vegetales; insoluble en agua. Cipionato de Testosterona: Polvo cristalino blanco o blanco cremoso. Es inodoro o tiene un olor leve y es estable al aire. Fácilmente soluble en alcohol, en cloroformo, en dioxano y en éter; soluble en aceites vegetales; insoluble en agua. Ciromazina: Polvo cristalino blanco o blanquecino, inodoro. Poco soluble en metanol y en agua. Cisaprida: Polvo blanco o casi blanco. Fácilmente soluble en dimetilformamida; soluble en cloruro de metileno; moderadamente soluble en metanol; prácticamente insoluble en agua. Citarabina: Polvo cristalino, inodoro, blanco a blanquecino. Fácilmente soluble en agua; poco soluble en alcohol y en cloroformo. Citrato de Acetiltributilo: Líquido aceitoso, transparente, prácticamente incoloro. Fácilmente soluble en alcohol, en alcohol isopropílico, en acetona y en tolueno; insoluble en agua. Categoría del NF: Plastificante. Citrato de Acetiltrietilo: Líquido aceitoso, transparente, prácticamente incoloro. Fácilmente soluble en alcohol, en alcohol isopropílico, en acetona y en tolueno; insoluble en agua. Categoria del NF: Plastificante. Citrato de Bismuto: Polvo blanco, amorfo o cristalino. Es estable al aire. Funde aproximadamente a 300º, con descomposición. Soluble en amoníaco SR y en soluciones de citratos alcalinos; insoluble en agua y en alcohol. Citrato de Calcio: Polvo cristalino blanco e inodoro. Fácilmente soluble en ácido clorhídrico 3 N diluido y en ácido
2424 Descripción y Solubilidad / Tablas de Referencia nítrico 2 N diluido; poco soluble en agua; insoluble en alcohol. Citrato de Clomifeno: Polvo blanco a amarillo pálido, esencialmente inodoro. Fácilmente soluble en metanol; moderadamente soluble en alcohol; poco soluble en agua y en cloroformo; insoluble en éter. Citrato de Dietilcarbamazina: Polvo cristalino blanco. Funde aproximadamente a 136º, con descomposición. Es inodoro o tiene un leve olor; es ligeramente higroscópico. Muy soluble en agua; moderadamente soluble en alcohol; prácticamente insoluble en acetona, en cloroformo y en éter. Citrato de Feniltoloxamina: Polvo cristalino blanco. Muy soluble en agua en ebullición; poco soluble en agua fría y en alcohol; prácticamente insoluble en acetona fría, en éter etílico y en tolueno. Citrato de Fentanilo: Cristales blancos, brillantes o polvo cristalino blanco. Funde aproximadamente a 150º, con descomposición. Soluble en metanol; moderadamente soluble en agua; poco soluble en cloroformo. Citrato de Litio: Polvo o gránulos blancos, inodoros y delicuescentes, con un sabor refrescante, débilmente alcalino. Fácilmente soluble en agua; poco soluble en alcohol. Citrato de Magnesio, Solución Oral: Líquido incoloro a ligeramente amarillo, transparente, efervescente, con un sabor dulce, acídulo y sabor a limón. Citrato de Monoglicérido: Sólido ceroso, blando, de color blanco a marfil, olor suave y con consistencia similar a la del tocino. Dispersable en la mayoría de los disolventes de grasas comunes y en alcohol; insoluble en agua. Citrato de Orfenadrina: Polvo cristalino blanco, prácticamente inodoro, con sabor amargo. Moderadamente soluble en agua; poco soluble en alcohol; insoluble en cloroformo, en benceno y en éter. Citrato de Piperazina: Polvo cristalino blanco con no más que un olor leve. Su solución (1 en 1O) tiene un pH de aproximadamente 5. Soluble en agua, insoluble en alcohol y en éter. Citrato de Potasio: Cristales transparentes o polvo granular blanco. Es inodoro, tiene un sabor refrescante salino y es delicuescente cuando se expone al aire húmedo. Fácilmente soluble en agua; muy poco soluble en alcohol. Categoría del NF: Modificador de pH (agente acidificante/agente alcalinizante/agente amortiguador); agente quelante y/o complejante. Citrato de Sildenafil: Polvo cristalino blanco o casi blanco, poco higroscópico. Poco soluble en agua y en metano!; prácticamente insoluble en hexano. Citrato de Sodio: Cristales incoloros o polvo cristalino blanco. La forma hidratada es muy soluble en agua en ebullición; fácilmente soluble en agua; insoluble en alcohol. Categoría del NF: Modificador de pH (agente acidificante/ agente alcalinizante/agente amortiguador); agente secuestrante; ligando de transferencia. Citrato de Sodio, Solución Anticoagulante: Líquido transparente e incoloro. Citrato de Sodio y Ácido Cítrico, Solución Oral: Solución transparente con el color de cualquier agente conservante o saborizante agregado. Citrato de Sufentanilo: Polvo blanco. Fácilmente soluble en metanol; soluble en agua; moderadamente soluble en acetona, en alcohol y en cloroformo. Funde entre 133º y 140º. Citrato de Tamoxifeno: Polvo cristalino blanco y fino. Soluble en metanol; muy poco soluble en agua, en acetona, en cloroformo y en alcohol. Funde aproximadamente a 142º, con descomposición. Citrato de Tributilo: Líquido aceitoso, transparente, prácticamente incoloro. Fácilmente soluble en alcohol, en
USP 39
alcohol isopropílico, en acetona y en tolueno; insoluble en agua. Categona del NF: Plastificante. Citrato de Trietilo: Líquido aceitoso, prácticamente incoloro. Soluble en agua. Miscible con alcohol y con éter. Categoría del NF: Plastificante; disolvente. Citrato Dextrosa, Solución Anticoagulante: Líquido transparente, incoloro e inodoro. Es dextrógira. Citrato Fosfato Dextrosa, Solución Anticoagulante: Líquido transparente, incoloro a ligeramente amarillo, inodoro. Es dextrógira. Claritromicina: Polvo cristalino blanco a blanquecino. Soluble en acetona; poco soluble en alcohol deshidratado, en metanol, en acetonitrilo y en solución amortiguadora de fosfato a valores de pH entre 2 y 5; prácticamente insoluble en agua. Clavulanato Potásico: Polvo blanco a blanquecino. Es sensible a la humedad. Fácilmente soluble en agua, pero su estabilidad en soluciones acuosas no es buena, estabilidad óptima a un pH entre 6,0 y 6,3; soluble en metanol, con descomposición. Clioquinol: Polvo voluminoso, esponjoso, blanco amarillento a amarillo amarronado, con un olor leve característico. Se oscurece con su exposición a la luz. Funde aproximadamente a 180º, con descomposición. Soluble en acetato de etilo caliente y en ácido acético glacial caliente; prácticamente insoluble en agua y en alcohol. Clofazimina: Cristales de color rojo oscuro. Funde aproximadamente a 21 7º, con descomposición. Soluble en cloroformo y en benceno; moderadamente soluble en alcohol, en acetona y en acetato de etilo; prácticamente insoluble en agua. Clofibrato: Líquido incoloro a amarillo pálido con un olor característico. Soluble en acetona, en alcohol, en benceno y en cloroformo; insoluble en agua. Clonazepam: Polvo amarillo claro con un olor tenue. Moderadamente soluble en acetona y en cloroformo; poco soluble en alcohol y en éter; insoluble en agua. Clonidina: Polvo cristalino blanco a casi blanco. El punto de fusión es aproximadamente 130º. Fácilmente soluble en metanol y en alcohol. Cloprostenol Sódico: Polvo amorfo blanco o casi blanco. Es higroscópico. Fácilmente soluble en agua, en alcohol y en metanol; prácticamente insoluble en acetona. Clorambucilo: Polvo blanquecino, ligeramente granular. Fácilmente soluble en acetona; soluble en álcali diluido; muy poco soluble en agua. Cloranfenicol: Cristales con forma de aguja o placas alargadas finas de color blanco a blanco grisáceo o blanco amarillento. Sus soluciones son prácticamente neutras al tornasol. Es razonablemente estable en soluciones neutras o moderadamente ácidas. Su solución en alcohol es dextrógira y su solución en acetato de etilo es levógira. Fácilmente soluble en alcohol, en propilenglicol, en acetona y en acetato de etilo; poco soluble en agua. Clorazepato Dipotásico: Polvo cristalino, de color amarillo claro. Se oscurece con su exposición a la luz. Soluble en agua, pero, en reposo, puede precipitar a partir de la solución; poco soluble en alcohol y en alcohol isopropílico; prácticamente insoluble en acetona, en benceno, en cloroformo, en éter y en cloruro de metileno. Clordiazepóxido: Polvo cristalino amarillo, prácticamente inodoro. Sensible a la luz solar. Funde aproximadamente a 240º. Moderadamente soluble en cloroformo y en alcohol; insoluble en agua. Clorhidrato de Acebutolol: Polvo cristalino blanco o casi blanco. Soluble en alcohol y en agua; muy poco soluble en acetona y en cloruro de metileno; prácticamente insoluble en éter. Funde aproximadamente entre 141 º y 144º.
USP 39
Agregar lo siguiente: •Clorh1drato de Ácido Arnínotevulínico: Sólido cri$ta:..
lino de· color blanco a· blanquecino e inodoro. Muy soluble en agua; poco soluble en metano! y en etanol; ptácticarnente inso.luble en cloroformo/ en hexa'no y en aceite mineral.&usP.l9
Clorhidrato de Ácido L-Glutámico: Polvo cristalino blanco. 1 g disuelve en aproximadamente 3 ml de agua. Prácticamente insoluble en alcohol y en éter. Sus soluciones son ácidas al tornasol. Categoría del NF: Saborizantes y fragancia. Clorhidrato de Alfentanilo: Polvo blanco a casi blanco. Fácilmente soluble en metanol, en alcohol y en cloroformo; soluble en agua; moderadamente soluble en acetona. Intervalo del punto de fusión; cristales obtenidos a partir de acetona: l 36º-143º (anhidro) y cristales que se reportan como obtenidos a partir de ácido clorhídrico acuoso: l 16º-126º (monohidrato ). Clorhidrato de Alfuzosina: Polvo blanco a casi blanco, ligeramente higroscópico. Fácilmente soluble en agua; moderadamente soluble en alcohol; prácticamente insoluble en cloruro de metileno. Clorhidrato de Amantadina: Polvo cristalino blanco o prácticamente blanco, con sabor amargo. Fácilmente soluble en agua; soluble en alcohol y en cloroformo. Clorhidrato de Amilorida: Polvo inodoro o prácticamente inodoro, de color amarillo a amarillo verdoso. Fácilmente soluble en dimetil sulfóxido; moderadamente soluble en metano!; poco soluble en agua; insoluble en éter, en acetato de etilo, en acetona y en cloroformo. Clorhidrato de Amiodarona: Polvo cristalino fino blanco o casi blanco. Fácilmente soluble en cloruro de metileno; soluble en metanol; moderadamente soluble en alcohol; muy poco soluble en agua. Clorhidrato de Amitriptilina: Polvo cristalino o pequeños cristales, inodoros o prácticamente inodoros, blancos o prácticamente blancos. Fácilmente soluble en agua, en alcohol, en cloroformo y en metano!; insoluble en éter. Clorhidrato de Amodiaquina: Polvo cristalino amarillo. Es inodoro y tiene un sabor amargo. Soluble en agua; moderadamente soluble en alcohol; muy poco soluble en benceno, en cloroformo y en éter. Clorhidrato de Anagrelida: Polvo de color blanquecino a rosado pálido. Moderadamente soluble en dimetilsulfóxido y en dimetilformamida; muy poco soluble en agua. Clorhidrato de Anileridina: Polvo cristalino blanco o casi blanco e inodoro. Es estable al aire. Funde aproximadamente a 270º, con descomposición. Fácilmente soluble en agua; moderadamente soluble en alcohol; prácticamente insoluble en éter y en cloroformo. Clorhidrato de Apomorfina: Cristales diminutos brillantes, blancos o blancos grisáceos, o polvo blanco. Es inodoro. Adquiere gradualmente un color verde al exponerse a la luz y al aire. Sus soluciones son neutras frente al tornasol. Soluble en agua a 80º; moderadamente soluble en agua y en alcohol; muy poco soluble en cloroformo y en éter. Clorhidrato de Apraclonidina: Polvo blanco a blanquecino, inodoro a prácticamente inodoro. Soluble en metano!; moderadamente soluble en agua y en alcohol; insoluble en cloroformo, en acetato de etilo y en hexanos. Clorhidrato de Arginina: Cristales o polvo cristalino, de color blanco, prácticamente inodoros. Fácilmente soluble en agua. Clorhidrato de Articaína: Polvo cristalino blanco o casi blanco. Fácilmente soluble en agua y en alcohol. Clorhidrato de Atomoxetina: Sólido de color blanco a prácticamente blanco. Moderadamente soluble en agua. Clorhidrato de Azelastina: Polvo cristalino blanco o casi blanco. Soluble en etanol y en cloruro de metileno; moderadamente soluble en agua.
Tablas de Referencia / Descripción y Solubilidad 2425 Clorhidrato de Bacampicilina: Polvo blanco o prácticamente blanco. Es higroscópico. Fácilmente soluble en alcohol y en cloroformo; soluble en cloruro de metileno y en agua; muy poco soluble en éter. Clorhidrato de Benazepril: Polvo cristalino blanco a blanquecino. Soluble en agua, en metano! y en alcohol. Clorhidrato de Benoxinato: Polvo cristalino o cristales de color blanco o levemente blanquecino. Es inodoro o tiene un olor leve característico, su sabor es salado y presenta propiedades anestésicas locales cuando se coloca sobre la lengua. Sus soluciones son neutras al tornasol y funde aproximadamente a 158º. Muy soluble en agua; fácilmente soluble en cloroformo y en alcohol; insoluble en éter. Clorhidrato de Betahistina: Polvo cristalino blanco a casi amarillo. Muy higroscópico. Funde entre 151 º y 154º. Muy soluble en agua; fácilmente soluble en alcohol; prácticamente insoluble en alcohol isopropílico. Clorhidrato de Betaína: Polvo cristalino blanco. Soluble en agua y en alcohol; prácticamente insoluble en cloroformo y en éter. Clorhidrato de Betaxolol: Polvo cristalino blanco. Fácilmente soluble en agua, en alcohol, en cloroformo y en metano!. Clorhidrato de Biperideno: Polvo cristalino blanco, prácticamente inodoro. Funde aproximadamente a 275º, con descomposición. Es ópticamente inactivo. Moderadamente soluble en metanol; poco soluble en agua, en éter, en alcohol y en cloroformo. Clorhidrato de Bromodifenhidramina: Polvo cristalino, de color blanco a beige pálido, con un leve olor característico. Fácilmente soluble en agua y en alcohol; soluble en alcohol isopropílico; insoluble en éter y en éter de petróleo. Clorhidrato de Bupivacaína: Polvo cristalino blanco, inodoro. Funde aproximadamente a 248º, con descomposición. Fácilmente soluble en agua y en alcohol; poco soluble en cloroformo y en acetona. Clorhidrato de Bupivacaína, Inyección: Solución transparente e incolora. Clorhidrato de Bupivacaína y Epinefrina, Inyección: Solución transparente e incolora. Clorhidrato de Bupropión: Polvo blanco. Soluble en agua, en ácido clorhídrico O, 1 N y en alcohol. Clorhidrato de Buspirona: Polvo cristalino blanco. Muy soluble en agua; fácilmente soluble en metanol y en cloruro de metileno; moderadamente soluble en etanol y en acetonitrilo; muy poco soluble en acetato de etilo; prácticamente insoluble en hexanos. Clorhidrato de Cefalexina: Polvo cristalino blanco a blanquecino. Soluble hasta 1O mg por ml en agua, en acetona, en acetonitrilo, en alcohol, en dimetilformamida y en metano!; prácticamente insoluble en cloroformo, en éter, en acetato de etilo y en alcohol isopropílico. Clorhidrato de Cefepima: Sólido no higroscópico, cristalino, de color blanco a blanquecino. Fácilmente soluble en agua. Clorhidrato de Cefmenoxima: Polvo cristalino o cristales de color blanco a amarillo anaranjado claro. Fácilmente soluble en formamida; poco soluble en metanol; muy poco soluble en agua; prácticamente insoluble en alcohol deshidratado y en éter. Clorhidrato de Cetirizina: Polvo blanco a casi blanco. Fácilmente soluble en agua; prácticamente insoluble en acetona y en cloruro de metileno. Clorhidrato de Ciclizina: Polvo cristalino blanco o cristales pequeños e incoloros. Es inodoro o prácticamente inodoro, y tiene un sabor amargo. Funde de manera indistinta aproximadamente a 285º, con descomposición. Moderadamente soluble en cloroformo; poco soluble en agua y en alcohol; insoluble en éter. Clorhidrato de Ciclobenzaprina: Polvo cristalino blanco a blanquecino, inodoro. Fácilmente soluble en agua,
2426 Descripción y Solubilidad / Tablas de Referencia en alcohol y en metanol; moderadamente soluble en isopropanol; poco soluble en cloroformo y en cloruro de metileno; insoluble en hidrocarburos. Clorhidrato de Ciclopentolato: Polvo cristalino blanco que en reposo desarrolla un olor característico. Sus soluciones son ácidas al tornasol. Funde aproximadamente a 1 38º y la sustancia fundida tiene una apariencia opaca. Muy soluble en agua; fácilmente soluble en alcohol; insoluble en éter. Clorhidrato de Ciprofloxacino: Cristales ligeramente amarillentos a amarillo claro. Moderadamente soluble en agua; poco soluble en ácido acético y en metanol; muy poco soluble en alcohol deshidratado; prácticamente insoluble en acetona, en acetonitrilo, en acetato de etilo, en hexano y en cloruro de metileno. Clorhidrato de Ciproheptadina: Polvo cristalino, blanco a ligeramente amarillo, inodoro o prácticamente inodoro. Fácilmente soluble en metanol; soluble en cloroformo; moderadamente soluble en alcohol; poco soluble en agua; prácticamente insoluble en éter. Clorhidrato de Cisteína: Polvo cristalino o cristales de color blanco. Soluble en agua, en alcohol y en acetona. Clorhidrato de Clenbuterol: Polvo cristalino blanco o casi blanco. Soluble en agua y en alcohol; poco soluble en acetona. Funde con descomposición a 173º. Clorhidrato de Clindamicina: Polvo cristalino blanco o prácticamente blanco. Es inodoro o tiene un olor tenue semejante al del mercaptano. Es estable en presencia de aire y luz. Sus soluciones son ácidas y dextrógiras. Fácilmente soluble en agua, en dimetilformamida y en metanol; soluble en alcohol; prácticamente insoluble en acetona. Clorhidrato de Clomipramina: Polvo cristalino blanco a ligeramente amarillo. Muy soluble en agua. Clorhidrato de Clordiazepóxido: Polvo cristalino, inodoro, blanco o prácticamente blanco. Es afectado por la luz solar. Soluble en agua; moderadamente soluble en alcohol; insoluble en éter de petróleo. Clorhidrato de Clorhexidina: Polvo cristalino blanco o casi blanco. Moderadamente soluble en propilenglicol y en agua; muy poco soluble en alcohol. Clorhidrato de Cloroprocaína: Polvo cristalino blanco. Es inodoro y es estable al aire. Sus soluciones son ácidas al tornasol. Presenta propiedades anestésicas locales cuando se coloca sobre la lengua. Soluble en agua; poco soluble en alcohol; muy poco soluble en cloroformo; prácticamente insoluble en eter. Clorhidrato de Cloroquina, Inyección: Líquido incoloro. Clorhidrato de Clorpromazina: Polvo cristalino blanco o blanco ligeramente cremoso e inodoro. Se oscurece con exposición prolongada a la luz. Muy soluble en agua; fácilmente soluble en alcohol y en cloroformo; insoluble en éter y en benceno. Clorhidrato de Clortetraciclina: Polvo cristalino amarillo. Es inodoro y tiene un sabor amargo. Es estable al aire pero es afectado lentamente por su exposición a la luz. Soluble en soluciones de hidróxidos y carbonatos alcalinos; moderadamente soluble en agua; poco soluble en alcohol; prácticamente insoluble en acetona, en cloroformo, en dioxano y en éter. Clorhidrato de Cocaína: Cristales incoloros o polvo cristalino blanco. Muy soluble en agua; fácilmente soluble en alcohol; soluble en cloroformo y en glicerina; insoluble en éter. Clorhidrato de Colestipol: Gránulos amarillos a anaranjados. Se hincha pero no se disuelve en agua ni en soluciones acuosas diluidas de ácido o álcali. Insoluble en los disolventes orgánicos comunes. Clorhidrato de Daunorubicina: Polvo higroscópico, cristalino y de color rojo anaranjado. Fácilmente soluble en agua y en metanol; poco soluble en alcohol; muy poco soluble en cloroformo; prácticamente insoluble en acetona.
USP 39 Clorhidrato de Demeclociclina: Polvo amarillo, cristalino, inodoro, con un sabor amargo. Moderadamente soluble en agua y en soluciones de carbonatos e hidróxidos alcalinos; poco soluble en alcohol; prácticamente insoluble en acetona y en cloroformo. Clorhidrato de Desipramina: Polvo cristalino blanco a blanquecino. Funde aproximadamente a 213º. Fácilmente soluble en metanol y en cloroformo; soluble en agua y en alcohol; insoluble en éter. Clorhidrato de Dexmedetomidina: Polvo blanco o casi blanco. Fácilmente soluble en agua y tiene un pKa de 7, 1. Clorhidrato de Dibucaína: Cristales incoloros, o de color blanco a blanquecino, o polvo cristalino de color blanco a blanquecino. Es inodoro, levemente higroscópico y se oscurece al exponerse a la luz. Sus soluciones tienen un pH de aproximadamente 5,5. Fácilmente soluble en agua, en alcohol, en acetona y en cloroformo. Clorhidrato de Diciclomina: Polvo fino, blanco y cristalino. Es prácticamente inodoro y tiene un sabor muy amargo. Fácilmente soluble en alcohol y en cloroformo; soluble en agua; muy poco soluble en éter. Clorhidrato de Diciclomina, Inyección: Solución transparente que puede tener olor a un conservante. Clorhidrato de Diclonina: Cristales blancos o polvo cristalino blanco, que pueden tener un olor leve. Presenta propiedades anestésicas locales cuando se coloca sobre la lengua. Soluble en agua, en acetona, en alcohol y en cloroformo. Clorhidrato de Dietilpropión: Polvo cristalino fino, blanco a blanquecino. Es inodoro o tiene un olor leve característico. Funde aproximadamente a 175º, con descomposición. Fácilmente soluble en agua, en cloroformo y en alcohol; prácticamente insoluble en éter. Clorhidrato de Difenhidramina: Polvo cristalino blanco, inodoro. Se oscurece lentamente al exponerse a la luz. Sus soluciones son prácticamente neutras al tornasol. Fácilmente soluble en agua, en alcohol y en cloroformo; moderadamente soluble en acetona; muy poco soluble en benceno y en éter. Clorhidrato de Difenoxilato: Polvo cristalino blanco, inodoro. Su solución saturada tiene un pH de aproximadamente 3,3. Fácilmente soluble en cloroformo; soluble en metanol; moderadamente soluble en alcohol y en acetona; poco soluble en agua y en isopropanol; prácticamente insoluble en éter y en éter de petróleo. Clorhidrato de Diltiazem: Pequeños cristales o polvo cristalino blanco e inodoro. Fácilmente soluble en cloroformo, en ácido fórmico, en metanol y en agua; moderadamente soluble en alcohol deshidratado; insoluble en éter. Funde aproximadamente a 21 Oº, con descomposición. Clorhidrato de Dipivefrina: Pequeños cristales o polvo cristalino de color blanco, con un olor leve. Muy soluble en agua. Clorhidrato de Dobutamina: Polvo cristalino, blanco a prácticamente blanco. Soluble en alcohol y en piridina; moderadamente soluble en agua y en metanol. Clorhidrato de Donepezilo: Polvo cristalino blanco. Algunas formas polimórficas son muy higroscópicas. Fácilmente soluble en cloroformo; soluble en agua y en ácido acético glacial; poco soluble en alcohol y en acetonitrilo; prácticamente insoluble en acetato de etilo y en n-hexano. Clorhidrato de Dopamina: Polvo cristalino blanco a blanquecino. Puede presentar un leve olor a ácido clorhídrico. Funde aproximadamente a 240º, con descomposición. Fácilmente soluble en agua y en soluciones acuosas de hidróxidos alcalinos; soluble en metanol; insoluble en éter y en cloroformo. Clorhidrato de Dorzolamida: Polvo cristalino blanco a blanquecino. Soluble en agua. Clorhidrato de Doxapram: Polvo cristalino blanco a blanquecino, inodoro. Funde aproximadamente a 220º. So-
USP 39
luble en agua y en cloroformo; moderadamente soluble en alcohol; prácticamente insoluble en éter. Clorhidrato de Doxorubicina: Polvo cristalino o amorfo, higroscópico de color anaranjado rojizo. Soluble en agua, en solución isotónica de cloruro de sodio y en metano!; prácticamente insoluble en cloroformo, en eter y en otros disolventes orgánicos. Clorhidrato de Duloxetina: Sólido blanco a blanco amarronado. Poco soluble en agua. Clorhidrato de Efedrina: Polvo o cristales finos, blancos e inodoros. Es afectado por la luz. Fácilmente soluble en agua; soluble en alcohof; insoluble en éter. Clorhidrato de Emetina: Polvo cristalino, blanco o levemente amarillento e inodoro. Es afectado por la luz. Fácilmente soluble en agua y en alcohol. Clorhidrato de Epirubicina: Polvo rojo anaranjado. Soluble en agua y en metanol; poco soluble en etanol anhidro; prácticamente insoluble en acetona. Clorhidrato de Esmolol: Polvo cristalino blanco a blanquecino. Muy soluble en agua; fácilmente soluble en alcohol. Clorhidrato de Espectinomicina: Polvo cristalino blanco a beige pálido. Fácilmente soluble en agua; prácticamente insoluble en alcohol, en cloroformo y en éter. Clorhidrato de Etambutol: Polvo cristalino blanco. Fácilmente soluble en agua; soluble en alcohol y en metanol; poco soluble en éter y en cloroformo. Clorhidrato de Fenazopiridina: Polvo cristalino, rojo claro u oscuro a violeta oscuro. Es inodoro o tiene un olor leve. Funde aproximadamente a 235º, con descomposición. Poco soluble en agua, en alcohol y en cloroformo. Clorhidrato de Fenilefrina: Cristales inodoros, de color blanco o prácticamente blanco, con sabor amargo. Fácilmente sofuble en agua y en alcohol. Clorhidrato de Fenilefrina, Solución Nasal: Líquido transparente, incoloro o ligeramente amarillo, inodoro. Es neutro o ácido al tornasol. Clorhidrato de Fenilefrina, Solución Oftálmica: Líquido transparente, incoloro o ligeramente amarillo, según la concentración. Clorhidrato de Fenilpropanolamina: Polvo cristalino blanco con un olor aromático leve. Es afectado por la luz. Fácilmente soluble en agua y en alcohol; insoluble en éter. Clorhidrato de Fenmetrazina: Polvo cristalino blanco a blanquecino. Muy soluble en agua; fácilmente soluble en alcohol y en cloroformo. Clorhidrato de Fentermina: Polvo cristalino blanco, inodoro e higroscópico. Soluble en agua y en alcoholes inferiores; poco soluble en cloroformo; insoluble en éter. Clorhidrato de Fexofenadina: Polvo blanco a blanquecino. Fácilmente soluble en metanol; muy poco a poco soluble en agua; muy poco soluble en acetona. Clorhidrato de Flavoxato: Polvo cristalino blanco o casi blanco. Poco soluble en alcohol, en agua y en cloruro de metileno. Clorhidrato de Flufenazina: Polvo cristalino blanco o casi blanco e inodoro. Funde dentro de un intervalo de 5º a una temperatura superior a los 225º. Fácilmente soluble en agua; poco soluble en acetona, en alcohol y en cloroformo; prácticamente insoluble en benceno y en éter. Clorhidrato de Fluoxetina: Polvo cristalino blanco a blanquecino. Fácilmente soluble en alcohol y en metanol; moderadamente soluble en agua y en diclorometano; prácticamente insoluble en éter. Clorhidrato de Flurazepam: Polvo cristalino blanquecino a amarillo. Es inodoro o tiene un leve olor y sus soluciones son ácidas al tornasol. Funde aproximadamente a 212º, con descomposición. Fácilmente soluble en agua y en alcohol; poco soluble en alcohol isopropílico y en cloroformo.
Tablas de Referencia / Descripción y Solubilidad 2427 Clorhidrato de Gemcitabina: Sólido blanco a blanquecino. Soluble en agua; poco soluble en metanol; prácticamente insoluble en alcohol y en disolventes orgánicos polares. Clorhidrato de Granisetrón: Polvo blanco o casi blanco. Fácilmente soluble en agua; moderadamente soluble en cloruro de metileno; poco soluble en metanol. Clorhidrato de Hidralazina: Polvo cristalino inodoro blanco a blanquecino. Funde aproximadamente a 275º, con descomposición. Soluble en agua; poco soluble en alcohol; muy poco soluble en éter. Clorhidrato de Hidromorfona: Polvo cristalino fino, blanco o prácticamente blanco e inodoro. Es afectado por la luz. Fácilmente soluble en agua; moderadamente soluble en alcohol; prácticamente insoluble en éter. Clorhidrato de Hidroxizina: Polvo blanco e inodoro. Funde aproximadamente a 200º, con descomposición. Muy soluble en a9ua; soluble en cloroformo; poco soluble en acetona; practicamente insoluble en éter. Clorhidrato de ldarubicina: Polvo de color anaranjado rojizo a marrón rojizo. Soluble en metanol; poco soluble en agua; insoluble en acetona y en éter etílico. Clorhidrato de lmipramina: Polvo cristalino blanco a blanquecino, inodoro o prácticamente inodoro. Fácilmente soluble en agua y en alcohol; soluble en acetona; insoluble en éter y en benceno. Clorhidrato de lrinotecán: Polvo cristalino de color amarillo pálido a amarillo. Poco soluble en agua y en disolventes orgánicos. Clorhidrato de lsoetarina: Sólido cristalino blanco a blanquecino, inodoro. Funde entre 196º y 208º, con descomposición. Soluble en agua; moderadamente soluble en alcohol; prácticamente insoluble en éter. Clorhidrato de lsoproterenol: Polvo cristalino blanco a prácticamente blanco, inodoro, con un leve sabor amargo. Se oscurece paulatinamente al exponerse al aire y a la luz. Sus soluciones adquieren un color rosado a rosado amarronado cuando se las deja expuestas al aire y también, de manera casi inmediata, cuando se las alcaliniza. Su solución (1 en 100) tiene un pH de aproximadamente 5. Fácilmente soluble en agua; moderadamente soluble en alcohol y menos soluble en alcohol deshidratado; insoluble en cloroformo y en éter. Clorhidrato de lsoprotenerol, Inyección: Líquido incoloro o prácticamente incoloro, que se oscurece gradualmente al exponerse al aire y a la luz. Clorhidrato de lsoxsuprina: Polvo cristalino blanco, inodoro, con sabor amargo. Funde aproximadamente a 200º, con descomposición. Moderadamente soluble en alcohol; poco soluble en agua. Clorhidrato de Ketamina: Polvo cristalino blanco con un olor leve característico. Fácilmente soluble en agua y en metanol; soluble en alcohol; moderadamente soluble en cloroformo. Clorhidrato de Labetalol: Polvo blanco a blanguecino. Funde aproximadamente a 180º, con descomposicion. Soluble en agua y en alcohol; insoluble en éter y en cloroformo. Clorhidrato de Levamisol: Polvo cristalino blanco o casi blanco. Fácilmente soluble en agua; soluble en alcohol; poco soluble en cloruro de metileno; prácticamente insoluble en éter. Clorhidrato de Levobunolol: Polvo cristalino blanco, inodoro. Soluble en agua y en metanol; poco soluble en alcohol y en cloroformo. Clorhidrato de Lidocaína: Polvo cristalino blanco, inodoro, con un leve sabor amargo. Muy soluble en agua y en alcohol; soluble en cloroformo; insoluble en éter. Clorhidrato de Lincomicina: Polvo cristalino blanco o prácticamente blanco. Es inodora o tiene un olor tenue. Es estable en presencia de aire y luz. Sus soluciones son ácidas
2428 Descripción y Solubilidad / Tablas de Referencia y dextrógiras. Fácilmente soluble en agua; soluble en dimetilformamida; muy poco soluble en acetona. Clorhidrato de Lincomicina, Inyección: Solución transparente, incolora a ligeramente amarilla, con un olor tenue. Clorhidrato de Lincomicina, Polvo Soluble: Polvo fino de libre fluidez, de color blanco a blanquecino o tostado claro. Clorhidrato de Lisina: Polvo blanco e inodoro. Fácilmente soluble en agua. Categoría del NF: Modificador de pH (agente acidificante/agente alcalinizante/agente amortiguador). Clorhidrato de Loperamida: Polvo blanco a ligeramente amarillo. Funde aproximadamente a 225º, con algo de descomposición. Fácilmente soluble en metanol y en cloroformo; poco soluble en agua y en ácidos diluidos; muy poco soluble en alcohol isopropílico. Clorhidrato de Maprotilina: Polvo cristalino, fino, blanco a blanquecino. Es prácticamente inodoro. Fácilmente soluble en metanol y en cloroformo; poco soluble en agua; prácticamente insoluble en isooctano. Clorhidrato de Meclizina: Polvo cristalino de color blanco o li~eramente amarillento. Tiene un olor leve y es insípido. Facilmente soluble en cloroformo, en piridina y en mezclas de ácido-alcohol-agua; poco soluble en ácidos diluidos y en alcohol; prácticamente insoluble en agua y en éter. Clorhidrato de Mecloretamina: Polvo cristalino blanco. Es higroscópico. Clorhidrato de Mefloquina: Polvo cristalino blanco o ligeramente amarillo. Presenta polimorfismo. Fácilmente soluble en metano!; soluble en alcohol; muy poco soluble en agua. Clorhidrato de Memantina: Polvo blanco a blanquecino. Poco soluble en agua. Clorhidrato de Meperidina: Polvo fino, blanco, cristalino e inodoro. El pH de una solución (1 en 20) es de aproximadamente 5. Muy soluble en agua; soluble en alcohol; moderadamente soluble en éter. Clorhidrato de Mepivacaína: Sólido cristalino blanco, inodoro. El pH de una solución (1 en 50) es de aproximadamente 4,5. Fácilmente soluble en agua y en metanol; muy poco soluble en cloroformo; prácticamente insoluble en éter. Clorhidrato de Metaciclina: Polvo cristalino, amarillo a amarillo oscuro. Soluble en agua. Clorhidrato de Metadona: Cristales incoloros o polvo cristalino blanco e inodoro. Fácilmente soluble en alcohol y en cloroformo; soluble en agua; prácticamente insoluble en éter y en glicerina. Clorhidrato de Metadona, Concentrado Oral: Líquido transparente a ligeramente turbio, siruposo. Clorhidrato de Metanfetamina: Cristales blancos o polvo cristalino blanco. Es inodoro o prácticamente inodoro. Sus soluciones tienen un pH de aproximadamente 6. Fácilmente soluble en agua, en alcohol y en cloroformo; muy poco soluble en éter absoluto. Clorhidrato de Metdilazina: Polvo cristalino de color tostado claro con un olor leve característico. Fácilmente soluble en agua, en alcohol y en cloroformo. Clorhidrato de Metformina: Polvo cristalino blanco. Fácilment.e soluble en agua; poco soluble en alcohol; prácticamente insoluble en acetona y en cloruro de metileno. Clorhidrato de Metildopato: Polvo cristalino blanco o prácticamente blanco, inodoro o prácticamente inodoro. Fácilmente soluble en agua, en alcohol y en metanol; poco soluble en cloroformo; prácticamente insoluble en éter. Clorhidrato de Metilfenidato: Polvo cristalino blanco, inodoro y fino. Sus soluciones son ácidas al tornasol. Fácilmente soluble en agua y en metanol; soluble en alcohol; poco soluble en cloroformo y en acetona.
USP 39 Clorhidrato de Metoclopramida: Polvo cristalino blanco o prácticamente blanco, inodoro o prácticamente inodoro. Muy soluble en agua; fácilmente soluble en alcohol; moderadamente soluble en cloroformo; prácticamente insoluble en éter. Clorhidrato de Mexiletina: Polvo blanco. Fácilmente soluble en alcohol deshidratado y en agua; po,co soluble en acetonitrilo; prácticamente insoluble en éter. Opticamente inactivo (solución en agua 1 en 20). Clorhidrato de Midodrina: Polvo cristalino blanco. Soluble en agua; moderadamente soluble en metanol. Clorhidrato de Minociclina: Polvo cristalino amarillo. Soluble en soluciones de hidróxidos y carbonatos alcalinos; moderadamente soluble en agua; poco soluble en alcohol; prácticamente insoluble en cloroformo y en éter. Clorhidrato de Mitoxantrona: Polvo de color azul oscuro. Moderadamente soluble en agua; poco soluble en metano!; prácticamente insoluble en acetona, en acetonitrilo y en cloroformo. Clorhidrato de Moexipril: Polvo blanco a blanquecino. Soluble en agua, en alcohol y en metano!. Clorhidrato de Moricizina: Polvo cristalino blanco a blanquecino. Funde aproximadamente a 189º, con descomposición. Soluble en agua y en alcohol. Clorhidrato de Moxifloxacino: Polvo o cristales de color amarillo tenue a amarillo. Soluble en hidróxido de sodio O, 1 N; moderadamente soluble en agua y en metanol; poco soluble en ácido clorhídrico O, 1 N, en dimetilformamida y en alcohol; prácticamente insoluble en cloruro de metileno, en acetona, en acetato de etilo y en tolueno; insoluble en terc-butil metil éter y en n-heptano. Clorhidrato de Nafazolina: Polvo cristalino blanco. Es inodoro y tiene un sabor amargo. Funde a una temperatura de aproximadamente 255º, con descomposición. Facilmente soluble en a9ua y en alcohol; muy poco insoluble en cloroformo; prácticamente insoluble en éter. Clorhidrato de Naloxona: Polvo blanco a levemente blanquecino. Su solución acuosa es ácida. Soluble en agua, en ácidos diluidos y en álcalis fuertes; poco soluble en alcohol; prácticamente insoluble en éter y en cloroformo. Clorhidrato de Naloxona, Inyección: Líquido transparente, incoloro. Clorhidrato de Naratriptán: Sólido de color blanco a amarillo pálido. Soluble en agua. Clorhidrato de Nefazodona: Polvo blanco no higroscópico. Fácilmente soluble en cloroformo, soluble en propilenglicol; poco soluble en polietilenglicol y en agua. Clorhidrato de Nortriptilina: Polvo de color blanco a blanquecino, con un olor leve característico. Su solución (1 en 100) tiene un pH de aproximadamente 5. Soluble en agua y en cloroformo; moderadamente soluble en metanol; prácticamente insoluble en éter, en benceno y en la mayoría de los otros disolventes orgánicos. Clorhidrato de Olopatadina: Polvo cristalino blanco. Muy soluble en ácido fórmico; moderadamente soluble en agua; muy poco soluble en alcohol deshidratado. Clorhidrato de Ondansetrón: Polvo blanco a blanquecino. Soluble en metanol; moderadamente soluble en agua y en alcohol; poco soluble en alcohol isopropílico y en diclorometano; muy P,OCO soluble en acetona, en cloroformo y en acetato de etilo. Clorhidrato de Oxicodona: Polvo o cristales higroscópicos, blancos a blanquecinos. Es inodoro. Soluble en agua; poco soluble en alcohol. Clorhidrato de Oximetazolina: Polvo cristalino, fino, de color blanco a prácticamente blanco. Es higroscópico. Funde aproximadamente a 300º, con descomposicion. Soluble en agua y en alcohol; prácticamente insoluble en benceno, en cloroformo y en éter. Clorhidrato de Oximorfona: Polvo blanco o levemente blanquecino, inodoro. Se oscurece al exponerse a la luz. Sus
USP 39 soluciones acuosas son ligeramente ácidas. Fácilmente soluble en agua; moderadamente soluble en alcohol y en éter. Clorhidrato de Oxitetraciclina: Polvo cristalino, de color amarillo, inodoro, con un leve sabor amargo. Es higroscópico. Se descompone a temperaturas superiores a 180º y se oscurece al exponerse a la luz solar fuerte o a temperaturas superiores a 90º en aire húmedo. Su potencia dJsr;iinuye en soluciones con pH inferior a 2 y se degrada rap1damente por medio de las soluciones de hidróxidos alcalinos. Fácilmente soluble en agua, pero los cristales de la base de oxitetraciclina se separan como resultado de la hidrólisis parcial del clorhidrato; moderadamente soluble en alcohol y en metanol; poco soluble en alcohol deshidratado· insoluble en cloroformo y en éter. ' Clorhidrato de Oxprenolol: Polvo cristalino blanco. Fácilmente soluble en alcohol, en cloroformo y en agua; mo<;Jeradamente soluble en acetona; prácticamente insoluble en eter. Clorhidrato de Palmitato de Clindamicina: Polvo amorfo, blanco a blanquecino, con un olor característico. Muy soluble en acetato de etilo y en dimetilformamida; fácilmente soluble en agua, en benceno, en éter, en cloroformo y en alcohol. Clorhidrato de Papaverina: Cristales blancos o polvo cristalino blanco. Es inodoro y tiene un sabor levemente amargo. Es ópticamente inactivo. Sus soluciones son ácidas al tornasol. Funde aproximadamente a 220º, con descomposición. Soluble en agua y en cloroformo; poco soluble en alcohol; prácticamente insoluble en éter. Clorhidrato de Paroxetina: Sólido blanco a blanquecino. Soluble en metanol y en alcohol; poco soluble en agua. Clorhidrato de Pentazocina: Polvo cristalino blanco. Presenta polimorfismo; una de las formas funde aproximadamente a 254º y la otra aproximadamente a 218º. Fácilmente soluble en cloroformo; soluble en alcohol; moderadamente soluble en agua; muy poco soluble en acetona y en éter; prácticamente insoluble en benceno. Clorhidrato de Pilocarpina: Cristales incoloro, translúcidos e inodoros, ligeramente amargos. Es higroscópico y es afectado por la luz. Sus soluciones son ácidas al tornasol. Muy soluble en agua; fácilmente soluble en alcohol; poco soluble en cloroformo; insoluble en éter. Clorhidrato de Pioglitazona: Polvo cristalino o cristales de color blanco. Soluble en dimetilformamida; poco soluble en alcohol deshidratado; muy poco soluble en acetona y en ~cetonitrilo; prácticamente insoluble en agua; insoluble en eter. Clorhidrato de Piridoxina: Polvo cristalino o cristales de color blanco a prácticamente blanco. Es estable al aire y es afectado lentamente al exponerse a la luz solar. Sus soluciones tienen un pH de aproximadamente 3. Fácilmente soluble en agua; poco soluble en alcohol; insoluble en éter. Clorhidrato de Pramoxina: Polvo cristalino blanco a prácticamente blanco, con sabor adormecedor. Puede tener un olor ligeramente aromático. El pH de una solución (1 en 100) es de aproximadamente 4,5. Fácilmente soluble en agu~ y en alcohol; soluble en cloroformo; muy poco soluble en eter. Clorhidrato de Prazosina: Polvo de color blanco a tostado. Poco soluble en agua, en metanol, en dimetilformamida y en dimetilacetamida; muy poco soluble en alcohol; prácticamente insoluble en cloroformo y en acetona. Clorhidrato de Prilocaína: Polvo blanco, inodoro cristalino, con sabor amargo. Fácilmente soluble en agua 'y en alcohol; poco soluble en cloroformo; muy poco soluble en acetona; prácticamente insoluble en éter. Clorhidrato de Procaína: Cristales blancos pequeños o polvo cristalino blanco. Es inodoro. Presenta propiedades anestésicas locales cuando se coloca sobre la lengua. Fácilmente soluble en agua; soluble en alcohol; poco soluble en cloroformo; prácticamente insoluble en éter.
Tablas de Referencia/ Descripción y Solubilidad 2429 Clo~hidrato de Procaína, Inyección: Líquido transparente, incoloro. Clorhidrato de Procainamida: Polvo cristalino, de color blanco a tostado. Es inodoro. Su solución (1 en 1 O) tiene un pH entre 5 y 6,5. Muy soluble en agua; soluble en alcohol; poco ,soluble en cloroformo; muy poco soluble en benceno y en eter. Clorhidrato de Procainamida, Inyección: Incoloro o con apenas un color ligeramente amarillo. Clorhidrato de Prociclidina: Polvo cristalino blanco con un olor característico moderado. Funde aproximadamente a 225º, con descomposición. Soluble en agua y en alcohol· ' insoluble en éter y en acetona. Clorhidrato de Proguanil: Polvo cristalino blanco. Mode~a~amente S?luble en alcohol; poco soluble en agua; pract1camente insoluble en cloruro de metileno. Clorhidrato de Promazina: Polvo cristalino, de color blanco a ligeramente amarillo, prácticamente inodoro. Se oxida cuando se expone de forma prolongada al aire y adquiere un color azul o rosado. Fácilmente soluble en agua y en cloroformo. Clorhidrato de Prometazina: Polvo cristalino, de color blanco a amarillo pálido, prácticamente inodoro. Se oxida lentamente y adquiere un color azul al exponerse prolongad~mente al a!re. Fácilmente soluble en, agua, en alcohol deshidratado caliente y en cloroformo; practicamente insoluble en éter, en acetona y en acetato de etilo. Clorhidrato de Propafenona: Polvo blanco. Soluble en metanol y en agua caliente; poco soluble en alcohol y en cloroformo; muy poco soluble en acetona; insoluble en éter dietílico y en tolueno. Clorhidrato de Proparacaína: Polvo cristalino de color blanco a blanquecino o beige pálido, inodoro. Sus soluciones son neutras al tornasol. Soluble en agua, en alcohol tibio y en metanol; insoluble en éter y en benceno. Clorhidrato de Proparacaína, Solución Oftálmica: Solución incolora o ligeramente amarilla. . Clorhidrato de Propoxicaína: Sólido cristalino blanco, inodoro, que se decolora al exponerse un tiempo prolongado a la luz y al aire. El pH de una solución (1 en 50) es de aproximadamente 5,4. Fácilmente soluble en agua; soluble en alcohol; moderadamente soluble en éter; prácticamente insoluble en acetona y en cloroformo. Clorhidrato de Propoxifeno: Polvo cristalino blanco. Es inodoro y tiene un sabor amargo. Fácilmente soluble en agua; soluble en alcohol, en cloroformo y en acetona; prácticamente insoluble en benceno y en éter. Clorhidrato de Propranolol: Polvo cristalino blanco a blanquecino. Es inodoro y tiene un sabor amargo. Funde aproximadamente a 164º. Soluble en agua y en alcohol; poco soluble en cloroformo; prácticamente insoluble en eter. Clorhidrato de Protriptilina: Polvo blanco a amarillento. Es inodoro o no tiene más que un olor leve. Funde aproximadamente a 168º. Fácilmente soluble en agua, en alcohol y en cloroformo; prácticamente insoluble en éter. Clorhidrato de Pseudoefedrina: Polvo o cristales finos de color blanco a blanquecino, con un olor leve caracterís- ' tico. Muy soluble en agua; fácilmente soluble en alcohol; poco soluble en cloroformo. Clorhidrato de Quinapril: Polvo blanco a blanquecino a veces con un tinte rosado. Fácilmente soluble en disolven~ tes acuosos. Clorhidrato de Racepinefrina: Polvo fino blanco e inodoro. Se oscurece al exponerse a la luz y al aire. Sus soluciones son ácidas al tornasol. Funde aproximadamente a 157º. Fácilmente soluble en agua; moderadamente soluble en alcohol. Clorhidrato de Raloxifeno: Polvo de color casi blanco a amarillo pálido. Fácilmente soluble en dimetil sulfóxido; poco soluble a moderadamente soluble en metanol; prácti-
2430 Descripción y Solubilidad / Tablas de Referencia
camente insoluble a muy poco soluble en agua; prácticamente insoluble en éter y en acetato de etilo. Clorhidrato de Ranitidina: Polvo cristalino de color blanco a amarillo pálido, prácticamente inodoro. Es sensible a la luz y a la humedad. Funde aproximadamente a 140º, con descomposición. Muy soluble en agua; moderadamente soluble en alcohol. Clorhidrato de Ritodrina: Polvo cristalino blanco a casi blanco, inodoro o prácticamente inodoro. Funde aproximadamente a 200°. Fácilmente soluble en agua y en alcohol; soluble en alcohol n-propílico; prácticamente insoluble en éter. Clorhidrato de Ropinirol: Polvo de color crema pálido a amarillo. Soluble en agua. Clorhidrato de Ropivacaína: Polvo cristalino blanco. Soluble en agua. Clorhidrato de Selegilina: Polvo cristalino blanco, inodoro. Fácilmente soluble en agua, en cloroformo y en metano!. Clorhidrato de Sertralina: Polvo cristalino blanco o blanquecino. Moderadamente soluble o poco soluble en alcohol absoluto; poco soluble en agua y en isopropanol; y poco o muy poco soluble en acetona. Clorhidrato de Sibutramina Monohidrato: Polvo cristalino blanco a crema. Poco soluble en agua de pH 5,2. Clorhidrato de Sotalol: Polvo blanco a blanquecino. Fácilmente soluble en agua; soluble en alcohol; muy poco soluble en cloroformo. Clorhidrato de Tacrina: Polvo blanco. Fácilmente soluble en agua, en ácido clorhídrico O, 1 N, en solución amortiguadora de acetato de pH 4,0, en solución amortiguadora de fosfato (con pH entre 7,0 y 7,4), en metanol, en dimetil sulfóxido, en alcohol y en propilenglicol; moderadamente soluble en ácido linoleico y en politilenglicol 400. Clorhidrato de Tamsulosina: Polvo cristalino blanco o casi blanco. Funde con descomposición aproximadamente a 230º. Fácilmente soluble en ácido fórmico; moderadamente soluble en metanol; poco soluble en agua y en alcohol deshidratado; prácticamente insoluble en éter. Clorhidrato de Terazosina: Polvo cristalino blanco a amarillo pálido. Fácilmente soluble en solución salina isotónica; soluble en metanol y en agua; poco soluble en alcohol y en ácido clorhídrico O, 1 N; muy poco soluble en cloroformo; prácticamente insoluble en acetona y en hexanos. Clorhidrato de Terbinafina: Polvo blanco o blanquecino. Fácilmente soluble en alcohol deshidratado y en metano!; poco soluble en acetona; muy poco o poco soluble en agua. Clorhidrato de Tetracaína: Polvo cristalino fino, blanco e inodoro. Tiene un sabor ligeramente amargo seguido por una sensación de adormecimiento. Sus soluciones son neutras al tornasol. Funde aproximadamente a 148º, o puede existir en cualquiera de otras dos modificaciones polimórficas que funden aproximadamente a 134º y 139º, respectivamente. Mezclas de estas formas pueden fundir dentro del intervalo de 134º a 147º. Es higroscópico. Muy soluble en agua; soluble en alcohol; insoluble en éter y en benceno. Clorhidrato de Tetraciclina: Polvo cristalino amarillo, inodoro. Es moderadamente higroscópico. Es estable al aire, pero se oscurece si se expone a luz solar intensa en una atmósfera húmeda. Pierde potencia en una solución con un pH inferior a 2 y se degrada rápidamente por las soluciones de hidróxidos alcalinos. Soluble en agua y en soluciones de carbonatos e hidróxidos alcalinos; poco soluble en alcohol; prácticamente insoluble en cloroformo y en éter. Clorhidrato de Tetrahidrozolina: Sólido blanco e inodoro. Funde aproximadamente a 256º, con descomposición. Fácilmente soluble en agua y en alcohol; muy poco soluble en cloroformo; prácticamente insoluble en éter. Clorhidrato de Tiagabina: Polvo blanco a blanquecino. Fácilmente soluble en metanol y en alcohol; soluble en isa-
USP 39 propano!; moderadamente soluble en agua; muy poco soluble en cloroformo; prácticamente insoluble en n-heptano. Clorhidrato de Tiamina: Polvo cristalino o cristales de color blanco, por lo general con un olor leve característico. Cuando se expone al aire, el producto anhidro absorbe rápidamente aproximadamente 4% de agua. Funde aproximadamente a 248º, con algo de descomposición. Fácilmente soluble en agua; soluble en glicerina; poco soluble en alcohol; insoluble en éter y en benceno. Clorhidrato de Tiletamina: Polvo cristalino blanco a blanquecino. Fácilmente soluble en agua y en ácido clorhídrico O, 1 N; soluble en metanol; poco soluble en cloroformo; prácticamente insoluble en éter. Clorhidrato de Tioridazina: Polvo granular, de color blanco a ligeramente amarillo, con un olor débil y sabor muy amargo. Fácilmente soluble en agua, en metanol y en cloroformo;. insoluble en éter. Clorhidrato de Tiotixeno: Polvo cristalino de color blanco o prácticamente blanco, con un olor leve; es afectado por la luz. Soluble en agua; poco soluble en cloroformo; prácticamente insoluble en benceno, en acetona y en éter. Clorhidrato de Tizanidina: Polvo cristalino de color casi blanco a ligeramente amarillo. Poco soluble en agua y en metanol. Clorhidrato de Tocainida: Polvo fino, blanco e inodoro. Fácilmente soluble en agua y en alcohol; prácticamente insoluble en cloroformo y en éter. Clorhidrato de Tolazolina: Polvo cristalino blanco a blanquecino. Sus soluciones son levemente ácidas al tornasol. Fácilmente soluble en agua y en alcohol. Clorhidrato de Tramado!: Polvo cristalino blanco. Fácilmente soluble en agua y en metano!; muy poco soluble en acetona. Clorhidrato de Trazodona: Polvo cristalino blanco a blanquecino. Moderadamente soluble en cloroformo y en agua. Funde entre 231° y 234º cuando la determinación del punto de fusión se lleva a cabo en un tubo capilar vacío; de lo contrario, funde con descomposición en un intervalo amplio inferior a 230º. Clorhidrato de Trientina: Polvo cristalino blanco a amarillo pálido. Funde aproximadamente a 117°. Fácilmente soluble en agua; soluble en metanol; poco soluble en alcohol; insoluble en cloroformo y en éter. Clorhidrato de Trifluoperazina: Polvo cristalino blanco a amarillo pálido. Es prácticamente inodoro y tiene un sabor amargo. Funde aproximadamente a 242º, con descomposición. Fácilmente soluble en agua; soluble en alcohol; moderadamente .soluble en cloroformo; insoluble en éter y en benceno. Clorhidrato de Triflupromazina: Polvo cristalino, de color blanco a tostado pálido, con un leve olor característico. Funde entre 170º y 178º. Soluble en agua, en alcohol y en acetona; insoluble en éter. Clorhidrato de Trihexifenidilo: Polvo cristalino, de color blanco o levemente blanquecino, con un olor muy leve. Funde aproximadamente a 250º. Soluble en alcohol y en cloroformo; poco soluble en agua. Clorhidrato de Trimetobenzamida: Polvo cristalino blanco con un leve olor fenólico. Soluble en agua y en alcohol tibio; insoluble en éter y en benceno. Clorhidrato de Tripelenamina: Polvo cristalino blanco. Se oscurece lentamente al exponerse a la luz. Sus soluciones son prácticamente neutras al tornasol. Fácilmente soluble en agua, en alcohol y en cloroformo; poco soluble en acetona; insoluble en benceno, en éter y en acetato de etilo. Clorhidrato de Triprolidina: Polvo cristalino blanco con apenas un olor leve, pero desagradable. Sus soluciones son alcalinas al tornasol y funde aproximadamente a 115º. Soluble en agua, en alcohol y en cloroformo; insoluble en éter.
USP 39 Clorhidrato de Valaciclovir: Polvo blanco a blanquecino. Soluble en agua; insoluble en diclorometano. Clorhidrato de Valganciclovir: Polvo de color blanco a blanquecino. Muy poco soluble en alcohol; prácticamente insoluble en 2-propanol, en hexano, en acetona y en acetato de etilo. Clorhidrato de Vancomicina: Polvo de libre fluidez, de color blanco, casi blanco o tostado a marrón, inodoro y con sabor amargo. Fácilmente soluble en agua; insoluble en éter y en cloroformo. Clorhidrato de Venlafaxina: Polvo cristalino blanquecino a blanco. Soluble en metanol y en agua. Clorhidrato de Verapamilo: Polvo cristalino blanco o prácticamente blanco. Es prácticamente inodoro y tiene un sabor amargo. Fácilmente soluble en cloroformo; soluble en agua; moderadamente soluble en alcohol; prácticamente insoluble en éter. Clorhidrato de Xilazina: Cristales incoloros a blancos. Moderadamente soluble en ácido diluido, en acetona y en metanol; insoluble en álcali diluido. Clorhidrato de Xilometazolina: Polvo cristalino blanco a blanquecino, inodoro. Funde a más de 300º, con descomposición. Fácilmente soluble en alcohol; soluble en agua; moderadamente soluble en cloroformo; prácticamente insoluble en benceno y en éter. Clorhidrato de Yohimbina: Polvo blanco a amarillo. Funde aproximadamente a 295º, con descomposición. Soluble en agua en ebullición; poco soluble en agua y en alcohol. Clorhidrato de Ziprasidona (anhidro): Polvo blanco a ligeramente rosado. Soluble en ácido fórmico anhidro; insoluble en n-hexano. Clorhidrato de Ziprasidona (monohidrato): Polvo blanco a ligeramente rosado. Poco soluble en metano! y en cloruro de metileno; prácticamente insoluble en agua. Clorhidrato de Zolazepam: Polvo cristalino blanco a blanquecino. Fácilmente soluble en agua y en ácido clorhídrico O, 1 N; soluble en metano!; poco soluble en cloroformo; prácticamente insoluble en éter. Clorobutanol: Cristales incoloros a blancos, con olor y sabor característicos y algo canforáceos. La forma anhidra funde aproximadamente a 95º y la forma hidratada funde a aproximadamente 76º. Fácilmente soluble en alcohol, en éter, en cloroformo y en aceites volátiles; soluble en glicerina; poco soluble en agua. Categoría del NF: Conservante antimicrobiano; plastificante. Clorocresol: Polvo cristalino o cristales incoloros o prácticamente incoloros, con un olor característico, no alquitranado. Volátil en vapor. Muy soluble en alcohol; soluble en éter, en terpenos, en aceites fijos y en soluciones de hidróxidos alcalinos; poco soluble en agua y más soluble en agua caliente. Categoría del NF: Conservante antimicrobiano. Cloroquina: Polvo cristalino blanco o ligeramente amarillo. Es inodoro y tiene un sabor amargo. Soluble en ácidos diluidos, en cloroformo y en éter; muy poco soluble en agua. Clorotiazida: Polvo cristalino blanco o prácticamente blanco e inodoro. Funde aproximadamente a 340º, con descomposición. Fácilmente soluble en dimetilformamida y en dimetil sulfóxido; poco soluble en metanol y en piridina; muy poco soluble en agua; prácticamente insoluble en éter, en benceno y en cloroformo. Cloroxilenol: Polvo cristalino o cristales de color blanco, con un olor característico. Volátil en vapor. Fácilmente soluble en alcohol, en éter, en terpenos, en aceites fijos y en soluciones de hidróxidos alcalinos; muy poco soluble en agua. Categoría del NF: Conservante antimicrobiano. Clorpromazina: Sólido cristalino blanco con un olor semejante a las aminas. Se oscurece después de exposición prolongada a la luz. Funde aproximadamente a 60º. Fácilmente soluble en alcohol, en benceno, en cloroformo, en
Tablas de Referencia/ Descripción y Solubilidad 2431
éter y en ácidos minerales diluidos; prácticamente insoluble en agua y en hidróxidos alcalinos diluidos. Clorpropamida: Polvo cristalino blanco con un olor leve. Soluble en alcohol; moderadamente soluble en cloroformo; prácticamente insoluble en agua. Clorsulón: Polvo blanco a blanquecino. Fácilmente soluble en acetonitrilo y en metanol; poco soluble en agua; muy poco soluble en cloruro de metileno. Clortalidona: Polvo cristalino blanco a blanco amarillento. Funde con descomposición a temperaturas mayores de 215º. Soluble en metanol; poco soluble en alcohol; prácticamente insoluble en agua, en éter y en cloroformo. Cloruro Crómico: Cristales de color verde oscuro, inodoros, ligeramente delicuescentes. Soluble en agua y en alcohol; poco soluble en acetona; prácticamente insoluble en éter. Cloruro Cúprico: Cristales de color verde azulado, delicuescentes. Fácilmente soluble en agua; soluble en alcohol; poco soluble en éter. Cloruro de Acetilcolina: Polvo cristalino o cristales de color blanco o blanquecino. Muy soluble en agua; fácilmente soluble en alcohol; insoluble en éter. Se descompone en agua caliente y en álcalis. Cloruro de Aluminio: Polvo blanco o blanco amarillento, delicuescente y cristalino. Es prácticamente inodoro y tiene un sabor dulce y muy astringente. Sus soluciones son ácidas al tornasol. Muy soluble en agua; fácilmente soluble en alcohol; soluble en glicerina. Cloruro de Amonio: Cristales incoloros o polvo cristalino blanco, fino o grueso. Tiene un sabor salino y refrescante, y es algo higroscópico. Fácilmente soluble en agua y en glicerina, y aun más soluble en agua en ebullición; moderadamente soluble en alcohol. Categoría del NF: Modificador de pH (agente acidificante/agente alcalinizante/agente amortiguador). Cloruro de Bencetonio: Cristales blancos con olor suave. Su solución (1 en 100) es ligeramente alcalina al tornasol. Soluble en agua, en alcohol y en cloroformo; poco soluble en éter. Categoría del NF: Conservante antimicrobiano; agente humectante y/o solubilizante. Cloruro de Bencetonio, Solución: Líquido transparente e inodoro, ligeramente alcalino al tornasol. Cloruro de Bencetonio, Tintura: Líquido transf.arente con el olor característico de la acetona y del alcoho . Cloruro de Benzalconio: Gel espeso o trozos gelatinosos, de color blanco o blanco amarillento. Por lo general tiene un olor suave y aromático. Su solución acuosa tiene sabor amargo, produce abundante espuma cuando se agita y normalmente es ligeramente alcalina. Muy soluble en agua y en alcohol. La forma anhidra es fácilmente soluble en benceno y poco soluble en éter. Categoría del NF: Conservante antimicrobiano; agente humectante y/o solubilizante; agente emulsionante. Cloruro de Benzalconio, Solución: Líquido transparente, incoloro o ligeramente amarillo, a menos que se haya agregado colorante. Tiene un olor aromático y sabor amargo. Categoría del NF: Conservante antimicrobiano. Cloruro de Betanecol: Cristales blancos o incoloros, o polvo cristalino blanco, por lo general con un leve olor semejante a las aminas. Es higroscópico. Presenta polimorfismo y de las dos formas cristalinas observadas, una funde aproximadamente a 211 º y la otra aproximadamente a 219º. Fácilmente soluble en agua y en alcohol; insoluble en cloroformo y en éter. Cloruro de Calcio: Fragmentos o gránulos duros, inodoros y de color blanco. Es delicuescente. Muy soluble en agua en ebullición; fácilmente soluble en agua, en alcohol y en alcohol en ebullición. Categoría del NF: Desecante; conservante antimicrobiano. Cloruro de Cetilpiridinio: Polvo blanco con un olor leve característico. Muy soluble en agua, en alcohol y en
2432 Descripción y Solubilidad / Tablas de Referencia cloroformo; poco soluble en benceno y en éter. Categoría del NF: Conservante antimicrobiano; agente humectante y/o solubilizante; agente emulsionante. Cloruro de Cetilpiridinio, Solución Tópica: Líquido transparente. Es incoloro a menos que se haya añadido un color, tiene un olor aromático y un sabor amargo. Cloruro de Cinc: Polvo cristalino blanco o prácticamente blanco, inodoro, o gránulos cristalinos blancos o prácticamente blancos. También puede estar ~~ m?sas semejantes a porcelana o moldeado en forma c1hndnca. Es muy delicuescente. Una solución (1 en 1 O) es ácida al tornasol. Muy soluble en agua; fácilmente soluble en alcohol y en glicerina. Su solución en agua o en alcohol es por lo general ligeramente turbia, pero la turbidez desaparece cuando se agrega una pequeña cantidad de ácido clorhídrico. Cloruro de Colina: Polvo cristalino, o cristales incoloros o de color blanco, por lo general, con un leve olor a trimetilamina. Transparente e incoloro en solución. Higroscópico. Soluble en alcohol y en agua. Cloruro de Edrofonio: Polvo cristalino blanco, inodoro. Su solución (1 en 1O) es prácticamente incolora. Muy soluble en agua; fácilmente soluble en alcohol; insoluble en cloroformo y en éter. Cloruro de Estroncio: Gránulos blancos o cristales incoloros e inodoros. Eflorescente en el aire; delicuescente en el aire húmedo. Muy soluble en agua; soluble en alcohol. Cloruro de Etilo: Líquido incoloro, móvil y muy volátil a bajas temperaturas o bajo presión, con un olor etéreo característico. Alcanza el punto de ebullición entre 12º y 13º, y su peso específico a Oº es de aproximadamente 0,921. Se vaporiza inmediatamente cuando se libera a temperatura ambiente de su recipiente sellado. Se quema con una llama verdosa humeante, produciendo cloruro de hidrógeno. Fácilmente soluble en alcohol y en éter; poco soluble en agua. Cloruro de Itrio: Cristales incoloros, delicuescentes. Soluble en agua y en alcohol. Cloruro de Magnesio: Escamas o cristales incoloros, inodoros y delicuescentes, que pierden agua al calentarse a 100º y ácido clorhídrico al calentarse a 11 Oº. Muy soluble en agua; fácilmente soluble en alcohol. Cloruro de Manganeso: Cristales translúcidos grandes, irregulares, rosados e inodoros. Soluble en agua y en alcohol; insoluble en éter. Cloruro de Manganeso para Solución Oral: Polvo de color blanquecino a tostado con olor a fresa. Soluble en agua. Cloruro de Metacolina: Cristales incoloros o blancos, o polvo cristalino blanco. Es inodoro o tiene un olor leve, y es muy higroscópico. Sus soluciones son neutras al tornasol. Muy soluble en agua; fácilmente soluble en alcohol y en cloroformo. Cloruro de Metilbencetonio: Cristales blancos, higroscópicos, con olor suave. Sus soluciones son neutras o ligeramente alcalinas al tornasol. Muy soluble en agua, en alcohol y en éter; prácticamente insoluble en cloroformo. Cloruro de Metileno: Líquido transparente, incoloro, móvil, con un olor similar al del cloroformo. Miscible con alcohol, con éter y con aceites fijos y volátiles. Categoría del NF: Disolvente. Cloruro de Oxibutinina: Polvo cristalino blanco, prácticamente inodoro. Muy soluble en metanol y en cloroformo; fácilmente soluble en agua y en alcohol; soluble en acetona; poco soluble en éter; muy poco soluble en hexano. Cloruro de Potasio: Cristales incoloros, elongados, prismáticos o cúbicos, o polvo granular blanco. Es inodoro, su sabor es salino y es estable al aire. Sus soluciones son neutras al tornasol. Fácilmente soluble en agua; insoluble en alcohol. Categoría del NF: Agente de tonicidad. Cloruro de Pralidoxima: Polvo cristalino blanco a amarillo pálido. Es inodoro y estable al aire. Fácilmente soluble en agua.
USP 39 Cloruro de Sodio: Cristales cúbicos incoloros o polvo cristalino blanco. Tiene un sabor salino. Fácilmente soluble en agua; soluble en glicerina; poco soluble en alcohol. Categoría del NF: Agente de tonicidad; diluyente. Cloruro de Sodio Bacteriostático, Inyección: Solución transparente, incolora, inodora o con el olor de la sustancia bacteriostática. Categoría del NF: Vehículo (estéril). Cloruro de Sodio, Irrigación: Solución transparente e incolora. Cloruro de Sodio, Solución para Inhalación: Solución transparente e incolora. Cloruro de Succinilcolina: Polvo cristalino blanco, inodoro. Sus soluciones tienen un pH de aproximadamente 4. La forma de dihidrato funde aproximadamente a 160º, la forma anhidra funde aproximadamente a 190º, y es higroscópica. Fácilmente soluble en agua; poco soluble en alcohol y en cloroformo; prácticamente insoluble en éter. Cloruro de Trospium: Polvo cristalino incoloro o blanco a levemente amarillento. Muy soluble en agua; fácilmente soluble en metanol. Cloruro de Tubocurarina: Polvo cristalino blanco o blanco amarillento a blanco grisáceo. Funde aproximadamente a 270º, con descomposición. Soluble en agua; moderadamente soluble en alcohol. Cloruro Estannoso: Polvo cristalino blanco o cristales incoloros; eflorescente en aire. Fácilmente soluble en agua (la solución se torna turbia después de reposar o con dilución) y en alcohol; se disuelve en ácido clorhídrico diluido. Categoría del NF: Agente emulsionante; antioxidante; agente reductor. Clorzoxazona: Polvo cristalino blanco o prácticamente blanco, prácticamente inodoro. Soluble en soluciones de hidróxidos alcalinos y amoníaco; moderadamente soluble en alcohol, en alcohol isopropílico y en metanol; poco soluble en agua. Clotrimazol: Polvo cristalino blanco a amarillo pálido. Funde aproximadamente a 142º, con descomposición. Fácilmente soluble en metanol, en acetona, en cloroformo y en alcohol; prácticamente insoluble en agua. Cloxacilina Benzatínica: Polvo cristalino o cristales, de color blanco o casi blanco, casi inodoros. Soluble en cloroformo y en metanol; moderadamente soluble en acetona; poco soluble en agua, en alcohol y en alcohol isopropílico. Cloxacilina Sódica: Polvo cristalino blanco, inodoro. Fácilmente soluble en agua; soluble en alcohol; poco soluble en cloroformo. Clozapina: Polvo cristalino amarillo. Soluble en cloroformo, en acetona y en alcohol; moderadamente soluble en acetonitrilo; insoluble en agua. Cocaína: Cristales incoloros a blancos, o polvo cristalino blanco. Es levógiro en una solución de ácido clorhídrico 3 N. Su solución saturada es alcalina al tornasol. Muy soluble en alcohol tibio; fácilmente soluble en alcohol, en cloroformo y en éter; soluble en aceite de oliva; moderadamente soluble en aceite mineral; poco soluble en agua. Coccidioidina: Líquido transparente, prácticamente incoloro o de color ámbar. Codeína: Cristales incoloros o blancos, o polvo cristalino blanco. Efloresce lentamente expuesto al aire seco y es afectado por la luz. En soluciones ácidas o alcohólicas es levógiro. Su solución saturada es alcalina al tornasol. Muy soluble en cloroformo; fácilmente soluble en alcohol; moderadamente soluble en éter; poco soluble en agua. Cuando se calienta en una cantidad de agua insuficiente para lograr la disolución completa, se funde hasta formar gotas aceitosas que cristalizan al enfriar. Colchicina: Polvo cristalino, o polvo o escamas amorfas, de color amarillo pálido a amarillo verdoso pálido. Es inodora o casi inodora y se oscurece al exponerse a la luz. Fácilmente soluble en alcohol y en cloroformo; soluble en agua; poco soluble en éter.
USP 39 Colecalciferol: Cristales blancos inodoros. Es afectado por el aire y la luz. Funde aproximadamente a 85º. Soluble en alcohol, en cloroformo y en aceites grasos; insoluble en agua. Colesterol: Laminillas, agujas, polvo o gránulos perlados de color blanco o ligeramente amarillo, prácticamente inodoros. Adquiere un color amarillo a tostado pálido cuando se expone a la luz durante un tiempo prolongado. Soluble en acetona, en cloroformo, en dioxano, en éter, en acetato de etilo, en éter de petróleo y en aceites vegetales; moderadamente soluble en alcohol deshidratado; poco soluble (y de manera lenta) en alcohol; insoluble en agua. Categoría del NF: Agente emulsionante; emoliente. Colistimetato Sódico: Polvo fino, blanco a ligeramente amarillo, inodoro. Fácilmente soluble en agua; soluble en metanol; insoluble en acetona y en éter. Colodión: Líquido viscoso, transparente o ligeramente opalesc:_ente. Es incoloro, o ligeramente amarillento y tiene olor a eter. Colodión Flexible: Líquido viscoso transparente o ligeramente opalescente. Es incoloro o ligeramente amarillo y tiene olor a éter. El olor fuerte de alcanfor se aprecia cuando el éter se evapora. Copolímero de Ácido Metacrílico: Polvo blanco con un olor leve característico. El polímero es soluble en álcali diluido, en fluido intestinal simulado SR y en soluciones amortiguadoras de pH 7 o mayor. La solubilidad a valores de pH entre 5,5 y 7 depende del contenido de unidades de ácido metacrílico en el copolímero. El polímero es de fácilmente soluble a soluble en metano!, en alcohol, en alcohol isopropílico y en acetona, cada uno de los cuales contiene no menos de 3% de agua; insoluble en agua, en ácidos diluidos, en fluido gástrico simulado SR y en soluciones amortiguadoras con pH de hasta 5. Categoría del NF: Agente de recubrimiento; aglutinante por vía húmeda; agente formador de película; diluyente. Copolímero de Ácido Metacrílico, Dispersión: Líquido blanco lechoso de baja viscosidad. Miscible con agua en cualquier proporción; se mantiene la apariencia bfanca lechosa. Al mezclar una parte con cinco partes de acetona, alcohol o alcohol isopropílico, se obtiene una solución viscosa transparente o levemente opalescente; el polímero primero precipita, pero luego se disuelve en el disolvente orgánico en exceso. Al mezcfar una parte con dos partes de hidróxido de sodio 1 N, se obtiene una solucion viscosa transparente o levemente opalescente. Categoría del NF: Agente de recubrimiento; agente formador de película; diluyente; aglutinante por vía húmeda. Copolímero de Ácido Metacrílico y Acrilato de Etilo: Polvo blanco con un olor leve característico. Soluble a fácil'!1ente soluble en metanol, en alcohol, en alcohol isopropíhco y en acetona, cada uno de los cuales contiene no menos de 3% de agua; soluble en álcalis diluidos, en fluido intestinal simulado SR y en soluciones amortiguadoras de pH 7 y mayor; insoluble en agua, en ácidos diluidos, en fluido gástrico simulado SR y en soluciones amortiguadores de hasta pH 5. La solubilidad entre pH 5,5 y pH 7 depende del contenido de unidades de ácido metacrílico en el copolímero. Categoría del NF: Agente de recubrimiento; agente formador efe película. Copolímero de Ácido Metacrílico y Acrilato de Etilo Parcialmente Neutralizado: Polvo blanco o casi blanco de libre fluidez. Fácilmente soluble en alcohol, en metanol y en una solución de hidróxido de sodio de 40 g/L; soluble formando sales en soluciones con pH superior a 5,5; prácticamente insoluble en acetato de etilo y en soluciones acuosas ácidas. Categoría del NF: Agente de recubrimiento; agente formador de película. Copolímero de Ácido Metacrílico y Metacrilato de Metilo: Polvo blanco con un olor leve característico. Soluble a fácilmente soluble en metano!, en alcohol, en alcohol isopropílico y en acetona, cada uno de los cuales contiene no menos de 3% de agua; soluble en álcalis diluidos, en fluido
Tablas de Referencia / Descripción y Solubilidad 2433 intestinal simulado SR y en soluciones amortiguadoras de pH 7 y mayor; insoluble en agua, en ácidos diluidos, en fluido gástrico simulado SR y en soluciones amortiguadores de hasta pH 5. La solubilidad entre pH 5,5 y pH 7 depende del contenido de unidades de ácido metacrílico en el copolímero. Categoría del NF: Agente de recubrimiento; agente formador de película. Copolímero de Acrilato de Etilo y Metacrilato de Metilo, Dispersión: Líquido blanco lechoso de baja viscosidad con un débil olor característico. Miscible con agua en cualquier proporción; se mantiene la apariencia blanca lechosa. Al mezclar una parte con cinco partes de acetona, alcohol o alcohol isopropílico, se obtiene una solución viscosa transparente o levemente opalescente; el polímero primero precipita, pero luego se disuelve en el disolvente orgánico en exceso. Cuando se mezcla con hidróxido de sodio 1 N en una relación de 1 :2, la dispersión no se disuelve; se mantiene la apariencia blanca lechosa. Categoría del NF: Agente de recubrimiento; polímero de membrana; aglutinante por vía húmeda; agente formador de película; diluyente. Copolímero de Amino Metacrilato: Gránulos incoloros a amarillentos. Soluble en acetona, en alcohol isopropílico y en ácidos diluidos; prácticamente insoluble en agua. Las soluciones son transparentes a ligeramente turbias. Categoría del NF: Agente de recubrimiento; polímero de membrana; aglutinante por vía húmeda; diluyente; agente formador de película. . Copolír:nero de Carbómero: Polvo blanco, higroscópico. Se hincha en agua cuando se neutraliza una dispersión con hidróxido de sodio a un pH dentro del intervalo de 7,3 a 7,8. Categoría del NF: Agente emulsionante; agente de suspensión y/o viscosante; aglutinante por vía húmeda; polímeros para uso oftálmico; agente modificador de liberación. Copolímero de Injerto de Etilenglicol y Alcohol Vinílico: Polvo blanco o ligeramente amarillento. Muy soluble en agua; prácticamente insoluble en alcohol anhidro y en acetona. Se disuelve en ácidos diluidos y en soluciones diluidas de hidróxidos alcalinos. Categoría del NF: Agente de recubrimiento; aglutinante por vía númeda; agente formador de película. Copolímero de Metacrilato de Amonio: Gránulos incoloros, transparentes a blanco opaco, o polvo blanco; ambos con un leve olor semejante a las aminas. Soluble a fácil!llente ~
2434 Descripción y Solubilidad / Tablas de Referencia a temperatura ambiente. Es inodoro o tiene el olor de un agente antimicrobiano. Corticotropina Hidróxido de Cinc, Suspensión Inyectable: Suspensión acuosa, blanca, floculenta, exenta de partículas grandes después de agitación moderada. Corticotropina, Inyección: Líquido incoloro o color pajizo claro. Corticotropina para Inyección: Sólido amorfo blanco o prácticamente blanco, soluble, con la apariencia característica de las sustancias preparadas por liofilización. Creatinina: Polvo cristalino o cristales de color blanco, inodoros. Soluble en agua; poco soluble en alcohol; prácticamente insoluble en acetona, en éter y en cloroformo. Categoría del NF: Agente de volumen. Cresol: Líquido incoloro o amarillento a amarillo amarronado, o rosadizo, muy refractivo, que se torna más oscuro con el tiempo y al exponerse a la luz. Tiene un olor parecido al del fenal, a veces empireumático. Su solución saturada es neutra o sólo levemente ácida al tornasol. Moderadamente soluble en agua, con la cual suele formar una solución turbia; se disuelve en soluciones de hidróxidos alcalinos fijos. Miscible con alcohol, con éter y con glicerina. Categoría del NF: Conservante antimicrobiano. Cromato de Sodio Cr 51, Inyección: Solución transparente, ligeramente amarilla. Cromolín Sódico: Polvo cristalino blanco, inodoro. Es insípido al principio y luego deja un resabio levemente amargo. Es higroscópico. Soluble en agua; insoluble en alcohol y en cloroformo. Cromolín Sódico para Inhalación: Polvo blanco a blanco cremoso, inodoro, higroscópico y dividido muy finamente. Croscarmelosa Sódica: Polvo blanco de libre fluidez. Parcialmente soluble en agua; insoluble en alcohol, en éter y en otros disolventes orgánicos. Categoría del NF: Desintegrante. Crospovidona: Polvo higroscópico de color blanco a blanco cremoso, con un olor leve. Insoluble en agua y en los disolventes orgánicos comunes. Categoría del NF: Desintegrante. Crotamitón: Aceite incoloro a ligeramente amarillento, con un ligero olor a aminas. Soluble en alcohol y en metano!. Dactinomicina: Polvo cristalino de color rojo brillante. Es algo higroscópica y es afectada por la luz y el calor. Fácilmente soluble en alcohol; soluble en agua a 1Oº; poco soluble en agua a 37º; muy poco soluble en éter. Danazol: Polvo cristalino blanco a amarillo pálido. Funde aproximadamente a 225º, con algo de descomposición. Fácilmente soluble en cloroformo; soluble en acetona; moderadamente soluble en alcohol y en benceno; poco soluble en éter; prácticamente insoluble o insoluble en agua y en hexano. Dantroleno Sódico: Polvo fino de color anaranjado a marrón anaranjado. Moderadamente soluble en dimetilformamida y en glicerina; moderadamente soluble a prácticamente insoluble en acetona. Dapsona: Polvo cristalino blanco o blanco cremoso. Es inodoro y tiene un sabor levemente amargo. Soluble en acetona y en ácidos minerales diluidos; moderadamente soluble en alcohol; muy poco soluble en agua. Decanoato de Haloperidol: Polvo blanco o casi blanco. Muy soluble en alcohol, en metanol y en cloruro de metileno; prácticamente insoluble en agua. Decanoato de Nandrolona: Polvo cristalino fino, de color blanco a blanco cremoso. Es inodoro, o puede tener un olor leve. Soluble en cloroformo, en alcohol, en acetona y en aceites vegetales; prácticamente insoluble en agua. Demeclociclina: Polvo amarillo, cristalino, inodoro, con un sabor amargo. Soluble en alcohol; moderadamente solu-
USP 39 ble en agua. Se disuelve fácilmente en ácido clorhídrico 3 N y en soluciones alcalinas. Deshidroacetato de Sodio: Polvo inodoro, de color blanco o prácticamente blanco, con un sabor leve característico. Fácilmente soluble en agua, en propilenglicol y en glicerina. Categoría del NF: Conservante antimicrobiano. Desonida: Polvo blanco o cristal. Soluble en cloroformo; moderadamente soluble en etanol y en acetona; prácticamente insoluble en agua. Desoximetasona: Polvo cristalino blanco a prácticamente blanco e inodoro. Fácilmente soluble en alcohol, en acetona y en cloroformo; insoluble en agua. Dexametasona: Polvo cristalino blanco a prácticamente blanco e inodoro. Es estable al aire. Funde aproximadamente a 250º, con algo de descomposición. Moderadamente soluble en acetona, en alcohol, en dioxano y en metano!; poco soluble en cloroformo; muy poco soluble en éter; prácticamente insoluble en agua. Dexpantenol: Líquido transparente, viscoso, algo higroscópico, con un olor leve característico. Se puede producir cierta cristalización con el tiempo. Fácilmente soluble en agua, en alcohol, en metanol y en propilenglicol; soluble en cloroformo y en éter; poco soluble en glicerina. Dextrano 1: Polvo blanco a blanquecino. Es higroscópico. Muy soluble en agua; moderadamente soluble en alcohol. Dextratos: Gránulos esféricos, inodoros, blancos, porosos, que fluyen fácilmente y consisten en agregados de microcristales, de sabor dulce, que producen una sensación refrescante en la boca. Se pueden comprimir directamente en tabletas autoaglutinantes. Fácilmente soluble en agua (el calentamiento aumenta su solubilidad en agua); soluble en álcalis y ácidos diluidos, y en disolventes orgánicos básicos como piridina; insoluble en los disolventes orgánicos comunes. Categoría del NF: Agente edulcorante; diluyente; aglutinante por vía húmeda. Dextrina: Polvo de libre fluidez, de color blanco, amarillo o marrón. Su solubilidad en agua varía; por lo general es muy soluble, pero a menudo contiene una porción insoluble. Categoría del NF: Agente de suspensión y/o viscosante; diluyente; aglutinante por vía húmeda; agente formador de película; agente espesante. Dextrometorfano: Polvo cristalino, inodoro, prácticamente blanco a ligeramente amarillo. Once mg de Dextrometorfano equivafen a 15 mg de bromhidrato de dextrometorfano monohidrato. Fácilmente soluble en cloroformo; prácticamente insoluble en agua. Dextrosa: Cristales incoloros o polvo cristalino o granular blanco. Es inodoro y tiene un sabor dulce. Muy soluble en agua en ebullición; fácilmente soluble en agua; soluble en alcohol en ebullición; poco soluble en alcohol. Categoría del NF: Agente edulcorante; agente de tonicidad; vehículo (saborizado y/o edulcorado); diluyente. Dextrosa, Excipiente: Cristales incoloros o polvo cristalino o granular blanco. Es inodoro y tiene un sabor dulce. Muy soluble en agua en ebullición; fácilmente soluble en agua; moderadamente soluble en alcohol en ebullición; poco soluble en alcohol. Categoría del NF: Agente edulcorante; diluyente. Diacetato de Diflorasona: Polvo cristalino blanco a amarillo pálido. Soluble en metanol y en acetona; moderadamente soluble en acetato de etilo; poco soluble en tolueno; muy poco soluble en éter; insoluble en agua. Diacetato de Etinodiol: Polvo cristalino blanco, inodoro. Es estable al aire. Muy soluble en cloroformo; fácilmente soluble en éter; soluble en alcohol; moderadamente soluble en aceites fijos; insoluble en agua. Diacetato de Triamcinolona: Polvo cristalino fino, de color blanco a blanquecino, con apenas un olor leve. Soluble en cloroformo; moderadamente soluble en alcohol y en metanol; poco soluble en éter; prácticamente insoluble en agua.
USP 39 Diatrizoato Meglumínico: Polvo blanco e inodoro. Fácilmente soluble en agua. Diatrizoato Meglumínico, Inyección: Líquido transparente, de incoloro a amarillo pálido, ligeramente viscoso. . , Diatr~zo~to Meglumínico y l?iatrizoato Sód.ico, l!1yecc1on: L1qu1do transparente, de incoloro a amarillo palido, ligeramente viscoso. Puede cristalizar a temperatura ambiente o inferior. Diatrizoato Sódico: Polvo blanco e inodoro. Soluble en agua; poco soluble en alcohol; prácticamente insoluble en acetona y en éter. Diatrizoato Sódico, Inyección: Líquido transparente, de incoloro a amarillo pálido, ligeramente viscoso. Diatrizoato Sódico, Solución: Líquido transparente de color amarillo pálido a marrón claro. ' Diazepam: Polvo cristalino, de color blanquecino a amarillo, prácticamente inodoro. Fácilmente soluble en cloroformo; soluble en alcohol; prácticamente insoluble en agua. Diazóxido: Polvo cristalino o cristales de color blanco o blanco cremoso. Muy soluble en soluciones alcalinas concentradas; fácilmente soluble en dimetilformamida; moderadamente soluble a prácticamente insoluble en agua y en la mayoría de los disolventes orgánicos. Dibehenato de Glicerilo: Polvo fino con un olor tenue. Funde aproximadamente a 70º. Soluble en cloroformo· prácticamente insoluble en agua y en alcohol. Categorfa del NF: Lubricante; agente de recubrimiento; agente de suspensión y/o viscosante; aglutinante por vía húmeda. Dibucaína: Polv? de color blanco a blanquecino, con un olor leve caractenstico. Se oscurece al exponerse a la luz. Soluble en ácido clorhídrico 1 N y en éter; poco soluble en agua. Dicaprilato/Dicaprato de Propilenglicol: Líquido aceitoso, transparente, incoloro o li9eramente amarillo a 20º. Soluble en aceites grasos y en eter de petróleo; poco soluble en alcohol deshidratado; prácticamente insoluble en agua. Categoría del NF: Agente emulsionante; vehículo. Diclazurilo: Polvo de color blanco a amarillo. Moderadamente soluble en dimetilformamida; prácticamente insoluble en agua, en alcohol y en cloruro de metileno. Diclofenaco Potásico: Polvo cristalino blanco a blanquecino o levemente amarillento. Es ligeramente higroscópico. Fácilmente soluble en metano!; soluble en alcohol; moderadamente soluble en agua; poco soluble en acetona. Diclofenaco Sódico: Polvo cristalino, higroscópico, blanco a blanquecino. Funde aproximadamente a 284º. Fácilmente soluble en metanol; soluble en etanol; moderadamente soluble en agua; prácticamente insoluble en cloroformo y en éter. Dicloralfenazona: Polvo microcristalino blanco. Tiene un olor leve, característico del hidrato de cloral. Se descompone con álcali diluido, liberando cloroformo. Fácilmente soluble en agua, en alcohol y en cloroformo; soluble en ácidos diluidos. Diclorhidrato de Levocetirizina: Polvo blanco a casi blanco. Fácilmente soluble en agua y en metanol. Diclorhidrato de Piperazina: Polvo cristalino blanco. Soluble en agua. Diclorhidrato de Pramipexol: Polvo cristalino blanco a casi blanco. Fácilmente soluble en agua; soluble en metanol; poco soluble en alcohol; prácticamente insoluble en cloruro de metileno. Diclorodifluorometano: Gas transparente, incoloro, con u:i olor leve y etéreo. Su presión de vapor a 25º es de aproximadamente 4880 mm de mercurio (80 psig). Categoría del NF: Propelente. Diclorotetrafluoroetano: Gas transparente, incoloro, con u:i olor leve y etéreo. Su presión de vapor a 25º es de aproximadamente 1620 mm de mercurio (1 7 psig). Por lo
Tablas de Referencia / Descripción y Solubilidad 2435 general contiene entre 6% y 10% de su isómero, CCliF-CF 3 • Categoría del NF: Propelente. Dicloxacilina Sódica: Polvo cristalino blanco a blanquecino. Fácilmente soluble en agua . Didanosina: Polvo cristalino blanco a blanquecino. Muy soluble en dimetil sulfóxido; prácticamente insoluble o insoluble en acetona y en metanol. . Didrogesterona: Polvo cristalino blanco a amarillo pálido. Moderadamente soluble en alcohol; prácticamente insoluble en agua. Dien~st~ol: Cristales en forma de aguja, incoloros, blancos o pract1camente blancos, o polvo cristalino blanco o prácticamente blanco. Es inodoro. Soluble en alcohol, en acetona, en éter, en metanol, en propilenglicol y en soluciones de hidróxidos alcalinos; poco soluble en cloroformo y en aceites grasos; prácticamente insoluble en agua. Diestearato de Glice.rilo: Masa dura y cerosa, o polvo, o escamas blancas o casi blancas. Soluble en cloruro de metileno y en tetrahidrofurano; poco soluble en alcohol caliente; insoluble en agua. Categoría del NF: Agente emulsionante. Dietanolamina: Cristales incoloros, blancos o transparentes, delicuescentes en aire húmedo; o líquido incoloro. Miscible con agua, con alcohol, con acetona, con cloroformo y con 9licerina. Poco soluble a insoluble en benceno en éter y en eter de petróleo. Categoría del NF: Agente ' emulsionante; modificador de pH (agente acidificante/ agente alcalinizante/agente amortiguador). Dietilestilbestrol: Polvo cristalino blanco, inodoro. Soluble en alcohol, en cloroformo, en éter, en aceites grasos y en hidróxidos alcalinos diluidos; prácticamente insoluble en agua. Dietiltoluamida: Líquido incoloro con olor leve y agradable. Alcanza el punto de ebullición aproximadamente a 111 º bajo una presión de 1 mm de mercurio. Prácticamente insoluble en agua y en glicerina. Miscible con alcohol con alcohol isopropílico, con éter, con cloroformo y con disulfuro de carbono. Difilina: Sólido cristalino o amorfo, de color blanco inodoro y extremadamente amargo. Fácilmente soluble 1en agua; moderadamente soluble en alcohol y en cloroformo· prácticamente insoluble en éter. ' Diflunisal: Polvo blanco a blanquecino prácticamente inodoro. Fácilmente soluble en alcohol y e~ metanol; soluble en acetona y en acetato de etilo; poco soluble en cloroformo, en tetracloruro de carbono y en cloruro de metileno· ' insoluble en hexano y en agua. Difosfato Sódico de Menadiol: Polvo de color blanco a rosado con un olor característico. Es higroscópico. Sus soluciones son neutras o ligeramente alcalinas al tornasol con un pH de aproximadamente 8. Muy soluble en agua; insoluble en alcohol. Digitoxina: Polvo microcristalino, blanco o beige pálido, inodoro. Moderadamente soluble en cloroformo; poco soluble en alcohol; muy poco soluble en éter; prácticamente insoluble en agua. Digoxina: Cristales transparentes a blancos, inodoros, o P?lvo cristalino, blanco, inodoro. Fácilmente soluble en piridtna; poco soluble en alcohol diluido y en cloroformo; prácticamente insoluble en agua y en éter. Dihidrotaquisterol: Cristales incoloros o blancos, inodoros, o polvo cristalino blanco, inodoro. Fácilmente soluble en éter y en cloroformo; soluble en alcohol; moderadamente soluble en aceites vegetales; prácticamente insoluble en agua. Dihidroxiacetona: Polvo cristalino blanco a blanquecino. La forma monomérica es fácilmente soluble en agua, en alcohol y en éter. La forma dimérica es fácilmente soluble ,en agua; soluble en alcohol; y moderadamente soluble en eter.
2436 Descripción y Solubilidad / Tablas de Referencia Diisoestearato de Poliglicerilo-3: Líquido viscoso. Soluble en alcohol, en cloruro de metileno, en aceite mineral y en aceites vegetales; insoluble en agua. Categoría del NF: Agente emulsionante; base para ungüentos. Dilaurato de Propilenglicol: Líquido transparente y aceitoso a 20º. Incoloro o ligeramente amarillo. Muy soluble en alcohol, en metano! y en cloruro de metileno; prácticamente insoluble en agua. Categoría del NF: Emoliente; agente emulsionante. Dimenhidrinato: Polvo cristalino blanco, inodoro. Fácilmente soluble en alcohol y en cloroformo; moderadamente soluble en éter; poco soluble en agua. Dimercaprol: Líquido incoloro o prácticamente incoloro, con olor desagradable similar al del mercaptano. Soluble en agua, en alcohol, en benzoato de bencilo y en metano!. Dimercaprol, Inyección: Solución amarilla y viscosa, con olor acre y desagradable. El peso específico es aproximadamente 0,978. Dimeticona: Líquido transparente, incoloro e inodoro. Soluble en hidrocarburos dorados, en benceno, en tolueno, en xileno, en n-hexano, en alcoholados de petróleo, en éter y en acetato de amilo; muy poco soluble en alcohol isopropílico; insoluble en agua, en metanol, en alcohol y en acetona. Categoría del NF: Agente antiespumante; agente hidrofóbico; adhesivo; emoliente. Dimetil Sulfóxido: Líquido transparente, incoloro, inodoro e higroscópico. Funde aproximadamente a 18,4º. Alcanza el punto de ebullición aproximadamente a 189º. Soluble en agua; prácticamente insoluble en acetona, en alcohol, en benceno, en cloroformo y en éter. Categoría del NF: Disolvente. Dinitrato de lsosorbida Diluido: Polvo de color blanco marfil, inodoro. [NOTA-El dinitrato de isosorbida sin diluir se presenta en forma de rosetas cristalinas blancas.] El dinitrato de isosorbida sin diluir es muy soluble en acetona; fácilmente soluble en cloroformo; moderadamente soluble en alcohol; muy poco soluble en agua. Dinoprost Trometamina: Polvo cristalino blanco a blanquecino. Muy soluble en agua; fácilmente soluble en dimetilformamida; soluble en metanol; poco soluble en cloroformo. Dinoprostona: Polvo cristalino blanco a blanquecino. Fácilmente soluble en acetona, en alcohol, en éter, en acetato de etilo, en alcohol isopropílico, en metanol y en cloruro de metileno; soluble en tolueno y en éter diisopropílico; prácticamente insoluble en hexanos. Dioleato de Poliglicerilo: Líquido viscoso. Soluble en cloruro de metileno, en aceite mineral y en aceites vegetales; moderadamente soluble en alcohol; insoluble en agua. Categoría del NF: Agente emulsionante. Dioxibenzona: Polvo amarillo. Fácilmente soluble en alcohol y en tolueno; prácticamente insoluble en agua. Dióxido de Azufre: Gas incoloro no inflamable con un olor fuerte y sofocante característico del azufre en combustión. Bajo presión, se condensa fácilmente para formar un líquido incoloro que alcanza el punto de ebullición a -1 Oº y tiene una densidad de aproximadamente 1,5. A 20º y a presión estándar, se disuelven aproximadamente 36 volumenes en 1 volumen de agua, y aproximadamente 114 volúmenes se disuelven en 1 volumen de alcohol. También es soluble en éter y en cloroformo. Categoría del NF: Antioxidante; conservante antimicrobiano. Dióxido de Carbono: Gas inodoro e incoloro. Sus soluciones son ácidas al tornasol. Un L a Oº y a una presión de 760 mm de mercurio pesa 1,977 g. Un volumen se disuelve en aproximadamente 1 volumen de agua. Categoría del NF: Desplazador de aire; propelente. Dióxido de Silicio: Polvo amorfo, fino, blanco, higroscópico, inodoro, cuyas partículas promedio tienen un diámetro comprendido entre 2 µm y 1O µm. Soluble en soluciones calientes de hidróxidos alcalinos; insoluble en agua,
USP 39 en alcohol y en otros disolventes orgánicos. Categoría del NF: Desecante; agente de suspensión y/o viscosante. Dióxido de Silicio Coloidal: Polvo liviano, blanco, no arenoso, de un tamaño de partícula extremadamente fino (aproximadamente 15 nm). Soluble en soluciones calientes de hidróxidos alcalinos; insoluble en agua y en ácido (excepto fluorhídrico). Categoría del NF: Deslizante y/o agente antiaglutinante; agente de suspensión y/o viscosante; desintegrante. Dióxido de Titanio: Polvo blanco, inodoro e insípido. Su suspensión 1 en 1 O en a_gua es neutra al tornasol. Insoluble en agua, en ácido clorh1drico, en ácido nítrico y en ácido sulfúrico 2 N. Se disuelve en ácido fluorhídrico y en ácido sulfúrico caliente. Se solubiliza por fusión con bisulfato de potasio o con carbonatos o hidróxidos alcalinos. Categoría del NF: Agente de recubrimiento. Dipiridamol: Polvo o agujas cristalinos, de color amarillo intenso. Muy soluble en metanol, en alcohol y en cloroformo; poco soluble en agua; muy poco soluble en acetona y en acetato de etilo. Dipropionato de Beclometasona: Polvo inodoro de color blanco a blanco cremoso. Muy soluble en cloroformo; fácilmente soluble en acetona y en alcohol; muy poco soluble en agua. Dipropionato de Betametasona: Polvo inodoro de color blanco a blanco cremoso. Fácilmente soluble en acetona y en cloroformo; moderadamente soluble en alcohol; insoluble en agua. Diritromicina: Polvo blanco o prácticamente blanco. Muy soluble en metanol y en cloruro de metileno; muy poco soluble en agua. Disulfato Tosilato de Ademetionina: Polvo blanco. Fácilmente soluble en agua. Disulfiram: Polvo cristalino blanco a blanquecino, inodoro. Soluble en acetona, en alcohol, en disulfuro de carbono y en cloroformo; muy poco soluble en agua. Divalproex Sódico: Polvo cristalino blanco a blanquecino. Muy soluble en cloroformo; fácilmente soluble en metano! y en éter etílico; soluble en acetona; prácticamente insoluble en acetonitrilo. Docetaxel: Polvo cristalino blanco o casi blanco. Fácilmente soluble en acetona; soluble en metanol; prácticamente insoluble en agua. Docusato Cálcico: Sólido blanco y amorfo con el olor característico del alcohol octílico. No presenta olor a otros disolventes. Muy soluble en alcohol, en polietilenglicol 400 y en aceite de maíz; muy poco soluble en agua. Docusato Potásico: Sólido blanco y amorfo con un olor característico parecido al del alcohol octílico. Muy soluble en éter de petróleo; soluble en alcohol y en glicerina; moderadamente soluble en agua. Docusato Sódico: Sólido plástico, parecido a la cera, blanco, con un olor característico parecido al del alcohol octílico, pero sin olor a otros disolventes. Muy soluble en éter de petróleo; fácilmente soluble en alcohol y en glicerina; moderadamente soluble en agua. Categona del NF: Agente humectante y/o solubilizante. Dofetilida: Polvo blanco a blanquecino. Soluble en hidróxido de sodio O, 1 N, en acetona y en ácido clorhídrico O, 1 N; muy poco soluble en agua y en alcohol isopropílico. Doxiciclina: Polvo cristalino amarillo. Fácilmente soluble en ácido diluido y en soluciones de hidróxidos alcalinos; muy poco soluble en alcohol y en agua; prácticamente insoluble en cloroformo y en éter. Dronabinol: Aceite resinoso de color amarillo pálido que es viscoso a temperatura ambiente y endurece al refrigerarse. Insoluble en agua. Droperidol: Polvo amorfo o microcristalino, de color blanco a tostado claro. Fácilmente soluble en cloroformo; poco soluble en alcohol y en éter; prácticamente insoluble en agua. Funde aproximadamente a 145º.
Tablas de Referencia/ Descripción
USP 39 Drospirenona: Polvo blanco a blanquecino. Fácilmente soluble en cloruro de metileno; soluble en acetona y en metano!; moderadamente soluble en acetato de etilo y en alcohol; prácticamente insoluble en hexano y en agua. Dutasterida: Polvo blanco a amarillo pálido. Soluble en etanol y en metano!; poco soluble en polietilenglicol 400; e insoluble en agua. Ecamsul, Solución: Líquido amarillo transparente. Edetato Cálcico Disódico: Gránulos cristalinos blancos o polvo cristalino blanco. Es i~odoro, ligeramen~e hiQí<;>scópico y tiene un leve sabor salrno. Es estable al aire. Fac1lmente soluble en agua. Categoría del NF: Agente quelante y/ o complejante. Edetato Disódico: Polvo cristalino blanco. Soluble en agua. Categoría del NF: Agente quelante y/o complejante; ligando de transferencia. Edisilato de Proclorperazina: Polvo cristalino, blanco a amarillo muy claro, inodoro. Sus soluciones son ácidas al tornasol. Fácilmente soluble en agua; muy poco soluble en alcohol; insoluble en éter y en cloroformo. Efavirenz: Polvo cristalino blanco a ligeramente rosado. Soluble en metano!; prácticamente insoluble en agua. Efedrina: Sólido untuoso, prácticamente incoloro, o cristales o gránulos de color blanco. Se descompone gradualmente al exponerse a la luz. Funde entre 33º y 40º; la variabilidad en el punto de fusión es el resultado de las diferencias en el contenido de humedad; la Efedrina anhidra tiene un punto de fusión inferior al del hemihidrato de Efedrina. Sus soluciones son alcalinas al tornasol. Soluble en agua, en alcohol, en cloroformo y en éter; lenta y moderadamente soluble en aceite mineral, la solución se enturbia si la Efedrina contiene más de aproximadamente 1% de agua. Elíxir Aromático: Categoría del NF: Vehículo (saborizado y/o edulcorado). Enalaprilat: Polvo cristalino, higroscópico, blanco a casi blanco. Moderadamente soluble en metano! y en dimetilformamida; poco soluble en agua y en alcohol isopropílico; muy poco soluble en acetona, en alcohol y en hexano; prácticamente insoluble en acetonitrilo y en cloroformo. Enantato de Flufenazina: Líquido viscoso de color amarillo pálido a anaranjado amarillento, transparente a ligeramente turbio, con un olor característico. Es inestable en presencia de luz fuerte, pero estable al aire a temperatura ambiente. Fácilmente soluble en alcohol, en cloroformo y en éter; insoluble en agua. Enantato de Testosterona: Polvo cristalino blanco o blanco cremoso. Es inodoro o posee un leve olor característico a ácido heptanoico. Muy soluble en éter; soluble en aceites vegetales; insoluble en agua. Enflurano: Líquido transparente, incoloro, estable, volátil, con olor leve y dulce. No es inflamable. Poco soluble en agua. Miscible con disolventes orgánicos, con grasas y con aceites. Enrofloxacino: Polvo cristalino de color amarillo pálido a amarillo claro. Muy poco soluble en agua a pH 7. Entacapona: Polvo amarillo verdoso a amarillo. Moderadamente soluble en acetona y en metano!; poco soluble en etanol, en cloroformo, en isopropanol y en éter; muy poco soluble en tolueno; prácticamente insoluble en agua.
Agregar Jp sigÜlente: .t-En~eé:<1vir: ..
Polvo blat1c:O á
l:>l<1rjgu~drj6. P.~á~~ié~ctJerjte
insoluble .a pp<:o sqluqle en. <1gua; practkarnente .insoluble en etanol anhidroy en heptanQ•.t.u$P~9
Epinefrina: Polvo o gránulos microcristalinos, inodoros, de color blanco a prácticamente blanco, qu~ se oscur,e~en gradualmente si se los expone a la luz y al aire. Con ac1dos, forma sales que son fácilmente solubles en agua y la base puede recuperarse mediante el agregado de hidróxido de
y Solubilidad 2437
amonio o carbonatos alcalinos. Sus soluciones son alcalinas al tornasol. Muy poco soluble en agua y en alcohol; insoluble en éter, en cloroformo y en aceites fijos y volátiles. Epinefrina, Inyección: Líquido prácticamente incoloro, ligeramente ácido. Se oscurece gradualmente al exponerse a la luz y al aire. Epinefrina, Solución para Inhalación: Líquido prácticamente incoloro, ligeramente ácido. Se oscurece gradualmente al exponerse a la luz y al aire. Epinefrina, Solución Nasal: Líquido casi incoloro, ligeramente ácido. Se oscurece gradualmente al exponerse a la luz y al aire. Epinefrina, Solución Oftálmica: Solución incolora a ligeramente amarilla. Se oscurece gradualmente al exponerse a la luz y al aire. Eprinomectina: Polvo blanco a blanquecino. Insoluble en agua fría. Ergocalciferol: Cristales blancos, inodoros. Es afectado por e[ aire y la luz. Soluble en alcohol, en cloroformo, en éter y en aceites grasos; insoluble en agua. Ergocalciferol, Solución Oral: Líquido transparente con las características del disolvente usado para preparar la Solución. Eritritol: ~olvo cristalino blanco o casi blan.co, o 9r~nu los de libre flwdez. Es estable al calor y no es h1groscop1co. Fácilmente soluble en agua; muy poco soluble en alcohol. Categoría del NF: Humectante; agente edulcorante; diluyente. Eritrocitos: Color rojo oscuro cuando están envasados. Puede presentar una capa ligeramente cremosa en la super~ ficie y una pequeña capa de sobrenadante de plasma amarillo u opalescente. También se suministra en forma congelada con una sustancia criofiláctica agregada para prolongar el tiempo de almacenamiento. Eritromicina: Polvo cristalino blanco o ligeramente amarillo. Es inodoro o prácticamente inodoro. Soluble en alcohol, en cloroformo y en éter; poco soluble en agua. Escualeno: Aceite incoloro, transparente, prácticamente inodoro. Poco soluble en acetona; muy poco soluble en alcohol absoluto; insoluble en agua. Miscible con éter y con cloroformo. Categoría del NF: Base para ungüentos; vehículo (oleoso). Esomeprazol Magnésico: Polvo blanco a una ligera coloración. Soluble en metano!; poco soluble en agua; prácticamente insoluble en heptano. Espironolactona: Polvo cristalino, de color crema claro a tostado claro. Tiene un olor entre leve y suave parecido al del mercaptano; es estable al aire. Fácilmente soluble en benceno y en cloroformo; soluble en acetato de etilo y en alcohol; poco soluble en metano! y en aceites fijos; prácticamente insoluble en agua. Estanozolol: Polvo cristalino, inodoro, que se presenta en dos formas: como agujas, funde aproximadamente a 155º, y como prismas, funde aproximadamente a 235º. Soluble en dimetilformamida; moderadamente soluble en alcohol y en cloroformo; poco soluble en acetato de etilo y en acetona; muy poco soluble en benceno; insoluble en agua. Estavudina: Polvo cristalino blanco a blanquecino. Soluble en agua, en dimetilacetamida y en dimetil sulfóxido; moderadamente soluble en metano!, en alcohol y en acetonitrilo; poco soluble en diclorometano; insoluble en hexano. Estazolam: Cristal blanco a blanco amarillento pálido . Soluble en metano! y en anhídrido acético; moderadamente soluble en etanol; prácticamente insoluble en agua y en éter. Estearato de Butilo: Sólido ceroso incoloro o amarillento pálido a temperaturas inferiores a l 9º-24º o líquido incoloro o amarillento pálido a temperaturas de l 9º-24º o superiores. Soluble en acetona, en alcohol, en éter, en aceites minerales y en aceites vegetales; prácticamente insoluble
2438 Descripción y Solubilidad / Tablas de Referencia en agua y en propilenglicol. Categoría del NF: Agente emulsionante; saborizantes y fragancia; plastificante. Estearato de Calcio: Polvo voluminoso, fino, de color blanco a blanco amarillento, con un leve olor característico. Es untuoso y está libre de arenosidad. Insoluble en agua, en alcohol y en éter. Categoría del NF: Lubricante. Estearato de Cinc: Polvo fino, blanco, voluminoso, exento de arenosidad. Tiene un olor leve característico. Es neutro al papel tornasol humedecido. Insoluble en agua, en alcohol y en éter. Categoría del NF: Lubricante. Estearato de Eritromicina: Polvo o cristales blancos o levemente amarillos. Es inodoro o puede tener un leve olor a tierra y tiene un sabor ligeramente amargo. Soluble en alcohol, en cloroformo, en metanol y en éter; prácticamente insoluble en agua. Estearato de Magnesio: Polvo blanco, muy fino, liviano y resbaladizo al tacto. Insoluble en agua, en alcohol y en éter. Categoría del NF: Lubricante. Estearato de Polietileno 50: Categoría del NF: Agente emulsionante. Estearato de Polioxilo: Masa cerosa blanca o ligeramente amarillenta. Soluble en alcohol y en alcohol isopropílico. El estearato de polioxilo que corresponde a un producto con 6-8 unidades de óxido de etileno por molécula es soluble en aceites grasos y en ceras; prácticamente insoluble en agua. El estearato de polioxilo que corresponde a un producto con 20-100 unidades de óxido de etileno por molécula es soluble en agua; prácticamente insoluble en aceites grasos y en ceras. Categoría del NF: Agente emulsionante; agente humectante y/o solubilizante. Estearato de Polioxilo 40: Sólido ceroso, de color blanco o tostado claro. Es inodoro o tiene un olor tenue, semejante al de la grasa. Soluble en agua, en alcohol, en éter y en acetona; insoluble en aceite mineral y en aceites vegetales. Categoría del NF: Agente humectante y/o solubilizante; agente emulsionante; lubricante. Estearato de Sacarosa: Polvo untuoso blanco o casi blanco. Moderadamente soluble en etanol (96%); muy poco soluble en agua. Categoría del NF: Agente emulsionante; lubricante. Estearato de Sodio: Polvo blanco fino, jabonoso al tacto, generalmente con un olor leve parecido al del sebo. Es afectado por la luz. Sus soluciones son alcalinas a la fenolftaleína SR. Lentamente soluble en agua fría y en alcohol frío; rápidamente soluble en agua caliente y en alcohol caliente. Categoría del NF: Agente emulsionante; deslizante y/o agente antiaglutinante; agente espesante; lubricante. Estearatos de Dietilenglicol: Sólido ceroso blanco o casi blanco. Soluble en acetona y en alcohol caliente; prácticamente insoluble en agua. Categoría del NF: Agente emulsionante. Estearatos de Etilenglicol: Sólido ceroso blanco o casi blanco. Soluble en acetona y en alcohol caliente; prácticamente insoluble en agua. Categoría del NF: Agente emulsionante; emoliente. Estearil Fumarato de Sodio: Polvo fino blanco. Poco soluble en metanol; prácticamente insoluble en agua. Categoría del NF: Lubricante. Ésteres de Cetilo, Cera: Escamas blancas a blanquecinas, algo translúcidas, con estructura cristalina y un reflejo perlado cuando se endurecen. Desprende un olor débil y tiene un sabor suave e insípido, sin rancidez y un peso específico de aproximadamente 0,83 a 50º. Soluble en alcohol en ebullición, en éter, en cloroformo y en aceites fijos y volátiles; poco soluble en éter de petróleo frío; prácticamente insoluble en alcohol frío; insoluble en agua. Categoría del NF: Agente espesante; emoliente. Estolato de Eritromicina: Polvo cristalino blanco. Es inodoro o prácticamente inodoro, y prácticamente insípido. Soluble en alcohol, en acetona y en cloroformo; prácticamente insoluble en agua.
USP 39 Estoraque: Masa semilíquida, grisácea a marrón grisácea, pegajosa, opaca, que, al dejar en reposo, deposita una pesada capa marrón oscura (Estoraque levantino); o masa semisólida, a veces una masa sólida, que se reblandece por entibiado suave (Estoraque americano). Es transparente en capas delgadas, tiene un olor y un sabor característicos y es más denso que el agua. Soluble, por lo general de manera incompleta, en un peso igual de alcohol tibio, en acetona, en disulfuro de carbono y en éter, normalmente con algunos restos insolubles; insoluble en agua. Estradiol: Polvo cristalino o cristales pequeños de color blanco o blanco cremoso. Es inodoro y estable al aire. Es higroscópico. Soluble en alcohol, en acetona, en dioxano, en cloroformo y en soluciones de hidróxidos alcalinos fijos; moderadamente soluble en aceites vegetales; prácticamente insoluble en agua. Estriol: Polvo cristalino blanco a prácticamente blanco e inodoro. Funde aproximadamente a 280º. Soluble en acetona, en cloroformo, en dioxano, en éter y en aceites vegetales; moderadamente soluble en alcohol; insoluble en agua. Estrógenos Conjugados: Los Estrógenos Conjugados obtenidos a partir de fuentes naturales son un polvo amorfo de color beige, inodoro o con un olor leve característico. La forma sintética es un polvo cristalino o amorfo, blanco a beige claro, inodoro o con un olor leve. Estrógenos Conjugados Sintéticos: Un polvo cristalino o amorfo, de color blanco a beige claro que es inodoro o con un olor leve. Estrógenos Esterificados: Polvo amorfo, de color blanco o beige, inodoro o con un olor leve característico. Estrona: Cristales blancos pequeños o polvo cristalino blanco a blanco cremoso. Es inodoro y estable al aire. Funde aproximadamente a 260º. Soluble en alcohol, en acetona, en dioxano y en aceites vegetales; poco soluble en soluciones de hidroxidos alcalinos fijos; prácticamente insoluble en agua. Estropipato: Polvo cristalino fino, blanco a blanco amarillento. Es inodoro, o puede tener un olor leve. Funde aproximadamente a 190º en forma de líquido viscoso de color marrón claro, que se solidifica con el calentamiento adicional hasta fundir aproximadamente a 245º, con descomposición. Soluble en agua tibia; muy poco soluble en agua, en alcohol, en cloroformo y en éter.
Etclorvinol: Líquido ligeramente viscoso, de incoloro a amarillo, con un olor acre característico. Se oscurece al exponerse a la luz y al aire. lnmiscible con agua; miscible con la mayoría de los disolventes orgánicos. Éter: Líquido incoloro, móvil, volátil, con olor dulce y acre característico. Se oxida lentamente por la acción del aire y la luz formando peróxidos. Alcanza el punto de ebullición aproximadamente a 35º. Soluble en agua y en ácido clorhídrico. Miscible con alcohol, con benceno, con cloroformo, con éter de petróleo, con cloruro de metileno y con aceites fijos y volátiles. Éter Monoetílico de Dietilenglicol: Líquido transparente, incoloro. Es higroscópico. Miscible con agua, con acetona y con alcohol; parcialmente miscible con aceites vegetales; inmiscible con aceites minerales. El peso específico es aproximadamente 0,991. Categoría del NF: Base de ungüento; disolvente; agente emulsionante. , Éter Monometílico de Polietilenglicol: En general, el Eter Monometílico de Polietilenglicol se designa mediante un número que corresponde aproximadamente a su peso
Tablas de Referencia / Descripción y Solubilidad 2439
USP 39
molecular promedio. A medida que aumenta el peso molecular promedio, disminuye la solubilidad en agua, la presión de vapor, la higroscopicidad y la solubilidad en disolventes orgánicos, a la vez que aumenta la temperatura de solidificación, el peso específico, el punto de inflamabilidad y la viscosidad. Los grados líquidos se presentan como líquidos viscosos transparentes a li9eramente turbios, incoloros a prácticamente incoloros, ligeramente higroscópicos con un olor leve característico y un peso específico a 25º de aproximadamente 1,09-1, 1O. Los grados sólidos se presentan como material plástico, prácticamente inodoro e insípido, blanco, ceroso, con una consistencia similar a la cera de abejas, ya sea en escamas, perlas o polvos de color blanco cremoso. La tabla adjunta indica las temperaturas de solidificación aproximadas que son características de los grados más comúnmente disponibles. Los grados líquidos son miscibles con agua; los grados sólidos son fácilmente solubles en agua; y todos son solubles en acetona, en alcohol, en cloroformo, en éter monoetílico de etilenglicol, en acetato de etilo y en tolueno; todos son insolubles en éter y en hexano. Categoría del NF: Base para ungüentos; disolvente; plastificante. Éter Monometíllco de Polletllengllcol Peso Molecular Nominal 350 550 750 1000 2000 5000 8000 10000
Temperatura de Solldlflcaclón Aoroxlmada (º) -7 17 28 35 51 59 60 61
Éter Polioxil 10 Oleílico: Semisólido blanco blando o líquido amarillo pálido, con un olor leve. Soluble en agua y en alcohol; dispersable en aceite mineral y en propilenglicol, con posible separación al dejar en reposo. Categoría de1 NF: Agente emulsionante; lubricante; agente humectante y/o solubilizante. Éter Polioxil 20 Cetoestearílico: Masa untuosa de color crema con consistencia cerosa; cuando se la calienta, funde y se transforma en un líquido transparente de color amarillo amarronado. Soluble en agua, en alcohol y en acetona; insoluble en éter de petróleo. Categoría del NF: Agente humectante y/o solubilizante; agente emulsionante; lubricante. Éter Polioxil Estearílico: Masa, pellets, microperlas o escamas de,color blanco a blanco amarillento, untuosos y cerosos. El Eter Polioxil Estearílico con 2 unidades de oxietileno por molécula es soluble en alcohol, con calentamiento, y e,n cloruro de metileno; prácticamente insoluble en agua. El Eter Polioxil Estearílico con 1O unidades de ,oxietileno por molécula es soluble en agua y en alcohol. El Eter Polioxif Estearílico con 20 unidades de oxietileno por molécula es soluble en agua, en alcohol y en cloruro de metileno. Después de fundido, se solidifica aproximadamente a 45º. Categoría del NF: Agente emulsionante; agente humectante y/o solubilizante. Éter Polioxil Laurílico: La sustancia que tiene entre 3-5 unidades de oxietileno por molécula es un líquido incoloro. Soluble o dispersable en alcohol; prácticamente insoluble en agua y en hexano. La sustancia que tiene entre 9-23 unidades de oxietileno por molécula es una masa de color blanco y consistencia cerosa. Soluble o dispersable en agua; soluble en alcohol; prácticamente insoluble en hexano. Categoría del NF: Agente emulsionante; agente humectante y/o solubilizante. Éter Sulfobutílico Sódico de Betadex: Polvo amorfo de color blanco a blanquecino. Fácilmente soluble en agua; moderadamente soluble en metanol; prácticamente insoluble en etanol, en n-hexano, en 1-butanol, en acetonitrilo, en
2-propanol y en acetato de etilo. Categoría del NF: Agente quelante y/o complejante; agente secuestrante; agente humectante y/o solubihzante. Etidronato Disódico: Polvo blanco que puede contener grumos. Fácilmente soluble en agua; prácticamente insoluble en alcohol. Etil Maltol: Polvo cristalino blanco con olor a algodón de azúcar (cotton-candy) y un sabor dulce frutal en solución diluida. Un g se disuelve en aproximadamente 55 mL de agua, 1O mL de alcohol, 17 mL de propilenglicol y 5 mL de cloroformo. Se funde aproximadamente a 90º. Categoría del NF: Vehículo (saborizado y/o edulcorado); saborizantes y fragancia. Etil Vainillina: Cristales finos, de color blanco o ligeramente amarillo. Su sabor y olor son similares al sabor y olor de la vainillina. Es afectado por la luz. Sus soluciones son ácidas al tornasol. Fácilmente soluble en alcohol, en cloroformo, en éter y en soluciones de hidróxidos alcalinos; moderadamente soluble en agua a 50º. Categoría del NF: Saborizantes y fragancia. Etilcelulosa: Polvo de libre fluidez, de color blanco a tostado claro. Forma películas que tienen un índice de refracción de aproximadamente 1,47. Sus suspensiones acuosas son neutras al tornasol. La etilcelulosa que contiene menos de 46,5% de grupos etoxi es fácilmente soluble en tetrahidrofurano, en acetato de metilo, en cloroformo y en mezclas de hidrocarburos aromáticos con alcohol. La etilcelulosa que contiene no menos de 46,5% de grupos etoxi es fácilmente soluble en alcohol, en metanol, en tolueno, en cloroformo y en acetato de etilo; insoluble en agua, en glicerina y en propilenglicol. Categoría del NF: Agente de recubrimiento; aglutinante por vía húmeda; saborizantes y fragancia; agente formador de película; polímero de membrana; agente modificador de liberación; agente de suspensión y/o viscosante. Etilcelulosa, Dispersión de Tipo B: Líquido ligeramente viscoso de color blanquecino. Soluble en alcohol, en alcohol metílico, en tetrahidrofurano y en acetato de etilo; insoluble en agua y en cloroformo. Categoría del NF: Agente de recubrimiento; agente formador de película; polímero de membrana; agente modificador de liberación. Etilendiamina: Líquido transparente, incoloro o sólo levemente amarillo, con un olor parecido al amoníaco y una reacción alcalina fuerte. Miscible con agua y con alcohol. Etilparabeno: Cristales incoloros pequeños o polvo blanco. Fácilmente soluble en acetona, en alcohol, en éter y en propilenglicol; poco soluble en agua y en glicerina. Categoría del NF: Conservante antimicrobiano.
Etilsuccinato de Eritromicina: Polvo cristalino blanco o ligeramente amarillo. Es inodoro o prácticamente inodoro y es prácticamente insípido. Fácilmente soluble en alcohol, en cloroformo y en polietilenglicol 400; muy poco soluble en agua. Etinil Estradiol: Polvo cristalino, inodoro, de color blanco a blanco cremoso. Soluble en alcohol, en cloroformo, en éter, en aceites vegetales y en soluciones de hidróxidos alcalinos fijos; insoluble en agua. Etionamida: Polvo amarillo brillante, con un olor leve a moderado semejante al sulfuro. Soluble en metanol; moderadamente soluble en alcohol y en propilenglicol; poco soluble en agua, en cloroformo y en éter. Etomidato: Polvo blanco o casi blanco. Fácilmente soluble en alcohol y en cloruro de metileno; muy poco soluble en agua.
2440 Descripción y Solubilidad / Tablas de Referencia Etopabato: Polvo blanco a blanco rosado, inodoro o prácticamente inodoro. Soluble en acetonitrilo, en acetona, en alcohol deshidratado y en metanol; moderadamente soluble en alcohol isopropílico, en dioxano, en acetato de etilo y en cloruro de metileno; poco soluble en éter; muy poco soluble en agua. Etopósido: Polvo cristalino, fino, blanco a blanquecino. Moderadamente soluble en metanol; poco soluble en alcohol, en cloroformo, en acetato de etilo y en cloruro de metileno; muy poco soluble en agua. Etosuximida: Sólido ceroso o polvo cristalino, blanco a blanquecino, con un olor característico. Fácilmente soluble en agua y en cloroformo; muy soluble en alcohol y en éter; muy poco soluble en éter de petróleo. Etotoína: Polvo cristalino blanco. Fácilmente soluble en alcohol deshidratado y en cloroformo; soluble en éter; insoluble en agua. Eugenol: Líquido incoloro o amarillo pálido, que tiene un fuerte olor aromático a clavo y un sabor acre y picante. Se oscurece y espesa al exponerlo al aire. Es ópticamente inactivo. Poco soluble en agua. Miscible con alcohol, con cloroformo, con éter y con aceites fijos. Extracto en Polvo de Ginseng Asiático: Masa polvorienta o fácilmente pulverizable, higroscópica, de color marrón amarillento pálido. Soluble en agua, produce una solución levemente turbia. Extracto en Polvo de Valeriana: Masa de color marrón, higroscópica, polvorienta o fácilmente pulverizable. Soluble en agua con la que forma una solución ligeramente turbia; moderadamente soluble en alcohol al 70 por ciento; prácticamente insoluble en alcohol. Extracto de Piretro: Líquido de color amarillo pálido con un olor floral suave. Soluble en aceite mineral y en la mayoría de los disolventes orgánicos; insoluble en agua. Piretrinas I denota el grupo que contiene piretrina 1, cinerina 1 y jasmolina 1; Piretrinas 11 denota el grupo que contiene piretrina 2, cinerina 2 y jasmolina 2. Ezetimiba: Polvo blanco. Fácilmente soluble en alcohol; soluble en acetonitrilo; insoluble en disolventes acuosos y disolventes no polares como hexano. Factor Antihemofílico: Polvo blanco o amarillento. Cuando se reconstituye, es opalescente con un leve matiz azul o es un líquido amarillento. Factor Antihemofílico Crioprecipitado: Sólido amarillento, congelado. Durante el descongelamiento se vuelve un líquido gomoso, amarillo y muy viscoso. Famciclovir: Sólido de color blanco a amarillo pálido. Fácilmente soluble en metanol y en acetona; moderadamente soluble en etanol y en alcohol isopropílico. Famotidina: Polvo cristalino, blanco a blanco amarillento pálido. Es sensible a la luz. Fácilmente soluble en dimetilformamida y en ácido acético glacial; poco soluble en metanol; muy poco soluble en agua; prácticamente insoluble en acetona, en alcohol, en cloroformo, en éter y en acetato de etilo. Felbamato: Polvo blanco a blanquecino. Fácilmente soluble en dimetil sulfóxido; moderadamente soluble en metano!; poco soluble en acetonitrilo; muy poco soluble en agua. Felodipino: Polvo cristalino, amarillo claro a amarillo. Fácilmente soluble en acetona y en metano!; muy poco soluble en heptano; insoluble en agua. Fenbendazol: Polvo blanco a blanquecino. Moderadamente soluble en dimetilformamida; muy poco soluble en metanol; prácticamente insoluble en agua. Fenilalanina: Cristales blancos, inodoros, con un leve sabor amargo. Moderadamente soluble en agua; muy poco soluble en metanol, en alcohol y en ácidos minerales diluidos.
USP 39 Fenilbutazona: Polvo cristalino blanco a blanquecino, inodoro. Fácilmente soluble en acetona y en éter; soluble en alcohol; muy poco soluble en agua. Fenitoína: Polvo blanco e inodoro. Funde aproximadamente a 295º. Soluble en alcohol caliente; poco soluble en alcohol frío, en cloroformo y en éter; prácticamente insoluble en agua. Fenitoína Sódica: Polvo blanco e inodoro. Es algo higroscópica y al exponerse al aire absorbe gradualmente dióxido de carbono. Fácilmente soluble en agua y la solución es normalmente al_go turbia debido a la hidrólisis parcial y a la absorción de dioxido de carbono; soluble en alcohol; prácticamente insoluble en éter y en cloroformo. Fenobarbital: Pequeños cristales blancos, inodoros y brillantes, o polvo blanco, cristalino, que puede presentar polimorfismo. Es estable al aire. Su solución saturada tiene un pH de aproximadamente 5. Soluble en alcohol, en éter y en soluciones de carbonatos e hidróxidos alcalinos fijos; moderadamente soluble en cloroformo; muy poco soluble en agua. Fenobarbital Sódico: Cristales escamosos o gránulos cristalinos blancos o polvo blanco. Es inodoro, tiene un sabor amargo y es higroscópico. Sus soluciones son alcalinas a la fenolftaleína SR y se descomponen en reposo. Muy soluble en agua; soluble en alcohol; prácticamente insoluble en éter y en cloroformo. Fenofibrato: Polvo cristalino blanco o casi blanco. Muy soluble en cloruro de metileno; poco soluble en alcohol; prácticamente insoluble en agua. Fenol: Cristales en forma de aguja, de incoloros a color rosado claro, entrelazados o separados, o masa cristalina de color blanco a rosado claro. Posee un olor característico. Pasa a estado líquido con calentamiento y con el agregado de 10% de agua. Alcanza el punto de ebullición aproximadamente a 182º y su vapor es inflamable. Se oscurece gradualmente al exponerse a la luz y al aire. Muy soluble en alcohol, en glicerina, en cloroformo, en éter y en aceites fijos y volátifes; soluble en agua; moderadamente soluble en aceite mineral. Categoría del NF: Conservante antimicrobiano. Fenol Alcanforado, Gel Tópico: Gel aceitoso, transparente e incoloro. Fenol Licuado: Líquido incoloro a rosado, que puede desarrollar un tinte rojo al exponerse al aire o a la luz. Tiene un olor algo aromático característico. Torna blancas las membranas mucosas y la piel y las cauteriza. El peso específico es aproximadamente 1,065. Miscible con alcohol, con éter y con glicerina. Una mezcla de volúmenes iguales de Fenol Licuado y glicerina es miscible con agua. Fenolsulfonftaleína: Polvo cristalino, de color rojo brillante a oscuro. Poco soluble en alcohol; muy poco soluble en agua. Fenoprofeno Cálcico: Polvo cristalino blanco. Poco soluble en n-hexanol, en metanol y en agua; prácticamente insoluble en cloroformo. Fenoxietanol: Líquido incoloro, ligeramente viscoso. Poco soluble en agua, en aceite de cacahuete y en aceite de oliva. Miscible con acetona, con alcohol y con glicerol. Categoría del NF: Conservante antimicrobiano. Fensuximida: Polvo cristalino blanco a blanquecino. Es inodoro o no tiene más que un olor leve. Muy soluble en cloroformo; soluble en alcohol; poco soluble en agua. Ferumoxidas, Inyección: Coloide acuoso de color negro a marrón rojizo. Es estable durante 24 horas después de su dilución. Finasterida: Sólido cristalino blanco a blanquecino. Funde aproximadamente a 257º. Fácilmente soluble en cloroformo y en alcohol; muy poco soluble en agua. Fisostigmina: Polvo microcristalino blanco, inodoro. Adquiere un tinte rojizo cuando se la expone al calor, la luz o el aire o cuando está en contacto con trazas de metales.
USP 39
Funde a una temperatura no menor a 103º. Muy soluble en cloroformo y en diclorometano; fácilmente soluble en alcohol; soluble en benceno y en aceites fijos; poco soluble en agua. Fitonadiona: Líquido transparente, de color amarillo a ámbar, muy viscoso, inodoro o prácticamente inodoro, con un peso específico de aproximadamente 0,967. Es estable al aire, pero se descompone al exponerse a la luz solar. Soluble en alcohol deshidratado, en benceno, en cloroformo, en éter y en aceites vegetales; poco soluble en alcohol; insoluble en agua. Flucitosina: Polvo cristalino blanco a blanquecino. Es inodora o tiene un olor leve. Moderadamente soluble en agua; poco soluble en alcohol; prácticamente insoluble en cíoroformo y en éter. Fluconazol: Polvo cristalino blanco o casi blanco. Fácilmente soluble en metanol; soluble en alcohol y en acetona; moderadamente soluble en isopropanol y en cloroformo; poco soluble en agua; muy poco soluble en tolueno. Flumazenil: Polvo blanco a blanquecino. Poco soluble en soluciones acuosas ácidas; prácticamente insoluble en agua. Flunisolida: Polvo cristalino blanco a blanco cremoso. Funde aproximadamente a 245º, con descomposición. Soluble en acetona; moderadamente soluble en cloroformo; poco soluble en metanol; prácticamente insoluble en agua. Flunixino Meglumínico: Polvo cristalino blanco a blanquecino. Soluble en agua, en alcohol y en metanol; prácticamente insoluble en acetato de etilo. Fluocinónida: Polvo cristalino de color blanco a crema que sólo presenta un olor leve. Moderadamente soluble en acetona y en cloroformo; poco soluble en alcohol, en metano! y en dioxano; muy poco soluble en éter; prácticamente insoluble en agua. Fluoresceína: Polvo inodoro de color rojo amarillento a rojo. Soluble en hidróxidos alcalinos diluidos; insoluble en agua. Fluoresceína Sódica: Polvo inodoro, higroscópico y de color rojo anaranjado. Fácilmente soluble en agua; moderadamente soluble en alcohol. Fluoresceína Sódica, Tira Oftálmica: Cada Tira es un papel blanco seco con un extremo redondeado de color rojo anaranjado uniforme debido a la fluoresceína sódica impregnada en el papel. Fluorometolona: Polvo cristalino blanco a blanco amarillento, inodoro. Funde aproximadamente a 280º, con algo de descomposición. Poco soluble en alcohol; muy poco soluble en cloroformo y en éter; prácticamente insoluble en agua. Fluorouracilo: Polvo cristalino blanco a prácticamente blanco, prácticamente inodoro. Se descompone aproximadamente a 282º. Moderadamente soluble en agua; poco soluble en alcohol; prácticamente insoluble en cloroformo y en éter. Fluoruro de Sodio: Polvo blanco e inodoro. Soluble en agua; insoluble en alcohol. Fluoruro Estannoso: Polvo blanco, cristalino, con sabor amargo y salado. Funde aproximadamente a 213º. Fácilmente soluble en agua; prácticamente insoluble en alcohol, en éter y en cloroformo. Categoría del NF: Agente reductor. Fluoximesterona: Polvo cristalino blanco o prácticamente blanco e inodoro. Funde aproximadamente a 240º, con algo de descomposición. Moderadamente soluble en alcohol; poco soluble en cloroformo; prácticamente insoluble en agua. Flurandrenolida: Polvo cristalino blanco a blanquecino, poco denso. Es inodoro. Fácilmente soluble en cloroformo; soluble en metanol; moderadamente soluble en alcohol; prácticamente insoluble en agua y en éter. Flurbiprofeno: Polvo cristalino blanco. Fácilmente soluble en acetona, en alcohol deshidratado, en éter y en meta-
Tablas de Referencia / Descripción y Solubilidad 2441 nol; soluble en acetonitrilo; prácticamente insoluble en agua. Es ópticamente inactivo (solución 1 en 50 en alcohol deshidratado). Flutamida: Polvo cristalino amarillo pálido. Fácilmente soluble en acetona, en acetato de etilo y en metanol; soluble en cloroformo y en éter; prácticamente insoluble en aceite mineral, en éter de petróleo y en agua. Fluvastatina Sódica: Polvo higroscópico de color blanco a amarillo pálido, amarillo pálido amarronado, o amarillo pálido rojizo. Soluble en alcohol, en metanol y en agua. Formaldehído, Solución: Líquido transparente, incoloro o prácticamente incoloro, con olor acre. El vapor producido irrita la membrana mucosa de la garganta y la nariz. Tras un largo reposo, especialmente en el frío, puede tornarse turbio debido a la separación de paraformaldehído. Esta turbidez desaparece al entibiar la solución. Miscible con agua y con alcohol. Formaldehído Sulfoxilato de Sodio: Cristales blancos o masas duras de color blanco, con el olor característico del ajo. Fácilmente soluble en agua; poco soluble en alcohol, en éter, en cloroformo y en benceno. Categoría del NF: Antioxidante. Foscarnet Sódico: Polvo cristalino blanco a casi blanco. Soluble en agua; prácticamente insoluble en alcohol. Fosfato de Amonio: Polvo o gránulos incoloros o blancos, con sabor salino. Fácilmente soluble en agua; prácticamente insoluble en acetona y en alcohol. Categoría del NF: Modificador de pH (agente acidificante/agente alcalinizante/ agente amortiguador). Fosfato de Antazolina: Polvo cristalino blanco a blanquecino, con sabor amargo. Soluble en agua; moderadamente soluble en metanol; prácticamente insoluble en benceno y en éter. Fosfato de Clindamicina: Polvo cristalino, higroscópico, blanco a blanquecino. Es inodoro o prácticamente inodoro y tiene un sabor amargo. Fácilmente soluble en agua; poco soluble en alcohol deshidratado; muy poco soluble en acetona; prácticamente insoluble en cloroformo, en benceno y en éter. Fosfato de Cloroquina: Polvo cristalino blanco. Es inodoro, tiene un sabor amargo y cambia lentamente su color al exponerse a la luz. Sus soluciones tienen un pH de aproximadamente 4,5. Existe en dos formas polimórficas; una funde entre 193º y 195º y la otra entre 21 Oº y 215º (ver Intervalo o Temperatura de Fusión (7 41 )); la mezcla de las dos formas funde entre 193º y 215º. Fácilmente soluble en agua; prácticamente insoluble en alcohol, en cloroformo y en éter. Fosfato de Codeína: Cristales blancos, finos, en forma de aguja, o polvo cristalino blanco. Es inodoro y es afectado por la luz. Sus soluciones son ácidas al tornasol. Muy soluble en agua caliente; fácilmente soluble en agua; poco soluble en aícohol pero un poco más soluble en alcohol en ebullición. Fosfato de Disopiramida: Polvo blanco o prácticamente blanco, inodoro. Funde aproximadamente a 205º, con descomposición. Fácilmente soluble en agua; poco soluble en alcohol; prácticamente insoluble en cloroformo y en éter. Fosfato de Fludarabina: Polvo cristalino, higroscópico, blanco a blanquecino. Fácilmente soluble en dimetilformamida; poco soluble en agua y en ácido clorhídrico O, 1 M; prácticamente insoluble en etanol. Fosfato de Histamina: Cristales prismáticos largos, incoloros e inodoros. Es estable al aire, pero lo afecta la luz. Sus soluciones son ácidas al tornasol. Fácilmente soluble en agua. Fosfato de Magnesio: Polvo blanco, inodoro e insípido. Soluble en ácidos minerales diluidos; prácticamente insoluble en agua.
2442 Descripción y Solubilidad / Tablas de Referencia Fosfato de Oseltamivir: Polvo blanco a blanquecino. Fácilmente soluble en agua; soluble en metanol, en dimetil sulfóxido y en propilenglicol; moderadamente soluble en dimetilformamida; poco soluble en alcohol; muy poco soluble en alcohol isopropílico y en polietilenglicol 400; prácticamente insoluble en acetonitrilo, en acetona, en diclorometano y en n-hexano. Fosfato de Piperazina: Polvo cristalino blanco. Moderadamente soluble en agua; prácticamente insoluble en alcohol. Fosfato de Primaquina: Polvo cristalino de color rojo anaranjado. Es inodoro y tiene un sabor amargo. Sus soluciones son ácidas al tornasol. Funde aproximadamente a 200º. Soluble en agua; insoluble en cloroformo y en éter. Agregar lo sigfllente: "'fosfato de Sitagliptina: Polvo blanco a casi bl¡¡nco. Soluble en agua; muy poco soluble en .etanol anhidro;· prácticamente insoluble en heptano ....usP39 Fosfato de Sodio P 32, Solución: Solución transparente e incolora. Al reposar la Solución y el envase de vidrio pueden oscurecerse a consecuencia de los efectos de la radiación. Fosfato Dibásico de Calcio: Polvo blanco, inodoro e insípido. Es estable al aire. Soluble en ácido clorhídrico 3 N y en ácido nítrico 2 N; prácticamente insoluble en agua; insoluble en alcohol. Categoría del NF: Diluyente. Fosfato Dibásico de Potasio: Polvo granular, algo higroscópico, incoloro o blanco. El pH de una solución (1 en 20) es de aproximadamente 8,5 a 9,6. Fácilmente soluble en agua; muy poco soluble en alcohol. Categoría del NF: Modificador de pH (agente acidificante/agente alcalinizante/ agente amortiguador). Fosfato Dibásico de Sodio (heptahidrato): Sal granular o a~lutinada, incolora o blanca. Es eflorescente en aire seco y calido. Sus soluciones son alcalinas a la fenolftaleína SR y una solución O, l M tiene un pH de aproximadamente 9. Fácilmente soluble en agua; muy poco soluble en alcohol. Categoría del NF: Agente amortiguador. Fosfato Dibásico de Sodio (seco): Polvo blanco que absorbe la humedad con facilidad. Fácilmente soluble en agua; insoluble en alcohol. Categoría del NF: Modificador de pH (agente acidificante/agente alcalinizante/agente amortiguador); agente quelante y/o complejante. Fosfato Monobásico de Potasio: Cristales incoloros o polvo cristalino o granular blanco. Es inodoro y es estable al aire. El pH de una solución (1 en 100) es de aproximadamente 4,5. Fácilmente soluble en agua; prácticamente insoluble en alcohol. Categoría del NF: Modificador de pH (agente acidificante/agente alcalinizante/agente amortiguador). Fosfato Monobásico de Sodio: Cristales incoloros o polvo cristalino blanco. Es inodoro y ligeramente delicuescente. Sus soluciones son ácidas al tornasol y efervescentes con carbonato de sodio. Fácilmente soluble en agua; prácticamente insoluble en alcohol. Categoría del NF: Modificador de pH (agente acidificante/agente alcalinizante/agente amortiguador); agente quelante y/o complejante. Fosfato Sódico de Betametasona: Polvo inodoro, de color blanco a prácticamente blanco. Es higroscópico. Fácilmente soluble en agua y en metanol; prácticamente insoluble en acetona y en cloroformo. Fosfato Sódico de Celulosa: Polvo de libre fluidez, de color crema, inodoro e ins~ido. Insoluble en agua, en ácidos diluidos y en la mayona de los disolventes orgánicos. Fosfato Sódico de Dexametasona: Polvo cristalino blanco a ligeramente amarillo. Es inodoro o tiene un olor leve a alcohol y es extremadamente higroscópico. Fácilmente soluble en agua; poco soluble en alcohol; muy poco soluble en dioxano; insoluble en cloroformo y en éter.
USP 39 Fosfato Sódico de Hidrocortisona: Polvo blanco a amarillo claro, inodoro o prácticamente inodoro. Es excesivamente higroscópico. Fácilmente soluble en agua; poco soluble en alcohol; prácticamente insoluble en cloroformo, en dioxano y en éter. Fosfato Sódico de Prednisolona: Polvo o gránulos friables, blancos o levemente amarillos. Es inodoro o tiene un olor leve. Es ligeramente higroscópico. Fácilmente soluble en agua; soluble en metanol; poco soluble en alcohol y en cloroformo; muy poco soluble en acetona y en dioxano. Fosfato Tribásico de Calcio: Polvo blanco, inodoro e insípido. Es estable al aire. Fácilmente soluble en ácido clorhídrico 3 N y en ácido nítrico 2 N; prácticamente insoluble en agua; insoluble en alcohol. Categoría del NF: Diluyente; modificador de pH (agente acidificante/agente alcalinizante/ agente amortiguador); deslizante y/o agente antiaglutinante. Fosfato Tribásico de Sodio: La fórmula para un material cristalino es aproximadamente 4(Na3PÜ4 · 12H20)NaOH. Se presenta en forma de cristales o gránulos de color blanco, inodoros, o como polvo cristalino. Fácilmente soluble en agua; insoluble en alcohol. El pH de una solución 1 en 100 está entre 11,5 y 12,0. (Piro- y Trimeta-) Fosfatos de Tecnecio Te 99m, Inyección: Solución transparente. Fosfenitoína Sódica: Sólido de color blanco a amarillo pálido. Fácilmente soluble en agua. Fructosa: Cristales incoloros o polvo cristalino blanco. Es inodoro y tiene un sabor dulce. Fácilmente soluble en agua; soluble en alcohol y en metano!. Categoría del NF: Agente edulcorante; diluyente; saborizantes y fragancia. Ftalato de Dibutilo: Líquido transparente aceitoso, incoloro o muy ligeramente amarillo. Practicamente insoluble en agua. Miscible con alcohol y con éter. Categoría del NF: Agente formador de película; disolvente. Ftalato de Dietilo: Líquido aceitoso, incoloro, prácticamente inodoro. Insoluble en agua. Miscible con alcohol, con éter y con otros disolventes orgánicos comunes. Categoría del NF: Plastificante; agente formador de película; disolvente. Ftalato de Hipromelosa: Gránulos o polvo de color blanco. Es inodoro e insípido. Prácticamente insoluble en agua, en alcohol deshidratado y en hexano. Produce una solución viscosa en una mezcla de metano! y diclorometano (1 :1 ), o en una mezcla de alcohol deshidratado y acetona (1 :1 ). Se disuelve en hidróxido de sodio 1 N. Categoría del NF: Agente de recubrimiento; agente formador de película. Ftalato de Polivinil Acetato: Polvo blanco de libre fluidez. Puede presentar un leve olor a ácido acético. Soluble en metanol y en alcohol; insoluble en agua, en cloruro de metileno y en cloroformo. Categoría del NF: Agente de recubrimiento; agente formador de película. Fucsina Básica: Polvo verde oscuro o fragmentos cristalinos de color verde brillante con reflejo similar al bronce y un olor no más que leve. Soluble en agua, en alcohol y en alcohol amílico; insoluble en éter. Fulvestrant: Polvo blanco. Fácilmente soluble en alcohol. Fumarato de Bisoprolol: Polvo cristalino blanco. Muy soluble en agua y en metanol; fácilmente soluble en cloroformo, en ácido acético glacial y en alcohol; poco soluble en acetona y en acetato de etilo. Fumarato de Clemastina: Polvo blanco a blanquecino, inodoro. Sus soluciones son ácidas al tornasol. Poco soluble en metano!; muy poco soluble en agua y en cloroformo. Fumarato de Emedastina: Polvo cristalino blanco a ligeramente amarillo. Soluble en agua. Fumarato de Formoterol Dihidrato: Polvo blanco o casi blanco o ligeramente amarillento. Fácilmente soluble en dimetil sulfóxido y en ácido acético; soluble en metano!; poco soluble en agua y en 2-propanol; prácticamente insoluble en acetonitrilo y en éter dietílico.
USP 39 Fumarato de lbutilida: Polvo blanco a blanquecino. Fácilmente soluble en agua; moderadamente soluble en metano!. Fumarato de Quetiapina: Polvo cristalino de color blanco a blanquecino. Soluble en ácido clorhídrico O, 1 N; poco soluble en agua, en alcohol y en metanol. Fumarato Ferroso: Polvo inodoro de color anaranjado rojizo a marrón rojizo. Puede contener grumos blandos que producen una franja amarilla cuando se aplastan. Poco soluble en agua; muy poco soluble en alcohol. Su solubilidad en ácido clorhídrico diluido está limitada por la separación de ácido fumárico. Furazolidona: Polvo cristalino amarillo, inodoro. Es insípida al principio, luego deja un resabio amargo. Prácticamente insoluble en agua, en alcohol y en tetracloruro de carbono. Furoato de Diloxanida: Polvo cristalino blanco o casi blanco. Fácilmente soluble en cloroformo; poco soluble en alcohol y en éter; muy poco soluble en agua. Furoato de Mometasona: Polvo blanco a blanguecino. Funde aproximadamente a 220º, con descomposicion. Soluble en acetona y en cloruro de metileno. Furosemida: Polvo cristalino, blanco a ligeramente amarillo, inodoro. Fácilmente soluble en acetona, en dimetilformamida y en soluciones de hidróxidos alcalinos; soluble en metano!; moderadamente soluble en alcohol; poco soluble en éter; muy poco soluble en cloroformo; prácticamente insoluble en agua. Furosemida, Inyección: Solución transparente e incolora. Gabapentina: Sólido cristalino blanco a blanquecino. Fácilmente soluble en agua y en soluciones alcalinas y ácidas. Gadodiamida: Polvo blanco e inodoro. Fácilmente soluble en agua y en metano!; soluble en alcohol etílico; poco soluble en acetona y en cloroformo. Gadoteridol: Polvo cristalino, blanco a blanquecino, inodoro. Fácilmente soluble en agua y en alcohol metílico; soluble en alcohol isopropílico. Funde aproximadamente a 300º. Gadoversetamida: Polvo blanco e inodoro. Fácilmente soluble en agua. Galactosa: Polvo cristalino o finamente granulado de color blanco. Soluble en agua; muy poco soluble en alcohol. Categoría del NF: Agente edulcorante; agente quelante y/o complejante. Galato de Propilo: Polvo cristalino blanco con un olor muy leve y característico. Fácilmente soluble en alcohol; poco soluble en agua. Categoría del NF: Antioxidante. Gamma Ciclodextrina: Polvo cristalino o amorfo, de color blanco o casi blanco. Fácilmente soluble en agua y en propilenglicol; muy poco soluble en alcohol. Categoría del NF: Agente secuestrante; agente quelante y/o complejante. Ganciclovir: Polvo cristalino blanco a blanquecino. Ganciclovir para Inyección: Polvo blanco a blanquecino. Soluble en agua. Gasa con Vaselina: La vaselina recuperada mediante el drenaje realizado en la Valoración es una masa untuosa, blanca o ligeramente amarillenta, transparente, en capas delgadas incluso después de enfriar a Oº. Gel de Fosfato de Aluminio: Suspensión viscosa blanca, de la que pueden separarse pequeñas cantidades de agua cuando se deja en reposo. Gel de Hidróxido de Aluminio: Suspensión viscosa blanca, de la que pueden separarse pequeñas cantidades de líquido transparente cuando se deja en reposo. Gel de Hidróxido de Aluminio Desecado: Polvo blanco, inodoro, insípido y amorfo. Soluble en ácidos minerales diluidos y en soluciones de hidróxidos alcalinos fijos; insoluble en agua y en alcohol.
Tablas de Referencia /Descripción y Solubilidad 2443
Cambio en la redacción: Gelatina: Láminas, escamas o fragmentos, o polvo grueso a fino. Tiene color ligeramente amarillo o ámbar; la intensidad del color varía según el tamaño de partícula. En solución tiene un olor suave característico a caldo. Es estable al aire cuando está seca, pero está sujeta a la descomposición microbiana cuando está húmeda o en solución. La Gelatina tiene cualquier consistencia adecuada que esté señalada por un valor de un gelómetro Bloom. • • (AF 01-may.201ai La Gelatina Tipo A presenta un punto isoeléctrico entre pH 7 y pH 9, y la Gelatina Tipo B presenta un punto isoeléctrico entre pH 4,7 y pH 5,2. Soluble en agua caliente, en ácido acético 6 N y en una mezcla caliente de glicerina y agua; insoluble en agua fría, pero se hincha y se ablanda al sumergirla en agua y absorbe gradualmente de 5 a 1O veces su propio peso de agua, en alcohol, en cloroformo, en éter y en aceites volátiles y fijos. Cate_goría del NF: Agente de recubrimiento; agente de suspension y/o viscosante; aglutinante por vía húmeda; cubierta de cápsula; agente estabilizante de coloides; agente formador de película. Gelatina Absorbible, Esponja: Sólido liviano, casi blanco, inflexible, duro, poroso e hidrófilo. Insoluble en agua. Gelatina Absorbible, Película: Película flexible, transparente, de color ámbar claro, que se vuelve gomosa cuando se humedece. Insoluble en agua. Gemfibrozilo: Sólido cristalino, ceroso, de color blanco. Soluble en alcohol, en metanol y en cloroformo; prácticamente insoluble en agua. Gentamicina, Inyección: Solución transparente, ligeramente amarilla, con un olor tenue. Glicerina: Líquido transparente, incoloro, siruposo y de sabor dulce. No tiene más que un olor leve característico, que no es acre ni desagradable. Es higroscópico. Sus soluciones son neutras al tornasol. Insoluble en cloroformo, en éter y en aceites fijos y volátiles. Miscible con agua y con alcohol. Categoría del NF: Humectante; plastificante; disolvente; agente de tonicidad; conservante antimicrobiano; emoliente; agente edulcorante. Glicina: Polvo cristalino blanco, inodoro, con un sabor ligeramente dulce. Sus soluciones son ácidas al tornasol. Fácilmente soluble en agua; muy poco soluble en alcohol y en éter. Categoría del NF: Agente de volumen; desintegrante; agente humectante y/o solubilizante; modificador de pH (agente acidificante/agente alcalinizante/agente amortiguador). Glicinato de Teofilina Sódica: Polvo cristalino blanco, con un leve olor a amoníaco y sabor amargo. Fácilmente soluble en agua; muy poco soluble en alcohol; prácticamente insoluble en cloroformo. Glicirrizato de Amonio: Polvo higroscópico de color blanco o blanco amarillento. Poco soluble en agua; muy poco soluble en etanol anhidro; prácticamente insoluble en acetona. Se disuelve en soluciones diluidas de ácidos y de hidróxidos de álcali. Categoría del NF: Saborizantes y fragancia; agente humectante y/o solubilizante. Glicopirrolato: Polvo cristalino blanco, inodoro. Soluble en agua y en alcohol; prácticamente insoluble en cloroformo y en éter. Glimepirida: Polvo blanco a casi blanco. Soluble en dimetilformamida; moderadamente soluble en cloruro de metileno; poco soluble en metanol; prácticamente insoluble en agua. Glipizida: Polvo cristalino blanco a blanquecino. Fácilmente soluble en dimetilformamida; soluble en hidróxido de sodio O, 1 N; poco soluble en cloruro de metileno. Glucagón: Polvo cristalino fino, blanco o de color leve. Prácticamente no tiene olor ni sabor. Soluble en soluciones ácidas y en álcali diluido; insoluble en la mayoría de los disolventes orgánicos.
2444 Descripción y Solubilidad / Tablas de Referencia Glucagón para Inyección: Polvo blanco e inodoro. Gluceptato de Calcio: Polvo amorfo de color blanco a ligeramente amarillo. Es estable al aire pero las formas hidratadas pueden perder parte de su agua de hidratación con el tiempo. Fácilmente soluble en agua; insoluble en alcohol y en muchos otros disolventes orgánicos. Gluceptato de Eritromicina: Cristales incoloros a blancos. Levemente higroscópico. Fácilmente soluble en agua, en alcohol, en metanol, en dioxano y en propilenglicol; poco soluble en acetona y en cloroformo; prácticamente insoluble en éter, en tetracloruro de carbono, en benceno y en tolueno. Gluconato de Calcio: Polvo o gránulos cristalinos de color blanco, inodoros e insípidos. Es estable al aire. Sus soluciones son neutras al tornasol. Fácilmente soluble en agua en ebullición; moderadamente (y lentamente) soluble en agua; insoluble en alcohol. Gluconato de Cinc: Polvo o gránulos de color blanco o prácticamente blanco. Soluble en agua; muy poco soluble en alcohol. Gluconato de Clorhexidina, Solución: Líquido transparente casi incoloro o de color amarillo pálido. Miscible con ácido acético glacial y con agua; miscible con tres veces su volumen de acetona y con cinco veces su volumen de alcohol deshidratado; el agregado de más acetona o alcohol deshidratado produce una turbidez blanca. Gluconato de Magnesio: Cristales incoloros o P,Olvo o gránulos de color blanco. Es inodoro e insípido. Fácilmente soluble en agua; muy poco soluble en alcohol; insoluble en éter. Gluconato de Potasio: Gránulos o polvo cristalino blanco a blanco amarillento. Es inodoro, tiene un sabor ligeramente amargo y es estable al aire. Sus soluciones son ligeramente alcalinas al tornasol. Fácilmente soluble en a9ua; prácticamente insoluble en alcohol deshidratado, en eter, en benceno y en cloroformo. Gluconato de Quinidina: Polvo blanco. Es inodoro y tiene un sabor intensamente amargo. Fácilmente soluble en agua; poco soluble en alcohol. Gluconato Ferroso: Polvo fino o gránulos de color gris amarillento o amarillo verdoso pálido, con un ligero olor semejante al del azúcar quemado. Su solución (1 en 20) es ácida al tornasol. Soluble en agua, con ligero calentamiento; prácticamente insoluble en alcohol. Gluconolactona: Polvo cristalino fino, blanco, prácticamente inodoro. Funde aproximadamente a 153º, con descomposición. Fácilmente soluble en agua; moderadamente soluble en alcohol; insoluble en éter. Glucosa Líquida: Líquido espeso, siruposo, incoloro o amarillento. Es inodoro o prácticamente inodoro y tiene un sabor dulce. Moderadamente soluble en alcohol. Miscible con agua. Categoría del NF: Aglutinante por vía húmeda; agente de recubrimiento; agente edulcorante. Glutamato Monosódico: Cristales o polvo cristalino, de color blanco, prácticamente inodoros y de libre fluidez. Fácilmente soluble en agua; moderadamente soluble en alcohol. Puede tener un sabor ligeramente dulce o ligeramente salado. Categoría del NF: Saborizantes y fragancia; modificador de pH (agente acidificante/agente alcalinizante/ agente amortiguador). Glutamina: Polvo cristalino o cristales de color blanco. Soluble en agua; prácticamente insoluble en alcohol y en éter. Glutaral, Concentrado: Líquido transparente, incoloro o ligeramente amarillo, con un olor característico irritante. Goma Arábiga: Es prácticamente inodora y produce una sensación mucilaginosa en la lengua. Insoluble en alcohol. La rotación óptica varía dependiendo del origen de la Goma Arábiga. Por ejemplo, los valores de rotación específica, calculados con respecto a la sustancia anhidra y determinados en una solucion al 1,0% (p/v), generalmente se
USP 39 encuentran entre -25º y -35º en el caso de la Acacia senegal y entre +35º y +60º en el caso de la Acacia seyal. Categona del NF: Agente emulsionante; agente de suspensión y/ o viscosante; aglutinante por vía húmeda. Goma de Xantana: Polvo de color crema. Sus soluciones en agua son neutras al tornasol. Soluble en a~ua caliente o fría. Categoría del NF: Agente de suspension y/o viscosante; agente formador de película; polímeros para uso oftálmico; agente modificador de liberación. Goma Gellan: Polvo blanquecino. Soluble en agua desionizada caliente o fría. Categoría del NF: Agente de suspensión y/o viscosante. Goma Guar: Polvo blanco a blanco amarillento, prácticamente inodoro. Dispersable en agua fría o caliente en donde forma una solución coloidal. Categoría del NF: Agente de suspensión y/o viscosante; aglutinante por vía húmeda; polímeros para uso oftálmico; agente modificador de liberación; desintegrante. Goma Laca: Goma Laca Anaranjada-Escamas delgadas, duras, quebradizas, transparentes, de color amarillo limón pálido a anaranjado amarronado, inodoras o con olor leve; Goma Laca Blanqueada-Gránulos o polvo grueso, amorfos y opacos, de color crema a amarillo, inodoros o con olor leve. Soluble (muy lentamente) en alcohol, 85% a 95% (p/p); en éter, 1 3% a 15%; en benceno, 1 0% a 20%; en éter de petróleo, 2% a 6%; soluble en soluciones acuosas de etanolaminas, álcalis y bórax; moderadamente soluble en aceite de trementina; insoluble en agua. Categoría del NF: Agente de recubrimiento; a~ente formador de película; agente modificador de liberacion. Gonadotropina Coriónica: Polvo amorfo, blanco o prácticamente blanco. Fácilmente soluble en agua. Gonadotropina Coriónica para Inyección: Sólido amorfo, blanco o prácticamente blanco, con la apariencia característica de las sustancias preparadas por liofilización. Gramicidina: Polvo cristalino blanco o prácticamente blanco e inodoro. Soluble en alcohol; insoluble en agua. Grasa Sólida: Masa blanca, casi inodora y sin olor rancio, grasosa al tacto. Al calentarla, se funde y se forma un líquido incoloro o ligeramente amarillento. Cuando el material fundido se agita con una cantidad i9ual de agua caliente, se forma una emulsión blanca. Facilmente soluble en éter; poco soluble en alcohol; prácticamente insoluble en ag1;1a. Categoría del NF: Agente espesante; base para supositorios. Griseofulvina: Polvo inodoro, de color blanco a blanco cremoso, en el que predominan partículas del orden de 4 µm de diámetro. Soluble en acetona, en dimetilformamida y en cloroformo; moderadamente soluble en alcohol; muy poco soluble en agua. Guaifenesina: Polvo cristalino blanco a ligeramente gris. Puede tener un olor suave característico. Soluble en agua, en alcohol, en cloroformo y en propilenglicol; moderadamente soluble en glicerina. Gutta Percha: Grumos o bloques de diversos tamaños; en el exterior es de color marrón o marrón grisáceo a blanco grisáceo; en el interior es de color amarillo rojizo o gris rojizo Y. tiene una apariencia laminada o fibrosa. Es flexible pero solo ligeramente elástica. Tiene un olor leve característico y un sabor leve. Soluble en cloroformo; parcialmente soluble en benceno, en disulfuro de carbono y en aceite de trementina; insoluble en agua. Halazona: Polvo cristalino blanco con un olor característico semejante al del cloro. Es afectado por la luz. Funde aproximadamente a 194º, con descomposición. Soluble en ácido acético glacial; muy poco soluble en agua y en cloroformo. Se disuelve en soluciones de carbonatos e hidróxidos alcalinos con la formación de una sal. Halazona, Tabletas para Solución: Soluble en agua. Halcinónida: Polvo cristalino blanco a blanquecino, inodoro. Soluble en acetona y en cloroformo; poco soluble en alcohol y en éter etílico; insoluble en agua y en hexanos.
USP 39
Haloperidol: Polvo amorfo o microcristalino, de color blanco a ligeramente amarillo. Su solución saturada es neutra al tornasol. Soluble en cloroformo; moderadamente soluble en alcohol; poco soluble en éter; prácticamente insoluble en agua. Halotano: Líquido pesado, incoloro, móvil, no inflamable, con un olor característico similar al del cloroformo. Su sabor es dulce y produce una sensación de ardor. Poco soluble en agua. Miscible con alcohol, con cloroformo, con éter y con aceites fijos. Helio: Gas incoloro, inodoro e insípido, que no es combustible y no promueve la combustión. Muy poco soluble en agua. A Oº y a una presión de 760 mm de mercurio, 1000 mL del gas pesan aproximadamente 180 mg. Hemisuccinato de Metilprednisolona: Sólido hi9roscópico, blanco o casi blanco, inodoro o casi inodoro. Facilmente soluble en alcohol; soluble en acetona; muy poco soluble en agua. Hemisuccinato de Prednisolona: Polvo fino de color blanco cremoso con grumos friables, prácticamente inodoro. Funde aproximadamente a 205º, con descomposición. Fácilmente soluble en alcohol; soluble en acetona; muy poco soluble en agua. Heparina Sódica: Polvo amorfo, blanco o de color pálido. Es inodoro o prácticamente inodoro e higroscópico. Soluble en agua. Hexacetónido de Triamcinolona: Polvo de color blanco a crema. Soluble en cloroformo; poco soluble en metano!; prácticamente insoluble en agua. Hexaclorofeno: Polvo cristalino, de color blanco a tostado claro. Es inodoro o sólo tiene un olor fenólico leve. Fácilmente soluble en acetona, en alcohol y en éter; soluble en cloroformo y en soluciones diluidas de hidróxidos alcalinos fijos; insoluble en agua. Hexaclorofeno, Jabón Líquido: Líquido transparente, de color ámbar, con un olor leve característico. Su solución (1 en 20) es transparente y tiene una reacción alcalina. Hexilenglicol: Líquido viscoso, transparente e incoloro. Absorbe la humedad cuando se expone al aire húmedo. Miscible con agua y con muchos disolventes orgánicos, incluyendo alcohol, eter, cloroformo, acetona y hexanos. Categoría del NF: Humectante; disolvente. Hiclato de Doxiciclina: Polvo cristalino amarillo. Soluble en agua y en soluciones de carbonatos e hidróxidos alcalinos; poco soluble en alcohol; prácticamente insoluble en cloroformo y en éter. Hidrato de Amileno: Líquido transparente, incoloro, con olor a alcanfor. Sus soluciones son neutras al tornasol. Fácilmente soluble en agua. Miscible con alcohol, con cloroformo, con éter y con glicerina. Categoría del NF: Disolvente. Hidrato de Cloral: Cristales incoloros, transparentes o blancos con un olor ligeramente acre, penetrante y aromático, y un sabor ligeramente amargo y cáustico. Funde aproximadamente a 55º y se volatiliza lentamente cuando se expone al aire. Muy soluble en agua y en aceite de oliva; fácilmente soluble en alcohol, en cloroformo y en éter. Hidrato de Terpina: Cristales incoloros, brillantes, o polvo blanco. Tiene un olor leve y eflorece expuesto al aire seco. Una solución caliente (1 en 100) es neutra al tornasol. Al secar al vacío a 60º durante 2 horas, funde aproximadamente a 103º. Muy soluble en alcohol en ebullición; soluble en alcohol; moderadamente soluble en agua en ebullición; poco soluble en agua, en cloroformo y en éter. Hidroclorotiazida: Polvo cristalino blanco o prácticamente blanco e inodoro. Fácilmente soluble en solución de hidróxido de sodio, en n-butilamina y en dimetilformamida; muy poco soluble en agua; moderadamente soluble en metano!; insoluble en éter, en cloroformo y en ácidos minerales diluidos. Hidrocortisona: Polvo cristalino blanco a prácticamente blanco e inodoro. Funde aproximadamente a 215º, con des-
Tablas de Referencia / Descripción y Solubilidad 2445 composición. Moderadamente soluble en acetona y en alcohol; poco soluble en cloroformo; muy poco soluble en agua y en éter. Hidroflumetiazida: Polvo cristalino de color blanco a crema, finamente dividido, inodoro. Fácilmente soluble en acetona; soluble en alcohol; muy poco soluble en agua. Hidrolizado de Almidón Hidrogenado: Solución acuosa concentrada o polvo secado por aspersión o polvo seco. Muy soluble en agua; insoluble en alcohol. Categoría del NF: Agente edulcorante; humectante; diluyente; aglutinante por vía húmeda. Hidrolizado de Proteína, Inyección: Líquido transparente de color amarillento a ámbar rojizo. Hidroquinona: Agujas finas de color blanco. Se oscurece al exponerse a la luz y al aire. Fácilmente soluble en agua, en alcohol y en éter. Hidróxido de Calcio: Polvo blanco. Tiene un sabor alcalino, ligeramente amargo. Soluble en glicerina y en jarabe; poco soluble en agua; muy poco soluble en agua en ebullición; insoluble en alcohol. Categoría del NF: Modificador de pH (agente acidificante/agente alcalinizante/agente amortiguador). Hidróxido de Calcio, Solución: Líquido transparente, incoloro, con sabor alcalino. Es alcalino al tornasor. Hidróxido de Magnesio: Polvo voluminoso de color blanco. Soluble en ácidos diluidos; prácticamente insoluble en agua y en alcohol. Hidróxido de Potasio: Masas fundidas, pellets pequeños, escamas, varillas u otras formas de color blanco o prácticamente blanco. Es duro y quebradizo y muestra una fractura cristalina. Expuesto al aire, absorbe rápidamente dióxido de carbono y humedad, y se torna delicuescente. Muy soluble en alcohol en ebullición; fácilmente soluble en agua, en alcohol y en glicerina. Categoría del NF: Modificador de pH (agente acidificante/agente alcalinizante/agente amortiguador). Hidróxido de Sodio: Masas fundidas en pellets pequeños, escamas, varillas u otras formas de color blanco o prácticamente blanco. Es duro y quebradizo y muestra una fractura cristalina. Expuesto al aire, absorbe rápidamente dióxido de carbono y humedad. Fácilmente soluble en agua y en alcohol. Categoría del NF: Modificador de pH (agente acidificante/agente alcalinizante/agente amortiguador). Hidroxiestearato de Polioxilo 15: Masa cerosa de color amarillento a blanco. Muy soluble en agua; soluble en alcohol y en 2-propanol; insoluble en aceite mineral. Se solidifica a 25º. Categoría del NF: Agente humectante y/o solubilizante; vehículo (oleoso); lubricante; agente emulsionante. Hidroxietil Celulosa: Polvo higroscópico, blanco a tostado claro, prácticamente inodoro e insípido. Soluble en agua caliente y en a9ua fría, dando como resultado una solución coloidal; practicamente insoluble en alcohol y en la mayoría de los disolventes orgánicos. Categoría del NF: Agente de suspensión y/o viscosante; agente de recubrimiento; agente formador de película; polímeros para uso oftálmico; aglutinante por vía húmeda. Hidroxipropil Betadex: Polvo cristalino o amorfo de color blanco o casi blanco. Fácilmente soluble en agua y en propilenglicol. Categoría del NF: Agente secuestrante; agente quelante y/o compíejante; agente modificador de liberación. Hidroxipropil Celulosa: Polvo o sólido granular de color blanco a crema, prácticamente inodoro e insípido. Es higroscópica después de secar. Soluble en agua fría, en alcohol, en cloroformo y en propilenglicol, formando una solución coloidal; insoluble en agua caliente. Categoría del NF: Agente de recubrimiento; agente de suspensión y/o viscosante; agente emulsionante; agente formador de película; agente modificador de liberación; aglutinante por vía húmeda. Hidroxipropil Celulosa de Baja Sustitución: Polvo fibroso o granular de color blanco a blanco amarillento, prácticamente inodoro e insípido. Es higroscópica. Prácticamente
2446 Descripción y Solubilidad / Tablas de Referencia insoluble en alcohol y en éter. Se disuelve en una solución de hidróxido de sodio (1 en 1 O) y produce una solución viscosa. Se hincha en el agua, en carbonato de sodio SR y en ácido clorhídrico 2 N. El pH de la suspensión, obtenida al agitar 1,0 g con 100 mL de agua, está entre 5,0 y 7,5. Categoría del NF: Desintegrante; aglutinante por vía húmeda. Hidroxiurea: Polvo blanco a blanquecino. Es algo higroscópica y se descompone en presencia de humedad. Funde con descomposición a temperaturas mayores de 133º. Fácilmente soluble en agua y en alcohol caliente. Hidroxocobalamina: Cristales de color rojo oscuro o polvo cristalino de color rojo. Es inodora o tiene un leve olor a acetona. La forma anhidra es muy higroscópica. Moderadamente soluble en agua, en alcohol y en metanol; prácticamente insoluble en acetona, en éter, en cloroformo y en benceno. Hierro Dextrano, Inyección: Líquido levemente viscoso de color marrón oscuro. Hierro Sorbitex, Inyección: Líquido transparente, de color marrón oscuro. Himetelosa: Polvo o gránulos de color blanco, blanco amarillento o blanco grisáceo. Es higroscópica después de secar. Se disuelve en agua fría, y produce una solución coloidal. Insoluble en agua caliente, en acetona, en alcohol, en éter y en tolueno. Hiosciamina: Polvo cristalino blanco. Es afectado por la luz. Sus soluciones son alcalinas al tornasol. Fácilmente soluble en alcohol, en cloroformo y en ácidos diluidos; moderadamente soluble en éter; poco soluble en agua y en benceno. Hipoclorito de Sodio, Solución: Líquido transparente, de color amarillo verdoso pálido, con olor a cloro. Es afectado por la luz. Hipromelosa: Polvo fibroso o granular, de color blanco a ligeramente blanquecino. Se hincha en agua y produce una mezcla coloidal, viscosa, transparente a opalescente. Insoluble en alcohol deshidratado, en éter y en cloroformo. Categoría del NF: Agente de recubrimiento; a~ente de suspensión y/o viscosante; aglutinante por vía humeda; polímeros para uso oftálmico; cubierta de cápsula; agente emulsionante; agente formador de película; agente modificador de liberación. Hipromelosa 2208: Polvo fibroso o granular, de color blanco a ligeramente blanquecino. Se hincha en agua y produce una mezcla coloidal, viscosa, transparente a opalescente. Insoluble en alcohol deshidratado, en éter y en cloroformo. Cate9oría del NF: Agente de recubrimiento; agente de suspension y/o viscosante; aglutinante de tabletas. Hipromelosa 2906: Polvo fibroso o granular, de color blanco a ligeramente blanquecino. Se hincha en agua y produce una mezcla coloidal, viscosa, transparente a opalescente. Insoluble en alcohol deshidratado, en éter y en cloroformo. Cate9oría del NF: Agente de recubrimiento; agente de suspension y/o viscosante; aglutinante de tabletas. Hipromelosa 2910: Polvo fibroso o granular, de color blanco a ligeramente blanquecino. Se hincha en agua y produce una mezcla coloidal, viscosa, transparente a opalescente. Insoluble en alcohol deshidratado, en éter y en cloroformo. Cate9oría del NF: Agente de recubrimiento; agente de suspension y/o viscosante; aglutinante de tabletas. Histidina: Cristales blancos, inodoros, con un sabor ligeramente amargo. Soluble en agua; muy poco soluble en alcohol; insoluble en éter. Histoplasmina: Líquido rojo transparente. Miscible con agua. Hojas de Belladona: Cuando están húmedas, tienen un olor leve, algo semejante al del tabaco. Su sabor es un tanto amargo y acre. Homopolímero de Carbómero: Polvo blanco, voluminoso e higroscópico, con un olor suave característico. El pH de una dispersion 1 en 100 en agua es aproximadamente 3.
USP 39 Cuando se lo neutraliza en agua con hidróxidos alcalinos o con aminas, se hincha y parece disolverse; cuando se lo neutraliza en metano! o glicerina con aminas menores y alcanolaminas, se hincha y parece disolverse; cuando se lo neutraliza en etanol con aminas etoxiladas de cadena larga (C14-C1s), se hincha y parece disolverse. Categoría del NF: Aglutinante por vía húmeda; agente de suspensión y/o viscosante; agente emulsionante; polímeros para uso oftálmico; agente modificador de liberacion. lbuprofeno: Polvo cristalino de color blanco a blanquecino, con un olor leve característico. Muy soluble en alcohol, en metanol, en acetona y en cloroformo; poco soluble en acetato de etilo; prácticamente insoluble en agua. lctammol: Fluido viscoso, marrón rojizo a negro amarronado, con un olor empireumático fuerte y característico. Miscible con agua, con glicerina y con grasas y aceites fijos. Parcialmente soluble en alcohol y en éter. ldoxuridina: Polvo cristalino blanco, prácticamente inodoro. Poco soluble en agua y en alcohol; prácticamente insoluble en cloroformo y en eter. lfosfamida: Polvo cristalino blanco. Funde aproximadamente a 40º. Muy soluble en alcohol, en acetato de etilo, en alcohol isopropílico, en metanol y en cloruro de metileno; fácilmente soluble en agua; muy poco soluble en hexanos. lmidurea: Polvo blanco, inodoro e insípido. Soluble en agua y en glicerina; moderadamente soluble en propilenglicol; insoluble en la mayoría de los disolventes orgánicos. Categoría del NF: Conservante antimicrobiano. lmipenem: Polvo cristalino de color blanco a tostado. Poco soluble en agua y en metanol. lmiquimod: Polvo cristalino o polvo de color blanco o casi blanco. Muy poco soluble en metanol; prácticamente insoluble en agua y en acetona. lnamrinona: Polvo de color amarillo pálido a tostado. Es inodoro o tiene un olor tenue. Poco soluble en metanol; prácticamente insoluble o insoluble en cloroformo y en agua. lndapamida: Polvo cristalino blanco a blanquecino. Funde entre 167º y 170º. Soluble en metano!, en alcohol, en acetonitrilo, en ácido acético glacial y en acetato de etilo; muy poco soluble en éter y en cloroformo; prácticamente insoluble en agua. lndigotindisulfonato Sódico: Polvo oscuro, azul purpúreo o gránulos azules con brillo cobrizo; es afectado por la luz. Sus soluciones tienen un color azul o púrpura azulado. Poco soluble en agua y en alcohol; prácticamente insoluble en la mayoría de los disolventes orgánicos. lndometacina: Polvo cristalino de color amarillo pálido a tostado amarillento que sólo presenta un olor leve. Es sensible a la luz. Funde aproximadamente a 162º. Presenta polimorfismo. Moderadamente soluble en alcohol, en cloroformo y en éter; prácticamente insoluble en agua. lnmunoglobulina: Líquido algo opalescente o transparente, incoloro o de color amarronado debido a la hemoglobina desnaturalizada. Es prácticamente inodoro. Puede aparecer un leve depósito granular durante el almacenamiento. lnmunoglobulina Antirrábica: Líquido transparente o ligeramente opalescente, prácticamente incoloro y prácticamente inodoro. Puede aparecer un leve depósito granular durante el almacenamiento. lnmunoglobulina Antitetánica: Líquido transparente o ligeramente opalescente, prácticamente incoloro y prácticamente inodoro. Puede aparecer un leve depósito granular durante el almacenamiento. lnmunoglobulina de Vaccinia: Líquido transparente o ligeramente opalescente. Es prácticamente incoloro y prácticamente inodoro. Puede aparecer un leve depósito granular durante el almacenamiento. lnmunoglobulina Pertussis: Líquido transparente o ligeramente opalescente, prácticamente incoloro, exento de
USP 39 turbidez o partículas y prácticamente inodoro. Puede aparecer un leve depósito granular durante el almacenamiento. Su actividad aglutinante está normalizada con el Suero Antipertussis Estándar de los EE.UU. lnmunoglobulina Rho(D): Líquido transparente o ligeramente opalescente. Es prácticamente incolora e inodora. Puede aparecer un leve depósito granular durante el almacenamiento. lnositol: Polvo cristalino blanco o casi blanco. Muy soluble en agua; prácticamente insoluble en alcohol absoluto y en éter. Categoría del NF: Humectante. Insulina: Cristales blancos o prácticamente blancos. Soluble en soluciones de álcalis y ácidos diluidos. Insulina Cinc, Suspensión: Suspensión prácticamente incolora de una mezcla de cristales característicos predominantemente entre 1O µm y 40 µm de dimensión máxima y muchas partículas que no presentan nin~una forma uniforme y no exceden de 2 µm de dimensión máxima. Contiene entre O, 15% y O, 17% (p/v} de acetato de sodio, entre 0,65% y 0,75% (p/v} de cloruro de sodio y entre 0,09% y O, 11 % (p/v} de metilparabeno. Insulina Cinc de Acción Inmediata, Suspensión: Suspensión prácticamente incolora de partículas que no presentan ninguna forma uniforme y cuya dimensión máxima no excede de 2 µm. Contiene entre O, 15% y O, 1 7% (p/v} de acetato de sodio, entre 0,65% y 0,75% (p/v} de cloruro de sodio, y entre 0,09% y O, 11 % (p/v) de metilparabeno. Insulina Cinc de Acción Prolongada, Suspensión: Suspensión prácticamente incolora de una mezcla de cristales característicos, cuya dimensión máxima está predominantemente entre 1O µm y 40 µm. Contiene entre O, 15% y 0, 17% (p/v) de acetato de sodio, entre 0,65% y 0,75% (p/v} de cloruro de sodio, y entre 0,09% y O, 11 % (p/v) de metilparabeno. Insulina, Inyección: La Inyección que contiene, en cada mL, no más de 100 Unidades USP, es un líquido transparente, incoloro o casi incoloro; la Inyección que contiene, en cada mL, 500 Unidades, puede ser de color pajizo. Contiene entre O, 1 % y 0,25% (p/v) de fenol o de cresol. Contiene entre 1,4% y 1,8% (p/v} de glicerina. Insulina lsófana, Suspensión: Suspensión blanca de cristales en forma de bastón, exenta de agregados grandes de cristales después de agitación moderada. Contiene (1) entre 1,4% y 1,8% (p/v) de glicerina, entre O, 15% y O, 17% (p/v} de metacresol y entre 0,06% y 0,07% (p/v) de fenol; o (2) entre 1,4% y 1,8% (p/v) de glicerina y entre 0,20% y 0,25% (p/v) de fenol. Contiene entre O, 15% y 0,25% (p/v) de fosfato dibásico de sodio. Cuando se examina al microscopio, la materia insoluble de la Suspensión es cristalina y no contiene más que trazas de material amorfo. Insulina Lispro: Cristales blancos o prácticamente blancos. Soluble en soluciones de álcalis y ácidos diluidos. lnterpolímero de Carbómero: Polvo blanco, higroscópico. Se hincha en agua cuando se neutraliza una dispersión con hidróxido de sodio a un pH dentro del intervalo de 5,5 a 9. Categoría del NF: Agente emulsionante; a_gente de suspensión y/o viscosante; aglutinante eor vía humeda; polímeros para uso oftálmico; agente modificador de liberación. lnulina: Polvo blanco, friable, semejante a la tiza, amorfo, inodoro e insípido. Soluble en a9ua caliente, poco soluble en agua fría y en disolventes organicos. Categoría del NF: Agente edulcorante; aglutinante por vía húmeda. lodipamida: Polvo cristalino blanco, prácticamente inodoro. Poco soluble en alcohol; muy poco soluble en agua, en cloroformo y en éter. lodipamida Meglumínica, Inyección: Líquido transparente, incoloro a amarillo pálido, ligeramente viscoso. lodixanol: Polvo higroscópico, inodoro, amorfo, de color blanco a blanquecino. Facilmente soluble en agua. lodoquinol: Polvo microcristalino que no se humedece fácilmente con agua, de color amarillento claro a tostado. Es
Tablas de Referencia /Descripción y Solubilidad 2447 inodoro o tiene un olor débil; es estable al aire. Se funde con descomposición. Moderadamente soluble en alcohol y en éter; prácticamente insoluble en agua. lofendilato: Líquido viscoso, de incoloro a color amarillo pálido, que se oscurece con exposición prolongada al aire. Es inodoro o tiene un tenue olor a éter. Fácilmente soluble en alcohol, en benceno, en cloroformo y en éter; muy poco soluble en agua. lofendilato, Inyección: Líquido viscoso, de incoloro a color amarillo pálido, que oscurece con exposición prolongada al aire. Es inodoro o tiene un tenue olor a éter. Fácilmente soluble en alcohol, en benceno, en cloroformo y en éter; muy poco soluble en agua. lohexol: Polvo inodoro, higroscópico, blanco a blanquecino. Muy soluble en agua y en metano!; prácticamente insoluble o insoluble en éter y en cloroformo. lohexol, Inyección: Líquido transparente, incoloro a amarillo pálido. lopamidol: Polvo blanco a blanquecino, prácticamente inodoro. Muy soluble en agua; moderadamente soluble en metanol; practicamente insoluble en alcohol y en cloroformo. lopromida: Polvo blanco a ligeramente amarillo. Fácilmente soluble en agua y en dimetil sulfóxido; prácticamente insoluble en alcohof, en acetona y en éter. lotalamato Meglumínico, Inyección: Líquido transparente, incoloro a amarillo pálido, ligeramente viscoso. lotalamato Meglumínico e lotalamato Sódico, Inyección: Líquido transparente, incoloro a amarillo pálido, ligeramente viscoso. lotalamato Sódico, Inyección: Líquido transparente, incoloro a amarillo pálido, ligeramente viscoso. loxilán: Polvo blanco a blanquecino, prácticamente inodoro. Soluble en agua y en metanol. loxilán, Inyección: Líquido transparente, incoloro a amarillo pálido. Ipecacuana en Polvo: Polvo marrón pálido, amarillo suave o gris oliva claro. lpodato Sódico: Polvo cristalino fino de color blanco a blanquecino, inodoro. Fácilmente soluble en agua, en alcohol y en metanol; muy poco soluble en cloroformo. lrbesartán: Polvo cristalino blanco a blanquecino. Poco soluble en alcohol y en cloruro de metileno; prácticamente insoluble en agua. lsetionato de Pentamidina: Polvo blanco o casi blanco o cristales incoloros. Es higroscópico. Fácilmente soluble en agua; moderadamente sofuble en alcohol; prácticamente insoluble en cloruro de metileno. lsobutano: Gas incoloro e inflamable (la temperatura de ebullición es de aproximadamente -11 º). La presión de vapor a 21 º es de aproximadamente 2950 mm de mercurio (31 psig). Categoría del NF: Propelente. lsoetarina, Solución para Inhalación: Líquido incoloro o ligeramente amarillo, poco ácido, que se oscurece gradualmente al exponerse al aire y a la luz. lsoflurano: Líquido transparente, incoloro, volátil, con olor leve. Alcanza el punto de ebullición aproximadamente a 49º. Insoluble en agua. Miscible con disolventes orgánicos comunes y con grasas y aceites. lsoleucina: Cristales blancos, prácticamente inodoros, con un leve sabor amargo. Soluble en agua; poco soluble en alcohol caliente; insoluble en éter. lsoniazida: Cristales incoloros o blancos o polvo cristalino blanco. Es inodoro y es afectado lentamente al exponerse al aire y a la luz. Fácilmente soluble en agua; moderadamente soluble en alcohol; poco soluble en cforoformo; muy poco soluble en éter. lsoniazida, Inyección: Líquido transparente, incoloro a ligeramente amarillo verdoso. Oscurece paulatinamente al
2448 Descripción y Solubilidad / Tablas de Referencia exponerse al aire y a la luz. Tiende a cristalizarse a bajas temperaturas. lsoproterenol, Solución para Inhalación: Líquido incoloro o prácticamente incoloro, ligeramente ácido, que se oscurece gradualmente al exponerse al aire y a la luz. lsosorbida, Concentrado: Líquido incoloro a ligeramente amarillo. Soluble en agua y en alcohol. lsotiocianato de Alilo: Líquido incoloro a color amarillo pálido, muy refrgctivo. Tiene olor acre e irritante y sabor agrio. [PRECAUCION: Lacrimógeno.] Miscible con alcohol, con disulfuro de carbono y con éter. Poco soluble en agua. lsotretinoína: Cristales amarillos. Soluble en cloroformo; moderadamente soluble en alcohol, en alcohol isopropílico y en polietilenglicol 400; prácticamente insoluble en agua. lsradipino: Polvo cristalino fino de color amarillo. ltraconazol: Polvo blanco o casi blanco. Fácilmente soluble en cloruro de metileno; moderadamente soluble en tetrahidrofurano; muy poco soluble en alcohol; prácticamente insoluble en agua. lvermectina: Polvo cristalino blanco a blanco amarillento. Levemente higroscópico. Fácilmente soluble en metano! y en cloruro de metileno; soluble en acetona y en acetonitrilo; prácticamente insoluble en hexano y en agua. Jabón Verde: Masa transparente a translúcida blanda, untuosa, de color blanco amarillento a amarillo amarronado o verdoso. Tiene un olor leve característico, que suele indicar el aceite a partir del cual se preparó. Su solución (1 en 20) es alcalina al azul de bromotimol SR. Jarabe: Categoría del NF: Agente edulcorante; aglutinante por vía húmeda; vehículo. Jarabe de Maíz: Líquido viscoso transparente, de color blanco a amarillo claro. Es miscible en todas las proporciones con agua. Categoría del NF: Agente de suspensión y/o viscosante; agente edulcorante; diluyente; aglutinante por vía húmeda; agente de tonicidad. Ketorolaco Trometamina: Polvo cristalino blanco a blanquecino. Funde entre 165º y 170º, con descomposición. Fácilmente soluble en agua y en metanol; poco soluble en alc,oh.ol, en alc<;>hol deshidratado y en tetrahidrofurano; pract1camente insoluble en acetona, en diclorometano, en tolueno, en acetato de etilo, en dioxano, en hexano, en alcohol butílico y en acetonitrilo. Lactato de Calcio: Polvo o gránulos de color blanco, prácticamente inodoros. El pentahidrato es algo eflorescente y a 120º se vuelve anhidro. El pentahidrato es soluble en agua; es prácticamente insoluble en alcohol. Categoría del NF: Modificador de pH (agente acidificante/a9ente alcalinizante/agente amortiguador); conservante ant1microb:ano; aglutinante por vía húmeda. Lactato de Sodio, Solución: · Líquido transparente, incoloro o prácticamente incoloro, ligeramente viscoso, inodoro o con un leve olor no desagradable. Miscible con agua. Categoría del NF: Modificador de pH (agente acidificante/ agente alcalinizante/agente amortiguador); conservante antimicrobiano; humectante; saborizantes y fragancia. Lactitol: Cristal inodoro de color blanco o marrón claro. Tiene un sabor dulce suave y no deja resabio. Categoría del NF: Saborizantes y fragancia; diluyente; agente edulcorante. Lactobionato de Eritromicina para Inyección: Polvo o cristales blancos o ligeramente amarillos, con un olor leve. Su solución (1 en 20) es neutra o ligeramente alcalina. Fácilmente soluble en agua, en alcohol y en metanol; poco solu91e en acetona y en cloroformo; prácticamente insoluble en eter. Lactosa Anhidra: Polvo blanco o casi blanco. Fácilmente soluble en agua; prácticamente insoluble en alcohol. Categoría del NF: Diluyente; transportador. Lactosa Monohidrato: Polvo blanco de libre fluidez. Fácil pero lentamente soluble en agua; prácticamente inso-
USP 39
luble en alcohol. Cate9oría del NF: Diluyente; transportador; aglutinante por vía humeda. Lactulosa, Concentrado: Líquido siruposo, incoloro a color ámbar, que en reposo puede presentar cierta precipitación y oscurecimiento. Miscible con agua. Lamivudina: Sólido blanco a blanquecino. Soluble en agua. Funde aproximadamente a 176º. Lamotrigina: Polvo de color blanco a crema pálido. Poco soluble en ácido clorhídrico O, 1 N, en acetona, en metano! y en agua. Lanolina: Masa untuosa y pegajosa de color amarillo con un leve olor característico. Fácilmente soluble en éter y en cloroformo; soluble en alcohol caliente; moderadamente soluble en alcohol frío; insoluble en agua, pero se mezcla sin separación con aproximadamente dos veces su peso de ª!ilua. Categoría del NF: Agente emulsionante; base para unguentos. Lanolina Hidrogenada: Sustancia untuosa de color blanco o amarillo pálido. Soluble en alcohol deshidratado en ebullición y en éter de petróleo; insoluble en agua. Categoría del NF: A~ente emulsionante; emoliente; humectante; base para unguentos. Lansoprazol: Polvo blanco a blanco amarronado. Fácilmente soluble en dimetilformamida; prácticamente insoluble e!l, agua. Funde aproximadamente a 166º, con descomposic1on. Latanoprost: Aceite incoloro a ligeramente amarillo. Muy soluble en acetonitrilo; fácilmente soluble en acetona, en etanol, en acetato de etilo, en isopropanol, en metanol y en octanol; prácticamente insoluble en agua. Lauril Sulfato de Sodio: Cristales pequeños, de color blanco o amarillo claro, con un olor leve característico. Fácilmente soluble en agua, con la que forma una solución opalescente. Categoría del NF: Agente emulsionante; lubricante; agente humectante y/o solubilizante. Leche de Bismuto: Suspensión densa, blanca y opaca que se separa cuando está en reposo. Es inodora y practicamente insípida. Miscible con agua y con alcohol. Leche de Magnesia: Suspensión blanca, opaca, más o menos viscosa, de la cual, en reposo, suelen separarse proporciones variables de agua. El pH es aproximadamente 1O. Lecitina: La consistencia, tanto de los grados naturales como de los grados refinados de lecitina, puede variar de plástica a fluida, dependiendo del contenido de ácido graso libre y de aceite, y de la presencia o ausencia de otros diluyentes. Su color varía de amarillo claro a marrón, dependiendo del origen, de las variaciones de cultivo y si está o no blanqueada. Es inodora o tiene un olor característico levemente parecido al de la nuez y su gusto es soso. Prácticamente insoluble en agua, pero se hidrata rápidamente hasta formar emulsiones. Los fosfátidos sin aceite son solubles en ácidos grasos, pero son prácticamente insolubles en aceites fijos. Cuando todas las fracciones de fosfátido están presentes, la lecitina es moderadamente soluble en alcohol y prácticamente insoluble en acetona. Categoría del NF: Agente emulsionante; emoliente. Leflunomida: Polvo blanco a casi blanco. Fácilmente soluble en metanol, en alcohol, en 2-propanol, en acetato de etilo, en acetona y en acetonitrilo; practicamente insoluble en agua. Letrozol: Polvo cristalino de color blanco a amarillento. Fácilmente soluble en diclorometano; poco soluble en alcohol; prácticamente insoluble en agua. Leucina: Cristales blancos, prácticamente inodoros e insípidos. Moderadamente soluble en agua; insoluble en éter. Categoría del NF: Saborizantes y fragancia. Leucovorina Cálcica: Polvo de color blanco amarillento o amarillo. Poco soluble a fácilmente soluble en agua; prácticamente insoluble en alcohol. Leucovorina Cálcica, Inyección: Solución transparente, amarillenta.
USP 39 Levetiracetam: Polvo blanco a casi blanco. Muy soluble en agua; soluble en acetonitrilo; prácticamente insoluble en hexano. Levmetanfetamina: Líquido transparente, prácticamente incoloro. Levocarnitina: Polvo cristalino o cristales de color blanco. Higroscópico. Fácilmente soluble en agua y en alcohol caliente; prácticamente insoluble en acetona, en éter y en benceno. Levodopa: Polvo cristalino blanco a blanquecino, inodoro. En presencia de humedad, se oxida rápidamente por el oxígeno atmosférico y se oscurece. Fácilmente soluble en ácido clorhídrico 3 N; poco soluble en agua; insoluble en alcohol. Levofloxacino: Polvo cristalino o cristales de color blanco amarillento claro a blanco amarillento. Soluble en dimetil sulfóxido y en ácido acético; moderadamente soluble en agua, en acetona y en metano!; prácticamente insoluble en glicerina y en n-octanol. Levonordefrina: Sólido cristalino de color blanco a beige, inodoro. Funde aproximadamente a 21 Oº. Fácilmente soluble en soluciones acuosas de ácidos minerales; poco soluble en acetona, en cloroformo, en alcohol y en éter; prácticamente insoluble en agua. Levonorgestrel: Polvo blanco o prácticamente blanco, inodoro. Soíuble en cloroformo; poco soluble en alcohol; prácticamente insoluble en agua. Levotiroxina Sódica: Polvo higroscópico de color amarillo claro a beige, inodoro e insípido. Es estable al aire seco, pero puede adquirir un color ligeramente rosado al exponerse a la luz. El pH de una solución saturada es aproximadamente 8,9. Soluble en soluciones de hidróxidos alcalinos y en soluciones calientes de carbonatos alcalinos; poco soluble en alcohol; muy poco soluble en agua; insoluble en acetona, en cloroformo y en éter. Levulinato de Calcio: Polvo blanco, cristalino o amorfo, que tiene un olor suave, parecido a azúcar quemado. Tiene un sabor salado y amargo. Fácilmente soluble en agua; poco soluble en alcohol; insoluble en éter y en cloroformo. Lidocaína: Polvo cristalino blanco o ligeramente amarillo. Tiene un olor característico y es estable al aire. Muy soluble en alcohol y en cloroformo; fácilmente soluble en benceno y en éter; prácticamente insoluble en agua. Se disuelve en aceites. Lindano: Polvo cristalino blanco con un leve olor a moho. Fácilmente soluble en cloroformo; soluble en alcohol deshidratado; moderadamente soluble en éter; poco soluble en etilenglicol; prácticamente insoluble en agua. Liotironina Sódica: Polvo cristalino de color tostado claro, inodoro. Poco soluble en alcohol; muy poco soluble en agua; prácticamente insoluble en la mayoría de los otros disolventes orgánicos. Lisinopril: Polvo cristalino blanco. Funde aproximadamente a 160º, con descomposición. Soluble en agua; moderadamente soluble en metanol; prácticamente insoluble en alcohol, en acetona, en acetonitrilo y en cloroformo. Lomustina: Polvo cristalino amarillo. Fácilmente soluble en acetona y en cloruro de metileno; soluble en etanol; prácticamente insoluble en agua. Lopinavir: Polvo blanco. Fácilmente soluble en metanol y en alcohol; soluble en isopropanol; prácticamente insoluble en agua. Loratadina: Polvo blanco a blanquecino. Fácilmente soluble en acetona, en cloroformo, en metanol y en tolueno; insoluble en agua. Lorazepam: Polvo blanco o prácticamente blanco, prácticamente inodoro. Moderadamente soluble en alcohol; poco soluble en cloroformo; insoluble en agua. Losartán Potásico: Polvo blanco a blanquecino. Fácilmente soluble en agua; moderadamente soluble en alcohol isopropílico; poco soluble en acetonitrilo.
Tablas de Referencia / Descripción y Solubilidad 2449 Lovastatina: Polvo cristalino blanco a blanquecino. Fácilmente soluble en cloroformo; soluble en acetona, en acetonitrilo y en metanol; moderadamente soluble en alcohol; prácticamente insoluble en hexano; insoluble en agua. Lumefantrina: Polvo cristalino amarillo. Fácilmente soluble en N,N-dimetilformamida, en cloroformo y en acetato de etilo; soluble en diclorometano; poco soluble en etanol y en metano!; prácticamente insoluble en agua. Luteína: Polvo cristalino rojo. Soluble en etanol, en acetato de etilo y en cloruro de metileno; parcialmente soluble en hexano. Magaldrato: Polvo cristalino blanco, inodoro. Soluble en soluciones diluidas de ácidos minerales; insoluble en agua y en alcohol. Malatión: Líquido transparente, incoloro o ligeramente amarillo, con olor característico. Se solidifica aproximadamente a 2,9º. Poco soluble en agua. Miscible con alcoholes, con ésteres, con cetonas, con éteres, con hidrocarburos aromáticos y con aromáticos alquilatados, y con aceites vegetales. Malato de Almotriptán: Polvo cristalino, blanco a ligeramente amarillo. Soluble en agua; poco soluble en metanol y en N,N-dimetilformamida; muy poco soluble en acetona, en acetonitrilo, en etanol, en acetato de etilo, en propano!, en tetrahidrofurano y en tolueno; prácticamente insoluble en cloroformo y en cloruro de metileno. Maleato de Azatadina: Polvo inodoro de color blanco a crema claro. Funde aproximadamente a 153º. Fácilmente soluble en agua, en alcohol, en cloroformo y en metanol; prácticamente insoluble en benceno y en éter. Maleato de Bromfeniramina: Polvo cristalino blanco e inodoro. Fácilmente soluble en agua; soluble en alcohol y en cloroformo; poco soluble en éter y en benceno. Maleato de Carbinoxamina: Polvo cristalino blanco, inodoro. Muy soluble en agua; fácilmente soluble en alcohol y en cloroformo; muy poco soluble en éter. Maleato de Clorfeniramina: Polvo cristalino blanco, inodoro. Sus soluciones tienen un pH entre 4 y 5. Fácilmente soluble en agua; soluble en alcohol y en cloroformo; poco soluble en éter y en benceno. Maleato de Dexbromfeniramina: Polvo cristalino blanco, inodoro. Existe en dos formas polimórficas, una funde entre 106º y 107° y la otra, entre 112º y 113º. Mezclas de estas formas pueden fundir entre 105º y 113º. El pH de una solución (1 en 100) es aproximadamente 5. Fácilmente soluble en agua; soluble en alcohol y en cloroformo. Maleato de Dexclorfeniramina: Polvo cristalino blanco, inodoro. Fácilmente soluble en agua; soluble en alcohol y en cloroformo; poco soluble en benceno y en éter. Maleato de Enalapril: Polvo cristalino blanquecino. Funde aproximadamente a 144º. Fácilmente soluble en metano! y en dimetilformamida; soluble en alcohol; moderadamente soluble en a9ua; poco soluble en disolventes orgánicos semipolares; practicamente insoluble en disolventes orgánicos no polares. Maleato de Ergonovina: Polvo microcristalino, blanco a blanco grisáceo o ligeramente amarillo, inodoro. Se oscurece con el tiempo y al exponerse a la luz. Moderadamente soluble en agua; poco soluble en alcohol; insoluble en éter y en cloroformo. Maleato de Feniramina: Polvo cristalino blanco con un leve olor semejante a las aminas. Soluble en agua y en alcohol. Maleato de Fluvoxamina: Polvo cristalino blanco a blanquecino. Fácilmente soluble en alcohol y en cloroformo; moderadamente soluble en agua; prácticamente insoluble en éter dietílico. Maleato de Metilergonovina: Polvo microcristalino de color blanco a tostado rosáceo. Es inodoro. Poco soluble en agua y en alcohol; muy poco soluble en cloroformo y en éter.
2450 Descripción y Solubilidad / Tablas de Referencia Maleato de Metisergida: Polvo cristalino blanco a blanco amarillento o blanco rojizo. Inodoro o con apenas un olor leve. Poco soluble en agua y en alcohol; muy poco soluble en cloroformo; prácticamente insoluble en éter. Maleato de Pirilamina: Polvo cristalino blanco, por lo general, con un olor leve. Sus soluciones son ácidas al tornasol. Muy soluble en agua; fácilmente soluble en alcohol y en cloroformo; poco soluble en éter y en benceno. Maleato de Proclorperazina: Polvo cristalino blanco o amarillo pálido, prácticamente inodoro. Su solución saturada es ácida al tornasol. Poco soluble en cloroformo tibio; prácticamente insoluble en agua y en alcohol. Maleato de Rosiglitazona: Sólido de color blanco a blanquecino. Moderadamente soluble en alcohol; poco soluble en cloruro de metileno; prácticamente insoluble a muy poco soluble en agua. Maleato de Tietilperazina: Polvo granular amarillento. Inodoro o con apenas un olor leve. Funde aproximadamente a 183º, con descomposición. Poco soluble en metano!; prácticamente insoluble en agua y en cloroformo. Maleato de Timolol: Polvo blanco a prácticamente blanco, inodoro o prácticamente inodoro. Soluble en agua, en alcohol y en metano!; moderadamente soluble en cloroformo y en propilenglicol; insoluble en éter y en ciclohexano. Maleato de Trimipramina: Polvo cristalino blanco a casi blanco. Poco soluble en agua y en alcohol. Maltitol: Polvo cristalino blanco. Muy soluble en agua; prácticamente insoluble en etanol. Categoría del NF: Humectante; agente edulcorante; diluyente; agente de recubrimiento. Maltodextrina: Gránulos o polvo higroscópico de color blanco. Fácilmente soluble o rápidamente dispersable en agua; poco soluble a insoluble en alcohol anhidro. Categoría del NF: Agente de recubrimiento; agente de suspensión y/o viscosante; diluyente; aglutinante por vía húmeda. Maltol: Polvo cristalino blanco con un olor a caramelo característico semejante al aroma de fresa o fruta en solución diluida. Un g se disuelve en aproximadamente 82 mL de agua, en 21 mL de alcohol, en 80 mL de glicerina y en 28 mL de propilenglicol. Categoría del NF: Saborizantes y fragancia. Maltosa: La Maltosa se presenta en estado anhidro o como monohidrato. Polvo cristalino blanco, inodoro, con un sabor dulce. Muy poco soluble en etanol; fácilmente soluble en agua; poco soluble en metano!; prácticamente insoluble en éter. Categoría del NF: Agente edulcorante; diluyente; desintegrante; aglutinante por vía húmeda. Mandelato de Metenamina: Polvo cristalino blanco. Tiene un sabor agrio y es prácticamente inodoro. Sus soluciones tienen un pH de aproximadamente 4. Funde aproximadamente a 127º, con descomposición. Muy soluble en agua; soluble en alcohol y en cloroformo; poco soluble en éter. Mangafodipir Trisódico: Polvo cristalino o cristales de color amarillo pálido. Fácilmente soluble en agua; moderadamente soluble en metano!; poco soluble en cloroformo; muy poco soluble en alcohol y en acetona. Manitol: Polvo cristalino blanco o gránulos de libre fluidez. Es inodoro y tiene un sabor dulce. Fácilmente soluble en agua; soluble en soluciones alcalinas; poco soluble en piridina; muy poco soluble en alcohol; prácticamente insoluble en éter. Categoría del NF: Agente edulcorante; agente de tonicidad; agente de volumen; diluyente; plastificante. Manteca de Cacao: Sólido de color blanco amarillento con un olor leve y agradable y de sabor soso similar al chocolate, si la manteca de cacao se obtiene por presión. Si se obtiene por extracción, su sabor es soso. Por lo general, se quiebra a temperaturas inferiores a 25º. Fácilmente soluble en éter y en cloroformo; soluble en alcohol deshidratado en ebullicion; poco soluble en alcohol. Categoría del NF: Base para supositorios.
USP 39 Mazindol: Polvo cristalino, de color blanco a blanquecino, con un olor apenas leve. Poco soluble en metano! y en cloroformo; insoluble en agua. Mebendazol: Polvo blanco a ligeramente amarillo. Es casi inodoro. Funde aproximadamente a 290º. Fácilmente soluble en ácido fórmico; prácticamente insoluble en agua, en soluciones diluidas de acidos minerales, en alcohol, en éter y en cloroformo. Meclofenamato Sódico: Polvo cristalino, inodoro a casi inodoro, de color blanco a blanco cremoso. Fácilmente soluble en agua, la solución algunas veces es algo turbia debido a la hidrólisis parcial y a la absorción de dióxido de carbono; soluble en metanol; poco soluble en cloroformo; prácticamente insoluble en eter. La solución es transparente con un pH superior a 11,5. Mefobarbital: Polvo cristalino blanco, inodoro, con sabor amargo. Su solución saturada es ácida al tornasol. Soluble en cloroformo y en soluciones de hidróxidos y carbonatos alcalinos fijos; poco soluble en agua, en alcohol y en éter. Meglumina: Polvo o cristales inodoros de color blanco a levemente blanco amarillento. Fácilmente soluble en agua; moderadamente soluble en alcohol. Melfalán: Polvo de color blanquecino a beige con un olor tenue. Funde aproximadamente a 180º, con descomposición. Soluble en ácidos minerales diluidos; poco soluble en alcohol y en metanol; prácticamente insoluble en agua, en cloroformo y en éter. Meloxicam: Polvo amarillo pálido. Soluble en dimetilformamida; poco soluble en acetona; muy poco soluble en metanol y en alcohol; prácticamente insoluble en agua. Menadiona: Polvo cristalino de color amarillo brillante, prácticamente inodoro; es afectado por la luz solar. Soluble en aceites vegetales; moderadamente soluble en cloroformo y en alcohol; prácticamente insoluble en agua. Menta: Tiene un olor aromático característico y un sabor acre, y produce una sensación refrescante en la boca. Categoría del NF: Saborizantes y fragancia. Mentol: Cristales hexagonales, incoloros, usualmente con forma de aguja, o en masas fundidas, o polvo cristalino. Tiene un olor agradable parecido al de la menta. Muy soluble en alcohol, en cloroformo, en éter y en éter de petróleo; fácilmente soluble en ácido acético glacial, en aceite mineral y en aceites fijos y volátiles; poco soluble en agua. Categoría del NF: Saborizantes y fragancia. Meprobamato: Polvo blanco, con un olor característico y sabor amargo. Fácilmente soluble en acetona y en alcohol; poco soluble en agua; prácticamente insoluble o insoluble en éter. Mercaptopurina: Polvo cristalino, amarillo, inodoro o prácticamente inodoro. Funde con descomposición a temperaturas mayores de 308º. Soluble en alcohol caliente y en soluciones de álcalis diluidos; poco soluble en ácido sulfúrico 2 N; insoluble en agua, en acetona y en éter. Mercurio Amoniacal: Fragmentos pulverulentos blancos o polvo amorfo blanco. Es inodoro y estable al aire, pero se oscurece al exponerse a la luz. Fácilmente soluble en ácidos clorhídrico, nítrico y acético tibios; insoluble en agua y en alcohol. Meropenem: Polvo cristalino o cristales de color amarillo claro o incoloro a blanco. Soluble en dimetilformamida y en solución de fosfato dibásico de potasio al 5%; moderadamente soluble en agua y en solucion de fosfato monobásico de potasio al 5%; prácticamente insoluble en alcohol, en acetona, en cloruro de metileno y en éter. Mesalamina: Cristales en forma de aguja de color tostado claro a rosado. El color puede oscurecerse con la exposición al aire. Es inodoro o puede presentar un leve olor característico. Soluble en ácido clorhídrico diluido y en hidróxidos alcalinos diluidos; poco soluble en agua; muy poco soluble en metanol, en alcohol deshidratado y en acetona; prácticamente insoluble en alcohol n-butílico, en cloro-
USP 39 formo, en éter, en acetato de etilo, en n-hexano, en cloruro de metileno y en alcohol n-propílico. Mesilato de Benzatropina: Polvo cristalino blanco, ligeramente higroscópico. Muy soluble en agua; fácilmente soluble en alcohol; muy poco soluble en éter. Mesilato de Bromocriptina: Polvo cristalino fino, blanco o de coloración ligera, inodoro o con un ligero olor característico. Mesilato de Deferoxamina: Polvo blanco a blanquecino. Fácilmente soluble en agua; poco soluble en metanol. Mesilato de Dihidroergotamina: Polvo blanco a ligeramente amarillento, o polvo blanquecino a ligeramente rojo, con un olor leve. Soluble en alcohol; poco soluble en agua y en cloroformo. Mesilato de Dolasetrón: Polvo blanco a blanquecino. Fácilmente soluble en agua y en propilenglicol; poco soluble en alcohol y en solución salina SR. Mesilato de Doxazosina: Polvo de color blanco a tostado. Fácilmente soluble en ácido fórmico; muy poco soluble en metanol y en agua. Mesilato de Fenoldopam: Polvo blanco a blanquecino. Soluble en agua. Mesilato de Fentolamina: Polvo cristalino blanco o blanquecino, inodoro. Sus soluciones son ácidas al tornasol, con un pH de aproximadamente 5, y se deterioran lentamente. Funde aproximadamente a 178º. Fácilmente soluble en agua y en alcohol; poco soluble en cloroformo. Mesilato de lsoetarina: Cristales inodoros de color blanco o prácticamente blanco, con sabor salado y amargo. Fácilmente soluble en agua; soluble en alcohol; prácticamente insoluble en acetona y en éter. Mesilato de Pergolida: Polvo blanco a blanquecino. Moderadamente soluble en metanol; poco soluble en agua, en alcohol deshidratado y en cloroformo; muy poco soluble en acetona; prácticamente insoluble en éter. Mesilatos de Ergoloides: Polvo microcristalino o amorfo, blanco a blanquecino, prácticamente inodoro. Soluble en metanol y en alcohol; moderadamente soluble en acetona; poco soluble en agua. Mesna: Polvo cristalino blanco o levemente amarillo; higroscópico. Fácilmente soluble en agua; poco soluble en alcohol; prácticamente insoluble en ciclohexano. Mestranol: Polvo cristalino, inodoro, de color blanco a blanco cremoso. Fácilmente soluble en cloroformo; soluble en dioxano; moderadamente soluble en alcohol deshidratado; poco soluble en metanol; insoluble en agua. Metabisulfito de Potasio: Cristales, polvo cristalino o gránulos de color blanco o incoloros, de libre fluidez, normalmente con olor a dióxido de azufre. Se oxida gradualmente en el aire y se vuelve sulfato. Sus soluciones son ácidas al tornasol. Soluble en agua; insoluble en alcohol. Categoría del NF: Antioxidante; conservante antimicrobiano. Metabisulfito de Sodio: Cristales blancos o polvo cristalino blanco a amarillento, con el olor característico del dióxido de azufre. Fácilmente soluble en agua y en glicerina; poco soluble en alcohol. Categoría del NF: Antioxidante; conservante antimicrobiano. Metafosfato de Potasio: Polvo blanco e inodoro. Soluble en soluciones diluidas de sales de sodio; insoluble en agua. Categoría del NF: Modificador de pH (agente acidificante/agente alcalinizante/agente amortiguador). Metaxalona: Polvo cristalino, blanco a casi blanco. Fácilmente soluble en cloroformo; soluble en metano! y en alcohol; prácticamente insoluble en éter y en agua. Metazolamida: Polvo cristalino, blanco o ligeramente amarillo, con un olor leve. Funde aproximadamente a 213º. Soluble en dimetilformamida; poco soluble en acetona; muy poco soluble en agua y en alcohol. Metenamina: Cristales incoloros, brillantes, o polvo cristalino blanco. Es prácticamente inodoro. Cuando se pone en
Tablas de Referencia/ Descripción y Solubilidad 2451
contacto con el fuego, se enciende fácilmente y se quema con una llama que no produce humo. Sublima aproximadamente a 260º, sin fusión. Sus soluciones son alcalinas al tornasol. Fácilmente soluble en agua; soluble en alcohol y en cloroformo. Meticlotiazida: Polvo cristalino blanco o prácticamente blanco. Es inodoro o con olor leve. Fácilmente soluble en acetona y en piridina; moderadamente soluble en metanol; poco soluble en alcohol; muy poco soluble en agua, en cloroformo y en benceno. Metil Bencilideno Alcanfor: Polvo cristalino blanco y fino. Muy soluble en cloroformo; fácilmente soluble en alcohol; prácticamente insoluble en agua. Metil lsobutil Cetona: Líquido transparente, incoloro, móvil, volátil, con olor leve a cetona y a alcanfor. Poco soluble en agua. Miscible con alcohol, con éter y con benceno. Categoría del NF: Desnaturalizante de alcohol; disolvente. Metilbromuro de Homatropina: Polvo blanco e inodoro. Se oscurece lentamente al exponerse a la luz. Funde aproximadamente a 190º. Muy soluble en agua; fácilmente soluble en alcohol y en acetona que contiene aproximadamente 20% de agua; prácticamente insoluble en éter y en acetona. Metilcelulosa: Gránulos o polvo fibroso de color blanco. Sus suspensiones acuosas son neutras al tornasol. Se hincha en agua y produce una suspensión coloidal, viscosa, transparente a opalescente. Soluble en ácido acético glacial y en una mezcla de volúmenes i.9.uales de alcohol y cloroformo; insoluble en alcohol, en eter y en cloroformo. Categoría del NF: Agente de recubrimiento; agente de suspensión y/o viscosante; aglutinante por vía húmeda; agente emulsionante; agente formador de película; desintegrante. Metildopa: Polvo fino, inodoro, de color blanco a blanco amarillento, que puede contener grumos friables. Muy soluble en ácido clorhídrico 3 N; moderadamente soluble en agua; poco soluble en alcohol; prácticamente insoluble en éter. Metilparabeno: Polvo cristalino blanco o cristales incoloros. Fácilmente soluble en alcohol y en metanol; poco soluble en agua. Categoría del NF: Conservante antimicrobiano. Metilparabeno Sódico: Polvo blanco, higroscópico. Fácilmente soluble en agua; moderadamente soluble en alcohol; insoluble en aceites fijos. Categoría del NF: Conservante antimicrobiano. Metilpirrolidona: Líquido transparente, incoloro a muy levemente amarillo. Miscible con agua y con la mayoría de disolventes orgánicos, incluyendo alcohol, cetonas e hidrocarburos aromáticos y clorinados. Punto de ebullición: aproximadamente 202º. Indice de refracción: aproximadamente 1,469. Categoría del NF: Disolvente. Metilprednisolona: Polvo cristalino blanco a prácticamente blanco e inodoro. Funde aproximadamente a 240º, con cierto grado de descomposición (ver Intervalo o Temperatura de Fusión (7 41 )). Moderadamente soluble en alcohol, en dioxano y en metanol; poco soluble en acetona y en cloroformo; muy poco soluble en éter; prácticamente insoluble en agua. Metilsulfonilmetano: Polvo o cristales escamosos de color blanco. Funde aproximadamente a 109º. Fácilmente soluble en agua, en metanol, en alcohol y en acetona; moderadamente soluble en éter. Metiltestosterona: Polvo cristalino o cristales de color blanco o blanco cremoso. Es inodora y estable al aire, pero ligeramente higroscópica. Es afectado por la luz. Soluble en alcohol, en metano!, en éter y en otros disolventes orgánicos; moderadamente soluble en aceites vegetales; prácticamente insoluble en agua. Metimazol: Polvo cristalino, de color blanco a beige pálido, con un débil olor característico. Sus soluciones son prácticamente neutras al tornasol. Fácilmente soluble en agua, en alcohol y en cloroformo; poco soluble en éter.
2452 Descripción y Solubilidad / Tablas de Referencia Metionina: Cristales blancos, con olor y sabor característicos. Soluble en agua, en alcohol diluido tibio y en ácidos minerales diluidos; insoluble en éter, en alcohol absoluto, en benceno y en acetona (forma L). Categoría del NF: ~~bori zantes y fragancia; modificador d~ pH (agente _ao~1f1cante/ agente alcalinizante/agente amortiguador); ant1ox1dante. Metirapona: Polvo cristalino fino de color blanco a ámbar claro, con un olor característico. Se oscurece al exponerse a la luz. Soluble en metanol y en cloroformo; moderadamente soluble en agua. Con ácidos, forma sales hidrosolubles. Metocarbamol: Polvo blanco, inodoro o con un olor leve característico. Funde aproximadamente a 94º o, si se lo molió previamente hasta convertirlo en un ¡o!vo f!no, funde aproximadamente a 90º. Soluble en alcoho solo s1 se lo calienta; moderadamente soluble en agua y en cloroformo; insoluble en benceno y en n-hexano. Metohexital: Polvo blanco a levemente blanco amarillento, cristalino e inodoro. Poco soluble en alcohol, en cloroformo y en álcalis diluidos; muy poco soluble en agua. Metohexital Sódico para lnxección: Pol_vo higros_cópico de color blanco a blanquecino. Es esencialmente inodoro. Metotrexato: Polvo cristalino de color marrón anaranjado o amarillo. Fácilmente soluble en soluciones di)u!das de hidróxidos y carbonatos alcalinos; poco soluble en ac1do clorhídrico 6 N; prácticamente insoluble en agua, en alcohol, en cloroformo y en éter. Metotrimeprazina: Polvo cristalino fino, blanco, p~ácti camente inodoro. Funde aproximadamente a 126º. Fac1lmente soluble en cloroformo, en éter y en alcohol en ebullición; moderadamente soluble en metanol y en alcohol a 25º; prácticamente insoluble en agua. Metoxaleno: Cristales de color blanco a crema, poco denso en forma de aguja. Es inodoro. Fácilmente soluble en clorof~rmo; soluble en alcohol en ebullición, en acetona, en ácido acético, en propilenglicol y en benceno; moderadamente soluble en agua en ebullición y en éter; prácticamente insoluble en agua. Metoxaleno, Solución Tópica: Líquido transparente, incoloro. Metoxicinamato de Octilo: Aceite de color amarillo pálido. Insoluble en agua. Metoxiflurano: Líquido transparente, prácticamente incoloro móvil, con olor característico. Alcanza el punto de ebulli¿ión aproximadamente a 105º. Miscible con alcohol, con acetona, con cloroformo, con éter y con aceites fijos. Metrifonato: Polvo cristalino blanco. Muy soluble en cloruro de metileno; fácilmente soluble en acetona, en alcohol, en benceno, en cloroformo, en éter y en agua; muy poco soluble en hexano y en pentano. Se descompon~ ~5m álcali. Funde aproximadamente a 78º, con descompos1c1on. Metronidazol: Polvo cristalino o cristales inodoros, de color blanco a amarillo pálido. Es estable al aire, pero se oscurece al exponerse a la luz. Soluble en ácido clorhídrico diluido (1 en 2); moderadamente soluble en agua y en alcohol; poco soluble en éter y en cloroformo. Metsuximida: Polvo cristalino de color blanco a blanco grisáceo. Es inodoro o no tiene más que un olor leve. Muy soluble en cloroformo; fácilmente soluble en alcohol y en éter; poco soluble en agua caliente. Mezlocilina Sódica: Polvo cristalino blanco a amarillo pálido. Fácilmente soluble en agua. Mibolerona: Polvo blanco a blanquecino. Poco soluble en cloroformo, en dioxano y en cloruro de metileno; prácticamente insoluble en agua (0,0454 mg por mL a 37º). Micofenolato de Mofetilo: Polvo cristalino blanco o casi blanco. Tiene un intervalo de fusión entre 94º y 98º. Fácilmente soluble en acetona; soluble en metanol; moderadamente soluble en alcohol deshidratado; poco soluble en agua.
USP 39
Agregar lo siguiente:
•Micofenolato Sódico; Polvo cristalino de.color.blanco a blanquecino. Poco soluble en agua; prácticaménte insolu. ble en ácido clorhídrico O, l N...,usm Miconazol: Polvo de color blanco a crema pálido. Funde en el intervalo de 78º a 88º. Puede presentar polimorfismo. Fácilmente soluble en alcohol, en metanol, en alcohol isopropílico, en acetona, en propile~glic~I, en cloroformo y en dimetilformamida; soluble en eter; insoluble en agua. Midazolam: Polvo blanco o amarillento. La sal clorhidrato de midazolam es soluble en soluciones acuosas. Insoluble en agua. Milrinona: Sólido cristalino, de color blanco a tostado. Es higroscópico. Fácilmente soluble en dimetil sulfóxido; muy poco soluble en metanol; prácticamente insoluble en agua y en cloroformo. Minoxidil: Polvo cristalino blanco a blanquecino. Funde a un intervalo aproximado entre 248º y 26~º, con descomposición. Soluble en alcohol y en prop1lenghcol; mod,er~da mente soluble en metanol; poco soluble en agua; pract1camente insoluble en cloroformo, en acetona, en acetato de etilo y en hexano. Miristato de lsopropilo: Líquido aceitoso, transparente, prácticamente incoloro. Es prácticamente inodoro y se congela aproximadamente a 5º. Fác!lm~nte soluble e~ alc~hol al 90%; insoluble en a,gua, en gl!cenna y en p~opilengl1col_. Miscible con la mayona de los, disolventes orgarn~os y ac~1tes fijos. Categoría del NF: Veh1culo (oleoso); emoliente; disolvente. Mirtazapina: Polvo cristalino blanco a blanco cremo_so. Fácilmente soluble en metanol y en tolueno; soluble en eter etílico; moderadamente soluble en n-hexano; prácticamente insoluble en agua. Misoprostol: Líquido viscoso transparente incoloro o de color amarillo claro. Muy poco soluble en agua. Mitomicina: Polvo cristalino de color violeta azulado. Soluble en acetona, en metanol, en acetato de butilo y en ciclohexanona; poco soluble en agua. Mitotano: Polvo cristalino blanco con un olor aromático leve. Soluble en alcohol, en éter, en éter de petróleo y en aceites fijos y grasas; prácticamente insoluble en agua. Modafinilo: Polvo cristalino blanco a blanquecino. Moderadamente soluble en metanol; poco soluble en alcohol absoluto; muy poco soluble en agua. Molibdato de Amonio: Cristales incoloros o ligeramente verdosos o amarillentos. Soluble en agua; prácticamente insoluble en alcohol. Monensina Sódica: Polvo cristalino de color blanquecino a tostado. Soluble en cloroformo y en metanol; poco soluble en agua; prácticamente insoluble en éter de petróleo. Monobenzona, Ungüento: Dispersable con agua, pero no soluble en ella. Agregar lo siguiente: •Monocaprilato de Glicerllo: líqt¡ido aceitoso o semisólido, incoloro o ligeramentéamariHo. Mu.Y. solul;)le ;en. ¡;¡lcohol· fácilmente soh,.ible en cloruro de met1hmo; practu;:amenté insoluble en agua, Cótegoría det NF: Lubrkante; agente emul~ionante,,.NF34
Agregar lo siguiente: •Monocaprilocaprato de Glicerilo:. . líquido aceitoso o f\;'\Uy sc>tu91e.en alcohol; facilmente .soluble en cloruro de metlleno; .pra<::tlca. semisólid~, incoloro o ligeramente amanlli;>.
USP 39 mente insoluble en agua. Categoría· del NF: lubricante¡ agente emulsionante ..t..NFJ4 Monocaprilato de Propilenglicol: Líquido oleoso de color amarillo ligero, transparente o incoloro a 20º. Muy soluble en alcohol, en cloroformo y en cloruro de metileno; prácticamente insoluble en agua. Categoría del NF: Vehículo; agente emulsionante; diluyente. Monoestearato de Aluminio: Polvo voluminoso, fino, de color blanco a blanco amarillento, con un leve olor característico. Insoluble en agua, en alcohol y en éter. Categoría del NF: Agente de suspensión y/o viscosante; emoliente. Monoestearato de Glicerilo: Sólido, gránulos, escamas, o polvo de color blanco a amarillento, semejantes a la cera. Olor y sabor leve y agradable a grasa. Es afectado por la luz. Se disuelve en disolventes orgánicos calientes como por ejemplo alcohol, minerales o aceites fijos, benceno, eter y acetona. Insoluble en agua, pero puede dispersarse en agua caliente con la ayuda de una pequeña cantidad de jabón u otro agente tensoactivo adecuado. Categoría del NF: Agente emulsionante; emoliente; agente modificador de liberación; lubricante. Monoestearato de Propilenglicol: Sólido blanco semejante a la cera, o gránulos o escamas blancas semejantes a la cera. Tiene un olor y sabor grasos leves y agradables. Soluble en disolventes orgánicos, tales como alcohol, aceites minerales o fijos, benceno, éter y acetona; insoluble en agua, pero puede dispersarse en agua caliente con ayuda de una pequeña cantidad de jabón o de otro agente tensoactivo adecuado. Categoría del NF: Agente emulsionante. Monoestearato de Sorbitán: Sólido ceroso, duro, de color crema a tostado, con un olor y sabor suaves. Soluble, con turbidez, por encima de los 50º en aceite mineral y en acetato de etilo; insoluble en agua fría y en acetona. Dispersable en agua tibia. Categoría del NF: Agente emulsionante; lubricante; agente de suspensión y/o viscosante; agente humectante y/o solubilizante. Monoetanolamina: Líquido transparente, incoloro, moderadamente viscoso, con olor distintivo a amoníaco. Miscible con agua, con acetona, con alcohol, con glicerina y con cloroformo. lnmiscible con éter, con éter de petróleo y con aceites fijos, aunque disuelve muchos aceites esenciales. Categoría del NF: Agente emulsionante; modificador de pH (agente acidificante/agente alcalinizante/agente amortiguador). Monofluorofosfato de Sodio: Polvo inodoro de color blanco a ligeramente gris. Fácilmente soluble en agua. Monoglicéridos Diacetilados: Líquido transparente. Muy soluble en alcohol acuoso al 80% (p/p), en aceites vegetales y en aceites minerales; moderadamente soluble en alcohol al 70%. Categoría del NF: Plastificante. Monoglicéridos y Diglicéridos: Varían en consistencia, abarcando desde líquidos amarillos, semisólidos de color marfil, hasta sólidos de color blanco marfil (en forma de perlas o escamas). Soluble en alcohol, en acetato de etilo, en cloroformo y en otros hidrocarburos dorados; insoluble en agua. Categoría del NF: Agente emulsionante. Monolaurato de Propilenglicol: A 20º, líquido oleoso transparente. Incoloro o ligeramente amarillo. Muy soluble en alcohol, en metano! y en cloruro de metileno; prácticamente insoluble en agua. Categoría del NF: Emoliente; agente emulsionante. Monolaurato de Sorbitán: Líquido aceitoso, de color amarillo a ámbar, con un olor suave característico. Soluble en aceite mineral; poco soluble en aceite de semillas de algodón y en acetato de etilo; insoluble en agua. Categoría del NF: Agente emulsionante; lubricante; agente de suspensión y/o viscosante; agente humectante y/o solubilizante. Monolinoleato de Glicerilo: Líquidos aceitosos de color ámbar que se pueden solidificar parcialmente a temperatura ambiente. Fácilmente soluble en cloruro de metileno; solu-
Tablas de Referencia/ Descripción y Solubilidad 2453 ble en tetrahidrofurano; prácticamente insoluble en agua. Categoría del NF: Agente emulsionante. Mononitrato de Tiarnina: Polvo cristalino o cristales de color blanco, por lo general con un olor leve característico. Moderadamente soluble en agua; poco soluble en alcohol; muy poco soluble en cloroformo. Monooleato de Glicerilo: Líquidos aceitosos de color ámbar que se pueden solidificar parcialmente a temperatura ambiente. Fácilmente soluble en cloruro de metileno; soluble en tetrahidrofurano; prácticamente insoluble en agua. Categoría del NF: Agente emulsionante; emoliente; agente modificador de liberación. Monooleato de Sorbitán: Líquido aceitoso, viscoso, de color amarillo a ámbar, con un olor suave característico. Insoluble en agua y en propilenglicol. Miscible con aceites minerales y vegetales. Categoría del NF: Agente emulsionante; lubricante; agente de suspensión y/o viscosante; agente humectante y/o solubilizante. Monopalrnitato de Sorbitán: Sólido ceroso de color crema, con un débil olor a grasa. Soluble en alcohol absoluto tibio; soluble, con turbidez, en aceite de cacahuete tibio y en aceite mineral tibio; insoluble en agua. Categoría del NF: Agente emulsionante; lubricante; agente de suspensión y/o viscosante; agente humectante y/o solubilizante. Monosulfato de Guanetidina: Polvo cristalino blanco a blanquecino. Muy soluble en agua; moderadamente soluble en alcohol; prácticamente insoluble en cloroformo. Monotioglicerol: Líquido viscoso, incoloro o amarillo pálido, con leve olor sulfurico. Es higroscópico. Fácilmente soluble en agua, insoluble en éter. Miscible con alcohol. Categoría del NF: Antioxidante; conservante antimicrobiano. Montelukast Sódico: Polvo higroscópico blanco o casi blanco. Fácilmente soluble a muy soluble en alcohol; fácilmente soluble en agua y en cloruro de metileno. Moxidectina: Polvo blanco a amarillo pálido. Muy soluble en alcohol; poco soluble en hexano; prácticament insoluble en agua. Mucato de lsometepteno: Polvo cristalino blanco. Fácilmente soluble en agua; soluble en alcohol; prácticamente insoluble en cloroformo y en éter. Mupirocina: Sólido cristalino blanco a blanquecino. Fácilmente soluble en acetona, en cloroformo, en alcohol deshidratado y en metano!; poco soluble en éter; muy poco soluble en agua. Nabumetona: Polvo cristalino blanco o casi blanco. Fácilmente soluble en acetona; moderadamente soluble en alcohol y en metano!; prácticamente insoluble en agua. Nadolol: Polvo cristalino blanco a blanquecino, prácticamente inodoro. Fácilmente soluble en alcohol y en metano!; soluble en agua a un pH 2; poco soluble en cloroformo, en cloruro de metileno, en alcohol isopropílico y en agua (entre pH 7 y pH 1O); insoluble en acetona, en benceno, en éter, en hexano y en tricloroetano. Nafato de Cefamandol: Sólido cristalino blanco, inodoro. Soluble en agua y en metanol; prácticamente insoluble en éter, en cloroformo, en benceno y en ciclohexano. Nafcilina Sódica: Polvo de color blanco a blanco amarillento, con un olor característico apenas leve. Fácilmente soluble en agua y en cloroformo; soluble en alcohol. Naproxeno: Polvo cristalino blanco a blanquecino, prácticamente inodoro. Soluble en cloroformo, en alcohol deshidratado y en alcohol; moderadamente soluble en éter; prácticamente insoluble en agua. Naproxeno Sódico: Polvo cristalino de color blanco a cremoso. Soluble en agua y en metano!; moderadamente soluble en alcohol; muy poco soluble en acetona; prácticamente insoluble en cloroformo y en tolueno. Funde aproximadamente a 255º, con descomposición. Napsilato de Propoxifeno: Polvo blanco, esencialmente inodoro y con sabor amargo. Soluble en metano!, en
2454 Descripción y Solubilidad / Tablas de Referencia alcohol, en cloroformo y en acetona; muy poco soluble en agua. Na_rasina: Polvo cristalino blanco a blanquecino. Funde aproximadamente a 217º, con descomposicion. Soluble en metanol y en agua. Natamicina: Polvo de color blanquecino a crema, que puede contener hasta 3 moles de agua. Soluble en ácido acético glacial y en dimetilformamida; poco soluble en metano!; prácticamente insoluble en agua. Nateglinida: Polvo blanco. Fácilmente soluble en metanol y en alcohol; soluble en éter; moderadamente soluble en acetonitrilo y en octanol; prácticamente insoluble en agua. Nevirapina: Polvo cristalino blanco a blanquecino inodo;o .ª casi ino~oro. Poco soluble en alcohol y en met~nol; p~act1camente insoluble en agua. La forma hidratada también es poco soluble en propilenglicol. Niacina: Polvo cristalino o cristales de color blanco. Es inodoro o con olor leve. Funde aproximadamente a 235º. Fácilmente soluble en agua en ebullición, en alcohol en ebullición y en soluciones de hidróxidos y carbonatos alcalinos; moc}eradamente soluble en agua; practicamente insoluble en eter. Niacinamida: Polvo cristalino blanco. Es inodoro o prácticamente inodoro y tiene un sabor amargo. Sus soluciones son neutras al tornasol. Fácilmente soluble en agua y en alcohol; soluble en glicerina. Nifedipino: Polvo amarillo. Es afectado al exponerse a la luz. Fácilmente soluble en acetona; prácticamente insoluble en agua. Nimodipino: Polvo cristalino de color amarillo claro o amarillo y es afectado por la luz. Fácilmente soluble en acetato de_ etilo; moderadamente soluble en alcohol; prácticamente insoluble en agua. Presenta polimorfismo. Nistatina: Polvo de color amarillo a tostado claro con un olor similar al de los cereales. Es higroscópico y re~ulta afecta?? por su exposición prolongada al aire, al calor y a la luz. ,F~cllmente soluble en dimetilformamida y en dimetil sulfox1do; moderadamente a poco soluble en metanol, en alcohol n-propílico y en alcohol n-butílico; prácticamente in~oluble en agua y en alcohol; insoluble en cloroformo y en eter. Nitrato de Butoconazol: Polvo cristalino blanco a blanquecino. Funde aproximadamente a 160º. Moderadamente soluble en metanol; poco soluble en acetonitrilo, en acetona, en diclorometano y en tetrahidrofurano; muy poco soluble en acetato de etilo; prácticamente insoluble en agua. Nitrato de Econazol: Polvo cristalino de color blanco o prácticamente blanco que sólo presenta un olor leve. Soluble en metanol; moderadamente soluble en cloroformo; poco soluble en alcohol; muy poco soluble en agua y en eter. Nitrato de Miconazol: Polvo cristalino de color blanco o prácticamente blanco que sólo presenta un olor leve. F~n.de en el intervalo de 178º a 183º, con descomposición. Fac1lmente soluble en dimetil sulfóxido; soluble en dimetilformamida; moderadamente soluble en metanol; poco soluble en alcohol, en cloroformo y en propilenglicol; muy poco soluble en agua y en alcohol isopropílico; insoluble en eter. Nitrato ~e Pilocarpina: Cristales blancos y brillantes. Es estable al aire, pero es afectado por la luz. Sus soluciones son ácidas al tornasol. Fácilmente soluble en agua; moderac}amente soluble en alcohol; insoluble en cloroformo y en eter. Nitrato de Plata: Cristales incoloros o blancos. El pH de sus soluciones es aproximadamente 5,5. Al exponerse a la lu~ en presencia de materia orgánica, se torna gris o negro grisáceo. Muy soluble en agua e incluso más soluble en agua en ebullición; fácilmente soluble en alcohol en ebulli~ión; moderadamente soluble en alcohol; poco soluble en eter.
USP 39 Nitrato de Plata Endurecido: Masas blancas y cristalinas generalmente moldeadas como lápices o conos. Se quiebra con una fractura fibrosa. Sus soluciones son neutras al tornasol. Se torna gris o negro grisáceo al exponerse a la luz. Soluble en agua hasta el grado de su contenido de n_itrato (siempre queda un residuo de cloruro de plata); parcialmente soluble en alcohol; poco soluble en éter. Nitrato de Potasio: Polvo cristalino blanco o cristales incoloros. Muy soluble en agua en ebullición; fácilmente soluble en agua; soluble en glicerina; prácticamente insoluble en alcohol. Nitrato de Sulconazol: Polvo cristalino blanco a blanquecino. Funde aproximadamente a 130º, con descomposición. Fácilmente soluble en piridina; moderadamente soluble en metanol; poco soluble en alcohol, en cloroformo, en acetona y en cloruro _de metileno; muy poco soluble en agua, en tolueno y en d1oxano. Nitrato Fenilmercúrico: Polvo cristalino blanco. Es afectado por la luz. Su solución saturada es ácida al tornasol. Poco soluble en alcohol y en glicerina; muy poco soluble en agua. Es más soluble en presencia de ácido nítrico o de hidróxidos alcalinos. Categoría del NF: Conservante antimicrobiano. Nitrito de Amilo: Líquido transparente, amarillento, con un olor frutal y etéreo peculiar. Es volátil aun a bajas temperaturas y es inflamable. Alcanza el punto de ebullición aproximadamente a 96º. Prácticamente insoluble en agua. Miscible con alcohol y con éter. Nitrito de Sodio: Polvo granular de color blanco a ligeramente amarillo, o varillas o masas fundidas, opacas, de color blanco o prácticamente blanco. Tiene un suave sabor salino y es delicuescente en aire. Sus soluciones son alcalinas al tornasol. Fácilmente soluble en agua; moderadamente soluble en alcohol. Nitrito de Sodio, Inyección: Líquido transparente, incoloro. Nitrofurantoína: Polvo fino o cristales, de color amarillo limón, inodoros. Deja un resabio amargo. Soluble en dimetilformamida; muy poco soluble en agua y en alcohol. Nitrofurazona: Polvo cristalino amarillo limón, inodoro. Se oscurece lentamente al exponerse a la luz. Funde aproximadamente a 236º, con descomposición. Soluble en dimetilformamida; poco soluble en propilenglicol y en mezclas de polietilenglicol; muy poco soluble en alcohol y en agua· prácticamente insoluble en cloroformo y en éter. ' . Nitrofurazona, Solución Tópica:. Líquido ligerame~te viscoso, transparente, de color amarillo claro, con un debil olor característico. Miscible con agua. Nitrofurazona, Ungüento: Amarillo, opaco, miscible con agua y tiene la consistencia característica de un ungüento. Nitrógeno: Gas incoloro, inodoro e insípido. No es inflamable y no promueve la combustión. Un La Oº y a una presión de 760 mm de mercurio pesa aproximadamente 1,251 g. Un volumen se disuelve en aproximadamente 65 volúmenes de agua y en aproximadamente 9 volúmenes de alcohol a 20º y a una presión de 760 mm de mercurio. Categoría del NF: Desplazador de aire; propelente. Nitroglicerina Diluida: Cuando se diluye con lactosa, es un polvo blanco inodoro. Cuando se diluye con propilenglicol o alcohol, es un líquido transparente, incoloro o amarillo pálido. [NOTA-La nitroglicerina no diluida se presenta ~orno un líquido de color blanco a amarillo pálido, espeso, inflamable y explosivo.] La nitroglicerina no diluida es soluble en metanol, en alcohol, en disulfuro de carbono, en acetona, en éter etílico, en acetato de etilo, en ácido acético glacial, en benceno, en tolueno, en nitrobenceno, en fenol, en cloroformo y en cloruro de metileno; poco soluble en agua. Nitromersol: Gránulos o polvo de color amarillo amarronado a amarillo. Es inodoro e insípido y es afectado por la luz. Soluble en soluciones de álcalis y de amoníaco me-
USP 39 diante la apertura del anillo anhídrido y la formación de una sal; muy poco soluble en agua, en alcohol, en acetona y en éter. Nitromersol, Solución Tópica: Solución transparente, de color anaranjado rojizo. Es afectado por la luz. Nitroprusiato de Sodio: Polvo o cristales, prácticamente inodoros, de color marrón rojizo. Fácilmente soluble en agua; poco soluble en alcohol; muy poco soluble en cloroformo; insoluble en benceno. Nizatidina: Sólido cristalino de color blanquecino a beige. Fácilmente soluble en cloroformo; soluble en metano!; moderadamente soluble en agua. Nonoxinol 9: Líquido viscoso, transparente, de incoloro a amarillo claro. Soluble en agua, en alcohol y en aceite de maíz. Categoría del NF: Agente humectante y/o solubilizante. Noretindrona: Polvo cristalino, inodoro, de color blanco a blanco cremoso. Es estable al aire. Soluble en cloroformo y en dioxano; moderadamente soluble en alcohol; poco soluble en éter; prácticamente insoluble en agua. Norfloxacino: Polvo cristalino blanco a amarillo pálido. Sensible a la luz y a la humedad. Fácilmente soluble en ácido acético; moderadamente soluble en cloroformo; poco soluble en acetona, en agua y en alcohol; muy poco soluble en metano! y en acetato de etilo; insoluble en éter. Norelgestromina: Polvo blanco a blanquecino. Fácilmente soluble en acetona, en etanol, en metano! y en dimetilformamida; moderadamente soluble en cloruro de metileno y en isopropanol; poco soluble en acetonitrilo; prácticamente insoluble en agua. Norgestimato: Polvo de color blanco a amarillo pálido. Muy soluble a fácilmente soluble en cloruro de metileno; moderadamente soluble en acetonitrilo; insoluble en agua. Norgestrel: Polvo cristalino blanco o prácticamente blanco, prácticamente inodoro. Fácilmente soluble en cloroformo; moderadamente soluble en alcohol; insoluble en agua. Noscapina: Polvo cristalino fino, blanco o prácticamente blanco. Fácilmente soluble en cloroformo; soluble en acetona; poco soluble en alcohol y en éter; prácticamente insoluble en agua. Novobiocina Cálcica: Polvo cristalino blanco o blanco amarillento, inodoro. Fácilmente soluble en alcohol y en metano!; moderadamente soluble en acetona y en acetato de butilo; poco soluble en agua y en éter; muy poco soluble en cloroformo. Novobiocina Sódica: Polvo cristalino blanco o blanco amarillento, inodoro e higroscópico. Fácilmente soluble en agua, en alcohol, en metano!, en glicerina y en propilenglicol; poco soluble en acetato de butilo; prácticamente insoluble en acetona, en cloroformo y en éter. Octaacetato de Sacarosa: Polvo blanco, prácticamente inodoro, con un sabor amargo intenso. Es higroscópico. Muy soluble en metano! y en cloroformo; soluble en alcohol y en éter; muy poco soluble en agua. Categoría del NF: Desnaturalizante de alcohol. Octildodecanol: Líquido incoloro transparente que fluye libremente. Soluble en alcohol y en éter; insoluble en agua. Categoría del NF: Vehículo (oleoso); emoliente; agente emulsionante. Octoxinol 9: Líquido viscoso, transparente, de color amarillo pálido, con olor tenue y con sabor amargo. Soluble en benceno y en tolueno; prácticamente insoluble en éter de petróleo. Miscible con agua, con alcohol y con acetona. Categoría del NF: Agente humectante y/o solubilizante. Ofloxacino: Polvo cristalino o cristales, de color blanco amarillento pálido a blanco amarillento claro. Moderadamente soluble en cloroformo; poco soluble en alcohol, en metano! y en agua. Olanzapina: Sólido cristalino amarillo. Soluble en n-propanol; moderadamente soluble en acetonitrilo; poco soluble
Tablas de Referencia / Descripción y Solubilidad 2455 en metano! y en alcohol deshidratado; prácticamente insoluble en agua. Oleato de Etilo: Líquido móvil, prácticamente incoloro, con sabor agradable. Insoluble en agua. Miscible con aceites vegetales, con aceite mineral, con alcohol y con la mayoría de los disolventes orgánicos. Categoría del NF: Vehículo (oleoso); disolvente. Oleato de Polioxilo: Líquido viscoso, ligeramente amarillento. Dispersable en agua y en aceites; soluble en alcohol y en alcohol isopropílico. Miscible con aceites grasos y con ceras. Su índice de refracción es de aproximadamente 1,466. Oleato Oleílico: Líquido transparente, de incoloro a amarillo claro. Tiene un leve olor característico. Poco soluble en alcohol. Miscible con cloroformo y con éter. Categoría del NF: Emoliente; agente emulsionante. Oleorresina de Cápsico: Líquido aceitoso de color rojo oscuro. Soluble en alcohol, en acetona, en éter, en cloroformo y en aceites volátiles; soluble con opalescencia en aceites fijos. Oleovitaminas A y D: Líquido aceitoso de color amarillo a rojo, prácticamente inodoro o con olor a pescado, sin olor o sabor rancio. Es un líquido transparente a temperaturas superiores a 65º y puede cristalizar al enfriarse. Es inestable en presencia del aire y la luz. Muy soluble en éter y en cloroformo; soluble en alcohol deshidratado y en aceites vegetales; insoluble en agua y en glicerina. Oleovitaminas A y D, Cápsulas: El aceite contenido en las Cápsulas de Oleovitaminas A y D es un líquido aceitoso de color amarillo a rojo, prácticamente inodoro o con olor a pescado, sin olor o sabor rancio. Es un líquido transparente a temperaturas superiores a 65º y puede cristalizar al enfriarse. Es inestable en presencia de aire y de luz. Olmesartán Medoxomilo: Polvo cristalino blanco a blanquecino. Moderadamente soluble en metano!; prácticamente insoluble en agua. Omeprazol: Polvo blanco a blanquecino. Soluble en diclorometano; moderadamente soluble en metano! y en alcohol; muy poco soluble en agua. Omeprazol Magnésico: Polvo blanco a blanquecino. Moderadamente soluble en metano!; poco soluble en alcohol; muy poco soluble en agua y en diclorometano. Ondansetrón: Polvo blanco a blanquecino. Muy soluble en soluciones ácidas; moderadamente soluble en agua. Opio: Tiene un olor muy característico y un sabor muy amargo. Opio en Polvo: Polvo de color marrón claro o marrón moderadamente amarillento. Orbifloxacino: Polvo cristalino o cristales, de color blanco a amarillo pálido. Inodoro. Soluble en ácido acético; muy poco soluble en metano!, en agua y en cloroformo; prácticamente insoluble en etanol y en eter dietílico. Orlistat: Polvo blanco a blanquecino o polvo fino con grumos. Fácilmente soluble en cloroformo; muy soluble en metano! y en alcohol; prácticamente insoluble en agua. Oxacilina Sódica: Polvo cristalino, fino, de color blanco, inodoro o con un olor leve. Fácilmente soluble en agua, en metano! y en dimetil sulfóxido; poco soluble en alcohol absoluto, en cloroformo, en piridina y en acetato de metilo; insoluble en acetato de etilo, en éter, en benceno y en cloruro de etileno. Oxacilina Sódica para Inyección: Polvo cristalino, fino, de color blanco, inodoro o con un olor leve. Fácilmente soluble en agua, en metano! y en dimetil sulfóxido; poco soluble en alcohol absoluto, en cloroformo, en piridina y en acetato de metilo; insoluble en acetato de etilo, en éter, en benceno y en cloruro de etileno. Oxalato de Escitalopram: Polvo fino blanco a levemente amarillo. Fácilmente soluble en metano! y en dimetil sulfóxido; moderadamente soluble en agua y en alcohol;
2456 Descripción y Solubilidad / Tablas de Referencia muy poco soluble en acetato de etilo y en alcohol isopropílico; insoluble en heptano. Oxaliplatino: Polvo cristalino blanco a blanquecino. Poco soluble en agua; muy poco soluble en metanol; prácticamente insoluble en alcohol. Oxandrolona: Polvo cristalino blanco, inodoro. Es estable al aire, pero se oscurece al exponerse a la luz. Funde aproximadamente a 225º. Fácilmente soluble en cloroformo, moderadamente soluble en alcohol y en acetona; prácticamente insoluble en agua. Oxaprozina: Polvo cristalino de color blanco a blanco amarillento. Oxazepam: Polvo de color blanco cremoso a amarillo pálido. Es prácticamente inodoro. Poco soluble en alcohol y en cloroformo; muy poco soluble en éter; prácticamente insoluble en agua. Oxcarbazepina: Polvo de color blanguecino o anaranjado claro a bíanco cremoso. Soluble en acido acético; moderadamente soluble en cloroformo; prácticamente insoluble en agua. Oxfendazol: Polvo blanco o casi blanco. Poco soluble en alcohol y en cloruro de metileno; prácticamente insoluble en agua. Oxibenzona: Polvo de color amarillo pálido. Fácilmente soluble en alcohol y en tolueno; prácticamente insoluble en agua. Óxido de Aluminio: Se presenta como un polvo amorfo de color blanco o casi blanco. Muy poco soluble en ácidos minerales diluidos y en soluciones de hidróxidos alcalinos. Prácticamente insoluble en agua. Categoría del NF: Agente de colorante. Óxido de Cinc: Polvo muy fino, inodoro, amorfo, de color blanco o blanco amarillento, exento de partículas arenosas. Absorbe gradualmente dióxido de carbono del aire. Soluble en ácidos diluidos; insoluble en asiua y en alcohol. Cate9oría del NF: Conservante antimicrob1ano; agente de recubrimiento. Óxido de Magnesio: Polvo blanco muy voluminoso, polvo blanco relativamente denso o polvo granulado. Soluble en ácidos diluidos; prácticamente insoluble en agua; insoluble en alcohol. Categoría del NF: Agente emulsionante; deslizante y/o agente antiaglutinante; diluyente. Óxido de Polietileno: Las resinas de óxido de polietileno son polímeros de alto peso molecular que tienen la estructura común:
en donde n, el grado de polimerización, varía de aproximadamente 2000 flasta más de 100 000. El óxido de polietileno, siendo un poliéter, forma puentes de hidrógeno con el agua. Es no iónico y experimenta efectos de desplazamiento salino asociado con moléculas neutras en soluciones de alto valor dieléctrico. Los efectos de extracción de sales se manifiestan en la disminución del límite superior de temperatura de solubilidad y en la reducción de la viscosidad de las soluciones diluidas y las concentradas de los polímeros. Todos los grados de pesos moleculares son sólidos granulados o pulverizados. Son solubles en agua pero, debido a las altas viscosidades de las soluciones obtenidas (ver tabla), las soluciones con más de 1% de agua pueden ser difíciles de preparar. La solubilidad en agua, higroscopicidad, solubilidad en disolventes orgánicos y punto de fusión no varían en el intervalo de peso molecular especificado. A temperatura ambiente, el óxido de polietileno es miscible con agua en todas las proporciones. A concentraciones de aproximadamente 20% de polímero en agua, las soluciones son geles no pegajosos, reversibles y elásticos. A mayores concentraciones, las soluciones son materiales elásticos resistentes, en los que el a9ua actúa como plastificante. El óxido de polietileno también es fácilmente soluble en acetonitrilo, en dicloruro de
USP 39 etileno, en tricloroetileno y en cloruro de metileno. Puede ser necesario calentar para obtener soluciones en muchos otros disolventes orgánicos. Es insoluble en hidrocarburos alifáticos, en etilenglicol, en dietilenglicol y en glicerol. Categoría del NF: Agente de suspensión y/o viscosante; aglutinante por vía húmeda; agente de recubrimiento; agente modificador de liberación.
Peso Molecular Anroxlmado 100 000 200 000 300000 400000 600 000 900 000 4 000 000 5 000 000
Viscosidad de la Solución Típica (cps), 25º Solución al 50/o Solución al 1% 40 100 800 3000 6000 15 000 3500 5500
Óxido Férrico: Polvo que presenta dos colores básicos (rojo y amarillo) u otros tonos producidos al mezclar los colores básicos. Insoluble en ª!JUª y en disolventes orgánicos; se disuelve en ácido clorh1drico por calentamiento y normalmente presenta una pequeña cantidad de residuos insolubles. Categoría del NF: Agente de colorante. Óxido Ferrosoférrico: Polvo negro. Se disuelve en ácido clorhídrico al entibiarlo, quedando generalmente un pequeño residuo insoluble; insoluble en agua y en disolventes orgánicos. Categoría del NF: Agente de colorante. Óxido Nitroso: Gas incoloro, sin olor o sabor apreciables. Un L a Oº y a una presión de 760 mm de mercurio pesa aproximadamente 1,97 g. Un volumen se disuelve en aproximadamente 1,4 volúmenes de agua a 20º y a una presión de 760 mm de mercurio. Fácilmente soluble en alcohol; soluble en éter y en aceites. Categoría del NF: Propelente. Oxígeno: Gas incoloro, inodoro e insípido, que promueve la combustión con más intensidad que el aire. Un L a Oº y a una presión de 760 mm de mercurio pesa aproximadamente 1,429 g. Un volumen se disuelve en aproximadamente 32 volúmenes de agua y en aproximadamente 7 volúmenes de alcohol a 20º y a una presión de 760 mm de mercurio. Oximetolona: Polvo cristalino blanco a blanco cremoso. Es inodoro y estable al aire. Fácilmente soluble en cloroformo; soluble en dioxano; moderadamente soluble en alcohol; poco soluble en éter; prácticamente insoluble en agua. Oxitetraciclina: Polvo cristalino de color amarillo pálido a tostado, inodoro. Es estable al aire, pero se oscurece si se expone a luz solar intensa. Pierde potencia en soluciones con un pH inferior a 2 y se degrada rápidamente por las soluciones de hidróxidos alcalinos. Fácilmente soluble en ácido clorhídrico 3 N y en soluciones alcalinas; moderadamente soluble en alcohol; muy poco soluble en agua. Oxitetraciclina Cálcica: Polvo cristalino de color amarillo a marrón claro. Insoluble en agua. Oxtrifilina: Polvo cristalino blanco con un olor semejante a las aminas. Una solución (1 en 100) tiene un pH de aproximadamente 10,3. Fácilmente soluble en agua y en alcohol; muy poco soluble en cloroformo. Paclitaxel: Polvo blanco a blanquecino. Soluble en alcohol; insoluble en agua. Padimato O: Líquido móvil de color amarillo claro con un olor aromático leve. Soluble en alcohol, en alcohol isopropílico y en aceite mineral; prácticamente insoluble en agua, en glicerina y en propilenglicol.
USP 39
Palmitato de Ascorbilo: Polvo blanco a blanco amarillento, con un olor característico. Soluble en alcohol; muy poco soluble en agua y en aceites vegetales. Categoría del NF: Antioxidante. Palmitato de Cetilo: Cristales o escamas de color blanco. Fácilmente soluble en alcohol y en éter; prácticamente insoluble en agua. Categoría del NF: Agente espesante. Palmitato de Cloranfenicol: Polvo cristalino fino, blanco y untuoso, con un olor débil y un sabor suave e insípido. Fácilmente soluble en acetona y en cloroformo; soluble en éter; moderadamente soluble en alcohol; muy poco soluble en éter de petróleo; insoluble en agua. Palmitato de lsopropilo: Líquido incoloro, móvil, con olor muy leve. Soluble en acetona, en aceite de ricino, en cloroformo, en aceite de semillas de algodón, en acetato de etilo, en alcohol y en aceite mineral; insoluble en agua, en glicerina y en propilenglicol. Categoría del NF: Vehículo (oleoso); emoliente; disolvente. Palmitato de Sacarosa: Polvo untuoso blanco o casi blanco. Moderadamente soluble en etanol (96%); muy poco soluble en agua. Categoría del NF: Agente de suspensión y/o viscosante; agente emulsionante. Palmitoestearato de Butilo: Sólido ceroso incoloro o amarillento pálido a temperaturas inferiores a l 7º-24º, o líquido incoloro o amarillento pálido a temperaturas de l 7º-24º o superiores. Soluble en acetona, en alcohol, en éter, en aceites minerales y en aceites vegetales; prácticamente insoluble en agua y en propilenglicol. Categoría del NF: Agente emulsionante; saborizantes y fragancia; plastificante. Pamidronato Disódico: Polvo cristalino blanco. Soluble en agua y en hidróxido de sodio 2 N; moderadamente soluble en ácido clorhídrico O, 1 N y en ácido acético O, 1 N; prácticamente insoluble en disolventes orgánicos. Pamoato de Hidroxizina: Polvo amarillo claro, prácticamente inodoro. Fácilmente soluble en dimetilformamida; prácticamente insoluble en agua y en metano!. Pamoato de lmipramina: Polvo fino amarillo. Soluble en acetona, en cloroformo, en tetracloruro de carbono, en etanol y en éter; insoluble en agua. Pamoato de Pirantel: Sólido de color amarillo a tostado. Soluble en dimetil sulfóxido; poco soluble en dimetilformamida; prácticamente insoluble en agua y en metano!. Pamoato de Pirvinio: Polvo cristalino de color anaranjado brillante o rojo anaranjado a prácticamente negro. Fácilmente soluble en ácido acético glacial; poco soluble en cloroformo y en metoxietanol; muy poco soluble en metano[; prácticamente insoluble en agua y en éter. Pamoato de Pirvinio, Suspensión Oral: Suspensión opaca, de color rojo oscuro formada esencialmente por part1culas o agregados amorfos y muy finos, normalmente con un tamaño inferior a 1 O µm. Pueden encontrarse además partículas más grandes, algunas de las cuales pueden ser cristales, con un tamaño de hasta 100 µm. Pancreatina: Polvo amorfo de color crema, con ligero olor característico no desagradable. Hidroliza grasas a glicerol y ácidos grasos, convierte proteínas en proteosas y sustancias derivadas, y convierte el almidón en dextrinas y azúcares. Su mayor actividad se da en medios neutros o ligeramente alcalinos; algo más que trazas de ácidos minerales o cantidades grandes de hidroxidos alcalinos la hacen inerte. Un exceso de carbonato alcalino también inhibe su acción.
Tablas de Referencia/ Descripción y Solubilidad 2457
Pancreolipasa: Polvo amorfo de color crema, con ligero olor caractenstico no desagradable. La Pancreolipasa hidroliza grasas a glicerol y ácidos grasos, convierte proteínas en proteosas y sustancias derivacfas, y convierte el almidón en dextrinas y azúcares. Su mayor actividad se da en medios neutros o ligeramente alcalinos; algo más que trazas de ácidos minerales o cantidades grandes de hidróxidos alcalinos la hacen inerte. Un exceso de carbonato alcalino también inhibe su acción. Pancreolipasa, Cápsulas: El contenido de las Cápsulas cumple con los requisitos de la Descripción en Pancreolipasa, excepto que el olor puede variar segun el agente saborizante utilizado. Pantenol: Polvo cristalino de color blanco a blanco cremoso, con un olor leve característico. Fácilmente soluble en agua, en alcohol y en propilenglicol; soluble en cloroformo y en éter; poco soluble en glicerina. Pantoprazol Sódico: Polvo blanco a blanquecino. Fácilmente soluble en agua, en metanol y en alcohol deshidratado; prácticamente insoluble en hexano y en diclorometano. Pantotenato de Calcio: Polvo blanco, ligeramente higroscópico. Es inodoro y tiene un sabor amargo. Fácilmente soluble en agua; soluble en glicerina; prácticamente insoluble en alcohol, en cloroformo y en éter. Pantotenato de Calcio Racémico: Polvo blanco, levemente higroscópico, con un débil olor característico y sabor amargo. Es estable al aire. Sus soluciones son neutras o alcalinas al tornasol. Es ópticamente inactivo. Fácilmente soluble en agua; soluble en glicerina; prácticamente insoluble en alcohol, en cloroformo y en éter. Papaína: Polvo amorfo, de color blanco a tostado claro. Soluble en agua, la solución es de incolora a color amarillo claro y más o menos opalescente; prácticamente insoluble en alcohol, en cloroformo y en éter. Paraclorofenol: Cristales de color blanco o rosado con un olor fenólico característico. Cuando no está diluido, torna blancas las membranas mucosas y la piel y las cauteriza. Funde aproximadamente a 42º. Muy soluble en alcohol, en glicerina, en cloroformo, en éter y en aceites fijos y volátiles; soluble en vaselina; moderadamente soluble en agua y en vaselina líquida. Parafina: Masa incolora o blanca, más o menos traslúcida que presenta una estructura cristalina. Es inodora e insípida y es levemente grasosa al tacto. Fácilmente soluble en cloroformo, en éter, en aceites volátiles y en la mayoría de los aceites fijos tibios; poco soluble en alcohol deshidratado; insoluble en agua y en alcohol. Categoría del NF: Agente espesante; base para ungüentos. Parafina Sintética: Cera blanca, muy dura, prácticamente inodora e insípida. Contiene principalmente hidrocarburos saturados de cadena larga no ramificada y una pequeña cantidad de hidrocarburos ramificados. Está representada por la fórmula CnH2n+2, en donde n puede variar entre 20 y aproximadamente 100. El peso molecular promedio puede variar entre 400 y 1400. Poco soluble en disolventes parafínicos aromáticos y normales; muy poco soluble en disolventes hidrocarburos alifáticos, oxigenados y halogenados; insoluble en agua. Categoría del NF: Agente espesante. Paraldehído: Líquido incoloro y transparente. Tiene un olor fuerte y característico, no desagradable ni acre, y un gusto desagradable. El peso específico es aproximadamente 0,99. Es soluble en agua, pero menos soluble en agua en ebullición. Miscible con alcohol, con cloroformo, con éter y con aceites volátiles. Paricalcitol: Polvo blanco a casi blanco. Soluble en alcohol; insoluble en agua. Pectina: Polvo grueso o fino, de color blanco amarillento, casi inodoro y de sabor mucilaginoso. Soluble en 20 partes de agua, formando una solución viscosa, opalescente y coloidal que fluye fácilmente y es ácida al tornasol;
2458 Descripción y Solubilidad / Tablas de Referencia prácticamente insoluble en alcohol o en alcohol diluido y en otros disolventes orgánicos. La Pectina se disuelve en agua con mayor facilidad si antes se humedece con alcohol, 51licerina o jarabe simple, o si primero se mezcla con 3 o mas partes de sacarosa. Categoría del NF: Agente de suspensión y/o viscosante; agente emulsionante; agente formador de película. Penicilamina: Polvo cristalino de color blanco o prácticamente blanco, con un olor leve característico. Fácilmente soluble en a9ua; poco soluble en alcohol; insoluble en cloroformo y en eter. Penicilina G Benzatínica: Polvo cristalino blanco e inodoro. Moderadamente soluble en alcohol; muy poco soluble en agua. Penicilina G Potásica: Cristales incoloros o blancos, o polvo cristalino blanco. Es inodora o prácticamente inodora y moderadamente higroscópica. Sus soluciones son dextrógiras. Sus soluciones retienen sustancialmente su potencia total durante varios días a temperaturas inferiores a 15º, pero son rápidamente inactivadas por ácidos, hidróxidos alcalinos, glicerina y agentes oxidantes. Muy soluble en agua, en solución salina SR y en soluciones de dextrosa; moderadamente soluble en alcohol. Penicilina G Procaínica: Cristales blancos o polvo microcristalino blanco, muy fino. Es inodora o prácticamente inodora y relativamente estable al aire. Sus soluciones son dextrógiras. lnactivado rápidamente por acción de ácidos, hidróxidos alcalinos y agentes oxidantes. Soluble en alcohol y en cloroformo; poco soluble en agua. Penicilina G Sódica: Cristales incoloros o blancos, o polvo cristalino de color blanco a ligeramente amarillo. Es inodora o prácticamente inodora y moderadamente higroscópica. Sus soluciones son dextrógiras. Es relativamente estable al aire, pero la inactiva el calentamiento prolongado a aproximadamente 100º, especialmente en presencia de humedad. Sus soluciones pierden potencia con bastante rapidez a temperatura ambiente, pero conservan prácticamente toda su potencia durante varios días a temperaturas inferiores a 15º. Sus soluciones son rápidamente inactivadas por los ácidos, los hidróxidos alcalinos, los oxidantes y la penicilinasa. Penicilina V: Polvo cristalino blanco, inodoro. Fácilmente soluble en alcohol y en acetona; muy poco soluble en agua; insoluble en aceites fijos. Penicilina V Benzatínica: Polvo prácticamente blanco con un olor característico. Moderadamente soluble en cloroformo; poco soluble en alcohol y en éter; muy poco soluble en agua. Penicilina V Potásica: Polvo cristalino blanco e inodoro. Muy soluble en agua; poco soluble en alcohol; insoluble en acetona. Pentazocina: Polvo de color blanco o tostado muy pálido. Fácilmente soluble en cloroformo; soluble en alcohol, en acetona y en éter; moderadamente soluble en benceno y en acetato de etilo; prácticamente insoluble en agua. Pentetato de Tecnecio Te 99m, Inyección: Solución transparente e incolora. Pentobarbital: Polvo fino blanco a prácticamente blanco, prácticamente inodoro. Puede presentarse en una forma polimórfica que funde aproximadamente a 116º. Esta forma vuelve gradualmente a la forma más estable de mayor punto de fusión, al calentarse aproximadamente a 11 Oº. Muy soluble en alcohol, en metano], en éter, en cloroformo y en acetona; soluble en benceno; muy poco soluble en agua y en tetracloruro de carbono. Pentobarbital Sódico: Gránulos cristalinos blancos o polvo blanco. Es inodoro o con un olor leve característico, y tiene un ligero sabor amargo. Sus soluciones se descomponen en reposo y el calor acelera su descomposición. Muy soluble en agua; fácilmente soluble en alcohol; prácticamente insoluble en éter.
USP 39 Pentoxifilina: Polvo cristalino blanco a casi blanco. Fácilmente soluble en cloroformo y en metanol; soluble en agua; moderadamente soluble en alcohol; poco soluble en éter. Perfenazina: Polvo inodoro de color blanco a blanco cremoso. Fácilmente soluble en alcohol y en cloroformo; soluble en acetona; prácticamente insoluble en agua. Perflubrón: Líquido transparente, incoloro, prácticamente inodoro. Permanganato de Potasio: Cristales de color púrpura oscuro, casi opacos a la luz transmitida y con un brillo azul metálico a la luz reflejada. A veces adquiere un color bronce oscuro. Es estable al aire. Fácilmente soluble en agua en ebullición; soluble en agua. Peróxido de Benzoílo, Gel: Gel suave, blanco, con un olor característico. Peróxido de Benzoílo Hidratado: Polvo granular blanco con un olor característico. Soluble en acetona, en cloroformo y en éter; moderadamente soluble en agua y en alcohol. Peróxido de Benzoílo, Loción: Loción blanca, viscosa, cremosa, con un olor característico. Peróxido de Carbamida, Solución Tópica: Líquido transparente, incoloro, viscoso, con olor y sabor característicos. Peróxido de Hidrógeno Concentrado: Líquido transparente, incoloro. Es ácido al tornasol. Se descompone lentamente y es afectado por la luz. Peróxido de Hidrógeno, Solución: Líquido transparente, incoloro, inodoro o con un olor similar al del ozono. Es ácido al tornasol y al gusto, y produce espuma en la boca. Se descompone rápidamente cuando entra en contacto con muchas sustancias oxidantes y reductoras. Cuando se calienta en forma rápida, se puede descomponer repentinamente y es afectado por la luz. El peso específico es aproximadamente 1,01. Pertecnetato de Sodio Te 99m, Inyección: Solución transparente e incolora. Picosulfato de Sodio: Polvo cristalino blanco o casi blanco. Fácilmente soluble en agua; poco soluble en alcohol. Piedra Pómez: Masas grisáceas muy livianas, duras, ásperas y porosas, o polvo arenoso grisáceo. Es inodora e insípida, y estable al aire. Prácticamente insoluble en agua; los ácidos no la modifican. Pilocarpina: Líquido viscoso y aceitoso o cristales que funden aproximadamente a 34º. Extremadamente higroscópico. Soluble en agua, en alcohol y en cloroformo; moderadamente soluble en éter y en benceno; prácticamente insoluble en éter de petróleo. Pimozida: Polvo cristalino blanco. Fácilmente soluble en cloroformo; poco soluble en éter y en alcohol; insoluble en agua. Pindolol: Polvo cristalino de color blanco a blanquecino, con un olor leve. Poco soluble en metanol; muy poco soluble en cloroformo; prácticamente insoluble en agua. Piperacilina: Polvo cristalino blanco a blanquecino. Muy soluble en metanol; poco soluble en alcohol isopropílico; muy poco soluble en acetato de etilo y prácticamente insoluble a muy poco soluble en agua. Piperacilina Sódica: Sólido blanco a blanquecino. Fácilmente soluble en agua y en alcohol. Piperazina: Grumos o escamas de color blanco a ligeramente blanquecino con olor a amoníaco. Soluble en agua y en alcohol; insoluble en éter. Pirazinamida: Polvo cristalino blanco a prácticamente blanco, inodoro o prácticamente inodoro. Moderadamente soluble en agua; poco soluble en alcohol, en éter y en cloroformo.
USP 39 Pirirnetarnina: Polvo cristalino blanco, inodoro. Poco soluble en acetona, en alcohol y en cloroformo; prácticamente insoluble en agua. Piroxicam: Polvo blanquecino a tostado claro o amarillo claro, inodoro. Forma un monohidrato de color amarillo. Poco soluble en alcohol y en soluciones alcalinas acuosas; muy poco soluble en agua, en ácidos diluidos y en la mayoría de los disolventes orgánicos. Pivalato de Clocortolona: Polvo inodoro, blanco a blanco amarillento. Funde aproximadamente a 230º, con descomposición. Fácilmente soluble en cloroformo y en dioxano; soluble en acetona; moderadamente soluble en alcohol; poco soluble en benceno y en éter. Pivalato de Flumetasona: Polvo cristalino blanco a blanquecino. Poco soluble en metano!; muy poco soluble en cloroformo y en cloruro de metileno; insoluble en agua. Plicamicina: Polvo cristalino amarillo, inodoro e higroscópico. Fácilmente soluble en acetato de etilo; poco soluble en agua y en metanol; muy poco soluble en alcohol. Podófilo: Tiene un olor leve y un desagradable sabor amargo y acre. Podofilina: Polvo amorfo de color variable entre marrón claro y amarillo verdoso, que se torna más oscuro al exponerse a una temperatura superior a 25º o a la luz. Tiene un sabor leve, algo amargo y peculiar. Su solución en alcohol es ácida al papel tornasol humedecido. Soluble en alcohol con una leve opalescencia; parcialmente soluble en éter y en cloroformo. Polacrilina Potásica: Polvo blanco a blanquecino de libre fluidez. Tiene un olor tenue o es inodoro. Insoluble en agua y en la mayoría de los líquidos. Categoría del NF: Desintegrante. Policarbofilo: Gránulos de color blanco a blanco cremoso, con un olor característico similar al éster. Se hincha en agua a diversos volúmenes, dependiendo principalmente del pH. Insoluble en agua, en ácidos diluidos, en álcalis diluidos y en disolventes orgánicos comunes. Categoría del NF: Agente emulsionante; agente de suspensión y/o viscosante; aglutinante por vía húmeda. Policarbofilo de Calcio: Polvo blanco a blanco cremoso. Insoluble en agua, en ácidos diluidos, en álcalis diluidos y en disolventes orgánicos comunes. Polideceno Hidrogenado: Líquido insípido, inodoro, incoloro, transparente. Muy poco soluble en agua. Categoría del NF: Emoliente; base para ungüentos; disolvente; vehículo (oleoso). Polidextrosa: Sólido de color blanquecino a tostado claro. Muy soluble en agua; soluble en alcohol; poco soluble en glicerina y en propilenglicol. Categoría del NF: Agente de volumen; humectante; agente de recubrimiento; agente de suspensión y/o viscosante; diluyente. Polidextrosa Hidrogenada: Sólido blanquecino a tostado claro. Muy soluble en agua; soluble en alcohol; poco soluble en glicerina y en propilenglicol. Categoría del NF: Agente de volumen; agente de recubrimiento; humectante; agente de suspensión y/o viscosante; aglutinante por vía húmeda. Polietilenglicol: En general, el Polietilenglicol se designa mediante un número que corresponde aproximadamente a su peso molecular promedio. A medida que aumenta el peso molecular promedio, disminuye la solubilidad en agua, la presión de vapor, la higroscopicidad y la solubilidad en disolventes or~ánicos, a la vez que aumenta la temperatura de solidificacion, el peso específico, el punto de inflamabilidad y la viscosidad. Los grados líquidos se presentan como líquidos transparentes a levemente turbios, incoloros o prácticamente incoloros, levemente higroscópicos y viscosos, con un leve olor característico y un peso específico a 25º de aproximadamente 1, 12. Los grados sólidos se presentan como material plástico, prácticamente inodoro e insípido, blanco, ceroso, con una consistencia similar a la cera de abejas, ya sea en escamas, perlas o polvos de color blanco
Tablas de Referencia / Descripción y Solubilidad 2459 cremoso. La tabla adjunta indica las temperaturas de solidificación aproximadas que son características de los grados más comúnmente disponibles. Los grados líquidos son miscibles con agua; los grados sólidos son fácilmente solubles en agua; y todos son solubles en acetona, en alcohol, en cloroformo, en éter monoetílico de etilenglicol, en acetato de etilo y en tolueno; todos son insolubles en éter y en hexano. Categoría del NF: Agente de recubrimiento; plastificante; disolvente; base para supositorios; lubricante; agente formador de película; base para ungüentos; diluyente.
Polletilenglicol Peso Molecular Nominal
300 400 600 900 1000 1450 3350 4500 8000
Temperatura de Solidificación Anroximada (º) -11
6 20 34 38 44 56 58 60
Poliisobutileno: Los grados de bajo peso molecular son blandos y gomosos; los de alto peso molecular son duros y elásticos. Todos los grados tienen color claro y son inodoros e insípidos. Soluble en diisobutileno, en tolueno y en cloroformo; insoluble en agua. Categoría del NF: Adhesivo. Polioxilglicéridos de Behenoilo: Sólido ceroso o polvo fino. Soluble en cloruro de metileno; insoluble en alcohol; dispersable en agua. Categoría del NF: Lubricante; agente emulsionante; agente humectante y/o solubilizante. Polioxilglicéridos de Caprilocaproilo: Líquidos aceitosos de color amarillo pálido. Dispersables en agua caliente; fácilmente solubles en cloruro de metileno. Categoría del NF: Base para ungüentos; disolvente; agente humectante y/o solubilizante; agente emulsionante. Polioxilglicéridos de Estearoilo: Sólidos cerosos de color amaríllo pálido. Dispersables en agua tibia y en parafina tibia. Fácilmente solubles en cloruro de metileno; solubles en metanol tibio. Categoría del NF: Base para ungüentos; disolvente; agente emulsionante; agente humectante y/ o solubilizante. Polioxilglicéridos de Lauroílo: Semisólidos de color amarillo pálido. Fácilmente solubles en cloruro de metileno. Dispersables en agua caliente. Categoría del NF: Base para ungüentos; disolvente; agente emulsionante; agente humectante y/o solubilizante. Polioxilglicéridos de Linoleoilo: Líquidos aceitosos de color ámbar. Pueden desarrollar depósitos después de períodos de almacenamiento prolon9ados a 20º. Facilmente solubles en cloruro de metileno; practicamente insolubles pero dispersables en agua. Categoría del NF: Base para ungüentos; disolvente; agente emulsionante; agente humectante y/o solubilizante. Polioxilglicéridos de Oleoilo: Líquidos aceitosos de color ámbar. Pueden desarrollar depósitos después de almacenamiento prolongado a 20º. Fácilmente solubles en cloruro de metileno; prácticamente insolubles pero dispersables en agua. Categoría del NF: Base para ungüentos; disolvente; agente emulsionante; agente humectante y/o solubilizante. Polisorbato 20: Líquido de color límón a ámbar con un olor leve característico. Soluble en agua, en alcohol, en acetato de etilo, en metanol y en dioxano; insoluble en aceite mineral. Categoría del NF: Agente humectante y/o solubilizante; agente emulsionante; lubricante; agente de suspensión y/o viscosante. Polisorbato 40: Líquido amarillo con un olor leve característico. Soluble en agua y en alcohol; insoluble en aceite
2460 Descripción y Solubilidad / Tablas de Referencia mineral y en aceites vegetales. Categoría del NF: Agente humectante y/o solubilizante; agente emulsionante; lubricante; agente de suspensión y/o viscosante. Polisorbato 60: Líquido aceitoso o semi9el de color limón a anaranjado con un débil olor caractenstico. Soluble en agua, en acetato de etilo y en tolueno; insoluble en aceite mineral y en aceites vegetales. Categoría del NF: Agente emulsionante; lubricante; agente de suspensión y/o viscosante; agente humectante y/o solubilizante. Polisorbato 80: Líquido aceitoso de color limón a ámbar, con un olor leve característico y sabor cálido y algo amargo. Muy soluble en agua, lo que produce una solución inodora y prácticamente incolora; soluble en alcohol y en acetato de etilo; insoluble en aceite mineral. Categona del NF: Agente humectante y/o solubilizante; agente emulsionante; lubricante; agente de suspensión y/o viscosante. Poloxaleno: Líquido incoloro o amarillo pálido. Soluble en agua, en cloroformo y en dicloruro de etileno. Poloxámero: Categoría del NF: Agente humectante y/o solubilizante; agente emulsionante; lubricante. Poloxámero 124: Líquido incoloro con olor suave. Cuando se solidifica, funde aproximadamente a 16º. Fácilmente soluble en agua, en alcohol, en alcohol isopropílico, en propilenglicol y en xileno. Poloxámero 188: Sólido blanco moldeado o granulado. Es inodoro o tiene un olor muy suave. Funde aproximadamente a 52º. Fácilmente soluble en agua y en alcohol. Poloxámero 237: Sólido blanco moldeado o granulado. Es inodoro o tiene un olor muy suave. Funde aproximadamente a 49º. Fácilmente soluble en agua y en alcohol; moderadamente soluble en alcohol isopropílico y en xileno. Poloxámero 338: Sólido blanco moldeado o granulado. Es inodoro o tiene un olor muy suave. Funde aproximadamente a 57º. Fácilmente soluble en agua y en alcohol; moderadamente soluble en propilenglicol. Poloxámero 407: Sólido blanco moldeado o granulado. Es inodoro o tiene un olor muy suave. Funde aproximadamente a 56º. Fácilmente soluble en agua, en alcohol y en alcohol isopropílico. Polvo Secante Absorbible: Polvo blanco e inodoro. Potasa Sulfurada: Trozos irregulares de color marrón rojizo oscuro recientemente preparado, que después se torna amarillo verdoso. Tiene olor a sulfuro de hidrógeno y un sabor amargo, agrio y alcalino y se descompone al exponerlo al aire. Una solucion (1 en 1O) es de color marrón claro y alcalina al tornasol. Fácilmente soluble en agua, dejando normalmente un ligero residuo. El alcohol sólo disuelve los sulfuros. Povidona: Polvo de color blanco a blanco ligeramente cremoso. Es higroscópico. Fácilmente soluble en agua, en metanol y en alcohol; poco soluble en acetona; prácticamente insoluble en éter. Categoría del NF: Agente de suspensión y/o viscosante; aglutinante por vía húmeda; polímeros para uso oftálmico. Povidona Yodada: Polvo amorfo de color marrón amarillento a marrón rojizo, con un olor leve y característico. Su solución es ácida al tornasol. Soluble en agua y en alcohol; prácticamente insoluble en cloroformo, en tetracloruro de carbono, en éter, en éter de petróleo y en acetona. Povidona Yodada, Solución Tópica en Aerosol: El líquido obtenido de la Solución Tópica en Aerosol de Povidona Yodada es transparente, de color marrón rojizo. Pravastatina Sódica: Polvo higroscópico blanco a blanco amarillento. Fácilmente soluble en agua y en metano!; soluble en alcohol deshidratado; prácticamente insoluble en acetonitrilo y en cloroformo. Prazicuantel: Polvo cristalino de color blanco o prácticamente blanco, inodoro o con un olor leve característico. Fácilmente soluble en alcohol y en cloroformo; muy poco soluble en agua.
USP 39 Prednicarbato: Polvo cristalino blanco a casi blanco. Fácilmente soluble en acetona y en alcohol; moderadamente soluble en propilenglicol; prácticamente insoluble en agua. Prednisolona: Polvo cristalino blanco a prácticamente blanco e inodoro. Funde aproximadamente a 235º, con cierto grado de descomposición (ver Intervalo o Temperatura de Fusión (7 41 )). Soluble en metano! y en dioxano; moderadamente soluble en acetona y en alcohol; poco soluble en cloroformo; muy poco soluble en agua. Prednisona: Polvo cristalino blanco a prácticamente blanco e inodoro. Funde aproximadamente a 230º, con cierto grado de descomposición (ver Intervalo o Temperatura de Fusión (741)). Poco soluble en alcohol, en cloroformo, en dioxano y en metanol; muy poco soluble en agua. Prilocaína: Agregados de cristal o polvo de color blanco o casi blanco. Muy soluble en alcohol y en acetona; poco soluble en agua. Primidona: Polvo cristalino blanco. Es inodoro y tiene un sabor levemente amargo. Poco soluble en alcohol; muy poco soluble en agua y en la mayoría de los disolventes orgánicos. Probenecid: Polvo cristalino fino de color blanco o prácticamente blanco. Es prácticamente inodoro. Soluble en álcali diluido, en cloroformo, en alcohol y en acetona; prácticamente insoluble en agua y en ácidos diluidos. Probucol: Polvo cristalino blanco a blanquecino. Fácilmente soluble en cloroformo y en alcohol n-propílico; soluble en alcohol y en éter de petróleo; insoluble en agua. Proclorperazina: Líquido transparente, de color amarillo pálido y viscoso. Es sensible a la luz. Fácilmente soluble en alcohol, en cloroformo y en éter; muy poco soluble en agua. Progesterona: Polvo cristalino, inodoro, de color blanco o blanco cremoso. Es estable al aire. Soluble en alcohol, en acetona y en dioxano; moderadamente soluble en aceites vegetales; prácticamente insoluble en agua. Prolina: Cristales blancos, inodoros, con un leve sabor dulce. Fácilmente soluble en agua y en alcohol absoluto; insoluble en éter, en butanol y en isopropanol. Propano: Gas incoloro e inflamable (la temperatura de ebullición es de aproximadamente -42º). Cien volúmenes de agua disuelven 6,5 volúmenes a 17,8º y 753 mm de presión; 100 volúmenes de alcohol anhidro disuelven 790 volúmenes a 16,6º y 754 mm de presión; 100 volúmenes de éter disuelven 926 volúmenes a 16,6º y 757 mm de presión; 100 volúmenes de cloroformo disuelven 1299 volúmenes a 21,6º y 757 mm de presión. La presión de vapor a 21 º es de aproximadamente 1 O 290 mm de mercurio (108 psig). Categoría del NF: Propelente. Propanodiol: Líquido hiwoscópico transparente e incoloro. Peso Específico (841), Metodo 1: 1,040-1,065. Soluble en agua, en alcohol, en alcohol metílico, en alcohol isopropílico, en alcohol butílico, en acetona, en propilenglicol y miscible con muchos disolventes polares. Categoría del NF: Humectante; disolvente; agente humectante y/o solubilizante. Propilenglicol: Líquido transparente, incoloro, viscoso, con un sabor leve característico. Es prácticamente inodoro. Absorbe la humedad cuando se expone al aire húmedo. Miscible con agua, con acetona y con cloroformo. Es soluble en éter y disuelve muchos aceites esenciales, pero es inmiscible con aceites fijos. Categoría del NF: Humectante; plastificante; disolvente; conservante antimicrobiano. Propilhexedrina: Líquido transparente, incoloro, con olor característico semejante a las aminas. Se volatiliza lentamente a temperatura ambiente. Absorbe dióxido de carbono del aire y sus soluciones son alcalinas al tornasol. Alcanza el punto de ebullición aproximadamente a 205º. Muy poco soluble en agua. Miscible con alcohol, con cloroformo y con éter.
Tablas de Referencia/ Descripción y Solubilidad 2461
USP 39 Propiliodona: Polvo cristalino blanco o casi blanco. Es inodora o tiene un olor tenue. Soluble en acetona, en alcohol y en éter; prácticamente insoluble en agua. Propilparabeno: Cristales incoloros pequeños o polvo blanco. Fácilmente soluble en alcohol y en eter; poco soluble en agua en ebullición; muy poco soluble en agua. Categoría del NF: Conservante antimicrobiano. Propilparabeno Sódico: Polvo blanco. Es inodoro e higroscópico. Fácilmente soluble en agua; moderadamente soíuble en alcohol; insoluble en aceites fijos. Categoría del NF: Conservante antimicrobiano. Propiltiouracilo: Sustancia cristalina y pulverulenta de color blanco. Es similar al almidón en su aspecto y al tacto, y tiene sabor amargo. Soluble en hidróxido de amonio y en hidróxidos alcalinos; moderadamente soluble en alcohol; poco soluble en agua, en cloroformo y en éter. Propionato de Calcio: Se presenta como sólido, cristalino y blanco. Un g se disuelve en aproximadamente 3 ml de agua. Categoría del NF: Conservante antimicrobiano. Propionato de Clobetasol: Polvo cristalino de color blanco a crema. Soluble en acetona, en dimetil sulfóxido, en cloroformo, en metano! y en dioxano; moderadamente soluble en etanol; poco soluble en benceno y en éter dietílico· prácticamente insoluble en agua. ' Propionato de Fluticasona (micronizado): Polvo fino blanco. Propionato de Halobetasol: Polvo blanco a blanquecino. Fácilmente soluble en diclorometano y en acetona· prácticamente insoluble en agua. ' Propionato de Sodio: Cristales incoloros, transparentes, o polvo cristalino granular. Es inodoro o tiene un leve olor acético butírico y es delicuescente en aire húmedo. Muy soluble en agua; soluble en alcohol. Categoría del NF: Conservante antimicrobiano. Propionato de Testosterona: Polvo cristalino o cristales d.e coli;ir. blanco o blanco cremoso. Es inodoro y est~ble al aire. Facilmente soluble en alcohol, en dioxano, en eter y en otros disolventes orgánicos; soluble en aceites vegetales; insoluble en agua. Propofol: Líquido transparente, incoloro a ligeramente amarillento. Muy soluble en metanol y en etanol; poco soluble en ciclohexano y en alcohol isopropílico; muy poco soluble en agua. Pululano: Polvo blanco. Fácilmente soluble en agua; prácticamente insoluble en alcohol deshidratado. Categoría del NF: Agente de recubrimiento; plastificante; polímero de n:iembrana; agente secuestrante; agente de suspensión y/o v1scosante; agente humectante y/o solubilizante; agente de volumen; diluyente; desintegrante; aglutinante por vía húmeda; cubierta de cápsula; agente formador de película. Quazepam: Polvo blanquecino a amarillento. Quimotripsina: Polvo blanco a blanco amarillento, cristalino o amorfo, e inodoro. Una cantidad equivalente a 100 000 Unidades USP es soluble en 1 O ml de agua y en 1 O ml de solución salina SR. Quitosano: Polvo o gránulos de color blanco o casi 91~nco., Sol_uble en ,s
d:
ponerse a la luz y al aire. Con ácidos, forma sales que son fácilmente solubles en agua y la base puede recuperarse al agregar hidróxido de amonio. Muy poco soluble en agua y en aícohol; insoluble en éter, en cloroformo y en aceites fijos y volátiles. Ramipril: Polvo cristalino blanco a casi blanco. Fácilmente soluble en metano!; moderadamente soluble en agua. Rayón Purificado: Fibras filamentosas suaves, finas, brillantes u opacas, de color blanco, que bajo el microscopio aparecen como varillas translúcidas redondeadas, ovales o ligeramente aplanadas, rectas o rizadas, estriadas y con bordes transversales aserrados. Prácticamente inodoro y prácticamente insípido. Muy soluble en óxido cúprico amoniacal SR y en ácido sulfúrico diluido (3 en 5); insoluble en disolventes comunes. Repaglinida: Sólido blanco a blanquecino. Funde aproximadamente de 132º a 136º. Soluble en metanol. Reserpina: Polvo cristalino, blanco o beige pálido a ligeramente amarillento, inodoro. Se oscurece lentamente al exponerse a la luz y más rápidamente si está en solución. Fácilmente soluble en ácido acético y en cloroformo; poco soluble en benceno; muy poco soluble en alcohol y en éter· ' insoluble en agua. Resina de Colestiramina: Polvo fino, higroscópico de color blanco a beige. Inodoro o con un olor no mas q~e levemente semejante a las aminas. Insoluble en agua en alcohol, en cloroformo y en éter. ' Resorcinol: Polvo o cristales en forma de aguja de color blanco o prácticamente blanco. Desprende un olor suave característico y tiene un sabor ligeramente dulce, seguido de un sabor amargo. Adquiere un tinte rosado al exponerse a la luz y al aire. Su solución (1 en 20) es neutra o ácida al tornasol. Fácilmente soluble en agua, en alcohol, en glicerina y en éter; poco soluble en cloroformo. Ribavirina: Polvo cristalino blanco. Fácilmente soluble en agua; poco soluble en alcohol deshidratado. Riboflavina: Polvo cristalino, de color amarillo a amarillo anaranjado, con un olor leve. Funde aproximadamente a 280º. Su solución saturada es neutra al tornasol. Cuando está seca, la luz difusa no la afecta visiblemente, pero en forma de solución, la luz induce a un fácil deterioro especialmente en presencia de álcalis. Soluble en soluciones diluidas de álcalis; muy poco soluble en agua, en alcohol y en solución isotónica de cloruro de sodio; insoluble en éter y en cloroformo. Riboflavina 5'-Fosfato Sódico: Polvo cristalino fino de color amarillo anaranjado con un olor leve. Moderadamente soluble en agua. Cuando está seco, la luz difusa no la afecta, pero cuando está en solución la luz induce a un fácil deterioro. Es higroscópico. Rifabutina: Polvo amorfo de color violeta rojizo. Soluble en cloroformo y en metanol; moderadamente soluble en alcohol; muy poco soluble en agua. Rifampín: Polvo cristalino de color marrón rojizo. Fácilmente soluble en cloroformo; soluble en acetato de etilo y en metano!; muy poco soluble en agua. Riluzol: Polvo o polvo cristalino blanco a ligeramente amarillo. Fácilmente soluble en acetonitrilo, en alcohol y en cloruro de metileno; poco soluble en hexano; muy poco soluble en agua. Rimexolona: Polvo blanco a blanquecino. Fácilmente soluble en cloroformo; moderadamente soluble en metanol. Risedronato Sódico: Polvo blanco a blanquecino. Soluble en agua y en soluciones acuosas; insoluble en disolventes orgánicos comunes. Risperidona: Polvo blanco o casi blanco. Soluble en cloruro de metileno; moderadamente soluble en alcohol· prácticamente insoluble en agua. ' Ritonavir: Polvo blanco a color tostado claro. Fácilmente soluble en metano! y en cloruro de metileno; muy
2462 Descripción y Solubilidad / Tablas de Referencia poco soluble en acetonitrilo; prácticamente insoluble en agua. Rosa de Bengala Sódico 1 131, Inyección: Solución transparente de color rojo intenso. Roxarsona: Polvo cristalino, amarillo pálido. Fácilmente soluble en ácido acético, en acetona, en alcalis, en metanol y en alcohol deshidratado; soluble en agua en ebullición; moderadamente soluble en ácidos minerales diluidos; poco soluble en agua fría; insoluble en éter y en acetato de etilo. Se hincha y deflagra al calentarse. Rufinamida: Polvo blanco cristalino neutro. Poco soluble en tetrahidrofurano y en metano!; muy poco soluble en alcohol y en acetonitrilo; prácticamente insoluble en agua. Sacarato de Calcio: Polvo cristalino blanco, inodoro e insípido. Soluble en ácidos minerales diluidos y en soluciones de gluconato de calcio; poco soluble en agua en ebullición; muy poco soluble en alcohol y en agua fría; prácticamente insoluble en éter y en cloroformo. Sacarina: Cristales blancos o polvo cristalino blanco. Es inodora o tiene un olor aromático leve. En solución diluida, es intensamente dulce. Sus soluciones son ácidas al tornasol. Soluble en agua en ebullición; moderadamente soluble en alcohol; poco soluble en agua, en cloroformo y en éter. Se disuelve fácilmente en soluciones diluidas de amoníaco, en soluciones de hidróxidos alcalinos y en soluciones de carbonatos alcalinos con la liberación de dióxido de carbono. Categoría del NF: Agente edulcorante. Sacarina Cálcica: Cristales blancos o polvo cristalino blanco. Es inodoro o tiene un olor aromático leve, y un sabor intensamente dulce, aun en soluciones diluidas. Su solución diluida es aproximadamente 300 veces más dulce que la sacarosa. Facilmente soluble en agua. Categoría del NF: Agente edulcorante. Sacarina Sódica: Cristales blancos o polvo cristalino blanco. Es inodoro o tiene un olor aromático leve, y un sabor intensamente dulce, aun en soluciones diluidas. Su solución diluida es aproximadamente 300 veces más dulce que la sacarosa. En polvo, por lo general, contiene aproximadamente una tercera parte de Ta cantidad teórica de agua de hidratación como resultado de la eflorescencia. Fácilmente soluble en agua; moderadamente soluble en alcohol. Categoría del NF: Agente edulcorante. Sacarina Sódica, Solución Oral: Líquido transparente, incoloro, inodoro, con sabor dulce. Sacarosa: Polvo cristalino blanco o cristales brillantes y secos, incoloros o de color blanco. Muy soluble en agua; poco soluble en alcohol; prácticamente insoluble en alcohol deshidratado. Categoría del NF: Agente de recubrimiento; agente edulcorante; diluyente; agente de suspensión y/o viscosante; aglutinante por vía húmeda. Salicilamida: Polvo cristalino blanco, prácticamente inodoro. Fácilmente soluble en éter y en soluciones de álcalis; soluble en alcohol y en propilenglicol; poco soluble en agua y en cloroformo. Salicilato de Fisostigmina: Polvo blanco o cristales blancos, brillantes e inodoros. Adquiere un tinte rojizo cuando se lo expone al calor, la luz o el aire, o cuando está en contacto con trazas de metales durante períodos prolongados. Funde aproximadamente a 184º. Fácilmente soluble en cloroformo; soluble en alcohol; moderadamente soluble en agua; poco soluble en éter. Salicilato de Magnesio: Polvo cristalino blanco, inodoro y eflorescente. Fácilmente soluble en metanol; soluble en alcohol y en agua; poco soluble en éter. Salicilato de Metilo: Líquido incoloro, amarillento o rojizo, con olor y sabor característicos de la gaulteria (wintergreen). Alcanza el punto de ebullición entre 219º y 224º, con cierto grado de descomposición. Soluble en alcohol y en ácido acético glacial; poco soluble en agua. Categoría del NF: Saborizantes y fragancia. Salicilato de Sodio: Escamas o polvo microcristalino o amorfo. Es incoloro, o no tiene más que un matiz ligera-
USP 39
mente rosado. Es inodoro, o tiene un débil olor característico, y es afectado por la luz. La solución recién preparada (1 en 1O) es neutra o ácida al tornasol. Muy soluble en agua en ebullición y en alcohol en ebullición; fácil (y lentamente) soluble en agua y en glicerina; lentamente soluble en alcohol. Salvado de Trigo: Polvo de color tostado claro con un aroma característico. Prácticamente insoluble en agua fría y en alcohol. Disponible en una variedad de tamaños de partícula, dependiendo del grado de trituración al que se somete. El desarrollo de color y sabor es variable, dependiendo del grado de estabilización al calor. Sangre Entera: Líquido opaco, rojo intenso a partir del cual sedimentan fácilmente corpúsculos cuando se deja en reposo durante 24 a 48 horas, lo que deja una capa sobrenadante de plasma transparente, amarillenta o rosada. Sebacato de Dibutilo: Líquido incoloro y aceitoso de olor muy suave. Soluble en alcohol, en alcohol isopropílico y en aceite mineral; muy poco soluble en propilenghcol; prácticamente insoluble en agua y en glicerina. Categoría del NF: Plastificante. Sebacato de Dietilo: Líquido incoloro a ligeramente amarillo. Miscible con alcohol, con éter, con otros disolventes orgánicos y con la mayoría de los aceites fijos; insoluble o prácticamente insoluble en agua. Categoría del NF: Saborizantes y fragancia. Secobarbital: Polvo blanco, cristalino o amorfo, inodoro, con un leve sabor amargo. Su solución saturada tiene un pH de aproximadamente 5,6. Fácilmente soluble en alcohol, en éter y en soluciones de carbonatos e hidróxidos alcalinos fijos; soluble en cloroformo; muy poco soluble en agua. Secobarbital Sódico: Polvo blanco. Es inodoro, tiene un sabor amargo y es higroscópico. Sus soluciones se descomponen en reposo y el calor acelera su descomposición. Muy soluble en agua; soluble en alcohol; prácticamente insoluble en éter. Semilla de Plantago: Todas las variedades son prácticamente inodoras y tienen un sabor mucilaginoso y soso. Senósidos: Polvo amarronado. Serina: Cristales blancos, inodoros, con sabor dulce. Soluble en agua; prácticamente insoluble en alcohol absoluto y en éter. Sesquioleato de Sorbitán: Líquido aceitoso, viscoso, de color amarillo a ámbar. Soluble en alcohol, en alcohol isopropílico, en aceite de semillas de algodón y en aceite mineral; insoluble en agua y en propilenglicol. Categoría del NF: Agente emulsionante; lubricante; agente de suspensión y/o viscosante; agente humectante y/o solubilizante. Sevoflurano: Líquido transparente, incoloro, no inflamable y volátil. Poco soluble en agua. Miscible con alcohol, con cloroformo y con éter. Silicato de Aluminio y Magnesio: Polvo fino (micronizado), inodoro e insípido, gránulos pequeños de color crema a tostado, o escamas pequeñas de color crema si se mira la superficie plana o de tostado a marrón si se miran los bordes. Insoluble en agua y en alcohol. Se hincha si agrega a agua o a glicerina. Categoría del NF: Agente de suspensión y/o viscosante; desintegrante. Silicato de Calcio: Polvo blanco a blanquecino, de libre fluidez, que permanece así después de absorber cantidades relativamente grandes de agua u otros líquidos. Insoluble en agua. Forma un gel con ácidos minerales. Categoría del NF: Deslizante y/o agente antiaglutinante. Silicato de Magnesio: Polvo fino, blanco, inodoro e insípido, exento de arenosidad. Insoluble en agua y en alcohol. Se descompone fácilmente con ácidos minerales. Categoría del NF: Deslizante y/o agente antiaglutinante. Sílice Coloidal Hidrófoba: Polvo amorfo liviano, fino, de color blanco o casi blanco que no se humedece con agua. Se disuelve lentamente en soluciones calientes de hi-
USP 39 dróxidos alcalinos. Prácticamente insoluble en agua y en ácidos minerales, excepto en ácido fluorhídrico. Categoría del NF: Deslizante y/o agente antiaglutinante; agente de suspensión y/o viscosante. Sílice Tipo Dental: Polvo amorfo, fino, blanco, higroscópico, inodoro, cuyas partículas promedio tienen un diámetro que oscila entre 0,5 µm y 40 µm. Soluble en soluciones calientes de hidróxidos alcalinos; insoluble en agua, en alcohol y en ácido (excepto en ácido fluorhídrico). Categoría del NF: Agente deslizante y/o antiaglutinante; agente de suspensión y/o viscosante. Simeticona: Líquido viscoso y transparente de color gris. La fase líquida es soluble en cloroformo, en éter y en benceno, pero el dióxido de silicio queda como residuo en estos disolventes. Insoluble en agua y en alcohol. Categoría del NF: Agente antiespumante; agente hidrofóbico; diluyente. Simvastatina: Polvo blanco a blanquecino. Fácilmente soluble en cloroformo, en metano! y en alcohol; moderadamente soluble en propilenglicol; muy poco soluble en hexano; prácticamente insoluble en agua. Sólidos del Jarabe de Maíz: Gránulos o polvo blanco a amarillo claro, dulce. Soluble en agua. Categoría del NF: Agente de recubrimiento; vehículo (saborizado y/o edulcorado y transportador sólido); humectante; agente de suspensión y/o viscosante; agente edulcorante; diluyente; aglutinante por vía húmeda; agente de tonicidad. Solución de Amoníaco Concentrada: Líquido transparente, incoloro, con un olor característico, extremadamente acre. El peso específico es aproximadamente 0,90. Categoría del NF: Modificador de pH (agente acidificante/agente alcalinizante/agente amortiguador). Solución de Sorbitol: Líquido siruposo, incoloro y transparente. Es inodoro y tiene un sabor dulce. A veces se separa en masas cristalinas. Miscible con agua, con alcohol, con glicerina y con propilenglicol. Es neutro al tornasol. Categoría del NF: Agente edulcorante; vehículo (saborizado y/o edulcorado). Solución de Sorbitol-Sorbitán: Líquido transparente, incoloro a amarillo pálido, siruposo. Es inodoro y tiene un sabor dulce. Insoluble en aceite mineral y en aceite vegetal. Miscible con agua, con alcohol, con glicerina y con propilenglicol. Categoría del NF: Humectante; plastificante. Sorbato de Potasio: Cristales o polvo de color blanco, con un olor característico. Funde aproximadamente a 270º, con descomposición. Fácilmente soluble en agua; soluble en alcohol. Categoría del NF: Conservante antimicrobiano. Sorbitol: D-Sorbitol se presenta en masas cristalinas, polvo, o gránulos blancos. Es inodoro y tiene un sabor dulce con una sensación fría. Muy soluble en agua; moderadamente soluble en alcohol; prácticamente insoluble en éter etílico. Es higroscópico. Categoría del NF: Humectante; agente edulcorante; diluyente; plastificante. Subacetato de Aluminio, Solución Tópica: Líquido transparente, incoloro o ligeramente amarillo, con olor a ácido acético y reacción ácida al tornasol. Se torna gradualmente turbio en reposo, mediante la separación de una sal más básica. Subcarbonato de Bismuto: Polvo blanco o casi blanco. Prácticamente insoluble en agua, en alcohol y en éter. Se disuelve en ácidos diluidos con efervescencia. Subgalato de Bismuto: Polvo amorfo de color amarillo brillante. Es inodoro e insípido. Es estable al aire, pero es afectado por la luz. Se disuelve fácilmente con descomposición en ácido clorhídrico, nítrico o sulfúrico tibio y moderadamente diluido; se disuelve fácilmente en soluciones de hidróxidos alcalinos, formando un líquido amarillo transparente que toma rápidamente un color rojo intenso. Prácticamente insoluble en agua, en alcohol, en cloroformo y en éter; insoluble en ácidos minerales muy diluidos. Subnitrato de Bismuto: Polvo blanco, ligeramente higroscópico. Prácticamente insoluble en agua y en alcohol;
Tablas de Referencia / Descripción y Solubilidad 2463 se disuelve fácilmente en ácido clorhídrico o por ácido nítrico. Subsalicilato de Bismuto: Polvo fino, blanco a blanquecino, microcristalino, inodoro e insípido. Prácticamente insoluble en agua, en alcohol y en éter. Reacciona con álcalis y ácidos minerales. Subsulfato Férrico, Sqlución: Líquido marrón rojizo, inodoro, o casi inodoro. Acido al tornasol, es afectado por la luz. El peso específico es aproximadamente 1,548. Succinato de Doxilamina: Polvo blanco o blanco cremoso, con un olor característico. Muy soluble en agua y en alcohol; fácilmente soluble en cloroformo; muy poco soluble en éter y en benceno. Succinato de Loxapina: Polvo cristalino de color blanco a amarillento. Es inodoro. Succinato de Metoprolol: Polvo blanco a blanquecino. Fácilmente soluble en agua; soluble en metano!; moderadar:nente soluble en alcohol; poco soluble en alcohol isopropíl1co. Succinato Sódico de Cloranfenicol: Polvo amarillo claro. Fácilmente soluble en agua y en alcohol. Succinato Sódico de Hidrocortisona: Sólido blanco o casi blanco, inodoro, higroscópico y amorfo. Muy soluble en agua y en alcohol; muy poco soluble en acetona; insoluble en cloroformo. Succinato Sódico de Metilprednisolona: Sólido blanco o casi blanco, inodoro, higroscópico y amorfo. Muy soluble en agua y en alcohol; muy poco soluble en acetona; insoluble en cloroformo. Succinato Sódico de Prednisolona para Inyección: Polvo de color blanco cremoso con grumos friables y un olor leve. Succinato de Sumatriptán: Polvo blanco o casi blanco. Fácilmente soluble en agua; moderadamente soluble en metano!; prácticamente insoluble en cloruro de metileno. Sucralosa: Polvo cristalino blanco a blanquecino. Fácilmente soluble en agua, en metano! y en alcohol; poco soluble en acetato de etilo. Categoría del NF: Agente edulcorante. Suero Anti-A para Tipificación de Grupo Sanguíneo: El Suero Líquido es un fluido transparente o ligeramente opalescente a menos que esté artificialmente coloreado de azul. El Suero seco es de color amarillo claro a crema intenso, a menos que esté artificialmente coloreado según lo indicado para el Suero líquido. El Suero líquido puede desarrollar una ligera turbidez durante el almacenamiento. El Suero seco puede presentar una ligera turbidez al reconstituirlo para su uso. Suero Anti-B para Tipificación de Grupo Sanguíneo: El Suero Líquido es un fluido transparente o ligeramente opalescente a menos que esté artificialmente coloreado de amarillo. El Suero seco es de color amarillo claro a crema intenso, a menos que esté artificialmente coloreado según lo indicado para el Suero líquido. El Suero líquido puede desarrollar una ligera turbidez durante su almacenamiento. El Suero seco puede mostrar una ligera turbidez al reconstituirlo para su uso. Sueros Anti-D, Anti-C, Anti-E, Anti-e, Anti-e para Tipificación de Grupo Sanguíneo: Los Sueros hquidos son fluidos transparentes, ligeramente amarillentos, que pueden desarrollar una ligera turbidez durante su almacenamiento. Los Sueros secos son de color amarillo claro a cremoso intenso. Sulbactam Sódico: Polvo cristalino blanco a blanquecino. Fácilmente soluble en agua y en ácido diluido; moderadamente soluble en acetona, en acetato de etilo y en cloroformo. Sulfabenzamida: Polvo fino, blanco, prácticamente inodoro. Soluble en alcohol, en acetona y en hidróxido de sodio SR; insoluble en agua y en éter.
2464 Descripción y Solubilidad / Tablas de Referencia Sulfacetamida: Polvo blanco, cristalino, inodoro, con un sabor agrio característico. Sus soluciones acuosas son sensibles a la luz e inestables cuando son ácidas o fuertemente alcalinas. Fácilmente soluble en ácidos minerales diluidos y en soluciones de hidróxidos de potasio y de sodio; soluble en alcohol; poco soluble en agua y en éter; muy poco soluble en cloroformo; prácticamente insoluble en benceno. Sulfacetamida Sódica: Polvo cristalino blanco. Es inodoro y tiene un sabor amargo. Fácilmente soluble en agua; moderadamente soluble en alcohol; prácticamente insoluble en cloroformo y en éter. Sulfadiazina: Polvo blanco o ligeramente amarillo. Es inodoro o casi inodoro y es estable al aire, pero se oscurece lentamente al exponerse a la luz. Fácilmente soluble en ácidos minerales diluidos, en soluciones de hidróxidos de potasio y de sodio y en amoníaco SR; moderadamente soluble en alcohol y en acetona; poco soluble en suero humano a 37°; prácticamente insoluble en agua. Sulfadiazina de Plata: Polvo cristalino, blanco a blanco cremoso, de inodoro a un olor leve. Es estable al aire, pero se torna amarillo al exponerse a la luz. Fácilmente soluble en solución de amonio al 30%; poco soluble en acetona; prácticamente insoluble en alcohol, en cloroformo y en éter. Se descompone en ácidos minerales moderadamente fuertes. Sulfadiazina Sódica: Polvo blanco. Ante la exposición prolongada al aire húmedo absorbe dióxido de carbono con liberación de sulfadiazina y pasa a ser soluble, de manera incompleta, en el agua. Sus soluciones son alcalinas a la fenolftaleína. Es afectado por la luz. Fácilmente soluble en agua; poco soluble en alcohol. Sulfadimetoxina: Polvo cristalino prácticamente blanco. Soluble en hidróxido de sodio 2 N; moderadamente soluble en ácido clorhídrico 2 N; poco soluble en alcohol, en éter, en cloroformo y en hexano; prácticamente insoluble en agua. Sulfametazina: Polvo de color blanco a blanco amarillento, que puede oscurecerse al exponerse a la luz. Es prácticamente inodoro y tiene un sabor levemente amargo. Soluble en acetona; poco soluble en alcohol; muy poco soluble en agua y en éter. Sulfametizol: Polvo o cristales de color blanco, con un leve sabor amargo. Es prácticamente inodoro y no tiene olor a sulfuro de hidrógeno. Fácilmente soluble en soluciones de hidróxidos de amonio, de potasio y de sodio; soluble en ácidos minerales diluidos y en acetona; moderadamente soluble en alcohol; muy poco soluble en agua, en cloroformo y en éter; prácticamente insoluble en benceno. Sulfametoxazol: Polvo cristalino blanco a blanquecino, prácticamente inodoro. Fácilmente soluble en acetona y en soluciones diluidas de hidróxido de sodio; moderadamente soluble en alcohol; prácticamente insoluble en agua, en éter y en cloroformo. Sulfapiridina: Polvo, gránulos o cristales de color blanco o blanco ligeramente amarillento. Es inodoro o prácticamente inodoro, es estable al aire pero se oscurece lentamente al exponerse a la luz. Fácilmente soluble en ácidos minerales diluidos y en soluciones de hidróxidos de potasio y de sodio; moderadamente soluble en acetona; poco soluble en alcohol; muy poco soluble en agua. Sulfasalazina: Polvo fino, de color amarillo brillante o amarillo amarronado, inodoro. Funde aproximadamente a 255º, con descomposición. Soluble en soluciones acuosas de hidróxidos alcalinos; muy poco soluble en alcohol; prácticamente insoluble en agua, en éter, en cloroformo y en benceno. Sulfatiazol: Polvo fino, blanco o blanco ligeramente amarillento, prácticamente inodoro. Soluble en acetona, en ácidos minerales diluidos, en soluciones de hidróxidos alcalinos y en hidróxido de amonio 6 N; poco soluble en alcohol; muy poco soluble en agua.
USP 39
Sulfato Cúprico: Cristales triclínicos, de color azul profundo, o polvo o gránulos cristalinos de color azul. Efloresce lentamente expuesto al aire seco. Sus soluciones son ácidas al tornasol. Muy soluble en agua en ebullición; fácilmente soluble en agua y en glicerina; poco soluble en alcohol. Sulfato de Abacavir: Polvo blanco a blanquecino. Soluble en agua, en acetato de etilo, en alcohol absoluto y en metano l. Sulfato de Albuterol: Polvo blanco o prácticamente blanco. Fácilmente soluble en agua; poco soluble en alcohol, en cloroformo y en éter. Sulfato de Aluminio: Polvo cristalino de color blanco, láminas brillantes o fragmentos cristalinos. Es estable al aire. Es inodoro y tiene un sabor dulce, y se vuelve levemente astringente. Fácilmente soluble en agua; insoluble en alcohol. Sulfato de Amikacina: Polvo cristalino blanco. Fácilmente soluble en agua. Sulfato de Aminopentamida: Polvo cristalino blanco. Fácilmente soluble en agua y en alcohol; muy poco soluble en cloroformo; prácticamente insoluble en éter. Sulfato de Amonio: Cristales o gránulos incoloros o blancos que se descomponen a temperaturas superiores a 280º. Un g es soluble en aproximadamente 1,5 ml de a9ua. Es insoluble en alcohol. El pH de una solución O, 1 M esta entre 4,5 y 6,0. Sulfato de Anfetamina: Polvo cristalino blanco e inodoro con un leve sabor amargo. Sus soluciones son ácidas al tornasol, con un pH entre 5 y 6. Fácilmente soluble en agua; poco soluble en alcohol; prácticamente insoluble en éter. Sulfato de Atropina: Cristales incoloros o polvo cristalino blanco. Inodoro; eflorece expuesto al aire seco; es afectado lentamente por la luz. Muy soluble en agua; fácilmente soluble en alcohol e incluso más soluble en alcohol en ebullición; fácilmente soluble en glicerina. Sulfato de Bario: Polvo fino, blanco, inodoro e insípido, voluminoso y no arenoso. Prácticamente insoluble en agua, en disolventes orgánicos y en soluciones de ácidos y de álcalis. Sulfato de Bario para Suspensión: Polvo blanco o de color, voluminoso o granulado. Sulfato de Bleomicina: Polvo amorfo de color crema. Muy soluble en agua. Sulfato de Calcio: Polvo fino, inodoro, de color blanco a ligeramente blanco amarillento. Soluble en ácido clorhídrico 3 N; poco soluble en agua. Categoría del NF: Desecante; diluyente. Sulfato de Capreomicina: Polvo blanco a prácticamente blanco, amorfo. Fácilmente soluble en agua; prácticamente insoluble en la mayoría de los disolventes orgánicos. Sulfato de Cinc: Agujas pequeñas o prismas transparentes incoloros. Puede presentarse como polvo blanco, cristalino y granular. Es inodoro y eflorescente en aire seco. Sus soluciones son ácidas al tornasol. Muy soluble en agua (heptahidrato); fácilmente soluble en agua (monohidrato) y en glicerina (heptahidrato); prácticamente insoluble en alcohol (monohidrato); insoluble en alcohol (heptahidrato). Sulfato de Codeína: Cristales blancos, generalmente en forma de aguja, o polvo cristalino blanco; es afectado por la luz. Fácilmente soluble en agua a 80º; soluble en agua; muy poco soluble en alcohol; insoluble en cloroformo y en éter. Sulfato de Colistina: Polvo fino, blanco a ligeramente amarillo, inodoro. Fácilmente soluble en agua; poco soluble en metanol; insoluble en acetona y en éter. Sulfato de Dextroanfetamina: Polvo cristalino blanco, inodoro. Soluble en agua; poco soluble en alcohol; insoluble en éter. Sulfato de Dihidroestreptomicina: Polvo cristalino o amorfo, blanco o casi blanco. La apariencia amorfa es hi-
USP 39 groscópica. Fácilmente soluble en agua; prácticamente insoíuble en acetona, en cloroformo y en metanol. Sulfato de Efedrina: Polvo o cristales finos, blancos e inodoros. Se oscurece al exponerse a la luz. Fácilmente soluble en agua; moderadamente soluble en alcohol. Sulfato de Efedrina, Solución Nasal: Solución transparente e incolora. Es neutral o ligeramente ácida al tornasol. Sulfato de Estreptomicina: Polvo blanco o prácticamente blanco. Inodoro o con apenas un olor leve. Higroscópico, pero estable al aire y con la exposición a la luz. Sus soluciones varían entre ácidas y prácticamente neutras al tornasol. Fácilmente soluble en agua; muy poco soluble en alcohol; prácticamente insoluble en cloroformo. Sulfato de Estreptomicina, Inyección: Líquido viscoso transparente, incoloro a amarillo. Es inodoro o tiene un olor leve. Sulfato de Fenelzina: Polvo blanco a blanco amarillento, con un olor característico. Fácilmente soluble en agua; prácticamente insoluble en alcohol, en cloroformo y en éter. Sulfato de Fisostigmina: Polvo microcristalino blanco e inodoro. Es delicuescente en aire húmedo y adquiere un tinte rojizo al exponerse al calor, a la luz o al aire, o cuando está en contacto con trazas de metal durante períodos prolongados. Funde aproximadamente a 143º. Fácilmente soluble en agua; muy soluble en alcohol; muy poco soluble en éter. Sulfato de Gentamicina: Polvo de color blanco a beige. Fácilmente soluble en agua; insoluble en alcohol, en acetona, en cloroformo, en éter y en benceno. Sulfato de Guanadrel: Polvo cristalino blanco a blanquecino. Funde aproximadamente a 235º, con descomposición. Soluble en agua; moderadamente soluble en metanol; poco soluble en alcohol y en acetona. Sulfato de Hidroxicloroquina: Polvo cristalino blanco o prácticamente blanco. Es inodoro y tiene un sabor amargo. Sus soluciones tienen un pH de aproximadamente 4,5. Se presenta en dos formas: la más común funde aproximadamente a 240º mientras que la otra funde aproximadamente a 198º. Fácilmente soluble en agua; prácticamente insoluble en alcohol, en cloroformo y en éter. Sulfato de Hiosciamina: Polvo cristalino de color blanco o casi blanco, o agujas incoloras. Es delicuescente y es afectado por la luz. El pH de una solución (1 en 100) es de aproximadamente 5,3. Muy soluble en agua; fácilmente soluble en alcohol; prácticamente insoluble en éter. Funde a una temperatura de no menos de 200º. Sulfato de lndinavir: Polvo higroscópico blanco o casi blanco. Fácilmente soluble en agua; soluble en metanol; prácticamente insoluble en heptano. Sulfato de lsoproterenol: Polvo cristalino blanco a prácticamente blanco e inodoro. Se oscurece gradualmente al exponerse al aire y a la luz. Sus soluciones adquieren un color rosado a rosado amarronado cuando se las deja expuestas al aire y también, de manera casi inmediata, cuando se las alcaliniza. Una solución (1 en 100) tiene un pH de aproximadamente 5. Fácilmente soluble en agua; muy poco soluble en alcohol, en benceno y en éter. Sulfato de Kanamicina: Polvo cristalino blanco, inodoro. Fácilmente soluble en agua; insoluble en acetona, en acetato de etilo y en benceno. Sulfato de Magnesio: Cristales pequeños, incoloros, generalmente en forma de aguja; con un sabor amargo, salino y refrescante. Eflorece expuesto al aire seco y tibio. Muy soluble en agua en ebullición; fácilmente soluble en agua; fácil (y lentamente) soluble en glicerina; moderadamente soluble en alcohol. Sulfato de Manganeso: Cristales de color rojo pálido, levemente eflorescentes, o polvo inodoro de color púrpura. Soluble en agua; insoluble en alcohol.
Tablas de Referencia / Descripción y Solubilidad 2465 Sulfato de Metaproterenol: Polvo cristalino blanco a blanquecino. Fácilmente soluble en agua. Sulfato de Morfina: Cristales blancos, livianos y sedosos, masas cúbicas de cristales, o polvo cristalino blanco. Inodoro; cuando se lo expone al aire pierde agua de hidratación paulatinamente. Se oscurece después de exposición prolongada a la luz. Fácilmente soluble en agua caliente; soluble en agua; poco soluble en alcohol pero más soluble en alcohol caliente; insoluble en cloroformo y en éter. Sulfato de Neomicina: Polvo blanco a ligeramente amarillo, o sólido criodesecado. Es inodoro o prácticamente inodoro e higroscópico. Sus soluciones son dextrógiras. Fácilmente soluble en agua; muy poco soluble en alcohol; insoluble en acetona, en cloroformo y en éter. Sulfato de Netilmicina: Polvo de color blanco a blanco amarillento pálido. Fácilmente soluble en agua, prácticamente insoluble en alcohol deshidratado y en éter. Sulfato de Oxiquinolina: Polvo amarillo. Funde aproximadamente a 185º. Muy soluble en agua; fácilmente soluble en metanol; poco soluble en alcohol; prácticamente insoluble en acetona y en éter. Categoría del NF: Agente quelante y/o compfejante. Sulfato de Paromomicina: Polvo de color blanco cremoso a amarillo claro. Es inodoro o prácticamente inodoro y muy higroscópico. Muy soluble en agua; insoluble en alcohol, en cloroformo y en éter. Sulfato de Penbutolol: Polvo cristalino blanco a blanquecino. Funde aproximadamente a 217º, con descomposición. Soluble en agua y en metanol. Sulfato de Polimixina B: Polvo de color blanco a beige. Es inodoro o tiene un olor tenue. Fácilmente soluble en agua; poco soluble en alcohol. Sulfato de Protamina, Inyección: Solución incolora que puede tener olor a un conservante. Sulfato de Protamina para Inyección: Polvo inodoro de color blanco con el aspecto característico de los sólidos liofilizados. Sulfato de Pseudoefedrina: Polvo cristalino o cristales de color blanco. Es inodoro. Fácilmente soluble en alcohol. Sulfato de Quinidina: Cristales finos, en forma de aguja y blancos, que suelen formar masas, o polvo fino bfanco. Es inodoro y se oscurece al exponerse a la luz. Sus soluciones son neutras o alcalinas al tornasol. Soluble en alcohol; moderadamente soluble en cloroformo; poco soluble en agua; insoluble en éter. Sulfato de Quinina: Cristales blancos y finos en forma de aguja, por lo general opacos, que forman una masa ligera y fácil de comprimir. Es inodoro. Se oscurece al exponerse a la luz. Su solución saturada es neutral o alcalina al tornasol. Fácilmente soluble en alcohol a 80º y en una mezcla de 2 volúmenes de cloroformo y 1 volumen de alcohol deshidratado; moderadamente soluble en agua a 100º; poco soluble en agua, en alcohol y en cloroformo; muy poco soluble en éter. Sulfato de Sodio: Cristales grandes, incoloros, inodoros, transparentes, o polvo granular. Eflorece rápidamente en el aire, se licua en su agua de hidratación aproximadamente a 33º y pierde toda su agua de hidratación aproximadamente a 100º. Fácilmente soluble en agua; soluble en glicerina; insoluble en alcohol. Sulfato de Terbutalina: Polvo cristalino blanco a blanco grisáceo. Es inodoro o posee un tenue olor a ácido acético. Soluble en agua y en ácido clorhídrico O, 1 N; poco soluble en metanol; insoluble en cloroformo. Sulfato de Tobramicina, Inyección: Solución transparente e incolora. Sulfato de Tranilcipromina: Polvo cristalino blanco o casi blanco. Fácilmente soluble en agua; muy poco soluble en alcohol y en éter; prácticamente insoluble en cloroformo.
2466 Descripción y Solubilidad / Tablas de Referencia Sulfato de Trimetoprima: Polvo cristalino blanco a blanquecino. Soluble en agua, en alcohol, en ácidos minerales diluidos y en álcalis fijos. Sulfato de Vinblastina: Polvo cristalino o amorfo, de color blanco o ligeramente amarillo e inodoro. Es higroscópico. Fácilmente soluble en agua. Sulfato de Vincristina: Polvo cristalino o amorfo, de color blanco a ligeramente amarillo, inodoro. Es higroscópico. Fácilmente soluble en agua; soluble en metano!; poco soluble en alcohol. Sulfato de Vincristina para Inyección: Sólido de color blanco amarillento, con la apariencia característica de los productos preparados por liofilización. Sulfato Férrico: Polvo blanco grisáceo o amarillento, o perlas de color beige. Higroscópico. Poco soluble en agua y en etanol (96%); prácticamente insoluble en acetona y en acetato de etilo. Se hidroliza lentamente en soluciones acuosas. Sulfato Ferroso: Cristales o gránulos de color verde azulado pálido. Es inodoro y eflorescente en aire seco. Se oxida fácilmente en aire húmedo hasta formar sulfato férrico básico de color amarillo amarronado. Su solución (1 en 1O) es ácida al tornasol, con un pH de aproximadamente 3,7. Muy soluble en agua en ebullición; fácilmente soluble en agua; insoluble en alcohol. Sulfato Ferroso Seco: Polvo de color blanco grisáceo a beige, compuesto principalmente de FeS04 · HiO con cantidades variables de FeS04 · 4H20. Lentamente soluble en agua; insoluble en alcohol. Sulfinpirazona: Polvo blanco a blanquecino. Soluble en alcohol y en acetona; moderadamente soluble en álcali diluido; prácticamente insoluble en agua y en éter de petróleo. Sulfisoxazol: Polvo cristalino blanco a ligeramente amarillento, inodoro. Soluble en alcohol en ebullición y en ácido clorhídrico 3 N; muy poco soluble en agua. Sulfito de Sodio: Cristales incoloros. Fácilmente soluble en agua; muy poco soluble en alcohol. Categoría del NF: Antioxidante; conservante antimicrobiano. Sulfonato Sódico de Poliestireno: Polvo fino de color marrón dorado. Es inodoro y tiene un sabor característico. Insoluble en agua. Sulfuro de Selenio: Polvo de color marrón rojizo a anaranjado brillante, con apenas un olor leve. Prácticamente insoluble en agua y en disolventes orgánicos. Sulindaco: Polvo cristalino, inodoro o prácticamente inodoro, de color amarillo. Poco soluble en metano!, en alcohol, en acetona y en cloroformo; muy poco soluble en isopropanol y en acetato de etilo; prácticamente insoluble en hexano y en agua. Sulisobenzona: Polvo tostado claro con un punto de fusión de aproximadamente 145º. Fácilmente soluble en metano!, en alcohol y en agua; moderadamente soluble en acetato de etilo. Sumatriptán: Polvo de color blanco a amarillo pálido. Muy poco soluble en agua. Suprofeno: Polvo blanco a blanquecino, inodoro o con un olor leve. Moderadamente soluble en agua. Sustancias Específicas de Grupos Sanguíneos A, B y AB: Solución transparente que puede tener un leve olor debido al conservante. Tacrolimus: Polvo cristalino o cristales de color blanco. Muy soluble en metano!; fácilmente soluble en N,N-dimetilformamida y en alcohol; prácticamente insoluble en agua. Tadalafilo: Polvo blanco o casi blanco. Fácilmente soluble en dimetil sulfóxido; poco soluble en cloruro de metileno; prácticamente insoluble en agua. Tagatosa: Cristales blancos o casi blancos con un sabor dulce. Muy soluble en agua; muy poco soluble en alcohol. Categoría del NF: Agente edulcorante; humectante.
USP 39 Talco: Polvo cristalino muy fino, blanco o blanco grisáceo. Es untuoso, se adhiere fácilmente a la piel y está ílbre de arenosidad. Categoría del NF: Agente deslizante y anticoagulante; lubricante; diluyente. Talidomida: Polvo blanco a blanquecino. Muy soluble en dimetilformamida, en dioxano y en piridina; moderadamente soluble en acetona, en acetato de butilo, en etanol, en acetato de etilo, en ácido acético glacial, en metano! y en agua; prácticamente insoluble en oenceno, en cloroformo y en éter. Tartrato de Antimonio y Potasio: Cristales incoloros, inodoros, transparentes o polvo blanco. Los cristales eflorecen al exponerlos al aire y no se rehidratan con facilidad aunque se los exponga a gran humedad. Sus soluciones son ácidas al tornasol. Fácilmente soluble en agua en ebullición; soluble en agua y en glicerina; insoluble en alcohol. Tartrato de Butorfanol: Polvo blanco. Sus soluciones son ligeramente ácidas. Funde entre 217º y 219º, con descomposición. Soluble en ácidos diluidos; moderadamente soluble en agua; poco soluble en metano!; insoluble en alcohol, en cloroformo, en acetato de etilo, en éter etílico y en hexano. Tartrato de Ergotamina: Cristales incoloros, o polvo cristalino blanco a blanco amarillento. Es inodoro. Funde aproximadamente a 180º, con descomposición. Un g se disuelve en aproximadamente 3200 mL de agua; en presencia de un leve exceso de ácido tartárico 1 g se disuelve en aproximadamente 500 mL de agua. Poco soluble en alcohol. Tartrato de Fendimetracina: Polvo cristalino blanco, inodoro. Fácilmente soluble en agua; moderadamente soluble en alcohol tibio; insoluble en cloroformo, en acetona, en éter y en benceno. La Fendimetracina base se extrae de solución alcalina mediante disolventes orgánicos. Tartrato de Levorfanol: Polvo cristalino prácticamente blanco, inodoro. Moderadamente soluble en agua; poco soluble en alcohol; insoluble en cloroformo y en éter. Funde, en un tubo sellado, aproximadamente a 11 Oº, con descomposición. Tartrato de Metoprolol: Polvo cristalino blanco. Muy soluble en agua; fácilmente soluble en cloruro de metileno, en cloroformo y en alcohol; poco soluble en acetona; insoluble en éter. Tartrato de Morantel: Polvo cristalino blanco o amarillo pálido. Muy soluble en agua y en alcohol; prácticamente insoluble en acetato de etilo. Tartrato de Rivastigmina: Polvo blanco a blanquecino. Muy soluble en agua y en metano!; muy poco soluble en acetato de etilo. Tartrato de Sodio: Cristales transparentes, incoloros e inodoros. Fácilmente soluble en agua; insoluble en alcohol. Categoría del NF: Agente secuestrante; ligando de transferencia. Tartrato de Sodio y Antimonio: Cristales transparentes incoloros, inodoros o polvo blanco. Los cristales eflorecen al exponerse al aire. Fácilmente soluble en agua; insoluble en alcohol. Tartrato de Sodio y Potasio: Cristales incoloros o polvo cristalino blanco, con un sabor salino refrescante. Como eflorece levemente en aire tibio y seco, a menudo los cristales están recubiertos por una capa de polvo blanco. Fácilmente soluble en agua; prácticamente insoluble en alcohol. Tartrato de Tilosina: Polvo higroscópico casi blanco o ligeramente amarillo. Fácilmente soluble en agua y en diclorometano; poco soluble en alcohol. Se disuelve en soluciones diluidas de ácidos minerales. Tartrato de Tolterodina: Polvo cristalino blanco o casi blanco. Moderadamente soluble en agua; poco soluble en etanol anhidro; prácticamente insoluble en heptano. Tartrato de Trimeprazina: Polvo cristalino blanco a blanquecino e inodoro. Fácilmente soluble en agua y en clo-
USP 39 roformo; soluble en alcohol; muy poco soluble en éter y en benceno. Tartrato de Vinorelbina: Polvo amorfo, de color blanco a amarillo o marrón claro. Fácilmente soluble en agua. Tartrato de Zolpidem: Polvo blanco a blanquecino, higroscópico. Moderadamente soluble en metanol; poco soluble en agua; prácticamente insoluble en cloruro de metileno. Taurina: Polvo cristalino o cristales de color blanco. Soluble en agua. Tazobactam: Polvo cristalino, no higroscópico, de color blanco a amarillo pálido. Soluble en dimetilformamida; poco soluble en agua, en metanol, en acetona y en alcohol; muy poco soluble en acetato de etilo, en éter etílico y en cloroformo; insoluble en hexano. Tebutato de Prednisolona: Polvo blanco a levemente amarillo, de libre fluidez, que puede contener algunos grumos blandos. Es inodoro, o a lo sumo presenta un moderado olor característico. Es higroscópico. Fácilmente soluble en cloroformo y en dioxano; soluble en acetona; moderadamente soluble en alcohol y en metanol; muy poco soluble en agua. Telmisartán: Polvo cristalino blanco o ligeramente amarillento. Moderadamente soluble en cloruro de metileno; poco soluble en metanol; prácticamente insoluble en agua. Se disuelve en hidróxido de sodio 1 M. Temazepam: Polvo cristalino blanco o casi blanco. Moderadamente soluble en alcohol; muy poco soluble en agua. Funde entre 157º y 163º, dentro de un intervalo de 3º. Temozolomida: Polvo de color blanco a rosado claro/ tostado claro. Soluble en dimetil sulfóxido; moderadamente soluble en agua; prácticamente insoluble en tolueno. Teofilina: Polvo blanco, inodoro, cristalino, con sabor amargo. Es estable al aire. Fácilmente soluble en soluciones de hidróxidos alcalinos y en amoníaco; moderadamente soluble en alcohol, en cloroformo y en éter; poco soluble en agua, pero más soluble en agua caliente. Terconazol: Polvo blanco a blanquecino. Fácilmente soluble en cloruro de metileno; soluble en acetona; moderadamente soluble en alcohol; prácticamente insoluble en agua. Presenta polimorfismo. Testolactona: Polvo cristalino blanco a blanquecino, prácticamente inodoro. Funde aproximadamente a 218º. Soluble en alcohol y en cloroformo; poco soluble en agua y en alcohol bencílico; insoluble en éter y en éter de petróleo. Testosterona: Polvo cristalino o cristales de color blanco o blanco ligeramente cremoso. Es inodoro y es estable al aire. Fácilmente soluble en alcohol deshidratado y en cloroformo; soluble en dioxano y en aceites vegetales; poco soluble en éter; prácticamente insoluble en agua. Tetracaína: Sólido ceroso de color blanco o amarillo claro. Soluble en alcohol, en éter, en benceno y en cloroformo; muy poco soluble en agua. Tetraciclina: Polvo cristalino amarillo, inodoro. Es estable al aire, pero se oscurece si se expone a luz solar intensa. Pierde potencia en soluciones con un pH inferior a 2 y se degrada rápidamente por soluciones de hidróxidos alcalinos. Fácilmente soluble en ácido diluido y en soluciones de hidróxidos alcalinos; moderadamente soluble en alcohol; muy poco solubl~ en agua; prácticamente insoluble en cloroformo y en eter. Tiabendazol: Polvo blanco a prácticamente blanco, inodoro o prácticamente inodoro. Poco soluble en acetona y en alcohol; muy poco soluble en cloroformo y en éter; prácticamente insoíuble en agua. Tiacetarsamida: Polvo cristalino de color blanco a amarillento. Soluble en alcohol deshidratado tibio y en metanol tibio; moderadamente soluble en alcohol deshidratado frío, en metanol frío y en agua fría; más soluble en agua a una temperatura mayor de 90º; insoluble en alcohol isopropílico tibio. El pK. es 4.
Tablas de Referencia / Descripción y Solubilidad 2467 Tiamulina: Masa amarillenta pegajosa y translúcida, poco higroscópica. Muy soluble en diclorometano; fácilmente soluble en alcohol deshidratado; prácticamente insoluble en agua. Ticarcilina Disódica: Polvo o sólido de color blanco a amarillo pálido. Fácilmente soluble en agua. Ticlopidina: Polvo cristalino blanco o casi blanco. Moderadamente soluble en agua y en alcohol; muy poco soluble en acetato de etilo. Tierra Silícea Purificada: Mezcla de polvo amorfo muy fino, de color blanco, gris claro o beige pálido, con cantidades menores de sustancias polimorfas cristalinas, que incluyen cuarzo y cristobalita. Es arenosa, absorbe fácilmente la humedad y retiene aproximadamente cuatro veces su peso de agua sin tornarse fluida. Insoluble en agua, en ácidos y en soluciones diluidas de hidróxidos alcalinos. Categoría del NF: Auxiliar de filtración; sorbente. Tigeciclina: Polvo anaranjado. Fácilmente soluble en agua; soluble en 1-octanol; poco soluble en metanol, en etanol y en alcohol isopropílico. Tilmicosina: Sólido amorfo, blanco a blanquecino. Poco soluble en agua y en n-hexano. Tilosina: Polvo de color blanco a beige. Fácilmente soluble en metanol; soluble en alcohol, en acetato de amilo, en cloroformo y en ácidos minerales diluidos; poco soluble en agua. Tiloxapol: Líquido viscoso, color ámbar, con un olor leve aromático. Puede presentar una leve turbidez. Lenta pero fácilmente miscible con agua. Soluble en ácido acético glacial, en benceno, en tolueno, en tetracloruro de carbono, en cloroformo y en disulfuro de carbono. Categoría del NF: Agente humectante y/o solubilizante. Timerosal: Polvo cristalino de color crema claro con un olor leve característico. Es afectado por la luz. El pH de una solución (1 en 100) es de aproximadamente 6,7. Fácilmente soluble en agua; soluble en alcohol; prácticamente insoluble en éter. Categoría del NF: Conservante antimicrobiano. Timerosal, Solución Tópica: Líquido transparente, con un olor leve característico. Es afectado por la luz. Timerosal, Tintura: Líquido transparente y móvil con el olor característico de la acetona y del alcohol. Es afectado por la luz. Timol: Polvo cristalino blanco o cristales, incoloros, con frecuencia grandes, con un olor aromático similar al del tomillo y sabor acre. Es afectado por la luz. Su solución en alcohol es neutra al tornasol. Facilmente soluble en alcohol, en cloroformo, en éter y en aceite de oliva; soluble en ácido acético glacial y en aceites fijos y volátiles; muy poco soluble en agua. Categoría del NF: Conservante antimicrobiano; saborizantes y fragancia; antioxidante. Tinidazol: Polvo cristalino casi blanco o amarillo pálido. Soluble en acetona y en cloruro de metileno; moderadamente soluble en metanol; prácticamente insoluble en agua. Tioguanina: Polvo cristalino, amarillo pálido, inodoro o prácticamente inodoro. Fácilmente soluble en soluciones diluidas de hidróxidos alcalinos; insoluble en agua, en alcohol y en cloroformo. Tiopental Sódico: Polvo cristalino, blanco a blanquecino, o polvo higroscópico blanco amarillento a amarillo verdoso pálido. Puede tener un olor desagradable. Sus soluciones son alcalinas al tornasol. Sus soluciones se descomponen en reposo y se forma un precipitado al calentarlas a ebullición. Soluble en agua y en alcohol; insoluble en benceno, en éter absoluto y en éter de petróleo. Tiopental Sódico para Inyección: Polvo cristalino, blanco a blanquecino, o polvo higroscópico blanco amarillento a amarillo verdoso pálido. Puede tener un olor desagradable. Sus soluciones son alcalinas al tornasol. Sus soluciones se descomponen en reposo y se produce precipitación al calentar a ebullición.
2468 Descripción y Solubilidad / Tablas de Referencia Tioridazina: Polvo cristalino o micronizado de color blanco a ligeramente amarillo, inodoro o con un olor débil. Muy soluble en cloroformo; fácilmente soluble en alcohol deshidratado y en éter; prácticamente insoluble en agua. Tiostreptona: Sólido cristalino blanco a blanquecino. Soluble en ácido acético glacial, en cloroformo, en dimetilformamida, en dimetil suffóxido, en dioxano y en piridina; prácticamente insoluble en agua, en los alcoholes inferiores, en disolventes orgánicos no polares y en ácidos acuosos o álcalis diluidos. Tiosulfato de Sodio: Cristales grandes incoloros o polvo cristalino grueso. Es delicuescente en aire húmedo y eflorescente en aire seco a temperaturas que exceden de 33º. Sus soluciones son neutras o ligeramente alcalinas al tornasol. Muy soluble en agua; insoluble en alcohol. Categoría del NF: Antioxidante. Tiotepa: Escamas cristalinas finas, de color blanco y olor débil. Fácilmente soluble en agua, en alcohol, en cloroformo y en éter. Tiotepa para Inyección: Polvo blanco. Tiotixeno: Cristales de color blanco a tostado, prácticamente inodoros. Es afectado por la luz. Muy soluble en cloroformo; poco soluble en metanol y en acetona; prácticamente insoluble en agua. Tiroides: Polvo amorfo de color amarillento a beige, con un olor leve característico parecido al de la carne y un sabor salino. Tirosina: Polvo cristalino o cristales de color blanco, inodoros e insípidos. Muy poco soluble en agua; insoluble en alcohol y en éter. Tobramicina: Polvo higroscópico de color blanco a blanquecino. Fácilmente soluble en agua; muy poco soluble en alcohol; prácticamente insoluble en cloroformo y en éter. Tocoferol: Aceite viscoso transparente, incoloro a amarillo, marrón amarillento o amarillo verdoso. Es inodoro. Soluble en aceites, en grasas, en acetona, en alcohol, en cloroformo y en éter; insoluble en agua. Categoría del NF: Antioxidante. Tocoferoles, Excipiente: Aceite viscoso, de color rojo amarronado a rojo, transparente, con olor y sabor característicos suaves. Puede mostrar una leve separación de los componentes cerosos en forma microcristalina. Se oxida y oscurece lentamente al exponerse al aire y a la luz, particularmente en medios alcalinos. Soluble en alcohol; insoluble en agua. Miscible con acetona, con cloroformo, con éter y con aceites vegetales. Categoría del NF: Antioxidante. Tolazamida: Polvo cristalino, blanco a blanquecino, inodoro o con un olor leve. Funde con descomposición en el intervalo aproximado de 161 º a 173º. Fácilmente soluble en cloroformo; soluble en acetona; poco soluble en alcohol; muy poco soluble en agua. Tolbutamida: Polvo cristalino blanco o prácticamente blanco. Ligeramente amargo y prácticamente inodoro. Soluble en alcohol y en cloroformo; prácticamente insoluble en agua. Tolbutamida Sódica: Polvo cristalino blanco a blanquecino, prácticamente inodoro, con un leve sabor amargo. Fácilmente soluble en agua; soluble en alcohol y en cloroformo; muy poco soluble en éter. Tolcapona: Polvo fino de color amarillo o polvo fino con grumos. Fácilmente soluble en acetona y en tetrahidrofurano; soluble en metano! y en acetato de etilo; moderadamente soluble en cloroformo y en diclorometano; insoluble en agua y en n-hexano. Tolmetina Sódica: Polvo cristalino, amarillo claro a anaranjado claro. Fácilmente soluble en agua y en metanol; poco soluble en alcohol; muy poco soluble en cloroformo. Tolnaftato: Polvo fino de color blanco a blanco cremoso, con un olor leve. Fácilmente soluble en acetona y en cloroformo; moderadamente soluble en éter; poco soluble en alcohol; prácticamente insoluble en agua.
USP 39 Tolú, Bálsamo: Sólido plástico de color marrón o marrón amarillento, transparente, en capas delgadas y quebradizo cuando envejece, o cuando se seca o se expone a temperaturas frías. Tiene un agradable olor aromático similar al de la vainilla y un suave sabor aromático. Soluble en alcohol, en cloroformo y en éter, a veces con un ligero residuo o turbidez; prácticamente insoluble en agua y en éter de petróleo. Categoría del NF: Saborizantes y fragancia. Topiramato: Polvo blanco a blanquecino. Fácilmente solubfe en diclorometano. Torsemida: Polvo cristalino blanco a blanquecino. Poco soluble en hidróxido de sodio O, 1 N, en ácido clorhídrico O, 1 N, en alcohol y en metanol; muy poco soluble en acetona y en cloroformo; prácticamente insoluble en agua y en éter. Tosilato de Bretilio: Polvo cristalino blanco. Es higroscópico. Fácilmente soluble en agua, en metanol y en alcohol; prácticamente insoluble en éter, en acetato de etilo y en hexano. Toxoide Tetánico: Líquido transparente, incoloro a amarillo amarronado o ligeramente turbio, exento de grumos o partículas visibles, con un olor característico o un olor a formaldehído. Toxoide Tetánico Adsorbido: Suspensión turbia, de color blanco, levemente gris o rosado, exenta de grumos visibles después de agitarla. Toxoides Diftérico y Tetánico Adsorbidos: Suspensión turbia, de color blanco, levemente gris o rosada, exenta de grumos visibles después de agitarla. Toxoides Tetánico y Diftérico Adsorbidos para Adultos: Suspensión turbia, de color blanco, levemente gris o crema; exenta de grumos visibles después de agitarla. Tragacanto: Es inodoro y tiene un sabor insípido, mucilaginoso. Categoría del NF: Agente de suspensión y/o viscosante. Trandalopril: Polvo blanco o casi blanco. Fácilmente soluble en cloruro de metileno; moderadamente soluble en alcohol absoluto; prácticamente insoluble en agua. Travoprost: Aceite viscoso, transparente e incoloro. Insoluble en agua. Trehalosa: Polvo cristalino blanco, inodoro, no higroscópico. Soluble en agua, aumentando su solubilidad con la temperatura; prácticamente insoluble en alcohol deshidratado. La trehalosa es usada típicamente en la forma dihidrato. Categoría del NF: Agente de volumen; agente edulcorante; diluyente; desintegrante; aglutinante por vía húmeda; vehículo. Treonina: Cristales blancos, inodoros, con un sabor ligeramente dulce. Fácilmente soluble en agua; insoluble en alcohol absoluto, en éter y en cloroformo. Tretinoína: Polvo cristalino, amarillo a anaranjado claro. Poco soluble en alcohol, en cloroformo y en metanol; insoluble en agua. Triacetina: Líquido algo aceitoso, incoloro, con un sabor amargo y un débil olor a grasa. Soluble en agua; poco soluble en d1sulfuro de carbono. Miscible con alcohol, con éter y con cloroformo. Categoría del NF: Plastificante; humectante; disolvente. Triamcinolona: Polvo cristalino blanco o prácticamente blanco e inodoro. Poco soluble en alcohol y en metanol; muy poco soluble en agua, en cloroformo y en éter. Triamtereno: Polvo cristalino amarillo, inodoro. Soluble en ácido fórmico; moderadamente soluble en metoxietanol; muy poco soluble en ácido acético, en alcohol y en ácidos minerales diluidos; prácticamente insoluble en agua, en benceno, en cloroformo, en éter y en hidróxidos alcalinos diluidos. Triazolam: Polvo cristalino blanco a blanquecino, prácticamente inodoro. Soluble en cloroformo; poco soluble en alcohol; prácticamente insoluble en éter y en agua.
USP 39 Triclocarbán: Polvo blanco. Fácilmente soluble en etanol, en acetona y en polietilenglicol; poco soluble en acetonitrilo y en propilenglicol; insoluble en agua. Triclormetiazida: Polvo cristalino blanco o prácticamente blanco. Es inodoro o tiene un olor leve característico. Funde aproximadamente a 274º, con descomposición. Fácilmente soluble en acetona; soluble en metano[; moderadamente soluble en alcohol; muy poco soluble en agua, en éter y en cloroformo. Tricloromonofluorometano: Gas transparente, incoloro, con olor leve y etéreo. Su presión de vapor a 25º es de aproximadamente 796 mm de mercurio (1 psig). Categoría del NF: Propelente. Triclosán: Polvo fino, blanquecino y cristalino. Funde aproximadamente a 57º. Soluble en metano!, en alcohol y en acetona; poco soluble en hexano; prácticamente insoluble en agua. Triestearato de Glicerilo: Polvo blanco, sólido y microcristalino. Soluble en alcohol caliente, en acetona y en cloroformo; muy poco soluble en alcohol frío, en éter y en éter de petróleo; insoluble en agua. Categoría del NF: Lubricante; agente emulsionante. Trietioduro de Galamina: Polvo blanco, inodoro y amorfo. Es higroscópico. Muy soluble en agua; moderadamente soluble en alcohol; muy poco soluble en cloroformo. Triflupromazina: Líquido aceitoso, viscoso, de color ámbar claro, que forma cristales grandes e irregulares si se deja en reposo mucho tiempo. Prácticamente insoluble en agua. Trifluridina: Polvo inodoro blanco que se observa en el microscopio como cristales con aspecto de bastoncillos; funde a 175º, con sublimación. Triglicéridos de Cadena Media: Líquido aceitoso, incoloro o ligeramente amarillento. Prácticamente insoluble en agua. Miscible con alcohol, con cloruro de metileno, con hexano y con aceites grasos. Categoría del NF: A9ente emulsionante; disolvente; agente de suspensión y/o v1scosante. Trimetoprima: Polvo cristalino o cristales inodoros de color blanco a crema. Soluble en alcohol bencílico; moderadamente soluble en cloroformo y en metano!; poco soluble en alcohol y en acetona; muy poco soluble en agua; prácticamente insoluble en éter y en tetracloruro de carbono. Trioleato de Sorbitán: Líquido aceitoso, de color amarillo a ámbar. Soluble en alcohol metílico, en alcohol, en alcohol isopropílico, en aceite de maíz, en aceite de semillas de algodón y aceite mineral; insoluble en agua, en etilenglicol y en propilenglicol. Categoría del NF: Agente emulsionante; lubricante; agente de suspensión y/o viscosante; agente humectante y/o solubilizante. Trioxaleno: Sólido cristalino de color blanco a blanquecino o grisáceo e inodoro. Funde aproximadamente a 230º. Moderadamente soluble en cloroformo; poco soluble en alcohol; prácticamente insoluble en agua. Tripsina Cristalizada: Polvo blanco a levemente blanco amarillento, cristalino o amorfo, e inodoro. Triptófano: Polvo cristalino o cristales de color blanco a blanco levemente amarillento, inodoro, con un leve sabor amargo. Soluble en alcohol caliente y en ácido clorhídrico diluido. Trisilicato de Magnesio: Polvo fino, blanco, inodoro e insípido, exento de arenosidad. Insoluble en agua y en alcohol. Se descompone fácilmente con ácidos minerales. Categoría del NF: Deslizante y/o agente antiaglutinante. Trolamina: Líquido incoloro a amarillo pálido, viscoso, higroscópico, con leve olor a amoníaco. Soluble en cloroformo. Miscible con agua y con alcohol. Categoría del NF: Agente emulsionante; modificador de pH (agente acidificante/agente alcalinizante/agente amortiguador). Troleandomicina: Polvo cristalino blanco e inodoro. Fácilmente soluble en alcohol; soluble en cloroformo; poco soluble en éter y en agua.
Tablas de Referencia / Descripción y Solubilidad 2469 Trombina: Sustancia amorfa, de color blanco a grisáceo, liofilizada. Trometamina: Polvo cristalino blanco con un olor leve característico. Fácilmente soluble en agua. Tropicamida: Polvo cristalino de color blanco o prácticamente blanco, inodoro, con un olor apenas leve. Fácilmente soluble en cloroformo y en soluciones de ácidos fuertes; poco soluble en agua. Tuberculina: La Tuberculina Vieja es un líquido amarronado y transparente, fácilmente miscible con agua y con un olor caractenstico. El Derivado Proteico Purificado (PPD, por sus siglas en inglés) de Tuberculina es una solución incolora, muy poco opalescente. Los concentrados de Tuberculina Vieia y PPD contienen 50% de glicerina para uso con diferentes dispositivos de aplicación. La Tuberculina Vieja y el PPD también se secan en los dientes de dispositivos de punción múltiple. Ubidecarenona: Polvo cristalino, amarillo a anaranjado. Funde aproximadamente a 48º. Soluble en éter; muy poco soluble en alcohol deshidratado; prácticamente insoluble en agua. Undecilenato de Calcio: Polvo fino de color blanco, no arenoso y con un olor característico. Poco soluble en alcohol caliente; prácticamente insoluble en agua, en éter, en cloroformo, en acetona y en alcohol frío. Undecilenato de Cinc: Polvo fino blanco. Prácticamente insoluble en agua y en alcohol. Ungüento Amarillo: Categoría del NF: Base para ungüentos. Ungüento Blanco: Categoría del NF: Base para ungüentos. Ungüento Hidrófilo: Categoría del NF: Base para ungüentos. Urea: Cristales prismáticos, incoloros a blancos, polvo cristalino blanco o pequeños pellets blancos. Es prácticamente inodora, pero puede desarrollar gradualmente y con el tiempo un olor leve a amoníaco. Sus soluciones son neutras al tornasol. Fácilmente soluble en agua y en alcohol en ebullición; prácticamente insoluble en cloroformo y en éter. Urea C 13: Ver Urea. Ursodiol: Polvo cristalino blanco o casi blanco. Fácilmente soluble en alcohol y en ácido acético glacial; moderadamente soluble en cloroformo; poco soluble en éter; prácticamente insoluble en agua. Vacuna BCG: Masa seca de color blanco a blanco cremoso, con la textura característica del material liofilizado. Vacuna contra el Virus Influenza: Suspensión o líquido levemente turbio, que puede tener un matiz ligeramente amarillo o rojizo y un olor debido al conservante. Vacuna contra la Fiebre Amarilla: Masa desecada, levemente opaca, de color anaranjado claro, escamosa o como si fuera una costra. Vacuna contra la Rabia: Pellet amorfo de color blanco a pajizo que puede o no fragmentarse cuando se agita. Vacuna contra la Viruela: La Vacuna Líquida es una suspensión turbia de color blanquecino a verdoso que puede tener un ligero olor debido al agente antimicrobiano. La Vacuna Seca es un pellet de color amarillo a grisáceo que puede o no fragmentarse cuando se agita. Vacuna de Virus Vivo contra la Parotiditis: Sólido con el aspecto característico de las sustancias liofilizadas. La Vacuna se debe reconstituir con un diluyente adecuado justo antes de su uso. La vacuna reconstituida sufre pérdida de potencia al exponerse a la luz solar. Vacuna de Virus Vivo contra la Rubeola: Sólido con el aspecto característico de las sustancias liofilizadas. Pierde potencia al exponerse a la luz solar. La Vacuna se debe reconstituir con un diluyente adecuado justo antes de su uso.
2470 Descripción y Solubilidad/ Tablas de Referencia
Vacuna lnactivada contra el Poliovirus: Líquido transparente, de color amarillento o con matiz rojizo, que puede tener un olor leve debido al conservante. Vainillina: Cristales finos, blancos a ligeramente amarillos, por lo general en forma de aguja, con olor y sabor parecidos a vainilla. Es afectado por la luz. Sus soluciones son ácidas al tornasol. Fácilmente soluble en alcohol, en cloroformo, en éter y en soluciones de hidróxidos alcalinos fijos; soluble en glicerina y en agua caliente; poco soluble en agua. Categoría del NF: Saborizantes y fragancia. Valerato de Betametasona: Polvo inodoro, de color blanco a prácticamente blanco. Funde aproximadamente a 190º, con descomposición. Fácilmente soluble en acetona y en cloroformo; soluble en alcohol; poco soluble en benceno y en éter; prácticamente insoluble en agua. Valerato de Estradiol: Polvo cristalino blanco. Por lo general es inodoro pero puede tener un leve olor a grasa. Soluble en aceite de ricino, en metanol, en benzoato de bencilo y en dioxano; moderadamente soluble en aceite de sésamo y en aceite de cacahuate; prácticamente insoluble en agua. Valina: Cristales blancos, inodoros e insípidos. Soluble en agua; prácticamente insoluble en éter, en alcohol y en acetona. Valrubicina: Polvo cristalino de color anaranjado a rojo anaranjado. Soluble en cloruro de metileno, en alcohol deshidratado, en metanol y en acetona; muy poco soluble en agua, en hexano y en eter de petróleo. Valsartán: Polvo higroscópico blanco o casi blanco. Fácilmente soluble en etanol anhidro; moderadamente soluble en cloruro de metileno; prácticamente insoluble en agua. Vaselina: Masa untuosa de color amarillento a ámbar claro que no presenta más que una leve fluorescencia, aún despues de fundida. Es transparente en capas del9adas. Está exenta o prácticamente exenta de olor y sabor. Facilmente soluble en benceno, en disulfuro de carbono, en cloroformo y en aceite de trementina; soluble en éter, en éter de petróleo y en la mayoría de los aceites fijos y volátiles; prácticamente insoluble en alcohol frío y caliente y en alcohol deshidratado frío; insoluble en agua. Categoría del NF: Base para ungüentos; emoliente. Vaselina Blanca: Masa untuosa de color blanco o ligeramente amarillento, transparente en capas delgadas aun después de enfriar a Oº. Facilmente soluble en benceno, en disulfuro de carbono y en cloroformo; soluble en éter, en éter de petróleo y en la mayoría de los aceites fijos y volátiles; poco soluble en alcohol frío o caliente y en alcohol deshidratado frío; insoluble en agua. Categoría del NF: Base para ungüentos. Vaselina Hidrofílica: Categoría del NF: Base para ungüentos. Vasopresina, Inyección: Líquido transparente, incoloro o prácticamente incoloro, con olor leve característico. Venda Adhesiva: La compresa de la Venda Adhesiva prácticamente no presenta hilos sueltos ni hilachas. La tira adhesiva puede estar perforada y el reverso puede estar recubierto con una película que repele el agua. Venda de Gasa: Una pieza sola enrollada con firmeza, de diverso ancho y largo y que prácticamente no presenta hilos sueltos ni hilachas. Verde de lndocianina: Polvo de color marrón oliva, verde oscuro, verde azulado, azul oscuro o negro. Es inodoro o tiene un olor leve. Sus soluciones son de color verde esmeralda intenso. El pH de una solución (1 en 200) es de aproximadamente 6. Sus soluciones acuosas son estables durante 8 horas aproximadamente. Soluble en agua y en metanol; prácticamente insoluble en la mayoría de los demás disolventes orgánicos. Vidarabina: Polvo blanco a blanquecino. Poco soluble en dimetilformamida; muy poco soluble en agua.
USP 39 Vigabatrina: Polvo de color blanco o casi blanco. Fácilmente soluble en agua; poco soluble en metanol; muy poco soluble en alcohol y en cloroformo; prácticamente insoluble en cloruro de metileno; insoluble en hexano y en tolueno. Violeta de Genciana: Polvo verde oscuro o trozos verdosos brillantes con reflejo metálico y un olor no más que leve. Soluble en alcohol, en glicerina y en cloroformo; moderadamente soluble en agua; insoluble en éter. Violeta de Genciana, Crema: Crema de color púrpura oscuro, lavable con agua. Violeta de Genciana, Solución Tópica: Líquido púrpura, con un leve olor a alcohol. Una dilución (1 en 100), observada hacia abajo a través de 1 cm de profundidad, es de color púrpura intenso. Vitamina A: En forma líquida, aceite amarillo claro a rojo que se puede solidificar si se refrigera. En forma sólida, tiene el aspecto de cualquier diluyente que se haya agregado. Puede ser prácticamente inodoro o puede tener un olor suave a pescado, pero ni olor ni sabor rancio. Es inestable en presencia de aire y luz. En forma líquida, muy soluble en cloroformo y en éter; soluble en alcohol absoluto y en aceites vegetales; insoluble en agua y en glicerina. En su forma sólida, puede dispersarse en agua. Vitamina E: Es prácticamente inodora e insípida. Los alfa tocoferoles y los acetatos de alfa tocoferilo se presentan como aceites viscosos transparentes, amarillos o amarillo verdosos. El acetato de d-alfa tocoferilo puede solidificar en frío. El succinato ácido de alfa tocoferilo se presenta como un polvo blanco; el isómero d funde aproximadamente a 75º, y la forma di funde aproximadamente a 70º. Los alfa tocoferoles son inestables al aire y a la luz, particularmente cuando están en medios alcalinos. Los ésteres son estables al aire y a la luz, pero inestables al álcali; el succinato ácido también es inestable cuando se mantiene fundido. El succinato ácido de alfa tocoferilo es muy soluble en cloroformo; soluble en alcohol, en éter, en acetona y en aceites vegetales; poco soluble en soluciones alcalinas; insoluble en agua. Las otras formas de Vitamina E son solubles en alcohol; insolubles en agua; miscibles con éter, con acetona, con aceites vegetales y con cloroformo. Categoría del NF: Antioxidante; plastificante. Vitamina E, Preparación: Las formas líquidas son aceites viscosos transparentes, de color amarillo a rojo amarronado. Las formas sólidas son polvos granulares de color blanco a blanco tostado. Las formas líquidas son solubles en alcohol; insolubles en agua. Miscibles con éter, con acetona, con aceites vegetales y con cloroformo. Las formas sólidas se dispersan en agua para producir suspensiones turbias. Voriconazol: Polvo blanco o casi blanco. Fácilmente soluble en acetona y en cloruro de metileno; muy poco soluble en agua. Warfarina Sódica: Polvo cristalino o amorfo, de color blanco, inodoro, con un leve sabor amargo. Cambia de coloración por efecto de la luz. Muy soluble en agua; fácilmente soluble en alcohol; muy poco soluble en cloroformo y en éter. Xenón Xe 127: Gas transparente e incoloro. Xenón Xe 133, Inyección: Solución transparente e incolora. Xilazina: Cristales incoloros a blancos. Moderadamente soluble en ácido diluido, en acetona y en cloroformo; insoluble en álcalis diluidos. Xilitol: Polvo cristalino o cristales de color blanco. Tiene un sabor dulce y produce una sensación refrescante en la boca. Un g se disuelve en aproximadamente 0,65 mL de agua. Moderadamente soluble en alcohol. El xilitol cristalino tiene un intervalo de fusión entre 92º y 96º. Categoría del NF: Agente de recubrimiento; emoliente; humectante; agente edulcorante; diluyente. Xilosa: Agujas incoloras o polvo cristalino blanco. Es inodoro y tiene un sabor ligeramente dulce. Muy soluble en agua; poco soluble en alcohol.
USP 39
Xinafoato de Salmeterol: Polvo blanco a blanquecino. Soluble en metano!; poco soluble en alcohol, en isopropanol y en cloroformo; prácticamente insoluble en agua (pH 8) y en solución salina (0,9% p/p). Yodo: Placas o gránulos pesados de color negro 5Jrisáceo, con un brillo metálico y un olor característico. Facilmente soluble en disulfuro de carbono, en cloroformo, en tetracloruro de carbono y en éter; soluble en alcohol y en soluciones de yoduros; moderadamente soluble en glicerina; muy poco soluble en agua. Yodo Fuerte, Solución: Líquido transparente, de color marrón intenso y con olor a yodo. Yodo, Solución Tópica: Líquido transparente, de color marrón rojizo, con olor a yodo. Yodo, Tintura: Líquido transparente, de color marrón rojizo y con olor a yodo y alcohol. Yodoformo: Polvo brillante de color amarillo verdoso o cristales brillantes. Es poco volátil aun a temperaturas normales y destila lentamente con vapor. Fácilmente soluble en éter y en cloroformo; soluble en alcohol en ebullición; moderadamente soluble en alcohol, en glicerina y en aceite de oliva; prácticamente insoluble en agua. Funde hasta formar un líquido marrón aproximadamente a 115º y se descompone a mayor temperatura, emitiendo vapores de yodo. Yodohipurato Sódico 1 131, Inyección: Solución transparente e incolora. Al reposar la Inyección y el envase de vidrio pueden oscurecerse a consecuencia de los efectos de la radiación. Yoduro de Ecotiopato: Sólido higroscópico, cristalino, blanco, con un olor leve semejante al del mercaptano. Sus soluciones tienen un pH de aproximadamente 4. Fácilmente soluble en agua y en metano!; soluble en alcohol deshidratado; prácticamente insoluble en otros disolventes orgánicos. Yoduro de Ecotiopato para Solución Oftálmica: Polvo amorfo blanco. Yoduro de lsopropamida: Polvo cristalino blanco a amarillo pálido, con un leve sabor amargo. Fácilmente soluble en cloroformo y en alcohol; moderadamente soluble en agua; muy poco soluble en benceno y en éter. Yoduro de Potasio: Cristales hexaédricos transparentes e incoloros, o blancos y algo opacos, o polvo granulado blanco. Es ligeramente higroscópico. Sus soluciones son neutras o alcalinas al tornasol. Muy soluble en agua y aun más soluble en agua en ebullición; fácilmente soluble en glicerina; soluble en alcohol.
Tablas de Referencia/ Descripción y Solubilidad 2471
Yoduro de Potasio, Solución Oral: Líquido transparente, incoloro, inodoro, con sabor característico muy salado. Es neutro o alcalino al tornasol. El peso específico es aproximadamente 1, 70. Yoduro de Sodio: Cristales incoloros, inodoros, o polvo cristalino blanco. Es delicuescente en aire húmedo y desarrolla un tinte marrón al descomponerse. Muy soluble en agua; fácilmente soluble en alcohol y en glicerina. Yoduro de Sodio 1 123, Cápsulas: Las Cápsulas pueden contener una pequeña cantidad de sólido(s) o pueden parecer vacías. Yoduro de Sodio 1 123, Solución: Solución transparente e incolora. Al reposar, la Solución y el envase de vidrio pueden oscurecerse a consecuencia de los efectos de la radiación. Yoduro de Sodio 1 131, Cápsulas: Pueden contener una pequeña cantidad de sólido(s) o pueden parecer vacías. Yoduro de Sodio 1 131, Solución: Solución transparente e incolora. Al reposar, la Solución y el envase de vidrio pueden oscurecerse a consecuencia de los efectos de la radiación. Zalcitabina: Polvo cristalino blanco a blanquecino. Soluble en agua y en metano!; moderadamente soluble en alcohol, en acetonitrilo, en cloroformo y en cloruro de metileno; poco soluble en ciclohexano. Zaleplón: Polvo blanco a blanquecino. Moderadamente soluble en alcohol; poco soluble en propilenglicol; prácticamente insoluble en agua. Zanamivir: Polvo cristalino blanco. Moderadamente soluble en agua; insoluble en acetona, en acetonitrilo, en alcohol y en alcohol isopropílico. Zeína: Polvo blanco a amarillo. Soluble en alcoholes acuosos, en ~licoles, en éter etílico de etilen~licol, en alcohol furfurihco, en alcohol tetrahidrofurfurihco, en soluciones alcalinas acuosas de pH 11,5 o mayor, en mezclas de acetona y agua entre los límites de 60% y 80% de acetona en volumen; insoluble en agua, en acetona y en todos los alcoholes anhidros, excepto en metano!. Categoría del NF: Agente de recubrimiento; aglutinante por vía húmeda. Zidovudina: Polvo blanco a amarillento. Funde aproximadamente a 124º. Presenta polimorfismo. Soluble en alcohol; moderadamente soluble en agua. Zileutón: Polvo blanco a blanquecino. Zonisamida: Polvo blanco a blanquecino. Fácilmente soluble en dimetilformamida; soluble en metano!.
2472 Solubilidades / Tablas de Referencia
USP 39
SOLUBILIDADES
Solubllldades Aproximadas de Artículos de la USP y del NF Nombre \ Volumen en mL. del Disolvente Soluto l1 o\ Acenocumarol Acetaminofeno Acetato de Betametasona Acetato de Cinc Acetato de Cortisona Acetato de Fenilmercurio Acetato de Hidrocortisona Acetato de Metilorednisolona Acetato de Noretindrona Acetato de Parametasona Acetato de Potasio Acetato de Prednisolona Acetato de Sodio Acetil Sulfisoxazol Acetilcisteína Acetildiaitoxina Acetohexamida Acetónido de Fluocinolona Ácido Aminocaoroico Ácido Aminohioúrico Ácido Ascórbico Ácido Benzoico Ácido Bórico Ácido Cítrico Ácido Dehidrocólico
Ácido Ácido Ácido Ácido Ácido
Esteárico Etacrínico Nalidíxico Salicílico Sórbico
Ácido Tartárico Alcanfor Alcohol Feniletílico
Alcohol lsoorooílico Alumbre de Amonio Alumbre de Potasio Amaranto Aminosalicilato Sódico Anetol 1 Anileridina Ascorbato de Sodio Asoirina Atrooina
Aoua 67000
Agua en Ebullición 20
2000 25 180 1500 >10 000 05
02
08
06
5 6100 >1000 3 45 3 300 18
4
05
>1000 460 1000
08 800 60
<1 7 7 15 2 >10 000 13 300 460
15
05
Alcohol 280 10 9 30 350 225 230 400 10 3 120 19 176 4 62 5 230 45 50 40 3 18
Cloroformo 130
Otros
Éter 1800
hidróxido de sodio 1 N 15 16 4 68 200 250 <1 50
acetona 75· dioxano 30 200 1500 18
35
1064
12 210 25
>10000
dioxano 2 metanol 40
metanol 203
350 metanol 450 ácido clorhídrico 3 N 5
5
3 alcohol en ebullición, 6· alicerina 4
2 100
35
30 2200 (15º)
20 16 910 3 10
2 6 29 45 15
3 35 >1000 3 30
3 1 <1
05 <1
250 1 <1
<1
<1
<1
2 2
1
5 2
17 1
ácido acético a 15º, 1 35; acetona a 15º, 130; benceno a 15°, 960; acetato de etilo a 15° 135
benceno 135 alcohol absoluto, 8; metanol, 8; propilenalicol 19 metanol 1 7 solución en alcohol (1 en 2), 2; ftalato de dietilo, <1 · benzoato de bencilo <1
05 03
10 a 15 25
aaua a 80º 90
Los datos de solubilidad de los compuestos que normalmente son líquidos a 25º se expresan en términos del cociente entre el volumen de soluto y el volumen de disolvente; por ejemplo, 1 ml disuelto en_ _ ml de disolvente. 2 Únicamente fase líquida; el dióxido de silicio permanece como un residuo en estos disolventes. 1
Tablas de Referencia /Solubilidades 2473
USP 39
Solubilidades Aproximadas de Artículos de la USP y del NF (Continuación) Nombre ' Volumen en mL del Disolvente Soluto C1 o) Azufre Precipitado
Agua en Ebullición
Aoua
25
Azul de Metileno Bendroflumetiazida Benzoato de Denatonio Benzoato de Potasio Benzoato de Sodio Benzocaína
20 2 2 2500
Benzonatato Besilato de Mesoridazina Betadex Betametasona
<1 1 54 5300
Bicarbonato de Sodio Bisacodilo Bisulfito de Sodio Bitartrato de Eoinefrina Bitartrato de Noreoinefrina Borato de Sodio Bromhidrato de Dextrometorfano Bromhidrato de Escooolamina Bromhidrato de Hiosciamina Bromhidrato de Homatrooina Busulfano Butabarbital Sódico Butambén Butil Hidroxianisol Butil Hidroxitolueno Cafeína (hidratada)
12 >10000 4 3 25 16 65 15
Alcohol
65 23 24 75 75 5
Cloroformo
29
Éter
Otros disulfuro de carbono, 2 (lentamente y por lo general de forma incompleta) aceite de oliva 1 00
200 5000
2
4
<1 11
<1 3
<1 6300
65
325
210
25
solución de alcohol (9 en 1 Q) 50 alcohol al 90 oor ciento 50 aceite de almendra o aceite de oliva 30-50
alcohol tibio, 15; metano! 3
275
300 1
6
alicerina 1
20 25 40
17 420
2300
7
7000
10000
40 40 75
20 11 6
12 11 600
25 1000
23 10 000
10000
40
7
2800
acetona 45
2 7000
Carbonato de Amonio Carbonato de Sodio Carisonrodol Cefaloridina Cianocobalamina Cioionato de Estradiol Citrato de Potasio Citrato de Sodio
50 4 3 2083 5 80 >10 000 1 15 >100000 1
Clorambucilo Cloranfenicol Clordiazeoóxido Clorhidrato de Amantadina Clorhidrato de Amodiaauina Clorhidrato de Anileridina Clorhidrato de Aoomorfina Clorhidrato de Apraclonidina
18 acetona 2 5
alicerina 2 5
06 3500 4
120 >10 000
4500 >10000
400 >10 000 25 25 5 50 34
50 51 78 80 50 74
6250 18 >10 000 >10 000
130
08 <1
26 2
25 2
115
115
75
>10 000 >10 000
ácido clorhídrico O, 1 N, 1; hidróxido de sodio O1 N 1 acetona 2
oolietilennlicol 400 70 benceno 1O 000 aaua a 80° 20 metano!, 13; acetato de etilo, >1O 000; hexanos,
>10000
>10000 Clorhidrato de Benoxinato Clorhidrato de Bromodifenhidramina Clorhidrato de Ciclizina
>10000 3500
alcohol isopropílico, 31
Los datos de solubilidad de los compuestos que normalmente son líquidos a 25º se expresan en términos del cociente entre el volumen de soluto y el volumen de disolvente; por ejemplo, 1 ml disuelto en_ _ ml de disolvente. 2 Únicamente fase líquida; el dióxido de silicio permanece como un residuo en estos disolventes. 1
USP 39
2474 Solubilidades/ Tablas de Referencia Solubilidades Aproximadas de Artículos de la USP y del NF (Continuación) Nombre ' Volumen. en ml del Disolvente Soluto l1 o) Clorhidrato Clorhidrato Clorhidrato Clorhidrato Clorhidrato Clorhidrato Clorhidrato Clorhidrato Clorhidrato Clorhidrato Clorhidrato Clorhidrato Clorhidrato Clorhidrato
de de de de de de de de de de de de de de
Cioroheotadina Cloroorocaína Clororomazina Clortetraciclina Cocaína Demeclociclina Desioramina Diciclomina Diclonina Dietilorooión Difenhidramina Doxaoram Efedrina Fenazopiridina
Clorhidrato Clorhidrato Clorhidrato Clorhidrato
de de de de
Fenilorooanolamina Fenmetrazina Flufenazina Flurazepam
Clorhidrato Clorhidrato Clorhidrato Clorhidrato Clorhidrato
de de de de de
Hidralazina Hidromorfona Hidroxizina lsonroterenol lsoxsuprina
Agua en Ebullición
Aoua 275 20 1 75 05 60 12
35 2 23 3 2
>10 000 770 >10000
20
14 59
331
>5000
25 3 1 3 500
500 45 50 100
4
Clorhidrato de Metaciclina Clorhidrato de Metdilazina
Clorhidrato de Nortriotilina Clorhidrato de Oximetazolina Clorhidrato de Oximorfona Clorhidrato de Palmitato de Clindamicina Clorhidrato de Paoaverina Clorhidrato de Pentazocina Clorhidrato de Pilocarnina Clorhidrato de Piridoxina Clorhidrato de Pirrocaína Clorhidrato de Pramoxina Clorhidrato de Prilocaína Clorhidrato de Procaína Clorhidrato de Prociclidina Clorhidrato de Promazina Clorhidrato de Proooxicaína Clorhidrato de Protriotilina Clorhidrato de Pseudoefedrina Clorhidrato de Tiamina Clorhidrato de Tetraciclina Clorhidrato de Tetrahidrozolina Clorhidrato de Tiotixeno Clorhidrato de Tolazolina Clorhidrato de Trifluooerazina
26
15
acetona 50
90
5000
13
>1000
>10 000
>10000
14
60
>10 000
100 2
300 2
>1000 6
>1000 >10 000
90 67 4
30 36 100 3
20 862 >1000
>1000
30 30 03 5 15
120 20 3 115 12
35 1 35 3 2 2 05 1 10 35 8 <1 35
42 15 9 10 35 36 170 100 75 2 11
ácido acético alacia! 2 hexano > 1O 000
agua fría, 300; alicerina 100
4100 2
4 360
metano!, 3; isopropanol, 69; benceno, 2500; éter de oetróleo 5000
ácido clorhídrico O, 1 N, 2500; hidróxido de sodio O 1 N 100 metano!, 6; alcohol absoluto 60 hidróxido de sodio O 1 N 25 ácido clorhídrico O, 1 N, 1; hidróxido de sodio O 1 N 1 metano! 10 metano! 25 acetato de etilo, 9
>10 000
8 35 175 6
11 000
>10 000 25 91
80 >10000 7000
>1000 280 3 100
>1000 >10 000 >10 000
alcohol absoluto 270
Los datos de solubilidad de los compuestos que normalmente son líquidos a 25º se expresan en términos del cociente entre el volumen de soluto
y el volumen de disolvente; por ejemplo, 1 ml disuelto en _ _ ml de disolvente. 2
metano! 1 5
14 5 24 3 2
74 2 67 4
1
Otros
Éter
15
11 04 14 2
Clorhidrato de Ketamina
Cloroformo
35 100 15 560 35
metano! 50
13 60 05 1 50 3 <10
Alcohol
Únicamente fase líquida; el dióxido de silicio permanece como un residuo en estos disolventes.
USP 39
Tablas de Referencia/ Solubilidades 2475
Solubilidades Aproximadas de Artículos de la USP y del NF (Continuación) Nombre Soluto ll a) Clorhidrato de Trifluoromazina Clorhidrato de Trimetobenzamida Clorhidrato de Trioelenamina Clorhidrato de Triorolidina Clorhidrato de Xilometazolina Clorobutanol Clorocresol Clororomazina Cloruro de Aluminio Cloruro de Bencetonio Cloruro de Benzalconio (anhidro) Cloruro de Cloruro de Cloruro de Cloruro de Cloruro de Cloruro de Cloruro de Cloruro de Cloruro de Cloruro de Cocaína
Calcio Cetiloiridinio Cinc Edrofonio Metacolina Metilbencetonio Potasio Sodio Succinilcolina Tubocurarina
Codeína Colchicina Colesterol
Agua en Ebullición
Aaua
~
Volumen en ml del Disolvente
Alcohol
Cloroformo
<1
<1
2 1 21 35 125 260
59
17 67 6 1
6 18 1 04 3 4
09 <1 07 45 05 05 12 08 28 28 1 20 600 120 25
02
4 25 15
Éter
Otros
720 acetona 350
2000 olicerina 10
2
3
6000 100
benceno 2
benceno 6 alcohol en ebullición 2
45 alicerina 2
5
17 09
21 >10 000
07
2 27
alicerina 1O
350 45 7
1
3,5
2
05
50 220
100 (len-
aceite de oliva, 12; vaselina líauida 80-1 00
alcohol deshidratado, 50
tamente) agua en metanol (23 en 100), 1O; agua en alcohol (23 en 100), 1O; agua en alcohol isopropílico (23 en 100), 1O; agua en acetona (> 3 en 100). 1O metanol 40
Copolímero del Ácido Metacrílico
Demeclociclina Dextrosa Diacetato de Triamcinolona Diazeoam Dibucaína Didroaesterona Diaitoxina Dimercaorol Di metisterona Disulfiram Docusato Cálcico Docusato Sódico
1
200 100 13
333 4600 >10 000
16 07 40 150
80 2 05 2 40
metanol 40
39 14 200
20 >5000 3300
3 30 >1
07 >1
15 >1
140 1500 02 >1000
4
500
<1
70 (lentamente)
Drooeridol Edisilato de Procloroerazina Efedrina Enalaprilat
10000 2 20 200
Enantato de Flufenazina Eritromicina Esilato de Piminodina Estanozolol Estibofeno Estolato de Eritromicina
1000 >1000 >1000 1
dimetilformamida, 40; metanol 68
2
6 2 >1000 41 74 370 >10 000 >10 000 10000 20 10 acetona 15 1 Los datos de solubilidad de los compuestos que normalmente son líquidos a 25º se expresan en términos del cociente entre el volumen de soluto y el volumen de disolvente; por ejemplo, 1 ml disuelto en _ _ ml de disolvente. 2
Únicamente fase líquida; el dióxido de silicio permanece como un residuo en estos disolventes.
USP 39
2476 Solubilidades / Tablas de Referencia Solubilidades Aproximadas de Artículos de la USP y del NF (Continuación) Nombre' Volumen en ml del Disolvente Soluto (1 q)
Agua en Ebullición
Aaua
Estradiol Estrona
Estrooioato 1 Éter Etil Vainillina Fenobarbital Fenal Fluorometolona Fluoruro de Sodio Flurandrenolida Fluroxeno Fosfato de Codeína
>2000 12 100 (50°) 1000 15 >10 000 25
25 4 15 8 2 2 15 4
Glicinato de Teofilina Sódica Glicooirrolato Gluconato de Calcio
6 42
Otros
Éter
435 110 (15º)
150
>2000
>2000
>2000
200
2200
>10 000
72
10
alcohol en ebullición, 50; cloroformo en ebullición, 80; acetona a 50º, 50; acetona en ebullición, 33; benceno en ebullición 145 alcohol tibio 500
aceite mineral 70
metano! 25 alcohol en ebullición, 125; aaua a 80º O 5
325 >1000
>1000
>1000
470
>10 000
>10 000
metano! 13 metano! 14 agua a 50º, 2,6; a 75°, 1 9· a 100º 1 5
15 1254
4
30 (lenta-
Cloroformo
28 250 (15º)
2 10
220 2,5
Fosfato de Clindamicina Fosfato de Histamina Fosfato de Primaauina Fosfato de Sodio Seco Fosfato Sódico de Betametasona Fosfato Sódico de Dexametasona Fosfato Sódico de Hidrocortisona Fosfato Sódico de Prednisolona Fructosa Glicina
Alcohol
30
260
35 000
140 60 63
>1000 15 1064
>2000 200 248
35 2 140
40 15 140
>5000 51
2500 16 5
>10 000 3
>10 000
>10 000
100
10 000
10000
50
30
40
5
mente) Gluconato Ferroso Gluconato de Potasio Guaifenesina Halazona Halooeridol Hemisuccinato de Prednisolona Heoarina Sódica Hexacloruro de Gamma Benceno Hidrato de Cloral Hidrato de Teroina Hidrocortisona Hidroflumetiazida Hidroauinona Hidróxido de Calcio Hidróxido de Maanesio Hidróxido de Potasio Hidróxido de Sodio Hidroxocobalamina lctammol lndiaotindisulfonato Sódico lndometacina loduro de Ecotiopato 1
5 3 60-70 >1000 >10 000 4170 20
o 25 200 >5000 17 630 >10 000 1 1 50 10 100
35
13 13 40 39 4
alcohol en ebullición 3 acetona 80
1300 alicerina 2 5
1
alcohol deshidratado, 25; metano! 3
Los datos de solubilidad de los compuestos que normalmente son líquidos a 25º se expresan en términos del cociente entre el volumen de soluto
y el volumen de disolvente; por ejemplo, 1 ml disuelto en _ _ ml de disolvente. 2
alcohol deshidratado 20
Únicamente fase líquida; el dióxido de silicio permanece como un residuo en estos disolventes.
USP 39
Tablas de Referencia/ Solubilidades 2477
Solubilidades Aproximadas de Artículos de la USP y del NF (Continuación) Nombre' Volumen en ml del Disolvente Soluto '1 a) lpodato Sódico
lsoniazida Lactosa Lactato de Calcio Lauril Sulfato de Sodio Levotiroxina Sódica Lisinoaril Maleato de Bromfeniramina Maleato de Carbinoxamina Maleato de Clorfeniramina Maleato de Dexbromfeniramina Maleato de Dexclorfeniramina Maleato de Metileraonovina Maleato de Metiseraida Maleato de Pirilamina Maleato de Procloroerazina Maleato de Tietiloerazina Mandelato de Metenamina Manito! Menadiona Mesilato de Dihidroeraotamina Mesilato de Fentolamina Metenamina Meticlotiazida Metiloarabeno Metilorednisolona Metimazol Metocarbamol Metotrimeorazina Metoxiflurano Metsuximida Miconazol
Agua en Ebullición
Aoua
Éter
Otros dimetilacetamida, 2; dimetilformamida, 3,5; dimetil sulfóxido, 35
50 2,6
20 10 700 10
300 >10 000 15 15 10 25 2 175 165 3 1200 530 10
5
>10 000 15 15 10 2 17 1900 3400 2 >10 000 20
>10 000
metano! 70
8300 3000 2500 8400 >10 000 alcohol absoluto 15
>10 000 350
55
60 125
benceno, 1O; aceites veaetales 50
>10 000 400 10 000
90 4 12 5 92 5 3 100
5
5
40 (20º) 10 500 350 >100 000
10
2
1 15
3 9,5
Monoestearato de Glicerilo Mononitrato de Tiamina Naosilato de Proooxifeno Niacina Niacinamida Nifediaino Nitrato de Fenilmercurio Nitrato de Miconazol
Cloroformo
2
8 5 (lentamente)
Alcohol
44 10000 60 15 >10 000 600 6250
Nitrato de Pilocaroina Nitrato de Plata Nitrito de Sodio Nitrato de Sulconazol
4 04 15 3333
Nitrofurazona
4200
15 10
175 700 10 >10 000 800 45
2600 320 2700 10 800 125
aaua a 80º 50
metano! 10
2
2 15
10,0
100,0
alcohol isopropílico, 4; propilenglicol, 9; metano! 5 3 metano!, 100; alcohol isoorooílico 3 3
10
55 acetona 1O
312
o1
525
75 30 100
590
50 000
alcohol isopropílico, 1408; propilenglicol, 119· metano! 75 alcohol en ebullición 65
333
piridina, 1O; metano!, 71; acetona, 1 30; cloruro de metileno, 286; tolueno, 2000· dioxano 2000 orooilenalicol 350
Los datos de solubilidad de los compuestos que normalmente son líquidos a 25º se expresan en términos del cociente entre el volumen de soluto y el volumen de disolvente; por ejemplo, 1 mL disuelto en _ _ mL de disolvente. 2 Únicamente fase líquida; el dióxido de silicio permanece como un residuo en estos disolventes. 1
USP 39
2478 Solubilidades / Tablas de Referencia
Solubilidades Aproximadas de Artículos de la USP y del NF (Continuación) Nombre ' Volumen en mL del Disolvente Soluto (1 q) Nitromersol Octaacetato de Sacarosa Oxandrolona
Aqua >2000 1100
Agua en Ebullición
Alcohol >2000 11
Cloroformo >2000
<5 270 5
2200
>10 000
6250
>1000
>1000
>1000
125 700
>1000
>1000
>1000
>1000
5200
57
Oxazeoam
>10 000
220
Oximetolona
>10 000
40
Oxitetraciclina Oxitetraciclina Cálcica Oxtrifilina
4150 >1000
Éter >2000
acetona, O, 3; benceno, 0,6; tolueno O 5 860 82
acetona 69 dioxano 14 alcohol absoluto 66 hidróxido de sodio O, 1 N, 15
1
Palmitato de Ascorbilo
>1000
Pamoato de Hidroxizina
>1000
Pantotenato de Calcio Paraldehído 1
3 10
Pectina
20
Penicilina G Benzatínica Penicilina G Procaínica Estéril Penicilina G Sódica Estéril Penicilina V Benzatínica Penicilina V Potásica
5000
65
250
30
60
330
42
910 42 10
40 3200 >1000
11
2
>2000
45
40
Perfenazina
Pirazinamida Pirimetamina Pivalato de Flumetasona
acetona 13
7 15
35 1000
>10 000
67
10
1000
acetona, 100; metanol, 1000; ácido clorhídrico O 1 N > 1000
135
1000
alcohol absoluto, 175; metanol 72
200
125
89
350
Polietilenalicol 1540
>10 000 1
Polietilenalicol 4000
4
25
3 2
Potasa Sulfurada Prednisolona
2 30 150
200
Prednisona
2800 alcohol absoluto 100
acetona 50
180
Primidona
2000
Prooilhexedrina
>500
o1
2500
400
04 15
02
Prooiloarabeno Pronionato de Sodio
1
o 65
24
>10 000 6
>10 000
6
250
Reseroina Resorcinol
200
1800 1
Sacarina
290
Sacarina Cálcica Sacarina Sódica Sacarosa Salicilato de Fisostiamina
1 25
26 15 05 75
3
02
31 47 50 170 16
Secobarbital Senosido 2
Sorbato de Potasio Sorbitol Succinato de Doxilamina
acetona 37
150
Pentobarbital Permanaanato de Potasio Pimozida
dimetilformamida, 1O; hidróxido de sodio 10 N 3 5
17
Pentazocina
Simeticona
Otros
hidróxido de sodio 0,5 N, 85 35 >10 000
2100
3700
6100
10 2
102
45
35
>1000
>1000
2
2
370
benceno, 10 2; alcohol absoluto > 1O 000
o 45 1
Los datos de solubilidad de los compuestos que normalmente son líquidos a 25º se expresan en términos del cociente entre el volumen de soluto y el volumen de disolvente; por ejemplo, 1 ml disuelto en_ _ ml de disolvente. 2 Únicamente fase líquida; el dióxido de silicio permanece como un residuo en estos disolventes. 1
Tablas de Referencia /Solubilidades 2479
USP 39
Solubllldades Aproximadas de Artículos de la USP y del NF (Continuación) Nombre, Volumen en mL del Disolvente Soluto (1 a) Succinato Sódico de Metilorednisolona Sulfacetamida Sódica Sulfadiazina Sulfadiazina Sódica Sulfadimetoxina Sulfaetidol Sulfametizol Sulfametoxazol
Sulfaoiridina Sulfasalazina Sulfato de Aluminio Sulfato de Atrooina Sulfato de Calcio Sulfato de Cinc Sulfato de Codeína Sulfato Cúorico Sulfato de Dextroanfetamina Sulfato de Efedrina Sulfato Ferroso Sulfato de Fisostiomina Sulfato de Hiosciamina Sulfato de lsooroterenol Sulfato de Maonesio Sulfato de Morfina Sulfato de Neomicina Sulfato de Paromomicina Sulfato de Quinidina Sulfato de Ouinina Sulfisoxazol Sulfoxilato Formaldehído de Sodio Sulfuro de Selenio Tartrato de Antimonio v Potasio Tartrato de Erootamina Tartrato de Fenindamina Tartrato de Levorfanol Tartrato de Pentolonio Tartrato de Rotoxamina Tartrato de Sodio v Potasio Tartrato de Trimeorazina Testolactona Testosterona Tetracaína Tetraciclina Timerosal Timol Tioauanina Tiosulfato de Sodio Tioteoa Tiotixeno Triamtereno Triazolam 1
Aaua
Agua en Ebullición
Alcohol 12
15 25 13000 2
Cloroformo >10000
>10 000
>3000
200 75
1300
1700
2000 3400
38 50
1900 1000
1900 1000
3500 >10 000 1 05 375 06 30 3 10 13 15 4 05 4 08 16
440 2900
>10 000
>10 000
25 485
05
>1000 2500 1 1000
ácido clorhídrico 2 N 50 metano!, 51; acetona, 13; benceno 2277 acetona 13 disulfuro de carbono, 2 (lentamente y por lo general de forma incomoleta) acetona 65 metano! 1500 alicerina 25
5
alicerina 25 aoua a 80º 65 olicerina 3
1300 500 800 90
05 04 5 >2000
1200 >2000
>2000 alicerina 1 ílentamente) alcohol a 60º, 240; aoua a 80º 1
05 570
1 <1 100 500 7700 34 12 500 40 50 05 10 1 2 4050
Otros
suero humano a 37° 620
>10 000 10 120
>10000 15
>10 000
510
175 161
180 1667
alcohol en ebullición 1O
alicerina 15
3 500 350 120 475 100
>1000 >10 000
>2000 >10 000
20
5
1800
2 2
100 2
alcohol absoluto 6
1
15
aceite de oliva 2
19 2
41 120
25
>10 000
5 50 12 1 7700
05 13 >10 000
83
>10 000
1000
alcohol absoluto 11 O ácido fórmico, 30; 2-metoxietanol 85 ácido clorhídrico O, 1 N, 600
Los datos de solubilidad de los compuestos que normalmente son líquidos a 25º se expresan en términos del cociente entre el volumen de soluto
y el volumen de disolvente; por ejemplo, 1 ml disuelto en _ _ ml de disolvente. 2
Éter
Únicamente fase líquida; el dióxido de silicio permanece como un residuo en estos disolventes.
2480 Solubilidades / Tablas de Referencia
USP 39
Solubilidades Aproximadas de Artículos de la USP y del NF (Continuación) Nombre ' Volumen en mL. del Disolvente Soluto '1 n) Triclormetiazida Tricloroetileno Trietilenmelamina
Anua
Valerato de Betametasona Violeta de Genciana Yodo
Alcohol
Cloroformo
1100
48
5000
>10000 2,5
13
3,6
1150
84
18 15 100
45 5 10
>10 000
10 000
16 10
<10
3000
13
Trioxisaleno
Trometamina Urea Vainillina
Agua en Ebullición
Éter 1400
Otros dioxano, 9, 1; dimetilformamida 4 35 metanol, 8; acetona, 9,5; benceno 18 dicloruro de metileno, 43; 4-metil-2-pentanona, 100 alcohol en ebullición 1 glicerina, 20; agua a 80º, 20
400 alicerina 15 disulfuro de carbono, 4; alicerina 80
Yoduro de lsoorooamida 50 10 5 Yoduro de Potasio 07 05 22 alicerina 2 Yoduro de Sodio 06 2 alicerina 1 1 Los datos de solubilidad de los compuestos que normalmente son líquidos a 25º se expresan en términos del cociente entre el volumen de soluto y el volumen de disolvente; por ejemplo, 1 ml disuelto en_ _ ml de disolvente. 2 Únicamente fase líquida; el dióxido de silicio permanece como un residuo en estos disolventes.
Tablas de Referencia/ Pesos Atómicos 2481
USP 39
,
PESOS ATOMICOS Pesos Atómicos Estándar de los Elementos, Recomendados por la Commission on Atomic Weights and lsotopic Abundances (Comisión de Pesos Atómicos y Abundancia Isotópica) de la lnternational Union of Pure and Applied Chemistry (Unión Internacional de Química Pura y Aplicada) (2007) (©2008 IUPAC) Pesos atómicos estándar 2007 [En orden alfabético: ajustados a A,(12C)= 12, en donde 12C es un átomo neutro en su estado nuclear y electrónico fundamental.] Los pesos atómicos de muchos elementos no son invariables sino que dependen del ori9en y el tratamiento del material. Los valores estándar de A,(E) y las incertidumbres (que figuran entre paréntesis, a continuación de la última cifra significativa a la cual se les atribuyen) se aplican a los elementos de origen terrestre natural. Las notas al pie de página de esta Tabla detallan los tipos de variaciones que pueden presentarse para elementos en particular y que pueden ser mayores que las incertidumbres listadas de valores de A,(E). Los nombres de los elementos con números atómicos 112, 113, 114, 115, 116 y 118 son provisorios. Nombre Actinio*
.
Aluminio Ame ricio Antimonio
.
Bismuto Bohrio* Boro Bromo Cadmio Calcio Californio Carbono Cerio Cesio Cinc Cloro Cobalto Cobre Cromo Curio*
.
Símbolo Atómico
Número Atómico
Ac Al Am Sb Ar
89 13 95 51 18 33 85 16 56 4 97 83 107 5 35 48 20 98 6 58 55 30 17 27 29 24 96 110 66 105 99 68 21 50 38 63
As At
s Ba Be Bk Si Bh B Br Cd Ca Cf
c
.
Darmstadtio Disorosio Dubnio* Einstenio* Erbio Escandia Estaño Estroncio Eurooio
Ce Cs Zn CJ Co Cu Cr Cm Ds Dv Db Es Er Se Sn Sr Eu
Peso Atómico
Notas al ole de náalna
26 9815386(8) 121 760(1) 39 948(1) 74 92160(2)
a a. r
32 065(5) 137 327(7) 9 012182(3)
a. r
208 98040<1) 10811(7) 79 904(1) 112 411(8) 40 078(4)
a m r
12 0107(8) 140116(1) 132 9054519(2) 65 38(2) 35 453(2) 58 933195(5) 63 546(3) 51 9961(6)
a r a
162 500(1)
a
167 259<3) 44 955912(6) 118 710(7) 87 62(1) 151 964(1)
n
a a
m r
n
a r a
• El elemento no posee nucleidos estables. En la tabla adjunta se proporcionan uno o más isótopos conocidos, con la masa atómica relativa y vida media correspondientes. Sin embargo, tres de los elementos (Th, Pa y U) sí poseen una composición isotópica terrestre característica y para ellos se tabula un peso atómico. t Se sabe que los pesos atómicos de materiales de Li disponibles comercialmente varían entre 6,939 y 6,996; si se requiere un valor más exacto, debe determinarse para el material específico. g Se conocen muestras geológicas en las que el elemento posee una composición isotópica que se encuentra fuera de los límites del material normal. La diferencia entre el peso atómico del elemento en tales muestras y el proporcionado en Ja Tabla puede exceder la incertidumbre establecida. m Es posible encontrar composiciones isotópicas modificadas en el material disponible comercialmente debido a que dicho material ha sido sometido a fraccionamiento isotópico inadvertido o no revelado. Pueden presentarse desviaciones de importancia en el peso atómico del elemento respecto del proporcionado en Ja Tabla. r El rango de composición isotópica de material terrestre normal no permite que se proporcione un valor Ar(E) más preciso; el valor A,(E) tabulado debe ser aplicable a todo material normal.
2482 Pesos Atómicos / Tablas de Referencia
Nombre Fermio* Flúor Fósforo Francio* Gadolinio Galio Germanio Hafnio Hassio* Helio Hidróaeno Hierro Holmio Indio Iridio Iterbio Itrio Kriotón Lantano Lawrencio* Litio Lutecio Maanesio Manaaneso Meitnerio* Mendelevio* Mercurio Molibdeno Neodimio Neón Neotunio* Niobio Níauel Nitróaeno Nobelio* Oro Osmio Oxíaeno Paladio Plata Platino Plomo Plutonio * Polonio* Potasio Praseodimio Promecio* Protactinio * Radio* Radón*
Símbolo Atómico Fm F
p Fr Gd Ga Ge Hf Hs He H Fe Ho In Ir Yb y Kr La Lr Li Lu Ma Mn Mt Md Ha Mo Nd Ne No Nb Ni N No Au Os
o Pd Aa Pt Pb Pu Po K Pr Pm Pa Ra Rn
USP 39 Número Atómico 100 9 15 87 64 31 32 72 108 2 1 26 67 49 77 70 39 36 57 103 3 71 12 25 109 101 80 42 60 10 93 41 28 7 102 79 76 8 46 47 78 82 94 84 19 59
61 91 88 86
Peso Atómico
Notas al nle de páalna
18 9984032(5) 30 973762(2) 157 25(3) 69 723(1) 7264(1) 178 49(2)
a
4 002602(2) 1 00794(7) 55 845(2) 164 93032(2) 114 818(3) 192 217(3) 173 054(5) 88 90585(2) 83 798(2) 138 90547(7)
a. r a. m r
6 941(d 174 9668(1) 24 3050(6) 54 938045(5)
a m r
a a. m a
a
200 59(2) 95 96(2) 144 242(3) 20 1797(6)
a a a m
92 90638(2) 58 6934(4) 14 0067(2)
a r
196 966569(4) 190 23(3) 15 9994(3) 106 42(1) 107 8682(2) 195 084(9) 207 2(1)
a a. r a a n r
39 0983(1) 140 90765(2) 231 03588(2)
• El elemento no posee nucleidos estables. En la tabla adjunta se proporcionan uno o más isótopos conocidos, con la masa atómica relativa y vida media correspondientes. Sin embargo, tres de los elementos (Th, Pa y U) sí poseen una composición isotópica terrestre característica y para ellos se tabula un peso atómico. t Se sabe que los pesos atómicos de materiales de Li disponibles comercialmente varían entre 6,939 y 6,996; si se requiere un valor más exacto, debe determinarse para el material específico. g Se conocen muestras geológicas en las que el elemento posee una composición isotópica que se encuentra fuera de los límites del material normal. La diferencia entre el peso atómico del elemento en tales muestras y el proporcionado en la Tabla puede exceder la incertidumbre establecida. m Es posible encontrar composiciones isotópicas modificadas en el material disponible comercialmente debido a que dicho material ha sido sometido a fraccionamiento isotópico inadvertido o no revelado. Pueden presentarse desviaciones de importancia en el peso atómico del elemento respecto del proporcionado en la Tabla. 'El rango de composición isotópica de material terrestre normal no permite que se proporcione un valor A,(E) más preciso; el valor A,(E) tabulado debe ser aplicable a todo material normal.
Tablas de Referencia/ Pesos Atómicos 2483
USP 39
Nombre Renio Roentoenio* Rodio Rubidio Rutenio Rutherfordio * Samario Seaboraio* Selenio Silicio Sodio (Natrio) Talio Tantalio Tecnecio * Telurio Terbio Titanio Torio*
Símbolo Atómico Re Ra Rh Rb Ru Rf Sm Sa Se Si Na TI Ta Te Te Tb Ti Th Tm
Número Atómico 75
Peso Atómico
111 45 37 44 104
102 90550(2) 85 4678(3) 101 07(2)
a a
150 36(2)
a
62 106 34 14 11 81 73 43
52 65
Notas al oie de oáolna
186 207<1)
78 96(3) 28 0855(3) 22 98976928(2) 204 3833(2) 180 94788(2) 127 60(3) 158 92535(2) 47867(1) 232 03806(2) 168 93421 (2) 183 84(1)
r
a
22 a 90 Tulio 69 Tunasteno !Wolframio) w 74 Ununbio* 112 Uub Ununhexio* 116 Uuh Ununoctio* 118 Uuo Ununoentio * Uuo 115 Ununouadio * Uua 114 Ununtrio * Uut 113 Uranio* 238 02891 (3) u 92 a m 509415(1) Vanadio V 23 131 293(6) 54 Xenón Xe a m 126 90447(3) 1 53 Yodo 91 224(2) Zr 40 Zirconio a * El elemento no posee nucleidos estables. En la tabla adjunta se proporcionan uno o más isótopos conocidos, con la masa atómica relativa y vida media correspondientes. Sin embargo, tres de los elementos (Th, Pa y U) sí poseen una composición isotópica terrestre característica y para ellos se tabula un peso atómico. t Se sabe que los pesos atómicos de materiales de Li disponibles comercialmente varían entre 6,939 y 6,996; si se requiere un valor más exacto, debe determinarse para el material específico. g Se conocen muestras geológicas en las que el elemento posee una composición isotópica que se encuentra fuera de los límites del material normal. La diferencia entre el peso atómico del elemento en tales muestras y el proporcionado en la Tabla puede exceder la incertidumbre establecida. m Es posible encontrar composiciones isotópicas modificadas en el material disponible comercialmente debido a que dicho material ha sido sometido a fraccionamiento isotópico inadvertido o no revelado. Pueden presentarse desviaciones de importancia en el peso atómico del elemento respecto del proporcionado en la Tabla. ' El rango de composición isotópica de material terrestre normal no permite que se proporcione un valor A,(E) más preciso; el valor A,(E) tabulado debe ser aplicable a todo material normal.
2484 Masas Atómicas/ Tablas de Referencia
USP 39
Masas Atómicas Relativas y Vidas Medias de Radionucleidos Seleccionados (© 1998 IUPAC). [Las abreviaturas para las unidades son: a = año; d = día; h = hora; min = minuto; s nombres de los elementos con números atómicos 11 O; 111 y 112 son provisorios.] Número Atómico 43
Nombre Tecnecio
Símbolo Te
61
Promecio
Pm
84
Polonio
Po
85
Ástato
At
86
Radón
Rn
87 88
Francio Radio
Fr Ra
89 90
Actinio Torio
Ac Th
91 92
Protactinio Uranio
Pa
93
Neotunio
No
94
Plutonio
Pu
95
Americio
Am
96
Curio
Cm
u
97
Berkelio
Bk
98
Californio
Cf
99 100 101
Einstenio Fermio Mendelevio
Es Fm Md
Número Másico 97 98 99 145 147 209 210 210 211 211 220 222 223 223 224 226 228 227 230 232 231 233 234 235 236 238 237 239 238 239 240 241 242 244 241 243 243 244 245 246 247 248 247 249 249 250 251 252 252 257 256 258
Masa Atómica Relativa 96 9064 97 9072 98 9063 144 9127 1469151 208 9824 209 9828 209 9871 21 o 9875 210 9906 220 0114 222 0176 223 0197 223 0185 224 0202 226 0254 228 0311 227 0277 230 0331 232 0380 231 0359 233 0396 234 0409 235 0439 236 0456 238 0508 237 0482 239 0529 238 0496 239 0522 240 0538 241 0568 242 0587 244 0642 241 0568 243 0614 243 0614 244 0627 245 0655 246 0672 247 0703 248 0723 247 0703 249 0750 249 0748 250 0764 251 0796 252 0816 252 0830 257 0951 256 0941 258 09B4
'Las incertidumbres de estos elementos son asimétricas. b El valor proporcionado se determina a partir unas pocas desintegraciones solamente.
= segundo;
ms
= milisegundo.
Vida Media e Incertidumbre 2 6+0 4x106 4 2+0 3x106 21+0 3x10S 17 7±0 4 2 623±0 003 102±5 138 4±0 1 81±0 4 7 21±0 01 14 6±0 2 55 6±0 1 3 823±0 004 22 0±0 1 11 43+0 01 3 66+0 02 1599+4 5 75+0 03 21 77+0 02 7 54+0 03x1 o• 1 40+0 01xl0 10 3 25+0 01 xl O• 1 592+0 002x1 os 2 455±0 006x1 os 7 04±0 01 xl os 2 342±0 004x1 0 7 4 47±0 02x1 o• 2 14±0 01 xl 06 2 355±0 006 87 7±0 1 2 410±0 003x1 O• 6 56±0 01xl0' 14 4+0 1 3 75+0 02xl os 8 00+0 09x1 0 7 432 7+0 6 7 37+0 02x10' 29 1+O1 18 1+O 1 8 48+0 06x10' 4 76+0 04x10' 1 56+0 05x1 0 7 3 48±0 06xl os 1 4±0 3x10' 3 20±0 06x1 02 351±2 13 1±0 1 9 0±0 5x102 2 64±0 01 472±2 100 5±0 2 78+2 51 5+0 3
Los
Unidad a a a a a a d h h h s d min d d a a a a a a a a a a a a d a a a a a a a a a
a a a a a a d a a
a a d d min d
Tablas de Referencia / Masas Atómicas 2485
USP 39
Número Atómico 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112
Nombre
Símbolo
Número Másico 259 262 261 262 266 264 269 268 271 272 277
Masa Atómica Relativa 259 1011 262 110 261 1088 262 1141 2661219 264 1247 2691341 2681388 271 1461 272 1535
Nobelio No Lawrencio Lr Rutherfordio Rf Dubnio Db Sa Seaboraio Bohrio Bh Hassio Hs Meitnerio Mt Uun Ununnilio Unununio Uuu Ununbio Uub • Las incertidumbres de estos elementos san asimétricas. b El valor proporcionado se determina a partir unas pocas desintegraciones solamente,
Vida Media e Incertidumbre 58±5 3 6±0 3 1 3• 34+5 21' 044' 9 35•,b
70''" 1 1•,b 1 5•,b
o 24''"
Unidad min min min s s s s ms ms ms ms
2486 Tabla Alcoholimétrica / Tablas de Referencia
USP 39
TABLA ALCOHOLIMÉTRICA Basada en datos publicados en el National Bureau of Standards Bulletin, vol. 9, pp. 424--425 (publicación del National lnstitute of Standards and Technology, Instituto Nacional de Normas y Tecnología). (1) (2) Porcentaie de C,H,OH En volumena 15 56ºC En oeso
o 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52
o 00 o 80 1 59 2 39 3 19 4 00 4 80 5 61 642 723 8 05 8 86 9 68 10 50 11 32 1214 12 96 13 79 14 61 15 44 16 27 1710 17 93 18 77 19 60 2044 21 29 22 13 22 97 23 82 24 67 25 52 26 38 27 24 2810 28 97 29 84 30 72 31 60 32 48 33 36 34 25 3515 36 05 36 96 37 87 38 78 39 70 40 62 41 55 42 49 43 43 44 37
(3)
(4)
Peso específico en el aire
(6) (5) Porcentale de C2HsOH
(7)
(8)
Peso esoecíflco en el aire
A
A
25°/25º
15 56º/15 56º
En oeso
En volumen a 15 56º(
1 0000
1 0000
o
o 00
1 0000
1 0000
o 9985 o 9970 o 9956 o 9941 o 9927 o 9914 o 9901 o 9888 o 9875 o 9862 o 9850 o 9838 o 9826 o 9814 o 9802 o 9790 o 9778 o 9767 o 9756 o 9744 o 9733 o 9721 o 9710 o 9698 o 9685 o 9673 o 9661 o 9648 o 9635 o 9622 o 9609 o 9595 o 9581 o 9567 o 9552 o 9537 o 9521 o 9506 o 9489 o 9473 o 9456 o 9439 o 9421 o 9403 o 9385 o 9366 o 9348 o 9328 o 9309 o 9289 o 9269 o 9248
o 9985 o 9970 o 9956 o 9942 o 9928 o 9915 o 9902 o 9890 o 9878 o 9866 o 9854 o 9843 o 9832 o 9821 o 9810 o 9800 o 9789 o 9779 o 9769 o 9759 o 9749 o 9739 o 9729 o 9719 o 9708 o 9697 o 9687 o 9676 o 9664 o 9653 o 9641 o 9629 o 9617 o 9604 o 9590 o 9576 o 9562 o 9548 o 9533 o 9517 o 9501 o 9485 o 9469 o 9452 o 9434 o 9417 o 9399 o 9380 o 9361 o 9342 o 9322 o 9302
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52
1 26 2 51 3 76 5 00 6 24 7 48 8 71 9 94 11 17 12 39 13 61 14 83 16 05 17 26 18 47 19 68 20 88 22 08 23 28 2447 25 66 26 85 28 03 29 21 30 39 31 56 32 72 33 88 35 03 3618 37 32 38 46 39 59 40 72 41 83 42 94 44 05 4515 46 24 47 33 48 41 49 48 50 55 51 61 52 66 53 71 54 75 55 78 56 81 57 83 58 84 59 85
o 9981 o 9963 o 9945 o 9927 o 9911 o 9894 o 9879 o 9863 o 9848 o 9833 o 9818 o 9804 o 9789 o 9776 o 9762 o 9748 o 9734 o 9720 o 9706 o 9692 o 9677 o 9663 o 9648 o 9633 o 9617 o 9601 o 9585 o 9568 o 9551 o 9534 o 9516 o 9498 o 9480 o 9461 o 9442 o 9422 o 9402 o 9382 o 9362 o 9341 o 9320 o 9299 o 9278 o 9256 o 9235 o 9213 o 9191 o 9169 o 9147 o 9124 o 9102 o 9079
o 9981 o 9963 o 9945 o 9928 o 9912 o 9896 o 9881 o 9867 o 9852 o 9839 o 9825 o 9812 o 9799 o 9787 o 9774 o 9763 o 9751 o 9738 o 9726 o 9714 o 9701 o 9688 o 9675 o 9662 o 9648 o 9635 o 9620 o 9605 o 9590 o 9574 o 9558 o 9541 o 9524 o 9506 o 9488 o 9470 o 9451 o 9432 o 9412 o 9392 o 9372 o 9352 o 9331 o 9310 o 9289 o 9268 o 9246 o 9225 o 9203 o 9181 o 9159 o 9137
A
A
25°/25º
15 56°/15 56º
Tablas de Referencia /Tabla Alcoholimétrica 2487
USP 39 (1) (2) Porcentale de C,H,OH En volumena En neso 15 56ºC 53 45 33 46 28 54 47 25 55 48 21 56 57 49 19 58 50 17 51 15 59 5215 60 61 53 15 5415 62 55 17 63 5618 64 57 21 65 58 24 66 67 59 28 60 33 68 61 38 69 70 6244 71 63 51 72 64 59 73 65 67 74 66 77 75 67 87 76 68 98 70 10 77 78 71 23 79 72 38 73 53 80 81 74 69 82 75 86 77 04 83 84 78 23 7944 85 80 66 86 81 90 87 8314 88 84 41 89 90 85 69 91 8699 88 31 92 93 89 65 94 91 03 95 92 42 96 93 85 97 95 32 96 82 98 99 98 38 100 100 00
(3)
(4)
Peso esDecíflco en el aire A
A
25º/25º 09228 o 9207 o 9185 o 9164 o 9142 o 9120 o 9098 o 9076 o 9053 o 9030 o 9006 o 8983 o 8959 o 8936 o 8911 o 8887 o 8862 o 8837 o 8812 o 8787 o 8761 o 8735 o 8709 o 8682 o 8655 o 8628 o 8600 o 8572 o 8544 o 8516 o 8487 o 8458 o 8428 o 8397 o 8367 o 8335 o 8303 o 8271 o 8237 o 8202 o 8167 o 8130 o 8092 o 8053 o 8011 o 7968 o 7921 o 7871
15 56°/15 56º o 9282 o 9262 o 9241 o 9220 09199 o 9177 o 9155 o 9133 o 9111 o 9088 o 9065 o 9042 o 9019 08995 o 8972 o 8948 o 8923 o 8899 o 8874 o 8848 o 8823 o 8797 o 8771 o 8745 o 8718 o 8691 o 8664 o 8636 o 8608 o 8580 o 8551 o 8522 o 8493 o 8462 o 8432 o 8401 o 8369 o 8336 o 8303 o 8268 o 8233 o 8196 o 8158 o 8118 o 8077 o 8033 o 7986 o 7936
(5) (6) Porcentale de C,H,OH
En neso 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100
En volumen a 15 56ºC 60 85 61 85 62 84 63 82 64 80 65 77 66 73 67 79 68 64 69 59 70 52 71 46 72 38 73 30 74 21 7512 76 02 76 91 77 79 78 67 79 54 80 41 81 27 8212 82 97 83 81 84 64 85 46 8628 87 08 87 89 88 68 8946 90 24 91 01 91 77 92 52 93 25 93 98 94 70 95 41 9610 96 79 97 46 98 12 98 76 99 39 100 00
(7)
(8)
Peso específico en el aire A
A
25º/25° o 9056 o 9033 o 9010 o 8987 o 8964 o 8941 o 8918 o 8895 o 8871 08848 o 8824 o 8801 o 8777 o 8753 o 8729 o 8706 o 8682 o 8658 o 8634 o 8609 o 8585 o 8561 o 8537 o 8512 o 8488 o 8463 o 8439 o 8414 o 8389 o 8364 o 8339 o 8314 o 8288 o 8263 o 8237 o 8211 o 8184 o 8158 o 8131 o 8104 08076 o 8048 o 8020 o 7992 o 7962 o 7932 o 7902 o 7871
15 56º/15 56º 09114 o 9092 o 9069 o 9046 o 9024 o 9001 o 8978 o 8955 o 8932 o 8909 o 8886 o 8862 o 8839 08815 o 8792 o 8768 o 8745 o 8721 o 8697 o 8673 o 8649 o 8625 o 8601 o 8576 o 8552 o 8528 o 8503 o 8479 o 8454 o 8429 o 8404 o 8379 o 8354 o 8328 o 8303 o 8276 o 8250 o 8224 o 8197 o 8170 o 8142 o 8114 o 8086 o 8057 o 8028 o 7998 o 7967 o 7936
USP 39
2488 Tabla de Viscosidad Intrínseca/ Tablas de Referencia
TABLA DE VISCOSIDAD INTRÍNSECA Esta tabla se basa en datos publicados en la Tabla 3 del Método de Prueba D 1795 de ASTM (publicación de la American Society for Testing and Materials, Sociedad Norteamericana de Pruebas y Materiales). Viscosidad Intrínseca, [r¡]c, a Diferentes Valores de Viscosidad Relatlva, r¡,.,.,, rnlc
000 0098 o 189 o 276 o 358 0437 o 515 o 587 o 656 o 723
001 o 106 o 198 0285 o 367 0445 o 522 0595 o 663 o 730
002 o 115 0207 o 293 o 375 o 453 0529 o 602 o 670 o 736
003 o 125 o 216 o 302 o 383 0460 0536 o 608 o 677 o 743
004 o 134 o 225 o 310 o 391 0468 o 544 o 615 o 683 o 749
005 o 143 o 233 o 318 o 399 0476 o 551 o 622 o 690 o 756
006 o 152 0242 o 326 0407 0484 o 558 o 629 o 697 o 762
007 o 161 o 250 o 334 0414 0491 o 566 o 636 o 704 o 769
008 o 170 o 259 o 342 0422 0499 o 573 o 642 o 710 o 775
009 o 180 o 268 o 350 0430 0507 o 580 o 649 o 717 o 782
20 21 22 23 24 25 26 27 28 29
o 788 o 852 o 912 o 971
o 795 o 858 o 918
o 802 o 864 o 924
o 809 o 870 o 929
o 821 o 882 o 941
o 827 o 888 o 948
o 833 o 894 o 953
o 840
o 846
1 028 1 083 1 137 1 190 1 240 1 290
0976 1 033 1 089 1 142 1 195 1 245 1 295
0983 1 039 1 094 1 147 1 200 1 250 1 300
0988 1 044 1 100 1 153 1 205 1 255 1 305
o 815 o 876 o 935 o 994 1 050 1105 1 158 1 210 1 260 1 310
1 000 1 056 1 111 1 163 1 215 1 265 1 314
1 006 1 061 1 116 1 169 1 220 1 270 1 319
1 011 1 067 1 121 1 174 1 225 1 275 1 324
0900 o 959 1 017 1 072 1126 1 179 1 230 1 280 1 329
30 31 32 33 34 35 36 37 38 39
1 338 1 386 1 432 1 477 1 521 1 562 1 604 1 646 1 687 1 727
1 343 1 390 1 436 1 482 1 525 1 566 1 608 1 650 1 691 1 731
1 348 1 395 1 441 1 486 1 529 1 570 1 612 1 654 1 695 1 735
1 352 1 400 1 446 1 491 1 533 1 575 1 617 1 658 1 700 1 739
1 357 1 405 1 450 1 496 1 537 1 579 1 621 1 662 1 704 1 742
1 362 1 409 1 455 1 500 1 542 1 583 1 625 1 666 1 708 1 746
1 367 1 414 1 459 1 504 1 546 1 587 1 629 1 671 1 712 1 750
1 371 1 418 1 464 1 508 1 550 1 591 1 633 1 675 1 715 1 754
1 376 1 423 1 468 1 513 1 554 1 595 1 637 1 679 1 719 1 758
1 381 1 427 1 473 1 517 1 558 1 600 1 642 1 683 1 723 1 762
40 41 42 43 44 45 46 47 48 49
1 765 1 804 1 841 1 878 1 914 1 950 1 986 2 020 2 053 2 087
1 769 1 808 1 845 1 882 1 918 1 954 1 989 2 023 2 057 2 090
1 773 1 811 1 848 1 885 1 921 1 957 1 993 2 027 2 060 2 093
1 777 1 815 1 852 1 889 1 925 1 961 1 996 2 030 2 063 2 097
1 781 1 819 1 856 1 893 1 929 1 964 2 000 2 033 2 067 2100
1 785 1 822 1 859 1 896 1 932 1 968 2 003 2 037 2070 2103
1 789 1 826 1 863 1 900 1 936 1 971 2 007 2 040 2 073 2107
1 792 1 830 1 867 1 904 1 939 1 975 2 010 2 043 2 077 2 110
1 796 1 833 1 870 1 907 1 943 1 979 2 013 2 047 2 080 2113
1 800 1 837 1 874 1 911 1 946 1 982 2 017 2 050 2 083 2116
2135 2 167 2197 2 227 2 258 2288 2 318 2 347
2139 2 170 2 200 2 230 2 261 2 291 2 320 2 350
2142 2173 2 203 2 233 2 264 2 294 2 324 2 353
2 145 2176 2 206 2 236 2 267 2 297 2 326 2 355
2148 2180 2 209 2 240 2 270 2 300 2 329 2 358
TI
11 12 13 14 15 16 17 18 19
2 129 50 2119 2 122 2 125 2132 2154 2164 2 151 2 160 51 2 158 2 183 2190 2 192 2195 52 2186 53 2 212 2 215 2 218 2 221 2 224 54 2 243 2 246 2 249 2 252 2 255 2 282 55 2 273 2 276 2 279 2 285 2 312 2 315 56 2 303 2 306 2 309 2 344 2 341 57 2 332 2 335 2 338 A Método Sueco CCA 27:57, Karin Wilson, Svensk Papperstidning,Vol. 60, 1957, •Derivado de la ecuación: r¡,.1 - 1 = r¡,p = [r¡]ce*'[~Jc, donde k' = 0,30.
pp. 513 a 521.
0906
o 965 1 022 1 078 1 131 1 184 1 235 1 285 1 333
Tablas de Referencia /Tabla de Viscosidad Intrínseca 2489
USP 39
o 01
58 59
000 2 361 2 390
60 61 62 63 64 65 66 67 68 69
006 2 379 2 408
0.07 2 382 2 411
008 2 384 2414
009 2 387 2 417
2 431 2 458 2 486 2 513 2 540 2 566 2 592 2 618 2 643 2 668
2 433 2 461 2 489 2 516 2 542 2 568 2 595 2 620 2 645 2 670
2436 2464 2 492 2 518 2 545 2 571 2 597 2 623 2 648 2 673
2 439 2 467 2494 2 521 2 547 2 574 2 600 2 625 2 650 2 675
2442 2470 2497 2 524 2 550 2 576 2 603 2 627 2 653 2 678
2444 2 472 2 500 2 526 2 553 2 579 2 605 2 630 2 655 2 680
2 690 2 714 2 738 2 762 2 786 2 809 2 833 2 856 2 879 2 902
2 693 2 717 2 740 2 764 2 788 2 812 2 835 2 858 2 881 2 905
2 695 2 719 2 743 2 767 2 790 2 814 2 837 2 860 2 884 2 907
2 698 2 721 2 745 2 769 2 793 2 816 2 840 2 863 2 887 2 909
2 700 2 724 2 748 2 771 2 795 2 819 2 842 2 865 2 889 2 911
2 702 2 726 2 750 2 774 2 798 2 821 2 844 2 868 2 891 2 913
2 705 2 729 2 752 2 776 2 800 2 823 2 847 2 870 2 893 2 915
2 922 2 944 2 966 2 987 3 008 3 029 3 050 3 071 3 092 3 112
2 924 2 946 2 968 2 990 3 010 3 031 3 052 3 073 3 094 3114
2 926 2 948 2 970 2 992 3 012 3 033 3 054 3 075 3 096 3 116
2 928 2 950 2 972 2 994 3 015 3 035 3 056 3 077 3 098 3118
2 931 2 952 2 974 2 996 3 017 3 037 3 058 3 079 3100 3 120
2 933 2 955 2 976 2 998 3 019 3 040 3 060 3 081 3 102 3 122
2 935 2 957 2 979 3 000 3 021 3 042 3 062 3 083 3104 3124
2 937 2 959 2 981 3 002 3 023 3 044 3 064 3 085 3 106 3 126
3132 3152 3172 3192 3 212 3 231 3 250 3 269 3 289 3 307
3134 3154 3174 3 194 3 214 3 233 3 252 3 271 3 291 3 309
3 136 3 156 3 176 3 196 3 215 3 235 3 254 3 273 3 293 3 311
3138 3 158 3178 3 198 3 217 3 237 3 256 3 275 3 295 3 313
3 140 3 160 3 180 3 200 3 219 3 239 3 258 3 277 3 297 3 316
3 142 3 162 3 182 3 202 3 221 3 241 3 260 3 279 3 298 3 318
3 144 3 164 3 184 3 204 3 223 3 242 3 262 3 281 3 300 3 320
3146 3 166 3 186 3 206 3 225 3 244 3 264 3 283 3 302 3 321
07 3 45 3 61 3 77 3 92 4 06 419 4 31 4 43 4 54 4 64
08 3 46 3 63 3 79 3 93 4 07 4 20 4 33 4 44 4 55 4 65
09 3 48 3 64 3 80 3 95 4 09 4 22 4 34 4 45 4 56 4 66
003 2 370 2 400
004 2 373 2 403
2419 2447 2 475 2 503 2 529 2 555 2 581 2 608 2 633 2 658
2 422 2 450 2478 2 505 2 532 2 558 2 584 2 610 2 635 2 660
2 425 2 453 2 481 2 508 2 534 2 561 2 587 2 613 2 637 2 663
2428 2456 2483 2 511 2 537 2 563 2 590 2 615 2 640 2 665
70 71 72 73 74 75 76 77 78 79
2 683 2 707 2 731 2 755 2 779 2 802 2 826 2 849 2 873 2 895
2 685 2 710 2 733 2 757 2 781 2 805 2 828 2 851 2 875 2 898
2 687 2 712 2 736 2 760 2 783 2 807 2 830 2 854 2 877 2 900
80 81 82 83 84 85 86 87 88 89
2 918 2 939 2 961 2 983 3 004 3 025 3 046 3 067 3 087 3108
2 920 2 942 2 963 2 985 3 006 3 027 3 048 3 069 3 089 3 110
90 91 92 93 94 95 96 97 98 99
3 128 3 148 3 168 3 188 3 208 3 227 3 246 3 266 3 285 3304
3 130 3 150 3 170 3 190 3 210 3 229 3 248 3 268 3 287 3 305
n'"'
nlc 005
2 376 2 405
2 364 2 393
002 2 367 2 396
00 o1 02 03 04 3 34 3 39 10 3 32 3 36 3 37 11 3 52 3 53 3 55 3 56 3 50 12 3 66 3 68 3 71 3 72 3 69 3 83 3 85 3 86 3 88 3 80 13 14 3 96 3 97 3 99 4 00 4 02 411 15 410 413 414 4 15 4 23 4 24 4 27 4 28 16 4 25 17 4 35 4 36 4 37 4 38 4 39 18 4 46 447 448 449 4 50 4 59 4 60 4 61 19 4 57 4 58 •Método Sueco CCA 27:57, Karin Wilson, Svensk Papperstidning,Vol. 60, 1957, • Derivado de la ecuación: ,,,,, - 1 = T]sp = [11]ce"l"J', donde k' = O, 30.
05 06 3 43 3 41 3 58 3 60 3 76 3 74 3 89 3 90 4 03 4 04 417 418 4 30 4 29 4 42 4 41 4 53 4 52 4 63 4 62 pp. 513 a 521.
USP 39
2490 Equivalencias de Temperatura / Tablas de Referencia
EQUIVALENCIAS DE TEMPERATURA
Escala de Grados Fahrenhelt a Centígrados (Celslus) ºF
o 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50
ºC -17 78 -17 22 -16 67 -16 11 -15 56 -15 -14 44 -13 89 -13 33 -12 78 -12 22 -11 67 -11 11 -10 56 -10 -9 44 -8 89 -8 33 -7 78 -7 22 -6 67 -611 -5 56 -5 --4 44 -3 89 -3 33 -2 78 -2 22 -1 67 -111 -O 56
o o 56 1 11 1 67 2 22 2 78 3 33 3 89 4 44 5 5 56 6 11 6 67 7 22 7 78 8 33 8 89 9 44 10
ºF 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100
ºC 10 56 11 11 11 67 12 22 12 78 13 33 13 89 1444 15 15 56 16 11 16 67 17 22 17 78 18 33 18 89 1944 20 20 56 21 11 21 67 22 22 22 78 23 33 23 89 24 44 25 25 56 2611 26 67 27 22 27 78 28 33 28 89 2944 30 30 56 31 11 31 67 32 22 32 78 33 33 33 89 3444 35 35 56 3611 36 67 37 22 37 78
lºF - 32\ t S ºF 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150
I 9)
= ºC
ºC 38 33 38 89 39 44 40 40 56 41 11 41 67 42 22 42 78 43 33 43 89 44 44 45 45 56 4611 46 67 47 22 47 78 48 33 48 89 49 44 50 50 56 51 11 51 67 52 22 52 78 53 33 53 89 54 44 55 55 56 56 11 56 67 57 22 5778 58 33 58 89 59 44 60 60 56 61 11 61 67 62 22 62 78 63 33 63 89 64 44 65 65 56
ºF 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200
ºC 6611 66 67 67 22 67 78 68 33 68 89 69 44 70 70 56 71 11 71 67 72 22 72 78 73 33 73 89 7444 75 75 56 7611 76 67 77 22 77 78 78 33 78 89 7944 80 80 56 81 11 81 67 82 22 82 78 83 33 83 89 8444 85 85 56 86 11 86 67 87 22 87 78 88 33 88 89 89 44 90 90 56 91 11 91 67 92 22 92 78 93 33
ºF 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250
ºC 93 89 9444 95 95 56 9611 96 67 97 22 97 78 98 33 98 89 9944 100 100 56 101 11 101 67 102 22 102 78 103 33 103 89 104 44 105 105 56 10611 106 67 107 22 107 78 108 33 108 89 109 44 110 110 56 111 11 111 67 112 22 112 78 113 33 113 89 114 44 115 115 56 11611 116 67 117 22 117 78 118 33 118 89 119 44 120 120 56 121 11
Tablas de Referencia / Equivalencias de Temperatura 2491
USP 39
Escala de Grados Centígrados (Celslus) a Fahrenhelt (9 I SlºC + 32
ºC -20 -19 -18 -17 -16 -15 -14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1
o 1 2 3 4
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
ºF -4 o -2 2 -04 14 32 5 68 86 10 4 12 2 14 15 8 17 6 19 4 21 2 23 24 8 26 6 284 30 2 32 33 8 35 6 37 4 39 2 41 42 8 44 6 464 48 2 50 51 8 53 6 55 4 57 2 59 60 8 62 6 644 662 68
ºC 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60
ºF 69 8 71 6 73 4 75 2 77 78 8 80 6 82 4 84 2 86 87 8 89 6 91 4 93 2 95 96 8 98 6 100 4 102 2 104 105 8 107 6 109 4 111 2 113 114 8 116 6 118 4 120 2 122 123 8 125 6 127 4 129 2 131 132 8 134 6 136 4 138 2 140
ºC 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100
= ºF
ºF 141 8 143 6 145 4 147 2 149 150 8 152 6 1544 156 2 158 159 8 161 6 163 4 165 2 167 168 8 170 6 172 4 174 2 176 177 8 179 6 181 4 183 2 185 186 8 188 6 190 4 192 2 194 195 8 197 6 1994 201 2 203 204 8 206 6 208 4 210 2 212
ºC 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140
ºF 213 8 215 6 217 4 219 2 221 222 8 224 6 2264 228 2 230 231 8 233 6 235 4 237 2 239 240 8 242 6 244 4 246 2 248 249 8 251 6 253 4 255 2 257 258 8 260 6 262 4 264 2 266 267 8 269 6 271 4 273 2 275 276 8 278 6 2804 282 2 284
ºC 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180
ºF 285 8 287 6 289 4 291 2 293 294 8 296 6 2984 300 2 302 303 8 305 6 307 4 309 2 311 312 8 314 6 316 4 318 2 320 321 8 323 6 325 4 327 2 329 330 8 332 6 334 4 336 2 338 339 8 341 6 343 4 345 2 347 348 8 350 6 352 4 354 2 356
